HU209761B - Process for the preparation of basic salts of 5-formyl-5,6s,7,8- tetrahydrofolic acid - Google Patents

Process for the preparation of basic salts of 5-formyl-5,6s,7,8- tetrahydrofolic acid Download PDF

Info

Publication number
HU209761B
HU209761B HU908159A HU815990A HU209761B HU 209761 B HU209761 B HU 209761B HU 908159 A HU908159 A HU 908159A HU 815990 A HU815990 A HU 815990A HU 209761 B HU209761 B HU 209761B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
tetrahydrofolic acid
acid
formyl
tetrahydrofolic
compound
Prior art date
Application number
HU908159A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT61335A (en
HU908159D0 (en
Inventor
Gerhard Schlingmann
Stuart Alan Rosenfeld
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of HU908159D0 publication Critical patent/HU908159D0/hu
Publication of HUT61335A publication Critical patent/HUT61335A/hu
Publication of HU209761B publication Critical patent/HU209761B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
    • C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/842—Clostridium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

A találmány tárgya új eljárás 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav bázissal alkotott sóinak, előnyösen kalciumsójának előállítására.
A leucovorin (5-formil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav) és sói gyógyászatilag hatásos vegyületekként ismertek [lásd a Remington’s Pharmaceutical Services, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985 (Remington’s) 1023. oldal szakirodalmi helyen]. Kerwar és mtsai a 4 746 662 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban azt ismertetik, hogy methotrexate antiartritiszes hatása fokozható leucovorin vagy sóinak vizes oldatban való beinjektálásával. A 0 266 042 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésben tiszta leucovorin izomerek alkalmazását írják le methotrexate kiváltására szolgáló gyógyszerek előállítására, amelyek 5-fluor-uracillal kombinálva vastag- és végbélrák kezelésére, továbbá foláthiány kezelésére alkalmasak. A 4 500 711 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leucovorin és sói tisztítását ismertetik.
A leucovorint szokásosan sói, például alkálifém és alkáliföldfém sói formájában adagolják, például a leucovorin kalciumsót adják be, előnyös az 1-izomer.
Az N-[/(2-amino-5-formil-3,4,5,6,7,8-hexahidro-4oxo-6-pteridinil)-metil-amino/-benzoil]-L-glutaminsavkalciumsó (1:1) pentahidrát (Leucovorin Calcium USP) kereskedelmi forgalomban mint az (la) és (lb) vegyületek 1:1 arányú elegyének kalciumsója szerezhető be, az utóbbi vegyületek a 6-helyzetű szénatomra vonatkozóan (R) és (S) sztereoizomerek.
Ezt a vegyületet elsősorban a dihidrofolsavnak tetrahidrofolsavvá való alakulását gátló folsav antagonisták, például methotrexate antidotumaként használják. A leucovorin sókat vízben megfelelő tartósítószerekkel formálják injekciós készítményekké [lásd: Leucovorin: Calcium Injection in the Physician’s Desk Reference, 43. kiadás, Medical Economics Company, Oradell, NJ 1989 (PDR 43rd Ed.) 1124. oldal],
A két izomer farmokokinetikus viselkedése annyiban tér el egymástól, hogy az (S) izomer, (lb) képletű vegyület, szelektíven abszorbeálódik a gasztrointesztinális szakaszból és plazmában lévő fél-életideje rövidebb, mint az (R)-izomeré, amely az (la) képletnek felel meg.
A természetben előforduló (lb) izomerről, amely a 6S diasztereoizomer, C. Temple, Jr., J. P. Rose, W. R. Laster, és J. A. Montgomery [Cancer Treatment Reports, 65, 1117-1119 (1981)] ismertették, hogy a Cl metabolizmus helyreállításában való hatásossága folytán mentési terápiában fontos vegyület.
R. P. Leary, Y. Gaumont és R. L. Kisliuk [Biochem. and Biophys. Rés. Commun., 56, 484—488 (1974)] azt ismertették, hogy L. casei timidilát-szintézisét az 5,10metilén-tetrahidrofolát nem-természetes diasztereoizomerje gátolja, V. F. Scot és K. O. Donaldson [Biochem. and Biophys. Rés. Commun., 14, 523-526 (1964)] közleménye szerint az E. coli eredetű 5,10-metilén-tetrahidrofolát-dehidrogenáz ugyancsak gátolható a fenti diasztereoizomerrel; ez G. K. Smith, P. A. Benkovic és
S. J. Benkovic [Biochem., 20, 4034—4036 (1981)] megfigyelésével együttesen, ami szerint a 10-formiltetrahidrofolát azonos diasztereoizomerje a csirkemáj eredetű glicinamid-ribonukleotid-formil-transzferáz (GAR) hatásos kompetitív inhibitora, arra mutat rá, hogy a tetrahidrofolát Cl származékainak nem-természetes diasztereoizomerjei inhibitorai mind a pirimidin, mind a purin bioszintézisnek, így a DNS bioszintézisnek. Ennek folytán a nem-természetes formák nem tekinthetők biológiailag inertnek. Ha egy emlős szervezetében ilyen gátlás van jelen, akkor fennáll a tetrahidrofolátok, különösen a leucovorin természetes (6S) formája iránti lehetséges klinikai igény.
Az (la) és (lb) diasztereoizomer komponenseket frakcionált kristályosítással D. B. Cosulich, J. M. Smith, Jr. és Η. P. Proglist [J. Am. Chem. Soc., 74, 4215 (1953)], kromatográfiás eljárással J. Feeney, B. Birdsall, P. Albrand, G. C. K. Roberts, A. S. Bungen, P. A. Charlton és D. W. Young [Biochem., 20, 1837 (1981)] választották el. A dihidrofolátnak dihidrofolátreduktázzal katalizált sztereospecifikus redukálását, amely a (6S) izomert eredményezi L. Rees, E. Valente, C. J. Suckling és H. C. S. Wood [Tetrahedron, 42, 117 (1986)] ismertették.
L. Rees, E. Valente, C. J. Suckling és H. C. S. Wood [Tetrahedron, 42, 117-136 (1986)] tetrahidrofolát királis származékainak, köztük a leucovorinnak a szintézisét írják le. Ebben a rendszerben E. coli eredetű dihidrofolát-reduktáz alkalmazására és a redukáló NADPH kofaktor nagymértékű és költséges recilizálására van szükség. Egy másik munkájukban L. Rees, C. J. Suckling és H. C. S. Wood, [J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470, (1987)], (0 266 042 számú európai közrebocsátási irat) 6(R,S)-tetrahidrofolátnak (-)-mentil-klór-formiáttal való acilezését írják le, és az így kapott N-5 származékokat tartalmazó diasztereoizomer elegyet ífakcionált kicsapással választják el. Az egyes diasztereoizomereknek hangyasavval és hidrogén-bromiddal ecetsavban való utókezelése, majd hidrolízise révén nyerik az 5-formil-tetrahidrofolát diasztereoizomerjeit.
Arra a felismerésre jutottunk, hogy a tetrahidrofolát-származékok diasztereoizomerjeinek optikailag tiszta formája könnyebben állítható elő a találmány szerinti eljárással. Ennek az eljárásnak az ismert vagy szabadalmazott eljárásokhoz viszonyított nagy előnye az, hogy meglepő módon egyszerű, mivel a kulcslépéshez csak egy enzimre, a tetrahidrofolát-formilázra van szükség, amelyet más néven formiát aktiváló enzimnek vagy formil-tetrahidrofolát-szintetáznak (FTHFS) neveznek, amelynek alkalmazása esetén a racém 5,6(R,S)-7,8-tetrahidrofolsav (IIa,b) racém elegyének alkalmazásakor szelektíven csak a 6S-diasztereoizomerhez kapcsolódik a kívánt formilcsoport. Továbbá, ennek az enzimnek az alkalmazása a dihidrofolát-reduktáz alkalmazásához viszonyítva még azzal a külön előnnyel is jár, hogy nem kell alkalmaznunk a kofaktorok regenerálási rendszerét.
A tetrahidrofolát-formilázt előállíthatjuk Micrococcus aerogenes, Clostridium cylindrosporum, Clostridium acidi-urici, Clostridium thermoaceticum és más mikroorganizmusok, növények és állatok segítségével [D. H. Butlaire, Methods In Enzymology, 66, 585-599
HU 209 761 Β (1980)]. A találmány szerint előnyösen Clostridium cylindrosporum eredetű tetrahidrofolát formilázt alkalmazunk.
Ha izotóppal jelzett ammónium-formiátot vagy bármely más, köztük in situ előállított izotóppal jelzett hangyasav-sót vagy -származékot alkalmazunk az enzimes formilezés során, jelzett (IRb) képletű vegyületet nyerünk, ezt jelzett (IVb) vagy (Ib) képletű vegyületté alakíthatjuk. Az 5,10-metilén-tetrahidrofolát-dehidrogenáz enzim segítségével bármely izotóppal jelzett, formilcsoportot hordozó 5,6S,7,8-tetrahidrofolát [(Ib), (Illb) vagy (IVb), előnyösen (TVb)] átalakítható a jelzett 5,10-metilén-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavvá, amely ezután az 5,10-metilén-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavvá alakítható. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával létrehozott izotóppal jelzett (Ib) képletű vegyület az izotóppal jelzett 5,6S,7,8-tetrahidrofolsav-származékok előállításának hasznos köztiterméke.
A találmány szerinti eljárás nem várt módon lehetővé teszi az enzim által nem formilezett (Ila) képletű 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav izolálását. Az elkülönített (Ha) képletű vegyület ilyen formájában (ritka vegyületként forgalomba hozva) eladható, vagy kiindulási anyagul szolgálhat például az (la) képletű 5-formil5,6R,7,8-tetrahidrofolsav előállítására az R. G. Mórán és P. D. Colman [Anal. Biochem. 722, 70-78 (1982)] által leírt eljárással analóg módon hangyasav alkalmazásával a vízben oldható karbodiimid, az l-etil-3-(3’dimetil-amino-propil)-karbodiimid jelenlétében vagy jelenléte nélkül. Előnyösen azonban a (Ila) képletű vegyületet a (Illb) képletű vegyületnek (IVb) és/vagy (Ib) képletű vegyületté való alakítása után különítjük el. Ez a komponensek egyszerűbb elválasztását teszi lehetővé például fordított fázisú kromatográfiás eljárással. A (iía) képletű vegyület módosítható is a (IVb) és/vagy (Ib) képletű vegyületek jelenlétében, mivel a (Ha) képletű vegyület 5-helyzete még reakcióképes, míg a (IVb) vagy (Ib) képletű vegyületeké nem, így a (Ha) képletű vegyület származéka képezhető, például 5-karboxi-metil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsav, amely a (IVb) vagy (Ib) képletű vegyületektől egyszerű abszorpciós lépéssel elkülöníthető.
Az elkülönített (Ila) képletű vegyület reagáltatható továbbá C. Temple, Jr., L. L. Bennett, Jr., J. D. Rose, R. D. Elliott, J. A. Montgomery és J. H. Mangum eljárásával [J. Med. Chem., 25, 161-166 (1982)], így különböző 5- és 10-szubsztituált, 5,10-diszubsztituált és 5,10áthidaltan diszubsztituált 5,6R,7,8-tetrahidrofolsavszármazékok állíthatók elő. Különösen jelentős az 5metil-5,6R,7,8-tetrahidrofolát előállítása a (Ha) képletű vegyületből formaldehid és nátrium-bór-hidrid alkalmazásával lúgos körülmények között a J. A. Blair és K. J. Saunders által leírt eljárással [Anal. Biochem. 34, 376 (1970)]. A (Ha) képletű vegyület alkilezését dimetil-szulfáttal Ν,Ν-dimetil-acetamidban 55 °C hőmérsékleten végezzük a 73 32 120 számú japán szabadalmi leírásban ismertetett módon [Chem. Abst., 80, 2792X (1974)].
A hangyasavnak vagy az alkilezőszernek az előző eljárásokban izotóppal jelzett hangyasavval vagy az alkilezőszer radioaktív származékával való helyettesítése révén izotóppal jelzett 5,6R,7,8-tetrahidrofolsavszármazékokat állíthatunk elő.
A találmány szerinti eljárással külön előállíthatok mind az izotóppal jelzett 5,6S,7,8-tetrahidrofolsavszármazékok, mind az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav-származékok és ezek sói, amely vegyületek vizsgálatokban, például enzim-mechanizmusok vizsgálata során hasznosak.
A találmány tárgya eljárás tiszta 5-formil-5,6S,7,8tetrahidrofolsav bázissal alkotott előállítására, amely eljárás abban áll, hogy
i) a (Ila) és (Rb) képletű 5,6,7,8-tetrahidrofolsav 6R és 6S diasztereoizomerjéből a 6S-formát tetrahidrofolát-formiláz enzimmel, előnyösen Clostridium cylindrosporum eredetű tetrahidrofolát-formiláz enzimmel szelektíven formilezzük, ii) majd a kapott (Illb) képletű 10-formil-5,6S,7,8tetrahidrofolsavon a (Ilb) képletű reagálatlan 5,6S,7,8tetrahidrofolsav és a reagálatlan (Ila) képletű 5,6R,7,8tetrahidrofolsav jelenlétében gyűrűzárást hajtunk végre, a kapott (IVb) képletű 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat hidrolizáljuk, majd iii) az így kapott (Ib) képletű 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat fordított fázisú folyadékkromatográfiás eljárással elválasztjuk a (IVb) képletű 5,10-metenil5,6S,7,8-tetrahidrofolsavtól és a (Ila) képletű 5,6R,7,8tetrahidrofolsavtól, és iv) a tiszta (Ib) képletű 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat bázisos sóvá alakítjuk.
A fordított fázisú folyadékkromatográfiás elválasztásnál kifejlesztőszerként előnyösen 0,1 mól/l-es vizes hangyasavoldat és metanol gradiensét alkalmazzuk.
Az 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat előnyösen kalciumsóvá alakítjuk, ezt előnyösen kalcium-kloriddal való reagáltatásával valósítjuk meg.
Az eljárás termékei önmagukban is értékesek, például terápiás célra használhatók, továbbá értékes termékek köztitermékeiként használhatók, és izotóppal jelezve felhasználhatók például enzim-mechanizmus vizsgálatára. Szakember számára nyilvánvaló hogyan használhatók a vegyületek ilyen célra.
A tiszta 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav sói mentési szerként értékes tulajdonságokkal bírnak.
A tiszta 6S diasztereoizomer enzim-mechanizmus tanulmányozására alkalmazható.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kiindulási vegyületek a biokémiai transzformációk terén jártas szakember számára ismert eljárásokkal állíthatók elő. A (Ila) képletű vegyület (R) és a (Rb) képletű vegyület (S) elegye előállítható folsavnak nátrium-bórhidriddel való redukálásával C. Temple, Jr., R. D. Elliott, J. D. Rose és J. A. Montgomery módszere szerint [J. Med. Chem., 22,731 (1979)].
Ezen (Ila) és (Ilb) képletű vegyületekből kiindulva az 1. reakcióvázlatban mutatjuk be találmány szerinti eljárást.
A 2. reakció vázlatban azt mutatjuk be, hogy a (Ila) képletű vegyület, amelyet a (Illb) képletű vegyülettől kromatográfiás úton választhatunk el, hangyasavval
HU 209 761 Β formilezve az (la) képletű vegyület időszakos képződése mellett a (IVa) képletű imidazolinium-sót adja, amely utóbbit kristályosítás után hidrolizálunk, így az (la) képletű leucovorin tiszta nem-természetes izomerjét nyerjük. Más eljárás szerint a (IHb) és (Ila) képletű vegyületek elegyét (Hlb), majd (IVb) és/vagy (Ib) képletű vegyületekké alakíthatjuk, így olyan elegyet nyerünk, amely a (IVb) és/vagy (Ib) képletű és a (Ila) képletű vegyületeket tartalmazza. Az elegy komponenseit, például a (Ila) képletű vegyületet a (TVb) és/vagy (lb) képletű vegyülettől könnyen szétválaszthatjuk.
Ez az izolálási eljárás lényegében a tetrahidrofolsav 6R és 6S diasztereoizomerek szétválasztását képviseli. Mivel a (Ila) képletű vegyület kémiai úton átalakítható az (la) képletű vegyületté, a találmány formailag az (Ib) képletű vegyületek és az (la) képletű vegyületek hatékony elválasztására ad módszert. Ezeket a vegyületeket szokásosan a leucovorin természetes és nemtermészetes formáiként jelölik.
A következőkben a találmányt példákban mutatjuk be a korlátozás szándéka nélkül.
A Eljárás
Clostridium cylindrosporumot (amelyre Clostridium sp. ATCC No. 7905 jelöléssel is hivatkozunk) izolálunk és tenyésztünk.
Mivel a Clostridium anaerob, minden tenyésztési és fenntartási eljárást, minden kezelési műveletet olyan körülmények között hajtunk végre, amely minimálisra csökkenti a törzsnek oxigénnel való érintkezését. Hasonló módon a tetrahidrofolátnak és származékainak oxigén jelenlétében való rendkívüli labilitása folytán ezekkel a vegyületekkel kapcsolatos minden műveletet oxigén távollétében hajtunk végre. Erre a célra oxigénmentes nitrogéngáz forráshoz csatlakoztatott műanyag anaerob berendezést alkalmazunk.
1. Húgysavat tartalmazó szaporító tápközeg készítése
A húgysav tápközeget az ATCC Media Handbook 519. számú receptje szerint készítjük el.
Húgysav tápközeg kompozíció Húgysav 3,0 g
Élesztő extraktum 1,0 g
Dibázisos kálium-foszfát 4,0 g
Magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 g
Vas(II)-szulfát 5,0 mg
*0,04% fenolvörös oldat 1,0 g
Nátrium-tioglikolát 0,5 g
Desztillált víz 1,01
* 14,9 ml 0,01 n nátrium-hidroxid szükséges 0,1 g
indikátorhoz. Ezt vízzel 250 ml-re hígítva nyerünk 0,04%-os oldatot. A tápközeg készítésekor a húgysavat a folyadéknak majdnem teljes térfogatában szuszpendáljuk, forrásig hevítjük, majd nátrium-hidroxiddal fenolvörös állandó rózsaszín színéig állítjuk (pH = 7,6). A pH-t pH-papírral ellenőrizzük. A szilárd tápközeg elkészítéséhez a közegbe 20,0 g agart adunk.
A tápközeget csavaros tetejű lombikba töltjük, a tápközeggel a lombikot szinte tele töltjük, majd oxigénmentes nitrogéngázzal öblítve forraljuk a tápközeget. Közvetlenül autoklávozást követően a lombik tetejét meglehetősen szorosra csavarjuk.
A tápközeget szobahőmérsékleten tároljuk, hogy megelőzzük a húgysavnak alacsonyabb hőmérsékleten való kicsapódását.
2. A szaporító tápközeg beoltása Clostridium cylindrosporum tenyészettel
Minden eljárást anaerob körülmények között kesztyűs manipulátorban végzünk. Az ATCC gyűjteménytől kapott liofilizált baktérium-szemcsékhez 1,0 ml folyékony húgysav tápközeget adunk. A szemcséket feloldjuk, és steril, eldobható oltókacsot alkalmazunk a szuszpendált tenyészetnek a húgysav táptalajra való felvitelére. A lemezeket H2-CO2 fejlesztő burkolatot és egy metilénkék indikátor csíkot tartalmazó anaerob üvegbe helyezzük.
A beoltott lemezeket tartalmazó üveget 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 24 óra elteltével a szaporodás a lemezeken a telepekből sugárirányban kiinduló világos, transzparens, ujj-szerű képződmények formájában nyilvánvalóvá válik. Egy jellemző telepből vett mintát fáziskontraszt mikroszkóp alatt vizsgálva a Clostridium sejtekre jellemző morfológia és spóraképződés észlelhető.
3. Állandó Clostridium cylindrosporum törzstenyészet készítése
Szilárd húgysav tápközeget készítünk Hungate csövekben (Bellco Glass Co.), csövenként 10 ml tápközeget alkalmazunk, ezek a csövek szolgálnak az állandó Clostridium cylindrosporum törzstenyészet forrásaként. Az előzőekben leírt telepek közül egyetlen telepből származó sejtmintát veszünk fel steril oldókaccsal, és a Hungate cső tápközegébe szúrjuk. Ezt a műveletet nitrogéngázt tartalmazó anaerob térben végezzük. A csöveket anaerob üvegbe helyezzük és 35 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 5 nap elteltével a csöveket eltávolítjuk az üvegből és a csövek sapkáig parafilmmel szorosan lezárjuk. A csöveket ezután további felhasználásig szobahőmérsékleten tároljuk.
4. Oltóanyag készítése a folyékony szaporító tápközeghez
Félszilárd húgysav tápközeget (2,5 g/1 Bacto-Agar) tartalmazó csöveket Clostridium cylindrosporum teleppel oltunk be, 35 °C hőmérsékleten inkubálunk, majd az előzőekben leírt módon szobahőmérsékleten tárolunk. Ezek a tenyészetek szolgálnak a következőkben ismertetésre kerülő folyékony szaporító tápközeg oltóanyagául.
5. Clostridium cylindrosporum szaporítására szolgáló folyékony tápközeg
Folyékony húgysav tápközeghez egy lágy-agar cső tenyészetét (összesen 10 ml) adjuk. Minden műveletet anaerob manipulátorban végzünk, és a teljes tenyészetet anaerob üvegben inkubáljuk 4 napon át 35 °C hőmérsékleten.
B Eljárás
Nyers Clostridium cylindrosporum formil-tetrahidrofolát-szintetáz extraktumot állítunk elő.
Amint azt az A eljárásnál ismertettük, minden tenyésztési és fenntartási eljárást, valamint a kezelési műveleteket olyan körülmények között hajtjuk végre, amelyek a törzsnek oxigénnel való érintkezését mini4
HU 209 761 Β málisra csökkentik, mivel a Clostridium anaerob. Hasonlóképpen a tetrahidrofolát és származékai oxigén jelenlétében való rendkívüli labilitása folytán minden ezekkel a vegyületekkel végzett műveletet oxigén távollétében hajtunk végre. Műanyag anaerob manipulátor berendezést oxigénmentes nitrogéngáz forráshoz csatlakoztatunk, hogy ezt a célt eléqük. Az 1 liter tenyészet zavarossá válik, és szemcsés anyag ülepszik ki a tápközegből. A tenyészetet 4x250 ml alikvotokra osztjuk és 4x250 ml-es centrifuga palackokba töltjük. A tenyészeteket 4 °C hőmérsékleten 8000 fordulat/perc mellett 15 percig centrifugáljuk Beckman J2-21 centrifugán.
Bár a tápközeget 4 °C hőmérsékletre hűtjük, nem csapódik ki belőle húgysav, mivel a baktériumok ezt elfogyasztják. A sejtet tartalmazó üledéket 4x25 ml jéghideg desztillált vízben ismét felszuszpendáljuk és az előzőek szerinti centrifugálást megismételjük. Ezután az üledéket -20 °C hőmérsékleten 5 napig fagyasztjuk mielőtt formil-tetrahidrofolát-szintetáz aktivitását vizsgálnánk. A fagyasztott csapadékot összesen 4,0 ml pufferben kiolvasztjuk (0,05 mól/1 kálium-hidrogén-foszfátot, 0,05 mól/1 2-merkapto-etanolt tartalmazó, 1 mól/l-es kálium-hidroxiddal pH = 7,5-re állított puffer). A csapadékot a pufferrel összekeverjük, majd szobahőmérsékleten 60 percig, időnkénti összerázással hagyjuk oldódni. A sejt-csapadék a sejt lízise folytán láthatóan viszkózussá válik. Szobahőmérsékleten autolízis következik be. A sejt-lizátumot 17 000 fordulat/perc mellett 30 percig centrifugáljuk, a felülúszót jégen tároljuk, és megvizsgáljuk formil-tetrahidrofolát-szintetáz aktivitását.
C Eljárás
Formil-tetrahidrofolát-szintetáz vizsgálata Buttlaire [„Purification and Properties of Formyltetrahydrofolate Synthetase”, Enzymology 66, 585 (1980)] eljárásával.
1. példa
5,6(R,s),7,8-tetrahidrofolsavat nátrium-bór-hidriddel a szakirodalomban leírt eljárással [C. Temple, Jr., R. D. Elliott, J. D. Rose és J. A. Montgomery, J. Med. Chem. 22, 731 (1979)] folsavvá redukálunk.
2. példa
10-Formil-5,6S, 7,8-tetrahidrofolsav előállítása
5,6S,7,8-tetrahidrofolsav 10-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavvá való enzimes formilezéshez szükséges alábbi reakcióelegyet készítjük el: 100 ml 1,0 mól/l-es trietanolamin-hidrogén-klorid (pH = 8,0), 100 ml 0,5 mól/l-es adenozil-trifoszfát (pH = 8,0), 100 ml 0,5 mól/l-es káliumklorid, 100 ml 0,1 mól/l-es magnézium-klorid-hexahidrát és 200 ml 0,2 mól/l-es ammónium-formiát (pH = 8,0). Egy cső teljes 5 g 5,6(R,S),7,8-tetrahidrofolsav-tartalmát (Sigma; 69% tisztaság; gyártási szám: 117F-5013) 200 ml 0,2 mól/l-es trisz-HCl/0,05 mól/l-es 2-merkaptoetanol oldatban (pH = 7,0) szuszpendáljuk, és mintegy 15 ml 1 mól/l-es kálium-hidroxid hozzáadásával feloldjuk. A tiszta oldatot az előbbi elegyhez öntjük, és mintegy 200 ml desztillált vizet adunk hozzá, ezzel a 2 literes üveg palackban lévő reakcióelegyet 1,0 literre egészítjük ki.
A reagáltatást 4 ml „formil-tetrahidrofolát-szintetáz” (FTHFS) tartalmú nyers enzimextraktum hozzáadásával kezdjük meg, és szobahőmérsékleten (22 °C) végezzük. Időnként mintát veszünk a reakció lefolyásának nyomon követésére, a vizsgálatot nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végezzük C-18 fordított fázisú oszlopon, az eluálást 30 perc alatt végezzük metanolnak 0,1 mól/l-es hangyasavban lévő 12 és 25% közötti lineáris gradiensével. Az oszlop eluálását 282 nm-nél ellenőrizzük, az 5,6(R,S)7,8-tetrahidrofolsav 12 perc, az 5,10-metenil-tetrahidrofolsav 16 perc elúciós idővel jön le az oszlopról. A reagáltatás 18 óra alatt zajlik le. Erre az időre az eredeti 5,6(R,S),7,8-tetrahidrofolsav mennyiségnek 48%-a marad vissza (ezt a görbe alatti területből határozzuk meg). Az 5,10-metenil-tetrahidrofolát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kapott kromatogramjából számítva 1585 mg 10-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav ekvivalenst nyerünk. Ez az elméleti hozam 92%-ának felel meg, figyelembe véve azt, hogy a 3450 mg 5,6(R,S),7,8-tetrahidrofolsavból csak 1725 mg volt hozzáférhető az enzimes konverziós reakcióban. 5 óra reakcióidő után az elméleti hozam 50%-a alakult át.
3. példa
10-Formil-5,6S, 7,8-tetrahidrofolsav átalakítása 5formil-5,6S, 7,8-tetrahidrofolsavvá A 2. példa szerinti reakcióelegyet további 1 napon át folyamatosan ellenőrizzük, összetételében nem találunk változást. Az elegyből 100 ml-t háromnyakú lombikba viszünk át, és az oldat pH-ját kénsavval 6,5-re állítjuk. Az oldatot nitrogénnel gáztalanítjuk, eközben a lombikot vízfürdőbe merítjük és 2 órán át 90-95 °C hőmérsékleten tartjuk. A reagáltatást ezután nitrogéngáz atmoszférában 40 °C hőmérsékleten éjszakán át folytatjuk. A reakcióelegy 16 óra elteltével barnává válik. Az elegyből vett mintát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással fordított fázisú oszlopon (C-18) vizsgáljuk, az eluálást 30 perc alatt végezzük 0,1 mól/l-es hangyasavban 12 és 25% között növekvő lineáris metanol gradiens alkalmazásával. Az oszlop eluátumát 282 nm-nél vizsgáljuk. Az elemzés azt mutatja, hogy az 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolát és 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav csúcsok alatti területek figyelembevételével a konverzió 90,2%os. Az 5,6R,7,8-tetrahídrofolsavnak megfelelő terület, amelynek változatlanul kellene maradnia, 33,1%-ra csökken a kiindulási anyaghoz képest (48%).
A reakcióelegyből vett mintákat szivattyún át preparatív fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra visszük (Dynamax 60A-C18, 8 gm, 2,1x30 cm), kifejlesztésre 60 percen át 13 ml/perc áramlási sebességgel 0,1 mól/l-es vizes hangyasavban lévő metanol gradienst alkalmazunk. 82%-os összhozammal sárgás 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat nyerünk, amely savas elúciós körülmények mellett (0,1 mól/l-es vizes hangyasav és metanol) 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavvá alakul, amely állás közben 3-6 mg/ml koncentráció mellett az összegyűjtésére szolgáló csőben géllé alakul. A minta enantiomer tisztaságát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás5
HU 209 761 Β sál vizsgáljuk királis oszlop (Diacel Chiracel OD) alkalmazásával, izokratikus eluálást végzünk 0,5% ammónium-formiáttal, pH - 3,8 és 25% metanollal. 15,2 perces retenciós időt észlelünk, az optikai forgatóképesség hangyasavban az alábbi:
Vegyület Koncentráció (%) (88%-os hangyasavoldat) Rotáció [0¾26]
5,10-metenil5,6S,7,8-tetrahidrofolsav 0,611 442
4. példa
5,10-Metenil-5,6S, 7,8-tetrahidrofolsav átalakítása
5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsawá és 5,6R,7,8tetrahidrofolsavvá
A 2. példa szerint kapott reakcióelegy többi részének pH-ját kénsavval 8,0-ról 5,0-ra állítjuk, ezzel a 10-formil5.65.7.8- tetrahidrofolsav gyors ciklizációját indítjuk meg
5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavvá, amely vegyület állás közben szobahőmérsékleten lassan hidrolizál 5formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavvá. Az utóbbi vegyület a pH-állítás előtt nem mutatható ki a reakcióelegyben.
A reakció lefolyását nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással követjük nyomon, fordított fázisú oszlopot (C-18) alkalmazunk, az eluálást 30 perc alatt végezzük metanolnak 0,1 mól/l-es hangyasavban lévő 12 és 25% közötti lineáris gradiensével. A reakciónak nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással való nyomon követéséből látható, hogy a kiindulási 5,10metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavnak több mint 70%-a alakul 5 nap alatt szobahőmérsékleten 5-formil5.65.7.8- tetrahidrofolsavvá, ez idő alatt az 5,6R,7,8tetrahidrofolsav mennyisége változatlan marad a reakcióelegyben. Ezután az 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav és 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav formájában kapott formilezett termékeket és a nem formilezett 5,6R,7,8-tetrahidrofolsavat preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással fordított fázisú oszlopon (Dynamax 60A-C18, 8 gm, 2,1x30 cm) elválasztjuk, a kifejlesztést 60 perc alatt 13 ml/perc áramlási sebességgel végezzük 0,1 mól/l-es vizes hangyasav és metanol gradiensével.
A két eljárás hozamai (mindkét esetben 50 ml reakcióelegyre számítva) a következőek:
Izolált vegyület (mg) Hozam (%) Rel. hozam
5,10-metenil-5,6S ,7,8-tetrahidrofolsav (22,6) 12,9 6,5
5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav (118,2) 67,5 33,8
5,6R,7,8-tetrahidrofolsav* (145,5) 83,1 41,6
* Az elkülönített 5,6R,7,8-tetrahidrofolsavat azonnal szárítjuk, és hangyasavval formilezzük (az alábbiakban leírtak szerint), így 5,10-metenil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsavat nyerünk, amely a 6S formától eltérően híg hangyasavból kristályosodik.
5. példa
Kristályos 5,10-metenil-5,6R, 7,8-tetrahidrofolsav előállítása 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav formilezésével 253 mg kromatográfiásan tiszta, liofilizált 5,6R,7,8tetrahidrofolsavat 50 ml, 2% trifluor-ecetsavat tartalmazó 97%-os hangyasavban oldunk és szobahőmérsékleten nitrogéngáz alatt tartott reakcióedényben keverés nélkül állni hagyunk. A reakcióelegyet nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással fordított fázisú oszlop (C18) alkalmazásával vizsgáljuk, az eluálást 30 perc alatt végezzük 0,1 mól/l-es vizes hangyasavban lévő 12 és 25% közötti lineáris metanol gradienssel. Az eluátumot 282 nm-nél mérjük. A nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat kromatogramján megjelenő, az 5,10-metenil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsavat képviselő új csúcs alapján megállapítjuk, hogy 3 óra alatt az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav teljes mennyisége elreagál. Ezután a hangyasav zömét lepároljuk az elegyből és 30 ml 0,1 mól/l-es vizes hangyasavat adunk az elegyhez lassan, időnkénti keverés mellett. Az oldatot éjszakán át hűtőszobában tároljuk. Halványsárga tűk képződnek, amelyek az oldatnak szilárd megjelenést kölcsönöznek. A kristályokat üveg-szűrőbetétes tölcséren összegyűjtjük, acetonnal mossuk és vákuumban szárítjuk. így 218 mg sárga kristályos anyagot nyerünk.
A kristályos 5,10-metenil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsav enantiomer-tisztaságát királis oszlop (Diacel Chiracel OD) alkalmazásával határozzuk meg, izokratikus eluálást végzünk 0,5% ammónium-formiáttal, pH = 3,8 és 25% metanollal. A termék, az 5,10-metenil-5,6R,7,8tetrahidrofolsav 18,2 perc elúciós idővel jön le.
A 8 8 %-os hangyasavban meghatározott optikai forgatóképesség az alábbi:
Vegyület Koncentráció (%) (88%-os hangyasavoldat) Rotáció (¾26]
5,10-metenil5,6R,7,8-tetrahidrofolsav 0,619 -47
6. példa
Származék képzése 5,6R, 7,8-tetrahidrofolsavból 5formil-5,6S, 7,8-tetrahidrofolsav és/vagy 5,10-metenil-5,6S, 7,8-tetrahidrofolsav jelenlétében Az L. Rees, C. J. Suckling és H. C. S. Wood szerinti eljárás módosításával [J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470 (1987)] a 4. példában kapott reakcióelegy egy mintájához (-)-mentil-klór-formiátot adunk, az elegyet pH = 7re állítjuk be, így csak az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav karboxi-mentileződik, az 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav és/vagy 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav nem reagál. A reakció lejátszódását nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással követjük. Az 5-mentil-oxi-karbonil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsavat a reagálatlan komponensektől az elegynek XAD-2 töltetű oszlopon való átengedésével választjuk el. Az 5-mentil-oxi-karbonil-5,6R,7,8tetrahidrofolsav a gyantán adszorbeálódik, az 5-formil5,6S,7,8-tetrahidrofolsav vagy 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav áthalad az oszlopon.
HU 209 761 Β
7. példa
Az 5-formil-5,6S, 7,8-tetrahidrofolsav, az 5,6R,7,8tetrahidrofolsav és egyéb származékok tisztítása preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással
A 4. példában kapott reakcióelegy 50 vagy 100 ml-es részleteit közvetlenül fordított fázisú oszlopra visszük (Dynamax 60A-C18,8 pm, 2,1x30 cm) egy adagoló szivattyú segítségével, majd a kifejlesztést 60 perc alatt 13 ml/perces áramlási sebességű 0,1 mól/l-es vizes hangyasav és metanol gradiensével végezzük. A gradiens kezdeti állapotában a hangyasav 5% metanolt tartalmaz, a metanol koncentrációja 12 perc alatt 10%-ra nő. Ezután a 10%-os metanol koncentrációt tartjuk további 10 percig, ettől az időtől kezdve (22. perc) a metanol mennyiségét lineárisan növeljük 18%-ig a 38. percre, ettől kezdve tovább növeljük oly módon, hogy a kifejlesztés 52. percére a metanol 25% koncentrációt éljen el. Ezt a koncentrációt változatlanul tartjuk a kifejlesztés befejeztéig. Az oszlopról elfolyó oldatot 319 nm-nél vizsgáljuk, mivel az
5,10-5,6S,7,8-tetrahidrofolátnak és az 5-formil-5,6S,7,8tetrahidrofolsavnak ezen a hullámhosszon azonos az abszorpciós koefficiense.
A fenti körülmények mellett az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav 11 és 17,5 perc között eluálódik, míg az 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav 39,5 és 44,5 perc között jön le az oszlopról. Az 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolát sáv eluálása erősen koncentrációfüggő, a vegyület 20 és 30 perc között jelenik meg elnyúló csúcsként. Az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav sáv és az 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolát sáv nem választható el tökéletesen ha 140 ml-nél több reakcióelegyet viszünk az oszlopra, ami 700 mg anyagnak felel meg.
Az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav és az 5-formil5.65.7.8- tetrahidrofolsav sávok eluátumait üveg palackokba gyűjtjük, amely palackokat szárazjégbe merítünk, hogy az oszlopról lejövő folyadék azonnal megfagyjon. A megfagyott frakciókat ezután liofilizáljuk, így az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsavat szürkésfehér por, az 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat sárgásfehér por formájában nyerjük. Ezeket a porokat nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással vizsgáljuk fordított fázisú oszlopon (Dynamax 60A-C18, 8 pm,
2,1x30 cm), kifejlesztőszerként 0,1 mól/l-es vizes hangyasavban lévő metanol gradienst alkalmazunk. A görbe alatti terület alapján az 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav 97%-os, az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav 93%-os tisztaságú. Az 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav instabilitása miatt ezt kémiai formilezéssel a stabilabb 5,10-metenil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsavvá alakítjuk. Az 5-formil5.65.7.8- tetrahidrofolsavval kapcsolatos stabilitási problémák elkerülésére ezt a vegyületet kalciumsójává alakítjuk a 8. példában leírt módon.
8. példa
5-Formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav-kalciumsó vagy 5-formil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsav-kalciumsó előállítása
C. Temple, Jr., R. D. Elliott, J. D. Rose és J. A. Montgomery eljárásának [J. Med. Chem., 22,731 (1979)] módosított változatával állítunk elő racém 5-formil5,6(R,S),7,8-tetrahidrofolsav-kalciumsót. Az előzőek szerint előállított 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat a maradék ammónium-formiát eltávolítására éterrel mossuk. 62 mg mosott anyagot 32 ml gáztalanított metaiíolban oldunk (a sómentes folinsav metanolban jól oldható), az oldathoz 1 ml metanolos kalcium-klorid-oldatot adunk (72 mg kalcium-klorid/1 ml metanol). A só adagolása piszkosfehér csapadék azonnali képződését eredményezi, a csapadékot üvegbetétes tölcséren szüljük, és vákuumban szárítjuk. Szárítás után 60,5 mg terméket nyerünk, ez az elméleti hozam 90%-ának felel meg.
Az eljárást megismételjük a 6R kiindulási anyaggal, így 5-formil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsav-kalciumsót nyerünk.
Az előállított vegyületek tisztaságát UV/HPLC elemzéssel határozzuk meg, függetlenül bármely nemUV-elnyelő anyag jelenlététől. Az enantiomer-tisztaságot az 5,10-metenil-5,6(R,S),7,8-tetrahidrofolát származék terméken vizsgáljuk nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással királis oszlopon (Diacel Chiracel OD), az eluálást izokratikusan végezzük 0,5% ammónium-formiáttal, pH - 3,8 és 25% metanollal. Elsőként az 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav eluálódik 15,2 perces retenciós idővel, míg az 5,10-metenil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsav retenciós ideje 18,2 perc.
Az előállított vegyületek optikai forgatóképességének meghatározására 10 mól/l-es hangyasavas oldatukat alkalmazzuk az irodalomban megadott 12 mól/l-es hidrogén-kloridos oldat helyett, mivel a hangyasav savassága enyhébb, és folát-oldó képessége nagyobb. A fenti mintákon az alábbi forgatóképességeket mértük:
Vegyület Koncentráció (%) (88%-os hangyasavoldat) Rotáció [ocD 26]
5,10-metenil5,6S,7,8-tetrahidrofolsav* 0,611 +42
5,10-metenil5,6R,7,8-tetrahidrofolsav** 0,619 -47
* Kromatográfiásan 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavként izoláltuk, állás közben a 0,1 mól/l-es hangyasavas eluátum elegy 5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavvá alakul, majd géllé szilárdul, amelyet liofilizálunk.
** Eredetileg nem-konvertált 5,6R,7,8-tetrahidrofolsavként különítettük el, amelyet liofilizálást követően a hangyasavval az előzőekben leírt módon azonnal formileztünk. A kapott 5,10-metenil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsav híg hangyasavból kikristályosodik, ezt összegyűjtöttük, acetonnal mostuk és vákuumban szárítottuk. 253 mg 5,6R,7,8-tetrahidrofolsavból 218 mg kristályos 5,10-metenil-5,6R,7,8-tetrahidrofolsavat nyertünk.
9. példa
Izotóppal jelzett formil-folsav és származékai előállítása
Ha a 2. példában leírt eljárást követjük, de ammóni7
HU 209 761 Β um-formiát helyett izotóppal jelzett ammónium-formiátot vagy bármely más izotóppal jelzett hangyasavszármazékot alkalmazunk, izotóppal jelzett 10-formil5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat nyerünk. Ha ezt a vegyületet a 3-8. példákban leírt eljárásoknak tesszük ki, a megfelelő izotóppal jelzett savakat és sókat nyerjük.
A leírásban említett szabadalmakat, irodalmi közleményeket és vizsgáló eljárásokat leírásunkba referenciaként építjük be.
Az előzőekben részletesen ismertetett eljárás alapján szakember számára számos variációs lehetőség nyilvánvaló. Például kalcium-leucovorin helyett stroncium-leucovorin és nátrium-leucovorin is előállítható. A tetrahidrofolát formiláz előállítható Clostridium acidi-urici alkalmazásával is. Minden ilyen nyilvánvaló módosítás a találmány oltalmi körébe tartozik.

Claims (4)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás tiszta 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsav bázisos sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy
    i) 5,6,7,8-tetrahidrofolsav 6R és 6S diasztereoizomerjéből a 6S-formát tetrahidrofolát-formiláz enzimmel, előnyösen Clostridium cylindrosporum eredetű tetrahidrofolát-formiláz enzimmel szelektíven formilezzük, ii) majd a kapott 10-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavon a reagálatlan 5,6S,7,8-tetrahidrofolsav és a reagálatlan 5,6R,7,8-tetrahidrofolsav jelenlétében gyűrűzárást hajtunk végre, a kapott 5,10-metenil-5,6S,7,8tetrahidrofolsavat hidrolizáljuk, majd iii) az így kapott 5-formil,6S,7,8-tetrahidrofolsavat fordított fázisú folyadékkromatográfiás eljárással az
    5,10-metenil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavtól és az 5,6(R és S),7,8-tetrahidrofolsavtól elválasztjuk, és iv) a tiszta 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat bázisos sóvá alakítjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a iii) lépés szerinti fordított fázisú folyadékkromatográfiás elválasztást 0,1 mól/l-es vizes hangyasavoldatban metanol gradienssel végezzük.
  3. 3. Az 1. igénypont iv) lépése szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5-formil-5,6S,7,8-tetrahidrofolsavat kalciumsóvá alakítjuk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kalcium-sót metanolos kalcium-klorid-oldattal képezzük.
HU908159A 1989-12-11 1990-12-11 Process for the preparation of basic salts of 5-formyl-5,6s,7,8- tetrahydrofolic acid HU209761B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44966289A 1989-12-11 1989-12-11

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU908159D0 HU908159D0 (en) 1991-06-28
HUT61335A HUT61335A (en) 1992-12-28
HU209761B true HU209761B (en) 1994-10-28

Family

ID=23785009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU908159A HU209761B (en) 1989-12-11 1990-12-11 Process for the preparation of basic salts of 5-formyl-5,6s,7,8- tetrahydrofolic acid

Country Status (24)

Country Link
US (1) US5334535A (hu)
EP (1) EP0432441B1 (hu)
JP (1) JP3027613B2 (hu)
KR (1) KR0172118B1 (hu)
CN (1) CN1031804C (hu)
AR (1) AR245134A1 (hu)
AT (1) ATE139799T1 (hu)
AU (1) AU641710B2 (hu)
CA (1) CA2031784C (hu)
CZ (1) CZ279998B6 (hu)
DE (1) DE69027585T2 (hu)
DK (1) DK0432441T3 (hu)
ES (1) ES2090075T3 (hu)
FI (1) FI103804B (hu)
GR (1) GR3021060T3 (hu)
HU (1) HU209761B (hu)
IE (1) IE904439A1 (hu)
IL (1) IL96265A0 (hu)
NO (1) NO177541C (hu)
NZ (1) NZ236370A (hu)
PL (1) PL166096B1 (hu)
PT (1) PT96120B (hu)
SK (1) SK610390A3 (hu)
ZA (1) ZA909899B (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH681303A5 (hu) * 1991-01-16 1993-02-26 Eprova Ag
DE4136921A1 (de) * 1991-11-11 1993-05-13 Knoll Ag Verfahren zur trennung von 5-methyl-tetrahydrofolsaeure
CH683262A5 (it) * 1992-01-22 1994-02-15 Applied Pharma Res Procedimento per la separazione dei diastereomeri del sale di calcio dell'acido (6(R,S)-N-formiltetraidrofolico).
IT1254635B (it) * 1992-02-20 1995-09-28 Bracco Spa Processo per la separazione degli stereoisomeri dell'acido folinico
CH686369A5 (de) 1994-05-09 1996-03-15 Eprova Ag Stabile kristalline (6S)- und (6R)-Tetrahydrofolseure.
CH693255A5 (de) * 1997-06-13 2003-05-15 Eprova Ag Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels.
CH694251A5 (de) * 1999-07-14 2004-10-15 Eprova Ag Herstellung von Tetrahydropterin und Derivaten.
WO2001077367A1 (en) * 2000-04-05 2001-10-18 Rothenberg Sheldon P Radioenzymatic assay for methylenetetrahydrofolate reductase
CH696699A5 (de) * 2006-01-19 2007-10-15 Cerbios Pharma Sa Verfahren zur regioselektiven N(5) -Formylierung von (6S) -5, 6, 7, 8-Tetrahydropteroinsäure und Derivaten davon.
WO2010017526A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 The Scripps Research Institute Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof
WO2014018873A2 (en) * 2012-07-27 2014-01-30 Chemic Laboratories Inc. Compositions comprising folic acid derivatives. their preparations and methods of use
CN115656372A (zh) * 2022-10-27 2023-01-31 北京斯利安药业有限公司 一种s-四氢叶酸异构体手性分析方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4500711A (en) * 1977-03-21 1985-02-19 Burroughs Wellcome Co. Synthesis of leucovorin
US4148999A (en) * 1977-08-22 1979-04-10 The Government Of The United States Of America Preparation and purification of citrovorum factor
GB8621268D0 (en) * 1986-09-03 1986-10-08 Univ Strathclyde Separation of substances
US4746662A (en) * 1987-02-20 1988-05-24 American Cyanamid Company Treatment of arthritis with 3,5-dichloromethotrexate
DE3821875C1 (hu) * 1988-06-29 1990-02-15 Eprova Ag, Forschungsinstitut, Schaffhausen, Ch
FR2643081B1 (fr) * 1989-02-14 1991-06-07 Panmedica Sa Folates de magnesium, procede de preparation et compositions pharmaceutiques
CH680731A5 (hu) * 1990-04-12 1992-10-30 Sapec Fine Chemicals
JPH07332120A (ja) * 1994-06-08 1995-12-22 Sanshin Ind Co Ltd 多気筒エンジン

Also Published As

Publication number Publication date
HUT61335A (en) 1992-12-28
CN1031804C (zh) 1996-05-15
FI103804B1 (fi) 1999-09-30
FI906072A0 (fi) 1990-12-10
CZ610390A3 (en) 1995-06-14
IE904439A1 (en) 1991-06-19
AU641710B2 (en) 1993-09-30
DK0432441T3 (da) 1996-07-29
ATE139799T1 (de) 1996-07-15
US5334535A (en) 1994-08-02
PL166096B1 (pl) 1995-03-31
PT96120B (pt) 1998-08-31
NO905325D0 (no) 1990-12-10
ES2090075T3 (es) 1996-10-16
DE69027585T2 (de) 1997-01-16
IL96265A0 (en) 1991-08-16
NZ236370A (en) 1993-04-28
AR245134A1 (es) 1993-12-30
CN1052509A (zh) 1991-06-26
PL288204A1 (en) 1991-12-16
KR0172118B1 (ko) 1999-02-01
PT96120A (pt) 1991-09-30
NO177541B (no) 1995-06-26
CA2031784C (en) 2000-05-30
DE69027585D1 (de) 1996-08-01
CA2031784A1 (en) 1991-06-12
FI103804B (fi) 1999-09-30
NO177541C (no) 1995-10-04
GR3021060T3 (en) 1996-12-31
SK279435B6 (sk) 1998-11-04
JPH0491089A (ja) 1992-03-24
ZA909899B (en) 1991-10-30
EP0432441A1 (en) 1991-06-19
CZ279998B6 (cs) 1995-09-13
EP0432441B1 (en) 1996-06-26
AU6793290A (en) 1991-06-13
JP3027613B2 (ja) 2000-04-04
FI906072A (fi) 1991-06-12
SK610390A3 (en) 1998-11-04
NO905325L (no) 1991-06-12
KR910012262A (ko) 1991-08-07
HU908159D0 (en) 1991-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU209761B (en) Process for the preparation of basic salts of 5-formyl-5,6s,7,8- tetrahydrofolic acid
WO1993016066A1 (en) Cholesterol lowering compounds
ATE295173T1 (de) Pteridinderivat enthaltende pharmazeutische zusammensetzung
JP3131574B2 (ja) 新規抗腫瘍物質、該物質を製造するための微生物及び方法、並びに該物質を有効成分とする細胞周期阻害剤及び抗腫瘍剤
Baugh et al. Biosynthesis of riboflavine in Corynebacterium species: the purine precursor
Gal et al. Biopterin: II. Evidence for cerebral synthesis of 7, 8-dihydrobiopterin in vivo and in vitro
US3936355A (en) Microorganism growth media and the stabilization thereof
SINGARAM et al. Studies on the biosynthesis of the antibiotic streptozotocin (streptozocin) by Streptomyces achromogenes var. streptozoticus feeding experiments with carbon-14 and tritium labelled precursors
EP0173649A2 (en) Novel saframycin A derivatives and process for producing the same
Akers et al. Hydroxamic acid present in Rhodotorula pilimanae cultures grown at low pH and its metabolic relation to rhodotorulic acid
US4929551A (en) Process for producing L(-)-tetrahydrofolic acid
Nair et al. Folate analogs. 31. Synthesis of the reduced derivatives of 11-deazahomofolic acid, 10-methyl-11-deazahomofolic acid, and their evaluation as inhibitors of glycinamide ribonucleotide formyltransferase
RU2001116104A (ru) Ванкорезмицин, способ его получения и его использование в качестве лекарственного средства
Zygmunt et al. Formation of folic acid related compounds by Bacillus subtilis
US2483248A (en) Process for preparing compounds having folic acid activity
HU193238B (en) Process for preparing indanyl-derivatives and pharmaceutical compositions containing such compounds
US4551529A (en) Guanine-N7 -oxide
JP2000072760A (ja) 新規シストチアゾール類縁体
Porter et al. Syntheses and biological activities of some cycloalkenealanines
EP0048025A1 (en) Antibacterial composition of thienamycin type compound and a dipeptidase inhibitor
WO2024008046A1 (zh) 一种菌株及其在生产β-烟酰胺单核苷酸中的应用
Rickards et al. 3-Amino-5-hydroxybenzoic acid in antibiotic biosynthesis. IX. The status of reduced derivatives in mitomycin biosynthesis
US4264735A (en) Method of producing antibiotic 890A9
Kern et al. Guanine-N 7-oxide
JPH02174688A (ja) ジデオキシリバビリン誘導体及びその製造法