KR0172118B1

KR0172118B1 - 광학적으로 순수한 테트 라하이드로폴레이트 화합물의 부분입체 이성질체의 제조 방법

Info

Publication number: KR0172118B1
Application number: KR1019900020269A
Authority: KR
Inventors: 슐링만 게르하르트; 엘란 로젠펠드 스튜어트
Original assignee: 알퐁스 아아르 노에; 아메리칸 사이아나밋드 캄파니
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-12-10
Publication date: 1999-02-01
Also published as: FI103804B1; JP3027613B2; PT96120B; JPH0491089A; CZ610390A3; AR245134A1; PL288204A1; IE904439A1; US5334535A; CN1052509A; NO177541C; PL166096B1; EP0432441B1; ATE139799T1; AU641710B2; HUT61335A; CN1031804C; CA2031784A1; FI906072A0; PT96120A

Abstract

광학적으로 순수한 테트라하이드로폴레이트 화합물의 부분입체 이성질체의 제조 방법은, 5,6,7,8-테트라하이드로폴산의 라세미 혼합물 중 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 성분만을 포르밀 테트라하이드로폴레이트 합성 효소의 존재하에 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로 전환시킨 다음, 고리화시키고, 가수분해하여 유도체화한다. 또한 이 방법은 소망하는 실질적으로 순수한 (방사성표지된) 테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 유도체의 (6R 또는 6S) 거울상 이성질체를 제조하는데 유용하다.

Description

광학적으로 순수한 테트라하이드로폴레이트 화합물의 부분입체 이성질체의 제조 방법

본 발명은 5,6,7,8-테트라하이드로폴산의 라세미 혼합물 중 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 성분만을 세균 유래의 포르밀 테트라하이드로폴레이트 합성효소의 존재하에 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로 전환시키는 것으로 이루어지는 광학적으로 순수한 테트라하이드로폴레이트 화합물의 부분입체 이성질체의 신규 제조 방법에 관한 것이다.

류코보린(leucovorin)과 이의 염은 제약학적으로 유효한 것으로 알려져 있다. Remington's Pharmaceutical Services, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985(Remington's) p. 1023 참조. Kerwar et al., 미국 제 4,746,662호는 메토트렉세이트의 항관절염성 효능이 류코보린이나 이 염의 수용액을 주사함으로써 강화될 수 있음을 개시하고 있다. 유럽 특허 공개 1988년 5월 4일자 제 0,2666,042호는 결장직장암의 치료를 위해 5-플루오로우라실과 조합하여, 그리고 폴레이트 결핍을 치료하기 위하여, 메토트렉세이트 구조(rescue)를 위한 약물을 제조하기 위하여 류코보린 이성질체를 사용하는 것을 기술한다. 미국 제 4,500,711호에서, 위소와티 등(Wisowaty et al.)은 류코보린과 이 염의 정제를 기술한다.

류코보린은 보통 류코보린의 칼슘염 같은 알칼리 금속 및 알칼리토금속염 같은 염의 형태로 투여되며, 1-이성질체가 바람직하다.

화합물 N-((2-아미노-5-포르밀-3,4,5,6,7,-헥사하이드로-4-옥소-6-프테리디닐)메틸아미노)벤조일)-L-글루타민산, 칼슘염(1:1), 오수화물(류코보린 칼슘 USP)이 C-6에서 각각 (R)과 (S) 입체화학을 갖는 일반식(Ia 와 Ib) 1:1 혼합물의 칼슘염으로서 시판된다.

이것은 주로 메토트렉세이트 같은 폴산 길항물질에 대한 해독제로서 사용되며, 디하이드로폴산이 테트라하이드로폴산으로 전환되는 것을 차단한다. Leucovorin Calcium Injection in the Physician's De나 Reference, 43 판, Medical economics Company, Oradell, NJ 1989 (PDR 43rd Ed.) p. 1124에 기술된 바와 같이, 류코보린 염은 적당한 방부제와 함께 주사를 위해 물에 배합된다.

두 이성질체의 약동학적 양태는 (S)-이성질체(Ib)가 위장관으로부터 선택적으로 흡수되며, (R)-이성질체 (Ia)에 비해 더 짧은 혈장 반감기를 갖는다는 점에서 다르다.

자연적으로 존재하는 이성질체 Ib인, 6S 부분입체 이성질체는 일탄소복원 대사에서 이것의 효과 때문에 구조 요법에 중요한 것으로 보고되어 있다(C. Temple, Jr., J.P. Rose, W.R. Laster, 및 J.A. Montgomery, Cancer Treatment Reports, 65, 1117-1119 (1981)).

엘. 카세이 (L. casei)로부터의 티미딜레이트 합성은 5,10-메틸렌 테트라하이드로폴레이트의 비자연성 부분입체 이성질체에 의해 억제된다는 보고(R.P. Leary, Y. Gaumont, 및 R.L. Kisliuk, Biochem. 및 Biophys. Res. Commun., 56, 484-488 (1974)와 대장균으로부터의 5,10-메틸렌 테트라하이드로폴레이트 탈수소효소는 동일한 부분입체 이성질체에 의해 또한 억제된다는 보고 (V.F. Scott 및 K.O. Donaldson, Biochem. 및 Biophys. Res. Commun., 14, 523-526 (1964))는, 동일한 10-포르밀테트라하이드로폴레이트의 부분입체 이성질체가 닭 간으로부터의 글리신아미드 리보뉴클레오티드 포르밀 전이효소(GAR)의 강력한 경쟁 억제인자라는 관찰과 결부하여 테트라하이드로폴레이트의 일탄소 유도체의 비자연성 부분입체 이성질체에 의한 피리미딘과 퓨린 생합성의 억제 및 그로 인한 DNA 생합성의 억제를 시사한다. 그러므로, 비자연성 형태는 생물학적 불활성으로 생각할 수 없다. 이러한 억제가 포유동물 시스템에 존재한다면, 테트라하이드로폴레이트의 자연형(6S) 특히, 류코보린만을 위한 강력한 임상 필요조건이 존재한다.

부분입체 이성질체 성분 Ia 와 Ib 는 분별결정 및 크로마토그래피(J. Feeney, B. Birdsall, J.P. Albrand, G.C.K. Roberts, A.S. Bungen, P.A. Charlton 및 D.W. Young, Biochem., 20, 1837 (1981))에 의해 분리(D.B. Cousulich, J.M. Smith, Jr. 및 H.P. Proglist, J. Am. Chem. soc., 74, 4215(1953)) 되어 왔다. 디하이드로폴레이트 환원효소에 의해 촉매되는 디하이드로폴레이트의 입체특이성 환원반응이 입체특이적이므로 6(S)-이성질체를 제공하는 것으로 보고되었다.(L. Rees, E. Valente, C.J. Suckling 및 H. C. S. Wood, Tetrahedron, 42, 117(1986)).

L. Lees, E. Valents, C.J. Suckling 및 H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42, 117-136(1986)에 의한 보고서는 류코보린을 포함하여, 테트라하이드로폴레이트의 키랄 유도체의 합성을 기술한다. 이 시스템은 대장균으로부터의 디하이드로폴레이트 환원효소의 사용 및 보조인자 NADPH를 환원하는 광범위하고 값비싼 재순환을 필요로 한다. L. Rees, C.J. Suckling 및 H.C.S. Wood, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470, (1987) (유럽 특허 출원 0 266 042 A2에 의한 다른 보고서는 (-)-메틸 클로로포름에이트로 6(R,S)-테트라하이드로폴레이트를 아실화하여 분별 침전에 의해 분리되는 부분입체 이성질체 혼합물로서 N-5 유도체를 제공하는 것을 기술한다. 아세트산 내에서 포름산과 수소화브롬으로 각 부분입체 이성질체를 처리한 후 가수분해하여 5-포르밀 테트라하이드로폴레이트의 각각의 부분입체 이성질체를 제공한다.

현재 테트라하이드로폴레이트 화합물의 광학적으로 순수한 부분입체 이성질체는 본 발명에 따라 용이하게 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 놀랍게 단순하다는 점에서 이전에 공고 또는 특허된 방법보다 큰 잇점을 갖는다. 왜냐하면, 핵심단계에서 단지 하나의 효소, 테트라하이드로폴레이트 포르밀라제, 소위 포름에이트 활성 효소 또는 포르밀테트라하이드로폴로에트 합성효소(FTHFS)의 사용만을 필요로하는데, 이는 5,6(R,S),7,8-테트라하이드로폴산(IIa, b)의 라세미 혼합물을 사용할 때 필요한 포르밀기를 6S 부분입체 이성질체에만 선택적으로 첨가한다. 더욱이, 이 효소의 이용은 보조인자를 위한 광범위한 재생 시스템이 사용될 필요가 없다는 점에서 디하이드로폴레이트 환원효소의 사용보다 뚜렷한 잇점을 갖는다.

테트라하이드로폴레이트 포르밀라제는 마이크로코쿠스 에어로겐스(Micrococcus agrogenes), 클로스트리듐 실린드로스포룸 (Clostridium cylindrosporum), 클로스트리듐 아시디-우리시 (Clostridium acidi-urici), 클로스트리듐 써모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum) 및 다른 미생물, 식물 및 동물에 의해 생산될 수 있다. (D.H. Butlaire, Methods In Enzymology, 66, 585-599 (1980).

효소적 포르밀화에 있어서 방사선 표지된 암모늄 포름에이트 또는 현장에서 제조되는 다른 방사선 표지의 포름산염 또는 유도체들을 사용함으로써, 표지된(IIIb)를 얻을 수 있고 표지된(IVb)또는 표지된 (Ib)로 전환시킬 수 있다. 5,6S,7,8-테트라하이드로폴레이트(Ib, IIIb, 또는 IVb), 바람직하게는 (IVb)를 가지는 임의의 방사선 표지된 포르밀기를 효소 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 수소이탈 효소의 도움으로, 표지된 5,10-메틸렌-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로 변형시킬 수 있고, 차례로 효소 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원 효소의 작용하에 표지된 5-메틸-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로 전환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 적용에 의해 생성된 방사성 표지된(Ib)는 방사성 표지된 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 유도체의 제조에 유용한 화합물이다.

또한 발명된 방법은 의외로 효소에 의해 포르밀화되지 않은 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산(IIa)의 분리도 가능케한다. 그런다음 분리된(IIa)는 그 자체로서 (회유 화합물(rare compound)로서 시판됨) 판매될 수 있거나, 또는 수용성 카보디이미드, 1-에틸-3-(3′-디메틸-아미노프로필)카보디이미드와 함께 또는 없이 포름산을 사용하여 R.G. Moran 및 P.D. Colman, Anal. Biochem. 122, 70-78 (1982)에 기술된 방법과 유사하게 5-포르밀-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산(Ia)의 제조를 위한 출발 물질로 기여할 수도 있다. 그러나, (IIb)의 (IVb) 및/또는 (Ib)로의 전환이 완료된 후 (IIa)를 분리하는 것이 바람직하다.

예컨대, 역상 크로마토그래피에 의해 성분들을 보다 쉽게 분리하는 것이 가능하다. 또한, (IIa)는, (IIa)의 5-위치가 여전히 반응성이 있는 반면에 (IVb) 또는 (Ib)의 것은 반응성이 없으므로, (IVb) 및/또는 (Ib)의 존재 하에서 변형될 수 있어, 유도체화된 (IIa), 예컨대 5-카르복시멘틸-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산을 제조할 수 있으며, 이는 간단한 흡착 단계에 의해 (IVb) 또는 (Ib)로부터 분리될 수 있다.

더욱이, 분리된 (IIa)는 C. Temple, Jr., L. L. Bennett, Jr., J.D. Rose, R. D. Elliott, J. A. montgomery 및 J. H. Mangum, J. Med. Chem., 25, 161-166 (1982)에 의해 보고된 바와 같이 반응되어 각종 5-및 10-치환, 5, 10-이치환, 및 5,10-브리지 치환된 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 유도체를 제조할 수 있다. 특히, 5-메틸-5,6R,7,8-테트라하이드로폴레이트는 J.A. Blair 및 K. J. Saunders, Anal. Biochem., 34, 376(1970)에 의한 방법에서 기술된 바와 같은 염기성 조건 하에서 포름알데히드와 나트륨 보로하이드라이드와 함께(IIa)로부터 합성될 수 있다. N,N-디메틸아세트아미드 내에서 (IIa)를 디메틸술페이트로 55℃에서 알킬화하는 것은 일본 특허 73 32,120 (1973); Chem. Abst., 80, 2792X (1974)에 기술된 방법을 사용하여 수행된다.

상기에 나타낸 반응에서 포름산 또는 알킬화제를 방사성 표지의 포름산 또는 이의 유도체 또는 방사성 알킬화제로 치환함으로써, 방사성 표지된 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 유도체를 얻게 된다.

본 발명에 따라서, 방사성 표지된 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 유도체 및 방사성 표지된 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 유도체 및 이의 염은 모두 개별적으로 제도될 수 있으며, 테스트, 예컨대 효소 기작을 연구하는데 유용한 화합물이다.

본 발명에 따라서, 소망하는 실질적으로 순수한 테트라하이드로폴산 유도체의 (6R 또는 6S) 부분 입체 이성질체 또는 이의 염 또는 에스테르의 제조방법이 제공되며, 이 방법은

(a) 테르하이드로폴산 또는 치환된 테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 6R 및 6S 부분입체 이성질체 혼합물의 6S 형을 효소적으로 포르밀화하여 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르; 존재한다면 미반응 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 함유하는 혼합물을 형성하고;

(b) (1) 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르로부터 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 분리한 후, 상기 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 고리화하고 가수분해하여 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산, 또는 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르, 또는 상기의 것 둘다를 형성하거나; 또는

(2) 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 존재하에서, 상기 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 고리화하고 가수분해하여 5,10-메티닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산, 또는 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르, 또는 상기의 것 둘다를 형성한 다음; 그 후에

i) 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 유도체화하여 5-치환 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 형성한 다음 이 성분을 분리하거나; 또는 대안적으로

ii) 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르로부터 임의의 5, 10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산과 임의의 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 에스테르를 분리하고; 분리후, 소망하면

(3) 상기의 미반응 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 화학적으로 포르밀화하고 고리화하여 가수분해하여 5-포르밀-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 제조하거나, 또는 대안적으로 상기의 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 다른 작용기로 유도체화하여 5-치환 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 형성하고; 소망하면

(c) 실질적으로 순수한 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르 또는 5-포르밀-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 상응하는 산, 염 또는 에스테르로 전환시키는 단계로 구성된다.

본 방법의 생성물은 당연히 치료에 있어, 그리고 다른 유익한 생성물 만드는 중간물질로서 그 자체로 유용하며, 방사성 표시될 때는 효소 기작을 연구하는데 사용될 수 있다. 당 분야에서 숙련된 사람들은 그러한 목적을 위해 이러한 화합물을 사용하는 방법을 알 것이다.

바람직하게는, 본 방법은 소망하는, 실질적으로 순수한 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 제조하는데 이용된다. 이러한 화합물은 구조제(rescue agent)로서 유익한 성질을 갖는다. 선택적으로 포르밀화하는데 사용되는 효소가 테트라하이드로폴레이트 포르밀라제로 이루어진 방법이 특히 바람직하다. 또한, 이 방법은 소망하는 실질적으로 순수한 (방사성 표지된) 테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르 유도체의 (6R 또는 6S) 부분입체 이성질체를 제조하는데 유용하다. 이러한 물질은 효소 기작을 연구하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 출발 화합물은 당 분야에서 숙련된 사람들에게는 잘 알려진 생화학적 변형 기술에 의해 제조될 수 있다. IIa(R)과 IIb(S)의 혼합물은 C. Temple, Jr., R.D. Elliott, J.D. Rose 와 J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22 , 731(1979)의 방법을 사용하여 폴산의 나트륨 보로하이드라이드 환원에 의해 제조될 수 있다.

이러한 물질로 시작하여, 본 발명의 방법의 반응도가 도표 1에 보여진다.

도표 2에서 보여지는 바와 같이, 크로마토그래피에 의해 (IIIb)로부터 분리될 수 있는 (IIa)는 포름산으로 포르밀화되어, (Ia)의 간헐적인 형성하에, 이미다졸리늄염 (IVa)를 제공하는데, 이는 결정화한 후에 가수분해되어 순수한 류코보린(Ia)의 비자연성 이성질체를 제공한다. 또한, (IIIb)와 (IIa)의 혼합물은 (IIIb)를 (IVb) 및/또는 (Ib)로 전환시키기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 (IVb) 및/또는 (Ib) 및 (IIa)의 혼합물을 생성한다. 크로마토그래피로 혼합물의 성분, 즉 (IVb) 및/또는 (Ib)로부터 (IIa)는 쉽게 분리된다.

또한 이 분리 방법은 6R과 6S 테트라하이드로폴산 부분입체 이성질체의 de facto 분리를 구성한다. (IIa)는 (Ia)로 화학적으로 변형될 수 있으므로, 본 발명은 류코보린의 자연성 및 비자연성 형태로서 보다 일반적으로 불리우는 (Ia)로부터 (Ib)의 효과적인 분리를 위한 방법을 공식화한다.

다음의 실시예들은 본 발명은 설명하는 것이며 어떤 방법에서도 청구범위를 한정하려는 의도는 아니다.

방법 A

클로스트리듐 실리드로스포름 (Clostridum cylindrosporum; Clostridium sp. - ATCC No. 7905로도 불리움)의 분리 및 증식을 수행한다.

클로스트리듐이 무산소성 생물이므로, 모든 배양균의 생성, 유지 및 취급 작업은 균주의 산소에 대한 노출을 최소화하는 조건 하에서 수행된다. 또한, 테트라하이드로폴레이트와 이의 유도체의 심한 산소 불안정성에 기인하여, 이러한 화합물을 포함하는 모든 방법은 산소의 부존재하에서 수행된다. 무산소 질소 가스 원료에 연결된 플라스틱 무산소 주머니 도구가 이 목적을 위해 사용된다.

1. 요산 증식 배지의 제조.

요산 배지는 ATCC 배지 안내서 처방 519호 (ATCC Media Handbook - Recipe No. 519)에 기술된 대로 제조된다;

요산 배지의 조성

요산············3.0g

효모 추출물 ········1.0g

인산칼륨 2염기·······4.0g

황산마그네슘 7수화물····0.1g

황산 제일철 ········5.0mg

* 0.04% 페놀 레드 용액···1.0g

나트륨 - 티오글리콜레이트 ·0.5g

증류수···········1.0L

* 14.9ml의 0.01 N 수산화나트륨은 0.1g의 지시약을 필요로한다. 0.04% 용액을 위해서 증류수 250ml로 희석한다. 배지를 제조함에 있어서, 요산은 충분한 부피의 액체에 현탁시키고, 가열하여 끓이고 수산화나트륨으로 페놀 레드(pH 7.6)의 영구 장미색으로 조정한다. pH 는 pH 용지로 검사한다. 고체 배지용으로는 20.0g의 한천을 배지에 첨가한다.

배지를 나사 뚜껑 플라스크에 거의 가득차는 부피로 부은 다음 무산소 질소가스로 정화시키면서 끓인다. 오토클레이브한 다음 즉시 플라스크 뚜껑을 단단히 잠근다.

배지를 실온에서 보관하여 저온에서의 요산침전을 방지한다.

2. 클로스트리듐 실린드로스포룸 배양균의 증식 배지로의 접종

모든 과정은 글러브 주머니안에서 무산소 조건하에 수행된다. 액체 요산 배지 1.0ml 씩을 ATCC로부터 얻은 세균의 얼린 펠릿에 첨가한다. 펠릿을 용해시키고 무균의 일회용 접종루프는 요산을 입힌 배지위에 현탁된 배양균을 스트리킹하는데 사용된다. 플레이트를 H₂-CO₂발생 엔벨롭과 메틸렌 블루 지시약 스트립을 갖는 무산소병에 배치한다.

접종된 플레이트를 포함하는 병을 37℃에서 가온한다. 24시간 내에, 증식은 콜로니로부터 방출되는 약간 투명한 손가락 같은 투영으서 플레이트상에 나타난다. 위상차 현미경하에 보이는 대표적인 콜로니의 시료는 전형적인 클로스트리듐 세포의 형태학 및 포자 형성을 나타낸다.

3. 영구적인 클로스트리듐 실린드로스포룸 스톡 배양물의 제조

요산 플레이트 배지는 훈개이트 튜브 (Hungate tubes; Bellco Glass Co.)-10ml배지/튜브에서 제조되며 영구적인 클로스트리듐 실린드로스포룸 스톡 배양물의 원료로서 공급된다. 상기에 기술된 콜로니로부터 세포의 단일 콜로니 조각을 무균 접종루프로 떠서 훈개이트 튜브 배지에 찌른다. 이 과정은 질소 가스를 함유하는 무산소 주머니에서 수행된다. 튜브를 무산소 병에 배치하고 35℃로 가온한다. 5일후, 튜브를 병으로부터 제거하고 뚜껑을 파라필름으로 단단히 밀봉한다. 튜브는 다음 사용할 때까지 실온에서 보관한다.

4. 액체 증식 배지 접종원의 제조

반고체 요산 배지(2.5 g/l 박토-한천)의 시험관에 클로스트리듐 실린드로스포룸 콜로니를 접종하고, 35℃에서 배양하고 상기에 기술한 바와 같이 실온에서 저장한다. 이 배양물은 다음 부분에 기술된 바와 같은 액체 배지 증식을 위한 접종원 원료로서 공급된다.

5. 클로스트리듐 실린드로스포룸의 액체 배지의 증식

한 개의 연한천 시험관 배양물(총 10ml)을 액체 요산 배지 1 리터에 첨가한다. 모든 작동은 무산소 주머니에서 수행되고 총 배양물은 4일간 35℃로 무산소 병에서 보존한다.

방법 B

클로스트리듐 실린드로스포룸의 조(粗)포르밀테트라하이드로폴레이트 합성 효소 추출물의 제조가 수행된다.

방법 A 에서와 같이, 모든 배양균의 생성, 유지 및 취급 조작은 클로스트리듐이 무산소성 생물이기 때문에 산소에 균주의 노출을 최소화하는 조건하에서 수행된다. 또한 테트라하이드로플레이트 및 이의 유도체의 심한 산소 불안정성에 기인하여, 이러한 화합물을 포함하는 모든 과정은 무산소하에서 수행된다. 무산소 질소 가스 원료에 연결된 플라스틱 무산소 주머니 도구가 이 목적을 위해 사용된다. 1리터 배양물이 혼탁해지고 미립물질이 배지로부터 침전된다. 배양물을 4 ×250 ml의 부분 표본으로 나누고 4 ×250ml 원심분리 병에 첨가한다. 배양물을 배크만(Beckman) J2-21 원심분리기에서, 4℃, 8,000 RPM에서 15분 동안 원심분리한다.

배지가 4℃로 냉각된다 해도, 요산은 박테리아에 의해 소비되므로 침전되지 않는다. 세포 펠릿을 빙냉 증류수 4 ×25 ml에 재현탁시키고 상기와 같이 원심분리한다. 펠릿은 포르밀테트라하이드로 폴레이트 합성효소를 분석하기 전에 -20℃에서 5일간 냉각시킨다.

냉각된 펠릿을 총 4.0ml 완충액에서 (0.05M 이인산 칼륨, 0.05M 이인산 칼륨, 0.05M 2-머캅토 에탄올 (1M 수산화 칼륨 첨가에 의해 pH 7.5)) 해빙시킨다. 펠릿을 혼합하고 실온에서 60분 동안 간헐적으로 흔들어 줌으로써 용해시킨다. 세포 펠릿은 세포 용균현상 때문에 현저한 점성이 생긴다.

자가분해는 실온에서 일어난다. 세포 용해질은 17,000 RPM/30분에서 원심 분리되며 상층액은 얼음 위에서 보존되며 포르밀테트라하이드로 폴레이트 합성 효소를 분석한다.

방법 C

포르밀테트라하이드로폴레이트 합성효소 분석은 부톨레어(Buttaire)의 포르밀테트라하이드로폴레이트 합성 효소의 정제 및 성질,Enzymology Vol. 66, p. 585, (1980)에서 제공된 방법에 의해 제조된다.

[실시예 1]

폴산의 5,6(R,S),7,8-테트라하이드로폴산으로의 환원은 나트륨 보로하이드라이드를 사용하는 최근의 문헌 방법(C. Temple, Jr.,R.D. Elliott, J.D. Rose 및 J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22, 731(1979))을 이용하여 수행된다.

[실시예 2]

10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 생성

10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산을 제조하기 위하여 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 효소적 포르밀화에 적당한 다음 반응 혼합물이 제조된다: 100ml의 1.0M 트리에탄올아민 염산염(pH 8.0), 100ml의 0.5M 아데노신트리포스페이트 (pH 8.0), 100ml의 0.5M 염화칼륨, 100ml의 0.1M 염화 마그네슘 6 수화물, 및 200ml의 0.2M 암모늄 포름에이트(pH 8.0). 총 5g유리병의 5,6(R,S),7,8- 테트라하이드로폴산 (Sigma; 69% 순도; 롯트 번호 117F-5013)의 내용물을 200ml의 0.2M 트리스-HCl/0.05M 2-머캡토에탄올 (pH 7.0)에 현탁시키고 약 15ml의 1M 수산화칼륨을 첨가함으로써 용해시킨다. 맑은 용액을 앞의 혼합물에 붓고 증류수를 첨가하여 2 리터 유리병에서 총 반응 혼합물 1.0 리터를 만든다.

반응은 포르밀테트라하이드로폴레이트 합성효소 (FTHFS)를 함유하는 조(粗)효소 추출물 4ml를 첨가하고 반응을 실온(22℃)에서 진행시킨다. 주기적으로 시료를 제거하여 0.1M 포름산으로 용리하고 30분에 걸쳐 12 내지 25%의 선형 구배로 메탄올에 의해 변화하는 역상 컬럼 (reverse-phase column) (C-18)을 사용하여 HPLC에 의해 반응의 진행 경과를 조사한다. 컬럼 용출액은 282nm에서 검사하여 12분에서 5,6(R,S),7,8-테트라하이드로폴산을, 16분에서 5,10-메테닐-테트라하이드로폴산을 검출한다. 반응은 18시간 후에 완료된다. 이시간에서, 곡선 아래 면적에 의해 측정되는 바 5,6(R,S),7,8-테트라하이드로폴산 최초 양의 48%가 남는다. 반응 혼합물로부터 1585mg의 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산에 상당하는 양이 5,10-메테닐테트라하이드로 폴레이트를 나타내는 HPLC 크로마토그램으로부터 계산된다. 이것은 출발하는 3540mg 5,6(R,S),7,8-테트라하이드로폴산의 단지 1725mg만이 효소적 전환 반응에 이용될 것이라고 생각한 이론의 92%의 전환에 해당한다. 이론의 50%는 5시간 후에 전환된다.

[실시예 3]

10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로의 전환

실시예 2로부터의 반응 혼합물이 조성에서 아무런 변화도 보이지 않음을 다음날 검사하였다. 혼합물 100ml 씩을 3 목병으로 옮기고 용액의 pH는 황산에 의해 6.5로 조정한다. 질소로 가스를 빼는 동안, 병을 수욕에 잠그고 90-95℃에서 2시간 동안 가열한다. 그런 다음 반응은 40℃에서 하룻밤 동안 질소하에서 계속된다. 이 반응 혼합물은 16시간 후에 갈색 형상을 갖는다. 시료를 0.1M 포름산으로 용리하고 메탄올 12 내지 25% 선형 구배로 30분 동안 변형되는 역상 (reverse-phase)컬럼 (C-18)을 사용하여 HPLC에 의해 분석한다. 컬럼 용출액을 282nm에서 검사한다. HPLC 분석은 곡선 이하 면적을 고려할 때 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴레이트와 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 피크에 대하여 90.2%의 전환율을 나타낸다. 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산을 위한 면적은, 변화 되지 않았어야 하겠지만, 출발 물질의 것(48%)에 비해 33.1%로 감소된다.

반응 혼합물의 시료는 펌프를 통해 에비의 HPLC 역상 컬럼(Dynamax 60A-C18, 8㎛, 2,1 x 30 cm)으로 첨가된 다음 0.1M 포름산 수용액과 메탄올의 구배로 60분에 걸쳐 13ml/분의 유속으로 전개된다. 미황색 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산이 전체 수율 82%로 수득되며, 산성 용액 조건하에서 (0.1M 포름산 수용액과 메탄올) 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로 전환된 다음 유리 수집병에서 3 내지 6 mg/ml 농도로 그 자리에서 겔을 형성한다. 이 시료의 거울상 이성질체의 순도는 키랄 컬럼(Diacel Chiracel OD)을 사용하여, 0.5% 암모늄 포름에이트, pH=3.8과 25% 메탄올의 동량으로 용리하는 HPLC에 의해 측정하였다. 15.2 분의 보유시간이 기록되며, 포름산에서 광회전은 다음과 같다.

[실시예 4]

5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 및 5,6R,7,8-테트하이드로폴산으로의 전환

실시예 2로부터 얻은 나머지 반응 혼합물의 pH는 황산으로 8.0 내지 5.0 으로 조정하고, 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산을 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로 빠른 고리화를 시작한 다음 실온에서 그 자리에서 천천히 가수분해하여 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산을 형성한다. 후자는 pH 조정전에 반응 혼합물에서 검출되지 않는다.

반응은, 0.1M 포름산으로 용리하고 메탄올 12 내지 25%로 30분에 걸쳐서 선형 구배로 변형시키는 역상 컬럼 (C-18)을 사용하여 HPLC에 의해 계속된다. HPLC에 의한 검사는 반응 혼합물 중 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산의 농도가 변화되지 않는 시간 동안 실온에서 5일 후 최초 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 70% 이상이 5-프로밀-5,6S,7,8-테트로하이드로폴산으로 전화되었음을 나타낸다. 그런다음 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산과 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산으로서 수득되는 포르밀화된 생성물과 포르밀화안된 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산을 예비의 HPLC 역상 컬럼(Dynamax 60A-C18, 8um, 2.1 x 30cm)에 의해 분리한 다음, 0.1M 포름산 수용액과 메탄올 구배로 60분 동안 13ml/분의 유속으로 전개시킨다. 두 제조법에서 측정된 수율(각각은 50ml 반응 혼합물에 상당함)은 다음과 같다.

[실시예 5]

결정성 5,10-메테닐-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산을 수득하기 위한 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산의 포르밀화

크로마토그래피로 정제되고 얼림 건조된 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산의 시료 253mg을 2% 트리프루오로아세트산을 함유하는 97% 포름산 50ml에 용해시키고 교반없이 질소하에 반응용기내에서 주위온도에서 방치한다. 반응을, 0.1M 포름산 수용액으로 용리되며 메탄올 12내지 25% 선형 구배로 30분 동안 변형되는 역상 컬럼(C-18)을 사용하여 HPLC로 분석하고 282nm에서 검사한다. HPLC 크로마토그램에서 5,10-메테닐-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산을 나타내는 새로운 피크의 출현에 의해 판단되는 것처럼, 3시간 후 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 전부가 반응하였다. 포름산의 대부분이 결과적으로 증발에 의해서 제거되고, 0.1M 포름산 수용액 30ml을, 혼합물을 가끔 흔들면서 천천히 첨가하였다. 그런다음 용액을 냉실에서 하룻밤 동안 저장한다. 작은 황색 침상이 형성되며, 용액은 고체 형태를 나타낸다. 결정을 유리 프릿 깔때기 상에 수집하고, 아세톤으로 세척하고 진공중에서 건조시켜 황색 결정 물질 218mg을 수득한다.

결정성 5,10-메테닐-5.6R.7.8-테트라하이드로폴산의 거울상 이성질체의 순도는 0.5% 암모늄 포름에이트, pH 3.8 및 25% 메탄올의 동량으로 용리되는 키랄 컬럼 (Diacel Chiracel OD)을 사용함으로써 측정된다. 생성물인, 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 18.2분에서 용리된다.

88% 포름산에서 용액으로서 측정되는 광회전은 다음과 같다.

[실시예 6]

5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 및/또는 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 내에서 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산의 유도체화

L. Rees, C.J. Suckling 및 H. C. S. Wood, J. Chem. Soc. Chem. commun. 470 (1987)에 의해 기술된 방법을 변형시켜, (-) 멘실클로로포름에이트를 실시예 4로부터의 반응 혼합물 시료에 첨가하고, pH 7로 조정하여, 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산만을 카르복시멘틸화하고 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 및/또는 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 반응되지 않은 채로 남겨둔다. 반응은 HPLC로 검사했다. 반응안된 성분으로부터 5-멘틸옥시카르보닐-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산의 효과적인 분리는 XAD -2를 적하한 컬럼에 반응 혼합물을 통과시킴으로써 수행된다. 5-멘틸옥시카르보닐-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산을 수지에 흡수시키고 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산을 통과시킨다.

[실시예 7]

예비의 HPLC에 의해 5-포르밀 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산, 5,6R,7,8-테트하이드로폴산 및 다른 유도체의 정제

실시예 4로부터 반응 혼합물의 일부 (50 또는 100ml)를 적하 펌프를 통해 역상 컬럼 (Dynamax 60A-C18, 8㎛, 2.1x30cm)으로 직접 적하시킨 다음, 0.1M 포름산 수용액 및 메탄올의 구배로 60분에 걸쳐서 13ml/분의 유속으로 전개시킨다. 사용되는 구배는 5% 농도의 메탄올로 출발하여 12분의 가동시간 후 10%에 도달한다. 그런다음, 10%농도의 메탄올을 메탄올의 수준이 선형으로 증가하여 38분에서 18%에 도달하는 시간에서 다음 10분동안 일정하게 유지시키고 여기로부터 다시 증가하여 52분의 가동시간에서 25%에 도달한다. 이 농도는 가동의 끝까지 더 이상 증가되지 않는다. 유출되는 컬럼은 319nm에서 검사하는데, 왜냐하면, 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴레이트와 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 그 파장에서 같은 흡수율을 같기 때문이다.

이러한 제조 조건하에서 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 11과 17.5분 사이에서 융리되는 반면에, 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 39.5와 44.5분 사이에서 용리된다. 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴레이트 밴드의 용리는 길게 뻗친 피크로서 20분과 30분 사이에 나타나는 농도에 강하게 의존한다. 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 밴드와 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴레이트 밴드는, 700mg의 물질과 동량의 반응 혼합물 140ml 이상이 적하될 때, 완전히 분리될 수는 없다.

5,6R,7,8-테트라하이드로폴산과 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 용리 밴드를 드라이 아이스에 담가둔 유리병에 수집하여 액체가 즉시 동결되도록 한다. 그런 다음, 동결된 획분을 얼림 건조하여 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산의 경우에 회백색 분말을, 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 경우에 황백색 분말을 얻었다. HPLC 분석은 0.1 M 포름산 수용액과 메탄올 구배로 전개되는 액상 컬럼(Dynamax 60A-C18, 8㎛, 2.1 x 30 cm)을 사용하여 이러한 분말들에 대해 수행하였다. 곡선아래의 면적에 의해 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 97%로 나타났고 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 93%순도로 나타났다. 5,6R,7,8,-테트라하이드로폴산의 불안정성 때문에, 이것은 화학적 포르밀화에 의해서 보다 안정한 5,10-메테닐-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산으로 전환된다. 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산의 안정성 문제를 해결하기 위해서, 이 화합물은 실시예 8 에 기술된 바와 같은 갈슘염으로 전환된다.

[실시예 8]

칼슘 5-포르밀-5,6S,7,8-테르라하이드로폴레이트 또는 칼슘 5-포르밀-5,6R,7,8-테트라하이드로폴레이트의 제조

라세미칼슘 5-포르밀-5,6(R,S),7,8-테트라하이드로폴레이트를 제조하기 위하여 C. Temple, Jr., R.D. Elliott, J.D. Rose 및 J.A. Montgomery, J. Med. Chem., 22, 731 (1979)에 의해 발표된 방법의 변형으로, 제조된 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산을 에테르로 세척하여 암모늄 포름에이트를 가능한 제거한다. 그런다음 세척된 물질 62mg을 32ml의 가스를 뺀 메탄올에 용해시키고 (무염 폴린산은 메탄올에 잘 용해된다) 여기에 메탄올성 염화칼슘 약 1ml를 (메탄올 ml 당 염화칼슘 72mg)첨가한다. 염의 첨가는 회색빛 백색 침전물의 조숙한 형성을 야기하는데, 이는 유리프릿 깔때기에 수집되며 진공중에서 건조된다. 건조후 수율은 60.5mg(이론수율의 90%)이다.

이 방법을 6R 물질에 대해 반복하면, 칼슘 5-포르밀-5,6R,7,8-테트라하이드로폴레이트가 수득될 것이다.

제조된 화합물의 순도는 임의의 UV-비흡수 물질의 존재에 상관없이 UV/HPLC에 의해 측정된다. 거울상 이성질체의 순도는, 0.5%암모늄 포름에이트 pH 3.8 과 25% 메탄올의 동량으로 용리시키는 키랄 컬럼(Diacel Chiracel OD)을 사용하여 HPLC에 의해 5,10-메테닐-5,6(R,S),7,8-테트라하이드로폴레이트 유도체의 단계에서 측정된다. 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산은 처음에 15.2분에서 용리되는 반면 5,10-메테닐-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산은 18.2분에서 용리된다.

문헌에 보고된 바와 같이, 10M 또는 12M 염산에서보다는 오히려 포름산에서 제조된 화합물의 용액이 포름산의 감소된 산성과 폴레이트에 대한 증가된 용해력 때문에, 광회전 성질을 기록하는데 사용된다. 상기 제조의 시료는 다음의 광회전을 나타낸다.

[실시예 9]

방사성표지된 포르밀폴산 및 유도체의 제조

실시예 2의 방법이 방사성표지된 암모늄 포름에이트 또는 임의의 다른 방사성표지된 포름산 유도체로 암모늄 포름에이트를 치환시킴으로써 반복되면, 방사성표지된 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산이 수득될 것이다.

이것을 실시예 3-8의 방법에 적용시키면, 상응하는 방사성표지된 산과염이 수득될 것이다.

앞에서 상술한 설명은 이 분야에서 숙련된 사람들에게는 분명히 많은 변형을 제안할 것이다. 예컨대, 칼슘 류코보린 대신, 스트론튬 류코보린과 나트륨 류코보린이 제조될 수 있다. 테트라하이드로폴레이트 포르밀라제는 클로스트리듐 아시드-우리시(Clostridium acidi-urici)에 의해 생산될 수 있다. 모든 이러한 명백한 변형은 첨부되는 청구범위의 의도되는 범위내에 있다.

Claims

(a) 테트라하이드로폴산 또는 치환된 테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 6R 및 6S 부분입체 이성질체의 혼합물의 6S 형을 테트라하이드로폴레이트 호르밀라제의 존재하에 효소적으로 포르밀화하여 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 도는 에스테르; 존재한다면 미반응 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르; 미반응 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는 혼합물을 형성하고; (b) (1) 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르로부터 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 분리한 다음, 상기의 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 고리화하고 가수분해하여 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르, 또는 전술한 것 모두를 형성하거나; 또는 (2) 5,6r,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 존재하에, 상기 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 고리화하고 가수분해하여 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산, 또는 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르, 또는 전술한 것 모두를 형성한 다음, 그 이후에 (i) 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 유도체화아여 5-치환 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 형성한 다음 이 성분들을 분리하거나; 또는 대안적으로 (ii) 5,6R,7,8,-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르로부터 임의의 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산과 임의의 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 분리하고; 분리 후 소망에 따라 (3) 상기의 미반응 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 화학적으로 포르밀화하고 고리화하고 가수분해하여 5-포르밀-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 제조하거나, 또는 대안적으로, 다른 반응기들로 상기의 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 유도체화하여 5-치환 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 형성하고, 소망에 따라 (c) 실질적으로 순수한 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르 또는 5-포르밀-5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 상응하는 산, 염 또는 에스테르로 전환시키는 단계로 구성되는, 실질적으로 순수한 5,6(R 또는 S),7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르 유도체의 (6R 또는 6S) 부분입체 이성질체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 테트라하이드로폴레이트 포르밀라제는 클로스틸듐 종 (Clostridium sp.) ATCC 7905 또는 이의 돌연변이체에 의해 생산되는 방법.
제 1 항에 있어서, 미반응 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산의 화학적 포르밀화는 카보디이미드의 존재하에서 포름산과 함께 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 전환 단계(c)는 폴산 유도체를 상응하는 염으로 전환시키는 것으로 이루어지는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 염은 칼슘염, 마그네슘염, 스트론튬염, 철염, 또는 전술한 것들의 임의의 혼합물임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효소적 포르밀화는 방사성표지된 포름산 또는 화학적 등가물을 함유하는 반응 혼합물 내에서 수행되는 방법.
(a) 5,6,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 6R 및 6S 부분입체 이성질체의 혼합물 중 6S 형을 테트라하이드로폴레이트 포르밀라제의 존재하에 효소적으로 포르밀화하여 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르; 존재한다면 미반응 5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르; 미반응 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 형성하고; (b) 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 존재하에, 상기의 10-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 고리화하고 가수분해하여 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산, 또는 5,6R,7,8-테트라하이드로폴산 또는 전술한 것 모두를 형성한 다음; (c) 5,6R.7.8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르로부터 임의의 5,10-메테닐-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 분리하고; 분리후 소망에 따라 (d) 실질적으로 순수한 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르를 상응하는 산, 염 또는 에스테르로 전환시키는 단계로 구성되는, 실질적으로 순수한 5-포르밀-5,6S,7,8-테트라하이드로폴산 또는 이의 염 또는 에스테르의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 테트라하이드로폴레이트 포르밀라제는 클로스트리듐 종. (Clostridium sp.) ATCC 7905 또는 이의 돌연변이체에 의해 생산되는 방법.
제 7 항에 있어서, 전환 단계 (d)는 폴산 유도체를 상응하는 염으로 전환시키는 것으로 이루어지는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 염은 칼슘염, 마그네슘염, 스트론튬염, 철염, 또는 전술한 것들의 임의의 혼합물임을 특징으로 하는 방법.