JP2023075090A - がんを評価及び治療するための方法及び物質 - Google Patents

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Abstract

【課題】がんを有する対象を検出するための方法の提供。【解決手段】対象における膵臓癌の存在を同定するための方法であって、前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、または、オステオポンチン（ＯＰＮ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、を含む、前記方法である。【選択図】なし

Description

連邦政府の資金提供に関する声明文
本発明は、国立衛生研究所による助成金番号ＣＡ０６２９２４及びＨＧ００７８０４のもとで、米国政府による支援を受けて成立した。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
配列表
本出願は、電子出願制度により米国特許商標庁に提出された電子的形態の配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。上記配列表（２０１８年８月６日に作成）の名称は４４８０７０３０６ＷＯ１ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは２０８，３０５バイトである。
電子的に出願された表
本出願は、電子出願制度により米国特許商標庁に提出された電子的形態の表を含む。ＡＳＣＩＩテキストファイル（それぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）としては、Ｔａｂｌｅ１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１５２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３５１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４３８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，０８１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１７，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３７０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２６２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，５３６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，５９１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１６７，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３１２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、及び、Ｔａｂｌｅ５９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３０９，０００バイトのサイズを有する）、が挙げられる。
１．技術分野
本明細書では、がんを有する対象（例えば、ヒト）を検出及び／または治療するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、２クラス以上のバイオマーカーの２つ以上のメンバーの存在を検出する、対象ががん（例えば、限局性がん）を有することを同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１クラスのバイオマーカーの２つ以上のメンバーの存在及び異数性の存在を検出する、対象ががん（例えば、限局性がん）を有することを同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象（例えば、ヒト）のがんを検出する高い感度及び／または特異度を提供する。
２．背景情報
アメリカ人のがんによる死亡は今年５９２，０００人にのぼり、疾病管理センターによれば、がんは間もなくこの国における死因の第１位となる。この悲惨な状況をどのようにして回避できるであろうか？今日におけるがんの橋渡し研究の大部分は、進行疾患を有する患者の生存期間を延長することに焦点を置いている。本発明者らの研究展望はそれらとは異なり、長期的には、常に予防が治療よりも望ましいものであると考えている。この展望が重要となる例は感染症から心血管疾患の範囲まで豊富である。心血管疾患においては、この疾患の一次予防法と二次予防法の組み合わせが過去６０年間において死亡率を７５％低下させていることから、特に重要である。それに対し、全体的ながんの死亡率は同一期間にわたりほとんど変化していない。
血液検査の実施によるがんのより早期の検出は二次予防の一形態と捉えることができる。単語「ｅａｒｌｉｅｒ（より早期の）」の最後の３文字が特に重要である。研究が行われている全てのがんにおける治癒の見込みは、進行疾患のものと比較して早期の限局性疾患ではるかに高い。ステージがより早期であるほど、外科手術のみで腫瘍を治療できる可能性がより高くなる。更に、治療するがんが早期ステージにある場合は、そのがんを検出する必要はない。理論的には、治療に対する効果は、治療前におけるがん細胞の総数、及びヒト細胞における変異率によって決まる。がん細胞が多いほど、がん細胞のうちの少なくとも１つが、通常の化学療法であれ、放射線療法であれ、標的化療法であれ、または、免疫療法であれ、任意の形態の治療に対する耐性を付与する変異（複数可）を含有または発生する可能性がより高くなる。臨床的には、薬物がアジュバント療法において治療力を有し得るが進行疾患を有する患者においてはそうとはならないということを多数の研究が示している。例えば、ステージＩＩＩ結腸直腸癌を有する患者（自身の疾患により死亡することが想定される）のほぼ半数についてはアジュバント療法を用いて治療することができるが、ステージＩＶ結腸直腸癌を有する患者については同一のレジメンを用いて治療することがほとんどできない。
多くのがんにおいて、腫瘍ステージと予後の間には強い相関関係がある（Ａｎｓａｒｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｕｍｏｕｒ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ １０４（５）：６００－６０７）。肺、結腸、食道または胃のがんを有する患者（診断時に遠隔転移を有している）において、５年超生存する患者は極めて少ない（Ｈｏｗｌａｄｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｓｒ／１９７５＿２０１３／，２０１５年１１月のＳＥＥＲデータ提出に基づく、２０１６年４月にＳＥＥＲウェブサイトに掲載）。より大きな腫瘍と比較してより小さな腫瘍の方が診断時における転移頻度がより少なく、その結果、外科手術のみで治療できる可能性がより高くなるという点で、がんのサイズもまた一般的な意味において重要である。がんが遠隔部位に転移していたとしても、より少ない負荷量の疾患部は、大きな病変と比較してはるかにより容易に管理される（Ｂｏｚｉｃ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｌｉｆｅ ２：ｅ００７４７）。それゆえ、結腸直腸癌に由来する微小転移を有する患者に投与されたアジュバント化学療法剤は、ほぼ５０％の症例において治療力を有し得る（Ｓｅｍｒａｄ ＴＪ，Ｆａｈｒｎｉ ＡＲ，Ｇｏｎｇ ＩＹ，＆ Ｋｈａｔｒｉ ＶＰ（２０１５）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２２ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ８５５－８６２；Ｍｏｅｒｔｅｌ ＣＧ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｐｌｕｓ ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ａｆｔｅｒ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｆｉｎａｌ ｒｅｐｏｒｔ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １２２（５）：３２１－３２６；Ａｎｄｒｅ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ａｎｄ ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｓｔａｇｅ ＩＩ ｏｒ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ＭＯＳＡＩＣ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７（１９）：３１０９－３１１６）。Ｘ線で可視化される転移性病変を有する患者へと送達された同一の化学療法剤はほとんど治療をもたらさない（Ｄｙ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｌｏｎｅ：ａ Ｎｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ３８１１ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎ０１４４．Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ８（２）：８８－９３）。
それゆえ、より早期のがんの検出が膵臓癌を含むこれらの疾患による死亡を減少させるための１つの鍵であるということは明らかである。外科的切除の可能性の提供に加え、新たに開発されたアジュバント化学療法レジメン及び新たに出現した免疫療法レジメンが、外科的に治療可能な疾患部を超えた微小疾患部を有する患者においてより効果的であることは疑いようもなく証明されるだろう（Ｈｕａｎｇ ＡＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｕｍｏｕｒ ｂｕｒｄｅｎ ｒａｔｉｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５４５（７６５２）：６０－６５）。循環血液中のバイオマーカーは原則的に、より早期のステージでがんを検出するための最良の方法のうちの１つを提供する。歴史的に見て、がんをモニターするのに使用するバイオマーカーのタイプはタンパク質であり（Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ ＆ Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １（８）：４６０－４６２）、それらとしては、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、及びがん抗原１２５（ＣＡ１２５）が挙げられる。これらのバイオマーカーは既知の疾患を有する患者をフォローするのに有用であることが証明されているが、それらの低い感度または特異度が一因となり、そのどれもがスクリーニング用途においては承認されていない（Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ ＆ Ｇｏｇｇｉｎｓ Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ ６７５－７０１；Ｃｌａｒｋｅ－Ｐｅａｒｓｏｎ ＤＬ（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６１（２）：１７０－１７７；Ｌｏｃｋｅｒ ＧＹ，ｅｔ ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ ２００６ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２４（３３）：５３１３－５３２７）。ごく最近では、バイオマーカーとしての変異ＤＮＡについて研究が行われている。このアプローチ（「リキッドバイオプシー」と呼ばれることが多い）の基礎をなすコンセプトは、がん細胞が、正常な自己複製細胞と同様に頻繁にターンオーバーすることである。瀕死の細胞から放出されたＤＮＡは、尿、糞便及び血漿などの体液へと漏出する場合がある（Ｈａｂｅｒ ＤＡ ＆ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ＶＥ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ４（６）：６５０－６６１；Ｄａｗｓｏｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１３）：１１９９－１２０９；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｋｉｎｄｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｔｅｓｔ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１６７）：１６７ｒａ１６４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＨＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２（３１）：９７０４－９７０９；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｏｖａｒｉａｎ ｃｙｓｔ ｆｌｕｉｄ．Ｅｌｉｆｅ ５；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃｙｓｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４９（６）：１５０１－１５１０；Ｆｏｒｓｈｅｗ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（１３６）：１３６ｒａ１６８；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ ＆ Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ（１９９９）Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６（１６）：９２３６－９２４１；Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｄ，Ｙａｎ Ｈ，Ｔｒａｖｅｒｓｏ Ｇ，Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ，＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（２００３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００（１５）：８８１７－８８２２）。循環血液中の変異ＤＮＡをバイオマーカーとして使用することの利点はその正確な特異度である。がん内部の全ての細胞は、それら細胞のクローン増殖に影響を及ぼすドライバー遺伝子内に体細胞変異のコアセットを有している（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２７）：１５４６－１５５８）。それに対し、正常細胞は成熟期の間にクローン増殖せず、任意の特定の体細胞変異を有する正常細胞の画分は極めて少ない。
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に関する研究の大多数は、スクリーニング環境におけるそれらの使用を評価することではなく、がんを有する患者のフォローに焦点を置いている。入手可能なデータは、多くのがんタイプの進行形態を有する患者の＞８５％においてｃｔＤＮＡが上昇していることを示している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＨＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。しかしながら、より早期のステージのがんを有する患者のうちのかなり少ない割合は、検出可能レベルのｃｔＤＮＡを自身の血漿中に有している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＨＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。
限局性がんの大部分は、何ら全身療法を行うことなく外科手術のみで治療することができる（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７ ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６７：７－３０）。しかしながら、一旦遠隔転移が生じてしまうと、外科的切除が治療力を有することは稀である。それゆえ、がん研究における１つの主要な目的は、がんが遠隔部位に転移する前にそれらを検出することである。がんのタイプにもよるが、成人における標準的ながんが初期腫瘍性病変から末期ステージのがんにまで進行するには２０～３０年間を要するものと思われる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：１５４６－１５５８；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５：４２８３－４２８８；及びＹａｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８：６３３９－６３４７）。実際には、腫瘍性細胞が成功裏に転移性病変を拡散して生じさせるのは、この長い過程における最後の数年間においてのみであるものと思われる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：１５４６－１５５８；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５：４２８３－４２８８；Ｙａｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８：６３３９－６３４７；及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７３：１８９５－１８９８）。それゆえ、転移が開始する前には、がんを検出するための幅の広い機会がある。しかしながら、一旦大きな転移性腫瘍が形成されてしまうと現行療法は有効ではなくなる（Ｂｏｚｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｅｌｉｆｅ ２：ｅ００７４７；Ｓｅｍｒａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２２（Ｓｕｐｐｌ ３）：Ｓ８５５－８６２；Ｍｏｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １２２：３２１－３２６；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｎａｔｕｒｅ ５４５：６０－６５）。
膵管腺癌（以下「膵臓癌」）はがんによる死亡の原因の第三位であり、米国では２０３０年までに２番目に最も一般的な原因となることが予測されている（Ｒａｈｉｂ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅａｔｈｓ ｔｏ ２０３０：ｔｈｅ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ，ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４（１１）：２９１３－２９２１）。膵臓癌は致死的であることで有名であり、診断後５年間生存する患者は９％未満である（Ｓｉｅｇｅｌ ＲＬ，Ｍｉｌｌｅｒ ＫＤ，＆ Ｊｅｍａｌ Ａ（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６６（１）：７－３０）。膵臓癌を有する患者の予後不良の一因は、患者の８０％～８５％が、周囲の主要血管に腫瘍が浸潤するかまたはＸ線検査で遠隔転移が明らかとなるかのいずれかの時点である進行ステージにおいて診断されるという事実によるものである（Ｒｙａｎ ＤＰ，Ｈｏｎｇ ＴＳ，＆ Ｂａｒｄｅｅｓｙ Ｎ（２０１４）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７１（２２）：２１４０－２１４１）。疾患のこの末期の時点では、膵臓癌は外科的切除の対象とはならず、３年生存率は＜５％である。それに対し、切除可能がんの１つである極めて小さな限局性腫瘍ではほぼ６０％の５年生存が報告されており、腫瘍が小さいほど予後がより良好となる（Ａｎｓａｒｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｕｍｏｕｒ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ １０４（５）：６００－６０７；Ｊｕｎｇ ＫＷ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ５４２ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ｓｍａｌｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２２ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７９－８５；Ｅｇａｗａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｐａｎｃｒｅａｓ ２８（３）：２３５－２４０；Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｉｎｕｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ １ ｃｍ ｏｒ ｌｅｓｓ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ－－ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４６（２５）：８－１５；Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２０３（１）：７７－８１）。
膵臓癌は、腫瘍ステージと予後の間のその強い相関関係という点において、その他のがんとは異ならない（Ａｎｓａｒｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｕｍｏｕｒ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ １０４（５）：６００－６０７）。肺、結腸、食道または胃のがんを有する患者（診断時に遠隔転移を有している）において、５年超生存する患者は極めて少ない（Ｈｏｗｌａｄｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｓｒ／１９７５＿２０１３／，２０１５年１１月のＳＥＥＲデータ提出に基づく、２０１６年４月にＳＥＥＲウェブサイトに掲載）。より大きな腫瘍と比較してより小さな腫瘍の方が診断時における転移頻度がより少なく、その結果、外科手術のみで治療できる可能性がより高くなるという点で、がんのサイズもまた一般的な意味において重要である。がんが遠隔部位に転移していたとしても、より少ない負荷量の疾患部は、大きな病変と比較してはるかにより容易に管理される（Ｂｏｚｉｃ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｌｉｆｅ ２：ｅ００７４７）。それゆえ、結腸直腸癌に由来する微小転移を有する患者に投与されたアジュバント化学療法剤は、ほぼ５０％の症例において治療力を有し得る（Ｓｅｍｒａｄ ＴＪ，Ｆａｈｒｎｉ ＡＲ，Ｇｏｎｇ ＩＹ，＆ Ｋｈａｔｒｉ ＶＰ（２０１５）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２２ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ８５５－８６２；Ｍｏｅｒｔｅｌ ＣＧ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｐｌｕｓ ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ａｆｔｅｒ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｆｉｎａｌ ｒｅｐｏｒｔ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １２２（５）：３２１－３２６；Ａｎｄｒｅ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ａｎｄ ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｓｔａｇｅ ＩＩ ｏｒ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ＭＯＳＡＩＣ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７（１９）：３１０９－３１１６）。Ｘ線で可視化される転移性病変を有する患者へと送達された同一の化学療法剤はほとんど治療をもたらさない（Ｄｙ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｌｏｎｅ：ａ Ｎｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ３８１１ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎ０１４４．Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ８（２）：８８－９３）。
それゆえ、より早期のがんの検出が膵臓癌を含むこれらの疾患による死亡を減少させるための１つの鍵であるということは明らかである。外科的切除の可能性の提供に加え、新たに開発されたアジュバント化学療法レジメン及び新たに出現した免疫療法レジメンが、外科的に治療可能な疾患部を超えた微小疾患部を有する患者においてより効果的であることは疑いようもなく証明されるだろう（Ｈｕａｎｇ ＡＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｕｍｏｕｒ ｂｕｒｄｅｎ ｒａｔｉｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５４５（７６５２）：６０－６５）。循環血液中のバイオマーカーは原則的に、より早期のステージでがんを検出するための最良の方法のうちの１つを提供する。歴史的に見て、がんをモニターするのに使用するバイオマーカーのタイプはタンパク質であり（Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ ＆ Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １（８）：４６０－４６２）、それらとしては、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、及びがん抗原１２５（ＣＡ１２５）が挙げられる。これらのバイオマーカーは既知の疾患を有する患者をフォローするのに有用であることが証明されているが、それらの低い感度または特異度が一因となり、そのどれもがスクリーニング用途においては承認されていない（Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ ＆ Ｇｏｇｇｉｎｓ Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ ６７５－７０１；Ｃｌａｒｋｅ－Ｐｅａｒｓｏｎ ＤＬ（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６１（２）：１７０－１７７；Ｌｏｃｋｅｒ ＧＹ，ｅｔ ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ ２００６ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２４（３３）：５３１３－５３２７）。ごく最近では、バイオマーカーとしての変異ＤＮＡについて研究が行われている。このアプローチ（「リキッドバイオプシー」と呼ばれることが多い）の基礎をなすコンセプトは、がん細胞が、正常な自己複製細胞と同様に頻繁にターンオーバーすることである。瀕死の細胞から放出されたＤＮＡは、尿、糞便及び血漿などの体液へと漏出する場合がある（Ｈａｂｅｒ ＤＡ ＆ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ＶＥ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ４（６）：６５０－６６１；Ｄａｗｓｏｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１３）：１１９９－１２０９；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｋｉｎｄｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｔｅｓｔ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１６７）：１６７ｒａ１６４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＨＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２（３１）：９７０４－９７０９；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｏｖａｒｉａｎ ｃｙｓｔ ｆｌｕｉｄ．Ｅｌｉｆｅ ５；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃｙｓｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４９（６）：１５０１－１５１０；Ｆｏｒｓｈｅｗ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（１３６）：１３６ｒａ１６８；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ ＆ Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ（１９９９）Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６（１６）：９２３６－９２４１；Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｄ，Ｙａｎ Ｈ，Ｔｒａｖｅｒｓｏ Ｇ，Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ，＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（２００３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００（１５）：８８１７－８８２）。循環血液中の変異ＤＮＡをバイオマーカーとして使用することの利点はその正確な特異度である。がん内部の全ての細胞は、それら細胞のクローン増殖に影響を及ぼすドライバー遺伝子内に体細胞変異のコアセットを有している（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２７）：１５４６－１５５８）。それに対し、正常細胞は成熟期の間にクローン増殖せず、任意の特定の体細胞変異を有する正常細胞の画分は極めて少ない。
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に関する研究の大多数は、スクリーニング環境におけるそれらの使用を評価することではなく、がんを有する患者のフォローに焦点を置いている。入手可能なデータは、多くのがんタイプの進行形態を有する患者の＞８５％においてｃｔＤＮＡが上昇していることを示している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＨＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。しかしながら、より早期のステージのがんを有する患者のうちのかなり少ない割合は、検出可能レベルのｃｔＤＮＡを自身の血漿中に有している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＨＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。
当該技術分野においては、高い特異度を維持した条件下で切除可能または別の方法で治療可能ながんの検出感度を上昇させることに対する継続的な要望がある。
パパニコロウ（Ｐａｐ）検査は、スクリーニング集団における子宮頸癌の罹患率及び死亡率を劇的に低下させている。あいにく、Ｐａｐ検査は一般的に、子宮内膜癌または卵巣癌を検出することができない（（Ｌ．Ｇｅｌｄｅｎｈｕｙｓ，Ｍ．Ｌ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｐ ｓｍｅａｒ ｆｏｒ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｒｖｉｘ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ．Ａｃｔａ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ ５１，４７－５０（２００７）；Ａ．Ｂ．Ｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｒｅａｇａｎ，Ｓ．Ｈａｗｌｉｃｚｅｋ，Ｂ．Ｗ．Ｗｅｎｔｚ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ａｃｔａ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ １８，３５６－３６１（１９７４）；Ｐ．Ｆ．Ｓｃｈｎａｔｚ，Ｍ．Ｇｕｉｌｅ，Ｄ．Ｍ．Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｉ． Ｓｏｒｏｓｋｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａｔｙｐｉｃａｌ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １０７，７０１－７０８（２００６）；Ｃ．Ｚｈａｏ，Ａ．Ｆｌｏｒｅａ，Ａ．Ｏｎｉｓｋｏ，Ｒ．Ｍ．Ａｕｓｔｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ６６２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｐ ｔｅｓｔ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｔｙｐｉｃａｌ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ａｃａｄｅｍｉｃ ｗｏｍｅｎｓ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１４，３８３－３８９（２００９））。早期ステージの治療可能な子宮頸癌の検出におけるＰａｐ検査の成功を考慮すると、卵巣癌と子宮内膜癌のそれぞれは現在、Ｐａｐ検査が日常的に実施されている国々における最も致死的かつ最も一般的な婦人科悪性腫瘍となっている（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒｅｔ ａｌ．，ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。まとめると、子宮内膜癌及び卵巣癌による死亡は毎年約２５，０００人にのぼり、米国における女性のがん関連死因の第三位となっている（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。これらの死亡の大部分は、症状の発症前に転移する傾向のある高悪性度の腫瘍サブタイプを原因とするものである（Ｒ．Ｊ．Ｋｕｒｍａｎ，Ｍ．Ｓｈｉｈ Ｉｅ，Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｕｎｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅｏｒｙ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３４，４３３－４４３（２０１０）；Ｋ．Ｎ．Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｎ．Ｆａｄｅｒ，Ｕｔｅｒｉｎｅ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ５４，２７８－２９１（２０１１））。
子宮内膜癌は最も一般的な婦人科悪性腫瘍であり、米国における２０１７年の新たな症例は６１，３８０件にのぼると推定されている（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。子宮内膜癌の発症率は、肥満が増加するにつれて、また平均余命が長くなるにつれて、上昇している（Ｍ．Ａｒｎｏｌｄｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ ｔｏ ｈｉｇｈ ｂｏｄｙ－ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ ｉｎ ２０１２：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６，３６－４６（２０１５））。それと同時に、相対生存率は過去数十年にわたり改善していない（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７）；Ｌ．Ｒａｈｉｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅａｔｈｓ ｔｏ ２０３０：ｔｈｅ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ，ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４，２９１３－２９２１（２０１４））。このがんタイプ用のスクリーニング検査法の開発に多大な努力が向けられている。最も一般的な診断検査法は、子宮内膜の厚さを測定する経腟超音波法（ＴＶＵＳ）である。スクリーニング検査法としてのＴＶＵＳの潜在能力は、ＴＶＵＳが良性病変と悪性病変を確実に識別できないこと、がんを有さない女性に不必要な侵襲的処置を受けさせてその処置による関連合併症を引き起こすことにより、損なわれている。その高い偽陽性率は、ＴＶＵＳで陽性と判定された５０名の女性のうちのわずか１名だけが、追加の診断法を受けた後に子宮内膜癌を有するということが判明したという事実によって証明されている（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｖａｇｉｎａｌ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ：ａ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＵＫＣＴＯＣＳ ｃｏｈｏｒｔ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２，３８－４８（２０１１））。
卵巣癌は米国及びヨーロッパにおける２番目に最も一般的な婦人科悪性腫瘍である。５年生存率が３０％未満となる時点である末期ステージに診断が行われることが多い（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。その高い死亡率ゆえに、有効なスクリーニング検査法の開発の優先度が高くなっている。大規模無作為化試験において、卵巣癌用の有望なスクリーニング検査法としてのＣＡ－１２５及びＴＶＵＳの使用について評価が行われている（Ｂｕｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ：ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｌｕｎｇ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ Ｏｖａｒｉａｎ（ＰＬＣＯ）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ ３０５，２２９５－２３０３（２０１１）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ ｉｎ Ｊａｐａｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ １８，４１４－４２０（２００８）；Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ＵＫ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＵＫＣＴＯＣＳ）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８７，９４５－９５６（２０１６）；Ｍｅｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｓｋ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｄｏｕｂｌｅｓ ｔｈｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｓｃｒｅｅｎ－Ｄｅｔｅｃｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ Ｗｉｔｈ ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｒｕｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３，２０６２－２０７１（２０１５））。しかしながら、現行の診断アプローチを用いたスクリーニング法は、それが「がんを有さない女性における主要な外科的介入を含む重大な損傷」をもたらすことから、一般集団には推奨されない（Ｖ．Ａ．Ｍｏｙｅｒ，Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｓ．Ｔ．Ｆｏｒｃｅ，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｒｅａｆｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５７，９００－９０４（２０１２））。それゆえ、新規の診断アプローチの必要性が急務となっている。
卵巣癌の１つである高悪性度の漿液性がん（ＨＧＳＣ）は全卵巣癌死の９０％を占めている。ほとんどのＨＧＳＣが卵管で生じ、それに続いて卵巣表面上に侵入しているということを、ますます多くのエビデンスが示唆している（１６－２１Ｒ．Ｊ．Ｋｕｒｍａｎ，Ｍ．Ｓｈｉｈ Ｉｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｏｖａｒｉａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ－－ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｈｕｍａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４２，９１８－９３１（２０１１）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｏ ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２１１，２６－３５（２００７）Ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｏ ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２１１，２６－３５（２００７）；Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｆａｌｌｏｐｉａｎ Ｔｕｂｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ６，１３４２－１３５１（２０１６）；Ａ．Ｍ．Ｋａｒｓｔ，Ｋ．Ｌｅｖａｎｏｎ，Ｒ．Ｄｒａｐｋｉｎ，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｓｅｒｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，７５４７－７５５２（２０１１）；Ｚｈａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｒｉｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｏｖｉｄｕｃｔ ｖｉａ ｄｅｆｅｃｔｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２４３，１６－２５（２０１７）；Ｒ．Ｊ．Ｋｕｒｍａｎ，Ｍ． Ｓｈｉｈ Ｉｅ，Ｔｈｅ Ｄｕａｌｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １８６，７３３－７４７（２０１６））。ほとんどの早期診断ＨＧＳＣが卵巣外に起源を有していることを症候性女性における最近の前向き研究が報告している（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｗｏｍｅｎ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ＤＯｖＥ ｐｉｌｏｔ ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３，２８５－２９１（２０１２））。このことにより、卵巣異常が検出不能な時点である早期疾患に対するＴＶＵＳの低い感度が説明され得る。血清中ＣＡ－１２５レベルを用いたマルチモーダルスクリーニングでは感度が向上したが、ＣＡ－１２５は特異度に欠け様々な一般的な良性状態において上昇している（Ｈ．Ｍｅｄｅｎ，Ａ．Ｆａｔｔａｈｉ－Ｍｅｉｂｏｄｉ，ＣＡ １２５ ｉｎ ｂｅｎｉｇｎ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ １３，２３１－２３７（１９９８））。
腫瘍形成に関係するマーカーとは異なり、がんドライバー遺伝子変異は腫瘍形成の原因因子であり、非腫瘍状態には存在しない。卵巣癌を有する女性の膣管内において腫瘍ＤＮＡが検出され得るということが示されている（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔａｍｐｏｎｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｓｅｒｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １２４，８８１－８８５（２０１４））。更に、最近の原理証明研究では、子宮内膜癌及び卵巣癌から剥離した細胞が子宮頸部に集まることにより、検出可能レベルの腫瘍ＤＮＡが、通常のＰａｐ検査中に採取された体液中に見つかるようになるということを示している（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｔｅｓｔ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１６７ｒａ１６４（２０１３））。これらの細胞は、子宮頸管内に挿入されたブラシ（「Ｐａｐブラシ」）を用いて採取される。次に、そのブラシを保存液に浸す。子宮頸癌を検出するために、体液由来の細胞を細胞学的検査用のスライドに塗布する（標準的なパップスメア）。加えて、ＨＰＶ配列を検出するために体液からＤＮＡを精製することが多い。
膀胱癌（ＢＣ）は尿路における最も一般的な悪性腫瘍である。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙによれば、２０１７年の米国においてだけで、７９，０３０件の膀胱癌の新たな症例、及び１８，５４０件の死亡が発生すると推定されている［Ｓｉｅｇｅｌ ＲＬ，Ｍｉｌｌｅｒ ＫＤ，Ｊｅｍａｌ Ａ（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１７．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６７：７－３０］。尿路上皮組織の大部分では、浸潤性ＢＣは非浸潤性の乳頭前駆細胞または扁平前駆細胞から発生する。多くのＢＣ患者は進行前に複数回の再発を経験するため、早期の検出及び治療を行うための十分なリードタイムが転移前に用意されている［Ｎｅｔｔｏ ＧＪ（２０１３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｕｒｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：ｎｏ ｌｏｎｇｅｒ ｃｈａｓｉｎｇ ａ “ｍｉｒａｇｅ”？．Ａｄｖ Ａｎａｔ Ｐａｔｈｏｌ ２０：１７５－２０３］。尿細胞診、及び経尿道的生検（ＴＵＲＢ）を伴う膀胱鏡検査は、膀胱癌の診断及びフォローアップのための現時点におけるゴールドスタンダードである。尿細胞診は高悪性度腫瘍の検出において価値を有しているが、低悪性度腫瘍の大部分については検出することができない［Ｎｅｔｔｏ ＧＪ，Ｔａｆｅ ＬＪ（２０１６）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｕｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４３：６３－７６；Ｌｏｔａｎ Ｙ，Ｒｏｅｈｒｂｏｒｎ ＣＧ（２００３）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｖｅｒｓｕｓ ｃｙｔｏｌｏｇｙ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｕｒｏｌｏｇｙ ６１：１０９－１８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １１８；Ｚｈａｎｇ ＭＬ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ＤＬ，ＶａｎｄｅｎＢｕｓｓｃｈｅ ＣＪ（２０１６）Ｔｈｅ ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｌｏｗ－ｇｒａｄｅ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ ｖａｒｙ ｂｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ １２４：５５２－５６４］。この事実は、膀胱鏡検査とＴＵＲＢの反復手順の高コストかつ侵襲的な性質と共に、新規の非侵襲的戦略の開発へと多大な努力を導いている。これらの非侵襲的戦略としては、スクリーニング及びサーベイランスのための、尿または血清をベースとした遺伝的アッセイ及びタンパク質アッセイが挙げられる［Ｋａｗａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００９）９ｐ２１ Ｉｎｄｅｘ ａｓ Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｂｙ Ｄｕａｌ－Ｃｏｌｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｗａｓｈｉｎｇ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ４０：１７８３－１７８９；Ｋｒｕｇｅｒ Ｓ，Ｍｅｓｓ Ｆ，Ｂｏｈｌｅ Ａ，Ｆｅｌｌｅｒ ＡＣ（２００３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ ａｎｄ ｔｈｅ ９ｐ２１ ｌｏｃｕｓ ａｒｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２３：４１－４８；Ｓｋａｃｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｄｅｔｅｃｔｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｔｙｐｉｃａｌ ｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｕｒｏｌ １６９：２１０１－２１０５；Ｓａｒｏｓｄｙ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｍａｔｕｒｉａ．Ｊ Ｕｒｏｌ １７６：４４－４７；Ｍｏｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎ－ｍｕｓｃｌｅ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ５１：１２７５－８０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １２８０；Ｆｒａｄｅｔ Ｙ，Ｌｏｃｋｈａｒｄ Ｃ（１９９７）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ：ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ ｔｒａｄｅ ｍａｒｋ．Ｃａｎ Ｊ Ｕｒｏｌ ４：４００－４０５；Ｙａｆｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３３：６６．ｅ２５－６６．ｅ３１；Ｓｅｒｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＦＧＦＲ３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ；Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ａｒｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１６２－７１６７；Ｈｕｒｓｔ ＣＤ，Ｐｌａｔｔ ＦＭ，Ｋｎｏｗｌｅｓ ＭＡ（２０１４）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｏｉｄｅｄ ｕｒｉｎｅ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ６５：３６７－３６９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔａｎｔ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ ｕｐｐｅｒ ｔｒａｃｔ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｓｅｒｖｅ ａｓ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃａｓｔＰＣＲ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ５：１２４２８－１２４３９；Ｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｒｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ ５１：２００－２３１；Ｅｌｌｉｎｇｅｒ Ｊ，Ｍｕｌｌｅｒ ＳＣ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｄ（２０１５）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ １５：５０５－５１６；Ｂａｎｓａｌ Ｎ，Ｇｕｐｔａ Ａ，Ｓａｎｋｈｗａｒ ＳＮ，Ｍａｈｄｉ ＡＡ（２０１４）Ｌｏｗ－ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ａｐｐｒａｉｓａｌ ｖｉａ ｓｅｒｕｍ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ４３６：９７－１０３；Ｇｏｏｄｉｓｏｎ Ｓ，Ｃｈａｎｇ Ｍ，Ｄａｉ Ｙ，Ｕｒｑｕｉｄｉ Ｖ，Ｒｏｓｓｅｒ ＣＪ（２０１２）Ａ ｍｕｌｔｉ－ａｎａｌｙｔｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４７４６９；Ａｌｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ：ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｃｒｏｓｓ ｓｔａｇｅｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ ｌａｃｋ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ６５：３６０－３６６］。現在利用可能なＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）承認済みアッセイとしては、ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ ｔｅｓｔ（Ｓｃｉｍｅｄｘ Ｃｏｒｐ）、ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ２２（ＮＭＰ２２）ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｔｅｓｔ（Ｍａｔｒｉｔｅｃｈ）、及びｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ＦＩＳＨ（ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ）が挙げられる［Ｋａｗａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００９）９ｐ２１ Ｉｎｄｅｘ ａｓ Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｂｙ Ｄｕａｌ－Ｃｏｌｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｗａｓｈｉｎｇ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ４０：１７８３－１７８９；Ｋｒｕｇｅｒ Ｓ，Ｍｅｓｓ Ｆ，Ｂｏｈｌｅ Ａ，Ｆｅｌｌｅｒ ＡＣ（２００３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ ａｎｄ ｔｈｅ ９ｐ２１ ｌｏｃｕｓ ａｒｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２３：４１－４８；Ｓｋａｃｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｄｅｔｅｃｔｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｔｙｐｉｃａｌ ｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｌｏｇｙ． Ｊ Ｕｒｏｌ １６９：２１０１－２１０５；Ｓａｒｏｓｄｙ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｍａｔｕｒｉａ．Ｊ Ｕｒｏｌ １７６：４４－４７；Ｍｏｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎ－ｍｕｓｃｌｅ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ５１：１２７５
－８０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １２８０；Ｆｒａｄｅｔ Ｙ，Ｌｏｃｋｈａｒｄ Ｃ（１９９７）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ：ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ ｔｒａｄｅ ｍａｒｋ．Ｃａｎ Ｊ Ｕｒｏｌ ４：４００－４０５；Ｙａｆｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３３：６６．ｅ２５－６６．ｅ３１］。これらの検査の一部において、６２％～６９％の感度及び７９％～８９％の特異度が報告されている。しかしながら、アッセイ性能のばらつき、コスト、または、必要とされる技術的専門知識ゆえに、このようなアッセイの日常的な臨床業務への導入はまだ行われていない。
膀胱癌は一般的に、膀胱の裏打ちにおける細胞から生じる３つのタイプに分類される。いくつかの実施形態では、膀胱癌は、悪性（がん性）となる細胞のタイプに応じて命名されるが、それらとしては、移行上皮癌、扁平上皮癌、及び腺癌が挙げられる。移行上皮癌は膀胱組織の最内層における細胞から生じる。移行上皮癌は低悪性度または高悪性度であり得る。低悪性度移行上皮癌は治療後に再発する場合もあるが、膀胱の筋層または身体のその他の部位に転移することはめったにない。高悪性度移行上皮癌は治療後に再発する場合があり、膀胱の筋層、身体のその他の部位、及び、リンパ節に転移することが多い。膀胱癌によるほぼ全ての死亡は高悪性度疾患によるものである。扁平上皮癌は、長期にわたる感染または炎症後に膀胱内で形成され得る薄く扁平な細胞である扁平上皮細胞から生じる。腺癌は膀胱の裏打ちに存在する腺（分泌）細胞から生じるものであり、極めて希少なタイプの膀胱癌である。
ＴＥＲＴ遺伝子の上流プロモーターにおける高比率の活性化変異が、ＢＣの大部分、ならびに、その他のがんタイプに見つかっている［Ｈｕａｎｇ ＦＷ，Ｈｏｄｉｓ Ｅ，Ｘｕ ＭＪ，Ｋｒｙｕｋｏｖ ＧＶ，Ｃｈｉｎ Ｌ，Ｇａｒｒａｗａｙ ＬＡ（２０１３）Ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：９５７－９５９；Ｋｉｌｌｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎ ｇｌｉｏｍａｓ ａｎｄ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０：６０２１－６０２６；Ｓｃｏｔｔ ＧＡ，Ｌａｕｇｈｌｉｎ ＴＳ，Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ＰＧ（２０１４）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ ２７：５１６－５２３］。ＴＥＲＴプロモーター変異は主に、２つのホットスポット、ｇ．１２９５２２８ Ｃ＞Ｔ、及びｇ．１２９５２５０ Ｃ＞Ｔに影響を及ぼす。ＴＥＲＴプロモーター変異により、ＥＴＳ転写因子用の結合部位を変化させるＣＣＧＧＡＡ／ＴモチーフまたはＧＧＡＡ／Ｔモチーフが生成され、それに続いて、ＴＥＲＴプロモーター活性が上昇する［Ｈｕａｎｇ ＦＷ，Ｈｏｄｉｓ Ｅ，Ｘｕ ＭＪ，Ｋｒｙｕｋｏｖ ＧＶ，Ｃｈｉｎ Ｌ，Ｇａｒｒａｗａｙ ＬＡ（２０１３）Ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：９５７－９５９；Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：９５９－９６１］。ＴＥＲＴプロモーター変異は、膀胱と上部尿路における浸潤性尿路上皮癌の最大８０％、ならびに、その組織学的変異型のいくつかにおいて生じている［Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ａｒｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１６２－７１６７；Ｋｉｌｌｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎ ｇｌｉｏｍａｓ ａｎｄ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０：６０２１－６０２６；Ａｌｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ：ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｃｒｏｓｓ ｓｔａｇｅｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ ｌａｃｋ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ６５：３６０－３６６；Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ．Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ５３：８－１３；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｈｉｇｈ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｐａｐｉｌｌａｒｙ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ ４６９：４２７－４３４］。更に、ＴＥＲＴプロモーター変異は、低悪性度の乳頭尿路上皮腫瘍［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅ ｎｏｖｏ ＰＵＮＬＭＰ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ］、非浸潤性低悪性度乳頭尿路上皮癌、非浸潤性高悪性度乳頭尿路上皮癌、及び、「扁平」上皮内癌（ＣＩＳ）、ならびに、これらの患者のサブセットに由来する尿中細胞［Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ａｒｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１６２－７１６７］、を含む、ＢＣ前駆細胞の６０～８０％において生じている。それゆえ、ＴＥＲＴプロモーター変異は、ＢＣにおける最も一般的な遺伝的改変として確立している［Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｃｃｕｒ ｅａｒｌｙ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ａｒｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１６２－７１６７；Ｃｈｅｎｇ Ｌ，Ｍｏｎｔｉｒｏｎｉ Ｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｌｔｒａｎ Ａ（２０１７）ＴＥＲＴ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｏｃｃｕｒ Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ ａｎｄ Ｐａｐｉｌｌａｒｙ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｍ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ７１：４９７－４９８］。その他のがん遺伝子活性化変異としては、非筋肉浸潤性膀胱癌の大部分において生じることが判明している、ＦＧＦＲ３、ＲＡＳ及びＰＩＫ３ＣＡにおけるがん遺伝子活性化変異が挙げられる［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ．（２０１６）ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍａｌｅ Ｇｅｎｉｔａｌ Ｏｒｇａｎｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；４ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｎｅｔｔｏ ＧＪ（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ：ａｒｅ ｗｅ ｔｈｅｒｅ ｙｅｔ？．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｕｒｏｌ ９：４１－５１］。筋肉浸潤性膀胱癌では、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ及びＥＲＢＢ２における変異もまた頻繁に見つかっている［Ｎｅｔｔｏ ＧＪ（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ：ａｒｅ ｗｅ ｔｈｅｒｅ ｙｅｔ？．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｕｒｏｌ ９：４１－５１；Ｍｏ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈａ－ｒａｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｂｕｔ ｎｏｔ Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｂｌａｄｄｅｒ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：３１４－３２５；Ｓａｒｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎｕｃｌｅａｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８５：５３－５９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ，ｌｏｗ ｇｒａｄｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，ｐ１６，ｐ１４，ＲＡＳＳＦ１Ａ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２８：５９７－６０２；Ｓａｒｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ５３ ｎｕｃｌｅａｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ．Ｊ Ｕｒｏｌ １５２：３８８－３９２；Ｗｕ ＸＲ（２００５）Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｔａｌｅ ｏｆ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５：７１３－７２５；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（２０１４）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５０７：３１５－３２２］。
尿細胞診の再発検出感度が比較的低いことから、米国におけるこのような患者に対しては３ヶ月毎に膀胱鏡検査が実施される。事実、これらの患者を管理するための合計コストは任意のその他のタイプのがんを管理するためのコストよりも高く、年間３０億ドルにのぼる［Ｎｅｔｔｏ ＧＪ，Ｅｐｓｔｅｉｎ ＪＩ（２０１０）Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：ｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４２：３８４－３９４］。それゆえ、これらの患者のうちのどの患者が最も再発性ＢＣを発症する可能性があるかを予測することのできる非侵襲的検査法が、医学面と経済面の両方において重要となり得る。
４００，０００件超の泌尿器系移行上皮癌の新たな症例が毎年世界中で診断されている（Ａｎｔｏｎｉ，Ｓ．，Ｆｅｒｌａｙ，Ｊ．，Ｓｏｅｒｊｏｍａｔａｒａｍ，Ｉ．，Ｚｎａｏｒ，Ａ．，Ｊｅｍａｌ，Ａ．，＆ Ｂｒａｙ，Ｆ．（２０１７）．Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ：Ａ Ｇｌｏｂａｌ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ，７１（１），９６－１０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１６．０６．０１０）。これらの尿路上皮癌の大部分が下部尿路の膀胱において生じているが、５～１０％は、上部尿路の腎盂及び／または尿管を起源としている（Ｒｏｕｐｒｅｔ，Ｍ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐｅｒａｔ，Ｅ．，Ｚｉｇｅｕｎｅｒ，Ｒ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｗａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｂｏｈｌｅ，Ａ．，Ｖａｎ Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｋａａｓｉｎｅｎ，Ｅ．，Ｐａｌｏｕ，Ｊ．，＆ Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．（２０１５）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ｕｐｐｅｒ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｔｒａｃｔ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：２０１５ Ｕｐｄａｔｅ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ，６８（５），８６８－８７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１５．０６．０４４；Ｓｏｒｉａ，Ｆ．，Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｒｉｎｋ，Ｍ．，Ｋａｓｓｏｕｆ，Ｗ．，Ｓｐｉｅｓｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｌｏｔａｎ，Ｙ．，Ｙｅ，Ｄ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｉ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｃｈａｄｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．，＆ Ｔｈａｌｍａｎｎ，Ｇ．Ｎ．（２０１７）．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｕｐｐｅｒ－ｔｒａｃｔ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＵＴＵＣ）．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ，３５（３），３７９－３８７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００３４５－０１６－１９２８－ｘ）。欧米諸国におけるこれら上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）の年間発症率は１００，０００件あたり１～２症例であるが、アリストロキア酸（ＡＡ）に曝露された集団においては、はるかにより高い割合で生じている（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｍｏｒｉｙａ，Ｍ．，Ｚａｖａｄｉｌ，Ｊ．，Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ｓ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｇｎａｔｅｎｋｏ，Ｄ．Ｖ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｔｕｒｅｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．Ｒ．，Ｐｕ，Ｙ．Ｓ．，＆ Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．（２０１２）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０９（２１），８２４１－８２４６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１９９２０１０９；Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．（２０１３）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ：Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ ｏｆ ａ ｇｌｏｂａｌ ｉａｔｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ，５４（１），１－７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｍ．２１７５６；Ｌａｉ，Ｍ．Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｙ．，＆ Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２０１０）．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１０２（３），１７９－１８６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｎｃｉ／ｄｊｐ４６７；Ｔａｉｗａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．（２０１７）．Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｔａｉｗａｎ．Ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｃ ａｎｄ ｕｒｅｔｅｒａｌ ｔｕｍｏｒ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ．Ｔａｉｗａｎ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｉｓｔｒｙ．ＵＲＬ ｃｒｉｓ．ｂｈｐ．ｄｏｈ．ｇｏｖ．ｔｗ／ｐａｇｅｐｕｂ／Ｈｏｍｅ．ａｓｐｘ？ｉｔｅｍＮｏ＝ｃｒ．ｑ．１０から２０１７年８月１４日に入手した。）。ＡＡは、ウマノスズクサ属の植物が生成する、発がん性と腎毒性を有するニトロフェナントレンカルボン酸である（Ｈｓｉｅｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｉｎ，Ｉ．Ｈ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｗ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．，＆ Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２００８）．Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ ｄａｔａ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ ｂｅｔｗｅｅｎ １９９７ ａｎｄ ２００３，Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ，３，１３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４９－８５４６－３－１３；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍ．（２０１１）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｒｅｐ Ｃａｒｃｉｎｏｇ，１２，４５－４９）。ＡＡ曝露とＵＴＵＣの間の病因論的因果関係は２つの異なる集団において確立している。第１の集団は、ウマノスズクサ属の植物が小麦畑に自生しているバルカン諸国に居住している（Ｊｅｌａｋｏｖｉｃ，Ｂ．，Ｋａｒａｎｏｖｉｃ，Ｓ．，Ｖｕｋｏｖｉｃ－Ｌｅｌａ，Ｉ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｆ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｎｉｋｏｌｉｃ，Ｊ．，Ｔｏｍｉｃ，Ｋ．，Ｓｌａｄｅ，Ｎ．，Ｂｒｄａｒ，Ｂ．，Ｔｕｒｅｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｔｉｐａｎｃｉｃ，Ｚ．，Ｄｉｔｔｒｉｃｈ，Ｄ．，Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．，＆ Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．Ｇ．（２０１２）．Ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍ－ＤＮＡ ａｄｄｕｃｔｓ ａｒｅ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，８１（６），５５９－５６７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｋｉ．２０１１．３７１）。第２の集団は、ウマノスズクサ属のハーブが中医学の慣習において広く使用されているアジアに存在している（Ｇｒｏｌｌｍａｎ，２０１３；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍ，２０１１）。ウマノスズクサ属ハーブの医薬品利用がもたらす公衆衛生上の脅威の例は台湾であり、台湾におけるＵＴＵＣの発症率は世界で最も高い（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｍｏｒｉｙａ，Ｍ．，Ｚａｖａｄｉｌ，Ｊ．，Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ｓ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｇｎａｔｅｎｋｏ，Ｄ．Ｖ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｔｕｒｅｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．Ｒ．，Ｐｕ，Ｙ．Ｓ．，＆ Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．（２０１２）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０９（２１），８２４１－８２４６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１９９２０１０９；Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｋ．，Ｙｅｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｓ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｈ．，Ｈｕａｎｇ，Ｗ．Ｊ．，Ｆａｎ，Ｆ．Ｓ．，Ｃｈｉｏｕ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｈ．，＆ Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｍ．（２００２）．Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｈｉｇｈ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｕｐｐｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，５９（５），６８１－６８７）。台湾における成人人口の３分の１超がＡＡを含有するハーブ医薬品を処方されており（Ｈｓｉｅｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｉｎ，Ｉ．Ｈ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｗ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．，＆ Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２００８）．Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ ｄａｔａ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ ｂｅｔｗｅｅｎ １９９７ ａｎｄ ２００３．Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ，３，１３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４９－８５４６－３－１３）、結果として、全尿路上皮癌に対して異常に高い（３７％）割合のＵＴＵＣ症例がもたらされている（Ｔａｉｗａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．（２０１７）．Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｔａｉｗａｎ．Ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｃ ａｎｄ ｕｒｅｔｅｒａｌ ｔｕｍｏｒ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ．Ｔａｉｗａｎ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｉｓｔｒｙ．ＵＲＬ ｃｒｉｓ．ｂｈｐ．ｄｏｈ．ｇｏｖ．ｔｗ／ｐａｇｅｐｕｂ／Ｈｏｍｅ．ａｓｐｘ？ｉｔｅｍＮｏ＝ｃｒ．ｑ．１０から２０１７年８月１４日に入手した。）。
腎尿管切除術は、ＵＴＵＣを有する患者において、それが早期のステージで検出された場合に、治療力を有し得る（Ｌｉ，Ｃ．Ｃ．，Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｈ．，Ｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｋｅ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｐ．，Ｔｓａｉ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｃｈｏｕ，Ｙ．Ｈ．，＆ Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｈ．（２００８）．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｕｐｐｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒ ａｆｔｅｒ ｒａｄｉｃａｌ ｎｅｐｈｒｏｕｒｅｔｅｒｅｃｔｏｍｙ ｉｎ Ｔａｉｗａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ，５４（５），１１２７－１１３４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２００８．０１．０５４）。しかしながら、これらのがんは、明らかな臨床症状（典型的には血尿）が発症するまではほぼ無症候性であるため、結果として、ほとんどの患者は専ら進行ステージにおいて診断される（Ｒｏｕｐｒｅｔ，Ｍ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐｅｒａｔ，Ｅ．，Ｚｉｇｅｕｎｅｒ，Ｒ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｗａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｂｏｈｌｅ，Ａ．，Ｖａｎ Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｋａａｓｉｎｅｎ，Ｅ．，Ｐａｌｏｕ，Ｊ．，＆ Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．（２０１５）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ｕｐｐｅｒ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｔｒａｃｔ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：２０１５ Ｕｐｄａｔｅ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ，６８（５），８６８－８７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１５．０６．０４４）。早期ステージＵＴＵＣを検出するための診断検査法は現在利用可能な状態ではない。それゆえ、このタイプの悪性腫瘍を発症するリスクのある集団において早期ＵＴＵＣを同定するのに使用可能な臨床ツールに対する要望がある。ＵＴＵＣが反対側の上部尿路において、及び／または膀胱において再発し得ることから、外科手術後の再発もまた１つの懸念材料である（Ｒｏｕｐｒｅｔ，Ｍ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐｅｒａｔ，Ｅ．，Ｚｉｇｅｕｎｅｒ，Ｒ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｗａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｂｏｈｌｅ，Ａ．，Ｖａｎ Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｋａａｓｉｎｅｎ，Ｅ．，Ｐａｌｏｕ，Ｊ．，＆ Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．（２０１５）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ｕｐｐｅｒ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｔｒａｃｔ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：２０１５ Ｕｐｄａｔｅ．Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ，６８（５），８６８－８７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１５．０６．０４４；Ｓｏｒｉａ，Ｆ．，Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｒｉｎｋ，Ｍ．，Ｋａｓｓｏｕｆ，Ｗ．，Ｓｐｉｅｓｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｌｏｔａｎ，Ｙ．，Ｙｅ，Ｄ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｉ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｃｈａｄｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．，＆ Ｔｈａｌｍａｎｎ，Ｇ．Ｎ．（２０１７）．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｕｐｐｅｒ－ｔｒａｃｔ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＵＴＵＣ）．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ，３５（３），３７９－３８７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００３４５－０１６－１９２８－ｘ）。それゆえ、悪性腫瘍の徴候に対する注意深い監視がＵＴＵＣ患者におけるフォローアップケアの不可欠な要素であり、とりわけ、尿細胞診ではＵＴＵＣの大部分を検出することができないことから、再発性疾患用の非侵襲的検査法が術後管理を大幅に改善することになり得る（Ｂａａｒｄ，Ｊ．，ｄｅ Ｂｒｕｉｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｚｏｎｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｋａｍｐｈｕｉｓ，Ｇ．，ｄｅ ｌａ Ｒｏｓｅｔｔｅ，Ｊ．，＆ Ｌａｇｕｎａ，Ｍ．Ｐ．（２０１７）．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｉｌｅｍｍａｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｐｐｅｒ ｔｒａｃｔ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｕｒｏｌ，１４（３），１８１－１９１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｕｒｏｌ．２０１６．２５２）。
本明細書では一般的に、対象におけるがんの存在を同定するための従来の方法と比較して高い感度及び特異度で、対象におけるがんの存在を同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、対象におけるがんの存在を高い感度及び特異度で同定するための本明細書で提供する方法は、対象から採取した液体試料（例えば、血液、血漿または血清）に対して実施される。それに対し、対象におけるがんの存在を同定するための従来の方法では、対象から採取した液体試料に対して実施する際に、感度のレベル、特異度のレベル、または、その両方のレベルが実現されない。いくつかの実施形態では、対象が既にがんを患っていることが確認される前、対象ががん細胞を有していることが確認される前、及び／または、対象ががんに関連する症状を示す前に、対象におけるがんの存在を高い感度及び特異度で同定するための本明細書で提供する方法を実施する。いくつかの実施形態では、対象におけるがんの存在を高い感度及び特異度で同定するための本明細書で提供する方法は第１選択の検出法として使用され、対象ががんを有することの別の検出法の確認（例えば、「オーバーコール」）として単純に使用するものではない。
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、または、オステオポンチン（ＯＰＮ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象における膵臓癌の存在を同定すること、を含む、対象における膵臓癌の存在を同定するための方法を提供する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ及びＳＭＡＤ４のそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）のそれぞれのレベルを検出する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、または、ＭＰＯのうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象におけるがんの存在を同定すること、を含む、対象におけるがんの存在を同定するための方法を提供する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１及びＭＰＯのそれぞれのレベルを検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、または、ＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象におけるがんの存在を同定すること、を含む、対象におけるがんの存在を同定するための方法を提供する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ及びＣＡ１５－３のそれぞれのレベルを検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、または、ＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象におけるがんの存在を同定すること、を含む、対象におけるがんの存在を同定するための方法を提供する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１及びＣＡ１５－３のそれぞれのレベルを検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中のＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在を検出すること、対象から採取した第３の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、ＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、これらの組み合わせの場合に、対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定すること、を含む、対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法を提供する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である、第１の生体試料と第３の生体試料は同一である、第２の生体試料と第３の生体試料は同一である、または、第１の生体試料と前記第２の生体試料と前記第３の生体試料は同一である。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、第３の生体試料は、尿試料である。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、染色体腕５ｑ、８ｑ、または、９ｐのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ及びＶＨＬのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、ＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、その両方の場合に、対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定すること、を含む、対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法を提供する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料または第２の生体試料は、子宮頸部試料または子宮内膜試料である。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、または、９ｑのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ及びＣＤＫＮ２Ａのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象から採取した循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料中において、以下の遺伝子、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、または、ＴＰ５３のうちの１つまたは複数における少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーの存在を検出することを更に含む。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。方法及び物質については本発明で使用するために本明細書に記載しているが、当該技術分野において周知のその他の好適な方法及び物質もまた使用することができる。物質、方法及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー及びその他の参照文献の全体は参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合には、本明細書（定義を含む）が優先される。本明細書の様々なセクションにおいて使用する標題は、そのセクションにおける本開示をその標題の主題に限定すると解釈されるものではなく、その他のセクションにおける本開示をその標題の主題以外の主題に限定すると解釈されるものでもない。このような標題は例示的なものであり、単に、読解しやすいように組み込まれるものである。このような標題は更に、本開示のその他のパートへのそのセクションの適用性または普遍性を限定することを意図するものではない。
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面、ならびに、特許請求の範囲により明らかとなるであろう。
がんの検出及び位置特定を行うためのＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査を示す概略の全体像を含有する図である。 血漿試料中における腫瘍特異的変異を同定するためのＰＣＲベースアッセイの発現を示すグラフを含有する図である。色の着いた曲線は、短い（＜４０ｂｐ）アンプリコンの増加数により検出可能な本試験で評価した８タイプのがんの割合を示している。検出の感度はアンプリコンの数に伴い上昇するが、約６０アンプリコンでプラトーに達する。色の着いたドットは、本発明者らの研究で評価した８０５のがんに用いた６１アンプリコンパネルを使用して検出したがんの割合を示しており、その平均は８２％である（本文を参照のこと）。一般に利用可能なシークエンシングデータについては、Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）リポジトリから入手した。 評価した８０５の原発性腫瘍内における検出可能な変異の数の分布を示すグラフを含有する図である。 ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの性能を示すグラフを含有する図である。（Ａ）はＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。曲線上の赤色の点は、＞９９％特異度における検査の平均性能（６１％）を示している。エラーバーは、この特定の点における感度及び特異度の９５％信頼区間を示している。本文に記載のとおり、評価した８種のがんタイプ間の中央性能は７０％であった。（Ｂ）はステージ毎のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの感度である。エラーバーは中央値の標準誤差を示している。（Ｃ）は腫瘍タイプ毎のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの感度である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。 健康なドナーと健康な患者の間の境界を示すＣａｎｃｅｒＳＥＥＫで使用したｃｔＤＮＡと８種のタンパク質の特性のウォーターフォールプロットを含有する図である。数値については高（左）から低（右）へとソートしている。それぞれのカラムは個々の患者の試料（赤色はがん患者、青色は健康な対照）を示している。 ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫで使用したｃｔＤＮＡと８種のタンパク質の特性の主成分分析を示すグラフを含有する図である。それぞれのドットは個々の患者の試料（赤色はがん患者、青色は健康な対照）を示している。 感度に対する個々のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ特性の影響を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は図４Ｃと同様の腫瘍タイプ毎のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの感度である。（Ｂ～Ｊ）は、ロジスティック回帰から特定のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ特性を除外した際に達成された感度を示すそれぞれのパネルである。ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫによって達成された感度と比較した感度における差異は、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査の性能に対するそれぞれのバイオマーカーの相対的寄与を反映している。 ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫにより陽性と分類された患者における、教師あり機械学習によるがんタイプの同定を示すグラフを含有する図である。患者の割合に相当するパーセンテージは、最も可能性のある２つのタイプ（薄青色バーと濃青色バーの合計）または最も可能性のあるタイプ（薄青色バー）の一方により正確に分類されている。全がんタイプの全患者における予測については表６に記載している。エラーバーは９５％信頼区間を示している。 ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異をタンパク質バイオマーカーと組み合わせることによりＰＤＡＣを早期に検出するための感度が上昇することを示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、ＡＪＣＣステージに対応した、ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異単独、ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９－９、ならびに、ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９－９及びその他のタンパク質（組み合わせアッセイ）、の感度である。（Ｂ）は、腫瘍サイズに対応した、ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異単独、ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９－９、ならびに、ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９－９及びその他のタンパク質（組み合わせアッセイ）、の感度である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。 ほとんどの割合の患者が１つのマーカーのみで検出されることから、ｃｔＤＮＡとタンパク質マーカーを組み合わせることにより感度が上昇することを示す図形を含有する図である。ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異（赤色の円）、ＣＡ１９－９（緑色の円）、及び、３つのその他のタンパク質バイオマーカー（青色の円）、ならびに、これらの組み合わせ（重複領域）により、検出された患者の数である。８０名の患者（全体の３６％）については、３つのマーカーのいずれかにおいても検出不能であった。 １２名の患者の血漿（検出可能な量のＫＲＡＳとＴＰ５３の両方の変異を含有する血漿）中におけるＫＲＡＳ変異の変異アレル頻度（ＭＡＦ）とＴＰ５３変異の変異アレル頻度が強く相関しており（ピアソンｒ＝０．８８５）、ｃｔＤＮＡアッセイの信頼性及びその定量性が実証されていることを示すグラフを含有する図である。網掛け領域は９５％信頼区間を示している。 ＡＪＣＣステージ毎に分類した（ステージＩＡまたはＩＢは青色の曲線、ステージＩＩＡまたはＩＩＢは赤色の曲線）、本研究に組み込んだ２２１名のＰＤＡＣ患者のカプランマイヤー生存プロットを含有する図である。 トリプレックスアッセイマーカーと腫瘍サイズの間の相関関係を示すグラフを含有する図である。（Ａ）ＫＲＡＳ変異はより小さな腫瘍と比較してより大きな腫瘍でより頻繁に見つかったが、変異アレル頻度は腫瘍サイズとは相関しなかった（ピアソンｒ＝０．０３９）。（Ｂ）ＣＡ１９－９の高い患者では、血漿中ＣＡ１９－９濃度は腫瘍サイズと弱く相関している（ピアソンｒ＝０．２８７）。（Ｃ～Ｅ）ＣＥＡ、ＨＧＦ及びＯＰＮの血漿中レベルは、ＫＲＡＳ変異またはＣＡ１９－９と比較して、腫瘍サイズにより少なく依存していた（ＣＥＡピアソンｒ＝０．１５３、ＨＧＦピアソンｒ＝０．０３７、ＯＰＮピアソンｒ＝０．０１８）。網掛け領域は９５％信頼区間を示している。 プロラクチンのレベル（Ｇ）とミッドカインのレベル（Ｅ）が、麻酔の投与後ではあるが外科的切除前に採取した試料において有意に上昇したことを示すグラフを含有する図である。それに対し、麻酔の投与前後に採取した試料間における、変異ＫＲＡＳ ｃｔＤＮＡ（Ａ）、血漿中ＣＡ１９－９濃度（Ｂ）、血漿中ＣＥＡ濃度（Ｃ）、血漿中ＨＧＦ濃度（Ｄ）、及び血漿中ＯＰＮ濃度を有する試料の割合に差異は認められなかった。Ｎ．Ｓ．は有意差なし、Ｐ＞０．０５である（正確並べ替えｔ検定）。 麻酔の投与前と投与直後に採取した２９ペアの血漿試料に由来するタンパク質バイオマーカーレベルの倍率変化を示すグラフを含有する図である。評価を行った６つのマーカーのうちプロラクチン及びミッドカインのみが麻酔によって上昇したことが判明し、採取部位とタンパク質レベルの間の相関関係と完全に一致した。 多変量解析により同定された全生存率の独立した予測因子、（Ａ）組み合わせアッセイの状態（ＨＲ＝１．７６、９５％ＣＩ、１．１０～２．８４、ｐ＝０．０１８）、（Ｂ）分化のグレード（低分化、ＨＲ＝１．７２、９５％ＣＩ、１．１１～２．６６、ｐ＝０．０１５）、（Ｃ）リンパ管浸潤（有、ＨＲ＝１．８１、９５％ＣＩ、１．０６～３．０９、ｐ＝０．０２８）、（Ｄ）結節性病変（有、ＨＲ＝２．３５、９５％ＣＩ、１．２０～４．６１、ｐ＝０．０１３）、（Ｅ）断端の状態（ＨＲ＝１．５９、９５％ＣＩ、１．０１～２．５５、ｐ＝０．０５０）毎に分類したカプランマイヤー生存プロットを含有する図である。 （Ａ）ＫＲＡＳ変異、（Ｂ）ＣＡ１９－９、（Ｃ）ＣＥＡ、（Ｄ）ＨＧＦ、（Ｅ）ＯＰＮ、及び（Ｆ）組み合わせアッセイの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を含有する図である。（Ａ～Ｅ）ＲＯＣ曲線は、それぞれの組み合わせアッセイバイオマーカーの性能を個別に示している。曲線上の赤色の点は、組み合わせアッセイで使用した閾値におけるマーカー性能を示している。エラーバーは、特定の閾値（赤色のフォント）における感度及び特異度の９５％信頼区間を示している。（Ｆ）は、ＫＲＡＳ閾値を変化させてＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（黒色の曲線）、ＣＡ１９－９閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＨＧＦ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（赤色の曲線）、ＣＥＡ閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＡ１９－９、ＨＧＦ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（青色の曲線）、ＨＧＦ閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（緑色の曲線）、及び、ＯＰＮ閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ及びＨＧＦの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（オレンジ色の曲線）、組み合わせアッセイの性能を示すＲＯＣ曲線である。これら３つの曲線の交点は、トリプレックスアッセイの総合的な性能（感度６４％、感度９９．５％）を示している。 ８種のがんタイプにおいて、がんを同定するマーカーパネルの性能を示す図である。（Ａ）は数値データである。（Ｂ）はグラフデータである。 子宮内膜癌または卵巣癌を有する患者のＰａｐブラシ試料、Ｔａｏブラシ試料及び血漿試料中における腫瘍ＤＮＡを検出するための例示的なＰａｐＳＥＥＫ検査の概略図を含有する図である。卵巣癌または子宮内膜癌から剥離した腫瘍細胞が子宮腔へと運ばれ、そこで、それら腫瘍細胞がＴａｏブラシにより採取されることができる。子宮頸管内へと通過した腫瘍細胞は、通常のＰａｐ検査で使用されるＰａｐブラシにより捕捉されることができる。これらのブラシを液体固定剤に浸し、そこからＤＮＡを単離及びシークエンスする。体細胞変異及び異数性について配列を解析する。加えて、血流内へと流れ出た腫瘍ＤＮＡをｃｔＤＮＡ解析で検出してもよい。 健康な対照由来の、子宮内膜癌を有する患者由来の、卵巣癌を有する患者由来の、Ｐａｐブラシ試料（Ａ）及びＴａｏブラシ試料（Ｂ）中における、異数性及び体細胞変異の検出（ＰａｐＳＥＥＫ）を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。 体細胞変異と異数性の組み合わせ検査が、Ｐａｐブラシ（Ａ）試料に加えＴａｏブラシ（Ｂ）試料中における、卵巣癌と子宮内膜癌の両方に対する感度を上昇させることを示すベン図を含有する図である。卵巣癌において、Ｐａｐブラシ試料と血漿試料の組み合わせ検査はまた、いずれかの試料タイプ単独における検査と比較して、感度を上昇させる（Ｃ）。 ＰａｐＳＥＥＫを用いた、Ｐａｐブラシ試料またはＴａｏブラシ試料中におけるステージ毎の子宮内膜癌（Ａ）または卵巣癌（Ｂ）の検出を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。 Ｐａｐ試料及び血漿試料中における卵巣癌の検出を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。 ＰａｐＳＥＥＫを用いた、Ｐａｐブラシ試料、Ｔａｏブラシ試料、及び血漿試料中における子宮内膜癌及び卵巣癌の検出を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。 本研究において尿中細胞を評価するために使用される例示的なアプローチの概略図を含有する図である。 データの要約を含む早期検出コホート及びサーベイランスコホートにおける患者の数を示すフローチャートを含有する図である。患者のサブセットに対して細胞診を実施した。 早期検出コホート（Ａ）で評価した２３１点の尿中細胞試料及びサーベイランスコホート（Ｂ）で評価した１３２点の尿中細胞試料の１０遺伝子パネル中に存在する変異の割合を示すグラフを含有する図である。 早期検出コホート（Ａ）及びサーベイランスコホート（Ｂ）のための３つのアッセイのそれぞれにより陽性であった試料の分布のベン図を含有する図である。ＵＲＯ＝１０遺伝子パネル検査、ＴＥＲＴ＝ＴＥＲＴプロモーター領域検査、ＡＮＥＵ＝異数性検査である。 早期検出コホート（Ａ）及びサーベイランスコホート（Ｂ）における、陽性ＵｒｏＳＥＥＫ検査と臨床レベルでの疾患の検出の間のリードタイムの棒グラフを含有する図である。 早期検出コホート及びサーベイランスコホートの低及び高悪性度の尿路上皮腫瘍の診断における、ＵｒｏＳＥＥＫと比較した細胞診の性能を示す棒グラフを含有する図である。 尿中細胞ＤＮＡの遺伝子解析による、例示的な上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）の非侵襲的検出の概略図を含有する図である。上部尿路腫瘍は腎盂及び／または尿管において生じ、尿と直接接触している。尿は、存在する場合には悪性細胞（青色）と共に、様々な部位から泌尿器系を通って恒常的に流れ出た正常細胞の混合物を含有している。ＵｒｏＳＥＥＫアッセイは、染色体の喪失及び獲得の同定に加えて、泌尿器癌において頻繁に変異している遺伝子の変異解析に依存している。 ３つのＵｒｏＳＥＥＫアッセイのそれぞれにおける陽性結果の分布を示すベン図を含有する図である。 ＵＴＵＣコホートに由来するマッチした腫瘍及び尿中細胞ＤＮＡ試料におけるコピー数多型の比較を示すグラフを含有する図である。原発性腫瘍をそれぞれのセクションの上段に、尿中細胞ＤＮＡを下段に示している。染色体の獲得は青色で示し、一方、喪失については赤色で示している。獲得と喪失の有意レベルについてはそれぞれ、Ｚスコア＞３と＜－３に設定した。Ｘ軸は染色体腕である。Ｙ軸はＺスコアである。 ＵＴＵＣ患者由来の尿中細胞ＤＮＡを解析するのに使用した１０遺伝子パネル中のそれぞれの遺伝子における総変異の割合を示すグラフを含有する図である。 ４名の個々のＵＴＵＣ患者（図３５Ａ～Ｄ）に由来するマッチした腫瘍及び尿中細胞ＤＮＡ試料におけるコピー数多型の比較を示すグラフを含有する図である。Ｚスコア＞３または＜－３はそれぞれ、染色体の獲得または喪失において有意であるとみなされた。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを示している。全５６名の患者のデータについては表２８に記載している。 例示的なＷＡＬＤＯアプローチの全体像を示す概略図を含有する図である。（Ａ）一対のプライマーペアで約３８，０００長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）を増幅させる。（Ｂ）検査試料を、類似サイズのゲノムＤＮＡを有する７点の正倍数性試料にマッチさせる。（Ｃ）ゲノムを、それぞれが５００ｋｂサイズである４３６１の区間に分割する。（Ｄ）正倍数性試料中におけるこれら５００ｋｂゲノム区間内のリードを４３６１のクラスターにグループ分けする。クラスター内の全５００ｋｂゲノム区間は類似した読み取り深度を有している。（Ｅ）検査試料中の５００ｋｂゲノム区間のそれぞれに由来するリードを所定のクラスター内に配置する。（Ｆ）サポートベクターマシン（ＳＶＭ）ベースのアルゴリズムを含む統計的検定を用いて、試料が正倍数性である場合に、それぞれの染色体腕上の全５００ｋｂゲノム区間に由来する総リードが予測どおりに分布しているかどうかを確認する。統計的検定は検査試料のクラスター内に観察されたリード分布をベースとしているが、正倍数性試料中のリードとの比較によるものではない。（Ｇ）ＬＩＮＥ内の既知の一般的な多型部位における生殖細胞系配列変異型は、個々の染色体腕における異数性を評価するのにも使用可能な腕レベルのアレル不均衡についての情報を提供する。これら同一の多型を使用して、任意の２つの試料が同一個体に由来するかどうかを確認してもよい。（Ｈ）利用可能な同一個体に由来するマッチした正常試料が存在する場合、ＬＩＮＥ内における一塩基置換、一塩基挿入及び一塩基欠失の数及び内容をＷＡＬＤＯで検出することができる。 ９種のがんタイプにおいて同定された個々の染色体腕の獲得及び喪失を示すグラフを含有する図である。それぞれの染色体腕における獲得または喪失を有する腫瘍の平均割合について、図中に記載している。両方のコホートにおける同一の９種の腫瘍タイプを解析したが、ＷＡＬＤＯ（赤色）またはＧＩＳＴＩＣ（青色）で評価した試料間に重複は認められなかった。ＷＡＬＤＯでは本明細書で報告した腫瘍のＬＩＮＥシークエンシングに由来するデータを採用し、一方、ＧＩＳＴＩＣではＴＣＧＡが提供するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰ６．０アレイに由来するデータを採用した。 がん患者由来の血漿試料中に検出された異数性を示す図である。３つの範囲の腫瘍細胞割合についての受信者動作特性（ＲＯＣ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）を示している。真陽性を陽性とスコアリングしたがん患者由来の試料と定義し、一方、偽陽性を陽性とスコアリングした正常個体由来の試料と定義した。それぞれの血漿試料の腫瘍細胞割合については、本文に記載のドライバー遺伝子シークエンシングデータから推定した。（Ａ）は＜０．５％の腫瘍細胞割合を有する試料である。（Ｂ）は０．５～１％の範囲の腫瘍細胞割合を有する試料である。（Ｃ）は＞１％の腫瘍細胞割合を有する試料である。 ９種の異なるがんタイプに対して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰ６．０及びＧＩＳＴＩＣを使用したＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＦＡＳＴ－ＳｅｑＳ及びＷＡＬＤＯを使用して検出したがんにおける異数性相関関係比較を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は染色体腕獲得の割合の相関関係である。（Ｂ）は染色体腕喪失の割合の相関関係である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ａ）は浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｂ）は結腸腺癌及び直腸腺癌（ＣＯＡＤ、ＣＯＡＤＲＥＡＤ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｃ）は食道癌（ＥＳＣＡ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｄ）は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｅ）は肝臓肝細胞癌（ＬＩＨＣ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｆ）は膵腺癌（ＰＡＡＤ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｇ）は卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｈ）は胃腺癌（ＳＴＡＤ）である。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｉ）は子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）である。 読み取り深度に応じた２１トリソミー性能を示すグラフを含有する図である。トリソミーを有する個体由来のＤＮＡ試料を、２ｎｇの正常ＤＮＡと約０．２ｎｇの２１トリソミーＤＮＡと正常な末梢白血球（ＷＢＣ）試料の比率で物理的に混合した。混合物を作製して、非侵襲的出生前検査における通常の胎児画分（約１０％）を複製した。ＬＩＮＥ－アンプリコン中の多型を使用して、試料のトリソミー混和物を７．７％～１０．４％の範囲と推定した。２．５のｚ閾値を使用して、読み取り深度の範囲にわたる感度（Ａ）及び特異度（Ｂ）を算出した。 エキソームシークエンス対ＷＡＬＤＯにおいて検出された体細胞一塩基置換（ＳＢＳ）の総数の比較を示すグラフを含有する図である。 エキソームシークエンシング対ＷＡＬＤＯにより検出された、Ａ：Ｔ＞Ｔ：Ａ変異である一塩基置換変異のパーセンテージの比較を示すグラフを含有する図である。 一塩基置換（ＳＢＳ）変異のスペクトルを示すグラフを含有する図である。（Ａ）はＷＡＬＤＯにより同定されたＳＢＳである。（Ｂ）はエキソームシークエンシングにより同定されたＳＢＳである。 代表的な正常ＷＢＣ試料のクラスター内に含まれるゲノム区間の数の分布を示すグラフを含有する図である。 調整リードの分布を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、ＦＡＳＴ－ＳｅｑＳアンプリコンシークエンシングにおけるリードが無作為に分布していなかったことを示す調整リードの分布である。 調整リードの分布を示すグラフを含有する図である。（Ｂ）は、クラスター内における調整リードの正規性を示す正常ＷＢＣ試料の代表的なクラスターである。 調整リードの分布を示すグラフを含有する図である。（Ｃ）は、クラスター内における調整リードの正規性を示す異数性原発性腫瘍試料の代表的なクラスターである。 染色体腕の獲得または喪失を同定するための統計的手法の例を示すグラフを含有する図である。 読み取り深度に応じたヘテロ接合性ＳＮＰにおけるＢアレル頻度の分散の実験的推定を示すグラフを含有する図である。ＵＩＤ深度が高くなるほど、ヘテロ接合性ＳＮＰにおけるＢアレル頻度の推定は改善した。 一腕改変を有する合成物質を作製するための例示的な擬似コードを示す図である。 複数腕改変を有する合成物質を作製するための例示的な擬似コードを示す図である。 読み取り深度に応じたゲノムワイド異数性スコア（ＳＶＭスコア）の分布を示すグラフを含有する図である。読み取り深度が低いほどより高いスコアが生じる傾向が強く、ＵＩＤ深度の補正に失敗すると偽陽性が生じる場合がある。 ボトルネックシークエンシング法の例示的な全体像を示す概略図を含有する図である。図の最上部のそれぞれの色は、集団内における１つの細胞のゲノムに由来する二本鎖ＤＮＡを示している。ランダムで非クローン性の点変異（赤色）は個々の細胞に特有のものである。それに対し、クローン性のリファレンス変異（黒色のＡ）は細胞集団内の全てのゲノムに存在している。（ステップ１）ランダムせん断により様々なサイズのＤＮＡ分子を作製する。（ステップ２）Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｙアダプターの非相補的一本鎖領域（灰色のＰ５及び黒色のＰ７）は、それぞれのＤＮＡ分子の両末端にライゲートしたフォーク構造として示されている。（ステップ３）希釈により、元の集団由来のＤＮＡ分子（５つを示している）の数がランダムな様式で減少する。ＤＮＡ分子の末端は固有にリファレンスゲノムにアラインしている。マッピング座標は、データ処理中における固有の分子「バーコード」として使用される。（ステップ４）ＰＣＲプライマー（黒色の矢印）がアニールし、プライマーが元のＤＮＡ分子のワトソン鋳型とクリック鋳型に個別に伸長する（点線）。赤色のアスタリスクはライブラリのＰＣＲ中に生じたエラーを示している。（ステップ５）ワトソン鋳型とクリック鋳型により、２ファミリーのＰＣＲ複製物が生じる。ＤＮＡ分子（インサート）に対するアダプターを含有するＰ５（灰色）とＰ７（黒色）の方向により、２つのファミリーが識別される。Ｐ５配列とＰ７配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル上において、どちらの末端がそれぞれリード１対リード２においてシークエンスされるかを決定する。赤色のアスタリスクは、クリックファミリーメンバーにはないがワトソンファミリーメンバーにおいて伝播したＰＣＲエラーを示している。アーチファクトとは対照的に、真の変異（赤色のＣ：Ｇ変異）はワトソンファミリーメンバーとクリックファミリーメンバーの両方に存在する。（ステップ６）ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインは、アーチファクトとクローン性の変異（黒色のＡ：Ｔ）を排除することにより、シークエンシングデータ中における固有ＤＮＡ分子と点変異（赤色のＣ：Ｇ）の数を同定及び定量する。 対照と比較して、ＤＮＡ修復における欠損を有する個体または環境中の発がん性物質に曝露された個体に由来する正常組織において増加した核点変異を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、異なるＤＮＡミスマッチ修復遺伝子型（ＰＭＳ２＋／＋またはＰＭＳ２－／－）を有する年齢がマッチした正常結腸上皮（べた塗りの円）または発がん性物質曝露を有さない（無）もしくは発がん性物質曝露を有する（アリストロキア酸または喫煙）年齢がマッチした正常腎皮質（べた塗りの四角）における、核ゲノム（左）とミトコンドリアゲノム（右）における点変異有病率の比較である。赤色の線は平均を示している。＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定；＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ；ｎｓ、有意差なしはＰ＞０．０５を示している。（Ｂ）は、６つの発生し得るタイプ（凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの置換の置換頻度（ｙ軸）を示す積み重ねカラムである。コホートラベルはそれぞれのカラム真上のＡに示している。それぞれの変異スペクトルを生成する置換の数（Ｎ）をｘ軸上に示している。ｎ．ｄ．は、変異スペクトル解析における不十分な数の変異（Ｎ＝７）による未測定である。＊Ｐ＝０．０４、フィッシャーの正確確率検定；＊＊Ｐ＝２．６×１０－８及び＊＊＊Ｐ＝１．５×１０－１６、ボンフェローニ多重比較補正を伴うフィッシャーの正確確率検定；ｎｓ、有意差なしはＰ＞０．０５を示している。この図における全ての統計的検定は両側であった。 ゲノム特異的な変異パターン及び組織特異的な変異パターンで、生涯にわたり点変異を蓄積させた正常ヒト組織を示すグラフを含有する図である。４つの正常組織タイプ（９名の個体における脳前頭皮質、５名の個体における腎皮質、１１名の個体における結腸上皮、及び、１名の個体における十二指腸）における核ゲノム（上段）とミトコンドリアゲノム（下段）における点変異有病率を測定した。合計で２６名の個体について評価を行ったが、それぞれの個体は１つの正常組織タイプを提供した。円グラフ挿入図は、６つの発生し得る置換タイプ（右側の円グラフ凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの置換の有病率を示している。それぞれの円グラフを、十二指腸を省略したという点を除いて、個体それぞれの散布図で示した個体から集計した。核ゲノムにおける円グラフを生成する置換の数は、脳でｎ＝３１、腎臓でｎ＝７３、及び結腸でｎ＝９４であり、ミトコンドリアゲノムにおける円グラフを生成する置換の数は、脳でｎ＝１８１、腎臓でｎ＝２９９、及び結腸でｎ＝１１６であった。 ＭｉＳｅｑ（商標）プレランを用いた複製カウントの評価を含有する図である。ヒストグラムはファミリーメンバー（ｘ軸上に示す、個々の鋳型分子に由来するＰＣＲ複製物）の分布を示している。６点の試料（ＣＯＬ３７３、ＳＡ＿１１７、ＫＩＤ０３８、ＢＲＡ０１、ＢＲＡ０４、ＢＲＡ０７）についてＭｉＳｅｑ（商標）で２回または３回の系列希釈（１０３、１０４、１０５、または１０６）のいずれかを評価して、ライブラリあたり約５Ｍの適切なペアリードを生成した。ここで、Ｐｉｃａｒｄ’ｓ Ｅｓｔｉｍａｔｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙプログラムを使用してファミリーメンバーカウントを求めた。それに続き、１０５希釈（青色）で作製したライブラリを本研究で報告した最終のＨｉＳｅｑ（商標）ランに使用した。ライブラリあたりにシークエンスするクラスターの増加により、ＨｉＳｅｑ（商標）分布がＭｉＳｅｑ（商標）分布と比較して右側にシフトすることが予測されるということに留意されたい（約５Ｍのクラスターが約７０Ｍのクラスターに調整される）。例えば、ファミリーあたりのメンバーがＨｉＳｅｑ（商標）ランにとって多すぎて、任意の量のシークエンシングで評価可能な異なるファミリーの数を制限することから、１０６希釈（赤色）由来のＢｏｔＳｅｑＳライブラリは使用しなかった。 本研究で報告した４４のＢｏｔＳｅｑＳライブラリのファミリーメンバーカウントを示すグラフを含有する図である。４４のＢｏｔＳｅｑＳライブラリの水平な箱ひげ図（ｙ軸）及びファミリーあたりのメンバーの数（複製カウント、ｘ軸）である。白色の箱は第１四分位数～第３四分位数の範囲を示しており、ハッシュマークは中央値を示している。ひげは１．５＊ＩＱＲ（四分位数範囲）を示しており、ひげの外側のデータ点は外れ値として示している。ライブラリあたり平均３．９７Ｍ（０．３８～１０．９１Ｍの範囲）の未フィルターファミリーを評価した。ゲノムマッピング座標を固有分子識別コードとして使用したＢｏｔＳｅｑＳパイプラインによりファミリーを同定した。青色の名称はテクニカルレプリケート試料を示している。Ｂｏｔ０１～Ｂｏｔ０６とＢｏｔ２３～２８については、希釈に１００倍の差がある同一試料で実施したということに留意されたい（表４３を参照のこと）。 ワトソンファミリーメンバーとクリックファミリーメンバーの両方がアーチファクト、とりわけＧ＞Ｔ塩基転換を減少させることの考察を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、脳前頭皮質（左側）、腎皮質（中央部、網掛け）、または、結腸上皮（右側）に由来する正常組織における「ワトソンＡＮＤ／ＯＲクリック」ファミリー（黒色の円）または「ワトソンＡＮＤクリック」ファミリー（黒色の四角）に認められる変異を考察した核点変異頻度（ｙ軸）である。とりわけ、「ＯＲ」変異は、最低２つのワトソンリードを有するワトソンファミリーにおける≧９０％の変異割合、または、最低２つのクリックリードを有するクリックファミリーにおける≧９０％の変異割合を示している。「ＯＲ」変異がデータに示されるワトソンファミリーまたはクリックファミリーのみを有しているが両方を有しているわけではないということに留意されたい。「ＡＮＤ」変異は、最低２つのワトソンリードを有するワトソンファミリーにおける≧９０％の変異割合、及び、最低２つのクリックリードを有するクリックファミリーにおける≧９０％の変異割合を示している。「ＡＮＤ」変異は、ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインの改良型である「ＡＮＤ／ＯＲ」データセットのうちの内部サブセットである。それぞれの組織内において加齢させることにより２５の個体を組織する。（Ｂ）は、（ａ）それぞれの正常組織タイプにおけるワトソンＡＮＤ／ＯＲクリック（上段の円）またはワトソンＡＮＤクリック（下段の円）を考察することによる、６つの発生し得る置換タイプ（凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの核置換の頻度の円グラフである。ワトソンＡＮＤ／ＯＲクリックにおける変異スペクトルを生成する核変異の数は、脳でｎ＝６１６、腎臓でｎ＝１，２５７、結腸でｎ＝２，５４２であり、ワトソンＡＮＤクリックにおける変異スペクトルを生成する核変異の数は、脳でｎ＝３３、腎臓でｎ＝７４、結腸でｎ＝９９であった。 脳内よりも結腸の正常組織内により多く蓄積する希少な点変異を示すグラフを含有する図である。年齢でグループ分けした（若年乳児／小児は緑色、若年成人は紫色、老年成人は青色）、正常脳前頭皮質（左側）及び正常結腸上皮（右側）における、核ゲノム（上段のグラフ）とミトコンドリアゲノム（下段のグラフ）における点変異頻度（ｙ軸）である。それぞれの年齢コホートにおける平均値については、標準偏差を示すエラーバーで示している。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）５．０ｆソフトウェアを使用してボンフェローニ多重比較事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを実施し、Ｐ値については上記のバーで報告した。ｎ．ｓ．（有意差なし）はＰ＞０．０５を示している。脳における個体の数と群の平均年齢は以下のとおり、乳児／小児：ｎ＝３、３．５歳（ｙ／ｏ）（ＢＲＡ０１、ＢＲＡ０２、ＢＲＡ０３）；若年成人：ｎ＝３名の個体、２２ｙ／ｏ（ＢＲＡ０４、ＢＲＡ０５、ＢＲＡ０６）；及び老年成人：ｎ＝３、９３ｙ／ｏ（ＢＲＡ０７、ＢＲＡ０８、ＢＲＡ０９）である。結腸においては、乳児／小児：ｎ＝２、５．５ｙ／ｏ（ＣＯＬ２２９、ＣＯＬ２３１）；若年成人：ｎ＝６、２８（ＣＯＬ２３５、ＣＯＬ２３６、ＣＯＬ２３７、ＣＯＬ３７３、ＣＯＬ３７４、ＣＯＬ３７５）；老年成人：ｎ＝３、９６ｙ／ｏ（ＣＯＬ２３２、ＣＯＬ２３３、ＣＯＬ２３４）である。 同一個体由来の正常組織内におけるミトコンドリア点変異頻度と核点変異頻度を示すグラフを含有する図である。データ点は、同一個体の正常組織内におけるミトコンドリア点変異頻度と核点変異頻度の比率（ｙ軸）を示している。個体を４つのコホート（ｘ軸）にグループ分けしたが、対照にはｎ＝２４名の個体（表５１を参照のこと）、ＤＮＡ修復欠損ＰＭＳ２－／－にはｎ＝２名の個体（ＣＯＬ２３８、ＣＯＬ２３９）、アリストロキア酸曝露にはｎ＝３名の個体（ＡＡ＿１０５、ＡＡ＿１２４、ＡＡ＿１２６）、及び、喫煙曝露にはｎ＝３名の個体（ＳＡ＿１１７、ＳＡ＿１１８、ＳＡ＿１１９）であった。対照コホート（ＣＯＬ２２９）由来の１つの比率がゼロであったため本解析から除外した。それぞれのコホートにおける平均（赤色の線）比率は、対照において２４．５、ＤＮＡ修復欠損ＰＭＳ２－／－において０．５、アリストロキア酸曝露において１．１、及び、喫煙曝露において２．０である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。 同一組織タイプに由来する正常組織と腫瘍が類似した変異スペクトルを有していることを示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、結腸（上段）と腎臓（下段）に由来する正常（左側）と腫瘍（右側）を比較した、６つの発生し得る置換タイプ（凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの置換の核とミトコンドリアにおける頻度の円グラフである。「正常」とは、図５４に示す正常組織に由来する希少な変異スペクトルデータのことを示している。「核腫瘍変異」とは、ｓｙｎａｐｓｅ．ｏｒｇのウェブサイトにあるＴＣＧＡデータセット＃！Ｓｙｎａｐｓｅ：ｓｙｎ１７２９３８３の、結腸直腸癌（ＣＯＡＤ／ＲＥＡＤ）または明細胞腎癌（ＫＩＲＣ）に由来するクローン性の変異データのことを示している。結腸と腎臓に由来する「ｍｔＤＮＡ腫瘍変異」については、Ｊｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４ ｅＬｉｆｅ ３）の補助ファイル２内の「結腸直腸」腫瘍タイプと「腎臓」腫瘍タイプから得た。正常組織について評価した置換の数は、以下のとおり、結腸の核における１３名の個体に由来するｎ＝９４、結腸のｍｔＤＮＡにおける１２名の個体に由来するｎ＝１１６、腎臓の核における７名の個体に由来するｎ＝７３、及び、腎臓のｍｔＤＮＡにおける５名の個体に由来するｎ＝２９９であった。腫瘍組織について評価した置換の数は、以下のとおり、結腸直腸癌の核における１９３名の個体に由来するｎ＝１８，５３８、結腸直腸癌のｍｔＤＮＡにおける７６名の個体に由来するｎ＝６４、明細胞腎細胞癌の核における４１７名の個体に由来するｎ＝２４，５５９、及び、腎癌のｍｔＤＮＡにおける２３名の個体に由来するｎ＝１６であった。（Ｂ）は、（Ａ）に示したコホートに由来する変異スペクトルの主成分分析（ＰＣＡ）である。Ｒソフトウェアを使用してＰＣＡを実施してグラフを作成した。 Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳのエレメントを示す概略図を含有する図である。第１のステップでは、解析を行うそれぞれのフラグメントに固有識別子（ＵＩＤ）配列（メタルハッチをつけたバーまたは点々をつけたバー）を割り当てる。第２のステップでは、固有にタグ付けしたフラグメントを増幅して、それぞれのメンバーが同一ＵＩＤを有するＵＩＤファミリーを作製する。超変異体を、ファミリーメンバーの≧９５％が同一変異を有するＵＩＤファミリーと定義する。 内在ＵＩＤ＋捕捉による例示的なＳａｆｅ－ＳｅｑＳを示す概略図を含有する図である。ランダムせん断により作製されたそれぞれのフラグメントにおける末端の配列（様々に網掛けを施したバー）は、固有識別子（ＵＩＤ）として機能する。続けてＰＣＲで増幅可能となるように、これらのフラグメントにアダプター（アースハッチをつけたバー及びクロスハッチをつけたバー）をライゲートする。二本鎖鋳型のそれぞれのストランドに由来する１つの固有に識別可能なフラグメントを作製する（１つのストランドのみを示している）。目的の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含有する固相上で目的のフラグメントを捕捉する。５’「グラフト」配列（接着剤をべた塗りにしたバー及び軽く点々をつけたバー）を含有するプライマーを用いたＰＣＲ増幅によりＵＩＤファミリーを作製した後に、シークエンシングを実施して図６１におけるように超変異体を定義する。 外来ＵＩＤによる例示的なＳａｆｅ－ＳｅｑＳを示す概略図を含有する図である。一組の遺伝子特異的プライマーを用いてＤＮＡ（せん断または未せん断）を増幅する。プライマーの一方は、ランダムＤＮＡ配列の遺伝子特異的配列の５’側に配置された固有識別子（ＵＩＤ、様々に網掛けを施したバー）を形成するランダムＤＮＡ配列（例えば、一組の１４Ｎ’）を有しており、両方のプライマーは、次ステップにおけるユニバーサル増幅を可能とする配列（アースハッチをつけたバー及びクロスハッチをつけたバー）を有している。示すように、２回のＵＩＤ割当てサイクルにより、それぞれの二本鎖鋳型分子に由来する２つのフラグメント（それぞれが異なるＵＩＤを有する）が作製される。「グラフト」配列（接着剤をべた塗りにしたバー及び軽く点々をつけたバー）を同様に含有するユニバーサルプライマーを用いた続くＰＣＲにより、ダイレクトシークエンスされるＵＩＤファミリーが作製される。図６１の凡例におけるように超変異体を定義する。 通常の解析法及びＳａｆｅ－ＳｅｑＳ解析法により同定された一塩基置換を示すグラフを含有する図である。図６３に示した外来ＵＩＤ戦略を使用して、３名の正常な非血縁個体のＣＴＮＮＢ１遺伝子に由来するＰＣＲフラグメントを作製した。それぞれの位置は、８７の発生し得る一塩基置換（３つの発生し得る置換／塩基×解析した２９の塩基）のうちの１つを示している。これらのフラグメントをＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩｘ装置上でシークエンスして、通常の方法（Ａ）またはＳａｆｅ－ＳｅｑＳ（Ｂ）で解析した。直接比較するために、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳの結果を通常の解析法と同じスケールで示している（挿入図は拡大図である）。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳと比較した変異型の高頻度性及び非血縁試料間における変異型の一致性が示すように、通常の解析法により同定された変異型の大部分がシークエンシングエラーを示している可能性があることに留意されたい。 内在ＵＩＤ＋インバースＰＣＲによる例示的なＳａｆｅ－ＳｅｑＳを示す概略図を含有する図である。ランダムせん断により作製されたそれぞれのフラグメントにおける末端の配列は、固有識別子（ＵＩＤ、様々に網掛けを施したバー）として機能する。標準的なＩｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製と同様に、これらのフラグメントにアダプター（アースハッチをつけたバー及びクロスハッチをつけたバー）をライゲートする。二本鎖鋳型のそれぞれのストランドに由来する１つの固有にタグ付けしたフラグメントを作製する（１つのストランドのみを示している）。リガーゼを用いた環化に続いて、５’「グラフト」配列（接着剤をべた塗りにしたバー及び軽く点々をつけたバー）を同様に含有する遺伝子特異的プライマーを用いたインバースＰＣＲを実施する。このＰＣＲにより、ダイレクトシークエンスされるＵＩＤファミリーが作製される。図６１におけるように超変異体を定義する。 ホスホラミダイトを用いて合成したオリゴヌクレオチドとＰｈｕｓｉｏｎを用いて合成したオリゴヌクレオチドにおける一塩基置換の位置対エラー頻度を示すグラフを含有する図である。ホスホラミダイト（Ａ）またはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｂ）を用いて合成した同一の３１塩基ＤＮＡフラグメントの代表的な部位をＳａｆｅ－ＳｅｑＳで解析した。それぞれのタイプの７回の独立した実験における平均値及び標準偏差をプロットした。ホスホラミダイト合成フラグメントとＰｈｕｓｉｏｎ作製フラグメントにおいて同定されたＳＢＳ超変異体の平均値はそれぞれ、１，７２１±３８３と１９６±１４３であった。ｙ軸は指定位置における総エラーの割合を示している。合成そのものの間にエラーが体系的に導入されていたとすれば予測され得たように、ホスホラミダイト合成ＤＮＡフラグメントにおけるエラーが７つの複製間で一貫していたということに留意されたい。それに対し、Ｐｈｕｓｉｏｎ作製フラグメントにおけるエラーは、確率過程（Ｌｕｒｉａ ａｎｄ Ｄｅｌｂｒｕｃｋ，１９４３ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：４９１－５１１）から予測されるように、試料間で不均一であると思われた。 ＵＩＤファミリーメンバー分布を示すグラフを含有する図である。図６３に示した外来ＵＩＤ戦略を使用して、３名の正常な非血縁個体のＣＴＮＮＢ１の領域に由来するＰＣＲフラグメントを作製したが（表５３）、１名の個体から作製した≦３００のメンバー（総ＵＩＤファミリーの９９％）を含むＵＩＤファミリーの代表例を示している。ｙ軸は、ｘ軸上に示すファミリーメンバーの数に含まれる異なるＵＩＤファミリーの数を示している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ａ）は完全木を示しており、（Ｂ）～（Ｋ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ａ）は完全木を示している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｃ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｄ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｅ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｆ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｇ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｈ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｉ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｊ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｋ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。 ランダムフォレストモデルから抽出した組織認識用の例示的なルールを含有する図である。ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔパッケージ（ｖ４．６－１４）のｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ関数を、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫプロジェクトのタンパク質データに適用した。タンパク質データには、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫによりがんと正確に予測された３３のタンパク質と６２６の腫瘍試料が含まれている。正常試料における値の２５分位数未満である場合、それぞれのタンパク質の値をゼロに設定した。特定の決定ルール（表５８）を得るために、ｉｎＴｒｅｅｓパッケージ（ｖ１．２）を適用して、ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔで生成した全５００木から６以下の長さの全てのルールを抽出した。ｉｎＴｒｅｅｓパッケージの関数（ｓｅｌｅｃｔＲｕｌｅＲＲＦ、ｂｕｉｌｄＬｅａｒｎｅｒ、ａｐｐｌｙＬｅａｒｎｅｒ）を使用して、このルールセットから関連ルール及び非冗長ルールを選択し、分類器を生成してデータに適用し、最終ルールリストを抽出した。この最終ルールリストは完全ランダムフォレストと同様に機能し、完全フォレストの良好な近似を示している。 ランダムフォレストモデルから抽出した組織認識用の例示的なルールを含有する図である。ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔパッケージ（ｖ４．６－１４）のｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ関数を、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫプロジェクトのタンパク質データに適用した。タンパク質データには、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫによりがんと正確に予測された３３のタンパク質と６２６の腫瘍試料が含まれている。正常試料における値の２５分位数未満である場合、それぞれのタンパク質の値をゼロに設定した。特定の決定ルール（表５８）を得るために、ｉｎＴｒｅｅｓパッケージ（ｖ１．２）を適用して、ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔで生成した全５００木から６以下の長さの全てのルールを抽出した。ｉｎＴｒｅｅｓパッケージの関数（ｓｅｌｅｃｔＲｕｌｅＲＲＦ、ｂｕｉｌｄＬｅａｒｎｅｒ、ａｐｐｌｙＬｅａｒｎｅｒ）を使用して、このルールセットから関連ルール及び非冗長ルールを選択し、分類器を生成してデータに適用し、最終ルールリストを抽出した。この最終ルールリストは完全ランダムフォレストと同様に機能し、完全フォレストの良好な近似を示している。
本明細書中使用される場合、名詞の前の「ａ」という単語は、その特定名詞が単数または複数であることを表す。例えば、「遺伝子変異（ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」という語句は、「１つまたは複数の遺伝子変異（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）」を包含する。
本明細書中使用される場合、「約」という用語は、およそ、～の範囲、おおまか、または～前後、を意味する。数値範囲と合わせて使用される場合、「約」という用語は、その範囲を、指定の数値の境界を上下に拡張することにより修飾する。概して、「約」という用語は、本明細書中、使用することにより、記載される数値に上下それぞれその数値の１０％の幅を持たせる。
本明細書中使用される場合、「異数性」という用語は、天然よりも多いまたは少ない染色体二倍体数を有する状態、すなわち正倍数体からの逸脱を示す。
本明細書中、循環腫瘍ＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡの文脈で使用される場合、「遺伝子に由来する」という語句は、循環腫瘍ＤＮＡが、腫瘍細胞（例えば、溶解したもしくはそれ以外により死滅した腫瘍細胞）から脱落したものであることを意味する。例えば、「ＫＲＡＳ遺伝子に由来する」循環腫瘍ＤＮＡは、その循環腫瘍ＤＮＡが、元来、腫瘍細胞中に存在していたことを意味する。遺伝子に由来する循環腫瘍ＤＮＡ中に存在する変異を検出する場合、その変異が腫瘍細胞自身において最初に同定されていることは、必要ではない。
本明細書中使用される場合、「遺伝子バイオマーカー」及び「遺伝子マーカー」という語句は、単独で、または他の遺伝子バイオマーカーもしくは他のバイオマーカーと組み合わせて、対象におけるがんを特性決定する核酸を示す。遺伝子バイオマーカーは、遺伝子中の修飾（例えば、変異）を含むことができる。修飾の例として、特に制限なく、一塩基置換、挿入、欠失、挿入欠失、転座、及びコピー数多型が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーとして、腫瘍抑制遺伝子における修飾（例えば、不活化修飾）が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーとして、がん遺伝子における修飾（例えば、活性化修飾）が挙げられる。様々な遺伝子バイオマーカー及び遺伝子バイオマーカーパネルを、本明細書中、より詳細に説明する。
本明細書中使用される場合、「変異」、「遺伝子修飾」、及び「遺伝子変異」という用語は、同義で使用され、野生型核酸配列における変更を示す。例えば、いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における変異を検出する方法が、本明細書中記載される。そのような方法は、変異、遺伝子修飾、または遺伝子変異を検出するとして、同義で記載することができることが理解される。
本明細書中使用される場合、「タンパク質バイオマーカー」、「タンパク質マーカー」、「ペプチドバイオマーカー」、及び「ペプチドマーカー」という語句は、単独で、または他のタンパク質もしくは他のバイオマーカーと組み合わせて、対象におけるがんを特性決定するタンパク質を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーとして、対象（例えば、その対象ががんを有すると既知であるか否かに関わらず、がんを有する対象）におけるタンパク質のレベルが、がんを有さない参照対象と比較した場合に、上昇していることが挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーとして、対象（例えば、その対象ががんを有すると既知であるか否かに関わらず、がんを有する対象）におけるタンパク質のレベルが、がんを有さない参照対象と比較した場合に、低下していることが挙げられる。本明細書中使用される場合、「タンパク質バイオマーカーを検出する」という語句は、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、レベル上昇またはレベル低下）を検出することを示すことができる。様々なタンパク質バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカーパネルを、本明細書中、より詳細に説明する。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーとは異なるペプチドが、本明細書中提供される方法で使用される。
本明細書中タンパク質バイオマーカーに関連して使用される場合、「上昇したレベル」という語句は、健康な対象（例えば、特定の疾患または症状を呈示していない対象）由来の試料（例えば、参照試料）で典型的に観察されるタンパク質バイオマーカーの参照レベルより高いタンパク質バイオマーカーのレベルを示す。いくつかの実施形態では、参照試料は、がんを有さない対象（例えば、異なる対象または参照対象）から得られた試料が可能である。例えば、結腸直腸癌に関連したタンパク質バイオマーカーの場合、参照試料は、結腸直腸癌を有さない異なる対象または参照対象から得られた試料が可能である。いくつかの実施形態では、参照試料は、タンパク質バイオマーカーの上昇したレベルが観察された同一対象から得られた試料が可能であるが、ただしこの参照試料は、がんの発症前に得られたものである。いくつかの実施形態では、同一対象から得られたそのような参照試料は、参照試料として将来使用するために凍結されているかまたそれ以外で保存されている。いくつかの実施形態では、参照試料が検出不能なレベルのタンパク質バイオマーカーを有する場合、上昇したレベルは、タンパク質バイオマーカーの任意の検出可能なレベルが可能である。比較可能な試料のレベルは、その特定のレベルが上昇したレベルであるか否かを判定するのに使用することができることが理解される。
本明細書中タンパク質バイオマーカーに関連して使用される場合、「参照レベル」という語句は、健康な対象（例えば、特定の疾患または症状を呈示していない対象）に典型的に存在するタンパク質バイオマーカーのレベルを示す。タンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、疾患または症状（例えば、がん）を呈示していない参照対象に存在するレベルが可能である。例えば、結腸直腸癌に関連したタンパク質バイオマーカーの場合、参照試料は、結腸直腸癌を有さない対象から得られた試料が可能である。別の例として、タンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、ある対象で疾患または症状（例えば、がん）が発症する前にその対象に存在するレベルが可能である。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーで測定されたまたは検出されたレベルが、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベル（複数可）よりも高い場合に、その対象において同定することができる。
本明細書中使用される場合、「感度」という用語は、ある方法が持つ、対象における疾患の存在を正確に同定または診断する能力を示す（例えば、ある方法の感度は、その方法が持つ、対象において症状を検出する真の正の検出率または検出可能性を特定する能力として説明することができる）。例えば、本明細書中記載される、対象におけるがんの存在を検出することができる様々な方法のいずれかに関連して使用される場合、高感度は、その方法が、高いパーセンテージの確率で対象におけるがんの存在を正確に同定することを意味する。例えば、本明細書中記載される、その方法を行った場合に９５％の確率で対象中のがんの存在を正確に検出する方法は、９５％の感度を有すると言われる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される、対象におけるがんの存在を検出することができる方法は、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）の感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、１つのバイオマーカークラスのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法よりも高い感度を提供する。
本明細書中使用される場合、「特異性」という用語は、ある方法が持つ、対象における疾患の存在を正確に排斥する能力を示す（例えば、ある方法の特異性は、その方法が持つ、ある症状が対象中に存在しないことを正確に判定する真の負の判定率または判定可能性を特定する能力として説明することができる）。例えば、本明細書中記載される、対象におけるがんの存在を検出することができる様々な方法のいずれかに関連して使用される場合、高特異性は、その方法が、高いパーセンテージの確率でがんの不在を正確に同定することを意味する（例えば、その方法は、高いパーセンテージの確率で、対象におけるがんの存在を間違って同定することがない）。例えば、本明細書中記載される、その方法を行った場合に９５％の確率で対象におけるがんの不在を正確に検出する方法は、９５％の特異性を有すると言われる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される、対象におけるがんの不在を検出することができる方法は、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、１つのバイオマーカークラスのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法よりも高い特異性を提供する。
本明細書中使用される場合、「対象」という用語は、「患者」という用語と同義で使用され、哺乳綱のあらゆるメンバーを含む脊椎動物を意味し、そのようなメンバーとして、ヒト、家庭用及び家畜動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット用動物、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ（例えば、競走馬）、及び高等霊長類などが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、がん細胞を保有するヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、がん細胞を保有するが、がん細胞を保有していることが知られていないヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウイルス性疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、細菌性疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、真菌性疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、寄生虫症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、喘息を有する。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、移植片対宿主病を有する。
本明細書中使用される場合、「治療」という用語は、「治療介入」という語句と同義で使用される。
遺伝子変異が対象中のがん細胞を起源とするかどうかを判定する目的で、白血球細胞（例えば、加齢に関連したクローン性造血（例えば、クローン性造血の拡大、これは不確定潜在性クローン性造血（ｃｌｏｎａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、すなわちＣＨＩＰとしても知られる）または骨髄形成異常症から生じる白血球細胞クローン）から単離されたまたは得られたＤＮＡを、がんに関連した遺伝子変異の有無について検査する方法は、本明細書中、概して「白血球細胞に対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞由来のＤＮＡに対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞検証」、及び同様な語句で記載される。
概要
概して、対象におけるがんの存在を同定する従来方法に比べて高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を検出または同定する方法及び物質が、本明細書中提供される。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を同定する方法は、対象から得られた液体試料（複数可）（例えば、血液、血漿、血清）で行われるが、それに対して、対象におけるがんの存在を同定する従来方法は、対象から得られた液体試料で行った場合に、本方法レベルの感度、本方法レベルの特異性、またはその両方を達成できない。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を同定する方法は、その対象がすでにがんに罹患していると確定する前に、その対象ががん細胞を保有すると確定する前に、及び／またはその対象ががんに関連した症候を呈示する前に、行われる。すなわち、いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を同定する方法は、最初に行われる検出法として使用され、対象ががんを有するとする別の検出法の単なる確認（例えば、「オーバーコール（ｏｖｅｒｃａｌｌ）」）にとどまらない。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、がんの検出または診断において高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能である（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、膵癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、膀胱癌または上部尿路上皮癌が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、その対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味することが理解される。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
当業者には当然であるとおり、がんの検出または診断にふさわしい感度または特異性は、様々な因子に基づいて選択可能である。１つの非限定的な例として、がんの検出または診断においてより低い特異性を提供するように設計された方法は、高い感度を有するように設計されていることが可能である。別の非限定的な例として、がんの検出または診断において高い特異性を有するように設計された方法は、より低い感度を有するように設計されていることが可能である。いくつかの実施形態では、低い感度が有利となる場合さえあり得る（例えば、通常はスクリーニングしない集団のスクリーニングにおいて）。いくつかの実施形態では、がん（例えば、ある特定種類のがん）が蔓延している集団において、がんの存在を検出または診断する方法は、特異性を低下させる代償を払ったとしても、比較的高感度を有するように設計することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される様々な検出方法の感度及び特異性は、特定患者集団における疾患の有病率に基づいて決定される。例として、がんを有することが知られていない一般患者集団のスクリーニング検査は、高い特異性を有するように選択することができる（偽陽性診断、及び不要なさらなる診断検査及び／またはモニタリングを排除するために）。別の例として、がんの高リスク集団（例えば、リスクのある行動に従事しているもしくは従事していた、リスクのある家族歴を有する、リスクのある環境を経験しているまたは経験していた、などの集団であるため、例えば、がんを有するまたは発症するリスクが一般集団全体より高い集団）のスクリーニング検査は、高感度を有するように選択することができる（一般集団には適切ではない可能性がある追加のさらなる診断検査及び／またはモニタリングの代償を伴ったとしても、存在するがんの検出をより高い確実性で提供することを高める目的で）。１つの非限定的な例として、９０％の感度及び９５％の特異性を持つ検査は、有病率０．０１％の集団において陽性的中率（ＰＰＶ）が１５％及び陰性適中率（ＮＰＶ）が＞９９％となり、一方、有病率が４０％（高リスク集団）だとしたら、これらの的中率はどちらも９９％超となり得る。ＰＰＶは、以下のとおり計算することができる：真の陽性（ＴＰ）数／（真の陽性数＋偽陽性数）。ＰＰＶは、以下のとおり計算することもできる：（感度×有病率）／（感度×有病率）＋（（１－特異性）×（１－有病率））。ＮＰＶは、以下のとおり計算することができる：真の陰性数／陰性とされた数。ＰＰＶは、以下のとおり計算することもできる：特異性×（１－有病率）／（（１－感度）×有病率）＋（特異性×（１－有病率）。例えば、Ｌａｌｋｈｅｎ ａｎｄ ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ：ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｐａｉｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ８，２００８を参照、これはそのまま全体が本明細書中参照により援用される。
検出方法
本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）の存在及び／または異数性の存在を検出するための方法及び物質である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時及び順次検査する両方の実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、１つの遺伝子バイオマーカークラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、１つのタンパク質バイオマーカークラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つの遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及び１つのタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方を含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができる。
いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在（例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより検出される）は、疾患に関連し、対象がその疾患に罹患していることを示す。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在（そのバイオマーカー及び／または異数性は、疾患に関連する）が検出された場合に、対象は、疾患であると診断される。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々ながんのいずれか）。いくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出される前は、疾患（例えば、がん）を有することが知られていない。いくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出される前は、がん細胞を保有することが知られていない。いくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出される前に、がんに関連する症候を呈示していない。
診断方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ための方法及び物質である。対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することにより（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、がんを有すると診断する（例えば、がんを有すると同定する）ことができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、がんを有すると診断する（例えば、がんを有すると同定する）ことができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。
対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も実施される。
対象を、疾患を有するまたは発症するリスクがあるとして同定する方法
本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）の存在及び／または異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。
対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか、そのような治療介入として、化学予防剤が挙げられるが、これに限定されない）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか、そのような治療介入として、化学予防剤が挙げられるが、これに限定されない）も実施される。
治療方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象を治療することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると診断するまたは同定することができ、及び／またはその対象を治療することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受けることができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受ける。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受ける。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受ける。
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、治療は、本明細書中開示される様々な治療介入のいずれかであり、そのような治療介入として、特に制限なく、化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは改変型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）、キナーゼ阻害剤（例えば、転座または変異などの特定遺伝子損傷を標的とするキナーゼ阻害剤）の投与などの標的化療法、（例えば、キナーゼ阻害剤、抗体、二重特異性抗体）、シグナル伝達阻害剤、二重特異性抗体もしくは抗体断片（例えば、ＢｉＴＥ）、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、外科手術（例えば、外科的切除）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。疾患ががんである実施形態のいくつかにおいて、治療介入は、がんの重篤度を低下させ、がんの症候を低減させ、及び／または対象内に存在するがん細胞数を減少させる。
疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査（例えば、治療の実施前及び／または治療の実施後に、その治療の効果を判定するため、及び／または対象が、同一治療または異なる治療の追加実施の候補であるかどうかを判定するため）の候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリング（例えば、治療の実施前及び／または治療の実施後に、その治療の効果を判定するため、及び／または対象が、同一治療または異なる治療の追加実施の候補であるかどうかを判定するため）の候補としても同定される。
治療の同定方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象の治療を同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／またはその対象の治療を同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、同定される治療は、本明細書中開示される様々な治療介入のいずれかであり、そのような治療介入として、特に制限なく、化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは改変型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）、キナーゼ阻害剤（例えば、転座または変異などの特定遺伝子損傷を標的とするキナーゼ阻害剤）の投与などの標的化療法、（例えば、キナーゼ阻害剤、抗体、二重特異性抗体）、シグナル伝達阻害剤、二重特異性抗体もしくは抗体断片（例えば、ＢｉＴＥ）、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、外科手術（例えば、外科的切除）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。疾患ががんである実施形態のいくつかにおいて、同定された治療介入は、がんの重篤度を低下させ、がんの症候を低減させ、及び／または対象内に存在するがん細胞数を減少させる。
疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療も実施される（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）。
治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象の同定
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／または対象を、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／または対象を、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有するまたは発症する（例えば高いリスク）の１つまたは複数のメンバーを検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、本明細書中開示される様々な治療介入のいずれかである治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高いと同定され、そのような治療介入として、特に制限なく、化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは改変型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）、キナーゼ阻害剤（例えば、転座または変異などの特定遺伝子損傷を標的とするキナーゼ阻害剤）の投与などの標的化療法、（例えば、キナーゼ阻害剤、抗体、二重特異性抗体）、シグナル伝達阻害剤、二重特異性抗体もしくは抗体断片（例えば、ＢｉＴＥ）、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、外科手術（例えば、外科的切除）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。疾患ががんである実施形態のいくつかにおいて、同定された治療介入に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象であると同定される対象は、その対象において治療介入ががんの重篤度を低下させ、がんの症候を低減させ、及び／または対象内に存在するがん細胞数を減少させると思われる、またはそうなる可能性が高い対象として同定される。
いくつかの実施形態では、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。いくつかの実施形態では、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も受ける。
さらなる診断検査の候補として対象を同定する方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象を、さらなる診断検査の候補として同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／またはその対象を、さらなる診断検査の候補として同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有するまたは発症する１つまたは複数のメンバー（例えば高いリスク）を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、本明細書中開示される様々な種類のさらなる診断検査のいずれかの対象であり、そのような診断検査として、特に制限なく、スキャン（例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、コンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、またはＤＥＸＡスキャン）、または理学的検査（例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、または婦人科内診）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、さらなる診断検査の候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査の候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査の候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も受ける。
より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象を、より詳しいモニタリングの候補として同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／またはその対象を、より詳しいモニタリングの候補として同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。
いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングの候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、より詳しいモニタリングの候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、より詳しいモニタリングの候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も受ける。
遺伝子バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーとの併用
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、対象を、がんを有すると同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、その感度は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在またはタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を別々に検出することにより提供される感度よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において特異性を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、この特異性は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在またはタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を別々に検出することにより提供される特異性よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮを検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）。
対象から得られる試料は、本明細書中記載される、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）及び／またはタンパク質を含有する様々な試料のどれでも可能である。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）及び／またはタンパク質は、腫瘍細胞に由来する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを含む。遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーが検出可能な試料の非限定的な例として、血液、血漿、及び血清が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、対象から得られた単一試料で検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在は、対象から得られた第１の試料で検出され、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、対象から得られた第２の試料で検出される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの上昇したレベルが検出される可能性がある。例えば、タンパク質バイオマーカーの上昇したレベルは、参照レベルより高いレベルであることが可能である。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルが可能である。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルが可能である。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルが可能である。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルが可能である。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの低下したレベルが検出される可能性がある。例えば、タンパク質バイオマーカーの低下したレベルは、参照レベルより低いレベルであることが可能である。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルが可能である。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルが可能である。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルが可能である。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルが可能である。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）この遺伝子バイオマーカーパネルと併用して有用であると本明細書中記載されるパネルのいずれかにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。例えば、対象が、がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）場合、その対象は、さらなる診断検査を受けることができ、さらなる診断検査は、その対象におけるがんの存在を確認することができる。これに加えてまたはこれに代えて、その対象は、より高い頻度でモニタリングを受けることができる。がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）対象が、さらなる診断検査及び／またはより詳しいモニタリングを受ける実施形態のいくつかにおいて、その対象は、追加で、治療介入を実施される可能性がある。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、追加のさらなる診断検査（例えば、以前に行われたものと同じ種類のさらなる診断検査及び／または異なる種類のさらなる診断検査）及び／または継続したより詳しいモニタリング（例えば、以前に行われたものと同じ頻度または異なる頻度でのより詳しいモニタリング）を受ける。複数の実施形態において、対象が治療介入を実施され、追加のさらなる診断検査及び／または追加のより詳しいモニタリングを受けた後、その対象は、別の治療介入（例えば、以前に実施されたものと同じ治療介入及び／または異なる治療介入）を実施される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）この遺伝子バイオマーカーパネルと併用して有用であると本明細書中記載されるパネルのいずれかにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、について検査される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。任意の染色体またはその一部分（例えば、染色体腕）における異数性の存在が検出可能である。遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び９ｐの１つまたは複数における異数性の存在が検出される。遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑの１つまたは複数における異数性の存在が検出される。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに３）異数性の存在、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３の存在を検出することを含み、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、２）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに３）異数性の存在、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに３）異数性の存在、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む様々な方法のどれでも、さらに、１つまたは複数の追加のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。そのような追加のバイオマーカークラスの非限定的な例として、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、及び／または代謝産物。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスは、代謝産物バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の非限定的な例として、以下が挙げられる：５－メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ－アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ－グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’－ジホスホコリン、ジホモ－リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’－一リン酸（５’－ＣＭＰ）、ガンマ－グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ－１４５７７、Ｘ－１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２－アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ－アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド－ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ－ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３－メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３－リン酸、グルタミン、５－オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４－アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、トレオニン、Ｎ－アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ－アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６－アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３－グアニジノプロピオン酸、グルコース６－リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ－アセチルアスパラギン酸、４－グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ－アセチルアスパラギン、２－ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１－リン酸、Ｎ－ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ－アラニン、Ｎ－アセチルグルタミン酸、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、Ｇｌｙ－Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６－ニリン酸、３－アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルオルニチン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ－グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１－アミノシクロプロパン－１－カルボン酸ホモセリンラクトン、５－アミノ吉草酸、３－ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ－メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１－メチルニコチンアミド、Ｎ－アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ－メチルアラニン、パルミチン酸、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ－ＬＣＡ、オレオイル－Ｌ－カルニチン、オレアノール酸、３－ホスホグリセリン酸、５－ヒドロキシノルバリン、５－メトキシトリプタミン、アデノシン－５－一リン酸、アルファ－ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５－ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストラジオール、２－メトキシエストロン、２－メトキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、４－ヒドロキシエストロン、４－メトキシエストロン、４－メトキシエストラジオール、１６アルファ－ヒドロキシエストロン、１７－エピエストリオール、エストリオール、１６－ケトエストラジオール、１６－エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣ ａａ Ｃ２８：１、ＰＣ ａｅ Ｃ３０：０、及びＰＣ ａｅ Ｃ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｃｈｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）；Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＤ１３３，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）；Ｅｌｉａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ａｍｏｎｇ Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；７２（３）；６９６－７０６（２０１１）；Ｇａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ ２；７（５）：５８１５－５８２９（２０１６）；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２－２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅ－ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ｉｎ １０７７ ｃａｓｅｓ ａｎｄ １０７７ ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１２９１６－０１７－０８８５－６（２０１７）；を参照；これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書中参照により援用される。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、ペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なるペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの非限定的な例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ－β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α－１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン－１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質－８、αディフェンシン－１、－２、－３、血清Ｃ－ペプチド、アルファ－２－ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ－２、（チオレドキシン様タンパク質－２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ－ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ－１、Ｒａｂ－３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ－１、－６、－７、－８、－１０、－１１、－１２、－１６、－１８、－２１、－２３、－２８Ａ、－３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１－２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ－ａ、ＩＬ１Ｒ－ｂ、ＩＬ－２Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１ａ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ－β、ＭＣＰ－４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ－１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ－４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ－１、ＳＤＦ－１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン－１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン－２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ－１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ－３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧＦＲｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｂＲＩＩＩ、β－セルリン、ＩＧＦＢＰ１－４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン－２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２－ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ－５０、ＣＡ７２－４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ－２、－３、－７、－９、ＶＡＰ－１、ＴＩＭＰ１－２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ－１、オステオポンチン、ＫＩＭ－１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン－２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β－ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ－ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１－アンチトリプシン、ａ２－マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター－１）、Ｃｏｘ－１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１－１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ－ＭＢ、ヒト乳脂肪球１－２、ＮＴ－Ｐｒｏ－ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン－６、ＰＡＲＣ、Ｂ７－Ｈ４、ＹＫ－Ｌ４０、ＡＦＰ－Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５－ＨＩＡＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２－４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ－ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ－１、ｕＰＡ、フィブリンＤ－二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ－１、ｐ５３、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ－グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ－ＮＰＹ、セセルニン－１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ－２４、カベオリン－２、プロトロンビン、アンチトロンビン－ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ－１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ－２－糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ－１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７，Ｐａｇｅｓ １２１２－１２２１；Ｅｌｚｅｋ ａｎｄ Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１５ Ｍａｒ；３４（１）：８３－９６；Ｎｏｅｌ ａｎｄ Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ Ｊａｎ；８（１）：５５－７１；Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ ７；２１（３７）：１０５７３－１０５８３；Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１－９；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｊｕｎ ２７；８（２６）：４２７６１－４２７７１；Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．２０１７ Ｊｕｌ；６（７）：１７３８－１７５１；Ｚａｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７ Ｎｏｖ；９（１１）：１５５；Ｔａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｍａｒ １４；８（１１）：１８４９７－１８５１２を参照、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書中参照により援用される。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、核酸損傷または変異（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる核酸損傷または変異）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変異を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変異を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変異の非限定的な例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされてきており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されてきた（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６－３０５；Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９－５６；Ｇａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２；Ｏｇｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８－９７；米国特許第９，７４５，６３２号；及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化も、様々ながんのバイオマーカーとして使用されてきており、そのようながんとして、特に制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３；Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２；及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用されている。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされてきており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされてきた（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化は、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４－９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされてきた。そのような核酸または核酸の特徴の非限定的な例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されてきている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８；Ｆｕｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，１０８：８８６－９６；Ｇｉｒａｌｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９－７４；米国特許第８，３４３，７１８号；同第９，４１０，９５６号；及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ－２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５－５５）を参照；長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されてきている（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２－９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３－１００２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４－９；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７－６７；及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）；環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９－２５）のバイオマーカーとして使用されてきている；テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされてきた（例えば、前立腺、乳房、肺、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：４４７２－８０；Ｌｉｓｃｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１－６；Ｐｒｏｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０－７４；及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９－９０７を参照）；ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、再編成、及び／またはコピー数変化は、様々ながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されてきた。例えば、Ｍａｒａｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３－７３；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２－６８；Ｈｏｓｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７－９；Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ＆ Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４－８１；及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照；メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかってきており、そのようながんとして、特に制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９－４０６；Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：１５２１－５；及びＮｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ Ｍｅｄ．，７３：５４－８を参照）。これらの引用は、それぞれ、そのまま全体が本明細書中参照により援用される。
本文書は、がんを有する、または有することが疑われる哺乳類（例えば、ヒト）を評価及び／または治療するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、本文書は、哺乳類を、がんを有するとして同定するための方法及び物質を提供する。例えば、哺乳類から得られた試料（例えば、血液試料）を評価して、少なくとも部分的に、試料中の、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき、その哺乳類ががんを有するかどうかを判定することができる。本明細書中記載されるバイオマーカーパネル（例えば、１つまたは複数のバイオマーカーのセット）は、２つ以上（例えば、３つ、５つ、９つ、１０、２５、１００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、またはそれ以上）のバイオマーカー（例えば、がんに関連したバイオマーカー）の存在を含むことができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーパネルは、約２，０１１のバイオマーカー（例えば、約２，００１の遺伝子バイオマーカー及び約１０のペプチドバイオマーカー）を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、哺乳類におけるがんの位置（例えば、解剖学的部位）を同定することも含むことができる。例えば、哺乳類から得られた試料（例えば、血液試料）を評価して、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき、その哺乳類におけるがんの位置を特定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、がんを有する哺乳類を治療すること（例えば、１種または複数のがん治療を実施して哺乳類を治療すること）も含むことができる。例えば、哺乳類から得られた試料（例えば、血液試料）を評価して、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき、その哺乳類ががんを有するかどうかを判定し、１種または複数のがん治療を実施して哺乳類を治療する（例えば、がんの重篤度を低下させる、がんの症候を低減させる、及び／または哺乳類内に存在するがん細胞数を減少させる）ことができる。
「上昇したレベル」という用語は、ペプチドバイオマーカーのレベルに関して本明細書中使用される場合、１種または複数の健康な哺乳類由来の試料（例えば、参照試料）で典型的に観察されるペプチドの参照レベルより高い任意のレベルを示す。いくつかの実施形態では、参照試料は、がんを有さない哺乳類から得られた試料が可能である。例えば、結腸直腸癌に関連したペプチドバイオマーカーの場合、参照試料は、結腸直腸癌を有さない対象から得られた試料が可能である。いくつかの実施形態では、参照試料は、ペプチドバイオマーカーのレベル上昇が観察された同一対象から得られた試料が可能であるが、ただしこの参照試料は、がんの発症前に得られたものである。いくつかの実施形態では、同一哺乳類から得られたそのような参照試料は、参照試料として将来使用するために凍結されているかまたそれ以外で保存されている。いくつかの実施形態では、参照試料が検出不能なレベルのペプチドバイオマーカーを有する場合、上昇したレベルは、ペプチドバイオマーカーの任意の検出可能なレベルが可能である。比較可能な試料のレベルは、その特定のレベルが上昇したレベルであるか否かを判定するのに使用することが理解される。
任意の適切な哺乳類を、本明細書中記載されるとおり、評価及び／または治療することができる。哺乳類として、がんを有する哺乳類が可能である。哺乳類として、がんを有することが疑われる哺乳類が可能である。いくつかの実施形態では、ヒトまたは他の霊長類、例えばサルを、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができる。いくつかの実施形態では、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、及びラットを、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができる。例えば、ヒトを、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができ、任意選択で、本明細書中記載されるとり、１種または複数のがん治療で治療することができる。
哺乳類由来の任意の適切な試料を、本明細書中記載されるとおり評価することができる（例えば、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価する）。いくつかの実施形態では、試料は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、無細胞ＤＮＡ（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、ペプチドを含むことができる。例えば、試料は、循環ペプチド（例えば、がん関連ペプチド）を含むことができる。本明細書中使用される場合、「循環ペプチド」とは、哺乳類の体内の任意の閉鎖系（例えば、循環系）で検出可能なペプチドである。いくつかの実施形態では、試料は、流体試料（例えば、リキッドバイオプシー）が可能である。ＤＮＡ及び／またはペプチドを含む可能性がある試料の例として、特に制限なく、血液（例えば、全血、血清、または血漿）、羊膜、組織、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、パップスメア、母乳、及び呼気凝縮液が挙げられる。例えば、血漿試料を、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができる。
いくつかの実施形態では、試料を、処理することができる（例えば、試料からＤＮＡ及び／またはペプチドを単離及び／または精製するため）。例えば、ＤＮＡ単離及び／または精製は、細胞溶解（例えば、洗浄剤及び／または界面活性剤を用いる）、タンパク質除去（例えば、プロテアーゼを用いる）、及び／またはＲＮＡ除去（例えば、ＲＮＡ分解酵素を用いる）を含むことができる。別の例として、ペプチド単離及び／または精製は、細胞溶解（例えば、洗浄剤及び／または界面活性剤を用いる）、ＤＮＡ除去（例えば、ＤＮＡアーゼを用いる）、及び／またはＲＮＡ除去（例えば、ＲＮＡアーゼを用いる）を含むことができる。
任意の適切なバイオマーカーを、本明細書中記載されるとおり、使用することができる（例えば、少なくとも部分的に、試料中の１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づいて、哺乳類ががんを有するかどうかを判定するために）。バイオマーカーの例として、特に制限なく、遺伝子バイオマーカー、ペプチドバイオマーカー、代謝産物、ｍＲＮＡ転写物、ｍｉＲＮＡ、メチル化パターン（例えば、ＤＮＡメチル化パターン）、タンパク質（例えば、抗体）、及びクロマチンパターンが挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を用いて、哺乳類を、がんを有すると同定することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベル上昇を用いて、哺乳類を、がんを有すると同定することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベル上昇を併用して、哺乳類を、がんを有すると同定することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベル上昇を併用して検出することは、遺伝子バイオマーカーまたはペプチドバイオマーカー一方を単独で検出することと比べた場合に検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。
遺伝子バイオマーカーとして、任意の適切な遺伝子バイオマーカーが可能である。例えば、遺伝子バイオマーカーは、がんに関連した遺伝子バイオマーカーが可能である。遺伝子バイオマーカーは、遺伝子における修飾を含むことができる。修飾の例として、特に制限なく、一塩基置換、挿入、欠失、挿入欠失、転座、及びコピー数多型が挙げられる。遺伝子バイオマーカーは、任意の適切な遺伝子中にあることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーは、腫瘍抑制遺伝子における修飾（例えば、不活化修飾）を含むことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーは、がん遺伝子における修飾（例えば、活性化修飾）を含むことができる。遺伝子バイオマーカーを含むことができる遺伝子の例として、特に制限なく、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＧＮＡＳ、ＪＵＮ、ＡＢＣＡ７、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＪＵＢＡ、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＬＫ、ＡＭＢＲＡ１、ＡＭＥＲ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＫＲＤ４６、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＡＲＬ１５、ＡＲＭＣＸ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＡＤ２、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ５、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ２、ＡＸＩＮ１、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ９、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ８、ＢＬＶＲＡ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ７、ＢＲＥ、ＢＲＷＤ３、ＢＴＢＤ７、ＢＴＲＣ、Ｃ１１ｏｒｆ７０、Ｃ１２ｏｒｆ５７、Ｃ２ＣＤ５、Ｃ３ｏｒｆ６２、Ｃ８ｏｒｆ３４、ＣＡＭＫＶ、ＣＡＰＧ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＣＡＲ１、ＣＣＤＣ１１７、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＣＣＭ２、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＲ３、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＬＦ１、ＣＥＮＰＢ、ＣＥＰ１２８、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＤＬ１、ＣＨＵＫ、ＣＩＣ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＭＴＲ２、ＣＮＮ２、ＣＮＯＴ１、ＣＮＯＴ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＰＳ４、ＣＯＸ７Ｂ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＳＤＥ１、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＤＮＥＰ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＹＢ５Ｂ、ＤＡＣＨ１、ＤＣＨＳ１、ＤＣＵＮ１Ｄ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ１６、ＤＩＣＥＲ１、ＤＩＲＣ２、ＤＩＳ３、ＤＩＸＤＣ１、ＤＫＫ２、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＥＲ、ＤＮＭ１Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＩＦ２Ｓ２、ＥＩＦ４Ａ１、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＭＧ１、ＥＭＲ３、ＥＰ３００、ＥＰＢ４１Ｌ４Ａ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＳ８、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＦＩ１、ＥＸＯ５、ＥＺＨ２、Ｆ５、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＴ１、ＦＢＮ２、ＦＢＸＷ７、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＦＮ１、ＦＯＸＡ１、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＬＮＴＬ５、ＧＡＴＡ３、ＧＧＣＴ、ＧＩＧＹＦ２、ＧＫ２、ＧＬＩＰＲ２、ＧＮＰＴＡＢ、ＧＮＲＨＲ、ＧＯＬＭ１、ＧＯＴ２、ＧＰＳ２、ＧＰＸ７、ＧＲＫ１、ＧＳＥ１、ＧＺＭＡ、ＨＤＡＣ１、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ４、ＨＧＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＭＣＮ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＴ８８、ＩＫＺＦ２、ＩＮＯ８０Ｃ、ＩＮＰＰ４Ａ、ＩＮＰＰＬ１、ＩＷＳ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＫＡＮＳＬ１、ＫＡＴ８、ＫＡＴＮＡＬ１、ＫＢＴＢＤ７、ＫＣＮＭＢ４、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１４６７、ＫＬＦ４、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｂ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｅ、ＫＲＡＳ、ＫＲＴ１５、ＬＡＭＴＯＲ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＰＡＲ２、ＬＹＮ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ４Ｋ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ６、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ３、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ２３、ＭＥＮ１、ＭＧＡ、ＭＫＬＮ１、ＭＬＬＴ４、ＭＯＡＰ１、ＭＯＲＣ４、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＩ１、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ６、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ６、ＮＡＡ１５、ＮＡＡ２５、ＮＡＰ１Ｌ２、ＮＡＰ１Ｌ４、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＲ１、ＮＥＫ９、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＩＰＢＬ、ＮＩＴ１、ＮＫＸ３－１、ＮＭＥ４、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＳＤ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＨＦ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＯＬＡ２、ＰＯＴ１、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＰＦ４０Ａ、ＰＳＩＰ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＨ２、ＰＴＭＳ、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＢ１８、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＲＡＰＧＥＦ６、ＲＡＳＡ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ６、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２６、ＲＣ３Ｈ２、ＲＥＬ、ＲＥＲＥ、ＲＦＣ４、ＲＨＥＢ、ＲＨＯＡ、ＲＩＭＳ２、ＲＩＴ１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ４３、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ５、ＲＱＣＤ１、ＲＲＡＳ２、ＲＵＮＸ１、ＲＸＲＡ、ＳＡＲＭ１、ＳＣＡＦ１１、ＳＥＣ２２Ａ、ＳＥＮＰ３、ＳＥＮＰ８、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＩＮ３Ａ、ＳＫＡＰ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＮＣＢ、ＳＯＳ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ９、ＳＰ３、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ２、ＳＴＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３１、ＳＵＦＵ、ＴＡＦ１Ａ、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＥＴ２、ＴＥＸ１１、ＴＦＤＰ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＣＯ２、ＴＭＥＤ１０、ＴＭＥＭ１０７、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＰＯ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＲＣ６Ｂ、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ１、ＴＲＡＦ３、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＰ１２、ＴＳＣ１、ＴＴＫ、ＴＴＲ、ＴＵＢＡ３Ｃ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＲ５、ＵＮＣ１３Ｃ、ＵＮＫＬ、ＵＰＰ１、ＵＳＯ１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、ＶＮ１Ｒ２、ＶＰＳ３３Ｂ、ＷＡＣ、ＷＤＲ３３、ＷＤＲ４７、ＷＴ１、ＷＷＰ１、ＸＰＯ１、ＹＯＤ１、ＺＣ３Ｈ１３、ＺＤＨＨＣ４、ＺＦＨＸ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＧＲＦ１、ＺＭＹＭ３、ＺＭＹＭ４、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ２９２、ＺＮＦ３１８、ＺＮＦ３４５、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ７５０、及びＺＮＦ８００を挙げることができる。例えば、遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳの１つまたは複数中に存在することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子中の１つまたは複数の修飾）を検出することを含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、実施例１に記載されるタンパク質のいずれかをコードする１つまたは複数の遺伝子における変異、あるいは表３または表５に記載される遺伝子の１つまたは複数における変異を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、表３または表５に記載される修飾の１つまたは複数を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、約１６の遺伝子における約２，００１の修飾の有無を検出することを含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳの１つまたは複数における約２，００１の修飾の有無を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーは、どこかで記載されたとおりであることが可能である（例えば、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：２２４ｒａ２２４；Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ４：６５０－６６１；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８：１１９９－１２０９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：２９３ｒａ１０４；Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１３６ｒａ１６８；Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１；Ｂｅｄｄｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｂｒｅａｓｔ ３４（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３１－Ｓ３５；及びＰｈａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９を参照）。
任意の適切な方法を使用して、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無を検出することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、それぞれ別個に検出することができる（例えば、シングルプレックスペプチドツールを介して）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、同時に検出することができる（例えば、「チップ」またはマイクロアレイなどのマルチプレックスＤＮＡツールを介して）。遺伝子バイオマーカーの検出方法の例として、特に制限なく、配列決定法（例えば、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定などのＰＣＲ系配列決定）、ＤＮＡハイブリダイゼーション法（例えば、サザンブロッティング法）、制限酵素消化法、ＰＣＲ系マルチプレックス法、デジタルＰＣＲ法、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）法、ＰＣＲ系シングルプレックスＰＣＲ法、サンガー配列決定法、次世代配列決定法（例えば、単分子リアルタイム配列決定、ナノポア配列決定、及びポロニー配列決定）、定量ＰＣＲ法、ライゲーション法、及びマイクロアレイ法が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定を含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、実施例１に記載されるとおりにマルチプレックスＰＣＲ系配列決定を含むことができる。本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、超並列シークエンシング装置の感度を上昇させることが可能な方法を、エラー削減手法と合わせて行うことにより、検出される。例えば、そのような技法は、５，０００～１，０００，０００の野生型テンプレートの中の１つの変異テンプレートの範囲で希な変異アレルを検出することを可能にし得る。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、ＤＮＡ（例えば、試料中の細胞から得られたＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ）を増幅してファミリーの各メンバーが無細胞ＤＮＡの単一テンプレート分子に由来するアンプリコンのファミリーを形成することにより検出され、この場合、ファミリーの各メンバーは、共通するオリゴヌクレオチドバーコードを目印として持ち、各ファミリーは、異なるオリゴヌクレオチドバーコードを目印として持つ。例えば、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、各テンプレート分子に識別子（ＵＩＤ）を割り当て、それぞれ独特のタグを付けられたテンプレート分子を増幅してＵＩＤ－ファミリーを作製し、増幅産物の配列決定を重複して行うことにより検出可能である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードをまとめて含有するプライマー集団を用いる増幅ステップにより、テンプレート分子に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、テンプレート分子に内在するものであり、ＤＮＡ合成プライミング部位を含むアダプターを、オリゴヌクレオチドバーコードに隣接するテンプレート分子末端に結合させる。例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照。
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、配列決定技術（例えば、次世代配列決定技術）を用いて検出される。様々な配列決定技術が、当該分野で既知である。例えば、無細胞ＤＮＡ中の循環腫瘍ＤＮＡの検出及び特性決定のための方法が、いずれかの場所で記載されている可能性がある（例えば、Ｈａｂｅｒ ａｎｄ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，２０１４ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．，４：６５０－６１を参照）。そのような技法の非限定的な例として、ＳａｆｅＳｅｑｓ（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１０８：９５３０－５を参照）、ＯｎＴａｒｇｅｔ（例えば、Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ；４：１３６ｒａ６８を参照）、及びＴａｍＳｅｑ（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，７：ｅ３１５９７を参照）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて検出され、この方法は、変異検出に対して非常に高感度であることが知られている。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、他の配列決定技術を用いて検出され、そのような技術として、チェーンターミネーション技術、ショットガン技術、合成によるシークエンシング法、マイクロ流体技術を利用する方法、他の捕捉技術、または試料中の少量のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ試料中のｃｔＤＮＡ）を検出するのに有用である当該分野で既知のその他の配列決定技法のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、アレイに基づく方法を用いて検出される。例えば、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出するステップは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイは、複数のがん細胞変異のうち１つまたは複数を検出することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、遺伝子変異の検出の前に増幅される。本明細書中記載される方法のいずれかで使用可能なアレイに基づく方法の非限定的な例として、以下が挙げられる：相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）マイクロアレイ（例えば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ Ｓｃｉ．４（１）：２１－２６；Ｌａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１２：７１－９８；Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：２６８０－２６８８；Ａｌｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７－４６０を参照）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２７（３）：３９２－４０４；Ｌｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．２００９ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（７）：ｅ６２２９を参照）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）クローンチップ（例えば、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４（１）：１８８－１９６；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１５（１２）：１８３１－１８３７を参照）、一塩基多型（ＳＮＰ）マイクロアレイ（例えば、Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８（４）：２１９－２２８；Ｊａｓｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１２ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（２）：ｅ３１９６８を参照）、マイクロアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ（アレイＣＧＨ）（例えば、Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｎｅｄｅｒｌｏｆ，２００６ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８（３）：２１０；Ｐｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：Ｓ１１－Ｓ１７；Ｍｉｃｈｅｌｓ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．９：５７４－５８４を参照）、分子反転プローブ（ＭＩＰ）アッセイ（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ ２０５（７－８）：３４１－５５；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１０ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：７１２を参照）。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（例えば、Ｉｒｉｚａｒｒｙ ２００３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：ｅ１５；Ｄａｌｍａ－Ｗｅｉｓｚｈａｕｓｚ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４１０：３－２８を参照）、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎマイクロアレイ（例えば、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６（９）：２９２６－２９３８；Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：９０３－９０５を参照）、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（４）：３４２－３４７を参照）、またはＢｅａｄＡｒｒａｙアレイ（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ９２：５９６－６０１を参照）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、ＤＮＡタイリングアレイ（例えば、Ｍｏｃｋｌｅｒ ａｎｄ Ｅｃｋｅｒ，２００５ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８５（１）：１－１５；Ｂｅｒｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １６（２）：２７１－２８１を参照）である。他の適切なアレイに基づく方法は、当該分野で既知である。
いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの検出感度の改善をもたらす複数のアンプリコンを含むことができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定は、約６０のアンプリコン（例えば、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０のアンプリコン）を含むことができる。いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定は、６１のアンプリコンを含むことができる。マルチプレックスＰＣＲ系配列決定を用いて生成されたアンプリコンは、長さが約１５ｂｐ～約１０００ｂｐ（例えば、約２５ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３５ｂｐ～約１０００ｂｐ、約５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約２５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１５ｂｐ～約７５０ｂｐ、約１５ｂｐ～約５００ｂｐ、約１５ｂｐ～約３００ｂｐ、約１５ｂｐ～約２００ｂｐ、約１５ｂｐ～約１００ｂｐ、約１５ｂｐ～約８０ｂｐ、約１５ｂｐ～約７５ｂｐ、約１５ｂｐ～約５０ｂｐ、約１５ｂｐ～約４０ｂｐ、約１５ｂｐ～約３０ｂｐ、約１５ｂｐ～約２０ｂｐ、約２０ｂｐ～約１００ｂｐ、約２５ｂｐ～約５０ｂｐ、または約３０ｂｐ～約４０ｂｐ）である核酸を含むことができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定を用いて生成されたアンプリコンは、長さ約３３ｂｐの核酸を含むことができる。
ペプチドバイオマーカーは、任意の適切なペプチドバイオマーカーが可能である。いくつかの実施形態では、ペプチドバイオマーカーは、がんに関連したペプチドバイオマーカーが可能である。例えば、ペプチドバイオマーカーは、がんにおいてレベルが上昇する（例えば、ペプチドの参照レベルと比較した場合）ペプチドが可能である。ペプチドバイオマーカーの例として、特に制限なく、ＡＦＰ、アンジオポエチン－２、ＡＸＬ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＤ４４、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＤＫＫ１、エンドグリン、ＦＧＦ２、フォリスタチン、ガレクチン－３、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＦ１５、ＨＥ４、ＨＧＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、カリクレイン－６、レプチン、ＬＲＧ－１、メソテリン、ミッドカイン、ミエロペルオキシダーゼ、ＮＳＥ、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＰＡＲ、プロラクチン、ｓＥＧＦＲ、ｓＦａｓ、ＳＨＢＧ、ｓＨＥＲ２／ｓＥＧＦＲ２／ｓＥｒｂＢ２、ｓＰＥＣＡＭ－１、ＴＧＦａ、トロンボスポンジン－２、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、及びビトロネクチンが挙げられる。例えば、ペプチドバイオマーカーは、ＯＰＮ、ＩＬ－６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ－１のうち１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーを含むことができる（例えば、１つまたは複数のペプチドが、がんにおいて上昇したレベルを有する）。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、実施例１に記載されるペプチドバイオマーカーのうち１つまたは複数を含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、表４に記載されるペプチドバイオマーカーのうち上昇したレベルにある１種または複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、約１０種のペプチドのレベルを検出することを含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、ＯＰＮ、ＩＬ－６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ－１のレベルを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドバイオマーカーは、いずれかの場所で記載されるとおりであることができる（例えば、Ｌｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １：４６０－４６２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３：９９－１１４；及びＰａｔｚ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２５：５５７８－５５８３を参照）。
任意の適切な方法を用いて、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル（例えば、レベル上昇）を検出することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、それぞれ別個に検出することができる（例えば、シングルプレックスペプチドツールを介して）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、同時に検出することができる（例えば、「チップ」またはマイクロアレイなどのマルチプレックスＤＮＡツールを介して）。ペプチドレベルの検出方法の例として、特に制限なく、スペクトル測定法（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ／ＭＳ））、抗体依存式方法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈殿法、免疫電気泳動法、ウエスタンブロット法、及びタンパク質免疫染色法）、ならびにアプタマー依存式方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、実施例において記載されるとおりに検出することができる。例えば、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、マルチプレックス免疫アッセイにより検出することができる。
任意の適切ながんを、本明細書中記載されるとおりに同定及び／または治療することができる。いくつかの実施形態では、がんは、一般的ながんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、血液検査不可であるがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、早期検出不可であるがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩＩのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩＩＩのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩＶのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、外科切除可能ながんが可能である。本明細書中記載されるとおりに（例えば、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき）同定されるがんの例として、特に制限なく、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、及び前立腺癌が挙げられる。
本明細書中提供される方法及び物質は、哺乳類におけるがんの位置も同定することができる（例えば、がんの部位及び／または種類を特定することができる）。本明細書中記載されるとおり１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のペプチドバイオマーカーに変異を有する任意のがんの位置（例えば、がんの部位及び／または種類）を特定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、結腸直腸癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、及び／またはＴＰ５３遺伝子変異のうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＣＥＡのレベル上昇を用いて、哺乳類における結腸直腸癌の存在を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、肝臓癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、及び／またはＴＥＲＴのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＡＦＰのレベル上昇を用いて、哺乳類における肝臓癌の存在を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、卵巣癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＣＡ１２５のレベル上昇を用いて、哺乳類における卵巣癌の存在を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、膵癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＫＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳの１２番コドン）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＣＡ１９－９のレベル上昇を用いて、哺乳類における膵癌の存在を同定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中記載されるとおり（例えば、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき）がんを有すると同定された哺乳類は、任意の適切な方法を用いて、がん診断を確定することが可能である。がんを診断するまたは診断を確定するのに使用可能な方法の例として、特に制限なく、理学的検査（例えば、婦人科内診）、画像化検査（例えば、超音波またはＣＴスキャン）、細胞診断、及び組織検査（例えば、バイオプシー）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、以前にがん治療を受けたことがある対象で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、治療の有効性を判定することができる。例えば、がんを有する対象に治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）を実施することができ、その後、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ）における１つまたは複数の変異の存在及び／または１つまたは複数のペプチドバイオマーカー（例えば、ＯＰＮ、ＩＬ－６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ－１）のレベル上昇を検出することにより、がんが継続して存在するかどうかまたはがんの量（あるいはそれらがないこと）を判定する。
いくつかの実施形態では、対象は、いったんがんを有すると特定された後、さらにモニタリングされるまたはより詳しいモニタリングに選出される場合がある。いくつかの実施形態では、従来技法が対象を初期段階のがんを有すると診断することができる時点よりも前の時点で、本明細書中提供される方法を用いて、より詳しいモニタリングの対象を選出することができる。例えば、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの対象を選出する方法は、対象が従来方法によりがんと診断されたことがない場合及び／または対象ががんを保有することが知られていない場合に、使用可能である。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象には、より詳しいモニタリングに選出されなかった対象に比べてより高い頻度で診断検査（例えば、本明細書中開示される診断検査のいずれか）を実施することができる。例えば、より詳しいモニタリングに選出された対象には、１日２回、毎日、週２回、毎週、月２回、毎月、年４回、年２回、年１回の頻度、またはこれらの間の任意の頻度で診断検査を実施することができる。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象には、より詳しいモニタリングに選出されなかった対象に比べて追加の診断検査を１つまたは複数実施することができる。例えば、より詳しいモニタリングに選出された対象には、２つの診断検査を実施することができ、一方より詳しいモニタリングに選出されなかった対象には、１つの診断検査のみを実施する（または診断検査を実施しない）。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象は、さらなる診断検査にも選出される可能性がある。いったんがん細胞の存在が同定されたら（例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより）、より詳しいモニタリング（例えば、対象における腫瘍またはがんの進行を評価するため、及び／またはさらなるがん細胞変異の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を保有する腫瘍の寸法及び／または正確な場所を特定するため）の両方を行うことが対象にとって有益である場合がある。いくつかの実施形態では、がん細胞変異が検出された後、より詳しいモニタリングに選出された対象に治療介入が実施される。本明細書中開示されるまたは当該分野で既知である治療介入のいずれかを実施することができる。例えば、より詳しいモニタリングに選出された対象を、さらにモニタリングすることができ、より詳しいモニタリングの期間全体を通じてがん細胞の存在が維持されるならば、治療介入を実施することができる。これに加えてまたはこれに代えて、より詳しいモニタリングに選出された対象には、治療介入を実施することができ、治療介入の進行に合わせてさらにモニタリングすることができる。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象に治療介入を実施した後、より詳しいモニタリングは、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異を明らかにする場合がある。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数のさらなるがん細胞変異は、異なる治療介入を実施する理由を提供することになる（例えば、治療介入中にがん細胞において抵抗性変異が生じる場合があり、この抵抗性変異を保有するがん細胞は、元来の治療介入に対して抵抗性である）。
いくつかの実施形態では、いったん対象ががんを有すると判定されたら、その対象にさらなる検査を実施する、またはその対象をさらなる診断検査に選出することができる。いくつかの実施形態では、従来技法が対象を初期段階のがんを有すると診断することができる時点よりも前の時点で、本明細書中提供される方法を用いて、さらなる診断検査の対象を選出することができる。例えば、本明細書中提供される、さらなる診断検査の対象を選出する方法は、対象が従来方法によりがんと診断されたことがない場合及び／または対象ががんを保有することが知られていない場合に、使用可能である。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象には、さらなる診断検査に選出されなかった対象に比べてより高い頻度で診断検査（例えば、本明細書中開示される診断検査のいずれか）を実施することができる。例えば、さらなる診断検査に選出された対象には、１日２回、毎日、週２回、毎週、月２回、毎月、年４回、年２回、年１回の頻度、またはこれらの間の任意の頻度で診断検査を実施することができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象には、さらなる診断検査に選出されなかった対象に比べて追加の診断検査を１つまたは複数実施することができる。例えば、さらなる診断検査に選出された対象には、２つの診断検査を実施することができ、一方さらなる診断検査に選出されなかった対象には、１つの診断検査のみを実施する（または診断検査を実施しない）。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、最初に検出されたがんと同じ種類のがんの存在を判定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、診断検査方法は、最初に検出されたがんとは異なる種類のがんの存在を判定することができる。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャンである。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、理学的検査、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、婦人科内診、ポジトロン断層撮影法、及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャンである。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象は、より詳しいモニタリングにも選出される可能性がある。いったんがん細胞の存在が同定されたら（例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより）、より詳しいモニタリング（例えば、対象における腫瘍またはがんの進行を評価するため、及び／またはさらなるがん細胞変異の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を保有する腫瘍の寸法及び／または正確な場所を特定するため）の両方を行うことが対象にとって有益である場合がある。いくつかの実施形態では、がん細胞変異が検出された後、さらなる診断検査に選出された対象に治療介入が実施される。本明細書中開示されるまたは当該分野で既知である治療介入のいずれかを実施することができる。例えば、さらなる診断検査に選出された対象に、さらなる診断検査を実施することができ、がん細胞の存在が確認されたならば、治療介入を実施することができる。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査に選出された対象には、治療介入を実施することができ、治療介入の進行に合わせてさらにモニタリングすることができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象に治療介入を実施した後、さらなる診断検査は、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異を明らかにする場合がある。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数のさらなるがん細胞変異は、異なる治療介入を実施する理由を提供することになる（例えば、治療介入中にがん細胞において抵抗性変異が生じる場合があり、この抵抗性変異を保有するがん細胞は、元来の治療介入に対して抵抗性である）。
いったん、本明細書中記載されるとおり、がんを有すると同定されたら（例えば、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無、及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇、及び／または異数性の存在に基づき）、哺乳類を、１つまたは複数のがん治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）で治療することができる。
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、血流中に放出されるがん細胞における変異を検出可能な最新鋭の検査である。いくつかの実施形態では、１種または複数のがん種を検出可能である。本明細書中記載されるとおりのアッセイは、特異性を保持したまま感度を向上させたがんスクリーニング検査として使用可能である。例えば、そのようなアッセイは、血漿中の、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）の検出を、閾値化されたタンパク質マーカーの検出と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）のみが検査される。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーのみが検査される。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）とタンパク質マーカーの組み合わせは、どの単一マーカーよりも優れている可能性がある。１，７０３人の患者（１，２４０例のがん及び４６３例の健康な対照）での模範的予備研究において、ｃｔＤＮＡ及びタンパク質バイオマーカーのパネルは、感度が６４％であり、特異性が９９．３５％であった。
いくつかの実施形態では、本明細書中記載されるとおりのアッセイは、一見健康な個体に対して適用される場合がある。例えば、本明細書中記載されるとおりのアッセイは、医者への定期外来診療中に行われる血液検査を通じて、症状が出る前のがんを検出することにより、がんによる死亡及びがんの罹患を減少させる可能性がある。さらに、本明細書中記載されるとおりのアッセイは、限局性がんを有する患者、特にこれまでに治療されたもしくは切除されたことがあるまたはそうすることが可能ながんを有する患者に適用される場合がある。明細書中記載されるとおりのアッセイは、再発の早期検出を通じて、管理及び予後を改善する可能性がある。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）は、対象（例えば、ヒト対象）から得られる様々な生体試料のいずれかで検査される可能性があり、そのような試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、１０の代表的な遺伝子（ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ）における遺伝子バイオマーカー（例えば、ｃｔＤＮＡにおける変異）及び血清中の１１の代表的なタンパク質マーカーの閾値を超える上昇（ＣＡ１９－９（＞９２Ｕ／ｍｌ）、ＣＥＡ（＞７，５０７ｐｇ／ｍｌ）、ＣＡ１２５（＞５７７Ｕ／ｍｌ）、ＡＦＰ（＞２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）、プロラクチン（＞１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（＞８９９ｐｇ／ｍｌ）、ＯＰＮ（＞１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）、ＴＩＭＰ－１（＞１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（＞１，９７０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦ（＞８００ｐｇ／ｍｌ）、及びＣＡ１５－３（＞９８Ｕ／ｍｌ））を、アッセイで検査する場合がある。いくつかの実施形態では、１６の代表的な遺伝子（ＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＮＲＡＳ）における遺伝子バイオマーカー（例えば、ｃｔＤＮＡにおける変異）及び血清中の１１の代表的なタンパク質マーカーの閾値を超える上昇（ＣＡ１９－９（＞９２Ｕ／ｍｌ）、ＣＥＡ（＞７，５０７ｐｇ／ｍｌ）、ＣＡ１２５（＞５７７Ｕ／ｍｌ）、ＡＦＰ（＞２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）、プロラクチン（＞１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（＞８９９ｐｇ／ｍｌ）、ＯＰＮ（＞１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）、ＴＩＭＰ－１（＞１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（＞１，９７０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦ（＞８００ｐｇ／ｍｌ）、及びＣＡ１５－３（＞９８Ｕ／ｍｌ））を、アッセイで検査する場合がある。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在またはタンパク質バイオマーカーのいずれか１つの閾値を超える上昇が、陽性結果（例えば、対象におけるがんの同定）を構成する。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在または２つ以上のタンパク質バイオマーカーの上昇が、陽性結果を構成する。例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の代表的な遺伝子における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、及び／または２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１のタンパク質バイオマーカーにおける上昇が、陽性結果を構成する。
いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、タンパク質バイオマーカー）は、対象（例えば、ヒト対象）から得られる様々な生体試料のいずれかで検査される場合があり、そのような試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。がんで大量に見つかるタンパク質（例えば、タンパク質バイオマーカー）を、そのタンパク質が、健康なヒト対象では生じない量であるかどうかについて検査することができる。任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１が検査される可能性があるタンパク質（例えば、タンパク質バイオマーカー）の例として、特に制限なく、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３が挙げられる。健康なヒト対象では超えないが、がんを有するヒト対象では超える閾値が得られる場合に、当該分野で既知である任意のタンパク質バイオマーカーを使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９の閾値は、少なくとも約９２Ｕ／ｍＬ（例えば、約９２Ｕ／ｍＬ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９の閾値は、９２Ｕ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、少なくとも約７，５０７ｐｇ／ｍｌ（例えば、約７，５０７ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、７．５ｎｇ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、少なくとも約８９９ｐｇ／ｍｌ（例えば、約８９９ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、０．９２ｎｇ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、少なくとも約１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、１５８ｎｇ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１２５の閾値は、少なくとも約５７７Ｕ／ｍｌ（例えば、約５７７Ｕ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１２５の閾値は、５７７Ｕ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＡＦＰの閾値は、少なくとも約２１，３２１ｐｇ／ｍｌ（例えば、約２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＡＦＰの閾値は、２１，３２１ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、プロラクチンの閾値は、少なくとも約１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、プロラクチンの閾値は、１４５，３４５ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＴＩＭＰ－１の閾値は、少なくとも約１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＴＩＭＰ－１の閾値は、１７６，９８９ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、フォリスタチンの閾値は、少なくとも約１，９７０ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１，９７０ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、フォリスタチンの閾値は、１，９７０ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、Ｇ－ＣＳＦの閾値は、少なくとも約８００ｐｇ／ｍｌ（例えば、約８００ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、Ｇ－ＣＳＦの閾値は、８００ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１５－３の閾値は、少なくとも約９８Ｕ／ｍｌ（例えば、約９８Ｕ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１５－３の閾値は、９８Ｕ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、及び／またはＯＰＮの閾値は、上記に列挙した閾値より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上に高い（例えば、ＣＡ－１９－９の９２Ｕ／ｍＬ、ＣＥＡの７，５０７ｐｇ／ｍｌ、ＨＧＦの８９９ｐｇ／ｍｌ、ＯＰＮの１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ、ＣＡ１２５の５７７Ｕ／ｍｌ、ＡＦＰの２１，３２１ｐｇ／ｍｌ、プロラクチンの１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ、ＴＩＭＰ－１の１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ、フォリスタチンの１，９７０ｐｇ／ｍｌ、Ｇ－ＣＳＦの８００ｐｇ／ｍｌ、及び／またはＣＡ１５－３の９８Ｕ／ｍｌという閾値より高い）可能性がある。
いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの閾値は、診断または臨床目的で典型的に検査されるレベルよりも高い可能性がある。例えば、ＣＡ１９－９の閾値は、約３７Ｕ／ｍｌより高い（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、またはそれ以上のＵ／ｍＬより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＣＥＡの閾値は、約２．５ｕｇ／Ｌより高い（例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、またはそれ以上のｕｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＣＡ１２５の閾値は、約３５Ｕ／ｍＬより高い（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、またはそれ以上のＵ／ｍＬより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＡＦＰの閾値は、約２１ｎｇ／ｍＬより高い（例えば、約２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、またはそれ以上のｎｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＴＩＭＰ－１の閾値は、約２３００ｎｇ／ｍＬより高い（例えば、約２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、またはそれ以上のｎｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、フォリスタチンの閾値は、約２ｕｇ／ｍＬより高い（例えば、約２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、またはそれ以上のｕｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＣＡ１５－３の閾値は、約３０Ｕ／ｍＬより高い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、またはそれ以上のＵ／ｍＬより高い）可能性がある。いくつかの実施形態では、従来の診断または臨床アッセイ中に典型的に検査されるよりも高い閾値で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを検出することは、がん検出の感度を向上させる可能性がある。
いくつかの実施形態では、アッセイは、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）を検出することなく、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３のうち１種または複数を検出することを含む場合がある。いくつかの実施形態では、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３のうち１種または複数を、本明細書中開示される閾値のいずれかで、検出することを含む場合がある。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、後続の検査またはモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）が行われる。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー）を検出することを含む第２のアッセイ（例えば、本明細書中記載されるとおり無細胞ＤＮＡまたはｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーにおける様々な遺伝子変異のいずれかを検出すること）が行われ得る。
いくつかの実施形態では、アッセイは、閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することなく、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における遺伝子バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、本明細書中開示される遺伝子のうちいずれか１種または複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の検出を含む場合があり、そのような遺伝子として、制限なく、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及び／またはＴＣＦ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳのうち１種または複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の検出を含む場合がある。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＮＲＡＳのうち１種または複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の検出を含む場合がある。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、後続の検査またはモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）が行われる。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、高い閾値でタンパク質バイオマーカーを検出することを含む第２のアッセイ（例えば、本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーのいずれかを検出すること、そのようなタンパク質バイオマーカーとして、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）が行われ得る。
いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の少なくとも２つのコドンまたは少なくとも２つのアンプリコンを検査することができる。いくつかの実施形態では、個別の腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ以上のコドンまたはアンプリコンをアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子に分布する変異が増えるほど、検査することが望ましくあり得るコドンまたはアンプリコンが増える。
検査可能な腫瘍抑制遺伝子及びがん遺伝子のコドンの例として、制限なく、以下のコドン及びそれらの周囲のスプライス部位のうち１つまたは複数が挙げられる：ＡＫＴ１の１６～１８番コドン、ＡＰＣの１３０４～１３１１、１４５０～１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１～６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１～５８、７６～８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１～３９、３８～４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６～８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１～３７１、４６４～４７３、４７３～４８３、４９８～５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０～２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９～２０８番コドン、ＨＲＡＳの７～１９番コドン、ＫＲＡＳの７～１４、５７～６５、１４３～１４８番コドン、ＮＲＡＳの３～１５、５４～６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０～９０、３４３～３４８、５４１～５５１、１０３８～１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５～１８７番コドン、ＰＴＥＮの９０～９８、１２５～１３２、１３３～１４６、１４５～１５４番コドン、及びＴＰ５３の１０～２２、２５～３２、３３～４０、４０～５２、５２～６４、８２～９４、９７～１１０、１１２～１２５、１２３～１２５、１２６～１３２、１３２～１４２、１５０～１６３、１６７～１７７、１７５～１８６、１８７～１９５、１９５～２０６、２０７～２１９、２１９～２２４、２２６～２３７、２３２～２４５、２４８～２６１、２６１～２６８、２７２～２８３、２７９～２９０、２９８～３０７、３０７～３１４、３２３～３３１、３３３～３４４、３４４～３５５、３６７～３７５、３７４～３８６番コドン。これらの領域の全部または一部を検査することができる。いくつかの実施形態では、変異は、ＫＲＡＳにおいて、例えば、１２番コドンまたは６１番コドンにある可能性がある。他の実施形態において、変異は、ＫＲＡＳの他のコドンにある可能性がある。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＤＫＮ２Ａにある可能性があり（例えば、実施例２において同定されるＣＤＫＮ２Ａ変異のいずれか）、いくつかの実施形態では、変異は、腫瘍抑制因子またはがん遺伝子にある場合があり、そのような腫瘍抑制因子またはがん遺伝子として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及びＴＣＦ３。検査は、増幅及び／または配列決定を含むことができる。
いくつかの実施形態では、高い精度での配列決定は、分析物が少量及び／または低い割合で存在する場合に、有利となる可能性がある。高い精度での配列決定は、内在性であるか外来性であるかに関わらず、オリゴヌクレオチドバーコードを利用する場合がある。オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、外来性バーコードの場合、増幅によりテンプレート分析物に導入することができる。あるいは、内在性オリゴヌクレオチドバーコードを、例えば、ライゲーション手法により、オリゴヌクレオチドアダプター分子をそれに結合させることにより使用することができる。アダプター分子は、ＤＮＡ合成用、及び／または固体表面とのハイブリダイゼーション用のプライミング部位を含有することができる。アダプターは、内在性バーコードと直接隣接する、または内在性バーコードとの間に、決まった個数のヌクレオチドを挟んで隣接することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、プロセシング前、特に増幅前に、試料中の個別のテンプレート分子を標識化することを可能にする。例えば、ファミリーメンバー（同一オリゴヌクレオチドバーコードを有する）の全てまたは高い割合またはある閾値の割合が変異を呈示することを必要条件にすることにより、増幅及び／または他のＤＮＡ合成もしくはプロセシング中に生じる偽陽性変異を除外するまたは最小限にすることが可能である。例えば、Ｋｉｎｄｅ Ｉ，Ｗｕ Ｊ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ，Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ，＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（２０１１）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８（２３）：９５３０－９５３５を参照、この内容は、明示的に参照により援用される。これに加えてまたはこれに代えて、変異を変異と判定するための閾値は、２つの異なるファミリーで生じることを求める。この性質の複数のフィルターを適用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、無細胞ＤＮＡは、約１５００ｎｇ未満、例えば、約１４００ｎｇ未満、約１３００ｎｇ未満、約１２００ｎｇ未満、約１１００ｎｇ未満、約１０００ｎｇ未満、約９００ｎｇ未満、約８００ｎｇ未満、約７００ｎｇ未満、約６００ｎｇ未満、約５００ｎｇ未満、約４００ｎｇ未満、約３００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未満、約１５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約９５ｎｇ未満、約９０ｎｇ未満、約８５ｎｇ未満、約８０ｎｇ未満、約７５ｎｇ未満、約７０ｎｇ未満、約６５ｎｇ未満、約６０ｎｇ未満、約５５ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約４５ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約３５ｎｇ未満、約３０ｎｇ未満、約２５ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、約１５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、または約５ｎｇ未満の量で存在する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％を占める。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％未満、例えば無細胞ＤＮＡの約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．９５％、約０．９０％、約０．８５％、約０．８０％、約０．７５％、約０．７０％、約０．６５％、約０．６０％、約０．５５％、約０．５０％、約０．４５％、約０．４０％、約０．３５％、約０．３０％、約０．２５％、約０．２０％、約０．１５％、約０．１０％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、またはそれ以下を占める。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料から検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれららの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、同一試料から検査することができる。例えば、単一試料を対象から単離するまたは得ることができ、この単一試料を、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーについて、または両方について検査することができる。無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、同じ時点でまたは異なる時点で試料から検査することができる。例えば、試料を、第１の時点で無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて、第２の時点で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーについて検査することができ、その逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、異なる試料から検査することができる。例えば、対象から第１の試料を単離しまたは得て、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて検査することができ、対象から第２の試料を単離しまたは得て、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーについて検査することができる。第１の試料及び第２の試料は、同じ種類（例えば、血漿または血清）のものであることも、異なる種類のものであることも可能である。第１の試料及び／または第２の試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々なアッセイのいずれも、繰り返して、変異検出の精度を上昇させることができる。アッセイは、例えば、２つ組または３つ組で行うことができる。いくつかの実施形態では、患者由来の同一の最初の試料で陽性アッセイを繰り返すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、例えば、陽性結果が判明した場合、第２の試料を、後の時点で患者から得ることができる。ｃｔＤＮＡ、及び／またはタンパク質バイオマーカーを含む本明細書中開示される様々なアッセイのいずれも、並列反復試験で繰り返すまたは実行することができる。
いくつかの実施形態では、放射線技法、超音波検査技法、または他の技法を、変異が検出される任意の対象（例えば、ヒト対象）に適用することができる。そのような技法は、全身、単一臓器、または身体のある領域に対して施行することができる。そのような技法は、例えば、特定種のがんが存在することを確認するため、がんが存在することを確認するため、または身体中のがんの場所を同定するために、用いることができる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャン、またはポジトロン断層撮影法及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャンである。いくつかの実施形態では、そのような技法は、理学的検査、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、または婦人科内診であり、いくつかの実施形態では、そのような技法は、生検（例えば、骨髄穿刺、組織生検）である。いくつかの実施形態では、生検は、細針穿刺吸引により、または外科的切除により行われる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、さらに、生体試料（例えば、組織試料、尿試料、血液試料、拭き取り検体、唾液試料、粘膜試料（例えば、痰、気管支分泌物）、乳頭吸引液、分泌物、または、排泄物など）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、そのような技法は、エキソソームタンパク質（例えば、エキソソーム表面タンパク質（例えば、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＰＣＡ－３））を特定することを含む（Ｓｏｕｎｇｅｔａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒｓ９（１）：ｐｉｉ：Ｅ８）。いくつかの実施形態では、診断検査法は、オンコタイプＤＸ（登録商標）検査である（Ｂａｅｈｎｅｒ（２０１６）Ｅｃａｎｃｅｒｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ １０：６７５）。
いくつかの実施形態では、本明細書中記載される様々な方法を用いて、以下からなる群より選択されるがんを検出することができる：膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、及び乳癌、ならびにそれらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、対象のための治療を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、適切な治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を選択することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、治療の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、より詳しいモニタリングの対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なモニタリング技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、さらなる診断検査の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々な診断技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用することで、対象が初期段階のがんであると診断される前の時点、及び／または対象ががんに関連した症候を呈示する前の時点で、がん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法は、対象ががんと診断されていない場合、及び／または対象ががん細胞を保有することが知られていない場合に、使用することができる。
いくつかの実施形態では、ある特定のタンパク質バイオマーカーが、高閾値で検出されることにより、特定種のがんが検出される。例えば、高閾値のＣＡ１９－９が検出されることにより、膵臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＣＥＡが検出されることにより、例えば、結腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、及び／または乳癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＣＡ－１２５が検出されることにより、例えば、卵巣癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＡＦＰが検出されることにより、肝臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のプロラクチンが検出されることにより、例えば、卵巣癌、乳癌、及び／または肺癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＨＦＧが検出されることにより、例えば、食道癌、胃癌、及び／または肝臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＯＰＮが検出されることにより、例えば、卵巣癌、乳癌、及び／または肺癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＴＩＭＰ－１が検出されることにより、例えば、結腸癌及び／または膵臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のフォリスタチンが検出されることにより、例えば、卵巣癌及び／または肺癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＧ－ＣＳＦが検出されることにより、例えば、卵巣癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＣＡ１５－３が検出されることにより、例えば、乳癌の存在を示すことができる。様々ながん種で検出されるタンパク質バイオマーカーの例を、実施例２に示す。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）についてのアッセイを、タンパク質バイオマーカー上昇についてのアッセイと併用することで、低いステージの膵臓癌についての血液検査の感度を向上させることができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上を、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの６４％が、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。本明細書中提供されるある特定の研究の計画特徴の１つは、切除可能な膵臓癌である患者のみを含めるというものであり、進行した疾患（すなわち、ステージＩＩＩまたはＩＶ）の患者は除外するというものであった。この除外は、そうしなければ、ステージに関わらず全ての膵臓癌患者を評価することにより達成可能であった感度を低下させたものの、切除可能な症例は、スクリーニング技術の評価に関して、有利な臨床的関連性を持つ有望な群を表す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いることで、対象（例えば、ヒト対象）における全ての膵臓癌を検出することができる。
ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーとタンパク質マーカーを組み合わせることで、どちらか単独に勝る感度の向上が可能になるかどうかは、本開示の以前は不明であった。実際、検出可能な循環タンパク質マーカーを有する同一患者が、循環中にＤＮＡを放出しているものと大幅に重複することは考え得ることであった。このことは、特に、初期段階のがん患者に対する懸念であった。なぜなら、ｃｔＤＮＡ及びタンパク質系マーカーは、両方とも、初期段階のがん患者と比べて進行癌の患者で大幅に高いことが既知だからである（Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ ＆ Ｇｏｇｇｉｎｓ Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ ６７５－７０１、Ｌｏｃｋｅｒ ＧＹ，ｅｔ ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ ２００６ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２４（３３）：５３１３－５３２７、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、非常に高い特異性（例えば、９９．５％：９５％ ＣＩ ９７～１００％）を達成することができる。例えば、本明細書中提示される試験において、平均年齢６４歳の１８２人の健康個体のうち偽陽性は１例しか観察されなかった。一般集団におけるがんの相対的希少性を考慮すると、膵臓癌に有用である可能性がある血液系スクリーニング検査の特異性は、その検査が何であれ、高いことが好ましく、例えば、好ましくは＞９９％である。そうでないと、偽陽性の数が、真の陽性の数を大幅に超えると思われる（すなわち、最適陽性的中率を下回る）（Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ：Ｗｈａｔ Ｗｉｌｌ Ｉｔ Ｔａｋｅ ｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｅ ａｎｄ Ｔｒｅａｔ Ｃｕｒａｂｌｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ？Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４（１３）：３３８１－３３８９）。スクリーニング検査についてのそのような厳密性は、既知のがんを持つ患者において疾患をモニタリングする検査には、典型的には必要とされない。モニタリングの場合、特異性は、より高い感度を得るという利益のためにいくぶん緩和させることができる。高い特異性は、少なくとも２つのやり方で、本明細書中開示される様々な方法で達成された。第１に、ｃｔＤＮＡを検査の構成要素の１つとして使用した。ＫＲＡＳ変異は、見事なまでに腫瘍に特異的であり、それらの特異性は、従来、生物学的要因ではなく技術的要因により制限されてきた。分子バーコーディングを本明細書中記載される様々なアッセイに組み込むことで（例えば、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ技法を用いて）、従来、あらゆるｃｔＤＮＡ系アッセイが直面してきた大きな技術課題であった、配列決定の結果が偽陽性となることを最小限に抑えることができる。ＫＲＡＳ変異は、早期検出戦略に特に適している。なぜなら、ＫＲＡＳ変異は、年齢関連クローン性造血の間に生じるクローンではめったに見つからないからである。そのようなクローンは、骨髄形成異常症の初期型を表す場合もあるが、それらは、偽陽性ｃｔＤＮＡアッセイの原因となる可能性がある。そのような変異の圧倒的多数は、９つの遺伝子（ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＪＡＫ２、ＡＳＸＬ１、ＴＰ５３、ＧＮＡＳ、ＰＰＭ１Ｄ、ＢＣＯＲＬ１、及びＳＦ３Ｂ１）内で生じ（４８－５０）、ｃｔＤＮＡ系アッセイにおいてバイオマーカーとしてこれらの遺伝子を利用することの障害となっている。第２に、タンパク質マーカーを陽性として採点するために高い閾値を使用した。これらの閾値は、文献の先行研究または独立した対照セットに基づくものであり、健康な患者の圧倒的多数で陽性スコアを回避することを可能にした（Ｋｉｍ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９－９ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａｎ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９（２）：１８２－１８６）。いくつかの実施形態では、そのような高い閾値は、感度を全体的に低下させることなく使用可能である。なぜなら、ｃｔＤＮＡアッセイは、それ自体感度を与え、ｃｔＤＮＡ陽性の症例は、タンパク質バイオマーカー陽性の症例と部分的にしか重複していなかったからである（例えば、図９、図１０、及び実施例２を参照）。
タンパク質バイオマーカーは、これまで、互いに組み合わせられることで、より高い感度を達成してきた（Ｄｏｎｇ Ｔ，Ｌｉｕ ＣＣ，Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，＆ Ｔａｎｇ ＬＬ（２０１４）Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ３３（８）：１３０７－１３２）。例えば、ＣＡ１９－９とＴＩＭＰ－１を組み合わせることで、ＰＤＡＣの検出について、一方のバイオマーカー単独よりも高感度になることが示された（Ｚｈｏｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ７（２）：１０９－１１２）。さらに最近では、ＣＡ１９－９、ＴＩＭＰ－１、及びＬＲＧ－１の組み合わせが、初期ＰＤＡＣの検出について、ＣＡ１９－９単独よりも高感度になることが示された（Ｄｏｎｇ Ｔ，Ｌｉｕ ＣＣ，Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，＆ Ｔａｎｇ ＬＬ（２０１４）Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ３３（８）：１３０７－１３２０）。タンパク質バイオマーカーと超高感度ｃｔＤＮＡの併用は、本明細書中開示されるとおり、別物である。最近の研究では、膵臓癌に関してｃｔＤＮＡとＣＡ１９－９の併用が評価されたが、ＣＡ１９－９単独に勝るバイオマーカー併用の利点は見つからなかった。理論に固執するつもりはないが、ＫＲＡＳ変異の検出に使用された検査の感度が不適切だったためにこの結論が導かれた可能性がある（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ－Ｋｅｌｍ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ：ａ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（４８）：７８８２７－７８８４０）。そのうえさらに、その研究で達成されたｃｔＤＮＡについての特異性は、比較的低く、スクリーニングに対する適性を低下させていた。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、大多数の患者において非侵襲性血液検査を通じて切除可能ながんを検出することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて得られる結果は、早期検出の延命効果を過小評価する可能性がある。本明細書中試験された患者の大多数は、切除可能ながんを有していたが、症候性であり、患者のがんは、患者の症候によってのみ発見された。したがって、本明細書中記載されるコホート中の患者の７７％は、ステージＩＩＢであり、これらの患者における腫瘍寸法の中央値は、３ｃｍであった。いくつかの実施形態では、無症候性個体のスクリーニング試験において、より大きい割合のより初期段階の患者を、より小さな腫瘍で、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより発見することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、全ての腫瘍は外科的に切除可能ではあるが、腫瘍の小さい患者よりも腫瘍の大きく予後のより不良な患者の検出に対してより高感度となり得る（例えば、図９Ｂ、及び実施例２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、膵臓癌以外の種類のがんを有する患者、主に肺癌を有する患者の循環において見つかる可能性があり（Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳ，Ｈｅｙｍａｃｈ ＪＶ，＆ Ｌｉｐｐｍａｎ ＳＭ（２００８）Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５９（１３）：１３６７－１３８０）、そしてＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ発現は、複数の他のがん種で上昇する可能性がある（Ｋｉｍ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９－９ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａｎ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９（２）：１８２－１８６、Ｔｈｏｍａｓ ＤＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ＣＥＡ，ＣＹＦＲＡ２１－１ ａｎｄ ＣＡ１２５ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１３（２）：２６８－２７４、Ｄｉ Ｒｅｎｚｏ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔ／ＨＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １（２）：１４７－１５４、Ｅｌ－Ｔａｎａｎｉ ＭＫ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １７（６）：４６３－４７４）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて検査陽性であった患者は、腫瘍の所在を同定するために追加の適切な画像化調査を受けることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、ＰＤＡＣのリスクが高い患者の評価及び早期検出戦略の実現の基盤を築く（Ｋａｌｉｎｉｃｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｎ ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４（５）：１１２３－１１２８）。例として、初発糖尿病は、膵臓癌のリスク上昇と関連することが既知である。年齢５０歳以上の糖尿病患者の約１％は、糖尿病の基準を最初に満たしてから３年以内に膵臓癌と診断される（Ｃｈａｒｉ ＳＴ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２９（２）：５０４－５１１）。発生率１％の場合、本明細書中開示されるある特定の併用アッセイのＰＰＶ／ＮＰＶは、この集団において、それぞれ、５４％及び９９．６％であることが予想され、これは、現在承認されているがんのスクリーニング検査の範囲内に十分収まっている。
入手可能な証拠は、多くのがんが、それらの初期段階において、ｃｔＤＮＡ中に存在する検出可能な遺伝子バイオマーカーを有し、膵臓癌で観察されるよりも一般的にそうである場合が多いことを示す（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。同様に、多数のタンパク質バイオマーカーが、すでに、多数のがん種の検出について記載されている（Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ ＆ Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １（８）：４６０－４６２）。こうしたタンパク質バイオマーカーは、本明細書中記載される様々な方法のいずれかに従って閾値を設定することができ、様々ながん種の検出にｃｔＤＮＡ－タンパク質の併用を用いることを可能にする（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、特異性を保持したまま感度の改善されたがんスクリーニング検査として使用可能なアッセイである。いくつかの実施形態では、アッセイは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカーの変異の検出と血漿中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を併用する。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーの存在についてのｃｔＤＮＡ検査のみを行う。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカー検査のみを行う。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー及びタンパク質マーカーの併用は、いずれの単一マーカーよりも優れている可能性がある。例えば、いくつかの実施形態では、この併用は、外科的切除の時点では遠隔転移のエビデンスを有さない膵臓癌の約３分の２を検出することができる。いくつかの実施形態では、高い精度での配列決定は、分析物が少量及び／または低い割合で存在する場合に、有利となり得る。高い精度での配列決定は、内在性であるか外来性であるかに関わらず、オリゴヌクレオチドバーコードを利用する場合がある。オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、外来性バーコードの場合、増幅によりテンプレート分析物に導入することができる。あるいは、内在性オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、ライゲーション手法により、オリゴヌクレオチドアダプター分子をそれに結合させることにより使用可能である。アダプター分子は、ＤＮＡ合成用、及び／または固体表面とのハイブリダイゼーション用のプライミング部位を含有することができる。アダプターは、内在性バーコードと直接隣接する、または内在性バーコードとの間に、決まった個数のヌクレオチドを挟んで隣接することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、プロセシング前、特に増幅前に、試料中の個別のテンプレート分子を標識化することを可能にする。例えば、ファミリーメンバー（同一オリゴヌクレオチドバーコードを有する）の全てまたは高い割合またはある閾値の割合が変異を呈示することを必要条件にすることにより、増幅及び／または他のＤＮＡ合成もしくはプロセシング中に生じる偽陽性変異を除外するまたは最小限にすることが可能である。例えば、Ｋｉｎｄｅ Ｉ，Ｗｕ Ｊ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ，Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ，＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（２０１１）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８（２３）：９５３０－９５３５を参照、この内容は、明示的に参照により援用される。これに加えてまたはこれに代えて、変異を変異と判定するための閾値は、２つの異なるファミリーで生じることを必要とする。この性質についての複数のフィルターを適用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、無細胞ＤＮＡは、約１５００ｎｇ未満、例えば、約１４００ｎｇ未満、約１３００ｎｇ未満、約１２００ｎｇ未満、約１１００ｎｇ未満、約１０００ｎｇ未満、約９００ｎｇ未満、約８００ｎｇ未満、約７００ｎｇ未満、約６００ｎｇ未満、約５００ｎｇ未満、約４００ｎｇ未満、約３００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未満、約１５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約９５ｎｇ未満、約９０ｎｇ未満、約８５ｎｇ未満、約８０ｎｇ未満、約７５ｎｇ未満、約７０ｎｇ未満、約６５ｎｇ未満、約６０ｎｇ未満、約５５ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約４５ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約３５ｎｇ未満、約３０ｎｇ未満、約２５ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、約１５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、または約５ｎｇ未満の量で存在する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％を占める。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％未満、例えば無細胞ＤＮＡの約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．９５％、約０．９０％、約０．８５％、約０．８０％、約０．７５％、約０．７０％、約０．６５％、約０．６０％、約０．５５％、約０．５０％、約０．４５％、約０．４０％、約０．３５％、約０．３０％、約０．２５％、約０．２０％、約０．１５％、約０．１０％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、またはそれ以下を占める。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）の存在は、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料のいずれかから検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、同一試料から検査可能である。例えば、単一試料を対象から単離するまた得ることができ、この単一試料を、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー、あるいはその両方について検査することができる。無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、同一時点でまたは異なる時点で試料から検査可能である。例えば、試料を、第１の時点で無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、第２の時点で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができ、この逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、試料を、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、異なる試料から検査することができる。例えば、対象から第１の試料を単離しまたは得て、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、対象から第２の試料を単離しまたは得て、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができる。第１の試料及び第２の試料は、同じ種類（例えば、血漿または血清）のものであることも、異なる種類のものであることも可能である。第１の試料及び／または第２の試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々なアッセイのいずれかを繰り返して、変異検出の精度を上昇させることができる。アッセイは、例えば、２つ組または３つ組で行うことができる。いくつかの実施形態では、患者由来の同一の最初の試料で陽性アッセイを繰り返すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、例えば、陽性結果が判明した場合、第２の試料を、後の時点で患者から得ることができる。ｃｔＤＮＡ及び／またはタンパク質バイオマーカーを含む本明細書中開示される様々なアッセイのどれでも、並列反復試験で繰り返すまたは実行することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡにおける変異）は、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子にあることが可能である。例えば、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、変異のホットスポット、例えば、腫瘍または他のがんで頻繁にミュートされる部位にあることが可能である。いくつかの実施形態では、変異は、ＫＲＡＳにあること、例えば、１２番コドンまたは６１番コドンにあることが可能である。他の実施形態において、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、ＫＲＡＳの他のコドンにあることが可能である。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、ＣＤＫＮ２Ａにあることが可能であり（例えば、実施例２で同定されるＣＤＫＮ２Ａ変異のいずれか）。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、以下の腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子にあることが可能であるが、それらに限定されない：ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及びＴＣＦ３。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料のいずれかから検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。がんで大量に見つかるタンパク質バイオマーカーは、健康なヒト対象では生じない量のタンパク質バイオマーカーの量について検査することができる。タンパク質バイオマーカーの例として、そのうちの任意の１つ、２つ、３つ、または４つが検査され得るものとして、制限なく、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びオステオポンチン（ＯＰＮ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９の閾値は、少なくとも約１００Ｕ／ｍＬ（例えば、約１００Ｕ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９の閾値は、１００Ｕ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、少なくとも約７．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、約７．５ｎｇ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、７．５ｎｇ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、少なくとも約０．９２ｎｇ／ｍＬ（例えば、約０．９２ｎｇ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、０．９２ｎｇ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、少なくとも約１５８ｎｇ／ｍＬ（例えば、約１５８ｎｇ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、１５８ｎｇ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、及び／またはＯＰＮの閾値は、上記に列挙した閾値より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上に高い（例えば、ＣＡ－１９－９の１００Ｕ／ｍＬ、ＣＥＡの７．５ｎｇ／ｍＬ、ＨＧＦの０．９２ｎｇ／ｍＬ、及び／またはＯＰＮの１５８ｎｇ／ｍＬという閾値より高い）可能性がある。
正常で健康なヒト対象では超えないが、がんを有するヒト対象では超える閾値が得られる場合に、当該分野で既知である任意のタンパク質バイオマーカーを使用することができる。そのようなタンパク質バイオマーカーの限定ではなく例として、翻訳伸長因子（ＥＥＦ１Ａ１）；グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）；アクチンガンマ（ＡＣＴＧ１）；フェリチン、重鎖ポリペプチド１（ＦＴＨ１）；真核生物翻訳伸長因子１ガンマ（ＥＥＦ１Ｇ）；リボソームタンパク質、大サブユニット、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）；熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（細胞質）、クラスＢメンバー１（ＨＳＰ９０ＡＢ１）；ピルビン酸キナーゼ、筋肉（ＰＫＭ２）；フェリチン、軽鎖ポリペプチド（ＦＴＬ）；及びリボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）が挙げられる。血清で過剰発現することが既知であるタンパク質バイオマーカーとして、トランスフェリン、α－１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン－１、カリクレイン６、グルコース制御タンパク質－８、αデフェンシン－１、－２、－３、血清Ｃ－ペプチド、アルファ－２－ＨＳグリコールタンパク質、カテニン、デフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、及びＴｘｌ－２、（チオレドキシン様タンパク質－２）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、アッセイは、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）を検出せずに、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮのうち１種または複数を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮのうち１種または複数を、本明細書中開示される閾値のいずれかで検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、後続の検査またはモニタリングが行われる（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む第２のアッセイ（例えば、本明細書中記載されるとおり無細胞ＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ中に存在する様々な遺伝子変異のいずれかを検出する）を、行うことができる。
いくつかの実施形態では、アッセイは、閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出せずに、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、本明細書中開示される遺伝子のいずれかの１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を検出することを含むことができ、そのような遺伝子として、制限なく、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及び／またはＴＣＦ３を挙げることができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＫＲＡＳにおける（例えば、ＫＲＡＳの１２番コドンまたは６１番コドンにおける）遺伝子変異の検出を含むことができる。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、後続の検査またはモニタリングが行われる（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを高閾値で検出することを含む第２のアッセイを行うことができる（例えば、本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーのいずれかを検出すること、そのようなタンパク質バイオマーカーとして、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）。
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料のいずれかから検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、同一試料から検査可能である。例えば、単一試料を対象から単離するまた得ることができ、この単一試料を、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、あるいはその両方について検査することができる。無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、同一時点でまたは異なる時点で試料から検査可能である。例えば、試料を、第１の時点で無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、第２の時点で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができ、この逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、試料を、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、異なる試料から検査することができる。例えば、対象から第１の試料を単離しまたは得て、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、対象から第２の試料を単離しまたは得て、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができる。第１の試料及び第２の試料は、同じ種類（例えば、血漿または血清）のものであることも、異なる種類のものであることも可能である。第１の試料及び／または第２の試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。
いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の複数のコドンまたは遺伝子領域を検査して、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を同定する場合がある。例えば、遺伝子中の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のコドンまたは遺伝子領域を検査する場合がある。これに加えてまたはこれに代えて、複数種のがんまたは単一種内での複数のがんについてのアッセイの範囲を広げるために複数の遺伝子を検査する場合がある。
いくつかの実施形態では、放射線技法、超音波検査技法、または他の技法を、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が検出された任意の対象（例えば、ヒト対象）に適用することができる。そのような技法は、全身、単一臓器、または身体のある領域に対して施行することができる。そのような技法は、例えば、特定種のがんが存在することを確認するため、がんが存在することを確認するため、または身体中のがんの場所を同定するために、用いることができる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャン、またはポジトロン断層撮影法及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャンである。いくつかの実施形態では、そのような技法は、理学的検査、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、または婦人科内診であり、いくつかの実施形態では、そのような技法は、生検（例えば、骨髄穿刺、組織生検）である。いくつかの実施形態では、生検は、細針穿刺吸引により、または外科的切除により行われる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、さらに、生体試料（例えば、組織試料、尿試料、血液試料、拭き取り検体、唾液試料、粘膜試料（例えば、痰、気管支分泌物）、乳頭吸引液、分泌物、または、排泄物など）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、そのような技法は、エキソソームタンパク質（例えば、エキソソーム表面タンパク質（例えば、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＰＣＡ－３））を特定することを含む（Ｓｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒｓ ９（１）：ｐｉｉ：Ｅ８）。いくつかの実施形態では、診断検査法は、オンコタイプＤＸ（登録商標）検査である（Ｂａｅｈｎｅｒ（２０１６）Ｅｃａｎｃｅｒｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ １０：６７５）。
いくつかの実施形態では、本明細書中記載される様々な方法のいずれかによって、膵臓癌以外の臓器のがんを検出することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、対象のための治療を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、適切な治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を選択することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、治療の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、より詳しいモニタリングの対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なモニタリング技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、さらなる診断検査の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々な診断技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用することで、対象が初期段階のがんであると診断される前の時点、及び／または対象ががんに関連した症候を呈示する前の時点で、がん（例えば、膵臓癌）の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法は、対象ががんと診断されていない場合、及び／または対象ががん細胞を保有することが知られていない場合に、使用することができる。
本明細書中記載される方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、対象には、本明細書中記載される治療介入のいずれかの単回または複数用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回用量）を投与することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）についてのアッセイを、タンパク質バイオマーカー上昇についてのアッセイと併用することで、低いステージの膵臓癌についての血液検査の感度を向上させることができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上を、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの６４％が、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。本明細書中提供されるある特定の試験の設計上の特徴の１つは、切除可能な膵臓癌である患者のみを含めるというものであり、進行した疾患（すなわち、ステージＩＩＩまたはＩＶ）の患者は除外するというものであった。この除外は、そうしなければ、ステージに関わらず全ての膵臓癌患者を評価することにより達成可能であった感度を低下させたものの、切除可能な症例は、スクリーニング技術の評価に関して、有利な臨床的関連性を持つ有望な群を表す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いることで、対象（例えば、ヒト対象）における全ての膵臓癌を検出することができる。
ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーを組み合わせることで、どちらか単独に勝る感度の向上が可能になるかどうかは、本開示の以前は不明であった。実際、検出可能な循環タンパク質マーカーを有する同一患者が、循環中にＤＮＡを放出しているものと大幅に重複することは考え得ることであった。このことは、特に、初期段階のがん患者に対する懸念であった。なぜなら、ｃｔＤＮＡ及びタンパク質系マーカーは、両方とも、初期段階のがん患者と比べて進行癌の患者で大幅に高いことが既知だからである（Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ ＆ Ｇｏｇｇｉｎｓ Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ ６７５－７０１、Ｌｏｃｋｅｒ ＧＹ，ｅｔ ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ ２００６ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２４（３３）：５３１３－５３２７、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、非常に高い特異性（例えば、９９．５％：９５％ ＣＩ ９７～１００％）を達成することができる。例えば、本明細書中提示される試験において、平均年齢６４歳の１８２人の健康個体のうち偽陽性は１例しか観察されなかった。一般集団におけるがんの相対的希少性を考慮すると、膵臓癌に有用である可能性がある血液系スクリーニング検査の特異性は、その検査が何であれ、高いことが好ましく、例えば、好ましくは９９％超である。そうでないと、偽陽性の数が、真の陽性の数を大幅に超えると思われる（すなわち、最適陽性的中率を有下回る）（Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ：Ｗｈａｔ Ｗｉｌｌ Ｉｔ Ｔａｋｅ ｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｅ ａｎｄ Ｔｒｅａｔ Ｃｕｒａｂｌｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ？Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４（１３）：３３８１－３３８９）。スクリーニング検査についてのそのような厳密性は、既知のがんを持つ患者において疾患をモニタリングする検査には、典型的には必要とされない。モニタリングの場合、特異性は、より高い感度を得るという利益のためにいくぶん緩和させることができる。高い特異性は、少なくとも２つのやり方で、本明細書中開示される様々な方法で達成された。第１に、ｃｔＤＮＡを検査の構成要素の１つとして使用した。ＫＲＡＳ変異は、見事なまでに腫瘍に特異的であり、それらの特異性は、従来、生物学的要因ではなく技術的要因により制限されてきた。分子バーコーディングを本明細書中記載される様々なアッセイに組み込むことで（例えば、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ技法を用いて）、従来、あらゆるｃｔＤＮＡ系アッセイが直面してきた大きな技術課題であった、配列決定の結果が偽陽性となることを最小限に抑えることができる。ＫＲＡＳ変異は、早期検出戦略に特に適している。なぜなら、ＫＲＡＳ変異は、年齢関連クローン性造血の間に生じるクローンではめったに見つからないからである。そのようなクローンは、骨髄形成異常症の初期型を表す場合もあるが、それらは、偽陽性ｃｔＤＮＡアッセイの原因となる可能性がある。そのような変異の圧倒的多数は、９つの遺伝子（ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＪＡＫ２、ＡＳＸＬ１、ＴＰ５３、ＧＮＡＳ、ＰＰＭ１Ｄ、ＢＣＯＲＬ１、及びＳＦ３Ｂ１）内で生じ（４８－５０）、ｃｔＤＮＡ系アッセイにおいてバイオマーカーとしてこれらの遺伝子を利用することの障害となっている。第２に、タンパク質マーカーを陽性として採点するために高い閾値を使用した。これらの閾値は、文献の先行研究または独立した対照セットに基づくものであり、健康な患者の圧倒的多数で陽性スコアを回避することを可能にした（Ｋｉｍ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９－９ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａｎ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９（２）：１８２－１８６）。いくつかの実施形態では、そのような高い閾値は、感度を全体的に低下させることなく使用可能である。なぜなら、ｃｔＤＮＡアッセイは、それ自体感度を与え、ｃｔＤＮＡ陽性の症例は、タンパク質バイオマーカー陽性の症例と部分的にしか重複していなかったからである（例えば、図９、図１０、及び実施例２を参照）。
タンパク質バイオマーカーは、これまで、互いに組み合わせられることで、より高い感度を達成してきた（Ｄｏｎｇ Ｔ，Ｌｉｕ ＣＣ，Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，＆ Ｔａｎｇ ＬＬ（２０１４）Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ３３（８）：１３０７－１３２０）。例えば、ＣＡ１９－９とＴＩＭＰ－１を組み合わせることで、ＰＤＡＣの検出について、いずれのバイオマーカー単独よりも高感度になることが示された（Ｚｈｏｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ７（２）：１０９－１１２）。さらに最近では、ＣＡ１９－９、ＴＩＭＰ－１、及びＬＲＧ－１の組み合わせが、初期ＰＤＡＣの検出について、ＣＡ１９－９単独よりも高感度になることが示された（Ｃａｐｅｌｌｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ－Ｓｔａｇｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０９（４））。タンパク質バイオマーカーと超高感度ｃｔＤＮＡの併用は、本明細書中開示されるとおり、別物である。最近の研究では、膵臓癌に関してｃｔＤＮＡとＣＡ１９－９の併用が評価されたが、ＣＡ１９－９単独に勝るバイオマーカー併用の利点は見つからなかった。理論に固執するつもりはないが、ＫＲＡＳ変異の検出に使用された検査の感度が不適切だったためにこの結論が導かれた可能性がある（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ－Ｋｅｌｍ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ：ａ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（４８）：７８８２７－７８８４０）。そのうえさらに、その研究で達成されたｃｔＤＮＡについての特異性は、比較的低く、スクリーニングに対する適性を低下させていた。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、大多数の患者において非侵襲性血液検査を通じて切除可能な膵臓癌を検出することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて得られる結果は、早期検出の延命効果を過小評価する可能性がある。本明細書中試験された患者の大多数は、切除可能ながんを有していたが、症候性であり、患者のがんは、患者の症候によってのみ発見された。したがって、本明細書中記載されるコホート中の患者の７７％は、ステージＩＩＢであり、これらの患者における腫瘍寸法の中央値は、３ｃｍであった。いくつかの実施形態では、無症候性個体のスクリーニング試験において、より大きい割合のより初期段階の患者を、より腫瘍で、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより発見することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、全ての腫瘍は外科的に切除可能ではあるが、腫瘍の小さい患者よりも腫瘍の大きく予後のより不良な患者の検出に対してより高感度となり得る（例えば、図９Ｂ、及び実施例２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、膵臓癌以外の種類のがんを有する患者、主に肺癌を有する患者の循環において見つかる可能性があり（Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳ，Ｈｅｙｍａｃｈ ＪＶ，＆ Ｌｉｐｐｍａｎ ＳＭ（２００８）Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５９（１３）：１３６７－１３８０）、そしてＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ発現は、複数の他のがん種で上昇する可能性がある（Ｋｉｍ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９－９ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａｎ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９（２）：１８２－１８６、Ｔｈｏｍａｓ ＤＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ＣＥＡ，ＣＹＦＲＡ２１－１ ａｎｄ ＣＡ１２５ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１３（２）：２６８－２７４、Ｄｉ Ｒｅｎｚｏ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔ／ＨＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １（２）：１４７－１５４、Ｅｌ－Ｔａｎａｎｉ ＭＫ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １７（６）：４６３－４７４）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて検査陽性であった患者は、腫瘍の所在を同定するために追加の適切な画像化調査を受けることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、ＰＤＡＣのリスクが高い患者の評価及び早期検出戦略の実現の基盤を築く（Ｋａｌｉｎｉｃｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｎ ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４（５）：１１２３－１１２８）。例として、初発糖尿病は、膵臓癌のリスク上昇と関連することが既知である。年齢５０歳以上の糖尿病患者の約１％は、糖尿病の基準を最初に満たしてから３年以内に膵臓癌と診断される（Ｃｈａｒｉ ＳＴ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２９（２）：５０４－５１１）。発生率１％の場合、本明細書中開示されるある特定の併用アッセイのＰＰＶ／ＮＰＶは、この集団において、それぞれ、５４％及び９９．６％であることが予想され、これは、現在承認されているがんのスクリーニング検査の範囲内に十分収まっている。
入手可能な証拠は、多くのがんが、それらの初期段階において、検出可能なｃｔＤＮＡを有し、膵臓癌で観察されるよりも一般的にそうである場合が多いことを示す（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。同様に、多数のタンパク質バイオマーカーが、すでに、多数のがん種の検出について記載されている（Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ ＆ Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １（８）：４６０－４６２）。こうしたタンパク質バイオマーカーは、本明細書中記載される様々な方法のいずれかに従って閾値を設定することができ、様々ながん種の検出にｃｔＤＮＡ－タンパク質の併用を用いることを可能にする（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
遺伝子バイオマーカーと異数性との併用
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、対象を、がんを有すると同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断においてある感度を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、その感度は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される感度よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵臓癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、その対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断においてある特異性を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、この特異性は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される特異性よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有すると間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：膀胱癌または上部尿路上皮癌。
対象から得られる試料は、本明細書中記載される、ＤＮＡ（例えば、血液中のｃｔＤＮＡ、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質を含有する様々な試料のどれでも可能である。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質は、腫瘍細胞に由来する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ））は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーまたは異数体ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを含む。遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー及び／または異数性が検出可能な試料の限定ではない例として、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、子宮内膜試料、子宮頸部試料、及び子宮試料が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び異数性の存在は、対象から得られた単一試料で検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在は、対象から得られた第１の試料で検出され、異数性の存在は、対象から得られた第２の試料で検出される。
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。例えば、対象が、がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）場合、その対象は、さらなる診断検査を受けることができ、さらなる診断検査は、その対象におけるがんの存在を確認することができる。これに加えてまたはこれに代えて、その対象は、より高い頻度でモニタリングを受けることができる。がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）対象が、さらなる診断検査及び／またはより詳しいモニタリングを受ける実施形態のいくつかにおいて、その対象は、追加で、治療介入を実施される可能性がある。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、追加のさらなる診断検査（例えば、以前に行われたものと同じ種類のさらなる診断検査及び／または異なる種類のさらなる診断検査）及び／または継続したより詳しいモニタリング（例えば、以前に行われたものと同じ頻度または異なる頻度でのより詳しいモニタリング）を受ける。複数の実施形態において、対象が治療介入を実施され、追加のさらなる診断検査及び／または追加のより詳しいモニタリングを受けた後、その対象は、別の治療介入（例えば、以前に実施されたものと同じ治療介入及び／または異なる治療介入）を実施される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在、について検査される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。様々なタンパク質バイオマーカーのどれでも、検出可能である（例えば、本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーパネルのいずれか）。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、２）異数性の存在、ならびに３）タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在、のうち１つまたは複数の存在、を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、３）異数性の存在、ならびに４）タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在、を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：膀胱癌または上部尿路上皮癌。
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３。
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３。
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む様々な方法のどれでも、さらに、１つまたは複数の追加のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。そのような追加のバイオマーカークラスの限定ではない例として、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、及び／または代謝産物。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスは、代謝産物バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の限定ではない例として、以下が挙げられる：５－メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ－アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ－グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’－ジホスホコリン、ジホモ－リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’－一リン酸（５’－ＣＭＰ）、ガンマ－グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ－１４５７７、Ｘ－１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２－アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ－アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド－ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ－ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３－メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３－リン酸、グルタミン、５－オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４－アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、トレオニン、Ｎ－アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ－アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６－アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３－グアニジノプロピオン酸、グルコース６－リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ－アセチルアスパラギン酸、４－グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ－アセチルアスパラギン、２－ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１－リン酸、Ｎ－ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ－アラニン、Ｎ－アセチルグルタミン酸、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、Ｇｌｙ－Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６－ビスリン酸、３－アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルオルニチン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ－グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１－アミノシクロプロパン－１－カルボン酸ホモセリンラクトン、５－アミノ吉草酸、３－ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ－メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１－メチルニコチンアミド、Ｎ－アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ－メチルアラニン、パルミチン酸、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ－ＬＣＡ、オレオイル－Ｌ－カルニチン、オレアノール酸、３－ホスホグリセリン酸、５－ヒドロキシノルバリン、５－メトキシトリプタミン、アデノシン－５－一リン酸、アルファ－ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５－ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストラジオール、２－メトキシエストロン、２－メトキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、４－ヒドロキシエストロン、４－メトキシエストロン、４－メトキシエストラジオール、１６アルファ－ヒドロキシエストロン、１７－エピエストリオール、エストリオール、１６－ケトエストラジオール、１６－エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣａａＣ２８：１、ＰＣａｅＣ３０：０、及びＰＣａｅＣ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｃｈｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）、Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＤ１３３，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）、Ｅｌｉａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ａｍｏｎｇ Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７２（３）、６９６－７０６（２０１１）、Ｇａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ ２、７（５）：５８１５－５８２９（２０１６）、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２－２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅ－ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ｉｎ １０７７ ｃａｓｅｓ ａｎｄ １０７７ ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９１６－０１７－０８８５－６（２０１７）、を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、ペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なるペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの限定ではない例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ－β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α－１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン－１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質－８、αディフェンシン－１、－２、－３、血清Ｃ－ペプチド、アルファ－２－ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ－２、（チオレドキシン様タンパク質－２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ－ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ－１、Ｒａｂ－３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ－１、－６、－７、－８、－１０、－１１、－１２、－１６、－１８、－２１、－２３、－２８Ａ、－３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１－２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ－ａ、ＩＬ１Ｒ－ｂ、ＩＬ－２Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１ａ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ－β、ＭＣＰ－４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ－１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ－４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ－１、ＳＤＦ－１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン－１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン－２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ－１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ－３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧＦＲｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｂＲＩＩＩ、β－セルリン、ＩＧＦＢＰ１－４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン－２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２－ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ－５０、ＣＡ７２－４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ－２、－３、－７、－９、ＶＡＰ－１、ＴＩＭＰ１－２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ－１、オステオポンチン、ＫＩＭ－１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン－２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β－ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ－ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１－アンチトリプシン、ａ２－マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター－１）、Ｃｏｘ－１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１－１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ－ＭＢ、ヒト乳脂肪球１－２、ＮＴ－Ｐｒｏ－ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン－６、ＰＡＲＣ、Ｂ７－Ｈ４、ＹＫ－Ｌ４０、ＡＦＰ－Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５－ＨＩＡＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２－４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ－ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ－１、ｕＰＡ、フィブリンＤ－二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ－１、ｐ５３、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ－グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ－ＮＰＹ、セセルニン－１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ－２４、カベオリン－２、プロトロンビン、アンチトロンビン－ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ－１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ－２－糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ－１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７，Ｐａｇｅｓ １２１２－１２２１、Ｅｌｚｅｋ ａｎｄ Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１５ Ｍａｒ；３４（１）：８３－９６、Ｎｏｅｌ ａｎｄ Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ Ｊａｎ；８（１）：５５－７１、Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ ７；２１（３７）：１０５７３－１０５８３、Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１－９、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｊｕｎ ２７；８（２６）：４２７６１－４２７７１、Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．２０１７ Ｊｕｌ；６（７）：１７３８－１７５１、Ｚａｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７ Ｎｏｖ；９（１１）：１５５、Ｔａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｍａｒ １４；８（１１）：１８４９７－１８５１２を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照として援用される。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、核酸損傷または変型（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる核酸損傷または変型）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変型の限定ではない例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺癌、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされてきており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６－３０５、Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９－５６、Ｇａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２、Ｏｇｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８－９７、米国特許第９，７４５，６３２号、及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化が、様々ながんのバイオマーカーとして使用されてきており、そのようながんとして、制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２、及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用されている。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされている（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化が、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４－９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされている。そのような核酸または核酸の特徴の限定ではない例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されてきている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８、Ｆｕｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，１０８：８８６－９６、Ｇｉｒａｌｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９－７４、米国特許第８，３４３，７１８号、同第９，４１０，９５６号、及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ－２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５－５５）を参照。長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２－９、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３－１００２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０－７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４－９、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７－６７、及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９－２５）のバイオマーカーとして使用されてきている。テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされている（例えば、前立腺癌、乳癌、肺癌、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：４４７２－８０、Ｌｉｓｃｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１－６、Ｐｒｏｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０－７４、及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９－９０７を参照）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、再編成、及び／またはコピー数変化が、さまざまながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されている。例えば、Ｍａｒａｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３－７３、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２－６８、Ｈｏｓｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７－９、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ＆ Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４－８１、及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照。またメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかっており、そのようながんとして、制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９－４０６、Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：１５２１－５、及びＮｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ Ｍｅｄ．，７３：５４－８を参照）。これらの引用は、それぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、対象（例えば、ヒト）における疾患の検出方法である。本明細書中開示される様々な方法は、対象におけるがん（例えば、子宮内膜癌または卵巣癌などであるが、これらに限定されない）の非侵襲的検出に幅広く応用可能なアプローチを提供する。本明細書中開示される様々な方法は、対象におけるがん（例えば、子宮内膜癌または卵巣癌などであるが、これらに限定されない）の非侵襲的検出後に、がんを有するまたは有することが疑われる対象の治療に幅広く応用可能なアプローチを提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）中に存在する細胞由来の１つまたは複数の遺伝子において、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することを含む。例えば、本明細書中提供される方法を使用して、以下：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａからなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができ、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、対象に卵巣癌または子宮内膜癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することを含み、異数性の存在は、対象に卵巣癌または子宮内膜癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在のそれぞれを検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在のそれぞれを検出することを含む方法は、いずれかの態様を個別に検査する方法よりも良好に、対象ががん（例えば、子宮内膜癌または卵巣癌）を有することを示す。
いくつかの実施形態では、がん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の存在を検出するための試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取することができる。本明細書中提供される様々な方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、がん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の存在を検出するための試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、血漿試料）を、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）として存在する核酸中の遺伝子バイオマーカーについて検査することを含む。例えば、試料（例えば、血漿試料）は、以下の遺伝子の１つまたは複数において１つまたは複数の変異を保有する核酸中の遺伝子バイオマーカーを検出するために検査することができる：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及び／またはＴＰ５３。
本明細書中提供される、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）に存在する細胞中の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出する方法の様々な実施形態において、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これら１８の遺伝子全てにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１５に示す変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１６に示す変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１７に示す変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１５に示す遺伝子における変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１６に示す遺伝子における変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１７に示す遺伝子における変異が可能である。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰＦ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより、卵巣癌または子宮内膜癌の存在を検出する方法は、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることは、卵巣癌または子宮内膜癌の検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取される。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用して、子宮内膜癌の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法を使用して、以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができ、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、対象に子宮内膜癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これら１２の遺伝子全てにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される任意の変異が可能である（例えば、表１５、表１６、または表１７のいずれか１つに示されるとおりの変異）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより、子宮内膜癌の存在を検出する方法は、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることは、子宮内膜癌の検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取される。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用して、卵巣癌の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法を使用して、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができ、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、対象に卵巣癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することにより検出される卵巣癌は、グレードの高い卵巣癌の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される任意のＴＰ５３変異（例えば、表１５、表１６、または表１７のいずれか１つに示されるとおりのＴＰ５３変異）が可能である。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより子宮内膜癌の存在を検出する方法は、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する変異の検出、またはその両方と組み合わせることは、卵巣癌の検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取される。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取される。
本明細書中記載される遺伝子の１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される変異の検出技法の例のいずれかにより検出可能である。そのうえ、当業者なら、これらの遺伝子における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出するのに適した他の方法に気づくだろう。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、本明細書中記載される遺伝子のいずれかにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、異数性の検出、またはその両方を含む方法）は、さらに、対象から得られた試料（例えば、血漿試料）を、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）として存在する核酸中の遺伝子バイオマーカーについて検査することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を１つまたは複数保有する核酸を含み、これらの核酸は、本明細書中開示される様々な方法のいずれかによりアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、血漿試料は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及び／またはＴＰ５３）中に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を１つまたは複数保有する核酸を含み、これらの核酸は、本明細書中開示される様々な方法のいずれかによりアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、表１５に列挙される遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１５に列挙される遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１６に列挙される遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１６に列挙される１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１７に列挙される遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１７に列挙される１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。当業者ならわかるだろうが、そのようなｃｔＤＮＡは、がん細胞（例えば、子宮頸癌細胞、子宮内膜癌細胞、卵巣癌細胞、及び／または卵管癌細胞）から脱落した核酸であることが可能であり、そのため、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを使用してアッセイすることにより、対象におけるがんの存在を判定することができる。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するための試料は、血液（例えば、全血、血清、または血漿）、羊膜、組織、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液（例えば、卵巣嚢胞液）、糞便、腹水、パップスメア、腹水、腹膜灌流、子宮灌流、及びそれらの組み合わせであるか、あるいはそれらを含むことができる。ｃｔＤＮＡにおける変異は、本明細書中記載される変異検出技法の例のいずれかにより検出可能である。そのうえ、当業者なら、ｃｔＤＮＡにおける変異を検出するのに適した他の方法に気づくだろう。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、子宮頸部試料である。いくつかの実施形態では、試料は、子宮内膜試料である。いくつかの実施形態では、試料は、子宮頸部及び子宮内膜それぞれに由来する組織または細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを用いて得られる。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを用いて得られる。いくつかの実施形態では、方法は、試料の残部から細胞を単離することを含む。例えば、細胞を、試料の他成分から完全に分離することも可能であるし、単離細胞が試料由来の他の物質を少量しか含まないようにある程度分離することも可能である。いくつかの実施形態では、試料から単離された細胞中に存在する核酸は、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを用いてアッセイすることができる。例えば、試料由来の細胞中に存在する核酸は、単離及びアッセイすることが可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）において、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することを含み、遺伝子バイオマーカーのうち少なくとも１つ（例えば、変異のうち少なくとも１つ）は、試料中に低い頻度で存在する。例えば、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中の細胞の０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％以下にしか存在しない場合でも、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中に存在する全核酸の０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％未満にしか存在しない場合でも、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。
本明細書中開示される、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中に１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の、様々な方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、細胞診断を、本方法と併用してまたは本方法とは別個に行うことができる。例えば、細胞診断を、本明細書中開示される様々な方法のいずれかと併用して行うことにより、対象おけるがん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の検出を改善することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、アッセイ感度が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、アッセイ特異性が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、そうしなければ検出不可と思われるがんまたは細胞診断のみではめったに検出されないがん（例えば、グレードの低い腫瘍）の検出が可能になる。別の例として、がん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の存在が、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することにより判定された場合に、細胞診断を別個で行うことで、がんの存在を確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在それぞれを検出すること、ならびに細胞診断を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、以前にがん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）治療を受けたことがある対象で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、治療の有効性を判定することができる。例えば、卵巣癌または子宮内膜癌を有する対象に治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）を実施することができ、その後、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することにより、がんが継続して存在するかどうかまたはがんの量（あるいはそれらがないこと）を判定する。
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、対象（例えば、ヒト）において疾患を検出する方法である。本明細書中開示される様々な方法は、がん（例えば、膀胱癌または上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）などの初期段階のがんであるが、これらに限定されない）の非侵襲的検出に幅広く応用可能なアプローチを提供する。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、検出されるがんは、悪性である。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、尿路に関連する。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、尿路を患部とするがんである。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、膀胱癌である。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、腎盂に関連する。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、腎盂を患部とするがんである。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、ＵＴＵＣである。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、１つまたは複数の遺伝子中の変異を検出することを含む。例えば、本明細書中提供される方法を用いて、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）の存在を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料においてＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において、以下のうち２つ以上を検出することを含む：１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在のそれぞれを検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在のそれぞれを検出することを含む方法は、これら３つ全部より少ないパラメーターを検査する方法よりも良好に、対象ががん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）を有するとする指標を提供する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在のそれぞれを検出することを含む方法は、卵巣癌または子宮内膜癌（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）を検出する特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。
本明細書中提供される、対象から得られた試料（例えば、尿試料）における、遺伝子中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）を検出する方法の様々な実施形態において、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８、または９つにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１０全部における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中開示される任意の変異が可能である。例えば、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１９または表２９に示される変異が可能である。いくつかの実施形態では、ＴＲ５３またはＦＧＦＲ３の１つにおける少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が検出される。いくつかの実施形態では、ＴＲ５３またはＦＧＦＲ３のそれぞれにおける少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）が検出される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することを含む。本明細書中開示されるＴＥＲＴプロモーター中の任意の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。例えば、表２６または表３０に示される様々なＴＥＲＴプロモーター遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）のどれでも、本明細書中提供される方法を用いて検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される様々な方法により検出可能なＴＥＲＴプロモーター遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）として、ｇ．１２９５２２８ Ｃ＞Ｔ変異及び／またはｇ．１２９５２５０ Ｃ＞Ｔ変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される様々な方法により検出可能なＴＥＲＴプロモーター遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）として、位置ｈｇ１２９５２２８及び／またはｈｇ１２９５２５０での変異が挙げられ、これらはそれぞれ、転写開始位置から６６ｂｐ及び８８ｂｐ上流である。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴプロモーター中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、シングルプレックスＰＣＲアッセイを用いて同定される。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴプロモーター中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、マルチプレックスＰＣＲアッセイを用いて同定される。いくつかの実施形態では、単一増幅プライマーを用いて、がん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）において遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を保有することが知られているＴＥＲＴプロモーターの領域を含有するセグメントを増幅させることができる。
本明細書中使用される場合、「ＴＥＲＴ」という用語は、その遺伝子及び／またはその遺伝子によりコードされるタンパク質を示し、このタンパク質は、テロメラーゼ逆転写酵素、すなわち、テロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）と一緒になって、テロメラーゼ複合体の最も重要なユニットを構成する酵素テロメラーゼの触媒サブユニットである。ＴＥＲＴ遺伝子の上流プロモーターにおける活性化変異は、高い割合で、ＢＣの多数ならびに他のがん種において見つかる。ＴＥＲＴプロモーター変異は、一般的に、２つのホットスポット：ｇ．１２９５２２８ Ｃ＞Ｔ及びｇ．１２９５２５０ Ｃ＞Ｔに影響を及ぼす。これらの変異は、ＣＣＧＧＡＡ／ＴまたはＧＧＡＡ／Ｔモチーフを生成させ、ＥＴＳ転写因子の結合部位を改変して、その結果ＴＥＲＴプロモーター活性の上昇を招く。ＴＥＲＴプロモーター変異は、膀胱及び上部尿路の浸潤性尿路上皮癌のうち最高８０％ならびにその組織学的変異型のいくつかにおいて、発生する。そのうえ、ＴＥＲＴプロモーター変異は、ＢＣ前駆体の６０～８０％で発生し、そのようなＢＣ前駆体として、悪性可能性の低い乳頭状尿路上皮腫瘍、非浸潤性低異形度乳頭状尿路上皮癌、非浸潤性高異形度乳頭状尿路上皮癌、及び「平坦状」上皮内癌（ＣＩＳ）、ならびにこれらの患者のサブセットに由来する尿中細胞が挙げられる。このため、ＴＥＲＴプロモーター変異は、ＢＣの共通遺伝子変異として確立されている。ヒトＴＥＲＴプロモーター配列は、当該分野で既知である。
本明細書中記載される遺伝子の１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される変異の検出技法の例のいずれかにより検出可能である。そのうえ、当業者なら、これらの遺伝子における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出するのに適した他の方法に気づくだろう。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）の存在、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）の存在、またはその両方を検出することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、尿試料である。本明細書中提供される実施形態のいくつかにおいて、本方法は、試料の残部からそのような細胞を単離することを含む。例えば、細胞を、試料の他成分から完全に分離することも可能であるし、単離細胞が試料由来の他の物質（複数可）を少量しか含まないようにある程度分離することも可能である。いくつかの実施形態では、試料から単離された細胞中に存在する核酸における遺伝子バイオマーカーの存在及び／または試料から単離された細胞中の異数性の存在は、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを用いてアッセイすることができる。例えば、試料由来の細胞中に存在する核酸は、単離して、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在についてアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、細胞の核酸を分析用に単離する前に、その細胞を試料から単離することはしない。いくつかの実施形態では、試料は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中に１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を保有する核酸、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）、及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）を含み、この核酸は、本明細書中開示される様々な方法のいずれかによりアッセイされる。当業者ならわかるだろうが、そのような核酸は、がん細胞（例えば、膀胱癌細胞またはＵＴＵＣ由来細胞）から脱落した核酸であることが可能であり、そのため、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを使用してアッセイすることにより、対象におけるがんの存在を判定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、またはその両方を検出することを含み、遺伝子バイオマーカーのうち少なくとも１つ（例えば、変異の少なくとも１つ）は、試料中に低い頻度で存在する。例えば、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中の細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、またはそれ以下で存在する場合に、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中の細胞の０．０３％以下で存在する場合、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中に存在する全核酸の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％未満で存在する場合、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。
本明細書中開示される、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する様々な方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、細胞診断を、本方法と併用してまたは本方法とは別個に行うことができる。例えば、細胞診断を、本明細書中開示される様々な方法のいずれかと併用して行うことにより、対象におけるがん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）の検出を改善することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、細胞診断単独に比べてアッセイ感度が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、細胞診断単独に比べてアッセイ特異性が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、そうしなければ検出不可と思われるがんまたは細胞診断単独ではめったに検出されないがん（例えば、グレードの低い腫瘍）の検出が可能になる。別の例として、がん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）の存在が、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより判定された場合に、細胞診断を別個で行うことで、がんの存在を確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在それぞれを検出すること、ならびに細胞診断を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、以前にがん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）治療を受けている対象で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、治療の有効性を判定することができる。例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣを有する対象に治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）を実施することができ、その後、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより、がんが継続して存在するかどうかまたはがんの量（あるいはそれらがないこと）を判定する。
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかは、細胞学的検体をがんについて検査することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、診断またはスクリーニングのために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、がんの診断のために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、がんのスクリーニングのために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、疾患または状態を分類するために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、がんを分類するために用いる。
試料を採取するために様々な方法を用いることができ、そのような方法として、吸引細胞診断（例えば細針穿刺吸引）、剥離細胞診断（例えば、圧片塗抹標本及び組織擦過）、膀胱鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、細胞診は、肉眼検査を含む。いくつかの実施形態では、細胞診は、組織検査を含む。いくつかの実施形態では、細胞診は、凍結切片検査を含む。いくつかの実施形態では、細胞診は、別の方法または検査と合わせて実施される。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、組織化学染色を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、免疫組織化学染色を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、電子顕微鏡検査を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、フローサイトメトリーを含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、細胞画像解析を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、遺伝子検査を含む。例えば、遺伝子検査として、細胞遺伝学的検査、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）検査、及び／または分子遺伝学的検査を挙げることができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＴＰ５３中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。
タンパク質バイオマーカーと異数性との併用
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、対象を、がんを有すると同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される感度よりも高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵臓癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される特異性よりも高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵臓癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）。
対象から得られる試料は、本明細書中記載される、ＤＮＡ（例えば、血液中のｃｔＤＮＡ、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質を含有する様々な試料のどれでも可能である。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質は、腫瘍細胞に由来する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及びまたは異数体ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを含む。遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー及び／または異数性が検出可能な試料の限定ではない例として、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、子宮内膜試料、子宮頸部試料、及び子宮試料が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び異数性の存在は、対象から得られた単一試料で検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、対象から得られた第１の試料で検出され、異数性の存在は、対象から得られた第２の試料で検出される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及び異数性の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの上昇したレベルが検出され得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの上昇したレベルは、参照レベルより高いレベルであり得る。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルであり得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルであり得る。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルであり得る。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルであり得る。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及び異数性の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの低下したレベルが検出され得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの低下したレベルは、参照レベルより低いレベルであり得る。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルが可能であり得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルであり得る。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルであり得る。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルであり得る。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、：１）異数性の存在、ならびに２）異数性の存在と併用して有用であると本明細書中記載されるパネルのいずれかにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）が、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。例えば、対象が、がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）場合、その対象は、さらなる診断検査を受けることができ、さらなる診断検査は、その対象におけるがんの存在を確認することができる。これに加えてまたはこれに代えて、その対象は、より高い頻度でモニタリングを受けることができる。がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）対象が、さらなる診断検査及び／またはより詳しいモニタリングを受ける実施形態のいくつかにおいて、その対象は、追加で、治療介入を実施される可能性がある。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、追加のさらなる診断検査（例えば、以前に行われたものと同じ種類のさらなる診断検査及び／または異なる種類のさらなる診断検査）及び／または継続したより詳しいモニタリング（例えば、以前に行われたものと同じ頻度または異なる頻度でのより詳しいモニタリング）を受ける。複数の実施形態において、対象が治療介入を実施され、追加のさらなる診断検査及び／または追加のより詳しいモニタリングを受けた後、その対象は、別の治療介入（例えば、以前に実施されたものと同じ治療介入及び／または異なる治療介入）を実施される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在、について検査される。
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。様々な遺伝子バイオマーカーのどれでも、検出可能である（例えば、本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカー及び／または遺伝子バイオマーカーパネルのいずれか）。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法では、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに異数性の存在を検出することを含む方法では、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在、を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつか。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）の存在：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵臓癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）。
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ。
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４。
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ。
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ。
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａ。
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及び／またはＴＰ５３。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及びＴＰ５３。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む様々な方法のどれでも、さらに、１つまたは複数の追加のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。そのような追加のバイオマーカークラスの限定ではない例として、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、及び／または代謝産物。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスは、代謝産物バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の限定ではなく例として、以下が挙げられる：５－メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ－アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ－グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’－ジホスホコリン、ジホモ－リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’－一リン酸（５’－ＣＭＰ）、ガンマ－グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ－１４５７７、Ｘ－１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２－アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ－アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド－ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ－ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３－メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３－リン酸、グルタミン、５－オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４－アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、トレオニン、Ｎ－アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ－アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６－アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３－グアニジノプロピオン酸、グルコース６－リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ－アセチルアスパラギン酸、４－グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ－アセチルアスパラギン、２－ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１－リン酸、Ｎ－ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ－アラニン、Ｎ－アセチルグルタミン酸、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、Ｇｌｙ－Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６－ビスリン酸、３－アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルオルニチン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ－グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１－アミノシクロプロパン－１－カルボン酸ホモセリンラクトン、５－アミノ吉草酸、３－ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ－メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１－メチルニコチンアミド、Ｎ－アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ－メチルアラニン、パルミチン酸、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ－ＬＣＡ、オレオイル－Ｌ－カルニチン、オレアノール酸、３－ホスホグリセリン酸、５－ヒドロキシノルバリン、５－メトキシトリプタミン、アデノシン－５－一リン酸、アルファ－ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５－ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストラジオール、２－メトキシエストロン、２－メトキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、４－ヒドロキシエストロン、４－メトキシエストロン、４－メトキシエストラジオール、１６アルファ－ヒドロキシエストロン、１７－エピエストリオール、エストリオール、１６－ケトエストラジオール、１６－エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣａａＣ２８：１、ＰＣａｅＣ３０：０、及びＰＣａｅＣ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｃｈｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）、Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＤ１３３，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）、Ｅｌｉａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ａｍｏｎｇ Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７２（３）、６９６－７０６（２０１１）、Ｇａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ ２、７（５）：５８１５－５８２９（２０１６）、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２－２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅ－ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ｉｎ １０７７ ｃａｓｅｓ ａｎｄ １０７７ ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９１６－０１７－０８８５－６（２０１７）を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、ペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なるペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの限定ではない例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ－β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α－１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン－１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質－８、αディフェンシン－１、－２、－３、血清Ｃ－ペプチド、アルファ－２－ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ－２、（チオレドキシン様タンパク質－２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ－ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ－１、Ｒａｂ－３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ－１、－６、－７、－８、－１０、－１１、－１２、－１６、－１８、－２１、－２３、－２８Ａ、－３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１－２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ－ａ、ＩＬ１Ｒ－ｂ、ＩＬ－２Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１ａ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ－β、ＭＣＰ－４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ－１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ－４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ－１、ＳＤＦ－１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン－１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン－２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ－１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ－３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧＦＲｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｂＲＩＩＩ、β－セルリン、ＩＧＦＢＰ１－４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン－２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２－ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ－５０、ＣＡ７２－４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ－２、－３、－７、－９、ＶＡＰ－１、ＴＩＭＰ１－２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ－１、オステオポンチン、ＫＩＭ－１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン－２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β－ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ－ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１－アンチトリプシン、ａ２－マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター－１）、Ｃｏｘ－１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１－１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ－ＭＢ、ヒト乳脂肪球１－２、ＮＴ－Ｐｒｏ－ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン－６、ＰＡＲＣ、Ｂ７－Ｈ４、ＹＫ－Ｌ４０、ＡＦＰ－Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５－ＨＩＡＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２－４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ－ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ－１、ｕＰＡ、フィブリンＤ－二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ－１、ｐ５３、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ－グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ－ＮＰＹ、セセルニン－１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ－２４、カベオリン－２、プロトロンビン、アンチトロンビン－ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ－１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ－２－糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ－１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７，Ｐａｇｅｓ １２１２－１２２１、Ｅｌｚｅｋ ａｎｄ Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１５ Ｍａｒ；３４（１）：８３－９６、Ｎｏｅｌ ａｎｄ Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ Ｊａｎ；８（１）：５５－７１、Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ ７；２１（３７）：１０５７３－１０５８３、Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１－９、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｊｕｎ ２７；８（２６）：４２７６１－４２７７１、Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．２０１７ Ｊｕｌ；６（７）：１７３８－１７５１、Ｚａｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７ Ｎｏｖ；９（１１）：１５５、Ｔａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｍａｒ １４；８（１１）：１８４９７－１８５１２を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、核酸損傷または変型（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる核酸損傷または変型）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変型の限定ではない例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６－３０５、Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９－５６、Ｇａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２、Ｏｇｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８－９７、米国特許第９，７４５，６３２号、及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化も、様々ながんのバイオマーカーとして使用されており、そのようながんとして、特に制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２、及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用される。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされている（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化が、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４－９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされている。そのような核酸または核酸の特徴の限定ではない例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８、Ｆｕｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，１０８：８８６－９６、Ｇｉｒａｌｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９－７４、米国特許第８，３４３，７１８号、同第９，４１０，９５６号、及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ－２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５－５５）を参照。長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２－９、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３－１００２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０－７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４－９、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７－６７、及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９－２５）のバイオマーカーとして使用されてきている。テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされている（例えば、前立腺、乳房、肺、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：４４７２－８０、Ｌｉｓｃｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１－６、Ｐｒｏｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０－７４、及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９－９０７を参照）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、再編成、及び／またはコピー数変化が、さまざまながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されている。例えば、Ｍａｒａｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３－７３、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２－６８、Ｈｏｓｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７－９、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ＆ Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４－８１、及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照。またメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかってきており、そのようながんとして、特に制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９－４０６、Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：１５２１－５、及びＮｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ Ｍｅｄ．，７３：５４－８を参照）。これらの引用は、それぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
単一バイオマーカークラスまたは異数性
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定されている、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定されている対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されているまたは同定されている、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定されている対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵臓癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカータンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、単一のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）を検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）を検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）を検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及びＣＡ１５－３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）を検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、異数性の存在を検出することを含む方法は、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び／または９ｐの１つまたは複数における異数性を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、異数性の存在を検出することを含む方法は、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び／または９ｑの１つまたは複数における異数性を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、単一のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、あるバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含み、そのようなバイオマーカーとして、制限なく、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、または代謝産物。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の代謝産物の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の限定ではない例として、以下が挙げられる：５－メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ－アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ－アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ－グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’－ジホスホコリン、ジホモ－リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’－一リン酸（５’－ＣＭＰ）、ガンマ－グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ－１４５７７、Ｘ－１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２－アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ－アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド－ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ－ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３－メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３－リン酸、グルタミン、５－オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４－アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、トレオニン、Ｎ－アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ－アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６－アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３－グアニジノプロピオン酸、グルコース６－リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ－アセチルアスパラギン酸、４－グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ－アセチルアスパラギン、２－ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１－リン酸、Ｎ－ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ－アラニン、Ｎ－アセチルグルタミン酸、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、Ｇｌｙ－Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６－ビスリン酸、３－アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルオルニチン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ－グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１－アミノシクロプロパン－１－カルボン酸ホモセリンラクトン、５－アミノ吉草酸、３－ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ－メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１－メチルニコチンアミド、Ｎ－アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ－メチルアラニン、パルミチン酸、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ－ＬＣＡ、オレオイル－Ｌ－カルニチン、オレアノール酸、３－ホスホグリセリン酸、５－ヒドロキシノルバリン、５－メトキシトリプタミン、アデノシン－５－一リン酸、アルファ－ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５－ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストラジオール、２－メトキシエストロン、２－メトキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、４－ヒドロキシエストロン、４－メトキシエストロン、４－メトキシエストラジオール、１６アルファ－ヒドロキシエストロン、１７－エピエストリオール、エストリオール、１６－ケトエストラジオール、１６－エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣａａＣ２８：１、ＰＣａｅＣ３０：０、及びＰＣａｅＣ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｃｈｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）、Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＤ１３３，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）、Ｅｌｉａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ａｍｏｎｇ Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７２（３）、６９６－７０６（２０１１）、Ｇａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ ２、７（５）：５８１５－５８２９（２０１６）、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２－２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅ－ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ｉｎ １０７７ ｃａｓｅｓ ａｎｄ １０７７ ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９１６－０１７－０８８５－６（２０１７）を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数のペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なる１つまたは複数のペプチド）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの限定ではない例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ－β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α－１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン－１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質－８、αディフェンシン－１、－２、－３、血清Ｃ－ペプチド、アルファ－２－ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ－２、（チオレドキシン様タンパク質－２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ－ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ－１、Ｒａｂ－３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ－１、－６、－７、－８、－１０、－１１、－１２、－１６、－１８、－２１、－２３、－２８Ａ、－３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１－２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ－ａ、ＩＬ１Ｒ－ｂ、ＩＬ－２Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１ａ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ－β、ＭＣＰ－４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ－１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ－４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ－１、ＳＤＦ－１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン－１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン－２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ－１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ－３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧＦＲｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｂＲＩＩＩ、β－セルリン、ＩＧＦＢＰ１－４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン－２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２－ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ－５０、ＣＡ７２－４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ－２、－３、－７、－９、ＶＡＰ－１、ＴＩＭＰ１－２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ－１、オステオポンチン、ＫＩＭ－１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン－２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β－ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ－ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１－アンチトリプシン、ａ２－マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター－１）、Ｃｏｘ－１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１－１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ－ＭＢ、ヒト乳脂肪球１－２、ＮＴ－Ｐｒｏ－ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン－６、ＰＡＲＣ、Ｂ７－Ｈ４、ＹＫ－Ｌ４０、ＡＦＰ－Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５－ＨＩＡＡ、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２－４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ－ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ－１、ｕＰＡ、フィブリンＤ－二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ－１、ｐ５３、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ－グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ－ＮＰＹ、セセルニン－１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ－２４、カベオリン－２、プロトロンビン、アンチトロンビン－ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ－１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター－アルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ－２－糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ－１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７，Ｐａｇｅｓ １２１２－１２２１、Ｅｌｚｅｋ ａｎｄ Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１５ Ｍａｒ；３４（１）：８３－９６、Ｎｏｅｌ ａｎｄ Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ Ｊａｎ；８（１）：５５－７１、Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ ７；２１（３７）：１０５７３－１０５８３、Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１－９、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｊｕｎ ２７；８（２６）：４２７６１－４２７７１、Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．２０１７ Ｊｕｌ；６（７）：１７３８－１７５１、Ｚａｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７ Ｎｏｖ；９（１１）：１５５、Ｔａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７ Ｍａｒ １４；８（１１）：１８４９７－１８５１２を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の核酸損傷または変型（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる１つまたは複数の核酸損傷または変型）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変型の限定ではない例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６－３０５、Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９－５６、Ｇａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２、Ｏｇｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８－９７、米国特許第９，７４５，６３２号、及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化も、様々ながんのバイオマーカーとして使用されてきており、そのようながんとして、制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２、及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用される。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９－２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされている（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化が、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４－９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされている。そのような核酸または核酸の特徴の限定ではない例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８、Ｆｕｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，１０８：８８６－９６、Ｇｉｒａｌｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９－７４、米国特許第８，３４３，７１８号、同第９，４１０，９５６号、及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ－２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５－５５）を参照。長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２－９、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３－１００２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０－７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４－９、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７－６７、及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９－２５）のバイオマーカーとして使用されている。テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされている（例えば、前立腺、乳房、肺、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：４４７２－８０、Ｌｉｓｃｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１－６、Ｐｒｏｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０－７４、及びＳｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９－９０７を参照）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、再編成、及び／またはコピー数変化が、さまざまながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されている。例えば、Ｍａｒａｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３－７３、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２－６８、Ｈｏｓｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７－９、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ＆ Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４－８１、及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照。またメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかっており、そのようながんとして、特に制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９－４０６、Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：１５２１－５、及びＮｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ Ｍｅｄ．，７３：５４－８を参照）。これらの引用は、それぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
検出された遺伝子バイオマーカーの検証
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡで検出された遺伝子バイオマーカーが、対象における癌細胞の存在を示すものであることを検証することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡで検出された遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）が、対象における癌細胞の存在を示すものであることを検証することができる。例えば、癌細胞に存在するある特定の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、体内の他の非癌細胞にも生じる。そのような非癌細胞として、特に制限なく、加齢に関連したクローン性造血（例えば、クローン性造血拡大（不確定潜在性クローン性造血、すなわちＣＨＩＰとしても知られる）または骨髄形成異常症）中に生じる白血球細胞クローンが挙げられる。結果として、そのようなクローンは、骨髄形成異常症の初期型を表す場合があり、それらは、偽陽性ｃｔＤＮＡアッセイの原因となる可能性がある。そのような場合、無細胞ＤＮＡにおいて遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が検出されると、がんの誤診を招く可能性がある。なぜなら、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、がん（例えば、固形腫瘍）に由来するのではなく、造血性白血球細胞に由来するからである。本明細書中提供される方法は、そのようながんの誤診を減少させるまたは排除することができる。
本明細書中提供される方法は、無細胞ＤＮＡで検出された１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、がん細胞ではなく造血性白血球細胞に由来するかどうかを判定することにより、がんの誤診を減少させるまたは排除することができる。例えば、対象の白血球細胞からＤＮＡを単離するまたは得ることができ、このＤＮＡを検査して、対象由来の無細胞ＤＮＡで同定された遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の有無を判定することができ、この遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、がんに関連する。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞由来のＤＮＡで同定された場合、無細胞ＤＮＡで同定された遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、白血球細胞に由来したものであり、対象に存在するがん細胞に由来するものではなかったことを示す。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞由来のＤＮＡで同定されなかった場合、無細胞ＤＮＡで同定された遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、対象に存在するがん細胞に由来したものであり、白血球細胞に由来するものではなかったことを示す。遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が対象中のがん細胞に由来するかどうかを判定する目的で、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡを、がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の有無について検査する方法は、本明細書中、概して「白血球細胞に対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞由来のＤＮＡに対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞検証」、及び同様な表現で記載される。
がんに関連した任意の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、本明細書中記載される方法を用いて検証することができる。がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異を有する遺伝子）の例として、制限なく、ＡＢＣＡ７、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＪＵＢＡ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＬＫ、ＡＭＢＲＡ１、ＡＭＥＲ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＫＲＤ４６、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＡＲＬ１５、ＡＲＭＣＸ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＡＤ２、ＡＴＦ１、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ５、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ２、ＡＸＩＮ１、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ９、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ８、ＢＬＭ、ＢＬＶＲＡ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ７、ＢＲＥ、ＢＲＷＤ３、ＢＴＢＤ７、ＢＴＲＣ、Ｃ１１ｏｒｆ７０、Ｃ１２ｏｒｆ５７、Ｃ２ＣＤ５、Ｃ３ｏｒｆ６２、Ｃ８ｏｒｆ３４、ＣＡＭＫＶ、ＣＡＰＧ、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＸ４、ＣＣＡＲ１、ＣＣＤＣ１１７、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＣＣＭ２、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＲ３、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＬＦ１、ＣＥＮＰＢ、ＣＥＰ１２８、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＤＬ１、ＣＨＵＫ、ＣＩＣ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＭＴＲ２、ＣＮＮ２、ＣＮＯＴ１、ＣＮＯＴ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＰＳ４、ＣＯＸ７Ｂ２、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＳＤＥ１、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＤＮＥＰ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＹＬＤ、ＤＡＣＨ１、ＤＣＨＳ１、ＤＣＵＮ１Ｄ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ１６、ＤＩＣＥＲ１、ＤＩＲＣ２、ＤＩＳ３、ＤＩＸＤＣ１、ＤＫＫ２、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＥＲ、ＤＮＭ１Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＩＦ２Ｓ２、ＥＩＦ４Ａ１、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＬＫ４、ＥＭＧ１、ＥＭＲ３、ＥＰ３００、ＥＰＢ４１Ｌ４Ａ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＳ８、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＦＩ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＥＸＯ５、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、Ｆ５、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＴ１、ＦＢＮ２、ＦＢＸＷ７、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＥＶ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＦＮ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＬＮＴＬ５、ＧＡＴＡ３、ＧＧＣＴ、ＧＩＧＹＦ２、ＧＫ２、ＧＬＩＰＲ２、ＧＮＡＳ、ＧＮＰＴＡＢ、ＧＮＲＨＲ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＬＭ１、ＧＯＰＣ、ＧＯＴ２、ＧＰＣ３、ＧＰＳ２、ＧＰＸ７、ＧＲＫ１、ＧＳＥ１、ＧＺＭＡ、ＨＤＡＣ１、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ４、ＨＧＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＭＣＮ１、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＴ８８、ＩＫＺＦ２、ＩＬ２、ＩＮＯ８０Ｃ、ＩＮＰＰ４Ａ、ＩＮＰＰＬ１、ＩＲＦ４、ＩＷＳ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＵＮ、ＫＡＮＳＬ１、ＫＡＴ８、ＫＡＴＮＡＬ１、ＫＢＴＢＤ７、ＫＣＮＭＢ４、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１４６７、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｂ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｅ、ＫＲＡＳ、ＫＲＴ１５、ＬＡＭＴＯＲ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＣＫ、ＬＭＯ２、ＬＰＡＲ２、ＬＹＮ、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ４Ｋ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ６、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ３、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ２３、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＧＡ、ＭＩＴＦ、ＭＫＬＮ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬＴ４、ＭＯＡＰ１、ＭＯＲＣ４、ＭＰＬ、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＨ２、ＭＳＩ１、ＭＴＯＲ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ６、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ６、ＮＡＡ１５、ＮＡＡ２５、ＮＡＰ１Ｌ２、ＮＡＰ１Ｌ４、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＥＫ９、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＦＫＢ２、ＮＩＰＢＬ、ＮＩＴ１、ＮＫＸ３－１、ＮＭＥ４、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＳＤ１、ＮＴＲＫ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＨＦ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＭＬ、ＰＯＬＡ２、ＰＯＴ１、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＰＦ４０Ａ、ＰＳＩＰ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＨ２、ＰＴＭＳ、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＢ１８、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＲＡＰＧＥＦ６、ＲＡＳＡ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ６、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２６、ＲＣ３Ｈ２、ＲＥＬ、ＲＥＲＥ、ＲＥＴ、ＲＦＣ４、ＲＨＥＢ、ＲＨＯＡ、ＲＩＭＳ２、ＲＩＴ１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ４３、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ５、ＲＱＣＤ１、ＲＲＡＳ２、ＲＵＮＸ１、ＲＸＲＡ、ＳＡＲＭ１、ＳＣＡＦ１１、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＥＣ２２Ａ、ＳＥＮＰ３、ＳＥＮＰ８、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＩＮ３Ａ、ＳＫＡＰ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＯ、ＳＮＣＢ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＳ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ９、ＳＰ３、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ２、ＳＳ１８、ＳＴＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３１、ＳＵＦＵ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１Ａ、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＴ２、ＴＥＸ１１、ＴＦＤＰ２、ＴＦＧ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＬＸ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＣＯ２、ＴＭＥＤ１０、ＴＭＥＭ１０７、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＰＯ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＲＣ６Ｂ、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ１、ＴＰＲ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＰ１２、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＴＫ、ＴＴＲ、ＴＵＢＡ３Ｃ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＲ５、ＵＮＣ１３Ｃ、ＵＮＫＬ、ＵＰＰ１、ＵＳＯ１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ６、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、ＶＮ１Ｒ２、ＶＰＳ３３Ｂ、ＷＡＣ、ＷＤＲ３３、ＷＤＲ４７、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＰ１、ＸＰＯ１、ＹＯＤ１、ＺＣ３Ｈ１３、ＺＤＨＨＣ４、ＺＦＨＸ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＧＲＦ１、ＺＭＹＭ３、ＺＭＹＭ４、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ２９２、ＺＮＦ３１８、ＺＮＦ３４５、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ７５０、及び／またはＺＮＦ８００が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象から単離されたまたは得られた白血球細胞ＤＮＡに対して検証可能な、がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異を有する遺伝子）として、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のコドン及び／またはそれらの周囲のスプライス部位を、本明細書中開示される方法により検査することができる。検査可能な腫瘍抑制遺伝子及びがん遺伝子のコドンの例として、制限なく、以下のコドン及び／またはそれらの周囲のスプライス部位のうち１つまたは複数を挙げることができる：ＡＫＴ１の１６～１８番コドン、ＡＰＣの１３０４～１３１１、１４５０～１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１～６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１～５８、７６～８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１～３９、３８～４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６～８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１～３７１、４６４～４７３、４７３～４８３、４９８～５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０～２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９～２０８番コドン、ＨＲＡＳの７～１９番コドン、ＫＲＡＳの７～１４、５７～６５、１４３～１４８番コドン、ＮＲＡＳの３～１５、５４～６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０～９０、３４３～３４８、５４１～５５１、１０３８～１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５～１８７番コドン、ＰＴＥＮの９０～９８、１２５～１３２、１３３～１４６、１４５～１５４番コドン、及びＴＰ５３の１０～２２、２５～３２、３３～４０、４０～５２、５２～６４、８２～９４、９７～１１０、１１２～１２５、１２３～１２５、１２６～１３２、１３２～１４２、１５０～１６３、１６７～１７７、１７５～１８６、１８７～１９５、１９５～２０６、２０７～２１９、２１９～２２４、２２６～２３７、２３２～２４５、２４８～２６１、２６１～２６８、２７２～２８３、２７９～２９０、２９８～３０７、３０７～３１４、３２３～３３１、３３３～３４４、３４４～３５５、３６７～３７５、３７４～３８６番コドン。いくつかの実施形態では、対象から単離されたまたは得られた白血球細胞ＤＮＡに対して検証可能な、がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異を有する遺伝子）として、表１１または表１２において同定される遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の１つまたは複数が挙げられる。白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡの検査は、そのようなＤＮＡの増幅及び／または配列決定を含むことができる（例えば、本明細書中記載される方法のいずれかを用いて、そのような方法として、特に制限なく、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ法が挙げられる）。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳなどの技法の使用により、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡを検査する場合に、対象から得られた無細胞ＤＮＡを検査する場合にその技法が提供するのに相当する利点が得られる。
いくつかの実施形態では、単一遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証する。いくつかの実施形態では、１つより多い遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証する。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、本明細書中記載される方法を用いて、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証するすることができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られた複数の試料を用いて、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証する。例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、対象から単離されたまたは得られた２つの白血球細胞試料からＤＮＡを単離することにより白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証することができる。複数の試料を用いて、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証することにより、検査の感度が向上し、その結果、より正確な診断を導くことができる。
いくつかの実施形態では、追加の診断検査法を用いずに、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可））を検証することにより、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。いくつかの実施形態では、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可））を検証することにより、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。いくつかの実施形態では、そのような追加の診断検査法として、本明細書中記載される診断検査法の１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのような追加の診断検査法として、タンパク質バイオマーカー（例えば、本明細書中開示されるタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数）の検査を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのような追加の診断検査法として、ある特定閾値でのタンパク質バイオマーカー（例えば、本明細書中開示されるタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数）の検査を含むことができる。白血球細胞検証と併用可能なタンパク質バイオマーカーの例として、特に制限なく、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３が挙げられる。本明細書中開示されるそのようなタンパク質バイオマーカーの様々な閾値のどれでも、無細胞ＤＮＡで見つかる遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可））の白血球細胞検証と併用することができる。ある特定のタンパク質バイオマーカーの閾値の限定ではない例として、以下が挙げられる：ＣＡ１９－９（＞９２Ｕ／ｍｌ）、ＣＥＡ（＞７，５０７ｐｇ／ｍｌ）、ＣＡ１２５（＞５７７Ｕ／ｍｌ）、ＡＦＰ（＞２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）、プロラクチン（＞１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（＞８９９ｐｇ／ｍｌ）、ＯＰＮ（＞１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）、ＴＩＭＰ－１（＞１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（＞１，９７０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦ（＞８００ｐｇ／ｍｌ）、及びＣＡ１５－３（＞９８Ｕ／ｍｌ）。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの閾値は、本明細書中記載される例示の閾値より高い（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、またはそれより高い）ことが可能である。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの閾値は、本明細書中記載される例示の閾値より低い（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、またはそれより低い）ことが可能である。ある特定の実施形態において、単一タンパク質バイオマーカーの検査が、無細胞ＤＮＡで見つかった遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可）））の白血球細胞検証と併用される。ある特定の実施形態において、１つより多いタンパク質バイオマーカー（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、またはそれ以上のタンパク質バイオマーカー）の検査が、無細胞ＤＮＡで見つかった遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可）））の白血球細胞検証と併用される。
いくつかの実施形態では、複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカーパネル）が、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳのそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、またはＣＡ１５－３のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、またはＣＡ１５－３のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。
いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、またはＳＭＡＤ４のうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４のそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、またはＳＭＡＤ４のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、特に制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、またはＯＰＮのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。
いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａのそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、特に制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在（例えば、がんの存在に関連した、１つまたは複数の染色体または染色体腕における異数性）についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、異数性の存在は、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、または９ｑの１つまたは複数で検出される可能性がある。
いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、またはＶＨＬのうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬのそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、またはＶＨＬＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、特に制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在（例えば、がんの存在に関連した、１つまたは複数の染色体または染色体腕における異数性）についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、異数性の存在は、染色体腕５ｑ、８ｑ、または９ｐの１つまたは複数で検出される可能性がある。
いくつかの実施形態では、白血球細胞ＤＮＡを単離するまたは得るために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料は、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーを検査するために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料と同一であることが可能である。例えば、試料は、血液試料（例えば、全血）であることが可能であり、この血液試料は、引き続き、血漿画分及び白血球細胞画分に分離される。そのような分離は、例えば、密度勾配遠心により達成することができ、密度勾配遠心では、血漿は、白血球細胞と分離され、白血球細胞は典型的にはバフィーコート中に見られる。そのような分離後、バフィーコート中の白血球細胞由来のＤＮＡを単離及び検査することができ、一方で血漿画分由来の無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカーも、単離及び検査することができる。いくつかの実施形態では、血清画分を得る目的で、血漿画分を凝固させることができる。いくつかの実施形態では、試料は、検査及び／または分画の前及び／または後に、冷凍、冷蔵、またはその他で貯蔵される。いくつかの実施形態では、試料から得られた１つまたは複数の画分を、検査の前及び／または後に、冷凍、冷蔵、またはその他で貯蔵される。
いくつかの実施形態では、白血球細胞ＤＮＡを単離するまたは得るために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料は、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーを検査するために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料と異なるものであることが可能である。例えば、第１の試料を対象から単離するまたは得ることができ、この第１の試料は、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーを検査するために使用される。第１の試料が単離されるまたは得られる前、同時、またはその後、第２の試料を対象から単離するまたは得ることができ、この第２の試料は、無細胞ＤＮＡにおいて同定された１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を検証するため、白血球細胞からＤＮＡを単離するまたは得るために使用される。第２の試料は、本明細書中記載されるとおりに分画することができる（例えば、密度勾配遠心により）。いくつかの実施形態では第１の試料及び／または第２の試料（またはその画分）は、検査及び／または分画の前及び／または後に、冷凍、冷蔵、またはその他で貯蔵することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証され、その遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞から単離されたＤＮＡに存在しないと判定されたら（例えば、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来すると判定されたら）、その対象は、さらなる診断検査またはより詳しいモニタリングを受けることができる（例えば、本明細書中開示される診断検査及び／またはモニタリング法の１つまたは複数を用いて）。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証され、その遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞から単離されたＤＮＡに存在しないと判定されたら（例えば、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来すると判定されたら）、その対象は、治療介入（例えば、本明細書中開示される治療介入の１つまたは複数）を受けることができる。
試料分類
本開示は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー（例えば、全血または血漿中のタンパク質濃度）に基づいて、対象におけるがんの存在を同定する方法を提供する。様々な方法を用いて、対象ががんを有するかどうか及び／または対象ががんを有する可能性を判定することができる。こうした方法には、本明細書中記載される様々な種類の統計技法及び手法が関与し、そのような統計技法及び手法として、例えば、回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、クラスタリングモデル、主成分分析、相関成分分析、最近傍分類器分析、線形判別分析、二次判別分析、サポートベクターマシン、決定木、ランダムフォレスト、遺伝的アルゴリズム、バギングを用いる分類器最適化、ブースティングを用いる分類器最適化、ランダム部分空間法を用いる分類器最適化、射影追跡、ならびに遺伝的プログラミング及び重み付き投票などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、回帰分析を用いて、対象ががんを有するかどうか判定することができる。回帰分析は、タンパク質バイオマーカーパネル、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）パネル、及び／またはタンパク質バイオマーカー及び遺伝子バイオマーカー両方を含むパネルで行うことができる。いくつかの実施形態では、回帰分析は、１つまたは複数の変異（例えば、首位の変異）のΩスコア及び／またはタンパク質バイオマーカーパネルで行われる。
いくつかの実施形態では、回帰分析は、以下の形式を有する数学モデルに基づいて行われる：
Ｖ＝α＋Σβｉｆ（Ｘｉ）
この形のモデルでは、Ｖは、対象ががんを有する尤度スコアを示す値である。いくつかの実施形態では、尤度スコアは、検査対象ががんを有する可能性の指標である。Ｘｉは、各バイオマーカーの値（例えば、Ωスコア、血漿中のタンパク質濃度など）を表す。βｉは、ｆ（Ｘｉ）の係数であり、これは、バイオマーカーの値に対応した変数である。関数ｆ（ｘ）は、ｘに対応した値を与える関数である。いくつかの実施形態では、ｆ（ｘ）＝ｘである。すなわち、この数学モデルは、Ｖ＝α＋ΣβｉＸｉという形式を有することができる。一部のその他の実施形態では、ｆ（ｘ）は、正規化または標準化関数の場合がある。いくつかの実施形態では、この式は、年齢、性別、及び人種分類を考慮するための追加パラメーターを含む場合がある。
いくつかの実施形態では、Ｖは、対象ががんを有する尤度スコアを示す値である。いくつかの実施形態では、Ｖは、実際の確率である（０～１の範囲で変化する数）。他の実施形態において、Ｖは確率を導出することができる値である。
いくつかの実施形態では、数学モデルは、回帰モデル、例えば、ロジスティック回帰モデルまたは線形回帰モデルである。回帰モデルを用いて、様々なバイオマーカーのセットを検定することができる。
線形回帰モデルの場合、モデルを用いて、検定対象の発現データを分析し、及び検定対象の定量的尺度、例えば、対象ががんを有する尤度などを示す結果を提供することができる。
一般に、線形回帰式は、以下のとおり表される
Ｙ＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋．．．＋βｋＸｋ＋ε
Ｙは、従属変数であり、生物学的特徴（例えば、がんを有するまたは有さない尤度）の定量的尺度を示す。従属変数Ｙは、ｋ個の説明変数（バイオマーカーについて測定された特性値）、及び様々な規定されていない省略された因子を包含する誤差項によって決まる。上記で特定されるモデルにおいて、パラメーターβ１は、従属変数Ｙに対する第１の説明変数Ｘ１の効果の大きさを指定する。β２は、Ｙに対する説明変数Ｘ２の効果を指定する。
ロジスティック回帰モデルは、線形回帰を非線形変換したものである。ロジスティック回帰モデルは、「ロジット」モデルと称することが多く、以下のとおり表すことができ、
ｌｎ［ｐ／（１－ｐ）］＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋．．．＋βｋＸｋ＋ε
式中、
αは、定数であり、
εは、誤差項であり、
ｌｎは、自然対数、ｌｏｇ（ｅ）であり、ｅ＝２．７１８２８．．．であり、
ｐは、事象Ｙが起こる確率であり、
ｐ／（１－ｐ）は、「オッズ」であり、
ｌｎ［ｐ／（１－ｐ）］は、ｌｏｇ（オッズ）、すなわち「ロジット」である。
当業者ならわかるだろうが、α及びεは、単一の定数にまとめて、αとして表すことができる。いくつかの実施形態では、単一項αを使用し、εを省略する。「ロジスティック」分布とは、Ｓ字分布関数である。ロジット分布は、推定確率（ｐ）が、０～１になるように制約する。
いくつかの実施形態では、ロジスティック回帰モデルは、以下のとおり表される
Ｙ＝α＋ΣβｉＸｉ
ここで、Ｙは、所定の対象に関するバイオマーカーセットが、対照群（例えば、がんのない対象の群）ではなく、症例群（例えば、がんのある対象の群）に分類されるべきかどうかを示す値（例えば、尤度スコア）である。バイオマーカーセットが、対照群ではなく症例群に分類されるものである確率、すなわち対象ががんを有する確率は、Ｙから導出することができる。スコアが高いほど、対象ががんを有する確率が高い。
Ｘｉは、ｉ番目のバイオマーカーの値である。いくつかの実施形態では、これは、血漿中のタンパク質濃度、性別、年齢、または遺伝的マーカーから導出されたスコア（例えば、Ωスコア）であることが可能である。βｉは、バイオマーカーのロジスティック回帰式係数であり、αは、０になり得るロジスティック回帰式定数であり、βｉ及びαは、症例群及び対照群にロジスティック回帰分析を当てはめた結果である。
いくつかの実施形態では、ロジスティック回帰モデルは、最尤推定法（ＭＬＥ）により当てはめられる。係数（例えば、α、β１、β２、．．．）は、最尤度により決定される。尤度とは、条件付き確率である（例えば、Ｐ（Ｙ｜Ｘ）、すなわち、Ｘが与えられた場合のＹの確率）。尤度関数（Ｌ）は、試料データセットで生じる従属変数の値の特定セット（Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎ）が観察される確率の尺度である。いくつかの実施形態では、これは、Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎを観察する確率の積として表現される：
Ｌ＝Ｐｒｏｂ（Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎ）＝Ｐｒｏｂ（Ｙ１）＊Ｐｒｏｂ（Ｙ２）＊．．．Ｐｒｏｂ（Ｙｎ）
尤度関数が高いほど、試料においてＹが観察される確率が高い。ＭＬＥは、尤度関数のｌｏｇ（ＬＬ＜０）を可能な限り大きくする、または尤度関数のｌｏｇの－２倍（－２ＬＬ）を可能な限り小さくする係数（α、β１、β２、．．．）を見出すことを含む。ＭＬＥでは、パラメーターα、β１、β２、などについていくつかの初期推定値が決定される。次いで、これらのパラメーター推定値を前提としてデータの尤度を計算する。パラメーター推定値を改善し、データの尤度を再計算する。このプロセスを、パラメーター推定値が実質的に不変になるまで繰り返す（例えば、変化が０．０１または０．００１未満）。ロジスティック回帰及びロジスティック回帰モデルの当てはめの例は、Ｈａｓｔｉｅ，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１，ｐｐ．９５－１００に見られる。
ロジスティック回帰式係数及びロジスティック回帰式定数が決定されたら、容易にモデルを検定対象に適用してＹを得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｙを用いて、関数Ｙ＝ｌｎ（ｐ／（１－ｐ））を解くことにより、確率（ｐ）を計算することができる。
いくつかの実施形態では、説明変数を正規化または標準化してから、モデルにあてはめる。標準化係数（またはベータ係数）とは、従属変数及び説明変数の分散が１であるように標準化された回帰分析に由来する推定値である。したがって、標準化係数は、説明変数における標準偏差の増加当たり、従属変数が、標準偏差の何倍変化するかを表す。単変量回帰の場合、標準化係数の絶対値は、相関係数に等しい。係数の標準化は、通常、複数の回帰分析において説明変数のどれが従属変数により大きい効果を有するかを特定するために行われる。いくつかの実施形態では、変数を標準化または正規化してから、ロジスティック回帰モデルに当てはめる。標準化ロジスティック回帰係数（または標準化ベータ係数）とは、標準化された変数でロジスティック回帰分析を行なって得られる推定値である。いくつかの実施形態では、説明変数のみを標準化し、一部のその他の実施形態では、従属変数のみを標準化する。さらに、いくつかの実施形態では、説明変数及び説明変数を、両方とも標準化する。いくつかの実施形態では、標準化回帰係数は、対応する非標準化係数にｓｔｄ（Ｘｉ）／ｓｔｄ（Ｙ）の比を乗じたものに等しく、式中、「ｓｔｄ」は、標準偏差を示す。
いくつかの実施形態では、オメガスコア（例えば、首位の変異のオメガスコア）を、ロジスティック回帰における説明変数として使用することができる。いくつかの実施形態では、ロジスティック回帰は、１つまたは複数の他の説明変数（例えば、タンパク質濃度）を含むことができる。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、選択されたタンパク質バイオマーカーは、がん試料において、正常試料におけるよりも高い中央値を有する。いくつかの実施形態では、変数増加法を用いて、全てのバイオマーカー（遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカーを含む）から、説明変数を選択する。
数学モデルをデータに適用することで、１つまたは複数の分類器を発生させることができる。分類器は、適切なパラメーター（例えば、回帰モデルにおけるβ係数）を有する数学モデルである。これらのパラメーターは、数学モデルを学習データセット、例えば、対照群及びがんを有する対象の群両方を含むデータセットに適用することにより、決定できる。
分類器は、当業者に既知の方法を用いて、その分類器が持つ、データセット（例えば、学習データセットまたは検証データセット）中の各対象を適切に特性決定する能力について評価することができる。様々な統計的基準が使用可能であり、例えば、曲線下面積（ＡＵＣ）、正確な予測のパーセンテージ、感度、及び／または特異性などがある。いくつかの実施形態では、分類器は、交差検証、１つ抜き（Ｌｅａｖｅ Ｏｎｅ ＯＵＴ）交差検証（ＬＯＯＣＶ）、ｎ重交差検証、及びジャックナイフ分析により評価される。いくつかの実施形態では、各分類器は、その分類器が持つ、分類器の発生に使用されなかったデータセット（「検定データセット」）中の対象を適切に特性決定する能力について評価される
いくつかの実施形態では、分類器が有する、データセット中の各対象を適切に特性決定する能力について評価するのに使用される方法は、分類器の感度（真陽性率）及び１－特異性（真陰性率）を評価する方法である。いくつかの実施形態では、分類子を検定するのに使用される方法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）であり、これは、複数のパラメーターを提供して、発生した方程式の結果の感度及び特異性を両方とも評価する。いくつかの実施形態では、ＲＯＣ面積（曲線下面積）を用いて、方程式を評価する。０．５、０．６、０．７、０．８、０．９より大きいＲＯＣ面積が好ましい。１．０という完全なＲＯＣ面積スコアは、１００％の感度及び１００％の特異性両方を示す。いくつかの実施形態では、分類器は、評価スコアに基づいて選択される。いくつかの実施形態では、使用される評価採点システムは、ＲＯＣ曲線の曲線下面積により決定される受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線スコアである。いくつかの実施形態では、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７、０．６５、０．６、０．５５、または０．５を超えるスコアを有する分類器が選択される。分類器の使用に特異性が重要である実施形態のいくつかにおいて、感度閾値を設定することができ、特異性に基づいてランクづけされた分類器が選択される。例えば、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、または０．４５を超える特異性でカットオフされた分類器が選択可能である。同様に、特異性閾値を設定することができ、感度に基づいて（例えば、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７、０．６５、０．６、０．５５０．５、または０．４５超）ランクづけされた分類器が選択可能である。このように、いくつかの実施形態では、上位１０の分類器、上位２０の分類器、または上位１００の分類器のみが選択される。ＲＯＣ曲線は、様々な統計的手段により計算することができ、そのような手段として、統計分析システム（ＳＡＳ（登録商標））、Ｒ、及びＣＯＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）統計分析ソフトウェアが挙げられるが、これらに限定されない。
当業者には当然のことと思われるが、数学モデルにより決定された組み合わせ及び分類器の有用性は、モデルに入力するためのデータを発生させるのに使用した集団のいくつかの特性（例えば、人種、年齢集団、性別、病歴）に左右されることになる。個別に同定されたバイオマーカーまたは個別に同定された遺伝子のサブセットを選択することができ、選択されたバイオマーカーの全ての可能な組み合わせを検定して、有用なバイオマーカーセットの組み合わせを同定することができる。
いくつかの実施形態では、対象の尤度スコア（例えば、ロジスティック回帰におけるＹ値）を用いて、対象ががんを有する可能性が高いかどうかを判定することができる。したがって、尤度スコアがあらかじめ定められた参照閾値より高ければ、その対象はがんを有する可能性が高い。いくつかの実施形態では、尤度スコアが参照閾値より低ければ、対象は、がんを有する可能性は高くない。当業者ならわかるだろうが、各分類器に対する適切な参照閾値は異なる可能性があり、様々な統計学的尺度（例えば、感度、特異性、正確な予測のパーセンテージ）に合わせて最適化することができる。いくつかの実施形態では、参照閾値は、実験により、または臨床試験において決定される。
いくつかの実施形態では、所定の目的を満たす複数の分類器が作成される（例えば、全てが十分なＡＵＣ及び／または感度及び／または特異性を有する）。いくつかの実施形態では、１つより多い分類器を利用する式を生成させる。例えば、分類器を順次に利用する式を生成させることができる。分類器の他の可能な組み合わせ及び重み付けも理解の範疇にあり、本明細書に包含される。
いくつかの実施形態では、対象ががんを有する確率は、尤度スコアから導出することができる。すなわち、確率が、あらかじめ定められた参照閾値、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９より高い場合、対象は、がん治療を実施されることになる。いくつかの実施形態では、確率が、あらかじめ定められた参照閾値、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９より低い場合、対象は、がん治療を実施されないことになる。いくつかの実施形態では、治療するためのあらかじめ定められた閾値は、０．４、０．５、または０．６であり、治療しないとする、もしくは治療を中止するためのあらかじめ定められた閾値は、０．４、０．５、または０．６である。いくつかの実施形態では、あらかじめ定められた閾値は、実験により、または臨床試験において決定される。
当業者なら同じくわかるだろうが、方法の感度及び特異性は、参照閾値（すなわちカットオフ点）に左右される。参照閾値を上げた場合、感度は低下することになるが、特異性は上昇することになる。いくつかの実施形態では、参照閾値は、感度、特異性、または正確な予測のパーセンテージに合わせて最適化することができる。
組織の起源の判定
本開示は、がんの種類、またはがん細胞もしくは腫瘍細胞の起源を判定する方法を提供する。数理モデルは、本明細書に記載の様々なバイオマーカーに適用可能である（例えば、様々なバイオマーカーのタンパク質濃度、様々なバイオマーカーの遺伝子変異）。
本開示に基づいた有用な数理モデルには、教師あり学習法と教師なし学習法の両方を使用するものが含まれる。いくつかの実施形態では、選択された数理モデルは、教師あり学習をトレーニングデータセットと組み合わせて使用し、可能性のあるバイオマーカーの各組み合わせを評価する。様々な数理モデルが使用可能であり、例えば、回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、クラスタリングモデル、主成分分析、相関成分分析、最近傍分類器分析、線形判別分析、二次判別分析、サポートベクターマシン、決定木、ランダムフォレスト、遺伝的アルゴリズム、バギングを用いる分類器最適化、ブースティングを用いる分類器最適化、ランダム部分空間法を用いる分類器最適化、射影追跡、ならびに遺伝的プログラミング及び重み付き投票などである。
いくつかの実施形態では、教師あり学習モデルを使用して、がん細胞または腫瘍細胞の起源を判定する。教師あり学習モデルとは、入出力ペアの例に基づいて、入力を出力にマッピングする関数を学習するモデルを指す。トレーニング例のセットで構成されるラベル付きのトレーニングデータから関数を推測することができる。教師あり学習では、各例は、入力オブジェクト（通常はベクター、例えばタンパク質バイオマーカーのベクター）及び目的の出力値（教師信号とも呼ばれる、例えばがんの種類または組織の起源）で構成されるペアである。教師あり学習アルゴリズムは、トレーニングデータを分析し、推定関数（これは試験対象から得られたバイオマーカーのマッピングに使用可能である）を作成する。多くの教師あり機械学習法が使用可能である。本方法としては、サポートベクターマシン、回帰分析、線形回帰、ロジスティック回帰、単純ベイズ、線形判別分析、決定木、ｋ最近傍アルゴリズム、ニューラルネットワーク（例えば、多層パーセプトロン）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、教師なし学習モデルを使用して、がん細胞または腫瘍細胞の起源を判定する。教師なし機械学習とは、「ラベル付けされていない」データ（つまり、分類または類別されていないデータ）の構造を記述する関数を推定する機械学習タスクを指す。これは、試料が同じ起源であれば、関連するバイオマーカーの類似性がより高いという仮定の下で実施される。教師なし機械学習は、これらの共通の特性を同定して、これらのモデルを試験対象から得られたバイオマーカーに適用することができ、これにより、対象におけるがん細胞または腫瘍細胞の起源を判定する。多くの教師なし機械学習方法が使用可能である。本方法としては、クラスタリング（例えば、ｋ平均クラスタリング、混合モデルクラスタリング、及び階層的クラスタリングなど）、異常検知、教師なしニューラルネットワーク（例えば、オートエンコーダー、ディープビリーフネット、ヘブ学習則、敵対的生成ネットワーク、及び自己組織化マップなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ランダムフォレストが使用される。ランダムフォレストは、分類、回帰、及び他のタスクの学習方法を指し、トレーニング時に多数の決定木を構築し、個々の木のクラス（分類）または平均予測（回帰）のモードであるクラスを出力することにより動作する。Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔは、例えば、Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔパッケージ（Ｌｉａｗ，Ａｎｄｙ，ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗ Ｗｉｅｎｅｒ．”Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ．”Ｒ ｎｅｗｓ ２．３（２００２）：１８－２２）などの様々なプログラムによって実施することができる。いくつかの実施形態では、ランダムフォレストは、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー（例えば、全血または血漿中のタンパク質濃度）に基づいて、対象のがんの存在を同定する。いくつかの実施形態では、１０回以上の１０分割交差検証を実施可能である。
いくつかの実施形態では、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して、組織の起源を判定することができる。ＳＶＭはトレーニング例のセットによって始まり、それぞれが２つのカテゴリ（がんの種類など）のいずれかに属するとマークされる。ＳＶＭトレーニングアルゴリズムは、新しい例を１つのカテゴリまたは他のカテゴリに割り当てるモデルを構築し、非確率的なバイナリ線形分類器（特定の起源のがん、及び特定の起源からではないがんなど）にする。ＳＶＭモデルは、空間内にポイントとして打たれた例を表したものであり、別々のカテゴリの例ができるだけ広い明確なギャップで区別されるようにマッピングする。
これらの数理モデルは、がん細胞の起源を判定するために、本明細書に記載されるように、様々なバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネル（例えば、タンパク質バイオマーカー）に適用可能である。いくつかの実施形態では、これらの方法は、がんを有すると予測された対象にのみ適用される。
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定された、またはがんを有する可能性があると判定された場合、図６８に示すようにがんの組織の起源を判定する。例えば、図６８に示すツリーの各ブランチで判定を行うことができ、末端に到達すると（例えば、これ以上判定を行うことができない）、起源の組織は、図のように予測または判定され得る。図６８に示すツリーは、実務者が、がん（乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、及び胃腸癌など）の組織の起源を予測または判定するためのフレームワークを提供する。
図６８に示されているツリーは例示であり、非限定的である。例えば、いくつかの決定点で、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）を判定することができ（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）、そのタンパク質バイオマーカー（複数可）のレベルは、図６８に示すツリー上に示されるレベルと比較することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）が判定され、そのタンパク質バイオマーカーのレベルは、図６８に示すツリー上に示されるレベルとは異なるレベルと比較される。いくつかの実施形態では、図６８に示すツリー上のタンパク質バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）の異なるレベルは、図６８に示すツリー上に１つまたは複数の決定点で示されるそのタンパク質バイオマーカーのレベルとは、約１０％異なる（例えば、約１０％より大きい、または１０％より小さい）、約１５％異なる（例えば、約１５％より大きい、または１５％より小さい）、約２０％異なる（例えば、約２０％より大きい、または２０％より小さい）、約２５％異なる（例えば、約２５％より大きい、または２５％より小さい）、約３０％異なる（例えば、約３０％より大きい、または３０％より小さい）、約３５％異なる（例えば、約３５％より大きい、または３５％より小さい）、約４０％異なる（例えば、約４０％より大きい、または４０％より小さい）、約４５％異なる（例えば、約４５％より大きい、または４５％より小さい）、約５０％異なる（例えば、約５０％より大きい、または５０％より小さい）。いくつかの決定点で、対象の性別（例えば、生物学的性別）が判定され、図６８に示すツリー上に示される１つまたは複数の決定点で性別を比較する。いくつかの決定点で、対象は女性であると判定することができる。いくつかの決定点で、対象は男性であると判定することができる。
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定された、またはがんを有する可能性があると判定された場合、図６９及び以下の表に示す法則のリストにしたがって、がんの組織の起源を判定する。例えば、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）を判定することができ（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）、そのタンパク質バイオマーカー（複数可）のレベルは、図６９及び以下の表に示す規則に示されるレベルと比較することができる。１つの非限定的な例として、規則［条件＝ＣＡ１２５＞１０２．７６＆ｓＦａｓ＜＝８３０．３４５＆ｇｅｎｄｅｒ％ｉｎ％ ｃ（’Ｆ’）、予測＝卵巣］は、女性（％ｉｎ％ ｃ（’Ｆ’））が、ＣＡ１２５＞１０２．７６及びｓＦａｓ＜＝８３０．３４５を有する場合、当該女性は卵巣癌を有するか、卵巣癌を有すると予測されることを意味する。当業者は、対象における１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出し、及び／または対象の性別（例えば、生物学的性別）を判定し、対象が図６９に列挙されている種類のがんを有するか、または有する可能性が高いことを判定することができる。いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定された、またはがんを有する可能性があると判定された場合、がんの組織の起源は、対象における１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベル及び／または対象の性別（例えば、生物学的性別）が図６９及び以下の表に示す特定の規則のいずれにも従わない場合、結腸直腸癌であると判定される。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）が判定され、そのタンパク質バイオマーカーのレベルが、図６９及び以下の表に示す規則に示されるレベルとは異なるレベルと比較される。いくつかの実施形態では、図６９に示す規則のタンパク質バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）の異なるレベルは、図６９及び以下の表に示す規則の１つまたは複数の決定点で示されるそのタンパク質バイオマーカーのレベルとは、約１０％異なる（例えば、約１０％より大きい、または１０％より小さい）、約１５％異なる（例えば、約１５％より大きい、または１５％より小さい）、約２０％異なる（例えば、約２０％より大きい、または２０％より小さい）、約２５％異なる（例えば、約２５％より大きい、または２５％より小さい）、約３０％異なる（例えば、約３０％より大きい、または３０％より小さい）、約３５％異なる（例えば、約３５％より大きい、または３５％より小さい）、約４０％異なる（例えば、約４０％より大きい、または４０％より小さい）、約４５％異なる（例えば、約４５％より大きい、または４５％より小さい）、約５０％異なる（例えば、約５０％より大きい、または５０％より小さい）。いくつかの実施形態では、対象の性別（例えば、生物学的性別）が判定され、図６９及び以下の表に示す１つまたは複数の規則における性別と比較される。いくつかの実施形態では、対象は女性であると判定することができる（例えば、「ｇｅｎｄｅｒ ％ｉｎ％ ｃ（’Ｆ’）」）。いくつかの実施形態では、対象は男性であると判定することができる（例えば、「ｇｅｎｄｅｒ ％ｉｎ％ ｃ（’Ｍ’）」）。以下の表では、例示的かつ非限定的な規則及びがんの種類の予測が示される。「その他」は、他の例示的な規則のいずれも満たされない場合、がんが結腸直腸癌であると予測できることを示す。
Figure 2023075090000001
図６８及び図６９及び上記の表における特定のタンパク質バイオマーカーの単位が以下の記号表に示される。

Figure 2023075090000002

遺伝子バイオマーカーの検出
様々な手法のいずれかを使用して、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができる。そのような技術の非限定的な例としては、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、ＰＣＲベースのシングルプレックスＰＣＲアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、ライゲーションアッセイ、及びマイクロアレイアッセイが挙げられる。当業者であれば、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出するための他の適切な手法を知っているであろう。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、エラー削減手法により超並列シークエンシング機器の感度を向上させることができる方法を使用して検出される。例えば、そのような技術により、１００～１，０００，０００の野生型鋳型（例えば、５００～１，０００，０００の野生型鋳型）の中から１つの変異鋳型の範囲で、まれな変異アレルの検出が可能になる。いくつかの実施形態では、そのような技術により、まれな変異アレルが、鋳型の総数の低い割合として存在する場合（例えば、まれな変異アレルが、全鋳型の約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、約０．００１％未満、約０．００００１％未満、もしくはそれ以下の割合、またはこれらの例示的な割合の間の任意の割合で存在する場合）、その検出が可能になる。いくつかの実施形態では、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、ＤＮＡ（例えば、試料中の細胞から得られたＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ）を増幅してアンプリコンのファミリーを形成することによって検出される（ファミリーの各メンバーは無細胞ＤＮＡの単一の鋳型分子に由来し、ファミリーの各メンバーは共通のオリゴヌクレオチドバーコードでマークされ、各ファミリーは異なるオリゴヌクレオチドバーコードでマークされる）。例えば、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、各鋳型分子に固有識別子（ＵＩＤ）を分子的に割り当て、固有にタグ付けした各鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製し、増幅産物を重複してシークエンシングすることにより検出することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを集合的に含むプライマーの集団によって増幅するステップにより、鋳型分子に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは鋳型分子に内因性であり、ＤＮＡ合成プライミング部位を含むアダプターは、オリゴヌクレオチドバーコードに隣接する鋳型分子の末端にライゲートされる。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｉｎｄｅ Ｉ，Ｗｕ Ｊ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ，Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（２０１１）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、シークエンシング技術（例えば、次世代シークエンシング技術）を使用して検出される。様々なシークエンシング技術が当技術分野において既知である。例えば、無細胞ＤＮＡ中の循環腫瘍ＤＮＡの検出及び特性評価のための様々な技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＨａｂｅｒ ａｎｄ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．，Ｊｕｎ；４（６）：６５０－６１．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－１３－１０１４，２０１４に記載される。そのような技術の非限定的な例としては、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｆｅＳｅｑｓ（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ．ａｌ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１０８，９５３０－５，２０１１）、ＯｎＴａｒｇｅｔ（Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ；４：１３６ｒａ６８，２０１２）、及びＴａｍＳｅｑ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｎｎｏｗｉｎｇ ＤＮＡ ｆｏｒ ｒａｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，７：ｅ３１５９７，２０１２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の変異の存在は、変異検出の感度が高いことが知られているドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の変異の存在は、他のシークエンシング技術を用いて検出され、そのような技術には、これらに限定されないが、チェーンターミネーション技術、ショットガン技術、合成によるシークエンシング法、マイクロ流体技術を利用する方法、他の捕捉技術、または試料中の少量のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ試料中のｃｔＤＮＡ）の検出に有用な当技術分野で既知の他のシークエンシング技法のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、アレイベースの方法を使用して検出される。例えば、無細胞ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出するステップは、ＤＮＡマイクロアレイを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイは、複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞の変異）の１つまたは複数を検出可能である。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を検出する前に増幅される。本明細書に記載の方法のいずれかで使用可能なアレイベースの方法の非限定的な例には、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）マイクロアレイ（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ Ｓｃｉ．４（１）：２１－２６；Ｌａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１２：７１－９８；Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：２６８０－２６８８；Ａｌｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７－４６０）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２７（３）：３９２－４０４；Ｌｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（７）：ｅ６２２９）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）クローンチップ（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４（１）：１８８－１９６；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１５（１２）：１８３１－１８３７）、一塩基多型（ＳＮＰ）マイクロアレイ（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８（４）：２１９－２２８；Ｊａｓｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（２）：ｅ３１９６８）、マイクロアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ（アレイＣＧＨ）（Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｎｅｄｅｒｌｏｆ（２００６）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８（３）：２１０；Ｐｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：Ｓ１１－Ｓ１７；Ｍｉｃｈｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．９：５７４－５８４）、分子反転プローブ（ＭＩＰ）アッセイ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ ２０５（７－８）：３４１－５５；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：７１２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ｉｒｉｚａｒｒｙ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：ｅ１５；Ｄａｌｍａ－Ｗｅｉｓｚｈａｕｓｚ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４１０：３－２８）、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎマイクロアレイ（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６（９）：２９２６－２９３８；Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：９０３－９０５）、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（４）：３４２－３４７）、またはＢｅａｄＡｒｒａｙアレイ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ９２：５９６－６０１）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、ＤＮＡタイリングアレイである（Ｍｏｃｋｌｅｒ ａｎｄ Ｅｃｋｅｒ（２００５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８５（１）：１－１５；Ｂｅｒｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １６（２）：２７１－２８１）。他の好適なアレイベースの方法は、当該分野で既知である。
いくつかの実施形態では、対象ががん（例えば、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、またはＵＴＵＣ）を有すると判定された場合、対象は追加でモニタリングされ得る、またはモニタリングの強化のために選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、従来技術が対象を早期がんと診断することができる期間の前の時点において、モニタリングを強化する対象を選択するために使用することができる。例えば、モニタリングを強化するための対象を選択するために本明細書で提供される方法は、対象が従来の方法によってがんと診断されていない場合、及び／または対象ががんに罹患することが知られていない場合に使用することができる。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象は、モニタリングの強化のために選択されていない対象と比較して、頻度を増やして診断検査（例えば、本明細書に開示された診断検査のいずれか）を受けることができる。例えば、モニタリングの強化のために選択された対象は、１日２回、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、四半期、半年ごと、毎年、または任意の頻度で診断検査を受けることができる。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象は、モニタリングの強化のために選択されていない対象と比較して、１つまたは複数のさらなる診断検査を受けることができる。例えば、モニタリングの強化のために選択された対象は２つの診断検査を受けることができるが、モニタリングの強化のために選択されていない対象は１つの診断検査のみを受ける（または診断検査は実施しない）。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されることも可能である。がん細胞の存在が同定される場合（例えば、本明細書に開示されている様々な方法のいずれかによって）、対象は、強化したモニタリング（例えば、対象の腫瘍またはがんの進行を評価する、及び／またはさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を有する腫瘍のサイズ及び／または正確な位置を判定するため）の両方を受けることが有益であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性が検出された後、モニタリングの強化のために選択された対象は治療的介入を受ける。本明細書に開示されているか、または当技術分野で既知の治療的介入のいずれかを受けることができる。例えば、モニタリングの強化のために選択された対象は、さらにモニタリングされることができ、強化したモニタリング期間にわたって、がん細胞の存在が維持される場合、治療的介入を受けることができる。これに加えてまたはこれに代えて、モニタリングの強化のために選択された対象は、治療的介入を受けることができ、治療的介入が進むにつれてさらにモニタリングされることができる。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象が治療的介入を受けた後、モニタリングの強化により、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異）及び／または異数性が明らかとなる。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異）及び／または異数性は、異なる治療介入を受ける要因となる（例えば、治療介入中にがん細胞に耐性変異が生じる可能性があり、その耐性変異を有するがん細胞は、元の治療的介入に対して耐性である）。
いくつかの実施形態では、対象ががん（例えば、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、またはＵＴＵＣ）を有すると判定された場合、対象は、さらなる検査を受け得る、またはさらなる診断検査のために選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、従来技術が対象を早期がんと診断することができる期間の前の時点において、さらなる診断検査のための対象を選択するために使用することができる。例えば、さらなる診断検査のための対象を選択するために本明細書で提供される方法は、対象が従来の方法によってがんと診断されていない場合、及び／または対象ががんに罹患することが知られていない場合に使用することができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されていない対象と比較して、頻度を増やして診断検査（例えば、本明細書に開示された診断検査のいずれか）を受けることができる。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は、１日２回、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、四半期、半年ごと、毎年、または任意の頻度で診断検査を受けることができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されていない対象と比較して１つまたは複数のさらなる診断検査を受けることができる。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は２つの診断検査を受けることができるが、さらなる診断検査のために選択されていない対象は１つの診断検査のみを受ける（または診断検査は実施しない）。いくつかの実施形態では、診断検査法では、初期に検出されたがんと同じ種類のがんの存在を判定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、診断検査法では、初期に検出されたがんと異なる種類のがんの存在を判定することができる。いくつかの実施形態では、診断検査法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャンである。いくつかの実施形態では、診断検査法は、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自家蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、婦人科内診、ポジトロン断層撮影法、及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャンなどの理学的検査である。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、モニタリングの強化のために選択することも可能である。がん細胞の存在が同定される場合（例えば、本明細書に開示されている様々な方法のいずれかによって）、対象は、強化したモニタリング（例えば、対象の腫瘍またはがんの進行を評価する、及び／またはさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、さらなるがん細胞変異）及び／または異数性の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を有する腫瘍のサイズ及び／または正確な位置を判定するため）の両方を受けることが有益であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性が検出された後、さらなる診断検査のために選択された対象は治療的介入を受ける。本明細書に開示されているか、または当技術分野で既知の治療的介入のいずれかを受けることができる。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査を受けることができ、がん細胞の存在が確認される場合、治療的介入を受けることができる。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査のために選択された対象は、治療的介入を受けることができ、治療的介入が進むにつれて、さらにモニタリングされることができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象が治療的介入を受けた後、さらなる診断検査により、１つまたは複数のさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性が明らかとなる。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数のさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性は、異なる治療介入を受ける要因となる（例えば、治療介入中にがん細胞に耐性変異が生じる可能性があり、その耐性変異を有するがん細胞は、元の治療的介入に対して耐性である）。
いくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号第ＷＯ２０１７／１３２４３８号に記載の様々なボトルネックシークエンシングシステム方法のいずれかを使用して検出される。ボトルネックシークエンシングシステム（ＢｏｔＳｅｑＳ）は、ミトコンドリア及び核のゲノム全体にわたってまれな体細胞点変異を同時に定量化する次世代のシークエンシング方法である。ＢｏｔＳｅｑＳは、ライブラリ増幅の直前に、分子バーコーディングと単純な希釈ステップを組み合わせている。ＢｏｔＳｅｑＳを使用して、まれな変異の年齢及び組織依存性の蓄積を示すことができ、正常組織の体細胞変異負荷が生物学的及び環境的要因に応じて数桁変動する可能性があることを実証することができる。ＢｏｔＳｅｑＳは、正常組織のミトコンドリア及び核のゲノムの変異パターン間の大きな違いを示すために使用される。ＢｏｔＳｅｑＳにより、正常組織の変異スペクトルが、互いに異なっていたが、それらに生じたがんのスペクトルに類似していることが示された。
ＢｏｔＳｅｑＳのいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡの配列を得るための方法が提供される。アダプターは、ＤＮＡ集団のランダムフラグメントの末端にライゲートされてアダプターライゲートフラグメントのライブラリを形成し、これにより、アダプターライゲートフラグメントのライブラリ内のフラグメントの増幅時にフラグメントの各末端が明確な末端を持つようになる。アダプターライゲートフラグメントのライブラリを希釈して、希釈したアダプターライゲートフラグメントを形成する。希釈したアダプターライゲートフラグメントの少なくとも一部を増幅し、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖からファミリーを形成する。ファミリーメンバーをシークエンシングしてアダプターライゲートフラグメントの複数のファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。
ＢｏｔＳｅｑＳのいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡをシークエンシングする方法が提供される。アダプターは、断片化された二本鎖ＤＮＡ分子の集団の末端にライゲートされてアダプターライゲートフラグメントのライブラリを形成し、これにより、アダプターライゲートフラグメントのライブラリ内のフラグメントの増幅時にフラグメントの各末端が明確な末端を持つようになる。アダプターライゲートフラグメントのライブラリを希釈して、希釈したアダプターライゲートフラグメントを形成する。希釈したアダプターライゲートフラグメントの少なくとも一部を増幅し、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖からファミリーを形成する。ファミリーメンバーをシークエンシングしてアダプターライゲートフラグメントの複数のファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。第１のファミリーのメンバーのヌクレオチド配列は、参照配列にアラインメントされる。第１のファミリーのメンバーと参照配列の差が同定される。この差は、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖の反対の鎖の第２のファミリーにおいて見つかった場合、潜在的でまれな変異または潜在的で非クローン性変異として同定される。
ＢｏｔＳｅｑＳのいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡをシークエンシングする方法が提供される。試料に由来する二本鎖ＤＮＡ集団をランダムに断片化し、フラグメントのライブラリを形成する。アダプターは、フラグメントの末端にライゲートされてアダプターライゲートフラグメントのライブラリを形成し、これにより、アダプターライゲートフラグメントのライブラリ内のフラグメントの増幅時にフラグメントの各末端が明確な末端を持つようになる。アダプターライゲートフラグメントのライブラリを希釈して、希釈したアダプターライゲートフラグメントを形成する。希釈したアダプターライゲートフラグメントの少なくとも一部を増幅し、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖からファミリーを形成する。ファミリーメンバーをシークエンシングしてアダプターライゲートフラグメントの複数のファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。第１のファミリーのメンバーのヌクレオチド配列は、参照配列にアラインメントされる。第１のファミリーのメンバーと参照配列の差が同定される。この差は、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖の反対の鎖の第２のファミリーにおいて見つかった場合、潜在的でまれな変異または潜在的で非クローン性変異として同定される。
対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出するいくつかの実施形態では、まれな体細胞点変異は、ミトコンドリア及び核ゲノム全体にわたって定量化される。そのような方法の１つまたは複数の実施形態は、非公式にはＢｏｔＳｅｑＳと呼ばれ、これはボトルネックシークエンシングシステムの略である。ライブラリ増幅の直前に、分子バーコーディング（外因性または内因性）及び単純な希釈ステップを使用して、該方法は、例えば、正常組織の年齢または組織型に基づいて変異負荷を判定することを可能にする。本明細書に記載される様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法を使用して、変異原、及び変異率に対する環境障害の影響を示すことができる。本明細書に記載される様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法は、分子的にバーコード化されたライブラリ内のまれな点変異を完全に公平な方法で正確に検出するように設計される。
ＢｏｔＳｅｑＳは、例えば、Ｋｉｎｄｅ，Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０８，９５３０－９５３５（２０１１）に記載の内因性位置画定バーコード、及び外因的に追加された一致バーコード（Ｋｉｎｄｅ，Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０８，９５３０－９５３５（２０１１）；Ｊａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃｕｒａｔｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ－１ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ ａ Ｐｒｉｍｅｒ ＩＤ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０８，２０１６６－２０１７１（２０１１）；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９，１４５０８－１４５１３（２０１２）；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ，ｈｉｇｈ－ａｃｃｕｒａｃｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３，８４３－８５４（２０１３）；Ｋｉｖｉｏｊａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ９，７２－７４（２０１２）；Ｋｉｎｄｅ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｔｅｓｔ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，１６７ｒａｌ６４（２０１３）；Ｋｕｍａｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｐａｔｉａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｆｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ １５，５３０（２０１４）；Ｋｅｙｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｅｒ ＩＤ Ｉｎｆｏｒｍｓ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＨＩＶ－１ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｃｏｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ３１，６５８－６６８（２０１５））など、任意の分子バーコーディング戦略で使用可能であった。いくつかの実施形態では、ＢｏｔＳｅｑＳは、完全に公平な方法でゲノム全体で非常にまれな変異を測定するが、ＳａｆｅＳｅｑＳは、事前定義された標的遺伝子座における比較的頻繁ではあるが非クローン性変異（つまり「サブクローン」）を測定する。
概念的には、ＢｏｔＳｅｑＳは、低カバレッジのランダムにサンプリングされたゲノム遺伝子座を得るものと想定され得るが、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳは、超高カバレッジの標的遺伝子座を処理する。
本明細書に記載の様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法の特徴として見ることができる低いゲノムカバレッジは、まれな変異がそのゲノム位置でシグナルの大部分を構成し、方法の感度に寄与することを可能にする。そのような方法の用途は様々である。それらは非常にまれな体細胞変異の測定に使用することができる。それらは、体細胞モザイク、細胞系列の発達、老化に関する理論、環境発がん物質への曝露、及びがんリスクの評価に使用することができる。これらの用途の多くは、本明細書の実施例で実証されている。
様々なＢｏｔＳｅｑＳシークエンシング方法で生成されたデータに様々なフィルターが適用可能である。適用可能なフィルターの１つは、ｍｔＤＮＡのみ、Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋ複製ファミリーのみであり、高頻度の変異を含む鋳型（つまり、鋳型あたり１つより多くの変異のホモポリマー）、及びｒｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒにマッピングされる鋳型を除外する。適用可能な別のフィルターは、核のＤＮＡのみ、Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋ複製ファミリーのみであり、高頻度の変異を含む鋳型（つまり、鋳型あたり１つより多くの変異のホモポリマー）、及び反復ＤＮＡまたは構造変異型にマッピングされる鋳型を除外する。適用できる別のフィルターは、ｍｔＤＮＡのみ、一塩基置換のみ、３０以上の平均品質スコア、Ｒｅａｄ１＞＝２ ９０％以上の変異率のみを持つＷａｔｓｏｎ複製、Ｒｅａｄ２＞＝２ ９０％以上の変異率のみを持つＣｒｉｃｋ複製、ＷＧＳでコールされる全変異型を除外、ｄｂＳＮＰ１４２の全変異型を除外、ｒｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒにマッピングされるコールを除外、視覚的アーティファクト及び高頻度の変異（つまり、サイクル６及び７、鋳型あたり１つより多くの変化、変化あたり１つより多くの鋳型のホモポリマー）を除外、である。適用できるさらに別のフィルターは、核ＤＮＡのみ、一塩基置換のみ、３０以上の平均品質スコア、Ｒｅａｄ１＞＝２ ９０％以上の変異率のみを持つＰＣＲ複製、Ｒｅａｄ２＞＝２ ９０％以上の変異率のみを持つＰＣＲ複製、ＷＧＳでコールされる全変異型を除外、ｄｂＳＮＰ１３０及びｄｂＳＮＰ１４２の全変異型を除外、反復ＤＮＡまたは構造変異型にマッピングされるコールを除外、視覚的アーティファクト及び高頻度の変異（つまり、サイクル６及び７、鋳型あたり１つより多くの変化のホモポリマー）を除外、である。
様々なデータベースを使用して、ｄｂＳＮＰ ｂｕｉｌｄ １３０、Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ、Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔｓ、Ｓｉｍｐｌｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ、Ｒｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒ、ｄｂＳＮＰ ｂｕｉｌｄ １４２、最新のＤａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ、最新のＤａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ、最新のＳｅｇｍｅｎｔａｌ Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、最新のＦｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔｓ、最新のＳｉｍｐｌｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ、最新のＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒを含むデータをアラインメント及びフィルタリングした。ＵＳＣＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＢｒｏｗｓｅｒのＧＲＣｈ３７／ｈｇｌ９ゲノムアセンブリを使用した。
二本鎖ＤＮＡのフラグメントは、酵素消化、超音波処理、及びせん断を含むがこれらに限定されない当該分野で既知の任意の技術を使用して、より長い鎖のポリマーから作製することができる。あるいは、一部の供給源のＤＮＡはすでに適切なサイズで断片化されている。このような供給源には、唾液、喀痰、尿、血漿、及び便が含まれるが、これらに限定されない。その供給源のＤＮＡがすでに適切なサイズである場合、その後、フラグメントをさらに断片化する必要はない。望ましくは、断片化プロセスは、内因性であろうとヒトの操作であろうとランダムである。フラグメントの望ましいサイズは、シークエンシングリードの長さに依存し得る。フラグメントは、２ｋｂｐ未満、１５００ｂｐ未満、１ｋｂｐ未満、５００ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、または１００ｂｐ未満であり得る。フラグメントは、例えば、リード長の２倍よりも長いことが望ましい場合がある。フラグメントは、例えば、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐであり得る。
いくつかの実施形態では、フラグメントはアダプターにライゲートされる。いくつかの実施形態では、フラグメントの各末端には異なるアダプターを有する。これは困難なプロセスになり得、両端に２つの異なるアダプターを有するフラグメントを得るために多くのスクリーニング及びプロセシングを必要とする場合がある。この目標を達成するための１つの方法は、Ｗａｔｓｏｎ鎖及びＣｒｉｃｋ鎖に対する非相補配列の配列を含むか、または含むようにプロセシングすることができるＹ、Ｕ、またはヘアピン型アダプターを使用することである。アダプター内に非相補的な領域がある場合、アダプターライゲートフラグメントの増幅は、増幅時に各鎖に由来するフラグメント上で異なるアダプター配向を有する二本鎖フラグメントを生成する。
アダプターライゲートフラグメントのライブラリの希釈は、供給源に適した任意のレベルの希釈を使用して実施することができる。低濃縮度の試料ほど希釈が少なく、高濃縮度の試料ほどより希釈される。試料の複合性も望ましい希釈度に影響する。例えば、２倍希釈、５倍希釈、１０倍希釈など、任意の希釈系列を所望により使用してよい。いくつかの実施形態では、アダプターライゲートフラグメントあたり約５～１０のファミリーメンバーが得られる希釈レベルが選択される。これは、シークエンシングされるフラグメント数に影響される。例えば、ある特定の希釈では、２，０００万クラスターをシークエンシングすると１～４のメンバーが得られるが、７，５００万のクラスターをシークエンシングすると５～１０得られる（図５５を参照）。シークエンシングされる分子が多いほど、ファミリーあたりの見つかるメンバーの数が多くなる。希釈されたアダプターライゲートフラグメントに由来するファミリーメンバーをシークエンシングすると、望ましくは、アダプターライゲートフラグメントの４～１００ファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。
有利なことに、希釈によりゲノムのカバレッジが比較的低くなることがある。すなわち、網羅的かつ反復的にシークエンシングするのではなく、ゲノムをサンプリングしてもよい。いくつかの実施形態では、核ＤＮＡの１０未満のファミリーが非アダプター部分において２０以上の重複ヌクレオチドを含むように、希釈が十分なされる。いくつかの実施形態では、核ＤＮＡの５未満のファミリーが非アダプター部分において２０以上の重複ヌクレオチドを含むように、希釈が十分なされる。いくつかの実施形態では、１０未満のファミリーが、試験配列と参照配列間で検出される潜在的でまれな差異または潜在的で非クローン性の差異を含むように、希釈が十分なされる。いくつかの実施形態では、５未満のファミリーが、試験配列と参照配列間で検出される潜在的でまれな差異または潜在的で非クローン性の差異を含むように、希釈が十分なされる。
いくつかの実施形態では、希釈は３つの特徴を実現する。第１に、希釈により、１つまたは少数の分子に対する代表的な遺伝子座のカバレッジを低くして、まれな変異を「発見」することができる。第２に、希釈により、初期分子の両方の鎖が重複して配列される可能性を高めることができる。第３に、希釈により、最小限のシークエンシングでゲノムのランダムサンプリングを容易にすることができる。
増幅は、当該分野で公知の任意の技術によって実施され得る。典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応が使用される。線形であろうと対数であろうと、他の手法を使用してもよい。
典型的には、プライマーは、アダプター配列に相補的な増幅に使用される。
シークエンシングは、当該技術分野において任意の公知の技術により実施可能である。次世代シークエンシング方法を使用してもよい。フラグメントの配列は、参照配列にアラインメント可能である。それらは、内因性または外因性のバーコードに基づいてファミリーにグループ分けされ得る。内因性バーコードは通常、アダプターに隣接するＮ個のヌクレオチドを含む。Ｎの値は、所望により、十分な多様性／複合性をもたらすように選択することができる。外因性バーコードは、増幅プライマーにより、別のライゲーションステップで追加するか、または外因性バーコードはアダプターの一部であってもよい。いくつかの実施形態では、バーコードはランダムである。いくつかの実施形態では、２～１０００のファミリーメンバーがシークエンシングされる。いくつかの実施形態では、シークエンシングされるファミリーメンバーは１００未満である。いくつかの実施形態では、少なくとも４のファミリーメンバーがシークエンシングされる。いくつかの実施形態では、４～１０のファミリーメンバーがシークエンシングされる。
本明細書に記載の様々な方法によると、核ゲノム及びミトコンドリアゲノムを物理的に分離したり、別々に分析する必要はない。これにより、同じ細胞内の２つのゲノムの割合を比較することができる。
外因性バーコードを使用して、個々のフラグメント、試料、組織、患者などを識別してもよい。本明細書に提供される例では内因性バーコードを使用したが、これは、外因性バーコードによって補完または置換され得る。いくつかの実施形態では、バーコード集団の複合性は、バーコードが特定のフラグメントを表すようにバーコーディングされるフラグメントの集団の複合性よりも大きい。バーコードは、これらに限定されるものではないが、増幅またはライゲーションによるもの、またはライゲーションにより付加されるアダプター分子の一部としてを含む、当該分野で公知の任意の技術を使用して、フラグメントの集団に付加され得る。判定されたヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間で検出できる差異には、これらに限定されるものではないが、例えば、点変異、インデル（例えば、１～６塩基の挿入または欠失）、及び／または置換などの変異が含まれる。２つの異なるファミリーで同じ変異が見つかった場合、より高い確実性がそれに結び付けられる（例えば、実験過程ではなく、生体試料において生じた可能性が高くなる）。２つのファミリーは、二本鎖フラグメントに由来する同一の配列を有することができるが、アダプター配列に関して異なる配向を有することができる。より高い確実性を実現するには、２つのファミリーのそれぞれの少なくとも２つのメンバーに配列差異がある必要があり得る。より高い確実性を実現するには、ファミリーのメンバーの９０％以上に配列差異がある必要があり得る。
生殖系列またはクローン性変異を除外する手段として、増幅されておらず、同じ試料に由来するフラグメントのライブラリをシークエンシングすることができる。生殖系列及びクローン性変異は、繰り返し発生するため、検査から明らかになる。
ＢｏｔＳｅｑＳ方法は、実施が容易なＮＧＳベースのアプローチであり、公平なゲノムワイドな方法でまれな点変異を正確に測定することができる。ＢｏｔＳｅｑＳを使用して、いくつかの重要なこと：（ｉ）ゲノム全体にわたる、まれな変異頻度の推定値の定義、（ｉｉ）同じ細胞集団の核及びミトコンドリアの両方のゲノムにおける、まれな変異の同時評価、（ｉｉｉ）年齢、ＤＮＡ修復能力、または曝露歴の異なる個々の様々な正常組織間でのまれな変異頻度の比較、及び（ｉｖ）正常組織のまれな変異のスペクトルを同定し、がんのクローン性変異のスペクトルとの比較を可能にすること、が実現した。
本明細書に提示されたデータは、変異が年齢とともに増加することを示しており、その結果は文献とほぼ一致している（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｌｏｅｂ，Ｌ．Ａ．＆Ｈｅｒｒ，Ａ．Ｊ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｇｉｎｇ，ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ １３３，１１８－１２６（２０１２）；Ｖｉｊｇ，Ｊ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｓａｉｃｉｓｍ，ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｇｉｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２６，１４１－１４９（２０１４）。おそらく、結腸及び腎臓の両方が成人の生涯を通じて自己複製組織である一方で脳はそうではないため、変異の増加率は、脳においては、結腸または腎臓ほど大きくない。一方、前頭前皮質の主要な細胞型は一般に有糸分裂後と考えられていることを踏まえると、変異の頻度が幼少期以降に増加したという事実は驚くべきことであった（Ｓｐａｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｂｉｒｔｈ ｄａｔｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｃｅｌｌ １２２，１３３－１４３（２００５））。特定の理論に束縛されるものではないが、この増加にはいくつかの可能性のある説明が存在する。ニューロンまたはグリアよりも活発に複製している少数の細胞が増加の原因である可能性がある。そのような細胞には、ミクログリアまたは浸潤リンパ球または他の炎症細胞が含まれる可能性がある。あるいは、これらの変異は、ＤＮＡ複製とは無関係の自然発生的なＤＮＡ損傷の結果を表す可能性がある。ヒトニューロンの最近の単一細胞シークエンシング研究では、転写中に自然発生的な損傷が発生することが示唆された（Ｌｏｄａｔｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｒａｃｋｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０，９４－９８（２０１５））。しかしながら、単一細胞シークエンシングとは対照的に、ＢｏｔＳｅｑＳは、両方の鎖で見つかった変異を測定する。したがって、自然発生的なＤＮＡ損傷の説明が信頼に値するためには、ＢｏｔＳｅｑＳによって同定された変異がＤＮＡ修復の対象となっていたことが必要となる。この可能性と一致して、ＤＮＡ修復プロセスは、有糸分裂後のニューロン及びグリアにおいて活発であることが知られている（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ，Ｒ．，Ｐａｎ，Ｌ．＆Ｔｓａｉ，Ｌ．Ｈ．ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｎｋｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ ８３，２６６－２８２（２０１４））。
第３の可能性は、これらの変異が、それらを検出するために使用した手順のアーティファクトであることである。変異が、研究した組織の１つの細胞のみで見つかった可能性が高く、その細胞由来のＤＮＡは、その後の評価に使用できなくなるために、この公式な可能性を除外することは本質的に不可能であると言うことは興味深い。加えて、本明細書に記載の様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法によって実現される感度で、そのような変異の観察に利用可能な他の技術はない。この感度は現在、プロジェクト専用のシークエンシング量によってのみ制限される。ＨｉＳｅｑ（商標）２５００フローセルのごく一部を使用して、ｂｐあたり６×１０－８で発生する変異を検出するのは簡単である。フローセル全体を使用して、ｂｐあたり１０－９未満で変異を検出できると推定されている。この感度に近づく他の唯一の方法は、Ｌｏｅｂとその同僚によって記載されている（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９，１４５０８－１４５１３（２０１２）；Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｕｌｔｒａｌｏｗ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｄｕｐｌｅｘ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９，２５８６－２６０６（２０１４））が、これはゲノムの事前定義された領域（－０．００１％）にのみ適用される。直接的な確証がない場合、本明細書に記載の技術の精度をサポートするために、相関関係及び他のアプローチを使用せざるを得ない。これらの相関関係には、表５１に詳細が示されているとおり、同じ試料の異なるＤＮＡアリコートで同定された類似の変異頻度及びスペクトル、ほぼ同じ年齢の異なる個体の同じ組織で同定された類似の変異頻度及びスペクトル、年齢とともに予想される変異頻度の増加、変異頻度の年齢依存性の増加における組織特異的な差異、ミスマッチ修復を欠くか、または環境変異原に曝露した正常組織におけるより高い変異頻度、及び同じ組織のがんにおいて以前に観察されたものと一致する正常組織の変異スペクトルが含まれる。ＢｏｔＳｅｑＳの精度を評価するために使用される他のインシリコ及び実験的アプローチは、実施例７で説明される。
同じ組織のミトコンドリア及び核ゲノムの変異頻度を比較することも可能であった。変異原への曝露がない通常の個体では、変異頻度は、核ゲノムよりもミトコンドリアではるかに高かった（中央値比２６．２）。これは、核ゲノムと比較してミトコンドリアのＤＮＡ修復効率が比較的低いことと一致している。しかしながら、同様に重要なことは、タバコの煙またはＡＡに曝露された個体の正常な腎臓において、ミトコンドリア対核の変異頻度の比が非常に低かった（中央値１．３）ことである。この発見は、ミトコンドリア内のＤＮＡの既知の低効率の修復と一致していない。さらに、ＡＡに曝露された個体の正常な腎臓の核ＤＮＡにおいてはＡＡ変異シグネチャー、Ａ：ＴからＴ：Ａへの塩基転換があったが、ｍｔＤＮＡにおいてはほとんどなかった。特定の理論に束縛されるものではないが、１つの可能性は、ｍｔＤＮＡにおけるより高い変異率が、ミトコンドリアゲノムに対する環境変異原の影響を、核ゲノムに対するその影響と比較して遮蔽し得ることである。別の可能性は、これらの変異原がこれらの２つの小器官でＤＮＡ損傷を引き起こす方法において予想外の顕著な差異があることである。
本明細書に提示されたデータの別の新たな発見は、既知の変異原への曝露がない場合でも、正常組織間で変異スペクトルが異なるという発見である。そのような差異が、未だに同定されていない一般的に出くわす変異原への曝露の変化を表しているのか、組織特異的な修復プロセスを表しているのかは知られていない。いくつかの実施形態では、正常組織のまれな変異スペクトルは、がんに見られるクローン性変異に類似していることが判明した。がんの様々な変異スペクトルは、がん特異的なプロセスに起因することが多いが、本明細書に提示されたデータは、これらの変異の少なくとも１つのサブセットが実際に組織特異的なプロセスを表していることを示唆する。この概念は、がんに見られる変異のかなりの部分が正常な幹細胞で発生するという考えと一致している（Ｔｏｍａｓｅｔｔｉ，Ｃ．＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｃａｎｃｅｒ ｅｔｉｏｌｏｇｙ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ａｍｏｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４７，７８－８１（２０１５）；Ｔｏｍａｓｅｔｔｉ，Ｃ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．＆Ｐａｒｍｉｇｉａｎｉ，Ｇ．Ｈａｌｆ ｏｒ ｍｏｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，１９９９－２００４（２０１３）。本明細書に記載の様々なＢｏｔＳｅｑＳアプローチは、対象となる任意の組織または細胞型における非常にまれな変異を容易に測定することができ、幅広い生物医学的関心のある問題に適用可能である。
いくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願第９，４７６，０９５号に記載の様々な方法のいずれかを使用して検出される。ＤＮＡ鋳型のごく一部に存在する変異の同定は、生物医学研究のいくつかの分野での進歩に有利である。超並列シークエンシング機器は原則としてこのタスクに適しているが、そのような機器のエラー率は一般的に高すぎるため、まれな変異型を確実に同定することができない。本明細書では、この目的のために超並列シークエンシング機器の感度を大幅に高めることができるアプローチを提供する。「Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ」（Ｓａｆｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれる本アプローチの一例には、（ｉ）各鋳型分子への固有識別子（ＵＩＤ）の割り当て、（ｉｉ）それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び（ｉｉｉ）増幅産物を重複してシークエンシングすること、が含まれる。同じＵＩＤを持つＰＣＲフラグメントは、それらの９５％以上が同一の変異を含む場合、真の変異体（「超変異体」）である。本アプローチは、例えば、ポリメラーゼの忠実度、インビトロで合成されたオリゴヌクレオチドの精度、ならびに正常細胞の核及びミトコンドリアゲノムにおける変異率を判定するために有用である。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、複数の分析対象核酸フラグメントのそれぞれの第１の末端に結合して固有に同定された分析対象核酸フラグメントを形成する固有識別子（ＵＩＤ）核酸配列を使用して検出され、固有に同定された分析対象核酸フラグメントのヌクレオチド配列は重複して判定され、ＵＩＤを共有する判定されたヌクレオチド配列はメンバーのファミリーを形成し、ファミリーメンバーの少なくとも１％が当該配列を含む場合、ヌクレオチド配列は分析対象核酸フラグメントを正確に表すものとして同定される。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、第１及び第２プライマーによる少なくとも２サイクルの増幅を使用して複数の分析対象ＤＮＡフラグメントのそれぞれの第１の末端に結合して固有に同定された分析対象ＤＮＡフラグメントを形成する固有識別コード配列（ＵＩＤ）を使用して検出される。かかる実施形態において、ＵＩＤは、増幅中に分析対象ＤＮＡフラグメントを超える場合があり、第１のプライマーは、所望のアンプリコンに相補的な第１のセグメント、ＵＩＤを含む第２のセグメント、及び、その後の増幅のためのユニバーサルプライミング部位を含む第３のセグメントを含むことができ、第２のプライマーは、その後の増幅のためのユニバーサルプライミング部位を含むことができ、増幅の各サイクルは１つのユニバーサルプライミング部位を鎖に結合させることができ、固有に同定された分析対象ＤＮＡフラグメントは、増幅して固有に同定された各分析対象ＤＮＡフラグメントから固有に同定された分析対象ＤＮＡフラグメントのファミリーを形成することができ、ファミリーの複数のメンバーのヌクレオチド配列を判定することができる。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、内因性固有識別子（ＵＩＤ）を使用して検出される。例えば、合計３０～２０００塩基のフラグメントを含む断片化された分析対象ＤＮＡを得ることができる。フラグメントの各末端は、フラグメントの内因性ＵＩＤを形成することができる。アダプターオリゴヌクレオチドをフラグメントの末端に結合させて、アダプテッドフラグメント（ａｄａｐｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を形成することができる。１つまたは複数の選択された遺伝子を表すフラグメントは、分析対象ＤＮＡの選択された遺伝子に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを使用してフラグメントのサブセットを捕捉するか、選択された遺伝子に相補的なフラグメントを増幅することにより、任意に濃縮することができる。アダプテッドフラグメントは、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを使用して増幅し、アダプテッドフラグメントのファミリーを形成することができる。ヌクレオチド配列は、ファミリーの複数のメンバーについて判定することができる。ファミリーの複数のメンバーのヌクレオチド配列を比較することができる。ファミリーのメンバーの少なくとも１％が配列を含む場合、ヌクレオチド配列は分析対象ＤＮＡフラグメントを正確に表すものとして同定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書では、プライマー対の集団を含む組成物が提供され、各対は、遺伝子または遺伝子部分を増幅及び同定するための第１及び第２のプライマーを含む。第１のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）、及び第３のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）を含むことができる。第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）、及び第４のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの第１の部分と第２の部分の間に挿入されるのは、固有識別子（ＵＩＤ）を形成する２～４０００のヌクレオチドからなる第３の部分である。集団内の固有識別子は、少なくとも４つの異なる配列を有することができる。第１及び第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分の反対の鎖に相補的であり得る。キットは、プライマーの集団、ならびに第１及び第２のプライマーのそれぞれの第２の部分に相補的な第３及び第４のプライマーを含み得る。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、「Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ」（Ｓａｆｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して検出される。一実施形態では、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳには２つの基本ステップ：第１のステップは、分析される各核酸鋳型分子への固有識別子（ＵＩＤ）の割り当てであり、第２のステップは、固有にタグ付けした各鋳型を増幅して同一の配列を有する多くの娘分子を生成すること（ＵＩＤファミリーとして定義される）、が含まれる（図６１）。増幅に使用する鋳型分子に変異がすでに存在する場合、その変異は、そのＵＩＤを含む娘分子の特定の割合または全てにさえ存在する必要がある（後続の複製またはシークエンシングエラーがない限り）。全てのファミリーメンバー（または特定の所定の割合）が同一の変異を有するＵＩＤファミリーは、「超変異体」と呼ばれる。元の鋳型に発生しない変異、例えば、増幅ステップ中またはベースコールのエラーにより発生するものなどは、超変異体を発生させることはできない（例えば、ＵＩＤファミリーにおいて所定の頻度では存在しない）。いくつかの実施形態では、増幅は必要ない。
非常に高レベルの精度及び感度が配列データから得られることが望まれる場合、様々なＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいずれもあらゆる目的に使用することができる。本明細書で記載のとおり、本アプローチを使用して、ポリメラーゼの忠実度、インビトロで合成された核酸合成の精度、及び正常細胞の核またはミトコンドリア核酸における変異率を評価することができる。本アプローチは、モザイク及び体細胞変異を検出及び／または定量化するために使用してもよい。
本明細書で提供されるＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、核酸のフラグメントは、核酸を機械的せん断、超音波処理、または他の物理的もしくは化学的ストレスに曝すなどのランダムフラグメント形成技術を使用して得てもよい。一部の部位は他の部位よりもストレスの影響を受けやすいため、フラグメントは厳密にはランダムではない場合がある。ランダムにまたは特異的に断片化するエンドヌクレアーゼもまたフラグメントの生成に使用してもよい。様々なＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいずれかのいくつかの実施形態では、核酸のフラグメントは、ランダムなフラグメントにならない技術を使用して得てもよい。フラグメントのサイズは様々であり得るが、望ましくは３０～５，０００塩基対、１００～２，０００、１５０～１，０００の範囲、またはこれらのエンドポイントの異なる組み合わせの範囲内である。核酸は、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾形態も使用され得る。
本明細書で提供されるＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、分析対象核酸フラグメントへの外因性ＵＩＤの結合は、酵素的、化学的、または生物学的などの当技術分野で公知の任意の手段によって実施され得る。１つの手段は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する。別の手段は、リガーゼ酵素を使用する。酵素は、例えば哺乳動物または細菌のものであってもよい。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントなどの他の酵素を使用して結合する前に、フラグメントの末端を修復してもよい。結合に使用され得る他の酵素は、他のポリメラーゼ酵素である。ＵＩＤは、フラグメントの片端または両端に付加され得る。ＵＩＤは、他の意図された機能のための他の領域を含む核酸分子内に含まれ得る。例えば、後の増幅を可能にするために、ユニバーサルプライミング部位を付加してもよい。別の付加部位は、分析対象核酸中の特定の領域または遺伝子に相補的な領域であり得る。ＵＩＤの長さは、例えば２～４，０００、１００～１０００、４～４００の塩基長であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＩＤは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチドまたはより長い、またはこれらの長さの間の任意の長さであり得る。２つ以上のＵＩＤが使用される実施形態では、ＵＩＤは同じ長さでも異なる長さでもよい。
本明細書で提供されるＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、ＵＩＤは、ヌクレオチドのランダム付加を使用して作成され、識別子として使用される短い配列を形成し得る。付加の各位置で、４つのデオキシリボヌクレオチドのうちの１つからの選択が使用され得る。あるいは、３つ、２つ、または１つのデオキシリボヌクレオチドのうちの１つからの選択が使用され得る。したがって、ＵＩＤは、特定の位置で完全にランダム、幾分ランダム、または非ランダムになり得る。ＵＩＤを作製する別の方法では、チップ上に組み立てられた所定のヌクレオチドを利用する。このような作成方法で、計画的に複合性が実現される。いくつかの実施形態では、フラグメントの各末端にＵＩＤを結合させると、フラグメント上のＵＩＤ集団の複合性が増すため、有利な場合がある。
外因性ＵＩＤを付加するためのポリメラーゼ連鎖反応のサイクルは、二本鎖分子の熱変性、得られた一本鎖への第１プライマーのハイブリダイゼーション、元の一本鎖にハイブリダイズした新たな第２鎖を形成するプライマーの伸長を指す。第２のサイクルは、元の１本鎖からの新たな第２鎖の変性、新たな第２鎖への第２プライマーのハイブリダイゼーション、及び新たな第２鎖にハイブリダイズした新たな第３鎖を形成するための第２プライマーの伸長を指す。例えば、分析対象が希釈されている場合、または阻害物質が存在する場合、効率を高めるために複数のサイクルを使用してもよい。
内因性ＵＩＤの場合、ライゲーションを含むがこれに限定されない様々な方法のいずれかにより、フラグメントの末端にアダプターを付加することができる。いくつかの実施形態では、分析対象フラグメントの複合性は、固相または液相ステップのいずれかでの捕捉ステップにより低減することができる。いくつかの実施形態では、捕捉ステップでは、目的の遺伝子または遺伝子セットを表すプローブへのハイブリダイゼーションを使用する。いくつかの実施形態では、固相上にある場合、非結合フラグメントは結合フラグメントから分離される。当該分野で公知の好適な固相には、フィルター、膜、ビーズ、カラムなどが含まれる。いくつかの実施形態では、液相の場合、例えば、ビオチン－アビジン型相互作用を介してプローブに結合する捕捉試薬を付加することができる。捕捉後、目的のフラグメントは、さらなる処理のために溶出され得る。アダプターの付加及び捕捉の順序は重要ではない。分析対象フラグメントの複合性を低減する別の非限定的な手段は、１つまたは複数の特定の遺伝子または領域の増幅を伴う。これを達成する１つの例示的な方法は、逆ＰＣＲを使用することである。遺伝子特異的であるプライマーを使用して、ライブラリを形成しながら濃縮することができる。任意で、遺伝子特異的プライマーは、超並列シークエンシングプラットフォームへの後続の結合のためのグラフト配列を含むことができる。
なぜなら、いくつかの実施形態では、内因性ＵＩＤは、フラグメントサイズ及びシークエンシングリード長に応じて限られた数の固有の可能性しか提供せず、内因性ＵＩＤ及び外因性ＵＩＤの組み合わせを使用することができる。いくつかの実施形態では、増幅時に追加の配列を導入すると、利用可能なＵＩＤの増加が増幅し、これにより感度が向上する。例えば、増幅前に、鋳型を９６ウェルに分割し、増幅中に９６種類のプライマーを使用することができる。同じ内因性ＵＩＤを持つ最大９６鋳型を区別することができるため、これにより利用可能なＵＩＤが事実上９６倍に増加する。この手法は、各ウェルのプライマーが、増幅産物に固有で十分に特異的な配列を付加し、まれな鋳型の検出の特異性もまた改善できるように、外因性ＵＩＤでも使用することができる。
本明細書で提供されるＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、ＵＩＤを含むフラグメントの増幅は、フラグメントのファミリーを生成するための公知の技術にしたがって実施することができる。ポリメラーゼ連鎖反応を使用してもよい。所望により、他の増幅方法を使用してもよい。ローリングサークル増幅と同様に、逆ＰＣＲを使用してもよい。フラグメントの増幅は、通常、ＵＩＤと同時にフラグメントに結合するプライミング部位に相補的であるプライマーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、プライミング部位はＵＩＤより遠位にあるため、増幅にはＵＩＤが含まれる。いくつかの実施形態では、増幅はフラグメントのファミリーを形成し、ファミリーの各メンバーは同じＵＩＤを共有する。ＵＩＤの多様性は、通常、フラグメントの多様性を大きく超えるため、各ファミリーは分析対象物中の単一のフラグメント分子に由来する必要がある。増幅に使用されるプライマーは、エキソヌクレアーゼに対する耐性を高めるために化学的に修飾され得る。このような修飾の非限定的な例には、１つまたは複数の３’ヌクレオチドとボラノホスフェート間のホスホロチオエート結合の使用が含まれる。
本明細書で提供されるＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、ファミリーのメンバーは、ファミリー内のあらゆる相違を識別するためにシークエンシングされ、比較される。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、大部分が市販されている超並列シークエンシングプラットフォームで実施される。シークエンシングプラットフォームが「グラフティング」（すなわち、シークエンシングデバイスへの結合）のための配列を使用する場合、そのような配列は、ＵＩＤまたはアダプターの付加中に、または個別に付加することができる。グラフト配列は、ＵＩＤプライマー、ユニバーサルプライマー、遺伝子標的特異的プライマー、ファミリーの作成に使用される増幅プライマーの一部であるか、または別個であってもよい。重複シークエンシングとは、単一のファミリーの複数のメンバーのシークエンシングを指す。
分析対象中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を識別するための閾値を設定することができる。「変異」がファミリーの全てのメンバーに現れる場合、分析対象物に由来する。全てではないメンバーに現れた場合、分析中に導入された可能性がある。変異をコールするための閾値は、例えば１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または１００％に設定され得る。閾値は、シークエンシングしたファミリーのメンバー数ならびに特定の目的及び状況に基づいて設定することができる。
本明細書で提供されるＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、プライマー対の集団は、外因性ＵＩＤを結合するために使用される。例えば、第１のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）、及び第３のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの第１の部分及び／または第２の部分は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチド長、またはその間の任意の長さである。第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）、及び第４のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０～１００ヌクレオチド）を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの第１の部分及び／または第２の部分は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチド長、またはその間の任意の長さである。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの第１の部分と第２の部分の間に挿入されるのは、固有識別子（ＵＩＤ）を形成する第３の部分（例えば、２～４，０００ヌクレオチドのうちの、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはこれらの値の間の任意の数のヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマーの両方の第１部分と第２部分の間に挿入されるのは、第３の部分（例えば、２～４，０００ヌクレオチドのうちの、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはこれらの値の間の任意の数のヌクレオチド）であり、それぞれ固有識別子（ＵＩＤ）を形成する。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの第３の部分は、第２のプライマーの第３の部分と同じ長さである。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの第３の部分は、第２のプライマーの第３の部分とは異なる長さである。いくつかの実施形態では、集団内の固有識別子は、少なくとも４、少なくとも１６、少なくとも６４、少なくとも２５６、少なくとも１，０２４、少なくとも４，０９６、少なくとも１６，３８４、少なくとも６５，５３６、少なくとも２６２，１４４、少なくとも１，０４８，５７６、少なくとも４，１９４，３０４、少なくとも１６，７７７，２１６、または少なくとも６７，１０８，８６４の異なる配列を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分の反対の鎖に相補的である。外因性ＵＩＤを結合させるためのプライマー及び増幅プライマー、すなわち第１及び第２のプライマーのそれぞれの第２の部分に相補的な第３及び第４のプライマー、の両方を含むキットが作成可能である。第３及び第４のプライマーは、追加のグラフトまたはインデックス配列を任意に含むことができる。ＵＩＤには、ランダムに選択された配列、事前定義されたヌクレオチド配列、またはランダムに選択された配列と事前定義されたヌクレオチドの両方が含まれ得る。両方の場合、これらはブロック単位で一緒に結合するか、点在し得る。
本明細書で提供されるＳａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、分析方法は配列の定量化及び判定に使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、２つの分析対象ＤＮＡフラグメントの相対的な量を比較することができる。
本明細書に記載の結果は、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳアプローチが超並列シークエンシングの精度を大幅に改善できることを示す（表５２及び５３）。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳは、内因または外因的に導入されたＵＩＤのいずれか（またはその両方）によって実施することができ、実質的にあらゆる試料調製ワークフローまたはシークエンシングプラットフォームに適用可能である。本明細書に示されるように、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳは、ＤＮＡ鋳型の集団内のまれな変異体の同定、ポリメラーゼエラー率の測定、及びオリゴヌクレオチド合成の信頼性の判断に容易に使用することができる。この戦略の利点の１つは、分析された鋳型の数、及び変異型塩基を含む鋳型の割合が得られることである。少数の鋳型分子を検出するための以前に説明されたインビトロの方法（例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｄ，Ｙａｎ Ｈ，Ｔｒａｖｅｒｓｏ Ｇ，Ｋｉｎｚｌｅｒ Ｋ Ｗ，＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（２００３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：８８１７－８８２２；Ｌｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ＣＯＬＤ－ＰＣＲ ｅｎｒｉｃｈｅｓ ｖａｒｉａｎｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｒｅｄｅｆｉｎｅｓ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：５７９－５８４）により、変異鋳型の割合を判定することができるが、元の試料の変異鋳型及び通常鋳型の数を判定することができない。
次世代シークエンシングのエラーを低減するために、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳを他のアプローチと比較することは関心が持たれる。ベースコールの精度を高める高度なアルゴリズムが開発されている（例えば、（Ｅｒｌｉｃｈ Ｙ，Ｍｉｔｒａ Ｐ，ｄｅｌａＢａｓｔｉｄｅ Ｍ，ＭｃＣｏｍｂｉｅ Ｗ Ｒ，＆ Ｈａｎｎｏｎ Ｇ Ｊ（２００８）Ａｌｔａ－Ｃｙｃｌｉｃ：ａ ｓｅｌｆ－ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｂａｓｅ ｃａｌｌｅｒ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：６７９－６８２；Ｒｏｕｇｅｍｏｎｔ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｓｏｌｅｘａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ９：４３１；Ｄｒｕｌｅｙ Ｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｐｏｏｌｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：２６３－２６５；Ｖａｌｌａｎｉａ Ｆ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒａｒｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２０：１７１１－１７１８））。これらは確かに偽陽性コールを低減することができるが、その感度は、ライブラリ調製に必要なＰＣＲステップ中に発生するアーティファクトの変異及び（低減した数の）ベースコールエラーによって依然として制限される。例えば、現在の研究で採用されているアルゴリズムは、ベースコールに非常に厳しい基準を使用し、短いリード長へと適用したが、エラー率を平均２．０×１０－４エラー／ｂｐ未満に低減することは依然としてできなかった。このエラー頻度は、少なくとも他のアルゴリズムで報告されるエラー頻度と同程度の低さである。感度をさらに向上させるため、これらのベースコールの改善は、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳとともに使用可能である。Ｔｒａｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．は、エラーを低減するための別の強力な戦略について説明した（Ｅｉｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１３３－１３８）。この技術により、各鋳型分子の両方の鎖は、いくつかの分離用酵素ステップの後に重複してシークエンシングされる。しかしながら、本アプローチは、特定の機器でのみ実施可能である。さらに、多くの臨床応用に関して、初期試料には鋳型分子が比較的少なく、感度を得るためにはほとんど全ての鋳型分子の評価が必要である。いくつかの実施形態では、外因的に導入されたＵＩＤを採用する本明細書に記載のアプローチ（図６３）は、ＵＩＤ割り当てステップを、ほとんど分子が失われない後続の増幅と結合することにより、この懸念に対処する。
現在の研究の従来の分析で同定された変異が、元の鋳型の真の変異ではなくアーティファクトを表すという事実を裏付ける強力な証拠は、１つの実験を除く全ての変異率が類似している（２．０×１０－４～２．４×１０－４変異／ｂｐ）という観察からもたらされる（表５２及び５３）。例外は、ホスホロアミダイトから合成されたオリゴヌクレオチドによる実験であり、この合成プロセスのエラーは、厳密なベースコール基準で使用された場合、従来のＩｌｌｕｍｉｎａ分析のエラー率より明らかに高かった。対照的に、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳの変異率は、鋳型及び実験に応じて、０．０～１．４×１０－５変異／ｂｐの範囲で、より大きく変動した。さらに、ポリメラーゼ忠実度が測定された最も制御された実験においてＳａｆｅ－ＳｅｑＳによって測定された変異率（表５３Ａ）は、生物学的アッセイによってポリメラーゼ忠実度が測定された従来の実験から予測されたものとほぼ同一であった。本明細書で提供される正常細胞のＤＮＡにおける変異率の測定は、いくつかの従来の実験データと一致している。しかしながら、これらの変異率の推定値は大きな幅があり、分析される細胞型及び配列に依存し得る（ＳＩテキストを参照）。したがって、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳによって明らかとなった少数の変異は、元のＤＮＡ鋳型に存在する真の変異ではなく、シークエンシングプロセス中に発生したエラーを表しているとは断言できない。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳプロセスの潜在的なエラー原因は、ＳＩテキストにおいて説明される。
Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳのもう１つの潜在的な用途は、ＰＣＲ汚染の最小化であり、これは臨床検査室にとって重大な問題である。内因性または外因性ＵＩＤ割り当てを使用して、変異体鋳型のＵＩＤを以前の実験で同定されたものと単純に比較することができ、２つの独立した試料の同じ変異が異なる実験で同じＵＩＤを持ち得る可能性は、変異がまれな場合は僅かである。加えて、外因性ＵＩＤを使用した、同じ鋳型を使用するがＵＩＤ割り当てＰＣＲサイクルを使用しない対照実験（図６３）により、その鋳型調製物にＤＮＡ汚染が存在しないことを確認することができ、ＵＩＤ割り当てサイクルがない場合は鋳型が増幅されず、したがって、適切なサイズのＰＣＲ産物は観察されない。
外因性ＵＩＤ戦略を使用して、単一のアンプリコンを詳細に分析できることが実証された。この技術は、限られた数の鋳型が含まれる試料から複数のアンプリコンを分析する必要がある状況には適用できない場合がある。ＵＩＤ割り当てサイクル（図６３）の多重化は、この課題に対する解決策を提供し得る。２つ目の潜在的な懸念は、臨床試料にこのステップの効率を低下させる阻害物質が含まれている可能性があることである。この問題は、分析される鋳型数の判定が複雑になる可能性はあるが、ＵＩＤ割り当てＰＣＲステップ（図６３）で３サイクル以上を実施することでおそらく克服することができる。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳの特異性は現在、ＵＩＤ割り当てＰＣＲステップで使用されるポリメラーゼの忠実度によって制限されている、つまり、現在の２サイクルでの実施では８．８×１０－７変異／ｂｐである。ＵＩＤ割り当てＰＣＲステップのサイクル数を５に増やすと、全体的な特異性が約２×１０－６変異／ｂｐに低下する。しかしながら、この特異性は、変異の同定に複数の超変異体を必要とすることで高めることができ、同じアーティファクト変異を２、３回導入する確率は非常に低くなる（それぞれ［２×１０－６］２または［２×１０－６］３）。要するに、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳバリエーション及び分析バリエーションを実施して特定の実験ニーズを実現するいくつかの簡単な方法がある。
Ｌｕｒｉａ及びＤｅｌｂｒｕｃｋは、１９４３年の古典的論文にて、「予測を直接検証することはできない。なぜなら、培養液中の耐性菌の数を数える際に我々が観察しているのは、発生した変異の数ではなく、変異したものの増殖によって生じた耐性菌の数であり、増殖量は変異がどれくらい前に発生したかに依存するからである。」と述べた。ポリメラーゼの忠実性に関する実験で述べたように、本明細書で説明する様々なＳａｆｅ－ＳｅｑＳ手順は、各変異の数及び発生時間をデータから推定できるため、このような予測を検証することができる。インビトロのポリメラーゼにより生成された鋳型に加えて、同様のアプローチは、細菌、ウイルス、及び哺乳類細胞由来のＤＮＡに適用できる。したがって、この戦略により、様々な重要な生物医学的問題に対する明確な答えが得られることが期待される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２０８９９９号に記載されている様々な方法のいずれかを使用して検出される。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ウイルスなどの病原体の核酸を含む、例えば、血漿ＤＮＡ及び血清ＤＮＡなどの無細胞核酸の数、断片化パターン、及びサイズの分析を含むことができる。様々な実施形態は、ウイルスなどの病原体の核酸を含む、例えば、血漿ＤＮＡ及び血清ＤＮＡなどの無細胞核酸の数、断片化パターン、及びサイズの分析の応用（例えば、生体試料の分類）に関する。本出願のいくつかの実施形態は、対象が特定の状態を有するかどうかを判定することができる。例えば、方法は、対象が、がんまたは腫瘍、または他の病変を有するかどうかを判定することができる。別の応用の実施形態を使用して、状態の段階、または経時的な状態の進行を評価することができる。例えば、方法は、対象のがんの段階、または対象の経時的ながんの進行を判定するために使用してもよい（例えば、異なる時期に対象から採取した試料を使用して）。一実施形態によれば、無細胞核酸分子の混合物のシークエンシングから得られた配列リードを使用して、ウイルスに対応する参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することができる。参照ゲノムへアラインメントする配列リードの量を、カットオフ値と比較して病変についてスクリーニングすることができる。別の実施形態によれば、ウイルス核酸分子のサイズ（例えば、ウイルスに対応する参照ゲノムにアラインメントするもの）を使用することができる。ウイルスの核酸分子のサイズ分布の統計値を判定することができる。対象の病変のレベルは、カットオフ値に対して統計値を処理することによって判定することができる。別の実施形態によれば、ウイルスに対応する参照ゲノムの１つまたは複数の第１のウィンドウ内で終わる無細胞核酸分子の第１の量が判定される。各第１のウィンドウは、ウイルスに関連するがん（または他の病変）を有する対象において第１の閾値を超える割合で無細胞核酸分子の末端が存在する第１のゲノム位置のセットの少なくとも１つを含む。相対存在量は、第２の量の無細胞核酸分子を使用して第１の量を正規化することで計算することができ、これには、第１のゲノム位置のセットを含む１つまたは複数の第１のウィンドウの外側の第２のゲノム位置のセットで終わる無細胞核酸分子が含まれる。対象のがんのレベルは、カットオフ値に対して相対存在量を処理することで判定することができる。実施形態は、様々な技術を組み合わせることができる。例えば、第１のアッセイは、カウントベース、サイズベース、またはフラグメントベースにすることができる。第２のアッセイは、他の手法の１つであることができる。例として、両方の手法で、多数決を使用したり、カットオフ値を判定したりして、特定のレベルの病変に対応する２つの手法からデータポイントのセットを判定することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２０３９７４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、プロセッサ及びコンピュータ可読媒体を含むコンピュータでデータセットを受信することを伴うコンピュータ実装方法を含むことができ、コンピュータ可読媒体は、プロセッサによって実行される場合、コンピュータに、例えば、生物学的試験試料における体細胞変異を同定させ、体細胞変異を含む体細胞変異プロファイルを生成させる命令を含み、変異シグネチャーの曝露量に基づいて、患者のがんの存在を検出する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、非負値行列因子分解（ＮＭＦ）アプローチを使用して、患者の潜在的なシグネチャーを同定するために使用できるシグネチャー行列を構築することを含むことができる。他の実施形態では、方法は、主成分分析（ＰＣＡ）またはベクトル量子化（ＶＱ）アプローチを使用してシグネチャー行列を構築してもよい。一例において、患者試料は、無細胞核酸試料である（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び／または無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ））。非負値行列因子分解を使用したシグネチャー行列の構築は、がんの検出及び／または分類に関連する複数の機能に一般化できる。いくつかの実施形態では、シグネチャー行列は、複数の特徴のそれぞれの発生確率を表す複数のシグネチャーを含む。関連する特徴の例としては、塩基置換変異の上流配列コンテキスト、塩基置換変異の下流配列コンテキスト、挿入、欠失、体細胞コピー数変化（ＳＣＮＡ）、転座、ゲノムメチル化状態、クロマチンステート、シークエンシングのカバレッジ深度、初期対後期複製領域、センス対アンチセンス鎖、変異間距離、変異型アレル頻度、フラグメント開始／停止、フラグメント長、及び遺伝子発現状態、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、上流及び／または下流配列コンテキストは、塩基置換変異の配列コンテキストの、約２～約４０ｂｐ、例えば約３～約３０ｂｐ、例えば約３～約２０ｂｐ、または例えば約２～約１０ｂｐの長さの範囲の核酸の領域を含むことができる。一実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異の、トリプレット配列コンテキスト、クアドラプレット配列コンテキスト、クインティプレット配列コンテキスト、セクスタプレット配列コンテキスト、またはセプタプレット配列コンテキストであってもよい。いくつかの実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異のトリプレット配列コンテキストであり得る。一実施形態では、本方法は、がんの早期発見のために、対象（例えば、無症候性対象）のｃｆＤＮＡ試料の潜在的な体細胞変異シグネチャーを同定するために使用される。別の実施形態では、本方法は、患者のｃｆＤＮＡ試料において同定された潜在的な変異シグネチャーに基づいて、患者のがんの起源の組織を推定するために使用される。さらに別の実施形態では、本方法は、異なるタイプの治療に患者を分類するために使用可能な患者のｃｆＤＮＡ試料内の潜在的な変異シグネチャーを同定するために使用される。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解は、体細胞変異型（変異）コールアッセイにおいてエラーモードを学習するために適用される。例えば、アッセイの根底にある系統的エラー（例えば、ライブラリ調製、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションキャプチャ、及び／またはシークエンシング中に発生するエラー）を特定し、真の体細胞変異型と、アッセイの技術的プロセスから生じるアーティファクト変異型の寄与を区別するために使用可能な固有のシグネチャーを割り当てることができる。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解を使用して、健康な老化に関連する変異のシグネチャーを同定することができる。加齢に関連する変異プロセスには、患者の年齢に関連する健康な体細胞変異と、患者のがんプロセスが寄与し、それを示唆する体細胞変異とを区別するために使用可能な変異シグネチャーが割り当てられる。別の実施形態では、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的にモニタリングし、がんの診断、モニタリング、及び／または分類に使用することができる。例えば、２つまたはそれ以上の時点で患者試料由来のｃｆＤＮＡにおいて観察された変異プロファイルを評価することができる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の変異シグネチャープロセスは、異なる変異シグネチャーの組み合わせとして評価することができる。さらに別の実施形態では、治療レジメンまたは他のがん治療の有効性をモニタリングするために、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的に（例えば複数の時点で）モニタリングすることができる。がんゲノムにおける体細胞変異（すなわち、ドライバー変異及びパッセンジャー変異）は、通常、ＤＮＡ損傷及び修復の１つまたは複数の変異プロセスの累積的な結果である。理論に束縛されるものではないが、各変異プロセス（例えば、環境要因及びＤＮＡ修復プロセスなど）への曝露の強度及び期間は、対象（例えば、がん患者など）の体細胞変異の固有のプロファイルをもたらすと考えられている。これらの変異タイプの固有の組み合わせは、がん患者の固有の「変異シグネチャー」を形成する。さらに、当技術分野で周知であるように、体細胞変異、または変異プロファイルは、変異の特定の配列コンテキストに依存し得る。例えば、ＵＶ損傷は通常、（－Ｔ｜Ｃ｜－）Ｃ（Ａ｜Ｔ｜Ｃ｜Ｇ）の配列コンテキスト内で塩基変化が起こると、ＣからＴへの塩基変化を引き起こす。この例では、Ｃは変異した塩基であり、Ｃの上流（ＴまたはＣ）及び下流（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）の塩基は、ＵＶ照射下での変異の確率に影響を与える。別の例では、５－メチルシトシンの自発的な脱アミノ化は、通常、（Ａ｜Ｔ｜Ｃ｜Ｇ）Ｃ（－｜－｜－｜Ｇ）の配列コンテキスト内で塩基変化が起こると、ＣからＴへの塩基変化を引き起こす。したがって、一実施形態において、同定された変異の配列コンテキストは、がんの検出及び／または分類における体細胞変異を分析するための機能として利用することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１９３９９に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ライブラリ調製の変換効率を高めるために１つまたは複数の部分的にライゲートされたＤＮＡフラグメントを救済するための方法を含む、ＤＮＡ含有試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法を含むことができる。本方法はさらに、二本鎖ＤＮＡからのデュプレックス配列情報のリカバリーを改善するために使用することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡシークエンシングライブラリを調製するための方法を含むことができ、該方法は以下のステップ：（ａ）フォワード鎖及びリバース鎖を含む、複数の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントを含む試験試料を得ることと、（ｂ）二本鎖ＤＮＡアダプターをｄｓＤＮＡフラグメントの両端にライゲートすることと、（ｃ）ｄｓＤＮＡフラグメントのライゲーションしていない３’末端をＤＮＡポリメラーゼにより伸長させてｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型を作成し、シークエンシングライブラリを作製することと、を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型は、シークエンシングの前にさらに増幅される。他の実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）～（ｃ）は、ｄｓＤＮＡアダプター、リガーゼ、ポリメラーゼ（任意で、鎖置換活性を有する）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの第１セット、及びｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはプライマー（例えば、シークエンシングアダプター及び／またはユニバーサルプライマーを含む）の第２セットを含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。任意で、ライゲーションステップ（ｂ）の前に、ｄｓＤＮＡ分子を試験試料から精製し、任意で断片化することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡシークエンシングライブラリを調製するための方法を含むことができ、該方法は以下のステップ：（ａ）フォワード鎖及びリバース鎖を含む、複数の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントを含む試験試料を得ることと、（ｂ）二本鎖アダプターをｄｓＤＮＡフラグメントに付加し、二本鎖アダプターをｄｓＤＮＡフラグメントの両端にライゲートすることと、（ｃ）ｄｓフラグメントのライゲーションしていない３’末端をポリメラーゼにより伸長させてｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型を作製することであって、該ポリメラーゼが鎖置換活性をさらに含む、ことと、（ｄ）ｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型の３’末端にポリアデニンテールを付加することと、（ｅ）ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（またはプライマー）のセットを付加し、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型にハイブリダイズすることと、（ｆ）ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットを伸長させて、ｄｓＤＮＡシークエンシングライブラリを作製することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）～（ｆ）は、ｄｓＤＮＡアダプター、リガーゼ、ポリメラーゼ（任意で、鎖置換活性を有する）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの第１セット、及びｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはプライマー（例えば、シークエンシングアダプター及び／またはユニバーサルプライマーを含む）の第２セットを含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。任意で、ライゲーションステップ（ｂ）の前に、ｄｓＤＮＡ分子を試験試料から精製し、任意で断片化することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１９４３８に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、シークエンシングデータを分析して核酸試料中のＣＮＶを検出する方法を含むことができる。ヒト対象から採取した核酸試料中のＣＮＶの検出は、対象におけるがんの存在を判定するために有益であり得る。一実施形態では、ヒト対象から採取した核酸試料中のＣＮＶの検出は、対象のがんの早期発見に使用することができる。様々な実施形態では、本方法は、標的シークエンシングリードから判定された個々のヌクレオチド塩基でのカバレッジを判定する。カバレッジの変動の原因は、塩基レベルで修正可能である。標的遺伝子パネルの各遺伝子について、各遺伝子のＣＮＶをより効果的に検出するために、遺伝子の塩基にわたって判定された塩基レベルのカバレッジを考慮することができる。一般的に、各塩基位置に存在するベースラインカバレッジバイアスは、健康な個体から収集したトレーニングデータを使用してモデル化することができる。したがって、対象から採取した試験試料を分析する場合、塩基レベルのカバレッジは、モデリングを通じて得られる予想カバレッジバイアスを考慮して、各塩基位置に対して判定することができる。具体的には、対象から採取した試験試料の塩基位置でのカバレッジバイアスが、モデリングを通じて得られる予想カバレッジバイアスと異なる場合、カバレッジバイアスは正規化して削除できる。標的遺伝子パネルの遺伝子の場合、遺伝子の塩基位置にわたる塩基レベルのカバレッジを分析し、健康な個体から収集したトレーニングデータを使用して、遺伝子のカバレッジが以前に判定された遺伝子のカバレッジの予想レベルと異なるかどうかを判定する。その場合、ＣＮＶをコールすることができる。ＣＮＶのコールは、対象にがんが存在すること、または対象ががんを発症する可能性が高くなりやすいことを示すことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１１８７２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、逆転写酵素、例えば、ＭＭＬＶ ＲＴの末端トランスフェラーゼ活性によって導入されたポリＣテールにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドによって分子をタグ付けすることによりタグ付け及び増幅される複数のＲＮＡ分子に基づいてシークエンシングライブラリを調製することと、リガーゼ、例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼを使用してオリゴヌクレオチドをＲＮＡ分子へライゲートすることと、ｍＲＮＡ及び鎖置換逆転写酵素、例えばＭＭＬＶ ＲＴに基づいてｃＤＮＡ分子を生成することと、シークエンシングのためのｄｓＤＮＡライブラリを生成するために第２のｃＤＮＡ鎖を生成することと、を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、試験試料（例えば、対象の生体試料）のシークエンシングデータまたは配列リードを得るためにシークエンシングライブラリの少なくとも一部をシークエンシングすることを含む。一実施形態では、ＲＮＡを含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法は、以下のステップ：（ａ）ＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料からＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）ＲＮＡ配列及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖のＣテーリング３’末端に基づいて、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することと、（ｃ）相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡのＣテールにアニーリングして、相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションしてＲＮＡ鋳型を生成することと、（ｄ）鎖置換逆転写酵素を使用してＲＮＡ鋳型から複数のｃＤＮＡ鎖を合成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）～（ｄ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法は、以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がさらにｃＤＮＡ配列の３’末端に複数の非鋳型塩基を含む、ことと、（ｄ）ｃＤＮＡ配列の３’末端の非鋳型塩基に対して相補的核酸配列をアニールすることであって、該相補的核酸配列がさらに、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端に対して相補的核酸配列をライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、ＵＭＩまたは固有の配列タグを含む相補的核酸配列に共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列及びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）～（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。一実施形態では、本方法は、ＲＮＡ分子を含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製することを含み、該方法は以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ配列に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該末端トランスフェラーゼ活性が、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列の３’末端にシトシン（Ｃ）テールを付加する、ことと、（ｄ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ配列の３’－シトシンテールにアニールすることであって、該鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＴ４ ＲＮＡリガーゼにより１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド及びＵＭＩまたは固有の配列タグに共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列及びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、方法の１つまたは複数のステップを単一の反応ステップで実施することができる。例えば、ステップ（ｂ）～（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０８５８６２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、がんを有することが知られている、またはがんを有することが疑われる患者のがんを検出、診断、モニタリング、及び／または分類するための体細胞変異シグネチャーを同定するための方法及びシステムを含むことができる。様々な実施形態では、本方法は、がんの検出及び分類のために、非負値行列因子分解（ＮＭＦ）アプローチを使用して、患者試料の潜在的なシグネチャーを同定するために使用できるシグネチャー行列を構築することができる。他の実施形態では、方法は、主成分分析（ＰＣＡ）またはベクトル量子化（ＶＱ）アプローチを使用してシグネチャー行列を構築してもよい。一例において、患者試料は、無細胞核酸試料である（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び／または無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ））。非負値行列因子分解を使用したシグネチャー行列の構築は、がんの検出及び／または分類に関連する複数の機能に一般化できる。いくつかの実施形態では、シグネチャー行列は、複数の特徴のそれぞれの発生確率を表す複数のシグネチャーを含む。関連する特徴の例としては、塩基置換変異の上流配列コンテキスト、塩基置換変異の下流配列コンテキスト、挿入、欠失、体細胞コピー数変化（ＳＣＮＡ）、転座、ゲノムメチル化状態、クロマチンステート、シークエンシングのカバレッジ深度、初期対後期複製領域、センス対アンチセンス鎖、変異間距離、変異型アレル頻度、フラグメント開始／停止、フラグメント長、及び遺伝子発現状態、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、上流及び／または下流配列コンテキストは、塩基置換変異の配列コンテキストの、約２～約４０ｂｐ、例えば約３～約３０ｂｐ、例えば約３～約２０ｂｐ、または例えば約２～約１０ｂｐの長さの範囲の核酸の領域を含むことができる。一実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異の、トリプレット配列コンテキスト、クアドラプレット配列コンテキスト、クインティプレット配列コンテキスト、セクスタプレット配列コンテキスト、またはセプタプレット配列コンテキストであってもよい。いくつかの実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異のトリプレット配列コンテキストであり得る。一実施形態では、本方法は、がんの早期発見のために、対象（例えば、無症候性対象）のｃｆＤＮＡ試料の潜在的な体細胞変異シグネチャーを同定するために使用される。別の実施形態では、本方法は、患者のｃｆＤＮＡ試料において同定された潜在的な変異シグネチャーに基づいて、患者のがんの起源の組織を推定するために使用される。さらに別の実施形態では、本方法は、異なるタイプの治療に患者を分類するために使用可能な患者のｃｆＤＮＡ試料内の潜在的な変異シグネチャーを同定するために使用される。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解は、体細胞変異型（変異）コールアッセイにおいてエラーモードを学習するために適用される。例えば、アッセイの根底にある系統的エラー（例えば、ライブラリ調製、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションキャプチャ、及び／またはシークエンシング中に発生するエラー）を特定し、真の体細胞変異型と、アッセイの技術的プロセスから生じるアーティファクト変異型の寄与を区別するために使用可能な固有のシグネチャーを割り当てることができる。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解を使用して、健康な老化に関連する変異のシグネチャーを同定することができる。加齢に関連する変異プロセスには、患者の年齢に関連する健康な体細胞変異と、患者のがんプロセスが寄与し、それを示唆する体細胞変異とを区別するために使用可能な変異シグネチャーが割り当てられる。別の実施形態では、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的にモニタリングし、がんの診断、モニタリング、及び／または分類に使用することができる。例えば、２つまたはそれ以上の時点で患者試料由来のｃｆＤＮＡにおいて観察された変異プロファイルを評価することができる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の変異シグネチャープロセスは、異なる変異シグネチャーの組み合わせとして評価することができる。さらに別の実施形態では、治療レジメンまたは他のがん治療の有効性をモニタリングするために、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的に（例えば複数の時点で）モニタリングすることができる。一実施形態では、同定された変異の配列コンテキストは、がんの検出及び／または分類における体細胞変異を分析するための機能として利用することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１６３２０１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、複数のＲＮＡ分子を含むシークエンシングライブラリを調製する方法を含むことができる。一実施形態では、ＲＮＡを含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法は、以下のステップ：（ａ）ＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料からＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）ＲＮＡ配列及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖のＣテーリング３’末端に基づいて、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することと、（ｃ）相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡのＣテールにアニーリングして、相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションしてＲＮＡ鋳型を生成することと、（ｄ）鎖置換逆転写酵素を使用してＲＮＡ鋳型から複数のｃＤＮＡ鎖を合成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）～（ｄ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。一実施形態では、本方法は以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がさらに、ｃＤＮＡ配列の３’末端に複数の非鋳型塩基を含む、ことと、（ｄ）ｃＤＮＡ配列の３’末端の非鋳型塩基に対して相補的核酸配列をアニールすることであって、該相補的核酸配列がさらに、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端に対して相補的核酸配列をライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、ＵＭＩまたは固有の配列タグを含む相補的核酸配列に共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列及びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）～（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。一実施形態では、方法は、ＲＮＡ分子を含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製することを含み、該方法は以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ配列に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該末端トランスフェラーゼ活性が、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列の３’末端にシトシン（Ｃ）テールを付加する、ことと、（ｄ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ配列の３’－シトシンテールにアニールすることであって、該鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＴ４ ＲＮＡリガーゼにより１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド及びＵＭＩまたは固有の配列タグに共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列及びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、方法の１つまたは複数のステップを単一の反応ステップで実施することができる。例えば、ステップ（ｂ）～（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０８１１３０に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象から第１の生体試料を採取することを含む方法を含むことができ、該第１の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象から第２の生体試料を採取することを含み、該第２の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第２の生体試料中の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む第２のアッセイを実施して、配列リードを生成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の範囲内のサイズを有し、超並列シークエンシングに基づいて病原体の参照ゲノムにアラインメントする無細胞核酸分子の量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列リードを生成するために、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイの実施、及び第２の生体試料の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む第２のアッセイの実施に基づく腫瘍のスクリーニングを含む。いくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同じである。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リ－ドの割合を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リ－ドの割合をカットオフ値と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の範囲内のサイズを有する病原体の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料の無細胞核酸分子の第１の割合と、所定の範囲内のサイズを有する対象の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料の無細胞核酸分子の第２の割合とのサイズ比を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、サイズ比の逆であるサイズインデックスを判定することと、該サイズインデックスを第２のカットオフ値と比較することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は鼻咽頭癌である。いくつかの実施形態では、病原体はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数の測定には、増幅を含む。いくつかの実施形態では、増幅にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の生体試料及び第２の生体試料は血漿である。いくつかの実施形態では、本方法は、対象から第１の生体試料を採取することを含み、該第１の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイを実施することを含み、該第１のアッセイは、対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象の第２の生体試料に対して第２のアッセイを実施することを含み、該第２の生体試料は、対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含み、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率は、第１のアッセイの陽性反応適中率より少なくとも５倍大きい。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率は、第１のアッセイの陽性反応適中率よりも少なくとも７．５倍大きい。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性的中率は、少なくとも１５％である。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性的中率は、少なくとも２５％である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同じである。いくつかの実施形態では、第１の生体試料及び第２の生体試料は血漿である。いくつかの実施形態では、腫瘍は鼻咽頭癌である。いくつかの実施形態では、病原体はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数の測定には、増幅を含む。いくつかの実施形態では、増幅にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、配列リードを生成するための第２の生体試料中の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、所定の範囲内のサイズを有し、病原体の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料中の無細胞核酸分子の量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象から第１の生体試料を採取することを含み、該第１の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイを実施することを含み、該第１のアッセイは、対象における腫瘍の存在に関する偽陽性率を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象の第２の生体試料に対して第２のアッセイを実施することを含み、該第２の生体試料は、対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含み、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率は、第１のアッセイの偽陽性率より少なくとも５倍低い。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する偽陽性率は、第１のアッセイの偽陽性率よりも少なくとも１０倍低い。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在の偽陽性率は１％未満である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同じである。いくつかの実施形態では、第１の生体試料及び第２の生体試料は血漿である。いくつかの実施形態では、腫瘍は鼻咽頭癌である。いくつかの実施形態では、病原体はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数の測定には、増幅を含む。いくつかの実施形態では、増幅にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、配列リードを生成するための第２の生体試料中の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、所定の範囲内のサイズを有し、病原体の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料中の無細胞核酸分子の量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、無細胞核酸分子の混合物を含む生体試料を分析して、生体試料が得られる対象の病変のレベルを判定することを含み、該混合物は対象の核酸分子、及び潜在的に病原体の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象の生体試料の第１の複数の無細胞核酸分子を分析することを含み、該分析は、第１の複数の無細胞核酸の少なくとも一端に対応する参照ゲノム内のゲノム位置を判定することを含み、該参照ゲノムは病原体に対応する。いくつかの実施形態では、本方法は、第１のウィンドウの１つ内で終わる第１の複数の無細胞核酸分子の第１の量を判定することを含み、各第１のウィンドウは、病原体に関連する病変を有する対象において、無細胞核酸分子の末端が第１の閾値を超える割合で存在する第１のゲノム位置のセットの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料の第２の量の第１の複数の無細胞核酸分子を使用して第１の量を正規化することにより、第１のウィンドウの１つ内で終わる第１の複数の無細胞核酸分子の相対存在量を計算することを含み、該第２の量の第１の複数の無細胞核酸分子は、第１のゲノム位置のセットを含む第１のウィンドウの外側の第２のゲノム位置のセットで終わる無細胞核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のカットオフ値に対して相対存在量を処理することにより、対象の病変のレベルを判定することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のカットオフ値に対する相対存在量は、相対存在量が１つまたは複数のカットオフ値より大きいかどうかを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のウィンドウの１つ内で終わる第１の複数の無細胞核酸分子の第２の量を判定することをさらに含み、各第２のウィンドウは、病原体に関連する病変を持たない対象において、無細胞核酸分子の末端が第２の閾値を超える割合で存在する第２のゲノム位置のセットの少なくとも１つを含み、第１の量を正規化することは、第１の量及び第２の量を使用して相対存在量を計算することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のゲノム位置のセットを同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、同定は、コンピュータシステムによって、病変を持たない参照対象由来の参照試料の無細胞核酸分子を分析することを含む。いくつかの実施形態では、複数の無細胞核酸分子のそれぞれを分析することは、無細胞核酸分子の少なくとも一端に対応する参照ゲノム中のゲノム位置を判定することを含む。いくつかの実施形態では、参照対象は健康である。いくつかの実施形態では、相対存在量は、第１の量と第２の量の比率を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、無細胞核酸分子の末端が第１の閾値を超える割合で生じる第１のゲノム位置のセットを同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のゲノム位置のセットを識別することは、コンピュータシステムによって、少なくとも１つの第１の追加試料の第２の複数の無細胞核酸分子を分析して、第２の複数の無細胞核酸分子の終了位置を同定することを含み、該少なくとも１つの第１の追加試料は、病原体に関連する病変を持つことが知られており、生体試料と同じ試料タイプである。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のゲノムウィンドウの各ゲノムウィンドウについて、ゲノムウィンドウで終結する第２の複数の無細胞核酸分子の対応する数を計算することと、対応する数を参照値と比較してゲノムウィンドウ内の１つまたは複数のゲノム位置で終結する無細胞核酸分子の割合が第１の閾値を超えているかどうかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数のゲノムウィンドウの第１のゲノムウィンドウは、少なくとも１つのゲノム位置の幅を有し、第１のゲノムウィンドウ内の各ゲノム位置は、対応する数が基準値を超える場合に第１の閾値を超えたゲノム位置で終結する無細胞核酸分子の割合を有するものとして同定される。いくつかの実施形態では、第１のゲノム位置のセットは、対応する番号に対して最高のＮ値を持ち、Ｎは少なくとも１００である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０１１９２１６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡ（例えば、二本鎖ｃｆＤＮＡ）試料から一本鎖シークエンシングライブラリを調製及び分析する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子、及び損傷したｄｓＤＮＡ（例えば、ニックの入ったｄｓＤＮＡ）分子が含まれる。いくつかの実施形態では、試料には一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子が含まれる。本方法は、試料内のｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、及び損傷したＤＮＡ（例えば、ニックの入ったＤＮＡ）分子からの、鎖対形成及び連結性情報を含む情報の収集を容易にし、これにより、従来の方法を使用して準備したシークエンシングライブラリと比較して、向上した診断情報を提供する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、シークエンシングのための一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリの調製を含むことができる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡフラグメントのフォワード（センス）及びリバース（アンチセンス）鎖の両方が、ｄｓＤＮＡ分子の相補鎖の同定及び分析を可能にする、同一または実質的に同一な固有の配列タグ（例えば、パーティション特異的なバーコードまたはＵＭＩ）によってタグ付けされる、ｓｓＤＮＡライブラリの調製を使用することを含むことができる。一実施形態では、本方法は、シークエンシングのために一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することを含み、該方法は以下のステップ：（ａ）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む試験試料を得て、該試験試料からｄｓＤＮＡを単離することと、（ｂ）ｄｓＤＮＡ試料を複数の個別の反応区画に分割することと、（ｃ）個々の反応区画のそれぞれに、固有の配列タグを含む複数のオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を付加することと、（ｄ）ｄｓＤＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントを生成することと、（ｅ）固有の配列タグをｓｓＤＮＡフラグメントにライゲートすることと、を含む。別の実施形態では、シークエンシングのための無細胞ＤＮＡライブラリの調製方法が提供され、該方法は以下のステップ：（ａ）無細胞二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む試験試料を得て、該試験試料からｄｓＤＮＡを単離することと、（ｂ）ｄｓＤＮＡ試料を複数の個々の反応液滴に分割することと、（ｃ）複数のＤＮＡ捕捉ビーズを含む反応混合物を個々の液滴のそれぞれに付加することであって、各ＤＮＡ捕捉ビーズが固有の配列タグを含む複数の結合オリゴヌクレオチドを含む、ことと、（ｄ）液滴を加熱してｄｓＤＮＡを変性するか、またはｄｓＤＮＡを化学的に変性して一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントを生成し、ビーズから固有の配列タグを放出することと、（ｅ）ｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に固有の配列タグをライゲートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、ストレプトアビジン被覆ビーズ、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）ビーズ、及び磁気ビーズを含む群から選択される。別の実施形態では、シークエンシングのための一本鎖ＤＮＡライブラリの調製方法が提供され、該方法は以下のステップ：（ａ）複数のパーティションを提供することであって、複数のパーティションの個々のパーティションが、（ｉ）１つまたは複数の個体から単離された、例えば損傷した及び／または損傷のない二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む試験試料の一部、（ｉｉ）パーティション特異的なバーコードを含む複数のオリゴヌクレオチド、を含む、ことと、（ｂ）二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性するのに適した条件下でパーティションをインキュベートすることと、（ｃ）一本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオチドにライゲートすることであって、該ライゲーションが、パーティション特異的なバーコードを一本鎖ＤＮＡに共有結合し、パーティション特異的なバーコード付加一本鎖ＤＮＡを生成する、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のパーティションを結合することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチドプライマーをパーティション特異的なバーコード付加一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、プライマーを伸長させることをさらに含み、これにより、パーティション特異的なバーコード付加二本鎖ＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、本方法は、パーティション特異的なバーコード付加一本鎖ＤＮＡ及び／またはパーティション特異的なバーコード付加二本鎖ＤＮＡを増幅することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、１つまたは複数の個体から単離された二本鎖ＤＮＡを脱リン酸化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の個体から単離された二本鎖ＤＮＡを脱リン酸化し、次いで１つまたは複数の個体から単離された二本鎖ＤＮＡを分割することを含み、これにより、複数のパーティションが提供される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／００８７１０５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、混合無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料からシークエンシングライブラリを調製及び分析する方法を含むことができ、該混合試料には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、損傷したｄｓＤＮＡ（例えば、ニックの入ったｄｓＤＮＡ）、及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子が含まれる。主題の方法は、試料中のｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、及び損傷したＤＮＡ（例えば、ニックの入ったＤＮＡ）分子からの情報の収集を容易にし、これにより、ｄｓＤＮＡのみから調製したライブラリのシークエンシングと比較して、向上した診断情報が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、混合無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料から、混合ｃｆＤＮＡ試料内の少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子に固有の配列タグを含むユニバーサルアダプターをライゲートすることと、ユニバーサルアダプターを伸長させて、ｓｓＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を生成することと、ｓｓＤＮＡ由来のｄｓＤＮＡ分子から結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成することによって、結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを調製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成する前に、シークエンシングＹアダプターをｓｓＤＮＡ由来のｄｓＤＮＡ分子にライゲートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングＹアダプターは、固有の配列タグを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のシークエンシングＹアダプターを伸長させて、第２のニック由来ｄｓＤＮＡ分子を生成することと、第３のシークエンシングＹアダプターを第２のニック由来ｄｓＤＮＡ分子にライゲートすることと、第１及び第２のニック由来ｄｓＤＮＡ分子から、結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、混合ｃｆＤＮＡ試料から結合ｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを調製する方法は、混合ｃｆＤＮＡ試料中の、ニックの入った鎖及びニックのない鎖を含むニックの入ったｄｓＤＮＡ分子の第１の末端に、第１のシークエンシングＹアダプターをライゲートすることと、混合ｃｆＤＮＡ試料中のニックの入ったｄｓＤＮＡ分子の第２の末端に第２のシークエンシングＹアダプターをライゲートすることと、シークエンシングＹアダプターライゲーションしたニックの入ったｄｓＤＮＡ分子を変性して、ニックのない鎖に由来する第１のｓｓＤＮＡ分子、ニックの入った鎖に由来する第２のｓｓＤＮＡ分子、及びニックの入った鎖に由来する第３のｓｓＤＮＡ分子を生成することと、第２のシークエンシングＹアダプターを伸長させて、第１のニック由来ｄｓＤＮＡ分子を生成することと、第３のシークエンシングＹアダプターを第１のニック由来ｄｓＤＮＡ分子にライゲートすることと、第１のニック由来ｄｓＤＮＡ分子から結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成すること、を含む。いくつかの実施形態では、第１のシークエンシングＹアダプターは第１の固有の配列タグを含み、第２のシークエンシングＹアダプターは第２の固有の配列タグを含み、第３のシークエンシングＹアダプターは第３の固有の配列タグを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３の固有の配列タグは同じである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固有の配列タグは同じであり、第３の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第３の固有の配列タグは同じであり、第２の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、第２及び第３の固有の配列タグは同じであり、第１の固有の配列タグは異なる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０００２７４９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、単一供給源の試料のＲＮＡ及びＤＮＡの両方をシークエンシングするための方法、組成物、反応混合物、キット、及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、同じ試料に由来するＤＮＡ配列からＲＮＡ配列を識別するように処理される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡは無細胞ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本方法は、変異（例えば、まれな配列変異型）の同定におけるシークエンシング手法の感度及び／または塩基コーリング精度を向上させる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む試料を得ることと、（ｂ）ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を生成することと、（ｃ）ハイブリッド分子のＲＮＡを分解して、一本鎖ｃＤＮＡを生成することと、（ｄ）一本鎖ＤＮＡリガーゼを含む反応において、タグ配列を含むタグオリゴヌクレオチドを一本鎖ｃＤＮＡに優先的に結合して、タグ付けしたｃＤＮＡを生成することと、（ｅ）ＤＮＡ及びタグ付けしたｃＤＮＡをシークエンシングすることであって、該逆転写、優先的な結合、及びシークエンシングが、ＤＮＡの存在下で実施される、ことを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡは無細胞核酸である。核酸（無細胞核酸を含む）は、血液、血液分画（例えば、血清または血漿など）、尿、及び他の体液などの様々な供給源のいずれかから単離することができる。いくつかの実施形態では、逆転写は、ランダム配列（例えば、１つまたは複数の位置で２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチドであって、１つまたは複数の位置で選択された異なるヌクレオチドのそれぞれは、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのプールで表される）を含むプライマーの伸長を含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、ユニバーサルスイッチプライマー配列を含み得る、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）に沿ったハイブリッドのｃＤＮＡの伸長を含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に結合する。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、プライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡを増幅して、二本鎖のタグ付けしたｃＤＮＡを生成することを含む。いくつかの実施形態では、タグ付けしたｃＤＮＡを増幅することは、プライマー結合配列にハイブリダイズしたプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡ及びＤＮＡにシークエンシングアダプターを結合することを含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含み、複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子のそれぞれは、ＵＭＩに基づいて（例えば、ＵＭＩの配列によって判定される（任意にはｃＤＮＡの配列と組み合わせて））複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子中の他のものと区別可能である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血液画分、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、精液、経膣液、脳脊髄液、または便である。いくつかの実施形態では、試料は、血液または血液分画（例えば、血清または血漿）である。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ配列、またはタグ配列の相補体の有無に基づいて、プロセッサを使用してＲＮＡ由来配列をＤＮＡ由来配列とは別にグループ分けすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象の状態（例えば、がん）の有無を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象を治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む試料を得ることと、（ｂ）ＲＮＡリガーゼを含む反応において、タグ配列を含むタグオリゴヌクレオチドをＲＮＡに結合して、タグ付けしたＲＮＡを生成することと、（ｃ）タグ付けしたＲＮＡを逆転写してタグ付けしたｃＤＮＡを生成することと、（ｄ）ＤＮＡ及びタグ付けしたｃＤＮＡをシークエンシングすることであって、該結合、逆転写、及びシークエンシングが、ＤＮＡの存在下で実施される、ことを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡは無細胞核酸である。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ配列を結合する前に、ＲＮＡを断片化して断片化ＲＮＡを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、断片化されたＲＮＡは、所定の範囲内の平均サイズを有する（例えば、平均長もしくは中央値の長さが約１０～約１，０００ヌクレオチド長、例えば、１０～８００、１０～５００、５０～５００、９０～２００、もしくは５０～１５０ヌクレオチドなど、または平均長もしくは中央値の長さが１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２５０、またはそれ以下のヌクレオチド長）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの断片化は、ＲＮＡ及びＤＮＡを優先的にＲＮＡを断片化する条件にさせることを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの断片化には、超音波処理、化学的断片化、または加熱が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、断片化されたＲＮＡの３’末端を脱リン酸化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの３’末端に結合する。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、プライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、プライマー結合配列にハイブリダイズしたプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）に沿ったタグ付けしたｃＤＮＡの伸長を含み、これはユニバーサルスイッチプライマー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡを増幅して、二本鎖のタグ付けしたｃＤＮＡを生成することを含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡ及びＤＮＡにシークエンシングアダプターを結合することを含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含み、複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子のそれぞれは、ＵＭＩに基づいて（例えば、ＵＭＩの配列によって判定される（任意にはｃＤＮＡの配列と組み合わせて））複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子中の他のものと区別可能である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血液画分、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、精液、経膣液、脳脊髄液、または便である。いくつかの実施形態では、試料は、血液または血液分画（例えば、血清または血漿）である。いくつかの実施形態では、逆転写は、ランダム配列を含むプライマーの伸長を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ配列、またはタグ配列の相補体の有無に基づいて、プロセッサを使用してＲＮＡ由来配列をＤＮＡ由来配列とは別にグループ分けすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象の状態（例えば、がん）の有無を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象を治療することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／２１８５１２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料中の複数の標的核酸を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、エンドヌクレアーゼシステムを提供することであって、該複数の標的核酸のそれぞれが、第１の変異型及び第２の変異型を含み、該エンドヌクレアーゼシステムが、複数のクラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはその誘導体を含み、各ｃｒＲＮＡが、標的配列、及び複数のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、またはその変異型を含み、各Ｃａｓタンパク質が、標的核酸上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に結合することができ、各標的核酸の第１の変異型が、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、そして第２の変異型が、ＰＡＭ部位を含まない、またはＰＡＭ部位に隣接するｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域を含まない、ことと、該試料を該エンドヌクレアーゼシステムと接触させ、それにより、試料中の複数の標的核酸のそれぞれの第１の変異型を枯渇させ、第２の変異型を濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、各標的核酸の第１の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、第２の変異型はＰＡＭ部位を含まない。いくつかの実施形態では、各標的核酸の第１の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、第２の変異型は、ＰＡＭ部位に隣接するｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域を含まない。いくつかの実施形態では、各標的核酸の第１の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、第２の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域を含まない。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の標的核酸の濃縮された第２の変異型を増幅して、濃縮されたシークエンシングライブラリを生成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、濃縮シークエンシングライブラリをシークエンシングして、試料中の標的核酸の構造的再編成または変異を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１２７７４１に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、まれな核酸変異型の高忠実度シークエンシング及び同定のための方法及びシステムを含むことができる。該システム及び方法を使用して、正常なゲノム核酸の大部分を含む試料の中で腫瘍特異的変異などの、無細胞核酸試料中のまれな変異型を同定することができる。該システム及び方法により、試料内で１：１０，０００未満の頻度で発生する変異を確実に同定することができる。このようなまれな変異型の同定は、シークエンシングプロセスのいくつかのステップの最適化と、それに続くアンサンブルと呼ばれるアラインされたリードペアに基づいたシークエンシングリードの分析からもたらされる。該システム及び方法は、望ましいレベルのパフォーマンスまたは感度のためのシークエンシング最適化など、まれな変異型の同定以外の応用を見出す場合がある。本方法には、核酸のシークエンシングが含まれる。本方法のステップには、核酸のシークエンシングリードの取得、共有開始座標及びリード長を持つ２つ以上のシークエンシングリードを含むアンサンブルの同定、アンサンブルに含まれるシークエンシング分子の数の判定、アンサンブルの候補変異型の同定、ならびに尤度推定モデル及び測定された配列された分子の数を使用して、候補変異型が真の変異型である尤度を判定することを含み得る。ある特定の実施形態では、シークエンシングリードを得るステップは、核酸からシークエンシングライブラリを調製し、シークエンシングライブラリを増幅し、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用してシークエンシングライブラリをシークエンシングすることをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、アダプターは、アダプターがスタッキングできるように構成された条件下で核酸にライゲートされ得る。シークエンシングライブラリの調製は、約１６時間の反応時間を使用して、約１６℃の温度で核酸にアダプターをライゲートすることを含み得る。増幅ステップはＰＣＲ増幅を含み得、該方法は、インシリコモデルを使用して試料中の特定の濃度で変異型を検出するために必要な過剰増幅因子及びＰＣＲサイクル数を選択することをさらに含み得る。様々な実施形態では、本方法には、グアニン－シトシン（ＧＣ）含量、標的集団の変異頻度、及び配列の固有性を含む因子に基づいてゲノム領域を標的とするハイブリッド捕捉パネルを設計し、シークエンシングステップ前にハイブリッド捕捉パネルを使用して増幅された核酸を捕捉することを含む。捕捉ステップは、標的遺伝子座のセンス鎖を標的とする第１のハイブリッド捕捉パネル、及び標的遺伝子座のアンチセンス鎖を標的とする第２のハイブリッド捕捉パネルを使用することを含み得る。ある特定の実施形態では、対照配列、対照スパイク・イン、または陽性対照とも呼ばれる合成核酸対照は、シークエンシングライブラリの増幅前に核酸に追加され、合成核酸対照のシークエンシングリードを使用してエラー率が判定され得る。合成核酸対照は、該核酸が由来する種にわたって多様性が低い既知の配列を含み得、該既知の配列に対して複数の自然に発生しないミスマッチを有し、ある特定の実施形態では、複数の自然に発生しないミスマッチは４であり得る。合成核酸対照は、ハイブリッド捕捉パネルの標的遺伝子座を表すグアニン－シトシン（ＧＣ）含量分布を含み得る、またはハイブリッド捕捉パネルのプルダウンプローブとの様々なオーバーラップを含む複数の核酸を含み得る。エラー率または候補変異型頻度は、合成核酸対照のシークエンシングリードを使用して判定され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９０２，９９２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、固有のバーコードに任意で結合している、ことと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）ステップ（ａ）から取得した配列リードを参照配列にマッピングすることと、ｄ）参照配列の２つ以上の所定の領域でマッピングされたリードを定量化／カウントすることと、ｅ）（ｉ）所定の領域でのリード数を相互に正規化する、及び／または所定の領域での固有のバーコード数を相互に正規化すること、ならびに（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた正規化数を、対照試料から得られた正規化数と比較することにより、１つまたは複数の所定の領域でのコピー数多型を判定すること、を含むコピー数多型を検出する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成する、こと、対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照配列にマッピングすることと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｇ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を判定することと、ｈ）潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を有する各領域の得られた数を、参照試料から同様に導出された数と比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象における異常状態の不均一性を特徴付ける方法を含むことができ、該方法は、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することを含み、該遺伝的プロファイルは、コピー数多型及び／または他のまれな変異（例えば、遺伝子改変）分析から生じる複数のデータを含む。いくつかの実施形態では、対象において同定された各まれな変異型の有病率／濃度が同時に報告及び定量化される。他の実施形態では、対象のまれな変異型の有病率／濃度に関する信頼性スコアが報告される。いくつかの実施形態では、細胞外ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。他の実施形態では、細胞外ポリヌクレオチドはＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、フラグメントであるか、または単離後に断片化されている場合がある。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、循環核酸の単離及び抽出のための方法が含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、細胞外ポリヌクレオチドは、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排出物、喀痰、便、及び涙からなる群から選択され得る身体試料から単離される。いくつかの実施形態では、本方法はまた、身体試料中のコピー数多型または他のまれな遺伝子改変（例えば、配列変異型）を有する配列の割合を判定するステップを含む。いくつかの実施形態では、該身体試料中のコピー数多型を有する配列の割合は、所定の閾値を上回るまたは下回るポリヌクレオチドの量を有する所定の領域の割合を計算することにより判定される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）シークエンシングに由来する配列リードを参照配列にマッピングすることと、ｄ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または他の遺伝子改変（複数可）を判定することと、ｇ）各領域の得られた数を比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ．そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ．増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ．シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、を含む方法を含むことができる。ある特定の実施形態では、本方法は、さらに、ｅ．タグ付けした親分子の各セットのコンセンサス配列のセットの分析を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０６４６２９に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ゲノムの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する１つまたは複数のベイトセットを含むベイトセットパネルを含むことができ、該ヌクレオソーム関連領域は、異なるヌクレオソーム占有率で１つまたは複数のゲノム塩基位置を有するゲノム領域を含み、該異なるヌクレオソーム占有率は、細胞または組織タイプの起源または疾患状態の特徴を示す。いくつかの実施形態では、ベイトセットパネルの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域のそれぞれは、以下：（ｉ）ヌクレオソーム位置のばらつきを含む著しい構造変化であって、該構造変化が、挿入、欠失、転座、遺伝子再編成、メチル化状態、マイクロサテライト、コピー数多型、コピー数関連構造変化、または分化を示す他の変化からなる群から選択される、構造変化と、（ｉｉ）ゲノムのヌクレオソームマップ破壊の１つまたは複数の位置を示すゲノム分割マップの１つまたは複数の著しい変動またはピークを含む不安定性、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ベイトセットパネルの１つまたは複数のベイトセットは、（ｉ）１つまたは複数の疾患状態及び１つまたは複数の非疾患状態と関連する、（ｉｉ）ＳＮＶ、ＣＮＶ、インデル、または再編成などの既知の体細胞変異に関連する、及び／または（ｉｉｉ）差次的発現パターンに関連する、複数の参照ヌクレオソーム占有率プロファイルの機能に基づいて、ゲノムのヌクレオソーム関連領域を捕捉するように構成されている。一実施形態では、ベイトセットパネルの１つまたは複数のベイトセットは、無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料の１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）核酸試料をベイトセットパネルと接触させることであって、該ベイトセットパネルが、ゲノムの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する１つまたは複数のベイトセットを含む、ことと、（ｂ）ゲノムの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域の核酸試料を濃縮することと、を含む、ゲノムのヌクレオソーム関連領域の核酸試料を濃縮する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ベイトセットを生成する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）ヌクレオソームプロファイルに関連するゲノムの１つまたは複数の領域を同定することと、（ｂ）ベイトセットを選択して領域を選択的に捕捉することと、を含む。一実施形態では、ベイトセットパネルのベイトセットは、無細胞デオキシリボ核酸試料の１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のゲノム領域を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、所定量の核酸試料を、（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度比で提供される、核酸試料の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点に関連する第２の濃度比で提供される、核酸試料の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２ベイトセットとを含む、ベイトパネルと接触させることと、第１のセットのゲノム領域及び第２のセットのゲノム領域の核酸試料を濃縮することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の身体試料中の無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）分子に由来する複数の配列リードからの挿入または欠失（インデル）の検出精度を改善する方法であって、その複数の配列リードが核酸シークエンシングによって生成される、方法を含むことができ、該方法は、（ａ）無細胞ＤＮＡ分子に関連する複数の配列リードのそれぞれについて、複数の配列リードの１つまたは複数の配列リードにおいて検出されたインデルの予め定められた期待値と、１つまたは複数の配列リードにおいてインデルが検出された場合に検出されたインデルが無細胞ＤＮＡ分子の所与の無細胞ＤＮＡ分子に存在する真のインデルであるという予め定められた期待値と、１つまたは複数の配列リードにおいてインデルが検出された場合に検出されたインデルが非生物学的エラーによって導入されたという予め定められた期待値と、を提供することと、（ｂ）核酸シークエンシングによって生成された配列リードに特徴的な１つまたは複数のモデルパラメーターの定量的測定値を提供することと、（ｃ）無細胞ＤＮＡ分子に関連する複数の配列リードにおいて１つまたは複数の候補インデルを検出することと、（ｄ）各候補インデルについて、１つまたは複数のモデルパラメーターを使用して仮説検定を実施し、候補インデルを真のインデルまたは導入インデルとして分類し、これにより、インデルの検出精度が向上することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）所定量のＤＮＡを含む試料と、（ｂ）（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度比で提供される、所定量のＤＮＡを含む核酸試料の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点に関連する第２の濃度比で提供される、核酸試料の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２ベイトセットと、を含むベイトセットパネルと、を含むキットを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、複数のゲノム領域を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）試料に由来する所定量の核酸を、（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度で提供される、試料に由来する核酸の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点に関連する第２の濃度で提供される、核酸試料の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２のベイトセットとを含むベイト混合物と接触させることと、（ｂ）第１のセットのゲノム領域及び第２のセットのゲノム領域の核酸試料を濃縮することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、複数のゲノム領域を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）試料に由来する所定量の核酸を、（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度で提供される、試料に由来する核酸の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点またはそれを超える第２の濃度で提供される、試料に由来する核酸の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２ベイトセットとを含むベイト混合物と接触させることと、（ｂ）第１のセットのゲノム領域及び第２のセットのゲノム領域の試料に由来する核酸を濃縮し、それにより、濃縮された核酸を生成することと、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７９０，５５９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、コピー数多型を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、固有のバーコードに任意で結合している、ことと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）ステップ（ａ）から取得した配列リードを参照シークエンシングにマッピングすることと、ｄ）参照配列の２つ以上の所定の領域でマッピングされたリードを定量化／カウントすることと、ｅ）（ｉ）所定の領域でのリード数を相互に正規化する、及び／または所定の領域での固有のバーコード数を相互に正規化すること、ならびに（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた正規化数を、対照試料から得られた正規化数と比較することにより、１つまたは複数の所定の領域でのコピー数多型を判定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成する、こと、対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照シークエンシングにマッピングすることと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｇ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を判定することと、ｈ）潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を有する各領域の得られた数を、参照試料から同様に導出された数と比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象における異常状態の不均一性を特徴付ける方法を含むことができ、該方法は、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することを含み、該遺伝的プロファイルは、コピー数多型及び／または他のまれな変異（例えば、遺伝子改変）分析から生じる複数のデータを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、以下のステップ：ゲノム内の所定領域の選択、所定領域の配列リード数の列挙、所定領域全体の配列リード数の正規化、及び所定領域内のコピー数多型の割合の判定、を実施するためのコンピュータ可読媒体を備えるシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲノム全体、または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のゲノムが分析される。いくつかの実施形態では、コンピュータ可読媒体は、血漿または血清中のがんＤＮＡまたはＲＮＡの割合でデータをエンドユーザーに提供する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）シークエンシングに由来する配列リードを参照配列にマッピングすることと、ｄ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または他の遺伝子改変（複数可）を判定することと、ｇ）各領域の得られた数を比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ．そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ．増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ．シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、を含む方法を含むことができる。ある特定の実施形態では、本方法は、さらに、ｅ．タグ付けした親分子の各セットのコンセンサス配列のセットの分析を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ．そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ．増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ．シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、ｅ．コンセンサス配列の中から、品質閾値を満たしていないものを除外することを含む方法を含むことができる。一実施形態では、品質閾値は、コンセンサス配列へと折りたたまれた増幅した子孫ポリヌクレオチド由来の多くの配列リードの数を考慮する。別の実施形態では、品質閾値は、コンセンサス配列へと折りたたまれた増幅した子孫ポリヌクレオチド由来の多くの配列リードの数を考慮する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することであって、各セットは１つまたは複数のゲノム内の異なる参照配列にマップされ、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｉ．第１のポリヌクレオチドを増幅して、増幅されたポリヌクレオチドのセットを生成し、ｉｉ．増幅したポリヌクレオチドのセットのサブセットをシークエンシングして、配列リードのセットを生成し、ｉｉｉ．１．増幅した子孫ポリヌクレオチドからシークエンシングした配列リードをファミリーへと群化することにより配列リードを折りたたむことであって、各ファミリーは同じタグ付けした親ポリヌクレオチドから増幅される、こと、を含む方法を含むことができる。一実施形態では、折りたたむことは、２．各ファミリーの配列リードの定量的尺度を判定すること、をさらに含む。別の実施形態では、本方法は、ｂ．固有のファミリーの定量的尺度を判定することと、ｃ．（１）固有の家族の定量的尺度と、（２）セット内の固有のタグ付けした親ポリヌクレオチドの尺度を推測する、各群の配列リードの定量的尺度に基づくことと、をさらに含む（ａを含むａ）を含む）。別の実施形態では、推論は、統計的モデルまたは確率的モデルを使用して実施される。別の実施形態では、本方法は、２つのセットの間の増幅バイアスまたは表示バイアス（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｂｉａｓ）について訂正するために対照または対照試料のセットを使用することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、セット間のコピー数多型を判定することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、ｄ．ファミリーの間の多型の形態の定量的尺度を判定することと、ｅ．多型の形態の判定された定量的尺度に基づいて、推論されるタグ付けした固有親ポリヌクレオチドの数における多型の形態の定量的尺度を推論することとをさらに含む（ａ、ｂ、ｃを含む）。別の実施形態では、多型の形態には、置換、挿入、欠失、逆位、マイクロサテライトの変化、転換、転座、融合、メチル化、過剰メチル化、ヒドロキシメチル化、アセチル化、エピジェネティックな変異型、制御関連変異型またはタンパク質結合部位が含まれるがこれらに限定されない。セットが共通の試料に由来する別の実施形態では、本方法は、ａ．複数の参照配列の各々にマッピングする、各セット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドの推論される数の比較に基づいて、複数のセットに対してコピー数多型を推論することをさらに含む。別の実施形態では、各セット内のポリヌクレオチドの元の数が、さらに推論される。これに加えてまたはこれに代えて、本開示は、前述の方法を実施するためのコンピュータ可読媒体を備えるシステムも含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子に関する配列情報を通信する方法を含むことができ、該方法は、ａ．少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子を提供することと、ｂ．その少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子における配列情報を符号化することにより、信号を生成することと、ｃ．その信号の少なくとも一部をチャネルに通して、少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子に関するヌクレオチド配列情報を含む受信信号を生成することであって、該受信信号は、ノイズ及び／または歪みを含む、ことと、ｄ．受信信号を解読して、少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子に関する配列情報を含むメッセージを生成することであって、解読は、メッセージ内のノイズ及び／または歪みを減少させる、ことと、ｅ．そのメッセージをレシピエントに提供することと、を含む。一実施形態では、ノイズは、誤ったヌクレオチドコールを含む。別の実施形態では、歪みは、他の個々のポリヌクレオチド分子と比較して、個々のポリヌクレオチド分子の不均一な増幅を含む。別の実施形態では、歪みは、増幅バイアスまたはシークエンシングバイアスに起因する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）濃縮が実施されない場合、領域のマルチプレックスシークエンシングまたは全ゲノムシークエンシングを実施することと、ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照シークエンシングにマッピングすることと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異
型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｇ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を判定することと、ｈ）潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を有する各領域の得られた数を、参照試料から同様に導出された数と比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象における異常状態の不均一性を特徴付ける方法を含むことができ、該方法は、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することを含み、該遺伝的プロファイルは、コピー数多型及びまれな変異分析から生じる複数データを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、マルチプレックスシークエンシングを使用して、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料において、コピー数多型を判定すること、またはまれな変異分析を実施することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ）タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ）そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ）増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ）シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、ｅ）コンセンサス配列の中から、品質閾値を満たしていないものを除外することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７００，２８６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、遺伝子増幅及び遺伝子過剰発現の反映であるがん患者の血漿／血清中の特定の遺伝子のＤＮＡ及びＲＮＡの量を追加及び比較することによる血漿／血清測定におけるがん検出アッセイを含むことができる。したがって、遺伝子増幅（より多くのＤＮＡで見られる）及び遺伝子過剰発現（より多くのＲＮＡ）がリンクされている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、がん細胞中で増幅及び過剰発現される任意の遺伝子において、がんに罹患していると疑われる患者の体液中の遺伝子過剰発現（ＲＮＡ）及び遺伝子増幅（ＤＮＡ）を一緒に測定し、健康な対照と比較することを含む、がんの診断またはがんの進化の経過観察のための方法を含むことができる。より詳細には、ＲＮＡ及びＤＮＡを、血漿、血清、喀痰、唾液などの体液から抽出し、精製及び増幅し、過剰発現したＲＮＡ及び増幅したＤＮＡを分析し、固有のハウスキーピング遺伝子と比較する。いくつかの実施形態では、核酸は、逆転写酵素連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって増幅され、ゲル染色、放射性免疫学的手法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、またはマイクロチップ試験（遺伝子アレイ）によって分析され、場合により、核酸定量化のための任意の方法によって定量化する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡの定量化は、「ＴＡＱＭＡＮ（商標）」などのリアルタイムＰＣＲ、またはキャピラリー「ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）」、またはあらゆる企業のリアルタイムＰＣＲ及びＲＴ ＰＣＲによって実施される。いくつかの実施形態では、分析した遺伝子は、固有のハウスキーピング遺伝子の発現（ＲＮＡ）及び量（ＤＮＡ）に対応する参照核酸抽出物（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、もしくはハウスキーピングコーディング遺伝子の発現に対応する参照ＲＮＡ、もしくは固有の遺伝子に対応する参照ＤＮＡと比較され得る、または細胞株の核酸で得られた標準曲線を参照して推定され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１９５１３１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子を検出する方法を含むことができ、これはがんなどの疾患を検出するために使用され得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、がんなどの疾患に関連し得る融合遺伝子を検出及び特性決定するためなどに、ブレークポイントフラグメントを濃縮する方法が含まれる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、がんを有する、またはがんを有すると疑われる対象に診断的または治療的介入を提供する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象の無細胞核酸分子を含む生体試料を提供することと、（ｂ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、生体試料の無細胞核酸分子をプローブセットと接触させることであって、プローブセットが複数のポリヌクレオチドプローブを含み、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、（ｉ）融合遺伝子との配列相補性、及び（ｉｉ）融合遺伝子と相補的な配列を有するかつ非改変ヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドよりも大きい融合遺伝子に対する親和性、を有する、ことと、（ｃ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを混合物から単離し、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含む単離されたポリヌクレオチドが豊富な試料を生成することと、（ｄ）単離されたポリヌクレオチドをシークエンシングして配列を生成することと、（ｅ）配列に基づいて融合遺伝子のブレークポイントを含むポリヌクレオチドを検出することと、（ｆ）ブレークポイントフラグメントの検出に基づいて診断または治療介入を提供することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを捕捉する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含む無細胞核酸分子を含む、または含むと疑われる生体試料を提供することと、（ｂ）（ｉ）混合物中のプローブ捕捉ポリヌクレオチドを提供するために、ポリヌクレオチドプローブ及びブレークポイントフラグメントの間のハイブリダイゼーションを可能にすることであって、該ポリヌクレオチドプローブが、ブレークポイントフラグメントとの配列相補性を有し、融合遺伝子と相補的な配列を有するかつ非改変ヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドよりも大きい融合遺伝子に対する親和性を有する、ことと、（ｉｉ）混合物のプローブ捕捉ポリヌクレオチドの濃縮または単離であって、該ポリヌクレオチドプローブがブレークポイントフラグメントと配列相補性を有する、ことに十分な条件下で生体試料をポリヌクレオチドプローブと接触させることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のポリヌクレオチドプローブを含むプローブセットを含むことができ、ポリヌクレオチドプローブのそれぞれは、（ｉ）無細胞核酸分子の一部としての融合遺伝子との配列相補性、及び（ｉｉ）融合遺伝子と相補的な配列を有するかつ非改変ヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドよりも大きい融合遺伝子に対する親和性を有する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞核酸分子中の融合遺伝子に関連する核酸配列に特異的にハイブリダイズするように構成された配列を含む高親和性ポリヌクレオチドを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成された高親和性ポリヌクレオチドを含むことができる。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドのみを含む同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃、または２０℃のいずれか高い融解温度を有する。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドのみを含む同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも２％、４％、６％、８％、または１０％のいずれか高い融解温度を有する。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、がん融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成された高親和性ポリヌクレオチドを含む高親和性ポリヌクレオチドプローブを含むことができる。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、プローブは、検出可能な標識、結合部分、または固体支持体から選択される機能を備える。別の実施形態では、プローブは、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントにハイブリダイズするように構成されている。別の実施形態では、ブレークポイントフラグメントの長さは約１４０ヌクレオチド～約１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、フラグメントは無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡである。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは固体支持体に結合している。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを捕捉する方法を含むことができ、該方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でブレークポイントフラグメントを高親和性ポリヌクレオチドプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションさせることであって、該ポリヌクレオチドプローブは固体支持体に結合し、該ポリヌクレオチドプローブはブレークポイントフラグメントのヌクレオチド配列に実質的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する、ことを含む。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子のブレークポイントを含むポリヌクレオチドの試料を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、ａ）請求項２０に記載のプローブセットをハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドの混合物と接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成することと、ｂ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを混合物から単離し、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含むポリヌクレオチドが豊富な試料を生成することと、を含む。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡまたは断片化されたゲノムＤＮＡを含む。別の実施形態では、本方法は、捕捉されたポリヌクレオチドをプローブから単離することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、単離されたポリヌクレオチドをシークエンシングすることをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象のがんを診断する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象のポリヌクレオチドを含む試料を提供することと、ｂ）試料に由来する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）をハイブリダイゼーション条件下で請求項２０のプローブセットと接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成することと、ｃ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを混合物から単離し、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含むポリヌクレオチドが豊富な試料を生成することと、ｄ）単離されたポリヌクレオチドをシークエンシングして配列を生成することと、ｅ）配列に基づいて融合遺伝子のブレークポイントを含むポリヌクレオチドを検出することと、ｆ）ブレークポイントフラグメントの検出に基づいてがんを診断することと、を含む。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１２０２９１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の病状を分析する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）遺伝分析装置を使用して、（ｉ）２つ以上の時点、または（ｉｉ）実質的に同じ時点、で得られた対象の生体試料中の核酸分子から遺伝子データを生成することであって、該遺伝子データは対象の遺伝情報に関連し、該生体試料は無細胞生体試料を含む、ことと、（ｂ）遺伝分析装置から遺伝子データを受信することと、（ｃ）１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサとともに、遺伝子データを使用して、対象の遺伝情報の特性評価において調整した試験結果を生成することと、（ｄ）調整した試験結果をコンピュータメモリに出力することと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子データは、現在の配列リード及び以前の配列リードを含み、（ｃ）は、現在の配列リードを以前の配列リードと比較し、対象の遺伝情報の特性評価に関して診断信頼性指標を適宜更新することを含み、該診断信頼性指標は、対象の生体試料の１つまたは複数の遺伝的変化を同定する確率を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、後続の特性評価を得ること、及びｄｅ ｎｏｖｏ情報の後続の特性評価における診断信頼性指標をそのまま残すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子データに含まれる配列リードのコレクションにおいて検出された１つまたは複数の遺伝的変異型の頻度を判定し、２つ以上の時点で１つまたは複数の遺伝的変異型の頻度を比較することにより少なくとも部分的に調整した試験結果を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子データに含まれる配列リードのコレクションにおいて検出された１つまたは複数の遺伝子座でコピー数多型の量を判定し、２つ以上の時点での量を比較することにより少なくとも部分的に調整した試験結果を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、調整した試験結果を使用して、（ｉ）治療的介入、または（ｉｉ）対象に健康または疾患の診断を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子データは、遺伝子データの第１セット及び遺伝子データの第２セットを含み、該遺伝子データの第１セットは検出閾値、またはそれ以下であり、遺伝子データの第２セットは検出閾値を超える。いくつかの実施形態では、検出閾値はノイズ閾値である。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のサンプリングインスタンスまたは時点で、遺伝子データの第１セット及び遺伝子データの第２セットで同じ遺伝的変異型が検出された場合、（ｃ）において、対象の診断を陰性または不確実から陽性に調整することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、同じ遺伝的変異型が、より早い時点で遺伝子データの第１セットで検出され、より後の時点で遺伝子データの第２セットで検出された場合、（ｃ）において、より早い時点の特性評価において対象の診断を陰性または不確実から陽性に調整することをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象の生体試料中のがんポリヌクレオチドの量の傾向を経時的に検出する方法を含むことができ、該方法は、１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサを使用して、複数の時点のそれぞれでのがんポリヌクレオチドの頻度を判定することと、複数の時点のそれぞれにおける頻度の誤差範囲を判定して、第１の時点で少なくとも第１の誤差範囲、及び第１の時点に続く第２の時点で第２の誤差範囲を提供することと、（１）第１の誤差範囲が第２の誤差範囲と重複するかどうか（その重複は複数の時点でのがんポリヌクレオチドの頻度の安定性を示す）と、（２）第２の誤差範囲が第１の誤差範囲より大きいかどうか（それにより複数の時点でのがんポリヌクレオチドの頻度の増加を示す）と、または（３）第２の誤差範囲が第１の誤差範囲より小さいかどうか（それにより複数の時点でのがんポリヌクレオチドの頻度の減少を示す）と、を決定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の１つまたは複数の遺伝的変異及び／または遺伝的変異の量を検出する方法を含むことができ、該方法は、遺伝子分析装置を用いて対象の無細胞核酸試料中の核酸分子をシークエンシングし、第１の時点で配列リードの第１セットを生成することと、配列リードの第１セットと、第１の時点より前の少なくとも第２の時点で得られた配列リードの少なくとも第２セットとを比較して、配列リードの第１セットと配列リードの少なくとも第２セットとの比較を行うことと、どの診断信頼性指標が対象の無細胞核酸試料中の１つまたは複数の遺伝的変異型を同定する確率を示しているかを比較を使用して診断信頼性指標を適宜更新することと、診断信頼性指標に基づいて対象の無細胞核酸試料中の核酸分子における１つまたは複数の遺伝的変化の有無及び／または遺伝的変化の量を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、無細胞核酸を得ることをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞核酸試料中の変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）遺伝子分析装置から得られた現在の配列リードを、比較を行うために以前の期間から得られた以前の配列リードと比較することによってコンセンサス配列を判定し、該比較に基づいて診断信頼性指標を更新することであって、該各コンセンサス配列は、無細胞核酸試料に由来するタグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中の固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、（ｂ）診断的信頼性に基づいて、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することであって、該遺伝的プロファイルがコピー数多型または変異分析から得られるデータを含む、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、異常な細胞活動を検出する方法を含むことができ、該方法は、対象の生体試料に由来するタグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも1セットを提供することと、セット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅した子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、遺伝子分析装置を使用して増幅した子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセットをシークエンシングし、配列リードのセットを生成することと、配列リードのセットを折りたたみ、現在の配列リードを少なくとも1つの以前の期間の以前の配列リードと比較することによりコンセンサス配列のセットを生成し、診断信頼性指標を適宜更新することであって、該診断信頼性指標が、対象の生体試料の１つまたは複数の遺伝的変化を同定する確率を示し、各コンセンサス配列が、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞または実質的に無細胞の試料中の変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）遺伝子分析装置を用いて対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることと、（ｂ）細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれについて、複数の配列リードを生成することと、（ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、（ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照シークエンシングにマッピングすることと、（ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、（ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ｉ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｉｉ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、（ｇ）１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサを使用して、配列リードを少なくとも１つ前の時点の他の配列リードと比較し、診断信頼性指標を適宜更新することであって、該診断信頼性指標が、変異型を同定する確率を示す、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、遺伝子試験装置の操作を含むことができ、該方法は、対象から採取した身体試料から得られた初期出発遺伝物質を提供することと、二本鎖ポリヌクレオチド分子を最初の出発遺伝物質から少なくとも１セットの固有ではないタグ付けした親ポリヌクレオチドに変換することであって、セット内の各ポリヌクレオチドが参照配列にマッピング可能である、ことと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、（ｉ）セット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅した子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、（ｉｉ）増幅した子孫ポリヌクレオチドのセットをシークエンシングして、シークエンシングリードのセットを生成することと、（ｉｉｉ）シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサスシークエンシングのセットを生成することであって、該折りたたみはタグからの配列情報と、（１）配列リードの開始領域の配列情報、（２）配列リードの末端領域、及び（３）配列リードの長さ（コンセンサス配列のセットの各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中のポリヌクレオチド分子に対応する）のうちの少なくとも１つを使用する、ことと、（ｉｖ）タグ付けした親分子の各セットのコンセンサス配列のセットを分析することと、（ｖ）現在の配列リードを、少なくとも１つの他の時点の以前の配列リードと比較することと、（ｖｉ）診断信頼性指標を適宜更新することであって、該診断信頼性指標が、対象の身体試料の１つまたは複数の遺伝的変化を同定する確率を示す、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の１つまたは複数の遺伝的変異型を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象の１つまたは複数の無細胞生体試料から核酸分子を得ることと、（ｂ）核酸分子をアッセイして、遺伝子データの第１セット及び遺伝子データの第２セットを生成することであって、該遺伝子データの第１セット及び／または遺伝子データの第２セットが検出閾値内である、ことと、（ｃ）遺伝子データの第１セットを遺伝子データの第２セットと比較して、遺伝子データの第１セットまたは遺伝子データの第２セットにおける１つまたは複数の遺伝的変異型を同定することと、（ｄ）（ｃ）で同定された１つまたは複数の遺伝的変異型に基づいて、１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサを使用して、対象の無細胞生体試料中の１つまたは複数の遺伝的変異型を識別する診断信頼性指標を更新することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞デオキシリボース核酸（ｃｆＤＮＡ）の遺伝的変異型をコールする方法を含むことができ、該方法は、（ａ）ＤＮＡシークエンシングシステムを使用して、第１の時点で対象から採取した試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることと、（ｂ）シークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を第１の時点から検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｃ）ＤＮＡシークエンシングシステムを使用して、１つまたは複数の後続の時点で対象から採取した試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることと、（ｄ）１つまたは複数の後続の時点からシークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｅ）複数の時点で採取した試料における診断限界未満の遺伝的変異型の検出に基づいて、試料を遺伝的変異型の陽性としてコールすること、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞デオキシリボース核酸（ｃｆＤＮＡ）の遺伝的変異型をコールする方法を
含むことができ、該方法は、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）シークエンシングシステムを使用して、対象の試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることと、（ｂ）シークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｃ）ＤＮＡシークエンシングシステムを使用して、対象から採取した試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることであって、該試料が１または複数回、再シークエンシングされる、ことと、（ｄ）１つまたは複数の再シークエンシング試料からシークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｅ）再シークエンシング試料における診断限界未満の遺伝的変異型の検出に基づいて、試料を遺伝的変異型の陽性としてコールすること、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０２４０９７２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することにより遺伝子融合を判定し、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定し、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定し、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングし、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定するためのシステム及び方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、試料に由来する遺伝子配列リードデータを処理するための方法を含むことができ、該方法は、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することと、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定することと、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定することと、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングすることと、所定の基準を満たす各融合クラスターを、遺伝子融合として同定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、固有の分子またはリード識別子（リードＩＤ）を各リードへと割り当てることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、リードの各マッピング部分を、片側または両側からクリップすることを含む。いくつかの実施形態では、ブレークポイントは、同一性においてリードから独立しており、符号、染色体、及び位置により同定される。いくつかの実施形態では、ブレークポイントは、ブレークポイントでクリップされるか、または分割された多数のリード及び分子と、ブレークポイントを通り越す多数の野生型リード及び分子とを含む統計を保持する。いくつかの実施形態では、本方法は、適切な符号を伴う２つのブレークポイントに属する共通のリードＩＤを伴うあらゆる２つのマッピングリード部分を、潜在的な融合候補として選択することを含む。いくつかの実施形態では、マッピング前の元のリード内の潜在的な融合候補の場所は、該リード部分を、元々互いに隣接して位置するものとして示す。いくつかの実施形態では、本方法は、リード部分が、１つの鎖にマッピングされる場合、ブレークポイントの符号の差違についてチェックすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、融合セット統計を追跡するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡシーケンサー、該ＤＮＡシーケンサーに接続されたプロセッサ、コンピュータコードを実行して試料からの遺伝子配列リードデータを処理するプロセッサ、融合染色体ＤＮＡ分子の一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定し、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の少なくとも１つの所定のポイントを判定し、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定し、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作製して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングし、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定する指示を含むコンピュータコード、を含む遺伝情報を分析するシステムを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡシーケンサーでＤＮＡ分子をシークエンシングして、配列のコレクションを生成することと、配列のコレクションを参照ゲノムにマッピングすることと、マッピングされたコレクションから融合リードを同定することであって、融合リードが部分配列を含み、第１の部分配列が第１の遺伝子座にマップされ、第２の部分配列が第２の異なる遺伝子座にマップされる、ことと、各融合リードについて、第１の遺伝子座の第１のブレークポイント及び第２の遺伝子座の第２のブレークポイントを同定することであって、ブレークポイントは融合リードの配列がクリップされる参照ゲノム上のポイントであり、該第１及び第２のブレークポイントがブレークポイントペアを形成する、ことと、融合リードのセットを生成することであって、各セットが同じブレークポイントペアを有する融合リードを含む、ことと、融合リードのセットをクラスタリングすることであって、各クラスターが、第１の所定のヌクレオチド距離内に第１のブレークポイントを有し、第２の所定のヌクレオチド距離内に第２のブレークポイントを有する融合リードのセットから形成される、ことと、１つまたは複数のクラスターの遺伝子融合を判定することであって、クラスターの遺伝子融合が、第１の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第１のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、第２の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第２のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、該第１及び第２の融合遺伝子ブレークポイントが、選択基準に基づいてそれぞれ選択される、ことを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡシーケンサーで複数のＤＮＡ分子をシークエンシングすることと、複数の配列分子のそれぞれに識別子をタグ付けすることと、タグ付けした各配列を参照ゲノムにマッピングすることと、クリップされたリードをマッピングしたタグ付け配列から同定することであって、クリップされたリードが、マッピング部分及びクリップ部分を含むタグ付けした配列であり、マッピング部分は遺伝子座にマッピングされ、クリップ部分は遺伝子座にマッピングされない、ことと、各クリップされたリードのブレークポイントを判定することであって、ブレークポイントが、クリップされたリードの配列がクリップされる参照ゲノム上のポイントである、ことと、ブレークポイントセットを作成することであって、各ブレークポイントセットは、同じブレークポイントを有するクリップされたリードの識別子を含む、ことと、ブレークポイントセットのペアを比較して、ブレークポイントペアのセットを作成することであって、ブレークポイントペアの各セットが、ブレークポイントセットの比較されたペアの両方のメンバーに存在する識別子を含む、ことと、ブレークポイントペアのセットをクラスタリングすることであって、各クラスターが、第１の所定の遺伝的距離内にペアの第１のブレークポイントを有し、第２の所定の遺伝的距離内にペアの第２のブレークポイントを有するブレークポイントペアのセットを含む、ことと、１つまたは複数のクラスターの遺伝子融合を判定することであって、クラスターの遺伝子融合が、第１の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第１のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、第２の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第２のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、該第１及び第２の融合遺伝子ブレークポイントが、選択基準に基づいてそれぞれ選択される、ことを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、選択基準には、クラスター内で最も融合されたリードを有するブレークポイントが含まれる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子ブレークポイントを同定する方法を含むことができ、該方法は、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することと、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定し、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定し、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングし、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定し、遺伝子融合のブレークポイントを融合遺伝子のブレークポイントとして同定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の状態を診断する方法を含むことができ、該方法は、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することと、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定することと、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定することと、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングすることと、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定することであって、該遺伝子融合が状態を示す、ことと、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０２４０９７３号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象の無細胞体液試料のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子のシークエンシングリードを得ることと、（ｂ）配列リードから、複数の遺伝子座における遺伝子座毎にシークエンシングリードカバレッジ（「リードカバレッジ」）に関連する定量的尺度を含む第１のデータセットを生成することと、（ｃ）飽和平衡補正及びプローブ効率補正を実施することにより、第１のデータセットを補正することと、（ｄ）第１のデータセットについてベースラインリードカバレッジを判定することであって、ベースラインリードカバレッジが、飽和平衡及びプローブ効率に関連する、ことと、（ｅ）ベースラインリードカバレッジと比べた複数の遺伝子座における遺伝子座毎のコピー数状態を判定することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のデータセットは、複数の遺伝子座における遺伝子座毎に、（ｉ）遺伝子座のグアニン－シトシン含量（「ＧＣ含量」）に関連する定量的尺度を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｃ）に先立ち、第１のデータセットから、高変動遺伝子座である遺伝子座を除去することを含み、除去することは、（ｉ）グアニン－シトシン含量に関連する定量的尺度及び遺伝子座のシークエンシングリードカバレッジの定量的尺度に関連するモデルを適合させることと、（ｉｉ）遺伝子座から、遺伝子座の少なくとも１０％を除去することであって、この遺伝子座を除去することは、モデルと最も異なる遺伝子座を除去し、これにより、ベースライン化遺伝子座の第１のデータセットを提供することを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子座の少なくとも４５％を除去することを含む。いくつかの実施形態では、コピー数状態の判定は、遺伝子座のリードカバレッジをベースラインリードカバレッジと比較することを含む。いくつかの実施形態では、無細胞体液は、血清、血漿、尿、及び脳脊髄液からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、リードカバレッジは、シークエンシングリードを参照ゲノムにマッピングすることにより判定される。いくつかの実施形態では、シークエンシングリードを得ることは、対象由来の無細胞体液由来のＤＮＡ分子にアダプターをライゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、二重鎖ＤＮＡ分子であり、各アダプターが、ＤＮＡ分子の相補鎖を異なる形でタグ付けして、タグ付けされた鎖を提供するように、アダプターは、二重鎖ＤＮＡ分子にライゲートされる。いくつかの実施形態では、遺伝子座に由来するＤＮＡの鎖が、シークエンシングリード内に表される確率に関連する定量的尺度を判定することは、シークエンシングリードを、ペアリードと非ペアリードにソートすることを含み、（ｉ）各ペアリードは、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖及び第２の異なる形でタグ付けされた相補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各非ペアリードは、該配列リードのセットにおける該配列リード中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なる形でタグ付けされた相補鎖を有しない第１のタグ付けされた鎖を表す。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする、（ｉ）ペアリードリード及び（ｉｉ）非ペアリードの定量的尺度を判定して、各遺伝子座にマッピングするペアリード及び非ペアリードに関連する定量的尺度に基づき、１つまたは複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする、試料における総二本鎖ＤＮＡ分子に関連する定量的尺度を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、リードカバレッジの判定は、参照ゲノムへのシークエンシングリードのマッピングの位置及びバーコード配列に基づきシークエンシングリードを折りたたむことを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、１つまたは複数のがん遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象の生殖系列ゲノムがヘテロ接合性であるベースライン化遺伝子座内の変異型の相対量を判定することにより、ベースライン化遺伝子座の少なくともサブセットが、対象の腫瘍細胞においてコピー数変化を受けたことを判定することを含む。いくつかの実施形態では、変異型の相対量は、ほぼ等しいわけではない。いくつかの実施形態では、変異型の相対量がほぼ等しいわけではないベースライン化遺伝子座は、ベースライン化遺伝子座から除去され、これにより、アレル頻度補正されたベースライン化遺伝子座を提供する。いくつかの実施形態では、アレル頻度補正されたベースライン化遺伝子座は、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法におけるベースライン化遺伝子座として使用される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、メモリに、対象の無細胞体液試料のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子のシークエンシングリードを受け取ることと、コンピュータプロセッサを用いてコードを実施して、次のステップ：配列リードから、複数の遺伝子座における遺伝子座毎にシークエンシングリードカバレッジ（「リードカバレッジ」）に関連する定量的尺度を含む第１のデータセットを生成することと、飽和平衡補正及びプローブ効率補正を実施することにより、第１のデータセットを補正することと、第１のデータセットについてベースラインリードカバレッジを判定することであって、ベースラインリードカバレッジが、飽和平衡及びプローブ効率に関連する、ことと、ベースラインリードカバレッジと比べた複数の遺伝子座における遺伝子座毎のコピー数状態を判定することと、を遂行することと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ネットワークと、ネットワークに接続された核酸（例えば、ＤＮＡ）配列データを記憶するように構成されたコンピュータメモリを含むデータベースと、コンピュータメモリ及び１または複数のコンピュータプロセッサを含むバイオインフォマティクスコンピュータであって、ネットワークに接続されたコンピュータとを含むシステムを含むことができ、該コンピュータは、１または複数のコンピュータプロセッサによって実施される際に、データベースに記憶された核酸（例えば、ＤＮＡ）配列データをコピーし、コピーされたデータを、バイオインフォマティクスコンピュータにおけるメモリに書き出し、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列データから、複数の遺伝子座における遺伝子座毎にシークエンシングリードカバレッジ（「リードカバレッジ」）に関連する定量的尺度を含む第１のデータセットを生成することと、飽和平衡補正及びプローブ効率補正を実施することにより、第１のデータセットを補正することと、第１のデータセットについてベースラインリードカバレッジを判定することであって、ベースラインリードカバレッジが、飽和平衡及びプローブ効率に関連する、ことと、ベースラインリードカバレッジと比べた複数の遺伝子座における遺伝子座毎のコピー数状態を判定することと、を含むステップを遂行する、機械実行可能なコードをさらに含む。いくつかの実施形態では、データベースは、ＤＮＡシーケンサーに接続される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０２６０５９０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象の生体試料由来のがん細胞由来のポリヌクレオチドのシークエンシングと、（ｂ）ポリヌクレオチドの体細胞変異を同定し、定量化することと、（ｃ）ポリヌクレオチドの複数の体細胞変異の存在及び相対量を示す対象の腫瘍不均一性のプロファイルを作成することであって、異なる相対量が腫瘍不均一性を示す、ことと、（ｄ）腫瘍の不均一性を示すがんの治療的介入を判定することであって、治療的介入が、判定された腫瘍の不均一性のプロファイルを有するがんに対して有効である、ことを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、がん細胞は空間的に異なる。いくつかの実施形態では、治療的介入は、体細胞変異の全てではなくいずれか１つを呈するがんに対するよりも、複数の体細胞変異を呈するがんに対してより効果的である。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）経時的に対象の腫瘍の不均一性の変化を監視し、変化に基づいて経時的に異なる治療的介入を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）治療的介入を表示することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）治療的介入を実施することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）腫瘍プロファイルに基づいて腫瘍進化の系統を生成することであって、治療的介入の判定は系統を考慮に入れる、ことを含む。いくつかの実施形態では、判定は、コンピュータ実行アルゴリズムを使用して実施する。いくつかの実施形態では、シークエンシングによって生成された配列リードは、同定及び定量化前にノイズ低減の対象となる。いくつかの実施形態では、ノイズ低減には、試料内の単一のポリヌクレオチドから生成された配列の分子トラッキングを含む。いくつかの実施形態では、治療的介入の判定には、腫瘍関連の遺伝子変化の相対度数を考慮する。いくつかの実施形態では、治療的介入は、複数の薬物を組み合わせて、または連続して投与することを含み、各薬物は、異なる相対度数で発生する体細胞変異の異なる１つを示すがんに対して比較的効果的である。いくつかの実施形態では、より高い相対度数で発生する体細胞変異を呈するがんに対して比較的有効な薬物は、より多くの量で投与される。いくつかの実施形態では、薬物は、ＤＮＡの変異型の相対量を反映するように層別した用量で送達される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異型を呈するがんは、少なくとも１つの薬物に耐性がある。いくつかの実施形態では、治療的介入の判定には、がんの起源の組織が考慮される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、各体細胞変異を特徴とする腫瘍の不均一性を有するがんを治療することが示されている介入のデータベースに基づいて判定される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、腫瘍の不均一性が推測され得る腫瘍プロファイルを有するがんを有する対象に治療的介入を提供することを含む方法を含むことができ、該治療的介入は腫瘍プロファイルを有するがんに対して有効である。いくつかの実施形態では、腫瘍プロファイルは、複数のより多くの体細胞変異の相対度数を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、経時的に対象の相対度数の変化を監視し、その変化に基づいて経時的に異なる治療的介入を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、治療的介入は、体細胞変異の全てではなくいずれか１つを呈するがんに対するよりも、体細胞変異のそれぞれを呈するがんに対してより効果的である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、複数の薬物を組み合わせて、または連続して投与することを含み、各薬物は、異なる相対度数で発生する体細胞変異の異なる１つを示すがんに対して比較的効果的である。いくつかの実施形態では、より高い相対度数で発生する体細胞変異を呈するがんに対して比較的有効な薬物は、より多くの量で投与される。いくつかの実施形態では、薬物は、ＤＮＡの変異型の相対量を反映するように層別した用量で送達される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異型を呈するがんは、少なくとも１つの薬物に耐性がある。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、コンピュータプロセッサによって実行される際に、以下の方法：（ａ）メモリに、遺伝子座にマッピングされたポリヌクレオチドの配列リードを受け取ることと、（ｂ）上記配列リードのうち、遺伝子座にマッピングされる配列リードの総数の遺伝子座での参照配列の塩基とは異なる塩基の同一性を判定することと、（ｃ）判定された塩基の同一性及び相対量、ならびにゲノム内のそれらの位置を報告することと、（ｄ）（ｃ）の情報に基づいて特定の試料の不均一性を推測することとを遂行する、機械実行可能なコードを含む、コンピュータ可読媒体を備えるシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、実施される方法は、複数の異なる時点で試料に由来する配列リードをメモリに受け取り、２つの試料間の複数の塩基の相対量の差及び同一性を計算することをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象の疾患細胞（例えば、空間的に異なる疾患細胞など）からの生体分子ポリマーの生体分子分析の実施と、（ｂ）生体分子高分子における生体分子変異型を同定及び定量化することと、（ｃ）生体分子高分子における複数の変異型の存在及び相対量を示す、対象における疾患細胞不均一性のプロファイルを展開することであって、異なる相対量が、疾患細胞不均一性を示す、ことと、（ｄ）疾患細胞不均一性を示す疾患のための治療介入を判定することであって、治療介入が、判定された疾患細胞不均一性のプロファイルを有する疾患に対して有効であること、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、疾患細胞は、空間的に異なる疾患細胞である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、各体細胞変異を特徴とする腫瘍の不均一性を有するがんを治療することが示されている介入のデータベースに基づいて判定される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の疾患細胞不均一性を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象由来の試料からのポリヌクレオチドにおける複数の遺伝子座のそれぞれに配列変異型を有するポリヌクレオチドを定量化することであって、試料が、体細胞及び疾患細胞由来のポリヌクレオチドを含むことと、ｂ）各遺伝子座について、配列変異型を有するポリヌクレオチドのためのコピー数多型（ＣＮＶ）の測定値を判定することと、ｃ）各遺伝子座について、遺伝子座におけるＣＮＶの関数として、遺伝子座に配列変異型を有するポリヌクレオチドの量の重み付きされた測定値を判定することと、ｄ）複数の遺伝子座のそれぞれにおける重み付きされた測定値を比較することであって、異なる重み付きされた測定値が、疾患細胞不均一性を示すことと、を含む。いくつかの実施形態では、疾患細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｃｆＤＮＡを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料において細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡの負荷の測定値を推定する方法であって、細胞の複製起点への１つまたは複数のゲノム遺伝子座の近接によって誘導されるコピー数多型を測定することを含み、ＣＮＶ増加が、細胞分裂を行っている細胞を示す方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、負荷は、無細胞ＤＮＡにおいて測定される。いくつかの実施形態では、負荷の測定値は、試料における腫瘍細胞のフラクションまたは腫瘍細胞由来のＤＮＡのゲノム当量に関連する。いくつかの実施形態では、複製起点に近接していることによるＣＮＶは、対照試料または細胞株のセットから推定される。いくつかの実施形態では、隠れマルコフモデル、回帰モデル、主成分分析に基づくモデル、または遺伝子型修飾モデルを使用して、複製起点に起因する変異を模倣する。いくつかの実施形態では、負荷の測定値は、細胞分裂を行っている細胞の存在または非存在である。いくつかの実施形態では、近接は、複製起点の１ｋｂ以内である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複製起点に近接していることに起因する多型の影響を和らげることにより、遺伝子関連のコピー数多型を判定する感度及び／または特異性を高める方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子座におけるＣＮＶを測定し、遺伝子座が複製起点に近接していることに起因するＣＮＶの量を判定し、例えば、細胞分裂に起因し得るＣＮＶの量を減算することにより、ゲノムＣＮＶを反映するように測定されたＣＮＶを補正することを含む。いくつかの実施形態では、ゲノムデータは、無細胞ＤＮＡから得られる。いくつかの実施形態では、負荷の測定値は、試料における腫瘍細胞のフラクションまたはＤＮＡのゲノム当量に関連する。いくつかの実施形態では、複製起点による多型は、対照試料または細胞株のセットから推定される。いくつかの実施形態では、隠れマルコフモデル、回帰モデル、主成分分析に基づくモデル、または遺伝子型修飾モデルを使用して、複製起点に起因する変異を模倣する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００６１０７２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、体細胞及び生殖細胞由来の核酸分子の混合物など、対象の無細胞生体試料の体細胞供給源由来の単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の検出のための方法及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、本システム及び方法は、クラスラベル付きトレーニングデータを生成することと、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の各ベースコールごとに１つの出力を有する機械学習ユニットを形成することと、生体試料のトレーニングセットで機械学習ユニットをトレーニングすることと、機械学習ユニットを適用して、無細胞生物試料中の体細胞供給源からＳＮＶを検出することであって、該無細胞生物試料が、体細胞及び生殖細胞供給源由来の核酸分子（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ））の混合物、例えば、体細胞変異及び生殖細胞系ＤＮＡを含む細胞を含み得る、ことにより、対象の無細胞生体試料の体細胞供給源から単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を検出する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００５８３３２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、体細胞または生殖細胞系変異型を検出する方法を含むことができ、該方法は、アッセイ混合物に所定のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を提供し、遺伝子アナライザーを使用して対象の試料の遺伝情報をキャプチャし、遺伝情報から遺伝的変異型を検出することと、を含み、変異型を、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）由来分子よりも長い長さを有するｇＤＮＡ由来の分子において存在する場合に生殖系列供給源由来として分類する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡのフラグメント長は約２００塩基超である。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡのフラグメント長は、少なくとも４００塩基または少なくとも５００塩基である。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡのフラグメント長は、ｃｆＤＮＡフラグメント長の分布よりも長くなっている。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡは、アッセイ混合物に添加される。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡは、濾過操作後、アッセイ混合物中に残る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡは、遠心分離操作後、アッセイ混合物中に残る。いくつかの実施形態では、約１％～５％のｇＤＮＡがアッセイ混合物に添加される。いくつかの実施形態では、少なくとも１％のｇＤＮＡがアッセイ混合物に添加される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）と無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の両方を含む試料を提供することと、対象のｇＤＮＡ由来の生殖細胞系遺伝子型の少なくとも１つの遺伝子座を判定することと、ｃｆＤＮＡの各遺伝子座で少なくとも１つの遺伝的変異型の定量的測定値を判定することと、遺伝的変異型の定量的測定値が生殖細胞系遺伝子型と一致しているかどうかを判定することと、定量的測定値が生殖細胞系遺伝子型と一致する場合、遺伝的変異型を生殖細胞系変異型としてコールするか、または定量的測定値が生殖細胞系遺伝子型と一致しない場合、体細胞変異体としてコールする、ことと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）において検出された遺伝的変異型の定量的測定を判定することと、測定が対象のヘテロ接合性遺伝子型と一致していると判定することと、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）由来の遺伝子座の対象の推定遺伝子型を判定することと、ｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型をｃｆＤＮＡにおいて検出された変異型と比較することと、ｃｆＤＮＡで検出された変異型がｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型と一致しない場合、その変異型を体細胞変異としてコールすることと、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型がホモ接合性であると判断された場合、その変異型を体細胞変異としてコールする。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％からなる群から選択された信頼度でヘテロ接合性であると判断された場合、その変異型を体細胞変異としてコールする。いくつかの実施形態では、遺伝的変異型の定量的測定値を判定することは、ｃｆＤＮＡのシークエンシングを含む。いくつかの実施形態では、対象の推定遺伝子型を判定することは、対象由来のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることを含む。いくつかの実施形態では、配列は、標的シークエンシング、単一分子リアルタイムシークエンシング、エクソンシークエンシング、電子顕微鏡に基づくシークエンシング、パネルシークエンシング、トランジスタ媒介性シークエンシング、直接シークエンシング、ランダムショットガンシークエンシング、サンガージデオキシ終結シークエンシング、全ゲノムシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、パイロシークエンシング、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、デュプレックスシークエンシング、サイクルシークエンシング、一塩基伸長シークエンシング、固相シークエンシング、ハイスループットシークエンシング、超並列シグネチャーシークエンシング、エマルションＰＣＲ、低変性温度ＰＣＲ（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）での共増幅、マルチプレックスＰＣＲ、可逆的ダイターミネーターによるシークエンシング、ペアエンドシークエンシング、ニアターム（ｎｅａｒ－ｔｅｒｍ）シークエンシング、エキソヌクレアーゼシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ショートリードシークエンシング、単一分子シークエンシング、合成によるシークエンシング法、リアルタイムシークエンシング、リバースターミネーターシークエンシング、ナノポアシークエンシング、４５４シークエンシング、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒシークエンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シークエンシング、ＭＳ－ＰＥＴシークエンシング、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１９４５２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及び一本鎖ＲＮＡから選択される少なくとも２つの形態の核酸を含む核酸集団を分析するための方法、組成物、及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）核酸の少なくとも１つの形態を少なくとも１つのタグ核酸と連結して、その形態を互いに区別することと、（ｂ）少なくとも１つが少なくとも１つの核酸タグに連結されている核酸の形態を増幅することであって、該核酸及び連結された核酸タグが、存在する場合、増幅され、増幅核酸を生成し、そのうち少なくとも１つの形態から増幅されたものがタグ付けされる、ことと、（ｃ）少なくとも一部がタグ付けされた増幅核酸の配列データをアッセイすることと、（ｄ）増幅核酸のタグ核酸分子を解読して、集団内の核酸の形態を明らかにし、配列データがアッセイされたタグ核酸分子に連結された増幅核酸の元の鋳型を提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の他の形態に対して少なくとも１つの形態を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、集団内の核酸の各形態の分子の少なくとも７０％がステップ（ｂ）で増幅される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの形態の核酸が集団に存在し、少なくとも２つの形態が、３つの形態のそれぞれを互いに区別する異なるタグ核酸形態に連結される。いくつかの実施形態では、集団内の少なくとも３つの形態の核酸のそれぞれは、異なるタグに連結される。いくつかの実施形態では、同じ形態の各分子は、同じ識別情報タグを含むタグ（例えば、同じまたは同じ配列を含むタグ）に連結される。いくつかの実施形態では、同じ形態の分子は、異なる種類のタグに連結される。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、集団内のＲＮＡから生成されたｃＤＮＡに組み込まれるタグ付けしたプライマーを用いて集団を逆転写に供することを含む。いくつかの実施形態では、逆転写は配列特異的である。いくつかの実施形態では、逆転写はランダムである。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡへと二本鎖化したＲＮＡを分解することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡを分離し、核酸タグを二本鎖ＤＮＡにライゲートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、１つまたは複数の捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによって分離される。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、一本鎖核酸上で機能するリガーゼを使用して一本鎖タグで一本鎖ＤＮＡを、及び二本鎖核酸上で機能するリガーゼを使用して二本鎖アダプターで二本鎖ＤＮＡを、別個にタグ付けすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、アッセイの前に、異なる形態の核酸を含むタグ付けした核酸をプールすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個々のアッセイで分割されたＤＮＡのプールを別々に分析することをさらに含む。アッセイは、同じでも、実質的に類似でも、同等でも、または異なっていてもよい。上記の方法のいずれにおいても、配列データは、体細胞もしくは生殖細胞系変異型、またはコピー数多型もしくは単一ヌクレオチド変異、またはインデルもしくは遺伝子融合の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、修飾の程度が異なる核酸を含む核酸集団を分析する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、疾患に関連する特性（例えば、５’メチルシトシンなど）のスクリーニング方法を含むことができる。本方法は、核酸集団を、修飾を有する核酸に優先的に結合する物質（例えば、メチル結合ドメインまたはタンパク質など）と接触させることと、該物質に結合した核酸の第１のプールを、該物質に結合していない核酸の第２のプールから分離することであって、核酸の第１のプールが修飾に対して過剰に提示され、第２のプール内の核酸が修飾に対して過少に提示される、ことと、第１のプール及び／または第２のプール内の核酸を、第１のプール及び第２のプール内の核酸を区別する１つまたは複数の核酸タグに連結して、タグ付けした核酸の集団を生成する、ことと、核酸及び連結タグが増幅されるタグ付けした核酸を増幅することと、増幅核酸及び連結タグの配列データをアッセイすることと、タグをデコードして、配列データがアッセイされた核酸が第１または第２のプールの鋳型から増幅されたかどうかを明らかにすることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸の少なくとも一部が１つまたは複数の修飾シトシン残基を含む核酸集団を分析する方法を含むことができる。本方法は、例えばビオチンなどの捕捉部分を集団内の核酸に連結して、増幅のための鋳型として機能させることと、増幅反応を実施して鋳型から増幅産物を生成することと、増幅産物から捕捉部分に連結された鋳型を分離することと、バイサルファイトシークエンシングにより、捕捉部分に連結された鋳型の配列データをアッセイすることと、増幅産物の配列データをアッセイすることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、５－メチルシトシンの程度が異なる核酸を含む核酸集団を分析する方法を含むことができる。本方法は、（ａ）核酸集団を、５－メチル化核酸に優先的に結合する物質と接触させることと、（ｂ）該物質に結合した核酸の第１のプールを、該物質に結合していない核酸の第２のプールから分離することであって、核酸の第１のプールが５－メチルシトシンに対して過剰に提示され、第２のプール内の核酸が５－メチルシトシンに過少に提示される、ことと、（ｃ）第１のプール及び／または第２のプール内の核酸を、第１のプール及び第２のプール内の核酸を区別する１つまたは複数の核酸タグに連結することであって、該核酸タグが捕捉部分（例えば、ビオチン）を含む第１のプール内の核酸に連結される、ことと、（ｄ）核酸及び連結タグが増幅される標識核酸を増幅することと、（ｅ）捕捉部分を持たない増幅核酸から捕捉部分を持つ増幅核酸を分離することと、（ｆ）分離され、増幅された核酸の配列データをアッセイすることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及び一本鎖ＲＮＡから選択される少なくとも２つの形態の核酸を含む核酸集団を分析する方法を含むことができ、少なくとも２つの形態のそれぞれが複数の分子を含む該方法は、少なくとも１つの核酸の形態を少なくとも１つのタグ核酸と連結して、形態を互いに区別することと、少なくとも１つが少なくとも１つの核酸タグに連結されている核酸の形態を増幅することであって、該核酸及び連結された核酸タグが増幅され、増幅核酸を生成し、そのうち少なくとも１つの形態から増幅されたものがタグ付けされる、ことと、少なくとも一部がタグ付けされた増幅核酸の配列データをアッセイすることであって、該アッセイが、集団内の核酸の形態を明らかにして配列データがアッセイされたタグ核酸分子に連結した増幅核酸の元の鋳型を提供するために、増幅核酸のタグ核酸分子を解読するのに十分な配列情報を得ることと、を含む。一実施形態では、本方法は、集団内の核酸の形態を明らかにして配列データがアッセイされたタグ核酸分子に連結した増幅核酸の元の鋳型を提供するために、増幅核酸のタグ核酸分子を解読するステップをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の他の形態に対して少なくとも１つの形態を濃縮することをさらに含む。別の実施形態では、集団内の核酸の各形態の分子の少なくとも７０％が増幅される。別の実施形態では、少なくとも３つの形態の核酸が集団に存在し、少なくとも２つの形態が、３つの形態のそれぞれを互いに区別する異なるタグ核酸形態に連結される。別の実施形態では、集団内の少なくとも３つの形態の核酸のそれぞれは、異なるタグに連結される。別の実施形態では、同じ形態の各分子は、同じタグ情報を含むタグに連結される。別の実施形態では、同じ形態の分子は、異なる種類のタグに連結される。別の実施形態では、本方法は、集団内のＲＮＡから生成されたｃＤＮＡに組み込まれるタグ付けしたプライマーを用いて集団を逆転写に供することをさらに含む。別の実施形態では、逆転写は配列特異的である。別の実施形態では、逆転写はランダムである。別の実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡへと二本鎖化したＲＮＡを分解することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡを分離し、核酸タグを二本鎖ＤＮＡにライゲートすることをさらに含む。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、１つまたは複数の捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによって分離される。別の実施形態では、本方法は、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅで一本鎖ＤＮＡを環状化し、核酸タグを二本鎖ＤＮＡにライゲートすることをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、アッセイの前に、異なる形態の核酸を含むタグ付けした核酸をプールすることを含む。別の実施形態では、核酸集団は体液試料に由来する。別の実施形態では、体液試料は、血液、血清、または血漿である。別の実施形態では、核酸集団は、無細胞核酸集団である。別の実施形態では、体液試料は、がんを有する疑いのある対象由来のものである。別の実施形態では、配列データは、体細胞または生殖細胞系変異型の存在を示す。別の実施形態では、配列データは、コピー数多型の存在を示す。別の実施形態では、配列データは、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、インデル、または遺伝子融合の存在を示す。別の実施形態では、配列データは、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、インデル、または遺伝子融合の存在を示す。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の身体試料から採取した核酸分子の集団を提供することと、１つまたは複数の特性に基づいて核酸分子の集団を分別して、核酸分子の複数の群を生成することであって、該複数の群のそれぞれの核酸分子が、別個の識別子を含む、ことと、核酸分子の複数の群をプールすることと、プールされた核酸分子の複数の群をシークエンシングして、複数セットの配列リードを生成することと、識別子に基づいて配列リードを分別することと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞ＤＮＡの断片化パターンを分析する方法を含むことができ、該方法は、生体試料から無細胞ＤＮＡの集団を提供することと、無細胞ＤＮＡの集団を分別し、これにより無細胞ＤＮＡの亜集団を生成することと、無細胞ＤＮＡの少なくとも１つの亜集団をシークエンシングし、これにより配列リードを生成することと、配列リードを参照ゲノムにアラインメントすることと、参照ゲノムの各塩基位置へマッピングされる各配列リードの長さ、配列リードの長さに応じて参照ゲノムの塩基位置へマッピングされる配列リードの数、参照ゲノムの各塩基位置で始まる配列リードの数、または、参照ゲノムの各塩基位置で終わる配列リードの数のいずれかの数を分析することにより、各亜集団の無細胞ＤＮＡの断片化パターンを判定することと、を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の特性は、メチル化、ヒドロキシメチル化、ホルミル化、アセチル化、及びグリコシル化からなる群から選択される化学修飾を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／００９７２３に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞核酸（例えば、ｃｆＤＮＡなど）を使用してヌクレオソームプロファイリングを実施するための方法、システム、及び組成物を含むことができる。これを使用して、新たなドライバー遺伝子を同定すること、コピー数多型（ＣＮＶ）を判定すること、体細胞変異ならびに融合及びインデルなどの構造多型を同定すること、ならびに上記の多型のいずれかを検出するための多重アッセイにおいて使用可能な領域を同定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の様々な使用を含むことができる。そのような使用には、疾患（例えば、がん）などの健康状態を有する、または有する疑いのある対象の治療を検出、モニタリング、及び判定することが含まれる。提供する方法は、起源組織、疾患、進行などを表すことができるフラグメントームプロファイルを評価するために、体細胞変異型情報を伴うまたは伴うことなく、配列情報をマクロスケールで包括的に使用し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントにおける遺伝子異常の存在または非存在を判定するためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、ゲノム内の複数の塩基位置にわたるＤＮＡフラグメントのマルチパラメトリック分布を構築することと、（ｂ）対象の第１の遺伝子座における遺伝子異常の存在または非存在を判定するために、第１の遺伝子座における各塩基位置の塩基同一性を考慮に入れることなく、マルチパラメトリック分布を使用することと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子異常は配列異常を含む。いくつかの実施形態では、配列異常は単一ヌクレオチド変異型（ＳＮＶ）を含む。いくつかの実施形態では、配列異常は、挿入もしくは欠失（インデル）、または遺伝子融合を含む。いくつかの実施形態では、配列異常は、（ｉ）単一ヌクレオチド変異型（ＳＮＶ）、（ｉｉ）挿入または欠失（インデル）、及び（ｉｉｉ）遺伝子融合からなる群から選択される２つまたはそれより多くの異なるメンバーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子異常は、コピー数多型（ＣＮＶ）を含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアライメントするＤＮＡフラグメントの長さを示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアライメントするＤＮＡフラグメントの数を示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数を示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、（ｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの数、及び（ｉｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数のうちの２つまたはそれより多くを示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は（ｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの数、及び（ｉｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数を示すパラメータを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象が臨床的意義の１つまたは複数のクラスに属する可能性を判定するための分類器を作成する方法を含むことができ、該方法は、ａ）１つまたは複数の臨床的意義の各クラスについて、臨床的意義のクラスに属する種の複数の各対象及び臨床的意義のクラスに属していない種の複数の各対象由来の無細胞ＤＮＡの集団を含むトレーニングセットを提供することと、ｂ）無細胞ＤＮＡの集団由来の無細胞ＤＮＡフラグメントをシークエンシングして、複数のＤＮＡ配列を生成することと、ｃ）無細胞ＤＮＡの各集団について、複数のＤＮＡ配列を種の参照ゲノムの１つまたは複数の各ゲノム領域にマッピングすることであって、各ゲノム領域が複数の遺伝子座を含む、ことと、ｄ）無細胞ＤＮＡの各集団について、複数の遺伝子座のそれぞれについて、トレーニングセットを得るための、（ｉ）遺伝子座にマッピングされるＤＮＡ配列、（ｉｉ）遺伝子座で開始するＤＮＡ配列、及び（ｉｉｉ）遺伝子座で終止するＤＮＡ配列から選択される少なくとも１つの特性の定量的尺度を示す値を含むデータセットを準備することと、ｅ）トレーニングセットでコンピュータベースの機械学習システムをトレーニングすることにより、対象が臨床的意義の１つまたは複数のクラスに属する可能性を判定するための分類器を作成することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象における異常な生物学的状態を判定する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の無細胞ＤＮＡから無細胞ＤＮＡフラグメントをシークエンシングして、ＤＮＡ配列を生成することと、ｂ）対象の種の参照ゲノム中の１つまたは複数のゲノム領域のそれぞれにＤＮＡ配列をマッピングすることであって、各ゲノム領域が複数の遺伝子座を含む、ことと、ｃ）複数の各遺伝子座について、（ｉ）遺伝子座にマッピングされるＤＮＡ配列、（ｉｉ）遺伝子座で開始するＤＮＡ配列、及び（ｉｉｉ）遺伝子座で終止するＤＮＡ配列から選択される少なくとも１つの特徴の定量的測定値を示す値を含むデータセットを準備することと、ｄ）データセットに基づいて、異常な生物学的状態の可能性を判定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントにおける遺伝子異常の存在または非存在を示す出力を生成するためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、無細胞ＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントの分布を、ゲノムの複数の塩基位置にわたって構築することと、（ｂ）コンピュータにより、１つまたは複数の各遺伝子座について、（１）１つまたは複数の遺伝子座の遺伝子座に関連するジヌクレオソーム保護されたＤＮＡフラグメントの数と、（２）遺伝子座に関連するモノヌクレオソーム保護されたＤＮＡフラグメントの数、またはその逆の比率を示す定量的尺度を計算することと、（ｃ）１つまたは複数の各遺伝子座についての定量的尺度を使用して、対象の１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子異常の存在または非存在を示す出力を判定することと、を含む。いくつかの実施形態では、分布は、１つまたは複数のマルチパラメトリック分布を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントの分布をデコンボリューションするためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、無細胞ＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントのカバレッジの分布を、ゲノムの複数の塩基位置にわたって構築することと、（ｂ）１つまたは複数の各遺伝子座について、コンピュータにより、カバレッジの分布をデコンボリューションし、これにより、コピー数（ＣＮ）成分、細胞クリアランス成分、及び遺伝子発現成分からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーに関連する寄与率を生成することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、試験対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントを使用して試験対象の遺伝子異常を判定するためのコンピュータ実装分類器を含むことができ、該方法は、（ａ）複数の対象のそれぞれから採取した無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の集団のそれぞれの分布スコアのセットの入力であって、各分布スコアが、（ｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの数、及び（ｉｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数のうちの少なくとも１つまたは複数に基づいて生成される、入力と、（ｂ）試験対象の１つまたは複数の遺伝子異常の分類器の出力と、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、トレーニングした分類器を作成するためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）複数の異なるクラスを提供することであって、各クラスが共通の特性を有する対象のセットを表す、ことと、（ｂ）各クラスから採取した複数の無細胞ＤＮＡ集団のそれぞれについて、無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）集団由来の無細胞ＤＮＡフラグメントを表すマルチパラメトリックモデルを提供し、これによりトレーニングデータセットを提供することと、（ｃ）コンピュータにより、トレーニングデータセットの学習アルゴリズムをトレーニングして、１つまたは複数のトレーニングされた分類器を作成することであって、各トレーニングされた分類器は、試験対象由来の無細胞ＤＮＡの試験集団を１つまたは複数の複数の異なるクラスに分類するように構成される、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象由来の試験試料を分類する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象由来の無細胞ＤＮＡの試験集団由来の無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントを表すマルチパラメトリックモデルを提供することと、（ｂ）トレーニングされた分類器を使用して、無細胞ＤＮＡの試験集団を分類することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、コンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、対象由来の無細胞ＤＮＡフラグメントから配列情報を生成することと、（ｂ）コンピュータにより、配列情報に基づいて無細胞ＤＮＡフラグメントを参照ゲノムにマッピングすることと、（ｃ）コンピュータにより、マッピングされた無細胞ＤＮＡフラグメントを分析し、参照ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで、（ｉ）塩基位置にマッピングされた無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｉｉ）塩基位置にマッピングされた各無細胞ＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉｉ）無細胞ＤＮＡフラグメントの長さに応じて塩基位置にマッピングされた無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｉｖ）塩基位置で開始する無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｖ）塩基位置で終止する無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｖｉ）長さに応じて塩基位置で開始する無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｖｉｉ）長さに応じて塩基位置で終止する無細胞ＤＮＡフラグメントの数からなる群から選択される複数の測定値を判定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントの分布をデコンボリューションするためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、無細胞ＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントのカバレッジの分布を、ゲノムの複数の塩基位置にわたって構築することと、（ｂ）１つまたは複数の各遺伝子座について、コンピュータにより、カバレッジの分布をデコンボリューションし、これにより、コピー数（ＣＮ）成分、細胞クリアランス成分、及び遺伝子発現成分からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーに関連する寄与率を生成することと、
を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、寄与率の少なくとも一部に基づいて、遺伝子異常の存在または非存在を示す出力を生成することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１８１１４６に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、早期がん検出に使用され得る方法及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）対象由来のｃｆＤＮＡを含む試料を提供することであって、該対象ががんを検出可能に示さない、ことと、（ｂ）シークエンシングパネルに覆われた試料のｃｆＤＮＡ分子を捕捉することであって、該シークエンシングパネルが、複数の異なる遺伝子のそれぞれの１つまたは複数の領域を含み、（ｉ）該シークエンシングパネルが、５０，０００ヌクレオチド以下であり、（ｉｉ）異なる遺伝子のいずれかにおける腫瘍マーカーの存在が、対象ががんを有することを示し、（ｉｉｉ）がんを有する対象の少なくとも８０％が、複数の異なる遺伝子の少なくとも１つに存在する腫瘍マーカーを有する、ことと、（ｃ）捕捉されたｃｆＤＮＡ分子を、０．０１％という低い試料内の頻度で腫瘍マーカーを検出するのに十分な読み取り深度までシークエンシングすることと、を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍マーカーは、一塩基置換、コピー数多型、インデル、遺伝子融合、塩基転換、転座、逆位、欠失、異数性、部分異数性、倍数性、染色体不安定性、染色体構造変化、染色体融合、遺伝子切断、遺伝子増幅、遺伝子複製、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾の異常変化、エピジェネティックパターンの異常変化、及び核酸メチル化の異常変化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんを有する対象の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、複数の異なる遺伝子の少なくとも１つに存在する腫瘍マーカーを有する。いくつかの実施形態は、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子を、０．００５％、０．００１％または０．０００５％という低い試料内の頻度で腫瘍マーカーを検出するのに十分な読み取り深度までシークエンシングすることを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．対象由来の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）分子を含む試料を提供することであって、該対象ががんを検出可能に示さない、ことと、ｂ．シークエンシングパネルに覆われた試料のｃｆＤＮＡ分子を捕捉することであって、該シークエンシングパネルが、複数の異なる遺伝子のそれぞれの１つまたは複数の領域を含み、ｉ．該シークエンシングパネルが５０，０００ヌクレオチド以下であり、ｉｉ．異なる遺伝子のいずれかにおける腫瘍マーカーの存在は対象ががんを有することを示し、ｉｉｉ．がんを有する対象の少なくとも８０％が複数の異なる遺伝子の少なくとも１つに存在する腫瘍マーカーを有する、ことと、ｃ．捕捉されたｃｆＤＮＡ分子を、１．０％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０７５％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、または０．００５％という低い試料内の頻度で腫瘍マーカーを検出するのに十分な読み取り深度までシークエンシングすることと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象のがんを検出するための方法を含むことができ、該方法は、がんに関連する１つまたは複数の遺伝的変異型を検出するために、１塩基あたり少なくとも５０，０００リードの深さで対象由来の循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）をシークエンシングすることと、を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり少なくとも１００，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり約１２０，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり約１５０，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり約２００，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、１塩基あたりのリードは、少なくとも５，０００の元の核酸分子、少なくとも１０，０００の元の核酸分子、少なくとも２０，０００の元の核酸分子、少なくとも３０，０００の元の核酸分子、少なくとも４０，０００の元の核酸分子、または少なくとも５０，０００の元の核酸分子を表す。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃｆＤＮＡの配列情報を、健康な個体のコホート、がん患者のコホート、または対象由来の生殖細胞系ＤＮＡから得られた配列情報と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、シークエンシングの前にｃｆＤＮＡを増幅すること、及びシークエンシングから得られた配列リードからコンセンサス配列を判定して増幅またはシークエンシングからのエラーを低減することをさらに含む。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、分子ごとに実施される。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、塩基ごとに実施される。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の検出は、観測されたシークエンシング出力、ならびに個々の試料、試料のバッチ、または試料の参照セットのシークエンシング及び増幅エラープロファイル特性に基づいて潜在的ヌクレオチドのそれぞれの可能性を評価することに基づく。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、対象に由来する個々のｃｆＤＮＡ分子にタグを付加する分子バーコードを使用して実施する。いくつかの実施形態では、ヒト参照から逸脱したコンセンサス配列を有する分子のセットを、実験室で処理された他の試料で観察されたものと比較して、潜在的な汚染事象を判定し、除外した。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、コンセンサス配列を健康な個体のコホート、がん患者のコホート、または対象由来の生殖細胞系ＤＮＡから得られた配列情報と比較することにより最適化した。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に由来する試料中のｃｆＤＮＡの少なくとも２０％がタグ付けされるように、ｃｆＤＮＡ分子にバーコードをタグ付けすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグ付けは、バーコードを含むアダプターを結合させることによって実施する。いくつかの実施形態では、アダプターは、平滑末端アダプター、制限酵素オーバーハングアダプター、または単一ヌクレオチドオーバーハングを有するアダプターのいずれか、またはその全てを含む。いくつかの実施形態では、単一ヌクレオチドオーバーハングを有するアダプターは、Ｃテールアダプター、Ａテールアダプター、Ｔテールアダプター、及び／またはＧテールアダプターを含む。いくつかの実施形態では、タグ付けは、バーコードを有するプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって実施する。いくつかの実施形態では、バーコードは一本鎖である。いくつかの実施形態では、バーコードは二本鎖である。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃｆＤＮＡをパーティションに分割することをさらに含む。いくつかの実施形態では、各パーティション内のｃｆＤＮＡは、各パーティションごとに固有にタグ付けされる。いくつかの実施形態では、各パーティション内のｃｆＤＮＡは、各パーティションごとに非固有にタグ付けされる。いくつかの実施形態では、各パーティションのｃｆＤＮＡはタグ付けされない。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、がんを有する、またはがんを有すると疑われる対象において腫瘍を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象から採取した無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料に由来する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子のシークエンシングと、（ｂ）シークエンシングに由来する配列リードを分析して、（ｉ）ｃｆＤＮＡ分子中での循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）及び（ｉｉ）ｃｆＤＮＡにおける１つまたは複数のドライバー変異、を同定することと、（ｃ）ｃｔＤＮＡ分子内の１つまたは複数のドライバー変異の存在、非存在、または量に関する情報を使用して、（ｉ）対象の腫瘍及び（ｉｉ）対象によって採られる腫瘍の治療のためのアクションを同定することと、を含む。本方法は、少なくとも８５％の感度、少なくとも９９％の特異性、及び少なくとも９９％の診断精度で対象の腫瘍を検出する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１３６６０３に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、がんの進化を検出またはモニタリングするための方法及びシステムを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、コンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）第１の時点において、がんを有する複数の対象に関する情報を得ることであって、該情報が、複数の対象のそれぞれの対象について、少なくとも、無細胞体液からの核酸のジェノタイピングを行うことによって得られた腫瘍の遺伝子プロファイル及び第１の時点の前に対象に提供された任意の処置を含む、ことと、第１の状態のセットを生成するために第１の時点での情報に基づいて複数の対象のそれぞれの第１の状態を判定することと、（ｂ）第１の時点よりも後の１つまたは複数の第２の時点において、複数の対象に関する情報を得て、１つまたは複数の第２の時点のうちの所与の一時点における情報に基づいて、後続状態のセットを生成する、１つまたは複数の第２の時点のそれぞれにおける複数の対象のそれぞれの第２の状態を判定することと、（ｃ）（ａ）の第１の状態のセット及び（ｂ）の後続状態のセットを使用することであって、所与の第１の状態が、所与の第１の状態よりも後の後期時点における状態のセットの中で、第２の状態をもたらす確率を判定するように構成される予測アルゴリズムを生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）早期時点における状態のセットの中での所与の第１の状態に関して、所与の第１の状態が、後期時点における状態のセットの中で第２の状態をもたらす確率を判定することと、（ｅ）（ｄ）において判定された確率を示す電子出力を生成することとをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、コンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）第１の時点において、がんを有する複数の対象に関する情報を得ることであって、該情報が、複数の対象のそれぞれの対象について、少なくとも５０個の遺伝子のジェノタイピングを行うことによって得られた腫瘍の遺伝子プロファイル及び第１の時点の前に対象に提供された任意の処置を含む、ことと、第１の状態のセットを生成するために第１の時点での情報に基づいて複数の対象のそれぞれの第１の状態を判定することと、（ｂ）第１の時点よりも後の１つまたは複数の第２の時点において、複数の対象に関する情報を得て、１つまたは複数の第２の時点のうちの所与の一時点における情報に基づいて、後続状態のセットを生成する、１つまたは複数の第２の時点のそれぞれにおける複数の対象のそれぞれの第２の状態を判定することと、（ｃ）（ａ）の第１の状態のセット及び（ｂ）の後続状態のセットを使用することであって、所与の第１の状態が、所与の第１の状態よりも後の後期時点における状態のセットの中で、第２の状態をもたらす確率を判定するように構成される予測アルゴリズムを生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）早期時点における状態のセットの中での所与の第１の状態に関して、所与の第１の状態が、後期時点における状態のセットの中で第２の状態をもたらす確率を判定することと、（ｅ）（ｄ）において判定された確率を示す電子出力を生成することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、情報を得ることは、複数の対象由来の無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）をシークエンシングすることと、任意選択で、複数の対象のそれぞれの問診を実施することと、を含む。いくつかの実施形態では、処置は、第１の時点の前に対象に提供された。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の決定木を生成することを含み、それぞれの決定木が、ルートノード、１つまたは複数の決定ブランチ、１つまたは複数の決定ノード、及び１つまたは複数の終端ノードを含み、ルートノードにおける状態が、第１の時点を表し、１つまたは複数の決定ブランチが、代替処置を表し、１つまたは複数の決定ノード及び１つまたは複数の終端ノードが、後続状態を表す。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の決定ブランチは、複数の決定ブランチを含む。いくつかの実施形態では、後続状態は、対象が生きているかまたは死んでいるかを示す対象の生存状態（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、後続状態は、対象生存率を含む。いくつかの実施形態では、第１の状態のそれぞれは、１つまたは複数の体細胞変異の共通のセットを含む。いくつかの実施形態では、情報は、対象のプロファイルをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）第１の時点において、がんを有する対象に関する情報を得ることであって、該情報が、患者プロファイル、腫瘍プロファイル、または処置から対象の少なくとも１つの特徴を含む、ことと、（ｂ）第１の時点における情報に基づいて、対象の初期状態を判定することと、（ｃ）対象の初期状態に基づいて、１つまたは複数の後続時点のそれぞれにおいて、複数の後続状態のそれぞれの確率を判定し、それにより状態の転帰に関する確率のセットを提供することと、（ｄ）状態の転帰に関する確率のセットに少なくとも部分的に基づいて、対象が特定の転帰を得る確率を最適化する、がんの処置の推奨を作成することと、（ｅ）（ｄ）において作成された推奨を示す電子出力を生成することと、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、確率は、少なくとも部分的に、複数の処置選択肢の中からの処置選択の関数である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の後続時点は、複数の後続時点を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の後続時点において、確率を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、時点は、少なくとも３つの時点を含む。いくつかの実施形態では、時点は、少なくとも４つの時点を含む。いくつかの実施形態では、第１の時点は、対象が処置を受ける前であり、後続時点は、対象が処置を受けた後である。いくつかの実施形態では、第２の処置が、後続時点における後続状態に基づいて、後続時点の後に投与される。いくつかの実施形態では、対象の少なくとも１つの特徴は、患者プロファイルからであり、年齢、性別、遺伝子プロファイル、酵素レベル、器官機能、生活の質、医療介入の頻度、寛解の状況、及び患者の転帰からなる群から選択される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）通信ネットワーク上で、１つまたは複数の医療サービス提供者との１つまたは複数の通信リンクを確立することと、（ｂ）通信ネットワーク上で、１つまたは複数の医療サービス提供者から、１つまたは複数の対象に関する医療情報を受信することと、（ｃ）医療サービス提供者から、１つまたは複数の対象のそれぞれに由来する無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）を含む１つまたは複数の試料を受け取ることと、（ｄ）ｃｆＤＮＡをシークエンシングし、ｃｆＤＮＡに存在する１つまたは複数の遺伝的変異型を同定することと、（ｅ）１つまたは複数の対象のそれぞれについての情報を有するデータベースを作成または供給することであって、該情報が、同定された遺伝的変異型及び受信された医療情報の両方を含む、ことと、（ｆ）データベース及びコンピュータにより実装されるアルゴリズムを使用して、対象の初期状態に基づいて、複数の異なる治療介入のそれぞれについて、後続状態の確率を予測する、少なくとも１つの予測モデルを生成することと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサによって実行される際に、以下の方法：（ａ）第１の時点において、がんを有する複数の対象に関する情報を得ることであって、該情報が、複数の対象のそれぞれの対象について、少なくとも、無細胞体液からの核酸のジェノタイピングを行うことによって得られた腫瘍の遺伝子プロファイル及び第１の時点の前に対象に提供された任意の処置を含む、ことと、第１の状態のセットを生成するために第１の時点での情報に基づいて複数の対象のそれぞれの第１の状態を判定することと、（ｂ）第１の時点よりも後の１つまたは複数の第２の時点において、複数の対象に関する情報を得て、１つまたは複数の第２の時点のうちの所与の一時点における情報に基づいて、後続状態のセットを生成する、１つまたは複数の第２の時点のそれぞれにおける複数の対象のそれぞれの第２の状態を判定することと、（ｃ）（ａ）の第１の状態のセット及び（ｂ）の後続状態のセットを使用することであって、所与の第１の状態が、所与の第１の状態よりも後の後期時点における状態のセットの中で、第２の状態をもたらす確率を判定するように構成される予測アルゴリズムを生成することと、を遂行する、機械実行可能なコードを含む、非一時的なコンピュータ可読媒体を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象に関する、少なくとも、腫瘍の遺伝子プロファイル及び対象に以前提供されていたかまたは現在提供されている処置があればそれを含む、情報を得て、該情報に基づいて、対象の初期状態を判定することと、（ｂ）決定木を提供することであって、ルートノードが、初期対象状態を表し、決定ブランチが、対象に利用可能な代替処置を表し、機会ノードが、不確実性の点を表し、決定ノードまたは終端ノードが、後続状態を表す、ことと、（ｃ）対象が終端ノードにおいて生存している状態を達成する確率を最大化する、対象の処置過程を提供することと、（ｄ）処置過程を対象に投与することと、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）初期状態よりも後の第２の時点において、対象に関する、少なくとも、腫瘍の遺伝子プロファイル及び対象に以前提供されていたかまたは現在提供されている処置があればそれを含む、情報を得て、該情報に基づいて、複数の後続状態の中から、対象の第２の状態を判定することと、（ｆ）第２の状態に基づいて、対象が終端ノードにおいて生存している状態を達成する確率を最大化する、対象の後続の処置過程を提供することと、（ｇ）後続の処置過程を対象に投与することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）初期状態よりも後の第２の時点において、対象に関する、少なくとも、腫瘍の遺伝子プロファイル及び対象に以前提供されていたかまたは現在提供されている処置があればそれを含む、情報を得て、該情報に基づいて、複数の後続状態の中から、対象の第２の状態を判定することと、（ｆ）第２の状態に基づいて、対象が終端ノードにおいて生存している状態を達成する確率を最大化する、対象の後続の処置過程を提供することと、（ｇ）後続の処置過程を対象に投与することと、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０１７，７５９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸フラグメントのライブラリを調製する方法、より具体的には、例えば次世代ＤＮＡシークエンシングを含む様々な用途のためのプロテアーゼを使用して単一チューブ内で核酸フラグメントのライブラリを調製する方法を含むことができる。加えて、（ａ）細胞集団を溶解試薬と直接接触させて細胞溶解液を生成することであって、該溶解試薬は１つまたは複数のプロテアーゼを有し、該細胞溶解液は標的核酸を含む、ことと、（ｂ）１つまたは複数のプロテアーゼを不活性化して不活性化された細胞溶解液を形成することと、（ｃ）標的核酸及びトランスポゾン末端組成物が転位反応を受けて混合物を生成する条件下で、少なくとも１つのトランスポザーゼ及び転移鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物を不活性化細胞溶解液に直接適用することであって、（ｉ）該標的核酸を断片化して複数の標的核酸フラグメントを生成し、（ｉｉ）トランスポゾン末端組成物の転移鎖を複数の標的核酸フラグメントのそれぞれの５’末端に結合して、複数の５’タグ付けした標的核酸フラグメントを生成する、ことと、を含むタグ付けした核酸フラグメントのライブラリを調製する方法である。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、単一の反応混合物、例えばチューブ内で実施される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞の最小集団である。いくつかの実施形態では、細胞の最小集団には、１、２、３、４、または５個の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、該標的核酸は、ステップ（ｃ）でトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を適用する前に二本鎖ＤＮＡのままである。いくつかの実施形態では、標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は染色体ＤＮＡまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸には、ゲノムまたは部分ゲノムが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）３’タグが５’タグ付けした標的核酸フラグメントに結合して複数の二重タグ付けした（ｄｉ－ｔａｇｇｅｄ）標的核酸フラグメントを生成する条件下で、ステップ（ｃ）の混合物を、少なくとも１つの核酸修飾酵素と直接インキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は単一の反応チューブで実施される。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）１つまたは複数の二重タグ付けした標的核酸フラグメントを増幅して、二重タグ付けした核酸フラグメントの５’末端及び／または３’末端に追加配列を有するタグ付けした核酸フラグメントのライブラリを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）は単一の反応チューブで実施される。いくつかの実施形態では、増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写媒介増幅反応、またはループ媒介増幅反応の１つまたは複数の使用を含む。いくつかの実施形態では、増幅には、二重タグ付けした標的ＤＮＡフラグメントの３’タグに相補的な単一のプライマーを使用したＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、増幅は、第１及び第２のプライマーを使用するＰＣＲを含み、第１のプライマーの少なくとも３’末端部分は、二重タグ付け標的核酸フラグメントの３’タグの少なくとも一部に相補的であり、第２のプライマーの少なくとも３’末端部分は、二重タグ付けした標的核酸フラグメントの５’タグの少なくとも一部の配列を示す。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの５’末端部分は、二重タグ付けした標的核酸フラグメントの３’タグに対して非相補的であり、第２のプライマーの５’末端部分は、二重タグ付けした標的核酸フラグメントの５’タグの少なくとも一部の配列を示さない。いくつかの実施形態では、第１のプライマーは第１のユニバーサル配列を含み、及び／または第２のプライマーは第２のユニバーサル配列を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ付けした核酸フラグメントをシークエンシングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグ付けした核酸フラグメントのシークエンシングには、合成によるシークエンシング法、ブリッジＰＣＲ、連鎖停止シークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ナノポアシークエンシング、及びライゲーションによるシークエンシングの１つまたは複数の使用を含む。いくつかの実施形態では、タグ付けした核酸フラグメントのシークエンシングには、次世代シークエンシングの使用を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、コピー数多型を分析することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、単一ヌクレオチド変異を分析することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９４４，９２４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、次世代シークエンシングにおける特定用途向け捕捉プライマーの使用を含むことができる。固定化された捕捉プライマーを改変する方法には、以下：ａ）ｉ）特定用途向け捕捉領域を含む３’部分及びｉｉ）ユニバーサル捕捉領域を含む５’部分を含む、固定化された特定用途向け捕捉プライマーを有する固体支持体を提供することと、ｂ）固定化された特定用途向けポリヌクレオチドを生成するためにハイブリダイゼーションに十分な条件下で特定用途向けポリヌクレオチドを特定用途向け捕捉プライマーと接触させることと、ｃ）特定用途向けポリヌクレオチドにハイブリダイズしていない特定用途向け捕捉プライマーの特定用途向け捕捉領域を取り除き、ハイブリダイズされていない特定用途向け捕捉プライマーをユニバーサル捕捉プライマーに変換することと、を含むことができる。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉領域の一部が取り除かれる。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉プライマーは、複数の異なる特定用途向け固定化捕捉プライマーを含む。いくつかの実施形態では、特定用途向けポリヌクレオチドは、複数の異なる特定用途向けポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉領域は標的特異的な捕捉領域を含み、特定用途向けポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉領域はトランスポゾン末端（ＴＥ）領域を含み、特定用途向けポリヌクレオチドはＴＥオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップｃ）の実行前に、特定用途向け捕捉プライマーのユニバーサル捕捉領域とのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに十分な条件下でオリゴヌクレオチドを適用して、二本鎖ＤＮＡ領域を生成することをさらに含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップｃ）の実行前に、特定用途向け捕捉プライマーの特定用途向け捕捉領域とのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに十分な条件下でオリゴヌクレオチドを適用して、二本鎖ＤＮＡ領域を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、特定用途向け捕捉プライマーをヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、特定用途向けポリヌクレオチドとハイブリダイズしない特定用途向け捕捉プライマーの特定用途向け捕捉領域はヌクレアーゼによって除去される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩである。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９９２５９８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、アンプリコン調製のための方法を含むことができる。本方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸試料を、ハイブリダイゼーションにとって十分な条件下で少なくとも１つのプライマーと接触させることであって、該少なくとも１つのプライマーはアダプターを含む、ことと、（ｂ）複数のアンプリコンを生成するために、複数の標的ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することと、（ｃ）固体支持体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で該複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該固体支持体はさらに、複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む、ことと、（ｄ）該複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長させて、標的ポリヌクレオチドに対し相補的な複数の固定化伸長生成物を生成することと、（ｅ）該複数の固定化伸長生成物に対して複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールすることと、（ｆ）ＰＣＲにより該複数の固定化伸長生成物を増幅し、第２の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該固定化アンプリコンの集団は８５％以上の均一性を備える、ことと、を含む。本方法は、１０ｎｇ以下の入力核酸とともに使用することが可能であり、さらに、第２の複数の固定化アンプリコンのシークエンシングを含むことが可能である。本方法はまた、がん関連遺伝子を含む、障害または疾患に関連した遺伝子の存在を判定するために使用可能である。無細胞ＤＮＡも本方法で用いることが可能である。加えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸配列変異型の検出感度を高める方法を含むことができ、該方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸試料を、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で遺伝子特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させることであって、該遺伝子特異的フォワードプライマーの各種は固有の配列インデックス及びアダプターを含む、ことと、（ｂ）複数のアンプリコンを生成するために、複数の標的ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することと、（ｃ）固体支持体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で該複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該固体支持体はさらに、複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む、ことと、（ｄ）該複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長させて、標的ポリヌクレオチドに対し相補的な複数の固定化伸長生成物を生成することと、（ｅ）該複数の固定化伸長生成物に対して複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールすることと、（ｆ）ＰＣＲにより該複数の固定化伸長生成物を増幅し、第２の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該第２の複数の固定化アンプリコンは８５％以上の均一性を備える、ことと、（ｇ）該第２の複数の固定化アンプリコンをシークエンシングすることと、（ｈ）標的ポリヌクレオチド種に関して、変異型位置にある３つ以上のヌクレオチド配列を比較することにより、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドに関するランダムな配列エラーを解消することであって、該標的ポリヌクレオチド種を固有の配列インデックスにより同定し、これにより１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドにおける真のヌクレオチド配列変異型を判定する、ことと、を含む。本方法は、変異型ヌクレオチド位置について０．３％以下のミスマッチ率を検出することが可能である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，８７９，３１２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸の選択的濃縮法を含むことができる。いくつかの実施形態は、標的核酸を含む長い核酸の選択的濃縮を含む。いくつかの実施形態は、ＰＣＲ産物の選択的濃縮を含む。上記方法のいくつかの実施形態は、（ａ）核酸の集団をニッカーゼと接触させ、これにより、ニックの入った核酸の集団を生成することと、（ｂ）ニックの入った核酸の集団をエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、一本鎖部分を有する核酸が生成され、該一本鎖部分が標的の少なくとも一部を含む、ことと、（ｃ）捕捉プローブを標的の少なくとも一部に接触させ、該プローブが標的にハイブリダイズする、ことと、（ｄ）捕捉プローブに結合していない核酸から捕捉プローブにハイブリダイズした核酸を分離することと、を含む。他の実施形態では、本方法は、（ａ）集団内の核酸の少なくともいくつかが標的を含む、核酸の集団を得ることと、（ｂ）核酸の集団をニッカーゼと接触させ、これにより、ニックの入った核酸の集団を生成することと、（ｃ）ニックの入った核酸の集団をエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、一本鎖部分を有する核酸が生成され、該一本鎖部分が標的の少なくとも一部を含む、ことと、（ｄ）捕捉プローブを標的の少なくとも一部に接触させ、該プローブが標的にハイブリダイズする、ことと、（ｅ）捕捉プローブに結合していない核酸から捕捉プローブにハイブリダイズした核酸を分離することと、を含む。本方法のいくつかの実施形態は、捕捉プローブからハイブリダイズした核酸を放出するステップも含む。他の実施形態はまた、標的を増幅することを含む。なおさらなる実施形態は、標的の少なくとも一部をシークエンシングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプロセスステップ、例えばステップ（ａ）は、二本鎖核酸の集団をニッカーゼのアイソシゾマーを含むＩＩ型制限エンドヌクレアーゼと接触させることと、個々の核酸の分子内再循環を促進する条件下で、切断された二本鎖核酸を再循環させることもまた含むことができる。かかる実施形態において、様々なＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、またはＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの組み合わせを使用することができる。いくつかの実施形態では、例えば、制限エンドヌクレアーゼにはＢｂｖＣＩを含む。他の実施形態では、ニッカーゼはＮｂ．ＢｂｖＣＩ及びＮｔ．ＢｂｖＣＩを含む。上記方法のいくつかの実施形態では、プローブは捕捉部分を含む。一部のそのような実施形態では、捕捉部分はビオチンまたはストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブに結合していない核酸から捕捉プローブにハイブリダイズした核酸を分離するステップは、ハイブリダイズした標的及びプローブを結合部分に接触させることも含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、アビジン及びストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、結合部分はまた、ビーズ、ミクロスフェア、または他の粒子を含む。方法の実施形態は、プロセスの１つまたは複数のステップを繰り返すことも含む。ある特定の実施形態では、方法の全てのステップは繰り返される。上記方法のいくつかの実施形態では、標的は第１の捕捉部分を含み、プローブは第２の捕捉部分を含む。一部のそのような実施形態はまた、第１の捕捉部分を第１の結合部分に接触させ、それにより、標的の濃縮をもたらすことと、第２の捕捉部分を第２の結合部分に接触させ、それにより、プローブの濃縮をもたらすことと、を含む。上記に加えて、前述の方法のいくつかの実施形態は、以下のステップ：（ａ）核酸の集団を提供することであって、集団中の少なくとも一部の核酸が捕捉プローブとハイブリダイズした標的を含む、ことと、（ｂ）ハイブリダイズしたプローブを標的にロックさせることと、（ｃ）プローブにロックされた核酸を、プローブにロックされていない核酸から分離することを含む核酸の選択的濃縮ももたらす。他の実施形態では、本方法は、（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が標的を含む、核酸の集団を得ることと、（ｂ）標的を捕捉プローブとハイブリダイズさせることと、（ｃ）プローブハイブリダイズしたプローブを標的にロックすることと、（ｄ）プローブにロックされた核酸を、プローブにロックされていない核酸から分離することと、を含む。上記に加えて、本方法のいくつかの実施形態は、核酸の選択的濃縮のための以下の方法：（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が、核酸の５’末端の一部及び核酸の３’末端の一部を含む標的を含む、核酸の集団を提供することであって、該標的は一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブにハイブリダイズされ、第１のオリゴヌクレオチドは、核酸の５’末端の少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端の少なくとも一部に相補的である、ことと、（ｂ）セレクタープローブを標的に結合することと、（ｃ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離する、ことも含む。濃縮方法の他の実施形態は、以下のステップ：（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が標的を含む、核酸の集団を得ることであって、該標的が核酸の５’末端の一部及び核酸の３’末端の一部を含む、ことと、（ｂ）一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブを得ることであって、第１のオリゴヌクレオチドは核酸の５’末端の少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端の少なくとも一部に相補的である、ことと、（ｃ）セレクタープローブを標的に接触させることであって、該プローブは標的にハイブリダイズする、ことと、（ｄ）セレクタープローブを標的に結合させることと、（ｅ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離することと、を含む。上記に加えて、本方法のいくつかの実施形態は、核酸の選択的濃縮のための以下の方法：（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が、核酸の５’末端及び核酸の３’末端を含む標的を含む、一本鎖核酸の集団を提供することであって、該標的は一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブにハイブリダイズされ、第１のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端に相補的な５’部分、スペーサー部分、及び核酸の５’末端に相補的な３’部分を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、スペーサー部分に相補的である、ことと、（ｂ）セレクタープローブを標的に結合することと、（ｃ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離する、ことも含む。上記方法の他の実施形態は、（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が標的を含む、一本鎖核酸の集団を得ることであって、該標的が核酸の５’末端及び核酸の３’末端を含む、ことと、（ｂ）一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブを得ることであって、第１のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端に相補的な５’部分、スペーサー部分、及び核酸の５’末端に相補的な３’部分を含み、第２オリゴヌクレオチドは、スペーサー部分に相補的である、ことと、（ｃ）セレクタープローブを標的に接触させることであって、該プローブは標的にハイブリダイズする、ことと、（ｄ）セレクタープローブを標的に結合させることと、（ｅ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離することと、を含む。いくつかの実施形態は、オリゴヌクレオチドの第１の集団の捕捉部分を欠くオリゴヌクレオチドに対する捕捉部分を含むオリゴヌクレオチドの比率を有するオリゴヌクレオチドの第１の集団を選択することを含む増幅核酸を正規化する方法と、オリゴヌクレオチドの第２集団を得る方法と、オリゴヌクレオチドの第１及び第２集団を有する標的核酸を増幅する方法と、組み込まれたオリゴヌクレオチド捕捉部分を欠く増幅標的から捕捉部分を含む組み込まれたオリゴヌクレオチドを有する増幅標的を分離する方法と、を含むことができる。いくつかの実施形態では、分離するステップは、ハイブリダイズした標的及びプローブを結合部分に接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、結合部分はアビジン及びストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、結合部分はまた、ビーズ、ミクロスフェア、または他の粒子を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，８２８，６７２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、シデロフォアを含む核酸調製用の試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、シデロフォアは細菌のシデロフォアである。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ－Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、試薬はＤＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、試薬はｄＮＴＰを含み得る。いくつかの実施形態では、試薬はＥＤＴＡを含まない。いくつかの実施形態は、核酸ライブラリを調製する方法を提供し、試料由来の複数の核酸分子を提供することと、シデロフォアを含む核酸調製用試薬において複数の核酸分子を操作することと、を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子を操作することは、複数の核酸分子を複数のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子及び／または複数のオリゴヌクレオチドプローブは、担体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子及び／または複数のオリゴヌクレオチドプローブは、結合パートナーペアを介して担体に固定化される。いくつかの実施形態では、担体は磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子を操作することは、複数の核酸分子に特異的に結合していないオリゴヌクレオチドプローブを除去することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の核酸分子に特異的に結合したオリゴヌクレオチドプローブを修飾することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の核酸分子を断片化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の核酸分子にアダプターを追加することを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、増幅によって複数の核酸分子に追加される。いくつかの実施形態は核酸分子への酸化的損傷を低減する方法を提供し、その方法は、ＥＤＴＡの非存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、シデロフォアの存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、シデロフォアは細菌のシデロフォアである。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ－Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、核酸分子をＦｅ（ＩＩＩ）に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、核酸分子を磁気ビーズに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、酸化的損傷は、核酸分子の点突然変異を含む。いくつかの実施形態では、点突然変異はＣからＡへの塩基転換である。いくつかの実施形態は、シークエンシング反応のＱ（ｐｈｒｅｄ）スコアを増加させる方法を提供し、該方法は、ＥＤＴＡの非存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、シデロフォアの存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、シデロフォアは細菌のシデロフォアである。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ－Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、Ｑスコアは約３４より大きい。いくつかの実施形態では、Ｑスコアは約３８より大きい。いくつかの実施形態では、Ｑスコアは約４２より大きい。いくつかの実施形態では、シークエンシング反応は、ディープシークエンシングアプリケーションである。いくつかの実施形態では、ディープシークエンシングアプリケーションは、がん関連のディープシークエンシングアプリケーションである。いくつかの実施形態では、本方法は、ＥＤＴＡの非存在下で核酸分子をシークエンシングすることを含む。いくつかの実施形態は、少なくとも１つの容器手段を含むキットを提供し、少なくとも１つの容器手段は、シデロフォアを含む核酸調製用の試薬を含む。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ－Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、試薬はＥＤＴＡを含まない。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７０８，６５５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ナノポアに固定または隣接するテザーを使用して事象を検出するための組成物、システム、及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の側面、第２の側面、ならびに第１及び第２の側面に広がる開口部を含むナノポアと、ヘッド領域、テール領域、及びそれらの間に配置された細長い本体を含む永久テザーと、を含む。ヘッド領域は、ナノポアの第１の側面または第２の側面に固定するか、または隣接させることができる。レポーター領域を含む細長い本体は、ナノポアの第１の側面に隣接して発生する第１の事象に応じて開口内で移動可能にすることができる。１つの非限定的な例では、ヘッド領域は、ナノポアの第１の側面または第２の側面に配置されたタンパク質などの分子に固定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、第１の側面、第２の側面、ならびに第１及び第２の側面に広がる開口部を含むナノポアを提供することと、ヘッド領域、テール領域、及びそれらの間に配置された細長い本体を含む永久テザーを提供することと、を含む。ヘッド領域は、ナノポアの第１または第２の側面に固定するか、または隣接させることができ、細長い本体はレポーター領域を含むことができる。本方法は、ナノポアの第１の側面に隣接して発生する第１の事象に応じてレポーターを開口内で移動させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、レポーター領域は、第１の事象に応じて開口内で並進移動可能である。これに加えてまたはこれに代えて、レポーター領域は、第１の事象に応じて開口内で回転運動可能であり得る。これに加えてまたはこれに代えて、レポーター領域は、第１の事象に応じて開口内で立体構造的に移動可能であり得る。いくつかの実施形態では、ヘッド領域は、共有結合を介してナノポアの第１の側面または第２の側面に固定されるか、または隣接する。ヘッド領域は、ナノポアの第１の側面に固定され得る。テール領域は、ナノポアの第２の側面に向かって自由に伸長可能である。いくつかの実施形態では、レポーター領域は、第１の事象に応じてナノポアの第１の側面に向かって並進移動可能である。レポーター領域は、第１の事象の後、第２の側面に向かって並進移動可能であり得る。レポーター領域はさらに、ナノポアの第１の側面に隣接して発生する第２の事象に応じて第１の側面に向かって並進移動可能であり得、第２の事象は第１の事象の後にある。レポーター領域はさらに、第２の事象の後、第２の側面に向かって並進移動可能であり得る。いくつかの実施形態では、第１の事象は、第１のヌクレオチドをポリヌクレオチドに追加することを含む。第２の事象を含む実施形態では、第２の事象は、ポリヌクレオチドに第２のヌクレオチドを追加することを含むことができる。レポーター領域の電気的または流束遮断特性は、細長い本体の別の領域の電気的または流束遮断特性とは異なり得る。いくつかの実施形態では、システムは、開口部を通る第１の電流または流束を測定するか、またはレポーター領域が第１の事象に応じて移動する間に第１の光信号を測定するように構成された構成及び測定回路を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６７０，５３０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ゲノムＤＮＡの高分子量セグメントを含むＤＮＡ試料のハプロタイプまたは部分的ハプロタイプを判定する方法を含むことができる。このような方法は、次の操作：（ａ）ＤＮＡ試料を処理して、第１のハプロタイプ由来の複数のアレルを有する第１の高分子量セグメント由来のＤＮＡが濃縮された濃縮ＤＮＡ試料を生成することと、（ｂ）濃縮ＤＮＡ試料中のＤＮＡをシークエンシングして、第１の高分子量セグメントよりも長さが短い複数の配列リードを生成することであって、該配列リードの一方には、第１のハプロタイプの第１のアレルが含まれ、該配列リードの他方には、第１のハプロタイプの第２のアレルが含まれる、ことと、（ｃ）配列リードを参照ゲノムにアラインメントして、アラインメントリードを生成することであって、第１の高分子量セグメント由来のアラインメントリードは、参照ゲノム上の島にクラスター化する傾向がある、ことと、（ｄ）参照ゲノム上の隣接するアラインメントリード間の分離距離を判定することであって、隣接するアラインメントリード間の分離距離が、分離距離の大きさで区別可能な少なくとも２つの群に分類される、ことと、（ｅ）カットオフ値よりも小さい、隣接するアラインメントリードまでの分離距離を有するアライメントリードの第１の群を選択し、それにより、より大きな分離距離を有するアラインメントリードを除外し、該アラインメントリードの第１の群の少なくとも一部が、参照ゲノム上の同じ島に属する、ことと、（ｆ）アラインメントリードの第１の群のアレルを使用して、第１のハプロタイプまたは第１の部分ハプロタイプを定義することと、を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、本方法には、第１の部分ハプロタイプ及び他の部分ハプロタイプから完全なハプロタイプを判定するという追加の操作がある。いくつかの実施形態では、アラインメントリードの第１の群の選択は、カットオフ値の判定を含む一例として、カットオフ値の判定は、（ｉ）隣接するアラインメントリード間の分離距離から混合モデルを作成することであって、該混合モデルが２つの分布を分離距離に適合させる、ことと、（ｉｉ）２つの分布の少なくとも１つのプロパティからカットオフ値を判定することと、を含む。場合によっては、２つの分布のそれぞれは、それ自体の中心傾向（例えば、ガウス分布の平均など）を含む。ある特定の実施形態では、アラインメントリードの第１の群の選択は、カットオフ値の判定を含む一例として、カットオフ値の判定は、（ｉ）隣接するアラインメントリード間の分離距離から混合モデルを作成することであって、該混合モデルが２つの分布を分離距離に適合させる、ことと、（ｉｉ）２つの分布の少なくとも１つのプロパティからカットオフ値を判定することと、を含む。場合によっては、２つの分布のそれぞれは、それ自体の中心傾向（例えば、ガウス分布の平均など）を含む。ある特定の実施形態では、混合モデルの生成は、隣接するアラインメントリード間の分離距離に期待値最大化手順を適用することを含む。一部の実施では、カットオフ値の判定は、短い分離距離を含む分布の確率質量の割合を特定する操作を含む。例えば、短い分離距離を含む分布の確率質量の割合は、約８０％以上になる場合がある。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５８７，２７３号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複合混合物から核酸配列の代表試料を選択する方法を含むことができる。本方法は、（ａ）複合混合物に集合的に存在する配列の所定の部分を含む１つまたは複数の核酸に相補的な捕捉プローブの集団とハイブリダイゼーションに十分な条件下で核酸の複合混合物を接触させて、１つまたは複数の核酸とプローブの集団のハイブリダイゼーション複合体を形成することであって、該捕捉プローブの集団が固体支持体に結合している、ことと、（ｂ）複合混合物の１０％未満で０．００１％を超える複合性を有する核酸の代表試料を選択するために非ハイブリダイズ核酸を除去することであって、該代表試料は、コピー中の他の全ての配列に対するコピー中の各配列の割合が、複合混合物内の１つまたは複数の核酸の所定部分の配列の割合と実質的に同じである核酸コピーを含む、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、完全なゲノムからゲノム配列の代表的な試料を選択する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、複合混合物の１０％未満で０．００１％を超える複合性を有する代表試料を含む核酸集団をさらに提供し、該代表試料は、コピー中の他の全ての配列に対するコピー中の各配列の割合が、複合混合物内の１つまたは複数の核酸に集合的に存在する所定部分の配列の割合と実質的に同じである核酸コピーを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５７４，２３４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸配列を分析するための方法及び組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、ビーズ上に捕捉したＤＮＡボールなどのクローンオブジェクトを利用する。いくつかの実施形態は、ビーズ及び１つのクローンオブジェクトを有する組成物を提供し、該クローンオブジェクトは、例えば、親和性結合パッチまたはハイブリダイゼーションパッチなど、ビーズの表面上のパッチを通じてビーズに親和性結合またはハイブリダイズされる。一部の態様では、パッチは、ビーズの表面上の単一の領域に結合した複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態は、親和性結合またはハイブリダイズしたクローンオブジェクトを有するビーズの集団もまた提供する。特定の実施形態では、クローンオブジェクトのそれぞれは、親和性結合パッチまたはハイブリダイゼーションパッチなど、各ビーズの表面上のパッチを通じてビーズに親和性結合またはハイブリダイズする。集団内の結合またはハイブリダイズしたクローンオブジェクトに対するビーズの比率は１：１であり得る。特定の実施形態では、集団内の特定のビーズに結合またはハイブリダイズされるクローンオブジェクトは１つだけである。これらの方法を使用して、ビーズ及び１つのクローンオブジェクトが、ビーズの表面上のパッチへの結合を通じて互いに親和性結合またはハイブリダイズされる組成物を作製することができる。いくつかの実施形態は、複数の捕捉部分を有するビーズを提供することと、複数の捕捉－補体部分を有する固体表面を提供することであって、該捕捉－補体部分が、切断可能な部分及び親和性リガンドをさらに含む、ことと、捕捉部分を捕捉－補体部分に特異的に結合し、これにより固体表面上に固定化ビーズを形成することと、ビーズ上の親和性リガンドを保持するために切断可能な部分を切断し、これによりビーズ上に親和性結合パッチを作製することによりビーズ上に親和性結合パッチを作製する方法を提供することができる。特定の実施形態では、捕捉部分または捕捉－補体部分またはその両方は、ポリヌクレオチドの捕捉配列を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ビーズの表面に結合した複数の第１のポリヌクレオチドを有するビーズを提供することであって、該第１のポリヌクレオチドがそれぞれ、捕捉配列を有する、ことと、固体表面に結合した複数の第２のポリヌクレオチドを有する固体表面を提供することであって、該第２のポリヌクレオチドがそれぞれ、捕捉－補体配列、切断可能部分、及び親和性リガンドを有する、ことと、第１のポリヌクレオチドの捕捉配列を第２のポリヌクレオチドの捕捉－補体配列にハイブリダイズさせ、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、第２の複数のポリヌクレオチド上の親和性リガンドを保持するために切断可能部分で第２のポリヌクレオチドを切断し、これによりビーズ上に親和性結合パッチを作製することにより、ビーズ上に親和性結合パッチを作製する方法を提供することができる。一部の態様では、本方法は、親和性リガンドを結合剤と接触させることにより、親和性結合パッチに結合した１つのクローンオブジェクトを作製することであって、該結合剤は２つ以上の結合部位を有する、ことと、単一のタンデムに繰り返される標的核酸分子を有する、クローンオブジェクト上の第２の親和性リガンドを通じて、１つのクローンオブジェクトを結合剤に結合し、これにより親和性結合パッチに結合された１つのクローンオブジェクトを作製することと、をさらに含む。いくつかの実施形態は、複数の第１の捕捉部分を有するビーズを提供することと、表面上のパッチにパターン形成された複数の第２の捕捉部分を有する固体表面を提供することであって、該第２の捕捉部分がそれぞれ切断可能な部分を有し、１つのクローンオブジェクトが１つまたは複数の第２の捕捉部分を介して表面上の１つのパッチに結合し、１つのクローンオブジェクトが単一のタンデムに繰り返される標的核酸分子を有する、ことと、第１の捕捉部分をクローンオブジェクトに特異的に結合し、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、クローンオブジェクトを保持するために切断可能部分を切断し、これにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製することにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製する方法を提供することができる。特定の実施形態では、捕捉部分はポリヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態は、複数の第１のポリヌクレオチドを有するビーズを提供することと、表面上のパッチにパターン形成された複数の第２のポリヌクレオチドを有する固体表面を提供することであって、該第２のポリヌクレオチドがそれぞれ切断可能な部分を有し、１つのクローンオブジェクトが表面の１つのポリヌクレオチドパッチにハイブリダイズし、１つのクローンオブジェクトが単一のタンデムに繰り返される標的核酸分子を有する、ことと、第１のポリヌクレオチドをクローンオブジェクトにハイブリダイズし、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、クローンオブジェクトを保持するために切断可能部分で第２のポリヌクレオチドを切断し、これにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製することにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製する方法を提供することができる。いくつかの実施形態は、ビーズの表面に結合した複数の第１のポリヌクレオチドを有するビーズを提供することであって、該第１のポリヌクレオチドがそれぞれ第１の捕捉配列を有する、ことと、固体表面に結合した複数の第２のポリヌクレオチドを有する固体表面を提供することであって、該第２のポリヌクレオチドがそれぞれ、第１の捕捉－補体配列及び第２の捕捉－補体配列を有する、ことと、第１のポリヌクレオチドの第１の捕捉配列を第２のポリヌクレオチドの第１の捕捉－補体配列にハイブリダイズさせ、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、鋳型として第２の捕捉－補体配列を使用して固定化ビーズの第１のポリヌクレオチドを伸長させ、これにより、第２の捕捉配列を有する、ビーズ上に伸長された第１のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションパッチを作製することにより、ビーズ上に親和性結合パッチを作製する方法を提供することができる。一部の態様では、本方法は、第２の捕捉－補体配列を有するクローンオブジェクトを提供することによりビーズ上のパッチに結合された１つのクローンオブジェクトを作製することと、クローンオブジェクトの第２の捕捉－補体配列をビーズの第２の捕捉配列にハイブリダイズさせ、これにより、ビーズ上のパッチに結合された１つのクローンオブジェクトを作製することと、をさらに含む。本方法の一部の態様では、第１のポリヌクレオチドの伸長方法は、親和性リガンドを有する１つまたは複数のヌクレオシド三リン酸を追加し、これによりビーズ上に親和性結合パッチを作製することを含む。いくつかの実施形態は、標的核酸分子を増幅する方法を含む。いくつかの実施形態は、親和性結合またはハイブリダイズしたクローンオブジェクトを有するビーズの組成物または集団をマイクロウェルを有する固体表面上に配置することにより標的核酸分子を増幅する方法であって、１つのビーズのみが１つのマイクロウェルに空間的に適合することができる、方法と、マイクロウェル内の該標的核酸を増幅し、これによりアンプリコンを形成する方法と、を提供する。一部の態様では、本方法は、合成によるシークエンシング法、ライゲーションによるシークエンシング、またはハイブリダイゼーションによるシークエンシングなどの方法を使用して、増幅された標的核酸分子をシークエンシングし、それにより、標的核酸分子の核酸配列を判定することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４５３，２５８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、最小限の色素セット、最小限の励起光源、及び最小限の発光フィルターを使用して、シークエンシング反応において４つ全てのヌクレオチドの取り込みを区別しながら、例えば、核酸配列などの配列の判定を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ポリヌクレオチドへの３つの異なるタイプの検出可能なヌクレオチドコンジュゲートの取り込みをシークエンシング反応で検出することと、ポリヌクレオチドへの３つの異なるタイプの検出可能なヌクレオチドの検出パターンに基づいて第４のタイプのヌクレオチドの取り込みを判定し、これによりポリヌクレオチドの配列を判定することと、を含むポリヌクレオチドの配列を判定する方法であって、該３つの異なるタイプの検出可能なヌクレオチドコンジュゲートの取り込みがシグナル状態から検出され、第４のタイプのヌクレオチドの取り込みが暗状態から判定される、方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、４つの修飾ヌクレオチド種を含む溶液をシークエンシングするためにポリヌクレオチド試料に適用することであって、３つの修飾ヌクレオチド種は１つまたは複数の検出部分、及びヌクレオチドと１つまたは複数の検出部分の間に位置する１つまたは複数のリンカーにコンジュゲートし、第４のヌクレオチド種は検出部分がない、ことと、シークエンシング反応において該修飾ヌクレオチドの取り込みのパターンを検出し、それにより第１の検出可能なパターンを捕捉する、ことと、１つまたは複数の組成物をシークエンシング反応に適用し、それにより第１の検出可能なパターンを変更することと、第２の検出可能なパターンを検出することと、検出可能なパターンに基づいてポリヌクレオチド試料の配列を判定することと、を含む、ポリヌクレオチドの配列を判定する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、シークエンシングのためのポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸、修飾デオキシリボ核酸、リボ核酸、及び修飾リボ核酸のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングのためのポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡライブラリ調製物である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドコンジュゲートは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはそれらの非天然ヌクレオチド類似体からなる群から選択されるヌクレオチド種を含む。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチド類似体は、可逆的ターミネーター部分を含み、ｒｂＡＴＰ、ｒｂＴＴＰ、ｒｂＣＴＰ、ｒｂＵＴＰ、及びｒｂＧＴＰからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの取り込みは、合成による配列、ライゲーションによる配列、及びハイブリダイゼーションによる配列、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、蛍光部分を検出することにより、３つのヌクレオチド種コンジュゲートが検出される。いくつかの実施形態では、蛍光部分は３つのヌクレオチドコンジュゲートと同じであるが、他の実施形態では、蛍光部分は１つまたは複数の異なる蛍光部分である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異なる蛍光成分が同じ発光フィルターにより検出される。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、蛍光共鳴エネルギー移動システム部分を含む。いくつかの実施形態では、第４のヌクレオチドの取り込みは、検出の欠如によって判定される。いくつかの実施形態では、検出可能な核酸コンジュゲートは蛍光によって検出される。いくつかの実施形態では、蛍光は、第１及び第２のイメージング事象によって検出され、さらなる実施形態では、第１及び第２のイメージング事象は時間的に分離される。いくつかの実施形態では、第１のイメージング事象は、第２のイメージング事象により検出された蛍光のパターンとは異なる蛍光のパターンを検出する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの取り込みは、第１及び第２のイメージング事象間の蛍光パターンの違いによって判定される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド種コンジュゲートは１つまたは複数のリンカー配列をさらに含み、さらなる実施形態では、１つまたは複数のリンカー配列は切断可能なリンカー及びスペーサーリンカーの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ジスルフィド、ジオール、ジアゾ、エステル、スルホン、アジド、アリル、及びシリルエーテルからなる群から選択される１つまたは複数の切断可能な連結基を含むが、好ましい実施形態では切断可能な連結基はジスルフィドである。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、１つまたは複数の、ポリエチレングリコールまたはそのコンカテマー及び２－｛２－［３－（２－アミノ－エチルカルボルニル）－フェノキシ］－１－アジド－エトキシ｝－エトキシ－酢酸である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサーリンカーは１つまたは複数の切断可能な連結基をさらに含み、切断可能な連結基は、ジスルフィド、ジオール、ジアゾ、エステル、スルホン、アジド、アリル、及びシリルエーテルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、ポリエチレングリコールまたはそのコンカテマーであるが、他の実施形態では、スペーサーリンカーは、２－｛２－［３－（２－アミノ－エチルカルボルニル）－フェノキシ］－１－アジド－エトキシ｝－エトキシ－酢酸である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドコンジュゲートは、ハプテン及び蛍光部分をさらに含んでも含まなくてもよい、ポリエチレングリコールリンカー及び２－｛２－［３－（２－アミノ－エチルカルボニル）フェノキシ］－１－アジド－エトキシ｝エトキシ－酢酸リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びジニトロフェノールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドコンジュゲートは、ストレプトアビジン－蛍光部分コンジュゲートを含むが、他の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドコンジュゲートは、抗ジゴキシゲニン及び抗ジニトロフェノールからなる群から選択される抗ハプテン抗体－蛍光部分コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドコンジュゲートは、２つの蛍光部分をさらに含む、ポリエチレングリコールリンカー及び２－｛２－［３－（２－アミノ－エチルカルボルニル）－フェノキシ］－１－アジド－エトキシ｝－エトキシ－酢酸リンカーを含む。いくつかの実施形態では、２つの蛍光部分は、蛍光共鳴エネルギー移動システムを構成する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，４４１，２６７号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列の検出位置でヌクレオチドの同一性を決定する方法を含む。これらの方法は、当該標的配列と、基材表面でのミクロスフェアに共有結合した捕捉プローブとを含むハイブリダイゼーション複合体を提供することを含む。これらの方法は、当該検出位置で、当該ヌクレオチドを決定することを含む。当該ハイブリダイゼーション複合体は、捕捉プローブ、捕捉伸長プローブ、及び、標的配列を含むことができる。加えて、当該標的配列は、外因性アダプター配列を含み得る。追加の態様では、当該方法は、当該ミクロスフェアを、それぞれが、測定位置での固有のヌクレオチドと、検出可能な固有の標識を含む複数の検出プローブとを接触させることを含む。当該検出可能な標識の少なくとも１つに由来するシグナルを検出して、当該検出位置でのヌクレオチドを同定する。追加の態様では、当該検出プローブは、検出標識を含まないが、例えば、質量分析を介して、その特徴的な質量に基づいて同定をする。加えて、当該検出プローブは、その特徴的な質量に基づいて検出される固有の標識を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該標的配列が、当該検出位置に対して直接に５’で隣接する第１の標的ドメインを含む方法を含むことができる。当該ハイブリダイゼーション複合体は、当該標的配列、捕捉プローブ、及び、当該標的配列の第１の標的ドメインにハイブリダイズした伸長プライマーを含む。当該決定ステップは、当該ミクロスフェアを、ポリメラーゼ酵素、及び、それぞれが共有結合した検出可能な標識を含む複数のＮＴＰと接触させることを含み、同接触は、当該ＮＴＰの１つが、当該検出位置で当該塩基と塩基対を形成すると、当該伸長プライマーが、当該酵素の作用を受けて伸長して当該標識を取り込むという条件下で行う。当業者に公知の通り、ｄＮＴＰ、及び、ｄｄＮＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼにとって好ましい基材である。ＮＴＰは、ＲＮＡポリメラーゼにとって好ましい基材である。次に、当該検出位置での塩基を同定する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該標的配列が、当該検出位置に対して直接に５’で隣接する第１の標的ドメインを含み、当該捕捉プローブは、伸長プライマーとして機能し、かつ、当該標的配列の第１の標的ドメインにハイブリダイズする方法を含むことができる。当該決定ステップは、当該ミクロスフェアを、ポリメラーゼ酵素、及び、それぞれが共有結合した検出可能な標識を含む複数のＮＴＰと接触させることを含み、同接触は、当該ＮＴＰの１つが、当該検出位置で当該塩基と塩基対を形成すると、当該伸長プライマーが、当該酵素の作用を受けて伸長して当該標識を取り込むという条件下で行う。これにより、当該検出位置での塩基を同定する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該標的配列が、（５’から３’に向けて）、当該検出位置に少なくともヌクレオチドを含む重複ドメインを含む第１の標的ドメインと、当該検出位置に隣接する第２の標的ドメインを含む方法を含むことができる。当該ハイブリダイゼーション複合体は、当該第１の標的ドメインに対してハイブリダイズした第１のプローブ、及び、当該第２の標的ドメインに対してハイブリダイズした第２のプローブを含む。当該第２のプローブは、当該標的配列に対してハイブリダイズしない検出配列と、検出可能な標識とを含む。当該第２のプローブが、当該検出位置に対して完全に相補的である塩基を含む場合に、開裂構造を形成する。この方法は、当該ハイブリダイゼーション複合体を、当該シグナル伝達プローブ由来の検出配列を開裂する開裂酵素と接触させ、次いで、当該検出配列を有するアッセイ複合体、基材の表面でミクロスフェアに共有結合した捕捉プローブ、及び、少なくとも１つの標識を形成すること、をさらに含む。これにより、当該検出位置での塩基を同定する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，０６０，４３１号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面を備えた基材を含むアレイ構成を含むことができる。当該構成は、少なくとも第１及び第２の亜集団；それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み；及び、デコーダー結合リガンドに結合して生物活性剤の同一性を解明する識別子結合リガンドを含む、ミクロスフェアの集団をさらに含むことができる。これらのミクロスフェアは、表面に分布している。いくつかの実施形態は、不連続な部位を含む表面を有する基材と、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団とを含むアレイ構成を提供する。それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み、そして、光学的シグネチャーを含まない。いくつかの実施形態は、上記に概説したアレイ構成を作製する方法を提供する。これらの方法は、基材上に個々の部位を含む表面を形成し、及び、当該個々の部位がミクロスフェアを含むように、当該当該表面にミクロスフェアを分布させることを含む。これらのミクロスフェアは、少なくとも第１及び第２の亜集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み、そして、光学的シグネチャーを含まない。いくつかの実施形態は、基材での個々の部位を含む表面を形成し、及び、当該個々の部位が、ミクロスフェアを含むように表面にミクロスフェアを分布させること、を含む組成物の製造方法を提供する。これらのミクロスフェアは、少なくとも第１及び第２の亜集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤と、デコーダー結合リガンドに結合して、生物活性剤の実体を明らかにする識別子結合リガンドとを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記で概説したアレイ構成を提供し、及び、複数のデコーダー結合リガンドを当該アレイ構成に対して加えて、少なくとも複数の生物活性剤の位置を同定すること、を含むアレイ構成を解読する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料での標的分析物の存在を決定する方法を含むことができる。これらの方法は、上記で概説したように、当該試料をアレイ構成と接触させ、そして、当該標的分析物の有無を決定することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含むアレイ構成を提供すること、それぞれの亜集団が、生物活性剤、及び、少なくとも第１及び第２の解読属性を含み、及び、当該第１及び第２の解読属性のそれぞれを検出して、当該生物活性剤のそれぞれを識別すること、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、解読ステップで得た情報を増やす方法を含むことができる。この方法は、ＤＢＬ－ＩＢＬの組合せで、縮退プローブを使用することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ビーズに関する複数の解読属性の使用を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、解読の信頼性を高める方法を含むことができる。この方法は、品質管理手段として解読を使用することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも５０個の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含むアレイ構成を提供することであって、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む、提供すること、ミクロスフェアの当該集団に対して、複数の当該デコーダー結合リガンドを加えて、少なくとも５０個の当該生物活性剤を識別することを含む、アレイ構成を解読する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料での標的分析物の存在を決定する方法を含むことができ、当該方法は、当該試料を、少なくとも５０個の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含む組成物と接触させることであって、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む、接触させること、ミクロスフェアの当該集団に対して、複数の当該デコーダー結合リガンドを加えて、少なくとも５０個の当該生物活性剤を識別すること、及び当該標的分析物の有無を決定することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，０６０，４３１号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料での標的分析物の検出のためのマイクロ流体機器を含む。これらの機器は、試料入口ポートと、ウェル入口ポートとウェル出口ポートとを含む少なくとも１つの試料操作ウェルとを含む、いずれかの個数のモジュールを有する固体支持体を含む。当該機器は、一般的に、当該試料入口ポートと当該試料取り扱いウェルとの間の流体接触を可能にする第１のマイクロチャネルをさらに含む。また、当該機器は、不連続な部位を含む表面を有する基材を含む検出モジュール、及び、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む。これらのミクロスフェアは、当該表面に分布している。当該検出モジュールは、試料を受け入れるための検出入口ポートも含む。また、機器は、当該試料処理ウェルと当該検出入口ポートとの間の流体接触を可能にする第２のマイクロチャネルも含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、マイクロ流体機器に検出器を組み込む方法を含むことができる。この方法は、試料入口ポートと試料処理ウェルとの間の流体接触を可能にする第１のマイクロチャネル、当該試料処理ウェルと検出入口ポートとの間の流体接触を可能にする第２のマイクロチャネル、及び、不連続な部位を含む表面を備えた基材を含む検出モジュールを含む機器を提供することを含む。この方法は、基材全体に対して流体を流す、ことをさらに含む。この流体は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み、それにより、ビーズが、当該不連続な部位を横切るようにして流れ、そして、当該不連続な部位にランダムに堆積する。この方法は、流体の流れを逆にすること、をさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、マイクロ流体機器に検出器を組み込む方法を含むことができる。この方法は、複数の第１のマイクロチャネルと、マイクロチャネル内のミクロスフェアの集団とを含むマイクロ流体機器を提供することを含む。当該機器は、当該マイクロチャネルに接続した受け入れチャンバーをさらに含む。この方法は、当該ミクロスフェアを、当該マイクロチャネルを通じて、当該受け入れチャンバーに流し込む、ことをさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，２２２，１３４号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、分子を検出するための方法、システム、及び、組成物を含む。特に、固体支持体での複数のタイプの分子を検出するための方法、システム、及び、組成物。いくつかの実施形態は、分子を検出する方法に関する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、（ａ）検出ステップの間に当該分子を集合体で検出する、固体支持体での部位に関連する分子を含む固体支持体を提供するステップであって、当該部位は少なくとも２つの異なるタイプの分子を含む、ステップ；（ｂ）当該部位での分子の集合体に対応するシグナルを検出するステップ；（ｃ）当該部位での異なるタイプの分子の割合を推定すること、または、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推定するステップ；（ｄ）割合推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナル量を計算し、それにより、シグナル推定値を取得するステップ、または、当該シグナル推定値を使用して当該部位での異なるタイプの分子の割合を計算し、それにより、割合推定値を得るステップ；及び、（ｅ）推定値が収束するまで、割合推定値とシグナル推定値を繰り返し更新し、それにより、当該部位に関連する分子を検出するステップを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、提供するステップは、分子の混合物を、当該固体支持体に提供すること、をさらに含む。その他の実施形態では、当該提供するステップは、当該分子を当該部位に関連付ける、ことをさらに含む。さらにその他の実施形態では、当該提供するステップは、当該部位で分子を付着させること、をさらに含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該推定ステップは、当該部位での異なるタイプの分子の割合を推測し、あるいは、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推測して行う。その他の実施形態では、当該推定ステップは、主成分分析（ＰＣＡ）を行う、ことを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、更新ステップは、数値最適化アルゴリズムを行う、ことを含む。一部のそのような方法では、当該数値最適化アルゴリズムは、反復マップ検索に基づく。一部のそのような実施形態では、当該数値最適化アルゴリズムは、フィエナップの反復マップに基づく。上記した方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の分子の配列データを得る。一部のそのような方法では、合成によるシークエンシングプロセスで配列データを得る。ある特定の実施形態では、当該合成によるシークエンシングプロセスは、パイロシーケンシングプロセスを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該固体支持体は、ビーズを含む。一部のその他の実施形態では、当該固体支持体は、フローセルを含む。上記した方法の好ましい実施形態では、当該分子は、核酸を含む。一部のそのような方法では、当該核酸は、その部位に付着する。いくつかの実施形態では、当該核酸は、核酸の第１の亜集団と、核酸の第２の亜集団とを含み、当該第１の亜集団の核酸は、それぞれが、同一の標的領域を有しており、かつ、当該第２の亜集団の核酸は、それぞれが、当該標的領域の変異型である同一の領域を有する。いくつかの実施形態では、当該第１の亜集団の核酸の標的領域のヌクレオチド配列は、当該第２の亜集団の核酸の標的領域の変異型のヌクレオチド配列と比較して異なる少なくとも１つのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、当該第１の亜集団の核酸の標的領域のヌクレオチド配列は、当該第２の亜集団の核酸の標的領域の変異型のヌクレオチド配列と比較して異なる少なくとも３つのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、当該第１の亜集団の核酸での標的領域と、当該第２の亜集団の核酸での標的領域の変異型との間のヌクレオチド配列の差異は、突然変異、多型、挿入、欠失、置換、単純なタンデムリピート多型、及び、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）からなる群から選択した少なくとも１つの差異を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸は、倍数体生物由来の遺伝子座のアレルを含む。一部のその他の実施形態では、当該核酸は、核酸の選択的スプライシング形態を含む。さらにその他の実施形態では、当該核酸は、二倍体生物由来の遺伝子座のアレルを含む。また、分子検出システムについても説明をする。当該分子検出システムは、分子が集合的に検出されるように、固体支持体での部位に関連付けた分子を含む当該固体支持体を含むことができ、当該分子は、少なくとも２つの異なるタイプの分子を含み、そして、検出器は、当該部位と関連付けた分子を検出するように構成する。いくつかの実施形態では、当該分子は、その部位に付着している。好ましい実施形態では、当該分子は、核酸を含む。当該分子検出システムのいくつかの実施形態では、部位は、約２～約１０１１個の分子、約２～約１０１０個の分子、約２～約１０９個の分子、約２～約１０８個の分子、約２～約１０７個の分子、約２～約１０６個の分子、約２～約１０５個の分子、約２～約１０４個の分子を含む。いくつかの実施形態では、これらの分子は、当該部位に関連している。その他の実施形態では、当該分子は、その部位に付着している。ある特定の実施形態では、当該分子は、核酸を含む。上記した分子検出システムのいくつかの実施形態は、当該部位に対して流体を提供するように構成した流体処理システムをさらに含むことができる。上記した分子検出システムのその他の実施形態は、当該部位に対して励起ビームを提供するように構成した光源をさらに含むことができる。上記した分子検出システムのいくつかの実施形態は、当該部位での異なるタイプの分子の割合、または、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推定するように構成した第１のデータ処理モジュールをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、当該第１のデータ処理モジュールは、推定に関連する変動を決定するためにも使用する。その他の実施形態では、当該決定ステップは、別個のデータ処理モジュールを使用して行う。そのようなシステムのいくつかの実施形態では、当該システムは、割合推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を計算する、または、シグナル推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子の割合を計算するように構成した第２のデータ処理モジュールをさらに含むことができる。そのようなシステムのその他の実施形態では、当該システムは、割合推定値、及び、シグナル推定値を繰り返し更新するように構成した第３のデータ処理モジュールをさらに含むことができる。上記した分子検出システムのいくつかの実施形態では、それらのシステムは、核酸の標的領域のヌクレオチド配列を同定するように構成する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸の標的領域を同定する方法を含むことができる。これらの方法は、（ａ）核酸の第１の亜集団を、固体支持体での部位に関連付けさせることであって、当該第１の亜集団の核酸は、同一の標的領域を含む、関連付けさせること；（ｂ）核酸の第２の亜集団を、固体支持体での部位に関連付けさせることであって、当該第２の亜集団の核酸は、当該第１の亜集団の核酸の標的領域の変異型である同一の標的領域を含む、関連付けさせること；（ｃ）第１の亜集団核酸の標的領域の１つ以上のヌクレオチド、及び、第２の亜集団核酸の標的領域の変異型の１つ以上のヌクレオチドに対応するシグナルを検出すること；（ｄ）当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸の割合を推定すること、または、当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸に対応するシグナルの量を推定すること；（ｅ）当該割合推定値を使用して、当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸の割合に対応するシグナルの量を計算すること、または、当該シグナル推定値を使用して、当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸の割合に対応するシグナルの量を計算すること；及び、（ｆ）当該推定値が収束するまで、割合推定値とシグナル推定値とを繰り返し更新し、それにより、核酸の標的領域を同定すること、を含むことができる。上記した方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸を、当該固体支持体に付着させること、を含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、主成分分析（ＰＣＡ）を行う、ことを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は、数値最適化アルゴリズムを行う、ことを含む。一部のそのような実施形態では、当該数値最適化アルゴリズムは、反復マップ検索に基づく。一部のそのような実施形態では、当該数値最適化アルゴリズムは、フィエナップの反復マップに基づく。上記した方法のいくつかの実施形態では、配列データを、第１、及び、第２の亜集団核酸の両方から得る。一部のそのような実施形態では、合成によるシークエンシングプロセスで、配列データを得る。いくつかの実施形態では、当該合成によるシークエンシングプロセスは、パイロシーケンシングプロセスを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、バイオシグネチャーを同定するための方法を含むことができる。この方法は、（ａ）複数の対象から得た試料の提供を行うステップであって、当該試料は、分子を含む、ステップ；（ｂ）当該試料に由来する分子にタグを付けて、それぞれの試料の由来となる対象を同定するステップ；（ｃ）当該試料に由来する分子を固体支持体での部位と関連付けして、検出ステップの間に分子を集合体として検出を行うステップであって、当該部位は、少なくとも２つの異なるタイプの分子を含む、ステップ；（ｄ）当該部位に関連する分子のバイオシグネチャーを：ｉ）当該部位での分子の集合体に対応するシグナルを検出すること、ｉｉ）当該部位での異なるタイプの分子の割合、または、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推定すること、ｉｉｉ）割合推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を計算すること、または、当該シグナル推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子の割合を計算すること、及び、ｉｖ）推定値が収束するまで、割合推定値とシグナル推定値とを反復して更新し、それにより、当該部位での分子のバイオシグネチャーを得ること、で当該バイオシグネチャーを得るステップ；及び、（ｅ）ステップ（ｄ）で得たバイオシグネチャーを、参照バイオシグネチャーと比較して、それにより、当該バイオシグネチャーを同定するステップを含むことができる。好ましい実施形態では、当該分子は、その部位に付着する。上記した方法の好ましい実施形態では、当該分子は、核酸を含む。一部のそのような実施形態では、当該核酸は、病原体由来のマーカーを含む。ある特定の実施形態では、当該病原体は、ウイルス、細菌、及び、真核細胞からなる群から選択する病原体を含む。いくつかの実施形態では、当該真核細胞を、がん細胞とすることができる。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該試料は、異常な細胞型を含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該試料を、がん患者から得る。固体支持体での部位に関連した核酸の集団を含む固体支持体も記載されており、同支持体は、核酸の集団での核酸を集合体で検出するものであり、核酸の当該集団は、第１の亜集団と第２の亜集団とを含み、当該第１の亜集団の核酸は、同一の標的領域を含み、そして、当該第２の亜集団の核酸は、当該標的領域の変異型である同一の領域を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、競合分子がハイブリダイズした捕捉核酸の第１亜集団、及び、相補分子のハイブリダイゼーションを可能にする領域を含む捕捉核酸の第２亜集団を含むビーズを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、縮退
タグを含む増幅核酸とハイブリダイズした捕捉核酸を含むビーズを含むことができ、当該縮退タグは、捕捉核酸に対してハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、当該ビーズは、基材のチャネルに存在する。その他の実施形態では、当該ビーズは、マルチウェル基材のウェルに存在する。好ましい実施形態では、当該ウェルを、増幅した核酸がハイブリダイズした単一のビーズを保持するように構成する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，１６３，２８３号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の核酸を含む組成物を含むことができ、それぞれの核酸は、不変配列、可変配列、及び、標識を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、アレイ構成を解読する方法を含むことができる。この方法は、不連続な部位を含む表面と、第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団とを含む基材を含むアレイ構成を提供することを含み、それぞれの亜集団は、プライマー配列と解読配列とを含む同定核酸配列を含む。この方法は、プライミング配列、少なくとも１つの解読ヌクレオチド、及び、標識を含む第１のセットの組合せ解読プローブを、当該アレイに対して加えること、そして、当該標識の存在を検出すること、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，０４５，７９６号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、所定のゲノムに含まれる１つ、または、幾つかの型決定可能な遺伝子座を検出する方法を含むことができ、当該方法は、そのような型決定可能な遺伝子座を有する増幅した代表的なゲノム断片の集団を提供するステップ、プローブ－断片ハイブリッドを形成する条件下で、型決定可能な遺伝子座に対応する配列を有する複数の核酸プローブと、当該ゲノム断片とを接触させるステップ；及び、当該プローブ－断片ハイブリッドの型決定可能な遺伝子座を検出するステップを含む。特定の実施形態では、これらの核酸プローブは、最大で１２５ヌクレオチド長である。しかしながら、以下に詳述するように、あらゆる様々な長さ、または、配列を有するプローブを使用することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ゲノムの型決定可能な遺伝子座を検出する方法を含むことができ、同方法は、そのような型決定可能な遺伝子座を有する増幅したゲノム断片の代表的な集団を提供するステップ、プローブ－断片ハイブリッドを形成する条件下で、型決定可能な遺伝子座に対応する配列を有する複数の核酸プローブと、当該ゲノム断片とを接触させるステップ；及び、当該プローブ－断片ハイブリッドの型決定可能な遺伝子座を直接に検出するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ゲノムの型決定可能な遺伝子座を検出する方法を含むことができ、同方法は、型決定可能な遺伝子座を有する増幅したゲノム断片の代表的な集団を提供するステップ；固定化プローブ－断片ハイブリッドを形成する条件下で、当該ゲノム断片を、型決定可能な遺伝子座に対応する配列を有する複数の固定化核酸プローブと接触させるステップ；固定化したプローブ－断片ハイブリッドを改変するステップ；及び、改変したプローブまたは断片を検出し、それにより、当該ゲノムの型決定可能な遺伝子座を検出するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）複数のゲノム断片を提供するステップであって、当該複数のゲノム断片は、少なくとも１ギガベースの複雑度を有する少なくとも１００ｕｇのＤＮＡを有している、ステップ；（ｂ）当該複数のゲノム断片を、複数の異なる固定化核酸プローブと接触させるステップであって、少なくとも５００の異なる核酸プローブが、当該ゲノム断片とハイブリダイズして、プローブ断片ハイブリッドを形成する、ステップ；及び、（ｃ）プローブ－断片のハイブリッドの型決定可能な遺伝子座を検出するステップを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）複数のゲノム断片を提供するステップであって、当該複数のゲノム断片が、少なくとも１ギガベースの複雑度を有する少なくとも１ｕｇ／ｕｌの濃度のＤＮＡを有している、ステップ；（ｂ）当該複数のゲノム断片を、複数の異なる固定化核酸プローブと接触させるステップであって、少なくとも５００の異なる核酸プローブが、当該ゲノム断片とハイブリダイズして、プローブ断片ハイブリッドを形成する、ステップ；及び、（ｃ）プローブ－断片のハイブリッドの型決定可能な遺伝子座を検出するステップも含むことができる方法も含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、単離した二本鎖ゲノムＤＮＡを提供するステップ、二本鎖ゲノムＤＮＡを、ニッキング剤と接触させてニックの入ったＤＮＡを生成するステップ、このニックの入ったＤＮＡを、鎖置換ポリメラーゼ、及び、複数のプライマーと接触させて、ゲノムＤＮＡを増幅するステップを含む、ゲノムＤＮＡを増幅する方法が含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ゲノムの型決定可能な遺伝子座を検出する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）複数の増幅したｇＤＮＡ断片をインビトロで転写し、それにより、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）断片を得るステップ；（ｂ）型決定可能な遺伝子座に対応する配列を有する複数の核酸プローブと、当該ｇＲＮＡ断片とをハイブリダイズするステップ；及び、（ｃ）当該プローブにハイブリダイズするｇＲＮＡ断片の型決定可能な遺伝子座を検出するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複雑さが小さく、遺伝子座特異的な、増幅したゲノム断片の代表的な集団を生成する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）複数のランダムプライマーで、ネイティブゲノムを複製し、それにより、ゲノム断片の増幅した代表的な集団を生成するステップ；（ｂ）複数の異なる遺伝子座特異的プライマーを用いて、ゲノム断片の増幅した代表的な集団の亜集団を複製し、それにより、遺伝子座特異的な、増幅したゲノム断片の代表的な集団を生成するステップ；及び、（ｃ）亜集団を単離し、それにより、複雑さが小さく、遺伝子座特異的な、増幅したゲノム断片の代表的な集団を生成するステップを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、プライマー伸長アッセイにおけるプローブの異所性伸長を阻害する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）プローブ－標的ハイブリッドを形成する条件下で、複数のプローブ核酸を、複数の標的核酸と接触させるステップ；（ｂ）プローブ－異所性伸長阻害剤ハイブリッドを形成する条件下で、複数のプローブ核酸を、異所性伸長阻害剤と接触させるステップ；及び（ｃ）プローブ－異所性伸長阻害剤ハイブリッドのプローブと比較して、プローブ－標的ハイブリッドのプローブを選択的に改変するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）固定化プローブ－断片ハイブリッドを形成する条件下で、複数のゲノム断片を、複数の異なる固定化核酸プローブと接触させるステップ；（ｂ）当該ゲノム断片にハイブリダイズしながら、当該固定化プローブを改変し、それにより、改変した固定化プローブを形成するステップ；（ｃ）当該プローブ－断片ハイブリッド由来の当該ゲノム断片を除去するステップ；及び、（ｄ）ゲノム断片を除去した後に、当該改変した固定化プローブを検出し、それにより、当該ゲノム断片の型決定可能な遺伝子座を検出するステップを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）ネイティブゲノムを再現的に増幅するステップであって、型決定可能な遺伝子座を有するゲノム断片の増幅した代表集団を等温条件下で生成する、ステップ；（ｂ）当該ゲノム断片を、プローブ－断片ハイブリッドを形成する条件下で、型決定可能な遺伝子座に対応する配列を有する複数の核酸プローブと接触させるステップ；及び、（ｃ）プローブ－断片のハイブリッドの型決定可能な遺伝子座を検出する、ステップを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，７６５，４１９号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ピロリン酸塩の検出のための方法、及び、システムを含むことができ、それらは、単独で、または、パイロシーケンシングなどのその他の技術と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、そのような方法、及び、システムは、バックグラウンドを抑えながら、ピロリン酸塩の検出を可能にする。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、バックグラウンドを抑えながら、核酸のパイロシーケンシングのための方法、及び、システムを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ピロリン酸塩の検出を遅延させる方法を含むことができる。この方法は、ピロリン酸塩金属イオン封鎖剤を提供するステップ、当該金属イオン封鎖剤の存在下でピロリン酸塩を生成し、それにより、ピロリン酸塩を可逆的に封鎖するステップ、当該ピロリン酸塩を、当該金属イオン封鎖剤から放出するステップ、及び、ピロリン酸塩を検出するステップを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸をシークエンシングする方法を含むことができる。この方法は、ピロリン酸塩金属イオン封鎖剤、及び、ピロリン酸塩検出剤の存在下で、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を提供するステップ、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、ポリヌクレオチドに組み込むステップであって、ピロリン酸塩金属イオン封鎖剤の存在下で、ポリヌクレオチドを伸長させ、それにより、金属イオン封鎖ピロリン酸塩を生成するステップ、組み込まれなかったヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、当該ピロリン酸塩検出剤の存在から除去するステップ、当該ピロリン酸塩検出剤の存在下で、当該金属イオン封鎖剤から当該ピロリン酸塩を放出し、放出したピロリン酸塩を検出するステップであって、放出したピロリン酸塩は、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、ポリヌクレオチドに組み込まれていることを示す、ステップを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸分子のシークエンシングの間の遊離ピロリン酸塩の利用可能性を調節する方法を含むことができる。これらの方法は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、核酸鋳型と組み合わせるステップ；当該核酸鋳型の全部または一部に相補的なポリヌクレオチドを形成するのに十分な条件下で、当該核酸鋳型、及び、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、ポリメラーゼ及びピロリン酸塩金属イオン封鎖剤と共にインキュベートするステップであって、当該インキュベーションの間に生成したピロリン酸塩は、当該金属イオン封鎖剤に可逆的に封鎖される、ステップ；当該ポリヌクレオチドに組み込まれていないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、当該核酸鋳型から除去するステップ；及び、放出試薬を提供することで、当該ピロリン酸塩金属イオン封鎖剤からピロリン酸塩を放出する、ステップ、を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、分布した複数の部位を上に有する固体支持体を含むアレイを含むことができ、当該部位の少なくとも一部は、鋳型核酸と、可逆的にピロリン酸塩を封鎖することができるピロリン酸塩金属封鎖剤とを含む。ある特定の態様では、当該部位は、ウェルを含む。ある特定の態様では、当該鋳型核酸は、ウェル内の粒子またはビーズに付着する。ある特定の態様では、当該ウェルは、ピロリン酸塩検出剤が付着したビーズをさらに含む。ある特定の態様では、当該ピロリン酸塩封鎖剤を、当該鋳型核酸と当該ピロリン酸塩検出剤との間に配置する。ある特定の態様では、当該ピロリン酸塩検出剤は、ＡＴＰスルフリラーゼ、及び、ルシフェラーゼを含む。ある特定の態様では、当該ウェルは、パッキングビーズをさらに含む。いくつかの実施形態では、ピロリン酸塩は、金属イオン封鎖剤が吸着して可逆的に封鎖される。ある特定の態様では、当該金属イオン封鎖剤は、キレート化、錯体形成、または、吸着によりピロリン酸塩を金属イオン封鎖することができるカチオン剤を含む。ある特定の態様では、当該カチオン剤は、金属、金属塩、金属酸化物、または、後述するその他の作用物質からなる群から選択する作用物質を含む。ある特定の態様では、当該金属または金属酸化物は、ＴｉまたはＴｉＯ２を含む。その他の態様では、当該ピロリン酸塩封鎖剤は、ヒドロキシアパタイトを含む。その他の態様では、当該金属イオン封鎖剤は、アンモニウムまたは置換アンモニウム塩、または、そのような基を含む樹脂またはビーズを含む。上記した実施形態のある特定の態様では、ピロリン酸塩封鎖剤は、粒子またはビーズを含む。上記したものに加えて、方法及びアレイのいくつかの実施形態では、放出試薬を当該金属イオン封鎖剤に供給することで、ピロリン酸塩を、当該金属イオン封鎖剤から放出させることができる。ある特定の態様では、当該放出試薬は、例えば、当該金属イオン封鎖剤のカチオンを、優先的に錯体形成またはキレート化することで、当該金属イオン封鎖剤からピロリン酸塩を移動させることができるアニオンを含む。ある特定の態様では、当該放出試薬は、シュウ酸、シュウ酸塩、スルファミン酸、スルファミン酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス－β－アミノ－エチルエーテルΝ，Ν，Ν’，Ν’－四酢酸（ＥＧＴＡ）クエン酸、酒石酸、酢酸、または、その他のカルボン酸、または、それらの塩などの酸または酸の塩からなる群から選択した作用物質を含む。その他の態様では、当該放出試薬は、リン酸塩を含む。その他の態様では、当該放出試薬は、ビスホスホネートを含む。ある特定の態様では、当該放出試薬は、酵素ＡＴＰスルフリラーゼである。この特定の態様では、当該ＡＴＰスルフリラーゼは、ビーズまたはその他の表面には結合しておらず、溶液中にある。当該ＡＴＰスルフリラーゼは、アデニシンホスホ硫酸（ＡＰＳ）の存在下で、ピロリン酸塩をＡＴＰに変換することで、当該金属イオン封鎖剤から当該ピロリン酸塩を放出することができる。一般的に、当該ＡＴＰは、ピロリン酸塩よりも金属イオン封鎖剤に対する結合親和性は小さい。一部の態様では、アレイは、ポリメラーゼ、及び、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をさらに含む部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、アレイは、当該部位の存在下で電場を生成することができる少なくとも１つの電極をさらに含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、アレイを作成する方法を含むことができる。これらの方法は、分布した複数の部位を上に有する固体支持体を提供するステップ、及び、当該部位の少なくとも一部にピロリン酸塩を可逆的に金属イオン封鎖することができる鋳型核酸、及び、ピロリン酸塩金属イオン封鎖剤を提供するステップを含むことができる。ある特定の態様では、当該鋳型核酸を複数の部位に提供するステップを、ピロリン酸塩封鎖剤を提供する前に置く。ある特定の態様では、当該鋳型核酸を複数の部位に提供するステップを、ピロリン酸塩封鎖剤を提供した後に置く。ある特定の態様では、当該鋳型核酸を複数の部位に提供するステップを、ピロリン酸塩封鎖剤の提供と同時に行う。いくつかの実施形態では、上記した方法に従って製造したアレイは、シークエンシング、及び／または、ピロリン酸塩封鎖、及び、放出プロセスで使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、当該ピロリン酸塩を、金属イオン封鎖剤による吸着で可逆的に金属封鎖する。ある特定の態様では、当該金属イオン封鎖剤は、キレート化、錯体形成、または、吸着によりピロリン酸塩を金属イオン封鎖することができるカチオン剤を含む。ある特定の態様では、当該カチオン剤は、金属、金属塩、金属酸化物、または、後述するその他の作用物質からなる群から選択する作用物質を含む。ある特定の態様では、当該金属または金属酸化物は、ＴｉまたはＴｉＯ２を含む。その他の態様では、当該ピロリン酸塩封鎖剤は、ヒドロキシアパタイトを含む。その他の態様では、当該金属イオン封鎖剤は、アンモニウムまたは置換アンモニウム塩、または、そのような基を含む樹脂またはビーズを含む。上記した実施形態のある特定の態様では、ピロリン酸塩封鎖剤は、粒子またはビーズを含む。上記したものに加えて、いくつかの実施形態では、上記した方法で製造したアレイは、放出試薬を当該金属イオン封鎖剤に供給することで、ピロリン酸塩を当該金属イオン封鎖剤から放出させることができるプロセスで使用することができる。ある特定の態様では、当該放出試薬は、例えば、当該金属イオン封鎖剤のカチオンを、優先的に錯体形成またはキレート化することで、当該金属イオン封鎖剤からピロリン酸塩を移動させることができるアニオンを含む。ある特定の態様では、当該放出試薬は、シュウ酸、シュウ酸塩、スルファミン酸、スルファミン酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス－β－アミノ－エチルエーテルΝ，Ν，Ν’，Ν’－四酢酸（ＥＧＴＡ）クエン酸、酒石酸、酢酸、または、その他のカルボン酸、または、それらの塩などの酸または酸の塩からなる群から選択した作用物質を含む。その他の態様では、当該放出試薬は、リン酸塩を含む。その他の態様では、当該放出試薬は、ビスホスホネートを含む。ある特定の態様では、当該放出試薬は、酵素ＡＴＰスルフリラーゼである。この特定の態様では、当該ＡＴＰスルフリラーゼは、ビーズまたはその他の表面には結合しておらず、溶液中にある。当該ＡＴＰスルフリラーゼは、アデニシンホスホ硫酸（ＡＰＳ）の存在下で、ピロリン酸塩をＡＴＰに変換することで、当該金属イオン封鎖剤から当該ピロリン酸塩を放出することができる。一般的に、当該ＡＴＰは、ピロリン酸塩よりも金属イオン封鎖剤に対する結合親和性は小さい。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，７４１，６３０号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、表面を有する基材を含む複合アレイを提供すること；当該表面の第１及び第２のアッセイ位置であって、当該アッセイ位置は、ミクロスフェアの集団を含み、かつ、当該ミクロスフェアは、生物活性剤を含む、第１及び第２のアッセイ位置；当該第１のアッセイ位置を、当該第２のアッセイ位置から分離する物理的パーティション；当該標的分析物が、当該生物活性剤に結合することを可能にするのに十分な条件下で、当該生物学的試料を、当該第１のアッセイ位置に加えること；及び、当該標的分析物に対する当該生物活性剤の結合を検出することを含む、生体試料での標的分析物を検出する方法を含むことができる。より具体的な実施形態では、当該標的分析物に対する当該生物活性剤の結合は、当該ミクロスフェアの光学的シグネチャーの変化によって検出することができる。標的分析物、及び、生物活性剤は、例えば、核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、これらの方法は、第２の生体試料を、当該第２のアッセイ位置に加え、その後、当該標的検体に対する当該生物活性剤の結合を検出することで、当該第２の生体試料での標的検体を検出すること、をさらに含むことができる。ある特定の態様では、当該基材は、顕微鏡スライドを含むことができる。さらなる方法は、生体試料での標的核酸を検出することを含み、当該標的核酸は、１つ以上の所定の位置に、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含んでおり、同方法は、表面を有する基材を含む複合アレイを提供すること；ミクロスフェアの集団であって、当該ミクロスフェアは、当該１つ以上の所定の位置で、当該標的核酸に結合するように構成した捕捉プローブに結合している、ミクロスフェアの集団；当該表面での第１及び第２のアッセイ位置であって、当該ミクロスフェアの集団を含む、第１及び第２のアッセイ位置；当該第１のアッセイ位置を、当該第２のアッセイ位置から分離する物理的パーティション；当該捕捉プローブに対して当該標的核酸が結合することを可能にするのに十分な条件下で、当該生物学的試料を、当該第１のアッセイ位置に加えること；及び、当該捕捉プローブに対する当該標的核酸の結合を検出すること、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、剛性支持体を含むアレイ構成；不連続な部位を含む少なくとも第１のアッセイ位置を備えた成形層であって、当該剛性支持体に接着されている、成形層；当該成形層に対して当該剛性支持体を接着する結合剤の層；及び、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団であって、当該第１の亜集団は、第１の生物活性剤を含み、かつ、当該第２の亜集団は、第２の生物活性剤を含み、当該ミクロスフェアが、当該部位にランダムに分布している、集団を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を有する少なくとも第１のアッセイ位置を含むアレイ構成を作成する方法であって、鋳型構造の表面、すなわち、１組以上の突起を含む当該表面を、成形可能な材料と接触させるステップ；当該鋳型構造の表面から成形可能材料を除去し、それにより、当該除去した成形可能材料が、不連続な部位を含む少なくとも第１のアッセイ位置を備えた成形層を形成するステップ；当該成形層を、剛性支持体に対して接着させるステップ；及び、個々の不連続な部位が、ミクロスフェアを含むように、当該成形層にミクロスフェアをランダムに分布させるステップであって、当該ミクロスフェアは、少なくとも第１及び第２の亜集団を含み、当該第１の亜集団は、第１の生物活性剤を含み、かつ、第２の亜集団は、第２も生物活性剤である、ステップを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，９０１，８９７号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のアッセイ位置を含む表面を備えた第１の基材を含む複合アレイ構成を含むことができ、それぞれのアッセイ位置は、複数の不連続な部位を含む。当該基材は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団をさらに含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む。これらのミクロスフェアは、それぞれのアッセイ位置で分布している。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のアッセイ位置を含む表面を有する第１の基材と、複数のアレイ位置を含み、それぞれのアレイ位置が不連続な部位を含む第２の基材とを含む複合アレイ構成を含むことができる。これらの構成は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団をさらに含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む。これらのミクロスフェアは、それぞれのアレイ位置に分布している。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、先に概説したアレイ構成を提供すること、そして、複合アレイ構成に対して複数のデコーダー結合リガンドを加えて、少なくとも複数の生物活性剤の位置を同定することを含む、アレイ構成を解読する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料と当該構成とを接触させ、及び、当該標的分析物の有無を決定することを含む、１つ以上の試料での１つ以上の標的分析物の存在を決定する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ハイブリダイゼーションチャンバーを含むことができる。当該ハイブリダイゼーションチャンバーは、底板と蓋とを含む。当該蓋と底板の間にシーラントを配置して、気密シールを提供する。二成分アレイシステムを使用する場合、当該チャンバーは、当該蓋に成分ポートも設けて、当該アレイ成分を固定する。つまり、アレイ成分を、当該蓋のポートから挿入する。これらのポートは、気密シールを維持するために、シールを含み得る。当該チャンバーは、クランプと位置合わせピンも含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該底板に設けているハイブリダイゼーションチャンバーを含むことができる。これらの穴は、マイクロプレートアレイ形式とし得る。ある実施形態では、少なくとも２つの穴を、チャネルで接合する。ある実施形態では、当該底板に可撓性膜を配置する。圧力、すなわち、真空を、膜に対して加えると、当該底板の穴の位置で、当該膜にウェルが形成される。この装置は、当該膜に対して、真空または陽圧を送達するための空気圧装置も含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料を、アレイ形式で混合する方法を含むことができる。この方法は、ウェルが形成されるように、当該膜に対して真空を提供することを含む。次いで、当該膜に対して溶液を与えて、少なくとも１つのウェルを液体で満たすようにする。その後、膜に対して断続的に真空を負荷し、その結果、液体を混合する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ハイブリダイゼーションチャンバー、及び、複合アレイ構成のいずれかを含む装置を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ハイブリダイゼーションチャンバー内のアレイ構成を解読する方法を実行すること、を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ハイブリダイゼーションチャンバー内の１つ以上の試料での１つ以上の標的分析物の存在を決定する方法を実行すること、を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，２８８，１０３号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の標的配列を含む第１の固体支持体を提供すること、当該第１及び第２の標的配列を、それぞれ、第１及び第２のプローブと接触させることであって、当該第１及び第２のプローブのそれぞれは、第１のユニバーサルプライミング部位、当該標的配列の少なくとも一部に実質的に相補的な標的特異的ドメインを含み、第１及び第２のハイブリダイゼーション複合体をそれぞれ形成する、接触させること、ハイブリダイズしていないプローブを除去すること、当該第１及び第２のハイブリダイゼーション複合体を、第１の酵素と接触させて、改変した第１及び第２のプローブを形成すること、改変した第１及び第２のプローブを、それぞれ、ユニバーサルプライミング部位ＮＴＰにハイブリダイズする少なくとも第１のプライマー、及び、伸長酵素と接触させることであって、当該第１及び第２の改変プローブ増幅をして、それぞれ、第１及び第２のアンプリコンを形成する、接触させること、及び、アンプリコンを検出することを含む、試料での標的配列を検出する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の標的配列を含む第１の固体支持体を提供すること、当該第１及び第２の標的配列を、それぞれ、第１及び第２のプローブと接触させることであって、当該第１及び第２のプローブのそれぞれは、第１のユニバーサルプライミング部位、当該標的配列の少なくとも一部に実質的に相補的な標的特異的ドメインを含み、第１及び第２のハイブリダイゼーション複合体をそれぞれ形成する、接触させること、ハイブリダイズしていないプローブを除去すること、当該第１及び第２のプローブを、ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズする少なくとも第１のユニバーサルプライマー、ＮＴＰ、及び、伸長酵素と接触させることであって、当該第１及び第２プローブを伸長させて、それぞれ、第１及び第２の改変プローブを形成する、接触させること、当該第１及び第２の改変プローブを、それぞれ、少なくとも第３及び第４のプローブ及び第２酵素と接触させることであって、当該改変した第１及び第２のプローブは、検出位置を含み、当該第３及び第４プローブのそれぞれは、調査位置を含み、当該第２酵素は、当該調査位置での塩基と、検出位置での塩基との間に完全な相補性がある場合にのみ、当該第３及び第４のプローブを改変する、接触させること、当該第３及び第４の改変プローブを形成すること、及び、当該第３及び第４の改変プローブを検出することを含む、試料での標的配列を検出する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、それぞれが、３’から５’に向けて、第１、第２、及び、第３の標的ドメインを含む複数の標的核酸配列を提供することであって、当該第１の標的ドメインは、検出位置を含み、当該第２の標的ドメインは、少なくとも１つのヌクレオチドである、提供すること、当該標的核酸配列を、それぞれの標的配列のプローブのセットと接触させることであって、それぞれのセットは、５’から３’に向けて、第１のユニバーサルプライミング配列を含む第１のドメイン、標的配列の当該第１の標的ドメインに実質的に相補的な配列を含む第２のドメイン、及び、３’にある４つの末端塩基内の調査位置、を含む第１のプローブ、標的配列の第３の標的ドメインに実質的に相補的な配列を含む第１のドメインを含む第２のプローブを含み、第１のハイブリダイゼーション複合体のセットを形成する、接触させること、当該調査位置での塩基が、当該検出位置での塩基と完全に相補的であれば、当該第１のプローブの伸長が、当該第２の標的ドメインを介して始まり、第２のハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、当該第１のハイブリダイゼーション複合体を、伸長酵素、及び、ｄＮＴＰと接触させること、当該第２のハイブリダイゼーション複合体を、リガーゼと接触させて、当該伸長した第１のプローブを、当該第２のプローブに結合させて、増幅鋳型を形成すること、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の標的を含む試料を提供すること、当該第１及び第２の標的を、それぞれ、当該第１及び第２のプローブとハイブリダイズさせ、当該第１及び第２のハイブリダイゼーション複合体を、それぞれ、形成すること、当該第１及び第２のハイブリダイゼーション複合体を固定すること、洗浄して、ハイブリダイズしなかった核酸を除去すること、当該第１及び第２のハイブリダイゼーション複合体を酵素と接触させること、それにより、当該第１及び第２のプローブを改変して、それぞれを、改変した第１及び第２のプローブを形成すること、それにより、改変した当該第１及び第２のプローブを改変して、当該第１及び第２の標的において、第１及び第２の検出ヌクレオチドのそれぞれに相補的な第１及び第２の調査ヌクレオチドを含むようにすること、当該改変した第１及び第２のプローブを、それぞれ、当該第１及び第２のアレル特異的プライマーと接触させること、それにより、当該第１及び第２のアレル特異的プライマーを、それぞれ、当該第１及び第２の調査ヌクレオチド、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼの５’側に、当該改変した第１及び第２のプローブにハイブリダイズさせること、それにより、当該アレル特異的プライマーの標的ドメインが、当該改変標的プローブに対して完全に相補的であれば、当該第１及び第２のアレル特異的プライマーを改変して、改変した第１及び第２のアレル特異的プローブを形成すること、当該改変した第１及び第２のアレル特異的プローブを増幅して、第１及び第２のアンプリコンを形成すること、及び、当該第１及び第２のアンプリコンを検出すること、を含むマルチプレックス反応法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、それぞれが、３’から５’に向けて、第１、第２、及び、第３の標的ドメインを含む複数の標的核酸配列を提供することであって、当該第１の標的ドメインは、検出位置を含み、当該第２の標的ドメインは、少なくとも１つのヌクレオチドである、提供すること、当該標的核酸配列を、それぞれの標的核酸のためのプローブのセットと接触させることであって、それぞれのセットは、５’から３’に向けて、第１のユニバーサルプライミング配列を含む第１のドメイン、及び、標的配列の当該第１の標的ドメインに実質的に相補的な配列を含む第２のドメイン、及び、３’にある４つの末端塩基内の調査位置を含む第１のプローブを含み、標的配列の第３の標的ドメインに実質的に相補的な配列を含む第１のドメインを含む第２のプローブを含み、第１のハイブリダイゼーション複合体のセットを形成する、接触させること、当該調査位置での塩基が、当該検出位置での塩基と完全に相補的であれば、当該第１のプローブの伸長が、当該第２の標的ドメインを介して始まり、第２のハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、当該第１のハイブリダイゼーション複合体を、少なくとも、第１のユニバーサルプライミング配列とハイブリダイズする第１のユニバーサルプライマー、伸長酵素、及び、ｄＮＴＰと接触させること、当該第２のハイブリダイゼーション複合体を、リガーゼと接触させて、当該伸長した第１のプローブを、当該第２のプローブに連結させて、増幅鋳型を形成すること、を含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，８９９，６２６号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＤＮＡのメチル化レベルを測定する方法を含むことができる。この方法は、ＤＮＡのメチル化測定の標準偏差を表すデータを提供すること、試料ＤＮＡでの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定すること、及び、少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを、当該データと比較して、当該読み取りの標準偏差を決定するステップを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＤＮＡ試料のメチル化レベルを比較する方法を含むことができる。この方法は、ＤＮＡのメチル化読み取りの標準偏差を表すデータを提供するステップ；第１の試料ＤＮＡでの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定するステップ；第２の試料ＤＮＡでの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定するステップ；当該データから、当該第１の試料ＤＮＡ、及び、当該第２の試料ＤＮＡの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルの標準偏差を同定するステップ；及び、当該標準偏差に基づいて、当該第１の試料ＤＮＡ、及び、当該第２の試料ＤＮＡの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルが同一であるか否かを判定するステップを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料ＤＮＡでの複数の遺伝子座のメチル化レベルを読み取るスキャナー、及び、当該メチル化レベルを、ＤＮＡのメチル化読み取りの標準偏差を表すデータと比較する構成とした第１のモジュールを含む、ＤＮＡメチル化レベル検出システムを含むことができる。いくつかの実施形態は、ＤＮＡのメチル化読み取りの標準偏差を表すデータを提供すること；試料ＤＮＡでの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定すること；及び、当該少なくとも１つの遺伝子座でのメチル化レベルを、当該データと比較して、当該読み取りの標準偏差を決定することを含む、ＤＮＡのメチル化レベルを測定する方法に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子座が、複数の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、当該メチル化レベルを、アレイを使用して決定する。いくつかの実施形態では、当該複数の遺伝子座は、当該アレイで同時に測定した少なくとも１００個の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、当該データを、メチル化レベルに応じて、メチル化レベルの標準偏差と相関させる。いくつかの実施形態では、当該データは、異なるメチル化レベルについての異なる標準偏差を含む。いくつかの実施形態では、当該データは、当該異なるメチル化レベルと相関すれば、放物線に沿って生じる当該異なる標準偏差値を含む。いくつかの実施形態では、メチル化レベルが異なるＤＮＡの混合物を含むトレーニングセットを作成することであって、当該トレーニングセットは、当該混合物の複製を含む、作成すること；当該トレーニングセットの当該混合物での少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定すること；当該トレーニングセットの当該複製について決定した当該メチル化レベルの標準偏差値を決定すること；及び、当該標準偏差値と、当該トレーニングセットに対して決定した当該メチル化レベルとを相関させることで、当該データを生成する。いくつかの実施形態では、トレーニングセットの混合物は、高度にメチル化したＤＮＡを含む細胞集団と、メチル化を最小限にしたＤＮＡを含む細胞集団に由来するゲノムＤＮＡの異なる比率を含む。いくつかの実施形態では、当該トレーニングセットの混合物のメチル化レベルは、０～１で変化する。いくつかの実施形態は、０～１の少なくとも３つの領域を同定すること、それぞれの領域のメチル化レベルの中央値を決定すること、及び、それぞれの領域の中央値に放物線を当てはめる、ことをさらに含む。いくつかの実施形態では、標準偏差値は、９５パーセンタイル標準偏差値を含む。いくつかの実施形態は、第２の試料ＤＮＡでの少なくとも１つの当該遺伝子座のメチル化レベルを決定するステップ；当該データから、当該試料ＤＮＡ、及び、当該第２の試料ＤＮＡでの少なくとも１つの当該遺伝子座の当該メチル化レベルの標準偏差を同定するステップ；及び、当該第１の試料ＤＮＡ、及び、当該第２の試料ＤＮＡにおける少なくとも１つの当該遺伝子座の当該メチル化レベルが、当該標準偏差に基づいて、同一か否かを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態は、試料ＤＮＡでの複数の遺伝子座のメチル化レベルを読み取るスキャナー；及び、当該メチル化レベルを、ＤＮＡのメチル化読み取りの標準偏差を表すデータと比較するように構成した第１のモジュールを含む、ＤＮＡメチル化レベル検出システムに関する。いくつかの実施形態では、当該メチル化レベルを、アレイを使用して決定する。いくつかの実施形態では、当該複数の遺伝子座は、当該アレイで同時に測定した少なくとも１００個の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、当該データを、メチル化レベルに応じて、メチル化レベルの標準偏差と相関させる。いくつかの実施形態では、当該データは、異なるメチル化レベルについての異なる標準偏差を含む。いくつかの実施形態では、当該データは、当該異なるメチル化レベルと相関すれば、放物線に沿って生じる当該異なる標準偏差値を含む。いくつかの実施形態では、メチル化レベルが異なるＤＮＡの混合物を含むトレーニングセットを作成することであって、当該トレーニングセットは、当該混合物の複製を含む、作成すること；当該トレーニングセットの当該混合物での少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定すること；当該トレーニングセットの当該複製について決定した当該メチル化レベルの標準偏差値を決定すること；及び、当該標準偏差値と、当該トレーニングセットに対して決定した当該メチル化レベルとを相関させることで、当該データを生成する。いくつかの実施形態は、ＤＮＡのメチル化読み取りの標準偏差を表すデータを提供すること；第１の試料ＤＮＡでの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定すること；第２の試料ＤＮＡでの少なくとも１つの遺伝子座のメチル化レベルを決定すること；当該第１の試料ＤＮＡ、及び、当該第２の試料ＤＮＡにおける少なくとも１つの当該遺伝子座の当該メチル化レベルの標準偏差を当該データから同定すること；及び、当該第１の試料ＤＮＡ、及び、当該第２の試料での少なくとも１つの当該遺伝子座での当該メチル化レベルが、当該標準偏差に基づいて、同一か否かを決定することを含む、ＤＮＡ試料のメチル化レベルを比較する方法に関する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，７７６，５３１号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）基材；（ｂ）当該基材に付着したプローブ分子；及び、（ｃ）当該基材での安定化ポリマー層を含み、当該安定化ポリマー層が、当該プローブ分子を被覆しているプローブ組成物を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、プローブ組成物を作成する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）付着したバイオポリマープローブを有する基材を提供するステップ；及び、（ｂ）当該基材を、安定化ポリマーと接触させるステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、固相プローブを輸送する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）プローブ分子が付着しており、さらに、安定化ポリマー層を有する基材を提供するステップ；（ｂ）当該基材をパッケージに入れるステップ；及び（ｃ）当該パッケージを、遠隔地に出荷するステップを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，４９９，８０６号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面、少なくとも１つの基準、及び、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含む基材を含むアレイ構成を含むことができる。それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み、そして、それらのミクロスフェアは、当該表面に分布している。それぞれの亜集団は、固有の光学的シグネチャー、生物活性剤の特定を行えるようにデコーダー結合リガンドに結合する識別子結合リガンド、またはその両方を任意に含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出では、コンピューターが特定の方法で機能する指示を与えるコンピューター可読メモリを含む構成を含むことができる。当該コンピューター可読メモリは、複数の不連続な部位を含むランダムアレイのデータ画像を受け取る取得モジュール、データ画像を登録する登録モジュール、及び、登録したデータ画像を比較する比較モジュールを含む。それぞれのモジュールは、その機能を実行するためのコンピューターコードを含む。当該登録モジュールは、当該基材が、光ファイバー束、基準ミクロスフェア、または、ランダムアレイ由来の基準鋳型を含んでおれば、基準ファイバーを含む、あらゆる数の基準を利用し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、基材での個々の部位を含む表面を形成すること、個々の部位がミクロスフェアを含むように当該表面にミクロスフェアを分布させること、及び、当該表面に対して、少なくとも１つの基準を取り込むことを含む、当該アレイ構成を作製する方法を含むことができる。当該アレイが、完全な回転の自由を有しておれば、回転の補正を可能にする上で、当該アレイでは少なくとも２つの基準点が好ましい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ランダムアレイの別々のデータ画像を比較する方法を含むことができる。この方法は、コンピューターシステムを使用して、ランダムアレイの第１のデータ画像を登録して、登録した第１のデータ画像を生成すること、コンピューターシステムを使用して、当該ランダムアレイの第２のデータ画像を登録して、登録した第２のデータ画像を生成すること、及び、第１及び第２の登録したデータ画像を使用して、それらの差異を決定することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ランダムアレイ構成を提供することを含む、ランダムアレイ構成を解読する方法を含むことができる。第１の複数のデコーダー結合リガンドを、当該アレイ構成に対して加え、そして、第１のデータ画像を作成する。第１の登録したデータ画像を生成するために、基準を使用する。第２の複数のデコーダー結合リガンドを、当該アレイ構成に対して加え、そして、第２のデータ画像を作成する。第２の登録したデータ画像を生成するために、基準を使用する。コンピューターシステムを使用して、第１と第２の登録データ画像を比較して、少なくとも２つの生物活性剤の位置を同定する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料での標的分析物の存在を決定する方法を含むことができる。これらの方法は、ランダムアレイ構成での第１のデータ画像を取得すること、及び、当該第１のデータ画像を登録して、登録した第１のデータ画像を作成することを含む。次いで、当該試料をランダムアレイに加え、そして、第２のデータ画像を当該アレイから得る。第２のデータ画像を登録して、登録した第２のデータ画像を作成する。次いで、当該第１及び第２の登録データ画像を比較して、当該標的分析物の有無を決定する。任意に、当該データ収集は、異なる波長で行い得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、アレイからデータ画像を得ること、及び、少なくとも１つのアレイ部位由来の第１のシグナルと、参照シグナルとの類似性を決定して、当該部位が、候補ビーズを含むか否かを決定することを含む、シグナルデータを前処理または事前フィルタリングする方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ハイブリダイゼーション強度イメージを提供することを含む、ミクロスフェアアレイの分析イメージを登録する方法を含むことができる。ミクロスフェアアレイの解読後に、登録グリッドを、当該解読ステップから得たミクロスフェアでの生物活性剤の公知の位置に基づいて計算する。当該試料を、ミクロスフェアアレイに加え、そして、アレイからハイブリダイゼーション強度イメージを得る。輝くタイプのビーズは、アレイ全体に分散しており、基準として機能する。当該登録グリッドを、イメージに重ね、次いで、当該登録グリッドを、当該アレイ内のそれぞれのタイプのビーズのそれぞれのグリッド位置でのシグナル強度の同一性が確認できるように調整する。当該グリッドの正しい位置を得ると、それぞれのコアに番号が割り当てられるので、さらに連続したイメージに対して、当該グリッドを、正しい配置にすることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第６，９４２，９６８号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面を備えた基材、当該表面での反射コーティング、及び、当該基材に分布したミクロスフェアの集団を含む組成物を含むことができる。これらのミクロスフェアは、少なくとも第１及び第２の亜集団を含む。一般的に、少なくとも１つの亜集団は、生物活性剤を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該基材が、第１及び第２の表面を含み、当該第１の表面が、不連続な部位を含み、そして、当該反射コーティングが、当該第２の表面にある組成物を含むことができる。これらのミクロスフェアの集団は、第１の表面に分布している。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、反射アレイを作成する方法を含むことができる。この方法は、不連続な部位を含む表面を有する基材を提供すること、当該表面に対して反射材料のコーティングを施すこと、及び、当該表面にミクロスフェアを分布させることを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該基材が、第１及び第２の表面を含み、当該第１の表面が、不連続な部位を含み、当該反射材料が、第２の表面にあり、そして、これらのミクロスフェアが、当該第１の表面に分布している方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、近位端と遠位端とを含む事前に形成した単一光ファイバー束を提供することであって、当該遠位端は、ミクロスフェアの集団を含む複数の不連続な部位を含み、当該集団は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含む、提供すること、及び、当該遠位端からの光ファイバー束をイメージ化することを含む方法を含むことができる。当該光ファイバー束の遠位端または近位端のいずれかに、反射コーティングを施し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、代替形状のウェルを含む不連続な部位を含む表面を備えた基材を含むアレイ構成を含むことができる。これらのウェルは、正方形、六角形、星形、三角形、五角形、または、八角形の形をした断面を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の不連続な部位を有する基材を提供することであって、当該部位は、代替形状のウェル、及び、ミクロスフェアの集団を含み、当該集団は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含む、提供すること、当該基材をイメージ化することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面を有する基材を含むアレイ構成、及び、基材に分布したミクロスフェアの集団を含むことができ、当該ミクロスフェアは、生物活性剤、及び、シグナル伝達物質要素を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の不連続な部位を有する基材を提供すること、当該部位に、生物活性剤とシグナル伝達物質要素とを含むミクロスフェアの集団を分布させること、当該基材と当該試料とを接触させること、それにより、当該標的分析物が、生物活性剤と結合すると、当該シグナル伝達物質要素由来のシグナルを、標的分析物の存在を表示するものへと改変すること、を含む試料での非標識標的分析物を検出する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の不連続な部位で、それぞれが、当該第１及び第２の不連続な部位に付着した、少なくとも第１及び第２の生物活性剤を含む表面を有する基材を提供すること、当該基材を、当該試料と接触させること、当該基材に対して偏光で照射すること、及び、当該キラル分子の存在の指標として、当該第１及び第２の不連続な部位の少なくとも１つで光の回転を検出すること、を含む試料でのキラル分子を検出する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の不連続な部位を含む第１の表面を有する基材を提供することであって、当該第１の不連続な部位は、ミクロスフェアを含むが、当該第２の不連続な部位は、ミクロスフェアを含まない、提供すること、当該基材に対して光を照射すること、当該基材での照射を検出すること、それにより、当該第２の不連続な部位に対する当該第１の不連続な部位での照度の低下は、当該第１の不連続な部位での第１のミクロスフェアの存在を示す、ことを含むアレイでのミクロスフェアの位置を決定する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の不連続な部位、及び、当該第１及び第２の不連続な部位のそれぞれに付着した少なくとも第１及び第２の標識を含む表面を有する基材を提供すること、当該基材を、少なくとも室温未満にまで冷却すること、及び、当該第１及び第２の標識に由来するシグナルを検出すること、それにより、冷却されていない基材から得たシグナルと比べてシグナルが強くなること、を含むアレイ由来のシグナル出力を増大させる方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の不連続な部位、及び、当該第１及び第２の不連続な部位のそれぞれに付着した少なくとも第１及び第２の標識を含む表面を有する基材を提供すること、当該第１及び第２の不連続な部位に由来する複数の異なる出力のシグナルを検出すること、及び、当該第１及び第２の不連続な部位のそれぞれに由来する残存シグナルから、当該第１及び第２の不連続な部位でのそれぞれの最小シグナルを差し引くことを含む、アレイにおけるバックグラウンドシグナルを差し引く方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の不連続な部位、当該第１及び第２の不連続な部位のそれぞれに付着した少なくとも第１及び第２の標識、及び、シグナル強度が公知である少なくとも第１の内部基準点を含む表面を有する基材を提供すること、当該第１及び第２の標識から第１及び第２のシグナルをそれぞれ検出すること、当該内部基準点からシグナルを検出すること、及び、当該内部基準点に由来するシグナルと、当該イメージの不均一性の指標である公知のシグナル強度を示す内部基準点との間の変化を決定することを含む、イメージの不均一性を補正する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面を有する基材を含むアレイ、当該表面での反射コーティング、及び、当該基材に分布したミクロスフェアの集団を含むアレイを提供することを含む、試料での標的分析物を検出する方法を含むことができる。これらのミクロスフェアは、それぞれが、異なる生物活性剤を含む、少なくとも第１及び第２の亜集団を含む。この方法は、当該標的分析物が、生物活性剤の少なくとも１つに結合するように、当該アレイを当該試料と接触させること、及び、当該標的分析物の存在を検出すること、をさらに含む。好ましい実施形態では、当該標的分析物に、標識を付ける。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、代替形状のウェル、及び、当該基材に分布したミクロスフェアの集団を含む、不連続な部位を含む表面を有する基材を含むアレイを提供することを含む、試料での標的分析物を検出する方法を含むことができる。これらのミクロスフェアは、それぞれが、異なる生物活性剤を含む、少なくとも第１及び第２の亜集団を含む。この方法は、当該標的分析物が、生物活性剤の少なくとも１つに結合するように、当該アレイを当該試料と接触させること、及び、当該標的分析物の存在を検出すること、をさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の不連続な部位を含む表面を有する基材、及び、当該基材に分布させたミクロスフェアの集団を提供することであって、当該ミクロスフェアは、それぞれが異なる生物活性剤を含む、少なくとも第１及び第２の亜集団を含む、提供すること、当該基材を当該試料と接触させて、当該標的分析物を、当該生物活性剤の少なくとも１つに結合させること、を含む試料での標的分析物を検出する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、当該基材を、少なくとも室温未満にまで冷却し、そして、シグナルを検出することを含み、それにより、当該シグナルは、冷却していない基材に由来するシグナルよりも強くなる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第６，８９０，７６４号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位と、当該部位に分布したミクロスフェアの集団を含む表面を有する基材を含む組成物を含むことができる。当該ミクロスフェアの少なくとも１つは、ナノクリスタルを含む。当該ナノクリスタルは、例えば、ゾルゲル重合プロセスを使用して、ミクロスフェアに埋め込むことができ、または、ミクロスフェアに付着させることができる。これらのミクロスフェアは、生物活性剤、及び／または、識別子結合リガンドを任意に含む。追加の態様では、当該ミクロスフェアの集団は、少なくとも第１及び第２の生物活性剤をそれぞれ含む第１及び第２の亜集団、及び、それぞれの生物活性剤を同定することができる第１及び第２の光学的シグネチャーをそれぞれ含む。当該光学的シグネチャーの少なくとも１つは、ナノクリスタルを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、基材の個々の部位を含む表面を形成し、及び、当該個々の部位が、ミクロスフェアを含むように、当該表面にミクロスフェアを分布させることを含む、組成物を製造する方法を含むことができる。これらのミクロスフェアは、光学的シグネチャーを含み、及び、少なくとも１つの光学的シグネチャーは、少なくとも１つのナノクリスタルを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該試料を組成物と接触させることを含む、試料での標的分析物の存在を決定する方法を含むことができる。当該組成物は、不連続な部位を含む表面を有する基材と、それぞれが、生物活性剤、及び、当該生物活性剤を同定することができる光学的シグネチャーとを含む、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団とを含む。これらのミクロスフェアは、不連続な部位でミクロスフェアを含み、そして、光学的シグネチャーの少なくとも１つが、少なくとも１つのナノクリスタルを含むようにして当該表面に分布している。次いで、標的分析物の有無を決定する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ナノクリスタルを多孔質シリカに付着させること、及び、ゾルゲル重合プロセスを使用して、シリカの細孔を封孔することを含む、組成物を作製する方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／０２０１９９２号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、固有分子指標（ＵＭＩ）を使用して、核酸断片配列を決定するための方法、装置、システム、及び、コンピュータープログラム製品を含むことができる。一部の実施態様では、当該ＵＭＩは、非ランダムＵＭＩ（ＮＲＵＭＩ）、または、可変長の非ランダム固有分子指標（ｖＮＲＵＭＩ）を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料由来の核酸分子をシークエンシングする方法を含むことができる。この方法は；（ａ）当該試料でのＤＮＡ断片にアダプターを施して、ＤＮＡ－アダプター産物を得ることであって、それぞれのアダプターは、非ランダム固有分子指標を含み、それらアダプターの非ランダム固有分子指標は、少なくとも２つの異なる分子長を有しており、かつ、可変長の非ランダム固有分子指標（ｖＮＲＵＭＩ）のセットを形成する、ＤＮＡ－アダプター産物を得ること；（ｂ）当該ＤＮＡ－アダプター産物を増幅して、複数の増幅したポリヌクレオチドを得ること；（ｃ）当該複数の増幅したポリヌクレオチドのシークエンシングを行い、それにより、ｖＮＲＵＭＩのセットに関連する複数の読み取りを得ること；（ｄ）当該複数の読み取りの内、同じ可変長の非ランダム固有分子指標（ｖＮＲＵＭＩ）に関連した読み取りを同定すること；及び、（ｅ）同じｖＮＲＵＭＩに関連した読み取りを使用して、当該試料でのＤＮＡ断片の配列を決定すること、を含む。一部の実施態様では、同じｖＮＲＵＭＩに関連した読み取りを同定することは、複数の読み取りのそれぞれの読み取りについて、ｖＮＲＵＭＩのセットに関するアライメントスコアを得ることを含み、それぞれのアライメントスコアは、読み取りとｖＮＲＵＭＩとの間の部分配列の類似性を示し、当該部分配列は、当該ｖＮＲＵＭＩから誘導したヌクレオチドが存在する可能性が高い読み取り領域にある。一部の実施態様では、当該アライメントスコアは、当該読み取りとｖＮＲＵＭＩとの間の部分配列のヌクレオチドの一致とヌクレオチドの編集に基づいている。一部の実施態様では、ヌクレオチドの編集は、ヌクレオチドの置換、付加、及び、欠失を含む。一部の実施態様では、各アライメントスコアは、配列が始まる時点での不一致に対してペナルティーを科すが、当該配列が終わる時点での不一致に対してはペナルティーを科さない。一部の実施態様では、読み取りとｖＮＲＵＭＩとの間のアライメントスコアを得ることは、（ａ）ｖＮＲＵＭＩと、当該読み取りの部分配列の可能なすべてのプレフィックス配列のそれぞれとの間のアライメントスコアを計算すること；（ｂ）読み取りの部分配列と、ｖＮＲＵＭＩの可能なすべてのプレフィックス配列のそれぞれとの間のアライメントスコアを計算すること；及び、（ｃ）（ａ）及び（ｂ）で計算したアライメントスコアの内で最大のアライメントスコアを、読み取りとｖＮＲＵＭＩとの間のアライメントスコアとして得る、ことを含む。一部の実施態様では、当該部分配列の長さは、ｖＮＲＵＭＩのセットにおいて最長のｖＮＲＵＭＩの長さと等しい。一部の実施態様では、（ｄ）で同じｖＮＲＵＭＩに関連付けした読み取りを同定することは、複数の読み取りのそれぞれの読み取りについて、アライメントスコアに基づいて、ｖＮＲＵＭＩのセットから、少なくとも１つのｖＮＲＵＭＩを選択すること；及び、複数の読み取りのそれぞれの読み取りを、読み取りのために選択した少なくとも１つのｖＮＲＵＭＩに関連付ける、ことをさらに含む。一部の実施態様では、ｖＮＲＵＭＩのセットから少なくとも１つのｖＮＲＵＭＩを選択することは、ｖＮＲＵＭＩのセットの内で最高のアライメントスコアを有するｖＮＲＵＭＩを選択することを含む。一部の実施態様では、少なくとも１つのｖＮＲＵＭＩが、２つ以上のｖＮＲＵＭＩを含む。一部の実施態様では、当該方法は、２つ以上のｖＮＲＵＭＩの内の１つを、（ｄ）及び（ｅ）での同じｖＮＲＵＭＩとして選択すること、をさらに含む。一部の実施態様では、（ａ）で施すアダプターは、（ｉ）少なくとも２つの異なる分子長を有するオリゴヌクレオチド配列のセットを提供すること；（ｉｉ）オリゴヌクレオチド配列のセットからオリゴヌクレオチド配列のサブセットを選択することであって、オリゴヌクレオチド配列のサブセットのオリゴヌクレオチド配列の間でのすべての編集距離が閾値を満たし、オリゴヌクレオチド配列のサブセットが、ｖＮＲＵＭＩのセットを形成する、選択すること；及び（ｉｉｉ）それぞれが、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’腕、一本鎖３’腕、及び、ｖＮＲＵＭＩのセットの少なくとも１つのｖＮＲＵＭＩを含んでいるアダプターを合成して得る。一部の実施態様では、当該閾値は、３である。一部の実施態様では、ｖＮＲＵＭＩのセットは、６個のヌクレオチドのｖＮＲＵＭＩと、７個のヌクレオチドのｖＮＲＵＭＩとを含む。一部の実施態様では、（ｅ）の決定は、同じｖＮＲＵＭＩに関連付けした読み取りをグループにまとめて、試料内のＤＮＡ断片の配列のコンセンサスヌクレオチド配列を得る、ことを含む。一部の実施態様では、当該コンセンサスヌクレオチド配列を、部分的には、読み取りの品質スコアに基づいて得る。一部の実施態様では、（ｅ）の決定は、同じｖＮＲＵＭＩに関連付けた読み取りの内、参照配列内での同じ読み取り位置または類似の読み取り位置を有する読み取りを同定すること、及び、読み取りを使用して、ＤＮＡ断片の配列が、（ｉ）同じｖＮＲＵＭＩと関連付いており、及び、（ｉｉ）当該参照配列内で同じ読み取り位置または同様の読み取り位置を有することを決定すること、を含む。一部の実施態様では、ｖＮＲＵＭＩのセットは、約１０，０００個以下の異なるｖＮＲＵＭＩを含む。一部の実施態様では、ｖＮＲＵＭＩのセットは、約１，０００個以下の異なるｖＮＲＵＭＩを含む。一部の実施態様では、ｖＮＲＵＭＩのセットは、約２００個以下の異なるｖＮＲＵＭＩを含む。一部の実施態様では、当該試料でのＤＮＡ断片にアダプターを施すことは、アダプターを、当該試料でのＤＮＡ断片の両端に対して施すことを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）少なくとも２つの異なる分子長を有するオリゴヌクレオチド配列のセットを提供すること；（ｂ）オリゴヌクレオチド配列のセットからオリゴヌクレオチド配列のサブセットを選択することであって、オリゴヌクレオチド配列のサブセットのオリゴヌクレオチド配列の間のすべての編集距離は、閾値を満たしており、オリゴヌクレオチド配列の当該サブセットは、可変長の非ランダムな固有分子指標（ｖＮＲＵＭＩ）のセットを形成する、選択すること；及び、（ｃ）複数のシークエンシングアダプターを合成することであって、それぞれのシークエンシングアダプターは、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’腕、一本鎖３’腕、及び、ｖＮＲＵＭＩセットの少なくとも１つのｖＮＲＵＭＩを含む、合成することを含むシークエンシングアダプターを調製するための方法を含むことができる。一部の実施態様では、（ｂ）は、（ｉ）オリゴヌクレオチド配列のセットからオリゴヌクレオチド配列を選択すること；（ｉｉ）当該選択したオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド配列の拡張セットに加え、そして、オリゴヌクレオチド配列のセットから当該選択したオリゴヌクレオチドを除去して、オリゴヌクレオチド配列が減ったセットを得ること；（ｉｉｉ）距離関数を最大化する縮小セットからインスタントオリゴヌクレオチド配列を選択することであって、当該距離関数は、インスタントオリゴヌクレオチド配列と、拡張セット内のいずれかのオリゴヌクレオチド配列との間の最小編集距離であり、当該距離関数は、閾値を満たす、選択すること；（ｉｖ）当該インスタントオリゴヌクレオチドを、当該拡張セットに加え、そして、当該縮小セットからインスタントオリゴヌクレオチドを除去すること；（ｖ）（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を、１回以上反復すること；及び、（ｖｉ）ｖＮＲＵＭＩのセットを形成するオリゴヌクレオチド配列のサブセットとして、拡張セットを提供すること、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）試料内のＤＮＡ断片に対してアダプターを施して、ＤＮＡ－アダプター産物を得ることであって、それぞれのアダプターは、非ランダム固有分子指標を含み、及び、当該アダプターの非ランダム固有分子指標は、少なくとも２つの異なる分子長を有し、かつ、可変長の非ランダム固有分子指標（ｖＮＲＵＭＩ）のセットを形成する、ＤＮＡ－アダプター産物を得ること；（ｂ）ＤＮＡ－アダプター産物を増幅して、複数の増幅したポリヌクレオチドを得ること；（ｃ）複数の増幅したポリヌクレオチドをシークエンシングして、それにより、ｖＮＲＵＭＩのセットに関連した複数の読み取りを得ること；及び、（ｄ）複数の読み取りの内、同じ可変長の非ランダム固有分子指標（ｖＮＲＵＭＩ）に関連付けた読み取りを同定することを含む、試料由来の核酸分子をシークエンシングする方法を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）当該試料でのＤＮＡ断片に対してアダプターを施して、ＤＮＡアダプター産物を得ることであって、それぞれのアダプターは、固有分子指標（ＵＭＩ）を含んでおり、及び、当該アダプターの固有分子指標（ＵＭＩ）は、少なくとも２つの異なる分子長を有しており、かつ、可変長の固有分子指標（ｖＵＭＩ）のセットを形成する、ＤＮＡアダプター産物を得ること；（ｂ）ＤＮＡ－アダプター産物を増幅して、複数の増幅したポリヌクレオチドを得ること；（ｃ）複数の増幅したポリヌクレオチドをシークエンシングすること、それにより、ｖＵＭＩのセットに関連する複数の読み取りを得ること；及び、（ｄ）複数の読み取りの内で、同じ可変長固有分子指標（ｖＵＭＩ）に関連付けられた読み取りを同定することを含む、試料由来の核酸分子をシークエンシングする方法を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）当該試料でのＤＮＡ断片に対してアダプターを施して、ＤＮＡアダプター産物を得ることであって、それぞれのアダプターは、複数の固有分子指標（ＵＭＩ）のセットにおいて、固有分子指標（ＵＭＩ）を含んでいる、ＤＮＡアダプター産物を得ること；（ｂ）ＤＮＡ－アダプター産物を増幅して、複数の増幅したポリヌクレオチドを得ること；（ｃ）複数の増幅したポリヌクレオチドをシークエンシングすること、それにより、ＵＭＩのセットに関連した複数の読み取りを得ること；（ｄ）複数の読み取りのそれぞれの読み取りについて、ＵＭＩのセットに関するアライメントスコアを得ることであって、それぞれのアライメントスコアは、読み取りとＵＭＩとの間の部分配列の類似性を示す、アライメントスコアを得ること；（ｅ）複数の読み取りの内、当該アライメントスコアを使用して、同じＵＭＩに関連付けた読み取りを同定すること；及び（ｅ）同じＵＭＩに関連付けた読み取りを使用して、当該試料でのＤＮＡ断片の配列を決定することを含む、試料由来の核酸分子をシークエンシングする方法を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、これらの方法を実施する、ＤＮＡ断片配列を決定するためのシステム、装置、及び、コンピュータープログラム製品を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、コンピューターシステムの１つ以上のプロセッサーにより実行されると、コンピューターシステムが、固有分子指標（ＵＭＩ）を使用して、試料での目的の配列の配列情報を決定するための方法を実行に移す、一時的でない機械可読媒体保存プログラムコードを含むコンピュータープログラム製品を含むことができる。当該プログラムコードは、上記した方法を実行するための指示を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／０２０１９７４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＤＮＡの標的増幅及び試料の特定を行うための方法及び組成物を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体試料から核酸配列情報を得るための方法であって、（ａ）異なる標的核酸を含む生体試料を用意すること、（ｂ）その生体試料と、複数の異なるプローブセットを接触させて、その異なる標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体を形成させること、（ｃ）その生体試料から核酸を増幅して、アンプリコンを作製すること（接触ステップ（ｂ）の前には、生体試料から核酸を精製しない）、及び（ｄ）増幅した試料の複数の部分に関する核酸配列情報を得ることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＦＦＰＥ試料から核酸配列情報を得る方法であって、（ａ）保存組織に包埋された異なる標的核酸を含むＦＦＰＥ試料を用意すること、（ｂ）そのＦＦＰＥ試料と、複数の異なるプローブセットを接触させて、その異なる標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体を形成すること、（ｃ）そのＦＦＰＥ試料から核酸を増幅して、アンプリコン作製すること（接触ステップ（ｂ）の前には、ＦＦＰＥ試料から核酸を精製しない）、及び（ｄ）複数のそのアンプリコンに関する核酸配列情報を得ることを含む方法を含むことができる。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）において増幅する前に、ＦＦＰＥ試料から核酸を精製しない。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＦＦＰＥ試料から核酸を増幅するための方法であって、（ａ）保存組織に包埋された核酸を含むＦＦＰＥ試料を用意すること（その核酸は、３’から５’に向かって、連続した第１、第２及び第３の標的ドメインを有する）、（ｂ）そのＦＦＰＥ試料と、複数の異なるプローブセットを接触させて、その異なる標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体を形成すること（各プローブセットは、（ｉ）５’から３’に向かって、第１のプライミング配列、及び第１の標的ドメインと実質的に相補的である配列を含む第１のプローブと、（ｉｉ）５’から３’に向かって、第３の標的ドメインと実質的に相補的な配列、及び第２のプライミング配列を含む第２のプローブを含む）、（ｃ）そのハイブリダイゼーション複合体と、伸長酵素及びヌクレオチドを接触させること（第１のプローブが、（ｂ）で形成したハイブリダイゼーション複合体の第２の標的ドメインに沿って伸長する）、（ｄ）伸長した第１のプローブを第２のプローブにライゲーションして、増幅鋳型を形成すること、ならびに（ｅ）第１のプライミング配列及び第２のプライミング配列と相補的である第１及び第２のプライマーを用いて、その増幅鋳型を増幅して、アンプリコンを作製し、複数のそのアンプリコンに関する核酸配列情報を得ることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸試料の特定方法であって、（ａ）核酸を含む細胞試料を用意すること、（ｂ）その試料の細胞を溶解試薬によって溶解させて、その細胞試料の細胞内から核酸を遊離させることによって、溶解液を形成すること、（ｃ）溶解した試料から、核酸を増幅すること（増幅ステップ（ｃ）の開始前には、溶解液から核酸を精製しない）、及び（ｄ）増幅した試料の複数の部分に関する核酸配列情報を得て、その配列情報を第２の配列情報セットと比較することを含む方法を含むことができる。ある特定の態様では、その核酸は、ＤＮＡである。ある特定の態様では、その試料は、血液試料である。ある特定の態様では、その試料は、乾燥血液を含む。ある特定の態様では、その試料は、ＦＦＰＥ組織試料を含む。ある特定の態様では、第２の配列情報セットは、全ゲノム配列を含む。ある特定の態様では、第２の配列情報セットは、エキソーム配列情報を含む。ある特定の態様では、その増幅作業は、標的増幅反応を含む。ある特定の態様では、その標的増幅反応は、２つのプローブの伸長及びライゲーションを含む。ある特定の態様では、その標的増幅反応は、試料ゲノムの一部に対して特異的である少なくとも２つの増幅プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、異なる試料処理段階の際の生体試料の同一性を調べる方法であって、（ａ）核酸を含む細胞試料を用意すること、（ｂ）その試料の一部を第１の部分及び第２の部分に分離し、上記の実施形態に従って、その生体試料の第１の部分から、第１の核酸配列情報セットを得ること（第１の核酸配列情報セットは、同一性の情報を与える配列情報を含む）、（ｃ）第２の部分から核酸を精製し、第２の配列情報セットを得ること、ならびに（ｄ）コンピューターによるロジックを用いて、第１の核酸配列情報セットから得られる、同一性の情報を与える配列情報と、第２の配列情報セットを比較して、第１の配列情報セット及び第２の配列情報セットが、同一の供給源から得たものであることを確認することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、２つの異なる生体試料の供給源を確認する方法であって、（ａ）核酸を含む第１の細胞試料を用意すること、（ｂ）上記の実施形態のうちのいくつかに従って、その生体試料の第１の部分から第１の核酸配列情報セットを得ること（第１の核酸配列情報セットは、同一性の情報を与える配列情報を含む）、（ｃ）精製核酸を含む第２の核酸試料を用意し、第２の配列情報セットを得ること、及び（ｄ）コンピューターによるロジックを用いて、第１の核酸配列情報セットから得られる、同一性の情報を与える配列情報と、第２の配列情報セットを比較して、第１の配列情報セット及び第２の配列情報セットが、同一の個体から得たものであることを確認することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／０１５５７７４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ナノポアに隣接するポリメラーゼに固定されたテザーを用いて、ポリヌクレオチドをシークエンシングするための組成物、システム及び方法を含むことができる。一態様では、組成物は、第１の側、第２の側、ならびに第１及び第２の側を貫通している孔を含むナノポアを含む。その組成物は、複数のヌクレオチドも含むことができ、その各ヌクレオチドは、細長いタグを含む。その組成物は、第１及び第２のポリヌクレオチドも含むことができ、その第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと相補的である。その組成物は、ナノポアの第１の側に隣接して配置されたポリメラーゼも含むことができ、そのポリメラーゼは、第２のポリヌクレオチドの配列に基づき、第１のポリヌクレオチドに、上記の複数のヌクレオチドのヌクレオチドを付加するように構成されている。その組成物は、ヘッド領域、テール領域、及びそれらの間に配置された細長い本体を含む恒久的なテザーも含むことができ、そのヘッド領域は、ポリメラーゼに固定されており、細長い本体は、ナノポアの孔の中にある。その組成物は、その細長い本体の上に配置された第１の部分であって、ポリメラーゼが作用を及ぼす第１のヌクレオチドの細長いタグに結合するように構成されている第１の部分、及びその細長い本体の上に配置されたレポーター領域であって、第１のヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドの配列内の次のヌクレオチドと相補的であるかまたは相補的でないときに知らせるように構成されているレポーター領域も含むことができる。別の態様では、方法は、第１の側、第２の側、ならびに第１及び第２の側を貫通している孔を含むナノポアを用意することを含むことができる。その方法は、複数のヌクレオチドであって、そのヌクレオチドのそれぞれが、細長いタグを含む複数のヌクレオチドを用意することをさらに含むことができる。その方法は、第１及び第２のポリヌクレオチドであって、その第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドと相補的である第１及び第２のポリヌクレオチドを用意することをさらに含むことができる。その方法は、ナノポアの第１の側に隣接して配置されたポリメラーゼであって、第２のポリヌクレオチドの配列に基づき、第１のポリヌクレオチドに、その複数のヌクレオチドのうちのヌクレオチドを付加するように構成されており、ヘッド領域、テール領域、及びそれらの間に配置された細長い本体（その細長い本体は、ナノポアの孔の中にある）を含む恒久的なテザーに固定されているポリメラーゼを用意することをさらに含むことができる。その方法は、その細長いタグが、その細長い本体の上に配置された第１の部分に結合することに基づき、第１のヌクレオチドが、そのポリメラーゼの作用を受けていると判断することをさらに含むことができる。その方法は、第１のヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドの配列内の次のヌクレオチドと相補的であるかまたは相補的でないときに、その細長い本体の上に配置されたレポーター領域によって知らせることをさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／０１４１０２０号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、単分子を標的領域に配置するのに有用な基材及び方法を含むことができる。第１の態様は、その基材上の構造体に固定化された複数の第１及び第２の捕捉プライマーと、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドであって、その一方の末端が、その捕捉プライマーのうちの１つに結合し、他方の末端が標的分子に連結され、その標的ポリヌクレオチドが、第１及び第２の捕捉プライマーと相補的な第１及び第２の捕捉プライマー結合領域に挟まれた標的領域を含み、第２の捕捉プライマー結合領域が、第２の捕捉プライマーに対する塩基対ミスマッチを含む標的ポリヌクレオチドと、その構造体に固定化されたその標的ポリヌクレオチドと相補的な複数のクローナルアンプリコンを含む基材である。いくつかの実施形態では、その塩基対ミスマッチは、１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、６塩基対、７塩基対、８塩基対、９塩基対または１０塩基対のミスマッチである。いくつかの実施形態では、その塩基対ミスマッチは、３塩基対のミスマッチである。いくつかの実施形態では、その基材は、複数の構造体をさらに含む。いくつかの実施形態では、その構造体は、単一標的分子を含む。いくつかの実施形態では、その構造体は、複数のクローナルアンプリコンで埋め尽くされている。いくつかの実施形態では、その複数の構造体は、単一標的分子を含む。いくつかの実施形態では、構造体のうちの２つ以上が、異なる単一標的分子を含む。いくつかの実施形態では、それらの構造体は、複数のクローナルアンプリコンで埋め尽くされている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、基材の構造体の上に、単一標的分子を配置する方法を含むことができる。一態様では、その方法は、基材上の構造体に固定化された複数の第１及び第２の捕捉プライマーを少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって、基材の構造体の上に、単一標的分子を配置する方法であって、その標的ポリヌクレオチドが、第１及び第２の捕捉プライマーと相補的な第１及び第２の捕捉プライマー結合領域に挟まれた標的領域を含み、第２の捕捉プライマー結合領域が、第２の捕捉プライマーに対する塩基対ミスマッチを含み、標的分子に連結される方法である。その方法は、標的ポリヌクレオチドと相補的な複数のクローナルアンプリコンを作製するために、標的ポリヌクレオチドの構造体への平均輸送速度を上回る平均増幅速度で、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを増幅することをさらに含む。その方法のいくつかの実施形態では、塩基対ミスマッチは、１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、６塩基対、７塩基対、８塩基対、９塩基対または１０塩基対のミスマッチである。その方法のいくつかの実施形態では、塩基対ミスマッチは、３塩基対のミスマッチである。その方法のいくつかの実施形態では、その基材は、複数の構造体を含む。その方法のいくつかの実施形態では、その構造体は、単一標的分子を含む。その方法のいくつかの実施形態では、その構造体は、複数のクローナルアンプリコンで埋め尽くされている。その方法のいくつかの実施形態では、その複数の構造体は、単一標的分子を含む。その方法のいくつかの実施形態では、その構造体のうちの２つ以上は、異なる単一標的分子を含む。その方法のいくつかの実施形態では、その構造体は、複数のクローナルアンプリコンで埋め尽くされている。その方法のいくつかの実施形態では、その構造体で作製される２つ目以降のアンプリコンの平均増幅速度は、第１のアンプリコンの平均増幅速度を上回る。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＰＮＡからなる群から選択した１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチドは、１，０００ヌクレオチド未満を含む。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチドは、１０～２５塩基対、２６～５０塩基対、５１～１００塩基対、１０１～２００塩基対、２０１～３００塩基対、３０１～４００塩基対、４０１～５００塩基対、５０１～６００塩基対、６０１～７００塩基対、７０１～８００塩基対、８０１～９００塩基対または９０１～１０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、その標的分子としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖鎖、アミノ酸、ヌクレオチド、単糖、ハプテン、リガンド、抗原、分析物、低分子有機化合物または無機化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、その標的分子としては、ポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、ナノポア、結合ポリペプチド及び酵素からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ナノポアの孔は、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＮａｌＰ、ＷＺＡ、ＣｌｙＡ毒素、α－溶血素、炭疽毒素、ロイコチジン及びＤＮＡオリガミのナノポアからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、その結合ポリペプチドは、抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）、Ｔ細胞受容体、ミクロシン、神経ペプチド、Ｇタンパク質共役型受容体、抗体、上皮細胞増殖因子受容体及びＨＥＲ２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／００９５９６９号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ハイスループットな生物学的及び化学的アッセイプラットフォームから、大規模データをキャプチャー、統合、編成、ナビゲート及び照会するための方法、システム及び装置を含むことができる。いくつかの実施形態は、オントロジーまたは分類学において、化学的、医学的及び／または生物学的観点により、構造及び／または機能によって関係付けられる実験データ、特徴及びデータグループを関連付けるための方法、システム及びインターフェースを提供する。いくつかの実施形態は、データソース情報によってデータをフィルタリングし、大量のデータを通じた動的ナビゲーションを実行して、特定の照会について、最も関連する結果を見つけられるようにするための方法、システム及びインターフェースも提供する。１つまたは複数のコンピューターのシステムは、動作中にそのシステムにアクションを実行させるソフトウェア、ファームウェア、ハードウェアまたはそれらの組み合わせがそのシステムにインストールされていることによって、特定の動作またはアクションを実行するように構成できる。１つまたは複数のコンピュータープログラムは、データ処理装置によってその命令が実行されると、（ａ）１つまたは複数のプロセッサーによって、データベースから複数の遺伝子セットを選択すること（その複数の遺伝子セットの各遺伝子セットは、複数の遺伝子及びその複数の遺伝子と関連する複数の実験値を含み、その複数の実験値は、少なくとも１つの実験における生物学的、化学的または医学的な関心概念と相関している）、（ｂ）その複数の遺伝子の中の第１の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の実験値を用いて、遺伝子セットごとに、１つまたは複数のプロセッサーによって、その第１の１つまたは複数の遺伝子について、１つまたは複数の実験遺伝子スコアを求めること、（ｃ）その第１の１つまたは複数の遺伝子と、その複数の遺伝子の中の第２の１つまたは複数の遺伝子の相関関係に少なくとも部分的に基づき、第２の１つまたは複数の遺伝子について、遺伝子セットごとに、１つまたは複数のプロセッサーによって、１つまたは複数のインシリコ遺伝子スコアを求めること（その第１の１つまたは複数の遺伝子と、その第２の１つまたは複数の遺伝子の相関関係は、データベースにおける、その複数の遺伝子セット以外の他の遺伝子セットに示される）、（ｄ）第１の１つまたは複数の遺伝子について、（ｂ）で求めた１つまたは複数の実験遺伝子スコア、及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、（ｃ）で求めた１つまたは複数のインシリコ遺伝子スコアに少なくとも部分的に基づき、１つまたは複数のプロセッサーによって、第１及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、要約スコアを得ること（各要約スコアは、その複数の遺伝子セットにわたって集計される）、ならびに（ｅ）第１及び第２の１つまたは複数の遺伝子の要約スコアを用いて、１つまたは複数のプロセッサーによって、生物学的、化学的または医学的な関心概念と関連する可能性がある遺伝子を特定することを含む動作をその装置に実行させる命令を含むことによって、特定の動作またはアクションを実行するように構成できる。実施態様は、下記の特徴のうちの１つまたは複数を含んでよい。いくつかの実施態様では、（ｃ）は、その複数の遺伝子セットの遺伝子セットごとに、（ｉ）データベースから第２の複数の遺伝子セットを特定することを含み、その第２の複数の遺伝子セットの各遺伝子セットは、第２の複数の遺伝子及びその第２の複数の遺伝子と関連する第２の複数の実験値を含み、その第２の複数の実験値は、第１の１つまたは複数の遺伝子の中の第１の遺伝子と相関している。その方法は、（ｉｉ）第２の複数の遺伝子セットにわたって実験値を集計して、第１の１つまたは複数の遺伝子の中の第１の遺伝子について、集計値のベクトルを得ることも含み得る。その方法は、（ｉｉｉ）第１の１つまたは複数の遺伝子の中の１つまたは複数の他の遺伝子に（ｉ）及び（ｉｉ）を適用し、それによって、第１の１つまたは複数の遺伝子の中の１つまたは複数の他の遺伝子の実験値の１つまたは複数のベクトルを得ることも含み得る。その方法は、（ｉｖ）第１の１つまたは複数の遺伝子の中の第１の遺伝子及び１つまたは複数の他の遺伝子の集計値のベクトルを集約し、それによって、第２の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数のインシリコ遺伝子スコアを含む１つの圧縮ベクトルを得ることも含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、第１の１つまたは複数の遺伝子の中の特定の遺伝子の（ｉｖ）の各集約ベクトルを、その特定の遺伝子の実験値に比例して重み付けする方法を含むことができる。その方法では、第１の１つまたは複数の遺伝子中の特定の遺伝子の（ｉｖ）の各集約ベクトルを、その特定の遺伝子について特定された第２の複数の遺伝子セットの遺伝子セットの数に比例して重み付けする。いくつかの実施態様は、（ｄ）の前に、第３の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の遺伝子群スコアを求めることをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施態様は、（ｉ）群ラベルに関係付けられた遺伝子群（その遺伝子群は、特定の遺伝子を含む）をそれぞれ含む１つまたは複数の遺伝子群の遺伝子メンバーシップ、及び（ｉｉ）第１の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の実験値の少なくともいくつかを用いて、その特定の遺伝子の各遺伝子群スコアを求める方法を提供する。いくつかの実施態様は、（ｄ）第３の１つまたは複数の遺伝子の少なくともいくつかの遺伝子群スコア、ならびに第１の１つまたは複数の遺伝子について、（ｂ）で求めた１つまたは複数の実験スコア、及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、（ｃ）で求めた１つまたは複数のインシリコスコアに少なくとも部分的に基づき、第１及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、要約スコアを得ることを含む方法を提供する。いくつかの実施態様は、第３の１つまたは複数の遺伝子について１つまたは複数の遺伝子群スコアを求める方法であって、第３の１つまたは複数の遺伝子の中の特定の遺伝子について、その特定の遺伝子をそれぞれ含む１つまたは複数の遺伝子群を特定することを含む方法を提供する。その方法は、遺伝子群ごとに、第１の１つまたは複数の遺伝子の中のものである遺伝子群のメンバーの割合（％）を求めることも含み得る。その方法は、遺伝子群ごとに、その遺伝子群のメンバーである第１の１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくともいくつかの１つまたは複数の実験値を集計し、それによって、その遺伝子群について、実験値の和を得ることも含み得る。その方法は、第１の１つまたは複数の遺伝子の中のものである遺伝子群のメンバーの割合（％）、及びその遺伝子群の実験値の和を用いて、第３の１つまたは複数の遺伝子の中の特定の遺伝子について、遺伝子群スコアを求めることも含み得る。いくつかの実施態様は、第１の１つまたは複数の遺伝子の中のものである遺伝子群のメンバーの割合（％）、及びその遺伝子群の実験値の和を用いて、遺伝子群スコアを求めることが、遺伝子群ごとに、メンバーの割合（％）と実験値の和の積を得て、それによって、１つまたは複数の遺伝子群について、１つまたは複数の積を得ることを含む方法を提供する。その方法は、その１つまたは複数の遺伝子群にわたって、１つまたは複数の積を合計し、それによって、合計した積を得ることも含み得る。その方法は、合計した積に基づき、第３の１つまたは複数の遺伝子の中の特定の遺伝子について、遺伝子群スコアを求めることも含み得る。いくつかの実施態様では、その方法は、（ｄ）の前に、第４の１つまたは複数の遺伝子についてそれぞれ、インタラクトームスコアを求めることをさらに含む。いくつかの実施態様では、特定の遺伝子の各インタラクトームスコアは、（ｉ）遺伝子のネットワークにおける、特定の遺伝子と、その特定の遺伝子に結びつけられた他の遺伝子との関係、及び（ｉｉ）第１の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の実験値のうちの少なくともいくつかを用いて求める。いくつかの実施態様では、（ｄ）は、第４の１つまたは複数の遺伝子の少なくともいくつかのインタラクトームスコア、ならびに第１の１つまたは複数の遺伝子について、（ｂ）で求めた１つまたは複数の実験遺伝子スコア、及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、（ｃ）で求めた１つまたは複数のインシリコ遺伝子スコアに少なくとも部分的に基づき、少なくとも第１の１つまたは複数の遺伝子及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、要約スコアを得ることを含む。いくつかの実施態様では、遺伝子のネットワークは、遺伝子、タンパク質及び／またはリン脂質間の相互作用及び関係に基づくものである。いくつかの実施態様では、インタラクトームスコアを算出することは、下記のように、インタラクトームスコアをＮｉ’として算出することを含む。
Ｎｉ’＝Ｎｉ＋Σ（（Ｎｉ＋Ｎｎ）＊ｅｄｇｅ＿ｗｅｉｇｈｔｎ）
式中、Ｎｉは、特定の遺伝子ｉの要約スコアであり、Ｎｎは、特定の遺伝子に結びつけられた遺伝子ｎの要約スコアであり、ｅｄｇｅ＿ｗｅｉｇｈｔｎは、特定の遺伝子ｉ及び遺伝子ｎを結ぶエッジの重みである。いくつかの実施態様では、インタラクトームスコアを算出することは、第２の閾値よりも小さいＮｉ’を第１のパス辞書に保存し、第１のパス辞書中のすべての遺伝子について算出を繰り返し、それによって、インタラクトームスコアをアップデートすることをさらに含む。いくつかの実施態様では、その方法は、目的関数を最適化することによって、モデルを訓練することをさらに含む。いくつかの実施態様では、モデルの訓練は、ブートストラップ法をブートストラップ試料に適用することを含む。いくつかの実施態様では、その目的関数は、ブートストラップを実施後の少なくとも１つの要約スコア分布に関連するものである。いくつかの実施態様では、目的関数の最適化は、訓練セット及び検証セット間における要約スコアの差を最小限にすることを含む。いくつかの実施態様では、目的関数の最適化は、複数の遺伝子セットから得られる要約スコア分布と、ランダム遺伝子セットから得られる要約スコア分布の間の距離を最大にすることを含む。いくつかの実施態様では、要約スコアを、定められたサイズのバケットでランク付け及びビニングし、その際、ペナルティスコアをそのバケットに割り当て、そのペナルティスコアは、ランクの高い要約スコアほど好ましい。いくつかの実施態様では、その目的関数は、上位にランク付けされた要約スコアのみに基づくものである。いくつかの実施態様では、モデルの訓練は、その目的関数を教師なし機械学習のアプローチで用いて、そのモデルのパラメーターを学習することを含む。いくつかの実施態様では、そのモデルは、以下の形である。
Ｆ（θ）＝ｋ１＊ｃ１＋ｋ２＊ｃ２＋．．．＋ｋｎ＊ｃｎ
式中、θは、モデルのパラメーターであり、ｃｉは、モデルのコンポーネントであり、ｋｉは、コンポーネントに対する重み係数である。いくつかの実施態様では、その方法は、実験データタイプのサンプル重みに基づき、そのモデルのコンポーネントのうちの１つまたは複数をサブコンポーネントに区分することをさらに含む。いくつかの実施態様では、第１及び第２の１つまたは複数の遺伝子の要約スコアは、１つまたは複数のランダム遺伝子セット中の第１及び第２の１つまたは複数の遺伝子の実験値が、生物学的、化学的または医学的な関心概念と相関している確率に基づき減点される。いくつかの実施態様では、特定の遺伝子の各要約スコアは、ランクの積のｐ値に反比例するペナルティ値の分、減点され、そのランクの積は、その１つまたは複数のランダム遺伝子セットにわたる、特定の遺伝子のランクの積を含む。一般的な一態様は、コンピューターシステムの１つまたは複数のプロセッサーによって実行されると、生物学的、化学的または医学的な関心概念と関連する可能性がある遺伝子を特定するための方法をそのコンピューターシステムに実施させるプログラムコードを格納する非一時的な機械可読媒体を含むコンピュータープログラム製品を含み、前記プログラムコードは、（ａ）データベースから複数の遺伝子セットを選択するためのコード（その複数の遺伝子セットの各遺伝子セットは、複数の遺伝子、及びその複数の遺伝子と関連する複数の実験値を含み、その複数の実験値は、少なくとも１つの実験における生物学的、化学的または医学的な関心概念と相関している）を含む。そのプログラムコードは、（ｂ）第１の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の実験値を用いて、遺伝子セットごとに、その複数の遺伝子の中の第１の１つまたは複数の遺伝子について、１つまたは複数の実験遺伝子スコアを求めるためのコードも含む。そのプログラムコードは、（ｃ）第１の１つまたは複数の遺伝子と、第２の１つまたは複数の遺伝子の相関関係に少なくとも部分的に基づき、遺伝子セットごとに、その複数の遺伝子の中の第２の１つまたは複数の遺伝子について、１つまたは複数のインシリコ遺伝子スコアを求めるためのコードも含み、その第１の１つまたは複数の遺伝子と、第２の１つまたは複数の遺伝子の相関関係は、データベースにおける、その複数の遺伝子セット以外の他の遺伝子セットに示される。そのプログラムコードは、（ｄ）第１の１つまたは複数の遺伝子について、（ｂ）で求めた１つまたは複数の実験遺伝子スコア、及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、（ｃ）で求めた１つまたは複数のインシリコ遺伝子スコアに少なくとも部分的に基づき、第１及び第２の１つまたは複数の遺伝子について、要約スコアを得るためのコードも含み、その各要約スコアは、その複数の遺伝子セットにわたって集計される。そのプログラムコードは、（ｅ）第１及び第２の１つまたは複数の遺伝子の要約スコアを用いて、生物学的、化学的または医学的な関心概念と関連する可能性がある遺伝子を特定するためのコードも含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／００２３１１９号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の単細胞に由来する核酸を含むシークエンシングライブラリを調製するための方法を含むことができる。一実施形態では、その方法は、複数の細胞に由来する単離核を用意すること、その単離核の完全性を維持したまま、その単離核に化学的処理を施して、ヌクレオソーム除去核を作製すること、そのヌクレオソーム除去核のサブセットを第１の複数の区画に分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させること（各区画内のトランスポソーム複合体は、トランスポゼース、及び他の区画内の第１のインデックス配列とは異なる第１のインデックス配列を含む）、ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を断片化して、複数の核酸断片にし、それらの核酸断片の少なくとも１本の鎖に第１のインデックス配列を組み込んで、インデックス付き核酸断片を含むインデックス付き核を作製すること（そのインデックス付き核酸断片は、トランスポゼースに結合したままである）、インデックス付き核を組み合わせて、インデックス付き核のプールを作製すること、インデックス付き核のプールのサブセットを第２の複数の区画に分配すること、各区画内のインデックス付き核酸断片に第２のインデックス配列を組み込んで、デュアルインデックス断片を作製すること（各区画内の第２のインデックス配列は、他の区画内の第２のインデックス配列とは異なる）、ならびにデュアルインデックス断片を組み合わせ、それによって、その複数の単細胞に由来する全ゲノム核酸を含むシークエンシングライブラリを作製することを含む。一実施形態では、その化学的処理としては、リチウム３，５－ジヨードサリチル酸のように、核酸とタンパク質の相互作用を破壊できるカオトロピック剤による処理が挙げられる。一実施形態では、その化学的処理としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のように、核酸とタンパク質の相互作用を破壊できる洗浄剤による処理が挙げられる。一実施形態では、核をホルムアルデヒドのような架橋剤で処理してから、単離核に化学的処理を施す。その架橋剤は、約０．２％～約２％の濃度であることができ、一実施形態では、約１．５％である。一実施形態では、インデックス付き核のプールのサブセットを分配後、各区画内のインデックス付き核酸断片に第２のインデックス配列を組み込む前に、ホルムアルデヒドによる架橋を解消する。一実施形態では、架橋の解消は、約５５℃～約７２℃でのインキュベーションを含む。一実施形態では、架橋の解消前に、トランスポゼースをインデックス付き核酸断片から解離する。一実施形態では、トランスポゼースは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、インデックス付き核酸断片から解離する。一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を断片化して、複数の核酸断片にし、第１のインデックス配列を組み込む前に、核を制限酵素で処理する。一実施形態では、核は、制限酵素で処理した後に、リガーゼで処理する。一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセットの分配、インデックス付き核のプールのサブセットの分配、またはこれらの組み合わせは、蛍光活性化核選別によって行う。一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセットは、ほぼ同数の核を含み、一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセットは、１～約２０００個の核を含む。一実施形態では、インデックス付き核のプールのサブセットは、ほぼ同数の核を含み、一実施形態では、インデックス付き核のプールのサブセットは、１～約２５個の核を含む。一実施形態では、インデックス付き核のプールのサブセットは、ヌクレオソーム除去核のサブセットよりも少なくとも１０倍少ない核、またはヌクレオソーム除去核のサブセットよりも少なくとも１００倍少ない核を含む。一実施形態では、第１の複数の区画、第２の複数の区画またはそれらの組み合わせは、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのようなマルチウェルプレートである。一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセットを区画に分配した後に、トランスポソーム複合体を区画に加える。一実施形態では、各トランスポソーム複合体は、トランスポゾンを含み、各トランスポゾンは、移入鎖を含む。一実施形態では、その移入鎖は、第１のインデックス配列及び第１のユニバーサル配列を含む。一実施形態では、インデックス付き核酸断片への第２のインデックス配列の組み込みは、各区画内のインデックス付き核酸断片と、第１のユニバーサルプライマー及び第２のユニバーサルプライマーを接触させること（各プライマーは、インデックス配列を含むとともに、各プライマーは、第１のユニバーサル配列の一部と同一または相補的である配列を含む）、ならびに指数関数的な増幅反応を行うことを含む。一実施形態では、その指数関数的な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であることができ、一実施形態では、そのＰＣＲは、１５～３０サイクルを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／００３７９５０号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、固定化された捕捉プライマーを修飾するマイクロアレイ及び方法を含むことができる。一態様は、ａ）少なくとも１つのウェル、そのウェルを囲む面及びウェル内面を含む基材、ｂ）ウェル内面を覆うとともに、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対を含む第１の層、ならびにｃ）第１の層及びウェルを囲む面を覆う第２の層を含むマイクロアレイである。別の態様は、ａ）少なくとも１つのウェル、そのウェルを囲む面及びウェル内面を含む基材、ならびにｂ）そのウェル内面を覆うとともに、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対及び少なくとも１つの第２の捕捉プライマー対を含む層を含むマイクロアレイである。別の態様は、核酸を増幅するための方法であって、ａ）第１の層を基材の上に作製すること（その基材は、少なくとも１つのウェル、そのウェルを囲む面及びウェル内面を含み、その第１の層は、そのウェル内面を覆う）、ｂ）第１の層内に、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対を付着させること、ｃ）第１の層及びウェルを囲む面を覆う第２の層を基材の上に作製すること、ｄ）標的ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対の捕捉プライマーとハイブリダイズするのに充分な条件で、複数の標的ポリヌクレオチドを含む試料と基材を接触させること、ならびにｅ）第１の結合平衡除外アッセイ（ＫＥＡ）を行って、ウェルの内側で、標的ポリヌクレオチドからアンプリコンのクローン集団を作製し、それによって、標的ポリヌクレオチドを増幅することを含む方法である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸を増幅するための方法であって、ａ）第１の層を基材の上に作製すること（その基材は、少なくとも１つのウェル、そのウェルを囲む面及びウェル内面を含み、その第１の層は、ウェル内面を少なくとも部分的に覆う）ｂ）その第１の層内に少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対を付着させること（その第１の捕捉プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第１の捕捉プライマー、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第２の捕捉プライマーを含む）、ｃ）第１の層及びウェルを囲む面を覆う第２の層を基材の上に作製すること、ｄ）第２の層内に、少なくとも１つの第２の捕捉プライマー対を付着させること（その第２の捕捉プライマー対は、３’末端にリン酸基を持つとともに、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第１の捕捉プライマー、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第２の捕捉プライマーを含む）、ｅ）１ウェルあたり１つの標的ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対のプライマーとハイブリダイズするのに充分な条件で、複数の標的ポリヌクレオチドを含む試料と基材を接触させること（その標的ポリヌクレオチドは、相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５’プライマーヌクレオチド配列または相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７’プライマーヌクレオチド配列をそれぞれ含む相補的なユニバーサルプライマー領域に挟まれている）、ｆ）第１のＫＥＡを行って、少なくとも１つのウェルの内側で、単一の標的ポリヌクレオチドからアンプリコンのモノクローナル集団を作製し、それによって、標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ｇ）基材とＴ４キナーゼを接触させて、第２のプライマー対のプライマーを脱ブロックすること、ならびにｈ）ブリッジ増幅または第２のＫＥＡを行って、ウェルを越えて、単一の標的ポリヌクレオチドのアンプリコンのモノクローナル集団を増大させることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸を増幅するための方法であって、ａ）第１の層を基材の上に作製すること（その基材は、少なくとも１つのウェル、そのウェルを囲む面及びウェル内面を含み、その第１の層は、ウェル内面を少なくとも部分的に覆う）、ｂ）第１の層内に、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対を付着させること（その第１の捕捉プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＳＢＳ３プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の少なくとも１つの第１の捕捉プライマーと、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７プライマーヌクレオチド配列及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＳＢＳ８プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の少なくとも１つの第２の捕捉プライマーを含む）、ｃ）第１の層及びウェルを囲む面を覆う第２の層を基材の上に作製すること、ｄ）第２の層内に、少なくとも１つの第２の捕捉プライマー対を付着させること（その少なくとも１つの第２の捕捉プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第１の捕捉プライマー、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７ヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第２の捕捉プライマーを含む）、ｅ）１ウェルあたり１つの標的ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対のプライマーとハイブリダイズするのに充分な条件で、複数の標的ポリヌクレオチドを含む試料と基材を接触させること（その複数の標的ポリヌクレオチドは、相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＳＢＳ３’プライマーヌクレオチド配列または相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＳＢＳ８’ヌクレオチド配列をそれぞれ含む相補的なＳＢＳに挟まれている）、ならびにｆ）長時間にわたってＫＥＡを行って、少なくとも１つのウェルの内外で、単一の標的ポリヌクレオチドからアンプリコンのモノクローナル集団を作製し、それによって、ウェルの内側で、単一の標的ポリヌクレオチドを増幅し、その少なくとも１つのウェルを越えて、標的ポリヌクレオチドのモノクローナル集団を増大させることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸を増幅するための方法であって、ａ）第１の層を基材の上に作製すること（その基材は、少なくとも１つのウェル、そのウェルを囲む面及びウェル内面を含み、その第１の層は、ウェル内面を少なくとも部分的に覆う）、ｂ）第１の層内に、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対を付着させること（その第１のプライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第１の捕捉プライマー、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第２の捕捉プライマーを含む）、ｃ）第１の層及びウェルを囲む面を覆う第２の層を基材の上に作製すること、ｄ）１ウェルあたり１つの標的ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対のプライマーとハイブリダイズするのに充分な条件で、複数の標的ポリヌクレオチドを含む試料と基材を接触させること（その複数のポリヌクレオチドは、相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５’プライマーヌクレオチド配列、または相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７’プライマーヌクレオチド配列をそれぞれ含む相補的なユニバーサルプライマー領域に挟まれている）、ｅ）第１のＫＥＡを行って、その少なくとも１つのウェルの内側で、単一の標的ポリヌクレオチドからアンプリコンのモノクローナル集団を作製し、それによって、標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ｆ）第２の層内に、少なくとも１つの第２の捕捉プライマー対を付着させること（その少なくとも１つの第２の捕捉プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第１の捕捉プライマー、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７プライマーヌクレオチド配列を含む３’部分を含む複数の第２の捕捉プライマーを含む）、ならびにｇ）ブリッジ増幅または第２のＫＥＡを行って、単一の標的ポリヌクレオチドのアンプリコンのモノクローナル集団を増大させることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸を増幅するための方法であって、ａ）基材の上に層を作製すること（その基材は、少なくとも１つのウェル、そのウェルを囲む面及びウェル内面を含み、そのウェルの直径は、約１μｍ以上であり、その層は、ウェル内面を少なくとも部分的に覆う）、ｂ）その層内に、少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対及び少なくとも１つの第２の捕捉プライマー対を付着させること（その少なくとも１つの第１の捕捉プライマー対のプライマー濃度は、少なくとも第２のプライマー対のプライマー濃度よりも高い）、ｃ）１ウェルあたり１つの標的ポリヌクレオチドが、第２のプライマーとハイブリダイズするのに充分な条件で、複数の標的ポリヌクレオチドを含む試料と基材を接触させること、ならびにｄ）ＫＥＡを行って、ウェルの内側で、第２のプライマーにハイブリダイズした単一の標的ポリヌクレオチドからアンプリコンのモノクローナル集団を作製し、それによって、単一の標的ポリヌクレオチドを増幅することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、固定化された捕捉プライマーを修飾するための方法であって、ａ）ハイブリダイゼーションに充分な条件で、複数の固定化された捕捉プライマーを含む基材と、複数の鋳型核酸を接触させて、１つまたは複数の固定化された鋳型核酸を作製すること（その複数の固定化された捕捉プライマーは、５’末端のユニバーサル捕捉領域Ｙを含む第１の複数のプライマー、及び３’末端のユニバーサル捕捉領域Ｚを含む第２の複数のプライマーを含み、各鋳型核酸は、５’末端及び３’末端のユニバーサル捕捉領域ＹまたはＺに挟まれているとともに、１つまたは複数の制限部位、及び５’末端のユニバーサル捕捉領域と１つまたは複数の制限部位の間、または３’末端のユニバーサル捕捉領域と１つまたは複数の制限部位の間に、標的特異的な捕捉領域を含む）、ｂ）１つまたは複数の固定化された捕捉プライマーを伸長させて、１つまたは複数の鋳型核酸と相補的な１つまたは複数の固定化された伸長生成物を作製することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、固定化された捕捉プライマーを修飾するための方法であって、ａ）ハイブリダイゼーションに充分な条件で、複数の固定化された捕捉プライマーを含む基材と、複数の鋳型核酸を接触させて、１つまたは複数の固定化された鋳型核酸を作製すること（その複数の固定化された捕捉プライマーは、３’末端のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列を含む第１の複数のプライマー、及び３’末端のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７プライマーヌクレオチド配列を含む第２の複数のプライマーを含み、各鋳型核酸は、３’末端の相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５’プライマーヌクレオチド配列、及び５’末端の相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７’プライマーヌクレオチド配列に挟まれているとともに、２つのＳａｐＩ制限部位、それらのＳａｐＩ制限部位間のスペーサー領域、及び３’末端の相補的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５’プライマーヌクレオチド配列とＳａｐＩ制限部位の間の標的特異的な捕捉領域を含む）、ｂ）１つまたは複数の固定化された捕捉プライマーを伸長させて、１つまたは複数の鋳型核酸と相補的な１つまたは複数の固定化された伸長生成物を作製すること、ｃ）その１つまたは複数の固定化された伸長生成物をブリッジ増幅またはＫＥＡによって増幅して、固定化された二本鎖鋳型核酸の１つまたは複数のモノクローナルクラスターを作製
すること、ｄ）その固定化された二本鎖鋳型核酸の１つまたは複数のモノクローナルクラスターとＳａｐＩを接触させて、複数の固定化された二本鎖鋳型核酸における２つの制限部位を切断して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ５プライマーヌクレオチド配列及び標的特異的な捕捉領域を含む複数の固定化された二本鎖キメラ捕捉プライマーと、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐ７プライマーヌクレオチド配列を含む複数の固定化された二本鎖再生ユニバーサル捕捉プライマーを作製すること、ならびにｅ）任意に、その複数の固定化された二本鎖キメラ捕捉プライマー、及び固定化された二本鎖再生ユニバーサル捕捉プライマーと、５’－３’ｄｓＤＮＡ－エキソヌクレアーゼを接触させて、複数の固定化された一本鎖キメラ捕捉プライマー、及び複数の固定化された一本鎖再生ユニバーサル捕捉プライマーを作製することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１７／０３５６０３０号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、化学発光を用いて、高分子サブユニットの存在を検出するための組成物、システム及び方法を含むことができる。一態様では、組成物は、基材、その基材に結合された第１のポリヌクレオチド、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第２のポリヌクレオチド、及び第２のポリヌクレオチドの第１のヌクレオチドに結合する触媒を含み、その触媒は、化学発光分子に光子を放出させるように機能可能である。いくつかの実施形態では、その組成物は、複数の化学発光分子をさらに含む。その触媒は、各化学発光分子に、対応する光子を放出させることができる。その組成物は、複数の試薬分子をさらに含むことができ、触媒は、試薬分子を用いて、各化学発光分子を酸化させることによって、その化学発光分子に、対応する光子を放出させる。酸化した化学発光分子は、対応する光子を放出することによって減衰する励起状態を有することができる。システムは、上記の組成物のいずれか、及び化学発光分子によって放出された光子を検出するように構成された回路を含むことができる。いくつかの実施形態では、その回路はさらに、光子の検出に基づき、第１のヌクレオチドの存在を検出するように構成されている。別の態様では、方法は、基材を用意すること、その基材に結合された第１のポリヌクレオチドを用意すること、第２のポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせること、第１の触媒を第２のポリヌクレオチドの第１のヌクレオチドに結合させること、及び第１の触媒によって、第１の化学発光分子に光子を放出させることを含むことができる。別の態様では、第１のポリヌクレオチドをシークエンシングする方法は、シークエンシング対象の第１のポリヌクレオチドであって、基材に結合された第１のポリヌクレオチドを用意すること、ｂ）第２のポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ならびに第２のポリヌクレオチドと、ポリメラーゼ及び複数のヌクレオチドを接触させることを含む。その複数のヌクレオチドの第１のサブセットは、第１の部分を含み、その複数のヌクレオチドの第２のサブセットは、第２の部分を含み、その複数のヌクレオチドの第３のサブセットは、第３の部分を含み、その複数のヌクレオチドの第４のサブセットは、第４の部分を含むか、部分を含まない。その方法は、第１のポリヌクレオチドの配列に基づき、その複数のヌクレオチドのうちのヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドに付加することをさらに含むことができる。その方法は、第５の部分に結合された触媒にヌクレオチドを暴露すること、そのヌクレオチドを化学発光分子に暴露すること、及びその化学発光分子からの光子の放出または光子の不在を検出することをさらに含むことができる。その方法は、第６の部分に結合された触媒にヌクレオチドを暴露すること、そのヌクレオチドを化学発光分子に暴露すること、及びその化学発光分子からの光子の放出または光子の不在を検出することをさらに含むことができる。その方法は、ヌクレオチドをクリーバー分子に暴露すること、そのヌクレオチドを化学発光分子に暴露すること、及びその化学発光分子からの光子の放出または光子の不在を検出することをさらに含むことができる。その方法は、検出ステップの１つまたは複数において、化学発光分子からの光子の放出もしくは光子の不在、またはこれらの組み合わせの検出に基づき、付加されたヌクレオチドを検出することをさらに含むことができる。別の態様では、組成物は、化学発光分子に光子を放出させるように機能可能である触媒、基材、その基材に結合された第１のポリヌクレオチド、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第２のポリヌクレオチド、及び第２のポリヌクレオチドの第１のヌクレオチドに結合するクエンチャーを含み、そのクエンチャーは、化学発光分子による光子の放出を阻害するように機能可能である。別の態様では、方法は、第１の化学発光分子に光子を放出させるように機能可能である触媒を用意すること、基材を用意すること、基材に結合された第１のポリヌクレオチドを用意すること、第２のポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせること、第１のクエンチャーを第２のポリヌクレオチドの第１のヌクレオチドに結合させること、及び第１のクエンチャーによって、第１の化学発光分子による光子の放出を阻害することを含む。別の態様では、第１のポリヌクレオチドをシークエンシングする方法は、シークエンシング対象の第１のポリヌクレオチドであって、基材に結合された第１のポリヌクレオチドを用意すること、第２のポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせること、及び第２のポリヌクレオチドに結合したクエンチャーが、触媒と相互作用する化学発光分子からの光子の放出を阻害できるように、充分に第２のポリヌクレオチドの近くに結合する触媒を用意することを含む。その方法は、第２のポリヌクレオチドと、ポリメラーゼ及び複数のヌクレオチドを接触させることをさらに含むことができる。その複数のヌクレオチドの第１のサブセットは、第１の部分を含み、その複数のヌクレオチドの第２のサブセットは、第２の部分を含み、その複数のヌクレオチドの第３のサブセットは、第３の部分を含み、その複数のヌクレオチドの第４のサブセットは、第４の部分を含むか、または部分を含まない。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１７／０１３７８７６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、１回目の伸長中に発生し得る高品質なエラーを実質的に低減または除去するのに使用し得る方法を含むことができる。別の実施形態では、その方法は、増幅サイクルの最初の数回におけるヌクレオチドのミスインコーポレーションを原因とするエラーを低減するのにも使用し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、精度の向上したシークエンシングを行う方法であって、核酸鋳型を用意すること、その鋳型核酸から直接、直線的増幅によって、互いに近接した状態で保たれるか、または同一の鋳型核酸から得たものとして特定可能である複数の相補鎖を含む集団を作製すること、前記近接した状態で保たれた（例えば、表面に結合された）オリゴヌクレオチドにおいて、シークエンシング反応を行うことを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、直線的増幅ラウンドの後、及びシークエンシング反応の実施前に、相補鎖集団のさらなる（指数関数的な）増幅を行うステップをさらに含む。任意に、その直線的増幅（核酸鋳型から直接行う）は、前記核酸鋳型を第１のプライマーにハイブリダイズさせるステップ、第１のプライマーを伸長させて、その鋳型に対する相補鎖を作製すること、近接した状態を保っている（例えば、表面に結合した状態のままであり、すなわち、近くで再びハイブリダイズさせる前には、まったく移動しないか、または遠くに拡散しない）相補鎖を変性させて解離すること、ならびにハイブリダイゼーションステップ及び増幅ステップを繰り返して、表面に結合された相補鎖であって、鋳型核酸から直接得られる相補鎖の集団を作製することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１７／０１０１６７６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸ライブラリ中の標的配列を濃縮し、標的ハイブリダイゼーションプローブセットによるオフターゲット配列の捕捉を低減する技法を含むことができる。標的ハイブリダイゼーションプローブは、それらの核酸標的に対する特異性が不完全であるので、標的ハイブリダイゼーションプローブセットを用いるシークエンシングランには、オフターゲットである配列を示すリードも特定の割合で含まれることがある。例えば、エキソームシークエンシング反応では、特定のハイブリダイゼーションプローブは、核酸ライブラリから、標的配列とともに、イントロン配列または遺伝子間配列を捕捉することがある。これらのオフターゲット断片は、捕捉されると、シークエンシングされる核酸断片プールに存在する。オフターゲットリードを表すシークエンシング情報は典型的には破棄されるが、本発明の技法では、これらのオフターゲットリードの、取得されたシークエンシング情報を用いて、オフターゲット配列に対して特異的であるとともに、標的特異的なハイブリダイゼーションプローブによって捕捉された断片のプールから、これらの配列を含む断片を分離及び／または除去するのに使用するハイブリダイゼーションプローブを設計する。そのオフターゲットハイブリダイゼーションプローブは、標的ハイブリダイゼーションプローブセットによって実施されるハイブリッド捕捉シークエンシングランのオフターゲットリードの解析に基づき設計する。ある特定の実施形態では、標的ハイブリダイゼーションプローブの、それらの所望の標的に対する特異性を改善するために、オンターゲットプローブの設計も、試料にわたる系統的なオフターゲット解析に基づいてよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的化シークエンシング反応において、オフターゲットの捕捉を低減する方法を含むことができる。その方法は、試料から作製した核酸ライブラリに存在する複数のオフターゲット配列に特異的に結合するオフターゲットハイブリダイゼーションプローブセットを用意するステップ（その核酸ライブラリは、複数の核酸断片を含む）、及びその核酸ライブラリに存在する複数の標的配列に特異的に結合する標的特異的なハイブリダイゼーションプローブセットを用意するステップを含む。その方法は、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブがオフターゲット配列にハイブリダイズする条件で、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブと、核酸ライブラリを接触させるステップ、及び標的特異的なハイブリダイゼーションプローブが標的配列にハイブリダイズする条件で、標的特異的なハイブリダイゼーションプローブと、核酸ライブラリを接触させるステップも含む。その方法は、核酸ライブラリから、標的特異的なハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸断片群を選択するステップ、及び標的特異的なハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸断片群をシークエンシングするステップも含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的化シークエンシング反応における、オフターゲット配列の捕捉用のプローブを用意する方法を含むことができる。その方法は、標的特異的なハイブリダイゼーションプローブセットへの要請を受けるステップを含む。その方法は、その標的特異的なハイブリダイゼーションプローブと、参照試料から作製した参照核酸ライブラリを接触させるステップ（その核酸ライブラリは、標的特異的なハイブリダイゼーションプローブに結合する標的特異的な核酸断片及びオフターゲット核酸断片の参照群を作製するための複数の核酸断片を含む）、ならびに未結合の核酸断片から、標的特異的なハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸断片の参照群を分離するステップも含む。その方法は、核酸断片の参照群をシークエンシングして、参照シークエンシングデータを作成するステップ、その参照シークエンシングデータ中のオフターゲット配列を特定するステップ、及び特定したオフターゲット配列に基づき、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブセットを用意するステップも含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的化シークエンシング反応において、オフターゲットの捕捉を低減するためのシークエンシングキットであって、試料から作製した核酸ライブラリに存在する複数のオフターゲット配列に特異的に結合するオフターゲットハイブリダイゼーションプローブセット（その核酸ライブラリは、複数の核酸断片を含む）、及びその核酸ライブラリに存在する複数の標的配列に特異的に結合する標的特異的なハイブリダイゼーションプローブセットを含むシークエンシングキットを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１６／０３１９３４５号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、固有分子指標（ＵＭＩ）を用いて、核酸断片配列を求めるための方法、装置、システム及びコンピュータープログラム製品を含むことができる。各種実施態様では、シークエンシング方法は、核酸断片の両方の鎖に由来する核酸断片の配列を求める。いくつかの実施態様では、その方法は、シークエンシングアダプターの一方または両方の鎖に位置する物理的ＵＭＩを用いる。いくつかの実施態様では、その方法は、核酸断片の両方の鎖に位置する仮想ＵＭＩも用いる。一態様は、固有分子指標（ＵＭＩ）を用いて、試料に由来する核酸分子をシークエンシングするための方法に関するものである。各固有分子指標（ＵＭＩ）は、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の個々の分子を特定するのに使用できるオリゴヌクレオチド配列である。その方法は、（ａ）試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の両末端にアダプターを付加し（そのアダプターはそれぞれ、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’アーム、一本鎖３’アーム、及びそのアダプターの一方の鎖または各鎖上の物理的ＵＭＩを含む）、それによって、ＤＮＡ－アダプター生成物を得ること、（ｂ）そのＤＮＡ－アダプター生成物の両方の鎖を増幅して、複数の増幅ポリヌクレオチドを得ること、（ｃ）その複数の増幅ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって、物理的ＵＭＩとそれぞれ関連付けられた複数のリードを得ること、（ｄ）その複数のリードと関連付けられた複数の物理的ＵＭＩを特定すること、（ｅ）その複数のリードと関連付けられた複数の仮想ＵＭＩを特定すること（各仮想ＵＭＩは、試料中のＤＮＡ断片に見られる配列である）、ならびに（ｆ）（ｃ）で得た複数のリード、（ｄ）で特定した複数の物理的ＵＭＩ、及び（ｅ）で特定した複数の仮想ＵＭＩを用いて、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求めることを含む。いくつかの実施態様では、その方法は、（ｉ）試料中の二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つまたは複数のそれぞれについて、（１）５’から３’の方向に、第１の物理的ＵＭＩ及び少なくとも１つの仮想ＵＭＩを有するリードと、（２）５’から３’の方向に、第２の物理的ＵＭＩ及び上記の少なくとも１つの仮想ＵＭＩを有するリードを組み合わせて、コンセンサスヌクレオチド配列を求めること、ならびに（ｉｉ）そのコンセンサスヌクレオチド配列を用いて、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つまたは複数のそれぞれについて、配列を求めることを含む作業（ｆ）を含む。いくつかの実施態様では、アダプターはそれぞれ、アダプターの一方の鎖のみに、一本鎖５’アームまたは一本鎖３’アームに、物理的ＵＭＩを含む。これらの実施態様のうちのいくつかでは、（ｆ）は、（ｉ）同じ第１の物理的ＵＭＩを有するリードを第１の群にまとめて、第１のコンセンサスヌクレオチド配列を得ること、（ｉｉ）同じ第２の物理的ＵＭＩを有するリードを第２の群にまとめて、第２のコンセンサスヌクレオチド配列を得ること、及び（ｉｉｉ）その第１及び第２のコンセンサスヌクレオチド配列を用いて、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つの配列を求めることを含む。いくつかの実施態様では、（ｉｉｉ）は、（１）第１及び第２のコンセンサスヌクレオチド配列の局在情報及び配列情報を用いて、第３のコンセンサスヌクレオチド配列を得ること、ならびに（２）第３のコンセンサスヌクレオチド配列を用いて、その二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つの配列を求めることを含む。いくつかの実施態様では、作業（ｅ）は、複数の仮想ＵＭＩを特定することを含むと同時に、アダプターがそれぞれ、アダプターの一方の鎖のみに、一本鎖５’アーム領域または一本鎖３’アーム領域に物理的ＵＭＩを含む。いくつかの実施態様では、（ｆ）は、（ｉ）５’から３’の方向に、第１の物理的ＵＭＩ及び少なくとも１つの仮想ＵＭＩを有するリードと、５’から３’の方向に、第２の物理的ＵＭＩ及び上記の少なくとも１つの仮想ＵＭＩを有するリードを組み合わせて、コンセンサスヌクレオチド配列を求めること、ならびに（ｉｉ）そのコンセンサスヌクレオチド配列を用いて、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つの配列を求めることを含む。上記の方法のいくつかの実施態様では、作業（ｃ）で複数のリードを得ることは、各増幅ポリヌクレオチドから、２つのペアエンドリードを得ることを含み、その２つのペアエンドリードは、ロングリード及びショートリードを含み、そのロングリードは、ショートリードよりも長い。これらの実施態様のうちのいくつかでは、作業（ｆ）は、第１の物理的ＵＭＩと関連付けられたリードペアを組み合わせて第１の群にし、第２の物理的ＵＭＩと関連付けられたリードペアを組みわせて第２の群にすること（その第１及び第２の物理的ＵＭＩは、試料中の二本鎖断片と一意に関連付けられている）、ならびに第１の群におけるロングリードの配列情報、及び第２の群におけるロングリードの配列情報を用いて、試料中の二本鎖断片の配列を求めることを含む。別の態様は、（ａ）試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の両末端にアダプターを付加すること（そのアダプターはそれぞれ、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’アーム、一本鎖３’アーム、及び一本鎖５’アームまたは一本鎖３’アーム上の物理的な固有分子指標（ＵＭＩ）を含む）、（ｂ）（ａ）から得られるライゲーション生成物の両方の鎖を増幅し、それによって、複数の一本鎖増幅ポリヌクレオチドを得ること、（ｃ）その複数の増幅ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって、物理的ＵＭＩとそれぞれ関連付けられた複数のリードを得ること、（ｄ）その複数のリードと関連付けられた複数の物理的ＵＭＩを特定すること、ならびに（ｅ）（ｃ）で得た複数の配列、及び（ｄ）で特定した複数の物理的ＵＭＩを用いて、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求めることを含む。追加の態様は、試料に由来する核酸分子をシークエンシングするための方法に関するものである。その方法は、（ａ）試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の両末端にアダプターを結合させること（そのアダプターはそれぞれ、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’アーム、一本鎖３’アーム、及びそのアダプターの一方の鎖または各鎖上の、１２ヌクレオチドよりも短い物理的な固有分子指標（ＵＭＩ）を含む）、（ｂ）（ａ）から得られるライゲーション生成物の両方の鎖を増幅し、それによって、物理的ＵＭＩをそれぞれ含む複数の一本鎖増幅ポリヌクレオチドを得ること、（ｃ）その複数の増幅ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって、物理的ＵＭＩとそれぞれ関連付けられた複数のリードを得ること、（ｄ）その複数のリードと関連付けられた複数の物理的ＵＭＩを特定すること、ならびに（ｅ）（ｃ）で得た複数のリード、及び（ｄ）で特定した複数の物理的ＵＭＩを用いて、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求めることを含む。別の態様は、各鎖に物理的ＵＭＩを有するデュプレックスシークエンシングアダプターを作製するための方法に関するものである。その方法は、二本鎖ハイブリダイズ領域、２つの一本鎖アーム及びその２つの一本鎖アームから遠く離れている、二本鎖ハイブリダイズ領域の末端に５’－ＣＣＡＮＮＮＮＡＮＮＮＮＴＧＧ－３’を含むオーバーハングを含む予備的なシークエンシングアダプターを用意すること、そのオーバーハングを鋳型として用いて、その二本鎖ハイブリダイズ領域の一方の鎖を伸長させ、それによって、伸長生成物を作製すること、ならびに制限酵素Ｘｃｍ１を加えて、その伸長生成物の二本鎖末端を消化し、それによって、各鎖に物理的ＵＭＩを有するデュプレックスシークエンシングアダプターを作製することを含む。いくつかの実施態様では、その予備的なシークエンシングアダプターは、各鎖にリードプライマー配列を含む。さらなる態様は、コンピューターシステムの１つまたは複数のプロセッサーによって実行されると、固有分子指標（ＵＭＩ）を用いて、試料中の対象とする配列の配列情報を求めるための方法をコンピューターシステムに実施させるプログラムコードを格納している非一時的な機械可読媒体を含むコンピュータープログラム製品に関するものである。そのプログラムコードは、（ａ）複数の増幅ポリヌクレオチドのリードを得るためのコード（その複数の増幅ポリヌクレオチドは、対象とする配列を含む試料中の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅し、アダプターをその二本鎖ＤＮＡ断片に結合させることによって得られる）、（ｂ）その複数の増幅ポリヌクレオチドのリード内の複数の物理的ＵＭＩを特定するためのコード（各物理的ＵＭＩは、その二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つに結合されたアダプター内にある）、（ｃ）複数の増幅ポリヌクレオチドの、受け取ったリード内の複数の仮想ＵＭＩを特定するためのコード（各仮想ＵＭＩは、その二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つの個々の分子にある）、及び（ｃ）その複数の増幅ポリヌクレオチドのリード、複数の物理的ＵＭＩ及び複数の仮想ＵＭＩを用いて、その二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求め、それによって、その二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求める際のエラーを低減するためのコードを含む。いくつかの実施態様では、アダプターはそれぞれ、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’アーム、一本鎖３’アーム、及びそのアダプターの一方の鎖または各鎖上の物理的な固有分子指標（ＵＭＩ）を含む。追加の態様は、１つまたは複数のプロセッサー、システムメモリ及び１つまたは複数のコンピューター可読格納媒体を含むコンピューターシステムに関するものである。その媒体には、コンピューターが実行可能な命令であって、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の個々の分子を特定するのに使用できるオリゴヌクレオチド配列である固有分子指標（ＵＭＩ）を用いて、試料中の対象とする配列の配列情報を求める方法をコンピューターシステムに実施させる命令が格納されている。その命令は、（ａ）複数の増幅ポリヌクレオチドのリードを受け取ること（その複数の増幅ポリヌクレオチドは、対象とする配列を含む試料中の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅し、その二本鎖ＤＮＡ断片にアダプターを結合させることによって得られる）、（ｂ）その複数の増幅ポリヌクレオチドの、受け取ったリード内の複数の物理的ＵＭＩを特定すること（各物理的ＵＭＩは、その二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つに結合されたアダプター内にある）、（ｃ）その複数の増幅ポリヌクレオチドの、受け取ったリード内の複数の仮想ＵＭＩを特定すること（各仮想ＵＭＩは、その二本鎖ＤＮＡ断片のうちの１つの個々の分子にある）、ならびに（ｄ）その複数の増幅ポリヌクレオチドの配列、複数の物理的ＵＭＩ及び複数の仮想ＵＭＩを用いて、その二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求め、それによって、その二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求める際のエラーを低減することを含む。一態様は、非ランダムな固有分子指標（ＵＭＩ）を用いて、試料に由来する核酸分子をシークエンシングするための方法を提供する。その方法は、（ａ）試料中のＤＮＡ断片の両末端にアダプターを付加し（そのアダプターはそれぞれ、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’アーム、一本鎖３’アーム、及びそのアダプターの一方の鎖または各鎖上の非ランダムな固有分子指標（ＵＭＩ）を含む）、それによって、ＤＮＡ－アダプター生成物を得ること、（ｂ）ＤＮＡ－アダプター生成物を増幅して、複数の増幅ポリヌクレオチドを得ること、（ｃ）その複数の増幅ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって、複数の非ランダムなＵＭＩと関連付けられた複数のリードを得ること、（ｄ）その複数のリードから、共通の非ランダムなＵＭＩを共有するリードを特定すること、ならびに（ｅ）共通の非ランダムなＵＭＩを共有する、その特定したリードから、試料に由来するＤＮＡ断片であって、共通の非ランダムなＵＭＩを含むアダプターが付加されているＤＮＡ断片の少なくともの一部の配列を求めることを伴う。別の態様は、非ランダムな固有分子指標（ＵＭＩ）
を用いて、試料に由来する核酸分子をシークエンシングするための方法に関するものである。いくつかの実施態様では、方法は、（ａ）試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の両末端にアダプターを付加し（そのアダプターはそれぞれ、二本鎖ハイブリダイズ領域、一本鎖５’アーム、一本鎖３’アーム、及びアダプターの一方の鎖または各鎖上の非ランダムな固有分子指標（ＵＭＩ）を含む）、それによって、ＤＮＡ－アダプター生成物を得ること（その非ランダムなＵＭＩを他の情報と組み合わせて、その二本鎖ＤＮＡ断片の個々の分子を一意に特定できる）、（ｂ）そのＤＮＡ－アダプター生成物の両方の鎖を増幅して、複数の増幅ポリヌクレオチドを得ること、（ｃ）その複数の増幅ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって、非ランダムなＵＭＩとそれぞれ関連付けられた複数のリードを得ること、（ｄ）その複数のリードと関連付けられた複数の非ランダムなＵＭＩを特定すること、ならびに（ｅ）その複数のリード及び複数の非ランダムなＵＭＩを用いて、試料中の二本鎖ＤＮＡ断片の配列を求めることを伴う。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、開示されている方法を実施してＤＮＡ断片配列を求めるためのシステム、装置及びコンピュータープログラム製品を含むことができる。一態様は、コンピューターシステムの１つまたは複数のプロセッサーによって実行されると、固有分子指標（ＵＭＩ）を用いて、試料中の対象とする配列の配列情報を求める方法をコンピューターシステムに実施させるプログラムコードを格納している非一時的な機械可読媒体を含むコンピュータープログラム製品を提供する。そのプログラムコードは、上記の方法を行うための命令を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１５／０３６０１９３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸試料を増幅して、核酸ライブラリを作製するための方法、組成物及びキットを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸試料から核酸ライブラリを作製する方法であって、ａ）核酸試料に対する増幅プライマーセットを用意すること（その増幅プライマーセットは、複数のランダムプライマー及び複数の遺伝子座特異的プライマーを含み、その遺伝子座特異的プライマーは、核酸ライブラリの複数の所定の領域を増幅するように構成されており、そのランダムプライマーは、遺伝子座特異的プライマーよりも存在量が多い）ならびにｂ）増幅プライマーセットを用いて、核酸ライブラリを増幅し、それによって、核酸ライブラリを作製することを含む方法を含むことができる。核酸試料を増幅するためのキットも提供し、そのキットは、複数のランダムプライマー、及び核酸ライブラリの複数の所定の領域を増幅するように構成された複数の遺伝子座特異的プライマーを含む。ある特定の態様では、そのキットは、増幅反応セットにおいてランダムプライマー及び遺伝子座特異的プライマーを用いるための命令セットをさらに含み、そのランダムプライマーは、遺伝子座特異的プライマーよりも存在量が多い。ある特定の態様では、そのキットは、増幅プライマーセットと核酸ライブラリを組み合わせ、核酸ライブラリを増幅するための命令セットをさらに含む。上記の方法に加えて、核酸試料から核酸ライブラリを作製する方法であって、ａ）ＡＴリッチなランダム増幅プライマーセットによって、核酸試料を増幅することを含む方法も提供されている。ある特定の態様では、ＡＴリッチなランダム増幅プライマーセットは、プライマーの混合物である。核酸試料を増幅するためのキットであって、ＡＴリッチなランダム増幅プライマーセットを含むキットも提供されている。ある特定の態様では、そのキットは、増幅プライマーセットと核酸ライブラリを組み合わせ、核酸ライブラリを増幅するための命令セットをさらに含む。ある特定の他の態様では、そのキットは、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。さらに別の態様では、ＡＴリッチなランダム増幅プライマーセットは、プライマーの混合物である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸試料から核酸ライブラリを作製する方法であって、ａ）ランダム増幅プライマーセットを用いて、核酸試料を増幅すること（そのランダム増幅プライマーは、ＡＴリッチな５’テールを含む）を含む方法を含むことができる。ある特定の態様では、そのランダム増幅プライマーセットは、プライマーの混合物である。核酸試料から核酸ライブラリを作製する方法であって、可変長のランダム増幅プライマーのセットを用いて、核酸試料を増幅することを含み、その可変長の各ランダム増幅プライマーが、ランダムな３’部分及び縮重５’テールを含み、その縮重５’テールの長さが、プライマーのランダムな３’部分のＡ／Ｔ含有量に比例している方法も提供されている。ある特定の態様では、その可変長のランダム増幅プライマーのセットは、プライマーの混合物である。核酸試料から核酸ライブラリを作製する方法であって、ａ）ランダム増幅プライマーセットを用いて核酸試料を増幅し（各プライマーは、ランダムな３’部分及び一定の５’プライミング部分を含む）、それによって、増幅生成物を作製すること（各増幅生成物は、一定の５’プライミング部分を含む）、ｂ）その増幅生成物を環状化すること、ならびにｃ）一定の５’プライミング部分にハイブリダイズするプライマーを用いて、その環状化した増幅生成物を増幅することを含む方法も提供されている。ある特定の態様では、ステップ（ｃ）における増幅は、マルチプルディスプレースメント増幅を行うことを含む。ある特定の態様では、ランダム増幅プライマーセットは、プライマーの混合物である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１５／０１７６０７１号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、配列断片の由来元である、より大きい標的核酸に対して、その断片の近接性を求めることを含むことができる。例えば、その方法を用いて、個々の配列リードが、評価中の標的核酸の長さよりも短いときに、相対的に長い標的核酸配列についてフェージングを行い、ハプロタイプを特定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸ポリマーをシークエンシングする方法を含むことができる。その方法は、（ａ）標的核酸ポリマーを改変して、改変核酸ポリマーを作製するステップ（その改変核酸ポリマーは、その標的核酸ポリマーに由来する複数の配列領域を含む）、（ｂ）固体支持体面を有する容器内で、その改変核酸ポリマーの断片を作製するステップ（その各断片は、上記の配列領域のうちの１つを含む）、（ｃ）その固体支持体面の領域の位置で、その断片をランダムに捕捉するステップ、（ｄ）それらの位置の断片を検出することによって、その配列領域のヌクレオチド配列を求めるステップ、ならびに（ｅ）その断片から得られたヌクレオチド配列、及び固体支持体面上の上記位置間の相対距離に基づき、標的核酸ポリマーのヌクレオチド配列の説明を生成するステップを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸ポリマーをシークエンシングする方法であって、（ａ）標的核酸ポリマーにインサートを付加して、複数の内部インサートを含む改変核酸ポリマーを形成するステップ、（ｂ）固体支持体面と接している流体中で、その改変核酸ポリマーの断片を作製し、それによって、インサートの少なくとも一部をそれぞれ含む断片を放出するステップ、（ｃ）固体支持体面上の位置で、その流体からその断片をランダムに捕捉するステップ、（ｄ）それらの位置の断片を検出することによって、その断片からヌクレオチド配列を求めるステップ、ならびに（ｅ）その断片から得られたヌクレオチド配列、及び固体支持体面上の上記位置間の相対距離に基づき、標的核酸ポリマーのヌクレオチド配列の説明を生成するステップを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸ポリマーをシークエンシングする方法であって、（ａ）標的核酸ポリマーを改変して、改変核酸ポリマーを作製するステップ（その改変核酸ポリマーは、標的核酸ポリマーに由来する複数の配列領域を含む）、（ｂ）その改変核酸ポリマーを固体支持体面上の領域に結合させるステップ、（ｃ）固体支持体面に結合されている改変核酸ポリマーの断片を作製するステップ（その断片は、固体支持体面の領域の位置に結合される）、（ｄ）それらの位置の断片を検出することによって、その断片からヌクレオチド配列を求めるステップ、ならびに（ｅ）断片から得られたヌクレオチド配列、及び固体支持体面上の上記位置間の相対距離に基づき、標的核酸ポリマーのヌクレオチド配列の説明を生成するステップを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、異なる供給源に由来する配列の混合物中の個々の配列の供給源を求める方法を含むことができる。その方法は、（ａ）複数の異なる供給源に由来する標的核酸ポリマーの混合物を用意するステップ、（ｂ）標的核酸ポリマーの混合物を改変して、改変核酸ポリマーの混合物を作製するステップ（その改変核酸ポリマーの混合物は、その異なる供給源に由来する複数の配列領域を含む）、（ｃ）固体支持体面を有する容器内で、その改変核酸ポリマーの断片を作製するステップ（各断片は、その異なる供給源のうちの１つに由来する配列領域を有する）、（ｄ）共通の標的核酸ポリマーに由来する断片が、固体支持体面上の近接した位置に優先的に局在化される条件で、その断片を固体支持体面の位置でランダムに捕捉するステップ、（ｅ）それらの位置の断片のヌクレオチド配列を求めるステップ、ならびに（ｆ）断片から得られたヌクレオチド配列、及び固体支持体面上の上記位置間の相対距離に基づき、複数の異なる供給源における共通の供給源に由来するヌクレオチド配列を特定するステップを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１４／０３６４３２３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、各試料の識別性を保持しながら、複数の試料に、対象とする複数のヌクレオチド配列が存在するかを判断するための方法を含むことができる。その方法は、複合試料中の個々の種のジェノタイピング、発現解析及び識別を含む多くの用途で使用できる。一実施形態では、各試料を複数のプローブセットと接触させる。第１のプローブは、第１の識別配列、及び対象とする配列の第１の部分と相補的な第１のハイブリダイゼーション配列を有する。第２のプローブは、対象とする同一の配列の第２の部分と相補的な第２のハイブリダイゼーション配列、及び第２の識別配列を有する。第１のハイブリダイゼーション配列が、対象とする配列の第１の部分にハイブリダイズし、第２のハイブリダイゼーション配列が、対象とする同一の配列の第２の部分にハイブリダイズした場合には、第１及び第２のプローブが連結される。これは、ライゲーション及び／または伸長方法（ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ（登録商標）アッセイデザインによるなど）を用いて行うこともできる。対象とする配列の存在、及び対象とする配列を含む試料の識別性は、連結したプローブに存在する識別配列コードに基づき判断する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１３／００５９７４１号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、固体支持体を用いて、試料中の標的分析物の存在をアッセイするための組成物及び方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、その固体支持体に固定化された抗体、抗体断片またはタンパク質受容体のような結合タンパク質、及びその結合タンパク質の近くに固定化された少なくとも２つの別個の核酸プライマーを有する固体支持体を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、その固体支持体に固定化された結合タンパク質、標的分析物及び第２の結合タンパク質の間で結合複合体が形成される固体支持体を含むことができる。いくつかの実施形態では、このような結合複合体が、固体支持体上に固定化された１つの核酸プライマーと、第２の結合タンパク質に連結されたオリゴヌクレオチドタグの間でハイブリダイゼーション複合体をさらに形成する固体支持体を提供する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、これらの固体支持体を複数含むアレイを含むことができる。いくつかの実施形態では、多数の標的分析物を検出するための方法で、固体支持体を使用できる。一実施形態では、標的分析物を検出するための方法は、その固体支持体に固定化された結合タンパク質、及び溶液中に供給された第２の結合タンパク質を有する固体支持体を用意すること（その第１の結合タンパク質は、第２の結合タンパク質の存在下で、標的分析物を認識して、標的分析物と結合でき、第２の結合タンパク質も、同一の標的分析物を認識してその標的分析物に結合する）、標的分析物と、第１及び第２の結合タンパク質の両方の間で、結合複合体を形成させるのに充分な条件で、固体支持体と、標的分析物及び第２の結合タンパク質を接触させること、第２の結合タンパク質に連結されたオリゴヌクレオチドタグを、固体支持体に固定化された第１の核酸プライマーにハイブリダイズさせること、この第１のプライマーを伸長させ、それによって、オリゴヌクレオチドタグの相補体を生成させること、固体支持体に固定化された第２の核酸プライマーを用いて、新たに生成されたその相補体を増幅すること、ならびにそのアンプリコンの存在を検出すること（そのアンプリコンの存在によって、標的分析物の存在が示される）を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的分析物を検出するための方法であって、上記の方法が、上記の代わりに、伸長ステップの後に、生成されるオリゴヌクレオチドタグ相補体を、固体支持体に固定化された第２の核酸プライマーにハイブリダイズさせて、第２のハイブリダイゼーション複合体を形成し、その後、一塩基伸長または合成によるシークエンシングのような方法を用いて、少なくとも１つの標識化核酸残基によって、第２の核酸プライマーを伸長させ（そのプライマーに付加される核酸残基は、オリゴヌクレオチドタグの核酸配列に依存する）、その後、固体表面上の標識化核酸残基の存在を検出する（その標識化核酸残基の存在によって、標的分析物の存在が示される）ことによって進行する方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１２／０１５６７５３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料中のＲＮＡのうち、キャップ構造を有さず、５’ポリリン酸基を有するＲＮＡに、５’ライゲーションによってタグ付けするための方法であって、（Ａ）（ｉ）キャップ構造を有さず、５’ポリリン酸基を有するＲＮＡを含む試料（その試料は、５’モノリン酸基を有するＲＮＡ及び／またはキャップ構造を有するＲＮＡ及び／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含む）、（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、（ｉｉｉ）タグを呈するアクセプターオリゴヌクレオチド、ならびに（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼを用意することと、（Ｂ）キャップ構造を有さず、５’ポリリン酸基を有するＲＮＡが、５’モノリン酸基を有するＲＮＡに変換される条件かつ充分な時間で、試料と、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼを接触させることと、（Ｃ）アクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端が、５’モノリン酸基を有するＲＮＡにはライゲーションされるが、キャップ構造を有するＲＮＡにはライゲーションされずに、５’ライゲーションによりタグ付けされたＲＮＡが生成される条件かつ充分な時間で、ステップ（Ｂ）から得た試料と、アクセプターオリゴヌクレオチド及びＲＮＡリガーゼを接触させることを含む方法を含むことができる。他の実施形態では、ステップ（Ａ）で用意する試料は、５’モノリン酸基を有するＲＮＡをさらに含むが、アクセプターオリゴヌクレオチドは、５’モノリン酸基を有するＲＮＡのうち、ステップ（Ｂ）において、キャップ構造を有さず、５’ポリリン酸基を有するＲＮＡから変換されたＲＮＡにのみライゲーションし、５’モノリン酸基を有するＲＮＡのうち、ステップ（Ａ）で用意した試料中にすでに存在していたＲＮＡにはライゲーションせず、その方法は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを用意するサブステップ、ステップ（Ｂ）の前に、試料中の、５’モノリン酸基を有するＲＮＡが、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡに変換される条件かつ充分な時間で、試料と、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを接触させるサブステップ、及びＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブステップをさらに含む。他の実施形態では、その方法は、試料中の、キャップ構造を有するＲＮＡに、５’ライゲーションによってタグ付けすることをさらに含み、その方法は、核酸ピロホスファターゼまたは脱キャップ酵素を用意するサブステップ、及びステップ（Ｃ）の前に、試料中の、キャップ構造を有するＲＮＡが、５’モノリン酸基を有するＲＮＡに変換される条件かつ充分な時間で、ステップ（Ｂ）から得られた試料と、核酸ピロホスファターゼまたは脱キャップ酵素を接触させ、それによって、ステップ（Ａ）で用意した試料に含まれる、キャップ構造を有するＲＮＡも、ステップ（Ｃ）で、５’ライゲーションによってタグ化するサブステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１２／００１００９１号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の単細胞から、ｃＤＮＡライブラリを調製するための方法を含むことができる。一態様では、その方法は、各単細胞からｍＲＮＡを放出して、複数の個別のｍＲＮＡ試料を用意するステップ、個別の各ｍＲＮＡ試料中のｍＲＮＡから、ｃＤＮＡの第１の鎖を合成するとともに、そのｃＤＮＡにタグを導入して、複数のタグ付きｃＤＮＡ試料を用意するステップ、そのタグ付きｃＤＮＡ試料をプールするステップ、及びプールしたｃＤＮＡ試料を増幅して、二本鎖ｃＤＮＡを有するｃＤＮＡライブラリを作製するステップを含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡライブラリは、上記の方法によって作製できる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記のようにｃＤＮＡライブラリを調製し、そのライブラリをシークエンシングすることによって、複数の細胞における遺伝子発現を解析するための方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１１／０１５２１１１号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、保存組織試料中の標的核酸配列を検出する方法であって、保存組織試料から調製した核酸試料を用意すること、第１のライゲーションプローブセットを前記標的配列にハイブリダイズさせて、ライゲーション構造体を形成すること、リガーゼを用いて、前記プローブをライゲーションして、ライゲーションされたプローブを形成すること、前記ライゲーションされたプローブを増幅して、アンプリコンを形成すること、及び前記アンプリコンを検出することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、保存組織試料中の複数の標的核酸配列を検出する方法であって、保存組織試料から調製した核酸試料を用意すること（前記試料は、複数の標的核酸配列を含む）、前記標的核酸配列のうちの１つとそれぞれ実質的に相補的な複数の検出プローブを加えること、酵素を供給して、改変検出プローブを形成すること、前記改変検出プローブを増幅して、アンプリコンを形成すること、及び前記アンプリコンを検出することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、保存組織試料中の複数の標的核酸配列を検出する方法であって、保存組織試料から調製した核酸試料を用意すること（前記試料は、複数の標的核酸配列を含む）、複数のライゲーションプローブセットを前記標的配列にハイブリダイズさせて、複数のライゲーション構造体を形成すること、リガーゼを用いて、前記複数のライゲーション構造体のそれぞれをライゲーションして、複数のライゲーションされたプローブを形成すること、前記ライゲーションされたプローブを増幅して、複数のアンプリコンを形成すること、及び前記複数の標的核酸配列の存在を示すものとして、前記アンプリコンを検出することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／０１９４５６（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、組織中の標的核酸の由来元に関連する空間的情報を保持しながら、組織中のトランスクリプトーム及び／または遺伝子変化の特徴付けを促進する方法及び組成物を含むことができる。例えば、その方法は、異常変異を有する、組織生検標本中の細胞または細胞クラスターの位置を特定可能にできる。したがって、その方法は、診断目的、例えば、がんの診断に有用であり得るとともに、標的療法の選択を助ける可能性があり得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、組織試料中の核酸の空間的な検出及び解析のための捕捉アレイであって、表面に固定化された一対の捕捉プローブを含む捕捉部位を含み、その一対の捕捉プローブの第１の捕捉プローブが、第１のプライマー結合領域及び空間アドレス領域を含み、その一対の捕捉プローブの第２の捕捉プローブが、第２のプライマー結合領域及び捕捉領域を含む捕捉アレイを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、組織試料中の核酸の空間的な検出及び解析のための方法であって、（ａ）表面に固定化された一対の捕捉プローブを含む捕捉部位を含む捕捉アレイを用意することを含み、その一対の捕捉プローブの第１の捕捉プローブが、第１のプライマー結合領域及び空間アドレス領域を含み、その一対の捕捉プローブの第２の捕捉プローブが、第２のプライマー結合領域及び捕捉領域を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、組織試料中の核酸の空間的な検出及び解析のための方法であって、捕捉領域を含む固定化された捕捉プローブを含む磁性ナノ粒子を用意することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、組織試料中の核酸の空間的な検出及び解析のための捕捉アレイであって、空間アドレス領域及びトランスポゾン末端（ＴＥ）領域を含む捕捉プローブを含む捕捉部位を含む捕捉アレイを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１６／１３０７０４（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、近接性保持エレメント（ＣＥ）内に保存、包埋または含有されている単細胞の成分の評価に関連する方法及び組成物を含むことができる。一態様は、単細胞に由来する複数の分析物の種類を解析するための方法である。いくつかの実施形態では、複数の近接性保持エレメント（ＣＥ）であって、各ＣＥが単細胞を含むＣＥを提供する。単細胞中の複数の分析物がＣＥ内で放出されるように、その細胞は、ＣＥ内で溶解される。いくつかの実施形態では、複数種のレポーター部分が供給されており、レポーター部分のそれぞれの種類が、分析物のそれぞれの種類に対して特異的であるようになっている。いくつかの実施形態では、そのレポーター部分は、単細胞を特定する。分析物のそれぞれの種類が、その分析物の種類に対して特異的なレポーター部分を含むように、複数の分析物は改変されている。いくつかの実施形態では、前記レポーター部分を含む分析物を含むＣＥが組み合わされている。いくつかの実施形態では、前記レポーター部分を含む分析物を含む組み合わされたＣＥは、仕切られている。いくつかの実施形態では、追加のレポーター部分が供給されており、分析物が２つ以上の異なるレポーター部分を含むように、追加のレポーター部分は、分析物を含む分析物と組み合わされている。レポーター部分を含む分析物を解析して、分析物の同一性を検出し、レポーター部分によって、単細胞に由来する分析物の供給源を特定するようにする。いくつかの実施形態では、例示的な複数の分析物としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、脂質、糖鎖、細胞小器官（例えば、核、ゴルジ体、リボソーム、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、細胞膜など）、細胞内代謝物、組織切片、細胞、単細胞、複数の細胞もしくは単細胞に由来する内容物、複数の細胞もしくは単細胞から単離した核酸、複数の細胞もしくは単細胞から単離した核酸であって、さらに改変した核酸、または無細胞ＤＮＡ（例えば、胎盤液もしくは血漿由来の無細胞ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その複数の分析物は、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、そのｍＲＮＡは、ポリＡテールを有する。いくつかの実施形態では、そのゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡは、ＣＥ内の固体支持体上に同時に固定化する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの固定化は、固体支持体にｍＲＮＡを固定化した後に行う。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡをトランスポソーム複合体と組み合わせ、トランスポゾン末端を固体支持体上に固定化し、固体支持体上に固定化されたオリゴ（ｄＴ）プローブをハイブリダイゼーションさせることによって、ｍＲＮＡをその固体に固定化する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡをトランスポソーム複合体と組み合わせ、任意に、トランスポゾン末端が、固体支持体上に固定化された相補配列にハイブリダイズし、固体支持体上に固定化されたオリゴ（ｄＴ）プローブをハイブリダイゼーションさせることによって、ｍＲＮＡが、その固体に固定化されるようにする。他の方法を用いて、ｍＲＮＡを固定化することもできる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルの表面である。いくつかの実施形態では、固体表面は、反応容器の壁である。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＥ内に保存、包埋または含有されている核酸をシークエンシングすることを含む。いくつかの実施形態は、ＣＥ内のＤＮＡを調製して、標的核酸からフェージング及び配列アセンブリー情報を得るとともに、当該鋳型からフェージング及び配列アセンブリー配列情報を得ることに関するものである。特定の実施形態は、インテグラーゼ、例えばトランスポゼースを用いて、断片化した核酸の関連する末端の物理的近接性を保持すること、及び組み合わせインデックス付与を用いて、各ＣＥから個別のライブラリを作製することに関するものである。ＣＥからハプロタイプ情報を得ることは、標的核酸において異なるアレル（例えば、ＳＮＰ、遺伝子異常など）を区別することを含む。このような方法は、標的核酸において異なるアレルを特徴付けて、配列情報におけるエラー率を低下させるのに有用である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２００２／０１２８９７（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面、少なくとも１つの基準、ならびに少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェア集団を含む基材を含むアレイ構成を含むことができる。各亜集団は、生物活性剤を含み、ミクロスフェアは、前記表面上に分布している。各亜集団は、その生物活性剤の特定を行えるように、任意に、固有の光学的シグネチャー、解読結合リガンドと結合する識別子結合リガンド、またはこれらの両方を含み得る。追加の態様では、所定の形式で機能するようにコンピューターに指示するコンピューター可読メモリを含む組成物を提供する。そのコンピューター可読メモリは、複数の不連続な部位を含むランダムアレイのデータ画像を受け取るための取得モジュール、データ画像を登録するための登録モジュール、及び登録されたデータ画像を比較するための比較モジュールを含む。各モジュールは、その機能を行うためのコンピューターコードを含む。登録モジュールは、基準繊維（基材が光ファイバーバンドルを含む場合）、基準ミクロスフェア、またはランダムアレイから作製した基準鋳型を含め、いずれかの数の基準を使用し得る。いくつかの実施形態では、そのアレイ構成を作製する方法であって、基材上に個別の部位を含む表面を形成すること、その個別の部位がミクロスフェアを含むように、その表面上にミクロスフェアを分布させること、その表面上に少なくとも１つの基準を組み込むことを含む方法を提供する。アレイが完全な回転自由度を有する場合には、回転の補正を可能にするために、アレイには、少なくとも２つの基準が好ましい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ランダムアレイの別々のデータ画像を比較するための方法を含むことができる。その方法は、コンピューターシステムを用いて、ランダムアレイの第１のデータ画像を登録し、登録された第１のデータ画像を作成すること、コンピューターシステムを用いて、ランダムアレイの第２のデータ画像を登録し、登録された第２のデータ画像を作成すること、ならびに第１及び第２の登録されたデータ画像を比較して、それらのいずれかの違いを判断することを含む。いくつかの実施形態は、ランダムアレイ構成を解読する方法であって、ランダムアレイ構成を用意することを含む方法を提供する。第１の複数の解読結合リガンドをアレイ構成に付加し、第１のデータ画像を作成する。基準を用いて、第１の登録されたデータ画像を作成する。第２の複数の解読結合リガンドをアレイ構成に付加し、第２のデータ画像を作成する。基準を用いて、第２の登録されたデータ画像を作成する。コンピューターシステムを用いて、第１及び第２の登録されたデータ画像を比較し、少なくとも２つの生物活性剤の位置を特定する。いくつかの実施形態は、試料における標的分析物の存在を判断する方法を提供する。その方法は、ランダムアレイ構成の第１のデータ画像を取得すること、及び第１のデータ画像を登録して、登録された第１のデータ画像を作成することを含む。続いて、試料をランダムアレイに加え、そのアレイから第２のデータ画像を取得する。第２のデータ画像を登録して、登録された第２のデータ画像を作成する。続いて、第１及び第２の登録されたデータ画像を比較して、標的分析物の有無を判断する。任意に、データの取得は、異なる波長における取得であってよい。いくつかの実施形態は、シグナルデータを事前処理または事前フィルタリングするための方法であって、アレイからデータ画像を取得すること、及び少なくとも１つのアレイ部位に由来する第１のシグナルと、基準シグナルとの類似性を求めて、その部位が候補ビーズを含むかを判断することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１３６４１６（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、スプライス変異型を特定するための方法及びシステムを含むことができる。一実施態様では、方法は、単一の生体試料に由来する複数のＲＮＡ配列リードから、１つまたは複数の試料スプライスジャンクションを求めること、複数の健常なＲＮＡ試料から求めたベースラインスプライスジャンクションセットを取り出すこと、１つまたは複数の試料スプライスジャンクションと、ベースラインスプライスジャンクションセットを比較すること、及び１つまたは複数のフィルタリングされた試料スプライスジャンクションを特定することを含み、フィルタリングされた試料スプライスジャンクションは、ベースラインスプライスジャンクションと重複しない試料スプライスジャンクションを含み、その１つまたは複数のフィルタリングされた試料スプライスジャンクションは、発がん事象候補である。いくつかの実施形態は、発がん事象候補のリストを出力することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の健常なＲＮＡ試料は、地理的地域、年齢、性別、民族、組織の種類または試料保存品質の種類のうちの１つまたは複数の切り口で得た健常なＲＮＡ試料を含む。いくつかの実施形態では、複数の健常なＲＮＡ試料は、肺、副腎、膀胱、乳房、卵巣、肝臓、前立腺、皮膚及び脾臓からなる群から選択した１つまたは複数の組織の種類に由来する試料を含む。いくつかの実施形態では、複数の健常なＲＮＡ試料は、広範な年齢にわたるドナーから得た試料を含む。いくつかの実施形態では、複数の健常なＲＮＡ試料に由来するベースラインスプライスジャンクションは、単一試料に由来する試料ジャンクションを求める前に求める。いくつかの実施形態では、ベースラインスプライスジャンクション用の複数の健常なＲＮＡ試料は、その単一の生体試料と同一の生体からは採取しない。いくつかの実施形態では、ベースラインジャンクションは、試料ジャンクションと同一のゲノム領域に由来する。いくつかの実施形態では、その単一の生体試料は、腫瘍試料に由来するものである。いくつかの実施形態では、試料スプライスジャンクション及びベースラインスプライスジャンクションはいずれも、一般的なアッセイを用いて求める。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の試料ジャンクションを求めることは、単一の生体試料から複数のＲＮＡ配列リードを決定すること、その単一の生体試料に由来するＲＮＡ配列リードとアラインメントしたＤＮＡ参照配列を取り出すこと、及びそのＲＮＡリードにおいて、そのＤＮＡ参照配列と比べて欠失している連続的な位置として、１つまたは複数の試料ジャンクションを求めることを含む。いくつかの実施形態では、フィルタリングされた試料スプライスジャンクションは、第三者のジャンクションと重複しないものであり、その第三者のジャンクションは、所定の遺伝子について、エキソンを複数交互に組み合わせたものを捕えるスプライスグラフから求める。いくつかの実施形態では、所定の遺伝子について、エキソンを複数交互に組み合わせたものを捕えるスプライスグラフを定めずに、ベースラインスプライスジャンクションセットを求める。いくつかの実施形態は、スプライス変異型を特定するためのシステムを提供する。そのシステムは、メモリ、少なくとも１つのプロセッサー、ならびに少なくとも１つのプロセッサーによって実行されると、単一の生体試料に由来する複数のＲＮＡ配列リードから、１つまたは複数の試料スプライスジャンクションを求めること、複数の健常なＲＮＡ試料から求めたベースラインスプライスジャンクションセットを取り出すこと、その１つまたは複数の試料スプライスジャンクションと、ベースラインスプライスジャンクションセットを比較すること、及び１つまたは複数のフィルタリングされた試料スプライスジャンクションを特定することを含む動作を少なくとも１つのプロセッサーに実行させる命令を含む少なくとも１つの非一時的なコンピューター可読媒体（そのフィルタリングされた試料スプライスジャンクションは、ベースラインスプライスジャンクションセットと重複しない試料スプライスジャンクションを含み、そのフィルタリングされた試料スプライスジャンクションは、発がん事象候補である）を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０９３７８０（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、変異型コールを検証するために、コンピューターによって実施される方法を含むことができる。その方法は、対象とするゲノム配列沿いのヌクレオチドの対応配列を有する試料リードを含むシークエンシングデータを受け取り、対象とするゲノム配列沿いのヌクレオチドの配列内の指定の位置における潜在的変異型コールの指示を受け取り、１つまたは複数のベースラインゲノム配列内の指定の位置におけるベースライン変異型頻度を固有分子指標
得るためのプログラム命令を実行する１つまたは複数のプロセッサーの制御下で行われる。その方法では、対象とするゲノム配列の指定の位置における試料変異型頻度を得る。その方法では、指定の位置におけるベースライン変異型頻度及び試料変異型頻度を解析して、品質スコアを得て、その品質スコアに基づき、対象とするゲノム配列の潜在的変異型コールを検証する。任意に、その解析作業は、試料変異型頻度と、ベースライン変異型頻度の分布との関係を得て、その関係に基づき、品質スコアを得ることを含む。任意に、その解析作業は、ベースライン変異型頻度の分布と比べて、試料変異型頻度にインデックスを付与することを含む。その関係は、ノンパラメトリックなウイルコクソンの順位和検定に基づいてよい。ベースライン変異型頻度は、ベースラインゲノム配列沿いの対応する位置におけるバックグラウンドノイズの程度を示す。任意に、その検証は、品質スコアと閾値を比較すること、及び品質スコアが閾値を上回る場合に、潜在的変異型コールが有効な変異型コールであることを宣言することをさらに含む。ベースライン変異型頻度は、２つ以上の種類のアレルと関連する複数のベースラインゲノム配列から抽出し得る。任意に、その方法は、ベースラインゲノム配列沿いのヌクレオチドの配列の複数の参照リードを含むシークエンシングデータを受け取ること、及び指定の位置におけるその参照リードのベースライン変異型頻度を求めることをさらに含む。ベースライン変異型頻度を求めることは、現行の塩基対の枠内の位置セットについて、参照リードからシークエンシングデータを受け取ること、現行の塩基対の枠内の位置セット中の１つまたは複数の位置について、変異型頻度候補を特定すること、参照リード内の指定の位置のベースライン変異型頻度として、変異型頻度候補のうちの１つを選択すること、及び塩基対の枠をベースラインゲノム配列に沿って移動させて、上記の作業を繰り返すことをさらに含み得る。上記の実施形態に従って、系統的エラーに由来する偽陽性の変異型コールを低減するためのシステム及び方法が記載されている。系統的エラーは、ＦＦＰＥのアーチファクト、シークエンシングエラー、ライブラリ調製エラー、ＰＣＲエラーなどのような様々な要因が原因で発生し得る。変異型コールは、ＮＧＳベースのアッセイによってシークエンシングされた、様々な組織由来のＤＮＡの品質が様々であるＦＦＰＥ正常試料パネルから作成し得る遺伝子座特異的なバックグラウンドエラー分布の影響を静的に受ける。また、ＦＦＰＥ正常試料の同一のシークエンシングデータを用いて、ＰＣＲ、ＤＮＡの品質、プローブのプルダウン効率または配列ＧＣ含有率を原因とする、リードカバレッジにおける系統的バイアスを正規化して、試験試料における真のコピー数変化を明らかにし得る。ＣＮＶコールにおけるシグナルノイズ比をさらに改善するために、ハイブリッドキャプチャーの際に、追加のエンハンサープローブを付加して、遺伝子増幅のロバスト推定を実施し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ノイズの問題に対処して、系統的エラーが偽陽性変異型コールに寄与するのを防ぐ方法及びシステムを含むことができる。これに関連して、そのシステムが、腫瘍試料において、バックグラウンドノイズの高い領域で、コールストリンジェンシーを向上させるように、正常試料セットを用いて、系統的バイアスを特定する。ＦＦＰＥ試料では、正常なＦＦＰＥ試料を用いて、ベースラインを構築し得る。ｃｔＤＮＡ試料では、正常なゲノムＤＮＡデータを用いて、ベースラインを構築し得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０６８０１４（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ポリヌクレオチドをシークエンシングするためのシステム及び方法を含むことができる。一実施形態では、そのシステムは、参照ヌクレオチド配列を含むメモリ、シークエンシングシステムから、リードの第１のヌクレオチド部分配列を受け取ること、第１のアラインメントパスを用いて、第１のヌクレオチド部分配列を処理して、参照配列上のそのリードの第１の複数の候補位置を求めること、求めた候補位置に基づき、第１のヌクレオチド部分配列が参照配列にアライメントするか判断すること、シークエンシングシステムから第２のヌクレオチド部分配列を受け取ること、第２のヌクレオチド部分配列を処理して、そのリードが参照配列にアラインメントされる場合には、第２のアラインメントパスを用いて、アラインメントされない場合には、第１のアラインメントパスを用いて、参照配列にアライメントするそのリードの第２の複数の候補位置を求めることを含む方法を行う命令を実行するように構成されたプロセッサー（そのリードの第２の複数の候補位置を求めるには、第２のアラインメントパスの方が、第１のアラインメントパスよりも計算効率が高い）を含む。一実施形態では、その方法は、シークエンシングランの最中に、シークエンシングシステムから、第１のヌクレオチド部分配列を受け取ること、及び第１の解析パスまたは第２の解析パスを用いて、参照配列に基づき、リードの第１のヌクレオチド部分配列の二次解析を行うことを含み、二次解析を行う際、その第２の解析パスは、第１の処理パスよりも計算効率が高い。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０５７７７０（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体試料におけるコピー数変化の検出を含むことができる。一実施形態では、コピー数変異型は、少なくとも単一遺伝子のサイズであり得る。別の実施形態では、コピー数変異型は、少なくとも１４０ｂｐ、１４０～２８０ｂｐまたは少なくとも５００ｂｐであり得る。一実施形態では、「コピー数変異型」とは、試験試料中の対象とする配列と、対象とする配列の期待されるレベルを比較することによって、コピー数の差が見られる核酸の配列を指す。いくつかの実施形態では、不一致試料のシークエンシングデータセットから参照試料を抽出して、個別の試験試料の正規化を可能にする正規化情報を作成して、正規化シークエンシングデータで、期待されるコピー数からの偏差を求められるようにする。その正規化データは、提供されている技法を用いて作成し、試験試料に一致した最も代表的な仮想試料に対する正規化を可能にする。試験試料を正規化することによって、シークエンシングによって導入されたノイズ、またはその他のバイアスを除去する。ある特定の実施形態では、標的化シークエンシングランの生のシークエンシングデータカバレッジを正規化して、技術的及び生物学的なノイズを除去して、ＣＮＶの検出を向上させる。一実施形態では、対象とする標的領域に対するプローブのシークエンシングパネルを使用する標的化シークエンシング法のような所望のシークエンシング法に従って、対象とする試料（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋試料）をシークエンシングする。シークエンシングデータを収集したら、そのシークエンシングデータを正規化して、ノイズを除去し、続いて、その正規化データを解析して、ＣＮＶを検出する。いくつかの実施形態では、コピー数を正規化する方法であって、シークエンシング要求をユーザーから受け取って、生体試料中の対象とする１つまたは複数の領域をシークエンシングするステップ、その生体試料に一致しない複数のベースライン生体試料に由来する対象とする１つまたは複数の領域から、ベースラインシークエンシングデータを取得するステップ、ベースラインシークエンシングデータを用いて、コピー数正規化情報を定めるステップ（そのコピー数正規化情報は、対象とする１つまたは複数の領域のうちの対象とする領域に対する少なくとも１つのコピー数ベースラインを含む）、及びコピー数正規化情報をユーザーに提供するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、コピー数変化を検出する方法であって、シークエンシングデータを生体試料から取得するステップ（そのシークエンシングデータは、対象とする複数の領域のそれぞれに関する生のシークエンシングリードカウントを複数含む）、及びシークエンシングデータを正規化して、領域依存的なカバレッジを除去するステップを含む方法を提供する。その正規化ステップは、対象とする領域ごとに、生体試料の対象とする領域における１つまたは複数のビンの生のシークエンシングリードカウントと、ベースラインシークエンシングリードカウント中央値を比較して、対象とする領域における１つまたは複数のビンに関して、ベースライン補正したシークエンシングリードカウントを作成すること（対象とする領域における１つまたは複数のビンに関するそのベースラインシークエンシングリードカウント中央値は、生体試料に一致しない複数のベースライン試料から抽出し、対象とする各領域のベースラインシークエンシングデータの最も代表的な部分のみから求める）、及びベースライン補正したシークエンシングリードカウントからＧＣバイアスを除去して、対象とする各領域の正規化シークエンシングリードカウントを作成することを含む。その方法は、対象とする各領域における１つまたは複数のビンの正規化シークエンシングリードカウントに基づき、対象とする各領域におけるコピー数変化を求めることも含む。別の実施形態では、標的化シークエンシングパネルを評価する方法であって、標的化シークエンシングパネルのゲノム内の第１の複数の標的を特定するステップ（その第１の複数の標的は、それぞれの複数の遺伝子の部分に対応する）、第１の複数の標的のそれぞれのＧＣ含有率を求めるステップ、第１の複数の標的のうち、ＧＣ含有率が所定の範囲外である標的を排除して、第１の複数の標的よりも少ない第２の複数の標的を得るステップ、排除後、個別の遺伝子が、その個別の遺伝子の部分に対応する標的を所定数よりも少ない数有する場合、その個別の遺伝子において、追加の標的を特定するステップ、その追加の標的を第２の複数の標的に加えて、第３の複数の標的を得るステップ、及び第３の複数の標的に対して特異的なプローブを含むシークエンシングパネルを用意するステップを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１９７０２７（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ポリヌクレオチドを濃縮または増幅するための方法、より具体的には、エンドヌクレアーゼシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムまたはＡｒｇｏｎａｕｔｅシステムを用いて、標的ＤＮＡ配列を濃縮または増幅するための方法、及びそれらの用途を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて、標的二本鎖核酸を増幅するための方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的二本鎖核酸を増幅するための方法であって、（ａ）クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはその誘導体、及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはその変異型を有するシステムを用意すること（そのｃｒＲＮＡまたはその誘導体は、標的二本鎖核酸の第１の鎖の領域と相補的な標的特異的なヌクレオチド領域を含む）、（ｂ）その標的二本鎖核酸とそのシステムを接触させて、複合体を形成すること、（ｃ）プライマーを標的二本鎖核酸の第２の鎖にハイブリダイズさせること（そのプライマーは、標的二本鎖核酸の第２の鎖の領域と相補的な配列を含む）、ならびに（ｄ）ポリメラーゼを用いて、そのプライマーから、標的二本鎖核酸の第２の鎖と相補的な核酸を伸長させることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的二本鎖核酸を増幅するための方法であって、（ａ）第１のクラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはその誘導体、及び第１のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはその変異型を有する第１のシステムを用意すること（その第１のｃｒＲＮＡまたはその誘導体は、標的二本鎖核酸の第１の鎖の領域と相補的な標的特異的なヌクレオチド領域を含む）、（ｂ）第２のクラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはその誘導体、及び第２のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはその変異型を有する第２のシステムを用意すること（その第２のｃｒＲＮＡまたはその誘導体は、標的二本鎖核酸の第２の鎖の領域と相補的な標的特異的なヌクレオチド領域を含む）、（ｃ）その標的二本鎖核酸と、第１のシステム及び第２のシステムを接触させること、（ｄ）第１のプライマーを標的二本鎖核酸の第２の鎖にハイブリダイズさせ（その第１のプライマーは、標的二本鎖核酸の第２の鎖の領域と相補的な配列を含む）、第２のプライマーを標的二本鎖核酸の第１の鎖にハイブリダイズさせること（その第２のプライマーは、標的二本鎖核酸の第１の鎖の領域と相補的な配列を含む）、ならびに（ｅ）１つまたは複数のポリメラーゼによって、第１のプライマー及び第２のプライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖標的核酸を作製することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、ステップ（ａ）及びステップ（ｅ）を１回または複数回、例えば、所望の増幅度に達するまで繰り返すことをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的二本鎖核酸を増幅するための方法であって、（ａ）５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体、及びＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質またはその変異型を有するシステムを用意すること（その５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体は、標的二本鎖核酸の第１の鎖の領域と相補的な標的特異的なヌクレオチド領域を含む）、（ｂ）その標的二本鎖核酸と、そのシステムを接触させて、複合体を形成すること、（ｃ）プライマーを標的二本鎖核酸の第２の鎖にハイブリダイズさせること（そのプライマーは、標的二本鎖核酸の第２の鎖の領域と相補的な配列を含む）、ならびに（ｄ）ポリメラーゼを用いて、そのプライマーから、標的二本鎖核酸の第２の鎖と相補的な核酸を伸長させることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸を濃縮するための方法であって、対象の血漿または血清から、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の集団を得ること（その無細胞ＤＮＡ集団は、標的核酸を含む）、５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体、及びＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質またはその変異型を有するシステムを用意すること（その５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体は、標的核酸の領域と相補的な標的特異的なヌクレオチド領域を含む）、その標的核酸と、そのエンドヌクレアーゼシステムを接触させて、複合体を形成すること、ならびにその複合体を分離し、それによって、標的核酸を濃縮することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、一塩基変異型（ＳＮＶ）を検出するための方法であって、対象の血漿または血清から、無細胞ＤＮＡの集団を得ること、第１の５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体、及び第１のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質またはその変異型を有する第１のシステムを用意すること（その第１の５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体は、第１の標的核酸の領域と相補的な第１の標的特異的なヌクレオチド領域を含み、その第１のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有する）、第１のエンドヌクレアーゼシステムを用いて、第１の標的核酸を切断すること、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、第２の標的核酸を増幅すること（その第２の標的核酸は、第１の標的核酸の一塩基変異型を含む）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸を標識するための方法であって、５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体、及び第１のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質またはその変異型を有する第１のシステムを用意すること（その第１の５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体は、標的核酸の第１の領域と相補的な第１の標的特異的なヌクレオチド領域を含み、その第１のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、一本鎖ニックを作製できる）、標的核酸を含む二本鎖核酸と、その第１のヌクレアーゼシステムを接触させて、標的核酸の第１の領域に、第１の一本鎖ニックを作製すること、ならびに標的核酸を標識することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、その標識を通じて、標的核酸を分離し、それによって、標的核酸を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その方法は、標的核酸を増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その方法は、第２の５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体、及び第２のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質またはその変異型を有する第２のシステムを用意すること（その第２の５’リン酸化一本鎖核酸またはその誘導体は、標的核酸の第２の領域と相補的な第２の標的特異的なヌクレオチド領域を含み、第２のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、一本鎖ニックを作製できる）、ならびに標的核酸を含む二本鎖核酸と、その第２のヌクレアーゼシステムを接触させて、標的核酸の第２の領域に、第２の一本鎖ニックを作製すること（標的核酸の第１の領域は、標的核酸の第２の領域とは異なる）をさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸を濃縮するための方法であって、５’リン酸化一本鎖核酸セットによってプログラムしたＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の集団を用意すること（その５’リン酸化一本鎖核酸セットは、標的核酸の一連の異なる領域と相補的な５’リン酸化一本鎖核酸を含む）、標的核酸と、５’リン酸化一本鎖核酸セットによってプログラムしたＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質集団を接触させて、一連の核酸断片を作製すること、ならびにアダプターを核酸断片の少なくとも１つにライゲーションすること（そのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ切断を起こすことができる）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸をシークエンシングするための方法であって、５’リン酸化一本鎖核酸セットによってプログラムしたＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の集団を用意すること（その５’リン酸化一本鎖核酸セットは、標的核酸にわたる一連の異なる領域と相補的な５’リン酸化一本鎖核酸を含む）、標的核酸と、５’リン酸化一本鎖核酸セットによってプログラムしたＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の集団を接触させて、一連の核酸断片を作製すること、及びその一連の核酸断片をシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸をシークエンシングするための方法であって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の複数の集団を用意すること（そのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の各集団は、異なる５’リン酸化一本鎖核酸セットによってプログラムされており、その各５’リン酸化一本鎖核酸セットは、標的核酸にわたる異なる一連の領域と相補的な５’リン酸化一本鎖核酸を含む）、標的核酸と、複数のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質集団のそれぞれを別々の反応で接触させて、異なる一連の核酸断片を作製すること、及びそれらの核酸断片をシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１５／１９８０７４（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、配列情報を表示するための方法、装置、システム及びコンピュータープログラム製品を含むことができる。いくつかの実施形態では、これは、第１の配列及び第２の配列を得ること、第１の配列と第２の配列の類似性を求めること（その類似性は、第１の配列と第２の配列との距離に基づくものである）、ならびに第１の配列と第２の配列の類似性に基づき、マトリックスプロット上の交点で、ブロックを表示することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２００２／０９９９８２（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面を有する基材、その表面上の反射コーティング、及びその基材上に分布したミクロスフェアの集団を含む組成物を含むことができる。そのミクロスフェアは、少なくとも第１及び第２の亜集団を含む。概して、少なくとも１つの亜集団は、生物活性剤を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、組成物であって、その基材が、第１及び第２の表面を含み、第１の表面が、不連続な部位を含み、反射コーティングが第２の表面上にある組成物を含むことができる。第１の表面上には、ミクロスフェアの集団が分布している。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、反射アレイを作製する方法を含むことができる。その方法は、不連続な部位を含む表面を有する基材を用意すること、その表面に、反射材のコーティングを施すこと、及びその表面上にミクロスフェアを分布させることを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料において、非標識化標的分析物を検出する方法であって、複数の不連続な部位を有する基材を用意すること、生物活性剤及びシグナル伝達要素を含むミクロスフェアの集団をそれらの部位に分布させること、その基材と試料を接触させることで、標的分析物が生物活性剤に結合したら、標的分析物が存在することの指標として、シグナル伝達要素から伝達されるシグナルが変化することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２００２／０１６６４９（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸を検出する方法を含むことができる。その方法は、標的核酸とアダプター配列を接触させて、標的核酸がアダプター配列に結合して、改変標的核酸を形成するようにすることを含む。加えて、その方法は、その改変標的核酸と、不連続な部位及び第１の捕捉プローブを含む少なくとも第１の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含む表面を有する基材を含むアレイを接触させて、第１の捕捉プローブ及び改変標的核酸が複合体を形成するようにすること（そのミクロスフェアは、その表面上に分布している）、ならびに標的核酸の存在を検出することを含む。加えて、その方法は、少なくとも１つの解読結合リガンドをそのアレイに加えて、標的核酸の特定を行うようにすることを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，９１４，９７３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、遺伝子融合及び染色体転座に起因するような遺伝子調節障害を検出するための方法、組成物及びキットを含むことができる。その方法、組成物及びキットは、標的遺伝子の３’領域に対する、標的遺伝子の５’領域の差次的発現を引き起こす変異を検出するのに有用である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料中の標的遺伝子における調節障害の有無を検出するための方法を含むことができる。一実施形態では、その方法は、（ａ）試験試料に存在する場合に、標的遺伝子の転写産物またはその転写産物に由来するｃＤＮＡの５’領域の部分を、標的遺伝子の５’領域のそれらの部分に対する２つ以上の異なる５’標的プライマー対によって増幅すること、（ｂ）試験試料に存在する場合に、標的遺伝子の転写産物またはその転写産物に由来するｃＤＮＡの３’領域の部分を、標的遺伝子の３’領域のそれらの部分に対する２つ以上の異なる３’標的プライマー対によって増幅すること、（ｃ）その２つ以上の５’標的プライマー対及び２つ以上の３’標的プライマー対によって生成された増幅生成物を検出すること、（ｄ）その２つ以上の５’標的プライマー対における平均サイクル閾値（Ｃｔ）、及びその２つ以上の３’標的プライマー対における平均Ｃｔを求めること、（ｅ）その５’標的プライマー対における平均サイクル閾値と、３’標的プライマー対における平均サイクル閾値の差として、ＩＤＥスコアを算出すること、ならびに（ｆ）（ｉ）そのＩＤＥスコアとカットオフ値との差が有意である場合に、標的遺伝子の調節障害を有するものとして試験試料を特定し、その差によって、標的遺伝子の調節障害の存在が示されるか、または（ｉｉ）試験試料のＩＤＥスコアとカットオフ値との差が有意ではない場合、標的遺伝子の調節障害を有さないものとして試験試料を特定することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象におけるがんまたはがん感受性の有無を診断するための方法を含むことができる。一実施形態では、その方法は、（ａ）対象から、核酸を含む試験試料を採取すること、（ｂ）試験試料に存在する場合に、標的遺伝子の転写産物またはその転写産物に由来するｃＤＮＡの５’領域の部分を、標的遺伝子の５’領域のそれらの部分に対する２つ以上の異なる５’標的プライマー対によって増幅すること、（ｃ）試験試料に存在する場合に、標的遺伝子の転写産物またはその転写産物に由来するｃＤＮＡの３’領域の部分を、標的遺伝子の３’領域のそれらの部分に対する２つ以上の異なる３’標的プライマー対によって増幅すること、（ｄ）その２つ以上の５’標的プライマー対及び２つ以上の３’標的プライマー対によって生成された増幅生成物を検出すること、（ｅ）その２つ以上の５’標的プライマー対における平均サイクル閾値（Ｃｔ）、及びその２つ以上の３’標的プライマー対における平均Ｃｔを求めること、（ｆ）５’標的プライマー対における平均サイクル閾値と、３’標的プライマー対における平均サイクル閾値の差として、ＩＤＥスコアを算出すること、ならびに（ｇ）（ｉ）そのＩＤＥスコアとカットオフ値との差が有意であるときに、がんまたはがん感受性を有する者として対象を診断し、その差によって、がんまたはがん感受性の存在が示されるか、または（ｉｉ）試験試料のＩＤＥスコアとカットオフ値との差が有意ではない場合、標的遺伝子の調節障害に起因するがんまたはがん感受性を有さない者として対象を診断することを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の５’領域の発現レベルは、標的遺伝子の５’領域の様々な部分に対する２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの異なるプライマー対を用いて増幅することによって求める。同様に、標的遺伝子の３’領域の様々な部分に対する２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの異なるプライマー対を用いて、標的遺伝子の３’領域の発現レベルを求めてもよい。増幅生成物の量はそれぞれ、例えばＡＢＬのような内在性対照遺伝子転写産物（「対照」）の量に対して正規化し得る。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲを用いて、各アンプリコンについてサイクル閾値（Ｃｔ）を比較して、転写産物の発現レベルまたは相対量を求めることができる。標的遺伝子の３’領域の平均Ｃｔ値（ａｖｇＣｔ３’）及び５’領域の平均Ｃｔ値（ａｖｇＣｔ５’）を用いて、ＩＤＥスコアを算出するが、そのＩＤＥスコアは、ＩＤＥ＝（ａｖｇＣｔ５’－ａｖｇＣｔ３’）またはＩＤＥ＝（ａｖｇＣｔ５’）／（Ｃｔｃｏｎｔｒｏｌ）－（ａｖｇＣｔ３’）／（Ｃｔｃｏｎｔｒｏｌ）またはＩＤＥ＝［Ｌｎ（（ａｖｇＣｔ５’）／Ｃｔｃｏｎｔｒｏｌ）］－［Ｌｎ（（ａｖｇＣｔ３’）／Ｃｔｃｏｎｔｒｏｌ）］として算出し得る。いくつかの実施形態では、Ｃｔ値は、参照試料に対して正規化する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，７８３，８５４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、大量の非標的核酸の存在下で、非常に低いレベルの標的核酸を検出するための方法及び組成物を含むことができる。概して、標的核酸と非標的核酸は、制限酵素認識部位のような断片化部位の有無によって区別する。その方法及び組成物は、断片化部位によって標的と非標的を識別することによって、ＰＣＲのような、当該技術分野において知られている様々な核酸検出方法とともに使用できる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、非標的核酸の存在下で、標的核酸を含む可能性のある試料を試験することによって、標的核酸の有無を検出するための方法であって、ａ）標的核酸に対して、断片化後に増幅を行うと、非標的核酸に対する標的核酸の検出量が、断片化せずに増幅した場合と比べて増加する条件で、試料核酸を断片化すること、ｂ）プライマー対を用いて、標的核酸を増幅すること（第１のプライマーは、標的核酸に対して特異的である）、及びｃ）増幅生成物の有無を検出すること（その検出によって、試料における標的核酸の有無が示される）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、個体が、がんまたは腫瘍細胞腫と関連する変異配列を有するか判断することによって、がんを診断するか、または腫瘍細胞の存在を検出するための方法であって、ａ）個体から、核酸を含む試料を採取すること、ｂ）標的核酸に対して、断片化後に増幅を行うと、非標的核酸に対する標的核酸の検出量が、断片化せずに増幅した場合と比べて増加する条件で、試料核酸を断片化すること、ｃ）プライマー対を用いて、標的核酸を増幅すること（第１のプライマーは、標的核酸に対して特異的である）、及びｄ）上記の変異配列を含む増幅生成物の有無を検出すること（その変異配列を含む増幅生成物の有無または量によって、がんの診断を決定する）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、個体が、がんと関連する変異配列を有するか判断することによって、がんの予後を判断するための方法であって、ａ）個体から、核酸を含む試料を採取すること、ｂ）その変異核酸に対して、断片化後に増幅を行うことによって、非変異核酸に対する変異核酸の検出量が、断片化せずに増幅した場合と比べて増加する条件で、その変異核酸を断片化すること、ｃ）プライマー対を用いて、その変異核酸を増幅すること（第１のプライマーは、その変異核酸に対して特異的である）、ならびにｄ）その変異配列を含む増幅生成物の有無及び／または量を検出すること（その個体における転帰の可能性は、変異核酸配列の存在及びまたは量と関連する）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、がんと診断された個体の薬物感受性を定めるための方法であって、ａ）個体から、核酸を含む試料を採取すること、ｂ）その変異核酸に対して、断片化後に増幅を行うと、非変異核酸に対する変異核酸の検出量が、断片化せずに増幅した場合と比べて増加する条件で、変異核酸を断片化すること、ｃ）プライマー対を用いて、その変異核酸を増幅すること（第１のプライマーは、その変異核酸に対して特異的である）、ｄ）その変異配列を含む増幅生成物の有無及び／または量を検出すること、ならびにｅ）その変異配列を含む増幅生成物の有無及び／または量をがんの薬物感受性に関連付けることを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その核酸配列の変異は、欠失、挿入、置換及び／または転座、あるいはこれらの組み合わせによるものである。好ましい実施形態では、核酸配列の断片化（野生型配列が切断される）は、制限酵素によるものである。増幅前のこのような消化処理によって、増幅し得る野生型配列を破壊するかまたはその数を実質的に減少させる断片化が可能になる。さらに好ましい実施形態では、制限酵素を用いる断片化と、変異特異的プライマー（または変異配列プライマー）の使用を組み合わせる。好ましい実施形態では、変異配列は、対応する野生型配列に存在する制限酵素認識部位を破壊するかまたは崩壊させ、変異特異的プライマーは、変異型の配列に結合し、その野生型対応物には結合しないように設計できる。例えば、変異特異的プライマーは、ボーダー領域（変異配列の一部に隣接する野生型配列の両方の部分を含む領域）と重複できる。アプローチの１つでは、増幅し、得られた増幅生成物を検出することによって、変異配列の有無について、試料をアッセイする。好ましい実施形態では、標的核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行う。単一または複数の変異配列をアッセイできる。複数の変異配列の増幅は、単一の反応容器、例えばマルチプレックスＰＣＲで同時に行うことができる。このケースでは、プローブは、識別可能に標識してよく、及び／またはアンプリコンは、サイズによる区別によって識別可能であってよい。あるいは、そのアッセイは、並列して、別個の反応容器で行うことができる。このような後者のケースでは、プローブは、同一の標識を有することができる。いくつかの実施形態では、その方法は、核酸抽出ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅反応における各プライマー対の少なくとも１つのプライマーは、検出可能な部分で標識されている。したがって、増幅後、サイズ及び色によって、様々な標的セグメントを特定できる。その検出可能な部分は好ましくは、蛍光色素である。いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲにおける異なるプライマー対は、識別可能に検出可能な異なる部分で標識してよい。したがって、例えば、ＨＥＸ及びＦＡＭ蛍光色素が、マルチプレックスＰＣＲにおける異なるプライマーに存在して、得られるアンプリコンと関連付けられていてよい。他の実施形態では、フォワードプライマーは、ある１つの検出可能な部分で標識されており、リバースプライマーは、異なる検出可能な部分で標識されており、例えば、フォワードプライマーでは、ＦＡＭ色素であり、リバースプライマーでは、ＨＥＸ色素である。異なる検出可能な部分の使用は、同一の長さであるか、または長さが非常に近い増幅生成物を識別するのに有用である。したがって、ある特定の実施形態では、少なくとも２つの異なる蛍光色素を用いて、１回の増幅で用いる異なるプライマーを標識する。さらに別の実施形態では、対照試料及び患者試料（または試験試料）の両方を（ＰＣＲ後に）混合して、正常試料と試験試料のシグナルを同時に検出して比較できるように、対照プライマーは、ある１つの部分で標識でき、患者（または試験試料）プライマーは、異なる部分で標識できる。この実施形態の修正形態では、結果をさらに確認できるように、対照試料及び患者試料に用いるプライマーを入れ替えることができる。
マルチプレックスＰＣＲのような増幅反応から得た増幅生成物の解析は、サイズ（電気泳動移動度によって判断する）及び／またはそれぞれの蛍光標識に基づき、増幅生成物を評価できる自動ＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）のような自動ＤＮＡアナライザーを用いて行うことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，５４６，４０４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、遺伝子融合及び染色体異常、例えば、転座、挿入、逆位及び欠失に起因するような遺伝子調節障害を検出するための方法、組成物及びキットを含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法、組成物及びキットは、標的遺伝子の３’領域に対する、標的遺伝子の５’領域の差次的発現を引き起こす変異を検出するのに有用である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的遺伝子における調節障害を検出するための方法を含むことができる。その方法は、（ａ）存在する場合、生体試料における標的遺伝子転写産物の５’領域を、標的遺伝子の５’領域と相補的である１つまたは複数の５’標的プライマー対によって増幅すること、（ｂ）存在する場合、生体試料における標的遺伝子転写産物の３’領域を、標的遺伝子の３’領域と相補的である１つまたは複数の３’標的プライマー対によって増幅すること、ならびに（ｃ）その１つまたは複数の５’標的プライマー対及び１つまたは複数の３’標的プライマー対によって生成された増幅生成物の量を検出することを含み得る。その方法は、ステップ（ａ）及び（ｂ）で生成された増幅生成物の量の差によって、標的遺伝子が異常調節されていることを示すことも提供する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料中の標的遺伝子における調節障害の有無を検出するための方法を含むことができる。その方法は、（ａ）試験試料中の標的遺伝子の５’領域及び標的遺伝子の３’領域の転写量を測定すること、ならびに（ｂ）試験試料中の標的遺伝子の３’領域に対する５’領域の相対的な発現と、参照試料中の標的遺伝子の３’領域に対する５’領域の相対的な発現を比較することを含み得る。その方法は、試験試料における相対的な発現を参照試料の場合と比べた差によって、遺伝子調節障害の存在を示すことも提供し得る。一実施形態では、転写産物の相対量は、リアルタイムＰＣＲを用いて、各アンプリコンについて閾値サイクル、すなわちＣｔ値を比較して求めることができる。Ｃｔ値は、参照試料に対して正規化できる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象において、がんまたはがん感受性を診断するための方法を含むことができる。その方法は、（ａ）存在する場合、生体試料における標的遺伝子転写産物の５’領域を、標的遺伝子の５’領域と相補的である１つまたは複数の５’標的プライマー対によって増幅すること、（ｂ）存在する場合、生体試料における標的遺伝子転写産物の３’領域を、標的遺伝子の３’領域と相補的である１つまたは複数の３’標的プライマー対によって増幅すること、ならびに（ｃ）その１つまたは複数の５’標的プライマー対及び１つまたは複数の３’標的プライマー対によって生成された増幅生成物の量を検出することを含み得る。その方法は、ステップ（ａ）及び（ｂ）で生成された増幅生成物の量の差によって、対象が、遺伝子調節障害に起因するがんであるか、またはそのがんに罹患しやすいことを示すことも提供し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象において、前立腺癌または前立腺癌感受性を診断するための方法を含むことができる。その方法は、（ａ）存在する場合、生体試料における標的遺伝子転写産物の５’領域を、標的遺伝子の５’領域と相補的である１つまたは複数の５’標的プライマー対によって増幅すること、（ｂ）存在する場合、生体試料における標的遺伝子転写産物の３’領域を、標的遺伝子の３’領域と相補的である１つまたは複数の３’標的プライマー対によって増幅すること、ならびに（ｃ）その１つまたは複数の５’標的プライマー対及び１つまたは複数の３’標的プライマー対によって生成された増幅生成物の量を検出することを含み得る。その方法は、ステップ（ａ）及び（ｂ）によって生成された増幅生成物の量の差によって、標的遺伝子が異常調節されていることを示すことも提供し得る。任意に、対象とする標的遺伝子を含む核酸試料に対して別の解析を行って、遺伝子調節障害の性質を求めてもよい。好適な解析としては、例えば、比較ハイブリダイゼーション（例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション）が挙げられる。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）のような比較ハイブリダイゼーション法は、不均衡な再構成（遺伝物質を増減させる再構成）を検出できるに過ぎないことにより、制限がある。比較ハイブリダイゼーションは、均衡転座のような染色体異常を正確には検出できない。したがって、上記の方法のいずれも、比較ハイブリダイゼーション法と組み合わせて用いてよい。上記の方法と比較ハイブリダイゼーション（例えばＣＧＨ）を組みわせると、均衡な再構成及び不均衡な再構成の両方を検出して、比較ハイブリダイゼーション法を単独で用いた場合よりも正確な診断を行うことができることになる。不均衡な再構成の場合には、比較ハイブリダイゼーション法を確認アッセイとして使用してよい。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の調節障害は、遺伝子融合、ならびに例えば、転座、欠失、逆位及び挿入を含む染色体異常に起因し得る。いくつかの実施形態では、マルチプレックス増幅反応で、生体試料を１つまたは複数の５’標的プライマー対及び１つまたは複数の３’標的プライマーと接触させる。一実施形態では、検出作業は、各増幅生成物と相補的な標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて行う。例えば、各オリゴヌクレオチドプローブは、ドナーフルオロフォア及びクエンチャー部分のような異なる検出可能な標識を含み得る。別の実施形態では、５’領域に対するプライマーのうちの少なくとも１つ、及び／または３’領域に対するプライマーのうちの少なくとも１つは、検出可能に、好ましくは異なる検出可能な標識で標識されている。実例的な実施形態では、増幅作業は、定量ＲＴ－ＰＣＲ、例えばリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いて行う。いくつかの実施形態では、染色体異常は、転座、欠失、逆位及び挿入からなる群から選択する。一実施形態では、生体試料は、染色体異常について検査する対象から得た試料である。いくつかの実施形態では、その方法は、生体試料に存在する内在性対照遺伝子転写産物の領域を、その内在性対照遺伝子と相補的なプライマー対によって増幅すること、及びその内在性対照遺伝子の領域の増幅を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅された標的遺伝子転写産物（すなわち、５’領域及び３’領域）の量は、増幅された内在性対照遺伝子転写産物の量に対して正規化してよい。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）試験試料における第２の標的遺伝子の５’領域及び第２の標的遺伝子の３’領域の転写量を測定すること、ならびに（ｂ）試験試料における第２の標的遺伝子の３’領域に対する５’領域の相対的な発現と、参照試料における第２の標的遺伝子の３’領域に対する５’領域の相対的な発現を比較することをさらに含む。その方法は、試験試料における標的遺伝子及び第２の標的遺伝子の両方の相対的な発現を参照試料の場合と比べた差によって、標的遺伝子：第２の標的遺伝子の転座の存在を示すことも提供し得る。好適な生体試料としては、例えば、全血、単離血液細胞、血漿、血清及び尿が挙げられる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，９１１，９４２号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸アレイにハイブリダイズした試験核酸と参照核酸の量を比較することによって比較ハイブリダイゼーションを行う方法を含むことができ、その量は、ハイブリダイズした核酸であって、同一の検出可能な標識で標識されている核酸からのシグナルを検出することによって求める。この方法は、広くは、比較ハイブリダイゼーション法に、特には、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）に適用可能である。したがって、試験核酸及び参照核酸がゲノム核酸であるＣＧＨに言及している場合には、試験核酸及び参照核酸がゲノム核酸以外である方法が含まれると理解すべきである。好ましい実施形態では、ＣＧＨは、ゲノム核酸を含む試験試料、及び既知の染色体異常または遺伝子異常がないゲノム核酸を含む参照試料または対照試料という２つのゲノム核酸試料を用いて行う。その試験試料及び参照試料は、表面（スライドガラスなど）の上に別個の位置でスポットされた複数の核酸または核酸セグメントを含む核酸アレイに共ハイブリダーゼーションさせる。そのアレイは、特定の既知の遺伝子変異または病態に対する標的核酸マーカーを含んでも、または核型分析と同様の遺伝子プロファイルを得るために、（全体で）染色体全体または全染色体組を表してもよい。これらのアプローチでは、検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前またはハイブリダイゼーションの後に、試験核酸及び参照核酸に結合してよい。別のアプローチでは、ハイブリダイゼーションの前に、検出可能な標識を試験核酸または参照核酸のうちの１つに結合してよく、ハイブリダイゼーションの後に、標識を試験核酸または参照核酸のうちのもう一方に結合してよい。検出可能な標識は、リガンドと受容体の相互作用または相補的なヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションによるなどして、共有結合または非共有結合し得る。いくつかの実施形態では、比較ハイブリダイゼーションは、「付加的な」アプローチと称し得る別のアプローチによって、同一の検出可能な標識を用いて行うことができる。このアプローチによれば、試験試料核酸は、第１のタグを含み、参照試料核酸は、第２のタグを含む。ハイブリダイゼーション後、その表面と、検出可能な標識及び第１の実体を含む第１の複合体を接触させて、第１の複合体が第１のタグと選択的に結合するようにする。次のステップは、アレイ表面に結合した検出可能な標識の位置及び量を求めること（すなわち、アレイを「読み取る」こと）を含む。アレイを読み取って、第１のタグを含む核酸と関連する検出可能な標識の量を求めたら、第１の複合体に存在する標識と同一の検出可能な標識を含むとともに、第２の実体を含む第２の複合体と、その表面を接触させて、第２の複合体が、第２のタグと選択的に結合するようにする。続いて、アレイの２回目の読み取りを行って、表面にハイブリダイズした両方の核酸を表すすべての検出可能な標識の位置及び量を求める。最後のステップは、その２つのリードの結果を用いて、ハイブリダイズした核酸であって、第２のタグと関連付けられた核酸の量を求めることを含む。好ましいアプローチでは、第１のリードを第２のリードから除去して、第２のタグに連結している核酸を表すシグナルを得る。このようにして求めた、２つの試料からのシグナルを用いて、試験試料ゲノム核酸と参照試料ゲノム核酸との差を特定して、試験試料核酸と関連するいずれかの染色体異常または遺伝子異常を検出するようにできる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズした核酸であって、第２のタグと関連付けられた核酸の量は、ハイブリダイズしたアレイの複製であるが、第１の複合体と接触させなかった複製を用いて求めることができる。すなわち、その複製アレイは、第２の複合体とは接触させ、第１の複合体とは接触させない。この第２のアレイからのシグナルは直接、ハイブリダイズした核酸であって、第２のタグを有する核酸の量を表すとともに（その量は、第１の複合体のみと接触させた第１のアレイからのシグナルの量と比較できる）、ハイブリダイズした核酸であって、第１のタグと関連付けられた核酸の量を表す。これらの２つの解析は、互いから独立しているので、各アレイは、いずれかの順序で、または同時に処理し得る。いくつかの実施形態では、最初に、アレイと、試験核酸及び参照核酸をハイブリダイズし得る（その試験核酸及び参照核酸のうちの１つは、（例えばランダムプライミングによって）すでに標識されている）。続いて、ハイブリダイゼーション後に、そのアレイを読み取って、特定の標識化核酸試料と対応するシグナルを求める。そして、そのアレイと、検出可能な標識及び実体を含む複合体を接触させる（その複合体は、試験核酸または参照核酸のうちのもう一方に結合したタグを介して、試験核酸または参照核酸のうちの前記もう一方と選択的に反応する）。そのアッセイを再度読み取って、ハイブリダイズした両方の核酸の全シグナルを測定する。次のステップは、それらの２つのリードの結果を用いて、ハイブリダイズした核酸であって、そのタグと関連付けられた核酸の量を求めることを含む。好ましいアプローチでは、第１のリードを第２のリードから除去して、タグに連結された核酸を表すシグナルを得る。このようにして求めた、２つの試料からのシグナルを用いて、試験試料ゲノム核酸と参照試料ゲノム核酸との差を特定して、試験試料核酸と関連するいずれかの染色体異常または遺伝子異常を検出するようにできる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズした核酸であって、第２のタグと関連付けられている核酸は、ハイブリダイズしたアレイの複製（ただし、その複製は、検出可能な標識を含まない試験核酸及び参照核酸にハイブリダイズさせることによって調製する）を用いて、求めることができる。このケースでは、その複製アレイと、検出可能な標識及び実体を含む複合体を接触させる（その複合体は、試験核酸または参照核酸のうちのもう一方に結合したタグを介して、試験核酸または参照核酸のうちの前記もう一方と選択的に反応する）。この第２のアレイからのシグナルは直接、ハイブリダイズした核酸であって、第２のタグを有する核酸の量を表すとともに（その量は、第１の複合体のみと接触させた第１のアレイからのシグナルの量と比較できる）、ハイブリダイズした核酸であって、第１のタグと関連付けられた核酸の量を表す。これらの２つの解析は、互いから独立しているので、各アレイは、いずれかの順序で、または同時に処理し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料における遺伝子の発現と、参照試料における発現を比較する方法を含むことができる。その方法の第１のステップは、表面上の別個の位置にそれぞれ固定化された複数の核酸セグメントを含む表面に、ハイブリダイゼーション条件で、試験試料のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡ、及び参照試料のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを接触させることを含む。このケースでは、ハイブリダイゼーション前または後に、試験試料のｃＤＮＡに第１の結合を介して連結されるとともに、参照試料のｃＤＮＡに第２の結合を介して連結される同一の検出可能な標識で、試験試料のｃＤＮＡ及び参照試料のｃＤＮＡを標識する。第１の結合または第２の結合のいずれかに対して、選択的除去を行い、表面にハイブリダイズした核酸に連結された検出可能な標識を求める。支持体の表面にハイブリダイズした核酸に連結された検出可能な標識の位置及び量を求める。続いて、ハイブリダイズした試験試料ｃＤＮＡまたはハイブリダイズした参照試料ｃＤＮＡのいずれかから、その標識を選択的に除去する。そして、支持体上に残った検出可能な標識の位置及び量を求め、その位置及び量が、試料のうちの一方を表す。除去後に残った位置及び量と、除去前の位置及び量の差が、試料のもう一方を表す。アレイにハイブリダイズした各試料核酸の相対量には、試験試料における遺伝子の発現を参照試料と比べたものが反映される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，８７１，６８７号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ポリヌクレオチド内の連続した塩基の配列を求めるための方法であって、標識化ジデオキシヌクレオチドターミネーターを用いた一塩基プライマー伸長に依存する方法を含むことができる。そのプライマーは、固体支持体（例えば、ミクロスフェアまたは二次元アレイ）に固定化されており、各プライマーに導入された標識化ターミネーターの特定が可能になる。導入されたターミネーターに関するデータを用いて、標的核酸におけるヌクレオチドの連続配列の塩基の特定を行う。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸の少なくとも４つの塩基を含む連続配列を求めるための方法であって、（ａ）標的核酸、及び標的核酸の一部と相補的な４つ以上のプライマー（プライマーはそれぞれ、求める配列の各ヌクレオチド位置の５’側に配置される３’末端を有するようになっている）を含む１つまたは複数の反応混合物を調製すること（各反応は、前記プライマーのうちの１つ～全部をいずれかの組み合わせで含むとともに、プライマーが標的核酸にアニールする条件下である）、（ｂ）ステップ（ａ）の１つまたは複数のプライマーをポリメラーゼによって、１つまたは複数の標識化ジデオキシヌクレオチドの存在下で伸長させること、（ｃ）前記プライマーを固体支持体に固定化すること、及び（ｄ）各プライマーに導入されたジデオキシヌクレオチドの標識を検出し、この情報を用いて、標的核酸の少なくとも４つの塩基の前記連続配列を求めることを含む方法を含むことができる。そのプライマーは、固体支持体に固定化する前に伸長してよく、すなわち、ステップ（ｂ）をステップ（ｃ）の前に行い、あるいは、プライマーは、固体支持体に固定化した後に伸長してよく、すなわち、ステップ（ｃ）をステップ（ａ）の前に行う。一実施形態では、異なる標識で標識した少なくとも２つのジデオキシヌクレオチドを同一の反応混合物に供給する。別の実施形態では、異なる標識で標識した４つのジデオキシヌクレオチドを同一の反応混合物に供給する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、シングルプレックス一塩基プライマー伸長反応またはマルチプレックス一塩基プライマー伸長反応を行うことによって、標的核酸の４つ以上の塩基の連続配列を求めるための方法を含むことができる。一実施形態では、シークエンシングする標的核酸の全体部分に対応する４つ以上のプライマーを単一の反応混合物で組み合わせる。別の実施形態では、２つ以上のプライマーを１つの反応混合物で組み合わせ、２つ以上のプライマーを追加の反応混合物または混合物で組み合わせる。あるいは、その４つ以上のプライマーはそれぞれ、別々の反応混合物に加える。一実施形態では、プライマーは、タグ配列を含み、固体支持体にコンジュゲートされた相補的な捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを介して、その固体支持体に固定化する。別の実施形態では、プライマーは、共有結合を介して固体支持体に固定化する。一実施形態では、固体支持体は、標識化ミクロスフェアである。例えば、ミクロスフェアは、ポリスチレンで作られていてよい。一実施形態では、各ミクロスフェアの標識は、少なくとも２つの色素の変動する濃度に基づき、光検出する。ある特定の実施形態では、標識化ミクロスフェア及び標識化ジデオキシヌクレオチドは、フローサイトメトリーによって検出する。別の実施形態では、固体支持体は、二次元アレイであり、固定化されたプライマーは、アレイ上で、位置に基づき定められる。そのプライマーは、共有結合またはリンカー配列を介して、アレイに固定化し得る。ある特定の実施形態では、標識化ジデオキシヌクレオチドを有する伸長されたプライマーは、アレイを走査することによって検出する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，４９２，０８９号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸アレイにハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の量を比較することによって比較ハイブリダイゼーションを行う方法を含むことができ、その量は、ハイブリダイズした核酸であって、同一の検出可能な標識で標識されている核酸からのシグナルを検出することによって求める。この方法は、広くは、比較ハイブリダイゼーション法に、特には、ＣＧＨに適用可能である。したがって、試験核酸及び参照核酸がゲノム核酸であるＣＧＨに言及している場合には、試験核酸及び参照核酸がゲノム核酸以外である方法が含まれると理解すべきである。好ましい実施形態では、ＣＧＨは、ゲノム核酸を含む試験試料、及び既知の染色体異常または遺伝子異常がないゲノム核酸を含む参照試料または対照試料という２つのゲノム核酸試料を用いて行う。その試験試料及び参照試料は、表面（スライドガラスなど）の上に別個の位置でスポットされた複数の核酸または核酸セグメントを含む核酸アレイに共ハイブリダーゼーションさせる。そのアレイは、特定の既知の遺伝子変異または病態に対する標的核酸マーカーを含んでも、または核型分析と同様の遺伝子プロファイルを得るために、（全体で）染色体全体または全染色体組を表してもよい。これらのアプローチでは、検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの前またはハイブリダイゼーションの後に、試験核酸及び参照核酸に結合してよい。別のアプローチでは、ハイブリダイゼーションの前に、検出可能な標識を試験核酸または参照核酸のうちの１つに結合してよく、ハイブリダイゼーションの後に、標識を試験核酸または参照核酸のうちのもう一方に結合してよい。検出可能な標識は、リガンドと受容体の相互作用または相補的なヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションによるなどして、共有結合または非共有結合し得る。いくつかの実施形態では、試験試料及び参照試料は、検出可能な標識で標識し、好ましくは、試験試料及び参照試料は、同一の検出可能な標識で標識し、好ましくは、その検出可能な標識は、蛍光色素であり、好ましくは、その検出可能な標識は、ｄＣＴＰ－Ｃｙ３である。ある特定の態様では、単一の標識を用いて、アレイにハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の相対量を求めることを可能にする方法を提供する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料及び参照試料における核酸間の差を求める方法であって、試験試料の核酸に由来する核酸配列を増幅すること、及び参照試料の核酸に由来する核酸配列を増幅すること（その増幅反応のうちの一方は、ｄＴＴＰではなくｄＵＴＰを用いて行い、もう一方は、ｄＵＴＰではなくｄＴＴＰを用いて行う）、増幅した試験試料及び増幅した参照試料を含む溶液を核酸アレイにハイブリダイズさせること、ならびにハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸であって、アレイに結合した試験核酸及び参照核酸の相対量を求めることを伴う方法を含むことができる。ある特定の実施形態では、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の相対量を求めることは、ａ）アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルであって、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の総数を表すシグナルを求めること、ｂ）ウラシル残基を有するＤＮＡを選択的に分解する酵素で、ハイブリダイズした核酸を処理すること、ならびにｃ）ステップｂ）の後に、アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルを求めること（そのシグナルは、ハイブリダイズした試験核酸または参照核酸のうちの１つを表す）を含む。特に好ましい実施形態では、ウラシル残基を有するＤＮＡを選択的に分解する酵素は、ウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料及び参照試料における核酸間の差を求める方法であって、（ａ）その表面上の別個の位置にそれぞれ固定化された複数の核酸セグメントを含む表面に、ハイブリダイゼーション条件で、核酸を含む試験試料及び核酸を含む参照試料を接触させること（その試験試料及び参照試料は、ハイブリダイゼーションの前または後に、同一の検出可能な標識で標識する）、（ｂ）その表面にハイブリダイズした核酸に連結された検出可能な標識の位置及び量を求めること、（ｃ）ハイブリダイズした試験試料核酸またはハイブリダイズした参照試料核酸のいずれかを選択的に除去すること、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、その表面にハイブリダイズした核酸に連結された検出可能な標識の位置及び量を求めること、ならびに（ｅ）ステップ（ｂ）の結果と、ステップ（ｄ）の結果を比較して、試験試料及び参照試料の核酸の差を検出することを伴う方法を含むことができる。いくつかの好ましい実施形態では、ハイブリダイズした試験核酸または参照核酸を選択的に除去するステップは、特定の特性を有するＤＮＡを選択的に分解する酵素、好ましくは、ウラシル残基を有するＤＮＡを分解する酵素で、その核酸を処理することによって行い、より好ましくは、ウラシル残基を有するＤＮＡを選択的に分解する酵素は、ウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）である。いくつかの実施形態では、ウラシル残基を有するＤＮＡを選択的に分解する酵素で、核酸を処理することによって、ハイブリダイズした試験核酸または参照核酸を選択的に除去するステップは、（１）試験試料に由来する配列を増幅し、参照試料核酸に由来する配列を増幅すること（増幅反応のうちの一方は、ｄＴＴＰではなく、ｄＵＴＰを用いて行い、もう一方は、ｄＵＴＰではなく、ｄＴＴＰを用いて行う）、（２）増幅した核酸をハイブリダイズさせること、ならびに（３）ウラシル残基を有するＤＮＡを選択的に分解する酵素で、ハイブリダイズした核酸を処理することによって行う。いくつかの実施形態では、その方法を用いて、特定の配列を有する核酸の量の差、または核酸配列の相違を含め、試験試料及び参照試料における核酸間のいずれかの相違を検出し得る。特に好ましい実施形態では、その方法を用いて、試験試料における遺伝子異常を検出する。その方法は、染色体スプレッドを用いるＣＧＨまたはアレイベースのＣＧＨに適用し得る。いくつかの好ましい実施形態では、提供するその方法を用いて、試験試料における遺伝子の発現と、参照試料における発現を比較し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、比較ハイブリダイゼーションを行う方法を含むことができる。その方法は、核酸アレイにハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の量を比較することを含み、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の量は、ハイブリダイズした核酸であって、同一の検出可能な標識で標識されている核酸からのシグナルを検出することによって求める。一実施形態では、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の量は、ａ）アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルであって、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の総量を表すシグナルを求めること、ｂ）ハイブリダイズした核酸を処理して、試験核酸または参照核酸のうちの１つを選択的に除去すること、ｃ）ステップｂ）の後に、アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルであって、ハイブリダイズした試験核酸または参照核酸のうちの１つを表すシグナルを求めること、ならびにｄ）ｃ）及びｂ）から得られたシグナルを用いることによって、ハイブリダイズした試験核酸または参照核酸のうちのもう一方のシグナルを求めることによって求める。特定の好ましい実施形態では、試験試料に由来する配列を増幅し、参照試料に由来する配列を増幅するステップは、試料中のゲノムＤＮＡを増幅することを伴い、その増幅は、当該技術分野において周知であるようなランダムプライミングを用いて行う。あるいは、試験試料に由来する配列を増幅し、参照試料に由来する配列を増幅するステップは、ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを作製し、ランダムプライミングを用いてそのｃＤＮＡを増幅し、及びまたは特定のプライマーを用いて、特異的配列を増幅することを伴ってよい。特定の好ましい実施形態では、その増幅反応は、増幅した核酸を検出可能な標識で標識する手段として、１つまたは複数の標識化ヌクレオチドを用いて行ってよく、好ましくは、試験試料及び参照試料核酸の両方を同一の標識化ヌクレオチドを用いて増幅し、好ましくは、その標識化ヌクレオチドは、ｄＣＴＰ－Ｃｙ３である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料における遺伝子の発現を参照試料における発現と比較する方法を含むことができる。その方法は、試験試料のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡ、及び参照試料のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡであって、核酸アレイにハイブリダイズしたｃＤＮＡの量を比較することを含み、ハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ及び参照ｃＤＮＡの量は、ハイブリダイズしたｃＤＮＡであって、同一の検出可能な標識で標識されているｃＤＮＡからのシグナルを検出することによって求める。その方法は、試験試料のＲＮＡから調製したｃＤＮＡに由来する核酸配列を増幅すること、参照試料のＲＮＡから調製したｃＤＮＡに由来する核酸配列を増幅すること（その増幅反応のうちの１つは、ｄＴＴＰではなく、ｄＵＴＰを用いて行い、もう一方は、ｄＵＴＰではなく、ｄＴＴＰを用いて行う）、増幅した試験試料及び増幅した参照試料を含む溶液を核酸アレイにハイブリダイズさせること、ならびにハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸であって、アレイに結合した試験核酸及び参照核酸の相対量を求めることを伴う。ある特定の実施形態では、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の相対量を求めることは、ａ）アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルであって、ハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の総量を表すシグナルを求めること、ｂ）ウラシル残基を有するＤＮＡを選択的に分解する酵素で、ハイブリダイズした核酸を処理すること、ならびにｃ）ステップｂ）の後に、アレイにハイブリダイズした検出可能な標識のシグナルを求めること（そのシグナルは、ハイブリダイズした試験核酸または参照核酸のうちの１つを表す）を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，０９３，０６３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、増幅せず、かつインタクト細胞または核の必要なく、試験試料において、対象とするゲノム核酸を検出するための方法を含むことができる。概して、ゲノム核酸は、標識化プローブにハイブリダイズさせ、核酸ハイブリダイゼーション以外の手段を通じて、固体支持体に固定する。そのゲノム核酸は、固体支持体上のハイブリダイズした複合体中の標識を検出することによって検出する。その方法を用いて、遺伝子異常、例えば、点変異、遺伝子重複または欠失、及び染色体転座を検出し得る。その方法は、疾患の診断または予後にも使用し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ａ．標的配列を含むゲノム核酸試料と、標的配列に対して特異的なプローブを接触させ、固体支持体上に、そのゲノム核酸、及び標的配列にハイブリダイズしたプローブからなる複合体を形成すること（そのプローブは、検出可能な標識を含み、そのゲノム核酸は、核酸ハイブリダイゼーション以外の手段を通じて、固体支持体に固定されており、そのゲノム核酸の標的配列は、増幅されていない）、ならびにｂ．その標識と固体支持体の結合を検出することによって、そのゲノム核酸における標的配列の存在を検出することによって、そのゲノム核酸において標的配列を検出するための方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ａ．ゲノム核酸の試料と、遺伝子異常に対して特異的なプローブを接触させ、遺伝子異常がそのゲノム核酸に存在する場合に、固体支持体上に、そのゲノム核酸及びそのプローブからなる複合体を形成すること（そのゲノム核酸は、核酸ハイブリダイゼーション以外の手段を通じて、固体支持体に固定されており、そのゲノム核酸の標的配列は、増幅されていない）、ｂ．標識と固体支持体の結合を検出することによって、遺伝子異常の存在を検出することによって、そのゲノム核酸における遺伝子異常の有無を検出するための方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ａ．遺伝子異常を含むゲノム核酸の試料と、その遺伝子異常に対して特異的な第１のプローブを接触させ、固体支持体上に、そのゲノム核酸及び第１のプローブからなる第１の複合体を形成すること（そのプローブは、検出可能な標識を含み、そのゲノム核酸は、核酸ハイブリダイゼーション以外の手段を通じて、固体支持体に固定されており、そのゲノム核酸の標的配列は増幅されていない）、ｂ．ゲノム核酸の試料と、参照核酸に対して特異的な第２のプローブを接触させ、固体支持体上に、その参照核酸及び第２のプローブからなる第２の複合体を形成すること（その第２のプローブは、検出可能な標識を含む）、ｃ．第１の複合体と関連する第１のプローブの検出可能な標識を検出することによって、形成された第１の複合体の量を測定し、第２の複合体と関連する第２のプローブの検出可能な標識を検出することによって、形成された第２の複合体の量を測定すること、ならびにｄ．第１の複合体の量と、第２の複合体の量を比較すること（その２つの複合体の量の差によって、遺伝子異常が示される）によって、ゲノム核酸において遺伝子異常を検出するための方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのゲノム核酸及び参照核酸は、同一の試料に由来するものである。上記の態様のいずれかの別の実施形態では、そのゲノム核酸及び参照核酸は、異なる試料に由来し、それらの試料は、同一の個体に由来しても、異なる個体に由来してもよい。別の実施形態では、第１の複合体及び第２の複合体の量は、同一の固体支持体を用いて求め、第１のプローブ及び第２のプローブの検出可能な標識は、異なっている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ａ．遺伝子異常を含むゲノム核酸の試料と、その遺伝子異常に対して特異的な第１のプローブを接触させ、固体支持体上に、ゲノム核酸及び第１のプローブからなる第１の複合体を形成すること（そのプローブは、検出可能な標識を含み、そのゲノム核酸は、核酸ハイブリダイゼーション以外の手段を通じて、固体支持体に固定されており、そのゲノム核酸の標的配列は、増幅されていない）、ｂ．ゲノム核酸の試料と、参照核酸に対して特異的な第２のプローブを接触させ、固体支持体上に、その参照核酸及び第２のプローブからなる第２の複合体を形成すること（その第２のプローブは、検出可能な標識を含む）、ｃ．第１の複合体と関連する第１のプローブの検出可能な標識を検出することによって、形成された第１の複合体の量を測定し、第２の複合体と関連する第２のプローブの検出可能な標識を検出することによって、形成された第２の複合体の量を測定すること、ｄ．第１の複合体の量と第２の複合体の量の比率を求めること、ｅ．求めた比率と、参照試料に由来するゲノム核酸を用いて、上記と同様にして求めた比率を比較すること（その比率の差によって、遺伝子異常が示される）によって、ゲノム核酸における遺伝子異常を検出するための方法を含むことができる。好ましい実施形態では、そのゲノム核酸及び参照核酸は、ビオチンとアビジンの相互作用を通じて、固体支持体に固定されている。別の好ましい実施形態では、固体支持体は、ビーズである。別の好ましい実施形態では、第１及び第２の複合体は、フローサイトメトリーによって検出する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ａ．個体に由来するゲノム核酸の試料と、疾患に特異的な核酸配列と相補的なプローブを接触させ、そのゲノム核酸が、その疾患に特異的な核酸配列を含む場合に、固体支持体上に、そのゲノム核酸及びそのプローブからなる複合体を形成すること（そのプローブは、検出可能な標識を含み、そのゲノム核酸は、核酸ハイブリダイゼーション以外の手段を通じて、固体支持体に固定されており、そのゲノム核酸の標的配列は、増幅されていない）、ｂ．固体支持体と関連する検出可能な標識の量を検出することによって、固体支持体上に形成された複合体の量を測定すること、ｃ．形成された複合体の量と、参照試料に由来するゲノム核酸を用いて形成された複合体であって、上記と同様の条件でアッセイした複合体の量を比較すること（上記の個体から形成された複合体の量と参照試料での量の差は、上記の疾患の診断指標となる）によって、個体において診断を行うための方法を含むことができる。一実施形態では、その参照試料は、その疾患に罹患していないと推定される個体から採取し得る。別の実施形態では、その参照試料は、その疾患に罹患していることが分かっている個体から採取し得る。別の実施形態では、その参照試料は、第１の試料を採取した後に、同一の個体から採取する。一実施形態では、その方法は、がんの疑いのある個体の腫瘍量の測定に使用し得る。別の実施形態では、その方法は、疾患の予後に使用し得る。そのゲノム核酸は、固体支持体に共有結合または非共有結合し得る。いくつかの実施形態では、そのゲノム核酸は、「結合対」（特異的相互作用を通じて、複合体を形成する２つの分子を指す）を介して、固体支持体に非共有結合し得る。したがって、そのゲノム核酸は、結合対のメンバーのうち、そのゲノム核酸に連結された一方のメンバーと、結合対のメンバーのうち、固体支持体に結合されたもう一方のメンバーとの相互作用を通じて、固体支持体上に捕捉できる。好ましい実施形態では、その結合対は、ビオチン、ならびにアビジンまたはアビジンの類似物、例えばストレプトアビジン及びＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）である。他の実施形態では、その結合対は、リガンドと受容体、ホルモンと受容体、抗原と抗体であってよい。いくつかの実施形態では、そのゲノム核酸は、共有結合を通じて、固体支持体に固定し得る。一実施形態では、そのゲノム核酸の固体支持体への共有結合は、光活性基、例えば、アジド、アジドフェナシル、４－ニトロフェニル３－ジアゾピルベート、ソラレン、ソラレン誘導体を介して行われる。別の実施形態では、そのゲノム核酸は、ＵＶ架橋によって、様々な固体表面に架橋できる。別の実施形態では、そのゲノム核酸は、化学リンカーを用いた化学カップリングを通じて、固体支持体に固定し得る。別の好ましい実施形態では、そのゲノム核酸は、ゲノムＤＮＡである。別の実施形態では、その参照核酸は、ハウスキーピング遺伝子または染色体におけるシングルコピー配列である。いくつかの実施形態では、ゲノム核酸を含む試験試料または参照核酸を含む参照試料は、細胞、組織、体液、血漿、血清、尿、中枢神経系の流体、便、胆管、パラフィン包埋組織、細胞溶解液、組織溶解液などから採取することも、これらの中で入手することもできる。試験核酸及び参照核酸は、いずれかの数の供給源から、いずれかの方法によって採取してよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，０７６，０７４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、均衡転座を含む染色体異常を検出するための方法であって、その転座を検出するためのプローブと併せて、アレイベースのＣＧＨを行うことを伴う方法を含むことができる。一態様では、その方法は、ゲノム核酸アレイに、ゲノム核酸の試験試料、核酸の参照試料、及び均衡転座を検出するための少なくとも１つのプローブをハイブリダイズさせること、そのアレイにハイブリダイズした試験核酸及び参照核酸の相対量を求めること、ならびにその転座を検出するための１つのプローブまたは複数のプローブのアレイへのハイブリダイゼーションを判断することを伴う。好ましい実施形態では、その方法は、ゲノム核酸を含む試験試料、及びゲノム核酸を含む参照試料または対照試料という２つのゲノム核酸試料を用いて行い、後者の試料は、既知の染色体異常または遺伝子異常を有さない。その試験試料及び参照試料は、表面（スライドガラスなど）の上に別個の位置でスポットされた複数の核酸または核酸セグメントを含む核酸アレイに共ハイブリダーゼーションさせる。そのアレイは、特定の既知の遺伝子変異または病態に対する標的核酸マーカーを含んでも、または遺伝子プロファイルを得るために、（全体で）染色体全体もしくは全染色体組を表してもよい。これらのアプローチでは、ハイブリダイゼーションの前またはハイブリダイゼーションの後に、いずれかの順序で、検出可能な標識を試験核酸及び参照核酸に結合してよい。その検出可能な標識は、リガンドと受容体の相互作用または相補的なヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションによるなどして、共有結合または非共有結合し得る。加えて、転座を検出するためのプローブをゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせる。ある１つのアプローチでは、そのプローブは、転座するゲノムの移動セグメントと相補的である。その移動セグメントは、転座切断点の上流もしくは５’であっても、または転座切断点の下流もしくは３’であってもよい。試験試料が均衡転座を含まない場合には、そのプローブは、移動セグメントが野生型の位置にあるアレイにハイブリダイズすることになる。試験試料が均衡転座を含む場合には、そのプローブは、移動セグメントが野生型の位置にあるアレイと、移動セグメントを含む核酸を含むアレイ区域にハイブリダイズすることになる。加えて、いずれも、転座する移動セグメントと相補的である複数のプローブを１回のハイブリダイゼーションで使用できる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第８，０２１，８８８号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、迅速なハイブリダイゼーションアッセイを行うための方法を含むことができる。その方法を用いて、溶液中の核酸と、固体支持体に固定化した核酸の間の核酸ハイブリダイゼーションを完了させる時間を短縮できる。その方法では、非特異的核酸へのプレハイブリダイゼーションのいずれか、標的核酸へのハイブリダイゼーション、またはハイブリダイゼーション後のいずれかの洗浄ステップの最中に、弾性表面波を適用する。ある１つのアプローチでは、固定化された核酸への核酸ハイブリダイゼーションは、ａ）ハイブリダイゼーション条件で、１つまたは複数の固定化された核酸プローブ分子を含む固体支持体と、非特異的なブロッキング核酸を接触させるステップ（その１つまたは複数の固定化された核酸プローブ分子は、その分子と相補的な配列とハイブリダイズできる）、ｂ）ハイブリダイゼーション条件で、その固体支持体と、核酸標的分子を含む試験試料を接触させるステップ、ｃ）ステップａ）もしくはステップｂ）、または両方のハイブリダイゼーションに弾性表面波を適用するステップ、ならびにｄ）その固体支持体の１つまたは複数の核酸プローブが、試験試料核酸標的分子にハイブリダイズしたか判断するステップを含む。別のアプローチでは、固定化された核酸への核酸ハイブリダイゼーションは、ａ）ハイブリダイゼーション条件で、１つまたは複数の固定化された核酸プローブ分子を含む固体支持体と、１つまたは複数の核酸標的分子を含む核酸試験試料を接触させるステップ（その１つまたは複数の固定化された核酸プローブ分子は、その分子と相補的な配列とハイブリダイズできる）、ｂ）ステップａ）のハイブリダイゼーションに弾性表面波を適用するステップ、及びｃ）その固体支持体の１つまたは複数の核酸プローブが、試験試料核酸標的分子にハイブリダイズしたか判断するステップを含む。この方法は、上記の方法に関して記載したように、非特異的核酸とのプレハイブリダイゼーションステップも含み得る。１つまたは複数の洗浄ステップは、プレハイブリダイゼーションステップまたはハイブリダイゼーションステップの後に適用し得る。１つまたは複数の洗浄ステップは、弾性表面波の適用を含み得る。弾性波の適用によって、プレハイブリダイゼーションステップは、約７時間未満、より好ましくは、約５時間未満、さらに好ましくは、約３時間未満に収め得る。標的核酸へのハイブリダイゼーションステップは、約３時間未満、より好ましくは、約２時間未満、さらに好ましくは、約１時間未満であり得る。洗浄ステップは、約１時間未満、より好ましくは、約３０分未満で行う。好ましい実施形態では、その方法は、約９時間未満、より好ましくは、約７時間未満、さらに好ましくは、約５時間未満で行う。試験核酸標的分子へのハイブリダイゼーション方法は、１つまたは複数の参照核酸標的分子をさらに含み得る。その試験核酸標的分子及び／または参照核酸標的分子は、検出可能な作用剤で標識し得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、固定化された核酸プローブ分子のアレイを含んでよい。いくつかの実施形態では、固定化された核酸プローブ分子は、細菌人工染色体の配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／０１４２３０４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、乳癌、結腸直腸癌、メラノーマまたは肺癌と診断された対象の、特定の治療レジメンに対する応答性を予測する変異を検出するための方法及び組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法によって、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＦＯＸＬ２、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＲＥＴ、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＭＯ、ＢＲＡＦ、ＦＢＸＷ７、ＧＮＡＱ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＴＫ１１、ＣＴＮＮＢ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＴＰ５３、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ３、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＰＴＣＨ１、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ４、ＩＤＨ１、ＮＯＴＣＨ１及びＰＴＥＮの標的核酸配列における変異を迅速かつ好感度に検出可能になる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象の複数のがん関連遺伝子における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、（ａ）その対象から採取したホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料から、ゲノムＤＮＡを抽出すること、（ｂ）その複数のがん関連遺伝子のそれぞれに対応するアンプリコンを含むライブラリを作製すること（前記複数のがん関連遺伝子は、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＦＯＸＬ２、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＲＥＴ、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＧＮＡ１１、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＭＯ、ＢＲＡＦ、ＦＢＸＷ７、ＧＮＡＱ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＴＫ１１、ＣＴＮＮＢ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＴＰ５３、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ３、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＰＴＣＨ１、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ４、ＩＤＨ１、ＮＯＴＣＨ１及びＰＴＥＮを含み、（ｉ）前記ライブラリの作製は、その複数のアンプリコンの少なくとも１つと相補的である核酸配列を含むベイトセットを使用せずに行い、（ｉｉ）そのホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料から抽出したゲノムＤＮＡの品質は、そのライブラリの作製前に、定量ＰＣＲを用いて評価しない）（ｃ）その複数のアンプリコンの末端に、アダプター配列をライゲーションすること、ならびに（ｄ）高スループットな大規模並行的シークエンシングを用いて、その複数のアンプリコンの少なくとも１つにおける少なくとも１つの変異を検出することを含む方法を含むことができる。その方法のいくつかの実施形態では、検出する少なくとも１つの変異は、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＥＲＢＢ２またはＰＩＫ３ＣＡにおける変異である。一実施形態では、検出する少なくとも１つの変異は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ Ｋ４８３Ｑ、ＢＲＡＦ Ｇ４６６Ｖ、ＢＲＡＦ Ｇ４６４Ｖ、ＢＲＡＦ Ｅ５０１Ｖ、ＢＲＡＦ Ｅ５０１Ｋ、ＥＧＦＲ ΔＥ７４６＿Ａ７５０、ＥＧＦＲ Ｒ６８０Ｑ、ＥＧＦＲ Ｇ５９８Ｅ、ＫＲＡＳ Ａ１４６Ｔ、ＫＲＡＳ Ｒ６８Ｍ、ＫＲＡＳ Ｌ１９Ｆ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｑ２２Ｋ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｃ４２０Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｇ１０６Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｒ３８Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ４５３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４４Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｎ１０４４Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４３Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｍ１０４３Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４２Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｔ１０５３Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｉ１２１Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｌ、ＥＲＢＢ２ Ｌ７５５Ｓ、ＥＲＢＢ２ Ｓ３１０Ｙ、ＥＲＢＢ２ Ｄ７６９Ｙ、ＥＲＢＢ２ Ｓ２５５Ｒ、ＤＤＲ２ Ｈ９２Ｙ、ＤＤＲ２ Ｒ３１Ｌ、ＤＤＲ２ Ｌ３４Ｐ、ＤＤＲ２ Ｐ３８１Ｒ及びＤＤＲ２ Ｋ３９２Ｎからなる群から選択する。その方法のいくつかの実施形態では、その複数のがん関連遺伝子のそれぞれに対応するアンプリコンを含むライブラリは、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料に由来する１０ｎｇ以下の抽出ゲノムＤＮＡを用いて作製する。その方法のいくつかの実施形態では、その複数のがん関連遺伝子のそれぞれに対応するアンプリコンを含むライブラリは、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料に由来する１１～２５ｎｇの抽出ゲノムＤＮＡを用いて作製する。ある特定の実施形態では、高スループットな大規模並行的シークエンシングは、パイロシークエンシング、可逆色素ターミネーターによるシークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ １分子シークエンシング、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシングまたはＳＭＲＴ（商標）シークエンシングを用いて行う。その方法のいくつかの実施形態では、そのアダプター配列は、Ｐ５アダプター、Ｐ７アダプター、Ｐ１アダプター、ＡアダプターまたはＩｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ（商標）バーコードアダプターである。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態では、その複数のアンプリコンは、固有インデックス配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、そのホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料は、不均一な腫瘍である。ある特定の実施形態では、その不均一な腫瘍の細胞の５％は、その複数のアンプリコンの少なくとも１つにおける少なくとも１つの変異を有する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／００５１３２９号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象の１つまたは複数の遺伝子における変異型の存在を判断するための方法であって、（ａ）核酸シークエンサーを用いて、対象に由来する核酸試料で核酸シークエンシング反応を行うことで生成した生のシークエンシングデータを用意すること、（ｂ）クオリティーフィルターにはじかれた低品質リードを生のシークエンシングデータから除去すること、（ｃ）フィルタリングされた生のシークエンシングデータから、アダプター及び／または分子特定（ＭＩＤ）配列をトリミングすること、（ｄ）フィルタリングされた生のシークエンシングデータをゲノム参照配列にマッピングして、マッピング済みのリードを作製すること、（ｅ）マッピング済みのリードをソーティングして、インデックスを付与すること、（ｆ）リード群をデータファイルに加えて、処理済みの配列ファイルを作成すること、（ｇ）再アライナー標的を作成すること、ｈ）処理済みの配列ファイルの局所的再アラインメントを行って、再アラインメント済みの配列ファイルを作成すること、（ｉ）再アラインメント済みの配列ファイルから、重複リードを除去すること、（ｊ）対象とするコード領域を解析すること、ならびに（ｋ）ステップ（ｊ）での解析に基づき、変異型が存在するか特定するレポートを作成すること（ステップ（ｇ）及び（ｊ）は、対象とする１つまたは複数の遺伝子を含む核酸領域に限定した修正済みゲノムアラインメントユーティリティを用いて行う）を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、核酸シークエンサーを用いて、対象に由来する核酸試料で核酸シークエンシング反応を行って、ステップ（ａ）の生のシークエンシングデータを作成することを含む。いくつかの実施形態では、対象とするコード領域の解析は、対象とするその領域のすべての位置で変異型をコールすることを含む。いくつかの実施形態では、対象とするその領域は、追加の１５０塩基によってパディングする。いくつかの実施形態では、変異型コールは、修正済みのＧＡＴＫ変異型コーラーで行う。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列へのリードのマッピングは、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）によって行う。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列へのリードのマッピングは、ソフトクリッピングを含まない。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列は、ヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３７．１である。いくつかの実施形態では、シークエンシング方法は、エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）、ローリングサークル型増幅または固相増幅を含む。いくつかの実施形態では、その固相増幅は、クローンブリッジ増幅である。いくつかの実施形態では、配列解析用の核酸は、対象に由来する生体試料から抽出する。いくつかの実施形態では、その生体試料は、流体または組織試料である。いくつかの実施形態では、その生体試料は、血液試料である。いくつかの実施形態では、その核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、その核酸は、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、その核酸試料は、（ａ）核酸をせん断化する方法、（ｂ）核酸試料を濃縮する方法、（ｃ）せん断化した核酸試料中の核酸分子をサイズ選別する方法、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、その試料中の核酸分子の末端を修復する方法、（ｅ）１つまたは複数のアダプター配列を結合させる方法、（ｆ）核酸を増幅して、アダプター配列が結合されている核酸の割合を上昇させる方法、（ｇ）対象とする１つまたは複数の遺伝子について、核酸試料を濃縮する方法、及び／または（ｈ）シークエンシングの直前に、核酸試料プライマーを定量する方法のうちの１つまたは複数を行うことによって、シークエンシングの前に調製する。いくつかの実施形態では、その１つまたは複数のアダプター配列は、シークエンシング反応及び／または核酸増幅反応をプライミングするための核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、その１つまたは複数のアダプター配列は、分子特定（ＭＩＤ）タグを含む。いくつかの実施形態では、対象とする１つまたは複数の遺伝子について、核酸試料を濃縮することは、１つまたは複数のビオチン化ＲＮＡベイトを用いて、エキソンを捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、配列解析用の核酸は、哺乳動物である対象から採取する。いくつかの実施形態では、その対象は、ヒト患者である。いくつかの実施形態では、その対象は、がんの疑いがあるか、またはがんを発症するリスクのある疑いがあるヒトである。いくつかの実施形態では、提供する方法は、シークエンシングによって、１つまたは複数の変異型の存在を確認することをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）生のシークエンシングデータから、クオリティーフィルターにはじかれた低品質リードを除去し、（ｂ）フィルタリングされた生のシークエンシングデータから、アダプター及び／または分子特定（ＭＩＤ）配列をトリミングし、（ｃ）フィルタリングされた生のシークエンシングデータをゲノム参照配列にマッピングして、マッピング済みのリードを作成し、（ｄ）マッピング済みのリードをソーティングして、インデックスを付与し、（ｅ）リード群をデータファイルに加えて、処理済みの配列ファイルを作成し、（ｆ）再アライナー標的を作成し、（ｇ）処理済みの配列ファイルの局所的再アラインメントを行って、再アラインメント済みの配列ファイルを作成し、（ｈ）再アラインメント済みの配列ファイルから、重複リードを除去し、（ｉ）対象とするコード領域を解析するように構成された１つまたは複数の電子処理装置を含むシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象とするコード領域の解析は、対象とするその領域のすべての位置で変異型をコールすることを含む。いくつかの実施形態では、対象とするその領域は、追加の１５０塩基によってパディングする。いくつかの実施形態では、変異型コールは、修正済みのＧＡＴＫ変異型コーラーで行う。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列へのリードのマッピングは、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）によって行う。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列へのリードのマッピングは、ソフトクリッピングを含まない。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列は、ヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３７．１である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、命令が格納されている非一時的なコンピューター可読媒体を含むことができ、その命令は、（ａ）クオリティーフィルターにはじかれた低品質リードを除去する命令、（ｂ）フィルタリングされた生のシークエンシングデータから、アダプター及びＭＩＤ配列をトリミングする命令、（ｃ）フィルタリングされた生のシークエンシングデータをゲノム参照配列にマッピングして、マッピング済みのリードを作成する命令、（ｄ）マッピング済みのリードをソーティングして、インデックスを付与する命令、（ｅ）リード群をデータファイルに加えて、処理済みの配列ファイルを作成する命令、（ｆ）再アライナー標的を作成する命令、（ｇ）処理済みの配列ファイルの局所的再アラインメントを行って、再アラインメント済みの配列ファイルを作成する命令、（ｈ）再アラインメント済みの配列ファイルから、重複リードを除去する命令、及び（ｉ）対象とするコード領域を解析する命令を含む。いくつかの実施形態では、対象とするコード領域の解析は、対象とするその領域のすべての位置で変異型をコールすることを含む。いくつかの実施形態では、対象とするその領域は、追加の１５０塩基によってパディングする。いくつかの実施形態では、変異型コールは、修正済みのＧＡＴＫ変異型コーラーで行う。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列へのリードのマッピングは、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）によって行う。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列へのリードのマッピングは、ソフトクリッピングを含まない。いくつかの実施形態では、ゲノム参照配列は、ヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３７．１である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１７／０３１６１４９号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、遺伝子変異型を分類するための装置、システム及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、標準化されたルールベースプロセスによって、ＣＬＩＡ認証を得たラボでの臨床グレード情報に基づき、変異型病原性リスクスコアを提供し得る。このような標準化されたシステムは、臨床検査の場で見られるＤＮＡ変異型について、信頼性のある病原性スコアを提供し得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、患者から採取してよく、その患者は、疾患またはその他の病状と診断されていても、または診断されていなくてもよい。その試料から、患者のゲノムを全体または部分的にシークエンシングしてよい。そして、シークエンシングの結果を、例えば１つまたは複数の参照ゲノムと比較して、患者のゲノム内の変異型を特定し得る。その変異型のうちの１つまたは複数を既知の変異型のデータベースと比較し得る。その比較結果は、それまで未知であった１つもしくは複数の変異型、既知であるが、未分類である１つもしくは複数の変異型、またはこれらの両方を特定するものであり得る。いくつかの実施形態では、未分類変異型は、１つまたは複数の客観的基準に照らして評価し得る。例えば、一実施形態では、実施形態は、開始スコアを割り当ててよい。１つまたは複数の客観的基準の適用によって、スコアの加減を行って、変異型の分類に使用し得る最終スコアを導いてよい。いくつかの実施形態では、以前に分類された１つまたは複数の変異型の分類は、以前の評価以降に得られた新たな情報に鑑み、例えば定期的に改訂して、変異型を再評価し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、スコアを遺伝子変異型に割り当てる方法であって、複数のスコアリング基準に基づくとともに、変異型の病原性の推定を反映する方法を含むことができる。その方法は、患者から採取したＤＮＡをシークエンシングしたものにおいて変異型を特定すること、及び開始スコアをその変異型に割り当てることを含み、その開始スコアは、意義が未知の変異型と関連付けられる単一の数値である。いくつかの実施形態では、その方法は、マイナーエビデンス及びスプライシング予測の客観的評価に基づく第１のスコア調整値を算出すること、その変異型が一般集団で見られる頻度の客観的エビデンスに基づく第２のスコア調整値を算出すること、その変異型が、臨床的に特徴付けられた患者で見られる頻度の客観的エビデンスに基づく第３のスコア調整値を算出すること、その変異型が、病原性のあることが知られている１つまたは複数の他の変異型と同時に見られることが観察された頻度の客観的エビデンスに基づく第４のスコア調整値を算出すること、その変異型が、１つまたは複数の家系において分離している程度の客観的エビデンスに基づく第５のスコア調整値を算出すること、１つまたは複数の家系を記述するデータにおける、その変異型と、１つまたは複数の疾患表現型との関連性の客観的エビデンスに基づく第６のスコア調整値を算出すること、及びその変異型が、疾患と関連することが知られている１つまたは複数のタンパク質の機能に影響を及ぼすかに関する客観的エビデンスに基づく第７のスコア調整値を算出することも含む。いくつかの実施形態では、その方法は、開始値、第１のスコア調整値、第２のスコア調整値、第３のスコア調整値、第４のスコア調整値、第５のスコア調整値、第６のスコア調整値及び第７のスコア調整値に基づき、変異型スコアを算出することも含み、その変異型スコアは、単一の数値である。また、その方法は、変異型スコアのみに基づき、割り当てられる分類に、変異型を割り当てることを含み、その割り当てられる分類は、複数の分類からなる群のうちの１つであり、その複数の分類における各分類は、変異型病原性のそれぞれ異なる評価と関連付けられている。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１７／０００９２８７号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、生物のゲノム内の遺伝子部分配列のコピー数の変化を検出する装置、システム及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡを含む遺伝物質の試料は、数人の患者から採取し得る。続いて、例えば、患者ごとに、患者のＤＮＡを精製、濃縮及び断片化することを含むプロセスを通じて、患者のＤＮＡの一部をシークエンシングし得る。各断片には、ＤＮＡの採取元である患者を特定する分子標識を付加してよく、さもなければ、シークエンシングのために調製する際に、（例えば、ろ過、増幅、及びプライマーを断片に結合するなどの改変のうちの１つまたは複数を含み得る１つまたは複数のステップを通じて、）ＤＮＡを改変してよい。数人の患者に由来する断片をプールしてよく、そのプールは、例えば、既知の遺伝物質を含む１つまたは複数の対照を含んでよい。続いて、そのプール中の断片をシークエンシングしてよく、シークエンシングの結果を、例えば１つまたは複数のコンピューターファイルとして保存してよい。そして、その結果を、例えば１つまたは複数のコンピューターシステムによって処理して、試料の採取元である患者における考え得るコピー数変化を特定する。例えば、いくつかの実施形態では、その配列をデマルチプレックスして、ＤＮＡの各配列によって表される各患者を特定し得る。続いて、各患者の試料を参照ゲノムにアラインメントしてよく、その後、患者のゲノム上の、対象とする各領域における各塩基対のカバレッジを求めてよい。続いて、その塩基対カバレッジから、患者のゲノムの１つまたは複数のサブユニットのカバレッジを求めてよい。例えば、いくつかの実施形態では、複数のエキソンのカバレッジを求めてよい。いくつかの実施形態では、その後、カバレッジの測定値に対して、１つまたは複数の正規化ステップを行ってよい。例えば、常染色体上にあることが知られている１つまたは複数のアンプリコンの平均カバレッジと、Ｘ染色体上にあることが知られている１つまたは複数のアンプリコンの平均カバレッジを比較して、患者の核型におけるＸ染色体の数（すなわち、１つまたは２つ）を大まかに推定してよい。患者が、Ｘ染色体を１つのみ有すると判断した場合には、正規化は、Ｘ染色体に由来することが知られているすべてのアンプリコンのカバレッジを２倍することを含んでよい。正規化後、アンプリコンごとに、参照値を算出してよく、各患者のアンプリコンの実際のカバレッジ値と、算出した参照値を比較することによって、ＣＮＶを検出してよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の患者のＤＮＡのコピー数変化（ＣＮＶ）を検出する方法を含むことができる。その方法は、複数の試料を受け取ること（各試料は、１人の患者に由来するＤＮＡを含む）、及び各試料から、ＤＮＡの複数の断片を作製することを含む。その方法は、ＤＮＡの採取元であるそれぞれの患者を一意に特定する識別子を用いて、その断片のそれぞれにバーコードを付加すること、その複数の試料をプールして、ＤＮＡライブラリにすること、及びそのＤＮＡライブラリに対して、１つまたは複数のフィルタリング段階を行って、対象とする複数の所定の領域内の断片の相対濃度を上昇させることも含む。いくつかの実施形態では、その方法は、そのフィルタリングされたＤＮＡライブラリをシークエンシングすることによって、複数の患者のシークエンシングデータを作成すること、そのシークエンシングデータをデマルチプレックスすること、対象とする領域ごとに、そのシークエンシングデータにおいて、対象とする各領域のカバレッジを特定することによって、患者ごとに、カバレッジデータを作成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その方法は、そのカバレッジデータから、正規化カバレッジデータを作成すること、及び対象とする領域ごとに、全試料に共通する参照カバレッジを生成すること（その参照カバレッジの生成は、正規化カバレッジデータに基づく）を含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その参照カバレッジと正規化カバレッジデータの比較に基づき、患者の少なくとも１人の、対象とする領域のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの部分配列のＣＮＶを自動的に検出すること、ならびにその患者、部分配列及びＣＮＶを特定する出力を供給することも含む。いくつかの実施形態では、そのカバレッジデータから正規化カバレッジデータを作成することは、患者ごとに、少なくとも、カバレッジデータに基づき、患者のＸ染色体の数の推定を行うことによって、生のカバレッジデータを作成すること、及びＸ染色体に連鎖することが知られている少なくとも１つの対象とする領域の患者のカバレッジをスケーリングすることを含み、生のカバレッジデータから、正規化カバレッジデータを作成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、各患者のＸ染色体の数の推定を行うことは、各患者に関するいずれの人口学的情報も参照しないとともに、各患者の表現型に関するいずれの情報も参照せずに行う。あるいは、いくつかの実施形態では、その方法は、患者ごとに、正規化カバレッジデータに基づき、患者のＸ染色体の数の２回目の推定を行うことを含み、２回目の推定に基づき、正規化カバレッジデータを改訂することも含む。いくつかの実施形態では、各患者のＸ染色体の数の２回目の推定は、各患者に関するいずれの人口学的情報も参照しないとともに、各患者の表現型に関するいずれの情報も参照せずに行う。いくつかの実施形態では、そのカバレッジデータは、シークエンシングデータにおける対象とする領域ごとの１塩基当たりのカバレッジを含み、生のカバレッジデータの作成は、Ｘ染色体に連鎖することが知られている少なくとも１つの対象とする領域の、患者の１塩基当たりのカバレッジをスケーリングすることを含み、正規化カバレッジデータは、１塩基当たりのカバレッジを含み、参照カバレッジは、対象とする各領域内の位置ごとの１塩基当たりのカバレッジを含み、ＣＮＶを自動的に検出することは、１塩基当たりの参照カバレッジ及び正規化カバレッジデータに基づく。いくつかの実施形態では、対象とする各領域はそれぞれ、きっかり１つのエキソンに対応し、そのエキソンを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、患者の遺伝子内の複数の隣接するエキソンのＣＮＶを自動的に検出すること（その隣接する各エキソンは、同一のＣＮＶを有する）、及び隣接するエキソンのＣＮＶを自動的にロールアップすることを含む。さらに、一実施形態では、その方法は、患者の遺伝子内のすべてのエキソンのＣＮＶを自動的に検出すること（その遺伝子内の各エキソンは、同一のＣＮＶを有する）、及びその遺伝子内のエキソンのＣＮＶを自動的にロールアップして、その遺伝子の単一のＣＮＶとすることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＤＮＡライブラリに対して、１つまたは複数の増幅段階を行って、対象とする各領域がアンプリコンとなるようにすることを含む。いくつかの実施形態では、カバレッジデータは、シークエンシングデータ内の対象とする領域ごとの１塩基当たりのカバレッジを含み、正規化カバレッジデータは、１塩基当たりのカバレッジを含み、参照カバレッジは、対象とする各領域内の位置ごとの１塩基当たりのカバレッジを含み、ＣＮＶを自動的に検出することは、１塩基当たりの参照カバレッジ及び正規化カバレッジデータに基づく。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２００９／００８８３２８号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸アレイの印刷品質を求める方法及び核酸アレイ上の非特異的結合をブロックする手順の効率を求める方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、蛍光の検出を用いて、蛍光化合物または色素を核酸に付加するか、または別段の形で連結させる必要なしに、印刷された核酸アレイの品質を評価することを含むことができる。この解析に適する核酸アレイは、核酸及び１つまたは複数のイオンを含む溶液を印刷することによって、アレイのスポットが形成されるアレイである。したがって、そのアレイは、イオン溶液中の核酸から形成され、印刷品質は、印刷された各スポットと関連付けられた蛍光によって評価する。印刷品質は、印刷された各試料の位置における蛍光の強度を測定することによって、及び／または印刷された試料の「形態」（すなわち形）を測定することによって評価し得る。印刷されたスポットは、スポットされた試料全体の蛍光を二次元で測定することによって、「画像化」できる。印刷されたスポットの、得られた画像は、使用する印刷装置及び固相で期待される参照印刷画像と比較できる。その方法を用いて、アレイ上の特異的スポットの品質を求めることも、アレイの特定の領域の品質を求めることも、またはアレイ全体の品質を求めることもできる。スポット品質及び／またはアレイ品質は、アレイ印刷の直後、またはアレイに対して、ハイブリダイゼーション前の処理ステップを行った後に検出できる。このようなステップは、アレイに、熱処理、湿度処理、ＵＶ照射、ブロッキング手順及び／または洗浄を行うことを含み得る。非特異的結合に対するブロッキングステップの品質を行うケースでは、ブロッキング品質は、ブロッキング手順の前及び後に、各充填試料における蛍光を測定することによって求めることができる。洗浄及び／またはブロッキング手順後の蛍光の減少によって、ブロッキングステップ及び／または洗浄ステップの効率が示される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ハイブリダイゼーションの前に、核酸アレイの印刷品質を求めるための方法であって、（ａ）核酸試料のアレイを固体支持体上に印刷すること（各試料は、イオン溶液中の核酸を含む）、及び（ｂ）印刷された試料の蛍光を検出して、印刷品質を求めることを含む前記方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２００６／０２９２５７６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料において、対象とする染色体異常を検出及び解析する方法を含むことができる。好ましい実施形態では、試験試料に由来する核酸は、対象とする遺伝子の異なるセグメントまたは対象とする染色体断片の異なるセグメントと相補的な２つのプローブにハイブリダイズさせる。一方のプローブは、固体支持体に固定されており、第２のプローブは、検出に使用する検出可能な標識を含む。この方法では、同時に両方のプローブにハイブリダイズする標的核酸の捕捉及び検出を行う。第１及び第２のプローブの両方が同一の標的核酸にハイブリダイズすることによって、その標的核酸における染色体異常の検出が示され、一方のプローブのみが同一の標的核酸にハイブリダイズすることによって、その標的核酸における遺伝子異常の不在が示される。固定されているそのプローブは、支持体に共有結合または非共有結合されてもいてよい。非共有結合を用いる場合、好ましい方法は、「結合対」を介したものであり、その結合対とは、特異的な相互作用を通じて複合体を形成する２つの分子を指す。したがって、核酸プローブは、そのプローブに連結された、結合対の一方のメンバーと、固体支持体に結合された、結合対のもう一方のメンバーとの相互作用を通じて、固体支持体上で捕捉できる。結合対メンバーは、検出可能な標識をもう一方の核酸プローブに連結させるのにも用いることができる。好ましい実施形態では、結合対は、ビオチン、及びアビジンまたはストレプトアビジンである。他の実施形態では、結合対は、リガンドと受容体、ホルモンと受容体、抗原と抗体、またはオリゴヌクレオチドと相補体で構成されている。いくつかの実施形態では、その２つのプローブは、液体中で標的核酸にハイブリダイズしてよく、続いて、その複合体は、固体支持体によって捕捉できる。このアプローチにおける、固定されているプローブは、好ましくは、非共有結合されており、好ましくは、結合対を介して結合されている。別の変形形態では、固体支持体は最初は、固定されているプローブを含んでよく、続いて、ハイブリダイゼーションのために、単独で、または標識化プローブとともに、標的核酸と接触させる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料中の標的核酸における遺伝子異常の有無を検出する方法を含むことができる。その方法は、標的核酸、標的核酸の第１のセグメントにハイブリダイズした第１の核酸プローブ（その第１の核酸プローブは、検出可能な標識で標識されている）、及び標的核酸の第２のセグメントにハイブリダイズした第２の核酸プローブ（その第２の核酸プローブは、固体支持体に固定されている）を含む複合体を固体支持体上に形成することを含む。その複合体は、導入された検出可能な標識を検出することによって検出し、第１及び第２のプローブの両方が同一の標的核酸にハイブリダイズすることによって、標的核酸における遺伝子異常の存在が示され、片方のプローブのみが同一の標的核酸にハイブリダイズすることによって、標的核酸における遺伝子異常の不在が示される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料の核酸における染色体転座を検出する方法を含むことができる。その方法は、２つの核酸プローブ（一方は、ドナー染色体セグメントの配列と相補的であり、もう一方は、挿入されたドナー染色体セグメントに隣接するかまたは近いレシピエント染色体配列と相補的である）のハイブリダイゼーションを含む。一方のプローブは、支持体に固定されており、もう一方のプローブは、検出可能な標識で標識されている。両方のプローブにハイブリダイズするゲノムＤＮＡの試験試料は、支持体上で複合体を形成するか、またはこのような複合体を事前に形成して固体支持体上で捕捉し、検出可能な標識を介して検出する。試験試料に由来するもののうち、捕捉された標識化複合体の量は、試験値を表す。その試験値によって、標識が、捕捉されたハイブリダイゼーション複合体と関連することが示される場合、その試験試料は、染色体転座を含むものと判断する。一実施形態では、試験試料の試験値と、標的遺伝子を含むが、転座を含まない参照試料から得られた試験値を比較できる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、個体の特定の標的染色体領域または遺伝子における重複または欠失を検出する方法を含むことができる。その方法は、試料から得られる特定の染色体領域または遺伝子と関連する核酸、その特定の染色体領域または遺伝子の第１のセグメントにハイブリダイズした標識化核酸プローブ、及びその特定の染色体領域または遺伝子の第２のセグメントにハイブリダイズした第２の核酸プローブ（その第２の核酸プローブは、固体支持体に固定されている）を含む複合体を固体支持体上に形成することを含む。好ましい実施形態では、その標的核酸は、断片化されたゲノムＤＮＡである。試験試料に由来するもののうち、捕捉された標識化複合体の量は、試験値を表す。その試験値は、好ましくは同一の試料の異なる標的遺伝子または染色体領域から得た複合体の量から得ることができる対照値と比較し得る。対照値と比べて、試験値が高いことによって、重複または増幅が示され、対照値と比べて、試験値が低いことによって、染色体または遺伝子の欠失が示される。別のアプローチでは、その試料において、試験試料の試験値の、対照値に対する比率を求め、対象とする染色体領域または遺伝子に欠失、重複または増幅を含まない核酸を含む参照試料の試験値及び対照値を表す同様の比率と比較することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、個体において、診断を行い、治療に対する応答を予測し、疾患の微小残存病変または予後を検出する方法を含むことができる。この方法では、試験試料に由来する標的核酸、検出可能な標識を含むとともに、標的核酸の一セグメントにハイブリダイズするプローブ、及び支持体に固定されているとともに、標的核酸の第２のセグメントにハイブリダイズする第２のプローブの間で、複合体が形成される。第１のプローブの、導入された検出可能な標識の検出を通じて、固体支持体上の複合体の量を測定する。形成された複合体の量は、参照試料から得られた試料から、同様にして形成された複合体の量と比較する。その参照試料は、正常な個体から採取してよく、試験試料及び参照試料の測定値の差は、疾患の診断または予後と相関している。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、疾患の治療または進行をモニタリングする方法を含むことができる。この方法では、試料は、患者から、異なる時点（例えば、疾患の治療レジメンの前及び後）に採取する。第１の試料に由来する標的核酸、検出可能な標識を含むとともに、標的核酸の一セグメントにハイブリダイズするプローブ、及び支持体に固定されているとともに、標的核酸の第２のセグメントにハイブリダイズする第２のプローブの間で、複合体が形成される。支持体上の、第１の試料に由来する複合体の量は、同一のプローブ及び第２の試料に由来する標的核酸を用いて形成された複合体の量と比較する。形成された複合体の量の差は、疾患の進行または治療レジメンの奏効に相関し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、個体の腫瘍量を測定する方法を含むことができる。この方法では、試験試料に由来する標的核酸、検出可能な標識を含むとともに、標的核酸の一セグメントにハイブリダイズするプローブ、及び支持体に固定されているとともに、標的核酸の第２のセグメントにハイブリダイズする第２のプローブ間で、固体支持体上に複合体が形成される。固体支持体上の複合体の量は、第１のプローブの、導入された検出可能な標識の検出を通じて測定する。形成された複合体の量は、参照値または腫瘍量が既知である患者の参照試料から得た試料から、同様にして形成された複合体の量の一連の値と比較して、試験試料の腫瘍量を求める。いくつかの実施形態では、腫瘍量を求める方法は、固体支持体上に２つの複合体を形成することを含む。その第１の複合体は、個体の試験試料に由来する第１の標的核酸、及び２つの核酸プローブ（一方は、検出可能な標識を含み、もう一方は、支持体に固定されている）を含む。第２の複合体は、その試験試料に由来する第２の標的核酸、すなわち対照標的核酸、及び２つの異なる核酸プローブ（一方は、第１の複合体の標識から識別可能な検出可能な標識を含み、もう一方のプローブは、固体支持体に固定されている）を含む。それらの２つの複合体のそれぞれの量を測定し、試験比率を求める。そして、この比率と、参照比率またはその試験比率を腫瘍量に相関させる一連の比率を比較する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２００６／０１２７９１８号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸を含む基材であって、（ａ）オルガノシランで前処理した表面、（ｂ）そのオルガノシランで前処理した表面に架橋されたポリマーフィルム、ならびに（ｃ）そのポリマーフィルム及びオルガノシランで前処理した表面のうちの１つまたは複数に結合された核酸分子を含む基材を含むことができる。好ましい実施形態では、そのポリマーフィルムは、反応性基を含むポリマーから形成されており、その核酸分子は、その反応性基での共有結合を促すために、共有結合によって修飾されていない。その核酸分子は、共有結合的及び／または非共有結合的な相互作用を通じて、そのポリマーフィルム及びオルガノシランで前処理した表面のうちの１つまたは複数と会合または結合し得る。好ましい実施形態では、その核酸分子は、少なくとも約２５０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは、少なくとも約５００ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、その核酸分子は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または別の好適なクローニングベクター（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ１ベースの人工染色体、プラスミド、コスミドなど）の形態で存在するＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、結合された核酸分子は、核酸ハイブリダイゼーション法によって核酸標的分子を検出するのに充分な濃度で、基材の表面上に存在する。例えば、その核酸分子は、少なくとも約５００コピー／ｃｍ２の濃度で、基材の表面上に存在し得る。より好適には、その核酸分子は、少なくとも約１０００コピー／ｃｍ２及び／または少なくとも約５０００コピー／ｃｍ２の濃度で、基材の表面上に存在する。その核酸分子は好ましくは、高ストリンジェントな条件で洗浄したときに（例えば、比較的高温で、非イオン性洗浄剤を任意に含む低塩緩衝液によってスライドを洗浄したときに）、基材に実質的に結合された状態を維持する。いくつかの実施形態では、そのオルガノシランは、アルキル基を含む変性シラン分子である。一実施形態では、そのオルガノシランは、６個以上の炭素原子、好ましくは１０個以上の炭素原子を有するアルキル基を含む。そのオルガノシランは、アルコキシ基を含み得る。そのオルガノシランは、ハロゲン化物基も含み得る。いくつかの実施形態では、そのポリマーは、反応性基を含む。好適な反応性基としては、好適な条件で求核基と反応する求電子基が挙げられる。例えば、反応性基としては、アミノ反応性基（すなわち、アミノ基の窒素原子と反応する基）、チオール反応性基（すなわち、チオール基の硫黄原子と反応する基）、ヒドロキシル反応性基（すなわち、ヒドロキシル基の酸素原子と反応する基）及びこれらを組み合わせたものを挙げてよい。いくつかの実施形態では、そのポリマーとしては、活性化エステル、エポキシド、アズラクトン、活性化ヒドロキシル、アルデヒド、イソシアン酸塩、チオイソシアン酸塩、カルボン酸塩化物、ハロゲン化アルキル、マレイミド、α－ヨードアセトアミドまたはこれらを組み合わせたものを挙げてよい。一実施形態では、その反応性基は、活性化エステルであり、特には、その活性化エステルとしては、Ｎ－ヒドロキシルスクシンイミドエステルを挙げてよい。いくつかの実施形態では、その核酸を含む基材は、核酸マイクロアレイとして構成されている。その核酸マイクロアレイは、比較ゲノムハイブリダイゼーション解析を行うのに適するものであってよい。一実施形態では、その核酸マイクロアレイは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）にクローニングされたゲノムＤＮＡを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記のような、核酸を含有する基材を調製するための方法を含むことができる。その方法は典型的には、（ａ）オルガノシランを含む組成物によって、基材の表面を前処理すること、（ｂ）オルガノシランで前処理した表面にポリマーをカップリングして、ポリマーフィルムを形成すること、ならびに（ｃ）そのオルガノシランで前処理した表面及びポリマーフィルムのうちの１つまたは両方に核酸分子を結合することを含む。好ましい実施形態では、そのポリマーフィルムは、反応性基を含むポリマーから形成されており、その核酸は、反応性基での共有結合を促すために、共有結合によって修飾されていない。その核酸分子は、共有結合的及び／または非共有結合的な相互作用を通じて、そのポリマーフィルム及びオルガノシランで前処理した表面のうちの１つまたは複数に会合及び／または結合し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料における標的核酸分子の存在及び／または量を検出するための方法であって、ａ）標的と、核酸を含有する基材であって、上記のようにして調製した基材の核酸をハイブリダイズさせるのに好適な条件で、その標的分子と、その基材を接触させること、及びｂ）その基材に結合した標的分子の存在を検出することを含む方法を含むことができる。好ましい実施形態では、その核酸を含有する基材は、核酸マイクロアレイであり、核酸標的の存在及び／または量の検出は、比較ゲノムハイブリダイゼーション解析を用いて行う。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１２５８９２（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、がんであるか、またはがんの疑いがあると診断された対象に由来する試料に存在するｃｔＤＮＡにおける変異の検出に関連する方法及びポリヌクレオチドアダプター組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、１つまたは複数のがん関連遺伝子（ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＯＳ１及びＲＥＴが挙げられるが、これらに限らない）のエキソン及び／またはイントロンの様々な標的核酸配列におけるｃｔＤＮＡ変異の迅速で高感度な検出及びプロファイリングを可能にする。その方法は、検出限界の正確な解析モデルを用いて実現される超高感度なｃｔＤＮＡプロファイリングの枠組みを提供する。これらの品質によって、ＤＮＡ量の限られた試料に対して、以前の方法を上回って、検出限界が向上する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、第１のオリゴヌクレオチド鎖及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸アダプターを含むことができ、（ａ）その第１のオリゴヌクレオチド鎖は、（ｉ）第１の近位領域及び第１の遠位領域を含み（その第１の近位領域は、第１の固有分子識別子配列、及び５’ＴＧＡＣＴ３’という配列（配列番号）を有する第１のスペーサー配列を含み、その第１のスペーサー配列は、第１の固有分子識別子配列の３’側に位置する）、（ｉｉ）縮重または半縮重配列を含まず、（ｂ）その第２のオリゴヌクレオチド鎖は、（ｉ）第２の近位領域及び第２の遠位領域を含み（その第２の近位領域は、第２の固有分子識別子配列、及び５’ＧＴＣＡ３’という配列（配列番号）を有する第２のスペーサー配列を含み、そのスペーサー配列は、第２の固有分子識別子の５’側に位置する）、（ｉｉ）縮重または半縮重配列を含まず、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチド鎖の第１の近位領域は、第２のオリゴヌクレオチド鎖の第２の近位領域とハイブリダイズし、（ｄ）第１のオリゴヌクレオチド鎖の第１の遠位領域は、第２のオリゴヌクレオチド鎖の第２の遠位領域とハイブリダイズしない。その核酸アダプターのいくつかの実施形態では、第１のスペーサー配列の３’末端に位置するヌクレオチド「Ｔ」は、ホスホロチオエート結合を含む。その核酸アダプターのいくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、ビオチンで標識されている。その核酸アダプターの他の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端は、ビオチンで標識されている。いくつかの実施形態では、その核酸アダプターを用いて、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡからなる群から選択した二本鎖標的核酸分子をシークエンシングする。その二本鎖ＤＮＡは、せん断化したゲノムＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、本技術の核酸アダプターは、少なくとも２つのＰＣＲプライマー結合部位、少なくとも２つのシークエンシングプライマー結合部位またはこれらをいずれかに組み合わせたものをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態では、本技術の核酸アダプターは、試料特異的なバーコード配列をさらに含み、その試料特異的なバーコード配列は、２～２０個のヌクレオチドを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、患者から採取した試料に存在する二本鎖循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、（ａ）複数のＹ字アダプターを二本鎖ｃｔＤＮＡ分子の両末端にライゲーションして、二本鎖アダプター－ｃｔＤＮＡ複合体を形成すること（各Ｙ字アダプターは、第１のオリゴヌクレオチド鎖及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む）、（ｂ）アダプター－ｃｔＤＮＡ複合体の両方の鎖を増幅して、第１のアンプリコン及び第２のアンプリコンを作製すること（その第１のアンプリコンは、第１のオリゴヌクレオチド鎖に由来し、第２のアンプリコンは、第２のオリゴヌクレオチド鎖に由来する）、（ｃ）第１及び第２のアンプリコンをシークエンシングすること、（ｄ）第１のアンプリコンで検出された変異が、第２のアンプリコンで検出された変異と一致した場合に、二本鎖ｃｔＤＮＡ分子における少なくとも１つの変異を検出することを含む方法を含むことができる。その方法のいくつかの実施形態では、患者は、卵巣癌、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、メラノーマ、頭頸部癌または脳腫瘍と診断される。いくつかの実施形態では、その方法は、複数のベイト配列によって第１のアンプリコン及び第２のアンプリコンを濃縮することをさらに含み、その複数のベイト配列は、複数のがん関連遺伝子のそれぞれに対応する少なくとも１つの遺伝子領域を含む。その複数のがん関連遺伝子は、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＯＳ１及びＲＥＴを含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、その方法のいくつかの実施形態では、その複数のベイト配列は、ＲＮＡベイト、ＤＮＡベイト、またはＲＮＡベイト及びＤＮＡベイトの混合物である。ある特定の実施形態では、その複数のベイト配列は、ＲＮＡベイトとＤＮＡベイトの１：１混合物を含む。他の実施形態では、その複数のベイト配列は、ＲＮＡベイトとＤＮＡベイトの混合物であって、比率が２：ｌ、１．５：１、０．７５：１または０．５：ｌである混合物を含む。その方法のある特定の実施形態では、二本鎖ｃｔＤＮＡ分子の両方の３’末端は、「Ａ」オーバーハングをさらに含む。上記の実施形態のいずれにおいても、各Ｙ字アダプターは、少なくとも２つのシークエンシングプライマー結合部位をさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態では、各Ｙ字アダプターは、患者特異的なバーコード配列をさらに含み、その患者特異的なバーコード配列は、２～２０個のヌクレオチドを含む。本技術の各Ｙ字アダプターは、ビオチンで標識されていてよい。その方法のいくつかの実施形態では、その試料は、５ｎｇ以下の無細胞ＤＮＡを含む。他の実施形態では、その試料は、少なくとも６～３０ｎｇの無細胞ＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、その試料は、全血、血清、血漿、滑液、リンパ液、腹水または間質液である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，３８９，２３４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、分子プロファイリング、及び分子プロファイリングの結果を用いて、個体に対する治療を特定するための方法及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、その治療は、最初は、疾患に対する治療としては特定されていない。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、治療が必要な対象に対する治療候補を特定する方法であって、その対象に由来する試料に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を行って、少なくとも５つのタンパク質のＩＨＣ発現プロファイルを求めること、その試料に対してマイクロアレイ解析を行って、少なくとも１０個の遺伝子のマイクロアレイ発現プロファイルを求めること、その試料に対して蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を行って、少なくとも１つの遺伝子のＦＩＳＨ変異プロファイルを求めること、その試料においてＤＮＡシークエンシングを行って、少なくとも１つの遺伝子のシークエンシング変異プロファイルを求めること、ならびにそのＩＨＣ発現プロファイル、マイクロアレイ発現プロファイル、ＦＩＳＨ変異プロファイル及びシークエンシング変異プロファイルを規則データベースに照らして比較することを含む方法を含むことができる。その規則データベースは、その治療の生物学的活性が、ｉ．そのＩＨＣ発現プロファイルに含まれる１つもしくは複数のタンパク質を過剰発現もしくは過少発現するか、ｉｉ．そのマイクロアレイ発現プロファイルに含まれる１つもしくは複数の遺伝子を過剰発現もしくは過少発現するか、ｉｉｉ．そのＦＩＳＨ変異プロファイルに含まれる１つもしくは複数の遺伝子に、変異を有さないか、１つもしくは複数の変異を有するか、及び／またはｉｖ．そのシークエンシング変異プロファイルに含まれる１つまたは複数の遺伝子に、変異を有さないか、１つまたは複数の変異を有するがん細胞に対するものであることが知られている治療のマッピングを含む。その治療候補は、ｉ．比較ステップによって、その治療が、がんに対する生物学的活性を有する見通しであることが示された場合、及びｉｉ．比較ステップによって、その治療が、がんの治療に禁忌とならない場合に特定される。いくつかの実施形態では、そのＩＨＣ発現プロファイリングは、ＳＰＡＲＣ、ＰＧＰ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲ、ＰＲ、ｃ－ｋｉｔ、ＡＲ、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＳ、ＥＲＣＣ１、ＲＲＭ１、ＢＣＲＰ、ＴＯＰＯ１、ＰＴＥＮ、ＭＧＭＴ及びＭＲＰ１のうちの１つまたは複数をアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、そのマイクロアレイ発現プロファイリングは、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡ、ＡＲ、ＡＳＮＳ、ＢＣＬ２、ＢＩＲＣ５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤＡ、ＣＥＳ２、ＤＣＫ、ＤＨＦＲ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ３、ＥＳＲ１、ＦＬＴ１、ＦＯＬＲ２、ＦＹＮ、ＧＡＲＴ、ＧＮＲＨ１、ＧＳＴＰ１、ＨＣＫ、ＨＤＡＣ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＨ２、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＯＧＦＲ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＧＲ、ＰＯＬＡ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＭ２Ｂ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ、ＳＰＡＲＣ、ＳＲＣ、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５、ＴＫ１、ＴＮＦ、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＹＭＳ、ＶＤＲ、ＶＥＧＦＡ、ＶＨＬ、ＹＥＳ１及びＺＡＰ７０のうちの１つまたは複数をアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、そのＦＩＳＨ変異プロファイリングは、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２をアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、そのシークエンシング変異プロファイリングは、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｃ－ＫＩＴ及びＥＧＦＲのうちの１つまたは複数をアッセイすることを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、治療が必要な対象に対する治療候補を特定する方法であって、その対象に由来する試料に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を行って、ＳＰＡＲＣ、ＰＧＰ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲ、ＰＲ、ｃ－ｋｉｔ、ＡＲ、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＳ、ＥＲＣＣ１、ＲＲＭ１、ＢＣＲＰ、ＴＯＰＯ１、ＰＴＥＮ、ＭＧＭＴ及びＭＲＰ１のうちの少なくとも５つのＩＨＣ発現プロファイルを求めること、その試料に対してマイクロアレイ解析を行って、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡ、ＡＲ、ＡＳＮＳ、ＢＣＬ２、ＢＩＲＣ５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤＡ、ＣＥＳ２、ＤＣＫ、ＤＨＦＲ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ３、ＥＳＲ１、ＦＬＴ１、ＦＯＬＲ２、ＦＹＮ、ＧＡＲＴ、ＧＮＲＨ１、ＧＳＴＰ１、ＨＣＫ、ＨＤＡＣ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＨ２、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＯＧＦＲ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＧＲ、ＰＯＬＡ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＭ２Ｂ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ、ＳＰＡＲＣ、ＳＲＣ、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５、ＴＫ１、ＴＮＦ、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＹＭＳ、ＶＤＲ、ＶＥＧＦＡ、ＶＨＬ、ＹＥＳ１及びＺＡＰ７０のうちの少なくとも５つのマイクロアレイ発現プロファイルを求めること、その試料に対して蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を行って、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２のＦＩＳＨ変異プロファイルを求めること、その試料に対してＤＮＡシークエンシングを行って、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｃ－ＫＩＴ及びＥＧＦＲのうちの少なくとも１つのシークエンシング変異プロファイルを求めること、ならびにそのＩＨＣ発現プロファイル、マイクロアレイ発現プロファイル、ＦＩＳＨ変異プロファイル及びシークエンシング変異プロファイルを規則データベースに照らして比較することを含む方法を含むことができる。その規則データベースは、その治療の生物学的活性が、ｉ．そのＩＨＣ発現プロファイルに含まれる１つもしくは複数のタンパク質を過剰発現もしくは過少発現するか、ｉｉ．そのマイクロアレイ発現プロファイルに含まれる１つもしくは複数の遺伝子を過剰発現もしくは過少発現するか、ｉｉｉ．そのＦＩＳＨ変異プロファイルに含まれる１つもしくは複数の遺伝子に、変異を有さないか、１つもしくは複数の変異を有するか、及び／またはｉｖ．そのシークエンシング変異プロファイルに含まれる１つまたは複数の遺伝子に、変異を有さないか、１つまたは複数の変異を有するがん細胞に対するものであることが知られている治療のマッピングを含む。その治療候補は、ｉ．比較ステップによって、その治療が、がんに対する生物学的活性を有する見通しであることが示された場合、及びｉｉ．比較ステップによって、その治療が、がんの治療に禁忌とならない場合に特定される。いくつかの実施形態では、そのＩＨＣ発現プロファイリングは、列挙されているバイオマーカーの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に対して行う。いくつかの実施形態では、そのマイクロアレイ発現プロファイリングは、列挙されているバイオマーカーの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に対して行う。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、治療が必要な対象のがんに対する治療候補を特定する方法であって、対象に由来する試料に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を行って、少なくとも、ＳＰＡＲＣ、ＰＧＰ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲ、ＰＲ、ｃ－ｋｉｔ、ＡＲ、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＳ、ＥＲＣＣ１、ＲＲＭ１、ＢＣＲＰ、ＴＯＰＯ１、ＰＴＥＮ、ＭＧＭＴ及びＭＲＰ１からなるタンパク質群のＩＨＣ発現プロファイルを求めること、その試料に対してマイクロアレイ解析を行って、少なくとも、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡ、ＡＲ、ＡＳＮＳ、ＢＣＬ２、ＢＩＲＣ５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤＡ、ＣＥＳ２、ＤＣＫ、ＤＨＦＲ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ３、ＥＳＲ１、ＦＬＴ１、ＦＯＬＲ２、ＦＹＮ、ＧＡＲＴ、ＧＮＲＨ１、ＧＳＴＰ１、ＨＣＫ、ＨＤＡＣ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＨ２、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＯＧＦＲ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＧＲ、ＰＯＬＡ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＭ２Ｂ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ、ＳＰＡＲＣ、ＳＲＣ、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５、ＴＫ１、ＴＮＦ、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＹＭＳ、ＶＤＲ、ＶＥＧＦＡ、ＶＨＬ、ＹＥＳ１及びＺＡＰ７０からなる遺伝子群のマイクロアレイ発現プロファイルを求めること、その試料に対して蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を行って、少なくとも、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２からなる遺伝子群のＦＩＳＨ変異プロファイルを求めること、その試料に対してＤＮＡシークエンシングを行って、少なくとも、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｃ－ＫＩＴ及びＥＧＦＲからなる遺伝子群のシークエンシング変異プロファイルを求めること、ならびにそのＩＨＣ発現プロファイル、マイクロアレイ発現プロファイル、ＦＩＳＨ変異プロファイル及びシークエンシング変異プロファイルを規則データベースに対して比較することを含む方法を含むことができる。その規則データベースは、その治療の生物学的活性が、ｉ．そのＩＨＣ発現プロファイルに含まれる１つもしくは複数のタンパク質を過剰発現もしくは過少発現するか、ｉｉ．そのマイクロアレイ発現プロファイルに含まれる１つもしくは複数の遺伝子を過剰発現もしくは過少発現するか、ｉｉｉ．そのＦＩＳＨ変異プロファイルに含まれる１つもしくは複数の遺伝子に、変異を有さないか、１つもしくは複数の変異を有するか、及び／またはｉｖ．そのシークエンシング変異プロファイルに含まれる１つまたは複数の遺伝子に、変異を有さないか、１つまたは複数の変異を有するがん細胞に対するものであることが知られている治療のマッピングを含む。その治療候補は、ｉ．比較ステップによって、その治療が、がんに対する生物学的活性を有する見通しであることが示された場合、及びｉｉ．比較ステップによって、その治療が、がんの治療に禁忌とならない場合に特定される。いくつかの実施形態では、そのマイクロアレイ発現プロファイリングは、低密度のマイクロアレイ、発現マイクロアレイ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）マイクロアレイ、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マイクロアレイ、プロテオームアレイまたは抗体アレイを用いて行う。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１８／０１７１３３７号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ａ）複数の遺伝子及び／または遺伝子産物を評価することによって、対象に由来する少なくとも１つの試料の分子プロファイルを求めること、ならびにｂ）その分子プロファイルに基づき、ｉ）がん治療のための有用性と関連付けられる少なくとも１つの治療、ｉｉ）がん治療のための有用性の欠如と関連付けられる少なくとも１つの治療、及びｉｉｉ）臨床試験と関連付けられる少なくとも１つの治療のうちの少なくとも１つを特定することを含む方法を含むことができる。その複数の遺伝子及び／または遺伝子産物は、様々な化学療法剤との関係が知られている有効性を有する遺伝子及びまたは遺伝子産物（例えば、転写産物及びタンパク質）の中から選択できる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、いずれかの所望の遺伝子パネルに対して行う変異解析を含むことができる。一実施形態では、複数の遺伝子及び／または遺伝子産物を評価することは、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ４（ＨＥＲ４）、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）、ＫＩＴ（ｃＫＩＴ）、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ（ｃＭＥＴ）、ＭＰＬ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３及びＶＨＬのうちの少なくとも１つ、例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個または４６個の変異解析をさらに含む。その変異解析は、これらの遺伝子のいずれかの有用な組み合わせを含み得る。その変異解析を用いて、少なくとも１つ、例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個の変異、多型、欠失、挿入、置換、転座、融合、切断、重複、増幅、反復、コピー数変化、転写産物変異型及びスプライス変異型を評価できる。その変異解析は、いずれかの有用な検査方法または方法を組み合わせたものを用いて行うことができる。例えば、その変異解析は、ＩＳＨ、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、シークエンシング、パイロシークエンシング、サンガーシークエンシング、高スループットもしくは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、断片解析、またはＲＦＬＰのうちの少なくとも１つを用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、その変異解析は、次世代シークエンシングを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許出願公開第２０１７／０１７５１９７号、同第２０１７／００３９３２８号及び同第２０１５／０３０７９４７号、ならびにＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１２／０９２３３６（参照により、それらの全体が明細書に援用される）に記載された任意の様々な方法を含み得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／０５３９１５（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、生物学的データを解析するためのアプリケーション用のユーザーインターフェースを提供するためのシステム、方法、装置及びコンピュータープログラム製品を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、生物学的データを解析する方法であって、プロセッサー及びメモリを含む計算装置で、複数の患者の患者データを受け取ること（その患者データは、生体試料採取事象、生物学的処理事象、少なくとも１つの治療レジメ、少なくとも１つのバイオマーカーの状態及び患者の状態のうちの少なくとも１つに対応する）、その生体試料採取事象、生物学的処理事象、少なくとも１つの治療レジメ、少なくとも１つのバイオマーカーの状態のうちのいずれか１つと、患者の状態との少なくとも１つの相互関係を求めること、治療レジメ解析を行って、少なくとも１つの治療レジメと、患者の状態及び少なくとも１つのバイオマーカーの状態のうちの少なくとも１つのとの相互関係について、相互関係の状態を求めること、ならびにその計算装置と通信して、少なくとも１つのグラフィカルインターフェースをユーザーインターフェースに表示すること（そのグラフィカルインターフェースは、複数の視覚的要素を含み、その複数の視覚的要素の各視覚的要素は、患者データと関連付けられており、少なくとも１つの視覚的要素は、少なくとも１つの相互関係と関連付けられており、少なくとも１つの視覚的要素は、相互関係の状態及びバイオマーカーの状態のうちの少なくとも１つに対応する表示を含む）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的患者に由来する生体試料と関連する生物学的データを解析する方法であって、プロセッサー及びメモリを含む計算装置で、その標的患者と関連する患者データを受け取ること（その患者データは、生体試料採取事象、生物学的処理事象、治療レジメ、マーカーの状態及び患者の状態に対応する）、複数の患者と関連する参照データを受け取ること（その参照データは、複数の生体試料採取事象、生物学的処理事象、治療レジメ、マーカーの状態及び患者の状態に対応する）、その生体試料採取事象、生物学的処理事象、治療レジメ、マーカーの状態のうちのいずれか１つと、患者の状態との少なくとも１つの相互関係を求めること、治療レジメ解析を行って、少なくとも１つの治療レジメと、少なくとも１つの患者の状態及び少なくとも１つのマーカーの状態のうちの少なくとも１つとの相互関係を求めること、少なくとも１つのグラフィカルユーザーインターフェースを表示すること（そのグラフィカルユーザーインターフェースは、ｉ）参照データと関連する複数のグラフィカルユーザーインターフェースオブジェクトを表示し、ｉｉ）患者データと関連する複数のグラフィカルユーザーインターフェースオブジェクトを表示し、ｉｉｉ）その計算装置と通信して、ユーザーインターフェース上の少なくとも１つのグラフィカルインターフェースに、第１のグラフィカルユーザーインターフェースオブジェクトを表示するように構成されており、その第１のグラフィカルユーザーインターフェースオブジェクトは、その第１のグラフィカルユーザーインターフェースオブジェクトの選択を定義するユーザー入力の指示を受け取ったら、第２のグラフィカルユーザーインターフェースオブジェクトをグラフィカルユーザーインターフェースに表示させるように構成されている）、ならびにユーザーインターフェースに表示された１つまたは複数の相互関係に基づき、患者のケアを行うのを補助することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、第１の視覚的要素を操作して、その視覚的要素の選択に応じて、患者データに対応する追加の情報を含む第２の視覚的要素を表示することをさらに含み得る。その方法は、第２の視覚的要素を表示して、その第２の視覚的要素が第１の視覚的要素にオーバーレイするようにするか、または第１の視覚的要素のサイズを変更して、第１の視覚的要素に隣接して、第２の視覚的要素が表示されるようにすることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、その方法は、ユーザーインターフェースに表示された１つまたは複数の相互関係に基づき、患者のケアを行うのを補助することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、患者のケアを行うのを補助することは、その１つまたは複数の相互関係に基づき、診断を行うこと、予後を示すこと、推奨の治療レジメを選択すること、仮説を立てること及び治療レジメの効率を評価することのうちの少なくとも１つを補助することを含む。いくつかの実施形態では、患者のケアを行うのを補助することは、グラフィカルインターフェース、及びそのインターフェースに表示された複数の視覚的要素のうちの１つまたは複数を選択的に操作して、標的患者を一連の参照患者に照らして視覚的に比較することを含む。標的患者を一連の参照患者に照らして視覚的に比較することは、様々な所望の属性（共通の患者属性が挙げられるが、これに限らない）、少なくとも１つの治療レジメ及び／または少なくとも１つのバイオマーカーの状態に基づくことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、非一時的であるコンピューター可読記憶媒体であって、コンピューター可読プログラムコード部分が格納されているコンピューター可読記憶媒体を含むことができ、そのコンピューター可読プログラムコード部分は、装置に少なくとも、プロセッサーによる実行に応じて、プロセッサー及びメモリを含む計算装置で、複数の患者の患者データ（その患者データは、生体試料採取事象、生物学的処理事象、少なくとも１つの治療レジメ、少なくとも１つのバイオマーカーの状態及び患者の状態のうちの少なくとも１つに対応する）を受け取らせ、その生体試料採取事象、生物学的処理事象、少なくとも１つの治療レジメ、少なくとも１つのバイオマーカーの状態のうちのいずれか１つと、患者の状態との少なくとも１つの相互関係を求めさせ、治療レジメ解析を実行させて、少なくとも１つの治療レジメと、患者の状態及び少なくとも１つのバイオマーカーの状態のうちの少なくとも１つとの相互関係について、相互関係の状態を求めさせ、その計算装置と通信して、少なくとも１つのグラフィカルインターフェースをユーザーインターフェースに表示させる（そのグラフィカルインターフェースは、複数の視覚的要素を含み、その複数の視覚的要素の各視覚的要素は、患者データと関連し、少なくとも１つの視覚的要素は、少なくとも１つの相互関係と関連し、少なくとも１つの視覚的要素は、相互関係の状態及びバイオマーカーの状態のうちの少なくとも１つに対応する表示を含む）。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、生物学的データを解析するための装置を含むことができ、その装置は、ユーザーインターフェース、及びそのユーザーインターフェースと通信する計算装置を含み、その計算装置は、プロセッサー、及びコンピューター可読プログラムコードが格納されているメモリを含み、そのコンピューター可読コードは、その装置に、そのプロセッサーによる実行に応じて、複数の患者の患者データを受け取らせ（その患者データは、生体試料採取事象、生物学的処理事象、少なくとも１つの治療レジメ、少なくとも１つのバイオマーカーの状態及び患者の状態のうちの少なくとも１つに対応している）、その生体試料採取事象、生物学的処理事象、少なくとも１つの治療レジメ、少なくとも１つのバイオマーカーの状態のうちのいずれか１つと、患者の状態との少なくとも１つの相互関係を求めさせ、治療レジメ解析を実行させて、少なくとも１つの治療レジメと、患者の状態及び少なくとも１つのバイオマーカーの状態のうちの少なくとも１つとの相互関係について、相互関係の状態を求めさせ、少なくとも１つのグラフィカルインターフェースをユーザーインターフェースに表示させる（そのグラフィカルインターフェースは、複数の視覚的要素を含み、その複数の視覚的要素の各視覚的要素は、患者データと関連し、少なくとも１つの視覚的要素は、少なくとも１つの相互関係と関連し、少なくとも１つの視覚的要素は、相互関係の状態及びバイオマーカーの状態のうちの少なくとも１つに対応する表示を含む）ように構成されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０６４２２９（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象とするバイオマーカーと結合するアプタマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、生体試料におけるバイオマーカーまたはその他の生物学的実体の存在またはレベルを検出する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／２０５６８６（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象とする表現型を有する組織を認識するオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。各種実施形態では、そのオリゴヌクレオチドプローブを診断プロセス、予後プロセスまたはセラノスティクスプロセスで用いて、その試料の表現型を特徴付ける。その診断は、がんに関連し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリを濃縮する方法であって、（ａ）複数の試料をアレイ化した支持体を用意すること、（ｂ）その支持体と、複数のオリゴヌクレオチドを接触させること、及び（ｃ）その複数の試料のメンバーに結合したオリゴヌクレオチドプローブライブラリのメンバーを回収し、それによって、オリゴヌクレオチドプローブライブラリを濃縮することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリを濃縮する方法であって、（ａ）ポジティブ選択ラウンドを少なくとも１回行うことを含み（そのポジティブ選択は、（ｉ）複数の試料と、複数のオリゴヌクレオチドを同時に接触させること、及び（ｉｉ）その複数の試料と関連付けられた複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収することを含む）、（ｉｉｉ）任意に、ネガティブ選択ラウンドを少なくとも１回行うことを含む（そのネガティブ選択は、（ｉ）複数の対照試料と、複数のオリゴヌクレオチドを同時に接触させること、（ｉｉ）その複数の対照試料と関連付けられなかった複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収することを含む）方法を含むことができる。その濃縮方法の実施形態では、複数の試料は、対象とする表現型を代表するものとなるように選択する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料において表現型を特徴付ける方法であって、（ａ）少なくとも１つの試料を基材上にアレイ化すること、（ｂ）その基材と、複数のオリゴヌクレオチドを接触させること、及び（ｂ）その複数のオリゴヌクレオチドのメンバーと、基材上でアレイ化したその試料の間で形成された複合体の存在またはレベルを測定すること（その存在またはレベルを用いて、表現型を特徴付ける）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、濃縮及び特徴付けの方法を含む方法を行うための少なくとも１つの試薬を含むキットを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、その方法を行うための少なくとも１つの試薬を用いることを含むことができる。その少なくとも１つの試薬は、いずれかの有用な試薬であることができ、その試薬としては、支持体、複数のヌクレオチド、ろ過ユニット及びＰＥＧのうちの少なくとも１つが挙げられるが、こられに限らない。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第１０，０１１，８２６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、同一の固定生体試料に由来する特定の核酸及びタンパク質中の様々な生体分子を並行して単離／抽出する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、上記の方法によって単離した生体分子を定量及び解析すること、固定試料から様々な生体分子を並行して単離／抽出するためのキット、ならびに疾患の診断、疾患の予後の判定、疾患の療法の判断、及び疾患の療法のモニタリングに、前記キットを用いることも含む。いくつかの実施形態では、架橋によって固定した同一の出発生体物質に由来する様々な種類の生体分子を並行して精製する方法は、ａ）その出発物質の前記架橋を解消するステップ、ｂ）その出発物質に存在する異なる生体分子を少なくとも１つの画分（Ａ）及び少なくとも１つの画分（Ｂ）に分離するステップ、ならびにｃ）ステップｂ）の前記画分（Ａ）及び（Ｂ）のうちの少なくとも１つから、異なる生体分子を単離もしくは検出するか、または単離及び検出するステップ、ならびに前記方法を行うためのキットを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，７９７，０００号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的ＲＮＡの存在を検出する方法であって、ａ）少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブを用意すること（その少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブは、支持体に結合する）、ｂ）標的ＲＮＡを前記少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブにハイブリダイズさせて、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を得ること、ｃ）その標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を単離すること、ｄ）少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを用意し、前記少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを前記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体にハイブリダイズさせて、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を得ること、ｅ）抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体を用意し、前記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を前記抗体とともにインキュベートして、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を得ること、ｆ）前記抗体を検出すること（前記検出によって、前記標的ＲＮＡの存在が示される）を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされており、その検出ステップは、そのマーカーを検出することを含む。一態様では、その検出可能なマーカーは、アルカリホスファターゼ及び西洋わさびペルオキシダーゼからなる群から選択する。いくつかの実施形態では、その検出ステップは、前記抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体に結合する第２の抗体を用意することを含み、前記第２の抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされており、前記検出は、そのマーカーを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その支持体は、磁気ビーズを含む。一態様では、その磁気ビーズは、少なくとも１つのストレプトアビジン分子にコンジュゲートされており、少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブは、ビオチン分子にコンジュゲートされている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、検出用の標的ＲＮＡを用意する方法であって、標的ＲＮＡを含む生体試料をカルボキシルビーズとインキュベートすること、そのビーズを単離すること、単離したビーズに結合した生体試料を溶解させること、溶解した生体試料からビーズを単離すること（得られる上清は、検出用の標的ＲＮＡを含む）を含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，６８９，０４７号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、非標的核酸を含む試料中の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）（ｉ）試料と、少なくとも１つの精製プローブを接触させ（その核酸プローブの少なくともの一部は、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成する）、（ｉｉ）そのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと、そのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに結合できる少なくとも第１の抗体を接触させることを含む方法によって、そのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを第１の固体支持体に固定化すること（その抗体は、その第１の固体支持体に結合するか、または結合するように適合されている）、及び（ｉｉｉ）その第１の固体支持体をその試料から分離して、少なくとも１つの精製標的核酸を作製することを含む方法によって、試料から標的核酸を精製すること、ｂ．（ｉ）全ゲノム増幅などの等温増幅によるなどして、その精製標的核酸の少なくともの一部を増幅して、アンプリコンを作製すること、（ｉｉ）そのアンプリコンと、少なくとも１つの固定化プローブを接触させることを含む方法によって、そのアンプリコンを第２の固体支持体に固定化すること（（α）その固定化プローブは、第２の固体支持体に結合するか、または結合するように適合されており、（β）その固定化プローブの少なくとも一部は、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズする）、（ｉｉｉ）その固定化されたアンプリコンと、少なくとも１つの検出プローブを接触させること（その検出プローブの少なくともの一部は、少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズして、検出複合体を形成する）、ならびに（ｉｖ）その検出複合体によって生成される少なくとも第１の検出可能なシグナルを検出すること（その検出可能なシグナルによって、標的核酸の遺伝子型が示される）を含む方法によって、その精製標的核酸をジェノタイピングすることを含む前記方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その複数の精製標的核酸を複数の固定化プローブと接触させ、その複数の固定化プローブのそれぞれは、別々の精製標的核酸に対して特異的である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ａ．その少なくとも１つの標的核酸に対して特異的な少なくとも第１の核酸プローブを含むハイブリッドプローブセットに、その少なくとも１つの標的核酸をハイブリダイズさせることによって、その少なくとも１つの標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを作製すること、その二本鎖核酸ハイブリッドと、二本鎖核酸ハイブリッドに結合できる少なくとも第１の抗体を接触させるとともに、その少なくとも第１の抗体を第１の固体支持体に結合することによって、その二本鎖核酸ハイブリッドを第１の固体支持体に固定化すること、及びその二本鎖核酸ハイブリッドを試料から分離して、少なくとも１つの精製核酸を作製することを含む精製ステップ、ｂ．その少なくとも１つの精製核酸の少なくともの一部を増幅して、増幅核酸を作製する増幅ステップ、ならびにｃ．その少なくとも１つの標的核酸に対して特異的な少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含む固定化プローブセットに、その増幅核酸をハイブリダイズさせることによって、その増幅核酸を少なくとも第２の固体支持体に固定化すること、及びその少なくとも１つの標的核酸に対して特異的な少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを含む検出プローブセットによって、その少なくとも１つの標的核酸の存在を検出することを含むジェノタイピングステップを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，４２２，５９３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、（１）試料から標的核酸を配列特異的に単離すること、（２）その単離標的核酸を増幅すること、及び（３）複数の検出可能な標識化核酸検出プローブを用いて、その標的核酸を検出すること（そのプローブはそれぞれ、（ａ）他の検出プローブと異なる検出可能な標識を有し、及び／または（ｂ）同一の検出可能な標識を有するプローブと融解温度が異なる）を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、Ａ．Ａ１．その少なくとも１つの標的核酸に対して特異的な少なくとも第１の核酸プローブを含むハイブリッドプローブセットに、その少なくとも１つの標的核酸をハイブリダイズさせることによって、その少なくとも１つの標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを作製すること、Ａ２．その二本鎖核酸ハイブリッドを試料から分離して、少なくとも１つの精製核酸を作製することを含む方法によって、少なくとも１つの標的核酸を精製すること、Ｂ．その少なくとも１つの精製核酸の少なくともの一部を増幅すること、ならびにＣ．Ｃ１．その増幅核酸と、少なくとも１つの検出プローブセットを接触させること（Ｃ１（ａ）．その検出プローブセットの各検出プローブは、検出可能な標識を有し、Ｃ１（ｂ）．その検出プローブセットの検出プローブの少なくとも２つは、同一の検出可能な標識を有し、Ｃ１（ｃ）．同一の検出可能な標識を有するプローブのそれぞれは、同一の標識を有する他のプローブとは融解温度（Ｔｍ）が異なる）、Ｃ２．その核酸配列に標識化プローブがハイブリダイズしたか判断することによって、その増幅核酸を検出すること、及びＣ３．各検出プローブが、結合していた核酸配列から解離する温度を検出することを含む方法によって、その標的核酸を検出することを含む。いくつかの実施形態では、その二本鎖核酸ハイブリッドに特異的に結合する分子、好ましくは抗ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド抗体と、その二本鎖核酸ハイブリッドを接触させることを含む方法によって、その二本鎖核酸ハイブリッドを試料から分離する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，５９３，３６６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸配列をランダムに増幅する方法であって、プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び標的試料を接触させること（そのプライマーは、Ｇ欠損型ランダムプライマーである）、及びその標的配列の複製を促す条件で、その標的試料をインキュベートすること（その標的配列の複製により、複製鎖が得られる）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸配列をランダムに増幅する方法であって、プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び標的試料を接触させること（そのプライマーは、Ｇ欠損型ランダムプライマーである）、ならびにその標的配列の複製を促す条件で、その標的試料をインキュベートすること（その標的試料中の核酸は、その標的試料中の他の物質から分離されていない）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、メッセンジャーＲＮＡをランダムに増幅する方法であって、メッセンジャーＲＮＡを逆転写して、第１の鎖のｃＤＮＡを作製すること、Ｇ欠損型ランダムプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及びその第１の鎖のｃＤＮＡを接触させること、ならびに第１の鎖のｃＤＮＡの複製を促す条件でインキュベートすること（第１の鎖のｃＤＮＡの複製によって、複製鎖が得られ、複製中、その複製鎖の少なくとも１つが、別の複製鎖の鎖置換複製によって、第１の鎖のｃＤＮＡから解離される）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸配列をランダムに増幅する方法であって、（ａ）Ｇ欠損型ランダムプライマーセットと標的試料を混合して、プライマー－標的試料混合物を作製し、そのプライマー－標的試料混合物中のＧ欠損型ランダムプライマーと標的配列のハイブリダイゼーションを促す条件で、そのプライマー－標的試料混合物をインキュベートすること、ならびに（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと、そのプライマー－標的試料混合物を混合して、ポリメラーゼ－標的試料混合物を作製し、標的配列の複製を促す条件で、そのポリメラーゼ－標的試料混合物をインキュベートすること（その標的配列の複製によって、複製鎖が得られ、複製中、その複製鎖の少なくとも１つは、別の複製鎖の鎖置換複製によって、標的配列から解離され、その標的配列は、かなり複雑な核酸試料である）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、全ゲノムをランダムに増幅する方法であって、Ｇ欠損型ランダムプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び標的試料を接触させること、及び標的配列の複製を促す条件で、標的試料をインキュベートすることを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，４８７，８２３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象とする核酸配列を増幅するための組成物及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、プライマーによる、その核酸配列の鎖置換複製に基づく。いくつかの実施形態では、その方法は、複雑度の高いゲノム核酸試料及びその他の核酸試料を増幅するのに有用なマルチプルディスプレースメント増幅（ＭＤＡ）の形態である。その方法は、１つのみまたは限られた数のプライマーを用いて、このように複雑度の高い核酸試料を増幅するのに使用できる。１つまたは少数のプライマーによって、配列複雑度の高い全ゲノム及びその他の核酸試料を有効に増幅できることが発見されている。そのプライマーは、そのプライマーに見られるプライマー配列の量が限られても、複雑度の高い核酸試料に存在する広範な配列をプライミングして、効率的に増幅できるように特別に選択または設計する。その方法は概して、特異的な核酸配列を有する１つ、数個またはそれを上回るプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び核酸試料を接触させること、ならびにその核酸試料中の核酸分子の複製を促す条件で、その核酸試料をインキュベートすることを伴う。その核酸分子の複製によって、複製鎖が得られ、複製中、その複製鎖は、別の複製鎖の鎖置換複製によって、核酸分子から解離される。その複製によって、核酸試料中の核酸分子のすべてまたはかなりの部分を増幅できる。いくつかの実施形態では、全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）の形態を用いる方法では、１つ、少数またはそれを上回るプライマーを用いて、ゲノム核酸の試料（または複雑度の高い核酸の別の試料）をプライミングする。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ヒトゲノムを増幅する方法であって、長さが少なくとも６ヌクレオチドであり、縮重プライマーでもランダムプライマーでもない単一のＤＮＡプライマー、ヒト以外の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、及びヒトゲノム核酸試料を接触させて、混合物を形成すること、そのヒトゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促す条件で、その混合物をインキュベートすること（そのプライマーは、そのゲノム核酸試料中の核酸分子にハイブリダイズし、そのプライマーは、特異的なヌクレオチド配列を有し、そのゲノム核酸試料は、ヒトゲノムのすべてまたはかなりの部分を含む）、ならびに等温条件で、そのヒトゲノム核酸試料中の核酸分子を複製すること（そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、鎖置換複製によって進行し、そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製によって、そのゲノム核酸試料中の核酸分子のすべてまたはかなりの部分が複製される）を含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，１１５，４１０号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的特異的なハイブリッドキャプチャー（「ＴＳＨＣ」）と称される核酸検出方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、１つまたは複数の標的核酸を検出及び／または定量する方法であって、標的核酸配列の迅速で高感度な検出のために、標的の濃縮ステップ、増幅ステップ及び検出ステップを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的核酸は、標的核酸、その標的核酸と相補的な核酸プローブ（その一方はＲＮＡであり、もう一方はＤＮＡである）及び固体支持体を混合することによって、標的核酸を固体支持体に捕捉すること、未結合の標的核酸及び核酸プローブを除去すること、捕捉された標的核酸または核酸プローブを増幅して、複数のアンプリコンを形成すること（そのアンプリコンの存在によって、標的核酸の存在が示される）、ならびに標的核酸、その標的核酸の一部にハイブリダイズする選択可能かつ識別可能なオリゴヌクレオチド（すなわち、捕捉配列プローブ、ＣＳＰ）、及び標的核酸の異なる部分と相補的な核酸プローブ（すなわち、シグナル配列プローブ、ＳＳＰ）を混合することによって、標的核酸を検出すること（そのプローブまたは標的のいずれかはＲＮＡであり、もう一方はＤＮＡであり、そのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、直接または間接的に標識されているＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異的結合剤によって検出し、それによって、標的核酸を検出する）によって検出する。そのＳＳＰは、検出のためのシグナルを生成する手段としてのみ機能することに限定されず、標的核酸にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異的結合剤による捕捉を可能にすることによって、標的濃縮ステップでも使用し得る。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、標的核酸と相補的である核酸プローブに、複数の標的核酸をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成すること、固体支持体にコンジュゲートしたＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異的抗体によって、そのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを捕捉すること、未結合の標的核酸及び核酸プローブを除去すること、ランダムプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを用いて、捕捉された標的核酸または核酸プローブを増幅して、複数のアンプリコンを形成すること（その複数のアンプリコンの存在によって、標的核酸の存在が示される）、標的核酸配列の一部と相補的な核酸プローブをハイブリダイズさせて、標的とプローブの間でＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成すること、固体支持体にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、標的核酸の異なる部分にハイブリダイズさせること（その固体支持体は、選択可能である）、そのオリゴヌクレオチド複合体を選択すること、ならびにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異的結合剤をそのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに結合することによって、複数の標的核酸を検出することによって検出する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡと相補的であるＲＮＡプローブに、複数の標的ＤＮＡをハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成するステップ、ビーズにコンジュゲートされているＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異的抗体によって、そのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを捕捉するステップ、余分の核酸及びプローブを洗浄することによって、未結合の核酸及び核酸プローブを除去するステップ、ランダムプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的ＤＮＡを等温増幅して、複数のアンプリコンを形成するステップ、標的ＤＮＡの一部と相補的なＲＮＡプローブ（すなわち、ＳＳＰ）をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成するステップ、特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡの異なる部分にハイブリダイズさせるステップ（そのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、選択可能なビーズにコンジュゲートされている）、ならびに検出可能に標識されたＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異的抗体をそのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに結合し、選択可能なオリゴヌクレオチドコンジュゲートビーズ（すなわち、ＣＳＰ）を用いて、標的ＤＮＡを選択することによって、複数の標的ＤＮＡを検出するステップ（そのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異的抗体は、検出可能かつ識別可能に標識されている）を有するマルチプレックス方法によって検出する。各標的の存在は、その標的とＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成するＳＳＰを通じて、標識化ＤＮＡ：ＲＮＡ抗体によって検出し、各種標的は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートビーズ（すなわち、ＣＳＰ）に基づき分離または選択する。アンプリコン及びＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの存在によって、標的ＤＮＡの存在が示される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，０５１，６０６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）を作製及び使用するための方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも２つ以上のオリゴヌクレオチド成分を含む組成物であって、その少なくとも第１のオリゴヌクレオチド成分及び第２のオリゴヌクレオチド成分が、ＭＮＡｚｙｍｅ組織化促進物質の存在下で自己組織化して、触媒活性を持つ多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）を形成し、前記少なくとも第１のオリゴヌクレオチド成分及び前記第２のオリゴヌクレオチド成分のそれぞれが、基材アーム部分、触媒コア部分及びセンサーアーム部分を含み、自己組織化の際に、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分が、ＭＮＡｚｙｍｅのセンサーアームとして機能し、第１及び第２のオリゴヌクレオチド成分の基材アーム部分が、ＭＮＡｚｙｍｅの基材アームとして機能し、第１及び第２のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が、ＭＮＡｚｙｍｅの触媒コアとして機能し、ＭＮＡｚｙｍｅのセンサーアームが、前記ＭＮＡｚｙｍｅ組織化促進物質と相互作用して、それぞれの触媒コア部分の会合のために、第１及び第２のオリゴヌクレオチド成分を近接した状態に保つようにして、ＭＮＡｚｙｍｅの触媒コアを形成し、前記触媒コアが、少なくとも１つの基材を改変でき、前記ＭＮＡｚｙｍｅの前記基材アームが基材に結合して、前記ＭＮＡｚｙｍｅの前記触媒コアが、前記基材を改変できるようにする組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、その組成物は、前記基材アーム部分またはセンサーアーム部分の少なくとも１つを安定化するように機能する少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、その方法は、少なくとも１つの追加の組織化促進物質の存在下で自己組織化して、触媒活性を持つ少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅを形成する少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分及び第４のオリゴヌクレオチド成分をさらに含んでよく、前記少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分及び第４のオリゴヌクレオチド成分のそれぞれは、基材アーム部分、触媒コア部分及びセンサーアーム部分を含み、前記少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分及び第４のオリゴヌクレオチド成分の自己組織化の際に、前記少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分及び前記少なくとも第４のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分は、前記触媒活性を持つ少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅのセンサーアームを形成し、前記少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分及び前記少なくとも第４のオリゴヌクレオチド成分の基材アーム部分は、前記触媒活性を持つ少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅの基材アームを形成し、前記少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分及び前記少なくとも第４のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分は、前記触媒活性を持つ少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅの触媒コアを形成し、前記少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅのセンサーアームは、前記少なくとも１つの追加の組織化促進物質と相互作用して、それぞれの触媒コア部分の会合のために、前記少なくとも第３のオリゴヌクレオチド成分及び前記少なくとも第４のオリゴヌクレオチド成分を近接した状態に保つようにして、前記少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅの触媒コアを形成し、前記触媒コアは、少なくとも１つの追加の基材に作用することができ、前記少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅの基材アームは、少なくとも１つの追加の基材に結合して、前記少なくとも１つの追加のＭＮＡｚｙｍｅの触媒コアが、前記少なくとも１つの追加の基材に作用できるようにする。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも１つの組織化促進物質の存在を検出するための方法であって、（ａ）２つ以上のオリゴヌクレオチド成分を用意すること（少なくとも第１のオリゴヌクレオチド成分及び第２のオリゴヌクレオチド成分は、組織化促進物質の存在下で自己組織化して、触媒活性を持つ少なくとも１つの多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）を形成する）、（ｂ）（１）前記触媒活性を持つ少なくとも１つのＭＮＡｚｙｍｅの自己組織化、及び（２）前記ＭＮＡｚｙｍｅの触媒活性を可能にする条件で、その２つ以上のオリゴヌクレオチド成分と、その組織化促進物質を含むと推定される試料を接触させること、ならびに（ｃ）前記少なくとも１つのＭＮＡｚｙｍｅの触媒活性の存在を判断すること（その触媒活性の存在によって、前記少なくとも１つの組織化促進物質の存在が示される）を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、組織化促進物質を増幅するステップをさらに含み得る。その増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、環状型等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、自己支持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）のうちの１つまたは複数を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも１つの組織化促進物質の存在を検出するための方法であって、（ａ）２つ以上のオリゴヌクレオチド成分を用意すること（少なくとも第１のオリゴヌクレオチド成分及び第２のオリゴヌクレオチド成分は、少なくとも第１の組織化促進物質の存在下で自己組織化して、触媒活性を持つ少なくとも第１の多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）を形成する）、（ｂ）少なくとも第１の基材を用意すること（前記第１の基材は、前記第１のＭＮＡｚｙｍｅによって改変でき、前記ＭＮＡｚｙｍｅによる前記基材の前記改変によって、検出可能な作用が生じる）、（ｃ）（１）前記少なくとも第１のＭＮＡｚｙｍｅの自己組織化、及び（２）前記少なくとも第１のＭＮＡｚｙｍｅの触媒活性を可能にする条件で、前記２つ以上のオリゴヌクレオチド成分と、前記少なくとも第１の組織化促進物質を含むと推定される試料を接触させること、ならびに（ｄ）前記検出可能な作用を検出することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は、その核酸を増幅するステップをさらに含み得る。その増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、環状型等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、自己支持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）のうちの１つまたは複数を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも１つの標的の存在を検出するための方法であって、（ａ）２つ以上のオリゴヌクレオチド成分を用意すること（その少なくとも第１のオリゴヌクレオチド成分及び少なくとも第２のオリゴヌクレオチド成分は、前記標的の存在下で自己組織化して、触媒活性を持つ多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）を形成でき、前記第１及び前記第２のオリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのアプタマー部分をさらに含む）、（ｂ）（１）前記アプタマー部分への前記標的の結合、及び（２）ＭＮＡｚｙｍｅの触媒活性を可能にする条件で、前記オリゴヌクレオチド成分と、前記少なくとも１つの標的を含むと推定される試料を接触させること、ならびに（ｃ）ＭＮＡｚｙｍｅ触媒活性の存在を判断すること（その触媒活性の存在によって、前記標的の存在が示される）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＭＮＡｚｙｍｅ媒介性シグナル増殖カスケードを用いて、標的を検出するための方法であって、（ａ）前記標的の存在下で自己組織化して、触媒活性を持つ第１の多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）を形成する第１のオリゴヌクレオチド成分及び第２のオリゴヌクレオチド成分を用意すること、（ｂ）第１及び第２の基材が結合されている不溶性支持体を用意すること（前記第１及び第２の基材は、前記第１のＭＮＡｚｙｍｅによって改変でき、少なくとも、前記第１の基材は、触媒活性を持つ第２のＭＮＡｚｙｍｅを形成できる第３のオリゴヌクレオチド成分を、前記第２の基材は、触媒活性を持つ第２のＭＮＡｚｙｍｅを形成できる第４のオリゴヌクレオチド成分を含み、前記第１及び第２の基材が前記第１のＭＮＡｚｙｍｅによって改変されると、前記第３及び第４のオリゴヌクレオチド成分が解離する）、（ｃ）第３及び第４の基材が結合されている前記不溶性支持体を用意すること（前記第３及び第４の基材は、前記第２のＭＮＡｚｙｍｅによって改変でき、少なくとも、前記第３の基材は、触媒活性を持つ第３のＭＮＡｚｙｍｅを形成できる第５のオリゴヌクレオチド成分を、前記第４の基材は、触媒活性を持つ第３のＭＮＡｚｙｍｅを形成できる第６のオリゴヌクレオチド成分を含み、前記第３及び第４の基材が前記第２のＭＮＡｚｙｍｅによって改変されると、前記第５及び前記第６のオリゴヌクレオチド成分が解離する）、（ｄ）前記第２及び前記第３のＭＮＡｚｙｍｅの組織化を促進できる組織化促進物質を用意すること、（ｅ）前記第２のＭＮＡｚｙｍｅによって改変されて、検出可能な作用を示すことができる第５の基材を用意すること、（ｆ）前記組織化促進物質の存在下、かつ前記第１、第２、第３及び第４の基材が結合されている前記不溶性支持体の存在下で、（１）前記第１、第２及び第３のＭＮＡｚｙｍｅの自己組織化、ならびに（２）前記第１、第２及び第３のＭＮＡｚｙｍｅの触媒活性を可能にする条件で、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド成分と、前記標的を含むと推定される試料を接触させること、（ｇ）前記第３のＭＮＡｚｙｍｅが前記第１及び第２の基材を改変することによって、前記第２のＭＮＡｚｙｍｅをさらにもたらし、前記第２のＭＮＡｚｙｍｅが、前記第３、第４及び第５の基材のうちの少なくとも１つをさらに改変することによって、前記第３のＭＮＡｚｙｍｅをさらにもたらし、それによって、前記検出可能な作用をさらにもたらすこと、ならびに（ｈ）前記検出可能な作用の検出によって、前記標的の存在を示すことを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０１２，１４９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ポリメラーゼ連鎖反応などの標準的な核酸増幅方法を使用して増幅され得るｍｉＲＮＡまたは他の小型ＲＮＡの配列を含む、ｃＤＮＡの合成方法を含むことができる。この方法は、小型ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成に高い特異度を提供し、同時に、この合成に必要な２つの主要な酵素反応を実質的に同じ反応条件下で実施する実験を可能とすることができ、この条件は、１０ミリモル～８０ミリモルの濃度での二価カチオンの存在を含む。これらの反応条件が小型ＲＮＡ、とりわけｍｉＲＮＡのアッセイの一部として使用される場合、より大きな特異度及び感度をもたらす。いくつかの実施形態では、小型ＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピーを調製する方法は、（ａ）生体試料から小型ＲＮＡを提供し、前記ＲＮＡが１８～２８個のヌクレオチド長さであること、（ｂ）小型ＲＮＡを、小型ＲＮＡの３’末端へのヌクレオチドの付加を触媒することができる酵素と共に、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰからなる群から選択される単一リボヌクレオチド三リン酸、及び最終濃度が２０ミリモル～８０ミリモルの二価マグネシウムカチオンの存在下、小型ＲＮＡにヌクレオチドを付加する反応においてインキュベートして、尾状小型ＲＮＡを生成すること、（ｃ）ＤＮＡプライマーを尾状小型ＲＮＡにアニールし、そのことが鋳型ＤＮＡを尾状小型ＲＮＡの３’末端から伸長させ、それによって、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の重合の誘導に使用され得るＤＮＡの一本鎖領域を提供すること、ならびに（ｄ）アニールした尾状小型ＲＮＡ及びＤＮＡプライマーを、逆転写酵素及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸及び最終濃度が２０ミリモル～８０ミリモルの二価マグネシウムカチオンの存在下、ｃＤＮＡへの逆転写及びアニールされた尾状小型ＲＮＡの増幅を可能にする条件下でインキュベートして、増幅産物を産生することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，９６２，２５０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）複数の選択された核酸分子を、各対が、選択された核酸配列に特異的である複数の外側プライマー対を含む第１回マルチプレックス増幅反応において増幅し、増幅反応が、反応構成要素のアンプリコン間に大幅な競合が発生した時点の前の時点への進行を可能にすること、ならびに（ｂ）選択された核酸分子を、それぞれが、鋳型として完全マルチプレックス反応の一部及び各対が選択された核酸配列のうちの１つに特異的である少なくとも一対の内側プライマーを含む、複数の第２回増幅反応において、それぞれの第２回反応が、複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれ更に増幅するように、更に増幅することを含む、核酸分子のプールから選択された複数の核酸分子を増幅する方法など、核酸分子増幅及び定量化の方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）複数の選択された核酸分子を、各対が、選択された核酸配列に特異的である複数の外側プライマー対を含む第１回マルチプレックス増幅反応において増幅し、増幅反応が、反応構成要素のアンプリコン間に大幅な競合が発生した時点の前の時点への進行を可能にすること、ならびに（ｂ）選択された核酸分子を、それぞれが、鋳型として完全マルチプレックス反応の一部及び各対が内側プライマーと外側プライマーのうちの１つとを含み、かつ選択された核酸配列のうちの１つに特異的である少なくとも一対のプライマーを含む、複数の第２回増幅反応において、それぞれの第２回反応が、複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれ更に増幅するように、更に増幅することを含む、核酸分子のプールから選択された複数の核酸分子を増幅する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）複数の選択された核酸分子を、各対が、選択された核酸配列に特異的である複数の外側プライマー対を含む第１回マルチプレックス増幅反応において増幅し、増幅反応が、反応構成要素のアンプリコン間に大幅な競合が発生した時点の前の時点への進行を可能にすること、（ｂ）選択された核酸分子を、それぞれが、検出可能レポーター、鋳型として完全マルチプレックス反応の一部及び各対が選択された核酸配列のうちの１つに特異的である少なくとも一対の内側プライマーを含む、複数の第２回増幅反応において更に増幅し、これにより、それぞれの第２回反応が、複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれ更に増幅すること、ならびに（ｃ）それぞれの第２回増幅反応を、検出可能レポーターにより、それぞれの選択された配列の選択された核酸分子の数が推定されるようにモニターすることを含む、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を推定する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）複数の選択された核酸分子を、各対が、選択された核酸配列に特異的である複数の外側プライマー対を含む第１回マルチプレックス増幅反応において増幅し、増幅反応が、反応構成要素のアンプリコン間に大幅な競合が発生した時点の前の時点への進行を可能にすること、（ｂ）選択された核酸分子を、それぞれが、検出可能レポーター、鋳型として完全マルチプレックス反応の一部及び各対が内側プライマーと外側プライマーを含み、かつ選択された核酸配列のうちの１つに特異的である少なくとも一対の外側プライマーを含む、複数の第２回増幅反応において、それぞれの第２回反応が、複数の選択された核酸分子のサブセットをそれぞれ更に増幅するように、更に増幅すること、ならびに（ｃ）それぞれの第２回増幅反応を、検出可能レポーターにより、それぞれの選択された配列の選択された核酸分子の数が推定されるようにモニターすることを含む、核酸分子のプールから選択された核酸分子の数を推定する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、完全入れ子形態（ｆｕｌｌｙ ｎｅｓｔｅｄ ｆｏｒｍ）のマルチプレックス・タンデム・ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｔａｎｄｅｍ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＭＴ－ＰＣＲ）方法が、第１及び第３態様に従って使用され、これにより、選択されたそれぞれの核酸分子が、第１回の増幅において一対の外側プライマーを使用して増幅され、第２回の増幅において２つの内側プライマーを使用して増幅される。いくつかの実施形態では、半入れ子形態のＭＴ－ＰＣＲ方法が第２及び第４態様に従って使用され、これにより、選択されたそれぞれの核酸分子が、第１回の増幅において一対の外側プライマーを使用して増幅され、選択された核酸配列は、第２回の増幅において、第１回の増幅に使用された外側プライマーのうちの１つと、１つの内側プライマーとを対にして含む、一対のプライマーを使用して更に増幅される。いくつかの実施形態では、第２回の増幅反応は、複数のプライマー対及び複数の蛍光プローブを、選択された配列それぞれの選択された複数の核酸分子が、選択された核酸配列にそれぞれ特異的である蛍光プローブにより増幅及び定量化されるように含む。いくつかの実施形態において、外側プライマーのうちの少なくとも１つは、ＵＴＰヌクレオチドを含み、これにより、プライマーは、ＵＮＧ酵素による消化を受けやすくなり、外側プライマーは、ＵＮＧ酵素による消化によって第１回の増幅の終了時に除去され、それによって、第１回のプライマーによる第２回増幅反応における汚染を実質的に防止する。いくつかの実施形態では、この方法は、多形、変異、挿入及び欠失を検出する方法に使用される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ｉ）１つまたは複数の選択された核酸配列を、１つまたは複数の以上の検出可能レポーターと混合するステップ、（ｉｉ）前記１または複数の検出可能レポーターにより生成されたシグナルを測定することにより、解離曲線を生成するステップ、（ｉｉｉ）前記１つまたは複数の選択された核酸配列を、前記解離曲線から同定及び／または定量化するステップが挙げられる、少なくとも１つまたは複数の核酸配列を同定及び／または定量化する方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８７７，４３６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体物質を含有する試料中における標的核酸分子の存在を決定する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料中における標的核酸分子の存在を決定する方法は、ａ）収集媒体に試料を懸濁すること、ｂ）標的核酸分子を試料から収集媒体に放出すること、ｃ）二本鎖標的分子を一本鎖標的核酸分子に変換すること、ｄ）１つまたは複数のプローブと一本鎖標的核酸分子とを、プローブ及び標的一本鎖標的核酸分子がハブリッド形成して、二本鎖核酸ハイブリッドを形成することを可能にする条件下で接触させること、ｅ）二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉すること、ｆ）二本鎖核酸ハイブリッドを、非結合一本鎖標的核酸分子から分離すること、ならびにｇ）二本鎖核酸ハイブリッドを検出し、それにより、標的核酸の存在を示すことを含む。いくつかの実施形態では、検出方法は、自動化されていてもよく、完全自動化または部分的自動化（人間によるなんらかの入力を必要とするもの）のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、複数の試料中における標的核酸分子の、同時または短時間内での、例えば、１台の機械による、または一連の機械による検出である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸分子を含む試料が収集される収集媒体が含まれてもよい。標的核酸分子は、標的核酸分子の最小限の分解を伴って、数週間または数か月間にわたって収集媒体中に保持され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベースの試料物質は、標的核酸分子の最小限の分解を伴って、数週間または数か月間にわたって収集媒体中に保持され得る。いくつかの実施形態では、洗剤ベースの収集媒体は、試料の迅速な分析及びプロセシングを可能にする。いくつかの実施形態では、収集媒体は、約０．５％～約２．０％のＮＰ－４０、約０．１０％～約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ～約７５ｍＭのトリス－ＨＣｌ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのＮａＣｌ及び約０．０１％～約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３７２，６３７号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、以下のステップ、すなわちａ）生体試料を準備するステップ及びｂ）生体試料を、以下の構造式による物質を有する組成物と接触させるステップを有する、生体試料を安定化する方法を含むことができ、
Figure 2023075090000003



式中、Ｒ１は、水素残基またはメチル残基であり、Ｒ２及びＲ３は、１～２０個の炭素鎖の長さを有する、同一の、または異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である。炭化水素残基であるＲ２及び／またはＲ３は、アルキル、長鎖アルキル、アルケニル、アルコキシ、長鎖アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、アルキルシリル、アルキルシリルオキシ、アルキレン、アルケンジイル、アリーレン、カルボキシレート及びカルボニルを含む群から互いに独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｒ２及び／またはＲ３の鎖長ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０の値を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、１～１０個の炭素鎖の長さを有する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、１～５個の炭素鎖の長さを有する。この場合、鎖長ｎは、特に、１、２、３、４及び５の値を有することができる。いくつかの実施形態では、メチル及びエチル残基がＲ２及び／またはＲ３に使用される。その場合鎖長ｎは、１及び２の値を有する。いくつかの実施形態では、この組成物に使用される物質を、唯一の保存剤として使用することができる。いくつかの実施形態では、この物質を他の保存用物質と共に使用することもでき、または組成物中の他の保存用物質への添加剤として使用するだけてあることも可能である。いくつかの実施形態では、組成物中のこの物質と１つまたは複数の他の保存用物質との体積比または重量比は、０．０１：１００～１００：０の範囲であり得る。好ましくは、０．１：１００～１００：０の範囲であり、とりわけ好ましくは、１：１００～１００：０の範囲であり、特に好ましくは、５：１００～１００：０の範囲である。いくつかの実施形態では、使用される物質の種類は、例えば、ジアルキルアセトアミド（Ｒ１がメチル残基の場合）またはジアルキルホルムアミド（Ｒ１が水素残基の場合）である。いくつかの実施形態では、生体試料は、試料物質、血漿、体液、血液、血清、細胞、白血球分画、血液淡黄層、痰、唾液、尿、精液、糞便、法医学的試料、スメア、吸引物、生検材料、組織試料、組織部分及び臓器、食物試料、環境試料、植物及び植物部分、細菌、ウイルス、ウイロイド、プリオン、酵母菌及び真菌、及び前述の物質のフラグメントまたは構成物、ならびに／あるいは単離、合成もしくは修飾タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、代謝産物及び／または代謝物質を含む群から選択される物質である。いくつかの実施形態では、物質は、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルチオホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジエチルチオホルムアミドを含む群から選択される物質である。これらの構造式は以下の通りである。
Figure 2023075090000004


いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０４３，８３４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、分析物を標識及び検出するのに有用な組成物及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、レポーター結合剤、増幅標的サークル及びＤＮＡポリメラーゼの３つの構成要素が会合したものである。組成物は、ローリングサークル増幅反応に使用する前に配合され、使用前に活性を相当量失うことなく貯蔵及び輸送され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、レポーター結合剤、増幅標的サークル及びＤＮＡポリメラーゼを含み、レポーター結合剤は、特異的結合分子及びローリングサークル複製プライマーを含み、特異的結合分子は、標的分子に特異的であり、特異的結合分子は、標的分子に結合しておらず、組成物は、タンデム配列ＤＮＡを含まず、レポーター結合剤、増幅標的サークル及びＤＮＡポリメラーゼは、互いに直接的に会合しており、複合体を形成し、組成物は、アッセイまたは反応物中に存在しない。いくつかの実施形態では、組成物をローリングサークル増幅反応のユニバーサル試薬として使用することができる。この目的のため、組成物は、任意の目的標的分子に存在する、または任意の目的標的分子の標識に使用される特定の部分、または分子と相互作用することができる、特異的結合分子を有することができる。例えば、試薬組成物中の特異的結合分子は、ストレプトアビジンまたは別のビオチン特異的分子（例えば、抗ビオチン抗体）であり得る。次いで、ビオチンで標識された任意の標的分子は、試薬組成物と会合され、標識され、及び／または組成物により媒介されるローリングサークル増幅を介して検出することができる。この試薬組成物は、任意のビオチン化標的分子と共に使用することができる。同様に、抗体のクラス（例えば、抗マウス抗体）に特異的な抗体の、試料組成物における特異的結合分子としての使用である。そのような試薬組成物を使用して、アッセイにおいて抗体クラスを標識及び検出することができる。例えば、試薬組成物を使用して、個別のマウス抗体の特異度にかかわりなく、免疫アッセイにおいて抗原に結合した全てのマウス抗体を標識及び検出することができる。このことは、サンドイッチ免疫アッセイにおける抗体クラスに特異的な抗体の使用に類似している。試薬組成物は、伝統的な免疫アッセイより大きなシグナル増幅及びシグナルの厳密な局在化を提供する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６８２，７９０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体由来物質における核酸の単離及び／または安定化のための組成物を含むことができる。組成物は、必須成分として、下記一般式のカチオン性化合物を含有し、
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ－
式中、
Ｙは、窒素またはリンを示してもよく、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立して、分枝鎖または非分枝鎖Ｃ１～Ｃ２０アルキル基及び／またはＣ６～Ｃ２０アリール基、ならびにＣ６～Ｃ２６アラルキル基を示してもよく、
Ｘ－は、無機または有機の一塩基または多塩基酸のアニオン及び添加剤として少なくとも１つのプロトンドナーを表してもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性化合物はアンモニウム塩からなり、ここでＲ１は、好ましくは１２、１４または１６個の炭素原子を有する高級アルキル基を示し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれの場合にメチル基を示す。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、アラルキル基、好ましくはベンジル基を示し、Ｒ２は、好ましくは１２、１４または１６個の炭素原子を有する高級アルキル基を示し、Ｒ３及びＲ４は、メチル基を示す。いくつかの実施形態では、アニオンは、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫化物、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩である。いくつかの実施形態では、脂肪族ヒドロキシ－ジ及びトリカルボン酸、例えば、タルトロン酸、Ｄ－（＋）、Ｌ－（－）またはＤＬ－リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）－（＋）－酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）－（－）－酒石酸、メソ－酒石酸及びクエン酸が使用される。いくつかの実施形態では、脂肪酸ケトジカルボン酸も添加剤として使用してもよく、例えば、メソシュウ酸及びメソ酢酸などであり、これらのうち、オキサロ酢酸が最も特定的に好ましい。いくつかの実施形態では、アミノ酸を使用してもよく、そのうちα－アミノ酸、例えば、アミノ酢酸（グリシン）、α－アミノプロピオン酸（アラニン）、α－アミノ－イソ吉草酸（バリン）、α－アミノ－イソカプロン酸（ロイシン）及びα－アミノ－β－メチル吉草酸（イソロイシン）などが好ましい。更なる添加剤として、鉱酸及びこれらの塩を使用することもできる。好ましくは、リン酸またはスルホン酸などの鉱酸とアルカリ金属との塩、またはこれらのアンモニウム塩が使用される。リン酸及び硫酸アンモニウムが最も好ましく使用される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体試料において核酸を安定化させる方法であって、貯蔵した安定化組成物を核酸含有溶液と混合することを含む方法（ここで、組成物は、下記一般式のカチオン性化合物を含み、
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ－
式中、Ｙは、窒素またはリンを表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して、分枝鎖または非分枝鎖Ｃ１～Ｃ２０アルキル基及び／またはＣ６～Ｃ２０アリール基、ならびにＣ６～Ｃ２６アラルキル基を表し、
Ｘ－は、無機または有機の一塩基または多塩基酸のアニオン及び少なくとも１つのプロトンドナーを表し、
プロトンドナーは、５０ｍＭ超～飽和の濃度で組成物に存在し、プロトンドナーは、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルキルカルボン酸、飽和及び／または不飽和脂肪族Ｃ２～Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ－ジ及びトリカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、もしくは無機酸、またはこれらの塩の、それら自体または組合せからなる群から選択される）、核酸を安定化すること（ここで、核酸は、カチオン性化合物とのイオン性複合体を形成することによって安定化される）、任意選択で不溶性のイオン性複合体を溶液から分離すること、ならびに任意選択で核酸を不溶性のイオン性複合体から放出することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６８３，０３５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、（１）生体試料からの核酸を安定化及び／または単離する方法であって、次のステップ、生体試料を少なくとも１つの式（Ｉ）のカチオン性化合物と接触させるステップを含む方法
Figure 2023075090000005



（ここで、強及び／または弱無機及び／または有機酸の共役塩基が、アニオン（Ａ）として使用され、（Ｉ）及びアニオンからなる物質は、全体の電荷が中性であり、式中、
Ｘは、窒素（Ｎ）またはリン（Ｐ）を表し、
ｋは、整数の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４を表し、
Ｂｋは、脂肪族アルカンジイル架橋を表し、これは置換されていなくても、１個または複数の炭素原子で置換されていてもよく、１個以上の非隣接炭素原子は、酸素に置き換えられていてもよく、以下の構造を有し、
－（ＣＨ２）ｎ－（ＯＣＨ２）ｍ－
ここで、ｎ及びｍは、それぞれ、整数の０、１、２、３、４、５、または６を独立して表し、ｎ＋ｍ＞０であり、
Ｂｋは、置換フェニル、ナフチルまたはビフェニル架橋を表し、これらは追加的に１個または複数の炭素原子で置換されていてもよく、以下の構造を有し、
Figure 2023075090000006


または
Figure 2023075090000007


または
Figure 2023075090000008



ここで、ｎ、ｍ、ｌ、ｐ、ｑは、整数の０、１、２、３、４、５、または６を独立して表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｋは、同一であっても、異なっていてもよく、非置換であっても、１個または複数の炭素原子で置換されていてもよく、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１～Ｃ６アルキル、直鎖または分枝鎖Ｃ１～Ｃ６アルケニル、直鎖または分枝鎖Ｃ１～Ｃ６アルキニル、フェニル、ベンジル、及び以下の構造を有するフェノキシエチルを表し、
Figure 2023075090000009



ここで、ｎ、ｍは、整数の０、１、２、３、４、５、または６を独立して表し、
Ｚは、構造－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＣＯ２－、－ＯＣＯ－、－ＣＯ－Ｎ－、－Ｎ－ＣＯ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｎ－、－Ｎ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｓ－、または－Ｓ－Ｓ－のうちの１つ表し、
あるいは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ｋは、フェニル、ベンジル、以下の構造を有するフェノキシエチルを表し、
Figure 2023075090000010



ここで、ｎ、ｍは、整数の０、１、２、３、４、５、または６を独立して表し、
ＲＡ、ＲＢｋ、ＲＣは、同一であっても、異なっていてもよく、非置換であっても、１個または複数の炭素原子で置換されていてもよく、水素、直鎖または分枝鎖Ｃ１～Ｃ２１アルキル、直鎖または分枝鎖Ｃ１～Ｃ２１アルケニル、直鎖または分枝鎖Ｃ１～Ｃ２１アルキニル、及び以下の構造を表し、
ＣＨ３－（ＣＨ２）ｎ－Ｚ－（ＣＨ２）ｍ－
ここで、ｎ、ｍは、整数の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４を独立して表し、
Ｚは、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＣＯ２－、－ＯＣＯ－、－ＣＯ－Ｎ－、－Ｎ－ＣＯ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｎ－、－Ｎ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｓ－、または－Ｓ－Ｓ－を表し、
またはこれに代えて、ＲＡ及びＲＣは、一緒になって、環状構造を有する残基ＲＡＣを形成し、
Figure 2023075090000011



ここで、残基ＲＡＣは、非置換であっても、１個または複数の炭素原子で置換されていてもよく、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１～Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１～Ｃ８アルケニル、または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１～Ｃ８アルキニルを表し、
ｋ＞１の場合、架橋基Ｂｋ、基ＲＢｋ及びＲ３ｋは、同一である、または異なっている）、
（２）上記の式（Ｉ）により定義された少なくとも１つのカチオン性化合物を含む、核酸を安定化及び／または単離するキット、（３）方法（１）の結果により形成された、核酸及び少なくとも１個のカチオン性化合物を含む複合体、（４）上記の式（Ｉ）により定義された少なくとも１つカチオン性化合物を含む組成物、（５）（４）の組成物を含む薬学的組成物、（６）（４）の組成物を含む診断用組成物、ならびに（７）（４）の組成物を含む研究用組成物を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３２３，３１０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的鋳型ＲＮＡからＲＮＡを選択的に増幅するための、細胞ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及び前記標的鋳型ＲＮＡに相補的な少なくとも２つのプライマーを含む増幅反応混合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）は、トマトまたは他の細胞ＲｄＲｐである。いくつかの実施形態では、ＲｄＲｐは、細胞ＲｄＲｐであり、特に好ましい実施形態では、ＲｄＲｐは、トマトＲｄＲｐ、タバコＲｄＲｐ、キュウリＲｄＲｐ及びコムギＲｄＲｐからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、増幅反応混合物は、細胞ＲｄＲｐ及び標的鋳型ＲＮＡに相補的な少なくとも２つのプライマーを含む。好ましい実施形態において、反応混合物はＲＮＡヘリカーゼ、エネルギー源、任意選択で、例えばＭｇ２＋、Ｍｎ２＋またはＣｏ２＋などの二価カチオンを更に含む。増幅反応混合物は、ＲＮアーゼ阻害剤、ＲＮＡ安定剤、一本鎖結合タンパク質、ｒＮＴＰ及びｒＮＴＰ類縁体を、標的ＲＮＡをＲＮＡ産物に増幅するために更に含むことができる。増幅緩衝液も提供され、ＲｄＲｐとＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を支持する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、鋳型ＲＮＡからＲＮＡを選択的に増幅する方法であって、鋳型ＲＮＡを請求項１に従って増幅反応混合物と接触させること及び前記増幅反応混合物をインキュベートして、増幅ＲＮＡ産物を産生することを含み、前記インキュベーションステップが少なくとも１つの変性条件を含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９７７，１５３号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＲＮＡ分子から第１鎖ｃＤＮＡ分子を合成すること、第１鎖ｃＤＮＡ分子を環状化すること及びローリングサークル複製を使用して、環状化第１鎖ｃＤＮＡを複製することを伴う方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＲＮＡ配列を増幅する方法であって、ｃＤＮＡプライマー、及びＲＮＡ分子を含むＲＮＡ試料を、ＲＮＡ分子からの第１鎖ｃＤＮＡ分子の合成を促進する条件下でインキュベートすること、環状化プローブ及び第１鎖ｃＤＮＡ分子を、第１鎖ｃＤＮＡ分子の環状化を促進する条件下でインキュベートすること、ならびに環状化第１鎖ｃＤＮＡ分子を、環状化第１鎖ｃＤＮＡ分子のローリングサークル複製を促進する条件下でインキュベートして、ＲＮＡ配列を増幅することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＲＮＡ配列を増幅する方法であって、ｃＤＮＡプライマー、及びＲＮＡ分子を含むＲＮＡ試料を、ＲＮＡ分子からの第１鎖ｃＤＮＡ分子の合成を促進する条件下でインキュベートすること（ここで、第１鎖ｃＤＮＡ分子の合成を促進する条件は、ｃＤＮＡプライマー及びＲＮＡ試料を逆転写酵素の存在下でインキュベートすることを含む）、第１鎖ｃＤＮＡ分子をＲＮアーゼＨ活性の存在下でインキュベートすること、第１鎖ｃＤＮＡ分子をアルカリ条件下でインキュベートすること、第１鎖ｃＤＮＡ分子を中和すること、第１鎖ｃＤＮＡ分子を精製すること、環状化プロ－ブ及び第１鎖ｃＤＮＡ分子を、第１鎖ｃＤＮＡ分子の環状化を促進する条件下でインキュベートすること（ここで、第１鎖ｃＤＮＡ分子の環状化を促進する条件は、環状化プローブ及び第１鎖ｃＤＮＡ分子をリガーゼの存在下でインキュベートすることを含む）、環状化された第１鎖ｃＤＮＡ分子を、環状化第１鎖ｃＤＮＡ分子のローリングサークル複製を促進する条件下でインキュベートし、それによってＲＮＡ配列を増幅すること（ここで、環状化第１鎖ｃＤＮＡ分子のローリングサークル複製を促進する条件は、環状化第１鎖ｃＤＮＡ分子をＤＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベートすることを含む）を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＲＮＡ配列を増幅する方法であって、ｃＤＮＡプライマー、及びＲＮＡ分子を含むＲＮＡ試料を、ＲＮＡ分子からの第１鎖ｃＤＮＡ分子の合成を促進する条件下でインキュベートすること、環状化プローブ及び第１鎖ｃＤＮＡ分子を、第１鎖ｃＤＮＡ分子を互いに連結させて第１鎖ｃＤＮＡ鎖状体を形成する条件下でインキュベートすること、ならびに第１鎖ｃＤＮＡ鎖状体を、第１鎖ｃＤＮＡ鎖状体の鎖置換複製を促進する条件下でインキュベートして、ＲＮＡ配列を増幅することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８１５，２１２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、リガンド対の第２メンバーへの第１メンバーの結合を検出するために提供される方法であって、（ａ）１セットのタグ付け第１メンバーを、１つまたは複数の第２メンバーを含有し得る生体試料と、第２メンバーへの第１メンバーの結合を許容する条件下で十分な時間にわたって組合せ、前記タグが特定の第１メンバーと相関関係にあり、非蛍光分光測定または電位差測定により検出可能であるステップ、（ｂ）結合した第１及び第２メンバーを非結合メンバーから分離するステップ、（ｃ）タグをタグ付け第１メンバーから切断するステップ、ならびに（ｄ）タグを非蛍光分光測定または電位差測定により検出し、そこから第２メンバーへの第１メンバーの結合を検出するステップを含む方法を含むことができる。多種多様な第１及び第２メンバー対を利用することができ、例えば、核酸分子、（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸類縁体、例えばＰＮＡ、もしくはこれらの任意の組合せ）、タンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、もしくはＣＤＲなどの結合パートナー）、オリゴ糖、ホルモン、有機分子及び他の基質（例えば、グルクロニダーゼなどの生体異物－薬物分子）、または任意の他のリガンド対が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１及び第２メンバーは、同じタイプの分子または異なるタイプの分子であってもよい。例えば、代表的な第１メンバー第２メンバーリガンド対には、核酸分子／核酸分子、抗体／核酸分子、抗体／ホルモン、抗体／生体異物、及び抗体／タンパク質が挙げられる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、選択された生体試料から遺伝子発現パターンを分析する方法であって、（ａ）生体試料から核酸を露出させるステップ、（ｂ）露出させた核酸を１つまたは複数の選択されたタグ付け核酸プローブと、前記プローブを前記核酸とハイブリッド形成させる条件下で十分な時間にわたって組合せ、タグが特定の第１メンバーと相関関係にあり、非蛍光分光測定または電位差測定により検出可能であるステップ、（ｃ）ハイブリッド形成プローブを非ハイブリッド形成プローブから分離するステップ、（ｄ）タグをタグ付けフラグメントから切断するステップ、及び（ｅ）タグを非蛍光分光測定または電位差測定により検出し、そこから生体試料の遺伝子発現パターンを決定するステップを含む方法を含むことができる。一実施形態の範囲内では、生体試料を、核酸を露出させるステップの前に、選択された分子で刺激してもよい。「刺激剤」の代表的な例には、核酸分子、組み換え遺伝子送達ビヒクル、有機分子、ホルモン、タンパク質、炎症性因子、サイトカイン、薬物、薬物候補、パラクリン及びオートクリン因子などが挙げられる。更なる実施形態の範囲内では、タグ（複数可）は、蛍光光度分析、質量分析、赤外分光測定、紫外分光測定、または定電位電流測定（例えば、電量または電流滴定検出器を利用する）によって検出され得る。適切な分光測定技術の代表的な例には、飛行時間型質量分析、四重極型質量分析、磁場セクター型質量分析及び電場セクター型質量分析が挙げられる。そのような技術の特定の実施形態には、イオントラップ質量分析、エレクトロスプレーイオン化質量分析、イオンスプレー質量分析、液体イオン化質量分析、大気圧イオン化質量分析、電子イオン化質量分析、高速原子衝撃イオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、光イオン化飛行時間型質量分析、レーザー液滴質量分析、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析、ＡＰＣＩ質量分析、ナノスプレー質量分析、噴霧スプレーイオン化質量分析、化学イオン化質量分析、共鳴イオン化質量分析、二次イオン化質量分析及び熱スプレー質量分析が挙げられる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３６１，９４０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＰＣＲにおいて核酸のハイブリッド形成特異度及び核酸のプライミングを増加するための組成物及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は核酸及び塩を含み、塩はアニオン及びカチオンを含み、アニオンは、ハロゲン化酢酸塩、プロピオン酸塩及びハロゲン化プロピオン酸塩から選択され、カチオンは、１～３６個の炭素原子を含む第一級、第二級及び第三級アンモニウム、ならびに４～４８個の炭素原子を含む第四級アンモニウムから選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、非流動性であり、６～１００個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド及び塩を含み、塩はアニオン及びカチオンを含み、アニオンは、酢酸塩、ハロゲン化酢酸塩、プロピオン酸塩及びハロゲン化プロピオン酸塩から選択され、カチオンは、１～３６個の炭素原子を含む第一級、第二級及び第三級アンモニウム、ならびに４～４８個の炭素原子を含む第四級アンモニウムから選択される。いくつかの実施形態では、組成物は有機溶媒を含まず、６～１００個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド及び塩を含み、塩はアニオン及びカチオンを含み、アニオンは、酢酸塩、ハロゲン化酢酸塩、プロピオン酸塩及びハロゲン化プロピオン酸塩から選択され、カチオンは、１～３６個の炭素原子を含む第一級、第二級及び第三級アンモニウム、ならびに４～４８個の炭素原子を含む第四級アンモニウムから選択される。いくつかの実施形態では、組成物は核酸及び塩を含み、核酸は、固体支持体に固定化されており、塩はアニオン及びカチオンを含み、アニオンは、酢酸塩、ハロゲン化酢酸塩、プロピオン酸塩及びハロゲン化プロピオン酸塩から選択され、カチオンは、１～３６個の炭素を含む第一級、第二級及び第三級アンモニウム、ならびに４～４８個の炭素を含む第四級アンモニウムから選択される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）ＲａがＣ４～Ｃ７ヒドロカルビルである式ＨＮ（ＣＨ３）２Ｒａのカチオンの酢酸塩、（ｂ）ＲｂがＣ７～Ｃ１２ヒドロカルビルである式ＨＮ（ＣＨ３）２Ｒｂのカチオンのハロゲン化酢酸塩、（ｃ）ＲｃがＣ１～Ｃ１２ヒドロカルビルである式Ｈ２Ｎ（Ｃ５～Ｃ７シクロアルキル）Ｒｃのカチオンの酢酸塩及びハロゲン化酢酸塩、ならびに（ｄ）ピペリジンの窒素がＣ１～Ｃ１２ヒドロカルビルで置換されている、Ｎ置換ピペリジンの酢酸塩及びハロゲン化酢酸塩の群から選択される塩を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、溶液中のオリゴヌクレオチドを含むことができ、オリゴヌクレオチドは、複数のフラグメントを含む構成物から形成され、それぞれのフラグメントは、下記構造（１）により概略的に示されており、
Figure 2023075090000012



ここで、
Figure 2023075090000013



は、野生型ＤＮＡに見いだされる少なくとも３個のヌクレオチドの配列を表し、「Ｂ」は、それぞれの位置で独立して選択される塩基を表し、－は、一連の共有化学結合を表し、「特異度スペーサー」と称され、２個の塩基Ｂ３及びＢ５を分離及び接続し、特異度スペーサーは、（ａ）構造（１）のフラグメントと、下記構造（２）として概略的に示されている相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドフラグメントとの間のハイブリッド形成を防止しないような、
Figure 2023075090000014



及び（ｂ）構造（２）のハイブリッド形成相補的塩基配列の反対側に位置する塩基との水素結合を始めることができないような、立体及び化学特性を有する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、アレイを含むことができ、アレイは、固体支持体にアレイ形式で固定化された複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドにおける、それぞれのオリゴヌクレオチドは、複数のフラグメントを含む構成要素から形成され、それぞれのフラグメントは、下記構造（１）により概略的に示されており
Figure 2023075090000015



ここで、
Figure 2023075090000016



は、野生型ＤＮＡに見いだされる少なくとも３個のヌクレオチドの配列を表し、「Ｂ」は、それぞれの位置で独立して選択される塩基を表し、－は、一連の共有化学結合を表し、「特異度スペーサー」と称され、２個の塩基Ｂ３及びＢ５を分離及び接続し、特異度スペーサーは、（ａ）構造（１）のフラグメントと、下記構造（２）として概略的に示されている相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドフラグメントとの間のハイブリッド形成を防止しないような、
Figure 2023075090000017



及び（ｂ）構造（２）のハイブリッド形成相補的塩基配列の反対側に位置する塩基との水素結合を始めることができないような、立体及び化学特性を有する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、プローブと標的が完全に相補的である相補的核酸標的及び核酸プローブのハイブリッド形成と、プローブと標的が１個または複数の塩基ミスマッチを有するハイブリッド形成を区別する方法であって、（ａ）核酸標的を、ハイボトロープ（ｈｙｂｏｔｒｏｐｅ）を含む溶液中において核酸プローブと混合すること、（ｂ）区別温度（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）でハイブリッド形成すること、及び（ｃ）標的とハイブリッド形成したプローブを検出し、それによって、核酸プローブと標的が完全に相補的であるか、またはミスマッチしているかを決定することを含む方法を含むことができる。好ましい実施形態では、核酸プローブは、放射性分子、蛍光分子、質量分析タグ、または酵素により標識される。好ましい実施形態では、核酸プローブ及び／または標的核酸は、６～４０個の塩基のものである。好ましくは、ハイボトロープはアンモニウム塩である。特に好ましいアンモニウム塩ハイボトロープには、限定されることなく、ビス（２－メトキシエチル）アミンアセテート、１－エチルピペリジンアセテート、１－エチルピペリジントリクロロアセテート、１－エチルピペリジントリフルオロアセテート、１－メチルイミジゾールアセテート、１－メチルピペリジンアセテート、１－メチルピペリジントリクロロアセテート、１－メチルピロリジンアセテート、１－メチルピロリジントリクロロアセテート、１－メチルピロリジントリフルオロアセテート、２－メトキシエチルアミンアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルシクロヘキシルアミンアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルシクロヘキシルアミントリフルオロアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプチルアミンアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプチルアミンアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキシルアミンアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキシルアミンアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルイソプロピルアミンアセテート、Ｎ－エチルブチルアミンアセテート、Ｎ－エチルブチルアミントリフルオロアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノブタントリクロロアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルイソプロピルアミントリクロロアセテート、トリエタノールアミンアセテート、トリエチルアミンアセテート、トリエチルアミントリクロロアセテート、トリプロピルアミンアセテート及びテトラエチルアンモニウムアセテートが挙げられる。他の適切なハイボトロープには、ＬｉＴＣＡ、ＲｂＴＣＡ、ＧｕＳＣＮ、ＮａＳＣＮ、ＮａＣｌＯ ４、ＫＩ、ＴＭＡＴＣＡ ＴＥＡＴＣＡ、ＴＭＡＴＢＡ、ＴＭＴＣＡ、ＴＭＴＢＡ、ＴＢＡＴＣＡ及びＴＢＡＴＢＡが挙げられる。好ましくは、ハイボトロープは、約０．００５Ｍ～約６Ｍのモル濃度で存在する。好ましくは、プローブ核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。好ましくは、標的核酸は、固体基材に固定されている。好ましくは、方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を更に含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、プローブと標的が完全に相補的である相補的核酸標的及び核酸プローブのハイブリッド形成と、プローブと標的が１個または複数の塩基ミスマッチを有するハイブリッド形成を区別する方法であって、（ａ）核酸標的を、少なくとも１個の脱塩基またはデオキシネブラリン（ｄｅｏｘｙＮｅｂｕｌａｒｉｎｅ）置換を含有する核酸プローブと混合すること、（ｂ）区別温度でハイブリッド形成すること、及び（ｃ）標的に結合したプロ－ブを検出し、それによって、核酸プローブと標的が完全に相補的であるか、またはミスマッチしているかを決定することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸合成手順において区別を増加する方法であって、（ａ）一本鎖核酸標的を、ハイボトロープおよびポリメラーゼを含む溶液中において、オリゴヌクレオチドプライマーと混合すること、（ｂ）プライマーを標的に区別温度でアニールすること、及び（ｃ）相補鎖を標的と合成して、二重鎖を形成することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸分子における単一塩基変化を野生型から区別する方法であって、（ａ）一本鎖核酸標的を、アミンベース塩及びポリメラーゼを含む溶液中において、オリゴヌクレオチドプライマーと混合し、オリゴヌクレオチドプライマーが、野生型配列に相補的な最３’塩基、または単一塩基変化を有すること、（ｂ）プライマーを区別温度で標的にアニールすること、（ｃ）プライマーを伸長し、プライマーの最３’塩基が標的に相補的である場合、標的に相補的な鎖が合成されること、及び（ｄ）プライマーの伸長を検出することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２４８，５２１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、鋳型から核酸分子を増幅する方法であって、（ａ）固体基材上の一本鎖標的核酸鋳型を、鋳型とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを含む溶液と混合し、混合が、基材の別の区域において生じ、溶液が別の区域に留まっていること、（ｂ）相補鎖を鋳型に合成して、二重鎖を形成すること、（ｃ）二重鎖を変性すること、及び（ｄ）相補鎖を鋳型に合成し、これから核酸分子を増幅することを含み、混合、合成及び変性が露点で実施される方法を含むことができる。固体基材はケイ素ウエハまたはガラススライドであってもよい。鋳型は、固体基材に共有結合していても、基材の表面に付着していてもよい。鋳型は、混合される前にアレイ全体に均一に適用されてもよく、または基材の別の区域にそれぞれ個別に適用されてもよい。個別に適用される場合、好ましくは、適用はスプリングプローブを使用して実施される。最も好ましい実施形態では、機器が露点を制御するために使用される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、単一ヌクレオチド伸長アッセイを実施する方法が提供され、（ａ）固体基材上のオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する一本鎖核酸分子を含む溶液、単一ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼと混合し、混合が基材の別の区域において生じ、溶液が別の区域に留まっていること、ならびに（ｂ）オリゴヌクレオチドの伸長産物を検出し、単一オリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチドと相補的である場合にのみ、オリゴヌクレオチドが伸長することを含み、混合が露点で実施される方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０１５５７０５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、細胞外核酸を生体試料から単離する方法であって、（ａ）試料から、ｉ）細胞外核酸、ｉｉ）アニオン交換表面を提供する粒子、ｉｉｉ）少なくとも１種の非イオン性洗剤（ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル）、ｉｖ）任意選択で少なくとも１種の塩を含む結合混合物を調製し、結合混合物が、細胞外核酸が粒子に結合するようなｐＨを有すること、（ｂ）結合した細胞外核酸を有する粒子を、残りの結合混合物から分離すること、（ｃ）任意選択で、結合細胞外核酸を洗浄すること、及び（ｄ）任意選択で、結合細胞外核酸を溶出することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、結合混合物は、粒子を、少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含み、任意選択で塩を含む溶解産物及び／もしくは結合組成物、及び／または緩衝液と接触させて懸濁液を形成すること、懸濁液を、細胞外核酸を含む試料と接触させること、ならびに任意選択で、試料が懸濁液と接触する前、接触すると同時、または接触した後に、タンパク質分解酵素を添加することによって、調製される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、方法を実施するためのキットであって、（ａ）ｉ）少なくとも１種の非イオン性洗剤（ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル）、ｉｉ）任意選択で少なくとも１種の塩、ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝液を含む溶解産物及び／または結合組成物（ここで前記組成物は、酸性ｐＨを有する）、（ｂ）アニオン交換表面を提供する粒子、（ｃ）任意選択で、タンパク質分解酵素（ｄ）任意選択で１種または複数の洗浄溶液、ならびに（ｅ）任意選択で、１種または複数の溶出溶液を含むキットを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０１４８７１６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、環状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）またはシークエンシングライブラリを生成する方法を含むことができ、この方法は、ｄｓＤＮＡを環状化すること、または第１及び第２ｄｓＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼ及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質もしくは二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で連結させることを含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングライブラリを生成する方法は、連結する前に、更なるステップ、すなわち（ｉ）ＤＮＡフラグメントを提供するステップ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ酵素、及びポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって、ＤＮＡフラグメントを末端修復するステップ、ならびに（ｉｉｉ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素により、末端修復ＤＮＡフラグメントの末端に末端アデニンを付加するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、シークエンシングのために、連結されたフラグメントを精製及びサイズ選択する後続ステップを更に含む。いくつかの実施形態では、アダプター連結フラグメントはシークエンシングの前に増幅される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ｉ）ＤＮＡリガーゼ及び（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合タンパク質または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合タンパク質を含むキットを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ、及びポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、（ｉｉ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、（ｉｉｉ）ＤＮＡリガーゼ、（ｉｖ）一本鎖または二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ならびに（ｖ）任意選択で、反応緩衝液を含む。好ましい実施形態では、キットのうちのいずれも、リガーゼ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合タンパクまたは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合タンパク質及び任意選択で、反応緩衝液の混合物を含む。好ましい実施形態では、ポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡポリメラーゼである。上記に参照された方法またはキットでは、ポリヌクレオチドキナーゼ酵素は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）であり、ポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼであり、及び／またはデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素は、Ｔａｑポリメラーゼもしくはクレノウ断片エキソ－である。いくつかの実施形態では、第１及び第２ｄｓＤＮＡが、両方とも２つのｓｓＤＮＡ末端を含み、これによって、第１ｄｓＤＮＡのそれぞれのｓｓＤＮＡ末端が、第２ｄｓＤＮＡのそれぞれの相補的ｓｓ末端と連結して、連結環状ｄｓＤＮＡをもたらす連結方法が参照される。いくつかの実施形態では、第１または第２ＤＮＡは、コンピテント細胞内で自己複製をする能力を付与することができる。上記に参照された方法またはキットでは、ＤＮＡ結合タンパク質は、ウイルス、細菌、古細菌、または真核細胞一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質もしくは二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、上記の方法またはキットのうちのいずれにおけるＤＮＡリガーゼも、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。他の実施形態では、リガーゼは、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼまたはＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）である。上記の方法のいくつかの実施形態では、第１及び第２ｄｓＤＮＡのそれぞれは、１つまたは２つの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）末端（複数可）を有する。この／これらのｓｓＤＮＡ末端（複数可）は、２０個未満のヌクレオチド（ｎｔ）長さである。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０００２７３８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸試料中の標的核酸を増幅する方法及びそのような方法に有用なキットを含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸試料中の標的核酸を増幅する方法は、（ａ）複数のバーコードプライマー（ＢＣプライマー）を、標的核酸を鋳型として使用してそれぞれ伸長して、伸長産物を得ること（ここで、（ｉ）それぞれのバーコードプライマーは、５’から３’の順で、第１ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ１）、分子タグ配列（ＭＴ）及び第１標的特異性配列（ＴＳ１）を含み、（ｉｉ）複数のバーコードプライマーは、少なくとも２０個の異なるバーコードプライマーを含み、（ｉｉｉ）複数のバーコードプライマー（ＢＣプライマー）のうち、第１ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ１）は同一であるが、第１標的特異性配列（ＴＳ１）は異なっている）、（ｂ）ステップ（ａ）で伸長されなかった複数のバーコードプライマーを伸長産物から分離すること、ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）の伸長産物を、複数の限定増幅プライマー（ＬＡプライマー）の存在下で増幅して、複数の第１増幅産物を得ること（ここで、（ｉ）それぞれの限定増幅プライマーは、５’から３’の順で、第２ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ２）及び第２標的特異性配列（ＴＳ２）を含み、（ｉｉ）複数の限定増幅プライマーのうち、第２ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ２）は同一であるが、第２標的特異性配列（ＴＳ２）は異なっている）を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（１）複数のバーコードプライマー（ＢＣプライマー）（ここで、（ｉ）それぞれのバーコードプライマーは、５’から３’の順で、第１ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ１）、分子タグ配列（ＭＴ）及び第１標的特異性配列（ＴＳ１）を含み、（ｉｉ）複数のバーコードプライマーは、少なくとも２０個の異なるバーコードプライマーを含み、（ｉｉｉ）複数のバーコードプライマー（ＢＣプライマー）のうち、第１ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ１）は同一であり、分子タグ配列（ＭＴ）は異なっており、第１標的特異性配列（ＴＳ１）は異なっている）、及び（２）複数の限定増幅プライマー（ＬＡプライマー）（ここで、（ｉ）それぞれの限定増幅プライマーは、５’から３’の順で、第２ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ２）及び第２標的特異性配列（ＴＳ２）を含み、（ｉｉ）複数の限定増幅プライマーのうち、第２ユニバーサルプライマー配列（ＵＳ２）は同一であるが、第２標的特異性配列（ＴＳ２）は異なっている）を含むキットを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３７４３３０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、細胞含有生体試料に含まれる細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法が提供され、細胞含有試料を、安定剤として少なくとも１種のポリ（オキシエチレン）ポリマーと接触させること、または安定剤としてモノエチレングリコールと接触させることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離する方法が提供され、この方法が、ａ）細胞含有生体試料を上記に定義された方法に従って安定化すること及びｂ）安定化された試料から細胞外核酸を単離することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、細胞含有生体試料を安定化するのに適した組成物が提供され、ｉ）安定剤としてポリ（オキシエチレン）ポリマー、あるいはｉｉ）安定剤としてモノエチレングリコール、ならびに１種または複数の第一級、第二級もしくは第三級アミド、カスパーゼ阻害剤、抗凝固剤及び／またはキレート剤からなる群から選択される１種または複数、好ましくは２種または複数の更なる添加剤を含む組成物を含むことができる。好ましくは、組成物は、安定剤として、ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、これは、好ましくは少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであり、好ましくは高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである第１のポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量を少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００、もしくは少なくとも４００下回る分子量を有する少なくとも１種の更なるポリ（オキシエチレン）ポリマー（ここで、前記更なるポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである）、１種以上の第一級、第二級もしくは第三級アミド、カスパーゼ阻害剤、抗凝固剤及び／またはキレート剤からなる群から選択される１種または複数、好ましくは２種または複数の更なる添加剤を更に含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、細胞含有生体試料を収集する収集装置が提供され、収集装置が、ｉ）安定剤としてポリ（オキシエチレン）ポリマー、あるいはｉｉ）安定剤としてモノエチレングリコール、ならびに１種もしくは複数の第一級、第二級もしくは第三級アミド、カスパーゼ阻害剤、抗凝固剤及び／またはキレート剤からなる群から選択される１種または複数の更なる添加剤を含む収集装置をを含むことができる。好ましくは、第５の態様による収集装置は、安定剤として、ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、これは、好ましくは少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであり、好ましくは高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである第１のポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量を少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００もしくは少なくとも４００下回る分子量を有する少なくとも１種の更なるポリ（オキシエチレン）ポリマー（ここで、前記更なるポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである）、１種以上の第一級、第二級もしくは第三級アミド、カスパーゼ阻害剤、抗凝固剤及び／またはキレート剤からなる群から選択される１種または複数、好ましくは２種または複数の更なる添加剤を更に含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００４８５６４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、変異型観察のための地域データベースの構築方法であって、複数の個別のユーザーにより生成された試料に由来するヒト変異型データベースを受け取り、ユーザーが、プールした変異型観察を他のユーザーと共有することに同意すること、受け取ったヒト変異型デーテセットをゲノム情報知識ベースに記憶すること、知識ベースを検索して、プールへの算入基準を満たす複数の変異型観察を同定すること、同定された変異型観察をそれぞれプールに追加すること、及びプールにおいて１つまたは複数の匿名としたアレル統計を計算することを含み、受け取ること、記憶、検索、追加または計算のうちの少なくとも１つは、１台または複数のコンピュータによって実施される方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、臨床試験の候補を決定する方法であって、遺伝子標的化基準を含む臨床試験登録基準をユーザーから受け取ること、複数の独立した実体から受け取った患者試験情報の知識ベースを、臨床試験登録基準にマッチした患者について検索すること、及び臨床試験登録基準にマッチした同意済患者についての検索結果をユーザーに提供することを含み、受け取ること、検索または提供のうちの少なくとも１つは、１台または複数のコンピュータによって実施される方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００１７３２０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシングエラーを低減し、それにより変異検出及びトランスクリプトームプロファイリングの精度を改善する方法を含むことができ、準ランダムバーコードを使用して、増幅前のシークエンシングフラグメントにタグ付けして、バイアス及びシークエンシングエラーを低減する方法が挙げられる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、準ランダムバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことができ、シークエンシングアダプター、逆転写プライマー及びＰＣＲプライマーが挙げられる。「準ランダムバーコード配列」、「準ランダム配列」または「準ランダムバーコード」という用語は、それぞれ（Ｘｍｅｒ）ｎからなる準ランダムヌクレオチド配列の集団を指し、Ｘｍｅｒは、３－ｍｅｒ（すなわち、３ヌクレオチドオリゴヌクレオチド、「三量体」とも呼ばれる）、４－ｍｅｒ（すなわち、４ヌクレオチドオリゴヌクレオチド、「四三量体」とも呼ばれる）、５－ｍｅｒ（すなわち、５ヌクレオチドオリゴヌクレオチド、「五量体」と呼ばれる）または６－ｍｅｒ（すなわち、６ヌクレオチドオリゴヌクレオチド、「六量体」とも呼ばれる）であり、ｎは、２～１０の整数である。集団におけるそれぞれのヌクレオチド配列は、「準ランダムバーコード配列」、「準ランダムバーコード」または「準ランダム配列」と呼ばれる。ある特定の実施形態では、準ランダム配列は、（Ｘｍｅｒ）ｎからなり、Ｘｍｅｒは３－ｍｅｒであり、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは、４、５、６、７、８、または９である。ある特定の実施形態では、Ｘｍｅｒは４－ｍｅｒであり、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、または９、好ましくは、２、３、４、５、６、または７である。ある特定の実施形態では、Ｘｍｅｒは５－ｍｅｒであり、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８、好ましくは、２、３、４、５、または６である。ある特定の実施形態では、Ｘｍｅｒは６－ｍｅｒであり、ｎは、２、３、４、５、６、または７、好ましくは、２、３、４、または５である。準ランダムバーコード配列は、確定された配列のＸｍｅｒの混合物から合成されてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、準ランダムバーコードは（Ｘｍｅｒ）ｎからなり、Ｘｍｅｒは、３－ｍｅｒであり、ｎは７である。換言すると、準ランダムバーコードは、７個の三量体からなる２１ｂｐオリゴヌクレオチドの集団である。そのような準ランダムバーコードは、７回の連続ステップで合成されてもよく、それぞれのステップでは、確定された三量体混合物からのランダム三量体が組み込まれてもよい。準ランダムバーコードを合成するための確定されたＸｍｅｒ混合物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個の異なるＸｍｅｒを有してもよい。確定Ｘｍｅｒ混合物から合成された異なる準ランダムバーコードの数は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、または１，０００，０００個であってもよい。好ましくは、それぞれのＸｍｅｒ（例えば、三量体、四量体、五量体及び六量体）は、確定Ｘｍｅｒ混合物において別のＸｍｅｒと異なる少なくとも２個の塩基を有し、それによって、シークエンシングリードにおいて、それぞれのＸｍｅｒブロック内の任意の単一塩基変異型を、異なるバーコードではなくエラーとして同定することができる。ある特定の実施形態において、それぞれのＸｍｅｒ（例えば、四量体、五量体及び六量体）は、確定Ｘｍｅｒ混合物において別のＸｍｅｒと異なる少なくとも３個の塩基を有し、それによって、シークエンシングリードにおいて、それぞれのＸｍｅｒブロック内の任意の単一または２塩基変異型を、異なるバーコードではなくエラーとして同定することができる。ある特定の実施形態において、それぞれのＸｍｅｒ（例えば、五量体及び六量体）は、確定Ｘｍｅｒ混合物において別のＸｍｅｒと異なる少なくとも４個の塩基を有し、それによって、シークエンシングリードにおいて、それぞれのＸｍｅｒブロック内の任意の１、２または３塩基変異型を、異なるバーコードではなくエラーとして同定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドを含むことができ、それぞれのオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に、第１配列及び第２配列を含み、（ａ）第１配列は、（Ｘｍｅｒ）ｎからなる準ランダム配列であり、ここでＸｍｅｒは、３－ｍｅｒ、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒまたは６－ｍｅｒであり、ｎは、２～８の整数であり、（ｂ）第２配列は、（ｉ）少なくとも１０個のヌクレオチド長さであり、（ｉｉ）標的配列に対して完全または実質的に相補的であり、（ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチドにおいて同一である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の二本鎖（ｄｓ）シークエンシングアダプターを含むことができ、それぞれのシークエンシングアダプターは、（ａ）上記のオリゴヌクレオチド（「第１オリゴヌクレオチド」）、ならびに（ｂ）３’から５’の方向に、（ｉ）シークエンシングアダプターの第１オリゴヌクレオチドの第１配列に完全に相補的な配列（「配列Ａ」）及び（ｉｉ）標的配列（「配列Ｂ」）を含む第２ｓｓオリゴヌクレオチドを含み、第１オリゴヌクレオチドは、第２ｓｓオリゴヌクレオチドにアニールする。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の二本鎖（ｄｓ）シークエンシングアダプターセットを含むことができ、（Ａ）それぞれのセットは、複数の一本鎖（ｓｓ）シークエンシングアダプターを含み、それぞれのセットにおいて、それぞれのシークエンシングアダプターは、（ａ）上記の複数のｓｓオリゴヌクレオチドからのオリゴヌクレオチド（「第１オリゴヌクレオチド」）、ならびに（ｂ）（ｉ）シークエンシングアダプターの第１オリゴヌクレオチドの第１配列に完全に相補的な配列（「配列Ａ」）、（ｉｉ）配列Ａの５’に位置する標的配列（「配列Ｂ」）及び（ｉｉｉ）配列Ｂの３’に位置し、第１オリゴヌクレオチドの第３配列に完全に相補的な配列（「配列Ｃ」）を含む第２ｓｓオリゴヌクレオチドを含み、ここで第１オリゴヌクレオチドは、第２ｓｓオリゴヌクレオチドにアニールしており、（Ｂ）異なるセットにおける複数のｄｓシークエンシングアダプターは、第１オリゴヌクレオチドの第３配列及び第２オリゴヌクレオチドの配列Ｃを除いて、互いに同一である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシングライブラリを調製する方法であって、（１）準ランダムバーコード配列（すなわち、第１オリゴヌクレオチドの第１配列）を含む複数のｄｓシークエンシングアダプターを、試料のｄｓＤＮＡ分子またはフラグメントに連結させることを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０２７５２６７号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、最初のＲＮＡ含有組成物をから標的ＮＡ枯渇組成物を調製する方法であって、ａ）最初のＲＮＡ含有組成物を、１つまたは複数のプローブ分子群と接触させ、プローブ分子群が以下、ｉ）群が、１００ｎｔ以下の長さを有する２個または複数の異なるプローブ分子含む、ｉｉ）前記群に含まれるプローブ分子が、標的ＲＮＡに存在する標的領域に相補的である、ｉｉｉ）前記標的領域とハイブリッド形成した場合、２個または複数の異なるプローブ分子が、二本鎖ハイブリッドを形成するように互いに隣接して位置する、という特徴を有し、標的ＲＮＡとプローブ分子の間に二本鎖ハイブリッドを生成すること、ｂ）二本鎖ハイブリッドを、二本鎖ハイブリッドと結合する結合剤を使用して捕捉し、それによってハイブリッド／結合剤複合体を形成すること、ｃ）ハイブリッド／結合剤複合体を組成物から分離し、それによって標的ＲＮＡ枯渇組成物を提供することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、枯渇させるために、例えば異なるｒＲＮＡ種などの不要な標的ＲＮＡにハイブリッド形成し、それによってマーク付けするように、特定的に設計されたプローブ分子群を含むことができる。プローブ分子の各群は、標的領域とも呼ばれる標的ＲＮＡの特定の領域を標的にし、前記標的領域とハイブリッド形成する２個または複数の異なる短プローブ分子を含む。標的領域とハイブリッド形成すると、一群の短プローブ分子は、二本鎖ハイブリッドを形成するように互いに隣接して位置し、したがって近接して位置する。形成された二本鎖ハイブリッドは、標的領域をまたがり、したがって覆っている。次いで、一群の短プローブ分子を含む、形成された二本鎖ハイブリッドは、抗ハイブリッド結合剤により結合され、これによってハイブリッド／結合剤複合体が形成される。前記複合体は、残りの組成物から容易に分離され、それによって、不要な標的ＲＮＡを除去し、したがって、標的ＲＮＡ枯渇組成物を提供することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料に含まれる目的のＲＮＡ分子をシークエンシングする方法であって、ａ）好ましくは試料から全ＲＮＡを単離することによって、ＲＮＡ含有組成物を得ること、ｂ）第１態様による方法を使用して、好ましくは全ＲＮＡであるＲＮＡ含有組成物から、不要な標的ＲＮＡを枯渇させ、それによって、標的ＲＮＡ枯渇組成物を提供すること、ｃ）任意選択で、非結合プローブ分子を除去すること、ｄ）標的ＲＮＡ枯渇組成物に含まれるＲＮＡ分子をシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０２２５７７５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する方法であって、ａ）単一反応混合物中において１個または複数の異なる標的核酸に特異的な１個または複数の異なるプライマー対の存在下、１個または複数の異なる標的核酸をＰＣＲにより増幅することを含み、１個または複数の異なるプライマー対のそれぞれのプライマーが、１個または複数の切断可能塩基を含有し、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれが、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも４個のヌクレオチドによって隔てられている方法を含むことができる。ある特定の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも５個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも６個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも７個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも８個のヌクレオチドによって隔てられている。ステップａ）は、単一反応混合物中において単一標的核酸に特異的なプライマー対の存在下、単一標的核酸を増幅することを含んでもよい。これに代えて、ステップａ）は、単一反応混合物中において複数の標的核酸に特異的な複数の異なるプライマー対を増幅することを含んでもよい。ある特定の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも４個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも５個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも6個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも7個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも8個のヌクレオチドによって隔てられている。好ましくは、切断可能塩基はウラシルである。これに代えて、切断可能塩基は、イノシン、酸化ピリミジン、酸化プリン、５－ヒドロキシウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシルまたは５－ホルミルウラシルである。１個または複数の異なるプライマー対は、少なくとも１００個の異なるプライマー対から構成されてもよい。いくつかの実施形態では、方法は、ｂ）ステップａ）の増幅産物（複数可）において１個または複数の切断可能塩基を切断して、増幅産物（複数可）中に一本鎖ＤＮＡオーバーハングを産生すること、ｃ）ステップｂ）で得た一本鎖ＤＮＡオーバーハングを消化して、切断（ｔｒｉｍｍｅｄ）増幅産物（複数可）を生成すること、ｄ）アダプターを切断増幅産物（複数可）に連結して、アダプター連鎖切断増幅産物（複数可）を産生すること、及びステップｄ）のアダプター連鎖切断増幅産物（複数可）をシークエンシングすること、の１つまたは複数を更に含んでもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、プライマー対のセットであって、１個または複数の異なる標的核酸に特異的な１個または複数の異なるプライマー対を含み、１個または複数の異なるプライマー対のそれぞれのプライマーが、１個または複数の切断可能塩基を含有し、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれが、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも４個のヌクレオチドによって隔てられている、プライマー対のセットを含むことができる。ある特定の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも５個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも６個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも7個のヌクレオチドによって隔てられている。ある特定の他の実施形態では、１個または複数の異なるプライマー対の実質的に全てのプライマーにおいて、１個または複数の切断可能塩基のそれぞれは、１個または複数の切断可能塩基を含むプライマーの３’末端から少なくとも8個のヌクレオチドによって隔てられている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、プライマー対のセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ反応緩衝液を含む、ＰＣＲ反応混合物を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０１９７７８７号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシングライブラリから標的配列を富化して、標的富化配列ライブラリを提供するための方法が提供され、シークエンシングライブラリが大規模並行シークエンシングに適しており、かつ複数の二本鎖核酸分子を含み、方法が、ａ）（ｉ）一本鎖侵襲性プローブ（ここで侵襲性プローブが、二本鎖標的配列の１本の鎖に実質的に相補的な領域を有する）と（ｉｉ）リコンビナーゼとを含む核タンパク質フラグメントを提供すること、ｂ）侵襲性プローブ及び標的配列の相補的部分の間で複合体を形成し、複合体形成がリコンビナーゼにより媒介されること、ｃ）複合体を、残りのシークエンシングライブラリから分離し、それによって、標的配列を富化することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、目的の標的領域をシークエンシングする方法が提供され、ａ）大規模並行シークエンシングに適しており、かつ複数の二本鎖核酸分子を含むシークエンシングライブラリを提供し、二本鎖核酸分子の一部がシークエンシングライブラリに含まれる場合、標的配列は、目的の標的領域にある配列を含むこと、ｂ）上記の方法に従って目的の標的領域に対応する標的配列を富化し、それによって、標的富化シークエンシングライブラリを提供すること、ｃ）富化標的配列を並行してシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、エクソームシークエンシング、エクソンシークエンシング、標的化ゲノム再シークエンシング、遺伝子パネル指向（ｇｅｎｅ ｐａｎｅｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｅｄ）標的化ゲノム再シークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング及び／または分子診断薬のためのシークエンシング方法の使用を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、第１態様に従って方法を実施するためのキットであって、ａ）大規模並行シークエンシングに適したシークエンシングライブラリを作製するためのアダプター、ｂ）任意選択で、アダプターを核酸フラグメントにカップリングする１種または複数のライゲーション試薬、ｃ）リコンビナーゼ、好ましくはＲｅｃＡ様リコンビナーゼ、ｄ）リコンビナーゼのための非加水分解性補助因子、好ましくはアデノシン５’－（ガンマ－チオ）トリホスフェート、ｅ）複数の異なる侵襲性プローブ（侵襲性プローブは、目的の標的領域に相補的な領域が異なっている）、ｆ）複数の侵襲性プローブに少なくとも部分的に相補的である、複数の異なる安定化プローブ、及びｇ）侵襲性プローブと標的配列の間に形成されたシナプス複合体を捕捉するのに適した固体支持体を含むキットを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／００９３７５６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅及び検出する方法、ならびに検出を補助するための修飾検出標識を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法であり、この方法は、（ａ）増幅される標的核酸を提供し、標的核酸が二本鎖であり、ステップ（ｂ）の前に、５０ｍＭのＮａＯＨの存在下、６５℃で１０分間加熱して変性されていること、（ｂ）ハイブリッド形成するため、オリゴヌクレオチドプライマーをステップ（ａ）の標的核酸に付加すること、（ｃ）鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物をＤＮＡポリメラーゼによって合成して、二重鎖を形成すること、（ｄ）ステップ（ｃ）の二重鎖をヘリカーゼ調合剤と接触させて、ヘリカーゼ調合剤がヘリカーゼ及び一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含むように、二重鎖を巻き戻すこと（ヘリカーゼ調合剤が熱安定性ヘリカーゼを含まない場合を除く）（一本鎖結合タンパク質は任意である）、及び（ｅ）ステップ（ｂ）と（ｄ）を繰り返して、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を指数関数的及び選択的に増幅することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法を含むことができ、標的核酸は、ＲＮＡプローブ及びＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド捕捉抗体を伴う「前」ステップに付される。この方法は、（ａ）増幅される標的核酸を提供し、標的核酸が一本鎖ＤＮＡであり、相補的なＲＮＡプローブが、一本鎖ＤＮＡに付加されて、ＤＮＡに結合して、標的核酸ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを形成し、磁気ビーズに結合されたＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを認識するハイブリッド捕捉抗体が、ステップ（ｂ）に使用されるために、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドに付加されること、（ｂ）ハイブリッド形成するため、オリゴヌクレオチドプライマーをステップ（ａ）の標的核酸ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドに付加すること、（ｃ）鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物をＤＮＡポリメラーゼによって合成して、二重鎖を形成すること、（ｄ）ステップ（ｃ）の二重鎖をヘリカーゼ調合剤と接触させて、ヘリカーゼ調合剤がヘリカーゼ及び一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含むように、二重鎖を巻き戻すこと（ヘリカーゼ調合剤が熱安定性ヘリカーゼを含まない場合を除く）（一本鎖結合タンパク質は任意である）、及び（ｅ）ステップ（ｂ）と（ｄ）を繰り返して、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を指数関数的及び選択的に増幅することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、修飾ＴａｑＭａｎプローブ（及びこのプローブの使用方法）を含むことができる。プローブは、５’末端または３’末端に相補的なショートテールを、５’末端または３’末端に有し、ＴａｑＭａｎプローブは、このショートテールを除いて、標的核酸に相補的であり、ショートテール配列は、ステムループ構造を形成する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／００１１４１６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、１個または複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって、鎖の分離、プライマーのアニーリング及びプライマーの伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料、及びそれぞれの標的ポリヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む反応混合物に対して実施し、ここで、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーセットが、第１サブセットの少なくとも１個の切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）二重ドメインフォワードプライマー及び第２サブセットの少なくとも１個のリバースプライマーを含み、セットにおけるそれぞれの切断型二重ドメインプライマーが、セットにおける他の切断型二重ドメインプライマーの５’テール領域と異なる５’テール領域、及び標的を含んでいる二本鎖核酸の１本の鎖の配列に相補的な３’コア領域を含み、それぞれの切断型二重ドメインプライマーにおいて、３’コアが第１アニーリング温度で相補的標的部位配列に実質的にアニールし、５’テール及び３’コア領域に含まれる配列が、第２アニーリング温度で補体に実施的にアニールし、第２アニーリング温度が第１アニーリング温度より高く、それによって、第２アニーリング温度で、切断型二重ドメインプライマーの３’コアが、同じく切断型二重ドメインプライマーの５’テール配列の補体を有さない鋳型分子に実質的にアニールすることができず、プライマーセットにおけるそれぞれの切断型二重ドメインプライマーにおいて、５’テール配列が、標的配列に相同性を全く有さず、５’テール配列が、切断型二重ドメインプライマーセットの他のいかなる５’テール配列に対しても６個以下の近接相同性塩基を有し、ＰＣＲ増幅レジメンが、第１及び第２段階を含み、第１段階が、第１サイクルセットにおいて第１アニーリング温度でアニールすることを含み、第２フェーズが、第２サイクルセットにおいて第２アニーリング温度でアニールすることを含むこと、ならびにそれぞれの標的ポリヌクレオチドにおいて増幅産物を検出し、検出が標的ポリヌクレオチドの存在を示すこと、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは切断型二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、少なくとも１個の二重ドメインフォワードプライマーを含み、セットにおけるそれぞれの二重ドメインプライマーは、セットにおける他の二重ドメインプライマーの５’テール領域と異なる５’テール領域、前記標的を含んでいる二本鎖核酸の１本の鎖の配列に相補的な３’コア領域及び前記標的部位に生じる変異型ヌクレオチドの１つに相補的な末端ヌクレオチドを含み、それぞれの二重ドメインプライマーにおいて、３’コアは、第１アニーリング温度で相補的標的部位配列に実質的にアニールし、５’テール及び３’コア領域に含まれる配列は、第２アニーリング温度で補体に実質的にアニールし、第２アニーリング温度は、第１アニーリング温度より高く、それによって、前記第２アニーリング温度で、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、二重ドメインプライマーの５’テール配列の補体も有さな鋳型分子に実質的にアニールすることができず、プライマーセットにおけるそれぞれの切断型二重ドメインプライマーにおいて、５’テール配列は、標的配列に相同性を全く有さず、５’テール配列は二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの他のいかなる５’テール配列に対しても６個以下の近接相同性塩基を有する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、１個または複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、それぞれの標的ポリヌクレオチドに特異的な少なくとも１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーセットが、第１サブセットの少なくとも１個の切断型二重ドメインフォワードプライマー及び第２サブセットの少なくとも１個のリバースプライマーを含み、セットにおけるそれぞれの切断型二重ドメインプライマーが、セットにおける他の切断型二重ドメインプライマーの５’テール領域と異なる５’テール領域及び標的を含んでいる二本鎖核酸の１本の鎖の配列に相補的な３’コア領域を含み、それぞれの切断型二重ドメインプライマーにおいて、３’コアが第１アニーリング温度で相補的標的部位配列に実質的にアニールし、５’テール及び３’コア領域に含まれる配列が、第２アニーリング温度で補体に実質的にアニールし、第２アニーリング温度が第１アニーリング温度より高く、それによって、第２アニーリング温度で、切断型二重ドメインプライマーの３’コアが、同じように５’テール配列の補体を有さない鋳型分子に実質的にアニールすることができず、切断型二重ドメインプライマーセットにおけるそれぞれのメンバーにおいて、５’テール配列が、標的配列に相同性を全く有さず、５’テール配列が、切断型二重ドメインプライマーセットの他の５’テール配列に対して６個以下の近接相同性塩基を有する組成物を、含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は核酸試料を更に含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、１個または複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって、鎖の分離、プライマーのアニーリング及びプライマーの伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料及びそれぞれの標的ポリヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む反応混合物において実施し、ここで、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーセットが、第１サブセットの少なくとも１個の切断型二重ドメインフォワードプライマー及び第２サブセットの少なくとも１個のリバースプライマーを含み、セットにおけるそれぞれの切断型二重ドメインプライマーが、セットにおける他の切断型二重ドメインプライマーの５’テール領域と異なる５’テール領域及び標的を含んでいる二本鎖核酸の１本の鎖の配列に相補的な３’コア領域を含み、それぞれの切断型二重ドメインプライマーにおいて、３’コアが第１アニーリング温度で相補的標的部位配列に実質的にアニールし、５’テール及び３’コア領域に含まれる配列が、第２アニーリング温度で補体に実質的にアニールし、第２アニーリング温度が第１アニーリング温度より高く、それによって、第２アニーリング温度で、切断型二重ドメインプライマーの３’コアが、同じように切断型二重ドメインプライマーの５’テール配列の補体を有さない鋳型分子に実質的にアニールすることができず、プライマーセットにおけるそれぞれの切断型二重ドメインプライマーにおいて、５’テール配列が、標的配列に相同性を全く有さず、５’テール配列が、切断型二重ドメインプライマーセットの他のいかなる５’テール配列に対しても６個以下の近接相同性塩基を有し、ＰＣＲ増幅レジメンが、第１及び第２段階を含み、第１段階が、第１サイクルセットにおいて第１アニーリング温度でアニールすることを含み、第２段階が、第２サイクルセットにおいて第２アニーリング温度でアニールすることを含むこと、ならびにそれぞれの標的ポリヌクレオチドにおいて増幅産物を検出し、検出が標的ポリヌクレオチドの存在を示すこと、を含む方法であり得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、１個または複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、それぞれの標的ポリヌクレオチドに特異的な少なくとも１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーセットが、第１サブセットの少なくとも１個の切断型二重ドメインフォワードプライマー及び第２サブセットの少なくとも１個のリバースプライマーを含み、セットにおけるそれぞれの切断型二重ドメインプライマーが、セットにおける他の切断型二重ドメインプライマーの５’テール領域と異なる５’テール領域及び標的を含んでいる二本鎖核酸の１本の鎖の配列に相補的な３’コア領域を含み、それぞれの切断型二重ドメインプライマーにおいて、３’コアが第１アニーリング温度で相補的標的部位配列に実質的にアニールし、５’テール及び３’コア領域に含まれる配列が、第２アニーリング温度で補体に実質的にアニールし、第２アニーリング温度が第１アニーリング温度より高く、それによって、第２アニーリング温度で、切断型二重ドメインプライマーの３’コアが、同じように５’テール配列の補体を有さない鋳型分子に実質的にアニールすることができず、切断型二重ドメインプライマーセットにおけるそれぞれのメンバーにおいて、５’テール配列が、標的配列に相同性を全く有さず、５’テール配列が、切断型二重ドメインプライマーセットの他の５’テール配列に対して６個以下の近接相同性塩基を有する組成物を、含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０１１３７５８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料から生体分子を精製する工程であって、以下、ａ）結合マトリックスを有する反応器を遠心分離機に配置し、生体分子を含有する試料の溶液または懸濁液が、このステップの前または後に、反応器の中で調製される、または反応器の中に導入されるステップ、ｂ）第１加速値の少なくとも第１遠心分離ステップ及び第１加速値より高い第２加速値の少なくとも第２遠心分離ステップを含む、少なくとも１つの多段階遠心分離ステップを含めるステップを含み、ｃ）ステップｂ）が結合ステップ、洗浄ステップ及び／または溶出ステップである工程を含むことができる。好ましくは、多段階のステップｂ）は、生体分子が遠心分離により結合マトリックスに結合される結合ステップである。特に好ましくは、生体分子は、核酸、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、単糖、オリゴ糖、脂肪、脂肪酸及び／または脂質を含む群から選択される物質であることが想定される。いくつかの実施形態では、結合マトリックスは、ケイ酸塩基材を含み、更に、生体分子を含有する試料は、遠心分離の前に少なくとも１種のカオトロピック塩と混合される。この実施形態は、特に核酸に適している。好ましくは、以下のステップがこの実施形態に想定されている。ａ）ケイ酸塩基材を含む結合マトリックスを有するカラム様反応器を遠心分離機に配置し、核酸含有試料及び少なくとも１種のカオトロピック塩の溶液または懸濁液が、このステップの前または後に、反応器の中で調製される、または反応器の中に導入されるステップ、ｂ）第１加速値の第１遠心分離ステップを含めるステップ、ｃ）第１加速値より高い第２加速値の第２遠心分離ステップを含めるステップ、ｄ）任意選択で、ステップｃ）とステップｄ）の間、またはステップｄ）の後に、更なる遠心分離ステップを含めるステップ、ｅ）任意選択で、１つまたは複数の洗浄ステップを含めるステップ、ならびにｆ）ケイ酸塩基材に結合した核酸を溶出溶液で溶出するステップ。この実施形態では、多段階の遠心分離ステップは、核酸がケイ酸塩マトリックスに結合される結合ステップである。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／０２９８１８７号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料中における標的核酸の存在を決定する方法を含むことができる。この方法は、ａ）１個または複数のポリヌクレオチドプローブを、１個または複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸とハイブリッド形成して、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なハイブリッド形成条件下で試料と接触させ、１個または複数のポリヌクレオチドプローブが、標的核酸の変異型とハイブリッド形成しないこと、及びｂ）二本鎖核酸ハイブリッドを検出し、検出が、二本鎖核酸ハイブリッドを、二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第１抗ハイブリッド抗体と接触させることを含み、これにより、二本鎖核酸ハイブリッドの検出が、試料中の標的核酸を決定することを含む。いくつかの実施形態では、核酸のハイブリッド形成及び二本鎖核酸ハイブリッドの検出は、同時に実施される。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸ハイブリッドが、二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第１抗ハイブリッド抗体と接触した後、二本鎖核酸ハイブリッドを検出するため、第２抗ハイブリッド抗体が添加され、このことにより、これらの第２抗ハイブリッド抗体による二本鎖核酸ハイブリッドの検出が、試料中の標的核酸の存在を決定する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６８６，１５７号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、特異的核酸配列の量及び位置の高感度検出のための方法及び組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、分枝鎖オリゴマーを使用し、ロリポップオリゴマー（ｌｏｌｌｉｐｏｐ ｏｌｉｇｏｍｅｒ）と呼ばれ、これは、テール部分、右アーム部分及び左アーム部分を有する。これらの３つの構成要素は、共通の接合部で一緒になって、３テール構造を作る。２本のアームは、それぞれ、標的配列に隣接する配列に相補的な配列で終了している。このことは、オリゴマーが標的配列とハイブリッド形成する場合に、右と左のアームが一緒に連結することを可能にし、したがって、オリゴマーを標的配列に位相幾何学的に連鎖させることを可能にする。次いで、テール部分を標的配列の位置で検出することができる。オリゴマーのテールを使用して、ＤＮＡサークルのローリングサークル複製を初回刺激することによって、ロングタンデムリピートＤＮＡが、標的配列と関連付けられる。ローリングサークル複製は、アームと標的配列の会合を妨げず、したがって、タンデムリピートＤＮＡと標的配列の密接な会合を維持する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸配列を増幅する方法であって、（ａ）１個または複数の異なるロリポップオリゴマーを、それぞれ１個または複数の標的配列を含む１個または複数の標的試料と混合し、オリゴマーと標的配列のハイブリッド形成を促進する条件下でインキュベートし、ロリポップオリゴマーが、テール部分を含む分枝鎖オリゴマーをそれぞれ含み、テール部分がローリングサークル複製プライマーを含み、ローリングサークル増幅プライマーが、増幅標的サークルのプライマ－補体部分に相補的な相補的部分を含むこと、（ｂ）ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）と同時に、またはステップ（ａ）の後で、１個または複数の増幅標的サークルをオリゴマーと混合し、増幅標的サークルと、オリゴマーのローリングサークル複製プライマー部分とのハイブリッド形成を促進する条件下でインキュベートすること、ならびに（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを、オリゴマー及び増幅標的サークルと混合し、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でインキュベートし、増幅標的サークルの複製がタンデム配列ＤＮＡの形成をもたらすことを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０９０，９３５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料から核酸を単離する方法であって、前記試料を沸騰させること、沸騰した試料を冷却すること、冷却された試料の液相中の核酸を、磁気粒子を含む固体支持体に直接結合させること、及び核酸が結合された固体支持体を前記液相の残部から分離することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、固定または老化された試料から核酸を単離する方法であって、固定または老化された試料を沸騰させること、沸騰した試料を冷却して、冷却された試料の液相中の核酸を、磁気粒子を含む高表面積を有する固体支持体に直接結合させること、及び核酸が結合された固体支持体を、冷却された試料残部から分離することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／０３２８０８に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＲＮＡシークエンシングの方法であって、（ｉ）ＲＮＡを提供すること、（ｉｉ）（ａ）逆転写酵素、第１セットのオリゴヌクレオチドプライマー及びステップ（ｉ）のＲＮＡを使用して、ＲＮＡを逆転写に付すことによって、ＲＮＡに相補的である一本鎖第１ＤＮＡ鎖（複数可）（ｃＤＮＡ）を生成すること、ならびに（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、第２セットのオリゴヌクレオチドプライマー及び（ｉｉ）の一本鎖ｃＤＮＡを使用して、第２ＤＮＡ鎖を生成することを含み、ａ）第１セットのオリゴヌクレオチドプライマーが５’末端ヌクレオチドに共有結合部分を含み、このことが、生成された第１ＤＮＡ鎖の５’末端でのライゲーションを遮断している、またはｂ）第２セットのオリゴヌクレオチドプライマーが５’末端ヌクレオチドに共有結合部分を含み、このことが、生成された第２ＤＮＡ鎖の５’末端でのライゲーションを遮断している方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、続く、（ｉｖ）任意選択で、ポリヌクレオチドキナーゼ、及びポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して二本鎖ＤＮＡ鎖を末端修復して、末端修復ＤＮＡ鎖を得るステップ、（ｖ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して、ＤＮＡ鎖の３’末端に末端アデニンを付加するステップ、ならびに（ｖｉ）任意選択で末端チミンを含むアダプターを、任意選択で３’末端アデニンを含むＤＮＡ鎖に連結するステップを更に含む。前記方法は、生成されたＤＮＡの配列分析を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、前記方法は、（ｉ）ＲＮＡを提供すること、（ｉｉ）（ａ）逆転写酵素、第１セットのオリゴヌクレオチドプライマー及びステップ（ｉ）のＲＮＡを使用して、ＲＮＡを逆転写に付すことによって、ＲＮＡに相補的である一本鎖第１ＤＮＡ鎖（複数可）（ｃＤＮＡ）を生成すること、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、第２セットのオリゴヌクレオチドプライマー及び（ｉｉ）の一本鎖ｃＤＮＡを使用して、第２ＤＮＡ鎖を生成すること、（ｉｖ）アダプターを、ステップ（ｉｉｉ）の二本鎖ＤＮＡに連結すること、ならびに（ｖ）生成されたＤＮＡをシークエンシングすることを含み、ａ）第１セットのオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端ヌクレオチドに共有結合部分を含み、このことが、生成された第１ＤＮＡ鎖の５’末端でのライゲーションを遮断している、またはｂ）第２セットのオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端ヌクレオチドに共有結合部分を含み、このことが、生成された第２ＤＮＡ鎖の５’末端でのライゲーションを遮断している。第２ＤＮＡ鎖を生成することによって、二本鎖ＤＮＡが生成される。上記に記述された方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）の前に、方法は、（ｉｉｉ）（ａ）ポリヌクレオチドキナーゼ、及びポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、二本鎖ＤＮＡ鎖を末端修復して、末端修復ＤＮＡ鎖を得るステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）（ａ）の後に、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して、ＤＮＡ鎖の３’末端に末端アデニンを付加することを含むステップ（ｉｉｉ）（ｂ）が続き、アダプターが３’末端チミンを含み、ステップ（ｉｖ）において、３’末端アデニンを含むＤＮＡ鎖に連結する。いくつかの実施形態では、遮断部分及び／または非修飾オリゴヌクレオチドプライマーに共有結合しているオリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーである。いくつかの実施形態では、前記方法は、目的のＲＮＡを抽出する、任意選択で富化する初期ステップを含む。いくつかの実施形態では、抽出されたＲＮＡは、１９～５１０ｂｐの平均サイズに断片化される。上記の方法のいくつかの実施形態では、分子は、ペアードエンドシークエンシング（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のために、固体支持体に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、「ライゲーションを遮断する部分」または「遮断部分」は、大きな分子の特定部分を指し、１個を超える原子のものであり、ここでは、修飾オリゴヌクレオチドプライマーの５’ヌクレオチドに共有結合している修飾オリゴヌクレオチドの部分である。前記部分は、好ましくは、部分が位置する部位、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端の５’末端ヌクレオチドにおいて、任意のライゲーションを遮断する。上記の方法のいくつかの実施形態では、遮断部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、（ｉ）オリゴヌクレオチドが、遊離していない５’ホスフェートを５’末端ヌクレオチドに含み、任意に、５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基または５’ホスフェート基が、ライゲーションを遮断する部分に共有結合していること、（ｉｉ）５’末端ヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニン及びウラシルのいずれでもないこと、（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの一方または両方の２’水素（複数可）が、別の原子または遮断部分に置き換えられていること、ならびに／あるいは（ｉｖ）オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡのリボースまたはデオキシリボースの立体配置ではなく、ペントースの立体配置を有する５’末端ヌクレオチドを含むことを特徴とする。上記の方法のいくつかの実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、部分に共有結合する前に、５’ＯＨまたは遊離５’ホスフェート基を５’末端ヌクレオチドに含み、ライゲーション遮断特性を付与する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１６／１９３４９０に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＤＮＡ含有試料から、ある特定のカットオフ値を超えるサイズを有するＤＮＡ分子を単離するポリ（アルキレンオキシド）ポリマーベースサイズ選択的ＤＮＡ単離方法が提供され、（ａ）ＤＮＡ含有試料、少なくとも１個のポリ（アルキレンオキシド）ポリマー及び少なくとも１個の二価カチオンを含む結合混合物を調製し、前記結合混合物が、８～１０の範囲にあるｐＨを有し、非修飾ケイ素含有表面を有する固相に沈降ＤＮＡ分子を結合し、それによって、カットオフ値を超えるサイズを有するＤＮＡ分子が結合された固相を提供し、使用される結合条件下では、カットオフ値未満のサイズを有するＤＮＡ分子が固相に実質的に結合しないこと、（ｂ）結合したＤＮＡ分子を残りの試料から分離し、任意選択で、結合したＤＮＡ分子を洗浄し、任意選択で、結合したＤＮＡ分子を固相から溶出することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、所望のカットオフ値を超えるサイズを有するＤＮＡ分子は、高い収率で固相に効率的に結合するが、前記のカットオフ値を下回るサイズを有するＤＮＡ分子は、大部分が結合せず、したがって、ステップ（ａ）において回収されない。カットオフ値は、結合混合物中のポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの濃度を変更することによって調整することができ、このことは従来技術によって既知であり、実施例によっても実証されている。二価カチオンの存在及び特定されたアルカリ性ｐＨ値は、非修飾ケイ素含有表面を有する固相が使用されるが、カットオフ値を超えるサイズを有するＤＮＡ分子の効率的な結合を確実にする。この方法は、アダプターライゲーション試料から、標的ＤＮＡ分子としてアダプター連結ＤＮＡ分子を単離するため、ならびにアダプターモノマー及びアダプターアダプターライゲーション産物を除去するために、特に適している。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８１１，７５９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、疾患の状態（ｓｔａｔｅ）または病状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）のシグネチャーｎｃＲＮＡプロファイルを作製する方法であって、ａ．第１供給源から第１ｎｃＲＮＡプロファイルを決定し、前記第１供給源が前記疾患の状態または病状のないことを特徴とすること、ｂ．第２供給源から第２ｎｃＲＮＡプロファイルを決定し、前記第２供給源が前記疾患の状態または病状において陽性であることを特徴とし、前記第１及び第２ｎｃＲＮＡプロファイルが、ＲＮＡ試料中の複数の標的ｎｃＲＮＡ分子のプロファイルと決定する方法に従って得られ、ここで前記方法が、ｉ．対象から前記ＲＮＡ試料を提供し、前記試料が前記複数の標的ｎｃＲＮＡを含有するステップ、ｉｉ．前記試料を、前記第１オリゴヌクレオチドと前記標的ｎｃＲＮＡの複合体を形成するのに適した条件下で検出される前記標的ｎｃＲＮＡのそれぞれに特異的な第１オリゴヌクレオチドと接触させ、前記第１オリゴヌクレオチドが、第１検出可能シグナルを生成する第１シグナルジェネレーターを含み、前記第１オリゴヌクレオチドが、それぞれ、実質的に同一である、前記標的ｎｃＲＮＡのそれぞれに結合する第１Ｔｍを有するステップ、ｉｉｉ．前記試料を、前記第２オリゴヌクレオチド及び前記標的ｎｃＲＮＡの複合体を形成するのに適した条件下で検出される前記標的ｎｃＲＮＡのそれぞれに結合することができる第２オリゴヌクレオチドと接触させ、前記第２オリゴヌクレオチドが、第２検出可能シグナルを生成する第２シグナルジェネレーターを含み、前記第２オリゴヌクレオチドが、それぞれ、実質的に同一である、前記標的ｎｃＲＮＡのそれぞれに結合する第２Ｔｍを有するステップ、ｉｖ．前記試料における前記複数の標的ｎｃＲＮＡの存在を、第１及び第２検出可能シグナルを測定することによって決定するステップ、ならびにｖ．検出された標的ｎｃＲＮＡに基づいて試料のプロファイルを生成するステップを含むこと、ｃ．前記第１及び第２ｎｃＲＮＡプロファイルを比較し、前記第２ｎｃＲＮＡプロファイルにおいて変更されているｎｃＲＮＡ分子を同定して、前記疾患状態または病状のシグネチャーｎｃＲＮＡプロファイルを作製することを含む、前記方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２４４８４７号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、環状核酸鋳型を増幅する方法であって、鋳型を、熱安定性ポリメラーゼ、個別のヌクレオチド、ならびに鋳型内の共通領域に相補的なフォワード及びリバースプライマーを含む反応混合物と接触させ、共通領域が好ましくは約８０～１５０塩基対長さであることを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、プライマーの５’末端が約１０～５０塩基対の間隔を置いて、なおより好ましくは０～２５塩基対の間隔を置いて、鋳型の反対側の鎖とハイブリッド形成する。いくつかの実施形態では、フォワードプライマーの５’末端は、一般にリバースプライマーの５’末端の近位にあり、プライマーが鋳型とハイブリッド形成すると、リバースプライマーの３’末端の遠位になる。特に好ましい実施形態では、共通領域は、染色体外核酸内の保存領域、例えば、複製開始点である。反応混合物には、弱有機塩基及び弱有機酸が含まれる反応緩衝液を更に含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、染色体外ＤＮＡのインビトロ増幅を実施するための試薬であって、増幅反応、その後に続くライゲーション反応を支持する溶液、ならびに増幅とライゲーションの組合せ反応を支持する、すなわち、同時ポリメラーゼ及びリガーゼ酵素活性に適した環境を提供する溶液を含む試薬を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１３７８２６に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、鋳型核酸を富化する方法及びシークエンシングライブラリを生成する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、鋳型核酸を富化する及びシークエンシングライブラリを生成する方法は、ａ）鋳型核酸を、固体表面に結合され、かつ最初に少なくとも２個の機能性配列エレメントを含むオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させること、ｂ）鋳型核酸とハイブリッド形成した表面結合オリゴヌクレオチドを伸長して、二本鎖を形成すること、ｃ）任意選択で、ステップｂ）で生成した二本鎖核酸を修飾すること、ｄ）ステップａ）の鋳型核酸とのハイブリッド形成に使用されていない表面結合オリゴヌクレオチドを３’切断すること、ならびにｅ）任意選択で、ステップｄ）で生成された一本鎖表面結合オリゴヌクレオチドを修飾することを含む。いくつかの実施形態では、ｆ）更なる鋳型核酸を表面結合オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する、または表面結合オリゴヌクレオチド内の機能性配列エレメントを下流適用のために使用する追加のステップを更に含む。いくつかの実施形態では、下流適用は、固体表面での核酸増幅、固体表面からのデカップリング、オリゴヌクレオチド内におけるＲＮＡポリメラーゼプロモーターの使用によるインビトロ転写、オリゴヌクレオチド内における同定のためのプライマー結合部位または分子バーコード領域の使用による固定化核酸の標識、シークエンシング、またはこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、少なくとも１個の機能性配列エレメントは、ハイブリッド形成部位である、または好ましくは下流適用に有用な配列である。別の実施形態では、機能性配列エレメントは、連続または重複している。ある特定の実施形態では、機能性配列エレメントは、予め定義された切断部位によって分離される、または保護オリゴヌクレオチドと表面結合オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって生成される。いくつかの実施形態では、ステップａ）～ｃ）は、異なる試料の鋳型核酸によって少なくとも１回繰り返される。他の実施形態では、ステップａ）～ｅ）は、同じ試料または異なる試料の鋳型核酸によって少なくとも１回繰り返され、任意選択で、繰り返し（複数可）は、並行して実施される。いくつかの実施形態では、表面結合オリゴヌクレオチドの密度は、５００～５０００００個のオリゴヌクレオチド／μｍ２、より好ましくは７５０～２０００００個のオリゴヌクレオチド／μｍ２、最も好ましくは１０００～１０００００個のオリゴヌクレオチド／μｍ２である。他の実施形態では、表面結合オリゴヌクレオチドは、２～２０個、より好ましくは２～１０個、最も好ましくは２～５個の機能性配列エレメントを含む。ある特定の実施形態では、表面結合オリゴヌクレオチドの長さは、４～２００ｎｔ、好ましくは１０～２００ｎｔ、より好ましくは６～１８０ｎｔ、より好ましくは８～１６０ｎｔ、より好ましくは１０～１４０ｎｔ、最も好ましくは２０～１００ｎｔの範囲内である。いくつかの実施形態では、表面結合オリゴヌクレオチドの長さは１０ｎｔ、好ましくは２０ｎｔである。いくつかの実施形態では、表面結合オリゴヌクレオチド内の同じ位置にある全ての機能性配列エレメントは、固有の配列を有する、または２～１０００００個、好ましくは２～５００００個、より好ましくは２～２５０００個、より好ましくは２～１００００個、より好ましくは２～５０００個、より好ましくは２～２５００個、最も好ましくは２～１０００個の異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、３’切断は、酵素的または化学的に達成される。いくつかの実施形態では、表面に結合された二本鎖核酸は、バーコード配列を導入すること、シークエンシングアダプターを付加すること、蛍光団を末端に付加すること、修飾塩基を組み込むこと、または他の修飾によって修飾される。他の実施形態では、表面に結合された一本鎖オリゴヌクレオチドは、ビオチンを付加すること、部分を標識すること、部分を遮断すること、または他の修飾によって修飾される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０１３５９８に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、単一末端二重鎖ＤＮＡシークエンシングを実施するための方法、アダプター及びキットを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡシークエンシングを実施する方法は、（ａ）複数の二本鎖標的核酸及び第１セットの実質的に相補的な二本鎖アダプターの存在下で連結反応を実施して、ライゲーション産物を生成し、第１セットのそれぞれのアダプターが第１鎖及び第２鎖を含み、第１鎖が、５’から３’の順で、１０個以上のヌクレオチド長さである５’領域、分子タグ配列及び任意選択で３’領域を含み、第２鎖が、３’から５’の順で、第１鎖の５’領域の１０個以上のヌクレオチド長さの部分に完全に相補的な配列、第１鎖の分子タグ配列に完全に相補的な配列及び任意選択で５’領域を含み、第１鎖と第２鎖の少なくとも１個のミスマッチが、３’領域が存在する場合に３’領域に位置しており、及び／または第１鎖の５’領域の１０個以上のヌクレオチド長さの部分に対して３’である５’領域に位置しており、第１セットの異なるアダプターが、異なる分子タグ配列をその第１鎖に含み、対応する、異なる分子タグ配列に完全に相補的な配列を第２鎖に含むが、それ以外は、互いに同一であること、（ｂ）鋳型としてステップ（ａ）のライゲーション産物を使用して、増幅反応を実施して、増幅産物を生成し、増幅産物が、実質的に相補的な第１及び第２鎖の二本鎖アダプターと相補的塩基対を形成しない、１個または複数の位置を含むこと、ならびに（ｃ）鋳型としてステップ（ｂ）の増幅産物または更なる増幅産物を使用して、シークエンシング反応を実施して、相補的塩基対が第１及び第２鎖の二本鎖アダプターに形成されない、１個または複数の位置を含む配列リードを得ることを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、実施的に相補的な二本鎖アダプターのセットであって、少なくとも１６個の異なるアダプターを含み、セットにおけるそれぞれのアダプターが、第１鎖及び第２鎖を含み、第１鎖が、５’から３’の順で、５’領域、分子タグ配列及び任意に３’領域を含み、第２鎖が、３’から５の順で、第１鎖の５’領域の１０個以上のヌクレオチド長さの部分に完全に相補的な配列を含む３’領域、第１鎖の分子タグ配列に完全に相補的な配列及び任意に５’領域を含み、第１鎖と第２鎖の少なくとも１個のミスマッチが、３’領域が存在する場合に第１鎖の３’領域に位置しており、及び／または第１鎖の５’領域の１０個以上のヌクレオチド長さの部分に対して３’である５’領域に位置しており、異なるアダプターが、異なる分子タグ配列を第１鎖に含み、対応する、異なる分子タグ配列の完全に相補的な配列を第２鎖に含むが、それ以外は互いに同一であるセットを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（１）実施的に相補的な二本鎖アダプターのセット及び（２）リガーゼを含むキットを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７／１６５２８９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、多置換増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＤＡ）のプライマー、プライマーセット、キット及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、多置換増幅により核酸を増幅する方法は、１つまたは複数の別個の多置換増幅反応を実施することを含み、それぞれの反応は、（１）プライマーセット（プライマーセットのそれぞれのプライマーは、５’末端に自己相補的配列及び３’末端にランダム配列または準ランダム配列を含み、それぞれのプライマーセットの自己相補的配列は同一であるが、別のプライマーセットの自己相補的配列と異なる）、（２）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ならびに（３）標的核酸の存在下で実施される。ある特定の実施形態では、１個または複数のプライマーセットにおける自己相補的配列は、それぞれ、６～２０個のヌクレオチド長さである。ある特定の実施形態では、１個または複数のプライマーセットにおけるランダム配列または準ランダム的配列は、４～２０個のヌクレオチド長さである。好ましくは、プライマーは３’－５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性に抵抗性がある。ある特定の実施形態では、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼである。ある特定の実施形態では、少なくとも２つの別個の多置換増幅反応が実施される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の別個の多置換増幅反応に使用される標的核酸は、１個または複数の異なる単一細胞、例えばヒト細胞からのゲノムＤＮＡである。ある特定の実施形態では、多置換増幅は、約２０℃から約４０℃の温度で、例えば、上記範囲内の２つの温度の間で循環させて、または等温条件下で実施される。複数の別個の多置換増幅反応が実施される、ある特定の実施形態では、方法は、複数の多置換増幅反応で増幅された核酸を一緒にプールすること、プールした増幅核酸を使用してシークエンシングライブラリを生成すること及びプールした増幅核酸をシークエンシングすることを更に含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、プライマーセットであって、プライマーセットにおけるそれぞれのプライマーが、５’末端に自己相補的配列、及び３’末端にランダム配列または準ランダム配列を含み、プライマーの自己相補的配列が互いに同一であるプライマーセットを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のプライマーセットであって、それぞれのプライマーが、５’末端に自己相補的配列及び、３’末端にランダム配列または準ランダム配列を含み、それぞれのプライマーセットにおける自己相補的配列は互いに同一であるが、別のプライマーセットにおけるプライマーの自己相補的配列と異なっている、複数のプライマーセットを含むことができる。ある特定の実施形態では、複数のプライマーセットは、少なくとも３個の異なるプライマーセットを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／０８５３２１に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体試料の細胞外核酸集団を安定化するのに適した滅菌組成物を産生する方法であって、ａ）ｉ．少なくとも１個のカスパーゼ阻害剤及びｉｉ．チオアルコール（好ましくは、Ｎ－アセチル－システインもしくはグルタチオン）、水溶性ビタミン及びビタミンＥまたはこれらの誘導体から選択される少なくとも１個の化合物を含む組成物を提供すること、ならびにｂ）組成物を滅菌のために照射することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、細胞含有生体試料に含まれる細胞外核酸集団を安定化する方法であって、ａ）ｉ）生体試料の細胞外核酸集団を安定化するのに適した滅菌組成物、またはｉｉ）滅菌形態の上記組成物を得ること、及びｂ）細胞含有生体試料を、安定化するために滅菌組成物と接触させることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離する方法であって、ａ）細胞含有生体試料を上記方法に従って安定化すること及びｂ）細胞外核酸を単離することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、細胞外核酸をプロセシング及び／または分析する方法であって、ａ）細胞外核酸を、安定化された細胞含有生体試料から上記方法に従って単離すること、ならびにｂ）単離された細胞外核酸をプロセシング及び／または分析することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、滅菌組成物を産生する方法であって、滅菌形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に適しており、ａ）ｉ）少なくとも１個のカスパーゼ阻害剤、ならびにｉｉ．チオアルコール（好ましくは、Ｎ－アセチル－システインもしくはグルタチオン）、水溶性ビタミン及びビタミンＥまたはこれらの誘導体から選択される少なくとも１個の化合物を含む組成物を調製すること、ならびに任意選択でｂ）組成物を滅菌することを含む前記方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、滅菌組成物であって、滅菌形態の組成物が生体試料の細胞外核酸集団の安定化に適しており、組成物が上記方法のステップａ）において提供される組成物である、滅菌組成物を含むことができる。これは、ｉ．少なくとも１個のカスパーゼ阻害剤、ならびにｉｉ．チオアルコール（好ましくは、Ｎ－アセチル－システインもしくはグルタチオン）、水溶性ビタミン及びビタミンＥまたはこれらの誘導体から選択される少なくとも１個の化合物を含む。上記方法のステップａ）において提供される組成物であり得る、実施形態の第６態様による滅菌可能組成物を滅菌して、滅菌組成物を提供することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、容器などの試料収集装置、好ましくは上記の滅菌可能な組成物を含む試料収集管を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体試料の細胞外核酸集団を安定化するのに適した組成物を保護するため、または照射による滅菌の際にその構成要素を保護するための、チオアルコール（好ましくは、Ｎ－アセチル－システインもしくはグルタチオン）、水溶性ビタミン及びビタミンＥまたはこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１個の化合物の使用を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１６／１７０１４７に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ｄｓＤＮＡを生成する方法であって、両方とも任意選択で１つまたは２つの一本鎖末端（複数可）を有する第１及び第２ｄｓＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼ、及びｄｓＤＮＡの融解温度を調節する作用物質の存在下で連結することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、第１及び第２ｄｓＤＮＡを連結する方法であって、第１及び第２ｄｓＤＮＡが両方とも２個のｓｓＤＮＡ領域を含み、これにより第１ｄｓＤＮＡのｓｓＤＮＡ領域末端のそれぞれが、ｄｓＤＮＡの融解温度を調節する作用物質の存在下で第２ｄｓＤＮＡの相補的ｓｓ領域末端のそれぞれと連結して、連結環状ｄｓＤＮＡを提供する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１または第２ＤＮＡは、コンピテント細胞内で自己複製をする能力を付与することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシングライブラリの生成方法であって、（ｉ）ＤＮＡフラグメントを提供するステップ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ酵素、及びポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって、ＤＮＡフラグメントを末端修復して、平滑末端５’リン酸化ＤＮＡフラグメントを得るステップ、（ｉｉｉ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素により、末端修復ＤＮＡフラグメントの末端に末端アデニンを付加するステップ、ならびに（ｉｖ）任意選択で末端アデニンを有するＤＮＡフラグメントを、シークエンシングアダプターに連結し、フラグメントが末端アデニンを有する場合、好ましくはアタプターが末端チミジンを有するステップを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、ステップ（ｉｖ）の連結フラグメントがシークエンシングのために精製及びサイズ選択される、ステップ（ｖ）を更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、アダプター連結フラグメントが増幅され、増幅産物がシークエンシングの前に任意選択で精製される、ステップ（ｖｉ）を更に含む。別の実施形態では、ステップ（ｖ）または（ｖｉ）のフラグメントは、シークエンシングに付される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ｉ）ＤＮＡリガーゼ及び（ｉｉ）ｄｓＤＮＡの融解温度を調節する作用物質から構成されるキットを含むことができる。別の実施形態では、ｄｓＤＮＡの融解温度を調節する作用物質は、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、ピペラジニウムクロリド、テトラメチルピペラジニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、トリメチルアミンＮ－オキシド（ＴＭＡＮＯ）、２－メチル－４－カルボキシ－５－ヒドロキシ－３，４，５，６－テトラヒドロピリミジンＴＨＰ（Ａ）、２－メチル－４－カルボキシ－３，４，５，６－テトラヒドロピリミジンＴＨＰ（Ｂ）、非イオン性洗剤、例えばＮＰ－４０及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ならびにこれらの混合物のいずれか１つから選択される。好ましい実施形態では、ｄｓＤＮＡの融解温度を調節する作用物質は、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、ピペラジニウムクロリド、テトラメチルピペラジニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）、トリメチルアミンＮ－オキシド（ＴＭＡＮＯ）、２－メチル－４－カルボキシ－５－ヒドロキシ－３，４，５，６－テトラヒドロピリミジンＴＨＰ（Ａ）、２－メチル－４－カルボキシ－３，４，５，６－テトラヒドロピリミジンＴＨＰ（Ｂ）及びこれらの混合物のいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡの融解温度を調節する作用物質は、ライゲーション緩衝液中にある。いくつかの実施形態では、リガーゼ、及びｄｓＤＮＡの融解温度を調節する作用物質は、別々の容器の中にある。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１６／１３５３００に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＮＧＳライブラリ構築プロトコールにおけるＤＮＡ調製に関与する酵素の特異的阻害のための方法及びキットを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシングライブラリの生成方法であって、（ｉ）ＤＮＡフラグメントを提供するステップ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドキナーゼ酵素、及びポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって、ＤＮＡフラグメントを末端修復して、平滑末端５’リン酸化ＤＮＡフラグメントを得るステップ、（ｉｉｉ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素により、末端修復ＤＮＡフラグメントの末端に末端アデニンを付加するステップ、ならびに（ｉｖ）任意選択で末端アデニン塩基を有するＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡリガーゼによりシークエンシングアダプターに連結し、これによりステップ（ｉｉ）及び／または任意選択のステップ（ｉｉｉ）が完了した後、この／これらのステップに使用される１つの酵素または複数の酵素が、（ａ）特異的阻害剤（複数可）の添加によって不活性化されるステップを含む方法を含むことができる。上記の方法における阻害剤のうちで、後に続くステップ（複数可）の酵素活性を阻害するものはない。いくつかの実施形態では、特異的阻害剤による酵素不活性化を含む上記方法のステップは、前記酵素（複数可）の熱不活性化を含まない。いくつかの実施形態では、特異的阻害剤による酵素不活性化を含む上記方法のステップは、前記酵素（複数可）からの後続精製ステップを含まない。いくつかの代替実施形態では、（ａ）特異的阻害剤（複数可）の添加を含む上記方法のステップは、前記酵素（複数可）の上流熱不活性化を含むが、前記酵素（複数可）の精製ステップを含まない。いくつかの実施形態では、上記方法は、ステップ（ｉｖ）の連結フラグメントがシークエンシングのために精製及びサイズ選択される、ステップ（ｖ）を更に含んでもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２００１／０２３６１８に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、オリゴヌクレオチド及びアニーリング促進化合物（ＡＰＣ）を含む組成物を含むことができる。組成物を、例えば、オリゴヌクレオチドが関与するハイブリッド形成反応の特異度を低減するために使用してもよい。オリゴヌクレオチドを固体表面に任意選択で固定化してもよく、適切な固体表面には、ナイロンチップ、ナイロンビーズ及びナイロン膜が挙げられる。好ましい実施形態では、ＡＰＣはアミノアルコールであり、アミノアルコールは、少なくとも１個のアミノ基及び少なくとも１個のヒドロキシル基を含む。組成物は、酸及び／または緩衝液を更に含んでもよく、それにより、アミノアルコールは、全体的または部分的にアミノアルコールの塩として組成物に存在してもよい。組成物は、好ましくは水性であり、４～１０のｐＨを有する。例示的なアミノアルコールＡＰＣは、４－ヒドロキシピペリジン、１－メチル－３－ピペリジンメタノール、４，４’－トリメチレンビス（ｌ－ピペリジンエタノール）、３－ピペリジンメタノール、１－エチル－４－ヒドロキシ－ピペリジン、２－ピペリジンエタノール、３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジン、１－エチル－３－ヒドキシ－ピペリジン、４－ヒドロキシ－１－メチルピペリジン、１－メチル－２－ピペリジンメタノール、２－ピペリジン－メタノール、２，２，６，６－テトラメチル－４－ピペリジノール、１，４－ビス（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン及び１－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジンである。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、２個のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成反応の特異度を減少させる方法を含むことができる。この方法は、アニーリング促進化合物（ＡＰＣ）を、２個のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成反応物に添加することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、２個のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成反応の特異度を減少させる方法を含むことができる。この方法は、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及びアニーリング促進化合物（ＡＰＣ）を、オリゴヌクレオチド二重鎖の形成に適した条件下で混合することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的オリゴヌクレオチドを同定する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する第１オリゴヌクレオチド、標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する第２オリゴヌクレオチド、アニーリング促進化合物（ＡＰＣ）、ポリメラーゼ、ポリメラーゼに適合する緩衝液及び標的オリゴヌクレオチドを混合すること、（ｂ）（ａ）の混合物を、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及びこれらの対応する相補的配列の融解温度を超える温度で加熱すること、（ｃ）（ｂ）の混合物の温度を、融解温度を下回る温度に低減し、それによって第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド及び標的オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にすること、（ｄ）混合物（ｃ）の温度を、ポリメラーゼ活性に適合する温度に上昇させること、ならびに（ｅ）重合産物の検出することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７９２，４０３号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象、例えばヒト対象、例えば癌患者からの組織または試料、例えば腫瘍または腫瘍試料において、変異型（例えば、変異）の特徴決定モデル（例えば、変異型タイプ及び／または接合性を含む）を生成するシステムを含むことができる。システムは、メモリに動作可能に接続されている少なくとも１個のプロセッサを含み、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、ａ）ｉ）複数の選択されたサブゲノム区間（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｒｖａｌ）（例えば、エクソン）のそれぞれについて、選択されたサブゲノム区間の配列包括度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ）の値（例えば、正規化配列包括度値が挙げられる）を含む配列包括度入力（ＳＣＩ）、ｉｉ）複数の選択された生殖細胞系列ＳＮＰのそれぞれについての、組織または試料、例えば腫瘍試料中のアレル頻度の値を含む、ＳＮＰアレル頻度入力（ＳＡＦＩ）、ｉｉｉ）組織または試料、例えば腫瘍試料中の変異型、例えば変異についてのアレル頻度を含む、変異型アレル頻度入力（ＶＡＦＩ）を取得する、ｂ）複数のゲノムセグメントのそれぞれのゲノムセグメント総コピー数（Ｃ）、複数のゲノムセグメントのそれぞれのゲノムセグメント少数アレルコピー数（Ｍ）及び試料純度（ｐ）のＳＣＩ及びＳＡＦＩの関数として決定された値を取得する、ならびにｃ）ｉ）変異型が、体細胞、生殖細胞系列、サブクローン性体細胞または区別不能であることを示す変異型タイプ、例えば変異タイプ、例えばｇの値（少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、変異型タイプ、例えば変異タイプをＶＡＦＩ、ｐ、Ｃ及びＭの関数として計算するように構成される）、及び（ｉｉ）組織または試料、例えば腫瘍試料中の、Ｃ及びＭの関数としての変異型、例えば変異の接合性（例えば、ホモ接合性、ヘテロ接合性及び不在）の指標の一方または両方を計算するように構成される。一実施形態では、システムは、分析が、対象の非腫瘍組織を分析する必要なく実施できるように構成される。一実施形態において、システムは、変異型タイプ、例えば変異タイプを分析値によって決定することができない腫瘍試料、選択されたサブゲノム区間及び選択された生殖細胞系列ＳＮＰのうちの１つを決定するように構成される。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、サブゲノム区間のリード数と対照（例えば、プロセスマッチド対照（ｐｒｏｃｅｓｓ－ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ））のリード数との関数（例えば、ｌｏｇ比）として計算されたＳＣＩを取得する。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、サブゲノム区間のリード数と対照（例えば、プロセスマッチド対照）のリードとの関数（例えば、ｌｏｇ比）としてＳＣＩを計算するように構成される。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、サブゲノム区間の最小数が選択または分析されたことを確認するように構成される。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、最小数の複数の生殖細胞系列ＳＮＰが選択または分析されたことを確認するように構成される。一実施形態では、生殖細胞系列ＳＮＰの最小数は、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、または１５，０００個の生殖細胞系列ＳＮＰを含む。一実施形態では、ＳＡＦＩは、少なくとも部分的に、腫瘍試料中の少数アレル頻度に基づいている。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、少なくとも部分的に、腫瘍試料中の少数アレル頻度に基づいて、ＳＡＦＩを計算または取得するように構成される。一実施形態では、ＳＡＦＩは、少なくとも部分的に、代替的なアレル頻度（例えば、ヒトゲノム基準データベースの標準アレル以外のアレル頻度）に基づいている。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、少なくとも部分的に代替的なアレル頻度（例えば、ヒトゲノム基準データベースの標準アレル以外のアレル頻度）に基づいて、ＳＡＦＩを計算または取得するように構成される。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサーは、実行時に、ゲノムワイドコピー数モデル（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｍｏｄｅｌ）をＳＣＩ及びＳＡＦＩに当てはめることにより計算されたＣ、Ｍ及びｐの値にアクセスするように構成される。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、Ｃ、Ｍ及びｐを計算するように構成される。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、ゲノムワイドコピー数モデルとＳＣＩ及びＳＡＦＩの最良適合を生成して、Ｃ、Ｍ及びｐを計算する。一実施形態では、Ｃ、Ｍ及びｐの値を、ＳＣＩ及びＳＡＦＩの複数のゲノムワイドコピー数モデル入力に適合させる。一実施形態では、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、ユーザーインターフェイスを生成するように構成される。一実施形態では、ユーザインターフェースは、入力として、複数の選択されたサブゲノム区間、例えばエクソンのそれぞれについて、選択されたサブゲノム区間の配列包括度値（例えば、正規化配列包括度値を含む）を含む配列包括度入力（ＳＣＩ）、複数の選択された生殖細胞系列ＳＮＰのそれぞれについて、腫瘍試料中のアレル頻度の値を含むＳＮＰアレル頻度入力（ＳＡＦＩ）、腫瘍試料中の変異型、例えば変異についてのアレル頻度を含む、変異型アレル頻度入力（ＶＡＦＩ）、複数のゲノムセグメントのそれぞれのゲノムセグメント総コピー数（Ｃ）、複数のゲノムセグメントのそれぞれのゲノムセグメント少数アレルコピー数（Ｍ）及び試料純度（ｐ）のうちのいずれか１つまたは複数を受け取るるように構成される。一実施形態では、ユーザーインターフェース入力に応答して、例えばＳＣＩ、ＳＡＦＩ、ＶＡＦＩ、Ｃ、Ｍ、またはｐのうちの１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、または全て）について、システムは特徴決定モデル、例えば、変異型の特徴決定モデルを生成する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象、例えばヒト対象、例えば癌患者からの組織または試料、例えば腫瘍または腫瘍試料において、変異型、例えば変異を特徴決定する方法であって、ａ）ｉ）複数の選択されたサブゲノム区間、例えばエクソンのそれぞれについて、選択されたサブゲノム区間の正規化配列包括度の値を含む配列包括度入力（ＳＣＩ）、ｉｉ）複数の選択された生殖細胞系列ＳＮＰのそれぞれについて、組織または試料、例えば腫瘍試料中のアレル頻度の値を含む、ＳＮＰアレル頻度入力（ＳＡＦＩ）、ｉｉｉ）腫瘍または試料、例えば腫瘍試料中の変異型、例えば変異についてのアレル頻度を含む、変異型アレル頻度入力（ＶＡＦＩ）を取得すること、ｂ）複数のゲノムセグメントのそれぞれのＣ（ここでＣは、ゲノムセグメント総コピー数である）、複数のゲノムセグメントのそれぞれのＭ（ここでＭは、ゲノムセグメント少数アレルコピー数である）及びｐ（ここでｐは、試料純度である）のＳＣＩ及びＳＡＦＩの関数としての値を取得すること、ならびにｃ）ｉ）変異型、例えば変異が、体細胞、サブクローン性体細胞、生殖細胞系列または区別不能であることを示し、ＶＡＦＩ、ｐ、Ｃ及びＭの関数である、変異型タイプ、例えば変異タイプの値、及び（ｉｉ）腫瘍または試料、例えば腫瘍試料中の、Ｃ及びＭの関数としての変異型、例えば変異の接合性の指標表示の一方または両方を取得すること、を含む方法を含むことができる。一実施形態では、分析は、対象の非腫瘍組織を分析する必要なく実施することができる。一実施形態では、分析は、対象の非腫瘍組織を分析することなく実施され、例えば、同じ対象からの非腫瘍組織はシークエンシングされない。一実施形態では、ＳＣＩは、例えば試料のサブゲノム区間のリード数と対照、例えばプロセスマッチド対照のリード数との関数、例えばｌｏｇ比である値を含む。一実施形態では、ＳＣＩは、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００個のサブゲノム区間、例えばエクソンについての値、例えばｌｏｇ ｒ値を含む。一実施形態では、ＳＣＩは、少なくとも１００個のサブゲノム区間、例えばエクソンについての値、例えばｌｏｇ ｒ値を含む。一実施形態では、ＳＣＩは、１，０００～１０，０００、２，０００～９，０００、３，０００～８，０００、３，０００～７，０００、３，０００～６，０００、または４，０００～５，０００個のサブゲノム区間、例えばエクソンについての値、例えばｌｏｇ ｒ値を含む。一実施形態では、ＳＣＩは、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、または４，０００個の遺伝子において、サブゲノム区間、例えばエクソンについての値、例えばｌｏｇ ｒ値を含む。一実施形態では、ＳＣＩに含まれる少なくとも１つ、複数、または実質的全ての値が、ＧＣ含有量との相関関係に対して修正される。一実施形態では、試料のサブゲノム区間、例えばエクソンは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００個のリードを有する。一実施形態では、試料の複数の、例えば少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００個のサブゲノム区間、例えばエクソンは、所定数のリードを有する。一実施形態では、所定数のリードは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００個である。一実施形態では、複数の生殖細胞系列ＳＮＰは、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、または１５，０００個の生殖細胞系列ＳＮＰを含む。一実施形態では、複数の生殖細胞系列ＳＮＰは、少なくとも１００個の生殖細胞系列ＳＮＰを含む。一実施形態では、複数の生殖細胞系列ＳＮＰは、５００～５，０００、１，０００～４，０００、または２，０００～３，０００個の生殖細胞系列ＳＮＰを含む。一実施形態では、アレル頻度は、少数アレル頻度である。一実施形態では、アレル頻度は、代替アレル、例えば、ヒトゲノム基準データベースの標準アレル以外のアレルのものである。一実施形態では、方法は、腫瘍試料において複数の変異型、例えば変異体を特徴決定することを含む。一実施形態では、方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８ ９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個の変異型、例えば変異体を特徴決定することを含む。一実施形態では、方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個の異なる遺伝子において変異型、例えば変異体を特徴決定することを含む。一実施形態では、方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００
個の変異型、例えば変異体についてＶＡＦＩを取得することを含む。一実施形態では、方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個の変異型、例えば変異体について、ステップａ）、ｂ）及びｃ）の１つ、２つ、または全てを実施することを含む。一実施形態では、Ｃ、Ｍ及びｐの値は、ゲノムワイドコピー数モデルをＳＣＩ及びＳＡＦＩの一方または両方に当てはめることによって得られる、得られた、または得ることができる。一実施形態では、Ｃ、Ｍ及びｐの値を、ＳＣＩ及びＳＡＦＩの複数のゲノムワイドコピー数モデル入力に当てはめる。一実施形態では、ゲノムセグメントは、複数のサブゲノム区間、例えばエクソン、例えば、ＳＣＩ値が割り当てられているサブゲノム区間を含む。一実施形態では、ゲノムセグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のサブゲノム区間、例えばエクソンを含む。一実施形態では、ゲノムセグメントは、１０～１，０００、２０～９００、３０～７００、４０～６００、５０～５００、６０～４００、７０～３００、８０～２００、８０～１５０もしくは８０～１２０、９０～１１０、または約１００個のサブゲノム区間、例えばエクソンを含む。一実施形態では、ゲノムセグメントは、１００～１０，０００、１００～５，０００、１００～４，０００、１００～３，０００、１００～２，０００、または１００～１，０００個のサブゲノム区間、例えばエクソンを含む。一実施形態では、ゲノムセグメントは、１０～１，０００、２０～９００、３０～７００、４０～６００、５０～５００、６０～４００、７０～３００、８０～２００、８０～１５０もしくは８０～１２０、９０～１１０、または約１００個のゲノムＳＮＰを含み、これらにはＳＡＦＩ値が割り当てられている。一実施形態では、ゲノムセグメントは、ＳＡＦＩ値が割り当てられている１００～１０，０００、１００～５，０００、１００～４，０００、１００～３，０００、１００～２，０００、または１００～１，０００個のゲノムＳＮＰを含む。一実施形態では、複数のゲノムセグメントは、それぞれ、予め選択された量以下で異なる、例えば、ゲノムセグメントの範囲内のサブゲノム区間、例えばエクソンにおけるｌｏｇ２ ｒの値が基準値以下で異なる、または実質的に一定である、正規化配列包括度、例えばｌｏｇ ｒの測定値、及び予め選択された量以下で異なる、例えば、ゲノムセグメントの範囲内のサブゲノム区間、例えばエクソンにおける生殖細胞系列ＳＮＰアレル頻度の値が基準値以下で異なる、または実質的に一定である、生殖細胞系列ＳＮＰのＳＮＰアレル頻度の測定値の一方または両方を有することによって特徴決定される。一実施形態では、ゲノムセグメントに含有されている、または組み合わされてゲノムセグメントを形成するサブゲノム区間、例えばエクソンの数は、ゲノムセグメントの数の少なくとも、２、５、１０、１５、２０、５０、または１００倍である。一実施形態では、サブゲノム区間、例えばエクソンの数は、ゲノムセグメントの数の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍である。一実施形態では、ゲノムセグメントの範囲が提供される。一実施形態では、方法は、サブゲノム区間、例えばエクソンの配列をゲノムセグメントに組み立てることを含む。一実施形態では、方法は、例えば、円形二分割法（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｂｉｎａｒｙ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＣＢＳ）、ＨＭＭベースの方法、Ｗａｖｅｌｅｔベースの方法、または染色体に沿ったクラスター法（Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｌｏｎｇ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｍｅｔｈｏｄ）を含む方法によって、サブゲノム区間の配列を組み立てることを含む。一実施形態では、ゲノムワイドコピー数モデルをＳＣＩに当てはめることは、下記の方程式を使用することを含む。
Figure 2023075090000018



式中、ψは腫瘍倍数性である。一実施形態では、ψ＝（ΣｉｌｉＣｉ）／Σｉｌｉであり、ｌｉは、ゲノムセグメントの長さである。一実施形態では、ゲノムワイドコピー数モデルをＳＡＦＩに当てはめることは、下記の方程式を使用することを含む。
Figure 2023075090000019



式中、ＡＦはアレル頻度である。一実施形態では、当てはめは、Ｇｉｂｂｓサンプリングを使用することを含む。一実施形態では、当てはめは、例えば、Ｍａｒｋｏｖ ｃｈａｉｎ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ（ＭＣＭＣ）アルゴリズム、例えば、ＡＳＣＡＴ（Ａｌｌｅｌｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ）、ＯｎｃｏＳＮＰ、またはＰＩＣＮＩＣ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）を使用することを含む。一実施形態では、当てはめは、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ－Ｈａｓｔｉｎｇｓ ＭＣＭＣを使用することが含まれる。一実施形態では、当てはめは、非ベイズ手法、例えば頻度論者（ｆｒｅｑｕｅｎｔｉｓｔ）手法を使用すること、例えば最小二乗当てはめを使用することを含む。一実施形態では、体細胞／生殖細胞系列状態のモデルへのＶＡＦＩ、ｐ、Ｃ及びＭの値の当てはめを決定することによって、ｇが決定される。一実施形態では、方法は、前記変異型、例えば変異のヘテロ接合性の指標を取得することを含む。一実施形態では、試料純度（ｐ）は、包括的純度であり、例えば、全てのゲノムセグメントにわたって同じである。一実施形態では、ｇの値は、下記式によって取得される。
Figure 2023075090000020



式中、ＡＦはアレル頻度である。一実施形態では、０に近い、例えば、０と大幅に異ならないｇの値は、変異型が体細胞変異型であることを示している。一実施形態では、０である、または０に近い、例えば、０からの所定距離の範囲内にあるｇの値、例えば、０．４未満のｇの値は、変異型が体細胞変異型であることを示している。一実施形態では、１に近い、例えば、１と大幅に異ならないｇの値は、変異型が生殖細胞系列変異型であることを示している。一実施形態では、１である、または１に近い、例えば、１からの所定距離の範囲内にあるｇの値、例えば、０．６を超えるｇの値は、変異型が生殖細胞系列変異型であることを示している。一実施形態では、ｇの値は、１未満であるが０を超えており、例えば、所定量の１未満から所定量の０超である場合、例えば、ｇが０．４～０．６である場合、区別不能な結果を示している。一実施形態では、０より大幅に少ないｇの値は、サブクローン性体細胞変異型を示している。一実施形態では、ｇの値は、下記式によって取得される。
Figure 2023075090000021



式中、ＡＦはアレル頻度であり、Ｍ’＝Ｃ－Ｍであり（例えば、Ｍが非少数アレル頻度であるとき）、例えば、変異型は、ｇ＝１である場合、生殖細胞系列多型であり、変異型は、ｇ＝０である場合、体細胞性変異である。
一実施形態では、例えば、試料純度が約４０％を下回るとき、例えば約１０％～約３０％、例えば約１０％～約２０％、または約２０％～３０％であるとき、体細胞／生殖細胞系列の状態が決定される。一実施形態において、Ｃに等しくなく０に等しいＭの値は、変異型、例えば変異の不在、例えば、腫瘍中に存在しないことを示し、Ｃに等しいＭの非０値は、変異型、例えば変異のホモ接合性、例えばヘテロ接合性の損失（ＬＯＨ）を示し、Ｃに等しく０に等しいＭの値は、変異型、例えば変異のホモ接合性欠失、例えば腫瘍中に存在しないことを示し、Ｃに等しくないＭの非０値は、変異型、例えば変異のヘテロ接合性を示す。一実施形態では、方法は、前記変異型、例えば変異の接合性の指標を取得することを含む。一実施形態では、変異状態は、Ｍ＝Ｃ≠０である場合、ホモ接合性（例えば、ＬＯＨ）と決定される。一実施形態では、変異状態は、Ｍ＝Ｃ＝０である場合、ホモ接合性欠失と決定される。一実施形態では、変異状態は、０＜Ｍ＜Ｃであるとヘテロ接合性と決定される。一実施形態では、変異状態は、Ｍ＝０であり、Ｃ≠０である場合、腫瘍に不在である。一実施形態では、例えば、試料純度が約８０％より大きいとき、例えば約９０％～約１００％、例えば約９０％～約９５％、または約９５％～１００％であるとき、接合性が決定される。一実施形態では、対象は、腫瘍試料の対象以外の対象からの正倍数体（例えば、二倍体）組織の試料、または腫瘍試料の対象以外の対象からの１人または複数（例えば、少なくとも２人、３人、４人もしくは５人）の対象からの混合正倍数体（例えば、二倍体）組織の試料である。一実施形態では、方法は、選択されたサブゲノム区間のそれぞれ及び選択された生殖細胞系列ＳＮＰのそれぞれを、例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によりシークエンシングすることを含む。一実施形態では、正規化する前の配列包括度は、少なくとも約１０×、２０×、３０×、５０×、１００×、２５０×、５００×、７５０×、または１０００×のシークエンシング深度である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０２１８１１3に記載された任意の様々な方法を含み得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７／０３５６０５３号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料中の目的の領域を評価するため、例えば、目的の領域のクローンプロファイルを評価するため、試料核酸とベイトセットのハイブリッド形成を使用することを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象の区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間（または、細胞が含有されたもの）のクローンプロファイルを対象において評価または提供する方法であって、（ａ）複数のメンバーを含む核酸ライブラリを取得し、複数のメンバーのそれぞれが対象からの核酸、例えば、固体腫瘍または血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）試料からの複数の腫瘍メンバーを含むこと、（ｂ）ライブラリをベイトセットと接触させて、複数の選択されたメンバーを提供し、それぞれが、対象の区間またはその一部を含むこと（本明細書において、ライブラリキャッチ（ｌｉｂｒａｒｙ ｃａｔｃｈ）と呼ばれることもある）、任意選択で（ｃ）複数の選択されたメンバーのそれぞれのメンバーを増幅して、例えば、対象区間の増幅配列を提供すること、（ｄ）対象区間おける１個または複数の出現した配列を取得して、それによって対象区間のクローンプロファイルを提供または評価することを含む方法を含むことができる。一実施形態では、方法は、サブゲノム区間及び発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む。一実施形態では、方法は、対象区間の第１アレルまたはシグネチャー（例えば、第１Ｖセグメント）の配列を、比較値、例えば、あらかじめ選択された値、例えば、第２アレルまたはシグネチャー（例えば、第２Ｖセグメント）の配列の関数である値と比較することを含む。一実施形態では、方法は、（ｅ）（ｉ）対象区間における配列、シグネチャーもしくはアレルの分布、発現（サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現もしくはレベル）、存在量もしくは同一性の値、例えば、対象区間における配列、シグネチャーもしくはアレルの相対的存在量、または複数の配列、シグネチャーもしくはアレルのそれぞれの相対的存在量の値、あるいは（ｉｉ）変動性の値、例えば、体細胞過剰変異によって生じる配列の変動性、ＶＤ、ＤＪもしくはＶＪ接合部によって、例えば、接合部でのインデルの形成によって、またはＣＤＲ、例えば重鎖ＣＤＲ３によって生じる配列変動性、シグネチャーまたは対象区間の範囲内の配列変動性（例えば、変動性の値が、対象もしくは試料中の対象区間に存在する異なる変異型の数の関数である場合）の値を取得することを更に含む。一実施形態では、方法は、第１対象区間における配列、アレルまたはシグネチャー、例えば、Ｖセグメント、またはＶＤＪもしくはＶＪ再編成のクローンプロファイル、及びｉ）対象の表現型、例えば、疾患状態、またはｉｉ）第２対象区間における遺伝子型を提供することを含む。一実施形態では、ステップ（ｄ）は、（ｉ）対象区間における複数の出現のそれぞれの配列を取得し、例えば、Ｖセグメントを含む対象区間における第１出現の配列及びＶセグメントを含む対象区間における第２出現の配列を取得しすることを含み、第１及び第２出現が、ＶＤ、ＤＪもしくはＶＪ接合部の多様性によって異なる、または（ｉｉ）第１対象区間及び異なる第２対象区間の配列を取得することを含み、例えば、第１対象区間が第１遺伝子の配列を含み、第２対象区間が第２遺伝子の配列を含む。一実施形態では、ステップ（ｄ）は、対象区間における複数の出現、例えばＶＤＪ配列を含む対象区間における複数の出現、例えば、特異的Ｖセグメント、特異的Ｄセグメント及び特異的Ｊセグメントを含むＶＤＪ配列を含む対象区間における複数の出現のそれぞれの配列を取得することを含む。一実施形態では、方法は、ｅ（ｉ）の値を取得することを含む。一実施形態では、ｅ（ｉ）の値は、比較値、例えば、あらかじめ選択された値、例えば、第２配列、シグネチャーまたはアレル（例えば、第２Ｖセグメント）の存在量の関数である値と比べた、対象区間の配列、シグネチャーまたはアレル（例えば、第１Ｖセグメント）の存在量の値を含む。一実施形態では、ｅ（ｉ）の値は、比較値、例えば、あらかじめ選択された値、例えば、事象を欠いている配列の存在量、例えば、対象区間における非変異または非再編成配列の存在量の関数である値と比べた、対象区間における事象、例えば、配列、アレルまたはシグネチャー、例えば、変異または再編成の存在量の値を含む。一実施形態では、ｅ（ｉ）の値は、対象区間におけるＸ個の固有の（すなわち、互いに異なっている）配列、シグネチャーまたはアレルのそれぞれの相対的存在量の値を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％、または全ての染色体アームを含む全アームまたは大型再編成、例えば、再編成、例えば、転座、重複、挿入、または欠失の出現ついて対象を評価する方法であって、（ａ）複数のメンバーを含む核酸ライブラリを取得し、複数のメンバーのそれぞれが対象の核酸を含むこと、（ｂ）ライブラリを、例えばハイブリッド形成溶液の条件下でベイトセットと接触させて、複数の選択されたメンバーを提供し、それぞれが、対象区間またはその一部を含むこと（本明細書において、ライブラリキャッチと呼ばれることもある）、（ｃ）複数のメンバーのそれぞれを、例えば、メンバーの標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、複数のメンバーのそれぞれを、メンバーの標的／対象核酸に結合しないプライマーにより増幅することによって増幅すること、ならびに（ｄ）複数の対象区間の配列を取得し、全アームまたは大型再編成の決定を可能にするように、前記複数の対象区間の配列が染色体に配置されることを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象を評価する方法であって、（ａ）複数のメンバーを含む核酸ライブラリを取得し、複数のメンバーのそれぞれが対象の核酸を含み、例えば、複数の腫瘍メンバーが血液癌試料からのものであること、（ｂ）ライブラリを、例えばハイブリッド形成溶液の条件下でベイトセットと接触させて、複数の選択されたメンバーを提供し、それぞれが、対象区間またはその一部を含むこと（本明細書において、ライブラリキャッチと呼ばれることもある）、（ｃ）複数の選択されたメンバーのそれぞれを、例えば、メンバーの標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、複数の選択されたメンバーのそれぞれのメンバーを、メンバーの標的／対象核酸に結合しないプライマーにより増幅することによって増幅すること、（ｄ）サブゲノム区間及び発現サブゲノム区間の配列を取得し、それによって対象を評価することを含み、（ｉ）方法が、ライブラリを、サブゲノム区間及び発現サブゲノム区間の両方を提供するベイトセットと接触させることを含み、（ｉｉ）方法が、ライブラリを、サブゲノム区間を提供する第１ベイトセット及び発現サブゲノム区間を提供する第２ベイトセットと接触させることを含み、（ｉｉｉ）ライブラリが、ゲノムＤＮＡを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触し、方法が、ベイトセットと接触して発現サブゲノム区間を提供するｃＤＮＡを含む、第２ライブラリを更に含み、（ｉｖ）ライブラリが、ゲノムＤＮＡを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触し、方法が、第２ベイトセットと接触して発現サブゲノム区間を提供するｃＤＮＡを含む、第２ライブラリを更に含み、または（ｖ）方法が、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つを第１反応ミックスに実施して、第１対象区間、例えば、サブゲノム区間を提供し、第２反応ミックスに実施して、第２対象区間、例えば、発現サブゲノム区間、例えば、サブゲノム区間に対応するものを提供することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）を分析する方法を含むことができる。方法は、（ａ）試料から複数のメンバーを含む、例えば、腫瘍試料から複数の腫瘍メンバーを含む１つまたは複数のライブラリを取得すること、（ｂ）任意選択で、１つまたは複数のライブラリの、あらかじめ選択された配列を、例えば、１つまたは複数のライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）に接触させることによって富化して、選択されたメンバーを提供すること（本明細書において、ライブラリキャッチと呼ばれることもある）、（ｃ）メンバー、例えば、ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーの対象区間、例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間におけるリードを、例えば、シークエンシングを含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング方法によって取得すること、（ｄ）前記リードを整列方法によって整列させること、ならびに（ｅ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法によって呼び出し）、それによって、前記腫瘍試料を分析することを含み、任意選択で、Ｘ個の固有の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間、またはその両方）のそれぞれのリードは、固有の整列方法によって整列され、固有の対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）とは、他のＸ－１個の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間、またはその両方）と異なることを意味し、固有の整列方法とは、他のＸ－１つの整列方法と異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）を分析する方法を含むことができる。方法は、（ａ）試料から複数のメンバーを含む、例えば、試料から、例えば、腫瘍試料から複数の腫瘍メンバーを含む１つまたは複数のライブラリを取得すること、（ｂ）任意選択で、１つまたは複数のライブラリのあらかじめ選択された配列を、例えば、ライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）に接触させることによって富化して、選択されたメンバー、例えば、ライブラリキャッチを提供すること、（ｃ）メンバー、例えば、前記ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーの対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）におけるリードを、例えば、シークエンシングを含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング方法によって取得すること、（ｄ）前記リードを整列方法によって整列させること、ならびに（ｅ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法または呼び出し方法によって呼び出し）、それによって、前記腫瘍試料を分析することを含み、任意選択で、Ｘ個の固有の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間、またはその両方）のそれぞれのヌクレオチド位置に割り当てられたヌクレオチド値は、固有の呼出方法によって割り当てられ、固有の対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）とは、他のＸ－１個の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間、またはその両方）と異なることを意味し、固有の呼出方法とは、他のＸ－１つの呼出方法と異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。呼出方法は異なっていてもよく、それによって、固有であってもよく、例えば、異なるベイズ前値に依存していてもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３２４５１９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、例えば標的シークエンシングにより得た試料のシークエンシングリードに基づいて、より精密な変異型コール（ｃａｌｌ）を行う方法、システム及び機器を含むことができる。例えば、配列リードが受け取られ、基準配列に整列されると、ある位置に変異型を有する配列リードを計数することができる。試料の１つの位置で測定された特定の変異型の第１変異型頻度を、他の位置及び／または他の試料で測定された特定の変異型の１つまたは複数の第２変異型頻度と比較することができる。第２変異型頻度は、シークエンシング実行のシークエンシングエラーの期待値に対応することができる。いくつかの実施形態では、ある位置で変異型が真陽性である信頼レベルを示す確率値は、１つまたは複数の試料の標的領域における複数の位置での変異型の計数値及び合計リードの計数値に基づいて計算することができる。次いで、確率値を閾値レベルと比較して、検出された変異型が真陽性であるかを決定することができる。他の実施形態では、試験試料及び基準試料における同じ位置での変異型の計数値と合計リードの計数値の差（例えば、その位置でのシークエンシングエラーのみを有すると仮定して）を使用して、変異型が試験試料において真陽性であるかを決定することができる。一実施形態によると、方法は、試験試料の標的領域における稀な変異型の真陽性を検出することができる。それぞれの試料において、基準アレルが基準配列に存在する位置での同じ変異型クラスの変異型の変異型頻度は、変異型の計数値及び合計リードの計数値を使用して計算することができる。同じクラスの変異型の変異型頻度の分布を使用して、決定された変異型頻度を有する変異型の試験試料の位置における確率値を決定することができる。その確率値に基づいて、試験試料の位置における変異型は、真陽性（変異）または偽陽性のいずれかに分類される。他の実施形態では、方法は、１つまたは複数の基準試料との比較を使用して、試験試料の標的領域における稀な変異型の真陽性を検出することができる。試験試料の特異的位置における特異的変異型についての変異型の計数値及び野生型の計数値は、整列された配列リードから決定することができ、１つまたは複数の基準試料の特異的位置における特異的変異型についての変異型の計数値及び野生型の計数値と比較して、確率値を決定することができる。その確率値に基づいて、試験試料の特異位置における特異的変異型は、真陽性または偽陽性いずれかに分類される。一実施形態では、第１試料の標的領域における低頻度変異型を検出するコンピュータ利用方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、（コンピュータシステムにおいて）１つまたは複数の試料のＤＮＡフラグメントをシークエンシングして得た複数の配列リードを受け取り、１つまたは複数の試料は第１試料を含み、シークエンシングがＤＮＡフラグメントの標的領域を標的にすることを含むこと、複数の配列リードを基準配列の標的領域に整列させること、基準配列の第１位置の基準アレルと異なる第１試料の配列リードに基づいて、標的領域の第１位置に第１アレルを有する第１候補変異型を同定すること、基準配列の第１位置に整列された第１試料の配列リードに基づいて、第１位置の第１アレルの第１変異型頻度を決定すること、複数の変異型クラスから選択された第１変異型クラスに対応する第１候補変異型を同定し、複数の変異型クラスのそれぞれの変異型クラスが異なるタイプの変異型に対応すること、基準アレルを有する基準配列の標的領域における第２位置のセットを同定し、１つまたは複数の試料における他の位置の少なくとも５０％が第１アレルの偽陽性を呈し、第２位置のセットが第１位置を含むこと、第２位置のセットのそれぞれ及び１つまたは複数の試料のそれぞれにおいて、基準配列の第２位置に整列された試料の配列リードに基づいて、第１アレルの第２変異型頻度を決定し、第２変異型頻度が統計分布を形成すること、第１変異型頻度を統計分布の統計値と比較して、統計分布の統計値と比べた第１変異型頻度の確率値を決定すること、及び第１候補変異型が第１試料において第１アレルに関して真陽性であるかを決定する一部として、確率値を閾値と比較し、閾値が第１アレルに関して偽陽性と真陽性を区別することを含む。ある特定の実施形態では、基準配列は、正常細胞において決定した、コンセンサス配列に対応する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の試料は、無細胞ＤＮＡフラグメントに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の試料は、生体試料のＲＮＡに由来する。いくつかの実施形態では、複数の試料は、単一のシークエンシングの実行においてシークエンシングされる。他の実施形態では、統計分布の統計値は、平均値を含む。他の実施形態では、確率値は、ｚスコア、修正ｚスコア、累積確率、Ｐｈｒｅｄクオリティスコアまたは修正Ｐｈｒｅｄクオリティスコアである。他の実施形態では、統計分布は、第２変異型頻度の対数変換の統計分布である。他の実施形態では、閾値は、１回または複数回のシークエンシング実行によって得たトレーニングデータに基づいて、サポートベクターマシン分類器を使用して決定される。他の実施形態では、閾値は変異型頻度の関数である。別の実施形態では、第１試料の標的領域における第１位置に第１アレルを有する変異型を検出するコンピュータ利用方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は（コンピュータシステムにおいて）、少なくとも２つの試料のＤＮＡフラグメントをシークエンシングして得た複数の配列リードを受け取り、少なくとも２つの試料が第１試料を含み、シークエンシングがＤＮＡフラグメントの標的領域を標的にすることを含むこと、複数の配列リードを基準配列の標的領域に整列させること、基準配列の第１位置の基準アレルと異なる、それぞれの試料の第１位置の整列された配列リードに基づいて、第１アレルが少なくとも２つの試料のそれぞれの試料の第１位置に存在するかを同定すること、少なくとも２つの試料のそれぞれの試料の第１位置における第１アレルの変異型の計数値及び第１位置における基準アレルの野生型の計数値を決定すること、少なくとも２つの試料から、少なくとも１つの試料を基準試料として選択すること、第１試料の第１位置における第１アレルの第１変異型の計数値及び第１位置における基準アレルの第１野生型の計数値を、基準試料の第１位置における第１アレルの第２変異型の計数値及び第１位置における基準アレルの第２野生型の計数値と比較して、第１試料の第１位置に第１アレルを有する変異型の確率値を決定すること、ならびに第１試料の第１位置の第１アレルが第１アレルに関して真陽性であるかを決定する一部として、確率値を閾値と比較し、閾値が第１位置の第１アレルに関して偽陽性と真陽性を区別することを含む。ある特定の実施形態では、基準試料は２つの試料を含み、第１試料以外における少なくとも２つの試料の第１位置における第１アレルに最低の変異型頻度を有する。いくつかの実施形態では、確率値は、カイ二乗累積分布関数を使用して決定される。いくつかの実施形態では、確率値は、Ｐｅａｒｓｏｎ比率検定を使用して決定される。いくつかの実施形態では、確率値は、ｚスコア、修正ｚスコア、ｐ値、カイ二乗値、累積確率値及びクオリティスコアのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、クオリティスコアは、ルックアップテーブルを使用して決定される。いくつかの実施形態では、閾値は、１回または複数回のシークエンシング実施によって得たトレーニングデータに基づいて、サポートベクターマシン分類器を使用して決定される。いくつかの実施形態では、閾値は変異型頻度の関数である。別の実施形態では、実行時にコンピュータシステムが第１試料の標的領域における真の変異型を検出するように制御する複数の命令を記憶する非一過性コンピュータ可読媒体を含む、コンピュータ製品が提供される。いくつかの実施形態では、命令は、１つまたは複数の試料のＤＮＡフラグメントをシークエンシングして得た複数の配列リードを受け取り、１つまたは複数の試料が第１試料を含み、シークエンシングがＤＮＡフラグメントの標的領域を標的にすることを含むこと、複数の配列リードを基準配列の標的領域に整列させること、変異型クラスの変異型の基準アレルを有する基準配列の標的領域において配列位置のセットを同定し、１つまたは複数の試料の配列位置の少なくとも５０％が、配列リードにおいて変異型クラスの変異型について偽陽性を呈し、配列位置のセットが第１位置を含むこと、配列位置のセットのそれぞれの位置及び１つまたは複数の試料のそれぞれの試料において、それぞれの試料のそれぞれの位置においてリード計数値を決定すること、基準配列の同じ位置の基準アレルと異なるそれぞれの試料の配列リードに基づいて、変異型クラスの変異型の変異型アレルを有する候補変異型を同定し、それぞれの試料のそれぞれの位置における候補変異型の総数がそれぞれの試料のそれぞれの位置における変異型の計数値であること、リード計数値及び変異型計数値に基づいて、変異型クラスの変異型の変異型頻度を決定し、それぞれの試料のそれぞれの位置における変異型頻度が統計分布を形成し、第１試料の配列位置のセットにおける第１位置の変異型頻度が第１変異型頻度であること、第１変異型頻度を統計分布の値と比較して、統計分布の値に対する第１変異型頻度の確率値を決定すること、ならびに第１試料の候補変異型が真陽性であるかを決定する一部として、確率値を閾値と比較し、閾値が変異型クラスの変異型に関して偽陽性と真陽性を区別することを含む。ある特定の実施形態では、統計分布は、それぞれの試料のそれぞれの位置における変異型頻度の対数変換の統計分布である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，３４０，８３０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、腫瘍試料を分析する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）試料、例えば腫瘍試料からの複数の標的メンバー、例えば腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、（ｂ）任意選択で、ライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）と接触させて、選択されたメンバーを提供すること（本明細書において、「ライブラリキャッチ」と呼ばれることもある）、（ｃ）前記ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーのサブゲノム区間におけるリードを、例えば、シークエンシングにより、例えば、次世代シークエンシング方法により取得すること、（ｄ）前記リードを整列させること、及び（ｅ）前記リードのヌクレオチド値を、あらかじめ選択されたヌクレオチド位置に、例えば、複数のサブゲノム区間のそれぞれにおける、例えば、複数の遺伝子のそれぞれにおけるあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法によって呼び出し）、それによって前記試料を分析することを含み、（ｉ）Ｘ個のヌクレオチド位置のそれぞれは、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の１つまたは組合せに固有の条件セットの下で分析される（固有とは、他のＸ－１の条件セットと異なることを意味し、Ｘは、少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００または５００である）。例えば、第１条件セットは第１ヌクレオチド位置、例えば、第１サブゲノム区間または遺伝子に使用され、第２条件セットは、第２ヌクレオチド位置、例えば、第２サブゲノム区間または遺伝子に使用され、（ｉｉ）Ｘ個のヌクレオチド位置のそれぞれにおいて、ヌクレオチド位置に発生し得る、あらかじめ選択された変更、例えば、変異の特徴に応答して、ヌクレオチド位置は、固有の条件セットの下で分析される（固有とは、他のＸ－１条件のセットと異なることを意味し、Ｘは、少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００または５００である）。例えば、第１サブゲノム区間のヌクレオチド位置に発生し得るあらかじめ選択された変更、例えば、変異の特徴に応答して、ヌクレオチド位置は、第１条件セットの下で分析され、第２サブゲノム区間のヌクレオチド位置に発生し得るあらかじめ選択された変更、例えば、変異の特徴に応答して、ヌクレオチド位置は、第２条件セットの下で分析され、（ｉｉｉ）前記方法は、少なくとも２、５、１０、２０、５０または１００個のサブゲノム区間、例えば遺伝子におけるヌクレオチド位置に対して９５、９８または９９％の感受性または特異性を可能にする条件下で、試料、例えば、保存腫瘍試料に実施され、あるいは（ｉｖ）方法は、ａ）第１サブゲノム区間をシークエンシングして、例えば、試料の５％未満の細胞に存在する変異をシークエンシングするため、約５００×以上のシークエンシング深度を提供すること、ｂ）第２サブゲノム区間をシークエンシングして、例えば、試料の１０％未満の細胞に存在する変異をシークエンシングするため、約２００×以上、例えば約２００×～約５００×のシークエンシング深度を提供すること、ｃ）第３サブゲノム区間をシークエンシングして、例えば、ａ）患者が異なる薬物を代謝する能力を説明し得る薬理ゲノミクス（ＰＧｘ）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）またはｂ）患者を固有に同定するために使用され得るゲノムＳＮＰ（例えば、フィンガープリント）から選択される１個または複数のサブゲノム区間（例えば、エクソン）をシークエンシングするため、約１０×～約１００×のシークエンシング深度を提供すること、ｄ）第４サブゲノム区間をシークエンシングして、例えば、ゲノム転座またはインデルなどの構造切断点を検出するため、約５～５０×のシークエンシング深度を提供することの１つもしくは複数、または全てを含む。例えば、イントロン切断点の検出は、高い検出信頼度を確実にするため５～５０×の配列対スパニング深度（ｓｐａｎｎｉｎｇ ｄｅｐｔｈ）を必要とする。そのようなベイトセットは、例えば、転座／インデル誘発性癌遺伝子を検出するために使用することができ、あるいはｅ）第５サブゲノム区間をシークエンシングして、例えば、コピー数変化を検出するため、約０．１～３００×のシークエンシング深度を提供する。一実施形態では、シークエンシング深度は、コピー数変化を検出するため、約０．１～１０×のシークエンシング深度の範囲である。他の実施形態では、シークエンシング深度は、ゲノムＤＮＡのコピー数増加／損失またはヘテロ接合性損失（ＬＯＨ）の評価に使用されるゲノムＳＮＰ／遺伝子座を検出するため、約１００～３００×の範囲である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば腫瘍試料を分析する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）試料から複数のメンバーを含む、例えば、腫瘍試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、（ｂ）任意選択で、ライブラリのあらかじめ選択された配列を、例えば、ライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）に接触させることによって富化して、選択されたメンバーを提供すること（本明細書において、ライブラリキャッチと呼ばれることもある）、（ｃ）メンバー、例えば、前記ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーのサブゲノム区間におけるリードを、例えば、シークエンシングを含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング方法によって取得すること、（ｄ）前記リードを整列方法によって整列させること、ならびに（ｅ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法によって呼び出し）、それによって、前記腫瘍試料を分析することを含み、Ｘ個の固有のサブゲノム区間のそれぞれにおけるリードは、固有の整列方法によって整列され、固有のサブゲノム区間とは、他のＸ－１のサブゲノム区間と異なることを意味し、固有の整列方法とは、他のＸ－１の整列方法と異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。一実施形態では、ステップ（ｂ）が存在する。一実施形態では、ステップ（ｂ）が不在である。一実施形態では、Ｘは少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、５００、または１，０００である。一実施形態では、方法（例えば、上記に列挙された方法の要素（ｄ））は、リードを分析する、例えば整列させるために整列方法を選択すること、または整列方法を使用することを含み、前記整列方法は、（ｉ）腫瘍タイプ、例えば前記試料の腫瘍タイプ、（ｉｉ）シークエンシングされる前記サブゲノム区間が位置する遺伝子または遺伝子タイプ、例えば、あらかじめ選択された変異型もしくは変異型タイプ、例えば変異により、またはあらかじめ選択された頻度の変異より特徴決定される、遺伝子または遺伝子タイプ、（ｉｉｉ）分析される部位（例えば、ヌクレオチド位置）、（ｉｖ）評価されるサブゲノム区間内の変異型のタイプ、例えば置換、（ｖ）試料のタイプ、例えばＦＦＰＦ試料、及び（ｖｉ）評価される前記サブゲノム区間における、または近くの配列、例えば、前記サブゲノム区間の誤整列の期待傾向、例えば、前記サブゲノム区間における、または近くの反復配列の存在のうちの１つもしくは複数、または全てについての関数である、１つもしくは複数、または全てに選択的に応答性である、または１つもしくは複数、または全てのために最適化されている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば腫瘍試料を分析する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）試料から複数のメンバーを含む、例えば、試料、例えば腫瘍試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、（ｂ）任意選択で、ライブラリのあらかじめ選択された配列を、例えば、ライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）に接触させることによって富化して、選択されたメンバー、例えば、ライブラリキャッチを提供すること、（ｃ）メンバー、例えば、前記ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーの対象区間におけるリードを、例えば、シークエンシングを含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング方法によって取得すること、（ｄ）前記リードを整列方法によって整列させること、ならびに（ｅ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法または呼び出し方法によって呼び出し）、それによって、前記腫瘍試料を分析することを含み、Ｘ個の固有のサブゲノム区間のそれぞれのヌクレオチド位置に割り当てられたヌクレオチド値は、固有の呼出方法によって割り当てられ、固有のサブゲノム区間とは、他のＸ－１のサブゲノム区間と異なることを意味し、固有の呼出方法とは、他のＸ－１の呼出方法と異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。呼出方法は異なっていてもよく、それによって、特有であってもよく、例えば、異なるベイズ前値に依存していてもよい。一実施形態では、ステップ（ｂ）が存在する。一実施形態では、ステップ（ｂ）が不在である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば腫瘍試料を分析する方法を含むことができる。この方法は、（ａ）試料から複数のメンバー（例えば、標的メンバー）を含む、例えば、腫瘍試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、（ｂ）ライブラリをベイトセットと接触させて、選択されたメンバー（例えば、ライブラリキャッチ）を提供すること、（ｃ）メンバー、例えば、前記ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーのサブゲノム区間におけるリードを、例えば、シークエンシングを含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング方法によって取得すること、（ｄ）前記リードを整列方法によって整列させること、ならびに（ｅ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法または呼び出し方法によって呼び出し）、それによって、前記腫瘍試料を分析することを含み、方法は、ライブラリを、複数の、例えば、少なくとも２、３、４、または５個のベイトまたはベイトセットと接触させ、前記複数のベイトまたはベイトセットのそれぞれは、選択において、（複数の他のベイトセットではなく）固有のあらかじめ選択された効率を有する。例えば、それぞれの固有のベイトまたはベイトセットがシークエンシングの特有深度を提供する。一実施形態では、複数のベイトセットにおける第１ベイトセットの選択効率は、複数のベイトセットにおける第２ベイトセットの効率と少なくとも２倍の差がある。一実施形態では、第１及び第２ベイトセットは、少なくとも２倍の差があるシークエンシング深度を提供する。一実施形態では、方法は、以下のベイトセットの１つまたは複数をライブラリと接触させることを含む。ａ）例えば、試料の５％以下の細胞に存在する変異をシークエンシングするため、約５００×以上のシークエンシング深度を提供するサブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット、ｂ）例えば、試料の１０％以下の細胞に存在する変異をシークエンシングするため、約２００×以上、例えば約２００×～約５００×のシークエンシング深度を提供するサブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット、ｃ）例えば、ａ）患者が異なる薬物を代謝する能力を説明し得る薬理ゲノミクス（ＰＧｘ）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）またはｂ）患者を固有に同定するために使用され得るゲノムＳＮＰ（例えば、フィンガープリント）から選択される１個または複数のサブゲノム区間（例えば、エクソン）をシークエンシングするため、約１０×～約１００×のシークエンシング深度を提供するサブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット、ｄ）例えば、ゲノム転座またはインデル
などの構造切断点を検出するため、約５～５０×のシークエンシング深度を提供するサブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット。例えば、イントロン切断点の検出は、高い検出信頼度を確実にするため５～５０×の配列対のスパニング深度を必要とする。そのようなベイトセットは、例えば、転座／インデル誘発性癌遺伝子を検出するために使用することができ、あるいはｅ）例えば、コピー数変化を検出するため、約０．１～３００×のシークエンシング深度を提供するサブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセットである。一実施形態では、シークエンシング深度は、コピー数変化を検出するため、約０．１～１０×のシークエンシング深度の範囲である。他の実施形態では、シークエンシング深度は、ゲノムＤＮＡのコピー数増加／損失またはヘテロ接合性損失（ＬＯＨ）の評価に使用されるゲノムＳＮＰ／遺伝子座を検出するため、約１００～３００×の範囲である。そのようなベイトセットは、例えば、増幅／欠失誘発性癌遺伝子を検出するために使用することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば腫瘍試料を含むことができる。この方法は、（ａ）試料から複数のメンバーを含む、例えば、腫瘍試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、（ｂ）任意選択で、ライブラリのあらかじめ選択された配列を、例えば、ライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）に接触させることによって富化して、選択されたメンバー（例えば、ライブラリキャッチ）を提供すること、（ｃ）メンバー、例えば、前記ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーのサブゲノム区間におけるリードを、例えば、シークエンシングを含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング方法によって取得すること、（ｄ）前記リードを整列方法によって整列させること、ならびに（ｅ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法または呼び出し方法によって呼び出し）、それによって、前記腫瘍試料を分析することを含み、方法は、例えば次世代シークエンシング方法によって、試料の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物のサブゲノム区間をシークエンシングすることを含み、遺伝子または遺伝子産物は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、またはＴＰ５３から選択される。一実施形態では、ステップ（ｂ）が存在する。一実施形態では、ステップ（ｂ）が不在である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１５１５２４に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料のサブゲノム区間セットの配列を提供すること及び変異荷重の値を決定することによって、試料の変異荷重を評価し、値がサブゲノム区間セットにおける変更数の関数である方法を含むことができる。ある特定の実施形態では、サブゲノム区間セットは、遺伝子の所定のセットからのもの、例えば、全ゲノムまたはエクソームを含まない遺伝子の所定のセットからのものである。ある特定の実施形態では、サブゲノム区間セットは、コーディングサブゲノム区間のセットである。他の実施形態では、サブゲノム区間セットは、コーディングサブゲノム区間及び非コーディングサブゲノム区間の両方を含有する。ある特定の実施形態では、変異荷重の値は、サブゲノム区間セットにおける変更（例えば、体細胞変更）数の関数である。ある特定の実施形態では、変更数には、機能的変更、生殖細胞系列の変更、またはこれらの両方が除外される。いくつかの実施形態では、試料は、腫瘍試料または腫瘍由来試料である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、例えば、試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、ライブラリを、ハイブリッド形成によってベイトセットと接触させて、選択された腫瘍メンバーを提供し、それによって、ライブラリキャッチを提供すること、ライブラリキャッチから、腫瘍メンバーにおける変更を含むサブゲノム区間のリードを取得すること、リードを整列方法によって整列させること、リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当てること、及び割り当てらたヌクレオチド位置のセットからサブゲノム区間セットを選択することの１つまたは複数を含み、サブゲノム区間セットが、遺伝子の所定のセットからのものである方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば腫瘍試料（例えば、腫瘍から取得した試料）の変異荷重を評価する方法を含むことができ、方法は、ａ）試料のサブゲノム区間（例えば、コーディングサブゲノム区間）セットの配列、例えば、ヌクレオチド配列を提供し、サブゲノム区間セットが遺伝子の所定のセットからのものであること、及びｂ）変異荷重の値を決定し、値がサブゲノム区間セットにおける変更（例えば、１個または複数の変更）、例えば体細胞変更（例えば、１個または複数の変更）数の関数であることを含む。ある特定の実施形態では、変更数には、サブゲノム区間における機能的変更が除外される。他の実施形態では、変更数には、サブゲノム区間における生殖細胞系列の変更が除外される。ある特定の実施形態では、変更数には、サブゲノム区間における機能的変更及びサブゲノム区間における生殖細胞系例の変更が除外される。ある特定の実施形態では、サブゲノム区間セットは、コーディングサブゲノム区間を含む。他の実施形態では、サブゲノム区間セットは、非コーディングサブゲノム区間を含む。ある特定の実施形態では、サブゲノム区間セットは、コーディングサブゲノム区間を含む。他の実施形態では、サブゲノム区間セットは、１個または複数のコーディングサブゲノム区間及び１個または複数の非コーディングサブゲノム区間を含む。ある特定の実施形態では、サブゲノム区間セットにおける約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、または約９５％以上のサブゲノム区間がコーディングサブゲノム区間である。他の実施形態では、サブゲノム区間セットにおける約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、または約５％以下のサブゲノム区間が非コーディングサブゲノム区間である。他の実施形態では、サブゲノム区間セットは、全ゲノムまたは全エクソームを含まない。他の実施形態では、コーディングサブゲノム区間セットは、全エクソームを含まない。ある特定の実施形態では、変異荷重は、例えば、基準集団の試料における変異荷重の百分位数として表される。ある特定の実施形態では、基準集団には、対象と同じタイプのがんを有する患者を含む。他の実施形態では、基準集団には、対象と同じタイプの療法を受けている、または受けた患者を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば腫瘍試料または腫瘍由来試料の変異荷重を評価する方法を含むことができる。この方法は、（ｉ）試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、（ｉｉ）ライブラリをベイトセットと接触させて、選択された腫瘍メンバーを提供し、前記ベイトセットが腫瘍メンバーとハイブリッド形成し、それによって、ライブラリキャッチを提供すること、（ｉｉｉ）前記ライブラリキャッチから、例えば、次世代シークエンシング方法によって、腫瘍メンバーの変更（例えば、体細胞変更）を含むサブゲノム区間のリードを取得すること、（ｉｖ）前記リードを整列方法により整列させること、（ｖ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当てること、（ｖｉ）割り当てられたヌクレオチド位置のセットからサブゲノム区間（例えば、コーディングサブゲノム区間）セットを選択し、サブゲノム区間セットが遺伝子の所定のセットからのものであること、及び（ｖｉｉ）変異荷重の値を決定し、値がサブゲノム区間セットにおける変更（例えば、１個または複数の変更）、例えば体細胞変更（例えば、１個または複数の変更）数の関数であることを含む。ある特定の実施形態では、変更（例えば、体細胞変更）数には、サブゲノム区間における機能的変更が除外される。他の実施形態では、変更数には、サブゲノム区間における生殖細胞系列の変更が除外される。ある特定の実施形態では、変更（例えば、体細胞変更）数には、サブゲノム区間における機能的変更及びサブゲノム区間における生殖細胞系例の変更が除外される。ある特定の実施形態では、遺伝子の所定のセットは、複数の遺伝子を含み、これらは変異体の形態であり、細胞分化、増殖もしくは生存に対する影響に関連する、またはがんに関連する。ある特定の実施形態では、方法は、試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得することを更に含む。ある特定の実施形態では、方法は、ライブラリをベイトセットと接触させて、選択された腫瘍メンバーを提供し、前記ベイトセットがライブラリの腫瘍メンバーとハイブリッド形成し、それによって、ライブラリキャッチを提供することを更に含む。ある特定の実施形態では、方法は、ライブラーまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーにおける変更（例えば、体細胞変更）を含むサブゲノム区間のリードを取得し、それによって、例えば、次世代シークエンシング方法によりサブゲノム区間のリードを取得することを更に含む。ある特定の実施形態では、方法は、整列方法によりサブゲノム区間のリードを整列させることを更に含む。ある特定の実施形態では、方法は、ヌクレオチド値を、例えば変異呼出方法によって、サブゲノム区間のリードのあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当てることを更に含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）試料から複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを取得すること、（ｂ）ライブラリをベイトセットと接触させて、選択された腫瘍メンバーを提供し、前記ベイトセットが腫瘍メンバーとハイブリッド形成し、それによって、ライブラリキャッチを提供すること、（ｃ）前記ライブラリキャッチの腫瘍メンバーにおける変更（例えば、体細胞変更）を含むサブゲノム区間のリードを取得し、それによって、例えば次世代シークエンシング方法によりサブゲノム区間のリードを取得すること、（ｄ）整列方法により前記リードを整列させること、または（ｅ）前記リードのヌクレオチド値を、例えば変異呼出方法によりあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当てることのうちの１、２、３、４つ、または全てを更に含む。ある特定の実施形態では、生殖細胞系列の変更は、ＳＧＺアルゴリズムの使用を含む方法またはシステムから除外される。ある特定の実施形態では、方法は、ａ）ｉ）複数の選択されたサブゲノム区間のそれぞれにおいて、選択されたサブゲノム区間の正規化配列包括度の値を含む配列包括度入力（ＸＣＩ）（ここで、ＳＣＩは、サブゲノム区間のリード数及びプロセスマッチド対照のリード数の関数である）、ｉｉ）複数の選択された生殖細胞系列ＳＮＰのそれぞれにおいて、腫瘍試料におけるアレル頻度の値を含むＳＮＰアレル頻度入力（ＳＡＦＩ）（ここで、ＳＡＦＩは、少なくとも部分的に、少数または代替のアレル頻度に基づいている）、及びｉｉｉ）腫瘍試料の変異型のアレル頻度を含む変異型アレル頻度入力（ＶＡＦＩ）、を取得すること、ｂ）ｉ）複数のゲノムセグメントのそれぞれのゲノムセグメント総コピー数（Ｃ）、ｉｉ）複数のゲノムセグメントのそれぞれのゲノムセグメント少数アレルコピー数（Ｍ）及びｉｉｉ）試料純度（ｐ）の値を、ＳＣＩ及びＳＡＦＩの関数として取得すること（ここで、Ｃ、Ｍ及びｐの値は、ゲノムワイドコピー数モデルをＳＣＩ及びＳＡＦＩに当てはめることによって得られる）、ならびにｃ）変異型が体細胞、サブクローン体細胞変異型、生殖細胞系列または区別不能であることを示し、かつＶＡＦＩ、ｐ、Ｃ及びＭの関数である、変異タイプの値ｇを取得することによって、腫瘍試料中の変異型、例えば変更を特徴決定することを更に含む。ＳＧＺアルゴリズムは、国際出願公開第２０１４／１８３０７８号及び米国特許出願公開第２０１４／０３３６９９６号に記載されており、それらの内容は、それらの全体が参照により援用される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料（例えば、腫瘍試料または腫瘍由来試料）の変異荷重を評価するシステムを含むことができる。システムは、メモリに動作可能に接続されている少なくとも１個のプロセッサを含み、少なくとも１個のプロセッサは、実行時に、ａ）試料のサブゲノム区間（例えば、コーディングサブゲノム区間）セットの配列、例えば、ヌクレオチド配列を取得する（ここで、コーディングサブゲノム区間セットは遺伝子の所定のセットからのものである）及びｂ）変異荷重の値を決定する（ここで、値はサブゲノム区間セットにおける変更（例えば、体細胞変更）数の関数である）ように構成される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料を分析する方法を含むことができる。方法は、（ａ）試料から複数のメンバーを含む、例えば、腫瘍試料から複数の腫瘍メンバーを含む１つまたは複数のライブラリを取得すること、（ｂ）任意選択で、１つまたは複数のライブラリのあらかじめ選択された配列を、例えば、１つまたは複数のライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）に接触させることによって富化して、選択されたメンバーを提供すること（本明細書において、ライブラリキャッチと呼ばれることもある）、（ｃ）メンバー、例えば、ライブラリまたはライブラリキャッチの腫瘍メンバーの対象区間、例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間におけるリードを、例えば、シークエンシングを含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング方法によって取得すること、（ｄ）前記リードを整列方法によって整列させること、ならびに（ｅ）前記リードのヌクレオチド値をあらかじめ選択されたヌクレオチド位置に割り当て（例えば、変異を、例えば、ベイズ法によって呼び出し）、それによって、前記腫瘍試料を分析することを含み、任意選択で、Ｘ個の固有の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間、またはその両方）のそれぞれのリードは、固有の整列方法によって整列され、固有の対象区間（例えば、サブ
ゲノム区間または発現サブゲノム区間）とは、他のＸ－１個の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間、またはその両方）と異なることを意味し、固有の整列方法とは、他のＸ－１つの整列方法と異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。一実施形態では、方法（例えば、上記に列挙された方法の要素（ｄ））は、リードを分析する、例えば整列させるために選択すること、または整列方法を使用することを含み、前記整列方法は、（ｉ）腫瘍タイプ、例えば前記試料の腫瘍タイプ、（ｉｉ）シークエンシングされる前記対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）が位置する遺伝子または遺伝子タイプ、例えば、あらかじめ選択された変異型もしくは変異型タイプ、例えば変異により、またはあらかじめ選択された頻度の変異より特徴決定される、遺伝子または遺伝子タイプ、（ｉｉｉ）分析される部位（例えば、ヌクレオチド位置）、（ｉｖ）評価される対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）内の変異型のタイプ、例えば置換、（ｖ）試料のタイプ、例えばＦＦＰＦ試料、血液試料、または骨髄吸引試料、及び（ｖｉ）評価される前記サブゲノム区間における、または近くの配列、例えば、前記対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）の誤整列の期待傾向、例えば、前記対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）における、または近くの反復配列の存在のうちの１つもしくは複数、または全てについての関数である、１つもしくは複数、または全てに選択的に応答性である、または１つもしくは複数、または全てのために最適化されている。いくつかの実施形態では、方法は、適切に調整され、リードとの整列のために再編成基準配列を選択することを含む整列方法を使用すること（ここで、前記再編成基準配列は、あらかじめ選択された再編成と整列するようにあらかじめ選択される）（実施形態では、基準配列はゲノム再編成と同一ではない）、リードを前記あらかじめ選択された再編成基準配列と比較する、例えば整列させることを含むことができる。実施形態では、他の方法を使用して、問題のあるリードを整列させる。これらの方法は、比較的多数の多様なサブゲノム区間におけるリードの整列が最適化される場合、特に有効である。例として、腫瘍試料を分析する方法は、第１パラメータセット（例えば、第１マッピングアルゴリズムまたは第１基準配列）によるリードの比較、例えば整列比較を実施すること、前記リードが第１所定整列基準を満たす（例えば、リードを、例えばあらかじめ選択されたミスマッチ数未満で前記第１基準配列と整列させることができる）かを決定すること、前記リードが第１所定整列基準を満たすことができない場合、第２パラメータセット（例えば、第２マッピングアルゴリズムまたは第２基準配列）による第２整列比較を実施すること、任意選択で、前記リードが前記第２所定基準を満たす（例えば、リードを、所定数未満のミスマッチで前記第２基準配列と整列させることができる）かを決定することを含み、前記第２パラメータセットは、パラメータセットの使用を含み、例えば、前記第２基準配列は、前記第１パラメータセットと比較して、あらかじめ選択された変異型、例えば、再編成、例えば、挿入、欠失または転座のリードとの整列をもたらす可能性が高い。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２６６９３８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、生体試料中における標的核酸配列の存在または不在を決定する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、ａ．アンカー核酸ドメイン及びレポーター核酸ドメインを含む検出可能に標識されたプローブを、試料と接触させること、ならびにｂ．プローブと標的核酸への結合の存在または不在を検出することを含み、アンカードメインとレポータードメインは、非ヌクレオシドリンカーにより連結しており、アンカードメインとレポータードメインのいずれも標的核酸の不在下でステムループを形成せず、（ｉ）プローブはポリメラーゼにより伸長され得ず、（ｉｉ）リンカーは、アンカードメインの３’末端の２個のヌクレオチド内のアンカードメインに連結し、リンーカーは、レポータードメインの５’末端の２個のヌクレオチド内のレポータードメインに連結し、アンカードメインは、検出可能標識に連結しておらず、ならびに／または（ｉｉｉ）アンカードメイン及びレポータードメインは、それぞれ、標的核酸の同じ鎖に相補的な少なくとも６個のヌクレオチドの近接配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、ポリメラーゼによって伸長されない。いくつかの実施形態では、リンカーは、アンカードメインの３’末端の２個のヌクレオチド内のアンカードメインに連結し、リンカーは、レポータードメインの５’末端の２個のヌクレオチド内のレポータードメインに連結し、アンカードメインは、検出可能標識に連結していない。いくつかの実施形態では、アンカードメイン及びレポータードメインは、それぞれ、標的核酸の１つの鎖に相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドの近接配列を含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、レポータードメイン及び標的核酸により形成された複合体の融解温度を測定することを含む。いくつかの実施形態では、レポータードメインの長さは、４～２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、レポータードメインの長さは、６～１２個のヌクレオチドである。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列の存在または不在を検出する反応混合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ａ．アンカー結合領域及びレポーター結合領域を含む標的核酸、ならびにｂ．アンカー核酸ドメイン及びレポーター核酸ドメインを含む検出可能に標識されたプローブを含み、アンカードメインとレポータードメインは、非ヌクレオシドリンカーにより連結しており、アンカードメインとレポータードメインのいずれも標的核酸の不在下でステムループを形成せず、（ｉ）プローブはポリメラーゼにより伸長され得ず、（ｉｉ）リンカーは、アンカードメインの３’末端の２個のヌクレオチド内のアンカードメインに連結し、リンーカーは、レポータードメインの５’末端の２個のヌクレオチド内のレポータードメインに連結し、アンカードメインは、検出可能標識に連結しておらず、ならびに／または（ｉｉｉ）アンカードメイン及びレポータードメインは、それぞれ、標的核酸の同じ鎖に相補的な少なくとも６個のヌクレオチドの近接配列を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及び／またはオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む。いくつかの実施形態では、プローブは、ポリメラーゼによって伸長され得ない。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、アンカー核酸ドメイン及びレポーター核酸ドメインを含む検出可能に標識されたプローブを含むことができ、アンカードメインとレポータードメインは、非ヌクレオシドリンカーにより連結しており、アンカードメインとレポータードメインのいずれも標的核酸の不在下でステムループを形成せず、（ｉ）プローブはポリメラーゼにより伸長され得ず、及び／または（ｉｉ）リンカーは、アンカードメインの３’末端の２個のヌクレオチド内のアンカードメインに連結し、リンーカーは、レポータードメインの５’末端の２個のヌクレオチド内のレポータードメインに連結し、アンカードメインは、検出可能標識に連結していない。いくつかの実施形態では、プローブは、ポリメラーゼによって伸長され得ない。いくつかの実施形態では、リンカーは、アンカードメインの３’末端の２個のヌクレオチド内のアンカードメインに連結し、リンカーは、レポータードメインの５’末端の２個のヌクレオチド内のレポータードメインに連結し、アンカードメインは、検出可能標識に連結していない。いくつかの実施形態では、レポータードメインの長さは、４～２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、レポータードメインの長さは、６～１２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンカードメインは、６～４０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。いくつかの実施形態では、プローブは、少なくとも１個の非天然ヌクレオチドを含み、非天然ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドの位置にある対応する天然ヌクレオチドと比較して、レポータードメインの融解温度を増加する。いくつかの実施形態では、リンカーはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、リンカーはヘキサエチレングリコールである。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２２５４２８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＤＮＡ及びＬＮＡヌクレオチドを含むプローブセットを含むことができる。いくつかの実施形態では、プローブの５’末端において核酸塩基が決定され、一方、３’末端において、１個または複数（例えば、２または３個）のランダムヌクレオチドが存在する（「ゆらぎ」位置とも呼ばれる）。実施形態は、様々な標的配列の検出に普遍的に使用され得る短核酸鎖から構成される。短核酸配列は、アレル特異的でもあり、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）などの特異的変異の検出を可能とする。いくつかの実施形態は、第１プローブ及び第２プローブを含む組成物を含む。そのような実施形態によると、第１プローブは、３’末端の反対側に５’末端、少なくとも８個のヌクレオチド（少なくとも８個のヌクレオチドは、少なくとも１個のＤＮＡヌクレオチド及び少なくとも５個のロックド核酸ヌクレオチドを含む）、ならびに第１識別位置を有し、第２プローブは、３’末端の反対側に５’末端及び第１プローブと同じ数のヌクレオチドを有する。第２プローブのヌクレオチドは、第１プローブと同じ数のＤＮＡヌクレオチド及びロックド核酸ヌクレオチド、ならびに第１プローブの第１識別位置に対応する位置に位置する第２識別位置を有する。また、そのような実施形態によると、第１及び第２プローブのヌクレオチドは、アデニン核酸塩基、シトシン核酸塩、グアニン核酸塩基、チミン核酸塩、ウラシル核酸塩基及びメチルシトシン核酸塩基のうちの１つを含み、第１及び第２プローブは、第１及び第２識別位置に異なる核酸塩基を含む。しかし、そのような実施形態によると、第１及び第２プローブは、プローブの他の全てのヌクレオチド位置において同じ核酸塩基を含む。他の実施形態には、第１及び第２セットのプローブを含む組成物が含まれる。第１及び第セットにおけるそれぞれのプローブは、３’末端の反対側に５’末端及び８個のヌクレオチドを有する。第１セットにおけるそれぞれのプローブのヌクレオチドは、少なくとも１個のＤＮＡヌクレオチド、少なくとも５個のロックド核酸ヌクレオチド及び第１識別位置を有し、少なくとも１個のロックド核酸ヌクレオチドはランダムロックド核酸ヌクレオチドであり、一方、第２セットにおけるそれぞれのプローブは、第１セットのプローブに対応する数のＤＮＡヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド及びランダムロックド核酸ヌクレオチドを有し、第２セットのプローブにおけるそれぞれのプローブは、第１セットのプローブの第１識別位置と同じヌクレオチド位置に位置する第２識別位置を有する。また、いくつかのそのような実施形態によると、第２及び第２セットにおける全てのプローブは、（ｉ）ランダムロックド核酸ヌクレオチドの核酸塩基、ならびに（ｉｉ）第１及び第２識別位置の核酸塩基を除いて、同じ核酸塩基配列を有する。また、第２識別位置の核酸塩基は、同じヌクレオチド位置において第１識別位置の核酸塩基と異なり、第２セットのそれぞれのプローブの少なくとも１個のランダムロックド核酸ヌクレオチドは、第１セットのプローブの少なくとも１個のランダムロックド核酸ヌクレオチドと同じヌクレオチド位置に位置する同じ核酸塩基を含む。そのような実施形態によると、ランダムロックド核酸ヌクレオチドの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンのうちの１つから選択され、１個または複数のランダムロックド核酸ヌクレオチド位置（複数可）の核酸塩基の変動によってもたらされる、あらゆる可能な核酸塩基配列は、第１及び第２セットのプローブの両方における少なくとも１個のプローブによって表される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、遺伝物質を含む試料において目的の遺伝子座の遺伝子型を決定する方法の提供を含むことができる。この方法は、遺伝物質を第１プローブ及び第２プローブと接触させるステップ、ならびに遺伝物質への第１または第２プローブの結合を検出し、それによって、遺伝子座の遺伝子型を決定するステップが挙げられる。そのような実施形態によると、第１及び第２プローブは、それぞれ、３’末端の反対側に５’末端、ならびに少なくとも１個のＤＮＡヌクレオチド及び少なくとも５個のロックド核酸ヌクレオチドを含む８個のヌクレオチドを有する。第１プローブのヌクレオチドは、第１識別位置を含み、第２プローブのヌクレオチドは、第２プローブにおける、第１プローブの第１識別位置と同じヌクレオチド位置に第２識別位置を含む。また、第１識別位置は、第２識別位置と異なる核酸塩基を含み、第１及び第２プローブの他のヌクレオチドの核酸塩基は、同じである。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、第１プローブセット及び第２プローブセットを含む組成物を含む含むことができ、プローブは、それぞれ、１～３個のＤＮＡヌクレオチド及び５～７個のＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオチドから構成される８個のヌクレオチドを有する。そのような実施形態によると、第１及び第２セットのプローブにおける全てのプローブは、（ｉ）１、２または３個のＬＮＡランダム位置（複数可）の塩基（複数可）及び（ｉｉ）識別位置の塩基を除いて、同一のヌクレオチド配列を有し、１、２または３個のＬＮＡランダム位置（複数可）及び識別位置は、第１及び第２セットの全てのプローブにおいて同一の位置に位置している。更に、そのような実施形態によると、それぞれのＬＮＡランダム位置において、塩基は、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンから独立して選択され、１、２または３個のＬＮＡランダム位置（複数可）の塩基の変動（複数可）によってもたらされる、あらゆる可能な配列は、それぞれのプローブセットにおける少なくとも１個のプローブによって表される。追加的に、そのような実施形態によると、識別位置の塩基は、それぞれのプローブセット内で同一であるが、第１セットと第２セットのプローブでは異なっている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも２つのプローブセットのライブラリを含むことができる。そのような実施形態によると、ライブラリは、複数のプローブセットを含み、プローブは、それぞれ、一般構造５’－Ｄ－Ｌ－Ｌ－Ｌ－Ｌ－Ｌ－Ｘ－Ｘ－３’または５’－Ｄ－Ｌ－Ｌ－Ｌ－Ｌ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－３’（ここで、ＤはＤＮＡヌクレオチドであり、各ＬはＬＮＡヌクレオチドであり、各ＸはＬＮＡランダムヌクレオチドである）を持つ８個のヌクレオチドを有する。また、１つのプローブセット内において、全てのプローブは、２及び／または３個のＬＮＡランダムヌクレオチドを除いて、同一のヌクレオチド配列を有する（それぞれの位置のＬＮＡランダムヌクレオチド塩基は、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンから独立して選択される）。また、そのような実施形態によると、２つの位置の塩基の変動（複数可）によってもたらされる、あらゆる可能な配列は、それぞれのプローブセットにおけるプローブにより表され、１つのプローブセットは、配列において少なくともＤＮＡヌクレオチドＤまたはＬＮＡヌクレオチドＬが他のプローブセットと異なる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象から得た試料において目的の遺伝子座の遺伝子型を決定する方法の提供を含むことができる。この方法は、遺伝物質を上記の組成物実施形態のいずれかの組成物と接触させるステップ、及び遺伝物質への第１または第２のプローブセットのプローブの結合を検出し、それによって、遺伝子座の遺伝子型を決定するステップを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０２４８９９１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも２個の配列特異的増幅プライマーを含む固体支持体を含むことができ、少なくとも１個のプライマーは、誘導切断可能リンカーで前記支持体に結合されている。好ましくは、前記切断可能リンカーは光切断可能リンカーである。第１主要実施形態において、前記固体支持体はビーズである。そのようなビーズは、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ランタニド酸化物、ガラス、ケイ酸塩、ポリスチレン、セルロース、セファロース及びポリアミドからなる群から選択される物質から構成される。ビーズは、１個の純粋な物質であるか、または２個もしくは複数の物質から構成され、２個または複数の物質は、コアシェル粒子のように規則的に混合または組み立てられている。ビーズの表面は、オリゴヌクレオチドが結合され得るように官能化されている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記に開示されたビーズのライブラリを含むことができる。好ましくは、切断可能リンカーを介してビーズに結合している複数のプライマーのそれぞれのメンバーは、異なる検出可能標識または多重標識の固有の混合物を担持する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、複数のウエルを含むマイクロタイターまたはピコタイター（ＰＴＰ）プレートであり、複数の前記ウエルが、少なくとも２個の配列特異的増幅プライマーを有する表面を含み、少なくとも１個のプライマーが前記支持体に切断可能リンカーで結合していることを特徴とする。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、固体支持体を調製する、好ましくは少なくとも２個の配列特異的プライマーを含むビーズを調製する方法であって、前記プライマーの少なくとも１個が切断可能であることを更に特徴とし、少なくとも１個または複数の官能基を担持する固体支持体を提供するステップ、及び前記１個または複数の官能基を、２個の配列特異的プライマーの反応性基（複数可）と反応させるステップを含み、切断可能反応性部分が、前記固体支持体とその官能基を接続しているスペーサーのうちの１個の中、もしくはその官能基の中に存在している、または前記切断可能部分が、前記配列特異的プライマーの１個とその反応性基を接続しているスペーサーのうちの１個の中に存在している前記方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、それぞれ異なる保護基を担持している２個の官能基を含む、固体支持体を提供するステップ、第１官能基を脱保護し、前記基を第１プライマーの反応性基と反応させるステップ、及び第２官能基を脱保護し、前記ビーズの前記基を第２プライマーの反応性基と反応させるステップを含む方法を含むことができる。前記２個の官能基は、２個の別々のリンカーを介してビーズに接続しているが、特定の実施形態では、前記２個の官能基は、２アームリンカーを介してビーズに接続している。いくつかの実施形態では、この方法は、正確に１個の官能基を担持する固体支持体を提供するステップ、前記官能基を脱保護するステップ、ならびに前記基を、第１及び第２配列特異的プライマーの混合物と反応させるステップを含み、前記第１及び第２プライマーが同一の反応性基を含み、前記プライマーのうちの少なくとも一方が切断可能部分を介して反応性基に接続していることを特徴とする。いくつかの実施形態では、この方法は、正確に１個の官能基を担持するビーズを提供するステップ、ならびに前記官能基を脱保護し、前記基を、切断可能部分により接続されている第１及び第２増幅プライマーを表すオリゴヌクレオチドと反応させるステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、２個の異なる直交保護基で保護されている保護ＯＨ基を担持するビーズを提供するステップ、前記直交保護基の１個を切断し、第１プライマーをビーズに合成するステップ、及び前記直交保護基の２番目を切断し、第２プライマーをビーズに合成するステップを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／０１０５０８１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸の捕捉及び富化、ならびに富化された標的核酸の分析のための方法及びシステムを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、溶液ベースフォーマットによる標的化配列の富化を含むことができる。いくつかの実施形態では、溶液ベース捕捉方法は、プローブ由来アンプリコンを含み、前記増幅用プローブは、固体支持体に固定されている。固体支持体は、例えば、ゲノム試料から特異的核酸配列（例えば、標的核酸）を捕捉する支持体固定化核酸プローブを含む。プローブ増幅は、溶液中にプローブアンプリコンを提供し、これは標的配列とハイブリッド形成する。プローブアンプリコンと標的配列のハイブリッド形成の後、試料に存在する標的核酸配列は、プローブを捕捉（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなどのリンカー化学を介して）及び洗浄すること、ならびにハイブリッド形成した標的核酸を捕捉されたプローブから溶出することによって富化される（図１）。標的核酸配列（複数可）は、例えば、非特異的ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ－ＰＣＲ）を使用して更に増幅され、元の標的試料と比較して複雑性が低減されたＰＣＲ産物の増幅プールをもたらし得る。いくつかの実施形態では、プローブと標的核酸のハイブリッド形成は、好ましくは、溶液ベースプローブアンプリコン同士のハイブリッド形成を支持するのに十分なストリンジェントな条件下で実施され、前記プローブは、リンカー化学及び標的核酸試料に相補的な領域を含み、プローブ／標的ハイブリッド形成複合体を提供する。複合体は、続いて、リンカー化学を介して捕捉され、非特異的結合核酸を除去するのに十分な条件下で洗浄され、ハイブリッド形成した標的核酸配列は、捕捉されたプローブ／標的複合体から溶出される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の核酸分子を単離し、遺伝的複雑性を低減する方法であって、前記集団の断片化され変性された核酸分子を、固体支持体に結合された多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成条件下で暴露して、前記プローブと特異的にハイブリッド形成する核酸分子を捕捉するステップ、または前記集団の断片化され変性された核酸分子を、多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成条件下で暴露し、続いて、ハイブリッド形成された分子の複合体を、固体支持体に結合させて、前記プローブと特異的にハイブリッド形成する核酸分子を捕捉するステップ（ここで、両方の場合において、前記断片化され変性された核酸分子は、約１００～約１０００個のヌクレオチド残基、好ましくは約２５０～約８００個のヌクレオチド残基、最も好ましくは約４００～約６００個のヌクレオチド残基の平均サイズを有する）、捕捉された分子から、非結合及び非特異的ハイブリッド形成核酸を分離するステップ、捕捉された分子を溶出するステップ、ならびに任意選択で、溶出された捕捉分子により前述の過程を少なくとも更に１サイクル繰り返すステップを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、エクソンまたは変異型、好ましくはＳＮＰ部位などのゲノム試料における標的核酸配列を富化する方法を含むことができる。これは、ゲノムの領域に特異的なゲノムプローブを合成し、複雑なゲノム試料に含有されている相補的標的核酸配列を捕捉することによって、達成され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、捕捉され溶出された標的分子の核酸配列を、特に合成反応によるシークエンシングを実施することによって決定することを更に含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、基準ゲノムと比べた、特に断片化され変性されたゲノム核酸分子を含む基準ゲノムと比べたコーディング領域の変動を検出する方法であって、前に記載されているように、捕捉され溶出された標的分子の核酸配列を、特に合成反応によるシークエンシングを実施することによって決定すること、及び決定された配列を、データベースの配列と、特に基準ゲノムの多形についてのデータベースの配列と比較して、基準ゲノムによって変異型を同定することを更に含む方法を含むことができる。実施形態では、核酸（あらかじめ選択された）捕捉プローブは、固体支持体（例えば、スライド、チップ、ビーズなど）に、いくつかの認識されている方法（例えば、スポッティング、フォトリソグラフィ、インサイツ合成など）を使用して固定化される。好ましい実施形態では、プローブは、基材におけるマスクレスアレイ合成によりインサイツ合成され、続いて、例えばＰＣＲにより増幅されて、溶液中にプローブ由来アンプリコンをもたらす。いくつかの実施形態では、このように合成されたプローブ配列は、プローブの３’及び５’末端の一方または両方に（例えば、末端に、または末端の近くに）増幅のためのプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、プローブのプライマー結合部位の配列は、プローブの３’及び５’末端の両方において同じであり、一方、他の実施形態では、プライマー結合部位の配列は、３’末端と５’末端の配列が異なっている。いくつかの実施形態では、プローブ増幅のための増幅プライマーは、最終捕捉標的からプライマー配列を容易に除去するため、制限エンドヌクレアーゼ部位、例えばＭｌｙＩ部位を更に含み、プライマーのうちの一方（例えば、フォワードまたはリバースプライマー）は、結合部位または配列（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＨＩＳタグ）などのリンカー化学を更に含み、固定化プローブを有する支持体に、指数関数的ＰＣＲ増幅（例えば、当業者に既知の指数関数的標的増幅のためのＰＣＲ手順）に必要な試薬と共に付着される。ＰＣＲが実施され、それによって、鎖のうちの１本が結合部分または配列などのリンカー化学を含むように、プローブ捕捉配列のアンプリコンを作製する。アンプリコンを含有する溶液は、容器（例えば、管、９６ウエルプレートのウエルなど）に移され、いくつかの実施形態では、反応成分が精製される。追加の回の増幅が、非対称ＰＣＲの使用によってプローブ由来アンプリコンに優先的に実施され、ここでは、リンカー化学標識プライマーが、非標識プライマーと比較して多量に存在して、一本鎖結合部位／配列標識アンプリコンを優先的に合成する。アンプリコンは、反応構成要素から精製され、容器に移され、変性核酸試料が添加され、ハイブリッド形成が発生することを可能にする。ハイブリッド形成の後、標識アンプリコン／標的核酸複合体が捕捉される。例えば、ビオチンが結合部分である場合、ストレプトアビジン（ＳＡ）コーティング基材、例えばＳＡコーティングビーズ（例えば、常磁性ビーズ／粒子）を使用して、ビオチン標識アンプリコン／標的複合体を捕捉する。ＳＡ結合複合体は洗浄され、ハイブリッド形成標的核酸は複合体から溶出され、シークエンシング適用などの下流用途に利用される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の核酸配列を単離し、複雑性を低減する方法であって、固体支持体を提供し、前記支持体が、標的核酸配列とハイブリッド形成可能なハイブリッド形成プローブを含むこと、標的核酸配列を含む断片化核酸試料を提供すること、ハイブリッド形成プローブを増幅し、増幅産物が結合部分を含み、増幅産物が溶液中にあること、核酸試料を、増幅産物と標的核酸配列とのハイブリッド形成の発生を可能にするような条件下で、溶液中の増幅産物とハイブリッド形成させること、ハイブリッド形成標的核酸配列／増幅産物複合体を、非特異的ハイブリッド形成核酸から前記結合部分によって分離すること、及びハイブリッド形成標的核酸配列を複合体から溶出し、それによって複数の核酸配列を単離し、複雑性を低減することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、固体支持体はマイクロアレイスライドである。いくつかの実施形態では、標的核酸試料は、フラグメントの一方または両方の末端にアダプター分子を有する、または有さない断片化ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成プローブは、制限エンドヌクレアーゼ部位、例えばＭｌｙＩ部位を含む。いくつかの実施形態では、プローブ増幅は、指数関数的ポリメラーゼ連鎖反応を含み、非対称非指数関数的増幅を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、結合部分はビオチンであり、ビーズ、例えば常磁性粒子などの捕捉基材は、標的核酸／増幅産物複合体を非特異的ハイブリッド形成標的核酸から分離するため、ストレプトアビジンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、捕捉標的核酸／増幅産物複合体は、結合標的核酸を溶出する前に洗浄される。いくつかの実施形態では、溶出標的核酸はシークエンシングされる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の核酸配列を単離し、複雑性を低減する方法であって、固体支持体を提供し、前記支持体が、標的核酸配列とハイブリッド形成可能なハイブリッド形成プローブを含むこと、及び標的核酸配列を含む断片化核酸試料を提供すること、ハイブリッド形成プローブを増幅し、増幅産物が結合部分を含み、増幅産物が溶液中にあること、核酸試料を、増幅産物と標的核酸配列とのハイブリッド形成の発生を可能にするような条件下で、溶液中の増幅産物とハイブリッド形成させること、ハイブリッド形成標的核酸配列／増幅産物複合体を、非特異的ハイブリッド形成核酸から前記結合部分によって分離すること、ハイブリッド形成標的核酸配列を複合体から溶出し、それによって複数の核酸配列を単離し、複雑性を低減すること、及び溶出標的核酸配列をシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、固体支持体はマイクロアレイスライドである。いくつかの実施形態では、標的核酸試料は、フラグメントの一方または両方の末端にアダプター分子を有する、または有さない断片化ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成プローブは、制限エンドヌクレアーゼ部位、例えばＭｌｙＩ部位を含む。いくつかの実施形態では、プローブ増幅は、指数関数的ポリメラーゼ連鎖反応を含み、非対称非指数関数的増幅を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、結合部分はビオチンであり、ビーズ、例えば常磁性粒子などの捕捉基材は、標的核酸／増幅産物複合体を非特異的ハイブリッド形成標的核酸から分離するため、ストレプトアビジンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、捕捉標的核酸／増幅産物複合体は、結合標的核酸を溶出する前に洗浄される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０７７８４７に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の標的分子を含む試料から標的核酸分子のライブラリを作製する方法であって、実質的にそれぞれの標的分子において、単一アダプターを標的分子に連結して、環状分子を形成し、アダプターが２個のバーコードを含み、２個のプライマー結合部位が２個のバーコードの間に位置しており、結合部位にアニールするプライマーが互いに反対側を向いており、核酸ポリメラーゼによる鎖合成終結に影響をもたらす少なくとも１個の修飾ヌクレオチドが２個のプライマー結合部位の間に位置していること、アダプターに相補的なフォワードプライマーを標的分子の１本の鎖にアニールすること、フォワードプライマーを修飾ヌクレオチドまで伸長し、それによって、第１鎖を産生すること、アダプターに相補的なリバースプライマーを第１鎖にアニールすること、第１プライマーを伸長し、それによって、第２鎖を産生し、２個のバーコードが標的配列に隣接している第１鎖及び第２鎖を含む二本鎖分子を産生することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方が、アダプターに相補的ではない５’フラップ配列を含み、追加のプライマー結合部位を含む。次いで、この方法は、追加のプライマーを、フォワードプライマーのフラップ配列に相補的な配列にアニーリングし、追加のプライマーを伸長し、それによって、２個の追加のプライマー部位及び２個の標的配列に隣接するバーコードを含む二本鎖分子を産生するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、標的分子及びアダプターは、一本鎖のものである。他の実施形態では、標的分子及びアダプターは、二本鎖のものであり、環状分子は、プライマーをアニールするため、少なくとも部分的に変性されたプライマーである。いくつかの実施形態では、バーコードは、４～２０個の塩基長さのヌクレオチド配列である。核酸ポリメラーゼによる鎖合成終結をもたらす修飾ヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチド、タンパク質側鎖を有するヌクレオチド、合成ヌクレオチドＡｒａＣ（シタラビン）もしくはデオキシウラシル、イソグアニン、５－メチルイソシトシン、エチレングリコールスペーサー、蛍光体などの嵩高類縁体を有するヌクレオチド、または非天然塩基対（ＵＢＰ）「ｄ５ＳＩＣＳ－ｄＮａＭ」核酸類縁体から選択され得る。ライゲーションは、オーバーハングライゲーション、Ｔ－Ａライゲーション、平滑末端ライゲーション及びトポイソメラーゼ触媒ライゲーションから選択され得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、一方の末端に光切断可能リンカーを有する。これらの実施形態では、リンカーは一方の末端に連結され、ＵＶ光線に暴露されて他方の末端へのライゲーションが可能になる。いくつかの実施形態では、追加のプライマーはシークエンシングプライマーである。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸分子のライブラリであって、それぞれの分子が、標的配列及び標的配列のアダプター連鎖末端を含む環状分子であり、アダプターが２個のバーコードを含み、２個のプライマー結合部位が２個のバーコードの間に位置しており、結合部位にアニールするプライマーが互いに反対側を向いており、核酸ポリメラーゼによる鎖合成終結をもたらす少なくとも１個の修飾ヌクレオチドが２個のプライマー結合部位の間に位置しているライブラリを含むことができる。いくつかの実施形態では、バーコードは、４～２０個の塩基長さのヌクレオチド配列である。核酸ポリメラーゼによる鎖合成終結をもたらす修飾ヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチド、タンパク質側鎖を有するヌクレオチド、合成ヌクレオチドＡｒａＣ（シタラビン）もしくはデオキシウラシル、イソグアニン、５－メチルイソシトシン、エチレングリコールスペーサー、蛍光体などの嵩高類縁体を有するヌクレオチド、または非天然塩基対（ＵＢＰ）「ｄ５ＳＩＣＳ－ｄＮａＭ」核酸類縁体から選択され得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の標的分子を含む試料において標的核酸をシークエンシングする方法であって、単一の二本鎖アダプターを実質的にそれぞれの二本鎖標的分子に連結して、二本鎖環状分子を形成することによって、試料から標的核酸分子のライブラリを作製し、アダプターが２個のバーコードを含み、２個のプライマー結合部位が２個のバーコードの間に位置しており、結合部位にアニールするプライマーが互いに反対側を向いており、核酸ポリメラーゼによる鎖合成終結をもたらす少なくとも１個の修飾ヌクレオチドが２個のプライマー結合部位の間に位置していること、二本鎖環状標的分子の少なくとも一部分を変性すること、アダプターに相補的なフォワードプライマーを標的分子の１本の鎖にアニールすること、フォワードプライマーを修飾ヌクレオチドまで伸長し、それによって、第１鎖を産生すること、アダプターに相補的なリバースプライマーを第１鎖にアニールすること、第１プライマーを伸長し、それによって、第２鎖を産生し、２個のバーコードが標的配列に隣接している第１鎖及び第２鎖を含む二本鎖分子を産生すること、二本鎖分子を増幅すること、及び二本鎖分子の増幅産物をシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、フォワード及びリバースプライマーの少なくとも一方が、アダプターに相補的ではない５’フラップ配列を含み、追加のプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１プライマーを伸長した後、追加のプライマーを、フォワードプライマーのフラップ配列に相補的な配列にアニールすること、追加のプライマーを伸長し、それによって、２個の追加のプライマー部位及び２個の標的配列隣接バーコードを含む二本鎖分子を産生することを更に含む。いくつかの実施形態では、増幅またはシークエンシングは、追加のプライマーによって実施されてもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１２３３１６に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的化シークエンシングワークフローを含むことができ、シークエンシングする前に最小限の増幅プロセスが必要なように、または増幅プロセスが必要ないように、ゲノム物質の十分な量を含む入力試料が提供される。いくつかの実施形態では、入力試料は、無処置腫瘍またはリンパ節に由来する。いくつかの実施形態では、入力試料は、患者または哺乳類対象から得た無処置腫瘍試料（全体もしくは一部分）及び／または１個もしくは複数のリンパ節の均質化によって得られる。いくつかの実施形態では、入力試料は、全血または任意の分画を含む、十分な量の血液に由来する。いくつかの実施形態では、入力試料は癌性組織に由来する。いくつかの実施形態では、入力試料は前癌性組織に由来する。いくつかの実施形態では、標的化シークエンシングワークフローは、シークエンシングする前に１つまたは複数の増幅ステップ（例えば、捕捉前増幅ステップ、捕捉後増幅ステップ）を含み、シークエンシングする前のそれぞれの増幅ステップは、０～３回の増幅サイクルを含み、シークエンシングする前の増幅サイクルの総計は４回を超えない。他の実施形態では、標的化シークエンシングワークフローは、シークエンシングする前に１つまたは複数の増幅ステップ（例えば、捕捉前増幅ステップ、捕捉後増幅ステップ）を含み、シークエンシングする前のそれぞれの増幅ステップは、０～２回の増幅サイクルを含み、シークエンシングする前の増幅サイクルの総計は３回を超えない。なお他の実施形態では、標的化シークエンシングワークフローは、シークエンシングする前に１つの増幅ステップ（例えば、捕捉前増幅ステップまたは捕捉後増幅ステップ）を含み、シークエンシングする前の単一増幅ステップは、０～３回の増幅サイクルを含む。更なる実施形態では、標的化シークエンシングワークフローは、シークエンシングする前に１つの増幅ステップを含み、シークエンシングする前の単一増幅ステップは、１～３回のサイクルを含む。なお更なる実施形態では、標的化シークエンシングワークフローは、シークエンシングする前に１つの増幅ステップを含み、シークエンシングする前の単一増幅ステップは、１回のサイクルを含む。なお更なる実施形態では、標的化シークエンシングワークフローは、シークエンシングする前に１つの増幅ステップを含み、シークエンシングする前の単一増幅ステップは、２回のサイクルを含む。いくつかの実施形態では、捕捉前の増幅ステップ、または捕捉後であるがシークエンシングする前の増幅ステップのいずれか、または両方は、ＬＭ－ＰＣＲを利用する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料内のゲノム物質をシークエンシングする方法であって、腫瘍試料及び／またはリンパ節試料を均質化して、均質化試料を提供すること、均質化試料から少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を単離すること、少なくとも０．５マイクログラムの単離ゲノム物質をシークエンシングのために調製すること、及び調製されたゲノム物質をシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、シークエンシングする前にいかなる増幅ステップも含まない。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも１つの捕捉前または捕捉後増幅ステップを含み、少なくとも１つの捕捉前または捕捉後増幅ステップの際に実施される増幅サイクルの総計数は、最大で４回のサイクルである。いくつかの実施形態では、増幅サイクルの総計数は３回である。いくつかの実施形態では、増幅サイクルの総計数は２回である。いくつかの実施形態では、シークエンシングするために少なくとも０．５マイクログラムの単離ゲノム物質を調製することは、少なくとも０．５マイクログラムの単離ゲノムを捕捉プローブとハイブリッド形成すること及びハイブリッド形成ゲノム物質を捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、捕捉ゲノム物質の量は、約９０ｎｇ～約９００ｎｇの範囲である。いくつかの実施形態では、１または２回の増幅サイクルが捕捉ゲノム物質に実施される。いくつかの実施形態では、均質化試料は代表的な試料採取された細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１マイクログラムのゲノム物質が均質化試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも５マイクログラムのゲノム物質が均質化試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質が均質化試料から単離される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料内のＤＮＡをシークエンシングする方法であって、血液試料から少なくとも０．５マイクログラムのＤＮＡを単離すること、少なくとも０．５マイクログラムの単離ＤＮＡをシークエンシングのために調製すること、及び調製されたＤＮＡをシークエンシングすることを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、シークエンシングする前に０回の増幅ステップを含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングするために少なくとも０．５マイクログラムの単離ＤＮＡを調製することは、少なくとも０．５マイクログラムの単離ゲノムを捕捉プローブとハイブリッド形成すること及びハイブリッド形成ゲノム物質を捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、捕捉ゲノム物質の量は、約９０ｎｇ～約９００ｎｇの範囲である。いくつかの実施形態では、１または２回の増幅サイクルが捕捉ゲノム物質に実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１マイクログラムのＤＮＡが血液試料から単離される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的化提示シークエンシングの方法であって、（ｉ）腫瘍の少なくとも一部分、１つもしくは複数の全体的もしくは部分的なリンパ節、または任意の組合せを均質化して、均質化試料を提供すること、（ｉｉ）ゲノム物質を均質化試料から抽出すること、（ｉｉｉ）抽出ゲノム物質をビーズに捕捉させること、及び（ｉｖ）捕捉ゲノム物質をシークエンシングすることを含み、標的化提示シークエンシングが、捕捉ゲノム物質をシークエンシングする前に最大で４回の増幅サイクルを実施することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、最大で３回の増幅サイクルが、抽出ゲノム物質を捕捉する前、または抽出ゲノム物質を捕捉した後、またはこれらの任意に組合せで実施され得る。いくつかの実施形態では、捕捉前増幅サイクルは実施されない。いくつかの実施形態では、捕捉ゲノム物質の量は、約９０ｎｇ～約９００ｎｇの範囲である。いくつかの実施形態では、１～３回の増幅サイクルが、抽出ゲノム物質の捕捉の後であるがシークエンシングの前に実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質が均質化試料から抽出される。いくつかの実施形態では、４回を超える増幅サイクルを必要とするシークエンシング方法に使用される入力物質の量と比較して、少なくとも１００倍多くのゲノム物質が均質化試料から得られる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料内のＤＮＡをシークエンシングする方法であって、少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質を提供し、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質が、腫瘍試料、リンパ節試料または血液試料に由来すること、ＤＮＡを入力ゲノム試料から単離すること、単離ＤＮＡをシークエンシングのために調製すること、及び調製したＤＮＡをシークエンシングすることを含み、いかなる増幅ステップをも含まない方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質が、複数の組織学的及び／または生検材料から得られる。いくつかの実施形態では、少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質が均質化腫瘍試料かから得られる。いくつかの実施形態では、少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質が均質化リンパ節試料が得られる。いくつかの実施形態では、少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質は、それが由来する腫瘍試料、リンパ節試料または血液試料から代表的に試料採取されたものある。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、次世代シークエンシング方法を使用して実施される。一部実施形態では、シークエンシングは、合成シークエンシング方法を使用して実施される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシングの際にＰＣＲによって導入される変異を低減する方法であって、ＤＮＡを、十分な量のゲノム物質を含む試料から単離すること、単離されたＤＮＡをシークエンシングのために調製すること、及び調製されたＤＮＡをシークエンシングすることを含み、シークエンシングする前に、最大で３回の増幅サイクルを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、シークエンシングする前に１または２回の増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態では、十分な量の入力ゲノム物質は、捕捉前増幅サイクルを利用しないような量である。いくつかの実施形態では、試料は、がんを有すると疑われた患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、がんを有すると診断された患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、がんを発生するリスクのある患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は健康な組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、０．５マイクログラムのＤＮＡが試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも１マイクログラムのゲノム物質が試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも５マイクログラムのゲノム物質が試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質が試料から単離される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＰＣＲにより導入される変異が低減されるシークエンシング方法であって、少なくとも０．０５マイクログラムのゲノム物質を捕捉すること、及びシークエンシングする前に０～２回の増幅サイクルを実施することを含むシークエンシング方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、０回の増幅サイクルが実施される。他の実施形態では、１回の増幅サイクルが実施される。なお他の実施形態では、２回の増幅サイクルが実施される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、代表的な割合のゲノム含有量におけるＰＣＲにより導入されるバイアスが低減される配列捕捉方法であって、シークエンシング方法が、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を含む入力試料を提供することを含み、シークエンシングする前に０～２回の増幅サイクルを実施することを含む配列捕捉方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、０回の増幅サイクルが実施される。他の実施形態では、１回の増幅サイクルが実施される。なお他の実施形態では、２回の増幅サイクルが実施される。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも１マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも５マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＰＣＲ導入偏向が排除される配列捕捉方法であって、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を含む入力試料を調製することを含む配列捕捉方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも１マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも５マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質を含む。別の態様では、シークエンシングする前にＰＣＲ重複リードを除去するステップが排
除される配列捕捉方法であって、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を含む入力試料を提供することを含む配列捕捉方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも１マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも５マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は、少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＰＣＲにより導入される変異が実質的に排除されるシークエンシング方法であって、少なくとも０．０５マイクログラムのゲノム物質を捕捉することを含むシークエンシング方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、約０．０５マイクログラムのゲノム物質が、ゲノム物質の捕捉後に提供される。いくつかの実施形態では、１または２回の捕捉後増幅サイクルが、シークエンシングする前に実施される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１３２２７６に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、第１治療剤に応答しないと予測される腫瘍試料の領域が自動切開ツールにより試料から切除され、予測バイオマーカーに相関する変異が、ＮＧＳを使用して切除領域において検出され、追加の腫瘍試料が、ＮＧＳにより同定された１個または複数の予測バイオマーカー（複数可）で染色される方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、第１の腫瘍試料を得て、第１試料が第１治療剤の第１予測バイオマーカーで組織化学的に染色されること、自動切開ツールにより第１試料から１つまたは複数の領域（複数可）を切除し、切除領域が、この領域が第１治療剤に応答しそうにないことを示す第１予測バイオマーカーの染色パターンを有すること、第１試料の切除領域（複数可）に由来する核酸試料において、１種または複数の追加の治療剤に応答すると予測される１個または複数の変異を次世代シークエンサーにより検出すること、試料において同定された１個または複数の変異に相関する１個または複数の追加の予測バイオマーカー（複数可）で、１個または複数の追加の腫瘍試料を染色することを含み、１個または複数の追加の予測バイオマーカーが１種または複数の追加の治療剤（複数可）に応答すると予測される方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）第１の腫瘍試料から切除された１つまたは複数の領域に由来する核酸試料（ここで、第１の腫瘍試料は、第１予測バイオマーカーで染色され、更に、切片から切除された１つまたは複数の領域は、腫瘍の少なくとも一部分が第１治療剤に応答しそうにないことを示す第１予測バイオマーカーの染色パターンを有する）、（ｂ）１個または複数の追加の予測バイオマーカーに相関する変異の存在または不在を同定するように適合された次世代シークエンサー、（ｃ）データベーを含む検査情報システム（ＬＩＳ）、を含むシステムであって、データベースが、（ｃ１）次世代シークエンシングによる核酸試料の変異分析（ここで、変異分析は、少なくとも、核酸試料における変異の存在または不在を示し、変異は、１種又は複数の追加の治療剤（複数可）の１個または複数の追加の予測バイオマーカー（複数可）に相関する）、及び（ｃ２）自動スライド染色装置が、変異分析により同定された１個または複数の追加の予測バイオマーカーを有する第２の腫瘍試料を染色するように指示する命令を含有するシステムを含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，０２３，９１７号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／ＡＫＴ経路に関する最も一般的な遺伝子（ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１）のホットスポット領域における変異を診断する診断方法をプレスクリーニングする高分解能溶融（ＨＲＭ）アッセイを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、増幅プライマー対を含むことができ、これらは、癌治療薬への応答を予測するのに重要な遺伝子のＨＲＭ分析に有用である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、増幅及び分析のために以下の増幅プライマー対を含むことができ、ＫＲＡＳにはエクソン２及び３、ＢＲＡＦにはエクソン１５、ＰＩＫ３ＣＡにはエクソン７、９及び２０、ならびにＡＫＴ１にはエクソン２である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上で開示された、少なくとも１つの増幅プライマー対を含む組成物または反応混合物を含むことができる。組成物を、核酸増幅反応の際の核酸のＰＣＲ増幅、またリアルタイムのＰＣＲ増幅及びモニタリングに使用してもよい。いくつかの実施形態によると、混合物は、少なくとも上で開示された一対の増幅プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、通常はｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴ、またはｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＵであるデオキシヌクレオシド三リン酸ミックス、ならびに緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、１個または複数の特異的核酸標的配列（複数可）のリアルタイム増幅及び検出に適している場合、そのような組成物は、蛍光ハイブリッド形成プローブまたは蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素などの核酸検出実体を追加的に含む。いくつかの実施形態では、そのようなＤＮＡ二重鎖色素は、ＨＲＭ曲線分析の実施に使用され得る色素である。いくつかの実施形態では、増幅プライマー対は、分子生物学の分野に既知の標準的な方法に従って、目的の特異的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態では、分析される試料と接触する場合、そのようなＰＲＣ反応混合物は、目的の特異的配列を含むと推定される、少なくとも部分的に精製されたＤＮＡまたは他の核酸を追加的に含む。また、いくつかのそのような実施形態では、含まれる全てに試薬の濃度は、一般に当業者に知られており、標準的プロトコールに従って特異的に適合させるために最適化することができる。いくつかのそのような実施形態では、蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素の濃度は、およそ０．１～１０．０μｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、キットが提供される。キットのいくつかの例示的実施形態は、少なくとも１つの増幅プライマー対を含む。キットのいくつかの実施形態は、以下の１種、数種または全ての追加的な成分を更に含んでもよく、それらは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、通常はｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴ、またはｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＵであるデオキシヌクレオシド三リン酸ミックス、緩衝液、ならびに蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素であり、これらは、ＨＲＭに使用するのに適切であり得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、癌疾患の標的化治療に応答する可能性の増加を決定する方法であって、ａ）患者の試料からゲノムＤＮＡを単離するステップ、ｂ）特異的増幅プライマー対を用いるＰＣＲによって、前記ＤＮＡの少なくとも１個のフラグメントを増幅するステップ、ｃ）前記増幅フラグメントが野生型配列を有するか、または変異を含むかを高分解能溶融分析（ＨＲＭ）により決定するステップ、及びｄ）変異の存在または不在を、前記標的治療が成功する可能性の増加と相関させるステップを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、変異は、ハイブリッド形成分析により、またはシークエンシングにより同定される。例えば、患者の試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織であってもよい。いくつかのそのような場合では、ＨＲＭ分析は、ＤＮＡをスパイクすることなく実施され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，８７３，９０８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、低存在量アレル（例えば、変異ＤＮＡ）を、そのようなアレルの後続検出を可能にするように試料中で富化する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料の核酸の混合物における標的核酸の変異型を富化し、標的核酸は２個の変異型配列の形態の存在し、前記変異型が単一ヌクレオチド位置で異なる方法であって、標的核酸を含む試料を提供し、富化される変異型が、大過剰量の他方の変異型の中に低存在量で試料中に存在すること、標的核酸の１本の鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを、標的核酸のモル過剰量の濃度で提供し、オリゴヌクレオチドに親和性標識が結合されており、富化される変異型の単一ヌクレオチド位置に完全にマッチしており、他方の変異型の単一ヌクレオチド位置とのミスマッチがあること、オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリッド形成して、オリゴヌクレオチド及び標的核酸のいずれかの変異型の１本の鎖からなる二重鎖ポリヌクレオチドを生成するのに適した条件を提供すること、二重鎖ポリヌクレオチドを、ミスマッチを含有する二重鎖ポリヌクレオチドのみに優先的に結合するミスマッチ介在分子を接触させ、前記化合物が、更に、二重鎖ポリヌクレオチドの１本の鎖のミスマッチ部位での光による切断を触媒することができること、二重鎖ポリヌクレオチドを光に付して、切断及び非切断二重鎖ポリヌクレオチドの両方をもたらすこと、オリゴヌクレオチドの親和性標識を認識し、親和性標識に結合する親和性マトリックスに、切断及び非切断二重鎖ポリヌクレオチドの両方を適用すること、切断二重鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、変性された単一鎖を親和性マトリックスから除去すること、非切断ポリヌクレオチド二重鎖を変性する条件下で緩衝液を提供すること、ならびに標的核酸の富化された変異型の１本の鎖を含有する緩衝液を収集することを含む方法を含むことができる。一実施形態では、ミスマッチ介在化合物は、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋もしくはＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、またはこれらの対応する類縁体である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸の富化された変異型を増幅及び検出する更なるステップを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料の核酸の混合物における標的核酸の変異アレルを検出し、変異アレルが単一ヌクレオチド位置で野生型と異なり、大過剰量の野生型アレルの中で低存在量で試料中に存在する方法であって、試料中の変異アレルを富化し、富化が、標的核酸の１本の鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを、標的核酸のモル過剰量の濃度で提供することによって実施され、オリゴヌクレオチドに親和性標識が結合されており、変異アレルの単一ヌクレオチド位置に完全にマッチしており、他の野生型アレルの単一ヌクレオチド位置とのミスマッチがあること、オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリッド形成して、オリゴヌクレオチド及び変異アレルまたは野生型アレルのいずれかの１本の鎖からなる二重鎖ポリヌクレオチドを生成するのに適した条件を提供すること、二重鎖ポリヌクレオチドを、ミスマッチを含有する二重鎖ポリヌクレオチドのみに優先的に結合するミスマッチ介在分子と接触させ、前記化合物が、更に、二重鎖ポリヌクレオチドの１本の鎖のミスマッチ部位での光による切断を触媒することができること、二重鎖ポリヌクレオチドを光に付して、切断及び非切断二重鎖ポリヌクレオチドの両方をもたらすこと、オリゴヌクレオチドの親和性標識を認識し、親和性標識に結合する親和性マトリックスに、切断及び非切断二重鎖ポリヌクレオチドの両方を適用すること、切断二重鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、野生型アレルの変性された単一鎖を親和性マトリックスから除去すること、非切断ポリヌクレオチド二重鎖を変性する条件下で緩衝液を提供すること、標的核酸の富化された変異アレルの１本の鎖を含有する緩衝液を収集すること、富化された変異アレルを増幅すること、ならびに富化された増幅変異アレルの産物、または富化された増幅変異アレルから生成されたシグナルを検出することを含む方法を含むことができる。一実施形態では、ミスマッチ介在化合物は、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋もしくはＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、またはこれらの対応する類縁体である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，３９９，７９４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料中の標的核酸の存在または不在を検出する方法であって、標的核酸及び対照核酸の量が知られている試料のトレーニングセットのデータを学習統計分類器システムに入力し、学習統計分類器システムを使用し、一般線形分類器の複数の重みを計算すること、学習統計分類器システムにより計算された複数の重みで一般線形分類器を構築すること、試験試料を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により標的及び対照核酸を増幅するのに必要な試薬を含有する反応混合物と、ＰＣＲを可能にする条件下で接触させること、標的及び対照核酸の少なくとも１個の増幅依存パラメータを測定して、試験データセットを得ること、一般線形分類器を試験データセットに適用して、試験試料を、標的核酸を含有するか、または含有しないとして分類し、それによって試験試料中の標的核酸の存在または不在を検出することを含む方法を含むことができる。この実施形態の変形では、学習統計分類器システムは、ＳＶＭ、ＬＤＡ及びＱＤＡから選択される。この実施形態の更なる変形では、増幅依存パラメータは、増幅の各サイクルの際に検出される蛍光である。この実施形態の更なる変形では、データは、サイクル閾（Ｃｔ）値である。この実施形態の更なる変形では、一般線形分類器は、区分的線形分類器である。この実施形態の更なる変形では、対照核酸の増幅依存パラメータに課された制約によって決定された区分的関数が、区分的線形分類器に入力される。この実施形態の更なる変形では、標的核酸は、ヒト配列の核酸変異型である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料中の標的核酸の存在または不在を検出する方法であって、標的核酸及び対照核酸の量が知られている試料のトレーニングセットのデータを学習統計分類器システムに入力すること、学習統計分類器システムを使用し、一般線形分類器の複数の重みを計算すること、学習統計分類器システムにより計算された複数の重みで一般線形分類器を構築すること、試料をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付すこと、標的及び対照核酸の少なくとも１個の増幅依存パラメータを測定して、試験セットのデータを得ること、一般線形分類器を試験セットのデータに適用すること、試験試料を標的核酸を含有するか、または含有しないとして分類し、それによって、試験試料中の標的核酸の存在または不在を検出することを含む方法を含むことができる。この実施形態の変形では、学習統計分類器システムは、ＳＶＭ、ＬＤＡ及びＱＤＡから選択される。この実施形態の更なる変形では、増幅依存パラメータは、増幅の各サイクルの際に検出される蛍光である。この実施形態の更なる変形では、データは、サイクル閾（Ｃｔ）値である。この実施形態の更なる変形では、一般線形分類器は、区分的線形分類器である。この実施形態の更なる変形では、対照核酸の増幅依存パラメータに課された制約によって決定された区分的関数が、区分的線形分類器に入力される。この実施形態の更なる変形では、標的核酸は、ヒト配列の核酸変異型である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸が試験試料に存在するかを決定する方法であって、標的核酸及び対照核酸の量が知られている試料のトレーニングセットをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付し、標的及び対照核酸の少なくとも１個の増幅依存パラメータを測定して、トレーニングセットのデータを得ること、データを学習統計分類器システムに入力すること、学習統計分類器システムを使用し、一般線形分類器の複数の重みを計算すること、学習統計分類器システムにより決定された複数の重みで一般線形分類器を構築すること、試験試料をＰＣＲに付し、標的及び対照核酸少なくとも１個の増幅依存パラメータを測定して、試験セットのデータを得ること、一般線形分類器を試験セットのデータに適用すること、試験試料を標的核酸を含有するか、または含有しないとして分類することを含む方法を含むことができる。この実施形態の変形では、学習統計分類器ステムは、ＳＶＭ、ＬＤＡ及びＱＤＡから選択される。この実施形態の更なる変形では、増幅依存パラメータは、増幅の各サイクルの際に検出される蛍光である。この実施形態の更なる変形では、データは、サイクル閾（Ｃｔ）値である。この実施形態の更なる変形では、一般線形分類器は、区分的線形分類器である。この実施形態の更なる変形では、対照核酸の増幅依存パラメータに課された制約によって決定された区分的関数が、区分的線形分類器に入力される。この実施形態の更なる変形では、標的核酸は、ヒト配列の核酸変異型である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸が試験試料に存在するかを決定する方法であって、標的核酸及び対照核酸の量が知られている試料のトレーニングセットをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付し、標的及び対照核酸の少なくとも１個の増幅依存パラメータを測定して、トレーニングセットのデータを得ること、データを学習統計分類器システムに入力すること、学習統計分類器システムを使用し、一般線形分類器の複数の重みを計算すること、学習統計分類器システムにより決定された複数の重みで一般線形分類器を構築すること、試験試料をＰＣＲに付し、標的及び対照核酸少なくとも１個の増幅依存パラメータを測定して、試験セットのデータを得ること、一般線形分類器を、得られた試験セットのデータに適用すること、試験試料を標的核酸を含有するか、または含有しないとして分類することを含む方法を含むことができる。この実施形態の変形では、学習統計分類器システムは、ＳＶＭ、ＬＤＡ及びＱＤＡから選択される。この実施形態の更なる変形では、増幅依存パラメータは、増幅の各サイクルの際に検出される蛍光である。この実施形態の更なる変形では、データは、サイクル閾（Ｃｔ）値である。この実施形態の更なる変形では、一般線形分類器は、区分的線形分類器である。この実施形態の更なる変形では、対照核酸の増幅依存パラメータに課された制約によって決定された区分的関数が、区分的線形分類器に入力される。この実施形態の更なる変形では、標的核酸は、ヒト配列の核酸変異型である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料が標的核酸を含有するかを分類する１つまたは複数のプロセッサを制御するコードを含むコンピュータ可読媒体を含むことができ、このコードは、式Ｉの一般線形分類器を構築するために、学習統計分類器システムを、標的核酸及び対照核酸の量が知られているトレーニングデータセットに適用し、一般線形分類器を、試験試料のデータを含むトレーニングデータセットに適用して、試験試料を、標的核酸を含有するか、または含有しないとして分類する統計的に導出された決定を生成する命令を含む。この実施形態の変形では、学習統計分類器システムは、ＳＶＭ、ＬＤＡ及びＱＤＡから選択される。この実施形態の更なる変形では、データセットのデータは、サイクル閾（Ｃｔ）値である。この実施形態の更なる変形では、一般線形分類器は、区分的線形分類器である。この実施形態の更なる変形では、標的核酸は、ヒト配列の核酸変異型である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料中の標的核酸を検出するシステムであって、試料のトレーニングセット及び１つまたは複数の試験試料からデータセットを生成するように構成されたデータ取得モジュール（データセットは、標的核酸及び対照核酸の存在及び量を示す）、取得モジュールにより取得されたデータを、式Ｉの一般線形分類器を構築するために学習統計分類器システムを試験データセットに適用して、次いで式Ｉの一般線形分類器を、試験試料のデータを含む試験データセットに適用して、試験試料を、標的核酸を含有するか、または含有しないかとして分類する統計的に導出された決定を生成することにより、処理するように構成されたデータ処理ユニット、データ処理ユニットにより生成されたデータを表示するように構成された表示モジュールを含むシステムを含むことができる。この実施形態の変形では、学習統計分類器システムは、ＳＶＭ、ＬＤＡ及びＱＤＡから選択される。この実施形態の更なる変形では、一般線形分類器は、区分的線形分類器である。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，３８２，５８１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列の変異型のアレル特異的増幅の方法であって、標的がいくつかの変異型配列の形態で存在する方法であり、（ａ）第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを標的配列の少なくとも１個の変異型とハイブリッド形成し、第１オリゴヌクレオチドが標的配列の１個または複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、第２オリゴヌクレオチドが標的配列の１個または複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、かつ標的配列の１個の変異型のみに相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドを有し、前記第２オリゴヌクレオチドが、環外アミノ基において共有結合的に修飾されている塩基を有するヌクレオチド及び以下の構造を有する修飾リン酸塩の両方を含み、
Figure 2023075090000022



式中、Ａ及びＢがヌクレオチド鎖を表し、Ｄが、ＯＨまたはＣＨ３であり、Ａｃｃが、電子受容体または残基Ｒで置換されている電子受容体であり、Ｒが有機置換基であり、Ａｃｃが、ＣＮ、ＳＯ２－Ｒ’（ここでＲ’が少なくとも１個のアミノ置換アルキルを含む）、任意選択で置換されているアリールまたは任意選択で置換されている複素環、及び６員Ｎ＋複素環（少なくとも１個のアルキル化Ｎ原子がオルトまたはパラ位置にある）からなる群から選択され、前記複素環が、ピリジニウム、ピリミジニウム及びキノリニウムからなる群から選択されること、（ｂ）核酸ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド伸長に適した条件を提供すること、（ｃ）前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第２オリゴヌクレオチドを前記核酸ポリメラーゼにより伸長し、前記オリゴヌクレオチドが、前記少なくとも１個の選択的ヌクレオチドに相補的な標的配列の変異型とハイブリッド形成する場合は効率的に、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記少なくとも１個の選択的ヌクレオチドに相補的ではない標的配列の変異型とハイブリッド形成する場合は大幅に少ない効率で、前記核酸ポリメラーゼが前記第２オリゴヌクレオチドを伸長できること、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列の変異型を検出し、標的がいくつかの変異型配列の形態で存在する方法であって、（ａ）第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを標的配列の少なくとも１個の変異型とハイブリッド形成し、第１オリゴヌクレオチドが標的配列の１個または複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、第２オリゴヌクレオチドが標的配列の１個または複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、かつ標的配列の１個の変異型のみに相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドを有し、前記第２オリゴヌクレオチドが、環外アミノ基において共有的結合的に修飾されている塩基を有するヌクレオチド及び以下の構造を有する修飾リン酸塩の両方を含み、
Figure 2023075090000023



式中、Ａ及びＢがヌクレオチド鎖を表し、Ｄが、ＯＨまたはＣＨ３であり、Ａｃｃが、電子受容体または残基Ｒで置換されている電子受容体であり、Ｒが有機置換基であり、Ａｃｃが、ＣＮ、ＳＯ２－Ｒ’（ここでＲ’が少なくとも１個のアミノ置換アルキルを含む）、任意選択で置換されているアリールまたは任意選択で置換されている複素環、及び６員Ｎ＋複素環（少なくとも１個のアルキル化Ｎ原子がオルトまたはパラ位置にある）からなる群から選択され、前記複素環が、ピリジニウム、ピリミジニウム及びキノリニウムからなる群から選択されること、（ｂ）核酸ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド伸長に適した条件を提供すること、（ｃ）前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第２オリゴヌクレオチドを前記核酸ポリメラーゼにより伸長し、前記オリゴヌクレオチドが、前記少なくとも１個の選択的ヌクレオチドに相補的な標的配列の変異型とハイブリッド形成する場合は効率的に、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記少なくとも１個の選択的ヌクレオチドに相補的ではない標的配列の変異型とハイブリッド形成する場合は大幅に少ない効率で、前記核酸ポリメラーゼが前記第２オリゴヌクレオチドを伸長できること、（ｄ）前記オリゴヌクレオチド伸長の産物を検出し、前記伸長が、前記第２オリゴヌクレオチドが相補的な選択的ヌクレオチドを有する前記標的配列の変異型の存在を示すことを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列のアレル特異的増幅を実施するためのオリゴヌクレオチドであって、標的がいくつかの変異型配列の形態で存在し、（ａ）前記標的配列の１個または複数の変異型の一部分に少なくとも部分的に相補的な配列、（ｂ）標的配列の１個の変異型のみに相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチド、（ｃ）環外アミノ基において共有結合的に修飾されている塩基を有するヌクレオチド、（ｄ）以下の構造を有する修飾リン酸塩、を含むオリゴヌクレオチドを含むことができ、
Figure 2023075090000024



式中、Ａ及びＢはヌクレオチド鎖を表し、Ｄは、ＯＨまたはＣＨ３であり、Ａｃｃは、電子受容体または残基Ｒで置換されている電子受容体であり、Ｒは有機置換基であり、Ａｃｃは、ＣＮ、ＳＯ２－Ｒ’（ここでＲ’は少なくとも１個のアミノ置換アルキルを含む）、任意選択で置換されているアリールまたは任意選択で置換されている複素環、及び６員Ｎ＋複素環（少なくとも１個のアルキル化Ｎ原子はオルトまたはパラ位置にある）からなる群から選択され、前記複素環は、ピリジニウム、ピリミジニウム及びキノリニウムからなる群から選択される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列のアレル特異的増幅のための反応混合物であって、標的がいくつかの変異型配列の形態で存在し、（ａ）標的配列の１個または複数の変異型に少なくとも部分的に相補的な第１オリゴヌクレオチド、ならびに（ｂ）標的配列の１個または複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、標的配列の１個の変異型のみに相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドを有する第２オリゴヌクレオチド（前記第２オリゴヌクレオチドは、環外アミノ基において共有的結合的に修飾されている塩基を有するヌクレオチド及び以下の構造を有する修飾リン酸塩の両方を含み、
Figure 2023075090000025



式中、Ａ及びＢはヌクレオチド鎖を表し、Ｄは、ＯＨまたはＣＨ３であり、Ａｃｃは、電子受容体または残基Ｒで置換されている電子受容体であり、Ｒは有機置換基であり、Ａｃｃは、ＣＮ、Ｒ’が少なくとも１個のアミノ置換アルキルを含むＳＯ２－Ｒ’、任意選択で置換されているアリールまたは任意選択で置換されている複素環、及び少なくとも１個のアルキル化Ｎ原子がオルトまたはパラ位置にある６員Ｎ＋複素環からなる群から選択され、前記複素環は、ピリジニウム、ピリミジニウム及びキノリニウムからなる群から選択される）、（ｃ）核酸ポリメラーゼ、（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、ならびに（ｅ）核酸ポリメラーゼによる核酸の伸長に適した緩衝液、を含む混合物を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，２７９，１４６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、低存在量アレル（例えば、変異ＤＮＡ）を、そのようなアレルの後続検出を可能にするように試料中において富化する方法及び組成物を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料の核酸の混合物における標的核酸配列の変異型を富化し、標的核酸が２個の変異型配列の形態で存在し、前記変異型が単一ヌクレオチド位置で異なる方法であって、標的核酸配列を含む試料を提供し、富化される変異型が、大過剰量の他方の変異型の中で低存在量で試料中に存在すること、標的核酸配列の１本の鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドが、富化される変異型の単一ヌクレオチド位置にミスマッチを有し、他方の変異型の単一ヌクレオチド位置に完全にマッチしていること、オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリッド形成して、オリゴヌクレオチド及び標的核酸配列のいずれかの変異型の１本の鎖からなる二重鎖ポリヌクレオチドを生成するのに適した条件を提供すること、二重鎖ポリヌクレオチドを、親和性標識が結合しているミスマッチ介在化合物と接触させて、反応混合物を生成し、前記ミスマッチ介在化合物が、ミスマッチを含有する二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、ミスマッチを含有しない二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができないこと、反応混合物を、ミスマッチ介在化合物上の親和性標識を認識し、親和性標識に結合する親和性マトリックスに付すこと、反応混合物を洗浄し、親和性マトリックスを、親和性マトリックスが結合していない全ての物質から分離すること、ならびに核酸を親和性マトリックスから溶出する緩衝液を提供し、標的核酸配列の富化された変異型を含有する溶出緩衝液を収集することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料の核酸の混合物における標的核酸配列の変異アレルを検出し、変異アレルが単一ヌクレオチド位置で野生型と異なり、大過剰量の野生型アレルのうちで低存在量で試料中に存在する方法であって、試料中の変異アレルを富化し、富化が、標的核酸配列の１本の鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを提供することによって実施され、オリゴヌクレオチドが、変異アレルの単一ヌクレオチド位置にミスマッチを有し、野生型アレルの単一ヌクレオチド位置に完全にマッチしていること、オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリッド形成して、オリゴヌクレオチド及び変異アレルまたは野生型アレルのいずれかの１本の鎖からなる二重鎖ポリヌクレオチドを生成するのに適した条件を提供すること、二重鎖ポリヌクレオチドを、親和性標識が結合しているミスマッチ介在化合物と接触させて、反応混合物を生成し、ミスマッチ介在化合物が、ミスマッチを含有する二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、ミスマッチを含有しない二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができないこと、反応混合物を、ミスマッチ介在化合物上の親和性標識を認識し、親和性標識に結合する親和性マトリックスに付すこと、反応混合物を洗浄し、親和性マトリックスを、親和性マトリックスに結合していない全ての物質から分離すること、核酸を親和性マトリックスから溶出する緩衝液を提供し、富化された変異アレルを含有する溶出緩衝液を収集すること、富化された変異アレルを増幅すること、ならびに富化された増幅変異アレルの産物または富化された増幅変異アレルから生成されたシグナルを検出することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料の核酸の混合物における標的核酸配列の変異型を富化し、標的核酸が２個の変異型配列の形態で存在し、前記変異型が単一ヌクレオチド位置で異なる方法であって、標的核酸配列を含む試料を提供し、富化される変異型が、大過剰量の他方の変異型の中で低存在量で試料中に存在すること、核酸混合物が変性されるように試料を加熱すること、標的核酸の再アニーリングに適した条件を提供し、二重鎖ポリヌクレオチドが一方の変異型配列の１本の鎖と他方の変異型の１本の鎖の間に形成され得て、変異型が異なる単一ヌクレオチド位置でミスマッチを生成すること、二重鎖ポリヌクレオチドを、親和性標識が結合しているミスマッチ介在化合物と接触させて、反応混合物を生成し、前記ミスマッチ介在化合物が、ミスマッチを含有する二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、ミスマッチを含有しない二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができないこと、反応混合物を、ミスマッチ介在化合物上の親和性標識を認識し、親和性標識に結合する親和性マトリックスに付すこと、反応混合物を洗浄し、親和性マトリックスを、親和性マトリックスに結合していない全ての物質から分離すること、ならびに核酸を親和性マトリックスから溶出する緩衝液を提供し、標的核酸配列の富化された変異型を含有する溶出緩衝液を収集することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料の核酸の混合物における標的核酸配列の変異アレルを検出し、変異アレルが単一ヌクレオチド位置で野生型と異なり、大過剰量の野生型アレルの中で低存在量で試料中に存在する方法であって、試料中の変異アレルを富化し、富化が、核酸混合物が変性されるように、試料を加熱することによって実施され、標的核酸の再アニーリングに適した条件を提供し、二重鎖ポリヌクレオチドが、変異アレルの１本の鎖と野生型アレルの１本の鎖の間に形成され得て、アレルが異なる単一ヌクレオチド位置でミスマッチを生成すること、二重鎖ポリヌクレオチドを、親和性標識が結合しているミスマッチ介在化合物と接触させて、反応混合物を生成し、前記ミスマッチ介在化合物が、ミスマッチを含有する二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができ、ミスマッチを含有しない二重鎖ポリヌクレオチドに結合することができないこと、反応混合物を、ミスマッチ介在化合物上の親和性標識を認識し、親和性標識に結合する親和性マトリックスに付すこと、反応混合物を洗浄し、親和性マトリックスを、親和性マトリックスに結合していない全ての物質から分離すること、核酸を親和性マトリックスから溶出する緩衝液を提供し、標的核酸配列の富化された変異型を含有する溶出緩衝液を収集すること、富化された変異アレルを増幅すること、ならびに富化された増幅変異アレルの産物または富化された増幅変異アレルから生成されたシグナルを検出することを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，２３８，８３２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出としては、いくつかの変異型配列の形態で存在する標的である、標的配列の変異型のアレル特異的増幅の方法が挙げられ、この方法は、（ａ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドを標的配列の少なくとも１つの変異型にハイブリダイズすることであって、この第１のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、標的配列の１つだけの変異型に相補的な少なくとも１つの内部選択ヌクレオチドを有する、ハイブリダイズすることと；（ｂ）第２オリゴヌクレオチドを核酸ポリメラーゼで伸長することであって、上記選択ヌクレオチドが標的と塩基対を形成する場合、上記ポリメラーゼは優先的に上記第２オリゴヌクレオチドを伸長することが可能であり、上記選択ヌクレオチドが標的と塩基対を形成しない場合、実質的に少ない、伸長することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列の変異型を検出する方法を含んでもよく、この標的はいくつかの変異型配列の形態で存在し、この方法は、（ａ）第１及び第２オリゴヌクレオチドを、標的配列の少なくとも１つの変異型にハイブリダイズさせることであって；上記第１のオリゴヌクレオチドは標的配列の１つまたは複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、上記第２のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であり、かつ標的配列の１つだけの変異型に相補的な少なくとも１つの内部選択ヌクレオチドを有する、ハイブリダイズさせることと；（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを核酸ポリメラーゼで延長することであって；上記ポリメラーゼは、上記選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成する場合に優先的に上記第２のオリゴヌクレオチドを伸長することが可能であり、上記選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成しない場合は実質的に少ない、延長することと；（ｃ）上記オリゴヌクレオチド伸長の産物を検出することであって、この伸長は、オリゴヌクレオチドが相補的な選択的ヌクレオチドを有する標的配列の変異型の存在を示す、伸長することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列のアレル特異的増幅を行うためのオリゴヌクレオチドを含んでもよく、上記標的はいくつかの変異型配列の形態で存在し、このオリゴヌクレオチドは（ａ）上記標的配列の１つまたは複数の変異型の一部に対して少なくとも部分的に相補的な配列；（ｂ）標的配列の１つだけの変異型に相補的な少なくとも１つの内部選択的ヌクレオチドを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列のアレル特異的増幅のための反応混合物を含んでもよく、上記標的は、いくつかの変異型配列の形態で存在し、その混合物は、（ａ）標的配列の１つまたは複数の変異型に少なくとも部分的に相補的である第１のオリゴヌクレオチド；及び（ｂ）標的配列の１つまたは複数の変異型に少なくとも部分的に相補的であるが、標的配列の１つだけの変異型に相補的な少なくとも１つの内部選択ヌクレオチドを有する第２のオリゴヌクレオチド、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００９２６３０号に記載されている任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、標的シークエンシングから得られたシークエンシング読み取りの正確かつ高速なマッピングを含み得る。例えば、標的領域が一旦選択されれば、標的領域に十分に類似したゲノムの代替領域が特定され得る。シークエンシング読み取りが代替領域よりも標的領域により類似しているならば、読み取りは標的領域に整列していると判断され得る。次に、標的領域に整列する読み取りを分析して、標的領域に変異が存在するか否かが判断され得る。したがって、シークエンシング読み取りは、ゲノム全体ではなく、標的領域及び対応する代替領域と比較され得るので、計算効率が向上する。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、生物の試料ゲノムの標的領域内の変異型を検出する方法を含み得る。複数のシークエンシング読み取りが受信される。配列の読み取りは、生物から得られた試料のゲノムセグメントのシーケンンシングから取得され、このシークエンシングには、標的領域からのゲノムセグメントの標的化が含まれる。参照ゲノムの標的領域からの変動のそれぞれの最初の数を有する１つまたは複数の代替領域が特定される。それぞれの第１の数は、１より大きく、第１の閾値より小さい。コンピューターシステムは、複数の配列読み取りの参照ゲノムの標的領域へのアライメントを実行して、第２の閾値未満の変動で基準ゲノムの標的領域に整列する配列読み取りのセットを特定する。第３の閾値よりも小さい第２の数の変動を有する代替領域の１つに整列する配列読み取りは、このセットから除去され得る。このセットの残りの配列読み取りを分析して、試料ゲノムの標的領域の変異型を決定する。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９７７，１０８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、反復ヌクレオチド配列を含む核酸の変異体と非変異体型との間を迅速かつ確実に検出及び同定するためのアプローチが含まれ得る。ある特定の実施形態では、例えば、この方法は、診断または予後の応用の一部として患者のマイクロサテライト不安定性を評価するために使用される。多くの実施形態では、単一のプローブ核酸を使用して、所与の反復ヌクレオチド配列の様々な多型が検出される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、標的核酸の変異型を検出する方法を含み得る。この方法は、少なくとも１つの標的核酸及び／または標的核酸のアンプリコンを提供することを含む。標的核酸は、少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。この方法はまた、少なくとも１つのプローブ核酸を標的核酸に、及び／または標的核酸のアンプリコンに結合すること（例えば、ハイブリダイズすることなど）を含む。このプローブ核酸は、反復ヌクレオチド配列の非変異体型の少なくとも一部に少なくとも実質的に相補的である少なくとも第１のヌクレオチド配列を含む。さらに、この方法は、標的核酸から、及び／または標的核酸のアンプリコンからのプローブ核酸の二峰性解離を検出することも含む。いくつかの実施形態では、検出された二峰性解離は、融解ピークの二峰性分布を含む。さらに、検出された二峰性解離は、一般に、反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの変異体と相関している。いくつかの実施形態では、検出された非二峰性（例えば、単一モードなど）解離は、反復ヌクレオチド配列の非変異体型と相関する。典型的には、プローブ核酸、標的核酸、及び／または標的核酸のアンプリコンは、少なくとも１つの標識部分及び／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含むか、またはそれらに関連する。これらの実施形態では、検出ステップは一般に、標識部分によって生成される検出可能なシグナルを検出することを含む。さらに、標的核酸から、及び／または標的核酸のアンプリコンからのプローブ核酸の二峰性解離は、典型的には、温度変化などのような少なくとも１つの変化した条件下で検出される。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、反応混合物が含まれ得る。反応混合物は、少なくとも１つの標的核酸及び／または標的核酸のアンプリコンを含む。標的核酸は、少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。この反応混合物はまた、反復ヌクレオチド配列の非変異体型の少なくとも一部に少なくとも実質的に相補的である少なくとも第１のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのプローブ核酸も含む。さらに、プローブ核酸は、少なくとも１つの変化した条件下で反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの変異体型を含む結合標的核酸から二峰性に解離する。ある特定の実施形態では、この反応混合物は、様々な他の成分も含む。例えば、反応混合物は、必要に応じて、少なくとも１つの塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなど）を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物はまた、少なくとも１つの緩衝液も含む。緩衝液は、典型的には、反応混合物のｐＨを約５．５～約１０．０に維持する。この反応混合物はまた、Ｍｇ２＋（例えば、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２など）、Ｍｎ２＋（例えば、ＭｎＳＯ４、ＭｎＣｌ２など）などのような少なくとも１つの補因子を必要に応じて含む。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、プローブ核酸が含まれ得る。プローブ核酸は、反復ヌクレオチド配列の非変異体型の少なくとも一部に少なくとも実質的に相補的である少なくとも第１のヌクレオチド配列を含む。さらに、プローブ核酸は、少なくとも１つの変化した条件下で反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの変異体型を含む結合標的核酸から二峰性に解離する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸の変異体型を検出するためのシステムを含んでもよい。このシステムは、反復ヌクレオチド配列の非変異体型に少なくとも実質的に相補的である少なくとも第１のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのプローブ核酸を含む。プローブ核酸は、少なくとも１つの変化した条件下で、反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの変異体型を含む結合標的核酸から二峰的に解離する。典型的には、少なくとも１つの容器は、例えば溶液中にプローブ核酸を含む。このシステムはまた、プローブ核酸が標的核酸及び／または標的核酸のアンプリコンに結合しており、１つまたは複数の様々な条件にさらされる場合、標的核酸から及び／または標的核酸のアンプリコンからのプローブ核酸の解離を検出する少なくとも１つの検出器を備える。いくつかの実施形態では、このシステムは、プローブ核酸が標的核酸に、及び／または標的核酸のアンプリコンに結合して様々な条件に効果を発揮する場合に、プローブ核酸がさらされる温度を調節する少なくとも１つの温度調節装置も含む。ある特定の実施形態では、このシステムはまた、少なくとも検出器に作動可能に接続された少なくとも１つのコントローラーも備え、このコントローラーは、結合した標的核酸及び／または標的核酸の結合アンプリコンからのプローブ核酸の検出された二峰性解離を、この標的核酸が得られた対象についての少なくとも１つの遺伝的障害及び／または少なくとも１つの疾患状態の診断と相関させる。いくつかの実施形態では、この標的核酸は典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡを含み、一般に少なくとも１人の対象から得られる。標的核酸の変異体型は、典型的には、少なくとも１つの遺伝的障害（例えば、脆弱Ｘ症候群など）及び／または少なくとも１つの病状（例えば、少なくとも１つの形態のがんなど）の診断と、標的核酸の変異体型を含む対象について相関する。さらに、反復ヌクレオチド配列の変異体型は、典型的には、反復ヌクレオチド配列の非変異体型と比較して少なくとも１つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、例えば、反復ヌクレオチド配列は、マイクロサテライトマーカー、モノヌクレオチドリピートなどに対応する。いくつかの実施形態では、この反復ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのモノヌクレオチドリピート（例えば、Ａｎ、Ｔｎ、Ｇｎ、Ｃｎ、Ｕｎなど、ここでｎは１より大きい整数）を含む。例えば、モノヌクレオチドリピートは、他の多くの中でも特に、ＢＡＴ－２５リピート、ＢＡＴ－２６リピートを必要に応じて含む。ある特定の実施形態では、モノヌクレオチドリピートの検出された変異体型は、２２個以下のアデニンヌクレオチドを含む。さらに説明すると、標的核酸の反復ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＡＴリピート、少なくとも１つのＧＣリピート、少なくとも１つのＣＧＧリピート、少なくとも１つのＣＧＣリピート、少なくとも１つのＴＡＴリピート、少なくとも１つのＡＴＴリピート、及び／またはその少なくとも１つの相補的リピートを、ある特定の実施形態では含む。いくつかの実施形態では、例えば、第１のヌクレオチド配列は、反復ヌクレオチド配列の非突然変異体型よりも長い。これらの実施形態では、反復ヌクレオチド配列の非変異体型の長さを超えて伸びる第１ヌクレオチド配列の部分は、通常、反復ヌクレオチド配列に隣接する標的核酸のヌクレオチド配列に実質的に相補的ではない。特定の理論に拘束されないが、これらの実施形態では、プローブ核酸が標的核酸の変異体型またはこの標的核酸の変異体型アンプリコンに対して、少なくとも１つの選択された条件下で結合する場合、プローブ核酸の少なくとも１つのセグメントが三重らせんを形成すると考えられる。ある特定の実施形態では、このプローブ核酸は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。プローブ核酸、標的核酸、及び／または標的核酸のアンプリコン（例えば、アンプリコンを生成するために使用されるプライマー核酸などを介して）は、必要に応じて、少なくとも１つの標識部分及び／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含むか、またはそれに会合される。説明のために、標識部分は必要に応じて、例えば、蛍光色素、弱蛍光標識、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素などのうちの１つまたは複数を含む。さらに例示するために、この蛍光色素は、必要に応じて、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＦＡＭ、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ、ＥｔＢｒなどからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４５，１２５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸の重合及び増幅に関する方法を含み得る。ある特定の実施形態では、例えば、加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）関連方法は、加ピロリン酸分解と重合の連続した結合を伴う。これらの方法は、例えば、他の多くの他の用途の中でも、ＳＮＰ分析及びまれな体細胞突然変異の検出に使用され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド媒介合成反応の一般的な特異性を高める。例えば、他の「ホットスタート」方法（例えば、可逆的、化学修飾酵素、アプタマーまたは抗体媒介「ホットスタート」）と同様に、「ゼロサイクル拡張」（ｐｒｅ－ＰＣＲ）は、減少または排除される。これらの他の方法とは異なり、プライマーの活性化は、新しいオリゴヌクレオチドを介した合成ステップのたびに行われる。これにより、反応の全体的な特異性が向上し、不要な副産物の生成が最小限に抑えられる。したがって、低コピー、さらには単一コピーの配列の検出が改善される。さらに、マルチプレックス（数個または多数の異なる標的が増幅される）増幅反応の能力も、意図しない望ましくない非特異的な合成産物（例えば、ＰＣＲの場合のプライマー二量体など）の生成を削減または排除することによって改善される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、２’－ターミネーターヌクレオチドを含む（例えば、３’末端で）、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー核酸、プローブ核酸など）を含む反応混合物を含んでもよい。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは式：
Figure 2023075090000026



を含み、
式中、ＺはＯまたはＣＨ２であり；Ｂは、少なくとも１つの同素環、少なくとも１つの複素環、少なくとも１つのアリール基、またはそれらの組み合わせであり；ＢＧは保護基であり；Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、親水性基、または疎水性基であり；Ｘはヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；ｎは０より大きい整数であり；そして、単結合または二重結合を表す。必要に応じて、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識を含む。ある特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド位置は、標的核酸の多型ヌクレオチド位置に対応する。これらの実施形態のいくつかでは、例えば、２’－ターミネーターヌクレオチドは、標的核酸の多型ヌクレオチド位置に対応する。反応混合物は、典型的には、反応混合物が利用される特定の用途に応じて追加の試薬を含む。いくつかの実施形態では、例えば、追加の試薬は、例えば、ヌクレオチド除去活性（例えば、加ピロリン酸分解活性及び／またはヌクレアーゼ活性）を含む第１生体触媒、ヌクレオチド取り込み活性を含む第２生体触媒、このオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的な少なくともあるサブ配列を含む標的核酸、アンプリコン、プライマー核酸、プローブ核酸（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、５’－ヌクレアーゼプローブ、ヘアピンプローブなど）、追加のヌクレオチド（例えば、伸長可能なヌクレオチド、ターミネーターヌクレオチド、リボヌクレオシド三リン酸、デオキシリボヌクレオシド三リン酸など）、追加のオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー核酸、プローブ核酸など）、可溶性発光修飾剤、共溶媒、挿入剤、臨床検体、試料、緩衝液、塩、金属イオン、ピロリン酸塩、グリセロール、ジメチルスルホキシド、ポリｒＡなどから選択される。いくつかの実施形態では、標的核酸、アンプリコン、プライマー核酸、プローブ核酸、追加のヌクレオチド、及び／または追加のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、少なくとも９０ｍＭ（例えば、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭなど）の濃度のＮ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシンを含む。いくつかの実施形態では、第１の生体触媒は、ヌクレオチド取り込み活性（すなわち、ヌクレオチド除去活性に加えて）を含む。第１及び／または第２の生体触媒のヌクレオチド取り込み活性は、典型的には、ポリメラーゼ活性及び／またはリガーゼ活性を含む。必要に応じて、第１及び／または第２の生体触媒は、ヌクレアーゼ活性を含む。さらに説明すると、第１及び／または第２生体触媒は、例えば、ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リガーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、及びテロメラーゼから選択される酵素を必要に応じて含む。ある特定の実施形態では、第１及び／または第２の生体触媒は、Ｇ４６、Ｌ３２９、Ｑ６０１、Ｄ６４０、Ｉ６６９、Ｓ６７１、及びＥ６７８からなる群より選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の変異体を含むＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを含む。これらの実施形態のいくつかでは、例えば、変異は、Ｇ４６Ｅ変異、Ｌ３２９Ａ変異、Ｑ６０１Ｒ変異、Ｄ６４０Ｇ変異、Ｉ６６９Ｆ変異、Ｓ６７１Ｆ変異、及び／またはＥ６７８Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、例えば、２’－ターミネーターヌクレオチドは、２’－一リン酸－３’－ヒドロキシルヌクレオシドを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、オリゴヌクレオチドからヌクレオチドを除去する方法を含み得る。この方法は、少なくとも１つの標的核酸と：ヌクレオチド除去活性（例えば、加ピロリン酸分解活性及び／またはヌクレアーゼ活性）を含む少なくとも第１の生体触媒、及び２’－ターミネーターヌクレオチドを（例えば、３’末端で）含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー核酸、プローブ核酸など）とをインキュベートすることを含み、このオリゴヌクレオチドは、第１の生体触媒が、オリゴヌクレオチドから少なくとも２’－ターミネーターヌクレオチドを除去して、除去された２’－ターミネーターヌクレオチド及び短縮されたオリゴヌクレオチドを生成し、それによりオリゴヌクレオチドからヌクレオチドを除去する条件下で、標的核酸の少なくとも第１の部分配列に少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、この方法は、標的核酸を、第１の生体触媒、オリゴヌクレオチド、及びピロリン酸塩とともにインキュベートすることを含み、ピロリン酸塩は、除去された２’－ターミネーターヌクレオチドに添加される。いくつかの例示的な実施形態では、標的核酸は、少なくとも１つの多型ヌクレオチド位置を含み、この方法は、オリゴヌクレオチドからの２’ターミネーターヌクレオチドの除去を検出することを含み、この除去は、多型ヌクレオチド位置に対応する少なくとも１つのヌクレオチド位置を含むオリゴヌクレオチドと相関する。これらの実施形態では、２’－ターミネーターヌクレオチドは通常、多型ヌクレオチド位置に対応する。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識を含み、この方法は標識から放出される検出可能なシグナルを検出することを含む。これらの実施形態のいくつかでは、標識はドナー部分及び／またはアクセプター部分を含み、検出可能なシグナルは発光を含み、この方法は標的核酸を第１の生体触媒、オリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの可溶性発光修飾剤とともにインキュベートすること、ならびにドナー部分及び／またはアクセプター部分からの発光を検出することを含む。必要に応じて、２’－ターミネーターヌクレオチドは、ドナー部分及び／またはアクセプター部分を含む。いくつかの実施形態では、第１の生体触媒は、ヌクレオチド取り込み活性（すなわち、ヌクレオチド除去活性に加えて）を含み、この方法は、最初の生体触媒が、短縮されたオリゴヌクレオチドの末端に追加のヌクレオチドを組み込んで、延長されたオリゴヌクレオチドを生成する条件下で、標的核酸を第１の生体触媒、短縮オリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの追加のヌクレオチドとともにインキュベートすることを含む。必要に応じて、この方法は、第２の生体触媒が短縮オリゴヌクレオチドの末端に追加ヌクレオチドを組み込んで、延長されたオリゴヌクレオチドを生成する条件下で、標的核酸を、ヌクレオチド取り込み活性を含む少なくとも第２の生体触媒、短縮オリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの追加ヌクレオチドとインキュベートすることを含む。例示すると、ヌクレオチド取り込み活性は、典型的には、ポリメラーゼ活性及び／またはリガーゼ活性を含む。第１及び／または第２の生体触媒は、典型的には、例えば、ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リガーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、テロメラーゼなどから選択される酵素を含む。ある特定の実施形態では、第１及び／または第２の生体触媒は、例えば、Ｇ４６、Ｌ３２９、Ｑ６０１、Ｄ６４０、１６６９、Ｓ６７１、及びＥ６７８から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の変異を含むＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを含む。これらの実施形態のいくつかでは、この変異は、Ｇ４６Ｅ変異、Ｌ３２９Ａ変異、Ｑ６０１Ｒ変異、Ｄ６４０Ｇ変異、Ｉ６６９Ｆ変異、Ｓ６７１Ｆ変異、及び／またはＥ６７８Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及び標的核酸がハイブリダイズしてハイブリダイズした核酸を形成する場合、標的核酸の末端を超えて延びる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドは、追加のヌクレオチドを含む。追加のヌクレオチドは、伸長可能なヌクレオチド及び／またはターミネーターヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、追加のヌクレオチドは少なくとも１つの標識を含み、この方法は標識から放出される検出可能なシグナルを検出することを含む。例えば、標識は必要に応じてドナー部分及び／またはアクセプター部分を含み、検出可能なシグナルは発光を含み、この方法は、標的核酸を少なくとも１つの可溶性発光修飾剤とインキュベートすること、及び標識からの発光を検出することを包含する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも１つの標識を含む少なくとも１つのプローブ核酸とともに標的核酸をインキュベートすること（プローブ核酸は、標的核酸の少なくとも第２の部分配列に少なくとも部分的に相補的である）、及びプローブ核酸またはその断片の標識から放出される検出可能なシグナルを検出することを包含し得る。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、発光を含み、この方法はさらに、標的核酸を少なくとも１つの可溶性発光修飾剤とインキュベートすること、及び標識からの発光を検出することを含む。例えば、プローブ核酸は必要に応じて５’－ヌクレアーゼプローブを含み、第１及び／または第２の生体触媒は、短縮オリゴヌクレオチドを５’から３’方向に伸長し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む。必要に応じて、プローブ核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ及び／またはヘアピンプローブを含む。ある特定の実施形態では、標的核酸は少なくとも１つの多型ヌクレオチド位置を含み、この方法は、短縮されたオリゴヌクレオチドの伸長を検出することを含み、この伸長は、多型ヌクレオチド位置に対応する少なくとも１つのヌクレオチド位置を含む伸長オリゴヌクレオチドと相関する。これらの実施形態のいくつかでは、２’－ターミネーターヌクレオチドは、多型ヌクレオチド位置に対応する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）２’－ターミネーターヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つの容器または支持体を含むシステムを含んでもよい。このシステムはまた、以下のうち少なくとも１つを備える：（ｂ）容器または支持体と熱的に連絡して、容器内または支持体の温度を調節するように構成された少なくとも１つの温度調節装置；（ｃ）容器または支持体に及び／またはそこから流体を移送する少なくとも１つの流体移送構成要素；ならびに、（ｄ）容器内または支持体中で生成された検出可能なシグナルを検出するように構成された少なくとも１つの検出器。いくつかの実施形態では、このシステムは、以下に作動可能に接続された少なくとも１つのコントローラーを備える：容器内または支持体上の温度の調節を行う温度調節装置、容器もしくは支持体上への及び／もしくはそこからの流体の移送を行う流体移送構成要素、ならびに／または容器もしくは支持体上で生成された検出可能なシグナルの検出を行う検出器。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１３５１０３号に記載されている任意の様々な様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、二重機能で使用される参照試料と組み合わせたデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に基づく方法を含み得る。まず、これは、外部標準としてｄＰＣＲの実行に追加される。第２に、同じ標準試料を、好ましくはそれを一次試料に追加することによって、内部標準として使用する。これによって、目的の核酸（標的核酸）と同じ方法で、試料調製プロセス全体を実行する。内部参照と外部参照の両方が、ｄＰＣＲを使用して定量される。内部基準と外部基準の定量化の比率は、ｄＰＣＲの前の試料調製の収率を示す。この収量が判明すれば、一次試料の初期目標濃度が算出され得る。ｄＰＣＲで使用される基準は、ｄＰＣＲで使用される標準の完全な理解につながり、ピペッティング及び希釈のエラーに起因する誤計算の防止に役立つ。正確でない標準であっても、ｄＰＣＲの絶対精度はさらに向上し、標準はボーナスとして再調整され得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、未処理試料中の目的の核酸の量または濃度を決定する方法を含んでもよく、この方法は、以下のステップを含む：ａ）目的の核酸を含むと疑われる未処理試料、及び目的の核酸とは異なる参照核酸を含むことが既知の参照試料を提供すること；ｂ）未処理の試料を定義された量の参照試料と組み合わせ、それにより組み合わせ試料を取得すること；ｃ）組み合わせた試料を処理し、それによりデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に適した処理済み試料を取得すること；ｄ）処理された試料でｄＰＣＲを実行し、それにより、処理された試料中の目的の核酸の量または濃度及び参照核酸の量または濃度を決定すること；ｅ）定義された量の参照試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それにより、定義された量の参照試料中の参照核酸の量または濃度を決定すること、
ｆ）ステップｄ）で決定された参照核酸の量または濃度を、ステップｅ）で決定された参照核酸の量または濃度と比較し、それによってステップｃ）で核酸の収率を決定すること；ならびに
ｇ）ステップｄ）で決定した処理済み試料中の目的の核酸の量または濃度、及びステップｆ）で決定した収率に基づいて、未処理の試料中の目的の核酸の量または濃度を決定すること。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、未処理試料中の目的の核酸の量または濃度を決定する方法を含んでもよく、この方法は、以下のステップを含む：ａ）目的の核酸を含むと疑われる未処理試料を提供すること、
ｂ）目的の核酸とは異なる参照核酸を含むことが知られている参照試料を提供すること；ｃ）参照試料を処理し、それによりｄＰＣＲに適した処理済み参照試料を取得すること；ｄ）処理された参照試料でｄＰＣＲを実行し、それにより、この処理された参照試料中の参照核酸の量または濃度を決定すること；ｅ）定義された量の未処理の参照試料でｄＰＣＲを実行し、それにより、定義された量の未処理の参照試料中の参照核酸の量または濃度を決定すること；ｆ）ステップｄ）で決定した参照核酸の量または濃度を、ステップｅ）で決定したものと比較し、それによりステップｃ）の核酸の収率を決定すること；ｇ）未処理の試料を処理して、それによってｄＰＣＲに適した処理済み試料を取得すること（ここでこの処理ステップｃ）及びｇ）は同一である）；ｈ）処理された試料でｄＰＣＲを実行し、それにより目的の核酸の量または濃度を決定すること；ならびにｉ）ステップｉ）で決定された処理済み試料中の目的の核酸の量または濃度、及びステップｆ）で決定された収率に基づいて、未処理の試料中の目的の核酸の量または濃度を決定すること。いくつかの実施形態では、（ｉ）参照試料中の参照核酸の量または濃度を参照値と比較し、それにより参照試料を管理し；（ｉｉ）参照試料中の参照核酸の量または濃度が不明であるか、事前に決定されていないか；及び／または（ｉｉｉ）ステップｅ）の参照試料の量または濃度が、ステップｂ）のそれと同一である。さらに、参照核酸は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：（ｉ）ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの混合物からなる群より選択される核酸である；（ｉｉ）目的の核酸と同じプライマー結合部位を有する；（ｉｉｉ）目的の核酸のプライマー結合部位とは異なるプライマー結合部位を有する；（ｉｖ）目的の核酸の長さと最大５０％、最大２５％、最大１０％、または最大５％異なる核酸の長さを有する；（ｖ）目的の核酸の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％同一の配列を有する；（ｖｉ）目的の核酸の含有量と最大で５０％、最大で２５％、最大で１０％、または最大で５％異なるＧ及びＣの含有量を有する；ならびに（ｖｉｉ）目的の核酸の一部ではなく、参照核酸の検出に使用される部分を含む。さらに、目的の核酸は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：（ｉ）ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの混合物からなる群より選択される核酸である；（ｉｉ）参照核酸の一部ではなく、目的の核酸の検出に使用される部分を含む；ならびに（ｉｉｉ）微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝的状態、または疾患の指標である。さらに、未処理の試料は、次の特徴のうちの１つまたは複数を有する：（ｉ）細胞培養、汚染されている疑いのある供給源、または対象から得られたもので、特にこの対象はヒト、動物及び植物、特にヒトからなる群より選択され；（ｉｉ）体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床検体、臓器試料、及び組織試料からなる群より選択される。処理ステップには、以下のプロセスのうちの１つまたは複数が挙げられる：希釈、溶解、遠心分離、抽出、沈殿、ろ過、及び精製。いくつかの実施形態では、ｄＰＣＲは、以下のうちの１つまたは複数によって特徴づけられる：（ｉ）液体内、ゲル内、エマルジョン内、液滴内、小型チャンバのマイクロアレイ内、マイクロ流体デバイスのチャンバ内、マイクロウェルプレート内、チップ上、毛細管内、核酸結合表面上またはビーズ上、特にマイクロアレイ内またはチップ上で実施される；（ｉｉ）少なくとも１００の反応領域、特に少なくとも１，０００の反応領域、特に少なくとも５，０００の反応領域で同一に行われる；ならびに（ｉｉｉ）少なくとも１０，０００個の反応領域、特に少なくとも５０，０００個の反応領域、特に少なくとも１００，０００個の反応領域で同様に実行される。より具体的には、ステップｄ）及びｅ）は、同じｄＰＣＲ実行及び／または同じｄＰＣＲデバイスで実行される。さらなる実施形態では、ｄＰＣＲは、１つまたは複数の蛍光プローブを単独でまたはクエンチャーと組み合わせて使用して、目的の核酸及び／または参照核酸を検出することを含む。ある特定の実施形態では、蛍光プローブは、フルオレセイン、ローダミン、またはシアニンを含む。この実施形態では、決定するステップは、蛍光シグナルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、外部制御が使用される。特定の実施形態では、この方法を使用して、疾患、病原体、まれな遺伝子配列、まれな突然変異、コピー数の変動、または相対的な遺伝子発現の有無を診断する。必要に応じて、この方法を使用して、疾患の進行、治療反応、及びそれらの組み合わせをモニターする。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１２８２７０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、配列決定計算を含むマイクロアレイ分析により、センス及びアンチセンス鎖を有する標的核酸の配列を調べる方法を含み得、この方法は、標的核酸配列内の１つまたは複数のヌクレオチド位置のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１つからのシグナルを計算から省略することを含む。この実施形態のバリエーションでは、ヌクレオチド位置でセンス鎖及びアンチセンス鎖の一方からのシグナルを省略することは、複数のマイクロアレイを使用するステップ、センス及びアンチセンス鎖の各々について１つまたは複数のプローブセットを使用してヌクレオチド位置でハイブリダイゼーションシグナルを測定するステップ；各プローブセットについて、各プローブセット内のハイブリダイゼーションシグナルを比較することにより、塩基識別能力を決定するステップ；各ヌクレオチド位置について、各プローブセットから計算された識別能力を使用して、センス鎖及びアンチセンス鎖の識別能力を個別に計算するステップ；各ヌクレオチド位置について、センス鎖とアンチセンス鎖との間の計算された識別能力を比較するステップ；より低い塩基識別能力を備えた鎖からのシグナルを省略するステップ、を含む。この実施形態のバリエーションでは、塩基識別は式１を使用して測定される。この実施形態のさらなるバリエーションでは、センス及びアンチセンス鎖の識別能力は、塩基位置の鎖のプローブセットの識別能力の百分位数として計算される。この実施形態のさらなるバリエーションでは、式３を使用して、センス鎖とアンチセンス鎖との識別能力を比較する：
Figure 2023075090000027


追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、配列決定または変異検出計算を含むマイクロアレイ分析を使用して、試験試料中のセンス及びアンチセンス鎖を有する標的核酸の有無を検出する方法が含まれてもよく、この方法は、標的核酸配列中の１つまたは複数のヌクレオチド位置のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１つからのシグナルを計算から省くことを含む。この実施形態のバリエーションでは、ヌクレオチド位置でセンス鎖及びアンチセンス鎖の一方からのシグナルを省略することは、複数のマイクロアレイを使用すること、各センス及びアンチセンス鎖について１つまたは複数のプローブセットを使用してヌクレオチド位置でハイブリダイゼーションシグナルを測定すること；各プローブセットについて、各プローブセット内のハイブリダイゼーションシグナルを比較することにより、塩基識別を決定すること；各ヌクレオチド位置について、各プローブセットからの識別能力を使用して、センス鎖及びアンチセンス鎖の識別能力を個別に計算すること；各ヌクレオチド位置について、センス鎖とアンチセンス鎖との間の識別能力を比較すること；より低い塩基識別能力を有する鎖からのシグナルを省略すること、というステップを含む。この実施形態のバリエーションでは、塩基識別は式１を使用して測定される。この実施形態のさらなるバリエーションでは、センス及びアンチセンス鎖の識別能力は、複数のマイクロアレイを使用して測定されたベース位置で、鎖におけるプローブセットの識別能力の百分位数として計算される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、配列決定または変異検出計算を含むマイクロアレイ分析を使用して試験試料中のセンス及びアンチセンス鎖を有する標的核酸の有無を検出するために１つまたは複数のプロセッサーを制御するコードを含むコンピューター可読媒体を含んでもよく、これには標的核酸配列内の１つまたは複数のヌクレオチド位置のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１つからのシグナルを計算から省略することを含む。この実施形態のバリエーションでは、コンピューター可読媒体は、以下のステップを制御するコードを含む：複数のマイクロアレイを使用し、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて１つまたは複数のプローブセットを使用してヌクレオチド位置でハイブリダイゼーションシグナルを測定すること；各プローブセットについて、各プローブセット内のハイブリダイゼーションシグナルを比較することにより、塩基識別能力を決定すること；各ヌクレオチド位置について、各プローブセットからの識別能力を使用して、センス鎖及びアンチセンス鎖の識別能力を個別に計算すること；各ヌクレオチド位置について、センス鎖とアンチセンス鎖との間の識別能力を比較すること；より低い塩基識別能力を有する鎖からのシグナルを省略すること。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試験試料中の標的核酸を検出するためのシステムを含んでもよく、このシステムは：マイクロアレイからハイブリダイゼーションデータを取得するように構成されたデータ取得モジュールと；以下のステップ：複数のマイクロアレイを使用し、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて１つまたは複数のプローブセットを使用して、ヌクレオチド位置でハイブリダイゼーションシグナルを測定すること；各プローブセットについて、各プローブセット内のハイブリダイゼーションシグナルを比較することにより、塩基識別能力を決定すること；各ヌクレオチド位置について、各プローブセットからの識別能力を使用して、センス鎖及びアンチセンス鎖の識別能力を個別に計算すること；各ヌクレオチド位置について、センス鎖とアンチセンス鎖との間の識別能力を比較すること；より低い塩基識別能力を有する鎖からのシグナルを省略することを介して標的配列の１つまたは複数のヌクレオチド位置にあるセンス鎖及びアンチセンス鎖の１つからのシグナルを省略することにより、データを処理して標的ヌクレオチド配列を決定するように構成されたデータ処理ユニットと；データ処理ユニットによって生成されたデータを表示すように構成された表示モジュール、とを備える。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／０１６０４０４号に記載されている任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡを増幅するために、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼの混合物が使用され、その少なくとも１つが３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする、完全に無作為化されたプライマーが最初の増幅反応で使用され、特定のプライマーが２回目の増幅反応で使用される２つまたは３つのサーモサイクル増幅反応を含む試料からの核酸断片の増幅方法が含まれ得る。増幅反応は、約２０から６０のサーモサイクルを含んでもよい。第１の増幅反応は、好ましくは少なくとも４０のサーモサイクル、最も好ましくは少なくとも５０のサーモサイクルを含む。第２の増幅反応は、好ましくは、少なくとも３０のサーモサイクル、最も好ましくは少なくとも４０のサーモサイクルを含む。各サーモサイクルは、変性段階、アニーリング段階、及び少なくとも１つの伸長段階を含む。一本鎖への変性は、好ましくは９０℃～９６℃の温度で起こる。プライマーを標的核酸とハイブリダイズさせるアニーリング段階は、好ましくは３０℃～５０℃の温度で起こる。最も好ましくは、アニーリング段階は、３５℃～４５℃の温度で行われる。最初の増幅反応中、アニーリング段階は、約３７℃で行われることが最も好ましい。伸長段階は、５０℃～７５℃の温度で行われる。好ましい実施形態では、第１の増幅反応の伸長段階は、５０℃～６０℃の温度で起こる。約５５℃の温度が特に好ましい。伸長は、２つ以上の伸長ステップを使用するサイクルの大部分の最初の増幅反応中に実行し、１つの伸長を低温で実行し、その後、高温で伸長を継続することが有利である。このアプローチを使用すると、最初の増幅反応中に特に長いアンプリコンの集団が作成される。この実施形態では、第１の増幅反応は好ましくは約５５℃で起こり、第２の増幅反応は約６５℃～７２℃で起こる。約６８℃の温度が最適である。最初の増幅反応で使用されるプライマーは完全に無作為化されており、すなわち、あらゆる単一位置のあらゆる単一ヌクレオチドが４つのヌクレオチド構成要素Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣの１つを含み得る一本鎖オリゴヌクレオチドの集団が使用される。これらのプライマーは１０～２０ヌクレオチド長であることが好ましい。最も好ましくは、プライマーは、約１５ヌクレオチド長である。第２の増幅反応で使用される特異的プライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの範囲にわたって標的核酸の配列またはその相補的配列と同一の配列を有することを特徴とする。潜在的な第３増幅反応で「ネストＰＣＲ」を実行するために使用される特定のプライマーは、第２増幅反応で使用されるプライマーと同じ基準に従って選択される。標的核酸またはその相補体と同一の使用されるプライマーの配列は、第２の増幅反応で増幅された配列の成分でなければならない。ＤＮＡポリメラーゼの混合物は、好ましくは、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｋｏｋｋｕｓ ｗｏｅｓｉｉから入手したＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼなどの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する別の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）注文番号１６４４９４７）。３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない他のＤＮＡポリメラーゼも、ポリメラーゼ混合物の構成要素として使用され得る。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡ増幅の方法を含み得る。ある特定の配列を検出する感度を確保するには、試料のＤＮＡを取得するために酵素プロテアーゼ消化を使用して分析される材料の細胞分析を実行することが有利である。例えば、プロテイナーゼＫを使用してもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、分析される物理的材料からＲＮＡが最初に単離される方法を含み得る。物理的材料の試料は、１つの細胞、１０未満の細胞、または１００未満の細胞を含み得る。ＲＮＡを取得するには、イソチオシアン酸グアニジンを含む緩衝液を使用した化学溶解を使用することが好ましい。次に、対応するｃＤＮＡを、逆転写酵素反応を使用して作成する。次いで、このｃＤＮＡを、プライマー伸長前増幅の開始材料として使用する。ｃＤＮＡは、ポリＡ ＲＮＡの逆転写により得られることが好ましい。プライマー伸長前増幅ＰＣＲにおけるポリメラーゼ混合物の使用は、先行技術から公知の方法を使用しても達成できないＤＮＡ検出の驚くべき高感度をもたらす。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、２つまたは３つのサーモサイクル増幅反応を含む核酸断片の増幅方法を含み得る。最初の増幅反応では完全にランダム化されたプライマーが使用され、第２の増幅反応では特定のプライマーが使用される。さらに、試料には、１００個以下の細胞に相当する量の核酸が含まれている。いくつかの実施形態では、増幅物が形成される可能性は９０％を超える。いくつかの実施形態では、増幅物が５～１０個以下の細胞の等価物から形成される可能性は９０％を超える。特別な実施形態では、１つの細胞の等価物から増幅物が形成される可能性は５０％を超える。この方法は、長さが１００～１０００塩基対の核酸断片の増幅での使用に適している。この方法は、１５０～５５０塩基対の長さを有する核酸断片の増幅での使用に特に適している。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６５８，５７２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、高密度のオリゴペプチド特徴を備えたマイクロアレイを含んでもよく、それによって生物のプロテオーム全体のタンパク質相互作用の検出が可能になる。ある実施形態は、１ｃｍ２あたり少なくとも５０，０００個のオリゴペプチド特徴を含むマイクロアレイである。別の実施形態は、ウイルスまたは生物から選択された標的のプロテオームの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％に相当するオリゴペプチドの特徴を有するマイクロアレイである。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、１ｃｍ２あたり少なくとも５０，０００個のオリゴペプチド特徴を含むマイクロアレイを含んでもよく、その特徴は、標的プロテオーム、ウイルス及び生物から選択される標的のプロテオームの約９０％～１００％を表し、特徴の少なくとも一部は、末端２－（２－ニトロ－４－ベンゾイル－フェニル）－プロポキシカルボニル（ベンゾイル－ＮＰＰＯＣ）－保護されたチロシン残基を有するオリゴペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，８２２，１５８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、以下のステップを含む目的の複数の核酸分子を処理する方法を含み得る：（ａ）複数のビーズを提供し、各ビーズが少なくとも１対の配列特異的増幅プライマーを含むことを特徴とし、さらに、上記プライマーの少なくとも１つが光切断可能なリンカーを介してビーズに結合されることによって特徴づけられるステップと、（ｂ）試料から目的の核酸分子を捕捉することと、（ｃ）上記複数のビーズをクローン的に単離するステップと、（ｄ）上記少なくとも１つのプライマーを光切断するステップと、（ｅ）上記核酸をクローン的に増幅し、それにより複数の増幅産物を作成するステップと、（ｆ）上記増幅産物を分析するステップ。第１の主要な実施形態では、ステップｃ）は、各ビーズが単一のミセルにカプセル化されているエマルジョンの生成を含む。好ましくは、ステップｆ）は、マイクロまたはピコタイタープレートの空洞への上記複数のビーズの分布と、上記増幅産物の検出とを含む。第１の特定の実施形態では、ステップｆ）は、上記増幅産物のシークエンシング反応をさらに含む。好ましくは、上記シークエンシング反応は、合成反応、例えばパイロシークエンシング反応によるシークエンシングである。複数の核酸分子が同じタイプの核酸の変異型である場合、そのような方法は、定量的突然変異分析に使用されてもよい。複数の分子が複数の異なる細胞ＲＮＡまたはそれらの対応するｃＤＮＡに対応する場合、そのような方法は、遺伝子発現をモニターするために使用され得る。第２の特定の実施形態では、例えばＰＣＲによる上記増幅産物の生成がモニターされる。好ましくは、上記増幅産物は、特異的二本鎖ＤＮＡ結合蛍光体、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブによって検出される：さらに、上記増幅産物は、上記増幅産物を熱勾配に供することによって分析され得る。第２の主要な実施形態では、ステップｃ）は、マイクロプレートまたはピコタイタープレートの空洞への上記複数のビーズの分配を含む。好ましくは、ステップｅ）及びｆ）は、リアルタイムＰＣＲによって同時に実行される。ＰＣＲに続いて、融解曲線分析が実行され得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーを介してビーズに結合される少なくとも１つのプライマーは、検出可能なタグを保有する。好ましくは、上記検出可能なタグは、質量タグ、カラー標識、ｅタグ、及び抗体によって検出可能なハプテンからなる群より選択される。非常に好ましいのは、上記標識プライマーが伸長されていない限り、好ましくは消光される蛍光標識である。あるいは、切断可能なプライマーは検出可能なタグを保持している。この場合、上記増幅産物は、標識プライマーまたは標識ｄＮＴＰを使用して検出される。例えば、検出可能なタグは、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどのハプテンであってもよい。特定の実施形態では、切断可能なリンカーを介してビーズに結合される複数のプライマーの各メンバーは、異なる検出可能な標識を保持している。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／００２４９４８号に記載されている任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸配列の富化及び分析のためのシステム及び方法を含み得る。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、捕捉プラットフォーム上で１つの融合パートナー遺伝子を表すこと、及びゲノムの異なるＤＮＡ領域に関する情報を保持する核酸鎖などのキメラ核酸のその後のシークエンシングを可能にすることによるフォーマットでの標的配列の富化を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ゲノム中のバランスの取れた染色体異常を検出する方法を含み得る。この方法は、以下のステップ：（ａ）上記ゲノムの断片化変性核酸分子を、ハイブリダイズ条件下で固体支持体の複数の異なる部位に位置する複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブに曝露して、上記プローブに特異的にハイブリダイズする核酸分子を捕捉するステップであって、上記断片化変性核酸分子は、約１００～約１０００ヌクレオチド残基、好ましくは約２５０～約８００ヌクレオチド残基、最も好ましくは約４００～約６００ヌクレオチド残基、特に約５００ヌクレオチド残基の平均サイズを有し、上記オリゴヌクレオチドプローブは、約２０～約１００ヌクレオチド、好ましくは約４０～約８５ヌクレオチド、より好ましくは約４５～約７５ヌクレオチド、特に約５５～約６５ヌクレオチド残基または約６０ヌクレオチド残基の平均サイズを有するステップと、（ｂ）この捕捉された分子からの非結合及び非特異的にハイブリダイズした核酸を分離するステップと；（ｃ）この固体支持体からこの捕捉分子を溶出するステップと、（ｄ）ステップ（ａ）～（ｃ）を、この溶出した捕捉分子で、少なくとも１つのさらなるサイクルについて必要に応じて繰り返すステップと、（ｅ）特に、合成反応によるシークエンシングを実行することにより、この捕捉分子の核酸配列を決定するステップと、（ｆ）決定された配列を参照ゲノムのデータベース内の配列と比較するステップと、（ｇ）参照ゲノムの配列と部分的にのみ一致するか、または一致しない、決定された配列における配列を同定するステップと、（ｈ）少なくとも１つのバランスの取れた染色体異常を検出するステップと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料を固体支持体上のプローブにハイブリダイズさせることにより、例えばゲノム試料から標的核酸配列を捕捉するための事前選択された固定化核酸プローブを含み得る。いくつかの実施形態によれば、捕捉された標的核酸は洗浄され、プローブから溶出され得る。場合によっては、溶出されたゲノム配列は、この方法に供されていない試料よりも詳細な遺伝子分析に適している場合がある。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、増幅用の上記プローブが固体支持体に固定されている、プローブ由来アンプリコンを含む溶液ベースの捕捉方法を含み得る。固体支持体は、ゲノム試料から特定の核酸配列を捕捉するための支持体固定化核酸プローブを含む。プローブ増幅は、標的配列にハイブリダイズされる、溶液中のプローブアンプリコンを提供する。プローブアンプリコンの標的配列へのハイブリダイゼーションに続いて、試料に存在する標的核酸配列は、プローブを捕捉及び洗浄し、捕捉されたプローブからハイブリダイズした標的核酸を溶出することにより富化される。標的核酸配列（複数可）は、例えば、非特異的ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ－ＰＣＲ）を使用してさらに増幅され、元の標的試料と比較して複雑さの低減したＰＣＲ産物の増幅プールが得られ、これを上記のようにシークエンシングによってさらに分析する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、生物のゲノムにおけるバランスの取れた染色体異常を検出する方法を含み得る。この方法は、ゲノムの断片化され変性された核酸分子を、固体支持体の異なる位置に結合された複数のオリゴヌクレオチドプローブに曝露するステップを含む。核酸分子は、約１００～約１０００ヌクレオチド残基の平均サイズを有し、オリゴヌクレオチドプローブは、約２０～約１００ヌクレオチド残基の平均サイズを有する。この方法はまた、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブに結合していない核酸分子から１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸分子を分離し、次いで１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸分子を固体支持体から溶出するというステップを含む。その後、溶出ステップで溶出された核酸分子がシークエンシングされ、それにより核酸分子の決定された配列が得られる。また、この方法は、決定された配列を、参照ゲノム配列を含むデータベースと比較すること、及び参照ゲノムの配列と部分的にのみ一致するかまたは一致しない決定された配列内の配列を同定し、それにより少なくとも１つの均衡染色体異常を検出するこというステップを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体に結合するためのリンカーを含む。様々な実施形態では、リンカーは化学リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、アダプター分子に特異的にハイブリダイズする配列を含む少なくとも１つのプライマーを用いて、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブに結合する核酸分子を曝露及び増幅するステップの前に核酸分子の少なくとも１つの末端に対して、少なくとも１つのアダプター分子を連結するステップをさらに含んでもよく、それによって溶出のステップの後に増幅のステップが行われる。さらに、いくつかの実施形態によれば、固体支持体は、核酸マイクロアレイまたはビーズの集団のいずれかである。いくつかの実施形態では、この検出方法は、ゲノム中の染色体異常を均衡させた。この方法は、固体支持体の異なる位置に結合した複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体を提供するステップを含み、このオリゴヌクレオチドプローブは約２０～約１００ヌクレオチドの平均サイズを有し、約１００～約１０００ヌクレオチド残基の平均サイズを有する複数の断片化及び変性された核酸分子を提供する。この方法はまた、オリゴヌクレオチドプローブを増幅し、それにより、結合部分を含み、溶液中に維持される増幅産物を生成するというステップを含む。その後、この方法は、標的核酸分子を特定のハイブリダイズ条件下で溶液中の増幅産物にハイブリダイズし、それにより複数のハイブリダイゼーション複合体を生成すること、及び増幅産物にハイブリダイズしていない核酸分子からハイブリダイゼーション複合体を分離することというステップを含む。次に、この方法によれば、ハイブリダイズした標的核酸分子は、ハイブリダイゼーション複合体を含む増幅産物から分離され、シークエンシングされ、それにより、核酸分子の決定された配列が得られる。この方法によれば、決定された配列は、参照ゲノムを含むデータベースと比較され、少なくとも１つの均衡型染色体異常を検出するために、参照ゲノムの配列と部分的にのみ一致するかまたは一致しない決定された配列内の配列が決定される。いくつかの実施形態では、結合部分はビオチン部分である。いくつかの実施形態によれば、高度に反復する配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは使用されない。さらに、いくつかの実施形態では、特定された均衡型染色体異常は転座を含んでも、または逆位を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５１４，７３６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、プライマー及び熱安定性酵素を使用して、核酸またはその混合物に存在する１つまたは複数の特定の核酸配列を増幅するプロセスを含んでもよい。一方のプライマーの伸長生成物は、他方とハイブリダイズすると、所望の特定の核酸配列を生成するための鋳型になり、逆もまた同様であり、所望の量の配列を生成するのに必要な頻度でこのプロセスが繰り返される。この方法は、増幅反応の特異性を改善し、増幅された核酸の極めて明確なシグナルをもたらす。さらに、この方法により、各増幅サイクル後に試薬をある容器から別の容器に移す必要がなくなる。熱安定性酵素は核酸鎖の変性に必要な高温に耐えるので、このような移行は必要ないため、このような置き換えは必要がなない。さらに、増幅反応を実現するために必要な人員とステップをさらに削減するために、温度サイクルを自動化してもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸または核酸の混合物に含まれる少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅するプロセスが含まれてもよく、核酸が二本鎖である場合、これは等長または不等長の２つの分離した相補鎖からなり、このプロセスは：（ａ）各核酸鎖を４つの異なるヌクレオシド三リン酸、及び１つのオリゴヌクレオチドプライマーと増幅される異なる特定の配列ごとに接触させることであって、各プライマーがそれぞれの特異的な配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択され、その結果伸長生成物が１つのプライマーから合成され、これがその相補体から分離された場合、他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として機能し得、この接触は、各プライマーのその相補的核酸鎖に対するハイブリダイゼーションを促進する温度である、接触させることと；（ｂ）各核酸鎖を、ステップ（ａ）と同時またはその後に、以下、各核酸の各鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成するヌクレオシド三リン酸の組み合わせを可能にする熱安定性酵素と接触させること；（ｃ）ステップ（ｂ）からの混合物を有効な温度で有効な時間維持して、酵素を活性化し、増幅される各異なる配列ごとに、各核酸鎖鋳型に相補的な各プライマーの伸長生成物を合成すること（しかし、各伸長生成物をその相補鎖鋳型から分離するほど高くはない（温度））；（ｄ）ステップ（ｃ）の混合物を有効な時間及び有効な温度（合成された鋳型からプライマー伸長生成物を分離し、一本鎖分子を生成するが、酵素を不可逆的に変性させるほど高くない（温度））で加熱すること；（ｅ）有効な時間、有効な温度でステップ（ｄ）からの混合物を冷却し、ステップ（ｄ）で生成された各一本鎖分子への各プライマーのハイブリダイゼーションを促進すること；ならびに（ｆ）ステップ（ｅ）由来の混合物を効果的な温度で効果的な時間維持して、酵素の活性を促進し、増幅される各異なる配列について、ステップ（ｄ）で生成された各核酸鎖鋳型に相補的である各プライマーの伸長生成物を合成すること（ただし各伸長生成物をその相補鎖鋳型から分離するほど高くはない（温度））、ステップ（ｅ）と（ｆ）は同時にまたは連続して実行される）こと、を含む。所望のレベルの配列増幅が得られるまで、ステップ（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）を繰り返してもよい。好ましい熱安定性酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから抽出されたポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）である。最も好ましくは、酵素がＴａｑポリメラーゼである場合、ステップ（ａ）において、核酸鎖は、約１．５～２ｍＭのマグネシウム塩、各１５０～２００μＭのヌクレオチド、及び各１μＭのプライマーを含む緩衝液と接触され、ステップ（ａ）、（ｅ）及び（ｆ）は約４５～５８℃で実施され、ステップ（ｄ）は約９０～１００℃で実施される。好ましい実施形態では、核酸（複数可）は、二本鎖であり、ステップ（ａ）は、（ｉ）４つの異なるヌクレオシド三リン酸と、１つのオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で、増幅される異なる特定の配列について、各核酸を、有効な時間及び有効な温度で加熱して、各核酸を変性することであって、各プライマーが、各特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択され、その結果、１つのプライマーから合成された伸長生成物は、その相補体から分離されると、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型として機能し得ること；及び（ｉｉ）変性核酸を、各プライマーとその相補的核酸鎖とのハイブリダイゼーションを促進する温度まで冷却すること、によって達成される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸または核酸の混合物を含む試料中の少なくとも１つの特定の核酸配列の有無を検出するプロセス、または上記試料中の２つの異なる配列を区別するプロセスを含んでもよく、この試料は、上記配列（複数可）を含む疑いがあり、この核酸（複数可）が二本鎖である場合、それらはそれぞれ等長または不等長の２つの分離された相補鎖からなり、このプロセスは上記のステップ（ａ）～（ｆ）（存在する場合、特定の核酸配列（複数可）の量の増幅をもたらす）；（ｇ）ステップ（ｆ）の生成物に、検出される各配列について、上記配列またはその変異体にハイブリダイズし得る標識オリゴヌクレオチドプローブを追加すること；ならびに（ｈ）上記ハイブリダイゼーションが起こったか否かを決定すること、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、試料に含まれる１つまたは複数の核酸の配列の少なくとも１つのヌクレオチドバリエーションの有無を検出するためのプロセスが含まれ、核酸が二本鎖の場合、これは、等長または不等長の２つの分離した相補的な鎖からなり、このプロセスは上記のステップ（ａ）～（ｆ）（ここでステップ（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）は、十分な回数繰り返され、存在する場合、その配列を含む核酸の検出可能な増幅を生じる）；（ｇ）ステップ（ｆ）の生成物を膜に固定するステップ；（ｈ）プローブの配列が増幅された配列の領域に相補的である場合にのみ、増幅された核酸配列とハイブリダイズし得る標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション条件下で膜を処理するステップ；（ｉ）プローブが核酸試料中の増幅された配列にハイブリダイズしたか否かを検出するステップ、を含む。試料が細胞を含む場合、好ましくは、ステップ（ａ）の前にそれらを加熱して、その中の核酸を試薬にさらす。このステップにより、試薬添加前の核酸の抽出が回避される。このプロセスのバリエーションでは、プライマー（複数可）及び／またはヌクレオシド三リン酸が標識され、その結果、得られた増幅された配列が標識される。標識されたプライマー（複数可）及び／またはヌクレオシド三リン酸（複数可）は、最初に反応混合物中に存在してもよいし、または後のサイクル中に添加されてもよい。配列特異的オリゴヌクレオチド（非標識）を膜に固定して、ハイブリダイゼーション条件下で、標識増幅産物を用いて処理し、膜結合配列が増幅産物に存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こるようにする。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸または核酸の混合物に含まれる１つまたは複数の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローニングするプロセスを含み得、この核酸（複数可）は、二本鎖の場合、２つの分離された相補鎖からなり、及びこの核酸（複数可）は、クローニングの前に量的に増幅され、このプロセスは、上記のステップ（ａ）～（ｆ）であって、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を、十分な回数繰り返して、配列（複数可）を含む核酸（複数可）の検出可能な増幅をもたらすステップ；（ｇ）ステップ（ｆ）の生成物に、上記制限部位の各々について制限酵素を加えて、制限消化物の切断産物を得るステップ；ならびに（ｈ）特定の配列（複数可）を含むステップ（ｇ）の切断生成物（複数可）を連結して、プロモーター及び選択マーカーを含む１つまたは複数のクローニングベクターにクローニングするステップ、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸または核酸の混合物に含まれる１つまたは複数の特定の核酸配列をクローニングベクターにクローニングするプロセスを含み得、この核酸（複数可）は、二本鎖の場合、等長または不等長の長さの２つの分離された相補鎖からなり、核酸（複数可）は、クローニングの前に量的に増幅され、このプロセスは、上記ステップ（ａ）～（ｆ）であって、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を、十分な回数繰り返して、１つまたは複数のクローニングベクターへの平滑端ライゲーションのための配列（複数可）を含む核酸（複数可）の有効な増幅をもたらすステップ；ならびに（ｇ）ステップ（ｆ）から得られたクローニングされる増幅された特定の配列（複数可）を、リガーゼの存在下で上記クローニングベクターのうちの１つまたは複数に連結するステップであって、上記増幅された配列（複数可）及びベクター（複数可）はライゲーションを行うのに十分な量で存在するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸または核酸混合物に含まれる少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅するのに有用な物質の組成を含んでもよく、４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び増幅される各異なる特定の配列のための１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで各プライマーは、特定の各配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択され、その結果、１つのプライマーから合成された伸長生成物は、その相補体から分離されると、他のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型として機能し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸（複数可）に含まれる特定の核酸配列の複数の鎖を含む１つまたは複数の核酸の試料を含んでもよい。この試料は、約１０～１００本の鎖、約１００～１０００本の鎖、または約１０００本超の鎖を含んでもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記の増幅プロセスによって生成された配列の複数のコピーを含む核酸または核酸の混合物由来の増幅された核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１８１１３４に記載の、任意の様々な方法が挙げられ得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、様々な種類のがんのドライバー遺伝子、変異、及び／または経路を特定するための技術が含まれ得る。例えば、特定されたドライバー遺伝子は、特定されたドライバー遺伝子に生じる変異を特定することによる診断のため、または特定されたドライバー遺伝子を標的とすることによる治療のために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子特異的バックグラウンド変異率を決定することにより、ドライバー遺伝子が特定され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子特異的バックグラウンド変異率の統計モデルは、単一遺伝子及び交差遺伝子モデリングから推定されるパラメーターを最適化することにより決定され得る。一実施例では、遺伝子特異的バックグラウンド変異は、負の二項回帰及びベイズ推定を使用して、遺伝子特異的平均及び遺伝子特異的分散を再帰的に最適化することにより統計的に決定され得る。試料全体で予想されるバックグラウンド変異よりも有意に多くの変異を有する遺伝子、変異、及び／または経路は、候補ドライバー遺伝子、変異、及び／または経路として特定され得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、同じタイプのがんを有する異なる対象からの複数の試料の各試料について、その試料で測定されたＤＮＡであって、複数の遺伝子を含むＤＮＡの１つまたは複数の変異のセットを受け取ること；複数の試料の各試料について、その試料で測定された変異の総数に基づいて試料変異率を決定すること；複数の変異コンテキストの各変異コンテキストについて、変異コンテキストの変異のセットで特定された変異の最初の数に基づいてコンテキスト変異率を決定することであって、変異コンテキストは、置換または欠失のタイプに対応すること；複数の遺伝子の各遺伝子について、複数の試料の各試料について、試料内の遺伝子で測定された第２の数のサイレント変異を決定すること；遺伝子のサイレント変異のコンテキスト変異率の合計を使用して、予想されるサイレント変異率を決定することであって、サイレント変異は、遺伝子の翻訳タンパク質のアミノ酸配列に変化を引き起こさないこと；遺伝子の予想されるサイレント変異率及び複数の試料の試料変異率に基づいて、遺伝子の複数の試料にわたる遺伝子特異的バックグラウンド変異率の確率分布を決定することを含む方法を含み得、遺伝子について、遺伝子特異的バックグラウンド変異率の確率分布を決定することは、以下を含む：サイレント変異の第２の数に対する確率分布の適合度を高めるように遺伝子の遺伝子特異的バックグラウンド変異率の確率分布の１つまたは複数のパラメーターを最適化すること；遺伝子の非サイレント変異のサブセットのコンテキスト変異率の合計を使用して、予想される非サイレント変異率を決定すること；予想される非サイレント変異率及び遺伝子の遺伝子特異的バックグラウンド変異率の確率分布を使用して、少なくとも１つの非サイレント変異を有する予想される試料数を決定すること；及び予想数を、少なくとも１つの非サイレント変異を有する試料の測定数と比較して、その測定数の尤度値を取得すること；及び閾値を超える尤度値を有する遺伝子のグループを候補ドライバー遺伝子として同定すること。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／２０１３１５に記載の任意の様々な方法が挙げられる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、以下のステップを含み得る自動化核酸増幅法を含んでもよい：（ａ）少なくとも２つの液滴を提供するステップであって、各液滴は標的核酸にアニールするプライマーを含む、提供するステップ；（ｂ）上記の各液滴内の標的核酸を並行して増幅するステップ；（ｃ）少なくとも１つの液滴中の増幅された標的核酸を定量するステップ；及び（ｄ）所望の量の標的核酸が得られた後、少なくとも１つの液滴をさらに分析または処理するために少なくとも１つの液滴を回収するステップ。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、以下のステップを含み得る自動化核酸増幅法が挙げられ得る：（ａ）少なくとも２つの液滴を提供するステップであって、各液滴は標的核酸を含む、提供するステップ；（ｂ）上記各液滴内の標的核酸を並行して増幅するステップ；（ｃ）少なくとも１つの液滴中の増幅された標的核酸を定量するステップ；及び（ｄ）所望の量の標的核酸が得られた後、少なくとも１つの液滴をさらに分析または処理するために上記少なくとも１つの液滴を回収するステップ。ある実施形態では、上記液滴は、エレクトロウェッティングベースのデバイス上に提供されてもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、以下のステップを含む自動化核酸増幅法を含んでもよい：（ａ）エレクトロウェッティングベースのデバイスを提供するステップ；（ｂ）上記エレクトロウェッティングに基づくデバイス上に少なくとも２つの液滴を提供するステップであって、ここで各液滴は、標的核酸にアニールするプライマーを含む、提供するステップ；（ｃ）上記各液滴内の標的核酸を並行して増幅するステップ；（ｄ）少なくとも１つの液滴中の増幅された標的核酸を定量化するステップ；及び（ｅ）所望の量の標的核酸が得られた後、少なくとも１つの液滴を回収して上記少なくとも１つの液滴のさらなる分析または処理に使用するステップ。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、以下のステップを含む自動化核酸増幅法を含んでもよい：（ａ）エレクトロウェッティングベースのデバイスを提供するステップ；（ｂ）上記エレクトロウェッティングに基づくデバイス上に少なくとも２つの液滴を提供するステップであって、ここで各液滴は標的核酸を含む、提供するステップ；（ｃ）上記各液滴内の標的核酸を並行して増幅するステップ；（ｄ）少なくとも１つの液滴中の増幅された標的核酸を定量化するステップ；及び（ｅ）所望の量の標的核酸が得られた後、少なくとも１つの液滴を回収して上記少なくとも１つの液滴のさらなる分析または処理に使用するステップ。いくつかの実施形態では、上記液滴はそれぞれ異なる標的核酸を含んでもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、上記小滴がそれぞれ同じ標的核酸を含み得る方法を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記液滴が同じ標的核酸及び異なる標的核酸を含む液滴の混合物を含み得る方法を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、エレクトロウェッティングに基づくデバイスが、電極の平行アレイの二平面構成を含み、エレクトロウェッティング媒介液滴操作をもたらし得る方法を含み得る。いくつかの実施形態は、エレクトロウェッティングベースのデバイスが、エレクトロウェッティング媒介液滴操作をもたらす電極の平面構成を備え得る方法に関する。いくつかの実施形態は、エレクトロウェッティングベースのデバイスが正方形電極を備えてもよく、必要に応じて上記電極が約５ｍｍ×５ｍｍである方法に関する。いくつかの実施形態は、エレクトロウェッティングベースのデバイスが電極を備えてもよく、上記電極が正方形、三角形、長方形、円形、台形、及び／または不規則な形状である方法に関する。いくつかの実施形態は、エレクトロウェッティングベースのデバイスが電極を含んでもよく、上記電極が約１００μｍ×１００μｍ～約１０ｃｍ×１０ｃｍの範囲の電極寸法を含み得る方法に関する。いくつかの実施形態は、エレクトロウェッティングベースのデバイスが櫛形電極を備え得る方法に関する。いくつかの実施形態は、エレクトロウェッティングベースのデバイスが電極を備え得る方法に関し、ここで上記電極は、酸化インジウムスズ（「ＩＴＯ」）、透明導電性酸化物（「ＴＣＯ」）、導電性ポリマー、カーボンナノチューブ（「ＣＮＴ」）、グラフェン、ナノワイヤメッシュ、及び／または金属薄膜、例えばＩＴＯを含んでもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、検出ゾーンが電気化学的及び／または蛍光シグナルを検出し得る方法を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記検出ゾーンが液滴の静電容量を検出し得る方法を含み得る。追加の実施形態は、上記検出ゾーンが固定位置であり得る方法に関する。別の実施形態は、上記検出ゾーンがエレクトロウェッティングベースのデバイス内の任意の位置を含み得る方法に関する。さらに別の実施形態は、一般に、増幅方法がホットスタートＰＣＲを含み得る方法に関する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記増幅が等温増幅を含み得る方法を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記増幅がサーモサイクリングを含み得る方法を含み得る。上記サーモサイクリングは、約５０℃から約９８℃の範囲の温度、例えば約５０℃、約６０℃、約６５℃、約７２℃、約９５℃、または約９８℃を含んでもよい。上記サーモサイクリングは、約１秒から約５分の範囲の時間、例えば、約１秒、約５秒、約１０秒、約２０秒、約３０秒、約４５秒、約１分、及び／または約５分を含んでもよい。さらに、上記サーモサイクリングは、３つのサーモサイクルステップを含んでもよく、上記３つのサーモサイクルステップは１分以内に完了され得る。いくつかの実施形態では、各液滴はさらに検出剤を含んでもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、各小滴が同じ検出剤を含み得る方法を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、各小滴が異なる検出剤を含み得る方法を含み得る。別の実施形態は、一般に、液滴が、液滴のサブセット内の各液滴が標的核酸を検出するための薬剤を含む液滴の標識サブセットと、液滴のサブセット内の各液滴が標的核酸を検出するための上記薬剤を含まない液滴の未標識サブセットとを含み得る方法に関する。追加の実施形態は一般に、検出剤を含むサブセット内の各液滴が異なる検出剤を含み得る方法を包含する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、検出剤を含むサブセット内の各液滴が同じ検出剤を含み得る方法を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、修飾された天然に存在するＡ型ポリメラーゼであり得る。さらなる実施形態は、一般に、改変Ａ型ポリメラーゼがＭｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、またはＴｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍというの属の任意の種から選択され得る方法に関する。別の実施形態は、一般に、ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌｌｉｆｏｒｍｉｓのいずれかから単離され得る方法に関する。さらなる実施形態は、一般に、改変Ａ型ポリメラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｉｃｔｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから単離され得る方法を包含する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、修飾されたＡ型ポリメラーゼが、変異体７ａ－Ｅ５０７Ｋポリメラーゼであり得る方法を含み得る。別の実施形態は一般に、熱安定性ポリメラーゼを使用して標的核酸の増幅をもたらし得る方法に関する。さらなる実施形態は、一般的に、熱安定性ポリメラーゼが以下から選択され得る方法に関する：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｐｓ １ ７．Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ、及びＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、修飾ポリメラーゼを使用して標的核酸の増幅を行い得る方法、例えば、上記修飾ポリメラーゼが以下から選択され得る方法を含み得る：Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ、ΔΖ０５ポリメラーゼ、ＡＺ０５－Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ＡＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ ＴＭＡ－２５ポリメラーゼ、及びＥ６７８Ｇ ＴＭＡ－３０ポリメラーゼ。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、検出剤の検出が増幅サイクルの終わりに起こり得る方法を含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、単一ヌクレオチド多型を検出し得る。追加の実施形態は一般に、アンプリコン生成に使用できる方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、融解曲線分析に使用され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、標的核酸濃縮のために使用され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、プライマー伸長標的濃縮（「ＰＥＴＥ」）に使用され得る。いくつかの実施形態では、ライブラリー増幅のためにこの方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ライブラリー調製中にアダプター連結標的核酸分子の数を定量化するためにこの方法を使用してもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、アダプター連結標的核酸分子の数の上記定量を、（ａ）アダプター連結後に行って、アダプター連結分子に変換された入力物質の量（変換率）及び／またはライブラリー増幅に使用される鋳型の量を決定するか；（ｂ）ライブラリー増幅後に行って、十分な量の各ライブラリーが生成されたか否かを判断するため、及び／または標的捕捉もしくはクラスター増幅のためにプールされたインデックス付きライブラリーの同等の代表を確保するか；ならびに／あるいは（ｃ）クラスター増幅の前に行って、個々のライブラリーまたは試料プールがＮＧＳフローセルローディングに最適な濃度に希釈されていることを確認し得る、方法を含み得る。加えて、アダプター結合標的核酸分子の数の上記定量化は、ライゲーション後のクリーンアップステップ（ライブラリー増幅の前）後に起こり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの液滴を回収した後、上記少なくとも１つの液滴の上記さらなる分析または処理は、核酸シークエンシング反応、次世代シークエンシング反応、全ゲノムショットガンシークエンシング、全エクソームまたは標的シークエンシング、アンプリコンシークエンシング、メイトペアシークエンシング、ＲＩＰ－ｓｅｑ／ＣＬＩＰ－ｓｅｑ、ＣｈｌＰ－ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、トランスクリプトーム解析、及び／またはメチル－ｓｅｑを含み得る。これに加え
てまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、液滴が充填液で囲まれ得る方法、例えば、上記充填液が油であり得る方法を含み得る。いくつかの実施形態では、上記油は、透明な油を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記油は、液体重合シロキサン、シリコーン油鉱油、及び／またはパラフィン油を含んでもよい。別の実施形態は、一般に、液滴が気体で囲まれ得る方法、例えば、この気体が空気であり得る方法に関する。さらに別の実施形態は、一般に、過剰増幅バイアスを回避するために用いられ得る方法に方法に関する。別の実施形態は、一般に、変異の集団の代表的な試料を生成するために使用され得る方法に関する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸の所望の濃度を生成するのに必要な増幅サイクルの数を決定するために使用され得る方法を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、エレクトロウェッティングベースのデバイスと通信するコンピューターを介して制御され得る方法を含み得る。いくつかの実施形態は一般に、マスターミックスを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、上記マスターミックスは、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（複数可）、ＭｇＣｌ２、及び／またはオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態では、上記マスターミックスは、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば約１ｍＭ、約１０ｍＭ、もしくは約１００ｍＭを含む濃度のｄＮＴＰ（複数可）；約１ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば約１ｍＭ、約１０ｍＭ、もしくは約１００ｍＭを含む濃度のＭｇＣｌ２；及び／または約１ｎＭ～約１ｍＭ、例えば、約１ｎＭ、約１μＭ、もしくは約１ｍＭを含む濃度のオリゴヌクレオチドプライマー（複数可）、を含んでもよい。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、標的核酸の増幅のためのデバイスを含んでもよく、上記デバイスは、（ａ）エレクトロウェッティング媒介液滴操作を達成するための電極の平行アレイの二平面構成を含んでもよく；（ｂ）少なくとも１つの発熱体を含むか、またはそれと接触してもよく；及び（ｃ）少なくとも１つの検出ゾーンを含むか、またはそれと接触していてもよい。ある実施形態では、上記発熱体は、誘導発熱体を含んでもよい。別の態様は、一般に、標的核酸の増幅のためのデバイスに関し、上記デバイスは、（ａ）エレクトロウェッティング媒介液滴操作をもたらすための電極の平面構成を備えてもよく；（ｂ）少なくとも１つの発熱体を含むか、それと接触してもよく；及び（ｃ）少なくとも１つの検出ゾーンを含むか、または接触してもよい。一実施形態では、上記発熱体は誘導発熱体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記電極は、必要に応じて約５ｍｍ×５ｍｍの正方形の形状を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記電極は、正方形、三角形、長方形、円形、台形、及び／または不規則な形状を備えてもよい。いくつかの実施形態では、上記電極は、約１００μｍ×１００μｍ～約１０ｃｍ×１０ｃｍの範囲の電極寸法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記電極は、互いにかみ合され得る。いくつかの実施形態では、上記電極は、酸化インジウムスズ（「ＩＴＯ」）、透明導電性酸化物（「ＴＣＯ」）、導電性ポリマー、カーボンナノチューブ（「ＣＮＴ」）、グラフェン、ナノワイヤメッシュ及び／または超薄膜金属フィルム、例えば、ＩＴＯを含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記デバイスは、体積が約１ピコリットル～約５ｍＬの範囲、例えば約１２．５μｌの範囲の液滴を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記デバイスは、約０．５ｍｍという上部プレートと下部プレートとの間のギャップを備えてもよい。いくつかの実施形態では、上記デバイスは、複数の入口／出口ポートを備えてもよい。いくつかの実施形態では、上記デバイスは、同じ試料もしくは異なる試料の装填及び除去のための１～約４００個の入口／出口ポートを備えてもよく、及び／または上記デバイスは、充填液（複数可）の導入及び除去用の１～約１００個の入口／出口ポートをさらに備える。いくつかの実施形態では、上記デバイスは、隣接するポート間の間隔が約５ｍｍ～約５００ｍｍの範囲である入口／出口ポートを備えてもよい。さらなる実施形態では、上記発熱体は、接触ヒーターを備えてもよい。追加の態様は、上記増幅がサーモサイクリングを含む実施形態に関する。上記サーモサイクルは、３つのサーモサイクルステップを含んでもよく、上記３つのサーモサイクルステップは、１分以内に完了され得る。別の実施形態では、上記増幅は等温増幅を含み得る。さらなる実施形態では、上記増幅は、ホットスタートＰＣＲを含み得る。さらに別の実施形態では、検出ゾーンは、電気化学的及び／または蛍光シグナルを検出し得る。追加の実施形態は、液滴の静電容量を検出し得る検出ゾーンに関する。さらなる実施形態では、上記検出ゾーンは固定位置であってもよい。別の実施形態では、上記検出ゾーンは、エレクトロウェッティングベースのデバイス内の任意の場所を含んでもよい。別の実施形態では、標的核酸は、少なくとも３つの液滴内でデバイス上に提供され得る。さらなる実施形態では、上記液滴は、それぞれ同じ標的核酸を含んでもよい。さらに別の実施形態では、上記液滴は、同じ標的核酸及び異なる標的核酸を含む液滴の混合物を含んでもよい。別の実施形態では、各液滴はさらに検出剤を含んでもよい。追加の実施形態では、各液滴は同じ検出剤を含んでもよい。別の実施形態では、各液滴は異なる検出剤を含んでもよい。さらに、別の実施形態では、液滴は、それぞれ標的核酸を検出するための薬剤を含む液滴の標識サブセット、及びそれぞれ標的核酸を検出するための上記薬剤を含まない液滴の非標識サブセットを含んでもよい。追加の実施形態では、検出剤を含むサブセット内の各液滴は、異なる検出剤を含んでもよい。別の実施形態では、検出剤を含むサブセット内の各液滴は、同じ検出剤を含んでもよい。さらなる実施形態では、液滴の各サブセットは、１個以上、２個以上、１０個以上、１００個以上、１，０００個以上、または１０，０００個以上の液滴を含み得る。いくつかの実施形態では、デバイスは一塩基多型を検出し得る。さらに別の実施形態では、このデバイスはアンプリコン生成をもたらし得る。追加の実施形態では、このデバイスは融解曲線分析を達成し得る。さらに別の実施形態では、このデバイスは、標的核酸の富化をもたらし得る。さらに別の実施形態では、このデバイスはＰＥＴＥをもたらし得る。さらなる実施形態では、このデバイスは、ライブラリー増幅をもたらし得る。さらなる実施形態では、このデバイスは、ライブラリー調製中にアダプターに連結された標的核酸分子の数を定量化し得る。例えば、上記定量を、（ａ）アダプター連結後に行って、アダプター結合分子に変換された入力材料の量（変換率）及び／またはライブラリー増幅に使用される鋳型の量を決定してもよく；（ｂ）ライブラリー増幅後に行って、十分な量の各ライブラリーが生成されたか否かを判断しても、及び／または標的捕捉もしくはクラスター増幅のためにプールされたインデックス付きライブラリーの同等の代表を確保してもよく；及び／または（ｃ）クラスター増幅の前に行って、個々のライブラリーもしくは試料プールがＮＧＳフローセルローディングに最適な濃度に希釈されていることを確認してもよい。また、ライゲーション後のクリーンアップのステップ後（ライブラリー増幅の前）に、この定量を行ってもよい。さらに別の実施形態では、所望の量の標的核酸が得られた後、少なくとも１つの液滴が、上記液滴のさらなる分析または処理の前に上記デバイスから回収され得る。例えば、上記少なくとも１つの液滴の上記さらなる分析または処理は、核酸シークエンシング反応、次世代シークエンシング反応、全ゲノムショットガンシークエンシング、全エクソームまたは標的シークエンシング、アンプリコンシークエンシング、メイトペアシークエンシング、ＲＩＰ－ｓｅｑ／ＣＬＩＰ－ｓｅｑ、ＣｈｌＰ－ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、トランスクリプトーム解析、及び／またはメチル－ｓｅｑを含んでもよい。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的核酸の自動増幅のためのシステムを含んでもよく、これには以下を含み得る：（ａ）エレクトロウェッティングベースのデバイス；（ｂ）エレクトロウェッティングベースのデバイスを含むか、またはそれと接触する少なくとも１つの発熱体；（ｃ）エレクトロウェッティングベースのデバイスを含む、またはそれと接触する少なくとも１つの検出ゾーン。一実施形態では、上記発熱体は誘導発熱体を含んでもよい。さらなる実施形態では、上記発熱体は、接触ヒーターを備えてもよい。追加の態様は、上記増幅がサーモサイクリングを含む実施形態に関する。上記サーモサイクリングは、３つのサーモサイクルステップを含んでもよく、上記３つのサーモサイクルステップは、１分以内に完了され得る。別の実施形態では、上記増幅は、等温増幅を含み得る。さらなる実施形態では、上記増幅は、ホットスタートＰＣＲを含み得る。さらに別の実施形態では、検出ゾーンは、電気化学的及び／または蛍光シグナルを検出してもよい。追加の実施形態は、液滴の静電容量を検出し得る検出ゾーンに関する。さらなる実施形態では、上記検出ゾーンは固定位置であってもよい。別の実施形態では、上記検出ゾーンは、システム内の任意の場所を含んでもよい。別の実施形態では、標的核酸は、少なくとも３つの液滴内でシステム上に提供され得る。さらなる実施形態では、上記液滴は、それぞれ同じ標的核酸を含んでもよい。さらに別の実施形態では、上記液滴は、同じ標的核酸及び異なる標的核酸を含む液滴の混合物を含んでもよい。別の実施形態では、各液滴はさらに検出剤を含んでもよい。追加の実施形態では、各液滴は同じ検出剤を含んでもよい。別の実施形態では、各液滴は異なる検出剤を含んでもよい。さらに、別の実施形態では、液滴は、それぞれ標的核酸を検出するための薬剤を含む液滴の標識サブセット、及びそれぞれ標的核酸を検出するための薬剤を含まない液滴の非標識サブセットを含んでもよい。追加の実施形態では、検出剤を含むサブセット内の各液滴は、異なる検出剤を含んでもよい。別の実施形態では、検出剤を含むサブセット内の各液滴は、同じ検出剤を含んでもよい。さらなる実施形態では、液滴の各サブセットは、１個以上、２個以上、１０個以上、１００個以上、１，０００個以上、または１０，０００個以上の液滴を含み得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、（ａ）エレクトロウェッティング媒介性の液滴操作を果たすために、電極の平行配列の二平面構成をエレクトロウェッティングベースのデバイスに提供することであって、及びさらに、上記デバイスが少なくとも１つの誘導発熱体と少なくとも１つの検出ゾーンとを含むこと；（ｂ）上記デバイスに、標的核酸を含む液滴を提供することであって、上記液滴が、標的核酸検出用の薬剤を含む液滴のサブセットと、標的核酸検出用の上記薬剤を含まない液滴のサブセットとを含むこと；（ｃ）上記各液滴内の標的核酸を並行して増幅すること；（ｄ）上記薬剤の検出を通じて、上記薬剤を含む上記液滴のサブセット内の増幅された標的核酸を定量化すること；及び（ｅ）所望の量の上記標的核酸が、薬剤を含む液滴の上記サブセットで得られた後、さらなる分析または処理のための薬剤を含まない液滴の上記サブセットから少なくとも１つの液滴を回収することを含み得る、自動化された増幅法を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１２３３１６に記載される任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、十分な量のゲノム物質を含む入力試料が提供され、その結果、シークエンシングの前に必要な増幅プロセスが最小になるか、または増幅プロセスが不要となる標的シークエンシングワークフローが含まれ得る。いくつかの実施形態では、入力試料は、インタクトな腫瘍またはリンパ節に由来する。いくつかの実施形態では、入力試料は、インタクトな腫瘍試料（全体または部分）及び／または患者もしくは哺乳動物対象から得られた１つまたは複数のリンパ節の均質化により得られる。いくつかの実施形態では、入力試料は、全血またはその任意の画分を含む十分な量の血液に由来する。いくつかの実施形態では、入力試料はがん性組織に由来する。いくつかの実施形態では、入力試料は前がん組織に由来する。いくつかの実施形態では、標的シークエンシングワークフローは、シークエンシング前の１つまたは複数の増幅ステップ（例えば、捕捉前増幅ステップ、捕捉後増幅ステップ）を含み、シークエンシング前の各増幅ステップは、０～３の増幅サイクルを含み、シークエンシングの前の増幅サイクルの総計は４を超えない。他の実施形態では、標的シークエンシングワークフローは、シークエンシング前の１つまたは複数の増幅ステップ（例えば、捕捉前増幅ステップ、捕捉後の増幅ステップ）を含み、シークエンシング前の各増幅ステップは、０～２回の増幅サイクルを含み、シークエンシング前の増幅サイクルの総計は３を超えない。さらに他の実施形態では、標的シークエンシングワークフローは、シークエンシング前の１つの増幅ステップを含み（例えば、標的捕捉または増幅ステップまたは捕捉後増幅ステップ）、シークエンシング前の単一の増幅ステップは、０～３回の増幅サイクルを含む。さらなる実施形態では、標的シークエンシングワークフローは、シークエンシング前の１つの増幅ステップを含み、シークエンシング前の単一の増幅ステップは、１～３サイクルを含む。さらなる実施形態では、標的シークエンシングワークフローは、シークエンシング前の１つの増幅ステップを含み、シークエンシング前の単一の増幅ステップは、１サイクルを含む。さらに別の実施形態では、標的シークエンシングワークフローは、シークエンシング前の１つの増幅ステップを含み、シークエンシング前の単一の増幅ステップは２サイクルを含む。いくつかの実施形態では、捕捉前増幅ステップまたは捕捉後（ただしシークエンシングの前）の増幅ステップのいずれかまたは両方が、ＬＭ－ＰＣＲを利用する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料内のゲノム物質をシークエンシングする方法を含み得、この方法は：腫瘍試料及び／またはリンパ節試料を均質化して均質化試料を提供すること；均質化された試料から少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を分離すること；シークエンシングのために、少なくとも０．５マイクログラムの単離されたゲノム物質を調製すること；及び、調製されたゲノム物質をシークエンシングすること、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、シークエンシング前に増幅ステップを含まない。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも１つの捕捉前または捕捉後増幅ステップを含み、少なくとも１つの捕捉前または捕捉後増幅ステップ中に実施される増幅サイクルの総計は、多くとも４サイクルである。いくつかの実施形態では、増幅サイクルの総数は３である。いくつかの実施形態では、増幅サイクルの総数は２である。いくつかの実施形態では、シークエンシングのための少なくとも０．５マイクログラムの単離ゲノム物質の調製は、捕捉プローブに対して少なくとも０．５マイクログラムの単離されたゲノムをハイブリダイズすること、及びハイブリダイズしたゲノム物質を捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、捕捉されたゲノム物質の量は、約９０ｎｇ～約９００ｎｇの範囲である。いくつかの実施形態では、捕捉されたゲノム物質に対して１または２回の増幅サイクルを実行する。いくつかの実施形態では、均質化された試料は、細胞の代表的なサンプリングを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１マイクログラムのゲノム物質が均質化された試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも５マイクログラムのゲノム物質が、均質化された試料から単離される。いくつかの実施形態では、均質化された試料から少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質が単離される。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、試料内のＤＮＡをシークエンシングする方法を含み得、この方法は、血液試料から少なくとも０．５マイクログラムのＤＮＡを単離すること；少なくとも０．５マイクログラムの単離ＤＮＡをシークエンシング用に調製すること、及び調製したＤＮＡをシークエンシングすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、シークエンシングの前に増幅ステップを含まない。いくつかの実施形態では、シークエンシングのための少なくとも０．５マイクログラムの単離されたＤＮＡの調製は、少なくとも０．５マイクログラムの単離されたゲノムを、捕捉プローブに対してハイブリダイズすること、及びハイブリダイズしたゲノム物質を捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、捕捉されたゲノム物質の量は、約９０ｎｇ～約９００ｎｇの範囲である。いくつかの実施形態では、捕捉されたゲノム物質に対して１または２回の増幅サイクルを実行する。いくつかの実施形態では、血液試料から少なくとも１マイクログラムのＤＮＡを単離する。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、以下を含む標的化代表的シークエンシングの方法が含まれ得る：（ｉ）腫瘍の少なくとも一部、１つもしくは複数のリンパ節全体もしくは部分リンパ節、またはそれらの任意の組み合わせを均質化して、均質化された試料を提供すること；（ｉｉ）均質化された試料からゲノム物質を抽出すること；（ｉｉｉ）抽出されたゲノム物質をビーズに捕捉すること；及び（ｉｖ）捕捉されたゲノム物質のシークエンシングであって；標的化代表的シークエンシングは、捕捉されたゲノム物質のシークエンシングの前に最大で４回の増幅サイクルを実行することを含むシークエンシング。いくつかの実施形態では、抽出されたゲノム物質の捕捉の前に、または抽出されたゲノム物質の捕捉の後に、またはそれらの任意の組み合わせで、最大で３回の増幅サイクルが実施され得る。いくつかの実施形態では、捕捉前増幅サイクルは実施されない。いくつかの実施形態では、捕捉されたゲノム物質の量は、約９０ｎｇ～約９００ｎｇの範囲である。いくつかの実施形態では、抽出されたゲノム物質の捕捉後、ただしシークエンシングの前に、１～３回の増幅サイクルを実行する。いくつかの実施形態では、均質化された試料から少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質が抽出される。いくつかの実施形態では、４回を超える増幅サイクルを必要とするシークエンシング法で使用される入力材料の量と比較して、少なくとも１００倍以上のゲノム物質が均質化試料から得られる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料内のＤＮＡをシークエンシングする方法を含み得、この方法は：少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質、すなわち、腫瘍試料、リンパ節試料、または、血液試料に由来する少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を提供すること、入力ゲノム試料からＤＮＡを単離すること、シークエンシングのために単離されたＤＮＡを調製すること、及びこの調製されたＤＮＡをシークエンシングすることを含み、この方法は増幅ステップを含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質は、複数の組織学的及び／または生検標本に由来する。いくつかの実施形態では、入力ゲノム物質の少なくとも０．５マイクログラムは、均質化された腫瘍試料に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも０．５マイクログラムの入力ゲノム物質は、均質化されたリンパ節試料に由来する。いくつかの実施形態では、入力ゲノム物質の少なくとも０．５マイクログラムは、それが由来する腫瘍試料、リンパ節試料、または血液試料の代表的なサンプリングである。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、次世代シークエンシング方法を使用して実行される。いくつかの実施形態では、合成シークエンシング方法論を使用してシークエンシングが実行される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシング中にＰＣＲ導入変異を低減する方法を含み得、この方法は、十分な量のゲノム物質を含む試料からＤＮＡを単離すること；シークエンシングのために分離されたＤＮＡを準備すること；及び調製されたＤＮＡをシークエンシングすることを含み、ここでこの方法は、シークエンシングの前に最大３回の増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、シークエンシングの前に１または２回の増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態では、入力ゲノム物質の十分な量は、捕捉前増幅サイクルが利用されないような量である。いくつかの実施形態では、試料は、がんを有する疑いのある患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、がんと診断された患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、がんを発症するリスクのある患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は健康な組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、０．５マイクログラムのＤＮＡが試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも１マイクログラムのゲノム物質が試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも５マイクログラムのゲノム物質が試料から単離される。いくつかの実施形態では、少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質が試料から単離される。追加的にまたは代替的に、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＰＣＲで導入された変異が減少するシークエンシング方法を含み得、このシークエンシング方法には、少なくとも０．０５マイクログラムのゲノム物質を捕捉すること、及びシークエンシングの前に０～２回の増幅サイクルを実行することが含まれる。いくつかの実施形態では、増幅サイクルを実施しない。他の実施形態では、１増幅サイクルが実施される。さらに他の実施形態では、２つの増幅サイクルが実施される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、代表的な割合のゲノム含有量におけるＰＣＲにより導入されるバイアスが低減される配列捕捉方法を含み得、このシークエンシング方法は、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を含む入力試料を提供することを含み、このシーケンス捕捉方法は、シークエンシングの前に０～２回の増幅サイクルを実行することを含む。いくつかの実施形態では、増幅サイクルを実施しない。他の実施形態では、１増幅サイクルが実施される。さらに他の実施形態では、２つの増幅サイクルが実施される。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも１マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも５マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＰＣＲ導入変異が排除される配列捕捉方法を含んでもよく、この配列捕捉方法は、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を含む入力試料を調製することを含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも１マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも５マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、シークエンシングの前にＰＣＲ重複読み取りを
除去するステップが除かれる配列捕捉法を含んでもよく、この配列捕捉法は、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム物質を含む入力試料を提供することを含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも１マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも５マイクログラムのゲノム物質を含む。いくつかの実施形態では、入力試料は少なくとも１０マイクログラムのゲノム物質を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ＰＣＲにより導入された突然変異が実質的に排除されるシークエンシング法を含んでもよく、このシークエンシング法は少なくとも０．０５マイクログラムのゲノム物質を捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム物質の捕捉後に約０．０５マイクログラムのゲノム物質が提供される。いくつかの実施形態では、シークエンシングの前に１または２回の捕捉後増幅サイクルが実行される。
本明細書に記載される任意の様々な技術を用いて検出され得る遺伝子バイオマーカーの例としては、限定するものではないが、ＡＢＣＡ７、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＪＵＢＡ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＬＫ、ＡＭＢＲＡ１、ＡＭＥＲ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＫＲＤ４６、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＡＲＬ１５、ＡＲＭＣＸ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＡＤ２、ＡＴＦ１、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ５、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ２、ＡＸＩＮ１、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ９、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ８、ＢＬＭ、ＢＬＶＲＡ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ７、ＢＲＥ、ＢＲＷＤ３、ＢＴＢＤ７、ＢＴＲＣ、Ｃ１１ｏｒｆ７０、Ｃ１２ｏｒｆ５７、Ｃ２ＣＤ５、Ｃ３ｏｒｆ６２、Ｃ８ｏｒｆ３４、ＣＡＭＫＶ、ＣＡＰＧ、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＸ４、ＣＣＡＲ１、ＣＣＤＣ１１７、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＣＣＭ２、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＲ３、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＬＦ１、ＣＥＮＰＢ、ＣＥＰ１２８、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＤＬ１、ＣＨＵＫ、ＣＩＣ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＭＴＲ２、ＣＮＮ２、ＣＮＯＴ１、ＣＮＯＴ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＰＳ４、ＣＯＸ７Ｂ２、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＳＤＥ１、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＤＮＥＰ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＹＬＤ、ＤＡＣＨ１、ＤＣＨＳ１、ＤＣＵＮ１Ｄ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ１６、ＤＩＣＥＲ１、ＤＩＲＣ２、ＤＩＳ３、ＤＩＸＤＣ１、ＤＫＫ２、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＥＲ、ＤＮＭ１Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＩＦ２Ｓ２、ＥＩＦ４Ａ１、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＬＫ４、ＥＭＧ１、ＥＭＲ３、ＥＰ３００、ＥＰＢ４１Ｌ４Ａ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＳ８、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＦＩ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＥＸＯ５、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、Ｆ５、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＴ１、ＦＢＮ２、ＦＢＸＷ７、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＥＶ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＦＮ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＬＮＴＬ５、ＧＡＴＡ３、ＧＧＣＴ、ＧＩＧＹＦ２、ＧＫ２、ＧＬＩＰＲ２、ＧＮＡＳ、ＧＮＰＴＡＢ、ＧＮＲＨＲ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＬＭ１、ＧＯＰＣ、ＧＯＴ２、ＧＰＣ３、ＧＰＳ２、ＧＰＸ７、ＧＲＫ１、ＧＳＥ１、ＧＺＭＡ、ＨＤＡＣ１、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ４、ＨＧＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＭＣＮ１、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＴ８８、ＩＫＺＦ２、ＩＬ２、ＩＮＯ８０Ｃ、ＩＮＰＰ４Ａ、ＩＮＰＰＬ１、ＩＲＦ４、ＩＷＳ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＵＮ、ＫＡＮＳＬ１、ＫＡＴ８、ＫＡＴＮＡＬ１、ＫＢＴＢＤ７、ＫＣＮＭＢ４、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１４６７、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｂ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｅ、ＫＲＡＳ、ＫＲＴ１５、ＬＡＭＴＯＲ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＣＫ、ＬＭＯ２、ＬＰＡＲ２、ＬＹＮ、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ４Ｋ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ６、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ３、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ２３、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＧＡ、ＭＩＴＦ、ＭＫＬＮ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬＴ４、ＭＯＡＰ１、ＭＯＲＣ４、ＭＰＬ、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＨ２、ＭＳＩ１、ＭＴＯＲ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ６、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ６、ＮＡＡ１５、ＮＡＡ２５、ＮＡＰ１Ｌ２、ＮＡＰ１Ｌ４、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＥＫ９、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＦＫＢ２、ＮＩＰＢＬ、ＮＩＴ１、ＮＫＸ３－１、ＮＭＥ４、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＳＤ１、ＮＴＲＫ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＨＦ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＭＬ、ＰＯＬＡ２、ＰＯＴ１、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＰＦ４０Ａ、ＰＳＩＰ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＨ２、ＰＴＭＳ、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＢ１８、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＲＡＰＧＥＦ６、ＲＡＳＡ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ６、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２６、ＲＣ３Ｈ２、ＲＥＬ、ＲＥＲＥ、ＲＥＴ、ＲＦＣ４、ＲＨＥＢ、ＲＨＯＡ、ＲＩＭＳ２、ＲＩＴ１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ４３、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ５、ＲＱＣＤ１、ＲＲＡＳ２、ＲＵＮＸ１、ＲＸＲＡ、ＳＡＲＭ１、ＳＣＡＦ１１、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＥＣ２２Ａ、ＳＥＮＰ３、ＳＥＮＰ８、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＩＮ３Ａ、ＳＫＡＰ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＯ、ＳＮＣＢ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＳ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ９、ＳＰ３、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ２、ＳＳ１８、ＳＴＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３１、ＳＵＦＵ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１Ａ、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＴ２、ＴＥＸ１１、ＴＦＤＰ２、ＴＦＧ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＬＸ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＣＯ２、ＴＭＥＤ１０、ＴＭＥＭ１０７、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＰＯ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＲＣ６Ｂ、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ１、ＴＰＲ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＰ１２、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＴＫ、ＴＴＲ、ＴＵＢＡ３Ｃ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＲ５、ＵＮＣ１３Ｃ、ＵＮＫＬ、ＵＰＰ１、ＵＳＯ１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ６、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、ＶＮ１Ｒ２、ＶＰＳ３３Ｂ、ＷＡＣ、ＷＤＲ３３、ＷＤＲ４７、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＰ１、ＸＰＯ１、ＹＯＤ１、ＺＣ３Ｈ１３、ＺＤＨＨＣ４、ＺＦＨＸ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＧＲＦ１、ＺＭＹＭ３、ＺＭＹＭ４、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ２９２、ＺＮＦ３１８、ＺＮＦ３４５、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ７５０、及び／またはＺＮＦ８００が挙げられる。
本明細書で使用する「ＴＰ５３」とは、遺伝子及び／または遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、このタンパク質とは細胞増殖の調節に関与する腫瘍抑制タンパク質ｐ５３である。ＴＰ５３遺伝子は、がん形成の予防に重要な役割を果たす。ＴＰ５３遺伝子は、ＤＮＡに結合し、遺伝子発現を調節してゲノムの変異を防ぐタンパク質をコードする。ヒトＴＰ５３配列は当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２７６７６１、ＮＭ＿０００５４６、ＮＭ＿００１１２６１１２、ＮＭ＿００１１２６１１３、及びＮＭ＿００１１２６１１４）。当業者は、追加のＴＰ５３配列及びその変異型を同定し得る。
本明細書において用いる場合、「ＰＩＫ３ＣＡ」とは、遺伝子及び／または遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、このタンパク質とはホスホイノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の触媒サブユニット、アイソフォームアルファであり、またｐ１１０アルファとも呼ばれる。ＰＩＫ３ＣＡは発がん性であることが判明しており、様々ながんに関与している。ヒトＰＩＫ３ＣＡ配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６２１８）。当業者は、追加のＰＩＫ３ＣＡ配列及びその変異型を同定し得る。
本明細書において用いる場合、「ＦＧＦＲ３」という用語は、遺伝子及び／またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、４つの異なる遺伝子によってコードされる、構造的に関連するチロシンキナーゼ受容体（ＦＧＦＲ１～４）のファミリーに属する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）である。タンパク質の細胞外部分は線維芽細胞成長因子と相互作用し、最終的に細胞の有糸分裂及び分化に影響を与える下流シグナルの進行するカスケードを設定する。ヒトＦＧＦＲ３配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１４２、ＮＭ＿００１１６３２１３、ＮＭ＿０２２９６５、ＮＭ＿００１３５４８０９、及びＮＭ＿００１３５４８１０）。当業者は、さらなるＦＧＦＲ３配列及びその変異型を同定し得る。
本明細書において用いる場合、「ＫＲＡＳ」という用語は、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスで最初に同定されたがん遺伝子に対応するがん原遺伝子であるＫ－ｒａｓもしくはＫｉ－ｒａｓとして知られる遺伝子、及び／またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、その遺伝子産物は最初ｐ２１ ＧＴＰａｓｅとして発見された。ヒトＫＲＡＳ配列は、当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４９８５及びＮＭ＿０３３３６０）。当業者は、追加のＫＲＡＳ配列及びその変異型を特定し得る。
本明細書で使用する場合、「ＥｒｂＢ２」という用語は、ｖ－ｅｒｂ－ｂ２トリ赤芽球性白血病ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ２、ｃ－ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、またはＨｅｒ２としても知られる、遺伝子及び／またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＥｒｂＢ２は、チロシンキナーゼの表皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。これは、乳癌及び卵巣癌を含むいくつかのがんで増幅及び／または過剰発現される。ヒトＥｒｂＢ２配列は、当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００５８６２、ＮＭ＿００１２８９９３６、ＮＭ＿００１２８９９３７、ＮＭ＿００１２８９９３８、及びＮＭ＿００４４４８）。当業者は、追加のＥｒｂＢ２配列及びその変異型を同定し得る。
本明細書で使用する「ＣＤＫＮ２Ａ」とは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａとして公知の遺伝子及び／またはその遺伝子によりコードされるタンパク質を指し、細胞周期を調節することにより腫瘍抑制因子として作用する。ヒトＣＤＫＮ２Ａ配列は、当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７７、ＮＭ＿００１１９５１３２、ＮＭ＿０５８１９５、ＮＭ＿０５８１９６、及びＮＭ＿０５８１９７）。当業者は、追加のＣＤＫＮ２Ａ配列及びその変異型を同定し得る。
本明細書において用いる場合、「ＭＬＬ」という用語は、リンパ系または混合系統白血病２である、遺伝子及び／またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＭＬＬは、主要な哺乳類ヒストンＨ３リジン４（Ｈ３Ｋ４）モノ－メチルトランスフェラーゼである。ＭＬＬタンパク質は、転写エンハンサーの転写因子を決定する系統と共局在し、細胞分化と胚発生に不可欠である。ＭＬＬはまた、細胞の運命の移行、代謝、及び腫瘍抑制の調節にも重要な役割を果たす。ＭＬＬの変異は、歌舞伎症候群、先天性心疾患、及び様々な形態のがんに関連している。ヒトＭＬＬ配列は、当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３４８２）。当業者は、追加のＭＬＬ配列及びその変異型を特定し得る。
本明細書において用いる場合、「ＨＲＡＳ」という用語は、ハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログである遺伝子及び／またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、ＭＡＰキナーゼ経路を活性化する低分子量Ｇタンパク質である。ＨＲＡＳは、成長因子刺激に応答した細胞分裂の調節に関与している。ＨＲＡＳはがん原遺伝子であることが示されている。変異すると、がん原遺伝子は、正常細胞をがん化させる能力を有する。ヒトＨＲＡＳ配列は、当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１３０４４２、ＮＭ＿００５３４３、ＮＭ＿１７６７９５、及びＮＭ＿００１３１８０５４）。当業者は、追加のＨＲＡＳ配列及びその変異型を特定し得る。
本明細書において用いる場合、「ＭＥＴ」という用語は、遺伝子及び／またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＭＥＴ遺伝子は、チロシンプロテインキナーゼＭｅｔまたは肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）とも呼ばれる、ｃ－Ｍｅｔをコードする。ＭＥＴは、胚発生、器官形成、及び創傷治癒に不可欠な一回通過チロシンキナーゼ受容体である。肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）及びそのスプライシングアイソフォーム（ＮＫ１、ＮＫ２）は、ＭＥＴ受容体の唯一の公知のリガンドである。ＭＥＴは通常上皮由来の細胞によって発現されるが、ＨＧＦ／ＳＦの発現は間葉由来の細胞に限定される。ＨＧＦ／ＳＦがその同族受容体ＭＥＴに結合すると、まだ完全には理解されていないメカニズムを介してその活性化につながる二量体化を誘導する。ヒトＭＥＴ配列は、当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００２４５、ＮＭ＿００１１２７５００、ＮＭ＿００１３２４４０１、及びＮＭ＿００１３２４４０２）。当業者は、追加のＭＥＴ配列及びその変異型を同定し得る。
本明細書において用いる場合、「ＶＨＬ」という用語は、遺伝子及び／またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＶＨＬ遺伝子は、フォン・ヒッペル・リンダウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ）腫瘍抑制遺伝子である。ＶＨＬ遺伝子の生殖細胞変異は、眼、脳、脊髄、腎臓、膵臓、及び副腎腺の様々な悪性及び良性腫瘍の素因となる優性遺伝性遺伝性癌症候群であるフォン・ヒッペル・リンダウ症候群の家族性遺伝の基礎である。ヒトＶＨＬ配列は、当該技術分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５５１、ＮＭ＿１９８１５６、及びＮＭ＿００１３５４７２３）。当業者は、追加のＶＨＬ配列及びその変異型を特定し得る。
遺伝子変異のスコアリング
本開示は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在に少なくとも部分的に基づいて、高感度及び特異性で対象におけるがんの存在を同定する方法を提供する。本明細書では、対象ががんを有するか否か、及び／または対象ががんを有する可能性を判定するための様々な方法が提供される。いくつかの実施形態では、これらの方法は、例えば、スコアリング方法、回帰分析、クラスタリング、主成分分析、最近傍分類子分析（例えば、ｋ－最近傍アルゴリズム）、線形判別分析、ニューラルネットワーク、及び、サポートベクターマシンなどを含む様々なタイプの統計的手法及び方法に関与する。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを使用してスコアを生成してもよい。スコアは、対象ががんに罹患している可能性またはがんに罹患していない可能性を示し得る。いくつかの実施形態では、可能性は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーにおける各変異の変異アレル頻度を、変異アレル頻度の参照分布と比較することにより生成される。本明細書に記載されるように、１つまたは複数のバイオマーカーを含むゲノムセグメントは、プライマーのセットにより増幅され得る。プライマーのセットは、１つまたは複数の重複しないゲノムセグメントを増幅する１つまたは複数のプライマーの対を有してもよい。同じプライマーのセットを使用して、１つまたは複数のウェルで対象から収集した鋳型ＤＮＡを増幅してもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０、または３０ウェル以上）、したがって、増幅プロセスは、複数のウェルで検出可能な変異体（例えば、まれな変異）の重複シグナルを提供し得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ産物は、シークエンシングの前に１回以上の追加の増幅を受けてもよい。いくつかの実施形態では、次に、例えば分子バーコードとして組み込まれる固有識別子配列（ＵＩＤ）に基づいて、共通の鋳型分子からの読み取りをグループ分けしてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、各ＵＩＤファミリーにおける８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える読み取りで変異が存在することを必要とするすることにより、試料調製またはシークエンシングステップ中に導入される人為的変異が減らされ得る。いくつかの実施形態では、同じＵＩＤ及び試料インデックスを有する読み取りを、同じタイル上に位置する場合、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または９０００ピクセル離れた場所にあることを必要とすることによって、光学複製から生じる冗長な読み取りを排除してもよい。
いくつかの実施形態では、以下の２つの基準のうち１つまたは２つを満たす変異は、（ｉ）がんの体細胞変異カタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）（ＣＯＳＭＩＣ）データベースに存在するか、または（ｉｉ）腫瘍抑制遺伝子で不活化すると予測される（ナンセンス変異、フレーム外の挿入または削除、標準的なスプライス部位の変異）、とみなされる。いくつかの実施形態では、エキソン末端の変異を除く同義変異、及びスプライス部位の変異を除くイントロン変異は除外される。これらの選択された変異は、スーパーミュータント（ｓｕｐｅｒｍｕｔａｎｔ）と呼ばれる。したがって、いくつかの実施形態では、スーパーミュータントとしては、例えば、がんの体細胞変異のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）（ＣＯＳＭＩＣ）データベースに存在する変異、腫瘍抑制遺伝子で不活性化すると予測される変異（ナンセンス変異、フレーム外挿入または欠失、標準スプライス部位）、非同義変異、スプライシングに影響し得る変異、及び／または発現に影響をし得る変異などが挙げられる。
したがって、本明細書で使用される場合、試料（例えば、ウェル、試験試料）内の「変異アレル頻度」または「ＭＡＦ」という用語は、そのような変異を有する試料中のＵＩＤの割合を指す。ＭＡＦは、各試料（例えば、各ウェル）内の変異画分を反映し、目的の試料内の変異体アレル頻度の独立したサンプリングを表す。いくつかの実施形態では、試料（ウェルではなく）の変異のＭＡＦは、試料（例えば、対象から収集された試料）の全てのウェルに存在する変異の総数をＵＩＤの総数で割って算出され得る。
いくつかの実施形態では、ＭＡＦ正規化が実行される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのウェルに少なくとも１つのスーパーミュータントを有さない全ての変異は分析から除外される。例えば、変異アレル頻度（ＭＡＦ）は、その試料由来の各ウェルのスーパーミュータントの総数と、その試料の同じウェルのＵＩＤの総数との比率を反映し得る。いくつかの実施形態では、トレーニングセット内の正常な血漿を含む正常な対照のセット内の各突然変異について観察されたＭＡＦに基づいて、ＭＡＦを最初に正規化する。いくつかの実施形態では、１００ＵＩＤ未満の変異は除外される。正規化は、標準正規化（すなわち、平均値を減算し、標準偏差で除算する）またはＭＡＦに所定の比率を乗算することで実行され得る。いくつかの実施形態では、正規化は、正常な対照の中で見出される、各変異ｉ＝１，．．．ｎについて最初に平均ＭＡＦ（ａｖｅ＿ｉ）を計算することにより実行される。これらの平均によって生成された分布の２５パーセンタイルを基準値（ａｖｅ＿ｒｅｆ）として使用して、各ＭＡＦを正規化して、比率ａｖｅ＿ｒｅｆ／ａｖｅ＿ｉを乗算してもよい。例えば、対照のセットで観察された変異の平均ＭＡＦがａｖｅ＿ｒｅｆの１０倍である場合、その変異の各ＭＡＦに１／１０を乗算してもよい。
試料の遺伝子バイオマーカーの状態の分類は、例えば、選択された遺伝子バイオマーカーの１つまたは複数の変異のＭＡＦを、対象試料のグループ内の変異についての変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、選択した遺伝子バイオマーカーの１つまたは複数の変異のアレル頻度を、対照試料中の変異アレル頻度の第１の参照分布、及びがんを有する対象から収集した試料中の変異アレル頻度の第２の参照分布と比較することにより、または選択されたた遺伝子バイオマーカーの１つまたは複数の変異の変異アレル頻度を、対照試料の変異の最大変異アレル頻度と比較することにより、統計的試験から得てもよい。
対照参照分布及び変異の最大変異アレル頻度は、対照試料から決定され得る。いくつかの実施形態では、対照試料のグループは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはそれ以上の対照の対象を有する。いくつかの実施形態では、対照の対象は健常な対象であるか、少なくともがんを有していないか、またはがんを有すると疑われていない。これらの対照対象から収集された対照試料は、増幅及びシークエンシングされ得る。１つまたは複数の選択された遺伝子バイオマーカーの変異が決定され得る。したがって、１人の対象における特定の変異のＭＡＦを決定してもよく、対照試料中のＭＡＦの分布は、対照の対象のグループから決定され得る。同様に、変異の最大変異アレル頻度も、対照試料で決定され得る。
いくつかの実施形態では、選択された遺伝子バイオマーカーにおける１つまたは複数の変異のＭＡＦを参照分布と比較しもよく、それによりスコアが得られて、対象ががんを有する可能性または確率が示される。いくつかの実施形態では、スコア（例えば、可能性または確率）が参照閾値以上である場合、対象ががんを有する可能性が高いと判断され得、そうでなければ、対象ががんである可能性は低いと判断され得る。いくつかの実施形態では、比較は、対象ががんを有していない可能性または確率を示すスコアを提供し得る。いくつかの実施形態では、スコア（例えば、可能性または確率）が参照閾値以下であるならば、対象ががんを有する可能性が高いと判断され得、そうでなければ、対象ががんである可能性が低いと判断され得る。
いくつかの実施形態では、ＭＡＦは最初に、各変異の正常対照のセットにおいて観察されたＭＡＦに基づいて正規化される。この変異特異的正規化に続いて、各ウェルの各変異のＭＡＦは、全ての変異を含む通常の対照から構築されたＭＡＦの参照分布と比較され、この分布からｐ値が計算される。いくつかの実施形態では、所与の試料で検出された全ての変異の中で最も低いｐ値が「トップ変異（ｔｏｐ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」とみなされた。試料のｃｔＤＮＡ状態の分類は、このトップ変異のｐ値が所定の閾値を下回ったか上回ったかに基づいている。この閾値は、独立した正常な対照のセット間で観察される望ましい特異性に基づいて選択され得る。
いくつかの実施形態では、ＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアを使用して、２つ以上の独立した試験からの仮説の試験結果（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ウェルからの試験結果）を組み合わせる。例えば、２つまたは変異のＭＡＦの結果を１つの試験に組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、試料は、ＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアが参照閾値よりも大きい場合に陽性とスコア付けされる。いくつかの実施形態では、対照における最初の数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の最高のＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアの平均に対するＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアの比が、参照閾値よりも大きい場合に、試料は陽性とスコア付けされる。
いくつかの実施形態では、選択された遺伝子バイオマーカーにおける１つまたは複数の変異のＭＡＦは、対照試料における変異の最大変異アレル頻度と比較される。１つまたは複数の変異（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００またはそれと同数）が、対照試料の変異の最大変異アレル頻度よりも大きいＭＡＦを有する場合、対象はがんにかかっていると判断され得る。いくつかの実施形態では、比較からスコアを取得してもよい。いくつかの実施形態では、スコアは、対照試料における変異の最大変異アレル頻度よりも大きいＭＡＦを有する変異の総数である。スコアが参照閾値よりも大きいならば、その対象ががんに罹患している可能性が高いと判断され得る。いくつかの実施形態では、選択された遺伝子バイオマーカーにおける１つまたは複数の変異の平均ＭＡＦが算出される。
いくつかの実施形態では、選択された遺伝子バイオマーカーにおける１つまたは複数の変異のＭＡＦは、対照試料の変異アレル頻度の第１の参照分布、及びがんを有する対象から収集された試料の変異アレル頻度の第２の参照分布と比較され得る。いくつかの実施形態では、目的の試料の変異頻度を、それぞれ、トレーニングセット内の正常及びがん試料の変異頻度の分布と比較することにより、スコアが取得される。
いくつかの実施形態では、各変異のＵＩＤ範囲は１０の間隔に分割される（例えば、＜１，０００、１，０００～２，０００、．．．、８，０００～９，０００、＞９，０００）。ＵＩＤの数に応じて、各ウェルの各変異のＭＡＦは、対応するＵＩＤ範囲の試料から作成されたＭＡＦの２つの参照分布と比較され得る：１）トレーニングセットの全ての通常の対照試料から作成された分布；及び２）トレーニングセットのがん患者の試料から作成された分布。いくつかの実施形態では、がんのトレーニングセットは、同じ変異が試料（例えば、血漿）及び対応する原発腫瘍に存在し、腫瘍内のＭＡＦが５％を超えるもののみを含む。対応するｐ値、ｐＮ及びｐＣが取得され得る。正常試料とがん試料の両方の参照分布は、各ラウンド及び１０倍交差検証の各反復で、トレーニングセットから独立して構築され得、すなわち、各反復の試料の９０％がトレーニングに使用され、試料の１０％は試験に使用される。
各変異について、オメガスコアが取得され得る。次いで、これら２つのｐ値の対数比、ｐＣ／ｐＮが計算され得る。いくつかの実施形態では、結果が外れ値に対して鋭敏にならないように、複製ウェル全体にわたるこれらの対数比の最小値と最大値を排除してもよい。いくつかの実施形態では、対数尤度比を使用する。対数尤度比と比較して、ｐ値の対数比は、利用可能なデータポイントの数が比較的少なく、ＭＡＦ分布の密度のロバストな推定ができないため、いくつかの追加の利点がもたらされ得る（特にｐＣの場合）。したがって、いくつかの実施形態では、「オメガ」スコアは、次の式に従って決定された：
Figure 2023075090000028



式中、ｗｉはウェルｉのＵＩＤの数を、分析に含まれるウェルのその変異についてのＵＩＤの総数で割ったものである。いくつかの実施形態では、分析に含まれるウェルの総数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０、３０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、最大対数比及び最小対数比を有するウェルを分析から除外してもよい。いくつかの実施形態では、分析のために含まれるウェルの総数は１であるため、オメガスコアは代わりに以下の式で取得され得る：
Figure 2023075090000029


ｐ値の対数比は、より多くの鋳型分子を含むウェルが最終統計（オメガスコア）に大きな影響を及ぼすように重み付けすることが可能である。この重み付けの理論的根拠は、ウェル内の鋳型分子の数が多いほど、結果の信頼性が高いことであった。
いくつかの実施形態では、各変異のΩスコアを決定することが可能である。いくつかの実施形態では、参照スコア（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）よりも大きいΩスコアを有する変異が選択される。Ωスコアが参照スコアよりも大きい変異の総数は、対象の変異負荷を反映している。いくつかの実施形態では、参照スコアよりも大きいΩスコアを有する変異の総数が参照閾値よりも大きい場合、対象ががんを有する可能性が高いと判定され、そうでない場合、対象ががんに罹患している可能性が低いと判断することが可能である。
いくつかの実施形態では、Ωスコアが最大の変異は「首位の変異」とみなされる。トップ変異のΩスコアは、対象ががんを有する可能性が高いか否かを判断するために使用され得る。例えば、トップ変異のΩスコアを参照閾値と比較してもよいし、様々な方法（例えば、回帰分析）でいくつかの他の情報（例えば、タンパク質バイオマーカー）と組み合わせて、対象ががんを有する可能性を判断してもよい。いくつかの実施形態では、トップ変異のΩスコアが参照閾値よりも大きい場合、対象ががんを有する可能性が高いと判断され、そうでない場合、対象ががんに罹患している可能性が低いと判断することが可能である。いくつかの実施形態では、Ωスコアは、回帰分析（例えば、ロジスティック回帰）で使用される。
タンパク質バイオマーカーの検出
いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの存在は、限定するものではないが、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、便、腹水、及びそれらの組み合わせを含む、対象（例えば、ヒト対象）から単離または取得された様々な生物試料のいずれかで検出され得る。当該分野で公知の任意のタンパク質バイオマーカーは、それを超えると正常であり、健常なヒト対象が下回らないが、がんを有するヒト対象が下回る閾値が得られたときに検出され得る。
任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、所定の閾値と比較される。いくつかの実施形態では、所定の閾値は一般的または全般的な閾値である。他の場合、所定の閾値は、特定のタンパク質バイオマーカーに関連する閾値である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、参照タンパク質バイオマーカーの絶対量と比較される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、参照タンパク質バイオマーカーの量に対するものである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは上昇したレベルである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、所定の閾値を超える。他の場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、所定の閾値範囲内にある。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、所定の閾値であるか、それに近い。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、所定の閾値未満である。いくつかの実施形態では、生物試料からの１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、特定の閾値よりも低い。いくつかの実施形態では、生物試料由来の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、所定の閾値と比較して低くなっている。
いくつかの実施形態では、さらなる診断試験及び／またはモニタリングの増大のために対象を選択するために本明細書で提供される方法は、生物試料中のタンパク質バイオマーカーを検出すること、及び生物試料中のタンパク質バイオマーカーの量を参照試料中の参照レベルと比較することを含む。いくつかの実施形態では、さらなる診断試験及び／または増大したモニタリングのために対象を選択する方法は、生物試料中のタンパク質バイオマーカーを検出すること、及び生物試料中のタンパク質バイオマーカーの量を参照レベルと比較することを含み、ここで参照レベルは、複数の参照試料から導出された合成数である。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも５％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも１０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも１５％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも２０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも２５％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも３０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも４０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも５０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも６０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも７０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも８０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも９０％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも１００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも２００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも３００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも４００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも５００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも６００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも７００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも８００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも９００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも１０００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約５％～約１０００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約１０％～約１０００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約１５％～約１０００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約２０％～約１０００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約２５％～約１０００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約３０％～約１０００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約１０％～約１００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約１５％～約１００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約２０％～約１００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約２５％～約１００％高い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約３０％～約１００％高い。
いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは参照レベルよりも少なくとも５％低い。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは参照レベルより少なくとも１０％低い。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは参照レベルよりも少なくとも１５％低い。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは参照レベルよりも少なくとも２０％低い。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは参照レベルよりも少なくとも２５％低い。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは参照レベルよりも少なくとも３０％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも４０％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも５０％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも６０％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも７０％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも８０％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも少なくとも９０％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約５％～約１００％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約１０％～約１００％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約１５％～約１００％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約２０％～約１００％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約２５％～約１００％低い。いくつかの実施形態では、生物試料中のタンパク質バイオマーカーは、参照レベルよりも約３０％～約１００％低い。
いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、サイトカインバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、ケモカインバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、成長因子バイオマーカーである。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは炎症に関連している。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーはがんに関連している。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは特定の種類のがんに関連している。本明細書に記載されるように、任意の適切ながんを特定及び／または治療してもよい。いくつかの実施形態では、がんは一般的ながんである。いくつかの実施形態では、がんは、血液ベースの検査が利用可能でないがんである。いくつかの実施形態では、がんは、早期発見のための試験が利用可能でないがんである。いくつかの実施形態では、がんはステージＩのがんである。いくつかの実施形態では、がんはステージＩＩのがんである。いくつかの実施形態では、がんはステージＩＩＩのがんである。いくつかの実施形態では、がんはステージＩＶのがんである。いくつかの実施形態では、がんは外科的に切除可能ながんである。いくつかの実施形態では、がんは外科的に切除不可能ながんである。本明細書に記載されるように同定される（例えば、１つまたは複数の第１バイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無、及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベルが高い、及び／または異数性の存在に、少なくとも部分的に基づいて同定される）がんの例としては、限定するものではないが、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、及び前立腺癌が挙げられる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは独立して検出され得る（例えば、一重鎖ペプチドツールを介して）。タンパク質レベルを検出する方法の例としては、限定するものではないが、分光分析法（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ））、抗体依存法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、及びタンパク質免疫染色）、及びアプタマー依存法が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルは、実施例に記載されるように検出され得る。
複数のペプチドバイオマーカーを分析するために、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングなどの多くのシングルプレックスペプチドツールを順次または同時に使用してもよい。マルチプレックスペプチドツールには、シングルプレックスペプチドツールまたはシングルプレックスペプチドツールの要素の組み合わせが含まれ得る。追加的にまたは代替的に、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルの検出は、「チップ」、マイクロアレイ、またはイムノアッセイシステムなどのマルチプレックスペプチドツールを介して行ってもよい。１つの非限定的な例では、複数の分析物を、マイクロアレイ上にスポットされた複数の捕捉抗体によって探索し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体／化学発光システムを介して分析してもよい。この方法では、各スポットが特定の標的タンパク質を捕捉し、定量化のために２番目の標的特異的な検出抗体を使用する。膜抗体アレイに加えて、ガラススライドを定量抗体アレイに使用してもよい。多重化ＥＬＩＳＡの商業的実施形態としては、限定するものではないが、Ｑｕａｎｓｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＱ－Ｐｌｅｘ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＭｏｓａｉｃ（商標）、Ａｕｓｈｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＣｉｒａｐｌｅｘ（登録商標）、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから入手可能なＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ、Ｗｈａｔｍａｎ Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅから入手可能なＦＡＳＴ Ｑｕａｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから入手可能なＡ２、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈから入手可能なＱｕａｎｔｉｂｏｄｙ（登録商標）が挙げられる。これに加えてまたはこれに代えて、マルチプレックスアッセイは、ビーズまたは粒子を利用して、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを同時に検出することが可能である。非限定的な例では、ポリスチレンまたは常磁性ビーズに異なる波長の色素を含浸させ、複数の標的抗体を同時に検出するために使用し、ここで各色素または色素の組み合わせは異なる標的抗体に対応する。サンドイッチアッセイを、タンパク質レベルの測定に使用する。この技術の商業的実施形態は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）及びＦｉｒｅＰｌｅｘ（登録商標）テクノロジープラットフォーム、例えばＢｉｏ－Ｒａｄから入手可能なＢｉｏ－Ｐｌｅｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＩｍＭｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＰｒｏｃａｒｔａｌＰｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙｓを利用する。
いくつかの実施形態では、アッセイは、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の変異）及び／または異数性及び／または追加のクラスのバイオマーカーの検出のない生物試料（例えば、限定するものではないが、血液または血漿などの本明細書に記載の任意の生物試料）における閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の変異）及び／または異数性及び／または追加のクラスのバイオマーカーの検出を伴う生物試料（例えば、限定するものではないが、血液または血漿などの本明細書に記載の任意の生物試料）における閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を含む。例えば、アッセイは、生物試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含み得る。いくつかの実施形態では、アッセイは、本明細書に開示されている任意の閾値レベルで生物試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含み得る。別の例として、アッセイは、生物試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含み得る。いくつかの実施形態では、アッセイは、本明細書に開示される任意の閾値レベルでの生物試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含んでもよい。別の例として、アッセイは、生物試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３の１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含み得る。いくつかの実施形態では、アッセイは、本明細書に開示される任意の閾値レベルでの生物試料中のＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３の１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含み得る。別の例として、アッセイは、生物試料中のＫＲＡＳ（例えば、コドン１２及び６１）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含み得る。いくつかの実施形態では、アッセイは、本明細書に開示される任意の閾値レベルでの生物試料中のＫＲＡＳ（例えば、コドン１２及び６１）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４の１つまたは複数（例えば、それぞれ）の検出を含み得る。いくつかの実施形態では、生物試料中の閾値タンパク質バイオマーカーの検出を含むアッセイが一旦実施されれば、その後の試験またはモニタリングが実施される（例えば、本明細書に開示される任意の様々なさらなる診断試験またはモニタリング技術の増大）。いくつかの実施形態では、生物試料中の閾値タンパク質バイオマーカーの検出を含むアッセイが一旦、実施されれば、無細胞ＤＮＡに存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在（例えば、ｃｔＤＮＡ、例えば、本明細書に記載のような無細胞ＤＮＡまたはｃｔＤＮＡに存在する任意の様々な遺伝子変異）、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在（例えば、本明細書に記載の任意の様々なタンパク質バイオマーカー）、異数性の存在、及び／またはバイオマーカーの１つまたは複数の追加クラスの存在を検出することを含む第２のアッセイが実行され得る。
本明細書に記載の任意の様々な技術を使用して検出され得るタンパク質バイオマーカーの例としては、限定するものではないが、アクチンガンマ（ＡＣＴＧ１）、ＡＦＰ、アルファ－２－ＨＳグリコールタンパク質、アンジオポエチン－２、アポリポタンパク質１、ＡＸＬ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、カテニン（Ｃａｔｅｎｉｎ）、カベオリン（Ｃａｖｅｏｌｉｎ）－１、ＣＤ４４、クラスＢメンバー１（ＨＳＰ９０ＡＢ１）、補体ｃ３ａ、サイクリンＤ、ＣＹＦＲＡ ２１－１、ディフェンシン（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）α６、ＤＫＫ１、ＥＡＦＰ、エンドグリン（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、真核生物翻訳伸長因子１ガンマ（ＥＥＦ１Ｇ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）、ＦＧＦ２、フォリスタチン、ガレクチン－３、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＦ１５、グルコース調節タンパク質－８、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ＨＥ４、熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（サイトゾル）、重ポリペプチド１（ＦＴＨ１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＩＬ－６、ＩＬ－８、カリクレイン６（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ６）、ラミンＡ（Ｌａｍｉｎ Ａ）／Ｃフィラメントタンパク質、ラージサブユニット、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、軽ポリペプチド（ＦＴＬ）、ＬＲＧ－１、メソセリン、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、ＭＭＰ類、筋肉（ＰＫＭ２）、ミエロペルオキシダーゼ、ＮＳＥ、ＯＰＧ、オステオポンチン（ＯＰＮ）、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）、ＰＡＲ、プロラクチン、ピルビン酸キナーゼ、リボソーム（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ）タンパク質、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、リボソームタンパク質ラージサブユニットＰ０（ＲＰＬＰ０）、Ｓ１００ Ｐ、ｓＥＧＦＲ、血清Ｃペプチド、ｓＦａｓ、ＳＨＢＧ、ｓＨＥＲ２／ｓＥＧＦＲ２／ｓＥｒｂＢ２、ｓＰＥＣＡＭ－１、ＴＧＦａ、チオレドキシン様タンパク質２、トロンボスポンジン－２、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、トランスフェリン、翻訳伸長因子（ＥＥＦ１Ａ１）、Ｔｘｌ－２（チオレドキシン様タンパク質－２）、ビトロネクチン、αデフェンシング－１、－２、－３、及び／またはα－１アンチトリプシンが挙げられる。様々な種類のがんで検出された例示的なタンパク質バイオマーカーを、実施例２に示す。
異数性の検出
異数性とは、細胞内に異常な数の染色体が存在することである。異数性は通常、染色体が２つの細胞間で適切に分離しない場合、細胞分裂中に発生する。異数性は、弱った減数分裂チェックポイントの結果として発生する。これらのチェックポイントは、細胞の全ての成分が次の段階に入る準備ができるまで、細胞分裂を停止または遅延させる傾向があるからである。チェックポイントが弱くなると、細胞は有糸分裂プレートに染色体対が並んでいないことを認識しない場合がある。このような場合、ほとんどの染色体は、正常に分離する（各細胞に１つの染色分体が含まれる）が、他の染色体はまったく分離できない可能性がある。これにより、コピーのない娘細胞と余分なコピーのある娘細胞が生成されることとなる。異数性は、多くのがんで一貫して観察されている。
異数性は、細胞の試料を固定して染色し、典型的な明及び暗の染色体バンディングパターンを作成し、染色体の写真を分析するプロセスである、核型分析によって検出され得る。異数性を検出するためのその他の非限定的な技術としては、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、短タンデムリピートの定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ－ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ用量分析、一塩基多型の定量的質量分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、マイクロアレイ、サンガーシークエンシング、及び超並列シークエンシング法などが挙げられる。
本開示は、異数性を検出する方法を提供する。例えば、本開示は、シークエンシングデータを評価して、１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患（例えば、がん）を有する哺乳動物を同定するための方法及び物質を提供する。試料内異数性検出（Ｗｉｔｈｉｎ－Ｓａｍｐｌｅ ＡｎｅｕｐＬｏｉｄｙ ＤｅｔｅｃｔｉＯｎ）（ＷＡＬＤＯ）法を使用して、シークエンシングデータを処理して、重要な単一染色体アームの増加または損失、及び染色体アームのアレルの不均衡を同定し得る。ＷＡＬＤＯには、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）が組み込まれており、異数体試料と正倍数体試料との間を識別する。ＳＶＭは、異数体試料（例えば、合成異数体試料）及び正倍数体試料（例えば、末梢白血球（ＷＢＣ））を使用して訓練され得る。ＳＶＭ識別スコアが所定の閾値を超えた場合、試料は陽性（異数性）と評価され得る。いくつかの実施形態では、単一のプライマーの対を使用して、ゲノム全体にわたって約３８，０００遺伝子座の長散在ヌクレオチド要素（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（ＬＩＮＥ）を増幅する。その後、超並列シークエンシングが実行される。いくつかの実施形態では、プライマーの１つは、ＰＣＲ及びシークエンシングに関連するエラー率を低減するために使用され得る分子バーコードとしてＵＩＤを含む。
ＷＡＬＤＯの概要
正倍数体試料では、各５００ｋｂゲノム間隔内のＬＩＮＥリードの数は、ある特定の他のゲノム領域のリード数で追跡されるはずである。一緒に追跡されるゲノム間隔は、それらの間のアンプリコンが同様の程度に増幅するので、そうなる。ここでは、一緒に追跡されるこれらのゲノム領域を「クラスター」と呼ぶ。クラスターは、正倍数体試料のシークエンシングデータ由来であり得る。試験試料では、各定義済みクラスターの各ゲノム間隔の読み取り数が、同じ試料の他のクラスターの予想範囲内にあるか否かが判断される。ゲノム間隔内の読み取りが統計的に予想される範囲を超えており、同じ染色体アームにそのような範囲外のものが多くあるならば、その染色体アームは異数性として分類される。
手短に言えば、各ＬＩＮＥでの読み取り数は、ゲノム全体にランダムに分布しているわけではないが、各クラスター内のスケーリングされた読み取りの分布はほぼ正規である。正規分布の便利な特性は、複数の正規分布の合計も正規分布であるということである。各染色体アームの合計読み取りの理論上の平均及び分散は、その染色体アームで表される全てのクラスターの平均及び分散を合計するだけで計算され得る。
ＷＡＬＤＯは、それを臨床試料からＰＣＲで生成されたアンプリコンの分析に適用することを可能にするいくつかの方法を採用している。これらの方法の１つは、初期鋳型のサイズに対するデータの強い依存性に起因する増幅バイアスを制御することである。もう１つは、サポートベクターマシン（Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ）（ＳＶＭ）を使用して、低新生物画分を含む試料の異数性を検出できるようにすることである。
図３６に示すように、単一のプライマー対を使用してＬＩＮＥを増幅する。次に、試験試料を、同様のサイズのゲノムＤＮＡを有するいくつかの正倍数体試料と照合する。ゲノムは複数の間隔に分割され、各間隔は同様のサイズ（例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００Ｋｂ、または１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、または５Ｍｂ）を有する。倍数体試料のこれらのゲノム間隔内の読み取りは、クラスターに分類される。クラスター内の全てのゲノム間隔は、同様の読み取り深度を有する。試験試料の各ゲノム間隔からの読み取りは、事前定義されたクラスターにグループ分けされる。統計試験、例えばＳＶＭベースのアルゴリズムを使用して、試料が正倍数体である場合、各染色体アームの全てのゲノム間隔からの総読み取りが予想どおりに分布しているか否かを判断する。統計試験は、正倍数試料の読み取りと比較するのではなく、試験試料のクラスター内の読み取りの観察分布に基づいている。ＬＩＮＥ内の既知の一般的な多型の部位にある生殖系列配列変異型は、個々の染色体アームの異数性の評価にも使用され得るアームレベルのアレルの不均衡に関する情報を提供する。これらの同じ多型を使用して、２つの試料が同じ個人に由来するか否かを判断することができる。利用可能な同じ個人からの一致した正常試料がある場合、本明細書に記載の方法は、ＬＩＮＥ内の単一塩基置換及び挿入及び欠失の数及び性質を検出し得る。
Ｆａｓｔ－ＳｅｑＳ
評価した各ＤＮＡ試料について、ＦＡＳＴ－ＳｅｑＳを使用して、単一のプライマー対で約３８，０００個のアンプリコンを増幅し得る（Ｋｉｎｄｅ Ｉ、Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ、Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ、＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（２０１２）ＦＡＳＴ－ＳｅｑＳ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ＰｌｏＳ ＯＮＥ ７（７）：ｅ４１１６２）。超並列シークエンシングが実行され得る。いくつかの実施形態では、プライマーの５’末端の縮重塩基が、各ＤＮＡ鋳型分子を一意に標識する分子バーコードとして使用される。したがって、各ＤＮＡ鋳型分子は、１回だけカウントされる。いくつかの実施形態では、各一意の読み取りは、１～２０回の間でシークエンシングされ得る（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回）。
試料のアライメント及びゲノム間隔の分類
アラインメントプログラム（例えば、Ｂｏｗｔｉｅ２）を使用して、読み取りをヒト参照ゲノムアセンブリ（例えば、ＧＲＣ３７）に整列させることができる。参照ゲノムと完全に一致するものが同定され得る。これらの完全一致により、一般的な多型を含めることが可能になる。実験的及び確率的変動に照らして、任意の正倍数体試料の各ゲノム領域にマッピングされた読み取りの数は変動すると予想される。いくつかの実施形態では、この変動性を最小限に抑えるために、複数の正倍数性試料中の全ての染色体にわたって同様の読み取り深度を有するゲノム間隔のクラスターが同定される。このステップでは、異数性が存在しない場合の試料の読み取り深度の予想される変動を推定し得る。いくつかの実施形態では、ゲノム間隔は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００Ｋｂ、または１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、もしくは５Ｍｂのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ゲノム間隔は５００ｋｂのサイズを有する。
ゲノム間隔のクラスタリングは、次のように実行され得る。各試験試料を、同様のアンプリコンサイズを有する正倍数体試料と照合させる。増幅前に小さなサイズのＤＮＡから生成されたアンプリコンでは、より小さなアンプリコンが過剰に表現される可能性があるため、これは重要である。正倍数体の試料は、正常な個体由来のＷＢＣまたは血漿ＤＮＡから誘導され得、総称して「正倍数体参照セット（ｅｕｐｌｏｉｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｔ）」と呼ばれる。正倍数体試料には、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００の試料を含み得る。いくつかの実施形態では、倍数体試料は、５、６、７、８、９、または１０個を超える試料を含まない。
各試験試料ｐについて、試料は、以下として定義される、ｐへのユークリッド距離が最小であり
Figure 2023075090000030



式中、ｐｎ及びｑｎは、試料ｐ及びｑのサイズｎのアンプリコンの割合であり、合計は２つの試料において全てのアンプリコンサイズを超えている。いくつかの実施形態では、正倍数体参照セットの試料由来の試験試料間のユークリッド距離を計算する前に、以下のアンプリコンを除外する：（ｉ）最大尤度推定を使用して、アンプリコンは、正倍数体試料の中の分散によってランク付けして、上位１％を除外する。（ｉｉ）１つの試料で１０未満の読み取りがあるが、他の試料で５０を超える読み取りがある任意のアンプリコンは除外する。各試料では、平均値を差し引き、各試料の読み取り値の標準偏差で割ることにより、ゲノム間隔をスケーリングする。
スケーリングされたゲノム間隔を、次いで、選択された正常な試料全体でクラスター化する。最初に、各ゲノム間隔ｉが、プライマリクラスターＣｉに割り当てられる。次に、全ての試料にわたるゲノム間隔ｉでの読み取りを、残りの常染色体上で発生した他の全てのゲノム間隔ｉ’での試料での読み取りの平均数と比較する。ゲノム間隔ｉ’の読み取りの平均数が、ゲノム間隔ｉの読み取りの数と有意に変わらない場合、これをクラスターＣｉに追加する。このプロセスは、各ゲノム間隔で繰り返され、複数のクラスター（例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００を超えるクラスター）が生成される。各間隔ｉは、いずれもそのプライマリクラスターに属するが、同じ間隔はいくつかの他のクラスターに属し得る場合もある。いくつかの実施形態では、約４３００個のクラスターが存在する。
いくつかの実施形態では、スケーリングされた読み取りはランダムに分布するものではない。いくつかの実施形態では、各クラスターのゲノム間隔内のスケーリングされた読み取りの分布は、ほぼ正規の分布に従う。
試験試料で染色体アームの増加または損失を同定する
本明細書に記載の方法は、ほんの少数の正倍数試料（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０試料）を使用して、同様の増幅特性を有するゲノム間隔のクラスターを定義し得る。異数性の統計的検定は、試験試料内の読み取り分布に基づいており、いかなる正倍数性試料の読み取り分布からも独立している。いくつかの実施形態では、最大尤度を使用して、各クラスター内のゲノム間隔の平均μ及び分散δ２を推定する。いくつかの実施形態では、これらの推定値の堅牢性は、試験試料内の外れたゲノム間隔をクラスターから繰り返し除去することにより改善し得る。いくつかの実施形態では、１０未満のゲノム間隔を含むクラスターは分析に含まれない。いくつかの実施形態では、各クラスターについて、以下の基準を満たす、いかなるゲノム間隔
Figure 2023075090000031



も、全てのクラスターから除去される。次に、各クラスターのμ及び分散δ２パラメーターが最大尤度法によって再推定される。範囲外ゲノム間隔がなくなるまで、２つのステップを繰り返す。アーム上の全てのゲノム間隔からの総読み取りの統計的有意性が推定される。正規分布ランダム変数の合計も正規分布ランダム変数であるため、計算は簡単である。各染色体アームについて、
計算することが可能であり得
Figure 2023075090000032



式中、Ｒｉはスケーリングされた読み取りであり、ｉはアーム上のクラスターの数である。変位値関数を使用してＺスコアを生成し得る
Figure 2023075090000033



正のＺスコア＞αは増加を表し、負のＺスコア＜－αは損失を表す。α値は、選択された有意閾値である。
アームレベルのアレルの不均衡
１０００個のゲノムからの一般的な多型（例えば、２４，７２０個の単一ヌクレオチドと１，５００個のインデル、ＭＡＦ＞１％を含む）う、候補ヘテロ接合部位として使用することができる。正常な試料のそれぞれについて、多型部位は確信をもってヘテロ接合及び二倍体と呼ぶことができる。多形性は、変異型アレル頻度（ＶＡＦ）（０．４＜ＶＡＦ＜０．６）を有するものとして定義され得、ここで、ＶＡＦ＝＃非参照読み取り／総読み取りである。ＶＡＦは、これらの部位で、μ＝０．５の正規分布から取得したランダム変数としてモデル化され得、分散δ２は、読み取りの深さの関数として最大尤度法によって推定され得る。
試験試料の染色体アーム上のアレルが不均衡であるか否かを判断するために、両方のアレルが存在し、両方のアレルの読み取りの合計が２５を超える多型部位のサブセットが同定される。
観察された読み取り深度の予想される分散を使用して、正規分布の観察されたＶＡＦは、両側のＰ値を生じる。染色体アーム上の全てのｐ値をＺ変換し、加重Ｓｔｏｕｆｆｅｒの方法と組み合わせて、各部位で、観察された読み取り深度をその重みとして使用してもよい。この計算に使用される式は以下
Figure 2023075090000034



であり、式中、ｗｉは変異型ｉのＵＩＤ深度であり、Ｚｉは変異型ｉのＺスコアであり、ｋは染色体アームで観察される変異型の数である。染色体アームは、結果のＺスコアが選択された統計的有意性閾値αよりも大きい場合（例えば、片側検定により）、アレルの不均衡があるとスコア付けされる（例えば、片側検定により）。
合成異数体試料の生成
合成異数体試料は、いくつかの染色体アームからの読み取りをこれらの正常なＤＮＡ試料からの読み取りに加える（またはそれから取り去る）ことで作成され得る。１、５、１０、１５、２０、または２５のランダムに選択された染色体アームからの読み取りを各試料に加えるまたはそれから取り去る。加えることと取り去ることは、０．５％～１０％の範囲の腫瘍細胞画分を表すように設計されており、正確に９００万回の読み取りを含む合成試料が得られる。各染色体アームからの読み取りを、均一に加えるまたは取り去ることができる。単一の染色体アームからの読み取りのみが加えられるまたは取り去られるこれらの合成的に生成された試料を使用して、ＷＡＬＤＯの性能が推定され得る。
ゲノム全体にわたる異数性検出
本開示は、ゲノム全体にわたるの異数性検出を提供する。いくつかの実施形態では、２クラスのサポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ）（ＳＶＭ）を訓練して、倍数体試料と合成試料とを識別し得る。訓練セットには、白血球（ＷＢＣ）試料と異数性のある試料（例えば、全ての合成試料）を含んでもよい。
ＳＶＭ訓練は、様々な統計ソフトウェアによって実行され得る（例えば、Ｒでは、動径基底カーネル及びデフォルトパラメーターを使用）。
実験試料のデータからの読み取り数は、特に試料が血漿などのＤＮＡの量が限られている供給源に由来する場合、大きく異なる場合がある。いくつかの実施形態では、読み取り深度が考慮されない場合、読み取りが低い試料は、不自然に高いＳＶＭスコアを生成し得る。したがって、ＳＶＭスコアの変化を通常の試料の読み取り深度の関数としてモデル化することにより、読み取り深度を制御し得る。各深さでの平均比ｒは、読み取り深さの増大の関数として単調に減少した。読み取り深度とＳＶＭスコアとの間の関係は、次の式を使用してモデル化され得る。したがって、生のＳＶＭスコアは、式ｒを使用して比率ｒで除算することにより修正され得る。
Figure 2023075090000035


。
異数性として試料をスコア付けするために、その中の任意の単一の染色体アームが統計的に有意な方法で失われるか得られるか否かを決定する。単一の染色体アームの統計的に有意な増加は、そのＺスコアが通常の試料で観察される最大Ｚスコアを超えるものとして定義される（例えば、１σ、２σ、３σ、４σ、または５σ超）。同様に、単一染色体アームの統計的に有意な損失は、そのＺスコアが正常な試料で観察される最小Ｚスコアを下回るものとして定義される（例えば、１σ、２σ、３σ、４σ、または５σ未満）。ＳＮＰに基づくアレルの不均衡は、そのＺスコアが正常な試料で観察される最大Ｚスコアを超える（例えば、１σ、２σ、３σ、４σ、または５σ）染色体アームに対して定義され得る。この方法で定義された場合、単一の染色体アームが増加または損失しない試料のみを、ＳＶＭ分析に供する。このプロセスの理論的根拠は、ＳＶＭは多数の染色体アームの増加または損失を有する試料を同定するように設計されているが、腫瘍細胞の割合が比較的低いことである。いくつかの実施形態では、ＳＶＭは、腫瘍細胞画分が１０％を超える試料中の異数性を検出するように設計されておらず、それはＺスコアの評価及び正常試料との比較により容易に同定される。
体細胞配列変異及びマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）
本開示はまた、体細胞配列変異及びマイクロサテライト不安定性を検出する方法も提供する。マッチした正常試料が利用可能な場合、体細胞単一塩基置換（ＳＢＳ）、挿入及び欠失（インデル）変異が、ＬＩＮＥアンプリコン配列及びアライメントに基づいて検出され得る。いくつかの実施形態では、エラー低減のための分子バーコード化アプローチが使用される。いくつかの実施形態では、ＳＢＳ変異は、試験試料由来のアンプリコンを、マッチした正常由来のアンプリコンと直接比較することにより同定することが可能で、参照ゲノムへのアラインメントを必要としない。
インデルも同様の方法で呼び出され得る。アンプリコンは、試験試料からアラインされ、正常試料を参照ゲノム（ＧＲｃ３７）と照合させる。いくつかの実施形態では、体細胞インデルとは、同じ挿入または欠失により、任意の正常な読み取りとは異なる試験試料からの少なくとも１０回の読み取りであり得る。
試験試料中のマイクロサテライト不安定性は、３ヌクレオチドを超えるモノヌクレオチド領域の体細胞インデルの数を数えることにより決定され得る。モノトラクトの体細胞インデルは、正常な試料ではまれであり得る。したがって、カウントのヌル分布は、ポアソン（λ＝１）としてモデル化され得、ここで、λは、正常な試料のモノトラクトの体細胞インデルの平均数である。体細胞インデルの数が統計的に有意な場合、試料はＭＳＩを含むと判断される。このプロセスを使用してＭＳＩとして、正常な試料をスコア付けし得る頻度を評価するには、正常な試料の総読み取りをランダムに２つの等しい区分に分割することができる。最初の区分は参照試料として使用され得、２番目の区分は試験試料として使用され得る。
本文書は、試料中の１つまたは複数の染色体異常（例えば、異数性）を同定するための方法及び物質を提供する。例えば、哺乳動物（例えば、哺乳動物から得られた試料）は、１つまたは複数の染色体異常の有無について評価され得る。場合によっては、本文書は、アンプリコンベースのシークエンシングデータを使用して、１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患（例えば、がん）を有する哺乳動物を同定する方法及び物質を提供する。例えば、本明細書に記載の方法及び物質は、哺乳動物から得られた試料に適用して、その哺乳動物が１つまたは複数の染色体異常を有すると同定し得る。例えば、本明細書に記載の方法及び物質を、哺乳動物から得られた試料に適用して、哺乳動物が１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患（例えば、がん）を有すると同定することが可能である。本文書はまた、１つまたは複数の染色体異常（例えば、本明細書に記載のように同定された１つまたは複数の染色体異常）に関連する疾患または障害を同定及び／または治療する方法及び物質を提供する。場合によっては、１つまたは複数の染色体異常は、哺乳動物から得られた試料から得られたＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）で同定され得る。例えば、出生前の哺乳動物（例えば出生前のヒト）は、少なくとも部分的には１つまたは複数の染色体異常の存在に基づいて疾患または障害を有すると同定され得、必要に応じて、疾患または障害について、１つまたは複数の治療で治療され得る。例えば、１つまたは複数の染色体異常の存在に少なくとも部分的に基づいて、がんを有すると同定された哺乳動物は、１つまたは複数のがん治療で治療され得る。
任意の適切な哺乳動物を、本明細書に記載されるように評価及び／または治療することができる。哺乳動物は、出生前の哺乳動物（例えば、出生前のヒト）であってもよい。哺乳動物は、１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患（例えば、がん）を有する疑いのある哺乳動物であってもよい。いくつかの場合、ヒトまたはサルなどの他の霊長類を、本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常の存在について評価することができる。場合によっては、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、及びラットを、本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常の存在について評価してもよい。例えば、ヒトは、本明細書に記載される１つまたは複数の染色体異常の存在について評価することができ、必要に応じて、本明細書に記載される１つまたは複数のがん治療で治療され得る。
本明細書に記載のように、哺乳動物由来の任意の適切な試料を評価してもよい（例えば、１つまたは複数の染色体異常の存在について評価する）。試料にはゲノムＤＮＡを含んでもよい。場合によっては、試料には無細胞循環ＤＮＡ（例えば、無細胞循環胎児ＤＮＡ）が含まれ得る。場合によっては、試料には循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が含まれ得る。ＤＮＡを含み得る試料の例としては、限定するものではないが、血液（例えば、全血、血清、または血漿）、羊膜、組織、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、パップスメア、脳脊髄液、子宮頸部、子宮内膜、及び卵管の試料が挙げられる。例えば、試料は血漿試料であってもよい。例えば、試料は尿試料であってもよい。例えば、試料は唾液試料であってもよい。例えば、試料は嚢胞液試料であってもよい。例えば、試料は喀痰試料であってもよい。場合によっては、試料には腫瘍性細胞画分（例えば、低腫瘍性細胞画分）を含んでもよい。試料に低腫瘍性細胞画分が含まれる場合、新生物細胞画分は、試料全体の細胞含有量の約０．０１％～約１０％（例えば、約０．０５％～約１０％、約０．５％～約１０％、約１％～約１０％、約３％～約１０％、約５％～約１０％、約７％～約１０％、約０．０１％～約８％、約０．０１％～約５％、約０．０１％～約２％、約０．０１％～約１％、約０．０１％～約０．５％、約０．０５％～約８％、約０．１％～約４％、または約０．５％～約１％）であってもよい。例えば、低腫瘍性細胞画分を含む試料は、約１％の腫瘍性細胞であり得る。例えば、低い新生細胞画分を含む試料は、約０．５％の新生細胞であり得る。
場合によっては、試料を処理して、その試料からＤＮＡを分離及び／または精製してもよい。場合によっては、ＤＮＡの単離及び／または精製には細胞溶解が含まれ得る（例えば、界面活性剤及び／または界面活性物質の使用）。場合によっては、ＤＮＡの単離及び／または精製には、タンパク質の除去が含まれ得る（例えば、プロテアーゼの使用）。場合によっては、ＤＮＡの単離及び／または精製には、ＲＮＡの除去が含まれる場合がある（例えば、ＲＮａｓｅの使用）。
１つまたは複数の染色体異常を同定するための方法及び物質には、１つまたは複数の染色体異常（例えば異数性）の有無についてゲノム（例えば、哺乳動物のゲノム）を評価することが含まれ得る。哺乳動物のゲノムにおける１つまたは複数の染色体異常の有無は、例えば、その哺乳動物から得られた試料から得られた複数のアンプリコンをシークエンシングしてシークエンシング読み取りを取得すること、及びこのシークエンシング読み取りをゲノム間隔のクラスターに分類することによって、決定され得る。場合によっては、ゲノム間隔の読み取りカウントを、同じ試料内の他のゲノム間隔の読み取りカウントと比較してもよい。ゲノム間隔の読み取り間隔が、同じ試料内の他のゲノム間隔の読み取りカウントと比較される場合には、２番目（例えば、対照または参照）の試料は分析されない。例えば、本明細書に記載の方法及び物質を使用して、数値的障害（例えば、異数性）及び／または構造異常を同定する場合、ゲノム間隔を、同じ試料内の他のゲノム間隔の読み取りカウントと比較してもよい。場合によっては、ゲノム間隔の読み取りカウントを、別の試料のゲノム間隔の読み取りカウントと比較してもよい。例えば、本明細書で説明する方法と資料を使用して、遺伝的関連性、多型（例、体細胞変異）、及び／またはマイクロサテライトの不安定性を同定する場合、ゲノム間隔を参照試料のゲノム間隔の読み取りカウントと比較することが可能である。参照試料は合成試料であってもよい。参照試料は、データベース由来であってもよい。本明細書に記載の方法及び物質を使用して遺伝的関連性を同定する場合、参照試料は法医学的試料であり得る。本明細書に記載の方法及び物質を使用して遺伝的関連性を同定する場合には、疑われる関係から参照試料を取得してもよい。本明細書に記載の方法及び物質を使用して、異常（例えば、異数性）、１つまたは複数の多型（例えば、体細胞変異）、及び／またはマイクロサテライト不安定性を同定する場合、参照試料は、同じがん患者（例えば、がん細胞を保持していないがん患者の試料）から得られる正常試料であっても、または別の供給源（例えば、がんのない患者）由来の正常試料であってもよい。
場合によっては、哺乳動物のゲノムの異数性を検出するために、本明細書に記載の方法及び物質を使用することができる。例えば、哺乳動物から得られた試料から得られた複数のアンプリコンを、シークエンシングしてもよく、このシークエンシング読み取りを、ゲノム間隔のクラスターにグループ分けし、各ゲノム間隔でのシークエンシング読み取りの分布の合計を計算してもよく、染色体アームのスコアを計算してもよく、哺乳動物のゲノムにおける異数性の有無を同定してもよい。各ゲノム間隔でのシークエンシング読み取りの分布を合計してもよい。例えば、各ゲノム間隔でのシークエンシング読み取りの分布の合計は、次の式を使用して算出され得
Figure 2023075090000036


、
式中、Ｒｉはシークエンシング読み取りの数であり、Ｉは染色体アーム上のクラスターの数であり、Ｎは、パラメーターμｉ及びσｉ ２をもつガウス分布であり、μｉは各ゲノム間隔のシークエンシング読み取りの平均数であり、及びσｉ ２は、各ゲノム間隔でのシークエンシング読み取りの分散である。染色体アームのＺスコアは、任意の適切な技術を使用して計算され得る。例えば、染色体アームのＺスコアは、分位数関数
Figure 2023075090000037



を使用して計算され得る。Ｚスコアが所定の有意閾値を超えている場合、哺乳動物のゲノムにおける異数性の存在が哺乳動物のゲノムにおいて同定され得、Ｚスコアが所定の有意性閾値内にある場合、哺乳動物のゲノムにおける異数性の非存在が哺乳動物のゲノムにおいて同定され得る。所定の閾値は、試験の信頼度及び許容できる誤検知数に対応し得る。例えば、有意性の閾値は、±１．９６、±３、または±５であり得る。
場合によっては、本明細書に記載の方法及び物質を使用して、哺乳動物のゲノム中の１つまたは複数の多型を検出し得る。例えば、第１の哺乳動物（例えば、試験哺乳動物または１つ以上の多型を有すると疑われる哺乳動物）から得られた試料から得られた複数のアンプリコンを、シークエンシングすることが可能であり、第２の哺乳動物（例えば、参照哺乳動物）から取得した試料から取得した複数のアンプリコンをシークエンシングしてもよく、第１の哺乳動物から取得した試料由来の変異型シークエンシング読み取りを、ゲノム間隔のクラスターにグループ分けしてもよく、第２の哺乳動物から取得した試料からの参照シークエンシング読み取りを、ゲノム間隔のクラスターにグループ分けしてもよく、両方のアレルの変異型シークエンシング読み取りと参照シークエンシング読み取りの合計が約３を超える（例えば、約４より大きい、約５より大きい、約６より大きい、約７より大きい、約８より大きい、約９より大きい、約１０より大きい、約１２より大きい、約１５より大きい、約１８より大きい、約２０より大きい、約２２より大きい、約より大きい２５、または約３０より大きい）染色体アームを選択してもよく、選択した染色体アームの変異型アレル頻度（ＶＡＦ）を決定してもよく、選択した染色体アーム上の１つまたは複数の多型の有無が同定され得る。選択した染色体アームのＶＡＦは、適切な技術を使用して決定され得る。例えば、選択した染色体アームのＶＡＦは、変異型シークエンシング読み取りの数／シークエンシング読み取りの総数であり得る。哺乳動物のゲノムにおける１つまたは複数の多型の存在は、ＶＡＦが約０．２～約０．８（例えば、約０．３～約０．８、約０．４～約０．８、約０．５～約０．８、約０．６～約０．８、約０．２～約０．７、約０．２～約０．６、約０．２～約０．５、または約０．２～約０．４）である場合、哺乳動物のゲノムで同定され得、哺乳動物のゲノム中に１つまたは複数の多型が存在しないことは、ＶＡＦが所定の有意性閾値内にある場合、哺乳動物のゲノム内で同定され得る。１つの非限定的な例として、哺乳動物のゲノムにおける１つまたは複数の多型の存在は、ＶＡＦが約０．４～０．６である場合、哺乳動物のゲノムで同定され得る。
本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常を同定するための方法及び物質には、アンプリコンに基づくシークエンシング読み取りの使用が含まれ得る。例えば、複数のアンプリコン（例えば、哺乳動物から得られた試料から得られたアンプリコン）を、シークエンシングしてもよい。場合によっては、各アンプリコンは、約１～約２０（例えば、約１～約１５、約１～約１２、約１～約１０、約１～約８、約１～約５、約５～約２０、約７～約２０、約１０～約２０、約１３～約２０、約３～約１８、約５～約１６、または約８～約１２）回、シークエンシングされ得る。場合によっては、アンプリコンベースのシークエンシング読み取りには、連続シークエンシング読み取りを含んでもよい。場合によっては、アンプリコンに長散在ヌクレオチド要素（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（ＬＩＮＥ）を含んでもよい。場合によっては、アンプリコンベースのシークエンシング読み取りは、約１００，０００～約２５００万（例えば、約１００，０００～約２０００万、約１００，０００～約１５００万、約１００，０００～約１２００万、約１００，０００～約１０００万、約１００，０００～約５００万、約１００，０００～約１００万、約１００，０００～約７５０，０００、約１００，０００～約５００，０００、約１００，０００～約２５０，０００、約２５０，０００～約２５００万、約５００，０００～約２，５００万、約７５０，０００～約２，５００万、約１００万～約２，５００万、約５００万～約２，５００万、約１，０００～約２，５００万、約１，５００～約２，５００万、約２００，０００～約２０００万、約２５０，０００～約１５００万、約５００，０００～約１０００万、約７５０，０００～約５００万、または約１００万～約２００万）のシークエンシング読み取りを含んでもよい。場合によっては、アンプリコンをシークエンシングする方法としては、限定するものではないが、高速異数性スクリーニング試験シークエンシングシステム（Ｆａｓｔ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｅｓｔ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＦＡＳＴ－ＳｅｑＳ）が挙げられる。例えば、複数のアンプリコンのシークエンシングには、一意の識別子（ＵＩＤ）を各鋳型分子（例えば、各アンプリコン）に割り当てること、一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作成すること、及び増幅産物を重複してシークエンシングすることが含まれ得る。例えば、複数のアンプリコンのシークエンシングには、式
Figure 2023075090000038



を使用して、上記選択された染色体アーム上の変異型のＺスコアを算出することを含み得、式中、ｗｉは変異型ｉのＵＩＤ深度であり、Ｚｉは変異型ｉのＺスコアであり、ｋは、染色体アームで観察される変異型の数である。場合によっては、アンプリコンのシークエンシングの方法は、実施例６に記載されているとおりであり得る。場合によっては、アンプリコンのシークエンシングの方法は、他のいずれかに記載されている場合がある（例えば、ＵＳ２０１５／００５１０８５、及びＫｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１２ ＰｌｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４１１６２２を参照のこと）。
場合によっては、本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常（例えば異数性）を同定するための方法及び物質は、複数のアンプリコンの増幅を含んでもよい。例えば、複数のアンプリコンの増幅は、単一のプライマーの対を使用して実行してもよい。複数のアンプリコンを増幅する方法としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイが挙げられる。
複数のアンプリコンは、任意の適切な数のアンプリコンを含んでもよい。いくつかの場合に、複数のアンプリコンは、約１０，０００～約１，０００，０００（例えば、約１５，０００～約１，０００，０００、約２５，０００～約１，０００，０００、約３５，０００～約１，０００，０００、約５０，０００～約１，０００，０００、約７５，０００～約１，０００，０００、約１００，０００～約１，０００，０００、約１２５，０００～約１，０００，０００、約１６０，０００～約１，０００，０００、約１８０，０００～約１，０００，０００、約２００，０００～約１，０００，０００、約３００，０００～約１，０００，０００、約５００，０００～約１，０００，０００、約７５０，０００～約１，０００，０００、約１０，０００～約８００，０００、約１０，０００～約５００，０００、約１０，０００～約２５０，０００、約１０，０００～約１５０，０００、約１０，０００～約１００，０００、約１０，０００～約７５，０００、約１０，０００～約５０，０００、約１０，０００～約４０，０００、約１０，０００～約３０，０００、または約１０，０００～約２０，０００）のアンプリコンを含み得る。非限定的な一例として、複数のアンプリコンは、約３８，０００のアンプリコンを含んでもよい。複数のアンプリコン中のアンプリコンは、任意の適切な長さであり得る。ある場合には、アンプリコンは、約５０～約１４０（例えば、約６０～約１４０、約７６～約１４０、約９０～約１４０、約１００～約１４０、約１３０～約１４０、約５０～約１３０、約５０～約１２０、約５０～約１１０、約５０～約１００、約５０～約９０、約５０～約８０、約６０～約１３０、約７０～約１２５、約８０～約１２０、または約９０～約１００）のヌクレオチドを含み得る。１つの非限定的な例として、アンプリコンは約１００個のヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常を同定するための方法及び物質は、シークエンシング読み取り（例えば、複数のアンプリコン由来）をゲノム間隔のクラスター（例えば、固有のクラスター）に分類することを含み得る。ゲノム間隔は、１つまたは複数のクラスターに含まれてもよい。場合によっては、ゲノム間隔は、約１００～約２５２（例えば、約１２５～約２５２、約１５０～約２５２、約１７５～約２５２、約２００～約２５２、約２２５～約２５２、約１００～約２５０、約１００～約２２５、約１００～約２００、約１００～約１７５、約１００～約１５０、約１２５～約２２５、約１５０～約２００、または約１６０～約１８０）のクラスターに属し得る。１つの非限定的な例として、ゲノム間隔は約１７６クラスターに属し得る。各クラスターには、任意の適切な数のゲノム間隔を含み得る。場合によっては、各クラスターには同数のゲノム間隔を含み得る。場合によっては、クラスターには様々な数のゲノムクラスターを含み得る。１つの非限定的な例として、各クラスターには約２００のゲノム間隔を含んでもよい。
ゲノム間隔のクラスターには、任意の適切な数のゲノム間隔を含み得る。場合によっては、ゲノム間隔のクラスターは、約４０００～約４５００（例えば、約４１００～約４５００、約４２００～約４５００、約４３００～約４５００、約４４００～約４５００、約４０００～約４４００、約４０００～約４３００、約４０００～約４２００、約４０００～約４１００、約４１００～約４４００、または約４２００～約４３００）のゲノム間隔を含んでもよい。１つの非限定的な例として、ゲノム間隔のクラスターは、約４３６１個のゲノム間隔を含み得る。ゲノム間隔は、任意の適切な長さであってもよい。例えば、ゲノム間隔は、本明細書に記載されるようにシークエンシングされたアンプリコンの長さであってもよい。例えば、ゲノム間隔は、染色体アームの長さであってもよい。場合によっては、ゲノム間隔は、約１００～約１２５，０００，０００（例えば、約２５０～約１２５，０００，０００、約５００～約１２５，０００，０００、約７５０～約１２５，０００，０００、約１，０００～約１２５，０００，０００、約１，５００～約１２５，０００，０００、約２，０００～約１２５，０００，０００、約５，０００～約１２５，０００，０００、約７５００～約１２５，０００，０００、約１０，０００～約１２５，０００，０００、約２５，０００～約１２５，０００，０００、約５０，０００～約１２５，０００，０００、約１００，０００～約１２５，０００，０００、約２５０，０００～約１２５，０００，０００、約５００，０００～約１２５，０００，０００、約１００～約１，０００，０００、約１００～約７５０，０００、約１００～約５００，０００、約１００～約２５０，０００、約１００～約１００，０００、約１００～約５０，０００、約１００～約２５，０００、約１００～約１０，０００、約１００～約５，０００、約１００～約２，５００、約１００～約１，０００、約１００～約７５０、約１００～約５００、約１００～約２５０、約５００～約１，０００，０００、約５０００～約９００，０００、約５０，０００～約８００，０００、または約１００，０００～約７５０，０００）のヌクレオチドを含み得る。１つの非限定的な例として、ゲノム間隔は、約５００，０００ヌクレオチドを含み得る。ゲノム間隔のクラスターは、任意の適切な方法を使用して形成され得る。例えば、同様のサイズのアンプリコンをクラスター化してもよい。場合によっては、実施例６で説明するように、ゲノム間隔のクラスターが形成され得る。
本明細書に記載の方法及び物質は、教師あり機械学習も使用し得る。場合によっては、教師あり機械学習により、１つまたは複数の染色体アームの小さな変化が検出され得る。例えば、教師あり機械学習は、がんなどの染色体異常に関連する疾患または障害によく見られる、染色体アームの増加または損失などの変化を検出し得る。場合によっては、教師あり機械学習を使用して、異数性の状態に従って試料を分類してもよい。例えば、教師あり機械学習を使用して、ゲノム全体の異数性呼び出しを行ってもよい。場合によっては、サポートベクターマシンモデルには、ＳＶＭスコアの取得を含んでもよい。ＳＶＭスコアは、任意の適切な技術を使用して取得され得る。場合によっては、ＳＶＭスコアは、他のいずれかに記載のように得てもよい（例えば、Ｃｏｒｔｅｓ １９９５ Ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ２０：２７３－２９７、及びＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ：１．６－３を参照のこと）。読み取り深度が低ければ、試料は、通常、生のＳＶＭスコアが高くなる。従って、場合によっては、生のＳＶＭ確率は、式
Figure 2023075090000039



を用いて試料の読み取り深度に基づいて補正され得、式中、ｒは、十分な読み取り深度を前提として、特定の試料の特定の読み取り深度でのＳＶＭスコア／最小ＳＶＭスコアでの比である。Ａ及びＢは、実施例６に記載されるように決定され得る。例えば、
Ａ＝－７．０７６＊１０＾－７であり、
ｘ＝所定の試料についての一意の鋳型分子の数であり、Ｂ＝－１．９４６＊１０＾－１である。
本明細書に記載の方法及び物質を使用して、任意の適切な染色体異常を同定し得る。染色体異常の例としては、限定するものではないが、数値障害、構造異常、アレルの不均衡、及びマイクロサテライト不安定性が挙げられる。染色体異常には、数値障害が含まれる場合がある。例えば、染色体異常は異数性（例えば、異常な数の染色体）を含み得る。場合によっては、異数性には染色体全体が含まれる場合がある。場合によっては、異数性には染色体の一部を含む場合がある（例えば、染色体アーム増加または染色体アーム損失）。異数性の例としては、限定するものではないが、モノソミー、トリソミー、テトラソミー、及びペンタソミーが挙げられる。染色体異常には、構造異常が含まれ得る。構造異常の例としては、限定するものではないが、欠失、複製、転座（例えば、相互転座及びロバートソン転座）、逆位、挿入、リング、及びイソ染色体が挙げられる。染色体異常は、任意の染色体対で発生し得る（例えば、染色体１、染色体２、染色体３、染色体４、染色体５、染色体６、染色体７、染色体８、染色体９、染色体１０、染色体１１、染色体１２、染色体１３、染色体１４、染色体１５、染色体１６、染色体１７、染色体１８、染色体１９、染色体２０、染色体２１、染色体２２、及び／または性染色体の１つ（Ｘ染色体またはＹ染色体など））。例えば、異数性は、限定するものではないが、染色体１３（例えば、１３トリソミー）、染色体１６（例えば、１６トリソミー）、染色体１８（例えば、１８トリソミー）、染色体２１（例えば、２１トリソミー）、及び／または性染色体に発生し得る（例えば、Ｘ染色体モノソミー；性染色体トリソミー、例えば、ＸＸＸ、ＸＸＹ、及びＸＹＹ；性染色体テトラソミー、例えば、ＸＸＸＸ、ＸＸＹＹ；ならびに性染色体ペンタソミー、例えば、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、及びＸＹＹＹＹ）。例えば、構造異常は、限定するものではないが、染色体４で（例えば、染色体４の短腕の部分的欠失）、染色体１１（例えば、末端１１ｑ欠失）、染色体１３（例えば、染色体１３のロバートソン転座）、染色体１４（例えば、染色体１４のロバートソン転座）、染色体１５（例えば、染色体１５のロバートソン転座）、染色体１７（例えば、末梢ミエリンタンパク質２２をコードする遺伝子の複製）、染色体２１（例えば、染色体２１でのロバートソン転座）、及び染色体２２（例えば、染色体２２でのロバートソン転座）で発生する場合がある。
本明細書に記載の方法及び物質は、１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患を同定及び／または治療するために使用され得る（例えば、限定するものではないが、異数性など、本明細書に記載のように同定された１つまたは複数の染色体異常）。場合によっては、哺乳動物から得られたＤＮＡ試料（例えば、ゲノムＤＮＡ試料）を、１つまたは複数の染色体異常の有無について評価することができる。例えば、出生前の哺乳動物（例えば出生前のヒト）は、１つまたは複数の染色体異常の存在に少なくとも部分的に基づいて、１つまたは複数のがん治療で治療され得る疾患を有すると同定され得る。別の例として、１つまたは複数の染色体異常の存在に少なくとも部分的に基づいて、がんを有すると同定された哺乳動物は、１つまたは複数のがん治療で治療され得る。
場合によっては、本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患を有すると同定された哺乳動物（例えば、限定するものではないが、異数性などの１つまたは複数の染色体異常の存在に少なくとも部分的に基づく）は、任意の適切な方法を使用して、疾患の診断を確認することが可能である。１つまたは複数の染色体異常の存在を確認するために使用できる方法の例としては、限定するものではないが、核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、短いタンデムリピートの定量ＰＣＲ、定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ－ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ用量解析、ＳＮＰの定量的質量分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、全ゲノムシークエンシング、及びエクソームシークエンシングが挙げられる。
本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患を有するとされると（例えば、限定するものではないが、異数性などの１つまたは複数の染色体異常の存在に少なくとも部分的に基づいて）、哺乳動物はそれに応じて治療され得る。例えば、哺乳動物が本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常に関連するがんを有すると同定された場合、哺乳動物は１つまたは複数のがん治療で治療することが可能である。１つまたは複数のがん治療には、任意の適切ながん治療が含まれ得る。がん治療には手術が含まれる。がん治療には放射線療法が含まれ得る。がん治療には、化学療法、ホルモン療法、標的療法、及び／または細胞毒性療法などの薬物療法の投与が含まれ得る。がん治療の例としては、限定するものではないが、白金化合物類（シスプラチンまたはカルボプラチンなど）、タキサン類（パクリタキセルまたはドセタキセルなど）、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ－パクリタキセル）、アルトレタミン、カペシタビン、シクロホスファミド、エトポシド（ｖｐ－１６）、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン（ｃｐｔ－１１）、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ペメトレキセド、トポテカン、ビノレルビン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト類（ゴセレリン及びロイプロリドなど）、抗エストロゲン療法（タモキシフェンなど）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール、及びエキセメスタンなど）、血管新生阻害剤（ベバシズマブなど）、ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（オラパリブ、ルカパリブ、及びニラパリブなど）、外部照射療法、近接照射療法、放射性リン、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本明細書に記載の１つまたは複数の染色体異常に関連する任意の適切な疾患（例えば、限定するものではないが、異数性などの１つまたは複数の染色体異常の存在に少なくとも部分的に基づく）は、本明細書に記載のとおり、同定及び／または治療され得る。１つまたは複数の染色体異常に関連し得る疾患及び状態の例としては、限定するものではないが、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌）、甲状腺乳頭癌、甲状腺髄様癌、分化型甲状腺癌、再発性甲状腺癌、難治性分化型甲状腺癌、肺腺癌、細気管支肺細胞癌、多発性内分泌腫瘍２Ａまたは２Ｂ型（それぞれＭＥＮ２ＡまたはＭＥＮ２Ｂ）、褐色細胞腫、副甲状腺過形成、乳癌、大腸癌（例えば、転移性大腸癌）、乳頭状腎細胞癌、胃腸粘膜の神経節神経腫症、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、または子宮頸癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、青年期のがん、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、未知の原発癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胆管癌、上皮内乳管癌、胚性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、卵管癌、骨の線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、ヘアリー細胞腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫骨、骨癌、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性扁平上皮頸癌、正中線癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口唇癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、肝胆道癌、上部尿路癌、乳頭腫症、乳頭腫傍神経節腫、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体癌、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平頸部癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎及び尿管の移行上皮癌、未知の原発癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ウォルデンストロムマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、１ｐ３６欠失症候群、１ｑ２１．１欠失症候群、２ｑ３７欠失症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン（Ｗｏｌｆ－Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ）症候群、ネコなき症候群（Ｃｒｉ ｄｕ ｃｈａｔ）、５ｑ欠失症候群、ウィリアムズ症候群、モノソミー８ｐ、モノソミー８ｑ、アルフィ症候群、クリーフストラ症候群、モノソミー１０ｐ、モノソミー１０ｑ、ヤコブセン症候群、パタウ症候群、エンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、ミラー・ディーカー症候群、スミス・マゲニス症候群、エドワーズ症候群、ダウン症候群、ディ・ジョージ症候群、フェラン・マクダーミド（Ｐｈｅｌａｎ－ＭｃＤｅｒｍｉｄ）症候群、２２ｑ１１．２遠位欠失症候群、キャットアイ症候群、ＸＹＹ症候群、トリプルＸ症候群、クラインフェルター症候群、ウルフ・ハーシュホーン症候群、ヤコブセン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型、及びリンチ症候群が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部試料、子宮内膜試料、または尿試料）における異数性（例えば、一染色体性または三染色体性）を検出するために使用され得る。異数性は、がん（例えば、子宮内膜癌または卵巣癌）に関連していることが知られているゲノムの任意の領域で検出され得る。いくつかの実施形態では、異数性は、アーム４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び／または９ｑで検出され得る。これらの各アームには、子宮内膜癌または卵巣癌を含む多くのがんでコピー数の変化が見られている、がん遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子が保有されている。いくつかの実施形態では、異数性は、アーム５ｑ、８ｑ、及び／または９ｐで検出され得る。これらの各アームには、膀胱癌を含む多くのがんでコピー数の変化が見られているがん遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子が含まれている。異数性領域（複数可）が対象のがんの存在に関連する、異数性検出のための他の適切な領域は、当業者に公知であろう。
いくつかの実施形態では、異数性は、散在したヌクレオチド要素を増幅することにより検出され得る。例えば、異数性は、長散在ヌクレオチド要素（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＬＩＮＥ）を増幅することによって検出され得る。これに加えてまたはこれに代えて、異数性は、短散在ヌクレオチド要素（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＳＩＮＥ）を増幅することによって検出され得る。いくつかの実施形態では、異数性は、単一のＰＣＲを使用して、長い散在ヌクレオチド要素－１（ＬＩＮＥとも呼ばれるＬ１レトロトランスポゾン）のサブファミリーの複数のメンバー（例えば、約３８，０００）を同時増幅する技術を使用して検出され得る。Ｌ１レトロトランスポゾンは、他のヒトリピートと同様に、レトロトランスポジションを介してゲノム全体に広がっており、３９の全ての非末端動原体常染色体アームに見られる。いくつかの実施形態では、異数性は、特許協力条約出願公開番号ＷＯ２０１３１４８４９６に開示されている任意の様々な方法によって検出され得、その内容全体を参照により本明細書に組み込む。当業者は、異数性を検出するための他の適切な方法を承知しているであろう。いくつかの実施形態では、異数性を検出するための試料は、パップブラシを使用して収集される。いくつかの実施形態では、異数性を検出するための試料は、タオブラシを使用して収集される。
いくつかの実施形態では、異数性を検出するために本明細書で提供される方法は、以下からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌の存在を判断するため）を検出する方法と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、異数性を検出するために本明細書で提供される方法は、以下からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ならびにｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、など）の検出、またはその両方（例えば、子宮内膜癌の存在を判定するため）を検出する方法と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、異数性を検出するために本明細書で提供される方法は、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、及びｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方（例えば、卵巣癌の存在を判定するため）を検出する方法と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、異数性の検出と、本明細書に記載の任意の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方を組み合わせれば、卵巣癌または子宮内膜癌の検出の特異性及び／または感度を増大し得る。いくつかの実施形態では、試料は、パップブラシを使用して収集される。いくつかの実施形態では、試料はタオブラシを使用して収集される。
がん
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、対象におけるがんの存在（例えば、がん細胞の存在）を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して、早期にがんの存在を検出し得る。いくつかの実施形態では、対象におけるがんの存在を高い感度及び特異性で同定するために本明細書で提供される方法は、対象がすでにがんに罹患していると判定する前に、対象ががん細胞を有すると判定する前に、及び／または対象ががんに関連する症状を示す前に行われる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して、遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び／または異数性の存在を検出し得、遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び／または異数性によって、対象ががんを有する（例えば、がん細胞を保有する）ことが示される。
本明細書に記載の任意の様々な方法によって検出され得るがんの種類としては、限定するものではないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎癌、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ－関連リンパ腫、筋萎縮性側索硬化症またはＡＬＳ、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、星状細胞腫、小児小脳または脳、異型奇形腫様／横紋様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、胆管癌、肝外癌（胆管癌を参照）、膀胱癌、骨癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳腫瘍、小脳星細胞腫、脳腫瘍、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、脳腫瘍、上衣腫、脳腫瘍、髄芽腫、脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、脳腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、脳幹神経膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、気管支腫瘍、細気管支肺細胞癌、バーキットリンパ腫、青年期のがん、カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、小児期、カルチノイド腫瘍、胃腸、原発不明癌、心臓腫瘍、中枢神経系リンパ腫、原発性、小脳星細胞腫、小児期、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、小児、子宮頸癌、小児癌、軟骨肉腫、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸癌（例えば、転移性結腸直腸癌）、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、分化型甲状腺癌、上皮内乳管癌、胚性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、類上皮血管内皮腫（ＥＨＥ）、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイングファミリーの腫瘍のユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼癌、眼内メラノーマ、眼癌、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の線維性組織球腫、胆嚢癌、胃腸粘膜の神経節神経腫症、胃（胃）癌、胃（胃）癌、胃カルチノイド、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍：頭蓋外、性腺外、または卵巣、妊娠性絨毛性疾患、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、脳幹の神経膠腫、神経膠腫、小児脳星細胞腫、神経膠腫、小児視覚経路及び視床下部、ヘアリー細胞白血病、ヘアリー細胞腫瘍、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視力神経膠腫、小児、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、眼内メラノーマ、眼内メラノーマ、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎癌（腎細胞癌）、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病、急性骨髄性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、白血病、慢性リンパ球性（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病、白血病、慢性骨髄性（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、白血病、ヘアリー細胞、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌（例えば、原発性）、肺腺癌、肺癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌）、リンパ腫、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連、リンパ腫、バーキット、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞、リンパ腫、ホジキン、リンパ腫、原発性中枢神経系、リンパ腫、非ホジキン（ホジキンを除く全てのリンパ腫の古い分類）、マクログロブリン血症、男性の乳癌、骨の悪性線維性組織球腫、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、甲状腺髄様癌、髄芽腫、小児、メラノーマ、メラノーマ、眼内（目）、メラノーマ、眼内（目）、メルケル細胞癌、メルケル細胞癌腫、中皮腫、中皮腫、成人悪性、中皮腫、小児期、転移性扁平上皮頸部癌、原発不明の転移性扁平上皮頸癌、正中線癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、小児、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性内分泌腫瘍２Ａまたは２Ｂ型（それぞれＭＥＮ２ＡまたはＭＥＮ２Ｂ）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、骨髄性白血病、慢性、骨髄性白血病、成人急性、骨髄性白血病、小児急性、骨髄腫、多発性（骨髄のがん）、骨髄増殖性障害、慢性、骨髄増殖性新生物、粘液腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨癌、骨肉腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、膵島細胞、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腎細胞癌、乳頭状甲状腺癌、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔癌及び副鼻腔癌、副甲状腺癌、副甲状腺過形成、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、葉状乳癌、松果体星細胞腫、松果体胚腫、松果体芽細胞腫及び下垂体原発性神経外胚葉腺腫、小児、下垂体腺腫、下垂体癌、形質細胞腫／多発性骨髄腫、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発甲状腺癌、難治性分化甲状腺癌、腎細胞癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盂及び尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫、小児期、唾液腺癌、肉腫、肉腫、ユーイングファミリーの腫瘍、肉腫、カポジ、セザリー症候群、皮膚癌（メラノーマ）、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌、メルケル細胞、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮癌－皮膚癌（非メラノーマ）、扁平頸部癌、原発不明扁平頸部癌、転移性、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚癌、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、胸腺腫、小児期、甲状腺癌、甲状腺癌、小児期、腎盂及び尿管の移行細胞癌、栄養芽腫、妊娠、原発不明癌、原発不明部位、、小児、原発部位部位、のがん、成人、尿管及び腎盂、のがん、移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮癌、子宮内膜、子宮肉腫、膣癌、視経路及び視床下部神経膠腫、小児、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍（腎臓癌）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、単一のタイプのがんの存在を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）のタイプのがんを検出し得る。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌の存在を検出し得る。別の例として、本明細書に記載の方法は、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び乳癌のそれぞれの存在を検出し得る（例えば、本明細書に記載の方法は、対象において、これらのタイプのがんのそれぞれの存在を検出し得るが、対象には１種類のがんしか存在しない場合がある）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の様々な方法を使用して、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、及び乳癌、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択されるがんを検出し得る。別の例として、本明細書に記載の方法を使用して、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌の存在を検出し得る。別の例として、本明細書に記載の方法は、子宮頸部、子宮内膜、卵巣、及び卵管の各がんの存在を検出し得る（例えば、本明細書に記載の方法は、対象におけるこれらのタイプのがんのそれぞれの存在を検出し得るが、対象には１種類のがんしか存在しない場合がある）。別の例として、本明細書に記載の方法を使用して、膀胱癌または上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）の存在を検出することが可能である。別の例として、本明細書に記載の方法は、膀胱癌及び上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）のそれぞれの存在を検出し得る（例えば、本明細書に記載の方法は、対象におけるこれらのタイプのがんのそれぞれの存在を検出し得るが、対象には１種類のがんしか存在しない場合がある）。
さらなる診断検査
対象における疾患（例えば、がん）の存在を診断または同定するいくつかの実施形態では（例えば、本明細書に記載の任意の様々な方法を使用して）、対象はさらなる診断検査の候補としても同定される。本明細書では、さらなる診断検査のために対象を選択する方法が提供される。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために対象を選択する方法は、対象から単離された生物試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から単離された生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在を検出すること、及び／または対象から単離された生物試料中の異数性の存在を検出すること、及び１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー、もしくは異数性の存在が確認された場合、さらなる診断検査のために対象を選択することを含む。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために対象を選択する方法は、バイオマーカーの１つまたは複数の他のクラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この検出するステップは、対象がすでに癌に罹患していると判断する前に実行される（例えば、対象ががん細胞を保有することが知られていない場合）。
いくつかの実施形態では、生物試料は対象から単離される。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び／または異数性を含む任意の適切な生物試料が、本明細書に記載の任意の様々な方法に従って使用され得る。例えば、生物試料としては、血液、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。対象から生物試料を単離する方法は、当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、対象はさらなる診断検査のために選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して、従来の技術が対象を早期がんと診断し得る期間の前の期間でさらなる診断検査のために対象を選択し得る。例えば、さらなる診断検査のために対象を選択するために本明細書で提供される方法は、対象が従来の方法によってがんと診断されていない場合、及び／または対象ががんを有すると知られていない場合に使用され得る。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されていない対象と比較して高い頻度で診断検査（例えば、本明細書に記載の任意の診断検査）を実施されてもよい。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は、毎日２回、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、四半期、半年ごと、毎年の頻度で、またはその中の任意の頻度で診断検査を実施されてもよい。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されていない対象と比較して、１つまたは複数の追加の診断検査を実施されてもよい。例えば、追加の診断検査用に選択された対象には２つ以上の診断検査を実施してもよいが、追加の診断検査用に選択されなかった対象には１つの診断検査のみが実施される（または診断検査なし）。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、最初に検出されたがんと同じ種類のがんの存在を判定し得る。これに加えてまたはこれに代えて、診断検査方法は、最初に検出されたがんとは異なる種類のがんの存在を判定し得る。
いくつかの実施形態では、診断検査方法はスキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、骨スキャン、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道図（バリウム嚥下）、バリウム注腸、ガリウムスキャン、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、マンモグラフィー、モノクローナル抗体スキャン（例えば、前立腺癌のＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（登録商標）スキャン、卵巣癌のＯｎｃｏＳｃｉｎｔ（登録商標）スキャン、及び結腸癌のＣＥＡ－Ｓｃａｎ（登録商標））、マルチゲート取得（ＭＵＧＡ）スキャン、ＰＥＴスキャン、ＰＥＴ／ＣＴスキャン、甲状腺スキャン、超音波（例えば、乳房超音波、気管支内超音波、内視鏡超音波、経膣超音波）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャンである。
いくつかの実施形態では、診断検査方法は、限定するものではないが、肛門鏡検査、生検、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、ナビゲーション気管支鏡検査）、デジタル乳房トモシンセシス、デジタル直腸検査、内視鏡、例としては、限定するものではないが、カプセル内視鏡検査、仮想内視鏡検査、関節鏡検査、気管支鏡検査、大腸内視鏡検査、コルポスコピー検査、膀胱鏡検査、食道鏡検査、胃鏡検査、腹腔鏡検査、喉頭鏡検査、神経内視鏡検査、直腸鏡検査、Ｓ状結腸鏡検査、皮膚癌検査、胸腔鏡検査、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、婦人科内診などの理学的検査である。
いくつかの実施形態では、診断検査法は、生検（例えば、骨髄吸引、組織生検）である。いくつかの実施形態では、生検は、微細な針吸引または外科的切除によって実施される。いくつかの実施形態では、診断検査方法（複数可）は、生物試料（例えば、組織試料、尿試料、血液試料、チェックスワブ、唾液試料、粘膜試料（例えば、喀痰、気管支分泌物）、乳頭吸引物、分泌物または排泄物）を取得することをさらに含む。いくつかの実施形態では、診断検査方法（複数可）は、エキソソームタンパク質（例えば、エキソソーム表面タンパク質（例えば、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＰＣＡ－３））を決定することを含む（Ｓｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒｓ ９（１）：ｐｉｉ：Ｅ８）。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、腫瘍型ＤＸ（登録商標）検査である（Ｂａｅｈｎｅｒ（２０１６）Ｅｃａｎｃｅｒｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ １０：６７５）。
いくつかの実施形態では、診断検査方法は、限定するものではないが、アルファフェトプロテイン血液検査、骨髄検査、便潜血検査、ヒトパピローマウイルス検査、低用量ヘリカルコンピューター断層撮影法、腰椎穿刺、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）検査、パップスメア、または腫瘍マーカー検査などの検査である。
いくつかの実施形態では、診断検査方法は、公知のタンパク質バイオマーカー（例えば、ＣＡ－１２５または前立腺特異抗原（ＰＳＡ））のレベルを決定することを含む。例えば、卵巣癌、子宮内膜癌、卵管癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、結腸癌、肝臓癌、乳癌、または肺癌に罹患している対象の血液中に大量のＣＡ－１２５を見出し得る。本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって定義される、「血液、他の体液中に見出される、正常なまたは異常なプロセスの兆候、または状態や疾患の兆候である生体分子」を指す（例えば、ｔｈｅ ＵＲＬ ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ／ｃａｎｃｅｒ－ｔｅｒｍｓ？ＣｄｒＩＤ＝４５６１８を参照のこと）。バイオマーカーは、限定するものではないが、核酸（例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）または他の非コードＲＮＡ）などの遺伝子バイオマーカーを含み得る。バイオマーカーは、限定するものではないが、ペプチド、タンパク質、またはその断片などのタンパク質バイオマーカーを含み得る。
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＦＬＴ３、ＮＰＭ１、ＣＥＢＰＡ、ＰＲＡＭ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｋｉｔ、ＮＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＨＰＶウイルス、ＥＲＢＢ２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＥＡ、ＡＦＰ、及び／またはＬＤＨである。例えば、Ｅａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５６：２６５－２７１，Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１６８４－１６８９、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４９：１９２－１９９、Ａｌｌｅｇｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）（２００９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７：２０９１－２０９６、Ｐａｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１：２８１７－２８２６、Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ ３７６：６８７－６９７、Ｐｉｃｃａｒｔ－Ｇｅｂｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：１６５９－１６７２、Ｒｏｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：１６７３－１６８４、Ｌｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：５３１３－５３２７、Ｇｉｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８：３３８８－３４０４、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：５２８７－５３１２、Ｈｅｎｒｙ ａｎｄ Ｈａｙｅｓ（２０１２）Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６：１４０－１４６を参照のこと。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、限定するものではないが、ＭＵＣ－１、ＣＥＡ、ｐ５３、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、及び／またはＨＥＲ２などの対象における乳癌の検出のためのバイオマーカーである（Ｇａｍ（２０１２）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２（５）：８６－９１）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、限定するものではないが、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＭＥＴ、及び／またはＲＯＳ１などの、対象中の肺癌の検出のためのバイオマーカーである（Ｍａｏ（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：６９６０－６９６９、Ｋｏｒｐａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．４：２０４）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、限定するものではないが、ＨＰＶ、ＣＡ－１２５、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＶＣＡＭ－１、ＫＬＫ６／７、ＧＳＴ１、ＰＲＳＳ８、ＦＯＬＲ１、ＡＬＤＨ１などの、対象における卵巣癌の検出のためのバイオマーカーである（Ｎｏｌｅｎ ａｎｄ Ｌｏｋｓｈｉｎ（２０１２）Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．８（１）：５５－７１、Ｓａｒｏｊｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０１２：７０９０４９）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、限定するものではないが、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ、及びＢＲＡＦなど、対象における結腸直腸癌の検出のためのバイオマーカーである（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐｏｎｓ ａｎｄ Ｃｒｕｚ－Ｃｏｒｒｅａ（２０１５）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１５：１４９０１４、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｃｈａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０（１４）：３８０４－３８２４）。いくつかの実施形態では、診断検査法は、核酸の存在、及び／または発現レベル（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（Ｓｅｔｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．Ｍｕｔａｇ．Ｓ１－００５）、ＲＮＡ、ＳＮＰ（Ｈｏｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌａｂｉｎｖｅｓｔ．２０１３．５４、Ｆａｌｚｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：５５９－５７１）、メチル化状態（Ｃａｓｔｅｌｏ－Ｂｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １４：５３４－５４２）、ホットスポット癌変異（Ｙｏｕｓｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｈｅｓｔ １４３：１６７９－１６８４））を決定する。試料中の核酸を検出する方法の非限定的な例としては以下が挙げられる：ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング法、ディープシークエンシング）、ＤＮＡマイクロアレイ、マイクロＲＮＡマイクロアレイ、ＳＮＰマイクロアレイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、ＳＮＰ遺伝子型決定、及びＤＮＡメチル化アッセイ。例えば、Ｍｅｌｄｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．３２（４）：１７７－１９５；Ｓｉｄｒａｎｋｓｙ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４０）：１０５４－９を参照のこと。
いくつかの実施形態では、診断検査方法は、試料中のタンパク質バイオマーカーの存在を判定することを含む（例えば、血漿バイオマーカー（Ｍｉｒｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１（７）：１７６４－１７７１））。タンパク質バイオマーカーの存在を決定する方法の非限定的な例には、以下が挙げられる：ウエスタンブロット分析、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光、質量分析（ＭＳ）（例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）－ＭＳ、表面増強レーザー）脱着／イオン化飛行時間（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ）－ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、近接アッセイ（例えば、ＶｅｒａＴａｇ近接アッセイ（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｐａｒｔ Ｂ：１８：１１－２１、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＡＭ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３４：３０３－１１））、タンパク質マイクロアレイ（例えば、抗体マイクロアレイ（Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８：２２１１－９、Ｗｏｏｄｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１：２３３－２３７）、ＩＨＣベースのマイクロアレイ（Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７：２１４２－５０）、マイクロアレイＥＬＩＳＡ（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ９：１２７１－８０）。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの存在を決定する方法は、機能アッセイである。いくつかの実施形態では、機能アッセイは、キナーゼアッセイである（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２６：４２４－３１、Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：３９６４－７５、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ １４：２４７－５７）、プロテアーゼアッセイ（Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＡＣＳ ｎａｎｏ．６：８５１－７，Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ １３：２７２－８、Ｄａｒｒａｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０：１５０５－１２）。例えば、癌患者を診断するためのタンパク質分析アッセイの概説については、Ｐｏｗｅｒｓ ａｎｄ Ｐａｌｅｃｅｋ（２０１５）Ｊ．Ｈｅａｔｈｃ Ｅｎｇ．３（４）：５０３－５３４を参照のこと。
いくつかの実施形態では、診断検査方法は、生物試料中の異数性の存在を検出すること（例えば、生物試料が異常な数の染色体を有する細胞を含むか否かを検出すること）を含む。異数性の存在を検出する方法の非限定的な例としては、核型分析、デジタル核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、短いタンデムリピートの定量ＰＣＲ、定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ－ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ用量分析、一塩基多型の定量質量分析、及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、モニタリングの増大のためにも選択してよい。がん細胞の存在が同定されると（例えば、本明細書に記載の任意の様々な方法により）、対象にとって、モニタリングを増大させること（例えば、腫瘍またはがんの進行を対象において評価すること及び／または追加のがん細胞変異の発生を評価すること）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を有する腫瘍のサイズ及び／または正確な位置を決定する）の両方を受けることが、有益であり得る。
いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択される対象を、治療的介入のためにも選択してもよい。本明細書に記載のまたは当該技術分野で公知の任意の治療的介入を実施してもよい。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査を実施されてもよく、がん細胞の存在が確認された場合、治療的介入をほどこしてもよい。追加的または代替的に、さらなる診断検査のために選択された対象に治療的介入を実施し、治療的介入が進行するにつれてさらにモニターしてもよい。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象に治療的介入を実施した後、追加の検査により、１つまたは複数の追加の遺伝子バイオマーカーの存在、１つまたは複数の追加のタンパク質バイオマーカーの存在、及び／または異数性の存在が明らかになる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の遺伝子バイオマーカーの存在、１つまたは複数の追加のタンパク質バイオマーカーの存在、及び／または異数性の存在は、異なる治療的介入の実施をもたらす（例えば、耐性変異が、治療的介入中のがん細胞で発生する可能性があり、耐性変異を有するがん細胞は、元の治療的介入に耐性である）。
モニター増大
本明細書では、モニタリングを増大する対象を選択する方法も提供する。いくつかの実施形態では、増大したモニタリングのために対象を選択する方法は、対象から単離された生物試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から単離された生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在を検出すること、及び／または対象から単離された生物試料中の異数性の存在を検出すること、ならびに１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー、または異数性の存在が同定された場合にモニタリングを増大する対象を選択することを含む。いくつかの実施形態では、モニタリングの増大のために対象を選択する方法は、バイオマーカーの１つまたは複数の他のクラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象ががん細胞を保有することが知られていない場合（例えば、対象ががん細胞を保有することが知られていない場合）、検出するステップを実行する。
いくつかの実施形態では、生物試料は対象から単離される。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び／または異数性を含む任意の適切な生物試料は、本明細書で開示される任意の様々な方法に従って使用され得る。例えば、生物試料としては、血液、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。対象から生物試料を単離する方法は、当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、対象ががんを有すると判定されると、その対象は増大または追加のモニタリングのために選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して、従来の技術が対象を早期がんと診断することが可能である期間の前の期間でモニタリングを増大する対象を選択し得る。例えば、モニタリング増大のための対象を選択するために本明細書で提供される方法は、対象が従来法によりがんと診断されていない場合、及び／または対象ががんを有すると知られていない場合に使用され得る。いくつかの実施形態では、増大したモニタリングのために選択された対象は、モニタリング増大のために選択されなかった対象と比較して、増大した頻度で診断検査（例えば、本明細書に開示される診断検査のいずれか）を実施されてもよい。例えば、モニタリングの増大のために選択された対象は、１日２回、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、年四回、半年ごと、毎年という頻度で、またはその間の任意の頻度で診断検査を実施されてもよい。いくつかの実施形態では、モニタリング増大のために選択された対象は、モニタリングの増大のために選択されなかった対象と比較して、１つまたは複数の追加の診断検査を実施されてもよい。例えば、モニタリング増大のために選択した対象には２つの診断検査を実施してもよいが、モニタリング増大のために選択していない対象には１つの診断検査しか実施しない（または診断検査は実施しない）。
いくつかの実施形態では、モニタリングを増大するために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択してもよい。がん細胞の存在が同定されると（例えば、本明細書に記載の任意の様々な方法により）、対象がモニタリングの増大（例えば、対象において、腫瘍もしくはがんの進行を評価すること、及び／または追加のがん細胞変異の発生を評価すること）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を有する腫瘍のサイズ及び／または正確な位置を決定すること）の両方を受けることが有益であり得る。
いくつかの実施形態では、モニタリングの増大のために選択される対象を、治療的介入のためにも選択してもよい。本明細書に記載のまたは当該技術分野で公知の任意の治療的介入を実施してもよい。例えば、モニタリングの増大のために選択された対象をさらにモニタリングしてもよく、増大したモニタリング期間を通してがん細胞の存在が維持される場合、治療的介入を実施してもよい。追加的または代替的に、モニタリングの増大のために選択された対象に治療的介入を実施し、治療的介入が進行するにつれてさらにモニタリングしてもよい。いくつかの実施形態では、モニタリングの増大のために選択された対象に治療的介入が実施された後、モニタリングの増大により、１つもしくは複数の追加の遺伝子バイオマーカーの存在、１つもしくは複数の追加のタンパク質バイオマーカーの存在、及び／または異数性の存在が明らかになる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の遺伝子バイオマーカーの存在、１つまたは複数の追加のタンパク質バイオマーカーの存在、及び／または異数性の存在によって、異なる治療的介入の実施がもたらされる（例えば、耐性変異が、治療的介入中のがん細胞で発生する可能性があり、この耐性変異を有するがん細胞は元の治療的介入に耐性である）。
治療的介入
いくつかの実施形態では、対象ががん（例えば、子宮頸部、子宮内膜、卵巣、または卵管癌）を有すると判定されるか、がんを有すると疑われると、その対象は治療的介入を実施されるか、または治療的介入に選択され得る。がん（例えば、子宮頸部、子宮内膜、卵巣、または卵管の癌）の存在が対象で検出されているいくつかの実施形態では、対象は、対象のがん（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌に存在する遺伝子の修飾）を特異的に標的する治療的介入を実施される。例えば、対象が卵巣癌を患っていると判定された場合、卵巣癌に適した治療的介入を実施してもよい。別の例として、対象が子宮内膜癌を有すると判定された場合、子宮内膜癌に適切な治療的介入を実施してもよい。いくつかの実施形態では、治療的介入は、化学療法（例えば、本明細書に記載の任意の白金ベースの化学療法剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、またはタキサン（例えば、プラシタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））またはドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）））である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アルブミン結合パクリタキセル（ナップ－パクリタキセル、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ－１６）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、リポソームドキソルビシン（ｄｏｘｉｌ（登録商標））、メルファラン、ペメトレキセド（ａｌｉｍｔａ（登録商標））、トポテカン、またはビノレルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、化学療法剤（例えば、パクリタキセル、イホスファミド、及びシスプラチン；ビンブラスチン、イホスファミド、及びシスプラチン；エトポシド、イホスファミド、及びシスプラチン）の組み合わせである。いくつかの実施形態では、治療的介入は、エピジェネティック療法である（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．２０：８１－８６）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、エピジェネティック療法は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤（例えば、５－アザシチジン（５－ＡＺＡ）、デシタビン（５－アザ－２’－デオキシシチジン）（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ １１７（８）：１６６１－１６６９、Ｆａｌｃｈｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ３１（５）：１１９２－１２００、Ｍａｔｅｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（９）：２１９７－２２０５）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ１阻害剤は、ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｏｄｕｎｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２（１）：３７－４９）である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック療法は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット（Ｍｏｄｅｓｉｔｔ（２００８） １０９（２）：１８２－１８６）またはベリノスタット（Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６（９）：１５７３－１５７９）である。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、化学療法剤（例えば、カルボプラチン（パラプラチン）、シスプラチン、パクリタキセルまたはドセタキセル（タキソテール））と組み合わせて与えられる（Ｍｅｎｄｉｖｉｌ（２０１３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２３（３）：５３３－５３９、Ｄｉｚｏｎ（２０１２）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１２５（２）：３６７－３７１、Ｄｉｚｏｎ（２０１２）Ｉｎｔ Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２３（３）：５３３－５３９）。いくつかの実施形態では、治療的介入は、抗血管新生剤（例えば、ベバシズマブ）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）－１及び／またはＰＡＲＰ－２阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＰ－１及びＰＡＲＰ－２阻害剤は、ニラパリブ（ゼジュラ）である（Ｓｃｏｔｔ（２０１７）Ｄｒｕｇｓ ｄｏｉＬ１０．１００７／ｓ４０２６５－０１７－０７５２）。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ（リンパルザ）またはルカパリブ（ルブラカ）である。いくつかの実施形態では、治療的介入はホルモン（例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト）である。いくつかの実施形態では、ＬＨＲＨアゴニストは、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））またはロイプロリド（Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、抗エストロゲン化合物（例えば、タモキシフェン）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））またはエキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、手術（例えば、腫瘍量の減量、子宮摘出術、両側卵管卵巣摘出術、大網摘出術）である。「減量」という用語は、腫瘍ほぼ全体の外科的除去（「最適減量」）を指す。いくつかの実施形態では、減量には、膀胱、脾臓、胆嚢、胃、肝臓及び／または膵臓の一部の除去が含まれる。いくつかの実施形態では、手術（例えば、腫瘍塊の減量、子宮摘出、両側卵管卵巣摘出、大網切除）後に、補助化学療法を対象にさらに実施してもよい。いくつかの実施形態では、補助化学療法は、腹腔内（腹腔内）に投与される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、予防的手術（例えば、子宮摘出術）である。いくつかの実施形態では、腹水を除去するために穿刺術を行う。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の様々な方法に従って対象ががん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）を有すると判定されると、その対象は治療的介入を実施されるか、または治療的介入のために選択され得る。例えば、対象が膀胱癌を患っていると判定された場合、膀胱癌に適した治療的介入を実施してもよい。膀胱癌に適したこのような治療的介入の例としては、限定するものではないが、膀胱の経尿道的切除（ＴＵＲＢ）、膀胱内ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、膀胱切除術または膀胱前立腺切除術、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、または上記の任意の組み合わせが挙げられる。別の例として、対象がＵＴＵＣを有すると判定された場合、ＵＴＵＣに適した治療的介入を実施してもよい。ＵＴＵＣに適したこのような治療的介入の例としては、限定するものではないが、経尿道的切除、膀胱内ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、尿管切除または腎尿管切除、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、または上記の任意の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、検出されるがんは低悪性度腫瘍（例えば、低悪性度の新生物（ＰＵＮＬＭＰ）または非侵襲性低悪性度乳頭尿路上皮癌）である。いくつかの実施形態では、対象が低悪性度腫瘍を有すると判定されると、その対象は膀胱の経尿道的切除（ＴＵＲＢ）を含む治療的介入を実施されるか、または治療的介入のために選択され得る。
対象において結腸直腸癌の存在が検出されているいくつかの実施形態では、その対象は、対象の結腸直腸癌（例えば、結腸直腸癌に存在する遺伝子の修飾）を特異的に標的とする治療的介入を実施される。いくつかの実施形態では、対象には、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ）が投与される（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１（４）：３３７－３４５）。いくつかの実施形態では、治療的発明は、抗血管新生剤である。いくつかの実施形態では、抗血管新生剤は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）である（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２３３５－２３４２）。いくつかの実施形態では、抗血管新生剤はＶＥＧＦ阻害剤である（例えば、アフリベルセプト（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ２６（Ｍａｙ ２０ ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ４０２７）、バタラニブ（ＰＴＫ／ＺＫ２２２５８４；Ｈｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：１６Ｓ（ａｂｓｔｒ．ＬＢＡ３））、スニチニブ（Ｓａｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：４７９３－４７９９）、ＡＺＤ２１７１（Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：２３６９－７６）、ＡＭＧ ７０６（Ｄｒｅｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）２５：３０４５－２０５４））。いくつかの実施形態では、ベバシズマブは、化学療法治療とともに投与される（例えば、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２３３５－２３４２、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１８３０－１８３５を参照のこと）。結腸直腸癌の対象に使用され得る化学療法治療の非限定的な例としては、以下が挙げられる：５－ＦＵ、ロイコボリン、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）、カペシタビン、セレコキシブ、及びスリンダク。いくつかの実施形態では、化学療法剤の組み合わせ、例えば、ＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵ、ロイコボリン及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、５－ＦＵ及びイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣａｐｅＯｘ（カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）及びオキサリプラチン）が使用される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、哺乳動物のラパマイシン標的（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、ラマパイシン類似体（Ｋｅｓｍｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（ａｂｓｔｒ ２３４））、ＲＡＤ－００１（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１６０３－１６１０））。いくつかの実施形態では、治療的介入は、プロテインキナーゼＣ拮抗剤（例えば、エンザスタウリン（Ｃａｍｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １９：７７－８４、Ｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（Ｍａｙ ２０ ｓｕｐｐｌ）（ａｂｓｔｒ ３５２９））。いくつかの実施形態では、治療的介入は、非受容体型チロシンキナーゼＳｒｃの阻害剤である（例えば、ＡＺ０５３０（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１８Ｓ（ａｂｓｔｒ ３５２０）））。いくつかの実施形態では、治療的介入は、キネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）の阻害剤である（例えば、イスピネシブ（ＳＢ－７１５９９２）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１４Ｓ（ａｂｓｔｒ ２０７８）、Ｂｕｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１２８（ａｂｓｔｒ ２００４）））。
対象において肺癌の存在が検出されるいくつかの実施形態では、その対象は、対象の肺癌（例えば、肺癌に存在する遺伝子の修飾）を特異的に標的とする治療的介入を実施される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、化学療法（例えば、本明細書に記載の任意の白金ベースの化学療法剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、またはタキサン（例えば、プラシタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））またはドセタキセル（タキソテール（登録商標）））である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アルブミン結合パクリタキセル（ナップ－パクリタキセル、アブラキサン（登録商標））、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎｔ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ－１６）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、リポソームドキソルビシン（ドキシル（登録商標））、メルファラン、ペメトレキセド（アリムタ（登録商標））、トポテカン、またはビノレルビン（ナベルビン（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、化学療法剤（例えば、パクリタキセル、イホスファミド、及びシスプラチン；ビンブラスチン、イホスファミド、及びシスプラチン；エトポシド、イホスファミド、及びシスプラチン）の組み合わせである。いくつかの実施形態では、治療的介入は、エピジェネティック療法である（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．２０：８１－８６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、エピジェネティック療法は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤（例えば、５－アザシチジン（５－ＡＺＡ）、デシタビン（５－アザ－２’－デオキシシチジン）（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ １１７（８）：１６６１－１６６９、Ｆａｌｃｈｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ３１（５）：１１９２－１２００、Ｍａｔｅｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（９）：２１９７－２２０５）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ１阻害剤は、ＮＹ－ＥＳＯ－１である（Ｏｄｕｎｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２（１）：３７－４９）。いくつかの実施形態では、エピジエネティック療法は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット（Ｍｏｄｅｓｉｔｔ（２００８）１０９（２）：１８２－１８６）またはベリノスタット（Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６（９）：１５７３－１５７９）である。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、化学療法剤（例えば、カルボプラチン（パラプラチン）、シスプラチン、パクリタキセルまたはドセタキセル（タキソテール））と組み合わせて投与される（Ｍｅｎｄｉｖｉｌ（２０１３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２３（３）：５３３－５３９、Ｄｉｚｏｎ（２０１２）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１２５（２）：３６７－３７１、Ｄｉｚｏｎ（２０１２）Ｉｎｔ Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２３（３）：５３３－５３９）。いくつかの実施形態では、治療的介入は、抗血管新生阻害剤（例えば、ベバシヅマブ）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）－１及び／またはＰＡＲＰ－２阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＰ－１及びＰＡＲＰ－２阻害剤は、ニラパリブ（ゼジュラ）である（Ｓｃｏｔｔ（２０１７）Ｄｒｕｇｓ ｄｏｉＬ１０．１００７／ｓ４０２６５－０１７－０７５２）。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ（リンパルザ）またはルカパリブ（ルブラカ）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、ホルモン（例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト）である。いくつかの実施形態では、ＬＨＲＨアゴニストは、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））またはロイプロリド（Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、抗エストロゲン化合物（例えば、タモキシフェン）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））またはエキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、手術（例えば、腫瘍塊の減量、子宮摘出術、両側卵管卵巣摘出術、大網摘出術）である。「減量」という用語は、腫瘍ほぼ全体の外科的除去（「最適減量」）を指す。いくつかの実施形態では、減量には、膀胱、脾臓、胆嚢、胃、肝臓及び／または膵臓の一部の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、手術（例えば、腫瘍塊の減量、子宮摘出術、両側卵管卵巣摘出、大網切除）後に、補助化学療法が対象にさらに投与される。いくつかの実施形態では、補助化学療法は、腹腔の中（腹腔内）に投与される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、予防的手術（例えば、子宮摘出術）である。いくつかの実施形態では、腹水を除去するために穿刺術が実行される。
乳癌の存在が対象において検出されているいくつかの実施形態では、対象は、対象の乳癌（例えば、乳癌に存在する遺伝子修飾）を特異的に標的とする治療的介入を実施される。いくつかの実施形態では、標的薬物療法は、ＨＥＲ２阻害剤（例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ペルツズマブ（ペルジェタ）；アド－トラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１；Ｋａｄｃｙｌａ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ネラチニブ）である。例えば、Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６：１０９－１１９、Ｋｏｎｅｃｎｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１６３０－１６３９、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：１１７０－１１７５、Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６：２９９９－３０００５、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：２５５２－２５５８、Ａｇｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２：１２７－１３７、Ｌｅｗｉｓ Ｐｈｉｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：９２８０－９２９０を参照のこと。いくつかの実施形態では、標的薬物療法は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ（Ｉｂｒａｎｃｅ（登録商標））、リボシクリン（Ｋｉｓｑａｌｉ（登録商標））、アベマシクリブ）（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７３：２０９－２１９、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３７５：１９２５－１９３６、Ｅｈａｂ ａｎｄ Ｅｌｂａｚ （２０１６）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ８：８３－９１、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０（１）：９７、Ｃｏｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｒｉ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ １１２：２０８－２１４、Ｂａｒｒｏｓｏ－Ｓｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｒｅ １１（３）：１６７－１７３））。いくつかの実施形態では、標的薬物療法は、ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパリブ（ＡＺＤ２２８１）、ベリパリブ（ＡＢＴ－８８８）、ニラパリブ（ＭＫ－４８２７）、タラゾパリブ（ＢＭＮ－６７３）、ルカパリブ（ＡＧ－１４６９９）、ＣＥＰ－９７２２）である。例えば、Ａｕｄｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ ３７６：２４５－２５１、Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６１：１２３－１３４、Ｌｉｖｒａｈｉ ａｎｄ Ｇａｒｂｅｒ（２０１５）ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３：１８８、Ｋａｕｆａｍｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３３：２４４－２５０、Ｇｅｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１２：８５２－６１、Ｉｓａｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７１：Ｐ３－１６－０５、Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １４：８８２－９２、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ ３７６：２３５－４４、Ｓｏｍｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３１：１０２４、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＣＬｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９（１８）：５００３－１５、Ａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ２７（４）：３４２－８を参照のこと。いくつかの実施形態では、標的薬物療法は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス（アフィニトール））である。例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．１６３３６、Ｌｏｕｓｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １０：２３９－２５２、Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｈａｒｖｅｙ（２０１７）Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７（３）：３８３－４０４を参照のこと。いくつかの実施形態では、標的薬物療法は、熱ショックタンパク質９０阻害剤（例えば、タネスピマイシン）である（Ｍｏｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２６：ｓ１０２７、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：ｓ１１１５、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０９（２）：２７５－８９）。いくつかの実施形態では、標的薬物療法は、骨改変薬（例えば、ビスホスホネートまたはデノスマブ（Ｘｇｅｖａ））をさらに含む。例えば、Ｅｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ １９（３）：１５、Ａｂｄｅｌ－Ｒａｈｍａｎ（２０１６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １６（８）：８８５－９１を参照のこと。いくつかの実施形態では、治療的介入は、ホルモン（例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト）である。いくつかの実施形態では、ＬＨＲＨアゴニストは、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））またはロイプロリド（Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、抗エストロゲン化合物（例えば、タモキシフェン、フルベストラント（ファスロデックス））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））またはエキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術、単独乳房切除術、両乳房切除術、全乳房切除術、根治的乳房切除術、センチネルリンパ節生検、腋窩リンパ節郭清；乳房温存手術）である。外科的切除の程度は、乳癌の病期及び全体的な予後に依存する。いくつかの実施形態では、治療的介入は放射線療法である。いくつかの実施形態では、放射線療法は、乳房部分照射または強度変調放射線療法である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、化学療法（例えば、カペシタビン（ゼローダ）、カルボプラチン（パラプラチン）、シスプラチン（プラチノール）、シクロホスファミド（ネオサール）、ドセタキセル（ドセフェレス、タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ペグ化リポソームドキソルビシン（ドキシル）、エピルビシン（エレンス）、フルオロウラシル（５－ＦＵ、アドルシル）、ゲムシタビン（ゲムザール）、メトトレキサート、パクリタキセル（タキソール）、タンパク質結合パクリタキセル（アブラキサン）、ビノレルビン（ナベルビン）、エリブリン（ハラベン）、またはイクサベピロン（イクセンプラ））である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、少なくとも２つの化学療法剤（例えば、ドキソルビシン及びシクロホスファミド（ＡＣ）；エピルビシン及びシクロホスファミド（ＥＣ）；シクロホスファミド、ドキソルビシン及び５－ＦＵ（ＣＡＦ）；シクロホスファミド、エピルビシン及び５－ＦＵ（ＣＥＦ）；シクロホスファミド、メトトレキサート及び５－ＦＵ（ＣＭＦ）；エピルビシン及びシクロホスファミド（ＥＣ）；ドセタキセル、ドキソルビシン及びシクロホスファミド（ＴＡＣ）；ドセタキセル及びシクロホスファミド（ＴＣ）の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、がんが検出または同定された後、治療的介入が対象に実施される。本明細書に開示されているかまたは当該技術分野で公知である任意の治療的介入を実施してもよい。例示的な治療的介入としては、限定するものではないが、キナーゼ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ－４免疫チェックポイント阻害剤）、化学療法剤、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは改変Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）、抗体、二重特異性抗体またはその断片（例えば、ＢｉＴＥ類）、化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、細胞毒性療法、ホルモン療法、免疫療法、モノクローナル抗体、放射線療法、シグナル伝達阻害剤、手術（例えば、外科的切除）、キナーゼ阻害剤の投与などの標的療法（例えば、転座または変異などの特定の遺伝的病変を標的とするキナーゼ阻害剤）、またはその任意の組み合わせが挙げられる。そのような治療的介入は、単独で投与されてもよいし、または組み合わせて投与されてもよい。本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の治療的介入が、がん細胞が検出された後に対象に対して、順次または同時に投与される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象が初期がんを有する時点で実施されてもよく、治療的介入は、治療的介入が後に対象に実施される場合よりも効果的である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、がんの重症度を軽減するか、がんの症状を軽減するか、かつ／または対象内に存在するがん細胞の数を減らし得る。
いくつかの実施形態では、治療的介入は、免疫チェックポイント阻害剤を含んでもよい。免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンシオ）、デュルバルマブ（インフィンジ）、イピリムマブ（ヤーボイ）が挙げられる。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－２６４、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｕｒ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２１（６）：１１９８－１２０５、Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３３（３４）：４０１５－２２、Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６（２６）：２４５５－６５、Ｒｉｃｃｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．１２（５）：ｅ５１－ｅ５５、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｐｉｉ：Ｓ１５２５－７３０４（１７）３００４３－８、Ｚｏｕ ａｎｄ Ａｗａｄ（２０１７）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２８（４）：６８５－６８７、Ｓｏｒｓｃｈｅｒ（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６（１０：９９６－７、Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２８（４）：８７４－８８１、Ｖａｎｓｔｅｅｎｋｉｓｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １７（６）：７８１－７８９、Ｈｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：３１－４１、Ｃｈｅｎ（２０１７）Ｊ．Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ ８０（１）：７－１４を参照のこと。
いくつかの実施形態では、治療的介入は、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは修飾Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）である。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３０）：６２－６８、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎ（２０１７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２３（５）：４３０－４５０、Ｙｅｅ ａｎｄ Ｌｉｚｅｅ（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２３（２）：１４４－１４８、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６（２）：ｅ１２７３３０２、米国特許出願公開第２０１６／０１９４４０４、米国特許出願公開第２０１４／００５０７８８号、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６３５号、米国特許第９，２３３，１２５号を参照のこと（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、治療的介入は化学療法剤である。化学療法剤の非限定的な例としては以下が挙げられる：アムサクリン、アザシチジン、アキサチオプリン、ベバシズマブ（またはその抗原結合フラグメント）、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カペシタビン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ塩酸塩、エトポシド、フルダラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、全トランスレチノイン酸、ストレプトゾシン、タフルポシド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、ウラムスチン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びそれらの組み合わせ。抗癌療法の追加の例は、当該技術分野で公知である。例えば、米国臨床腫瘍学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）（ＡＳＣＯ）、欧州医学腫瘍学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｒｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）（ＥＳＭＯ）、または全米総合癌ネットワーク（ＮＣＣＮ）の治療ガイドラインを参照のこと。
いくつかの実施形態では、対象がＮＲＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独もしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＲＡＳ標的治療薬、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤、及びファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＥＲＫ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、及びＬＸＨ２５４のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（登録商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標）、ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＳＨＲ７３９０、ＴＡＫ－７３３、ＲＯ５１２６７６６、ＣＳ３００６、ＷＸ－５５４、ＰＤ９８０５９、ＣＩ１０４０（ＰＤ１８４３５２）、及びヒポテマイシンのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫ阻害剤は、ＦＲＩ－２０（ＯＮ－０１０６０）、ＶＴＸ－１１ｅ、２５－ＯＨ－Ｄ３－３－ＢＥ（Ｂ３ＣＤ、ブロモアセトキシカルシジオール）、ＦＲ－１８０２０４、ＡＥＺ－１３１（ＡＥＺＳ－１３１）、ＡＥＺＳ－１３６、ＡＺ－１３７６７３７０、ＢＬ－ＥＩ－００１、ＬＹ－３２１４９９６、ＬＴＴ－４６２、ＫＯ－９４７、ＫＯ－９４７、ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）、ＳＣＨ７７２９８４、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）（ＢＶＤ－５２３）、ＣＣ－９０００３、ＧＤＣ－０９９４（ＲＧ－７４８２）、ＡＳＮ００７、ＦＲ１４８０８３、５－７－オキソゼエノール、５－ヨードツベルシジン、ＧＤＣ０９９４、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びｍＴＯＲ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ミルテフォシン（ＩＭＰＡＤＩＶＯ（登録商標））、ウォルトマニン、ＮＬ－７１－１０１、Ｈ－８９、ＧＳＫ６９０６９３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ－６７４５６３、Ａ－４４３６５４、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、ＤＣ１２０、２－［４－（２－アミノプロプ－２－イル）フェニル］－３－フェニルキノキサリン、ＭＫ－２２０６、エデルフォシン、ミルテフォシン、ペリフォシン、エルシルホスホコリン（ｅｒｕｃｙｌｐｈｏｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、エルフォシン、ＳＲ１３６６８、ＯＳＵ－Ａ９、ＰＨ－３１６、ＰＨＴ－４２７、ＰＩＴ－１、ＤＭ－ＰＩＴ－１、トリシリビン（リン酸トリシリビン一水和物）、ＡＰＩ－１、Ｎ－（４－（５－（３－アセトアミドフェニル）－２－（２－アミノピリジン－３－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンジル）－３－フルオロベンズアミド、ＡＲＱ０９２、ＢＡＹ１１２５９７６、３－オキソ－チルカル酸、ラクトキノマイシン、ｂｏｃ－Ｐｈｅ－ビニルケトン、ペリフォシン（Ｄ－２１２６６）、ＴＣＮ、ＴＣＮ－Ｐ、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＭＬＮ０１２８、ＡＺＤ－２０１４、ＣＣ－２２３、ＡＺＤ２０１４、ＣＣ－１１５、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダフォロリムス（ＡＰ－２３５７３）、及びシロリムス（ラパマイシン）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、ロナファルニブ、チピファルニブ、ＢＭＳ－２１４６６２、Ｌ７７８１２３、Ｌ７４４８３２及びＦＴＩ－２７７のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＭＥＫ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＭＥＫ阻害剤及びＥＲＫ阻害剤である。ＮＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんを治療するのに有効である。例えば、ＮＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数は、減らされ得、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズは低減され得るか、転移の速度もしくは程度は低下され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が、全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または、治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＣＴＮＮＢ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＣＴＮＮＢ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＣＴＮＮＢ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、β－カテニン阻害剤、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤、及び紡錘体アセンブリチェックポイントキナーゼＴＴＫ（ＭＰＳ１）阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、β－カテニン阻害剤は、ＰＲＩ－７２４、ＣＷＰ２３２２９１、ＰＮＵ７４６５４、２，４ジアミノ－キナゾリン、ＰＫＦ１１５－５８４、ＰＫＦ１１８－７４４、ＰＫＦ１１８－３１０、ＰＦＫ２２２－８１５、ＣＧＰ０４９０９０、ＺＴＭ０００９９０、ＢＣ２１、ビタミンＤ、レチノイド酸、アスピリン、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、２，４ジアミノ－キナゾリン誘導体、メチル３－｛［（４－メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝安息香酸メチル（ＭＳＡＢ）、ＡＶ６５、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、及びｉＣＲＴ１４のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤は、ＰＲＩ－７２４、ＣＷＰ２３２２９１、ＰＮＵ７４６５４、２，４ジアミノ－キナゾリン、ＰＫＦ１１５－５８４、ＰＫＦ１１８－７４４、ＰＫＦ１１８－３１０、ＰＦＫ２２２－８１５、ＣＧＰ０４９０９０、ＺＴＭ０００９９０、ＢＣ２１、ビタミンＤ、レチノイド酸、アスピリン、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、２，４ジアミノ－キナゾリン誘導体、３－｛［（４－メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝安息香酸メチル（ＭＳＡＢ）、ＡＶ６５、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、ｉＣＲＴ１４、ＳＭ０４５５４、ＬＧＫ９７４、ＸＡＶ９３９、クルクミン（例えば、Ｍｅｒｉｖａ（登録商標））、ケルセチン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＣ）、レスベラトロール、ＤＩＦ、ゲニステイン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））、ＣＷＰ２３２２９１、ＮＳＣ６６８０３６、ＦＪ９、ＢＭＬ－２８６（３２８９－８６２５）、ＩＷＰ、ＩＷＰ－１、ＩＷＰ－２、ＪＷ５５、Ｇ００７－ＬＫ、ピルビニウム、ｆｏｘｙ－５、Ｗｎｔ－５ａ、イパフリセプト（ＯＭＰ－５４Ｆ２８）、バンチクツマブ（ＯＭＰ－１８Ｒ５）、ＯＴＳＡ１０１、ＯＴＳＡ１０１－ＤＴＰＡ－９０Ｙ、ＳＭ０４６９０、ＳＭ０４７５５、ヌトリン３ａ、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１、ＪＷ７４、オカダ酸、タウトマイシン、ＳＢ２３９０６３、ＳＢ２０３５８０、アデノシン二リン酸（ヒドロキシメチル）ピロリジンジオール（ＡＤＰ－ＨＰＤ）、２－［４－（４－フルオロフェニル）ピペラジン－１－イル］－６－メチルピリミジン－４（３Ｈ）－オン、ＰＪ３４、ニクロサミド（ＮＩＣＬＯＣＩＤＥＴＭ）、カンビノール、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、Ｊ０１－０１７ａ、ＮＳＣ６６８０３６、フィリピン、ＩＣ２６１、ＰＦ６７０４６２、ボスチニブ（ＢＯＳＵＬＩＦ（登録商標））、ＰＨＡ６６５７５２、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＩＣＧ－００１、エタクリン酸、エタクリン酸誘導体、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、Ｒｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、ＳＤＸ－３０８、ＷＮＴ９７４、ＣＧＸ１３２１、ＥＴＣ－１９２２１５９、ＡＤ－ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ３、ＷＩＫＩ４、及びウィンドルフェン（ｗｉｎｄｏｒｐｈｅｎ）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、紡錘体アセンブリチェックポイントキナーゼＴＴＫ（ＭＰＳ１）阻害剤は、ＮＴＲＣ００６６－０、ＣＦＩ－４０２２５７、（５，６－ジヒドロ）ピリミド［４，５－ｅ］インドリジン、及びＢＯＳ１７２７２２のうちの１つまたは複数である。ＣＴＮＮＢ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＣＴＮＮＢ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＣＴＮＮＢ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が減少され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状は、全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または生存は、治療を受けない場合の予想生存期間と比較して延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、ならびにＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲ二重阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤は、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ＧＤＣ－００７７、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、及びＣＨ５１３２７９９である。いくつかの実施形態では、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＺＳＴＫ４７４、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ＡＭＧ５１１、ＰＫＩ－４０２、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、及びＷＸ－０３７である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲ二重阻害剤は、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、ＰＱＲ３０９、ＳＦ１１２６、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、及びＰＩ－１０３である。いくつかの実施形態では、ＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの１つまたは複数である。ＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＦＢＸＷ７に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＦＢＸＷ７に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独もしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＦＢＸＷ７に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ｍＴＯＲ阻害剤及びＭＣＬ－１阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＭＬＮ０１２８、ＡＺＤ－２０１４、ＣＣ－２２３、ＡＺＤ２０１４、ＣＣ－１１５、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダフォロリムス（ＡＰ－２３５７３）、及びシロリムス（ラパマイシン）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＣＬ－１阻害剤は、Ｓ６３８４５、ＡＺＤ５９９１、ＡＭＧ１７６、４８３－ＬＭ、及びＭＩＫ６６５である。ＦＢＸＷ７に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＦＢＸＷ７に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＦＢＸＷ７に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＡＰＣに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＡＰＣに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＡＰＣに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＴＡＳＩＮ－１（短縮ＡＰＣ選択的阻害剤（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＡＰＣ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＩＮｈｉｂｉｔｏｒ））及びＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤は、ＰＲＩ－７２４、ＣＷＰ２３２２９１、ＰＮＵ７４６５４、２，４ジアミノ－キナゾリン、ＰＫＦ１１５－５８４、ＰＫＦ１１８－７４４、ＰＫＦ１１８－３１０、ＰＦＫ２２２－８１５、ＣＧＰ０４９０９０、ＺＴＭ０００９９０、ＢＣ２１、ビタミンＤ、レチノイド酸、アスピリン、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、２，４ジアミノ－キナゾリン誘導体、３－｛［（４－メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝安息香酸メチル（ＭＳＡＢ）、ＡＶ６５、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、ｉＣＲＴ１４、ＰＲＩ－７２４、ＣＷＰ２３２２９１、ＰＮＵ７４６５４、２，４ジアミノキナゾリン、ＰＫＦ１１５－５８４、ＰＫＦ１１８－７４４、ＰＫＦ１１８－３１０、ＰＦＫ２２２－８１５、ＣＧＰ０４９０９０、ＺＴＭ０００９９０、ＢＣ２１、ビタミンＤ、レチノイド酸、アスピリン、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、２，４ジアミノ－キナゾリン誘導体、３－｛［（４－メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝安息香酸メチル（ＭＳＡＢ）、ＡＶ６５、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、ｉＣＲＴ１４、ＳＭ０４５５４、ＬＧＫ９７４、ＸＡＶ９３９、クルクミン（例えば、Ｍｅｒｉｖａ（登録商標））、ケルセチン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＣ）、レスベラトロール、ＤＩＦ、ゲニステイン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））、ＣＷＰ２３２２９１、ＮＳＣ６６８０３６、ＦＪ９、ＢＭＬ－２８６（３２８９－８６２５）、ＩＷＰ、ＩＷＰ－１、ＩＷＰ－２、ＪＷ５５、Ｇ００７－ＬＫ、ピルビニウム、ｆｏｘｙ－５、Ｗｎｔ－５ａ、イパフリセプト（ＯＭＰ－５４Ｆ２８）、バンチクツマブ（ＯＭＰ－１８Ｒ５）、ＯＴＳＡ１０１、ＯＴＳＡ１０１－ＤＴＰＡ－９０Ｙ、ＳＭ０４６９０、ＳＭ０４７５５、ヌトリン３ａ、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１、ＪＷ７４、オカダ酸、タウトマイシン、ＳＢ２３９０６３、ＳＢ２０３５８０、アデノシン二リン酸（ヒドロキシメチル）ピロリジンジオール（ＡＤＰ－ＨＰＤ）、２－［４－（４－フルオロフェニル）ピペラジン－１－イル］－６－メチルピリミジン－４（３Ｈ）－オン、ＰＪ３４、ニクロサミド（ＮＩＣＬＯＣＩＤＥＴＭ）、カンビノール、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、Ｊ０１－０１７ａ、ＮＳＣ６６８０３６、フィリピン、ＩＣ２６１、ＰＦ６７０４６２、ボスチニブ（ＢＯＳＵＬＩＦ（登録商標））、ＰＨＡ６６５７５２、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＩＣＧ－００１、エタクリン酸、エタクリン酸誘導体、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、Ｒｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、ＳＤＸ－３０８、ＷＮＴ９７４、ＣＧＸ１３２１、ＥＴＣ－１９２２１５９、ＡＤ－ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ３、ＷＩＫＩ４、及びウィンドルフェン（ｗｉｎｄｏｒｐｈｅｎ）のうちの１つまたは複数である。ＡＰＣにおいて遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＡＰＣに遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＥＧＦＲに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独もしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、１つまたは複数のＥＧＦＲ選択的阻害剤、汎ＨＥＲ阻害剤、及び抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、共有結合阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、非共有結合阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、オシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１、メレレチニブ、ＴＡＧＲＩＳＳＯＴＭ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、ネシツムマブ（ＰＯＲＴＲＡＺＺＡＴＭ、ＩＭＣ－１１Ｆ８）、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２、ＮＥＲＬＹＮＸ（登録商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、パニツムマブ（ＡＢＸ－ＥＧＦ、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、バンデタニブ（ＣＡＰＲＥＬＳＡ（登録商標））、ロシレチニブ（ＣＯ－１６８６）、オルムチニブ（ＯＬＩＴＡＴＭ、ＨＭ６１７１３、ＢＩ－１４８２６９４）、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６、ＮＶＳ－８１６）、ＰＦ－０６７４７７７５、イコチニブ（ＢＰＩ－２００９Ｈ）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、ＧＩＬＯＴＲＩＦ（登録商標））、ダコミチニブ（ＰＦ－００２９９８０４、ＰＦ－８０４、ＰＦ－２９９、ＰＦ－２９９８０４）、アビチニブ（ＡＣ００１０）、ＡＣ００１０ＭＡ ＥＡＩ０４５、マツズマブ（ＥＭＤ－７２００）、ニモツズマブ（ｈ－Ｒ３、ＢＩＯＭＡｂ ＥＧＦＲ（登録商標））、ザルツマブ、ＭＤＸ４４７、デパツキシズマブ（ヒト化ｍＡｂ ８０６、ＡＢＴ－８０６））、デパツツキシズマブマホドチン（ＡＢＴ－４１４）、ＡＢＴ－８０６、ｍＡｂ ８０６、カネルチニブ（ＣＩ－１０３３）、シコニン、シコニン誘導体（例えば、デオキシシコニン、イソブチリルシコニン、アセチルシコニン、β、β－ジメチルアクリルシコニン及びアセチルアルカンニン）、ポジオチニブ（ＮＯＶ１２０１０１、ＨＭ７８１－３６Ｂ）、ＡＶ－４１２、イブルチニブ、ＷＺ４００２、ブリガチニブ（ＡＰ２６１１３、ＡＬＵＮＢＲＩＧ（登録商標））、ペリチニブ（ＥＫＢ－５６９）、タロキソチニブ（ＴＨ－４０００、ＰＲ６１０）、ＢＰＩ－１５０８６、Ｈｅｍａｙ０２２、ＺＮ－ｅ４、テセバチニブ（ＫＤ０１９、ＸＬ６４７）、ＹＨ２５４４８、エピチニブ（ＨＭＰＬ－８１３）、ＣＫ－１０１、ＭＭ－１５１、ＡＺＤ３７５９、ＺＤ６４７４、ＰＦ－０６４５９９８８、バルリンチニブ（ＡＳＬＡＮ００１、ＡＲＲＹ－３３４５４３）、ＡＰ３２７８８、ＨＬＸ０７、Ｄ－０３１６、ＡＥＥ７８８、ＨＳ－１０２９６、アビチニブ、ＧＷ５７２０１６、ピロチニブ（ＳＨＲ１２５８）、ＳＣＴ２００、ＣＰＧＪ６０２、Ｓｙｍ００４、ＭＡｂ－４２５、モドツキシマブ（Ｍｏｄｏｔｕｘｉｍａｂ）（ＴＡＢ－Ｈ４９）、フツキシマブ（９９２ ＤＳ）、ザルツムマブ、ＫＬ－１４０、ＲＯ５０８３９４５、ＩＭＧＮ２８９、ＪＮＪ－６１１８６３７２、ＬＹ３１６４５３０、Ｓｙｍ０１３、ＡＭＧ５９５、ＥＧＦＲＢｉアームド自己Ｔ細胞、及びＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ療法のうちの１つまたは複数である。ＥＧＦＲに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＥＧＦＲに遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＢＲＡＦに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、ＬＸＨ２５４のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、またはＬＸＨ２５４であり、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（登録商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標）、ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＳＨＲ７３９０、ＴＡＫ－７３３、ＲＯ５１２６７６６、ＣＳ３００６、ＷＸ－５５４、ＰＤ９８０５９、ＣＩ１０４０（ＰＤ１８４３５２）、またはヒポテマイシンである。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＢＲＡＦ阻害剤及びＥＲＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、またはＬＸＨ２５４であり、ＥＲＫ阻害剤は、ＦＲＩ－２０（ＯＮ－０１０６０）、ＶＴＸ－１１ｅ、２５－ＯＨ－Ｄ３－３－ＢＥ（Ｂ３ＣＤ、ブロモアセトキシカルシジオール）、ＦＲ－１８０２０４、ＡＥＺ－１３１（ＡＥＺＳ－１３１）、ＡＥＺＳ－１３６、ＡＺ－１３７６７３７０、ＢＬ－ＥＩ－００１、ＬＹ－３２１４９９６、ＬＴＴ－４６２、ＫＯ－９４７、ＫＯ－９４７、ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）、ＳＣＨ７７２９８４、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）（ＢＶＤ－５２３）、ＣＣ－９０００３、ＧＤＣ－０９９４（ＲＧ－７４８２）、ＡＳＮ００７、ＦＲ１４８０８３、５－７－オキソゼエノール、５－ヨードツベルシジン、ＧＤＣ０９９４、またはＯＮＣ２０１である。ＢＲＡＦの遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦの遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＢＲＡＦに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤＮＫ２Ａに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有するとして対象が同定される場合、その対象は治療的介入を実施される。いくつかの実施形態では、ＣＤＮＫ２Ａに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＣＤＮＫ２Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＣＤＫ４／６阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブ、リボシクリブ、及びアベマシクリブのうちの１つまたは複数である。ＣＤＮＫ２Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＣＤＮＫ２Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＣＤＮＫ２Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤＫＮ２に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると対象が同定される場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＣＤＫＮ２に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＣＤＫＮ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＣＤＫ４／６阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブ、リボシクリブ、及びアベマシクリブのうちの１つまたは複数である。ＣＤＫＮ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＣＤＫＮ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＣＤＫＮ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＰＴＥＮに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路阻害剤及びＰＡＲＰ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びｍＴＯＲ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの1つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ミルテフォシン（ＩＭＰＡＤＩＶＯ（登録商標））、ウォルトマニン、ＮＬ－７１－１０１、Ｈ－８９、ＧＳＫ６９０６９３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ－６７４５６３、Ａ－４４３６５４、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、ＤＣ１２０、２－［４－（２－アミノプロプ－２－イル）フェニル］－３－フェニルキノキサリン、ＭＫ－２２０６、エデルフォシン、ミルテフォシン、ペリフォシン、エルシルホスホコリン（ｅｒｕｃｙｌｐｈｏｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、エルフォシン、ＳＲ１３６６８、ＯＳＵ－Ａ９、ＰＨ－３１６、ＰＨＴ－４２７、ＰＩＴ－１、ＤＭ－ＰＩＴ－１、トリシリビン（リン酸トリシリビン一水和物）、ＡＰＩ－１、Ｎ－（４－（５－（３－アセトアミドフェニル）－２－（２－アミノピリジン－３－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンジル）－３－フルオロベンズアミド、ＡＲＱ０９２、ＢＡＹ１１２５９７６、３－オキソ－チルカル酸、ラクトキノマイシン、ｂｏｃ－Ｐｈｅ－ビニルケトン、ペリフォシン（Ｄ－２１２６６）、ＴＣＮ、ＴＣＮ－Ｐ、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＭＬＮ０１２８、ＡＺＤ－２０１４、ＣＣ－２２３、ＡＺＤ２０１４、ＣＣ－１１５、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダフォロリムス（ＡＰ－２３５７３）、及びシロリムス（ラパマイシン）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、ロナファルニブ、チピファルニブ、ＢＭＳ－２１４６６２、Ｌ７７８１２３、Ｌ７４４８３２及びＦＴＩ－２７７のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、ベリパリブ、イニパリブ、ルカパリブ、ＣＥＰ－９７２２、Ｅ７０１６、またはＥ７４４９のうちの１つまたは複数である。ＰＴＥＮに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＰＴＥＮに遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＦＧＦＲ２に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、抗ＦＧＦＲ２抗体、ＦＧＦＲ２選択的阻害剤及び汎ＦＧＦＲ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、共有結合性ＦＧＦＲ２阻害剤（例えば、ＰＲＮ１３７１、ＢＬＵ９９３１、ＦＩＩＮ－４、Ｈ３Ｂ－６５２７、及びＦＩＩＮ－２）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、非共有結合性ＦＧＦＲ２阻害剤（例えば、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８、Ｄｅｂｉｏ－１３４７、ドビチニブ、ＪＮＪ－４２７５６４９３及びＬＹ２８７４４５５）である。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２抗体は、ＧＰ３６９、ＢＡＹ１１８７９８２、またはＦＰＡ１４４（ベマリツズマブ）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、ＰＲＮ１３７１、ＢＬＵ９９３１、ＦＩＩＮ－４、Ｈ３Ｂ－６５２７、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８、ＡＲＱ０８７、ＴＡＳ－１２０、ＪＮＪ－４２７５６４９３、ＣＨ５１８３２８４／Ｄｅｂｉｏ １３４７、ＩＮＣＢ０５４８２８、ＧＰ３６９、ＢＡＹ１１８７９８２、またはＦＰＡ１４４（ベマリツズマブ）、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８、ＪＮＪ－４２７５６４９３（エルダフィチニブ）、ロガラチニブ（ＢＡＹ１１６３８７７）、ＦＩＩＮ－２、ＪＮＪ－４２７５６４９３、ＬＹ２８７４４５５、レンバチニブ（Ｅ７０８０）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３－４５０６）、ドビチニブ（ＴＫＩ２５８）、ルシタニブ（Ｅ３８１０）、セジラニブ（ＡＺＤ２１７１）、インテダニブ（ＢＩＢＦ１１２０）、ブリバニブ（ＢＭＳ－５４０２１５）、ＡＳＰ５８７８、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８（インフィグラチニブ）、Ｅ７０９０、ＨＭＰＬ－４５３、ニンテダニブ（ＯＦＥＶ（登録商標）、ＢＩＢＦ１１２０）、ＭＡＸ－４０２７９、ＸＬ９９９、オランチニブ（ＳＵ６６６８）、パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（登録商標））、アンロチニブ、ＡＬ３８１８のうちの１つまたは複数である。ＦＧＦＲ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＦＧＦＲ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＨＲＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＨＲＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＨＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＲＡＳ標的治療薬、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤、及びファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＥＲＫ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、及びＬＸＨ２５４のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（登録商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標）、ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＳＨＲ７３９０、ＴＡＫ－７３３、ＲＯ５７６６、ＣＳ３００６、ＷＸ－５５４、ＰＤ９８０５９、ＣＩ１０４０（ＰＤ１８４３５２）、及びヒポテマイシンのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫ阻害剤は、ＦＲＩ－２０（ＯＮ－０１０６０）、ＶＴＸ－１１ｅ、２５－ＯＨ－Ｄ３－３－ＢＥ（Ｂ３ＣＤ、ブロモアセトキシカルシジオール）、ＦＲ－１８０２０４、ＡＥＺ－１３１（ＡＥＺＳ－１３１）、ＡＥＺＳ－１３６、ＡＺ－１３７６７３７０、ＢＬ－ＥＩ－００１、ＬＹ－３２１４９９６、ＬＴＴ－４６２、ＫＯ－９４７、ＫＯ－９４７、ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）、ＳＣＨ７７２９８４、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）（ＢＶＤ－５２３）、ＣＣ－９０００３、ＧＤＣ－０９９４（ＲＧ－７４８２）、ＡＳＮ００７、ＦＲ１４８０８３、５－７－オキソゼエノール、５－ヨードツベルシジン、ＧＤＣ０９９４、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びｍＴＯＲ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ミルテフォシン（ＩＭＰＡＤＩＶＯ（登録商標））、ウォルトマニン、ＮＬ－７１－１０１、Ｈ－８９、ＧＳＫ６９０６９３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ－６７４５６３、Ａ－４４３６５４、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、ＤＣ１２０、２－［４－（２－アミノプロプ－２－イル）フェニル］－３－フェニルキノキサリン、ＭＫ－２２０６、エデルフォシン、ミルテフォシン、ペリフォシン、エルシルホスホコリン（ｅｒｕｃｙｌｐｈｏｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、エルフォシン、ＳＲ１３６６８、ＯＳＵ－Ａ９、ＰＨ－３１６、ＰＨＴ－４２７、ＰＩＴ－１、ＤＭ－ＰＩＴ－１、トリシリビン（リン酸トリシリビン一水和物）、ＡＰＩ－１、Ｎ－（４－（５－（３－アセトアミドフェニル）－２－（２－アミノピリジン－３－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンジル）－３－フルオロベンズアミド、ＡＲＱ０９２、ＢＡＹ１１２５９７６、３－オキソ－チルコール酸、ラクトキノマイシン、ｂｏｃ－Ｐｈｅ－ビニルケトン、ペリフォシン（Ｄ－２１２６６）、ＴＣＮ、ＴＣＮ－Ｐ、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＭＬＮ０１２８、ＡＺＤ－２０１４、ＣＣ－２２３、ＡＺＤ２０１４、ＣＣ－１１５、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダフォロリムス（ＡＰ－２３５７３）、及びシロリムス（ラパマイシン）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、ロナファルニブ、チピファルニブ、ＢＭＳ－２１４６６２、Ｌ７７８１２３、Ｌ７４４８３２及びＦＴＩ－２７７のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＨＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＭＥＫ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＨＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＭＥＫ阻害剤及びＥＲＫ阻害剤である。ＨＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＨＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＨＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＫＲＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＲＡＳ標的治療薬、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤、及びファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳ標的治療薬は、ＳＭＬ－１０－７０－４及びＡＡ１２のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＥＲＫ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、及びＬＸＨ２５４のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（登録商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標）、ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＳＨＲ７３９０、ＴＡＫ－７３３、ＲＯ５１２６７６６、ＣＳ３００６、ＷＸ－５５４、ＰＤ９８０５９、ＣＩ１０４０（ＰＤ１８４３５２）、及びヒポテマイシンのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫ阻害剤は、ＦＲＩ－２０（ＯＮ－０１０６０）、ＶＴＸ－１１ｅ、２５－ＯＨ－Ｄ３－３－ＢＥ（Ｂ３ＣＤ、ブロモアセトキシカルシジオール）、ＦＲ－１８０２０４、ＡＥＺ－１３１（ＡＥＺＳ－１３１）、ＡＥＺＳ－１３６、ＡＺ－１３７６７３７０、ＢＬ－ＥＩ－００１、ＬＹ－３２１４９９６、ＬＴＴ－４６２、ＫＯ－９４７、ＫＯ－９４７、ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）、ＳＣＨ７７２９８４、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）（ＢＶＤ－５２３）、ＣＣ－９０００３、ＧＤＣ－０９９４（ＲＧ－７４８２）、ＡＳＮ００７、ＦＲ１４８０８３、５－７－オキソゼエノール、５－ヨードツベルシジン、ＧＤＣ０９９４、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びｍＴＯＲ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ミルテフォシン（ＩＭＰＡＤＩＶＯ（登録商標））、ウォルトマニン、ＮＬ－７１－１０１、Ｈ－８９、ＧＳＫ６９０６９３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ－６７４５６３、Ａ－４４３６５４、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、ＤＣ１２０、２－［４－（２－アミノプロプ－２－イル）フェニル］－３－フェニルキノキサリン、ＭＫ－２２０６、エデルフォシン、ミルテフォシン、ペリフォシン、エルシルホスホコリン（ｅｒｕｃｙｌｐｈｏｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、エルフォシン、ＳＲ１３６６８、ＯＳＵ－Ａ９、ＰＨ－３１６、ＰＨＴ－４２７、ＰＩＴ－１、ＤＭ－ＰＩＴ－１、トリシリビン（リン酸トリシリビン一水和物）、ＡＰＩ－１、Ｎ－（４－（５－（３－アセトアミドフェニル）－２－（２－アミノピリジン－３－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンジル）－３－フルオロベンズアミド、ＡＲＱ０９２、ＢＡＹ１１２５９７６、３－オキソ－チルコール酸、ラクトキノマイシン、ｂｏｃ－Ｐｈｅ－ビニルケトン、ペリフォシン（Ｄ－２１２６６）、ＴＣＮ、ＴＣＮ－Ｐ、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＭＬＮ０１２８、ＡＺＤ－２０１４、ＣＣ－２２３、ＡＺＤ２０１４、ＣＣ－１１５、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダフォロリムス（ＡＰ－２３５７３）、及びシロリムス（ラパマイシン）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、ロナファルニブ、チピファルニブ、ＢＭＳ－２１４６６２、Ｌ７７８１２３、Ｌ７４４８３２及びＦＴＩ－２７７のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＭＥＫ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＭＥＫ阻害剤及びＥＲＫ阻害剤である。ＫＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＫＲＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＡＫＴ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ミルテフォシン（ＩＭＰＡＤＩＶＯ（登録商標））、ウォルトマニン、ＮＬ－７１－１０１、Ｈ－８９、ＧＳＫ６９０６９３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ－６７４５６３、Ａ－４４３６５４、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、ＤＣ１２０、２－［４－（２－アミノプロプ－２－イル）フェニル］－３－フェニルキノキサリン、ＭＫ－２２０６、エデルフォシン、ミルテフォシン、ペリフォシン、エルシルホスホコリン（ｅｒｕｃｙｌｐｈｏｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、エルフォシン、ＳＲ１３６６８、ＯＳＵ－Ａ９、ＰＨ－３１６、ＰＨＴ－４２７、ＰＩＴ－１、ＤＭ－ＰＩＴ－１、トリシリビン（リン酸トリシリビン一水和物）、ＡＰＩ－１、Ｎ－（４－（５－（３－アセトアミドフェニル）－２－（２－アミノピリジン－３－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンジル）－３－フルオロベンズアミド、ＡＲＱ０９２、ＢＡＹ１１２５９７６、３－オキソ－チルカル酸、ラクトキノマイシン、ｂｏｃ－Ｐｈｅ－ビニルケトン、ペリフォシン（Ｄ－２１２６６）、ＴＣＮ、ＴＣＮ－Ｐ、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。ＡＫＴ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＡＫＴ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＴＰ５３に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ｐ５３再活性化及び大規模アポトーシス－１の誘導（ｐ５３ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｓｓｉｖｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－１）（ＰＲＩＭＡ－１）、ＡＰＲ－２４６（ＰＲＩＭＡ－１ＭＥＴ）、ＰＫ１１００７などの２－スルホニルピリミジン、ＰＫ７０８８などのピラゾール、亜鉛メタロシャペロン－１（ＺＭＣ１；ＮＳＣ３１９７２６／ＺＭＣ１）、チオセミカルバゾン（例えば、ＣＯＴＩ－２）、ＣＰ－３１３９８、ＳＴＩＭＡ－１（大規模なアポトーシスを誘導するＳＨグループ標的化化合物）、ＭＩＲＡ－１（ＮＳＣ１９６３０）及びその類似体ＭＩＲＡ－２及び－３、ＲＩＴＡ（ＮＳＣ６５２２８７）、ケトミン（ＣＴＭ）、ＰＫ７０８８、スチクト酸（ＮＳＣ８７５１１）、ｐ５３Ｒ３、ＳＣＨ５２９０７４、ＷＲ－１０６５、Ｈｓｐ９０阻害剤（例えば、１７－ＡＡＧ、ゲルダナマイシン、ガネテスピブ、ＡＵＹ９２２、ＩＰＩ－５０４）、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ボリノスタット／ＳＡＨＡ、ロミデプシン／デプシペプチド、ＨＢＩ－８０００）、ヒ素化合物、ガンボギン酸、スパウチン－１、ＹＫ－３－２３７、ＮＳＣ５９９８４、ジスルフィラム（ＤＳＦ）、ゲンタマイシン、Ｇ４１８、及びアミカミシン、再活性化転写活性（ｒｅａｃｔｉｖａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＲＥＴＲＡ）、ＰＤ０１６６２８５、ＭＤＭ２の阻害剤（例えば、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＲＯ５５０３７８１、ＭＩ－７７３（ＳＡＲ４０５８３８）、ＤＳ－３０３２ｂ、ＡＭ－８５５３、ＡＭＧ２３２、ＭＩ－２１９、ＭＩ－７１３、ＭＩ－８８８、ＴＤＰ５２１２５２、ＮＳＣ２７９２８７、ＰＸＮ８２２、ＳＡＨ－８（ステープルドペプチド）、ＡＴＳＰ－７０４１、スピロオリゴマー、ＰＫ０８３、ＰＫ５１７４、ＰＫ５１９６、ＰＫ７０８８、ヌトリン３ａ、ＲＧ７３８８、Ｒｏ－２４４３、スティック酸、及びＮＳＣ３１９７２６）、及びＭＤＭ４の阻害剤のうちの１つまたは複数である。ＴＰ５３に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＴＰ５３に遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、ＰＰＰ２Ｒ１Ａに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると対象が同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＰＰＰ２Ｒ１Ａに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＰＰＰ２Ｒ１Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＳＥＴ阻害剤（例えば、ＦＴＹ－７２０、セラミド、及びＯＰ４４９）などのＰＰ２Ａの活性化剤のうちの１つまたは複数である。ＰＰＰ２Ｒ１Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＰＰＰ２Ｒ１Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＰＰＰ２Ｒ１Ａに遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＧＮＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＧＮＡＳに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＧＮＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤及びＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＥＲＫ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、及びＬＸＨ２５４のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（登録商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標）、ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＳＨＲ７３９０、ＴＡＫ－７３３、ＲＯ５１２６７６６、ＣＳ３００６、ＷＸ－５５４、ＰＤ９８０５９、ＣＩ１０４０（ＰＤ１８４３５２）、及びヒポテマイシンのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫ阻害剤は、ＦＲＩ－２０（ＯＮ－０１０６０）、ＶＴＸ－１１ｅ、２５－ＯＨ－Ｄ３－３－ＢＥ（Ｂ３ＣＤ、ブロモアセトキシカルシジオール）、ＦＲ－１８０２０４、ＡＥＺ－１３１（ＡＥＺＳ－１３１）、ＡＥＺＳ－１３６、ＡＺ－１３７６７３７０、ＢＬ－ＥＩ－００１、ＬＹ－３２１４９９６、ＬＴＴ－４６２、ＫＯ－９４７、ＫＯ－９４７、ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）、ＳＣＨ７７２９８４、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）（ＢＶＤ－５２３）、ＣＣ－９０００３、ＧＤＣ－０９９４（ＲＧ－７４８２）、ＡＳＮ００７、ＦＲ１４８０８３、５－７－オキソゼエノール、５－ヨードツベルシジン、ＧＤＣ０９９４、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤は、ＰＲＩ－７２４、ＣＷＰ２３２２９１、ＰＮＵ７４６５４、２，４ジアミノ－キナゾリン、ＰＫＦ１１５－５８４、ＰＫＦ１１８－７４４、ＰＫＦ１１８－３１０、ＰＦＫ２２２－８１５、ＣＧＰ０４９０９０、ＺＴＭ０００９９０、ＢＣ２１、ビタミンＤ、レチノイド酸、アスピリン、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、２，４ジアミノ－キナゾリン誘導体、３－｛［（４－メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝安息香酸メチル（ＭＳＡＢ）、ＡＶ６５、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、ｉＣＲＴ１４、ＰＲＩ－７２４、ＣＷＰ２３２２９１、ＰＮＵ７４６５４、２，４ジアミノキナゾリン、ＰＫＦ１１５－５８４、ＰＫＦ１１８－７４４、ＰＫＦ１１８－３１０、ＰＦＫ２２２－８１５、ＣＧＰ０４９０９０、ＺＴＭ０００９９０、ＢＣ２１、ビタミンＤ、レチノイド酸、アスピリン、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、２，４ジアミノ－キナゾリン誘導体、３－｛［（４－メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝安息香酸メチル（ＭＳＡＢ）、ＡＶ６５、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、ｉＣＲＴ１４、ＳＭ０４５５４、ＬＧＫ９７４、ＸＡＶ９３９、クルクミン（例えば、Ｍｅｒｉｖａ（登録商標））、ケルセチン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＣ）、レスベラトロール、ＤＩＦ、ゲニステイン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））、ＣＷＰ２３２２９１、ＮＳＣ６６８０３６、ＦＪ９、ＢＭＬ－２８６（３２８９－８６２５）、ＩＷＰ、ＩＷＰ－１、ＩＷＰ－２、ＪＷ５５、Ｇ００７－ＬＫ、ピルビニウム、ｆｏｘｙ－５、Ｗｎｔ－５ａ、イパフリセプト（ｉｐａｆｒｉｃｅｐｔ）（ＯＭＰ－５４Ｆ２８）、バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）（ＯＭＰ－１８Ｒ５）、ＯＴＳＡ１０１、ＯＴＳＡ１０１－ＤＴＰＡ－９０Ｙ、ＳＭ０４６９０、ＳＭ０４７５５、ヌトリン３ａ、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１、ＪＷ７４、オカダ酸、タウトマイシン、ＳＢ２３９０６３、ＳＢ２０３５８０、アデノシン二リン酸（ヒドロキシメチル）ピロリジンジオール（ＡＤＰ－ＨＰＤ）、２－［４－（４－フルオロフェニル）ピペラジン－１－イル］－６－メチルピリミジン－４（３Ｈ）－オン、ＰＪ３４、ニクロサミド（ＮＩＣＬＯＣＩＤＥＴＭ）、カンビノール、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）、Ａｆｌｏｄａｃ）、Ｊ０１－０１７ａ、ＮＳＣ６６８０３６、フィリピン、ＩＣ２６１、ＰＦ６７０４６２、ボスチニブ（ＢＯＳＵＬＩＦ（登録商標））、ＰＨＡ６６５７５２、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＩＣＧ－００１、エタクリン酸、エタクリン酸誘導体、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、Ｒｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、ＳＤＸ－３０８、ＷＮＴ９７４、ＣＧＸ１３２１、ＥＴＣ－１９２２１５９、ＡＤ－ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ３、ＷＩＫＩ４、及びウインドルフェン（ｗｉｎｄｏｒｐｈｅｎ）のうちの１つまたは複数である。ＧＮＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＧＮＡＳに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＧＮＡＳの遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＳＭＡＤ４に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ４に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ４に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、抗血管新生療法、及び５－ＦＵベースの化学療法のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、抗血管新生療法は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＨ５、ＥＤＮＲＡ、ＡＮＧＰＴ２、ＣＤ３４、及びＡＮＧＰＴのうちの１つまたは複数の阻害剤である。いくつかの実施形態では、抗血管新生療法は、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＴＫＩ－５３８、スニチニブ（ＳＵ１１２４８、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、サリドマイド、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、ラニビズマブ、ＥＹＥ００１、及びアキシチニブ（ＡＧ０１３７３６、ＩＮＬＹＴＡ（登録商標））のうちの１つまたは複数である。ＳＭＡＤ４に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ４に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＳＭＡＤ４に遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＰＯＬＥに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＥに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＥに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、免疫療法及び免疫チェックポイント阻害剤のうちの１つまたは複数である。ＰＯＬＥの遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＥに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんを治療するのに有効である。例えば、ＰＯＬＥの遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＲＮＦ４３に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＲＮＦ４３に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＲＮＦ４３に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、自己ＲＮＦ４３ペプチドパルス樹状細胞（ＤＣ）、ＲＮＦ４３ペプチドパルスＤＣ、全身低用量インターロイキン－２、及びＰＯＲＣＮ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＯＲＣＮ阻害剤は、ＲＸＣ０００４、ＥＴＣ－１９２２１５９、ＥＴＣ－１５９、ＩＷＰ－２、ＬＧＫ９７４、及びＷＮＴ－Ｃ５９のうちの１つまたは複数である。ＲＮＦ４３に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＲＮＦ４３に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＲＮＦ４３に遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＭＡＰＫ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＭＡＰＫ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でまたは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＭＡＰＫ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＢＢ受容体阻害剤（例えばＥＧＦＲ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤）、またはＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫ阻害剤は、ＦＲＩ－２０（ＯＮ－０１０６０）、ＶＴＸ－１１ｅ、２５－ＯＨ－Ｄ３－３－ＢＥ（Ｂ３ＣＤ、ブロモアセトキシカルシジオール）、ＦＲ－１８０２０４、ＡＥＺ－１３１（ＡＥＺＳ－１３１）、ＡＥＺＳ－１３６、ＡＺ－１３７６７３７０、ＢＬ－ＥＩ－００１、ＬＹ－３２１４９９６、ＬＴＴ－４６２、ＫＯ－９４７、ＫＯ－９４７、ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）、ＳＣＨ７７２９８４、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）（ＢＶＤ－５２３）、ＣＣ－９０００３、ＧＤＣ－０９９４（ＲＧ－７４８２）、ＡＳＮ００７、ＦＲ１４８０８３、５－７－オキソゼエノール、５－ヨードツベルシジン、ＧＤＣ０９９４、ＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（登録商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標）、ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＳＨＲ７３９０、ＴＡＫ－７３３、ＲＯ５１２６７６６、ＣＳ３００６、ＷＸ－５５４、ＰＤ９８０５９、ＣＩ１０４０（ＰＤ１８４３５２）、及びヒポテマイシンのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びｍＴＯＲ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ウォルトマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ阻害剤は、ミルテフォシン（ＩＭＰＡＤＩＶＯ（登録商標））、ウォルトマニン、ＮＬ－７１－１０１、Ｈ－８９、ＧＳＫ６９０６９３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ－６７４５６３、Ａ－４４３６５４、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、ＤＣ１２０、２－［４－（２－アミノプロプ－２－イル）フェニル］－３－フェニルキノキサリン、ＭＫ－２２０６、エデルフォシン、ミルテフォシン、ペリフォシン、エルシルホスホコリン（ｅｒｕｃｙｌｐｈｏｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、エルフォシン、ＳＲ１３６６８、ＯＳＵ－Ａ９、ＰＨ－３１６、ＰＨＴ－４２７、ＰＩＴ－１、ＤＭ－ＰＩＴ－１、トリシリビン（リン酸トリシリビン一水和物）、ＡＰＩ－１、Ｎ－（４－（５－（３－アセトアミドフェニル）－２－（２－アミノピリジン－３－イル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンジル）－３－フルオロベンズアミド、ＡＲＱ０９２、ＢＡＹ１１２５９７６、３－オキソ－チルコール酸、ラクトキノマイシン、ｂｏｃ－Ｐｈｅ－ビニルケトン、ペリフォシン（Ｄ－２１２６６）、ＴＣＮ、ＴＣＮ－Ｐ、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＭＬＮ０１２８、ＡＺＤ－２０１４、ＣＣ－２２３、ＡＺＤ２０１４、ＣＣ－１１５、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、リダフォロリムス（ＡＰ－２３５７３）、及びシロリムス（ラパマイシン）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２阻害剤は、ＡＺＤ８９３１、ＡＳＴ１３０６、ＡＥＥ７８８、ＣＰ７２４７１４、ＣＵＤＣ１０１、ＴＡＫ２８５、ダコミチニブ、ペリチニブ、ＡＣ４８０、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））、トラスツズマブ－ｄｋｓｔ（ＯＧＩＶＲＩ（登録商標））、ＤＸＬ－７０２、Ｅ－７５、ＰＸ－１０４．１、ＺＷ２５、ＣＰ－７２４７１４、イルビニチニブ（ＡＲＲＹ－３８０、ＯＮＴ－３８０）、ＴＡＳ０７２８、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、ＡＳＴ－１３０６、ＡＥＥ－７８８、ペルリチニブ（ＥＫＢ－５６９）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、ＧＩＬＯＴＲＩＦ（登録商標））、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２、ＮＥＲＬＹＮＸ（登録商標）、ＰＫＩ－１６６、Ｄ－６９４９１、ＨＫＩ－３５７、ＡＰ３２７８８、ＧＷ５７２０１６、カネルチニブ（ＣＩ－１０３３）、ＡＣ－４８０（ＢＭＳ－５９９６２６）、ダコミチニブ（ＰＦ２９９８０４、ＰＦ２９９）、ＲＢ－２００ｈ、ＡＲＲＹ－３３４５４３（ＡＲＲＹ－５４３、ＡＳＬＡＮ００１）、ポジオチニブ（ＮＯＶ１２０１０１）、ＣＵＤＣ－１０１、エモジン、ＩＤＭ－１、アド－トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、ゼマブ、ＤＳ－８２０１ａ、Ｔ－ＤＭ１、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ療法、ＨＥＲ２－ペプチド－Ｖａｋｚｉｎｅ、及びＨＥＲ２Ｂｉ－アームド活性化Ｔ細胞のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、オシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１、メレレチニブ、ＴＡＧＲＩＳＳＯＴＭ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、ネシツムマブ（ＰＯＲＴＲＡＺＺＡＴＭ、ＩＭＣ－１１Ｆ８）、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２、ＮＥＲＬＹＮＸ（登録商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、パニツムマブ（ＡＢＸ－ＥＧＦ、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、バンデタニブ（ＣＡＰＲＥＬＳＡ（登録商標））、ロシレチニブ（ＣＯ－１６８６）、オルムチニブ（ＯＬＩＴＡＴＭ、ＨＭ６１７１３、ＢＩ－１４８２６９４）、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６、ＮＶＳ－８１６）、ＰＦ－０６７４７７７５、イコチニブ（ＢＰＩ－２００９Ｈ）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、ＧＩＬＯＴＲＩＦ（登録商標））、ダコミチニブ（ＰＦ－００２９９８０４、ＰＦ－８０４、ＰＦ－２９９、ＰＦ－２９９８０４）、アビチニブ（ＡＣ００１０）、ＡＣ００１０ＭＡ ＥＡＩ０４５、マツズマブ（ＥＭＤ－７２００）、ニモツズマブ（ｈ－Ｒ３、ＢＩＯＭＡｂＥＧＦＲ（登録商標））、ザルツマブ、ＭＤＸ４４７、デパツキシズマブ（ヒト化ｍＡｂ ８０６、ＡＢＴ－８０６）、デパツキシズマブマフォドチン（ＡＢＴ－４１４）、ＡＢＴ－８０６、ｍＡｂ ８０６、カネルチニブ（ＣＩ－１０３３）、シコニン、シコニン誘導体（例えば、デオキシシコニン、イソブチリルシコニン、アセチルシコニン、β，β－ジメチルアクリルシコニン及びアセチルアルカンニン）、ポジオチニブ（ＮＯＶ１２０１０１、ＨＭ７８１－３６Ｂ）、ＡＶ－４１２、イブルチニブ、ＷＺ４００２、ブリガチニブ（ＡＰ２６１１３、ＡＬＵＮＢＲＩＧ（登録商標））、ペリチニブ（ＥＫＢ－５６９）、タロキソチニブ（ＴＨ－４０００、ＰＲ６１０）、ＢＰＩ－１５０８６、Ｈｅｍａｙ０２２、ＺＮ－ｅ４、テセバチニブ（ＫＤ０１９、ＸＬ６４７）、ＹＨ２５４４８、エピチニブ（ＨＭＰＬ－８１３）、ＣＫ－１０１、ＭＭ－１５１、ＡＺＤ３７５９、ＺＤ６４７４、ＰＦ－０６４５９９８８、バルリンチニブ（ＡＳＬＡＮ００１、ＡＲＲＹ－３３４５４３）、ＡＰ３２７８８、ＨＬＸ０７、Ｄ－０３１６、ＡＥＥ７８８、ＨＳ－１０２９６、アビチニブ、ＧＷ５７２０１６、ピロチニブ（ＳＨＲ１２５８）、ＳＣＴ２００、ＣＰＧＪ６０２、Ｓｙｍ００４、ＭＡｂ－４２５、モドツキシマブ（ＴＡＢ－Ｈ４９）、フツキシマブ（９９２ ＤＳ）、ザルツムマブ、ＫＬ－１４０、ＲＯ５０８３９４５、ＩＭＧＮ２８９、ＪＮＪ－６１１８６３７２、ＬＹ３１６４５３０、Ｓｙｍ０１３、ＡＭＧ５９５、ＥＧＦＲＢｉ－アームド自己Ｔ細胞、及びＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ療法である。ＭＡＰＫ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＭＡＰＫ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＭＡＰＫ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＰＩ３ＫＲ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象は治療的介入を実施される。いくつかの実施形態では、ＰＩ３ＫＲ１に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＰＩ３ＫＲ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、二重のＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲ阻害剤、ならびにＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＺＳＴＫ４７４、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ＡＭＧ５１１、ＰＫＩ－４０２、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、及びＷＸ－０３７である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲ二重阻害剤は、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、ＰＱＲ３０９、ＳＦ１１２６、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、及びＰＩ－１０３である。いくつかの実施形態では、ＰＩＫ３ＣＡに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ブパリシブ（ＢＫＭ１２０）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ＷＸ－０３７、コパンリシブ（ＡＬＩＱＯＰＡＴＭ、ＢＡＹ８０－６９４６）、ダクトリシブ（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＥＺ－２３５）、タセリシブ（ＧＤＣ－００３２、ＲＧ７６０４）、ソノリシブ（ＰＸ－８６６）、ＣＵＤＣ－９０７、ＰＱＲ３０９、ＺＳＴＫ４７４、ＳＦ１１２６、ＡＺＤ８８３５、ＧＤＣ－００７７、ＡＳＮ００３、ピチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ピララリシブ（ＸＬ１４７、ＳＡＲ２４５４０８）、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、セラベリシブ（ＴＡＫ－１１７、ＭＬＮ１１１７、ＩＮＫ１１１７）、ＢＧＴ－２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０）、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８）、ＧＳＫ４５８）、ボクスタリシブ（ＸＬ７５６、ＳＡＲ２４５４０９）、ＡＭＧ５１１、ＣＨ５１３２７９９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＤＣ－００８４（ＲＧ７６６６）、ＶＳ－５５８４（ＳＢ２３４３）、ＰＫＩ－４０２、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ－１０３、リゴセルチブ、ＸＬ－７６５、ＬＹ２０２３４１４、ＳＡＲ２６０３０１、ＫＩＮ－１９３（ＡＺＤ－６４２８）、ＧＳ－９８２０、ＡＭＧ３１９、及びＧＳＫ２６３６７７１のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＥＲＫ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、及びエンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩＴＭ）、ＢＭＳ－９０８６６２（ＸＬ２８１）、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、ＡＲＱ７３６、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ＡＺ３０４、ＰＬＸ－８３９４、ＨＭ９５５７３、ＲＯ５１２６７６６、及びＬＸＨ２５４のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（登録商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標）、ＭＥＫ１６２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＳＨＲ７３９０、ＴＡＫ－７３３、ＲＯ５１２６７６６、ＣＳ３００６、ＷＸ－５５４、ＰＤ９８０５９、ＣＩ１０４０（ＰＤ１８４３５２）、及びヒポテマイシンのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫ阻害剤は、ＦＲＩ－２０（ＯＮ－０１０６０）、ＶＴＸ－１１ｅ、２５－ＯＨ－Ｄ３－３－ＢＥ（Ｂ３ＣＤ、ブロモアセトキシカルシジオール）、ＦＲ－１８０２０４、ＡＥＺ－１３１（ＡＥＺＳ－１３１）、ＡＥＺＳ－１３６、ＡＺ－１３７６７３７０、ＢＬ－ＥＩ－００１、ＬＹ－３２１４９９６、ＬＴＴ－４６２、ＫＯ－９４７、ＫＯ－９４７、ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）、ＳＣＨ７７２９８４、ウリキセルチニブ（ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）（ＢＶＤ－５２３）、ＣＣ－９０００３、ＧＤＣ－０９９４（ＲＧ－７４８２）、ＡＳＮ００７、ＦＲ１４８０８３、５－７－オキソゼエノール、５－ヨードツベルシジン、ＧＤＣ０９９４、及びＯＮＣ２０１のうちの１つまたは複数である。ＰＩ３ＫＲ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＰＩ３ＫＲ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＰＩ３ＫＲ１に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＦＧＦＲ３に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、抗ＦＧＦＲ３抗体、ＦＧＦＲ３選択的阻害剤及び汎ＦＧＦＲ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、共有結合性ＦＧＦＲ阻害剤（例えば、ＰＲＮ１３７１、ＢＬＵ９９３１、ＦＩＩＮ－４、Ｈ３Ｂ－６５２７、及びＦＩＩＮ－２）である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、非共有結合ＦＧＦＲ阻害剤（例えば、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８、Ｄｅｂｉｏ－１３４７、ドビチニブ、ＪＮＪ－４２７５６４９３及びＬＹ２８７４４５５）である。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＭＦＧＲ１８７７ＳまたはＢ－７０１である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、ＭＦＧＲ１８７７Ｓ、Ｂ－７０１、ＦＰ－１０３９（ＧＳＫ２３０）、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８、ＪＮＪ－４２７５６４９３（エルダフィチニブ）、ロガラチニブ（ＢＡＹ１１６３８７７）、ＦＩＩＮ－２、ＪＮＪ－４２７５６４９３、ＬＹ２８７４４５５、レンバチニブ（Ｅ７０８０）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３－４５０６）、ドビチニブ（ＴＫＩ２５８）、ルシタニブ（Ｅ３８１０）、セジラニブ（ＡＺＤ２１７１）、インテダニブ（ＢＩＢＦ１１２０）、ブリバニブ（ＢＭＳ－５４０２１５）、ＡＳＰ５８７８、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８（インフィグラチニブ）、Ｄｅｂｉｏ－１３４７、ドビチニブ、Ｅ７０９０、ＨＭＰＬ－４５３、ニンテダニブ（ＯＦＥＶ（登録商標）、ＢＩＢＦ１１２０）、ＭＡＸ－４０２７９、ＸＬ９９９、オランチニブ（ＳＵ６６６８）、パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（登録商標））、アンロチニブ、及びＡＬ３８１８のうちの１つまたは複数である。ＦＧＦＲ３に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＦＧＦＲ３に遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＥＲＢＢ２に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＥＲＢＢ２に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＥＲＢＢ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、抗ＥＲＢＢ２抗体、選択的ＥＲＢＢ２阻害剤、及び汎ＥＲＢＢ阻害剤のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、共有結合ＥＲＢＢ２阻害剤である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、非共有結合ＥＲＢＢ２阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＥＲＢＢ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＡＺＤ８９３１、ＡＳＴ１３０６、ＡＥＥ７８８、ＣＰ７２４７１４、ＣＵＤＣ１０１、ＴＡＫ２８５、ダコミチニブ、ペリチニブ、ＡＣ４８０、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））、トラスツズマブ－ｄｋｓｔ（ＯＧＩＶＲＩ（登録商標））、ＤＸＬ－７０２、Ｅ－７５、ＰＸ－１０４．１、ＺＷ２５、ＣＰ－７２４７１４、イルビニチニブ（ＡＲＲＹ－３８０、ＯＮＴ－３８０）、ＴＡＳ０７２８、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、ＡＳＴ－１３０６、ＡＥＥ－７８８、ペリチニブ（ＥＫＢ－５６９）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、ＧＩＬＯＴＲＩＦ（登録商標））、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２、ＮＥＲＬＹＮＸ（登録商標）、ＰＫＩ－１６６、Ｄ－６９４９１、ＨＫＩ－３５７、ＡＰ３２７８８、ＧＷ５７２０１６、カネルチニブ（ＣＩ－１０３３）、ＡＣ－４８０（ＢＭＳ－５９９６２６）、ダコミチニブ（ＰＦ２９９８０４、ＰＦ２９９）、ＲＢ－２００ｈ、ＡＲＲＹ－３３４５４３（ＡＲＲＹ－５４３、ＡＳＬＡＮ００１）、ポジオチニブ（ＮＯＶ１２０１０１）、ＣＵＤＣ－１０１、エモジン、ＩＤＭ－１、アド－トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、Ｚｅｍａｂ、ＤＳ－８２０１ａ、Ｔ－ＤＭ１、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ療法、ＨＥＲ２－Ｐｅｐｔｉｄ－Ｖａｋｚｉｎｅ、及びＨＥＲ２Ｂｉアームド活性化（Ａｒｍｅｄ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞のうちの１つまたは複数である。ＥＲＢＢ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するために有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＥＲＢＢ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＥＲＢＢ２に遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＭＬＬに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＭＬＬに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独もしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＭＬＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、シトシンアラビノシド、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、バルプロ酸及びＨＢＩ－８０００）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、デシタビン）、ＬＳＤ１阻害剤（例えば、ＯＲＹ１００１（ＲＧ６０１６）、ＯＲＹ１００１（ＲＧ６０１６）、ＧＳＫ２８７９５５２、ＧＳＫ２８７９５５２、ＩＮＣＢ０５９８７２、ＩＭＧ７２８９、ＣＣ９００１１）、メニン１阻害剤（例えば、ＭＩ１、ＭＩ２、ＭＩ３、Ｍｉ２－２（ＭＩ－２－２）、ＭＩ４６３、ＭＩ５０３、ＭＩＶ－６Ｒ）、ＤＯＬＴ１（ヒストン－リジンＫＭＴ）阻害剤（例えば、ＥＰＺ００４７７７、ＥＰＺ－５６７６、ＳＧＣ０９４６、ＣＮ－ＳＡＨ、ＳＹＣ－５２２、ＳＡＨ、及びＳＹＣ－５３４）、及びＷＤＲ５－ＭＬＬアンタゴニスト（例えば、ＭＭ－１０１、ＭＭ－１０２、ＭＭ－１０３、ＭＭ－４０１、ＷＤＲ５－０１０１、ＷＤＲ５－０１０２、ＷＤＲ５－０１０３、及びＯＩＣＲ－９４２９）のうちの１つまたは複数である。ＭＬＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＭＬＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんを治療するのに有効である。例えば、ＭＬＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＭＥＴに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＭＥＴに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＭＥＴに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、ＭＥＴ阻害剤、ＨＧＦアンタゴニスト、抗ＨＧＦ抗体（例えば、リロツムマブ（ＡＭＧ１０２）、フィクラツズマブ（ＡＶ－２９９）、及びＴＡＫ７０１、ＹＹＢ１０１）、及びムルチキナーゼ阻害剤（例えば、チバンチニブ（ＡＲＱ１９７）、ゴルバチニブ（Ｅ７０５０）、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＢＭＳ－９０７３５１）、フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９）、クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６）、ＭＫ－２４６１、ＢＰＩ－９０１６Ｍ、ＢＰＩ－９０１６Ｍ、ＴＱ－Ｂ３１３９、ＭＧＣＤ２６５、及びＭＫ－８０３３）である。いくつかの実施形態では、ＭＥＴ阻害剤は、カプマチニブ（ＩＮＣ２８０、ＩＮＣＢ２８０６０）、オナルツズマブ（ＭｅｔＭＡｂ）、サボリチニブ、テポチニブ（ＭＳＣ２１５６１１９Ｊ、ＥＭＤ１２１４０６３）、ＣＥ－３５５６２、ＡＭＧ－３３７、ＡＭＧ－４５８、フォレチニブ、ＰＨＡ－６６５７２５、ＭＫ－２４６１、ＰＦ－０４２１７９０３及びＳＵ１１２７４、ＳＵ１１２７４及びＰＨＡ－６６５７５２、ＳＡＩＴ３０１、ＨＳ－１０２４１、ＡＲＧＸ－１１１、ＭＳＣ２１５６１１９Ｊ、グルメチニブ（ＳＣＣ２４４）、ＥＭＤ １２０４８３１、ＡＺＤ６０９４（サボリチニブ、ボリチニブ、ＨＭＰＬ－５０４）、ＰＬＢ１００１、ＡＢＴ－７００、ＡＭＧ２０８、ＩＮＣＢ０２８０６０、ＡＬ２８４６、及びＰＦ－０４２１７９０３のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、ＭＥＴに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、カプマチニブ（ＩＮＣ２８０、ＩＮＣＢ２８０６０）、オナルツズマブ（ＭｅｔＭＡｂ）、サボリチニブ、テポチニブ（ＭＳＣ２１５６１１９Ｊ、ＥＭＤ１２１４０６３）、ＣＥ－３５５６２、ＡＭＧ－３３７、ＡＭＧ－４５８、フォレチニブ、ＰＨＡ－６６５７２５、ＭＫ－２４６１、ＰＦ－０４２１７９０３及びＳＵ１１２７４、ＳＵ１１２７４及びＰＨＡ－６６５７５２、ＳＡＩＴ３０１、ＨＳ－１０２４１、ＡＲＧＸ－１１１、ＭＳＣ２１５６１１９Ｊ、グルメチニブ（ｇｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）（ＳＣＣ２４４）、ＥＭＤ１２０４８３１、ＡＺＤ６０９４（サボリチニブ、ボリチニブ、ＨＭＰＬ－５０４）、ＰＬＢ１００１、ＡＢＴ－７００、ＡＭＧ２０８、ＩＮＣＢ０２８０６０、ＡＬ２８４６、ＰＦ－０４２１７９０３、リロツムマブ（ＡＭＧ１０２）、フィクラツズマブ（ＡＶ－２９９）、及びＴＡＫ７０１、ＹＹＢ１０１、チバンチニブ（ＡＲＱ１９７）、ゴルバチニブ（Ｅ７０５０）、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＢＭＳ－９０７３５１）、フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９）、クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６）、ＭＫ－２４６１、ＢＰＩ－９０１６Ｍ、ＢＰＩ－９０１６Ｍ、ＴＱ－Ｂ３１３９、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ－８０３３、ＡＢＢＶ－３９９、ＨＴＩ－１０６６、及びＪＮＪ－６１１８６３７２のうちの１つまたは複数である。ＭＥＴの遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＭＥＴに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＭＥＴの遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍の大きさが低減され得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＶＨＬに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＶＨＬに遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独でもしくは他の遺伝子バイオマーカーの存在と組み合わせた遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＶＨＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、抗血管新生療法（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＨ５、ＥＤＮＲＡ、ＡＮＧＰＴ２、ＣＤ３４、及びＡＮＧＰＴのうちの１つまたは複数の阻害剤）バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＴＫＩ－５３８、スニチニブ（ＳＵ１１２４８、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、サリドマイド、レナリドマイド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、ラニビズマブ、ＥＹＥ００１、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６、ＩＮＬＹＴＡ（登録商標））、ｃ－ＫＩＴ阻害剤（例えば、ドビチニブ（ＴＫＩ２５８））、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ボリノスタット及びＨＢＩ－８０００）、ＨＩＦ－２α阻害剤（例えば、ＰＴ２３８５及びＰＴ２９７７）、Ｈｓｐ９０阻害剤（例えば、１７アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ＡＵＹ９２２、及びＩＰＩ－５０４）、ならびに成長因子及び受容体阻害剤（例えば、Ｅ１００３０）のうちの１つまたは複数である。ＶＨＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＶＨＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＶＨＬに遺伝子バイオマーカーを有する対象の治療に有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象の１つもしくは複数の腫瘍のサイズが減らされ得るか、転移の速度もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に軽減され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象がＴＥＲＴ（例えば、ＴＥＲＴプロモーター）に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された場合、その対象に治療的介入が実施される。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴに（例えば、ＴＥＲＴプロモーター内に）遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を有すると同定された対象は、がんを有すると同定される（例えば、単独もしくは他の遺伝子遺伝マーカーの存在との組み合わせた、遺伝子バイオマーカーの存在か、及び／または他のクラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴに（例えば、ＴＥＲＴプロモーター内に）遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、エリブリン、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ形質移入樹状細胞ワクチン（例えば、ＡＳＴ－ＶＡＣ１（ｈＴＥＲＴ－ＤＣ、ＧＲＮＶＡＣ１））、ＩＮＯ－１４００、ＩＮＯ－１４０１、ＧＸ３０１、ｈＴＥＲＴ由来、サバイビン由来及び腫瘍細胞由来のｍＲＮＡで形質移入した樹状細胞、及び三酸化ヒ素のうちの１つまたは複数である。ＴＥＲＴに（例えば、ＴＥＲＴプロモーター内に）遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な他の治療的介入は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴに（例えば、ＴＥＲＴプロモーター内に）遺伝子バイオマーカーを有する対象に実施される治療的介入は、対象のがんの治療に有効である。例えば、ＴＥＲＴに（例えば、ＴＥＲＴプロモーター内に）遺伝子バイオマーカーを有する対象を治療するのに有効な治療的介入の実施後、対象のがん細胞の数が減らされ得るか、対象における１つもしくは複数の主要の大きさが低減され得るか、転移の割合もしくは程度が低減され得るか、疾患もしくは障害もしくは状態に関連する症状が全体的もしくは部分的に緩和され得るか、疾患の状態が安定化され得る（すなわち悪化され得ない）か、及び／または、治療を受けていない場合の予想生存期間と比較して、生存期間が延長され得る。
いくつかの実施形態では、対象が疾患を発症するリスク（例えば、リスクの増大）があると同定された場合（例えば、本明細書に記載の任意の様々な方法を使用して）、その対象は治療的介入を受ける。いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に記載の任意の様々な方法を使用して）疾患を発症するリスクがある（例えば、リスクが高い）と同定された対象は、がんを発症するリスクがあると同定される（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在か、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在か、１つまたは複数の他のバイオマーカーの存在か、及び／または本明細書に記載の異数性の存在に基づいて）。いくつかの実施形態では、がんを発症するリスクがあると同定された対象に実施される治療的介入は化学的予防である。化学予防剤の非限定的な例としては、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、アスピリン、トルフェナム酸、インドメタシン、セレコキシブ、スリンダク硫化物、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、ピロキシカム、ジフルニサル、エトドラク、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、サルサレート、及びトルメチン）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＳＯＬＴＡＭＯＸ（商標））及びラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）））、点滴ＢＣＧ、バルルビシン、フィナステリド、デュタステリド、クルクミン、ビスデメトキシクルクミン、メトホルミン、アロマターゼ阻害剤（例えば、エキセメスタン）、レスベラトロール、ルナシン、ビタミンＡ、イソチオシアネート、緑茶、ルテオリン、ゲニステイン、リコピン、ニガウリ、ウィタフェリンＡ、グッグルステロン、セレニド類、ジセレニド類、クロセチン、ピペリン、スタチン（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ阻害剤）、カロテノイド、ビタミンＡ、レチノイド、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、カルシウム、フラボノイド、及び抗がんワクチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、タモキシフェン及び／またはラロキシフェンが、乳癌を発症するリスクがあると同定された対象に投与される。いくつかの実施形態では、点滴ＢＣＧ及び／またはバルルビシンが、膀胱癌を発症するリスクがあると同定された対象に投与される。いくつかの実施形態では、フィナステリド及び／またはデュタステリドが、前立腺癌を発症するリスクがあると同定された対象に投与される。いくつかの実施形態では、セレコキシブが、結腸直腸新生物を発症するリスクがあると同定された対象に投与される。
いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象におけるがんの寛解の早期発生をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象におけるがんの寛解時間の延長をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の生存時間の増大をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入により、対象の固形原発腫瘍のサイズが減少し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入により、対象の固形原発腫瘍の体積が減少し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入により、対象の転移のサイズが減少し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入により、対象の転移の体積が減少し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入により、対象の腫瘍負荷が減少し得る。
いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の予後の改善をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入により、対象に転移が発生するリスクが低下し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入により、対象に追加の転移が発生するリスクが低下し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象におけるがん細胞移動の減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象におけるがん細胞浸潤の減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の入院時間の短縮をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍内のがん幹細胞の存在の減少をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍微小環境内の免疫細胞浸潤の増大をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍の腫瘍微小環境内の免疫細胞組成を変化し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、以前に免疫抑制性の腫瘍微小環境を免疫原性の炎症性腫瘍微小環境に調節し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の免疫抑制性腫瘍微小環境の逆転をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍進行を停止させ得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍進行を遅延し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍進行を阻害し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍の免疫チェックポイント経路を阻害し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍の腫瘍微小環境を免疫調節し得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象の腫瘍の腫瘍マクロ環境を免疫調節し得る。
いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象に存在するがん細胞の数を減らし得る。例えば、治療的介入は、対象に存在するがん細胞の数を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上減らし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、がん細胞が観察不能になるように、対象に存在するがん細胞の数を減らし得る。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象に存在する観察可能な腫瘍を減らし得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の治療的介入（例えば、本明細書に開示される化学療法または任意の他の適切な治療的介入）は、数日から数週間におよぶ期間にわたって対象に１回または複数回実施され得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の治療的介入は、がんを有する対象への投与のための薬学的に受容可能な組成物に処方されてもよい。例えば、治療的有効量の治療的介入（例えば、化学療法剤または免疫療法剤）は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）及び／または希釈剤とともに製剤化してもよい。薬学的組成物は、滅菌溶液、懸濁液、徐放性製剤、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、及び顆粒を含むがこれらに限定されない固体または液体形態で投与するために製剤化してもよい。
本明細書に記載の薬学的組成物に使用され得る薬学的に許容される担体、充填剤、及びビヒクルとしては、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質類、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が挙げられる。
１つまたは複数の治療的介入を含む薬学的組成物は、経口または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内を含む）投与用に設計してもよい。経口投与される場合、薬学的組成物は、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態であり得る。非経口投与に適した組成物としては、水性及び非水性滅菌注射液を含んでもよく、これには、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提供されてもよく、滅菌液体担体、例えば注射用水を使用直前に加えるだけでよい、凍結され乾燥された（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即席の注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の治療的介入を含む薬学的に許容される組成物を、局所的または全身的に投与してもよい。例えば、本明細書で提供される組成物は、腫瘍への注射により局所投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、全身的に、経口的に、または対象（例えば、ヒト）への注射により投与され得る。
有効用量は、がんの重症度、投与経路、対象の年齢及び一般的な健康状態、賦形剤の使用、他の薬剤の使用などの他の治療法との併用の可能性、及び治療する医師の判断に応じて異なり得る。
１つまたは複数の治療的介入を含む組成物の有効量は、対象に有意な毒性を生じることなく、対象内に存在するがん細胞の数を減らす任意の量であり得る。特定の対象が特定の量に反応しなかった場合、治療的介入の量は、例えば２倍増大されてもよい。このより多くの量を受け取った後、対象を、治療に対する反応性及び毒性症状の両方についてモニターし、それに応じて調整を行ってもよい。有効量は、一定のままであってもよいし、または治療に対する対象の反応に応じて、スライディングスケールとして調整されてもまたは可変用量として調整されてもよい。特定の用途で使用される実際の有効量には、様々な要因が影響し得る。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療剤の使用、投与経路、及び状態（例えば、がん）の重症度によって、投与される実際の有効量の増大または減少を必要とする場合がある。
１つまたは複数の治療的介入の実施頻度は、対象に対して有意な毒性を生じることなく、対象内に存在するがん細胞の数を減少させる任意の量であり得る。例えば、１つまたは複数の治療的介入の実施頻度は、週に約２～約３回から月に約２～約３回であり得る。１つまたは複数の治療的介入の実施頻度は一定のままであるか、治療期間中に変動することができる。１つまたは複数の治療的介入を含む組成物による治療過程には、休薬期間を含んでもよい。例えば、１つまたは複数の治療的介入を含む組成物が、２週間の期間にわたって毎日投与され、その後に２週間の休憩期間が続き、そのようなレジメンは複数回繰り返され得る。有効量と同様に、様々な要因が特定の適用に使用される実際の投与頻度に影響を与え得る。例えば、有効量、治療期間、複数の治療剤の使用、投与経路、及び状態（例えば、がん）の重症度により、投与頻度の増大または減少を必要とする場合がある。
１つまたは複数の治療的介入を含む組成物を投与するための有効継続時間は、対象に対して有意な毒性を生じることなく対象内に存在するがん細胞の数を減らす任意の期間であり得る。いくつかの実施形態では、有効継続時間は、数日から数週間まで様々であり得る。一般に、対象内に存在するがん細胞の数を減らすための有効継続時間は、約１週間～約４週間の期間の範囲であり得る。特定の治療に使用される実際の有効継続時間には、複数の要因が影響し得る。例えば、有効継続時間は、投与頻度、有効量、複数の治療剤の使用、投与経路、及び治療中の状態の重症度によって異なり得る。
例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、バイオマーカーを検出する方法が本明細書で提供され、方法は、対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中のバイオマーカーの第２のクラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することをさらに含む。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは遺伝子バイオマーカーを含む。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１クラスのメンバーはがんの存在に関連している。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２のクラスは、タンパク質バイオマーカーを含む。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２のクラスのメンバーは、がんの存在に関連している。
いくつかの実施形態では、以下を含む、バイオマーカーを検出する方法が本明細書で提供される：対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出すること。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象から得られた試料中のバイオマーカーの第２クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することをさらに含む。バイオマーカーをｉｄ検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは、遺伝子バイオマーカーを含む。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは、タンパク質バイオマーカーを含む。バイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１クラスのメンバーは、がんの存在に関連している。バイオマーカーの第１クラスがタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２クラスは、遺伝子バイオマーカーを含む。バイオマーカーの第１クラスがタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーを検出する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２クラスのメンバーは、がんの存在に関連している。
いくつかの実施形態では、以下を含む、対象をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、対象から得られた試料中のバイオマーカーの第２クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び、第１クラスのバイオマーカーの１つまたは複数のメンバーの存在が試料で検出された場合、第２クラスのバイオマーカーの１つまたは複数のメンバーの存在が試料中で検出された場合、またはその両方の場合に、対象をがんを有するとして同定すること。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含み、ここで対象は、第１クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、第２クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、異数性の存在が試料中で検出されるか、またはその組み合わせの場合に、がんを有するとして同定される。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは、遺伝子バイオマーカーを含む。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１クラスのメンバーは、がんの存在に関連している。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２のクラスはタンパク質バイオマーカーを含む。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２クラスのメンバーは、がんの存在と関連している。
いくつかの実施形態では、以下を含む、対象をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出すること、及び、第１クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、異数性の存在が試料で検出されるか、またはその両方である場合、その対象をがんを有するとして同定すること。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、対象から得られた試料中のバイオマーカーの第２クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含み、ここで対象は、第１クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、第２クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、異数性の存在が試料中で検出されるか、またはそれらの組み合わせの場合、がんを有するとして同定される。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは遺伝子バイオマーカーを含む。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは、タンパク質バイオマーカーを含む。対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１クラスのメンバーは、がんの存在に関連している。バイオマーカーの第１クラスがタンパク質バイオマーカーを含む、対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２クラスは、遺伝子バイオマーカーを含む。第１クラスのバイオマーカーがタンパク質バイオマーカーを含む、対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、第２クラスのバイオマーカーのメンバーは、がんの存在に関連している。
対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１のクラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中のバイオマーカーの第２クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む、対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する感度が、単一のクラスのバイオマーカーのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法と比較して増大する。対象から得られた試料中の第１クラスのバイオマーカーの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中の第２クラスのバイオマーカーの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む、対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する特異性が、バイオマーカーの単一クラスのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法と比較して増大している。対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む、対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する感度が、バイオマーカーのクラスの１つまたは複数のメンバーのみまたは異数性の存在のみを検出することを含む方法と比較して増大している。対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む、対象をがんを有するとして同定する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する特異性が、バイオマーカーのクラスの１つまたは複数のメンバーのみ、または異数性の存在のみを検出することを含む方法と比較して増大している。
いくつかの実施形態では、以下を含む、がんを有するとして同定された対象を治療する方法が本明細書で提供される：対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、対象から得られた試料中のバイオマーカーの第２クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、試料で第１クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が検出されるか、試料中で第２クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が検出されるか、またはその両方である場合、対象をがんを有するとして同定すること、及び治療的介入を対象に実施すること。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含み、ここで対象は、第１クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、第２クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、異数性の存在が試料中で検出されるか、またはそれらの組み合わせの場合、対象は、がんを有するとして同定される。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは遺伝子バイオマーカーを含む。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１クラスのメンバーはがんの存在に関連している。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２のクラスはタンパク質バイオマーカーがを含む。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２クラスのメンバーはがんの存在と関連している。
いくつかの実施形態では、以下を含む、がんを有するとして同定された対象を治療する方法が本明細書で提供される：対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスのメンバーの存在を検出すること、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出すること、第１クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、異数性の存在が試料で検出されるか、またはその両方である場合、対象をがんを有するとして同定すること、及び治療的介入を対象に実施すること。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、対象から得られた試料中のバイオマーカーの第２クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含み、ここで対象は、第１クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、第２クラスのバイオマーカーの１つもしくは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、異数性の存在が試料中で検出されるか、またはその組み合わせである場合、がんを有するとして同定される。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１のクラスは、遺伝子バイオマーカーを含む。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１クラスはタンパク質バイオマーカーを含む。がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第１クラスのメンバーは、がんの存在に関連している。バイオマーカーの第１のクラスがタンパク質バイオマーカーを含む、がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２のクラスは遺伝子バイオマーカーを含む。バイオマーカーの第１クラスがタンパク質バイオマーカーを含むがんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、バイオマーカーの第２クラスのメンバーは、がんの存在に関連している。
対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中の第２クラスのバイオマーカーの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む、がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する感度が、単一クラスのバイオマーカーのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法と比較して、増大している。対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中の第２クラスのバイオマーカーの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む、がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する特異性が、単一クラスのバイオマーカーのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法と比較して、増大している。対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む、がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する感度が、バイオマーカーのクラスの１つまたは複数のメンバーのみ、または異数性の存在のみを検出することを含む方法と比較して増大している。対象から得られた試料中のバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む、がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、がんの存在を検出する特異性が、バイオマーカーのクラスの１つまたは複数のメンバーのみ、または異数性の存在のみを検出することを含む方法と比較して増大している。
がんを有するとして同定された対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の様々な治療的介入（例えば、手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、放射線療法、及びそれらの組み合わせ）を、対象に実施してもよい。
いくつかの実施形態では、以下を含む、対象をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルの存在を検出すること、及び前記血液試料中の循環ＤＮＡ中に、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記血液試料中に、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルが検出された場合、またはその両方の場合に、その対象ががんであると同定すること。いくつかの実施形態では、以下を含む、がんを有する対象を治療する方法が本明細書で提供される：対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルの存在を検出すること、及び前記血液試料中の循環ＤＮＡ中に１つもしくは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出される場合、血液試料中に１つもしくは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルが検出される場合、またはその両方の場合、１つまたは複数の治療的介入（例えば、手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、及び放射線療法の１つまたは複数）を前記対象に実施すること。いくつかの実施形態では、以下を含む、対象におけるがんの位置を同定する方法が本明細書で提供される：前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルの存在を検出すること、前記血液試料中の循環ＤＮＡ中に、１つもしくは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記血液試料中に１つもしくは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルが検出された場合、またはその両方の場合、対象におけるがんの位置を同定すること。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つもしくは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた血液試料中の１つもしくは複数のペプチドバイオマーカーのレベルの上昇の存在に基づく）いくつかの実施形態では、対象はヒトである。対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、前記血液試料は血漿試料である。対象をがんを有することを同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象内のがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、がんはステージＩのがんである。対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の改変を含む。対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変は、不活性化改変を含み、前記１つまたは複数の遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子を含む。対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変は、単一塩基の置換、挿入、または欠失、転座、融合、中断、複製、または増幅から独立して選択される改変を含む。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルの上昇に基づく）いくつかの実施形態では、がんは肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌である。がんが肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌であり、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが遺伝子である、対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は以下のうちの１つまたは複数である：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳ。１つまたは複数の遺伝子がＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数である、対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象のがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの１つまたは複数である。１つまたは複数の遺伝子がＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数である、対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数である。１つまたは複数の１つまたは複数の遺伝子がＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうちの１つ以上である、対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象のがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数である。１つまたは複数の１つまたは複数の遺伝子がＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数である、対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象のがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変は、表３に示す改変から独立して選択される。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／またはある対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルの存在に基く）いくつかの実施形態において、がんは膵臓癌である。がんが膵臓癌であり、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが遺伝子である、対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、またはある対象のがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数である。１つまたは複数の遺伝子がＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、もしくはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数である、対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象のがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、またはＯＰＮのうちの１つまたは複数である。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／またはある対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルの存在に基づく）いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出するステップは、ＰＣＲ－ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイ、ＰＣＲベースのシングルプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、マイクロアレイアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、定量ＰＣＲアッセイ、またはライゲーションアッセイを含む方法を使用して行われる。いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイは以下を含む：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／またはある対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルの存在に基づく）いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの上昇したレベルのステップは、マルチプレックスイムノアッセイシステムを使用して行われる。
対象をがんを有するとして同定するいくつかの実施形態では、方法は、がんの位置を同定することをさらに含む。対象をがんを有するとして同定するいくつかの実施形態では、方法は、対象に１つまたは複数の治療的介入を実施することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の治療的介入は、手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、または放射線療法のうちの１つまたは複数である。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または前記対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーレベル上昇の存在に基づく）いくつかの実施形態では、方法はさらに以下を含む：ａ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーの血液試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択した遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の変異アレル頻度の第１の参照分布、及びがんを有する対象から収集した試料中の変異アレル頻度の第２の参照分布と比較することにより、対象ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、ならびにｃ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合、その対象をがんを有するとして同定すること、を含む。いくつかの実施形態では、スコアを取得することは、選択された遺伝子バイオマーカーの各変異について、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布における変異アレル頻度の確率の比を計算することを含む。いくつかの実施形態では、スコアは、選択された遺伝子バイオマーカーの各変異について、第１の参照分布の変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布の変異アレル頻度の確率の対数比の加重平均を計算することによって決定される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在の検出は、以下を含むアッセイを使用する２つ以上の試験試料で行われる：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、スコアは以下の式により計算され：
Figure 2023075090000040


、
式中、ｗｉは、試験試料ｉの一意の識別子配列（ＵＩＤ）の数を、全ての試験試料のその変異についてのＵＩＤの総数で割ったものであり、ｐｉＮは、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率であり、ｐｉＣは第２の参照分布における変異アレル頻度の確率である。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルの上昇の存在に基づく）いくつかの実施形態では、対象をがんを有するとして同定する感度は、１）対象から得られた試料中のバイオマーカーの単一クラスのみの１つまたは複数のメンバーの存在が検出される場合に、得られる感度と比較して増大している。対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定するいくつかの実施形態では、対象をがんを有するとして同定する特異性は、１）対象から得られた試料中のバイオマーカーの単一クラスのみの１つまたは複数のメンバーの存在が検出される場合に得られる特異性と比較して増大している。
対象をがんを有するとして同定するか、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんの位置を同定する（例えば、前記対象から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルの上昇の存在に基づく）いくつかの実施形態では、方法はさらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含み、ここで、対象はバイオマーカーの第１クラスの１つまたは複数のメンバーの存在が試料で検出されるか、バイオマーカーの第２クラスの１つまたは複数のメンバーの存在が試料中で検出されるか、異数性の存在が試料中で検出されるか、またはその組み合わせである場合、がんを有するとして同定される。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳの１つまたは複数の各変異について患者から収集された試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子の各変異の変異アレル頻度を、対照試料の変異アレル頻度の第１の参照分布及びがんを有する患者から収集した試料中の変異アレル頻度の第２の参照分布と比較することにより、患者ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、ならびにｃ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合に、患者をがんを有するとして同定すること。いくつかの実施形態では、そのような方法は、以下のタンパク質：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のタンパク質の１つまたは複数の濃度を測定すること、ならびに少なくとも１つのタンパク質の濃度が参照値よりも高いことを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、以下のタンパク質：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、またはＣＡ１５－３のタンパク質の１つまたは複数の濃度を測定すること、ならびに少なくとも１つのタンパク質の濃度が参照値よりも高いことを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、以下のタンパク質：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数の濃度を測定すること、少なくとも１つのタンパク質の濃度が参照値よりも高いことを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、スコアを取得することは、選択された遺伝子の各変異について、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布における変異アレル頻度の確率との比を計算することを含む。いくつかの実施形態では、スコアは、選択された遺伝子の各変異について、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布における変異アレル頻度の確率の対数比の加重平均を計算することによって決定される。いくつかの実施形態では、試料は、以下を含む方法を使用して、２つ以上の試験試料でアッセイされる：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、スコアは以下の式によって算出される：
Figure 2023075090000041


、
式中、ｗｉは、試験試料ｉの一意の識別子配列（ＵＩＤ）の数を、全ての試験試料におけるその変異についてＵＩＤの総数で割ったものであり、ｐｉＮは、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率であり、ｐｉＣは第２の参照分布における変異アレル頻度の確率である。いくつかの実施形態では、血液試料は血漿試料である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩのがんである。いくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、不活性化改変を含み、ここで少なくとも１つの変異は腫瘍抑制遺伝子にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、単一塩基置換、挿入、または欠失である変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、表３に示される変異である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質のレベルを検出するステップは、マルチプレックスイムノアッセイシステムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、方法は、がんの位置を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、哺乳動物に１つまたは複数の治療的介入を実施することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の治療的介入は、手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、または放射線療法のうちの１つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）以下の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数の各変異について患者から収集された試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子の各変異の変異アレル頻度を、対照試料の変異アレル頻度の第１の参照分布及びがんを有する患者から収集した試料中の変異アレル頻度の第２の参照分布と比較することにより、患者ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、ｃ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合に、患者ががんにかかっていると同定すること。いくつかの実施形態では、そのような方法は、以下のタンパク質：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、またはＯＰＮのうちの１つまたは複数の濃度を測定すること、及び少なくとも１つのタンパク質の濃度が参照値より高いことを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、スコアを取得することは、選択された遺伝子の各変異について、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布における変異アレル頻度の確率との比を計算することを含む。いくつかの実施形態では、スコアは、選択された遺伝子の各変異について、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布における変異アレル頻度の確率の対数比の加重平均を計算することによって決定される。いくつかの実施形態では、試料は、以下を含む方法を使用して、２つ以上の試験試料でアッセイされる：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、スコアは以下の式により計算され：
Figure 2023075090000042



式中、ｗｉは、試験試料ｉの一意の識別子配列（ＵＩＤ）の数を、全ての試験試料におけるその変異のＵＩＤの総数で割ったものであり、ｐｉＮは、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率であり、かつｐｉＣは第２の参照分布における変異アレル頻度の確率である。いくつかの実施形態では、血液試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態では、がんはステージＩのがんである。いくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、不活性化改変を含み、少なくとも１つの変異は、腫瘍抑制遺伝子にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、単一塩基置換、挿入、または欠失である変異を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質のレベルを検出するステップは、マルチプレックスイムノアッセイシステムを使用して実行される。いくつかの実施形態では、方法は、がんの位置を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、哺乳動物に１つまたは複数の治療的介入を実施することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の治療的介入は：手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、または放射線療法のうちの１つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のレポートを作成するためのシステムが提供される：生物試料中の遺伝子セットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セット中の各変異の変異アレル頻度を決定するように構成される少なくとも１つのデバイスであって、ここで、遺伝子のセットは以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、及びｉｉ）遺伝子セットの各変異についてがんを有する患者から収集された試料の変異アレル頻度の第２の参照分布を含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合、患者をがんを有するとして示すレポートを作成するための命令、または、スコアが参照値より高くない場合に、患者をがんを有していないとして示すレポートを含む、コンピューター可読プログラムコード。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のレポートを作成するためのシステムが本明細書で提供される：生物試料中の遺伝子セットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セット中の各変異の変異アレル頻度を決定するように構成されたデバイスであって、ここで、遺伝子セットは以下の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって：ｉ）遺伝子セットの各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、及びｉｉ）遺伝子セットの各変異についてがんを有する患者から収集された試料の変異アレル頻度の第２の参照分布、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががん有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値より高くない場合に、患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含むコンピューター可読プログラムコード。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：ａ）生物試料中の遺伝子セットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セットにおける各変異の変異アレル頻度を決定するように構成される少なくとも１つのデバイスであって、ここで、遺伝子セットは以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）を含む、デバイスと、ｂ）ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリスト、を含む少なくとも１つのコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること；及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者について同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで、計算されたスコアが、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：ａ）生物試料中の遺伝子セットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子のセットにおいて各変異の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスであって、ここで、遺伝子セットは、以下の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）を含むデバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリストを含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｅ）コンピューター可読プログラムコードであって、患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアが、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコードと。
いくつかの実施形態では、以下を含む、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するように患者のレポートを作成するためのシステムが本明細書で提供される：ａ）患者から収集された試料の遺伝子セットの各変異の変異アレル頻度を決定するための生物試料中の遺伝子のセットをアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスであって、ここで、遺伝子セットが、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリストを含む、少なくとも１つのコンピューターデータベースと；ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート；または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポート、を生成するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となるコンピューター可読プログラムコード。
いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するように患者のレポートを作成するためのシステムが本明細書で提供される：ａ）患者から収集された試料中の遺伝子セットの各変異の変異アレル頻度を決定するための生物試料中の遺伝子のセットをアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスであって、ここで、遺伝子のセットが、以下の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子のセット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリストを含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアが、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。
患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、または患者のより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するために患者のレポートを作成するシステムのいくつかの実施形態では、スコアを計算することは、選択された遺伝子の各変異について、第１の参照分布の変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布の変異アレル頻度の確率の比を計算することを含む。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するために患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、スコアは、選択した遺伝子の各変異について、第１の参照分布の変異アレル頻度の確率と、第２の参照分布の変異アレル頻度の確率の対数比の加重平均を計算することによって計算される。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、コンピューターデータベースは、試験試料データを含み、試験試料データは、試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれへの一意の識別子（ＵＩＤ）の割り当てを含む。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、スコアは次の式で計算され、
Figure 2023075090000043


、
式中、ｗｉは、試験試料ｉの一意の識別子配列（ＵＩＤ）の数を、全ての試験試料のその変異のＵＩＤの総数で割ったものであり、ｐｉＮは、第１の参照分布における変異アレル頻度の確率であり、かつｐｉＣは、第２の参照分布における変異アレル頻度の確率である。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、遺伝子セットをアッセイするように構成されたデバイスは、ＰＣＲベースのシングルプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、マイクロアレイアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、またはライゲーションアッセイを使用するデバイスを含む。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイは、以下を含む：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、ここでタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）である。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、ここで、タンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）である。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、タンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）である。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、ここで、タンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）である。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、ここで、タンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）である。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、ここで、タンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）である。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、ここでタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）である。以下の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含み、タンパク質バイオマーカーは：ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）である。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、対象をがんを有するとして同定する際のシステムの感度が、患者のレポートを作成するための従来のシステムと比較して改善されている。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、対象をがんを有するとして同定する際のシステムの特異性が、患者に関するレポートを作成するための従来のシステムと比較して改善されている。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、変異アレル頻度値の第１及び第２の参照分布は、少なくとも１つのコンピューターデータベースからリモートである場所からシステムに入力される。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、変異アレル頻度値の第１及び第２の参照分布は、インターネット接続を介してシステムに入力される。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、レポートは電子形式または紙形式である。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは、本明細書に記載されている任意の様々ながんタイプである（例えば、「がん」というタイトルのセクションを参照）。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイス、ならびに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成された少なくとも１つのデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）（ここでタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）である）を含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、直腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌である。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイス、ならびに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成された、少なくとも１つのデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）（ここでタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）である）を含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌である。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイス、ならびに、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成された少なくとも１つのデバイス（例えばマルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）（ここでタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／またはＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）である）を含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌である。以下の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数（１、２、３、または４）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスと、生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するように構成された少なくとも１つのデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）（ここでタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）である）を含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは膵臓癌である。患者のレポートを作成するシステム、または患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステムのいくつかの実施形態では、患者は、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方（例えば、本明細書に記載の任意の種々のより詳しいモニタリングまたはさらなる診断法）の候補として同定される。
いくつかの実施形態では、以下を含む、対象をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、前記対象から得られた第２の試料における異数性の存在を検出すること、及び１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が第１の試料で検出された場合、異数性の存在が第２の試料で検出された場合、またはその両方で、対象をがんを有するとして同定すること。いくつかの実施形態では、以下を含む、がんを有する対象を治療する方法が本明細書で提供される：前記対象から得られた第１の試料における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、前記対象から得られた第２の試料中の異数性の存在を検出すること、及び１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが第１の試料で検出された場合、異数性の存在が第２の試料で検出された場合、またはその両方の場合に、前記対象に対して１つまたは複数の治療的介入を実施すること。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出するステップは、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイ、ＰＣＲベースのシングルプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、マイクロアレイアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、またはライゲーションアッセイを含む方法を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出するステップは、以下を含むエラー削減手法により超並列シークエンシング機器の感度を増大させる方法を含む：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療する（例えば、前記対象から得られた第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／またはその対象から得られた第２試料の異数性の存在に基づいて）いくつかの実施形態では、異数性の存在を検出するステップは以下を含む：第２の試料のゲノム全体にわたって長散在ヌクレオチド要素（ＬＩＮＥ）を増幅し、それにより複数のアンプリコンを取得すること、複数のアンプリコンをシークエンシングしてシークエンシングリードを取得すること、ゲノム間隔の事前定義されたクラスターにシークエンシングリードを配置すること、及び事前定義されたクラスター内のゲノム領域のシークエンシングリードの数が事前定義されたクラスター内のゲノム領域のシークエンシングリードの予想数と有意に異なる場合、第２の試料の異数性の存在を決定すること。いくつかの実施形態では、ゲノム間隔の事前定義されたクラスターは、２つ以上の正倍数体試料のシークエンシングリードのリード深度に基づいて、ゲノム間隔を分類することにより作成される。いくつかの実施形態では、事前定義されたクラスター内のゲノム領域のシークエンシングリードの数が事前定義されたクラスター内のゲノム領域のシークエンシングリードの予想数と有意に異なることを決定することは、以下を含む：事前定義されたクラスター内の全てのゲノム間隔のシークエンシングリードの分布を計算することであって、ここで、事前定義されたクラスター内の全てのゲノム間隔の配列読み取りは、第２の試料から派生したアンプリコンをシークエンシングすることによって取得される、計算すること、及びゲノム領域のシークエンシングリードの数が、分布の有意性閾値を超えていることを決定すること。いくつかの実施形態では、事前定義されたクラスター内のゲノム領域のシークエンシングリードの数が事前定義されたクラスター内のゲノム領域のシークエンシングリードの予想数と有意に異なることを決定することは、以下の式
Figure 2023075090000044



を使用して各ゲノム間隔におけるシークエンシングリードの分布の合計を計算すること（式中、Ｒｉはシークエンシングリードの数であり、Ｉは、染色体腕上のクラスターの数であり、Ｎはパラメーターμｉ及びσｉ ２のガウス分布であり、ここで、μｉは各ゲノム間隔のシークエンシングリードの平均数であり、ここでσｉ ２は、各ゲノム間隔でのシークエンシングリードの分散である）、分位関数
Figure 2023075090000045



を使用して染色体腕のＺスコアを計算すること、及びＺスコアが有意な閾値を超えている場合に、哺乳動物の組織に異数性の存在を同定すること、を含む。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づいて）、異数性の存在を検出するステップは、以下を含む：第２の試料から得られた複数のアンプリコンをシークエンシングして、複数の多型部位の変異型シークエンシングリードを取得すること、両方のアレルに、約３を超える変異型シークエンシングリード及び参照シークエンシングリードを有する染色体腕を選択すること、選択された染色体腕の各多型部位の変異型アレル頻度（ＶＡＦ）を決定することであって、前記ＶＡＦは変異型シークエンシングリードの数／シークエンシングリードの総数である、選択すること、ならびに１つまたは複数の多型部位のＶＡＦが正規分布の有意閾値外である場合、選択された染色体腕上の異数性の存在を同定すること（予想されるＶＡＦが０．５である）。いくつかの実施形態では、シークエンシングのステップは以下を含む：ａ．複数のアンプリコンのそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各アンプリコンを増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、選択された染色体腕上の異数性の存在を同定するステップは、方程式
Figure 2023075090000046



を使用して、前記選択された染色体腕上の１つまたは複数の多型部位のＺスコアを計算することを含み、ここで、ｗｉは、変異型ｉのＵＩＤ深度であり、Ｚｉは、変異型ｉのＶＡＦのＺスコアであり、ｋは染色体腕で観察される変異型の数である。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、方法は、第１の試料、第２の試料、またはその両方で細胞診を実施すること、及び第１の試料で１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、第２の試料で異数性の存在が検出された場合、陽性細胞診が、対象ががんを有することを示す場合、またはそれらの組み合わせで、対象をがんを有するとして同定することをさらに含む。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、がんは膀胱癌または上部尿路上皮癌であり、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、またはＶＨＬのうちの１つまたは複数であり、方法はさらに、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することを含み、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、または異数性の存在は、対象が膀胱癌であることを示す。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、及び異数性の存在は、その対象が膀胱癌を有することを示す。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ３、またはその両方である。いくつかの実施形態では、異数性の存在を検出するステップは、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び９ｐのうちの１つまたは複数の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー、ＴＥＲＴプロモーター内の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）、またはその両方は、試料中の尿細胞の０．０３％以下に存在する。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出するステップは、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、または次世代シークエンシングアッセイを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴプロモーター内の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出するステップは、以下を含むエラー削減手法で超並列シークエンシング機器の感度を高めることにより実行される：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料の異数性の存在に基づく）、方法は膀胱癌の検出を含み、さらに膀胱の経尿道的切除（ＴＵＲＢ）、膀胱内ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、膀胱切除または膀胱前立腺切除術、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを実施することを含む。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、方法は上部尿路上皮癌の検出を含み、さらに経尿道的切除、膀胱内ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、尿管切除または腎尿管切除、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを実施することを含む。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、がんは卵巣癌または子宮内膜癌であり、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数であり、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａのうちの１つもしくは複数における１つもしくは複数の変異の存在、異数性の存在、またはその両方の存在によって、その対象は、卵巣癌または子宮内膜癌を有することが示される。対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、がんは子宮内膜癌であり、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数であり、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の変異の存在、異数性の存在、またはその両方は、その対象が子宮内膜癌を有することを示す。対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、がんは高悪性度漿液性がんであり、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーはＴＰ５３にあり、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、異数性の存在、またはその両方は、その対象が高悪性度漿液性癌を有することを示す。いくつかの実施形態では、異数性の存在を検出するステップは、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑのうちの１つまたは複数の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、第１の試料、第２の試料、または両方は、子宮内サンプリングを介して収集される。いくつかの実施形態では、第１の試料、第２の試料、または両方は、Ｔａｏブラシで収集される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から得られた循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料において、以下の遺伝子：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、またはＴＰ５３のうちの１つまたは複数における少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーの存在を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、対象に治療を実施することを含み、治療は、手術、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料の異数性の存在に基づく）、遺伝子バイオマーカーは遺伝子の変異である。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、第１の試料と第２の試料は同じである。対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、第１の試料と第２の試料とは異なる。対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、第１の試料は血液試料である。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、方法はさらに、ａ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーについて試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異の変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、対象ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、及びｃ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合、その対象をがん有しているとして同定すること、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、さらに、２つ以上の遺伝子バイオマーカーから対象をがんを有する確率を示す最高スコアを有する１つの遺伝子バイオマーカーを選択すること、及び選択した遺伝子バイオマーカーのスコアを参照値と比較することを含む。いくつかの実施形態では、スコアはＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアである。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料の異数性の存在に基づく）、方法はさらに、ａ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーについて試料中の変異アレル頻度を決定すること、及びｂ）選択した遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料中の各変異についての各変異の最大変異アレル頻度と比較すること、を含む。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、対象をがんを有するとして同定する感度は：１）対象から得られる試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在のみが検出された場合に得られた感度、または２）対象から得られる試料に異数性のみの存在が検出された場合に得られる感度、と比較して増大している。対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、対象をがんを有するとして同定する特異性は：１）対象から得られた試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在のみが検出された場合に得られる特異性、または２）対象から得られる試料に異数性のみの存在が検出された場合に得られる特異性と比較して、増大している。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料の異数性の存在に基づく）、方法はさらに、試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在を検出することを含み、試料は第１試料、第２試料、または第３試料である。対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、対象はヒトである。対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られた第１の試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２の試料中の異数性の存在に基づく）、がんはステージＩのがんである。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の改変を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変は不活性化改変を含み、ここで前記１つまたは複数の遺伝子は腫瘍抑制遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変は、単一塩基の置換、挿入、または欠失、転座、融合、切断、複製、または増幅から独立して選択される改変を含む。
対象をがんを有するとして同定するか、またはがんを有する対象を治療するいくつかの実施形態では（例えば、前記対象から得られる第１試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、及び／または対象から得られた第２試料中の異数性の存在に基づく）、
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における各変異について患者から収集された試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異の変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、対象ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、及びｃ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合、その対象をがんを有するとして同定すること。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数の各変異について患者から収集された試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異の変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、対象ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、及びｃ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合、その対象をがんを有するとして同定すること。いくつかの実施形態では、方法はさらに、２つ以上の遺伝子バイオマーカーから対象ががんを有する確率を示す最高スコアを有する１つの遺伝子バイオマーカーを選択すること、及び選択した遺伝子バイオマーカーのスコアを参照値と比較することを含む。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異の変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、対象ががんを有していない確率を示すスコアを取得すること、及びｃ）スコアがスコアの基準値よりも低い場合、その対象をがん有していないと同定すること。いくつかの実施形態では、方法はさらに、対象ががんを有していない確率を示す最低スコアを有する１つの遺伝子バイオマーカーを選択すること、及び選択した遺伝子バイオマーカーのスコアを参照値と比較することを含む。いくつかの実施形態では、スコアはＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアである。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーについて血液試料中の変異アレル頻度を決定すること、及びｂ）選択した遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異について各変異の最大変異アレル頻度と比較すること。いくつかの実施形態では、前の段落に記載の、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供され、試料は、以下を含む方法を使用して２つ以上の試験試料でアッセイされる：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。患者をがんを有するとして同定するいくつかの実施形態では、方法は、試料中の異数性の存在（例えば、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑのうちの１つまたは複数の異数性の存在）を検出することをさらに含む。患者をがんを有するとして同定するいくつかの実施形態では、方法は、以下の遺伝子：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、またはＴＰ５３のうちの１つまたは複数における少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーの存在を対象から得た循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料中で検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、がんはステージＩのがんである。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は不活性化改変を含み、少なくとも１つの変異は腫瘍抑制遺伝子にある。いくつかの実施形態では、改変は、単一塩基の置換、挿入、欠失、転座、融合、切断、複製、または増幅から独立して選択される。いくつかの実施形態では、方法は、１つまたは複数の治療的介入（例えば、手術、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数）を対象に施すことをさらに含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、またはＶＨＬのうちの１つまたは複数における各変異について患者から収集された試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異の変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、対象ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、及びｃ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合、その対象をがんを有するとして同定すること。いくつかの実施形態では、方法はさらに、２つ以上の遺伝子バイオマーカーから対象ががんを有する確率を示す最高スコアを有する１つの遺伝子バイオマーカーを選択すること、及び選択した遺伝子バイオマーカーのスコアを参照値と比較することを含む。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて試料中の変異アレル頻度を決定すること、ｂ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異の変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、対象ががんを有していない確率を示すスコアを取得すること、及びｃ）スコアがスコアの基準値よりも低い場合、その対象をがんを有していないとして同定すること。いくつかの実施形態では、方法はさらに、対象ががんを有していない確率を示す最低スコアを有する１つの遺伝子バイオマーカーを選択すること、及び選択した遺伝子バイオマーカーのスコアを参照値と比較することを含む。いくつかの実施形態では、スコアは、ＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアである。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供される：ａ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーについて血液試料中の変異アレル頻度を決定すること、及びｂ）選択した遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異について各変異の最大変異アレル頻度と比較すること。いくつかの実施形態では、前の段落に記載の、患者をがんを有するとして同定する方法が本明細書で提供され、試料は、以下を含む方法を使用して２つ以上の試験試料でアッセイされる：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、方法は、試料中のＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することをさらに含む。患者をがんを有するとして同定するいくつかの実施形態では、方法は、試料中の異数性の存在（例えば、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び９ｐの１つまたは複数の異数性の存在）を検出することをさらに含む。患者をがんを有するとして同定するいくつかの実施形態では、方法は、対象から得られた循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料において、以下の遺伝子：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、またはＴＰ５３のうちの１つまたは複数における少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーの存在を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、がんはステージＩのがんである。いくつかの実施形態では、がんは、膀胱癌または上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、不活性化改変を含み、少なくとも１つの変異は腫瘍抑制遺伝子にある。いくつかの実施形態では、改変は、単一塩基の置換、挿入、欠失、転座、融合、切断、複製、または増幅から独立して選択される。いくつかの実施形態では、方法は、１つまたは複数の治療的介入（例えば、手術、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数）を対象に実施することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：生物試料中の遺伝子セットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セット中の各変異の変異アレル頻度を決定するように構成される少なくとも１つのデバイスであって、遺伝子セットは、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、及びｉｉ）遺伝子セットの各変異についてがんを有する患者から収集された試料の変異アレル頻度の第２の参照分布を含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）スコアが参照値よりも高い場合、患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値より高くない場合、患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含むコンピューター可読プログラムコード。患者に関するレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、ＴＥＲＴプロモーター内の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）の存在を検出するように構成される少なくとも１つのデバイスを含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者用のレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：生物試料中の遺伝子セットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セット中の各変異の変異アレル頻度を決定するように構成される少なくとも１つのデバイスであって、ここで、遺伝子セットは、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、及びｉｉ）遺伝子セットの各変異についてがんを有する患者から収集された試料の変異アレル頻度の第２の参照分布を含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｄ）スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値より高くない場合に、患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含むコンピューター可読プログラムコード。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者用のレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：生物試料中の遺伝子セットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セット中の各変異の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスであって、遺伝子セットが、以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、及びｉｉ）遺伝子セットの各変異についてがんを有する患者から収集された試料の変異アレル頻度の第２の参照分布、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート；または、スコアが参照値より高くない場合に、患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含むコンピューター可読プログラムコード。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のがんのレポートを作成するためのシステムが本明細書で提供される：患者から収集された生物試料中のＴＰ５３遺伝子をアッセイして、ＴＰ５３の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）ＴＰ５３について、対照試料における変異アレル頻度の第１参照分布、及びｉｉ）ＴＰ５３について、がんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布を含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）ＴＰ５３の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート；または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコード。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：ａ）生物試料中の遺伝子のセットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セットの各変異の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスであって、ここで、遺伝子セットは以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリスト、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）スコアが参照値よりも高い場合、患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。患者のがん治療を同定するためのレポートを作成するシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、ＴＥＲＴプロモーター内の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）の存在を検出するように構成された少なくとも１つのデバイスを含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：ａ）患者から収集された生物試料中の遺伝子セットをアッセイして遺伝子セットの各変異の変異アレル頻度を決定するように構成される少なくとも１つのデバイスであって、遺伝子セットは、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリスト、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のがん治療を同定するためのレポートを作成するシステムが本明細書で提供される：ａ）生物試料中の遺伝子セットをアッセイして遺伝子のセットの各変異の変異アレル頻度を決定するように構成される少なくとも１つのデバイスであって、遺伝子セットは、以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリスト、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコードと。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、患者のがん治療を同定するレポートを作成するためのシステムであり、以下を含む：ａ）患者から収集された生物試料中のＴＰ５３遺伝子をアッセイして、ＴＰ５３の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって：ｉ）ＴＰ５３の対照試料における変異アレル頻度の第１参照分布、ｉｉ）ＴＰ５３のがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）ＴＰ５３の生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリストを含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）ＴＰ５３の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。
いくつかの実施形態では、以下を含む、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するための、患者のレポートを作成するためのシステムが本明細書で提供される：ａ）生物試料の遺伝子のセットをアッセイして、患者から収集された試料中の遺伝子セットの各変異の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスであって、ここで、患者から収集された試料中の遺伝子のセット、遺伝子のセットは、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリスト、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するシステムのいくつかの実施形態では、システムは、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）の存在を検出するように構成された少なくとも１つのデバイスをさらに含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のレポートを作成して、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するためのシステムが本明細書で提供される：ａ）患者から収集された試料中の遺伝子セットの各変異の変異アレル頻度を決定するための生物試料中の遺伝子のセットをアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスであって、ここで、患者から収集された試料中の遺伝子のセットは、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリスト、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。いくつかの実施形態では、以下を含む、患者のレポートを作成して、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するためのシステムが本明細書で提供される：ａ）生物試料中の遺伝子のセットをアッセイして、その遺伝子セット内の各変異の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスであって、遺伝子のセットが、以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）を含む、デバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）遺伝子セット内の各変異の対照試料における変異アレル頻度の第１の参照分布、ｉｉ）遺伝子セット内の各変異についてがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）遺伝子セットの少なくとも１つのメンバーの生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリスト、を含むコンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｉ）遺伝子セットの各変異の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。いくつかの実施形態では、以下を含む、、患者のレポートを作成して、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定するためのシステムが本明細書で提供される：患者から収集された生物試料中のＴＰ５３遺伝子をアッセイして、ＴＰ５３の変異アレル頻度を決定するように構成された少なくとも１つのデバイスと、ｂ）少なくとも１つのコンピューターデータベースであって、ｉ）ＴＰ５３の対照試料における変異アレル頻度の第１参照分布、ｉｉ）ＴＰ５３のがんを有する患者から収集された試料における変異アレル頻度の第２の参照分布、及びｉｉｉ）ＴＰ５３の生物学的状態に関連する有効性を有するがん治療のリストを含む、コンピューターデータベースと、ｃ）コンピューター可読プログラムコードであって、ｃ）ｉ）ＴＰ５３の生物試料における変異アレル頻度を入力すること、ｉｉ）変異アレル頻度を第１の参照分布と比較すること、ｉｉｉ）変異アレル頻度を第２の参照分布と比較すること、及びｉｖ）患者ががんを有する可能性を示すスコアを計算すること、を実行するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードと、ｄ）コンピューター可読プログラムコードであって、スコアが参照値よりも高い場合に患者をがんを有するとして示すレポート、または、スコアが参照値よりも高くない場合に患者をがんを有していないとして示すレポートを作成するための命令を含む、コンピューター可読プログラムコードと、ｅ）患者がステップ（ｄ）でがんを有するとして同定された場合、（ｂ）（ｉｉｉ）のがん治療のリストから少なくとも１つのがん治療を患者のために同定するための命令を含むコンピューター可読プログラムコードであって、ここで計算されたスコアは、同定されたがん治療が患者に効果的であることの指標となる、コンピューター可読プログラムコード。
患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、またはその両方の候補として患者を同定する患者のレポートを作成するシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、以下を実行するための命令を含むコンピューター読み取り可能なプログラムコードを含む：ｉ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーの試料における変異アレル頻度を決定すること、ｉｉ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異の変異アレル頻度の参照分布と比較することにより、対象ががんを有する可能性を示すスコアを取得すること、及びｉｉ）スコアがスコアの参照値よりも高い場合に、対象をがん有するとして同定すること。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、以下の命令を実行する命令を含むコンピューター可読プログラムコードを含む：ｉ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーから対象ががんを有する確率を示す最高スコアを有する１つの遺伝子バイオマーカーを選択すること、及びｉｉ）選択した遺伝子バイオマーカーのスコアを参照値と比較すること。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、スコアはＳｔｏｕｆｆｅｒのＺスコアである。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、以下の命令を実行するための命令を含むコンピューター読み取り可能なプログラムコードを含む：ｉ）２つ以上の遺伝子バイオマーカーについて試料中の変異アレル頻度を決定すること、及びｉｉ）選択された遺伝子バイオマーカーの各変異の変異アレル頻度を、対照試料の各変異について各変異の最大変異アレル頻度と比較すること。
患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査もしくはその両方の候補として患者を同定する患者のレポートを作成するシステムのいくつかの実施形態では、遺伝子セットをアッセイするように構成されたデバイスは、ＰＣＲベースマルチプレックスアッセイ、ＰＣＲベースのシングルプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、マイクロアレイアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、またはライゲーションアッセイを使用するデバイスを含む。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイは、以下を含む：ａ．試料に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ．増幅産物を重複シークエンシングすること。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムは、生物試料中の異数性の存在を検出するように構成されたデバイスをさらに含む。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムはさらに、生物試料中の異数性の存在を検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）を含む。１）以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳのうちの１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイス、および２）ＴＥＲＴプロモーター内の遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）の存在を検出するように構成されたデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムは、生物試料中の異数性の存在を検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）をさらに含む。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムは、生物試料中の異数性の存在を検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）をさらに含む。以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムは、生物試料中の異数性の存在を検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）をさらに含む。ＴＰ５３をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、システムは、生物試料中の異数性の存在を検出するように構成されたデバイス（例えば、マルチプレックスイムノアッセイシステムを含むデバイス）をさらに含む。異数性の存在は、がんに関連する１つまたは複数の染色体または染色体腕で検出され得る。いくつかの実施形態では、異数性の存在は、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び／または９ｐのうちの１つまたは複数で検出される。いくつかの実施形態では、異数性の存在は、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び／または９ｑのうちの１つまたは複数で検出される。
患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定する、患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、対象をがんを有するとして同定する際のシステムの感度が、患者のレポートを作成するための従来のシステムと比較して改善される。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、対象をがんを有するとして同定する際のシステムの特異性が、患者に関するレポートを作成するための従来のシステムと比較して改善されている。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、変異アレル頻度値の第１及び第２の参照分布は、少なくとも１つのコンピューターデータベースからリモートである場所からシステムに入力される。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、変異アレル頻度値の第１及び第２の参照分布は、インターネット接続を介してシステムに入力される。患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、レポートは電子形式または紙形式である。
患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定する、患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは、本明細書に記載されている任意の様々ながんタイプである（例えば、「がん」と題されたセクションを参照）。以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイス、及び生物試料中の異数性の存在を検出するように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは、膀胱癌または上部尿路上皮癌である。以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイス、ならびに生物試料の異数性の存在を検出するように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管卵管癌である。以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイス、ならびに生物試料の異数性の存在を検出するように構成された少なくとも１つのデバイスを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは子宮内膜癌である。ＴＰ５３をアッセイするように構成された少なくとも１つのデバイスと、生物試料の異数性の存在を検出するように構成された少なくとも１つのデバイスとを含む、患者のレポートを作成するシステム、患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステム、またはより詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方の候補として患者を同定するための患者のレポートを作成するためのシステムのいくつかの実施形態では、がんは高悪性度漿液性癌である。患者のレポートを作成するシステム、または患者のがん治療を同定するレポートを作成するシステムのいくつかの実施形態では、患者は、より詳しいモニタリング、さらなる診断検査、もしくはその両方（例えば、本明細書に記載の、任意の様々なより詳しいモニタリング、またはさらなる診断方法）の候補として同定される。
早期のがん検出のために現在承認されている検査の多くは、本質的に手続き型であり、大腸内視鏡検査、マンモグラフィー、及び子宮頸部細胞診分析を含む。現在までに、変異ベースのリキッドバイオプシ―で評価されたがん患者の大多数は、進行期の疾患を有する。リキッドバイオプシ―のさらに別の問題は、原臓器の同定である。同じ遺伝子変異が複数の腫瘍タイプを誘導するため、そのような変化に基づくリキッドバイオプシ―では、一般的に、陽性血液検査結果を引き起こす原発腫瘍の位置を同定し得ない。本明細書では、多くの一般的ながんの早期検出及び局在化のための非侵襲的組み合わせ血液検査（例えば、ＤＮＡマーカーとタンパク質マーカーを組み合わせた検査）について記載する。
本明細書は、がんを有するか、またはがんを有する疑いのある哺乳動物（例えば、ヒト）を評価及び／または治療するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書は、哺乳動物をがんを有するとして同定するための方法及び物質を提供する。例えば、哺乳動物から得られた試料（例えば、血液試料）を、少なくとも部分的に、１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無、及び／または上昇した１つもしくは複数のバイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベルに基づいて、哺乳動物ががんを有するか否かを判定するために評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書は、哺乳動物におけるがんの位置（例えば、解剖学的部位）を同定するための方法及び物質を提供する。例えば、哺乳動物から得られた試料（例えば、血液試料）を評価して、少なくとも部分的に、１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無、及び／または上昇した１つもしくは複数のバイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベルに基づいて、哺乳動物におけるがんの位置を決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書は、哺乳動物をがんを有するとして同定すること、及び哺乳動物を治療するために１つまたは複数の薬理学的介入を実施することのための方法及び物質を提供する。例えば、哺乳動物から得られた試料（例えば、血液試料）を、少なくとも部分的に、１つもしくは複数のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無、及び／または上昇した１つもしくは複数のバイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベルに基づいて、哺乳動物ががんを有するか否かを評価し、１つもしくは複数のがん治療を哺乳動物へ実施することができる。
本明細書で実証されているように、わずか２，００１ｂｐのゲノムＤＮＡの分析で、８種類の一般的ながんタイプの８２％で少なくとも１つの変異を検出し得た。１０個の循環タンパク質のレベルと、循環する無細胞ＤＮＡのこれらの２，００１ｂｐの変異を評価する試験（ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ）を設計した。この検査を、肝臓、卵巣、食道、胃、膵臓、結腸直腸、肺、または乳房のがんを有する１，００５名の患者に適用した。ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査は、８種類のがんの中央値で７０％が陽性であったが、正のスコアが得られたのは８１２人の正常な個人の１％未満であった。平均リスクの個人を対象としたスクリーニング検査がない５種類のがん（肝臓、卵巣、食道、胃、及び膵臓）の検出に対する感度は６９％～９８％の範囲であった。さらに、がんの発生源は、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫアッセイで陽性とスコアリングされた患者の８４％という中央値で少数の解剖学的部位に限局され得る。
極めて高い特異性を有する血液検査を使用することができると（例えば、ＤＮＡマーカーとタンパク質マーカーを組み合わせることにより）、臨床医は、早期段階でがんを検出することが可能となり、不必要なフォローアップ手順が少ないか、不安が少ないか、及び／または癌による死亡が減少する、早期治療をもたらす。
一般に、本明細書の一態様は、哺乳動物をがんを有するとして同定する方法を特長とする。方法は、哺乳動物から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出すること、哺乳動物から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルを検出すること、及び前記血液試料中の循環ＤＮＡで１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記血液試料で１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルの上昇が検出された場合、またはその両方の場合、その哺乳動物をがんを有するとして同定すること、を含むか、または本質的にそれからなり得る。この哺乳動物はヒトであり得る。血液試料は、血漿試料であり得る。がんはステージＩのがんであり得る。このがんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌であり得る。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、１つまたは複数の遺伝子に１つまたは複数の改変を含み得る。１つまたは複数の改変は、不活性化改変を含み得、１つまたは複数の遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子を含み得る。１つまたは複数の改変は、単一の塩基置換、挿入、及び欠失から独立して選択され得る。１つまたは複数の遺伝子は、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳを含み得る。１つまたは複数の改変は、表５に記載の改変から独立して選択され得る。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出するステップは、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して実行され得る。マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイは、各鋳型分子に一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及び増幅産物を重複シークエンシングすることを含み得る。１つまたは複数のペプチドバイオマーカーは、プロラクチン、ＯＰＮ、ＩＬ－６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ－１を含んでもよい。１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルを検出するステップは、マルチプレックスイムノアッセイシステムを使用して実行され得る。方法は、前記がんの位置を同定することも含み得る。方法はまた、１つまたは複数のがん治療を哺乳動物に施すことを含み得る。１つまたは複数のがん治療は、手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、放射線療法、及びそれらの組み合わせを含み得る。
別の態様では、本明細書は、がんを有する哺乳動物を治療する方法を特長とする。方法は、哺乳動物から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出すること、哺乳動物から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルを検出すること、及び前記血液試料中の循環ＤＮＡ中に、１つもしくは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記血液試料中に１つもしくは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルが検出された場合、またはその両方の場合に、前記哺乳動物に１つまたは複数のがん治療を実施すること、を含むか、または本質的にそれからなってもよい。１つまたは複数のがん治療は、手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、放射線療法、及びそれらの組み合わせを含み得る。哺乳動物はヒトであってもよい。血液試料は血漿試料であってもよい。がんはステージＩのがんであってもよい。がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌であり得る。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、１つまたは複数の遺伝子に１つまたは複数の改変を含んでもよい。１つまたは複数の改変は、不活性化改変を含んでもよく、１つまたは複数の遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子を含んでもよい。１つまたは複数の改変は、単一の塩基置換、挿入、及び欠失から独立して選択され得る。１つまたは複数の遺伝子は、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳを含み得る。１つまたは複数の改変は、表５に記載の改変から独立して選択され得る。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出するステップは、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して実行され得る。マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイは、各鋳型分子に一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及び増幅産物を重複して配列することを含んでもよい。１つまたは複数のペプチドバイオマーカーとしては、プロラクチン、ＯＰＮ、ＩＬ－６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ－１が挙げられ得る。１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルを検出するステップは、マルチプレックスイムノアッセイシステムを使用して実行され得る。
別の態様では、本明細書は、哺乳動物におけるがんの位置を同定する方法を特長とする。方法は、哺乳動物から得られた血液試料中の循環ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出すること、哺乳動物から得られた血液試料中の１つまたは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルを検出すること、及び前記血液試料中の循環ＤＮＡ中に、１つもしくは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記血液試料中に１つもしくは複数のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルが検出された場合、またはその両方の場合に、哺乳動物におけるがんの位置を同定すること、を含むか、または本質的にそれからなってもよい。哺乳動物はヒトであってもよい。血液試料は血漿試料であってもよい。がんはステージＩのがんであり得る。がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または前立腺癌であってもよい。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、１つまたは複数の遺伝子に１つまたは複数の改変を含んでもよい。１つまたは複数の改変は、不活性化改変を含んでもよく、１つまたは複数の遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子を含んでもよい。１つまたは複数の改変は、単一の塩基置換、挿入、及び欠失から独立して選択され得る。１つまたは複数の遺伝子は、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳを含み得る。１つまたは複数の改変は、表５に記載の改変から独立して選択され得る。１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出するステップは、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して実行され得る。マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイは、各鋳型分子に一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及び増幅産物を重複してシークエンシングすることを含み得る。１つまたは複数のペプチドバイオマーカーは、プロラクチン、ＯＰＮ、ＩＬ－６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ－１を含み得る。１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルを検出するステップは、マルチプレックスイムノアッセイシステムを使用して実行され得る。
以下を含む、ヒト対象におけるがんの存在を同定する方法が本明細書で提供される：ヒト対象から単離された第１の生物試料において、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＮＲＡＳ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子に由来する無細胞ＤＮＡにおける１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出すること、ヒト対象から単離された第２の生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することであって、タンパク質バイオマーカーは、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＡ１５－３、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルを、タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の参照レベルと比較すること、ならびに、無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在が検出されるか、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベルよりも高いか、またはその両方である場合、ヒト対象のがんの存在を特定すること。いくつかの実施形態では、第１の生物試料は、血液、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の生物試料、第２の生物試料、または両方は血漿を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の生物試料は同じである。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、第１の生物試料中の無細胞ＤＮＡにおける１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出するステップは、コドン及びその周囲のスプライス部位を含むアンプリコンを増幅することを含み、コドンは以下からなる群より選択される：ＡＫＴ１の１６～１８番コドン、ＡＰＣの１３０４～１３１１または１４５０～１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１～６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１～５８または７６～８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１～３９または３８～４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６～８６８ 番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１～３７１、４６４～４７３、４７３～４８３、または４９８～５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０～２５６ 番コドン、ＧＮＡＳの１９９～２０８番コドン、ＨＲＡＳの７～１９番コドン、ＫＲＡＳの７～１４、５７～６５、または１４３～１４８ 番コドン、ＮＲＡＳの３～１５または５４～６３ 番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０～９０、３４３～３４８、５４１～５５１、または１０３８～１０５０ 番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５～１８７ 番コドン、ＰＴＥＮの９０～９８、１２５～１３２、１３３～１４６、１４５～１５４番コドン、ＴＰ５３の１０～２２、２５～３２、３３～４０、４０～５２、５２～６４、８２～９４、９７～１１０、１１２～１２５、１２３～１２５、１２６～１３２、１３２～１４２、１５０～１６３、１６７～１７７、１７５～１８６、１８７～１９５、１９５～２０６、２０７～２１９、２１９～２２４、２２６～２３７、２３２～２４５、２４８～２６１、２６１～２６８、２７２～２８３、２７９～２９０、２９８～３０７、３０７～３１４、３２３～３３１、３３３～３４４、３４４～３５５、３６７～３７５、または３７４～３８６番コドン、及びそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、第１の生物試料中の無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出するステップは、コドン及びその周囲のスプライス部位を含む遺伝子領域のシークエンシングを含み、ここでコドンは以下からなる群より選択される：ＡＫＴ１の１６～１８番コドン、ＡＰＣの１３０４～１３１１または１４５０～１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１～６０２ 番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１～５８または７６～８８ 番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１～３９または３８～４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６～８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１～３７１番コドン、４６４～４７３、４７３～４８３、または４９８～５０７ 番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０～２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９～２０８番コドン、ＨＲＡＳの７～１９番コドン、ＫＲＡＳの７～１４、５７～６５、または１４３～１４８ 番コドン、ＮＲＡＳの３～１５または５４～６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０～９０、３４３～３４８、５４１～５５１、または１０３８～１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５～１８７番コドン、ＰＴＥＮの９０～９８、１２５～１３２、１３３～１４６、１４５～１５４ 番コドン、ＴＰ５３の１０～２２、２５～３２、３３～４０、４０～５２、５２～６４、８２～９４、９７～１１０、１１２～１２５、１２３～１２５、１２６～１３２、１３２～１４２、１５０～１６３、１６７～１７７、１７５～１８６、１８７～１９５、１９５～２０６、２０７～２１９、２１９～２２４、２２６～２３７、２３２～２４５、２４８～２６１、２６１～２６８、２７２～２８３、２７９～２９０、２９８～３０７、３０７～３１４、３２３～３３１、３３３～３４４、３４４～３５５、３６７～３７５、または３７４～３８６番コドン、及びそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、第１の生物試料中の無細胞ＤＮＡにおける１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出するステップは、以下のコドン及び各々由来のそれらの周囲のスプライスを含む遺伝子領域をシークエンシングすることを含む：ＡＫＴ１の１６～１８番コドン、ＡＰＣの１３０４～１３１１及び１４５０～１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１～６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１～５８及び７６～８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１～３９及び３８～４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６～８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１～３７１、４６４～４７３、４７３～４８３、及び４９８～５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０～２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９～２０８番コドン、ＨＲＡＳの７～１９番コドン、ＫＲＡＳの７～１４、５７～６５、１４３～１４８番コドン、ＮＲＡＳの３～１５及び５４～６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０～９０、３４３～３４８、５４１～５５１、及び１０３８～１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５～１８７番コドン、ＰＴＥＮの９０～９８、１２５～１３２、１３３～１４６、１４５～１５４番コドン、ＴＰ５３の１０～２２、２５～３２、３３～４０、４０～５２、５２～６４、８２～９４、９７～１１０、１１２～１２５、１２３～１２５、１２６～１３２、１３２～１４２、１５０～１６３、１６７～１７７、１７５～１８６、１８７～１９５、１９５～２０６、２０７～２１９、２１９～２２４、２２６～２３７、２３２～２４５、２４８～２６１、２６１～２６８、２７２～２８３、２７９～２９０、２９８～３０７、３０７～３１４、３２３～３３１、３３３～３４４、３４４～３５５、３６７～３７５、及び３７４～３８６の番コドン、ならびにそれらの組み合わせ。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはＣＡ１９－９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９タンパク質バイオマーカーの参照レベルは９２Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはＣＥＡを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＡタンパク質バイオマーカーの参照レベルは７．５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＨＧＦタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、０．８９ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＯＰＮを含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＮタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、１５８ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１２５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ１２５タンパク質バイオマーカーの参照レベルは５７７Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＡＦＰを含む。いくつかの実施形態では、ＡＦＰタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、２１ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはプロラクチンを含む。いくつかの実施形態では、プロラクチンタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、１４５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＴＩＭＰ－１を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＭＰ－１タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、１７７ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、フォリスタチンを含むま。いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、２ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはＧ－ＣＳＦを含む。いくつかの実施形態では、Ｇ－ＣＳＦタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、８００ｐｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはＣＡ１５－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ１５－３タンパク質バイオマーカーの参照レベルは９８Ｕ／ｍＬである。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、ヒト対象におけるがんの存在は、（ｉ）得られた無細胞ＤＮＡにおける１つまたは複数の遺伝子変化の存在が検出される場合、及び（ｉｉ）１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベルよりも高い場合に、同定される。
ヒト対象のがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、第１の生物試料中の無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在が、無細胞ＤＮＡを増幅してアンプリコンのファミリーを形成することにより検出され、ここではファミリーの各メンバーは、無細胞ＤＮＡの単一の鋳型分子に由来し、ファミリーの各メンバーは、共通のオリゴヌクレオチドバーコードでマークされ、各ファミリーは、別個のオリゴヌクレオチドバーコードでマークされる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを集合的に含むプライマーの集団で増幅するステップにより、鋳型分子に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、鋳型分子に対して内因性であり、ＤＮＡ合成プライミング部位を含むアダプターが、オリゴヌクレオチドバーコードに隣接する鋳型分子の末端に連結される。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、がんの存在が同定されたとき、治療的介入が対象に投与される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、養子Ｔ細胞療法、放射線療法、手術、化学療法剤の投与、免疫チェックポイント阻害剤の投与、標的療法の投与、キナーゼ阻害剤の投与、シグナル伝達阻害剤の投与、二重特異性抗体の投与、モノクローナル抗体の投与、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、がん、及び治療的介入は、後に治療的介入がヒト対象に投与される場合よりも効果的である。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、ヒト対象におけるがんの存在は、がんを有するヒト対象の診断の前の時点で検出される。いくつかの実施形態では、ヒト対象におけるがんの存在は、ヒト対象ががんに関連する症状を示す前の時点で検出される。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、ヒト対象とは、がんの位置を同定するために臓器または身体領域の放射線スキャンを受けたヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、がんの位置を同定するために全身放射線スキャンを受けたヒトである。いくつかの実施形態では、走査は、コンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャンである。
いくつかの実施形態では、がんは、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、及び乳癌、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。
以下を含む、ヒト対象におけるがんの存在を同定する方法も本明細書で提供される：ヒト対象から単離された第１の生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することであって、ここで１つまたは複数タンパク質バイオマーカーは、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルを、タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の参照レベルと比較すること、ならびに１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベルよりも高い場合に、ヒト対象におけるがんの存在を同定すること。
以下を含む、ヒト対象における膵臓癌の存在を同定する方法が本明細書で提供される：ヒト対象から単離された第１の生物試料において、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＭＡＤ４、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子から得られる無細胞ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子改変の存在を検出すること、ヒト対象から単離された第２の生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することであって、ここで１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出されたレベルを、タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の参照レベルと比較すること、ならびに、無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在が検出されるか、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベルよりも高いか、またはその両方の場合に、ヒト対象の膵臓癌の存在を同定すること。いくつかの実施形態では、第１の生物試料は、血液、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、便、腹水、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の生物試料、第２の生物試料、または両方は血漿を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の生物試料は同じである。
ヒト対象における膵臓癌の存在を同定する方法のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変化は、ＫＲＡＳ遺伝子の１２または６１番コドンで生じる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはＣＡ１９－９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９タンパク質バイオマーカーの参照レベルは１００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＥＡを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＡタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、７．５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＨＧＦタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、０．９２ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＯＰＮを含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＮタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、１５８ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮのそれぞれのレベルを検出することを含み、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルを、タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の参照レベルと比較することは、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮのそれぞれの検出レベルを、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮのそれぞれの参照レベルと比較することを含む。
ヒト対象における膵臓癌の存在を同定する方法のいくつかの実施形態では、ヒト対象における膵臓癌の存在は、以下の場合に同定される：（ｉ）ＫＲＡＳ遺伝子に由来する無細胞ＤＮＡ中の１つまたは複数の遺伝子改変の存在が検出される場合、及び（ｉｉ）１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベルよりも高い場合。ヒト対象における膵臓癌の存在を同定する方法のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変化が、無細胞ＤＮＡを増幅し、アンプリコンのファミリーを形成することにより検出され、ここでは、ファミリーの各メンバーが、無細胞ＤＮＡ中の単一の鋳型分子に由来し、ファミリーの各メンバーが共通のオリゴヌクレオチドバーコードによってマークされ、各ファミリーが別個のオリゴヌクレオチドバーコードによってマークされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを集合的に含むプライマーの集団で増幅するステップにより、鋳型分子に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、鋳型分子に対して内因性であり、ＤＮＡ合成プライミング部位を含むアダプターが、オリゴヌクレオチドバーコードに隣接する鋳型分子の末端に連結される。
いくつかの実施形態では、膵臓癌の存在が確認された場合、ヒト対象への治療的介入である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、養子Ｔ細胞療法、放射線療法、手術、化学療法剤の投与、免疫チェックポイント阻害剤の投与、標的療法の投与、キナーゼ阻害剤の投与、シグナル伝達阻害剤の投与、二重特異性抗体の投与、モノクローナル抗体の投与、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、ヒト対象が初期膵臓がんを有するときに投与され、治療的介入は、治療的介入が後にヒト対象に投与される場合よりも効果的である。
いくつかの実施形態では、ヒト対象における膵臓癌の存在は、膵臓がんを有するヒト対象の診断の前の時点で検出される。いくつかの実施形態では、ヒト対象における膵臓癌の存在は、ヒト対象が膵臓癌に関連する症状を示す前の時点で検出される。
以下を含む、ヒト対象の膵臓癌の存在を同定する方法も本明細書で提供される：ヒト対象から単離された第１の生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することであって、ここで１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルをタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の参照レベルと比較すること、及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出されたレベルが、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベルよりも高い場合、ヒト対象における膵臓癌の存在を同定すること。
以下を含む、ヒト対象におけるがんの存在を同定する方法が本明細書で提供される：対象から単離された第１の生物試料において、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＮＲＡＳ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子に由来する無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出すること、対象から単離された第２の生物試料において、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＮＲＡＳ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子に由来するＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の不在を検出することであって、ここで、第２の生物試料は対象の白血球から分離されている、検出すること、第１の試料で検出された１つまたは複数の遺伝子変異が第２の試料で検出されない場合、対象のがんの存在を同定すること。いくつかの実施形態では、第１の生物試料、第２の生物試料、またはその両方は、血液、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の生物試料、第２の生物試料、またはその両方は血漿を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の生物試料は同じである。ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、方法はさらに、対象から単離された第３の生物試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、及びＣＡ１５－３、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルを、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較すること、ならびに、第１の試料で無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変異の存在が検出されるか、第２の試料のＤＮＡで１つまたは複数の遺伝子変異の非存在が検出されるか、及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが、タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の参照レベルよりも高くなっている場合、対象のがんの存在を同定すること。いくつかの実施形態では、第３の生物試料は第１の生物試料と同じである。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、第１の生物試料中の無細胞ＤＮＡにおける１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出するステップ、第２の生物試料中のＤＮＡにより多くの遺伝子変化がないことを検出するステップ、またはその両方は、コドン及びその周囲のスプライス部位を含むアンプリコンの増幅を含み、コドンは、以下からなる群より選択される：ＡＫＴ１のコドン１６－１８、ＡＰＣのコドン１３０４－１３１１または１４５０－１４５９、ＢＲＡＦのコドン５９１－６０２、ＣＤＫＮ２Ａのコドン５１－５８または７６－８８、ＣＴＮＮＢ１のコドン３１－３９または３８－４７、ＥＧＦＲのコドン８５６－８６８、ＦＢＸＷ７のコドン３６１－３７１、４６４－４７３、４７３－４８３、または４９８－５０７、ＦＧＦＲ２のコドン２５０－２５６、ＧＮＡＳのコドン１９９－２０８、ＨＲＡＳのコドン７－１９、ＫＲＡＳのコドン７－１４、５７－６５、または１４３－１４８、ＮＲＡＳのコドン３－１５または５４－６３、ＰＩＫ３ＣＡのコドン８０－９０、３４３－３４８、５４１－５５１、または１０３８－１０５０、ＰＰＰ２Ｒ１Ａのコドン１７５－１８７、及びＰＴＥＮのコドン９０－９８、１２５－１３２、１３３－１４６、１４５－１５４、ならびにＴＰ５３のコドン１０－２２、２５－３２、３３－４０、４０－５２、５２－６４、８２－９４、９７－１１０、１１２－１２５、１２３－１２５、１２６－１３２、１３２－１４２、１５０－１６３、１６７－１７７、１７５－１８６、１８７－１９５、１９５－２０６、２０７－２１９、２１９－２２４、２２６－２３７、２３２－２４５、２４８－２６１、２６１－２６８、２７２－２８３、２７９－２９０、２９８－３０７、３０７－３１４、３２３－３３１、３３３－３４４、３４４－３５５、３６７－３７５、または３７４－３８６。いくつかの実施形態では、第１の生物試料中の無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出するステップ、第２の生物試料中のＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の非存在を検出するステップ、またはその両方は、コドン及びそれらの周囲のスプライス部位を含む遺伝子領域をシークエンシングすることを含み、ここで、コドンは以下からなる群より選択される：ＡＫＴ１の１６～１８番コドン、ＡＰＣの１３０４～１３１１または１４５０～１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１～６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１～５８または７６～８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１～３９または３８～４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６～８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１～３７１、４６４～４７３、４７３～４８３、または４９８～５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０～２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９～２０８番コドン、ＨＲＡＳの７～１９番コドン、ＫＲＡＳの７～１４、５７～６５、または１４３～１４８番コドン、ＮＲＡＳの３～１５または５４～６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０～９０、３４３～３４８、５４１～５５１、または１０３８～１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５～１８７番コドン、及びＰＴＥＮの９０～９８、１２５～１３２、１３３～１４６、１４５～１５４番コドン、ならびにＴＰ５３の１０～２２、２５～３２、３３～４０、４０～５２、５２～６４、８２～９４、９７～１１０、１１２～１２５、１２３～１２５、１２６～１３２、１３２～１４２、１５０～１６３、１６７～１７７、１７５～１８６、１８７～１９５、１９５～２０６、２０７～２１９、２１９～２２４、２２６～２３７、２３２～２４５、２４８～２６１、２６１～２６８、２７２～２８３、２７９～２９０、２９８～３０７、３０７～３１４、３２３～３３１、３３３～３４４、３４４～３５５、３６７～３７５、または３７４～３８６番コドン。いくつかの実施形態では、第１の生物試料中の無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在を検出するステップ、第２の生物試料中のＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の非存在を検出するステップ、またはその両方は、以下のそれぞれからのコドン及びその周囲のスプライスを含む遺伝子領域をシークエンシングすることを含む：ＡＫＴ１の１６～１８番コドン、ＡＰＣの１３０４～１３１１及び１４５０～１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１～６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１～５８及び７６～８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１～３９及び３８～４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６～８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１～３７１、４６４～４７３、４７３～４８３、及び４９８～５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０～２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９～２０８番コドン、ＨＲＡＳの７～１９番コドン、ＫＲＡＳの７～１４、５７～６５、１４３～１４８番コドン、ＮＲＡＳの３～１５及び５４～６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０～９０、３４３～３４８、５４１～５５１、及び１０３８～１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５～１８７番コドン、及びＰＴＥＮの９０～９８、１２５～１３２、１３３～１４６、１４５～１５４番コドン、ならびにＴＰ５３の１０～２２、２５～３２、３３～４０、４０～５２、５２～６４、８２～９４、９７～１１０、１１２～１２５、１２３～１２５、１２６～１３２、１３２～１４２、１５０～１６３、１６７～１７７、１７５～１８６、１８７～１９５、１９５～２０６、２０７～２１９、２１９～２２４、２２６～２３７、２３２～２４５、２４８～２６１、２６１～２６８、２７２～２８３、２７９～２９０、２９８～３０７、３０７～３１４、３２３～３３１、３３３～３４４、３４４～３５５、３６７～３７５、及び３７４～３８６番コドン。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはＣＡ１９－９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９－９タンパク質バイオマーカーの参照レベルは９２Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーはＣＥＡを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＡタンパク質バイオマーカーの参照レベルは７．５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＨＧＦタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、０．８９ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＯＰＮを含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＮタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、１５８ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１２５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ１２５タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、５７７Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＡＦＰを含む。いくつかの実施形態では、ＡＦＰタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、２１ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、プロラクチンを含む。いくつかの実施形態では、プロラクチンタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、１４５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＴＩＭＰ－１を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＭＰ－１タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、１７７ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、フォリスタチンを含む。いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、２ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、Ｇ－ＣＳＦを含む。いくつかの実施形態では、Ｇ－ＣＳＦタンパク質バイオマーカーの参照レベルは、８００ｐｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１５－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ１５－３タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、９８Ｕ／ｍＬである。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、第１の生物試料における無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の存在、第２の生物試料におけるＤＮＡの１つまたは複数の遺伝子変化の非存在、またはその両方は、無細胞ＤＮＡを増幅してアンプリコンのファミリーを形成することで検出され、ファミリーの各メンバーは無細胞ＤＮＡの単一の鋳型分子に由来し、ファミリーの各メンバーは一般的なオリゴヌクレオチドバーコードによってマークされ、及び各ファミリーは別個のオリゴヌクレオチドバーコードによってマークされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを集合的に含むプライマーの集団で増幅するステップにより、鋳型分子に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは鋳型分子に対して内因性であり、ＤＮＡ合成プライミング部位を含むアダプターが、オリゴヌクレオチドバーコードに隣接する鋳型分子の末端に連結される。
いくつかの実施形態では、がんの存在が確認された場合、治療的介入が対象に投与される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、養子Ｔ細胞療法、放射線療法、手術、化学療法剤の投与、免疫チェックポイント阻害剤の投与、標的療法の投与、キナーゼ阻害剤の投与、シグナル伝達阻害剤の投与、二重特異性抗体の投与、モノクローナル抗体の投与、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、対象が初期がんを有する場合に、投与され、治療的介入は、治療的介入が後に対象に投与される場合よりも効果的である。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、対象におけるがんの存在は、がんを有する対象の診断の前の時点で検出される。いくつかの実施形態では、対象におけるがんの存在は、対象ががんに関連する症状を示す前の時点で検出される。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、ヒト対象は、がんの位置を同定するために臓器または身体領域の放射線スキャンを受けるヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、がんの位置を同定するために全身放射線スキャンを受けるヒトである。いくつかの実施形態では、走査はコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャンである。
ヒト対象におけるがんの存在を同定するいくつかの実施形態では、がんは、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、及び乳癌、ならびにその組み合わせからなる群より選択される。
本明細書でより詳細に説明するように、サンプリングされた体液（例えば、子宮頸管から採取された細胞を含む体液）由来のＤＮＡを、アッセイ（例えば、ＰＣＲベースのマルチプレックス試験）で使用して、子宮内膜癌または卵巣癌で一般的に発生する遺伝子変化を同時に評価することが示された（図１９）。さらに、本明細書でより詳細に説明するように、そして限定するものではないが、感度を高める２つの方法を特定した。最初に、子宮内サンプリング（「Ｔａｏブラシ」による）を試験した。これは、腫瘍の解剖学的部位により近い試料収集を可能にする方法である。第２に、最近の研究で、同じ個人からの唾液及び血漿の両方の変異を検査すると、頭頸部腫瘍の検出感度が増大することが示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＨＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７，２９３ｒａ１０４（２０１５））。先例に基づいて、血漿とＰａｐ検査液の両方の変異を検査すると、がん（例えば、卵巣癌）に対する感受性が高まり得ることが示された。
いくつかの態様では、体液（例えば、慣用的なパパニココロウ（Ｐａｐ）検査中に得られた体液）から回収されたＤＮＡの遺伝分析に基づいて子宮内膜及び卵巣癌を検出する方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＰａｐＳＥＥＫと呼ばれる、この新しい試験は、１８個の遺伝子のうちの１つまたは複数における変異のアッセイ、及び／または異数性のアッセイを組み込む。いくつかの実施形態では、婦人科癌を検出するために本明細書で提供される方法は、がんが治癒する可能性がより高い段階で使用される。いくつかの実施形態では、ＰａｐＳＥＥＫは、血漿試料に存在する核酸中の１つまたは複数の遺伝子の変異のアッセイと組み合わされ得る。
いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ、からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の変異の存在を対象から得た試料において検出すること、試料中の異数性の存在を検出すること、またはその両方を含む、対象において卵巣癌または子宮内膜癌を検出する方法が本明細書で提供され、ここでＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａの１つもしくは複数の変異の存在、異数性の存在、またはその両方によって、対象が卵巣癌または子宮内膜癌を有することが示される。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップは、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイを使用するか、ＰＣＲベースのシングルプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、マイクロアレイアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、またはライゲーションアッセイを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップは、１００～１，０００，０００の野生型鋳型の中で１つの変異鋳型の範囲で稀な変異アレルの検出を可能にするエラー削減手法により、超並列シークエンシング機器の感度を高めることによって実行される。例えば、１つまたは複数の変異を検出するステップは、エラー削減手法を使用して、超並列シークエンシング機器の感度を高めることにより実行され得、技術は以下を含む：ａ）各鋳型分子に一意の識別子（ＵＩＤ）を分子的に割り当てること、ｂ）それぞれ一意にタグ付けされた鋳型分子を増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ）増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法はさらに、試料上で細胞診を実施することを含み、ここでＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａにおける１つまたは複数の変異の存在、異数性の存在、及び／または細胞診陽性によって、対象が卵巣癌または子宮内膜癌を有することが示される。いくつかの実施形態では、異数性の存在を試料で検出するステップは、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑの１つまたは複数の１つまたは複数上の変化の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、異数性の存在を試料内で検出するステップは、散在したヌクレオチド要素を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む第２の試料において、以下：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及びＴＰ５３からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における少なくとも１つの変異の存在を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の試料は血漿を含む。いくつかの実施形態では、試料は子宮内サンプリングにより収集される。いくつかの実施形態では、試料はタオブラシ（Ｔａｏ ｂｒｕｓｈ）で収集される。いくつかの実施形態では、方法は、治療法（例えば、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、免疫チェックポイント阻害剤、及びそれらの組み合わせ）を対象に施すことをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書では、対象における子宮内膜癌を検出する方法が提供され、方法は、以下：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａからなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の変異の存在を、対象から得た試料において検出すること、試料中の異数性の存在を検出すること、またはその両方を含み、ここでＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａにおける１つまたは複数の変異の存在、異数性の存在、またはその両方によって、その対象が子宮内膜癌であることが示される。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップは、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイを使用するか、ＰＣＲベースのシングルプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、マイクロアレイアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、定量ＰＣＲアッセイ、またはライゲーションアッセイを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップは、１００～１，０００，０００個の野生型鋳型の中の１つの変異鋳型の範囲で、稀な変異アレルの検出を可能にするエラー削減手法で、超並列シークエンシング装置の感度を高めることによって実行される。例えば、１つまたは複数の変異を検出するステップは、エラー削減手法を使用して、超並列シークエンシング機器の感度を高めることで実行され得、これには、以下を含む：ａ）各鋳型分子に一意の識別子（ＵＩＤ）を分子的に割り当てること、ｂ）タグ付き鋳型分子をそれぞれ一意に増幅してＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ）増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法はさらに、試料上で細胞学を実施することを含み、ここで、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａにおける１つまたは複数の変異の存在、異数性の存在、及び／または陽性細胞診によって、対象が子宮内膜癌を有することが示される。いくつかの実施形態では、異数性の存在を試料中で検出するステップは、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑのうち１つまたは複数上の１つまたは複数の変化の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、異数性の存在を試料内で検出するステップは、散在したヌクレオチド要素を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む第２の試料において、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及びＴＰ５３からなる群より選択される１つまたは複数における遺伝子の少なくとも１つの変異の存在を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の試料は血漿を含む。いくつかの実施形態では、試料は、子宮内サンプリングにより収集される。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシで収集される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、治療法（例えば、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、免疫チェックポイント阻害剤、及びそれらの組み合わせ）を対象に施すことを含む。
いくつかの実施形態では、対象から得られた試料においてＴＰ５３における１つまたは複数の変異の存在を検出するか、試料において異数性の存在を検出するか、またはその両方を含む、対象において卵巣癌を検出する方法が本明細書において提供され、ここで、ＴＰ５３における１つまたは複数の変異の存在、異数性の存在、またはその両方によって、対象が卵巣癌を有することが示される。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３における１つまたは複数の変異の存在を検出するステップは、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイを使用するか、ＰＣＲベースのシングルプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、マイクロアレイアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、またはライゲーションアッセイを使用して行われる。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３における１つまたは複数の変異の存在を検出するステップは、１００～１，０００，０００個の野生型鋳型の中での１つの変異鋳型の範囲で、稀な変異アレルの検出を可能にする、エラー削減手法で、超並列シークエンシング機器の感度を高めることによって実行される。例えば、１つまたは複数の変異を検出するステップは、エラー削減手法で超並列シークエンシング装置の感度を増大することによって実行され得、技術は以下を含む：ａ）各鋳型分子に一意の識別子（ＵＩＤ）を分子的に割り当てること、ｂ）各一意にタグ付けされた鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ）増幅産物を重複シークエンシングすること。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法はさらに、試料上で細胞診を実施することを含み、ＴＰ５３における１つまたは複数の変異の存在、異数性の存在、及び／または陽性細胞診によって、その対象が卵巣がんを有することが示される。いくつかの実施形態では、異数性の存在を試料で検出するステップは、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑの１つまたは複数上の１つまたは複数の変化の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、異数性の存在を試料内で検出するステップは、散在したヌクレオチド要素を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法はさらに、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む第２の試料において、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及びＴＰ５３からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における少なくとも１つの変異の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、第２の試料は血漿を含む。いくつかの実施形態では、試料は子宮内サンプリングにより収集される。いくつかの実施形態では、試料はＴａｏブラシで収集される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、治療法（例えば、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、免疫チェックポイント阻害剤、及びそれらの組み合わせ）を対象に施すことを含む。
対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法が本明細書で提供され、方法は、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬからなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の変異の存在を、対象から得た尿試料において検出すること、試料中でＴＥＲＴプロモーターの少なくとも１つの変異の存在を検出すること、及び試料中で異数性の存在を検出することを含み、ここでＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬからなる群における１つまたは複数の変異の存在、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在、または異数性の存在によって、対象が膀胱癌を有することが示される。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ３、またはその両方である。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、もしくはＶＨＬにおける１つもしくは複数の変異、ＴＥＲＴプロモーターにおける１つもしくは複数の変異、またはその両方は、試料中の尿細胞の０．０３％以下に存在する。
対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、またはマイクロアレイ技術を使用して実行される。対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、サンガーシークエンシングアッセイを使用して実行される。対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターの少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、次世代シークエンシングアッセイを使用して実行される。
対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、試料中の異数性の存在を検出するステップは、１つまたは複数の染色体腕５ｑ、８ｑ、及び９ｐ上の１つまたは複数の変化の存在を検出することを含む。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、異数性の存在を検出するステップは、長散在ヌクレオチド要素（ＬＩＮＥＳ）を増幅することを含む。
対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、５，０００～１，０００，０００個の野生型鋳型の中で１つの変異鋳型という範囲内の稀な変異アレルの検出を可能にするエラー削減手法を使用して、超並列シークエンシング機器の感度を高めることによって実行される。対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、以下を含むエラー削減手法を使用して超並列シークエンシング機器の感度を高めることによって実行される：ａ）一意の識別子（ＵＩＤ）を各鋳型分子に割り当てること、ｂ）一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ）増幅産物を重複シークエンシングすること。
対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、試料で細胞診を実施することを含み、ここでＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在、異数性の存在、または陽性細胞診によって、対象が膀胱癌を有することが示される。
対象における膀胱癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、膀胱の経尿道切除（ＴＵＲＢ）、膀胱内ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、膀胱切除または膀胱前立腺切除術、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを実施することを含む。
対象の上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、経尿道切除、膀胱内ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、尿管切除または腎尿管切除、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを実施することを含む。
対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、がんは低悪性度の腫瘍である。癌が低悪性度腫瘍である対象において膀胱癌または上部管尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、低悪性度腫瘍は、低悪性度の乳頭状尿路上皮新生物（ＰＵＮＬＭＰ）または非浸潤性低悪性度乳頭状尿路上皮新生物である。がんが低悪性度腫瘍である対象において膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに膀胱の経尿道的切除（ＴＵＲＢ）を施すことを含む。
対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、対象は以前に膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を受けている。対象が膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象において膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象から得られた尿試料中の、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ３、またはその両方における１つまたは複数の変異の存在を検出することを含む。対象が膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象において膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、またはＶＨＬにおける１つまたは複数の変異、ＴＥＲＴプロモーターにおける１つまたは複数の変異、またはその両方は、試料の尿細胞の０．０３％以下に存在する。膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイを使用して実行される。対象が膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、サンガーシークエンシングアッセイを使用して実行される。膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、次世代シークエンシングアッセイを使用して実行される。
対象が膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象において膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、異数性の存在を試料で検出するステップは、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び９ｐのうち１つまたは複数上の１つまたは複数の変化の存在を検出することを含む。対象が膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象において膀胱癌または上部管尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、異数性の存在を検出するステップは、長散在ヌクレオチド要素（ＬＩＮＥＳ）を増幅することを含む。
膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象において膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、５，０００～１，０００，０００の野生型鋳型の中で１つの変異鋳型の範囲で稀な変異アレルの検出を可能にするエラー削減手法を使用し、超並列シークエンシング装置の感度を上げることによって実行される。膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象の膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するステップ、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在を検出するステップ、またはその両方は、ａ）各鋳型分子に一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ）一意にタグ付けされた各鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作成すること、及びｃ）増幅産物を重複シークエンシングすること、を含むエラー削減手法を用いて超並列シークエンシング機器の感度を高めることで実行される。
対象が膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象において膀胱癌または上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、試料で細胞診を実施することを含み、ここでＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＶＨＬにおける１つまたは複数の変異の存在、ＴＥＲＴプロモーターにおける少なくとも１つの変異の存在、異数性の存在、または陽性細胞診によって、対象が膀胱癌を有することが示される。
膀胱癌または上部尿路上皮癌の治療を以前に受けている対象の膀胱癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、膀胱の経尿道的切除（ＴＵＲＢ）、膀胱内ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、膀胱切除術または膀胱前立腺切除術、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、または上記の任意の組み合わせを施すことを含む。
対象が膀胱癌または上部尿路尿路上皮癌の治療を受けたことがある対象の上部尿路上皮癌を検出する方法のいくつかの実施形態では、方法はさらに、経尿道切除、膀胱内ＢＣＧ（カルメット菌－ゲリン）、膀胱内化学療法、補助化学療法、ネオアジュバント化学療法、尿管切除または腎尿管切除、放射線療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを実施することをさらに含む。
本明細書は、１つまたは複数の染色体異常（異数性など）を同定するための方法及び物質を提供する。場合によっては、本明細書では、アンプリコンベースのシークエンシングデータを使用して、哺乳動物を、１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患または障害を有するとして同定する方法及び物質を提供する。例えば、本明細書に記載の方法及び物質を、哺乳動物から得られた試料に適用して、哺乳動物を１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患または障害を有するとして同定し得る。例えば、本明細書に記載の方法及び物質を哺乳動物から得られた試料に適用して、哺乳動物が１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患または障害を有するとして同定し得る。例えば、出生前哺乳動物は、少なくとも部分的に、１つまたは複数の異数性の存在に基づいて、疾患または障害を有するとして同定され得る。本明細書はまた、１つまたは複数の染色体異常に関連する疾患を同定及び／または治療するための方法及び物質を提供する。場合によっては、哺乳動物から得られた試料から得られたＤＮＡにおいて１つまたは複数の染色体異常が同定され得る。例えば、１つまたは複数の染色体異常の存在に少なくとも部分的に基づいて、がんを有するとして同定された哺乳動物は、１つまたは複数のがん治療で治療され得る。
本明細書に示すように、新しいアプローチ（Ｗｉｔｈｉｎ－Ｓａｍｐｌｅ－ＡｎｅｕｐＬｏｉｄｙ－ＤｅｔｅｃｔｉＯｎ（サンプル内異数性検出）を略してＷＡＬＤＯと呼ばれる）を使用して、アンプリコンから得られた配列データを評価し、１つまたは複数の染色体異常（異数性など）の存在を同定してもよい。例えば、ＷＡＬＤＯは、教師あり機械学習を使用して、がんによく見られる複数の染色体腕における小さな変化を検出し得る。本明細書に記載するように、ＷＡＬＤＯを使用して、がん患者または正常な個人由来の１，６７７個の腫瘍及び血液の１，５２２個のリキッドバイオプシ―における染色体腕の増加及び損失について検索した。がん生検の９５％及びリキッドバイオプシ―の２２％で異数性が検出された。増幅された分散されたヌクレオチド要素（ＬＩＮＥ）内の単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を使用して、ＷＡＬＤＯは、アレル不均衡、マイクロサテライト不安定性、及び試料同定を同時に評価した。ＷＡＬＤＯは、わずか数ナノグラム（ｎｇ）のＤＮＡを含み、かつわずか１％の新生物含有量の試料で使用され得る。
アンプリコンベースのシークエンシングリードを使用して、１つまたは複数の染色体異常を検出する能力により、比較的低コストで感度を向上させて高いカバレッジ深度を実現する、固有でかつ未実現の機会が得られる。さらに、アンプリコンベースのシークエンシングリードを使用する能力により、限られた量のＤＮＡを含む試料から１つまたは複数の染色体異常（例えば、異数性）の検出が可能になる。このアプローチは、限定するものではないが、診断（例えば、出生前診断及び／またはがんの診断）及び法医学を含む、様々な適用に使用され得る。
一般に、本明細書の一態様は、哺乳動物のゲノムにおける異数性を検出する方法を特長としている。方法は、哺乳動物から得られた試料から得られた複数のアンプリコンをシークエンシングしてシークエンシングリードを取得すること、シークエンシングリードをゲノム間隔のクラスターに分類すること、方程式
Figure 2023075090000047



を使用して、各ゲノム間隔での配列読み取りの分布の合計を計算すること（式中、Ｒｉはシークエンシングリードの数であり、Ｉは染色体腕上のクラスターの数であり、Ｎはパラメーターμｉ及びσｉ ２のガウス分布であり、ここで、μｉは各ゲノム間隔のシークエンシングリードの平均数であり、σｉ ２は、各ゲノム間隔でのシークエンシングリードの分散である）、分位関数
Figure 2023075090000048



を使用して、染色体腕のＺスコアを計算すること、及びＺ－スコアが、有意閾値外である場合、哺乳動物のゲノム中の異数性の存在を同定すること、を含むか、または本質的にそれからなる。複数のアンプリコンは、約１０，０００個のアンプリコン～約１，０００，０００個のアンプリコンを含んでもよい（例えば、複数のアンプリコンは、約３８，０００個のアンプリコンを含んでもよい）。ゲノム間隔は、約１００ヌクレオチド～約１２５，０００，０００ヌクレオチドを含んでもよい（例えば、ゲノム間隔は、約５００，０００ヌクレオチドを含んでもよい）。哺乳動物は、ヒトであってもよい。試料は、リキッドバイオプシ―であってもよい。リキッドバイオプシ―は、血液、尿、唾液、嚢胞液、喀痰、組織、糞便、パップスメア、または脳脊髄液であってもよい。リキッドバイオプシ―は、血液試料（例えば、血漿試料）であってもよい。血液試料は、無細胞胎児ＤＮＡを含んでもよい。試料は、新生細胞画分を含んでもよい。試料中の新生物細胞画分は、試料全体の約１％未満（例えば、約０．５％未満）を含んでもよい。アンプリコンは、固有の長散在ヌクレオチド要素（ＬＩＮＥ）を含んでもよい。シークエンシングステップはまた、アンプリコンを得るために哺乳動物から得られた試料からＤＮＡを増幅することも含んでもよい。増幅は、単一のプライマーの対を使用して実行され得る。アンプリコンは、約１００～約１４０塩基対を含んでもよい。各アンプリコンは、１～２０回シークエンシングされ得る。方法は、約１００，０００～約２５００万のシークエンシングリードを含んでもよい。各クラスターは、約２００のゲノム間隔を含んでもよい。方法はまた、教師あり機械学習も含み得る。教師あり機械学習では、サポートベクターマシンモデルを使用し得る。
別の態様では、本明細書は、哺乳動物のゲノム中の１つまたは複数の多型を検出する方法を特長とする。方法は、哺乳動物由来の試料から得られた複数のアンプリコンをシークエンシングして変異型シークエンシングリードを取得すること、哺乳動物由来の参照試料から得られた複数のアンプリコンをシークエンシングして、参照シークエンシングリードを取得すること、変異型シークエンシングリード及び参照シークエンシングリードをゲノム間隔のクラスターに分類すること、両方のアレルの変異型シークエンシングリード及び参照シークエンシングリードの合計が約３を超える染色体腕を選択すること、選択された染色体腕の変異型アレル頻度（ＶＡＦ）を決定すること（ここで、前記ＶＡＦは変異型シークエンシングリードの数／シークエンシングリードの総数である）、ならびに、ＶＡＦが約０．２と約０．８の間である場合、哺乳動物の前記選択された染色体腕上の１つまたは複数の多型の存在を同定すること、を含むか、または本質的にそれからなる。シークエンシングステップは、各アンプリコンに一意の識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、一意にタグ付けされた各アンプリコンを増幅して、ＵＩＤファミリーを作成すること、及び増幅産物を重複シークエンシングすることを含んでもよい。シークエンシングステップはさらに、式
Figure 2023075090000049



を使用して、前記選択された染色体腕上の変異型のＺスコアを計算することをさらに含んでもよく、ここで、ｗｉは変異型ｉのＵＩＤ深度であり、Ｚｉは変異型ｉのＺスコアであり、ｋは染色体腕で観察される変異型の数である。１つまたは複数の多型は、単一塩基の置換、挿入、欠失、インデル、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。複数のアンプリコンは、約１０，０００個のアンプリコン～約１，０００，０００個のアンプリコンを含んでもよい（例えば、複数のアンプリコンは、約３８，０００個のアンプリコンを含んでもよい）。ゲノム間隔は、約１００ヌクレオチド～約１２５，０００，０００ヌクレオチドを含んでもよい（例えば、ゲノム間隔は、約５００，０００ヌクレオチドを含んでもよい）。哺乳動物はヒトであってもよい。試料はリキッドバイオプシ―であってもよい。リキッドバイオプシ―は、血液、尿、唾液、嚢胞液、喀痰、組織、糞便、パップスメア、または脳脊髄液であってもよい。リキッドバイオプシ―は、血液試料（例えば、血漿試料）であってもよい。血液試料は、無細胞胎児ＤＮＡを含んでもよい。試料は、新生細胞画分を含んでもよい。試料中の新生物細胞画分は、試料全体の約１％未満（例えば、約０．５％未満）を含み得る。アンプリコンは、固有の長散在ヌクレオチド要素（ＬＩＮＥ）を含んでもよい。シークエンシングステップはまた、アンプリコンを得るために哺乳動物から得られた試料からＤＮＡを増幅することも含んでもよい。増幅は、単一のプライマーの対を使用して実行してもよい。アンプリコンは、約１００～約１４０塩基対を含んでもよい。各アンプリコンは、１～２０回シークエンシングされ得る。方法は、約１００，０００～約２５００万のシークエンシングリードを含んでもよい。各クラスターは、約２００のゲノム間隔を含んでもよい。方法は、教師あり機械学習も含み得る。教師あり機械学習では、サポートベクターマシンモデルを使用し得る。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、及び改変が、添付の特許請求の範囲内にある。
実施例１：多検体リキッドバイオプシーを用いた外科的に切除可能ながんの検出及び位置特定
より早期にがんを検出するための現時点で承認済みの検査の多くは本質的に手順的なものであり、それらとしては、大腸内視鏡検査、マンモグラフィー、及び子宮頸部細胞診解析が挙げられる。これまでのところ、変異ベースのリキッドバイオプシーで評価されたがん患者の大部分は進行ステージ疾患を有している。リキッドバイオプシーに関する更に別の課題は根元的な起源器官の同定である。同一遺伝子の変異が多数の腫瘍タイプを駆動することから、このような改変をベースとしたリキッドバイオプシーでは通常、血液検査の陽性のもととなる原発性腫瘍の位置を同定することはできない。
本実施例ではＣａｎｃｅｒＳＥＥＫと呼ばれる新規の血液検査について説明するが、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫは上記の未解決の課題に対処するものである。この検査は遺伝的改変用とタンパク質バイオマーカー用の組み合わせアッセイを利用しており、比較的早期のがんの存在を同定する能力だけではなく、これらのがんの起源となる器官の位置を正確に特定する能力も有している（図１）。
ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫは、ほとんどのがんに対して広く適用可能な非侵襲的検査法である。本明細書において検査を行った８種のがんのタイプは２０１７年の米国におけるがんによる推定死亡件数のうちの３６０，０００件（６０％）に相当し、それらがんタイプをより早期に検出することにより、おそらくはそれら疾患による死亡を減少させることができる。本開示の時点におけるＣａｎｃｅｒＳＥＥＫのコストは５００ドル未満（単一のがんを対象とした大腸内視鏡検査などのその他のスクリーニング検査法のコストと同等またはそれ以下）であり、その上、この検査法では少なくとも８種の異なるがんタイプを検出することができる。
物質及び方法
血漿試料、白血球試料、及び腫瘍ＤＮＡ試料
本試験はそれぞれの施設におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに承認され、試料の採取についてはインフォームドコンセントを取得した後に行った。参加施設で外科的切除術を受けたステージＩ～ＩＩＩのがんを有する患者を本試験に組み込んだ。任意の治療を実施する前に（すなわち、ネオアジュバント療法を受ける患者においてはネオアジュバント療法前に）、全ての患者においては外科手術の前に、患者から血液を採取した。外科手術当日に試料を採取する場合には、麻酔により循環バイオマーカーレベルが上昇する場合がある（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４：１０２０２－１０２０７）ことから、麻酔の投与前に血液を採取することを徹底するように注意した。一般的な人口統計、外科的病態、及びＡＪＣＣステージ（第７版）を添付した。「健康な」コホートを、がんの病歴のない中央年齢５５歳（ＩＱＲ四分位数範囲２８～６５）の８１２名の個体から採取した末梢血試料で構成した。がん試料と健康な対照試料を同一の方法で処理した。１，００５名のがん患者のうちの４６名に由来する血漿試料と８１２点の正常試料のうちの１８１点についてはこれまでに、異なるアプローチで評価が行われている（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４：１０２０２－１０２０７）（表２）。
ＱＩＡＳｙｍｐｈｏｎｙ循環ＤＮＡキット（ｃａｔ ＃ １０９１０６３）を製造業者の指示どおりに使用して、平均７．５ｍＬの血漿からＤＮＡを精製した。末梢ＷＢＣ由来のＤＮＡについても同様に、製造業者の指示どおりにＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＤＰ ＤＮＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ＃ ９３７２５５）を用いて精製した。標準的な組織病理学的手順に従い腫瘍組織をホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）し、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＤＰ ＤＮＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ＃ ９３７２５５）を用いて同様に精製した。
変異の検出及び解析
血漿由来のＤＮＡの増幅用に６１組のプライマーペアを設計して（以下を参照のこと）、１６の遺伝子に由来する目的の領域を含有する６６～８０ｂｐセグメントを増幅した。
６１組のプライマーペアを、２８組のプライマーペアまたは３３組のプライマーペアの一方をそれぞれが含有する２組の非重複セットに分割した。これら２組のプライマーセットのそれぞれを使用して、初期増幅に１５サイクルを使用した以外は他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｅｌｉｆｅ ５を参照のこと）６つの独立した２５μｌ反応液中でＤＮＡを増幅した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）でＰＣＲ産物を精製してから、精製ＰＣＲ産物のうちの１％を、２１サイクルを使用した以外は他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｅｌｉｆｅ ５を参照のこと）ＰＣＲの第２ラウンドで増幅した。次に、第２ラウンドの増幅に由来するＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅで精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ ４０００装置上でシークエンスした。
ＳＱＬとＣ＃で書かれたカスタムスクリプトを使用して、リードの鋳型特異的な部位をリファレンス配列にマッチさせた。次に、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）、分子バーコードとして組み込まれた固有識別子配列（ＵＩＤ）に基づいて、共通鋳型分子に由来するリードをグループ分けした。それぞれのＵＩＤファミリーにおける＞９０％のリードに変異を存在させる必要があるため、試料調製ステップ中またはシークエンシングステップ中に導入される人為的変異を減少させた。同一タイル上にリードを配置する際に、同一のＵＩＤと試料インデックスを有するリードを少なくとも５，０００ピクセル離す必要があるため、光学複製により生じた重複リードを除去した。以下の２つの基準、（ｉ）ＣＯＳＭＩＣデータベースに存在すること（Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５：Ｄ７７７－Ｄ７８３）、または、（ｉｉ）腫瘍抑制遺伝子内において不活性であることが予測されていること（ナンセンス変異、フレームシフト挿入または欠失、標準的なスプライス部位変異）、のうちの１つに適合した変異についての考察を行った。同義変異（エキソン末端における変異以外）とイントロン変異（スプライス部位における変異以外）を除外した。
血漿タンパク質の評価
Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００プラットフォーム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、血漿試料中における多数の標的タンパク質の濃度を測定した。製造業者のプロトコルに従いＬｕｍｉｎｅｘビーズベースイムノアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｅｒｉｃａ ＮＹ）を実施し、供給業者が提供する標準物質と品質管理試料を用いた５パラメータログカーブフィッティング（Ｂｉｏｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ６．０を使用）を使用して濃度を測定した。ＨＣＣＢＰ１ＭＡＧ－５８Ｋパネルを使用して、ＦＧＦ２、オステオポンチン、ｓＦａｓ、ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８、プロラクチン、ＨＥ４、ＨＧＦ、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＩＬ６、ＣＡ１５－３、ＴＧＦａ、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９、及びレプチンを検出した。ＨＡＮＧ２ＭＡＧ－１２Ｋパネルを使用して、ＰＡＲ、ｓＰＥＣＡＭ－１、ＴＳＰ－２、ｓＥＧＦＲ、ＡＸＬ、及びｓＨＥＲ２／ｓＥＧＦＲ２／ｓＥｒｂＢ２を検出した。ＨＣＭＢＭＡＧ－２２Ｋパネルを使用して、ＤＫＫ１、ＧＤＦ１５、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、及びニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を検出した。ＨＣＣＢＰ４ＭＡＧ－５８Ｋパネルを使用して、カリクレイン－６、ＣＤ４４、ミッドカイン、及びメソテリンを検出した。ＨＡＧＰ１ＭＡＧ－１２Ｋパネルを使用して、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、アンジオポエチン－２、及びエンドグリンを検出した。ＨＣＣＢＰ３ＭＡＧ－５８Ｋパネルを使用して、ＳＨＢＧ、ガレクチン、及びミエロペルオキシダーゼを検出した。ＨＴＭＰ１ＭＡＧ－５４Ｋパネルを使用して、ＴＩＭＰ－１、及びＴＩＭＰ－２を検出した。ＬＲＧ－１及びビトロネクチンについては、それらが単一のイムノアッセイプラットフォームでは再現性をもって評価できないことから本検査に組み込まなかった。
ｃｔＤＮＡステータスを分類するためのアルゴリズム
試料のｃｔＤＮＡステータスの分類については、目的の試料の正規化変異頻度と、訓練事例集合内の正常試料とがん試料のそれぞれにおける正規化変異頻度の分布を比較する統計的検定から得た。具体的には、超変異体の数とＵＩＤの数の比率として定義される変異アレル頻度（ＭＡＦ）を、正常対照のセットにおけるそれぞれの変異に認められたＭＡＦに基づき最初に正規化した。この変異特異的正規化に続き、それぞれのウェルにおけるそれぞれの変異のＭＡＦを、２つのＭＡＦ基準分布、１）訓練事例集合内の正常対照血漿と非血縁健康個体由来の１８８点のＷＢＣのセットから構築した分布、２）対応する原発性腫瘍内にも＞５％のＭＡＦで存在する血漿中に存在する変異のみを含んだ訓練事例集合内のがんの試料から構築した分布、と比較した。このようにして、対応するｐ値、ｐＮ及びｐＣを得た。それぞれの変異に対して、これら２つのｐ値のログ比を計算し、結果が外れ値の影響をより少なく受けることになるように、６つのウェルにわたるこれらログ比の最小値及び最大値を除去した。次に、以下の式、
Figure 2023075090000050



（式中、ｗｉは、４つのウェルにわたり存在する変異におけるＵＩＤの総数中におけるウェルｉにおけるＵＩＤの割合である）に従い、「オメガ」スコアを求めた。血漿試料中において同定された変異がΩ＞１を有した場合、また患者の原発性腫瘍において変異が同定されなかった場合、同一患者の白血球（ＷＢＣ）（ＷＢＣが利用可能（がん患者の２３％）な場合は常に）に由来するＤＮＡを評価した。同一の６１アンプリコンパネルでＷＢＣ ＤＮＡを検査して、血漿中の変異が未確定の潜在能をもつクローン性造血によるものではないということを確認した（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７１：２４８８－２４９８）。Ω＞１を有する変異が血漿中に存在する場合は常に、正常個体由来のＷＢＣを同様に評価した。ＷＢＣ中に加え血漿中において同定されたあらゆる変異を解析から除外した。除外要件は、血漿中における最大ＭＡＦとＷＢＣ中における最大ＭＡＦの比率が１００未満であることであった。
その後、それぞれの患者または正常対照における最大Ωスコアを有する変異を「トップ変異」とみなしたが、それについては表３に列挙している。このスコアを、ロジスティック回帰、ならびに、最適化ステップで選択した以下の１０のタンパク質、プロラクチン、ＯＰＮ、ＩＬ６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン、及びＴＩＭＰ－１の濃度に使用した。慎重を期すために、ロジスティック回帰で使用した特性に非線形変換を適用した。具体的には、目的の試料中におけるタンパク質の濃度が、訓練事例集合内の正常試料中の同一タンパク質に認められた濃度の９５パーセンタイルよりも低かった場合には、タンパク質の濃度をゼロと同等に設定し、そうでなければ、その濃度のログを使用した。Ωスコアに対しては、同一のログ閾値変換を使用したが、定数閾値は１と同等であった。次に、Ｒ ｇｌｍｎｅｔパッケージ（バージョン２．１０－１３）を使用し、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３３：７４８６２を参照のこと）ラムダパラメータをゼロに設定して、ロジスティック回帰を実施した。それぞれの特性の係数（以下を参照のこと）に正常試料とがん試料の間の特性の平均値における差異を掛けることにより、それぞれの特性の重要性を評価した。１０ラウンドの１０倍クロス確認を実施した。８１２名の正常個体と１，００５名のがん患者のそれぞれに対する１０倍クロス確認（ＣＶ）の平均ラウンドで得られた分類コールについては、表２に列挙している。
ロジスティック回帰モデル係数及び重要性スコア
Figure 2023075090000051

がんタイプの予測のために、患者の性別及び本研究で評価したその他２９種のタンパク質に加え、同一の１１の特性（変異スコアと１０種のタンパク質のレベル）を使用した。ロジスティック回帰によりがんであると正確に分類されたがん試料に対してのみ、がんタイプ予測を実施した。この予測には、ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔパッケージ（バージョン４．６－１２）に実装されているランダムフォレスト（例えば、Ｌｉａｗ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｒ ｎｅｗｓ ２：１８－２２を参照のこと）を使用した。１０ラウンドの１０倍ＣＶを実施し、一致性のために、ランダムフォレストにおけるそれぞれのラウンド及びそれぞれの倍において、ロジスティック回帰で使用したものと同一のパーティションを使用した。１０倍ＣＶの平均ラウンド（がんステータスについて表３に記載している同一のラウンド）で得られた分類コールについては、表６に列挙している。
原発性腫瘍内において同定された変異を含む血漿中において同定された変異間の一致（表５）を確認するために、血漿中における変異を高い信頼度（Ωスコア＞３、表３）で同定可能な、原発性腫瘍が＞５％の変異アレル割合で存在する任意の変異を含む（表１）、１５５症例のみについて考察を行った。このアプローチにより、本発明者らが低い腫瘍含有率を有する腫瘍のスコアリングを回避することが可能となった。
試料の同定
血漿試料、ＷＢＣ試料、及び原発性腫瘍ＤＮＡ試料が同一患者に起因することを確認するために、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７：ｅ４１１６２を参照のこと）ゲノム全体から約３８，０００の固有長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）を増幅するのに使用することができるプライマーを利用した。これら約３８，０００のＬＩＮＥは、血漿試料、白血球試料、及び腫瘍試料の間の試料同一性を立証または証明することができる２６，２２０の共通の多型を含有している。それぞれの多型位置における遺伝子型を同定し、目的の試料間の一致率を計算した。一致を、両方の試料において十分なカバレッジを有する遺伝子型の総数で割った、両方の試料において同一であるマッチした多型位置の数と定義した。一致が＞０．９９であり、少なくとも５，０００のアンプリコンが十分なカバレッジを有する場合、２つの試料をマッチとみなした。
統計解析
必要と思われる場合には連続変数を平均値及び標準偏差または中央値及び範囲として記録し、一方、カテゴリー変数を整数及びパーセンテージとして記録した。二項分布を使用して感度の信頼区間（ＣＩ）を計算した。Ｒ ｓｔａｔｓパッケージ（バージョン３．３．１）を使用した片側二項検定でｐ値を計算した。
結果
遠隔転移が発生する前のステージにおいて多くの固形がんを検出するのに使用可能なタンパク質マーカーのパネルと遺伝子マーカーのパネルを同定するために、様々ながんタイプにおいて一般的に変異しているドライバー遺伝子の複数の領域を同時に評価することができるＰＣＲベースアッセイを設計した。この設計には４つの課題が立ちはだかっていた。第１に、検査では、多数のがんを検出するために十分な数の塩基を検索する必要がある。第２に、低有病率で存在する変異を検出するためにそれぞれの検索塩基を数千回シークエンスする必要がある。第３に、検索する塩基がより多くなるほど、人為的変異が同定される可能性がより高くなり、信号対雑音比が低下することになる。そして第４に、スクリーニング環境に実装可能な検定は費用対効果に優れ高い処理能力を有する必要があり、実施する必要のあるシークエンシングの量に限界がある。これらの対照的な課題に対処するために、評価する８種の腫瘍タイプのそれぞれにおける少なくとも１つのドライバー遺伝子の検出を可能とし得る最小限の数の短いアンプリコンを同定した。一般に利用可能なシークエンシングデータを使用して、必要とされるアンプリコンの数と検出の感度の間に部分的な指数法則関係（約６０アンプリコンにプラトーがある）が存在することを確認した（図２）。アンプリコンの数を閾値レベル超に増加させると、より多くのがんを実質的に検出することはなくなくなるが、偽陽性結果の確率が上昇することになる。この限界効用逓減により最適数のアンプリコンを規定した。
これらのデータに基づいて、それぞれのアンプリコンが１６の遺伝子のうちの１つの内部における平均３３ｂｐを検索する６１アンプリコンパネルを設計した（物質及び方法を参照のこと）。図２に示すとおり、このパネルは理論的に、Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データセットにおける４１％（肝臓）～９５％（膵臓）のがんを検出し得る（Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５：Ｄ７７７－Ｄ７８３）。実際、パネルは非常に良好に機能しており、本発明者らの研究において評価した８０５のがんのうちの、８２％において少なくとも１つの変異を、４７％において２つの変異を、８％において３つ以上の変異を検出した（図２、図３のドット、及び表１）。従来のゲノムワイドシークエンシングと比較してＰＣＲベースシークエンシングアッセイが変異を検出する上でより高感度であったために、ＣＯＳＭＩＣデータセットによって予測されたよりもより大きな割合の腫瘍が検出された。原発性腫瘍組織に由来するＤＮＡのこの解析を基準とすると、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の予測最大検出能は、腫瘍タイプにより、肝臓癌の６０％から卵巣癌の１００％までの範囲で変化した（図２）。
この小規模ではあるが強力なアンプリコンパネルを備えることで、血漿中に存在することが予測される希少変異の検出を可能とする２つのアプローチを開発した。第１に、マルチプレックスＰＣＲを使用して、それぞれの元の鋳型分子をＤＮＡバーコードで直接及び固有に標識した。この設計は超並列シークエンシングに固有のエラーを最小化し、血漿中に存在する少量の無細胞ＤＮＡの利用を効率的なものとした。加えて、血漿から回収したＤＮＡの総量を複数のアリコートに分割して、それぞれの複製に対して独立したアッセイを実施した。このことによりウェルあたりのＤＮＡ分子の数は減少したが、ウェルあたりのそれぞれの変異分子の割合が増加することになり、よりアッセイしやすくなった。それぞれの複製における変異アレルの割合によって検出感度が制限される場合が多いことから、この分割戦略では、血漿ＤＮＡの全てを一度に評価する場合に、信号対雑音比を増加させて、考えられるよりもより低い有病率で存在する変異の同定を行った。
ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの第２の構成要素はタンパク質バイオマーカーに基づいている。文献を調査して、＞１０％の感度及び＞９９％の特異度での上記の８種のがんタイプのうちの少なくとも１種における早期検出及びがん診断に潜在的に有用なタンパク質を発見した。４１の潜在的なタンパク質バイオマーカーを同定し、がんを有さない個体に由来する血漿試料とがん患者に由来する血漿試料に対する予備試験において評価を行った。これらタンパク質のうちの３９については単一のイムノアッセイプラットフォームで再現性をもって評価できたため、これらを使用して全ての血漿試料をアッセイした。これら３９のタンパク質のうちの１０は、がん患者と健康な対照を区別するのに有用であることが証明されたが、それについては以下に記載している。
例示的なＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査での解析用に組み込んだタンパク質バイオマーカー。
Figure 2023075090000052


Figure 2023075090000053

本試験には、卵巣、肝臓、食道、膵臓、胃、結腸直腸、肺または乳房のステージＩ～ＩＩＩのがんを有する１，００５名の患者を組み込んだ。血液試料の採取前にネオアジュバント化学療法を受けた患者はいなかった。試験登録時において明らかな遠隔転移を有する患者はおらず、全員が治療目的で外科的切除術を受けていた。診断時における中央年齢は６４歳（２２～９３歳の範囲）であった。８種のがんタイプについて、それらが一般的であり、一般的な臨床使用においてそれらをより早期に検出するための血液ベースの検査法が存在しないことから、８種のがんタイプを選択した。患者の組織病理学的特性及び臨床的特性については表２にまとめている。
診察時における最も一般的なステージは患者の４９％に相当するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）ステージＩＩであり、残りの患者はステージＩ（２０％）またはステージＩＩＩ（３１％）の疾患を有していた。８種の腫瘍タイプのそれぞれにおけるステージあたりの試料の数については以下にまとめている。がん、高悪性度異形成症、自己免疫疾患または慢性腎臓病の既知の病歴のない中央年齢５５歳（１７～８８歳の範囲）の８１２名の個体の全てを健康対照コホートとした。
腫瘍タイプ毎、ステージ毎に本研究において評価したがん患者
Figure 2023075090000054

ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫでは２，００１のゲノム位置における１０のタンパク質と変異のレベルを評価するが、それぞれのゲノム位置はいくつかの様式（一塩基置換、一塩基挿入または一塩基欠失）で変異している場合がある。アッセイした遺伝子における変異の存在、またはこれらタンパク質のうちのいずれかのレベルの上昇により、患者が陽性と分類される場合がある。厳密な統計学的手法を採用して検査の精度を確保した。ログ比を使用して変異を評価してから、変異データとタンパク質バイオマーカーレベルの両方を考慮するロジスティック回帰アルゴリズムにそれら評価内容を組み込んでＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査の結果をスコアリングした。１０反復の１０倍クロス確認により平均感度及び平均特異度を測定した。１つの代表的な反復におけるがん患者と対照の全コホートの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線については図４Ａに示している。
評価した８種のがんタイプ間におけるＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの中央感度は７０％（ｐ＜１０－９６ 片側二項検定）であり、肝臓癌の９８％から乳癌の３３％までの範囲であった（図４Ｃ）。この感度における特異度は＞９９％であり、それはすなわち、既知のがんを有さない個体のうちの６名のみが陽性とスコア付けされたということであった。
アルゴリズムにとって最も重要な検査における特性はｃｔＤＮＡ変異の存在であり、それに続き、プロラクチン、ＯＰＮ、ＩＬ－６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９－９、ミッドカイン及びＴＩＭＰ－１のタンパク質レベルの上昇であった。ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫに使用したｃｔＤＮＡの特性とタンパク質の特性のそれぞれのウォーターフォールプロットは、がんを有する個体とがんを有さない個体の間におけるそれら特性の分布を示している（図５）。ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫに使用したｃｔＤＮＡの特性とタンパク質の特性の重要性ランキングについては以下に記載しており、がんを有する個体とがんを有さない個体のクラスタリングを示す主成分分析については図５に示している。血漿試料中における試験した全てのタンパク質のレベル及び血漿試料中において同定された変異を含む完全なデータセットについては、表３及び表４に記載している。本明細書において試料を陽性とコールするために使用するアプローチの決定論的というよりはむしろ確率論的な性質は図６から明らかであり、それぞれのパネルは、１つの特定の特性を解析から除外した際におけるＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの感度を示している。
スクリーニング検査により、がんを早期のステージにおいて有利に検出することができる。ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの中央感度は、評価を行った最も一般的なステージ（ステージＩＩ）で７３％、ステージＩＩＩがんでほぼ同等（７８％）であり、ステージＩがんでより低かった（４３％）（図４Ｂ）。最も早期のステージのがん（ステージＩ）の感度は、肝臓癌で最も高く（１００％）、食道癌で最も低かった（２０％）。
リキッドバイオプシーの基本原理は、血漿中の変異ＤＮＡ鋳型が瀕死のがん細胞に由来していることから、腫瘍形成の特異的マーカーとして正確に機能するということである。この見込みを検証するために、統計的に有意なレベルでｃｔＤＮＡを検出可能な、原発性腫瘍を利用可能な、１５５名の患者に由来する腫瘍組織を評価した。血漿中における変異は、これら１５５症例のうちの１３８症例（９０％）において、同一個体の原発性腫瘍内に存在する変異と同一であった（表５）。血漿と原発性腫瘍の間のこの一致は全８種のがんタイプにおいて明らかであり、卵巣癌及び膵臓癌の１００％から胃癌の８２％までの範囲であった。
従来のリキッドバイオプシーの主な制約は、陽性と判定された患者におけるがんのタイプを同定できないという点であり、それにより、臨床フォローアップの課題がもたらされている。検出の感度を上昇させることに加えて、タンパク質バイオマーカーとｃｔＤＮＡを組み合わせることにより、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査陽性で存在し得るがんのタイプを同定するための補助となった。教師あり機械学習を使用して、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査陽性の患者における根元的ながんタイプを予測した。インプットアルゴリズムでは、患者の性別、及び、タンパク質バイオマーカーとｃｔＤＮＡバイオマーカーのデータを考慮に入れた。このような予測の主な目的の１つは、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査陽性後におけるがん診断またはモニタリングに最も適切なフォローアップ検査を同定することである。食道癌を有する患者と胃癌を有する患者について、これら２つのがんを潜在的に発症する個体における最適なフォローアップが内視鏡検査であり得ることから、それらを共にグループ分けした。
アルゴリズムを使用して、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査で陽性とスコア付けされた６１７名の患者に対して試験を行った。患者に関する臨床情報を何ら用いてはいないが、これら患者の８３％（中央値）において、がんの供給源が２つの解剖学的部位に限局していた（図８、表６、ｐ＜１０－７７ 片側二項検定）。更に、これら患者の６３％（中央値）において、陽性検査の供給源が単一の器官に限局していた（図８、表６、ｐ＜１０－４７ 片側二項検定）。予測の精度は腫瘍タイプによって様々であったが、以下に示すように（図８も参照のこと）、結腸直腸癌で最高であり、肺癌で最低であった。
がんタイプの限局結果とトップ予測の混同行列
Figure 2023075090000055

本明細書に記載の結果は、遺伝子とタンパク質をベースとした血液検査を使用して８種の主要ながんタイプのうちの大半の割合（中央値７０％）を検出することができるということを示している。陽性とスコア付けされた試料の大部分について、患者の病歴または疾患状態に関する事前情報がなくても、検査結果から根元的ながんタイプを簡便に予測することができた。ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの特異度は高く、陽性とスコアリングされたのは、既知のがんを有さない８１２名の個体のうちの１％未満であった。
実施例２：高い感度と高い特異度を有する、リキッドバイオプシーがんスクリーニング検査に対する組み合わせアプローチ
多くのがんにおいて、腫瘍ステージと予後の間には強い相関関係がある（例えば、Ａｎｓａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ １０４（５）：６００－６０７を参照のこと）。肺、結腸、食道または胃のがんを有する患者（診断時に遠隔転移を有している）において、５年超生存する患者は極めて少ない（例えば、Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５－２０１３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照のこと）。それゆえ、より早期のがんの検出がこれらの疾患による死亡を減少させるための１つの鍵であるということは明らかである。
循環血液中のバイオマーカーは原則的に、より早期のステージでがんを検出するための最良の方法のうちの１つを提供する。歴史的に見て、がんをモニターするのに使用するバイオマーカーのタイプはタンパク質である（例えば、Ｌｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １（８）：４６０－４６２を参照のこと）。ごく最近では、瀕死の細胞から放出されたＤＮＡが、尿、糞便及び血漿などの体液へと漏出する場合があることから、バイオマーカーとしての変異ＤＮＡについて研究が行われている（例えば、Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ４（６）：６５０－６６１；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１３）：１１９９－１２０９；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１６７）：１６７ｒａ１６４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２（３１）：９７０４－９７０９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｅｌｉｆｅ ５；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４９（６）：１５０１－１５１０；Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（１３６）：１３６ｒａ１６８；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６（１６）：９２３６－９２４１；及びＤｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００（１５）：８８１７－８８２２を参照のこと）。このアプローチ（「リキッドバイオプシー」と呼ばれることが多い）の基礎をなすコンセプトは、がん細胞が、正常な自己複製細胞と同様に頻繁にターンオーバーすることである。しかしながら、多くのがんタイプの進行形態を有する患者の＞８５％においてｃｔＤＮＡが上昇している一方で、より早期のステージのがんを有する患者のうちのかなり少ない割合が検出可能レベルのｃｔＤＮＡを自身の血漿中に有しているということを、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に関する研究が示している（例えば、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２９３）：２９３ｒａ１０４を参照のこと）。
本実施例では、高い特異度を維持した条件下で切除可能または別の方法で治療可能ながんの検出感度を上昇させる、組み合わせアプローチを使用したがんスクリーニング検査について説明する。例えば、本実施例に記載のアッセイでは、ｃｔＤＮＡにおける変異の検出と血漿中における閾値タンパク質マーカーの検出を組み合わせている。
物質及び方法
血漿試料、白血球試料、及び腫瘍ＤＮＡ試料
ＱＩＡＳｙｍｐｈｏｎｙ循環ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，ｃａｔ ＃ １０９１０６３）を使用して血漿からＤＮＡを精製した。固有識別子（ＵＩＤ）とアンプリコン特異的配列を含有するカスタムプライマー（表３８）を使用して血漿ＤＮＡを増幅し、得られた産物をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ装置上でシークエンスした。Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００プラットフォーム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）上でＬｕｍｉｎｅｘビーズベースイムノアッセイを使用してタンパク質バイオマーカーの血漿中濃度を測定した。試料がＫＲＡＳ変異を含有していた場合、または、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦまたはＯＰＮの濃度がそれぞれ、１００Ｕ／ｍＬ超、７．５ｎｇ／ｍＬ超、０．９２ｎｇ／ｍＬ超、または、１５８ｎｇ／ｍＬ超であった場合に、血漿試料を陽性とスコア付けした。全ての試料は、それぞれの施設におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈによる承認及びインフォームドコンセント後に採取した。
試料は、それぞれの施設におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈによる承認及びインフォームドコンセント後に採取した。外科手術前に末梢血を採取しており、ネオアジュバント療法を受けておらず、２０１１年４月～２０１６年５月の間に参加施設で外科的切除術を受けたステージＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡまたはＩＩＢ（切除可能とみなされた）を有する患者を本試験に組み込んだ。一般的な人口統計、外科的病態、及びＡＪＣＣステージ（第７版）を添付した。「健康な」コホートを、がんの病歴のない平均年齢６４歳の１８５名の個体から採取した末梢血試料で構成した。膵臓癌試料と健康な対照試料を同一の方法で採取及び処理した。
ＱＩＡＳｙｍｐｈｏｎｙ循環ＤＮＡキット（ｃａｔ ＃ １０９１０６３）を製造業者の指示どおりに使用して、３．７５ｍＬの血漿からＤＮＡを精製した。標準的な組織病理学的手順に従い腫瘍組織をホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）し、顕微鏡下でマクロ解剖して＞３０％の腫瘍細胞充実度を確認した。ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＤＰ ＤＮＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ＃ ９３７２５５）を製造業者の指示どおりに用いてＤＮＡを精製した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃａｔ ＃ Ｓ７５８５）を使用して、蛍光によりＤＮＡ濃度を評価した。
変異の検出及び解析
血漿由来のＤＮＡの増幅用にプライマーペアを設計して、ＫＲＡＳ遺伝子とＴＰ５３遺伝子に由来する目的の領域を含有する６６～８０ｂｐセグメントを増幅した（表１１及び表１２）。これらのプライマーを使用して、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２（３１）：９７０４－９７０９を参照のこと）６つの独立した２５μｌ反応液中でＤＮＡを増幅した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて反応液を精製し、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）中に溶出した。次に、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２（３１）：９７０４－９７０９を参照のこと）ＰＣＲの第２ラウンドで精製ＰＣＲ産物の画分（５μｌ）を増幅した。ＡＭＰｕｒｅを用いてＰＣＲ産物を精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ ４０００装置上でシークエンスした。
ＳＱＬとＣ＃で書かれたカスタムスクリプトを使用して、リードの鋳型特異的な部位をリファレンス配列にマッチさせた。次に、分子バーコードとして組み込まれた固有識別子配列（ＵＩＤ）に基づいて、共通鋳型分子に由来するリードをグループ分けした（例えば、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２６５（１）：１８５－１９１を参照のこと）。それぞれのＵＩＤファミリーにおける＞９０％のリードに変異を存在させる必要があるため、試料調製ステップ中またはシークエンシングステップ中に導入される人為的変異を減少させた。
血漿タンパク質の評価
Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００プラットフォーム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、血漿試料中における多数の標的タンパク質の濃度を測定した。製造業者のプロトコルに従いＬｕｍｉｎｅｘビーズベースイムノアッセイを実施し、供給業者が提供する標準物質と品質管理試料を用いた５パラメータログカーブフィッティング（Ｂｉｏｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ６．０を使用）を使用して濃度を測定した。ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ及びプロラクチンのアッセイ用に血漿試料を６倍希釈し、ミッドカインのアッセイ用に血漿試料を５倍希釈した。ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦまたはＯＰＮの濃度がそれぞれ、１００Ｕ／ｍＬ超、７．５ｎｇ／ｍＬ超、０．９２ｎｇ／ｍＬ超、または、１５８ｎｇ／ｍＬ超であった場合に、血漿試料を陽性とスコア付けした。ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、プロラクチン及びミッドカイン用のこれらイムノアッセイのダイナミックレンジはそれぞれ、２．７４～２，０００Ｕ／ｍＬ、７８．１９～５７，０００ｐｇ／ｍＬ、２７．４３～２０，０００ｐｇ／ｍＬ、５４８．７～４００，０００ｐｇ／ｍＬ、１３７．１７～１００，０００ｐｇ／ｍＬ、及び、１３．７２～１０，０００ｐｇ／ｍＬであった。
ｃｔＤＮＡステータスを分類するためのアルゴリズム
試料のｃｔＤＮＡステータスの分類については、目的の試料の正規化変異頻度と正常対照の分布を比較する統計的検定から得た。具体的には、超変異体の数とＵＩＤの数の比率として定義されるＭＡＦを、それぞれの変異において正常対照のセットに認められたＭＡＦに基づき最初に正規化した。この変異特異的正規化に続き、それぞれのウェルにおけるそれぞれの変異のＭＡＦを、全ての変異が含まれる正常対照から構築したＭＡＦの基準分布と比較し、この分布からｐ値を計算した。任意の試料において検出された全ての変異の中で最も低いｐ値を「トップ変異」とみなした。試料のｃｔＤＮＡステータスの分類は、このトップ変異のｐ値が任意の閾値を下回るかまたは上回るかを基準とした。正常対照の独立したセット間に認められる所望の特異度に基づいて閾値を選択した。それゆえ、これらの対照を除く任意のその他の試料に対する訓練は実施しなかった。とりわけ、本文に記載の１８２名の健康な対照も２２１名の膵臓癌患者もアルゴリズムの訓練に使用する対照には組み込まなかった。
統計解析
必要と思われる場合には連続変数を平均値及び標準偏差または中央値及び範囲として記録し、一方、カテゴリー変数を整数及びパーセンテージとして記録した。二項分布を使用して感度の信頼区間（ＣＩ）を計算した。カプランマイヤー法を使用して生存曲線を推定し、ログランク検定を用いて曲線間の差異を検証した。単変量解析における統計的に有意な変数を多変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルに供した。
多変量モデルに組み込んだ変数のハザード比（ＨＲ）と９５％信頼区間（ＣＩ）を記録した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
結果
ＰＤＡＣを有する患者と推定健康対照の特性
本試験では外科的に切除可能な膵臓癌を有する２２１名の患者を評価した。これら患者の組織病理学的特性及び臨床的特性については表７にまとめている。がん、自己免疫疾患または慢性腎臓病の既知の病歴のない類似した年齢の１８２名の個体の全てを健康対照コホートとした。
２０％の患者は、典型的に膵臓癌に関連する症状を有していなかった。診察時における原発性腫瘍のサイズは０．６ｃｍ～１３ｃｍの範囲であり、中央サイズは３．０ｃｍであった。診察時における最も一般的なステージは患者の７７％に相当するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ ｃａｎｃｅｒステージ（ＡＪＣＣ）のステージＩＩＢであり、残りの患者はステージＩＡ（５％）、ステージＩＢ（８％）またはステージＩＩＡ（１０％）を有していた（表７）。図１２においてグラフで示したとおり、また先行臨床試験（例えば、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２６５（１）：１８５－１９１を参照のこと）から予測されたとおり、患者の生存はステージと相関していた。
血漿試料中における腫瘍特異的ＫＲＡＳ変異を同定するためのＰＣＲベースアッセイ
周囲のコドンに加えてＰＤＡＣにおいて最も頻繁に変異しているＫＲＡＳ遺伝子における２つのコドン（コドン１２とコドン６１）を同時に評価することができるＰＣＲベースアッセイを設計した。本アッセイでは、Ｓａｆｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ）と呼ばれる高感度技術を採用した（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８（２３）：９５３０－９５３５を参照のこと）。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳでは、それぞれの鋳型分子を固有に標識する分子バーコードを組み込むことにより、超並列シークエンシングにおいて機械的に発生するエラーを徹底的に最小化する。このアプローチでは、１０，０００ほどもの正常な鋳型の中から１つの変異鋳型を同定することができる。この技術を使用して、２２１の膵臓癌症例のうちの６６症例（３０％：９５％ＣＩ ２４～３６％）における血漿中のＫＲＡＳ変異を同定した（以下及び表８を参照のこと）。６２症例（９４％）の変異と４症例（６％）の変異がそれぞれコドン１２とコドン６１に存在しており、Ｇ＞Ｔ塩基転換が最も一般的に認められた（表８）。ステージＩ患者と比較してステージＩＩ患者において変異がより頻繁に見つかった（以下、ならびに、表８及び図９Ａを参照のこと）。加えて、変異アレル頻度は腫瘍サイズとは相関しなかった（表８及び図１１Ａ）が、変異はより小さな腫瘍と比較してより大きな腫瘍でより頻繁に見つかった（以下、ならびに、表８及び図９Ｂを参照のこと）。
それぞれの個々のアッセイとそれらの全ての組み合わせで検出したＡＪＣＣステージ毎に分類した試料の割合
Figure 2023075090000056


それぞれの個々のアッセイとそれらの全ての組み合わせで検出した腫瘍サイズ毎に分類した試料の割合
Figure 2023075090000057


様々ながんのタイプにおけるタンパク質バイオマーカー
Figure 2023075090000058
血漿中における変異鋳型の数は、それぞれの血漿試料中における変異アレル割合とＤＮＡ濃度から計算することができた（表８）。この数は極めて少ない場合が多く、検出可能なＫＲＡＳ変異を有する患者のうちの１５名（２３％）は血漿１ｍｌあたり＜２の変異鋳型を有していた。血漿１ｍＬあたりの変異鋳型の平均数は９．４であった（表８）。これらの結果は、極めて高感度な技術を使用すれば、早期ステージの膵臓癌患者における変異を検出することができるということを強調している。ＫＲＡＳ変異は、推定健康コホートにおける２２１名の個体のうちの１名（既知のがんを有さない６９歳の男性）においてのみ認められた。
リキッドバイオプシーコンセプトの基本原理は、循環血液中において同定された変異ＤＮＡ鋳型ががんに由来するということである。それゆえ、これらの患者の血漿試料中において同定されたＫＲＡＳ変異が患者らの原発性がん内においても存在するかどうかを確認することが重要であった。自身の血漿中において検出可能なＫＲＡＳ変異を有する６６名の患者のうちの５０名に由来する原発性がんを採取した。全５０症例において、血漿中に存在する変異が原発性がん内に存在する変異と同一であったため、特異度の別の直交指標がもたらされた。
血漿中のＣＡ１９－９変異とＫＲＡＳ変異の同時評価
ＫＲＡＳ ｃｔＤＮＡ検査とＣＡ１９－９（ＰＤＡＣバイオマーカー）の組み合わせがＫＲＡＳ ｃｔＤＮＡ検査単独の場合と比較して感度の向上をもたらし得るかどうかを確認するための調査を行った。膵臓癌を有する患者においては診断の２年前にＣＡ１９－９が上昇し得るということを最近の研究が示している（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１（３）：６２２－６３１を参照のこと）。しかしながら、ＣＡ１９－９の上昇が非悪性状態においても認められ、その集団のうちの５％が生殖細胞の遺伝的変異によりＣＡ１９－９抗原を生成できないことから、スクリーニング用途におけるＣＡ１９－９の使用には制限がある（例えば、Ｌｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ ６７５－７０１を参照のこと）。しかしながら、結果を陽性とスコアリングするための閾値が十分に高い場合には、ＣＡ１９－９がスクリーニングバイオマーカーとして有用であることが証明され得ると推定された。１００Ｕ／ｍＬのレベルが膵胆管疾患の病歴を有しない健康な個体で認められていないという先行データ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９（２）：１８２－１８６を参照のこと）に基づいて１００Ｕ／ｍＬの閾値を選択した。
この所定の高い閾値を使用すると、膵臓癌を有する２２１名の患者のうちの１０９名（４９％：９５％ＣＩ ４３～５６％）においてＣＡ１９－９が検出され、１８２名の健康対照のいずれにおいてもＣＡ１９－９が検出されなかったことから、このように使用した際のＣＡ１９－９の特異度が確認された（表８及び表９）。予測したとおり、検出可能なＣＡ１９－９レベルを有する患者の数はステージと腫瘍サイズに伴い増加した（図９及び表８）。目下の研究において取り組まれている論点は、これら２つのバイオマーカー（ＫＲＡＳ変異及び陽性ＣＡ１９－９スコア）が疾患の存在の独立した指標であるかどうかということであった。図１０のベン図に示すとおり重複が部分的にすぎないということが見出された。４２名の患者（１９％）は自身の血漿中に検出可能なＫＲＡＳ変異に加えて高いＣＡ１９－９レベルを有していたが、９１名の別の患者はＫＲＡＳの変異または高いＣＡ１９－９のいずれか（しかし、両方ではない）を有していた（図１０）。それゆえ、これらの解析の感度を組み合わせると６０％（９５％ＣＩ ５３～６７％）となり、いずれか単独の感度よりも高かった（図９）。それゆえ、それぞれのアッセイが使用した閾値において極めて特異的であったことから偽陽性率を実質的に上昇させることなく２つのアッセイを組み合わせることができたということを本実施例は示している。
その他のタンパク質バイオマーカーの組み込みによる感度の上昇
上記の結果に励まされ、ｃｔＤＮＡ ＫＲＡＳ変異及びＣＡ１９－９をその他のタンパク質バイオマーカーと組み合わせることにより感度を更に上昇させるための調査を行った（表１０）。本明細書において研究を行った膵臓癌試料とは独立した少数の膵臓癌試料に関するパイロットスタディでは、がんにおいて上昇していることが判明したその他のタンパク質（α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１５－３、レプチン、ＩＬ－６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、インターロイキン８（ＩＬ－８）、ｓＦａｓ、プロラクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、サイトケラチン－１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ ２１－１）、ヒト精巣上体タンパク４（ＨＥ４）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）、増殖／分化因子１５（ＧＤＦ１５）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ－１）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ－２）、メソテリン、ミッドカイン、カリクレイン－６、ＣＤ４４、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ、可溶性ヒト上皮成長因子受容体２（ｓＨＥＲ２）、可溶性上皮成長因子受容体（ｓＥＧＦＲ）、可溶性ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｓｕＰＡＲ）、及び、可溶性血小板内皮細胞接着分子（ｓＰＥＣＡＭ－１）を含む）の潜在的な有用性についての評価を行った。これら２９のタンパク質バイオマーカーのうち５つ、ＣＥＡ（例えば、Ｎａｚｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４７（３６）：１７５０－１７５２を参照のこと）、ＨＧＦ（例えば、Ｄｉ Ｒｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（５）：１１２９－１１３８を参照のこと）、ミッドカイン（例えば、Ｉｋｅｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３（６）：７０１－７０６を参照のこと）、ＯＰＮ（例えば、Ｋｏｏｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ １３（３）：４８７－４９１を参照のこと）、及び、プロラクチン（例えば、Ｌｅｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（１２）：５２２６－５２３３を参照のこと）を更なる解析用に選択した。
２２１名の患者（膵臓癌コホート）に由来する血漿中におけるこれら５つのマーカーのレベルを評価した際に、プロラクチンとミッドカインの血漿中濃度と手術部位の間に関連が認められ（Ｐ＜０．０１、χ２検定、自由度＝５）、採血の条件によりこれら２つのマーカーのレベルが上昇する場合があるということが示唆された。ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦまたはＯＰＮのレベルと採取部位の間には有意な相関関係はなく、ＫＲＡＳ ｃｔＤＮＡ変異の存在と採取部位の間にも何ら相関関係はなかった（Ｐ＞０．０１、χ２検定、自由度＝５）。更に調査を行うと、プロラクチンのレベルとミッドカインのレベルが、麻酔の投与後ではあるが外科的切除前に採取した試料において有意に上昇していたことが確認された（図１４）。プロラクチンに関する結果は、麻酔薬がこのタンパク質のレベルを上昇させることを示す以前の研究（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００７ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２（１２）：ｅ１２８１を参照のこと）と一致していた。麻酔が上記のその他のタンパク質バイオマーカーのレベルに影響を及ぼしていないということを保証するために、２９名の新たな患者において麻酔の投与前と投与直後に一対の血漿試料を採取した。麻酔によって上昇したことが判明したタンパク質はプロラクチンとミッドカインのみであり（図１５）、採取部位とタンパク質レベルの間の上記の相関関係と完全に一致していた。それゆえ、プロラクチン及びミッドカインについては更なる解析から除外した。
ＣＡ１９－９とは異なり、膵臓癌用のマーカーとしてのＣＥＡ、ＨＧＦまたはＯＰＮの使用には所定の閾値は存在していない。その結果、健康対照に由来する２７３点の血漿試料の独立したセットを用いて適切な閾値を決定した。慎重を期すために、それぞれのタンパク質の閾値について、２７３点の正常な血漿試料のいずれかにおいて認められた最大値よりも１０％高い閾値を選択した。注目すべきことに、これらの閾値を１８２点の血漿試料の独立したテスト事例集合に適用すると、３つのタンパク質マーカー全てが１００％の特異度を維持した（表９）。これら３つのマーカーのそれぞれの感度は、それぞれのマーカーを単独で使用した際にＫＲＡＳ変異またはＣＡ１９－９で得られた感度よりも低かったが、それら３つのマーカーのレベルは、ＫＲＡＳ変異またはＣＡ１９－９と比較してステージ及びサイズにより少なく依存していた（図１３及び表８）。ＫＲＡＳ変異アッセイとＣＡ１９－９アッセイを組み合わせると、この５メンバーバイオマーカーパネル（「組み合わせアッセイ」）は、２２１の切除可能がんのうちの１４１（６４％：９５％ＣＩ ５７～７０％）を検出した（表７、図９Ａ、図１０、及び表８）。
組み合わせアッセイで検出可能な患者の一部は特に注目に値した。４５名（２０％）の患者は、典型的に膵臓癌に関連する症状を有していなかった（表８）。組み合わせアッセイはこれらの個体のうちの２７名（６０％）を同定し、そのうちの１９名（７０％）は、中央フォローアップ１２ヶ月間（３～１６ヶ月間の範囲）において再発のエビデンスを有していなかった（表８）。ＡＪＣＣが認める最も早期のステージの疾患（ステージＩＡ及びＩＢ）を有する２９名の患者のうちの１２名（４１％）については組み合わせアッセイを使用して検出可能であり（図９Ａ）、そのうちの７名（５８％）は、試験終了時及び中央フォローアップ１９ヶ月間（２～２５ヶ月間の範囲）において再発のエビデンスを有していなかった。
本試験の注目に値するがありのままの別の結果は、生存率のより低い患者が検査陽性を示す可能性がより高かったということであった。試験を行った全２２１名の膵臓癌患者のうちの１２２名（５６％）の患者は、試験終了時及び中央フォローアップ１３ヶ月間（７～２１ヶ月間）において生存した。一般的な臨床的特性及び組織病理学的特性に依存しない予後の度合いを組み合わせアッセイが提供するということが見出された。詳細には、多変量解析は、全生存率の独立した予測因子が、組み合わせアッセイの状態（ＨＲ＝１．７６、９５％ＣＩ、１．１０～２．８４、ｐ＝０．０１８）、加齢（ＨＲ＝１．０４、９５％ＣＩ １．０２～１．０６、ｐ＝０．００１）、分化のグレード（低分化、ＨＲ＝１．７２、９５％ＣＩ、１．１１～２．６６、ｐ＝０．０１５）、リンパ管浸潤（有、ＨＲ＝１．８１、９５％ＣＩ、１．０６～３．０９、ｐ＝０．０２８）、結節性病変（有、ＨＲ＝２．３５、９５％ＣＩ、１．２０～４．６１、ｐ＝０．０１３）、及び、断端の状態（ＨＲ＝１．５９、９５％ＣＩ、１．０１～２．５５、ｐ＝０．０５０）であることを示した（表７、図１６）。
マルチプレックスアッセイにおけるＴＰ５３
ほぼ全ての膵臓癌がＫＲＡＳ内に変異を有しているが、多くの割合（約７５％）はＴＰ５３内にも変異を含有している（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１（５８９７）：１８０１－１８０６；Ｂｉａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｎａｔｕｒｅ ４９１（７４２４）：３９９－４０５；及びＷａｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｎａｔｕｒｅ ５１８（７５４０）：４９５－５０１を参照のこと）。更に、ＴＰ５３はがんにおいてほとんどの場合に一般的に変異している遺伝子であり（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２７）：１５４６－１５５８を参照のこと）、その他の腫瘍タイプに関する将来の研究におけるｃｔＤＮＡ検出のための魅力的な標的となっている。血漿中におけるＴＰ５３の変異アレル頻度がＫＲＡＳの変異アレル頻度と相関しているかどうかを確認するために、また血漿中における変異ＴＰ５３アッセイが変異ＫＲＡＳアッセイの感度に加算され得るかどうかを確認するためにも、マッチした腫瘍と血漿試料が利用可能な１５２のがんを評価した。ＰＤＡＣのゲノムワイド研究で同定された「ホットスポット」（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１（５８９７）：１８０１－１８０６を参照のこと）のうちの１つにおける変異について最初に調査を行った。合計で６４（４２％）のがんが、これらの位置のうちの１つにＴＰ５３変異を含有していた。次に、特定のＴＰ５３変異に特異的なプライマーを使用した以外はＫＲＡＳについて前述したアッセイに類似したＳａｆｅ－ＳｅｑＳベースアッセイを使用して、これら同一の変異がこれら６４名の患者の血漿中において同定され得るかどうかを確認した。
６４点の血漿試料のうちの１３点（２０％）（以下を参照のこと）においてＴＰ５３変異が同定された。興味深い２つの所見があった。第１に、検出可能なＴＰ５３変異を含有する１３点の血漿試料のうちの１２点は、検出可能なＫＲＡＳ変異も含有していた。それゆえ、ＴＰ５３変異アッセイは、上で記載したＫＲＡＳ変異の高い有病率から予測されたとおりには、膵臓癌検出の感度を実質的に上昇させてはいなかった。第２に、１２名の患者の血漿（検出可能な量のＫＲＡＳとＴＰ５３の両方の変異を含有する血漿）中におけるＴＰ５３変異の変異アレル頻度とＫＲＡＳ変異の変異アレル頻度の間には強い相関関係があった（図３、ピアソンｒ＝０．８８５）。このことは、ｃｔＤＮＡアッセイの信頼性及びその定量性に関する更に別の実証を提供している。
ＰＤＡＣ患者において検出された例示的なＴＰ５３変異のリスト
Figure 2023075090000059


ＰＤＡＣ患者において検出された例示的なＣＤＫＮ２Ａ変異のリスト
Figure 2023075090000060


Figure 2023075090000061

実施例３：ｃｔＤＮＡ及びタンパク質バイオマーカーの感度及び特異度
物質及び方法
フェーズＡ
健康コホート：１０，０００名の非症候性女性をリクルートする。参加者の年齢範囲は６５～７５歳としたが、それはこの範囲が、検出の標的である８タイプのがんのリスクが最大となる患者をカバーしているからである。卵巣摘出術を受けた女性、非メラノーマ皮膚癌以外の任意のタイプの既知のがんを有する女性については、本試験から除外する。試験登録時にそれぞれの参加者から血漿を採取する。陽性と判定された参加者に加え検査陰性参加者の無作為標本については、最初の検査の３ヶ月後に追加の血漿試料を１点採取する。両方の検査で同一の変異に対して陽性であった場合、全身ＰＥＴ／ＣＴスキャンを実施する。ＰＥＴ／ＣＴ検査が陽性であった場合、患者の担当医が適切とみなすとおりに患者を管理する。この管理には年に一度のフォローアップｃｔＤＮＡ検査が含まれている。患者の年に一度のフォローアップでは、必要に応じて電話インタビューと組み合わせた電子アンケートを全ての個人（それら個人の検査が陽性であるかまたは陰性であるかにかかわらず）から得る。
管理コホート：オーストラリア、ニュージーランド及びシンガポールにまたがる少なくとも１０拠点から、ステージＩＩＩ結腸癌を有する２００名の患者及び切除可能膵臓癌を有する５０名の患者をリクルートする。腫瘍試料を検査して、続くｃｔＤＮＡ検査に利用可能な変異を同定する。外科手術前に全ての患者（通常の治療を受けるように無作為化された患者を含む）から血漿試料を採取する。３、６及び１２ヶ月時点において、外科手術前にｃｔＤＮＡ検査が陽性であった患者から追加の血漿試料を採取する。ｃｔＤＮＡ陰性患者または通常の治療を受けるように無作為化された患者については更なるｃｔＤＮＡ解析は実施しない。ｃｔＤＮＡインフォームド管理（標準治療と比較して治療を漸増または漸減する）、または、通常の治療［ｃｔＤＮＡ検査の結果はブラインドにする］に、患者を１：１に無作為化する。
フェーズＢ
健康コホート：更に４０，０００名の非症候性女性をリクルートする。包含基準及び除外基準はフェーズＡのものと同一である。フェーズＡとフェーズＢの間には、より長いフォローアップ及びより多くの患者数以外に、少なくとも２つのその他の差異がある。第１に、フェーズＡ試料において特異度閾値（＞９９．５％）を超えたタンパク質バイオマーカーが含まれている。これらのタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数に対して陽性と判定された患者は、陽性のｃｔＤＮＡ結果を有する患者と同様に管理されている。第２に、「対照」健康コホートが加えられている。これらのことは、同一集団からリクルートされてはいるが、疾患を評価するためまたは管理を誘導するための血液試料を採取されていない個体であることを示している。これらの対照を使用して、症状または健康な個体の標準治療に基づいて疾患が通常どおりに検出され得る前にスクリーニング検査が疾患を検出する能力を評価する。スクリーニングコホート及び対照コホートにおけるステージと生存率の間の比較についても実施する。
管理コホート：更に、ステージＩＩＩ結腸癌を有する１０００名の患者（合計で１２００名の患者）及び切除可能膵臓癌を有する２１０名の患者（合計で２５０名の患者）をリクルートしているが、現時点では、１０拠点ではなく３０拠点からである。フェーズＡと同様に、全ての新規の患者から外科手術時に腫瘍試料を採取して、続くｃｔＤＮＡ検査に利用可能となるように変異を同定する。加えて、フェーズＡにおいて特異度閾値（＞９９．５％）を超えた結腸直腸癌または膵臓癌用のタンパク質バイオマーカーが含まれている。これらのタンパク質バイオマーカーに対して陽性と判定された患者は、陽性のｃｔＤＮＡ結果を有する患者と同様に管理されている。外科手術前に全ての患者から血漿試料を採取し、３、６及び１２ヶ月時点において、外科手術前にｃｔＤＮＡ検査が陽性であった患者から血漿試料を採取する。ｃｔＤＮＡインフォームド管理（標準治療と比較して治療を漸増または漸減する）、または、通常の治療［ｃｔＤＮＡの結果はブラインドにする］に、患者を１：１に無作為化する。
評価
健康コホートにおいて使用したＳａｆｅ－ＳｅｑＳベースｃｔＤＮＡ検査には、がんドライバー遺伝子の最も一般的に変異している領域を示す６１のアンプリコンを組み込んだ。標的とする８種のがんタイプのうちの約７０％が、これらアンプリコンがカバーする領域のうちの少なくとも１つに変異を有していると推定されている。これらアンプリコンのうちの少なくとも１つに変異を有する血漿の割合は、全てのがんがｃｔＤＮＡを生じるとは限らないことから、７０％未満である（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４ Ｆｅｂ １９；６（２２４）：２２４ｒａ２４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００７０９４．を参照のこと）。
管理コホートでは、標的シークエンシングアッセイを最初に使用して、外科手術または生検で採取したＦＦＰＥがん内における少なくとも１つの変異を同定する。このＳａｆｅ－ＳｅｑＳベース検査では１２８のアンプリコンを採用しており、本発明者らは、検査を行った４０１の結腸直腸癌のうちの３９５及び２００の膵臓癌のうちの２００における少なくとも１つの病原性ドライバー遺伝子変異を検出するためにそれらアンプリコンを使用している。そのため、個々の患者のそれぞれの腫瘍における変異を検出する１つの特異的なアンプリコンを使用して、その患者由来の血漿を特定の時点で評価するのだが、それは言い換えると、完全個別化アッセイである。
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に対する検査に加え、健康コホートに由来する血漿試料のサブセットに対しＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して、約２５のタンパク質バイオマーカーのパネルを評価する。これらのタンパク質用のアッセイは確立している。陽性の閾値が高いレベルに設定されている場合、それら閾値は、ｃｔＤＮＡ検査結果と組み合わせて特異度を損なうことなく感度を向上させることのできる追加の情報を提供する。フェーズＡにおいて＞９９．５％の特異度を示すマーカーを試験のフェーズＢに組み込む。
４：がんスクリーニング検査の組み合わせアプローチを使用した婦人科悪性腫瘍の検出
婦人科悪性腫瘍（例えば、子宮頸癌、卵巣癌及び子宮内膜癌）の診断には多くの場合、パパニコロウ（Ｐａｐ）検査、経腟超音波（ＴＶＵＳ）、及び／または、ＣＡ－１２５バイオマーカーの検出が含まれる。しかしながら、現行の診断アプローチを用いたスクリーニング法は、それが「がんを有さない女性における主要な外科的介入を含む重大な損傷」をもたらすことから、一般集団には推奨されない（例えば、Ｍｏｙｅｒ，２０１２ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５７：９００－９０４を参照のこと）。それゆえ、新規の診断アプローチの必要性が急務となっている。
本実施例ではＰａｐＳＥＥＫと呼ばれる新規の血液検査について説明するが、ＰａｐＳＥＥＫは上記の未解決の課題に対処するものである。本試験では、採取した体液（例えば、子宮頸管から採取した細胞を含有する体液）に由来するＤＮＡをアッセイ（例えば、ＰＣＲベースのマルチプレックス検査）に使用して、子宮内膜癌または卵巣癌において一般的に生じている遺伝的改変を同時に評価することができる（図１９）。総合的には、子宮内膜癌または卵巣癌を有する６５６名の患者及び１００２名の健康対照を含む１６５８名の個体に由来する１９１５点の試料を本明細書に記載する試験に組み込んだ。がん患者の年齢、人種、組織病理学的診断、ステージ、及びその他の臨床情報については、表１３に記載している。これらの患者に由来する検査試料については表１４に列挙している。
物質及び方法
患者の試料
本試験用の全ての試料は、ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、ＭｃＧｉｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ（Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＤ）、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，ＮＹ）、及びｔｈｅ Ｄａｎｉｓｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓにより承認されたプロトコルに従い採取された。がんを有するそれぞれの患者に関して収集した人口統計データ、臨床データ及び病理学的ステージ分類データについては、表１３に列挙している。Ｐａｐブラシ解析に利用したがんを有さない７１４名の女性の平均年齢は３４歳（範囲：１７～６７歳）であった。Ｔａｏブラシ解析に利用したがんを有さない１２５名の女性の平均年齢は２９歳（範囲：１８～７４歳）であった。全ての組織変化について委員会が認定した病理学者による再レビューを行った。他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５；及びＢｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６：２２４ｒａ２２４を参照のこと）、腫瘍、パップスメア検査体液、及び血漿からＤＮＡを抽出した。子宮内試料採取のために、Ｔａｏ Ｂｒｕｓｈ ＩＵＭＣ Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ Ｓａｍｐｌｅｒ（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ）を子宮底のレベルにまで穏やかに挿入した。次に、アウターシースを引き戻し、ブラシを時計回りに３６０度回転させてから反時計回りに３６０度回転させた。その後、再度アウターシースを押し込んでから器具を引き抜いた。試料をＴｈｉｎ－Ｐｒｅｐバッファーに入れ、製造業者の取扱説明書に従いＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してそこからＤＮＡを精製した。他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｒａｇｏ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７：９３６４－９３７０を参照のこと）、全ての試料に由来する精製ＤＮＡを定量した。
健康対照には、パップスメアにおける正常な細胞診所見を有し婦人科腫瘍の病歴のない患者が含まれていた。卵管結紮術の履歴のある卵巣癌患者については本試験から除外した。
体細胞変異の検出及び解析
他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｅｌｉｆｅ ５を参照のこと）、１１０～１４２ｂｐのセグメントを増幅するように設計された１３９組のプライマーペアからなる３回のマルチプレックスＰＣＲ反応で、パップスメア検査体液、Ｔａｏブラシ試料または原発性腫瘍に由来するＤＮＡを増幅した。これらのセグメントは、以下の１８の遺伝子、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＡＰＫ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＯＬＥ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＮＦ４３、及びＴＰ５３に由来する目的の領域を含有している。それぞれの試料に対して、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｅｌｉｆｅ ５を参照のこと）、それぞれが非重複アンプリコンを含有する３回のマルチプレックス反応を実施した。それぞれの試料を２つの複製ウェルで評価した。６７～８１ｂｐのセグメントを増幅するように設計された６１組のプライマーペアからなる２回のマルチプレックスＰＣＲ反応で、血漿に由来するＤＮＡを増幅した。それぞれの試料を６つの複製ウェルで評価した。これらのセグメントは、以下の遺伝子、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及びＴＰ５３に由来する目的の領域を含有していた。
全てのシークエンシング解析に、低頻度変異を検出するためのエラー低減技術であるＳａｆｅ－ＳｅｑＳ（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）を使用した。それぞれのペアの一方のプライマーは、Ａ、Ｃ、ＴまたはＧである可能性が等しい１４の変性塩基からなる固有識別子配列（ＵＩＤ）を含有していた。塩基がエラーとコールされる確率を示すためにシークエンシング装置で生成した品質スコアを基準として、高品質なシークエンスリードを選択した。次に、分子バーコードとして組み込まれたＵＩＤに基づいて、共通鋳型分子に由来するリードをグループ分けした。それぞれのＵＩＤファミリーにおける＞９０％のリードに変異を存在させる（すなわち、「超変異体」とスコア付けさせる）必要があるため、試料調製ステップ中またはシークエンシングステップ中に導入される人為的変異を減少させた（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）。
シークエンシングデータの統計解析
変異アレル割合（ＭＡＦ）ベースのアプローチを使用して、Ｐａｐブラシ試料とＴａｏブラシ試料の全てを解析した。以下の２つの基準、（ｉ）ＣＯＳＭＩＣデータベースに存在すること（例えば、Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５：Ｄ７７７－Ｄ７８３を参照のこと）、または、（ｉｉ）腫瘍抑制遺伝子内において不活性であることが予測されていること（ナンセンス変異、フレームシフト挿入または欠失、標準的なスプライス部位変異）、のうちの１つに適合した変異についての考察を行った。同義変異（エキソン末端における変異以外）（例えば、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４７：１２４２－１２４８を参照のこと）とイントロン変異（スプライス部位における変異以外）を除外した。対照群における同一変異のＭＡＦの分布を基準として、目的の試料のＭＡＦを最初に正規化した。この変異特異的正規化に続き、それぞれのウェルにおけるそれぞれの変異のＭＡＦを、全ての変異が含まれる正常対照から構築したＭＡＦの基準分布と比較することにより、ｐ値を得た。次に、ウェルにおけるＵＩＤの数で重み付けした２つのウェルのｐ値からＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコアを計算した。
試料の変異のいずれかが、以下の３つの基準、１）試料のＭＡＦと対照におけるその変異に認められた対応する最大ＭＡＦの間の差異、２）試料のＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコアと対照の同一変異における６つのゼロではない最高ＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコアの平均値の比率、または、３）試料のＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコア単独（変異が対照において認められない場合）、のいずれかに対応する閾値超の値を有していた場合に、試料を陽性とスコア付けした。
１０倍クロス確認で感度及び特異度を得た。それぞれのラウンドでは、がんを有さない７１４名の女性の９０％に由来するＰａｐブラシ試料を対照とした。１０ラウンドのそれぞれでは、がんを有さない女性に由来するＰａｐブラシ試料の残りの１０％をスコア付けして特異度を得た。全てのその他の試料に対し、１０ラウンドのそれぞれにおいて１回のスコア付け（合計で１０回）を実施し、回数の半数超（すなわち、５ラウンド以上）において試料が陽性とスコア付けされた場合に総合的に陽性であるとみなした。陽性とスコア付けされた試料における変異については表１５に列挙している。
実験的ベイズ手法を使用して血漿試料の解析を実施した。最尤推定法を使用して、ＭＡＦを基準としてベータ分布を最初に対照のセットにフィッティングした。次に、全ての変異のＭＡＦを適宜調節した。対照間における調節ＭＡＦの分布と比較することにより、それぞれのウェルにおけるそれぞれの変異のｐ値を計算した。全ての変異における総合的なｐ値を、６つのウェル全てに由来するｐ値の積として得た。１０倍クロス確認で感度及び特異度を得た。それぞれのラウンドでは、上記のＰａｐブラシ試料の場合と同様に、１９２名の健康な個体に由来する正常な血漿試料を対照とした。５ラウンド以上において試料が陽性であった場合に、その試料を陽性とみなした。陽性とスコア付けされた試料における変異については表１７に列挙している。
対応する成功確率として設定した実際の感度と特異度の二項分布を仮定して、感度と特異度の信頼区間を計算した。
異数性の検出及び解析
それぞれの試料に対し、一対のプライマーペアを使用して、ゲノム全体における約３８，０００遺伝子座の長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）を増幅した（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４１１６２を参照のこと）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ装置上で超並列シークエンシングを実施した。プライマーのうちの１つには、ＰＣＲ及びシークエンシングに関連するエラー率を低減させるための上記の分子バーコードとしてのＵＩＤが含まれている。次に、Ｗｉｔｈｉｎ－Ｓａｍｐｌｅ ＡｎｅｕｐＬｏｉｄｙ ＤｅｔｅｃｔｉＯｎ（ＷＡＬＤＯ）ソフトウェアを使用してシークエンシングデータを処理して、３９の染色体腕上におけるアレル不均衡に加え、有意な単一染色体腕の獲得と喪失を同定した（例えば、実施例６を参照のこと）。ＷＡＬＤＯでは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を実装して異数性試料と正倍数性試料を識別している。腫瘍含有率の低い３１５０点の合成異数性試料及び６７７点の正倍数性末梢白血球（ＷＢＣ）試料を使用してＳＶＭを訓練した。ＳＶＭ識別スコアが所定の閾値を超えた場合、または、染色体腕７ｑ及び８ｑにおける有意な獲得が認められた場合に、試料を陽性（異数性）とスコア付けした。これらの染色体腕における獲得は子宮内膜癌と卵巣癌の両方において頻繁に生じている（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３ Ｎａｔｕｒｅ ４９７：６７－７３；及びＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１ Ｎａｔｕｒｅ ４７４：６０９－６１５を参照のこと）。
結果
子宮内膜癌または卵巣癌を有する患者由来のＰａｐブラシ試料中における体細胞変異の評価
腫瘍細胞から剥離したＤＮＡの量はＰａｐブラシ試料中における総ＤＮＡのうちのわずかな割合であり、ほとんどのＤＮＡが正常細胞から生じていると予測された。それゆえ、Ｓａｆｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ）と呼ばれる高感度なＰＣＲベースのエラー低減技術を使用して、これらの試料中における変異を同定した（方法及び物質を参照のこと）。端的に言うと、目的の１８の遺伝子内における９，３９２の異なるヌクレオチド位置をカバーする１３９の領域（表３９）を増幅するためのプライマーを設計した。次に、それぞれが非重複アンプリコンを含有する３回のマルチプレックスＰＣＲ反応をそれぞれの試料に対して実施した。
子宮内膜癌を有する３８２名の女性のＰａｐブラシ試料、卵巣癌を有する２４５名の女性のＰａｐブラシ試料、及び、がんを有さない７１４名の女性のＰａｐブラシ試料に、このアッセイを適用した。早期ステージ（ステージＩ及びＩＩ）の疾患を有する患者の７８％及び末期ステージの疾患（ステージＩＩＩ及びＩＶ、表Ｓ２）を有する患者の８９％を含む、子宮内膜癌を有する患者の８１％が検出可能な変異を有していることが見出された。最も一般的に変異している遺伝子は、ＰＴＥＮ（６４％）、ＴＰ５３（４１％）、ＰＩＫ３ＣＡ（３１％）、ＰＩＫ３Ｒ１（２９％）、ＣＴＮＮＢ１（２１％）、ＫＲＡＳ（１８％）、ＦＧＦＲ２（１１％）、ＰＯＬＥ（９％）、ＡＰＣ（９％）、ＦＢＸＷ７（８％）、ＲＮＦ４３（７％）、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａ（５％）であった。中央変異アレル割合（ＭＡＦ）は４．０％（９５％信頼区間（ＣＩ）：３．５％～４．５％）であった（表１５）。
２４５名の卵巣癌患者の２９パーセントは、自身のＰａｐブラシ試料中に検出可能な変異を有していた。これらには、早期ステージの疾患を有する患者の２８％及び末期ステージの疾患を有する患者の３０％が含まれていた（表１４）。最も一般的に変異している遺伝子はＴＰ５３（７４％）であった。中央ＭＡＦは０．５４％（９５％ＣＩ：０．４％～０．８７％）であった（表１５）。このアッセイをがんを有さない７１４名の女性にも適用すると、１．３％が検出可能な変異を有することが判明し、９８．７％（９５％ＣＩ：９７．６％～９９．４％）の特異度がもたらされた（図２０）。
Ｐａｐブラシ試料を提供した子宮内膜癌患者と卵巣癌患者のそれぞれ８３％と８４％に由来する腫瘍組織が利用可能であった。Ｐａｐブラシ試料に適用した同一のマルチプレックスアッセイを使用して、子宮内膜癌組織と卵巣癌組織のそれぞれ９８％と８２％におけるドライバー遺伝子変異を同定した（表１６）。自身の原発性腫瘍内において同定されたドライバー変異を有する子宮内膜癌患者と卵巣癌患者のうちのそれぞれ８５％と２９％は、自身のＰａｐブラシ試料中に変異を有していた。逆の言い方をすれば、子宮内膜癌または卵巣癌を有する患者に由来する陽性Ｐａｐブラシ試料のうちの９３％は、自身の原発性腫瘍内に認められた変異と同一の少なくとも１つのドライバー遺伝子変異を含有していた。原発性腫瘍内にも存在する変異を含むＰａｐブラシ試料の割合は、卵巣癌患者における割合（７３％）と比較して、子宮内膜癌患者においてより高かった（９７％）。
Ｐａｐブラシ試料中における異数性の評価
体細胞変異に加えて、異数性が子宮内膜癌及び卵巣癌の大部分において見つかっている（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３ Ｎａｔｕｒｅ ４９７：６７－７３；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１ Ｎａｔｕｒｅ ４７４：６０９－６１５；及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：１５４６－１５５８を参照のこと）。異数性を評価するために、ＰＣＲベースの方法を使用して、一対のプライマーペアで約３８，０００遺伝子座の長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）を増幅した。ＬＩＮＥはレトロ転移によりゲノム全体に散在しており、３９の非末端動原体型常染色体腕上全てに存在している。シークエンシング後、データを処理して単一染色体腕上の獲得または喪失を同定した。
早期ステージの疾患を有する患者と末期ステージの疾患を有する患者のうちのそれぞれ３４％と５１％を含む、子宮内膜癌を有する患者の３８％（ｎ＝３８２）のＰａｐブラシ試料中における異数性を検出した（表１４）。早期ステージの疾患を有する患者と末期ステージの疾患を有する患者のうちのそれぞれ１５％と９．３％を含む、卵巣癌患者の１１％（ｎ＝２４５）のＰａｐブラシ試料中における異数性についても検出した（表１４）。子宮内膜癌及び卵巣癌において最も一般的に改変されている腕は４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑであった。それに対し、がんを有さない７１４名の女性のＰａｐブラシ試料に異数性アッセイを適用すると、１名の女性のみが陽性であった（図２０）。
たとえ試料が評価した１８の遺伝子のうちの１つに遺伝的変化を含有していないとしても、その試料は依然として異数性であり得、本明細書で提供する方法を用いて検出可能であり得る。この推測は、自身のＰａｐブラシ試料または原発性腫瘍（利用可能な場合）内に変異を有していなかったが自身のＰａｐブラシ試料が異数性を示した６名の患者（３名は子宮内膜癌を有し、３名は卵巣癌を有している）の同定により裏付けられた。変異＋異数性の上記アッセイを組み込んだ組み合わせ検査は「ＰａｐＳＥＥＫ」と呼ばれた。ＰａｐＳＥＥＫでは、試料が変異を有するまたは異常染色体腕数を有するのいずれかである場合、試料を陽性とスコア付けする。早期ステージの疾患を有する患者の７８％及び末期ステージの疾患を有する患者の９２％を含む、子宮内膜癌を有する女性に由来するＰａｐブラシ試料の８１パーセントはＰａｐＳＥＥＫ陽性であった（図２１及び図２２）。早期ステージの疾患を有する患者の３４％及び末期ステージの疾患を有する患者の３３％を含む、卵巣癌を有する女性に由来するＰａｐブラシ試料の３３パーセントはＰａｐＳＥＥＫ陽性であった（図２１及び図２２）。がんを有さない７１４名の女性に由来するＰａｐブラシ試料の１．４％のみがＰａｐＳＥＥＫ陽性であり、９８．６％（９５％ＣＩ：９７．４％～９９．３％）の特異度がもたらされた（図２０）。
卵巣癌または子宮内膜癌を有する患者に由来するＴａｏブラシ試料の評価
より直接的な子宮内腔（子宮頸管の代わりに）の低侵襲性試料採取により、婦人科がんを検出するためのこのアプローチの感度は上昇し得る。この可能性を調査するために、Ｔａｏブラシ（子宮筋層への損傷または子宮頸管からの汚染を伴うことなく子宮内膜腔全体における直接的な試料採取を可能とする引込式のアウターシースで覆われたしなやかで細いブラシである）を使用して子宮内試料を採取した。子宮内膜試料採取はＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認されており、麻酔を必要とすることなく外来診療環境において使用することができる。十分患者に許容されるということは潜在的なスクリーニング検査にとっては有利なことである。
子宮内膜癌を有する１２３名の患者から採取したＴａｏブラシ試料、卵巣癌を有する５１名の患者から採取したＴａｏブラシ試料、及び、がんを有さない１２５名の女性から採取したＴａｏブラシ試料に、ＰａｐＳＥＥＫを適用した。早期ステージの疾患を有する患者と末期ステージの疾患を有する患者のうちのそれぞれ９０％と９８％を含む、子宮内膜癌患者に由来するＴａｏブラシ試料の９３パーセントは、ＰａｐＳＥＥＫにより検出された遺伝的改変を含有していた（図２２）。Ｔａｏブラシ試料において最も一般的に変異している遺伝子は、ＰＴＥＮ（６３％）、ＴＰ５３（４２％）、ＰＩＫ３ＣＡ（３６％）、ＰＩＫ３Ｒ１（２０％）、ＫＲＡＳ（１７％）、ＣＴＮＮＢ１（１５％）、ＦＧＦＲ２（１５％）、ＲＮＦ４３（１１％）、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ（７％）、ＰＯＬＥ（７％）、及びＦＢＸＷ７（６％）であり、Ｐａｐブラシ試料において認められた変異と類似していた。中央ＭＡＦは２４．７％（９５％ＣＩ：２１．３％～２６．９％）であり、Ｐａｐブラシ試料において認められた中央ＭＡＦ４．０％（９５％ＣＩ：３．５％～４．５％、表Ｓ４）よりも大幅に高かった。
ＰａｐＳＥＥＫを用いて検出可能な遺伝的改変は、早期ステージを有する患者と末期ステージを有する患者のうちのそれぞれ４７％と４４％を含む、卵巣癌を有する５１名の女性に由来するＴａｏブラシ試料の４５％（９５％ＣＩ：３１％～６０％）に見つかった（図２２）。最も一般的に変異している遺伝子はＴＰ５３（８６％）であり、Ｐａｐブラシ試料に関するデータと一致した。中央ＭＡＦは０．８８％（９５％ＣＩ：０．６１％～２．８％）であり、Ｐａｐブラシ試料におけるもの（中央０．５４％、９５％ＣＩ：０．４％～０．８７％、表１５）よりも高かった。
がんを有さない１２５名の女性に由来するＴａｏブラシ試料にＰａｐＳＥＥＫを適用した。これらの女性のいずれもが変異に対して陽性と判定されず（０％）、１００％（９５％ＣＩ：９７％～１００％、図２０）の特異度がもたらされた。
Ｔａｏブラシ試料とＰａｐブラシ試料は、１４５名の患者（１０３名は子宮内膜癌を有し、４２名は卵巣癌を有する）中の同一女性から入手可能であった。子宮内膜癌におけるＰａｐＳＥＥＫでは、Ｔａｏブラシ試料の９１％及びＰａｐブラシ試料の８１％で陽性であった（ｐ＝０．０２、ｍｉｄ－Ｐ値マクネマー検定）。同様に、ＰａｐＳＥＥＫ検査陽性の卵巣癌患者の割合は、Ｐａｐブラシ（１７％、ｐ＝０．００２、ｍｉｄ－Ｐ値マクネマー検定、表１３）と比較してＴａｏブラシ（４５％）でより高かった。
Ｔａｏブラシ試料を提供した子宮内膜癌を有する患者と卵巣癌を有する患者のそれぞれ９０％と８８％に由来する腫瘍組織が利用可能であった。ＰａｐＳＥＥＫを用いて、子宮内膜癌組織と卵巣癌組織のそれぞれ９７％と８０％におけるドライバー遺伝子変異を同定した（表１６）。自身の原発性腫瘍内において同定されたドライバー変異を有する子宮内膜癌患者と卵巣癌患者のうちのそれぞれ９３％と４２％は、自身のＴａｏブラシ試料中において検出可能な変異を有していた。逆の言い方をすれば、子宮内膜癌または卵巣癌を有する患者に由来する陽性Ｔａｏブラシ試料のうちの９１％は、自身の原発性腫瘍内に認められた変異と同一の少なくとも１つのドライバー遺伝子変異を含有していた。原発性腫瘍内にも存在する変異を含むＴａｏブラシ試料の割合は、卵巣癌患者における割合（５３％）と比較して、子宮内膜癌患者においてより高かった（９７％）。
卵巣癌を有する患者におけるｃｔＤＮＡの評価
解剖学的またはその他の要因によりＰａｐまたはＴａｏブラシ試料採取では入手し難い卵巣癌は、血漿中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）により検出可能となり得る。Ｐａｐブラシ試料と血漿試料の両方を提供した８３名の卵巣癌患者においてこのことを検証した。分解ｃｔＤＮＡのより小さなサイズに起因して、目的の１６の遺伝子内における１，９３１の異なるヌクレオチド位置をカバーする短い６７～８１ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーを設計した。このアッセイの特異度を示すために、このアッセイを１９２名の健康な個体に由来する血漿試料に適用したが、いずれもが陽性と判定されず（０％）、１００％（９５％ＣＩ：９８％～１００％）の特異度がもたらされた。
卵巣癌を有する８３名の患者に由来する血漿の４３％（９５％ＣＩ：３３％～５５％）が検出可能なｃｔＤＮＡを有していることが見出された。検出された変異については表１７に列挙している。予測したとおり、血漿中のｃｔＤＮＡに対する感度は、早期ステージの腫瘍を有する患者と比較して末期ステージの腫瘍を有する患者においてより高かった（３５％対５６％、図２３）。早期ステージの疾患における血漿中の中央ＭＡＦは０．８５％であり、パップスメア中の中央ＭＡＦ（５．７％）未満であった。血漿中において同定された変異のうちの少なくとも１つは、対応する原発性腫瘍の８８％において同定され得た。
８３名の患者のこの同一コホートに由来するＰａｐブラシ試料のうちの４０％は、ＰａｐＳＥＥＫ検査により陽性であった。自身のＰａｐブラシ試料で陽性とスコアリングされた個体と自身の血漿試料で陽性とスコアリングされた個体は、わずかに部分的に重複していた（図２１）。結果として、患者の６３％（９５％ＣＩ：５１％～７３％）は、２つの検査のうちの少なくとも１つにおいて陽性であった。陽性と判定された患者には、早期ステージの疾患を有する患者の５４％と末期ステージの疾患を有する患者の７５％のそれぞれが含まれていた（表１３、図２３）。
考察
本明細書に記載するとおり、Ｐａｐブラシ試料またはＴａｏブラシ試料中における遺伝的改変を検出するためのマルチプレックスＰＣＲベースの検査（ＰａｐＳＥＥＫ）を設計及び適用した。これらの試料は通常の外来診療中に低侵襲性かつ都合よく得られる。子宮内膜癌の大部分（９３％はＴａｏブラシを用いて、８１％はＰａｐブラシを用いて）はＰａｐＳＥＥＫを用いて検出することができた。卵巣癌のかなりの割合（４５％はＴａｏブラシを用いて、３３％はＰａｐブラシを用いて）についても、ＰａｐＳＥＥＫを用いて検出することができた。ＰａｐＳＥＥＫの特異度は高く、Ｔａｏブラシ試料を用いて陽性と判定されたがんを有さない女性とＰａｐブラシ試料を用いて陽性と判定されたがんを有さない女性のうちのそれぞれ０％と１．４％のみであった（図２４）。血漿中のｃｔＤＮＡ用のアッセイをＰａｐブラシ試料に対するＰａｐＳＥＥＫと共に使用することが可能であり、それにより卵巣癌を検出するための感度が６３％に上昇することも示された。
早期ステージの卵巣癌を検出するための感度が末期ステージの疾患を検出するための感度と同程度に高かったこと（Ｔａｏで４７％対４４％、Ｐａｐで３４％対３３％）が注目に値した。理論に束縛されるものではないが、この予想外ではあるが魅惑的な発見に対する考えられる説明が少なくとも２つ存在している。第１に、一部の卵巣癌が卵管内に起源を有しており、それにより、腫瘍細胞が子宮腔内へと流れ出た場合にＰａｐＳＥＥＫによる卵巣癌の早期検出が促進され得ることが示されている。第２に、末期ステージの腫瘍においては、疾患部によって卵管が覆われて閉塞する場合が多く、それにより、子宮または子宮頸管内へと腫瘍細胞を通過させる導管として機能する可能性がより少なくなる。この状況においては、ＰａｐまたはＴａｏブラシ試料採取に血漿中のｃｔＤＮＡ解析を加えることは、特に有益となり得る。
本明細書において検査した試料のサブセットは、高悪性度の早期ステージのがんで構成されていた。現在利用可能な診断モダリティのこれらの病変に対する感度は低い（例えば、Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９２：１２１４－１２２１；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ４０：３３８－３４４；及びＨａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ９４：６４２－６４６を参照のこと）。高悪性度のサブタイプは偶発的な子宮内膜癌のうちの約１０％のみを含んでいるが、それらはその疾患による死亡の４０％超に相当している（例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ５４：２７８－２９１を参照のこと）。これら高悪性度のがんが多くの場合、萎縮性子宮内膜の背景から生じてイメージングで目に見える異常となる前に転移し得ることから、経腟超音波法はスクリーニング及び早期診断において限定的な役割を有している。それゆえ、Ｐａｐブラシ試料中の子宮内膜に閉じ込められた高悪性度の子宮内膜癌とＴａｏブラシ試料中の子宮内膜に閉じ込められた高悪性度の子宮内膜癌のうちのそれぞれ８５％（ｎ＝３４）と８９％（ｎ＝９）をＰａｐＳＥＥＫが検出したことは励みとなった。卵巣癌の場合には、検査を行ったコホートには少数の早期ステージの高悪性度症例のみが含まれており、これらのがんが多くの場合進行ステージにおいてのみ診断されるという残念な事実と一致していた。それでもなお、Ｐａｐ試料検査と血漿試料検査の組み合わせで３６％（ｎ＝１１）が陽性であり、Ｔａｏブラシ試料で８０％（ｎ＝５）が陽性であったという発見は注目に値する。
本明細書に記載の研究は後ろ向きであった。検査した試料は、かなりの割合は早期ステージの病変を有する患者に由来するものの、既知のがんを有する患者に由来していた。スクリーニング環境においては、がんはより早期のステージであることが有利であり得、検出感度は本研究において認められた早期ステージのがんにおける感度により近いことが期待され得る。更に、対照の年齢範囲及び症例は通常、本後ろ向き研究におけるよりも前向き研究においてより良好にマッチする。自身のＰａｐブラシ試料またはＴａｏブラシ試料中において検出可能な変異を有していた卵巣癌患者の一部は、自身の原発性腫瘍内には同一の変異を有していなかった。このことは、ブラシ試料中における少なくとも１つの変異が対応する原発性腫瘍内にほぼ常に（９７％）見つかることから、子宮内膜癌においては問題ではなかった。しかし、この現象は、卵巣癌患者、とりわけＴａｏブラシを用いた卵巣癌患者において観察された。Ｐａｐブラシ中において同定可能な少なくとも１つの変異は、対応する原発性卵巣腫瘍の７３％において同定可能であったが、その一方で、Ｔａｏブラシ試料の５３％においてのみ同一のことが当てはまった。
理論に束縛されるものではないが、同一患者に由来するブラシ試料中における変異と卵巣癌内における変異の間の不一致に対する１つの考えられる説明は、アッセイがインビボでは存在していない変異を検出しており、技術的なアーチファクトを示しているということである。しかしながら、アッセイの特異度ががんを有さない女性におけるＴａｏブラシ試料とＰａｐブラシ試料でそれぞれ１００％と９９％であったことを考慮すると、このことが可能性を有するとは考えられない。別の考えられる説明は腫瘍の不均一性である。解析を行った腫瘍のうちのわずか一部のみを採取及びシークエンスしており、パップスメアまたは子宮内試料中に存在する別の変異は腫瘍の別の部分に由来する変異を示す場合があった。一部の変異が、病理学者が気付かなかった小さな同時性子宮内膜癌または早期前がん性子宮内膜病変に由来していたということも考えられる。卵巣癌を有する女性のかなりの割合は、リンチ症候群、多嚢胞性卵巣症候群、周閉経期、肥満症、未経産、及び拮抗作用のないエストロゲン補充療法を含むリスク因子と共に、同時性子宮内膜癌を有している（例えば、Ａｌ Ｈｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２５：１０９－１１３；Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １０６：６９３－６９９；Ｚａｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８３：３５５－３６２；及びＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２４：５２０－５２７を参照のこと）。
腫瘍の不均一性または複数の同時性腫瘍が、リキッドバイオプシー検査における不一致を説明するのに多くの場合使用されるもっともらしい説明ではあるのだが、理論に束縛されるものではないが、非悪性細胞のクローン増殖が本観察結果に関与し得るということが考えられる。子宮洗浄液、骨髄、皮膚、及びその他の組織における腫瘍性とは考えられないクローン増殖について記載されている（例えば、Ｓｔｅｅｎｓｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｂｌｏｏｄ １２６：９－１６；Ｃｏｏｍｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２１（３）：３７４－３８２；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７：１２４８４；Ｋｒｉｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１３：６００５－６０１０；及びＮａｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ ＰＬｏＳ Ｍｅｄ １３：ｅ１００２２０６を参照のこと）。特に興味深いのは、時として、数百万人の女性に影響を及ぼす衰弱性の病気である、子宮内膜症の原因となる子宮内膜細胞のクローン増殖である。これらの病変（腹部の全体にわたり生じ得、子宮内膜に由来する）が、子宮内膜癌内において検出された同一の変異により駆動され得るクローン増殖であることが最近示されている（例えば、Ａｎｇｌｅｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６：１８３５－１８４８を参照のこと）。理論に束縛されるものではないが、卵巣癌の一因となるまたは卵巣癌に起因するホルモンの変化及び生理的変化が、子宮内膜の裏打ちにおけるこのようなクローン増殖を促進または選択するという可能性がある。一方で、この可能性は、全てのリキッドバイオプシーにおける概念上の基本原理である正確な特異度に対して反対の結論を示すものである。その一方で、大規模なクローン増殖が婦人科悪性腫瘍を有する女性にほぼ排他的に見つかる場合には、特異度を低下させることなく、卵巣癌の検出感度を実際に高めることができる。子宮内膜の裏打ちにおける総細胞数の＞０．０３％に相当するクローン増殖は、本明細書で提供する方法により検出可能である。
実施例５：がんスクリーニング検査の組み合わせアプローチを使用した泌尿器悪性腫瘍の検出
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙによれば、２０１７年の米国においてだけで、７９，０３０件の膀胱癌（ＢＣ）の新たな症例、及び１８，５４０件の死亡が発生すると推定されており（例えば、Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７ ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６７：７－３０を参照のこと）、多くのＢＣ患者は進行前に複数回の再発を経験するため、早期の検出及び治療を行うための十分なリードタイムが転移前に用意されている（例えば、Ｎｅｔｔｏ，２０１３ Ａｄｖ Ａｎａｔ Ｐａｔｈｏｌ ２０：１７５－２０３を参照のこと）。尿細胞診、及び経尿道的生検（ＴＵＲＢ）を伴う膀胱鏡検査は、膀胱癌の診断及びフォローアップのための現時点におけるゴールドスタンダードである。尿細胞診は高悪性度腫瘍の検出において価値を有しているが、低悪性度腫瘍の大部分については検出することができない（例えば、Ｎｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｕｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４３：６３－７６；Ｌｏｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｕｒｏｌｏｇｙ ６１：１０９－１８；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ １２４：５５２－５６４を参照のこと）。この事実は、膀胱鏡検査とＴＵＲＢの反復手順の高コストかつ侵襲的な性質と共に、スクリーニング及びサーベイランスのための、尿または血清をベースとした遺伝的アッセイ及びタンパク質アッセイを含む、新規の非侵襲的戦略の開発へと多大な努力を導いている（例えば、Ｋａｗａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ４０：１７８３－１７８９；Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２３：４１－４８；Ｓｋａｃｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ Ｕｒｏｌ １６９：２１０１－２１０５；Ｓａｒｏｓｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｊ Ｕｒｏｌ １７６：４４－４７；Ｍｏｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ５１：１２７５－８０；Ｆｒａｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃａｎ Ｊ Ｕｒｏｌ ４：４００－４０５；Ｙａｆｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３３：６６．ｅ２５－６６．ｅ３１；Ｓｅｒｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２９（１）：７８－８７；Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１６２－７１６７；Ｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ６５：３６７－３６９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ５：１２４２８－１２４３９；Ｒａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ ５１：２００－２３１；Ｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ １５：５０５－５１６；Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ４３６：９７－１０３；Ｇｏｏｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４７４６９；及びＡｌｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ６５：３６０－３６６を参照のこと）。現在利用可能なＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）承認済みアッセイとしては、ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ検査（Ｓｃｉｍｅｄｘ Ｃｏｒｐ）、核マトリックスタンパク質２２（ＮＭＰ２２）イムノアッセイ検査（Ｍａｔｒｉｔｅｃｈ）、及びｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ＦＩＳＨ（ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ）が挙げられる（例えば、Ｋａｗａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ４０：１７８３－１７８９；Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２３：４１－４８；Ｓｋａｃｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ Ｕｒｏｌ １６９：２１０１－２１０５；Ｓａｒｏｓｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｊ Ｕｒｏｌ １７６：４４－４７；Ｍｏｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ ５１：１２７５－８０；Ｆｒａｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃａｎ Ｊ Ｕｒｏｌ ４：４００－４０５；及びＹａｆｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３３：６６．ｅ２５－６６．ｅ３１を参照のこと）。これらの検査の一部において、６２％～６９％の感度及び７９％～８９％の特異度が報告されている。しかしながら、アッセイ性能のばらつき、コスト、または、必要とされる技術的専門知識ゆえに、このようなアッセイの日常的な臨床業務への導入はまだ行われていない。更に、尿細胞診の再発検出感度が比較的低いことから、米国におけるこのような患者に対しては３ヶ月毎に膀胱鏡検査が実施されており、これらの患者を管理するための合計コストは任意のその他のタイプのがんを管理するためのコストよりも高く、年間３０億ドルにのぼっている（例えば、Ｎｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４２：３８４－３９４を参照のこと）。
更に、欧米諸国におけるこれら上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）の年間発症率は１００，０００件あたり１～２症例であるが、アリストロキア酸（ＡＡ）に曝露された集団においては、はるかにより高い割合で生じている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０９（２１）：８２４１－８２４６；Ｇｒｏｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ，５４（１）：１－７；及びＬａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１０２（３）：１７９－１８６）。腎尿管切除術は、ＵＴＵＣを有する患者において、それが早期のステージで検出された場合に、治療力を有し得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ．５４（５）：１１２７－３４）。しかしながら、これらのがんは、明らかな臨床症状（典型的には血尿）が発症するまではほぼ無症候性であるため、結果として、ほとんどの患者は専ら進行ステージにおいて診断される（Ｒｏｕｐｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ．６８（５）：８６８－７９）。早期ステージＵＴＵＣを検出するための診断検査法は現在利用可能な状態ではない。
がん（例えば、ＢＣまたはＵＴＵＣなどの早期ステージのがん）の非侵襲的検出に広く適用できるアプローチが医学面と経済面の両方において重要となり得る。
本実施例ではＵｒｏＳＥＥＫと呼ばれる新規の血液検査について説明するが、ＵｒｏＳＥＥＫは上記の未解決の課題に対処するものである。本試験では、尿試料に由来するＤＮＡをアッセイ（例えば、ＰＣＲベースのマルチプレックス検査）に使用して、ＢＣまたはＵＴＵＣにおいて一般的に生じている遺伝的改変を同時に評価することができる。膀胱癌検査に使用したアプローチの概略図については図２５に記載し、ＵＴＵＣ検査に使用したアプローチの概略図については図３１に記載している。
物質及び方法
患者及び試料
Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ；Ａ．Ｃ．Ｃａｍａｒｇｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ；Ｏｓａｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ；及びＨａｃｅｔｔｅｐｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ａｎｋａｒａ，Ｔｕｒｋｅｙを含む４つの参加施設における患者から、先を見越して尿試料を採取した。本試験は、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ及び全てのその他の参加施設におけるｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓにより承認された。適切な物質移動合意書を得た。膀胱癌以外の悪性腫瘍の既知の病歴がある患者については本試験から除外した。本試験には患者の２つのコホートが含まれていた。
早期検出コホートには、血尿症状または下部尿路症状が原因で上記の病院のうちの１つにおける泌尿器科に紹介された５７０名の患者が含まれていた（表１８）。第２のコホート（３２２名の患者）は、膀胱癌（ＢＣ）の確定診断を以前に受けて疾患再発のサーベイランス中である患者を示している（サーベイランスコホート）。これらの患者の原発性腫瘍は、マルチプレックスアッセイまたはシングルプレックスアッセイにより評価した１１の遺伝子のうちの少なくとも１つに変異を有していた。早期検出コホートまたはサーベイランスコホートのそれぞれにおける偶発的な腫瘍または再発性腫瘍のエビデンスのない症例について、尿採取日から１２ヶ月間の最低限のフォローアップを必須とした。患者の来院中に実施される膀胱鏡検査などの任意の処置の前に尿試料を採取した。本試験では、２タイプの試料からなる合計で８９２点の尿試料について解析を行った。第１の試料タイプは、標準的なＢＤ ＳｕｒｅＰａｔｈ（商標）液状化検体細胞診プロトコル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）による処理後に残った尿中細胞であった。標準治療を見越し、同一試料の細胞診処理を繰り返す必要性が生じるあらゆる可能性を考慮して、残ったＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）液を６～８週間冷蔵保存してからＤＮＡ精製にかけた。第２の試料タイプは、バイオバンクに提供された新鮮な尿試料（１５～２５ｍＬの排尿された尿試料を４℃で最長６０分間保存してから遠心分離（５００ｇで１０分間）にかけて、－８０℃でペレットを保存してからＤＮＡ精製を行った）から構成されていた。平均年齢２６歳の１８８名の健康な個体に由来する尿も採取して、バイオバンクに提供された新鮮な尿試料と同様に処理した。
８９２症例のうちの４１３症例から経尿道的切除術（ＴＵＲＢ）または膀胱切除術によるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料を収集した。同一患者に由来する数種類の異なる腫瘍が利用可能であった場合（再発のため）、早期検出コホートには、尿試料の提供後に採取した最も早期の腫瘍組織を使用した。サーベイランスコホートでは、３２２名の患者のうちの１４６名における、尿試料の提供直前の腫瘍を使用した。その他１７６例のサーベイランス症例では、尿試料の提供後に採取した最も早期の組織を使用した。泌尿生殖器の病理学者が全ての組織スライドを精査して診断を確定し、その症例においてできるだけ高い腫瘍細胞充実度を有する代表的な腫瘍エリアを選択した。滅菌１６ゲージ針を用いて対応するＦＦＰＥブロックから円筒形標本を得た。他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１６２－７１６７を参照のこと）、腫瘍あたり１～３つの円筒形標本を得て、ＤＮＡ精製用の１．５ｍＬ滅菌チューブ内に入れた。電子医療記録を確認して全患者における病歴及びフォローアップデータを得た。
試験を行ったＵＴＵＣコホート
２０１２年～２０１６年にかけてＮａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて根治的な片側腎尿管切除術を順次受ける予定のあるＵＴＵＣを有する患者に本試験への参加を要請した。全ての患者から同意書を用いたインフォームドコンセントの提供を受け、試験デザインについては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＳｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓによる審査及び承認を受けた。肉眼的血尿を有する４名の患者及び同一性試験による腫瘍－尿のＤＮＡ不一致を有する１名の患者を除外した後に、合計で５６名のＵＴＵＣ患者を本試験に登録した。平均年齢４０歳（１９～６０歳の範囲）の米国の健康な個体により提供された１８８点の尿試料に由来する尿中細胞ＤＮＡを使用して、ＵｒｏＳＥＥＫ検査の特異度を評価した。米国出身の９４名の正常個体に由来する白血球（ＷＢＣ）ＤＮＡを使用して、ＰＣＲ解析の実用上の特異度を評価した。
生体試料－ＵＴＵＣコホート
外科手術の前日に患者から尿試料を採取した。室温で５８１ｇの遠心分離に１０分間かけて尿中細胞を単離してから、同一の遠心分離条件を使用して生理食塩水中で３回洗浄し、Ｑｉａｇｅｎキット＃９３７２５５（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用してＤＮＡを単離するまで冷凍保存した。他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０９（２１）：８２４１－８２４６；及びＪｅｌａｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．８１（６）：５５９－６７を参照のこと）、標準的なフェノール－クロロホルム抽出法を用いて上部尿路腫瘍と腎皮質の新鮮凍結切除試料からＤＮＡを精製した。患者あたり１つの上部尿路腫瘍を解析したが、複数の部位に腫瘍を有する症例については、利用可能な場合は常に骨盤腫瘍を優先的に選択した。泌尿器の病理学者がホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料をステージ分類及び等級付けし、それぞれの登録対象における組織変化により１つまたは複数の上部尿路上皮癌の存在を確認した。それぞれの対象のカルテを精査することにより関連する臨床データ及び人口統計データを得た。ＭＤＲＤ式でｅＧＦＲを計算し（例えば、Ｌｅｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１４５（４）：２４７－５４を参照のこと）、そのｅＧＦＲを使用してＣＫＤステージを判定した（例えば、Ｌｅｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．６７（６）：２０８９－１００を参照のこと）。
ＤＮＡ付加体の解析
他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１２ ２５（５）：１１１９－３１を参照のこと）、線形四重極イオントラップ質量分析計を備えた超高速液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化／マルチステージ質量分析計（ＵＰＬＣ－ＥＳＩ／ＭＳｎ）（ＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、ＵＴＵＣ患者の正常腎皮質に由来する２μｇのＤＮＡにおけるＡＬ－ＤＮＡ付加体（７－（デオキシアデノシン－Ｎ６－イル）アリストラクタムＩ；ｄＡ－ＡＬ－Ｉ）レベルを定量した。
変異の解析
３つの独立したアッセイを使用して尿中細胞ＤＮＡにおける異常を検索した。第１に、マルチプレックスＰＣＲを使用して、泌尿器悪性腫瘍において一般的に変異している１０の遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、及びＶＨＬの領域内における変異を検出した（例えば、Ｎｅｔｔｏ，２０１１ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｕｒｏｌ ９：４１－５１；Ｍｏ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：３１４－３２５；Ｓａｒｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８５：５３－５９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２８：５９７－６０２；Ｓａｒｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ Ｕｒｏｌ １５２：３８８－３９２；Ｓａｒｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １３：１３８４－１３９０；Ｗｕ，２００５ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５：７１３－７２５；及びＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，２０１４ Ｎａｔｕｒｅ ５０７：３１５－３２２を参照のこと）。このマルチプレックスＰＣＲに使用するプライマーペアを、それぞれが非重複アンプリコンを含有する合計で３回のマルチプレックス反応に分割した（以下を参照のこと）。これらのプライマーを使用して、初期増幅に１５サイクルを使用した以外は他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）、２５μＬ反応液中でＤＮＡを増幅した。第２に、ＴＥＲＴプロモーター領域を評価した。単一の増幅用プライマーを使用して、ＢＣにおいて変異を有することが知られているＴＥＲＴプロモーターの領域を含有する７３ｂｐのセグメントを増幅した（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１６２－７１６７を参照のこと）。そのセグメントを増幅するのに使用した条件は、ＨＦバッファーの代わりにＰｈｕｓｉｏｎ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して初期増幅に２０サイクルを使用した以外は、上記のマルチプレックス反応に使用した条件と同一であった。前者の高いＧＣ含有量ゆえに、ＴＥＲＴプロモーター領域をマルチプレックスＰＣＲに含ませることはできなかった。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）でＰＣＲ産物を精製してから、精製ＰＣＲ産物（マルチプレックス）のうちの０．２５％またはＰＣＲ産物（ＴＥＲＴシングルプレックス）のうちの０．０１２５％を、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｅｌｉｆｅ ５：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１５１７５を参照のこと）ＰＣＲの第２ラウンドで増幅した。次に、第２ラウンドの増幅に由来するＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅで精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ装置上でシークエンスした。同定したそれぞれの変異について、変異を有する固有に識別されたリードの数を固有に識別されたリードの総数で割ることにより変異アレル頻度（ＭＡＦ）を求めた（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）。ＴＥＲＴプロモーターアッセイとマルチプレックスアッセイの両方におけるそれぞれのＤＮＡ試料を２回の独立したＰＣＲで評価し、両方のＰＣＲが同一の変異を示した場合にのみ試料を陽性とスコア付けした。表１９、表２０、表２２及び表２３に列挙した変異アレル頻度及びＵＩＤの数は、２つの独立したアッセイの平均を意味している。
推定上の変異の統計的有意性を評価するために、１８８名の非血縁正常個体の白血球に由来するＤＮＡを評価した。がん患者に由来する試料において認められた変異型を、正常ＷＢＣにおいて認められたＭＡＦよりもはるかに高いＭＡＦで認められた場合においてのみ変異とスコア付けした。具体的には、試料のｃｔＤＮＡステータスの分類は、それぞれの変異に適用される２つの相補的な基準、１）目的の試料における平均ＭＡＦと対照のセットにおける同一変異に認められた対応する最大ＭＡＦの間の差異、及び、２）目的の試料におけるＭＡＦと正常対照の分布を比較することにより得られたＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコア、を基準とした。Ｚスコアを計算するために、全対照間に認められたＭＡＦの変異特異的分布に基づいて、目的の試料におけるＭＡＦを最初に正規化した。この変異特異的正規化に続き、それぞれのウェルにおけるそれぞれの変異のＭＡＦを、全ての変異が含まれる正常対照から構築したＭＡＦの基準分布と比較することにより、ｐ値を得た。次に、ウェルにおけるＵＩＤの数で重み付けした２つのウェルのｐ値からＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコアを計算した。試料の変異における差異またはＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコアのいずれかが正常ＷＢＣにより決定された閾値超であった場合に、その試料を陽性に分類した。差分パラメータの閾値を、任意の正常ＷＢＣに認められた最大ＭＡＦと定義した。検査を行った１８８点の正常尿試料の中で１点が偽陽性となるようにＳｔｏｕｆｆｅｒＺスコアの閾値を選択した。
異数性の解析
ゲノム全体に散在する約３８，０００遺伝子座を増幅するのに一対のプライマーペアを使用するＦａｓｔ－ＳｅｑＳ（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４１１６２を参照のこと）を用いて異数性を評価した。超並列シークエンシング後に、特注の統計学習法を使用して、アッセイがカバーする３９の染色体腕のそれぞれにおける獲得または喪失を同定した。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して異数性試料と正倍数性試料を識別した。腫瘍細胞割合の低い３１５０点の合成異数性試料及び６７７点の正倍数性末梢白血球（ＷＢＣ）試料を使用してＳＶＭを訓練した。ゲノムワイド異数性スコアが＞０．７であり、染色体腕に少なくとも１つの獲得または喪失が存在していた場合に、試料を陽性とスコア付けした。
同一性の検査
マルチプレックスＰＣＲについて前述した増幅条件を使用して、１０番染色体及び２０番染色体上の３１の一般的なＳＮＰを検出する２６のプライマーを含有するマルチプレックス反応を実施した。この同一性評価に使用したプライマーについては、膀胱癌コホート用に図３４（表４２）、及び、ＵＴＵＣコホート用に図３３（表４１）に列挙している。
統計解析
ＭｅｄＣａｌｃ統計ソフトウェア（ｍｅｄｃａｌｃ．ｏｒｇ／ｃａｌｃ／ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ＿ｔｅｓｔ．ｐｈｐ）を使用して、尿細胞診、ＵｒｏＳＥＥＫ、及びＵｒｏＳＥＥＫの３つの構成要素における性能特性を計算した。
結果
早期検出コホートの特性
本試験において評価した患者の数及び主な結果を示すフローチャートを図２６に記載している。
合計５７０名の患者を早期検出コホートに組み込み、それぞれの患者につき１点の尿試料を解析した。患者の９０％は血尿を有し、３％は下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を有し、９％は自身にＢＣのリスクがあることを示唆するその他の適応症を有していた。参加者の中央年齢は５８歳（５～８９の範囲）であった（表１８）。患者の７０％は男性であった。１８ヶ月間の中央フォローアップ期間（０～４０ヶ月間の範囲）後に、１７５名（３１％）の患者がＢＣを発症した。ＢＣを発症したそれぞれの患者のために、フォローアップ期間中に類似症状を示したがＢＣを発症しなかった２名のその他の患者を選択した。そのため、デザイン上、このコホートにおいてＢＣを発症している症例の割合は、標準的な診療ではＢＣを発症している可能性のある類似症状を有する患者の割合（５％）よりも高かった。５７０名の患者において発症している腫瘍の特性については以下にまとめている。
早期検出コホートにおける人口統計特性、臨床特性、及び遺伝的特性
Figure 2023075090000062


Figure 2023075090000063


Figure 2023075090000064


＊細胞診は症例のサブセットにおいてのみ利用可能であった。
Ｎ／Ａは該当なしである。
膀胱癌コホートにおける遺伝子解析。
ＢＣに由来する尿中細胞内に存在し得る遺伝子異常について、３つの独立した検査を実施した（図２６）。第１に、尿路上皮腫瘍において頻繁に改変されていることが判明している１０の遺伝子の選択領域における変異を評価した（表１９）。この目的のために、尿中細胞のわずか０．０３％における変異の検出を可能とする特定のプライマーセットを設計した。このような低い変異割合を検出する能力は、プライマーのそれぞれに分子バーコードを組み込むことにより、超並列シークエンシングに関連するアーチファクトを大幅に減少させた結果によるものであった。第２に、ＴＥＲＴプロモーター変異を評価した。ＴＥＲＴプロモーターの異常に高いＧＣ含有量がマルチプレックスＰＣＲ設計へのＴＥＲＴプロモーターの組み込みを妨げたことから、この解析にはシングルプレックスＰＣＲを使用した。第３に、シングルＰＣＲを用いて長鎖散在反復配列－１（Ｌ１レトロトランスポゾン、ＬＩＮＥとも呼ばれる）のサブファミリーの約３８，０００のメンバーを共増幅する技術を使用して、異数性の度合いを評価した。Ｌ１レトロトランスポゾンは、その他のヒト反復と同様に、レトロ転移によりゲノム全体に散在しており、３９の非末端動原体型常染色体腕上全てに存在している。
マルチプレックスアッセイでは、本試験中にＢＣを発症した個体に由来する１７５点の尿中細胞試料のうちの６８％（９５％ＣＩ、６１％～７５％）において変異を検出した（表１９）。１０の標的遺伝子のうちの８つにおいて合計で２４６の変異が検出された（図２７Ａ及び表１９）。検出可能な変異を含む尿中細胞における平均変異アレル頻度は１８％であり、０．１７％～９９％の範囲であった。最も一般的に改変されている遺伝子は、ＴＰ５３（総変異の４５％）及びＦＧＦＲ３（総変異の２０％、図２７Ａ）であった。使用した閾値において、本試験中にＢＣを発症しなかった早期検出コホートにおける３９５名の患者のうちの１．７％は、１０の遺伝子のいずれかに検出可能な変異を有していた。同一の閾値において、健康な個体に由来する１８８点の尿中細胞試料のいずれも、アッセイした１０の遺伝子のいずれかに何ら変異を有していなかった（１００％の特異度、９５％ＣＩ、９８％～１００％）。
試験期間中にがんを発症した患者に由来する１７５点の尿中細胞試料のうちの５７％（９５％ＣＩ、４９％～６４％、表２０）において、ＴＥＲＴプロモーター内における変異が検出された。尿中細胞における平均ＴＥＲＴ変異アレル頻度は１４％であり、０．１８％～７８％の範囲であった。３つの位置で変異が検出されたが、それら変異の９８％が、それぞれが転写開始部位の６６ｂｐ上流と８８ｂｐ上流であるｈｇ１２９５２２８（７９％）とｈｇ１２９５２５０（１９％）におけるものであった。これらの位置がＴＥＲＴの適切な転写制御に関与しているということは以前から分かっている。詳細には、変異アレルがＧＡＢＰＡ／Ｂ１転写因子をリクルートし、活性クロマチンのＨ３Ｋ４ｍｅ２／３マークをもたらし、正常細胞内に存在するエピジェネティックサイレンシングを逆転させる。本試験中にＢＣを発症しなかったこのコホートにおける３９５名の患者のうちの４％は、ＴＥＲＴプロモーター内に検出可能な変異を有していた。健康な個体に由来する１８８点の尿試料のうちの１点のみがＴＥＲＴプロモーター変異を有していた。
本試験中にＢＣを発症した患者に由来する１７５点の尿中細胞試料のうちの４６％（９５％ＣＩ、３９％～５４％）において異数性が検出された（表２０及び表２１）。最も一般的に改変されている腕は５ｑ、８ｑ、及び９ｐであった。これら３つの腕全ては、ＢＣを含む多くのがんにおいてコピー数改変を生じさせることが判明している周知のがん遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を有している。本試験中にＢＣを発症しなかった３９５名の患者に由来する尿中細胞試料のうちの１．５％は異数性を示した。同一の技術を用いて評価した際、健康な個体に由来する１８８点の尿試料のいずれもが異数性を示さなかった。
原発性腫瘍との比較
本コホートに登録された患者のうちの１０２名に由来する腫瘍試料が比較用に利用可能であり、尿中細胞試料を検査するのに使用したものと同一の３つのアッセイを用いてそれら腫瘍試料の検査を行った（表２０）。これら１０２のがんのうちの９１（８９％）において、検査した１１の遺伝子内における少なくとも１つの変異が変異していた（１０遺伝子パネル中またはＴＥＲＴプロモーター内）。更に、これら１０２名の患者に由来する尿試料中において同定された変異のうちの少なくとも１つは、対応するＢＣの８３％においても同定された（表１９及び表２０）。ＢＣの解析はまた、「偽陰性」（すなわち、ＢＣを発症した患者に由来する尿試料の２１％が検査した１１の遺伝子内に検出可能な変異を有していなかったことの原因）の基本原理を明らかにする。その原因は、対応するＢＣがこれら１１の遺伝子内に変異を有していなかった、または、変異を有してはいたが尿試料中における腫瘍細胞の割合が使用したアッセイでそれの検出を可能とするのに十分高くなかった、のいずれかであった場合がある。原発性腫瘍の６２％における１１の遺伝子のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つの変異が、変異尿検査の偽陰性を示す患者から同定された（表２２及び表２３）。この結果は、変異検査の２９の偽陰性のうちの３８％が検索した変異のいずれもが腫瘍内に存在しなかったという事実によるものであり、偽陰性のうちのその他の６２％が尿中における不十分な量のがん細胞によるものであった、ということを示している。
ＵｒｏＳＥＥＫ：バイオマーカーの組み合わせ。
上記のとおり、１０遺伝子マルチプレックスアッセイ、ＴＥＲＴシングルプレックスアッセイ及び異数性アッセイはそれぞれ、別々に使用した際に、６８％、５７％及び４６％の感度をもたらした（表１９、表２０及び表２１）。ＴＥＲＴプロモーター変異を含まない４５点の試料は、その他の１０の遺伝子のうちの１つにおける変異により検出され得た（図２８Ａ及び表１９）。逆に、マルチプレックスアッセイを用いて検出可能な変異を含まない３５点の試料は、ＴＥＲＴプロモーター変異により検出され得た（図２８Ａ及び表２０）。１１の遺伝子内に検出可能な変異を何ら含まない尿中細胞試料のうちの１０点は、異数性のアッセイにより検出され得た（図２８Ａ及び表２１）。それゆえ、３つのアッセイを同時に使用（「ＵｒｏＳＥＥＫ」と呼ばれる検査）した場合、いずれかのアッセイにおける陽性結果が試料を陽性とスコア付けするのに十分であった場合、感度は８３％（９５％ＣＩ、７６％～８８％）に上昇した。健康な個体に由来する１８８点の試料のうちの１点のみがＵｒｏＳＥＥＫにより陽性とスコア付けされた（特異度９９．５％、ＣＩ、９７％～１００％）。本試験中にＢＣを発症しなかったこのコホートにおける３９５名の患者のうちの２６名（６．５％）は、ＵｒｏＳＥＥＫ検査により陽性とスコア付けされた（特異度９３％、ＣＩ、９１％～９６％）。平均すると、ＵｒｏＳＥＥＫの陽性はＢＣの診断よりも２．３ヶ月先行しており、８症例においては１年超先行していた（図２９Ａ及び表１８）。
ＵｒｏＳＥＥＫ＋細胞診
細胞診検査とＵｒｏＳＥＥＫ検査の両方が非侵襲的であり同一の尿試料に対して実施可能であることから、それらの組み合わせ性能を評価した。早期検出コホートには細胞診が利用可能な３４７名の患者がいた（表１８）。生検で判明したがんを発症したこのコホートにおける４０名の患者のうち、１７名は細胞診により陽性であった（４３％の感度）。がんを発症しなかった２９９名の患者のいずれもが、細胞診により陽性ではなかった（１００％の特異度）。自身の尿が細胞診により陽性であった１７名のがん患者の１００％、及び、自身の尿が細胞診により陰性であった２３名のがん患者の９５％において、ＵｒｏＳＥＥＫは陽性であった。それゆえ、組み合わせると、ＵｒｏＳＥＥＫ＋細胞診は９５％（９５％ＣＩ、８３％～９９％）の感度をもたらし、それは、ＵｒｏＳＥＥＫと比較して１２％の上昇、細胞診と比較して５２％の上昇であった。本試験中にＢＣを発症しなかった早期検出コホートにおける２９９名の患者のうちの２０名（６．６％）はＵｒｏＳＥＥＫまたは細胞診により陽性であり、ＵｒｏＳＥＥＫと細胞診の組み合わせにより９３％（９５％ＣＩ、９０％～９６％）の特異度がもたらされた。
サーベイランスコホートの特性
サーベイランスにおける戦略は、早期検出において使用した戦略とは異なっていた。治療及び診断のためにＢＣを外科的に切除した患者は通常、利用可能な腫瘍組織を有しており、このような腫瘍のほとんどにおいて変異が同定され得る。例えば、１１の検索遺伝子のうちの少なくとも１つにおける変異が評価したＢＣのうちの９５．２％に存在していたことが本試験中に判明した。サーベイランス試験用に選択された全ての患者は、生検で確定したＢＣを有しており、術後０～５年に採取された尿試料を有していた。尿を提供し、解析した１１の遺伝子のうちの少なくとも１つにおける変異が自身のＢＣに含まれている合計３２２名の患者を評価した。ＢＣの外科的切除後比較的短時間に採取された単一の尿試料が、これら３２２名の患者における後々の再発により立証される残存病変を明らかにし得るかどうかを確認した。３２２名の患者のうちの１８７名（５８％）が、１０．７ヶ月間の中央フォローアップ期間（０～５１ヶ月間の範囲）後に臨床的に明らかなＢＣを発症した。これらの患者の組織病理学的タイプ及び腫瘍ステージについては、以下にまとめており、表２４に詳細に記載している。参加者の中央年齢は６２歳（２０～９３歳の範囲）であった。ＢＣの人口統計から予測されたとおり、患者の７５％は男性であった。
サーベイランスコホートにおける人口統計特性、臨床特性、及び遺伝的特性
Figure 2023075090000065


Figure 2023075090000066


Figure 2023075090000067


＊細胞診は症例のサブセットにおいてのみ利用可能であった。
Ｎ／Ａは該当なしである。
サーベイランスコホートの遺伝子解析
尿中細胞を用いたマルチプレックスアッセイでは、試験期間中に再発性ＢＣを発症した患者に由来する尿中細胞試料のうちの４９％（９５％ＣＩ、４５％～６０％、表２４及び表２５）における変異を検出した。検出可能な変異を含む尿中細胞における平均変異アレル頻度は１６％であり、０．０８％～９３％の範囲であった。最も一般的に改変されている遺伝子は、ＦＧＦＲ３（１３４変異の４３％）及びＴＰ５３（１３４変異の３０％、図２７Ｂ）であった。本試験中に再発性ＢＣを発症しなかった１３５名の患者のうちの７％は、自身の尿中細胞試料中に検出可能な変異を有していた（これらは偽陽性であると考えられるが、考察を参照のこと）。マルチプレックスアッセイ検査陽性と再発性ＢＣの診断の間の平均期間は７ヶ月間（０～５１ヶ月間の範囲）であった。
試験期間中に再発性ＢＣを発症した患者に由来する尿中細胞試料のうちの５１％（９５％ＣＩ、４４％～５８％、表２６）において、ＴＥＲＴプロモーター内における変異が検出された。検出可能な変異を含む尿中細胞における平均ＴＥＲＴ変異アレル頻度は６％であり、０．２３％～４３％の範囲であった。早期検出コホートの尿中細胞内において認められた位置と同一の３つの位置に変異が検出された。本試験中に再発性ＢＣを発症しなかった１３５名の患者のうちの１０％（９５％ＣＩ、８３％～９４％）は、自身の尿試料中に検出可能なＴＥＲＴプロモーター変異を有していた（偽陽性）。ＴＥＲＴ検査陽性と再発性ＢＣの診断の間の平均期間は７ヶ月間（０～４０ヶ月間の範囲）であった。
本試験中に再発性ＢＣを発症した患者に由来する尿中細胞試料のうちの３０％（９５％ＣＩ、２４％～３７％）において異数性が検出された（表２７）。最も一般的に改変されている腕は、早期検出コホートと同様に８ｐ、８ｑ、及び９ｐであった。本試験中に再発性ＢＣを発症しなかった１３５名の患者のうちの２％は、自身の尿中細胞試料のうちの少なくとも１点に異数性を示した。
マーカーの組み合わせ－サーベイランスコホート
上記のとおり、１０遺伝子マルチプレックスアッセイ、ＴＥＲＴシングルプレックスアッセイ及び異数性アッセイはそれぞれ、別々に使用した際に、４９％、５１％及び３０％の感度をもたらした（表２５、表２６及び表２７）。ＴＥＲＴプロモーター変異を含まない３２点の試料は、その他の１０の遺伝子のうちの１つにおける変異により検出され得た（図２８Ｂ及び表２５）。逆に、マルチプレックスアッセイを用いて検出可能な変異を含まない４１点の試料は、ＴＥＲＴプロモーター変異により検出され得た。検出可能な変異を何ら含まない尿中細胞試料のうちの３点は、異数性のアッセイにより検出され得た。それゆえ、ＵｒｏＳＥＥＫの感度は６６％（９５％ＣＩ、５９％～７３％）であった。本試験中にＢＣを発症しなかったこのコホートにおける１３５名の患者のうちの１４％は、ＵｒｏＳＥＥＫ検査により陽性とスコア付けされ、８６％（９５％ＣＩ、７７％～９１％）の特異度がもたらされた。平均すると、ＵｒｏＳＥＥＫの陽性はＢＣの診断よりも７ヶ月先行しており、４７症例においては１年超先行していた（図２９Ｂ及び表２４）。
サーベイランスコホートには細胞診が利用可能な１９６名の患者がいた（表２４）。再発性ＢＣを発症したこのコホートにおける１２０名の患者のうち、３０名（２５％）は細胞診により陽性であった。逆に、自身の腫瘍が再発しなかった患者においては、細胞診の陽性結果は認められなかった。自身の尿が細胞診により陽性であった再発性ＢＣ患者の９０％、及び、自身の尿が細胞診により陰性であった９０名の再発性ＢＣ患者の６１％において、ＵｒｏＳＥＥＫは陽性であった。それゆえ、組み合わせると、ＵｒｏＳＥＥＫ＋細胞診は７１％（９５％ＣＩ、６１．８４％～７８．７７）の感度をもたらした（図２８Ｄ及び表２２）。本試験中に再発性ＢＣを発症せずに細胞診が利用可能であった７６名の患者のうちの１８％は、細胞診またはＵｒｏＳＥＥＫのいずれかにより陽性とスコア付けされ、８２％（９５％ＣＩ、７１％～９０％）の特異度がもたらされた。
早期検出コホートとサーベイランスコホートの両方における低悪性度尿路上皮腫瘍対高悪性度尿路上皮腫瘍
細胞診と比較したＵｒｏＳＥＥＫの優位性は、とりわけ低悪性度腫瘍（低悪性度の乳頭尿路上皮腫瘍及び非浸潤性低悪性度乳頭尿路上皮癌）において明らかであった。本試験において評価した細胞診が利用可能な合計で４９の低悪性度腫瘍（６つは早期検出コホート由来であり、４３はサーベイランスコホート由来である）が存在した。これらの低悪性度腫瘍のいずれも細胞診により検出されなかった（０％の感度、９５％ＣＩ、０．０％～６．７％）。それに対し、ＵｒｏＳＥＥＫでは、低悪性度腫瘍の６７％（９５％ＣＩ、５１％～８１％）（両コホートにおいて同率の６７％、図３０）が検出された。同様に、本試験において評価した細胞診が利用可能な合計で１０２の高悪性度腫瘍（尿路上皮内癌、非浸潤性高悪性度乳頭尿路上皮癌、または、浸潤性高悪性度尿路上皮癌）（３４は早期検出コホート由来であり、６８はサーベイランスコホート由来である）が存在した。これらの患者の４５％（早期検出コホートとサーベイランスコホートにおいてそれぞれ５０％と４１％）において細胞診が陽性であった一方、これらの患者の８０％（早期検出コホートとサーベイランスコホートにおいてそれぞれ１００％と７１％）においてＵｒｏＳＥＥＫが陽性であったが、以下を参照されたい。
細胞診対ＵｒｏＳＥＥＫにおける性能の一覧。

Figure 2023075090000068

ＵＴＵＣコホートの特性
３９～８５歳の年齢範囲の３２名の女性と２４名の男性が本試験に参加した（以下を参照のこと。個体のデータについては表２８を参照のこと）。この性別分布（男性が優勢を占めている、欧米諸国における不規則なＵＴＵＣ患者）（Ｓｈａｒｉａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ．２９（４）：４８１－６）は、ＡＡへの曝露が知られている台湾の個体における以前の疫学的研究（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０９（２１）：８２４１－８２４６を参照のこと）と一致している。このコホートの１８％（全て男性）によるタバコの使用が報告された。推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）の値を基準とすると、対象の４５％における腎機能は低下しておらず（慢性腎臓病（ＣＫＤ）ステージ０～２）、その一方で、コホートのそれぞれ４３％と１２％において軽度から中程度の腎疾患（ＣＫＤステージ３）または重度の疾患（ＣＫＤステージ４～５）が認められた。
ＵｒｏＳＥＥＫ結果毎に分類したＵＴＵＣコホートにおける人口統計特性、臨床特性、及び遺伝的特性。
Figure 2023075090000069


Figure 2023075090000070


Figure 2023075090000071

大部分の症例において腫瘍が上部尿路に沿った単一の部位に限定していた（３８％は腎盂、３９％は尿管）一方で、患者の２３％において腎盂と尿管の両方に影響を及ぼす多巣性腫瘍が発生していた。同時性膀胱癌（腎尿管切除術前の３ヶ月間以内に診断された）は３８％に存在していた。組織学的には、腫瘍の８９％は高悪性度に分類され、大部分は筋肉浸潤性に分類された（Ｔ２～Ｔ４、６６％）。
変異の解析－ＵＴＵＣコホート
ＵＴＵＣに由来する尿中細胞内に存在し得る遺伝子異常について、３つの独立した検査を実施した（図３２、表２９、表３０、表３１、及び表３３）。第１に、泌尿器腫瘍において頻繁に改変されている１０の遺伝子（ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ３、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、及びＶＨＬ）（Ｓｆａｋｉａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）の選択エキソン領域における変異を評価した。この目的のために、尿中細胞のわずか０．０３％における変異の検出を可能とする特定のマルチプレックスプライマーセットを設計した（表４０）。このような低い変異割合を検出する能力は、プライマーのそれぞれに分子バーコードを組み込むことにより、超並列シークエンシングに関連するアーチファクトを大幅に減少させた結果によるものであった。第２に、ＴＥＲＴプロモーター変異が多くの場合ＵＴＵＣに存在しているという先行エビデンスに基づいて、ＴＥＲＴプロモーター変異を評価した。ＴＥＲＴプロモーターの異常に高いＧＣ含有量がマルチプレックスＰＣＲ設計へのＴＥＲＴプロモーターの組み込みを妨げたことから、この解析にはシングルプレックスＰＣＲを使用した。第３に、シングルＰＣＲを用いて長鎖散在反復配列－１（Ｌ１レトロトランスポゾン）のサブファミリーの約３８，０００のメンバーを共増幅する技術を使用して、異数性の度合いを評価した。Ｌ１レトロトランスポゾンは、その他のヒト反復と同様に、レトロ転移によりゲノム全体に散在しており、３９の非末端動原体型常染色体腕上全てに存在している。
マルチプレックスアッセイでは、ＵＴＵＣ患者に由来する５６点の尿中細胞試料のうちの３６点（６４％、９５％ＣＩ、５１％～７６％）において変異を検出した（表２９）。１０の標的遺伝子のうちの９つにおいて合計で５７の変異が検出された（図３４）。尿中細胞における中央変異アレル頻度（ＭＡＦ）は５．６％であり、０．３％～８０％の範囲であった。最も一般的に改変されている遺伝子は、ＴＰ５３（５７変異の５８％）及びＦＧＦＲ３（５７変異の１６％）（表１８）であった。健康な個体に由来する１８８点の尿中細胞試料のいずれも、アッセイした１０の遺伝子のいずれかに検出可能な変異を有していなかった（１００％の特異度、ＣＩ、９７．５％～１００％）。
ＵＴＵＣ患者に由来する５６点の尿中細胞試料のうちの１６点（２９％、９５％ＣＩ、１８％～４２％）においてＴＥＲＴプロモーター内の変異が検出された（表３０）。尿中細胞における中央ＴＥＲＴ ＭＡＦは２．２２％であり、０．５９％～４６．３％の範囲であった。健康な個体に由来する１８８点の尿試料のうちの１点が変異（０．３９％のＭＡＦを有するＴＥＲＴ ｇ．１２９５２５０Ｃ＞Ｔ）を有していた。ＵＴＵＣ尿中細胞試料では３つの位置で変異が検出されたが、変異の９４％が、それぞれが転写開始部位の６９ｂｐ上流と９１ｂｐ上流であるｈｇ１２９５２２８（６７％）とｈｇ１２９５２５０（２８％）におけるものであった。これらの位置がＴＥＲＴの適切な転写制御に関与しているということは以前から分かっている。詳細には、変異アレルがＧＡＢＰＡ／Ｂ１転写因子をリクルートし、活性クロマチンのＨ３Ｋ４ｍｅ２／３マークをもたらし、正常細胞内に存在するエピジェネティックサイレンシングを逆転させる。
ＵＴＵＣコホートにおけるアリストロキア酸曝露
アリストロキア酸の活性化代謝産物はｄＡを優先的にプリン塩基内の環外アミノ基に共有結合し、特徴的なＡ＞Ｔ塩基転換をもたらす。コホートにおける個体がＡＡに曝露されていたかどうかを確認するために、質量分析計を使用して腎皮質ＤＮＡ付加体を定量した。５６名の患者のうちの２名を除く全員が、１０８ヌクレオチドあたり０．４～６８のｄＡ－ＡＬ付加体の範囲のレベルで、検出可能なアリストラクタム（ＡＬ）－ＤＮＡ付加体を有していた。更に、ＡＡに関連するＡ＞Ｔシグネチャー変異が、尿中細胞内に存在するＴＰ５３（１８／３２ Ａ＞Ｔ）とＨＲＡＳ（２／２ Ａ＞Ｔ）の変異スペクトルに多く示された（表３０）。
ＵＴＵＣコホートにおける異数性の解析
ＵＴＵＣ患者に由来する５６点の尿中細胞試料のうちの２２点（３９％、９５％ＣＩ、２８％～５２％、表３１及び図３３）において異数性が検出されたが、健康な個体に由来する１８８点の尿中細胞試料のいずれにおいても異数性は検出されなかった。最も一般的に改変されている腕は１ｑ、７ｑ、８ｑ、１７ｐ、及び１８ｑであった。これらの腕の一部は、多くのがんにおいてコピー数の変化を生じさせることが判明している周知の腫瘍がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を有している（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
原発性腫瘍との比較－ＵＴＵＣコホート
本試験に登録された全５６名の患者に由来する腫瘍試料が比較用に利用可能であり、尿中細胞試料を解析するのに使用したものと同一の３つのアッセイを用いてそれら腫瘍試料の検査を行った。この比較は２つの目的に貢献した。第１に、この比較は、尿中細胞内において同定された変異が同一患者由来の利用可能な腫瘍標本に由来するかどうかを確認することを可能とした。変異が尿中細胞内において同定され得るＵＴＵＣ症例が合計で３９例あった。これら３９例のうちの３５例（９０％）において、尿試料中において同定された変異（表２９及び表３０）のうちの少なくとも１つは、対応する腫瘍ＤＮＡ試料中においても同定された（表３２及び表３３）。尿中細胞内において同定された８０の変異全てを考察すると、６３（７９％）は対応する腫瘍試料中において同定された（表３２及び表３３）。３つのアッセイのいずれかにおける尿試料と腫瘍試料の間の不一致は、たとえ解剖学的に異なる２つ以上の腫瘍が臨床的に明らかな場合が多かったとしても患者あたり１つの腫瘍のみが入手可能であったという事実により説明され得る。加えて、それぞれの腫瘍に由来する１片の組織のみからＤＮＡを抽出したが、腫瘍内不均一性が不一致の一部に影響を及ぼしている場合があった。
ＵＴＵＣ患者に由来する５６点の尿中細胞試料のうちの１７点がなぜ検出可能な変異を含有していなかったのかを確認するために腫瘍データが役立った。その原因は、原発性腫瘍が遺伝子パネル中に存在する変異を有していなかった、または、原発性腫瘍がこのような変異を実際に有してはいたが尿試料中における腫瘍細胞の割合がその検出を可能とするのに十分高くなかった、のいずれかであった場合がある。原発性腫瘍試料の評価から、検出可能な変異を含まない１７点の尿試料のうちの４点（２４％）が、自身の腫瘍が検索変異（表３２）のいずれをも含有していない患者に由来していることが見出された。変異検査の失敗の主な理由が尿中における不十分な数のがん細胞であるということが結論であり、この理由が１７の失敗のうちの１３（７６％）に相当した。
尿中細胞試料中において異数性が認められたのは２２症例であった。総合的に言えば、尿中細胞内において認められた染色体の獲得または喪失のうちの９６％が、原発性腫瘍内においても認められた（図３５中の例）。逆に、尿中細胞試料中において異数性が認められなかったのは３４症例であった。同一のアッセイを用いて５６の腫瘍を評価すると、３つを除く全てが異数性であることが判明したが、変異と場合と同様に、異数性アッセイの失敗の主な理由は尿中細胞内における不十分な量の腫瘍ＤＮＡであった。
バイオマーカーの組み合わせ－ＵＴＵＣコホート
遺伝子をベースとしたバイオマーカーに対する感度を制限し得る要因は２つある。第１に、アッセイで検出するのに十分な数の腫瘍細胞に由来するＤＮＡを試料が含有する場合においてのみ、その試料がバイオマーカーに対して陽性とスコア付けされ得る。第２に、そこから腫瘍細胞を得る腫瘍は、検索される遺伝的改変を有していなければならない。組み合わせアッセイでは、より多くの遺伝的改変を評価することにより感度を上昇させることができ、その結果、腫瘍内に存在する少なくとも１つの遺伝的改変を検出する可能性がより高くなる。しかしながら、臨床試料中における変異が多くの場合低アレル頻度で存在することから（表２９及び表３０）、検索する全ての塩基に対する高いカバレッジが必要となる。１０，０００×のカバレッジで全エキソームシークエンシングを実施するためには途方もなく高価になる場合がある。本試験では、３９の染色体腕のコピー数解析と共に１１の遺伝子の選択領域（ＴＥＲＴを含む）を慎重に評価した。たとえ腫瘍が評価した１１の遺伝子のうちの１つに遺伝的改変を含有していないとしても、その腫瘍は依然として異数性であり得、異数性の尿中細胞アッセイを用いて検出可能であり得る。異数性検出の感度は変異アッセイの感度未満である。確実な異数性検出には最低１％の腫瘍細胞に含まれるＤＮＡが必要となるが、本試験で使用した変異アッセイによりＤＮＡ鋳型のわずか０．０３％に存在する変異を検出可能であることが、シミュレーションにより示された。それでもなお、比較的高い割合の腫瘍細胞を含んではいたが１１の検索遺伝子内には検出可能な変異を含有していなかった尿中細胞試料は、上記のとおり本明細書において検査を行った５６のＵＴＵＣのうちの５３が異数性であったことから、依然としてそれら試料の異数性により検出可能なはずである。加えて、検索した１１の遺伝子内における変異の一部、例えば、大規模な挿入もしくは欠失または複雑な変化などは、変異ベースのアッセイでは検出不能となり得たが、このような検出不能な変異を含む試料は依然として異数性の検査において陽性とスコア付けされ得た。
これら理論上の証明が実践において差異を生むのかどうかを確認するために、集合的にＵｒｏＳＥＥＫと呼ばれる組み合わせアプローチを用いてバイオマーカー性能を評価した。上記のとおり、１０遺伝子マルチプレックスアッセイ、ＴＥＲＴシングルプレックスアッセイ及び異数性アッセイはそれぞれ、別々に使用した際に、６４％、２９％及び３９％の感度をもたらした。ＴＥＲＴプロモーター変異を含まない２３点の試料は、その他の１０の遺伝子のうちの１つにおける変異に対して陽性と判定された（図３２中のベン図）。逆に、マルチプレックスアッセイを用いて検出可能な変異を含まない３点の試料は、ＴＥＲＴプロモーター変異に対して陽性とスコア付けされた（図３２）。また、検出可能な変異を何ら含まない尿中細胞試料のうちの３点は、異数性に対して陽性であった（図３２）。それゆえ、３つのアッセイを同時に使用した場合、いずれか１つのアッセイにおける陽性結果が試料を陽性とスコア付けするのに十分であった場合、感度は７５％（９５％ＣＩ、６２．２％～８４．６％）に上昇した。健康な個体に由来する１８８点の試料のうちの１点のみがＵｒｏＳＥＥＫ検査により陽性とスコア付けされた（特異度９９．５％、ＣＩ９７．５％～１００％）。
組み合わせアッセイにより得られた感度上昇の基本原理を明らかにするために、自身の尿中細胞試料が異数性を示してはいたが検出可能な変異を有していなかった３名の患者の原発性腫瘍に由来するデータを評価した。これら３つの腫瘍が１１の検索遺伝子内に変異を何ら含有していないことが見出され、尿中細胞ＤＮＡに適用した際にこれら同一のアッセイがなぜ陰性となったかを説明するものとなった。上記のとおり、これら３つの腫瘍は異数性であり、その結果、尿中細胞試料中におけるこれらコピー数多型を検出する機会が与えられた。
臨床特性との相関関係
がんバイオマーカーは、広範にわたる転移が生じる前における病変の外科的切除を可能とする早期のステージにおいて腫瘍を有利に検出できるはずである。ＵｒｏＳＥＥＫは早期腫瘍と末期腫瘍の両方を検出する上で高感度であった。ＵｒｏＳＥＥＫは、ステージＴａまたはＴ１の腫瘍を有する１９名の患者のうちの１５名（７９％）、及び、ステージＴ２～Ｔ４の腫瘍を有する３７名の患者のうちの２７名（７３％）を陽性とスコア付けした。１０年がん特異的生存率は、ステージ２、３または４の腫瘍を有する患者のうちのそれぞれわずか７８％、３４％及び０％と比較して、ステージＴ１悪性腫瘍を有するＵＴＵＣ患者のうちの９１％が外科手術により治癒すると予測されていることを示している。
ＵｒｏＳＥＥＫの感度が、性別、ＣＫＤステージ、腫瘍グレード、腫瘍位置、及び、ＵＴＵＣを発症するリスク因子を含む、腫瘍ステージ以外の様々な臨床パラメータには依存していないため、このアッセイが多種多様な患者集団の評価に好適であることが示された。更に、ＵｒｏＳＥＥＫは本コホートにおいて、尿細胞診と比較して相当より高感度であった。細胞診は４２症例において利用可能であり、そのうちの４症例（９．５％）のみが細胞学的にがんと診断された。細胞診により「悪性腫瘍の疑い」とスコア付けされた試料を陽性とみなしたとしても、感度は２６％（陽性とスコア付けされた４症例及び疑いとスコア付けされた７症例を含む）にすぎなかった。ＵｒｏＳＥＥＫでは、細胞診により陽性とスコア付けされた全４症例、悪性腫瘍の疑いとスコア付けされた７症例のうちの５症例、及び、細胞診により非確定または陰性とスコア付けされた３１点の試料のうちの２２点を検出した。
実施例６：長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）の増幅による、がんを有する患者における異数性の検出
本実施例では、アンプリコンベースの異数性検出のための新規のアプローチについて説明する。このアプローチ（Ｗｉｔｈｉｎ－Ｓａｍｐｌｅ－ＡｎｅｕｐＬｏｉｄｙ－ＤｅｔｅｃｔｉＯｎ（ＷＡＬＤＯ）でＷＡＬＤＯと呼ばれる）は、多くの場合がんに存在している複数の染色体腕におけるわずかな変化を検出するための教師あり機械学習を採用している。本明細書では、ＷＡＬＤＯを適用することにより、従来のアプローチと比較して向上した感度及び同等の特異度で染色体腕の獲得または喪失を同定することができるということを示している。更に、機械学習を実装して、試料の異数性ステータスに応じて試料を分類する、ゲノムワイドな異数性コールを実行してもよい。本実施例は、がん患者に由来する血漿のリキッドバイオプシーに加えて１０種の異なる腫瘍タイプの組織を含む数千点の試料に関するＷＡＬＤＯ結果について報告するものである。比較用に２点の試料が利用可能な場合、ＷＡＬＤＯを使用して、遺伝的関連性を評価してもよく、または、ＬＩＮＥ内における体細胞変異を検出してもよい。それゆえ、このアプローチを使用して、体細胞変異量の推定を実施してもよく、発がん性物質シグネチャーを評価してもよく、また、マイクロサテライト不安定性を検出してもよい（図１）。
物質及び方法
試料
本検査においては合計１，６７８の腫瘍を評価した（以下を参照のこと）。

Figure 2023075090000072

Figure 2023075090000073


それぞれの組織病理学的サブタイプのがんの数については付録に列挙している。腫瘍をホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した。全ての症例において、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（ｃａｔ ＃ ９３７２５５）を使用してＤＮＡを精製した。１７６名の健康な個体の血液から末梢白血球（ＷＢＣ）を精製した。５６６名の健康な個体と９８２名のがん患者に由来する血漿を精製した。Ｑｉａｇｅｎキット番号（ｃａｔ ＃ １０９１０６３）と（ｃａｔ ＃ ９３７２５５）をそれぞれ使用してＷＢＣと血漿からＤＮＡを精製した。本試験に使用した血漿試料の大部分について個別に、１２の一般的に変異している遺伝子のうちの１つにおける変異を評価した。これらの血漿試料中における変異アレルの割合を試料の腫瘍細胞含有率の概算として使用した。本試験に参加している全ての個人は、それら個人が集められた病院のｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄｓによる承認後に書面でのインフォームドコンセントを提出した。
Ｆａｓｔ－ＳｅｑＳ
評価したそれぞれのＤＮＡ試料に対し、ＦＡＳＴ－ＳｅｑＳを使用して、一対のプライマーペアで約３８，０００のアンプリコンを増幅した（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰｌｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４１１６２）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ装置（ＨｉＳｅｑ ２５００、ＨｉＳｅｑ ４０００、またはＭｉＳｅｑ）上で超並列シークエンシングを実施した。増幅中、他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）、プライマーの５’末端における変性塩基を分子バーコードとして使用して、それぞれのＤＮＡ鋳型分子を固有に標識した。このことにより、それぞれのＤＮＡ鋳型分子が１度だけカウントされることが保証された。本明細書における全ての例において、用語「リード」とは固有に識別されたリードのことを意味する。実験に応じて、それぞれのリードを１～２０回シークエンスした。それぞれのＷＢＣ試料と腫瘍ＤＮＡ試料において、１００，０００～２５百万のリードを解析に使用した。それぞれの血漿ＤＮＡ試料において、１００，０００～１５百万のリードを使用した。全シークエンシング実験に正常ＤＮＡの複製を組み込んで、確率的ばらつき及び実験的ばらつきを評価するために使用した。
試料のアライメント及びゲノム区間のグループ分け
Ｂｏｗｔｉｅ２を使用して、ヒトリファレンスゲノムアセンブリＧＲＣ３７にリードをアラインした。リファレンスゲノムへの３７，６６９の正確なマッチ（性染色体を除く３３，８４４）を同定した。これらの正確なマッチにより、一般的な多型の包含が可能となった。多型としては、２４，７２０の一塩基多型（ＳＮＰ）ならびに１，５００の挿入及び欠失（インデル）多型が挙げられ、マイナーアレル頻度は１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓデータベース（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ２０１２ Ｎａｔｕｒｅ ４９１：５６－６５）中の＞１％であった。
実験的ばらつき及び確率的ばらつきを考慮すると、任意の正倍数性試料におけるそれぞれのゲノム領域にマッピングしたリードの数は、ばらついていると予測された。このばらつきを最小限とするために、複数の正倍数性試料中における全染色体にわたり類似の読み取り深度を有する５００ｋｂゲノム区間のクラスターを同定した。このステップにより、異数性が存在しない場合における、試料中において予測される読み取り深度のばらつきの推定が可能となった。５００ｋｂより小さなゲノム区間及び５００ｋｂより大きなゲノム区間について試験を行うことにより、５００ｋｂが、以下で説明するアッセイにおいて妥当なコンピュータ費用で妥当な性能を生むことが見出された。
５００ｋｂゲノム区間のクラスタリングを以下のとおりに実施した。それぞれの検査試料を、類似したアンプリコンサイズを有する正倍数性試料にマッチさせた。増幅前におけるサイズの小さなＤＮＡから作製したアンプリコン中においてより小さなアンプリコンが大きな比率を占めることから、このことを実施した。Ｆａｓｔ－ＳｅｑＳで作製したアンプリコンのサイズは１００～１４０ｂｐの範囲である（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰｌｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４１１６２）。血漿ＤＮＡのサイズが１４０～１８０ｂｐであることから（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０２：１６３６８－１６３７３；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０：８８－９２；Ｊａｈｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：１６５９－１６６５；及びＧｉａｃｏｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｐａｎｃｒｅａｓ １７：８９－９７）、最も大きなＬＩＮＥアンプリコンは、例えば、ＷＢＣ ＤＮＡと比較して、血漿ＤＮＡ中においてかなり小さな比率を占めることになる。任意の検査試料と比較するには７点の正倍数性試料で十分であり、７点超の正倍数性試料を使用しても性能がほぼ向上しないということが見出された。７点の正倍数性試料は、正常個体に由来する６７７のＷＢＣまたは５６６の血漿ＤＮＡの集合に由来しており、集合的に「正倍数性リファレンスセット」と呼ばれた。それぞれの検査試料ｐに対し、ｐへの最小ユークリッド距離を有する７点の正常試料を選択し、
Figure 2023075090000074


（式中、ｐｎ及びｑｎは試料ｐ及びｑ中におけるサイズｎのアンプリコンの割合であり、合計は２つの試料中における全てのアンプリコンサイズを超える）と定義した。正倍数性リファレンスセット中の試料から検査試料間のユークリッド距離を計算する前に、以下のアンプリコンを除外した。（ｉ）最尤推定法を使用して、７点の正倍数性試料間の分散によりアンプリコンをランク付けし、トップ１％を除外した。（ｉｉ）１点の試料において＜１０のリードを有するがその他６点の試料のいずれかにおいて＞５０のリードを有する全てのアンプリコンを除外した。それぞれの試料において、それぞれの試料中におけるリードの平均値を引いて標準偏差で割ることにより、５００ｋｂゲノム区間を調整した。
次に、調整した５００ｋｂゲノム区間を、以下の方法で７点の選択正常試料にわたってクラスタリングした。第１に、それぞれの５００ｋｂゲノム区間ｉを主要クラスターＣｉに割り当てた。次に、全試料にわたるゲノム区間ｉ内のリードを、残る２１の常染色体上において生じた、全てのその他のゲノム区間ｉ’内における７点の試料中のリードの平均数と比較した。類似性の検索中に、有意ではない結果（対応のあるｔ検定 ｐ＞０．０５、ｆ検定 ｐ＞０．０５）について検証を行った。ゲノム区間ｉ’内におけるリードの平均数がゲノム区間ｉ内におけるリードの数とは有意に異なっていなかった場合、その平均数をクラスターＣｉに加えた。４３６１のゲノム区間のそれぞれに対してこのプロセスを繰り返し、４３６１のクラスターを得た。全ての区間ｉがその主要クラスターに属していたが、同一の区間はまた、平均１７６のその他のクラスター（１９０点の代表的な試料中における１００～２５２の範囲のクラスター）に属していた。一部のクラスターが同一の５００ｋｂゲノム区間で構成されていたため、固有クラスターの数は４３６１未満であった。１９０点の代表的な試料中における固有クラスターの数は通常、４３１０～４３３０であった。クラスターには、平均約２００の５００ｋｂゲノム区間が含まれていた（図４５を参照のこと）。調整リードは無作為に分布していなかった（図４６Ａを参照のこと）。しかしながら、それぞれのクラスターの約２００のゲノム区間内における調整リードの分布は、ほぼ正規分布に従っていた（図４６Ｂ～Ｃ中の例）。
検査試料中における染色体腕の獲得または喪失の同定
ＷＡＬＤＯでは、類似した増幅特性を有するゲノム区間のクラスターを定義するためだけに、上で記載した７点の正倍数性試料を使用した。ＷＡＬＤＯにおける異数性の統計的検定は、検査試料中におけるリード分布をベースとしており、任意の正倍数性試料中におけるリード分布とは独立していた。検査試料に対し、最尤推定法を使用して、アンプリコン長を基準として検査試料にマッチするように選択された７点の正倍数性試料により定義された４，３６１のクラスターのそれぞれにおけるゲノム区間の平均
Figure 2023075090000075
及び分散
Figure 2023075090000076
を推定した。これら推定のロバスト性は、クラスターから離れた検査試料内のゲノム区間を繰り返し除去することにより向上した。１０未満のゲノム区間を含むクラスターについては解析に含めなかった。それぞれのクラスターにおいて、基準 最小（２＊ ＣＤＦ（μ，σｉ ２），２＊（１－ＣＤＦ（μ，σｉ ２））＜０．０１を満たす全ての５００ｋｂゲノム区間を全クラスターから除去した。次に、それぞれのクラスターの
Figure 2023075090000077
パラメータ及び
Figure 2023075090000078
パラメータを最尤推定法で再推定した。範囲外のゲノム区間が残らなくなるまで２つのステップを繰り返した。次に、腕上の全５００ｋｂゲノム区間から総リードの統計的有意性を推定した。正規分布した確率変数の合計がまた正規分布した確率変数であることから、計算は単純明快であった（図４７を参照のこと）。それぞれの染色体腕に対し、
Figure 2023075090000079
（式中、Ｒｉは調整リードであり、Ｉは腕上におけるクラスターの数である）を計算した。分位点関数
Figure 2023075090000080
を使用してＺスコアを生成した。陽性Ｚスコア＞αは獲得を示し、陰性Ｚスコア＜－αは喪失を示した（式中、αは選択した有意性閾値であった）。
腕レベルのアレル不均衡
１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓの一般的な多型（２４，７２０の一塩基及び１，５００のインデル、ＭＡＦ＞１％）を候補ヘテロ接合性位置として使用した。６７７点の正常試料のそれぞれにおいて、確信的にヘテロ接合性及び二倍体と呼ぶことのできる多型位置を同定した。多型を、変異型対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）（０．４＜ＶＡＦ＜０．６）（式中、ＶＡＦ＝非参照リード数／総リードである）を有する多型と定義した。これらの位置におけるＶＡＦを、正規分布（
Figure 2023075090000081
＝０．５であり、分散
Figure 2023075090000082
は読み取り深度に応じた最尤推定法により推定した）から得た確率変数としてモデル化した（図４８）。検査試料中における染色体腕上のアレルが不均衡であるかどうかを確認するために、両方のアレルが存在する多型位置のサブセット、及び、両方のアレル上におけるリードの合計が＞２５である多型位置のサブセットを同定した。次に、認められた読み取り深度に対して予測された分散を使用して、認められたＶＡＦを正規分布と比較して、両側ｐ値を得た。染色体腕上の全てのｐ値をＺ変換し、それぞれの位置において認められた読み取り深度をｐ値の重みとして使用し、重み付けＳｔｏｕｆｆｅｒ法と組み合わせた。この計算に使用した式は
Figure 2023075090000083
（式中、ｗｉは変異型ｉにおけるＵＩＤ深度であり、Ｚｉは変異型ｉのＺスコアであり、ｋは染色体腕上に認められた変異型の数である）であった。得られたＺスコアが選択した統計的有意性閾値α超であった場合に、染色体腕をアレル不均衡を有するものとスコア付けした（片側検定）。
合成異数性試料の作製
それぞれが少なくとも９百万のリードを含有し、それぞれが正常ＷＢＣのＤＮＡに由来する、６３点の推定上の正倍数性試料に由来するデータを選択した。これら正常ＤＮＡ試料に由来するリードにいくつかの染色体腕に由来するリードを足すことにより（これら正常ＤＮＡ試料に由来するリードからいくつかの染色体腕に由来するリードを引くことにより）、合成異数性試料を作製した。１、５、１０、１５、２０または２５の無作為に選択された染色体腕に由来するリードをそれぞれの試料に加える、または、それぞれの試料から引いた。０．５％～１０％の範囲の腫瘍細胞割合を示すように加法及び減法を設計し、正確に９百万のリードを含有する合成試料を得た。それぞれの染色体腕に由来するリードを均一に加算または減算した。例えば、喪失した５つの染色体腕（それぞれの染色体腕は同程度に喪失していた）をモデル化する際、本発明者らは腫瘍の不均一性をモデルに実装しなかった。更に、２つ以上の同一の追加の染色体腕を含有する合成試料、例えば、染色体３ｐの４つの複製を含有する合成細胞などについては、作製しなかった。この簡略化されたアプローチは、全ての生物学的にもっともらしい異数性イベントを包括的にカバーしていなかった。しかしながら、改変腕の可能な組み合わせを限定することにより試料の作製がコンピュータ上で扱いやすくなり、得られたサポートベクターマシンが実際に良好に動作するようになった。
単一染色体腕のみに由来するリードを加算または減算した合成作製試料により、目的の単一染色体腕のみが獲得または喪失した場合におけるＷＡＬＤＯの性能を本発明者らが推定することが可能となった。５～２５の染色体腕を改変させた合成セットにより、がんに由来する通常の試料におけるＷＡＬＤＯの性能の評価が可能となった。図３７に示すとおり、ほとんどのがんは複数の染色体の獲得または喪失を有している。合成試料を作製するために使用したアルゴリズムは、図４９及び図５０において擬似コードとして示されている。
ゲノムワイド異数性検出
２クラスのサポートベクターマシン（ＳＶＭ；Ｃｏｒｔｅｓ １９９５ Ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ２０：２７３－２９７）を訓練して、正倍数性試料と、５～２５の染色体腕に由来するリードを加算または減算した合成試料を識別した。６７７点のＷＢＣ陰性試料（３百万～１５百万のリードを含有する推定上の正倍数性のＷＢＣ）と３１５０点の陽性試料を含有する訓練事例集合は全て、上で説明したとおり合成である。ラジアル基底カーネルパラメータ及びデフォルトパラメータを使用して、Ｒのｅ１０７１パッケージによるＳＶＭの訓練を実施した（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ：１．６－３）。それぞれの試料は、染色体腕の獲得及び喪失を示す３９のＺスコア特性を有していた。陰性クラスのサイズと陽性クラスのサイズが同等となるように６７７点の合成試料を無作為にサンプリングし、これを１０回繰り返した。全１０回のＳＶＭにより分類するそれぞれの試料をスコア付けし、１０回分のスコアを平均して最終スコアを得た。
実験試料に関するデータに由来するリード数は、とりわけ、ＤＮＡの量が限られた供給源、例えば、血漿などに試料が由来する場合、広く様々であり得る。リードの少ない試料では、読み取り深度を考慮しない場合、人為的に高いＳＶＭスコアを生成することができる。それゆえ、正常試料における読み取り深度に応じたＳＶＭスコアの変化をモデル化することにより、読み取り深度を制御した。詳細には、６３点のＷＢＣ正倍数性試料のそれぞれを無作為にダウンサンプリングして、１００，０００～９百万の範囲の読み取り深度のより少ないリードの正倍数性試料の１０の複製を得た。１０回のＳＶＭを使用して、ダウンサンプリングした正倍数性試料の全てをスコア付けし、それらスコアを平均した。この手順により、それぞれの読み取り深度における、ダウンサンプリングした正倍数性試料の６３０のＳＶＭスコアを得た。それぞれの読み取り深度における試料に最小のＳＶＭスコアを見つけ出して同一深度における全てのスコアをその値で割ることにより、全てのスコアを比率に変換した。それぞれの深度における平均比率ｒは、読み取り深度が高くなるに応じて単調に減少した（図５１）。以下の方程式（Ａ＝－７．０７６＊１０＾－７及びＢ＝－１．９４６＊１０＾－１）を使用して、読み取り深度とＳＶＭスコアの間の関係をモデル化した。式
Figure 2023075090000084


を使用して比率ｒで割ることにより、生ＳＶＭスコアを補正した。
試料を異数性とスコア付けするために、試料中における任意の単一染色体腕が統計的に有意な様式で喪失または獲得したかどうかを最初に確認した。単一染色体腕の統計的に有意な獲得を、Ｚスコアが、６７７点の正常ＷＢＣ試料において認められた最大Ｚスコア超の＞４σである獲得と定義した。同様に、単一染色体腕の統計的に有意な喪失を、Ｚスコアが、６７７点の正常ＷＢＣ試料において認められた最小Ｚスコア未満の＜－４σである喪失と定義した。ＳＮＰをベースとしたアレル不均衡を、Ｚスコアが、６７７点の正常ＷＢＣ試料において認められた最大Ｚスコア超の＞４σである染色体腕と定義した。この様式で定義する場合に単一染色体腕の獲得または喪失のない試料だけをＳＶＭ解析に供した。このプロセスの基本原理は、ＳＶＭを設計して、染色体腕の多数の獲得または喪失を有するが腫瘍細胞の割合が比較的低い試料を同定することであった。ＳＶＭは、腫瘍細胞の割合が＞１０％である試料中における異数性（本パラグラフの最初の部分に記載のとおりに、試料のＺスコアを評価して６７７点の正常試料と比較することにより容易に同定される）を検出するために設計されたものではなかった。
体細胞配列変異及びマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）
マッチした正常試料が利用可能な場合、ＬＩＮＥアンプリコン配列及びアライメントに基づいて体細胞一塩基置換（ＳＢＳ）変異、一塩基挿入及び一塩基欠失（インデル）変異を検出するための試みを行った。このようなケースでは、エラーを低減するための分子バーコード法を使用した。ＳＢＳに対しては、少なくとも２００のリード及び５０の固有分子バーコードを有するアンプリコンのみについて考察を行った。インデルに対しては、シークエンシング装置上の少なくとも２つのクラスター内において認められたリードについての考察を行った。検査試料に由来するアンプリコンとマッチした正常に由来するアンプリコンを直接比較することによりＳＢＳ変異を同定したが、リファレンスゲノムへのアライメントは何ら必要ではなかった。マッチした正常試料中における５０未満のリードを有するアンプリコンについては除外した。体細胞ＳＢＳを、検査試料に由来する少なくとも５つのリードが任意の正常リードとは正確に１ヌクレオチド置換分異なっていたＳＢＳと定義した。
インデルを同様にコールした。Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ ２０１２ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３５７－３５９）を用いて、検査試料に由来するアンプリコンとマッチした正常試料に由来するアンプリコンを最初に、リファレンスゲノム（ＧＲｃ３７）にアラインした。体細胞インデルを、検査試料に由来する少なくとも１０のリードが同一の挿入または欠失により任意の正常リードとは異なっていたインデルと定義した。
＞３ヌクレオチドのモノヌクレオチドトラクト中における体細胞インデルの数をカウントすることにより、検査試料中におけるマイクロサテライト不安定性を同定した。検査したＬＩＮＥアンプリコン中には１７，４８８のこれらモノヌクレオチドトラクトが存在していた。モノトラクト中における体細胞インデルが正常試料では希少であり得ることが予測された。それゆえ、カウントのｎｕｌｌ分布はポアソン（λ＝１）（式中、λは、正常試料のモノトラクト中における体細胞インデルの平均数である）としてモデル化することができた。体細胞インデルの数が統計的に有意な場合に、試料がＭＳＩを有するとコールした。このプロセスを使用して正常試料がどの程度頻繁にＭＳＩとスコア付けされ得るかを評価するために、正常試料中における総リードを２つの等しい区分に無作為に分割した。第１の区分を参照試料として使用し、第２の区分を検査試料として使用した。
試料のマッチング
ある試料を別の試料と比較するために、Ｂｏｗｔｉｅ２を用いて、アンプリコンをリファレンスゲノムＧＲＣ３７に最初にアラインした。１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓの一般的な多型を使用して、それぞれの試料中の２６，２２０の位置における遺伝子型を同定した。それぞれの多型位置を、「０」（ホモ接合性参照、参照アレルにおける＞０．９５のリードマッチ、最低１０のリード）、「１」（ヘテロ接合性、参照アレルまたは代替アレルのいずれかにおける０．０５～０．９５のＵＩＤのマッチ、それぞれのアレルにおける最低１０のリード）、または、「２」（ホモ接合性代替、代替アレルにおける＞０．９５のＵＩＤマッチ、最低１０のリード）、とコールした。一致を、両方の試料において十分なカバレッジを有する遺伝子型の総数で割った、両方の試料において同一であるマッチした多型位置（すなわち、両方が「０」、両方が「１」、または、両方が「２」である）の数と定義した。一致が＞０．９８であり、少なくとも１５，０００のアンプリコンが十分なカバレッジを有する場合、２つの試料をマッチとみなした。
ＴＣＧＡ体細胞コピー数改変
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰ６アレイのＧＩＳＴＩＣ解析（Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０４：２０００７－２００１２）による、最新のＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｌｅｖｅｌ ４体細胞コピー数改変ファイル（Ａｇｇｒｅｇａｔｅ＿ＡｎａｌｙｓｉｓＦｅａｔｕｒｅｓ．Ｌｅｖｅｌ＿４．２０１６ ０１２８００．０．０）をＦｉｒｅｈｏｓｅからダウンロードした。本発明者らの原発性腫瘍試料（浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、結腸または直腸の腺癌（ＣＯＡＤＲＥＡＤ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、肝臓肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）、膵腺癌（ＰＡＡＤ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、及び、子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ））のコホートにマッチする９種のＴＣＧＡ腫瘍タイプを選択した。合計で６２７６点の試料が利用可能であった（浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）：１０８１点、結腸腺癌、結腸または直腸の腺癌（ＣＯＡＤ、ＣＯＡＤＲＥＡＤ）：２７５５点、食道癌（ＥＳＣＡ）：１８５点、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）：５２３点、肝臓肝細胞癌（ＬＩＨＣ）：３７１点、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）：５８０点、膵腺癌（ＰＡＡＤ）：１８５点、胃腺癌（ＳＴＡＤ）：４４２点、子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）：５４０点）。データは、それぞれの染色体腕の獲得または喪失を示すＧＩＳＴＩＣログ２比で構成されていた（Ｍｅｒｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ １２：Ｒ４１）。＞０．２または＜０．２の比率は獲得または喪失とみなされた（Ｌａｄｄｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：４８５－４９０）。
単一染色体腕改変を検出するための従来技術との比較
６７７点のＷＢＣ試料のそれぞれにおいてそれぞれの染色体腕にマッピングしたリードの割合、ならびに、リードの平均及び標準偏差を計算した（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８：９５３０－９５３５）。それぞれの腕のスコアをｚｉ，ｃｈｒＮ＝（ｃｈｒＮｉ－μｃｈｒＮ）／σｃｈｒＮ（式中、ｃｈｒＮｉはその染色体腕用に正規化したリードカウントを示し、μｃｈｒＮ及びσｃｈｒＮは正規化したリードカウントの平均及び標準偏差を示している）で計算した。
結果
ＷＡＬＤＯの基礎をなす統計原理
コピー数変化を評価するための大多数の従来のアプローチとは異なり、ＷＡＬＤＯでは、検査試料中におけるそれぞれの染色体腕に由来する正規化したリードカウントとその他の試料中におけるそれぞれの染色体腕におけるリードの割合を比較しない。このような従来の比較は、バッチ効果、及び、制御し難い変数に関連するその他のアーチファクトを受けやすい。全ゲノムシークエンシングデータを評価するため、それぞれが５００ｋｂの配列を含有する４３６１のゲノム区間内におけるＬＩＮＥのリードカウントを比較することにより、異数性を検出した。試料中の５００ｋｂゲノム区間内におけるリードカウントを同一試料中のその他のゲノム区間のリードカウントとだけ比較したが、この理由で、ＷＡＬＤＯには「Ｗｉｔｈｉｎ－Ｓａｍｐｌｅ」の表記がある。
正倍数性試料では、それぞれの５００ｋｂゲノム区間内におけるＬＩＮＥリードの数は特定のその他のゲノム領域内におけるリードの数と一致するはずである。互いに一致するゲノム区間は、それらゲノム区間内におけるアンプリコンが類似した度合い増幅するために、互いに一致する。本明細書では、互いに一致するこのようなゲノム領域を「クラスター」と呼ぶ。正倍数性試料に関するシークエンシングデータからクラスターを同定することは可能である。検査試料では、それぞれの所定のクラスター内のそれぞれのゲノム区間内におけるリードの数がその同一試料に由来するその他のクラスターの予測された範囲内にあるかどうかを確認する。ゲノム区間内におけるリードが統計的に予測された範囲の外側にあり、多くのこのような外側のリードが同一染色体腕上に存在する場合、その染色体腕は異数性に分類される。この検査における統計の基本原理については物質及び方法に記載している。要するに、それぞれのＬＩＮＥにおけるリードの数がゲノム全体にわたり無作為に分布していない一方で、それぞれのクラスター内における調整リードの分布はほぼ正規である。正規分布の好都合な特性は、複数の正規分布の合計もまた正規分布であるということである。それゆえ、染色体腕上に示された全てのクラスターの平均及び分散を単純に合計することにより、それぞれの染色体腕上の合計したリードの理論上の平均及び分散を計算することが可能である。
ＷＡＬＤＯはまた、ＰＣＲで作製した臨床試料に由来するアンプリコンの解析にＷＡＬＤＯを適用可能とするいくつかのその他の新方式を採用している。これらの新方式のうちの１つは、データが初期鋳型のサイズに強く依存することに起因する増幅バイアスを制御することである。別の新方式は、少ない腫瘍画分を含有する試料中における異数性の検出を可能とするためのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）の使用である。ＷＡＬＤＯの概念上及び統計上の基本原理については、本明細書の物質及び方法のセクションに詳細に記載されている。
原発性腫瘍試料中における染色体腕の獲得及び喪失の評価
ＷＡＬＤＯを最初に使用して、１０種のがんタイプに由来する１，６７７点の原発性腫瘍試料中における染色体腕の獲得及び喪失を検査した。ＷＡＬＤＯの出力のうちの１つは、常染色体上の３９の非末端動原体型腕のそれぞれにおけるＺスコアである。本試験で評価した原発性腫瘍試料のそれぞれにおける、これら染色体腕のそれぞれにおけるＺスコアについては、表３５に記載している。これらの結果を、同一腫瘍タイプの別々の試料に関するＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）により得られた結果（Ｚａｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：１１３４－１１４０；及びＢｅｒｏｕｋｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０４：２０００７－２００１２）と比較した。全腫瘍タイプを総合して考察し、またそれぞれの腫瘍タイプを個別に考察して、本発明者らのデータ及びＴＣＧＡにおける、それぞれの染色体腕における獲得または喪失を有する腫瘍試料の割合を同定した。図３７の上半分に示すとおり、ＷＡＬＤＯにより獲得とスコア付けされたまたはＴＣＧＡのアルゴリズム（ＧＩＳＴＩＣ）により獲得とスコア付けされた全てのがんタイプにおける試料の割合は、それぞれの染色体腕について示されており、喪失を有する試料の割合は下半分に示されている。本試験においてスコア付けされた腕レベルの獲得とＴＣＧＡにおける獲得の間の相関関係については図３９Ａに示されており（Ｒ２＝０．４５）、本試験においてスコア付けされた腕レベルの喪失とＴＣＧＡにおける喪失の間の相関関係については図３９Ｂに示されている（Ｒ２＝０．３９）。試料が完全に異なる患者に由来していたことを考慮すると、両方のデータセットにおける獲得及び喪失した特定の染色体腕は著しく類似していた。大多数の獲得を有する染色体腕は１ｑ、３ｑ、７ｐ、７ｑ、８ｑ及び２０ｑであり、これらの腕上には比較的少ない喪失が認められた。大多数の喪失を有する染色体腕は４ｐ、４ｑ、８ｐ及び１８ｑであり、これらの腕上には比較的少ない獲得が認められた。最も少ない獲得または喪失を有する腕は１０ｐ、１６ｐ、１９ｐ及び１９ｑであった。
比較用に十分な数のがんが利用可能なそれら症例における特定の腫瘍タイプの多くに同様に高い相関関係が認められた（以下及び図４０を参照のこと）。


Figure 2023075090000085

相関関係が最も高かったのは膵腺癌と肝臓癌であった（それぞれ、Ｒ２＝０．７０とＲ２＝０．６４）。この解析の興味深い結果は、がん症例の大多数において異数性であった多数の染色体腕であった。がんあたり喪失または獲得した染色体腕の中央数は１４であり、５～２２の四分位数範囲であった。この大きな数を以下に記載するサポートベクターマシンの開発に使用した。
結腸の３２の良性腫瘍（結腸直腸腺腫）についても評価を行った。それらのうちの２５が染色体の獲得または喪失を示していたことが見出された。良性腫瘍あたり喪失または獲得した染色体腕の中央数は４であり、１～９．７５の四分位数範囲であった。良性腫瘍についてはまだＴＣＧＡによる試験が行われていなかったため、比較は不可能であった。しかしながら、結腸直腸癌との比較は、がんにおいて認められた染色体腕変化と比較して良性腫瘍がより少ない染色体腕変化を有することを示した。加えて、腺腫において改変されている染色体腕はがんにおいて改変されている染色体腕と重複しており、変化（獲得対喪失）の指向性は保存されていた。
ＷＡＬＤＯはまた、同時にシークエンスされるＬＩＮＥと共に、ＳＮＰに基づくアレル不均衡の同定を可能とした。このことにより、５００ｋｂゲノム区間にわたるリードの数によりもたらされる指標以外に、完全に独立した染色体腕変化の指標がもたらされる。アレル不均衡の測定値が参照アレルのリードの数と変異型対立遺伝子のリードの数の間の比率を示していることに留意されたい。参照アレルを含有している染色体腕が獲得しているかまたは変異型対立遺伝子を含有している腕が喪失しているかにかかわらず、この比率は同一である。それにもかかわらず、理論に束縛されるものではないが、同一腫瘍内におけるアレル不均衡を示す染色体と獲得または喪失のいずれかを示す染色体の間には強い関係が存在し得るということが予想され得る。アレル不均衡を有する染色体腕の６３％が同一染色体腕における有意な獲得または喪失も有するということが見出された。本明細書では、ＬＩＮＥ内におけるＳＮＰのその他の使用について記載している。
次に、ＷＡＬＤＯが単一染色体腕の獲得または喪失をコールする感度と特異度を比較した（物質及び方法を参照のこと）。両方の方法を６７７点の正常な末梢白血球（ＷＢＣ）試料に由来するＬＩＮＥアンプリコンシークエンシングデータに適用し、それぞれのＷＢＣ試料を別々に増幅して９．５Ｍのリードの平均深度までシークエンスした。単一染色体改変を有する２４，５７０点の合成試料でこの実験データを増強した（物質及び方法を参照のこと）。合成試料中における改変腕の総数で割った正確に同定された改変腕の総数として感度を計算した。正常ＷＢＣ試料に由来する実験データ中における正常腕の総数で割った不正確にコールされた改変腕の総数を１から引いたものとして特異度を計算した。ＷＡＬＤＯと従来の方法の両方において、３つの有意な閾値（±１．９６、±３．０、±５．０）及び３つの腫瘍細胞割合（１％、５％、１０％）についての考察を行った。全ての閾値及び腫瘍細胞割合において、ＷＡＬＤＯはより高い特異度及び感度を有していた（以下及び表３４を参照のこと）。


Figure 2023075090000086

ＷＡＬＤＯが単一染色体異常を検出する能力を更に評価するために、２１トリソミーを有する患者に由来するＤＮＡについても評価した。トリソミーを有する個体由来のＤＮＡを、２ｎｇの正常ＤＮＡと０．２ｎｇの２１トリソミーＤＮＡの比率で物理的に混合した。混合物を作製して、非侵襲的出生前検査における通常の胎児画分（約１０％）を複製した。ＬＩＮＥアンプリコン中の多型を使用して、試料のトリソミー混合率（７．７％～１０．４％の範囲）を推定した。２．５のｚ閾値を使用すると、わずか２Ｍのリードで、胎児画分において通常認められる２１トリソミーを検出可能（感度９５％）であることが見出された。次に、１６の正常ＷＢＣを様々な読み取り深度でサンプリングした。同一閾値を使用した２Ｍのリードにおける特異度は１００％であった。その他の読み取り深度及びの２１トリソミー試料のその他の混合における感度及び特異度については、図４１にまとめている。
低い割合の腫瘍細胞ＤＮＡを含む試料中における異数性の検出
がん内の異数性を検出するための多くの有望なアンプリコンは、正常細胞に由来する大きなＤＮＡプール内において、腫瘍細胞に由来する比較的少ない割合のＤＮＡを同定することを含む。１つの注目に値する処理は、リキッドバイオプシー、すなわち、がんの明らかにするための尿、唾液、嚢胞液または痰などの体液の評価である。異数性がほぼ全てのタイプのがんの一般的な特徴であることを考慮すると（図３７を参照のこと）、この目的のために異数性の検出を使用することができる。
リキッドバイオプシーにＷＡＬＤＯを採用するために、２段階のアプローチを使用した。最初に、上で説明したとおり、個々の染色体腕の獲得もしくは喪失またはアレル不均衡の検索を採用した。合成ＤＮＡを用いたシミュレーションは、腫瘍細胞に起因するＤＮＡの割合が総ＤＮＡの＞５％である場合に、このアプローチが個々の染色体腕の獲得または喪失を感度＞９０％及び特異度＞９９％で検出することができることを示した。より低い割合の腫瘍細胞ＤＮＡを含む試料中における異数性を検出するために、腫瘍あたりの染色体腕の獲得または喪失の中央数が高いというあの事実（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰｌｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４１１６２）を利用した。結果として、複数の染色体異常を有する低い割合の腫瘍ＤＮＡを含有する試料と正倍数性試料を識別するための様々なアプローチについての考察を行った。これらのアプローチは、有意な腕の数をカウントし、最も有意な腕のスコアを合算して、二乗ウィンドウベースのＺスコアを計算することを含んでいた。合成試料に基づき、サポートベクターマシン（試験を行った多くの機械学習アルゴリズムの１つ）で最適なアプローチが得られることが見出された。特定のがんタイプに特有な獲得及び喪失のパターンに基づくのではなく、あらゆるがんタイプに一般に適用可能となるように、サポートベクターマシンの訓練を設計した。合成試料では、サポートベクターマシンは、１％の腫瘍細胞割合を有する試料の７８％における異数性をクロス確認により測定された９９％の特異度で検出することができた。そのため、少ない腫瘍組成物を含む臨床試料を評価するために、このサポートベクターマシンベースのアルゴリズムをＷＡＬＤＯに実装した（図３８を参照のこと）。
次に、ＷＡＬＤＯを使用して、９６１名のがん患者と５６６名の健康な個体に由来する血漿試料中における異数性を評価する試みを行った（物質及び方法を参照のこと）。８種の異なるタイプのがんについて評価を行った（表３６を参照のこと）。それぞれのがん試料の腫瘍細胞割合を、ディープシークエンシングデータから同定した変異アレル割合とみなした。＞１％（１２２点の試料）、０．５％～１％（９６点の試料）、及び、＜０．５％（７３８点の試料）の腫瘍細胞割合を有する試料へと、試料を分割した。感度を、異数性とスコア付けされたがん患者試料の割合と定義した一方で、特異度を、異数性とスコア付けされた健康患者試料の割合を１から引いたものと定義した。これら３つの範囲の腫瘍割合における受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）については図３８に示している。＞１％の腫瘍細胞割合を有する試料の４２％における異数性が厳密な特異度（９９％）で同定された（図３８Ａを参照のこと）。予測したとおり、腫瘍細胞割合が低下するにつれて感度は低下した（図３８Ｂ、図３８Ｃを参照のこと）。ＷＡＬＤＯは、０．５～１％の腫瘍細胞割合を有する試料の２４％における異数性、及び、０～０．５％の腫瘍細胞割合を有する試料の１９％における異数性を９９％の特異度で検出した。患者の特定のがんタイプは陽性異数性コールと高度に相関していなかった。しかしながら、評価した鋳型分子の数は実際に感度と相関していた。
腫瘍細胞含有率のより高い血漿試料中において、どの染色体腕が獲得または喪失しているかを同定することは可能であった。一対の原発性腫瘍を有する５５８点の血漿試料のうち、１８８点の試料は原発性腫瘍内に有意な染色体腕の獲得または喪失を有し、５４％は原発性腫瘍内に一致した獲得または喪失を有していた。腫瘍含有率の低い試料中においては、個々の腕のいずれも統計的に有意なレベルで獲得または喪失していなかったが、ＷＡＬＤＯのサポートベクターマシン構成要素は推定上、それら試料を正倍数性試料と区別する、複数の染色体腕におけるわずかなずれを抽出することが可能であった。
試料のマッチング
縦列型反復配列によるＤＮＡプロファイリングは、現在日常的に使用されている確立された法医学技術である。同一患者に由来する腫瘍標本と正常標本の間などにおける試料の同一性を確保するための慎重にキュレートされたＳＮＰパネルについても開発されている（Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １６４：２０－３２；及びＰｅｎｇｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｇｅｎｏｍｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：８９）。ＦＡＳＴ－ＳｅｑＳで増幅されたＬＩＮＥは、１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ２０１２ Ｎａｔｕｒｅ ４９１：５６－６５）の＞１％において検出された変異型を含む２６，２２０の一般的な多型を含有している。これらの多型は理論的に、追加の作業または費用を何ら伴うことなく異数性の評価を行ったＤＮＡ試料をプロファイルするための有力な方法をもたらす。このような同定が実際に可能であるかどうかを確認するために、任意の２つの試料間の一致の指標を設計した（物質及び方法を参照のこと）。次に、１７６点の正常ＷＢＣ試料の互いの複製、試料あたり約５点の複製を使用して、合計で６７６点のＷＢＣ試料に、この指標の一致を使用した。ＷＡＬＤＯへの入力は６７６点の試料（試料名を指定せずに）であったため、合計で４５６，９７６（６７６×６７６）の考えられるマッチが存在することになった。ＷＡＬＤＯでは、偽マッチングを何ら伴うことなく、全ての複製試料を高い一致（＞９９．９％）で正確にマッチングさせた。次に、９７０点の血漿試料及び１，６８４点の腫瘍試料に対してこのプロトコルを実施した。５５８点の血漿試料は対応する原発性腫瘍試料にマッチするはずであり、その他のマッチは認められないはずである。このことにより、７，０３８，４０９（（９７０＋１，６８３）×（９７０＋１，６８３））の考えられるマッチが生成された。２６５３点の試料のほぼ全てが＞９９．８％の一致で予測どおりにマッチした（すなわち、試料自体に対してまたは対応する原発性腫瘍に対して）。しかしながら、２点の血漿試料は予測された原発性腫瘍にマッチしていないことが見出され、その他の血漿試料にマッチした１２点の血漿試料は異なるドナーに由来するといわれた。これら「ミスマッチケース」の全てにおいて、Ｆａｓｔ－ＳｅｑＳデータは高い一致（＞９９．８％）を示した。それゆえ、ミスマッチが試料の誤分類をもたらす可能性が最も高く、ＷＡＬＤＯによる試料同一性確認の有用性を示した。
変異量、発がん性シグネチャー、マイクロサテライト不安定性
２点の試料、正常試料とがん試料が同一患者から入手可能な場合、おそらくは、一方の試料にはあるがもう一方の試料にはないＬＩＮＥ変異を検出することができる。この用途のために、ＷＡＬＤＯの実験的構成要素及びバイオインフォマティクス構成要素により達成されたように（物質及び方法を参照のこと）、シークエンシングエラーを低減するための分子バーコード法（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）を使用することができる。
体細胞変異検出が実行可能かどうかを確認するために、同一患者に由来する１０の上部尿路の尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）及び正常組織を評価した。これらの試料はエキソームシークエンシングによりこれまでに解析されていた（Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１９７ｒａ１０２－１９７ｒａ１０２）。それぞれの腫瘍試料について、体細胞変異の数をカウントし、一塩基置換（ＳＢＳ）（Ａ－＞Ｔ、Ａ－＞Ｃなど）のスペクトルを確認した。ＬＩＮＥ内におけるＳＢＳの数がこれら腫瘍のエキソーム内におけるＳＢＳの数と高度に相関していることが見出された（Ｒ２＝０．９８、ｐ＜２．６＊１０－８）。ＬＩＮＥ内における変異のスペクトルも同様に、エキソン配列内における変異のスペクトルと相関していた（Ｒ２＝０．９５、ｐ＜１．８＊１０－６）。注目すべきことに、これら腫瘍のうちの６つはアリストロキア酸に曝露された患者に由来しており、この変異原の疾病特徴的シグネチャー（Ａ－＞Ｔ、Ｔ－＞Ａ）はこれら６つの腫瘍において顕著であった（図４２、図４３及び図４４を参照のこと）。
ＷＡＬＤＯにより評価したＬＩＮＥは、１７，４８８の＞３ヌクレオチドのモノヌクレオチドトラクトを有している。モノヌクレオチドトラクトがとりわけ、ミスマッチ修復における欠損の影響を受けやすいことから、ＷＡＬＤＯを使用してミスマッチ修復欠損を評価できるかどうかを確認した。この目的のために、１７，４８８のＬＩＮＥモノヌクレオチドトラクト内におけるインデルの数を評価した。６種のミスマッチ修復欠損結腸直腸癌内におけるインデルの数の平均が３５であり、１０～６７の範囲であることが見出された。これらの患者に由来する正常組織はわずかゼロまたは１のインデルを有しており、がんと正常組織の間の差異は極めて有意であった（ｐ＜７．２＊１０－４）。
実施例７：ボトルネックシークエンシングによる希少変異のゲノムワイド定量
核ゲノムとミトコンドリアゲノムにおける体細胞変異の時間の経過に伴う無作為な蓄積は、発がん、神経変性及び老化の基本理論の基礎となっている（例えば、Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７１９－７２４；Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ １３３：１１８－１２６；及びＶｉｊｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２６：１４１－１４９を参照のこと）。それゆえ、人体におけるこれら希少変異の加齢に伴う直接観察には、ヒトの疾患に対する我々の理解を向上させる可能性がある。現時点において、正常な非疾患ヒト組織内における体細胞変異量をゲノムワイドレベルで直接及び体系的に定量するための簡便なハイスループット法は存在していない。次世代ＤＮＡシークエンシング（ＮＧＳ）技術はこの課題に対処するものではあるが、それらのシークエンシングエラー率により希少変異の検出が制限されている（例えば、Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２４：３０５－３２６；及びＣｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ３０４：３３－１０５を参照のこと）。
本実施例では、任意の分子バーコードライブラリ内における希少な点変異を完全にバイアスのない方法で正確に検出するように設計されたボトルネックシークエンシングシステム（ＢｏｔＳｅｑＳ）技術について説明する。ＢｏｔＳｅｑＳは、ミトコンドリアゲノムと核ゲノムにわたる希少な体細胞点変異を同時に定量する次世代シークエンシング法である。ＢｏｔＳｅｑＳでは、分子バーコード法とライブラリ増幅直前の簡便な希釈ステップを組み合わせている。本実施例では、ＢｏｔＳｅｑＳを使用して、希少変異の年齢依存性蓄積と組織依存性蓄積を示し、正常組織内における体細胞変異負荷量が生物学的因子及び環境因子に応じて数桁変わり得るということを示している。本実施例はまた、正常組織内におけるミトコンドリアゲノムの変異パターンと核ゲノムの変異パターンの間の主要な差異を示している。最後に、正常組織の変異スペクトル同士は互いに異なっていたが、正常組織内に生じたがんの変異スペクトルには類似していた。この技術は、正常組織内における遺伝的改変の数及び性質への洞察をもたらすことができ、疾患組織のゲノムに関する様々な基本的な問題に対処するために使用することができる。
物質及び方法
ヒト組織試料
本試験用に５つの異なる供給源から正常な非疾患組織を得た（表４３）。ＣＯＬ２２９～ＣＯＬ２３７及びＳＩＮ２３０用に、そのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの承認を有するＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける同意した患者から結腸または十二指腸を得た。ＣＯＬ３７３～ＣＯＬ３７５及びＢＲＡ０１～ＢＲＡ０９用に、ＮＩＨ ＮｅｕｒｏＢｉｏＢａｎｋ（ｎｅｕｒｏｂｉｏｂａｎｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に急速冷凍した死後の結腸及び脳を請求し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉａｍｉ Ｂｒａｉｎ Ｅｎｄｏｗｍｅｎｔ Ｂａｎｋ（Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ）によりその請求が承認されて履行された。ＫＩＤ０３４～ＫＩＤ０３８用に、Ｗｉｎｄｂｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｗｉｎｄｂｅｒ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から急速冷凍した死後の腎皮質ブロック（２００ｍｇ）を購入した。ＣＯＬ２３８及びＣＯＬ２３９については、他の箇所で報告されたとおり（例えば、Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：７３８－７４０；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３２：８３９－８４７；及びＤｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７４：９５４－９６４を参照のこと）とした。ＳＡ＿１１７、ＳＡ＿１１８、ＳＡ＿１１９、ＡＡ＿１０５、ＡＡ＿１２４及びＡＡ＿１２６については、他の箇所で報告されたとおり（例えば、Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１９７ｒａ１０２を参照のこと）とした。結腸及び脳の試料数に関する最初の基本原理は、それぞれの年齢層における体細胞変異パターンの平均的な傾向を理解するためにそれぞれの年齢層における少なくとも３つの個体を得ることであった。結腸及び脳の年齢層は、人体の発育及び維持、＜１０歳における初期の身体成長、約２０～４０歳における成熟した若年成人の身体、及び、＞９０歳における老年の維持された成人の身体、に基づいて選択した。結腸用の若年小児年齢層に由来する１つの組織（ＳＩＮ２３０）を後ほど十二指腸に決め、結腸上皮用に若年小児年齢層を示すわずか２つの個体を残した。正常な腎臓用の腎臓の取得基準は、喫煙者の腎臓及びアリストロキア酸曝露試料に対する年齢がマッチした非喫煙対照群であった。全ての正常な腎臓対照は白人であったため、ハイリスクＡＡ曝露集団（例えば、アジア）に起源を有する可能性はより少なかった。同一の腎臓組織供給源から、５ヶ月齢の個体に由来する急速冷凍した死後の正常腎臓の３つのアリコートがテクニカルレプリケートとして利用可能であり、非発がん性物質曝露正常腎臓の年齢傾向を更に試験した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｙアダプターライゲート分子の調製
ＢｉｏＲｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用して、高強度のオンを１５秒間、オフを９０秒間を７サイクル３℃で使用して、５５μＬのＴＥバッファー中のゲノムＤＮＡ（３４ｎｇ～１μｇ）を断片化させた。ランダムな断片化の後、３５０ｂｐのインサートサイズを選択して標準的な低ＤＮＡ入力Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコルに従ってＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ＤＮＡフラグメントにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｙアダプターをライゲートした。これにより、２０μＬの総容積中のアダプターライゲート分子がもたらされた。
Ｙアダプターライゲート分子の希釈
９６ウェルＰＣＲプレート中で１８μＬの希釈バッファー（１ｎｇ／μＬのｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含有するＴＥ）中の２μＬのアダプターライゲート分子（ＰＣＲ前）から開始して５回の１０倍系列希釈を実施した。マルチチャンネルピペットで軽くピペッティングすることにより試料を混合した。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、それぞれの試料の２μＬを１８μＬの新しい希釈バッファーへと移した。合計で５回の系列希釈をするまで混合と移動を繰り返した。それぞれの希釈溶液の２μＬのみ（１／１０の総容積）をそれぞれのＰＣＲ用の鋳型として使用した。１０３倍希釈を以下のとおり、（ｉ）合計２０μＬのアダプターライゲート分子（１０倍希釈）となる２μＬを使用し、（ｉｉ）２μＬのアダプターライゲート分子をの２０μＬの総容積となるように希釈バッファーと混合し（１０倍希釈）、（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応に合計２０μＬ容積に由来する２μＬの希釈アダプターライゲート分子（１０倍希釈、以下を参照のこと）を使用すること、により実施した。５回の系列希釈により、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７の最終希釈倍率が得られた。
希釈したＹアダプターライゲート分子のＰＣＲ増幅
カスタムＨＰＬＣ精製ＰＣＲプライマー（ＩＤＴ）であるＴＳ－ＰＣＲ Ｏｌｉｇｏ１（５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ＊Ａ；配列番号：８０８）及びＴＳ－ＰＣＲ Ｏｌｉｇｏ２（５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ＊Ｇ；配列番号：８０９）を、３’末端に１つのホスホロチオエート結合（＊）を導入して設計した。０．５μＭのＴＳ－ＰＣＲ Ｏｌｉｇｏ１、０．５μＭのＴＳ－ＰＣＲ Ｏｌｉｇｏ２、Ｑ５ ２Ｘ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を含む５０μＬの総容積（１×終濃度）、及び、鋳型としての２μＬの希釈アダプターライゲート分子を用いてＰＣＲを実施した。Ｔｈｅｒｍｏ ＨｙＢａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＨＢＰＸ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ内でＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲプログラム、１）９８℃で３０秒間、２）９８℃で１０秒間、６９℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、を１８サイクル、及び、３）７２℃で２分間、を使用した。製造業者のプロトコルに従い１．０×ビーズ－試料比率のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＰＣＲ反応液を精製した。
ＭｉＳｅｑラン及び解析
増幅ＢｏｔＳｅｑＳシークエンシングライブラリのサブセットをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置上で評価して（ライブラリあたり約５Ｍのクラスターがフィルターを通過する）、実験的に最適希釈を演繹した。ＨｉＳｅｑ装置の１／２レーン（Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎモードでライブラリあたり約７０Ｍのクラスターがフィルターを通過する）に調整する際には、１分子あたり５～１０のＰＣＲ複製物となるように「最適希釈」を決定した。例えば、５００ｎｇのｇＤＮＡをＴｒｕＳｅｑ ＰＣＲ－ｆｒｅｅライブラリ調製試薬に入力するために（３５０ｂｐのインサートサイズを選択する）、１０４、１０５、１０６倍希釈に由来する増幅ライブラリをＭｉＳｅｑ上で２×５０ｂｐの深度でシークエンスした。適切にバーコード化された３点の異なる試料（分子バーコード化もされている）を、それぞれの試料の３つの希釈を試験するために１つのＭｉＳｅｑレーン内に多重化した。．ｂａｍ出力ファイルをＧａｌａｘｙにアップロードし、デフォルトパラメータを使用してＰｉｃａｒｄ’ｓ Ｅｓｔｉｍａｔｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ Ｔｏｏｌ（Ｇａｌａｘｙ Ｔｏｏｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．５６．０）を実行した。最適希釈は、総カウントの約６０～８０％を含む単集合で、１ファミリーあたり１～４メンバーの範囲の分布を示した。一般的に、５００ｎｇのｇＤＮＡをＴｒｕＳｅｑ ＰＣＲ－ｆｒｅｅライブラリ調製試薬に入力すると、１０５倍希釈では、ＢｏｔＳｅｑＳに使用する続くＨｉＳｅｑランにおいて１ファミリーあたり約１０のメンバーが生成される。本発明者らのシークエンシングデータから、本発明者らは、結腸組織内における１つの希少変異を同定するのに必要な高品質なクラスターの平均数が、（１）正常な小児において３０Ｍ、（２）正常な若年成人において１２Ｍ、及び、（３）正常な老年成人において５．８Ｍであると推定した。
全ゲノムシークエンシング
本試験中の３４の個体から３２の全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）ライブラリを調製した。ＷＧＳをしない残りの２つの個体、ＣＯＬ２３８及びＣＯＬ２３９については、サンガーシークエンス法を実施してＢｏｔＳｅｑＳデータ中のクローン変異型を除去した。ＢｏｔＳｅｑＳライブラリを調製するのに用いる最終２０μＬのアダプターライゲート分子（希釈前）のうちの１０μＬを用い、ＴｒｕＳｅｑ ＰＣＲプロトコルに従いＴｒｕＳｅｑ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及びＴｒｕＳｅｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、全ゲノムシークエンシング用のライブラリを増幅した。製造業者の取扱説明書に従い１．０×ビーズ－試料比率のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＰＣＲ反応液を精製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ上、＞３０×カバレッジでライブラリを２×１００ｂｐ ＰＥシークエンスした。
スパイクイン感度実験
正常な脾臓試料ＰＥＮ９３とＰＥＮ９５のＤＮＡから２つのＤＮＡ混合液を調製した。全ゲノムシークエンスデータはこれら２点の試料から取得可能であり（例えば、Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３１：１１９９－１２０３を参照のこと）、ＰＥＮ９５中には存在しないＰＥＮ９３中のＳＮＰを同定することができた。両方の混合液は同量のＰＥＮ９５ ＤＮＡを含有していたが、低スパイクイン混合液は、高スパイクイン混合液中に含まれるＰＥＮ９３ ＤＮＡのうちのわずか１０％を含有していた。クローン変異及び生殖細胞系変異を最小とするために標準的なＢｏｔＳｅｑＳパイプラインを使用して、これらの試料に由来するＢｏｔＳｅｑＳライブラリを最初に解析した。実際に、２つのライブラリの中から合計でわずか２つの変異が検出されたが、これら２つの変異は、ＰＥＮ９５試料中における希少変異を示し、約８×１０－７の変異／ｂｐの変異頻度を示唆していると考えられた。次に、ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインにより、ｄｂＳＮＰ（ｂｕｉｌｄ１３０及び１４２）内に存在する変異を除去することなくデータを処理した。低スパイクイン混合液中の７つのＰＥＮ９３特異的ＳＮＰ及び高スパイクイン混合液中の８９のＰＥＮ９３特異的ＳＮＰを同定した。シークエンスした塩基の数に正規化した後、「変異頻度」（ＰＥＮ９３特異的ＳＮＰ／ｂｐの数）は、低スパイクイン試料で２．７１×１０－６、高スパイクイン試料で２．０１×１０－５であった。低スパイクインと高スパイクインの間の差異は７．４倍であり、低スパイクイン試料中において同定された比較的少ない数の変異を考慮すると、１０倍希釈から予測された範囲内であった。
ＢｏｔＳｅｑＳ特異度の特性解析
特異度の１つの指標として、本発明者らは、本発明者らが両方のストランド内ではなく一方のストランド内のみに存在する変異を使用することを除いて、希少変異を通常起こるものと同定した。具体的には、「希少」とするための本発明者らのその他の基準が満たされる以外は、変異はワトソンファミリーメンバーのうちの≧９０％に存在し、リファレンス配列はクリックファミリーメンバーのうちの≧９０％に存在し、あるいは、逆の場合もまた同様であった。次に、偽ワトソンクリック対（ワトソンストランドはクリックストランドと比較して重複しているが異なる座標を有する（逆の場合もまた同様））を作製して、それら偽ワトソンクリック対が同一の変異を偶然に含有しているかどうかを確認した。ＢｏｔＳｅｑＳは、ボトルネック希釈ステップにより生じたゲノム全体にわたる低いカバレッジを有することにより機能するが、核ＤＮＡにおいてはこの解析を除外した。１細胞あたり複数コピーのｍｔＤＮＡがあることから、その代わりにｍｔＤＮＡを使用した。ＢｏｔＳｅｑＳによるｍｔＤＮＡのカバレッジは核ＤＮＡのカバレッジよりもはるかに高く、重複分子の同定を促進させた。３０のＢｏｔＳｅｑＳ対照ライブラリをこの様に処理して、一方のストランドのみに存在する合計で１４６のｍｔＤＮＡ変異を同定した。次に、このデータセットを使用してそれぞれの試料における重複分子を検索し、２７の例を同定した。２７の偽ワトソンクリック対のいずれも同一の人為的変異を共有していなかった。
非ランダムせん断により別のタイプのアーチファクト（ファミリーのワトソンストランドとクリックストランドが実際に、偶然に同一のゲノム座標を有する２つの異なる分子に由来していることを偽って示唆する）が作製され得た。このようなアーチファクトの検査を行うために、ワトソンストランド内に変異型を含有しクリックストランド内にリファレンス配列を含有する（あるいは、逆の場合もまた同様）ワトソンファミリークリックファミリー対を同定したが、今回は、ｍｔＤＮＡ内ではなく核ＤＮＡ内に、単なる希少変異型ではなくヘテロ接合性生殖細胞系変異型を含ませた。ｍｔＤＮＡが卵母細胞のみに由来することから、ｍｔＤＮＡ内と比較して核ＤＮＡ内により多くのヘテロ接合性変異型が存在している。目的の不一致は、異なる鋳型分子に由来するワトソンストランドとクリックストランドの誤対合、すなわち、非ランダムせん断の結果として生じ得た。あるいは、不一致は、初期ＰＣＲサイクル中における２つのストランドのうちの一方における増幅エラーに起因するものであり得た。本発明者らのＷＧＳデータを使用して、本発明者らは、対照ＢｏｔＳｅｑＳライブラリに使用した３０点のＤＮＡ試料中に認められた８，５３５，８９１の核ヘテロ接合性変異型を最初に同定した（多くのライブラリ内に存在する同一の一般的な変異型で、中央はライブラリあたり２６８，１８０の変異型であり、１２１，８５１～５２９，９２２の範囲である）。本発明者らは、８，５３５，８９１の核ヘテロ接合性変異型から、両方のストランドを評価することのできた合計で３，９６０，８１８ファミリー（中央はライブラリあたり１２３，１３４ファミリーであり、６５，８３２～２２２，１３５の範囲である）を同定した。これらのうちの３，９６０，８０７ファミリーは、両方のストランド内の変異型位置に一致配列を有しており、わずか１１のヘテロ接合性変異型が不一致であった（すなわち、変異型はワトソンファミリーメンバーのうちの≧９０％に存在し、リファレンス配列はクリックファミリーメンバーのうちの≧９０％に存在し、あるいは、逆の場合もまた同様であった）。それゆえ、生殖細胞系ヘテロ接合性変異型の不一致率は、１ｂｐあたり２．７８×１０－６（３，９６０，８１８中の１１）であった。この比率はハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼにおける既知のエラー率に適合しており、初期ＰＣＲサイクル中に２つのストランドのうちの一方において生じた増幅エラーを容易に示すことがあり得るために、せん断アーチファクトの過大評価を示している。更に、両方のストランド上に変異が認められることを必要とすることによりＢｏｔＳｅｑＳがこのような増幅エラーを排除するということに留意することが重要である。ＢｏｔＳｅｑＳが両方のストランド上に変異が認められることを必要とすることから、実際の偽陽性率は、約（１／３）（２．７８×１０－６）（２．７８×１０－６）＝２．５８×１０－１２になると推定され得る。
ＢｏｔＳｅｑＳ変化テーブル及び分子テーブルの作成
ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ヒトリファレンスゲノムにマッチングさせるＥＬＡＮＤｖ２を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ二次解析パッケージ（ＣＡＳＡＶＡ １．８）により配列アライメント及び変異型コーリングを実施した。高品質なリードが以下の基準、（ｉ）純度フィルターを通過すること、（ｉｉ）適切なペアでリードがマップされること、（ｉｉｉ）リファレンス配列に対して≦５のミスマッチであること、及び、（ｉｖ）それぞれのリードの最初と最後の５塩基内においてリファレンス配列に対して完全に同一であること、の全てを満たす場合に限り、更なる解析用に高品質なリードを選択した。同一のペアエンド内在バーコードに基づきシークエンシングリードをファミリーにグループ分けした。ワトソンに由来するファミリーメンバーの数とクリックに由来するファミリーメンバーの数を測定するために、ファミリーのメンバーを２つの考えられるシークエンシング方向へと更に再分割した。ワトソンファミリーとクリックファミリーは、向かい合わせのリード内でシークエンスされたそれぞれの末端と同一のゲノム座標を有していた。ファミリー内における同一変化の品質スコアをファミリーメンバー間の平均として計算した。それぞれのＢｏｔＳｅｑＳライブラリの出力を変化と鋳型分子（すなわち、ファミリー）の２つのテーブルにアノテートした。
高品質な変化と高品質な分子の選択
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＳＱＬ Ｓｅｒｖｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｔｕｄｉｏでカスタムアルゴリズムを作成し、それぞれのＢｏｔＳｅｑＳライブラリにおける変化テーブル及び分子テーブルを検索した。選択基準については表４４～表４８に詳細に記載されている。一般的に、選択は、品質、クローン性、及び、一塩基対置換のマッピング精度を基準としていた。例えば、全てのショートリードアライメント及び変異型コーラーが直面しているエラーの主要な原因の１つが、低複雑性領域及びコピー数変異型を含むゲノム中の反復領域に変異型をマッピングする際に生じるアーチファクトであることが知られている（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：２８４３－２８５１を参照のこと）。ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインは、反復ＤＮＡ及び構造変異型からゲノムノイズを除去することにより、この一般的なエラーを下流ステップで排除する（表４８に詳細に記載されている）。インデルがアーチファクトにアライメントする傾向があり、自然な点変異と比較して約１０倍より少なく頻繁であることから、インデルを除外した。高品質な一塩基置換を、≧Ｑ３０の平均品質スコア（ファミリー内）、≧２のリード、及び、ワトソンストランドとクリックストランドの両方における≧９０％の変異割合、を有する一塩基置換と定義した。変異型位置がその試料に由来するＷＧＳデータ中に存在する場合、または、変異型位置が＞１の鋳型分子（すなわち、両方のストランドの２つ以上のＵＩＤ）内に認められた場合に、変異型をクローンとみなした。ｄｂＳＮＰ１３０内またはｄｂＳＮＰ１４２内に存在するあらゆる位置についても除外した。ｄｂＳＮＰのフィルタリングが、再発性のシークエンシングまたはマッピングアーチファクト及び極めて変異しやすい領域を徹底的に最小化させるということに注目した。例えば、ホモポリマートラクト（≧８ｂｐ）は、変異リストをあふれさせる変異ホットスポットである。ｄｂＳＮＰ１４２におけるほぼ全てが除去されたことが認められた。最後に、＞１の変異（マッピングアーチファクト）を有するファミリーをできるだけ除外した。
変異頻度の計算
希少変異の総数をシークエンスした総ｂｐで割ることにより、それぞれのＢｏｔＳｅｑＳライブラリの変異頻度を求めた（表５１を参照のこと）。シークエンスした総ｂｐを、ファミリーの数×２×それぞれのファミリーのリード長と定義した。ライブラリの平均長は約５００ｂｐであり、その結果、１００ｂｐのペアエンドリードは重複しそうになかった。全てのリードの最初と最後の５ｂｐ内においてリファレンス配列に対して完全に同一な鋳型のみについての考察を行った。品質を確保するための除外サイクル６及び７によりリードを更にトリミングした。その結果、実際のリード長は８８塩基（１００－７－５＝８８）であった。そこからテクニカルレプリケートＢｏｔＳｅｑＳライブラリを作製した試料について、テクニカルレプリケートの平均変異頻度を試料の変異頻度とみなした。
体細胞変異の確認
核ゲノムとｍｔＤＮＡゲノムに由来する全ての希少変異は、シークエンシングリードの目視検査を通過した。希少核変異のために、代表的なセット（８７６の変異のうちの５１４）に対してサンガーシークエンシングを実施した。これらのうち、５１４のうちの５１４（１００％）について、サンガーシークエンシングでは見えないことが確認された（マッチしたＷＧＳを有していなかったＣＯＬ２３８試料及びＣＯＬ２３９試料を除く）。このことは、これらの変異が生殖細胞系内にも存在せず、極めてクローン的な様式でも存在しないことを示した。サンガーシークエンシングにより存在しないことが確認された変異については表５０に示している。
がんゲノムとの比較
１９種のＴＣＧＡ腫瘍タイプに由来する核体細胞変異を示す１９のＭＡＦファイルをｓｙｎａｐｓｅ．ｏｒｇ／＃！Ｓｙｎａｐｓｅ：ｓｙｎ１７２９３８３でダウンロードした（例えば、Ｋａｎｄｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｎａｔｕｒｅ ５０２：３３３－３３９を参照のこと）。ＴＣＧＡデータからは、一塩基置換のみについての考察を行い、極端に変異した腫瘍に由来する体細胞変異については除外した。結腸直腸腫瘍と腎臓腫瘍に由来するミトコンドリアＤＮＡ体細胞変異については、Ｊｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４ ｅＬｉｆｅ ３）の補助ファイル２から得た。
統計
試験デザインにおいて、分散が最初に未知であったために、事前の検定力分析または無作為化については実施しなかった。本試験の目的は、コホート間における主要で生物学的に有意な差異を発見することであった。主要な差異を発見するための試料数は少なくてもよい。とはいえ、たとえ試料数が少なかったとしても、分散の均一性に関する違反を含む、検査の仮定の違反は検出されなかった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ｆを使用してｔ検定及びＡＮＯＶＡ分析を実施した。Ｒバージョン３．２．２を使用してフィッシャーの正確確率検定を実施した。Ｒで主成分分析を実施した。全ての解析試料については原稿中において報告した。
結果
ＢｏｔＳｅｑＳの基礎をなす原理
ＢｏｔＳｅｑＳの主な特徴は、ＰＣＲ増幅前にあらゆるタイプのシークエンシングライブラリを希釈することである。この希釈によりボトルネックが生成され、最小量のシークエンシングでの二本鎖鋳型分子の効率的な無作為抽出が可能となる。希少変異（通常は、従来のライブラリ内において多数の野生型配列によってマスクされ得る）は、ボトルネックライブラリ内の対応するゲノム位置におけるはるかに多くのシグナルに相当する。希釈はまた、ＤＮＡ分子の「ワトソン」ストランドと「クリック」ストランドの両方が重複してシークエンスされる可能性を高めるが、このことは、高精度のＢｏｔＳｅｑＳ、及び、高精度のＢｏｔＳｅｑＳを実施するのに必要な比較的少量のシークエンシングにおいて重要な特徴である。両方のストランド上における同一希少変異の存在により、アーチファクトを大幅に減少させ特異度を上昇させることができる（例えば、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＰＮＡＳ Ｕ Ｓ Ａ １０９：１４５０８－１４５１３を参照のこと）。最後に、希釈のランダム性により、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方に由来するＤＮＡ分子を１つのライブラリで評価することが可能となる。
ＢｏｔＳｅｑＳライブラリの作製
標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅキットを使用して、３４名の個体の正常組織に由来する４４のＢｏｔＳｅｑＳライブラリを作製した（表４３）。このライブラリには、１つまたは２つのテクニカルレプリケートを有する９名の個体が含まれていた。加えて、それぞれが２～６名の個体を含有する本発明者らの１２のコホートのうちの１０は、２つ以上の生物学的複製を有していた。
ＢｏｔＳｅｑＳライブラリの調製はゲノムＤＮＡのランダムせん断で開始する（図５２）。このランダムせん断で、ゲノムを、それぞれが内在バーコードと呼ばれる固有の末端座標を有する様々なサイズのＤＮＡ分子に断片化する（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ＰＮＡＳ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）。標準的なシークエンシングアダプターのＤＮＡ分子へのライゲーションに続き、ライブラリを希釈して集団内の分子の数を減少させる。適切な希釈倍率を同定するために、ＭｉＳｅｑ装置上で１０倍希釈系列を評価した（図５３）。希釈後、ライブラリのＰＣＲ増幅により、それぞれのＤＮＡ分子の多数のコピー（複製）が生成された。ＵＩＤ（固有識別子）（例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ＰＮＡＳ Ｕ Ｓ Ａ １０８：９５３０－９５３５を参照のこと）としても周知の内在バーコードにより、シークエンシングリードのファミリーへのグループ分けが可能となるが、それぞれのファミリーは一本鎖鋳型のＰＣＲ由来後代を示し、ファミリーのそれぞれのメンバーはＩｌｌｕｍｉｎａ装置上の単一クラスターに由来する配列を示している。以下において、本発明者らは、ファミリーのそれぞれのメンバーのワトソンストランドをシークエンシング装置の第１のリードに由来する配列（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ａｄａｐｔｅｒ Ｐ５）、ファミリーのそれぞれのメンバーのクリックストランドをシークエンシング装置の第２のリードに由来する配列（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ａｄａｐｔｅｒ Ｐ７）、とみなしている（図５２）。ＢｏｔＳｅｑＳにおいて潜在的な変異とみなすには、ワトソンファミリーメンバーのうちの≧９０％及びクリックファミリーメンバーのうちの≧９０％において同一配列変化が認められ、それぞれのファミリーが少なくとも２つのメンバーで構成されていることが必要となる。それぞれ１００塩基のペアエンドリードを用いたラピッドランモードのＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００装置を使用してＢｏｔＳｅｑＳライブラリを解析した。ライブラリあたり中央で７０百万（Ｍ）のクラスター（ライブラリあたり３７～１８８Ｍのクラスターの範囲、表４３）が標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ品質フィルターを通過した。
ＢｏｔＳｅｑＳデータ処理パイプライン
ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインの目的は、希少な体細胞点変異を正確に同定して、試料中におけるこれら変異の頻度を計算することであった。この目的のためにデータを処理するために、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ヒトリファレンスゲノムにマッピングさせるＥＬＡＮＤｖ２を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａの二次解析パッケージ（ＣＡＳＡＶＡ １．８）に生シークエンシングデータを入力した。ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインは解析用の高品質なリードを選択することにより開始する（物質及び方法を参照のこと）。次に、データを、それぞれのＢｏｔＳｅｑＳライブラリ用の２つのテーブル、（ｉ）リファレンス配列に由来する全ての差異を列挙する「変化」テーブル、及び、（ｉｉ）全てのファミリーを列挙する固有分子テーブル、に編成した。重要なことに、それぞれのテーブルがストランド情報を含有している（それぞれのＢｏｔＳｅｑＳライブラリに由来する固有分子のうちのほぼ半数（中央４５％、８％～６２％の範囲）が、データセット内に示されたワトソンストランドとクリックストランドの両方を有していた）ことにより、続く変異解析における特異度が保証されている。更に、ほとんどのＢｏｔＳｅｑＳライブラリ（４４のうちの３７）が５～２０の中央数のファミリーメンバーを有しており（図５６）、ライブラリが順調なボトルネック化を受けていることが更に実証された。
希少な体細胞変異を同定するためには、ＢｏｔＳｅｑＳデータから生殖細胞系変異型及びクローン変異型を除去することが必要であった（本発明者らは、クローン変異型を、２つ以上の鋳型分子の両方のストランド内に存在する変異型と定義した）。本発明者らは、本試験における３４名の個体のうちの３２名の、同一ＤＮＡ試料、または、ＢｏｔＳｅｑＳ用に希釈されていた同一ライブラリ、の全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を実施した（表４３）。残りの２つの個体（ＣＯＬ２３８及びＣＯＬ２３９）についてはサンガーシークエンシングを実施してクローン変異型を除去したが、ＢｏｔＳｅｑＳにＷＧＳが必須ではないことが実証された。マッチしたＷＧＳデータセットから容易に同定可能であり、大多数（中央９２％、８８～９４％の範囲）の変異型が生殖細胞系であることが判明した。本発明者らは、クローン性に加えて、適切にマッピングされた位置についてのみ考察を行うことにより、またその他のフィルターを使用することにより、潜在的なアーチファクトを除去した（表４４～表４８、ならびに、物質及び方法）。両方のストランド上に変異を存在させるという条件は、このフィルターがないと、ＮＧＳライブラリ調製においてアーチファクトを示すことが知られている多数のＧ＞Ｔ塩基転換（図５７）が存在してしまうことから、実際のところ必要であった（例えば、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１：ｅ６７を参照のこと）。１名の個体の正常ＤＮＡ（ＰＥＮ９３）を別の個体の正常ＤＮＡ（ＰＥＮ９５）に２つの異なる比率で混合することにより、「スパイクイン」確認実験を更に実施した。ＢｏｔＳｅｑＳを使用すると、目的の１０倍差異の予測されたエラー内において、低スパイクインと高スパイクインの間の７．４倍の頻度差で、両方の試料中におけるＰＥＮ９３特異的ＳＮＰを検出することが可能であった（物質及び方法を参照のこと）。
４４のＢｏｔＳｅｑＳライブラリから、ｍｔＤＮＡ内と核ＤＮＡ内のそれぞれにおける、合計で６６６と８７６の希少体細胞点変異が同定された（表４９及び表５０）。全ての希少変異が目視検査を通過し、サブセットをサンガーシークエンスして、変異が生殖細胞系ではないこと、または、評価した試料中に変異が多く認められていることを確認した（物質及び方法を参照のこと）。これまでの試験から予測されるとおり、２５名の対照個体におけるｍｔＤＮＡの点変異頻度（１．４０±１．２９×１０－５の変異／ｂｐ、平均±ｓ．ｄ．）は、核ＤＮＡの点変異頻度（５．２３±３．４７×１０－７）よりも有意に高かった（両側ｔ検定、Ｐ＜０．０００１、表５１）。２．５８×１０－１２の偽陽性率を推定するための一致しない生殖細胞系ヘテロ接合性コールを使用して、ＢｏｔＳｅｑＳの特異度を更に測定した（物質及び方法を参照のこと）。
変異頻度はＤＮＡ修復能及び発がん性物質曝露によって変化する
ＢｏｔＳｅｑＳがミスマッチ修復欠損個体の正常組織内における高レベルの変異を検出できるかどうかを最初に確認した。ミスマッチ修復機構内にバイアレル不活化生殖細胞系変異を有する個体は、正常組織と腫瘍組織の両方においてより高いレベルの変異を示す（例えば、Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：７３８－７４０；及びＳｈｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４７：２５７－２６２を参照のこと）。それゆえ、Ｐｏｓｔ－Ｍｅｉｏｔｉｃ Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ２（ＰＭＳ２）遺伝子内にバイアレル不活化生殖細胞系変異を有する個体（ＣＯＬ２３８及びＣＯＬ２３９）の正常結腸上皮に由来するＤＮＡを検査した。ＢｏｔＳｅｑＳを使用すると、これら２名の同胞内における核ＤＮＡの平均変異頻度（６．６３±３．４７×１０－５の変異／ｂｐ、年齢、１６歳及び１８歳）が、優れたミスマッチ修復を有する類似した年齢の個体内における核ＤＮＡの平均変異頻度（ＣＯＬ２３５、ＣＯＬ２３６、ＣＯＬ２３７、ＣＯＬ３７４における、５．１３±１．７３×１０－７、平均年齢２４歳）よりも有意に高いことが見出された（両側ｔ検定、Ｐ＜０．０５、図５３ａ）。核変異頻度のこの１２９倍の増加は、ＰＭＳ２＋／＋コホートとＰＭＳ２－／－コホートの間における核変異スペクトルの有意な差異に関連していた（フィッシャーの正確確率検定、Ｐ＝０．０４、図５３ｂ）。
ＢｏｔＳｅｑＳが環境中の発がん性物質に曝露された個体の正常組織内における多数の変異を同定できるかどうかについても試験を行った。上部尿路上皮癌のゲノムワイドシークエンシングがこれまでに実施されており、がんのタイプがアリストロキア酸（ＡＡ）への曝露または喫煙に関連していることを示している（例えば、Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１９７ｒａ１０２を参照のこと）。ＡＡに加えてタバコの煙に含まれる変異原は正常腎皮質内で代謝されてＤＮＡ付加体を生成する（例えば、Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１９７ｒａ１０２；及びＲａｎｄｅｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８１：３４１－３４７を参照のこと）。タバコの煙またはＡＡへの既知の曝露を有さない個体（ＫＩＤ０３４、ＫＩＤ０３５、ＫＩＤ０３６、ＫＩＤ０３７、平均年齢６４歳）に由来する４つの年齢がマッチした正常腎皮質を、ＡＡに曝露されてきた３名の個体（ＡＡ＿１０５、ＡＡ＿１２４、ＡＡ＿１２６、平均年齢７９歳）に加えて、３名のヘビースモーカー（ＳＡ＿１１７、ＳＡ＿１１８、ＳＡ＿１１９、平均年齢６５歳）の正常腎皮質と比較した。喫煙者とＡＡ曝露腎臓における核点変異頻度は非曝露対照における核点変異頻度よりも有意に高く、それぞれ２７倍と３６倍であった（ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ＡＡでＰ＜０．０００１、喫煙でＰ＜０．００１）（図５３ａ）。核ゲノムにおけるこの増加した数の変異は、有意に変わった核変異スペクトルに関連していた（ボンフェローニ多重比較補正を伴うフィッシャーの正確確率検定、ＡＡでＰ＝２．５８×１０－８、喫煙でＰ＝１．５１×１０－１５）（図５３ｂ）。興味深いことに、非曝露群と曝露群の間におけるｍｔＤＮＡの点変異頻度及びスペクトルには有意差はなかったが、それにもかかわらず、それらの核ゲノムには劇的な差異があった（図５３ａ、ｂ）。
希少変異は加齢に伴い蓄積する
多方面のエビデンスが、人体が加齢に伴い無作為な変異を蓄積することを示している。本発明者らは、これらなどの差異を直接測定するためのＢｏｔＳｅｑＳを設計し、３つの正常ヒト組織のＤＮＡ内における希少点変異頻度が加齢に依存するかどうかを試験した。１１名の個体に由来する正常結腸上皮は、変異頻度が加齢に伴い有意に増加した（９１歳超で、ｍｔＤＮＡにおいて平均３０倍、核ＤＮＡにおいて平均６．１倍）ことを示した（以下及び図５４を参照のこと、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、両方においてＰ＜０．００１）。同様に、正常腎皮質においては、６４歳超で、ｍｔＤＮＡにおいて平均１９倍、核ＤＮＡにおいて平均６．５倍、変異頻度が増加した。より緩慢にではあるが、脳前頭皮質における変異頻度も加齢に伴い有意に増加した（９０歳超で、ｍｔＤＮＡにおいて７．３倍、核ＤＮＡにおいて５．７倍）（ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ｍｔＤＮＡでＰ＜０．００１、核でＰ＜０．０５）。
正常ヒト組織における希少変異頻度の一覧
Figure 2023075090000087

ｎｄ、未測定
データセット内において、３つの異なる年齢層（小児＜１０歳、成人２０～４０歳、及び、老年成人≧９０歳）の脳組織対結腸組織中における点変異頻度を直接比較することができた。興味深いことに、小児においては、結腸内における核変異頻度と脳内における核変異頻度には有意差はなかった（結腸内で１．８１±０．４５×１０－７、対、脳内で１．０６ ± ０．２７×１０－７、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｐ＞０．０５）。しかしながら、結腸内における変異頻度は、若年成人（結腸内で５．５１±１．６２×１０－７、対、脳内で２．１６±１．１１×１０－７、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）ならびに老年成人（結腸内で１．１０±０．１５×１０－６、対、脳内で６．２９±２．３１×１０－７、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１）の脳内における変異頻度よりも有意に高かった（図５８）。比較的若年の個体（小児または若年成人）においては、結腸のｍｔＤＮＡ変異頻度と脳のｍｔＤＮＡ変異頻度の間に有意差は認められなかった。しかしながら、老年個体においては、結腸内におけるｍｔＤＮＡ変異頻度は脳のｍｔＤＮＡ変異頻度よりも有意に高かった（結腸内で３．６５±１．０３×１０－５、対、脳内で１．３１±０．１８×１０－５、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）（図５８）。
ｍｔＤＮＡにおける変異パターンは核ＤＮＡにおける変異パターンとは極めて異なっている
検査したそれぞれの正常組織内における希少点変異のスペクトルを調査した。これまでの研究１２から予測されたように、ｍｔＤＮＡにおける変異では、強いストランドバイアスのあるトランジションが優位を占めていた（結腸内で９７％、腎臓内で８９％、及び、脳内で９１％）（図５４及び表４９）。３つの組織全てにおけるトランジションと塩基転換の比率は、核ＤＮＡ（平均で１．１）と比較してｍｔＤＮＡで著しく異なっていた（平均で１５．３）。
２つのゲノム間における変異頻度の差異を更に評価するために、本発明者らは、それぞれの個体におけるｍｔＤＮＡ変異頻度と核変異頻度の比率を計算した（表５１）。ｍｔＤＮＡにおける点変異頻度は、正常組織において、核ゲノムよりも平均で２４．５倍高かった（対照コホート、図５９）。曝露歴またはＤＮＡ修復欠損を有する患者では、比率は、対照コホートに由来する個体と比較してこのような個体における核（しかしミトコンドリアではない）ＤＮＡ変異の数が付随してより多いことに起因して、有意により小さかった（ボンフェローニ多重比較事後検定を伴うｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）（図５９）。
変異スペクトルは組織特異的である
ｍｔＤＮＡにおける希少変異ではトランジションが優位を占めているが、図３の円グラフから理解できる組織特異的なｍｔＤＮＡの差異が依然として存在している。例えば、正常な腎臓組織（それぞれ３６％と５３％）と比較して、正常な結腸（それぞれ５４％と４２％）及び脳（それぞれ５１％と４０％）において、ミトコンドリアのＣ：ＧからＴ：Ａへのトランジションはより顕著であり、Ａ：ＴからＧ：Ｃへのトランジションはそれほど顕著ではなかった。３つの組織全ての核ＤＮＡにおける変異スペクトルは、はるかにより多様であった。例えば、正常結腸（腎臓における２２％及び脳における２９％と比較して結腸における４４％）においてはＣ：ＧからＴ：Ａへのトランジションが優位を占めていた一方で、正常な腎臓及び脳は、その分だけより高い割合の、Ａ：ＴからＧ：Ｃへのトランジション（結腸における１５％と比較して腎臓における２５％及び脳における１９％）ならびにＡ：ＴからＣ：Ｇへの塩基転換（結腸における５％と比較して腎臓における１２％及び脳における１６％）を有していた。更に、Ａ：ＴからＴ：Ａへの塩基転換は、結腸（６％）及び脳（６％）と比較して腎臓（１６％）においてより頻繁であった。それぞれのゲノム中における変異スペクトルのペアワイズ比較により、腎臓の置換パターンと結腸の置換パターンの間の有意な差異が明らかとなった（ボンフェローニ多重比較補正を伴うフィッシャーの正確確率検定、ｍｔＤＮＡでＰ＝０．００２９、核ＤＮＡでＰ＝０．０３１２）。
正常な腎臓組織及び結腸組織内に見つかった希少変異のスペクトルをこれら組織の細胞に由来するがん内におけるクローンＤＮＡ変異と比較した（一般に利用可能な後者のデータを使用して）（例えば、Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ ｅＬｉｆｅ ３；及びＫａｎｄｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｎａｔｕｒｅ ５０２：３３３－３３９を参照のこと）。どの腫瘍タイプを比較用に使用すべきかが明確ではなかったことから、脳前頭皮質については本解析から除外した。正常及び腫瘍における変異スペクトルの間の類似性及び差異を調査するために、正常腎皮質、正常結腸上皮、明細胞腎癌及び結腸直腸癌に関するデータに由来する核スペクトル及びｍｔＤＮＡスペクトルに対して主成分分析を実施した。正常な結腸組織内における希少変異スペクトル及び正常な腎臓組織内における希少変異スペクトルが、対応するがんタイプの希少変異スペクトルに非常に類似していることが見出された（図６０）。
実施例８：Ｓａｆｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ
遺伝子変異は、例えば、それぞれ進化と疾患を含む生存と死亡における多くの局面の基礎となっている（例えば、Ｌｕｒｉａ ｅｔ ａｌ．，１９４３ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：４９１－５１１；Ｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８：６３６－６３９；Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｎａｔｕｒｅ ４６７：１０６１－１０７３；Ｓｈｉｂａｔａ，２０１１ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３２：１２３－１２８；ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５６：２６１４－２６２１；Ｅａｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７７：５５７－５６４；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５：２０４５８－２０４６３；及びＦａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５：１６２６６－１６２７１を参照のこと）。このような変異の検出、とりわけ、それら変異が集団内において支配的となる前の段階における検出は、診断及び／または治療を最適化するために不可欠であると考えられる。例えば、その全てが体細胞変異により駆動される腫瘍性病変における希少変異体検出の実施は多種多様であり、血漿を用いて評価を行う際に体細胞変異を利用して切除断端またはリンパ節における残存病変の同定を補助して治療期間のフォローを行うことができ、またおそらく、糞便、痰、血漿及びその他の体液を用いて評価を行う際に早期の外科的に治療可能な疾患を有する患者を同定することができる（例えば、Ｈｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：５７２３－５７２６；Ｔｈｕｎｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ５６：８０５－８１０；及びＤｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５：４８９－４９８を参照のこと）。
本実施例では、シークエンスデータから非常に高いレベルの精度及び感度を得るための「Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ」（Ｓａｆｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）について説明する。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳを使用して、ポリメラーゼのフィデリティ、インビトロで合成した核酸合成物の精度、及び、正常細胞の核またはミトコンドリアの核酸における変異の有病率を評価することができる。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳを使用して、モザイク及び体細胞変異を検出及び／または定量することもできる。ＷＯ２０１２／１４２２１３もまた参照されたい（その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。
物質及び方法
内在ＵＩＤ
Ｑｉａｇｅｎキットを使用してヒト膵臓または培養リンパ芽球様細胞に由来するゲノムＤＮＡを調製した。捕捉実験用に膵臓ＤＮＡを使用し、インバースＰＣＲ実験用にリンパ芽球様細胞を使用した。光学的吸収及びｑＰＣＲによりＤＮＡを定量した。超音波せん断（Ｃｏｖａｒｉｓ）により約２００ｂｐの平均サイズへとＤＮＡを断片化してから、末端修復、Ａテール付加を行い、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａプロトコルに従いＹ形状のアダプターにライゲートした。それぞれの鋳型分子の末端は、末端の染色体位置に対応する内在ＵＩＤを提供する働きをする。プライマー配列を用いたアダプターの内側におけるライブラリのＰＣＲ介在増幅の後、６種のがん遺伝子に対応する２，５９４のｎｔを含有するフィルターを用いてＤＮＡを捕捉した。捕捉後、１８サイクルのＰＣＲを実施して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩｘ装置上でシークエンスするのに十分な量の鋳型を確保した。
インバースＰＣＲ実験（図６５）用に、本発明者らは、標準的なＹ形状のＩｌｌｕｍｉｎａアダプターの代わりにカスタムアダプター（ＩＤＴ、表５７）をせん断細胞ＤＮＡにライゲートした。これらのアダプターは、ユニバーサルシークエンシングプライマーに対して相補的な領域を維持しているが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩｘフローセルへのハイブリダイゼーションに必要なグラフト配列を欠いていた。ライゲートＤＮＡを９６ウェル中に希釈し、１２のインデックス配列のうちの１つをその５’末端に含有する固有フォワードプライマーに加え、標準的なリバースプライマー（表５７）を用いて、それぞれのカラムの８ウェル中のＤＮＡを増幅した。１× Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦバッファー、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、それぞれ０．５ｕＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー（両方５’－リン酸化）、ならびに、１ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを含有する５０ｕＬの反応液を入れた、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｉ（ＮＥＢ）を使用して、増幅を実施した。以下のサイクリング条件、９８℃で３０秒間を１サイクル、及び、９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、を１６サイクル、を使用した。９６の反応液全てをプールしてから、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ｃａｔ．ｎｏ．２８００４）及びＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ｃａｔ．ｎｏ．２８７０４）を使用して精製した。インバースＰＣＲに必要な環状鋳型を調製するために、ＤＮＡを約１ｎｇ／ｕＬに希釈し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を用い、１× Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ及び１８，０００ＵのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを含有する６００ｕＬの反応液中、室温で３０分間ライゲートした。Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅキットを使用してライゲーション反応液を精製した。１× Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、それぞれ０．５ｕＭのＫＲＡＳフォワードプライマー及びＫＲＡＳリバースプライマー（表５７）、ならびに、１ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼをそれぞれが含有する１２の５０ｕＬ反応液中に分散した９０ｎｇの環状鋳型を入れた、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｉを使用して、インバースＰＣＲを実施した。ＫＲＡＳ特異的プライマーは両方共、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩｘフローセルへのハイブリダイゼーション用のグラフト配列を含有していた（表５７）。以下のサイクリング条件、９８℃で２分間を１サイクル、及び、９８℃で１０秒間、６１℃で１５秒間、７２℃で１０秒間、を３７サイクル、を使用した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて最後の精製を実施し、２０ｕＬのＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ中に溶出した。得られたＤＮＡフラグメントは、３つの配列（２つは元の断片化フラグメントの２つの末端で表される内在配列、及び、インデックス増幅中に導入された外来配列）で構成されるＵＩＤを含有していた。１２の外来配列を使用したことから、これにより、外来ＵＩＤを用いずに得られた異なるＵＩＤの数と比較して、異なるＵＩＤの数が１２倍増加した。より多い数の異なるプライマーを使用することにより、この数を容易に増加させることができた。
外来ＵＩＤ
Ｑｉａｇｅｎキットを使用して正常なヒト結腸粘膜または血液リンパ球に由来するゲノムＤＮＡを調製した。結腸粘膜に由来するＤＮＡをＣＴＮＮＢ１及びミトコンドリアＤＮＡに関する実験用に使用する一方で、リンパ球ＤＮＡをＣＴＮＮＢ１、及びポリメラーゼのフィデリティに関する実験用に使用した。ヒト細胞に由来する単一コピー遺伝子（ポリメラーゼのフィデリティ及びＣＴＮＮＢ１の解析）を増幅するプライマーを使用したＤｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ（ミトコンドリアＤＮＡ）、または、光学的吸収（オリゴヌクレオチド）を用いて、ＤＮＡを定量した。本文中及び図６３に記載のとおりに、２サイクルのアンプリコン特異的ＰＣＲを使用して、それぞれの鋳型分子のそれぞれのストランドを１２または１４塩基のＵＩＤでコードした。アンプリコン特異的プライマーは両方共、それらの５’末端に後の増幅ステップのためのユニバーサルタグ配列を含有していた。ＵＩＤは、フォワードアンプリコン特異的プライマーの５’末端に付加された１２または１４のランダムヌクレオチド配列で構成されていた（表５７）。これらのプライマーにより、それぞれ１６．８百万と２６８百万の異なるＵＩＤを生成することができる。２つの異なる元の鋳型が同一のＵＩＤを獲得する確率を最小化するために、異なるＵＩＤの数が元の鋳型分子の数を大幅に超過していることが重要である。ＵＩＤ割当てＰＣＲサイクルは、１× Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦバッファー、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、それぞれ０．５ｕＭのフォワードプライマー（１２～１４Ｎを含有する）及びリバースプライマー、ならびに、２ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを含有する４５ｕＬの反応液を入れた、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ（ＮＥＢ）を含んでいた。最終鋳型濃度を＜１．５ｎｇ／ｕＬに維持するために、複数のウェルを使用していくつかのライブラリを作製した。以下のサイクリング条件、９８℃で３０秒間の１インキュベーション（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩを活性化させるため）、及び、９８℃で１０秒間、６１℃で１２０秒間、７２℃で１０秒間、を２サイクル、を採用した。第１ラウンドのプライマーの完全な除去を確実とするために、６０Ｕの一本鎖ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｉ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を用いてそれぞれのウェルを３７℃で１時間消化した。９８℃での５分間の熱失活後、導入ユニバーサルタグに対して相補的なプライマー（表５７）をそれぞれ０．５ｕＭの終濃度となるように加えた。これらのプライマーは、あらゆる残存Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｉ活性に対する抵抗性をそれらプライマーに持たせるための２つの末端ホスホロチオエートを含有していた。それらプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩｘフローセルへのハイブリダイゼーションに必要な５’グラフト配列も含有していた。最後に、それらプライマーは、グラフト配列とユニバーサルタグ配列の間にインデックス配列を含有していた。このインデックス配列により、複数の異なる個体に由来するＰＣＲ産物をシークエンサーの同一フローセルコンパートメント内で同時に解析することが可能となる。続く２５サイクルのＰＣＲ用に以下のサイクリング条件、９８℃で１０秒間、及び、７２℃で１５秒間、を使用した。鋳型分子のロスを抑制するために中間精製ステップは実施しなかった。
第２ラウンドの増幅後、ウェルを集約してから、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ｃａｔ．ｎｏ．２８１０４）を使用して精製し、５０ｕＬのＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中に溶出した。アガロース（ｍｔＤＮＡライブラリ）またはポリアクリルアミド（全てのその他のライブラリ）のゲル電気泳動の後に、予測されたサイズのフラグメントを精製した。アガロースゲル精製用に、製造業者の指示どおり、８つの６ｕＬアリコートを２％Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェル中に入れて、予測されたサイズのバンドをＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ中に回収した。ポリアクリルアミドゲル精製用に、１０の５ｕＬアリコートを１０％ＴＢＥ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェル中に入れた。他の箇所に記載のとおりに（例えば、Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｎａｔｕｒｅ ４６７：１０６１－１０７３を参照のこと）、目的のフラグメントを含有するゲルスライスを切り出し、粉砕し、溶出した。
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのフィデリティの解析
上記のＰＣＲ条件を使用して、ＢＭＸ（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿２０３２８１．２）遺伝子内におけるヒトゲノムＤＮＡのフラグメントの増幅を最初に実施した。９６ウェルＰＣＲプレートの全１０ウェル内に平均で１つの鋳型分子が存在することになるように鋳型を希釈した。次に、１× Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦバッファー、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、それぞれ０．５ｕＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー（表５７）、ならびに、２ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを入れた、５０ｕＬのＰＣＲ反応を実施した。サイクリング条件は、９８℃で３０秒間を１サイクル、及び、９８℃で１０秒間、６１℃で１２０秒間、７２℃で１０秒間、を１９サイクル、であった。６０ＵのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｉを用いて３７℃で１時間消化することによりプライマーを除去してから、９８℃での５分間の熱失活を行った。Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｉ消化の前または後のいずれかにおけるＰＣＲ産物の精製は実施しなかった。次に、それぞれのウェルの全内容物を上記の外来ＵＩＤ戦略用の鋳型として使用した。
シークエンシング
製造業者の指示どおりにＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩｘ装置を使用して、上記の全ライブラリのシークエンシングを実施した。それぞれの実験に使用したリードの合計長は３６～７３塩基と様々であった。Ｅｌａｎｄパイプライン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて塩基コーリング及び配列アライメントを実施した。以下の基準、（ｉ）最初の２５塩基が標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ純度フィルターを通過すること、（ｉｉ）リード内の全ての塩基が≧２０の品質スコアを有すること、及び、（ｉｉｉ）予測配列に対して≦３のミスマッチであること、を満たす高品質なリードのみを続く解析用に使用した。外来ＵＩＤライブラリ用に、本発明者らは、≧３０の品質スコアを有するＵＩＤを追加で必要とした。標準的なＩｌｌｕｍｉｎａプロトコルを用いて調製した内在ＵＩＤライブラリ内におけるリードの末端に、おそらくせん断または末端修復中に導入されたと思われる比較的高頻度のエラーが認められたことから、これらのタグの最初と最後の３塩基を解析から除外した。
Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ解析
リードの内在ＵＩＤまたは外来ＵＩＤに基づき高品質なリードをＵＩＤファミリーにグループ分けした。２つ以上のメンバーを有するＵＩＤファミリーのみについて考察を行った。このようなＵＩＤファミリーには大多数（≧９９％）のシークエンシングリードが含まれていた。通常の解析とＳａｆｅ－ＳｅｑＳ解析の両方に同一のデータが使用されることを確保するために、１つのメンバーのみを含有するＵＩＤファミリーについても通常の解析から除外した。更に、通常のシークエンシング解析では、通常の解析と外来ＵＩＤを用いたＳａｆｅ－ＳｅｑＳの解析を比較した際に、少なくとも１つのＵＩＤファミリーの少なくとも２つのメンバーに同一の変異型（すなわち、２つの変異）が同定された場合にのみ、塩基を「変異体」と同定した。内在ＵＩＤを用いたＳａｆｅ－ＳｅｑＳとの比較用に、本発明者らは、通常の解析において位置を「変異体」と同定するのに、２つのＵＩＤファミリーのそれぞれにおける少なくとも２つのメンバー（すなわち、４つの変異）を必要とした。内在ＵＩＤまたは外来ＵＩＤのいずれかを用いて、超変異体を、メンバーの≧９５％が同一の変異を共有するＵＩＤファミリーと定義した。それゆえ、＜２０のメンバーを有するＵＩＤファミリーは変異位置において１００％同一でなければならない一方で、より多くのメンバーを有するＵＩＤファミリーでは複製エラー率とシークエンシングエラー率の合算の５％が許容された。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳを使用してポリメラーゼのフィデリティを同定するために、また、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのフィデリティに関する以前の解析の結果を比較するために、以前の解析がＰＣＲ産物の両方のストランド内に存在する変異を検出し得るにすぎない（例えば、Ｓｈｉｂａｔａ，２０１１ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３２：１２３－１２８を参照のこと）ということを認識する必要があった。このことは、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳよりも１回少ないサイクルで生成されたＰＣＲ産物を解析することに相当し得、表５３Ａにおける適切な補正を行った。特に明記しない限り、本文及び表に列挙する全ての値は平均及び標準偏差を示している。
結果
内在ＵＩＤ
バーコードまたはインデックスと呼ばれることもあるＵＩＤを、様々な方法で核酸フラグメントに割り当てることができる。これらの方法としては、ＰＣＲまたはライゲーションによる外来配列の導入が挙げられる。更により簡便に言うと、ランダムにせん断されたゲノムＤＮＡは本質的に、それぞれせん断されたフラグメントの２つの末端の配列で構成されるＵＩＤを含有している（図６２及び図６５）。これらフラグメントのペアエンドシークエンシングにより、上記のように解析することができるＵＩＤファミリーが得られる。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳにおいてこのような内在ＵＩＤを採用するために、２つの別々のアプローチ（一方は多くの遺伝子を同時に評価するように設計され、もう一方は単一の遺伝子フラグメントを深度で評価するように設計された（それぞれ図６２と図６５））を使用した。
複数の遺伝子を評価するために、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターをせん断ＤＮＡフラグメントの末端にライゲートして標準的なシークエンシングライブラリを作製してから、固相上に目的の遺伝子を捕捉した。この実験では、約１５，０００の正常細胞のＤＮＡで作製したライブラリを使用し、６種の遺伝子に由来する２，５９４ｂｐを捕捉の標的とした。既知の一塩基多型を除外した後、２．４×１０－４±の変異／ｂｐに相当する２５，５６３の明らかな変異についても同定を行った（表５２）。ヒト細胞内の変異率に関するこれまでの解析を基準とすると、これらの明らかな変異のうちの少なくとも９０％は、鋳型調製及びライブラリ調製中に導入された変異または塩基コーリングエラーを示していると考えられた。本発明者らが塩基コーリングに極めて厳密な基準を使用していることから、本明細書において同定したエラー率（２．４×１０－４の変異／ｂｐ）が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ装置を使用した実験で一般的に報告されているエラー率と比較して大幅に低いということに留意されたい。
同一データのＳａｆｅ－ＳｅｑＳ解析では、この実験で６９，５０５の元の鋳型分子を評価する（すなわち、１ファミリーあたり４０のメンバーを有する６９，５０５のＵＩＤファミリーを同定、表５２）ことが決定された。通常の解析により同定された多型変異型の全てについてもＳａｆｅ－ＳｅｑＳによる同定を行った。しかしながら、これらのファミリー間には、３．５×１０－６の変異／ｂｐに相当するわずか８つの超変異体が認められた。それゆえ、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳでは、推定上のシークエンシングエラーが少なくとも７０倍減少した。
Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ解析は鋳型のどちらのストランドが変異しているかを同定することもできることから、変異をコールするための別の基準は、変異が元々の二本鎖鋳型の一方のストランドのみに生じているかまたは両方のストランドに生じているかを必要とし得る。超並列シークエンサーは、２つの連続リードにおける鋳型の両方の末端から配列情報を得ることができる。（このタイプのシークエンシング実験はＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で「ペアエンド」ランと呼ばれているが、その他のシークエンシングプラットフォーム上で類似した実験を行うことができ、それらの実験は別の名称で呼ばれる場合がある。）二本鎖鋳型の２つのストランドは、配列の観察方向、及び、両方の末端から配列情報が得られた際に配列が出現する順番により区別することができる。例えば、ＵＩＤストランドペアは、鋳型のそれぞれの末端が連続リードでシークエンスされる場合、以下の２グループの配列、１）第１のリードにおける２番染色体の１００位から始まるセンス方向の配列に続いて、第２のリードにおける２番染色体の４００位から始まるアンチセンス方向の配列、及び、２）第１のリードにおける２番染色体の４００位から始まるアンチセンス方向の配列に続いて、第２のリードにおける２番染色体の１００位から始まるセンス方向の配列、で構成され得る。上記の捕捉実験では、目的の領域内における６９，５０５のＵＩＤのうちの４２，２２２（２１，１１１の元の二本鎖分子を示している）がＵＩＤストランドペアを示した。これら４２，２２２のＵＩＤは、目的の領域内における１，４１７，８３８の塩基を包含していた。ＵＩＤストランドペア内（一方のストランド内かまたは両方のストランド内かにかかわらず）においてのみ変異を生じさせると、２つの超変異体が認められ、１．４×１０－６の超変異体／ｂｐの変異率が得られた。ＵＩＤストランドペアのうちの一方のストランド内においてのみ変異を生じさせると、わずか１つの超変異体が認められ、７．１×１０－７の超変異体／ｂｐの変異率が得られた。ＵＩＤストランドペアのうちの両方のストランド内において変異を生じさせると、わずか１つの超変異体が認められ、７．１×１０－７の超変異体／ｂｐの変異率が得られた。それゆえ、鋳型の一方のストランド内においてのみ、または、両方のストランドにおいて、変異を生じさせると、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳの特異度を更に上昇させることができる。
内在ＵＩＤを採用する戦略を使用して、目的の単一領域のディープシークエンシングをする際の偽陽性変異を減少させることもできる。この場合、約１，７５０の正常細胞から上記のとおりに調製したライブラリを、目的の遺伝子に対して相補的なプライマーを採用するインバースＰＣＲ用の鋳型として使用することにより、ＰＣＲ産物をシークエンシング用に直接使用することが可能となった（図６５）。通常の解析では、平均で２．３×１０－４の変異／ｂｐが認められ、捕捉実験において認められた変異／ｂｐに類似していた（表５２）。この実験において、正常細胞に由来するわずか１，０５７の独立した分子をＳａｆｅ－ＳｅｑＳ解析を介して同定することにより評価したことを考慮すると、通常の解析で認められた全ての変異は偽陽性を示したと考えられる（表５２）。同一データのＳａｆｅ－ＳｅｑＳ解析では、いかなる位置においても超変異体は同定されなかった。
外来ＵＩＤ
上記の結果はＳａｆｅ－ＳｅｑＳが超並列シークエンシングの信頼性を向上させることが可能であることを示しているが、内在ＵＩＤを使用して調査可能な異なる分子の数には限りがある。１５０ｂｐの平均サイズ（１２５～１７５の範囲）にせん断されたフラグメントでは、３６塩基のペアエンドシークエンシングは、特定の変異を含有する最多で約７，２００の異なる分子を評価することができる（２つのリード×２方向×３６塩基／リード×フラグメントのいずれかの末端上の５０の塩基バリエーション）。実際には、せん断プロセスが完全にはランダムではないことから、ＵＩＤの実数はより少ない。
元の鋳型をより効率的に使用するために、最小限の数の酵素ステップを採用するＳａｆｅ－ＳｅｑＳ戦略を開発した。この戦略はまた、例えば、臨床標本中に存在する、または、シトシンメチル化の検査用のバイサルファイト処理後に存在する、劣化または損傷したＤＮＡの使用を可能とした。図６３に示すように、この戦略は２セットのＰＣＲプライマーを採用している。第１のセットは、標準的なホスホラミダイト前駆体を用いて合成され、３’末端上に目的の遺伝子に対して相補的な配列、及び、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方の５’末端に異なるテールを含有していた。異なるテールにより、次ステップにおけるユニバーサル増幅が可能となった。最後に、フォワードプライマー内におけるテールと配列特異的ヌクレオチドの間の、１２～１４のランダムヌクレオチドのストレッチが存在していた。ランダムヌクレオチドはＵＩＤを形成している。本研究では使用していない、ＵＩＤをフラグメントに割り当てるための同等の方法は、マイクロアレイ上で合成した１０，０００のフォワードプライマー及び１０，０００のリバースプライマーを採用し得る。これら２０，０００のプライマーのそれぞれは、それらの３’末端に遺伝子特異的プライマー、及び、それらの５’末端に１０，０００の特定で所定の非重複ＵＩＤ配列のうちの１つを有し得、１０８（すなわち、［１０４］２）の考えられるＵＩＤの組み合わせを可能としている。いずれの場合も、プライマー及びハイフィデリティポリメラーゼを用いた２サイクルのＰＣＲを実施し、それぞれの元の鋳型分子の２つのストランドのそれぞれから、固有にタグ付けした二本鎖ＤＮＡフラグメントを作製する（図６３）。残りの未使用ＵＩＤ割当てプライマーについては、更なる精製を行うことなく、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼを用いた消化により除去し、２つの新しいプライマーを加える。このような消化に代えてまたはそれに加えて、より大きなサイズのフラグメントを選択的に保持するシリカカラムを使用してもよく、または、より大きなフラグメントを選択的に保持してより小さな非特異的な増幅アーチファクトを除去する条件下で固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズを使用してもよい。この精製は、後のステップにおいてプライマー二量体蓄積を低下させるのに潜在的に役立ち得る。ＵＩＤ割当てサイクル中に導入したテールに対して相補的な新しいプライマーは、それらプライマーの５’末端に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ装置上における固相増幅を可能とするグラフト配列を含有しており、それらプライマーの３’末端に、あらゆる残存エキソヌクレアーゼに対する抵抗性をそれらプライマーに持たせるためのホスホロチオエート残基を含有している。追加の２５サイクルのＰＣＲ後の産物をＩｌｌｕｍｉｎａ装置に入れる。以下に示すように、この戦略により、本発明者らが入力フラグメントの大部分を評価して、いくつかの例示的な実験にそれらを使用することが可能となった。
ＤＮＡポリメラーゼのフィデリティの解析
ＤＮＡポリメラーゼのエラー率の測定値は、ＤＮＡポリメラーゼの特性解析に不可欠であり、これらの酵素を使用可能な状況を決定する。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼがあらゆる市販の酵素において報告された最も低いエラー頻度のうちの１つを有しており、その結果、インビトロベースのアプローチにおける特定の課題を有していることから、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのエラー率を測定した。恣意的に選択したヒト遺伝子のセグメントを含む単一のヒトＤＮＡ鋳型分子を１９ラウンドのＰＣＲで最初に増幅した。これらの増幅に由来するＰＣＲ産物の全てを図６３に記載のＳａｆｅ－ＳｅｑＳ用の鋳型として使用した。このタイプの７つの独立した実験では、シークエンシングにより同定されたＵＩＤファミリーの数は６２４，６７８±４２１，２７４であり、ＰＣＲのラウンドあたり９２±９．６％の増幅効率と一致していた。
β－ガラクトシダーゼをコードするＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングして細菌に形質転換することにより推定したＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのエラー率については、製造業者が４．４×１０－７のエラー／ｂｐ／ＰＣＲサイクルと報告している。極めて厳密性の高い塩基コーリングであっても、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングデータの通常の解析は９．１×１０－６のエラー／ｂｐ／ＰＣＲサイクルの明白なエラー率を明らかにし、それは、報告されたＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのエラー率よりも１桁超高かった（表５３Ａ）。それに対し、同一データのＳａｆｅ－ＳｅｑＳは４．５×１０－７のエラー／ｂｐ／ＰＣＲサイクルのエラー率を明らかにし、それは、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのバイオアッセイにおいて測定されたエラー率とほぼ同一であった（表５３Ａ）。これらエラーの大多数（＞９９％）は一塩基置換であり（表５４Ａ）、その他の原核細胞ＤＮＡポリメラーゼにより生成された変異スペクトルに関するこれまでのデータ（Ｔｉｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．１９８８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：６００８－６０１３；ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１８：１８１－１９１；Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：３７３９－３７４４）と一致していた。
Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳはまた、異なる変異イベントの総数の同定、及び、変異が生じるＰＣＲサイクルの推定を可能とした。これらの実験においては、単一の鋳型分子を含有するウェルにおいて実施された１９サイクルのＰＣＲがあった。ポリメラーゼのエラーがサイクル１９で生じた場合、生成された超変異体（変異を含有するストランドから）は１つのみとなり得る。エラーがサイクル１８で生じた場合、２つの超変異体（サイクル１９で生成された変異ストランドに由来する）となるはず、などである。それゆえ、エラーが生じたサイクルは、そのエラーを含有する超変異体の数に関連している。７つの独立した実験に由来するデータは、認められた比較的一定数の総ポリメラーゼエラー（２．２±１．１×１０－６の異なる変異／ｂｐ）を示しており、シミュレーションで認められた予測数（１．５±０．２１×１０－６の異なる変異／ｂｐ）と十分に一致している。データはまた、実験間におけるポリメラーゼエラー発生タイミングの大幅なばらつきを示している（表５５）。同一の次世代シークエンシングデータの通常の解析を使用してこの種の情報を導き出すのは、上記の途方もなく高い明らかな変異率が一因となり、困難である。
オリゴヌクレオチド組成物の解析
通常のＰＣＲまたはクローニングなどのほとんどの用途においては、ホスホラミダイト前駆体からオリゴヌクレオチドを合成する際中における少数のミスは許容される。しかしながら、多くのオリゴヌクレオチドを互いに連結させる必要のある合成生物学においては、このようなミスは成功に対する重大な障害をもたらす。遺伝子構築プロセスをより効率的とするための巧みな戦略が考案されている（例えば、Ｋｏｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８：１２９５－１２９；及びＭａｔｚａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８：１２９１－１２９４を参照のこと）が、このような戦略の全ては、オリゴヌクレオチド自体のより精度の高い合成から恩恵を受けている場合がある。合成したオリゴヌクレオチド内におけるエラーの数を同定することは、エラーを含有するオリゴヌクレオチドの割合が通常の次世代シークエンシング解析の感度と比較してより低い場合があることから、困難である。
この同定にＳａｆｅ－ＳｅｑＳが使用可能かどうかを確認するために、標準的なホスホラミダイト化学反応を使用して、上記のポリメラーゼのフィデリティに関する実験において解析されたオリゴヌクレオチドと同一となるように設計された３１の塩基を含有するオリゴヌクレオチドを合成した。合成オリゴヌクレオチド内において、３１の塩基は、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳのＵＩＤ割当てステップに使用可能なプライマーに対して相補的な配列に囲まれていた（図６３）。約３００，０００のオリゴヌクレオチドに対してＳａｆｅ－ＳｅｑＳを実施することにより、８．９±０．２８×１０－４の超変異体／ｂｐが存在し、これらのエラーがオリゴヌクレオチド中にわたり生じていることが見出された（図６６Ａ）。オリゴヌクレオチドは多数の挿入エラー及び欠失エラーを含有しており、それぞれ８．２±０．６３％と２５±１．５％の総超変異体を示していた。重要なことに、エラーの位置と内容の両方は、同一バッチのオリゴヌクレオチドに対して実施されたこの実験の７つの独立した複製間において大いに再現可能であった（図６６Ａ）。エラーのこの内容と分布には、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼにより生成されたエラーの内容と分布（図６６Ｂ及び表５６）との共通点がほとんどなく、複製実験間において予測された確率的パターンで分布していた。ホスホラミダイトを用いて合成したオリゴヌクレオチド内におけるエラーの数は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼにより合成された同等の産物内におけるエラーの数よりも約６０倍多かった。これらのデータは全体として、前者におけるエラーの大多数がＳａｆｅ－ＳｅｑＳ処理中ではなくオリゴヌクレオチドの合成中に生じたことを示している。
Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳは元の鋳型における変異配列：正常配列の比率を維持しているであろうか？この疑問に対処するために、ｎｔ１５を除いて配列が同一である３１塩基のオリゴヌクレオチド（５０：５０ Ｃ／Ｇ（Ｔの代わり））を２つ合成し、３．３％と０．３３％の公称変異／通常割合でそれらを混合した。オリゴヌクレオチド混合物のＳａｆｅ－ＳｅｑＳ解析により、比率がそれぞれ２．８％と０．２７％であることが見出された。それゆえ、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳで使用したＵＩＤ割当て手順及び増幅手順は変異型配列の比率を大幅に変えることはなく、その結果、既知ではない場合において、信頼性の高い割合の推定をもたらす。このことはまた、独立したＳａｆｅ－ＳｅｑＳ実験で解析した際における変異型割合の再現性により裏付けられている（図６６Ａ）。
正常ヒト細胞に由来するＤＮＡ配列の解析
次に、外来ＵＩＤ戦略（図６３）を使用して、３名の非血縁個体に由来する約１００，０００の正常ヒト細胞に由来するＣＴＮＮＢ１遺伝子の小さな領域における希少変異の有病率を同定した。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ実験で得られたＵＩＤファミリーの数（表５３Ｂ）と比較することにより、入力フラグメントの大多数（７８±９．８％）がＵＩＤファミリーに変換されたことを計算した。平均で６８メンバー／ＵＩＤファミリーが存在し、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳに求められる冗長性を容易に満たした（図６７）。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングデータの通常の解析により、試料あたりにおいて解析した約５６０Ｍｂの配列中の平均１１８，４８８±１１，３５７の変異が明らかとなり、２．１±０．１６×１０－４の変異／ｂｐの明らかな変異有病率と一致していた（表５３Ｂ）。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ解析では平均でわずか９９±７８の超変異体が認められた。超変異体の大多数（＞９９％）は一塩基置換であり、計算された変異率は９．０±３．１×１０－６の変異／ｂｐであった（表５４Ｂ）。その結果、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳは、ゲノムＤＮＡ内における明らかな変異の頻度を少なくとも２４倍低下させた（図６４）。
Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳの特異度を上昇させるための１つの可能性のある戦略は、複数のウェルでライブラリ増幅（場合により、ＵＩＤ割当てサイクル）を実施することである。標準的なＰＣＲプレートを使用したわずか２または３８４ほどものウェルを用いて、または、マイクロ流体デバイスを使用する場合にはより多くのウェルにスケールアップして（数千から数百万）、この戦略を実施してもよい。この方法を実施する場合、鋳型を増幅するウェルに固有の鋳型にインデックス配列を導入してもよい。その結果、希少変異は、両方が同一ウェルのインデックス配列を有する２つの超変異体（すなわち、それぞれのストランドから１つ）を誘発するはずである。上記のＣＴＮＮＢ１鋳型に対して外来ＵＩＤを用いたＳａｆｅ－ＳｅｑＳを実施して１０ウェルに希釈すると（それぞれのウェルは、異なるインデックス配列で増幅された鋳型を生じる）、変異率は９．０±３．１×１０－６から３．７±１．２×１０－６の超変異体／ｂｐへと更に低下した。それゆえ、複数のコンパートメント内で鋳型を解析すること（鋳型を増幅するコンパートメントに基づいて、個別にコードされた鋳型を生じさせるような方法で）は、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳの特異度を上昇させるための別の戦略となり得る。
ミトコンドリアＤＮＡに由来するＤＮＡ配列の解析
７名の非血縁個体のそれぞれに由来する約１，０００の細胞内におけるミトコンドリアＤＮＡの短いセグメントに同一の戦略を適用した。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ処理で作製したＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングライブラリ（図６３）の通常の解析により、試料あたりにおいて解析した約１５０Ｍｂの配列中の平均３０，５９９±１２，９７０の変異が明らかとなり、２．１±０．９４×１０－４の変異／ｂｐの明らかな変異有病率と一致していた（表５３Ｃ）。Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ解析ではわずか１３５±６１の超変異体が認められた。ＣＴＮＮＢ１遺伝子の場合と同様に、変異の大多数は一塩基置換であったが、ところどころ一塩基欠失も認められた（表５４Ｃ）。ｍｔＤＮＡの解析セグメント内における計算された変異率は１．４±０．６８×１０－５の変異／ｂｐであった（表５３Ｃ）。その結果、Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳは、ゲノムＤＮＡ内における明らかな変異の頻度を少なくとも１５倍低下させた。
実施例９：異数性の検出と組み合わせた遺伝的バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーの検出
遺伝的バイオマーカー（ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／または、ＧＮＡＳ）及びタンパク質バイオマーカー（ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、及び／または、ＭＰＯ）の存在について、多数の患者に由来する試料を検査した。異数性の存在についても、本明細書に記載のＷＡＬＤＯ法を使用して同一の試料を検査した。結果については表５９に示している。理解され得るように、遺伝的バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーの検査は異数性検査を補完することができ（例えば、一部の患者が遺伝的バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーの検査に対して陰性である一方で、異数性に対して陽性であり、逆の場合もまた同様）、その結果、両方の検査を使用して、がんの存在をより精度高くより完全に検出することが可能となる。
遺伝的バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーの検査、異数性検査、または、その両方により、がんを有すると対象が一旦同定されると、その対象は、更なる診断検査及び／または追加モニタリング（例えば、本明細書に記載の様々な更なる診断検査法及び／または追加モニタリング法のいずれか）を受けてもよく、及び／または、治療介入（例えば、本明細書に記載の様々な治療介入のいずれか）を実施されてもよい。
参照文献
以下の特定の参照文献について本明細書で言及している。以下の参照文献におけるそれぞれの内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
・ＡｌＨｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ．Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２５，１０９－１１３（２０１２）．
・Ａｌｌｅｎ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｕｌｔｉ－ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｃｈａｎｇｅｓ ｆｏｒ Ｔ ａｎｄ Ｎ Ｓｔａｇｉｎｇ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２６５（１）：１８５－１９１．
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・Ｆｒｏｋｊａｅｒ ＪＢ，Ｏｌｅｓｅｎ ＳＳ，＆ Ｄｒｅｗｅｓ ＡＭ（２０１３）Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ａｔｒｏｐｈｙ，ａｎｄ ｄｕｃｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍｓ．Ｐａｎｃｒｅａｓ ４２（７）：１１８２－１１８７．
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・Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｏ ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２１１，２６－３５（２００７）．
・Ｌｅｎｎｏｎ ＡＭ ＆ Ｇｏｇｇｉｎｓ Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ ６７５－７０１．
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・Ｓｃｏｔｔ ＧＡ，Ｌａｕｇｈｌｉｎ ＴＳ，Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ＰＧ（２０１４）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ ２７：５１６－５２３．
・Ｓｅｍｒａｄ ＴＪ，Ｆａｈｒｎｉ ＡＲ，Ｇｏｎｇ ＩＹ，＆ Ｋｈａｔｒｉ ＶＰ（２０１５）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２２ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ８５５－８６２．
・Ｓｅｒｉｚａｗａ ＲＲ，Ｒａｌｆｋｉａｅｒ Ｕ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｋ，Ｌａｍ ＧＷ，Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌ Ｓ，Ｓｃｈｕｚ Ｊ，Ｈａｎｓｅｎ ＡＢ，Ｈｏｒｎ Ｔ，Ｇｕｌｄｂｅｒｇ Ｐ（２０１０）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＦＧＦＲ３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．
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・Ｓｋａｃｅｌ Ｍ，Ｆａｈｍｙ Ｍ，Ｂｒａｉｎａｒｄ ＪＡ，Ｐｅｔｔａｙ ＪＤ，Ｂｉｓｃｏｔｔｉ ＣＶ，Ｌｉｏｕ ＬＳ，Ｐｒｏｃｏｐ ＧＷ，Ｊｏｎｅｓ ＪＳ，Ｕｌｃｈａｋｅｒ Ｊ，Ｚｉｐｐｅ ＣＤ，Ｔｕｂｂｓ ＲＲ（２００３）Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｄｅｔｅｃｔｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｔｙｐｉｃａｌ ｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｕｒｏｌ １６９：２１０１－２１０５．
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・Ｓｔｅｒｎ ＪＬ，Ｔｈｅｏｄｏｒｅｓｃｕ Ｄ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ，Ｃｅｃｈ ＴＲ（２０１５）Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｓｗｉｔｃｈ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，ａｎｄ ｍｏｎｏａｌｌｅｌｉｃ ＴＥＲＴ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２９：２２１９－２２２４．
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・Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ６６２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｐ ｔｅｓｔ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｔｙｐｉｃａｌ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ａｃａｄｅｍｉｃ ｗｏｍｅｎｓ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１４，３８３－３８９（２００９）．
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Claims (52)

  1. 対象における膵臓癌の存在を同定するための方法であって、
    前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
    前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、または、オステオポンチン（ＯＰＮ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
    前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
    １つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象における膵臓癌の存在を同定すること、
    を含む、前記方法。
  2. 前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項１に記載の方法。
  4. ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ及びＳＭＡＤ４のそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１に記載の方法。
  5. 糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）のそれぞれのレベルを検出する、請求項１に記載の方法。
  6. ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
    ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
    ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
    を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項１に記載の方法。
  9. 対象におけるがんの存在を同定するための方法であって、
    前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
    前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、または、ＭＰＯのうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
    前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
    １つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象におけるがんの存在を同定すること、
    を含む、前記方法。
  10. 前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項９に記載の方法。
  12. ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項９に記載の方法。
  13. ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１及びＭＰＯのそれぞれの前記レベルを検出する、請求項９に記載の方法。
  14. ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
    ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
    ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
    を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項９に記載の方法。
  15. 前記がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である、請求項９に記載の方法。
  16. 前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項９に記載の方法。
  17. 前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項９に記載の方法。
  18. 対象におけるがんの存在を同定するための方法であって、
    前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
    前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ、または、ＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
    前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
    １つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象におけるがんの存在を同定すること、
    を含む、前記方法。
  19. 前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項１８に記載の方法。
  21. ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１８に記載の方法。
  22. ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、フォリスタチン、Ｇ－ＣＳＦ及びＣＡ１５－３のそれぞれの前記レベルを検出する、請求項１８に記載の方法。
  23. ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
    ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
    ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
    を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である、請求項１８に記載の方法。
  25. 前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項１８に記載の方法。
  26. 前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項１８に記載の方法。
  27. 対象におけるがんの存在を同定するための方法であって、
    前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
    前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１、または、ＣＡ１５－３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
    前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
    １つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象におけるがんの存在を同定すること、
    を含む、前記方法。
  28. 前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項２７に記載の方法。
  30. ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項２７に記載の方法。
  31. ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ－１及びＣＡ１５－３のそれぞれの前記レベルを検出する、請求項２７に記載の方法。
  32. ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
    ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
    ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
    を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項２７に記載の方法。
  33. 前記がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である、請求項２７に記載の方法。
  34. 前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項２７に記載の方法。
  35. 前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項２７に記載の方法。
  36. 対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法であって、
    前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
    前記対象から採取した第２の生体試料中のＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在を検出すること、
    前記対象から採取した第３の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び
    １つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記ＴＥＲＴプロモーター内における前記少なくとも１つの変異の存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、これらの組み合わせの場合に、前記対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定すること、
    を含む、前記方法。
  37. 前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、
    前記第１の生体試料と前記第３の生体試料は同一である、
    前記第２の生体試料と前記第３の生体試料は同一である、または、
    前記第１の生体試料と前記第２の生体試料と前記第３の生体試料は同一である、
    請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、前記第３の生体試料は、尿試料である、請求項３７に記載の方法。
  39. 染色体腕５ｑ、８ｑ、または、９ｐのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する、請求項３６に記載の方法。
  40. ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ及びＶＨＬのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項３６に記載の方法。
  41. ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
    ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
    ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
    を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、前記ＴＥＲＴプロモーター内における前記少なくとも１つの変異の存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する、請求項３６に記載の方法。
  43. 前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項３６に記載の方法。
  44. 対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法であって、
    前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
    前記対象から採取した第２の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び
    １つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、その両方の場合に、前記対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定すること、
    を含む、前記方法。
  45. 前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記第１の生体試料または前記第２の生体試料は、子宮頸部試料または子宮内膜試料である、請求項４５に記載の方法。
  47. 染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、または、９ｑのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する、請求項４４に記載の方法。
  48. ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ及びＣＤＫＮ２Ａのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項４４に記載の方法。
  49. ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
    ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
    ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
    を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項４４に記載の方法。
  50. 前記対象から採取した循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料中において、以下の遺伝子、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、または、ＴＰ５３のうちの１つまたは複数における少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーの存在を検出することを更に含む、請求項４４に記載の方法。
  51. 前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する、請求項４４に記載の方法。
  52. 前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項４４に記載の方法。
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