JP6705911B2 - 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化 - Google Patents

多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化 Download PDF

Info

Publication number
JP6705911B2
JP6705911B2 JP2018553183A JP2018553183A JP6705911B2 JP 6705911 B2 JP6705911 B2 JP 6705911B2 JP 2018553183 A JP2018553183 A JP 2018553183A JP 2018553183 A JP2018553183 A JP 2018553183A JP 6705911 B2 JP6705911 B2 JP 6705911B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cdx2
endoderm
protein
gene expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018553183A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019511228A (ja
JP2019511228A5 (ja
Inventor
リーク，セバスチャン
レザニア，アリレザ
Original Assignee
ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド, ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド filed Critical ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
Publication of JP2019511228A publication Critical patent/JP2019511228A/ja
Publication of JP2019511228A5 publication Critical patent/JP2019511228A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6705911B2 publication Critical patent/JP6705911B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/38—Stomach; Intestine; Goblet cells; Oral mucosa; Saliva
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、糖尿病などの状態のための細胞療法の分野に関する。特に、本発明は、中腸内胚葉細胞集団を発生させるための、ヒト多能性幹細胞の分化誘導などの細胞分化に関する。本発明は、中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現している細胞又は細胞集団、及びそれらの産生方法を提供する。
幹細胞及び内分泌細胞の両方のステージにおける、インクレチンホルモンの作用機構に対する知識の増加は、腸への分化の理解の増加と連動して、生着に適するインクレチンホルモン産生細胞源の開発への興味をもたらしている。１つのアプローチは、ヒト胚性幹細胞（「ｈＥＳＣ」）又は人工多能性幹細胞（「ｉＰＳ」）などの多能性幹細胞からの、機能性腸内分泌Ｌ−又はＫ−細胞の発生である。
腸Ｌ細胞からのグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、又は、腸Ｋ細胞からのグルコース依存性インスリン分泌ポリペプチド（ＧＩＰ）の産生／分泌は、糖尿病の治療に有益な効果を有する。インクレチンホルモンは、糖尿行（１型及び２型）の治療に有益な全身作用を有する（Ｕｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｃｕｒｒ Ｄｉａｂ Ｒｅｐ．，２０１３；１３（５）：６６３〜６６８）。利点として、多くの性状のベータ（β）細胞機能及び数の増大、グルカゴン分泌の抑制、末梢代謝組織のインスリン感受性の増加、肝糖新生の低下、及び食欲の低下を挙げることができる。糖尿病の治療には、２種類のインクレチン系治療薬が確認されている（ＧＬＰ−１受容体アゴニスト及びジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）阻害剤）。しかし現在、改善されかつ効率的なＧＬＰ１系糖尿病治療のための、内因性及び細胞性の指標を包含するインクレチン系細胞治療の選択肢がない。更に、現在のインクレチン系治療は循環血糖値により調節されていないため、非生理学的に制御されたＧＬＰ産生がもたらされる。
脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られるプロセスにおいて３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）から構成される細胞群を生じる。間葉組織は中胚葉由来であり、遺伝子の中でも、ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ １（ＨＡＮＤ１）、ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｆ１（ＦＯＸＦ１）を特徴とする。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前方前腸、後方前腸、中腸、及び後腸領域を特異的に示す一連の因子の発現によって認識することができる、前方−後方ドメインに分割される。
Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，２０００；１６（３）：１２４〜１３０に記載されるように、特定の転写因子（「ＴＦ」）の発現レベルを用いて組織の同一性を表記できる。ＦＯＸＡ２は、内胚葉全体を前後軸に沿って特徴付ける。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。前方前腸は、ＳＯＸ２の高発現によって広範囲に特徴付けられ、甲状腺、肺、食道などの臓器ドメインを包含する。中腸（十二指腸、回腸、空腸を含む）及び後腸（結腸を含む）は、ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２（ＣＤＸ２）の高発現によって特徴付けられる。ＳＯＸ２−ＣＤＸ２の境界は後方前腸内に発生し、その内部で更なるＴＦが、特定の臓器ドメインを特徴付ける。後方前腸内で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ１の非常に高い発現並びにＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＴＦ１Ａは、膵臓組織で高度に発現する。高ＣＤＸ２発現と共に、低ＰＤＸ１発現は十二指腸ドメインの特徴である。腸内胚葉は、特定のホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子によってパターン化される。例えば、ＨＯＸＣ５は、中腸内胚葉細胞に優先的に発現される。また、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＤ１３の発現は、後腸内胚葉細胞に限定される。ＡＬＢ遺伝子、つまりアルブミン１タンパク質は、後方前腸内胚葉中の最初期肝前駆細胞の特徴である（Ｚａｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２０１６；１１７：６４７〜６６９）。
ヒト多能性幹細胞から腸内胚葉細胞を発生させるためのプロトコールの改善において、進歩がなされている。例えば、以下の公表文献（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１；４７０（７３３２）：１０５〜１０９；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４；２０（１１）：１３１０〜１３１４；及びＫａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１３；４（７９）：１〜１８）は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−４、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅファミリー、３Ａ（ＷＮＴ３Ａ）、Ｃｈｉｒｏｎ ９９０２１、又はレチノイン酸（ＲＡ）のいずれかを用いる分化プロトコールと、ＣＤＸ２＋／ＦＯＸＡ２＋内胚葉集団だけではなく、かなりの間葉系ＣＤＸ２＋細胞集団を含む中腸／後腸スフェロイドが発生する、胚体内胚葉ステージでのＦＧＦ７染色について概説している。これらｈＥＳＣ由来の中腸／後腸スフェロイドから腸内分泌細胞を分化する工程は、非常に非効率で、長い期間が必要であり、絨毛間領域及び絨毛領域の全ての種類の腸細胞を発生させるように識別化されずに誘導される。
細胞治療用の腸内分泌細胞を高効率で産生できるための、実質的に間葉細胞が混在することがない、中腸内胚葉細胞を発生させる手法の必要性が依然として存在している。
具現化され十分に説明されるように、本発明は、細胞、細胞集団及び、ヒト多能性幹細胞を分化させることによるその細胞の発生方法を提供する。特に、本発明は、中腸内胚葉細胞、より具体的には中腸内胚葉細胞の内胚葉単層を発生させるヒト多能性幹細胞の分化誘導を特徴とする。
本発明の一態様は、培地中でヒト多能性幹細胞を培養することを含む、中腸内胚葉細胞集団を産生する方法である。実施形態では、この方法は、ヒト多能性幹細胞を中腸内胚葉細胞への分化を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞集団が産生される。いくつかの実施形態では、実質的に中腸内胚葉細胞集団が産生される。本発明の実施形態では、中腸内胚葉細胞は、培地中で単層を形成し、単層として安定である。実施形態では、分化細胞の５０％超が中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現し、好ましくは分化細胞の６０％超が中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現し、より好ましくは７０％超、８０％超、及び９０％超が中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する。実施形態では、中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する分化細胞は、中腸内胚葉細胞である。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現する。全ての実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５から選択される転写因子を発現する。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５から選択される転写因子を発現しない。
本発明の実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、ａ）ＭＣＸ化合物などのＧＤＦ−８及びＧＳＫ３β阻害剤を含む第１の培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、胚体内胚葉細胞への分化を誘導する工程と、ｂ）アスコルビン酸及びＦＧＦ７を含む第２の培地中で胚体内胚葉細胞を培養し、原始腸管細胞への分化を誘導する工程と、ｃ）酸性条件下でレチノイン酸及びＢＭＰ２又はＢＭＰ４を含む第３の培地中で原始腸管細胞を培養し、中腸内胚葉細胞への分化を誘導する工程と、を含む工程によって、中腸内胚葉細胞に分化させる。特定の実施形態では、酸性条件とはＢＬＡＲ培地での培養である。酸性培地のｐＨは、６．８〜７．２の範囲であってよい。本発明の実施形態では、中腸内胚葉細胞は培地中で単層を形成する。実施形態では、中腸内胚葉細胞の単層は培養中維持される。
本発明の別の実施形態は、ヒト多能性幹細胞を中腸内胚葉細胞に分化させることと、分化した中腸内胚葉細胞を糖尿病患者に投与することと、を含む、糖尿病に罹っている、又は糖尿病発症のリスクがある患者を治療する方法である。実施形態では、糖尿病は１型又は２型である。実施形態では、細胞の投与は、治療部位への直接的又は間接的移植、注入、ないしは別の投与方法であってよい。いくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞は、皮下腔、網膜、肝臓、腎臓などの体内に移植される。更なる実施形態は、マクロ又はマイクロ封入デバイスによる封入などの、細胞の封入化送達を包含する。
本発明の更なる実施形態は、培養液中の胚体内胚葉細胞の原始腸管細胞への分化を誘導することを含む、中腸内胚葉細胞を産生する方法である。実施形態では、胚体内胚葉細胞を、アスコルビン酸及びＦＧＦ７を含む培地中で培養する。更なる実施形態では、原始腸管細胞は、レチノイン酸及びＢＭＰ２又はＢＭＰ４を含む培地中で培養される。原始腸管細胞は、中腸内胚葉細胞に分化する。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞は、酸性条件下（酸性培地）で中腸内胚葉細胞に分化する。特定の実施形態では、酸性条件とはＢＬＡＲ培地での培養である。酸性培地のｐＨは、６．８〜７．２の範囲であってよい。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、培地中で単層を形成し、その単層を維持する。
上記実施形態のそれぞれにおいて、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である。上記実施形態のそれぞれにおいて、中腸内胚葉細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現する。全ての実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５から選択される転写因子を発現する。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５から選択される転写因子を発現しない。上記実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５を発現する。上記実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５を発現しない。実施形態では、分化細胞の５０％超が中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現し、好ましくは分化細胞の６０％超が中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現し、より好ましくは７０％超、８０％超、及び９０％超が中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する。実施形態では、中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する分化細胞は、中腸内胚葉細胞である。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現する。全ての実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５から選択される転写因子を発現する。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５から選択される転写因子を発現しない。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＨＡＮＤ１を発現しない。
上記実施形態では、中腸内胚葉細胞集団は、実質的に中腸内胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞の集団は、７０％超の中腸内胚葉細胞、好ましくは８０％超、９０％超、及び９５％超の中腸内胚葉細胞を含む。いくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞の集団は、２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満の間葉細胞を含む。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＨＡＮＤ１の発現を欠いている。
上記本発明のいくつかの実施形態では、分化はｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される。他の実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで更に分化する。別の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで更に腸内分泌細胞に分化する、中腸内胚葉細胞に関する。腸内分泌細胞は、インクレチンホルモンを発現又は分泌する。実施形態では、インクレチンホルモンは、ＧＬＰ１及びＧＩＰである。
更なる実施形態では、中腸内胚葉細胞は、中腸内胚葉細胞の、最初に腸内分泌前駆細胞へ、最終的にはインクレチンを発現又は分泌する腸内分泌細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を高い効率で促進する小分子を同定するための出発物質として働く。
中腸内胚葉細胞の分化方法を示す。図１Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２；ＣＤＸ２、ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２；ＫＬＦ５、クルッペル様転写因子５；ＳＯＸ９、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ ９；ＰＤＸ１、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １；ＬＯ、低発現かつ低タンパク質量）を含む、分化方法の概要である。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３の間に、ＢＬＡＲ培地（「ＢＬＡＲ酸性培地」と互換的に使用される）中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９８±０．０５；Ｓ３Ｄ２、７．０２±０．０４；Ｓ３Ｄ５、７．１８±０．０３）（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びヒト結腸腺癌上皮細胞株（「Ｃａｃｏ−２」）（右）（分化の特徴の基準として使用した）の代表的な位相差画像を示す。Ｓ３Ｄ５における均一な形態が一貫して観察された。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（Ａｌｌｅｒｏｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、カタログ番号９００−００４）を用いて細胞数を確認すると、１つのｈＥＳＣが、４．５６±２．６０個のＳ３Ｄ５中腸内胚葉細胞に分化したことを示す（図１Ｄ）。 中腸内胚葉細胞の分化方法を示す。図１Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２；ＣＤＸ２、ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２；ＫＬＦ５、クルッペル様転写因子５；ＳＯＸ９、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ ９；ＰＤＸ１、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １；ＬＯ、低発現かつ低タンパク質量）を含む、分化方法の概要である。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３の間に、ＢＬＡＲ培地（「ＢＬＡＲ酸性培地」と互換的に使用される）中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９８±０．０５；Ｓ３Ｄ２、７．０２±０．０４；Ｓ３Ｄ５、７．１８±０．０３）（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びヒト結腸腺癌上皮細胞株（「Ｃａｃｏ−２」）（右）（分化の特徴の基準として使用した）の代表的な位相差画像を示す。Ｓ３Ｄ５における均一な形態が一貫して観察された。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（Ａｌｌｅｒｏｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、カタログ番号９００−００４）を用いて細胞数を確認すると、１つのｈＥＳＣが、４．５６±２．６０個のＳ３Ｄ５中腸内胚葉細胞に分化したことを示す（図１Ｄ）。 中腸内胚葉細胞の分化方法を示す。図１Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２；ＣＤＸ２、ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２；ＫＬＦ５、クルッペル様転写因子５；ＳＯＸ９、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ ９；ＰＤＸ１、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １；ＬＯ、低発現かつ低タンパク質量）を含む、分化方法の概要である。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３の間に、ＢＬＡＲ培地（「ＢＬＡＲ酸性培地」と互換的に使用される）中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９８±０．０５；Ｓ３Ｄ２、７．０２±０．０４；Ｓ３Ｄ５、７．１８±０．０３）（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びヒト結腸腺癌上皮細胞株（「Ｃａｃｏ−２」）（右）（分化の特徴の基準として使用した）の代表的な位相差画像を示す。Ｓ３Ｄ５における均一な形態が一貫して観察された。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（Ａｌｌｅｒｏｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、カタログ番号９００−００４）を用いて細胞数を確認すると、１つのｈＥＳＣが、４．５６±２．６０個のＳ３Ｄ５中腸内胚葉細胞に分化したことを示す（図１Ｄ）。 中腸内胚葉細胞の分化方法を示す。図１Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２；ＣＤＸ２、ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２；ＫＬＦ５、クルッペル様転写因子５；ＳＯＸ９、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ ９；ＰＤＸ１、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １；ＬＯ、低発現かつ低タンパク質量）を含む、分化方法の概要である。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３の間に、ＢＬＡＲ培地（「ＢＬＡＲ酸性培地」と互換的に使用される）中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９８±０．０５；Ｓ３Ｄ２、７．０２±０．０４；Ｓ３Ｄ５、７．１８±０．０３）（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びヒト結腸腺癌上皮細胞株（「Ｃａｃｏ−２」）（右）（分化の特徴の基準として使用した）の代表的な位相差画像を示す。Ｓ３Ｄ５における均一な形態が一貫して観察された。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（Ａｌｌｅｒｏｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、カタログ番号９００−００４）を用いて細胞数を確認すると、１つのｈＥＳＣが、４．５６±２．６０個のＳ３Ｄ５中腸内胚葉細胞に分化したことを示す（図１Ｄ）。 骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を利用する、転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の両方を含む、単層の中腸内胚葉細胞を発生させる分化方法を示す。図２Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様に、９０．０±５．８５パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。逆に、胚体内胚葉（ＤＥ−Ｓ１Ｄ３）細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２が共存していなかった（２．３±１．２）。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図２Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図２Ｃ）ことが示される。図２Ｄは、ＦＯＸＡ２陽性の原始腸内胚葉ステージであるＳ２Ｄ２（図２Ｄ−ｉ）の樹立後に、Ｓ３Ｄ２（図２Ｄ−ｉｉ）の間に徐々に増加し、Ｓ３Ｄ５（図２Ｄ−ｉｉｉ）において、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）に見られるのと同様のレベルに達するように、ＣＤＸ２タンパク質レベルが誘導され、ＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質が共存することを示す。ＣＤＸ２タンパク質は下列に示され、ＦＯＸＡ２タンパク質は上列に示される。各画像は、定量分析が可能になるように同一のパラメータを用いて撮影された。タンパク質発現をＦＡＣＳによって評価し、遺伝子発現をｑＰＣＲによって評価した。 骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を利用する、転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の両方を含む、単層の中腸内胚葉細胞を発生させる分化方法を示す。図２Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様に、９０．０±５．８５パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。逆に、胚体内胚葉（ＤＥ−Ｓ１Ｄ３）細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２が共存していなかった（２．３±１．２）。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図２Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図２Ｃ）ことが示される。図２Ｄは、ＦＯＸＡ２陽性の原始腸内胚葉ステージであるＳ２Ｄ２（図２Ｄ−ｉ）の樹立後に、Ｓ３Ｄ２（図２Ｄ−ｉｉ）の間に徐々に増加し、Ｓ３Ｄ５（図２Ｄ−ｉｉｉ）において、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）に見られるのと同様のレベルに達するように、ＣＤＸ２タンパク質レベルが誘導され、ＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質が共存することを示す。ＣＤＸ２タンパク質は下列に示され、ＦＯＸＡ２タンパク質は上列に示される。各画像は、定量分析が可能になるように同一のパラメータを用いて撮影された。タンパク質発現をＦＡＣＳによって評価し、遺伝子発現をｑＰＣＲによって評価した。 骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を利用する、転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の両方を含む、単層の中腸内胚葉細胞を発生させる分化方法を示す。図２Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様に、９０．０±５．８５パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。逆に、胚体内胚葉（ＤＥ−Ｓ１Ｄ３）細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２が共存していなかった（２．３±１．２）。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図２Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図２Ｃ）ことが示される。図２Ｄは、ＦＯＸＡ２陽性の原始腸内胚葉ステージであるＳ２Ｄ２（図２Ｄ−ｉ）の樹立後に、Ｓ３Ｄ２（図２Ｄ−ｉｉ）の間に徐々に増加し、Ｓ３Ｄ５（図２Ｄ−ｉｉｉ）において、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）に見られるのと同様のレベルに達するように、ＣＤＸ２タンパク質レベルが誘導され、ＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質が共存することを示す。ＣＤＸ２タンパク質は下列に示され、ＦＯＸＡ２タンパク質は上列に示される。各画像は、定量分析が可能になるように同一のパラメータを用いて撮影された。タンパク質発現をＦＡＣＳによって評価し、遺伝子発現をｑＰＣＲによって評価した。 骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を利用する、転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の両方を含む、単層の中腸内胚葉細胞を発生させる分化方法を示す。図２Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様に、９０．０±５．８５パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。逆に、胚体内胚葉（ＤＥ−Ｓ１Ｄ３）細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２が共存していなかった（２．３±１．２）。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図２Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図２Ｃ）ことが示される。図２Ｄは、ＦＯＸＡ２陽性の原始腸内胚葉ステージであるＳ２Ｄ２（図２Ｄ−ｉ）の樹立後に、Ｓ３Ｄ２（図２Ｄ−ｉｉ）の間に徐々に増加し、Ｓ３Ｄ５（図２Ｄ−ｉｉｉ）において、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）に見られるのと同様のレベルに達するように、ＣＤＸ２タンパク質レベルが誘導され、ＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質が共存することを示す。ＣＤＸ２タンパク質は下列に示され、ＦＯＸＡ２タンパク質は上列に示される。各画像は、定量分析が可能になるように同一のパラメータを用いて撮影された。タンパク質発現をＦＡＣＳによって評価し、遺伝子発現をｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 継続的な中腸内胚葉誘導を構成する追加の転写因子（ＴＦ）の転写レベル及びタンパク質レベルであるＳ３Ｄ５による誘導を示し、正しく中腸内胚葉が達成された。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共発現に加えて、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５（ホメオボックスＣ５）の共発現も示すが、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−ｂｏｘ２）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＰＴＦ１Ａ（膵臓特異的転写因子１ａ）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５）は発現していない。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図３Ｂ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、免疫蛍光（ＩＦ）分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図３Ｆ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５がＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。遺伝子発現はｑＰＣＲによって評価した。 分化しているＳ３Ｄ５細胞の増殖プロファイルの特徴である。図４Ａは、ＣＤＸ２タンパク質陽性細胞のほとんどの細胞周期が活性化されている（ＫＩ６７タンパク質との共発現によって示される）Ｃａｃｏ−２細胞（左）及び、経時的に減少したステージ３中のＨ１−ｈＥＳＣ由来細胞の増殖指標（Ｓ３Ｄ２−中；Ｓ３Ｄ５−右）を示す。ＣＤＸ２（上列）及びＫＩ６７（下列）のタンパク質レベルは、単一チャネル画像として示される。ＦＡＣＳによって評価された、総Ｓ３Ｄ５細胞中のＫＩ６７タンパク質陽性細胞の割合（総細胞は、＞９０％がＣＤＸ２陽性）は、Ｓ１Ｄ３（９７．３±１．３）及びＣａｃｏ−２細胞（９９．２±０．２）とは対称的に、１６．８±３．１２であった（図４Ｂ）。 分化しているＳ３Ｄ５細胞の増殖プロファイルの特徴である。図４Ａは、ＣＤＸ２タンパク質陽性細胞のほとんどの細胞周期が活性化されている（ＫＩ６７タンパク質との共発現によって示される）Ｃａｃｏ−２細胞（左）及び、経時的に減少したステージ３中のＨ１−ｈＥＳＣ由来細胞の増殖指標（Ｓ３Ｄ２−中；Ｓ３Ｄ５−右）を示す。ＣＤＸ２（上列）及びＫＩ６７（下列）のタンパク質レベルは、単一チャネル画像として示される。ＦＡＣＳによって評価された、総Ｓ３Ｄ５細胞中のＫＩ６７タンパク質陽性細胞の割合（総細胞は、＞９０％がＣＤＸ２陽性）は、Ｓ１Ｄ３（９７．３±１．３）及びＣａｃｏ−２細胞（９９．２±０．２）とは対称的に、１６．８±３．１２であった（図４Ｂ）。 ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２タンパク質が共存している中腸内胚葉細胞の単層を達成するための、ステージ３中のＢＭＰ４の代替としてのＢＭＰ２の使用を示す。図５Ａは、各ステージで添加された培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化のステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、及びＰＤＸ１ＬＯ）を含む、分化方法の概要である。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３全体の間に、ＢＬＡＲ培地中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９２；Ｓ３Ｄ２、７．０１；Ｓ３Ｄ５、７．２２）（図５Ｂ）。図５Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びＣａｃｏ−２細胞（右）の代表的な位相差画像を示し、Ｓ３Ｄ５における均一な形態が観察された。 ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２タンパク質が共存している中腸内胚葉細胞の単層を達成するための、ステージ３中のＢＭＰ４の代替としてのＢＭＰ２の使用を示す。図５Ａは、各ステージで添加された培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化のステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、及びＰＤＸ１ＬＯ）を含む、分化方法の概要である。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３全体の間に、ＢＬＡＲ培地中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９２；Ｓ３Ｄ２、７．０１；Ｓ３Ｄ５、７．２２）（図５Ｂ）。図５Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びＣａｃｏ−２細胞（右）の代表的な位相差画像を示し、Ｓ３Ｄ５における均一な形態が観察された。 ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２タンパク質が共存している中腸内胚葉細胞の単層を達成するための、ステージ３中のＢＭＰ４の代替としてのＢＭＰ２の使用を示す。図５Ａは、各ステージで添加された培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化のステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、及びＰＤＸ１ＬＯ）を含む、分化方法の概要である。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３全体の間に、ＢＬＡＲ培地中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９２；Ｓ３Ｄ２、７．０１；Ｓ３Ｄ５、７．２２）（図５Ｂ）。図５Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びＣａｃｏ−２細胞（右）の代表的な位相差画像を示し、Ｓ３Ｄ５における均一な形態が観察された。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞の発生を示す。ＩＦ画像については、全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネル画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様又はそれより多く、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、Ｓ３Ｄ５において誘導される、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）と同様のレベルに達していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。Ｃａｃｏ−２細胞（図６Ｆ）で見られるレベルまでのＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導、及び、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。中腸／後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）とは異なり、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５が、Ｓ３Ｄ５細胞内で誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。 分化しているＳ３Ｄ５細胞の増殖プロファイルの特徴である。ＣＤＸ２タンパク質陽性細胞のほとんどの細胞周期が活性化されている（ＫＩ６７タンパク質との共発現によって示される）Ｃａｃｏ−２細胞（左）と比較して、ステージ３中のＨ１−ｈＥＳＣ由来細胞の増殖指標が減少した（Ｓ３Ｄ５−右）。ＣＤＸ２（上列）及びＫＩ６７（下列）のタンパク質レベルは、単一チャネル画像として示される。ＦＡＣＳによって評価された、総Ｓ３Ｄ５細胞中のＫＩ６７タンパク質陽性細胞の割合（総細胞は、＞９０％がＣＤＸ２陽性）は、Ｓ１Ｄ３（９７．３±１．３）及びＣａｃｏ−２細胞（９９．２±０．２）とは対称的に、１４．１パーセントであった。 ＣＤＸ２＋細胞の不均一集団の誘導を示す。図８Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸／後腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＨＡＮＤ１）を含む、分化方法の概要である。図８Ｂは、Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞（上列、左）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１で２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、中）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び５００ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａで２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、右）、ＲＡ／ＢＭＰ４でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、左）、及び、ＲＡ／ＢＭＰ２でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、右）の、位相差画像を示す。２日間のコンディショニング後の遺伝子発現の誘導が、ＣＤＸ２については低レベルで示され（図８Ｃ）、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２については維持され（図８Ｄ）、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１については誘導される（図８Ｆ）。ＫＬＦ５は誘導されなかった（図８Ｅ）。 ＣＤＸ２＋細胞の不均一集団の誘導を示す。図８Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸／後腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＨＡＮＤ１）を含む、分化方法の概要である。図８Ｂは、Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞（上列、左）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１で２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、中）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び５００ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａで２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、右）、ＲＡ／ＢＭＰ４でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、左）、及び、ＲＡ／ＢＭＰ２でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、右）の、位相差画像を示す。２日間のコンディショニング後の遺伝子発現の誘導が、ＣＤＸ２については低レベルで示され（図８Ｃ）、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２については維持され（図８Ｄ）、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１については誘導される（図８Ｆ）。ＫＬＦ５は誘導されなかった（図８Ｅ）。 ＣＤＸ２＋細胞の不均一集団の誘導を示す。図８Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸／後腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＨＡＮＤ１）を含む、分化方法の概要である。図８Ｂは、Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞（上列、左）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１で２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、中）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び５００ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａで２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、右）、ＲＡ／ＢＭＰ４でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、左）、及び、ＲＡ／ＢＭＰ２でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、右）の、位相差画像を示す。２日間のコンディショニング後の遺伝子発現の誘導が、ＣＤＸ２については低レベルで示され（図８Ｃ）、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２については維持され（図８Ｄ）、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１については誘導される（図８Ｆ）。ＫＬＦ５は誘導されなかった（図８Ｅ）。 ＣＤＸ２＋細胞の不均一集団の誘導を示す。図８Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸／後腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＨＡＮＤ１）を含む、分化方法の概要である。図８Ｂは、Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞（上列、左）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１で２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、中）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び５００ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａで２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、右）、ＲＡ／ＢＭＰ４でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、左）、及び、ＲＡ／ＢＭＰ２でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、右）の、位相差画像を示す。２日間のコンディショニング後の遺伝子発現の誘導が、ＣＤＸ２については低レベルで示され（図８Ｃ）、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２については維持され（図８Ｄ）、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１については誘導される（図８Ｆ）。ＫＬＦ５は誘導されなかった（図８Ｅ）。 ＣＤＸ２＋細胞の不均一集団の誘導を示す。図８Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸／後腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＨＡＮＤ１）を含む、分化方法の概要である。図８Ｂは、Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞（上列、左）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１で２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、中）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び５００ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａで２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、右）、ＲＡ／ＢＭＰ４でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、左）、及び、ＲＡ／ＢＭＰ２でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、右）の、位相差画像を示す。２日間のコンディショニング後の遺伝子発現の誘導が、ＣＤＸ２については低レベルで示され（図８Ｃ）、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２については維持され（図８Ｄ）、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１については誘導される（図８Ｆ）。ＫＬＦ５は誘導されなかった（図８Ｅ）。 ＣＤＸ２＋細胞の不均一集団の誘導を示す。図８Ａは、各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸／後腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＨＡＮＤ１）を含む、分化方法の概要である。図８Ｂは、Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞（上列、左）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１で２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、中）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び５００ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａで２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、右）、ＲＡ／ＢＭＰ４でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、左）、及び、ＲＡ／ＢＭＰ２でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、右）の、位相差画像を示す。２日間のコンディショニング後の遺伝子発現の誘導が、ＣＤＸ２については低レベルで示され（図８Ｃ）、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２については維持され（図８Ｄ）、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１については誘導される（図８Ｆ）。ＫＬＦ５は誘導されなかった（図８Ｅ）。
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的システムに限定されるものではなく、これらは無論のこと変更可能であることは理解されるはずである。また、本明細書において使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明することを目的としたものに過ぎず、限定的なものではない点も理解されるはずである。
本発明は、中腸内胚葉細胞の発生に関する。細胞は、特定の培養順を用いて発生された。したがって、本発明は、多能性幹細胞由来の細胞を、中腸内胚葉細胞系統に特徴的なマーカー、例えばＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現している細胞に分化するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養法を提供する。本発明は更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養法によって、かかる細胞を単層で得て、維持するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、レチノイン酸及びＢＭＰ４又はＢＭＰ２又はそれらの類似体を含めると、中腸内胚葉細胞への分化を促進するために、分化している細胞中でＣＤＸ２を誘導し、ＦＯＸＡ２タンパク質の発現を維持するように作用するという発見に基づいている。ＣＤＸ２は、胚体内胚葉（ステージ１）又は原始腸管（ステージ２）においてはタンパク質レベルで発現していない。したがって、本発明は、多能性幹細胞を分化し、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現する中腸内胚葉を発生させる方法を提供する。
定義
特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に述べられるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の試験を実施するために使用することができるが、本明細書では好ましい材料及び方法について述べる。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
幹細胞は、単一細胞の、自己複製する能力、並びに自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するために分化する能力の双方によって定義される、未分化細胞である。幹細胞はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能細胞に分化する能力によって、並びに、移植後に複数の胚葉組織を生じさせる能力、及び胚盤胞内への注入後に、全部ではないが実質的にほとんどの組織に寄与する能力によっても、特徴付けられる。
幹細胞は、その発生能に応じて、（１）全能性、（２）多分化能性、（３）複能性、（４）少能性、及び（５）単能性に分類される。全能細胞は、全ての胚細胞型及び胚体外細胞型を生じさせることが可能である。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。複能性細胞は、細胞系統のサブセットを生じさせることが可能であるが、全てが、特定の組織、器官、又は生理系の範囲内であるものを含む（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣを含む子孫（自己複製）、血球に制限された少能性前駆細胞、並びに血液の正常成分である全ての細胞型及び要素（例えば、血小板）を産生することができる）。少能性の細胞は、複能性幹細胞よりも制限された、細胞系統のサブセットを生じさせることができ、単能性の細胞は、単一の細胞系統を生じさせることができる（例えば、精原幹細胞）。
幹細胞はまた、それらの幹細胞を得ることができる供給源に基づいても分類される。成体幹細胞は、全般的には、複数の分化細胞型を含む組織内に見出される、多分化能性の未分化細胞である。成体幹細胞は、自己複製することができる。通常の状況下では、成体幹細胞はまた、その細胞が起源とする組織の、特殊化した細胞型、また恐らくは他の組織型を産生するように、分化することもできる。誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、多能性幹細胞に変換された成熟細胞である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００６；１２６（４）：６６３〜６７６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００７；１３１：１〜１２）。胚幹細胞は、胚盤胞期の胚の内部細胞塊からの、多能性細胞である。胎生幹細胞は、胎児組織又は胎膜を起源とする幹細胞である。
胚組織は、典型的には、胚（ヒトの場合、受精から、約６週間の発達までの期間を指す）を起源とする組織として定義される。胎児組織は、ヒトでは約６週間の発達から分娩までの期間を指す、胎児に由来する組織を指す。胚体外組織は、胚又は胎児に関連するが、胚又は胎児を起源とはしない組織である。胚体外組織としては、胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、及び尿膜）、臍帯、並びに胎盤（それ自体は、絨毛膜及び母体基底脱落膜から形成される）が挙げられる。
分化は、特殊化されていない（「コミットされていない」）細胞、又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、腸管細胞又は膵臓細胞などの、特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「コミットされた」）状態を呈している細胞である。コミットされたという用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下では、特定の細胞型又は細胞型のサブセットへと分化を継続して、通常の状況下では、異なる細胞型へと分化することも、又はより未分化の細胞型に復帰することもできない地点まで、分化経路が進行している細胞を指す。脱分化とは、細胞が、細胞の系統の範囲内で、比較的特殊化されて（又はコミットされて）いない状態に復帰するプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、即ち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞の系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。
広義には、前駆細胞は、それ自体よりも分化した子孫を作り出す能力を有し、かつ前駆細胞のプールを補充する能力を更に保持する細胞である。その定義によれば、幹細胞自体もまた、より直接的な、最終分化細胞への前駆体であるため、前駆細胞である。より狭義には、前駆細胞は、分化経路での中間体である細胞として定義される場合が多く、即ち、前駆細胞は、幹細胞から生じるものであり、成熟細胞型又は細胞型のサブセットを産生する際の中間体である。この型の前駆細胞は、全般的には、自己複製が不可能である。したがって、このタイプの細胞が本明細書で言及される場合には、その細胞は、非複製前駆細胞、又は中間的前駆細胞若しくは中間的前駆細胞と称される。
本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。これに関して、差異的発現とは、未分化細胞と比べて、陽性マーカーについては増殖したレベルを意味し、陰性マーカーについては減少したレベルを意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。とりわけ、蛍光活性フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）による陽性は通常２％を超えるが、ＦＡＣＳによる陰性閾値は通常１％を下回る。
本明細書で使用するとき、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）による陽性は、２８サイクル（Ｃｔｓ）未満であり、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）を用いると、３３Ｃｔｓ未満であり、一方、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙ（登録商標）による陰性は、２８．５サイクルを超え、ＴＬＤＡによる陰性は３３．５Ｃｔｓを超える。
静的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において、多能性幹細胞を機能的中腸内胚葉細胞に分化するため、分化プロセスは、連続ステージを通じて進行すると見られる場合が多い。このとき、中腸内胚葉への分化工程は３つのステージで発生する。この段階的進行では、「ステージ１」は、分化プロセスの第１の工程、多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（以下、代替的に「ステージ１細胞」と称する）への分化を指す。「ステージ２」は、第２の工程、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（以下、代替的に「ステージ２細胞」と称する）への分化を指す。「ステージ３」は、第３の工程、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、中腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞（以下、代替的に「ステージ３細胞」と称する）への分化を指す。
しかしながら、特定集団の全ての細胞がこれらのステージを同じ速度で進行するとは限らないことに留意されたい。結論として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において、特に後期分化ステージでは、集団に存在する細胞の大半よりも分化経路を進行していなかったり、大半よりも進行しいていたりする細胞の存在を検出することは稀ではない。本発明を例証する目的で、上で特定されたステージと関連した様々な細胞型の特徴が本明細書に記載される。
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉細胞」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保有している細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＦＯＸＡ２（肝細胞核因子３−β（「ＨＮＦ３−β」）としても知られる）、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ブラキュリ、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１のうちの少なくとも１つを発現する。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーには、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７が挙げられる。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７の発現で特徴付けられ得る。加えて、細胞がステージ１に留まることができる時間の長さに応じて、ＨＮＦ４αにおける増加が観察され得る。
「原始腸管細胞」は、本明細書で使用するとき、胚体内胚葉由来の、肺、肝臓、膵臓、胃、及び腸などの全ての内胚葉器官を生じ得る内胚葉細胞を指す。原始腸管細胞は、胚体内胚葉細胞によって発現されたものに対するＨＮＦ４αの実質的に増加した発現で特徴付けられ得る。
「前腸内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、膀胱、及び十二指腸の最も前方の部分を生じる内胚葉細胞を指す。前腸内胚葉細胞は、とりわけ、ＳＯＸ２、ＰＤＸ１、ＡＬＢ、ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２の発現で特徴付けられ得る。
「中腸内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、小腸を生じる内胚葉細胞を指す。中腸内胚葉細胞は、ＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２の発現、及びＰＤＸ１の低発現（ＰＤＸ１ＬＯ）で特徴付けられ得る。特定のＨＯＸ遺伝子の発現により、中腸内胚葉と後腸内胚葉との差を区別できる。例えば、ＨＯＸＣ５は、中腸内胚葉細胞に優先的に発現される。
「後腸内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、大腸を生じる内胚葉細胞を指す。後腸内胚葉細胞は、ＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＤ１３の発現で特徴付けられ得る。
本明細書で使用するとき、「間葉細胞」は、骨、軟骨、リンパ管、及び循環系などの結合組織を生じる中胚葉細胞を指す。ＨＡＮＤ１及びＦＯＸＦ１の発現は、間葉細胞を決定する。
「患者」又は「対象」又は「宿主」という用語は、組成物、つまり医薬組成物で治療される、又は本明細書で説明される方法に従って治療される、哺乳類などの動物、好ましくはヒトを指す。
用語「有効量」又はその同等用語は、ヒト多能性幹細胞の、分化した細胞集団、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、中腸内胚葉、後腸内胚葉、膵内胚葉などに促進かつ分化するのに十分な、成長因子が挙げられるがこれらに限定されない薬剤又は化合物の量を指す。
用語「投与する」及び「投与」は、本明細書で代替的に使用され、細胞が、治療部位に直接的又は間接的に移植（implanted）、注入、移植（transplanted）、ないしは別の方法で投与され得ることを意味する。細胞が半固体又は固体デバイス中で投与されるとき、移植、特に、皮下腔、網膜、肝臓、腎臓（腎被膜）などの体内の正確な位置への外科的移植が好適な送達手段である。液体又は流体医薬組成物は、より一般的な位置に投与してもよい。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について特に明らかに断らない限り、複数の指示対象を含むものである。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
本明細書で使用するとき、量、時間の長さなどの測定可能な値に関して使用する「約」という用語は、指定値から±２０％〜±０．１％、好ましくは±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．５％、±０．１％の変動を包含することを意味する。このような、特定の値から０．０５％又は０．０１％の変動は、開示される方法を実施するうえで適切なものである。
以下の略語は、明細書及び特許請求の範囲全体で使用され得る。
ＡＢＣＧ２−ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ、メンバー２；
ＡＬＢ−アルブミン；
ＢＭＰ−骨形成タンパク質；
ＣＤＸ２−ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２；
ＣＸＣＲ４−Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４型：
ＦＡＦ−ＢＳＡ−脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン
ＦＧＦ−線維芽細胞増殖因子；
ＦＯＸＡ２−Ｆｏｒｋｈｅａｄ Ｂｏｘ Ａ２；
ＧＡＴＡ４−ＧＡＴＡ結合タンパク質４；
ＧＤＦ−増殖分化因子；
ＧＩＰ−グルコース依存性インスリン分泌ポリペプチド；
ＧＬＰ−１−グルカゴン様ペプチド１；
ＧＳＫ３Ｂ−グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β；
ＨＡＮＤ１−ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ １；
ＨＯＸ−ホメオボックス；
ｈＴＥＲＴ−ヒトテロメラーゼ逆転写酵素；
ＫＬＦ−クルッペル様転写因子；
ＬＧＲ５−ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５；
ＭＩＸＬ１−Ｍｉｘ Ｐａｉｒｅｄ様ホメオボックス−１；
ＯＣＴ４−オクタマー結合転写因子４；
ＯＴＸ２−ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２；
ＰＤＸ１−ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １；
ＰＴＦ１Ａ−膵臓特異的転写因子１ａ；
ＳＯＸ−性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ｂｏｘ；
ＴＲＡ１−６０−Ｔ細胞受容体α−１−６０；
ＵＴＦ１−未分化胚細胞転写因子１；
ＷＮＴ３Ａ−ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅファミリー、メンバー３Ａ；及び
ＺＦＰ４２−ジンクフィンガータンパク質４２。
詳細な説明
多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉の全ての細胞に分化する能力を有している。使用が可能な多能性幹細胞の例示の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織を含む、多能性細胞の樹立株が挙げられる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）などである。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を使用して、成体体細胞から誘導されるｉＰＳ、つまり再プログラム化された多能性細胞（ＡａＡｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２０１１，１２：１６５〜１８５；更に、ｉＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６も参照）も使用できる。本発明の方法で使用されるヒト胚性幹細胞もまた、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記載されるように調製され得る（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）などの変異体ヒト胚性幹細胞株、又はＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）に開示されている細胞などのヒト成体細胞に由来する細胞を使用することもできる。ある特定の実施形態では、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９，２００９）；Ｍａｈｅｒａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：５５〜７０，２００７）；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：２３０〜２４０）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１〜１０６，２００８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）；及び米国特許出願公開第２０１１／０１０４８０５号に記載され得方法に従って誘導され得る。ある特定の実施形態において、多能性幹細胞は、非胎生起源であり得る。これらの参考文献、特許、及び特許出願の全ては、とりわけそれらが多能性細胞の単離、培養、増殖、及び分化に関するため、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
多能性幹細胞は、様々なステージを通じて分化し、各々が特定のマーカーの存在又は非存在で特徴付けられ得る。これらのステージへの細胞の分化は、培養培地に添加されるある特定の因子の存在又は欠失を含む、特異的培養条件によって達成される。一般に、この分化は、本明細書でステージ１と称する、多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化を含み得る。次に、これらの胚体内胚葉細胞は、本明細書でステージ２と称する、原始腸管細胞へと更に分化し得る。続いて、原始腸管細胞は、本明細書でステージ３と称する、中腸内胚葉細胞へと分化し得る。
多能性幹細胞の、中腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
多能性幹細胞の特性は当業者には周知であり、多能性幹細胞の更なる特性が引き続き同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、ＡＢＣＧ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうち１つ又は２つ以上の発現が挙げられる。
例示的な多能性幹細胞として、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。また、多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も好適である。
胚体内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞もまた、本発明における使用に適している。本発明の一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
中腸内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞もまた、本発明における使用に適している。本発明の一実施形態では、中腸内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、細胞がＦＯＸＡ２及びＣＤＸ２を発現している中腸内胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、ＨＯＸＡ１３又はＬＧＲ５を発現していない。実施形態では、中腸内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、細胞がＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５の各々を発現している中腸内胚葉細胞である。実施形態では、中腸内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、細胞がＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５をいずれも発現していない中腸内胚葉細胞である。
本発明は、細胞培養条件及び培地を使用する、多能性幹細胞の、中腸内胚葉細胞への段階的な分化誘導を提供する。本発明の実施形態では、中腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に到達するため、多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞及び人工多能性細胞から始めるプロトコールが採用される。このプロトコールは、以下のステージを含む。
ステージ１：細胞培養株から得られる胚性幹細胞などの多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導するように適切な因子で処理する。
ステージ２：ステージ１から得た細胞を、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への更なる分化を誘導するように適切な因子で処理する。
ステージ３：ステージ２から得た細胞を、中腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への更なる分化を誘導するように適切な因子で処理する。
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらの方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及びイムノアッセイ（例えば、材料切片の免疫組織化学的分析）、ウェスタンブロット、並びに無傷細胞内でアクセス可能なマーカーの場合、ＦＡＣＳ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。分化の効率は、処理した細胞集団を、対象とする細胞型に特徴的なマーカーを発現している細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤（例えば、抗体など）に暴露することにより測定することができる。
１．多能性幹細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
多能性幹細胞は、当技術分野において既知の任意の方法により、又は本発明で提案される任意の好適な方法により、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。本発明の一実施形態では、多能性幹細胞を、ＧＤＦ８及びＧＳＫ３β阻害剤などの因子（例えば、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１号に開示される、環状アニリン−ピリジノトリアジン化合物）を添加したＭＣＤＢ−１３１培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの培地で処理し、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化を誘導する。スタウロスポリンなど広範なＧＳＫ３β阻害剤、好ましいＧＳＫ３β阻害剤（本明細書で「ＭＣＸ化合物」と称される、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン）が存在する。処理は、多能性幹細胞を、約１０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を添加した培地と接触させることを含み得る。この処理はまた、細胞を、約０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭ、代替的に約０．５〜約２．５μＭ、好ましくは約１．５μＭ又は約１．０μＭのＭＣＸ化合物と接触させることも含み得る。その他培地の構成成分として、約２．７ｇ／１０００ｍＬ〜３．６ｇ／１０００ｍＬ、好ましくは２．７ｇ／１０００ｍＬの重炭酸ナトリウム；約０．１％〜２．０％、好ましくは約０．５％のＦＡＦ−ＢＳＡ；１：１００（「１×濃度」）に希釈したＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；及び、１０ｍＭ濃度のＤ−グルコースを得るための、約２ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは４．５ｍＭのＤ−グルコースを含んでよい。
多能性細胞は、胚体内胚葉細胞への分化を促進するため、約２〜５日間、好ましくは３〜４日間培養されてよい。一実施形態では、多能性細胞は、有効量のＴＧＦβシグナル伝達分子及び／又はＧＳＫ３β阻害剤の存在下、例えば、有効量のＧＤＦ８及びＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及びより低い濃度のＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物の非存在下で１日培養される。具体的には、細胞は、ＧＤＦ８及び約１．５μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及び約０．１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物の非存在下で１日培養されてよい。代替的な実施形態では、細胞は、ＧＤＦ８及び約１．５μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及び約０．１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養されてよい。
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の発生は、以下の特定のプロトコールの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞が胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカー、例えばＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７を発現し始めた際に検出され得る。実施形態では、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
２．胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化され得る。一実施形態では、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７を含有するＭＣＤＢ−１３１などの培地で培養し、これらの細胞を分化させることを含む。例えば、培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬ〜約７５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を含んでよい。細胞は、これらの条件下で約２〜３日間、好ましくは約２日間培養され得る。
別の実施形態では、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）と共に培養することを含む。ＭＣＤＢ−１３１などの培地は、約０．１ｍＭ〜約１．０ｍＭのアスコルビン酸、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１．０ｍＭ、代替的には約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ、代替的には約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を含んでよい。また培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７も含んでよい。例えば、培地は、約０．２５ｍＭのアスコルビン酸及び約５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を含んでよい。その他培地の構成成分として、約２．７ｇ／１０００ｍＬ〜３．６ｇ／１０００ｍＬ、好ましくは２．７ｇ／１０００ｍＬの重炭酸ナトリウム；約０．１％〜２．０％、好ましくは約０．５％のＦＡＦ−ＢＳＡ；１：１００（「１×濃度」）に希釈したＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；及び、１０ｍＭ濃度のＤ−グルコースを得るための、約２ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは４．５ｍＭのＤ−グルコースを含んでよい。一実施形態では、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＦＧＦ７及びアスコルビン酸で２日間処理される。胚体内胚葉細胞の分化は、細胞が原始腸管細胞に特徴的なマーカーの発現、例えばＦＯＸＡ２の発現及びＨＮＦ４αの発現増加を始めた際に検出され得る。実施形態では、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始腸管である。
３．原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞の、中腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化
原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、中腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化できる。一実施形態では、原始腸管細胞を、レチノイン酸及びＢＭＰ４又はＢＭＰ２を添加したＢＬＡＲ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの培地中で培養することにより、中腸内胚葉細胞に更に分化させる。好ましい実施形態では、培地に、約０．５μＭ〜約５μＭのレチノイン酸、好ましくは約１μＭと、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４又はＢＭＰ２、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４又はＢＭＰ２を添加する。培地へのその他の添加成分として、約０．１％〜２．０％、好ましくは約０．５％のＦＡＦ−ＢＳＡ；ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；及び、１０ｍＭ濃度のＤ−グルコースを得るための、約２ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは４．５ｍＭのＤ−グルコースを含んでよい。一実施形態では、原始腸管細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＢＭＰ４又はＢＭＰ２及びレチノイン酸で、３〜５日間、好ましくは５日間処理される。培地のｐＨは、５日間のステージ３コンディショニング期間中、６．８〜７．２の範囲であってよい（７．３以上であるＳ２Ｄ２での通常ｐＨと比べて）。
本発明は、中腸内胚葉細胞を発生させるために選択された培地中でヒト多能性幹細胞を培養することによる、中腸内胚葉細胞集団の産生方法に関する。実施形態では、この方法は、ヒト多能性幹細胞の、段階的プロセスでの中腸内胚葉細胞への分化を誘導する。実施形態では、中腸内胚葉細胞集団が産生される。いくつかの実施形態では、実質的に中腸内胚葉細胞集団が産生される。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、平面培養において単層を形成し、その単層を維持する。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、培地中で単層として安定である。本明細書で、単層として安定、又は単層として安定のままである細胞とは、培養液中でスフェロイドを形成しない単層細胞を指す。
実施形態では、分化細胞の５０％超が、中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する。実施形態では、分化細胞の６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、又は９５％超が、中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する。実施形態では、中腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する分化細胞は、中腸内胚葉細胞である。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＦＡＣＳ分析及びｑＰＣＲによって測定するとき、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現する。いくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＩＦ分析及びｑＰＣＲによって測定するとき、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５から選択される転写因子を発現する。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＩＦ分析及びｑＰＣＲによって測定するとき、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、並びにｑＰＣＲによって測定するとき、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５から選択される転写因子を発現しない。
本発明の更なる実施形態は、培養液中の胚体内胚葉細胞の原始腸管細胞への分化を誘導することを含む、中腸内胚葉細胞を産生する方法である。実施形態では、胚体内胚葉細胞は、アスコルビン酸及びＦＧＦ７を含む培地中で培養される。更なる実施形態では、原始腸管細胞は、レチノイン酸及びＢＭＰ２又はＢＭＰ４を含む培地中で培養される。原始腸管細胞は、中腸内胚葉細胞に分化する。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞は、酸性条件下（酸性培地）で中腸内胚葉細胞に分化する。特定の実施形態では、酸性条件とはＢＬＡＲ培地中での培養である。酸性培地のｐＨは、原始腸管細胞から中腸内胚葉細胞への５日間の分化コンディショニング期間中、６．８〜７．２の範囲であってよい（７．３以上であるＳ２Ｄ２での通常ｐＨと比べて）。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、培地中で単層を形成し、その単層を維持する。
本明細書に記載される実施形態のそれぞれにおいて、ヒト多能性幹細胞は、ｈＥＳＣ又はｉＰＳ細胞である。上記かつ本明細書に記載される実施形態のそれぞれにおいて、中腸内胚葉細胞は、ＦＡＣＳ分析及びｑＰＣＲによって測定するとき、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現する。全ての実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＩＦ分析及びｑＰＣＲによって測定するとき、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５から選択される転写因子を発現する。上記かつ本明細書に記載される実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＩＦ分析及びｑＰＣＲによって測定するとき、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、並びにｑＰＣＲによって測定するとき、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５から選択される転写因子を発現しない。上記かつ本明細書に記載される実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＩＦ分析及びｑＰＣＲによって、ＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５を発現する。実施形態のそれぞれにおいて、中腸内胚葉細胞は、ＩＦ分析及びｑＰＣＲによって測定するとき、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａを、並びにｑＰＣＲによって測定するとき、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５を発現しない。
上記かつ本明細書に記載される分化プロトコールの結果として、特定の培地成分及び培養条件、特に、ＢＬＡＲ培地中での培養などの酸性培養条件を用いて、中腸内胚葉細胞のマーカーを発現している培養細胞が産生され、ｑＰＣＲによって測定するとき、この細胞は、中胚葉／間葉細胞系統のマーカーであるＨＡＮＤ１の発現を欠いている。多能性幹細胞を中腸／後腸内胚葉系統に誘導するための分化プロトコールを、例えば原始腸管細胞ステージ２ではなく胚体内胚葉ステージ１において幹細胞を誘導するように変更すると、ｑＰＣＲによって測定するときＨＡＮＤ１を発現している、内胚葉−間葉ＣＤＸ２＋中腸／後腸細胞の混合集団が得られる。
特定の実施形態では、中腸内胚葉細胞集団は、実質的に中腸内胚葉細胞である。いくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞の集団は、７０％超の中腸内胚葉細胞、好ましくは８０％超、９０％超、及び９５％超の中腸内胚葉細胞を含む。いくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞の集団は、２０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満の間葉細胞を含む。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ＨＡＮＤ１の発現を欠いている。
分化した中腸内胚葉細胞の使用
本発明の別の実施形態では、分化した中腸内胚葉細胞を単独で、又は分化した、つまり成熟した内分泌細胞、例えば腸内分泌細胞と組み合わせて、糖尿病に罹っている、又は糖尿病発症のリスクがある患者の治療に使用できる。かかる実施形態では、分化した中腸内胚葉細胞又はそれらの混合物を、糖尿病、例えば１型又は２型糖尿病の患者に投与してもよい。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、腸内分泌細胞に分化して成熟する。実施形態では、中腸内胚葉細胞は、腸内分泌細胞に分化して成熟し、腸内分泌細胞はインクレチン型ホルモンを発現又は分泌する。実施形態では、インクレチンホルモンとして、ＧＬＰ１及びＧＩＰが挙げられる。細胞の投与は、体内への移植又は注入、特に皮下腔、網膜、肝臓、腎臓などへの移植によるものであってよい。
上記本発明のいくつかの実施形態では、中腸内胚葉細胞の分化がｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される。他の実施形態では、中腸内胚葉細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで更に分化し成熟する。別の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで腸内分泌細胞に、又はｉｎ ｖｉｖｏで腸内分泌細胞の混合物に更に分化する、中腸内胚葉細胞に関する。かかる腸内分泌細胞は、インクレチンホルモンを発現又は分泌する。実施形態では、腸内分泌細胞が分泌するインクレチンホルモンは、ＧＬＰ１及びＧＩＰである。
更なる実施形態では、中腸内胚葉細胞は、中腸内胚葉細胞型の、最初に腸内分泌前駆細胞へ、次にインクレチンを発現又は分泌する腸内分泌細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を高い効率で促進する小分子を同定するための出発物質として働く。
細胞及び細胞集団及び本明細書に記載されるものなどの混合物をマイクロ又はマクロ封入化した後、哺乳類の宿主に移植してもよい。封入細胞又は細胞単独を、皮下又は体内のいずれかの場所に移植（投与）することができ、それによって細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで血管形成され、分化した成熟することができる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考察することによって更に理解され得る。
（実施例１）
ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２が共存／共発現している中腸内胚葉細胞集団の産生方法
以下の実施例は、ヒト胚性幹細胞（「ｈＥＳＣ」）から中腸内胚葉細胞を発生させるための分化誘導法について記載する。「中腸内胚葉」は、マウスの発生中の胎生期約８．５日（「Ｅ８．５」）、又は、ヒト胚発生中の約３〜４週の時点で存在するＣＤＸ２陽性かつＦＯＸＡ２陽性の内胚葉細胞である、対応するｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕ細胞型タイプを指す。
材料及び方法
細胞培養：ＥＺ８培地（カタログ＃Ａ１５１６９０１ Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した、継代数２８のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞（「Ｈ１−ｈＥＳＣ」）（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を、０．０９４×１０６個／ｃｍ２の単一細胞として、１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、カタログ＃３５６２３１）をコーティングしたディッシュで、以下を含むダルベッコ変性イーグル培地栄養素混合液Ｆ−１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号１１３３０−０３２）中に播種した。
播種から４８時間後、培養物を不完全ＰＢＳ（マグネシウム又はカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号１４１９０）で洗浄した。Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｙ化合物）は、培養の最初の２４時間のみ使用した。
分化：以下のプロトコールを用いて培養物を分化させた。プロトコールのステージ１〜３の間、培養物を平面付着培養上で維持した。ただし、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号などの他のものでは、懸濁培養を用いる分化について記載されており、本明細書に記載されるプロトコールを変更し、大規模製造の可能性をもたらす懸濁で実施することができる。以下の表記であるＳ＃Ｄ＃は、ステージ１〜３の間の実際の時点を示す。例えば、Ｓ１Ｄ３は、１ステージの３日目である。簡潔に言えば、各ステージは、胚体内胚葉（ステージ１）、原始腸管（ステージ２）、及び中腸内胚葉（ステージ３）への分化と定義する。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を、以下のステージ１培地で１日間培養した。
続いて翌日は、細胞を以下の培地で培養した。
続いて翌日は、細胞をＭＣＸ化合物を含まない２日目と同じ培地中で培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：細胞を以下の培地で２日間処理した。
ｃ．ステージ３（５日間）：細胞をＢＬＡＲ００１特注培地で５日間処理した。
図１Ａ〜４Ｂ（ＢＭＰ４）、図５Ａ〜７（ＢＭＰ２）に示されるように、ＢＭＰ４又はＢＭＰ２のいずれかを本発明の方法のステージ３の間に用いて、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２タンパク質が共存している単層の中腸内胚葉細胞を実現できる。
分化細胞の定量：共局在化して存在しているタンパク質の定量には、Ｓ３Ｄ５細胞を回収し、ＦＡＣＳにより分析した。ＦＡＣＳ染色は、表ＩＩに記載される抗体を用いて、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれるＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３に記載されるように実施した。簡潔に言うと、分化細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号１２６０４）中で５〜１０分間３７℃でインキュベートし、単一細胞懸濁液へと放出した後、それらを０．２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳの染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号５５４６５７）で２回洗浄した。細胞内抗体染色は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ紫色蛍光反応染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号Ｌ３４９５５）を４℃で３０分間用いて、続いて冷ＰＢＳで１回洗浄することによって達成した。細胞の固定は、３００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号５５４７２３）と、続いてＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号５５４７２２）で２回洗浄することにより行った。続いて、細胞を適切な抗体と共に４℃で３０分間（非結合抗体）又は１時間（結合抗体）インキュベートした後、２回洗浄し、その後、獲得される事象を少なくとも３０，０００にしてＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用い、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。ＦＡＣＳ分析中、非生細胞は除外し、ゲーティングはアイソタイプ抗体（「ＩｇＧ」）を用いて決定した。ＩｇＧ ＦＡＣＳデータは、示される各ＦＡＣＳ実験で上側の図として示す。抗体の特異性は、Ｃａｃｏ−２細胞などの陽性対照、又はＳ１Ｄ３胚体内胚葉（「ＤＥ」）細胞などの陰性対照を用いて検査した。
様々なステージにおけるタンパク質の共局在化の定量には、Ｃａｃｏ−２、Ｓ２Ｄ２、Ｓ３Ｄ２及びＳ３Ｄ５細胞を単層として回収し、免疫蛍光法（「ＩＦ」）により分析した。ＩＦ像で見られる形態は、付着培養の単層の細胞を掻き取る方法が原因であることに留意されたい。Ｈ１−ｈＥＳＣ由来細胞を、表ＩＩＩに記載される抗体を用いて、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３に記載されるように調製し、染色した。凍結切片作製のため、細胞をＰＢＳで洗浄した後、４℃の４％ＰＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号１５８１２７）中で一晩固定した。固定後、４％ＰＦＡを除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、４℃の３０％スクロース溶液（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ、カタログ番号０３３５）中で一晩インキュベートした。これらのサンプルを試料は、ＯＣＴ溶液（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号４５８３）中で凍結保存し、５μｍの切片を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＬＬＣ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ、カタログ番号４８３１１〜７０３）に置いた。ＩＦ染色には、一次抗体を適切に希釈して４℃で一晩加え、一方二次抗体は室温で３０分間加えた後に、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｔａｉｎ封入試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号Ｈ−１２００）を加えた。Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて切片を可視化した。
様々なステージにおける遺伝子発現の定量には、Ｃａｃｏ−２、Ｈ１−ｈＥＳＣ、Ｓ１Ｄ３、Ｓ２Ｄ２、Ｓ３Ｄ２及びＳ３Ｄ５細胞を、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３に記載されるように回収した。簡潔に言えば、遺伝子発現を、特注のＴａｑｍａｎ（登録商標）アレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて細胞内で評価するものであるが、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙ（登録商標）（ＯＡ）は、ＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａに使用し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ）は、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５、及びＬＧＲ５に使用し、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨは両方で使用した。配列検出用ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてデータを解析し、ΔΔＣｔ法を用いて、未分化Ｈ１−ｈＥＳＣに対してハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨを用いて補正した。プライマーの詳細は、表ＩＶに示す。
結果
各ステージで添加された重要な培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、及びＰＤＸ１ＬＯ）を含む、分化方法の概要を図１Ａに示す。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３全体の間に、ＢＬＡＲ培地中で、ＢＬＡＲ培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９８±０．０５；Ｓ３Ｄ２、７．０２±０．０４；Ｓ３Ｄ５、７．１８±０．０３）（図１Ｂ）。ステージ３の５日間の間、培養液のｐＨは約６．８〜７．２の範囲であってよい。図１Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びヒト結腸腺癌上皮細胞株（「Ｃａｃｏ−２」）（右）（分化の特徴の基準として使用した）の代表的な位相差画像を示す。Ｓ３Ｄ５における均一な形態が観察された。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（Ａｌｌｅｒｏｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、カタログ番号９００−００４）を用いて細胞数を確認すると、１つのｈＥＳＣが、４．５６±２．６０個のＳ３Ｄ５後腸内胚葉細胞に分化したことを示す（図１Ｄ）。
ＢＭＰ４を利用する分化方法は、転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の両方をそれぞれ含む、単層の中腸内胚葉細胞を効率的に発生させ、維持する。図２Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で観察される割合（８６．０±６．６７）と同様に、９０．０±５．８５パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。逆に、胚体内胚葉（ＤＥ−Ｓ１Ｄ３）細胞は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２が共存していなかった（２．３±１．２）。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図２Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図２Ｃ）ことが示される。図２Ｄは、ＦＯＸＡ２陽性の原始腸内胚葉ステージであるＳ２Ｄ２（図２Ｄ−ｉ）の樹立後に、Ｓ３Ｄ２（図２Ｄ−ｉｉ）の間に徐々に増加し、Ｓ３Ｄ５（図２Ｄ−ｉｉｉ）において、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）に見られるのと同様のレベルに達するように、ＣＤＸ２タンパク質レベルが誘導され、ＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質が共存することを示す。ＣＤＸ２タンパク質は下列に示され、ＦＯＸＡ２タンパク質は上列に示される。
継続的な中腸内胚葉誘導を構成する、追加のＴＦの転写レベル及びタンパク質レベルは、Ｓ３Ｄ５において見られる。図３Ａ〜３Ｐは、正常な中腸内胚葉が得られたことを示す。ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２の共存に加え、Ｓ３Ｄ５細胞は、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５、ＨＯＸＣ５の共存も示したが、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、及びＬＧＲ５は発現しなかった。全てのＴＦのタンパク質の存在が、別々の単一チャネル画像に示される。図３Ａ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９８．７±０．２５パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。ＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導は、Ｃａｃｏ−２細胞で観察されるのと匹敵するレベルであり（図３Ｂ）、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図３Ｃ）。６９．４±１４．２パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図３Ｄ−下）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号）（図３Ｅ）と比較して低いレベルで誘導され、ＩＦ分析での低レベル〜存在しないタンパク質を反映した（図３Ｆ）。
Ｓ３Ｄ５細胞は、前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２を発現せず、Ｓ３Ｄ５細胞の１．４５±０．１５のみがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図３Ｇ−下；図３Ｉ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図３Ｈ）に見られるレベルより低かった。後腸内胚葉の正常な発達に必須であるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で上方制御されていた（図３Ｊ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図３Ｋ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図３Ｌ）及びタンパク質の存在（図３Ｍ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。同様に、膵臓系列のマーカーであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は、膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図３Ｎ）と比較して、Ｓ３Ｄ５細胞では誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５は、Ｓ３Ｄ５細胞内で強く誘導された（図３Ｏ）。図３Ｐは、マウスの妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。図３Ｑは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図３Ｐ）。
図４Ａ〜４Ｂは、分化しているＳ３Ｄ５細胞の増殖プロファイルを示す。図４Ａは、ＣＤＸ２タンパク質陽性細胞のほとんどの細胞周期が活性化されている（ＫＩ６７タンパク質との共発現によって示される）Ｃａｃｏ−２細胞（左）及び、経時的に減少したステージ３中のＨ１−ｈＥＳＣ由来細胞の増殖指標（Ｓ３Ｄ２−中；Ｓ３Ｄ５−右）を示す。ＣＤＸ２（上列）及びＫＩ６７（下列）のタンパク質レベルは、単一チャネル画像として示される。ＦＡＣＳによって評価された、総Ｓ３Ｄ５細胞中のＫＩ６７タンパク質陽性細胞の割合（総細胞は、＞９０％がＣＤＸ２陽性）は、Ｓ１Ｄ３（９７．３±１．３）及びＣａｃｏ−２細胞（９９．２±０．２）とは対称的に、１６．８±３．１２であった（図４Ｂ）。
ＢＭＰ２は、ＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２タンパク質が共存している中腸内胚葉細胞の単層を産生するための本発明の方法におけるステージ３中で、ＢＭＰ４の代替として使用できる。図５Ａは、各ステージで添加された培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸内胚葉細胞の分化の主要なステージ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、及びＰＤＸ１ＬＯ）を含む、分化方法の概要を示す。Ｓ２Ｄ２と記される中性ｐＨ（７．３５±０．０４）と比べて、細胞をステージ３全体の間に、ＢＬＡＲ培地中で、ＢＬＡＲ酸性培地中の重炭酸ナトリウム濃度を低下させてわずかに酸性条件にしたものに曝した（ｐＨ；Ｓ３Ｄ１、６．９２；Ｓ３Ｄ２、７．０１；Ｓ３Ｄ５、７．２２）（図５Ｂ）。図５Ｃは、Ｓ３Ｄ５単層（左）及びＣａｃｏ−２細胞（右）の代表的な位相差画像を示す。Ｓ３Ｄ５における均一な形態が観察された。
この分化方法は、転写レベル及びタンパク質レベルでＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＫＬＦ５、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１ＬＯ及びＨＯＸＣ５をそれぞれ含む、単層の正常な中腸内胚葉細胞を発生させ、維持する。全てのＴＦタンパク質レベルを単一チャネルのＩＦ画像として示す。図６Ａ（下）は、Ｃａｃｏ−２細胞で見られる割合（８６．０±６．６７）と同様に、９４パーセントのＳ３Ｄ５細胞に、ＣＤＸ２及びにＦＯＸＡ２タンパク質の両方が共存していたことを示す。遺伝子発現解析により、ステージ３の間に、ＣＤＸ２が誘導され（図６Ｂ）、ＦＯＸＡ２が維持された（図６Ｃ）ことが示される。図６Ｄは、ＣＤＸ２タンパク質レベルとＣＤＸ２／ＦＯＸＡ２タンパク質の完全な共存が、Ｓ３Ｄ５において誘導され（図６Ｄ）、これが、Ｃａｃｏ−２細胞（図２Ｄ−ｉｖ）で観察されるレベルに匹敵していることを示す。図６Ｅ（下）は、Ｓ３Ｄ５において、９９．８パーセントの細胞にＣＤＸ２及びＳＯＸ９の両方が共存していたことを示す。ＳＯＸ９遺伝子発現の強い誘導は、Ｃａｃｏ−２細胞と同様のレベルで観察され（図６Ｆ）、ＩＦ分析によって評価されるタンパク質の存在が観察された（図６Ｇ）。４５．５パーセントの細胞が、ＣＤＸ２及びＰＤＸ１の両方に共陽性であった（図６Ｈ−下）。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｉ）と比較して、ＰＤＸ１遺伝子発現は低いレベルで誘導され、ＩＦ分析では、低レベル〜存在しないタンパク質が反映された（図６Ｊ）。前方内胚葉ＴＦであるＳＯＸ２は、Ｓ３Ｄ５細胞において観察されず、Ｓ３Ｄ５細胞の０．８パーセントがＳＯＸ２及びＣＤＸ２の共存を示し（図６Ｋ−下；図６Ｍ）、遺伝子発現は、ｈＥＳＣ及びＣａｃｏ−２細胞（図６Ｌ）に見られるレベルより低かった。後腸内胚葉の正常な発達に必須のマーカーであるＫＬＦ５の遺伝子発現は、Ｓ３Ｄ５で強く上方制御されていた（図６Ｎ）。Ｓ３Ｄ５において、ＣＤＸ２陽性細胞内でＫＬＦ５タンパク質の共存が観察された（図６Ｏ）。ＡＬＢ遺伝子の発現（図６Ｐ）及びタンパク質の存在（図６Ｑ）は、Ｓ３Ｄ５細胞で観察されなかった。膵臓に偏ったＳ４Ｄ３細胞（図６Ｒ）と比較するとき、Ｓ３Ｄ５細胞では、膵臓系列に割り当てられるＴＦであるＰＴＦ１Ａの遺伝子発現は誘導されなかった。胚性中腸内胚葉中に存在するホメオボックス遺伝子であるＨＯＸＣ５は、Ｓ３Ｄ５細胞内で強く誘導された（図６Ｓ）。図６Ｔは、妊娠中期に見られ始める胚性腸管内胚葉マーカーであるＬＧＲ５が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す。図６Ｕは、後腸内胚葉のマーカーであるＨＯＸＡ１３が、Ｓ３Ｄ５細胞で誘導されなかったことを示す（図６Ｕ）。
図７は、分化しているＳ３Ｄ５細胞の増殖プロファイルの特徴であり、ＣＤＸ２タンパク質陽性細胞のほとんどの細胞周期が活性化されている（ＫＩ６７タンパク質との共発現によって示される）Ｃａｃｏ−２細胞（左）と比較して、ステージ３中のＨ１−ｈＥＳＣ由来細胞の増殖指標が減少した（Ｓ３Ｄ５−右）。ＣＤＸ２（上列）及びＫＩ６７（下列）のタンパク質レベルは、単一チャネル画像として示される。ＦＡＣＳによって評価された、総Ｓ３Ｄ５細胞中のＫＩ６７タンパク質陽性細胞の割合（総細胞は、＞９０％がＣＤＸ２陽性）は、Ｓ１Ｄ３（９７．３±１．３）及びＣａｃｏ−２細胞（９９．２±０．２）で見られる割合とは対称的に、１４．１であった（図７、４Ｂ）。
（実施例２）
胚体内胚葉から開始し、ＦＧＦ４及びＷＮＴアゴニストを使用する腸管培養は、ＣＤＸ２＋中腸／後腸細胞の内胚葉−間葉混合物を産生する
この実施例は、胚体内胚葉ステージで開始し、ＦＧＦ４及びＷＮＴアゴニストを使用する、腸管培養から産生される内胚葉−間葉混合品質のＣＤＸ２＋中腸／後腸細胞を実証する（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１；４７０：１０５〜１０９；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，２０１４；１１：１３１０〜１３１４）。Ｓｐｅｎｃｅら（以下）に記載される中腸／後腸内胚葉細胞への誘導を調べるため、以下のプロトコールを用いてｈＥＳＣを分化させた。この実施例で概説される分化条件は、（ｉ）腸管状態の開始点が胚体内胚葉で始まる、（ｉｉ）ＲＡ及びＢＭＰ４又はＢＭＰ２とは異なる成長因子及び小分子を用いる、及び（ｉｉｉ）酸性培養条件を使用しない点において、実施例１とは異なることに留意されたい。
材料及び方法
細胞培養：Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞を、実施例１に記載されるように培養し、維持した。
分化：以下のプロトコールを用いて培養物を分化させた。
ステージ１−ミミック（３日間）：細胞を、以下のステージ１培地で１日間培養した。
続いて翌日は、細胞を以下の培地で培養した。
続いて翌日は、細胞を以下の培地で培養した。
ステージ１後（２日間）：例えば、ｐＳ１ｄ１は、ステージ１後１日目、ｐＳ１ｄ２は、ステージ１後２日目である。細胞を、地下のステージ１後培地で２日間培養した。
定量化：位相差撮像及び遺伝子発現の定量化は、実施例１の手順に従った。
結果
各ステージで添加される培地成分、成長因子及び小分子、並びに、中腸／後腸内胚葉細胞の分化のサイン、つまり主要なステージ特異的マーカー（ＨＡＮＤ１）を含む、分化方法の概要を図８Ａに示す。腸管状態（ステージ１後）は、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４、及び、３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１（Ｗａｔｓｏｎｅｔ ａｌ．）、又は５００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａ（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．）のいずれかと共に、胚体内胚葉ステージで開始した。用語「ステージ１−ミミック」は、実施例１に記載されるステージ１のコンディショニングを指す「Ｓ１Ｄ３−オリジナル」とは異なる、本実施例の胚体内胚葉の分化プロトコールを指す。図８Ｂは、Ｈ１−ｈＥＳＣ細胞（上列、左）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び３μＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１で２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、中）、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４及び５００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａで２日間コンディショニングしたステージ１後の細胞（上列、右）と共に、ＲＡ／ＢＭＰ４でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、左）、及び、ＲＡ／ＢＭＰ２でコンディショニングしたＳ３Ｄ５単層（下列、右）（実施例１」）の、位相差画像を示す。
ＣＤＸ２遺伝子発現の誘導は、２日間のコンディショニング後に達成されたが、ＲＡ／ＢＭＰ２又はＲＡ／ＢＭＰ４のＳ３Ｄ５に比べてはるかに低いレベルであった（図８Ｃ）。しかし、内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２の遺伝子発現は維持され（図８Ｄ）、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１は強く誘導された（図８Ｆ）。また、ＲＡ／ＢＭＰ４及びＲＡ／ＢＭＰ２によるコンディショニングとは異なり、２日間の時点でＫＬＦ５は誘導されなかった（図８Ｅ）。図８Ｆに最終的に示されるように、この遺伝子発現パターンは、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．及びＳｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．で見られる、ＣＤＸ２＋ＦＯＸＡ２＋内胚葉集団だけではなく、かなりの間葉系ＣＤＸ２＋細胞集団も含む、不均一な細胞集団を反映している。対称的に、ＲＡ／ＢＭＰ４又はＲＡ／ＢＭＰ２のステージ２後（原始腸管細胞）のコンディショニングは、中胚葉／間葉マーカーであるＨＡＮＤ１を誘導せず、内胚葉ＣＤＸ２＋ＦＯＸＡ２＋集団のみが誘導された。
本発明及び本発明の様々な実施形態を説明する際に、明瞭化のために特定の用語が用いられる。しかしながら、本発明は、選択された特定の用語に限定されるように意図されていない。関連分野の当業者であれば、他の同等の構成要素を使用することができ、また、本発明の広い概念から逸脱することなく他の方法を開発することができることを認識するであろう。本明細書のいずれかにおいて引用される全ての参照文献は、それぞれが個別に組み込まれているかのように参照により組み込まれる。

Claims (9)

  1. ＧＤＦ−８及びＧＳＫ３β阻害化合物を含む第１の培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、胚体内胚葉細胞にする工程と、
    アスコルビン酸及びＦＧＦ７を含む第２の培地中で前記胚体内胚葉細胞を培養し、原始腸管細胞にする工程と、
    レチノイン酸及びＢＭＰ２又はＢＭＰ４を含む第３の培地中で前記原始腸管細胞を培養し、中腸内胚葉細胞にする工程と、を含み、
    実質的に中腸内胚葉細胞の細胞集団が産生される、中腸内胚葉細胞集団の産生方法。
  2. ＧＤＦ−８及びＧＳＫ３β阻害化合物を含む第１の培地中でヒト多能性幹細胞を培養し、胚体内胚葉細胞にする工程と、
    アスコルビン酸及びＦＧＦ７を含む第２の培地中で前記胚体内胚葉細胞を培養し、原始腸管細胞にする工程と、
    レチノイン酸及びＢＭＰ２又はＢＭＰ４を含む第３の培地中で前記原始腸管細胞を培養し、中腸内胚葉細胞にする工程と、を含み、
    前記中腸内胚葉細胞が単層を形成し、前記単層として維持する、中腸内胚葉細胞集団の産生方法。
  3. 前記中腸内胚葉細胞がＣＤＸ２及びＦＯＸＡ２を発現する、請求項１又は請求項２に記
    載の方法。
  4. 前記中腸内胚葉細胞が、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＫＬＦ５及びＨＯＸＣ５からなる群から
    選択される転写因子を発現する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  5. 前記中腸内胚葉細胞が、ＳＯＸ２、ＡＬＢ、ＰＴＦ１Ａ、ＨＯＸＡ１３及びＬＧＲ５か
    らなる群から選択される転写因子を発現しない、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  6. 前記中腸内胚葉細胞が、培地中で単層を形成し、前記単層を維持する、請求項１に記載
    の方法。
  7. 前記実質的に中腸内胚葉細胞の細胞集団が間葉細胞を含まない、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  8. 前記実質的に中腸内胚葉細胞の細胞集団がＨＡＮＤ１を発現しない、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  9. 前記培養工程がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
JP2018553183A 2016-04-14 2017-04-04 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化 Active JP6705911B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662322636P 2016-04-14 2016-04-14
US62/322,636 2016-04-14
PCT/US2017/025847 WO2017180361A1 (en) 2016-04-14 2017-04-04 Differentiation of pluripotent stem cells to intestinal midgut endoderm cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020084976A Division JP2020146042A (ja) 2016-04-14 2020-05-14 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019511228A JP2019511228A (ja) 2019-04-25
JP2019511228A5 JP2019511228A5 (ja) 2020-04-23
JP6705911B2 true JP6705911B2 (ja) 2020-06-03

Family

ID=60039713

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018553183A Active JP6705911B2 (ja) 2016-04-14 2017-04-04 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化
JP2020084976A Pending JP2020146042A (ja) 2016-04-14 2020-05-14 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化
JP2022094028A Pending JP2022132249A (ja) 2016-04-14 2022-06-10 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020084976A Pending JP2020146042A (ja) 2016-04-14 2020-05-14 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化
JP2022094028A Pending JP2022132249A (ja) 2016-04-14 2022-06-10 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化

Country Status (17)

Country Link
US (2) US10420803B2 (ja)
EP (2) EP4450076A2 (ja)
JP (3) JP6705911B2 (ja)
KR (4) KR102162505B1 (ja)
CN (2) CN115449506A (ja)
AR (1) AR108134A1 (ja)
AU (1) AU2017251651B2 (ja)
BR (1) BR112018070293A2 (ja)
CA (1) CA3020905A1 (ja)
DK (1) DK3443073T3 (ja)
MA (1) MA45479A (ja)
MX (1) MX2018012629A (ja)
PH (1) PH12018502061A1 (ja)
RU (2) RU2741114C2 (ja)
SG (1) SG11201807915QA (ja)
TW (1) TW201803983A (ja)
WO (1) WO2017180361A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA45479A (fr) * 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
JP2022535239A (ja) 2019-05-31 2022-08-05 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
AU2020282355B2 (en) 2019-05-31 2023-11-02 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
AU2020283150B2 (en) 2019-05-31 2023-08-17 Viacyte, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
JP2022534545A (ja) 2019-05-31 2022-08-01 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
CN110540962B (zh) * 2019-08-28 2022-02-25 北京协同创新研究院 一种制备人定型内胚层细胞的方法
CA3190424A1 (en) * 2020-07-30 2022-02-03 Riken Bladder organoid and method for producing same

Family Cites Families (268)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
SU1767433A1 (ru) 1989-11-27 1992-10-07 Пермский государственный медицинский институт Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US5795965A (en) 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
JP2813467B2 (ja) 1993-04-08 1998-10-22 ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド 細胞培養法および培地
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ja) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
CA2209124C (en) 1994-12-29 2010-03-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor agent effect enhancer containing il-6 antagonist
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5681561A (en) 1995-06-07 1997-10-28 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
US5965583A (en) 1997-04-24 1999-10-12 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory disease
PT1028737E (pt) 1997-07-03 2007-07-11 Osiris Therapeutics Inc Células estaminais mesenquimatosas humanas de sangue periférico
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ES2340857T3 (es) 1997-09-16 2010-06-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Metodo para la sintesis quimica completa y emsamblaje de genes y genomas.
AU729377B2 (en) 1997-10-23 2001-02-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US6372779B1 (en) 1997-12-29 2002-04-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-inflammatory compounds
JP4740452B2 (ja) 1998-03-18 2011-08-03 オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド 移植で免疫応答の予防と処置のための間葉幹細胞を利用する方法、組成物およびその使用法
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
WO2000043500A2 (en) 1999-01-21 2000-07-27 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6800460B1 (en) 1999-03-11 2004-10-05 Schering Corporation Mammalian cytokine complexes
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
EP1224259A4 (en) 1999-09-27 2005-04-27 Univ Florida INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
AU778155B2 (en) 1999-12-13 2004-11-18 Scripps Research Institute, The Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
EP2295539A1 (en) 2000-06-26 2011-03-16 Nc Medical Research Inc. Cell fractions containing cells capable of differentiating into neural cells
EP1333833B1 (en) 2000-10-23 2011-08-24 GlaxoSmithKline LLC Novel trisubstituted-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-one compound for the treatment of CSBP/p38 kinase mediated diseases
YU46603A (sh) 2000-12-08 2006-05-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc. Indazolil-supstituisana jedinjenja pirolina, kao inhibitori kinaze
MXPA03005139A (es) 2000-12-08 2004-01-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos macroheterociclicos utiles como inhibidores de cinasa.
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
US20040121460A1 (en) 2001-01-24 2004-06-24 Lumelsky Nadya L Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
CA2435146C (en) 2001-01-25 2011-03-29 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
JP2004527249A (ja) 2001-04-19 2004-09-09 デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法
CN100516204C (zh) 2001-04-24 2009-07-22 味之素株式会社 干细胞及其分离方法
EP1393066A4 (en) 2001-05-15 2006-01-25 Rappaport Family Inst For Res INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
AU2002319780A1 (en) 2001-08-06 2003-02-24 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003033697A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
EP1442115B9 (en) 2001-11-15 2009-12-16 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
AU2002357135C1 (en) 2001-12-07 2009-01-22 Macropore Biosurgery, Inc. Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells
GB2415432B (en) 2001-12-07 2006-09-06 Geron Corp Islet cells from human embryonic stem cells
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
EP1461421A2 (en) 2001-12-28 2004-09-29 Cellartis AB A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
WO2003087349A1 (fr) 2002-04-17 2003-10-23 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Methode de formation de cellules pancreatiques $g(b) a partir de cellules mesenchymales
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
ATE387444T1 (de) 2002-05-08 2008-03-15 Janssen Pharmaceutica Nv Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren
GB0210539D0 (en) 2002-05-08 2002-06-19 Univ Edinburgh Control of es cell self renewal and lineage specification, and medium therefor
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
WO2003102134A2 (en) 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Pancreatic acinar cells into insulin producing cells
AU2003238874A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 Janssen Pharmaceutica N.V. Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
EP1539930A4 (en) 2002-07-29 2006-08-09 Es Cell Int Pte Ltd METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
WO2004023100A2 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Amcyte Inc. Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
US20060252150A1 (en) 2002-11-08 2006-11-09 Linzhao Cheng Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US20060040385A1 (en) 2002-12-05 2006-02-23 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
DK1572984T3 (en) 2002-12-16 2016-06-13 Technion Res & Dev Foundation FEEDER CELL-FREE, XENOPHRIC CULTIVATION SYSTEM FOR HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US20050118148A1 (en) 2002-12-20 2005-06-02 Roland Stein Compositions and methods related to mammalian Maf-A
BRPI0407074A (pt) 2003-01-29 2006-01-24 Takeda Pharmaceutical Método para produção de uma preparação revestida, preparação revestida, e, método para melhorar a dissolução do cloridreto de pioglitazona de uma preparação revestida com cloridreto de pioglitazona
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070020242A1 (en) 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
PL1641913T3 (pl) 2003-06-27 2016-06-30 Depuy Synthes Products Inc Komórki poporodowe pochodzące z tkanek pępowinowych i sposoby ich wytwarzania i zastosowania
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US7569385B2 (en) 2003-08-14 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
WO2005021728A2 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
DK1709159T3 (da) 2003-12-23 2019-07-29 Viacyte Inc Definitiv endoderm
CN112813019A (zh) 2003-12-23 2021-05-18 维亚希特公司 定形内胚层
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US7541185B2 (en) * 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20050233446A1 (en) 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
US7964401B2 (en) 2004-02-19 2011-06-21 Kyoto University Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance affecting ECAT2 and ECAT3
US20060281174A1 (en) 2004-03-09 2006-12-14 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
AU2005221079B2 (en) 2004-03-10 2010-07-22 Regents Of The University Of California Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
WO2005090557A1 (ja) 2004-03-23 2005-09-29 Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. 多能性幹細胞の増殖方法
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
EP1730268A2 (en) 2004-04-01 2006-12-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
KR101278421B1 (ko) 2004-04-27 2013-07-15 비아싸이트, 인크. Ｐｄｘ１ 발현 내배엽
EP1786896B1 (en) * 2004-07-09 2018-01-10 Viacyte, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US8187878B2 (en) 2004-08-13 2012-05-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for increasing definitive endoderm differentiation of pluripotent human embryonic stem cells with PI-3 kinase inhibitors
US20080268533A1 (en) 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
KR101264940B1 (ko) 2004-09-08 2013-05-15 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물
DK3196296T3 (en) 2004-09-08 2019-02-04 Wisconsin Alumini Res Foundation Cultivation of human embryonic stem cells
DK1838843T3 (da) * 2004-12-23 2019-08-26 Viacyte Inc Ekspansion af definitive endodermceller
EP1841857A1 (en) 2004-12-30 2007-10-10 Stemlifeline, Inc. Methods and compositions relating to embryonic stem cell lines
WO2006079854A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Novathera Ltd Methods for embryonic stem cell culture
JP2008528038A (ja) 2005-01-31 2008-07-31 エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用
US20060182724A1 (en) 2005-02-15 2006-08-17 Riordan Neil H Method for expansion of stem cells
AU2006218359A1 (en) 2005-03-04 2006-09-08 John O'neil Adult pancreatic derived stromal cells
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
EP1876893B1 (en) 2005-04-15 2012-04-11 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
EP1874367B1 (en) 2005-04-26 2011-07-06 Arhus Universitet Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces
WO2006126574A1 (ja) 2005-05-24 2006-11-30 Kumamoto University Es細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
WO2006135824A1 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
EP1910516B1 (en) 2005-06-22 2019-06-19 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
UA92608C2 (en) 2005-06-30 2010-11-25 Янссен Фармацевтика Н.В. Cyclic anilino - pyridinotriazines as gsk-3 inhibitors
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
AU2006274438A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
AU2006286149B2 (en) 2005-08-29 2012-09-13 Technion Research And Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
JP2009506770A (ja) 2005-09-02 2009-02-19 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 前駆細胞株の誘導法
US9422521B2 (en) 2005-09-12 2016-08-23 Es Cell International Pte Ltd. Differentiation of pluripotent stem cells with a kinase inhibitor or PGI2
WO2007047509A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
DK2674485T3 (da) 2005-10-27 2019-08-26 Viacyte Inc Pdx-1 udtrykkende dorsal og ventral fortarm endoderm
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
EP1994141B1 (en) 2006-02-23 2017-11-15 ViaCyte, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
EP2650360B1 (en) 2006-03-02 2019-07-24 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
GB0615327D0 (en) 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
AU2007244675A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
SE534150C2 (sv) 2006-05-02 2011-05-10 Wisconsin Alumni Res Found Förfarande för differentiering av stamceller till celler av den endodermala och pankreatiska utvecklingslinjen
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
WO2007136673A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Medistem Laboratories, Inc. Treatment of disc degenerative disease and compositions for same
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
WO2007143193A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
CA2893679C (en) 2006-06-26 2018-10-30 Lifescan, Inc. Conditioned medium for pluripotent stem cell culture
GB2454386B (en) 2006-07-06 2011-07-06 Es Cell Int Pte Ltd Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
EP2059586B1 (en) 2006-08-02 2016-07-20 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
BRPI0718310A2 (pt) 2006-10-17 2013-11-19 Stiefel Laboratories Metabólitos de talarozol
US8835163B2 (en) 2006-10-18 2014-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
EP2088190A4 (en) 2006-11-09 2011-01-05 Japan Government METHOD FOR THE CULTURE AND PASSAGE OF PRIMATE EMBRYONIC STRAIN CELL, AND METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF EMBRYONIC STEM CELL
TW200836749A (en) 2007-01-09 2008-09-16 Vioquest Pharmaceuticals Inc Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
EP2126045A4 (en) 2007-01-30 2010-05-26 Univ Georgia EARLY MESODERM CELLS, STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS WITH THE ABILITY TO GENERATE ENDODERM AND MESODERM CELL LINES AND MULTIPOTENTIAL MIGRATION CELLS
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US20090053182A1 (en) 2007-05-25 2009-02-26 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
CA2691793A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Cellular Dynamics International, Inc. Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
CA2693156C (en) 2007-07-18 2018-03-06 Alireza Rezania Differentiation of human embryonic stem cells
RU2473685C2 (ru) 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
EP2190413B1 (en) 2007-08-24 2015-01-28 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Compositions for the treatment of neoplastic diseases
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
ATE523585T1 (de) 2007-11-27 2011-09-15 Lifescan Inc Differenzierung menschlicher embryonaler stammzellen
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
WO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
EP2271747B1 (en) 2008-03-17 2016-09-07 Agency for Science, Technology And Research Microcarriers for pluripotent stem cell culture
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
AU2008355123B2 (en) 2008-04-21 2014-12-04 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8728812B2 (en) 2008-04-22 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
EP2993226B1 (en) 2008-06-03 2020-12-16 Viacyte, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
JP5734183B2 (ja) 2008-06-30 2015-06-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞の分化
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
WO2010022395A2 (en) 2008-08-22 2010-02-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
RU2528861C2 (ru) 2008-10-31 2014-09-20 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
CN102272291B (zh) 2008-10-31 2018-01-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
DK2356213T3 (da) 2008-11-04 2019-09-09 Viacyte Inc Stamcelleaggregatsuspensionssammensætninger og fremgangsmåder til differentiering deraf
EP2356227B1 (en) 2008-11-14 2018-03-28 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
BRPI0920956A2 (pt) 2008-11-20 2015-08-18 Centocor Ortho Biotech Inc Cultura de células-tronco pluripotentes em microveículos
JP5604766B2 (ja) 2008-12-05 2014-10-15 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 多能性細胞の神経分化のための方法および培地
EP2435471A2 (en) * 2009-05-29 2012-04-04 Novo Nordisk A/S INDUCED DERIVATION OF SPECIFIC ENDODERM FROM hPS CELL-DERIVED DEFINITIVE ENDODERM
WO2011011300A2 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
SG177416A1 (en) 2009-07-20 2012-02-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
AR078805A1 (es) 2009-10-29 2011-12-07 Centocor Ortho Biotech Inc Celulas madre pluripotentes
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
RU2701335C2 (ru) 2009-12-23 2019-09-25 Янссен Байотек, Инк. Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
ES2633648T3 (es) 2009-12-23 2017-09-22 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas
KR101646308B1 (ko) 2010-02-03 2016-08-05 데츠야 이시카와 유도간 간세포 및 그 제조 방법, 그리고 그 세포의 응용
SG183400A1 (en) 2010-03-02 2012-09-27 Univ Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
CN102959076B (zh) 2010-03-31 2015-09-16 斯克里普斯研究所 重编程细胞
EP2563908B1 (en) 2010-04-25 2019-01-09 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
RU2663339C1 (ru) 2010-05-12 2018-08-03 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
CN103180434A (zh) 2010-08-05 2013-06-26 威斯康星校友研究基金会 用于人多能细胞培养的简化基础培养基
PL2611910T3 (pl) 2010-08-31 2018-06-29 Janssen Biotech, Inc Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
EP2611907B1 (en) 2010-08-31 2016-05-04 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
CA2821562A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 National University Corporation Kumamoto University Method of producing intestinal cells
WO2012117333A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
US20130274184A1 (en) 2011-10-11 2013-10-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Er stress relievers in beta cell protection
US9670463B2 (en) 2011-10-14 2017-06-06 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
EP2794857A4 (en) 2011-12-22 2015-07-08 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS IN SINGLE INSULIN POSITIVE CELLS
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
EP3450542B1 (en) 2012-06-08 2021-09-01 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
US20150247123A1 (en) 2012-09-03 2015-09-03 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from Pluripotent Stem cells using small molecules
WO2014062138A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-24 Agency For Science, Technology And Research Methods of differentiating stem cells into one or more cell lineages
CA2896658C (en) 2012-12-31 2021-06-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators
WO2014106141A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
CA3212301A1 (en) * 2013-02-06 2014-08-14 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
SG10201708332WA (en) 2013-03-15 2017-11-29 Jackson Lab Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
US10266807B2 (en) 2013-04-03 2019-04-23 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
KR102162138B1 (ko) * 2014-05-16 2020-10-06 얀센 바이오테크 인코포레이티드 췌장 내분비 세포에서 mafa 발현을 향상시키기 위한 소분자의 용도
JP2017534269A (ja) * 2014-10-08 2017-11-24 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞を肝臓細胞系譜に分化させる方法
MA45479A (fr) * 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen

Also Published As

Publication number Publication date
KR102619151B1 (ko) 2023-12-27
EP3443073B1 (en) 2024-06-05
KR102509926B1 (ko) 2023-03-14
WO2017180361A1 (en) 2017-10-19
MX2018012629A (es) 2019-02-28
KR20180125519A (ko) 2018-11-23
CN115449506A (zh) 2022-12-09
KR20230038322A (ko) 2023-03-17
RU2021100063A (ru) 2021-01-27
US20170296594A1 (en) 2017-10-19
EP3443073A4 (en) 2019-10-23
KR102162505B1 (ko) 2020-10-06
CN109563478B (zh) 2022-09-27
KR20200115680A (ko) 2020-10-07
AU2017251651B2 (en) 2023-08-10
AU2017251651A1 (en) 2018-10-04
RU2018139710A3 (ja) 2020-07-06
TW201803983A (zh) 2018-02-01
CA3020905A1 (en) 2017-10-19
DK3443073T3 (da) 2024-09-02
US10420803B2 (en) 2019-09-24
EP4450076A2 (en) 2024-10-23
CN109563478A (zh) 2019-04-02
KR20220070585A (ko) 2022-05-31
JP2020146042A (ja) 2020-09-17
JP2019511228A (ja) 2019-04-25
RU2741114C2 (ru) 2021-01-22
SG11201807915QA (en) 2018-10-30
BR112018070293A2 (pt) 2019-01-29
PH12018502061A1 (en) 2019-06-24
KR102403165B1 (ko) 2022-05-26
RU2018139710A (ru) 2020-05-14
EP3443073A1 (en) 2019-02-20
MA45479A (fr) 2019-02-20
JP2022132249A (ja) 2022-09-07
AR108134A1 (es) 2018-07-18
US20190365823A1 (en) 2019-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6705911B2 (ja) 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化
JP7278990B2 (ja) Ｈｂ９調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化
KR102084561B1 (ko) 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 공기-액체 계면에서의 인간 배아 줄기세포의 배양
CN102712902B (zh) 人胚胎干细胞的分化
JP2022095886A (ja) 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム
DK2898063T3 (en) PANCREATIC DIFFERENTIALIZATION OF PLURIPOTENT PATTERN CELLS IN VITRO
CN101952415B (zh) 人胚胎干细胞的分化
JP2013524836A (ja) 多能性細胞からの前部前腸内胚葉の生成
WO2010007031A2 (en) Methods for improving cardiac differentiation of human embryonic stem cells
JP2018512886A (ja) 真正膵臓前駆細胞の単離
Delaspre Stepwise differentiation of pancreatic acinar cells from mES cells by manipulating signalling pathway

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200310

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200310

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20200310

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20200319

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20200414

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200514

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6705911

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250