JP6876062B2 - 自動ダイセクション、次世代シークエンシング、及び自動スライド染色装置を用いる、腫瘍のための予測診断ワークフロー - Google Patents

自動ダイセクション、次世代シークエンシング、及び自動スライド染色装置を用いる、腫瘍のための予測診断ワークフロー Download PDF

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Description

関連相互出願
２０１６年１月２６日出願の米国仮出願第６２／２８７，１８２号の利益が、本出願において主張され、その内容の全体が、参照により本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、予測バイオマーカーのアッセイを行い、かつ／又はがんのための治療を選択するための、自動スライド染色装置、自動ダイセクションツール、及び／又は次世代シークエンサーの使用に関する。
関連技術の記載
過去２０年間に、がんの研究及び治療は、急激な変化を経験してきた。およそ５億ドルから１０億ドルかかったヒトゲノムの最初のシークエンシングのコストに対し、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ストラテジーは、そのコストを２０００ドル未満に削減しており、そのことで、大規模かつ比較的安価ながん遺伝学の判定を可能にしている。Reuter et al.を参照されたい。これらの進歩は、新規の治療及び診断の標的が同定され開発される速度を加速している：２０１４年だけでも、ＦＤＡは、その多くが標的治療である、計５１件の新規分子化合物及び新規バイオ製品を承認した。ＦＤＡ白書を参照されたい。
このような開発が治療の状況を確実に改善しているとは言え、がんは、相変わらず実に強靭である。その天然の不均一性により、腫瘍は、今なお頻繁に、過去に効果的だった治療法に耐性をもつようになる。Sun & Yuを参照されたい。この問題を効果的かつ効率的に解決する診断ワークフローは、未だ実現されていない。
いくつかの診断ワークフローは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）及びＮＧＳを用いて、同定されている。Amemiya et al.;AB Brochure; Zhang et al.を参照されたい。これらの手順は、通常、ＬＣＭシステムを用いて腫瘍から腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を分離して採集し、採集した細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又はＲＮＡを抽出し、かつ特定の遺伝子座をシークエンシングして腫瘍細胞及び正常細胞におけるがん関連変異を同定することを含む。腫瘍細胞における変異は、腫瘍細胞において過剰に呈示される変異を同定するため、非腫瘍細胞における変異と比較される。これらの方法は、腫瘍で呈示される変異の概観をもたらし得るとは言え、変異の空間的関連性、又はいかに変異が機能的な見地から相互に関連づけられているか、については何も情報をもたらさない。
この開示は、概して、がんの診断及び治療法の選択における、自動ダイセクションツール及び／又は次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プラットフォームの使用に関する。
第１の治療剤に応答しないと予測される腫瘍試料の領域が自動ダイセクションツールを用いて試料から切り出され、予測バイオマーカーと相関する変異が切り出される領域中でＮＧＳを用いて検出され、かつ腫瘍の更なる試料がＮＧＳにより同定される１つ又は複数の予測バイオマーカーについて染色される方法が、提供される。
本明細書に記載される方法を実行するためのシステムは、細胞試料、核酸試料、自動ダイセクションツール、ＮＧＳシステム、自動スライド染色装置、画像スキャナー及び解析システム、並びに臨床検査情報システムの様々な組み合わせを含めて提供される。
本明細書で開示される方法及びシステムにおける使用のための診断試料のセットは、腫瘍の細胞試料を含むスライド及びそのようなスライドの特定の領域から取得される核酸試料を含めて提供される。
前記の他の発明及び実施形態が、本明細書に記載される。
本明細書で開示されるプロセスについての例示的なワークフローを示すフローチャートである。長方形のボックスは、試料で実行されるプロセスを示す。ひし形のボックスは、評価ステップを示す。八角形のボックスは、治療の決定又は治療ステップを示す。 本明細書で開示される画像解析コンポーネントを含む、例示的なシステムである。 臨床検査情報システム（ＬＩＳ）及び任意選択の画像解析コンポーネントを含む、例示的なシステムである。円及び楕円は、システムの潜在的な試料コンポーネントを示す。正方形及び長方形は、システムの、試料操作、データ解析、及びデータストレージのコンポーネントを示す。五角形は、本システムからのデータの出力を示す。破線は、代替のワークフローを示す。 図４は、本明細書で開示される方法及びシステムによって評価された、前立腺腫瘍からの一連のＩＨＣ画像である。第１の試料は、ＰＴＥＮについて染色された。切り出し及び変異解析のためのＲＯＩは、ＰＴＥＮ染色画像において、「ｏ」記号で輪郭を描かれている。第２の試料は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２について染色された。 本明細書で開示されるような方法及びシステムによって評価された、前立腺腫瘍からの一連のＩＨＣ画像である。第１の試料は、ＰＴＥＮについて染色された。切除及び変異解析のためのＲＯＩは、ＰＴＥＮ染色画像において、「ｏ」記号で輪郭を描かれている。第２の試料は、ＥＺＨ２について染色された。 本明細書で開示される方法及びシステムによって評価された、肺腫瘍からの一連のＩＨＣ画像である。第１の試料は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒについて染色された。切り出し及び変異解析のためのＲＯＩは、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ染色画像において、「ｏ」記号で輪郭を描かれている。第２の試料は、ｐ５３について染色された。
Ｉ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4th ed. 2007)；Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y.1989)を参照されたい。用語「ある」（「ａ」又は「ａｎ」）は、「１つ又は複数」を意味することを意図される。用語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、ステップ又は要素の列挙に先立つ場合、更なるステップ又は要素の追加が任意選択であり、かつ排斥されないことを意味することを意図される。
抗体：本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含むがそれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
抗体断片：抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されない。
バイオマーカー：本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、生体試料又は生体試料を取得される対象を特徴づけするために使用され得る、生体試料において見出される任意の分子又は分子のグループを指すこととする。例えば、バイオマーカーは、存在、不在、又は比存在度が：
・特定の細胞若しくは組織の、タイプ若しくは状態の特徴を示す；
・特定の病理学的状況若しくは状態の特徴を示す；又は
・疾患状態の重篤度、疾患状態の進行若しくは退行の可能性、及び／又は疾患状態が特定の治療に応答する可能性を示す
分子又は分子のグループであり得る。別の例では、バイオマーカーは、細胞のタイプ若しくは微生物（細菌、マイコバクテリア、真菌、ウイルスなど）、又は置換分子若しくはその分子のグループであり得る。
バイオマーカー特異的試薬：細胞試料中の１つ又は複数のバイオマーカーに直接、特異的に結合することを可能とする、１次抗体などの特異的検出試薬
細胞試料：本明細書で使用される場合、用語「細胞試料」は、病理学的、組織学的、又は細胞学的解釈のために取得される、細胞培養物、体液試料、又は外科標本などのインタクトな細胞を含む任意の試料を指す。
検出試薬：「検出試薬」は、細胞試料中のバイオマーカー特異的試薬付近に染色を沈着するために使用される、任意の試薬である。非限定的な例には、バイオマーカー特異的試薬（１次抗体など）、２次検出試薬（１次抗体に結合可能な２次抗体など）、３次検出試薬（２次抗体に結合可能な３次抗体など）、バイオマーカー特異的試薬に直接又は間接に結合する酵素、そのような酵素と反応して蛍光性又は発色性の染色の沈着をもたらす化学物質などが含まれる。
検出可能部分：試料上に沈着される検出可能部分の存在（即ち定性分析）及び/又は濃度（即ち定量分析）を示す、（視覚的に、電子的に又は他の方法で）検出可能なシグナルを産生し得る分子又は材料。検出可能なシグナルは、光子（ラジオ周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数、及び紫外周波数の光子を含む）の吸収、放出、及び／又は散乱を含む、任意の既知又は未発見の機構により生成され得る。用語「検出可能部分」には、発色性、蛍光性、リン光性、及び発光性の分子及び物質、検出可能な差異を提供するために（例えば無色の物質を着色物質に変換すること若しくはその逆により、又は沈殿物を産生すること若しくは試料濁度を上昇することにより）ある物質を別の物質に変換する触媒（酵素など）が含まれる。いくつかの例では、検出可能部分は、クマリン、フルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体及び類似体）、ローダミン、レゾルフィン、発光団、及びシアニンを含むいくつかの一般的な化学的クラスに属する、蛍光団である。蛍光分子の更なる例は、Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR, TheroFisher Scientific, 11thEditionで、見出される。他の実施形態では、検出可能部分は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ），４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ），テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｐｕｒｐｌｅ），Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５），及びローダミン１１０（ローダミン）を含む色素などの、明視野顕微鏡を介して検出可能な分子である。
組織化学的検出：組織試料の構造間の横断切片関係において、バイオマーカー又は他の構造の顕微鏡検出を許容する方法で、検出試薬で組織試料中のバイオマーカー又は他の構造を染色することを含むプロセス。例には、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）、発色性のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、蛍光性のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、及びヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色が含まれる。
モノクローナル抗体：実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、即ち、集団を構成する個々の抗体は、例えば天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、一般的に少量存在する、存在し得るバリアント抗体を除いて、同一であり、かつ/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部若しくは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法、又はそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない、様々な技術によって作製され得る。
予測バイオマーカー：細胞試料における染色パターンが、特定の治療コースが効果的である可能性、又は他の治療コースが効果的でない可能性を示す、バイオマーカー。
試料：本明細書で使用される場合、用語「試料」は、バイオマーカーの存在又は不在について試験可能な対象から取得される、任意の材料を指すこととする。
２次検出試薬：バイオマーカー特異的試薬に特異的に結合可能な特異的検出試薬。
切片：名詞として使用される場合、通常ミクロトームを用いて切断される、顕微鏡解析に適する、組織試料の薄いスライス。動詞として使用される場合、切片を生成するプロセス。
連続切片：本明細書で使用される場合、用語「連続切片」は、組織試料からミクロトームによって順番に切断される一連の切片の何れか１つを指すこととする。２つの切片が互いの「連続切片」と見なされるために、それらは、組織からの連続する切片であることを必ずしも要しないが、それらは、形態学によって互いに合致され得る、同じ横断切片関係における同じ組織構造を全体に含まなければならない。
特異的検出試薬：細胞試料における標的化学構造に特異的に結合することができる、任意の物質組成物。本明細書で使用される場合、語句「特異的に結合すること」、「に特異的に結合する」、若しくは「特異的に」又は他の類似の繰り返しは、生体分子を含む不均一性の分子集団の存在下における標的の存在の決定因子である、標的と特異的検出試薬の間の測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、ある標的に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも、より高いアフィニティー、アヴィディティーで、より迅速に、かつ／又は長い間、この標的に結合する抗体である。ある実施形態では、無関係の標的に対する特異的検出試薬の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、標的に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、標的に結合するバイオマーカー特異的試薬は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。別の実施形態では、特異的な結合は、排他的な結合を含み得るが、それを要しない。例示的な特異的検出試薬には、特定のヌクレオチド配列に特異的な核酸プローブ；抗体及びその抗原結合断片；並びにＡＤＮＥＣＴＩＮ（第１０ＦＮ３フィブロネクチンベースのスカフォールド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．）、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのＺドメインベースのスカフォールド；Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡＶＩＭＥＲ（ドメインＡ／ＬＤＬ受容体ベースのスカフォールド；Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ｄＡｂ（ＶＨ又はＶＬ抗体ドメインベースのスカフォールド；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＰＬＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＤＡＲＰ（アンキリンリピートタンパク質ベースのスカフォールド；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、ＣＨ）、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮ（リポカリンベースのスカフォールド；Ｐｉｅｒｉｓ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、ＤＥ）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（ＶＨＨ（ラクダ科のＩｇ）ベースのスカフォールド；Ａｂｌｙｎｘ Ｎ／Ｖ、Ｇｈｅｎｔ、ＢＥ）、ＴＲＡＮＳ−ＢＯＤＹ（トランスフェリンベースのスカフォールド；Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ＳＭＩＰ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、及びテトラネクチン（Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）ベースのスカフォールド、テトラネクチン；Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａ Ａ／Ｓ、Ａａｒｈｕｓ、ＤＫ）を含む改変された特異的結合合成物が含まれる。このような改変された特異的結合構造体の説明は、Wurch et al., Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 9, pp. 502-509 (2008)で、概説されており、その内容が、参照により援用される。
染色：名詞として使用される場合、用語「染色」は、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡等を含む顕微鏡観察のために、細胞試料中の特定の分子又は構造を可視化するために使用され得る、任意の物質を指すこととする。動詞として使用される場合、用語「染色」は、細胞試料上に染色の沈着をもたらす、任意のプロセスを指すこととする。
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」又は「個体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、それらに限定されない。特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
組織試料：本明細書で使用される場合、用語「組織試料」は、試料が取得された対象内に存在していた時の細胞間の横断切片空間関係を保持する細胞試料を指すこととする。
腫瘍試料：腫瘍から取得される細胞試料。
ＩＩ．略称
１°：第１の
２°：第２の
５−ＦＵ：５−フルオロウラシル
ＣＩＳＨ：発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋
ＦＩＳＨ：蛍光性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｇＤＮＡ：ゲノムＤＮＡ
Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン・エオジン
ＩＨＣ：免疫組織化学
ＩＳＨ：ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＬＣＭ：レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
ＬＩＳ：臨床検査情報システム
ＭＰＳ：大量並列シークエンシング
ＮＡ：核酸
ＮＧＳ：次世代シークエンシング
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＯＩ：対象領域
ＳＩＳＨ：銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＳＮＰ：一塩基多型
ＩＩＩ．がん治療選択の方法及びがん治療の方法
ある実施形態では、治療選択のプロセスは、組織化学染色、自動ダイセクション、及び次世代シークエンシングのステップを含めて提供される。治療コースを選択するための典型的なワークフローが、図１に図解される。
Ａ．試料及び試料の染色
腫瘍試料が、取得され、腫瘍試料の第１の部分（以下「第１の試料」又は「１°試料」と呼称）が、第１の治療剤１０１のための第１の予測バイオマーカー（「第１の予測バイオマーカー」又は「１°予測バイオマーカー」と呼称）について染色される。
通常、腫瘍試料は、組織試料である。特定の実施形態では、腫瘍試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である。現在知られていようが将来的に知られようが、任意の予測バイオマーカーが、使用され得る。例えば、予測バイオマーカーは、化学療法、標的療法、放射線療法、又はそれらの組み合わせへの応答を予測し得る。例示的な予測バイオマーカーが、表１に開示される：
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多くのリソースが、予測バイオマーカー及びそれらが関連する治療法を同定するために利用可能である。１つの例は、ヴァンダービルト・イングラムがんセンターが管理するウェブサイト「ｍｙｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ」である。更に、ＦＤＡは、コンパニオン診断及び補完的診断の最新の承認に関するウェブサイトを管理している。特定の実施形態では、少なくとも第１の予測バイオマーカーが、標的療法について予測する。別の実施形態では、予測バイオマーカーは、標的治療についてのコンパニオン診断に用いる。
腫瘍試料は、通常、いくつかの部分に分けられ、顕微鏡スライドなどの、顕微鏡解析のための媒体に固定される。試料が組織試料である場合、いくつかの部分は、組織切片であり得る。いくつかの実施形態では、連続切片は、ＦＦＰＥ組織試料から取得される。いくつかの実施形態では、連続切片は、ＦＦＰＥブロックの複数の異なる部位から取得されるが、それは切片内不均一性及びブロック内不均一性の両方をキャプチャ−するためになされ得る。いくつかの実施形態では、連続切片は、同一腫瘍内の異なる位置から取得される複数の異なる生検試料から取得されるが、それは切片内不均一性及び腫瘍内不均一性の両方をキャプチャーするためになされ得る。
染色は、通常、組織化学染色である。組織化学染色技術は、通常、バイオマーカー特異的試薬と対象のバイオマーカーとの間の特異的結合を許容するのに十分な条件下で、バイオマーカー特異的試薬に試料を接触させることを含む。バイオマーカーへのバイオマーカー特異的試薬の結合は、バイオマーカーを含む場所付近で、試料上の検出可能部分の沈着を促進する。検出可能部分は、特異的検出試薬が対象とするバイオマーカーを位置決めし、かつ／又は定量化するために使用され得る。それによって、試料中の標的の存在及び／又は濃度は、検出可能部分により産生されるシグナルを検出することにより検出され得る。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、バイオマーカー特異的試薬に直接コンジュゲートされ、従ってバイオマーカー特異的試薬のその標的への結合の際に、試料上に沈着される（一般に直接標識法と呼称される）。直接標識法は、しばしばより直接的な定量化が可能であるが、しばしば感度の欠如に悩まされる。他の実施形態では、検出可能部分の沈着は、バイオマーカー特異的試薬に結合する検出試薬の使用によって実施される（一般に間接標識法と呼称される）。間接標識法は、バイオマーカー特異的試薬の付近に沈着することができる検出可能部分の数を増加させるので、特に色素と組み合わせて使用する場合に、直接標識法よりしばしば感度が高い。
いくつかの実施形態では、検出可能部分がバイオマーカー特異的試薬に局在化される酵素反応を介して沈着される間接的方法が、使用される。そのような反応に適する酵素は、周知であり、酸化還元酵素、加水分解酵素、及びペルオキシダーゼを含むが、それらに限定されない。明示的に含まれる特定の酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、及びβ−ラクタマーゼである。酵素は、バイオマーカー特異的試薬に直接的にコンジュゲートされることもあり得るし、又は標識コンジュゲートを介してバイオマーカー特異的試薬に間接的に結合されることもあり得る。本明細書中で使用される場合、「標識コンジュゲート」は：
（ａ）特異的検出試薬；及び
（ｂ）特異的検出試薬にコンジュゲートされる酵素であって、組織試料上で色素のｉｎ ｓｉｔｕ生成及び/又は色素の沈着をもたらすのに適する反応条件下において、発色基質、シグナル伝達コンジュゲート、又は酵素反応性色素と反応性である酵素。
を含む。非限定的な例において、標識コンジュゲートの特異的検出試薬は、２次検出試薬（１次抗体に結合される種特異的二次抗体、ハプテンコンジュゲートバイオマーカー特異的試薬に結合される抗ハプテン抗体、又はビオチン化バイオマーカー特異的試薬に結合されるビオチン結合タンパク質など）、３次検出試薬（２次抗体に結合される種特異的３次抗体、ハプテンコンジュゲート２次バイオマーカー特異的試薬に結合される抗ハプテン抗体、又はビオチン化２次バイオマーカー特異的試薬に結合されるビオチン結合タンパク質など）、又は他のそのような構成体であり得る。このようにして試料結合バイオマーカー特異的試薬に局在化される酵素は、その後、検出可能部分を沈着する多くのスキームで使用され得る。
いくつかの場合で、酵素は発色性化合物／基質と反応する。特定の発色性化合物／基質の例には、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリン スルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ-ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチル カルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、又はテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
いくつかの実施形態では、酵素は、金属組織学的検出スキームで使用され得る。金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン及び酵素のレドックス不活性な基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することを含む。いくつかの実施態様では、いくつかの実施態様では、基質は、酵素によってレドックス活性剤に変換され、レドックス活性剤は、金属イオンを還元して、検出可能な沈殿物の形成を引き起こす。（例えば、２００４年１２月２０日出願の米国特許出願第１１／０１５，６４６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号、及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照されたい；これらの各々は、その全体が本明細書に参照により援用される。）金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に酸化還元酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を用いて、検出可能な沈殿物を再度形成することを含む。（例えば、その全体が本明細書に参照により援用される、米国特許第６，６７０，１１３号を参照されたい。）
いくつかの実施形態では、酵素作用が、酵素と色素自体との間で生じ、反応が、色素を非結合の種から試料に沈着される種に変換する。例えば、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）とのＤＡＢの反応は、ＤＡＢを酸化し、その沈殿を引き起こす。
更に他の実施形態では、検出可能部分は、酵素と反応して試料又は他の検出成分に結合することができる反応種を形成するように構成される、潜在的な反応性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートを介して沈着される。これらの反応種は、これらの発生の付近、すなわち酵素の近傍で試料と反応可能であるが、非反応性種に速やかに変換する結果、シグナル伝達コンジュゲートは、酵素が沈着される部位から遠位の部位には沈着されない。潜在的な反応性部分の例には、ＷＯ２０１５１２４７０３Ａ１に記載されるものなどのキノンメチド（ＱＭ）類似体、及びＷＯ２０１２００３４７６Ａ２に記載されるものなどのチラミドコンジュゲートが含まれ、これらの各々は、その全体が本明細書に参照により援用される。いくつかの例で、潜在的な反応性部分は、Ｎ、Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯ Ｐｕｒｐｌｅ）、及びローダミン１１０（ローダミン）などの色素に直接コンジュゲートされる。他の例では、潜在的な反応性部分は、特異的結合対の一方のメンバーにコンジュゲートされ、かつ色素は、特異的結合対の他方のメンバーに連結される。他の例では、潜在的な反応性部分は、特異的結合対の一方のメンバーに連結され、かつ酵素は、特異的結合対の他方のメンバーに連結され、その酵素は、（ａ）発色基質と反応して色素の生成をもたらすか、又は（ｂ）色素と反応して色素（ＤＡＢなど）の沈着をもたらす。特異的結合対の例には、以下が含まれる：
（１）潜在的な反応性部分に連結されるビオチン又はビオチン誘導体（デスチオビオチンなど）、及びビオチン結合体（アビジン、ストレプトアビジン、脱グリコシル化アビジン（ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮなど）など）、又は色素にか、発色基質と反応性若しくは色素と反応性の酵素（例えば、色素がＤＡＢの場合における、ビオチン結合タンパク質に連結されるペルオキシダーゼ）に連結される、ビオチン結合部位にニトロチロシンを有するビオチン結合タンパク質（ＣＡＰＴＡＶＩＤＩＮなど）；並びに
（２）潜在的な反応性部分に連結されるハプテン、及び色素に又は発色基質と反応性か若しくは色素と反応性の酵素（例えば、色素がＤＡＢの場合における、ビオチン結合タンパク質に連結されるペルオキシダーゼ）に連結される抗ハプテン抗体。
特定の実施形態では、第１の予測バイオマーカーは、タンパク質であり、かつ染色方法は、組織化学的タンパク質染色法（免疫組織化学又はタンパク質バイオマーカーに特異的な他の実体を用いる類似の手法など）を含む。いくつかの実施形態では、第１の予測バイオマーカーは、核酸であり、かつ染色方法は、核酸プローブを用いる組織化学染色法（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）など）を含む。他の実施形態では、他のタイプのバイオマーカーが、それらのバイオマーカーのための特異的結合剤をしようして用いて検出され得る。例えば、ヒアルロナン（ＨＡ）は、特定の腫瘍のタイプに共通して蓄積する、アニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。ＨＡは、通常、アフィニティー組織化学技術を用いて検出され、そこでは特異的結合剤が、ＨＡ結合タンパク質（ヒアルロナン結合タンパク質（ユニプロット番号Ｑ０７０２１）又はＴＮＦ刺激遺伝子６（ユニプロット番号Ｐ９８０６６）など）とイムノグロブリンＦｃ領域又は特異的結合対の一員（ビオチンなど）との融合タンパク質である。
本方法での使用に適する、商業的に入手可能な検出試薬又は検出試薬を含むキットの非限定な例には、以下が含まれる：ＶＥＮＴＡＮＡ ｕｌｔｒａＶｉｅｗ検出システム（ＨＲＰ及びＡＰを含む酵素にコンジュゲートされる２次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ ｉＶＩＥＷ検出システム（ビオチン化抗種２次抗体及びストレプトアビジンコンジュゲート酵素）；ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ検出システム（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（ハプテンにコンジュゲートされる抗種２次抗体及び酵素多量体にコンジュゲートされる抗ハプテン３次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ増幅キット（先述のＶＥＮＴＡＮＡ検出システムのいずれかを用いて、１次抗体結合部位に沈着される酵素の数を増幅することができる、非コンジュゲート２次抗体）；ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ増幅システム（ハプテンにコンジュゲートされる抗種２次抗体、酵素多量体にコンジュゲートされる抗ハプテン３次抗体、及び同じハプテンにコンジュゲートされるチラミド）。使用時には、２次抗体は、１次抗体に結合させるため、試料に接触される。次に、試料は、二次抗体に酵素を結合させるため、抗ハプテン抗体とインキュベートされる。試料は、次に、更なるハプテン分子を沈着させるため、チラミドとインキュベートされる。試料は、次に、更なる酵素分子を沈着させるため、抗ハプテン抗体と再度インキュベートされる。試料は、次に、検出可能部分；ＶＥＮＴＡＮＡ ｕｌｔｒａＶｉｅｗ ＩＳＨ検出システム（ハプテン化核酸プローブ及び抗ハプテン１次抗体と共に使用するための、ＨＲＰ及びＡＰを含む酵素にコンジュゲートされる２次抗体を含むキット）；ＶＥＮＴＡＮＡ ＩＳＨ ｉＶＩＥＷ検出システム（ハプテン化核酸プローブ及び抗ハプテン１次抗体；ビオチン化抗種２次抗体及びストレプトアビジンコンジュゲート酵素と共に使用するための）；いずれもＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ）から入手可能な、ＶＥＮＴＡＮＡ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＯｍｎｉＭａｐ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＵｌｔｒａＭａｐ抗ハプテン抗体、２次抗体、発色原、蛍光色素、及び色素のキット；ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ及びＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋ ＩＨＣ検出システム（ＨＲＰ又はＡＰと直接重合して、抗体に対する酵素の高い比率をもつコンパクトなポリマーを生じる２次抗体）；及びＤＡＫＯ ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ＋システム（２次抗体にコンジュゲートされている酵素標識ポリマー）と、色素の沈着を引き起こすためにインキュベートされる。
Ｂ．不均一性の解析及び治療の選択
図１に立ち戻ると、ひとたび、第１試料が第１の予測バイオマーカー１０１について染色されれば、それは、不均一性１０２について判定される。この状況で、不均一性は、染色される試料の異なる部分が第１の薬剤への応答の差を示す染色パターンを有するかどうかに基づいて判定される。腫瘍中の異なる場所又はＦＦＰＥ組織ブロック中の異なる場所からの複数の切片が、第１の予測バイオマーカーについて評価される場合、もし任意の切片が不均一性の染色パターンを示すのであれば、試料は、「不均一性」とみなされるであろう。この文脈で、用語「第１の薬剤」又は「１°薬剤」は、第１の予測バイオマーカーが予測する治療コースを指すこととする。
試料が不均一性でない（即ち、腫瘍の第１の部分の全体が、同じ応答を示す染色パターンを有する）場合、ユーザーは、染色パターンを評価して、腫瘍が第１の薬剤１０３に応答する可能性が高いかどうかを判定する。答えがイエスであれば、対象は、第１の薬剤１０４で治療される。答えがノーであれば、腫瘍領域が、第１の試料中の対象領域（ＲＯＩ）としてマークされ、ＲＯＩが、自動ダイセクションツールに移され、ＲＯＩが、十分な数の非染色の第１の試料の連続切片から自動ダイセクションツールで切り出され、核酸試料が、切り出される試料１０５から生成される。この文脈において、「十分な数」は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プロセスを実行するのに十分な材料を提供するのに少なくとも十分な切片を意味することとする。核酸試料は、更なる予測バイオマーカー（「第２の予測バイオマーカー」又は「２°予測バイオマーカー」と呼称する）１０６と相関する変異の存在について、ＮＧＳによって判定される。ユーザー（病理学者など）が、変異解析に基づいて第２の予測バイオマーカーを選択し、腫瘍の更なる部分（「第２の試料」又は「２°試料」と呼称する）が、第２の予測バイオマーカーについて染色され、かつ１つ又は複数の染色パターンが、腫瘍が１つ又は複数の第２の薬剤１０７に応答する可能性が高いかどうかを決定するために解析される。この文脈において、用語「第２の薬剤」又は「２°薬剤」は、第２の予測バイオマーカーが予測する治療コースを指すこととする。腫瘍が応答する可能性のある１つ又は複数の第２の薬剤は、治療候補１０８として選択される。ある実施形態では、第２の試料は、試料の第１の部分の連続切片である。
試料が不均一性である（即ち、腫瘍の第１の部分が、腫瘍の残部と異なる応答を示す少なくとも１つの領域における染色パターンを有する）場合、応答の欠如を示す染色パターンを有する第１の試料の領域が、ＲＯＩとしてマークされ、ＲＯＩが、自動ダイセクションツールに移され、ＲＯＩが、第１の試料の十分な数の非染色の連続切片から自動ダイセクションツールで切り出され、かつ核酸サンプルが、切り出される試料１０９から生成される。核酸試料は、更なる予測バイオマーカー（「第２の予測バイオマーカー」又は「２°予測バイオマーカー」と呼称する）１１０と相関する変異の存在についてＮＧＳにより判定される。ユーザー（病理学者など）が、変異解析に基づいて二次予測バイオマーカーを選択し、腫瘍の更なる部分（「第２の試料」又は「２°試料」と呼称する）が、二次予測バイオマーカーについて染色され、かつ１つ又は複数の染色パターンが、腫瘍が１つ又は複数の第２の薬剤１１１に応答する可能性が高いかどうかを決定するために解析される。腫瘍が応答する可能性のある１つ又は複数の第２薬剤は、治療候補１１２として選択される。ある実施形態では、第２試料は、試料の第１部分の連続切片である。
ＩＶ．システム
ある実施形態では、システムが、本明細書に記載の方法を実行するために提供される。ある実施形態では、本明細書に記載の方法を実行するように適合されているシステムが、自動ダイセクション装置、ＮＧＳプラットフォーム、及び／又は自動スライド染色プラットフォームの１つ又は複数を含めて提供される。システムは、染色されるスライドの染色パターンを評価するための、かつその画像をキャプチャーし保存するための画像解析システム、並びに／又は試料とワークフローを追跡し、試料についての診断情報を保存し、かつ／又は試料に実行されるアッセイについての指示を追跡するか若しくは提供するためのＬＩＳを含み得る。
Ａ．自動ダイセクションツール
自動ダイセクションツールは、スライドから組織を自動的に切り出す装置である。典型的な自動ダイセクションツールは、２つの主要なコンポーネントを有する：（１）組織の非対象領域を実質的に取り出すことなくＲＯＩを正確に切り出す方法でスライド上の組織に作用する、組織取出しコンポーネント；及び（２）ユーザーがスライドの画像中で切り出しのための領域を選択することを可能とし、かつ組織取出しコンポ―ネントをガイドする、コンピューターに実装されるガイダンスシステム。自動ダイセクションツールは、一般に、２つのカテゴリー：レーザーマイクロダイセクション及びメソダイセクションに分類される。
レーザーマイクロダイセクションツールは、通常、顕微鏡及びレーザービーム（赤外及び／又は紫外領域の波長を有する）を含む。様々なレーザーマイクロダイセクション技術の総説は、Legres et al.で見出すことができる。ユーザーが、ガイダンスシステムから切り出しのための細胞を選択し、レーザーが、ＲＯＩを囲う領域を切断し、そしてＲＯＩの細胞が、取出される。
メソダイセクションツールは、基本的に組織粉砕器である。典型的なデザインでは、スライドは、Ｘ及びＹ軸を制御するステージ上に置かれる。組織が、スライドから所望の切片を切断するために回転する切断ビットに押し付けられ、切断された切片が、スライドから取り出される。メソダイセクションツールの例は、Adey et al.に記載される。Ａｄｅｙにより記載される例では、同時にスライド上に液体を吐出しかつスライドから液体を吸引する切断ビットが、使用されている。組織が切断されると、それは、液体中に懸濁され、吸引される液体と共に吸引される。ユーザーが切り出しのために組織切片をデジタル的にアノテートすることを可能とするソフトウェアシステムが、提供される。ある実施形態では、自動ダイセクションツールは、メソダイセクションツールである。
Ｂ．次世代シークエンシングシステム
本明細書で使用される場合、「次世代シークエンシング解析プラットフォーム」は、大量並列シークエンシング（ＭＰＳ）：数百万から数十億の短い読み取り断片（数十から数百の塩基長）の同時シークエンシングに基づく、任意の核酸シークエンシングプラットフォームである。ＭＰＳは、通常、１８時間のサイクル毎に、少なくとも１０Ｍｂｐの出力を達成し得る。ＮＧＳプラットフォームは、（１）テンプレートの作成方法；及び（２）ＭＰＳを実行するプロセスに基づく、カテゴリーに、広く分類され得る。表２は、テンプレートの作成方法のいくつかの例を含む。
Figure 0006876062
表３は、ＭＰＳのストラテジーのためのいくつかの例を含む。
Figure 0006876062
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ある実施形態において、ＮＧＳ法は、表２又は表３からの１つ又は複数の技術を含む。
Ｃ．自動スライド染色装置
いくつかの実施形態では、システムは、自動スライド染色プラットフォームを含む。自動化スライド染色装置は、通常、少なくとも：染色プロトコルで使用される様々な試薬のリザーバー、スライド上に試薬を分注するためのリザーバーと流通する試薬分注ユニット、使用済み試薬及び他の廃棄物をスライドから除去する廃棄物除去システム、並びに試薬分注ユニット及び廃棄物除去システムの動作を調整する制御システムを含む。染色ステップの実行に加えて、多くの自動スライド染色装置は、スライドのベーキング（スライドに試料を接着するため）、脱蝋（脱パラフィン化とも呼称される）、抗原回収、対比染色、脱水及び清澄化、並びにカバースリッピングを含む、染色に付随するステップを実行することもできる（又は、そのような付随ステップを実行する別々のシステムに適合している）。Ｐｒｉｃｈａｒｄの参考文献は、ＩｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ＷＡＶＥ（Ｃｅｌｅｒｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳ及びＤＡＫＯ ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ ＬＩＮＫ ４８（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ、及びＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の自動スライド染色装置を含む、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置のいくつかの具体例及びそれらの様々な特徴を記載している。更に、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．は、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，６５０，３２７号、第５，６５４，２００号、第６，２９６，８０９号、第６，３５２，８６１号、第６，８２７，９０１号及び第６，９４３，０２９号、並びに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含む、自動解析を実行するためのシステム及び方法を開示する、多数の米国特許の譲受人である。
商業的に入手可能な染色ユニットは、通常、以下の原理で作動する：（1）スライドが水平に配置され、試薬が組織試料を含むスライドの表面上に水たまりとして分注される、開放型個別スライド染色装置（ＤＡＫＯ ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ Ｌｉｎｋ ４８（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＩｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）染色装置で実装されるものなど）；（２）試薬が試料上に沈着される不活性液体層で覆われるか又はそこを通して分注される、液体オーバーレイ技術（ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ染色装置で実装されるものなど）；（３）スライド表面が別の表面（別のスライド又はカバープレートでありうる）の近傍に配置されて狭い間隙を形成し、毛細管力を通して試料と接触する液体試薬を吸引かつ保持する、キャピラリー間隙染色（ＤＡＫＯ ＴＥＣＨＭＡＴＥ、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳ染色装置で使用される染色原理など）。キャピラリー間隙染色のいくらかの反復は、間隙中の液体を混合しない（例えば、ＤＡＫＯ ＴＥＣＨＭＡＴＥ及びｔｈｅ Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤにおいて）。ダイナミック間隙染色と名付けられた毛細管間隙染色のバリエーションでは、毛細管力が、スライドに試料を適用するために使用され、次いで平行面が、インキュベーション中試薬を攪拌させて試薬を混合させるために互いに対し平行移動される（例えば、ＤＡＫＯ ＯＭＮＩＳスライド染色機（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実装される染色原理）。平行移動間隙染色では、平行移動可能なヘッドが、スライドの上方に配置される。ヘッドの下面は、スライドの平行移動中、スライド上の液体から液体のメニスカスが形成することを許容する、十分に小さい第１の間隙によって、スライドから間隔をあけられている。スライドの幅より小さい横方向寸法を有する混合液の外延は、平行移動可能なヘッドの下面から延びて、混合液外延とスライドとの間の第１の間隙より小さい第２の間隙を画定する。ヘッドの平行移動中、混合液の外延の横方向寸法は、第２の間隙から第１の間隙に通常延びる方向で、スライド上の液体における横方向の動きを生成するのに十分である。国際公開第２０１１−１３９９７８Ａ１号を参照されたい。最近、インクジェット技術を用いてスライド上に試薬を沈着することが提案されている。国際公開第２０１６−１７０００８Ａ１号を参照されたい。この自動染色技術のリストは、包括的であることを意図されておらず、バイオマーカー染色を実行するための完全又は半自動システムが、使用され得る。
Ｄ．画像解析システム
いくつかの実施形態では、染色されたスライドのデジタル画像が、顕微鏡上のライブリーディングの代わりに（又はそれに加えて）解析される。そのような実施形態では、染色されたスライドは、イメージャースライドスキャナー上で、画像化され得る。基本的なレベルで、スライドスキャナーは、染色された試料の代表的なデジタル画像を生成する。典型的なスライドスキャナーは、少なくとも：（１）対物レンズを備える顕微鏡。（２）光源（ハロゲン、発光ダイオード、白色光、及び／又はマルチスペクトル光源）、（３）スライドガラスの周囲を動かすため（又はスライド周囲の光学系を動かすため）のロボット技術、（４）画像キャプチャーのための１つ又は複数のデジタルカメラ、（５）ロボットを制御し、デジタルスライドを操作し、管理し、かつ表示するためのコンピューター及び関連ソフトウェアを備える。スライド上の多くの異なるＸ−Ｙ位置（場合によっては複数のＺ面における）におけるデジタルデータは、カメラの電荷結合素子（ＣＣＤ）によってキャプチャーされ、画像は、互いに結合されてスキャン面全体の合成画像を形成する。実施するための一般的な方法は、以下の通りである：
（１）タイルベースのスキャンでは、スライドステージ又光学系が、非常に小さな増分で移動されて、隣接する正方形とわずかに重なる正方形の画像フレームをキャプチャーする。キャプチャーされる四角形は、次に、互いに対し自動的に一致されて合成画像を構築する；そして
（２）ラインベースのスキャンでは、スライドステージが、多数の合成画像「ストリップ」をキャプチャーするための取得の間、単一の軸において移動する。画像ストリップは、次に、より大きな合成画像を形成するように互いと一致され得る。いくつかの場合において、
様々なスライドスキャナーの詳細な概説は、Farahani et al.で見出される。スライドスキャナーの例には：３ＤＨｉｓｔｅｃｈ ＰＡＮＮＯＲＡＭＩＣ ＳＣＡＮ ＩＩ；ＤｉｇｉＰａｔｈ ＰＡＴＨＳＣＯＰＥ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＮＡＮＯＺＯＯＭＥＲ ＲＳ、ＨＴ、及びＸＲ；Ｈｕｒｏｎ ＴＩＳＳＵＥＳＣＯＰＥ ４０００、４０００ＸＴ、及びＨＳ；Ｌｅｉｃａ ＳＣＡＮＳＣＯＰＥ ＡＴ、ＡＴ２、ＣＳ、ＦＬ、及びＳＣＮ４００；Ｍｉｋｒｏｓｃａｎ Ｄ２；Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０−ＳＬ；Ｏｍｎｙｘ ＶＬ４、及びＶＬ１２０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＭＩＮＡ；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＵＬＴＲＡ−ＦＡＳＴ ＳＣＡＮＮＥＲ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＶＩＳＩＯＮＴＥＫ；Ｕｎｉｃ ＰＲＥＣＩＣＥ ５００、及びＰＲＥＣＩＣＥ ６００ｘ；ＶＥＮＴＡＮＡ ＩＳＣＡＮ ＣＯＲＥＯ及びＩＳＣＡＮ ＨＴ；及びＺｅｉｓｓ ＡＸＩＯ ＳＣＡＮ．Ｚ１が含まれる。他の例示的なシステム及び特徴は、例えば、「イメージングシステム及び技術」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２（国際公開第２０１１／０４９６０８号）で見出され、又は「イメージングシステム、カセット及びそれらの使用方法」と題する、２０１１年９月９日出願の米国特許出願第６１／５３３，１１４号に記載される。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２及び米国特許出願第６１／５３３，１１４号は、それらの実体が参照により援用される。
いくつかの実施形態では、画像解析システムは、画像解析システム内で病理学者により同定されるＲＯＩが、スライドから切り出される領域の同定のために自動ダイセクションツールへ直接転送され得るように、自動ダイセクションツールと統合されている。他の実施形態では、画像解析システムは、顕微鏡スライドの診断評価にためにのみ適応され、別個のイメージシステムが、ＲＯＩを同定しかつその切り出しを指示するための自動ダイセクションツールと統合されている。
画像解析システムを含む例示的なシステムが、図２に図示される。自動スライド染色機２０１が、単一の試料２０２からのスライドのセットの第１のスライドを染色するために提供される。染色されるスライドは、画像解析システム２０３によってスキャンされ、病理学者は、染色パターンを検討し、（ａ）試料が不均一性であるかどうか、及び（ｂ）試料のいずれかの部分が第１のバイオマーカーが診断対象とする薬物に応答する可能性が高いかどうかを判定する。病理学者は、自動画像解析システム２０３内で、任意の非応答領域をＲＯＩとして手動でマークし、それがダイセクションツール２０４に移される。第１スライドの連続切片を含むスライドのセットからの非染色のスライドが、自動ダイセクションツール２０４に移され、ＲＯＩが、非染色の切片に合致され、そしてＲＯＩが、切り出される。試料の切り出された部分が、核酸試料を得るために処理され、核酸試料が、ＮＧＳシーケンサー２０５でシークエンシングされる。ソフトウェアスイートは、試料に関連する変異を同定するために使用され、ユーザーは、予測バイオマーカーに関連する変異の１つ又は複数を選択する。スライドのセット２０２からの非染色のスライドは、自動スライド染色装置２０１（第１のスライドを染色した自動スライド染色装置と同じでも異なっていてもよい）に渡される。自動スライド染色装置２０１は、ユーザーによって選択される予測バイオマーカーのためのバイオマーカー特異的試薬で非染色のスライドを染色する。所望の場合、第２の予測バイオマーカーで染色されたスライドが、画像解析システム２０３上で評価され得る。全てのスライドが評価されると、各予測バイオマーカーについての予測を含む診断レポート２０６が、生成され、そこから治療医師が、診断及び治療の決定を下すことができる。
Ｅ．臨床検査情報システム
システムは、更に、ＬＩＳを含み得る。ＬＩＳは、通常、試料上とスライド上とで実施されるプロセス及び試料に由来する画像を記録すること及び追跡すること、試料、スライド、及び／又は画像において特定のプロセスを実行するようにシステムの他のコンポーネントに指示すること、並びに試料及び／又はスライドに適用される特異的試薬についての情報の追跡（ロット番号、有効期限、分注量など）から選択される、１つ又は複数の機能を実行する。ＬＩＳは、通常、少なくとも、試料に関する情報を含むデータベース；試料、スライド、及び／又は画像ファイルに関連するラベル（バーコード（１次元バーコード及び２次元バーコード）、無線周波数識別（ＲＦＩＤ）タグ、試料に添付される英数字コードなど）；並びに試料又はスライド上のラベルを読み取り、かつ／又はＬＩＳと免疫コンテキストスコアリングシステムの他のコンポーネントとの間のスライドについての情報を通信する通信デバイスを含む。従って、例えば、通信装置は、試料処理ステーション、自動スライド染色装置、自動ダイセクションツール、及びＮＧＳシステムのそれぞれに配置され得る。試料が、最初、切片へと処理されると、試料に関する情報（患者ＩＤ、試料のタイプ、１つ又は複数の切片で実行されるプロセス）が、通信デバイスに入力され、ラベルが、試料から生成される各切片について作成される。各後続のステーションでは、ラベルが、（バーコード若しくはＲＦＩＤタグをスキャンすることにより又は英数字コードを手動で入力することにより）通信装置に入力され、ステーションが、例えば、ステーション若しくはステーションオペレーターに特定のプロセスを切片において実行するように指示するために、かつ／又は切片において実行されるプロセスを記録するために、データベースと電子的に通信する。スキャニングプラットフォームでは、スキャニングプラットフォームは、画像が画像解析システムに送られている場合、実行される画像処理ステップがＬＩＳのデータベースから画像解析システムに送ることができ、かつ／又は画像解析システムによって画像上で実施される画像処理ステップがＬＩＳのデータベースによって記録されるように、画像が由来する切片又は試料に立ち戻って相互に関連付けられる、コンピューターが読み取り可能なラベル又はコードで各画像をコード化し得る。本明細書の方法及びシステムに有用な、商業的に入手可能なＬＩＳシステムには、例えば、ＶＥＮＴＡＮＡ Ｖａｎｔａｇｅ Ｗｏｒｋｆｌｏｗシステム（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。
ＬＩＳ及び任意選択の画像解析システムを含む例示的なシステムが、図３に図示される。組織サンプル３０１は、顕微鏡スライド上にマウントされる少なくとも１つの第１の試料３０２と、やはり顕微鏡スライド上にマウントされる第２の試料３０３のセットとを含む、複数の試料に分割される。第１の予測バイオマーカーについて第１の試料３０２を染色するための指示は、ＬＩＳ３０４に記録され、自動スライド染色装置３０５に入力される。いくつかの実施形態では、指示は、ＬＩＳ３０４から自動スライド染色装置３０５に送られ、自動スライド染色装置３０５上で自動的に実施される。いくつかの実施形態では、ＬＩＳ３０４は、第１の試料３０２に関連付けられるラベルを生成する。いくつかの実施形態では、ラベルには、ユーザーが自動スライド染色装置３０５に手動で入力し得る、ラベルに刷り込まれる指示の記載がある。他の実施形態では、ラベルは、自動スライド染色装置におけるステーションによって読み取り可能な、バーコード（１次元バーコード及び２次元バーコードを含む）、ラジオ周波数識別（ＲＦＩＤ）タグ、英数字コードなどの記号表記を含み、自動染色装置３０５にスライド上で実施するプログラムを直接指示するか、又はユーザーに自動染色装置３０５のプログラム方法を知らせる。スライドは、第１の染色スライド３０６を取得するため、自動スライド染色装置３０５によって第１の予測バイオマーカーについて染色される。画像解析システムにおける評価が所望される場合、第１の染色スライド３０６は、画像解析システム３０７によってスキャンされ、病理学者は、染色パターンを検討し、（ａ）試料が不均一性であるかどうか、及び（ｂ）試料の任意の場所が第１のバイオマーカーが診断対象とする薬物に応答する可能性が高いかどうかを判定する。画像解析が所望されない場合、病理学者は、顕微鏡で同じ解析を実施する。いずれの場合においても、病理学者の解析は、ＬＩＳ３０４に記録される。画像解析が実行される場合、第１の染色スライド３０６のデジタル画像も、ＬＩＳ３０４に記録され得るが、その場合、ＲＯＩを同定するために手動でアノテートもされ得る。第１の染色スライド３０６は、次に、自動ダイセクションツール３０８に移され、ＲＯＩは、第１の試料３０２の十分な数の非染色の連続切片中で同定され、切り出される。いくつかの実施形態では、ＲＯＩは、例えば、第１のスライドからのＲＯＩと相関する非染色の切片の形態学的構造を同定する技術者又は病理学者によって、自動ダイセクションツール３０８上で新規に同定される。他の実施形態では、ＲＯＩは、画像解析システム３０７又はＬＩＳ３０４から自動ダイセクションツール３０８に転送され、その後、ユーザーによって修正されるか、又は受け入れられる。正確な切り出される部分は、ＬＩＳ３０４に記録され得る。試試料の切り出された部分は、核酸試料３０９を取得するために処理され、核酸試料は、ＮＧＳシークエンサー３１０でシークエンシングされる。ＮＧＳに関連するソフトウェアスイートは、試料に関連する変異を同定し、ユーザーは、予測バイオマーカーに関連する変異の１つ又は複数を選択する。ＮＧＳ３１０によって同定される変異及びユーザーによって選択される第２の予測バイオマーカーは、ＬＩＳ３０４に保存され得る。１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて１つ又は複数の第２の試料３０３を染色するための指示は、ＬＩＳ３０４に記録され、自動スライド染色装置３０５（第１のスライドを染色した自動スライド染色装置と同じでも異なっていてもよい）に入力される。いくつかの実施形態では、指示は、ＬＩＳ３０４から自動スライド染色装置３０５に送られ、自動スライド染色機３０５上で自動的に実施される。いくつかの実施形態では、ＬＩＳ３０４は、第１の試料３０２に関連付けられるラベルを生成する。いくつかの実施形態では、ラベルには、ユーザーが自動スライド染色装置３０５に手動で入力することができる、ラベルに刷り込まれる指示の記載がある。他の実施形態では、ラベルは、自動スライド染色装置におけるステーションによって読み取り可能な、バーコード（１次元バーコード及び２次元バーコードを含む）、ラジオ周波数識別（ＲＦＩＤ）タグ、英数字コードなどの記号表記を含み、自動染色装置３０５にスライド上で実施するプログラムを直接指示するか、又はユーザーに自動染色装置３０５のプログラム方法を知らせる。スライドは、第２の染色スライド３１１を得るために更なる予測バイオマーカーについて自動スライド染色装置３０５によって染色される。画像解析が所望される場合、１つ又は複数の第２の染色スライド３０６は、画像解析システム３０７によってスキャンされ、病理学者は、染色パターンを検討し、試料の任意の部分が１つ又は複数の第２のバイオマーカーが診断対象とする１つ又は複数の薬剤に応答する可能性が高いかどうかを判定する。画像解析が所望されない場合、病理学者は顕微鏡で同じ解析を実行する。いずれの場合においても、病理学者の解析は、ＬＩＳ３０４に記録される。画像解析が実行される場合、１つ又は複数の第１の染色スライド３１１のデジタル画像も、ＬＩＳ３０４に記録され得る。全てのスライドが解析されると、各予測バイオマーカーについての解析を含む診断レポート３１２が、生成され、そこから治療医師は、診断及び治療の決定を下すことができる。
Ｖ．実施例
記載される方法及びワークフローの実行可能性を試験し、それが症例に関する予測診断情報を得るために使用できるかどうかを判定するために、モデルシステムが、ＰＴＥＮ又はＥＧＦＲを第１の予測バイオマーカーとして用いて開発された。全ての組織化学染色は、ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＵＬＴＲＡ ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色装置で実施された。ＲＯＩの同定及び切り出しは、ＲＯＣＨＥ自動ダイセクションツールメソダイセクション装置を用いて実行された。ＤＮＡは、Ｒｏｃｈｅ ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ９６を用いて単離され、こうして得られたＤＮＡ試料の品質管理は、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０を利用するｑＰＣＲにより実行された。１０ｎｇのＤＮＡが、最高のライブラリー調製成功率の場合に得られた（好ましくは１．６ｎｇ／μＬ）。各ＲＯＩに必要なスライドの総数は、約２５０ｍｍ２の組織が必要とされるという仮定に基づいて計算された。標的シークエンシングは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｎｃｅｒ ＨｏｔＳｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２及びオンシステムバリアント解析を利用するＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ ＰＧＭ ＮＧＳプラットフォームで実行された。
第１の実施例では、前立腺腫瘍が、ＰＥＴＮについてＩＨＣにより染色された。陽性染色腫瘍領域は、カバレッジ及び非同義変異についてのフィルターのみを用いて単離された。結果は、表４に示される。
Figure 0006876062
品質目的のために、５００Ｘ（ＳＮＰが少なくとも５００回シークエンシングされたことを意味する）より高いカバレッジを有する変異のみが、記録された。このリストから、ＩＨＣ試験は、ＥＧＦＲ発現及びＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされるＨＥＲ２について、商業的に入手可能である。これらの試験に２つのライドを用いて、前立腺がん症例におけるＥＧＦＲの過剰発現及びＨＥＲ２の予期せぬ発現が、観察され、そのどちらもが更なる治療標的を同定することができた。
第２の前立腺がん症例は、ＩＨＣによってＰＴＥＮについて再度染色され、その画像が、図５で見ることができる。陽性染色試料の切片が、シークエンシングされ、その結果が、表５に表示される：
Figure 0006876062
更なる切片が、ＥＺＨ２について染色され、その結果は、図５で見られる。ｃ−Ｋｉｔは、潜在的な予測バイオマーカーと追加的に認識された。しかしながら、ＩＨＣ染色は、対象の染色を示さなかった。これは、予測バイオマーカーと相関する変異の存在が、臨床的に実行可能な治療コースを提供するとは限らないことを示している。
肺の症例が、ＩＥＧＦＲの一塩基多型：ＥＧＦＲ Ｌ８５８ＲについてＩＨＣによって染色された。画像が、図６に表示される。変異陰性領域が、切り出され、シークエンシングされた。結果が、６に示される。ｐ５３ＩＨＣ染色が、実行され、その画像は、図６で見られる。染色スライドは、シスプラチンベースの化学療法及びＭＤＭ２アンタゴニストを予測する、ｐ５３発現の喪失を至る所で示した。
肺の症例は、全体試料のシークエンシングに対抗する、ダイセクションツールの必要性の試験にも用いられた。表７で見られるように、試料の切り出された部分で検出可能ないくつかの変異は、もし全体試料がシークエンシングされるなら、見失われ得る。これは、全体組織よりむしろアノテートされた腫瘍領域をシークエンシングすることの重要性を示している。
Figure 0006876062
Figure 0006876062
ＶＩＩ．更なる例示的実施形態
以下の更なる実施形態も、具体的に開示される。これは、網羅的なリストであることを意図されていない。
１．
腫瘍の第１の試料を採取することであって、第１の試料が、第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色される、採取すること；
自動ダイセクションツールで第１の試料から１つ又は複数の領域を切り出すことであって、切り出される領域が、領域が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、切り出すこと；
第１の試料の切り出された１つ又は複数の領域に由来する核酸試料における、１つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する１つ又は複数の変異を、次世代シークエンサーで検出すること；
試料中で同定される１つ又は複数の変異に相関する１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて１つ又は複数の更なる試料を染色することであって、１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが１つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、染色すること
を含む方法。
２．
第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて染色される腫瘍の第１の試料であって、第１の予測バイオマーカーの染色パターンが、第１の試料の少なくとも第１の領域が第１の治療剤に反応する可能性が低いことを示す試料；及び
第１の試料の第１の領域に由来する核酸試料であって、自動ダイセクションツールで第１の試料の第１の領域を切り出すこと、及び試料の切り出される部分からゲノムＤＮＡを抽出することによって、腫瘍の第１の部分の第１の領域から得られる核酸試料
を取得すること；
１つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、核酸試料中の１つ又は複数の変異を、次世代シークエンサーで検出すること；
試料中で同定される１つ又は複数の変異に相関する１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて、腫瘍の１つ又は複数の更なる試料を染色することであって、１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、１つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、染色すること
を含む方法。
３．
第１の治療化合物のための第１の予測バイオマーカーについて染色される腫瘍の第１の試料であって、第１の予測バイオマーカーの染色パターンが、第１の試料の少なくとも第１の領域が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す試料；及び
腫瘍の１つ又は複数の更なる試料
を取得すること；
更なる治療剤のための１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて１つ又は複数の更なる試料を染色することであって、更なる予測バイオマーカーが、第１の試料の第１の領域から自動ダイセクションツールで切り出される核酸試料中の次世代シークエンサーによって同定される１つ又は複数の変異に対応し、１つ又は複数の変異が、１つ又は複数の更なる治療剤への反応を予測する、染色すること
を含む方法。
４．
第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーに特異的な第１の特異的結合剤、及び
第１の切片に結合される場合に特異的結合剤を可視化するための検出剤のセット
を用いて腫瘍の第１の試料を染色すること；並びに
少なくとも１つの更なる治療剤のための、１つ又は複数の予測バイオマーカーに特異的な１つ又は複数の更なる特異的結合剤であって、１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、自動ダイセクションツールで第１の切片から抽出される領域において同定される核酸に対応し、自動ダイセクションツールで抽出される領域が、腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１のバイオマーカーについての染色パターンを有する特異的結合剤、及び
第２の切片に結合した場合に特異的結合剤を可視化するための検出試薬のセット
を用いて腫瘍の１つ又は複数の更なる試料を染色すること
を含む方法。
５．対象のための治療コースを同定するレポートを生成することを更に含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法であって、前記治療コースが対象に：
第１の試料の少なくとも１つの領域が、腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が高いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、第１の治療剤；及び
１つ又は複数の更なる試料の少なくとも１つの領域が、腫瘍の少なくとも１つの部分が更なる治療剤に応答する可能性が高いことを示す、対応する更なる予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、１つ又は複数の更なる治療剤
を投与することを含む、方法。
６．対象のための治療コースを施すことを更に含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法であって、前記治療コースが：
第１の試料の少なくとも１つの領域が、腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が高いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、第１の治療剤；及び／又は
１つ又は複数の更なる試料の少なくとも１つの領域が、腫瘍の少なくとも１つの部分が更なる治療剤に応答する可能性が高いことを示す、対応する更なる予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、１つ又は複数の更なる治療剤
を投与することを含む、方法。
７．腫瘍が固形腫瘍である、実施形態１〜６の何れか１つに記載の方法。
８．固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であり、かつ第１の試料及び１つ又は複数の更なる試料が、ＦＦＰＥ組織試料のミクロトーム切片である、実施形態７に記載の方法。
９．第１の試料及び１つ又は複数の更なる試料が、連続切片である、実施形態８に記載の方法。
１０．次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．
（ａ）（ａ１）腫瘍の第１の試料が付着した第１の顕微鏡スライドであって、第１の試料が、第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色された、顕微鏡スライド；
（ａ２）腫瘍の更なる試料が付着した、１つ又は複数の更なる非染色顕微鏡スライド
を含む顕微鏡スライドのセット；
（ｂ）腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第１の試料の１つ又は複数の領域を同定するための画像解析システム；
（ｃ）第１の試料からの第１の治療剤への応答の欠如の特徴を示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第１の試料の１つ又は複数の領域を切り出すようにプログラムされた自動ダイセクションツール；
（ｄ）自動ダイセクションツールによって切り出される第１の試料の領域に由来する核酸試料中の１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異の存在又は不在を同定するようにプログラムされる次世代シークエンサー；及び
（ｅ）１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで１つ又は複数の更なるスライドを染色するようにプログラムされる自動スライド染色装置
を含む、システム。
１３．
（ｆ）データベースを含む臨床検査情報システム（ＬＩＳ）を更に含む実施形態１２に記載のシステムであって、データベースが：
（ｆ１）次世代シークエンサーによる核酸試料の変異解析であって、変異解析が、少なくとも、１つ又は複数の更なる治療剤のための１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する核酸試料中の変異の存在又は不在を示す変異解析：及び
（ｆ２）変異解析によって同定される１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第２の試料を染色するよう自動スライド染色装置に命令するための指示
を含む、システム。
１４．非染色顕微鏡スライドの少なくとも１つが、ＬＩＳによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、スライドを自動スライド染色装置による（ｆ２）の指示の実行に適するものであると同定する、実施形態１２に記載のシステム。
１５．ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置に自動的に命令する、実施形態１４に記載のシステム。
１６．ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、実施形態１４に記載のシステム。
１７．次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態１２〜１６のいずれか１つに記載のシステム。
１８．第１の予測バイオマーカー及び更なる１つ又は複数の予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態１２〜１７のいずれか１つに記載のシステム。
１９．
（ａ）腫瘍の第１の試料から切り出される１つ又は複数の領域に由来する核酸試料であって、腫瘍の第１の試料が、第１の予測バイオマーカーについて染色され、かつ更に、切片から切り出される１つ又は複数の領域が、腫瘍の少なくとも１つの領域が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーの染色パターンを有する核酸試料；
（ｂ）１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異の存在又は不在を同定するように適合される次世代シークエンサー；
（ｃ）データベースを含む臨床検査情報システム（ＬＩＳ）であって、データベースが：
（ｃ１）次世代シークエンシングによる核酸試料の変異解析であって、変異解析が、少なくとも、核酸試料中の変異の存在又は不在を示し、変異が、１つ又は複数の更なる治療剤のための１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異解析；及び
（ｃ２）変異解析によって同定される１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第２の試料を染色するように自動スライド染色装置に命令するための指示
を含むＬＩＳ
を含むシステム。
２０．
（ｄ）腫瘍の第２の試料を吸着されている非染色顕微鏡スライド；及び
（ｅ）（ｃ２）の指示によって第２の試料を染色するよう適合される自動スライド染色装置
をさらに含む、実施形態１９に記載のシステム。
２１．非染色顕微鏡スライドが、ＬＩＳによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、自動スライド染色装置によって、スライドを（ｃ２）の指示の実行に適するものであると同定する、実施形態２０に記載のシステム。
２２．ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように、自動スライド染色装置に自動的に命令する、実施形態２１に記載のシステム。
２３．ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、実施形態２１に記載のシステム。
２４．次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態１９〜２３のいずれか１つに記載のシステム。
２５．第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態１９〜２４のいずれか１つに記載のシステム。
２６．
（ａ）腫瘍の第１の試料が付着した非染色顕微鏡スライド；
（ｂ）自動スライド染色装置；及び
（ｃ）データベースを含む臨床検査情報システム（ＬＩＳ）であって、データベースが：
（ｃ１）腫瘍の第２の試料の診断情報であって、第２の試料が、第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて染色された診断情報；
（ｃ２）次世代シークエンシングによる核酸試料の変異解析であって、核酸試料が、第２の試料の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する第２の試料の部分から取得され、かつ変異解析が、少なくとも、１つ又は複数の更なる治療剤のための１つ又は複数の更なるバイオマーカーに相関する、核酸試料中の変異の存在又は不在を示す変異解析；及び
（ｃ３）変異解析によって同定される１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第１の試料を染色するように自動スライド染色装置に命令するための指示
を含むＬＩＳ
を含むシステム。
２７．非染色顕微鏡スライドが、ＬＩＳによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、スライドを自動スライド染色装置によって（ｃ２）の指示の実行に適するものであると同定する、実施形態２６に記載のシステム。
２８．ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように、自動スライド染色装置に自動的に命令する、実施形態２７に記載のシステム。
２９．ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、実施形態２７に記載のシステム。
３０．次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態２６〜２９のいずれか１つに記載のシステム。
３１．第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態２６〜３０のいずれか１つに記載のシステム。
３２．腫瘍が、固形腫瘍である、実施形態１２〜３１の何れか１つに記載のシステム。
３３．固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であり、かつ腫瘍の試料が、ＦＦＰＥ組織試料のミクロトーム切片である、実施形態３２に記載のシステム。
３４．１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色される試料が、第１の予測バイオマーカーについて染色される試料の連続切片である、実施形態３３に記載のシステム。
３５．腫瘍に由来する診断試料のセットであって、
（ａ）腫瘍の第１の試料であって、第１の試料が、第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて染色され、第１の試料の少なくとも１つの部分が、腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーについての第１の染色パターンを有する、試料；
（ｂ）（ｂ１）腫瘍の部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す染色パターンを有する第１の試料の部分を自動ダイセクションツールで切り出すこと；及び
（ｂ２）次世代シークエンサーにおける核酸試料の使用に適合する方法で第１の試料の切り出された部分から核酸試料を抽出すること
を含む方法により取得される核酸試料；並びに
（ｃ）腫瘍の１つ又は複数の更なる試料であって、１つ又は複数の更なる試料が、１つ又は複数の更なる治療剤のための１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色され、１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、核酸試料中で同定される変異に対応する、試料
を含む、診断試料のセット。
３６．腫瘍が、固形腫瘍である、実施形態３５に記載の診断試料のセット。
３７．固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であり、かつ腫瘍の試料が、ＦＦＰＥ組織試料のミクロトーム切片である、実施形態３６に記載の診断試料のセット。
３８．１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色される試料が、第１の予測バイオマーカーについて染色される試料の連続切片である、実施形態３７に記載の診断試料のセット。
３９．次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態３５〜３８のいずれか１つに記載の診断試料のセット。
４０．第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態３５〜３９のいずれか１つに記載の診断試料のセット。
４１．第１の予測バイオマーカーのためのバイオマーカー特異的試薬で腫瘍の第１の組織切片を組織化学的に染色することを含む方法であって、第１の予測バイオマーカーが、第１の組織切片の連続切片の領域で同定される変異と関連し、領域が第２の予測バイオマーカーが予測する治療剤に応答しないと予測される第２の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する方法。
４２．変異が：
自動ダイセクションツールで組織切片から領域を切り出すこと；及び
次世代シークエンサーによって切り出される領域に由来する核酸試料を配列解析すること
によって同定される、実施形態４１に記載の方法。
４３．次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、実施形態４２に記載の方法。
４４．腫瘍が固形腫瘍である、実施形態４１〜４３の何れか１つに記載の方法。
４５．固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であり、かつ第１の試料及び１つ又は複数の更なる試料がＦＦＰＥ組織試料のミクロトーム切片である、実施形態４４に記載の方法。
４６．第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、実施形態４１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．実施形態１〜４６のいずれかであって、１つ又は複数の予測バイオマーカーが、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって染色される実施形態。
ＶＩＩＩ．引用文献
以下の引用のそれぞれの内容は、本明細書で、その全体が引用により援用される。
Adey et al., A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation, BMC Clinical Pathology, Vol. 13, Issue 29 (2013).
Amemiya, An approach for analyzing genetic heterogeneity in retrospective tumor samples using laser capture microdissection, real-time PCR, and next-generation sequencing) (2015), https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/PG1345-PJ5184-CO34268-VariantDetectionAnalysisLCM_AmpliSeq_qPCR_Americas_FLR.pdf
Applied Biosystems, Inc. Uncovering tumor heterogeneity in FFPE samples by laser capture microdissection and next-generation sequencing (2015), https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/PG1395-PJ6555-CO29666-LCM-App-note-Focus-on-LCM-for-tumor-heterogeneity-Global-FHR.pdf (“AB Brochure”).
Farahani et al., Whole slide imaging in pathology: advantages, limitations, and emerging perspectives, Pathology and Laboratory Medicine Int’l, Vol. 7, p. 23-33 (June 2015), the content of which is incorporated by reference in its entirety.
White Paper: FDA and Accelerating the Development of the New Pharmaceutical Therapies, available at http://www.fda.gov/downloads/AboutFDA/ReportsManualsForms/ Reports/UCM439183.pdf（「ＦＤＡ」白書）.
Legeres et al., Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research, Am J Cancer Res.Vol. 4, Issue 1, pp. 1-28 (2014).
Prichard, Overview of Automated Immunohistochemistry, Arch Pathol Lab Med., Vol. 138, pp. 1578-1582 (2014).
Reuter et al., High-Throughput Sequencing Technologies, Molecular Cell, Vol. 58, issue 4, pp. 586-597, (May 21, 2015).
Sun & Yu, Intra-tumor heterogeneity of cancer cells and its implications for cancer treatment, Acta Pharmacol Sin.Vol. 36, Issue 10, pp 1219-1227 (Oct. 2015).
Zhang et al., Profiling Cancer Gene Mutations in Clinical Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Colorectal Tumor Specimens Using Targeted Next-Generation Sequencing, The Oncologist, Vol. 19, No. 4, pp 336-342 (2014).

Claims (20)

  1. 腫瘍の第１の試料を、第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色すること；
    自動ダイセクションツールで第１の試料から１つ又は複数の領域を切り出すことであって、切り出される領域が、領域が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、切り出すこと；
    第１の試料の切り出された１つ又は複数の領域に由来する核酸試料における、１つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する１つ又は複数の変異を、次世代シークエンサーで検出すること；
    試料中で同定される１つ又は複数の変異に相関する１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて１つ又は複数の更なる試料を染色することであって、１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが１つ又は複数の更なる治療剤への応答を予測する、染色すること
    を含む方法。
  2. 対象のための治療コースを同定するレポートを生成することを更に含む、請求項１に記載の方法であって、前記治療コースが対象に：
    第１の試料の少なくとも１つの領域が、腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が高いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、第１の治療剤；及び
    １つ又は複数の更なる試料の少なくとも１つの領域が、腫瘍の少なくとも１つの部分が更なる治療剤に応答する可能性が高いことを示す、対応する更なる予測バイオマーカーについての染色パターンを有する場合は、１つ又は複数の更なる治療剤
    を投与することを含む、方法。
  3. 腫瘍が固形腫瘍である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であり、かつ第１の試料及び１つ又は複数の更なる試料が、ＦＦＰＥ組織試料のミクロトーム切片である、請求項３に記載の方法。
  5. 第１の試料及び１つ又は複数の更なる試料が、連続切片である、請求項４に記載の方法。
  6. （ａ）（ａ１）腫瘍の第１の試料が付着した第１の顕微鏡スライドであって、第１の試料が、第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて組織化学的に染色された、顕微鏡スライド；
    （ａ２）腫瘍の更なる試料が付着した、１つ又は複数の更なる非染色顕微鏡スライド
    を含む顕微鏡スライドのセット；
    （ｂ）腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第１の試料の１つ又は複数の領域を同定するための画像解析システム；
    （ｃ）第１の試料からの第１の治療剤への応答の欠如の特徴を示す第１の予測バイオマーカーについての染色パターンを有する、第１の試料の１つ又は複数の領域を切り出すようにプログラムされた自動ダイセクションツール；
    （ｄ）自動ダイセクションツールによって切り出される第１の試料の領域に由来する核酸試料中の１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する変異の存在又は不在を同定するようにプログラムされる次世代シークエンサー；及び
    （ｅ）１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで１つ又は複数の更なるスライドを染色するようにプログラムされる自動スライド染色装置
    を含む、システム。
  7. （ｆ）データベースを含む臨床検査情報システム（ＬＩＳ）を更に含む請求項６に記載のシステムであって、データベースが：
    （ｆ１）次世代シークエンサーによる核酸試料の変異解析であって、変異解析が、少なくとも、１つ又は複数の更なる治療剤のための１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーに相関する核酸試料中の変異の存在又は不在を示す変異解析：及び
    （ｆ２）変異解析によって同定される１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーで腫瘍の第２の試料を染色するよう自動スライド染色装置に命令するための指示
    を含む、請求項６に記載のシステム。
  8. 非染色顕微鏡スライドの少なくとも１つが、ＬＩＳによって生成されかつ自動スライド染色装置によって読み取り可能なラベルを添付され、ラベルが、スライドを自動スライド染色装置による（ｆ２）の指示の実行に適するものであると同定する、請求項７に記載のシステム。
  9. ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置に自動的に命令する、請求項８に記載のシステム。
  10. ラベルが、第２の試料上で指示を実行するように自動スライド染色装置をプログラムするように手動の操作者に指示するレポートを、自動スライド染色装置の操作者のために生成する、請求項８に記載のシステム。
  11. 腫瘍に由来する診断試料のセットであって、
    （ａ）腫瘍の第１の試料であって、第１の試料が、第１の治療剤のための第１の予測バイオマーカーについて染色され、第１の試料の少なくとも１つの部分が、腫瘍の少なくとも１つの部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す第１の予測バイオマーカーについての第１の染色パターンを有する、試料；
    （ｂ）（ｂ１）腫瘍の部分が第１の治療剤に応答する可能性が低いことを示す染色パターンを有する第１の試料の部分を自動ダイセクションツールで切り出すこと；及び
    （ｂ２）次世代シークエンサーにおける核酸試料の使用に適合する方法で第１の試料の切り出された部分から核酸試料を抽出すること
    を含む方法により取得される核酸試料；並びに
    （ｃ）腫瘍の１つ又は複数の更なる試料であって、１つ又は複数の更なる試料が、１つ又は複数の更なる治療剤のための１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色され、１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、核酸試料中で同定される変異に対応する、試料
    を含む、診断試料のセット。
  12. 腫瘍が、固形腫瘍である、請求項１１に記載の診断試料のセット。
  13. 固形腫瘍が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であり、かつ腫瘍の試料がＦＦＰＥ組織試料のミクロトーム切片である、請求項１２に記載の診断試料のセット。
  14. １つ又は複数の更なる予測バイオマーカーについて染色される試料が、第１の予測バイオマーカーについて染色される試料の連続切片である、請求項１３に記載の診断試料のセット。
  15. 次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  16. 次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
  17. 次世代シークエンサーが、パイロシークエンス、サイクリック可逆的ターミネーション、セミコンダクターシークエンシング技術、及びリン酸結合蛍光ヌクレオチドからなる群から選択される原理で作動する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の診断試料のセット。
  18. 第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  19. 第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
  20. 第１の予測バイオマーカー及び１つ又は複数の更なる予測バイオマーカーが、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ｃ−ＫＩＴ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＣＤ３０、クローディン、１７ｐ１３．１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ１、エストロゲン受容体、ＥＲＥＧ、ＥＲＣＣ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ヒアルロナン、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、Ｋ−ｒａｓ、ＭＧＭＴ、ＭＳＬＮ、ｐ５３、ＭＤＭ２、プロゲステロン受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＴＥＮ、及びチラミドホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の診断試料のセット。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016499B (zh) 2011-04-15 2023-11-14 约翰·霍普金斯大学 安全测序系统
CN104956225B (zh) 2012-10-29 2018-10-02 约翰·霍普金斯大学 卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试
CA2973769C (en) * 2015-01-31 2021-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Systems and methods for meso-dissection
WO2016120433A1 (en) 2015-01-31 2016-08-04 Roche Diagnostics Gmbh Systems and methods for meso-dissection
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
WO2018087155A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Automated tissue dissection instrument and methods of using the same
MX2020001575A (es) 2017-08-07 2020-11-18 Univ Johns Hopkins Materiales y métodos para evaluar y tratar el cáncer.
US11348239B2 (en) 2018-05-14 2022-05-31 Tempus Labs, Inc. Predicting total nucleic acid yield and dissection boundaries for histology slides
US11348661B2 (en) * 2018-05-14 2022-05-31 Tempus Labs, Inc. Predicting total nucleic acid yield and dissection boundaries for histology slides
US11348240B2 (en) 2018-05-14 2022-05-31 Tempus Labs, Inc. Predicting total nucleic acid yield and dissection boundaries for histology slides
EP3794551A4 (en) 2018-05-14 2022-02-09 Tempus Labs, Inc. FRAMEWORK FOR GENERALIZABLE AND INTERPRETABLE DEEP LEARNING FOR PREDICTING MSI FROM HISTOPATHOLOGICAL SLIDE IMAGES
US10957041B2 (en) 2018-05-14 2021-03-23 Tempus Labs, Inc. Determining biomarkers from histopathology slide images
JP2022516154A (ja) 2018-12-31 2022-02-24 テンプス ラブス，インコーポレイティド 組織画像の人工知能セグメンテーション
KR20210145778A (ko) * 2019-03-26 2021-12-02 템퍼스 랩스, 인크. 조직병리학 슬라이드 이미지로부터 바이오마커를 결정하는 방법
WO2021039889A1 (ja) * 2019-08-28 2021-03-04 公益財団法人がん研究会 病理画像管理システム
CN115552248A (zh) * 2020-05-07 2022-12-30 文塔纳医疗系统公司 用于评价肿瘤样品中egfr和egfr配体表达的组织化学系统和方法
CN116230214B (zh) * 2023-05-08 2023-08-01 浙江大学滨江研究院 Hcc及vetc辅助诊断装置及设备

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1564604A (en) 1925-06-12 1925-12-08 Chas S Hodges Water wheel
US5595707A (en) 1990-03-02 1997-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Automated biological reaction apparatus
US6296809B1 (en) 1998-02-27 2001-10-02 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US6582962B1 (en) 1998-02-27 2003-06-24 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US20030211630A1 (en) 1998-02-27 2003-11-13 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US6670113B2 (en) 2001-03-30 2003-12-30 Nanoprobes Enzymatic deposition and alteration of metals
DK1636586T3 (da) 2003-06-24 2009-11-23 Ventana Med Syst Inc Enzymkatalyseret metaldeponering til foröget in situ-detektion af immunhistokemisker epitoper og nucleinsyresekvenser
US8768629B2 (en) * 2009-02-11 2014-07-01 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
CA2776527C (en) 2009-10-19 2014-08-05 Ventana Medical Systems, Inc. Imaging system and techniques
CA2797291C (en) * 2010-04-22 2020-08-11 British Columbia Cancer Agency Branch Novel biomarkers and targets for ovarian carcinoma
WO2011139978A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Ventana Medical Systems, Inc. Moving meniscus rinsing and mixing in cell staining
JP2013531801A (ja) 2010-07-02 2013-08-08 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 標的検出のためのハプテンコンジュゲート
AU2015220750B2 (en) 2014-02-24 2020-04-16 Ventana Medical Systems, Inc. Quinone methide analog signal amplification
WO2016170008A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Ventana Medical Systems, Inc. Inkjet deposition of reagents for histological samples

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