CN111190013B - 一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用 - Google Patents
一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子生物学和肿瘤学领域,具体涉及一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用。其中,食管癌检测标志物为能够特异性检测CA19‑9、CYFRA21‑1、CA125、FBXW7和FAT1或该组基因表达产物的试剂;食管癌早期诊断试剂盒为液相蛋白芯片试剂盒。本申请首次将CA19‑9单克隆抗体、CYFRA21‑1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体这一组合作为食管癌标志物,并用于制备对早期食管癌具有较高检测灵敏度和特异度的液相蛋白芯片,本发明液相蛋白芯片对食管癌的检测灵敏度为93.5%,特异度为73.9%。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和肿瘤学领域,具体涉及一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用。
背景技术
中国北部,尤其是河南省林州及其毗邻的辉县、安阳、磁县等地是世界食管癌发病率和死亡率最高的地区,局部地区食管癌发病率可高达190/10万,并且预后极差,目前仍然是该地区肿瘤相关主要死亡原因。
目前,食管癌的诊断仍以消化道内镜检查为主。然而,消化道内镜检查具有侵入性,操作不便,患者较痛苦,还有感染、出血等风险,而且检测费用较贵。近年来,国内外学者开始致力于从血液中寻找敏感、特异、可靠、有效的食管癌生物标记物并建立无创伤性检查来提高食管癌早期诊断率。
以往对血液中肿瘤标志物的检测,一般采用PCR、免疫层析荧光标记等方法。PCR不适用于快速检测,免疫层析法虽然快速,但是假阴性的比例大,只能定性或半定量,其特异性和灵敏度有待提升。因此,需要结合新方法新技术新材料开发新型食管癌血液早期检测的手段,提高食管癌早期诊断的特异性和敏感性。
发明内容
本发明的目的旨在提供一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用。
基于上述目的,本发明采取了如下技术方案:
能够特异性检测CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1或该组基因表达产物的试剂在食管癌早期诊断试剂盒中的应用。
进一步地,试剂盒为液相蛋白芯片试剂盒。
食管癌早期诊断用多标志物液相蛋白芯片试剂盒,包括混合微粒悬液,所述微粒分别由五种食管癌标志物抗体与嵌入了量子点的胶体金包被原微粒偶联而成;所述五种食管癌标志物抗体为CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体。
进一步地,混合微粒悬液通过下述方法制备:
(1)制备胶体金包被原微粒,然后将胶体金包被原微粒分成5份,在各份胶体金包被原微粒表面分别嵌入激发波长相同但发射波长互不相同的量子点,得到5种嵌入了不同量子点的胶体金包被原微粒;
(2)制备单克隆抗体:分别以CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1的重组蛋白作为抗原,分别制备出CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体;
(3)制备蛋白芯片:将步骤(2)制的5种单克隆抗体分别与胶体金包被原微粒偶联,分别制得CA19-9微粒溶液、CYFRA21-1微粒溶液、CA125微粒溶液、FBXW7微粒溶液和FAT1微粒溶液;取等量的CA19-9微粒溶液、CYFRA21-1微粒溶液、CA125微粒溶液、FBXW7微粒溶液和FAT1微粒溶液混合均匀,得到混合微粒悬液,于–80℃冰箱中保存。
进一步地,步骤(1)包括如下操作过程:
将量子点嵌入到胶体金包被的原微粒表面:取玻璃试管,分别加入2mL浓度为300ppb的量子点氯仿溶液和0.01g步骤制得的胶体金包被原微粒,充分振荡后于通风橱中待氯仿挥发完全后,将剩下的微粒用无水乙醇反复洗涤,在室温下干燥后获得嵌入了量子点的胶体金包被原微粒,其中,充分振荡的目的在于使得溶液中的量子点全部嵌入到胶体金包被后的原微粒的表面,从而使溶液中不存在游离的量子点。
进一步地,胶体金的制备过程为:将氯金酸配置成0.01wt%的水溶液,取100mL置于250mL容量的烧杯中,加热至沸腾后,保持沸腾的状态下加入80g柠檬酸钠,当氯金酸水溶液的颜色为稳定的红色后停止加热,待红色水溶液冷却至室温后,用蒸馏水恢复至原体积,即得胶体金。
进一步地,步骤(3)中各微粒溶液的制备过程如下:
.对溶于磷酸缓冲液中的CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体,分别进行下述处理:在电磁搅拌仪的持续搅拌下,加入磷酸缓冲液,稀释成浓度为30μg/mL的溶液;
.向步骤中稀释后的溶液中再依次加入20ml1%的吐温80、0.01g步骤中制得的嵌入了量子点的胶体金包被原微粒,持续搅拌15min后,加入30ml5%的BSA溶液封闭微粒上没有偶联完的位点,待封闭完成后,对溶液进行离心,取沉淀用PBS缓冲液反复洗涤后,分别得到偶联了CA19-9单克隆抗体的CA19-9微粒、偶联了CYFRA21-1单克隆抗体的CYFRA21-1微粒、偶联了CA125单克隆抗体的CA125微粒和偶联了FBXW7单克隆抗体的FBXW7微粒、偶联了FAT1单克隆抗体的FAT1微粒,各号微粒保存于100ml的PBS缓冲液中,微粒浓度均为1μg/mL。
进一步地,原微粒由聚苯乙烯与丙烯酸松香脂按照质量比2:1聚合而成。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
(1)本申请首次将CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体这一组合作为食管癌标志物,并用于制备检测食管癌的液相蛋白芯片,本发明液相蛋白芯片对食管癌的检测灵敏度为93.5%,特异度为73.9%。
(2)本发明利用量子点本身具有的同一激发波长但发射波长互不相同的特点,利用量子点对负载有多个单克隆抗体的微粒进行编码而制得的蛋白芯片,根据量子点被激发后的荧光强弱进行定量分析,实现多个食管癌分子靶标的同时检测;此外,量子点还具有产率高、发光强度强,光化学稳定性好的优点,能够长时间反复激发。
(3)本发明制备的蛋白芯片能够起到补充消化道内镜检查的作用,当病灶微小或由于位置关系无法通过消化道内镜看到时,可通过检查血液肿瘤标志物来发现食管癌,或者通过血液肿瘤标记物的敏感性调整复查消化道内镜的间隔时间。
附图说明
图1为本发明所述蛋白芯片的制备方法流程图;
图2为本发明单克隆抗体与嵌入量子点的胶体金包被的原微粒偶联的结构示意图;
图3为本发明液相蛋白芯片示意图;
图4为食管癌相关抗原在食管癌组和对照组中的相对表达量水平分布图;
图5为不同组合的蛋白芯片检测食管癌的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1 液相蛋白芯片的制备
本发明液相蛋白芯片的制备流程如图1所示,主要包括以下步骤:
(一)单克隆抗体的制备,包括以下步骤:
1.细胞融合和杂交瘤细胞的制备
选取6-8周龄雌性Balb/c小鼠,分别腹腔注射CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1的重组蛋白作为抗原,使抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。三天后,采用CO2气体处死小鼠,在无菌操作下取出脾脏,制备成脾细胞悬液。取对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞按5:1的比例,在40℃水浴的无菌无毒环境中混合,加入50%聚乙二醇(PEG)作为促融合剂,使淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合形成杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞置于HAT培养基上培养,每三天换液一次,观察杂交瘤细胞增殖情况。
2.阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检查抗体。确定为能特异性分泌抗体的阳性杂交瘤细胞后,取继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代,在传代过程中,以10%FCS取代HAT,将传代细胞保存于液氮中,接下来采用有限稀释法进行克隆化。每一代杂交瘤细胞都需要检查抗体,避免阳性细胞的变异和丢失。
3.单克隆抗体腹水的制备及抗体的纯化
取Balb/c小鼠,腹腔注射0.5mL液体石蜡进行预处理1-2周后,分别在腹腔内接种阳性杂交瘤细胞,观察1-2周,待小鼠腹部明显膨大后,用注射器抽取腹水,反复收集数次,获得含有大量单克隆抗体的腹水。腹水均采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化,经纯化沉淀的单克隆抗体,溶于10μmol/L的磷酸缓冲溶液中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定各单克隆抗体的纯度,并采用ELISA方法对各单克隆抗体的效价进行测定。依本发明所述方法制备和纯化的单克隆抗体效价1:521000-1:124000。通过纯度和效价测定的单克隆抗体保存于-80℃冰箱中备用。
(二)胶体金包被原微粒的制备及量子点的嵌入,包括以下步骤:
1.胶体金的制备
本发明中按照下述方法制备的胶体金颗粒,粒径约为20nm,其中金的浓度为0.1mg/mL。具体制备方法为:先将氯金酸(HAUC14)配置成0.01wt%的水溶液,取100mL置于250mL容量的烧杯中,烧杯使用前经酸洗、蒸馏水冲净并硅化处理。加热至沸腾后,保持沸腾的状态下加入80g柠檬酸钠并观察氯金酸水溶液的颜色变化,可见氯金酸水溶液由淡黄色变为灰色,随后变为黑色,再逐渐过渡到红色并保持稳定不变,全程约3min。待红色水溶液冷却至室温后,用蒸馏水恢复至原体积,即得胶体金。
2.原微粒的包被
本发明中的原微粒表面带有负电性,能通过静电作用吸引上述制备的胶体金,使胶体金在原微粒表面沉积,从而实现在原微粒表面包被胶体金。具体实施方法为:在15mL离心管中加入0.05g原微粒和3g胶体金,其中,原微粒为由聚苯乙烯和丙烯酸松香脂按单位质量比为2:1聚合而成,充分振荡混匀后离心,弃去上层液体,沉淀反复用蒸馏水和无水乙醇洗涤后,在室温下干燥后获得胶体金包被的原微粒,备用。其中,充分振荡的目的在于使得溶液中的量子点全部嵌入到胶体金包被后的原微粒的表面,从而使溶液中不存在游离的量子点,避免游离的量子点对检测结果准确度的影响。
3.量子点的嵌入
选取同一激发波长但发射波长互不相同的五份量子点材料,分别以游离的形式保存于氯仿溶液中,氯仿溶液中量子点的分散浓度均为300ppb。量子点按以下步骤嵌入到包被胶体金的原微粒表面,分别制备五种嵌入了量子点的胶体金包被原微粒:取洁净的5mL玻璃试管,加入2mL分散有量子点的氯仿溶液和0.01g胶体金包被的原微粒,充分振荡至溶液中无游离的量子点检出,量子点在激光照射下会显示颜色,如果没有游离的量子点则溶液在激光的照射下不显示颜色,从而判断溶液中是否存在游离量子点。随后,将振荡后混合液于通风橱中,待氯仿挥发完全后,将剩下的微粒用无水乙醇反复洗涤,在室温下干燥后即得嵌入了量子点的胶体金包被原微粒,备用。
(三)蛋白芯片的制备,主要包括以下步骤:
1.单克隆抗体与嵌入量子点的胶体金包被原微粒偶联
分别将溶于磷酸缓冲液中的单克隆抗体,即CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体,在电磁搅拌仪的持续搅拌下,加入磷酸缓冲液,稀释成浓度为30μg/mL的溶液,再依次加入20ml1%的吐温80,0.01g已嵌入量子点的胶体金包被原微粒,持续搅拌15min后,加入30ml5%的BSA溶液封闭微粒上没有偶联完的位点,待封闭完成后,对溶液进行离心,取沉淀用PBS缓冲液反复洗涤后,分别获得偶联了CA19-9单克隆抗体的CA19-9微粒、偶联了CYFRA21-1单克隆抗体的CYFRA21-1微粒、偶联了CA125单克隆抗体的CA125微粒、偶联了FBXW7单克隆抗体的FBXW7微粒、偶联了FAT1单克隆抗体的FAT1微粒。单克隆抗体与嵌入量子点的胶体金包被原微粒偶联后的结构如图2所示。各号微粒分别保存在PBS缓冲液中,微粒浓度均保持在1μg/mL左右。
2.蛋白芯片制备
分别取等量的CA19-9微粒溶液、CYFRA21-1微粒溶液、CA125微粒溶液、FBXW7微粒溶液和FAT1微粒溶液,在电磁搅拌仪的持续搅拌下充分混匀,即得本发明液相蛋白芯片,如图3所示,其中各个微粒的浓度均为1μg/mL,并于–80℃冰箱中保存,以备同时检测血液样品中五种食管癌标志物(CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1)用。
实施例2 蛋白芯片的使用方法
取保存在PBS缓冲液中的液相蛋白芯片,充分震荡形成微粒悬液。在培养皿中加入待检测的血清样本和悬液状态的蛋白芯片,充分混匀后,于37℃孵箱内避光反应45min;取出培养皿后再次加入适量微粒悬液,充分混匀后,于37℃孵箱内避光反应30min。将孵育完成的样本置于多功能流式细胞仪分析仪上检测,计算待测血清样本中五个食管癌标志物的相对表达量。
实施例3蛋白芯片的诊断价值分析
利用本发明实施例1所述的蛋白芯片对早期食管癌患者和正常人的血清样本进行检测,以评估和分析本发明蛋白芯片用于早期食管癌筛查和诊断的价值。
1.样本来源
收集来自郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室血清样本,其中正常人血清245份,作为对照组,早期食管癌患者血清245份,作为早期食管癌组。245例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群,无任何肿瘤相关的证据。245例正常人中,男性136例,女109例,平均年龄为57.6±8.5岁,年龄范围为36-83岁。245份早期食管癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管癌患者,均未接受放疗或化疗治疗。245例食管癌患者中,男性130例,女性115例,平均年龄58.7±7.3岁,年龄范围34-85岁。
2.血清制备
抽取空腹静脉血5ml至离心管中,室温中静置30分钟,离心(2000rpm/min),吸取上层血清分装,每管100µl,-80℃冰箱储存。
3.实验方法
采用实施例1制备的蛋白芯片和实施例2所述的蛋白芯片的使用方法对245例正常人群血清(对照组)和245例食管癌患者血清(食管癌组)中五个食管癌相关抗原的含量进行检测。应用MedCalc软件绘制五个食管癌相关抗原在食管癌组和对照组中的相对表达量水平分布图,结果如图4所示;不同组合的蛋白芯片检测食管癌的ROC曲线如图5所示。
应用SPSS22.0软件进行统计学检验,采用两独立样本卡方检验方法比较食管癌组和对照组抗原阳性率,结果如表1所示,表中检验水准α=0.05,当P<0.05时,结果具有统计学意义,然后采用筛检试验的评价方法评价相关标志物检测食管癌的诊断价值。
4.结果分析
图4为五个相关标志物分别在245例早期食管癌组和正常组血清中的分布图,从该图中可以看出,这五个相关标志物在早期食管癌组中相对表达量比较高,在0.6附近浮动。而这五个相关标志物在对照组中相对表达量比较低,为0.38左右。由图4可知,早期食管癌组患者血清中五个相关标志物相对表达量的平均水平均明显高于对照组,提示着五个相关标志物可以用于早期食管癌的筛查。此外,本发明首次发现FBXW7抗原蛋白和FAT1抗原蛋白在食管癌患者体内高表达。
为进一步探究负载有不同单克隆抗体组合的蛋白芯片对早期食管癌检测灵敏度和特异度的影响,利用负载有不同单克隆抗体组合的蛋白芯片对食管癌组和对照组的血清样本进行检测,结果如表1所示。由表1可知,随着单克隆抗体组合数目的增加,早期食管癌诊断的灵敏度也随之增加;当五个肿瘤相关单克隆抗体组合进行检测时,灵敏度高达93.5%,也就是说食管癌患者中应用该方法能够正确的诊断为食管癌的百分比为93.5%;虽然随着抗体数目的增加,检测特异度逐渐降低,但当五个肿瘤相关单克隆抗体组合进行检测时,其特异度仍然能够达到73.9%,这一结果表明非食管癌患者采用五个相关标志物联合检测时,被正确的诊断为未患食管癌的百分比为73.9%;因此,使用CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1这五个肿瘤相关单克隆抗体进行早期食管癌诊断,可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。
此外,约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1,其数值范围是0-1,约登指数越接近于1,其诊断价值越大,表明该方法的应用价值越高。随着单克隆抗体数目的增加,约登指数在不断增大且逐渐趋向于1,表明五个单克隆抗体组合用于诊断和筛查早期食管癌的方法具有较好的诊断价值。因此,采用CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1这五个肿瘤相关单克隆抗体联合检测待测血清中相应标志物的方法,既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度,对评估待测对象患食管癌的风险具有很好的诊断和应用价值。
为进一步验证五种肿瘤相关单克隆抗体组合进行检测时具有相对较高的判断正确性,利用负载有不同单克隆抗体组合的蛋白芯片对食管癌组和对照组的血清样本进行检测分析,不同组合的蛋白芯片检测食管癌的ROC曲线如图5所示,由图5可知,随着单克隆抗体数目的增加,ROC曲线下面积由0.58升至0.89,说明使用这五个单克隆抗体抗体联合检测蛋白芯片对于早期食管癌具有较高的判定正确性和诊断价值,进一步证实了该蛋白芯片可以作为较理想的早期食管癌的筛查方法和手段。
Claims (2)
1.能够特异性检测CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1基因表达产物的试剂在制备食管癌早期诊断试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒为液相蛋白芯片试剂盒。
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