FI103804B - Menetelmä tetrahydrofotolaattiyhdisteiden optisesti puhtaiden diastereoisomeerien valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä tetrahydrofotolaattiyhdisteiden optisesti puhtaiden diastereoisomeerien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI103804B FI103804B FI906072A FI906072A FI103804B FI 103804 B FI103804 B FI 103804B FI 906072 A FI906072 A FI 906072A FI 906072 A FI906072 A FI 906072A FI 103804 B FI103804 B FI 103804B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- tetrahydrofolic acid
- acid
- salt
- formyl
- site
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
- C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
- C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/842—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Description
103804
Menetelmä tetrahydro£olaattiyhdlsteiden optisesti puhtaiden diastereoisomeerien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uutta menetelmää tetrahydro-5 folaattiyhdisteiden optisesti puhtaiden diastereoisomeerien valmistamiseksi, käsittäen 5,6,7,8-tetrahydrofoolihapon ra-seemisen seoksen vain 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo-komponentin uuttamisen 10-formyyli-5,6S,7,8tetrahydrofooli-hapoksi bakteeriperäisen formyylitetrahydrofolaattisynte-io taasin läsnä ollessa.
Leukovoriinin ja sen suolojen tiedetään olevan farmaseuttisesti vaikuttavia. Katso Remington's Pharmaceutical Services, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985 (Remington's) p. 1023. Kerwar ym., US 4 746 662 paljasta-15 vat, että metotreksaatin niveltulehduksen vastaista vaikutusta voidaan tehostaa injektoimalla leukovoriinin tai sen suolojen vesiliuosta. EP-patenttijulkaisu nro 0 266 042, toukokuun 4. päivä, 1988, selostaa puhtaiden leukovoriini-isomeerien käyttöä lääkkeiden valmistamiseksi metotreksaat-20 tisuojaksi, paksunsuolensyövän hoitamiseksi 5-fluoriura-siilin yhdistelmänä ja folaattivajauksen hoitamiseksi. US-patentissa 4 500 711, Wisowaty ym., selostetaan leukovoriinin ja sen suolojen puhdistusta.
Leukovoriinia annetaan tavallisesti suolojen muodossa, . . 25 kuten alkalimetalli- ja maa-alkalimetallisuoloina, kuten leukovoriinin kalsiumsuolana, 1-isomeerin ollessa ensisijainen.
Yhdistettä N- ({ [ (2-amino-5-formyyli-3,4,5,6,7,8-heksa-hydro-4-okso-6-pteridinyyli)metyyli]amino}bentsoyyli)-L-30 glutamiinihappo, kalsiumsuola (1:1), pentahydraatti, (Leu-covorin Calsium USP) myydään kaupallisesti kaavojen (Ia ja Ib) l:l-seoksen kalsiumsuolana, jossa yhdisteillä esiintyy (R)- ja vastaavasti (S)-stereokemia kohdalla C-6.
103804 2
O CHO
Jl Lr" /HV\
5 il J LII ,co-H
| nc-n-c^-^ h
h | ^(CH,).CO,H
H 112.
10
Ia
O CHO
15 H
j NH
.^XKtXi
H2N C-N-C H
20 ' I \ H | (ch2)2co2h
Ib 25 Sitä käytetään pääasiallisesti vasta-aineena fooli- happoantagonisteille, kuten metotreksaatille, joka estää dihydrofoolihapon muuttumisen tetrahydrofoolihapoksi. Leu-kovoriinisuolat sekoitetaan veteen injektointia varten sopivien säilöntäaineiden kanssa, kuten on selostettu julkai- 30 sussa Leucovorin Calsium Injection in the Physician's Desk • Reference, Forty-third Edition, Medical Economics Company,
Oradell, NJ 1989 (PDR 43. painos), s. 1124.
Kahden isomeerin farmakokineettinen toiminta eroaa sikäli, että (S)-isomeeri (Ib) absorboituu selektiivisesti 35 maha-suoli-kanavasta ja sillä on lyhyempi plasmapuoliutu-misaika suhteessa (R)-isomeeriin (Ia).
3 103804
Luonnossa esiintyvän isomeerin Ib, joka on 6S-dia-stereoisomeeri, on ilmoitettu [C. Temple, Jr., P.V. Rose, W.R. Laster ja J.A. Montgomery, Cancer Treatment Reports, 65, 1117 - 1119 (1981)] olevan tärkeä korvaavassa terapias-5 sa johtuen sen tehokkuudesta korvata yksihiilistä aineenvaihduntaa .
Ilmoitus [R.P. Leary, Y. Gaumont, ja R.L. Kisliuk, Biochem. and Biophyd. Res. Commun., 56, 484 - 488 (1974)], että tymidylaatin synteesiä L. casei'sta inhiboi 5,10-10 metyleenitetrahydrofolaatin ei-luonnollinen diastereo-isomeeri, ja ilmoitus [V.F. Scott and K.O. Donaldson, Biochem. and Biophys. Res. Commun., 14, 523 - 526 (1964)], että 5,10-metyleenitetrahydrofolaattidehydrogenaasia E. co-li'sta inhiboi myöskin sama diastereoisomeeri, kytkettynä 15 havaintoon [G.K. Smith, P.A. Benkovic ja S.J. Benkovic, Biochem., 20, 4034 - 4036 (1981)], että 10-formyylitetra- hydrofolaatin sama diastereoisomeeri on tehokas kompetetii-vinen glysiiniamidiribonukleotidi-formyylitransferaasin (GAR) inhibiittori kananpojan maksasta, viittaa sekä pyri-20 midiinin että puriinin biosynteesin inhibointiin ja täten tetrahydrofolaatin yksihiilisten johdannaisten ei-luon-nollisten diastereoisomeerien DNA:n biosynteesin inhibointiin. Sen vuoksi ei-luonnollisia muotoja ei voida katsoa biologisesti inerteiksi. Jos sellaista inhibointia esiintyy 25 nisäkässysteemeissä, silloin tehokas kliininen tarvemuoto on ainoastaan tetrahydrofolaattien luonnollinen (6S)-muoto, erityisesti leukovoriini.
Diastereoisomeerikomponentteja Ia ja Ib on eristetty [D.B. Cosulich, J.M. Smith, Jr. ja H.P. Proglist, J. Am. 30 Chem. Soc., 74, 4215 (1953)] fraktiokiteyttämällä ja kroma-tografoimalla (J. Feeney, B. Birdsall, J.P. Albrand, G.C.K. Roberts, A. S. Bungen, P.A. Charlton ja D.W. Young, Biochem., 20, 1837 (1981)]. Dihydrofolaatin stereospesi- fisestä pelkistyksestä on tiedotettu dihydrofolaattireduk-35 taasin katalysoimana [L. Rees, E. Valente, C.J. Suckling ja 103804 4 H.C.S. Wood, Tetrahedron, 42, 117 (1986)], jolloin saadaan 6(S)-isomeeriä stereospesifisesti.
L. Reesin, E. Valenten, C.J. Sucklingin ja H.C.S. Woodin artikkeli, Tetrahedron, 42, 117 - 136 (1986), selos-5 taa tetrahydrofolaatin kiertävien johdannaisten synteesiä, leukovoriini mukaan lukien. Tämä systeemi edellyttää E. co-li'sta saatavan dihydrofolaattireduktaasin käyttöä ja laajaa ja kallista pelkistävän NADPH-kofaktorin kierrätystä. Toinen L. Reesin, C.J. Sucklingin ja H.C.S. Woodin artikke-10 li, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470, (1987) , (EP- patenttihakemus 0 266 042 A2) selostaa 6(R,S)-tetrahydrofolaatin asylointia (-)-mentyyliklooriformiaatilla, jolloin saadaan N-5-johdannaisia diastereoisomeerisena seoksena, jotka erotettiin fraktiosaostamalla. Käsittelemällä sen is jälkeen kumpaakin diastereoisomeeria muurahaishapolla ja bromivedyllä etikkahapossa ja hydrolysoimalla sen jälkeen, saatiin kumpaakin 5-formyylitetrahydrofolaatin diastereoisomeeria .
Nyt on keksitty, että optisesti puhtaita tetrahydro-20 folaattiyhdisteiden diastereoisomeereja voidaan valmistaa helpommin tämän keksinnön mukaisesti. Tämän menetelmän suurena etuna aikaisemmin julkaistuihin tai patentoituihin menetelmiin verrattuna on se, että se on yllättävän yksinkertainen, koska avainvaihe edellyttää vain yhden entsyy-25 min, tetrahydrofolaattiformylaasin, käyttöä, josta toisaalta käytetään nimitystä formiaattia aktivoiva entsyymi tai formyylitetrahydrofolaattisyntetaasi (FTHFS), joka myöskin lisää selektiivisesti tarvittavan formyyliryhmän ainoastaan 6S-diastereoisomeeriin käytettäessä 5,6(R,S)7,8-tetrahydro-30 foolihapon (IIa,b) raseemista seosta. Edelleen tämän ent-·. syymin hyväksikäytöstä on selvää etua dihydrofolaattireduk- taasientsyyymin käyttöön verrattuna sikäli, ettei tarvitse käyttää kallista kofaktorin regenerointisysteemiä.
Tetrahydrofolaattiformylaasia voivat kehittää Micro-35 coccus aerogenes, Clostridium cylindrosporum, Clostridium acidi-urici, Clostridium thermoaceticum ja muut mikro- s 103804 organismit, kasvit ja eläimet. D.H. Butlaire, Methods In Enzymology, 66, 585 - 599 (1980).
Käyttämällä radioaktiivisesti merkittyä ammoniumformi-aattia tai mitä tahansa muita, in situ valmistetut mukaan 5 lukien, radioaktiivisesti merkittyjä muurahaishapposuoloja tai -johdannaisia entsymaattisessa formyloinnissa, voidaan saada merkittyjä yhdisteitä (Illb) ja muuttaa merkityiksi yhdisteiksi (IVb) tai (Ib). 5,10-metyleenitetrahydrofolaat-tidehydrogenaasientsyymin avulla mikä tahansa radio-10 aktiivisesti merkityistä formyyliryhmän sisältävistä 5,6S,7,8-tetrahydrofolaateista (Ib, Illb tai IVb), ensisijaisesti (IVb), voidaan muuttaa merkityksi 5,10-mety-leeni-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapoksi, joka puolestaan, 5,10-metyleenitetrahydrofolaattireduktaasientsyymin vaiku-15 tuksen alaisena, voidaan muuttaa radioaktiivisesti merkityksi 5-metyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapoksi. Täten radioaktiivisesti merkitty (Ib), jota on kehitetty tätä keksintöä soveltamalla, on käyttökelpoinen yhdiste radioaktiivisesti merkittyjen 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo-20 johdannaisten valmistamiseksi.
Keksitty menetelmä yllättäen mahdollistaa myös 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon (Ha), joka ei ole entsyymin formyloima, eristämisen. Eristettyä yhdistettä (Ha) voidaan sitten myydä sellaisenaan (kaupallistettuna harvinai-• 25 sena yhdisteenä) tai se voi toimia lähtöaineena valmistet taessa esimerkiksi 5-formyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofooli-happoa (Ia) samalla tavalla kuin R.G. Moranin ja P.D. Col-manin selostamassa menetelmässä on selostettu, Anal. Biochem. 122, 70 - 78 (1982) käyttämällä muurahaishappoa 30 vesiliukoisen karbodi-imidin, l-etyyli-3-(3'-dimetyyli-aminopropyyli)karbodi-imidin, kanssa tai ilman sitä. Ensisijaisesti kuitenkin yhdisteen (II) eristäminen suoritetaan yhdisteen (Illb) muuttamisen jälkeen täydellisesti yhdisteeksi (IVb) ja/tai yhdisteeksi (Ib) . Tämä mahdollistaa 35 komponenttien helpomman eristämisen esimerkiksi käänteis-faasikromatografointia käyttäen. Myöskin (Ha) voidaan mo- s 103804 difioida (IVb) :n ja/tai (Ib) :n läsnä ollessa, koska (Ha) :n 5-asema on yhä reaktiokykyinen, kun taas (IVb):n tai (Ib):n 5-asema ei ole, jolloin saadaan (Ha) :n johdannaista, esimerkiksi 5-karboksimetyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa, 5 joka voidaan eristää (IVb):stä tai (Ib):stä yksinkertaisessa adsorptiovaiheessa.
Sen lisäksi eristetyn (Ha) :n voidaan antaa reagoida, kuten ovat selostaneet C. Temple, Jr., L.L. Bennett, Jr., J.D. Rose, R.D. Elliott, J.A. Montgomery ja J.H. Man-10 gum, J. Med. Chem., 25, 161 - 166 (1982), erilaisten 5- ja 10-substituoitujen, 5,10-disubstituoitujen ja 5,10-silta-substituoitujen 5,6R, 7,8-tetrahydrofoolihappojohdannaisten valmistamiseksi. Erityisesti 5-metyyli-5,6R,7,8-tetrahydro-folaattia voidaan syntetisoida (Ha) :sta formaldehydin ja 15 natriumboorihydridin kanssa emäksissä olosuhteissa, kuten on selostettu J.A. Blairin ja K.J. Saundersin menetelmän yhteydessä, Anal. Biochem. , 34, 376 (1970). (Ha) :n alky- lointi dimetyylisulfaatilla N,N-dimetyyliasetamidissa 55 °C:ssa saadaan tapahtumaan käyttämällä menetelmää, jota on 20 selostettu japanilaisessa patentissa 7 332 120 (1973) ;
Chem. Abst., 80, 2792X (1974).
Korvaamalla muurahaishappo tai alkylointiaineet edellä mainituissa reaktioissa radioaktiivisesti merkityllä muurahaishapolla tai sen johdannaisilla, tai radioaktiivisesti 25 merkityillä alkylointiaineilla saadaan radioaktiivisesti merkittyjä 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappojohdannaisia.
Tämän keksinnön mukaisesti sekä radioaktiivisesti merkittyjä 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappojohdannaisia että radioaktiivisesti merkittyjä 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo-30 johdannaisia ja niiden suoloja voidaan valmistaa erikseen, « jotka yhdisteet ovat käyttökelpoisia kokeiluun, esimerkiksi entsymaattisten mekanismien tutkimiseksi.
Tämän keksinnön mukaisesti varataan menetelmä halutun, pääasiallisesti puhtaan tetrahydrofoolihapon johdannaisen 35 (6R tai 6S)-diastereoisomeerin tai sen suolan tai esterin valmistamiseksi, johon menetelmään sisältyvät vaiheet: 7 103804 (a) formyloidaan entsymaattisesti tetrahydrofoo-lihapon tai substituoidun tetrahydrofoolihapon 6R- ja 6S-diastereoisomeerien seos tai niiden suola tai esteri siten, että muodostuu seos, joka sisältää 10-formyyli-5,6S,7,8-5 tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa tai sen esteriä; reagoimatonta 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa tai esteriä, mikäli niitä on läsnä; reagoimatonta 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa tai esteriä; ja joko (b)(1) eristetään 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoo-lo lihappo tai sen suola tai esteri 5,6R,7,8-tetrahyd-rofoolihaposta tai sen suolasta tai esteristä ja sen jälkeen syklisoidaan ja hydrolysoidaan mainittu 10-formyyli-5,6S, 7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola tai esteri siten, että muodostuu 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoo-15 lihappoa tai 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suoloja tai estereitä, tai kumpiakin edellä mainittuja; tai (2) syklisoidaan ja hydrolysoidaan mainittu 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola tai 20 esteri siten, että muodostuu 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suoloja tai estereitä, tai kumpiakin edellä mainittuja, 5,6R,7, 8-tetrahydrofoolihapon tai sen suolan tai esterin läsnä ollessa; ja sen jälkeen joko · 25 (i) valmistetaan 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon johdan nainen tai sen suola tai esteri siten, että muodostuu 5-substituoitua 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa tai esteriä ja sitten erotetaan komponentit, tai vaihtoehtoisesti 30 (ii) erotetaan mikä tahansa 5,lO-metyyli-5,6S,7,8- • · tetrahydrofoolihappo ja mikä tahansa 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai niiden suolat tai esterit 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihaposta tai sen suolasta tai esteristä; ja erottamisen jälkeen haluttaessa 35 (3) formyloidaan kemiallisesti, syklisoidaan ja hydro lysoidaan mainittu reagoimaton 5,6R,7,8-tetrahydrofooli- β 103804 happo tai sen suola tai esteri siten, että saadaan valmistetuksi 5-formyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa tai esteriä, tai vaihtoehtoisesti muodostetaan mainitun 5,6R, 7,8-tetrahydrofoolihapon johdannainen tai sen 5 suola tai esteri muiden toiminnallisten ryhmien kanssa siten, että muodostuu 5-substituoitua 5,6R,7,8-tetrahydro-foolihappoa tai sen suolaa tai esteriä; ja haluttaessa (c) muutetaan pääasiallisesti puhdas 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola tai esteri tai 10 5-formyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola tai esteri vastaavaksi hapoksi, suolaksi tai esteriksi.
Menetelmän tuotteet ovat arvokkaita itsessään, esimerkiksi terapiassa ja välituotteina muiden arvokkaiden tuotteiden valmistuksessa, ja radioaktiivisiksi merkittyinä 15 niitä voidaan käyttää esimerkiksi entsymaattisten mekanismien tutkimiseen. Tämän alan asiantuntijat tietävät, kuinka sellaisia yhdisteitä voidaan käyttää sellaisiin tarkoituksiin .
Ensisijaisesti menetelmää käytetään halutun, pääasial-20 lisesti puhtaan 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon tai sen suolan tai esterin valmistamiseen. Sellaisilla yhdisteillä on arvokkaita ominaisuuksia apuaineina. Erityisen ensisijainen on menetelmä, jossa entsyymi, jota käytetään selektiiviseen formylointiin, on tetrahydrofolaattifor-*' 25 mylaasi. Menetelmä on käyttökelpoinen myös halutun, pää asiallisesti puhtaan tetrahydrofoolihapon (radioaktii-visesti merkityn) johdannaisen (6R tai 6S)-diastereoiso-meerin tai sen suolan tai esterin valmistamiseen. Sellaisia aineita voidaan käyttää entsymaattisten mekanismien tutki-30 miseen.
Lähtöyhdisteitä, joita käytetään tämän keksinnön yhteydessä, voidaan valmistaa biokemiallisten transformaatioiden alan asiantuntijain hyvin tuntemin menetelmin. Ila(R):n ja Ilb(S):n seosta voidaan valmistaa pelkistämällä 35 foolihappo natriumboorihydridillä käyttämällä C. Templen, Jr., E.D. Elliottin, J.D. Rosen ja J.A. Montgomeryn menetelmää, J. Med. Chem., 22, 731 (1979).
9 103804 Lähtien näistä aineista keksinnön menetelmän reaktio-kaavio on esitetty kaaviossa 1:
Kaavio 1 5
R
i
O H I
I j, H I» axu uin / =‘ Η-,Ν^ N N C-tJH-C-^βΗ I \
H (CH2)2C02H
15 II a + 20
R
O H I
: 25 I H I
I / NH
/ H-N Π '
k II J
---- H N 1 30 I (FTHFS) « 5
H
T
Hb II Ib 35 103804 10
Kaavio 1 (jatkuu)
CHO
O H
5 I ,*
_ N / NH
rAir Πο H2N K N 'C02ti
| C-NH-C^—^ H
10 H \ (ch2)2co2h mb 15 20 y 11 iTiglfl0 A2” h-nA/ Y '
j II ''H C-NH-C —^ H
H2N N ΐ N'V\cH2) 9C02H
30 2 2
H
ivb --- 35 - „ 103804
Kuten kaaviossa 2 on esitetty, (Ha), joka voidaan eristää (Illb):stä kromatografoimalla, formyloidaan muurahaishapolla, jolloin saadaan jaksottaisen (Ia):n muodostumisen yhteydessä imidatsoliniumsuolaa (IVa), joka ki-5 teytyksen jälkeen hydrolysoidaan, jolloin saadaan puhdasta, keinotekoista leukovoriinin isomeeriä (Ia). Vaihtoehtoisesti (Illb) :n ja (Ha) :n seosta voidaan käsitellä edelleen (Illb):n muuttamiseksi (IVb):ksi ja/tai (Ib):ksi valmistamalla täten (IVb) :n ja/tai (Ib) :n ja (Ha) :n seos- 10 ta. Kromatografoimalla seoksen komponentit erottuvat helposti, se on (Ha) (IVb) :sta ja/tai (Ib) :stä.
Tämä eristämismenetelmä muodostaa myös 6R- ja 6S-tetrahydrofoolihappodiastereoisomeerien erotusmenetelmän de facto. Koska (Ha) voidaan muuttaa (Ia) :ksi kemiallisesti, 15 tämä keksintö antaa muodollisesti menetelmän (Ib):n erottamiseksi tehokkaasti (Ia):sta, joista yleisemmin käytetään nimityksiä leukovoriinin luonnolliset ja keinotekoiset muodot .
Kaavio 2 20
Ha
_v 0 C02H
ν[1Γ) QJjl |j / H,N'^^V‘N^SVN N\
2 I (CH2)2co2H
30 I
H
« iva i ' la 35 103804 12
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä, mutta niitä ei ole tarkoitettu patenttivaatimuksia millään tavoin rajoittaviksi .
Menetelmä A
5 Clostridium cylindrosporumin (käytetään myös nimitystä
Clostridium sp. - ATCC nro 7905) eristäminen ja kasvattaminen.
Koska Clostridium on anaerobi, kaikki viljelytuotan-to-, elatus- ja käsittelytoimenpiteet suoritetaan olosuh-lo teissä, joissa kantojen altistus hapelle on mahdollisimman vähäistä. Samalla tavoin johtuen tetrahydrofolaatin ja sen johdannaisten äärimmäisestä labiilisuudesta hapen suhteen, kaikki toimenpiteet näiden yhdisteiden yhteydessä suoritetaan hapen poissa ollessa. Tähän tarkoitukseen käytetään 15 muovista anaerobikaappilaitetta, joka on yhdistetty hapettomaan typpikaasulähteeseen.
1. Virtsahappo-kasvatusväliaineen valmistus
Virtsahappo-väliainetta valmistetaan, kuten on selostettu julkaisussa ATCC Media Handbook - Recipe nro 519: 20
Virtsahappo-väliainekoostumus Virtsahappo 3,0 g
Hiivauute 1,0 g
Kaliumfosfaatti, kaksiemäksinen 4,0 g ·' 25 Magnesiumsulfaattiheptahydraatti 0,1 g
Ferrosulfaatti 5,0 mg *0,04-%:inen fenolipunaliuos 1,0 g
Natriumtioglykolaatti 1,0 1 ♦tarvitaan 14,9 ml 0,01-norm. natriumhydroksidia 30 0,1 g kohden indikaattoria. Laimennetaan 250 ml:ksi tisla- ·* tulla vedellä 0,04-%risen liuoksen saamiseksi. Valmistetta essa väliainetta virtsahappo suspendoidaan nesteen lähes koko tilavuuteen, lämmitetään kiehuvaksi, ja pH säädetään natriumhydroksidilla pysyvään fenolipunan ruusunpunaiseen 35 väriin (pH 7,6). pH tarkistetaan pH-paperilla. Kiinteän väliaineen valmistamiseksi 20,0 g agaria lisätään väliaineeseen.
13 103804 Väliaine kaadetaan kierretulppaiseen pulloon lähes täyteen tilavuuteen, sitten kiehutetaan huuhtelemalla hapettomaksi typpikaasulla. Heti autoklaavikäsittelyn jälkeen pullon tulppa kierretään sopivan tiiviiksi. Väliainetta va-5 rastoidaan huoneenlämpötilassa virtsahapon saostumisen estämiseksi alemmissa lämpötiloissa.
2. Kasvatusväliaineen siirrostus Clostridium cylind-rosporum -viljelmällä
Kaikki käsittelytoimenpiteet suoritetaan anaerobi-io sissa olosuhteissa anaerobikaapissa. 1,0 ml:n erä nestemäistä virtsahappo-väliainetta lisätään lyofilisoituun bak-teeripilleriin, jota on saatu ATCCrstä. Pilleri liuotetaan, ja kertakäyttöistä siirrostussilmukkaa käytetään uudelleen-suspendoidun viljelmän sivelyyn virtsahappo-levyviljely-15 väliaineeseen. Levyt pannaan anaerobiseen astiaan, jossa on H2-C02:ta kehittävä säiliö ja metyleenisininen-indikaattori-liuska.
Siirrostettuja levyjä sisältävää astiaa inkuboidaan 37 °C:ssa. 24 tunnin kuluessa kasvu näkyy levyillä vaaleina, 20 läpikuultavina, sormimaisina ulokkeina kasvupesäkkeistä sä-teittäisesti lähtien. Tyypillisen kasvupesäkkeen näyte faa-sikontrastimikroskoopilla katseltaessa paljastaa tyypillistä Clostridium-solumorfologiaa ja -itiönmuodostusta.
3. Pysyvän Clostridium cylindrosporum -varastovil- • 25 jelmän valmistus
Virtsahappo-levyväliainetta valmistetaan Hungate-putkissa (Bellco Glass Co.), 10 ml väliainetta/putki, ja ne soveltuvat käytettäviksi pysyvänä Clostridium cylindrosporum -varastoviljelmänä. Edellä selostetusta kasvupesäkkees-30 tä otettu yksittäinen solujen kasvupesäke poimitaan sterii-Iillä siirrostussilmukalla ja pistetään Hungate-putkessa olevaan väliaineeseen. Tämä toimenpide suoritetaan anaerobikaapissa, jossa on typpikaasua. Putket pannaan anaerobiseen astiaan ja inkuboidaan 35 °C:ssa. Viiden päivän kulut-35 tua putket poistetaan astiasta, ja tulpat suljetaan tiiviisti parafiinikalvolla. Putkia varastoidaan huoneen lämpötilassa edelleen käyttöön saakka.
103804 14 4. Nestemäisen kasvatusväliaineympin valmistus
Puolikiinteää virtsahappo-väliainetta (2,5 g/1 Bacto-Agar) sisältäviin putkiin siirrostettiin Clostridium cy-lindrosporum -kasvupesäkettä, jota inkuboidaan 35 C:ssa ja 5 varastoidaan huoneen lämpötilassa edellä mainitulla tavalla. Näitä viljelmiä käytetään ymppilähteenä nestemäisessä väliaineessa kasvatusta varten, kuten on selostettu seu-raavassa kappaleessa.
5. Clostridium cylindrosporumin kasvatus nestemäisessä ίο väliaineessa
Yksi pehmeä agar -putkiviljelmä (koko 10 ml) lisätään yhteen litraan nestemäistä virtsahappo-väliainetta. Kaikki toimenpiteet suoritetaan anaerobikaapissa, ja koko viljelmää inkuboidaan anaerobisessa astiassa 4 päivää 35 °C:ssa.
15 Menetelmä B
Suoritetaan Clostridium cylindrosporumin raa'an for-myylitetrahydrofolaattisyntetaasiuutteen valmistus.
Kuten menetelmässä A, kaikki viljelmän valmistus-, elatus- ja käsittelytoimenpiteet suoritetaan olosuhteissa, 20 joissa lajien altistus hapelle on mahdollisimman vähäistä, koska Clostridium on anaerobinen. Samoin, johtuen tetrahyd-rofolaatin ja sen johdannaisten äärimmäisestä labiilisuu-desta hapen suhteen, kaikki toimenpiteet, joissa käsitellään näitä yhdisteitä, suoritetaan hapen poissa ollessa. 25 Tähän tarkoitukseen käytetään muovista anaerobikaappilaitetta, joka on yhdistetty hapettomaan typpikaasulähteeseen. Litran viljelmä tulee sameaksi, ja hiukkasmaista ainetta laskeutuu väliaineesta. Viljelmä jaetaan 4 x 250 ml:n tasaeriin ja lisätään 4 x 250 ml:n sentrifuugipulloihin. Vil-30 jelmiä sentrifigoidaan 4 °C:ssa, 8000 kierr./min., 15 minuuttia Beckman JA-21 -sentrifuugissa.
Vaikka väliaine on jäähdytetty 4 °C:seen, virtsahappo ei saostu johtuen sen kulumisesta bakteerien vaikutuksesta. Solupillerit suspendoidaan uudelleen 4 x 25 ml:aan jääkyl-35 mää tislattua vettä ja sentrifugoidaan kuten edellä. Pillereitä pakastetaan -20 °C:ssa 5 päivää ennen formyylitetra-hydrofolaattisyntetaasin määritystä.
103804 15
Pakastetut pillerit liuotetaan yhteensä 4,0 ml:aan puskuria [0,05-mol. kaliumbifosfaatti, 0,05-mol. 2-mer-kaptoetanoli (pH 7,5 lisäämällä 1-mol. kaliumhydroksidia)]. Pillereitä sekoitetaan ja annetaan liueta kieputtaen ajoit-5 tain huoneen lämpötilassa 60 minuutin ajan. Solupillereiden huomataan tulevan viskoosisiksi solujen hajoamisesta johtuen. Autolyysi tapahtuu huoneen lämpötilassa. Solulysaatti sentrifugoidaan nopeudella 1700 kierr/ min/30 min., ja su-pernatanttia pidetään jäissä ja siitä määritetään formyyli-lo tetrahydrofolaattisyntetaasi.
Menetelmä C
Formyylitetrahydrofolaattisyntetaasimääritys tehdään menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Buttlaire, "Purification and Properties of Formyltetrahydrofolate 15 Synthetase", Enzymology Voi. 66, sivu 585, 1980.
Esimerkki 1
Foolihapon pelkistys 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofooli-hapoksi suoritetaan käyttämällä hiljattain julkaistua kir-jallisuusmenetelmää [(C. Temple, Jr., R.D. Elliot, J.D. Ro-20 se ja J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 22, 731 (1979)] käyttämällä natriumboorihydridiä.
Esimerkki 2 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon tuottaminen ·· 25 Valmistetaan seuraava reaktioseos, joka soveltuu 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon entsymaattiseen formylointiin 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon tuottamiseksi: 100 ml 1,0-mol. trietanoliamiinihydrokloridia (pH 8,0), 100 ml 0,5-mol. adenosiinitrifosfaattia (pH 8,0) 100 ml 0, δ
ιό mol. kaliumkloridia, 100 ml 0,1-mol. magnesiumkloridi-·; heksahydraattia ja 200 ml 0,2-mol. ammoniumformiaattia (pH
8,0). Koko 5 g:n ampullin sisältämä 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofoolihappo (Sigma; puhtaus 69 prosenttia; eränumero 117F-5013) suspendoidaan 200 ml:aan seosta 0,2 mol. 35 Tris-HCl/0,05-mol. 2-merkaptoetanoli (pH 7,0) ja liuotetaan 16 103804 lisäämällä suunnilleen 15 ml 1-mol. kaliumhydroksidia. Kirkas liuos kaadetaan aikaisempaan seokseen ja lisätään tislattua vettä (noin 200 ml) koko reaktioseoksen saamiseksi 1,0 litraksi 2 litran lasipullossa.
5 Reaktio aloitetaan lisäämällä 4 ml raakaa entsyy- miuutetta, joka sisältää "formyylitetrahydrofolaattisyn-tetaasia" (FTHFS), ja reaktion annetaan jatkua huoneen lämpötilassa (22 °C) . Ajoittain otetaan näytteitä reaktion edistymisen seuraamiseksi HPLC:n avulla käyttämällä kään-10 teisfaasikolonnia (C-18), eluoimalla 0,1-mol. muurahaishapolla ja modifioimalla metanolilla lineaarisin 12 - 25-% :n gradientein 30 minuutin ajan. Kolonnin eluaattia tarkkaillaan aallonpituudella 282 nm, jolloin todetaan 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofoolihappoa 12 minuutin kohdalla ja is 5,10-metenyylitetrahydrofoolihappoa 16 minuutin kohdalla. Reaktio on päättynyt 18 tunnin kuluttua. Tänä ajankohtana 48 prosenttia alkuperäisestä 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofooli-happomäärästä on jäljellä määritettynä käyrän alapuolisten pinta-alojen avulla. Reaktioseoksesta lasketaan 1585 mg 20 vastaava 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappomäärä HPLC-kromatogrammista, joka esittää 5,10-metenyylitetra-hydrolaattia. Tämä vastaa 92 %:n teoreettista muuttumista ottamalla huomioon, että vain 1725 mg lähdössä käytetystä 3450 mg:sta 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofoolihappoa on ollut 25 käytettävissä entsymaattiseen konversioreaktioon. Viisikymmentä prosenttia teoreettisesta on muuttunut 5 tunnin kuluttua.
Esimerkki 3 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon muuttaminen 30 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapoksi .. Esimerkin 2 reaktioseosta tarkkaillaan toisen päivän ajan toteamatta mitään muutoksia sen koostumuksessa. 100 ml:n erä seoksesta siirretään 3-kaulaiseen pulloon, ja liuoksen pH säädetään arvoon 6,5 rikkihapolla. Samalla kun 35 kaasut poistetaan typellä, pullo upotetaan vesihauteeseen 17 103804 ja sitä lämmitetään 90 - 95 °C:ssa 2 tuntia. Reaktiota jatketaan sitten typen suojaamana 40 °C:ssa yön ajan. Tämä re-aktioseos on 16 tunnin kuluttua ruskeaa. Näyte siitä analysoidaan HPLC:n avulla käyttämällä käänteisfaasikolonnia 5 (C-18), eluoimalla 0,1-mol. muurahaishapolla ja modifi oimalla metanolilla 12 - 25-prosenttisin lineaarisin gra-dientein 30 minuutin ajan. Kolonnieluaattia tarkkaillaan aallonpituudella 282 nm. HPLC-analyysi osoittaa konversion määräksi 90,2 prosenttia ottamalla huomioon käyrän alapuo-10 liset pinta-alat 5,lO-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofolaatin ja 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon osalta.
5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon osalta pinta-ala, jonka pitäisi olla muuttumaton, on pienentynyt 33,1 prosenttiin suhteessa lähtöaineen pinta-alaan (48 prosenttia).
15 Reaktioseoksen näytteitä lisätään pumpun avulla prepa- ratiiviseen HPLC-käänteisfaasikolonniin (Dynamax 60A-C18, 8 mikrometriä, 2,1 x 30 cm) ja kehitetään käyttämällä gradi-entein 0,1-mol. muurahaishapon vesiliuosta ja metanolia virtausnopeuden ollessa 13 ml/minuutti 60 minuutin ajan. 20 Hieman keltaista 5-formyyli-5,6S,7,8tetrahydrofoolihappoa saadaan 82 prosentin kokonaissaannoin, jonka annetaan hap-pamissa eluointiolosuhteissa (0,1-mol. muurahaishapon vesi-liuos ja metanoli) muuttua 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetra-hydrofoolihapoksi, joka paikoillaan ollessaan konsentraati-: 25 on ollessa 3-6 mg/ml muodostaa geelin keräysampullissa.
Tämän näytteen enantiomeeripuhtaus määritettiin HPLC:n avulla käyttämällä kiraalista kolonnia (Diacel Chiracel OD) eluoimalla isokraattisesti 0,5-prosenttisella ammoniumfor-miaatilla, pH 3,8 ja 25-prosenttisella metanolilla. 15,2 30 minuutin retentioaika ja optinen kierto muurahaishapossa tallennetaan seuraavasti: » 18 103804
Yhdiste Konsentraatio(%) Kierto (88-%:inen muurahais- (ctD 26 °C:ssa) happoliuos) 5 5,10-metenyyli- 5.65.7.8- tetra- hydrofoolihappo 0,611 +42
Esimerkki 4 5,lO-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon muuttaminen 5-10 formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapoksi ja 5,6R,7,8-tetra-hydro f oo1ihapoks i
Esimerkissä 2 saadun reaktioseoksen jäljellä olevan osan pH säädetään arvosta 8,0 arvoon 5,0 rikkihapolla, jolloin alkaa 10 - formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon nopea 15 syklisoituminen 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapoksi, joka sitten ollessaan paikoillaan huoneen lämpötilassa hydrolysoituu hitaasti muodostaen 5-formyyli- 5.65.7.8- tetrahydrofoolihappoa. Jälkimmäistä ei ole todettu reaktioseoksessa ennen pH:n säätämistä.
20 Reaktiota seurataan HPLCrn avulla käyttämällä kään- teisfaasikolonnia (C-18), eluoimalla 0,1-mol. muurahaishapolla ja modifioimalla metanolilla lineaarisin gradientein 12 -> 25 prosenttiin 30 minuutin ajan. Reaktion tarkkailu HPLCrn avulla paljastaa yli 70 prosentin alkuperäisestä 25 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihaposta muuttuneen 5-formyyli5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapoksi 5 päivän kuluttua huoneen lämpötilassa, jonka aikana 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon konsentraatio reaktioseoksessa pysyy muuttumattomana. Formyloituneet tuotteet, jotka on saatu 5-formyyli-30 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappona ja 5,l0-metenyyli-5,6S,7,8- :« tetrahydrofoolihappona ja formyloitumaton 5,6R,7,8-tetra- hydrofoolihappo eristetään sitten preparatiivisen HPLC-käänteisfaasikolonnin avulla (Dynamax 60A-C18, 8 mikromet riä, 2,1 x 30 cm) kehittämällä 0,1-mol. muurahaishapon ve-35 siliuoksen ja metanolin gradientein virtausnopeuden ollessa 13 ml/minuutti 60 minuutin ajan. Kahden preparaatin määritetyt saannot (kumpikin vastaten 50 ml reaktioseoksia) ovat seuraavat: 103804 19
Eristetty yhdiste (mg) Saanto Suht.
(%) saanto 5.10- metenyyli-5,6S,7,8-tetra- 5 hydrofoolihappo (22,6) 12,9 6,5 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydro- foolihappo (118,2) 67,5 33,8 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo* (145,5) 83,1 41,6 10 ♦Eristetty 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo kuivataan heti ja formyloidaan muurahaishapolla (kuten alla on selostettu) , jolloin saadaan 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tetra-hydrofoolihappoa, joka toisin kuin 6S-muoto, kiteytyy 15 erilleen laimeasta muurahaishaposta.
Esimerkki 5 5,6R,7,8 -tetrahydrofoolihapon formylointi, jolloin saadaan kiteistä 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofooli-happoa 20 253 mg:n näyte kromatografisesti puhdistettua ja lyo- filisoitua 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa liuotetaan 50 ml:aan 97-prosenttista muurahaishappoa, jossa on 2 prosenttia trifluorietikkahappoa, ja annetaan olla ympäristön lämpötilassa reaktiopullossa typen suojaamana se-25 koittamatta. Reaktioseos analysoidaan HPLC:n avulla käyttämällä käänteisfaasikolonnia (C-18) eluoimalla 0,1-mol. muurahaishapon vesiliuoksella ja modifioimalla metanolilla lineaarisin gradientein 12 -> 25 prosenttiin 30 minuutin ajan ja tarkkaillaan aallonpituudella 282 nm. Kolmen tun-30 nin kuluttua kaikki 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo on rea-.. goinut päätellen uuden piikin ilmaantumisesta vastaten 5.10- metenyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa HPLC-kroma-togrammissa. Sen jälkeen poistetaan pääosa muurahaishaposta haihduttamalla ja lisätään hitaasti 30 ml 0,1-mol. muu- 35 rahaishapon vesiliuosta kieputtamalla seosta silloin täi- 20 1 0 3 8 0 4 löin. Liuosta varastoidaan sitten kylmähuoneessa yön ajan. Muodostuu pieniä neulasia, mikä saa liuoksen näyttämään kiinteältä aineelta. Kiteet kootaan huokoslasisuodatti-mella, pestään asetonilla ja kuivataan vakuumissa, jolloin 5 saadaan 218 mg keltaista kiteistä ainetta.
Kiteisen 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon enantiomeeripuhtaus määritetään käyttämällä kiraalista kolonnia (Diacel Chiracel OD) eluoimalla isokraattisesti 0,5-prosenttisella ammoniumformiaatilla, pH 3,8 ja 25-10 prosenttisella metanolilla. Tuote, 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo, eluoituu 18,2 minuutin kohdalla .
Optinen kierto määritettynä liuoksena 88-prosent-tisessa muurahaishapossa on seuraava: 15 Konsentraatio(%)
Yhdiste (88-%:inen muura- Kierto haishappoliuos) (a D 26°C:ssa) 5,10-metenyyli- 0,619 -47 20 5,6R,7,8-tetra- hydrofoolihappo
Esimerkki 6 5,6,7,8-tetrahydrofoolihapon johdannaisen valmistus 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon ja/tai 5,10- 25 metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon läsnä ollessa
Modifioimalla edellä esitettyä L. Reesin, C.J. Suck-lingin ja H.C.S. Woodin menetelmää, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 470 (1987), (-)mentyyliklooriformiaattia lisätään esimerkin 4 reaktioseoksen näytteeseen, joka on säädetty 30 arvoon pH 7, minkä seurauksena karboksimetyloituu vain .. 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo ja 5-formyyli5,6S,7,8-tet rahydrofoolihappo ja/tai 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetra-hydrofoolihappo jäävät reagoimattomiksi. Reaktiota tarkkailtiin HPLC:n avulla. 5-mentyylioksikarbonyyli-5,6R,7,8-35 tetrahydrofoolihapon tehokas erottaminen reagoimattomista 103804 21 komponenteista suoritetaan laskemalla reaktioseos XAD-2:11a täytetyn kolonnin läpi. Hartsi absorboi 5-mentyylioksikarbonyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon ja 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai 5,10-mentyyli-5 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo kulkee läpi.
Esimerkki 7 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon, 5,6R,7,8- tetrahydrofoolihapon ja muiden johdannaisten puhdistus preparatiivisen HPLC:n avulla io Eriä (50 tai 100 ml) esimerkin 4 reaktioseoksesta pannaan suoraan käänteisfaasikolonniin (Dynamax 60A-C18, 8 mikrometriä, 2,1 x 30 cm) syöttöpumpulla ja sitten kehitetään gradientein 0,1-mol. muurahaishapon vesiliuoksen ja metanolin kanssa virtausnopeuden ollessa 13 ml/minuutti 60 15 minuutin ajan. Käytetty gradientti alkaa metanoli-konsentraation ollessa 5 prosenttia lisääntyen 10 prosenttiin 12 minuutin ajoajan jälkeen. Metanolin 10-%:inen kon-sentraatio pidetään sitten vakiona seuraavan 10 minuutin aikana, josta ajankohdasta (22 minuutin ajon jälkeen) al-20 käen metanolin määrää lisätään lineaarisesti 18 prosenttiin asti 38 minuutin kohdalle ja tästä alkaen lisätään edelleen 25 prosenttiin asti 52 minuutin ajoaikaan saakka. Ajon päättymiseen asti tätä konsentraatiota ei enää lisätä. Kolonnista tulevaa virtausta tarkkaillaan aallonpituu-: 25 delle 319 nm, koska 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydro- folaatilla ja 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapolla on sama absorptiokerroin tuolla aallonpituudella.
Näissä preparatiivisissa olosuhteissa 5,6R,7,8-tetra-hydrofoolihappo eluoituu aikavälillä 11 - 17,5 minuuttia, 30 kun taas 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo eluoituu aikavälillä 39,5 - 44,5 minuuttia. 5,10-metenyyli- 5,6S,7,8-tetrahydrofolaattivyöhykkeen eluoituminen riippuu suuresti konsentraatiosta ilmeten 20 ja 30 minuutin välillä jälkipiikkinä. 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappovyöhy-35 kettä ja 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrolaattivyöhy- 103804 22 kettä ei voida erottaa täydellisesti, kun reaktioseosta on syötetty enemmän kuin 140 ml, mikä vastaa 700 mg lisättyä ainetta.
Eluoituneet 5,6R, 7,8-tetrahydrofoolihappo- ja 5-5 formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappovyöhykkeet kerätään lasipulloihin, jotka on upotettu kuivajäähän siten, että neste voi jäätyä heti. Jäätyneet fraktiot lyofilisoidaan sen jälkeen, jolloin saadaan harmahtavan valkeaa jauhetta, kun kyseessä on 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo, ja kello lanvalkeata jauhetta, kun kyseessä on 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo. Näiden jauheiden HPLC-analyysi suoritetaan käyttämällä käänteisfaasi-kolonnia (Dynamax 60A-C18, 8 mikrometriä, 2,1 x 30 cm) ja kehittämällä gradien-tein 0,1-mol. muurahaishapon vesiliuosta ja metanolia. 5-15 formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo osoittautuu olevan puhtaudeltaan 97-prosenttista ja 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo 93-prosenttista käyrän alapuolisen alueen perusteella. 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon epästabiilisuuden vuoksi se muutetaan kemiallisen formyloinnin avulla stabiilimmak-20 si 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapoksi. 5-for-myyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapon stabiilisuusongelmien neutraloimiseksi tämä yhdiste muutetaan kalsiumsuolakseen esimerkissä 8 selostetulla tavalla.
Esimerkki 8 25 Kalsium-5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofolaatin tai kalsium-5-formyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofolaatin valmistus C. Templen, Jr., R.D. Elliotin, J.D. Rosen ja J.A. Montgomeryn, J. Med. Chem., 22, 731 (1979), julkaiseman menetelmän muunnoksessa raseemisen kalsium-5-formyyli-30 5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolaatin valmistamiseksi val mistettu 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydroolihappo on pesty eetterillä mahdollisen ammoniumformiaatin poistamiseksi. Kuusikymmentäkaksi mg pestyä ainetta on sitten liuotettu 32 ml:aan kuivatislattua metanolia (suolaton foliinihappo 35 liukenee hyvin metanoliin), johon lisätään noin 1 ml kai- 103804 23 siumkloridin metanoliliuosta (72 mg kalsiumkloridia ml kohden metanolia). Suolan lisääminen aiheuttaa heti harmahtavan valkean sakan muodostumisen, joka kootaan talteen huokoslasisuppiloon ja kuivataan vakuumissa. Saanto kuiva-5 uksen jälkeen on 60,5 mg (90 % teoreettisesta saannosta).
Jos tämä menetelmä toistetaan 6R-aineilla, saadaan kalsium-5-formyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofolaattia.
Valmistettujen yhdisteiden puhtaus määritetään UV/HPLC:n avulla huomioimatta minkään UV:tä absorboimat-lo toman aineen läsnä oloa. Enantiomeerinen puhtaus määritetään 5,10-metenyyli-5,6(R,S),7,8-tetrahydrofolaattijoh-dannaisvaiheessa HPLC:n avulla käyttämällä kiraalista kolonnia (Diacel Chiracel OD) ja eluoimalla isokraattisesti 0,5-prosenttisella ammoniumformiaatilla, pH 3,8, ja 25-15 prosenttisella metanolilla. 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetra-hydrofoolihappo eluoituu ensin retentioajan ollessa 15,2 minuuttia, kun taas 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tetrahydro-foolihappo eluoituu 18,2 minuutin kohdalla.
Optisten kierto-ominaisuuksiensa taltioimiseksi käy-20 tettiin valmistettujen yhdisteiden muurahaishappoliuoksia mieluimmin kuin 10-mol. tai 12-mol. kloorivetyhappo-liuoksia, kuten kirjallisuudessa on ilmoitettu, johtuen muurahaishapon alemmasta happamuudesta ja sen paremmasta folaattien liuottamiskyvystä. Edellä esitettyjen valmis-25 teiden näytteillä oli seuraavat optiset kierto-ominaisuudet .
Konsentraatio(%) Kierto (66-%:inen muura- (a D 26 °C:ssa) 30 Yhdiste haishappoliuos ) • · 5.10- metenyyli- 5,6S,7,8-tetra- * hydrofoolihappo 0,611 +42 35 5.10- metenyyli- 5,6R,7,8-tetra- ** hydrofoolihappo 0,619 -4 7 103804 24 ♦Eristetty kromatograafisesti 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappona, joka ollessaan paikoillaan eluoi-dussa 0,1-mol. muurahaishapposeoksessa muuttui 5,10-5 metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihapoksi ja muuttui sitten kiinteäksi muodostaen geelin, joka lyofilisoitiin.
♦♦Eristettiin alkujaan konvertoimattomana 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappona, joka lyofilisoinnin jälkeen formyloitiin heti muurahaishapolla, kuten aikaisemmin ίο on selostettu. Muodostunut 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tet-rahydrofoolihappo, joka kiteytyi erilleen laimeasta muura-haishapposeoksesta, kerättiin talteen, pestiin asetonilla ja kuivattiin vakuumissa. 253 mg:sta 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa (paino) kerättiin talteen 218 mg ki-15 teistä 5,10-metenyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa (paino) .
Esimerkki 9
Radioaktiivisesti merkittyjen formyylifoolihapon ja johdannaisten valmistus 20 Jos toistetaan esimerkin 2 menetelmä korvaamalla am- moniumformiaatti radioaktiivisesti merkityllä ammonium-formiaatilla tai millä tahansa muulla radioaktiivisesti merkityllä muurahaishappojohdannaisella, saadaan radioaktiivisesti merkittyä 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydro-• 25 foolihappoa. Jos tätä käsitellään esimerkkien 3-8 mene telmin, saadaan näin ollen vastaavia radioaktiivisesti merkittyjä happoja ja suoloja.
Edellä mainitut patentit, julkaisut ja koemenetelmät on liitetty tähän viitteinä.
30 Edellä oleva yksityiskohtainen selostus tarjoaa tämän « . alan asiantuntijoille monia ilmeisiä variaatioita. Esimer kiksi kalsiumleukovoriinin asemesta voidaan valmistaa strontiumleukovoriinia ja natriumleukovoriinia. Tetrahydrof olaattiformylaasia voidaan kehittää käyttämällä la-35 jia Clostridium acidi-urici. Kaikki sellaiset ilmeiset modifikaatiot sisältyvät täydellisesti oheisten patentti-*· vaatimusten tarkoittamaan piiriin.
Claims (8)
1. Menetelmä 5,6(R- tai S-),7,8-tetrahydrofoolihap-pojohdannaisen halutun, pääasiallisesti puhtaan (6R- tai 5 6S)-diastereoisomeerin tai sen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa (a) tetrahydrofoolihapon tai substituoidun tetra-hydrofoolihapon 6R- ja 6S-diastereoisomeerien seoksen 6S-muoto tai sen suola formyloidaan entsymaattisesti tetra- 10 hydrofolaattiformylaasilla, joka on peräisin Clostridium cvlindrosporumista. ATCC-nro 7905 tai sen mutantista, joka on funktionaalisesti ekvivalentti emokannan kanssa, siten, että muodostuu seos, joka sisältää lO-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa ja reagoimatonta 15 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa sekä, mah dollisesti, reagoimatonta 5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa, ja (b) (1) 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola syklisoidaan ja hydrolysoidaan siten, että 2. muodostuu 5,10-metenyyli-5,6S,7,8 -tetrahydrofoolihappoa tai 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai niiden suoloja tai molempia edellä mainituista, 5,6R,7,8-tetra-hydrofoolihapon tai sen suolan läsnä ollessa, ja sen jälkeen joko 25 (i) muodostetaan 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon joh dannainen tai sen suola siten, että muodostuu 5-substitu-oitua 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa ja erotetaan sitten komponentit, tai vaihtoehtoisesti (ii) 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo 30 ja/tai 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai niiden - .. suolat erotetaan 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihaposta tai sen suolasta, ja erottamisen jälkeen haluttaessa (2) (i) reagoimaton 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola formyloidaan kemiallisesti, syklisoidaan ja 103604 hydrolysoidaan siten, että muodostuu 5-formyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa, tai vaihtoehtoisesti (ii) muodostetaan 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon johdannainen tai sen suola muiden toiminnallisten ryhmien 5 kanssa siten, että muodostuu 5-substituoitua 5,6R,7,8-tet-rahydrofoolihappoa tai sen suolaa, ja haluttaessa (c) pääasiallisesti puhdas 5-formyyli-5,6S,7,8-tet-rahydrofoolihappo tai sen suola tai 5-formyyli-5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola muutetaan vastaavaksi 10 hapoksi tai suolaksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reagoimattoman 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihapon kemiallinen formylointi suoritetaan muurahaishapolla karbodi-imidin läsnä ollessa.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuttamisvaiheeseen (c) sisältyy foolihappojohdannaisen muuttaminen vastaavaksi suolaksi .
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että suola on kalsiumsuola, mag-nesiumsuola, strontiumsuola, rautasuola tai joidenkin edellä mainittujen suolojen seos.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen formylointi 25 suoritetaan reaktioseoksessa, joka sisältää radioaktiivi-sesti merkittyä muurahaishappoa tai kemiallista vastinetta .
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä halutun, pääasiallisesti puhtaan 5-formyyli-5,6S,7,8-tetra- 30 hydrofoolihapon tai sen suolan valmistamiseksi, tun nettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa (a) 5,6,7,8-tetrahydrofoolihapon 6R- ja 6S-diaste-reoisomeerien seoksen 6S-muoto tai sen suola formyloidaan entsymaattisesti tetrahydrofolaattiformylaasilla, joka on 35 peräisin Clostridium cvlindrosporumista. ATCC-nro 7905, 103804 tai sen mutantista, joka on funktionaalisesta ekvivalentti emokannan kanssa siten, että muodostuu seos, joka sisältää 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen suolaa ja reagoimatonta 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai sen 5 suolaa sekä, mahdollisesti, reagoimatonta 5,6S,7,8-tetrahydrof oolihappoa tai sen suolaa, ja (b) 10-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suola syklisoidaan ja hydrolysoidaan siten, että muodostuu 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai 10 5-formyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappoa tai niiden suo loja tai molempia edellä mainittuja, 5,6R,7,8-tetrahydro-foolihapon tai sen suolan läsnä ollessa, minkä jälkeen (c) 5,10-metenyyli-5,6S,7,8-tetrahydrofoolihappo tai sen suolat erotetaan 5,6R,7,8-tetrahydrofoolihaposta 15 tai sen suolasta, ja erottamisen jälkeen haluttaessa (d) muutetaan pääasiallisesti puhdas 5-formyyli-5,6S,7,8 -tetrahydrofoolihappo tai sen suola vastaavaksi hapoksi tai suolaksi.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että muuttamisvaiheeseen (d) sisältyy foolihappojohdannaisen muuttaminen vastaavaksi suolaksi .
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suola on kalsiumsuola, mag- • 25 nesiumsuola, strontiumsuola, rautasuola tai joidenkin edellä mainittujen suolojen seos. 103804
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44966289A | 1989-12-11 | 1989-12-11 | |
| US44966289 | 1989-12-11 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI906072A0 FI906072A0 (fi) | 1990-12-10 |
| FI906072A FI906072A (fi) | 1991-06-12 |
| FI103804B1 FI103804B1 (fi) | 1999-09-30 |
| FI103804B true FI103804B (fi) | 1999-09-30 |
Family
ID=23785009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI906072A FI103804B (fi) | 1989-12-11 | 1990-12-10 | Menetelmä tetrahydrofotolaattiyhdisteiden optisesti puhtaiden diastereoisomeerien valmistamiseksi |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334535A (fi) |
| EP (1) | EP0432441B1 (fi) |
| JP (1) | JP3027613B2 (fi) |
| KR (1) | KR0172118B1 (fi) |
| CN (1) | CN1031804C (fi) |
| AR (1) | AR245134A1 (fi) |
| AT (1) | ATE139799T1 (fi) |
| AU (1) | AU641710B2 (fi) |
| CA (1) | CA2031784C (fi) |
| CZ (1) | CZ279998B6 (fi) |
| DE (1) | DE69027585T2 (fi) |
| DK (1) | DK0432441T3 (fi) |
| ES (1) | ES2090075T3 (fi) |
| FI (1) | FI103804B (fi) |
| GR (1) | GR3021060T3 (fi) |
| HU (1) | HU209761B (fi) |
| IE (1) | IE904439A1 (fi) |
| IL (1) | IL96265A0 (fi) |
| NO (1) | NO177541C (fi) |
| NZ (1) | NZ236370A (fi) |
| PL (1) | PL166096B1 (fi) |
| PT (1) | PT96120B (fi) |
| SK (1) | SK610390A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA909899B (fi) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH681303A5 (fi) * | 1991-01-16 | 1993-02-26 | Eprova Ag | |
| DE4136921A1 (de) * | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Knoll Ag | Verfahren zur trennung von 5-methyl-tetrahydrofolsaeure |
| CH683262A5 (it) * | 1992-01-22 | 1994-02-15 | Applied Pharma Res | Procedimento per la separazione dei diastereomeri del sale di calcio dell'acido (6(R,S)-N-formiltetraidrofolico). |
| IT1254635B (it) * | 1992-02-20 | 1995-09-28 | Bracco Spa | Processo per la separazione degli stereoisomeri dell'acido folinico |
| CH686369A5 (de) * | 1994-05-09 | 1996-03-15 | Eprova Ag | Stabile kristalline (6S)- und (6R)-Tetrahydrofolseure. |
| CH693255A5 (de) * | 1997-06-13 | 2003-05-15 | Eprova Ag | Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels. |
| CH694251A5 (de) * | 1999-07-14 | 2004-10-15 | Eprova Ag | Herstellung von Tetrahydropterin und Derivaten. |
| WO2001077367A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-18 | Rothenberg Sheldon P | Radioenzymatic assay for methylenetetrahydrofolate reductase |
| CH696699A5 (de) * | 2006-01-19 | 2007-10-15 | Cerbios Pharma Sa | Verfahren zur regioselektiven N(5) -Formylierung von (6S) -5, 6, 7, 8-Tetrahydropteroinsäure und Derivaten davon. |
| WO2010017526A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | The Scripps Research Institute | Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof |
| WO2014018873A2 (en) * | 2012-07-27 | 2014-01-30 | Chemic Laboratories Inc. | Compositions comprising folic acid derivatives. their preparations and methods of use |
| CN115656372A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-01-31 | 北京斯利安药业有限公司 | 一种s-四氢叶酸异构体手性分析方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4500711A (en) * | 1977-03-21 | 1985-02-19 | Burroughs Wellcome Co. | Synthesis of leucovorin |
| US4148999A (en) * | 1977-08-22 | 1979-04-10 | The Government Of The United States Of America | Preparation and purification of citrovorum factor |
| GB8621268D0 (en) * | 1986-09-03 | 1986-10-08 | Univ Strathclyde | Separation of substances |
| US4746662A (en) * | 1987-02-20 | 1988-05-24 | American Cyanamid Company | Treatment of arthritis with 3,5-dichloromethotrexate |
| DE3821875C1 (fi) * | 1988-06-29 | 1990-02-15 | Eprova Ag, Forschungsinstitut, Schaffhausen, Ch | |
| FR2643081B1 (fr) * | 1989-02-14 | 1991-06-07 | Panmedica Sa | Folates de magnesium, procede de preparation et compositions pharmaceutiques |
| CH680731A5 (fi) * | 1990-04-12 | 1992-10-30 | Sapec Fine Chemicals | |
| JPH07332120A (ja) * | 1994-06-08 | 1995-12-22 | Sanshin Ind Co Ltd | 多気筒エンジン |
-
1990
- 1990-11-05 ES ES90121120T patent/ES2090075T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90121120A patent/EP0432441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DE DE69027585T patent/DE69027585T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DK DK90121120.1T patent/DK0432441T3/da active
- 1990-11-05 AT AT90121120T patent/ATE139799T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-06 IL IL96265A patent/IL96265A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-11-27 CN CN90109616A patent/CN1031804C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-06 NZ NZ236370A patent/NZ236370A/xx unknown
- 1990-12-07 SK SK6103-90A patent/SK610390A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 CZ CS906103A patent/CZ279998B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 CA CA002031784A patent/CA2031784C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 PT PT96120A patent/PT96120B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 AU AU67932/90A patent/AU641710B2/en not_active Expired
- 1990-12-10 KR KR1019900020269A patent/KR0172118B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 AR AR90318584A patent/AR245134A1/es active
- 1990-12-10 NO NO905325A patent/NO177541C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-12-10 JP JP2407190A patent/JP3027613B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-10 ZA ZA909899A patent/ZA909899B/xx unknown
- 1990-12-10 FI FI906072A patent/FI103804B/fi active IP Right Grant
- 1990-12-10 IE IE443990A patent/IE904439A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-11 PL PL90288204A patent/PL166096B1/pl unknown
- 1990-12-11 HU HU908159A patent/HU209761B/hu unknown
-
1992
- 1992-09-18 US US07/947,641 patent/US5334535A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-18 GR GR960402428T patent/GR3021060T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI103804B (fi) | Menetelmä tetrahydrofotolaattiyhdisteiden optisesti puhtaiden diastereoisomeerien valmistamiseksi | |
| JP4810043B2 (ja) | 細胞分裂阻害剤及びその製造方法 | |
| FI105106B (fi) | Menetelmä optisesti aktiivisen (2S)-endo-bisyklo[2.2.1]heptan-2-olin tai (2R)-endo-bisyklo[2.2.1]heptan-2-olin valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävät välituotteet | |
| CA1300807C (en) | Heterocyclic derivatives | |
| US5981239A (en) | Synthesis of optically active phenylalanine analogs using Rhodotorula graminis | |
| HUT60741A (en) | Process for producing ammonium salts of n5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid, for separating (6rs)-diastereoisomer mixtures and for producing (6r)- and (6s)-alkali metal and alkali-earth metal salts | |
| EP0175312B1 (en) | Process for preparing optically active hydantoins | |
| Bailey et al. | Synthesis of tetrahydropteridine C6-stereoisomers, including N5-formyl-(6S)-tetrahydrofolic acid | |
| US4510246A (en) | Isolation of cyclase, epimerase and a ring expansion enzyme for producing unnatural cephalosporins | |
| EP0457735B1 (en) | Biocatalytic process for the production of L-(-)-carnitine from crotonobetaine and strains of Proteeae for use in said process | |
| Arnstein et al. | The biosynthesis of penicillin. 8. Investigation of cyclic cysteinylvaline peptides as precursors | |
| JP2696127B2 (ja) | 光学活性な２―ヒドロキシカルボン酸の製造法 | |
| RU2001116104A (ru) | Ванкорезмицин, способ его получения и его использование в качестве лекарственного средства | |
| JP2000072760A (ja) | 新規シストチアゾール類縁体 | |
| Totani et al. | Synthesis of a novel 5-deaza-5-thia analogue of tetrahydrofolic acid, N-(p-{[(2-amino-6, 7-dihydro-4-oxo-3H, 8H-pyrimido [5, 4-b][1, 4] thiazin-6-yl) methyl] amino} benzoyl) glutamic acid | |
| Zygmunt et al. | Formation of folic acid related compounds by Bacillus subtilis | |
| Young | Synthesis of Chirally Labelled Substrates Using Enzymes | |
| JPS5816694A (ja) | グルタチオンの製造法 | |
| RU2002118116A (ru) | Амикомицин, способ его получения и его применение в качестве фармацевтического средства | |
| JPH08131186A (ja) | 抗菌性物質ｂｅ−４３７６７類 | |
| JPH01215291A (ja) | 新規生理活性物質ＫＳ−５０３ｃおよびその製造法 | |
| JPH0258280B2 (fi) | ||
| JPH04121195A (ja) | 光学活性なプロパン―２―オール類の製造法 | |
| JP2000507447A (ja) | ヘリシウム・エリナシウスからの新規ベンズアルデヒド誘導体 | |
| JPH0761994A (ja) | Ｆｏ−２２９５−ｉ物質、ｆｏ−２２９５−ｉｉ物質および／またはｆｏ−２２９５−ｉｉｉ 物質並びにその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: WYETH HOLDINGS CORPORATION |