JP2844532B2 - 光学活性化合物の調製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は実質的に純粋なジアステレオマーであるテト
ラヒドロ葉酸エステル誘導体の調製法に関する。 ［従来の技術］ メトトレキセート［Ｎ−（４−（（2,4−ジアミノ−
６−プテルジル）メチル）メチルアミノ）−Ｌ−グルタ
ミン酸］は、ジヒドロ葉酸エステル還元酵素（DHFD）の
インヒビターであって、このものはドオキシウリジレー
トのチミジレートへの転化を阻止し、従って、DNAの生
合成を阻止するので、癌の化学療法に一般に使用されて
いる。しかし、多くの抗癌剤と同様に、このメトトレキ
セートは正常細胞にも毒性があるため、多量のメトトレ
キセートを投与した場合には、その後の12〜24時間は
「レスキュー剤」がしばしば投与される。ロイコボリン
（５−ホルミルテトラヒドロ葉酸）がメトトレキセート
のレスキュー剤として一般に使用される。 ロイコボリンは二つのキラル中心を有し、市販の製品
「ウェルカム・ファンディション・リミッドのウエルコ
ボリン（RTM）」は式（Ia）及び（Ib）の化合物（いず
れもカルシウム塩の形）を等量含み、これらの化合物は
それぞれ６位の炭素で（Ｒ）及び（Ｓ）立体化学の性質
を備えている。 天然のジアステレオマーである（6S）ジアステレオマ
ー（Ib）だけが一炭素代謝を回復するのに有効であっ
て、それ故にメトトレキセートのレスキューに有用であ
ることが報告されている（モトゴメリーほか、「カンサ
ー・トリートメント・リポート」1980,65,1117−1119参
照）。 L.カセイからのチミジレートシンターゼは非天然のジ
アステレオマーである5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸
エステルによって抑制されることが報告され（リアリー
ほか、「バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーション」、1973,56,484参照）、また太
陽菌（E,コリ）からの5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸
エステルデヒドロゲナーゼも同じジアステレオマーによ
って抑制されることが報告されている（スコット及びド
ナルドソン、「バイオケミカル・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション」、1984、147,523参
照）。さらに、非天然のジアステレオマーである10−ホ
ルミルテトラヒドロ葉酸エステルは、鶏の肝臓からのグ
リシナミドリボヌクレオチド（GAR）ホルミル−トラン
スフェラーゼの強い競争的な抑制剤である（スミス、ベ
ンコビック及びベンコビック、「バイオケミストリー」
1981,20,4034参照）。 ［発明が解決しようとする課題］ これらの報告は非天然のジアステレオマーであるテト
ラヒドロ葉酸エステルの一炭素誘導体によって、ピリミ
ジン及びプリンの両方の生合成が抑制され、従ってDNA
の生合成も抑制されることを意味する。もし、これらの
抑制が哺乳類系でも存在すれば、ロイコボリンの天然の
（6S）ジアステレオマーに対し、臨床的な潜在的要請が
ある。 ロイコボリンの二つのジアステレオマーを分離するこ
とは、分別結晶法（コウリッヒほか、「ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイェテー」1952,74,42
15参照）やクロマトグラフィー（フィーニーほか、「バ
イオケミストリー」1981,20,1837参照）で行われてい
る。そして、（6S）ジアステレオマーは酵素を触媒とし
てジヒドロ葉酸エステルを還元し、次いでホルミル化す
ることで得られているが（リー、バレンテ、サックリン
グ及びウッド、「テトラヒドロン」1986,42,117参
照）、ホルミル化の収率が低く、また還元工程では妥当
な純度で異性体を得ることが難しい。本発明の一つの目
的は、これらの不利益を解消することにある。 ［課題を解決するための手段］ ここにおいて、本発明者等はテトラヒドロ葉酸エステ
ル又はその誘導体ノエピメリック中心に近い６位の炭素
に、キラル補助グループを導入すると、新しい一対のジ
アステレオマーの分離が容易になり、分離されたジアス
テレオマーは高収率で純粋な（Ia）及び（Ib）に転化す
ることを見出し、この所見に基づいて本発明を完成した
ものである。 すなわち、本発明はテトラヒドロ葉酸誘導体の実質的
に純粋な所望の6R又は6Sジアステレオマーを調製する方
法を提供するものであって;a）テトラヒドロ葉酸又はそ
の誘導体である葉酸塩又は葉酸エステルのジアステレオ
マー6R及び6Sの混合物のＮ−５もしくはＮ−10のいずれ
かにキラル補助グループを付与させて一対の新しいジア
ステレオマーを形成させ;b）一対の新しいジアステレオ
マーを分離し、新しいジアステレオマー（6R又は6S）を
回収して対応する所望のジアステレオマー（6R又は6S）
を形成させ;c）こうして単離された実質的に純粋な新し
いジアステレオマーを、テトラヒドロ葉酸又はその塩も
しくはそのエステルの対応する所望のジアステレオマー
（6R又は6S）に転化する工程を含む。 テトラヒドロ葉酸、その塩及びそのエステルの適当な
誘導体には、ロイコボリン、５−メチルテトラヒドロホ
レート、5,10−メテニルテトラヒドロホレート、5,10−
メチレンテトラヒドロホレート等が含まれる。ロイコボ
リンは本発明にとって好ましいテトラヒドロホレート誘
導体である。 誤解のないように付言すれば、本発明はテトラヒドロ
葉酸の塩とエステルの両方を包含する。便宜上、ここで
はテトラヒドロホレート又は置換テトラヒドロホレート
と呼ぶが、特に断らない限り、これらはフリーの酸、塩
及びエステルを指す。特に好ましい生理学的に許容され
る塩にはカルシウム塩が含まれる。また、適当なエステ
ルには低級アルキルエステルが含まれる。 キラル補助グループは当業界で公知の標準的方法で導
入することができ、例えばペプチド化学でアミノグルー
プを保護するための方法で導入することができる。適当
なキラル補助グループは、一対の新しいジアステレオマ
ーを分離した後に除去が容易なものである。テトラヒド
ロホレートとの反応でウレタンを形成するようなキラル
アルコールは、特に好適な補助グループである。（−）
メントール（−）ボルネオール、（−）イソボルネオー
ル（Ｒ）及び（Ｓ）−ブタン−２−オール、（Ｓ）−２
−メチルブタン−１−オール、（Ｒ）−１−フェニルプ
ロパノール、（Ｒ）及び（Ｓ）−２−メチルフェニル−
プロパン−１−オール、（Ｒ）及び（Ｓ）−オクタン−
２−オール、（Ｒ）及び（Ｓ）−1,2,3,4−テトラヒド
ロ−１−ナフトール、（1S）−ノポール、（1S,2S,5S）
−ミルタノール、（1R）−ミルテノール、（Ｓ）−Ｂ−
シトロネロール、（−）−８−フェニルメンソールおよ
び（1S,2R,5R）−イソメンソールのようなキラルアルコ
ールのホルメートエステル、例えばクロロホルメートエ
ステルは、テトラヒドロホレートのＮ−５にキラル補助
グループを付加するための好ましい試薬である。Ｎ−５
が未置換であると、反応はこの位置で起こり、さもなけ
ればＮ−10で反応が起こる。Ｎ−10で反応が起こった場
合、Ｎ−５の置換基は所望のテトラヒドロホレート誘導
体のＮ−５に付加したグループであるか、そのグループ
に転化可能なものであるべきである。Ｎ−５の好ましい
グループはホルミル基、メチル基またはこれらの基に変
るものである。 キラルアルコールのコロルホルメートとテトラヒドロ
葉酸との反応は、極性溶媒中で、例えばエタノールのよ
うなアルコールの水溶液中で、ほぼ中性の領域のpHで都
合よく生起する。この反応は−20〜100℃の温度で進行
し、好ましくは室温で進行する。 こうして生成した一対の新しいジアステレオマーは、
結晶化法、クロマトグラフィー、溶媒抽出などの標準的
方法で分離される。溶媒抽出及び再結晶法で使用される
溶媒は適当な極性溶媒であって、好ましくはアルコール
が使用される。従って、例えば５−（−）メンチルオキ
シカルボニル−テトラヒドロ葉酸の場合は、ジアステレ
オマーがブタン−１−オール中への溶解度の違いによっ
て分離される。第１図はロイコボリンのジアステレオマ
ーのサンプルの調整に必要な反応と分離の工程を示して
いる。５−（−）ボルニルオキシカルボニル−テトラヒ
ドロ葉酸の場合は、ジアステレオマーがブタン−１−オ
ール中への、又はブタン−２−オールへの溶解度の違い
によって分離される。必要に応じて純度を向上させるた
めに、溶媒抽出又は分別結晶工程を繰返すこともでき
る。通常は純度90％以上のジアステレオマーが回収でき
るまで工程を繰返す。 分離されたジアステレオマーからキラル補助グループ
を取除くことは、ペプチド合成で普通採用される方法に
従い、酸で処理することによって行われる。使用可能な
酸には、臭化水素酸、硫酸のような鉱酸、ギ酸、酢酸、
三化酢酸のような有機酸又はこれらの混合物が含まれ
る。従って、例えばテトラヒドロホレートの５−（−）
メンチルオキシカルボニル誘導体又は５−（−）ボルニ
ルオキシカルボニル誘導体は、ギ酸と臭化水素と酢酸の
混合物で処理される（第１図参照）。この方法でキラル
補助グループが除去されると、5,10−メテニルテトラヒ
ドロホレートの個々のジアステレオマーが形成され、次
いでこれらはさらに所望のテトラヒドロホレート誘導体
に転化される。 従って、例えば、5,10−メテニルテトラヒドロホレー
トの個々のジアステレオマーは、英国特許第1560372号
に記載されているような当業界で公知の方法により、中
性のpHでロイコボリンの純粋なジアステレオマーに容易
に転化できる。また、5,10−メテニルテトラヒドロホレ
ートの個々のジアステレオマーは、チャナリン及びペリ
ーが記載した（バイオケミストリー・ジャーナル、106
7,105,633参照）と同様な方法で例えばナトリウムボロ
ハイドライドで還元することにより、５−メチルテトラ
ヒドロホレートの個々のジアステレオマーに転化するこ
とができる。 5,10−メチレンテトラヒドロホレートの個々のジアス
テレオマーは、例えばホルムアルデヒドの存在下に分離
された中間体ジアステレオマーからキラル補助グループ
を外すことによって調製できる。5,10−メチレンテトラ
ヒドロホレート自体は、サカミが「バイオケミカル・プ
レパレーション」1963,10,103に記載した方法及びホワ
イト、ベイリー及びゴールドマンが「バイオロジカル・
ケミストリー」1978,253,242に記載した方法に類似する
方法で、例えばナトリウムボロハイドライトで還元する
ことにより、５−メチルテトラヒドロホレートに転化さ
れる。 この明細書で「実質的に純粋な」とは、ジアステレオ
マーの純度が80％以上、好ましくは90％以上、さらに好
ましくは95％以上であることをいう。本発明はまた、テ
トラヒドロホレートの実質的に純粋なジアステレオマー
を提供する。好ましい具体例に於いては、本発明はロイ
コボリンの実質的に純粋なジアステレオマーを提供す
る。ジアステレオマーの純度は、ナトリウムシアノボロ
ハイドライドの存在下でのＤ−グリセリンアルデヒドと
の反応及び形成された新ジアステレオマーのNMRスペク
トルによって確認できる（第１図参照）。 テトラヒドロ葉酸又は置換テトラヒドロ葉酸のＮ−５
またはＮ−10にキラル補助グループが付いた中間体化合
物は新規化合物であって、これは本発明のもう一つの特
徴である。 そうした新規化合物は、（6R）及び（6S）５−（−）
メンチルオキシカルボニル−テトラヒドロ葉酸（第１図
参照）、（6R）及び（6S）５−（−）ボルニルオキシカ
ルボニル−テトラヒドロ葉酸（第２図参照）、（6R）及
び（6S）５−（−）イソボルニルオキシカルボニル−テ
トラヒドロ葉酸（第３図参照）、並びにこれらの塩及び
エステル等である。 本発明の新規中間体はプレリジン環の６位にキラル中
心を有し、これ故、（6R）または（6S）異性体としてあ
るいはジアステレオマーの混合物として存在する。 また、本発明は、テトラヒドロホレート誘導体の実質
的に純粋なジアステレオマーを薬剤的に許容される担体
と組合せた薬剤組成物を提供する。適当な担体にはロイ
コボリン含有薬剤組成物を調製する際に当業界で公知の
担体が含まれる。一般に、本発明の組成物は、商品名ウ
エルコボリンで市販されている公知のロイコボリン組成
物と同様に調合される（例えば、「フィジシャンス・デ
スクマニュアル」1986,769頁及びマルティンダーレの
「ザ・エキストラ・ファーマソピーア」26版、1948頁参
照）。ロイコボリンの実質的に純粋な6Sジアステレオマ
ーは、メトトレキセートのようなDHFR抑制剤の作用を中
和するレスキュー剤として使用できる。また、ホレート
欠乏症の治療にも使用できる。さらに結腸癌、直腸癌の
治療に５−フルオロウラシルとの組合せで使用可能であ
る（マコブァーほか、カンサー・トリートメント・リポ
ート」1982,66,1803頁及びマダジェビィック等、「カン
サー・リサーチ」1984,44,4467頁参照）。 従って、本発明はこのような病気を治療するための薬
剤の調製及び哺乳類のこのような疾患を治療する方法を
包含する。本発明の化合物は好適には塩の形で、特にカ
ルシウム塩の形で使用さされる。ロイコボリンの実質的
に純粋な6S−ジアステレオマーは経口的にまたは非経口
的に投与でき、また通常の方法で調合できる。適当な調
合には注射可能な溶液、注入用粉末（これは使用直前に
水を加え注射液とされる）及び錠剤がある。メトトレキ
セートのレスキュー剤として使用する場合、ロイコボリ
ンの6S−ジアステレオマーの投薬量は、投与されたメト
トレキセートの量に依存するが、典型的には１日の投与
量は一般に150mgまでであって、例えば25〜150mgが２〜
４回に分けて投与される。ホレート欠乏症の治療には一
般に少量のロイコボリンが投与され、成人に対する１日
当たりの投与量は通常２〜25mgの範囲で、これらは錠剤
の形で１日投与される。結腸直腸癌の治療には、成人に
対する１日当たりの典型的な投与量は通常200〜2000mg
で、200〜2000mgの５−フルオロウラシルと共に投与さ
れる。５−メチルテトラヒドロホレートは、食事療法の
補充物として使用される。 ［実施例］ 下記の実施例は本発明を限定することなく、さらに詳
しく説明するものである。第２図および第３図は前述の
ごとき手法によってテトラヒドロホレートの誘導体を調
製する場合の図式を示すものである。 実施例において、物理的特性は次のように測定した。 核磁気共鳴（NMR）：ブルカー（Bruker）HW−250分光計
を用いて測定。 内部標準物質にはテトラメチルシランを使用。 旋光度：通路長１デシメーターのジャケット付きセルを
有するパーキン ・エルマー（Perkin Elmer）241偏光計を使用して測
定。〈実施例１〉メンチルオキシカルボニル誘導体を経
て５−ホルミル−（6R及び6S）テトラヒドロ葉酸カルシ
ウムの調製。 （ｉ）５−（−）メンチルオキシカルボニル−テトラヒ
ドロ葉酸（3a,3b）の混合ジアステレオマー（6S）の調
製。 メカニカルスターラー、無酸素窒素用のガス出入口、
等圧に保持できる滴下ロートを備えた10リットルの三つ
口フラスコで、葉酸50gを蒸留水1050mlに分散させた。
以下すべての作業を窒素中で行った。フラスコを氷−水
浴中に漬け、水酸化ナトリウムの水溶液（50％,21ml）
を加え、次いで水（150ml）にナトリウムボロハイドラ
イド（50g）を溶かした溶液を30分間で滴下した。反応
混合物を０〜５℃で4.5時間撹拌し、次に蒸留水（150m
l）にナトリウムボロバイドライド（50g）を溶かした溶
液を30分間で滴下した。この混合物を窒素雰囲気で一夜
撹拌した。この反応混合物を氷−水浴に漬け、これに濃
塩酸（175ml）を45分間で滴下することで過剰のナトリ
ウムボロハイドライドを分離させた。脱ガスし、窒素で
飽和させたトリス−塩化水素緩衝液（50mM,pH7,1リット
ル）をこれに加えてpHを７に調節した。エタノール（2.
5リットル、脱ガスし、窒素で飽和したもの）に、
（−）メンチクロロホルメート（30ml）を溶かした溶液
を、溶液調製後直ちに添加し、全体を室温で21.5時間撹
拌した。 ロータリーエバポレーターを使用して反応混合物の容
量を半分に減少させて濾過した。濾液を氷−水浴で冷却
しpH3に調節した。分離した粗生成物を遠心分離機で収
拾し、水酸化ナトリウム水溶液（0.5M、1.5リットル）
に溶解して濾過し、再度pH3に調節した再沈澱させるこ
とにより精製した。このスラリーを遠心分離し、固形分
を少量の水で洗浄して濾過した。得られた固形物を吸引
乾燥し、最後に五酸化リン上で真空乾燥することによ
り、５−（−）メンチルオキシカルボニルーテトラヒド
ロ葉酸の混合ジアステレオマー（88g）を得た。 （ii）５−（−）メンチルオキシカルボニル−テトラヒ
ドロ葉酸（3a及び3b）の混合ジアステレオマー（6RS）
の分離。 ジアステレオマーの乾燥混合物（17g）を乾燥ブタン
−１−オール（1.5リットル）と一夜撹拌した。混合物
を遠心分離して可溶性フラクション（Ｉ）と不溶性フラ
クション（II）を得た。 以下、分離プロセスの工程を第４図に示す。 ロータリーエバポレーターを使用して可溶性フラクシ
ョン（Ｉ）を温度50〜60℃で容量を400mlに減少させ
た。これによって新しい沈澱（IV）が得られたので、こ
れを遠心分離で集めた。上澄（III）を蒸発乾固して（6
R）テトラヒドロ葉酸のメンチロキシカルボニル誘導体
（5.5g）を得た。沈澱（IV）は下記のようにして得られ
た可溶性フラクション（Ｖ）と混合した。 不溶性フラクション（II）は１リットルのブタン−１
−オールと一夜撹拌して第２のブタノール抽出を行っ
た。これによって可溶性フラクション（Ｖ）が得られる
ので、これを蒸発乾固して上記のように使用し、一方、
不溶性物質（VI）を五酸化リン上で真空乾燥することに
より、（6S）テトラヒドロ葉酸のメンチルオキシカルボ
ニル誘導体（5.47g）を得た。フラクション（IV）と
（Ｖ）を混合し、300mlのブタン−１−オールと48時間
撹拌することで第３のブタノール抽出を行った。これに
より再び可溶性フラクション（VII）と不溶性フラクシ
ョン（VIII）が得られた。ロータリーエバポレーターを
使用して不溶性フラクション（VII）を蒸発乾固し、残
渣を一夜35mlのブタン−１−オールと撹拌した。可溶性
物質を再び蒸発乾固して（6R）テトラヒドロ葉酸のメン
チルオキシカルボニル誘導体の第２群（1.2g）を得た。 不溶性フラクション（VIII）を200mlのブタン−１−
オールと一夜撹拌し、その不溶性物質を上のように乾燥
して（6S）テトラヒドロ葉酸のメンチルオキシカルボニ
ル誘導体の第２群（1.2g）を得た。 （iii）5,10−メテニル−（6R）テトラヒドロ葉酸の塩
化物（NB:天然ジアステレオマー）（4b）の調製。 ５−（−）メンチロオキシカルボニル−（6S）テトラ
ヒドロ葉酸（40g,異性体純度91％）を、ガスの出入口を
備えた２リットルの三つ口フラスコ内で、400mlのギ酸
（98％）に溶かした。 臭化水素の酢酸溶液（45％,800ml）を加えた。反応混
合物を浴中で55〜60℃に保持し、臭化水素ガスを液中に
５時間ゆっくり吹込んだ。 ２−メルカプトエタノール（8ml）を加え、ロータリ
ーエバポレーターを使用して反応混合物を50℃以下の温
度で殆ど乾燥するまで蒸発させた。塩酸（0.5M,1200ml,
0.1％の２−メルカプトエタノール含有）を加え、溶液
を50℃に加温した。加温溶液を濾過し、ロータリーエバ
ポレーターを使用して濾液を50℃以下の温度で約半量に
減少させた。混合物を一夜冷蔵し、濾過によって、5,10
−メテニル−（6R）テトラヒドロ葉酸の塩化物（12.9
g）を回収し、五酸化リン上で真空乾燥した。母液の蒸
発によってさらに1.1gの目的物を得た。 （iv）5,10−メテニル−（6S）テトラヒドロ葉酸の塩化
物（NB:非天然ジアステレオマー）（4a）の調製。 ５−（−）メンチルオキシカルボニル−（6R）テトラ
ヒドロ葉酸（30.4g）を使用し、上の（6R）ジアステレ
オマーの場合と同様にして標記の可溶性フラクション
（17.6g）を得た。 （ｖ）５−ホルミル−（6S）テトラヒドロ葉酸カルシウ
ム（1b）の調製。 すべての作業を無酸素窒素雰囲気下で行った。予め脱
ガスし、窒素で飽和した沸騰水（400ml）を撹拌し、こ
れに5,10−メテニル−（6S）テトラヒドロ葉酸の塩化物
（17.5g）を区分して転化した。脱ガスし、窒素で飽和
した水酸化ナトリウム水溶液（3.7M）を用いて、区分添
加毎にpHを6.5〜7.0に調節した。この添加には約45分を
要した。水酸化ナトリウム水溶液（3.7M）を加えてpHを
6.5〜7.0に調節しながら、還流下に撹拌した反応を５時
間行った。 反応混合物を一夜冷却し、pHを９に調節した。清浄な
塩化カルシウム溶液（22ml,無水塩化カルシウム210gを
水25mlに溶かした調製）を加え、さらに200mlのエタノ
ールを加えた。混合物を冷やし、クリーム色の生成物を
濾別し、少量のエタノール：水混合液（50:50）で洗浄
し、さらにエタノールで洗浄し、五酸化リン上で真空乾
燥することにより、５−ホルミル−（6S）テトラヒドロ
葉酸カルシウム（7.2g）を得た。 ［Gk］_D ²⁰−12.5。500mlのエタノールを母液に加え
て、さらに、3.2gの目的物を得た。 （vi）５−ホルミル−（6R）テトラヒドロ葉酸カルシウ
ム（1a）の調製。 5,10−メテニル−（6R）テトラヒドロ葉酸の塩化物
（17.5g）を使用し、上の（6S）ジアステレオマーの場
合と同様にして標記の化合物（14g）を得た。 ［Gk］_D ²⁰＋22.9。 〈実施例２〉ボルニルオキシカルボニル誘導体を経て５
−ホルミル−（6R及び6S）テトラヒドロ葉酸カルシウム
の調製。 （ｉ）（−）ボルニルクロロホルメートの調製。 氷−水浴に漬けた丸底フラスコ内で、30mlの乾燥トル
エンに溶かした（−）ボルネオール（4.92g）を、ホス
ゲンが溶けたトルエン（32ml、12.5％）に１時間で滴下
した。反応混合物を室温まで放冷し、密閉して一夜放置
した。 トルエンをオイルポンプで除去すると、きれいな残渣
が残るが、このものは蒸留された（0.5mmでの沸点70
℃）。赤外分光で1770cm^-1に強いカルボニルのシグナル
を有し、ヒドロキシルのシグナルを持たない白色固体と
して（−）ボルニルクロロホルメートが得られた。 （ii）５−（−）ボルニルオキシカルボニル−テトラヒ
ドロ葉酸（6a,6b）の混合ジアステレオマー（6RS）の調
製。 メンチルオキシカルボニル−テトラヒドロ葉酸を調製
する場合と同様にして葉酸（2.0g）をテトラヒドロ葉酸
に還元した。 反応混合物を氷−水浴に漬け、濃い塩酸（6ml）を滴
下した過剰のナトリウムボロハイドライドを分解した。
脱ガスし、窒素で飽和したトリス−塩化水素緩衝液（5m
M、pH7,150ml）を加え、pHを７に調節した。脱ガスし、
窒素で飽和した200mlのエタノールに1.2gの（−）ボル
ニルクロロホーメートを溶かした溶液を調製後直ちに一
度に添加し、全体を室温で2.25時間撹拌した。ロータリ
ーエバポレーターを使用して反応混合物の容量を半分に
減少させ、濾過した。濾液を氷−水浴で冷却し、pHを３
に調節した。分離した粗生成物を遠心分離で集め、水酸
化ナトリウム水溶液に溶解して洗浄し、濾過し、上記の
葉にpHを３に調整して再沈澱させた。スラリーを遠心分
離し、100mlの水で固形分を洗浄し、濾過した。固形分
を吸引乾燥し、最後に五酸化リン上で真空乾燥して、５
−（−）ボルニルオキシカルボニル−テトラヒドロ葉酸
の混合ジアステレオマー（2.42g）を得た。 ブタン−１−オール又はブタン−２−オールを使用し
て上記のメンチルオキシカルボニル誘導体と同じくこの
混合ジアステレオマーを分離した。分離したジアステレ
オマーを上記のメンチルオキシカルボニル同族体と同様
に、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸カルシウム（Ia）及
び（Ib）に転化させた。 〈実施例３〉イソボルニルオキシカルボニル誘導体を経
て５−ホルミル−（6R及び6S）テトラヒドロ葉酸カルシ
ウムの調製。 （ｉ）イソボロネオールの調製。 最初にリチウムトリ（テトラブトキシ）アルミニウム
ハイドライド試薬を調製した。リチウムアルミニウムハ
イドライド（1.52g）を乾燥エーテル（50ml）に分散さ
せて撹拌した。乾燥エーテル（10ml）に溶けた乾燥ｔ−
ブタノール（8.89g）を40分で滴下した。次いで混合物
を30分間還流した。乾燥エーテル（10ml）に溶けたカン
ファー（3.0g）を還流中の反応混合物に30分間滴下し
た。反応混合物をさらに2.25時間還流した。過剰の試薬
を分解するために、水と塩酸水溶液を加え、有機層を分
離して水で洗浄した。エーテルを含む溶液を無水硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、ロータリーエバポレーターを用い
て蒸発させて白い固体生成物2.9gを得た。これを石油エ
ーテル（沸点60〜80℃）から再結晶させて白色の結晶固
体を得た。 ［Gk］_D ²⁰＋29.0。 GCL分析（F.F.A.P.カラム120℃）によれば、このもの
は93.5％の（−）イソボルネオールと6.5％の（＋）ボ
ルネオールからなる。 （ii）（−）イソボルニルクロロホルメートの調製。 乾燥トルエン（20ml）に溶けたイソボルネオール（4.
92g）をホスゲンが溶けたトルエン（51.2ml,12.5％）１
時間で滴下した。塩化カルシウムの乾燥管を備えた丸底
フラスコ中で、反応混合物を一夜放置した。 反応混合物から取ったサンプルの赤外分光分析によれ
ば、反応は不完全であった。ホスゲンが溶けたトルエン
（26ml,12.5％）を一度に加え、フラスコを密閉した。
反応混合物を一夜室温で撹拌した。トルエンを真空下で
除去し、赤外分光で1770cm^-1に強いカルボニルのシグナ
ルを有し、ヒドロキシルのシグナルを持たない濃厚なオ
イルとして生成物を得た。 （iii）５−（−）イソボルニルオキシカルボニル−テ
トラヒドロ葉酸（7a,7b）の混合ジアステレオマー（6R
S）の調製。 葉酸（2.0g）をテトラヒドロ葉酸に還元し、過剰のナ
トリウムボロハイドライドを、メンチルオキシカルボニ
ル−テトラヒドロ葉酸調製の場合と同様にして分解し
た。脱ガスし、窒素で飽和したトリス−塩化水素緩衝液
（50mM,pH7,150ml）を加え、pHを７に調節した。脱ガス
し、窒素で飽和した200mlのエタノールに1.2mlの（−）
イソボロニルクロロホルメートを溶かした溶液を調製後
直ちに一度に添加し、全体を室温で撹拌した。 HPLS（高速液体クロマトグラフィー）分析によれば、
反応は１時間後約50％進行していた。さらに1.5時間後
のHPLC分析では、僅かな変化が認められた。この時点で
（−）イソボルニルクロロホルメート（1.2ml）を追加
し、１時間後にまた添加した。全体を室温で一夜撹拌し
た。 オフホワイトの沈澱である生成物を濾別し、水酸化ナ
トリウム水溶液に溶かして洗滌し、濾過し、pH3に調節
して再沈澱させた。スラリーを遠心分離し、固体を少量
の水で洗浄して濾過することにより、５−（−）イソボ
ルニルオキシカルボニル−テトラヒドロ葉酸の混合ジア
ステレオマー（1.45g）を得た。 反転層カラムにHPLCを使用したクロマトグラフィー
で、これらのジアステレオマーを分離し、分離されたジ
アステレオマーの純度をHPLCで確認した。 この実施例は、キラル補助グループが付加して形成さ
れた新しいジアステレオマーをクロマトグラフィーで分
離した例を示す。分離された新しいジアステレオマー
は、実施例１の手順によりテトラヒドロ葉酸の対応する
ジアステレオマーに転化させることができる。 〈実施例４〉５−ホルミルテトラヒドロ葉酸の混合ジア
ステレオマー誘導体の調製と物理的性質の比較。 （ｉ）５−ホルミル−10（2R,3−ジヒドロキシプロピ
ル）テトラヒドロ葉酸（5a,5b）の混合ジアステレオマ
ー（6RS）の調製。 酸（5a,5b）の混合ジアステレオマー（6RS）の調製。 すべての作業を無酸素窒素雰囲気下でおこなった。５
−ホルミル−（6RS）テトラヒドロ葉酸カルシウム
（「ウェルコボリン」0.1g）を蒸留水（2ml）に溶解さ
せ、Ｄ（＋）グリセルアルデヒド（0.071g）とナトリウ
ムシアノボロハイドライド（0.015g）を加えた。反応混
合物を室温で撹拌し、塩酸（1M）を加えてpHを約５に保
持した。24時間後及び48時間後に、再びＤ（＋）グリセ
ルアルデヒド（0.071g）とナトリウムシアノボロハイド
ライド（0.015g）を加え、pHを５に維持した。70時間
後、pHを３に調節し、溶液を冷やすことによって、淡色
の固体として混合ジアステレオマー（0.016g）を得た。
混合物のNMRスペクトルは、8.71ppm及び8.80ppmに５−
ホルミル基の特徴的ピークがあることを示した。 なお、同様にして５−ホルミル−（6S）−テトラヒド
ロ葉酸（上記実施例４によって調製され、かつジヒドロ
ホレートの酵素還元によって得たテトラヒドロホレート
のサンプルから調製された葉酸）の誘導体と、（6R）ジ
アステレオマーの対応誘導体とを調製した。これら誘導
体はNMRスペクトルによって次の葉に区別される。 （ａ）（6R）ジアステレオマーの誘導体（5b） （ｉ）実施例１（ｖ）で調製されたジアステレオマー…
…8.71ppmにピーク信号。 （ii）酵素反応的に調製されたジアステレオマー……8.
71ppmにピーク信号。 （ｂ）実施例１（vi）で調製された（6R）ジアステレオ
マーの誘導体（5a）……8.80ppmにピーク信号。

【図面の簡単な説明】 第１図はロイコボリンのジアステレオマーのサンプルの
調製に必要な反応と分離工程を示す図、第２図および第
３図はテトラヒドロホルメート誘導体を調製する場合の
概要図、第４図は分離プロセスの工程を示す図である。

フロントページの続き (72)発明者 ハーミッシュ クリストファー スワン ウッド イギリス国 スコットランド グラスゴ ウ ジ‐61 ２ピージー ベアスデン アルバート ドライブ 26 (72)発明者 コリン ジェイムス サックリング イギリス国 スコットランド グラスゴ ウ ジー61 ３エイエフ ベアスデン ノース グレインジロード62 (72)発明者 リリアス リーズ イギリス国 スコットランド グラスゴ ウ ジー64 ２デーゼット ビショップ ブリッグス ポロック ドライブ 100 (56)参考文献 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 42 Ｎｏ. １ ｐ117〜136（1986)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ａ）テトラヒドロ葉酸又はその置換体もしくはその
   塩またはエステルのジアステレオマー6R及び6Sの混合物
   のＮ−５又はＮ−10のいずれかに、（−）メンチルオキ
   シカルボニル、（−）ボルニルオキシカルボニル又は
   （−）イソボルニルオキシカルボニルのグループからな
   るキラル補助グループを付加させて、一対の新しいジア
   ステレオマーを形成させ、 ｂ）一対の新しいジアステレオマーを分離して所望のジ
   アステレオマー（6R又は6S）に対応して形成された新し
   いジアステレオマー（6R又は6S）を回収し、そして ｃ）単離された実質的に純粋な新しいジアステレオマー
   を、対応するテトラヒドロ葉酸又はその置換体もしくは
   その塩またはエステルの実質的に純粋なジアステレオマ
   ー（6R）又は（6S）に転化すべく、前記キラル補助グル
   ープを除去する 工程からなるテトラヒドロ葉酸の誘導体もしくはその塩
   またはエステルの実質的に純粋なジアステレオマー（6
   R）又は（6S）を調製する方法。 ２．得られたテトラヒドロ葉酸の誘導体又はその塩もし
   くはそのエステルが、ロイコボリン（５−ホルミルテト
   ロヒドロ葉酸）又はその塩もしくはそのエステルの実質
   的に純粋なジアステレオマー（6R）に転化されている特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．テトラヒドロ葉酸の誘導体又はその塩もしくはその
   エステルが、５−メチル−又は5,10−メチレン−または
   5,10−メテニル−テトラヒドロ葉酸又はその塩もしくは
   そのエステルである特許請求の範囲第１項または第２項
   に記載の方法。 ４．5,10−メテニルテトラヒドロホレートの実質的に純
   粋な（6R）ジアステレオマーを得る方法において、更に
   5,10−メテニルヒドロ葉酸の実質的に純粋な（6R）ジア
   ステレオマーを、ホルミル−又は５−メチルテトラヒド
   ロ葉酸又はその塩もしくはそのエステルの実質的に純粋
   な（6S）ジアステレオマーに転化する工程を含む特許請
   求の範囲第３項に記載の方法。 ５．新しいジアステレオマーが溶媒抽出、分別結晶又は
   クロマトグラフィーで単離される特許請求の範囲第１〜
   ４項のいずれか一つの項に記載の方法。 ６．溶媒抽出又は分別結晶が極性溶媒を使用して行われ
   る特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．溶媒抽出又は分別結晶を、単離される新しいジアス
   テレオマーの純度が90％以上になるまで繰返す特許請求
   の範囲第５項又は第６項に記載の方法。