PL166096B1 - pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PL - Google Patents
pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL166096B1 PL166096B1 PL90288204A PL28820490A PL166096B1 PL 166096 B1 PL166096 B1 PL 166096B1 PL 90288204 A PL90288204 A PL 90288204A PL 28820490 A PL28820490 A PL 28820490A PL 166096 B1 PL166096 B1 PL 166096B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- acid
- ester
- salt
- tetrahydrofolic acid
- tetrahydrofolic
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
- C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
- C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/842—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego diastereoizomeru (6R lub 6S ) pochodnej kwasu 5,6(R lub S),7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, znamienny tym, ze obejm uje etapy (a) enzymatycznego formylo- wama formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 6S kwasu tetrahydro- foliowego lub podstawionego kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy uzyciu form ylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez C lo- stridium sp. A TCC nr 7905 lub jego mutant i albo (b) (1) oddzielania kwasu 10-formylo-5,6S, 7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru od kwasu 5,6R, 7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i nastepnie cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy uzyciu kwasu siarkowego lub (2) cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy uzyciu kwasu siarkowego w obecnosci kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru; i nastepnie albo (i) derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydro- foliowego lub jego soli lub estru przy uzyciu mentylochloromrówczanu i wówczas rozdzielania skladników; lub alternatywnie (ii) oddzielania którego- kolwiek kwasu 5,10-metenylo-5,6S,7,8- tetrahydrofoliowego i kwasu 5-for- m ylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliow ego lub ich soli lub estrów od kwasu 5 ,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, i po rozdzieleniu w razie potrzeby (3) chemicznego formylowania przy uzyciu kwasu mrówkowego w obecnosci karbodiimidu, cyklizacji i hydrolizy nieprzereagowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub je g o soli lub estru przy uzyciu kwasu siarkowego lub alternatywnie derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofolio- wego lub jego soli lub estru z innymi grupami funkcyjnymi przy uzyciu mentylochloromrówczanu i w razie potrzeby (c) konwersji zasadniczo czyste- go kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru lub kwasu 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru. WZÓR 1a W ZÓR 1b PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania optycznie czystych diastereoizomerdw związków tetrahydrofolianowych obejmujący przekształcenie tylko komponenta kwasu
5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego mieszaniny racemicznej kwasu 5,6,7,8-tetrahydrofoliowego w kwas 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy w obecności syntetazy formylotetrahydrofolianowej pochodzenia bakteryjnego.
Leukoworyna i jej sole są uważane za farmaceutycznie skuteczne, patrz Remington's Pharmaceutical Services, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985 /Remington's/ str. 1023.
Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 746 662 ujawnia, że przeciwartretyczną skuteczność metotreksate można zwiększyć przez iniekcję wodnego roztworu leukoworyny lub jej soli. Publikacja patentowa EPO nr 0 266 042 z 4 maja 1988 opisuje zastosowanie czystych izomerów do wytwarzania leków do wspomagania metotreksate dla leczenia raka okołoodbytniczego w kombinacji z 5-fluorouracilem i dla leczenia niedoboru folianu. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 500 711 opisane jest oczyszczanie leukoworyny i jej soli.
Leukoworyna jest zwykle podawana w postaci soli takich jak sole z metalami alkalicznymi lub metalami ziem alkalicznych, takich jak sól wapniowa leukoworyny, przy czym korzystny jest izomer-1.
Pentahydrat soli wapniowej /1:1/ kwasu N-/ [/2-amino-5-formylo-3,4,5,6,7,8 -heksahydro-4okso-6-pterydynylometylo/amino/benzoilo/-L-glutaminowego /Leucovorin Calcium USP/ jest sprzedawany jako sól wapniowa mieszaniny związków o wzorze 1a i 1b /1:1/, w której związki mają stereochemię odpowiednio /R/ i /S/ przy węglu C-6.
Jest on stosowany głównie jako odtrutka dla antagonistów kwasu foliowego takich jak metotreksata, które blokuję konwersję kwasu dihydrofoliowego do kwasu tetrahydrofoliowego. Sole leukoworyny zestawia się w wodzie do iniekcji z odpowiednimi środkami konserwującymi, jak opisano pod hasłem Leucovorin Calcium Injection w Physician's Dask Reference, wyd. 43, Medical Economics Company, Dradell, NJ 1989 /PDR 34rd Ed./ str. 1124.
Farmakokinetyczne zachowanie się dwóch izomerów różni się tym, że izomer /S/ - związek o wzorze 1b jest selektywnie absorbowany z przewodu żołądkowo-jelitowego i ma krótszy półokres życia osocza w stosunku do izomeru /R/ - związku o wzorze 1a.
Naturalnie występujący izomer o wzorze 1b, który jest diastereoizomerem 6S, jest opisany przez C. Temple, Jr, J.P. Rose, W.R. Laster i J.A. Montgomery, Cancer Treatment Reports,
65. 1117 - 1119 /1981/, jako ważny do leczenia ze względu na jego skuteczność w przywracaniu metabolizmu jedno-węglowego.
Doniesienie R.P. Leary, Y. Gaumont i R.L. Kisliuk, Biochem. and Biophys. Res. Commun.,
56. 484-488 /1974/, że synteza tymidylanu z L. casei jest hamowana przez nie-naturalny izomer tetrahydrofolianu 5,10-metylenu i doniesienie V.F. Scott i K.O. Donalddson, Biochem. and Biophys. Res. Commun., 14, 523-526 /1964/, że dehydrogenaza 5,10-metylenotetrahydrofolianowa z E. Coli jest również hamowana przez ten sam diastereoizomer, skojarzone z obserwacją G.K. Smith, P.A. Benkovic i S.J. Benkovic, Biochem., 20, 4034-4036 /1981/, że ten sam diastereoizomer 10-formylotetrahydrofolianu jest silnie konkurencyjnym inhibitorem formylotransferazy rybonukleotydu glicynamidu /GAR/ z ostrego końca wątroby kurczęcia do hamowania biosyntezy pirymidyny i puryny i tym samym biosyntezy ONA przez nie-naturalne diastereoizomery pochodnych jednowęglowych tetrahydrofolianów. Dlatego więc postacie nie-naturalne nie mogą być uważane za biologicznie obojętne. Jeżeli takie hamowanie występuje w układach ssaków, wówczas istnieje potencjalna kliniczna potrzeba tylko dla naturalnej formy /6S/ tetrahydrofolianu, zwłaszcza leukoworyny.
Diastereoizomeryczne składniki o wzorze 1a i 1b są rozdzielane /D.B. Cosulich, J.M.
Smith, Jr. i H.P. Proglist, J. Am. Chem. Soc., 74, 4215 /1953// przez krystalizację frakcyjną i przez chromatografię /J. Feeney, B. Birdsall, J.P. Albrand, G.C.K. Roberts, A.S. Bungen, P.A. Charlton i D.W. Young. Biochem., 20, 1837 /1981//. Stereospecyficzna redukcja dihydrofolianu katalizowana przez reduktazę dihydrofolianową opisana przez L. Rees, E. Valente·,
C.J. Suckling i H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42, 117 /1986/, prowadzi do stereospecyficznego izomeru 6/S/.
Praca naukowa L. Rees, E. Valente, C.J. Suckling i H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42. 117-136
166 096 /1986/ opisuje syntezę chiralnych pochodnych tetrahydrofolianu, włącznie z leukoworyną.
Układ wymagał stosowania reduktazy dihydrofolianowej z E. coli i rozległego i kosztownego zawracania ko-czynnika redukującego NADPH. Inna praca L. Rees, C.J. Suckling i H.C.S. Wood,
J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470 /1987,/, /europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 266 042 A2/ opisuje acylowanie 6/R,S/-tetrahydrofolianu chloromrówczanem /-/-mentylu z wytworzeniem N-5 pochodnych jako mieszaniny diastereoizomerycznej, którą rozdzielano przez wytrącanie frakcyjne. Późniejsze traktowanie każdego diastereoizomeru kwasem mrówkowym i bromowodorem w kwasie octowym i następnie hydroliza dała każdy izomer 5-formylotetrahydrofolianu.
Odkryto, że optycznie czynne diastereoizomery związków tetrahydrofolianowych można wytwarzać łatwiej zgodnie z wynalazkiem. Główną zaletę tego procesu w porównaniu z uprzednio opublikowanymi i opatentowanymi procedurami jest jego zadziawiająca prostota, ponieważ kluczowy etap wymaga tylko stosowania jednego enzymu, formylazy tetrahydrofolianowej, inaczej zwanej enzymem aktywującym mrówczan lub syntetazą formylotetrahydrofolianową /FTHFS/, która również dodaje potrzebną grupę formylową tylko do diastereoizomeru 6S przy stosowaniu racemicznej mieszaniny kwasu 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrofoliowego /o wzorze 1a i 1b/. Ponadto wykorzystanie tego enzymu ma wyraźną przewagę nad stosowaniem enzymu reduktazy dihydrofolianowej w tym, że wymaga stosowania obszernego układu regeneracji dla ko-czynników.
Formylaza tetrahydrofolianowa może być wytwarzana przez Micrococcus aerogenes, Clostridium cylindrosporum, Clostridium acidi-urici, Clostridium thermoaceticum i przez inne mikroorganizmy, rośliny i zwierzęta /D.H. Butlaire, Methods In Enzymology, 66, 585-599 /1988//.
Stosując znakowany radioaktywnie mrówczan amonu lub inny związek, włącznie z wytworzonymi in situ w enzymatycznym formylowaniu, znakowanymi radioaktywnie solami lub pochodnymi kwasu mrówkowego, można otrzymać znakowany związek o wzorze 3b i przekształcać go w znakowany związek o wzorze 4b lub znakowany związek o wzorze 1b. Z pomocą enzymu dehydrogenazy 5,10-metylenotetrahydrofolianowej dowolne ze znakowanych radioaktywnie 5,6S,7,8-tetrahydrofolianów niosących grupę formylowę /związki o wzorze 1b, 3b lub 4b/, korzystnie związek o wzorze 4b, można przekształcać w znakowany kwas 5,l0-metyleno-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy, który z kolei pod wpływem enzymu reduktazy 5,10-metylenotetrahydrofolianowej można przekształ cać w znakowany radioaktywnie kwas 5-metylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy. Tak więc znakowany radioaktywnie związek o wzorze 1b generowany przez zastosowanie wynalazku jest użytecznym związkiem do wytwarzania znakowanych radioaktywnie pochodnych kwasu 5,68,7,8-tetrahydrofoliowego.
Odkryty sposób również nieoczekiwanie pozwala na wyodrębnienie kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego o wzorze 2a, który nie jest formylowany przez enzym. Wyodrębniony związek o wzorze 2a można następnie sprzedawać jako taki /skomercjalizowany jako związek rzadki/ lub można wykorzystywać jako związek wyjściowy do wytwarzania na przykład kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego o wzorze la analogicznie do procesu opisanego przez R.G.Moran i P.D. Colman, Anal. Biochem. 122, 70-78 /1982/, z wykorzystaniem kwasu mrówkowego razem z lub bez rozpuszczalnego w wodzie karbodiimidu, l-etylo-3-/3'-dimetyloaminopropylo/karbodiimidu. Jednakże korzystnie wyodrębnienie związku o wzorze 2a jest zakończone po konwersji związku o wzorze 3b do związku o wzorze 4b i/lub lb. Pozwala to na łatwiejsze rozdzielanie składbików przez chromatografię z odwróconymi fazami. Również związek o wzorze 2a można modyfikować w obecności związku o wzorze 4b i/lub lb, ponieważ pozycja 5 w związku o wzorze 2a jest jeszcze reaktywna, podczas gdy w związku o wzorze 4b lub lb nie jest reaktywna, otrzymując pochodną o wzorze 2a, na przykład kwas 5-karboksymentylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy, który można oddzielać od związku o wzorze 4b lub lb w prostym etapie adsorpcji.
Ponadto wydzielony związek o wzorze 2a można poddawać reakcji, jak podano przez C. Temple, Jr., L.L. Bennett, Jr., J.D. Rosę, R.D. Elliott, J.A. Montgomery i J.H. Mongum, J. Med. Chem., 25, l6l-l66 /l982/, w celu otrzymania różnych 5- i l0-podstaviionych, 5,l0-dipodstawionyąh i 5,10-mostkowo-podstawiObych pochodnych kwasu 5.6R.7.8-tetrahydrofoliowego.
W szczególności można syntetyzować 5-metylo-5,6R-7,8-tetrahydrofolian ze związku o wzorze 2a z formaldehydem i borowodorkiem sodu w warunkach zasadowych, jak opisano w metodzie A.A. Blair i K.J. Saunders, Anal. Biochem., 34, 376 /l970/. Alkilowanie związku o wzorze
166 096
2a dimatylosiarczanem w N,N-dimetyloacetamidzie w temperaturze 55°C uzyskuje się stosujęc metodę opisaną w japońskim patencie 7 332 120 /1973,/} Chem. Abst., 80.· 2792Χ /1974/.
Zastępując kwas mrówkowy lub czynniki alkilujące we wskazanych powyżej reakcjach znakowanym radioaktywnie kwasem mrówkowym lub jego pochodnymi lub radioaktywnymi czynnikami alkilującymi, otrzymuje się znakowane radioaktywnie pochodne kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego.
Według wynalazku zarówno znakowane radioaktywne pochodne kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego jak i znakowane radioaktywne pochodne kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego i ich sole można wytwarzać oddzielnie i są one użytecznymi związkami do testowania, na przykład do badania mechanizmów enzymatycznych.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania żądanego, zasadniczo czystego diastereoizomeru /6R lub 6S/ pochodnej kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, który obejmuje etapy;
/a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 65 kwasu tetrahydrofoliowego lub podstawionego kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp. ATCC nr 7905 lub jego mutant tak, aby otrzymać mieszaninę zawierającą kwas 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester oraz nieprzereagowany kwas 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester oraz nieprzereagowany kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester; i albo /b/ /1/ oddzielania kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i następnie cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego tak, aby otrzymać kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,3-tetrahydrofoliowy lub kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry lub oba poprzednie związki; lub /2/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego tak, aby otrzymać kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry lub oba poprzednie związki, w obecności kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru; i następnie albo /i/ derywatyzacji kwasu 5,aR,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu mentylochloromrówczanu tak, aby otrzymać 5-podstawiony 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester i wówczas rozdzielania składników lub alternatywnie, /ii/ oddzielanie któregokolwiek kwasu 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego i kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub ich soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i po rozdzieleniu, gdy to jest pożądane, /3/ chemicznego formylowania, przy użyciu kwasu mrówkowego w obecności karbodiimidu, cyklizacji i hydrolizy nieprzereagowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego tak, aby otrzymać kwas 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester lub.alternatywnie derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru z innymi grupami funkcyjnymi przy użyciu mantylochloromrówczanu tak, aby otrzymać kwas 5-podstawiony 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester; i w razie potrzeby /c/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru lub kwasu 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru w odpowiedni kwas, sól lub ester, przy czym konwersja obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli a enzymatyczny preparat wytwarza się w mieszaninie reakcyjnej zawierającej znakowany radioaktywnie kwas mrówkowy lub chemiczny odpowiednik.
Produkty z tego procesu same są cenne, na przykład w terapii i jako związki pośrednie do wytwarzania innych cennych produktów oraz gdy są znakowane radioaktywnie mogą być stosowane do badania na przykład mechanizmów enzymatycznych. Dla fachowców w tej dziedzinie oczywiste jest stosowanie takich związków do takich celów.
Korzystnie proces stosuje się do otrzymania żądanego, zasadniczo czystego kwasu 5-formylo6
166 096
-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i polega na tym, że obejmuje etapy /a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 6S kwasu 5,6,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp. ATCC nr 7905 lub jego mutant tak, aby otrzymać mieszaninę zawierającą kwas 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester, nieprzereagowany kwas 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub jego sól lub ester i nieprzereagowany kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry i /b/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10,formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru tak, aby otrzymać kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub ich sole lub estry lub oba powyższe związki i następnie /c/ oddzielania kwasu 5,10-metenylo5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub Jego soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru; i po rozdzieleniu w razie potrzeby /d/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru, przy czym /c/ obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli. Takie związki mają cenne własności jako środki odtruwające. Zwłaszcza korzystny jest sposób, w którym enzym stosowany do selektywnego formylowania obejmuje formylazę tetrahydrofolianową. Proces jest również uzyteczny do wytwarzania żądanego, zasadniczo czystego diastereoizomeru /6R lub 6S/ pochodnej /znakowanego radioaktywnie/ kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru. Takie substancje można stosować do badania mechanizmów enzymatycznych.
Związki wyjściowe stosowane w sposobie według wynalazku można wytwarzać technikami dobrze znanymi dla fachowców w dziedzinie biochemicznych przekształceń. Mieszaninę związków o wzorze 2a /izomer R/ i 2b /izomer S/ można wytwarzać przez redukcję kwasu foliowego borowodorkiem sodu z zastosowaniem procedury C.Temple, Jr., R.D. Elliott, J.D. Rose i J.A. Montgomery, J.Med.Chem., 222 , 731 /1979/.
Wychodząc z tych związków, reakcja według wynalazku jest pokazana na schemacie 1.
Jak pokazano na schemacie 2, związek o wzorze 2a, który może być oddzielony od związku o wzorze 3b przez chromatografię, formyluje się kwasem mrówkowym, aby uzyskać przy okresowym tworzeniu się związku o wzorze la, soli imidazoliniowej o wzorze 4a, którą po krystalizacji hydrolizuje się otrzymując czysty nienaturalny izomer leukoworyny o wzorze 1a. Alternatywnie, mieszaninę związków o wzorze 3b i 2a można doprowadzić do konwersji związku o wzorze 3b do związku o wzorze 4b i/lub 1b, otrzymując w ten sposób mieszaninę związku o wzorze 4b i/lub 1b oraz 2a. Składniki tej mieszaniny łatwo oddziela się chromatograficznie, to jest związek o wzorze 2a od 4b i/lub 1b.
Procedura wyodrębniania stanowi również w rzeczywistości rozdzielanie diastereoizomerów 6R i 6S kwasu tetrahydrofoliowego. Ponieważ związek o wzorze 2a można przekształcać w związek o wzorze 1a chemicznie, wynalazek formalnie dotyczy sposobu skutecznego rozdzielania związku o wzorze 1b od związku o wzorze 1a, które są bardziej powszechnie oznaczane jako naturalne i nienaturalne formy leukoworyny.
Następujęce przykłady ilustruję wynalazek lecz nie ograniczają w jakikolwiek sposób zakresu zastrzeżeń patentowych.
Procedura A. Przeprowadza się wyodrębnianie i wzrost Clostridium cylindrosporum /zwanego również Clostridium sp. ATCC nr 7905/.
Ponieważ Clostridium jest beztlenowcem, wszystkie operacje wytwarzania kultury, utrzymywania i obsługiwania prowadzi się w warunkach, które minimalizują narażenie szczepów na działanie tlenu. Podobnie, ze względu na ekstremalną nietrwałość tlenu tetrahydrofolianu i jego pochodnych, wszystkie procesy obejmujące te związki są prowadzone w nieobecności tlenu. Do tego celu stosuje się beztlenowy aparat workowy z tworzywa sztucznego połączony ze źródłem azotu nie zawierającego tlenu.
1. Wytwarzaarz pożywki wziostooet kwasu aouzmoezo. Pożywka z kwzsk mouzmocgo jest wytwarzana jak spieano w ATCC Media Handbkok - przepis nr 519:
166 O96
Skład pożywki z kwasu moczowego
| kwas moczowy | 3,0 | g, |
| ekstrakt drożdży | 1,0 | g, |
| dwuzasadowy fosforan potasu | 4,0 | 9. |
| heptahydrat siarczanu magnezu | 0,1 | g, |
| siarczan żelazawy | 5,0 | 9. |
| 0,04% roztwór czerwieni fenolowej* | 1,0 | g, |
| tioglikolan sodu | 0,5 | g, |
| woda destylowana | 1.0 | 1 |
x 14,9 ml 0.01N wodorotlenku sodu potrzebne do 0,.1 g indykatora.
Rozcieńcza się do 250 ml wodę destylowaną dla uzyskania 0,04% roztworu. Przy wytwarzaniu pożywki kwas moczowy zawiesza się w niemal całej objętości cieczy, ogrzewa do temperatury wrzenia i doprowadza do stałej barwy różowej czerwieni fenolowej /pH 7,6/ za pomocą wodorotlenku sodu. pH Sprawdza się papierkiem. W celu otrzymania stałej pożywki, dodaje się do niej 20,0 g agaru. Pożywkę wylewa się do kolby z nakrętkę prawie do pełna, następnie ogrzewa się do wrzenia przeczyszczając gazowym azotem nie zawierającym tlenu. Przy następującym po tym bezpośrednio autoklewowaniu, nakrętkę kolby całkowicie uszczelnia się. Pożywkę przechowuje się w temperaturze pokojowej, aby zapobiec wytrącaniu się kwasu moczowego w niższych temperaturach.
2. Posiew kultury Clostridium cylindrosporum na pożywce wzrostowej.
Wszystkie operacje przeprowadza się w warunkach beztlenowych w komorze rękawicowej. Porcję 1,0 ml ciekłej pożywki z kwasu moczowego dodaje się do liofilizowanych granulek bakterii otrzymanych z ATCC. Granule rozpuszczają się i sterylną jednorazową pętlę do szczepienia stosuje się do tworzenia smug ponownie zawieszonej kultury na płytce z pożywką z kwasu moczowego. Płytki umieszcza się w beztlenowym słoju zawierającym powłokę generującą H2-CO2 i pasek wskaźnika błękitu metylenowego. Słój zawierający zaszczepione płytki inkubuje się w temperaturze 37°C. W ciągu 24 godzin wzrost jest widoczny na płytkach jako jasne, przezroczyste, podobne do palca rzuty promieniujące z kolonii. Próbka reprezentatywnej kolonii, jak zobaczono pod mikroskopem z kontrastem fazowym, wykazuje typową morfologię komórki Clostridium i tworzenie się zarodników.
3. Wytwarzanie trwałej hodowli macierzystej Clostridium cylindrosporum.
Pożywkę z kwasu moczowego na płytkach wytwarza się w rurkach Hungate /Bellco Glass Co./
- 10 ml pożywki/rurkę i służy ona jako źródło trwałej hodowli macierzystej Clostridium cylindrosporum. Próbkę pojedyńczej kolonii komórek z opisanej powyżej kolonii wybiera się sterylną pętlą do szczepienia i wkłuwa do pożywki w rurce Hungate. Procedurę przeprowadza się w worku beztlenowym zawierającym gazowy azot. Rurki umieszcza się w beztlenowym słoju i inkubuje w temperaturze 35°C. Po pięciu dniach rurki usuwa się ze słoja i nakrętki dokładnie uszczelnia się parafilmem. Rurki przechowuje się w temperaturze pokojowej do dalszego ich wykorzystania .
4. Wytwarzanie materiału do szczepienia dla ciekłej pożywki wzrostowej.
Rurki półstałej pożywki z kwasu moczowego /2,5 g/l Bacto-Agar/ zaszczepia się kolonią Clostridium cylindrosporum inkubowaną w temperaturze 35°C i przechowywaną w temperaturze pokojowej, jak podano powyżej. Te kultury służą jako źródło materiału do szczepienia dla wzrostu ciekłej pożywki, jak opisano w następnym punkcie.
5. Wzrost ciekłej pożywki Clostridium cylindrosporum.
Jedną miękką kulturę agarową /całe 10 ml/ dodaje się do jednego litra ciekłej pożywki z kwasu moczowego. Wszystkie operacje przeprowadza się w worku beztlenowym i całą kulturę inkubuje się w beztlenowym słoju przez 4 dni w temperaturze 35°C.
Procedura B. Przeprowadza się wytwarzanie surowego ekstraktu syntetazy formylotetrahydrofolianowej Clostridira cylindrosporum.
Jak w procedurze A, wytwarzanie kultury, utrzymywanie i obsługiwanie prowadzi się w warunkach, które minimalizują narażenie szczepów na działanie tlenu, ponieważ Clostridium jest beztlenowcem. Podobnie, z powodu ekstremalnej nietrwałości tlenu tetrahydrofoliani
166 096 i jego pochodnych, wszystkie operacje obejmujące te związki przeprowadza się w nieobecności tlenu. Do tego celu stosuje się beztlenowy aparat workowy połączony ze źródłem gazowego azotu nie zawierającego tlenu. Jeden litr kultury staje się mętny i jednorodny materiał osadza się w pożywce. Kulturę dzieli się na podwielokrotności 4 x 250 ml i dodaje do 4 x 250 ml butelek wirówki. Kultury wiruje się w temperaturze 4°C z szybkością 8000 obrotów na minutę przez 15 minut w wirówce Beckman J2-21.
Chociaż pożywka jest ochłodzona do 4°C, kwas moczowy nie wytrąca się z powodu jego konsumpcji przez bakterie. Granulki komórek ponownie zawiesza się w 4 x 25 ml chłodzonej lodem wody destylowanej i odwirowuje, jak powyżej. Granulki wymraża się w temperaturze -20°C przez 5 dni przed oznaczaniem na syntetazę formylotetrahydrofolianową.
Zamrożone granulki rozmraża się w całych 4,0 ml buforu /0,05M bifosforan potasowy,
0,05M 2-merkaptoetanol /pH 7,5 przez dodanie 1M wodorotlenku potasu//. Granulki miesza się i pozostawia do rozpuszczenia przez okresowe wirowanie w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Dostrzegalnie granulki komórek stają się lepkie z powodu rozpadu komórek. Autorozpad następuje w temperaturze pokojowej. Lizat komórek odwirowuje się z szybkością 17000 obrotów na minutę przez 30 minut i nadsącz zachowuje się na lodzie, i oznacza na syntetazę formylotetrahydrofolianową.
Procedura C. Oznaczanie syntetazy formylotetrahydrofolianowej prowadzi się metodę opisaną w Buttlaire “Purification and Properties of Formyltetrahydrofolate Synthetase, Enzymology Vol. 66, str. 585, 1980/
Przykład I. Redukcję kwasu foliowego do kwasu 5,6/,S/,7,8-tetrahydrofoliowego prowadzi się stosując ostatnią metodę literaturową /C. Temple, Jr., R.D. Elliott, J.D. Rose i J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22_, 731 /1979//, wykorzystujacą borowodorek sodu.
Przyk ład II. Sposób wytwarzania kwasu lO-formylo-5,K,7,8-tetrahydrofoliowego. Wytwarza się następującą mieszaninę reakcyjną odpowiednią do enzymatycznego formylowania kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego do wytwarzania kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego 100 ml 1,0M chlorodoworku trietanoloaminy /pH 8,0/, 100 ml 0,5M trifosforanu adenozyny /pH 8,0/, 100 ml chlorku potasu, 100 ml 0,1M heksahydratu chlorku magnezu i 200 ml 0,2 M mrówczanu amonu /pH 8,0/. Zawartość całej 5 g fiolki kwasu 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrofoliowego /Sigma; 69% czystości, partia nr 117F-5013/ zawiesza się w 200 ml 0,2M tris-HCl/0,05M 2-merkaptoetano1u /pH 7,0/ i rozpuszcza przez dodanie około 15 ml 1M wodorotlenku potasu. Przezroczysty roztwór wylewa się do uprzedniej mieszaniny i dodaje się około 200 ml wody destylowanej otrzymując 1,0 litr całej mieszaniny reakcyjnej w 2 litrowej szklanej butli.
Reakcję rozpoczyna się przez dodanie 4 ml surowego ekstraktu enzymu zawierającego syntetazę formylotetrahydrofolianowę” /FTHFS/ i pozwala się na przebieg reakcji w temperaturze 22°C. Próbki okresowo usuwa się kontrolując postęp reakcji przez HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1M kwasem mrówkowym i modyfikowaną metanolem z liniowym gradientem od 12 do 25% przez 30 minut. Eluat z kolumny kontroluje się przy 282 nm wykrywając kwas 5,6/R,S/7,8-tetrahydrofoliowy przy 12 minutach i kwas 5,l0-netenylotetrahydrofoliowy przy 16 minutach. Reakcja jest zakończona po 18 godzinach. W tym czasie 48% początkowej ilości kwasu 5,6/R,S/7,8-tetrahydrofoliowego pozostaje, co oznaczono przez powierzchnię pod krzywą. Równoważnik 1585 mg kwasu 10-fornylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego z mieszaniny reakcyjnej oblicza się z chromatogramu HPLC przedstawiającego 5,10- metenylotetrahydrofolian. Ta ocena dla konwersji 92% teoretycznej wskazuje, że tylko 1725 mg z wyjściowych 3450 mg kwasu 5,6/R,S/,7,8-tetrahydrofoliowego było przyswajalne dla enzymatycznej reakcji konwersji. 50% Wydajności teoretycznej jest przekształcane po 5 godzinach.
Przykład III. Konwersja kwasu 10-fomylo-5,6S, 7,8-tetrahydrofoliowego w kwas 5-fo rmylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy.
Mieszaninę reakcyjną z przykładu II kontroluje się przez dalszy dzień nie stwierdzając zmian w składzie. Porcję 100 ml mieszaniny przenosi się do kolby trójszyjnej i pH roztworu doprowadza się do wartości 6,5 za pomocą kwasu siarkowego. Podczas odgazowania azotem, kolbę zanurza się w łaźni wodnej i ogrzewa w temperaturze 90 - 95°C przez 2 godziny. Następnie reakcję kontynuuje się w atmosferze azotu w temperaturze 4O°C przez noc. Mieszanina reakcyj166 036 o
na jest brązowa po 16 godzinach. Próbkę analizuje się przez HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1M kwasem mrówkowym i modyfikowaną metanolem w liniowym gradiencie od 12 do 25% przez 30 minut. Eluat kolumny monitoruje się przy 282 nm. Analiza HPLC wskazuje stopień konwersji 90,2% gdy rozpatruje się powierzchnię pod krzywą, dla pików 5,10-11^tenylo-5,6S,7,-ttttaahydaofolianu i kwasu S-formylo-S^S,7,8-tetrahydrofoliowego. Powierzchnia dla kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego, który nie powinien ulegać zmianie, jest zmniejszona do 33,1% w stosunku do powierzchni dla substancji wyjściowej /48%/.
Próbki mieszaniny reakcyjnej podaje się za pomocą pompy do kolumny z odwróconymi fazami preparatywnej HPLC /Dynamax 60A-C18, 8/J, 2,1 x 30 cm/ i następnie rozwija z gradientem 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu z szybkością przepływu 13 ml na minutę przez 60 minut. Otrzymuje się nieco żółtego kwasu 5tformylo-5»6S,7,8-tttaahydrofoliowego w 82% całkowitej wydajności produktu, który w warunkach kwasowego eluowania /0,1M wodny roztwór kwasu mrówkowego i metanol/ przekształca się w kwas 5,10-mtttnylot5,6S,7,--tetaahydrofoliowy, który następnie po odstaniu w stężeniu 3 do 6 mg/ml tworzy żel w zbiorczej fiolce. Enancjomerycznę czystość próbki oznaczono przez HPLC stosując kolumnę chiralną /Diacel Chiracel 00/, eluując izokratycznie 0,5% mrówczanu amonu, pH = 3,8 i 25% metanolu. Rejestruje się czas retencji 15,2 minut z następującą skręcalnością optyczną w kwasie mrówkowym:
| r-—— J Związek 1— __ ___________. | 1 J Stężenie /%/ i /88% roztwór kwasu J mrówkowego/ | ---r- 1 1 i 1 I f | Skręcalność i /alfa D w 26°C/ J |
| i kwas 5,1Otmtttnylo- | 1 f 1 | 1 1 1 | |
| • 5,6S ^^-tetrahydrofoliowy | ! 0,611 | 1 I | +42 J |
| --.-„.Λ. | ---U- | 1 |
P rzykłdd IV. Knnwersja wwasu 5l0t-ttteny0--5,5S77,8-ttarahydΓofoliowego do ww-~ su 5-foamylot5,6S,7,--tttaayydaofoliowego i kwasu 5 ^R^^-tetrahydrof oliowego.
pH Pozostałości mieszaniny reakcyjnej otrzymanej z przykładu II doprowadza się od wartości 8,0 do wartości 5,0 za pomocą kwasu siarkowego, zapoczątkowując szybką cyklizację kwasu 10tfoamylo-5,6S,7,--tetrahydaofoliowtgo do kwasu 5,10tmettnylo-5,6S,7,8ttetrahydaofoliowego, który następnie po odstaniu w temperaturze pokojowej powoli hydrolizuje do kwasu 5tfoamylo-5,6S,7,8ttetaayydrofollowtgo. Ten ostatni nie jest wykrywany w mieszaninie reakcyjnej przed nastawieniem pH.
Po reakcji prowadzi się HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1K kwasem mrówkowym i modyfikowaną metanolem w liniowym gradiencie od 12 do 25% przez 30 minut. Kontrolowanie reakcji przez HPLC ujawnia, że więcej niż 70% początkowego kwasu 5,10mtttnylot5,6S,7,--tttaahydaofoliowego przekształciło się w kwas 5tformylo-5,6S,7,--tetaahydrofoliowy po 5 dniach w temperaturze pokojowej, podczas których stężenie kwasu 5,65,7,8tttaayydaofollowtgo pozostaje niezmienione. Produkty formylowane, otrzymane jako kwas 5-formylot5,6S,7,-ttetrayydaofoliowy i kwas 5,l0t5,10-mttenylo-5,6S,7,-ttttaayydrofoliowy oraz nieformylowany kwas 5,6R,7,--tttaahydaofoliowy wyodrębnia się następnie przez preparatywną HPLC na kolumnie z odwróconymi fazami /Dynamex 6OA-C18, 8 J, 2,1 x 30 cm/, rozwijanej z gradientem 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu, z szybkością przepływu 13 ml/min. przez 60 minut. Oznaczone wydajności dwóch preparatów /każdy odpowiada 50 ml mieszaniny reakcyjnej/ są następujące;
| r* ........................ ' J J “ ,H 1 j Wyodrębniony związek /mg/ | i Wydajność /%/ | 1 Wydajność względna | i i - J |
| — —— — — — — — — — — — — — - — - — “ — — — “ — “ — — { kwas 5,10-mttenylo-5,&5 ^^-tetra- | ' 12,9 | j 6,5 | 1 1 |
| ihydrofoliowy /22,6/ | 1 | I | 1 1 |
| [ kwas 5-formylo-5,6S ^^-tetrahydro- | 1 | 1 | I |
| •foliowy /118,2/ | ! 67,5 | ! 33,8 | 1 |
| jkwas 5,6R,7,--tetrahydrofoliowyX /145,5/ | I 83,1 » - _ | ί 41,6 ł | J |
| Xwyodrębniony kwas 5,6R,7,--tttrahydrofoliowy kowym /jak opisano poniżej/ tworząc kwas 5,10- | natychmiast suszy metenylo-5,6R,7,8- | się i formyluje kwasem tetrahydrofoliowy, który | mrów |
166 096 odmiennie od formy 6S, krystalizuje z rozcieńczonego kwasu mrówkowego.
Przykład V. Formylowanie kwesu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego z wytworzeniem kwasu 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego.
Próbkę 253 mg chromatograficznie oczyszczonego i liofilizowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego rozpuszcza się w 50 ml 97% kwasu mrówkowego zawierającego 2% kwasu trifluorooctowego i pozostawia w temperaturze otoczenia w kolbie reakcyjnej w atmosferze azotu bez mieszania. Mieszaninę reakcyjną analizuje się metodę HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /C-18/ eluowaną 0,1M wodnym roztworem kwasu mrówkowego i modyfikowaną metanolem w liniowym gradiencie od 12 do 25% przez 30 minut oraz kontrolowany przy 282 nm. Po trzech godzinach cały kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy reaguje, sądząc z pojawienia się nowego piku odpowiadającego kwasowi 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowemu w chromatogramie HPLC. Następnie kwas mrówkowy usuwa się przez odparowanie i powoli dodaje się 30 ml 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego sporadycznie wirując mieszaninę. Następnie roztwór przechowuje się w wychładzalni przez noc. Tworzą się drobne żółte igły dając roztwór o wyglądzie ciała stałego. Kryształy zbiera się w lejku ze spiekanego szkła, przemywa acetonem i suszy pod próżnią otrzymując 218 mg żółtej krystalicznej substancji.
Enancjomeryczną czystość krystalicznego kwasu 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego oznacza się stosując chiralną kolumnę /Diacel Chiracel OD/ eluowaną izokratycznie 0,5% mrówczanem amonu, pH 3,8 i 25% metanolem. Produkt, kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy eluuje przy 18,2 minutach.
Skręcalność optyczna oznaczana dla roztworu w 88% kwasie mrówkowym jest następująca:
| 1———— — — — ——— — — — — — - — [ Związek J 1 i | Stężenie /%/ /88% roztwór kwasu mrówkowego/ | -r· I I i t I _ __JL. | Skręcalność /alfa D w 26°C/ | — — — | |
| Ł .... . . ... | 1 Jl | ||||
| i kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8• tetrahydrofoliowy | 1 1 t i 1 I | 0,619 | 1 I ł I 1 ! | -47 |
Przykład VI. Derywatyzacja kwasu 5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego w obecności kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego i/lub kwasu 5,10-metenylo-5,6S ,7,8-tetrahydrofoliowego.
Modyfikując procedurę przedstawioną przez L, Rees, C.J. Suckling i H.C.S. Wood, J.Chem. Commun. 470 /1987/, /-/mentylochloromrówczan dodaje się do próbki mieszaniny reakcyjnej z przykładu IV, doprowadza do pH 7, co powoduje karboksymentylowanie tylko kwasu 5,6R,7,8tetrahydrofoliowego i pozostawia kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy nieprzereagowany. Reakcję kontroluje się przez HPLC. Skuteczne oddzielanie kwasu 5-mentyloksykarbonylo-5,6R,
7,8-tetrahydrofoliowego od nieprzereagowanych składników prowadzi się przepuszczając mieszaninę reakcyjną przez kolumnę wypełnioną XAD-2. Kwas 5-mentyloksykarbonylo-5,6R„7,8-tetrahydrofoliowy jest absorbowany przez żywicę i kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy lub kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy przepuszcza się przez nią.
Przykład VII. Oczyszczanie kwasu 5-forrnylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego, kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego i innych pochodnych przez preparatywną HPLC.
Porcje /50 lub 100 ml/ mieszaniny reakcyjnej z przykładu IV ładuje się bezpośrednio do kolumny z odwróconymi fazami. /Dynamax 60A-C18/ 5 μ, 2,1 x 30 cm/ za pomocą pompy podającej i następnie rozwija z gradientem 0,1M wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu z szybkością przepływu 13 ml/min. przez 60 minut. Stosowany gradient wychodzi ze stężenia metanolu 5%, aby osiągnąć 10% po 12 minutach przebiegu. Następnie stężenie 10% metanolu utrzymuje się stałe przez dalsze 10 minut i w tym czasie /22 minuty przebiegu/ poziom metanolu liniowo rośnie osiągając 18% po 38 minutach i od tej chwili rośnie dalej osiągając 25% po 52 minutach przebiegu. Stężenie nie jest dalej zwiększane, aż do końca przebiegu. Czynnik wypływal66 095 ll jący z kolumny monitoruje się przy 3l9 na, ponieważ 5,10-metebylo-5.6S ,7,8-tetrahydrofolian i kwas S-formylo-S^S^^-tetrahydrofoliowy mają taki sam współczynnik absorpcji przy tej długości fali.
W tych preparatywnych warunkach kwas 5t6S.7,8-tetrahydrofoliowy eluuje między ll i l7,5 minutę, podczas gdy kwas 5-form^lι^-^ί5.6S ,7t8-tetrahydrofoliowy eluuje między 39,5 i 44,5 minutą. Eluacja pasma 5,10-metebyio-5,6S.7.8-tetrahydrofol3nu jest silnie zależna od stężenia pojawiając się między 20 i 30 minutę jako śladowy pik. Pasma kwasu 5,61^,7,8-tetrahydrofoliowego i pasmo 5,l0-rnetenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofolianu nie mogę być całkowicie oddzielone, gdy więcej niż l40 ml mieszaniny reakcyjnej równoważnej z 700 mg materiału wprowadza się.
Eluowane pasma kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego i kwasu 5-formylo-5.6S.7.8-tetrahydrofoliowego zbiera się do szklanych butelek, które zanurza się w suchym lodzie tak, aby ciecz mogła natychmiast zamarznąć. Następnie zamrożone frakcje liofilizuje się otrzymując szarawo-biały proszek w przypadku kwasu 5,6R.7,8-tetrahydrofoliowego i żółtawo-biały proszek w przypadku kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego. Na tych proszkach przeprowadza się analizę HPLC stosując kolumnę z odwróconymi fazami /Dynamax 60A-Cl8, 8 μ, 2,l x 30 cm/, rozwijaną z gradientem 0,lM wodnego roztworu kwasu mrówkowego i metanolu. Okazuje się, że kwas 5-formylo-5.6S.7,8-tetrahydrofoliowy ma 97% i kwas 5.6R.7.8-tetrahydrofoliowy ma 93% czystości, co widać z obszaru pod krzywą. Ze względu na niestabilność kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego, przekształca się go przez chemiczne formylowanie w bardziej stabilny kwas 5.10-metenylo-5,6R.7.8-tetrahydrofoliowy. Aby przeciwdziałać problemowi stabilności kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliotwego, związek ten przekształca się w jego sól wapniową, jak opisano w przykładzie VIII.
Przykład VIII. Sposób wytwarzania 5-formylo-5,6St7.8-tetrahydrofolianu wapnia lub 5-formylo-5,6R,7.8-tetrahydrofoliabu wapnia.
W modyfikacji procedury publikowanej przez C. Tempie, Jr. , R.O. Elliott, J.D. Rose i J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22, 73l /l979/ wytwarzania racemicznego 5-formylo-5,6/R.S/.
7,8-tetrahydrofoliabu wapnia, otrzymany kwas 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy przemywa się eterem aby usunąć ewentualny mrówczan amomu. Następnie 62 mg przemytego materiału rozpuszcza się w 32 ml odgazowanego metanolu /nie zawierający soli kwas foliowy jest dobrze rozpuszczalny w metanolu/, do którego dodaje się około l ml metanolowego roztworu chlorku wapnia /72mg chlorku wapnia na ml metanolu/. Dodanie soli powoduje natychmiastowe utworzenie białawego osadu, który zbiera się na lejku ze spiekanego szkła i suszy pod próżnią. Wydajność po wysuszeniu wynosi 60,5 mg /90% wydajności teoretycznej/.
Jeżeli ten proces powtarza się z izomerem 6R, otrzymuje się 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydroftalan wapnia.
Czystość otrzymanych związków oznacza się przez UV/HPLC nie zważając na obecność materii nie absorbującej UV. Czystość ebabcjomeryczną oznacza się w tym etapie dla pochodnych 5,l0metebylo-5,6/R,S/,7.8- tetrahydrofolianu przez HPLC stosując kolumnę chiralną /Diacel Chiracel OD/, eluowaną izokratycznie 0,5% mrówczanem amonu pH 3,8 i 25% metanolem. Kwas 5,l0-metenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy eluuje najpierw z czasem retencji l5,2 minut, podczas gdy kwas 5,10-metebylo-5.6R.7,8-tetrahydrofoliowy eluuje z czasem retencji l8,2 minut.
Roztwory otrzymanych związków o kwasie mrówkowym, a nie w l0M lub l2M kwasie solnym, jak podawano w literaturze, stosowano do rejestrowania ich rotacji optycznych, ze względu na zmniejszoną kwasowość kwasu mrówkowego i jego zwiększoną moc rozpuszczania dla folianów. Próbki powyższych preparatów wykazywały następującą skręcalność optyczną;
166 095
| Związek _ __________ ___________ | i Stężenie /%/ 'i /88% roztwór kwasu J mrówkowego/ | ! Skręcalność j • /alfa D w 26°C/ J 1 1 | ||
| kwas 5,10-metenylo-5,6S,7,m-tetrαhodrofoliowy x | 1 ! 0,611 | 1 1 ł 1 | +42 | |
| kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8tonrαhodrkfoliowy xx | J 0,619 ------------- | 1 1 1 1 | -47 | ___J |
^Wyodrębniony chromatograficznie jako kwas 5-fornylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowy, który po odstaniu w eluowanej mieszaninie 0,1M kwasu mrówkowego przekształcono w kwas 5,10-metenylo5.65.7.8- tetrahydrofoliowy i następnie zestalono do postaci żelu, który liofilizowano. xxPoczętkowo wyodrębniony jako nieprzekształcony kwas 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy, który po liofilizowaniu natychmiast formylowano kwasem mrówkowym, jak opisano uprzednio. Uzyskany kwas 5,10-metenylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowy, który krystalizował z mieszaniny rozcieńczonego kwasu mrówkowego zbiera się, przemywa acetonem i suszy w próżni. Z 253 mg kwasu 5,6R,
7.8- tetrahydrofoliowego /w/wawow /bżbie się 218 mg krystaliczczno kwawu 5jlO-rnemenylo-S^R,
7,8-tetrahydrofoliowego /wagowo/.
Przykład IX. Sposób wytwarzania znakowanego radioaktywnie kwasu fkrnolkfklikwego i pochodnych.
Jeżeli powtarza się procedurę opisaną w przykładzie II zastępując mrówczan amonu znakowanym radioaktywnie mrówczanem amonu lub inną znakowaną radioaktywnie pochodną kwasu mrówkowego, otrzymuje się znakowany radioaktywnie kwas l0-fornolo-l,6S,7,8-netrahodrkfkliowy. Jeżeli poddaje się go procedurom z przykładów III - VIII, otrzymuje się odpowiednie znakowane radioaktywnie kwasy i sole.
Wymienione powyżej patenty, publikacje i metody badań sę wprowadzone do opisu jako odnośniki literaturowe.
Powyższy szczegółowy opis sugeruje wiele oczywistych wariantów dla fachowców w tej dziedzinie. Na przykład zamiast leukoworyny wapnia można otrzymać sól strontową lub sodową leukoworyny. Formylaza nonrahydrkfolialkwę można wypreparować z Clostridium acidi-urici. Wszystkie takie oczywiste modyfikacje wchodzę w zakres załączonych zastrzeżeń patentowych.
166 096
WZÓR 1 a
„CO2H
-H
WZÓR Ib
166 096
SCHEMAT 1(1)
166 096
WZÓR Ib
SCHEMAT 1(2)
166 096
WZÓR 2 a
H
C02H
H 'rCH2)2CO2H
WZÓR 4 a
WZÓR 1a
SCHEMAT 2
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego diastereoizomeru /6R lub 6S/ pochodnej kwasu 5,6/R lub S/, 7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, znamienny tym, że obejmuje etapy /a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów6R i 6S kwasu tetrahydrofoliowego lub podstawionego kwasu tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp.ATCC nr 7905 lub jego mutant i albo /b/ /1/ oddzielania kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i następnie cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,KS,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, przy użyciu kwasu siarkowego lub /2/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5,6R,7-8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estruj i następnie albo /i/ derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu mentylochloromrówczanu i wówczas rozdzielania składników; lub alternatywnie /ii/ oddzielania któregokolwiek kwasu 5,10-netenylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego i kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub ich soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estruj i po rozdzieleniu w razie potrzeby /3/ chemicznego formylowania przy użyciu kwasu mrówkowego w obecności karbodiimidu, cyklizacji i hydrolizy nieprzereagowanego kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego lub alternatywnie derywatyzacji kwasu 5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru z innymi grupami funkcyjnymi przy użyciu mentylochloromrówczanu i w razie potrzeby /c/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru lub kwasu 5-formylo-5,6R,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap konwersji /c/ obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli.
- 3. Sposób 1, znamienny tym, że enzymatyczny preparat wytwarza się w mieszaninie reakcyjnej zawierajęcej znakowany radioaktywnie kwas mrówkowy lub chemiczny odpowiednik.
- 4. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego kwasu 5-formylo-5,6S,7,8-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru, znamienny tym, że obejmuje etapy /a/ enzymatycznego formylowania formy 6S mieszaniny diastereoizomerów 6R i 6S kwasu 5,6,7,8-tetrahydrofoliowsgo lub jego soli lub estru przy użyciu formylazy tetrahydrofolianowej wytworzonej przez Clostridium sp. ATCC nr 7905 lub jego mutant i /b/ cyklizacji i hydrolizy kwasu 10-formylo-5,6S,7,8-tetraaydrof oliowego lub jego soli lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5,6R,7,8-tttΓahydaofoliowego lub lub estru przy użyciu kwasu siarkowego w obecności kwasu 5^R^^-tetrahydrofoliowego lub jego soli lub estru i następnie /c/ oddzielania kwasu 5,l0tfπtttnylot5,6S,7,8ttttaayydrofot liowego lub jego soli lub estrów od kwasu 5,6R,7,--tttaayydrofoliowego lub jego soli lub estruj i po rozdzieleniu w razie potrzeby /d/ konwersji zasadniczo czystego kwasu 5tformylot5,6S,7,-ttetrayydaofoliowtgo lub jego soli lub estru do odpowiedniego kwasu, soli lub estru.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap konwersji /c/ obejmuje konwersję pochodnej kwasu foliowego do soli wapnia, magnezu, strontu, żelaza lub mieszaniny tych soli.166 096
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44966289A | 1989-12-11 | 1989-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL288204A1 PL288204A1 (en) | 1991-12-16 |
| PL166096B1 true PL166096B1 (pl) | 1995-03-31 |
Family
ID=23785009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90288204A PL166096B1 (pl) | 1989-12-11 | 1990-12-11 | pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PL |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334535A (pl) |
| EP (1) | EP0432441B1 (pl) |
| JP (1) | JP3027613B2 (pl) |
| KR (1) | KR0172118B1 (pl) |
| CN (1) | CN1031804C (pl) |
| AR (1) | AR245134A1 (pl) |
| AT (1) | ATE139799T1 (pl) |
| AU (1) | AU641710B2 (pl) |
| CA (1) | CA2031784C (pl) |
| CZ (1) | CZ279998B6 (pl) |
| DE (1) | DE69027585T2 (pl) |
| DK (1) | DK0432441T3 (pl) |
| ES (1) | ES2090075T3 (pl) |
| FI (1) | FI103804B1 (pl) |
| GR (1) | GR3021060T3 (pl) |
| HU (1) | HU209761B (pl) |
| IE (1) | IE904439A1 (pl) |
| IL (1) | IL96265A0 (pl) |
| NO (1) | NO177541C (pl) |
| NZ (1) | NZ236370A (pl) |
| PL (1) | PL166096B1 (pl) |
| PT (1) | PT96120B (pl) |
| SK (1) | SK279435B6 (pl) |
| ZA (1) | ZA909899B (pl) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH681303A5 (pl) * | 1991-01-16 | 1993-02-26 | Eprova Ag | |
| DE4136921A1 (de) * | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Knoll Ag | Verfahren zur trennung von 5-methyl-tetrahydrofolsaeure |
| CH683262A5 (it) * | 1992-01-22 | 1994-02-15 | Applied Pharma Res | Procedimento per la separazione dei diastereomeri del sale di calcio dell'acido (6(R,S)-N-formiltetraidrofolico). |
| IT1254635B (it) * | 1992-02-20 | 1995-09-28 | Bracco Spa | Processo per la separazione degli stereoisomeri dell'acido folinico |
| CH686369A5 (de) | 1994-05-09 | 1996-03-15 | Eprova Ag | Stabile kristalline (6S)- und (6R)-Tetrahydrofolseure. |
| CH693255A5 (de) * | 1997-06-13 | 2003-05-15 | Eprova Ag | Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels. |
| CH694251A5 (de) * | 1999-07-14 | 2004-10-15 | Eprova Ag | Herstellung von Tetrahydropterin und Derivaten. |
| AU2001259039A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-23 | Edward V Quadros | Radioenzymatic assay for methylenetetrahydrofolate reductase |
| CH696699A5 (de) * | 2006-01-19 | 2007-10-15 | Cerbios Pharma Sa | Verfahren zur regioselektiven N(5) -Formylierung von (6S) -5, 6, 7, 8-Tetrahydropteroinsäure und Derivaten davon. |
| WO2010017526A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | The Scripps Research Institute | Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof |
| US9382251B2 (en) * | 2012-07-27 | 2016-07-05 | Chemic Laboratories Inc. | Compositions comprising folic acid derivatives, their preparations and methods of use |
| CN115656372A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-01-31 | 北京斯利安药业有限公司 | 一种s-四氢叶酸异构体手性分析方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4500711A (en) * | 1977-03-21 | 1985-02-19 | Burroughs Wellcome Co. | Synthesis of leucovorin |
| US4148999A (en) * | 1977-08-22 | 1979-04-10 | The Government Of The United States Of America | Preparation and purification of citrovorum factor |
| GB8621268D0 (en) * | 1986-09-03 | 1986-10-08 | Univ Strathclyde | Separation of substances |
| US4746662A (en) * | 1987-02-20 | 1988-05-24 | American Cyanamid Company | Treatment of arthritis with 3,5-dichloromethotrexate |
| DE3821875C1 (pl) * | 1988-06-29 | 1990-02-15 | Eprova Ag, Forschungsinstitut, Schaffhausen, Ch | |
| FR2643081B1 (fr) * | 1989-02-14 | 1991-06-07 | Panmedica Sa | Folates de magnesium, procede de preparation et compositions pharmaceutiques |
| CH680731A5 (pl) * | 1990-04-12 | 1992-10-30 | Sapec Fine Chemicals | |
| JPH07332120A (ja) * | 1994-06-08 | 1995-12-22 | Sanshin Ind Co Ltd | 多気筒エンジン |
-
1990
- 1990-11-05 AT AT90121120T patent/ATE139799T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-05 DK DK90121120.1T patent/DK0432441T3/da active
- 1990-11-05 ES ES90121120T patent/ES2090075T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DE DE69027585T patent/DE69027585T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90121120A patent/EP0432441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-06 IL IL96265A patent/IL96265A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-11-27 CN CN90109616A patent/CN1031804C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-06 NZ NZ236370A patent/NZ236370A/xx unknown
- 1990-12-07 CA CA002031784A patent/CA2031784C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 PT PT96120A patent/PT96120B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 CZ CS906103A patent/CZ279998B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 SK SK6103-90A patent/SK279435B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 AU AU67932/90A patent/AU641710B2/en not_active Expired
- 1990-12-10 FI FI906072A patent/FI103804B1/fi active IP Right Grant
- 1990-12-10 NO NO905325A patent/NO177541C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 KR KR1019900020269A patent/KR0172118B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 ZA ZA909899A patent/ZA909899B/xx unknown
- 1990-12-10 AR AR90318584A patent/AR245134A1/es active
- 1990-12-10 JP JP2407190A patent/JP3027613B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-10 IE IE443990A patent/IE904439A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-11 HU HU908159A patent/HU209761B/hu unknown
- 1990-12-11 PL PL90288204A patent/PL166096B1/pl unknown
-
1992
- 1992-09-18 US US07/947,641 patent/US5334535A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-18 GR GR960402428T patent/GR3021060T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5350851A (en) | Intermediates and a process for synthesis of tetrahydropteridine C6-stereoisomers, including (6S)-tetrahydrofolate and N5-formyl-(6S)-tetrahydrofolate | |
| EP0608002B1 (en) | Optically active compounds | |
| Moran et al. | The 6S-and 6R-diastereomers of 5, 10-dideaza-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolate are equiactive inhibitors of de novo purine synthesis | |
| Kuttan et al. | Inhibition of inosinate dehydrogenase by metabolites of 2-β-D-ribofuranosylthiazole-4-car☐ amide | |
| PL166096B1 (pl) | pochodnej kwasu 5,6(R lub S), 7,8-tetrahydrofoliowego PL PL PL PL PL PL | |
| US4510246A (en) | Isolation of cyclase, epimerase and a ring expansion enzyme for producing unnatural cephalosporins | |
| Baugh et al. | Biosynthesis of riboflavine in Corynebacterium species: the purine precursor | |
| Gal et al. | Biopterin: II. Evidence for cerebral synthesis of 7, 8-dihydrobiopterin in vivo and in vitro | |
| Sullivan et al. | Metabolism of D-cephaloglycin-14C and L-cephaloglycin-14C in the rat | |
| Arnstein et al. | The biosynthesis of penicillin. 8. Investigation of cyclic cysteinylvaline peptides as precursors | |
| EP0457735B1 (en) | Biocatalytic process for the production of L-(-)-carnitine from crotonobetaine and strains of Proteeae for use in said process | |
| US4628090A (en) | Fluorine-containing antifolates incapable of polyglutanayte formation related compounds | |
| Vogel et al. | l-Histidinol, a precursor of l-histidine in Escherichia coli | |
| JPH0733749A (ja) | ６，６‐ジ置換プテリジン誘導体 | |
| US4929551A (en) | Process for producing L(-)-tetrahydrofolic acid | |
| US7259276B2 (en) | Polyenecarboxylic acid derivatives, processes for preparing them, and their use | |
| US2483248A (en) | Process for preparing compounds having folic acid activity | |
| Ochi et al. | BIOSYNTHESIS OF FORMYCIN FORMATION OF FORMYCIN FROM FORMYCIN B | |
| US4579818A (en) | Biosynthesis of unnatural cephalosporins | |
| Zygmunt et al. | Formation of folic acid related compounds by Bacillus subtilis | |
| Gajendiran et al. | Biotechnological production of high specific activity L‐35 S‐cysteine and L‐35 S‐methionine by using a diploid yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| EP0048025A1 (en) | Antibacterial composition of thienamycin type compound and a dipeptidase inhibitor | |
| Lipman et al. | Stereospecificity of folate binding to DNA photolyase from Escherichia coli | |
| CA1206901A (en) | Biosynthesis of unnatural cephalosporins | |
| Xu et al. | [9] Preparation of optically pure isotopically labeled l-glutamate |