JP6876062B2 - 自動ダイセクション、次世代シークエンシング、及び自動スライド染色装置を用いる、腫瘍のための予測診断ワークフロー - Google Patents

自動ダイセクション、次世代シークエンシング、及び自動スライド染色装置を用いる、腫瘍のための予測診断ワークフロー Download PDF

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Description

関連相互出願
2016年1月26日出願の米国仮出願第62/287,182号の利益が、本出願において主張され、その内容の全体が、参照により本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、予測バイオマーカーのアッセイを行い、かつ/又はがんのための治療を選択するための、自動スライド染色装置、自動ダイセクションツール、及び/又は次世代シークエンサーの使用に関する。
関連技術の記載
過去20年間に、がんの研究及び治療は、急激な変化を経験してきた。およそ5億ドルから10億ドルかかったヒトゲノムの最初のシークエンシングのコストに対し、次世代シークエンシング(NGS)ストラテジーは、そのコストを2000ドル未満に削減しており、そのことで、大規模かつ比較的安価ながん遺伝学の判定を可能にしている。Reuter et al.を参照されたい。これらの進歩は、新規の治療及び診断の標的が同定され開発される速度を加速している:2014年だけでも、FDAは、その多くが標的治療である、計51件の新規分子化合物及び新規バイオ製品を承認した。FDA白書を参照されたい。
このような開発が治療の状況を確実に改善しているとは言え、がんは、相変わらず実に強靭である。その天然の不均一性により、腫瘍は、今なお頻繁に、過去に効果的だった治療法に耐性をもつようになる。Sun & Yuを参照されたい。この問題を効果的かつ効率的に解決する診断ワークフローは、未だ実現されていない。
いくつかの診断ワークフローは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)及びNGSを用いて、同定されている。Amemiya et al.;AB Brochure; Zhang et al.を参照されたい。これらの手順は、通常、LCMシステムを用いて腫瘍から腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を分離して採集し、採集した細胞からゲノムDNA(gDNA)又はRNAを抽出し、かつ特定の遺伝子座をシークエンシングして腫瘍細胞及び正常細胞におけるがん関連変異を同定することを含む。腫瘍細胞における変異は、腫瘍細胞において過剰に呈示される変異を同定するため、非腫瘍細胞における変異と比較される。これらの方法は、腫瘍で呈示される変異の概観をもたらし得るとは言え、変異の空間的関連性、又はいかに変異が機能的な見地から相互に関連づけられているか、については何も情報をもたらさない。
この開示は、概して、がんの診断及び治療法の選択における、自動ダイセクションツール及び/又は次世代シークエンシング(NGS)プラットフォームの使用に関する。
第1の治療剤に応答しないと予測される腫瘍試料の領域が自動ダイセクションツールを用いて試料から切り出され、予測バイオマーカーと相関する変異が切り出される領域中でNGSを用いて検出され、かつ腫瘍の更なる試料がNGSにより同定される1つ又は複数の予測バイオマーカーについて染色される方法が、提供される。
本明細書に記載される方法を実行するためのシステムは、細胞試料、核酸試料、自動ダイセクションツール、NGSシステム、自動スライド染色装置、画像スキャナー及び解析システム、並びに臨床検査情報システムの様々な組み合わせを含めて提供される。
本明細書で開示される方法及びシステムにおける使用のための診断試料のセットは、腫瘍の細胞試料を含むスライド及びそのようなスライドの特定の領域から取得される核酸試料を含めて提供される。
前記の他の発明及び実施形態が、本明細書に記載される。
本明細書で開示されるプロセスについての例示的なワークフローを示すフローチャートである。長方形のボックスは、試料で実行されるプロセスを示す。ひし形のボックスは、評価ステップを示す。八角形のボックスは、治療の決定又は治療ステップを示す。 本明細書で開示される画像解析コンポーネントを含む、例示的なシステムである。 臨床検査情報システム(LIS)及び任意選択の画像解析コンポーネントを含む、例示的なシステムである。円及び楕円は、システムの潜在的な試料コンポーネントを示す。正方形及び長方形は、システムの、試料操作、データ解析、及びデータストレージのコンポーネントを示す。五角形は、本システムからのデータの出力を示す。破線は、代替のワークフローを示す。 図4は、本明細書で開示される方法及びシステムによって評価された、前立腺腫瘍からの一連のIHC画像である。第1の試料は、PTENについて染色された。切り出し及び変異解析のためのROIは、PTEN染色画像において、「o」記号で輪郭を描かれている。第2の試料は、EGFR及びHER2について染色された。 本明細書で開示されるような方法及びシステムによって評価された、前立腺腫瘍からの一連のIHC画像である。第1の試料は、PTENについて染色された。切除及び変異解析のためのROIは、PTEN染色画像において、「o」記号で輪郭を描かれている。第2の試料は、EZH2について染色された。 本明細書で開示される方法及びシステムによって評価された、肺腫瘍からの一連のIHC画像である。第1の試料は、EGFR L858Rについて染色された。切り出し及び変異解析のためのROIは、EGFR L858R染色画像において、「o」記号で輪郭を描かれている。第2の試料は、p53について染色された。
I.定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4th ed. 2007);Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y.1989)を参照されたい。用語「ある」(「a」又は「an」)は、「1つ又は複数」を意味することを意図される。用語「含む」(「comprise」、「comprised」、及び「comprising」)は、ステップ又は要素の列挙に先立つ場合、更なるステップ又は要素の追加が任意選択であり、かつ排斥されないことを意味することを意図される。
抗体:本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含むがそれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
抗体断片:抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’);ダイアボディ;線形抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されない。
バイオマーカー:本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、生体試料又は生体試料を取得される対象を特徴づけするために使用され得る、生体試料において見出される任意の分子又は分子のグループを指すこととする。例えば、バイオマーカーは、存在、不在、又は比存在度が:
・特定の細胞若しくは組織の、タイプ若しくは状態の特徴を示す;
・特定の病理学的状況若しくは状態の特徴を示す;又は
・疾患状態の重篤度、疾患状態の進行若しくは退行の可能性、及び/又は疾患状態が特定の治療に応答する可能性を示す
分子又は分子のグループであり得る。別の例では、バイオマーカーは、細胞のタイプ若しくは微生物(細菌、マイコバクテリア、真菌、ウイルスなど)、又は置換分子若しくはその分子のグループであり得る。
バイオマーカー特異的試薬:細胞試料中の1つ又は複数のバイオマーカーに直接、特異的に結合することを可能とする、1次抗体などの特異的検出試薬
細胞試料:本明細書で使用される場合、用語「細胞試料」は、病理学的、組織学的、又は細胞学的解釈のために取得される、細胞培養物、体液試料、又は外科標本などのインタクトな細胞を含む任意の試料を指す。
検出試薬:「検出試薬」は、細胞試料中のバイオマーカー特異的試薬付近に染色を沈着するために使用される、任意の試薬である。非限定的な例には、バイオマーカー特異的試薬(1次抗体など)、2次検出試薬(1次抗体に結合可能な2次抗体など)、3次検出試薬(2次抗体に結合可能な3次抗体など)、バイオマーカー特異的試薬に直接又は間接に結合する酵素、そのような酵素と反応して蛍光性又は発色性の染色の沈着をもたらす化学物質などが含まれる。
検出可能部分:試料上に沈着される検出可能部分の存在(即ち定性分析)及び/又は濃度(即ち定量分析)を示す、(視覚的に、電子的に又は他の方法で)検出可能なシグナルを産生し得る分子又は材料。検出可能なシグナルは、光子(ラジオ周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数、及び紫外周波数の光子を含む)の吸収、放出、及び/又は散乱を含む、任意の既知又は未発見の機構により生成され得る。用語「検出可能部分」には、発色性、蛍光性、リン光性、及び発光性の分子及び物質、検出可能な差異を提供するために(例えば無色の物質を着色物質に変換すること若しくはその逆により、又は沈殿物を産生すること若しくは試料濁度を上昇することにより)ある物質を別の物質に変換する触媒(酵素など)が含まれる。いくつかの例では、検出可能部分は、クマリン、フルオレセイン(又はフルオレセイン誘導体及び類似体)、ローダミン、レゾルフィン、発光団、及びシアニンを含むいくつかの一般的な化学的クラスに属する、蛍光団である。蛍光分子の更なる例は、Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR, TheroFisher Scientific, 11thEditionで、見出される。他の実施形態では、検出可能部分は、ジアミノベンジジン(DAB),4−(ジメチルアミノ)アゾベンゼン−4’−スルホンアミド(DABSYL),テトラメチルローダミン(DISCOVERY Purple),N,N’−ビスカルボキシペンチル−5,5’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン(Cy5),及びローダミン110(ローダミン)を含む色素などの、明視野顕微鏡を介して検出可能な分子である。
組織化学的検出:組織試料の構造間の横断切片関係において、バイオマーカー又は他の構造の顕微鏡検出を許容する方法で、検出試薬で組織試料中のバイオマーカー又は他の構造を染色することを含むプロセス。例には、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の免疫組織化学(IHC)、発色性のin situハイブリダイゼーション(CISH)、蛍光性のin situハイブリダイゼーション(FISH)、銀in situハイブリダイゼーション(SISH)、及びヘマトキシリン・エオジン(H&E)染色が含まれる。
モノクローナル抗体:実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、即ち、集団を構成する個々の抗体は、例えば天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、一般的に少量存在する、存在し得るバリアント抗体を除いて、同一であり、かつ/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)を対象とする異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部若しくは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法、又はそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない、様々な技術によって作製され得る。
予測バイオマーカー:細胞試料における染色パターンが、特定の治療コースが効果的である可能性、又は他の治療コースが効果的でない可能性を示す、バイオマーカー。
試料:本明細書で使用される場合、用語「試料」は、バイオマーカーの存在又は不在について試験可能な対象から取得される、任意の材料を指すこととする。
2次検出試薬:バイオマーカー特異的試薬に特異的に結合可能な特異的検出試薬。
切片:名詞として使用される場合、通常ミクロトームを用いて切断される、顕微鏡解析に適する、組織試料の薄いスライス。動詞として使用される場合、切片を生成するプロセス。
連続切片:本明細書で使用される場合、用語「連続切片」は、組織試料からミクロトームによって順番に切断される一連の切片の何れか1つを指すこととする。2つの切片が互いの「連続切片」と見なされるために、それらは、組織からの連続する切片であることを必ずしも要しないが、それらは、形態学によって互いに合致され得る、同じ横断切片関係における同じ組織構造を全体に含まなければならない。
特異的検出試薬:細胞試料における標的化学構造に特異的に結合することができる、任意の物質組成物。本明細書で使用される場合、語句「特異的に結合すること」、「に特異的に結合する」、若しくは「特異的に」又は他の類似の繰り返しは、生体分子を含む不均一性の分子集団の存在下における標的の存在の決定因子である、標的と特異的検出試薬の間の測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、ある標的に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも、より高いアフィニティー、アヴィディティーで、より迅速に、かつ/又は長い間、この標的に結合する抗体である。ある実施形態では、無関係の標的に対する特異的検出試薬の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)によって測定される場合、標的に対する抗体の結合の約10%未満である。特定の実施形態では、標的に結合するバイオマーカー特異的試薬は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、又は≦0.1nMの解離定数(Kd)を有する。別の実施形態では、特異的な結合は、排他的な結合を含み得るが、それを要しない。例示的な特異的検出試薬には、特定のヌクレオチド配列に特異的な核酸プローブ;抗体及びその抗原結合断片;並びにADNECTIN(第10FN3フィブロネクチンベースのスカフォールド;Bristol−Myers−Squibb Co.)、AFFIBODY(黄色ブドウ球菌由来のプロテインAのZドメインベースのスカフォールド;Affibody AB、Solna、Sweden)、AVIMER(ドメインA/LDL受容体ベースのスカフォールド;Amgen、Thousand Oaks、CA)、dAb(VH又はVL抗体ドメインベースのスカフォールド;GlaxoSmithKline PLC、Cambridge、UK)、DARP(アンキリンリピートタンパク質ベースのスカフォールド;Molecular Partners AG、Zurich、CH)、ANTICALIN(リポカリンベースのスカフォールド;Pieris AG、Freising、DE)、NANOBODY(VHH(ラクダ科のIg)ベースのスカフォールド;Ablynx N/V、Ghent、BE)、TRANS−BODY(トランスフェリンベースのスカフォールド;Pfizer Inc.、New York、NY)、SMIP(Emergent Biosolutions、Inc.、Rockville、MD)、及びテトラネクチン(C型レクチンドメイン(CTLD)ベースのスカフォールド、テトラネクチン;Borean Pharma A/S、Aarhus、DK)を含む改変された特異的結合合成物が含まれる。このような改変された特異的結合構造体の説明は、Wurch et al., Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 9, pp. 502-509 (2008)で、概説されており、その内容が、参照により援用される。
染色:名詞として使用される場合、用語「染色」は、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡等を含む顕微鏡観察のために、細胞試料中の特定の分子又は構造を可視化するために使用され得る、任意の物質を指すこととする。動詞として使用される場合、用語「染色」は、細胞試料上に染色の沈着をもたらす、任意のプロセスを指すこととする。
対象:本明細書で使用される場合、用語「対象」又は「個体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、及びげっ歯類(例えば、マウス及びラット)を含むが、それらに限定されない。特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
組織試料:本明細書で使用される場合、用語「組織試料」は、試料が取得された対象内に存在していた時の細胞間の横断切片空間関係を保持する細胞試料を指すこととする。
腫瘍試料:腫瘍から取得される細胞試料。
II.略称
1°:第1の
2°:第2の
5−FU:5−フルオロウラシル
CISH:発色性in situハイブリダイゼーション
FFPE:ホルマリン固定パラフィン包埋
FISH:蛍光性in situハイブリダイゼーション
gDNA:ゲノムDNA
H&E:ヘマトキシリン・エオジン
IHC:免疫組織化学
ISH:in situハイブリダイゼーション
LCM:レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
LIS:臨床検査情報システム
MPS:大量並列シークエンシング
NA:核酸
NGS:次世代シークエンシング
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
ROI:対象領域
SISH:銀in situハイブリダイゼーション
SNP:一塩基多型
III.がん治療選択の方法及びがん治療の方法
ある実施形態では、治療選択のプロセスは、組織化学染色、自動ダイセクション、及び次世代シークエンシングのステップを含めて提供される。治療コースを選択するための典型的なワークフローが、図1に図解される。
A.試料及び試料の染色
腫瘍試料が、取得され、腫瘍試料の第1の部分(以下「第1の試料」又は「1°試料」と呼称)が、第1の治療剤101のための第1の予測バイオマーカー(「第1の予測バイオマーカー」又は「1°予測バイオマーカー」と呼称)について染色される。
通常、腫瘍試料は、組織試料である。特定の実施形態では、腫瘍試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料である。現在知られていようが将来的に知られようが、任意の予測バイオマーカーが、使用され得る。例えば、予測バイオマーカーは、化学療法、標的療法、放射線療法、又はそれらの組み合わせへの応答を予測し得る。例示的な予測バイオマーカーが、表1に開示される:
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多くのリソースが、予測バイオマーカー及びそれらが関連する治療法を同定するために利用可能である。1つの例は、ヴァンダービルト・イングラムがんセンターが管理するウェブサイト「mycancergenome.org」である。更に、FDAは、コンパニオン診断及び補完的診断の最新の承認に関するウェブサイトを管理している。特定の実施形態では、少なくとも第1の予測バイオマーカーが、標的療法について予測する。別の実施形態では、予測バイオマーカーは、標的治療についてのコンパニオン診断に用いる。
腫瘍試料は、通常、いくつかの部分に分けられ、顕微鏡スライドなどの、顕微鏡解析のための媒体に固定される。試料が組織試料である場合、いくつかの部分は、組織切片であり得る。いくつかの実施形態では、連続切片は、FFPE組織試料から取得される。いくつかの実施形態では、連続切片は、FFPEブロックの複数の異なる部位から取得されるが、それは切片内不均一性及びブロック内不均一性の両方をキャプチャ−するためになされ得る。いくつかの実施形態では、連続切片は、同一腫瘍内の異なる位置から取得される複数の異なる生検試料から取得されるが、それは切片内不均一性及び腫瘍内不均一性の両方をキャプチャーするためになされ得る。
染色は、通常、組織化学染色である。組織化学染色技術は、通常、バイオマーカー特異的試薬と対象のバイオマーカーとの間の特異的結合を許容するのに十分な条件下で、バイオマーカー特異的試薬に試料を接触させることを含む。バイオマーカーへのバイオマーカー特異的試薬の結合は、バイオマーカーを含む場所付近で、試料上の検出可能部分の沈着を促進する。検出可能部分は、特異的検出試薬が対象とするバイオマーカーを位置決めし、かつ/又は定量化するために使用され得る。それによって、試料中の標的の存在及び/又は濃度は、検出可能部分により産生されるシグナルを検出することにより検出され得る。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、バイオマーカー特異的試薬に直接コンジュゲートされ、従ってバイオマーカー特異的試薬のその標的への結合の際に、試料上に沈着される(一般に直接標識法と呼称される)。直接標識法は、しばしばより直接的な定量化が可能であるが、しばしば感度の欠如に悩まされる。他の実施形態では、検出可能部分の沈着は、バイオマーカー特異的試薬に結合する検出試薬の使用によって実施される(一般に間接標識法と呼称される)。間接標識法は、バイオマーカー特異的試薬の付近に沈着することができる検出可能部分の数を増加させるので、特に色素と組み合わせて使用する場合に、直接標識法よりしばしば感度が高い。
いくつかの実施形態では、検出可能部分がバイオマーカー特異的試薬に局在化される酵素反応を介して沈着される間接的方法が、使用される。そのような反応に適する酵素は、周知であり、酸化還元酵素、加水分解酵素、及びペルオキシダーゼを含むが、それらに限定されない。明示的に含まれる特定の酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、及びβ−ラクタマーゼである。酵素は、バイオマーカー特異的試薬に直接的にコンジュゲートされることもあり得るし、又は標識コンジュゲートを介してバイオマーカー特異的試薬に間接的に結合されることもあり得る。本明細書中で使用される場合、「標識コンジュゲート」は:
(a)特異的検出試薬;及び
(b)特異的検出試薬にコンジュゲートされる酵素であって、組織試料上で色素のin situ生成及び/又は色素の沈着をもたらすのに適する反応条件下において、発色基質、シグナル伝達コンジュゲート、又は酵素反応性色素と反応性である酵素。
を含む。非限定的な例において、標識コンジュゲートの特異的検出試薬は、2次検出試薬(1次抗体に結合される種特異的二次抗体、ハプテンコンジュゲートバイオマーカー特異的試薬に結合される抗ハプテン抗体、又はビオチン化バイオマーカー特異的試薬に結合されるビオチン結合タンパク質など)、3次検出試薬(2次抗体に結合される種特異的3次抗体、ハプテンコンジュゲート2次バイオマーカー特異的試薬に結合される抗ハプテン抗体、又はビオチン化2次バイオマーカー特異的試薬に結合されるビオチン結合タンパク質など)、又は他のそのような構成体であり得る。このようにして試料結合バイオマーカー特異的試薬に局在化される酵素は、その後、検出可能部分を沈着する多くのスキームで使用され得る。
いくつかの場合で、酵素は発色性化合物/基質と反応する。特定の発色性化合物/基質の例には、4−ニトロフェニルホスフェート(pNPP)、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート(BCIP)、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、BCIP/NBT、ファストレッド、APオレンジ、APブルー、テトラメチルベンジジン(TMB)、2,2’−アジノ−ジ−[3−エチルベンゾチアゾリン スルホネート](ABTS)、o-ジアニシジン、4−クロロナフトール(4−CN)、ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド (ONPG)、o−フェニレンジアミン(OPD)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β-ガラクトピラノシド(X−Gal)、メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトピラノシド(MU−Gal)、p−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド(PNP)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β-D−グルクロニド(X−Gluc)、3−アミノ−9−エチル カルバゾール(AEC)、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム(INT)、テトラゾリウムブルー、又はテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
いくつかの実施形態では、酵素は、金属組織学的検出スキームで使用され得る。金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン及び酵素のレドックス不活性な基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することを含む。いくつかの実施態様では、いくつかの実施態様では、基質は、酵素によってレドックス活性剤に変換され、レドックス活性剤は、金属イオンを還元して、検出可能な沈殿物の形成を引き起こす。(例えば、2004年12月20日出願の米国特許出願第11/015,646号、PCT公開第2005/003777号、及び米国特許出願公開第2004/0265922号を参照されたい;これらの各々は、その全体が本明細書に参照により援用される。)金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に酸化還元酵素(西洋ワサビペルオキシダーゼなど)を用いて、検出可能な沈殿物を再度形成することを含む。(例えば、その全体が本明細書に参照により援用される、米国特許第6,670,113号を参照されたい。)
いくつかの実施形態では、酵素作用が、酵素と色素自体との間で生じ、反応が、色素を非結合の種から試料に沈着される種に変換する。例えば、ペルオキシダーゼ(西洋ワサビペルオキシダーゼなど)とのDABの反応は、DABを酸化し、その沈殿を引き起こす。
更に他の実施形態では、検出可能部分は、酵素と反応して試料又は他の検出成分に結合することができる反応種を形成するように構成される、潜在的な反応性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートを介して沈着される。これらの反応種は、これらの発生の付近、すなわち酵素の近傍で試料と反応可能であるが、非反応性種に速やかに変換する結果、シグナル伝達コンジュゲートは、酵素が沈着される部位から遠位の部位には沈着されない。潜在的な反応性部分の例には、WO2015124703A1に記載されるものなどのキノンメチド(QM)類似体、及びWO2012003476A2に記載されるものなどのチラミドコンジュゲートが含まれ、これらの各々は、その全体が本明細書に参照により援用される。いくつかの例で、潜在的な反応性部分は、N、N’−ビスカルボキシペンチル−5,5’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン(Cy5)、4−(ジメチルアミノ)アゾベンゼン−4’−スルホンアミド(DABSYL)、テトラメチルローダミン(DISCO Purple)、及びローダミン110(ローダミン)などの色素に直接コンジュゲートされる。他の例では、潜在的な反応性部分は、特異的結合対の一方のメンバーにコンジュゲートされ、かつ色素は、特異的結合対の他方のメンバーに連結される。他の例では、潜在的な反応性部分は、特異的結合対の一方のメンバーに連結され、かつ酵素は、特異的結合対の他方のメンバーに連結され、その酵素は、(a)発色基質と反応して色素の生成をもたらすか、又は(b)色素と反応して色素(DABなど)の沈着をもたらす。特異的結合対の例には、以下が含まれる:
(1)潜在的な反応性部分に連結されるビオチン又はビオチン誘導体(デスチオビオチンなど)、及びビオチン結合体(アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシル化アビジン(NEUTRAVIDINなど)など)、又は色素にか、発色基質と反応性若しくは色素と反応性の酵素(例えば、色素がDABの場合における、ビオチン結合タンパク質に連結されるペルオキシダーゼ)に連結される、ビオチン結合部位にニトロチロシンを有するビオチン結合タンパク質(CAPTAVIDINなど);並びに
(2)潜在的な反応性部分に連結されるハプテン、及び色素に又は発色基質と反応性か若しくは色素と反応性の酵素(例えば、色素がDABの場合における、ビオチン結合タンパク質に連結されるペルオキシダーゼ)に連結される抗ハプテン抗体。
特定の実施形態では、第1の予測バイオマーカーは、タンパク質であり、かつ染色方法は、組織化学的タンパク質染色法(免疫組織化学又はタンパク質バイオマーカーに特異的な他の実体を用いる類似の手法など)を含む。いくつかの実施形態では、第1の予測バイオマーカーは、核酸であり、かつ染色方法は、核酸プローブを用いる組織化学染色法(in situハイブリダイゼーション(ISH)など)を含む。他の実施形態では、他のタイプのバイオマーカーが、それらのバイオマーカーのための特異的結合剤をしようして用いて検出され得る。例えば、ヒアルロナン(HA)は、特定の腫瘍のタイプに共通して蓄積する、アニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。HAは、通常、アフィニティー組織化学技術を用いて検出され、そこでは特異的結合剤が、HA結合タンパク質(ヒアルロナン結合タンパク質(ユニプロット番号Q07021)又はTNF刺激遺伝子6(ユニプロット番号P98066)など)とイムノグロブリンFc領域又は特異的結合対の一員(ビオチンなど)との融合タンパク質である。
本方法での使用に適する、商業的に入手可能な検出試薬又は検出試薬を含むキットの非限定な例には、以下が含まれる:VENTANA ultraView検出システム(HRP及びAPを含む酵素にコンジュゲートされる2次抗体);VENTANA iVIEW検出システム(ビオチン化抗種2次抗体及びストレプトアビジンコンジュゲート酵素);VENTANA OptiView検出システム(OptiView)(ハプテンにコンジュゲートされる抗種2次抗体及び酵素多量体にコンジュゲートされる抗ハプテン3次抗体);VENTANA増幅キット(先述のVENTANA検出システムのいずれかを用いて、1次抗体結合部位に沈着される酵素の数を増幅することができる、非コンジュゲート2次抗体);VENTANA OptiView増幅システム(ハプテンにコンジュゲートされる抗種2次抗体、酵素多量体にコンジュゲートされる抗ハプテン3次抗体、及び同じハプテンにコンジュゲートされるチラミド)。使用時には、2次抗体は、1次抗体に結合させるため、試料に接触される。次に、試料は、二次抗体に酵素を結合させるため、抗ハプテン抗体とインキュベートされる。試料は、次に、更なるハプテン分子を沈着させるため、チラミドとインキュベートされる。試料は、次に、更なる酵素分子を沈着させるため、抗ハプテン抗体と再度インキュベートされる。試料は、次に、検出可能部分;VENTANA ultraView ISH検出システム(ハプテン化核酸プローブ及び抗ハプテン1次抗体と共に使用するための、HRP及びAPを含む酵素にコンジュゲートされる2次抗体を含むキット);VENTANA ISH iVIEW検出システム(ハプテン化核酸プローブ及び抗ハプテン1次抗体;ビオチン化抗種2次抗体及びストレプトアビジンコンジュゲート酵素と共に使用するための);いずれもVentana Medical Systems、Inc.(Tucson、Arizona)から入手可能な、VENTANA DISCOVERY、DISCOVERY OmniMap、DISCOVERY UltraMap抗ハプテン抗体、2次抗体、発色原、蛍光色素、及び色素のキット;PowerVision及びPowerVision+ IHC検出システム(HRP又はAPと直接重合して、抗体に対する酵素の高い比率をもつコンパクトなポリマーを生じる2次抗体);及びDAKO EnVisionTM+システム(2次抗体にコンジュゲートされている酵素標識ポリマー)と、色素の沈着を引き起こすためにインキュベートされる。
B.不均一性の解析及び治療の選択
図1に立ち戻ると、ひとたび、第1試料が第1の予測バイオマーカー101について染色されれば、それは、不均一性102について判定される。この状況で、不均一性は、染色される試料の異なる部分が第1の薬剤への応答の差を示す染色パターンを有するかどうかに基づいて判定される。腫瘍中の異なる場所又はFFPE組織ブロック中の異なる場所からの複数の切片が、第1の予測バイオマーカーについて評価される場合、もし任意の切片が不均一性の染色パターンを示すのであれば、試料は、「不均一性」とみなされるであろう。この文脈で、用語「第1の薬剤」又は「1°薬剤」は、第1の予測バイオマーカーが予測する治療コースを指すこととする。
試料が不均一性でない(即ち、腫瘍の第1の部分の全体が、同じ応答を示す染色パターンを有する)場合、ユーザーは、染色パターンを評価して、腫瘍が第1の薬剤103に応答する可能性が高いかどうかを判定する。答えがイエスであれば、対象は、第1の薬剤104で治療される。答えがノーであれば、腫瘍領域が、第1の試料中の対象領域(ROI)としてマークされ、ROIが、自動ダイセクションツールに移され、ROIが、十分な数の非染色の第1の試料の連続切片から自動ダイセクションツールで切り出され、核酸試料が、切り出される試料105から生成される。この文脈において、「十分な数」は、次世代シークエンシング(NGS)プロセスを実行するのに十分な材料を提供するのに少なくとも十分な切片を意味することとする。核酸試料は、更なる予測バイオマーカー(「第2の予測バイオマーカー」又は「2°予測バイオマーカー」と呼称する)106と相関する変異の存在について、NGSによって判定される。ユーザー(病理学者など)が、変異解析に基づいて第2の予測バイオマーカーを選択し、腫瘍の更なる部分(「第2の試料」又は「2°試料」と呼称する)が、第2の予測バイオマーカーについて染色され、かつ1つ又は複数の染色パターンが、腫瘍が1つ又は複数の第2の薬剤107に応答する可能性が高いかどうかを決定するために解析される。この文脈において、用語「第2の薬剤」又は「2°薬剤」は、第2の予測バイオマーカーが予測する治療コースを指すこととする。腫瘍が応答する可能性のある1つ又は複数の第2の薬剤は、治療候補108として選択される。ある実施形態では、第2の試料は、試料の第1の部分の連続切片である。
試料が不均一性である(即ち、腫瘍の第1の部分が、腫瘍の残部と異なる応答を示す少なくとも1つの領域における染色パターンを有する)場合、応答の欠如を示す染色パターンを有する第1の試料の領域が、ROIとしてマークされ、ROIが、自動ダイセクションツールに移され、ROIが、第1の試料の十分な数の非染色の連続切片から自動ダイセクションツールで切り出され、かつ核酸サンプルが、切り出される試料109から生成される。核酸試料は、更なる予測バイオマーカー(「第2の予測バイオマーカー」又は「2°予測バイオマーカー」と呼称する)110と相関する変異の存在についてNGSにより判定される。ユーザー(病理学者など)が、変異解析に基づいて二次予測バイオマーカーを選択し、腫瘍の更なる部分(「第2の試料」又は「2°試料」と呼称する)が、二次予測バイオマーカーについて染色され、かつ1つ又は複数の染色パターンが、腫瘍が1つ又は複数の第2の薬剤111に応答する可能性が高いかどうかを決定するために解析される。腫瘍が応答する可能性のある1つ又は複数の第2薬剤は、治療候補112として選択される。ある実施形態では、第2試料は、試料の第1部分の連続切片である。
IV.システム
ある実施形態では、システムが、本明細書に記載の方法を実行するために提供される。ある実施形態では、本明細書に記載の方法を実行するように適合されているシステムが、自動ダイセクション装置、NGSプラットフォーム、及び/又は自動スライド染色プラットフォームの1つ又は複数を含めて提供される。システムは、染色されるスライドの染色パターンを評価するための、かつその画像をキャプチャーし保存するための画像解析システム、並びに/又は試料とワークフローを追跡し、試料についての診断情報を保存し、かつ/又は試料に実行されるアッセイについての指示を追跡するか若しくは提供するためのLISを含み得る。
A.自動ダイセクションツール
自動ダイセクションツールは、スライドから組織を自動的に切り出す装置である。典型的な自動ダイセクションツールは、2つの主要なコンポーネントを有する:(1)組織の非対象領域を実質的に取り出すことなくROIを正確に切り出す方法でスライド上の組織に作用する、組織取出しコンポーネント;及び(2)ユーザーがスライドの画像中で切り出しのための領域を選択することを可能とし、かつ組織取出しコンポ―ネントをガイドする、コンピューターに実装されるガイダンスシステム。自動ダイセクションツールは、一般に、2つのカテゴリー:レーザーマイクロダイセクション及びメソダイセクションに分類される。
レーザーマイクロダイセクションツールは、通常、顕微鏡及びレーザービーム(赤外及び/又は紫外領域の波長を有する)を含む。様々なレーザーマイクロダイセクション技術の総説は、Legres et al.で見出すことができる。ユーザーが、ガイダンスシステムから切り出しのための細胞を選択し、レーザーが、ROIを囲う領域を切断し、そしてROIの細胞が、取出される。
メソダイセクションツールは、基本的に組織粉砕器である。典型的なデザインでは、スライドは、X及びY軸を制御するステージ上に置かれる。組織が、スライドから所望の切片を切断するために回転する切断ビットに押し付けられ、切断された切片が、スライドから取り出される。メソダイセクションツールの例は、Adey et al.に記載される。Adeyにより記載される例では、同時にスライド上に液体を吐出しかつスライドから液体を吸引する切断ビットが、使用されている。組織が切断されると、それは、液体中に懸濁され、吸引される液体と共に吸引される。ユーザーが切り出しのために組織切片をデジタル的にアノテートすることを可能とするソフトウェアシステムが、提供される。ある実施形態では、自動ダイセクションツールは、メソダイセクションツールである。
B.次世代シークエンシングシステム
本明細書で使用される場合、「次世代シークエンシング解析プラットフォーム」は、大量並列シークエンシング(MPS):数百万から数十億の短い読み取り断片(数十から数百の塩基長)の同時シークエンシングに基づく、任意の核酸シークエンシングプラットフォームである。MPSは、通常、18時間のサイクル毎に、少なくとも10Mbpの出力を達成し得る。NGSプラットフォームは、(1)テンプレートの作成方法;及び(2)MPSを実行するプロセスに基づく、カテゴリーに、広く分類され得る。表2は、テンプレートの作成方法のいくつかの例を含む。
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表3は、MPSのストラテジーのためのいくつかの例を含む。
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ある実施形態において、NGS法は、表2又は表3からの1つ又は複数の技術を含む。
C.自動スライド染色装置
いくつかの実施形態では、システムは、自動スライド染色プラットフォームを含む。自動化スライド染色装置は、通常、少なくとも:染色プロトコルで使用される様々な試薬のリザーバー、スライド上に試薬を分注するためのリザーバーと流通する試薬分注ユニット、使用済み試薬及び他の廃棄物をスライドから除去する廃棄物除去システム、並びに試薬分注ユニット及び廃棄物除去システムの動作を調整する制御システムを含む。染色ステップの実行に加えて、多くの自動スライド染色装置は、スライドのベーキング(スライドに試料を接着するため)、脱蝋(脱パラフィン化とも呼称される)、抗原回収、対比染色、脱水及び清澄化、並びにカバースリッピングを含む、染色に付随するステップを実行することもできる(又は、そのような付随ステップを実行する別々のシステムに適合している)。Prichardの参考文献は、IntelliPATH(Biocare Medical)、WAVE(Celerus Diagnostics)、DAKO OMNIS及びDAKO AUTOSTAINER LINK 48(Agilent Technologies)、BENCHMARK(Ventana Medical Systems)、Leica BOND、及びLab Vision Autostainer(Thermo Scientific)の自動スライド染色装置を含む、自動IHC/ISHスライド染色装置のいくつかの具体例及びそれらの様々な特徴を記載している。更に、Ventana Medical Systems, Inc.は、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第5,650,327号、第5,654,200号、第6,296,809号、第6,352,861号、第6,827,901号及び第6,943,029号、並びに米国特許出願公開第20030211630号及び第20040052685号を含む、自動解析を実行するためのシステム及び方法を開示する、多数の米国特許の譲受人である。
商業的に入手可能な染色ユニットは、通常、以下の原理で作動する:(1)スライドが水平に配置され、試薬が組織試料を含むスライドの表面上に水たまりとして分注される、開放型個別スライド染色装置(DAKO AUTOSTAINER Link 48(Agilent Technologies)及びIntelliPATH(Biocare Medical)染色装置で実装されるものなど);(2)試薬が試料上に沈着される不活性液体層で覆われるか又はそこを通して分注される、液体オーバーレイ技術(VENTANA BenchMark及びDISCOVERY染色装置で実装されるものなど);(3)スライド表面が別の表面(別のスライド又はカバープレートでありうる)の近傍に配置されて狭い間隙を形成し、毛細管力を通して試料と接触する液体試薬を吸引かつ保持する、キャピラリー間隙染色(DAKO TECHMATE、Leica BOND、DAKO OMNIS染色装置で使用される染色原理など)。キャピラリー間隙染色のいくらかの反復は、間隙中の液体を混合しない(例えば、DAKO TECHMATE及びthe Leica BONDにおいて)。ダイナミック間隙染色と名付けられた毛細管間隙染色のバリエーションでは、毛細管力が、スライドに試料を適用するために使用され、次いで平行面が、インキュベーション中試薬を攪拌させて試薬を混合させるために互いに対し平行移動される(例えば、DAKO OMNISスライド染色機(Agilent)で実装される染色原理)。平行移動間隙染色では、平行移動可能なヘッドが、スライドの上方に配置される。ヘッドの下面は、スライドの平行移動中、スライド上の液体から液体のメニスカスが形成することを許容する、十分に小さい第1の間隙によって、スライドから間隔をあけられている。スライドの幅より小さい横方向寸法を有する混合液の外延は、平行移動可能なヘッドの下面から延びて、混合液外延とスライドとの間の第1の間隙より小さい第2の間隙を画定する。ヘッドの平行移動中、混合液の外延の横方向寸法は、第2の間隙から第1の間隙に通常延びる方向で、スライド上の液体における横方向の動きを生成するのに十分である。国際公開第2011−139978A1号を参照されたい。最近、インクジェット技術を用いてスライド上に試薬を沈着することが提案されている。国際公開第2016−170008A1号を参照されたい。この自動染色技術のリストは、包括的であることを意図されておらず、バイオマーカー染色を実行するための完全又は半自動システムが、使用され得る。
D.画像解析システム
いくつかの実施形態では、染色されたスライドのデジタル画像が、顕微鏡上のライブリーディングの代わりに(又はそれに加えて)解析される。そのような実施形態では、染色されたスライドは、イメージャースライドスキャナー上で、画像化され得る。基本的なレベルで、スライドスキャナーは、染色された試料の代表的なデジタル画像を生成する。典型的なスライドスキャナーは、少なくとも:(1)対物レンズを備える顕微鏡。(2)光源(ハロゲン、発光ダイオード、白色光、及び/又はマルチスペクトル光源)、(3)スライドガラスの周囲を動かすため(又はスライド周囲の光学系を動かすため)のロボット技術、(4)画像キャプチャーのための1つ又は複数のデジタルカメラ、(5)ロボットを制御し、デジタルスライドを操作し、管理し、かつ表示するためのコンピューター及び関連ソフトウェアを備える。スライド上の多くの異なるX−Y位置(場合によっては複数のZ面における)におけるデジタルデータは、カメラの電荷結合素子(CCD)によってキャプチャーされ、画像は、互いに結合されてスキャン面全体の合成画像を形成する。実施するための一般的な方法は、以下の通りである:
(1)タイルベースのスキャンでは、スライドステージ又光学系が、非常に小さな増分で移動されて、隣接する正方形とわずかに重なる正方形の画像フレームをキャプチャーする。キャプチャーされる四角形は、次に、互いに対し自動的に一致されて合成画像を構築する;そして
(2)ラインベースのスキャンでは、スライドステージが、多数の合成画像「ストリップ」をキャプチャーするための取得の間、単一の軸において移動する。画像ストリップは、次に、より大きな合成画像を形成するように互いと一致され得る。いくつかの場合において、
様々なスライドスキャナーの詳細な概説は、Farahani et al.で見出される。スライドスキャナーの例には:3DHistech PANNORAMIC SCAN II;DigiPath PATHSCOPE;Hamamatsu NANOZOOMER RS、HT、及びXR;Huron TISSUESCOPE 4000、4000XT、及びHS;Leica SCANSCOPE AT、AT2、CS、FL、及びSCN400;Mikroscan D2;Olympus VS120−SL;Omnyx VL4、及びVL120;PerkinElmer LAMINA;Philips ULTRA−FAST SCANNER;Sakura Finetek VISIONTEK;Unic PRECICE 500、及びPRECICE 600x;VENTANA ISCAN COREO及びISCAN HT;及びZeiss AXIO SCAN.Z1が含まれる。他の例示的なシステム及び特徴は、例えば、「イメージングシステム及び技術」と題する国際特許出願PCT/US2010/002772(国際公開第2011/049608号)で見出され、又は「イメージングシステム、カセット及びそれらの使用方法」と題する、2011年9月9日出願の米国特許出願第61/533,114号に記載される。国際特許出願PCT/US2010/002772及び米国特許出願第61/533,114号は、それらの実体が参照により援用される。
いくつかの実施形態では、画像解析システムは、画像解析システム内で病理学者により同定されるROIが、スライドから切り出される領域の同定のために自動ダイセクションツールへ直接転送され得るように、自動ダイセクションツールと統合されている。他の実施形態では、画像解析システムは、顕微鏡スライドの診断評価にためにのみ適応され、別個のイメージシステムが、ROIを同定しかつその切り出しを指示するための自動ダイセクションツールと統合されている。
画像解析システムを含む例示的なシステムが、図2に図示される。自動スライド染色機201が、単一の試料202からのスライドのセットの第1のスライドを染色するために提供される。染色されるスライドは、画像解析システム203によってスキャンされ、病理学者は、染色パターンを検討し、(a)試料が不均一性であるかどうか、及び(b)試料のいずれかの部分が第1のバイオマーカーが診断対象とする薬物に応答する可能性が高いかどうかを判定する。病理学者は、自動画像解析システム203内で、任意の非応答領域をROIとして手動でマークし、それがダイセクションツール204に移される。第1スライドの連続切片を含むスライドのセットからの非染色のスライドが、自動ダイセクションツール204に移され、ROIが、非染色の切片に合致され、そしてROIが、切り出される。試料の切り出された部分が、核酸試料を得るために処理され、核酸試料が、NGSシーケンサー205でシークエンシングされる。ソフトウェアスイートは、試料に関連する変異を同定するために使用され、ユーザーは、予測バイオマーカーに関連する変異の1つ又は複数を選択する。スライドのセット202からの非染色のスライドは、自動スライド染色装置201(第1のスライドを染色した自動スライド染色装置と同じでも異なっていてもよい)に渡される。自動スライド染色装置201は、ユーザーによって選択される予測バイオマーカーのためのバイオマーカー特異的試薬で非染色のスライドを染色する。所望の場合、第2の予測バイオマーカーで染色されたスライドが、画像解析システム203上で評価され得る。全てのスライドが評価されると、各予測バイオマーカーについての予測を含む診断レポート206が、生成され、そこから治療医師が、診断及び治療の決定を下すことができる。
E.臨床検査情報システム
システムは、更に、LISを含み得る。LISは、通常、試料上とスライド上とで実施されるプロセス及び試料に由来する画像を記録すること及び追跡すること、試料、スライド、及び/又は画像において特定のプロセスを実行するようにシステムの他のコンポーネントに指示すること、並びに試料及び/又はスライドに適用される特異的試薬についての情報の追跡(ロット番号、有効期限、分注量など)から選択される、1つ又は複数の機能を実行する。LISは、通常、少なくとも、試料に関する情報を含むデータベース;試料、スライド、及び/又は画像ファイルに関連するラベル(バーコード(1次元バーコード及び2次元バーコード)、無線周波数識別(RFID)タグ、試料に添付される英数字コードなど);並びに試料又はスライド上のラベルを読み取り、かつ/又はLISと免疫コンテキストスコアリングシステムの他のコンポーネントとの間のスライドについての情報を通信する通信デバイスを含む。従って、例えば、通信装置は、試料処理ステーション、自動スライド染色装置、自動ダイセクションツール、及びNGSシステムのそれぞれに配置され得る。試料が、最初、切片へと処理されると、試料に関する情報(患者ID、試料のタイプ、1つ又は複数の切片で実行されるプロセス)が、通信デバイスに入力され、ラベルが、試料から生成される各切片について作成される。各後続のステーションでは、ラベルが、(バーコード若しくはRFIDタグをスキャンすることにより又は英数字コードを手動で入力することにより)通信装置に入力され、ステーションが、例えば、ステーション若しくはステーションオペレーターに特定のプロセスを切片において実行するように指示するために、かつ/又は切片において実行されるプロセスを記録するために、データベースと電子的に通信する。スキャニングプラットフォームでは、スキャニングプラットフォームは、画像が画像解析システムに送られている場合、実行される画像処理ステップがLISのデータベースから画像解析システムに送ることができ、かつ/又は画像解析システムによって画像上で実施される画像処理ステップがLISのデータベースによって記録されるように、画像が由来する切片又は試料に立ち戻って相互に関連付けられる、コンピューターが読み取り可能なラベル又はコードで各画像をコード化し得る。本明細書の方法及びシステムに有用な、商業的に入手可能なLISシステムには、例えば、VENTANA Vantage Workflowシステム(Roche)が含まれる。
LIS及び任意選択の画像解析システムを含む例示的なシステムが、図3に図示される。組織サンプル301は、顕微鏡スライド上にマウントされる少なくとも1つの第1の試料302と、やはり顕微鏡スライド上にマウントされる第2の試料303のセットとを含む、複数の試料に分割される。第1の予測バイオマーカーについて第1の試料302を染色するための指示は、LIS304に記録され、自動スライド染色装置305に入力される。いくつかの実施形態では、指示は、LIS304から自動スライド染色装置305に送られ、自動スライド染色装置305上で自動的に実施される。いくつかの実施形態では、LIS304は、第1の試料302に関連付けられるラベルを生成する。いくつかの実施形態では、ラベルには、ユーザーが自動スライド染色装置305に手動で入力し得る、ラベルに刷り込まれる指示の記載がある。他の実施形態では、ラベルは、自動スライド染色装置におけるステーションによって読み取り可能な、バーコード(1次元バーコード及び2次元バーコードを含む)、ラジオ周波数識別(RFID)タグ、英数字コードなどの記号表記を含み、自動染色装置305にスライド上で実施するプログラムを直接指示するか、又はユーザーに自動染色装置305のプログラム方法を知らせる。スライドは、第1の染色スライド306を取得するため、自動スライド染色装置305によって第1の予測バイオマーカーについて染色される。画像解析システムにおける評価が所望される場合、第1の染色スライド306は、画像解析システム307によってスキャンされ、病理学者は、染色パターンを検討し、(a)試料が不均一性であるかどうか、及び(b)試料の任意の場所が第1のバイオマーカーが診断対象とする薬物に応答する可能性が高いかどうかを判定する。画像解析が所望されない場合、病理学者は、顕微鏡で同じ解析を実施する。いずれの場合においても、病理学者の解析は、LIS304に記録される。画像解析が実行される場合、第1の染色スライド306のデジタル画像も、LIS304に記録され得るが、その場合、ROIを同定するために手動でアノテートもされ得る。第1の染色スライド306は、次に、自動ダイセクションツール308に移され、ROIは、第1の試料302の十分な数の非染色の連続切片中で同定され、切り出される。いくつかの実施形態では、ROIは、例えば、第1のスライドからのROIと相関する非染色の切片の形態学的構造を同定する技術者又は病理学者によって、自動ダイセクションツール308上で新規に同定される。他の実施形態では、ROIは、画像解析システム307又はLIS304から自動ダイセクションツール308に転送され、その後、ユーザーによって修正されるか、又は受け入れられる。正確な切り出される部分は、LIS304に記録され得る。試試料の切り出された部分は、核酸試料309を取得するために処理され、核酸試料は、NGSシークエンサー310でシークエンシングされる。NGSに関連するソフトウェアスイートは、試料に関連する変異を同定し、ユーザーは、予測バイオマーカーに関連する変異の1つ又は複数を選択する。NGS310によって同定される変異及びユーザーによって選択される第2の予測バイオマーカーは、LIS304に保存され得る。1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて1つ又は複数の第2の試料303を染色するための指示は、LIS304に記録され、自動スライド染色装置305(第1のスライドを染色した自動スライド染色装置と同じでも異なっていてもよい)に入力される。いくつかの実施形態では、指示は、LIS304から自動スライド染色装置305に送られ、自動スライド染色機305上で自動的に実施される。いくつかの実施形態では、LIS304は、第1の試料302に関連付けられるラベルを生成する。いくつかの実施形態では、ラベルには、ユーザーが自動スライド染色装置305に手動で入力することができる、ラベルに刷り込まれる指示の記載がある。他の実施形態では、ラベルは、自動スライド染色装置におけるステーションによって読み取り可能な、バーコード(1次元バーコード及び2次元バーコードを含む)、ラジオ周波数識別(RFID)タグ、英数字コードなどの記号表記を含み、自動染色装置305にスライド上で実施するプログラムを直接指示するか、又はユーザーに自動染色装置305のプログラム方法を知らせる。スライドは、第2の染色スライド311を得るために更なる予測バイオマーカーについて自動スライド染色装置305によって染色される。画像解析が所望される場合、1つ又は複数の第2の染色スライド306は、画像解析システム307によってスキャンされ、病理学者は、染色パターンを検討し、試料の任意の部分が1つ又は複数の第2のバイオマーカーが診断対象とする1つ又は複数の薬剤に応答する可能性が高いかどうかを判定する。画像解析が所望されない場合、病理学者は顕微鏡で同じ解析を実行する。いずれの場合においても、病理学者の解析は、LIS304に記録される。画像解析が実行される場合、1つ又は複数の第1の染色スライド311のデジタル画像も、LIS304に記録され得る。全てのスライドが解析されると、各予測バイオマーカーについての解析を含む診断レポート312が、生成され、そこから治療医師は、診断及び治療の決定を下すことができる。
V.実施例
記載される方法及びワークフローの実行可能性を試験し、それが症例に関する予測診断情報を得るために使用できるかどうかを判定するために、モデルシステムが、PTEN又はEGFRを第1の予測バイオマーカーとして用いて開発された。全ての組織化学染色は、VENTANA BenchMark ULTRA IHC/ISHスライド染色装置で実施された。ROIの同定及び切り出しは、ROCHE自動ダイセクションツールメソダイセクション装置を用いて実行された。DNAは、Roche MagNA Pure96を用いて単離され、こうして得られたDNA試料の品質管理は、Roche Lightcycler 480を利用するqPCRにより実行された。10ngのDNAが、最高のライブラリー調製成功率の場合に得られた(好ましくは1.6ng/μL)。各ROIに必要なスライドの総数は、約250mmの組織が必要とされるという仮定に基づいて計算された。標的シークエンシングは、Life Technology Cancer HotSpot Panel v2及びオンシステムバリアント解析を利用するLife Technologies ION TORRENT PGM NGSプラットフォームで実行された。
第1の実施例では、前立腺腫瘍が、PETNについてIHCにより染色された。陽性染色腫瘍領域は、カバレッジ及び非同義変異についてのフィルターのみを用いて単離された。結果は、表4に示される。
Figure 0006876062
品質目的のために、500X(SNPが少なくとも500回シークエンシングされたことを意味する)より高いカバレッジを有する変異のみが、記録された。このリストから、IHC試験は、EGFR発現及びERBB2遺伝子によってコードされるHER2について、商業的に入手可能である。これらの試験に2つのライドを用いて、前立腺がん症例におけるEGFRの過剰発現及びHER2の予期せぬ発現が、観察され、そのどちらもが更なる治療標的を同定することができた。
第2の前立腺がん症例は、IHCによってPTENについて再度染色され、その画像が、図5で見ることができる。陽性染色試料の切片が、シークエンシングされ、その結果が、表5に表示される:
Figure 0006876062
更なる切片が、EZH2について染色され、その結果は、図5で見られる。c−Kitは、潜在的な予測バイオマーカーと追加的に認識された。しかしながら、IHC染色は、対象の染色を示さなかった。これは、予測バイオマーカーと相関する変異の存在が、臨床的に実行可能な治療コースを提供するとは限らないことを示している。
肺の症例が、IEGFRの一塩基多型:EGFR L858RについてIHCによって染色された。画像が、図6に表示される。変異陰性領域が、切り出され、シークエンシングされた。結果が、6に示される。p53IHC染色が、実行され、その画像は、図6で見られる。染色スライドは、シスプラチンベースの化学療法及びMDM2アンタゴニストを予測する、p53発現の喪失を至る所で示した。
肺の症例は、全体試料のシークエンシングに対抗する、ダイセクションツールの必要性の試験にも用いられた。表7で見られるように、試料の切り出された部分で検出可能ないくつかの変異は、もし全体試料がシークエンシングされるなら、見失われ得る。これは、全体組織よりむしろアノテートされた腫瘍領域をシークエンシングすることの重要性を示している。
Figure 0006876062
Figure 0006876062
VII.更なる例示的実施形態
以下の更なる実施形態も、具体的に開示される。これは、網羅的なリストであることを意図されていない。
1.
腫瘍の第1の試料を採取することであって、第1の試料が、第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色される、採取すること;
自動ダイセクションツールで第1の試料から1つ又は複数の領域を切り出すことであって、切り出される領域が、領域が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、切り出すこと;
第1の試料の切り出された1つ又は複数の領域に由来する核酸試料における、1つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する1つ又は複数の変異を、次世代シークエンサーで検出すること;
試料中で同定される1つ又は複数の変異に相関する1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて1つ又は複数の更なる試料を染色することであって、1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが1つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、染色すること
を含む方法。
2.
第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて染色される腫瘍の第1の試料であって、第1の予測バイオマーカーの染色パターンが、第1の試料の少なくとも第1の領域が第1の治療剤に反応する可能性が低いことを示す試料;及び
第1の試料の第1の領域に由来する核酸試料であって、自動ダイセクションツールで第1の試料の第1の領域を切り出すこと、及び試料の切り出される部分からゲノムDNAを抽出することによって、腫瘍の第1の部分の第1の領域から得られる核酸試料
を取得すること;
1つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、核酸試料中の1つ又は複数の変異を、次世代シークエンサーで検出すること;
試料中で同定される1つ又は複数の変異に相関する1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて、腫瘍の1つ又は複数の更なる試料を染色することであって、1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、1つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、染色すること
を含む方法。
3.
第1の治療化合物のための第1の予測バイオマーカーについて染色される腫瘍の第1の試料であって、第1の予測バイオマーカーの染色パターンが、第1の試料の少なくとも第1の領域が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す試料;及び
腫瘍の1つ又は複数の更なる試料
を取得すること;
更なる治療剤のための1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて1つ又は複数の更なる試料を染色することであって、更なる予測バイオマーカーが、第1の試料の第1の領域から自動ダイセクションツールで切り出される核酸試料中の次世代シークエンサーによって同定される1つ又は複数の変異に対応し、1つ又は複数の変異が、1つ又は複数の更なる治療剤への反応を予測する、染色すること
を含む方法。
4.
第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーに特異的な第1の特異的結合剤、及び
第1の切片に結合される場合に特異的結合剤を可視化するための検出剤のセット
を用いて腫瘍の第1の試料を染色すること;並びに
少なくとも1つの更なる治療剤のための、1つ又は複数の予測バイオマーカーに特異的な1つ又は複数の更なる特異的結合剤であって、1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、自動ダイセクションツールで第1の切片から抽出される領域において同定される核酸に対応し、自動ダイセクションツールで抽出される領域が、腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1のバイオマーカーについての染色パターンを有する特異的結合剤、及び
第2の切片に結合した場合に特異的結合剤を可視化するための検出試薬のセット
を用いて腫瘍の1つ又は複数の更なる試料を染色すること
を含む方法。
5.対象のための治療コースを同定するレポートを生成することを更に含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の方法であって、前記治療コースが対象に:
第1の試料の少なくとも1つの領域が、腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が高いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、第1の治療剤;及び
1つ又は複数の更なる試料の少なくとも1つの領域が、腫瘍の少なくとも1つの部分が更なる治療剤に応答する可能性が高いことを示す、対応する更なる予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、1つ又は複数の更なる治療剤
を投与することを含む、方法。
6.対象のための治療コースを施すことを更に含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の方法であって、前記治療コースが:
第1の試料の少なくとも1つの領域が、腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が高いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、第1の治療剤;及び/又は
1つ又は複数の更なる試料の少なくとも1つの領域が、腫瘍の少なくとも1つの部分が更なる治療剤に応答する可能性が高いことを示す、対応する更なる予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、1つ又は複数の更なる治療剤
を投与することを含む、方法。
7.腫瘍が固形腫瘍である、実施形態1〜6の何れか1つに記載の方法。
8.固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料であり、かつ第1の試料及び1つ又は複数の更なる試料が、FFPE組織試料のミクロトーム切片である、実施形態7に記載の方法。
9.第1の試料及び1つ又は複数の更なる試料が、連続切片である、実施形態8に記載の方法。
10.次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の方法。
11.第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の方法。
12.
(a)(a1)腫瘍の第1の試料が付着した第1の顕微鏡スライドであって、第1の試料が、第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色された、顕微鏡スライド;
(a2)腫瘍の更なる試料が付着した、1つ又は複数の更なる非染色顕微鏡スライド
を含む顕微鏡スライドのセット;
(b)腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第1の試料の1つ又は複数の領域を同定するための画像解析システム;
(c)第1の試料からの第1の治療剤への応答の欠如の特徴を示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第1の試料の1つ又は複数の領域を切り出すようにプログラムされた自動ダイセクションツール;
(d)自動ダイセクションツールによって切り出される第1の試料の領域に由来する核酸試料中の1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異の存在又は不在を同定するようにプログラムされる次世代シークエンサー;及び
(e)1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで1つ又は複数の更なるスライドを染色するようにプログラムされる自動スライド染色装置
を含む、システム。
13.
(f)データベースを含む臨床検査情報システム(LIS)を更に含む実施形態12に記載のシステムであって、データベースが:
(f1)次世代シークエンサーによる核酸試料の変異解析であって、変異解析が、少なくとも、1つ又は複数の更なる治療剤のための1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する核酸試料中の変異の存在又は不在を示す変異解析:及び
(f2)変異解析によって同定される1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第2の試料を染色するよう自動スライド染色装置に命令するための指示
を含む、システム。
14.非染色顕微鏡スライドの少なくとも1つが、LISによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、スライドを自動スライド染色装置による(f2)の指示の実行に適するものであると同定する、実施形態12に記載のシステム。
15.ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置に自動的に命令する、実施形態14に記載のシステム。
16.ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、実施形態14に記載のシステム。
17.次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態12〜16のいずれか1つに記載のシステム。
18.第1の予測バイオマーカー及び更なる1つ又は複数の予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態12〜17のいずれか1つに記載のシステム。
19.
(a)腫瘍の第1の試料から切り出される1つ又は複数の領域に由来する核酸試料であって、腫瘍の第1の試料が、第1の予測バイオマーカーについて染色され、かつ更に、切片から切り出される1つ又は複数の領域が、腫瘍の少なくとも1つの領域が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーの染色パターンを有する核酸試料;
(b)1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異の存在又は不在を同定するように適合される次世代シークエンサー;
(c)データベースを含む臨床検査情報システム(LIS)であって、データベースが:
(c1)次世代シークエンシングによる核酸試料の変異解析であって、変異解析が、少なくとも、核酸試料中の変異の存在又は不在を示し、変異が、1つ又は複数の更なる治療剤のための1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異解析;及び
(c2)変異解析によって同定される1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第2の試料を染色するように自動スライド染色装置に命令するための指示
を含むLIS
を含むシステム。
20.
(d)腫瘍の第2の試料を吸着されている非染色顕微鏡スライド;及び
(e)(c2)の指示によって第2の試料を染色するよう適合される自動スライド染色装置
をさらに含む、実施形態19に記載のシステム。
21.非染色顕微鏡スライドが、LISによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、自動スライド染色装置によって、スライドを(c2)の指示の実行に適するものであると同定する、実施形態20に記載のシステム。
22.ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように、自動スライド染色装置に自動的に命令する、実施形態21に記載のシステム。
23.ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、実施形態21に記載のシステム。
24.次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態19〜23のいずれか1つに記載のシステム。
25.第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態19〜24のいずれか1つに記載のシステム。
26.
(a)腫瘍の第1の試料が付着した非染色顕微鏡スライド;
(b)自動スライド染色装置;及び
(c)データベースを含む臨床検査情報システム(LIS)であって、データベースが:
(c1)腫瘍の第2の試料の診断情報であって、第2の試料が、第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて染色された診断情報;
(c2)次世代シークエンシングによる核酸試料の変異解析であって、核酸試料が、第2の試料の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する第2の試料の部分から取得され、かつ変異解析が、少なくとも、1つ又は複数の更なる治療剤のための1つ又は複数の更なるバイオマーカーに相関する、核酸試料中の変異の存在又は不在を示す変異解析;及び
(c3)変異解析によって同定される1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第1の試料を染色するように自動スライド染色装置に命令するための指示
を含むLIS
を含むシステム。
27.非染色顕微鏡スライドが、LISによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、スライドを自動スライド染色装置によって(c2)の指示の実行に適するものであると同定する、実施形態26に記載のシステム。
28.ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように、自動スライド染色装置に自動的に命令する、実施形態27に記載のシステム。
29.ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、実施形態27に記載のシステム。
30.次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態26〜29のいずれか1つに記載のシステム。
31.第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態26〜30のいずれか1つに記載のシステム。
32.腫瘍が、固形腫瘍である、実施形態12〜31の何れか1つに記載のシステム。
33.固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料であり、かつ腫瘍の試料が、FFPE組織試料のミクロトーム切片である、実施形態32に記載のシステム。
34.1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色される試料が、第1の予測バイオマーカーについて染色される試料の連続切片である、実施形態33に記載のシステム。
35.腫瘍に由来する診断試料のセットであって、
(a)腫瘍の第1の試料であって、第1の試料が、第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて染色され、第1の試料の少なくとも1つの部分が、腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーについての第1の染色パターンを有する、試料;
(b)(b1)腫瘍の部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す染色パターンを有する第1の試料の部分を自動ダイセクションツールで切り出すこと;及び
(b2)次世代シークエンサーにおける核酸試料の使用に適合する方法で第1の試料の切り出された部分から核酸試料を抽出すること
を含む方法により取得される核酸試料;並びに
(c)腫瘍の1つ又は複数の更なる試料であって、1つ又は複数の更なる試料が、1つ又は複数の更なる治療剤のための1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色され、1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、核酸試料中で同定される変異に対応する、試料
を含む、診断試料のセット。
36.腫瘍が、固形腫瘍である、実施形態35に記載の診断試料のセット。
37.固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料であり、かつ腫瘍の試料が、FFPE組織試料のミクロトーム切片である、実施形態36に記載の診断試料のセット。
38.1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色される試料が、第1の予測バイオマーカーについて染色される試料の連続切片である、実施形態37に記載の診断試料のセット。
39.次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態35〜38のいずれか1つに記載の診断試料のセット。
40.第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態35〜39のいずれか1つに記載の診断試料のセット。
41.第1の予測バイオマーカーのためのバイオマーカー特異的試薬で腫瘍の第1の組織切片を組織化学的に染色することを含む方法であって、第1の予測バイオマーカーが、第1の組織切片の連続切片の領域で同定される変異と関連し、領域が第2の予測バイオマーカーが予測する治療剤に応答しないと予測される第2の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する方法。
42.変異が:
自動ダイセクションツールで組織切片から領域を切り出すこと;及び
次世代シークエンサーによって切り出される領域に由来する核酸試料を配列解析すること
によって同定される、実施形態41に記載の方法。
43.次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態42に記載の方法。
44.腫瘍が固形腫瘍である、実施形態41〜43の何れか1つに記載の方法。
45.固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料であり、かつ第1の試料及び1つ又は複数の更なる試料がFFPE組織試料のミクロトーム切片である、実施形態44に記載の方法。
46.第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態41〜45のいずれか1つに記載の方法。
47.実施形態1〜46のいずれかであって、1つ又は複数の予測バイオマーカーが、免疫組織化学(IHC)又はin situハイブリダイゼーション(ISH)によって染色される実施形態。
VIII.引用文献
以下の引用のそれぞれの内容は、本明細書で、その全体が引用により援用される。
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Farahani et al., Whole slide imaging in pathology: advantages, limitations, and emerging perspectives, Pathology and Laboratory Medicine Int’l, Vol. 7, p. 23-33 (June 2015), the content of which is incorporated by reference in its entirety.
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Claims (20)

  1. 腫瘍の第1の試料を、第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色すること;
    自動ダイセクションツールで第1の試料から1つ又は複数の領域を切り出すことであって、切り出される領域が、領域が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、切り出すこと;
    第1の試料の切り出された1つ又は複数の領域に由来する核酸試料における、1つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する1つ又は複数の変異を、次世代シークエンサーで検出すること;
    試料中で同定される1つ又は複数の変異に相関する1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて1つ又は複数の更なる試料を染色することであって、1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが1つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、染色すること
    を含む方法。
  2. 対象のための治療コースを同定するレポートを生成することを更に含む、請求項1に記載の方法であって、前記治療コースが対象に:
    第1の試料の少なくとも1つの領域が、腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が高いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、第1の治療剤;及び
    1つ又は複数の更なる試料の少なくとも1つの領域が、腫瘍の少なくとも1つの部分が更なる治療剤に応答する可能性が高いことを示す、対応する更なる予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、1つ又は複数の更なる治療剤
    を投与することを含む、方法。
  3. 腫瘍が固形腫瘍である、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料であり、かつ第1の試料及び1つ又は複数の更なる試料が、FFPE組織試料のミクロトーム切片である、請求項3に記載の方法。
  5. 第1の試料及び1つ又は複数の更なる試料が、連続切片である、請求項4に記載の方法。
  6. (a)(a1)腫瘍の第1の試料が付着した第1の顕微鏡スライドであって、第1の試料が、第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色された、顕微鏡スライド;
    (a2)腫瘍の更なる試料が付着した、1つ又は複数の更なる非染色顕微鏡スライド
    を含む顕微鏡スライドのセット;
    (b)腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第1の試料の1つ又は複数の領域を同定するための画像解析システム;
    (c)第1の試料からの第1の治療剤への応答の欠如の特徴を示す第1の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第1の試料の1つ又は複数の領域を切り出すようにプログラムされた自動ダイセクションツール;
    (d)自動ダイセクションツールによって切り出される第1の試料の領域に由来する核酸試料中の1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異の存在又は不在を同定するようにプログラムされる次世代シークエンサー;及び
    (e)1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで1つ又は複数の更なるスライドを染色するようにプログラムされる自動スライド染色装置
    を含む、システム。
  7. (f)データベースを含む臨床検査情報システム(LIS)を更に含む請求項6に記載のシステムであって、データベースが:
    (f1)次世代シークエンサーによる核酸試料の変異解析であって、変異解析が、少なくとも、1つ又は複数の更なる治療剤のための1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する核酸試料中の変異の存在又は不在を示す変異解析:及び
    (f2)変異解析によって同定される1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第2の試料を染色するよう自動スライド染色装置に命令するための指示
    を含む、請求項6に記載のシステム。
  8. 非染色顕微鏡スライドの少なくとも1つが、LISによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、スライドを自動スライド染色装置による(f2)の指示の実行に適するものであると同定する、請求項7に記載のシステム。
  9. ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置に自動的に命令する、請求項8に記載のシステム。
  10. ラベルが、第2の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、請求項8に記載のシステム。
  11. 腫瘍に由来する診断試料のセットであって、
    (a)腫瘍の第1の試料であって、第1の試料が、第1の治療剤のための第1の予測バイオマーカーについて染色され、第1の試料の少なくとも1つの部分が、腫瘍の少なくとも1つの部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第1の予測バイオマーカーについての第1の染色パターンを有する、試料;
    (b)(b1)腫瘍の部分が第1の治療剤に応答する可能性が低いことを示す染色パターンを有する第1の試料の部分を自動ダイセクションツールで切り出すこと;及び
    (b2)次世代シークエンサーにおける核酸試料の使用に適合する方法で第1の試料の切り出された部分から核酸試料を抽出すること
    を含む方法により取得される核酸試料;並びに
    (c)腫瘍の1つ又は複数の更なる試料であって、1つ又は複数の更なる試料が、1つ又は複数の更なる治療剤のための1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色され、1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、核酸試料中で同定される変異に対応する、試料
    を含む、診断試料のセット。
  12. 腫瘍が、固形腫瘍である、請求項11に記載の診断試料のセット。
  13. 固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料であり、かつ腫瘍の試料がFFPE組織試料のミクロトーム切片である、請求項12に記載の診断試料のセット。
  14. 1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色される試料が、第1の予測バイオマーカーについて染色される試料の連続切片である、請求項13に記載の診断試料のセット。
  15. 次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
  16. 次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、請求項6〜10のいずれか1項に記載のシステム。
  17. 次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、請求項11〜14のいずれか1項に記載の診断試料のセット。
  18. 第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
  19. 第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項6〜10のいずれか1項に記載のシステム。
  20. 第1の予測バイオマーカー及び1つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ALK、ATM、BCL2、BRAF、BRCA1、c−KIT、CAIX、CCR4、CD30、クローディン、17p13.1、DLL3、EGFR1、エストロゲン受容体、EREG、ERCC1、FGF19、FGFR2b、FGFR3、FOLR1、ヒアルロナン、HER2/NEU、K−ras、MGMT、MSLN、p53、MDM2、プロゲステロン受容体、PD−L1、PDGFRB、PTEN、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項11〜14のいずれか1項に記載の診断試料のセット。
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