CZ279998B6 - Způsob přípravy opticky čistých diastereoisomerů tetrahydrofolátových sloučenin - Google Patents
Způsob přípravy opticky čistých diastereoisomerů tetrahydrofolátových sloučenin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ279998B6 CZ279998B6 CS906103A CS610390A CZ279998B6 CZ 279998 B6 CZ279998 B6 CZ 279998B6 CS 906103 A CS906103 A CS 906103A CS 610390 A CS610390 A CS 610390A CZ 279998 B6 CZ279998 B6 CZ 279998B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- tetrahydrofolic acid
- salt
- acid
- ester
- formyl
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
- C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
- C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/842—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Způsob přípravy opticky čistého (6R nebo 6S)-diastereoisomeru derivátu kyseliny 5,6 (R nebo 7), 7,8-tetra-hydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje enzymatickou formylaci tetrahydrofosfát-formylázou 6S-formy 6R- a 6S-diastereoisomerů kyseliny tetrahydrolistové nebo substituované kyseliny tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku směsi obsahující kyselinu 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester, přpadně nezreagovanou kyselinu 5,6S,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester a nezreagovanou kyselinu 5,6R,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester.
ŕ
Description
Vynález se týká nového způsobu přípravy opticky čistých dia~ stereoisomerů tetrahydrofolátových sloučenin, který spočívá v tom, že se v racemické směsi kyseliny 5,6,7,8-tetrahydrolistové /5,6,7,8-tetrahydrofolové/ konvertuje pouze složka kyseliny
5,6S,7,8-tetrahydrolistové na kyselinu 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou v přítomnosti bakteriálně odvozené formyltetrahydrofolát-syntetázy.
Je známo, že leucovorin a jeho soli jsou farmaceuticky účinné látky. Tato skutečnost je například popsána v Remington's Pharmaceutical Services, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985 /Remington's/, str. 1023. Kerwar a kol. v patentovém spisu US 4,746,662 uvádí, že antiarthritická účinnost methotrexatu může být potenciována injekcí vodného roztoku leucovorinu nebo jeho solí. V evropském patentu 0,266,042 se popisuje použití čistého leucovorinu, respektive čistých leucovorinových isomerů pro přípravu léčiv pro restauraci účinnosti methotrexatu při léčení kolorektální rakoviny v kombinaci s 5-fluoruracilem, jakož i pro léčení folátové nedostatečnosti. V patentovém spisu US 4,500,711 Wisowaty a kol. popisují čištění leucovorinu a jeho solí.
Leucovorin se normálně podává ve formě solí, například ve formě solí odvozených od alkalických kovů a od kovů alkalických zemin, zejména například ve formě vápenaté soli leucovorinu, přičemž v tomto ohledu je výhodným isonerem 1-isomer.
Pentahydrát vápenaté soli /1:1/ kyseliny N-///2-amino-5formyl-3,4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxo-6-pteridinyl/methyl/amino/~ benzoyl/-L-glutamové /Leucovorin Calcium USP/ je komerčně dostupný jako vápenatá sůl směsi 1:1 sloučenin vzorců la a Ib, vykazujících steroisomerii na uhlíku C-6.
(Ib)
-1CZ 279998 B6
Uvedená sloučenina se hlavně používá jako antidotum pro antagonisty kyseliny listové, jako methotrexat, které blokuje konverzi kyseliny dihydrolistové na kyselinu tetrahydrolistovou. Leucovorinové soli se formulují ve vodě pro injekce společně s vhodnými stabilizačními prostředky, jak je to popsáno v Physician's Desk Reference, 43. vydáni, Medical Economics Company, Oradell, NJ 1989, str. 1124.
Farmakokinetické chování obou isomerů se liší tím, že /S/-isomer /vzorec lb/ je selektivně absorbován gastrointestinálním traktem a má v plasmě kratší poločas než /R/-isomer /vzorce la/.
Přírodně se vyskytující isomer lb, který je 6S-diastereisomerem, byl popsán /C. Temple, Jr., J. P. Rose, W. R. Laster a J. A. Montgomery, Cancer Treatment Reports, 65, 1117 až 1119 /1981// jako důležité terapeuticky účinná látka vzhledem k jeho účinnosti při restauraci jednouhlíkového metabolismu /one-carbon metabolism/.
Sdělení /R. P. Leary, Y. Gaumont a R.' L. Kisliuk, Biochem. and Biophys. Res. Commun., 56, 484 až 488 /1974// uvádějící, že thymidylátová syntéza z L. casei je inhibována nepřírodním diasteroisomerem 5,10-methylentetrahydrofolátu a sdělení /V. F. Scott a K. 0. Donaldson, Biochem. and Biophys. Res. Commun., 14, 523 až 526 /1964//, že 5,10-methylentetrahydrofolát-dehydrogenáza z E. coli je také inhibována stejným diasteroisomerem, v souvislosti s pozorováním /G. K. Smith, P. A. Benkovic a S. J. Benkovic, Biochem. , 2.0, 4034 až 4036 /1981//, že stejný 10-formyltetrahydrofolát je potentním kompetitivním inhibitorem glycinamidribonukleotidformyl-transferázy /GAR/ z kuřecích jater, ukazuje na inhibici jak pyrimidinové, tak i purinové biosyntézy a tedy i na inhibici biosyntézy DNA nepřírodními diastereoisomery jednouhlíkových derivátů tetrahydrofolátu. Vzhledem k tomu nemohou být nepřírodní formy uvedených diastereoisomerů považovány za biologicky inertní. Jestliže k uvedené inhibici dochází v systému savců, potom zde existuje potenciální klinická poptávka po přírodní formě /6S/-isomeru tetrahydrofolátů, zejména leukovorinu.
Diastereoisomerní složky vzorců la a lb byly odděleny /D. B. Cosulich, J. M. Smith, Jr. a Η. P. Proglist, J. Am. Chem. Soc., 74, 4215 /1953// frakční krystalizací a chromatografíčky /J. Feeney, B. Birdsall, J. P. Albrand, G. C. K. Roberts, A. S. Bungen, P. A. Charlton a D. W. Young, Biochem., 20, 1837 /1981//. Stereospecifické redukce dihydrofolátu katalyzovaná dihydrofolát-reduktátou byla popsána (L. Rees, E. Valente, C. J. Suckling a H. C. S. Wood, Tetrahedron, 42., 117 /1986// za účelem získání /6S/-isomeru stereospecifickým způsobem.
Sdělení L. Rees-e, E. Valente-ho, C. J. Suckling-a a H. C. S. Wood, Tetrahedron, 42., 117 až 136 /1986/ popisuje syntézu chirálních derivátů tetrahydrofolátu, včetně leucovorinu. Tento systém vyžaduje použití dihydrofolát-reduktázy z E. coli a rozsáhlé a nákladné recyklování redukujícího kofaktoru NADPH. Jiné sdělení L. Rees-e, C. J. Suckling-a a H. C. S. Wood-a, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470 /1987/ /evropská patentová přihláška 0 266 042 A2/ popisuje acylaci 6/R,S/-tetrahydrofolátu /-/-raenthylchloromravenčanem za vzniku N-5 derivátů ve formě diastereoisomerní směsi, která se rozdělí frakčním srážením. Následné
-2CZ 279998 B6 zpracování každého z isomerů kyselinou mravenčí a bromovodíkem v kyselině octové a následující hydrolýza poskytne oba diastereoisomery 5-formyltetrahydrofolátu.
Podstata vynálezu
Nyní bylo nově nalezeno, že opticky čisté diastereoisomery tetrahydrofolátových sloučenin mohou být snadněji získány způsobem podle vynálezu.
Předmětem vynálezu je způsob přípravy opticky čistého (6R nebo 6S)-diastereoisomeru derivátu kyseliny 5,6(R nebo S),7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje enzymatickou formylaci tetrahydrof olát-formylázou 6S-formy 6R- a 6S-diastereoisomerů kyseliny tetrahydrolistové nebo substituované kyseliny tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku směsi obsahující kyselinu 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester, popřípadě nezreagovanou kyselinu 5,6S,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester a nezreagovanou kyselinu 5,6R,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester a
a) bud oddělení kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové, nebo její soli nebo jejího esteru od kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a potom cyklizaci a hydrolýzu uvedené kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku kyseliny 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetralistové nebo kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo jejich solí nebo jejich esterů nebo obou předcházejících kyselin nebo jejich solí nebo jejich esterů, nebo
b) cyklizaci a hydrolýzou uvedené kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku kyseliny 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo kyseliny
5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo jejich solí nebo jejich esterů nebo obou předcházejících kyselin nebo jejich solí nebo jejich esterů v přítomnosti kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a potom
i) buď derivatizaci kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové, nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku 5-substituované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a potom separaci složek, nebo alternativně ii) separaci každé kyseliny 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové a každé kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo jejich solí nebo jejich esterů od kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a po separaci popřípadě
c) chemickou formylaci, cyklizaci a hydrolýzu uvedené nezreagované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku kyseliny 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru nebo alternativně derivatizaci kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru s jinými funkčními skupinami za vzniku 5-substituované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a popřípadě
d) konverzi opticky čisté kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru nebo kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru na odpovídající kyselinu, sůl nebo ester.
Chemická formylace nezreagované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové se výhodně provádí kyselinou mravenčí v přítomnosti karbodiimidu.
Konverzní stupeň d) výhodně zahrnuje konverzi kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo kyseliny 5-formyl-5,6R,-
7,8-tetrahydrolistové na sůl, výhodně vápenatou, hořečnatou, strontnatou sůl nebo/a sůl železa.
Podstatnou výhodou způsobu podle vynálezu oproti dříve publikovaným nebo patentovým postupům je to, že je překvapivě jednoduchý, protože klíčový stupeň vyžaduje použití pouze jediného enzymu a to tetrahydrofolát-formilázy, který je jinak také nazýván formiát-aktivující enzym nebo formyltetrahydrofolát-syntetáza (FTHFS) a který aduje požadovanou formylovou skupinu pouze na 6S-diastereoisomer v případě, že se použije racemická směs kyseliny 5,6(R,S),7,8-tetrahydrolistové (IIa,b). Kromě toho má použití tohoto enzymu oproti použití dihydrofolát-reduktázy zjevnou výhodou, spočívající v tom, že v tomto případě není nutné realizovat náročný regenerační systém kofaktorů.
Tetrahydrofolát-formyláza může být produkována mikroorganismy Micrococcus aerogenes, Clostridium cylindrosporum, Clostridium acidi-urici, Clostridium thermoaceticum a jinými mikroorganismy, rostlinami a živočichy (D. H. Butlaire, Methods in Enzymology, 66, 585 až 599 (1980).
Použitím radioaktivně značeného mravenčanu amonného nebo jiné, popřípadě in sítu připravené, soli radioaktivně značené kyseliny mravenčí nebo některého z jejích derivátů při enzymatické formylaci může být získán značený produkt vzorce IVb nebo značený produkt vzorce lb. Pomocí enzymu 5,10-methylentetrahydrofolátdehydrogenázy může být každý z radioaktivně značených 5,6S,7,8-tetrahydrofolátů (lb, Illb nebo IVb) nesoucích formylovou skupinu, výhodné radioaktivně značený 5,6S,7,8-tetrahydrofolát vzorce lb, převeden na radioaktivně značenou kyselinu 5,10-methylen-5,6S, 7 ,8-tetrahydrolistovou, která může být zase působením enzymu
5,10-methylentetrahydrofolát-reduktázy převedena na radioaktivně značenou 5-methyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou kyselinu. Radioaktivně značený produkt vzorce lb, připravený takto způsobem podle vynálezu, je užitečnou sloučeninou pro přípravu radioaktivně značených derivátů kyseliny 5,6S,7,8-tetrahydrolistové.
Způsob podle vynálezu tedy neočekávatelně umožňuje izolaci kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové vzorce Ha, která není formylovaná enzymem. Izolovaný produkt vzorce Ha může být prodáván jako takový (komercializovaný jako vzácná chemikálie) nebo může sloužit jako výchozí produkt pro přípravu například kyseliny 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové vzorce la způsobem, který je analogický se způsobem popsaným R. G. Moran-em a P.D. Colman-em v Anal. Biochem. 122, 70 až 78 (1982), za použití kyseliny mravenčí v přítomnosti nebo v nepřítomnosti ve vodě rozpustného karbodiimidu, a sice l-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)karbodiimidu.
-4CZ 279998 B6
S výhodou se však izolace provádí až tehdy (rozumí se izolace produktu Ha), kdy byla ukončena konverze produktu Illb na produkt IVb a/nebo produkt Ib. To umožňuje snadnější separaci složek například chromatografií s reverzní fází. Produkt Ha tedy může být modifikován v přítomnosti produktu IVb a/nebo Ib, protože poloha produktu Ha je ještě reaktivní, zatímco tato poloha produktu IVb nebo Ib již reaktivní není, za vzniku některého derivátu produktu Ha, například kyseliny 5-karboxymenthyl-5,6R, 7,8-tetrahydrolistové, která může být oddělena od produktu IVb nebo produktu Ib v jediném adsorpčním stupni.
Separovaný produkt Ha muže být dále podroben reakci, jak je to popsáno C. Temple-m, Jr. , L. L. Benett-em, Jr. , J. D. Rose-m, R. D. Elliott-em, J. A. Montgomery-m a J. H. Mangum-em v J. Med. Chem., 25, 161 až 166 (1982), za účelem přípravy různých derivátů 5- a 10-substituované, 5,10-disubstituované a 5,10-můstkem-substituované kyseliny 5,6R, 7,8-tetrahydrolistové. Například 5-methyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolát může být syntetizován z produktu Ha reakcí s formaldehydem a borohydridem sodným při zásaditých podmínkách metodou, popsanou J. A. Blair-em a K. J. Saunders-em v Anal. Biochem., 34, 376 (1970). Alkylace produktu Ha dimethylsulfátem v Ν,Ν-dimethylacetamidu při teplotě 55 °C se provádí za použití metody, popsané v japonském patentu 73 32, 120 (1973) a v Chem. Abst., 80, 2792X (1974).
Nahrazením kyseliny mravenčí nebo alkylačních činidel při shora uvedených reakcích radioaktivně značenou kyselinou mravenčí nebo jejími deriváty nebo radioaktivními alkylačními činidly může být získán některý z radioaktivně značených derivátů kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové.
Při způsobu podle vynálezu mohou být jak radioaktivně značené deriváty kyseliny 5,6S,7,8-tetrahydrolistové, tak i radioaktivně značené deriváty kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové a jejich soli produkovány separátně, přičemž tyto deriváty jsou užitečnými sloučeninami použitelnými například pro studium enzymatických mechanismů.
Produkty připravené způsobem podle vynálezu jsou hodnotnými produkty sami o sobě, například v terapii nebo jsou použitelné jako meziprodukty pro přípravu dalších hodnotných produktů, přičemž v případě, že se tyto produkty získají v radioaktivně značené formě, potom mohou být použity například pro studium enzymatických mechanismů. Odborníkům v těchto oborech bude zřejmé, jak tyto sloučeniny použít pro uvedené účely.
Způsob podle vynálezu se s výhodou používá pro přípravu požadované v podstatě čisté kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru. Tyto sloučeniny mají hodnotné vlastnosti jako terapeuticky účinné látky. Způsob podle vynálezu je také vhodný pro přípravu požadovaného v podstatě čistého (6R nebo 6S)-diastereoisomeru derivátu popřípadě radioaktivně značené kyseliny tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru. Tyto sloučeniny mohou být použity pro studium enzymatických mechanismů.
Výchozí sloučeniny použité při způsobu podle vynálezu mohou být připraveny technikami, které jsou velmi dobře známé v oboru
-5CZ 279998 B6 biochemických transformací. Směs produktů vzorců Ila(R) a Ilb(S) může být připravena redukcí kyseliny listové borohydridem sodným za použití postupu, popsaného C. Temple-m, Jr., R.D-Elliott-em, J. D. Rose-m a J. A. Montgomery-m v J. Med. Chem., 22, 731 (1979).
Jestliže se vychází z těchto výchozích produktů, potom způsob podle vynálezu probíhá podle následujícího reakčního schéma 1:
Reakční schéma 1
(Ha)
FTHFS v
(lllb) v
co2h /
/
Č-NH-C—H (CH2)2CO2H
IVb >· lb
-6CZ 279998 B6
Z následujícího reakčního schéma 2 je zřejmé, že produkt Ha, který může být od produktu Illb oddělen chromatograficky, se formyluje kyselinou mravenčí za vzniku imidazoliniové soli IVa, která se po krystalizaci hydrolyzuje za vzniku čistého nepřírodního isomerů leucovorinu Ia. Alternativně muže být ve směsi produktů Illb a Ha produkt Illb konvertován na produkt IVb a/nebo Ib, čímž se získá směs produktů IVb a/nebo Ib a Ha. Produkt Ha se snadno oddělí od produktu IVb a/nebo Ib chromatograficky.
Izolační postup tedy ve skutečnosti tvoří separace 6Ra 6S-diastereoisomerů kyseliny tetrahydrolistové. Protože produkt Ha může být chemicky převeden na produkt Ia, představuje vynález vlastně způsob pro účinnou separaci produktu Ib od produktu Ia, které jsou běžněji označovány jako přírodní nebo nepřírodní forma leucovorinu.
Reakční schéma 2
Ba
(CH2)2CO2H co2h / f
Ia
II
C-NhFC—H
-7CZ 279998 B6
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn konkrétními příklady provedení, které však mají pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezu, daný definicí předmětu vynálezu, nikterak neomezují.
Postup A
Při tomto postupu se provede izolace a kultivace mikroorganismu Clostridium cylindrosporum /tento mikroorganismus je také označován jako Clostridium sp. ATCC č. 7905/.
Vzhledem k tomu, že mikroorganismus Clostridium je anaerobním mikroorganismem, provádí se veškerá produkce kultury a její udržování, jakož i všechny manipulační operace s touto kulturou za podmínek, které omezují na možné minimum vystavení kmene mikroorganismu účinku kyslíku. Také s ohledem na extrémní labilitu tetrahydrofolátu a jeho derivátů v prostředí s obsahem kyslíku, provádí se všechny postupy týkající se těchto sloučenin v nepřítomnosti kyslíku. Pro tyto účely se používá plastiková anaerobní buňka napojená na zdroj dusíku prostého kyslíku.
1/ Příprava kultivačního prostřední na bázi kyseliny močové
Kultivační prostředí na bázi kyseliny močové se připraví postupem popsaným v ATCC Media Handbook-Recipe No. 519:
Složení kultivačního prostředí na bázi kyseliny močové:
Kyselina močová 3,0g
Kvasničný extrakt 1,0g
Sekundární fosforečnan draselný 4,0g
Heptahydrát síranu hořečnatého 0,1g
Síran železnatý 5,0mg +0,04% roztok fenolové červeně 1,0g
Thioglykolát sodný 0,5g
Destilovaná voda 1,01 +/ na 0,1 g indikátoru je zapotřebí 14,9 ml 0,01N roztoku hydroxidu sodného; zředěním na 250 ml destilovanou vodou se získá 0,04% roztok.
Při přípravě kultivačního média se kyselina močová suspenduje téměř v celém objemu kapaliny zahřívané k varu, přičemž se udržuje stálé růžové zbarvení fenolové červeně /pH 7,6/ hydroxidem sodným. Hodnota pH se kontroluje lakmusovým papírkem. Za účelem ztužení kultivačního prostředí se potom přidá 20,0 g agaru.
Takto připravené kultivační prostředí se potom nalije do baňky se šroubovým uzávěrem, a to tak, aby kultivační prostředí vyplňovalo téměř celý objem baňky, potom se baňka propláchne dusíkem prostým kyslíku. Bezprostředné po uložení do autoklávu se uzávěr baňky pevně zašroubuje a baňka se tak těsně uzavře. Kultivační prostředí se skladuje při pokojové teplotě, aby se zabránilo vysrážení kyseliny močové při nižších teplotách.
-8CZ 279998 B6
2/ Naočkování kultivačního prostředí kulturou Clostridium cylindrosporum
Všechny operace se provádí za anaerobních podmínek v boxu s manipulačními plastickými rukavicemi. 1,0 ml podíl kapalného kultivačního prostředí na bázi kyseliny močové se přidá k lyofilizované peletě bakterií získané z uvedeného kmene ATCC. Peleta se rozpustí a získaná kapalina se pomocí sterilního inokulačního očka v pruzích nanese na desky kultivačního prostředí na bázi kyseliny močové. Tyto desky jsou umístěny v anaerobním boxu pod atmosférou H9-C09 společně s indikátorovým proužkem methylenové modři.
Box s obsahem naočkovaných desek se potom inkubuje při teplotě 37 °C. Po 24 hodinách lze nárůst kultury na deskách pozorovat jako světlé, transparentní prstovité výběžky směřující z kolonií. Vzorek reprezentativní kolonie pozorovaný pod fázově-kontrastním mikroskopem dává spatřit typickou buněčnou morfologii a tvorbu spor mikroorganismu Clostridium.
3/ Příprava stálé zásoby kultury Clostridium cylindrosporum
Desky kultivačního prostředí na bázi kyseliny močové se připraví v Hungateových zkumavkách /Bellco Glass Co./, přičemž je v každé zkumavce obsaženo 10 ml kultivačního prostředí a tyto zkumavky potom slouží jako permanentní zásoba kultury Clostridium cylindrosporum. Sterilním inokulačním očkem se ze shora popsané kolonie odejme jediný svazek buněk a tento svazek se přenese na desku kultivačního prostředí v Hungateově zkumavce. Tento postup se provádí v anaerobním boxu pod atmosférou dusíku. Zkumavky se potom umístí do anaerobní schránky a inkubují se při teplotě 35 °C. Po pěti dnech se zkumavky vyjmou z uvedené anaerobní schránky a jejich uzávěry se utěsní parafínem. Takto utěsněné zkumavky se -potom skladují při pokojové teplotě až do okamžiku dalšího použití.
4/ Příprava inokula v kapalném kultivačním prostředí
Zkumavky s polo-pevným kultivačním prostředím na bázi kyseliny močové /2,5 g/1 baktoagaru/ se naočkují koloniemi mikroorganismu Clostridium cylindrosporum, inkubují při teplotě 35 °C a skladují při pokojové teplotě, jak bylo uvedeno shora. Tyto kultury slouží jako zdroj inokula pro kapalné kultivační prostředí a kultivací v tomto prostředí popsanou v následující části.
5/ Kultivace v kapalném kultivačním prostředí mikroorganismu Clostridium cylindrosporum
Jedna kultura na desce měkkého agaru /celkem 10 ml/ se přidá k jednomu litru kapalného kultivačního prostředí na bázi kyseliny močové. Všechny operace se provádí v anaerobním boxu a kultura se inkubuje v anaerobní schránce po dobu 4 dnů při teplotě 35 °C.
Postup B
Při tomto postupu se provede příprava surového extraktu kultury Clostridium cylindrosporum obsahujícího formylterahydrofolát-syntetázu.
-9CZ 279998 B6
Stejně jako při postupu A se všechny operace související s produkcí kultury, s jejím udržováním a s její manipulací, se provádí za podmínek zajišťujících minimálně možnou expozici kultury kyslíkem vzhledem k tomu, že mikroorganismus Clostridium je anaerobním mikroorganismem. Také s ohledem na extrémní labilitu tetrahydrofolátu a jeho derivátu v prostředí obsahujícím kyslík se všechny operace týkající se těchto sloučenin provádí v nepřítomnosti kyslíku. K tomuto účelu je použit plastikový anaerobní box připojený ke zdroji dusíku prostého kyslíku.
Jednolitrová kultura je zakalená a na dně se usadily částice vyloučeného materiálu. Tato kultura se rozdělí na čtyři 250 ml alikvoty, které se nalijí do čtyřech 250 ml centrifugačních kyvet. Kultura se potom odstředí při 8 000 otáčkách za minutu a teplotě 4 °C v odstředivce typu Beckman J2-21.
I když je kultivační prostředí ochlazeno na teplotu 4 °C, nedochází k vyloučení kyseliny močové, což je způsobeno její konzumací bakteriemi. Získané buněčné pelety se potom opětovně suspendují ve 4 x 25 ml ledově chladné destilované vody a znovu se odstředí za shora uvedených podmínek. Získané pelety se před testováním na formyltetrahydrofolát-syntetázu zmrazí při teplotě -20 °C po dobu 5 dnů.
Zmražené pelety se potom rozmrazí v celkovém objemu 4 ml pufru /0,05 M sekundární fosforečnan draselný, 0,05 M 2-merkaptoethanol /pH 7,5 přídavkem 1 M hydroxidu draselného/. Pelety se smísí a nechají rozpustit občasným rozvířením při teplotě okolí po dobu 60 minut. Lze pozorovat zhoustnutí buněčných pelet v důsledku buněčné lyže. Autolyze probíhá při pokojové teplotě. Buněčný lysát se potom odstředí při 17 000 otáčkách za minutu po dobu 3 0 minut a supernatant se přechovává na ledu a testuje na formyltetrahydrofolát-syntetázu.
Postup C
Testování na formyltetrahydrofolát-systetázu se provádí metodou popsanou v Purification and Properties of Formyltetrahydrofolate Synthetase, Enzymology, sv. 66, str. 585, 1980/.
Příklad 1
Redukce kyseliny listové na kyselinu 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrolistovou známou metodou /C. Temple, Jr., R. D. Elliott, J. D. Rose a J. A. Montgomery, J. Med. Chem. 22 , 731 /1979// za použití borohydridu sodného.
Příklad 2
Příprava kyseliny lO-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové
Připraví se směs vhodná pro enzymatickou formylaci kyseliny
5,6S,7,8-tetrahydrolistové za účelem přípravy kyseliny 10-formyl-5,6S,7, 8-tetrahydrolistové, přičemž tato směs obsahuje:
-10CZ 279998 B6
100 ml
100 ml
100 ml
100 ml
200 ml
1,0 M triethanolaminhydrochloridu /pH 8,0/,
0,5 M adenosintrifosfátu /pH 8,0/,
0,5 M chloridu draselného,
0,1 M hexahydrátu chloridu horečnatého a
0,2 M mravenčanu amonného /pH 8,0/.
Obsah celé 5 g lékovky s kyselinou 5,6/R,S/,7,8-tetrahydro~ listovou /Sigma; 69% čistota; šarže č. 117F-5013/ se suspenduje ve 200 ml 0,2 M Tris-HCl/0,05 M 2-merkaptoethanolu /pH 7,0/ a rozpustí přídavkem přibližně 15 ml 1M hydroxidu draselného. Čirý roztok se nalije do shora popsaným způsobem připravené směsi, potom se přidá destilovaná voda /asi 200 ml/ k získání celkového objemu reakční směsi 1 litru ve dvoulitrové skleněné baňce.
Reakce se zahájí přidáním 4 ml surového enzymového extraktu obsahujícího formyltetrahydrofolát-syntetázu /FTHFS/ při pokojové teplotě /22 °C/. Za účelem monitorování reakce, respektive jejího průběhu se z reakční směsi periodicky odebírají vzorky, které se analyzují vysokotlakou sloupcovou chromatografií za použití sloupce s reverzní fází /C-18/, který se eluuje 0,1 M kyselinou mravenčí modifikovanou methanolem v lineárním gradientu z 12 na 25 procent procent v průběhu 30 minut. Eluát se monitoruje vlnovou délkou 282 nm, přičemž kyselina 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrolistová se detekuje po 12 minutách eluce, zatímco kyseliny 5,10-methenyltetrahydrolistová se detekuje po 16 minutách eluce. Reakce je ukončena po 18 hodinách. V tomto okamžiku zbývá 48 % z původního množství kyseliny 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrolistové, což bylo stanoveno z ploch nacházejících se pod křivkou. Z vysokotlakého chromatogramu reprezentujícího 5,10-methenyltetrahydrofolát byl vypočten ekvivalent 1 585 mg kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové z reakční směsi. To ukazuje na skutečnost, že došlo k 92% konverzi vzhledem k teorii, bere-li se v úvahu, že z enzymatické reakční směsi lze získat pouze 1 725 mg z původního množství 3 450 mg kyseliny 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrolistové. Po pěti hodinách bylo konvertováno padesát procent.
Příklad 3
Konverze kyseliny lO-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové na kyselinu 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou
Reakční směs z příkladu 2 byla shora uvedeným způsobem monitorována ještě jeden den, přičemž nebyla detekována změna jejího složení. 100 ml podíl této reakční směsi se potom převede do tříhrdlé baňky a pH roztoku se nastaví na hodnotu 6,5 kyselinou sírovou. Za odplyňování dusíkem se baňka ponoří do vodní lázně a zahřívá na teplotu 90 až 95 °C po dobu dvou hodin. V reakci se potom pokračuje pod atmosférou dusíku přes noc při teplotě 40 °C.
Tato reakční směs má po 16 hodinách hnědé zbarvení. Vzorek reakční směsi se analyzuje vysokotlakou chromatografií za použití sloupce s reverzní fází /C-18/, který se eluuje kyselinou mravenči modifikovanou lineárním gradientem methanolu z 12 na 25 % v průběhu 30 minut. Eluát ze sloupce se monitoruje při vlnové délce 282 nm. Analýza vysokotlakou sloupcovou chromatografií prokazuje stupeň konverze 90,2 procenta, berou-li se v úvahu plochy pod křivkou pro píky odpovídající 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahy-11CZ 279998 B6 drofolátu a kyselině 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové. Plocha odpovídající kyselině 5,6R,7,8-tetrahydrolistové, která by měla zůstat nezměněna, je zmenšena na 33,1 procenta vzhledem k ploše výchozího materiálu /48 procent/.
Vzorky reakční směsi se potom čerpadlem zavádí na preparativní sloupec s reverzní fází vysokotlaké sloupcové chromatografie /Dynamax 60A-C-18/, 8 mikrometrů, 2,1 x 30 cm/, potom se sloupec eluuje gradientem 0,1 M vodného roztoku kyseliny mravenčí a methanolu při průtokové rychlosti 13 ml/minutu v průběhu 60 minut. Získá se nažloutlá kyselina 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová v celkovém výtěžku 82 %, která se za kyselých elučních podmínek konvertuje na kyselinu 5,lO-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou, která po odstavení v jímací lékovce při koncentraci 3 až 6 mg/1 tvoří gel. Enantiomerní čistota tohoto vzorku byla stanovena vysokotlakou sloupcovou chromatografií za použití chirálního sloupce /Diacel Chiracel OD/ a isokratické eluce 0,5 = mravenčanu amonného, pH = 3,8, a 25 % methanolu. Byla stanovena retenční doba 15,2 minuty a optická stáčivost v kyselině mravenčí:
Koncentrace /%/ Stáčivost /88% roztok ky- /alfa D při 26 °C/ Sloučenina seliny mravenčí/
Kyselina 5,10-methényl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová 0,611 +42
Příklad 4
Konverze kyseliny 5,lO-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové na kyselinu 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou a kyselinu 5,6R,7,8-tetrahvdrolistovou
Hodnota pH zbytku reakční směsi získané v příkladu 2 se nastaví na hodnotu 8,0 až 5,0 kyselinou sírovou, což iniciuje rychlou cyklizaci kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové na kyselinu 5,lO-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou, která potom po stání, respektive v průběhu stání při pokojové teplotě pomalu hydrolyzuje za vzniku kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové. Tato posledně uvedená kyselina nebyla v reakční směsi detekována před nastavením pH.
Průběh reakce se sleduje vysokotlakovou sloupcovou chromátografií za použití sloupce s reverzní fází /C-18/, který se eluuje 0,1 M roztokem kyseliny mravenčí modifikované methanolem v lineárním gradientu od 12 do 25 procent v průběhu 30 minut. Monitorování reakce vysokotlakovou sloupcovou chromatografií ukazuje, že více než 70 procent z původního množství kyseliny 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové bylo konvertováno na kyselinu 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou po pěti dnech při pokojové teplotě, přičemž v průběhu této doby zůstala koncentrace kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové v reakční směsi nezměněna.
Formylované produkty, získané jako kyselina 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová a kyselina 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová , a neformylovaná kyselina 5,6R,7,8-tetrahydrolistová
-12CZ 279998 B6 se potom izolují preparativní vysokotlakou chromatografií na sloupci s reverzní fází /Dynamax 60A-C18, 8 mikrometrů, 2,1 x 30 cm/, který se eluuje gradientem 0,1 M vodného roztoku kyseliny mravenčí a methanolu při průtokové rychlosti 13 ml/minutu v průběhu 60 minut. Stanovené výtěžky dvou příprav /každá je ekvivalentní 50 ml reakční směsi/ jsou následující:
| Izolovaná sloučenina /mg/ | Výtěžek /%/ | Rel. výtěžek |
| Kyselina 5,10-methenyl-5,6S, 7,8-tetrahydrolistová /22,6/ | 12,9 | 6,5 |
| Kyselina 5-formyl-5,6S,- 7,8-tetrahydrolistová /118,2/ | 67,5 | 33,8 |
| Kyselina 5,6R,7,8-tetrahydrolistová+/145,5/ | 83,1 | 41,6 |
+/ Izolovaná kyselina 5,6R, 7,8-tetrahydrolistová se bezprostředně vysuší a formyluje kyselinou mravenčí /jak je to popsáno níže/ za vzniku kyseliny 5, lO-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové, která na rozdíl od 6S-formy krystalizuje ze zředěné kyseliny mravenčí.
Příklad 5
Formylace kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové za vzniku krystalické kyseliny 5,lO-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové
253 mg vzorek chromatografíčky vyčištěné a lyofilizované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové se rozpustí v 50 ml 97% kyseliny mravenčí obsahující 2 procenta kyseliny trifluoroctové a ponechané při okolní teplotě v reakční bance pod atmosférou dusíku a bez míchání. Průběh reakce se analyzuje vysokotlakou sloupcovou chromatografií za použití sloupce s reverzní fází /C-18/, který se eluuje 0,1 M vodným roztokem kyseliny mravenči, modifikovaným methanolem v lineárním gradientu od 12 do 25 procent v průběhu 30 minut, přičemž eluát se monitoruje vlnovou délkou 282 nm.
Po třech hodinách zreagovala veškerá kyselina 5,6R,-7,8-tetrahydrolistová, což je zřejmé z detekce nového píku na vysokotlakém sloupcovém chromatogramu, který reprezentuje kyselinu
5,lO-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistovou. Zbytek kyseliny mravenčí se potom odstraní odpařením, potom se pomalu za občasného rozmíchání reakční směsi přidá 30 ml 0,1 M roztoku kyseliny mravenčí. Roztok se potom odstaví přes noc do chladničky. Vyloučí se drobounké žluté jehličky dávající roztoku vzhled pevného produktu. Krystalky se potom izolují ve filtrační nálevce se skleněnou fritou, promyjí acetonem a vysuší za vakua. Získá se žlutý krystalický materiál ve výtěžku 218 mg.
Enantiomerní čistota krystalické kyseliny 5,10-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové se stanoví za použití chirálního sloupce /Diacel Chiracel OD/, který se isokraticky eluuje 0,5 %
-13CZ 279998 B6 mravenčanem amonným, pH 3,8 a 25 % methanolu. Požadovaný produkt, tj. kyselina 5,10-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistová, opouští chromatografický sloupec po 18,2 minuty.
Produkt má následující optickou stáčivost, stanovenou v 88% kyselině mravenčí:
Koncentrace /%/ /88% roztok ky- Stáčivost
Sloučenina seliny mravenčí/ /alfa D při 26 °C/
Kyselina 5,10-methenyl-5,6R,7,8tetrahydrolistová 0,619 -47
Příklad 6
Derivatizace kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové v přítomnosti kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové a/nebo kyseliny
5,lO-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové
Za použití modifikace postupu, popsaného L. Rees-em, C. J. Suckling-em a H. C. S. Wood-em v J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470 /1987/ se ke vzorku reakční směsi z příkladu 4, jehož pH je nastaveno na hodnotu 7, přidá /-/methylchloroformiát, což má za následek karboxymethylaci pouze kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové, přičemž kyselina 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová a/nebo kyselina 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová zůstávají nezreagované.
Účinné oddělení kyseliny 5-methyloxykarbonyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové od nezreagovaných složek se provede zavedením reakční směsi na sloupec pryskyřice XAD-2. Tato pryskyřice absorbuje pouze kyselinu 5-menthyloxykarbonyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistovou, zatímco kyselina 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová nebo kyselina 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová projdou sloupcem pryskyřice nezachyceny.
Příklad 7
Čištění kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové, kyseliny 5,6R,7,8-tetrahvdrolistové a ostatních derivátů preparativní vysokotlakou sloupcovou chromatografií
Části /50 nebo 100 ml/ reakční směsi z příkladu 4 se čerpadlem zavádí přímo na sloupec s reverzní fází /Dynamax 60A-C18, 8 mikrometrů, 2,1 x 30 cm/, který se eluuje gradientem 0,1 M vodné kyseliny mravenčí a methanolu při průtokové rychlosti 13 ml/minutu v průběhu 60 minut. Použitý gradient má na začátku koncentraci methanolu 5 procent, která po 12 minutách eluce dosáhne hodnoty 10 %. Tato koncentrace 10 procent methanolu se potom udržuje konstantní po dobu dalších 10 minut, potom se /22 minut eluce/ koncentrace methanolu lineárně zvyšuje tak, že po 38 minutách eluce dosáhne 18 procent a od tohoto okamžiku se dále zvyšuje tak, že po 52 minutách eluce dosáhne hodnoty 25 procent. Tato koncentrace se již až do ukončení eluce nezvyšuje. Eluát
-14CZ 279998 B6 opouštějící sloupec se monitoruje při vlnové délce 319 nm, protože 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolát a kyselina 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová mají při této vlnové délce stejný absorpční koeficient.
Za těchto preparativních podmínek dochází k eluci kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové mezi 11 a 17,5 minuty, zatímco k eluci kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové dochází mezi 39,5 a 44,5 minuty. Eluce pásu 5,lO-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolátu je silně koncetračně závislá a objevuje se mezi 20 a 30 minutami ve formě vleklého píku. Pásy kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové a 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolátu nemohou být zcela odděleny v případě, kdy se na sloupec zavede více než 140 ml reakční směsi, což je ekvivalentní 700 mg separovaného materiálu.
Eluční pásy kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové a kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové se jímají do skleněných lahví, které jsou ponořeny do suchého ledu tak, aby docházelo k bezprostřednímu zmražení kapaliny. Zmražené frakce se potom lyofilizují k získání šedohnědého prášku v případě kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové a žluto-bílého prášku v případě kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové. Provede se vysokotlaká chromatografická analýza za použití sloupce s reverzní fází /Dynamax 60A-C18, 8 mikrometru, 2,1 x 30 cm/, eluovaného gradientem 0,1 M vodné kyseliny mravenčí a methanolu. Z odpovídajících ploch pod křivkou byla stanovena čistota kyseliny 5-formyl-5,6S,-
7,8-tetrahydrolistové 97 procent, zatímco pro kyselinu 5,6R,7,8-tetrahydrolistovou byla stanovena čistota 93 procent.
Vzhledem k malé stabilitě kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové se tato kyselina převede chemickou formylací na stabilnější kyselinu 5,10-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistovou. Aby se čelilo nestabilitě kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové, konvertuje se tato sloučenina na její vápenatou sůl, jak je to popsáno v následujícím příkladu 8.
Příklad 8
Příprava 5-formyl-5,6S , 7,8-tetrahydrofolátu vápnatého nebo 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolátu vápenatého
Za použití postupu pro přípravu racemického 5-formyl-5,6/R,S/,7,8-tetrahydrofolátu vápenatého, popsaného C. Temple-m Jr., R. D. Elliott-em, J. D. Rose-m a J. A. Mongomery-m v J. Med. Chem., 22, 731 /1979/, se připravená kyselina 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová promyje etherem za účelem odstranění popřípadě přítomného mravenčanu amonného. Šedesát dva miligramů takto promytého materiálu se potom rozpustí ve 32 ml odplyněného methanolu /kyselina listová prostá soli je v methanolu velmi dobře rozpustná/, ke kterému se přidá asi 1 ml roztoku chloridu vápenatého v methanolu /72 mg chloridu vápenatého na ml methanolu/. Přídavek vápenaté soli způsobí okamžité vyloučení bělavé sraženiny, která se izoluje ve filtrační nálevce se skleněnou fritou a vysuší za vakua. Výtěžek produktu po vysušení činí 60,5 mg /90 % teoretického výtěžku/.
-15CZ 279998 B6
V případě, že se uvedený postup opakuje s 6R-materiály, potom se získá 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolát vápenatý.
Čistota připravených sloučenin se stanoví vysokotlakou sloupcovou chromátografickou analýzou spojenou s ultrafialovou detekcí eluátu, přičemž se zanedbává přítomnost materiálů, neabsorbujících ultrafialové světlo. Enantiomerní čistota se stanoví ve stupni 5,10-methenyl-5,6/R,S/, 7,8-tetrahydrofolátových derivátů vysokotlakou sloupcovou chromatografií za použití chirálního sloupce /Diacel Chiracel OD/ isokraticky eluovaného 0,5% mravenčanem amonným, pH 3,8, s 25 % methanolu. Jako první opouští chromatografický sloupec kyselina 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová /po 15,2 minuty/, zatímco kyselina 5,10 methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistová je eluována po 18,2 minuty.
Pro stanovení optické stáčivosti připravených sloučenin byly použity roztoky těchto sloučenin v kyselině mravenčí a nikoliv v 10 M nebo 12 M kyselině chlorovodíkové, jak je to popsáno v odborné literatuře, protože kyselina mravenčí má nižší kyselost a vyšší rozpouštěcí schopnost pro foláty. Vzorky shora uvedených produktů vykazují následující optickou stáčivost:
Koncentrace /%/ /88% roztok ky- Stáčivost Sloučenina seliny mravenčí/ /alfa D při 26 °C/
Kyselina 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová+ 0,611 +42
Kyselina 5,10-methenyl-5,6R,7,8tetrahydrolistová++ 0,619 -47 +/ Chromatografíčky izolovaná jako kyselina 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistová, která se při stání v eluované směsi 0,1 M kyseliny mravenčí konvertuje na kyselinu 5,10-methenyl-5,6S,-
7,8-tetrahydrolistovou a potom solidifikuje za vzniku gelu, který byl lyofilizován;
++/původně izolovaná jako nekonvertovaná kyselina 5,6R,7,8-tetrahydrolistová, která byla po lyofilizaci bezprostředně formylována kyselinou mravenčí způsobem, který byl popsán shora; rezultující kyselina 5,10-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistová, která vykrystalizuje ze směsi zředěné kyseliny mravenči, se izoluje, promyje acetonem a vysuší za vakua. Z 253 mg kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové se získá 218 mg krystalické kyseliny 5,10-methenyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové.
Příklad 9
Příprava radioaktivně značené kyseliny formyllistové a jejích derivátů
V případě, že se opakuje postup podle příkladu 2 s tím, že se mravenčan amonný nahradí radioaktivně značeným mravenčanem amonným nebo jiným radioaktivně značeným derivátem kyseliny mravenčí, potom se získá radioaktivně značená kyselina 10-formyl-5,-16CZ 279998 B6
6S,7,8-tetrahydrolistová. Jestliže se tato kyselina zpracuje postupy podle přikladu 3 až 8, potom mohou být získány odpovídající radioaktivně značené kyseliny a soli.
Shora uvedený detailní popis způsobu podle vynálezu nabízí odborníkům v tomto oboru mnoho zřejmých variací tohoto způsobu. Tak například místo přípravy vápenaté soli leucovorinu může být připravena strontnatá nebo sodná sůl leucovorinu. Tetrahydrofolát-formyláza může být produkována mikroorganismem Clostridium acidi-urici. Je samozřejmé, že všechny tyto variace také spadají do rozsahu vynálezu.
Claims (3)
1. Způsob přípravy opticky čistého (6R nebo 6S)-diastereoisomeru derivátu kyseliny 5,6(R nebo S),7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru, vyznačený tím, že zahrnuje enzymatickou formylaci tetrahydrofolát-formylázou 6S-formy 6R- a 6S-diastereoisomerů kyseliny tetrahydrolistové nebo substituované kyseliny tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku směsi obsahující kyselinu 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester, popřípadě nezreagovanou kyselinu 5,6S,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester a nezreagovanou kyselinu 5,6R,7,8-tetrahydrolistovou nebo její sůl nebo její ester a
a) bud oddělení kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové , nebo její soli nebo jejího esteru od kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a potom cyklizaci a hydrolýzu uvedené kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku kyseliny 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetralistové nebo kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo jejich solí nebo jejich esterů nebo obou předcházejících kyselin nebo jejich solí nebo jejich esterů, nebo
b) cyklizaci a hydrolýzu uvedené kyseliny 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku kyseliny 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo jejich solí nebo jejich esterů nebo obou předcházejících kyselin nebo jejich solí nebo jejich esterů v přítomnosti kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a potom
i) bud derivatizaci kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku 5-substituované kyseliny 5, 6R, 7, 8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a potom separaci složek nebo alternativně ii) separaci každé kyseliny 5,10-methenyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové a každé kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo jejích soli nebo jejich esterů od kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a po separaci popřípadě
c) chemickou formylaci, cyklizaci a hydrolýzu uvedené nezreagované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru za vzniku kyseliny 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru nebo alternativně derivatizaci kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru s jinými funkčními skupinami za vzniku 5-substituované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru a popřípadě
d) konverzi opticky čisté kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru nebo kyseliny 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové nebo její soli nebo jejího esteru na odpovídající kyselinu, sůl nebo ester.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že chemická formylace nezreagované kyseliny 5,6R,7,8-tetrahydrolistové se provádí kyselinou mravenčí v přítomnosti karbodiimidu.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že kon^verzní stupeň c) zahrnuje konverzi kyseliny 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrolistové nebo kyseliny 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrolistové na sůl, výhodné vápenatou, horečnatou, strontnatou sůl nebo/a sůl železa.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44966289A | 1989-12-11 | 1989-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ610390A3 CZ610390A3 (en) | 1995-06-14 |
| CZ279998B6 true CZ279998B6 (cs) | 1995-09-13 |
Family
ID=23785009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS906103A CZ279998B6 (cs) | 1989-12-11 | 1990-12-07 | Způsob přípravy opticky čistých diastereoisomerů tetrahydrofolátových sloučenin |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334535A (cs) |
| EP (1) | EP0432441B1 (cs) |
| JP (1) | JP3027613B2 (cs) |
| KR (1) | KR0172118B1 (cs) |
| CN (1) | CN1031804C (cs) |
| AR (1) | AR245134A1 (cs) |
| AT (1) | ATE139799T1 (cs) |
| AU (1) | AU641710B2 (cs) |
| CA (1) | CA2031784C (cs) |
| CZ (1) | CZ279998B6 (cs) |
| DE (1) | DE69027585T2 (cs) |
| DK (1) | DK0432441T3 (cs) |
| ES (1) | ES2090075T3 (cs) |
| FI (1) | FI103804B1 (cs) |
| GR (1) | GR3021060T3 (cs) |
| HU (1) | HU209761B (cs) |
| IE (1) | IE904439A1 (cs) |
| IL (1) | IL96265A0 (cs) |
| NO (1) | NO177541C (cs) |
| NZ (1) | NZ236370A (cs) |
| PL (1) | PL166096B1 (cs) |
| PT (1) | PT96120B (cs) |
| SK (1) | SK610390A3 (cs) |
| ZA (1) | ZA909899B (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH681303A5 (cs) * | 1991-01-16 | 1993-02-26 | Eprova Ag | |
| DE4136921A1 (de) * | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Knoll Ag | Verfahren zur trennung von 5-methyl-tetrahydrofolsaeure |
| CH683262A5 (it) * | 1992-01-22 | 1994-02-15 | Applied Pharma Res | Procedimento per la separazione dei diastereomeri del sale di calcio dell'acido (6(R,S)-N-formiltetraidrofolico). |
| IT1254635B (it) * | 1992-02-20 | 1995-09-28 | Bracco Spa | Processo per la separazione degli stereoisomeri dell'acido folinico |
| CH686369A5 (de) * | 1994-05-09 | 1996-03-15 | Eprova Ag | Stabile kristalline (6S)- und (6R)-Tetrahydrofolseure. |
| CH693255A5 (de) * | 1997-06-13 | 2003-05-15 | Eprova Ag | Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels. |
| CH694251A5 (de) * | 1999-07-14 | 2004-10-15 | Eprova Ag | Herstellung von Tetrahydropterin und Derivaten. |
| AU2001259039A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-23 | Edward V Quadros | Radioenzymatic assay for methylenetetrahydrofolate reductase |
| CH696699A5 (de) * | 2006-01-19 | 2007-10-15 | Cerbios Pharma Sa | Verfahren zur regioselektiven N(5) -Formylierung von (6S) -5, 6, 7, 8-Tetrahydropteroinsäure und Derivaten davon. |
| WO2010017526A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | The Scripps Research Institute | Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof |
| US9382251B2 (en) * | 2012-07-27 | 2016-07-05 | Chemic Laboratories Inc. | Compositions comprising folic acid derivatives, their preparations and methods of use |
| CN115656372A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-01-31 | 北京斯利安药业有限公司 | 一种s-四氢叶酸异构体手性分析方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4500711A (en) * | 1977-03-21 | 1985-02-19 | Burroughs Wellcome Co. | Synthesis of leucovorin |
| US4148999A (en) * | 1977-08-22 | 1979-04-10 | The Government Of The United States Of America | Preparation and purification of citrovorum factor |
| GB8621268D0 (en) * | 1986-09-03 | 1986-10-08 | Univ Strathclyde | Separation of substances |
| US4746662A (en) * | 1987-02-20 | 1988-05-24 | American Cyanamid Company | Treatment of arthritis with 3,5-dichloromethotrexate |
| DE3821875C1 (cs) * | 1988-06-29 | 1990-02-15 | Eprova Ag, Forschungsinstitut, Schaffhausen, Ch | |
| FR2643081B1 (fr) * | 1989-02-14 | 1991-06-07 | Panmedica Sa | Folates de magnesium, procede de preparation et compositions pharmaceutiques |
| CH680731A5 (cs) * | 1990-04-12 | 1992-10-30 | Sapec Fine Chemicals | |
| JPH07332120A (ja) * | 1994-06-08 | 1995-12-22 | Sanshin Ind Co Ltd | 多気筒エンジン |
-
1990
- 1990-11-05 DE DE69027585T patent/DE69027585T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DK DK90121120.1T patent/DK0432441T3/da active
- 1990-11-05 ES ES90121120T patent/ES2090075T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90121120A patent/EP0432441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 AT AT90121120T patent/ATE139799T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-06 IL IL96265A patent/IL96265A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-11-27 CN CN90109616A patent/CN1031804C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-06 NZ NZ236370A patent/NZ236370A/xx unknown
- 1990-12-07 CA CA002031784A patent/CA2031784C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 CZ CS906103A patent/CZ279998B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 SK SK6103-90A patent/SK610390A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 PT PT96120A patent/PT96120B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 FI FI906072A patent/FI103804B1/fi active IP Right Grant
- 1990-12-10 KR KR1019900020269A patent/KR0172118B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 ZA ZA909899A patent/ZA909899B/xx unknown
- 1990-12-10 JP JP2407190A patent/JP3027613B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-10 AU AU67932/90A patent/AU641710B2/en not_active Expired
- 1990-12-10 AR AR90318584A patent/AR245134A1/es active
- 1990-12-10 NO NO905325A patent/NO177541C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 IE IE443990A patent/IE904439A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-11 HU HU908159A patent/HU209761B/hu unknown
- 1990-12-11 PL PL90288204A patent/PL166096B1/pl unknown
-
1992
- 1992-09-18 US US07/947,641 patent/US5334535A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-18 GR GR960402428T patent/GR3021060T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0608002B1 (en) | Optically active compounds | |
| CZ279998B6 (cs) | Způsob přípravy opticky čistých diastereoisomerů tetrahydrofolátových sloučenin | |
| KR940000759B1 (ko) | 신규 글리코펩티드계 항생물질의 제조방법 | |
| CZ279307B6 (cs) | Rebeccamycinový analog, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje | |
| Flynn et al. | Necessity of the sulfoxide moiety for the biochemical and biological properties of an analog of sparsomycin | |
| NAEGELI et al. | CLAVAMYCINS, NEW CLAVAM ANTIBIOTICS FROM TWO VARIANTS OF STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS II. ISOLATION AND STRUCTURES OF CLAVAMYCINS A, B AND C FROM STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS NRRL 15846, AND OF CLAVAMYCINS D, E AND F FROM STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS NRRL 15879 | |
| CA1252058A (en) | Enzyme-inhibitory griseolic acid derivatives, and their use | |
| EP0173649A2 (en) | Novel saframycin A derivatives and process for producing the same | |
| HU194283B (en) | Chemical process for preparing l 17054 antibiotic | |
| Wehrli et al. | CGP 4832, a new semisynthetic rifamycin derivative highly active against some gram-negative bacteria | |
| US4771070A (en) | CL-1957A antibiotic compound | |
| Silverman et al. | Labile citrovorum factor in urine | |
| Schlenk et al. | A convenient procedure for the biosynthesis and isolation of 35S‐adenosylmethionine | |
| JPH01168700A (ja) | 新規な抗生物質 | |
| EP0048025A1 (en) | Antibacterial composition of thienamycin type compound and a dipeptidase inhibitor | |
| JP3596904B2 (ja) | Ｆｏ−２２９５−ｉ物質、ｆｏ−２２９５−ｉｉ物質および／またはｆｏ−２２９５−ｉｉｉ 物質並びにその製造法 | |
| Zygmunt et al. | Formation of folic acid related compounds by Bacillus subtilis | |
| JPH0258280B2 (cs) | ||
| JPS58159494A (ja) | 新規抗生物質アゼピノマイシンおよびその製造法 | |
| JPS6219094A (ja) | ピロロキノリンキノンの製造方法 | |
| JPH02174688A (ja) | ジデオキシリバビリン誘導体及びその製造法 | |
| JPH01108994A (ja) | 新規マクロサイクリック・ラクタム・ラクトン系物質及びその製造方法 | |
| SK278338B6 (en) | Rebecamycine analogue, preparation method thereof and pharmaceutical agent containing its |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20101207 |