JP3027613B2 - テトラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレオ異性体の製造方法 - Google Patents
テトラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレオ異性体の製造方法Info
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Description
【０００１】本発明は、5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸のラ
セミ混合物の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸成分のみ
を、細菌的に誘導したホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸に転化させることよりなる、テトラヒドロ葉酸化合物
の光学異性的に純粋なジアステレオマーの新規な製造方
法に関するものである。
セミ混合物の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸成分のみ
を、細菌的に誘導したホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸に転化させることよりなる、テトラヒドロ葉酸化合物
の光学異性的に純粋なジアステレオマーの新規な製造方
法に関するものである。
【０００２】本発明を要約すれば、たとえば 5,6,7,8-
テトラヒドロ葉酸のラセミ混合物の 5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸成分のみをホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸に転化させ、続いて環化、加水分解および誘導体化
（derivatize）することよりなる、テトラヒドロ葉酸化
合物の光学異性的に純粋なジアステレオ異性体の製造方
法が記載されていることである。この方法はまた、誘導
体または（放射性標識した）テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルの所望の実質的に純粋な（6Ｒ ま
たは 6Ｓ）エナンショマーを製造するにも有用である。
テトラヒドロ葉酸のラセミ混合物の 5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸成分のみをホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸に転化させ、続いて環化、加水分解および誘導体化
（derivatize）することよりなる、テトラヒドロ葉酸化
合物の光学異性的に純粋なジアステレオ異性体の製造方
法が記載されていることである。この方法はまた、誘導
体または（放射性標識した）テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルの所望の実質的に純粋な（6Ｒ ま
たは 6Ｓ）エナンショマーを製造するにも有用である。
【０００３】ロイコボリンおよびその塩は医薬として有
効であることが知られている。レミントン医薬案内（Re
mington's Pharmaceutical Service），マック出版社
（Mack Publishing Co.,Easton,PA） 1985（Remington'
s）1023 ページを参照されたい。カーワー（Kerwer）ら
のＵ．Ｓ．4,746,662 は、メトトレキセートの抗関節炎
効力がロイコボリンまたはその塩の水溶液の注射により
増強し得ることを開示している。1988 年 5 月 4 日付
の ＥＰＯ 特許公報第 0,266,042 号は、 5-フルオロウ
ラシルと組み合わせて直腸癌（colorectal cancer）を
処置するためのメトトレキセート緊急排除（rescue）用
の、および葉酸欠損症（deficiency）の処置用の医薬を
製造するために、純粋なロイコボリン異性体を使用する
ことを記載している。Ｕ．Ｓ．4,500,711 において、ワ
イゾワティー（Wisowaty）らはロイコボリンおよびその
塩の精製を記述している。
効であることが知られている。レミントン医薬案内（Re
mington's Pharmaceutical Service），マック出版社
（Mack Publishing Co.,Easton,PA） 1985（Remington'
s）1023 ページを参照されたい。カーワー（Kerwer）ら
のＵ．Ｓ．4,746,662 は、メトトレキセートの抗関節炎
効力がロイコボリンまたはその塩の水溶液の注射により
増強し得ることを開示している。1988 年 5 月 4 日付
の ＥＰＯ 特許公報第 0,266,042 号は、 5-フルオロウ
ラシルと組み合わせて直腸癌（colorectal cancer）を
処置するためのメトトレキセート緊急排除（rescue）用
の、および葉酸欠損症（deficiency）の処置用の医薬を
製造するために、純粋なロイコボリン異性体を使用する
ことを記載している。Ｕ．Ｓ．4,500,711 において、ワ
イゾワティー（Wisowaty）らはロイコボリンおよびその
塩の精製を記述している。
【０００４】ロイコボリンは通常は塩、たとえばアルカ
リ金属塩およびアルカリ土類金属塩、たとえばロイコボ
リンのカルシウム塩の形状で投与され、リットル-異性
体が好ましい。
リ金属塩およびアルカリ土類金属塩、たとえばロイコボ
リンのカルシウム塩の形状で投与され、リットル-異性
体が好ましい。
【０００５】化合物 Ｎ-(((2-アミノ-5-ホルミル-3,4,
5,6,7,8-ヘキサヒドロ-4-オキソ-6-プテリジニル)-メチ
ル)-アミノ)-ベンゾイル)-Ｌ-グルタミン酸，カルシウ
ム塩（1:1）五水和物（ロイコボリンカルシウム ＵＳ
Ｐ）は、式（Ia および Ib）の1:1 混合物のカルシウム
塩として市販されており、これらの化合物はそれぞれ
Ｃ-6 において（Ｒ）および（Ｓ）立体化学性を有して
いる。
5,6,7,8-ヘキサヒドロ-4-オキソ-6-プテリジニル)-メチ
ル)-アミノ)-ベンゾイル)-Ｌ-グルタミン酸，カルシウ
ム塩（1:1）五水和物（ロイコボリンカルシウム ＵＳ
Ｐ）は、式（Ia および Ib）の1:1 混合物のカルシウム
塩として市販されており、これらの化合物はそれぞれ
Ｃ-6 において（Ｒ）および（Ｓ）立体化学性を有して
いる。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【化２】
【０００８】これは主として葉酸拮抗体、たとえば、ジ
ヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉酸への転化を遮蔽（bloc
k）するメトトレキセートに対する解毒剤として使用さ
れる。ロイコボリン塩は水中で適当な保存剤と、内科医
の手引き（Physician's DeskReference）のロイコボリ
ンカルシウム注射（Leucovorin Calcium Injection），
第 43 版，メディカルエコノミクス社(Medical Economi
cs Company，Oradell ，NJ) ，1989（ＰＤＲ 43 版）11
24 ページに記載されているようにして注射用に配合す
る。
ヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉酸への転化を遮蔽（bloc
k）するメトトレキセートに対する解毒剤として使用さ
れる。ロイコボリン塩は水中で適当な保存剤と、内科医
の手引き（Physician's DeskReference）のロイコボリ
ンカルシウム注射（Leucovorin Calcium Injection），
第 43 版，メディカルエコノミクス社(Medical Economi
cs Company，Oradell ，NJ) ，1989（ＰＤＲ 43 版）11
24 ページに記載されているようにして注射用に配合す
る。
【０００９】上記の 2 種の異性体の薬物動力学的挙動
は、 (Ｓ)-異性体（Iｂ）が胃腸管から選択的に吸収さ
れ、 (Ｒ)-異性体（Iａ）よりも血清内半減期が短いこ
とにおいて異なる。
は、 (Ｓ)-異性体（Iｂ）が胃腸管から選択的に吸収さ
れ、 (Ｒ)-異性体（Iａ）よりも血清内半減期が短いこ
とにおいて異なる。
【００１０】6Ｓ ジアステレオ異性体である天然起源の
異性体 Iｂ は、その１炭素代謝の回復における有効性
のために、緊急治療用に重要であることが報告されてい
る（テンプル二世（C. Temple Jr.）、ローズ（J. P. R
ose)、ラスター（W. R. Laster）およびモンゴメリー
（J. A. Montgomery），癌処置報告（Cancer Treatment
Reports），65，1117− 1119（1981））。
異性体 Iｂ は、その１炭素代謝の回復における有効性
のために、緊急治療用に重要であることが報告されてい
る（テンプル二世（C. Temple Jr.）、ローズ（J. P. R
ose)、ラスター（W. R. Laster）およびモンゴメリー
（J. A. Montgomery），癌処置報告（Cancer Treatment
Reports），65，1117− 1119（1981））。
【００１１】乳酸菌（L. casej）よりのチミジレート合
成がテトラヒドロ葉酸 5,10-メチレンの非天然ジアステ
レオ異性体により阻害されるという報告（リーリー(R.
P. Leary）、ゴーモン（Y. Gaumont）およびキスリュー
ク（R. L. Kisliuk），生物化学および生物物理学研究
通信（Biochem. and Biophys. Res. Commun.），56，48
4 − 488（1974）)ならびに大腸菌（E. Coli）よりのテ
トラヒドロ葉酸 5,10-メチレン脱水素酵素も同一のジア
ステレオ異性体により阻害されるという報告（スコット
（V. F. Scott）およびドナルドソン（K. O. Donaldso
n），生物化学および生物物理学研究通信（Biochem. an
d Biophys. Res. Commun.），14，523 − 526（196
4））が、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸化合物の同一の
ジアステレオ異性体がニワトリの肝臓からのグリシンア
ミドリボヌクレオチドホルミル転移酵素（ＧＡＲ）の潜
在的な競合的阻害剤であるという観察(スミス(G. K. Sm
ith)、ベンコビッチ（P. A. Benkovic）およびベンコビ
ッチ（S. J. Benkovic），生化学（Biochem.）20，4034
− 4036）（1981））と結び付いて、テトラヒドロ葉酸
化合物の１炭素誘導体の非天然ジアステレオ異性体によ
るピリミジン生合成およびプリン生合成の双方の、ひい
ては ＤＮＡ 生合成の阻害を指摘している。したがっ
て、非天然形状が生物学的に不活性であるとは考えられ
ない、この種の阻害が哺乳類系に存在するならば、テト
ラヒドロ葉酸化合物、特にロイコボリンの天然の (6Ｓ)
形状のみに対する潜在的な臨床的要求が存在する。 ジ
アステレオ異性体成分 Iａ および Iｂ は分別結晶化に
より、（コスリヒ（D. B. Cosulich）、スミス二世（J.
M. Smith Jr.）および プログリスト（H. P. Proglis
t），アメリカ化学会誌（J.Am. Chem. Soc.），74，421
5（1953））また、クロマトグラフィーにより(フィーニ
ー(J. Feeney)、バードソール（B. Birdsall）、アルブ
ランド（J.P. Albrand）、ロバーツ（G. C. K. Robert
s）、ブンゲン（A. S. Bungen）、チャールトン（P. A.
Charlton）およびヤング（D. W. Young），生化学（Bio
chem.），20，1837（1981））分離されている。ジヒド
ロ葉酸還元酵素により触媒されたジヒドロ葉酸化合物の
立体特異的還元は、立体特異的に 6(Ｓ)- 異性体を与え
ると報告されている（リーズ（L. Rees）、ヴァレンテ
（E. Valente）、サクリング（C. J. Suckling）および
ウッド（H. C. S.Wood），テトラヘドロン（Tetrahedro
n），42，117（1986））。
成がテトラヒドロ葉酸 5,10-メチレンの非天然ジアステ
レオ異性体により阻害されるという報告（リーリー(R.
P. Leary）、ゴーモン（Y. Gaumont）およびキスリュー
ク（R. L. Kisliuk），生物化学および生物物理学研究
通信（Biochem. and Biophys. Res. Commun.），56，48
4 − 488（1974）)ならびに大腸菌（E. Coli）よりのテ
トラヒドロ葉酸 5,10-メチレン脱水素酵素も同一のジア
ステレオ異性体により阻害されるという報告（スコット
（V. F. Scott）およびドナルドソン（K. O. Donaldso
n），生物化学および生物物理学研究通信（Biochem. an
d Biophys. Res. Commun.），14，523 − 526（196
4））が、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸化合物の同一の
ジアステレオ異性体がニワトリの肝臓からのグリシンア
ミドリボヌクレオチドホルミル転移酵素（ＧＡＲ）の潜
在的な競合的阻害剤であるという観察(スミス(G. K. Sm
ith)、ベンコビッチ（P. A. Benkovic）およびベンコビ
ッチ（S. J. Benkovic），生化学（Biochem.）20，4034
− 4036）（1981））と結び付いて、テトラヒドロ葉酸
化合物の１炭素誘導体の非天然ジアステレオ異性体によ
るピリミジン生合成およびプリン生合成の双方の、ひい
ては ＤＮＡ 生合成の阻害を指摘している。したがっ
て、非天然形状が生物学的に不活性であるとは考えられ
ない、この種の阻害が哺乳類系に存在するならば、テト
ラヒドロ葉酸化合物、特にロイコボリンの天然の (6Ｓ)
形状のみに対する潜在的な臨床的要求が存在する。 ジ
アステレオ異性体成分 Iａ および Iｂ は分別結晶化に
より、（コスリヒ（D. B. Cosulich）、スミス二世（J.
M. Smith Jr.）および プログリスト（H. P. Proglis
t），アメリカ化学会誌（J.Am. Chem. Soc.），74，421
5（1953））また、クロマトグラフィーにより(フィーニ
ー(J. Feeney)、バードソール（B. Birdsall）、アルブ
ランド（J.P. Albrand）、ロバーツ（G. C. K. Robert
s）、ブンゲン（A. S. Bungen）、チャールトン（P. A.
Charlton）およびヤング（D. W. Young），生化学（Bio
chem.），20，1837（1981））分離されている。ジヒド
ロ葉酸還元酵素により触媒されたジヒドロ葉酸化合物の
立体特異的還元は、立体特異的に 6(Ｓ)- 異性体を与え
ると報告されている（リーズ（L. Rees）、ヴァレンテ
（E. Valente）、サクリング（C. J. Suckling）および
ウッド（H. C. S.Wood），テトラヘドロン（Tetrahedro
n），42，117（1986））。
【００１２】リーズ、ヴァレンテ、サクリングおよびウ
ッドの論文、テトラヘドロン，42，117 − 136（1986）
は、ロイコボリンを含むテトラヒドロ葉酸の対掌性誘導
体の合成を記述している。この系は大腸菌からのジヒド
ロ葉酸還元酵素の使用と広範囲の、経費のかかる還元補
足因子 ＮＡＤＰＨ の再循環とを必要とする。リーズ、
サクリングおよびウッドの他の論文、化学会誌化学通信
（J. Chem. Soc.Chem. Commun.）470（1987）（ヨーロ
ッパ特許出願 0 266 042 Ａ2）は、クロロギ酸(−)-メ
ンチルを用いる 6(Ｒ,Ｓ)-テトラヒドロ葉酸化合物をア
シル化してジアステレオ異性体混合物としてのＮ-5 誘
導体を与え、これを分別沈澱により分離することを記載
している。引き続き、各ジアステレオ異性体をギ酸と酢
酸中の臭化水素とで処理し、続いて加水分解して 5-ホ
ルミルテトラヒドロ葉酸化合物の各ジアステレオ異性体
を得る。
ッドの論文、テトラヘドロン，42，117 − 136（1986）
は、ロイコボリンを含むテトラヒドロ葉酸の対掌性誘導
体の合成を記述している。この系は大腸菌からのジヒド
ロ葉酸還元酵素の使用と広範囲の、経費のかかる還元補
足因子 ＮＡＤＰＨ の再循環とを必要とする。リーズ、
サクリングおよびウッドの他の論文、化学会誌化学通信
（J. Chem. Soc.Chem. Commun.）470（1987）（ヨーロ
ッパ特許出願 0 266 042 Ａ2）は、クロロギ酸(−)-メ
ンチルを用いる 6(Ｒ,Ｓ)-テトラヒドロ葉酸化合物をア
シル化してジアステレオ異性体混合物としてのＮ-5 誘
導体を与え、これを分別沈澱により分離することを記載
している。引き続き、各ジアステレオ異性体をギ酸と酢
酸中の臭化水素とで処理し、続いて加水分解して 5-ホ
ルミルテトラヒドロ葉酸化合物の各ジアステレオ異性体
を得る。
【００１３】テトラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純
粋なジアステレオ異性体が本発明に従ってより容易に製
造し得ることがここに見いだされた。本件方法は、主要
段階が１種の酵素、他の呼び方ではギ酸活性化酵素また
はホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素（ＦＴＨＦＳ）と
呼ばれる、 5,6(Ｒ,Ｓ),7, 8-テトラヒドロ葉酸（IIａ,
ｂ）のラセミ混合物に使用した場合に所望のホルミル基
を 6Ｓ ジアステレオ異性体のみに選択的に添加する、
テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼの使用を要求するのみで
あるために、驚くほど簡単であることにおいて、これま
でに公刊された、または特許された方法を超える主要な
利点を有している。この酵素の利用はさらに、広範囲な
補助因子の再生系を使用する必要がないことにおいて、
酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を超える明確な利
点をも有している。
粋なジアステレオ異性体が本発明に従ってより容易に製
造し得ることがここに見いだされた。本件方法は、主要
段階が１種の酵素、他の呼び方ではギ酸活性化酵素また
はホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素（ＦＴＨＦＳ）と
呼ばれる、 5,6(Ｒ,Ｓ),7, 8-テトラヒドロ葉酸（IIａ,
ｂ）のラセミ混合物に使用した場合に所望のホルミル基
を 6Ｓ ジアステレオ異性体のみに選択的に添加する、
テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼの使用を要求するのみで
あるために、驚くほど簡単であることにおいて、これま
でに公刊された、または特許された方法を超える主要な
利点を有している。この酵素の利用はさらに、広範囲な
補助因子の再生系を使用する必要がないことにおいて、
酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を超える明確な利
点をも有している。
【００１４】テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼは、ミクロ
コックス・アエロゲネス（Micrococcus aerogens）、ク
ロストリジウム・シリンドロスポルム（Clostridium cy
rindrosporum）、クロストリジウム・アシジ-ウリキ（C
lostridium acidi-urici） 、クロストリジウム・テル
モアセティクム(Clostridiumthermoaceticum）により、
また、他の微生物、植物および動物により得ることがで
きる（バトレア（D. H. Butlaire，酵素学の方法（Meth
od In Enzymology），66，585 − 599（1980））。
コックス・アエロゲネス（Micrococcus aerogens）、ク
ロストリジウム・シリンドロスポルム（Clostridium cy
rindrosporum）、クロストリジウム・アシジ-ウリキ（C
lostridium acidi-urici） 、クロストリジウム・テル
モアセティクム(Clostridiumthermoaceticum）により、
また、他の微生物、植物および動物により得ることがで
きる（バトレア（D. H. Butlaire，酵素学の方法（Meth
od In Enzymology），66，585 − 599（1980））。
【００１５】放射性標識したギ酸アンモニウム、または
工程内で製造したもの、放射性標識したギ酸塩もしくは
酵素的ホルミル化中の誘導体を含む他のいかなるものを
用いても標識した（IIIｂ）が得られ、標識した（IV
ｂ）または標識した（Iｂ）に転化させることができ
る。酵素 5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナ
ーゼの助けを借りれば、放射性標識した、ホルミル基を
有する 5,6Ｓ,7, 8-テトラヒドロ葉酸化合物（Iｂ、III
ｂ、またはIVｂ）、好ましくは（IVｂ）のいかなるもの
も、標識した 5,10-メチレン-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸に転化させることができ、さらにこれを酵素 5,10-
メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼの作用下に放射
性標識した 5-メチル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転
化させることができる。したがって、本発明の適用によ
り生成した放射性標識した（Iｂ）は、放射性標識した
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体の製造に有用な化合
物である。
工程内で製造したもの、放射性標識したギ酸塩もしくは
酵素的ホルミル化中の誘導体を含む他のいかなるものを
用いても標識した（IIIｂ）が得られ、標識した（IV
ｂ）または標識した（Iｂ）に転化させることができ
る。酵素 5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナ
ーゼの助けを借りれば、放射性標識した、ホルミル基を
有する 5,6Ｓ,7, 8-テトラヒドロ葉酸化合物（Iｂ、III
ｂ、またはIVｂ）、好ましくは（IVｂ）のいかなるもの
も、標識した 5,10-メチレン-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸に転化させることができ、さらにこれを酵素 5,10-
メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼの作用下に放射
性標識した 5-メチル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転
化させることができる。したがって、本発明の適用によ
り生成した放射性標識した（Iｂ）は、放射性標識した
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体の製造に有用な化合
物である。
【００１６】本発明の方法はまた、予期しないことであ
ったが、酵素によりホルミル化されない 5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸（IIａ）の単離を可能にするのである。
単離された（IIａ）はそのままで販売する（希少化合物
として市販されている）ことができるか、または、たと
えばモラン（R. G. Moran）およびコルマン（P. D. Col
man），分析生化学（Anal. Biochem.）122，70 − 78
（1982）に記載されている方法と同様にして、水溶性カ
ルボジイミド、1-エチル-3-(3′-ジメチルアミノプロピ
ル)-カルボジイミドを使用して、または使用することな
く、ギ酸を用いて 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸（Iａ）の製造用の出発物質として使用することが
できる。しかし、（IIIｂ）の（IV）および／または（I
ｂ）への転化が完了したのちの（IIａ）の単離が好まし
い。このことは、たとえば逆相クロマトグラフィーによ
る各成分のより容易な分離を可能にする。また（IIａ）
は、（IIａ）の 5-位がなお反応性であり、他方（IV
ｂ）または（Iｂ）の 5-位は反応性でないので、（IV
ｂ）および／または（Iｂ）の存在下に改変（modify）
して誘導体化した（IIａ）、たとえば 5-カルボキシメ
チル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を製造することがで
き、これは簡単な吸収段階で（IVｂ）または（Iｂ）か
ら分離することができる。
ったが、酵素によりホルミル化されない 5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸（IIａ）の単離を可能にするのである。
単離された（IIａ）はそのままで販売する（希少化合物
として市販されている）ことができるか、または、たと
えばモラン（R. G. Moran）およびコルマン（P. D. Col
man），分析生化学（Anal. Biochem.）122，70 − 78
（1982）に記載されている方法と同様にして、水溶性カ
ルボジイミド、1-エチル-3-(3′-ジメチルアミノプロピ
ル)-カルボジイミドを使用して、または使用することな
く、ギ酸を用いて 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸（Iａ）の製造用の出発物質として使用することが
できる。しかし、（IIIｂ）の（IV）および／または（I
ｂ）への転化が完了したのちの（IIａ）の単離が好まし
い。このことは、たとえば逆相クロマトグラフィーによ
る各成分のより容易な分離を可能にする。また（IIａ）
は、（IIａ）の 5-位がなお反応性であり、他方（IV
ｂ）または（Iｂ）の 5-位は反応性でないので、（IV
ｂ）および／または（Iｂ）の存在下に改変（modify）
して誘導体化した（IIａ）、たとえば 5-カルボキシメ
チル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を製造することがで
き、これは簡単な吸収段階で（IVｂ）または（Iｂ）か
ら分離することができる。
【００１７】さらに、分離した（IIａ）はテンプル二世
（C.Temple，Jr.）、ベネット二世（L. L. Benett， J
r.）、ローズ（J. D. Rose）、エリオット（R. D. Elio
tt）、モンゴメリー（J. A. Montgomery）およびマンガ
ム（J. H. Mangum)，医化学雑誌 （J. Med. Chem.），
25，161 − 166（1982）に報告されているものと同様に
して反応させ、種々の 5- および 10- 置換、5,10-ジ置
換、および 5,10-橋架け置換 5,6Ｒ，,7,8-テトラヒド
ロ葉酸誘導体を製造することができる。特に 5-メチル-
5, 6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸化合物は、ブレア（J.
A. Blair）およびソーンダース(K.J. Saunders) ，分析
生化学（Anal. Biochem.）34，376（1970）の方法に記
載されているものと同様にして、塩基性条件下でホルム
アルデヒドとホウ水素化ナトリウムとを用いて（IIａ）
より合成することができる。硫酸ジメチルを用いる、
Ｎ,Ｎ-ジメチルアセタミド中、55℃ における（IIａ）
のアルキル化は、日本特許 73 32,120（1973）；ケミカ
ル・アブストラクツ（Chem. Abst.），80，2792ｘ（197
4）に記載されている方法を使用することにより達成さ
れる。
（C.Temple，Jr.）、ベネット二世（L. L. Benett， J
r.）、ローズ（J. D. Rose）、エリオット（R. D. Elio
tt）、モンゴメリー（J. A. Montgomery）およびマンガ
ム（J. H. Mangum)，医化学雑誌 （J. Med. Chem.），
25，161 − 166（1982）に報告されているものと同様に
して反応させ、種々の 5- および 10- 置換、5,10-ジ置
換、および 5,10-橋架け置換 5,6Ｒ，,7,8-テトラヒド
ロ葉酸誘導体を製造することができる。特に 5-メチル-
5, 6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸化合物は、ブレア（J.
A. Blair）およびソーンダース(K.J. Saunders) ，分析
生化学（Anal. Biochem.）34，376（1970）の方法に記
載されているものと同様にして、塩基性条件下でホルム
アルデヒドとホウ水素化ナトリウムとを用いて（IIａ）
より合成することができる。硫酸ジメチルを用いる、
Ｎ,Ｎ-ジメチルアセタミド中、55℃ における（IIａ）
のアルキル化は、日本特許 73 32,120（1973）；ケミカ
ル・アブストラクツ（Chem. Abst.），80，2792ｘ（197
4）に記載されている方法を使用することにより達成さ
れる。
【００１８】上記の各反応中のギ酸またはアルキル化剤
を放射性標識したギ酸もしくはその誘導体、または放射
性標識したアルキル化剤置き換えることにより、放射性
標識した 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体が得られ
る。
を放射性標識したギ酸もしくはその誘導体、または放射
性標識したアルキル化剤置き換えることにより、放射性
標識した 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体が得られ
る。
【００１９】本発明に従えば、たとえば酵素的メカニズ
ムを研究する試験に有用な化合物である放射性標識した
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体および放射性標識
した 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体の双方、なら
びにそれらの塩を個別に製造することができる。
ムを研究する試験に有用な化合物である放射性標識した
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体および放射性標識
した 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体の双方、なら
びにそれらの塩を個別に製造することができる。
【００２０】本発明に従えば、 （ａ） テトラヒドロ葉酸の、もしくは置換テトラヒド
ロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエステルの 6Ｒ
および 6Ｓ ジアステレオ異性体の混合物の 6Ｓ 形状
を酵素的にホルミル化して 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；存在す
れば未反応の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステル；および未反応の 5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルよりなる混
合物を形成させ； （ｂ） （1）10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離し、
その後環化し、上記の -10ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを環化し、加
水分解して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸ま
たはそれらの塩もしくはエステルを、またはこれらの双
方を形成させるか；または、 （2）上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に
環化、加水分解して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、またはこ
れらの双方を形成させ；その後、 （i）5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを誘導体化して 5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを形成させ、つ
いで各成分を分離するか、または、これに替えて （ii）全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸および全ての 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸、またはそれらの塩もしくはエステルを5,6Ｒ,7,8-
テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分
離し；分離後、所望ならば、 （3）上記の未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルを化学的にホルミル化し、環
化し、加水分解して 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを製造するか、ま
たは、これに替えて、上記の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを他の官能基で誘導
体化して5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル、または 5-
ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを対応する酸、塩またはエステルに転化
させる各段階よりなる、テトラヒドロ葉酸またはその塩
もしくはエステル誘導体の所望の実質的に純粋な（6Ｒ
または 6Ｓ）ジアステレオ異性体の製造方法が提供され
る。
ロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエステルの 6Ｒ
および 6Ｓ ジアステレオ異性体の混合物の 6Ｓ 形状
を酵素的にホルミル化して 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；存在す
れば未反応の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステル；および未反応の 5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルよりなる混
合物を形成させ； （ｂ） （1）10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離し、
その後環化し、上記の -10ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを環化し、加
水分解して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸ま
たはそれらの塩もしくはエステルを、またはこれらの双
方を形成させるか；または、 （2）上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に
環化、加水分解して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、またはこ
れらの双方を形成させ；その後、 （i）5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを誘導体化して 5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを形成させ、つ
いで各成分を分離するか、または、これに替えて （ii）全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸および全ての 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸、またはそれらの塩もしくはエステルを5,6Ｒ,7,8-
テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分
離し；分離後、所望ならば、 （3）上記の未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルを化学的にホルミル化し、環
化し、加水分解して 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを製造するか、ま
たは、これに替えて、上記の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを他の官能基で誘導
体化して5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル、または 5-
ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを対応する酸、塩またはエステルに転化
させる各段階よりなる、テトラヒドロ葉酸またはその塩
もしくはエステル誘導体の所望の実質的に純粋な（6Ｒ
または 6Ｓ）ジアステレオ異性体の製造方法が提供され
る。
【００２１】本件方法の生成物は本来、たとえば治療
に、および他の価値ある生成物を製造するための中間体
として価値があり、放射性標識した場合には、たとえば
酵素的メカニズムの研究に使用することができる。当業
者には、この種の化合物をこの種の目的に使用する方法
は周知されているであろう。本件方法は好ましくは、所
望の実質的に純粋な5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルの製造に使用され
る。この種の化合物は救急薬剤として価値ある性質を有
している。特に好ましいものは、テトラヒドロ葉酸ホル
ミラーゼを含む酵素を選択的ホルミル化に使用する方法
である。また、本件方法は（放射性標識した）テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの誘導体の所望
の実質的に純粋な （6Ｒ または 6Ｓ）ジアステレオ
異性体の製造にも有用である。この種の物質は酵素的メ
カニズムの研究に使用することができる。
に、および他の価値ある生成物を製造するための中間体
として価値があり、放射性標識した場合には、たとえば
酵素的メカニズムの研究に使用することができる。当業
者には、この種の化合物をこの種の目的に使用する方法
は周知されているであろう。本件方法は好ましくは、所
望の実質的に純粋な5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルの製造に使用され
る。この種の化合物は救急薬剤として価値ある性質を有
している。特に好ましいものは、テトラヒドロ葉酸ホル
ミラーゼを含む酵素を選択的ホルミル化に使用する方法
である。また、本件方法は（放射性標識した）テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの誘導体の所望
の実質的に純粋な （6Ｒ または 6Ｓ）ジアステレオ
異性体の製造にも有用である。この種の物質は酵素的メ
カニズムの研究に使用することができる。
【００２２】本発明に使用する出発化合物は、生化学的
転移反応の技術分野での熟練者に周知されている技術に
より製造することができる。IIａ(Ｒ) とIIｂ(Ｓ) との
混合物は、テンプル二世（C.Temple， Jr.）、エリオッ
ト（R. D. Eliott）、ローズ（J.D. Rose)およびモンゴ
メリー(J. A. Montgomery) ，医化学雑誌（J. Med. Che
m.），22，731（1979）の方法を使用して、葉酸のホウ
水素化ナトリウム還元により製造することができる。
転移反応の技術分野での熟練者に周知されている技術に
より製造することができる。IIａ(Ｒ) とIIｂ(Ｓ) との
混合物は、テンプル二世（C.Temple， Jr.）、エリオッ
ト（R. D. Eliott）、ローズ（J.D. Rose)およびモンゴ
メリー(J. A. Montgomery) ，医化学雑誌（J. Med. Che
m.），22，731（1979）の方法を使用して、葉酸のホウ
水素化ナトリウム還元により製造することができる。
【００２３】これらの物質から出発すれば、本発明の方
法の反応様式は図式１に示すとおりである：
法の反応様式は図式１に示すとおりである：
【００２４】
【化３】
【００２５】
【化４】
【００２６】図式 2 に示したように、クロマトグラフ
ィーにより（IIIｂ）から分離し得る（IIａ）をギ酸で
ホルミル化して、非連続的な（Iａ）の形成反応中にイ
ミダゾリニウム塩（IVａ）を得、これを結晶化したのち
に加水分解してロイコボリンの純粋な非天然異性体（I
ａ）を得る。これに替えて、（IIIｂ）と（IIａ）との
混合物から出発して（IIIｂ）を（IVｂ）および／また
は（Iｂ）に転化させ、ここで（IVｂ）および／または
（Iｂ）と（IIａ）との混合物を製造することもでき
る。この混合物の成分、すなわち（IIａ）と（IVｂ）お
よび／または（Iｂ）とは、クロマトグラフィーにより
容易に分離することができる。 この単離工程も、 6Ｒ
テトラヒドロ葉酸ジアステレオ異性体と 6Ｓ 異性体と
の実際上の分割を構成している。（IIａ）は（Iａ）に
化学的に変換することができるので、本発明は形式上、
より一般的にはロイコボリンの天然形状および非天然形
状と呼ばれる（Iｂ）と（Iａ）との効果的な分割方法を
完成する。
ィーにより（IIIｂ）から分離し得る（IIａ）をギ酸で
ホルミル化して、非連続的な（Iａ）の形成反応中にイ
ミダゾリニウム塩（IVａ）を得、これを結晶化したのち
に加水分解してロイコボリンの純粋な非天然異性体（I
ａ）を得る。これに替えて、（IIIｂ）と（IIａ）との
混合物から出発して（IIIｂ）を（IVｂ）および／また
は（Iｂ）に転化させ、ここで（IVｂ）および／または
（Iｂ）と（IIａ）との混合物を製造することもでき
る。この混合物の成分、すなわち（IIａ）と（IVｂ）お
よび／または（Iｂ）とは、クロマトグラフィーにより
容易に分離することができる。 この単離工程も、 6Ｒ
テトラヒドロ葉酸ジアステレオ異性体と 6Ｓ 異性体と
の実際上の分割を構成している。（IIａ）は（Iａ）に
化学的に変換することができるので、本発明は形式上、
より一般的にはロイコボリンの天然形状および非天然形
状と呼ばれる（Iｂ）と（Iａ）との効果的な分割方法を
完成する。
【００２７】
【化５】
【００２８】以下の実施例は本発明を説明するものであ
るが、いかなる様式であれ、特許請求の範囲を限定する
ことを意図したものではない。
るが、いかなる様式であれ、特許請求の範囲を限定する
ことを意図したものではない。
【００２９】方法 Ａ クロストリジウム・シリンドロスポルム（Clostridium
cyrindrosporum）（クロストリジウム （Clostridiu
m）種 ＡＴＣＣ 第 7905 とも呼ばれる）の単離および
増殖を行う。
cyrindrosporum）（クロストリジウム （Clostridiu
m）種 ＡＴＣＣ 第 7905 とも呼ばれる）の単離および
増殖を行う。
【００３０】クロストリジウムは嫌気性菌であるので、
全ての培養生産、保持および取り扱い操作は菌株の酸素
への暴露を最小にする条件下で行う。同様に、テトラヒ
ドロ葉酸化合物およびその誘導体の極端な酸素不安定性
のために、これらの化合物を含む全ての工程は酸素の不
存在で行う。無酸素の気体窒素源に接続したプラスチッ
クス製の嫌気袋装置をこの目的に使用する。
全ての培養生産、保持および取り扱い操作は菌株の酸素
への暴露を最小にする条件下で行う。同様に、テトラヒ
ドロ葉酸化合物およびその誘導体の極端な酸素不安定性
のために、これらの化合物を含む全ての工程は酸素の不
存在で行う。無酸素の気体窒素源に接続したプラスチッ
クス製の嫌気袋装置をこの目的に使用する。
【００３１】1 .尿酸増殖媒体の製造。
【００３２】ＡＴＣＣ 媒体ハンドブック（ATCC Media
Handbook） − 調合法第 519 に記載されているものと
同様にして尿酸媒体を製造する： 尿酸媒体組成物 尿酸 3.0 g 酵母抽出液 1.0 g リン酸二水素ナトリウム 4.0 g 硫酸マグネシウム七水和物 0.1 g 硫酸鉄(II) 5.0 mg *0.04 ％フェノールレッド溶液 1.0 g チオグリコール酸ナトリウム 0.5 g 蒸留水 1.0 リットル *0.1 g の指示薬に必要な 0.01 Ｎ 水酸化ナトリウム 1
4.9 ml。蒸留水で 250mlに希釈し、0.04 ％溶液とす
る。
Handbook） − 調合法第 519 に記載されているものと
同様にして尿酸媒体を製造する： 尿酸媒体組成物 尿酸 3.0 g 酵母抽出液 1.0 g リン酸二水素ナトリウム 4.0 g 硫酸マグネシウム七水和物 0.1 g 硫酸鉄(II) 5.0 mg *0.04 ％フェノールレッド溶液 1.0 g チオグリコール酸ナトリウム 0.5 g 蒸留水 1.0 リットル *0.1 g の指示薬に必要な 0.01 Ｎ 水酸化ナトリウム 1
4.9 ml。蒸留水で 250mlに希釈し、0.04 ％溶液とす
る。
【００３３】この媒体を製造する際には、尿酸を液体の
ほとんど全体積に懸濁させ、沸騰するまで加熱し、フェ
ノールレッドのバラ色が定常的になる（pＨ 7.6）よう
に水酸化ナトリウムで調節する。pＨ をpＨ 試験紙で検
査する。固体媒体には、上記の媒体に 20.0 g の寒天を
添加する。
ほとんど全体積に懸濁させ、沸騰するまで加熱し、フェ
ノールレッドのバラ色が定常的になる（pＨ 7.6）よう
に水酸化ナトリウムで調節する。pＨ をpＨ 試験紙で検
査する。固体媒体には、上記の媒体に 20.0 g の寒天を
添加する。
【００３４】この媒体をスクリューキャップフラスコ
に、ほぼ全体積にまで注ぎ入れ、ついで無酸素の気体窒
素でパージしながら煮沸する。加圧 （autoclave）の
直後にフラスコのキャップを十分緊密に締める。
に、ほぼ全体積にまで注ぎ入れ、ついで無酸素の気体窒
素でパージしながら煮沸する。加圧 （autoclave）の
直後にフラスコのキャップを十分緊密に締める。
【００３５】この媒体を室温で貯蔵して、低温における
尿酸の沈澱を避ける。
尿酸の沈澱を避ける。
【００３６】2 .増殖媒体へのクロストリジウム・シリ
ンドロスポルム（Clostridium cyrindrosporum）培養液
の接種。
ンドロスポルム（Clostridium cyrindrosporum）培養液
の接種。
【００３７】全ての手順をグローブバック中の嫌気条件
下で実施する。液体尿酸媒体の 1.0ml部分を、ＡＴＣＣ
から得た細菌の凍結乾燥したペレットに添加する。こ
のペレットを溶解させ、滅菌使い捨て接種ループを用い
て、再懸濁させた培養液を尿酸平板（plating）媒体上
に画線（streak）させる。この平板を Ｈ2-ＣＯ2発生外
被（envelope）とメチレンブルー帯状試験紙とを含有す
る嫌気ジャーに入れる。接種した平板を含有するジャー
を 37℃ で培養する。24 時間以内に平板上で、コロニ
ーから放射される明るい透明な指状の突出物（projecti
on）として、増殖が見られる。位相差顕微鏡下で見られ
る代表的なコロニーの試料は典型的なクロストリジウム
細胞の形態と胞子形成とを示す。
下で実施する。液体尿酸媒体の 1.0ml部分を、ＡＴＣＣ
から得た細菌の凍結乾燥したペレットに添加する。こ
のペレットを溶解させ、滅菌使い捨て接種ループを用い
て、再懸濁させた培養液を尿酸平板（plating）媒体上
に画線（streak）させる。この平板を Ｈ2-ＣＯ2発生外
被（envelope）とメチレンブルー帯状試験紙とを含有す
る嫌気ジャーに入れる。接種した平板を含有するジャー
を 37℃ で培養する。24 時間以内に平板上で、コロニ
ーから放射される明るい透明な指状の突出物（projecti
on）として、増殖が見られる。位相差顕微鏡下で見られ
る代表的なコロニーの試料は典型的なクロストリジウム
細胞の形態と胞子形成とを示す。
【００３８】3 .定常的なクロストリジウム・シリンド
ロスポルムの貯蔵培養液の製造。
ロスポルムの貯蔵培養液の製造。
【００３９】フンゲート（Hungate）管（ベルコグラス
社（Bellco Glass Co.））− 各管中の媒体 10ml− 中
で尿酸平板媒体を製造し、定常的なクロストリジウム・
シリンドロスポルムの貯蔵培養液の供給源として使用に
供する。上記のコロニーの細胞の単一のコロニー小片を
滅菌接種ループで取り出し、フンゲート管の媒体中に刺
し込む。この手順は気体窒素を含有する嫌気バッグ中で
行う。このフンゲート管を嫌気ジャーに入れ、35℃ で
培養する。 5日後、このフンゲート管をジャーから取り
出し、キャップをパラフィンで密封する。以後使用する
まで、このフンゲート管を室温で貯蔵する。
社（Bellco Glass Co.））− 各管中の媒体 10ml− 中
で尿酸平板媒体を製造し、定常的なクロストリジウム・
シリンドロスポルムの貯蔵培養液の供給源として使用に
供する。上記のコロニーの細胞の単一のコロニー小片を
滅菌接種ループで取り出し、フンゲート管の媒体中に刺
し込む。この手順は気体窒素を含有する嫌気バッグ中で
行う。このフンゲート管を嫌気ジャーに入れ、35℃ で
培養する。 5日後、このフンゲート管をジャーから取り
出し、キャップをパラフィンで密封する。以後使用する
まで、このフンゲート管を室温で貯蔵する。
【００４０】4 .液体増殖媒体接種材料の製造。
【００４１】半固体尿酸媒体（バクト寒天（Bacto-Aga
r）１リットル中2.5 g））の管にクロストリジウム・シ
リンドロスポルムのコロニーを上記の方法と同様にして
接種し、35℃ で培養し、室温で貯蔵する。これらの培
養物を、後続の各章で記述する液体媒体増殖用の接種材
料源として使用に供する。
r）１リットル中2.5 g））の管にクロストリジウム・シ
リンドロスポルムのコロニーを上記の方法と同様にして
接種し、35℃ で培養し、室温で貯蔵する。これらの培
養物を、後続の各章で記述する液体媒体増殖用の接種材
料源として使用に供する。
【００４２】5 .クロストリジウム・シリンドロスポル
ムの液体媒体増殖。
ムの液体媒体増殖。
【００４３】１個の柔らかい寒天管培養物（全量 10 m
l）を１リットルの液体尿酸媒体に添加する。全ての操
作を嫌気バッグ中で行い、全培養物を嫌気ジャー中、35
℃ で 4日間培養する。
l）を１リットルの液体尿酸媒体に添加する。全ての操
作を嫌気バッグ中で行い、全培養物を嫌気ジャー中、35
℃ で 4日間培養する。
【００４４】方法 Ｂ クロストリジウム・シリンドロスポルム粗ホルミルテト
ラヒドロ葉酸合成酵素抽出物の製造を実施する。
ラヒドロ葉酸合成酵素抽出物の製造を実施する。
【００４５】クロストリジウムが嫌気性菌であるので、
方法Ａ と同様に全ての培養生産、保持および取り扱い
操作は菌株の酸素への暴露を最小にする条件下で行う。
同様に、テトラヒドロ葉酸化合物およびその誘導体の極
端な酸素不安定性のために、これらの化合物を含む全て
の工程は酸素の不存在で行う。無酸素の気体窒素源に接
続したプラスチックス製の嫌気袋装置をこの目的に使用
する。上記の１リットルの培養液が濁り、粒状物質が媒
体から沈降する。この培養液を 4 個の 250ml の部分に
分け、 4 個の 250 mlの遠心ビンに添加する。この培養
液をベックマン（Beckman）Ｊ2-21 型遠心器中、 4℃、
8,000 ＲＰＭ で15 分間遠心する。 媒体を 4℃ に急
冷するが、尿酸は細菌により消費されているので沈澱し
ない。上記の細胞ペレットを 4 個の 25 mlの氷冷蒸留
水中に再懸濁させ、上と同様にして遠心する。ホルミル
テトラヒドロ葉酸合成酵素の検定に先立って、このペレ
ットを−20℃ で 5 日間凍結する。
方法Ａ と同様に全ての培養生産、保持および取り扱い
操作は菌株の酸素への暴露を最小にする条件下で行う。
同様に、テトラヒドロ葉酸化合物およびその誘導体の極
端な酸素不安定性のために、これらの化合物を含む全て
の工程は酸素の不存在で行う。無酸素の気体窒素源に接
続したプラスチックス製の嫌気袋装置をこの目的に使用
する。上記の１リットルの培養液が濁り、粒状物質が媒
体から沈降する。この培養液を 4 個の 250ml の部分に
分け、 4 個の 250 mlの遠心ビンに添加する。この培養
液をベックマン（Beckman）Ｊ2-21 型遠心器中、 4℃、
8,000 ＲＰＭ で15 分間遠心する。 媒体を 4℃ に急
冷するが、尿酸は細菌により消費されているので沈澱し
ない。上記の細胞ペレットを 4 個の 25 mlの氷冷蒸留
水中に再懸濁させ、上と同様にして遠心する。ホルミル
テトラヒドロ葉酸合成酵素の検定に先立って、このペレ
ットを−20℃ で 5 日間凍結する。
【００４６】凍結したペレットを全量 4.0 mlの緩衝液
（リン酸水素二カリウム 0.05 Ｍ、2-メルカプトエタノ
ール 0.05Ｍ（１Ｍ 水酸化カリウムの添加により pＨ
7.5））中で融解させる。ペレットを混合し、室温で断
続的に 60 分間攪拌（swirl）して、溶解させる。注意
すべきことには、細胞溶解（cell lysis）のために細胞
ペレットが粘稠になる。自己分解（autolysis）が室温
で起きるのである。この細胞分解物（lysate）を17,000
ＲＰＭ で 30 分間遠心し、上澄液を氷上に保持し、ホ
ルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素を検定する。 方法 Ｃ バトレア（Buttlaire），“ホルミルテトラヒドロ葉酸
合成酵素の精製と性質（Purification and Properties
of Formyltetrahydrofolate Synthetase）”，酵素学
（Enzymology）66 巻，585 ページ，（1980）に示され
た方法により、ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の検
定を行う。
（リン酸水素二カリウム 0.05 Ｍ、2-メルカプトエタノ
ール 0.05Ｍ（１Ｍ 水酸化カリウムの添加により pＨ
7.5））中で融解させる。ペレットを混合し、室温で断
続的に 60 分間攪拌（swirl）して、溶解させる。注意
すべきことには、細胞溶解（cell lysis）のために細胞
ペレットが粘稠になる。自己分解（autolysis）が室温
で起きるのである。この細胞分解物（lysate）を17,000
ＲＰＭ で 30 分間遠心し、上澄液を氷上に保持し、ホ
ルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素を検定する。 方法 Ｃ バトレア（Buttlaire），“ホルミルテトラヒドロ葉酸
合成酵素の精製と性質（Purification and Properties
of Formyltetrahydrofolate Synthetase）”，酵素学
（Enzymology）66 巻，585 ページ，（1980）に示され
た方法により、ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の検
定を行う。
【００４７】
【実施例１】最近の文献の方法（テンプル二世（C.Temp
le，Jr.）、エリオット（R. D. Eliott）、ローズ（J.
D. Rose)およびモンゴメリー(J. A. Montgomery)，医化
学雑誌（J. Med. Chem.），22，731 （1979））を用
い、ホウ水素化ナトリウムを使用して葉酸の5,6(Ｒ,
Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸への還元を実施する。
le，Jr.）、エリオット（R. D. Eliott）、ローズ（J.
D. Rose)およびモンゴメリー(J. A. Montgomery)，医化
学雑誌（J. Med. Chem.），22，731 （1979））を用
い、ホウ水素化ナトリウムを使用して葉酸の5,6(Ｒ,
Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸への還元を実施する。
【００４８】
【実施例２】10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
の生成 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の 10-ホルミル-5,
6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の製造用の酵素的ホルミル化
に適した以下の混合物を製造する：1.0 Ｍトリエタノー
ルアミン塩酸塩（pＨ 8.0）100 ml、0.5 Ｍ アデノシン
三リン酸（pＨ 8.0）100 ml、0.5 Ｍ 塩化カリウム100
ml、0.1 Ｍ 塩化マグネシウム六水和物 100 mlおよび
0.2 Ｍ ギ酸アンモニウム（pＨ 8.0）200 ml。全量5 g
の 5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸（シグマ；純度
69 パーセント；ロット番号 117Ｆ-5013）のバイアルの
内容物を 200 mlの 0.2 Ｍ トリス-ＨＣl/0.05 Ｍ2-メ
ルカプトエタノール（pＨ 7.0）に懸濁させ、約 15 ml
の１Ｍ 水酸化カリウムを添加して溶解させる。この透
明な溶液を上記の混合物に注ぎ入れ、蒸留水（約 200 m
l）を添加して全量 1.0 リットルの反応混合物とし、2
リットルのガラスビンに入れる。
の生成 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の 10-ホルミル-5,
6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の製造用の酵素的ホルミル化
に適した以下の混合物を製造する：1.0 Ｍトリエタノー
ルアミン塩酸塩（pＨ 8.0）100 ml、0.5 Ｍ アデノシン
三リン酸（pＨ 8.0）100 ml、0.5 Ｍ 塩化カリウム100
ml、0.1 Ｍ 塩化マグネシウム六水和物 100 mlおよび
0.2 Ｍ ギ酸アンモニウム（pＨ 8.0）200 ml。全量5 g
の 5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸（シグマ；純度
69 パーセント；ロット番号 117Ｆ-5013）のバイアルの
内容物を 200 mlの 0.2 Ｍ トリス-ＨＣl/0.05 Ｍ2-メ
ルカプトエタノール（pＨ 7.0）に懸濁させ、約 15 ml
の１Ｍ 水酸化カリウムを添加して溶解させる。この透
明な溶液を上記の混合物に注ぎ入れ、蒸留水（約 200 m
l）を添加して全量 1.0 リットルの反応混合物とし、2
リットルのガラスビンに入れる。
【００４９】 4 mlの“ホルミルテトラヒドロ葉酸合成
酵素”（ＦＴＨＦＳ）を含有する粗酵素抽出物を添加し
て反応を開始させ、室温（22℃）で反応を進行させる。
試料を定期的に採取し、逆相カラム（Ｃ- 18）を用い、
0.1 Ｍ のギ酸で溶離し、メタノールで改変（modify）
して 12 ないし 25 ％の直線的な濃度勾配（linear gra
dient）で 30 分にわたり、ＨＰＬＣ で反応の進行を監
視する。カラムの流出液を 282 nm で監視して 12 分で
5,6(Ｒ,Ｓ)，７，８−テトラヒドロ葉酸を、16 分で
5,10-メテニルテトラヒドロ葉酸を検出する。反応は 18
時間後に完了する。ここで、曲線下の面積で測定し
て、5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸の初期量の 48
パーセントが残留している。反応混合物からの 10-ホル
ミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の 1585 mg 相当量が
ＨＰＬＣ クロマトグラムから計算され、これは 5,10-
メテニルテトラヒドロ葉酸を表す。これは、出発物質の
3450 mgの 5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸の1725 mg
のみが酵素的転化反応に利用されたことを考慮して、
理論量の 92 パーセントの転化率を示す。理論量の 50
パーセントが 5時間後に転化する。
酵素”（ＦＴＨＦＳ）を含有する粗酵素抽出物を添加し
て反応を開始させ、室温（22℃）で反応を進行させる。
試料を定期的に採取し、逆相カラム（Ｃ- 18）を用い、
0.1 Ｍ のギ酸で溶離し、メタノールで改変（modify）
して 12 ないし 25 ％の直線的な濃度勾配（linear gra
dient）で 30 分にわたり、ＨＰＬＣ で反応の進行を監
視する。カラムの流出液を 282 nm で監視して 12 分で
5,6(Ｒ,Ｓ)，７，８−テトラヒドロ葉酸を、16 分で
5,10-メテニルテトラヒドロ葉酸を検出する。反応は 18
時間後に完了する。ここで、曲線下の面積で測定し
て、5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸の初期量の 48
パーセントが残留している。反応混合物からの 10-ホル
ミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の 1585 mg 相当量が
ＨＰＬＣ クロマトグラムから計算され、これは 5,10-
メテニルテトラヒドロ葉酸を表す。これは、出発物質の
3450 mgの 5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸の1725 mg
のみが酵素的転化反応に利用されたことを考慮して、
理論量の 92 パーセントの転化率を示す。理論量の 50
パーセントが 5時間後に転化する。
【００５０】
【実施例３】10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
の 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸への転化 実施例 2 の反応混合物を他日分析してその組成に変化
がないことを認めた。この混合物の 100mlを三つ首ビン
に移し、この溶液の pＨ を硫酸を用いて 6.5 に調整す
る。窒素で脱気しながらこのビンを水浴に浸し、90 −
95℃ で 2 時間加熱する。ついで、反応を窒素下、40℃
で一晩継続させる。この反応混合物は、16 時間後には
褐色の外見を有している。逆相カラム（Ｃ-18）を用
い、0.1 Ｍのギ酸で溶離し、メタノールで改変して 12
ないし 25 ％の直線的な濃度勾配で 30 分にわたり、Ｈ
ＰＬＣ で試料を分析する。カラムの流出液を 282 nm
で監視する。ＨＰＬＣ分析は、5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,
8-テトラヒドロ葉酸化合物のピークと 5-ホルミル-5,6
Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸のピークとに関して、曲線下
の面積を考慮すれば 90.2 パーセントの転化率を示す。
未変化の 5,6Ｒ,7,8- テトラヒドロ葉酸の面積は出発物
質のものに対して 33.1 パーセントに減少している（48
パーセント）。
の 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸への転化 実施例 2 の反応混合物を他日分析してその組成に変化
がないことを認めた。この混合物の 100mlを三つ首ビン
に移し、この溶液の pＨ を硫酸を用いて 6.5 に調整す
る。窒素で脱気しながらこのビンを水浴に浸し、90 −
95℃ で 2 時間加熱する。ついで、反応を窒素下、40℃
で一晩継続させる。この反応混合物は、16 時間後には
褐色の外見を有している。逆相カラム（Ｃ-18）を用
い、0.1 Ｍのギ酸で溶離し、メタノールで改変して 12
ないし 25 ％の直線的な濃度勾配で 30 分にわたり、Ｈ
ＰＬＣ で試料を分析する。カラムの流出液を 282 nm
で監視する。ＨＰＬＣ分析は、5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,
8-テトラヒドロ葉酸化合物のピークと 5-ホルミル-5,6
Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸のピークとに関して、曲線下
の面積を考慮すれば 90.2 パーセントの転化率を示す。
未変化の 5,6Ｒ,7,8- テトラヒドロ葉酸の面積は出発物
質のものに対して 33.1 パーセントに減少している（48
パーセント）。
【００５１】反応混合物の試料をポンプを経て製造用
ＨＰＬＣ 逆相カラム（ダイナマックス（Dynamax） 60
Ａ-Ｃ18、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）に添加し、つい
で、0.1 Ｍ 水性ギ酸とメタノールとの濃度勾配で、 13
メートルリットル/分の流速で60 分間展開する。若干
黄色い 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸が 82
パーセントの通算（overall）収率で得られ、これを酸
性溶離条件下（0.1 Ｍ 水性ギ酸およびメタノール）で
5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化さ
せ、ついでこれを 3ないし 6 mg/ メートルリットルの
濃度で放置して収集バイアル中でゲルを形成させる。対
掌性カラム（ダイアセルキーラセル（Diacel Chirace
l）ＯＤ）を用い、0.5 パーセントのギ酸アンモニウ
ム、pＨ ＝ 3.8、および 25 パーセントメタノールで平
等に溶離する ＨＰＬＣ で、この試料のエナンショマー
的純度を測定した、15.2 分の保持時間が記録され、ギ
酸中の旋光度は以下のとおりである：
ＨＰＬＣ 逆相カラム（ダイナマックス（Dynamax） 60
Ａ-Ｃ18、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）に添加し、つい
で、0.1 Ｍ 水性ギ酸とメタノールとの濃度勾配で、 13
メートルリットル/分の流速で60 分間展開する。若干
黄色い 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸が 82
パーセントの通算（overall）収率で得られ、これを酸
性溶離条件下（0.1 Ｍ 水性ギ酸およびメタノール）で
5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化さ
せ、ついでこれを 3ないし 6 mg/ メートルリットルの
濃度で放置して収集バイアル中でゲルを形成させる。対
掌性カラム（ダイアセルキーラセル（Diacel Chirace
l）ＯＤ）を用い、0.5 パーセントのギ酸アンモニウ
ム、pＨ ＝ 3.8、および 25 パーセントメタノールで平
等に溶離する ＨＰＬＣ で、この試料のエナンショマー
的純度を測定した、15.2 分の保持時間が記録され、ギ
酸中の旋光度は以下のとおりである：
【００５２】
【実施例４】 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸の5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸および
5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸への転化 実施例 2 で得られる反応混合物の残余のpＨ を硫酸を
用いて 8.0 から 5.0 に調整し、 10-ホルミル-5,6Ｓ,
7,8-テトラヒドロ葉酸の 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸への迅速環化を開始させ、ついで、これ
を室温のまま徐々に加水分解して 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,
8-テトラヒドロ葉酸を形成させる。後者は pＨ 調整の
前には反応混合物中に検出されない。
葉酸の5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸および
5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸への転化 実施例 2 で得られる反応混合物の残余のpＨ を硫酸を
用いて 8.0 から 5.0 に調整し、 10-ホルミル-5,6Ｓ,
7,8-テトラヒドロ葉酸の 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸への迅速環化を開始させ、ついで、これ
を室温のまま徐々に加水分解して 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,
8-テトラヒドロ葉酸を形成させる。後者は pＨ 調整の
前には反応混合物中に検出されない。
【００５３】この反応に続いて、逆相カラム（Ｃ-18）
を用い、0.1 Ｍ のギ酸で溶離し、メタノールで改変し
て、12 ないし 25 パーセントの直線的な濃度勾配で 30
分にわたり ＨＰＬＣ を行う。ＨＰＬＣ による反応の
監視により、初期の 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸の 70 パーセント以上が室温で 5 日後に5-
ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化したが、
この時間中、反応混合物中の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸濃度は変化しなかったことが示されている。つい
で、 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸および
5,10-メテニル-5,6 Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸として得
られるホルミル化生成物、ならびにホルミル化されなか
った 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を、0.1Ｍ 水性ギ酸
とメタノールとの濃度勾配で、13ml/分の流速で 60 分
間展開する製造用 ＨＰＬＣ逆相カラム（ダイナマック
ス 60Ａ-Ｃ18、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）で単離す
る。2 種の製造の測定した収率（50 mlの反応混合物に
対する各当量）は以下のとおりである： 単離した化合物（mg） 収率(％) 相対収量 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8- テトラヒドロ葉酸（22.6） 12.9 6.5 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8- テトラヒドロ葉酸(118.2) 67.5 33.8 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ 葉酸* （145.5） 83.1 41.6 *単離した 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を直ちに乾燥
し、ギ酸でホルミル化（以下に記載するように）して
5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を得る。こ
れは、 6Ｓ 型とは異なり、希ギ酸から結晶化する。
を用い、0.1 Ｍ のギ酸で溶離し、メタノールで改変し
て、12 ないし 25 パーセントの直線的な濃度勾配で 30
分にわたり ＨＰＬＣ を行う。ＨＰＬＣ による反応の
監視により、初期の 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸の 70 パーセント以上が室温で 5 日後に5-
ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化したが、
この時間中、反応混合物中の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸濃度は変化しなかったことが示されている。つい
で、 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸および
5,10-メテニル-5,6 Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸として得
られるホルミル化生成物、ならびにホルミル化されなか
った 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を、0.1Ｍ 水性ギ酸
とメタノールとの濃度勾配で、13ml/分の流速で 60 分
間展開する製造用 ＨＰＬＣ逆相カラム（ダイナマック
ス 60Ａ-Ｃ18、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）で単離す
る。2 種の製造の測定した収率（50 mlの反応混合物に
対する各当量）は以下のとおりである： 単離した化合物（mg） 収率(％) 相対収量 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8- テトラヒドロ葉酸（22.6） 12.9 6.5 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8- テトラヒドロ葉酸(118.2) 67.5 33.8 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ 葉酸* （145.5） 83.1 41.6 *単離した 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を直ちに乾燥
し、ギ酸でホルミル化（以下に記載するように）して
5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸を得る。こ
れは、 6Ｓ 型とは異なり、希ギ酸から結晶化する。
【００５４】
【実施例５】結晶性 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸を得るための5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の
ホルミル化 クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥した 5,6Ｒ,7,8
-テトラヒドロ葉酸の試料 253 mg を 2パーセントのト
リフルオロ酢酸を含有する 97 パーセントのギ酸 50 ml
に溶解させ、窒素下の反応ビン中、環境温度で攪拌せず
に放置する。反応は、逆相カラム（Ｃ-18）を用い、0.1
Ｍ の水性ギ酸で溶離し、メタノールで改変して、12
ないし 25 パーセントの直線的な濃度勾配で 30 分にわ
たる ＨＰＬＣ により分析し、282 nm で監視する。3
時間後には、5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉
酸を表す新しいピークが ＨＰＬＣ クロマトグラムに出
現することにより判定されるように、全ての 5,6Ｒ,7,8
-テトラヒドロ葉酸が反応している。続いて、ギ酸の大
部分を蒸発により除去し、この混合物をときどき攪拌し
ながら 30 mlの0.1 Ｍ 水性ギ酸を徐々に添加する。つ
いで、この溶液を冷却室に一晩貯蔵する。小さい黄色の
針状物が生成して溶液に固体様の外見を与える。この結
晶を焼結ガラスロート（glass-fritted funnel）に集め
てアセトンで洗浄し、真空中で乾燥して 218 mg の黄色
の結晶性物質を得る。
ヒドロ葉酸を得るための5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の
ホルミル化 クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥した 5,6Ｒ,7,8
-テトラヒドロ葉酸の試料 253 mg を 2パーセントのト
リフルオロ酢酸を含有する 97 パーセントのギ酸 50 ml
に溶解させ、窒素下の反応ビン中、環境温度で攪拌せず
に放置する。反応は、逆相カラム（Ｃ-18）を用い、0.1
Ｍ の水性ギ酸で溶離し、メタノールで改変して、12
ないし 25 パーセントの直線的な濃度勾配で 30 分にわ
たる ＨＰＬＣ により分析し、282 nm で監視する。3
時間後には、5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉
酸を表す新しいピークが ＨＰＬＣ クロマトグラムに出
現することにより判定されるように、全ての 5,6Ｒ,7,8
-テトラヒドロ葉酸が反応している。続いて、ギ酸の大
部分を蒸発により除去し、この混合物をときどき攪拌し
ながら 30 mlの0.1 Ｍ 水性ギ酸を徐々に添加する。つ
いで、この溶液を冷却室に一晩貯蔵する。小さい黄色の
針状物が生成して溶液に固体様の外見を与える。この結
晶を焼結ガラスロート（glass-fritted funnel）に集め
てアセトンで洗浄し、真空中で乾燥して 218 mg の黄色
の結晶性物質を得る。
【００５５】結晶性の 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸のエナンショマー的純度は対掌性カラム
（ダイアセルキーラセル ＯＤ）を用い、0.5 パーセン
トのギ酸アンモニウム、pＨ ＝ 3.8、および 25 パーセ
ントメタノールで平等に溶離して測定する。生成物の
5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸は 18.2 分
で溶離した。
ラヒドロ葉酸のエナンショマー的純度は対掌性カラム
（ダイアセルキーラセル ＯＤ）を用い、0.5 パーセン
トのギ酸アンモニウム、pＨ ＝ 3.8、および 25 パーセ
ントメタノールで平等に溶離して測定する。生成物の
5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸は 18.2 分
で溶離した。
【００５６】88 パーセントギ酸中の溶液として測定し
た旋光度は以下のとおりである：
た旋光度は以下のとおりである：
【００５７】
【実施例６】5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
および／または 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸の存在下における5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の
誘導体化 リーズ、サクリングおよびウッド，化学会誌
化学通信（J. Chem. Soc. Chem. Commun.）470（1987）
に示された方法を変更して、実施例 4 の反応混合物の
試料に (−) メンチルクロロギ酸を添加し、pＨ 7 に調
整すると、5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸のみのカルボキ
シメンチル化が生じ、5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸および／または 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸は反応せずに残る。反応は ＨＰＬＣ に
より監視した。5-メンチルオキシカルボニル-5,6Ｒ,7,8
-テトラヒドロ葉酸の未反応成分からの効果的な分離
は、ＸＲＤ-2 負荷カラムに反応混合物を通過させて達
成される。5-メンチルオキシカルボニル-5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸は樹脂に吸収され、5-ホルミル-5,6Ｓ,
7,8-テトラヒドロ葉酸または 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8
-テトラヒドロ葉酸は通過する。
および／または 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸の存在下における5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の
誘導体化 リーズ、サクリングおよびウッド，化学会誌
化学通信（J. Chem. Soc. Chem. Commun.）470（1987）
に示された方法を変更して、実施例 4 の反応混合物の
試料に (−) メンチルクロロギ酸を添加し、pＨ 7 に調
整すると、5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸のみのカルボキ
シメンチル化が生じ、5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸および／または 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸は反応せずに残る。反応は ＨＰＬＣ に
より監視した。5-メンチルオキシカルボニル-5,6Ｒ,7,8
-テトラヒドロ葉酸の未反応成分からの効果的な分離
は、ＸＲＤ-2 負荷カラムに反応混合物を通過させて達
成される。5-メンチルオキシカルボニル-5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸は樹脂に吸収され、5-ホルミル-5,6Ｓ,
7,8-テトラヒドロ葉酸または 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8
-テトラヒドロ葉酸は通過する。
【００５８】
【実施例７】5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸、5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸および他の誘導体の製
造用 ＨＰＬＣ による精製 実施例 4 の反応混合物の一部（50 または 100ml）を、
負荷用ポンプを通して逆相カラム（ダイナマックス 60
Ａ-Ｃ18、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）に直接に負荷
し、ついで、0.1Ｍ 水性ギ酸とメタノールとの濃度勾配
で、13 ml/分の流速で 60 分間展開する。使用した濃
度勾配は 5パーセントのメタノール濃度から出発して 1
2 分の作業時間（run time）後に 10 パーセントに達す
るものである。ついで、10 パーセントメタノールの濃
度を次の 10 分間一定に保ち、このと き（作業開始後
22 分）に、メタノールのレベルを直線的に増加させて
38 分で 18 パーセントに到達させ、ここからさらに 52
分の作業時間には 25 パーセントに到達させる。この
濃度は、作業の終了までこれ以上は増加させない。カラ
ム溶離液は、5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸と 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸とがその
波長で同一の吸収係数を有するので、319 nm で監視す
る。
酸、5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸および他の誘導体の製
造用 ＨＰＬＣ による精製 実施例 4 の反応混合物の一部（50 または 100ml）を、
負荷用ポンプを通して逆相カラム（ダイナマックス 60
Ａ-Ｃ18、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）に直接に負荷
し、ついで、0.1Ｍ 水性ギ酸とメタノールとの濃度勾配
で、13 ml/分の流速で 60 分間展開する。使用した濃
度勾配は 5パーセントのメタノール濃度から出発して 1
2 分の作業時間（run time）後に 10 パーセントに達す
るものである。ついで、10 パーセントメタノールの濃
度を次の 10 分間一定に保ち、このと き（作業開始後
22 分）に、メタノールのレベルを直線的に増加させて
38 分で 18 パーセントに到達させ、ここからさらに 52
分の作業時間には 25 パーセントに到達させる。この
濃度は、作業の終了までこれ以上は増加させない。カラ
ム溶離液は、5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸と 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸とがその
波長で同一の吸収係数を有するので、319 nm で監視す
る。
【００５９】これらの製造条件下で 5,6Ｒ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸は 11 分ないし 17.5 分で溶離し、他方、5-
ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸は 39.5分ないし
44.5 分で溶離する。5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸バンドの溶離は濃度に強く依存して 20 分な
いし 30 分に尾を引くピークとして現れる。700 mg の
物質に相当する 140 メートルリットルを超える反応混
合物を負荷すれば、5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸バンド
と、 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸バン
ドとは完全には分離することができない。
ヒドロ葉酸は 11 分ないし 17.5 分で溶離し、他方、5-
ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸は 39.5分ないし
44.5 分で溶離する。5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸バンドの溶離は濃度に強く依存して 20 分な
いし 30 分に尾を引くピークとして現れる。700 mg の
物質に相当する 140 メートルリットルを超える反応混
合物を負荷すれば、5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸バンド
と、 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸バン
ドとは完全には分離することができない。
【００６０】液体を直ちに凍結し得るように、5,6Ｒ,7,
8-テトラヒドロ葉酸と 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸との溶離バンドとをドライアイスに浸したガラ
スビンに集める。ついで、凍結した分画を凍結乾燥して
5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の場合には灰色がかった
白色の粉末を、5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸の場合には黄色がかった白色の粉末を得る。これらの
粉末に関して、逆相カラム（ダイナマックス 60Ａ-Ｃ1
8、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）を用い、0.1Ｍ 水性ギ
酸とメタノールとの濃度勾配で展開して ＨＰＬＣ 分析
を行う。曲線下の面積から、5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸は純度 97 パーセントであり、5,6Ｒ,7,
8-テトラヒドロ葉酸は純度 93 パーセントであることが
示される。5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の不安定性のた
めに、これを化学的にホルミル化して、より安定な 5,1
0-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化させ
る。5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の全ての
安定性の問題を打ち消すために、この化合物を実施例8
の記載と同様にしてカルシウム塩に転化させる。
8-テトラヒドロ葉酸と 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸との溶離バンドとをドライアイスに浸したガラ
スビンに集める。ついで、凍結した分画を凍結乾燥して
5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の場合には灰色がかった
白色の粉末を、5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸の場合には黄色がかった白色の粉末を得る。これらの
粉末に関して、逆相カラム（ダイナマックス 60Ａ-Ｃ1
8、8 ミクロン、2.1 × 30 cm）を用い、0.1Ｍ 水性ギ
酸とメタノールとの濃度勾配で展開して ＨＰＬＣ 分析
を行う。曲線下の面積から、5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸は純度 97 パーセントであり、5,6Ｒ,7,
8-テトラヒドロ葉酸は純度 93 パーセントであることが
示される。5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の不安定性のた
めに、これを化学的にホルミル化して、より安定な 5,1
0-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化させ
る。5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸の全ての
安定性の問題を打ち消すために、この化合物を実施例8
の記載と同様にしてカルシウム塩に転化させる。
【００６１】
【実施例８】5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
カルシウムまたは 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸カルシウムの製造 テンプル二世（C. Temple，Jr.）、エリオット（R. D.
Eliott）、ローズ（J. D. Rose)およびモンゴメリー
（J. A. Montgomery)，医化学雑誌（J. Med. Chem.），
22，731（1979）により公刊された方法を変更して、ラ
セミ体 5-ホルミル-5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸
カルシウムを製造し、生成した 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-
テトラヒドロ葉酸をエーテルで洗浄して可能なギ酸アン
モニウムを除去する。ついで、洗浄した物質の 62 mg
を 32 mlの脱気メタノール（塩非含有ギ酸はメタノール
に良好に溶解する）に溶解させ、これに約１ml のメタ
ノール性塩化カルシウム溶液（メタノール１mlあたりメ
タノール 72 mg）を添加する。この塩の添加により直ち
に純白でない白色の沈澱が生成するので、これを焼結ガ
ラスロートに集めて真空中で乾燥する。乾燥後の収量は
60.5 mg（理論収量の 90 パーセント）である。
カルシウムまたは 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸カルシウムの製造 テンプル二世（C. Temple，Jr.）、エリオット（R. D.
Eliott）、ローズ（J. D. Rose)およびモンゴメリー
（J. A. Montgomery)，医化学雑誌（J. Med. Chem.），
22，731（1979）により公刊された方法を変更して、ラ
セミ体 5-ホルミル-5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸
カルシウムを製造し、生成した 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-
テトラヒドロ葉酸をエーテルで洗浄して可能なギ酸アン
モニウムを除去する。ついで、洗浄した物質の 62 mg
を 32 mlの脱気メタノール（塩非含有ギ酸はメタノール
に良好に溶解する）に溶解させ、これに約１ml のメタ
ノール性塩化カルシウム溶液（メタノール１mlあたりメ
タノール 72 mg）を添加する。この塩の添加により直ち
に純白でない白色の沈澱が生成するので、これを焼結ガ
ラスロートに集めて真空中で乾燥する。乾燥後の収量は
60.5 mg（理論収量の 90 パーセント）である。
【００６２】6Ｒ 物質についてこの手順を繰り返せば、
5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸カルシウムが
得られる。
5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸カルシウムが
得られる。
【００６３】製造した物質の純度は、いかなる ＵＶ-非
吸収性物質の存在にも配慮することなく、ＵＶ/ＨＰＬ
Ｃ により測定する。エナンショマー的な純度は、5,10-
メテニル-5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体の段
階において、対掌性カラム（ダイアセルキーラセル Ｏ
Ｄ）を用い、0.5 パーセントのギ酸アンモニウム、pＨ
＝ ３．８、および 25 パーセントメタノールで平等に
溶離して、ＨＰＬＣ により測定する。5,10-メテニル-
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸が最初に、15.2 分の保持
時間で溶離し、一方、 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸は 18.2 分で溶離する。
吸収性物質の存在にも配慮することなく、ＵＶ/ＨＰＬ
Ｃ により測定する。エナンショマー的な純度は、5,10-
メテニル-5,6(Ｒ,Ｓ),7,8-テトラヒドロ葉酸誘導体の段
階において、対掌性カラム（ダイアセルキーラセル Ｏ
Ｄ）を用い、0.5 パーセントのギ酸アンモニウム、pＨ
＝ ３．８、および 25 パーセントメタノールで平等に
溶離して、ＨＰＬＣ により測定する。5,10-メテニル-
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸が最初に、15.2 分の保持
時間で溶離し、一方、 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸は 18.2 分で溶離する。
【００６４】ギ酸の方が酸性が弱く、葉酸塩に対する溶
解能力が大きいので、文献に報告されているように、製
造した化合物の 10 Ｍ または 12 Ｍ 塩酸溶液よりもむ
しろギ酸溶液を、その旋光性の記録に使用する。上記の
製造の試料は以下の旋光度を示した： * 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸として、0.1
Ｍギ酸混合物で溶離してクロマトグラフィー的に単離
し、5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化
させ、ついで固化してゲルを形成させ、これを凍結乾燥
する。 ** 最初に非転化 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸として
単離し、これを凍結乾燥したのち、直ちに上記のものと
同様にしてギ酸を用いてホルミル化する。得られる、希
ギ酸混合物から晶出した 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸を集め、アセトンで洗浄し、真空中で乾
燥する。253 mg の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸（重量
で）から 218 mg の結晶性5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸（重量で）が回収される。
解能力が大きいので、文献に報告されているように、製
造した化合物の 10 Ｍ または 12 Ｍ 塩酸溶液よりもむ
しろギ酸溶液を、その旋光性の記録に使用する。上記の
製造の試料は以下の旋光度を示した： * 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸として、0.1
Ｍギ酸混合物で溶離してクロマトグラフィー的に単離
し、5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸に転化
させ、ついで固化してゲルを形成させ、これを凍結乾燥
する。 ** 最初に非転化 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸として
単離し、これを凍結乾燥したのち、直ちに上記のものと
同様にしてギ酸を用いてホルミル化する。得られる、希
ギ酸混合物から晶出した 5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸を集め、アセトンで洗浄し、真空中で乾
燥する。253 mg の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸（重量
で）から 218 mg の結晶性5,10-メテニル-5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸（重量で）が回収される。
【００６５】
【実施例９】放射性標識したホルミル葉酸および誘導体
の製造 ギ酸アンモニウムを放射性標識したギ酸アンモニウム、
または他のいかなるものであれ、放射性標識したギ酸誘
導体で置き換えて実施例 2 の手順を繰り返せば、放射
性標識した 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
が得られる。これを実施例 3 − 8 の方法にかければ、
対応する放射性標識した酸および塩が得られるであろ
う。
の製造 ギ酸アンモニウムを放射性標識したギ酸アンモニウム、
または他のいかなるものであれ、放射性標識したギ酸誘
導体で置き換えて実施例 2 の手順を繰り返せば、放射
性標識した 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
が得られる。これを実施例 3 − 8 の方法にかければ、
対応する放射性標識した酸および塩が得られるであろ
う。
【００６６】上記の特許、刊行物および試験方法は本件
明細書中に引用文献として組み入れる。
明細書中に引用文献として組み入れる。
【００６７】上記の詳細な記述は当業者に多くの自明の
変更を示唆する。たとえば、カルシウムロイコボリンに
替えてストロンチウムロイコボリンまたはナトリウムロ
イコボリンを製造することもできる。テトラヒドロ葉酸
ホルミラーゼはクロストリジウム・アシジ-ウリキ（Clo
stridium acidi-urici）より得られる。この種の全ての
自明の改変は、添付した特許請求の範囲の意図した全範
囲の内にある。本発明の主なる特徴および態様は以下の
とおりである。
変更を示唆する。たとえば、カルシウムロイコボリンに
替えてストロンチウムロイコボリンまたはナトリウムロ
イコボリンを製造することもできる。テトラヒドロ葉酸
ホルミラーゼはクロストリジウム・アシジ-ウリキ（Clo
stridium acidi-urici）より得られる。この種の全ての
自明の改変は、添付した特許請求の範囲の意図した全範
囲の内にある。本発明の主なる特徴および態様は以下の
とおりである。
【００６８】１．（ａ） テトラヒドロ葉酸の、もしく
は置換テトラヒドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくは
エステルの 6Ｒ および 6Ｓ ジアステレオ異性体の混合
物の 6Ｓ 形状を酵素的にホルミル化して 10-ホルミル-
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テル；存在すれば未反応の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステル；および未反応の 5,6
Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを含んでなる混合物を形成させ； （ｂ） （1）10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離し、
その後、上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを環化し、加水分解
して、 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸も
しくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸または
それらの塩もしくはエステルを、またはこれらの双方を
形成させるか；または、 （2）上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に
環化、加水分解して、 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、または
これらの双方を形成させ；その後、 （i）5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを誘導体化して 5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを形成させ、つ
いで各成分を分離するか、または、これに替えて （ii）全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸および全ての 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸、またはそれらの塩もしくはエステルを5,6Ｒ,7,8-
テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分
離し；分離後、所望ならば、 （3）上記の未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルを化学的にホルミル化し、環
化し、加水分解して 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを製造するか、ま
たは、これに替えて、上記の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを他の官能基で誘導
体化して5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル、または 5-
ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを対応する酸、塩またはエステルに転化
させる各段階を有する、5,6(Ｒ または Ｓ),7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの誘導体の所
望の実質的に純粋な（6Ｒ または 6Ｓ）ジアステレオ異
性体の製造方法。
は置換テトラヒドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくは
エステルの 6Ｒ および 6Ｓ ジアステレオ異性体の混合
物の 6Ｓ 形状を酵素的にホルミル化して 10-ホルミル-
5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テル；存在すれば未反応の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステル；および未反応の 5,6
Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを含んでなる混合物を形成させ； （ｂ） （1）10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離し、
その後、上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを環化し、加水分解
して、 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸も
しくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸または
それらの塩もしくはエステルを、またはこれらの双方を
形成させるか；または、 （2）上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に
環化、加水分解して、 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、または
これらの双方を形成させ；その後、 （i）5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを誘導体化して 5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを形成させ、つ
いで各成分を分離するか、または、これに替えて （ii）全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸および全ての 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸、またはそれらの塩もしくはエステルを5,6Ｒ,7,8-
テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分
離し；分離後、所望ならば、 （3）上記の未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルを化学的にホルミル化し、環
化し、加水分解して 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを製造するか、ま
たは、これに替えて、上記の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを他の官能基で誘導
体化して5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル、または 5-
ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを対応する酸、塩またはエステルに転化
させる各段階を有する、5,6(Ｒ または Ｓ),7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの誘導体の所
望の実質的に純粋な（6Ｒ または 6Ｓ）ジアステレオ異
性体の製造方法。
【００６９】２．選択的ホルミル化に使用する酵素がテ
トラヒドロ葉酸ホルミラーゼよりなるものであることを
特徴とする上記の第１項記載の方法。
トラヒドロ葉酸ホルミラーゼよりなるものであることを
特徴とする上記の第１項記載の方法。
【００７０】３．上記のテトラヒドロ葉酸ホルミラーゼ
がクロストリジウム（Clostridium ）種 ＡＴＣＣ 第 7
905 号、またはその変種より得られるものであることを
特徴とする上記の第 2 項記載の方法。 ４．未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の化学的ホ
ルミル化をカルボジイミドの存在下にギ酸を用いて実施
することを特徴とする上記の第１項記載の方法。
がクロストリジウム（Clostridium ）種 ＡＴＣＣ 第 7
905 号、またはその変種より得られるものであることを
特徴とする上記の第 2 項記載の方法。 ４．未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸の化学的ホ
ルミル化をカルボジイミドの存在下にギ酸を用いて実施
することを特徴とする上記の第１項記載の方法。
【００７１】５．転化段階（ｃ）が葉酸誘導体を対応す
る塩転化させることよりなるものであることを特徴とす
る上記の第１項記載の方法。
る塩転化させることよりなるものであることを特徴とす
る上記の第１項記載の方法。
【００７２】６．上記の塩がカルシウム塩、マグネシウ
ム塩、ストロンチウムウ塩、鉄塩、またはこれらのいず
れかの混合物よりなるものであることを特徴とする上記
の第 5 項記載の方法。
ム塩、ストロンチウムウ塩、鉄塩、またはこれらのいず
れかの混合物よりなるものであることを特徴とする上記
の第 5 項記載の方法。
【００７３】７．上記の酵素的ホルミル化を放射性標識
したギ酸またはその化学的同等物を含有する反応混合物
中で行うことを特徴とする上記の第１項記載の方法。
したギ酸またはその化学的同等物を含有する反応混合物
中で行うことを特徴とする上記の第１項記載の方法。
【００７４】８．（ａ） 5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸ま
たはその塩もしくはエステルの 6Ｒ および 6Ｓ ジアス
テレオ異性体の混合物の 6Ｓ 形状を酵素的にホルミル
化して 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステル；存在すれば未反応の 5,6
Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ル；および未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルよりなる混合物を形成させ； （ｂ） 上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの存在下に
環化し、加水分解して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、または
これらの双方を形成させ；その後、 （ｃ） 全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離
し；分離後、所望ならば、 （ｄ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対応する
酸、塩またはエステルに転化させる各段階を有する、所
望の実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルの製造方法。
たはその塩もしくはエステルの 6Ｒ および 6Ｓ ジアス
テレオ異性体の混合物の 6Ｓ 形状を酵素的にホルミル
化して 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステル；存在すれば未反応の 5,6
Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ル；および未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルよりなる混合物を形成させ； （ｂ） 上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの存在下に
環化し、加水分解して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、または
これらの双方を形成させ；その後、 （ｃ） 全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離
し；分離後、所望ならば、 （ｄ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対応する
酸、塩またはエステルに転化させる各段階を有する、所
望の実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルの製造方法。
【００７５】９．選択的ホルミル化に使用する酵素がテ
トラヒドロ葉酸ホルミラーゼよりなるものであることを
特徴とする上記の第 8 項記載の方法。
トラヒドロ葉酸ホルミラーゼよりなるものであることを
特徴とする上記の第 8 項記載の方法。
【００７６】10．上記のテトラヒドロ葉酸ホルミラーゼ
がクロストリジウム種 ＡＴＣＣ 第 7905 号、またはそ
の変種より得られるものであることを特徴とする上記の
第 9項記載の方法。
がクロストリジウム種 ＡＴＣＣ 第 7905 号、またはそ
の変種より得られるものであることを特徴とする上記の
第 9項記載の方法。
【００７７】11．転化段階（ｄ）が葉酸誘導体を対応す
る塩転化させることよりなるものであることを特徴とす
る上記の第 8 項記載の方法。
る塩転化させることよりなるものであることを特徴とす
る上記の第 8 項記載の方法。
【００７８】12．上記の塩がカルシウム塩、マグネシウ
ム塩、ストロンチウム塩、鉄塩、またはこれらのいずれ
かの混合物よりなるものであることを特徴とする上記の
第 11 項記載の方法。
ム塩、ストロンチウム塩、鉄塩、またはこれらのいずれ
かの混合物よりなるものであることを特徴とする上記の
第 11 項記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スチユアート・アラン・ローゼンフエル ド アメリカ合衆国カリフオルニア州94501 アラメダ・サンアントニオアベニユー 908 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 41/00 C12P 17/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 （ａ） テトラヒドロ葉酸の、もしくは
置換テトラヒドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエ
ステルの 6Ｒ および 6Ｓ ジアステレオ異性体の混合物
の 6Ｓ 形状を、テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼを用い
て酵素的にホルミル化して 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；存在す
れば未反応の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステル；および未反応の 5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを含んでな
る混合物を形成させ； （ｂ） （1）10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離し、
その後、上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを環化し、加水分解
して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸もし
くは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはそ
れらの塩もしくはエステルを、またはこれらの双方を形
成させるか；または、 （2）上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に
環化、加水分解して、 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、または
これらの双方を形成させ；その後、 （i）5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを誘導体化して5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを形成させ、つ
いで各成分を分離するか、または、これに替えて （ii）全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸および全ての 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸、またはそれらの塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8
-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから
分離し； 分離後、所望ならば、 （3）上記の未反応の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルを化学的にホルミル化し、環
化し、加水分解して 5-ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを製造するか、ま
たは、これに替えて、上記の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを他の官能基で誘導
体化して5-置換 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル、または 5-
ホルミル-5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを対応する酸、塩またはエステルに転化
させる 各段階を有する、5,6(Ｒ または Ｓ),7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルの誘導体の所望の実
質的に純粋な（6Ｒ または 6Ｓ）ジアステレオ異性体の
製造方法。 - 【請求項２】 （ａ） 5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステルの 6Ｒ および 6Ｓ ジアステ
レオ異性体の混合物の 6Ｓ 形状を、テトラヒドロ葉酸
ホルミラーゼを用いて酵素的にホルミル化して 10-ホル
ミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステル；存在すれば未反応の 5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；および未反応
の 5,6Ｒ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくは
エステルよりなる混合物を形成させ； （ｂ） 上記の 10-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの存在下に
環化し、加水分解して 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テト
ラヒドロ葉酸もしくは 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、または
これらの双方を形成させ；その後、 （ｃ） 全ての 5,10-メテニル-5,6Ｓ,7,8-テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを 5,6Ｒ,7,8-テ
トラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分離
し； 分離後、所望ならば、 （ｄ） 実質的に純粋な 5-ホルミル-5,6Ｓ,7,8-テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対応する
酸、塩またはエステルに転化させる 各段階を有する、所望の実質的に純粋な 5-ホルミル-5,
6Ｓ,7,8-テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルの製造方法。
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