NO177541B - Fremgangsmåte ved fremstilling av optisk rene diastereoisomere tetrahydrofolatforbindelser ved hjelp av 10-formyltetrafolat syntetase isolert fra Clostridium - Google Patents
Fremgangsmåte ved fremstilling av optisk rene diastereoisomere tetrahydrofolatforbindelser ved hjelp av 10-formyltetrafolat syntetase isolert fra Clostridium Download PDFInfo
- Publication number
- NO177541B NO177541B NO905325A NO905325A NO177541B NO 177541 B NO177541 B NO 177541B NO 905325 A NO905325 A NO 905325A NO 905325 A NO905325 A NO 905325A NO 177541 B NO177541 B NO 177541B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- salt
- tetrahydrofolic acid
- acid
- formyl
- tetrahydrofolic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 title description 7
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical class C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 title description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 60
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 102000002686 Formate-Tetrahydrofolate Ligase Human genes 0.000 claims description 15
- 108010080982 Formate-tetrahydrofolate ligase Proteins 0.000 claims description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 14
- 230000022244 formylation Effects 0.000 claims description 12
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 6
- MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound N1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 0.000 claims description 5
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 claims description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 3
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- MSTNYGQPCMXVAQ-NEPJUHHUSA-N 6R-Tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-NEPJUHHUSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 claims 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims 2
- 159000000008 strontium salts Chemical class 0.000 claims 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N folinic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 13
- VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 6S-folinic acid Natural products C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000008191 folinic acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000011672 folinic acid Substances 0.000 description 11
- 229960001691 leucovorin Drugs 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 10
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000193165 Clostridium cylindrosporum Species 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000303040 Glycyrrhiza glabra Species 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N chembl252518 Chemical compound C([C@@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2O[C@H](O)[C@@H]4C BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N 0.000 description 4
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N (6R)-5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C1)N)N1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L calcium folinate Chemical compound [Ca+2].C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C([O-])=O)C=C1 KVUAALJSMIVURS-ZEDZUCNESA-L 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000007247 enzymatic mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 3
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- KIUPCUCGVCGPPA-UHFFFAOYSA-N (5-methyl-2-propan-2-ylcyclohexyl) carbonochloridate Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1OC(Cl)=O KIUPCUCGVCGPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MEANFMOQMXYMCT-OLZOCXBDSA-N 5,10-methenyltetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC2=C([N+]1=C1)C(=O)N=C(N2)N)N1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C([O-])=O)C=C1 MEANFMOQMXYMCT-OLZOCXBDSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000186530 Gottschalkia acidurici Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000008207 calcium folinate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011687 calcium folinate Substances 0.000 description 2
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- OBQMLSFOUZUIOB-SHUUEZRQSA-N glycineamide ribonucleotide Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O OBQMLSFOUZUIOB-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229960002293 leucovorin calcium Drugs 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- WKZGKZQVLRQTCT-ABLWVSNPSA-N (2S)-2-[[4-[(2-amino-4-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]-5-formyloxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound N1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC=O)C(O)=O)C=C1 WKZGKZQVLRQTCT-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- NDDLLTAIKYHPOD-ISLYRVAYSA-N (2e)-6-chloro-2-(6-chloro-4-methyl-3-oxo-1-benzothiophen-2-ylidene)-4-methyl-1-benzothiophen-3-one Chemical compound S/1C2=CC(Cl)=CC(C)=C2C(=O)C\1=C1/SC(C=C(Cl)C=C2C)=C2C1=O NDDLLTAIKYHPOD-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- UGWUWNVTCLDEOG-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-[[4-[(2-amino-4-oxo-1h-pteridin-6-yl)methyl-formylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CN(C=O)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 UGWUWNVTCLDEOG-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-STQMWFEESA-N (6S)-5-formyltetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C=O)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUFGTPPARQZWDO-YPMHNXCESA-N 10-formyltetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)N(C=O)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 AUFGTPPARQZWDO-YPMHNXCESA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 3-methylphenylacetic acid Chemical compound CC1=CC=CC(CC(O)=O)=C1 GJMPSRSMBJLKKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188260 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016880 Folate deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006933 Hydroxymethyl and Formyl Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010072462 Hydroxymethyl and Formyl Transferases Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002456 anti-arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004052 folic acid antagonist Substances 0.000 description 1
- 150000004675 formic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001640 fractional crystallisation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N imidazoline Chemical class C1CN=CN1 MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 150000004686 pentahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009118 salvage therapy Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 description 1
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 229940117957 triethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
- C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
- C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/842—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av en (6R eller 6S) diastereoisomer av et derivat av 5,6(R eller S),7,8-tetra-hydrofolsyre eller et salt derav.
Leucovorin og dets salter er kjent for å være farma-søytisk effektive. Se Remington's Pharmaceutical Services, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985 (Remington's) p. 1023. Kerwar et al., U.S. 4.746.662 hevder at metotreksatets anti-artritiske effektivitet kan flerdobles ved injisering av en vandig løsning av leucovorin eller dets salter. EPO patent-søknad nr. 0.266.042, 4. mai 1988, beskriver anvendelse av rene leucovorin-isomerer til fremstilling av medikamenter for metotreksat-redning, for behandling av kolorektal cancer i kombinasjon med 5-fluoruracil og til behandling av folat-mangel. I U.S. 4.500.711, beskriver Wisowaty et al., rensing av leucovorin og dets salter.
Leucovorin blir vanligvis administrert i form av salter så som alkalimetall- og jordalkalimetallsalter, såsom kalsiumsaltet av leucovorin, hvorav 1-isomeren blir foretrukket.
Forbindelsen N-(((2-amino-5-formyl-3,4,5,6,7,Sheksahydro-4-okso-6-pteridinyl)metyl)amino)benzoyl)-L-glutaminsyre, kalsiumsalt (1:1), pentahydrat, (Leucovorin Calsium USP) selges kommersielt som kalsiumsaltet av en 1:1 blanding av formlene (Ia og Ib) for hvilke forbindelsene har henholdsvis (R) og (S) stereokjemi ved C-6.
Den anvendes hovedsakelig som motgift for folsyre-antago-nister såsom metotreksat, som blokkerer omdanningen av dihydrofolsyre til tetrahydrofolsyre. Leucovorinsalter formuleres i vann for injeksjon med egnede konserverings-midler, som beskrevet under Leucovorin Calcium Injection i the Physician's Desk Reference, Forty-third Edition, Medical Economics Company, Oradell, NJ 1989 (PDR 43rd Ed.) p. 1124.
Den farmakokinetiske oppførsel av de to isomerene adskiller seg ved at (S)-isomeren (Ib) blir selektivt absorbert fra fordøyelseskanalen og har en kortere plasma-
halveringstid i forhold til (R)-isomeren (Ia).
Den naturlig forekommende isomeren Ib, som er 6S diastereoisomeren, er blitt rapportert (C. Temple, Jr., J. P. Rose, W.R. Laster, og J.A. Montgomery, Cancer Treatment Reports, 65, 1117-1119 (1981) å være viktig for redningsterapi p.g.a. sin effektivitet til å gjenopprette ett-karbon metabolismen.
En rapport (R.P. Leary, Y. Gaumont og R.L. Kisliuk, Biochem and Biophys. Res. Commun., 56, 484-488 (1974)) om at thymidylat-syntese fra L. casei blir inhibitert av den ikke naturlige diastereoisomeren av 5,10-metylentetrahydrofolat og en rapport (V.F. Scott og K.O. Donaldson, Biochem and Biophys. Res. Commun., 14, 523-526 (1964)) om at 5,10-metylentetrahydrofolat-dehydrogenase fra E. coli også blir inhibert av den samme diastereoisomer sammenkoblet med den observasjon (G.K. Smith, P.A. Benkovic og S. J. Benkovic, Biochem., 20, 4034-4036 (1981)) at den samme diastereoisomer av 10-formyltetrahydrofolat er en potent konkurrerende inhibitor for glycin-amid-ribonukleotid-formyltransferase (GAR) fra kylling-lever, peker på inhibering av både pyrimidin- og purin-biosyntese og således av DNA-biosyntese ved de ikke-naturlige diastereoisomerene av ett-karbonderivater av tetrahydrofolat. De ikke-naturl ige formene kan derfor ikke betraktes som biologisk inerte. Dersom en slik inhibering er tilstede i pattedyr-systemer, vil det derfor eksistere et potensielt klinisk behov for bare den naturlige (6S) formen av tetra-hydrofolater, spesielt leucovorin.
De diastereoisomere komponentene Ia og Ib er blitt separert (D.B. Cosulich, J. M. Smith Jr., og H.P. Proglist, J. Am. Chem. Soc., 74, 4215 (1953)) ved fraksjonert krystallisasjon og ved kromatografi (J. Feeney, B. Birdsall, J.P. Albrand, G.C.K. Roberts, A.S. Bungen, P.A. Charlton og D.W» Young, Biochem., 20, 1837 (1981)). En stereospesifikk reduksjon av dihydrofolat katalysert av dihydrofolatreduktase er blitt rapportert (L. Rees, E. Valente, C.J. Suckling og H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42, 117 (1986)) å gi 6(S)-isomeren stereospesifikt.
En publikasjon av L. Rees, E. Valente, C.J. Suckling og H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42, 117-136 (1986) beskriver syntese av chirale derivater av tetrahydrofolat, innbefattet leucovorin. Dette system krevet anvendelse av dihydrofolatreduktase fra E. coli og en utstrakt og dyr resirkulering av reduserende ko-faktor NADPH. En annen publikasjon av L. Rees, C.J. Suckling og H.C.S. Wood, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470,
(1987) (Europeisk patentsøknad 0 266 042 A2) beskriver acyl-ering av 6(R,S)-tetrahydrofolat med (-)-mentolklorformiat til å gi N-5-derivater som en diastereoisomer blanding som ble separert ved fraksjonert utfelling. Påfølgende behandling av hver diastereoisomer med maursyre og hydrogenbromid i eddik-syre etterfulgt av hydrolyse ga hver diastereoisomer av 5-formyltetrahydrofolat.
Det er nå blitt funnet at de optisk rene diastereoisomerene av tetrahydrofolat-forbindelser kan fremstilles lettere ifølge denne oppfinnelsen. Denne fremgangsmåte har en betydelig fordel over tidligere publiserte eller patenterte fremgangsmåter ved at den er overraskende enkel, fordi hoved-trinnet krever anvendelse av bare ett enzym, tetrahydrofolat-formylase, som ellers kalles formiataktiverende enzym eller formyltetrahydrofolatsyntetase (FTHFS), som også selektivt tilkobler den nødvendige formylgruppe bare til 6S diastereoisomeren når det anvendes en racemisk blanding av 5,6,(R,S),7-8-tetrahydrofolsyre (IIa,b). Dessuten har anvendelse av dette enzym en påtagelig fordel over anvendelse av enzymet dihydrofolatreduktase ved at et.utstrakt degenereringssystem for kofaktorer ikke behøver å anvendes.
Tetrahydrofolatformylase kan fremstilles av Micrococcus aero<g>enes, Clostridium cvlindrosporum. Clostridium acidi-urici. Clostridium thermoaceticum og av andre mikroorganismer, planter og dyr. D.H. Butlaire, Methods in Enzymology, 66, 585-599 (1980).
Ved anvendelse av radioaktivt merket ammoniumformiat eller hvilke som helst andre, innbefattet in situ fremstilte, radioaktivt merkede maursyresalter eller derivater i den enzymatiske formylering, kan merket (Illb) oppnås og omdannes til merket (IVb) eller merket (Ib). Ved hjelp av enzymet 5,10-metylentetrahydrofolat-dehydrogenase kan hvilken som helst av de radioaktivt merkede, formylgruppebærende 5,6S,7,8-tetrahydro-folåtene (Ib, Illb eller IVb), fortrinnsvis (IVb), bli omdannet til merket 5,10-metylen-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre, som i sin tur, under virkningen av enzymet 5,10-metylentetrahydrof olat-reduktase kan omdannes til radioaktivt merket 5-metyl-5,6S,7.8-tetrahydrofolsyre. Radioaktivt merket (Ib) dannet ved anvendelse av denne oppfinnelse er således en nyttig forbindelse for fremstilling av radioaktivt merket 5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre-derivater.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater også uventet isolering av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre (Ila) som ikke blir formylert av enzymet. Isolert (Ila) kan deretter selges som sådan (kommersielt som en sjelden forbindelse) eller tjene som utgangsmateriale for fremstilling av f.eks. 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre (Ia) i analogi med en fremgangsmåte beskrevet av R.G. Moran og P.D. Colman, Anal. Biochem. 122, 70-78, (1982) ved anvendelse av maursyre med eller uten det vannløselige karbodiimid, l-etyl-3-(3'-dimetylaminopropyl)-karbodiimid. Det foretrekkes imidlertid at isoleringen av (Ila) foretas etter at omdanningen av (Illb) til (IVb) og/eller (Ib) er blitt fullført. Dette tillater en lettere separasjon av komponentene f.eks. ved revers-fase-kromatografi. (Ila) kan også modifiseres i nærvær av (IVb) og/eller (Ib), siden 5-stillingen i (Ila) fremdeles er reaktiv, mens den i (IVb) eller (Ib) ikke er, for å fremstille derivatisert (Ila), f.eks. 5-karboksymentyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre, som kan separeres fra (IVb) eller (Ib) i et enkelt adsorpsjons-trinn.
Dessuten kan fraseparert (Ila) bli omsatt som rapportert av C. Temple, Jr., L.L. Bennett, Jr., J.D. Rose, R.D. Elliot, J.A. Montogmery og J.H. Mangum, J. Med. Chem., 25, 161-166
(1982) til fremstilling av forskjellige 5- og 10-substituerte, 5,10-disubstituerte og 5,10-brosubstituerte 5,6R,7,8-tetrahydrof olsyrederivater. Spesielt kan 5-metyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolat syntetiseres utifrå (Ila) med formaldehyd og natriumborhydrid under basiske betingelser som beskrevet i en fremgangmåte av J.A. Blair og K.J. Saunders, Anal. Biochem., 34, 376 (1970). Alkylering av (Ila) med dimetylsulfat i N,N-dimetylacetamid ved 55°C blir oppnådd ved anvendelse av en fremgangsmåte beskrevet i japansk patent 73 32,120 (1973); Chem. Abst. 80, 2792X (1974).
Ved å substituere maursyre eller alkyleringsmidlene i de ovenfor viste omsetningene med radioaktivt merket maursyre eller derivater derav eller radioaktive alkyleringsmidler, vil det oppnås radioaktivt merkede 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyrederi-vater.
Ifølge denne oppfinnelse kan det fremstilles separat både radioaktivt merkede 5,6S,7,8-tetrahydrofolsyrederivater og radioaktivt merkede 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyrederivater og deres,salter, som er nyttige forbindelser for testing f.eks. ved studium av enzymatiske mekanismer.
Ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av
(6R eller 6S) diastereoisomer av et derivat av tetrahydrofolsyre eller et salt derav, hvilken fremgangsmåte omfatter trinn for:
(a) enzymatisk formylering av 6S formen av en blanding av 6R og 6S diastereoisomerer av tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes en blanding omfattende 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; uomsatt 5,6S,7,8-tetrahydrof olsyre eller et salt derav, og uomsatt 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre, eller et salt derav; ved at enzymet som anvendes er tetrahydrofolat-formylase isolert fra Clostridium sp. ATCC Nr. 7905; og (1) syklisering og hydrolyse av nevnte 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrof olsyre, eller 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrof olsyre eller salter derav, eller begge de foregående, i nærvær av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; og deretter enten (i) derivatisering av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes 5-substituert 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, og deretter separasjonen av komponentene; eller alternativt , (ii) separasjon av eventuell 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre og eventuell 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller salter derav fra 5,6R,7,8-tetrahydro folsyre eller et salt derav; og etter separasjonen, eller om ønsket (2) kjemisk formylering, syklisering, og hydrolyse av nevnte uomsatte 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det fremkommer 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, og om ønsket, (b) omdanning av den i alt vesentlige rene 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, eller 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav til den tilsvarende syre, eller salt.
Produktene fra denne fremgangsmåte er verdifulle i seg selv, f.eks. i terapi, og som mellomprodukter ved fremstilling av andre verdifulle produkter, og når de er radioaktivt merket, kan de anvendes ved studium av f.eks. enzymatiske mekanismer. Spesialister på dette området vil vite hvordan slike forbindelser kan anvendes for slike formål.
Fortrinnsvis blir fremgangsmåten anvendt til fremstilling av en ønsket, i alt vesentlig ren 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt eller en ester derav. Slike forbindelser har verdifulle egenskaper som "rednings"-midler. Spesielt foretrekkes fremgangsmåten hvori det enzym som anvendes for selektiv formylering, omfatter tetrahydrofolat-formylase. Fremgangsmåten kan også anvendes til fremstilling av en ønsket i alt vesentlig ren (6R eller 6S) diastereoisomer av et derivat av (radioaktivt merket) tetrahydrofolsyre eller et salt eller en ester derav. Slike forbindelser kan anvendes
ved studium av enzymatiske mekanismer.
Utgangsforbindelsene som anvendes i denne oppfinnelse, kan fremstilles ved teknikker som er vel kjent for fagfolk på området biokjemiske omdanninger. Blandingen av Ila(R) og Ilb(S) kan fremstilles ved natriumborhydrid-reduksjon av folsyre ved anvendelse av fremgangmåten til C. Temple, Jr., R.D. Elliot, J.D. Rose og J.A. Montgomery, J. Med. Chem., 22, 731 (1979).
Med utgangspunkt i disse forbindelser er reaksjons-skjemaet for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som vist i skjema I:
Som vist i skjema 2, blir (Ila) som kan adskilles fra (Illb) ved kromatografi, formylert med maursyre til å gi, under foreløpig dannelse av (Ia) imidazoliniumsaltet (IVa), som etter krystallisasjon blir hydrolysert til å gi den rene ikke-naturlige isomeren av leucovorin (Ia). Alternativt kan blandingen av (Illb) og (Ila) utføres for å omdanne (Illb) til (IVb) og/eller (Ib), og således frembringe en blanding av (IVb) og/eller (Ib) og (Ila). Kromatografi vil lett adskille komponentene i blandingen, det er (Ila) fra (IVb) og/eller (Ib) .
Denne isolasjonsfremgangsmåten utgjør også en de facto adskillelse av diastereoisomerene 6R og 6S tetrahydrofolsyre. Siden (Ila) kan omdannes i (Ia) kjemisk, vil denne oppfinnelse formelt utgjøre en fremgangsmåte for en effektiv adskillelse av (Ib) fra (Ia) som vanligvis refereres til som den naturlige og den ikke-naturlige formen av leucovorin.
FREMGANGSMÅTE A
Isoleringen og veksten av Clostridium cylindrosporum (også referert til som Clostridium sp. - ATCC No. 7905) blir gjennomført.
Siden Clostridium er anaerob, blir alle dyrkings-, vedlikeholds-, og håndteringsoperasjoner utført under betingelser som minimaliserer eksponeringen av stammen for oksygen. På grunn av tetrahydrofolatets og dets derivaters ekstreme oksygen-labilitet blir likeså alle fremgangsmåter som involverer disse forbindelser, utført under fravær av oksygen. Et apparat bestående av en anaerob plastsekk forbundet med en oksygenfri nitrogengasskilde blir anvendt for dette formål.
1 Fremstilling av urinsyrevekstmedium.
Urinsyremediet fremstilles som beskrevet i ATCC Media Handbook - Resept nr. 519:
Sammensetning av urinsvremedium
<*> 14,9 ml 0,01 N natriumhydroksyd kreves til 0,1 g indikator. Fortynning til 250 ml med destillert vann for 0,04 % løsning. Ved fremstilling av mediet blir urinsyren oppslemmet i nesten hele væske-volumet, oppvarmet til koking, og justert til en permanent rosa farge av fenolrødt (pH 7,6) med natriumhydroksyd. pH kontrolleres med pH papir. For fast medium blir 20,0 g agar tilsatt til mediet. ;Mediet helles i en flaske med skrukork, slik at den blir nesten full, og kokes deretter under gjennom-strømming med oksygenfri nitrogengass. Umiddelbart etter autoklavering blir flaskekorken skrudd ganske tett igjen. ;Mediet blir lagret ved romtemperatur for å forhindre ;urinsyre-utfelling ved lavere temperaturer. ;2. Inokulering av vekstmediet med kultur av Clostridium cvlindrosporum. ;Alle prosedyrer blir utført under anaerobe betingelser i en hanskesekk. En 1,0 ml porsjon av det flytende urinsyremedium blir tilsatt til den lyofiliserte bakteriepellet levert fra ATCC. Pelleten blir løst og en steril engangs inokuler-ingssløyfe anvendes til å stryke ut den gjenopp-slemmede kultur på urinsyreplatemedium. Platene blir plassert i en anaerob krukke som inneholder en H2-C02 genererende innelukning og et metylenblått indikatorpapir. ;Krukken som inneholder de inokulerte platene blir inkubert ved 37°C. Etter 24 timer er veksten synlig på platene som lette, transparente, fingerlignende projeksjoner som stråler ut fra kolonier. En prøve av en representativ koloni betraktet under ;fasekontrast mikroskop, viser typisk Clostridium ;celle-morfologi og sporedannelse. ;3. Fremstilling av en permanent stamkultur av Clostridium cvlindrosporum ;Urinsyreplate-medium blir fremstilt i Hungate-rør (Bellco Glass Co.) - 10 ml medium/rør og tjente som kilde for en permanent stamkultur av Clostridium cylindrosporum. En enkeltkoloni-prøve av celler fra en koloni beskrevet ovenfor tas ut med en steril inokuleringssløyfe og stikkes inn i mediet i Hungate røret. Denne prosedyre utføres i en anaerob sekk inneholdende nitrogengass. Rørene plasseres i den anaerobe krukken og inkuberes ved 35°C. Etter 5 døgn tas rørene ut av krukken og lokkene forsegles tett med parafilm. Rørene blir lagret ved romtemperatur inntil videre anvendelse. 4. Fremstilling av inoculum for flytende dyrkingsmedium Rør med halv-fast urinsyremedium (2,5 g/l Bacto-Agar) blir inokulert med en koloni av Clostridium cylindrosporum, inkubert ved 35°C og lagret ved romtemperatur som beskrevet ovenfor. Disse kulturer tjener som inoculumkilde for dyring i flytende , medium som beskrevet i følgende avsnitt. 5. Dyrking i flytende medium av Clostridium cvlindrosporum ;En myk agarrør-kultur (totalt 10 ml) blir tilsatt til 1 1 flytende urinsyremedium. Alle operasjoner utføres i en anaerob sekk og hele kulturen blir inkubert i en anaerob krukke i 4 døgn ved 35°C. ;FREMGANGSMÅTE B ;Det gjennomføres fremstilling av rått formyltetrahydrofolat-syntetaseekstrakt fra Clostridium cylindrosporum. ;Som i fremgangsmåte A blir all kulturproduksjon, ved-likehold og håndteringsoperasjoner utført under betingelser som minimaliserer eksponering av stammene for oksygen, fordi Clostridium er en anaerob bakterie. På grunn av tetrahydrofolatets og dets derivaters ekstreme oksygenlabilitet blir likeså alle fremgangsmåter som involverer disse forbindelser gjennomført i fravær av oksygen. Et apparat med en anaerob plastsekk forbundet med en oksygenfri nitrogengasskilde blir anvendt for dette formål. Den 1 liters kulturen blir blakket, og partikkelformig materiale sedementerer ut av mediet. Kulturen deles opp i 4 x 250 ml alikvoter og overføres til 4 x 250 ml sentrifugeflasker. Kulturene sentrifugeres ved 4°C, 8.000 OPM, i 15 min. i en Beckman J2-21 sentrifuge. ;Selvom mediet er avkjølt til 4°C, vil urinsyren ikke falle ut, siden den blir forbrukt av bakteriene. Cellepelletene blir slemmet opp igjen i 4 x 2 5 ml iskaldt destillert vann og sentrifugert som ovenfor. Pelletene blir frosset ved -20°C i 5 døgn før de blir analysert på formyltetrahydrofolat-syntetase. ;De frosne pelletene blir tinet i tilsammen 4,0 ml buffer ;(0,05 M kaliumhydrogenfosfat, 0,05 M 2-merkaptoetanol (pH 7,5) ved tilsetning av 1 M kaliumhydroksyd. Pelletene blir blandet og får løse seg ved tidvis omvirvling ved romtemperatur i 60 minutter. Det bemerkes at cellepelletene blir viskøse pga. cellelyse. Autolyse foregår ved romtemperatur. Cellelysatet blir sentrifugert ved 17.000 OPM/30 min., og supernatanten holdes på is og analyseres på formyltetrahydrofolat-syntetase. ;FREMGANGSMÅTE C ;Bestemmelse av formyltetrahydrofolatsyntetase blir gjennomført etter metoden gitt i Buttlaire "Purification and Properties of Formyltetrahydrofolat Syntetase", Enzymology Vol. 66, p. 585, 1980). ;EKSEMPEL 1 ;Reduksjon av folsyre til 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolsyre blir gjennomført ved anvendelse av en ny fremgangsmåte fra litteraturen (C. Temple, Jr., R.D. Elliot, J.D. Rose og J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22, 731 (1979)) ved anvendelse av natriumborhydrid. ;EKSEMPEL 2 ;DANNELSE AV 10- FORMYL- 5. 6S. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE Følgende reaksjonsblanding som er egnet for enzymatisk formylering av 5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre for fremstilling av 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre, blir fremstilt: 100 ml av 1,0M trietanolaminhydroklorid (pH 8,0), 100 ml av 0,5M adenosintrifosfat (pH 8,0), 100 ml av 0,5M kaliumklorid, 100 ml av 0,1 M magnesiumkloridheksahydrat, og 200 ml av 0,2 M ammoniumformiat (pH 8,0). Inneholdet av et helt 5 g glass med 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolsyre (Sigma; 69 % renhet; Lot nr. 117F-5013) blir oppslemmet i 200 ml 0,2 M Tris-HCl/0,05 M 2-merkaptoetanol (pH 7,0) og løst ved tilsetning av ca. 15 ml av en 1 M kaliumhydroksyd. Den klare løsning helles over i den tidligere blanding, og destillert vann (ca. 200 ml) tilsettes for å lage en samlet reaksjonsblanding på 1,0 1 i en 2 liters glassflaske. ;Omsetningen startes ved å tilsette 4 ml av det rå enzym-ekstraktet inneholdende "formyltetrahydrofolatsyntetase" ;(FTHFS) og la omsetningen foregå ved romtemperatur (22°C) . Prøver blir periodisk uttatt for å overvåke fremdriften av omsetningen ved HPLC ved anvendelse av en reversfase-kolonne (C-18) eluert med 0,1 M maursyre modifisert med metanol i en lineær gradient fra 12 til 25 % i løpet av 30 minutter. Eluatet fra kolonnen blir overvåket ved 282 nm for påvisning a 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolsyre ved 12 minutter og 5,10-metenyl-tetrahydrofolsyre ved 16 minutter. Omsetningen er fullstendig etter 18 timer. På dette tidspunkt er 48 % av den opprinnelige mengde av 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolsyre tilbake, som bestemt ved områdene under kurven. En ekvivalent på 1585 mg av 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre fra reaksjons-blandingen blir beregnet fra HPLC kromatogrammet som representerer 5,10-metenyl-tetrahydrofolat. Dette tilsvarer en omdanning på 92 % av teoretisk, tatt i betraktning at bare 1725 mg av de opprinnelige 3450 mg 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolsyre ville være tilgjengelige for den enzymatiske omdannings-reaksjonen. 50 % av det teoretiske blir omdannet etter 5 timer. ;EKSEMPEL 3 ;OMDANNING AV 10- FORMYL- 5. 6S. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE ;TIL 5- FORMYL- 5. 6S. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE Reaksjonsblandingen fra eks. 2 blir overvåket ytterligere 1 dag, men viser ingen forandringer i sin sammensetning. En 100 ml porsjon av blandingen overføres til en trehalset flaske, og pH i løsningen justeres til 6,5 med svovelsyre. Mens den avgasses med nitrogen blir flasken senket ned i vannbad og oppvarmet ved 90-95°C i 2 timer. Reaksjonen blir deretter fortsatt under nitrogen ved 40°C over natten. Denne reaksjons-blandingen har et brunt utseende etter 16 timer. En prøve blir analysert med HPLC ved anvendelse av revers-fase-kolonne (C-18) eluert med 0,1 M maursyre og modifisert med metanol i en lineær gradient fra 12 til 25 % over 30 minutter. Kolonne-eluatet blir overvåket ved 282 nm. HPLC-analysen viser en omdanningsgrad på 90,2 %, tatt i betraktning områdene under kurven, for toppene av 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrof olat og 5-formy1-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre. Arealet på analyseutskriften for 5,6R,7,8-tetrahydro-folsyren, er redusert til 33,1 % i forhold til utgangsarealet (48 %) . ;Prøver av reaksjonsblandingen blir tilsatt via en pumpe ;til en preparativ HPLC reversfase-kolonne (Dynamax 60A-C18, 8 Hia) , 2,1 x 30 cm) og deretter fremkalt med en gradient på 0,1 M vandig maursyre og metanol ved en strømningshastighet på 13 ml/min over 60 minutter. Det oppnås en noe gul 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre i 82 % samlet utbytte, som under de sure elueringsbetingelser (0,1 M vandig maursyre og metanol) får omdannes til 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre som deretter ved henstand ved en konsentrasjon på 3 til 6 mg/ml danner en gel i oppsamlingsglasset. Enantiomer renhet av denne prøve ble bestemt ved HPLC ved anvendelse av en chiral kolonne (Diacel Chiracel OD), ved isokratisk eluering med 0,5 % ammoniumformiat, pH = 3,8, og 25 % metanol. En retensjons-tid på 15,2 min. blir registrert, med en optisk rotasjon i maursyre som følger: ;;EKSEMPEL 4 ;OMDANNING AV 5. 10- METENYL- 5. 6S. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE ;TIL 5- FORMYL- 5. 6S. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE ;OG 5. 6R. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE ;pH for resten av reaksjonsblandingen oppnådd fra eks. 2, blir justert fra 8,0 til 5,0 med svovelsyre, hvilket setter i gang en rask cyklisering av 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre til 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre som deretter ved henstand ved romtemperatur langsomt hydrolyserer under dannelse av 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre. Sistnenvte lar seg ikke påvise i reaksjonsblandingen før pH justeringen. ;Omsetningen følges ved HPLC ved anvendelse av en reversfase kolonne (C-18) eluert med 0,1 M maursyre og modifisert med metanol i en lineær gradient fra 12 til 25 % over 30 minutter. Overvåking av omsetningen ved HPLC viser at mer enn 70 % av den opprinnelige 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre ble omdannet til 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre etter 5 døgn ved romtemperatur, under hvilken tid konsentrasjonen av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre i reaksjonsblandingen forblir uforandret. De formylerte produkter, oppnådd som 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre og 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre, og den ikke formylerte 5,6R,7,8-tetrahydrof olsyre, blir deretter isolert med preparativ HPLC reversfase-kolonne (Dynamax 60A-C18, 8 jum, 2,1 x 30 cm), fremkalt med en gradient på 0,1 M vandig maursyre og metanol ved en strømningshastighet på 13 ml/min. over 60 minutter. Bestemte utbytter av to preparater (hver tilsvarende 50 ml reaksjonsblanding) er som følger: ;* Den isolerte 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre blir umiddelbart tørket og formylert med maursyre (som beskrevet nedenfor) slik at det ble oppnådd 5,10-metenyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre, som, ulikt 6S-formen, krystalliserer ut av fortynnet maursyre.
EKSEMPEL 5
FORMYLERING AV 5. 6R, 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE TIL Å GI
KRYSTALLINSK 5, 10- METENYL- 5. 6R. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE
En 253 mg prøve av kromatografisk renset og lyofilisert 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre blir løst i 50 ml av 97 % maursyre inneholdende 2 % trifluoreddiksyre og får stå ved romtemperatur i reaksjonsflasken under nitrogen uten omrøring. Reaksjonen blir analysert ved HPLC ved anvendelse av en reversfase-kolonne (C-18) eluert med 0,1 M vandig maursyre modifisert med metanol i en lineær gradient fra 12 til 25 % i løpet av 30 minutter og overvåket ved 282 nm. Etter 3 timer er all 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyren blitt omsatt, bedømt ved tilsynekomst av en ny topp som representerer 5,10-metenyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre i HPLC-kromatogrammet. Mesteparten av maursyren blir derfor fjernet ved inndamping, og 30 ml av 0,1 M vandig maursyre ble langsomt tilsatt med tidvis omvirvling av blandingen. Løsningen blir deretter lagret i kjøle-rommet over natten. Det dannes små. gule nåler som gir inntrykk av at løsningen er et fast stoff. Krystallene blir oppsamlet på glass-sintertrakt, vasket med aceton, tørket i våkum, og gir 218 mg gult krystallinsk stoff.
Den enantiomere renhet av krystallinsk 5,10-metenyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre blir bestemt ved anvendelse av en chiral kolonne (Diacel Chiracel OD), eluert isokratisk med 0,5 % ammoniumformiat med pH 3,8 og 25 % metanol. Produktet 5,10-metenyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eluerte ved 18,2 minutter.
Den optiske rotasjon, bestemt som løsning i 88 % maursyre, er som følger:
EKSEMPEL 6
DERIVATISERING AV 5 . 6R. 7 . 8- TETRAHYDROFOLSYRE I NÆRVÆR
AV 5- FORMYL- 5. 6S. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE OG/ ELLER
5. 10- METENYL- 5. 6S. 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE
Etter modifikasjon av fremgangsmåten fremsatt av L. Rees, C.J. Suckling og H.C.S. Wood, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470
(1987), blir (-)mentylklorformiat tilsatt til en prøve av omsetningsblandingen fra eks. 4, justert til pH 7, hvilket fører til karboksymentylering av bare 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre og etterlater 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre og/eller 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre uomsatt. Omsetningen ble overvåket ved HPLC. En effektiv separasjon av 5-mentyl-oksykarbonyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre fra de uomsatte komponentene blir gjennomført ved å lede omsetningsblandingen over en XAD-2 fyllt kolonne. 5-mentyloksykarbonyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyren blir absorbert av harpiksen, mens 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyren eller 5,10-metenyl-5, 6S,7,8-tetrahydrofolsyren passerer gjennom.
EKSEMPEL 7
RENSING AV 5- F0RMYL- 5. 6S. 7, 8- TETRAHYDROFOLSYRE.
5, 6R, 7. 8- TETRAHYDROFOLSYRE OG ANDRE DERIVATER
VED PREPARATIV HPLC
Porsjoner (50 eller 100 ml) av omsetningsblandingen fra eks. 4 blir fyllt direkte på reversfase-kolonnen (Dynamax 60A-C18, 8 /xm, 2,1 x 30 cm) gjennom en matepumpe, og deretter blir den fremkalt med en gradient på 0,1 M vandig maursyre og metanol ved en strømningshastighet på 13 ml/min i løpet av 60 minutter. Den anvendte gradient starter med en metanol-konsentrasjon på 5 % for å nå 10 % etter 12 minutters kjøre-tid. Konsentrasjonen på 10 % metanol blir deretter holdt konstant for de neste 10 minutter, ved hvilket tidspunkt (22 minutters kjøretid) metanolinnholdet blir øket lineært slik at det når 18 % etter 38 minutter og derifra økes ytterligere for å nå 25 % etter 52 minutters kjøretid. Denne konsentrasjonen blir ikke ytterligere øket inntil slutten av kjøringen. Kolonne-avløpet blir overvåket ved 319 nm fordi 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolat og 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre har samme absorpsjonskoeffisient ved denne bølge-lengde .
Under disse preparative betingelser eluerte 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre mellom 11 og 17,5 minutter, mens 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyren eluerte mellom 39,5 og 44,5 minutter. Elueringen av 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydro-folatbåndet er sterkt konsentrasjonsavhengig, og kommer til syne mellom 20 og 30 minutter som en krypende topp. 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyrebåndet og 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydro-folatbåndet kan ikke separeres fullstendig når mer enn 140 ml av omsetningsblandingen, tilsvarende 700 mg stoff, blir påfyllt.
Eluerende bånd av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre og 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre blir oppsamlet i glassflasker som er neddykket i tørris, slik at væsken kan fryse umiddelbart. De frosne fraksjonene blir deretter lyofilisert slik at det oppnås et gråhvitt pulver i tilfellet 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre, og et gulhvitt pulver i tilfellet 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre. HPLC-analyse gjennomføres på disse pulvere ved anvendelse av 1 reversfase-kolonne (Dynamax 60A-C18, 8 /im, 2,1 x 30 cm) fremkalt med en gradient av 0,1 M vandig maursyre og metanol. Det ble vist at 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydro-folsyren er 97 % og at 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyren er 93 % rene ved området under kurven. På grunn av ustabiliteten av 5,6R,7,8-tetrahydrofol-syren, blir den omdannet ved kjemisk formylering til den mere stabile 5,10-meteny1-5,6R,7,8-tetrahydrof ol syren. For å motvirke eventuelle stabilitetspro-blemer for 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre blir denne forbindelse omdannet til sitt kalsiumsalt som beskrevet i eks. 8.
EKSEMPEL 8
FREMSTILLING AV KALSIUM 5- FORMYL— 5. 6S. 7. 8— TETRAHYDROFOIAT
ELLER KALSIUM 5- F0RMYL- 5. 6R. 7. 8- TETRAHYDR0F0LAT
Som en modifikasjon av fremgangsmåten publisert av C. Temple, Jr., R.D. Elliott, J.D. Rose og J.A. Montgomery, J. Med. Chem., 22, 731 (1979) for fremstilling av racemisk kalsium 5-formyl-5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolat, blir den fremstilte 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre vasket med eter for å fjerne eventuelt ammoniumformiat. 62 mg av det vaskede materialet blir deretter løst i 32 ml avgasset metanol (salt-fri folinsyre er godt løselig i metanol) som blir tilsatt ca. 1 ml av en metanolisk kalsiumkloridløsning (72 mg kalsium-klorid pr. ml metanol). Tilsetningen av saltet forårsaker umiddelbar dannelse av et nesten hvitt bunnfall som blir oppsamlet på glass-sinter-trakt og tørket i vakuum. Utbytte etter tørkingen er 60,5 mg (90 % av teoretisk utbytte).
Dersom denne fremgangsmåte blir gjentatt med 6R-stoffer, vil det bli oppnådd kalsium 5-formy1-5,6R,7,8-tetrahydrofolat.
Renheten av de fremstilte forbindelser blir bestemt ved UV/HPLC, uansett tilstedeværelse av eventuelt ikke-UV-absor-berende stoff. Enantiomer renhet blir bestemt ved trinnet for 5,10-metenyl-5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolat-derivatene ved HPLC ved anvendelse av en chiral kolonne (Diacel Chiracel OD) eluert isokratisk med 0,5 % ammoniumformiat pH 3,8 og 25 % metanol. 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eluerer først med 15,2 minutters retensjon mens 5,10-metenyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eluerer ved 18,2 minutter.
Løsninger av de fremstilte forbindelser i maursyre i stedet for i 10 M eller 12 M saltsyre, som rapportert i literaturen, ble anvendt til å registrere deres optiske rotasjonsegenskaper, pga. maursyrens reduserte surhet og dens økte løseevne for folater. Prøver av preparatene ovenfor viste følgende optiske rotasjoner:
EKSEMPEL 9
FREMSTILLING AV RADIOAKTIVT MERKET FORMYLFOLSYRE
OG DERIVATER
Dersom fremgangsmåten i eks. 2 blir gjentatt ved å erstatte ammoniumformiat med radioaktivt merket ammoniumformiat eller et hvilket som helst annet radioaktivt merket maursyre-derivat, vil det bli oppnådd en radioaktivt merket 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre. Dersom denne blir underkastet fremgangsmåten i eks. 3 til og med 8, vil det bli oppnådd de tilsvarende radioaktivt merkede syrene og saltene.
De ovennevnte patenter, publikasjoner og testmetoder er inkorporert heri ved referanse.
Den foregående detaljerte beskrivelse vil antyde mange åpenbare variasjoner for fagfolk på dette området. For eksempel kan det, i stedet for kalsiumleucovorin, fremstilles strontium leucovorin og natrium leucovorin. Tetrahydrofolat-formylasen kan oppnås ved hjelp av Clostridium acidi-urici.
Claims (8)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av en (6R eller 6S) diastereoisomer av et derivat av 5,6(R eller S),7,8-tetrahydrof olsyre eller et salt derav, karakterisert ved følgende trinn: (a) enzymatisk formylering av 6S formen av en blanding av 6R og 6S diastereoisomerer av tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes en blanding omfattende 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; uomsatt 5,6S,7,8-tetrahydrof olsyre eller et salt derav; og uomsatt 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; ved at enzymet som anvendes er tetrahydrofolatformylase isolert fra Clostridium sp. ATCC Nr. 7905, og (1) syklisering og hydrolyse av nevnte 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrof olsyre, eller 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller salter derav, eller begge de foregående, i nærvær av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; og deretter enten (i) derivatisering av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes 5-substituert 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, og deretter separasjonen av komponentene; eller alternativt (ii) separasjon av eventuell 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre og eventuell 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller salter derav fra 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; og etter
separasjonen, eller om ønsket (2) kjemisk formylering, syklisering, og hydrolyse av nevnte uomsatte 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det fremkommer 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, og om ønsket, (c) omdanning av den i alt vesentlige rene 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, eller 5-formyl-5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav til den tilsvarende syre eller salt.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at den kjemiske formylering av uomsatt 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre blir utført med maursyre.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at omdanningstrinnet (c) omfatter omdanning av folsyrederivatet til det tilsvarende salt.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,
karakterisert ved at nevnte salt omfatter et kalsiumsalt, magnesiumsalt, strontiumsalt, jernsalt eller blandinger av hvilke som helst av de foregående.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at nevnte enzymatiske formylering blir gjennomført i en reaksjonsblanding som inneholder radioaktivt merket maursyre eller en kjemisk
ekvivalent.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av en ønsket i alt vesentlig ren 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav,
karakterisert ved trinnene: (a) enzymatisk formylering av 6S-formen av en blanding av 6R- og 6S-diastereoisomerene av 5,6,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes en blanding omfattende 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; uomsatt 5, 6S, 7,8-tetrahydrof olsyre eller et salt derav dersom den er tilstede; uomsatt 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav;
og ved at enzymet som anvendes er tetrahydrofolatformylase isolert fra Clostridium sp. ATCC nr. 7905, (b) syklisering og hydrolyse av nevnte 10-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav, slik at det dannes 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre, eller 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller salter derav, eller begge av de foregående, i nærvær av 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; og deretter (c) separasjon av eventuell 5,10-metenyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller salter derav fra 5,6R,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav; og etter separasjon, om ønsket (d) omdanning av den i alt vesentlige rene 5-formyl-5,6S,7,8-tetrahydrofolsyre eller et salt derav til den tilsvarende syre eller salt.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,
karakterisert ved at omdanningstrinnet (d) omfatter omdanning av folsyrederivatet til det tilsvarende salt.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,
karakterisert ved at nevnte salt omfatter et kalsiumsalt, magnesiumsalt, strontiumsalt, jernsalt eller blandinger av hvilke som helst av de foregående.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44966289A | 1989-12-11 | 1989-12-11 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO905325D0 NO905325D0 (no) | 1990-12-10 |
| NO905325L NO905325L (no) | 1991-06-12 |
| NO177541B true NO177541B (no) | 1995-06-26 |
| NO177541C NO177541C (no) | 1995-10-04 |
Family
ID=23785009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO905325A NO177541C (no) | 1989-12-11 | 1990-12-10 | Fremgangsmåte ved fremstilling av optisk rene diastereoisomere tetrahydrofolatforbindelser ved hjelp av 10-formyltetrafolat syntetase isolert fra Clostridium |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334535A (no) |
| EP (1) | EP0432441B1 (no) |
| JP (1) | JP3027613B2 (no) |
| KR (1) | KR0172118B1 (no) |
| CN (1) | CN1031804C (no) |
| AR (1) | AR245134A1 (no) |
| AT (1) | ATE139799T1 (no) |
| AU (1) | AU641710B2 (no) |
| CA (1) | CA2031784C (no) |
| CZ (1) | CZ279998B6 (no) |
| DE (1) | DE69027585T2 (no) |
| DK (1) | DK0432441T3 (no) |
| ES (1) | ES2090075T3 (no) |
| FI (1) | FI103804B (no) |
| GR (1) | GR3021060T3 (no) |
| HU (1) | HU209761B (no) |
| IE (1) | IE904439A1 (no) |
| IL (1) | IL96265A0 (no) |
| NO (1) | NO177541C (no) |
| NZ (1) | NZ236370A (no) |
| PL (1) | PL166096B1 (no) |
| PT (1) | PT96120B (no) |
| SK (1) | SK610390A3 (no) |
| ZA (1) | ZA909899B (no) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH681303A5 (no) * | 1991-01-16 | 1993-02-26 | Eprova Ag | |
| DE4136921A1 (de) * | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Knoll Ag | Verfahren zur trennung von 5-methyl-tetrahydrofolsaeure |
| CH683262A5 (it) * | 1992-01-22 | 1994-02-15 | Applied Pharma Res | Procedimento per la separazione dei diastereomeri del sale di calcio dell'acido (6(R,S)-N-formiltetraidrofolico). |
| IT1254635B (it) * | 1992-02-20 | 1995-09-28 | Bracco Spa | Processo per la separazione degli stereoisomeri dell'acido folinico |
| CH686369A5 (de) * | 1994-05-09 | 1996-03-15 | Eprova Ag | Stabile kristalline (6S)- und (6R)-Tetrahydrofolseure. |
| CH693255A5 (de) * | 1997-06-13 | 2003-05-15 | Eprova Ag | Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels. |
| CH694251A5 (de) * | 1999-07-14 | 2004-10-15 | Eprova Ag | Herstellung von Tetrahydropterin und Derivaten. |
| WO2001077367A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-18 | Rothenberg Sheldon P | Radioenzymatic assay for methylenetetrahydrofolate reductase |
| CH696699A5 (de) * | 2006-01-19 | 2007-10-15 | Cerbios Pharma Sa | Verfahren zur regioselektiven N(5) -Formylierung von (6S) -5, 6, 7, 8-Tetrahydropteroinsäure und Derivaten davon. |
| WO2010017526A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | The Scripps Research Institute | Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof |
| WO2014018873A2 (en) * | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Chemic Laboratories Inc. | Compositions comprising folic acid derivatives. their preparations and methods of use |
| CN115656372A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-01-31 | 北京斯利安药业有限公司 | 一种s-四氢叶酸异构体手性分析方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4500711A (en) * | 1977-03-21 | 1985-02-19 | Burroughs Wellcome Co. | Synthesis of leucovorin |
| US4148999A (en) * | 1977-08-22 | 1979-04-10 | The Government Of The United States Of America | Preparation and purification of citrovorum factor |
| GB8621268D0 (en) * | 1986-09-03 | 1986-10-08 | Univ Strathclyde | Separation of substances |
| US4746662A (en) * | 1987-02-20 | 1988-05-24 | American Cyanamid Company | Treatment of arthritis with 3,5-dichloromethotrexate |
| DE3821875C1 (no) * | 1988-06-29 | 1990-02-15 | Eprova Ag, Forschungsinstitut, Schaffhausen, Ch | |
| FR2643081B1 (fr) * | 1989-02-14 | 1991-06-07 | Panmedica Sa | Folates de magnesium, procede de preparation et compositions pharmaceutiques |
| CH680731A5 (no) * | 1990-04-12 | 1992-10-30 | Sapec Fine Chemicals | |
| JPH07332120A (ja) * | 1994-06-08 | 1995-12-22 | Sanshin Ind Co Ltd | 多気筒エンジン |
-
1990
- 1990-11-05 ES ES90121120T patent/ES2090075T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90121120A patent/EP0432441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DE DE69027585T patent/DE69027585T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DK DK90121120.1T patent/DK0432441T3/da active
- 1990-11-05 AT AT90121120T patent/ATE139799T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-06 IL IL96265A patent/IL96265A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-11-27 CN CN90109616A patent/CN1031804C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-06 NZ NZ236370A patent/NZ236370A/xx unknown
- 1990-12-07 SK SK6103-90A patent/SK610390A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 CZ CS906103A patent/CZ279998B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 CA CA002031784A patent/CA2031784C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 PT PT96120A patent/PT96120B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 AU AU67932/90A patent/AU641710B2/en not_active Expired
- 1990-12-10 KR KR1019900020269A patent/KR0172118B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 AR AR90318584A patent/AR245134A1/es active
- 1990-12-10 NO NO905325A patent/NO177541C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 JP JP2407190A patent/JP3027613B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-10 ZA ZA909899A patent/ZA909899B/xx unknown
- 1990-12-10 FI FI906072A patent/FI103804B/fi active IP Right Grant
- 1990-12-10 IE IE443990A patent/IE904439A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-11 PL PL90288204A patent/PL166096B1/pl unknown
- 1990-12-11 HU HU908159A patent/HU209761B/hu unknown
-
1992
- 1992-09-18 US US07/947,641 patent/US5334535A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-18 GR GR960402428T patent/GR3021060T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO177541B (no) | Fremgangsmåte ved fremstilling av optisk rene diastereoisomere tetrahydrofolatforbindelser ved hjelp av 10-formyltetrafolat syntetase isolert fra Clostridium | |
| Baugh et al. | Biosynthesis of riboflavine in Corynebacterium species: the purine precursor | |
| JPS62272986A (ja) | 抗生化合物の製法 | |
| Avissar | Biosynthesis of 5-aminolevulinate from glutamate in Anabaena variabilis | |
| JPH0673452B2 (ja) | 新規バチルス・ズブチリス | |
| JPH0491793A (ja) | 発酵法によるアミノ酸の製造法 | |
| EP0229219A2 (en) | Urease and process for preparation thereof | |
| Silverman et al. | Labile citrovorum factor in urine | |
| CA1187432A (en) | Microorganism and its use for the preparation of glutathione | |
| Gray et al. | Metabolism of alloxanic acid in a soil microorganism | |
| ICHIHARA et al. | Studies on the Oxidative Decomposition of Urocanic Acid. IV Isolation of Hydantoin Acrylic Acid and Other Intermediates | |
| EP0761818B1 (en) | Method for producing folic acid | |
| Piffeteau et al. | Mechanism of the antibiotic action of. alpha.-dehydrobiotin | |
| KR830002916B1 (ko) | 발효에 의한 세팔로스포린 제법 | |
| JPH03103186A (ja) | 醗酵法によるエバーメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａおよびＢ２ａの製造法およびストレプトミセス・アベルミチルスに属する新菌株 | |
| LIN | THE SYNTHESIS OF FOLIC ACID: THE OCCURRENCE OF A PHOSPHORYLATED INTERMEDIATE IN THE REACTION OF HYDROXYLMETHYLPTERIDINE PYROPHOSPHATE WITH EITHER PARA-AMINOBENZOYL GLUTAMIC ACID. | |
| JPS5931690A (ja) | 光学活性乳酸の製造方法 | |
| JPH06113876A (ja) | 発酵法によるヌクレオシドの製造法 | |
| Zygmunt et al. | Formation of folic acid related compounds by Bacillus subtilis | |
| JPH09168393A (ja) | 同位体を有する５−アミノレブリン酸の製造方法 | |
| Arzu | Investigations of the biosynthesis of sinefungin | |
| JPS5816694A (ja) | グルタチオンの製造法 | |
| Metzenberg | Studies on the biosynthesis of aromatic compounds in Neurospora crassa | |
| Cadicamo | Mechanistic studies on enzymes of secondary metabolism: 5'-fluoro-5'-deoxyadenosine synthase and 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase | |
| JPH08501215A (ja) | 抗生物質ｇｅ２２７０因子ａの生産を選択的に増加させる方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |