KR102619151B1 - 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 - Google Patents
만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102619151B1 KR102619151B1 KR1020237008352A KR20237008352A KR102619151B1 KR 102619151 B1 KR102619151 B1 KR 102619151B1 KR 1020237008352 A KR1020237008352 A KR 1020237008352A KR 20237008352 A KR20237008352 A KR 20237008352A KR 102619151 B1 KR102619151 B1 KR 102619151B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- intestinal
- endoderm
- midgut
- cdx2
- Prior art date
Links
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 166
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 title claims abstract description 135
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title description 66
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 402
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 claims description 64
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 claims description 62
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 30
- 101001139130 Homo sapiens Krueppel-like factor 5 Proteins 0.000 claims description 29
- 102100020680 Krueppel-like factor 5 Human genes 0.000 claims description 29
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 claims description 28
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims description 28
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 25
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 23
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 claims description 23
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 claims description 23
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 23
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 23
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 23
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 22
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 22
- 102100020762 Homeobox protein Hox-C5 Human genes 0.000 claims description 21
- 101001002966 Homo sapiens Homeobox protein Hox-C5 Proteins 0.000 claims description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 21
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 20
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 claims description 20
- 102100031036 Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Human genes 0.000 claims description 20
- 102100030307 Homeobox protein Hox-A13 Human genes 0.000 claims description 16
- 108010021685 homeobox protein HOXA13 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 claims description 15
- 102100023855 Heart- and neural crest derivatives-expressed protein 1 Human genes 0.000 claims description 14
- 101000905239 Homo sapiens Heart- and neural crest derivatives-expressed protein 1 Proteins 0.000 claims description 14
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 11
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 102100037878 Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 claims 2
- 101000693913 Homo sapiens Albumin Proteins 0.000 claims 1
- 101001065295 Homo sapiens Fas-binding factor 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101001063456 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Proteins 0.000 claims 1
- 101000738523 Homo sapiens Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Proteins 0.000 claims 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 abstract description 82
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 102100031671 Homeobox protein CDX-2 Human genes 0.000 description 84
- 101000777812 Homo sapiens Homeobox protein CDX-2 Proteins 0.000 description 84
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 40
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 31
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 25
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 21
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 20
- 101710174256 Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Proteins 0.000 description 19
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 19
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 15
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 14
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 14
- 210000003158 enteroendocrine cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 14
- -1 PTF1A Proteins 0.000 description 13
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 13
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 12
- MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N incretin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 11
- 239000000859 incretin Substances 0.000 description 11
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 10
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 10
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 10
- 102100039994 Gastric inhibitory polypeptide Human genes 0.000 description 9
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 9
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 8
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 8
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 8
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 8
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 7
- 108010004460 Gastric Inhibitory Polypeptide Proteins 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 description 7
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 7
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 101150058750 ALB gene Proteins 0.000 description 5
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 5
- 108091016366 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 5
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 5
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 5
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 5
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 101000954805 Homo sapiens Protein Wnt-3a Proteins 0.000 description 4
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 4
- 101150111723 PDX1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100037051 Protein Wnt-3a Human genes 0.000 description 4
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 4
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 102100020856 Forkhead box protein F1 Human genes 0.000 description 3
- 108010087745 Hepatocyte Nuclear Factor 3-beta Proteins 0.000 description 3
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 description 3
- 101000931494 Homo sapiens Forkhead box protein F1 Proteins 0.000 description 3
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 3
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 3
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 3
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 3
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 2
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 description 2
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102100040227 Homeobox protein Hox-D13 Human genes 0.000 description 2
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 2
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101000886868 Homo sapiens Gastric inhibitory polypeptide Proteins 0.000 description 2
- 101001037168 Homo sapiens Homeobox protein Hox-D13 Proteins 0.000 description 2
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 2
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 2
- 101000612089 Homo sapiens Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108700032475 Sex-Determining Region Y Proteins 0.000 description 2
- 102100022978 Sex-determining region Y protein Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 108700013515 Wnt3A Proteins 0.000 description 2
- 102000044880 Wnt3A Human genes 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 2
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 description 1
- 101710150365 Albumin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 description 1
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 description 1
- 101150040224 CDX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 1
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 1
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 108700031316 Goosecoid Proteins 0.000 description 1
- 102000050057 Goosecoid Human genes 0.000 description 1
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000009094 Hepatocyte Nuclear Factor 3-beta Human genes 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100035043 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Human genes 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710161360 Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 1
- 108010048992 Transcription Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108050000630 Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100030742 Transforming growth factor beta-1 proprotein Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940090124 dipeptidyl peptidase 4 (dpp-4) inhibitors for blood glucose lowering Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000604 fetal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001647 gastrula Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000004608 intestinal differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000023187 negative regulation of glucagon secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 210000001811 primitive streak Anatomy 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000985 reactive dye Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 1
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/38—Stomach; Intestine; Goblet cells; Oral mucosa; Saliva
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/602—Sox-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
장의 중장 내배엽 세포의 세포 집단 및 장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 생성하는 방법이 개시된다. 당뇨병과 같은 질환을 치료하는 방법이 또한 개시된다.
Description
본 발명은 당뇨병과 같은 질환에 대한 세포-기반 요법의 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 인간 만능성(pluripotent) 줄기 세포의 분화를 유도하여 장의 중장 내배엽 세포의 집단을 생성하는 것을 포함하는 세포 분화에 관한 것이다. 본 발명은 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포 또는 세포 집단 및 그러한 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
줄기 세포 및 내분비 세포 단계 둘 모두에서, 장 분화의 이해에 있어서의 진전과 결합되어 인크레틴 호르몬 작용 기전의 지식의 진보는 생착(engraftment)에 적절한, 인크레틴 호르몬 생성 세포의 공급원을 개발하는 데로 관심을 갖게 하였다. 한 가지 접근법은 인간 배아 줄기 세포 ("hESC") 또는 유도 만능성 줄기 세포 ("iPS")와 같은 만능성 줄기 세포로부터 기능성 장내분비 L- 또는 K-세포의 생성이다.
장 L-세포로부터의 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)의 생성/분비 또는 장 K-세포로부터의 글루코스 의존성 인슐린분비촉진 폴리펩티드 (GIP)의 생성/분비는 진성 당뇨병의 치료에 유익한 효과를 갖는다. 인크레틴 호르몬은 진성 당뇨병 (제1형 및 제2형)의 치료에 유익한 전신 효과를 갖는다 (문헌[Unger, J., Curr Diab Rep., 2013; 13(5):663-668]). 이득은 베타 (β) 세포 기능 및 수의 많은 양상의 증대, 글루카곤 분비의 억제, 말초 대사 조직의 인슐린 감수성의 증가, 간 당신생의 감소, 및 식욕의 감소를 포함할 수 있다. 2가지 부류의 인크레틴-기반 치료제가 진성 당뇨병의 치료에 대해 확인되어 있다 (GLP-1 수용체 효능제 및 다이펩티딜 펩티다제 4 (DPP-4) 억제제). 그러나, 개선되고 효율적인 GLP1-기반 당뇨병 치료를 위한 내인성 및 세포 바로미터(endogenous and cellular barometer)를 포괄하는 인크레틴-기반 세포 요법 선택지가 현재는 존재하지 않는다. 더욱이, 현재의 인크레틴-기반 요법은 혈당 수준을 순환시킴으로써 조절되지 않으며, 따라서 비생리학적으로 조절된 GLP 생성을 제공한다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층 (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 중간엽 조직은 중배엽으로부터 유래되며, 특히 유전자인 심장 및 신경 능선 유도체 발현 1 (HAND1), 및 포크헤드 박스 F1 (FOXF1)에 의해 표시된다. 갑상선, 흉선, 췌장, 장 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 낭배형성의 종료 시점까지, 내배엽은 내배엽의 전방 전장, 후방 전장, 중장, 및 후장 영역을 독특하게 표시하는 인자들의 패널의 발현에 의해 인식될 수 있는 전방-후방 도메인들로 나누어진다.
특정 전사 인자 ("TF")의 발현 수준은 문헌[Grapin-Botten et al., Trends Genet, 2000; 16(3):124-130]에 기재된 바와 같이, 조직의 정체(identity)를 지정하는 데 사용될 수 있다. FOXA2는 전방-후방 축을 따라 전체 내배엽을 표시한다. 완성 내배엽이 원시 장관(primitive gut tube)으로 형질전환하는 동안, 장관은 제한된 유전자 발현 패턴에 의해 분자 수준에서 관찰될 수 있는 폭넓은 도메인들로 국지화되게 된다. 전방 전장은 SOX2의 높은 발현에 의해 광범위하게 표시되며, 갑상선, 폐, 및 식도와 같은 기관 도메인을 포함한다. 중장 (십이지장, 회장, 공장을 포함함) 및 후장 (결장을 포함함)은 미측형 호메오박스(caudal type homeobox) 2 (CDX2)의 높은 발현에 의해 표시된다. SOX2-CDX2 경계는 후방 전장 내에서 일어나며, 그 안에서 추가의 TF는 특정 기관 도메인을 표시한다. 후방 전장 내의 국지화된 췌장 도메인은 PDX1의 매우 높은 발현 및 CDX2 및 SOX2의 매우 낮은 발현을 나타낸다. PTF1A는 췌장 조직에서 고도로 발현된다. 높은 CDX2 발현과 함께 낮은 PDX1 발현은 십이지장 도메인을 표시한다. 장 내배엽은 특정 호메오박스 (HOX) 유전자에 의해 패턴화된다. 예를 들어, HOXC5는 중장 내배엽 세포에서 선택적으로 발현된다. 게다가, HOXA13 및 HOXD13의 발현은 후장 내배엽 세포로 제한된다. ALB 유전자, 또는 알부민 1 단백질은 후방 전장 내배엽에서 가장 이른 간 전구체를 표시한다 (문헌[Zaret et al., Curr Top Dev Biol, 2016; 117:647-669).
인간 만능성 줄기 세포로부터 장 내배엽 세포를 생성하기 위한 프로토콜을 개선하는 데 있어서 진전이 이루어져 왔다. 예를 들어, 하기의 간행물 (문헌[Spence et al., Nature, 2011; 470(7332):105-109]; 문헌[Watson et al., Nature Medicine, 2014; 20(11):1310-1314]; 및 문헌[Kauffman et al., Front Pharmacol, 2013; 4(79):1-18])은 CDX2+/FOXA2+ 내배엽 집단뿐만 아니라 상당한 중간엽 CDX2+ 세포 집단을 함유하는, 중장/후장 구상체(spheroid)를 생성하는, 완성 내배엽 단계에서 출발하여 섬유아세포 성장 인자 (FGF)-4, 윙리스형(Wingless-type) MMTV 통합 부위 패밀리, 구성원 3A (WNT3A), Chiron 99021, 또는 레틴산 (RA) 및 FGF7 중 어느 하나를 사용하는 분화 프로토콜을 개략적으로 설명한다. 이들 hESC-유래 중장/후장 구상체로부터의 장내분비 세포의 분화 과정은 매우 비효율적이어서, 장시간을 필요로 하며, 융모간 및 융모 영역의 모든 장 세포 유형의 생성을 향해 비구별적으로 유도된다. 세포 요법을 위한 장 장내분비 세포를 고효율로 생성할 수 있도록 하기 위하여, 중간엽을 실질적으로 오염시키지 않고서, 장의 중장 내배엽 세포를 생성하는 기술에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
구체화되고 완전히 기재된 바와 같이, 본 발명은 인간 만능성 줄기 세포를 분화시킴으로써 생성되는 세포, 세포 집단 및 인간 만능성 줄기 세포를 분화시킴으로써 상기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 장의 중장 내배엽 세포, 더 특히 장의 중장 내배엽 세포의 내배엽 단층을 생성하기 위한, 인간 만능성 줄기 세포의 유도 분화 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양은 장의 중장 내배엽 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 인간 만능성 줄기 세포를 배양 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다. 실시 형태에서, 본 방법은 인간 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단이 생성된다. 일부 실시 형태에서, 실질적인 장의 중장 내배엽 세포의 집단이 생성된다. 본 발명의 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 배양 중에 단층으로서 형성되고 안정하다. 실시 형태에서, 분화된 세포의 50% 초과가 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하며, 바람직하게는 분화된 세포의 60% 초과가 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하며, 더 바람직하게는 70% 초과, 80% 초과, 및 90% 초과가 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현한다. 실시 형태에서, 분화된 세포는 장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 CDX2 및 FOXA2를 발현한다. 모든 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5로부터 선택되는 전사 인자를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 SOX2, ALB, PTF1A, HOXA13 및 LGR5로부터 선택되는 전사 인자를 발현하지 않는다.
본 발명의 실시 형태에서, 인간 만능성 줄기 세포는 하기를 포함하는 단계들에 의해 장의 중장 내배엽 세포로 분화된다: a) 인간 만능성 줄기 세포를 GDF-8 및 GSK3β 억제제, 예컨대 MCX 화합물을 함유하는 제1 배양 배지 중에서 배양하여 완성 내배엽 세포로의 분화를 유도하는 단계; b) 완성 내배엽 세포를 아스코르브산 및 FGF7을 함유하는 제2 배양 배지 중에서 배양하여 원시 장관 세포로의 분화를 유도하는 단계; 및 c) 원시 장관 세포를 산성 조건에서 레틴산 및 BMP2 또는 BMP4를 함유하는 제3 배양 배지 중에서 배양하여 장의 중장 내배엽 세포로의 분화를 유도하는 단계. 특정 실시 형태에서, 산성 조건은 BLAR 배지를 사용한 배양이다. 산성 배양의 pH는 6.8 내지 7.2의 범위일 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 배양 중에 단층을 형성한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 단층은 배양 중에 유지된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 당뇨병을 앓고 있거나 이것이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 인간 만능성 줄기 세포를 장의 중장 내배엽 세포로 분화시키는 단계 및 분화된 장의 중장 내배엽 세포를 당뇨병을 갖는 환자 내에 투여하는 단계를 포함한다. 실시 형태에서, 당뇨병은 제1형 또는 제2형이다. 실시 형태에서, 세포를 투여하는 단계는 치료 부위에 직접적으로 또는 간접적으로 이식, 주입 또는 다른 방식으로 투여하는 것을 통해 행해질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 피하 공간, 장막, 간, 신장 등과 같은 신체 내에 이식된다. 추가의 실시 형태는 매크로- 또는 마이크로-캡슐화 디바이스의 캡슐화를 포함한 세포의 캡슐화된 전달을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시 형태는 장의 중장 내배엽 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 배양 중인 완성 내배엽 세포의 원시 장관 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 실시 형태에서, 완성 내배엽 세포는 아스코르브산 및 FGF7을 함유하는 배양 배지 중에서 배양된다. 추가의 실시 형태에서, 원시 장관 세포는 레틴산과 BMP2 또는 BMP4를 함유하는 배양 배지 중에서 배양된다. 원시 장관 세포는 장의 중장 내배엽 세포로 분화된다. 일부 실시 형태에서, 원시 장관 세포는 산성 조건 (산성 배양 배지)에서 장의 중장 내배엽 세포로 분화된다. 특정 실시 형태에서, 산성 조건은 BLAR 배지를 사용한 배양이다. 산성 배양의 pH는 6.8 내지 7.2의 범위일 수 있다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 배양 중에 단층을 형성하고 유지한다.
상기 논의된 실시 형태들 각각에서, 인간 만능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 만능성 줄기 세포이다. 상기 실시 형태들 각각에서, 장의 중장 내배엽 세포는 CDX2 및 FOXA2를 발현한다. 모든 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5로부터 선택되는 전사 인자를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 SOX2, ALB, PTF1A, HOXA13 및 LGR5로부터 선택되는 전사 인자를 발현하지 않는다. 상기 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 CDX2, FOXA2, SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5를 발현한다. 상기 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 SOX2, ALB, PTF1A, HOXA13 및 LGR5를 발현하지 않는다. 실시 형태에서, 분화된 세포의 50% 초과가 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하며, 바람직하게는 분화된 세포의 60% 초과가 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하며, 더 바람직하게는 70% 초과, 80% 초과, 및 90% 초과가 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현한다. 실시 형태에서, 분화된 세포는 장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 CDX2 및 FOXA2를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5로부터 선택되는 전사 인자를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 SOX2, ALB, PTF1A, HOXA13 및 LGR5로부터 선택되는 전사 인자를 발현하지 않는다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 HAND1을 발현하지 않는다.
상기 논의된 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 실질적인 장의 중장 내배엽 세포이다. 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 70% 초과의 장의 중장 내배엽 세포, 바람직하게는 80% 초과, 90% 초과, 그리고 95% 초과의 장의 중장 내배엽 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 20% 미만의 중간엽 세포, 바람직하게는 15% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만을 포함한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 HAND1의 발현이 결여되어 있다.
상기 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 분화는 시험관내(in vitro)에서 유도된다. 다른 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 생체내(in vivo)에서 추가로 분화된다. 다른 실시 형태는 생체내에서 장내분비 세포로 추가로 분화되는 장의 중장 내배엽 세포에 관한 것이다. 장내분비 세포는 인크레틴 호르몬을 발현하거나 분비한다. 실시 형태에서, 인크레틴 호르몬은 GLP1 및 GIP이다.
추가의 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 장의 중장 내배엽 세포를 먼저 장내분비 선구체로, 그리고 최종적으로 인크레틴 발현 또는 분비 장내분비 세포로 고효율로 시험관내 분화를 촉진하는 소분자의 확인을 위한 출발 물질로서의 역할을 한다.
도 1a 내지 도 1d는 장의 중장 내배엽 세포의 분화 방법을 도시한다. 도 1a는 각각의 단계에 첨가된 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장 내배엽 세포의 단계-특이적 핵심 마커 (FOXA2, 포크헤드 박스 A2; CDX2, 미측형 호메오박스 2; KLF5, 크루펠-유사 인자 5; SOX9, SRY (성별 결정 영역 Y)-박스 9; PDX1, 췌장 및 십이지장 호메오박스 1; LO, 낮은 발현 및 단백질 존재)를 포함하여 분화 방법에 대한 요약이다. S2D2에서 언급된 중성 pH (7.35±0.04)와 대비할 때, 세포를 3기 동안 BLAR 배지 ("BLAR 산성 배지"와 상호교환가능하게 사용됨) 중에서 약산성인 조건에 노출시켰으며 (pH; S3D1, 6.98±0.05; S3D2, 7.02±0.04; S3D5, 7.18±0.03) (도 1b), 이는 BLAR 배지 중 더 낮은 중탄산나트륨 수준의 결과로서 그러하다. 도 1c는 S3D5 단층 (좌측), 및 인간 상피 결장 선암종 세포주 ("Caco-2") (우측) - 이는 분화 특성화를 위한 벤치마크로서 사용됨 - 의 대표적인 위상차 이미지를 보여준다. S3D5에서 균일한 형태가 일관되게 관찰되었다. Nucleocounter® NC-100 (덴마크 알레뢰드 소재의 Chemometec, 카탈로그 번호 900-004)를 사용한 세포수의 특성화는 1개의 hESC가 4.56±2.60개의 S3D5 장의 중장 내배엽 세포로 분화되었음을 보여준다 (도 1d).
도 2a 내지 도 2d는 골 형성 단백질-4 (BMP4)를 이용하는 분화 방법이 전사체 및 단백질 수준에서 CDX2 및 FOXA2 둘 모두를 포함하는 장의 중장 내배엽 세포들을 단층으로 생성함을 보여준다. 도 2a (하단)는 CDX2 및 FOXA2 단백질 둘 모두에 대해 90.0±5.85%의 S3D5 세포가 공존하였음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (86.0±6.67)과 유사하다. 대조적으로, 완성 내배엽 (DE ― S1D3) 세포에는 CDX2 및 FOXA2 공존이 없었다 (2.3±1.2). 유전자 발현 분석은 3기 동안 CDX2가 유도되었고 (도 2b), FOXA2가 유지되었음 (도 2c)을 보여준다. 도 2d는 FOXA2-양성 원시 장 내배엽 단계, S2D2 (도 2d-i)의 확립 후에 CDX2 단백질 수준 및 CDX2/FOXA2 단백질 공존이 유도되었고, S3D2 (도 2d-ii)까지 점진적으로 증가하였으며, S3D5 (도 2d-iii)에서 Caco-2 세포 (도 2d-iv)에서 보여지는 바와 유사한 수준에 도달하였음을 보여준다. CDX2 단백질은 하단 행에 도시되어 있고, FOXA2 단백질은 상단 행에 도시되어 있다. 정량적 분석을 가능하게 하도록 동일한 파라미터를 사용하여 각각의 이미지를 촬영하였다. 단백질 발현은 FACS에 의해 평가하였으며; 유전자 발현은 qPCR에 의해 평가하였다.
도 3a 내지 도 3q는 확실한 장의 중장 내배엽 유도를 구성하는 추가의 전사 인자 (TF)의 전사체 및 단백질 수준의 S3D5에 의한 유도를 보여주며; 적절한 장의 중장 내배엽이 달성되었다. CDX2 및 FOXA2 동시발현에 더하여, S3D5 세포는 또한 SOX9, PDX1, KLF5, HOXC5 (호메오박스 C5)의 동시발현을 나타내었지만, SOX2 (SRY-박스 2), ALB (알부민), PTF1A (췌장 특이적 전사 인자, 1a), 및 LGR5 (류신 풍부 반복 함유 G 단백질 결합된 수용체 5)의 동시발현은 나타내지 않았다. 모든 TF의 단백질 존재는 별개의 단일 채널 이미지로 도시되어 있다. 도 3a (하단)는 S3D5에서 CDX2 및 SOX9 둘 모두에 대해 98.7±0.25%의 세포가 공존하였음을 보여준다. SOX9 유전자 발현의 강한 유도는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준과 비견되었으며 (도 3b), 면역형광 (IF)-분석에 의해 평가된 바와 같이 단백질 존재가 관찰되었다 (도 3c). 69.4±14.2%의 세포는 CDX2 및 PDX1 둘 모두에 대해 동시-양성이었다 (도 3d - 하단). 췌장-편향된 S4D3 세포와 대비할 때 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0242693호 참조), PDX1 유전자 발현은 낮은 수준으로 유도되었으며 (도 3e), IF-분석에서 낮은 내지 부재하는 단백질 수준이 반영되었다 (도 3f). 전방 내배엽 TF SOX2는 1.45±0.15의 S3D5 세포가 SOX2 및 CDX2 공존을 나타낸 바와 같이 S3D5 세포에서 관찰되지 않았으며 (도 3g ― 하단; 도 3i), 유전자 발현은 hESC 및 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 미만이었다 (도 3h). 장 중장/후장 내배엽의 적절한 발생에 필수적인, KLF5의 유전자 발현이 S3D5에서 상향조절되었다 (도 3j). S3D5에서 CDX2-양성 세포 내의 KLF5의 단백질 공존이 관찰되었다 (도 3k). ALB 유전자 발현 (도 3l), 및 단백질 존재 (도 3m)는 S3D5 세포에서 관찰되지 않았다. 췌장 계통 할당 TF인 PTF1A의 유전자 발현은 췌장-편향된 S4D3 세포와 달리 S3D5 세포에서 유도되지 않았다 (도 3n). 배아 중장 내배엽에 존재하는 호메오박스 유전자, HOXC5는 S3D5 세포에서 유도되었다 (도 3o). 도 3p는 마우스에서 임신 중기에 시작하는 배아 장 내배엽의 마커인 LGR5가 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다. 도 3q는 장 후장 내배엽의 마커인 HOXA13이 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다 (도 3p). 유전자 발현은 qPCR로 평가하였다.
도 4a 및 도 4b는 분화 중인 S3D5 세포의 증식 프로파일을 특성화한다. 도 4a는 Caco-2 세포의 경우 대부분의 CDX2-단백질 양성 세포가 (KI67 단백질과의 동시발현에 의해 나타난 바와 같이) 활성 세포 주기에 있으며 (좌측), 3기 동안의 H1-hESC-유래 세포의 증식 지수는 시간 경과에 따라 감소되었음 (S3D2 ― 중간; S3D5 ― 우측)을 보여준다. CDX2 (상단 행) 및 KI67 (하단 행) 단백질 수준이 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. FACS에 의해 평가된, 총 S3D5 세포 (총 세포는 90% 초과의 CDX2-양성 세포임)의 KI67-단백질 양성 세포의 백분율은 16.8±3.12였는데, 이는 S1D3에서 관찰된 백분율 (97.3±1.3), 및 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (99.2±0.2)과는 대조적이었다 (도 4b).
도 5a 내지 도 5c는 BMP2를 3기 동안 BMP4에 대한 대안으로서 사용하여, CDX2 및 FOXA2 단백질 공존을 갖는 장의 중장 내배엽 세포의 단층을 달성함을 보여준다. 도 5a는 각각의 단계에 첨가된 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장 내배엽 세포의 단계-특이적 마커 (FOXA2, CDX2, KLF5, SOX9, 및 PDX1LO)를 포함하여 분화 방법을 요약한다. S2D2에서 언급된 중성 pH (7.35±0.04)와 대비할 때, 세포를 3기의 전체 동안 BLAR 배지 중에서 약산성인 조건에 노출시켰으며 (pH; S3D1, 6.92; S3D2, 7.01; S3D5, 7.22) (도 5b), 이는 BLAR 배지 중 더 낮은 중탄산나트륨 수준의 결과로서 그러하다. 도 5c는 S3D5 단층 (좌측), 및 Caco-2 세포 (우측)의 대표적인 위상차 이미지를 도시하고; S3D5에서 균일한 형태가 관찰되었다.
도 6a 내지 도 6u는 단층으로의 적절한 장의 중장 내배엽 세포들의 생성을 보여주며, 각각은 전사체 및 단백질 수준에서 CDX2, FOXA2, KLF5, SOX9, PDX1LO 및 HOXC5를 포함한다. IF 이미지의 경우, 모든 TF 단백질 수준은 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. 도 6a (하단)는 CDX2 및 FOXA2 단백질 둘 모두에 대해 94%의 S3D5 세포가 공존하였음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (86.0±6.67)과 유사하거나 더 크다. 유전자 발현 분석은 3기 동안 CDX2가 유도되었고 (도 6b), FOXA2가 유지되었음 (도 6c)을 보여준다. 도 6d는 CDX2 단백질 수준 및 완전한 CDX2/FOXA2 단백질 공존이 S3D5에서 유도되었음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 (도 2d-iv)과 유사한 수준에 도달한다. 도 6e (하단)는 S3D5에서 CDX2 및 SOX9 둘 모두에 대해 99.8%의 세포가 공존하였음을 보여준다. SOX9 유전자 발현의 강한 유도는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준과 비견되었으며 (도 6f), IF-분석에 의해 평가된 바와 같이 단백질 존재가 관찰되었다 (도 6g). 45.5%의 세포는 CDX2 및 PDX1 둘 모두에 대해 동시-양성이었다 (도 6h - 하단). 췌장-편향된 S4D3 세포와 대비할 때, PDX1 유전자 발현은 낮은 수준으로 유도되었으며 (도 6i); IF-분석에서 낮은 내지 부재하는 단백질 수준이 반영되었다 (도 6j). 전방 내배엽 TF SOX2는 0.8%의 S3D5 세포가 SOX2 및 CDX2 공존을 나타낸 바와 같이 S3D5 세포에서 관찰되지 않았으며 (도 6k ― 하단; 도 6m), 유전자 발현은 hESC 및 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 미만이었다 (도 6l). 장 중장/후장 내배엽의 적절한 발생에 필수적인, KLF5의 유전자 발현이 S3D5에서 상향조절되었다 (도 6n). CDX2-양성 세포 내의 KLF5의 단백질 공존이 S3D5에서 관찰되었다 (도 6o). ALB 유전자 발현 (도 6p), 및 단백질 존재 (도 6q)는 S3D5 세포에서 관찰되지 않았다. 췌장 계통 할당 TF인 PTF1A의 유전자 발현은 췌장-편향된 S4D3 세포와 달리 S3D5 세포에서 유도되지 않았다 (도 6r). 배아 장의 중장 내배엽에 존재하는 호메오박스 유전자, HOXC5는 S3D5 세포에서 유도되었다 (도 6s). 도 6t는 임신 중기에 시작하는 배아 장 내배엽의 마커인 LGR5가 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다. 도 6u는 장 후장 내배엽의 마커인 HOXA13이 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다 (도 6u).
도 7은 분화 중인 S3D5 세포의 증식 프로파일을 특성화한다. Caco-2 세포의 경우 대부분의 CDX2-단백질 양성 세포가 (KI67 단백질과의 동시발현에 의해 나타난 바와 같이) 활성 세포 주기에 있는 것과 대비하여 (좌측), 3기 동안의 H1-hESC-유래 세포의 증식 지수는 더 낮았다 (S3D5 ― 우측). CDX2 (상단 행) 및 KI67 (하단 행) 단백질 수준이 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. FACS에 의해 평가된, 총 S3D5 세포 (총 세포는 90% 초과의 CDX2-양성 세포임)의 KI67-단백질 양성 세포의 백분율은 14.1%였는데, 이는 S1D3에서 관찰된 백분율 (97.3±1.3), 및 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (99.2±0.2)과는 대조적이었다.
도 8a 내지 도 8f는 CDX2+ 세포의 불균질한 집단의 유도를 보여준다. 도 8a는 각각의 단계에 첨가된 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장/후장 내배엽 세포의 단계-특이적 핵심 마커 (HAND1)를 포함하여 분화 방법에 대한 요약이다. 도 8b는 H1-hESC 세포 (상단 행, 좌측), 500 ng/ml의 FGF4 및 3 μM Chiron99021로 2일간 컨디셔닝된 1기 후 세포 (상단 행, 중간), 500 ng/ml의 FGF4 및 500 ng/ml의 WNT3A로 2일간 컨디셔닝된 1기 후 세포 (상단 행, 우측), RA/BMP4에 의해 컨디셔닝된 S3D5 단층 (하단 행, 좌측), 및 RA/BMP2에 의해 컨디셔닝된 S3D5 단층 (하단 행, 우측)의 위상차 이미지를 보여준다. 2일의 컨디셔닝 후 유전자 발현의 유도가 낮은 수준으로 CDX2에 대해 나타나 있으며 (도 8c), 내배엽 마커 FOXA2에 대해 유지되고 있으며 (도 8d), 중배엽/중간엽 마커 HAND1에 대해 유도되어 있다 (도 8f). KLF5는 유도되지 않았다 (도 8e).
도 2a 내지 도 2d는 골 형성 단백질-4 (BMP4)를 이용하는 분화 방법이 전사체 및 단백질 수준에서 CDX2 및 FOXA2 둘 모두를 포함하는 장의 중장 내배엽 세포들을 단층으로 생성함을 보여준다. 도 2a (하단)는 CDX2 및 FOXA2 단백질 둘 모두에 대해 90.0±5.85%의 S3D5 세포가 공존하였음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (86.0±6.67)과 유사하다. 대조적으로, 완성 내배엽 (DE ― S1D3) 세포에는 CDX2 및 FOXA2 공존이 없었다 (2.3±1.2). 유전자 발현 분석은 3기 동안 CDX2가 유도되었고 (도 2b), FOXA2가 유지되었음 (도 2c)을 보여준다. 도 2d는 FOXA2-양성 원시 장 내배엽 단계, S2D2 (도 2d-i)의 확립 후에 CDX2 단백질 수준 및 CDX2/FOXA2 단백질 공존이 유도되었고, S3D2 (도 2d-ii)까지 점진적으로 증가하였으며, S3D5 (도 2d-iii)에서 Caco-2 세포 (도 2d-iv)에서 보여지는 바와 유사한 수준에 도달하였음을 보여준다. CDX2 단백질은 하단 행에 도시되어 있고, FOXA2 단백질은 상단 행에 도시되어 있다. 정량적 분석을 가능하게 하도록 동일한 파라미터를 사용하여 각각의 이미지를 촬영하였다. 단백질 발현은 FACS에 의해 평가하였으며; 유전자 발현은 qPCR에 의해 평가하였다.
도 3a 내지 도 3q는 확실한 장의 중장 내배엽 유도를 구성하는 추가의 전사 인자 (TF)의 전사체 및 단백질 수준의 S3D5에 의한 유도를 보여주며; 적절한 장의 중장 내배엽이 달성되었다. CDX2 및 FOXA2 동시발현에 더하여, S3D5 세포는 또한 SOX9, PDX1, KLF5, HOXC5 (호메오박스 C5)의 동시발현을 나타내었지만, SOX2 (SRY-박스 2), ALB (알부민), PTF1A (췌장 특이적 전사 인자, 1a), 및 LGR5 (류신 풍부 반복 함유 G 단백질 결합된 수용체 5)의 동시발현은 나타내지 않았다. 모든 TF의 단백질 존재는 별개의 단일 채널 이미지로 도시되어 있다. 도 3a (하단)는 S3D5에서 CDX2 및 SOX9 둘 모두에 대해 98.7±0.25%의 세포가 공존하였음을 보여준다. SOX9 유전자 발현의 강한 유도는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준과 비견되었으며 (도 3b), 면역형광 (IF)-분석에 의해 평가된 바와 같이 단백질 존재가 관찰되었다 (도 3c). 69.4±14.2%의 세포는 CDX2 및 PDX1 둘 모두에 대해 동시-양성이었다 (도 3d - 하단). 췌장-편향된 S4D3 세포와 대비할 때 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0242693호 참조), PDX1 유전자 발현은 낮은 수준으로 유도되었으며 (도 3e), IF-분석에서 낮은 내지 부재하는 단백질 수준이 반영되었다 (도 3f). 전방 내배엽 TF SOX2는 1.45±0.15의 S3D5 세포가 SOX2 및 CDX2 공존을 나타낸 바와 같이 S3D5 세포에서 관찰되지 않았으며 (도 3g ― 하단; 도 3i), 유전자 발현은 hESC 및 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 미만이었다 (도 3h). 장 중장/후장 내배엽의 적절한 발생에 필수적인, KLF5의 유전자 발현이 S3D5에서 상향조절되었다 (도 3j). S3D5에서 CDX2-양성 세포 내의 KLF5의 단백질 공존이 관찰되었다 (도 3k). ALB 유전자 발현 (도 3l), 및 단백질 존재 (도 3m)는 S3D5 세포에서 관찰되지 않았다. 췌장 계통 할당 TF인 PTF1A의 유전자 발현은 췌장-편향된 S4D3 세포와 달리 S3D5 세포에서 유도되지 않았다 (도 3n). 배아 중장 내배엽에 존재하는 호메오박스 유전자, HOXC5는 S3D5 세포에서 유도되었다 (도 3o). 도 3p는 마우스에서 임신 중기에 시작하는 배아 장 내배엽의 마커인 LGR5가 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다. 도 3q는 장 후장 내배엽의 마커인 HOXA13이 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다 (도 3p). 유전자 발현은 qPCR로 평가하였다.
도 4a 및 도 4b는 분화 중인 S3D5 세포의 증식 프로파일을 특성화한다. 도 4a는 Caco-2 세포의 경우 대부분의 CDX2-단백질 양성 세포가 (KI67 단백질과의 동시발현에 의해 나타난 바와 같이) 활성 세포 주기에 있으며 (좌측), 3기 동안의 H1-hESC-유래 세포의 증식 지수는 시간 경과에 따라 감소되었음 (S3D2 ― 중간; S3D5 ― 우측)을 보여준다. CDX2 (상단 행) 및 KI67 (하단 행) 단백질 수준이 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. FACS에 의해 평가된, 총 S3D5 세포 (총 세포는 90% 초과의 CDX2-양성 세포임)의 KI67-단백질 양성 세포의 백분율은 16.8±3.12였는데, 이는 S1D3에서 관찰된 백분율 (97.3±1.3), 및 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (99.2±0.2)과는 대조적이었다 (도 4b).
도 5a 내지 도 5c는 BMP2를 3기 동안 BMP4에 대한 대안으로서 사용하여, CDX2 및 FOXA2 단백질 공존을 갖는 장의 중장 내배엽 세포의 단층을 달성함을 보여준다. 도 5a는 각각의 단계에 첨가된 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장 내배엽 세포의 단계-특이적 마커 (FOXA2, CDX2, KLF5, SOX9, 및 PDX1LO)를 포함하여 분화 방법을 요약한다. S2D2에서 언급된 중성 pH (7.35±0.04)와 대비할 때, 세포를 3기의 전체 동안 BLAR 배지 중에서 약산성인 조건에 노출시켰으며 (pH; S3D1, 6.92; S3D2, 7.01; S3D5, 7.22) (도 5b), 이는 BLAR 배지 중 더 낮은 중탄산나트륨 수준의 결과로서 그러하다. 도 5c는 S3D5 단층 (좌측), 및 Caco-2 세포 (우측)의 대표적인 위상차 이미지를 도시하고; S3D5에서 균일한 형태가 관찰되었다.
도 6a 내지 도 6u는 단층으로의 적절한 장의 중장 내배엽 세포들의 생성을 보여주며, 각각은 전사체 및 단백질 수준에서 CDX2, FOXA2, KLF5, SOX9, PDX1LO 및 HOXC5를 포함한다. IF 이미지의 경우, 모든 TF 단백질 수준은 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. 도 6a (하단)는 CDX2 및 FOXA2 단백질 둘 모두에 대해 94%의 S3D5 세포가 공존하였음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (86.0±6.67)과 유사하거나 더 크다. 유전자 발현 분석은 3기 동안 CDX2가 유도되었고 (도 6b), FOXA2가 유지되었음 (도 6c)을 보여준다. 도 6d는 CDX2 단백질 수준 및 완전한 CDX2/FOXA2 단백질 공존이 S3D5에서 유도되었음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 (도 2d-iv)과 유사한 수준에 도달한다. 도 6e (하단)는 S3D5에서 CDX2 및 SOX9 둘 모두에 대해 99.8%의 세포가 공존하였음을 보여준다. SOX9 유전자 발현의 강한 유도는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준과 비견되었으며 (도 6f), IF-분석에 의해 평가된 바와 같이 단백질 존재가 관찰되었다 (도 6g). 45.5%의 세포는 CDX2 및 PDX1 둘 모두에 대해 동시-양성이었다 (도 6h - 하단). 췌장-편향된 S4D3 세포와 대비할 때, PDX1 유전자 발현은 낮은 수준으로 유도되었으며 (도 6i); IF-분석에서 낮은 내지 부재하는 단백질 수준이 반영되었다 (도 6j). 전방 내배엽 TF SOX2는 0.8%의 S3D5 세포가 SOX2 및 CDX2 공존을 나타낸 바와 같이 S3D5 세포에서 관찰되지 않았으며 (도 6k ― 하단; 도 6m), 유전자 발현은 hESC 및 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 미만이었다 (도 6l). 장 중장/후장 내배엽의 적절한 발생에 필수적인, KLF5의 유전자 발현이 S3D5에서 상향조절되었다 (도 6n). CDX2-양성 세포 내의 KLF5의 단백질 공존이 S3D5에서 관찰되었다 (도 6o). ALB 유전자 발현 (도 6p), 및 단백질 존재 (도 6q)는 S3D5 세포에서 관찰되지 않았다. 췌장 계통 할당 TF인 PTF1A의 유전자 발현은 췌장-편향된 S4D3 세포와 달리 S3D5 세포에서 유도되지 않았다 (도 6r). 배아 장의 중장 내배엽에 존재하는 호메오박스 유전자, HOXC5는 S3D5 세포에서 유도되었다 (도 6s). 도 6t는 임신 중기에 시작하는 배아 장 내배엽의 마커인 LGR5가 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다. 도 6u는 장 후장 내배엽의 마커인 HOXA13이 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다 (도 6u).
도 7은 분화 중인 S3D5 세포의 증식 프로파일을 특성화한다. Caco-2 세포의 경우 대부분의 CDX2-단백질 양성 세포가 (KI67 단백질과의 동시발현에 의해 나타난 바와 같이) 활성 세포 주기에 있는 것과 대비하여 (좌측), 3기 동안의 H1-hESC-유래 세포의 증식 지수는 더 낮았다 (S3D5 ― 우측). CDX2 (상단 행) 및 KI67 (하단 행) 단백질 수준이 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. FACS에 의해 평가된, 총 S3D5 세포 (총 세포는 90% 초과의 CDX2-양성 세포임)의 KI67-단백질 양성 세포의 백분율은 14.1%였는데, 이는 S1D3에서 관찰된 백분율 (97.3±1.3), 및 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (99.2±0.2)과는 대조적이었다.
도 8a 내지 도 8f는 CDX2+ 세포의 불균질한 집단의 유도를 보여준다. 도 8a는 각각의 단계에 첨가된 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장/후장 내배엽 세포의 단계-특이적 핵심 마커 (HAND1)를 포함하여 분화 방법에 대한 요약이다. 도 8b는 H1-hESC 세포 (상단 행, 좌측), 500 ng/ml의 FGF4 및 3 μM Chiron99021로 2일간 컨디셔닝된 1기 후 세포 (상단 행, 중간), 500 ng/ml의 FGF4 및 500 ng/ml의 WNT3A로 2일간 컨디셔닝된 1기 후 세포 (상단 행, 우측), RA/BMP4에 의해 컨디셔닝된 S3D5 단층 (하단 행, 좌측), 및 RA/BMP2에 의해 컨디셔닝된 S3D5 단층 (하단 행, 우측)의 위상차 이미지를 보여준다. 2일의 컨디셔닝 후 유전자 발현의 유도가 낮은 수준으로 CDX2에 대해 나타나 있으며 (도 8c), 내배엽 마커 FOXA2에 대해 유지되고 있으며 (도 8d), 중배엽/중간엽 마커 HAND1에 대해 유도되어 있다 (도 8f). KLF5는 유도되지 않았다 (도 8e).
본 발명은 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 한정되지 않으며, 이는 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
본 발명은 장의 중장 내배엽 세포의 생성에 관한 것이다. 특정 배양 서열을 사용하여 세포를 생성하였다. 따라서, 본 발명은 만능성 줄기 세포로부터 유래된 세포를 CDX2 및 FOXA2의 발현과 같은 장의 중장 내배엽 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기 위한 시험관내 세포 배양을 제공한다. 본 발명은 시험관내 세포 배양을 통해 단층으로 그러한 세포를 획득하고 유지하는 방법을 추가로 제공한다. 소정 실시 형태에서, 본 발명은 레틴산과 BMP4 또는 BMP2 또는 이들의 유사체의 포함이 분화 중인 세포에서 CDX2를 유도하고 FOXA2 단백질 발현을 유지하여 장의 중장 내배엽 세포로의 분화를 촉진시킨다는 발견에 기초한다. CDX2는 완성 내배엽 (1기) 또는 원시 장관 (2기)에서의 단백질 수준에서는 발현되지 않는다. 따라서, 본 발명은 만능성 줄기 세포를 분화시켜 CDX2 및 FOXA2를 발현하는 장의 중장 내배엽 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
줄기 세포는 자가 재생할 뿐만 아니라, 분화되어, 자가 재생 전구체, 비재생 전구체, 및 최종 분화된 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 단일 세포의 능력에 의해 정의되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관내에서 분화되는 이의 능력뿐만 아니라 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 생성시키며 배반포 내로의 주입 후 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 이의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그의 발생능(developmental potential)에 따라 하기와 같이 분류된다: (1) 전능성(totipotent); (2) 만능성; (3) 다능성; (4) 소기능성(oligopotent); 및 (5) 단일기능성(unipotent). 전능성 세포는 모든 배아 및 배외 세포 유형을 생성시킬 수 있다. 만능성 세포는 모든 배아 세포 유형을 생성시킬 수 있다. 다능성 세포는, 세포 계통의 하위세트(subset)이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트를 생성시킬 수 있는 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC (자가 재생), 혈구 세포 제한 소기능성 전구체 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소 (예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음)를 포함한다. 소기능성인 세포는 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 세포 계통의 하위세트를 생성시킬 수 있고; 단일기능성인 세포는 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자형성 줄기 세포)을 생성시킬 수 있다.
줄기 세포는 또한 이것이 얻어질 수 있는 공급원에 기초하여 분류된다. 성체 줄기 세포는 대체로 다수의 분화된 세포 유형을 포함하는 조직에서 발견되는 다능성 미분화 세포이다. 성체 줄기 세포는 스스로 재생할 수 있다. 정상 환경 하에서, 이는 또한 분화되어, 그의 기원이 되는 조직의 특수화된 세포 유형, 및 가능하게는 다른 조직 유형을 제공할 수 있다. 유도 만능성 줄기 세포 (iPS 세포)는 만능성 줄기 세포로 변환되는 성체 세포이다. (문헌[Takahashi et al., Cell, 2006; 126(4):663-676]; 문헌[Takahashi et al., Cell, 2007; 131:1-12]). 배아 줄기 세포는 배반포기 배아의 내세포집단 유래의 만능성 세포이다. 태아 줄기 세포는 태아 조직 또는 막으로부터 기원된 것이다.
배아 조직은 전형적으로 배아 (인간의 경우 수정에서 발생 약 6주까지의 기간을 지칭함)로부터 기원되는 조직으로 정의된다. 태아 조직은, 인간의 경우 발생 약 6주에서 분만까지의 기간을 지칭하는, 태아로부터 기원되는 조직을 지칭한다. 배외 조직은 배아 또는 태아와 관련되지만 이로부터 기원되지 않는 조직이다. 배외 조직은 배외 막 (융모막, 양막, 난황낭 및 요막), 제대 및 태반 (그 자체가 융모막 및 모체 기저탈락막으로부터 형성됨)을 포함한다.
분화는 특수화되지 않은 ("미수임된(uncommitted)") 또는 덜 특수화된 세포가, 예를 들어 장 세포 또는 췌장 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특수화된 ("수임된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, '수임된'이란 용어는 분화 경로에서, 정상적인 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화될 것이며, 정상적인 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화될 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 지칭한다. 탈분화(de-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특수화된 (또는 수임된) 위치로 되돌아가는 과정을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 생성시킬 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다.
넓은 의미에서, 전구 세포는 그 자신보다 더 분화되지만 전구체의 풀(pool)을 보충하는 능력을 유지하는 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포이다. 이 정의에 의하면, 줄기 세포 그 자체는 또한, 최종 분화된 세포에 대한 더 가까운 선구체(precursor)가 그러하듯이, 전구 세포이다. 좁은 의미에서, 전구 세포는 종종 분화 경로에서의 중간체인 세포로 정의되며, 다시 말하면, 이는 줄기 세포로부터 발생하고, 성숙 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트의 생성에서의 중간체이다. 이러한 유형의 전구 세포는 대체로 자가 재생할 수 없다. 따라서, 이러한 유형의 세포가 본 명세서에 지칭되는 경우, 이는 비재생 전구 세포 또는 중간 전구 세포 또는 중간 선구 세포로 지칭될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심 세포에서 차별적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차별적 발현(differential expression)은 미분화된 세포에 비하여 양성 마커에 대한 증가된 수준 및 음성 마커에 대한 감소된 수준을 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아서, 관심 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 특정 마커가 세포에서 충분히 검출될 때, 그 세포는 그 특정 마커에 "대하여 양성"이거나 그 세포는 "양성"이다. 유사하게, 특정 마커가 세포에서 충분히 검출되지 않을 때, 그 세포는 그 특정 마커에 "대하여 음성"이거나 그 세포는 "음성"이다. 특히, 형광 활성화 유세포측정 (FACS)에 의한 양성은 보통 2% 초과인 반면, FACS에 의한 음성 역치는 보통 1% 미만이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 실시간 PCR (RT-PCR)에 의한 양성은 28회 사이클 (Ct) 미만을 가졌고, Taqman® 저밀도 어레이(Low Density Array) (TLDA)를 사용하는 경우에는 33 Ct 미만을 가졌으며; 한편 Open Array®에 의한 음성은 28.5회 사이클 초과이고 TLDA에 의한 음성은 33.5 Ct 초과이다.
정치(static) 시험관내 세포 배양에서 만능성 줄기 세포를 기능성 장의 중장 내분비 세포로 분화시키는 데 있어서, 분화 과정은 종종 연속적인 단계들을 통해 진행되는 것으로 여겨진다. 여기서, 장의 중장 내배엽으로의 분화 과정은 3개의 단계를 통해 일어난다. 이러한 단계적 진행에서, "1기"는 분화 과정에서의 제1 단계, 즉, 만능성 줄기 세포의 완성 내배엽 세포 (이하, 대안적으로 "1기 세포"로 지칭됨)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화를 지칭한다. "2기"는 제2 단계, 즉, 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 원시 장관 세포 (이하, 대안적으로 "2기 세포"로 지칭됨)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화를 지칭한다. "3기"는 제3 단계, 즉, 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 장의 중장 내배엽 세포 (이하, 대안적으로 "3기 세포"로 지칭됨)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화를 지칭한다.
그러나, 특정 집단에서의 모든 세포가 동일한 속도로 이러한 단계들을 통해 진행되는 것은 아니라는 것에 주목해야 한다. 결과적으로, 시험관내 세포 배양에서, 특히 후기 분화 단계에서 집단에 존재하는 다수의 세포들보다 더 적거나 더 많은 분화 경로를 진행한 세포의 존재를 검출하는 것은 드문 일이 아니다. 본 발명을 설명하기 위하여, 상기 확인된 단계들과 관련된 다양한 세포 유형들의 특징들이 본 명세서에 기재된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 세포"는, 낭배형성 동안 상배엽(epiblast)으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하고 위장관 및 그의 파생물을 형성하는 세포를 지칭한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현한다: FOXA2 (간세포 핵 인자 3-β (HNF3β)로도 알려짐), GATA4, SOX17, CXCR4, 단미증(Brachyury), 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99, 및 MIXL1. 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커는 CXCR4, FOXA2 및 SOX17을 포함한다. 따라서, 완성 내배엽 세포는 그의 CXCR4, FOXA2, 및 SOX17 발현을 특징으로 할 수 있다. 게다가, 세포가 1기에 남아 있도록 허용되는 시간의 길이에 따라, HNF4α의 증가가 관찰될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "원시 장관 세포"는, 모든 내배엽성 기관, 예컨대 폐, 간, 췌장, 위, 및 장이 생기게 할 수 있는 완성 내배엽으로부터 유래된 내배엽 세포를 지칭한다. 원시 장관 세포는 완성 내배엽 세포에 의해 발현되는 것에 비해 실질적으로 증가된 그의 HNF4α 발현을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전장 내배엽 세포"는 식도, 폐, 위, 간, 췌장, 담낭, 및 십이지장의 최전방 부분이 생기게 하는 내배엽 세포를 지칭한다. 전장 내배엽 세포는 특히, 그의 SOX2, PDX1, ALB, SOX17 및 FOXA2 발현을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "장의 중장 내배엽 세포"는 소장이 생기게 하는 내배엽 세포를 지칭한다. 장의 중장 내배엽 세포는 그의 CDX2, FOXA2의 발현, 및 PDX1의 낮은 발현 (PDX1LO)을 특징으로 할 수 있다. 소정의 HOX 유전자의 발현은 중장 내배엽과 후장 내배엽을 구별할 수 있다. 예를 들어, HOXC5는 중장 내배엽 세포에서 선택적으로 발현된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "후장 내배엽 세포"는 대장이 생기게 하는 내배엽 세포를 지칭한다. 후장 내배엽 세포는 그의 CDX2, FOXA2, HOXA13 및 HOXD13 발현을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중간엽 세포"는 결합 조직, 예컨대 뼈, 연골, 림프계, 및 순환계를 생기게 하는 중배엽 세포를 지칭한다. HAND1 및 FOXF1의 발현은 중간엽 세포를 한정한다.
"환자" 또는 "대상체" 또는 "숙주"라는 용어는 조성물 또는 약제학적 조성물로 치료되거나 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 포유류를 포함하는 동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 이와 동등한 표현은 인간 만능성 줄기 세포를 분화된 세포 집단으로, 예를 들어 완성 내배엽, 전장 내배엽, 장의 중장 내배엽, 후장 내배엽, 췌장 내배엽 등으로 진행 및 분화시키기에 충분한 성장 인자를 포함하지만 이로 한정되지 않는 소정량의 작용제 또는 화합물을 지칭한다.
용어 "투여하는" 및 "투여"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 세포가 치료 부위에 직접적으로 또는 간접적으로 삽입, 주입, 이식 또는 달리 투여될 수 있음을 의미한다. 세포가 반고체 또는 고체 디바이스로 투여될 때, 이식은 적합한 전달 수단이며, 특히 신체 내의 정확한 위치 내로의, 예컨대 피하 공간, 장막, 간, 신장 (신장 피막) 내로의 외과적 이식이 그러하다. 액체 또는 유체 약제학적 조성물은 더 일반적인 위치에 투여될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 그 내용이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 측정가능한 값, 예를 들어 양, 시간적 길이 등을 지칭할 때 용어 "약"은 명시된 값의 ±20% 내지 ±0.1%, 바람직하게는 ±20% 또는 ±10%, 더 바람직하게는 ±5%, 더욱 더 바람직하게는 ±1%, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 ±0.5%, ±0.1%, 0.05% 또는 0.01%의 변동을 포함하는 것으로 의미되는데, 그러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다.
하기 약어는 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 나타날 수 있다:
ABCG2 - ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 G, 구성원 2;
ALB ― 알부민;
BMP - 골 형성 단백질;
CDX2 - 미측형 호메오박스 2;
CXCR4 - C-X-C 케모카인 4형 수용체;
FAF-BSA - 지방산 무함유 소혈청 알부민;
FGF - 섬유아세포 성장 인자;
FOXA2 - 포크헤드 박스 A2;
GATA4 - GATA 결합 단백질 4;
GDF - 성장 분화 인자;
GIP - 글루코스-의존성 인슐린분비촉진 폴리펩티드;
GLP-1 - 글루카곤-유사 펩티드 1;
GSK3B - 글리코겐 신타제 키나제 3 베타;
HAND1 - 심장 및 신경 능선 유도체 발현 1;
HOX ― 호메오박스;
hTERT ― 인간 텔로머라제 역전사효소;
KLF ― 크루펠-유사 인자;
LGR5 - 류신 풍부 반복 함유 G 단백질 결합된 수용체 5;
MIXL1 - 믹스 쌍형-유사 호메오박스-1(Mix Paired-Like Homeobox-1);
OCT4 - 옥타머-결합 전사 인자 4;
OTX2 - 오르토덴티클 호메오박스 2;
PDX1 - 췌장 및 십이지장 호메오박스 1;
PTF1A - 췌장 특이적 전사 인자, 1a;
SOX - 성별 결정 영역 Y (SRY)-박스;
TRA1-60 - T 세포 수용체 알파-1-60;
UTF1 - 미분화된 배아 세포 전사 인자 1;
WNT3A - 윙리스형 MMTV 통합 부위 패밀리, 구성원 3A; 및
ZFP42 - 징크 핑거 단백질 42.
상세한 설명
만능성 줄기 세포는 3개의 모든 배엽층, 즉 내배엽, 중배엽, 및 외배엽의 조직의 세포로 분화될 잠재력을 갖는다. 사용될 수 있는 만능성 줄기 세포의 예시적인 유형은 확립된 만능성 세포주를 포함하고, 이에는 전-배아 조직 (예컨대, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 임의의 시점에, 전형적으로는 그러나 반드시는 아니고, 대략 10 내지 12주의 임신 전에 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예는, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)와 같은, 확립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아생식 세포주이다. 지지 세포(feeder cell)의 부재 하에서 이미 배양된 만능성 줄기 세포 집단으로부터 취해진 세포가 또한 적합하다. 다수의 만능성 관련 전사 인자들, 예컨대 OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, 및 ZFP42의 강제 발현을 사용하여 성체 체세포로부터 유래되는, iPS, 또는 재프로그래밍된 만능성 세포 (문헌[Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185]; 또한 iPS는 문헌[Cell, 126(4): 663-676]을 참조함)가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 인간 배아 줄기 세포는 또한 문헌[Thomson et al.]에 의해 기재된 바와 같이 제조될 수 있다(미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science, 1998, 282:1145-1147]; 문헌[Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165]; 문헌[Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848]). BG01v (미국 조지아주 애선스 소재의 BresaGen), 또는 성체 인간 체세포로부터 유래된 세포, 예를 들어 문헌[Takahashi et al., Cell 131:1-12 (2007)]에 개시된 세포와 같은 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주가 또한 사용될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능성 줄기 세포는 문헌[Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009)]; 문헌[Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007)]; 문헌[Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240)]; 문헌[Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008)]; 문헌[Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007)]; 및 미국 특허 출원 공개 제2011/0104805호에 기재된 방법에 따라 유래될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 만능성 줄기 세포는 비-배아 기원의 것일 수 있다. 이들 참고문헌, 특허, 및 특허 출원 모두는, 특히, 만능성 세포의 단리, 배양, 확장 및 분화에 관련되므로, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
만능성 줄기 세포는 다양한 단계들을 거쳐 분화되며, 각각의 단계는 특정 마커의 존재 또는 부재를 특징으로 할 수 있다. 이들 단계로의 세포의 분화는 배양 배지에 첨가되는 소정의 인자들의 존재 또는 결여를 포함하는 구체적인 배양 조건들로 달성된다. 일반적으로, 이러한 분화는 만능성 줄기 세포의 완성 내배엽 세포 - 본 명세서에서 1기로 지칭됨 - 로의 분화를 포함할 수 있다. 이어서, 이들 완성 내배엽 세포는 본 명세서에서 2기로 지칭되는 원시 장관 세포로 추가로 분화될 수 있다. 이어서, 원시 장관 세포는 다시 본 명세서에서 3기로 지칭되는 장의 중장 내배엽 세포로 분화될 수 있다.
장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 만능성 줄기 세포의 분화
만능성 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능성 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능성 줄기 세포 마커는, 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2; 크립토(Cripto); FOXD3; CONNEXIN43; CONNEXIN45; OCT4; SOX2; NANOG; hTERT; UTF1; ZFP42; SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; 및 TRA-1-81.
예시적인 만능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 Cellartis)를 포함한다. 만능성 세포의 특징적인 하기의 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 적합하다: ABCG2, 크립토, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 선구 세포이다. 대안적인 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 대안적인 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
장의 중장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 장의 중장 내배엽 세포이며, 여기서 상기 세포는 FOXA2 및 CDX2를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 SOX2, ALB, PTF1A, HOXA13 또는 LGR5를 발현하지 않는다. 실시 형태에서, 장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 장의 중장 내배엽 세포이며, 여기서 상기 세포는 FOXA2, CDX2, SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5 각각을 발현한다. 실시 형태에서, 장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 장의 중장 내배엽 세포이며, 여기서 상기 세포는 SOX2, ALB, PTF1A, HOXA13 및 LGR5 중 어느 것도 발현하지 않는다.
본 발명은 세포 배양 조건 및 배지를 사용하여 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 단계적 유도 분화를 제공한다. 본 발명의 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 도달하기 위하여, 만능성 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포 및 유도 만능성 세포에서 출발하는 프로토콜이 사용된다. 이러한 프로토콜은 하기 단계들을 포함한다.
1기: 세포 배양 라인에서 얻어진 만능성 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포를 적절한 인자로 처리하여 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 발현을 유도한다.
2기: 1기에서 생성된 세포를 적절한 인자로 처리하여 원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 추가 분화를 유도한다.
3기: 2기에서 생성된 세포를 적절한 인자로 처리하여 장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 추가 분화를 유도한다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이러한 방법은 RT-PCR, 노던 블롯(Northern blot), 동소(in situ) 혼성화 (예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참조), 및 면역검정법 (예컨대, 절편화된 재료의 면역조직화학적 분석), 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우, FACS (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참조)를 포함한다. 분화의 효율은 관심 세포 유형의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 작용제 (예컨대, 항체)에 처리된 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
1.
완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 만능성 줄기 세포의 분화
만능성 줄기 세포는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 만능성 줄기 세포는 GDF8 및 GSK3β 억제제 (예컨대, 미국 특허 출원 공개 제2010/0015711호에 개시된 환형 아닐린-피리디노트라이아진 화합물; 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)를 포함한 인자가 보충된 배지, 예컨대 MCDB-131 배지 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies)로 처리되어 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화를 유도한다. 넓은 범위의 GSK3β 억제제, 예컨대 스타우로스포린이 있으며, 바람직한 GSK3β 억제제 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로 [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 있으며, 이는 본 명세서에서 "MCX 화합물"로 지칭된다. 처리는 만능성 줄기 세포를 약 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 50 ng/ml 내지 약 150 ng/ml, 대안적으로 약 75 ng/ml 내지 약 125 ng/ml, 대안적으로 약 100 ng/ml의 GDF8이 보충된 배지와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 처리는 또한 세포를 약 0.1 내지 10 μM, 바람직하게는 약 0.1 내지 5 μM, 대안적으로 약 0.5 내지 약 2.5 μM, 바람직하게는 약 1.5 μM 또는 약 1.0 μM의 MCX 화합물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 배지의 다른 성분은 약 2.7 g/1000 ml 내지 3.6 g/1000 ml, 바람직하게는 2.7 g/1000 ml의 중탄산나트륨; 약 0.1% 내지 2.0%, 바람직하게는 약 0.5%의 FAF-BSA; 1:100 희석 ("1X 농도")의 GlutaMAX™ (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies Corporation); 및 10 mM D-글루코스의 농도를 얻기 위한 약 2 mM 내지 20 mM의 농도 범위, 바람직하게는 4.5 mM의 D-글루코스를 포함할 수 있다.
만능성 세포는 완성 내배엽 세포로의 그의 분화를 촉진시키기 위하여 대략 2 내지 5일, 바람직하게는 약 3 내지 4일 동안 배양될 수 있다. 일 실시 형태에서, 만능성 세포는 유효량의 TGFβ 신호전달 분자 및/또는 GSK3β 억제제, 예를 들어 유효량의 GDF8 및 MCX 화합물의 존재 하에서 1일 동안 배양된 후, GDF8 및 더 낮은 농도의 MCX 화합물의 존재 하에서 1일 동안 배양된 후, MCX 화합물의 부재 하에서의 GDF8의 존재 하에서 1일 동안 배양된다. 상세하게는, 세포는 GDF8 및 약 1.5 μM의 MCX 화합물의 존재 하에서 1일 동안 배양된 후, GDF8 및 약 0.1 μM의 MCX 화합물의 존재 하에서 1일 동안 배양된 후, MCX 화합물의 부재 하에서의 GDF8의 존재 하에서 1일 동안 배양될 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 세포는 GDF8 및 약 1.5 μM의 MCX 화합물의 존재 하에서 1일 동안 배양된 후, GDF8 및 약 0.1 μM의 MCX 화합물의 존재 하에서 1일 동안 배양될 수 있다.
완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 생성은 특정 프로토콜을 이행하기 전과 후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능성 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능성 세포의 분화는 세포가 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커, 예컨대 CXCR4, FOXA2 및 SOX17을 발현하기 시작할 때 검출될 수 있다. 실시 형태에서, 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
2.
완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화
완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화될 수 있다. 일 실시 형태에서, 원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 FGF7을 함유하는 배지, 예컨대 MCDB-131로 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하여 이들 세포를 분화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 배양 배지는 약 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml, 대안적으로 약 30 ng/ml 내지 약 60 ng/ml, 대안적으로 약 50 ng/ml의 FGF7을 포함할 수 있다. 세포는 이러한 조건 하에서 약 2 내지 3일, 바람직하게는 약 2일 동안 배양될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화는 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 FGF7 및 아스코르브산 (비타민 C)과 함께 배양하는 것을 포함한다. 배양 배지, 예컨대 MCDB-131은 약 0.1 mM 내지 약 1.0 mM의 아스코르브산, 바람직하게는 약 0.1 mM 내지 약 1.0 mM, 대안적으로 약 0.2 mM 내지 약 0.4 mM, 대안적으로 약 0.25 mM의 아스코르브산을 포함할 수 있다. 배양 배지는 또한 약 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 대안적으로 약 15 ng/ml 내지 약 30 ng/ml, 대안적으로 약 50 ng/ml 또는 약 25 ng/ml의 FGF7을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지는 약 0.25 mM의 아스코르브산 및 약 50 ng/ml의 FGF7을 포함할 수 있다. 배지의 다른 성분은 약 2.7 g/1000 ml 내지 3.6 g/1000 ml, 바람직하게는 2.7 g/1000 ml의 중탄산나트륨; 약 0.1% 내지 2.0%, 바람직하게는 약 0.5%의 FAF-BSA; 1:100 희석 ("1X 농도")의 GlutaMAX™; 및 10 mM D-글루코스의 농도를 얻기 위한 약 2 mM 내지 20 mM의 농도 범위, 바람직하게는 4.5 mM의 D-글루코스를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 FGF7 및 아스코르브산으로 2일 동안 처리된다. 완성 내배엽 세포의 분화는 세포가 FOXA2의 발현 및 HNF4α의 증가된 발현과 같은 원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하기 시작할 때 검출될 수 있다. 실시 형태에서, 원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시 장관 세포이다.
3.
원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화
원시 장관 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화될 수 있다. 일 실시 형태에서, 원시 장관 세포는 레틴산 및 BMP4 또는 BMP2가 보충된 배양 배지, 예컨대 BLAR 배지 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies, Corporation) 중에서 원시 장관 세포를 배양함으로써 장의 중장 내배엽 세포로 추가로 분화된다. 바람직한 실시 형태에서, 배지에는 약 0.5 μM 내지 약 5 μM의 레틴산, 바람직하게는 약 1 μM, 및 약 10 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 BMP4 또는 BMP2, 바람직하게는 약 50 ng/ml의 BMP4 또는 BMP2가 보충된다. 배지에 대한 다른 보충물은 약 0.1% 내지 2.0%, 바람직하게는 약 0.5%의 FAF-BSA; GlutaMAX™; 및 10 mM D-글루코스의 농도를 얻기 위한 약 2 mM 내지 20 mM의 농도 범위, 바람직하게는 4.5 mM의 D-글루코스를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 원시 장 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 3 내지 5일 동안, 바람직하게는 5일 동안 BMP4 또는 BMP2 및 레틴산으로 처리된다. 배양의 pH는 (S2D2에서의 정상 pH가 7.3 이상인 것과 대비하여) 5일 3기 컨디셔닝 기간 동안 6.8 내지 7.2의 범위일 수 있다.
본 발명은 장의 중장 내배엽 세포를 생성하기 위하여 선택되는 배양 배지 중에서 인간 만능성 줄기 세포를 배양함으로써 장의 중장 내배엽 세포의 집단을 생성하는 방법에 관한 것이다. 실시 형태에서, 본 방법은 단계적 과정에서 인간 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화를 유도한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단이 생성된다. 일부 실시 형태에서, 실질적인 장의 중장 내배엽 세포의 집단이 생성된다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 평면 배양물 상에 단층을 형성하고 유지한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 배양 중에 단층으로서 안정하다. 단층으로서 안정하거나 단층으로서 안정하게 유지되는 세포는 배양 중에 구상체를 형성하지 않는 세포 단층을 지칭한다.
실시 형태에서, 분화된 세포의 50% 초과는 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현한다. 실시 형태에서, 분화된 세포의 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과가 장의 중장 내배엽의 특징적인 마커를 발현한다. 실시 형태에서, 분화된 세포는 장의 중장 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 FACS 분석 및 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 CDX2 및 FOXA2를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 IF 분석 및 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5로부터 선택되는 전사 인자를 발현한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 IF 분석 및 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 SOX2, ALB, PTF1A로부터 선택되는, 그리고 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 HOXA13 및 LGR5로부터 선택되는 전사 인자를 발현하지 않는다.
본 발명의 추가의 실시 형태는 장의 중장 내배엽 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 배양 중인 완성 내배엽 세포의 원시 장관 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 실시 형태에서, 완성 내배엽 세포는 아스코르브산 및 FGF7을 함유하는 배양 배지 중에서 배양된다. 추가의 실시 형태에서, 원시 장관 세포는 레틴산과 BMP2 또는 BMP4를 함유하는 배양 배지 중에서 배양된다. 원시 장관 세포는 장의 중장 내배엽 세포로 분화된다. 일부 실시 형태에서, 원시 장관 세포는 산성 조건 (산성 배양 배지)에서 장의 중장 내배엽 세포로 분화된다. 특정 실시 형태에서, 산성 조건은 BLAR 배지 중에서의 배양이다. 산성 배양의 pH는 (S2D2에서의 정상 pH가 7.3 이상인 것과 대비하여) 원시 장관 세포로부터 장의 중장 내배엽 세포로의 5일 분화 컨디셔닝 기간 동안 6.8 내지 7.2의 범위일 수 있다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 배양 중에 단층을 형성하고 유지한다.
본 명세서에 논의된 실시 형태들 각각에서, 인간 만능성 줄기 세포는 인간 hESC 또는 iPS 세포이다. 상기의 그리고 본 명세서의 실시 형태들 각각에서, 장의 중장 내배엽 세포는 FACS 분석 및 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 CDX2 및 FOXA2를 발현한다. 모든 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 IF 분석 및 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5로부터 선택되는 전사 인자를 발현한다. 상기의 그리고 본 명세서의 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 IF 분석 및 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 SOX2, ALB, PTF1A로부터 선택되는, 그리고 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 HOXA13 및 LGR5로부터 선택되는 전사 인자를 발현하지 않는다. 상기의 그리고 본 명세서의 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 IF 분석 및 qPCR에 의해 CDX2, FOXA2, SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5를 발현한다. 실시 형태들 각각에서, 장의 중장 내배엽 세포는 IF 분석 및 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 SOX2, ALB 및 PTF1A를, 그리고 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 HOXA13 및 LGR5를 발현하지 않는다.
특정 배양 성분 및 배양 조건, 특히 산성 배양 조건, 예컨대 BLAR 배지 중에서의 배양을 사용하는, 상기에 그리고 본 명세서에 기재된 분화 프로토콜의 결과로서, 장의 중장 내배엽 세포에 대한 마커를 발현하는 세포의 배양물이 생성되며; 상기 세포는 qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 중배엽/중간엽 계통의 마커인 HAND1의 발현이 결여되어 있다. 만능성 줄기 세포를 중장/후장 내배엽 계통으로 유도하기 위하여 분화 프로토콜을 변화시킴으로써, 예컨대 원시 장관 세포 2기보다는 오히려 완성 내배엽 1기에서 줄기 세포를 유도함으로써, qPCR에 의해 결정되는 바와 같이 HAND1을 발현하는 내배엽-중간엽 CDX2+ 중장/후장 세포의 혼합 집단이 생성된다.
소정 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 실질적인 장의 중장 내배엽 세포이다. 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 70% 초과의 장의 중장 내배엽 세포, 바람직하게는 80% 초과, 90% 초과, 그리고 95% 초과의 장의 중장 내배엽 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 20% 미만의 중간엽 세포, 바람직하게는 15% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만을 포함한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 HAND1의 발현이 결여되어 있다.
분화된 장의 중장 내배엽 세포의 용도
본 발명의 다른 실시 형태에서, 분화된 장의 중장 내배엽 세포는 단독으로 또는 분화된 또는 성숙한 내분비 세포, 예를 들어 장내분비 세포와 조합되어 당뇨병을 앓고 있거나 이것이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 그러한 실시 형태에서, 분화된 장의 중장 내배엽 세포, 또는 이들의 혼합물은 당뇨병을 갖는 환자, 예를 들어 제1형 또는 제2형 당뇨병을 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 장내분비 세포로 분화되고 성숙한다. 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 장내분비 세포로 분화되고 성숙하며, 장내분비 세포는 인크레틴 유형 호르몬을 발현하거나 분비한다. 실시 형태에서, 인크레틴 호르몬은 GLP1 및 GIP를 포함한다. 세포의 투여는 신체 내 이식 또는 주입, 특히 피하 공간, 장막, 간, 신장 등 내로의 이식을 통해 행해질 수 있다.
상기에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포의 분화는 시험관내에서 유도된다. 다른 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 추가로 생체내에서 분화되고 성숙한다. 다른 실시 형태는 생체내에서, 또는 생체내에서 장내분비 세포와의 혼합물 중에서, 장내분비 세포로 추가로 분화되는 장의 중장 내배엽 세포에 관한 것이다. 그러한 장내분비 세포는 인크레틴 호르몬을 발현하거나 분비한다. 실시 형태에서, 장내분비 세포-분비 인크레틴 호르몬은 GLP1 및 GIP를 포함한다.
추가의 실시 형태에서, 장의 중장 내배엽 세포는 장의 중장 내배엽 세포 유형을 먼저 장내분비 선구체로, 그리고 이어서 인크레틴 발현 또는 분비 장내분비 세포로 고효율로 시험관내 분화를 촉진하는 소분자의 확인을 위한 출발 물질로서의 역할을 한다.
본 명세서에 기재된 것들과 같은 세포 및 세포 집단 및 혼합물은 마이크로- 또는 매크로-캡슐화되고, 후속적으로 포유류 숙주 내로 이식될 수 있다. 캡슐화된 세포 또는 세포 단독은 피하로 또는 신체 내의 다른 어디에든 이식 (투여)될 수 있으며, 이에 의해 세포는 혈관화되고, 생체내에서 분화되고 성숙할 수 있다.
실시예
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 고려하여 더 이해될 수 있다.
실시예 1
CDX2 및 FOXA2 공존/공동발현을 갖는 장의 중장 내배엽 세포 집단을 생성하는 방법
하기 실시예는 인간 배아 줄기 세포 ("hESC")로부터 장의 중장 내배엽 세포를 생성하기 위한 유도-기반 방법을 기술한다. "장의 중장 내배엽"은 마우스 발생 동안 대략 배아 일수 8.5 ("E8.5")에, 또는 인간 배아 발생 동안 약 3 내지 4주 시점에 존재하는, CDX2-양성 및 FOXA2-양성 내배엽 세포인 상응하는 생체내 또는 원위치(in situ) 세포 유형을 지칭한다.
재료 및 방법
세포 배양: 계대 28의 EZ8 배지 (카탈로그 번호 A1516901 Gibco, Thermo Fisher Scientific)와 함께 배양된 인간 배아 줄기 세포주 H1 ("H1-hESC") (WA01 세포, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 WiCell Research Institute)의 세포를 하기를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 영양소 혼합물 F-12 ("DMEM-F12") (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies Corporation, 카탈로그 번호 11330-032)의 배지 중에서 1:30 희석의 MATRIGEL™ (미국 뉴욕주 코닝 소재의 Corning Incorporated, 카탈로그 번호 356231) 코팅된 접시 상에 단일 세포로서 0.094 x 106개의 세포/㎠로 시딩(seeding)하였다:
시딩 후 약 48시간째에, 배양물을 불완전 PBS (마그네슘 또는 칼슘을 함유하지 않는 인산염 완충 식염수) (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies, 카탈로그 번호 14190) 중에서 세척하였다. Rock 억제제 Y-27632 (Y 화합물)는 단지 처음 24시간의 배양 동안에만 사용하였다.
분화: 배양물을 하기 프로토콜을 사용하여 분화시켰다. 프로토콜의 1기 내지 3기 동안, 배양물을 평면 부착성 배양물 상에 유지하였다. 그러나, 전체적으로 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2014/0242693호를 포함한 다른 것들은 현탁 배양물을 사용한 분화를 기재해 왔으며; 본 명세서에 기재된 프로토콜은 현탁액 중에서 변형 및 수행될 수 있으며, 이는 제조의 확장성을 제공한다. 하기의 명명법, S#D#은 1기 내지 3기 동안의 정확한 시간을 명시한다. 예를 들어, S1D3은 1기 3일이다. 간략하게 말하면, 각각의 단계는 완성 내배엽(1기), 원시 장관 (2기), 및 장의 중장 내배엽 (3기)으로의 분화를 규정한다.
a. 1기 (3일): 세포를 하기 1기 배지 중에서 1일 동안 배양하였다:
이어서, 세포를 하기 배지 중에서 추가 1일 동안 배양하였다:
이어서, 세포를 MCX 화합물이 없는 것을 제외하고는 상기 일수 2와 동일한 배지 중에서 추가 1일 동안 배양하였다.
b. 2기 (2일): 세포를 하기 배지로 2일 동안 처리하였다:
c. 3기 (5일): 세포를 BLAR 001 주문제작 배지로 5일 동안 처리하였다:
도 1a 내지 도 4b (BMP4-기반), 및 도 5a 내지 도 7 (BMP2-기반)에 예시된 바와 같이, CDX2 및 FOXA2 단백질 공존을 가지면서 단층으로 장의 중장 내배엽 세포를 달성하기 위해 이 방법에서 3기 동안 BMP4 또는 BMP2가 사용될 수 있다.
[표 I]
분화된 세포의 정량화: 단백질 존재 공동-국재화의 정량화를 위하여, S3D5 세포를 수집하고 FACS에 의해 분석하였다. 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133]에 기재된 바와 같이, 그리고 표 II에 열거된 항체를 사용하여 FACS 염색을 수행하였다. 간략하게 말하면, 분화된 세포를 TrypLE™ Express (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies, 카탈로그 번호 12604) 중에서 37℃에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션하고, 단일-세포 현탁액으로 방출시키고, 이후에 이것을 0.2% BSA를 함유하는 PBS의 염색 완충액 (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 BD Biosciences, 카탈로그 번호 554657)으로 2회 세척하였다. 4℃에서 30분 동안 LIVE/DEAD 바이올렛 형광 반응성 염료 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies, 카탈로그 번호 L34955)를 이용한 후, 차가운 PBS 중에서 단회 세척함으로써 세포내 항체 염색을 달성하였다. 300 μl의 Cytofix/Cytoperm 완충액 (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 BD Biosciences, 카탈로그 번호 554723) 중에서 세포를 고정시킨 후, Perm/Wash 완충액 (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 BD Biosciences, 카탈로그 번호 554722) 중에서 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 30분 (비접합된 항체의 경우) 또는 1시간 (접합된 항체의 경우) 동안 적절한 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서 2회 세척한 후, BD FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 BD FACS Canto II 상에서 분석하였는데, 이때 적어도 30,000회 사건을 획득하였다. 생존 불가능한 세포를 FACS 분석 동안 배제시키고, 동종형 항체 ("IgG")를 사용함으로써 게이팅(gating)을 결정하였다. 제시된 각각의 FACS 실험에 대하여 IgG FACS 데이터가 상단 패널로서 나타나 있다. 양성 대조군, 예컨대 Caco-2 세포, 또는 음성 대조군, 예컨대 S1D3 완성 내배엽 ("DE") 세포를 사용하여 특이성에 대해 항체를 시험하였다.
[표 II]
다양한 단계에서의 단백질 공동-국재화의 정량화를 위하여, Caco-2, S2D2, S3D2 및 S3D5 세포를 단층으로 수집하고, 면역형광 ("IF")에 의해 분석하였다. IF 이미지에서 관찰된 형태는 부착성 배양물의 단층으로부터 세포 스크레이핑(cell scraping)의 방법에 의해 야기된 것임에 유의한다. 문헌[Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133]에 기재된 바와 같이, 그리고 표 III에 열거된 항체를 사용하여, H1-hESC-유래 세포를 제조하고 염색하였다. 동결절단(cryosectioning)을 위하여, 세포를 PBS로 헹군 후, 4% PFA (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 158127) 중에서 4℃에서 하룻밤 고정시켰다. 고정 후, 4% PFA를 제거하고, 세포를 PBS로 2 회 헹구고, 30% 수크로스 용액 (미국 오하이오주 솔론 소재의 Amresco, 카탈로그 번호 0335)에서 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 샘플을 OCT 용액 (미국 캘리포니아주 토랜스 소재의 Sakura Finetek USA Inc., 카탈로그 번호 4583) 중에서 동결보존시키고, 5 μm 절편을 Superfrost 플러스 슬라이드 (미국 펜실베이니아주 래드너 소재의 VWR International, LLC, 카탈로그 번호 48311-703) 상에 놓았다. IF-염색을 위하여, 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 적절한 희석물로 첨가하고, 한편 2차 항체를 실온에서 30분 동안 첨가한 후, PBS로 헹구고, Vectastain 마운팅 시약을 DAPI (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 Vector Laboratories Inc., 카탈로그 번호 H-1200)와 함께 첨가하였다. Nikon Ti 형광 현미경 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 Nikon Instruments, Inc.)을 사용하여 절편을 시각화하였다.
[표 III]
다양한 단계에서의 유전자 발현의 정량화를 위하여, 문헌[Nature Biotechnology, 2014 (32) 11, 1121-1133]에 기재된 바와 같이, Caco-2, H1-hESC, S1D3, S2D2, S3D2 및 S3D5 세포를 수집하였다. 간략하게 말하면, 주문제작 Taqman® 어레이 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)를 사용하여 세포에서 유전자 발현을 평가하였으며; Open Array® (OA)를 CDX2, FOXA2, SOX2, SOX9, PDX1, ALB, PTF1A에 대해 사용하였으며, Taqman® 저밀도 어레이 (TLDA)를 KLF5, HOXC5, 및 LGR5에 대해 사용하였으며, 하우스키핑(housekeeping) 유전자 GAPDH를 두 시험 모두에 대해 사용하였다. 데이터를 Sequence Detection 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)를 사용하여 분석하고, 하우스키핑 유전자로서 GAPDH를 사용하여 ΔΔCt 방법을 사용하여 미분화된 H1-hESC에 대해 정규화하였다. 프라이머 상세사항은 표 IV에 개략적으로 설명되어 있다.
[표 IV]
결과
각각의 단계에 첨가된 중요한 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장 내배엽 세포의 단계-특이적 핵심 마커 (FOXA2; CDX2; KLF5; SOX9; PDX1LO)를 포함하여 분화 방법의 요약이 도 1a에 도시되어 있다. S2D2에 대해 언급된 중성 pH (7.35±0.04)와 대비할 때, 세포를 3기의 전체 동안 BLAR 배지 중에서 약산성인 조건에 노출시켰으며 (pH; S3D1, 6.98±0.05; S3D2, 7.02±0.04; S3D5, 7.18±0.03) (도 1b), 이는 BLAR 배지 중 더 낮은 중탄산나트륨 수준의 결과로서 그러하다. 배양물의 pH는 3기의 5일 동안 약 6.8 내지 7.2의 범위일 수 있다. 도 1c는 S3D5 단층 (좌측), 및 인간 상피 결장 선암종 세포주 ("Caco-2") (우측) - 이는 분화 특성화를 위한 벤치마크로서 사용됨 - 의 대표적인 위상차 이미지를 보여준다. S3D5에서 균일한 형태가 관찰되었다. Nucleocounter® NC-100 (덴마크 알레뢰드 소재의 Chemometec, 카탈로그 번호 900-004)를 사용한 세포수의 특성화는 1개의 hESC가 4.56±2.60개의 S3D5 후장 내배엽 세포로 분화되었음을 보여준다 (도 1d).
BMP4를 이용한 분화 방법은 장의 중장 내배엽 세포들을 단층으로 효율적으로 생성 및 유지하며, 각각은 전사체 및 단백질 수준에서 CDX2 및 FOXA2 둘 모두를 포함한다. 도 2a (하단)는 CDX2 및 FOXA2 단백질 둘 모두에 대해 90.0±5.85%의 S3D5 세포가 공존하였음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (86.0±6.67)과 유사하다. 대조적으로, 완성 내배엽 (DE ― S1D3) 세포에는 CDX2 및 FOXA2 공존이 없었다 (2.3±1.2). 유전자 발현 분석은 3기 동안 CDX2가 유도되었고 (도 2b), FOXA2가 유지되었음 (도 2c)을 보여준다. 도 2d는 FOXA2-양성 원시 장 내배엽 단계, S2D2 (도 2d-i)의 확립 후에 CDX2 단백질 수준 및 CDX2/FOXA2 단백질 공존이 유도되었고, S3D2 (도 2d-ii)까지 점진적으로 증가하였으며, S3D5 (도 2d-iii)에서 Caco-2 세포 (도 2d-iv)에서 보여지는 바와 유사한 수준에 도달하였음을 보여준다. CDX2 단백질은 하단 행에 도시되어 있고, FOXA2 단백질은 상단 행에 도시되어 있다.
추가의 TF의 전사체 및 단백질 수준이 S3D5에서 발견되는데, 이들은 확실한 장의 중장 내배엽 유도를 구성한다. 도 3a 내지 도 3p는 적절한 장의 중장 내배엽이 달성되었음을 보여준다. CDX2 및 FOXA2 공존에 더하여, S3D5 세포는 또한 SOX9, PDX1, KLF5, HOXC5의 공존을 나타내었지만, SOX2, ALB, PTF1A, 및 LGR5는 발현하지 않았다. 모든 TF의 단백질 존재는 별개의 단일 채널 이미지로 도시되어 있다. 도 3a (하단)는 S3D5에서 CDX2 및 SOX9 둘 모두에 대해 98.7±0.25%의 세포가 공존하였음을 보여준다. SOX9 유전자 발현의 강한 유도는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준과 비견되었으며 (도 3b), IF-분석에 의해 평가된 바와 같이 단백질 존재가 관찰되었다 (도 3c). 69.4±14.2%의 세포는 CDX2 및 PDX1 둘 모두에 대해 동시-양성이었다 (도 3d - 하단). 췌장-편향된 S4D3 세포 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0242693호 참조)와 대비할 때, PDX1 유전자 발현은 낮은 수준으로 유도되었으며 (도 3e), 이는 IF-분석에서 낮은 내지 부재하는 단백질 수준으로 반영되었다 (도 3f).
S3D5 세포는 전방 내배엽 TF SOX2를 발현하지 않았고, S3D5 세포의 단지 1.45±0.15만이 SOX2 및 CDX2 공존을 나타내었으며 (도 3g ― 하단; 도 3i), 유전자 발현은 hESC 및 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 미만이었다 (도 3h). 후장 내배엽의 적절한 발생에 필수적인, KLF5의 유전자 발현이 S3D5에서 상향조절되었다 (도 3j). S3D5에서 CDX2-양성 세포 내의 KLF5의 단백질 공존이 관찰되었다 (도 3k). ALB 유전자 발현 (도 3l), 및 단백질 존재 (도 3m)는 S3D5 세포에서 관찰되지 않았다. 유사하게, 췌장 계통 마커인 PTF1A의 유전자 발현은 췌장-편향된 S4D3 세포와 대비할 때 S3D5 세포에서 유도되지 않았다 (도 3n). 배아 장의 중장 내배엽에 존재하는 호메오박스 유전자, HOXC5는 S3D5 세포에서 강하게 유도되었다 (도 3o). 도 3p는 마우스에서 임신 중기에 시작하는 배아 장 내배엽의 마커인 LGR5가 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다 (도 3p). 도 3q는 장 후장 내배엽의 마커인 HOXA13이 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다 (도 3p).
도 4a 및 도 4b는 분화 중인 S3D5 세포의 증식 프로파일을 예시한다. 도 4a는 Caco-2 세포의 경우 대부분의 CDX2-단백질 양성 세포가 (KI67 단백질과의 동시발현에 의해 나타난 바와 같이) 활성 세포 주기에 있으며 (좌측), 3기 동안의 H1-hESC-유래 세포의 증식 지수는 시간 경과에 따라 감소되었음 (S3D2 ― 중간; S3D5 ― 우측)을 보여준다. CDX2 (상단 행) 및 KI67 (하단 행) 단백질 수준이 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. FACS에 의해 평가된, 총 S3D5 세포 (총 세포는 90% 초과의 CDX2-양성 세포임)의 KI67-단백질 양성 세포의 백분율은 16.8±3.12였는데, 이는 S1D3에서 관찰된 백분율 (97.3±1.3), 및 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (99.2±0.2)과는 대조적이었다 (도 4b).
BMP2는 이 방법에서 3기 동안 BMP4에 대한 대안으로서 사용되어, CDX2 및 FOXA2 단백질 공존을 갖는 장의 중장 내배엽 세포의 단층을 생성할 수 있다. 도 5a는 각각의 단계에 첨가된 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장 내배엽 세포의 단계-특이적 핵심 마커 (FOXA2, CDX2, KLF5, SOX9, 및 PDX1LO)를 포함하여 분화 방법의 요약을 도시한다. S2D2에서 언급된 중성 pH (7.35±0.04)와 대비할 때, 세포를 3기의 전체 동안 BLAR 배지 중에서 약산성인 조건에 노출시켰으며 (pH; S3D1, 6.92; S3D2, 7.01; S3D5, 7.22) (도 5b), 이는 BLAR 산성 배지 중 더 낮은 중탄산나트륨 수준의 결과로서 그러하다. 도 5c는 S3D5 단층 (좌측), 및 Caco-2 세포 (우측)의 대표적인 위상차 이미지를 도시한다. S3D5에서 균일한 형태가 관찰되었다.
분화 방법은 단층으로 적절한 장의 중장 내배엽 세포들을 생성 및 유지하며, 각각은 전사체 및 단백질 수준에서 CDX2, FOXA2, KLF5, SOX9, PDX1LO 및 HOXC5를 포함한다. 모든 TF 단백질 수준은 단일 채널 IF 이미지로서 도시되어 있다. 도 6a (하단)는 CDX2 및 FOXA2 단백질 둘 모두에 대해 94%의 S3D5 세포가 공존하였음을 보여주는데, 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (86.0±6.67)과 유사하다. 유전자 발현 분석은 3기 동안 CDX2가 유도되었고 (도 6b), FOXA2가 유지되었음 (도 6c)을 보여준다. 도 6d는 CDX2 단백질 수준 및 완전한 CDX2/FOXA2 단백질 공존이 S3D5에서 유도되었음을 보여주는데 (도 6d), 이는 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 (도 2d-iv)과 비견된다. 도 6e (하단)는 S3D5에서 CDX2 및 SOX9 둘 모두에 대해 99.8%의 세포가 공존하였음을 보여준다. SOX9 유전자 발현의 강한 유도는 Caco-2 세포에서의 수준과 유사하게 관찰되었으며 (도 6f), IF-분석에 의해 평가된 바와 같이 단백질 존재가 관찰되었다 (도 6g). 45.5%의 세포는 CDX2 및 PDX1 둘 모두에 대해 동시-양성이었다 (도 6h - 하단). 췌장-편향된 S4D3 세포와 대비할 때, PDX1 유전자 발현은 낮은 수준으로 유도되었으며 (도 6i), IF-분석에서 낮은 내지 부재하는 단백질 수준이 반영되었다 (도 6j). 전방 내배엽 TF SOX2는 0.8%의 S3D5 세포가 SOX2 및 CDX2 공존을 나타낸 바와 같이 S3D5 세포에서 관찰되지 않았으며 (도 6k ― 하단; 도 6m), 유전자 발현은 hESC 및 Caco-2 세포에서 관찰된 수준 미만이었다 (도 6l). 후장 내배엽의 적절한 발생을 입증하기 위한 필수 마커인 KLF5의 유전자 발현이 S3D5에서 강하게 상향조절되었다 (도 6n). S3D5에서 CDX2-양성 세포 내의 KLF5의 단백질 공존이 관찰되었다 (도 6o). ALB 유전자 발현 (도 6p), 및 단백질 존재 (도 6q)는 S3D5 세포에서 관찰되지 않았다. 췌장 계통 할당 TF인 PTF1A의 유전자 발현은 췌장-편향된 S4D3 세포와 대비할 때 S3D5 세포에서 유도되지 않았다 (도 6r). 배아 장의 중장 내배엽에 존재하는 호메오박스 유전자, HOXC5는 S3D5 세포에서 강하게 유도되었다 (도 6s). 도 6t는 임신 중기에 시작하는 배아 장 내배엽의 마커인 LGR5가 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다. 도 6u는 장 후장 내배엽의 마커인 HOXA13이 S3D5 세포에서 유도되지 않았음을 보여준다 (도 6u).
도 7은 분화 중인 S3D5 세포의 증식 프로파일을 특성화하는데, 이는 Caco-2 세포의 경우 대부분의 CDX2-단백질 양성 세포가 (KI67 단백질과의 동시발현에 의해 나타난 바와 같이) 활성 세포 주기에 있으며 (좌측), 이와 대비하여, 3기 동안의 H1-hESC-유래 세포의 증식 지수는 더 낮았음 (S3D5 ― 우측)을 보여준다. CDX2 (상단 행) 및 KI67 (하단 행) 단백질 수준이 단일 채널 이미지로서 도시되어 있다. FACS에 의해 평가된 바와 같은, 총 S3D5 세포 (총 세포는 90% 초과의 CDX2-양성 세포임)의 KI67-단백질 양성 세포의 백분율은 14.1%였는데, 이는 S1D3에서 관찰된 백분율 (97.3±1.3)과 대조적이었고, Caco-2 세포에서 관찰된 백분율 (99.2±0.2)과 대비되었다 (도 7; 도 4b).
실시예 2
완성 내배엽으로부터 시작하여 FGF4 및 WNT-효능제를 사용한 장 배양은 CDX2+ 중장/후장 세포의 내배엽-중간엽 혼합물을 생성한다
본 실시예는 완성 내배엽 단계에서 시작하여 FGF4 및 WNT-효능제를 사용한 장 배양으로부터 CDX2+ 중장/후장 세포의 내배엽-중간엽-혼합 품질이 생성되었음을 보여준다 (문헌[Spence et al., Nature, 2011; 470:105-109]; 문헌[Watson et al. Nature Med, 2014; 11:1310-1314]). 하기의 문헌[Spence et al.]에 기재된 중장/후장 내배엽 세포에 대한 유도를 조사하기 위하여, hESC를 하기 프로토콜을 사용하여 분화시켰다. 본 실시예에 개략적으로 설명된 분화 조건은 하기에 의해 실시예 1과 상이함에 유의한다: (i) 장 조건 출발점이 완성 내배엽 단계에서 시작되며; (ii) RA 및 BMP4 또는 BMP2와 상이한 성장 인자 및 소분자가 사용되고; (iii) 산성 배양 조건은 사용되지 않는다.
재료 및 방법
세포 배양: H1-hESC 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하고 유지하였다.
분화: 배양물을 하기 프로토콜을 사용하여 분화시켰다.
1기-모방(Mimic) (3일): 세포를 하기 1기 배지 중에서 1일 동안 배양하였다:
이어서, 세포를 하기 배지 중에서 추가 1일 동안 배양하였다:
이어서, 세포를 하기 배지 중에서 추가 1일 동안 배양하였다:
1기 후 (2일): 예를 들어, pS1d1은 1기 후 1일이고, pS1d2는 1기 후 2일이다. 세포를 하기의 1기 후 배지 중에서 2일 동안 배양하였다:
정량화: 위상차 이미징 및 유전자 발현의 정량화는 실시예 1에서의 절차를 따랐다.
결과
각각의 단계에 첨가된 배지 성분, 성장 인자 및 소분자, 그리고 분화 중인 장의 중장/후장 내배엽 세포의 단계-특이적 시그너처 또는 핵심 마커 (HAND1)를 포함하여 분화 방법의 요약이 도 8a에 도시되어 있다. 장 컨디셔닝 (1기 후)은 500 ng/ml의 FGF4, 및 3 μM Chiron99021 (문헌[Watson et al.]), 또는 500 ng/ml의 Wnt3A (문헌[Spence et al.])를 사용하여, 완성 내배엽 단계에서 시작하였다. 용어 "1기-모방"은 실시예 1에 기재된 1기 컨디셔닝을 지칭하는 "S1D3-원래(Original)"와 상이한, 본 실시예에서의 완성 내배엽 분화 프로토콜을 지칭한다. 도 8b는 H1-hESC 세포 (상단 행, 좌측), 500 ng/ml의 FGF4 및 3 μM Chiron99021로 2일간 컨디셔닝된 1기 후 세포 (상단 행, 중간), 500 ng/ml의 FGF4 및 500 ng/ml의 Wnt3A로 2일간 컨디셔닝된 1기 후 세포 (상단 행, 우측), 그리고 이와 함께 (실시예 1 로부터의) RA/BMP4에 의해 컨디셔닝된 S3D5 단층 (하단 행, 좌측) 및 RA/BMP2에 의해 컨디셔닝된 S3D5 단층 (하단 행, 우측)의 위상차 이미지를 보여준다.
CDX2 유전자 발현의 유도는 2일의 컨디셔닝 후에 달성되었지만, RA/BMP2 또는 RA/BMP4 S3D5와 대비하여 훨씬 더 낮은 수준으로 이루어졌다 (도 8c). 그러나, 내배엽 마커 FOXA2의 유전자 발현은 유지되었고 (도 8d), 중배엽/중간엽 마커 HAND1이 강하게 유도되었다 (도 8f). 또한, KLF5는 RA/BMP4 및 RA/BMP2 컨디셔닝에 의한 것과 달리 2일 시점에서 유도되지 않았다 (도 8e). 도 8f에 결론적으로 도시된 바와 같이, 이러한 유전자 발현 패턴은 CDX2+ FOXA2+ 내배엽 집단뿐만 아니라 상당한 중간엽 CDX2+ 세포 집단을 함유하는 문헌[Watson et al.] 및 문헌[Spence et al.]에서 보여지는 불균질한 세포 집단에 대한 반영이다. 대조적으로, RA/BMP4 또는 RA/BMP2 2기 후 (원시 장관 세포) 컨디셔닝은 중배엽/중간엽 마커 HAND1을 유도하지 않았으며; 단지 내배엽 CDX2+ FOXA2+ 집단이 유도되었다.
본 발명 및 그의 다양한 실시 형태를 기술함에 있어서, 명확함을 위해 특정 용어가 사용된다. 그러나, 본 발명은 그렇게 선택되는 특정 용어에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 다른 등가의 구성요소가 사용될 수 있고 다른 방법이 본 발명의 광범위한 개념을 벗어나지 않고서 개발될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서의 어디에서든 인용된 모든 참고 문헌은 마치 각각이 개별적으로 포함된 것처럼 참고로 포함된다.
Claims (10)
- 장의 중장 내배엽 세포의 집단을 제조하는 방법으로서,
원시 장관 세포를 장의 중장 내배엽 세포로 분화시키기 위해, 원시 장관 세포를
레틴산 및
BMP2 또는 BMP4를 포함하는 배양 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하여,
실질적인 장의 중장 내배엽 세포의 집단을 제조하는 것으로서,
여기서 상기 장의 중장 내배엽 세포는 CDX2 및 FOXA2를 발현하는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 장의 중장 내배엽 세포는 배양 배지에서 단일층을 형성하고 유지하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원시 장관 세포가 레틴산 및 BMP2를 포함하는 배양 배지 중에서 배양되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원시 장관 세포가 레틴산 및 BMP4를 포함하는 배양 배지 중에서 배양되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장의 중장 내배엽 세포는 SOX9, PDX1, KLF5 및 HOXC5로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자를 발현하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장의 중장 내배엽 세포는 SOX2, ALB, PTF1A, HOXA13 및 LGR5로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자를 발현하지 않는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실질적인 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 중간엽 세포를 포함하지 않는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실질적인 장의 중장 내배엽 세포의 집단은 HAND1을 발현하지 않는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양하는 단계가 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것인, 방법.
- 삭제
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662322636P | 2016-04-14 | 2016-04-14 | |
US62/322,636 | 2016-04-14 | ||
PCT/US2017/025847 WO2017180361A1 (en) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | Differentiation of pluripotent stem cells to intestinal midgut endoderm cells |
KR1020227017510A KR102509926B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020227017510A Division KR102509926B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20230038322A KR20230038322A (ko) | 2023-03-17 |
KR102619151B1 true KR102619151B1 (ko) | 2023-12-27 |
Family
ID=60039713
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020187029579A KR102162505B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
KR1020237008352A KR102619151B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
KR1020227017510A KR102509926B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
KR1020207027896A KR102403165B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020187029579A KR102162505B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020227017510A KR102509926B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
KR1020207027896A KR102403165B1 (ko) | 2016-04-14 | 2017-04-04 | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10420803B2 (ko) |
EP (1) | EP3443073B1 (ko) |
JP (3) | JP6705911B2 (ko) |
KR (4) | KR102162505B1 (ko) |
CN (2) | CN115449506A (ko) |
AR (1) | AR108134A1 (ko) |
AU (1) | AU2017251651B2 (ko) |
BR (1) | BR112018070293A2 (ko) |
CA (1) | CA3020905A1 (ko) |
MA (1) | MA45479A (ko) |
MX (1) | MX2018012629A (ko) |
PH (1) | PH12018502061A1 (ko) |
RU (2) | RU2741114C2 (ko) |
SG (1) | SG11201807915QA (ko) |
TW (1) | TW201803983A (ko) |
WO (1) | WO2017180361A1 (ko) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MA45479A (fr) * | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
US20220234006A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-28 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
CA3139585C (en) | 2019-05-31 | 2024-01-23 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
WO2020243668A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
CN114173837A (zh) | 2019-05-31 | 2022-03-11 | W.L.戈尔及同仁股份有限公司 | 生物相容性膜复合材料 |
CN110540962B (zh) * | 2019-08-28 | 2022-02-25 | 北京协同创新研究院 | 一种制备人定型内胚层细胞的方法 |
EP4190893A1 (en) * | 2020-07-30 | 2023-06-07 | Riken | Bladder organoid and method for producing same |
Family Cites Families (268)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
US5759830A (en) | 1986-11-20 | 1998-06-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
SU1767433A1 (ru) | 1989-11-27 | 1992-10-07 | Пермский государственный медицинский институт | Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа |
US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
US5795965A (en) | 1991-04-25 | 1998-08-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reshaped human to human interleukin-6 receptor |
US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
JP2813467B2 (ja) | 1993-04-08 | 1998-10-22 | ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド | 細胞培養法および培地 |
US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ko) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
ES2170815T5 (es) | 1994-12-29 | 2012-11-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Uso de un anticuerpo PM-1 o de un anticuerpo MH166 para potenciar el efecto antitumoral de cisplatino o carboplatino |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
US5681561A (en) | 1995-06-07 | 1997-10-28 | Life Medical Sciences, Inc. | Compositions and methods for improving autologous fat grafting |
EP0986635A4 (en) | 1997-01-10 | 2001-11-07 | Life Technologies Inc | SERUM SUBSTITUTE FOR EMBRYONIC STEM CELLS |
US5965583A (en) | 1997-04-24 | 1999-10-12 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory disease |
WO1999001145A1 (en) | 1997-07-03 | 1999-01-14 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells from peripheral blood |
WO1999014318A1 (en) | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
CA2307807C (en) | 1997-10-23 | 2008-09-02 | Andrea G. Bodnar | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
ZA9811898B (en) | 1997-12-29 | 2000-06-28 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Anti-Inflammatory Compounds. |
US6328960B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-12-11 | Osiris Therapeutics, Inc. | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
IL144359A0 (en) | 1999-01-21 | 2002-05-23 | Vitro Diagnostics Inc | Immortalized cell lines and methods of making the same |
US6800460B1 (en) | 1999-03-11 | 2004-10-05 | Schering Corporation | Mammalian cytokine complexes |
US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
CA2385628A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Ammon B. Peck | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
US6753153B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-06-22 | The Scripps Research Institute | Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
EP2295539A1 (en) | 2000-06-26 | 2011-03-16 | Nc Medical Research Inc. | Cell fractions containing cells capable of differentiating into neural cells |
ES2372028T3 (es) | 2000-10-23 | 2012-01-13 | Glaxosmithkline Llc | Nuevo compuesto de 8h-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona trisustituida para el tratamiento de enfermedades mediadas por la csbp/p38 quinasa. |
MXPA03005140A (es) | 2000-12-08 | 2004-10-15 | Johnson & Johnson | Compuestos de pirrolina sustituidos con indazolilo como inhibidores de cinasa. |
MXPA03005139A (es) | 2000-12-08 | 2004-01-29 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos macroheterociclicos utiles como inhibidores de cinasa. |
US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
WO2002059278A2 (en) | 2001-01-24 | 2002-08-01 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Department Of Health & Human Services | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
FI2251344T4 (fi) | 2001-01-25 | 2024-04-29 | The United States Of America Represented By The Secretary | Boronihappoyhdisteiden formulointi |
US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
JP2004527249A (ja) | 2001-04-19 | 2004-09-09 | デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング | 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法 |
ATE421991T1 (de) | 2001-04-24 | 2009-02-15 | Ajinomoto Kk | Stammzellen und verfahren zu deren trennung |
JP2004531262A (ja) | 2001-05-15 | 2004-10-14 | ラッパポート ファミリー インスチチュート フォア リサーチ イン ザ メディカル サイエンシズ | ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞 |
US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
AU2002319780A1 (en) | 2001-08-06 | 2003-02-24 | Bresagen, Ltd. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
EP1444345A4 (en) | 2001-10-18 | 2004-12-08 | Ixion Biotechnology Inc | TRANSFORMATION OF STEM CELLS AND LIVER PROGENITORS INTO FUNCTIONAL CELLS OF PANCREAS |
JP4330995B2 (ja) | 2001-11-15 | 2009-09-16 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | 絨毛膜絨毛、羊水、および胎盤からの胎児性幹細胞を単離、増殖、および分化させる方法、ならびにその治療的使用方法 |
EP2264146A1 (en) | 2001-12-07 | 2010-12-22 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
EP2308963A3 (en) | 2001-12-07 | 2011-09-21 | Cytori Therapeutics, Inc. | System for processing lipoaspirate cells |
AU2002218893A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-09 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
US20050095703A1 (en) | 2001-12-28 | 2005-05-05 | Henrik Semb | Method for the establishment of a pluripotent human blastocyst - derived stem cell line |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
US20030180268A1 (en) | 2002-02-05 | 2003-09-25 | Anthony Atala | Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ |
JPWO2003087349A1 (ja) | 2002-04-17 | 2005-08-18 | 大塚製薬株式会社 | 間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法 |
US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
GB0210539D0 (en) | 2002-05-08 | 2002-06-19 | Univ Edinburgh | Control of es cell self renewal and lineage specification, and medium therefor |
AU2003225295A1 (en) | 2002-05-08 | 2003-11-11 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Substituted pyrroline kinase inhibitors |
US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
CA2487094A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-11 | Becton, Dickinson And Company | Methods for in vitro expansion and transdifferentiation of human pancreatic acinar cells into insulin-producing cells |
AU2003238874A1 (en) | 2002-06-05 | 2003-12-22 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
US20040110287A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-06-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose responsive cells |
WO2004016747A2 (en) | 2002-08-14 | 2004-02-26 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
US7371576B2 (en) | 2002-09-06 | 2008-05-13 | Reneuron, Inc. | CD56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
WO2004044158A2 (en) | 2002-11-08 | 2004-05-27 | The Johns Hopkins University | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
US20060040385A1 (en) | 2002-12-05 | 2006-02-23 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
PT2457999T (pt) | 2002-12-16 | 2019-01-28 | Technion Res & Dev Foundation | Sistema de cultura para células estaminais pluripotentes |
US20050118148A1 (en) | 2002-12-20 | 2005-06-02 | Roland Stein | Compositions and methods related to mammalian Maf-A |
US7560276B2 (en) | 2003-06-27 | 2009-07-14 | Ethicon, Incorporated | Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells |
RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
EP1588708A4 (en) | 2003-01-29 | 2006-03-01 | Takeda Pharmaceutical | METHOD FOR PRODUCING COATED PREPARATION |
WO2004073633A2 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
US20070154981A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
CA2520861A1 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
US20060194315A1 (en) | 2003-03-31 | 2006-08-31 | Condie Brian G | Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
US20050042595A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Martin Haas | Banking of multipotent amniotic fetal stem cells |
US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
JP2007503815A (ja) | 2003-08-27 | 2007-03-01 | ステムセルズ・カリフォルニア・インコーポレイテッド | 富化された膵臓幹細胞および前駆細胞集団、ならびにこれらの集団の同定、単離および富化方法 |
EP1696899A1 (en) | 2003-12-17 | 2006-09-06 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
CN109628371B (zh) | 2003-12-23 | 2021-02-19 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
WO2005063971A2 (en) | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Cythera, Inc | Definitive endoderm |
US7541185B2 (en) * | 2003-12-23 | 2009-06-02 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
WO2005065354A2 (en) | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
WO2005071066A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells |
US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
GB2441530B (en) | 2004-02-12 | 2009-09-23 | Univ Newcastle | Stem Cells |
WO2005080598A1 (ja) | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
WO2005086860A2 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
AU2005221079B2 (en) | 2004-03-10 | 2010-07-22 | Regents Of The University Of California | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
WO2005090557A1 (ja) | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. | 多能性幹細胞の増殖方法 |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
AU2005230832B2 (en) | 2004-04-01 | 2010-11-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage |
CN103103158B (zh) | 2004-04-27 | 2016-08-03 | 韦尔赛特公司 | 细胞培养基 |
JP5687816B2 (ja) * | 2004-07-09 | 2015-03-25 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法 |
MX2007001772A (es) | 2004-08-13 | 2007-07-11 | Univ Georgia Res Found | Composiciones y metodos para auto-renovacion y diferenciacion de celulas troncales embrionicas humanas. |
US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
ES2708384T3 (es) | 2004-09-08 | 2019-04-09 | Wisconsin Alumni Res Found | Cultivo de células madre embrionarias humanas |
NZ553241A (en) | 2004-09-08 | 2009-11-27 | Wisconsin Alumni Res Found | Medium and culture of pluripotent stem cells |
JP4824036B2 (ja) * | 2004-12-23 | 2011-11-24 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | 胚体内胚葉細胞の増殖 |
US20060275899A1 (en) | 2004-12-30 | 2006-12-07 | Stemlifeline, Inc. | Methods and compositions relating to embryonic stem cell lines |
WO2006079854A1 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Novathera Ltd | Methods for embryonic stem cell culture |
AU2006210955A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
US20060182724A1 (en) | 2005-02-15 | 2006-08-17 | Riordan Neil H | Method for expansion of stem cells |
PL1860950T3 (pl) | 2005-03-04 | 2017-09-29 | Lifescan, Inc. | Dojrzałe komórki podścieliska pochodzenia trzustkowego |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
WO2006113470A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
US20080227656A1 (en) | 2005-04-26 | 2008-09-18 | Flemming Besenbacher | Biosurface Structure Array |
WO2006126574A1 (ja) | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Kumamoto University | Es細胞の分化誘導方法 |
AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
RU2007147917A (ru) | 2005-06-10 | 2009-07-20 | Айрм Ллк (Bm) | Соединения, поддерживающие плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток |
WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
WO2006137787A1 (en) | 2005-06-21 | 2006-12-28 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method for cell culture |
AU2006262369B2 (en) | 2005-06-22 | 2012-07-05 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Suspension culture of human embryonic stem cells |
EA017545B1 (ru) | 2005-06-30 | 2013-01-30 | Янссен Фармацевтика Н.В. | Циклические анилино-пиридинотриазины в качестве ингибиторов gsk-3 |
WO2007016485A2 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Athersys, Inc. | Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells |
CA2616863A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Australian Stem Cell Centre Limited | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
US8476070B2 (en) | 2005-08-29 | 2013-07-02 | Technion Research & Development Foundation Limited | Media for culturing stem cells |
WO2007027156A1 (en) | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Agency For Science, Technology And Research | Method of deriving mesenchymal stem cells |
GB2444686B (en) | 2005-09-12 | 2010-08-25 | Es Cell Int Pte Ltd | Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins |
WO2007047509A2 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
US7732202B2 (en) | 2005-10-21 | 2010-06-08 | International Stem Cell Corporation | Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells |
EP1957636B1 (en) | 2005-10-27 | 2018-07-04 | Viacyte, Inc. | Pdx1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm |
AU2006325975B2 (en) | 2005-12-13 | 2011-12-08 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
CA2643478C (en) | 2006-02-23 | 2019-06-18 | Novocell, Inc. | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
JP6110048B2 (ja) | 2006-03-02 | 2017-04-05 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法 |
US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
GB0615327D0 (en) | 2006-03-30 | 2006-09-13 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof |
ES2725601T3 (es) | 2006-04-28 | 2019-09-25 | Lifescan Inc | Diferenciación de células madre embriónicas humanas |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
WO2007130474A2 (en) | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
WO2007136673A2 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Medistem Laboratories, Inc. | Treatment of disc degenerative disease and compositions for same |
US7964402B2 (en) | 2006-05-25 | 2011-06-21 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
WO2007143193A1 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems |
WO2007149182A2 (en) | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
PL2046946T3 (pl) | 2006-06-26 | 2017-04-28 | Lifescan, Inc. | Hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
US8968994B2 (en) | 2006-07-06 | 2015-03-03 | Jeremy Micah Crook | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
WO2008013664A2 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
DK3441459T3 (da) | 2006-08-02 | 2021-06-07 | Technion Res & Dev Foundation | Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
US20080091234A1 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-17 | Kladakis Stephanie M | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
US20100323442A1 (en) | 2006-10-17 | 2010-12-23 | Emmanuel Edward Baetge | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
JP5343267B2 (ja) | 2006-10-17 | 2013-11-13 | スティーフェル・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | タラロゾール代謝物 |
US8835163B2 (en) | 2006-10-18 | 2014-09-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
JP5067949B2 (ja) | 2006-11-09 | 2012-11-07 | 独立行政法人国立国際医療研究センター | 霊長類動物胚性幹細胞の培養及び継代方法、並びにその分化誘導方法 |
WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
WO2008094597A2 (en) | 2007-01-30 | 2008-08-07 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc) |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
WO2008148105A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
CA2691793A1 (en) | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Cellular Dynamics International, Inc. | Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture |
US20100255580A1 (en) | 2007-07-18 | 2010-10-07 | Lifesccan, Inc. | Differentiation of Human Embryonic Stem Cells |
CN101952415B (zh) | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
WO2009027644A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Composition |
US20110151447A1 (en) | 2007-11-06 | 2011-06-23 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells |
CN107574142B (zh) | 2007-11-27 | 2021-07-06 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
WO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
WO2009116951A2 (en) | 2008-03-17 | 2009-09-24 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
RU2359030C1 (ru) | 2008-03-19 | 2009-06-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
EP2283117B1 (en) | 2008-04-21 | 2013-10-23 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
EP2297319B1 (en) | 2008-06-03 | 2015-10-07 | Viacyte, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
CA2729121C (en) | 2008-06-30 | 2019-04-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
US9683215B2 (en) | 2008-08-22 | 2017-06-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of reprogramming cells |
JP2012507289A (ja) * | 2008-10-31 | 2012-03-29 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化 |
AU2009308967C1 (en) | 2008-10-31 | 2017-04-20 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
ES2743204T3 (es) | 2008-11-04 | 2020-02-18 | Viacyte Inc | Composiciones de suspensión de agregados de células madre y métodos para su diferenciación |
CA2743641C (en) * | 2008-11-14 | 2024-03-26 | Viacyte, Inc. | Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells |
MX2011005288A (es) | 2008-11-20 | 2011-06-01 | Centocor Ortho Biotech Inc | Celulas madre pluripotentes en microportadores. |
US20110229441A1 (en) | 2008-12-05 | 2011-09-22 | Association Francaise Contre Les Myopathies | Method and Medium for Neural Differentiation of Pluripotent Cells |
WO2010136583A2 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Novo Nordisk A/S | INDUCED DERIVATION OF SPECIFIC ENDODERM FROM hPS CELL-DERIVED DEFINITIVE ENDODERM |
WO2011011349A2 (en) | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
JP6219568B2 (ja) | 2009-07-20 | 2017-10-25 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | ヒト胚性幹細胞の分化 |
CN107058389A (zh) | 2009-10-29 | 2017-08-18 | 詹森生物科技公司 | 多能干细胞 |
FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
RU2586506C2 (ru) | 2009-12-23 | 2016-06-10 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток |
BR112012017761A2 (pt) | 2009-12-23 | 2015-09-15 | Centocor Ortho Biotech Inc | diferenciação das células-tronco embrionárias humanas |
CA2794473A1 (en) | 2010-02-03 | 2011-08-11 | National Cancer Center | Induced hepatic stem cell and process for production thereof, and applications of the cell |
EP2542666A4 (en) | 2010-03-02 | 2014-05-07 | Univ Singapore | CULTURE ADDITIVES FOR PROMOTING A STEM CELL PROGRAMMING AND DIFFERENTIATION REACTION |
JP5909482B2 (ja) | 2010-03-31 | 2016-04-26 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 細胞の再プログラム |
WO2011139628A1 (en) | 2010-04-25 | 2011-11-10 | Mount Sinai School Of Medicine | Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells |
MX351515B (es) | 2010-05-12 | 2017-10-17 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
CN108531444A (zh) | 2010-08-05 | 2018-09-14 | 威斯康星校友研究基金会 | 用于人多能细胞培养的简化基础培养基 |
RU2599420C2 (ru) | 2010-08-31 | 2016-10-10 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
ES2658146T3 (es) | 2010-08-31 | 2018-03-08 | Janssen Biotech, Inc. | Diferenciación de células madre embrionarias humanas |
US9376665B2 (en) * | 2010-11-02 | 2016-06-28 | National University Corporation Kumamoto University | Method for producing intestinal cells |
WO2012117333A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
WO2013055834A2 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | The New York Stem Cell Foundation | Er stress relievers in beta cell protection |
WO2013055397A1 (en) | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Children's Medical Center Corporation | Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes |
KR102090751B1 (ko) | 2011-12-22 | 2020-03-19 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화 |
US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
DK3450542T3 (da) | 2012-06-08 | 2021-11-01 | Janssen Biotech Inc | Differentiering af humane embryonale stamceller til endokrine pancreatiske celler |
CN104903440B (zh) | 2012-09-03 | 2018-04-06 | 诺和诺德股份有限公司 | 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层 |
JP6494515B2 (ja) * | 2012-10-19 | 2019-04-03 | エージェンシー フォー サイエンス, テクノロジー アンド リサーチ | 幹細胞を1又は2以上の細胞系列に分化させる方法 |
CN105705634A (zh) | 2012-12-31 | 2016-06-22 | 詹森生物科技公司 | 用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能细胞的悬浮和群集 |
SG11201505112SA (en) * | 2012-12-31 | 2015-07-30 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators |
CA2898431C (en) * | 2013-02-06 | 2023-10-17 | Viacyte, Inc. | Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
AU2014239954B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-07-16 | The Jackson Laboratory | Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof |
US10266807B2 (en) * | 2013-04-03 | 2019-04-23 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension |
RU2694311C2 (ru) * | 2014-05-16 | 2019-07-11 | Янссен Байотек, Инк. | Применение малых молекул для увеличения экспрессии mafa в панкреатических эндокринных клетках |
SG11201701844YA (en) * | 2014-10-08 | 2017-04-27 | Agency Science Tech & Res | Methods of differentiating stem cells into liver cell lineages |
MA45479A (fr) * | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
-
0
- MA MA045479A patent/MA45479A/fr unknown
-
2017
- 2017-04-04 EP EP17782848.0A patent/EP3443073B1/en active Active
- 2017-04-04 CN CN202211105679.1A patent/CN115449506A/zh active Pending
- 2017-04-04 CN CN201780023425.6A patent/CN109563478B/zh active Active
- 2017-04-04 KR KR1020187029579A patent/KR102162505B1/ko active IP Right Grant
- 2017-04-04 MX MX2018012629A patent/MX2018012629A/es unknown
- 2017-04-04 RU RU2018139710A patent/RU2741114C2/ru active
- 2017-04-04 KR KR1020237008352A patent/KR102619151B1/ko active IP Right Grant
- 2017-04-04 AU AU2017251651A patent/AU2017251651B2/en active Active
- 2017-04-04 SG SG11201807915QA patent/SG11201807915QA/en unknown
- 2017-04-04 KR KR1020227017510A patent/KR102509926B1/ko active IP Right Grant
- 2017-04-04 WO PCT/US2017/025847 patent/WO2017180361A1/en active Application Filing
- 2017-04-04 CA CA3020905A patent/CA3020905A1/en active Pending
- 2017-04-04 US US15/478,881 patent/US10420803B2/en active Active
- 2017-04-04 BR BR112018070293A patent/BR112018070293A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2017-04-04 JP JP2018553183A patent/JP6705911B2/ja active Active
- 2017-04-04 KR KR1020207027896A patent/KR102403165B1/ko active IP Right Grant
- 2017-04-04 RU RU2021100063A patent/RU2021100063A/ru unknown
- 2017-04-12 TW TW106112138A patent/TW201803983A/zh unknown
- 2017-04-12 AR ARP170100944A patent/AR108134A1/es unknown
-
2018
- 2018-09-26 PH PH12018502061A patent/PH12018502061A1/en unknown
-
2019
- 2019-08-14 US US16/540,657 patent/US20190365823A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-05-14 JP JP2020084976A patent/JP2020146042A/ja active Pending
-
2022
- 2022-06-10 JP JP2022094028A patent/JP2022132249A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Int. J. Mol. Sci., vol.15, 23418~23447(2014)* |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102619151B1 (ko) | 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화 | |
JP7278990B2 (ja) | Hb9調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化 | |
KR102084561B1 (ko) | 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 공기-액체 계면에서의 인간 배아 줄기세포의 배양 | |
JP2024045206A (ja) | 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム | |
ES2902650T3 (es) | Inducción eficiente de endodermo definitivo a partir de células madre pluripotentes | |
KR20170002630A (ko) | 췌장 내분비 세포에서 mafa 발현을 향상시키기 위한 소분자의 용도 | |
KR20120104386A (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 분화 | |
KR20130101028A (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 분화 | |
JP2018512886A (ja) | 真正膵臓前駆細胞の単離 | |
JP2019514354A (ja) | 胃底部組織のインビトロでの製造のための方法及び当該方法と関連した組成物 | |
Delaspre | Stepwise differentiation of pancreatic acinar cells from mES cells by manipulating signalling pathway |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |