JP2007536907A - Sars関連コロナウイルスの新規系統及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
− 23220位のg/t;Tor2 Sタンパク質のアミノ酸配列の577位のアラニンコドン(gct)がセリンコドン(tct)で置換されている、
− 25298位のa/g;Tor2 ORF3によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の11位のアルギニンコドン(aga)がグリシンコドン(gga)で置換されている。
− 7919位のt/c;ORF1aによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の2552位のバリンコドン(gtt)がアラニンコドン(gct)で置換されている、
− 16622位のt/c:この変異はORF1bによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変しない(サイレント変異)、
− 19064位のg/a:この変異はORF1bによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変しない(サイレント変異)、
− 24872位のc/t:この変異はSタンパク質のアミノ酸配列を改変しない、及び
− 26857位のc/t;Mタンパク質のアミノ酸配列の154位のプロリンコドン(ccc)がセリンコドン(tcc)で置換されている。
このポリヌクレオチドの有利な実施形態によれば、該ポリヌクレオチドは配列番号1の配列を有する。
− Sタンパク質をコードするORF-Sに相当するcDNAを表す配列番号2及び4の配列、
− Eタンパク質をコードするORF-Eに相当するcDNAを表す配列番号13及び15の配列、
− Mタンパク質をコードするORF-Mに相当するcDNAを表す配列番号16及び18の配列、
− Nタンパク質をコードするORF-Nに相当するcDNAを表す配列番号36及び38の配列、
− ORF1a及びORF1bに相当するcDNAを表す配列(ORF1ab、配列番号31)、ORF3及びORF4に相当するcDNAを表す配列(配列番号7、8)、ORF7〜11に相当するcDNAを表す配列(配列番号19、20)、ORF13に相当するcDNAを表す配列(配列番号32)、並びにORF14に相当するcDNAを表す配列(配列番号34)、並びに
− 前記ポリヌクレオチドの非コード5'末端に相当するcDNAを表す配列(配列番号39及び72)及び非コード3'末端に相当するcDNAを表す配列(配列番号40、73)。
− 上記で規定したポリヌクレオチドの配列の28507位〜28522位(センスプライマー、配列番号60)及び28774位〜28759位(アンチセンスプライマー、配列番号61)にそれぞれ相当するプライマー対No.1、
− 上記で規定したポリヌクレオチドの配列の28375位〜28390位(センスプライマー、配列番号62)及び28702位〜28687位(アンチセンスプライマー、配列番号63)にそれぞれ相当するプライマー対No.2、並びに
− 配列番号55及び56の配列からなるプライマー対。
このようなプローブ及びプライマーは、SARS関連コロナウイルスによる感染の診断に有用である。
(a)生物学的サンプル中に存在する核酸の抽出、
(b)上記で規定したプライマー対を用いるRT-PCRによるORF-Nのフラグメントの増幅、及び
(c)任意の適切な手段による、(b)で取得した増幅産物の検出
を含んでなることを特徴とする。
本発明によるDNA又はRNAのチップ又はフィルターは、それ自体は公知の従来方法により、例えばガラス又はナイロンの支持体上にオリゴヌクレオチドを化学的又は電気化学的にグラフトすることより製造される。
− 2003年6月20日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3059で寄託した細菌系統に含有されるSARS-Sと称すプラスミド;これは、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のSタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列AY274119.3を参照にして、21406位〜25348位(配列番号4)のヌクレオチドに相当する、
− ポリヒスチジンタグとのSタンパク質(配列番号3)のアミノ酸配列の475位〜1193位に相当するフラグメントのC末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.3Scと称す発現プラスミド、
− ポリヒスチジンタグとのNタンパク質(配列番号3)のN末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.4Nと称す発現プラスミド、
− ポリヒスチジンタグとのSタンパク質(配列番号3)のアミノ酸配列の14位〜1193位に相当するフラグメントのN末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.4SLと称す発現プラスミド。
a)2003年10月23日に寄託した系統No.I-3118、
b)2003年5月12日に寄託した系統No.I-3019、
c)2003年5月12日に寄託した系統No.I-3020、
d)2003年6月20日に寄託した系統No.I-3059、
e)2004年11月22日に寄託した系統No.I-3323、
f)2004年11月22日に寄託した系統No.I-3324、
g)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3326、
h)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3327、
i)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3332、
j)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3333、
k)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3334、
l)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3335、
m)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3336、
n)2004年12月1日に寄託した系統No.I-3337、
o)2004年12月2日に寄託した系統No.I-3338、
p)2004年12月2日に寄託した系統No.I-3339、
q)2004年12月2日に寄託した系統No.I-3340、
r)2004年12月2日に寄託した系統No.I-3341。
この発現ベクターの1つの実施形態によれば、この発現ベクターは、ウイルス粒子の形態又は組換えゲノムの形態のウイルスベクターである。
本発明の主題はまた、上記で規定したSタンパク質ファミリーのポリペプチドをコードする組換え麻疹ウイルスである。
本発明の主題はまた、上記で規定したSタンパク質ファミリーのポリペプチドをコードする組換えワクシニアウイルスである。
この実施形態の有利な特徴によれば、これは、2004年11月22日に、No.I-3325でCNCMに寄託した細胞FRhK4-Ssol-30である。
− 配列番号3の配列を有するSタンパク質又はそのエクトドメイン
− 配列番号14の配列を有するEタンパク質
− 配列番号17の配列を有するMタンパク質
− 配列番号37の配列を有するNタンパク質
− ORF:ORF1a、ORF1b、ORF3、ORF4、ORF7〜ORF11、ORF13、及びORF14によりコードされ、それぞれ配列番号74、75、10、12、22、24、26、28、30、33、及び35の配列を有するタンパク質。
a)Sタンパク質のアミノ酸配列の14位〜1193位及び475位〜1193位に相当するペプチド、
b)Mタンパク質のアミノ酸配列の2位〜14位(配列番号69)及び100位〜221位に相当するペプチド;これらペプチドはそれぞれ、Mタンパク質のエクトドメイン及びエンドドメインに相当する、
c)Eタンパク質のアミノ酸配列の1位〜12位(配列番号70)及び53位〜76位(配列番号71)に相当するペプチド;これらペプチドはそれぞれ、Eタンパク質のエクトドメイン及びC末端部に相当する、
d)a)、b)又はc)で規定したペプチドの配列を含むか又は部分的に若しくは完全に重複する、5〜50の連続アミノ酸の、好ましくは10〜30アミノ酸のペプチド。
− ORF1aによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の2552位に位置するアラニン、
− 上記で規定したSARS-CoV系統のSタンパク質のアミノ酸配列の577位に位置するセリン、
− 上記で規定したSARS-CoV系統のORF3によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の11位に位置するグリシン、
− 上記で規定したSARS-CoV系統のMタンパク質のアミノ酸配列の154位に位置するセリン。
− モノクローナル抗体87を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に番号I-3328でCNCMに寄託)、
− モノクローナル抗体86を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に番号I-3329でCNCMに寄託)、
− モノクローナル抗体57を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に番号I-3330でCNCMに寄託)、及び
− モノクローナル抗体156を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に番号I-3331でCNCMに寄託)。
(a)上記で規定したプライマー対、プローブ、又はDNAチップ、
(b)上記で規定した組換えベクター又は改変した細胞、
(c)上記で規定した単離したコロナウイルス系統又はポリヌクレオチド、
(d)上記で規定したタンパク質又はペプチド
(e)上記で規定した抗体又は抗体フラグメント、及び
(f)上記で規定したタンパク質チップ。
(a)生物学的サンプルを、少なくとも1つの上記で規定した抗体又は抗体フラグメント、タンパク質、ペプチド、或いはタンパク質又はペプチドのチップ又はフィルターと接触させ、そして
(b)任意の適切な手段により、例えばEIA、ELISA、RIA又は免疫蛍光により、(a)で形成された抗原-抗体複合体を可視化すること
を含んでなることを特徴とする。
(a1)生物学的サンプルを、少なくとも、適切な支持体、特にマイクロプレートに付着された第1の抗体又は抗体フラグメントと接触させ、
(a2)固相を洗浄し、そして
(a3)少なくとも、第1のものとは異なる第2の抗体又は抗体フラグメント(該抗体又は抗体フラグメントは任意に適切に標識されていてもよい)を加えること
を含んでなる。
− 工程(a1)は、少なくとも、S、M及び/又はEタンパク質を指向し、及び/又はこれらの内の1つのタンパク質のエクトドメインに相当するペプチド(M2-14ペプチド又はE1-12ペプチド)を指向する第1のモノクローナル又はポリクローナルの抗体又はそのフラグメントを用いて行われ、
(a)上記で規定したプライマー対又はプローブ、
(b)上記で規定した組換えベクター又は上記で規定した改変された細胞、
(c)上記で規定した単離したコロナウイルス系統又は上記で規定したポリヌクレオチド、
(d)上記で規定した抗体又は抗体フラグメント、
(e)上記で規定した、モノクローナル抗体mAb86及び/又はmAb87とモノクローナル抗体mAb57とを含んでなる抗体の組合せ、
(f)上記で規定したチップ又はフィルター
からなる群より選択されることを特徴とするSARS関連コロナウイルスを検出するための試薬である。
a)上記で規定したタンパク質又はペプチド
b)以下から選択される配列を有する、上記で規定したDNAタイプ若しくはRNAタイプのポリヌクレオチド又はその代表的なフラグメント:
(i)配列番号1の配列又はそのRNA等価物
(ii)配列番号1の配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列、
(iii)配列番号1の配列又は高ストリンジェンシー条件下で配列番号1の配列とハイブリダイズする配列に相補的な配列、
(iv)(i)、(ii)又は(iii)で規定したポリヌクレオチドの代表的なフラグメントのヌクレオチド配列、
(v)改変された、(i)、(ii)、(iii)又は(iv)で規定した配列、
d)上記で規定したcDNAライブラリ
からなる群より選択される少なくとも1つの生成物を含んでなることを特徴とする、SARS関連コロナウイルスに特異的な体液性又は細胞性の保護免疫、特にSARS関連コロナウイルスの特異エピトープを指向する抗体の産生を誘導し得る免疫原性組成物である。
アジュバントは、有利には、油性エマルジョン、サポニン、鉱物、細菌抽出物、水酸化アルミニウム及びスクアレンからなる群より選択される。
キャリア物質は、有利には、単層リポソーム、多層リポソーム、サポニンのミセル、又はサッカライド若しくは含金性の固体ミクロスフェアからなる群より選択される。
− 図1は、発現ベクターpIVEXからの組換えタンパク質N、SC及びSLのインビトロでの発現のウェスタンブロット分析を説明する。レーン1:pIV2.3N。レーン2:pIV2.3SC。レーン3:pIV2.3SL。レーン4:pIV2.4N。レーン5:pIV2.4S1又はpIV2.4SC。レーン6:pIV2.4SL。同じベクターから発現したGFPタンパク質の発現をコントロールとして使用する。
− 図15は、間接N ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す(第2シリーズの血清を検査)。
− 図17は、二重エピトープN ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す(第2シリーズの血清を検査)。
TM:ソフトウェアTMHMM v2.0(Sonnhammerら、1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp.175-182, AAAI Press)で予測された膜貫通領域(aa1196〜1218)。アミノ酸W1194及びP1195はそれぞれ0.13及び0.42の確率で膜貫通領域の一部である可能性があることに留意すべきである。
P-CMV:サイトメガロウイルス即時/初期プロモーター。BGH pA:ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナル。
SV40後期pA:SV40ウイルス後期ポリアデニル化シグナル。
SD/SA:スプライスドナー及びアクセプター部位。
WPRE:ウッドチャック肝炎ウイルスの「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」の配列。
CTE:マソン-ファイザーシミアンレトロウイルスの「構成性輸送エレメント」の配列。
SARS-CoV:SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の抽出物
Mock:非感染細胞のコントロール抽出物
SARS-CoV:SARS-CoVでの感染多重度3での感染の8時間後に調製したVeroE6細胞の抽出物。
Mock:非感染VeroE6細胞のコントロール抽出物。
TM:膜貫通領域
P-CMV:サイトメガロウイルス即時/初期プロモーター
P-EF1α:EF1α遺伝子プロモーター
SD/SA:スプライスドナー及びアクセプター部位
WPRE:ウッドチャック肝炎ウイルスの「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」の配列
CTE:マソン-ファイザーシミアンレトロウイルスの「構成性輸送エレメント」の配列
LTR:長末端反復
ΔU3:「プロモーター/エンハンサー」配列について欠失したLTR
cPPT:「ポリプリン路シス活性配列」
CTS:「中央終結配列」
T-:FrhK-4細胞のコントロール抽出物。
T+:SARS-CoVでの感染多重度3の感染の24時間後に調製したFrhK-4細胞の抽出物。
A.抗FLAGアフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過(G75)により精製した8、2、0.5及び0.125μgの組換えSsolポリペプチドを、8%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離した。Ssolポリペプチド及び種々の量の分子量マーカー(MM)を、硝酸銀での染色により可視化した(Gelcode SilverSNAP stain kit II, Pierce)。
IgG:MM 147300のウシIgG
ConA:MM 77490のコナルブミン
HRP:コントロールとして分析されるMM 43240の西洋ワサビペルオキシダーゼ
ピークA及びBは単一荷電及び二重荷電のSsolポリペプチドに相当する。
D.組換えSsolポリペプチドのN末端部の配列決定。液相中での5回のEdman分解サイクルを、ABI494シークエンサ(Applied Biosystems)で実施した。
A.7匹のBALB/cマウスの群を、pCI、pcDNA-S、pCI-S、pcDNA-N及びpCI-HAの50μgのプラスミドDNAを用いて4週間の間隔で2回免疫した。
B.6匹のBALB/cマウスの群を、pCI、pCI-S、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREの2μg、10μg又は50μgのプラスミドDNAを用いて4週間の間隔で2回免疫した。
B.pCI、pCI-S、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREの2μg、10μg又は50μgのプラスミドDNAを用いて4週間の間隔で2回免疫したBALB/cマウスの群。
A.プラスミドpTG-S及びpTG-Ssolを取得するために、SARS-CoVのSタンパク質及びSsolポリペプチドのcDNAを、トランスファープラスミドpTG186のBamH1部位とSma1部位との間に挿入した。
B.トランスファープラスミドpTN480、pTN-S及びpTN-Ssolを取得するために、合成プロモーター480の配列を、次いで、プラスミドpTG186poly、pTG-S及びpTG-SsolのNde1-Pst1フラグメントの交換により、7.5プロモーターの配列と置換した。
C.pTNシリーズのトランスファープラスミドのNde1部位とPst1部位との間に含有される合成プロモーター480の配列。後の取扱を容易にするためにAsc1部位を挿入した。制限部位及びプロモーター配列に下線を付した。
SP:ソフトウェアsignalP v2.0(Nielsenら、1997, Protein Engineering, 10: 1-6)で予測したシグナルペプチド(aa1〜13)
TM:ソフトウェアTMHMM v2.0(Sonnhammerら、1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp.175-182, AAAI Press)で予測した膜貫通領域(aa1196〜1218)。アミノ酸W1194及びP1195は膜貫通領域の一部を形成する可能性があり、その確率はそれぞれ0.13及び0.42であることに留意すべきである。
TK-L、TK-R:ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の左側部分及び右側部分
MCS:多クローニング部位
PE:初期プロモーター
PL:後期プロモーター
PL synth:合成後期プロモーター480
SARS-CoV:SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の抽出物
Mock:非感染細胞のコントロール抽出物
A.組換えワクシニアウイルスVV-TN(VV-TN-Ssolウイルスの種々のクローン)及びウイルスVV-TG-Ssol又はVV-TN-Sflagに感染したCV1細胞の上清を、2のM.O.I.でのCV1細胞の感染の18時間後に収穫した。
B.2のM.O.I.での組換えワクシニアウイルスVV-TN-Ssolに二連で(in duplicate)(1、2)感染した293T細胞、FRhK-4細胞、BHK-21細胞及びCV1細胞の上清を、感染の18時間後に収穫した。また、ウイルスVV-TNに感染したCV1細胞をコントロールとして収穫した(M)。
分子量ラダー(kDa)を図に示す。
抗FLAGアフィニティークロマトグラフィーにより精製した10、5及び2μlの組換えSsolポリペプチドを、4〜15%勾配SDSポリアクリルアミドゲル上で分離した。Ssolポリペプチド及び種々の量の分子量マーカー(MM)を、硝酸銀での染色により可視化した(Gelcode SilverSNAP stain kit II、Pierce)。
A.2回の免疫の各々の3週間後に収集された免疫血清のプールを、群の各々について調製し、抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を使用する間接ELISAにより分析した。抗SARS-CoV抗体力価は、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgGポリクローナル抗体(NA931V、Amersham)及びTMB(KPL)での可視化後に0.5の比ODを生じる希釈率の逆数として算出する。
B.免疫血清のプールを、FRhK-4細胞に対するSARS-CoVの100 TCID50の感染性を血清中和化する能力について評価した。1/20から検査した2倍希釈率の各々について4点を作成した。血清中和化力価は、Reed and Munschの方法に従って、4ウェル中2ウェルの感染性を中和する希釈率の逆数として算出する。
A.麻疹ベクターは、追加の転写ユニットが導入されている、Schwarzワクチン系統の麻疹ウイルス(MV)の完全ゲノムである(Combredet, 2003, Journal of Virology, 77: 11546-11554)。追加のオープンリーディングフレーム(ORF)の発現は、N/P接合部に存在するエレメントからコピーされた、転写、キャップの形成及び導入遺伝子のポリアデニル化に必要なシス作用性エレメントにより制御される。2つの異なるベクターは、一方ではP(リンタンパク質)遺伝子とM(マトリクス)遺伝子との間への挿入を、他方ではH(ヘマグルチニン)遺伝子とL(ポリメラーゼ)遺伝子との間への挿入を可能にする。
B.麻疹ウイルスの組換えゲノムMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolを、前記ベクターのP遺伝子とM遺伝子との間に位置する追加の転写ユニット中にSタンパク質のORF及びSsolポリペプチドのORFを挿入することにより構築した。
MVゲノムのサイズ:15,894nt
SP:シグナルペプチド
TM:膜貫通領域
FLAG:FLAGタグ
細胞質抽出物を、異なる継代数のウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssol並びにコントロールとしての野生型ウイルスMWSchwによるVero細胞の感染後に調製した。また、Laemmliに従うローディング緩衝液中の細胞抽出物を、3の感染多重度でのSARS-CoVでのVeroE6細胞の感染の8時間後に調製した。これらを、8%SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗Sウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。
分子量ラダー(kDa)を図に示す。
Pn:293-3-46細胞及びVero細胞の共培養後のウイルスのn代継代
SARS-CoV:SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の抽出物
Mock:非感染VeroE6細胞のコントロール抽出物
ガラススライド上の単層のVero細胞を、野生型ウイルスMWSchw(A)又はウイルスMVSchw2-SARS-S(B)及びMVSchw2-SARS-Ssol(C)に感染させた。シンシチウムが30〜40%コンフルエンス(A、B)又は90〜100%(C)に達したとき、細胞を固定し、透過化処理し、抗SARS-CoVウサギポリクローナル抗体及びFITCにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)接合体(Jackson)で標識した。
Eタンパク質及びMタンパク質の位置を矢印で示す。
分子量ラダー(kDa)を図に示す。
SARS-CoV系統のRNAを、ハノイ(ベトナム)のフランス病院でSARSに罹患している患者に対して行った番号031589で記録された気管支肺胞洗液のサンプルから抽出した。
単離したRNAを鋳型として使用して、ゲノムの種々のオープンリーディングフレーム(ORF1a、ORF1b、ORF-S、ORF-E、ORF-M、ORF-N(ORF-13及びORF-14を含む)、ORF3、ORF4、ORF7〜ORF11)、及び非コード5'及び3'末端に相当するcDNAを増幅した。増幅/検出に使用したプライマー及びプローブの配列は、入手可能なSARS-CoVヌクレオチド配列に基づいて規定した。
QIamp viral RNA extraction mini kit(QIAGEN)を製造業者の推奨に従って用いて、RNAを抽出した。より具体的には:140μlのサンプル及び560μlのAVL緩衝液を、15秒間激しく混合し、10分間、室温でインキュベートし、次いで最大速度で短く遠心分離した。560μlの100%エタノールを上清に加え、このように取得した混合物を15秒間非常に激しく撹拌した。630μlの混合物を次いでカラムに堆積した。
2.1)Sタンパク質をコードするcDNA
サンプルから抽出したRNAを、ランダム配列のヘキサマーオリゴヌクレオチド(pdN6)を用いる逆転写に付し、cDNAフラグメントを生成した。
SARS-CoV S糖タンパク質をコードする配列を、2つの重複DNAフラグメント:5'フラグメント(SARS-Sa、配列番号5)及び3'フラグメント(SARS-Sb、配列番号6)の形態で、ネステッドプライマーを用いる2連続増幅を行うことにより増幅した。このように取得したアンプリコンを配列決定し、PCRプラスミドベクター2.1-TOPOTM(INVITROGEN)中にクローニングし、次いでクローニングしたcDNAの配列を決定した。
a.1)cDNAの合成
RNA(5μl)と、注入用のH2O(3.5μl)と、5×逆転写酵素緩衝液(4μl)と、5mM dNTP(2μl)と、pdN6 100μg/ml(4μl)と、RNasin 40IU/μl(0.5μl)と、逆転写酵素AMV-RT 10IU/μl、PROMEGA(1μl)とを含有する反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件:42℃にて45分間、55℃にて15分間、95℃にて5分間の条件下でインキュベートし、次いで得られたcDNAを+4℃に維持した。
S遺伝子の5'末端及び3'末端を、それぞれ、プライマー対S/F1/+/21350-21372及びS/R1/-/23518-23498、S/F3/+/23258-23277及びS/R3/-/25382-25363で増幅した。cDNA(2μl)と、50μMプライマー(0.5μl)と、10×緩衝液(5μl)と、5mM dNTP(2μl)と、Taq Expand High Fidelity(Roche)(0.75μl)と、H2O(39、75μl)とを含有する50μlの反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件下で増幅した:94℃にて2分間の最初の変性工程に続いて、94℃にて30秒間の変性工程と、55℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて2分30秒間の伸長工程とを含んでなる40サイクル(各サイクルで10秒間の追加の伸長)、次いで72℃にて5分間の最終の伸長工程。
第1のPCR増幅の産物(5'アンプリコン及び3'アンプリコン)を、第1の増幅条件と同一の条件下で、5'アンプリコン及び3'アンプリコンについてそれぞれプライマー対S/F2/+/21406-21426及びS/R2/-/23454-23435、S/F4/+/23322-23341及びS/R4/-/25348-25329で第2のPCR増幅工程(ネステッドPCR)に付した。
このように取得したSa(5'末端)アンプリコン及びSb(3'末端)アンプリコンを、QIAquick PCR purification kit(QIAGEN)を製造業者の指示に従って用いて精製し、次いでベクターPCR2.1-TOPO(Invitrogen kit)中にクローニングして、SARS-S1及びSARS-S2と呼ぶプラスミドを得た。
完全SのcDNAを上記クローンSARS-S1及びSARS-S2から、以下の様式で得た:
1)PCR増幅反応をSARS-S2クローンで、上記プライマーS/R4/-/25348-25329及びプライマーS/S/+/24696-24715の存在下で行った:633bpのアンプリコンが得られた、
2)別のPCR増幅反応を、別のSARS-S2クローンで、上記のプライマーS/F4/+/23322-23341及びS/S/-/24803-24784の存在下で行った:1481bpのアンプリコンが得られた。
増幅反応を、94℃にて20秒間の変性工程及び72℃にて2分30秒間の伸長工程を含んでなる30の増幅サイクルを行うことを除きSaフラグメント及びSbフラグメントの増幅について上記で規定したような条件下で行った。
4)上記プライマーS/F4/+/23322-23341及びS/R4/-/25348-25329を用いる別のPCR増幅反応を、3)で取得した精製したアンプリコンについて行った。増幅反応を、30の増幅サイクルを実施したことを除いてSaフラグメント及びSbフラグメントの増幅について上記で規定した条件下で行った。
このように取得した2026bpアンプリコンを精製し、ベクターPCR2.1-TOPO中にクローニングし、次いでSaフラグメント及びSbフラグメントについて上記で規定したようなプライマーを用いて上記のように配列決定した。このように取得したクローンをクローン3'と呼んだ。
− 23220位のg/t;Tor2のSタンパク質のアミノ酸配列の577位のアラニンコドン(gct)がセリンコドン(tct)で置換されている、
− 24872位のc/t:この変異はSタンパク質のアミノ酸配列を改変しない、及び
上記のように抽出したサンプル031589に由来するRNAを、同じ工程(Titan One Step RT-PCR(登録商標) kit(Roche)の間にプライマー対:
− ORF-Eを増幅するためのS/E/F1/+/26051-26070及びS/E/R1/-/26455-26436、及び
− ORF-Mを増幅するためのS/M/F1/+/26225-26244及びS/M/R1/-/27148-27129
を用いるPCR増幅反応と組み合せた逆転写に付した。
− アンプリコンE用のS/E/F2/+/26082-26101及びS/E/R2/-/26413-26394、及び
− アンプリコンM用のS/M/F2/+/26330-26350及びS/M/R2/-/27098-27078
を用い、Expand High-Fi(登録商標) kit(Roche)を使用して第2のPCR増幅(ネステッドPCR)に付した。
同じ増幅、クローニング及び配列決定ストラテジーを使用して、以下のORF:ORF3、ORF4、ORF7、ORF8、ORF9、ORF10及びORF11にそれぞれ相当するcDNAフラグメントを取得した。第1の増幅に使用したプライマー対は:
− ORF3及びORF4:S/SE/F1/+/25069-25088及びS/SE/R1/-/26300-26281
− ORF7〜ORF11:S/MN/F1/+/26898-26917及びS/MN/R1/-/28287-28266
である。
第2の増幅に使用したプライマー対は:
− ORF3及びORF4:S/SE/F2/+/25110-25129及びS/SE/R2/-/26244-26225
− ORF7〜ORF11:S/MN/F2/+/26977-26996及びS/MN/R2/-/28218-28199
である。
ネステッドPCRの条件は以下のとおりである:94℃にて2分間の変性工程に続いて、94℃にて20秒間の変性工程と、58℃にて30秒間のアニーリング工程と72℃にて50秒間の伸長工程(1サイクル当たり4秒間の増加を伴う)とを含んでなる40サイクル、及び最後に72℃にて7分間の末端伸長工程。
cDNAを合成し、フラグメントSa及びSbについて上記で記載したように増幅した。より具体的には、5μlのRNAと、注入用の5μlのH2Oと、4μlの5×逆転写酵素緩衝液と、2μlのdNTP(5mM)と、2μlのオリゴ20T(5μM)と、0.5μlのRNasin(40IU/μl)と、1.5μlのAMV-RT(10IU/μl Promega)とを含有する反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件:42℃にて45分間、55℃にて15分間、95℃にて5分間の条件下でインキュベートし、次いで+4℃に維持した。
S1フラグメント及びS2フラグメントの増幅についての上記のような反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件下でインキュベートした:94℃にて2分間の最初の変性工程に続いて、94℃にて20秒間の変性工程と、55℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて1分30秒間の伸長工程(各サイクルで10秒間の追加の伸長を伴う)とを含んでなる40サイクル、次いで72℃にて5分間の最終の伸長工程。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF13及び14の配列はそれぞれ、添付の配列表の配列番号32及び34の配列に相当する。
a)非コード5'末端(5'NC)
a1)cDNAの合成
上記のように抽出したサンプル031589に由来するRNAを、以下の条件下で逆転写に付した:
RNA(15μl)及びプライマーS/L/-/443(5μmの濃度で3μl)を、75℃にて10分間インキュベートした。
次に、5×逆転写酵素緩衝液(6μl、INVITROGEN)、10Mm dNTP(1μl)、0.1M DTT(3μl)を加え、混合物を50℃にて3分間インキュベートした。
このようにして取得したcDNAを、QIAquick PCR purification kit(QIAGEN)を製造業者の推奨に従って用いて精製した。
cDNA(10μl)を100℃にて2分間インキュベートし、氷中で保存し、次いで以下のものを加えた:H2O(2.5μl)、5×TdT緩衝液(4μl、AMERSHAM)、5mM dATP(2μl)及びTdT(1.5μl、AMERSHAM)。このように取得した混合物を、37℃にて45分間、次いで65℃にて2分間インキュベートする。
a1)cDNAの合成
上記のように抽出したサンプル031589に由来するRNAを、以下のプロトコルに従って逆転写に付した:RNA(5μl)と、H2O(5μl)と、5×逆転写酵素緩衝液(4μl)と、5mM dNTP(2μl)と、5μMオリゴ20T(2μl)と、40U/μl RNasin(0.5μl)と、10IU/μl RT-AMV(1.5μl、PROMEGA)とを含有する反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件:42℃にて45分間、55℃にて15分間、95℃にて5分間の条件下でインキュベートし、次いで+4℃に維持した。
サンプル031589に由来するSARS-CoVゲノムのORF1a及びORF1bを含有する5'領域の増幅を、他のORFについて上記で記載されたものと同じ原理に従って、RT-PCR反応に続いてネステッドPCRを行うことにより実施した。増幅したフラグメントは数十の塩基が重複し、したがってゲノムのこの部分の完全配列のコンピュータによる再構築が可能である。平均すると、増幅したフラグメントは2キロベースである。
− RT-PCR:42℃にて30分間、55℃にて15分間、94℃にて2分間、次いで取得したcDNAを以下の条件下で増幅する:94℃にて15秒間の変性工程と、58℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで68℃にて1分30秒間の伸長工程とを含んでなる40サイクル(各サイクルで5秒間の追加の伸長を伴う)、次いで68℃にて7分間の最終の伸長工程。
番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のNタンパク質全体及びSタンパク質の2つのポリペプチドフラグメントを、E.coli中で、N末端又はC末端のポリヒスチジンを含んでなる融合タンパク質の形態で産生した。2つのSポリペプチドでは、Sタンパク質のN末端及びC末端の疎水性配列(シグナルペプチド:1位〜13位及び膜貫通ヘリックス:1196位〜1218位)が欠失している一方で、Sタンパク質のβヘリックス(565位〜687位)及びコイルドコイル型の2つのモチーフ(895位〜980位及び1155位〜1186位)は保存されていた。これら2つのポリペプチドは、Sタンパク質のアミノ酸配列の14位〜1193位に相当する長いフラグメント(SL)及びSタンパク質のアミノ酸配列の475位〜1193位に相当する短いフラグメント(SC)からなる。
Nタンパク質に対応するcDNA並びにSLフラグメント及びSCフラグメントに対応するcDNAを、DNAポリメラーゼPlatinium Pfx(登録商標)(INVITROGEN)を用いて、標準的な条件下でPCRにより増幅した。プラスミドSARS-N及びSARS-Sを鋳型として使用し、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた:
5'-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3' (Nセンス、配列番号55)
5'-CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3' (Nアンチセンス、配列番号56)
5'-CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3' (SCセンス、配列番号57)
5'-CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3' (SLセンス、配列番号58)
5'-CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3' (SC及びSLアンチセンス、配列番号29)。
6つの組換えベクターからの組換えタンパク質の発現を、第1の例では、インビトロ系(RTS100、Roche)で検査した。RTS100系で30℃にて4時間の組換えベクターpIVEXのインキュベーション後にインビトロで産生したタンパク質を、ペルオキシダーゼにカップリングした抗(his)6抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。インビトロ発現の結果(図1)は、Nタンパク質のみがポリヒスチジンタグの位置(N末端又はC末端)にかかわらず大量に発現されることを示す。第2の工程で、Nタンパク質及びSタンパク質の発現を、LB培地中、誘導剤(1mM IPTG)の存在下又は非存在下で30℃にて、インビボで検査した。Nタンパク質はこの細菌系では非常に良好に産生され(図2)、細菌の溶解後に主として可溶画分に見出される。対照的に、長いバージョンのS(SL)は、非常に貧弱に産生され、完全に不溶性である(図3)。短いバージョン(SC)もまた非常に弱い可溶性を示すが、発現レベルは、長いバージョンのレベルよりずっと高い。更に、C末端位でポリヒスチジンタグと融合した構築物SCは、予測されるものより小さいサイズを有する。抗ポリヒスチジン抗体での免疫検出実験は、この構築物が不完全であったことを示している。まとめると、2つの構築物pIV2.3N及びpIV2.4S1(これらはそれぞれ、C末端ポリヒスチジンタグと融合した全体Nタンパク質及びN末端ポリヒスチジンタグと融合した短いSタンパク質を発現する)を、この2つのタンパク質を大量に産生して精製するために選択した。プラスミドpIV2.3N及びpIV2.4S1は、2003年10月23日に、それぞれNo.I-3117及びI-3118でCNCM(25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS 15)に寄託した。
Nタンパク質、SLタンパク質及びSCタンパク質の抗原活性を、SARS-CoVに感染した同じ患者から得た、SARS症状の発症後8日目(M12)及び29日目(M13)に収集した2つの血清サンプルを用いるウェスタンブロッティングにより検査した。実験プロトコルは実施例3に記載のとおりである。図4に示す結果は、(i)患者のセロコンバージョン、及び(ii)Nタンパク質が短いSタンパク質より高い抗原反応性を保有することを示す。
ベクターpIV2.3Nから産生したNタンパク質を精製するための幾つかの実験を、以下のプロトコルに従って行った。発現ベクターpIV2.3Nで形質転換した細菌BL21(DE3)pDIA17を、0.1mg/mlのアンピシリンを含有する1リットルの培養培地中で30℃にて培養し、A600 = 0.8に等しい細胞密度に到達したとき(約3時間)に1mM IPTGで誘導した。誘導剤の存在下での2時間の培養後、細胞を遠心分離(5000rpmにて10分間)により回収し、溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、0.3M NaCl、20mMイミダゾール、pH8、プロテアーゼ阻害剤の混合物Complete(登録商標)(Roche)を含有)中に再懸濁し、French press(12,000psi)で溶解した。細菌溶解物の遠心分離(12,000rpmにて15分間)後、上清(50ml)を、溶解緩衝液で平衡化した金属キレートカラム(15ml)(Ni-NTA superflow、Qiagen)上で1ml/分の流量にて堆積させた。カラムを200mlの溶解緩衝液で洗浄後、Nタンパク質を10カラム容量のイミダゾール勾配(20→250mM)で溶出させた。Nタンパク質を含有する画分を集め、変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動に続くクーマシーブルーでの染色により分析した。図5に示す結果は、使用したプロトコルにより、非常に満足な均質性(95%)及び1リットルの培養物当たり15mgのタンパク質の平均収量でNタンパク質を精製することが可能になることを示す。
短いSタンパク質を精製するために従ったプロトコルは、上記のものとは非常に異なる。なぜなら、このタンパク質は、細菌系において高度に凝集するからである(封入体)。発現ベクターpIV2.4S1で形質転換した細菌BL21(DE3)pDIA17を、0.1mg/mlのアンピシリンを含有する1リットルの培養培地中で30℃にて培養し、A600 = 0.8に等しい細胞密度に到達したとき(約3時間)に1mM IPTGで誘導した。誘導剤の存在下での2時間の培養後、細胞を遠心分離(5000rpmにて10分間)により回収し、溶解緩衝液(0.1M Tris-HCl、1mM EDTA、pH7.5)中に再懸濁し、French press(12,000psi)で溶解した。細菌溶解物の遠心分離(12,000rpmにて15分間)後、ペレットを、2%Triton X100及び10mMβ-メルカプトエタノールを含有する25mlの溶解緩衝液中に再懸濁し、次いで12,000rpmにて20分間遠心分離した。ペレットを、7M尿素を含有する10mM Tris-HCl緩衝液中に再懸濁し、室温にて30分間穏やかに撹拌した。7M尿素での封入体のこの最終洗浄は、凝集したSCタンパク質と共に沈降するE.coli膜タンパク質のほとんどを除去するために必要である。12,000rpmにて20分間の最後の遠心分離後、最終ペレットを10mM Tris-HCl緩衝液中に再懸濁する。この調製物の電気泳動分析(図6)により、短いSタンパク質は、封入体(不溶性抽出物)から満足する均質性(約90%)で精製され得ることが示される。
SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)により引き起こされた異型肺炎に罹患している患者の血清中に存在する抗体の、このウイルスの種々のタンパク質に対する反応性を、下記の条件下でのウェスタンブロッティングにより分析した。
1)材料
a)SARS-CoVに感染した細胞の溶解物
Vero E6細胞(2×106)にSARS-CoV(番号FFM/MA104で記録した単離株)を10-1又は10-2の感染多重度(M.O.I.)で感染させ、次いで5%CO2を含有する雰囲気下で2%FCSを含有するDMEM培地中35℃にてインキュベートした。48時間後、細胞ローン(cellular lawn)をPBSで洗浄し、次いでLaemmliに従って調製したβ-メルカプトエタノールを含有する500μlのローディング緩衝液で溶解した。次いでサンプルを10分間煮沸し、次いで20秒間で3回超音波処理をした。
b1)異型肺炎に罹患している患者からの血清
National Reference Center for Influenza Viruses(Northern region)の参照によりNo.20033168で指称される血清は、症状の発症後38日目に収集したSARS-CoVにより引き起こされた異型肺炎に罹患しているフランス人患者からのものである;SARS-CoV感染の診断はネステッドRT-PCR及び定量PCRにより行った。
血清は、実施例4に記載の免疫プロトコルに従い、組換えのNタンパク質及びSCタンパク質(実施例2)で作成したものである;これらは、ウサギP13097血清(抗N血清)及びウサギP11135血清(抗S血清)である。
SARS-CoVに10-1及び10-2のM.O.I.値で感染した細胞の20μlの溶解物、及びコントロールとして、非感染細胞の20μlの溶解物(mock)を、10%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでニトロセルロース膜上に移した。PBS/5%ミルク/0.1%Tweenの溶液中でのブロッキング及びPBS/0.1%Tween中での洗浄後、この膜を、以下:(i)緩衝液PBS/1%BSA/0.1%Tween中で1/300、1/1000及び1/3000希釈した免疫血清No.20033168、(ii)同じ緩衝液中で1/50,000希釈したウサギP13097血清(抗N血清)、及び(iii)同じ緩衝液中で1/10,000希釈したウサギP11135血清(抗S血清)と一晩4℃にてハイブリダイズさせた。PBS/Tween中での洗浄後、ヒト免疫グロブリンGの重鎖及び軽鎖を指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたヒツジポリクローナル抗体(NA933V、Amersham)、又はウサギ免疫グロブリンGの重鎖及び軽鎖を指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)のいずれかを用いて二次ハイブリダイゼーションを実施した。結合した抗体を、ECL+ kit(Amersham)及びHyperfilm MPオートラジオグラフィーフィルム(Amersham)を用いて可視化した。分子量ラダー(kDa)を図に示す。
図7は、見かけの分子量35、55及び200kDaの3つのポリペプチドが、SARS-CoVに感染した細胞の抽出物中で特異的に検出されることを示す。
これらポリペプチドを同定するために、2つの他のイムノブロット(図8)を同じサンプルについて同じ条件下で、核タンパク質Nに特異的なウサギポリクローナル抗体(ウサギP13097、図8A)及び針状タンパク質Sに特異的なウサギポリクローナル抗体(ウサギP11135、図8B)を用いて調製した。この実験により、200kDaポリペプチドがSARS-CoV針状糖タンパク質Sに相当し、55kDaポリペプチドが核タンパク質Nに相当し、35kDaポリペプチドはおそらくNの短縮形態又は分解形態を表すことが示される。
1)材料及び方法
3匹のウサギ(P13097、P13081、P13031)を、実施例2に記載のプロトコルに従って製造した核タンパク質(N)全体に対応する精製した組換えポリペプチドで免疫した。完全フロイントアジュバント中で乳化した、ウサギ当たり0.35mgのタンパク質の第1回目の注射(皮内経路)の後、動物に、不完全フロイントアジュバント中で乳化した0.35mgの組換えタンパク質を3週間の間隔で、次いで4週間の間隔で3回の追加免疫の注射をした。
第1の例では、血清の反応性を、免疫に使用したものと同様な組換えタンパク質の調製物に対するELISA検査により分析した;ELISA検査を、実施例6に記載のプロトコルに従い、そこに記載の試薬を用いて行った。
第2の例では、血清の反応性を、実施例3に記載のプロトコルに従い、SARS-CoVに感染した細胞の溶解物のイムノブロット(ウェスタンブロット)を作成することにより分析した。
ELISA検査(図9)は、組換えNタンパク質の調製物及びSタンパク質の短いフラグメント(SC)の封入体の調製物が動物において免疫原性であること、及び免疫血清の力価が高い(1/25,000より高い)ことを証明する。
1)Mタンパク質及びEタンパク質の構造の分析
a)Eタンパク質
SARS-CoV Eタンパク質(76アミノ酸)の構造を、種々のソフトウェアパッケージ、例えばsignalP v1.1、NetNGlyc 1.0、THMM 1.0及び2.0(Kroghら、2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580)、或いはTOPPRED(von Heijne、1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494)を用いてコンピュータで分析した。分析により、この非グリコシル化ポリペプチドは、単一膜貫通ヘリックス(THMMに従うaa12〜34)を含有し、そこで親水性ドメイン(42残基)の大部分がC末端部、おそらくウイルス粒子内部(エンドドメイン)に位置するタイプ1膜タンパク質であることが示される。THMMソフトウェアのバージョン1.0(N-terは外部)及びバージョン2.0(N-terは内部)により予測されるトポロジーは正反対であるが、他のアルゴリズム、特にTOPPRED及びTHUMBUP(Zhou et Zhou、2003, Protein Science 12:1547-1555)は、EのN末端部の外部配置を確証することに気付く。
SARS-CoV Mタンパク質(221アミノ酸)で行った同様な分析は、このポリペプチドがシグナルペプチド(ソフトウェアsignalP v1.1による)を保有しないが、3つの膜貫通ドメイン(THMM2.0により残基15〜37、50〜72、77〜99)及びウイルス粒子内部に位置する大きな親水性ドメイン(aa100〜221)(エンドドメイン)を保有することを示す。これは、おそらく4位(NetNGlyc 1.0による)のアスパラギンでグリコシル化されている。
− Eのエクトドメインは、おそらく、このタンパク質の残基1〜11又は1〜12に相当する:MYSFVSEETGT(L)、配列番号70。確かに、残基12が膜貫通配置に関係する確率は中程度である(THMM 2.0により0.56)。
− Mのエクトドメインは、おそらく、このタンパク質の残基2〜14に相当する:ADNGTITVEELKQ、配列番号69。確かに、MのN末端メチオニンは非常に高い確率で成熟ポリペプチドから切断される。なぜなら、2位の残基はアラニンであるからである(Varshavsky、1996, 93:12142-12149)。
ペプチドM2-14(ADNGTITVEELKQ、配列番号69)、E1-12(MYSFVSEETGTL、配列番号70)及びE53-76(KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV、配列番号71)をNeosystemにより合成した。これらを、MBS(m-マレイミド-ベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を用いてKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と、ペプチドのN末端(E53-76の場合)又はC末端(M2-14及びE1-12の場合)のいずれかで、合成の間に付加したシステインを介してカップリングした。
1)材料
固相の調製に使用した抗原は、実施例2に記載のプロトコルに従って調製した精製した組換え核タンパク質Nである。
検査すべき血清(表IV)を、SARS-CoVに感染した細胞に対する免疫蛍光(IF-SARS力価)による反応性の分析結果に基づいて選択した。
0.1M炭酸塩緩衝液(pH9.6)中に種々の濃度(1、2又は4μg/ml)で希釈したNタンパク質(100μl)をELISAプレートのウェルに分配し、次いでプレートを一晩実験室温度でインキュベートする。プレートをPBS-スキムミルク-スクロース(5%)緩衝液で飽和したPBS-Tween緩衝液で洗浄する。予め希釈(1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600及び1/3200)した検査血清(100μl)を加え、次いでプレートを1時間37℃にてインキュベートする。3回の洗浄後、1/18,000希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG接合体(参照209-035-098、JACKSON)を加え、次いでプレートを1時間37℃にてインキュベートする。4回の洗浄後、色素原(TMB)及び基質(H2O2)を加え、プレートを、遮光して30分間室温でインキュベートする。次いで、反応を停止し、その後450nmの吸光度を自動化リーダーを用いて測定する。
ELISA検査(図10)は、組換えNタンパク質調製物が感染の後期(症状の発症の17日以上後)に収集したSARSに罹患している患者からの血清の抗体に特異的に認識される一方、感染の初期(症状の発症の3日後)に収集した患者の血清の抗体にも、SARSに罹患していない患者からのコントロール血清にも有意には認識されないことを証明する。
1)間接ELISA IgG検査
a)試薬
プレートの調製
プレートを、10mM PBS緩衝液(pH7.2)中2μg/mlのNタンパク質の溶液、0.25ml/lのフェノールレッドで感作する。100μlの溶液をウェル中に堆積し、放置して室温で一晩インキュベートする。10mM PBS/0.1%Tween緩衝液中で予備洗浄し、続いて飽和溶液PBS、25%ミルク/スクロースで洗浄することによって、飽和を得る。
緩衝液0.48g/l TRIS、10mM PBS、3.7g/l EDTA、15%v/vミルク、pH6.7
接合体希釈剤
クエン酸緩衝液(15g/l)、0.5%Tween、25%ウシ血清、12%NaCl、6%v/vスキムミルク pH6.5
接合体
50×抗ヒトIgG接合体(Bio-Radより市販:Platelia H. pylori kit ref 72778)
他の溶液:
洗浄溶液R2、TMBを含む可視化用溶液R8、希釈剤、R9色素原、R10停止溶液:Bio-Radより市販されている試薬(例えば:Platelia pylori kit、ref 72778)
血清をサンプル希釈剤中に1/200に希釈する
100μl/ウェルで分配する
37℃にて1時間のインキュベーション
脱塩水に予め10倍に希釈した10×洗浄溶液R2(すなわち1×洗浄溶液)中での3回の洗浄
100μlの接合体(提供された接合体希釈剤中で50×接合体を使用直前に希釈)を分配
37℃にて1時間のインキュベーション
1×洗浄溶液中での4回の洗浄
200μl/ウェルの可視化溶液(使用直前に希釈、例えば10mlのR8中に1mlのR9)を分配
暗所で、室温にて30分間のインキュベーション
100μl/ウェルのR10で反応を停止
450/620nmでの読み取り
結果は、検査された血清を陽性とみなす応答を超える応答を与える閾値血清を採用することにより解釈することができる。この血清は、バックグランドノイズより有意に高いシグナルを与えるように選択され、希釈される。
a)試薬
プレートの調製
プレートを、10mM PBS緩衝液(pH7.2)中1μg/mlのNタンパク質の溶液、0.25ml/lのフェノールレッドで感作する。100μlの溶液をウェル中に堆積し、放置して室温で一晩インキュベートする。10mM PBS/0.1%Tween緩衝液中で予備洗浄し、続いて飽和溶液10mM PBS、25%(V/V)ミルクで洗浄することによって、飽和を得る。
緩衝液50mM TRIS生理食塩水、pH8、2%ミルク
接合体
これは、Nakaneのプロトコル(Nakane P.K. and Kawaoi A.;(1974):Peroxidase-labeled antibody, a new method of conjugation. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry Vol.22, N) 23, pp.1084-1091)に従い、それぞれのモル比2/1で、ペルオキシダーゼにカップリングした精製した組換えNタンパク質である。このProtN POD接合体は、血清/接合体希釈剤中2μg/mlの濃度で使用する。
洗浄溶液R2、TMBを含む可視化用溶液R8、希釈剤、R9色素原、R10停止溶液:Bio-Radより市販されている試薬(例えば:Platelia pylori kit、ref 72778)
「予備希釈」プレートにおける第1工程
・ 各血清を予備希釈プレート中で1/5に希釈(48μlの希釈剤+12μlの血清)。
・ 全ての血清を希釈後、60μlの接合体を分配。
・ 適切な場合には、血清+接合体ミックスを放置してインキュベートする。
「反応」プレートにおける第2工程
・ 100μlの混合物/ウェルを反応プレート中に移す
・ 37℃にて1時間のインキュベーション
・ 予め脱塩水中で10倍に希釈した10×洗浄溶液R2(→ 1×洗浄溶液)中での5回の洗浄
・ 200μl/ウェルの可視化溶液(使用直前に希釈、例えば10mlのR8中に1mlのR9)を分配
・ 遮光し、室温にて30分間のインキュベーション
・ 100μl/ウェルのR10で反応を停止
・ 450/620nmでの読み取り
ハノイ(ベトナム)のフランス病院(French hospital of Hanoi)からの、又はハノイのフランス病院に関連して(JYK)、SARSの可能性が高い症例として分類された患者の血清を、間接IgG-N検査及び二重エピトープN検査を使用して分析した。
(1):鼻スワブ又は咽頭スワブについてネステッドRT-PCR BNI、LC Artus及びLC-NによりRT-PCR分析を行った;POSは、少なくとも1つのサンプルがこの患者において陽性であるとされたことを意味する。
(2):SARS-CoVに感染した細胞の溶解物を用いるELISA検査における血清の反応性は、検査した希釈率で得られたOD値に従って、非常に高い反応性(+++)、高い反応性(++)、反応性(+)及び陰性と分類された。
1)ヌクレオキャプシドタンパク質の遺伝子に特異的なプライマーを用いるリアルタイムRT-PCR条件の開発 − 「Light Cycler N」検査
a)プライマー及びプローブの設計
プライマー及びプローブを、番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノム配列から、プログラム「Light Cycler Probe Design(Roche)」を用いて設計した。したがって、以下の2つのシリーズのプライマー及びプローブを選択した:
− センスプライマー:N/+/28507:5'-GGC ATC GTA TGG GTT G-3' [28507〜28522]
− アンチセンスプライマー:N/-/28774:5'-CAG TTT CAC CAC CTC C-3' [28774〜28759]
− プローブ1:5'-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-フルオレセイン 3' [28561〜28586]
− プローブ2:5' Red705-GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-ホスフェート [28588〜28608]
− センスプライマー:N/+/28375:5'-GGC TAC TAC CGA AGA G-3' [28375〜28390]
− アンチセンスプライマー:N/-/28702:5'-AAT TAC CGC GAC TAC G 3' [28702〜28687]
− プローブ1:SARS/N/FL:5'-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC-フルオレセイン 3' [28541〜28563]
− プローブ2:SARS/N/LC705:5' Red705-CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C-ホスフェート 3' [28565〜28589]
2つのプライマー対のそれぞれの効力を検査するため、番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムのヌクレオチド28054〜29430に相当し、N遺伝子の配列を含有する合成RNAに対してRT-PCR増幅を行った。
より具体的には:
プライマー対No.2並びにSRAS/N/FL及びSRAS/N/LC705からなる一対のプローブを用いて、リアルタイムRT-PCRを開発した(図12)。
− 変性:95℃ 30秒間×1 分析モード:none
− 増幅:95℃ 2秒間 ]
50℃ 15秒間 分析モード:quantification* ] ×45
72℃ 13秒間 熱ランプ 2.0℃/秒 ]
− アニーリング: 40℃ 30秒間×1 分析モード:none
* 蛍光は、アニーリングの終了時及び各サイクルに測定する(SINGLEモードで)。
a)ウイルスRNAの抽出
臨床サンプル:製造業者の指示に従いQIAmp viral RNA Mini kit(QIAGEN)、又は等価の技法。RNAを60μlの容量で溶出させる。
第1工程:「SNE」カップルドRT-PCR
Invitrogenの「SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum(登録商標)Taq」キットを使用したが、Roche Boehringerの「Titan」キットも同様な結果を伴って適切に使用可能である。
− SNE-S1 5' GGT TGG GAT TAT CCA AAA TGT GA 5'
− SNE-AS1 5' GCA TCA TCA GAA AGA ATC ATC ATG 5'
→ 予想サイズ:440bp
H2O 6.5μl
反応ミックス 2× 12.5μl
オリゴSNE-S1 50μM 0.2μl
オリゴSNE-AS1 50μM 0.2μl
RNAsin 40U/μl 0.12μl
RT/Platinum Taqミックス 0.5μl
2.1 45℃ 30分間
55℃ 15分間
94℃ 2分間
2.2. 94℃ 15秒間 ]
45℃ 30秒間 ] ×5サイクル
72℃ 30秒間 ]
2.3. 94℃ 15秒間 ]
55℃ 30秒間 ] ×35サイクル
72℃ 30秒間 + 2秒間/サイクル ]
2.4. 72℃ 5分間
2.5. 10℃ ∞
+4℃で貯蔵
合成RNAは陽性コントロールとして働いた。コントロールとして、103、102及びa10コピーの合成RNA RSNEを各実験で増幅した。
オリゴヌクレオチド:
− SAR1-S 5' CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA 3'
− SAR1-AS 5' TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG 3'
→ 予想サイズ:121bp
H2O 35.8μl
Taq緩衝液 10× 5μl
MgCl2 25mM 4μl
ミックスdNTPs 5mM 2μl
オリゴSAR1-S 50 μM 0.5μl
オリゴSAR1-AS 50 μM 0.5μl
Taq DNA pol 5U/μl 0.25μl
Applied BiosystemsのAmpliTaq DNA Polを使用した(MgCl2を含まない10×緩衝液、ref 27216601)。
2.1. 94℃ 2分間
2.2. 94℃ 30秒間 ]
45℃ 45秒間 ] ×5サイクル
72℃ 30秒間 ]
2.3. 94℃ 30秒間 ]
55℃ 30秒間 ] ×35サイクル
72℃ 30秒間 + 1秒間/サイクル ]
2.4. 72℃ 5分間
2.5. 10℃ ∞
ネステッド検査の感度は、通常、記載した条件下で10コピーのRNAである。
4.次いで、オリゴSAR1-S及びSAR1-ASを用いて、フラグメントをQIAquick PCR kit(QIAGEN)で精製し配列決定することができる。
a)第1の比較研究
National Reference Center for the Influenza Virus(Northern region)が受け取り、SARS-CoVを含有する可能性が高い一連の呼吸器サンプルについて比較研究を行った。これを行うために、「Qiamp viral RNA extraction」キット(Qiagen)を用いてサンプルからRNAを抽出し、一方でNo.2シリーズのプライマー対及びプローブを上記の条件下で用い、他方でRocheにより市販されているキット「LightCycler SARS-CoV quantification kit」(reference 03 604 438)を用いるリアルタイムRT-PCRにより分析した。結果を下記の表VIにまとめる。結果は、2つのキットについて26サンプル中18サンプルが陰性であり、26サンプル中5サンプルが陽性である一方で、1つのサンプルがRocheのキットのみで、2つが「シリーズ2」N試薬のみで陽性であることを示す。加えて、3つのサンプル(20032701、20032712、20032714)について、検出したRNAの量は、No.2シリーズの試薬(プローブ及びプライマー)で、驚く程より高い。これらの結果は、「シリーズ2」Nプライマー及びプローブが、生物学的サンプル中のSARS-CoVゲノムの検出について、現在入手可能なキットより高感度であることを示す。
次いで、種々のネステッドRT-PCR法及びリアルタイムRT-PCR法の性能を、ハノイ(ベトナム)のフランス病院でSARSの可能性がある症例から症状の発症後4日目〜17日目に採取した121の呼吸器サンプルについて比較した。これらサンプルのうち、14サンプルが、Bernhard Nocht Instituteにより最初に記載されたORF1b(レプリカーゼをコードする)を標的にするネステッドRT-PCR法(BNIネステッドRT-PCR)を用いる第1の検査の間に陽性であるとされた。この検査に関連する情報は、インターネット上(アドレスhttp://www15.bni-hamburg.de/ bni2/neu2/getfile.acgi?area_engl=diagnostics&pid=4112)で入手可能である。
− 上記の「シリーズ2」Nプライマー及びプローブを用いる、本発明による定量RT-PCR法(LightCycler Nの列)、
− CDC、BNI及びInstitut Pasteurにより開発された、上記のRNAポリメラーゼ遺伝子を標的するネステッドRT-PCR検査(CDC/IPネステッドRT-PCR)、
− 「HPA Corona LC RT-PCR kit #5601-02」で参照されるARTUSキット(これはORF1b遺伝子を標的するリアルタイムRT-PCR検査である)、
− BNIネステッドRT-PCR検査(これもまた上記のRNAポリメラーゼ遺伝子を標的する)。
1)繰り返しの解凍の間のRNA調製物(特に最低量のRNAを含有するサンプルについて)の分解に関連する同じ技法の検査間のバラツキ、
2)BNIネステッドRT-PCRと比較したCDC/IPネステッドRT-PCRの減少した感度、及び
3)Artus LightCycler(LC)検査と比較した本発明による定量RT-PCR検査(LightCycler N)の匹敵する感度。
Balb Cマウスを精製した組換えNタンパク質で免疫し、Kohler and Milsteinの技法に従い、脾臓細胞を適切なマウスミエローマと融合させた。
抗N抗体を分泌する19のハイブリドーマを予備選択し、それらの免疫反応性を決定した。これら抗体は確かに、種々の強度で組換えNタンパク質を認識し(ELISAで)、ELISA及び/又はウェスタンブロッティングで天然のウイルスNタンパク質を認識する。図18〜20は、これら19のモノクローナル抗体のうちの15についてのこれら検査の結果を示す。
この群の代表は抗体156である。この抗体を産生するハイブリドーマは、パスツール研究所(Paris、France)のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に、2004年12月1日、番号I-3331で寄託した。この同じエピトープはまた、この同じNタンパク質を用いる従来の免疫によって取得したウサギ血清(抗Nポリクローナル)により認識される。
非常に特異的な性質であるので、対象者又は患者の血清におけるウイルスNタンパク質の追加の捕捉・検出研究用に、下記に列挙した抗体を選択した。
これら抗体をマウスの腹水中で産生し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、単独で又は組み合せて、捕捉抗体として、またシグナル抗体として使用した。
− Ab 抗C-ter領域(No.28、57、143)
− Ab 抗中央領域(No.87、166)
− Ab 抗N-ter領域(No.156)
− Ab 抗不連続構造エピトープ(86)
a)免疫捕捉ELISAプレート
プレートを、0.1M炭酸塩緩衝液(pH9.6)中5μg/mlの抗体溶液で感作する。(一価又は多価の)溶液をウェル中に100μlの容量で堆積し、一晩室温にてインキュベートする。これらプレートを次いで、PBS緩衝液(10mM pH7.4、0.1%Tween 20を補充し、次いで0.3%BSA及び5%スクロースを補充したPBS溶液で飽和)で洗浄する。次いで、プレートを乾燥させた後、乾燥剤の存在下でバッグに入れる。これらは直ぐに使用できる。
精製した抗体は、Nakaneのプロトコル(Nakaneら- 1974、J. of Histo and cytochemistry, vol.22, pp.1084-1091)に従い、3分子のペルオキシダーゼ当たり1分子のIgGの比でペルオキシダーゼにカップリングした。これら接合体を排除クロマトグラフィーにより精製し、50%グリセロールの存在下に−20℃にて濃縮して貯蔵した(1〜2mg/mlの濃度)。これらは、アッセイにおいて、1%BSAを補充したPBS緩衝液(pH7.4)中1又は2μg/mlの最終濃度で使用するために希釈される。
− HIV、HBV、HCV及びTHLVウイルスの全ての血清マーカーについて陰性であるヒト血清
− 0.5%Triton X 100を補充した陰性ヒト血清のプール
− 不活化ウイルスAg:照射により不活化し、不活化を感受性細胞での培養後に確認したウイルス培養上清 − 不活化前の懸濁液の力価 約107感染粒子/ml抗原、或いは約5×109物理的ウイルス粒子/ml抗原
− 陰性ヒト血清で希釈したAgサンプル:これらサンプルは、1:100希釈、次いで5倍系列希釈により調製した。
これら非感染性サンプルは、低濃度〜非常に低い濃度のウイルス核タンパク質Nを含有すると考えられるヒトサンプルを模擬する。このようなサンプルは、ルーチンの作業では入手できない。
− 洗浄溶液R2、可視化用溶液TMB R8、色素原R9及び停止溶液R10は、Bio-Radにより、そのELISAキット(例えば:Platelia pylori kit、ref 72778)として市販されている一般試薬である。
不活化ウイルスAgを過剰に負荷したヒト血清サンプルを、100μl/ウェルの量で、使用の準備が整っている感作済みプレートに直接分配し、次いで37℃にて1時間インキュベートする(Bio-Rad IPSインキュベーション)。
固相に結合しなかった材料を、3回の洗浄により除去する(希R2溶液で洗浄、自動LP 35洗浄機)。
適切な接合体(1又は2μg/mlの最終濃度に希釈)を100μl/ウェルの量で分配し、再度プレートを37℃にて1時間インキュベートする(IPSインキュベーション)。
過剰の接合体を4回の連続洗浄により除去する(希R2溶液 − LP 35洗浄機)。
酵素反応は、最終的に、100μlのR10試薬(1N H2SO4)を全てのウェルに加えることによりブロックする。
読み取りは、適切なマイクロプレートリーダーを用いて、2つの波長(450/620nm)で行う。
種々の捕捉抗体とシグナル抗体との組合せを、選択した抗体の性質に基づいて検査した。その際、固相中の抗体と接合体としての抗体に同じエピトープに特異的な抗体の組合せを避けた。
最良の結果を下記に列挙する4つの組合せで得た。これら結果を下記の表IXに示す。
固相(Ab166 + 87 中央領域):接合抗体28(C-ter)
2.組合せG/28
固相(Ab86 − 構造エピトープ):接合抗体28(C-ter)
3.組合せH/28
固相(Ab86、166及び87 中央領域及び構造エピトープ):接合抗体28(C-ter)
4.組合せH/28 + 87
固相(Ab86、166及び87 中央領域及び構造エピトープ):混合の接合抗体28(C-ter)及び87(中央)
5.組合せG/87
固相(Ab86 − 構造エピトープ):接合抗体87(中央領域)
固相(Ab87のみ):接合抗体57(C-ter)
7.組合せG/28の変形
固相(Ab86 − 構造エピトープ):接合抗体57(C-ter)
8.組合せH/28の変形
固相(Ab86及び87 中央領域及び構造エピトープ):接合抗体57(C-ter)
9.組合せH/28 + 87の変形
固相(Ab86及び87 中央領域及び構造エピトープ):混合の接合抗体57(C-ter)及び87(中央)
この研究から、天然型ウイルス核タンパク質の捕捉に最も適切な抗体は、中央領域及び/又は構造エピトープに特異的な抗体であることが明らかである。両抗体は、天然型抗原に対する高い親和性について選択された抗体でもある。
1)哺乳動物細胞でのSARS-CoV Sの発現条件の最適化
SARS-CoV針状(S)タンパク質の一過性発現の条件を、哺乳動物細胞(293T、VeroE6)中で最適化した。
2つの独立した実験を2つの細胞型の各々について行った。VeroE6細胞についての実験1では、トランスフェクションを2連で行った。結果を、測定した発現レベルの平均値及び標準偏差値の形で示す。
プラスミドpTRIP-Sを取得するために、SARS-CoV Sタンパク質のcDNAを、BamH1-Xho1フラグメントの形態で、中央DNAフラップを有する欠損レンチウイルスベクターTRIPを含有するプラスミドpTRIPΔU3-CMV中にクローニングした(Sirvenら、2001, Mol. Ther., 3: 438-448)(図24)。293T細胞における、このプラスミド、キャプシド形成プラスミド(p8.2)及びVSVエンベロープ糖タンパク質G(pHCMV-G)発現用プラスミドのZennouら(2000, Cell, 101: 173-185)に従う一過性の同時トランスフェクションにより、ベクターTRIP-Sを含有しエンベロープタンパク質Gで偽型化したレトロウイルス偽粒子の製造を可能にした。これら偽型化TRIP-Sベクターを使用して、293T細胞及びFRhK-4細胞に形質導入した:Sタンパク質の発現は、形質導入した細胞で、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光により検出することができなかった(データは示さず)。
可溶形態のSタンパク質(Ssol)をコードするcDNAを、このタンパク質のエクトドメイン(アミノ酸1〜1193)をコードする配列とタグ(FLAG:DYKDDDDK)の配列とをSGジペプチドをコードするBspE1リンカーを介して融合することにより取得した。実際には、プラスミドpcDNA-Ssolを取得するために、SARS-CoV SのエクトドメインをコードするDNAフラグメントを、プラスミドpcDNA-Sからのオリゴヌクレオチド5'-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3'及び5'-ACCTCCGGAT TTAATATATT GCTCATATTT TCCCAA-3'を用いるPCRにより増幅し、次いでそのBamH1部位とXho1部位との間にタグ配列FLAGを含有する改変した原核生物発現プラスミドpcDNA3.1(+)(Clontech)の独特なBamH1部位とBspE1部位との間に挿入した:
スプライスシグナルの効果並びに転写後シグナルWPRE及びCTEの効果をBALB/cマウスの遺伝子免疫後に分析した(図28)。
まとめると、スプライスシグナルの使用及びウッドチャック肝炎ウイルスの転写後シグナルWPREの使用は、SARS-CoV SのcDNAの発現を導くプラスミドDNAを用いての遺伝子免疫後に、SARS-CoVを指向する中和化抗体の誘導をかなり改善する。
SARSに罹患している患者からの血清に関して組換えSsolポリペプチドのELISA反応性を分析した。
SARS-CoVに感染したVeroE6細胞についての免疫蛍光検査及び/又は抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を用いる間接ELISA検査によりSARS-CoVの天然型抗原に対する特異的反応性の分析の結果(陽性又は陰性)に基づいて、SARSの可能性が高い症例からの検査血清を選択した。これら患者の血清は、National Reference Center for Influenza Virusesの通し番号並びに患者のイニシャル及び症状の発症からの経過日数により特定した。3、8及び12日目の呼吸器サンプルについて実施したRT-PCRによりSARS-CoV感染を確証できなかった患者VTTの血清032552を除き、可能性が高い症例の全ての血清(表XIIを参照)がSARS-CoVの天然型抗原を認識する。コントロール血清のパネルをコントロールとして使用した(TV血清):これらは、2003年に発生したSARS流行の前にフランスで収集した血清である。
組換えSsolポリペプチドの免疫原性をマウスにおいて研究した。
このため、1群の6匹のマウスを、3週間の間隔で、PBSに希釈した1mgの水酸化アルミニウム(Alu-gel-S、Serva)をアジュバントとして10μgの組換えSsolポリペプチドで免疫した。3回の連続免疫を実施し、免疫血清を免疫(IS1、IS2、IS3)の各々の3週間後に収集した。コントロールとして、1群のマウス(mock群)に、同じプロトコルに従って水酸化アルミニウムのみを与えた。
1)合成遺伝子の設計
SARS-CoV針状タンパク質をコードする合成遺伝子を、哺乳動物細胞、特にヒト起源の細胞における高レベル発現を可能にするように、単離株031589の遺伝子(プラスミドpSARS-S、C.N.C.M. No.I-3059)から設計した。
− 単離株031589の野生型遺伝子のコドンの使用を、ヒトにおいて観察される偏りに近くなるように、そして対応するmRNAの翻訳の効率が向上するように改変した
− この遺伝子の全体GC含量を、対応するmRNAの半減期を延長するように増加させた
− この遺伝子の効率的な発現に干渉し得る随意の潜在モチーフ(optionally cryptic motif)を欠失させた(スプライスドナー及びアクセプター部位、ポリアデニル化シグナル、GCが非常にリッチな(>80%)又は非常に低い(<30%)配列、反復配列、RNA二次構造の形成に関与する配列、TATAボックス)
− 第2の停止コドンを付加して、翻訳の効率的な終結を可能にした。
合成遺伝子040530と、C.N.C.M.に番号I-3059で寄託したSARS-CoVの単離株031589の野生型遺伝子の配列(配列番号4、プラスミドpSRAS-S)とのアラインメントを図32に示す。
合成遺伝子(配列番号140)を合成オリゴヌクレオチドから組み立て、プラスミド040530pUC-Kanaを取得するために、プラスミドpUC-KanaのKpn1部位とSac1部位との間にクローニングした。プラスミド040530pUC-Kanaの挿入物のヌクレオチド配列を自動化配列決定(Applied)により確認した。
合成遺伝子040530を含有するKpn1-Xho1フラグメントを、プラスミド040530pUC-Kanaから切り出し、プラスミドpCI-SSYNTH(2004年12月1日に、番号I-3333でCNCMに寄託)を取得するために、発現プラスミドpCI(Promega)のNhe1部位とXho1部位との間にサブクローニングした。
プラスミドpCI-Scube及びpCI-Ssolは同じ組換えSsolポリペプチドをコードする。
Sタンパク質をコードする合成遺伝子が哺乳動物細胞におけるSARS-CoV Sの発現を効率的に導く能力を、霊長類細胞(VeroE6)及びヒト細胞(293T)の一過性トランスフェクション後に、野生型遺伝子の能力と比較した。
図33及び表XIVに示した実験において、35mmペトリ皿中の5×105の単層VeroE6細胞又は7×105の単層293T細胞を、2μgのプラスミドpCI(コントロールとして)、pCI-S、pCI-S-CTE、pCI-S-WPRE及びpCI-S-Ssynthで、6μlのFugene6試薬を製造業者(Roche)の指示に従って用いてトランスフェクトした。37℃にて5%CO2下での48時間のインキュベーション後、細胞抽出物をLaemmliに従うローディング緩衝液中に調製し、8%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでPVDF膜(BioRad)に移した。このイムノブロット(ウェスタンブロット)の検出を、抗Sウサギポリクローナル血清(ウサギP11135の免疫血清:上記実施例4を参照)及びウサギIgGを指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いて行った。イムノブロットを、ECL+キット(Amersham)を用いる発光及びディジタル画像化デバイス(FluorS、BioRad)上への獲得により定量的に可視化した。
SARS-CoV Sをコードする合成遺伝子040530又はポリペプチドSsolをコードするそのScube変種の使用は、高レベルでのSの発現が必要である多くの適用において野生型遺伝子を有利に置換することができる。より詳細には、以下のために:
− pCI-Ssynth型のプラスミド(pCI-Ssynth-CTE型又はpCI-Ssynth-WPRE型のプラスミドでさえ)での遺伝子免疫の効率を改善するため
− それぞれSsynth遺伝子又はScube遺伝子を有する組換えレンチウイルスベクターを用いて、より高量のSタンパク質又はSsolポリペプチドを発現する新規細胞株を樹立するため
− Sタンパク質の発現又はSsolポリペプチドの発現を可能にする組換えレンチウイルスベクターの免疫原性を改善するため
− Sタンパク質の発現又はSsolポリペプチドの発現を可能にする、組換えワクシニアウイルス又は組換え麻疹ウイルスのような生ベクターの免疫原性を改善する(下記実施例16及び17を参照)のため。
ワクチン適用
可溶形態の針状(S)タンパク質の製造及びSARSについての血清学的検査の設計への適用
1)導入
この実施例の目的は、種々のSARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)抗原を発現する組換えワクシニアウイルス(VV)がSARSに対する新規ワクチン候補及び哺乳動物細胞で組換え抗原を産生する手段を構成する能力を評価することである。
7.5Kプロモーターの制御下でのSARS-CoVの031589単離株のS糖タンパク質の発現及びこのタンパク質の可溶性で分泌される形態であるSsolポリペプチドの発現を導く組換えワクシニアウイルスを取得した。Sの発現レベル及びSsolの発現レベルを増大させるために、SのcDNA及びSsolのcDNAが後期合成プロモーターの制御下に配置された組換えウイルスもまた取得した。
Sタンパク質及びSsolポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現をウェスタンブロッティングにより評価した。
単層のCV-1細胞を、種々の組換えワクシニアウイルスVV-TG、VV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN、VV-TN-S及びVV-TN-Ssolに多重度2で感染させた。37℃にて5%CO2下での18時間のインキュベーション後、細胞抽出物をLaemmliに従うローディング緩衝液中に調製し、8%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでPVDF膜(BioRad)に移した。このイムノブロット(ウェスタンブロット)の検出を、抗Sウサギポリクローナル血清(ウサギP11135からの免疫血清:実施例4を参照)及びウサギIgGを指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いて行った。結合した抗体を、ECL+キット(Amersham)を用いる発光及びオートラジオグラフィーフィルムHyperfilm MP(Amersham)により可視化した。
BHK-21株は、検査した株(BHK-21、CV1、293T及びFrhK-4、図36B)のうち、VV-TN-Ssolウイルスの感染後に最高量のSsolポリペプチド分泌する細胞株である;これは、組換えSsolポリペプチドの定量的産生及び精製を可能にする。感染、産生及び精製の実験条件が最適化された典型的な実験では、BHK-21細胞を標準培養培地(4.5g/lのグルコースを含有し5%TPB、5%FCS、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンを補充したピルビン酸塩フリーDMEM)に、サブコンフルエント単層(25mlの培地中各100cm2について10百万細胞)の形態で接種する。37℃にて5%CO2下での24時間のインキュベーション後、細胞を0.03のM.O.I.で感染させ、標準培地を、FCSの量が0.5%に減じられ、TPBが排除されている分泌培地に交換する。培養上清を35℃にて5%CO2下での2.5日のインキュベーション後に取り出し、ワクシニアウイルスをTriton X-100(0.1%)の添加により不活化する。0.1μmポリエーテルスルホン(PES)膜上での濾過後、TBS(50mM tris、pH7.4、150mM NaCl)中100μg/mlのFLAGペプチド(DYKDDDDK)の溶液で抽出する抗FLAGマトリクス上でのアフィニティークロマトグラフィーにより組換えSsolポリペプチドを精製する。
組換えSsolポリペプチドのELISA反応性を、SARSに罹患している患者からの血清に対して分析した。
組換えワクシニアウイルスの免疫原性をマウスで研究した。
このため、1群の7匹のBALB/cマウスを、4週間の間隔で2回、i.v.経路により、106 p.f.u.の組換えワクシニアウイルスVV-TG、VV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN、VV-TN-S及びVV-TN-Ssol並びにコントロールとして、A/PR/8/34系統のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの発現を導くVV-TG-HAで免疫した。免疫血清を免疫(IS1、IS2)の各々の3週間後に回収した。
第3世代組換えワクシニアウイルスは、上記のように、S遺伝子及びSsol遺伝子の野生型配列を哺乳動物細胞での発現に最適化した合成遺伝子で置換することにより構築する。これら組換えワクシニアウイルスは、より大量のS抗原及びSsol抗原を発現することができ、したがって増大した免疫原性を示すことができる。
組換えワクシニアウイルスVV-TN-Ssolは、診断適用(ELISAによる血清学)及びワクチン適用(サブユニットワクチン)のためのSsol抗原の定量的産生及び精製に使用することができる。
1)導入
麻疹ワクチン(MV)は、単回注射後にヒトで持続性保護免疫を誘導する(Hilleman、2002, Vaccine, 20: 651-665)。付与された保護は非常に強く、抗体応答の誘導並びにCD4及びCD8細胞応答の誘導に基づく。MVゲノムは非常に安定であり、ワクチン系統の毒性への復帰は今まで観察されていない。麻疹ウイルスは、Paramyxoviridae科のMorbillivirus属に属する;これは、ゲノムが16kbの一本鎖RNA(マイナス鎖)であり(図40A)、専ら細胞質で行われる複製サイクルが宿主ゲノムへの組み込みの可能性を排除する、エンベロープに被われたウイルスである。したがって、麻疹ワクチンは、ヒト集団に使用される最も効果的で最も安全な生ワクチンの1つである。Frederic Tangyのチームは、最近、最も安全な減弱系統であり、麻疹に対するワクチンとしてヒトで最も広く使用されているSchwarz系統の麻疹ウイルスに基づいて発現ベクターを開発した。このワクチン系統は、感染性分子クローンから単離され得るが、感染に対して感受性である霊長類及びマウスで免疫原性を保存している。これは、追加の転写ユニットの挿入後、異種配列の発現用ベクター構成する(Combredet、2003, J. Virol. 77: 11546-11554)。加えて、西ナイルウイルス(WNV)のエンベロープ糖タンパク質を発現する組換えMV Schwarzは、マウスをWNVの致死性攻撃感染から保護する効果的で持続性の抗体応答を誘導する(Despresら、2004, J. Infect. Dis.、印刷中)。これら特徴のすべてが、この減弱Schwarz系統の麻疹ウイルスを、新規組換え生ワクチンの構築に大いに見込みのある候補ベクターとする。
本発明者らは、遺伝子免疫後に動物でSARS-CoVの感染性を中和する抗体を誘導することができるSARS-CoV針状(S)タンパク質、及びこのタンパク質の可溶性で分泌される形態であるSsolポリペプチド(これは、C-ter端部で、SGジペプチドをコードするBspE1リンカーを介してFLAGタグ(DYKDDDDK)の配列と融合したSのエクトドメイン(aa1〜1193)から構成される)に着目した。このSsolポリペプチドは、Sタンパク質の抗原性と同様の抗原性を示し、アジュバントとして水酸化アルミニウムと組み合せた精製したタンパク質の形態でのマウスへの注射後に、SARS-CoVに対する高い中和化抗体力価の誘導を可能にする。
プラスミドpTM-MVSchw-ATU2(図40B)は、追加の転写ユニット(ATU)がP(リンタンパク質)遺伝子とM(マトリクス)遺伝子との間に導入されたSchwarzワクチン系統の麻疹ウイルス(MV)のアンチゲノムに相当する感染性cDNAを含有する(Combredet、2003, Journal of Virology, 77: 11546-11554)。Sタンパク質及びSsolポリペプチドのORFをMVSchw-ATU2ベクターの追加の転写ユニット中に挿入することによって麻疹ウイルスの組換えゲノムMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolを構築した。
Sタンパク質及びSsolポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現をウェスタンブロッティング及び免疫蛍光により評価した。
T-25フラスコ中の単層Vero細胞を、種々の継代の2つのウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssol並びにコントロールとしての野生型ウイルスMWSchwに多重度0.05で感染させた。シンシチウムが80〜90%コンフルエンスに達したときに、細胞質抽出物を抽出緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.2、1%Triton X-100、0.1%SDS、1%DOC)中に調製し、次いでLaemmliに従うローディング緩衝液中に希釈し、8%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、PVDF膜(BioRad)上に移した。このイムノブロット(ウェスタンブロット)の検出を、抗Sウサギポリクローナル血清(ウサギP11135の免疫血清:上記実施例4を参照)及びウサギIgGを指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いて行った。結合した抗体を、ECL+キット(Amersham)を用いる発光及びHyperfilm MPオートラジオグラフィーフィルム(Amersham)により可視化した。
ウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-SsolがSARS-CoV Sの発現を可能にすることが示されたので、MVによる感染に感受性である
a)S又はSsolの発現を(Sのフラグメントの発現でさえ)可能にするレンチウイルスベクターは、ヒト又は獣医学上の予防に使用されるべきSARS-CoVに対する組換えワクチンを構成することができる。このようなワクチンの実現可能性を証明するために、組換えレンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-S-WPRE及びTRIP-SD/SA-Ssol-WPREの免疫原性をマウスで研究する。
Claims (29)
- ゲノムが、相補DNAの形態で、Genbank配列AY274119.3を参照にして示される位置で、Sタンパク質の遺伝子の23220位〜23222位にセリンコドン又はORF3の遺伝子の25298位〜25300位にグリシンコドン、及びORF1aの7918位〜7920位にアラニンコドン又はMタンパク質の遺伝子の26857位〜26859位にセリンコドンを有することを特徴とする、重症急性呼吸器症候群関連ヒトコロナウイルスの単離又は精製した系統。
- ゲノムのDNA等価物が配列番号1の配列に相当する配列を有することを特徴とする請求項1に記載の単離又は精製したコロナウイルス系統。
- 配列が請求項1又は2に記載の単離したコロナウイルス系統のゲノムのものであることを特徴とする単離又は精製したポリヌクレオチド。
- 配列が配列番号1であることを特徴とする請求項3に記載の単離又は精製したポリヌクレオチド。
- 以下:
− 請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドの配列の28507位〜28522位(センスプライマー、配列番号60)及び28774位〜28759位(アンチセンスプライマー、配列番号61)にそれぞれ相当するプライマー対No.1、
− 請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドの配列の28375位〜28390位(センスプライマー、配列番号62)及び28702位〜28687位(アンチセンスプライマー、配列番号63)にそれぞれ相当するプライマー対No.2、及び
− 配列番号55及び56のプライマーからなるプライマー対
からなる群より選択されることを特徴とする、SARS関連コロナウイルスのゲノム配列又はそのDNA等価物のフラグメントを増幅し得るプライマー対。 - 請求項3又は4に記載のポリヌクレオチド配列の以下の位置:28561位〜28586位、28588位〜28608位、28541位〜28563位及び28565位〜28589位に相当するフラグメント(配列番号64〜67)からなる群より選択されることを特徴とする、SARS関連コロナウイルスのゲノム又はそのフラグメントの存在を検出し得るプローブ。
- 配列番号38の配列を有する挿入物を含んでなり、細菌系統中に含有され、2003年6月5日に、No.I-3048で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託されていることを特徴とする組換えクローニング及び/又は発現ベクター。
- 以下:
− Nタンパク質(配列番号37)のポリヒスチジンタグとのC末端融合体をコードするcDNAフラグメント、及び
− Nタンパク質(配列番号37)のポリヒスチジンタグとのN末端融合体をコードするcDNAフラグメント
からなる群より選択されるcDNAフラグメントを含有することを特徴とする組換えクローニング及び/又は発現ベクター。 - 2003年10月23日に、No.I-3117で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した細菌系統に含有されていることを特徴とする請求項8に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載のベクターで改変された細胞。
- 以下のハイブリドーマ:
− モノクローナル抗体87を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に、番号I-3328でCNCMに寄託)、
− モノクローナル抗体86を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に、番号I-3329でCNCMに寄託)、
− モノクローナル抗体57を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に、番号I-3330でCNCMに寄託)、及び
− モノクローナル抗体156を産生するハイブリドーマ(2004年12月1日に、番号I-3331でCNCMに寄託)
から選択されることを特徴とするNタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 請求項11に記載のハイブリドーマにより産生されることを特徴とするNタンパク質を指向するポリクローナル又はモノクローナルの抗体又は抗体フラグメント。
- 請求項12に記載の抗体又は抗体フラグメントを含んでなることを特徴とするチップ又はフィルター。
- 天然型ウイルス核タンパク質(Nタンパク質)に特異的なモノクローナル抗体を使用することを特徴とするSARS関連コロナウイルス感染を検出することを意図する免疫捕捉検査。
- 天然型ウイルス核タンパク質の捕捉に使用する抗体が中央領域及び/又は構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項14に記載の免疫捕捉検査。
- Nタンパク質の捕捉に使用する抗体が2004年12月1日に、番号I-3328でCNCMに寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体mAb87であることを特徴とする請求項14又は15に記載の免疫捕捉検査。
- Nタンパク質の捕捉に使用する抗体が2004年12月1日に、番号I-3329でCNCMに寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体mAb86であることを特徴とする請求項14又は15に記載の免疫捕捉検査。
- モノクローナル抗体mAb86及びmAb87がNタンパク質の捕捉に使用されることを特徴とする請求項14又は15に記載の免疫捕捉検査。
- Nタンパク質の可視化に使用する抗体が2004年12月1日に、番号I-3330でCNCMに寄託したハイブリドーマにより産生され、可視化分子又は粒子と接合されているモノクローナル抗体mAb57であることを特徴とする請求項14〜18のいずれか1項に記載の免疫捕捉検査。
- 可視化分子又は粒子と接合されているmAb57抗体とmAb87抗体との組合せがNタンパク質の可視化に使用されることを特徴とする請求項14〜18のいずれか1項に記載の免疫捕捉検査。
- 以下:
(a)請求項5に記載のプライマー対又は請求項6に記載のプローブ、
(b)請求項7〜9のいずれか1項に記載の組換えベクター又は請求項10に記載の改変された細胞、
(c)請求項1若しくは2に記載の単離したコロナウイルス系統又は請求項3及び4のいずれかに記載のポリヌクレオチド、
(d)請求項12に記載の抗体又は抗体フラグメント、
(e)モノクローナル抗体mAb86及び/又はmAb87とモノクローナル抗体mAb57を含んでなる抗体の組合せ、
(f)請求項13に記載のチップ又はフィルター
からなる群より選択されることを特徴とするSARS関連コロナウイルスの検出用試薬。 - 以下:請求項5に記載のプライマー対、請求項6に記載のプローブ、請求項7〜9のいずれか1項に記載の組換えベクター、請求項10に記載の改変された細胞、請求項1又は2に記載の単離したコロナウイルス系統、請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される物の、SARS関連コロナウイルスの検出用及び任意に遺伝子型決定用の試薬の製造のための使用。
- 少なくとも、
(a)生物学的サンプル中に存在する核酸の抽出、
(b)請求項5に記載のプライマー対を用いるRT-PCRによるORF-Nのフラグメントの増幅、及び
(c)任意の適切な手段による(b)で得られる増幅産物の検出
を含んでなることを特徴とする生物学的サンプルからのSARS関連コロナウイルスの検出方法。 - 検出工程(b)が請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドの配列の28561位〜28586位、28588位〜28608位、28541位〜28563位及び28565位〜28589位に相当する少なくとも1つのプローブを用いて実施されることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- プレートを10mM PBS緩衝液(pH7.2)中0.5〜4μg/ml、好ましくは2μg/mlの濃度のNタンパク質溶液、0.25ml/lのフェノールレッドで感作することを特徴とする、Nタンパク質を用いる間接IgG ELISAによる生物学的サンプルからのSARS関連コロナウイルス感染の検出方法。
- 検査すべき血清を可視化抗原と混合し、次いで該混合物を固体支持体に付着させた抗原に接触させることを特徴とする二重エピトープELISAによる生物学的サンプルからのSARS関連コロナウイルス感染の検出方法。
- 請求項11に記載のポリクローナル又はモノクローナルの抗体又は抗体フラグメントとSARS関連コロナウイルスタンパク質又はペプチドとから形成された免疫複合体。
- 以下:請求項5に記載のプライマー対、請求項6に記載のプローブ、請求項7〜9のいずれか1項に記載の組換えベクター、請求項10に記載の改変された細胞、請求項1又は2に記載の単離したコロナウイルス系統、及び請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1つの試薬を含んでなることを特徴とするSARS関連コロナウイルス検出キット又はボックス。
- 以下の位置:7919位と23220位、7919位と25298位、16622位と23220位、19064位と23220位、16622位と25298位、19064位と25298位、23220位と24872位、23220位と26857位、24872位と25298位、25298位と26857位に相当する少なくとも1つの塩基対又は複数の塩基対を含むことを特徴とする請求項3に記載のポリヌクレオチドのフラグメント。
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