ES2396127T3 - Uso de proteinas y peptidos codificados por el genoma de una nueva cepa de coronavirus asociado al SRAS - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado y purificado, caracterizado porque se trata del ectodominio de la proteína S de secuencia SECID nº 3, y porque está constituido por los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 a 1193 de la secuenciade aminoácidos de dicha proteína S o de los aminoácidos que corresponden a las posiciones 14 a 1193 de lasecuencia de aminoácidos de dicha proteína S.

Description

Uso de proteínas y péptidos codificados por el genoma de una nueva cepa de coronavirus asociado al SRAS

La presente invención se refiere a una nueva cepa de coronavirus asociada al síndrome respiratorio agudo severo (SRAS), procedente de una extracción catalogada bajo el nº 031589 y extraída en Hanoi (Vietnam), a moléculas de ácido nucleico procedentes de su genoma, a las proteínas y péptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico, así como a sus aplicaciones, en particular como agentes reactivos de diagnóstico y/o como vacuna.

El coronavirus es un virus de ARN monocatenario, de polaridad positiva, de aproximadamente 30 kilobases, que se replica en el citoplasma de células hospedantes; el extremo 5' del genoma tiene una estructura en capuchón y el extremo 3' comprende una cola polyA. Este virus está envuelto y comprende, en su superficie, estructuras peploméricas denominadas espículas.

El genoma comprende los cuadros abiertos de lectura, u ORF, siguientes, desde su extremo 5' hacia su extremo 3'; ORF1a y ORF1b, que corresponden a las proteínas del complejo de transcripción-replicación, y ORF-S, ORF-E, ORF-M y ORF-N, que corresponden a las proteínas estructurales S, E, M y N. Comprende también unos ORF que corresponden a proteínas de función desconocida codificadas por: la región situada entre el ORF-S y el ORF-E y que se superpone a esta última, la región situada entre el ORF-M y el ORF-N, y la región incluida entre el ORF-N.

La proteína S es una glicoproteína membranaria (200-220 kDa), que se presenta en forma de espículas o "pinchos" que emergen de la superficie de envoltura viral. Es responsable de la adhesión del virus a los receptores de la célula hospedante, y de la inducción de la fusión de la envoltura viral con la membrana celular.

La pequeña proteína de envoltura (E) también denominada sM (small membrane), que es una proteína transmembranaria no glicosilada de aproximadamente 10 kDa, es la proteína presente en cantidad más baja en el virión. Desempeña un papel motor en el proceso del brote de coronavirus que se produce a nivel del compartimiento intermedio en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi.

La proteína M, o proteína matriz (25-30 kDa), es una glicoproteína membranaria más abundante que está integrada en la partícula viral por una interacción M/E, mientras que la incorporación de S en las partículas está dirigida por una interacción S/M. Parece ser importante para la maduración viral de los coronavirus y para la determinación del sitio al nivel del cual las partículas virales se ensamblan.

La proteína N o proteína de nucleocápside (45-50 kDa), que es la más conservada entre las proteínas estructurales de los coronavirus, es necesaria para encapsidar el ARN genómico, y después para dirigir su incorporación en el virión. Esta proteína está probablemente también implicada en la replicación del ARN.

Cuando una célula hospedante es infectada, el cuadro de lectura (ORF) situado en 5' del genoma viral se traduce en una poliproteína que es escindida por las proteasas virales, y libera entonces varias proteínas no estructurales, tales como ARN-polimerasa, ARN dependiente (Rep) ATPasa helicasa (Hel). Estas dos proteínas están implicadas en la replicación del genoma viral, así como en la generación de transcritos que son utilizados en la síntesis de las proteínas virales. Los mecanismos por los cuales se producen estos ARNm sub-genómicos no están totalmente comprendidos; sin embargo, hechos recientes indican que las secuencias de regulación de la transcripción en el extremo 5' de cada gen representan señales que regulan la transcripción discontinua de los ARNm sub-genómicos.

Las proteínas de la membrana viral (proteínas S, E y M) están insertadas en el compartimiento intermedio, mientras que el ARN replicado (hebra +) se ensambla con la proteína N (nucleocápside). Este complejo proteína-ARN se asocia después con la proteína M incluida en las membranas del retículo endoplásmico y las partículas virales se forman cuando el complejo de la nucleocápside brota en el retículo endoplásmico. El virus migra después a través del complejo del Golgi y eventualmente sale de la célula, por ejemplo mediante exocitosis. El sitio de adhesión del virus a la célula hospedante se encuentra al nivel de la proteína S.

Los coronavirus son responsables del 15 al 30% de los catarros en el ser humano, y de infecciones respiratorias o digestivas en los animales, en particular gatos (FIPV: Feline infectious peritonitis virus), aves de corral (IBV: Avian Infectious bronchitis virus), ratones (MHV: Mouse Hepatitis virus), cerdos (TGEV: Transmissible gastroenterititis virus, PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV: Porcine Respiratory Coronavirus, HEV: Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) y los bovinos (BcoV: Bovine coronavirus).

En general, cada coronavirus afecta sólo a una especie; en los individuos inmunocompetentes, la infección induce unos anticuerpos eventualmente neutralizantes, y una inmunidad celular, capaces de destruir las células infectadas.

Una epidemia de neumonía atípica, denominada síndrome respiratorio agudo severo (SARS o Severe acute respiratory syndrome, SRAS en español), se ha propagado en diferentes países (Vietnam, Hong-Kong, Singapur, Thailandia y Canadá) durante el primer trimestre de 2003, a partir de un foco inicial aparecido en China, en el último trimestre de 2002. La severidad de esta enfermedad es tal, que su índice de mortalidad es aproximadamente del 3 al

6%. La determinación del agente causante de esta enfermedad se ha investigado por numerosos laboratorios, en todo el mundo.

En marzo de 2003, se ha aislado un nuevo coronavirus (SARS-CoV, SARS virus o virus SRAS en español), en asociación con unos casos de síndrome respiratorio agudo severo (T.G.KSIAZEK y otros, The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1319-1330; C. DROSTEN y otros, The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 19671976; Peiris y otros, Lancet, 2003, 361, 1319-).

Se obtuvieron así unas secuencias genómicas de este nuevo coronavirus, en particular las del aislado Urbani (Genbank nº de acceso AY274119.3 y A. MARRA y otros, Science, 1 de mayo, 2003, 300, 1399-1404) y del aislado de Toronto (Tor2, Genbank n° de acceso AY 278741 y A. ROTA y otros, Science, 2003, 300, 1394-1399).

La organización del genoma es comparable a la de los demás coronavirus conocidos, permitiendo así confirmar la pertenencia del SRAS-CoV a la familia de los Coronaviridae; se han identificado en particular los cuadros de lectura abiertos ORF1a y 1b, y los cuadros de lectura abiertos que corresponden a las proteínas S, E, M y N, así como a proteínas codificadas por: la región situada entre ORF-S y ORF-E (ORF3), la región situada entre ORF-S y ORF-E y que se superpone a ORF-E (ORF4), la región situada entre ORF-M y ORF-N (ORF7 a ORF11) y la región que corresponde a ORF-N (ORF13 y ORF14).

Se han puesto en evidencia siete diferencias entre las secuencias de los aislados Tor2 y Urbani; 3 corresponden a mutaciones silenciosas (c/t en la posición 16622 y a/g en la posición 19064 de ORF1b, t/c en la posición 24872 de ORF-S), y 4 modifican la secuencia en aminoácidos respectivamente: las proteínas codificadas por ORF1a (c/t en la posición 7919 que corresponde a la mutación A/V), la proteína S (g/t en la posición 23220 que corresponde a la mutación A/S), la proteína codificada por ORF3 (a/g en la posición 25298 que corresponde la mutación R/G) y de la proteína M (t/c en la posición 26857 que corresponde a la mutación S/P).

Además, el análisis filogenético muestra que el SRAS-CoV está distante de los demás coronavirus, y que no ha aparecido ni por mutación de coronavirus respiratorios humanos, ni por recombinación entre unos coronavirus conocidos (para una revisión, véase Homes J.C.I., 2003, 111, 1605-1609).

La puesta en evidencia y la consideración de nuevas variantes son importantes para la realización de agentes reactivos de detección y de diagnóstico de SRAS suficientemente sensibles y específicos, así como composiciones inmunógenas aptas para proteger las poblaciones contra unas epidemias de SRAS.

Los inventores han puesto en evidencia ahora otra cepa de coronavirus asociado al SRAS, que se distingue de los aislados Tor2 y Urbani.

La presente invención es tal como se define por las reivindicaciones 1 a 22 más adelante.

Los inventores describen una cepa aislada o purificada de coronavirus humano asociado al síndrome respiratorio agudo severo, caracterizada porque su genoma presenta, en forma de ADN complementario, un codón de serina en la posición 23220-23222 del gen de la proteína S, o un codón de glicina en la posición 25298-25300 del gen de ORF3, y un codón de alanina en la posición 7918-7920 de ORF1a, o un codón de serina en la posición 26857-26859 del gen de la proteína M, siendo dichas posiciones indicadas en referencia a la secuencia Genbank AY274119.3

Según otro modo de realización ventajoso de dicha cepa, el equivalente ADN de su genoma presenta una secuencia que corresponde a la secuencia SEC ID nº 1; esta cepa de coronavirus procede de la extracción de un lavado broncoalveolar de un paciente afectado de SRAS, catalogado bajo el nº 031589 y efectuado en el hospital francés de Hanoi (Vietnam).

Dicha secuencia SEC ID nº 1 es la del ácido desoxirribonucleico, que corresponde a la molécula de ácido ribonucleico del genoma de la cepa aislada de coronavirus, tal como se definió anteriormente.

La secuencia SEC ID nº 1 se distingue de la secuencia Genbank AY274119.3 (aislado Tor2) porque posee las mutaciones siguientes:

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g/t en la posición 23220; el codón de alanina (gct) en la posición 577 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S de Tor2 está sustituido con un codón de serina (tct),

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a/g en la posición 25298; el codón de arginina (aga) en la posición 11 de la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por ORF3 de Tor2 está sustituido con un codón de glicina (gga).

Además, la secuencia SEC ID nº 1 se distingue de la secuencia Genbank AY278741 (aislado Urbani) porque posee las mutaciones siguientes:

-

t/c en la posición 7919; el codón de valina (gtt) en la posición 2552 de la secuencia en aminoácidos de la

proteína codificada por ORF1a está sustituido con un codón de alanina (gct),

-

t/c en la posición 16622: esta mutación no modifica la secuencia en aminoácidos de las proteínas codificadas por ORF1b (mutación silenciosa),

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g/a en la posición 19064: esta mutación no modifica la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por ORF1b (mutación silenciosa),

-

c/t en la posición 24872: esta mutación no modifica la secuencia de aminoácidos de la proteína S, y

--

c/t en la posición 26857: el codón de prolina (ccc) en la posición 154 de la secuencia de aminoácidos de la proteína M está sustituido con un codón de serina (tcc).

En ausencia de mención particular, las posiciones de las secuencias nucleotídicas y peptídicas están indicadas con referencia a la secuencia Genbank AY274119.3.

Los inventores describen también un polinucleótido aislado o purificado, caracterizado porque su secuencia es la del genoma de la cepa aislada de coronavirus, tal como se ha definido anteriormente.

Según un modo de realización ventajoso de dicho polinucleótido, este presenta la secuencia SEC ID nº 1.

Los inventores describen también un polinucleótido aislado o purificado, caracterizado porque su secuencia hibrida en condiciones de fuerte rigor, con la secuencia del polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente.

Los términos "aislado o purificado" significan modificado "por la mano del ser humano" a partir del estado natural; dicho de otra manera, si un objeto existe en la naturaleza, este se denomina aislado, o purificado si se ha modificado

o extraído de su entorno natural, o las dos. Por ejemplo, un polinucleótido, o una proteína/péptido naturalmente presente en un organismo vivo, no es ni aislado, ni purificado; en cambio, el mismo polinucleótido o proteína/péptido separado de las moléculas que coexisten en su entorno natural, obtenido por clonación, amplificación y/o síntesis química, está aislado en el sentido de la presente invención. Además, un polinucleótido o una proteína/péptido introducido en un organismo por transformación, manipulación genética o cualquier otro método, está "aislado" incluso si está presente en dicho organismo. El término purificado, tal como se utiliza en la presente invención, significa que las proteínas/péptidos, según la invención, están esencialmente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos, como lo es, por ejemplo, el producto purificado del cultivo de células hospedantes recombinantes, o el producto purificado a partir de una fuente no recombinante.

Se entiende por condiciones de hibridación de fuerte rigor, condiciones de temperatura y de fuerza iónica seleccionadas de tal manera que permiten el mantenimiento de la hibridación específica y selectiva entre los polinucleótidos complementarios.

A título ilustrativo, condiciones de fuerte rigor con el fin de definir los polinucleótidos anteriores, son ventajosamente las siguientes: la hibridación ADN-ADN o ADN-ARN se realiza en dos etapas: (1) prehibridación a 42ºC durante 3 horas en tampón de fosfato (20 mM pH 7,5), que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución de 0,15 M de NaCl + 0,015 M de citrato de sodio), el 50% de formamida, el 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 10 x Denhardt's, 5% de sulfato de dextrano y el 1% de ADN de esperma de salmón; (2) hibridación durante 20 horas a 42ºC seguida de 2 lavados de 20 minutos a 20ºC en 2 x SSC + el 2% SDS, 1 lavado de 20 minutos a 20ºC en 0,1 x SSC + el 0,1% SDS. El último lavado se realiza en 0,1 x SSC + el 0,1% SDS durante 30 minutos a 60ºC.

Los inventores describen asimismo un fragmento representativo del polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque es susceptible de ser obtenido o bien mediante el uso de enzimas de restricción, cuyos sitios de reconocimiento y de escisión están presentes en dicho polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente, o bien mediante amplificación con la ayuda de cebadores oligonucleotídicos específicos de dicho polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente, o bien mediante transcripción in vitro, o bien mediante síntesis química.

Según un modo de realización ventajoso de dicho fragmento, éste se selecciona del grupo constituido por: el ADNc, que corresponde a al menos un cuadro de lectura abierto (ORF), seleccionado entre: ORF1a, ORF1b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 a ORF11, ORF13 y ORF 14, y el ADNc, que corresponde a los extremos 5'

o 3' no codificantes de dicho polinucleótido.

Según una disposición ventajosa de este modo de realización, dicho fragmento presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

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las secuencias SEC ID nº 2 y 4, que representan el ADNc que corresponde al ORF-S, que codifica la proteína S,

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las secuencias SEC ID nº 13 y 15, que representan el ADNc que corresponde al ORF-E, que codifica la proteína

E,

-

las secuencias SEC ID nº 16 y 18, que representan el ADNc que corresponde al ORF-M, que codifica la proteína M,

-

las secuencias SEC ID nº 36 y 38, que representan el ADNc que corresponde al ORF-N, que codifica la proteína N,

-

las secuencias que representan los ADNc que corresponden respectivamente: a ORF1a y ORF1b (ORF1ab, SEC ID nº 31), a los ORF3 y ORF4 (SEC ID nº 7, 8), a los ORF 7 a 11 (SEC ID nº 19, 20), al ORF13 (SEC ID no 32) y al ORF14 (SEC ID nº 34), y

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las secuencias que representan los ADNc que corresponden respectivamente a los extremos 5' (SEC ID no 39 y 72) y 3' no codificantes (SEC ID nº 40, 73) de dicho polinucleótido.

Los inventores describen también un fragmento del ADNc que codifica la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 5 y 6 (fragmentos Sa y Sb).

Los inventores describen también un fragmento del ADNc que corresponde a los ORF1a y ORF1b, tal como se han definido anteriormente, caracterizado porque presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 41 a 54 (fragmentos L0 a L12).

Los inventores describen también un fragmento del polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque presenta al menos 15 bases o pares de bases consecutivas de la secuencia del genoma de dicha cepa, que incluye al menos una de las situadas en las posiciones 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 y 26857. Preferiblemente, se trata de un fragmento de 20 a 2500 bases o pares de bases, de manera preferente de 20 a 400.

Según un modo de realización ventajoso de dicho fragmento, este incluye al menos una pareja de bases o de pares de bases que corresponden a las posiciones siguientes: 7919 y 23220, 7919 y 25298, 16622 y 23220, 19064 y 23220, 16622 y 25298, 19064 y 25298, 23220 y 24872, 23220 y 26857, 24872 y 25298, 25298 y 26857.

Los inventores describen también unos cebadores de al menos 18 bases, aptos para amplificar un fragmento del genoma de un coronavirus asociado al SRAS, o del equivalente ADN de este.

Según un modo de realización de dichos cebadores, estos se seleccionan del grupo constituido por:

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el par de cebadores nº 1, que corresponde respectivamente a las posiciones 28507 a 28522 (cebador sentido, SEC ID nº 60) y 28774 a 28759 (cebador anti-sentido, SEC ID nº 61) de la secuencia del polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente,

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el par de cebadores nº 2, que corresponde respectivamente a las posiciones 28375 a 28390 (cebador sentido, SEC ID nº 62) y 28702 a 28687 (cebador anti-sentido, SEC ID nº 63) de la secuencia del polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente, y

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el par de cebadores constituido de los cebadores SEC ID nºs 55 y 56.

Los inventores describen también una sonda para detectar la presencia del genoma de un coronavirus asociado al SRAS o de un fragmento de este, caracterizada porque se selecciona del grupo constituido por: los fragmentos tales como se han definido anteriormente, y los fragmentos que corresponden a las posiciones siguientes de la secuencia del polinucleótido, tal como se ha definido anteriormente: 28561 a 28586, 28588 a 28608, 28541 a 28563 y 28565 a 28589 (SEC ID nº 64 a 67).

Las sondas y cebadores pueden ser marcados directa o indirectamente por un compuesto radioactivo o no radioactivo, mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, a fin de obtener una señal detectable y/o cuantificable. Entre los isótopos radioactivos utilizados, se pueden citar 32P, 33P, 35S, 3H ó l'125I. La entidades no radioactivas se seleccionan entre los ligantes, tales como la biotina, la avidina, la estreptavidina, la digoxigenina, los haptenos, los colorantes, los agentes luminescentes tales como los agentes radioluminescentes, quemoluminescentes, bioluminescentes, fluorescentes, fosforescentes.

Las sondas y cebadores engloban las sondas y los cebadores marcados derivados de las secuencias anteriores.

Tales sondas y cebadores son útiles para el diagnóstico de la infección por un coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también un método de detección de un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una

muestra biológica, método el cual se caracteriza porque comprende al menos:

(a)

extraer los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra biológica,

(b)

amplificar un fragmento del ORF-N mediante RT-PCR con la ayuda de un par de cebadores tales como se han definido anteriormente, y

(c)

detectar mediante cualquier medio apropiado de los productos de amplificaciones obtenidos en (b).

Los productos de amplificaciones (amplicones) en (b) son de 268 pb para el par de cebadores nº 1 y de 328 pb para el par de cebadores nº 2.

Según un modo de aplicación ventajoso de dicho procedimiento, la etapa (b) de detección se realiza con la ayuda de al menos una sonda que corresponde a las posiciones 28561 a 28586, 28588 a 28608, 28541 a 28563 y 28565 a 28589 de la secuencia de polinucleótido, tal como se definió anteriormente.

Preferentemente, el genoma de coronavirus asociado al SRAS se detecta, y eventualmente se cuantifica por PCR en tiempo real, con la ayuda del par de cebadores nº 2 y de las sondas que corresponden a las posiciones 28541 a 28563, y 28565 a 28589, marcadas con unos compuestos diferentes, especialmente unos agentes fluorescentes diferentes.

LA RT-PCR en tiempo real que aplica este par de cebadores y esta sonda es muy sensible, ya que permite detectar 102 copias de ARN y hasta 10 copias de ARN, es además fiable y reproducible.

La presente solicitud engloba los polidesoxirribonucleótidos y los polirribonucleótidos monocatenarios, bicatenarios y tricatenarios, que corresponden a la secuencia del genoma de la cepa aislada de coronavirus y de sus fragmentos, tales como se han definido anteriormente, así como a sus secuencias complementarias, sentido o anti-sentido, en particular los ARN y los ADNc que corresponden a la secuencia del genoma y de sus fragmentos, tales como se han definido anteriormente.

Los inventores describen también los fragmentos de amplificación obtenidos con la ayuda de cebadores específicos del genoma de la cepa purificada o aislada, tal como se ha definido anteriormente, en particular con la ayuda de cebadores y de pares de cebadores, tales como se han definido anteriormente, los fragmentos de restricción constituidos por, o que comprenden la secuencia de los fragmentos, tales como se han definido anteriormente, los fragmentos obtenidos por transcripción in vitro a partir de un vector que contiene la secuencia SEC ID nº 1 o un fragmento tal como se ha definido anteriormente, así como fragmentos obtenidos por síntesis química. Ejemplos de fragmentos de restricción se deducen del mapa de restricción de la secuencia SEC ID nº 1, ilustrado por la figura 13. Dichos fragmentos están o bien en forma de fragmentos aislados, o bien en forma de mezclas de fragmentos. La presente solicitud engloba también los fragmentos modificados, con respecto a los anteriores, por escisión, o adición de nucleótidos en una proporción de aproximadamente el 15% con respecto a la longitud de los fragmentos anteriores, y/o modificados al nivel de la naturaleza de los nucleótidos, a partir del momento en el que los fragmentos nucleotídicos modificados conserven una capacidad de hibridación con las secuencias de ARN genómico o antigenómico del aislado, tal como se ha definido anteriormente.

Las moléculas de ácido nucleico, según la invención, se obtienen mediante los métodos clásicos, conocidos en sí, siguiendo los protocolos estándares, tales como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Frederick

M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Por ejemplo, se pueden obtener mediante amplificación de una secuencia nucleica por PCR o RT-PCR, o bien mediante síntesis química total o parcial.

Los inventores describen también un chip o filtro de ADN o de ARN, caracterizado porque comprende al menos un polinucleótido o uno de sus fragmentos, tales como se han definido anteriormente.

Los chip o filtros de ADN o de ARN se preparan mediante los métodos clásicos, conocidos en sí, como por ejemplo injerto químico o electroquímico de oligonucleótido sobre soporte de vidrio o de nylon.

La presente invención tiene también por objeto un vector de clonación y/o de expresión recombinante, en particular un plásmido, un virus, un vector viral o un fago, que comprende un fragmento de ácido nucleico, según la presente invención. Preferiblemente, dicho vector recombinante es un vector de expresión en el que dicho fragmento de ácido nucleico está colocado bajo el control de elementos reguladores de la transcripción y de la traducción apropiados. Además, dicho vector puede comprender unas secuencias (etiquetas o tag) fusionadas en fase con el extremo 5' y/o 3' de dicho inserto, útiles para la inmovilización y/o la detección y/o la purificación de la proteína expresada a partir de dicho vector.

Estos vectores están construidos e introducidos en células hospedantes mediante métodos clásicos de ADN recombinante y de ingeniería genética, que son conocidos en sí. Numerosos vectores en los que se pueden insertar una molécula de ácido nucleico de interés, a fin de introducirlo y mantenerlo en una célula hospedante, son

conocidos en sí; la elección de un vector apropiado depende del uso considerado para este vector (por ejemplo, replicación de la secuencia de interés, expresión de esta secuencia, mantenimiento de la secuencia en forma extracromosómica o bien integración en el material cromosómico del hospedante), así como de la naturaleza de la célula hospedante.

Los inventores describen los plásmidos siguientes:

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el plásmido denominado SRAS-S, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° 1-3059, el 20 de junio de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que para codifica la proteína S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 21406 a 25348 (SEC ID nº 4), en referencia a la secuencia Genbank AY274119.3,

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el plásmido denominado SRAS-S1, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° I-3020, el 12 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene un fragmento 5' de la secuencia de ADNc que codifica la proteína S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, fragmento que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 21406 a 23454 (SEC ID nº 5), en referencia a la secuencia Genbank AY274119.3 Tor2,

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el plásmido denominado SRAS-S2, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° I-3019, el 12 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene un fragmento 3' de la secuencia de ADNc que codifica la proteína S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, fragmento que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 23322 a 25348 (SEC ID nº 6), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3,

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el plásmido denominado SRAS-SE, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° 1-3126, el 13 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene el ADNc que corresponde a la región situada entre ORF-S y ORF-E y que se superpone al ORF-E de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, región que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 25110 a 26244 (SEC ID nº 8), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3,

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el plásmido denominado SRAS-E, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° 1-3046, el 28 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que codifica la proteína E de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 26082 a 26413 (SEC ID nº 15), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3,

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el plásmido denominado SRAS-M; comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° 1-3047, el 28 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que codifica la proteína M de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente; secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 26330 a 27098 (SEC ID Nº 18), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3,

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el plásmido denominado SRAS-MN, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° I-3125, el 13 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que corresponde a la región situada entre el ORF-M y el ORF-N de la cepa de SRAS-CoV, procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589 y extraída en Hanoi, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 26977 a 28218 (SEC ID nº 20), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3,

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el plásmido denominado SRAS-N, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° 1-3048, el 5 de junio de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene el ADNc que codifica la proteína N de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 28054 a 29430 (SEC ID Nº 38), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3; este plásmido comprende así un inserto de secuencia SEC ID nº 38, y está comprendido en una cepa bacteriana que se ha depositado bajo el n° 1-3048, el 5 de junio de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15,

-

el plásmido denominado SRAS-5'NC, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° I-3124, el 7 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene el ADNc que corresponde al extremo 5' no codificante del genoma de la cepa de SRAS

CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 1 a 204 (SEC ID nº 39), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3,

-

el plásmido denominado SRAS-3'NC, comprendido en la cepa bacteriana depositada bajo el n° 1-3123 el 7 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene el ADNc que corresponde al extremo 3' no codificante del genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a la situada entre el nucleótido en la posición 28933 a 29727 (SEC ID nº 40), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3, se termina por una serie de nucleótidos a.,

-

el plásmido de expresión denominado pIV2.3N, que contiene un fragmento de ADNc que codifica una fusión Cterminal de la proteína N (SEC ID nº 37) con una etiqueta de polihistidina,

-

el plásmido de expresión denominado pIV2.3SC, que contiene un fragmento de ADNc que codifica una fusión Cterminal del fragmento que corresponde a las posiciones 475 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S (SEC ID nº 3) con una etiqueta de polihistidina,

-

el plásmido de expresión pIV2.3SL, que contiene un fragmento de ADNc que codifica una fusión C-terminal del fragmento que corresponde a las posiciones 14 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S (SEC ID nº 3) con una etiqueta de polihistidina,

-

el plásmido de expresión denominado pIV2.4N, que contiene un fragmento de ADNc que codifica una fusión Nterminal de la proteína N (SEC ID nº 3) con una etiqueta de polihistidina,

-

el plásmido de expresión denominado pIV2.4SC o pIV2.4S1, que contiene un inserto que codifica una fusión Nterminal del fragmento que corresponde a las posiciones 475 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S (SEC ID nº 3) con una etiqueta de polihistidina, y

-

el plásmido de expresión denominado pIV2.4SL que contiene un fragmento de ADNc que codifica una fusión Nterminal del fragmento que corresponde a las posiciones 14 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S (SEC ID nº 3) con una etiqueta de polihistidina.

Según una disposición ventajosa del plásmido de expresión, tal como se ha definido anteriormente, está comprendido en una cepa bacteriana depositada bajo el n° I-3117, el 23 de octubre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

Según otra disposición ventajosa del plásmido de expresión, tal como se ha definido anteriormente, está comprendido en una cepa bacteriana depositada bajo el n° I-3118, el 23 de octubre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

Según otra disposición del plásmido de expresión, tal como se ha definido anteriormente, está comprendido en una cepa bacteriana depositada en la CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 bajo los números siguientes:

a) cepa n° I-3118, depositada el 23 de octubre de 2003,

b) cepa n° I-3019, depositada el 12 de mayo de 2003,

c) cepa n° I-3020, depositada el 12 de mayo de 2003,

d) cepa n° I-3059, depositada el 20 de junio de 2003,

e) cepa n° I-3323, depositada el 22 de noviembre de 2004,

f) cepa n° I-3324, depositada el 22 de noviembre de 2004,

g) cepa n° I-3326, depositada el 1 de diciembre de 2004,

h) cepa n° I-3327, depositada el 1 de diciembre de 2004,

i) cepa n° I-3332, depositada el 1 de diciembre de 2004,

j) cepa n° I-3333, depositada el 1 de diciembre de 2004,

k) cepa n° I-3334, depositada el 1 de diciembre de 2004,

l) cepa n° I-3335, depositada el 1 de diciembre de 2004,

m) cepa n° I-3336, depositada el 1 de diciembre de 2004,

n) cepa n° I-3337, depositada el 1 de diciembre de 2004,

o) cepa n° I-3338, depositada el 2 de diciembre de 2004,

p) cepa n° I-3339, depositada el 2 de diciembre de 2004,

q) cepa n° I-3340, depositada el 2 de diciembre de 2004,

r) cepa n° I-3341, depositada el 2 de diciembre de 2004.

Los inventores describen también un inserto de ácido nucleico de origen viral, caracterizado porque está contenido en cualquiera de las cepas tales como se definieron anteriormente en a)-r).

Los inventores describen también un ácido nucleico que comprende un gen sintético que permite una expresión optimizada de la proteína S en unas células eucariotas, caracterizado porque posee la secuencia SEC ID nº 140.

Los inventores describen también un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende un gen sintético que permite una expresión optimizada de la proteína S, vector que es conocido en la cepa bacteriana depositada en la CNCM, el 1 de diciembre de 2004, bajo el nº l-3333.

Según un modo de realización de dicho vector de expresión, se trata de un vector viral, en forma de partícula viral o en forma de genoma recombinante.

Según una disposición ventajosa de este modo de realización, se trata de una partícula viral recombinante o de un genoma viral recombinante susceptible de ser obtenido por transfección de un plásmido según los apartados g), h) y k) a r), tal como se han definido anteriormente, en un sistema celular apropiado, es decir, por ejemplo, células transfectadas con uno o algunos otros plásmido(s), destinados a transcomplementar ciertas funciones del virus eliminadas en el vector y necesarias para la formación de las partículas virales.

Se entiende aquí por "familia de la proteína S" la proteína S completa, su ectodominio y fragmentos de este ectodominio, que se producen preferiblemente en un sistema eucariota.

Los inventores describen también un vector lentiviral que codifica un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente.

Los inventores describen también un virus de la rubeola recombinante, que codifica un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente.

Los inventores describen también un virus de la vacuna recombinante que codifica un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente.

Los inventores describen también el uso de un vector según los apartados e) a r) tales como se han definido anteriormente, o de un vector que comprende un gen sintético de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, para la producción, en un sistema eucariota, de la proteína S del coronavirus asociado al SRAS, o de un fragmento de esta proteína.

Los inventores describen también un método de producción de la proteína S en un sistema eucariota, que comprende una etapa de transfección de células eucariotas en cultivo por un vector seleccionado entre los vectores contenidos en las cepas bacterianas mencionadas en los apartados e) a r) anteriores, o un vector que comprende un gen sintético que permite una expresión optimizada de la proteína S.

Los inventores describen también un banco de ADNc caracterizado porque comprende unos fragmentos tales como se han definido anteriormente, en particular unos fragmentos de amplificación o unos fragmentos de restricción, clonados en un vector recombinante, en particular un vector de expresión (banco de expresión).

Los inventores describen también unas células, en particular unas células procariotas, modificadas por un vector recombinante tal como se ha definido anteriormente.

Los inventores describen también una célula eucariota genéticamente modificada, que expresa una proteína o un polipéptido tales como se definen más adelante. Por supuesto, los términos "células eucariota genéticamente modificada" no designan una célula modificada por un virus salvaje.

Según un modo de realización ventajoso de dicha célula, es susceptible de ser obtenida mediante transfección por cualquiera de los vectores mencionados en los apartados k) a n) anteriores.

Según una disposición ventajosa de este modo de realización, se trata de la célula FRhK4-Ssol-30, depositada en la CNCM el 22 de noviembre de 2004, bajo el nº I-3325.

Los vectores recombinantes tales como se han definido anteriormente y las células transformadas por dichos vectores de expresión son ventajosamente utilizados para la producción de proteínas y de péptidos correspondientes. Los bancos de expresión derivados de dichos vectores, así como las células transformadas por dichos bancos de expresión, son ventajosamente utilizados para identificar los epítopos inmunógenos (epítopos B y T) de las proteínas del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también las proteínas y los péptidos purificados o aislados, caracterizados porque están codificados por el polinucleótido o uno de sus fragmentos tales como se han definido anteriormente.

Según un modo de realización ventajoso, dicha proteína se selecciona del grupo constituido por:

-

la proteína S de secuencia SEC ID nº 3 o su ectodominio

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la proteína E de secuencia SEC ID nº 14

-

la proteína M de secuencia SEC ID nº 17

-

la proteína N de secuencia SEC ID nº 37

-

las proteínas codificadas por ORF: ORF1a, ORF1b, ORF3, ORF4 y ORF7 a ORF11, ORF 13 y ORF 14 de secuencia respectivamente, SEC ID nº 74, 75, 10, 12, 22, 24, 26, 28, 30, 33 y 35.

Se usarán a continuación, indiferentemente, los términos "ectodominio de la proteína S" y "forma soluble de la proteína S".

Según un modo de realización ventajoso, dicho polipéptido está constituido de aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S.

Según otro modo de realización ventajoso, dicho péptido se selecciona del grupo constituido por:

a) los péptidos que corresponden a las posiciones 14 a 1193 y 475 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S,

b) los péptidos que corresponden a las posiciones 2 a 14 (SEC ID nº 69) y 100 a 221 de la secuencia en aminoácidos de la proteína M; estos péptidos corresponden respectivamente al ectodominio y al endodominio de la proteína M, y

c) los péptidos que corresponden a las posiciones 1 a 12 (SEC ID nº 70) y 53 a 76 (SEC ID nº 71) de la secuencia en aminoácidos de la proteína E; estos péptidos corresponden respectivamente al ectodominio y al extremo C-terminal de la proteína E, y

d) los péptidos de 5 a 50 aminoácidos consecutivos, preferiblemente de 10 a 30 aminoácidos, incluidos o que se superponen parcial o totalmente a la secuencia de los péptidos tales como se han definido en a), b) o c).

Los inventores describen también un péptido caracterizado porque presenta una secuencia de 7 a 50 aminoácidos, que incluye un residuo de aminoácido seleccionado del grupo constituido por:

-

la alanina, situada en la posición 2552 de la secuencia en aminoácidos de la proteína codificada por el ORF1a,

-

la serina, situada en la posición 577 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S de la cepa de SRAS-CoV tal como se ha definido anteriormente,

-

la glicina, en la posición 11 de la secuencia en aminoácidos de la proteína codificada por el ORF3 de la cepa de SRAS-CoV tal como se ha definido anteriormente,

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la serina, en la posición 154 de la secuencia en aminoácidos de la proteína M de la cepa de SRAS-CoV tal como se ha definido anteriormente,

Los inventores describen también un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo policlonal o monoclonal, susceptible

de ser obtenido mediante inmunización de un animal con un vector recombinante, tal como se ha definido anteriormente, un banco de ADNc tal como se ha definido anteriormente o bien una proteína o un péptido tales como se han definido anteriormente, caracterizado porque se enlaza con al menos una de las proteínas codificadas por el SRAS-CoV tal como se ha definido anteriormente.

Un anticuerpo, tal como se ha definido anteriormente, engloba los anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos quiméricos, tales como los anticuerpos humanizados, así como sus fragmentos (Fab, Fv, scFv).

Los inventores describen también un hibridoma, que produce un anticuerpo monoclonal contra la proteína N, caracterizado porque se selecciona entre los hibridomas siguientes:

-

el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 87, depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004 bajo el número I-3328,

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el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 86, depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004 bajo el número I-3329,

-

el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 57, depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004 bajo el número I-3330, y

-

el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 156, depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004 bajo el número I-3331.

Los inventores describen también un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo policlonal o monoclonal, dirigido contra la proteína N, caracterizado porque está producido por un hibridoma tal como se ha definido anteriormente.

Se entiende por anticuerpo quimérico, en relación a un anticuerpo de una especie animal particular o de una clase particular de anticuerpo, un anticuerpo que comprende todo o parte de una cadena pesada y/o de una cadena ligera de un anticuerpo de otra especie animal o de otra clase de anticuerpo.

Se entiende por anticuerpo humanizado una inmunoglobulina humana en la que los residuos de CDR (Complementary-Determining Regions), que forman el sitio de unión al antígeno, están sustituidos por los de un anticuerpo monoclonal no humano que posee la especificidad, la afinidad o la actividad buscadas. Por comparación con los anticuerpos no humanos, los anticuerpos humanizados son menos inmunógenos y poseen una vida media prolongada en el ser humano, ya que posee sólo una baja proporción de secuencias no humanas, debido a que la casi totalidad de los residuos de las regiones FR (Framework) y de la región constante (Fc) de estos anticuerpos son los de unas secuencias consenso de inmunoglobulinas humanas.

Los inventores describen también un chip o filtro de proteína, caracterizado porque comprende una proteína, un péptido o bien un anticuerpo tales como se han definido anteriormente.

Los chips de proteína son preparados mediante los métodos clásicos, conocidos. Entre los soportes apropiados sobre los cuales se pueden inmovilizar unas proteínas, se pueden citar los de material plástico o de vidrio, en particular en forma de microplacas.

Los inventores describen también agentes reactivos derivados de la cepa aislada de coronavirus asociado al SRAS, procedente de la extracción catalogada bajo el nº 031589, útiles para el estudio y el diagnóstico de la infección provocada por un coronavirus asociado al SRAS, agentes reactivos que se seleccionan del grupo constituido por:

(a)

un par de cebadores, una sonda o un chip de ADN tales como se han definido anteriormente,

(b)

un vector recombinante, o una célula modificada, tales como se han definido anteriormente,

(c)

una cepa aislada de coronavirus, o un polinucleótido, tales como se han definido anteriormente,

(d)

una proteína o un péptido tales como se han definido anteriormente,

(e)

un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, tales como se han definido anteriormente,

(f)

un chip de proteína tal como se ha definido anteriormente.

Estos diferentes agentes reactivos son preparados y utilizados según las técnicas clásicas de biología molecular y de inmunología, siguiendo los protocolos estándares, tales como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA), en Current Protocols in Immunology (John E. Cologan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA) y en Antibodies: A Laboratory

Manual (E. Howell y D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Los fragmentos de ácido nucleico, según la invención, son preparados y utilizados según las técnicas clásicas, tales como se han definido anteriormente. Los péptidos y las proteínas, según la invención, son preparados mediante las técnicas de ADN recombinante, conocidas por el experto en la materia, en particular con la ayuda de los vectores recombinantes tales como se han definido anteriormente. Alternativamente, los péptidos, según la invención, se pueden preparar mediante las técnicas clásicas de síntesis en fase sólida o líquida, conocidas por el experto en la materia.

Los anticuerpos policlonales son preparados mediante inmunización de un animal apropiado con una proteína o un péptido tales como se han definido anteriormente, eventualmente acoplado a la KLH o a la albúmina y/o asociado a un adyuvante apropiado tal como el adyuvante de Freund (completo o incompleto) o el hidróxido de alúmina; después de la obtención de un título en anticuerpo satisfactorio, los anticuerpos se recogen mediante extracción del suero de los animales inmunizados y enriquecidos en IgG por precipitación, según las técnicas clásicas, después los IgG específicos de las proteínas de SRAS-CoV se purifican eventualmente mediante cromatografía de afinidad sobre una columna apropiada, sobre la cual se fijan dicho péptido o dicha proteína, tales como se han definido anteriormente, a fin de obtener una preparación de IgG monoespecíficos.

Los anticuerpos monoclonales son producidos a partir de hibridomas obtenidos mediante fusión de linfocitos B de un animal inmunizado por una proteína o un péptido tales como se han definido anteriormente con unos mielomas, según la técnica de Kohler y Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497); los hibridomas son cultivados in vitro, en particular en fermentadores o producidos in vivo, en forma de ascito; alternativamente, dichos anticuerpos monoclonales son producidos mediante ingeniería genética tal, como se describe en la patente americana US

4.816.567.

Los anticuerpos humanizados son producidos mediante métodos generales como los descritos en la solicitud internacional WO 98/45332.

Los fragmentos de anticuerpos son producidos a partir de las regiones VH y VL clonadas, a partir de los ARNm de hibridomas o de linfocitos esplénicos de un ratón inmunizado; por ejemplo, los fragmentos Fv, scFv o Fab están expresados en la superficie de fagos filamentosos según la técnica de Winter y Milstein (Nature, 1991, 349, 293299); después de varias etapas de selección, los fragmentos de anticuerpos específicos del antígeno son aislados y expresados en un sistema de expresión apropiado, mediante las técnicas clásicas de clonación y de expresión de ADN recombinante.

Los anticuerpos o sus fragmentos tales como se han definido anteriormente, son purificados mediante las técnicas clásicas conocidas por el experto en la materia, tales como la cromatografía de afinidad.

Los inventores describen además el uso de un producto seleccionado del grupo constituido por: un par de cebadores, una sonda, un chip de ADN, un vector recombinante, una célula modificada, una cepa aislada de coronavirus, un polinucleótido, una proteína o un péptido, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y un chip de proteína tales como se han definido anteriormente, para la preparación de un agente reactivo de detección y eventualmente de genotipaje/serotipaje, de un coronavirus asociado al SRAS.

Las proteínas y los péptidos tales como se han definido anteriormente, que son adecuados para ser reconocidos y/o para inducir la producción de anticuerpos específicos del coronavirus asociado al SRAS, son útiles para el diagnóstico de la infección por tal coronavirus; la infección se detecta, mediante una técnica apropiada, en particular EIA, ELISA, RIA, inmunofluorescencia, a partir de una muestra biológica extraída en un individuo susceptible de ser infectado.

Según una disposición ventajosa de dicho uso, dichas proteínas se seleccionan del grupo constituido por las proteínas S, E, M y/o N, y los péptidos tales como se han definido anteriormente.

Las proteínas S, E, M y/o N y los péptidos derivados de estas proteínas tales como se han definido anteriormente, por ejemplo la proteína N, se utilizan para el diagnóstico indirecto de una infección con coronavirus asociado al SRAS (diagnóstico serológico; detección de anticuerpos específicos del SRAS-CoV), en particular mediante un método inmunoenzimático (ELISA).

Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos tales como se han definido anteriormente, en particular los dirigidos contra las proteínas S, E, M y/o N y los péptidos derivados tales como se han definido anteriormente, son útiles para el diagnóstico directo de una infección con coronavirus asociado al SRAS; la detección de proteína(s) del SRAS-CoV se realiza mediante una técnica apropiada, en particular EIA, ELISA, RIA, inmunofluorescencia a partir de una muestra biológica extraída en un individuo susceptible de ser infectado.

Los inventores describen asimismo un método de detección de un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica, método que se caracteriza porque comprende al menos:

(a)

la puesta en contacto de dicha muestra biológica con al menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, una proteína, un péptido o bien un chip o un filtro de proteína o de péptido, tales como se han definido anteriormente, y

(b)

el revelado mediante cualquier medio apropiado unos complejos antígeno-anticuerpo formados en (a), por ejemplo mediante EIA, ELISA, RIA, o mediante inmunofluorescencia.

Según un modo de aplicación ventajoso de dicho procedimiento, la etapa (a) comprende:

(a1) la puesta en contacto de dicha muestra biológica con al menos un primer anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que está fijado sobre un soporte apropiado, en particular una microplaca,

(a2) el lavado de la fase sólida, y

(a3) la adición de al menos un segundo anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, diferente del primero, estando dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo eventualmente marcado de manera apropiada.

Este procedimiento que permite capturar las partículas víricas presentes en la muestra biológica se denomina también procedimiento de inmunocaptura.

Por ejemplo:

-

la etapa (a1) se realiza con al menos un primer anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de estos, dirigido contra la proteína S, M y/o E, y/o un péptido que corresponde al ectodominio de una de estas proteínas (péptidos M2-14 o E1-12)

-

la etapa (a3) se realiza con al menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo dirigido contra otro epítopo de la misma proteína o preferiblemente contra otra proteína, de manera preferente contra una proteína interna, tal como la nucleoproteína N o el endodominio de la proteína E o M, de manera aún más preferente, se trata de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos dirigidos contra la proteína N, muy abundante en la partícula viral; cuando un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo dirigido contra una proteína interna (N) o contra el endodominio de las proteínas E o M se utiliza, dicho anticuerpo es incubado en presencia de detergente, como el Tween 20 por ejemplo, a unas concentraciones del orden del 0,1%,

-

la etapa (b) de revelado de los complejos antígeno-anticuerpo formados se realiza directamente con la ayuda de un segundo anticuerpo marcado, por ejemplo, con biotina o una enzima apropiada tal como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina, o bien indirectamente con la ayuda de un suero anti-inmunoglobulinas marcado como anteriormente. Los complejos así formados son revelados con la ayuda de un sustrato apropiado.

Según una realización preferente de este método, la muestra biológica se mezcla con el anticuerpo monoclonal de revelado previamente a su puesta en contacto con los anticuerpos monoclonales de captura. Llegado el caso, la mezcla suero-anticuerpo de revelado se incuba durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente antes de ser aplicada sobre la placa.

Los inventores describen también un ensayo de inmunocaptura destinado a detectar una infección por el coronavirus asociado al SRAS por detección de la nucleoproteína nativa (proteína N), en particular caracterizado porque el anticuerpo utilizado para la captura de la nucleoproteína viral nativa es un anticuerpo monoclonal específico de la región central y/o de un epítopo conformacional.

Según un modo de realización de dicho ensayo, el anticuerpo utilizado para la captura de la proteína N es el anticuerpo monoclonal Acm87, producido por el hibridoma depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004 bajo el número I-3328.

Según otro modo de realización de dicho ensayo de inmunocaptura, el anticuerpo utilizado para la captura de la proteína N es el anticuerpo monoclonal Acm86, producido por el hibridoma depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004 bajo el número I-3329.

Según otro modo de realización de dicho ensayo de inmunocaptura, los anticuerpos monoclonales Acm86 y Acm87 son utilizados para la captura de la proteína N.

En los ensayos de inmunocaptura, se puede utilizar el revelado de la proteína N, el anticuerpo monoclonal Acm57, producido por el hibridoma depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004 bajo el número 1-3330, estando dicho anticuerpo conjugado a una molécula o a una partícula reveladora.

Conforme a dicho ensayo de inmunocaptura, una combinación de los anticuerpos Acm57 y Acm87, conjugados a

una molécula o a una partícula reveladora, se utiliza para el revelado de la proteína N.

Una molécula reveladora puede ser un átomo radioactivo, un colorante, una molécula fluorescente, un fluoróforo, una enzima; una partícula reveladora puede ser, por ejemplo, oro coloidal, una partícula magnética o una bola de látex.

Los inventores describen también un agente reactivo de detección de un coronavirus asociado al SRAS, caracterizado porque se selecciona del grupo constituido por:

(a)

un par de cebadores o una sonda tales como se han definido anteriormente,

(b)

un vector recombinante tal como se ha definido anteriormente o una célula modificada tal como se ha definido anteriormente,

(c)

una cepa aislada de coronavirus tal como se ha definido anteriormente o un polinucleótido tal como se ha definido anteriormente,

(d)

un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo tal como se ha definido anteriormente,

(e)

una combinación de anticuerpos que comprende los anticuerpos monoclonales Acm86 y/o Acm87, y el anticuerpo monoclonal Acm57, tal como se ha definido anteriormente,

(f)

un chip o un filtro, tal como se han definido anteriormente.

Los inventores describen también un método de detección de una infección por un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica, mediante ELISA IgG indirecto que utiliza la proteína N, método que está caracterizado porque las placas son sensibilizadas por una solución de proteína N a una concentración comprendida entre 0,5 y 4 !g/ml, preferiblemente 2 !g/ml, en un tampón PBS 10 mM pH 7,2, rojo de fenol a 0,25 ml/l.

Los inventores describen, además, un método de detección de una infección por un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica, mediante ELISA doble epítopo, caracterizado porque el suero a ensayar está mezclado al antígeno de revelado, siendo dicha mezcla puesta en contacto después con el antígeno fijado sobre un soporte sólido.

Según una variante de los ensayos de detección de los coronavirus asociado al SRAS, estos ensayos combinan un ELISA que utiliza la proteína N, y otro ELISA que utiliza la proteína S, tal como se describe más adelante.

Los inventores describen también un complejo inmune formado de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo policlonal o monoclonal, tal como se han definido anteriormente, y de una proteína o de un péptido del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen además un kit de detección de un coronavirus asociado al SRAS, caracterizado porque comprende al menos un agente reactivo seleccionado del grupo constituido por: un par de cebadores, una sonda, un chip de ADN o ARN, un vector recombinante, una célula modificada, una cepa aislada de coronavirus, un polinucleótido, una proteína o un péptido, un anticuerpo, y un chip de proteína, tales como se han definido anteriormente.

Los inventores describen además una composición inmunógena, caracterizada porque comprende al menos un producto seleccionado del grupo constituido por:

a) una proteína o un péptido tales como se han definido anteriormente,

b) un polinucleótido de tipo ADN o ARN o uno de sus fragmentos representativos tales como se han definido anteriormente, de secuencia seleccionada entre:

(i)

la secuencia SEC ID nº 1 o su equivalente ARN,

(ii)

la secuencia que hibrida, en condiciones de fuerte rigor, con la secuencia SEC ID nº 1,

(iii) la secuencia complementaria de la secuencia SEC ID nº 1 o de la secuencia que hibrida en condiciones de fuerte rigor con la secuencia SEC ID nº 1,

(iv)

la secuencia nucleotídica de un fragmento representativo del polinucleótido, tal como se define en (i), (ii) o (iii),

(v)

la secuencia tal como se define en (i), (ii), (iii) o (iv), modificada, y

c) un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido tal como se define en b), y

d) un banco de ADNc tal como se definió anteriormente,

siendo dicha composición inmunógena capaz de inducir una inmunidad humoral o celular protectora específica del coronavirus asociado al SRAS, en particular la producción de un anticuerpo dirigido contra un epítopo específico del coronavirus asociado al SRAS.

Las proteínas y los péptidos, tales como se han definido anteriormente, en particular las proteínas S, M, E y/o N y los péptidos derivados, así como las moléculas de ácido nucleico (ADN o ARN) que codifican dichas proteínas o dichos péptidos, son buenas vacunas candidatas y pueden ser utilizadas en composiciones inmunógenas para la producción de una vacuna contra el coronavirus asociado al SRAS.

Según un modo de realización ventajoso de las composiciones, según la invención, estas contienen además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable y eventualmente sustancias portadoras y/o adyuvantes.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables, las sustancias portadoras y los adyuvantes son los clásicamente utilizados.

Los adyuvantes se seleccionan ventajosamente del grupo constituido por emulsiones oleosas, saponina, sustancias minerales, extractos bacterianos, hidróxido de alúmina y escualeno.

Las sustancias portadoras son ventajosamente seleccionadas del grupo constituido por los liposomas unilaminares, los liposomas multilaminares, unas micelas de saponina o unas microesferas sólidas de naturaleza sacarídica o aurífera.

Las composiciones, según la invención, se administran por vía general, en particular intramuscular o subcutánea, o bien por vía local, en particular nasal (aerosol).

Los inventores describen también el uso de una proteína o de un péptido aislado o purificado que presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 y 75 para formar un complejo inmune con un anticuerpo dirigido específicamente contra un epítopo del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también un complejo inmune formado por una proteína o por un péptido aislado o purificado, que presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 y 75, y de un anticuerpo dirigido específicamente contra un epítopo del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también el uso de una proteína o de un péptido aislado o purificado, que presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 y 75, para inducir la producción de un anticuerpo capaz de reconocer específicamente un epítopo del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también el uso de un polinucleótido aislado o purificado, que presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 1, 2, 4, 7, 8, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 31, 36 y 38 para inducir la producción de un anticuerpo dirigido contra la proteína codificada por dicho polinucleótido, y capaz de reconocer específicamente un epítopo del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también unos anticuerpos monoclonales que reconocen la proteína S nativa de un coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también el uso de una proteína o de un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, o de un anticuerpo que reconoce la proteína S nativa, tal como se ha definido anteriormente, para detectar una infección por un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica.

Los inventores describen también un método de detección de una infección por un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica, caracterizado porque la detección se efectúa mediante ELISA utilizando la proteína S recombinante, expresada en un sistema eucariota.

Según un modo de aplicación ventajoso de dicho método, se trata de un método por ELISA doble epítopo, y el suero a ensayar se mezcla con el antígeno de revelado, siendo dicha mezcla puesta en contacto después con el antígeno fijado sobre un soporte sólido.

Los inventores describen también un complejo inmune formado de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo

monoclonal que reconoce la proteína S nativa, y de una proteína o de un péptido del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen también un complejo inmune formado de una proteína o de un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, y de un anticuerpo dirigido específicamente contra un epítopo del coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen además un kit o estuche de detección de un coronavirus asociado al SRAS, caracterizado porque comprende al menos un agente reactivo seleccionado del grupo constituido por: una proteína o polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, un ácido nucleico que codifica una proteína o un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, una célula que expresa una proteína o un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, o un anticuerpo que reconoce la proteína S nativa de un coronavirus asociado al SRAS.

Los inventores describen una composición inmunógena y/o de vacuna, caracterizada porque comprende un polipéptido o una proteína recombinante de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente, obtenido en un sistema de expresión eucariota.

Los inventores describen también una composición inmunógena y/o de vacuna, caracterizada porque comprende un vector o virus recombinante, que expresa una proteína o un polipéptido de la familia de la proteína S, tal como se ha definido anteriormente.

Además de las disposiciones anteriores, la invención comprende también otras disposiciones, que destacarán de la descripción siguiente, que se refiere a unos ejemplos de aplicación del polinucleótido que representa el genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el número 031589, y unos fragmentos de ADNc derivados, que son objeto de la presente invención, así como a la Tabla I que presenta el listado de las secuencias:

TabAa�I:�Aistado�de�secuencias

Numero�de�identificacion

Secuencia Posicion�deA�ADNc�e� referencia�a�nenban� AY274119.3 Numero�d� deposito�en�A� CNCM�de� pAasmido correspondiente

SEC ID nº 1

Genoma de la cepa procedente de la extracción 031589 - -

SEC ID nº 2

ORF-S* 21406-25348 -

SEC ID nº 3

Proteína S - -

SEC ID nº 4

ORF-S** 21406-25348 I-3059

SEQ ID nº 5

fragmento Sa 21406-23454 I-3020

SEC ID nº 6

fragmento Sb 23322-25348 I-3019

SEC ID nº 7

ORF-3+ORF-4* 25110-26244 -

SEC ID nº 8

ORF-3+ORF-4** 25110-26244 I-3126

SEC ID nº 9

ORF3 - -

SEC ID nº 10

Proteína ORF-3 - -

SEC ID nº 11

ORF4 - -

SEC ID nº 12

Proteína ORF-4 - -

SEQ ID nº 13

ORF-E* 26082-26413 -

SEC ID nº 14

Proteína E - -

SEC ID nº 15

ORF-E** 26082-26413 I-3046

SEC ID nº 16

ORF-M* 26330-27098 -

SEC ID nº 17

Proteína M - -

SEC ID nº 18

ORF-M** 26330-27098 I-3047

SEC ID nº 19

ORF7 a 11* 26977-28218 -

SEC ID nº 20

ORF7 a 11** 26977-28218 I-3125

SEC ID nº 21

ORF7 - -

SEC ID nº 22

Proteína ORF7 - -

SEC ID nº 23

ORF8 - -

SEC ID nº 24

Proteína ORF8 - -

SEC ID nº 25

ORF9 - -

SEC ID nº 26

Proteína ORF9 - -

SEC ID nº 27

ORF10 - -

SEC ID nº 28

Proteína ORF10 - -

SEC ID nº 29

ORF11 - -

SEC ID nº 30

Proteína ORF11 - -

Numero�de�identificacion

Secuencia Posicion�deA�ADNc�en referencia�a�nenban� AY274119.3 Numero�de deposito�en �Aa CNCM�deA pAasmido correspondiente

SEC ID nº 31

OrF1ab 265-21485 -

SEC ID nº 32

ORF13 28130-28426 -

SEC ID nº 33

Proteína ORF13 - -

SEC ID nº 34

ORF14 - -

SEC ID nº 35

Proteína ORF14 28583-28795 -

SEC ID nº 36

ORF-N* 28054-29430

SEC ID nº 37

Proteína N - -

SEC ID nº 38

ORF-N** 28054-29430 I-3048

SEC ID nº 39

5'no codificante** 1-204 I-3124

SEC ID nº 40

3'no codificante** 28933-29727 I-3123

SEC ID nº 41

ORF1ab Fragmento L0 30-500 -

SEC ID nº 42

Fragmento L1 211-2260 -

SEC ID nº 43

Fragmento L2 2136-4187 -

SEC ID nº 44

Fragmento L3 3892-5344 -

SEC ID nº 45

Fragmento L4b 4932-6043 -

SEC ID nº 46

Fragmento L4 5305-7318 -

SEC ID nº 47

Fragmento L5 7275-9176 -

SEC ID nº 48

Fragmento L6 9032-11086 -

SEC ID nº 49

Fragmento L7 10298-12982 -

SEC ID nº 50

Fragmento L8 12815-14854 -

SEC ID nº 51

Fragmento L9 14745-16646 -

SEC ID nº 52

Fragmento L10 16514-18590 -

SEC ID nº 53

Fragmento L11 18500-20602 -

SEC ID nº 54

Fragmento L12 20319-22224 -

SEC ID nº 55

Cebador N sentido - -

SEC ID nº 56

Cebador N antisentido - -

SEC ID nº 57

Cebador SC sentido - -

SEC ID nº 58

Cebador SL sentido - -

SEC ID nº 59

Cebador SC y SL antisentido - -

SEC ID nº 60

Cebador sentido serie 1 28507-28522 -

SEC ID nº 61

Cebador antisentido serie 1 28774-28759

SEC ID nº 62

Cebador sentido serie 2 28375-28390 -

SEC ID nº 63

Cebador antisentido serie 2 28702-28687 -

SEC ID nº 64

Sonda 1/serie 1 28561-28586 -

SEC ID nº 65

Sonda 2/serie 1 28588-28608 -

SEC ID nº 66

Sonda 1/serie 2 28541-28563 -

SEC ID nº 67

Sonda 2/serie 2 28565-28589 -

SEC ID nº 68

Cebador ancla 14T

SEC ID nº 69

Péptido M2-14 - -

SEC ID nº 70

Péptido E1-12 - -

SEC ID nº 71

Péptido E53-76 - -

SEC ID nº 72

5' no codificante* 1-204 -

SEC ID nº 73

3' no codificante* 28933-29727 -

SEC ID nº 74

Proteína ORF1a - -

SEC ID nº 75

Proteína ORF1b - -

SEQ ID nºs 76-139

Cebadores

SEQ ID nº 140

Pseudógeno de S

SEQ ID nºs 141-148

cebadores

SEQ ID nº 149

Aa1-13 de S

SEQ ID nº 150

polipéptido

SEQ ID nºs 151-158

cebadores

* producto de amplificación PCR (amplicón) ** inserto clonado en el plásmido depositado en la CNCM

así como a los dibujos anexos en los que:

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la figura 1 ilustra el análisis por transferencia western de la expresión in vitro de las proteínas recombinantes N, 17

SC y SL a partir de los vectores de expresión pIVEX. Pista 1: pIV2.3N. Pista 2: pIV2.3SC. Pista 3: pIV2.3SL. Pista

4: pIV2.4N. Pista 5: pIV2.4S1 o pIV2.4SC. Pista 6: pIV2.4SL. La expresión de la proteína GFP expresada a partir del mismo vector se utiliza como control.

-

la figura 2 ilustra el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), y coloración con azul de Coomassie, de la expresión in vivo de la proteína N a partir de los vectores de expresión pIVEX. La cepa de E.coli BL21(DE3)pDIA17, transformada por los vectores pIVEX recombinantes, se cultiva a 30°C en un medio LB, en presencia o ausencia de inductor (IPTG 1mM). Pista 1: pIV2.3N Pista 2: pIV2.4N.

-

la figura 3 ilustra el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y coloración con azul de Coomassie, de la expresión in vivo de los polipéptidos SL y SC a partir de los vectores de expresión pIVEX. La cepa de E.coli BL21 (DE3)pDIA17, transformada por los vectores pIVEX recombinantes, se cultiva a 30°C en un medio LB, en presencia o ausencia de inductor (IPTG 1mM). Pista 1: pIV2.3SC Pista 2: pIV2.3SL. Pista 3: pIV2.4S1 Pista 4: pIV2.4SL.

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la figura 4 ilustra la actividad antigénica de las proteínas N, SL y SC recombinantes producidas en la cepa E. coli BL21(DE3)pDIA17, transformada por los vectores pIVEX recombinantes. A: electroforesis (SDS-PAGE) de los lisados bacterianos. B y C: transferencia western con los sueros, que provienen de un mismo paciente infectado por SRAS-CoV, extraídos respectivamente a los 8 días (B: suero M12) y a los 29 días (C: suero M13) después del comienzo de los síntomas del SRAS. Pista 1: pIV2.3N. Pista 2: pIV2.4N. Pista 3: pIV2.3SC. Pista 4: pIV2.4 S1. Pista 5: pIV2.3SL. Pista 6: pIV2.4SL

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la figura 5 ilustra la purificación sobre columna Ni-NTA agarosa de la proteína N recombinante, producida en la cepa E. coli BL21(DE3)pDIA17 a partir del vector pIV2.3N. Pista 1: Extracto bacteriano total. Pista 2: Extracto soluble. Pista 3: Extracto insoluble. Pista 4: Extracto depositado sobre la columna Ni-NTA. Pista 5: proteínas no retenidas. Pista 6: Fracciones del pico 1. Pista 7: Fracciones del pico 2.

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la figura 6 ilustra la purificación de la proteína SC recombinante a partir de los cuerpos de inclusiones producidos en la cepa E. coli BL21(DE3)pDIA17, transformada por el pIV2.4S1.A. Tratamiento con Tritón X-100 (2%): Pista

1: Extracto bacteriano total. Pista 2: Extracto soluble. Pista 3: Extracto insoluble. Pista 4: Sobrenadante después del tratamiento con Tritón X-100 (2%). Pistas 5 y 6: Residuo después del tratamiento con Tritón X-100 (2%).B: Tratamiento con urea 4M, 5M, 6M y 7M de los extractos solubles e insolubles.

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la figura 7 representa la inmunohuella realizada con la ayuda de un lisado de células infectadas por el SRAS-CoV y de un suero de paciente que padece neumopatía atípica.

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la figura 8 representa unas inmunohuellas realizadas con la ayuda de un lisado de células infectadas por el SRAS-CoV y de inmunosueros de conejos específicos de la nucleoproteína N (A) y de la proteína de espícula S (B). I.S.: suero inmune. p.i.: suero pre-inmune. El inmunosuero anti-N se utilizó al 1/50000 y el inmunosuero anti-S al 1/10000.

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la figura 9 ilustra la reactividad en ELISA de los sueros policlonales monoespecíficos de conejo dirigidos contra la proteína N o el fragmento corto de la proteína S (SC), frente a proteínas recombinantes correspondientes utilizadas para la inmunización. A: conejos P13097, P13081, y P13031 inmunizados con la proteína N recombinante purificada. B: conejos P11135, P13042, y P14001 inmunizados con una preparación de cuerpos de inclusiones que corresponden al fragmento corto de la proteína S (SC). I.S.: suero inmune. p.i.: suero preinmune.

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la figura 10 ilustra la reactividad en ELISA de la proteína N recombinante purificada, frente a suero de pacientes que padecen neumonía atípica causada por el SRAS-CoV. Figura 10a: placas ELISA preparadas con la proteína N a la concentración de 4 !g/ml y 2 !g/ml. Figura 10b: placa ELISA preparada con la proteína N a la concentración de 1 !g/ml. Los sueros designados A, B, D, E, F, G, H corresponden a los de la Tabla IV.

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la figura 11 ilustra la amplificación por RT-PCR de cantidades decrecientes de ARN sintético del gen N del SRAS-CoV (107 a 1 copia), con la ayuda de los pares de cebadores n° 1 (N/+/28507,N/-/28774) (A) y n° 2 (N/+/28375,N/-/28702) (B). T: amplificación realizada en ausencia de ARN. MW: marcador de ADN.

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la figura 12 ilustra la amplificación por RT-PCR en tiempo real de ARN sintético del gen N del SRAS-CoV: unas cantidades decrecientes de ARN sintético en replicado (repli. ; pistas 16 a 29) así como el ARN viral diluido al 1/20x10-4 (Pista 32) se amplificaron mediante RT-PCR en tiempo real con la ayuda del kit "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes" y de los pares de cebadores y de sondas de la serie n° 2, en las condiciones descritas en el ejemplo 8.

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la figura 13 (figura 13.1 a 13.70) representa el mapa de restricción de la secuencia SEC ID nº 1 que corresponde al equivalente ADN del genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el número 031589.

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la figura 14 muestra el resultado del ensayo de serología SRAS por ELISA N indirecto (1ª serie de sueros ensayados)

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la figura 15 muestra el resultado del ensayo de serología SRAS por ELISA N indirecto (2º serie de sueros ensayados)

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la figura 16 presenta el resultado del ensayo de serología SRAS por ELISA N doble epítopo (1ª serie de sueros ensayados)

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la figura 17 muestra el resultado del ensayo de serología SRAS por ELISA N doble epítopo (2ª serie de sueros ensayados)

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la figura 18 ilustra el ensayo de reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-N por ELISA sobre la nucleoproteína N nativa del SRAS-CoV. Los anticuerpos se ensayaron en forma de sobrenadantes de cultivo de hibridomas por un ELISA indirecto, utilizando un lisado irradiado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV como antígeno (curvas lisado SRAS). Un control negativo de reactividad se realiza para cada anticuerpo sobre un lisado de células VeroE6 no infectadas (curvas lisado negativo). Varios anticuerpos monoclonales de especificidad conocida se usaron como anticuerpos control negativos: para 1-3 dirigido contra los antígenos de los virus parainfluenza de tipo 1-3 (Bio-Rad) y gripe B dirigido contra los antígenos del virus de la gripe de tipo B (Bio-Rad).

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la figura 19 ilustra el ensayo de reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-N del SRAS-CoV por ELISA sobre los antígenos nativos de coronavirus humano 229E (HCoV-229E). Los anticuerpos se ensayaron en forma de sobrenadantes de cultivo de hibridomas por un ensayo ELISA indirecto, utilizando un lisado de células MRC5 infectadas por el coronavirus humano 229E como antígeno (curvas lisado 229E). Un control negativo de inmunorreactividad se realiza, para cada anticuerpo, sobre un lisado de células MRC-5 no infectadas (curvas lisado negativo). El anticuerpo monoclonal 5-11H.6 dirigido contra la proteína S del coronavirus humano 229E (Sizun y otros 1998, J. Virol. Met. 72: 145-152) se utiliza como anticuerpo control positivo. Los anticuerpos para 1-3 dirigidos contra los antígenos de los virus parainfluenza de tipo 1-3 (Bio-Rad) y gripe B dirigido contra los antígenos del virus de la gripe de tipo B (Bio-Rad) se añadieron al panel de los anticuerpos monoclonales ensayados.

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la figura 20 muestra un ensayo de reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-N del SRAS-CoV por transferencia western sobre la nucleoproteína N nativa del SRAS-CoV desnaturalizado. Un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-Cov- se preparó en el tampón de depósito según Laemmli y puesto a migrar en un gel SDS al 12% de poliacrilamida, después las proteínas se transfirieron sobre una membrana de PVDF. Los anticuerpos monoclonales anti-N ensayados se utilizaron para el inmunoensayo a la concentración de 0,05 !g/ml. El revelado se hace con unos anticuerpos anti-IgG (H+L) de ratón acoplados a la peroxidasa (NA93IV, Amersham) y el sistema ECL+. Dos anticuerpos monoclonales se usaron como controles negativos de reactividad: gripe B dirigido contra los antígenos del virus de la gripe de tipo B (Bio-Rad) y para 1-3 dirigido contra los antígenos de los virus parainfluenza de tipo 1-3 (Bio-Rad).

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la figura 21 presenta los plásmidos de expresión en células de mamíferos de la proteína S del SRAS-CoV. El ADNc de la S del SRAS-CoV se insertó entre los sitios BamH1 y Xho1 del plásmido de expresión ACNpc3.1(+) (Clontech) para obtener el plásmido ADNpc-S y entre los sitios Nhe1 y Xho1 del plásmido de expresión pCl (Promega) para obtener el plásmido pCl-S- Las secuencias WPRE y CTE se insertaron en cada uno de los dos plásmidos ADNpc-S y pCl-S entre los sitios Xho1 y Xba1 para obtener respectivamente los plásmidos ADNpc-S-CTE, ADNpc-S-WPRE, pCI-S-CTE y pCI-S-WPRE.

SP: péptido señal predicho (aa 1-3) con el programa signalP v2.0 (Nielsen y otros, 1997, Protein Engineering,

10: 1-6) TM: región transmembranaria predicha (aa 1196-1218) con el programa TMHMM v2.0 (Sonnhammer y otros, 1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182, AAAI Press). Se debe señalar que los aminoácidos W1194 y P1195 forman parte posiblemente de la región transmembranaria con probabilidades respectivas de 0,13 y 0,42

P-CMV: promotor inmediato/precoz del citomegalovirus. BGH pA: señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovina

SV40 late pA: señal de poliadenilación tardía del virus SV40

SD/SA: sitios donante y receptor de empalme WPRE: secuencias del "Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element" del virus de la hepatitis de la marmota

CTE: secuencias del "constitutive transport element" del retrovirus símico de Mason-Pfizer

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la figura 22 ilustra la expresión de la proteína S después de la transfección de células VeroE6. Se prepararon extractos celulares 48 horas después de la transfección de células VeroE6 por los plásmidos ADNpc, ADNpc-s, pCl y pCl-S. Extractos celulares se prepararon también 18 horas después de la infección por el virus recombinante de la vacuna antivariólica VV-TF7.3 y transfección por los plásmidos ADNpc o ADNpc-S. A título de control, unos extractos de células VeroE6 se prepararon 8 horas después de la infección por el SRAS-CoV con una multiplicidad de infección de 3. Se separaron sobre un gel SDS al 8% de acrilamida y fueron analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un anticuerpo policlonal anti-IgG (H+L) de conejo acoplado con la peroxidasa (NA934V, Amersham). Una escala de masa molecular (kDa) se muestra en la figura.

SRAS.CoV: extracto de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV

Mock: extracto control de células no infectadas

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la figura 23 ilustra el efecto de las secuencias CTE y WPRE sobre la expresión de la proteína S después de la transfección de células VeroE6 y 293T. Unos extractos celulares se prepararon 48 horas después de la transfección de células VeroE6 (A) o 293T (B) por los plásmidos ADNpc, ADNpc-S, ADNpc-S-CTE, ADNpc-S-WPRE, pCI-S, pCI-S-CTE y pCI- S-WPRE, separados sobre un gel SDS al 8% de acrilamida y analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un anticuerpo policlonal anti-IgG (H+L) de conejo acoplado con la peroxidasa (NA934V, Amersham). Una escala de masa molecular (kDa) se lleva sobre la figura.

SRAS-CoV: extracto de células VeroE6 preparadas 8 horas después de la infección por el SRAS-CoV con una multiplicidad de infección de 3.

Mock: extracto control de células VeroE6 no infectadas

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la figura 24 presenta vectores lentivirales defectivos con “ADN flap” central para la expresión de la S du SRAS-CoV. El ADNc de la proteína S del SRAS-CoV se clonó en forma de un fragmento BamH1-Xho1 en el plásmido pTRIPAU3-CMV que contiene un vector lentiviral defectivo TRIP con “ADN flap” central (Sirven y otros, 2001, Mol. Ther., 3: 438-448) para obtener el plásmido pTRIP-S. Los casetes de expresión óptimos constituidos por el promotor inmediato/precoz del virus CMV, de una señal de empalme, del ADNc de la S y de una u otra de las señales post-transcripcionales CTE o WPRE se han sustituido al casete EF1a-EGFP del vector de expresión lentiviral defectivo de ADN FLAP central TRIPAU3-EF1 a (Sirven y otros, 2001, Mol. Ther., 3:438-448) para obtener los plásmidos pTRIP-SD/SA-S-CTE y pTRIP-SD/SA-S-WPRE.

SP: péptido señal

TM: región transmembranaria

P-CMV: promotor inmediato/precoz el citomegalovirus

P-EF1a: promotor del gen EF1a

SD/SA: sitios donante y receptor de empalme

WPRE: secuencias del "Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element" del virus de la hepatitis de la marmota

CTE: secuencias del "constitutive transport element" del retrovirus símico de Mason-Pfizer

LTR: «Long terminal repeat»

LU3: LTR eliminado de las secuencias «promoter/enhancer»

cPPT: «polypurine tract cis-active sequence»

CTS: «central termination sequence»

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la figura 25 muestra el análisis mediante transferencia western de la expresión de la S du SRAS-CoV por líneas celulares transducidas por los vectores lentivirales TRIP-SD/SA-S-WPRE y TRIP-SD/SA-S-CTE. Se han preparado unos extractos celulares a partir de líneas FrhK4-S-CTE y FrhK4-S-WPRE establecidas después de la transducción por los vectores lentivirales TRIP-SD/SA-S-CTE y TRIP-SD /SA-S-WPRE respectivamente. Se han separado sobre un gel SDS al 8% de acrilamida y analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un conjugado anti-IgG(H+L) de conejo acoplado con la peroxidasa. Una escala de masa molecular (kDa) se muestra en la figura.

T-: Extracto control de células FrhK-4

T+: Extracto de células FrhK-4 preparadas 24h después de la infección por el SRAS-CoV con una multiplicidad de infección de 3.

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la figura 26 se refiere al análisis de la expresión de polipéptido Ssol por líneas celulares transducidas por los vectores lentivirales TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE y TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. La secreción del polipéptido Ssol se ha buscado en el sobrenadante de una serie de clones celulares aislados después de la transducción de células FRhK-4 por los vectores lentivirales TRIP-SD/SA-SsoI-WPRE y TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. 5 !l de sobrenadante diluidos al 1/2 en un tampón de depósito según Laemmli se analizaron mediante transferencia western revelado por un anticuerpo monoclonal anti-FLAG (M2, Sigma) y un conjugado anti-IgG(H+L) de ratón acoplado a la peroxidasa. T-: sobrenadante de la línea FRhK-4 parental. T+: sobrenadante de células BHK infectadas por un virus recombinante de la vacuna antivariólica que expresa el polipéptido Ssol. La flecha llena indica el polipéptido Ssol, mientras que la flecha hueca indica una reacción cruzada con una proteína de origen celular.

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la figura 27 muestra los resultados relativos al análisis del polipéptido Ssol purificado

A. 8, 2, 0,5 y 0,125 !g de polipéptido recombinante Ssol purificado mediante cromatografía de afinidad anti-FLAG y gel de filtración (G75) se separaron sobre gel SDS al 8% de poliacrilamida. El polipéptido Ssol así como unas cantidades variables de marcadores de masa molecular (MM) se revelaron mediante coloración con nitrato de plata (Gelcode SilverSNAP stain kit II, Pierce).

B. Marcadores estándar para el análisis por espectrometría de masas SELDI-TOF

IgG: IgG bovino de MM 147300

ConA: conalbúmina de MM 77490

HRP: peroxidasa de rábano picante a título de control y de MM 43240

C. Análisis por espectrometría de masas (SELDI-TOF) del polipéptido recombinante Ssol. Los picos A y B corresponden al polipéptido Ssol simple y doblemente cargado.

D. Secuenciación del extremo N-terminal del polipéptido recombinante Ssol. Se realizaron 5 ciclos de degradación de Edman en fase líquida sobre un secuenciador ABI494 (Applied Biosystems).

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la figura 28 ilustra la influencia de una señal de corte y empalme y de las secuencias CTE y WPRE sobre la eficacia de la inmunización génica con la ayuda de ADN plasmídico que codifica la S du SRAS-CoV

A. Unos grupos de 7 ratones BALB/c se inmunizaron dos veces con 4 semanas de intervalo con la ayuda de 50 !g de ADN plasmídico de pCI, ADNpc-S, pCI-S, ADNpc-N y pCI-HA.

B. Unos grupos de 6 ratones BALB/c se inmunizaron dos veces con 4 semanas de intervalo con la ayuda de 2 !g, 10 !g ó 50 !g de ADN plasmídico de pCI, pCI-S, pCI-S-CTE y pCI-S-WPRE.

Los sueros inmunes extraídos 3 semanas después de la segunda inmunización se analizaron mediante ELISA indirecta utilizando un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV como antígeno. Los títulos en anticuerpos anti-SRAS-CoV se calculan como la inversa de la dilución que produce una DO específica de 0,5 después del revelado por un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa (NA931V, Amersham) y de TMB (KPL).

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la figura 29 muestra la seroneutralización de la infectividad del SRAS-CoV por los anticuerpos inducidos en el ratón después de la inmunización génica con la ayuda de ADN plasmídico que codifica la S du SRAS-CoV. Unos grupos de sueros inmunes extraídos 3 semanas después de la segunda inmunización se realizaron para cada uno de los grupos de los experimentos descritos en la figura 28, y evaluados por su capacidad de seroneutralizar la infectividad de 100 TCID50 de SRAS-CoV sobre células FRhK-4. Se realizan 4 puntos para cada una de las diluciones de razón 2 ensayadas a partir del 1/20. El título seroneutralizante se calcula según el método de Reed y Munsch como la inversa de la dilución que neutraliza la infectividad de 2 pozos sobre 4.

A. Grupos de ratones BALB/c inmunizados dos veces con 4 semanas de intervalo con la ayuda de 50 !g de ADN plasmídico de pCI, ADNpc-S, pCI-S, ADNpc-N y pCI-HA. 0: suero preinmune. •: suero inmune.

B. Grupos de ratones BALB/c inmunizados dos veces con 4 semanas de intervalo con la ayuda de 2 !g, 10 !g ó 50 !g de ADN plasmídico de pCI, pCI-S, pCI-S-CTE y pCI-S-WPRE.

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la figura 30 ilustra la inmunorreactividad del polipéptido recombinante Ssol frente a sueros de pacientes que padecen SRAS. La reactividad de sueros de pacientes se ha analizado mediante el ensayo ELISA indirecto contra unas fases sólidas preparadas con la ayuda del polipéptido recombinante Ssol purificado. Los anticuerpos de pacientes que reaccionan con la fase sólida a una dilución del 1/400 se revelan mediante un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) humano acoplado a la peroxidasa (Amersham NA933V) y de TMB más H2O2 (KPL). Los sueros de casos posibles de SRAS son identificados por un número de orden del Centre National de Référence des virus influenzae así como por las iniciales del paciente y el número de días transcurridos desde el principio de los síntomas, llegado el caso. Los sueros TV son unos sueros controles de sujetos que han sido extraídos en Francia antes de la epidemia de SRAS aparecida en 2003.

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la figura 31 muestra la inducción de anticuerpos dirigidos contra el SRAS-CoV después de la inmunización con el polipéptido recombinante Ssol. Dos grupos de 6 ratones se inmunizaron con 3 semanas de intervalo con 10 !g de polipéptido recombinante Ssol (grupo Ssol) adyuvado con el hidróxido de aluminio o, a título de control, del adyuvante sólo (grupo mock). Se realizaron tres inmunizaciones sucesivas y los sueros inmunes se extrajeron 3 semanas después de cada una de las inmunizaciones (IS1, IS2, IS3). Los sueros inmunes se analizaron por grupo para cada uno de los 2 grupos por ELISA indirecto utilizando un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV como antígeno. Los títulos en anticuerpos anti-SRAS-CoV se calculan como la inversa de la dilución que produce una DO específica de 0,5 después del revelado por un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa (Amersham) y de TMB (KPL).

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La figura 32 presenta la alineación nucleotídica de las secuencias del gen sintético 040530 con la secuencia del gen salvaje del aislado 031589 del SRAS-CoV. I-3059 corresponde a los nucleótidos 21406-25348 del aislado 031589 del SRAS-CoV depositado a la C.N.C.M. bajo el número 1-3059 (SEC ID nº 4, plásmido pSRAS-S). S040530 es la secuencia del gen sintético 040530.

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la figura 33 ilustra el uso de un gen sintético para la expresión de la S del SRAS-CoV. Unos extractos celulares preparados 48 horas después de la transfección de células VeroE6 (A) o 293T (B) por los plásmidos pCI, pCI-S, pCI-S-CTE, pCI-S-WPRE y pCI-Ssynth se prepararon sobre un gel SDS al 8% de acrilamida y analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de conejo acoplado con la peroxidasa (NA934V, Amersham). La transferencia western se reveló mediante luminescencia (ECL+, Amersham) y adquisición sobre un dispositivo de creación de imagen numérica (FluorS, BioRad). Los niveles de expresión de la proteína S se midieron cuantificando las 2 bandas mayoritarias localizadas sobre la imagen.

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la figura 34 presenta un esquema de la construcción de los virus de vacuna antivariólica recombinantes VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN- S y VV-TN-Ssol

A.Los ADNc de la proteína S y del polipéptido Ssol del SRAS-CoV se insertaron entre los sitios BamH1 y Sma1 del plásmido de transferencia pTG186 para obtener los plásmidos pTG-S y pTG-Ssol.

B.

Las secuencias del promotor sintético 480 se sustituyeron después de las del promotor 7,5 mediante intercambio del fragmento Nde1-Pst1 de los plásmidos pTG186poli, pTG-S y pTG-Ssol para obtener los plásmidos de transferencia pTN480, pTN-S y pTN-Ssol.

C.

Secuencia del promotor sintético 480 tal como el contenido entre los sitios Nde1 y Pst1 de los plásmidos de transferencia de la serie pTN. Un sitio Asc1 se insertó para facilitar las manipulaciones ulteriores. Los sitios de restricción, así como la secuencia del promotor, son subrayados

D.

Los virus recombinantes de la vacuna antivariólica se obtienen mediante doble recombinación homóloga in vivo entre el casete TK de los plásmidos de transferencia de las series pTG y pTN, y el gen TK de la cepa Copenhague del virus de la vacuna antivariólica.

SP: péptido señal predicha (aa 1-13) con el programa signalP v2.0 (Nielsen y otros, 1997, Protein Engineering, 10: 1-6)

TM: región transmembranaria predicha (aa 1196-1218) con el programa TMHMM v2.0 (Sonnhammer y otros, 1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182, AAAI Press). Se debe de señalar que los aminoácidos W1194 y P1195 pertenecen posiblemente a la región transmembranaria con unas probabilidades respectivas de 0,13 y 0,42.

TK-L, TK-R: partes izquierda y derecha del gen de la timidinaquinasa del virus de la vacuna antivariólica

MCS: sitio múltiple de clonación

PE: promotor precoz

PL: promotor tardío

PL synth: promotor tardío sintético 480

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la figura 35 ilustra la expresión de la proteína S por los virus de la vacuna antivariólica recombinantes, analizada mediante transferencia western. Se han preparado unos extractos celulares 18 horas después de la infección de células CV1 por los virus de la vacuna antivariólica recombinantes VV-TG, VV-TG-S y VV-TN-S a una M.O.I. de 2 (A). A título de control, unos extractos de célula VeroE6 se prepararon 8 horas después de la infección por el SRAS-CoV con una multiplicidad de infección de 2. Unos extractos celulares se prepararon también 18 horas después de la infección de células CV1 por los virus de la vacuna antivariólica recombinantes VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S y VV-TN-Ssol (B). Se prepararon sobre geles SDS al 8% de acrilamida y analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de conejo acoplado a la peroxidasa (NA934V, Amersham). «1 !l» y «10 !l» indican las cantidades de extractos celulares depositadas sobre el gel. Una escala de masa molecular (kDa) se muestra en la figura.

SRAS-CoV: Extracto de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV

Mock: Extracto control de células non infectadas

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la figura 36 muestra el resultado de un análisis mediante transferencia western de la secreción del polipéptido Ssol por los virus de la vacuna antivariólica recombinantes.

A.Unos sobrenadantes de células CV1 infectadas por el virus de la vacuna antivariólica recombinante VV-TN, diferentes clones de virus VV-TN-Ssol y por los virus VV-TG-Ssol o VV-TN-Sflag se recogieron 18 horas después de la infección de células CV1 a una M.O.I. de 2.

B.Unos sobrenadantes de células 293T, FRhK-4, BHK-21 y CV1 infectadas por duplicados (1,2) por el virus de la vacuna antivariólica recombinante VV-TN-Ssol a una M.O.I. de 2 se recogieron 18 horas después de la infección. El sobrenadante de células CV1 infectadas por el virus VV-TN se recogió también a título de control (M).

Todos los sobrenadantes se han separado sobre gel SDS a 8% de acrilamida según Laemmli, y analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-FLAG y de un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de ratón acoplado a la peroxidasa (NA931V, Amersham) (A) o con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de conejo acoplado con la peroxidasa (NA934V, Amersham) (B). Una escala de masa molecular (kDa) se muestra en la figura.

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la figura 37 muestra el análisis del polipéptido Ssol, purificado mediante gel SDS de poliacrilamida

10, 5 y 2 !l de polipéptido recombinante Ssol purificado mediante cromatografía de afinidad anti-FLAG se separaron sobre gel SDS en gradiente del 4 al 15% de poliacrilamida. El polipéptido Ssol, así como unas cantidades variables de marcadores de masa molecular (MM), se revelaron mediante coloración con nitrato de plata (Gelcode SilverSNAP stain kit II, Pierce).

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la figura 38 ilustra la immunorreactividad del polipéptido recombinante Ssol producido por el virus de la vacuna antivariólica recombinante VV-TN-Ssol frente a sueros de pacientes que padecen SRAS. La reactividad de sueros de pacientes se analizó mediante un ensayo de ELISA indirecto contra unas fases sólidas preparadas con la ayuda del polipéptido recombinante Ssol purificado. Los anticuerpos de pacientes que reaccionan con la fase sólida a una dilución del 1/100 y 1/400 se revelan mediante un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) humano acoplado a la peroxidasa (Amersham NA933V) y de TMB más H2O2 (KPL). Los sueros de casos posibles de SRAS son identificados mediante un número del tipo del Centre National de Référence des virus influenzae, así como por las iniciales del paciente y el número de días transcurridos desde el principio de los síntomas, llegado el caso. Los sueros TV son unos sueros controles de sujetos que fueron extraídos en Francia antes de la epidemia de SRAS aparecida en 2003.

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la figura 39 muestra la respuesta en anticuerpo anti-SRAS-CoV en el ratón después de la inmunización por los virus de la vacuna antivariólica recombinantes. Se inmunizaron unos grupos de 7 ratones BALB/c por vía i.v.

dos veces con 4 semanas de intervalo por 106 u.f.p. de virus de la vacuna antivariólica recombinantes VV-TG, VV-TG-HA, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV- TN-S, VV-TN-Ssol.

A.Se realizaron unas grupos de sueros inmunes extraídos 3 semanas después de cada una de las dos inmunizaciones para cada uno de los grupos, y se analizaron mediante ELISA indirecto utilizando un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV como antígeno. Los títulos en anticuerpos anti-SRAS-CoV son calculados como la inversa de la dilución que produce una DO específica de 0,5 después del revelado por un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa (NA931V, Amersham) y de TMB (KPL).

B.Los grupos de suero inmunes se evaluaron para su capacidad para seroneutralizar la infectividad de 100 TCID50 del SRAS-CoV sobre células FRhK-4. Se realizan 4 puntos para cada una de las diluciones 2 veces ensayadas a partir del 1/20. El título seroneutralizante se calcula según el método de Reed y Munsch como la inversa de la dilución que neutraliza la infectividad de 2 pozos sobre 4.

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la figura 40 describe la construcción de los virus recombinantes MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol.

A.El vector rubeola es un genoma completo de la cepa vacínea Schwarz del virus de la rubeola (MV) en el que se ha introducido una unidad de transcripción suplementaria (Combredet, 2003, Journal of Virology, 77: 11546-11554). La expresión de las fases abiertas de lectura (ORF) suplementarias está controlada por los elementos que actúan en cis necesarias para la transcripción, para la formación del capuchón y para la poliadenilación del transgen, que se copiaron de los elementos presentes en la unión N/P. 2 vectores diferentes permiten la inserción entre los genes P (fosfoproteína) y M (matriz) por una parte y H (hemaglutinina) y L (polimerasa) por otra parte.

B.Los genomas recombinantes MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol del virus de la rubeola se construyeron mediante la inserción de los ORF de la proteína S y del polipéptido Ssol dentro de una unidad de transcripción suplementaria localizada entre los genes P y M del vector.

Los diferentes genes del virus de la rubeola (MV) son indicados: N (nucleoproteína), PVC (fosfoproteína y proteína V/C), M (matriz), F (fusión), H (hemaglutinina), L (polimerasa). T7 = promotor del ARN polimerasa T7, hh = ribozima "hammerhead", T7t = secuencia terminadora de la ARN polimerasa del fago T7, a = ribozima del virus de la hepatitis a, (2), (3) = unidades de transcripción suplementarias (ATU). Tamaño del genoma de MV: 15894 nt.

SP: péptido señal

TM: región transmembranaria

FLAG: etiqueta FLAG

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la figura 41 ilustra la expresión de la proteína S por los virus de la rubeola recombinantes, analizada mediante transferencia western. Se prepararon extractos citoplásmicos después de la infección de células Vero por diferentes pasos de los virus MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol y el virus salvaje MWSchw a título de control. Unos extractos celulares en tampón de depósito, según Laemmli, se prepararon también 8 horas después de la infección de células VeroE6 por el SRAS-CoV, con una multiplicidad de infección de 3. Se han preparado sobre un gel SDS al 8% de acrilamida y analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de conejo acoplado a la peroxidasa (NA934V, Amersham).

Una escala de masa molecular (kDa) se muestra en la figura.

Pn: enésimo paso del virus después del cocultivo de células 293-3-46 y Vero.

SRAS-CoV: extracto de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV

Mock: extracto control de células VeroE6 no infectadas

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la figura 42 muestra la expresión de la proteína S por los virus de la rubeola recombinantes, analizada mediante inmunofluorescencia

Se infectaron células Vero en monocapas sobre láminas de vidrio mediante el virus salvaje MWSchw (A) o los virus MVSchw2-SRAS-S (B) y MVSchw2-SRAS-Ssol (C). Cuando los sincitios alcanzaron del 30 al 40% de confluencia (A., B.) o 90-100% (C), las células se fijaron, permeabilizaron y marcaron mediante anticuerpos policlonales de conejo anti-SRAS-CoV y un conjugado anti-IgG(H+L) de conejo acoplado al FITC (Jackson).

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la figura 43 ilustra el análisis mediante transferencia western de la inmunorreactividad de sueros de conejo dirigidos contra los péptidos E1-12, E53-76 y M2-14. El conejo 20047 se inmunizó con el péptido E1-12 acoplado a la KLH. Los conejos 22234 y 22240 se inmunizaron con el péptido E53-76 acoplado a la KLH. Los conejos 20013 y 20080 se inmunizaron con el péptido M2-14 acoplado a la KLH. Los inmunosueros se analizaron mediante transferencia western con la ayuda de extractos de células infectadas por el SRAS-CoV (B)

o con la ayuda de extractos de células infectadas por un virus recombinante de la vacuna antivariólica que expresa la proteína E (A) o M (C) del aislado 031589 del SRAS-CoV. Las inmunohuellas se recogieron con la ayuda de un conjugado anti-IgG(H+L) de conejo acoplado a la peroxidasa (NA934V, Amersham).

La posición de las proteínas E y M se indica mediante una flecha. Una escala de masa molecular (kDa) se muestra en la figura.

Sin embargo, se debe entender, por supuesto, que estos ejemplos son dados únicamente a título de ilustración del objeto de la invención, y no constituyen de ninguna manera una limitación.

EjempAo�1:�CAonacion�3�secuenciacion�deA�genoma�de�Aa�cepa�de�SRAS-CoV�procedente�de�Aa�ettraccion cataAogada�bajo�eA�numero�531589

El ARN de la cepa de SRAS-CoV se ha extraído a partir de la extracción de lavado broncoalveolar catalogado bajo el número 031589, efectuado sobre un paciente del hospital francés de Hanoi (Vietnam) que padece SRAS.

El ARN aislado se utilizó como plantilla para amplificar los ADNc que corresponden a los diferentes cuadros de lectura abiertos del genoma (ORF1a, ORF1b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N (incluyendo los ORF-13 y ORF-14), ORF3, ORF4, ORF7 a ORF11), y a los extremos 5' y 3' no codificantes. Las secuencias de los cebadores y de las sondas utilizadas para la amplificación/detección se han definido según la secuencia nucleotídica disponible del SRAS-CoV.

A continuación, los cebadores y las sondas son identificados mediante: la letra S, seguida de una letra que indica la región correspondiente del genoma (L para el extremo 5' que incluye ORF1a y ORF1b; S, M y N para los ORF-S, ORF-M, ORF-N, SE y MN para las regiones intergénicas correspondientes), después, eventualmente, de Fn, Rn, con n incluido entre 1 y 6 que corresponde a los cebadores utilizados para la PCR anidada o imbricada (par F1 + R1 para la primera amplificación, par F2 + R2 para la segunda amplificación, etc.), después de /+/ o /-/ que corresponde a un cebador sentido o antisentido y finalmente unas posiciones de los cebadores en referencia a la secuencia Genbank AY27411.3; para los cebadores S y N sentido y antisentido y los otros cebadores sentido únicamente, cuando una sola posición está indicada ésta corresponde a la del extremo 5' de una sonda o de un cebador de aproximadamente 20 bases; para los cebadores antisentido diferentes de los cebadores S y N, cuando se indica una sola posición, ésta corresponde a la del extremo 3' de una sonda o de un cebador de aproximadamente 20 bases.

Los productos de amplificaciones así generados se secuenciaron con la ayuda de cebadores específicos a fin de determinar la secuencia completa del genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el número 031589. Estos productos de amplificación, con la excepción de los que corresponden a los ORF1a y ORF1b, se clonaron después en unos vectores de expresión a fin de producir las proteínas virales correspondientes y los anticuerpos dirigidos contra estas proteínas, en particular mediante inmunización a base de ADN.

1.�Ettraccion�de�Aos ARN

Los ARN han sido extraídos con la ayuda del kit QIamp viral RNA extraction mini (QIAGEN) siguiendo las recomendaciones del fabricante. De manera más precisa: se han mezclado 140 !l de la extracción y 560 !l de tampón AVL vigorosamente durante 15 segundos, incubados durante 10 minutos a temperatura ambiente y después centrifugados brevemente a velocidad máxima. Se han añadido 560 !l de etanol al 100% al sobrenadante y la mezcla así obtenida se agitó muy vigorosamente durante 15 s. Después, se han depositado 630 !l de la mezcla en la columna.

La columna se colocó sobre un tubo de 2 ml, se centrifugó durante 1 minuto a 8000 rpm, y después el resto de la mezcla se depositó sobre la misma columna, y se centrifugó nuevamente durante 1 minuto a 8000 rpm, y se transfirió la columna sobre un tubo de 2 ml limpio. Después, se añadieron 500 !l de tampón AW1 sobre la columna, se centrifugó después la columna durante 1 minuto a 8000 rpm y se eliminó el eluido. Se añadieron 500 !l de tampón AW2 sobre la columna que se centrifugó después durante 3 minutos a 14000 rpm y se trasfirió en un tubo de 1,5 ml. Finalmente, se añadieron 60 !l de tampón AVE sobre la columna que se incubó durante 1 a 2 minutos a temperatura ambiente y después se centrifugó durante 1 minuto a 8000 rpm. El eluido que corresponde al ARN purificado se recuperó y se congeló a -20ºC.

2.�AmpAificacion.�secuenciacion� �cAonacion�de �Aos ADNc

2.1) ADNc�uue �codifica�Aa �proteinaS

Los ARN extraídos a partir de la extracción se sometieron a una transcripción inversa con la ayuda de oligonucleótidos hexaméricos de secuencia aleatoria (pdN6), a fin de producir unos fragmentos de ADNc.

La secuencia que codifica la glicoproteína S del SRAS-CoV se amplificó en forma de dos fragmentos de ADN superpuestos: fragmentos 5' (SRAS-Sa, SEC ID nº 5) y fragmento 3' (SRAS-Sb, SEC ID nº 6), realizando dos amplificaciones sucesivas con la ayuda de cebadores imbricados. Los amplicones así obtenidos se secuenciaron, clonaron en el vector plasmídico PCR 2.1-TOPO™ (IN VITROGEN), y después se determinó la secuencia de los ADNc clonados.

a) clonación y secuenciación de los fragmentos Sa y Sb

a1) síntesis del ADNc

La mezcla de reacción que contiene: ARN (5 !l), H2O ppi (3,5 !l), tampón de transcriptasa inversa 5X (4 !l), dNTP 5 mM (2 !l), pdN6 100 ug/ml (4 !l), RNasin 40 UI/ul (0,5 !l) y transcriptasa inversa AMV-RT, 10 UI/ul, PROMEGA (1 !l) se incubó en un termociclador en las condiciones siguientes: 45 min. a 42°C, 15 min. a 55°C, 5 min. a 95°C, y después se mantuvo el ADNc obtenido a +4°C.

a2) primera amplificación PCR

Los extremos 5' y 3' del gen S se amplificaron respectivamente con los pares de cebadores S/F1/+/21350-21372 y S/R1/-/23518-23498, S/F3/+/23258-23277 y S/R3/-/25382-25363. La mezcla de reacción de 50 !l que contiene: ADNc (2 !l), cebadores 50 !M (0,5 !l), tampón 10 X (5 !l), dNTP 5 mM (2 !l), Taq Expand High Fidelity, Roche (0,75 !l) y H2O (39, 75 !l) se amplificó en un termociclador, en las condiciones siguientes: una etapa inicial de desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos, seguida de 40 ciclos que comprenden: una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 30 s, una etapa de hibridación a 55ºC durante 30 s y después una etapa de elongación a 72ºC durante 2 minutos 30 s, con 10 s de elongación suplementaria a cada ciclo, y después una etapa final de elongación a 72ºC durante 5 minutos.

a3) segunda amplificación PCR

Los productos de la primera amplificación PCR (amplicones 5' y 3') han sufrido una segunda etapa de amplificación PCR (PCR anidada) en condiciones idénticas a las de la primera amplificación, con los pares de cebadores S/F2/+/21406-21426 y S/R2/-/23454-23435, y S/F4/+/23322-23341 y S/R4/-/25348-25329, respectivamente para el amplicón 5' y el amplicón 3'.

a4) clonación y secuenciación de los fragmentos Sa y Sb

Los amplicones Sa (extremo 5') y Sb (extremo 3') así obtenidos se purificaron con la ayuda del kit QIAquick PCR purification (QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del fabricante, después se clonaron en el vector PCR2.1-TOPO (kit Invitrogen), para dar los plásmidos denominados SRAS-S1 y SRAS-S2.

El ADN de los clones Sa y Sb se aisló y después se secuenció el inserto con la ayuda del kit Big Dye, Applied Biosystem® y de los cebadores universales M13 directo y M13 inverso, así como de los cebadores: S/S/+/21867, S/S/+/22353, S/S/+/22811, S/S/+/23754, S/S/+/24207, S/S/+/24699, S/S/+/24348, S/S/-/24209, S/S/-/23630, S/S//23038, S/S/-/22454, S/S/-/21815, S/S/-/24784, S/S/+/21556, S/S/+/23130 y S/S/+/24465, siguiendo las instrucciones del fabricante; las secuencias de los fragmentos Sa y Sb así obtenidas corresponden a las secuencias SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

El plásmido denominado SRAS-S1 se depositó bajo el n° 1-3020, el 12 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene un fragmento 5' de la secuencia del gen S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031559, tal como se ha definido anteriormente, correspondiendo dicho fragmento denominado Sa a los nucleótidos de las posiciones 21406 a 23454 (SEC ID nº 5), en referencia a la secuencia Genbank AY274119.3 Tor2.

El plásmido denominado TOP10F'-SRAS-S2 se depositó bajo el n° 1-3019, el 12 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene un fragmento 3' de la secuencia del gen S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, correspondiendo dicho fragmento denominado Sb a los nucleótidos de las posiciones 23322 a 25348 (SEC ID nº 6), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3.

b) clonación y secuenciación del ADNc completo (clon SRAS-S de 4 kb)

El ADNc S completo se obtuvo a partir de los clones SRAS-S1 y SRAS-S2 antes citados, de la siguiente manera:

1) se realizó una reacción de amplificación PCR sobre un clon SRAS-S2 en presencia del cebador S/R4/-/ 2534825329 antes citado y del cebador S/S/+/24696-24715: se obtuvo un amplicón de 633 pb,

2) se realizó otra amplificación PCR sobre otro clon SRAS-S2, en presencia de los cebadores S/F4/+/23322-23341 antes citados y S/S/-/24803-24784: se obtuvo un amplicón de 1481 pb,

La reacción de amplificación se realizó en las condiciones tales como se han definido anteriormente para la amplificación de los fragmentos Sa y Sb, con la excepción de que se efectuaron 30 ciclos de amplificaciones que comprenden una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 20 s y una etapa de elongación a 72ºC durante 2 minutos 30 s.

3) los 2 amplicones (633 pb y 1481 pb) se purificaron en las condiciones tales como se han definido anteriormente para los fragmentos Sa y Sb.

4) se realizó otra reacción de amplificación PCR con la ayuda de los cebadores S/F4/+/23322-23341 y S/R4//25348-25329 antes citados, sobre los amplicones purificados obtenidos en 3). La reacción de amplificación se realizó en las condiciones tales como se han definido anteriormente para la amplificación de los fragmentos Sa y Sb, con la excepción de que se efectuaron 30 ciclos de amplificaciones.

El amplicón de 2026 pb así obtenido se purificó, se clonó en el vector PCR2.1-TOPO y después se secuenció como anteriormente, con la ayuda de los cebadores tales como se han definido anteriormente para los fragmentos Sa y Sb. El clon así obtenido se denominó clon 3'.

5) El clon SRAS-S1 obtenido anteriormente y el clon 3' se han digerido por EcoR I, se purificaron las bandas de aproximadamente 2 kb así obtenidas sobre gel y después se amplificaron mediante PCR con los cebadores S/F2/+/21406-21426 y S/R4/-/25348-25329 antes citados. La reacción de amplificación se realizó en las condiciones tales como se han definido anteriormente para la amplificación de los fragmentos Sa y Sb, con la excepción de que se efectuaron 30 ciclos de amplificaciones. El amplicón de aproximadamente 4 kb se purificó y se secuenció. Después, se clonó en el vector PCR2.1-TOPO para dar el plásmido denominado SRAS-S, y se secuenció el inserto contenido en este plásmido como anteriormente, con la ayuda de los cebadores tales como se han definido anteriormente para los fragmentos Sa y Sb. Las secuencias de ADNc del inserto y del amplicón que codifica la proteína S, corresponden respectivamente a las secuencias SEC ID nº 4 y SEC ID nº 2 en el listado de secuencias adjunto en anexo, éstas codifican para la proteína S (SEC ID nº 3).

La secuencia del amplicón que corresponde al ADNc que codifica la proteína S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 presenta las dos mutaciones siguientes con respecto a las secuencias que corresponden respectivamente a los aislados Tor2 y Urbani, siendo las posiciones de las mutaciones indicadas en referencia a la secuencia completa del genoma del aislado Tor2 (Genbank AY274119.3):

-

g/t en posición 23220; el codón de alanina (gct) en posición 577 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S de Tor2 está sustituido por un codón de serina (tct),

-

c/t en posición 24872: esta mutación no modifica la secuencia en aminoácidos de la proteína S, y

El plásmido denominado SRAS-S se depositó bajo el n° 1-3059, el 20 de junio de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que codifica la proteína S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 21406 a 25348 (SEC ID nº 4), en referencia a la secuencia Genbank AY274119.3.

2.2) ADNc �uue�codifica�Aas�proteinas�M�3E

Los ARN procedentes de la extracción 031589, extraídos como anteriormente, se sometieron a una transcripción inversa, asociada, durante la misma etapa (kit Titan One Step RT-PCR®, Roche), a una reacción de amplificación por PCR, con la ayuda de los pares de cebadores:

-

S/E/F1/+/26051-26070 y S/E/R1/-/26455-26436 para amplificar el ORF-E, y

-

S/M/F1/+/26225-26244 y S/M/R1/-/27148-27129 para amplificar el ORF-M.

Una primera mezcla de reacción que contiene: 8,6 !l de H2Oppi, 1 !l de dNTP (5 mM), 0,2 !l de cada uno de los cebadores (50 !M), 1,25 !l de DTT (100 mM) y 0,25 !l de ARNsin (40 UI/!l) se combinó con una segunda mezcla de

reacción que contiene: 1 !l de ARN, 7 !l de H2Oppi, 5 !l de tampón de RT-PCR 5X y 0,5 !l de mezcla de enzima, y se incubaron las mezclas combinadas en un termociclador en las condiciones siguientes: 30 min. a 42°C, 10 min. a 55°C, 2 min. a 94°C seguido de 40 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 10 s, una etapa de hibridación a 55°C durante 30 s y una etapa de elongación a 68°C durante 45 s, con 3 s de incremento por ciclo, y finalmente una etapa de elongación terminal a 68°C durante 7 min.

Los productos de amplificación así obtenidos (amplicones M y E) han sufrido una segunda amplificación PCR (PCR anidada) utilizando el kit Expand High-Fi®, Roche), con la ayuda de los pares de cebadores:

-

S/E/F2/+/26082-26101 y S/E/R2/-/26413-26394 para el amplicón E, y

-

S/M/F2/+/26330-26350 y S/M/R2/-/27098-27078 para el amplicón M.

Conteniendo la mezcla de reacción: 2 !l del producto del primer PCR, 39,25 !l de H2Oppi, 5 !l de tampón 10X que contiene MgCl2, 2 !l de dNTP (5 mM), 0,5 !l de cada uno de los cebadores (50 !M) y 0,75 !l de mezcla de enzima se incubaron en un termociclador en las condiciones siguientes: una etapa de desnaturalización a 94°C durante 2 min. seguido de 30 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 15 s, una etapa de hibridación a 60°C durante 30 s y una etapa de elongación a 72°C durante 45 s, con 3 s de incremento por ciclo, y finalmente una etapa de elongación terminal a 72°C durante 7 min. Los productos de amplificación obtenidos que corresponden a los ADNc que codifican para las proteínas E y M se secuenciaron como anteriormente, con la ayuda de los cebadores: S/E/F2/+/26082 y S/E/R2/-/26394, S/M/F2/+/26330, S/M/R2/-/27078 antes citados y de los cebadores S/M/+/26636-26655 y S/M/-/26567-26548. Después, se clonaron, como anteriormente, para dar los plásmidos denominados SRAS-E y SRAS-M. El ADN de estos clones se aisló y se secuenció después con la ayuda de los cebadores universales M13 directo y M13 inverso, así como unos cebadores S/M/+/26636 y S/M/-/26548 antes citados.

La secuencia del amplicón que representa el ADNc que codifica la proteína E (SEC ID nº 13) de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589, no comprende diferencias con respecto a las secuencias que corresponden a unos aislados AY274119.3-Tor2 y AY278741-Urbani. La secuencia de la proteína E de la cepa de SRAS-CoV 031589 corresponde a la secuencia s ID nº 14 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

El plásmido denominado SRAS-E se depositó bajo el n° 1-3046, el 28 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que codifica la proteína E de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 26082 a 26413 (SEC ID nº 15), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3.

La secuencia del amplicón que representa el ADNc que codifica la M (SEC ID nº 16) de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 no comprende diferencias con referencia a la secuencia correspondiente del aislado AY274119.3-Tor2. Sin embargo, en la posición 26857, el aislado AY278741-Urbani comprende una c y la secuencia de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n°031589 una t. Esta mutación desemboca en una modificación de la secuencia en aminoácidos de la proteína correspondiente: en la posición 154, una prolina (AY278741-Urbani) se cambia a serina en la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n°031589. La secuencia de la proteína M de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n°031589 corresponde a la secuencia SEC ID nº 17 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

El plásmido denominado SRAS-M se depositó bajo el n° 1-3047, el 28 de mayo de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que codifica la proteína M de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente; secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 26330 a 27098 (SEC ID nº 18), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3.

2.3) ADNc�uue�corresponde �a�Aos�ORF3.�ORF4.�ORF7�a�ORF11

La misma estrategia de amplificación, de clonación y de secuenciación, se utilizó para obtener los fragmentos de ADNc que corresponden respectivamente a los ORF siguientes: ORF 3, ORF4, ORF7, ORF8, ORF9, ORF10 y ORF11. Los pares de cebadores utilizados para la primera amplificación son:

-

ORF3 y ORF4: S/SE/F1/+/25069-25088 y S/SE/R1/-/26300-26281

-

ORF7 a ORF11: S/MN/F1/+/26898-26917 y S/MN/R1/-/28287-28266

Los pares de cebadores utilizados para la segunda amplificación son:

-

ORF3 y ORF4: S/SE/F2/+/25110-25129 y S/SE/R2/-/26244-26225

-

ORF7 a ORF11: S/MN/F2/+/26977-26996 y S/MN/R2/-/28218-28199

Las condiciones de la primera amplificación (RT-PCR) son las siguientes: 45 min. a 42°C, 10 min. a 55°C, 2 min. a 94°C, seguido de 40 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 15 s, una etapa de hibridación a 58°C durante 30 s y una etapa de elongación a 68°C durante 1 min., con 5 s de incremento por ciclo, y finalmente una etapa de elongación terminal a 68°C durante 7 min.

Las condiciones de la PCR anidada son las siguientes: una etapa de desnaturalización a 94°C durante 2 min. seguida de 40 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 20 s, una etapa de hibridación a 58°C durante 30 s y una etapa de elongación a 72°C durante 50 s, con 4 s de incremento por ciclo, y finalmente una etapa de elongación terminal a 72°C durante 7 min.

Los productos de amplificación obtenidos que corresponden a los ADNc que contienen respectivamente los ORF3 y 4 y los ORF7 a 11 se secuenciaron con la ayuda de los cebadores: S/SE/+/25363, S/SE/+/25835, S/SE/-/25494, S/SE/-/25875, S/MN/ +/27839, S/MN/+/27409, S/MN/-/27836 S/MN/-/27799 y se clonaron como anteriormente para los otros ORF, para dar los plásmidos denominados SRAS-SE y SRAS-MN. El ADN de estos clones se aisló y se secuenció con la ayuda de estos mismos cebadores, y unos cebadores universales M 13 sentido y M 13 antisentido.

La secuencia del amplicón que representa el ADNc de la región que contiene los ORF 3 y 4 (SEC ID nº 7) de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 comporta una diferencia nucleotídica con referencia a la secuencia correspondiente del aislado AY274119-Tor2. Esta mutación en la posición 25298 desemboca en una modificación de la secuencia en aminoácidos de la proteína correspondiente (ORF 3): en la posición 11, una arginina (AY274119-Tor2) se cambia a glicina en la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589. Sin embargo, no se ha identificado ninguna mutación con referencia a la secuencia correspondiente del aislado AY278741-Urbani. Las secuencias de los ORF 3 y 4 y la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 corresponden respectivamente a las secuencias SEC ID nº 10 y 12 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

El plásmido denominado SRAS-SE se depositó bajo el n° I-3126, el 13 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene el ADNc que corresponde a la región situada entre el ORF-S y el ORF-E y que se superpone a ORF-E de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, correspondiendo dicha región a los nucleótidos de las posiciones 25110 a 26244 (SEC ID nº 8), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3,

La secuencia del amplicón que representa el ADNc que corresponde a la región que contiene los ORF7 a ORF11 (SEC ID nº 19) de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 no comprende diferencias con respecto a las secuencias correspondientes de los aislados AY274119-Tor2 y AY278741-Urbani. Las secuencias de los ORF7 a 11 de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 corresponden respectivamente a las secuencias SEC ID nº 22, 24, 26, 28 y 30 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

El plásmido denominado SRAS-MN se depositó bajo el n° I-3125, el 13 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que corresponde a la región situada entre el ORF-M y el ORF-N de la cepa de SRAS-CoV, procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589 y extraída en Hanoi, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 26977 a 28218 (SEC ID nº 20 ), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3.

La secuencia del amplicón que representa el ADNc que corresponde a la región que contiene los ORF7 a ORF11 (SEC ID nº 19) de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 no comprenden diferencias con respecto a las secuencias correspondientes de los aislados AY274119-Tor2 y AY278741-Urbani. Las secuencias de los ORF7 a 11 de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 corresponden respectivamente a las secuencias SEC ID nº 22, 24, 26, 28 y 30 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

2.4) ADNc�uue�codifica �Aa�proteina�N� �uue�incAu3e�Aos�ORF13 � �ORF14

El ADNc se sintetizó y se amplificó como se describió anteriormente para los fragmentos Sa y Sb. De manera más precisa, la mezcla de reacción que contiene: 5 !l de ARN, 5 !l de H2O ppi 4 !l de tampón de transcriptasa inversa 5X, 2 !l de dNTP (5 mM), 2 !l de oligo 20T (5 !M), 0,5 !l de RNasin (40 UI/!l) y 1, 5 !l de AMV-RT (10 UI/!l Promega) se incubó en un termociclador en las condiciones siguientes: 45 min. a 42°C, 15 min. a 55°C, 5 min. a 95°C, y después se mantuvo a +4°C.

Se realizó una primera amplificación PCR con el par de cebadores S/N/F3/+/28023 y S/N/R3/-/29480.

La mezcla de reacción como anteriormente para la amplificación de los fragmentos S1 y S2 se incubó en un termociclador, en las condiciones siguientes: una etapa inicial de desnaturalización a 94°C durante 2 min. seguida

de 40 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 20 s, una etapa de hibridación a 55°C durante 30 s y después una etapa de elongación a 72°C durante 1 min. 30 s con 10 s de elongación suplementaria en cada ciclo, y después una etapa final de elongación a 72°C durante 5 min.

El amplicón obtenido en la primera amplificación PCR ha sufrido una segunda etapa de amplificación PCR (PCR anidada) con el par de cebadores S/N/F4/+/28054 y S/N/R4/-/29430 en condiciones idénticas a las de la primera amplificación.

El producto de amplificación obtenido que corresponde al ADNc que codifica la proteína N de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 se secuenció con la ayuda de los cebadores: S/N/F4/+/28054, S/N/R4//29430, S/N/+/28468, S/N/+/28918 y S/N/-/28607 y se clonó como anteriormente para los otros ORF, para dar el plásmido denominado SRAS-N. El ADN de estos clones se aisló y se secuenció con la ayuda de los cebadores universales M13 sentido y M13 anti-sentido, así como de los cebadores S/N/+/28468, S/N/+/28918 y S/N/-/28607.

La secuencia del amplicón que representa el ADNc que corresponde a ORF-N y que incluye los ORF13 y ORF14 (SEC ID nº 36) de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 no comprenden diferencias con respecto a las secuencias correspondientes de los aislados AY274119.3-Tor2 y AY278741-Urbani. La secuencia de la proteína N de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 corresponde a la secuencia SEC ID nº 37 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

Las secuencias de los ORF13 y 14 de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción n°031589 corresponden respectivamente a las secuencias SEC ID nº 32 y 34 en el listado de secuencias adjunto en anexo.

El plásmido denominado SRAS-N se depositó bajo el n° I-3048, el 5 de junio de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene el ADNc que codifica la proteína N de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 28054 a 29430 (SEC ID nº 38), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3.

2.5)�ettremos 5'�3�3'�no�codificantes

a) extremo 5' no codificante (5'NC)

a1) síntesis del ADNc

Los ARN procedentes de la extracción 031589, extraídos como anteriormente, se sometieron a una transcripción inversa en las condiciones siguientes:

El ARN (15 !l) y el cebador S/L/-/443 (3 !l de la concentración de 5 !m, se incubaron durante 10 min. a 75°C.

Después, se añadieron un tampón de transcriptasa inversa 5X (6 !l, INVITROGEN), unos dNTP 10 mM (1 !l), un DTT 0,1M (3 !l), y se incubó la mezcla a 50°C durante 3 min.

Finalmente, se añadió la transcriptasa inversa (3 !l de Superscript®, INVITROGEN) a la mezcla anterior, que se incubó a 50°C durante 1h30 y después a 90 °C durante 2 min.

El ADNc así obtenido se purificó con la ayuda del kit QIAquick PCR purification (QIAGEN), según las recomendaciones del fabricante.

b1) Reacción a la Terminal Transferasa (TdT)

El ADNc (10 !l) se incuba durante 2 min. a 100°C, se conserva en hielo, y después se añaden: H2O (2,5 !l), tampón TdT 5X (4 !l, AMERSHAM), dATP 5mM (2 !l) y TdT (1,5 !l, AMERSHAM). La mezcla así obtenida se incuba durante 45 min. a 37°C y después durante 2 min. a 65°C.

El producto obtenido se amplifica mediante una primera reacción PCR con la ayuda de los cebadores: S/L/-/225-206 y anclaje 14T: 5'-AGATGAATTCGGTACCTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEC ID nº 68). Las condiciones de la amplificación son las siguientes: una etapa inicial de desnaturalización a 94°C durante 2 min. es seguida de 10 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 10 s, una etapa de hibridación a 45°C durante 30 s y después una etapa de elongación a 72°C durante 30 s, y después de 30 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 10 s, una etapa de hibridación a 50°C durante 30 s y después una etapa de elongación a 72°C durante 30 s, y después de una etapa final de elongación a 72°C durante 5 min.

El producto de la primera amplificación PCR sufrió una segunda etapa de amplificación con la ayuda de los cebadores: S/L/-/204-185 y anclaje 14T antes citado en condiciones idénticas a las de la primera amplificación. El amplicón así obtenido se purificó, se secuenció con la ayuda del cebador S/L/-/182-163 y después se clonó como anteriormente para los diferentes ORF, para dar el plásmido denominado SRAS-5'NC. El ADN de este clon se aisló y se secuenció con la ayuda de los cebadores universales M13 sentido y M13 anti-sentido y del cebador S/L/-/182-163 antes citado.

El amplicón que representa el ADNc que corresponde al extremo 5'NC de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589 corresponde a la secuencia SEC ID nº 72 en el listado de secuencias adjunto en anexo; esta secuencia no comprende diferencias con respecto a las secuencias correspondientes de los aislados AY274119.3-Tor2 y AY278741-Urbani.

El plásmido denominado SRAS-5'NC se depositó bajo el n° I-3124, el 7 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene el ADNc que corresponde al extremo 5' no codificante del genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, secuencia que corresponde a los nucleótidos de las posiciones 1 a 204 (SEC ID nº 39), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3.

b) extremo 3' no codificante (3'NC)

a1) síntesis del ADNc

Los ARN procedentes de la extracción nº 031589, extraídos como anteriormente, se sometieron a una transcripción inversa, según el protocolo siguiente: conteniendo la mezcla de reacción: ARN (5 !l), H2O (5 !l), tampón de transcriptasa inversa 5X (4 !l), dNTP 5 mM (2 !l), Oligo 20T 5 !M (2 !l), RNasin 40 U/!l (0,5 !l) y RT-AMV 10 UI/!l (1,5 !l, PROMEGA) se incubó en un termociclador, en las condiciones siguientes: 45 min. a 42°C, 15 min. a 55°C, 5 min. a 95°C, y después se mantuvó a +4°C.

El ADNc obtenido se amplificó mediante una primera reacción PCR con la ayuda de los cebadores S/N/+/2846828487 y anclaje 14T antes citado. Las condiciones de la amplificación son las siguientes: una etapa inicial de desnaturalización a 94°C durante 2 min. seguida de 10 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 20 s, una etapa de hibridación a 45°C durante 30 s y después una etapa de elongación a 72°C durante 50 s. y después de 30 ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94°C durante 20 s, una etapa de hibridación a 50°C durante 30 s y después una etapa de elongación a 72°C durante 50 s, y después de una etapa final de elongación a 72°C durante 5 min.

El producto de la primera amplificación PCR sufrió una segunda etapa de amplificación con la ayuda de los cebadores S/N/+/28933-28952 y anclaje 14T antes citados, en condiciones idénticas a las de la primera amplificación. El amplicón así obtenido se purificó, se secuenció con la ayuda del cebador S/N/+/29257-29278 y se clonó como anteriormente para los diferentes ORF, para dar el plásmido denominado SRAS-3'NC. El ADN de este clon se aisló y se secuenció con la ayuda de los cebadores universales M13 sentido y M13 anti-sentido y del cebador S/N/+/29257-29278 antes citado.

El amplicón que representa el ADNc que corresponde al extremo 3'NC de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589 corresponde a la secuencia SEC ID nº 73 en el listado de secuencias adjunto en anexo; esta secuencia no comprende diferencias con respecto a las secuencias correspondientes de los aislados AY274119.3-Tor2 y AY278741-Urbani.

El plásmido denominado SRAS-3'NC se depositó bajo el n° I-3123, el 7 de noviembre de 2003, en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; contiene la secuencia de ADNc que corresponde al extremo 3' no codificante del genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, tal como se ha definido anteriormente, correspondiendo dicha secuencia a aquella situada entre el nucleótido en la posición 28933 a 29727 (SEC ID nº 40), en referencia a la secuencia Genbank n° de acceso AY274119.3, se termina por una serie de nucleótidos a.

2.6)�ORFAa3 ORF1b

La amplificación de la región 5' que contiene los ORF1a y ORF1b del genoma del SRAS-CoV procedente de la extracción nº 031589 se realizó practicando unas reacciones de RT-PCR seguidas de PCR anidadas según los mismos principios que los anteriormente descritos para los otros ORF. Los fragmentos amplificados están superpuestos sobre varias decenas de bases, permitiendo así la reconstrucción informática de la secuencia completa de esta parte del genoma. De media, los fragmentos amplificados son de dos kilobases.

Se amplificaron así 14 fragmentos superpuestos denominados L0 a L12 con la ayuda de los cebadores siguientes:

TabAa�II:�Cebadores�utiAioados�para�Aa�ampAificacion�de�Aa�region�5'RORF1a 3 �ORF1b)

REnION AMPLIFICADA Y SECUENCIADA �Rno tiene�en �cuenta�Aos cebadores)

Cebador�sentido�RT-PCR Cebador�antisentido RT-PCR Cebador�sentido�PCR anidada Cebador�antisentido PCR�anidada

L5 55-485

S/L0/F1/+30 S/L0/R1/-481

L1 231-2245

S/L1/F1/+147 S/L1/R1/-2336 S/L1/F2/+211 S/L1/R2/-2241

L2 2156-4167

S/L2/F1/+2033 S/L2/R1/-4192 S/L2/F2/+2136 S/L2/R2/-4168

L3 3913-5324

S/L3bis/F1/+3850 S/L3bis/R1/-5365 S/L3bis/F2/+3892 S/L3bis/R2/-5325

L4b 4952-6523

S/L4b/F1/+4878 S/L4b/R1/-6061 S/L4b/F2/+4932 S/L4b/R2/-6024

L4 5325-7318

S/L4/F1/+5272 S/L4/R1/-7392 S/L4/F2/+5305 S/L4/R2/-7323

L5 7296-9156

S/L5/F1/+7111 S/L5/R1/-9253 S/L5/F2/+7275 S/L5/R2/-9157

L6 9553-11566

S/L6/F1/+8975 S/L6/R1/-11151 S/L6/F2/+9032 S/L6/R2/-11067

L7 15928-12962

S/L7/F1/+10883 S/L7/R1/-13050 S/L7/F2/+10928 S/L7/R2/-12963

L8 12835-14834

S/L8/F1/+12690 S/L8/R1/-14857 S/L8/F2/+12815 S/L8/R2/-14835

L9 14765-16624

S/L9/F1/+14688 S/L9/R1/-16678 S/L9/F2/+14745 S/L9/R2/-16625

L15 16534-18575

S/L10/F1/+16451 S/L10/R1/-18594 S/L10/F2/+16514 S/L10/R2/-18571

L11 18521-25582

S/L11/F1/+18441 S/L11/R1/-20612 S/L11/F2/+18500 S/L11/R2/-20583

L12 25338-22255

S/L12/F1/+20279 S/L12/R1/-22229 S/L12/F2/+20319 S/L12/R2/-22206

Todos los fragmentos se purificaron en las condiciones siguientes, excepto el fragmento L0 que se amplificó como se describe anteriormente para el ORF-M:

-RT-PCR: 30 min. a 42°C, 15 min. a 55°C, 2 min. a 94°C, después el ADNc obtenido se amplifica en las condiciones siguientes: 40 ciclos que comprenden: una etapa de desnaturalización a 94°C durante 15 s, una etapa de hibridación a 58°C durante 30 s y después una etapa de elongación a 68°C durante 1 min. 30 s, con 5 s de elongación suplementaria en cada ciclo, después una etapa final de elongación a 68°C durante 7 min.

-

PCR anidada: una etapa inicial de desnaturalización a 94°C durante 2 min. seguida de 35 ciclos que comprenden: una etapa de desnaturalización a 94°C durante 15 s, una etapa de hibridación a 60°C durante 30 s y después una etapa de elongación a 72°C durante 1 min. 30 s, con 5 s de elongación suplementaria en cada ciclo, después una etapa final de elongación a 72°C durante 7 min.

Los productos de amplificaciones se secuenciaron con la ayuda de los cebadores definidos en la Tabla III siguiente:

TabAa�III:�Cebadores�utiAioados�para�Aa�secuenciacion�de�Aa region�5'�RORF1a 3 �ORF1b)

Nombres

S/L3/+/4932 S/L4/+/6401 S/L4/+/6964 S/L4/-/6817 S/L5/-/7633 S/L5/-/8127 S/L5/-/8633 S/L5/+/7839 S/L5/+/8785 S/L5/+/8255 S/L6/-/9422

Secuencias (SEC ID nº 76 a 139) 5'-CCACACACAGCTTGTGGATA-3' 5'-CCGAAGTTGTAGGCAATGTC-3' 5'-TTTGGTGCTCCTTCTTATTG-3' 5'-CCGGCATCCAAACATAATTT- 3' 5'-TGGTCAGTAGGGTTGATTGG-3' 5'-CATCCTTTGTGTCAACATCG-3' 5'-GTCACGAGTGACACCATCCT-3' 5'-ATGCGACGAGTCTGCTTCTA-3' 5'-TTCATAGTGCCTGGCTTACC-3' 5'-ATCTTGGCGCATGTATTGAC-3' 5'-TGCATTAGCAGCAACAACAT-3'

Nombres

Secuencias (SEC ID nº 76 a 139)

S/L6/-/9966

5'-TCTGCAGAACAGCAGAAGTG-3'

S/L6/-/10542

5'-CCTGTGCAGTTTGTCTGTCA-3'

S/L6/+/10677

5'-CCTTGTGGCAATGAAGTACA-3'

S/L6/+/10106

5'-ATGTCATTTGCACAGCAGAA-3'

S/L6/+/9571

5'-CTTCAATGGTTTGCCATGTT-3'

S/L7/-/11271

5'-TGCGAGCTGTCATGAGAATA-3'

S/L7/-/11801

5'-AACCGAGAGCAGTACCACAG-3'

S/L7/-/12383

5'-TTTGGCTGCTGTAGTCAATG-3'

S/L7/+/12640

5'-CTACGACAGATGTCCTGTGC-3'

S/L7/+/12088

5'-GAGCAGGCTGTAGCTAATGG-3'

S/L7/+111551

5'-TTAGGCTATTGTTGCTGCTG-3'

S/L8/-13160

5'-CAGACAACATGAAGCACCAC-3'

S/L8/-/13704

5'-CGCTGACGTGATATATGTGG-3'

S/L8/-14284

5'-TGCACAATGAAGGATACACC-3'

S/L8/+/14453

5'-ACATAGCTCGCGTCTCAGTT-3'

S/L8/+/13968

5'-GGCATTGTAGGCGTACTGAC-3'

S/L8/+/13401

5'-GTTTGCGGTGTAAGTGCAG-3'

S/L9/-15098

5'-TAGTGGCGGCTATTGACTTC-3'

S/L9/-15677

5'-CTAAACCTTGAGCCGCATAG-3'

S/L9/-16247

5'-CATGGTCATAGCAGCACTTG-3'

S/L9/+16323

5'-CCAGGTTGTGATGTCACTGAT-3'

S/L9/+15858

5'-CCTTACCCAGATCCATCAAG-3'

S/L9/+15288

5'-CGCAAACATAACACTTGCTG-3'

S/L10/-16914

5'-AGTGTTGGGTACAAGCCAGT-3'

S/L10/-17466

5'-GTTCCAAGGAACATGTCTGG-3'

S/L10/-18022

5'-AGGTGCCTGTGTAGGATGAA-3'

S/L10/+18245

5'-GGGCTGTCATGCAACTAGAG-3'

S/L10/+17663

5'-TCTTACACGCAATCCTGCTT-3'

S/L10/+17061

5'-TACCCATCTGCTCGCATAGT-3'

S/L11/-/18877

5'-GCAAGCAGAATTAACCCTCA-3'

S/L11/-19396

5'-AGCACCACCTAAATTGCATC-3'

S/L11/-20002

5'-TGGTCCCTTTGAAGGTGTTA-3'

S/L11/+20245

5'-TCGAACACATCGTTTATGGA-3'

S/L11/+/19611

5'-GAAGCACCTGTTTCCATCAT-3'

S/L11/+/19021

5'-ACGATGCTCAGCCATGTAGT-3'

SRAS/L1/F3/+800

5'-GAGGTGCAGTCACTCGCTAT-3'

SRAS/L1/F4/+1391

5'-CAGAGATTGGACCTGAGCAT-3'

SRAS/L1/F5/+1925

5'-CAGCAAACCACTCAATTCCT-3'

SRAS/L1/R3/-1674

5'-AAATGATGGCAACCTCTTCA-3'

SRAS/L1/R4/-1107

5'-CACGTGGTTGAATGACTTTG-3'

SRAS/L1/R5/-520

5'-ATTTCTGCAACCAGCTCAAC-3'

SRAS/L2/F3/+2664

5'-CGCATTGTCTCCTGGTTTAC-3'

SRAS/L2/F4/+3232

5'-GAGATTGAGCCAGAACCAGA-3'

SRAS/L2/F5/+3746

5'-ATGAGCAGGTTGTCATGGAT-3'

SRAS/L2/R3/-3579

5'-CTGCCTTAAGAAGCTGGATG-3'

SRAS/L2/R4/-2991

5'-TTTCTTCACCAGCATCATCA-3'

SRAS/L2/R5/-2529

5'-CACCGTTCTTGAGAACAACC-3'

SRAS/L3/F3/+4708

5'-TCTTTGGCTGGCTCTTACAG-3'

SRAS/L3/F4/+5305

5'-GCTGGTGATGCTGCTAACTT-3'

SRAS/L3/F5/+5822

5'-CCATCAAGCCTGTGTCGTAT-3'

SRAS/L3/R3/-5610

5'-CAGGTGGTGCAGACATCATA-3'

SRAS/L3/R4/-4988

5'-AACATCAGCACCATCCAAGT-3'

SRAS/L3/R5/-4437

5'-ATCGGACACCATAGTCAACG-3'

Las secuencias de los fragmentos L0 a L12 de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el n° 031589, corresponden respectivamente a las secuencias SEC ID nº 41 a SEC ID nº 54 en el listado de secuencias adjunto en anexo. Entre estas secuencias, sólo las que corresponden a los fragmentos L5 comprenden una diferencia nucleotídica con referencia a la secuencia correspondiente del aislado AY278741-Urbani. Esta mutación t/c en la posición 7919 desemboca una modificación de la secuencia en aminoácidos de la proteína correspondiente, codificada por el ORF 1a: en la posición 2552, una valina (codón gtt; AY278741) se cambia a alanina (codón gct) en la cepa de SRAS-CoV 031589. Sin embargo, no se identifica ninguna mutación con referencia a la secuencia correspondiente del aislado AY274119.3-Urbani. Los otros fragmentos no presentan diferencias con respecto a las secuencias correspondientes de los aislados Tor2 y Urbani.

EjempAo�2:�Produccion3 purificacion�de �proteinasN 3 S �recombinantes�de�Aa�cepa�de�SRAS-CoV procedente de�Aa�ettraccion�cataAogada�bajo�eA�numero�531589

La proteína entera N y dos fragmentos polipeptídicos de la proteína S de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el número 031589 se produjeron en E. coli, en forma de proteínas de fusión que comprende una etiqueta polihistidina N- o C-terminal. En los dos polipéptidos S, las secuencias hidrófobas N y Cterminales de la proteína S (péptido señal: posiciones 1 a 13 y hélice transmembranaria: posiciones 1196 a 1218) se eliminaron mientras que se preservaron la hélice 1 (posiciones 565 a 687) y las dos unidades de tipo “hélices enrolladas” (posiciones 895 a 980 y 1155 a 1186) de la proteína S. Estos dos polipéptidos están constituidos por: un fragmento largo (SL) que corresponde a las posiciones 14 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína S y un fragmento corto (SC) que corresponde a las posiciones 475 a 1193 de la secuencia en aminoácidos de la proteína

S.

1)�CAonacion de�Aos ADNc N.�SL �3�SC �en�eA vector�de�etpresion�pIVEX2.3 3 �pIVEX2.4

Los ADNc que corresponden a la proteína N y a los fragmentos SL y SC se amplificaron por PCR en condiciones estándares, con la ayuda del ADN polimerasa Platinium Pfx® (INVITROGEN). Los plásmidos SRAS-N y SRAS-S se usaron como plantillas y los oligonucleótidos siguientes como cebadores:

5'-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3' (N sentido, SEC ID nº 55)

5'-CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3' (N antisentido, SEC ID nº 56)

5'-CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3' (SC sentido, SEC ID nº 57)

5'-CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3' (SL sentido, SEC ID nº 58)

5'-CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3' (SC y SL antisentido, SEC ID nº 59).

Los cebadores sentido introducen un sitio NdeI (subrayado) mientras que les cebadores antisentido introducen un sitio XmaI o SmaI (subrayado). Los 3 productos de amplificación se purificaron sobre columna (kit QIAquick PCR Purification, QIAGEN) y se clonaron en un vector apropiado. El ADN plasmídico purificado de las 3 construcciones (kit QIAFilter Midi Plasmid, QIAGEN) se verificó mediante secuenciación y se digirió mediante las enzimas NdeI y XmaI. Los 3 fragmentos que corresponden a los ADNc N, SL y SC se purificaron sobre gel de agarosa y después se insertaron en los plásmidos pIVEX2.3MCS (etiqueta polihistidina C-terminal) y pIVEX2.4d (etiqueta polihistidina Nterminal) previamente digeridos por las mismas enzimas. Después de la verificación de las construcciones, los 6 vectores de expresión así obtenidos (pIV2.3N, pIV2.3SC, pIV2.3SL, pIV2.4N, pIV2.4SC también denominado pIV2.4SI, pIV2.4SL) se usaron después, por una parte para ensayar la expresión de las proteínas in vitro, y por otra parte para transformar la cepa bacteriana BL21(DE3)pDIA17 (NOVAGEN). Estas construcciones codifican unas proteínas cuya masa molecular esperada es la siguiente: pIV2.3N (47174 Da), pIV2.3SC (82897 Da), pIV2.3SL (132056 Da), pIV2.4N (48996 Da), pIV2.4S, (81076 Da) y pIV2.4SL(133877 Da). Unas bacterias transformadas por pIV2.3N se depositaron en la CNCM el 23 de octubre de 2003, bajo el número I-3117, y unas bacterias transformadas por pIV2.4S1 se depositaron a la CNCM el 23 de octubre de 2003, bajo el número I-3118.

2) AnaAisis�de Aa�etpresion�de �Aas�proteinas�recombinantes in vitro e in vivo

Se ha ensayado la expresión de proteínas recombinantes a partir de los 6 vectores recombinantes, en una primera etapa, en un sistema in vitro (RTS100, Roche). Las proteínas producidas in vitro, después de una incubación de los vectores recombinantes pIVEX, 4h a 30°C, en el sistema RTS100, se analizaron mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo anti-(his)6 acoplado a la peroxidasa. El resultado de la expresión in vitro (figura 1) muestra que sólo la proteína N está expresada en cantidades importantes, sea cual sea la posición, N- o C-terminal, de la etiqueta polihistidina. En una segunda etapa, la expresión de las proteínas N y S se ensayó in vivo a 30°C en un medio LB, en presencia o ausencia de inductor (IPTG 1 mM). La proteína N está muy bien producida en este sistema bacteriano (figura 2) y se encuentra principalmente en una fracción soluble después de la lisis de las bacterias. Sin embargo, la versión larga de S (SL) está muy poco producida y completamente insoluble (figura 3). La versión corta (SC) presenta también una muy baja solubilidad, pero un índice de expresión mucho más elevado que el de la versión larga. Por otra parte, la construcción SC fusionada con una etiqueta polihistidina en posición Cterminal presenta un tamaño más bajo de lo que se espera. Un experimento de inmunodetección con un anticuerpo anti-polihistidina ha mostrado que esta construcción era incompleta. En conclusión, las dos construcciones pIV2.3N y pIV2.4SI que expresan respectivamente la proteína N entera fusionada con la etiqueta polihistidina en C-terminal y la proteína S corta fusionada con la etiqueta polihistidina en N-terminal, se seleccionaron para producir las dos proteínas en gran cantidad a fin de purificarlas. Los plásmidos pIV2.3N y pIV2.4SI, se han depositado respectivamente bajo el n° I-3117 y I-3118 en la CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS 15, el 23 de octubre de 2003.

3) AnaAisis�de Aa�actividad�antigenica�de�Aas�proteinas�recombinantes

Se ha ensayado la actividad antigénica de las proteínas N, SL y SC mediante transferencia western, con la ayuda de dos muestras de suero, que provienen de un mismo paciente infectado por el SRAS-CoV, extraídas 8 días (M12) y 29 días (M13) después del principio de los síntomas del SRAS. El protocolo experimental es como se describe en el ejemplo 3. Los resultados ilustrados por la figura 4 muestran (i) la seroconversión del paciente, y (ii) que la proteína N posee una mayor reactividad antigénica que la proteína S corta.

4)�Purificacion�de �Aa�proteina�N�a�partir�de�pIV2.3N

Se han realizado varios experimentos de purificación de la proteína N, producida a partir del vector pIV2.3N, según el protocolo siguiente. Las bacterias BL21(DE3)pDIA17, transformadas por el vector de expresión pIV2.3N, se cultivaron a 30°C en 1 litro de medio de cultivo que contiene 0,1 mg/ml de ampicilina, e inducidas por 1 mM de IPTG cuando se alcanza la densidad celular, equivalente a A600 = 0,8 (aproximadamente 3 horas). Después de 2 horas de cultivo en presencia de inductor, las células se recuperaron mediante centrifugación (10 min. a 5000 rpm), se resuspendieron en el tampón de lisis (50 mM NaH2PO4, NaCl 0,3 M, 20 mM imidazol, pH 8 que contiene la mezcla de inhibidores de proteasas Complete®, Roche), y se lisaron mediante la prensa de French (12000 psi). Después de la centrifugación del lisado bacteriano (15 min. a 12000 rpm), el sobrenadante (50 ml) se depositó con un caudal de 1ml/min. sobre una columna (15 ml) de quelación metálica (Ni-NTA superflow, Qiagen), equilibrada por el tampón de lisis. Después del lavado de la columna por 200 ml de tampón de lisis, la proteína N se eluyó mediante un gradiente de imidazol (20 - 250 mM) en 10 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la proteína N se reunieron y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y después coloración con azul de Coomassie. Los resultados ilustrados por la figura 5 muestran que el protocolo empleado permite purificar la proteína N con una homogeneidad muy satisfactoria (95%) y un rendimiento medio de 15 mg de proteína por litro de cultivo.

5)�Purificacion�de �Aa�proteina�SC �a�partir�de�pIV2.4SC �RpIV2.4S1)

El protocolo seguido para purificar la proteína S corta es muy diferente de aquel descrito anteriormente, ya que la proteína está fuertemente agregada en el sistema bacteriano (cuerpo de inclusión). Las bacterias BL21(DE3)pDIA17, transformadas por el vector de expresión pIV2.4S1 se cultivaron a 30°C en 1 litro de medio de cultivo que contiene 0,1 mg/ml de ampicilina, e inducidas mediante 1 mM de IPTG cuando se alcanza la densidad celular, equivalente a A600 = 0,8, (aproximadmente 3 horas). Después de 2 horas de cultivo en presencia de inductor, las células se recuperaron mediante centrifugación (10 min. a 5000 rpm), se resuspendieron en el tampón de lisis (0,1 M Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5), y se lisaron mediante la prensa de French (1200 psi). Después de la centrifugación del lisado bacteriano (15 min. a 12000 rpm), el residuo se resuspendió en 25 ml de tampón de lisis que contiene 2% de Triton X100 y 10 mM :-mercaptoetanol, y después se centrifugó durante 20 min. a 12000 rpm. El residuo se resuspendió en un tampón Tris-HCl 10 mM que contiene 7 M de urea, y se agitó suavemente durante 30 min. a temperatura ambiente. Este último lavado de los cuerpos de inclusión con 7 M de urea es necesario para eliminar la mayoría de las proteínas membranarias de E. coli que cosedimentan con la proteína SC agregada. Después de una última centrifugación durante 20 min. a 12000 rpm, el residuo final se resuspende en el tampón Tris-HCl 10 mM. El análisis electroforético de esta preparación (digura 6) muestra que la proteína S corta puede ser purificada con una homogeneidad satisfactoria (aproximadamente el 90%) a partir de los cuerpos de inclusión (extracto insoluble).

EjempAo�3:�Inmunodominancia �de�Aa�proteinaN

La reactividad de los anticuerpos presentes en el suero de los pacientes que padecen neumopatía atípica causada por el coronavirus asociado al SRAS (SRAS-CoV), frente a diferentes proteínas de este virus, se analizó mediante transferencia western en las condiciones descritas a continuación.

1)�MateriaA

a) lisado de células infectadas por el SRAS-CoV

Células Vero E6 (2x106) se infectaron por el SRAS-CoV (aislado catalogado bajo el número FFM/MA104) a una multiplicidad de infección (M.O.I.) de 10-1 o 10-2 y después se incubaron en un medio DMEM que contiene el 2% de SVF, a 35°C en una atmósfera que contiene 5% de CO2. 48 horas más tarde, la alfombra celular se lavó con PBS y después se lisó con 500 !l de tampón de depósito preparado según Laemmli, y que contiene 1-mercaptoetanol. Las muestras se hirvieron después durante 10 minutos y después se sonificaron 3 veces durante 20 segundos.

b) anticuerpos

b1) suero de paciente que padece neumopatía atípica

El suero referenciado en el Centre National de Référence des virus influenzae (Région-Nord) bajo el n° 20033168 es el de un paciente francés que padece neumopatía atípica causada por el SRAS-CoV extraído 38 días después del principio de los síntomas; el diagnóstico de infección por el SRAS-CoV se realizó mediante par RT-PCR anidada y PCR cuantitativa.

b2) sueros policlonales de conejo monoespecíficos dirigidos contra la proteína N o la proteína S

Los sueros son los producidos a partir de las proteínas recombinantes N y SC (ejemplo 2), según el protocolo de inmunización descrito en el ejemplo 4; se trata del suero de conejo P13097 (suero anti-N) y del suero de conejo P11135 (suero anti-S).

2)�Metodo

Se separaron 20 !l de lisado de células infectadas por el SRAS-CoV con M.O.I. de 10-1 y 10-2 y, a título de control, 20 !l de un lisado de células no infectadas (mock) sobre un gel SDS al 10% de poliacrilamida y después se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Después del bloqueo en una solución de PBS/leche 5%/Tween 0,1% y lavado en PBS/ Tween 0,1%, esta membrana se hibridó durante una noche a 4°C con: (i) el inmunosuero n° 20033168 diluido al 1/300, 1/1000 y 1/3000 en el tampón PBS/BSA 1%/Tween 0,1%, (ii) el suero de conejo P13097 (suero anti-N) diluido al 1/50000 en el mismo tampón y (iii) el suero de conejo P11135 (suero anti-S) diluido al 1/10000 en el mismo tampón. Después del lavado en PBS/Tween, se realizó una hibridación secundaria con la ayuda de anticuerpos policlonales de carnero dirigidos contra las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas G humanas y acoplados a la peroxidasa (NA933V, Amersham), o bien de anticuerpos policlonales de asno dirigidos contra las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas G de conejo y acoplados a la peroxidasa (NA934V, Amersham). Los anticuerpos fijados se revelaron con la ayuda del kit ECL+ (Amersham) y de películas de autorradiografía Hyperfilm MP (Amersham). Una escala de masa molecular (kDa) se muestra en la figura.

3)�ResuAtados

La figura 7 muestra que tres polipéptidos de masa molécula aparente 35, 55 y 200 kDa son detectados específicamente en los extractos de células infectadas por el SRAS-CoV.

A fin de identificar estos polipéptidos, se realizaron otras dos inmunohuellas (figura 8) sobre las mismas muestras y en las mismas condiciones con dos anticuerpos policlonales de conejo específicos de la nucleoproteína N (conejo P13097, figura 8A) y de la proteína de espícula S (conejo P11135, figura 8B). Este experimento muestra que el polipéptido de 200 kDa corresponde a la glicoproteína de espícula S del SRAS-CoV, que el polipéptido de 55 kDa corresponde a la nucleoproteína N mientras que el polipéptido de 35 kDa representa posiblemente una forma truncada o degradada de la N.

Los datos presentados en la figura 7 muestran por lo tanto que el suero 20033168 reacciona fuertemente con la N, y mucho más débilmente con la S del SRAS-CoV, ya que los polipéptidos de 35 y 55 kDa se revelan en forma de bandas intensas para diluciones de 1/300, 1/1000 y 1/3000 del inmunosuero, mientras que el polipéptido de 200 kDa es débilmente revelado para una dilución de 1/300. Se puede anotar también que ningún otro polipéptido del SRAS-CoV es detectado para diluciones superiores al 1/300 del suero 20033168.

Este experimento indica que la respuesta en anticuerpo específico de la N del SRAS-CoV domina las respuestas en anticuerpos específicos de los otros polipéptidos del SRAS-CoV y en particular la respuesta en anticuerpos dirigida contra la glicoproteína S. Indica una inmunodominancia de la nucleoproteína N durante infecciones humanas por el SRAS-CoV.

EjempAo�4:�Preparacion�de anticuerpos�poAicAonaAes�monoespecificos�dirigidos�contra�Aas�proteinas�N3 �S�deA coronavirus�asociado�aA�SRAS�RSRAS-CoV)

1)�MateriaA�3�metodo

Se inmunizaron tres conejos (P13097, P13081, P13031) con el polipéptido recombinante purificado que corresponde a la totalidad de la nucleoproteína (N), preparado según el protocolo descrito en el ejemplo 2. Después de una primera inyección de 0,35 mg por conejo de proteína emulsionada en adyuvante completo de Freund (vía intradérmica), los animales recibieron 3 inyecciones de recuerdo con 3 y después con 4 semanas de intervalo, de 0,35 mg de proteína recombinante emulsionada en adyuvante completo de Freund.

Se inmunizaron tres conejos (P11135, P13042, P14001) con el polipéptido recombinante que corresponde al fragmento corto de la proteína S (SC), producida como se describe en el ejemplo 2. Como este polipéptido se encuentra principalmente en forma de cuerpo de inclusión en el citoplasma bacteriano, los animales han recibido 4 inyecciones intradérmicas con 3-4 semanas de intervalo de una preparación de cuerpo de inclusión que corresponde a 0,5 mg de proteína recombinante emulsionada en adyuvante incompleto de Freund. Las 3 primeras inyecciones se realizaron con una preparación de cuerpos de inclusión, preparados según el protocolo descrito en el ejemplo 2, mientras que la cuarta inyección se realizó con una preparación de cuerpos de inclusión, preparados según el protocolo descrito en el ejemplo 2, y después purificados sobre gradiente de sacarosa y lavados en 2% de Tritón X100.

Para cada conejo, se ha preparado un suero preinmune (p.i.) antes de la primera inmunización y un inmunosuero (I.S.) 5 semanas después de la cuarta inmunización.

En una primera etapa, se analizó la reactividad de los sueros mediante ensayo ELISA frente a preparaciones de proteínas recombinantes parecidas a las utilizadas para las inmunizaciones; los ensayos ELISA se realizaron según el protocolo y con los agentes reactivos descritos en el ejemplo 6.

En una segunda etapa, se analizó la reactividad de los sueros realizando una inmunohuella (Western-blot) de un lisado de células infectadas por el SRAS-CoV, siguiendo el protocolo tal como se ha descrito en el ejemplo 3.

2)�ResuAtados

Los ensayos ELISA (figura 9) demuestran que las preparaciones de proteína N recombinante y de cuerpos de inclusión del fragmento corto de la proteína S (SC) son inmunógenos en el animal y que el título de los sueros inmunes es elevado (más del 1/25000).

La inmunohuella (figura 8) muestra que el suero inmune del conejo P13097 reconoce dos polipéptidos presentes en los lisados de células infectadas por el SRAS-CoV: un polipéptido cuya masa molecular aparente (50-55 kDa según los experimentos) es compatible con la de la nucleoproteína N (422 residuos, masa molecular predicha de 46 kDa) y un polipéptido de 35 kDa, que representa probablemente una forma truncada o degradada de la N.

Este experimento muestra también que el suero de conejo P11135 reconoce principalmente un polipéptido cuya masa molecula aparente (180-220 kDa según los experimentos) es compatible con una forma glicosilada de la S (1255 residuos, cadena polipeptídica no glicosilada de 139 kDa), así como unos polipéptidos más ligeros, que representan probablemente unas formas truncadas y/o glicosiladas de la S.

En conclusión, el conjunto de estos experimentos demuestra que unos polipéptidos recombinantes expresados en E. coli y que corresponden a las proteínas N y S del SRAS-CoV permiten inducir en el animal unos anticuerpos policlonales capaces de reconocer las formas nativas de estas proteínas.

EjempAo�5:�Preparacion�de�anticuerpos�poAicAonaAes�monoespecificos�dirigidos�contra�Aas�proteinasM 3�E�deA coronavirus�asociado�aA�SRAS�RSRAS-CoV)

1) AnaAisis�de Aa�estructura de�Aas�proteinasM 3 E

a) Proteína E

La estructura de la proteína E del SRAS-CoV (76 aminoácidos) se analizó in silico, con la ayuda de diferentes programas como signalP v1.1, NetNGlyc 1.0, THMM 1.0 y 2.0 (Krogh y otros., 2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580) o también TOPPRED (von Heijne, 1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494). El análisis muestra que este polipéptido no glicosilado es una proteína membranaria de tipo 1, que contiene una sola hélice transmembranaria (aa 12-34 según THMM), y cuya parte más grande del dominio hidrófilo (42 residuos) está localizada en el extremo C-terminal y posiblemente en el interior de la partícula viral (endodominio). Se puede anotar una inversión en la topología predicha por las versiones 1.0 (N-ter es externo) y 2.0 (N-ter es interno) del programa THMM, pero que otros algoritmos, en particular TOPPRED y THUMBUP (Zhou y Zhou, 2003, Protein Science 12:1547-1555) confirman una localización externa del extremo N-terminal de E.

b) Proteína M

Un análisis similar realizado sobre la proteína M del SRAS-CoV (221 aminoácidos) muestra que este polipéptido no posee péptido señal (según el programa signalP v1.1) sino tres dominios transmembranarios (residuos 15-37, 50-72, 77-99 según THMM2.0) y un gran dominio hidrófilo (aa 100-221) localizado en el interior de la partícula viral (endodominio). Esta posiblemente glicosilada sobre la asparagina en la posición 4 (según NetNGlyc 1.0).

Así, de acuerdo con los datos experimentales conocidos para los otros coronavirus, es remarcable que las dos proteínas M y E presentan unos endodominios que corresponden a la mayor parte de sus polipéptidos y unos ectodominios de tamaño muy pequeño.

-

el ectodominio de E corresponde posiblemente a los residuos 1 a 11 ó 1 a 12 de la proteína: MYSFVSEETGT (L), SEC ID nº 70. En efecto, la probabilidad asociada a la localización transmembranaria del residuo 12 es intermedia (0,56 según THMM 2.0).

-

el ectodominio de M corresponde posiblemente a los residuos 2 a 14 de la proteína: ADNGTITVEELKQ, SEC ID nº

69. En efecto, la metionina N-teminal de M está, muy probablemente, escindida del polipéptido maduro, ya que el residuo en la posición 2 es una alanina (Varshavsky, 1996, 93:12142-12149).

Por otra parte, el análisis de hidrofobicidad (Kyte & Doolittle, Hopp & Woods) de la proteína E demuestra que el extremo C-terminal del endodominio de E es hidrófilo y por lo tanto probablemente expuesto a la superficie de este dominio. Así, un péptido sintético que corresponde a este extremo es un buen candidato inmunógeno para inducir en el animal unos anticuerpos dirigidos contra el endodominio de E. En consecuencia, se ha sintetizado un péptido que corresponde a los 24 residuos C-terminales de E.

2)�Preparacion �de �anticuerpos�dirigidos�contra�eA�ectodominio�de �Aas�proteinas�M3 E 3 eA�endodominio�de �Aa proteinaE

Los péptidos M2-14 (ADNGTITVEELKQ, SEC ID nº 69), E1-12 (MYSFVSEETGTL, SEC ID nº 70) y E53-76 (KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV, SEC ID nº 71) se sintetizaron mediante Neosystem. Se han acoplado a la KLH (Keylzole Limpet Hemocyanin) con la ayuda del MBS (m-maleimido-benzoil-N-hidroxisuccinimida éster) a través de una cisteína añadida durante la síntesis, o bien en N-terminal del péptido (caso de E53-76), o bien en C-terminal (caso de M2-14 y E1-12).

Se inmunizaron dos conejos con cada uno de los conjugados, siguiendo el protocolo de inmunización siguiente: después de una primera inyección de 0,5 mg de péptido acoplado a la KLH y emulsionado en adyuvante completo de Freund (vía intradérmica), los animales reciben 2 a 4 inyecciones de recuerdo con 3 ó 4 semanas de intervalo de 0,25 mg de péptido acoplado a la KLH y emulsionado en adyuvante incompleto de Freund.

Para cada conejo, se ha preparado un suero preinmune (p.i.) antes de la primera inmunización, y se prepara un inmunosuero (I.S.) 3 a 5 semanas después de la inyección de recuerdo.

La reactividad de los sueros se analizó mediante transferencia western con la ayuda de extractos de células infectadas por el SRAS-CoV (figura 43B), o con la ayuda de extractos de células infectadas por un virus recombinante de la vacuna que expresa la proteína E (VV-TG-E, figura 43A) o M (VV-TN-M, figura 43C) del aislado 031589 del SRAS-CoV.

Los inmunosueros de los conejos 22234 y 22240, inmunizados por el conjugado KLH-E53-76, reconocen un polipéptido de aproximadamente 9 a 10kD, que está presente en los extractos de células infectadas por el SRAS-CoV pero ausente en los extractos de células no infectadas (figura 43B). La masa aparente de este polipéptido es compatible con la masa predicha de la proteína E, que es de 8,4 kD. De manera similar, el inmunosuero del conejo 20047, inmunizado por el conjugado KLH-E1-12, reconoce un polipéptido presente en los extractos de células infectadas por el virus VV-TG-E, cuya masa molar aparente es compatible con la de la proteína E (figura 43A).

El inmunosuero de los conejos 20013 y 20080, inmunizados por el conjugado KLH-M2-14, reconoce un polipéptido presente en los extractos de células infectadas por el virus VV-TN-M (figura 43C), cuya masa molar aparente (18 kD aproximadamente) es compatible con la de la glicoproteína M, que es de 25,1 kD y presenta un punto isoeléctrico elevado (9,1 para el polipéptido desnudo).

Estos resultados demuestran que los péptidos E1-12 y E53-76 por un lado, y el péptido M2-14 por otro lado, permiten inducir en el animal unos anticuerpos policlonales capaces de reconocer las formas nativas de las proteínas E y M respectivamente del SRAS-CoV.

EjempAo�6:�AnaAisis�de�Aa�reactividad�en�ELISA�de�Aa�proteinaN recombinante.�frente�a�sueros�de�pacientes uue�padecen�SRAS

1)�MateriaA

El antígeno utilizado para preparar las fases sólidas es la nucleoproteína N recombinante purificada preparada según el protocolo descrito en el ejemplo 2.

Los sueros a ensayar (Tabla IV) se seleccionaron en base a unos resultados de análisis de su reactividad por inmunifluorescencia (título IF-SRAS), frente a células infectadas por el SRAS-CoV.

TabAa�IV:�Sueros�ensa3ados�en �ELISA

Referencia

N° de suero Tipo de suero Fecha del suero*** Título IF-SRAS

3050

A Control na* nt**

3048

B Control na nt

033168

D Paciente 1- SRAS 27/04/03 (D38) 320

033397

E Paciente-1 SRAS 11/05/03 (D52) 320

032632

F Paciente -2 SRAS 21/03/03 (D17) 2500

032791

G Paciente -3 SRAS 04/04/03 (D3) <40

033258

H Paciente -3 SRAS 28/04/03 (D27) 160

*na: no-aplicable. **nt: no-ensayado. *** los datos indicados corresponden al número de días después del principio de los síntomas de SRAS.

2)�Metodo

La proteína N (100 !l) diluida a diferentes concentraciones en tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6 (1, 2 ó 4 !g/ml) se distribuye en los pocillos de placas ELISA, después se incuban las placas durante una noche a temperatura del laboratorio. Las placas se lavan con tampón PBS-Tween, se saturan con tampón PBS-leche desnatada-sacarosa (5%). Se añaden los sueros a ensayar (100 !l) previamente diluidos (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 y 1/3200), después se incuban las placas durante 1h a 37° C. Después de 3 lavados, se añade el conjugado anti-IgG humano marcado con peroxidasa (referencia 209-035-098, JACKSON) diluido al 1/18000, y se incuban las placas durante 1h a 37°C. Después de 4 lavados, se añade el cromógeno (TMB) y el sustrato (H2O2), y se incuban las placas durante 30 min. a temperatura ambiente, protegido de la luz. La reacción se detiene después y se mide la absorbencia a 450 nm con la ayuda de un lector automático.

3)�ResuAtados

Los ensayos ELISA (figura 10) demuestran que la preparación de proteína N recombinante está reconocida específicamente por los anticuerpos de sueros de pacientes que padecen SRAS extraídos en fase tardía de la infección (� 17 días después del principio de los síntomas), mientras que no está reconocida de manera significativa por los anticuerpos de un suero de paciente extraído en fase precoz de la infección (3 días después del principio de los síntomas), ni por sueros controles de sujetos que no padecen SRAS.

EjempAo�7:�Ensa3os�ELISA reaAioados�para�una�deteccion�mu3 especifica 3 sensibAe�de�una�infeccion�por�eA coronavirus�asociado�aA�SRAS.a �partir�de�sueros�de �pacientes

1)�Ensa3o�ELISA �Ign�indirecto

a) Reactivos

Preparación de las placas

Las placas son sensibilizadas por una solución de proteína N a 2 !g/ml en un tampón PBS 10mM pH 7,2, rojo de fenol a 0,25 ml/l. Se depositan 100 !l de solución en los pocillos y se dejan incubar a temperatura ambiente durante una noche. La saturación se realiza mediante un prelavado en tampón PBS 10 mM/tween 0,1%, seguido de un lavado con una solución de saturación PBS, 25% leche/sacarosa.

Diluyente de sueros

Tampón TRIS 0,48 g/l, PBS 10 mM, EDTA 3,7 g/l, leche 15% v/v, pH 6,7

Diluyente conjugado

Tampón citrato (15 g/l), tween 0,5%, suero bovino 25%, NaCl 12%, leche desnatada 6% v/v PH 6,5

Conjugado

Conjugado anti-IgG humano 50X, comercializado por Bio-Rad: kit Platelia H. pylori ref. 72778

Otras Soluciones:

Solución de lavado R2, solución de revelado al TMB R8 diluyente, R9 cromógeno, R10 solución de detención: agentes reactivos comercializados por Bio-Rad (ej.: kit Platelia pylori, ref. 72778)

b) Modo de realización Diluir los sueros al 1/200 en el diluyente de las muestras Distribuir 100 !l/pocillo Incubación durante 1h a 37°C 3 lavados en solución de LAVADO R2 10x previamente diluido 10 veces en agua desmineralizada (es decir, solución

de lavado 1X)

Distribuir 100 !L de conjugado (conjugado 50x para diluir extemporáneamente en el diluyente conjugado proporcionado) Incubación durante 1h a 37°C 4 lavados en solución de lavado 1X Distribuir 200 !l/pocillo de solución de revelado (a diluir extemporáneamente, ej.:1 ml de R9 en 10ml de R8) Incubación durante 30 min. a temperatura ambiente en la oscuridad Detener la reacción con 100 !l/pocillo de R10 LECTURA a 450/620nm Los resultados pueden ser interpretados tomando un suero LIMITE que da una respuesta más allá de la cual los

sueros ensayados se considerarán como positivos. Este suero se selecciona y se diluye a fin de dar una señal significativamente superior al ruido de fondo.

2)�Ensa3o�ELISA �DOLLE�EPiTOPO

a) Agentes reactivos

Preparación de las placas

Las placas son sensibilizadas mediante una solución de proteína N a 1 !g/ml en un tampón PBS 10 mM pH 7,2, rojo de fenol a 0,25 ml/l. Se depositan 100 !l de solución en los pocillos y se dejan incubar a temperatura ambiente durante una noche. La saturación se lleva a cabo mediante un prelavado en tampón PBS 10 mM/0,1% tween seguido de un lavado con una solución de saturación PBS 10 mM, leche 25% (V/V)

Diluyente de sueros y conjugado

Tampón TRIS salino 50 mM pH 8, leche 2%

Conjugado

Se trata de la proteína N recombinante purificada, acoplada a la peroxidasa según el protocolo de Nakane (Nakane

P.K. y Kawaoi A; (1974): Peroxydase-labeled antibody, a new method of conjugation. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry Vol. 22, N) 23, p. 1084-1091), en unas relaciones molares respectivas 1/2. Este conjugado ProtN POD se utiliza a una concentración de 2 !g/ml en un diluyente suero/conjugado.

Otras soluciones:

Solución de lavado R2, soluciones de revelado con TMB R8, diluyente, R9 cromógeno, R10 solución de detención: agentes reactivos comercializados por Bio-Rad (ej. kit platelia pylori ref. 72778).

b) Modo de realización

1ª etapa en placa de "predilución"

•

Diluir cada suero al 1/5 en la placa de predilución (48 !l de diluyente + 12 !l de suero).

•

Después de diluir el conjunto de los sueros, distribuir 60 !l de conjugado

•

Llegado el caso, se deja incubar la mezcla suero + conjugado.

2ª etapa en placa de "reacción"

•

Transferir 100 !l de mezlca/pocillo en la placa de reacción

•

Incubación durante 1h 37°C

•

5 lavados en dislución de LAVADO R2 10x previamente diluida 10 veces con agua desmineralizada (- solución de lavado 1x)

•

Distribuir 200 !l/pocillo de solución de revelado (a diluir extemporáneamente, ej.:1 ml de R9 en 10 ml de R8)

•

Incubación durante 30 min. a temperatura ambiente protegido de la luz

•

Detener la reacción con 100 !l/pocillo de R10

•

LECTURA a 450/620nm

Como para el ensayo ELISA indirecto, los resultados pueden ser interpretados utilizando un suero de "valor límite". Cualquier suero que tiene una respuesta superior al suero de valor límite se considerará como positivo.

2)�ResuAtados

Los sueros de pacientes clasificados como posible caso de SRAS del hospital francés de Hanoi, Vietnam o en relación con el hospital francés de Hanoi (JYK) se han analizado utilizando el ensayo IgG-N indirecto y el ensayo N doble epítopo.

Los resultados del ensayo IgG-N indirecto (figuras 14 y 15) y N doble epítopo (figuras 16 y 17) muestran una excelente correlación entre sí, así como con un ensayo ELISA indirecto que compara la reactividad de los sueros frente a un lisado de células VeroE6 no infectadas o infectadas por el SRAS-CoV (ELISA-lisado SRAS-CoV; véase la tabla V a continuación). Todos los sueros extraídos 12 días o más después del principio de los síntomas se encontraron positivos, incluyendo en pacientes para los cuales la infección por el virus del SRAS-CoV no había podido ser documentada mediante análisis de extracción respiratoria por RT-PCR, probablemente debido a una extracción demasiado tardía durante la infección (� D12). En el caso del paciente TTH para el cual se realizó una extracción nasal a D7 fue encontrado negativo mediante RT-PCR, la calidad de la extracción podría ser la causa.

Ciertos sueros fueron encontrados negativos mientras que la presencia de SRAS-CoV se detectó mediante RT-PCR. Se trata en todos los casos de sueros precoces extraídos menos de 10 días después del principio de los síntomas (ej.: suero nº 032637). En el caso de un paciente PTTH (suero nº 032673), sólo se evocó una suspicacia de SRAS en el momento en el que las extracciones se realizaron.

En coclusión, los ensayos serológicos IgG-N indirecto y N-doble epítopo permiten documentar la infección por el SRAS-CoV en todos los pacientes para sueros extraídos 12 días o más después de la infección.

TabAa�V:�resuAtados�de�Aos�ensa3os�ELISA

N°�Pvt

Paciente Dia PCR-SRAS �R1) ELISA �Aisado SRAS-CoV�R2) Ign-N�R2s�serie) 2Xepitopo�R2� serie)

033168

JYK 38 POS +++ >5000 NT

033597

JYK 74 POS NT ' 5000 NT

032552

VTT 8 NEG-D3 y D8 y D12 NEG <200 <5

032544

CTP 16 NEG D16 y D20 ++ >5000 >>20

032546

CJF 15 NEG D15 y D19 ++ >5000 >>20

032548

PTL 17 NEG D17 y D21 ++ >5000 >>20

032550

NTH 17 NEG-D17 y D21 ++ >5000 >>20

032553

VTT 8 NEG-D3 y D8 y D12 NEG <200 <5

032554

NTBV 4 POS NEG <200 <5

N°�Pvt

Paciente Dia PCR-SRAS �R1) ELISA �Aisado SRAS-CoV�R2) Ign-N�R2s�serie) 2Xepitopo�R2s serie)

032555

NTBV 4 POS NEG <200

032564

NTP 15 POS ++ >5000 >>20

032629

NVH 4 POS NEG <200 <5

032631

BTTX 9 POS NEG <200 <5

032635

NHH 4 POS NEG <200 <5

032637

NHB 10 POS NEG <200 <5

032642

BTTX 9 POS NEG <200 <5

032643

LTDH 1 POS NEG <200 <5

032644

NTBV 4 POS NEG <200 <5

032646

TTH 12 NEG D7 y D 12 y D16 ++ >5000 >>20

032647

DTH 17 NEG D17 y D21 ++ >5000 >>20

032648

NNT 15 NEG D15 y D19 ++ >5000 >>20

032649

PTH 17 NEG D17 y D21 ++ >5000 >>20

032672

LVV 16 NEG D16 y D20 + >5000 >>20

032673

PTTH NA NEG NEG <200 <5

032674

PNB 17 NEG D17 y D21 ++ >5000 >>20

032682

VTH 12 NEG D12 y D16 ++ >5000 >>20

032683

DTV 17 NEG D17 y D21 + >1000 >>20

Notas: (1): Los análisis por RT-PCR se realizaron por RT-PCR anidada BNI, LC Artus y LC-N sobre unos hisopos nasales o de la faringe; POS significa que al menos una extracción se encontró positiva en este paciente. (2): La reactividad de los sueros en el ensayo ELISA que utiliza un lisado de células infectadas por el SRAS-CoV se clasificó en muy altamente reactivo (+++), altamente activo (++), reactivo (+) y negativo en función del valor DO obtenido en las soluciones ensayadas.

EjempAo�8:�Detecion�deA�coronavirus�asociado�aA�SRAS RSRAS-CoV)�por�RT-PCR

1)�DesarroAAo de�condiciones�de �RT-PCR en�tiempo�reaA�con�Aa �a3uda�de �cebadores�especificos�deA�gen�de �Aa proteina�de �nucAeocapside�-�ensa3o �LLight�C3cAer�N�

a) concepción de los cebadores y de las sondas

La concepción de los cebadores y de las sondas se realizó a partir de la secuencia del genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el número 031589, con la ayuda del programa "Light Cycler Probe Design (Roche)". Así, se seleccionaron las dos series de cebadores y de sondas siguientes:

-�serie �1�RSEC ID�n°�65.�61.�64.�65):

-

cebador sentido: N/+/28507: 5'-GGC ATC GTA TGG GTT G-3' [28507-28522]

-

cebador antisentido: N/-/28774: 5'-CAG TTT CAC CAC CTC C-3' [28774-28759]

-

sonda 1: 5'-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-fluoresceína 3' [28561-28586]

-

sonda 2: 5' Red705 -GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-fosfato [28588-28608]

-�serie2 �RSEC ID�n°�62.�63.�66.�67)

-

cebador sentido: N/+/28375: 5'-GGC TAC TAC CGA AGA G-3' [28375-28390]

-

cebador antisentido: N/-/28702: 5'-AAT TAC CGC GAC TAC G-3' [28702-28687]

-

sonda 1: SRAS/N/FL: 5'-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC-fluoresceína 3' [28541-28563]

-

sonda 2: SRAS/N/LC705: 5' Red705 -CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C-fosfato 3' [28565-28589]

b) análisis de la eficacia de los dos pares de cebadores

A fin de ensayar la eficacia respectiva de los dos pares de cebadores, se realizó una amplificación por RT-PCR sobre un ARN sintético que corresponde a los nucleótidos 28054-29430 del genoma de la cepa de SRAS-CoV procedente de la extracción catalogada bajo el número 031589 y que contiene la secuencia del gen N.

De manera más precisa:

Este ARN sintético se preparó mediante transcripción in vitro con la ayuda del ARN polimerasa del fago T7, de una plantilla de ADN obtenida por linearización del plásmido SRAS-N con la enzima Bam H1. Después de la eliminación de la plantilla de ADN por digestión con la ayuda de DNAsa 1, los ARN sintéticos se purifican mediante una extracción con fenol-cloroformo seguida de dos precipitaciones sucesivas en acetato de amonio e isopropanol. Se cuantifican entonces mediante la medición de la absorbencia a 260 nm y se controla su calidad mediante la relación de las absorbencias a 260 y 280 nm así como mediante una electroforesis en gel de agarosa. Así, la concentración de la preparación de ARN sintético utilizada para estos estudios es de 1,6 mg/ml, lo que corresponde a 2,1.1015 copias/ml de ARN.

Cantidades decrecientes de ARN sintético se amplificaron por RT-PCR con la ayuda del kit "Superscript™ One-Step RT-PCR with Platinum® Taq" y los pares de cebadores n° 1 (N/+/28507, N/-/28774) (figura 1A) y n° 2 (N/+/28375, N//28702) (figura 1B), siguiendo las indicaciones del proveedor. Las condiciones de amplificación utilizadas son las siguientes: el ADNc se sintetizó mediante incubación durante 30 min. a 45 °C, 15 min. a 55°C y después 2 min. a 94 °C, después se amplificó mediante 5 ciclos que comprenden: una etapa de desnaturalización a 94°C durante 15 s, una etapa de hibridación a 45°C durante 30 s, y después una etapa de elongación a 72°C durante 30 s, seguidas de 35 ciclos que comprenden: una etapa de desnaturalización a 94°C durante 15 s, una etapa de hibridación a 55°C durante 30 s, y después una etapa de elongación a 72°C durante 30 s, con 2 s de elongación suplementaria en cada ciclo, y de una etapa final de elongación a 72°C durante 5 min. Los productos de amplificación obtenidos se mantuvieron después a 10°C.

Los resultados presentados en la figura 11 muestran que el par de cebadores n° 2 (N/+/28375, N/-/28702) permite detectar hasta 10 copias de ARN (banda de baja intensidad) o 102 copias (banda de buena intensidad) contra 104 copias para el par de cebadores n° 1 (N/+/28507, N/-/28774). Los amplicones son respectivamente de 268 pb (par 1) y de 328 pb (par 2).

c) desarrollo de la RT-PCR en tiempo real

Se desarrolló una RT-PCR en tiempo real con la ayuda del par de cebadores n°2 y del par de sonda constituido por SRAS/N/FL y SRAS/N/LC705 (figura 2).

La amplificación se realizó sobre un LightCycler™ (Roche) con la ayuda del kit "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes" (referencia 2 015 145, Roche) en las condiciones optimizadas siguientes. Una mezcla de reacción que contiene: H2O (6,8 !l), MgCl2 25 mM (0,8 !l, 4 !M final de Mg2+), mezcla de reacción 5X (4 !l), sonda SRAS/N/FL 3 !M (0,5 !l, 0,075 !M final), sonda SRAS/N/LC705 3 !M (0,5 !l, 0,075 !M final), cebador N/+/28375 10 !M (1 !l, 0,5 !M final), cebador N/-/28702 10 !M (1 !l, 0,5 !M final), mezcla de enzima (0,4 !l) y muestra (ARN viral, 5 !l) se amplificó siguiendo el programa siguiente:

- Transcripción inversa:

50°C 10:00 min. modo de análisis: ninguno

- Desnaturalización:

95ºC 30 s x1 modo de análisis: ninguno

- Amplificación:

95ºC 50ºC 72ºC 2 s 15 s 13 s } modo de análisis: cuantificación*} x45 rampa térmica 2,0ºC/s}

- Enfriamiento:

40ºC 30 s x1 modo de análisis: ninguno

* la medición de fluorescencia se hace al final de la hibridación y a cada ciclo (en modo SINGLE).

Los resultados presentados en la figura 12 muestran que este RT-PCR en tiempo real es muy sensible ya que permite detectar 102 copias de ARN sintético en 100% de las 5 muestras analizadas (29/29 muestras en 8

experimentos) y hasta 10 copias de ARN en 100% de las 5 muestras analizadas (40/45 muestras en 8 experimentos). Muestra también que este RT-PCR permite detectar la presencia la presencia del genoma del SRAS-CoV en una muestra y cuantificar el número de genomas presentes. A título de ejemplo, el ARN viral de un stock de SRAS-CoV cultivado sobre células Vero E6 se extrajo con la ayuda del kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen), diluido a 0,05.10-4 y analizado por RT-PCR en tiempo real según el protocolo descrito anteriormente; el análisis presentado en la figura 12 muestra que este stock de virus contiene 6,5.109 genomas-equivalentes/ml (geq/ml), lo que es muy similar al valor de 1,0.1010 geq/ml medido con la ayuda del kit "RealArt™ HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents" comercializado por Artus.

2)�DesarroAAo de�condiciones�de �RT-PCR�anidada�uue �tiene�como�diana�eA �gen deA ARN�poAimerasa�-�ensa3o LRT-PCR�anidada�CDC�RCenters�for�Disease�ControA�and�Prevention)�iIPL

a) Extracción del ARN viral

Muestra clínica: QIAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN) según las indicaciones del fabricante, o una técnica equivalente. El ARN se evalúa en un volumen de 60 !l. b) RT-PCR anidada "SNE/SAR"

Primera etapa: RT-PCR acoplado «SNE»

Se utilizó el kit Invitrogen "Superscript™ One-Step RT-PCR with Platinum® Tacf", pero se le puede sustituir el kit "Titan" de Roche Boehringer con resultados similares. Oligonucleótidos:

-SNE-S1 5' GGT TGG GAT TAT CCA AAA TGT GA 3'

-SNE-AS 1 5'GCA TCA TCA GAA AGA ATC ATC ATG 3'

-

> Tamaño esperado: 445�pb

1.

Preparar una mezcla:

H2O 6,5 !l Reacción mezcla 2X 12,5 !l Oligo SNE-S1 50 !M 0,2 !l Oligo SNE-AS1 50 !M 0,2 !l ARNsin 40 U/!l 0,12 !l RT/Platinum Taq mix 0, 5 !l

2.

A 20 !l de la mezcla, añadir 5 !l de ARN y proceder a la amplificación sobre termociclador (condiciones ABI 9600)

2.1 45°C 30 min.

55°C 15 min. 94°C 2 min.

2.2. 94°C 15 s } 45°C 30 s } x 5 ciclos 72°C 30 s }

2.3. 94°C 15 s } 55°C 30 s } x 35 ciclos 72°C 30 s + 2 s/ciclo }

2.4. 72°C 5 min.

2.5 10°C 0 Conservación a +4°C.

La ARNsin (N2511/N2515) de Promega se utilizó como inhibidor de RNasa.

Unos ARN sintéticos sirvieron de control positivo. A título de control, 103, 102 y 10 copias de ARN sintético RSNE se amplificaron en cada experimento.

Segunda etapa: PCR anidada "STAR'

Oligonucleótidos:

-

SAR1-S 5' CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA 3'

-

SAR1-AS 5' TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG 3'

-

> Tamaño esperado: 121�pb

1. Preparar una mezcla:

H2O

35,8 !l

Tampón Taq 10X

5 !l

MgCl2 25 mM

4 !l

Mezcla dNTPs 5 mM

2 !l

Oligo SAR1-S 50 !M

0,5 !l

Oligo SAR1-AS 50 !M

0,5 !l

Taq ADN pol 5 U/!l

0,25 !l

Se utilizó el AmpliTaq DNA Pol de Applied Biosystems (tampón 10X sin MgCl2, ref. 27216601).

2.

A 48 !l de la mezcla, añadir 2 !l del producto de la primera PCR y proceder a la amplificación (condiciones ABI

3.

Analizar 10 !l del producto de reacción sobre gel "low-melting" (tipo Seakem GTG) a 3% de agarosa. La sensibilidad del ensayo anidada está, rutinariamente, en las condiciones descritas, de 10 copias de ARN.

4.

Los fragmentos puede después ser purificados sobre QIAquick PCR kit (QIAGEN) y secuenciados con los oligo SAR1-S y SAR1-AS.

9600):

2.1.

94°C 2 min.

2.2.

94°C 30 s }

45°C

45 s } x 5 ciclos

72°C

30 s }

2.3.

94°C 30 s }

55°C

30 s } x 35 ciclos

72°C

30 s + 1 s/cicle }

2.4.

72°C 5 min.

2.5 10°C

0

3)�Deteccion�deA ARN�deA�SRAS-CoV�por�PCR�a�partir�de�ettracciones�respiratorias

a) Primer estudio comparativo

Se ha realizado un estudio comparativo sobre una serie de extracciones respiratorias recibidas por el Centre National de Référence des virus influenzae (Région-Nord), y susceptibles de contener SRAS-CoV. Para ello, se ha extraído el ARN de las extracciones con la ayuda del kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen), y analizado por RT-PCR en tiempo real, por un lado con la ayuda de los pares de cebadores y de sondas de la serie n° 2 en las condiciones descritas anteriormente y, por otro lado, con la ayuda del kit "LightCycler SRAS-CoV quantification kit" comercializado por Roche (referencia 03 604 438). Los resultados se resumen en la tabla VI a continuación. Muestran que 18 de las 26 extracciones son negativas y 5 de las 26 extracciones son positivas para los dos kits, mientras que una extracción es positiva para el único kit Roche y dos para los únicos agentes reactivos N "serie 2". Además, para 3 extracciones (20032701, 20032712, 20032714) las cantidades de ARN detectadas son claramente superiores con los agentes reactivos (sondas y cebadores) de la serie n° 2. Estos resultados indican que los cebadores y las sondas N "serie 2" son más sensibles para la detección del genoma del SRAS-CoV en unas extracciones biológicas que las del kit actualmente disponible.

TabAa�VI: AnaAisis�por�RT-PCR�en �tiempo�reaA�de�Aos ARN�ettraidos�de�una�serie�de�ettracciones de5 pacientes�con�Aa�a3uda�de�Aos�pares�de�cebadores 3 de �sondas�de�Aa�serie�n°�2�RN�Lserie�2L)o �deA��it LLightC3cAer SARS-CoV�uuantification��itL�RRoche).�EA�tipo de�ettraccion�se�indica asi�como�eA�numero�de copias�deA�genoma viraA�medidos�en cada�uno�de �Aos�dos�ensa3os.�NEn:�RT-PCR�negativa.

Ettracciones�n°

Paciente Tipo �de�ettraccion KIT�ROCEE N�Lserie 2L

20033082

K nasal NEG NEG

20033083

K faríngea NEG NEG

20033086

K nasal NEG NEG

20033087

K faríngea NEG NEG

20032802

M nasal NEG NEG

20032803

M expectoración NEG NEG

20032806

M nasal o faríngea NEG NEG

20031746ARN2

C faríngea NEG NEG

20032711

C nasal o faríngea 39 NEG

20032910

B nasal NEG NEG

20032911

B faríngea NEG NEG

20033356

V expectoración NEG NEG

20033357

V expectoración NEG NEG

20031725

K asp. endotraqueal NEG 150

20032657

K asp. endotraqueal NEG NEG

20032698

K asp. endotraqueal NEG NEG

20032720

K asp. endotraqueal 3 5

20033074

K heces 115 257

20032701

M faríngea 443 1676

20032702

M expectoración NEG 249

20031747ARN2

C faríngea NEG NEG

20032712

C desconocida 634 6914

20032714

C faríngea 17 223

20032800

B nasal NEG NEG

20033353

V nasal NEG NEG

20033384

V nasal NEG NEG

b) Segundo estudio comparativo

Los rendimientos de diferentes métodos de RT-PCR anidada y de RT-PCR en tiempo real se compararon después para 121 extracciones respiratorias de posibles casos de SRAS del hospital francés de Hanoi, Vietnam, realizados entre el 4º y el 17º día después del principio de los síntomas. Entre estas extracciones, 14 se habían encontrado positivas durante un primer ensayo que utiliza el método de RT-PCR anidada que tiene como diana el ORF1b (que codifica la replicasa) tal como se describe inicialmente por el Bernhard Nocht Institute (RT-PCR anidada BNI). Informaciones en relación con este ensayo están disponibles en internet, en la dirección http://www15.bnihamburg.de/bni/bni2/neu2/getfile.acgi?area engl=diagnos-tics&pid=4112.

Los diferentes ensayos comparados en este estudio son:

-

el método de RT-PCR cuantitativa, según la invención, con los cebadores y sonda N "serie 2" descrito anteriormente (columna Light Cycler N),

-

el ensayo de RT-PCR anidada que tiene por diana el gen del ARN polimerasa descrito anteriormente, desarrollado por el CDC, el BNI y el Instituto Pasteur (RT-PCR anidada CDC/IP),

-

el kit ARTUS de referencia "HPA Corona LC RT-PCR Kit # 5601-02", que es un ensayo de RT-PCR en tiempo real que tiene por diana el gen ORF1b,

-

el ensayo de RT-PCR anidada de BNI, que tiene por diana también el gen del ARN polimerasa, mencionado anteriormente.

Los inventores han constatado:

1) una variabilidad inter-ensayo para una misma técnica, relacionada con la degradación de la preparación de ARN durante descongelaciones repetidas, en particular para las muestras que contienen las cantidades de ARN más bajas,

2) una sensibilidad reducida de la RT-PCR anidada CDC/IP con relación a la RT-PCR anidada BNI, y 3) una sensibilidad comparable del ensayo RT-PCR cuantitativa, según la invención, (Light Cycler N) con respecto al ensayo Light Cycler (LC) Artus.

Estos resultados, presentados en la tabla VII a continuación, muestran que el ensayo por RT-PCR cuantitativa, según la invención, constituye un excelente complemento, o una alternativa, a los ensayos actualmente disponibles. En efecto, el coronavirus relacinado al SRAS es un virus emergente, susceptible de evolucionar rápidamente. En particular, el gen del ARN polimerasa del coronavirus relacionado al SRAS, que está en el punto de mira de la mayoría de los ensayos actualmente disponibles, puede recombinar con el de otros coronavirus no relacionados al SRAS. El uso de un ensayo que tiene como diana exclusivamente este gen podría entonces conducir a la obtención de falsos negativos.

El ensayo RT-PCR cuantitativo, según la invención, no tiene por diana la misma región genómica que el kit ARTUS, ya que tiene por diana el gen que codifica la proteína N. Realizando un ensayo de diagnóstico que tiene por diana dos generes diferentes del coronavirus relacionado con el SRAS, se puede por lo tanto esperar librarse de resultados de tipo falsos positivos que podrían deberse a la evolución genética del virus.

Además, parece particularmente ventajoso tener por diana el gen de la proteína de nucleocápside, ya que es muy estable, debido a la fuerte presión de selección relacionada con las tensiones estructurales elevadas que conciernen a esta proteína.

TabAa�VII:�Comparacion�de�diferentes�metodos�de�anaAisis�por�ampAificacion�genica.�a�partir�de�121 ettracciones de�posibAes�casos�de�SRAS �deA�hospitaA �frances�de�Eanoi.�Vietnam�Repidemia�deA�2553)

N°�CNR

Tipo �de ettraccion�R1) Dia�de ettraccion Paciente RT-PCR anidada CDCiIP RT-PCR anidada LNI �it�Light C3cAer �Artus Light�C3cAer N�RIP)

107 extracciones

N y P Negativa Negativa Negativa Negativa

032529

P 10 NHB Negativa Positiva Negativa Negativa

032530

N 10 NHB Positiva Positiva 3,10E+01 4,20E+01

032531

P 7 LP Positiva Positiva 7,70E+00 3,10E+00

032534

N 15 BND Positiva Positiva 1,60E+00 Negativa

032600

P 4 NHH Negativa Positiva Negativa 1,30E+02

032612

P 17 NTS Negativa Positiva Negativa Negativa

032688

P 9 BTX Positiva Positiva Negativa Negativa

032689

N 4 NVH Positiva Positiva 1,20E+01 2,30E+02

032690

P 4 NVH Negativa Positiva 1,60E+00 Negativa

032727

P 8 NVH Positiva Positiva 2,30E+02 4,00E+02

032728

N 8 NVH Positiva Positiva 1,10E+03 1,60E+04

032729

P 14 NHB Positiva Positiva 5,90E+00 3,40E+01

032730

N 14 NHB Positiva Positiva 1,30E+02 4,80E+02

032741

P 8 NHH Positiva Positiva 2,10E+02 1,30E+02

Positivas

10 14 10 9

Fracción detectada de las 14 Positivas

71,4% 100,0% 71,4% 64,3%

(1) P= hisopo faríngeo N= hisopo nasal

EjempAo�9:�Obtencion3 �caracterioacion�de �anticuerpos�monocAonaAes �dirigidos�contra �Aa�proteinaN

Se inmunizaron ratones Balb C con la ayuda de la proteína N recombinante purificada y se fusionaron sus células esplénicas con un mieloma murino apropiado, según las técnicas de Kohler y Milstein.

Se preseleccionaron diez y nueve hibridomas secretores de anticuerpos anti N y se han preseleccionado sus inmunorreactividades precisadas. Estos anticuerpos reconocen bien la proteína N recombinante (en ELISA) con unas intensidades variables, así como la proteína viral, natural N en ELISA y/o transferencia western. Las figuras 18 a 20 muestran los resultados de estos ensayos para 15 de estos 19 anticuerpos monoclonales.

Se han sub-clonado los clones 12, 17, 28, 57, 72, 76, 86, 87, 98, 103, 146, 156, 166, 170, 199, 212, 218, 219 y 222, fuertemente reactivos. Los estudios de especificidad se prosiguieron con las herramientas apropiadas a fin de precisar los epítopos reconocidos, y verificar la ausencia de reactividad frente a otros coronavirus humanos y de algunos virus respiratorios.

Los estudios de cartografía (mapping) epitópica (realizados sobre membrana "spot", con la ayuda de péptidos superpuestos de 15 aa) y los estudios suplementarios realizados sobre la proteína N natural en transferencia western revelaron la existencia de 4 grupos de anticuerpos monoclonales:

1º Anticuerpos monoclonales específicos de un epítopo lineal mayor en posición N-ter (75-81, secuencia: INTNSVP). El representante de este grupo es el anticuerpo 156. El hibridoma que produce este anticuerpo se depositó en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Instituto Patseur (Paris, Francia) el 1 de diciembre de 2004, bajo el número I-3331. Este mismo epítopo es también reconocido por un suero de conejo (policlonal anti N) obtenido mediante inmunización clásica con la ayuda de esta misma proteína N.

2º Anticuerpos monoclonales específicos de un epítopo lineal mayor situado en posición central (posición 217-224, secuencia: ETALALL); los representantes de este grupo son los anticuerpos monoclonales 87 y 166. El hibridoma que produce el anticuerpo 87 se depositó en la CNCM el 1 de diciembre de 2004, bajo el número I-3328.

3° Anticuerpos monoclonales específicos de un epítopo lineal mayor situado en posición C-terminal (posición 403408, secuencia: DFFRQL), los representantes de este grupo son los anticuerpos 28, 57 y 143. El hibridoma que produce el anticuerpo 57 se depositó en la CNCM el 1 de diciembre de 2004, bajo el número I-3330.

4° Anticuerpos monoclonales específicos de un epítopo discontinuo, conformacional. Este grupo de anticuerpos no reconoce ninguno de los péptidos que recubren la secuencia de la proteína N, pero reaccionan fuertemente sobre la proteína natural no desnaturalizada. El representante de este último grupo es el anticuerpo 86. El hibridoma que produce este anticuerpo se depositó en la CNCM el 1 de diciembre de 2004, bajo el número I-3329.

La tabla VIII siguiente resume los resultados de cartografía epitópica obtenidos:

TabAa�VIII:�Cartografia�epitopica �de�Aos�anticuerpos�monocAonaAes

Anticuerpos

Epitopo Posicion Region

28

DFSRQL Q 453�...�458 C�-Ter.

143

DFSRQL Q

76

DFSRQL Q

57

DFSRQL Q

FFGMS RI

315�...�319

146

LPQRQ 383�...�387

166

ETALALLLL 217�...�224 centraA

87

ETALALL 217�...�224

156

INTNSnP 75�...�81 N - Ter.

86

ConformacionaA

212

ConformacionaA

175

ConformacionaA

Además, como se ilustra en particular en las figuras 18 a 19, estos anticuerpos no presentan reactividad en ELISA y/o en WB, frente a la proteína N del coronavirus humano 229 E.

EjempAo�15:�Combinaciones�de�anticuerpos �monocAonaAes�para�eA�desarroAAo�de un ensa3o �de�inmunocaptura sensibAe 3 �especifica�deA�antigeno viraA�N�en �eA�suero o Aos�fAuidos bioAogicos�de Aos �pacientes contaminados por�eA virus�SRAS CoV

Los anticuerpos listados a continuación se seleccionaron debido a sus propiedades bien particulares para un estudio suplementario de captura y detección de la proteína viral N, en el suero de los sujetos o pacientes.

Estos anticuerpos se produjeron en ascitis en ratones, purificados mediante cromatografía de afinidad y utilizados solos o en combinación como anticuerpos de captura, y como anticuerpos señal.

Listado de los anticuerpos seleccionados para este propósito:

-

Acm anti región C-ter (n° 28, 57, 143)

-

Acm anti región central (n° 87, 166)

-

Acm anti región N-ter (n° 156)

-

Acm anti epítopo discontinuo, conformacional (86)

1)�Preparacion�de �Aos�agentes�reactivos:

a) Placas ELISA de inmunocaptura

Las placas son sensibilizadas con las soluciones de anticuerpos a 5 !g/ml de tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6. Las soluciones (monovalentes o plurivalentes) son depositadas en un volumen de 100 !l en los pocillos, y se incuban durante una noche a temperatura ambiente. Estas placas se lavan después en tampón PBS (10 mM pH 7,4 adicionado del 0,1% de Tween 20) y después se saturan con una solución de PBS adicionada del 0,3% de BSA y del 5% de sacarosa). Las placas se secan después y se envasan en una bolsa en presencia de un desecador. Están listas para su empleo.

b) Conjugados

Los anticuerpos purificados se acoplaron con la peroxidasa según el protocolo de Nakane (Nakane y otros - 1974, J. of Histo and cytochemistry, vol. 22, p 1084-1091) en una relación de una molécula de IgG para 3 moléculas de peroxidasa. Estos conjugados se purificaron mediante cromatografía de exclusión y se conservaron concentrados (concentración comprendida entre 1 a 2 mg/ml) en presencia del 50% de glicerol y a -20°C. Están diluidos para su utilización en los ensayos para la concentración final de 1 ó 2 !g/ml en tampón PBS (pH 7,4) adicionado del 1% de BSA.

c) Otros agentes reactivos

-

Sueros humanos negativos para todos los marcadores séricos de los virus HIV, HBV, HCV y THLV

-

Conjunto (pool) de sueros humanos negativos con adición de 0,5% de Tritón X 100

-

Ag viral inactivo: sobrenadante de cultiuvo viral inactivo mediante irradiación e inactivación verificada después del cultivo sobre células sensibles - título de la suspensión antes de la inactivación de aproximadamente 107 partículas infecciosas por ml o también aproximadamente 5x109 partículas virales físicas por ml de antígeno

-

Las muestras de Ag diluidas en suero humano negativo: estas muestras se prepararon mediante dilución al 1:100 y después por dilución en serie de razón 5.

Estas muestras no infecciosas mimetizan unas muestras humanas que esperan contener concentraciones bajas a muy bajas de nucleoproteína viral N. Tales muestras no son accesibles para los trabajos rutinarios

-

Solución de lavado R2, solución de revelado TMB R8, cromógeno R9 y solución de detención R10, son los agentes reactivos genéricos comercializados por Bio-Rad en sus estuches ELISA (ej.: estuche Platelia Pylori ref. 72778).

2)�Modo de�reaAioacion

Las muestas de sueros humanos sobrecargados en Ag viral desactivado son distribuidas a razón de 100 !l por pozo, directamente en las placas sensibilizadas, listas para su empleo y después incubados durante 1 hora a 37ºC (incubación Bio-Rad IPS).

El material no retenido por la fase sólida se elimina mediante 3 lavados (lavado con solución R2 diluida, lavador automático LP 35).

Los conjugados apropiados, diluidos a la concentración final de 1 ó 2 !g/ml son distribuidos a razón de 100 !l por pozo y las placas se incuban de nuevo durante una hora a 37°C (incubación IPS).

El exceso de conjugado se elimina mediante 4 lavados sucesivos (solución R2 diluida - lavador LP 35).

La presencia de conjugado fijado sobre las placas se revela después de la adición de 100 !l de solución de revelado preparada antes del uso (1 ml de R9 y 10 ml de R8) y después de la incubación durante 30 minutos, a temperatura ambiente y protegido de la luz.

La reacción enzimática se bloquea finalmente mediante adición de 100 !l de agente reactivo R10 (H2SO4 1N) en todas los pozos.

La lectura se efectúa con la ayuda de un lector de microplacas apropiado de doble longitud de onda (450/620 nm).

Los resultados pueden ser interpretados utilizando como valor límite provisional la media de al menos dos controles negativos multiplicado por un factor 2 o también la media de 100 sueros negativos adicionada de un incremento que corresponde a 6 SD (Desviación estándar calculada sobre las 100 mediciones individuales).

3)�ResuAtados

Diferentes combinaciones anticuerpos de captura y anticuerpos señal se ensayaron basándose en las propiedades de los anticuerpos seleccionados, y evitando las combinaciones de anticuerpos específico de los mismos epítopos en fase sólida y conjugados

Los mejores resultados se obtuvieron con las 4 combinaciones listadas a continuación. Estos resultados son reproducidos en la tabla IX a continuación.

1.

Combinación F/28 Fase sólida (Acm 166 + 87 región central): conjugado anticuerpo 28 (C-ter)

2.

Combinación G/28 Fase sólida (Acm 86 - epítopo conformacional): conjugado anticuerpo 28 (C-ter)

3.

Combinación H/28 Fase sólida (Acms 86, 166 y 87 región central y epítopo conformacional): conjugado anticuerpo 28 (C-ter)

4.

Combinación H/28 + 87 Fase sólida (Acms 86, 166 y 87 región central y epítopo conformacional): conjugado mixto anticuerpo 28 (C-ter) y 87 (central)

5.

Combinación G/87 Fase sólida (Acm 86 - epítopo conformacional): conjugado anticuerpo 87 (región central)

Las 4 primeras combinaciones presentan unos rendimientos equivalentes y reproducibles, superiores a las otras combinaciones utilizadas (por ejemplo la combinación G/87). Por supuesto, en estas combinaciones, un anticuerpo monoclonal puede ser sustituido con otro anticuerpo que reconoce el mismo epítopo. Así, se pueden citar las variantes siguientes:

6.

Variante de la combinación F/28 Fase sólida (Acm 87 únicamente): conjugado anticuerpo 57 (C-ter)

7.

Variante de la combinación G/28 Fase sólida (Acm 86 - epítopo conformacional): conjugado anticuerpo 57 (C-ter)

8.

Variante de la combinación H/28 Fase sólida (Acms 86 y 87 región central y epítopo conformacional): conjugado anticuerpo 57 (C-ter)

9.

Variante de la combinación H/28 + 87 Fase sólida (Acms 86 y 87 región central y epítopo conformacional): conjugado mixto anticuerpo 57 (C-ter) y 87 (central)

Tabla IX: Control de la inmunorreactividad de los Acm anti-nucleoproteínas SRAS CoV: densidades ópticas medidas con cada combinación de anticuerpos, en función de las diluciones del antígeno viral inactivo.

N°

DiAucion Fi28 ni28 ni87 Ei28 Ei28+87

0

1/100 5 5 3,495 3,900 5

1

1/500 3,795 3,814 1,379 3,702 3,804

2

½ 500 2,815 2,950 0,275 3,268 2,680

3

1/12500 0,987 1,038 0,135 1,374 0,865

4

1/62500 0,404 0,348 0,125 0,480 0,328

5

1/312500 0,285 0,211 0,123 0,240 0,215

6

Control 0,210 0,200 0,098 0,186 0,156

7

Control 0,269 0,153 0,104 0,193 0,202

El límite de detección de estos 4 ensayos experimentales corresponde a la dilución de antígeno en suero negativo 1: 62500. Una extrapolación rápida deja suponer la detección de menos de 103 partículas por ml de sueros.

De este estudio, destaca que los anticuerpos más apropiados para la captura de la nucleoproteína viral nativa son los anticuerpos específicos de la región central y/o de un epítopo conformacional, siendo uno y otro anticuerpos seleccionados también por su fuerte afinidad para el antígeno nativo.

Habiendo determinado los mejores anticuerpos para la composición de la fase sólida, los anticuerpos para conservar la prioridad para la detección de antígenos fijados sobre la fase sólida son los anticuerpos complementarios específicos de un epítopo dominante en la región C-ter. El empleo de cualquier otro anticuerpo complementario, pero específico de los epítopos localizados en la región N-ter de la proteína, conduce a resultados medios o mediocres.

EjempAo�11: Sistemas�de�etpresion�eucariotas�de�Aa �proteina�de espicuAa�RS)�deA�co ronavirus�asociado�aA SRAS �RSRAS-CoV)

1)�Optimioacion�de Aas�condiciones�de�etpresion�de�Aa�S�deA�SRAS-CoV�en�ceAuAas�de�mamiferos.

Las condiciones de expresión transitoria de la proteína de espícula (S) del SRAS-CoV se optimizaron en células de mamíferos (293T, VeroE6).

Para ello, se amplificó un fragmento de ADN que contiene el ADNc de la S del SRAS-CoV mediante PCR con la ayuda de los oligonucleótidos 5'-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3' y 5'-ATACTCGAGTT ATGTGTAATG TAATTTGACA CCCTTG-3' a partir del plásmido pSRAS-S (C.N.C.M. n° 1-3059) y después se insertó en los sitio BamH1 y Xho1 del plásmido pTRIPLU3-CMV que contiene un vector lentiviral TRIP (Sirven, 2001, Mol. Ther., 3, 438-448) para obtener el plásmido pTRIP-S. El fragmento BamH1 y Xho1 que contiene el ADNc de la S se sub-clonó después entre los BamH1 y Xho1 del plásmido de expresión eucariota pcDNA3.1(+) (Clontech) para obtener el plásmido pcDNA-S. El fragmento Nhe1 y Xho1 que contiene el ADNc de la S se sub-clonó después entre los sitios correspondientes del plásmido de expresión pCI (Promega) para obtener el plásmido pCI-S. Las secuencias WPRE del virus de la hepatitis de la marmota ("Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element") y las secuencias CTE ("constitutive transport element") del retrovirus símico de Mason-Pfizer se insertaron en cada uno de los dos plásmidos pcDNA-S y pCI-S entre los sitios Xho1 y Xba1 para obtener respectivamente los plásmidos ADNpc-S-CTE, ADNpc-S-WPRE, pCI-S-CTE y pCI-S-WPRE (figura 21). El plásmido pCI-S-WPRE se depositó en la CNCM, el 22 de noviembre de 2004, bajo el número 1-3323. Todos los insertos se secuenciaron con la ayuda de un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) y de un secuenciador automático ABI377.

Se buscó la capacidad de los plásmidos construidos para dirigir la expresión de la S del SRAS-CoV en células de mamíferos después de la transfección de células VeroE6 (figura 22). En este experimento, se han transfectado monocapas de 5x105 células VeroE6 en cajas de Petri de 35 mm con 2 !g de los plásmidos ADNpc (a título de control), ADNpc-S, pCI y pCI-S y 6 !l de agente reactivo Fugene6 según las indicaciones del fabricante (Roche). Después de 48 horas de incubación a 37°C y bajo 5% de CO2, se prepararon unos extractos celulares en tampón de depósito según Laemmli, separados sobre un gel SDS al 8% de poliacrilamida, y después transferidos sobre una membrana de PVDF (BioRad). La detección de esta inmunohuella («western blot») se realizó con la ayuda de un suero policlonal de conejo anti-S (suero inmune del conejo P11135: véase el ejemplo 4 anterior) y de anticuerpos policlonales de asno dirigidos contra los IgG de conejo y acoplados con la peroxidasa (NA934V, Amersham). Los anticuerpos fijados se revelaron mediante luminescencia con la ayuda del kit ECL+ (Amersham) y de películas de autorradiografía Hyperfilm MP (Amersham).

Este experimento (figura 22) muestra que el plásmido pcDNA-S no permite dirigir la expresión de la S del SRAS-CoV a niveles detectables mientras que el plásmido pCI-S permite una expresión baja, próxima del límite de detección, que puede ser demostrado cuando la película está sobre-expuesta. Unos resultados similares se obtuvieron cuando la expresión de la S se buscó mediante inmunofluorescencia (datos no mostrados). Esta imposibilidad de detectar una expresión eficaz de la S no se puede imputar a las técnicas de detección utilizadas ya que la proteína S puede ser puesta en evidencia al tamaño esperado (180 kDa) en un extracto de células infectadas por el SRAS-CoV o en un extracto de células VeroE6 infectadas por el virus recombinante de la vacuna antivariólica VV-TF7.3 y transfectadas por el plásmido pcDNA-S. En este último experimento, el virus VV-TF7.3 expresa el ARN polimerasa del fago T7, y permite la transcripción citoplásmica de un ARN sin capuchón susceptible de ser traducido eficazmente. Este experimento sugiere que los defectos de expresión descritos anteriormente se deben a una incapacidad intrínseca del ADNc de la S para ser expresado eficazmente cuando la etapa de transcripción en ARN mensajero se realiza a nivel nuclear.

En un segundo experimento, el efecto de las señales CTE y WPRE sobre la expresión de la S se ha buscado después de la transfección de células VeroE6 (figura 23A) y 293T (figura 23B) y según un protocolo similar al descrito anteriormente. Mientras que la expresión de la S no se puede demostrar después de la transfección de los

plásmidos ADNpc-S-CTE y ADNpc-S-WPRE derivados de ADNpc-S, la inserción de las señales WPRE y CTE mejora fuertemente la expresión de la S en el contexto del plásmido de expresión pCI-S.

Para precisar este resultado, se realizó una segunda serie de experimentos, en la que la inmunohuella se revela de manera cuantitativa por luminescencia y adquisición sobre un dispositivo de imágenes digitales (FluorS, BioRad). El análisis de los resultados obtenidos con el programa QuantityOne v4.2.3 (BioRad) muestra que las secuencias WPRE y CTE aumentan respectivamente la expresión de la S de un factor 20 a 42 y 10 a 26 en células Vero E6 (tabla X). En células 293T (tabla X), el efecto de la secuencia CTE es más moderado (4 a 5 veces), mientras que el de la secuencia WPRE sigue importante (13 a 28 veces).

TabAa�X: AnaAisis�cuantitativo�deA�efecto �de�Aas seraAes CTE�3�WPRE sobre�Aa�etpresion�de�Aa�S�deA�SRAS-CoV:

Se prepararon extractos celulares 48 horas después de la transfección de células VeroE6 o 293T por los plásmidos pCI, pCI-S, pCI-S-CTE y pCI-S-WPRE, y se analizaron mediante transferencia western como se describe en la leyenda de la figura 22. La transferencia western se revela mediante luminescencia (ECL+, Amersham) y adquisición sobre un dispositivo de imágenes digitales (FluorS, BioRad). Los niveles de expresión son indicados en función de una escala arbitraria en la que el valor de 1 representa el nivel medido después de la transfección del plásmido pCI-

S. Se realizaron dos experimentos independientes para cada uno de los dos tipos celulares. En el experimento 1, sobre células VeroE6, las transfecciones se realizaron en duplicado y los resultados son indicados en forma de media y desviaciones estándares de los niveles de expresión medidos.

PAasmido

CeAuAa etp.1 etp.2

PCI

VeroE6 0,0 0,0

pCI-S

VeroE6 1,0 ± 0,1 1,0

pCI-S-CTE

VeroE6 9,8 ± 0,9 26,4

pCI-S-WPRE

VeroE6 20,1 ± 2,0 42,3

PCI

293T 0,0 0,0

PCI-S

293T 1,0 1,0

PCI-S-CTE

293T 4,6 4,0

PCI-S-WPRE

293T 27,6 12,8

En resumen, el conjunto de estos resultados muestra que la expresión en unas células de mamíferos del ADNc de la S del SRAS-CoV, bajo la dependencia de secuencias promotoras del ARN polimerasa II, requiere, para ser eficaz, la presencia de una señal de empalme así como una u otra de las secuencias WPRE y CTE.

2)�Obtencion�de�Aineas�estabAes�uue�permiten�Aa�etpresion�de �Aa�S�deA�SRAS-CoV

El ADNc de la proteína S del SRAS-CoV se clonó en forma de un fragmento BamH1-Xho1 en el plásmido pTRIP)AU3-CMV que contiene un vector lentiviral defectivo TRIP a ADN flap central (Sirven y otros, 2001, Mol. Ther., 3: 438-448), para obtener el plásmido pTRIP-S (figura 24). La co-transfección transitoria según Zennou y otros (2000, Cell, 101: 173-185) de este plásmido, de un plásmido de encapsidación (p8.2), y de un plásmido de expresión de la glicoproteína de envoltura G del VSV (pHCMV-G) en unas células 293T, permitió la preparación de pseudopartículas retrovíricas que contienen el vector TRIP-S, y pseudotipadas por la proteína de envoltura G. Estos vectores TRIP-S pseudotipados se utilizaron para transducir unas células 293T y FRhK-4: no se ha podido demostrar ninguna expresión de la proteína S, ni ha podido ser puesto en evidencia mediante transferencia western e inmunofluorescencia en las células transducidas (datos no presentados).

Los casetes de expresión óptimos constituidos del promotor inmediato/precoz del virus CMV, de una señal de corte y empalme, del ADNc de la S y de una u otra de las señales post-transcripcionales WPRE o CTE, descritas anteriormente, se sustituyeron entonces por el casete EF1a-EGFP del vector de expresión lentiviral defectivo a ADN FLAP central TRIPLU3-EF1a (Sirven y otros, 2001, Mol. Ther., 3:438-448) (figura 25). Estas sustituciones se realizaron mediante una serie de sub-clonaciones sucesivas de los casetes de expresión de S escindidos de los plásmidos pCT-S-CTE (BglII-Ap1) o respectivamente pCI-S-WPRE (BglII-Sal1), y después se insertan entre los sitios Mlu1 y Kpn1, o respectivamente Mlu1 y Xho1, del plásmido TRIPLU3-EF1a para obtener los plásmidos pTRIP-SD/SA-S-CTE y pTRIP-SD/SA-S-WPRE, depositados en la CNCM, el 1 de diciembre de 2004, bajo los números I3336 y 1-3334, respectivamente. Unos vectores pseudotipados se produjeron según Zennou y otros (2000, Cell,

101: 173-185) y utilizados para transducir unas células 293T (10000 células) y FRhK-4 (15000 células) según una serie de 5 ciclos sucesivos de transducción con una cantidad de vector que corresponde a 25 ng (TRIP-SD/SA-S-CTE) o 22 ng TRIP-SD/SA-S-WPRE) de p24 por ciclo.

Las células transducidas se clonaron por dilución límite y se analizó una serie de clones para la expresión de la S del SRAS-CoV cualitativamente por inmunofluorescencia (datos no mostrados), y después cuantitativamente por transferencia western (figura 25) con la ayuda de un suero policlonal de conejo anti-S. Los resultados presentados en la figura 25 muestran que los clones 2 y 15 de células FrhK4-s-CTE transducidas por TRIP-SD/SA-S-CTE y los clones 4, 9 y 12 de células FRhK4-S-WPRE transducidas por TRIP-SD/SA-S-WPRE, permiten la expresión de la S del SRAS-CoV a niveles respectivamente bajos y moderados si se les comparan con los que se pueden observar durante la infección por el SRAS-CoV.

En resumen, los vectores TRIP-SD/SA-S-CTE y TRIP-SD/SA-S-WPRE permiten la obtención de clones estables de células FRhK-4 y, de manera similar, 293T que expresa la S del SRAS-CoV, mientras que los ensayos realizados con el vector "de base" TRIP-S siguen infructuosos, lo que demuestra la necesidad de una señal de empalme, así como una u otra de las secuencias CTE y WPRE para la obtención de clones celulares estables que expresan la proteína S.

Además, estas modificaciones del vector TRIP (inserción de una señal de corte y empalme empalme posttranscripcional como CTE y WPRE), podrían revelarse interesantes para mejorar la expresión de otros ADNc diferente de aquel de la S.

3) Obtención de líneas estables que permiten la expresión de una forma soluble de la S del SRAS-CoV. Purificación de este antígeno recombinante

Un ADNc que codifica una forma soluble de la proteína S (Ssol) se obtuvo fusionando las secuencias que codifican para el ectodominio de la proteína (aminoácidos 1 a 1193) a las de una etiqueta (FLAG: DYKDDDDK) a través de un enlazador BspE1, que codifica el dipéptido SG. Prácticamente, para obtener el plásmido ADNpc-Ssol, se amplificó un fragmento de ADN que codifica el ectodominio de la S del SRAS-CoV por PCR con la ayuda de los oligonucleótidos 5'-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3' y 5'-ACCTCCGGAT TTAATATATT GCTCATATTT TCCCAA- 3' a partir del plásmido pcDNA-S, y después se insertó entre los sitios únicos BamH1 y BspE1 únicos de un plásmido de expresión eucariota ADNpc3.1 (+) (Clontech) modificado, que contiene entre sus sitios BamH1 y Xho1 la secuencia de la etiqueta FLAG:

Los fragmentos Nhe1-Xho1 y BamH1-Xho1, que contiene el ADNc de la forma soluble de la S, se extirparon después del plásmido pcDNA-Ssol, y se sub-clonaron entre los sitios correspondientes del plásmido pTRIP-SD/SA-S-CTE y del plásmido pTRIP-SD/SA-S-WPRE, respectivamente, para obtener los plásmidos pTRIP-SD/SA-Ssol-CTE y pTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE, depositados en la CNCM, el 1 de diciembre de 2004, bajo los números 1-3337 e 1-3335, respectivamente.

Se produjeron unos vectores pseudotipos según Zennou y otros (2000, Cell, 101: 173-185) y se utilizaron para transducir unas células FRhK-4 (15000 células) según una serie de 5 ciclos sucesivos de transducción (15000 células) con una cantidad de vector que corresponde a 24 ng (TRIP-SD/SA-Ssol-CTE) o 40 ng TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE) de p24 por ciclo. Las células transducidas se clonaron por dilución límite y una serie de 16 clones transducidos mediante TRIP-SD/SA-Ssol-CTE y de 15 clones mediante TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE se analizaron para la expresión del polipéptido Ssol mediante transferencia western, revelado por un anticuerpo monoclonal anti-FLAG (figura 26 y datos no mostrados), así como mediante un ELISA-captura específico del polipéptido Ssol que se realizó con este objetivo (tabla XI y datos no mostrados). Una parte del proceso de selección de los mejores clones secretores se muestra en la figura 26. El ELISA-captura se basa en el uso de fases sólidas recubiertas de anticuerpos policlonales de conejos inmunizados por SRAS-CoV purificado e inactivado. Estas fases sólidas permiten la captura del polipéptido Ssol secretado en los sobrenadantes celulares, cuya presencia se revela después mediante una serie de etapas que implican sucesivamente la fijación de un anticuerpo monoclonal anti-FLAG (M2, SIGMA), de anticuerpos biotinilados policlonales de conejo anti-IgG(H+L), de ratón (Jackson), y de un conjugado streptavidina-peroxidasa (Amersham), y después la adición de cromógeno y de sustrato (TMB + H202, KPL).

TabAa�XI:�anaAisis�de�Aa etpresion�de �poAipeptido�SsoA�por�unas�Aineas�ceAuAares�transducidas�por�Aos vectores Aentiviricos�TRIP-SDiSA-SsoA-WPRE�3�TRIP-SDiS A-SsoA-CTE. La secreción del polipéptido Ssol se buscó en el sobrenadante de una serie de clones celulares aislados después de la transducción de células FRhK-4 por los vectores lentivíricos TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE y TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. Los sobrenadates diluidos al 1/50 se analizaron mediante un ensayo ELISA-captura específico de la S du SRAS-CoV.

Vector

Clon DO (450 nm)

Control

- 0,031

TRIP-SD/SA-Ssol-CTE

CTE2 0,547

CTE3

0,668

CTE9

0,171

CTE12

0,208

CTE13

0,133

TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE

WPRE1 0,061

WPRE10

0,134

La línea celular que segrega las cantidades más elevadas de polipéptido Ssol en el sobrenadante de cultivo es la línea FRhK4-Ssol-CTE3. Se ha sometido a una segunda serie de 5 ciclos de transducción por el vector TRIP-SD/SASsol-CTE, en condiciones similares a las descritas anteriormente, y después se ha clonado. El sub-clon que segrega las cantidades más elevadas de Ssol se ha seleccionado mediante una combinación de análisis por transferencia western, y ELISA-captura: se trata del sub-clon FRhK4-Ssol-30, que se depositó en la CNCM, el 22 de noviembre de 2004, bajo el número I-3325.

La línea FRhK4-Ssol-30 permite la producción y la purificación en cantidad del polipéptido recombinante Ssol. En un experimento del tipo en el que las condiciones experimentales de crecimiento, de producción y de purificación se optimizaron, las células de la línea FRhK4-Ssol-30 son inoculadas en un medio de cultivo estándar (DMEM sin piruvato que contiene 4,5g/l de glucosa y suplementado con 5% de SVF, 100 U/ml de penicilina y 100 !g/ml de estreptomicina) en forma de una monocapa sub-confluente (1 millón de células para cada 100 cm2 en 20 ml de medio). A confluencia, el medio estándar se sustituye con el medio de secreción en el que la cantidad de SVF se reduce al 0,5% y la cantidad de medio se reduce a 16 ml para cada 100 cm2. El sobrenadante de cultivo se extrae después de 4 a 5 días de incubación a 35°C y bajo el 5% de CO2. El polipéptido recombinante Ssol se purifica a partir del sobrenandante mediante la cadena de etapas de filtración sobre membrana de poliétersulfona (PES) de 0,1 !m, de concentración por ultra-filtración sobre una membrana de PES de punto de escisión 50 kD, de cromatografía de afinidad sobre plantilla anti-FLAG con elución mediante una solución de péptido FLAG (DYKDDDDK) a 100 !g/ml en TBS (Tris 50 mM pH 7,4, 150 mMNaCl), y después de cromatografía de gel de filtración en TBS sobre bolas de sephadex G-75 (Pharmacia). La concentración del polipéptido recombinante Ssol purificado se determinó mediante el ensayo micro-BCA (Pierce), y después se analizaron sus características bioquímicas.

El análisis por gel SDS al 8% de acrilamida teñida con nitrato de plata pone de manifiesto un polipéptido mayoritario cuya masa molecular es de aproximadamente 180 kD y cuyo grado de pureza puede ser evaluado al 98% (figura 27A). Mediante espectrometría de masas SELDI-TOF (Cyphergen), se ponen en evidencia dos picos principales: corresponden a formas simple y doblemente cargadas de un polipéptido mayoritario, cuya masa molecular está así determinada a 182,6 ± 3,7 kD (figuras 27B y C). Después de la transferencia sobre membrana Prosorb y del aclarado en TFA 0,1%, el extremo N-terminal del polipéptido Ssol se secuenció en fase líquida mediante degradación de Edman sobre 5 residuos (ABI494, Applied Biosystems), y determinada como siendo SDLDR (figura 27D). Esto demuestra que el péptido señal localizado en el extremo N-terminal de la proteína S del SRAS-CoV, compuesto de las aa 1 a 13 (MFIFLLFLTLTSG) según un análisis realizado con el programa signalP v2.0 (Nielsen y otros, 1997, Protein Engineering, 10: 1-6), está escindido del polipéptido Ssol maduro. El polipéptido recombinante Ssol está por lo tanto constituido de los aminoácidos 14 a 1193 de la proteína S del SRAS-CoV fusionados en Cterminal con una secuencia SGDYKDDDDK que contiene la secuencia de la etiqueta FLAG (subrayada). La diferencia entre la masa molar teórica del polipéptido Ssol desnudo (132,0 kD) y la masa molar real del polipéptido maduro (182,6 kD) sugiere que el polipéptido Ssol está glicosilado.

Una preparación de polipéptido Ssol purificado, y cuya concentración proteica se determinó mediante un ensayo micro-BCA, permite realizar una escala estándar para medir, con la ayuda del ensayo ELISA-captura descrito anteriormente, las concentraciones de Ssol presente en los sobrenadantes de cultivo y volver a considerar las caracteríticas de las líneas secretoras. Según este ensayo, la línea FRhK4-Ssol-CT3 segrega 4 a 6 !g/ml de polipéptido Ssol mientras que la línea FRhK4-Ssol-30 segrega 9 a 13 !g/ml de Ssol después de 4 a 5 días de cultivo a confluencia. Además, el esquema de purificación presentado anteriormente permite, rutinariamente, purificar de 1 a 2 mg de polipéptido Ssol por litro de sobrenadante de cultivo.

EjempAo�12:�Inmunioacion genica�uue �impAicaa �Aa �proteina�de �espicuAa�RS)�deA�coronavirus asociado�aA�SRAS RSRAS-CoV)

El efecto de una señal de empalme y de las señales post-transcripcionales WPRE y CTE, se analizó después de la inmunización génica de ratones BALB/c (figura 28).

Para ello, se inmunizaron unos BALB/c a intervalos de 4 semanas por inyección en el tibialis anterior de una solución salina de 50 !g de ADN plasmídico de pcDNA-S y pCI-S así como, a título de control, mediante 50 !g de ADN plasmídico de ADNpc-N (que dirige la expresión de la N del SRAS-CoV), o de pCI-HA (que dirige la expresión de la HA del virus gripal A/PR/8/34), y se recogen los sueros inmunes 3 semanas después de la 2ª inyección. La

presencia de anticuerpos dirigidos contra la S del SRAS-CoV se buscó mediante ELISA indirecto utilizando como antígeno un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV y a título de control, un lisado de VeroE6 no infectadas. Los títulos (TI) en anticuerpos anti-SRAS-CoV se calculan como la inversa de la dilución que produce una DO específica de 0,5 (diferencia entre DO medida sobre lisado de células infectadas y DO medida sobre lisado de células no infectadas) después del revelado mediante un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa (NA931V, Amersham) y de TMB adicionado de H2O2 (KPL) (figura 28A).

En estas condiciones, el plásmido de expresión pcDNA-S permite sólo la inducción de bajos títulos de anticuerpos dirigidos contra la S del SRAS-CoV en 3 ratones de 6 (LOG10(TI)=1,9±0,6), mientras que el plásmido ADNpc-N permite la inducción de anticuerpos anti-N con títulos elevados (LOG10(TI)=3,9±0,3) en todos los animales, y los plásmidos controles (pCI, pCI-HA) no conducen a ningún anticuerpo detectable (LOG10(TI)<1,7). El plásmido pCI-S provisto de una señal de corte y empalme permite la inducción de anticuerpos con títulos elevados (LOG10(TI)=3,7±0,2), que son aproximadamente 60 veces superiores a los observados después de la inyección del plásmido pcDNA-S (p<10-5).

La eficacia de las señales post-transcriptionales se estudió realizando un estudio dosis-respuesta de los títulos en anticuerpos anti-S inducidos en ratón BALB/c en función de la cantidad de ADN plasmídico utilizado como inmunógeno (2 !g, 10 !g y 50 !g). Este estudio (figura 28B) demuestra que la señal post-transcriptional WPRE mejora fuertemente la eficacia de la inmunización génica cuando se utilizan bajas dosis de ADN (p<10-5 para una dosis de 2 !g de ADN y p<10-2 para una dosis de 10 !g), mientras que el efecto de la señal CTE sigue siendo marginal (p=0,34 para una dosis de 2 !g de ADN).

Finalmente, los anticuerpos inducidos en el ratón después de la inmunización génica neutralizan la infectividad del SRAS-CoV in vitro (figuras 29A y 29B) a títulos que están en relación con los títulos medidos por ELISA.

En resumen, el uso de una señal de empalme y de la señal post-transcripcional WPRE del virus de la hepatitis de la marmota mejora de manera considerable la inducción de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el SRAS-CoV después de una inmunización génica con la ayuda de ADN plasmídico que dirige la expresión del ADNc de la S del SRAS-CoV.

EjempAo�13: ApAicaciones�de�diagnosticos�de�Aa�proteinaS

La reactividad en ELISA del polipéptido recombinante Ssol se analizó frente a sueros de pacientes que padecen SRAS.

Los sueros de posibles casos de SRAS ensayados se seleccionaron sobre la base de unos resultados (positivos o negativos) de análisis de su reactividad específica frente a antígenos nativos del SRAS-CoV mediante ensayo de inmunofluorescencia sobre células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV y/o mediante ensayo ELISA indirecto utilizando como antígeno un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV. Los sueros de estos pacientes son identificados mediante un número de orden del Centre National de Référence des virus influenzae, así como por las iniciales del paciente y el número de días transcurridos desde el principio de los síntomas. Todos los sueros de posibles casos (véase la tabla XI) reconocen los antígenos nativos del SRAS-CoV, con la excepción del suero 032552 del paciente VTT, para el cual la infección por el SRAS-CoV no se ha podido confirmar mediante RT-PCR realizada sobre extracciones respiratorias de los días 3, 8 y 12. Un panel de sueros control se usó a título de control (sueros TV): se trata de suero extraídos en Francia antes de la epidemia de SRAS aparecida en 2003.

TabAa�XII:�sueros�de �posibAes�casos�de�SRAS

suero

paciente dia�de�ettraccion

031724

JYK 7

033168

JYK 38

033597

JYK 74

032632

NTM 17

032634

THA 15

032541

PHV 10

032542

NIH 17

032552

VTT 8

032633

PTU 16

032791

JLB 3

033258

JLB 27

032703

JCM 8

033153

JCM 29

Unas fases sólidas sensibilizadas por el polipéptido recombinante Ssol se preparan mediante adsorción de una solución de polipéptido Ssol purificado a 2 !g/ml en PBS en los pocillos de una placa ELISA, después se incuban las placas durante una noche a 4°C, y se lavan con tampón PBS-Tween (PBS, 0,1% Tween20). Después de la

saturación de las placas ELISA mediante una solución de PBS-leche desnatada al 10% (peso/volumen) y del lavado en PBS-tween, los sueros a ensayar (100 !l) se diluyen al 1/400 en un tampón PBS-leche desnatada-Tween (PBS, 3% leche desnatada, 0,1% Tween), y después se añaden en los pocillos de la placa ELISA sensibilizada. Las placas se incuban durante 1h a 37°C. Después de 3 lavados con tampón PBS-Tween, se añade el conjugado anti-IgG humano marcado con la peroxidasa (ref. NA933V, Amersham) diluido al 1/4000 en tampón PBS-leche desnatada-Tween, y después las placas se incuban durante una hora a 37°C. Después de 6 lavados con tampón PBS-Tween, se añaden el cromógeno (TMB) y el sustrato (H2O2) y se incuban las placas durante 10 minutos protegidas de la luz. La reacción se detiene mediante la adición de una solución 1N de H3PO4, y después se mide la absorbencia a 450 nm, con una referencia a 620nm.

Los ensayos ELISA (figura 30) demuestran que el polipéptido recombinante Ssol está reconocido específicamente por los anticuerpos séricos de pacientes que padecen SRAS extraídos en fase media o tardía de la infección ( 10 días después del principio de los síntomas, mientras que no está reconocido significativamente por los anticuerpos séricos de dos pacientes (JLB y JCM) extraídos en fase precoz de la infección (3 a 8 días después del principio de los síntomas) ni por unos sueros control de sujetos que no padecen SRAS. Los anticuerpos séricos de los pacientes JLB y JCM muestran una seroconversión entre los días 3 y 27 para el primero y 8 y 29 para el segundo, después del principio de los síntomas, lo que confirma la especificidad de la reactividad de estos sueros frente al polipéptido Ssol.

En conclusión, estos resultados demuestran que el polipéptido recombinante Ssol se puede utilizar como antígeno para el desarrollo de un ensayo ELISA de diagnético serológico de la infección por el SRAS-CoV.

EjempAo�14: ApAicaciones�como vacuna�de�Aa�proteina�S�soAubAe�recombinante

Se ha estudiado la inmunogenecidad del polipéptido recombinante Ssol en ratones.

Para ello, se ha inmunizado un grupo de 6 ratones con 3 semanas de intervalo con 10 !g de polipéptido recombinante Ssol adicionado de 1 mg de hidróxido de aluminio (Alu-gel-S, Serva) diluido en PBS. Se han realizado tres inmunizaciones sucesivas y los sueros inmunes se extrajeron 3 semanas después de cada una de las inmunizaciones (IS1, IS2, IS3). A título de control, un grupo de ratones (grupo mock) ha recibido el hidróxido de aluminio sólo según el mismo protocolo.

Los sueros inmunes se ha analizado por grupos para cada uno de los 2 grupos mediante ELISA indirecto utilizando un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV como antígeno, y a título de control un lisado de células VeroE6 no infectadas. Los títulos en anticuerpo anti-SRAS-CoV se calculan como la inversa de la dilución que produce una DO específica de 0,5 después del revelado por un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de ratón acoplado con la peroxidasa (NA931V, Amersham) y de TMB adicionado de H2O2 (KPL). Este análisis (figura 31) muestra que la inmunización por el polipéptido Ssol induce en el ratón, a partir de la primera inmunización, unos anticuerpos dirigidos contra la forma nativa de la proteína de espícula del SRAS-CoV, presente en el lisado de células VeroE6 infectadas. Después de 2 y después 3 inmunizaciones, los títulos en anticuerpos anti-S se vuelven muy elevados.

Los sueros inmunes se analizaron por grupo para cada uno de los 2 grupos para su capacidad para seroneutralizar la infectividad del SRAS-CoV. Se realizan 4 puntos de seroneutralización sobre células FRhK-4 (100 TCID50 de SRAS-CoV) para cada una de las diluciones 2 veces ensayadas a partir del 1/20. El título seroneutralizante se calcula según el método de Reed y Munsch como la inversa de la dilución que neutraliza la infectividad de 2 pozos sobre 4. Este análisis muestra que los anticuerpos inducidos en el ratón por el polipéptido Ssol son neutralizantes: los títulos observados son muy elevados después de 2 y después de 3 inmunizaciones (superiores a 2560 y 5120 respectivamente, tabla XIII).

TabAa�XIII :�In duccion�de a nticuerpos �di rigidosc ontrae A�SR AS-CoV�de spues de�Aa �inmuni oacionc one A poAipeptido�recombinante�SsoA. Los sueros inmunes se analizaron por grupo para cada uno de los 2 grupos para su capacidad para seroneutralizar la infectividad de 100 TCID50 del SRAS-CoV sobre células FRhK-4. Se han realizado 4 puntos para cada una de las diluciones de razón 2 ensayadas a partir del 1/20. El título serioneutralizante se calcula según el método de Reed y Munsch como la inversa de la dilución que neutraliza la infectividad de 2 pozos sobre 4.

nrupo

sueros Ac.�neutraAioantes

pi

< 20

Mock

IS1 < 20

IS2

< 20

IS3

< 20

pi

< 20

Ssol

IS1 57

IS2

> 2560

IS3

> 5120

Los títulos neutralizantes observados en los ratones inmunizados con el polipéptido Scol alcanzan niveles muy superiores a los títulos observados por Yang y otros en el ratón (2004, Nature, 428: 561-564) y a los observados por Buchholz en el hámster (2004, PNAS 101: 9804-9809), que protegen respectivamente el ratón y el hámster de la infección por el SRAS-CoV. Es por lo tanto probable que los anticuerpos neutralizantes inducidos en el ratón después de la inmuización por el polipéptido Ssol protegen estos animales contra la infección por el SRAS-CoV.

EjempAo�15:�nen�sintetico optimioado �para�Aa �etpresion�en�ceAuAas de�mamiferos�de �Aa �proteina�de �espicuAa RS)�deA�coronavirus�asociado�aA�SRAS�RSRAS-CoV).

1)�Concepcion�deA gen�sintetico

Se ha concebido un gen sintético que codifica la proteína de espícula del SRAS-CoV a partir del gen del aislado 031559 (plásmido pSRAS-S, C.N.C.M. n° 1-3059) a fin de permitir unos niveles de expresión elevados en unas células de mamíferos, y en particular en las células de origen humana.

Para ello:

-

el uso de los codones del gen salvaje del aislado 031589 se modificó a fin de acercarse a la tendencia observada en el ser humano, y mejorar la eficacia de la traducción del ARNm correspondiente

-

el contenido global en GC del gen se ha aumentado a fin de prolongar la vida media del ARNm correspondiente

-

las unidades, eventualmente crípticas, susceptibles de interferir con una expresión eficaz del gen, se han suprimido (sitios donantes y receptores de corte y empalme, señales de poliadenilación, secuencias muy ricas (>80%) o muy pobres (<30%) en GC, secuencias repetidas, secuencias implicadas en la formación de estructuras secundarias del ARN, cajas TATA)

-

un segundo codón STOP se ha añadido para permitir una terminación eficaz de la traducción.

Además, se han introducido unidades CpG en el gen a fin de aumentar su inmunogenecidad como vacuna de ADN. A fin de facilitar la manipulación del gen sintético, se ha colocado dos sitios de restricción BamH1 y Xho1 a ambos lados de la fase de lectura abierta de la proteína S, y los sitios de restricción BamH1, Xho1, Nhe1, Kpn1, BspE1 y Sall han sido evitados en el gen sintético.

La secuencia del gen sintético concebido (gen 040530) se da en SEC ID nº 140.

Una alineación del gen sintético 040530 con la secuencia del gen salvaje del aislado 031589 del SRAS-CoV depositada en la C.N.CM. bajo el número 1-3059 (SEC ID nº 4, plásmido pSRAS-S) está presentado en la figura 32.

2)�Construcciones�pAasmidicas

El gen sintético SEC ID nº 140 se ensambló a partir de oligonucleótidos sintéticos, y clonado entre los sitios Kpn1 y Sac1 del plásmido pUC-Kana para dar el plásmido 040530pUC-kana. La secuencia nucleotídica del inserto del plásmido 040530pUC-kana se verificó mediante secuenciación automática (Applied).

Se extirpó un fragmento Kpn1-Xho1 que contiene el gen sintético 040530 del plásmido 040530pUC-kana y sub-clon entre los sitios Nhe1 y Xho1 del plásmido de expresión pCI (Promega) para obtener el plásmido pCI-SSYNTH, depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004, bajo el número I-3333.

Un gen sintético que codifica para la forma soluble de la proteína S, se obtuvo después fusionando las secuencias sintéticas que codifican para el ectodominio de la proteína S (aminoácidos 1 a 1193) a las de la etiqueta (FLAG: DYKDDDDK) a través de un enlazador BspE1 que codifica el dipéptido SG. Prácticamente, se ha amplificado un fragmento de ADN que codifica el ectodominio de la S del SRAS-CoV por PCR con la ayuda de los oligonucleótidos 5'-ACTAGCTAGC GGATCCACCA TGTTCATCTT CCTG-3' y 5'-AGTATCCGGAC TTGATGTACT GCTCGTACTT GC-3' a partir del plásmido 040530pUC-kana, digerido por Nhe1 y BspE1 y después insertado entre los sitios únicos Nhe1 y BspE1 del plásmido pCI-Ssol, para dar el plásmido pCI-SCUBE, depositado en la CNCM el 1 de diciembre de 2004, bajo el número I-3332. (Los plásmidos pCI-Ssol, pCI-Ssol-CTE y pCI-Ssol-WPRE (depositados en la CNCM, el 22 de noviembre de 2004, bajo el número I-3324) se obtuvieron anteriormente mediante sub-clonación del fragmento Kpn1-Xho1 extirpado del plásmido pcDNA-Ssol (véase la nota técnica de la DI 2004-106) entre los sitios Nhe1 y Xho1 de los plásmidos pCI, pCI-S-CTE y pCI-S-WPRE, respectivamente.)

Los plásmidos pCI-Scube y pCI-Ssol codifican para el mismo polipéptido recombinante Ssol.

3)�ResuAtados

La capacidad del gen sintético que codifica la proteína S para dirigir eficazmente la expresión de la S del SRAS-CoV en unas células de mamíferos se ha comparado con la del gen salvaje después de la transfección transitoria de las células de primates (VeroE6), y de células humanas (293T).

En el experimento representado por la figura 33, y en la tabla XIV, se han transfectado unas monocapas de 5x105 células VeroE6 o 7x105 células 293T en cajas de Petri de 35 mm con 2 !g de plásmidos pCI (a título de control), pCI-S, pCI-S-CTE, pCI-S-WPRE y pCI-Ssynth y 6 !l de agente reactivo Fugene6 según las indicaciones del fabricante (Roche). Después de 48 horas de incubación a 37°C y bajo 5% de CO2, se han preparado unos extractos celulares en tampón de depósito según Laemmli, separados sobre un gel SDS al 8% de poliacrilamida y después transferidos sobre una membrana de PVDF (BioRad). La detección de esta inmunohuella («western blot») se ha realizado con la ayuda de un suero policlonal de conejo anti-S (suero inmune del conejo P11135: véase el Ejemplo 4 anterior) y de anticuerpos policlonales de asno dirigidos contra las IgG de conejo y acoplados con la peroxidasa (NA934V, Amersham). La inmunohuella se revela de manera cuantitativa por luminescencia con la ayuda del kit ECL+ (Amersham), y adquisición sobre un dispositivo de imágenes digitales (FluorS, BioRad).

El análisis de los resultados obtenidos con el programa QuantityOne v4.2.3 (BioRad) muestra que en este experimento, el plásmido pCI-Synth permite la expresión transitoria de la proteína S a niveles elevados en las células VeroE6 y 293T, mientras que el plásmido pCI-S no permite inducir una expresión a niveles suficientes para ser detectada. Los niveles de expresión observados son del orden de 2 veces superiores a los observados con el plásmido pCI-S-WPRE.

TabAa�XIV:�UtiAioacion�de�un gen�sintetico para�Aa�etpresion de �Aa�S�deA �SRAS-CoV. Se separaron unos extractos celulares preparados 48 horas después de la transfección de célulasVeroE6 o 293T por los plásmidos pCI, pCI-S, pCI-S-CTE, pCI-S-WPRE y pCI-Ssynth sobre un gel SDS al 8% de acrilamida y analizados mediante transferencia western con la ayuda de un anticuerpo policlonal de conejo anti-S y de un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de conejo acoplado con la peroxidasa (NA934V, Amersham). La transferencia western se revela mediante luminescencia (ECL+, Amersham), y la adquisición sobre un dispositivo de imágenes digitales (FluorS, BioRad). Los niveles de expresión de la proteína S se han medido cuantificando las 2 bandas mayoritarias localizadas en la imagen (véase la figura 33), y son indicados en función de una escala arbitraria en la que el valor de 1 representa el nivel medido después de la transfección del plásmido pCI-S-WPRE.

pAasmido

VeroE6 293T

pCI

0,0 0,0

pCI-S

< 0,1 < 0,1

pCI-S-CTE

0,5 < 0,1

pCI-S-WPRE

1,0 1,0

PCI-Ss3nth

1,8 1,9

En una segunda etapa, la capacidad del gen sintético Scube para dirigir eficazmente la síntesis y la secreción del polipéptido Ssol por unas células de mamíferos se ha comparado a la del gel salvaje después de la transfección transitoria de células de hámster (BHK-21) y de células humanas (293T).

En el experimento presentado por la tabla XV, se han transfectado unas monocapas de 6x105 células BHK-21 y de 7x105 células 293T en cajas de Petri de 35 mm con 2 !g de los plásmidos pCI (a título de control), pCI-Ssol, pCISsol-CTE, pCI-Ssol-WPRE y pCI-Scube y 6 !l de agente reactivo Fugene6 según las indicaciones del fabricante (Roche). Después de 48 horas de incubación a 37°C y bajo 5% de CO2, los sobrenadantes celulares se extrajeron y analizaron de manera cuantitativa para la secreción del polipéptido Ssol mediante un ensayo ELISA-captura específico del polipéptido Ssol.

El análisis de los resultados muestra que, en este experimento, el plásmido pCI-Scube permite la expresión del polipéptido Ssol a niveles 8 veces (células BHK-21) a 20 veces (células 293T) más elevados que el plásmido pCI-Ssol. Los niveles de expresión observados son del orden de 2 veces (células 293T) a 5 veces (células BHK-21) superiores a los observados con el plásmido pCI-Ssol-WPRE.

TabAa�XV :�UtiAioacion�deu n�gen�sintetico�para �Aa�etpresion�deA poAipeptidoS soA. Los sobrenadantes se recogieron 48 horas después de la transfección de células BHK o 293T por los plásmidos pCI, pCI-Ssol, pCI-Ssol-CTE, pCI-Ssol-WPRE y pCI-Scube y analizados de manera cuantitativa para la secreción del polipéptido Ssol mediante un ensayo ELISA-captura específico del polipéptido Ssol. Las transfecciones se han realizado en duplicado y los resultados se indican en forma de medias y desviación típica de las concentraciones de polipéptido Ssol (ng/ml) medidas en los sobrenadantes.

PAasmido

LEK 293T

Pci

< 20 < 20

pCI-SsoA

< 20 56 ± 10

pCI-SsoA-CTE

< 20 63 ± 8

pCI-SsoA-WPRE

28 ± 1 531 ± 15

PCI-Scube

152 ± 6 1140 ± 20

En resumen, estos resultados muestran que la expresión en unas células de mamíferos del gen sintético 040530 que codifica la S del SRAS-CoV bajo la dependencia de secuencias promotoras del ARN polimerasa II es mucho más eficaz que la del gen salvaje del aislado 031589. Esta expresión es incluso más eficaz que la dirigida por el gen salvaje en presencia de de las secuencias WPRE del virus de la hepatitis de la marmota.

4)�ApAicaciones

El uso del gen sintético 040530 que codifica la S del SRAS-CoV, o de su variante Scube que codifica el polipéptido Ssol es susceptible de sustituir ventajosamente el gen salvaje en numerosas aplicaciones, en las que la expresión de la S es necesaria a niveles elevados. En particular, para:

-

mejorar la eficacia de la inmunización génica por unos plásmidos del tipo pCI-Ssynth incluso pCI-Ssynth-CTE o pCI-Ssynth-WPRE

-

establecer nuevas líneas celulares que expresan cantidades más elevadas de la proteína S o del polipéptido Ssol con la ayuda de vectores lentivirales recombinantes portadores del gen Ssynth o del gen Scube respectivamente

-

mejorar la inmunogenecidad de los vectores lentivirales recombinantes que permite la expresión de la proteína S o del polipéptido Ssol

-

mejorar la inmunogenecidad de vectores vivos que permiten la expresión de la proteína S o del polipéptido Ssol como unos virus recombinantes de la vacuna antivariólica, o unos virus de la rubeola recombinantes (véanse los ejemplos ejemplos 16 y 17 a continuación)

EjempAo�16:�Etpresion�de �Aa�proteina�de �espicuAa�RS)�deA�coronavirus �asociado�aA�SRAS �RSRAS-CoV)�con�Aa a3uda�de virus�recombinantes�de�Aa vacuna�antivarioAica.

ApAicacion�vacuna.

ApAicacion�a�Aa�produccion�de�una�forma�soAubAe�de�Aa�proteina�de�espicuAa�RS)3 concepcion�de�un�ensa3o seroAogico�deA �SRAS.

1)�Introduccion

El objetivo de este ejemplo es evaluar la capacidad de virus recombinantes de la vacuna antivariólica (VV), que expresa diferentes antígenos del coronavirus asociado al SRAS (SRAS-CoV) para constituir nuevos candidatos vaccíneos contra el SRAS y un medio para producir unos antígenos recombinantes en células de mamíferos.

Para ello, los inventores se han interesado por la proteína de espícula (S) del SRAS-CoV, que permite inducir después de la inmunización génica en el animal, unos anticuerpos que neutralizan la infectividad del SRAS-CoV, así como a una forma soluble y secretada de esta proteína, el polipéptido Ssol, que es un compuesto del ectodominio (aa 1-1193) de la S fusionado en su extremo C-ter a una etiqueta FLAG (DYKDDDDK) vía un enlazador BspE1 que codifica el dipéptido SG. Este polipéptido Ssol presenta una antigenecidad similar a la de la proteína S y permite, después de la inyección al ratón en forma de una proteína purificada adicionada en hidróxido de aluminio, la inducción de títulos elevados de anticuerpos neutralizantes contra el SRAS-CoV.

Las diferentes formas del gen S se han colocado bajo la dependencia del promotor del gen 7.5K y después se han introducido en el locus de la timidina kinasa (TK) de la cepa Copenhague del virus de la vacuna antivariólica mediante doble recombinación homóloga in vivo. A fin de mejorar la inmunogenecidad de los virus de la vacuna antivariólica recombinantes, se ha seleccionado un promotor tardío sintético en lugar del promotor 7.5K, para aumentar la producción de S y Ssol durante unas fases tardías del ciclo viral.

Después de aislar los virus de la vacuna antivariólica recombinantes y de verificar su capacidad para expresar el antígeno S del SRAS-CoV, se ha ensayado su capacidad para inducir en el ratón una respuesta inmunitaria contra el SRAS. Después de haber purificado el antígeno Ssol del sobrenadante de células infectadas, se ha concebido un

ensayo ELISA de serodiagnóstico del SRAS, y se ha evaluado su eficacia con la ayuda de sueros de posibles casos de SRAS.

2)�Construccion�de virus�recombinantes

Se obtuvieron virus recombinantes de la vacuna antivariólica, que dirigen la expresión de la glicoproteína S del aislado 031589 del SRAS-CoV y de forma soluble y secretada de esta proteína, el polipéptido Ssol, bajo la dependencia del promotor 7.5K. Con el objetivo de aumentar los niveles de expresión de S y Ssol, se obtuvieron también unos virus recombinantes, en los que los ADNc de S y de Ssol están dispuestos bajo la dependencia de un promotor sintético tardío.

El plásmido pTG186poli es un plásmido de transferencia para la construcción de virus recombinantes de la vacuna antivariólica (Kieny, 1986, Biotechnology, 4:790-795). Para ello, contiene el gen de la timidina kinasa del VV en el que se ha insertado el promotor del gen 7.5K, seguido de un sitio múltiple de clonación que permite la inserción de genes heterólogos (figura 34A). El promotor del gen 7.5K contiene un grupo de dos secuencias promotoras activas respectivamente durante las fases precoces (PE) y tardías (PL) del ciclo de replicación del virus de la vacuna antivariólica. Los fragmentos BamH1-Xho1 se han extirpado de los plásmidos pTRIP-S y pcDNA-Ssol respectivamente e insertados entre los sitios BamH1 y Sma1 del plásmido pTG186poli para dar los plásmidos pTG-S y pTG-Ssol (figura 34A). Los plásmidos pTG-S y pTG-Ssol se han depositado en la CNCM, el 2 de diciembre de 2004, bajo los números I-3338 e I-3339, respectivamente.

Los plásmidos pTN480, pTN-S y pTN-Ssol se obtuvieron a partir de los plásmidos pTG186poli, pTG-S y pTG-Ssol respectivamente, sustituyendo el fragmento Nde1-Pst1 que contiene el promotor 7.5K por un fragmento de ADN que contiene el promotor tardío sintético 480, que se obtuvo mediante hibridación de los oligonucleótidos 5'-TATGAGCTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGGC ATATAAATAG ACTCGGCGCG CCATCTGCA-3' y 5'-GATGGCGCGC CGAGTCTATT TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TCA-3' (figura 34B). El inserto se ha secuenciado con la ayuda de un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) y de un secuenciador automático ABI377. La secuencia del promotor sintético tardío 480 tal como se clonó en los plásmidos de transferencia de la serie pTN está indicada en la figura 34C. Los plásmidos pTN-S y pTN-Ssol se han depositado en la CNCM, el 2 de diciembre de 2004, bajo los números 1-3340 e I-3341, respectivamente.

Los virus recombinantes de la vacuna antivariólica se obtuvieron mediante doble recombinación homóloga in vivo entre el casete TK de los plásmidos de transferencia de las series pTG y pTN y el gen TK de la cepa Copenhague del virus de la vacuna antivariólica según un procedimiento descrito por Kieny y otros (1984, Nature, 312: 163-166). Brevemente, se transfectan unas células CV-1 con la ayuda de DOTAP (Roche) mediante el ADN genómico de la cepa Copenhague del virus de la vacuna antivariólica y cada uno de los plásmidos de transferencia de las series pTG y pTN descritos anteriormente, y después se sobreinfecta por el virus de la vacuna antivariólica auxiliar VV-ts7 durante 24 horas a 33°C. El virus auxiliar está contra-seleccionado por incubación a 40°C durante 2 días, y después los virus recombinantes (fenotipo TK-) se seleccionan mediante dos ciclos de clonación en medio agar sobre células 143Btk- en pesencia de BuDr (25 !g/ml). Los 6 virus VV-TG, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S y VV-TN-Ssol se obtuvieron respectivamente con la ayuda de los plásmidos de transferencia pTG186poli, pTG-S, pTG-Ssol, pTN480, pTN-S, pTN-Ssol. Los virus VV-TG y VV-TN no expresan ningún gen heterólogo y han sido utilizados como control TK- en los experimentos. Las preparaciones de virus recombinantes se han realizado sobre monocapas de células CV-1 o BHK-21, y el título en unidades que forma el intervalo (u.f.p.) determinado sobre células CV-1 según Earl y Moss (1998, Current Protocols in Molecular Biology, 16.16.1-16.16.13).

3)�Caracterioacion�de �Aos virus�recombinantes

Se ha buscado la expresión de los transgenes que codifican la proteína S y el polipéptido Ssol mediante transferencia western.

Se han infectado monocapas de células CV-1 con una multiplicidad de 2 por los diferentes virus de la vacuna antivariólica recombinantes VV-TG, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S y VV-TN-Ssol. Después de 18 horas de incubación a 37°C y bajo 5% de CO2, se han preparado unos extractos celulares en tampón de depósito según Laemmli, se han separado sobre gel SDS al 8% de poliacrilamida, y después se han transferido sobre una membrana de PVDF (BioRad). La detección de esta inmunohuella («western blot») se ha realizado con la ayuda de un suero policlonal de conejo anti-S (suero inmune del conejo P11135: véase el ejemplo 4) y de anticuerpos policlonales de asno dirigidos contra las IgG de conejo, y acoplados con la peroxidasa (NA934V, Amersham). Los anticuerpos fijados se han revelado mediante luminescencia con la ayuda del kit ECL+ (Amersham) y de películas de autorradiografía Hyperfilm MP (Amersham).

Como se muestra en la figura 35A, el virus recombinante VV-TN-S dirige la expresión de la proteína S a niveles que son comparables a los que se puede observar 8h después de la infección por el SRAS-CoV pero que son mucho más elevados que los que se pueden observar después de la infección por VV-TG-S. En un segundo experimento (figura 35B), el análisis de cantidades variables de extractos celulares muestra que los niveles de expresión observados después de la infección por los virus de la serie TN (VV-TN-S y VV-TN-Ssol) son aproximadamente 10

veces más elevados que los observados con los virus de la serie TG (VV-TG-S y W-TG-Ssol respectivamente). Además, el polipéptido Ssol está secretado en el sobrenadante de células CV-1 infectadas por el virus VV-TN-Ssol más eficazmente que en el sobrenadante de células infectadas por VV-TG-Ssol (figura 36A). En este experimento, el virus VV-TN-Sflag se utilizó a título de control, porque expresa la forma membranaria de la proteína S fusionada en su extremo C-ter a la etiqueta FLAG. La proteína Sflag no está detectada en el sobrenadante de las células infectadas por VV-TN-Sflag, lo que demuestra que el polipéptido Ssol está bien secretado de manera activa después de la infección por W-TN-Ssol.

Estos resultados demuestran que los virus de la vacuna antivariólica recombinantes son portadores de los transgenes, y permiten la expresión de la glicoproteína del SRAS en su forma membranaria (S) o en una forma soluble y secretada (Ssol). El virus de la vacuna antivariólica portador del promotor sintético 480 permite la expresión de S y la secreción de Ssol a niveles mucho más elevados que los virus portadores del promotor del gen 7.5K.

4) ApAicacion a�Aa�produccion �de�una�forma�soAubAe de�Aa �S�deA�SRAS-CoV.

Purificacion�de�este�antigeno�recombinante3 apAicaciones�de�diagnosticos.

La línea BHK-21 es la línea celular que segregan las cantidades más elevadas de polipéptido Ssol después de la infección por el virus VV-TN-Ssol entre las líneas ensayadas (BHK-21, CV1, 293T y FrhK-4, figura 36B); permite la producción y la purificación en cantidad del polipéptido recombinante Ssol. En un experimento del tipo en el que las condiciones experimentales de infección, de producción y de purificación se han optimizado, las células BHK-21 están inoculadas en un medio de cultivo estándar (DMEM sin piruvato que contiene 4,5 g/l de glucosa y suplementado por 5% de TPB, 5% de SVF, 100 U/ml de penicilina y 100 !g/ml de estreptomicina) en forma de una monocapa sub-confluente (10 millones de células para cada 100 cm2 en 25 ml de medio). Después de 24h de incubación a 37°C bajo 5% de CO2, las células son infectadas a una M.O.I. de 0,03 y el medio estándar se sustituye por el medio de secreción en el que la cantidad de SVF está disminuido al 0,5% y el TPB está suprimido. El sobrenadante de cultivo se extrae después de 2,5 días de incubación a 35°C y bajo 5% de CO2 y el virus de la vacuna antivariólica se inactiva mediante adición de tritón X-100 (0,1%). Después de la filtración sobre membrana de poliétersulfona (PES) de 0,1 !m, el polipéptido recombinante Ssol se purifica mediante una cromatografía de afinidad sobre la plantilla anti-FLAG con elución por una solución de péptido FLAG (DYKDDDDK) a 100 !g/ml en TBS (Tris 50mM pH 7,4, 150 mMNaCl).

El análisis por gel SDS al 8% de acrilamida coloreado con nitrato de plata ha puesto en evidencia un polipéptido mayoritario cuya masa molecular es de aproximadamente 180kD y cuyo grado de pureza es superior al 90% (figura 37).La concentración del polipéptido recombinante Ssol purificado se determinó mediante comparación con los marcadores de masa molecular, y se estima a 24 ng/!l.

Esta preparación de polipéptido Ssol purificado permite realizar una escala estándar para medir, con la ayuda de un ensayo ELISA-captura, las concentraciones de Ssol presentes en los sobrenadantes de cultivo. Según este ensayo, la línea BHK-21 segrega aproximadamente 1 !g/ml de polipéptido Ssol en condiciones de producción descritas anteriormente. Además, el esquema de purificación presentado permite purificar del orden de 160 !g de polipéptido Ssol por litro de sobrenadante de cultivo.

La reactividad en ELISA del polipéptido recombinante Ssol se ha analizado frente a sueros de pacientes que padecen STRAS.

Los sueros de posibles casos de SRAS ensayados se seleccionaron en base a resultados (positivos o negativos) de análisis de su reactividad específica frente a antígenos nativos del SRAS-CoV mediante ensayo de inmunofluorescencia sobre células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV y/o mediante el ensayo ELISA indirecto utilizando como antígeno un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV. Los sueros de estos pacientes son identificados por un número de orden del Centre National de Référence des virus influenzae, así como mediante las iniciales del paciente, y el número de días transcurridos desde el principio de los síntomas. Todos los sueros de posibles casos (véase la tabla XVI) reconocen los antígenos nativos del SRAS-CoV con la excepción del suero 032552 del paciente VTT, para el cual la infección por el SRAS-CoV no se ha podido confirmar por RT-PCR realizada sobre extracciones respiratorias de los días 3, 8 y 12. Un panel de sueros control se ha utilizado a título de control (sueros TV): se trata de sueros extraídos en Francia antes de la epidemia de SRAS aparecida en 2003.

TabAa�XVI:�sueros�de �posibAes�casos�de�SRAS

suero

paciente Dia�de�ettraccion

033168

JYK 38

033597

JYK 74

032632

NTM 17

032634

THA 15

032541

PHV 10

032542

NIH 17

032552

VTT 8

032633

PTU 16

Se han preparado unas fases sólidas sensibilizadas por el polipéptido recombinante Ssol mediante adsorción de una solución de polipéptido Ssol purificado a 4 !g/ml en PBS en los pocillos de una placa ELISA. Las placas se incuban durante una noche a 4°C y después se lavan con tampón PBS-Tween (PBS, 0,1% Tween20). Después del lavado en PBS-tween, los sueros a ensayar (100 !l) se diluyen al 1/100 y al 1/400 en tampón PBS-leche desnatada-Tween (PBS, 3% leche desnatada, 0,1% Tween) y después se añaden en los pocillos de la placa ELISA sensibilizada. Las placas se incuban durante 1h a 37°C. Después de 3 lavados con tampón PBS-Tween, se añade el conjugado anti-IgG humano marcado con la peroxidasa (ref NA933V, Amersham) diluido al 1/4000 en tampón PBS-leche desnatada-Tween, y después se incuban las placas una hora a 37°C. Después de 6 lavados con tampón PBS-Tween, se añaden el cormógeno (TMB) y el sustrato (H2O2), y se incuban las placas durante 10 minutos protegidas de la luz. La reacción se detiene mediante adición de una solución 1M de H3PO4, y después se mide la absorbencia a 450 nm con una referencia a 620 nm.

Los ensayos ELISA (figura 38) demuestran que el polipéptido recombinante Ssol está reconocido específicamente por los anticuerpos séricos de pacientes que padecen SRAS extraídos en fase media o tardía de la infección ( ุ10 días después del principio de los síntomas), mientras que no se ha reconocido de manera significativa por los

anticuerpos séricos de los sueros controles de sujetos que no padecen SRAS.

En conclusión, estos resultados demuestran que el polipéptido recombinante Ssol puede ser purificado a partir del sobrenadante de células de mamíferos infectadas por el virus de la vacuna antivariólica recombinante VV-TN-Ssol y ser utilizado como antígeno para la realización de un ensayo ELISA de diagnóstico serológico de la infección por el SRAS-CoV.

5)�ApAicaciones�vacunas

Se ha estudiado la inmunogenecidad de los virus de la vacuna antivariólica recombinantes en el ratón.

Para ello, se han inmunizado unos grupos de 7 ratones BALB/c por vía i.v. dos veces con 4 semanas de intervalo por 106 u.f.p. de virus de la vacuna antivariólica recombinantes VV-TG, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S y VV-TN-Ssol así como, a título de control, VV-TG-HA que dirige la expresión de la hematoglutinina de la cepa A/PR/8/34 del virus de la gripe. Los sueros inmunes se han extraído 3 semanas después de cada una de las inmunizaciones (IS1, IS2).

Los sueros inmunes se han analizado por grupos para cada uno de los grupos por ELISA indirecto, utilizando un lisado de células VeroE6 infectadas por el SRAS-CoV como antígeno y a título de control, un lisado de células VeroE6 no infectadas. Los títulos (TI) en anticuerpos anti-SRAS-CoV se calculan como la inversa de la dilución que produce una DO específica de 0,5 después del revelado por un anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de ratón acoplado con la peroxidasa (NA931 V, Amersham), y de TMB adicionado de H2O2 (KPL). Este análisis (figura 39A) muestra que la inmunización por el virus VV-TG-S y VV-TN-S induce en el ratón, a partir de la primera inmunización, unos anticuerpos dirigidos contra la forma nativa de la proteína de espícula del SRAS-CoV presente en el lisado de células VeroE6 infectadas. Las respuestas inducidas por el virus VV-TN-S son más elevadas que las inducidas por el virus VV-TG-S después de la primera (TI=740 y TI=270 respectivamente) y de la segunda (TI=3230 y TI=600 respectivamente) inmunización. El virus VV-TN-Ssol induce fuertes títulos de anticuerpos anti-SRAS-CoV después de dos inmunizaciones (TI=640), mientras que el virus VV-TG-Ssol induce una respuesta al límite de la detección (TI=40).

Se han analizado los sueros inmunes por grupos para cada uno de los grupos para su capacidad a seroneutralizar la infectividad del SRAS-CoV. Se realizan 4 puntos de seroneutralización sobre células FRhK-4 (100 TCID50 de SRAS-CoV) para cada una de las diluciones 2 veces ensayadas a partir del 1/20. El título seroneutralizante se calcula según el método de Reed y Munsch como la inversa de la dilución que neutraliza la infectividad de 2 pozos sobre 4. Este análisis muestra que los anticuerpos inducidos en el ratón por los virus de la vacuna antivariólica que expresa la proteína S o el polipéptido Ssol son netralizantes y que los virus de promotores sintéticos son unos inmunógenos más eficaces que los virus portadores del promotor 7.5K: los títulos más elevados (640) son observados después de 2 inmunizaciones por el virus VV-TN-S (figura 39B).

El poder protector de los anticuerpos neutralizantes inducidos en el ratón después de la inmunización por los virus de la vacuna antivariólica recombinantes se evalúa con la ayuda de una infección de prueba por el SRAS-CoV.

6)�Otras�apAicaciones

Se construyen virus de la vacuna antivariólica recombinantes de tercera generación sustituyendo las secuencias salvajes de los genes S y Ssol por unos genes sintéticos optimizados para la expresión en células de mamíferos, descritos anteriormente. Estos virus de la vacuna antivariólica recombinantes son susceptibles de expresar unas cantidades más importantes de antígenos S y Ssol, y por lo tanto una inmunogenecidad incrementada.

El virus recombinante de la vacuna antivariólica VV-TN-Ssol se puede utilizar para la producción en cantidad y la purificación del antígeno Ssol, para aplicaciones de diagnósticos (seorología por ELISA) y vacunas (vacuna subunitaria).

EjempAo�17: Virus�recombinante�de Aa rubeoAa�uue etpresa�Aa �proteina�de �espicuAa�RS) �deAcoronavirus asociado�aA�SRAS�RSRAS-CoV). ApAicaciones vacunas.

1)�Introduccion

La vacuna de la rubeola (MV) induce en el ser humano una inmunidad protectora de larga duración después de una sola inyección (Hilleman, 2002, Vaccine, 20: 651-665). La protección conferida es muy firme y se basa en la inducción de una respuesta en anticuerpos y de una respuesta celular CD4 y CD8. El genoma del MV es muy estable y no se ha observado jamás ninguna reversión hacia la virulencia de las cepas de vacuna. El virus de la rubeola pertenece al género de los Morbillivirus de la familia de los Paramyxoviridae; es un virus recubierto cuyo genoma es un ARN monocatenario de polaridad negativa de 16kb (figura 40A) y cuyo ciclo de replicación exclusivamente citoplásmido excluye cualquier posibilidad de integración en el genoma del hospedante. La vacuna de la rubeola es así una de las vacunas vivas más eficaz y más segura utilizadas en la población humana. El equipo de Frédéric Tangy ha desarrollado recientemente un vector de expresión en base a la cepa Schwarz del virus de la rubeola, que es la cepa atenuada más segura y más utilizada en el ser humano como vacuna contra la rubeola. Esta cepa vacuna puede ser aislada a partir de un clon molecular infeccioso, conservando al mismo tiempo su inmunogenecidad en los primates así como el ratón susceptibles a la infección. Constituye, después de la inserción de unidades de transcripción suplementarias, un vector para la expresión de secuencias heterólogas (Combredet, 2003, J. Virol. 77: 11546-11554). Además, un MV Schwarz recombinante que expresa la glicoproteína de envoltura del virus West Nile (WNV) induce una respuesta en anticuerpos eficaz y de larga duración que protege el ratón de una infección de prueba letal por el WNV (Despres y otros, 2004, J. Infect. Dis., en impresión). Todas estas características hacen de la cepa atenuada Schwarz del virus de la rubeola un candidato vector extremadamente prometedor para la construcción de nuevas vacunas vivas recombinantes.

El objetivo de este ejemplo es evaluar la capacidad de virus recombinantes de la rubeola (MV) que expresa diferentes coronavirus asociado al SRAS (SRAS-CoV) para constituir nuevos candidatos vaccíneos contra el SRAS.

Los inventores se han interesado en la proteína de espícula (S) del SRAS-CoV, que permite inducir después de la inmunización génica en el animal unos anticuerpos que neutralizan la infectividad del SRAS-CoV, así como una forma soluble y secretada de esta proteína, el polipéptido Ssol, que está compuesto del ectodominio (aa 1-1193) de la S fusionado en su extremo C-ter a una etiqueta FLAG (DYKDDDDK) a través de un enlazador BspE1 que codifica el dipéptido SG. Este polipéptido Ssol presenta una antigenecidad similar a la de la proteína S y permite, después de la inyección al ratón en forma de una proteína purificada adyuvada en hidróxido de aluminio, la inducción de títulos elevados de anticuerpos que neutralizantes contra el SRAS- CoV.

Las diferentes formas del gen S se han introducido en forma de una unidad de transcripción suplementaria entre los genes P (fosfoproteína) y M (plantilla) en el ADNc de la cepa Schwarz del MV anteriormente descrito (Combredet, 2003, J. Virol. 77: 11546-11554; solicitud EP N° 02291551.6 del 20 de junio de 2002, y solicitud EP N° 02291550.8 del 20 de junio de 2002). Después de aislar los virus recombinantes MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol y verificar su capacidad para expresar el antígeno S del SRAS-CoV, se ensaya su capacidad para inducir en el ratón y después en el mono una respuesta inmunitaria protectora contra el SRAS.

2)�Construccion�de �Aos virus�recombinantes

El plásmido pTM-MVSchw-ATU2 (figura 40B) contiene un ADNc infeccioso que corresponde al antigénoma de la cepa vacuna Schwarz del virus de la rubeola (MV) en el que una unidad de transcripción suplementaria (ATU) se ha introducido entre los genes P (fosfoproteína) y M (plantilla) (Combredet, 2003, Journal of Virology, 77: 11546-11554). Se han construido unos genomas recombinantes MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol del virus de la rubeola mediante la inserción de los ORF de la proteína S, y del polipéptido Ssol en la unidad de transcripción suplementaria del vector MVSchw-ATU2.

Para ello, un fragmento de ADN que contiene el ADNc de la S du SRAS-CoV se ha amplificado mediante PCR con la ayuda de los oligonucleótidos 5'-ATACGTACGA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3' y 5'-ATAGCGCGCT CAT-TATGTGT AATGTAATTT GACACCCTTG-3' utilizando el plásmido ADNpc-S como plantilla, y

después insertado en el plásmido pCR®2.1-TOPO (Invitrogen) para obtener el plásmido pTOPO-S-MV. Los dos oligonucleótidos utilizados contienen unos sitios de restricción BsiW1 y BssHII, a fin de permitir la inserción ulterior en el vector de la rubeola, y se han concebido a fin de generar una secuencia de 3774 nt que incluye los codones de iniciación y de terminación, a fin de respectar la regla de los 6 que estipula que la longitud del genoma de un virus de la rubeola debe ser divisible por 6 (Calain & Roux, 1993, J. Virol., 67: 4822-4830; Schneider y otros, 1997, Virology,

227: 314-322). El inserto se ha secuenciado con la ayuda de un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) y de un secuenciador automático ABI377.

Con el fin de expresar una forma soluble y secretada de la S del SRAS-CoV, se ha obtenido después un plásmido que contiene el ADNc del polipéptido Ssol que corresponde al ectodominio (aa 1-1193) de la S del SRAS-CoV fusionado en su extremo C-ter a la secuencia de una etiqueta FLAG (DYKDDDDK) a través de un enlazador BspE1 que codifica el dipéptido SG. Para ello, se ha amplificado un fragmento de ADN con la ayuda de los oligonucleótidos 5'-CCATTTCAAC AATTTGGCCG-3' y 5'- ATAGGATCCG CGCGCTCATT ATTTATCGTC GTCATCTTTATAATC-3' a partir del plásmido pCDNA-Ssol, y después insertado en el plásmido pTOPO-S-MV entre los sitios Sal1 y BamH1 para obtener el plásmido pTOPO-S-MV-SF. La secuencia generada es larga de 3618 nt entre los sitios BsiW1 y BssHII y respeta la regla de los 6. El inserto se ha secuenciado como se ha indicado anteriormente.

Los fragmentos BsiW1-BssHII que contienen los ADNc de la proteína S y del polipéptido Ssol se han extirpado después mediante digestión de los plásmidos pTOPO-S-MV y pTOPO-S-MV-SF y después se han sub-clonado entre los sitios correspondientes del plásmido pTM-MVSchw-ATU2 para dar los plásmidos pTM-MVSchw2-SRAS-S y pTM-MVSchw2-SRAS-Ssol (figura 40B). Estos dos plásmidos se han depositado en la C.N.C.M. el 1 de diciembre de 2004, bajo los números 1-3326 y 1-3327, respectivamente.

Los virus de la rubeola recombinantes que corresponden a los plásmidos pTM-MVSchw2-SRAS-S y pTM-MVSchw2-SRAS-Ssol se han obtenido mediante genética inversa según el sistema que se basa en el uso de una línea celular auxiliar, descrito por Radecke y otros (1995, Embo J., 14: 5773-5784) y modificado por Parks y otros (1999, J. Virol.,

73: 3560-3566). Brevemente, las células auxiliares 293-3-46 son transfectadas según el método con fosfato de calcio por 5 !g de los plásmidos pTM-MVSchw2-SRAS-S o pTM-MVSchw2-SRAS-Ssol y 0,02 !g del plásmido pEMC-La que dirige la expresión de la polimerasa L del MV (donación de M. A. Billeter). Después de una noche de incubación a 37°C, se realiza un choque térmico durante 2 horas a 43°C y las células transfectadas son transferidas sobre una monocapa de células Vero. Para cada uno de los dos plásmidos, unos sincitios han aparecido después de 2 a 3 días de cocultivo, y se han transferido sucesivamente sobre una monocapas de células Vero al 70% de confluencia en cajas de petri de 35 mm y después en frascos de 25 y 75 cm2. Cuando los sincitios alcanzan 80-90% de confluencia, se recuperan las células con la ayuda de un raspador, y después se congelan y se descongelan una vez. Después de una centrifugación a baja velocidad, el sobrenadante que contiene el virus se conserva alícuotamente a -80°C. Los títulos de los virus recombinantes MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol se han determinado mediante dilución límite sobre células Vero y el título en dosis que infecta al 50% los pozos (TCID50) se ha calculado según el método de Karber.

3)�Caracterioacion�de �Aos virus�recombinantes

Se ha buscado la expresión de los transgenes que codifican la proteína S y el polipéptido Ssol mediante transferencia western e inmunofluorescencia.

Se han infectado unas monocapas de células Vero en frascos T-25 a una multiplicidad de 0,05 mediante diferentes pasos de los dos virus MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol y el virus salvaje MWSchw a título de control. Cuando los sincitios alcanzan 80 a 90% de confluencia, se preparan unos extractos citoplásmicos en un tampón de extracción (150 mMNaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1% tritón-X-100, 0,1% SDS, 1% DOC) y después se diluye en tampón de depósito según Laemmli, se separan sobre un gel SDS al 8% de poliacrilamida y se transfieren sobre una membrana de PVDF (BioRad). La detección de esta inmunohuella («western blot») se realiza con la ayuda de un suero policlonal de conejo anti-S (suero inmune del conejo P11135: véase el ejemplo 4 anterior) y de anticuerpos policlonales de asno dirigidos contra las IgG de conejo y acoplados con la peroxidasa (NA934V, Amersham). Los anticuerpos fijados se revelan mediante luminiscencia con la ayuda del kit ECL+ (Amersham) y de películas de autorradiografía Hyperfilm MP (Amersham).

Se han infectado células Vero en monocapas sobre láminas de vidrio mediante los dos virus MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol y el virus salvaje MWSchw a título de control a multiplicidades de infección de 0,05. Cuando los sincitios alcanzan del 90 al 100% (virus MVSchw2-SRAS-Ssol) o del 30 al 40% (MVSchw2-SRAS-S,MWSchw) de confluencia, las células se fijan en una solución de PBS-PFA 4%, se permeabilizan mediante una solución de PBS que contiene 0,2% de tritón y después se marcan mediante anticuerpos policlonales de conejos hiperinmunizados por medio de los viriones purificados y inactivados del SRAS-CoV, y mediante un conjugado de anticuerpos de cabra anti-IgG(H+L) de conejo acoplado al FITC (Jackson).

Como se muestra en las figuras 41 y 42, los virus recombinantes MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol dirigen la expresión de la proteína S y del polipéptido Ssol respectivamente a niveles comparables a los que se pueden observar 8h después de la infección por el SRAS-CoV. La expresión de estos polipéptidos es estable después de 3

pasos de los virus recombinantes en cultivo celular. Estos resultados demuestran que los virus de la rubeola recombinantes son bien portadores de los transgenes y permiten la expresión de la glicoproteína del SRAS en su forma membranaria (S) o en una forma soluble (Ssol). Se espera que el polipéptido Ssol sea secretado de las células infectadas por el virus MVSchw2-SRAS-Ssol, tal como es el caso cuando este mismo polipéptido está expresado en unas células de mamíferos después de la transfección transitoria de las secuencias correspondientes (véase el ejemplo 11 anterior).

4)�ApAicaciones

Como se ha demostrado que los virus MVSchw2-SRAS-S y MVSchw2-SRAS-Ssol permiten la expresión de la S del

SRAS-CoV, se evalúa su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra el SRAS-CoV en el ratón CD46+/- IFN-a1R-/-, que es susceptible a la infección por el MV. La respuesta en anticuerpos de los ratones inmunizados se evalúa mediante ensayo ELISA contra los antígenos nativos del SRAS-CoV y para su capacidad para neutralizar la infectividad del SRAS-CoV in vitro, utilizando las metodologías descritas anteriormente. El poder protector de la respuesta se evaluará midiendo la reducción de la carga vírica pulmonar 2 días después de una infección de prueba no letal por el SRAS-CoV.

Se construyen virus de rubeola recombinantes de segunda generación sustituyendo las secuencias salvajes de los genes S y Ssol por genes sintéticos optimizados para la expresión en células de mamíferos, descritos en el ejemplo 15 anteriormente. Estos virus de rubeola recombinantes son susceptibles de expresar cantidades más importantes de antígenos S y Ssol y por lo tanto presentar una inmunogenecidad incrementada.

Alternativamente, los genes salvajes o sintéticos que codifican para la proteína S o el polipéptido Ssol pueden ser insertados en el vector de la rubeola MVSchw-ATU3 en forma de una unidad de transcripción suplementaria localizada entre los genes H y L, y después los virus recombinantes producidos y caracterizados de manera similar. Esta inserción es susceptible de generar unos virus recombinantes que poseen unas características (multiplicación del virus, nivel de expresión del transgen) diferentes, y posiblemente una inmunogenecidad mejorada con respecto a los obtenidos después de la inserción de los transgenes entre los genes P y N.

El virus de la rubeola recombinante MVSchw2-SRAS-Ssol se puede utilizar para la producción en cantidad y la purificación del antígeno Ssol en vista a aplicaciones de diagnósticos y vaccíneos.

EjempAo�18:�Otras�apAicaciones�reAacionadas�con�Aa�proteinaS

a) Los vectores lentivirales que permiten la expresión de la S o de Ssol (incluso de fragmentos de la S) pueden constituir una vacuna recombinante contra el SRAS-CoV, para ser utilizado en profilaxis humana y veterinaria. A fin de demostrar la factibilidad de tal vacuna, se estudia en el ratón la inmunogenecidad de los vectores lentivirales recombinantes TRIP-SD/SA-S-WPRE y TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE.

b) Unos anticuerpos monoclonales son producidos con la ayuda del polipéptido recombinante Ssol. Según los resultados representados en el ejemplo 14 anterior, estos anticuerpos o por lo menos la mayoría de ellos reconocerán la forma nativa de la S del SRAS-CoV y serán susceptibles de aplicaciones de diagnósticos y/o profilácticas.

c) Un ensayo de serología del SRAS se realiza con el polipéptido Ssol utilizado como antígeno y la metodología del doble epítopo.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> INSTITUT PASTEUR CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE PARIS 7 VAN DER WERF, Sylvie ESCRIOU, Nicolas CRESCENZO-CHAIGNE, Bernadette MANUGUERRA, Jean-Claude KUNST, Franck CALLENDRET, Benoît BETTON, Jean-Michel LORIN, Valérie GERBAUD, Sylvie BURGUIERE, Ana Maria AZEBI, Saliha CHARNEAU, Pierre TANGY, Frédéric

COMBREDET, Chantai DELAGNEAU, Jean-François MARTIN, Monique

<120> UTILIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Y DE LOS PÉPTIDOS CODIFICADOS POR EL GENOMA DE UNA NUEVA CEPA DE CORONAVIRUS ASOCIADO AL SRAS

<130> 226-111ext

<150> FR 0314152

<151>

<150> FR 0314151

<151>

<160> 158

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 29746

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 1

<210> 2 <211>3945

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (89)..(3853)

<223>

<400> 2

<210> 3

<211> 1255

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 3

<210> 4

<211> 3943

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 4

<210> 5

<211> 2049

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 5 <210> 6

<211> 2027

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 6 <210> 7

<211> 1096

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 7

<210> 8

<211> 1135

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 8

<210> 9

<211> 1096

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (137)..(958)

<223>

<400> 9

<210> 10

<211> 274

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 10 <210> 11

<211> 1096

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (558)..(1019)

<223>

<400> 11 <210> 12

<211> 154

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 12 <210> 13

<211> 332

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (36)..(263)

<223>

<400> 13

<210> 14

<211> 76

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 14

<210> 15

<211> 332

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 15

<210> 16

<211> 708

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (41)..(703)

<223>

<400> 16 <210> 17

<211> 221

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 17

<210> 18

<211> 769

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 18

<210> 19

<211> 1231

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 19 <210> 20

<211> 1242

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 20 <210> 21

<211> 1231

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (86)..(274)

<223>

<400> 21

<210> 22

<211> 63

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 22

<210> 23

<211> 1231

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (285)..(650)

<223>

<400> 23

<210> 24

<211> 122

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 24

<210> 25

<211> 1231

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (650)..(781)

<223>

<400> 25

<210> 26

<211> 44

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 26 <210> 27

<211> 1231

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (791)..(907)

<223>

<400> 27

<210> 28

<211> 39

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 28

<210> 29

<211> 1231

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (876)..(1127)

<223>

<400> 29

<210> 30

<211> 84

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 30 <210> 31

<211> 21221

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 31

<210> 32

<211> 297

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 32

<210> 33

<211> 98

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 33

<210> 34

<211> 213

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 34

<210> 35

<211> 70

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 35

<210> 36

<211> 1377

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<220>

<221> CDS

<222> (67)..(1335)

<223>

<400> 36

<210> 37

<211> 422

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 37

<210> 38

<211> 1377

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 38

<210> 39

<211> 204

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 39

<210> 40

<211> 809

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 40

<210> 41

<211> 448

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 41

<210> 42

<211> 2033

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 42 <210> 43

<211> 2018

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 43

<210> 44

<211> 1442

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 44 <210> 45

<211> 1050

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 45 <210> 46

<211> 1995

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 46 <210> 47

<211> 1884

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 47 <210> 48

<211> 2020

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 48

<210> 49

<211> 2040

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 49 <210> 50

<211> 2012

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 50 <210> 51

<211> 1877

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 51 <210> 52

<211> 2051

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 52 <210> 53

<211> 2075

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 53

<210> 54

<211> 1891

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 54

<210> 55

<211> 32

<212> ADN

<213> SECUENCIA ARTIFICIAL

<220> <223> cebador N sentido

<400> 55 cccatatgtc tgataatgga ccccaatcaa ac

32

<210> 56 <211> 32 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador N antisentido

<400> 56 cccccgggtg cctgagttga atcagcagaa gc

32

<210> 57 <211> 31 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador Sc sentido

<400> 57 cccatatgag tgaccttgac cggtgcacca c

31

<210> 58 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador SL sentido

<400> 58 cccatatgaa accttgcacc ccacctgctc

30

<210> 59 <211> 33 <212> ADN <213> cebador Sc et SL antisentido

<400> 59 cccccgggtt taatatattg ctcatatttt ccc

33

<210> 60 <211> 16 <212> ADN <213> cebador sentido serie 1

<400> 60 ggcatcgtat gggttg

16

<210> 61 <211> 16 <212> ADN <213> cebador antisentido serie 2 (28774-28759)

<400>61 cagtttcacc acctcc

16

<210> 62

<211> 16

<212> ADN

<213> cebador sentido serie 2 (28375-28390)

<400> 62 ggctactacc gaagag 16

<210> 63

<211> 16

<212> ADN

<213> cebador antisentido serie 2 (28702-28687)

<400> 63 aattaccgcg actacg 16

<210> 64

<211> 26

<212> ADN

<213> sonda 1/serie 1 (28561-28586)

<400> 64 ggcacccgca atcctaataa caatgc 26

<210> 65

<211> 21

<212> ADN

<213> sonda 2/serie 1 (28588-28608)

<400> 65 gccaccgtgc tacaacttcc t 21

<210> 66

<211> 23

<212> ADN

<213> sonda 1/serie 2 /sonda N/FL (28541-28563)

<400> 66 atacacccaa agaccacatt ggc 23

<210> 67

<211> 25

<212> ADN

<213> sonda 2/serie 2/sonda SRAS/N/LC705 (28565-28589)

<400> 67 cccgcaatcc taataacaat gctgc 25

<210> 68

<211> 30

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador anclaje 14T

<400> 68 agatgaattc ggtacctttt tttttttttt 30

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> péptido M2-14

<400> 69

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> péptido E1-12

<400> 70

<210> 71

<211> 24

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> péptido E53-72

<400> 71

<210> 72

<211> 153

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 72

<210> 73

<211> 410

<212> ADN

<213> CORONAVIRUS

<400> 73 <210> 74

<211> 4382

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 74

<210> 75

<211> 2695

<212> PRT

<213> CORONAVIRUS

<400> 75

<210> 76 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L3/+/4932

<400> 76 ccacacacag cttgtggata

20

<210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L4/+/6401

<400> 77 ccgaagttgt aggcaatgtc

20

<210> 78 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L4/+/6964

<400> 78 20 tttggtgctc cttcttattg

20

<210> 79

<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L4/-/6817

<400> 79 20 ccggcatcca aacataattt

20

<210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L5/-/7633

<400> 80 tggtcagtag ggttgattgg

20

<210>81 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> S/L5/-/8127

<400> 81 catcctttgt gtcaacatcg

20

<210> 82 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L5/-/8633

<400> 82 gtcacgagtg acaccatcct

20

<210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L5/+/7839

<400> 83 atgcgacgag tctgcttcta

20

<210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L5/+/8785

<400> 84 ttcatagtgc ctggcttacc

20

<210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L5/+/8255

<400> 85 atcttggcgc atgtattgac

20

<210> 86 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L6/-/9422

<400> 86 tgcattagca gcaacaacat

20

<210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador 5/L6/-/9966

<400> 87 tctgcagaac agcagaagtg

20

<210> 88 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L6/-/10542

<400> 88 cctgtgcagt ttgtctgtca

20

<210> 89 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L6/+/10677

<400> 89 ccttgtggca atgaagtaca

20

<210> 90 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L6/+/10106

<400> 90 atgtcatttg cacagcagaa

20

<210>91 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L6/+/9571

<400> 91 cttcaatggt ttgccatgtt

20

<210> 92 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L7/-/11271

<400> 92 tgcgagctgt catgagaata

20

<210> 93 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L7/-/11801

<400> 93 aaccgagagc agtaccacag

20

<210> 94 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L7/-/12383

<400> 94 tttggctgct gtagtcaatg

20

<210> 95 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L7/+/12640

<400> 95 ctacgacaga tgtcctgtgc

20

<210> 96 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L7/+/12088

<400> 96 gagcaggctg tagctaatgg

20

<210> 97 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L7/+/11551

<400> 97 ttaggctatt gttgctgctg

20

<210> 98 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L8/-/13160

<400> 98 cagacaacat gaagcaccac

20

<210> 99 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L8/-/13704

<400> 99 cgctgacgtg atatatgtgg

20

<210> 100 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L8/-/14284

<400> 100 tgcacaatga aggatacacc

20

<210> 101 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L8/+/14453

<400> 101 acatagctcg cgtctcagtt

20

<210> 102 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L8/+/13968

<400> 102 ggcattgtag gcgtactgac

20

<210> 103 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L8/+/13401

<400> 103 gtttgcggtg taagtgcag

19

<210> 104 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L9/-/15098

<400> 104 tagtggcggc tattgacttc

20

<210> 105 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L9/-/15677

<400> 105 ctaaaccttg agccgcatag

20

<210> 106 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L9/-/16247

<400> 106 catggtcata gcagcacttg

20

<210> 107 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L9/+/16323

<400> 107 ccaggttgtg atgtcactga t

21

<210> 108 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L9/+/15858

<400> 108 ccttacccag atccatcaag

20

<210> 109 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L9/+/15288

<400> 109 cgcaaacata acacttgctg

20

<210> 110 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L10/-/16914

<400> 110 agtgttgggt acaagccagt

20

<210> 111 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L10/-/17466

<400> 111 gttccaagga acatgtctgg

20

<210> 112 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L10/-/18022

<400> 112 aggtgcctgt gtaggatgaa

20

<210> 113 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L10/+/18245

<400> 113 gggctgtcat gcaactagag

20

<210> 114 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L10/+/17663

<400> 114 tcttacacgc aatcctgctt

20

<210> 115 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L10/+/17061

<400> 115 tacccatctg ctcgcatagt

20

<210> 116 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L11/-/18877

<400> 116 gcaagcagaa ttaaccctca

20

<210> 117 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L11/-/19396

<400> 117 agcaccacct aaattgcatc

20

<210> 118 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L11/-/20002

<400> 118 tggtcccttt gaaggtgtta

20

<210> 119 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L11/+/20245

<400> 119 tcgaacacat cgtttatgga

20

<210> 120 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador S/L11/+/19611

<400> 120 gaagcacctg tttccatcat

20

<210> 121 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador S/L11/+/19021

<400> 121 acgatgctca gccatgtagt

20

<210> 122 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L1/F3/+/800

<400> 122 gaggtgcagt cactcgctat

20

<210> 123 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L1/F4/+/1391

<400> 123 cagagattgg acctgagcat

20

<210> 124 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L1/F5/+/1925

<400> 124 cagcaaacca ctcaattcct

20

<210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L1/R3/-/1674

<400> 125 aaatgatggc aacctcttca

20

<210> 126 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L1/R4/-/1107

<400> 126 cacgtggttg aatgactttg

20

<210> 127 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador SRAS/L1/R5/-/520

<400> 127 atttctgcaa ccagctcaac

20

<210> 128 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L2/F3/+/2664

<400> 128 cgcattgtct cctggtttac

20

<210> 129 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L2/F4/+/3232

<400> 129 gagattgagc cagaaccaga

20

<210> 130 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L2/F5/+/3746

<400> 130 atgagcaggt tgtcatggat

20

<210> 131 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L2/R3/-/3579

<400> 131 ctgccttaag aagctggatg

20

<210> 132 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L2/R4/-/2991

<400> 132 tttcttcacc agcatcatca

20

<210> 133 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador SRAS/L2/R5/-/2529

<400> 133 caccgttctt gagaacaacc

20

<210> 134 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L3/F3/+/4708

<400> 134 tctttggctg gctcttacag

20

<210> 135 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L3/F4/+/5305

<400> 135 gctggtgatg ctgctaactt

20

<210> 136 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L3/F5/+/5822

<400> 136 ccatcaagcc tgtgtcgtat

20

<210> 137 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L3/R3/-/5610

<400> 137 caggtggtgc agacatcata

20

<210> 138 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SRAS/L3/R4/-/4988

<400> 138 aacatcagca ccatccaagt

20

<210> 139 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador SRAS/L3/R5/-/4437

<400> 139 atcggacacc atagtcaacg 20

<210> 140

<211> 7788

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> gen S sintético

<400> 140

<210> 141 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SNE-S1

<400> 141 ggttgggatt atccaaaatg tga

23

<210> 142 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SNE-AS1

<400> 142 gcatcatcag aaagaatcat catg

24

<210> 143 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador SAR1-s

<400> 143 cctctcttgt tcttgctcgc a

21

<210> 144 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador SAR1-AS

<400> 144 tatagtgagc cgccacacat g 21

<210> 145

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 145 ataggatcca ccatgtttat tttcttatta tttcttactc tcact 45

<210> 146

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 146 atactcgagt tatgtgtaat gtaatttgac acccttg 37

<210> 147

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 147 ataggatcca ccatgtttat tttcttatta tttcttactc tcact 45

<210> 148

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 148 acctccggat ttaatatatt gctcatattt tcccaa 36

<210> 149

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> extremo N-terminal de la proteína S del SRAS-CoV (aminoácidos 1 a 13)

<400> 149

<210> 150

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligopéptido

<400> 150

<210> 151

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 151 actagctagc ggatccacca tgttcatctt cctg 34

<210> 152

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 152 agtatccgga cttgatgtac tgctcgtact tgc 33

<210> 153

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucléotide

<400> 153 tatgagcttt tttttttttt tttttttggc atataaatag actcggcgcg ccatctgca 59

<210> 154

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucléotide

<400> 154 gatggcgcgc cgagtctatt tatatgccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagc tca 53

<210> 155

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 155 atacgtacga ccatgtttat tttcttatta tttcttactc tcact 45

<210> 156

<211> 40

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador PCR

<400> 156 atagcgcgct cattatgtgt aatgtaattt gacacccttg

40

<210> 157 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador PCR

<400> 157 ccatttcaac aatttggccg

20

<210> 158 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador PCR

<400> 158 ataggatccg cgcgctcatt atttatcgtc gtcatcttta taatc

45

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Polipéptido aislado y purificado, caracterizado porque se trata del ectodominio de la proteína S de secuencia SEC ID nº 3, y porque está constituido por los aminoácidos que corresponden a las posiciones 1 a 1193 de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína S o de los aminoácidos que corresponden a las posiciones 14 a 1193 de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína S.

2. 2.

   Ácido nucleico que codifica un polipéptido, según la reivindicación 1.

3. 3.

   Vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende un ácido nucleico, según la reivindicación 2.

4. 4.

   Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, que codifica el ectodominio de la proteína S de secuencia SEC ID nº 3, caracterizado porque se selecciona entre los vectores contenidos en las capas bacterianas siguientes, depositadas en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15

   a) cepa n° I-3324, depositada el 22 de noviembre de 2004, b) cepa n° 1-3327, depositada el 1 de diciembre de 2004, c) cepa n° 1-3332, depositada el 1 de diciembre de 2004, d) cepa n° I-3335, depositada el 1 de diciembre de 2004, e) cepa n° I-3337, depositada el 1 de diciembre de 2004, f) cepa n° 1-3339, depositada el 2 de diciembre de 2004, y g) cepa n° I-3341, depositada el 2 de diciembre de 2004

5. 5.

   Vector de expresión, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un vector viral, en forma de partícula viral o en forma de genoma recombinante.

6. 6.

   Vector viral, en forma de partícula viral o en forma de genoma recombinante, según la reivindicación 5, caracterizado porque se trata de una partícula viral recombinante o de un genoma viral recombinante susceptible de ser obtenido por transfección de un plásmido según los apartados b) o d) a g) de la reivindicación 4, en un sistema celular apropiado.

7. 7.

   Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un vector lentiviral.

8. 8.

   Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un virus de la rubeola.

9. 9.

   Vector de expresión recombinante, según la reivindicación 3, caracterizado porque se trata de un virus de la vacuna antivariólica.

10. 10.

    Uso de un vector contenido en una cepa bacteriana, según la reivindicación 4, para la producción in vitro, en un sistema eucariota, del ectodominio de la proteína S del coronavirus asociado al SRAS, según la reivindicación 1.

11. 11.

    Método de producción del ectodominio de la proteína S, según la reivindicación 1, en un sistema eucariota, que comprende una etapa de transfección de células eucariotas en cultivo por un vector seleccionado entre los vectores contenidos en las cepas bacterianas mencionadas en la reivindicación 5.

12. 12.

    Célula eucariota aislada, genéticamente modificada, que expresa un polipéptido, según la reivindicación 1.

13. 13.

    Célula, según la reivindicación 12, susceptible de ser obtenida mediante transfección por cualquiera de los vectores mencionados en los apartados d) o e) de la reivindicación 4.

14. 14.

    Célula, según la reivindicación 13, caracterizada porque se trata de la célula FRhK4-Ssol-30, depositada en la CNCM el 22 de noviembre de 2004, bajo el n° I-3325.

15. 15.

    Uso de un polipéptido, según la reivindicación 1, para detectar una infección por un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica.

16. 16.

    Método de detección de una infección por un coronavirus asociado al SRAS o de anticuerpos dirigidos contra un coronavirus asociado al SRAS, a partir de una muestra biológica, caracterizado porque la detección se efectúa por

    ELISA utilizando un polipéptido, según la reivindicación 1, expresado en un sistema eucariota.

17. 17.

    Método de detección, según la reivindicación 16, que comprende además una etapa de detección por ELISA que utiliza la proteína N recombinante.

18. 18.

    Método, según la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque se trata de un método por ELISA doble epítopo, y porque el suero a ensayar se mezcla con el antígeno de revelado, siendo puesta después dicha mezcla en contacto con el antígeno fijado sobre un soporte sólido.

19. 19.

    Complejo inmune aislado formado por un polipéptido, según la reivindicación 1, y un anticuerpo dirigido específicamente contra un epítopo del coronavirus asociado al SRAS.

20. 20.

    Kit o estuche de detección de un coronarivus asociado al SRAS, caracterizado porque comprende el menos un agente reactivo seleccionado del grupo constituido por: un polipéptido, según la reivindicación 1, un ácido nucleico, según la reivindicación 2, una célula, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

21. 21.

    Composición inmunógena y/o de vacuna, caracterizada porque comprende un polipéptido recombinante, según la reivindicación 1, obtenido en un sistema de expresión eucariota.

22. 22.

    Composición inmunógena y/o de vacuna, caracterizada porque comprende un vector o un virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, y 5 a 9.

    FIGURA 8

    FIGURA 13.25

    FIGURA 13.28

    FIGURA 13.29

    FIGURA 13.43

    FIGURA 13. 70

    FIGURA 21

    FIGURA 22

    FIGURA 23

    FIGURA 24

    FIGURA 25

    FIGURA 26

    FIGURA 32.1

    FIGURA 32.2

    FIGURA 32.3

    FIGURA 33

    FIGURA 35

    FIGURA 36

    FIGURA 37

    FIGURA 40

    FIGURA 41

    FIGURA 42 FIGURA 43