JP5090741B2 - 新規なｓａｒｓ関連コロナウイルス系統のゲノムによりコードされるタンパク質及びペプチドの利用 - Google Patents

新規なｓａｒｓ関連コロナウイルス系統のゲノムによりコードされるタンパク質及びペプチドの利用 Download PDF

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Description

本発明は、No.031589で記録され、ハノイ(ベトナム)で収集されたサンプルに由来する重症急性呼吸器症候群(SARS)関連コロナウイルスの新規系統、そのゲノムに由来する核酸分子、該核酸分子によりコードされるタンパク質及びペプチド、及びそれらの利用、特に診断試薬及び/又はワクチンとしての利用に関する。
コロナウイルスは、宿主細胞の細胞質中で複製する約30キロベースのプラス鎖の一本鎖RNAを含有するウイルスである；そのゲノムの5'末端は、キャップ構造(capped structure)を有し、3'末端はポリＡテイルを含有する。このウイルスはエンベロープに被われ、その表面に、針(spicule)と呼ばれるペプロマー構造を含んでなる
ゲノムは、5'末端から3'末端へ、以下のオープンリーディングフレーム又はORF：転写−複製複合体のタンパク質に対応するORF1a及びORF1b、並びに構造タンパク質Ｓ、Ｅ、Ｍ、及びＮに対応するORF-S、ORF-E、ORF-M、及びORF-Nを含んでなる。ゲノムはまた、ORF-SとORF-Eとの間にORF-Eに重複して位置する領域、ORF-MとORF-Nとの間に位置する領域、並びにORF-Nに含まれる領域によりコードされる未知の機能のタンパク質に対応するORFを含んでなる。
Ｓタンパク質は、ウイルスエンベロープの表面から出現する針又は棘の形態で存在する膜糖タンパク質(200〜220kDa)である。これは、宿主細胞のレセプターへのウイルスの付着及びウイルスエンベロープと細胞膜との融合の誘導を担う。
約10kDaの非グリコシル化膜貫通タンパク質である小さなエンベロープタンパク質(Ｅ)は、sM(小膜)とも呼ばれ、ビリオン中に最も少ない量で存在するタンパク質である。これは、小胞体及びゴルジ装置中の中間区画のレベルで生じるコロナウイルスの出芽プロセスにおいて強力な役割を演じる。
Ｍタンパク質又はマトリクスタンパク質(25〜30kDa)は、M/E相互作用によりウイルス粒子中に組み込まれている、より豊富な膜糖タンパク質である。一方、ウイルス粒子へのＳの組み込みは、S/M相互作用により導かれる。これは、コロナウイルスのウイルス成熟に、及びウイルス粒子が組み立てられる部位の決定に重要でありそうである。
コロナウイルスの構造タンパク質の間で最も保存されているＮタンパク質又はヌクレオキャプシドタンパク質(45〜50kDa)は、ゲノムRNAをキャプシド化するために、そして次いでビリオン中への組み込みを導くために必要である。このタンパク質はまた、おそらく、RNAの複製にも関与する。
宿主細胞が感染すると、ウイルスゲノムの5'側に位置するリーディングフレーム(ORF)が、ポリタンパク質に翻訳され、このポリタンパク質はウイルスプロテアーゼにより切断され、次いで幾つかの非構造タンパク質、例えばRNA依存性RNAポリメラーゼ(Rep)及びATPアーゼヘリカーゼ(Hel)を遊離する。これら２つのタンパク質は、ウイルスゲノムの複製に、及びウイルスタンパク質の合成に使用される転写物の生成に関与する。これらサブゲノムmRNAが産生される機序は、完全には理解されていない；しかし、最近の事実により、各遺伝子の5'末端の転写調節用配列は、サブゲノムmRNAの不連続転写を調節するシグナルを表していることが示されている。
ウイルス膜のタンパク質(Ｓ、Ｅ、及びＭタンパク質)が中間区画に挿入される一方で、複製したRNA(＋鎖)は、Ｎ(ヌクレオキャプシド)タンパク質と共に組み立てられる。このタンパク質-RNA複合体は、次いで、小胞体の膜に含有されるＭタンパク質と組み合わさり、ヌクレオキャプシド複合体が小胞体中に出芽するときにウイルス粒子が形成する。次いで、ウイルスはゴルジ複合体を横切って移動し、最後には、例えばエクソサイトーシスにより、細胞を出る。ウイルスの宿主細胞への付着部位は、Ｓタンパク質のレベルである。
コロナウイルスは、ヒトの風邪の15〜30％の原因であり、動物、特にネコ(FIPV：ネコ感染性腹膜炎ウイルス)、家禽(IBV：トリ感染性気管支炎ウイルス)、マウス(MHV：マウス肝炎ウイルス)、ブタ(TGEV：伝染性胃腸炎ウイルス、PEDV：ブタ流行性下痢症ウイルス、PRCoV：ブタ呼吸器コロナウイルス、HEV：赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス)、及びウシ(BCoV：ウシコロナウイルス)の呼吸器及び消化器感染の原因である。
一般に、各コロナウイルスは１つの種にのみ影響する；免疫応答性個体では、感染は、場合によっては、感染細胞を破壊し得る中和化抗体及び細胞免疫を誘導する。
重症急性呼吸器症候群(SARS)と呼ばれる異型肺炎の流行が、最初の発生源(2002年の第４四半期の中国のようである)から、2003年の第１四半期の間に、種々の国々(ベトナム、香港、シンガポール、タイ、及びカナダ)で広がった。この疾患の重篤度は、死亡率が約３〜６％である。この疾患の原因物質の決定は、世界中の多くの研究所により進行中である。
2003年３月に、重症急性呼吸器症候群の症例に関連して新たなコロナウイルス(SARS-CoV又はSARSウイルス)が単離された(T.G. KSIAZEKら、The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1319-1330；C. DROSTENら、The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1967-1976；Peirisら、Lancet, 2003, 361, 1319)。
このようにして、この新たなコロナウイルスのゲノム配列、特にUrbani単離株(Genbank受理No.AY274119.3、及びA. MARRAら、Science, May 1, 2003, 300, 1399-1404)、及びToronto単離株(Tor2、Genbank受理No.AY278741、及びA. ROTAら、Science, 2003, 300, 1394-1399)のものが得られた。
ゲノムの構造は、他の既知のコロナウイルスのものに匹敵するので、SARS-CoVがCoronaviridae科に属していることを確証することができる；オープンリーディングフレームORF1a及び1b、並びにＳ、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質に対応するオープンリーディングフレーム、並びにORF-SとORF-Eとの間に位置する領域によりコードされるタンパク質に対応するオープンリーディングフレーム(ORF3)、ORF-SとORF-Eとの間にORF-Eに重複して位置する領域によりコードされるタンパク質に対応するオープンリーディングフレーム(ORF4)、ORF-MとORF-Nとの間に位置する領域によりコードされるタンパク質に対応するオープンリーディングフレーム(ORF7〜ORF11)、及びORF-Nに対応する領域によりコードされるタンパク質に対応するオープンリーディングフレーム(ORF13及びORF14)が、特に同定されている。
Tor2単離株及びUrbani単離株の配列間に７つの差異が同定されている；３つはサイレント変異(ORF1bの16622位のc/t及び19064位のa/g、ORF-Sの24872位のt/c)に相当し、４つはそれぞれ、ORF1aによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列(A/V変異に対応する7919位のc/t)、Ｓタンパク質のアミノ酸配列(A/S変異に対応する23220位のg/t)、ORF3によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列(R/G変異に対応する25298位のa/g)、及びＭタンパク質のアミノ酸配列(S/P変異に対応する26857位のt/c)を改変する。
加えて、系統発生分析により、SARS-CoVが他のコロナウイルスから遠縁であること、及びヒト呼吸器コロナウイルスの変異により出現したのでも、既知のコロナウイルス間の組換えによって出現したのでもないことが示される(概説には、Holmes、J.C.I., 2003, 111, 1605-1609を参照)。
新たな変種の決定及び考慮は、十分な感度且つ特異性であるSARS検出及び診断用の試薬の開発、並びにSARSの流行に対して人々を保護し得る免疫原性組成物の開発に重要である。
本発明者らは、ここに、Tor2単離株及びUrbani単離株と区別できる別の系統のSARS関連コロナウイルスを同定した。
したがって、本発明の主題は、ゲノムが、相補DNAの形態で、Ｓタンパク質の遺伝子の23220位〜23222位にセリンコドン又はORF3の遺伝子の25298位〜25300位にグリシンコドン、及びORF1aの7918位〜7920位にアラニンコドン又はＭタンパク質の遺伝子の26857位〜26859位にセリンコドンを有することを特徴とする、重症急性呼吸器症候群関連ヒトコロナウイルスの単離又は精製した系統である。ここで、前記位置は、Genbank配列AY274119.3を参照にして示される。
この系統の有利な実施形態によれば、そのゲノムのDNA等価物は配列番号１の配列に相当する配列を有する；このコロナウイルス系統は、No.031589で記録されハノイ(ベトナム)フランス病院で収集された、SARSに罹患している患者からの気管支肺胞洗液から収集されたサンプルに由来する。
本発明によれば、この配列番号１の配列は、上記で規定した単離したコロナウイルス系統のゲノムのリボ核酸分子に対応するデオキシリボ核酸の配列である。
配列番号１の配列は、以下の変異を保有するという点で、Genbank配列AY274119.3(Tor2単離株)と区別できる：
− 23220位のg/t；Tor2 Ｓタンパク質のアミノ酸配列の577位のアラニンコドン(gct)がセリンコドン(tct)で置換されている、
− 25298位のa/g；Tor2 ORF3によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の11位のアルギニンコドン(aga)がグリシンコドン(gga)で置換されている。
加えて、配列番号１の配列は、以下の変異を保有するという点で、Genbank配列AY278741(Urbani単離株)と区別できる：
− 7919位のt/c；ORF1aによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の2552位のバリンコドン(gtt)がアラニンコドン(gct)で置換されている、
− 16622位のt/c：この変異はORF1bによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変しない(サイレント変異)、
− 19064位のg/a：この変異はORF1bによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変しない(サイレント変異)、
− 24872位のc/t：この変異はＳタンパク質のアミノ酸配列を改変しない、及び
− 26857位のc/t；Ｍタンパク質のアミノ酸配列の154位のプロリンコドン(ccc)がセリンコドン(tcc)で置換されている。
特に言及しなければ、ヌクレオチド配列及びペプチド配列の位置は、Genbank配列AY274119.3を参照して示す。
本発明の主題はまた、その配列が上記で規定した単離したコロナウイルス系統ゲノムの配列であることを特徴とする単離又は精製したポリヌクレオチドである。
このポリヌクレオチドの有利な実施形態によれば、該ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を有する。
本発明の主題はまた、その配列が、上記で規定したポリヌクレオチドの配列と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを特徴とする単離又は精製したポリヌクレオチドである。
用語「単離又は精製した(された)」は、天然の状態から「ヒトの手によって」改変されたとの意である；換言すれば、目的物が天然に存在する場合、それは、その天然環境から改変若しくは抽出され又はその両方がされたとき、単離又は精製されたといえる。例えば、生きている生物中に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質/ペプチドは、単離も精製もされていない；他方、その天然環境で同時に存在する分子から分離されるか、クローニング、増幅、及び/又は化学合成により得られた同じポリヌクレオチド又はタンパク質/ペプチドは、本発明のために単離されている。更に、形質転換、遺伝子操作、又は他の任意の方法により生物に導入されているポリヌクレオチド又はタンパク質/ペプチドは、生物中に存在しても「単離」されている。本発明において使用される用語「精製した(された)」は、本発明によるタンパク質/ペプチドが、例えば組換え宿主細胞の培養物から精製した産物又は非組換え供給源から精製した産物のように、他のタンパク質又はポリペプチドと本質的に結合していないことを意味する。
本発明のためには、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、相補ポリヌクレオチド間の特異的且つ選択的なハイブリダイゼーションを維持することを可能にするように選択された温度条件及びイオン強度条件を意味すると理解される。
説明のために、上記ポリヌクレオチドを規定するための高ストリンジェンシー条件は、有利には、以下である：DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーションは、２つの工程で実施される：（１）42℃にて３時間、５×SSC(１×SSCは、0.15Ｍ NaCl＋0.015Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する)、50％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10×Denhardt溶液、５％硫酸デキストラン、及び１％サケ精子DNAを含有するリン酸緩衝液(20mM、pH7.5)中でのプレハイブリダイゼーション；（２）42℃にて20時間のハイブリダイゼーション、続いて２×SSC＋２％SDS中での20℃にて20分間の２回の洗浄、0.1×SSC＋0.1％SDS中での20℃にて20分間の１回の洗浄。最後の洗浄は、60℃にて30分間、0.1×SSC＋0.1％SDS中で実施する。
本発明の主題はまた、認識部位及び切断部位が上記で規定したポリヌクレオチド中に存在する制限酵素の使用によるか、又は上記で規定したポリヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅によるか、又はインビトロでの転写によるか、又は化学合成によるかのいずれかにより取得され得ることを特徴とする、上記で規定したポリヌクレオチドの代表的フラグメントである。
このフラグメントの有利な実施形態によれば、これは、前記ポリヌクレオチドのORF1a、ORF1b、ORF-S、ORF-E、ORF-M、ORF-N、ORF3、ORF4、ORF7〜ORF11、ORF13及びORF14から選択される少なくとも１つのオープンリーディングフレーム(ORF)に相当するcDNA並びに非コード5'又は3'末端に相当するcDNAからなる群より選択される。
この実施形態の有利な特徴によれば、前記フラグメントは、以下からなる群より選択される配列を有する：
− Ｓタンパク質をコードするORF-Sに相当するcDNAを表す配列番号２及び４の配列、
− Ｅタンパク質をコードするORF-Eに相当するcDNAを表す配列番号13及び15の配列、
− Ｍタンパク質をコードするORF-Mに相当するcDNAを表す配列番号16及び18の配列、
− Ｎタンパク質をコードするORF-Nに相当するcDNAを表す配列番号36及び38の配列、
− ORF1a及びORF1bに相当するcDNAを表す配列(ORF1ab、配列番号31)、ORF3及びORF4に相当するcDNAを表す配列(配列番号７、８)、ORF7〜11に相当するcDNAを表す配列(配列番号19、20)、ORF13に相当するcDNAを表す配列(配列番号32)、並びにORF14に相当するcDNAを表す配列(配列番号34)、並びに
− 前記ポリヌクレオチドの非コード5'末端に相当するcDNAを表す配列(配列番号39及び72)及び非コード3'末端に相当するcDNAを表す配列(配列番号40、73)。
本発明の主題はまた、配列番号５及び６の配列からなる群より選択される配列を有することを特徴とする、上記で規定したＳタンパク質をコードするcDNAフラグメントである(Sa及びSbフラグメント)。
本発明の主題はまた、配列番号41〜54の配列からなる群より選択される配列を有することを特徴とする、上記で規定したORF1a及びORF1bに相当するcDNAフラグメントである(L0〜L12フラグメント)。
本発明の主題はまた、7979位、16622位、19064位、23220位、24872位、25298位、及び26857位に位置する塩基の少なくとも１つを含む前記系統のゲノム配列の少なくとも15の連続塩基又は塩基対を有することを特徴とする、上記で規定したポリヌクレオチドフラグメントである。好ましくは、これは、20〜2500、好ましくは20〜400の塩基又は塩基対のフラグメントである。
このフラグメントの有利な実施形態によれば、これは、以下の位置：7919位と23220位、7919位と25298位、16622位と23220位、19064位と23220位、16622位と25298位、19064位と25298位、23220位と24872位、23220位と26857位、24872位と25298位、25298位と26857位に相当する少なくとも一対の塩基又は塩基対を含む。
本発明の主題はまた、SARS関連コロナウイルスのゲノム又はそのDNA等価物のフラグメントを増幅することができる少なくとも18塩基のプライマーである。
このプライマーの１つの実施形態によれば、それらは、以下からなる群より選択される：
− 上記で規定したポリヌクレオチドの配列の28507位〜28522位(センスプライマー、配列番号60)及び28774位〜28759位(アンチセンスプライマー、配列番号61)にそれぞれ相当するプライマー対No.1、
− 上記で規定したポリヌクレオチドの配列の28375位〜28390位(センスプライマー、配列番号62)及び28702位〜28687位(アンチセンスプライマー、配列番号63)にそれぞれ相当するプライマー対No.2、並びに
− 配列番号55及び56の配列からなるプライマー対。
本発明の主題はまた、上記で規定したフラグメント並びに上記で規定したポリヌクレオチド配列の以下の位置：28561位〜28586位、28588位〜28608位、28541位〜28563位、及び28565位〜28589位(配列番号64〜67)に相当するフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする、SARS関連コロナウイルスのゲノム又はそのフラグメントの存在を検出することができるプローブである。
本発明によるプローブ及びプライマーは、検出可能及び/又は定量可能なシグナルを得るように、当業者に周知の方法により放射活性又は非放射活性の化合物で直接又は間接に標識されてもよい。使用される放射活性アイソトープの内、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、3Ｈ又は125Ｉを挙げることができる。非放射活性物は、リガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、顔料、発光物質、例えば放射線ルミネセンス物質、化学発光物質、生物発光物質、蛍光物質、及びリン光物質から選択される。
本発明は、前述の配列に由来する標識したプローブ及びプライマーを包含する。
このようなプローブ及びプライマーは、SARS関連コロナウイルスによる感染の診断に有用である。
本発明の主題はまた、生物学的サンプルからのSARS関連コロナウイルスの検出方法である。この方法は、少なくとも：
（ａ）生物学的サンプル中に存在する核酸の抽出、
（ｂ）上記で規定したプライマー対を用いるRT-PCRによるORF-Nのフラグメントの増幅、及び
（ｃ）任意の適切な手段による、(ｂ)で取得した増幅産物の検出
を含んでなることを特徴とする。
(ｂ)における増幅産物(アンプリコン)は、プライマー対No.1では268bpであり、プライマー対No.2では328bpである。
この方法の有利な実施形態によれば、検出工程(ｂ)は、上記で規定したポリヌクレオチドの配列の28561位〜28586位、28588位〜28608位、28541位〜28563位、及び28565位〜28589位に相当する少なくとも１つのプローブを用いて実施される。
好ましくは、SARS関連コロナウイルスのゲノムは、プライマー対No.2並びに異なる化合物(特に異なる蛍光物質)で標識された28541位〜28563位及び28565位〜28589位に相当するプローブを用いるリアルタイムでのPCRにより検出され、任意に定量される。
このプライマー対及びこのプローブを使用するリアルタイムRT-PCRは、102コピーのRNA及び10コピーまでのRNAの検出を可能にするので、非常に高感度である；加えて、信頼性及び再現性がある。
本発明は、上記で規定したコロナウイルスの単離した系統のゲノム及びそのフラグメントの配列及びそれらのセンス又はアンチセンスの相補配列に対応する一本鎖、二本鎖及び三本鎖のポリデオキシリボヌクレオチド及びポリリボヌクレオチド、特に上記で規定したゲノム及びそのフラグメントの配列に対応するRNA及びcDNAを包含する。
本発明はまた、上記で規定した精製又は単離した系統のゲノムに特異的なプライマーを用いて、特に上記で規定したプライマー又はプライマー対を用いて取得される増幅フラグメント、上記で規定したフラグメントの配列により形成されるか又は該配列を含んでなる制限フラグメント、配列番号１の配列又は上記で規定したフラグメントを含有するベクターからインビトロでの転写により取得されるフラグメント、及び化学合成により取得されるフラグメントを包含する。制限フラグメントの例は、図13に示す配列番号１の配列の制限地図から推定される。本発明によれば、前記フラグメントは、単離したフラグメントの形態か、又はフラグメントの混合物の形態のいずれかである。本発明はまた、改変されたヌクレオチドフラグメントが上記で規定した単離株のゲノム又はアンチゲノム(antigenomic)RNA配列とハイブリダイズする能力を保持する限り、前述のヌクレオチドフラグメントの長さに対して約15％の割合でヌクレオチドを除去又は付加することによって前述のものに関して改変され、及び/又はヌクレオチドの性質に関して改変されたフラグメントを包含する。
本発明による核酸分子は、それ自体は公知の従来方法により、標準的なプロトコル、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc., Library of Congress, USA)に記載のものに従って取得される。例えば、それらは、PCR又はRT-PCRによる核酸配列の増幅によって、或いは完全又は部分的な化学合成によって取得される。
本発明の主題はまた、少なくとも１つの上記で規定したポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含んでなることを特徴とするDNA又はRNAのチップ又はフィルターである。
本発明によるDNA又はRNAのチップ又はフィルターは、それ自体は公知の従来方法により、例えばガラス又はナイロンの支持体上にオリゴヌクレオチドを化学的又は電気化学的にグラフトすることより製造される。
本発明の主題はまた、上記で規定した核酸フラグメントを含んでなる組換えクローニングベクター及び/又は発現ベクター、特にプラスミド、ウイルス、ウイルスベクター、又はファージである。好ましくは、この組換えベクターは、その中で前記核酸フラグメントが転写及び翻訳を調節する適切なエレメントの制御下に配置されている発現ベクターである。加えて、このベクターは、前記挿入物の5'末端及び/又は3'末端とインフェーズ(in phase)で融合した配列(タグ)を含んでなっていてもよい。タグは、このベクターから発現されるタンパク質の固定及び/又は検出及び/又は精製に有用である。
これらベクターは、それ自体は公知の従来の組換えDNA法及び遺伝子操作法により構築され、宿主細胞中に導入される。宿主細胞に導入して維持するために目的の核酸分子を挿入することができる多くのベクターは、それ自体公知である；適切なベクターの選択は、ベクターに想定する使用(例えば、目的の配列の複製、この配列の発現、染色体外形態での配列の維持、或いは宿主の染色体材料中への統合)に依存し、宿主細胞の性質にも依存する。
本発明によれば、このプラスミドは、特に、以下のプラスミドから選択される：
− 2003年６月20日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3059で寄託した細菌系統に含有されるSARS-Sと称すプラスミド；これは、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＳタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列AY274119.3を参照にして、21406位〜25348位(配列番号４)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年５月12日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3020で寄託した細菌系統に含有されるSARS-S1と称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＳタンパク質をコードするcDNA配列の5'フラグメントを含有する。このフラグメントは、Genbank配列AY274119.3 Tor2を参照にして、21406位〜23454位(配列番号５)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年５月12日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3019で寄託した細菌系統に含有されるSARS-S2と称すプラスミド；これは、上記で規定した番号No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＳタンパク質をコードするcDNA配列の3'フラグメントを含有する。このフラグメントは、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、23322位〜25348位(配列番号６)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年11月13日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3126で寄託した細菌系統に含有されるSARS-SEと称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のORF-SとORF-Eとの間にORF-Eに重複して位置する領域に相当するcDNA配列を含有する。この領域は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、25110位〜26244位(配列番号８)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年５月28日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3046で寄託した細菌系統に含有されるSARS-Eと称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＥタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、26082位〜26413位(配列番号15)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年５月28日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3047で寄託した細菌系統に含有されるSARS-Mと称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＭタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、26330位〜27098位(配列番号18)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年11月13日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3125で寄託した細菌系統に含有されるSARS-MNと称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されハノイで収集されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のORF-MとORF-Nとの間に位置する領域に相当するcDNA配列を含有する。この領域は、Genbank配列受理番号AY274119.3を参照にして、26977位〜28218位(配列番号20)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年６月５日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3048で寄託した細菌系統に含有されるSARS-Nと称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＮタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、28054位〜29430位(配列番号38)のヌクレオチドに相当する；このように、このプラスミドは、配列番号38の配列の挿入物を含んでなり、2003年６月５日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3048で寄託した細菌系統に含有されている、
− 2003年11月７日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3124で寄託した細菌系統に含有されるSARS-5'NCと称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムの非コード5'末端に相当するcDNAを含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、１位〜204位(配列番号39)のヌクレオチドに相当する、
− 2003年11月７日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3123で寄託した細菌系統に含有されるSARS-3'NCと称すプラスミド；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムの非コード3'末端に相当するcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、28933位〜29727位(配列番号40)のヌクレオチドに相当し、ヌクレオチドａの連続で終結する、
− ポリヒスチジンタグとのＮタンパク質(配列番号37)のＣ末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.3Nと称す発現プラスミド、
− ポリヒスチジンタグとのＳタンパク質(配列番号３)のアミノ酸配列の475位〜1193位に相当するフラグメントのＣ末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.3Scと称す発現プラスミド、
− ポリヒスチジンタグとのＳタンパク質(配列番号３)のアミノ酸配列の14位〜1193位に相当するフラグメントのＣ末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.3SLと称す発現プラスミド、
− ポリヒスチジンタグとのＮタンパク質(配列番号３)のＮ末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.4Nと称す発現プラスミド、
− ポリヒスチジンタグとのＳタンパク質(配列番号３)のアミノ酸配列の475位〜1193位に相当するフラグメントのＮ末端融合体をコードする挿入物を含有するpIV2.4SC又はpIV2.4Slと称す発現プラスミド、及び
− ポリヒスチジンタグとのＳタンパク質(配列番号３)のアミノ酸配列の14位〜1193位に相当するフラグメントのＮ末端融合体をコードするcDNAフラグメントを含有するpIV2.4SLと称す発現プラスミド。
上記で規定した発現プラスミドの有利な特徴によれば、この発現プラスミドは、2003年10月23日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3117で寄託した細菌系統に含有されている。
上記で規定した発現プラスミドの別の有利な特徴によれば、この発現プラスミドは、2003年10月23日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)にNo.I-3118で寄託した細菌系統に含有されている。
上記で規定した発現プラスミドの別の特徴によれば、この発現プラスミドは、ブダペスト条約に基づき、以下の番号でCNCM(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に国際寄託した細菌系統中に含有されている：
ａ）2003年10月23日に寄託した系統No.I-3118、
ｂ）2003年５月12日に寄託した系統No.I-3019、
ｃ）2003年５月12日に寄託した系統No.I-3020、
ｄ）2003年６月20日に寄託した系統No.I-3059、
ｅ）2004年11月22日に寄託した系統No.I-3323、
ｆ）2004年11月22日に寄託した系統No.I-3324、
ｇ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3326、
ｈ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3327、
ｉ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3332、
ｊ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3333、
ｋ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3334、
ｌ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3335、
ｍ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3336、
ｎ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3337、
ｏ）2004年12月２日に寄託した系統No.I-3338、
ｐ）2004年12月２日に寄託した系統No.I-3339、
ｑ）2004年12月２日に寄託した系統No.I-3340、
ｒ）2004年12月２日に寄託した系統No.I-3341。
本発明の主題はまた、上記ａ)〜ｒ)で規定した系統のいずれかに含有されていることを特徴とするウイルス起源の核酸挿入物である。
本発明の主題はまた、配列番号140の配列を保有することを特徴とする、真核細胞におけるＳタンパク質の最適化された発現を可能にする合成遺伝子を含有する核酸である。
本発明の主題はまた、Ｓタンパク質の最適化された発現を可能にする合成遺伝子を含有する核酸を含有する発現ベクターである。このベクターは、2004年12月１日に、No.I-3333でCNCMに寄託した細菌系統に含有されている。
この発現ベクターの１つの実施形態によれば、この発現ベクターは、ウイルス粒子の形態又は組換えゲノムの形態のウイルスベクターである。
この実施形態の有利な特徴によれば、この発現ベクターは、適切な細胞系における、すなわち、例えば該ベクターにおいて欠失しかつウイルス粒子の形成に必要である或る種のウイルス機能をトランス補完(transcomplement)することを意図される１以上の他のプラスミドでトランスフェクトした細胞における、上記の段落ｇ)、ｈ)及びｋ)〜ｒ)に従うプラスミドのトランスフェクションにより取得することができる組換えウイルス粒子又は組換えウイルスゲノムである。
語句「Ｓタンパク質ファミリー」は、本明細書では、好ましくは真核生物系で産生された、完全なＳタンパク質、そのエクトドメイン、及びこのエクトドメインのフラグメントを意味すると理解される。
本発明の主題はまた、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのポリペプチドをコードするレンチウイルスベクターである。
本発明の主題はまた、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのポリペプチドをコードする組換え麻疹ウイルスである。
本発明の主題はまた、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのポリペプチドをコードする組換えワクシニアウイルスである。
本発明の主題はまた、真核生物系におけるSARS関連コロナウイルスＳタンパク質又はこのタンパク質のフラグメントの産生のための、上記の段落ｅ)〜ｒ)に従うベクター又は上記で規定したＳタンパク質の合成遺伝子を含有するベクターの使用である。
本発明の主題はまた、上記の段落ｅ)〜ｒ)に記載の細胞系統に含有されているベクターから選択されるベクターか又はＳタンパク質の最適化された発現を可能にする合成遺伝子を含有するベクターで培養中の真核細胞をトランスフェクトする工程を含んでなる、真核生物系においてＳタンパク質の産生する方法である。
本発明の主題はまた、組換えベクター、特に発現ベクター中にクローニングされた上記で規定したフラグメント、特に増幅フラグメント又は制限フラグメントを含んでなることを特徴とするcDNAライブラリ(特に発現ライブラリ)である。
本発明の主題はまた、上記で規定した組換えベクターにより改変された細胞、特に原核細胞である。
本発明の主題はまた、上記で規定したタンパク質又はポリペプチドを発現する遺伝的に改変された真核細胞である。全く自明であることではあるが、用語「遺伝的に改変された真核細胞」は、野生型ウイルスで改変された細胞を指すものではない。
この細胞の有利な実施形態によれば、この細胞は上記の段落ｉ)〜ｌ)に記載のベクターのいずれかでのトランスフェクションにより取得することができる。
この実施形態の有利な特徴によれば、これは、ブダペスト条約に基づき、2004年11月22日に、No.I-3325でCNCMに国際寄託した細胞FRhK4-Ssol-30である。
有利には、上記で規定した組換えベクター及びこの発現ベクターで形質転換した細胞は、対応するタンパク質及びペプチドの産生に使用される。有利には、前記ベクターに由来する発現ライブラリ及びこの発現ライブラリで形質転換した細胞は、SARS関連コロナウイルスタンパク質の免疫原性エピトープ(Ｂエピトープ及びＴエピトープ)を同定するために使用される。
本発明の主題はまた、上記で規定したポリヌクレオチド又はそのフラグメントの１つによりコードされることを特徴とする精製又は単離したタンパク質及びペプチドである。
本発明の有利な実施形態によれば、このタンパク質は、以下からなる群より選択される：
− 配列番号３の配列を有するＳタンパク質又はそのエクトドメイン
− 配列番号14の配列を有するＥタンパク質
− 配列番号17の配列を有するＭタンパク質
− 配列番号37の配列を有するＮタンパク質
− ORF：ORF1a、ORF1b、ORF3、ORF4、ORF7〜ORF11、ORF13、及びORF14によりコードされ、それぞれ配列番号74、75、10、12、22、24、26、28、30、33、及び35の配列を有するタンパク質。
用語「Ｓタンパク質のエクトドメイン」及び「可溶形態のＳタンパク質」は、下記で、互換可能に使用される。
本発明の有利な実施形態によれば、このポリペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸配列の１〜1193位に相当するアミノ酸からなる。
本発明の別の有利な実施形態によれば、このペプチドは以下からなる群より選択される：
ａ）Ｓタンパク質のアミノ酸配列の14位〜1193位及び475位〜1193位に相当するペプチド、
ｂ）Ｍタンパク質のアミノ酸配列の２位〜14位(配列番号69)及び100位〜221位に相当するペプチド；これらペプチドはそれぞれ、Ｍタンパク質のエクトドメイン及びエンドドメインに相当する、
ｃ）Ｅタンパク質のアミノ酸配列の１位〜12位(配列番号70)及び53位〜76位(配列番号71)に相当するペプチド；これらペプチドはそれぞれ、Ｅタンパク質のエクトドメイン及びＣ末端部に相当する、
ｄ）ａ)、ｂ)又はｃ)で規定したペプチドの配列を含むか又は部分的に若しくは完全に重複する、５〜50の連続アミノ酸の、好ましくは10〜30アミノ酸のペプチド。
本発明の主題はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む７〜50アミノ酸の配列を有することを特徴とするペプチドである：
− ORF1aによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の2552位に位置するアラニン、
− 上記で規定したSARS-CoV系統のＳタンパク質のアミノ酸配列の577位に位置するセリン、
− 上記で規定したSARS-CoV系統のORF3によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の11位に位置するグリシン、
− 上記で規定したSARS-CoV系統のＭタンパク質のアミノ酸配列の154位に位置するセリン。
本発明の主題はまた、上記で規定したSARS-CoVによりコードされるタンパク質の少なくとも１つに結合することを特徴とする、上記で規定した組換えベクター、上記で規定したcDNAライブラリ、或いは上記で規定したタンパク質又はペプチドでの動物の免疫により取得することができるポリクローナル又はモノクローナルの抗体又は抗体フラグメントである。
本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、例えばヒト化抗体、及びそれらのフラグメント(Fab、Fv、scFv)を包含する。
本発明の主題はまた、以下のハイブリドーマから選択されることを特徴とする、Ｎタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである：
− モノクローナル抗体87を産生するハイブリドーマ(2004年12月１日に番号I-3328でCNCMに寄託)、
− モノクローナル抗体86を産生するハイブリドーマ(2004年12月１日に番号I-3329でCNCMに寄託)、
− モノクローナル抗体57を産生するハイブリドーマ(2004年12月１日に番号I-3330でCNCMに寄託)、及び
− モノクローナル抗体156を産生するハイブリドーマ(2004年12月１日に番号I-3331でCNCMに寄託)。
本発明の主題はまた、上記で規定したハイブリドーマにより産生されることを特徴とする、Ｎタンパク質を指向するポリクローナル又はモノクローナルの抗体又は抗体フラグメントである。
本発明のためには、語句「キメラ抗体」は、特定の動物種の抗体又は特定クラスの抗体に関して、別の動物種の抗体又は別のクラスの抗体の重鎖及び/又は軽鎖の全て又は一部を含んでなる抗体を意味すると理解される。
本発明のためには、語句「ヒト化抗体」は、抗原結合部位を形成するCDR(相補性決定領域)の残基が、所望の特異性、親和性、又は活性を保有する非ヒトモノクローナル抗体の残基で置換されているヒト免疫グロブリンを意味すると理解される。非ヒト抗体と比較して、ヒト化抗体は、ヒトにおいて、免疫原性が低く、半減期が延長されている。なぜなら、ヒト化抗体は、これら抗体のFR(フレームワーク)領域の残基及び定常(Fc)領域の残基の実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列の残基であることを考えれば、ほんの僅かな割合でしか非ヒト配列を有さないからである。
本発明の主題はまた、上記で規定したタンパク質、ペプチド、或いは抗体を含んでなることを特徴とするタンパク質チップ又はフィルターである。
本発明によるタンパク質チップは、それ自体は公知の従来方法により製造される。タンパク質が固定され得る適切な支持体の内、特にマイクロプレートの形態で、プラスチック又はガラスで製造された支持体を挙げることができる。
本発明の主題はまた、SARS関連コロナウイルスにより引き起こされた感染の研究及び診断に有用である、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS関連コロナウイルスの単離した系統に由来する試薬である。この試薬は、以下からなる群より選択される：
（ａ）上記で規定したプライマー対、プローブ、又はDNAチップ、
（ｂ）上記で規定した組換えベクター又は改変した細胞、
（ｃ）上記で規定した単離したコロナウイルス系統又はポリヌクレオチド、
（ｄ）上記で規定したタンパク質又はペプチド
（ｅ）上記で規定した抗体又は抗体フラグメント、及び
（ｆ）上記で規定したタンパク質チップ。
これら種々の試薬は、従来の分子生物学及び免疫学の技法により、標準的なプロトコル、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL、2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA)、Current Protocols in Immunology(John E. Cologan、2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA)、及びAntibodies: A Laboratory Manual(E. Howell and D. Lane、Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)に記載のプロトコルに従って調製され、使用される。
本発明による核酸フラグメントは、上記の従来技法により製造し、使用する。本発明によるペプチド及びタンパク質は、当業者に公知の組換えDNA技法により、特に上記で規定した組換えベクターを用いて製造される。或いは、本発明によるペプチドは、当業者に公知の固相合成又は液相合成の従来技法により製造されてもよい。
ポリクローナル抗体は、任意にKLH若しくはアルブミンにカップリングし且つ/又は適切なアジュバント、例えば(完全又は不完全)フロイントアジュバント若しくは水酸化アルミニウムと組み合せた上記で規定したタンパク質又はペプチドで適切な動物を免疫することにより製造される；従来技法に従って、満足する抗体力価が得られた後、免疫した動物から血清を収集することにより抗体を集め、沈降によりIgGを富化し、次いで任意にSARS-CoVタンパク質に特異的なIgGを上記で規定したペプチド又はタンパク質が付着した適切なカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製して、単一特異性のIgG調製物を取得する。
モノクローナル抗体は、Kohler and Milsteinの技法(Nature, 1975, 256, 495-497)により、上記で規定したタンパク質又はペプチドで免疫した動物からのＢリンパ球とミエローマとの融合により取得されるハイブリドーマから産生される；ハイブリドーマは、インビトロで、特に醗酵槽で培養されるか、又はインビボで、腹水の形態で産生される；或いは、モノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載のように遺伝子操作により製造される。
ヒト化抗体は、一般的な方法、例えば国際出願WO 98/45332に記載のものにより製造される。
抗体フラグメントは、免疫したマウスの脾臓リンパ球又はハイブリドーマのmRNAからクローン化したVH及びVL領域から製造される；例えば、Fv、scFv又はFabフラグメントは、Winter and Milsteinの技法(Nature, 1991, 349, 293-299)により、線状ファージの表面に発現される；幾つかの選択工程の後、抗原に特異的な抗体フラグメントは、従来の組換えDNAのクローニング及び発現のための従来技法により、単離され、適切な発現系で発現される。
上記で規定した抗体又はそのフラグメントは、当業者に公知の従来技法、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
本発明の主題は、更に、SARS関連コロナウイルスの検出用の試薬の製造及び任意に遺伝子型決定用/血清型決定用の試薬の製造のための、以下の群：上記で規定したプライマー対、プローブ、DNAチップ、組換えベクター、改変された細胞、単離したコロナウイルス系統、ポリヌクレオチド、タンパク質又はペプチド、抗体又は抗体フラグメント、及びタンパク質チップからなる群より選択される生成物の使用である。
SARS関連コロナウイルスに特異的な抗体を認識し得、及び/又は該抗体の産生を誘導し得る本発明によるタンパク質及びペプチドは、このようなコロナウイルスの感染の診断に有用である；感染は、感染し得る個体から収集した生物学的サンプルにおいて、適切な技法−特にEIA、ELISA、RIA、免疫蛍光−により検出される。
この使用の有利な特徴によれば、前記タンパク質は、上記で規定したＳ、Ｅ、Ｍ及び/又はＮタンパク質並びにペプチドからなる群より選択される。
上記で規定したＳ、Ｅ、Ｍ及び/又はＮタンパク質並びにこれらタンパク質(例えばＮタンパク質)に由来するペプチドは、特に酵素抗体法(ELISA)による、SARS関連コロナウイルス感染の間接診断(血清学的診断；SARS-CoVに特異的な抗体の検出)に有用である。
本発明による抗体及び抗体フラグメント、特に上記で規定したＳ、Ｅ、Ｍ及び/又はＮタンパク質並びにその誘導ペプチドを指向するものは、SARS関連コロナウイルス感染の直接診断に有用である；SARS-CoVのタンパク質の検出は、感染し得る個体から収集した生物学的サンプルにおいて、適切な技法、特にEIA、ELISA、RIA、免疫蛍光により実施される。
本発明の主題はまた、生物学的サンプルからSARS関連コロナウイルスを検出する方法である。この方法は、少なくとも：
（ａ）生物学的サンプルを、少なくとも１つの上記で規定した抗体又は抗体フラグメント、タンパク質、ペプチド、或いはタンパク質又はペプチドのチップ又はフィルターと接触させ、そして
（ｂ）任意の適切な手段により、例えばEIA、ELISA、RIA又は免疫蛍光により、(ａ)で形成された抗原-抗体複合体を可視化すること
を含んでなることを特徴とする。
この方法の１つの有利な実施形態によれば、工程(ａ)は以下：
（a1）生物学的サンプルを、少なくとも、適切な支持体、特にマイクロプレートに付着された第１の抗体又は抗体フラグメントと接触させ、
（a2）固相を洗浄し、そして
（a3）少なくとも、第１のものとは異なる第２の抗体又は抗体フラグメント(該抗体又は抗体フラグメントは任意に適切に標識されていてもよい)を加えること
を含んでなる。
生物学的サンプル中に存在するウイルス粒子の捕捉を可能にするこの方法は、免疫捕捉法とも呼ばれる。
例えば：
− 工程(a1)は、少なくとも、Ｓ、Ｍ及び/又はＥタンパク質を指向し、及び/又はこれらの内の１つのタンパク質のエクトドメインに相当するペプチド(M2-14ペプチド又はE1-12ペプチド)を指向する第１のモノクローナル又はポリクローナルの抗体又はそのフラグメントを用いて行われ、
− 工程(a3)は、同じタンパク質の別のエピトープ又は好ましくは別のタンパク質、好ましくは内部タンパク質(例えばＮ核タンパク質)又はＥタンパク質若しくはＭタンパク質のエンドドメインを指向する少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメントを用いて行われる。より好ましくは、これらは、ウイルス粒子中に非常に豊富であるＮタンパク質を指向する抗体又は抗体フラグメントである；内部タンパク質(Ｎ)又はＥタンパク質若しくはＭタンパク質のエンドドメインを指向する抗体又は抗体フラグメントを使用する場合、抗体は、例えば0.1％のオーダーの濃度の、界面活性剤(例えばTween 20)の存在下でインキュベートされる。
− 形成した抗原−抗体複合体を可視化するための工程(ｂ)は、例えばビオチン又は適切な酵素(例えばペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)で標識した第２の抗体を用いて直接的にか、又は上記のように標識された抗免疫グロブリン血清を用いて間接的にかのいずれかで行う。このように形成した複合体は適切な基質を用いて可視化される。
本発明のこの観点の好ましい実施形態によれば、生物学的サンプルは、捕捉モノクローナル抗体と接触させる前に、可視化モノクローナル抗体と混合される。適切な場合、血清-可視化抗体混合物は、プレートに適用される前に、少なくとも10分間、室温にてインキュベートされる。
本発明の主題はまた、天然型核タンパク質(Ｎタンパク質)を検出することによって、SARS関連コロナウイルスによる感染を検出することを意図した免疫捕捉検査である。特には、この検査は、天然型ウイルス核タンパク質の捕捉に使用する抗体が中央領域及び/又は構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体であることを特徴とする。
この検査の１つの実施形態によれば、Ｎタンパク質の捕捉に使用する抗体は、2004年12月１日に、番号I-3328でCNCMに寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体mAb87である。
この免疫捕捉検査の別の実施形態によれば、Ｎタンパク質の捕捉に使用する抗体は、2004年12月１日に、番号I-3329でCNCMに寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体mAb86である。
この免疫捕捉検査の別の実施形態によれば、モノクローナル抗体mAb86及びmAb87がＮタンパク質の捕捉に使用される。
本発明による免疫捕捉検査において、Ｎタンパク質を可視化するために、可視化分子又は粒子と接合された、2004年12月１日に、番号I-3330でCNCMに寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体mAb57を使用することが可能である。
この免疫捕捉検査によれば、可視化分子又は粒子と接合された抗体mAb57及びmAb87の組合せがＮタンパク質の可視化に使用される。
可視化分子は、放射活性原子、顔料、蛍光分子、蛍光体、酵素であり得る；可視化粒子は、例えば：コロイド金、磁性粒子又はラテックスビーズであり得る。
本発明の主題はまた、以下：
（ａ）上記で規定したプライマー対又はプローブ、
（ｂ）上記で規定した組換えベクター又は上記で規定した改変された細胞、
（ｃ）上記で規定した単離したコロナウイルス系統又は上記で規定したポリヌクレオチド、
（ｄ）上記で規定した抗体又は抗体フラグメント、
（ｅ）上記で規定した、モノクローナル抗体mAb86及び/又はmAb87とモノクローナル抗体mAb57とを含んでなる抗体の組合せ、
（ｆ）上記で規定したチップ又はフィルター
からなる群より選択されることを特徴とするSARS関連コロナウイルスを検出するための試薬である。
本発明の主題はまた、Ｎタンパク質を使用する間接IgG ELISAにより、生物学的サンプルからSARS関連コロナウイルス感染を検出する方法である。この方法は、プレートが、10mM PBS緩衝液(pH7.2)中で0.5〜４μg/ml、好ましくは〜２μg/mlの濃度のＮタンパク質溶液、0.25ml/lのフェノールレッドで感作されることを特徴とする。
本発明の主題は、更に、二重エピトープELSAにより、生物学的サンプルから、SARS関連コロナウイルス感染を検出する方法である。この方法は、検査される血清を可視化抗原と混合し、次いで該混合物を固相支持体に付着させた抗原と接触させることを特徴とする。
SARS関連コロナウイルスを検出するための検査の１つの変形によれば、これら検査は、上記で規定したＮタンパク質を使用するELSAと上記で規定したＳタンパク質を使用する別のELSAとを組み合わせる。
本発明の主題はまた、上記で規定したポリクローナル又はモノクローナルの抗体又は抗体フラグメントとSARS関連コロナウイルスのタンパク質又はペプチドとから形成される免疫複合体である。
本発明の主題は、更に、以下の群：上記で規定した、プライマー対、プローブ、DNA又はRNAチップ、組換えベクター、改変された細胞、単離したコロナウイルス系統、ポリヌクレオチド、タンパク質又はペプチド、抗体、及びタンパク質チップからなる群より選択される少なくとも１つの試薬を含んでなることを特徴とするSARS関連コロナウイルス検出キットである。
本発明の主題は、更に、以下：
ａ）上記で規定したタンパク質又はペプチド
ｂ）以下から選択される配列を有する、上記で規定したDNAタイプ若しくはRNAタイプのポリヌクレオチド又はその代表的なフラグメント：
（ｉ）配列番号１の配列又はそのRNA等価物
（ii）配列番号１の配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列、
（iii）配列番号１の配列又は高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の配列とハイブリダイズする配列に相補的な配列、
（iv）(ｉ)、(ii)又は(iii)で規定したポリヌクレオチドの代表的なフラグメントのヌクレオチド配列、
（ｖ）改変された、(ｉ)、(ii)、(iii)又は(iv)で規定した配列、
ｃ）ｂ)で規定したポリヌクレオチドを含んでなる組換え発現ベクター、及び
ｄ）上記で規定したcDNAライブラリ
からなる群より選択される少なくとも１つの生成物を含んでなることを特徴とする、SARS関連コロナウイルスに特異的な体液性又は細胞性の保護免疫、特にSARS関連コロナウイルスの特異エピトープを指向する抗体の産生を誘導し得る免疫原性組成物である。
上記で規定したタンパク質及びペプチド、特にＳ、Ｍ、Ｅ、及び/又はＮタンパク質及びその誘導ペプチド、並びにそのタンパク質又はペプチドをコードする核酸(DNA又はRNA)分子は、良好な候補ワクチンであり、SARS関連コロナウイルスに対するワクチンの製造のための免疫原性組成物中で使用し得る。
本発明による免疫原性組成物の有利な実施形態によれば、組成物は、更に、少なくとも１つの医薬的に受容し得るビヒクルと、任意にキャリア物質及び/又はアジュバントを含有する。
医薬的に許容し得るビヒクル、キャリア物質、及びアジュバントは、従来から使用されるものである。
アジュバントは、有利には、油性エマルジョン、サポニン、鉱物、細菌抽出物、水酸化アルミニウム及びスクアレンからなる群より選択される。
キャリア物質は、有利には、単層リポソーム、多層リポソーム、サポニンのミセル、又はサッカライド若しくは含金性の固体ミクロスフェアからなる群より選択される。
本発明によるこの組成物は、一般的な経路により、特に筋肉内又は皮下経路により或いは局所的に特には鼻(エアロゾル)経路により投与される。
本発明の主題はまた、SARS関連コロナウイルスのエピトープを特異的に指向する抗体と免疫複合体を形成するための、配列番号３、10、12、14、17、22、24、26、28、30、33、35、37、69、70、71、74及び75の配列からなる群より選択される配列を有する単離又は精製したタンパク質又はペプチドの使用である。
本発明の主題はまた、配列番号３、10、12、14、17、22、24、26、28、30、33、35、37、69、70、71、74及び75の配列からなる群より選択される配列を有する単離又は精製したタンパク質又はペプチドと、SARS関連コロナウイルスのエピトープを特異的に指向する抗体とからなる免疫複合体である。
本発明の主題はまた、SARS関連コロナウイルスのエピトープを特異的に認識し得る抗体の産生を誘導するための、配列番号３、10、12、14、17、22、24、26、28、30、33、35、37、69、70、71、74及び75の配列からなる群より選択される配列を有する単離又は精製したタンパク質又はペプチドの使用である。
本発明の主題はまた、前記ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を指向しSARS関連コロナウイルスのエピトープを特異的に認識し得る抗体の産生を誘導するための、配列番号１、２、４、７、８、13、15、16、18、19、20、31、36及び38の配列からなる群より選択される配列を有する単離又は精製したタンパク質又はペプチドの使用である。
本発明の主題はまた、SARS関連コロナウイルスの天然型Ｓタンパク質を認識するモノクローナル抗体である。
本発明の主題はまた、生物学的サンプルにおけるSARS関連コロナウイルスによる感染を検出するための、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのタンパク質又はポリペプチド或いは上記で規定した天然型Ｓタンパク質を認識する抗体の使用である。
本発明の主題はまた、検出が真核生物系で発現させた組換えＳタンパク質を用いるELISAにより実施されることを特徴とする、生物学的サンプルにおけるSARS関連コロナウイルスによる感染を検出する方法である。
この方法の有利な実施形態によれば、この方法は二重エピトープELISA法であり、検査すべき血清を可視化抗原と混合し、この混合物を次いで固相支持体に付着させた抗原と接触させる。
本発明の主題はまた、天然型Ｓタンパク質を認識するモノクローナルの抗体又は抗体フラグメントと、SARS関連コロナウイルスのタンパク質又はペプチドとからなる免疫複合体である。
本発明の主題はまた、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのタンパク質又はポリペプチドと、SARS関連コロナウイルスのエピトープを特異的に指向する抗体とからなる免疫複合体である。
本発明の主題は、更に、以下の群：上記で規定したＳタンパク質ファミリータンパク質又はポリペプチド、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのタンパク質又はペプチドをコードする核酸、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのタンパク質又はポリペプチドを発現する細胞、又はSARS関連コロナウイルスの天然型Ｓタンパク質を認識する抗体からなる群より選択される少なくとも１つの試薬を含んでなることを特徴とする、SARS関連コロナウイルスの検出キット又はボックスである。
本発明の主題は、真核生物発現系で得られる上記で規定したＳタンパク質ファミリーのポリペプチド又は組換えタンパク質を含んでなることを特徴とする、免疫原性及び/又はワクチン組成物である。
本発明の主題はまた、上記で規定したＳタンパク質ファミリーのタンパク質又はポリペプチドを発現するベクター又は組換えウイルスを含んでなることを特徴とする、免疫原性及び/又はワクチン組成物である。
前述の特徴に加えて、本発明は更に、以下の記載から明らかになる他の特徴を含んでなる。以下の記載は、番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムを表すポリヌクレオチド及び本発明の主題である誘導cDNAフラグメントの使用例、並びに配列表を表す表Ｉ及びに添付の図面に言及にする。
Figure 0005090741
Figure 0005090741
Figure 0005090741
 * PCR増幅産物(アンプリコン)
** CNCMに寄託したプラスミド中にクローニングした挿入物
添付の図面において
− 図１は、発現ベクターpIVEXからの組換えタンパク質Ｎ、SC及びSLのインビトロでの発現のウェスタンブロット分析を説明する。レーン１：pIV2.3N。レーン２：pIV2.3SC。レーン３：pIV2.3SL。レーン４：pIV2.4N。レーン５：pIV2.4S1又はpIV2.4SC。レーン６：pIV2.4SL。同じベクターから発現したGFPタンパク質の発現をコントロールとして使用する。
− 図２は、発現ベクターpIVEXからのＮタンパク質のインビボでの発現の、変性条件(SDS-PAGE)下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクーマシーブルーでの染色による分析を説明する。組換えベクターpIVEXで形質転換されたE.coli BL21(DE3)pDIA17系統を、30℃にてLB培地中で誘導剤(IPTG １mM)の存在下又は非存在下で培養する。レーン１：pIV2.3N。レーン２：pIV2.4N。
− 図３は、発現ベクターpIVEXからのSL及びSCポリペプチドのインビボでの発現の、変性条件(SDS-PAGE)下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクーマシーブルーでの染色による分析を説明する。組換えベクターpIVEXで形質転換されたE.coli BL21(DE3)pDIA17系統を、30℃にてLB培地中で誘導剤(IPTG １mM)の存在下又は非存在下で培養する。レーン１：pIV2.3Sc。レーン２：pIV2.3SL。レーン３：pIV2.4Sl。レーン４：pIV2.4SL。
− 図４は、組換えベクターpIVEXで形質転換したE.coli BL21(DE3)pDIA17系統中で産生した組換えＮ、SL及びSCタンパク質の抗原活性を説明する。Ａ：細菌溶解物の電気泳動(SDS-PAGE)。Ｂ及びＣ：SARS-CoVに感染した同じ患者から取得した、SARS症状の発症後それぞれ８日目(J8)(Ｂ：血清M12)及び29日目(J29)(Ｃ：血清M13)に収集した血清でのウェスタンブロット。レーン１：pIV2.3N。レーン２：pIV2.4N。レーン３：pIV2.3SC。レーン４：pIV2.4Sl。レーン５：pIV2.3SL。レーン６：pIV2.4SL。
− 図５は、ベクターpIV2.3Nからの、E.coli BL21(DE3)pDIA17系統中で産生した組換えＮタンパク質のNi-NTAアガロースカラムでの精製を説明する。レーン１：総細菌抽出物。レーン２：可溶性抽出物。レーン３：不溶性抽出物。レーン４：Ni-NTAカラム上に堆積させた抽出物。レーン５：未結合タンパク質。レーン６：ピーク１の画分。レーン７：ピーク２の画分。
− 図６は、pIV2.4S1で形質転換したE.coli BL21(DE3)pDIA17系統中で産生した封入体からの組換えSCタンパク質の精製を説明する。Ａ．Triton X-100(２％)での処理：レーン１：総細菌抽出物。レーン２：可溶性抽出物。レーン３：不溶性抽出物。レーン４：Triton X-100(２％)での処理後の上清。レーン５及び６：Triton X-100(２％)での処理後のペレット。Ｂ：可溶性及び不溶性抽出物の４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ及び７Ｍ尿素での処理。
− 図７は、SARS-CoVに感染した細胞の溶解物及び異型肺炎に罹患している患者からの血清を用いて作成したイムノブロットを表す。
− 図８は、SARS-CoVに感染した細胞の溶解物と核タンパク質Ｎ(Ａ)に特異的なウサギ免疫血清及び針状タンパク質(spicule protein)Ｓ(Ｂ)に特異的なウサギ免疫血清とを用いて作成したイムノブロットを表す。I.S.：免疫血清。p.i.：免疫前血清。抗Ｎ免疫血清は１/50,000で、抗Ｓ免疫血清は１/10,000で使用した。
− 図９は、免疫に使用した対応する組換えタンパク質に対する、Ｎタンパク質又はＳタンパク質の短いフラグメント(Sc)を指向するウサギ単一特異性ポリクローナル血清のELISA反応性を説明する。Ａ：精製した組換えＮタンパク質で免疫したウサギP13097、P13081及びP13031。Ｂ：Ｓタンパク質の短いフラグメント(SC)に対応する封入体の調製物で免疫したウサギP11135、P13042及びP14001。I.S.：免疫血清。p.i.：免疫前血清。
− 図10は、SARS-CoVにより引き起こされた異型肺炎に罹患している患者からの血清に対する、精製した組換えＮタンパク質のELISA反応性を説明する。図10a：４μg/ml及び２μg/mlの濃度のＮタンパク質で調製したELISAプレート。図10B：１μg/mlの濃度のＮタンパク質で調製したELISAプレート。Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈで示される血清は表IVのものに対応する。
− 図11は、プライマー対No.１(N/+/28507、N/-/28774)(Ａ)及びプライマー対No.２(N/+/28375、N/-/28702)(Ｂ)を用いた漸減量(107〜１コピー)のSARS-CoV Ｎ遺伝子の合成RNAのRT-PCRによる増幅を説明する。Ｔ：RNAの非存在下で実施した増幅。MW：DNAマーカー。
− 図12は、SARS-CoV Ｎ遺伝子の合成RNAのリアルタイムでのRT-PCRによる増幅を説明する：レプリカとしての漸減量の合成RNA(repli.；レーン16〜29)及び漸減量の１/20×10-4に希釈したウイルスRNA(レーン32)を、実施例８に記載の条件下で、キット「Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes」とNo.２シリーズのプライマー対及びプローブとを用いてリアルタイムでRT-PCRにより増幅した。
− 図13(図13.1〜13.7)は、番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムのDNA等価物に相当する配列番号１の配列の制限地図を表す。
− 図14は、間接N ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す(第１シリーズの血清を検査)。
− 図15は、間接N ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す(第２シリーズの血清を検査)。
− 図16は、二重エピトープN ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す(第１シリーズの血清を検査)。
− 図17は、二重エピトープN ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す(第２シリーズの血清を検査)。
− 図18は、SARS-CoVの天然型核タンパク質Ｎに対するELISAによる抗Ｎモノクローナル抗体の反応性の検査を説明する。抗体を、ハイブリドーマ培養上清の形態で、抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の照射した溶解物を用いる間接ELISAにより検査した(SARS溶解物曲線)。反応性に関する陰性コントロールは、非感染VeroE6細胞の溶解物に対して各抗体について実施する(陰性溶解物曲線)。既知の特異性の幾つかのモノクローナル抗体を陰性コントロール抗体として使用した：パラインフルエンザウイルスタイプ1-3の抗原を指向するpara1-3(Bio-Rad)及びインフルエンザウイルスタイプＢの抗原を指向するインフルエンザＢ(Bio-Rad)。
− 図19は、ヒトコロナウイルス229E(HCoV-229E)の天然型抗原に対するELISAによるSARS-CoVのＮに対するモノクローナル抗体の反応性の検査を説明する。抗体を、ハイブリドーマ培養上清の形態で、抗原としてヒトコロナウイルス229Eに感染したMRC-5細胞の溶解物を用いる間接ELISA検査により検査した(229E溶解物曲線)。免疫反応性に関する陰性コントロールは、非感染MRC-5細胞の溶解物に対して各抗体について実施した(陰性溶解物曲線)。ヒトコロナウイルス229EのＳタンパク質を指向するモノクローナル抗体5-11H.6(Sizunら、1998, J. Virol. Met. 72: 145-152)を陽性コントロール抗体として使用する。パラインフルエンザウイルスタイプ1-3の抗原を指向する抗体para1-3(Bio-Rad)及びインフルエンザウイルスタイプＢの抗原を指向するインフルエンザＢ(Bio-Rad)を、検査したモノクローナル抗体のパネルに加えた。
− 図20は、SARS-CoVの変性した天然型核タンパク質Ｎに対するウェスタンブロッティングによるSARS-CoVのＮに対するモノクローナル抗体の反応性の検査を示す。SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を、Laemmliに従うローディング緩衝液中に調製し、12％SDSポリアクリルアミドゲル中で移動させ、次いでタンパク質をPVDF膜に移した。検査した抗Ｎモノクローナル抗体を、0.05μg/mlの濃度で免疫アッセイに使用した。可視化は、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgG(H+L)抗体(NA93IV、Amersham)及びECL+システムで行った。２つのモノクローナル抗体を、反応性に関する陰性コントロールとして使用した：インフルエンザウイルスタイプＢの抗原を指向するインフルエンザＢ(Bio-Rad)及びパラインフルエンザウイルスタイプ1-3の抗原を指向するpara1-3(Bio-Rad)。
− 図21は、SARS-CoV Ｓタンパク質の哺乳動物細胞での発現用のプラスミドを示す。SARS-CoV ＳのcDNAを、プラスミドpcDNA-Sを取得するために発現プラスミドpcDNA3.1(+)(Clontech)のBamH1部位とXho1部位との間に、プラスミドpCI-Sを取得するために発現プラスミドpCI(Promega)のNhe1部位とXho1部位との間に挿入した。それぞれプラスミドpcDNA-S-CTE、pcDNA-S-WPRE、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREを取得するために、WPRE配列及びCTE配列を、２つのプラスミドpcDNA-S及びpCI-Sの各々のXho1部位とXba1部位との間に挿入した。
SP：ソフトウェアsignalP v2.0(Nielsenら、1997, Protein Engineering, 10: 1-6)で予測されたシグナルペプチド(aa１〜13)。
TM：ソフトウェアTMHMM v2.0(Sonnhammerら、1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp.175-182, AAAI Press)で予測された膜貫通領域(aa1196〜1218)。アミノ酸W1194及びP1195はそれぞれ0.13及び0.42の確率で膜貫通領域の一部である可能性があることに留意すべきである。
P-CMV：サイトメガロウイルス即時/初期プロモーター。BGH pA：ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナル。
SV40後期pA：SV40ウイルス後期ポリアデニル化シグナル。
SD/SA：スプライスドナー及びアクセプター部位。
WPRE：ウッドチャック肝炎ウイルスの「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」の配列。
CTE：マソン-ファイザーシミアンレトロウイルスの「構成性輸送エレメント」の配列。
− 図22は、VeroE6細胞のトランスフェクション後のＳタンパク質の発現を説明する。細胞抽出物を、プラスミドpcDNA、pcDNA-S、pCI及びpCI-SでのVeroE6細胞のトランスフェクションの48時間後に調製した。細胞抽出物をまた、組換えワクシニアウイルスVV-TF7.3での感染及びプラスミドpcDNA又はpcDNA-Sでのトランスフェクションの18時間後に調製した。コントロールとして、VeroE6細胞の抽出物を、SARS-CoVでの感染多重度３での感染の８時間後に調製した。これらを８％SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗Ｓウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。分子量ラダー(kDa)を図に示す。
SARS-CoV：SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の抽出物
Mock：非感染細胞のコントロール抽出物
− 図23は、VeroE6細胞及び293T細胞のトランスフェクション後のＳタンパク質の発現に対するCTE配列及びWPRE配列の効果を示す。細胞抽出物を、プラスミドpcDNA、pcDNA-S、pcDNA-S-CTE、pcDNA-S-WPRE、pCI-S、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREでのVeroE6細胞(Ａ)又は293T細胞(Ｂ)のトランスフェクションの48時間後に調製し、８％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、抗Ｓウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。分子量ラダー(kDa)を図に示す。
SARS-CoV：SARS-CoVでの感染多重度３での感染の８時間後に調製したVeroE6細胞の抽出物。
Mock：非感染VeroE6細胞のコントロール抽出物。
− 図24は、SARS-CoV Sの発現のための中央DNAフラップを有する欠損レンチウイルスベクターを示す。プラスミドpTRIP-Sを取得するために、SARS-CoV Ｓタンパク質のcDNAを、中央DNAフラップを有する欠損レンチウイルスベクターTRIP(Sirvenら、2001, Mol. Ther., 3: 438-448)を含有するプラスミドpTRIPΔU3-CMV中に、BamH1-Xho1フラグメントの形態でクローニングした。プラスミドpTRIP-SD/SA-S-CTE及びpTRIP-SD/SA-S-WPREを取得するために、CMVウイルス即時/初期プロモーター、スプライスシグナル、ＳのcDNA及び転写後シグナルCTE又はWPREのいずれかからなる最適発現カセットを、中央DNAフラップを有する欠損レンチウイルス発現ベクターTRIPΔU3-EF1α(Sirvenら、2001, Mol. Ther., 3: 438-448)のカセットEF1α-EGFPと置換した。
SP：シグナルペプチド
TM：膜貫通領域
P-CMV：サイトメガロウイルス即時/初期プロモーター
P-EF1α：EF1α遺伝子プロモーター
SD/SA：スプライスドナー及びアクセプター部位
WPRE：ウッドチャック肝炎ウイルスの「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」の配列
CTE：マソン-ファイザーシミアンレトロウイルスの「構成性輸送エレメント」の配列
LTR：長末端反復
ΔU3：「プロモーター/エンハンサー」配列について欠失したLTR
cPPT：「ポリプリン路シス活性配列」
CTS：「中央終結配列」
− 図25は、レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-S-WPRE及びTRIP-SD/SA-S-CTEで形質導入した細胞株によるSARS-CoV Sの発現のウェスタンブロット分析を示す。細胞抽出物を、レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-S-CTE及びTRIP-SD/SA-S-WPREでの形質導入後に、それぞれ樹立株FrhK4-S-CTE及びFrhK4-S-WPREから調製した。これらを８％SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗Ｓウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)接合体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。分子量ラダー(kDa)を図に示す。
T-：FrhK-4細胞のコントロール抽出物。
T+：SARS-CoVでの感染多重度３の感染の24時間後に調製したFrhK-4細胞の抽出物。
− 図26は、レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE及びTRIP-SD/SA-Ssol-CTEで形質導入した細胞株によるSsolポリペプチドの発現の分析に関する。Ssolポリペプチドの分泌を、レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE及びTRIP-SD/SA-Ssol-CTEでFrhK-4細胞の形質導入後に単離した一連の細胞クローンの上清中で決定した。Laemmliに従うローディング緩衝液中に１/２に希釈した５μlの上清を、抗FLAGモノクローナル抗体(M2、Sigma)及びペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgG(H+L)接合体で可視化したウェスタンブロッティングにより分析した。T-：親FRhK-4株の上清。T+：Ssolポリペプチドを発現する組換えワクシニアウイルスに感染したBHK細胞の上清。黒塗り矢印はSsolポリペプチドを示し、白抜き矢印は細胞起源のタンパク質との交差反応を示す。
− 図27は、精製したSsolポリペプチドの分析に関連する結果を示す。
Ａ．抗FLAGアフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過(G75)により精製した８、２、0.5及び0.125μgの組換えSsolポリペプチドを、８％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離した。Ssolポリペプチド及び種々の量の分子量マーカー(MM)を、硝酸銀での染色により可視化した(Gelcode SilverSNAP stain kit II, Pierce)。
Ｂ．SELDI-TOF質量分析による分析用の標準マーカー
IgG：MM 147300のウシIgG
ConA：MM 77490のコナルブミン
HRP：コントロールとして分析されるMM 43240の西洋ワサビペルオキシダーゼ
Ｃ．組換えSsolポリペプチドの質量分析(SELDI-TOF)による分析。
ピークＡ及びＢは単一荷電及び二重荷電のSsolポリペプチドに相当する。
Ｄ．組換えSsolポリペプチドのＮ末端部の配列決定。液相中での５回のEdman分解サイクルを、ABI494シークエンサ(Applied Biosystems)で実施した。
− 図28は、SARS-CoV SをコードするプラスミドDNAを用いる遺伝子免疫の効力に対する、スプライシングシグナル並びにCTE配列及びWPRE配列の影響を説明する。
Ａ．７匹のBALB/cマウスの群を、pCI、pcDNA-S、pCI-S、pcDNA-N及びpCI-HAの50μgのプラスミドDNAを用いて４週間の間隔で２回免疫した。
Ｂ．６匹のBALB/cマウスの群を、pCI、pCI-S、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREの２μg、10μg又は50μgのプラスミドDNAを用いて４週間の間隔で２回免疫した。
２回目の免疫の３週間後に収集した免疫血清を、抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を用いて間接ELISAにより分析した。抗SARS-CoV抗体力価は、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgGポリクローナル抗体(NA931V、Amersham)及びTMB(KPL)での可視化後に0.5の比ODを生じる希釈率の逆数として算出する。
− 図29は、SARS-CoV SをコードするプラスミドDNAを用いる遺伝子免疫後にマウスで誘導された抗体でのSARS-CoVの感染性の血清中和化(seroneutralization)を示す。２回目の免疫の３週間後に収集した免疫血清のプールを、図28に記載した実験の群の各々について調製し、FRhK-4細胞に対する100 TCID50のSARS-CoVの感染性を血清中和化する能力について評価した。検査した１/20からの２倍希釈率の各々について４点を作成した。血清中和化力価は、Reed and Munschの方法に従って、４ウェル中２ウェルの感染性を中和する希釈率の逆数として算出する。
Ａ．pCI、pcDNA-S、pCI-S、pcDNA-N及びpCI-HAの50μgのプラスミドDNAを用いて４週間の間隔で２回免疫したBALB/cマウスの群。□：免疫前血清。■：免疫血清。
Ｂ．pCI、pCI-S、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREの２μg、10μg又は50μgのプラスミドDNAを用いて４週間の間隔で２回免疫したBALB/cマウスの群。
− 図30は、SARSに罹患している患者からの血清に対する組換えSsolポリペプチドの免疫反応性を説明する。患者からの血清の反応性を、精製した組換えSsolポリペプチドを用いて調製した固相に対する間接ELISA検査により分析した。１/400の希釈率で固相と反応する患者からの抗体を、ペルオキシダーゼにカップリングしたヒト抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体(Amersham NA933V)及びTMB＋H202(KPL)で可視化する。SARS症例の可能性が高い血清を、National Reference Center for Influenza Virusesの通し番号並びに適切な場合には患者のイニシャル及び症状の発症からの経過日数により同定する。TV血清は、2003年に発生したSARS流行の前にフランスで収集した患者からのコントロール血清である。
− 図31は、組換えSsolポリペプチドでの免疫後のSARS-CoVを指向する抗体の誘導を示す。６匹のマウスの２群を、３週間の間隔で、水酸化アルミニウムをアジュバントとする10μgの組換えSsolポリペプチド(Ssol群)又はコントロールとしてアジュバント単独(mock群)で免疫した。３回の連続免疫を行い、３回の免疫の各々の３週間後に免疫血清を収集した(IS1、IS2、IS3)。免疫血清を、２群の各々について、抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を用いる間接ELISAにより、プールごとに分析した。抗SARS-CoV抗体力価は、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgGポリクローナル抗体(Amersham)及びTMB(KPL)での可視化後に0.5の比ODを生じる希釈率の逆数として算出する。
− 図32は、合成遺伝子040530の配列とSARS-CoV単離株031589の野生型遺伝子の配列とのヌクレオチドアラインメントを表す。I-3059は、番号I-3059でC.N.C.M.に寄託したSARS-CoV単離株031589のヌクレオチド21406〜25348(配列番号４、プラスミドpSARS-S)に相当する。S-040530は合成遺伝子040530の配列である。
− 図33は、SARS-CoV Sの発現のための合成遺伝子の使用を説明する。プラスミドpCI、pCI-S、pCI-S-CTE、pCI-S-WPRE及びpCI-SsynthでのVeroE6細胞(Ａ)又は293T細胞(Ｂ)のトランスフェクションの48時間後に調製した細胞抽出物を、８％SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗Ｓウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。ウェスタンブロットは、発光(ECL+、Amersham)及びディジタル画像化デバイス(FluorS、BioRad)上への獲得により可視化した。Ｓタンパク質の発現レベルを、画像上で同定した２つの優勢なバンドを定量化することにより測定した。
− 図34は、組換えワクシニアウイルスVV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN-S及びVV-TN-Ssolの構築のための図解を示す。
Ａ．プラスミドpTG-S及びpTG-Ssolを取得するために、SARS-CoVのＳタンパク質及びSsolポリペプチドのcDNAを、トランスファープラスミドpTG186のBamH1部位とSma1部位との間に挿入した。
Ｂ．トランスファープラスミドpTN480、pTN-S及びpTN-Ssolを取得するために、合成プロモーター480の配列を、次いで、プラスミドpTG186poly、pTG-S及びpTG-SsolのNde1-Pst1フラグメントの交換により、7.5プロモーターの配列と置換した。
Ｃ．pTNシリーズのトランスファープラスミドのNde1部位とPst1部位との間に含有される合成プロモーター480の配列。後の取扱を容易にするためにAsc1部位を挿入した。制限部位及びプロモーター配列に下線を付した。
Ｄ．組換えワクシニアウイルスは、pTGシリーズ及びpTNシリーズのトランスファープラスミドのTKカセットとコペンハーゲン系統のワクシニアウイルスのTK遺伝子との間のインビボ二重相同組換えにより取得する。
SP：ソフトウェアsignalP v2.0(Nielsenら、1997, Protein Engineering, 10: 1-6)で予測したシグナルペプチド(aa１〜13)
TM：ソフトウェアTMHMM v2.0(Sonnhammerら、1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp.175-182, AAAI Press)で予測した膜貫通領域(aa1196〜1218)。アミノ酸W1194及びP1195は膜貫通領域の一部を形成する可能性があり、その確率はそれぞれ0.13及び0.42であることに留意すべきである。
TK-L、TK-R：ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の左側部分及び右側部分
MCS：多クローニング部位
PE：初期プロモーター
PL：後期プロモーター
PL synth：合成後期プロモーター480
− 図35は、ウェスタンブロッティングにより分析した、組換えワクシニアウイルスによるＳタンパク質の発現を説明する。細胞抽出物を、組換えワクシニアウイルスVV-TG、VV-TG-S及びVV-TN-Sでの２のM.O.I.でのCV1細胞の感染の18時間後に調製した(Ａ)。コントロールとして、VeroE6細胞の抽出物を、２の感染多重度でのSARS-CoVでの感染の８時間後に調製した。細胞抽出物をまた、組換えワクシニアウイルスVV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN、VV-TN-S及びVV-TN-SsolでのCV1細胞の感染の18時間後に調製した(Ｂ)。これらを、８％SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗Ｓウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。「１μl」及び「10μl」は、ゲル上に堆積した細胞抽出物の量を示す。分子量ラダー(kDa)を図に示す。
SARS-CoV：SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の抽出物
Mock：非感染細胞のコントロール抽出物
− 図36は、組換えワクシニアウイルスによるSsolポリペプチドの分泌のウェスタンブロット分析の結果を示す。
Ａ．組換えワクシニアウイルスVV-TN(VV-TN-Ssolウイルスの種々のクローン)及びウイルスVV-TG-Ssol又はVV-TN-Sflagに感染したCV1細胞の上清を、２のM.O.I.でのCV1細胞の感染の18時間後に収穫した。
Ｂ．２のM.O.I.での組換えワクシニアウイルスVV-TN-Ssolに二連で(in duplicate)(1、2)感染した293T細胞、FRhK-4細胞、BHK-21細胞及びCV1細胞の上清を、感染の18時間後に収穫した。また、ウイルスVV-TNに感染したCV1細胞をコントロールとして収穫した(Ｍ)。
全ての上清を、Laemmliに従う８％SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗FLAGマウスモノクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA931V、Amersham)(Ａ)、又は抗Ｓウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)(Ｂ)を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。
分子量ラダー(kDa)を図に示す。
− 図37は、SDSポリアクリルアミドゲル上で精製したSsolポリペプチドの分析を示す。
抗FLAGアフィニティークロマトグラフィーにより精製した10、５及び２μlの組換えSsolポリペプチドを、４〜15％勾配SDSポリアクリルアミドゲル上で分離した。Ssolポリペプチド及び種々の量の分子量マーカー(MM)を、硝酸銀での染色により可視化した(Gelcode SilverSNAP stain kit II、Pierce)。
− 図38は、SARSに罹患している患者の血清に対する、組換えワクシニアウイルスVV-TN-Ssolにより産生された組換えSsolポリペプチドの免疫反応性を説明する。患者からの血清の反応性を、精製した組換えSsolポリペプチドを用いて調製した固相に対する間接ELISA検査により分析した。１/100及び１/400の希釈率で固相と反応する患者からの抗体が、ペルオキシダーゼにカップリングしたヒト抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体(Amersham NA933V)及びTMB＋H202(KPL)で可視化されている。可能性が高いSARS症例の血清が、National Reference Center for Influenza Virusの通し番号並びに適切な場合には患者のイニシャル及び症状の発症からの経過日数により同定される。TV血清は、2003年に発生したSARS流行の前にフランスで収集した患者からのコントロール血清である。
− 図39は、組換えワクシニアウイルスでの免疫後のマウスにおける抗SARS-CoV抗体応答を示す。７匹のBALB/cマウスの群を、106pfuの組換えワクシニアウイルスVV-TG、VV-TG-HA、VV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN、VV-TN-S、VV-TN-Ssolで、i.v.経路により４週間の間隔で２回免疫した。
Ａ．２回の免疫の各々の３週間後に収集された免疫血清のプールを、群の各々について調製し、抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を使用する間接ELISAにより分析した。抗SARS-CoV抗体力価は、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgGポリクローナル抗体(NA931V、Amersham)及びTMB(KPL)での可視化後に0.5の比ODを生じる希釈率の逆数として算出する。
Ｂ．免疫血清のプールを、FRhK-4細胞に対するSARS-CoVの100 TCID50の感染性を血清中和化する能力について評価した。１/20から検査した２倍希釈率の各々について４点を作成した。血清中和化力価は、Reed and Munschの方法に従って、４ウェル中２ウェルの感染性を中和する希釈率の逆数として算出する。
− 図40は、組換えウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolの構築を記載する。
Ａ．麻疹ベクターは、追加の転写ユニットが導入されている、Schwarzワクチン系統の麻疹ウイルス(MV)の完全ゲノムである(Combredet, 2003, Journal of Virology, 77: 11546-11554)。追加のオープンリーディングフレーム(ORF)の発現は、N/P接合部に存在するエレメントからコピーされた、転写、キャップの形成及び導入遺伝子のポリアデニル化に必要なシス作用性エレメントにより制御される。２つの異なるベクターは、一方ではＰ(リンタンパク質)遺伝子とＭ(マトリクス)遺伝子との間への挿入を、他方ではＨ(ヘマグルチニン)遺伝子とＬ(ポリメラーゼ)遺伝子との間への挿入を可能にする。
Ｂ．麻疹ウイルスの組換えゲノムMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolを、前記ベクターのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に位置する追加の転写ユニット中にＳタンパク質のORF及びSsolポリペプチドのORFを挿入することにより構築した。
麻疹ウイルス(MV)の種々の遺伝子を示す：Ｎ(核タンパク質)、PVC(V/Cリンタンパク質及びタンパク質)、Ｍ(マトリクス)、Ｆ(融合)、Ｈ(ヘマグルチニン)、Ｌ(ポリメラーゼ)。T7 = T7 RNAポリメラーゼプロモーター、hh = ハンマーヘッドリボザイム、T7t = T7ファージRNAポリメラーゼターミネーター配列、δ = 肝炎δウイルスのリボザイム、(２)、(３) = 追加の転写ユニット(ATU)。
MVゲノムのサイズ：15,894nt
SP：シグナルペプチド
TM：膜貫通領域
FLAG：FLAGタグ
− 図41は、ウェスタンブロッティングにより分析した、組換え麻疹ウイルスによるＳタンパク質の発現を説明する。
細胞質抽出物を、異なる継代数のウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssol並びにコントロールとしての野生型ウイルスMWSchwによるVero細胞の感染後に調製した。また、Laemmliに従うローディング緩衝液中の細胞抽出物を、３の感染多重度でのSARS-CoVでのVeroE6細胞の感染の８時間後に調製した。これらを、８％SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗Ｓウサギポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。
分子量ラダー(kDa)を図に示す。
Pn：293-3-46細胞及びVero細胞の共培養後のウイルスのｎ代継代
SARS-CoV：SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の抽出物
Mock：非感染VeroE6細胞のコントロール抽出物
− 図42は、免疫蛍光により分析した、組換え麻疹ウイルスによるＳタンパク質の発現を示す。
ガラススライド上の単層のVero細胞を、野生型ウイルスMWSchw(Ａ)又はウイルスMVSchw2-SARS-S(Ｂ)及びMVSchw2-SARS-Ssol(Ｃ)に感染させた。シンシチウムが30〜40％コンフルエンス(Ａ、Ｂ)又は90〜100％(Ｃ)に達したとき、細胞を固定し、透過化処理し、抗SARS-CoVウサギポリクローナル抗体及びFITCにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)接合体(Jackson)で標識した。
− 図43は、ペプチドE1-12、E53-76及びM2-14を指向するウサギ血清の免疫反応性のウェスタンブロット分析を説明する。ウサギ20047をKLHにカップリングしたペプチドE1-12で免疫した。ウサギ22234及び22240をKLHにカップリングしたペプチドE53-76で免疫した。ウサギ20013及び20080をKLHにカップリングしたペプチドM2-14で免疫した。免疫血清を、SARS-CoVに感染した細胞の抽出物(Ｂ)又はSARS-CoV 031589単離株のタンパク質Ｅ(Ａ)若しくはタンパク質Ｍ(Ｃ)を発現する組換えワクシニアウイルスに感染した細胞の抽出物を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。イムノブロットを、ペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)接合体(NA934V、Amersham)を用いて可視化した。
Ｅタンパク質及びＭタンパク質の位置を矢印で示す。
分子量ラダー(kDa)を図に示す。
しかし、これらの実施例は、本発明の主題を説明するためにのみ提供され、如何なる様式でも本発明に対する制限を構成するものではないと理解すべきである。
実施例１：番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムのクローニング及び配列決定
SARS-CoV系統のRNAを、ハノイ(ベトナム)のフランス病院でSARSに罹患している患者に対して行った番号031589で記録された気管支肺胞洗液のサンプルから抽出した。
単離したRNAを鋳型として使用して、ゲノムの種々のオープンリーディングフレーム(ORF1a、ORF1b、ORF-S、ORF-E、ORF-M、ORF-N(ORF-13及びORF-14を含む)、ORF3、ORF4、ORF7〜ORF11)、及び非コード5'及び3'末端に相当するcDNAを増幅した。増幅/検出に使用したプライマー及びプローブの配列は、入手可能なSARS-CoVヌクレオチド配列に基づいて規定した。
下記では、プライマー及びプローブは、文字Ｓ、続いて、ゲノムの対応領域を示す文字(ORF1a及びORF1bを含む5'末端についてはＬ；ORF-S、ORF-M、ORF-NについてはＳ、Ｍ及びＮ；対応する遺伝子間領域(intergene region)についてはSE及びMN)、任意ではあるがその後に、Fn、Rn(ｎは、ネステッドPCRに使用したプライマーに対応する１〜６であり、第１の増幅についてはF1+R1対、第２の増幅についてはF2+R2対という具合である)、それから、センスプライマー又はアンチセンスプライマーに対応する/+/又は/-/、そして最後に、Genbank配列AY27411.3を参照にしたプライマーの位置、により示す。センス及びアンチセンスのＳ及びＮプライマー並びにその他のセンスプライマーのみについては、単一位置が示されている場合、それは、約20塩基のプローブ又はプライマーの5'末端の位置に対応し；Ｓ及びＮプライマー以外のアンチセンスプライマーについては、単一位置が示されている場合、それは、約20塩基のプローブ又はプライマーの3'末端の位置に対応する。
このように作製した増幅産物を、番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムの完全配列を決定するために、特異的プライマーを用いて配列決定した。これら増幅産物は、ORF1a及びORF1bに相当するものを除き、次いで、対応するウイルスタンパク質及びこれらタンパク質を指向する抗体(特に、DNAに基づく免疫による)を産生するために、発現ベクター中にクローニングした。
１．RNAの抽出
QIamp viral RNA extraction mini kit(QIAGEN)を製造業者の推奨に従って用いて、RNAを抽出した。より具体的には：140μlのサンプル及び560μlのAVL緩衝液を、15秒間激しく混合し、10分間、室温でインキュベートし、次いで最大速度で短く遠心分離した。560μlの100％エタノールを上清に加え、このように取得した混合物を15秒間非常に激しく撹拌した。630μlの混合物を次いでカラムに堆積した。
カラムを２mlチューブに入れ、8000rpmにて１分間遠心分離し、次いで前記混合物の残りを同じカラムに堆積し、再度8000rpmにて１分間遠心分離し、カラムを清浄な２mlチューブに移した。次に、500μlのAW1緩衝液をカラムに加え、次いでカラムを8000rpmにて１分間遠心分離し、溶出物を廃棄した。500μlのAW2緩衝液をカラムに加え、次いでカラムを14,000rpmにて３分間遠心分離し、1.5mlチューブに移した。最後に、60μlのAVE緩衝液をカラムに加え、カラムを室温にて１〜２分間インキュベートし、次いで8000rpmにて１分間遠心分離した。精製したRNAに相当する溶出物を回収し−20℃に凍結した。
２．cDNAの増幅、配列決定及びクローニング
2.1）Ｓタンパク質をコードするcDNA
サンプルから抽出したRNAを、ランダム配列のヘキサマーオリゴヌクレオチド(pdN6)を用いる逆転写に付し、cDNAフラグメントを生成した。
SARS-CoV Ｓ糖タンパク質をコードする配列を、２つの重複DNAフラグメント：5'フラグメント(SARS-Sa、配列番号５)及び3'フラグメント(SARS-Sb、配列番号６)の形態で、ネステッドプライマーを用いる２連続増幅を行うことにより増幅した。このように取得したアンプリコンを配列決定し、PCRプラスミドベクター2.1-TOPOTM(INVITROGEN)中にクローニングし、次いでクローニングしたcDNAの配列を決定した。
ａ）Saフラグメント及びSbフラグメントのクローニング及び配列決定
a.1）cDNAの合成
RNA(５μl)と、注入用のH2O(3.5μl)と、５×逆転写酵素緩衝液(４μl)と、５mM dNTP(２μl)と、pdN6 100μg/ml(４μl)と、RNasin 40IU/μl(0.5μl)と、逆転写酵素AMV-RT 10IU/μl、PROMEGA(１μl)とを含有する反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件：42℃にて45分間、55℃にて15分間、95℃にて５分間の条件下でインキュベートし、次いで得られたcDNAを＋４℃に維持した。
a.2）第１のPCR増幅
Ｓ遺伝子の5'末端及び3'末端を、それぞれ、プライマー対S/F1/+/21350-21372及びS/R1/-/23518-23498、S/F3/+/23258-23277及びS/R3/-/25382-25363で増幅した。cDNA(２μl)と、50μMプライマー(0.5μl)と、10×緩衝液(５μl)と、５mM dNTP(２μl)と、Taq Expand High Fidelity(Roche)(0.75μl)と、H2O(39、75μl)とを含有する50μlの反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件下で増幅した：94℃にて２分間の最初の変性工程に続いて、94℃にて30秒間の変性工程と、55℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて２分30秒間の伸長工程とを含んでなる40サイクル(各サイクルで10秒間の追加の伸長)、次いで72℃にて５分間の最終の伸長工程。
a.3）第２のPCR増幅
第１のPCR増幅の産物(5'アンプリコン及び3'アンプリコン)を、第１の増幅条件と同一の条件下で、5'アンプリコン及び3'アンプリコンについてそれぞれプライマー対S/F2/+/21406-21426及びS/R2/-/23454-23435、S/F4/+/23322-23341及びS/R4/-/25348-25329で第２のPCR増幅工程(ネステッドPCR)に付した。
a.4）Saフラグメント及びSbフラグメントのクローニング及び配列決定
このように取得したSa(5'末端)アンプリコン及びSb(3'末端)アンプリコンを、QIAquick PCR purification kit(QIAGEN)を製造業者の指示に従って用いて精製し、次いでベクターPCR2.1-TOPO(Invitrogen kit)中にクローニングして、SARS-S1及びSARS-S2と呼ぶプラスミドを得た。
Saクローン及びSbクローンのDNAを単離し、次いで対応する挿入物を、Big Dyeキット(Applied Biosystem(登録商標))並びにユニバーサルプライマーM13フォワードとM13リバース及び以下のプライマー：S/S/+/21867、S/S/+/22353、S/S/+/22811、S/S/+/23754、S/S/+/24207、S/S/+/24699、S/S/+/24348、S/S/-/24209、S/S/-/23630、S/S/-/23038、S/S/-/22454、S/S/-/21815、S/S/-/24784、S/S/+/21556、S/S/+/23130及びS/S/+/24465を製造業者の指示に従って用いて配列決定した；このように取得したSaフラグメント及びSbフラグメントの配列は、添付の配列表の配列番号５及び６の配列に相当する。
SARS-S1と呼ぶプラスミドは、2003年５月12日に、No.I-3020で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＳ遺伝子の配列の5'フラグメントを含有する。Saと呼ぶフラグメントは、Genbank配列AY274119.3 Tor2を参照にして、21406位〜23454位のヌクレオチド(配列番号５)に相当する。
TOP10F'-SARS-S2と呼ぶプラスミドは、2003年５月12日に、No.I-3019で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記で規定したNo.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＳ遺伝子の配列の3'フラグメントを含有する。Sbと呼ぶフラグメントは、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、23322位〜25348位のヌクレオチド(配列番号６)に相当する。
ｂ）完全cDNA(４kbのSARS-Sクローン)のクローニング及び配列決定
完全ＳのcDNAを上記クローンSARS-S1及びSARS-S2から、以下の様式で得た：
１）PCR増幅反応をSARS-S2クローンで、上記プライマーS/R4/-/25348-25329及びプライマーS/S/+/24696-24715の存在下で行った：633bpのアンプリコンが得られた、
２）別のPCR増幅反応を、別のSARS-S2クローンで、上記のプライマーS/F4/+/23322-23341及びS/S/-/24803-24784の存在下で行った：1481bpのアンプリコンが得られた。
増幅反応を、94℃にて20秒間の変性工程及び72℃にて２分30秒間の伸長工程を含んでなる30の増幅サイクルを行うことを除きSaフラグメント及びSbフラグメントの増幅について上記で規定したような条件下で行った。
３）２つのアンプリコン(633bp及び1481bp)を、Saフラグメント及びSbフラグメントについて上記で規定したような条件下で精製した。
４）上記プライマーS/F4/+/23322-23341及びS/R4/-/25348-25329を用いる別のPCR増幅反応を、３)で取得した精製したアンプリコンについて行った。増幅反応を、30の増幅サイクルを実施したことを除いてSaフラグメント及びSbフラグメントの増幅について上記で規定した条件下で行った。
このように取得した2026bpアンプリコンを精製し、ベクターPCR2.1-TOPO中にクローニングし、次いでSaフラグメント及びSbフラグメントについて上記で規定したようなプライマーを用いて上記のように配列決定した。このように取得したクローンをクローン3'と呼んだ。
５）上記の取得したクローンSARS-S1及びクローン3'をEcoR Iで消化し、このように取得した約２kbのバンドをゲル精製し、次いで上記プライマーS/F2/+/21406-21426及びS/R4/-/25348-25329でPCRにより増幅した。増幅反応を、30の増幅サイクルを実施したことを除きSaフラグメント及びSbフラグメントの増幅について上記で規定した条件下で行った。約４kbのアンプリコンを精製し、配列決定した。これを次いで、SARS-Sと呼ぶプラスミドを得るために、ベクターPCR2.1-TOPO中にクローニングし、このプラスミド中に取得された挿入物を、Saフラグメント及びSbフラグメントについて上記で規定したプライマーを用いて上記のように配列決定した。Ｓタンパク質をコードするアンプリコン及び挿入物のcDNA配列はそれぞれ、添付の配列表の配列番号２及び４の配列(これらはＳタンパク質(配列番号３)をコードする)に相当する。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のＳタンパク質をコードするcDNAに相当するアンプリコンの配列は、Tor2単離株及びUrbani単離株のそれぞれの対応配列と比較して、以下の２つの変異を有する。変異の位置は、Tor2単離株のゲノムの完全配列(Genbank AY274119.3)を参照にして示されている：
− 23220位のg/t；Tor2のＳタンパク質のアミノ酸配列の577位のアラニンコドン(gct)がセリンコドン(tct)で置換されている、
− 24872位のc/t：この変異はＳタンパク質のアミノ酸配列を改変しない、及び
SARS-Sと呼ぶプラスミドを、2003年６月20日に、No.I-3059で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＳタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列AY274119.3を参照にして、21406位〜25348位のヌクレオチド(配列番号４)に相当する。
2.2）Ｍタンパク質及びＥタンパク質をコードするcDNA
上記のように抽出したサンプル031589に由来するRNAを、同じ工程(Titan One Step RT-PCR(登録商標) kit(Roche)の間にプライマー対：
− ORF-Eを増幅するためのS/E/F1/+/26051-26070及びS/E/R1/-/26455-26436、及び
− ORF-Mを増幅するためのS/M/F1/+/26225-26244及びS/M/R1/-/27148-27129
を用いるPCR増幅反応と組み合せた逆転写に付した。
注入用の8.6μlのH2Oと、１μlのdNTP(５mM)と、0.2μlの各プライマー(50μM)と、1.25μlのDTT(100mM)と、0.25μlのRNAsin(40IU/μl)とを含有する第１の反応混合物を、１μlのRNAと、注入用の７μlのH2Oと、５μlの５×RT-PCR緩衝液と、0.5μlの酵素混合物とを含有する第２の反応混合物と合わせ、合わせた混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件下でインキュベートした：42℃にて30分間、55℃にて10分間、94℃にて２分間、続いて、94℃にて10秒間の変性工程と、55℃にて30秒間のアニーリング工程と68℃にて45秒間の伸長工程(１サイクル当たり３秒間の増加を伴う)とを含んでなる40サイクル、最後に68℃にて７分間の末端伸長工程。
このように取得した増幅産物(Ｍアンプリコン及びＥアンプリコン)を、プライマー対：
− アンプリコンＥ用のS/E/F2/+/26082-26101及びS/E/R2/-/26413-26394、及び
− アンプリコンＭ用のS/M/F2/+/26330-26350及びS/M/R2/-/27098-27078
を用い、Expand High-Fi(登録商標) kit(Roche)を使用して第２のPCR増幅(ネステッドPCR)に付した。
２μlの第１のPCR産物と、注入用の39.25μlのH2Oと、MgCl2を含有する５μlの10×緩衝液と、２μlのdNTP(５mM)と、0.5μlの各プライマー(50μM)と、0.75μlの酵素混合物とを含有する反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件下でインキュベートした：94℃にて２分間の変性工程に続いて、94℃にて15秒間の変性工程と、60℃にて30秒間のアニーリング工程と72℃にて45秒間の伸長工程(１サイクル当たり３秒間の増加を伴う)とを含んでなる30サイクル、最後に72℃にて７分間の末端伸長工程。Ｅタンパク質及びＭタンパク質をコードするcDNAに対応する取得された増幅産物を、上記のプライマー：S/E/F2/+/26082及びS/E/R2/-/26394、S/M/F2/+/26330、S/M/R2/-/27078並びにプライマーS/M/+/26636-26655及びS/M/-/26567-26548を用いて、上記のように配列決定した。次いで、これらを、SARS-E及びSARS-Mと呼ぶプラスミドを取得するために上記のようにクローニングした。次いで、これらクローンのDNAを単離し、ユニバーサルプライマーM13フォワード及びM13リバース並びに上記のプライマーS/M/+/26636及びS/M/-/26548を用いて配列決定した。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のＥタンパク質をコードするcDNAを表すアンプリコンの配列(配列番号13)は、単離株AY274119.3-Tor2及びAY278741-Urbaniの対応配列に関して差異を含有しない。SARS-CoV 031589系統のＥタンパク質の配列は、添付の配列表の配列番号14の配列に相当する。
SARS-Eと呼ぶプラスミドは、2003年５月28日に、No.I-3046で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記のように、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＥタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、26082位〜26413位のヌクレオチド(配列番号15)に相当する。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統からのＭをコードするcDNAを表すアンプリコンの配列(配列番号16)は、単離株AY274119.3-Tor2の対応配列に関して差異を含有しない。対照的に、26857位に、単離株AY278741-Urbaniはｃを含有し、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統の配列はｔを含有する。この変異は、対応するタンパク質のアミノ酸配列の改変を生じる：154位で、プロリン(AY278741-Urbani)が、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統では、セリンに変化する。No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＭタンパク質の配列は、添付の配列表の配列番号17の配列に相当する。
SARS-Mと呼ぶプラスミドは、2003年５月28日に、No.I-3047で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記のように、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＭタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、26330位〜27098位のヌクレオチド(配列番号18)に相当する。
2.3）ORF3、ORF4、ORF7〜ORF11に相当するcDNA
同じ増幅、クローニング及び配列決定ストラテジーを使用して、以下のORF：ORF3、ORF4、ORF7、ORF8、ORF9、ORF10及びORF11にそれぞれ相当するcDNAフラグメントを取得した。第１の増幅に使用したプライマー対は：
− ORF3及びORF4：S/SE/F1/+/25069-25088及びS/SE/R1/-/26300-26281
− ORF7〜ORF11：S/MN/F1/+/26898-26917及びS/MN/R1/-/28287-28266
である。
第２の増幅に使用したプライマー対は：
− ORF3及びORF4：S/SE/F2/+/25110-25129及びS/SE/R2/-/26244-26225
− ORF7〜ORF11：S/MN/F2/+/26977-26996及びS/MN/R2/-/28218-28199
である。
第１の増幅(RT-PCR)の条件は以下のとおりである：42℃にて45分間、55℃にて10分間、94℃にて２分間、続いて94℃にて15秒間の変性工程と、58℃にて30秒間のアニーリング工程と68℃にて１分間の伸長工程(１サイクル当たり５秒間の増加を伴う)とを含んでなる40サイクル、及び最後に68℃にて７分間の末端伸長工程。
ネステッドPCRの条件は以下のとおりである：94℃にて２分間の変性工程に続いて、94℃にて20秒間の変性工程と、58℃にて30秒間のアニーリング工程と72℃にて50秒間の伸長工程(１サイクル当たり４秒間の増加を伴う)とを含んでなる40サイクル、及び最後に72℃にて７分間の末端伸長工程。
ORF3、ORF4及びORF7〜11をそれぞれ含有するcDNAに相当する取得した増幅産物を、プライマー：S/SE/+/25363、S/SE/+/25835、S/SE/-/25494、S/SE/-/25875、S/MN/+/27839、S/MN/+/27409、S/MN/-/27836、S/MN/-/27799を用いて配列決定し、他のORFについての上記のようにクローニングして、SARS-SE及びSARS-MNと呼ぶプラスミドを得た。これらクローンのDNAを、これら同じプライマー及びユニバーサルプライマーM13センス及びM13アンチセンスを用いて、単離し、配列決定した。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のOFR3及びORF4を含有する領域のcDNAを表すアンプリコンの配列(配列番号７)は、単離株AY274119-Tor2の対応配列に関してヌクレオチドの差異を含有する。25298位のこの変異は、対応するタンパク質(ORF3)のアミノ酸配列の改変を生じる：11位で、アルギニン(AY274119-Tor2)が、サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統では、グリシンに変化する。対照的に、単離株AY278741-Urbaniの対応配列に関しては変異は同定されなかった。サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF3及びORF4の配列はそれぞれ、添付の配列表の配列番号10及び12の配列に相当する。
SARS-SEと呼ぶプラスミドは、2003年11月13日に、No.I-3126で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記で規定したように、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のORF-SとORF-Eとの間でORF-Eに重複して位置する領域に相当するcDNA配列を含有する。この領域は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、25110位〜26244位のヌクレオチド(配列番号８)に相当する。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF7〜ORF11を含有する領域に相当するcDNAを表すアンプリコンの配列(配列番号19)は、単離株AY274119-Tor2及びAY278741-Urbaniの対応配列に関して差異を含有しない。サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF7〜ORF11の配列はそれぞれ、添付の配列表の配列番号22、24、26、28及び30の配列に相当する。
SARS-MNと呼ぶプラスミドは、2003年11月13日に、No.I-3125で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記で規定したように、No.031589で記録されハノイで収集されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のORF-MとORF-Nとの間に位置する領域に相当するcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、26977位〜28218位のヌクレオチド(配列番号20)に相当する。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF7〜ORF11を含有する領域に相当するcDNAを表すアンプリコンの配列(配列番号19)は、単離株AY274119-Tor2及びAY278741-Urbaniの対応配列に関して差異を含有しない。サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF7〜ORF11の配列はそれぞれ、添付の配列表の配列番号22、24、26、28及び30の配列に相当する。
2.4）Ｎタンパク質をコードし、ORF13及びORF14を含むcDNA
cDNAを合成し、フラグメントSa及びSbについて上記で記載したように増幅した。より具体的には、５μlのRNAと、注入用の５μlのH2Oと、４μlの５×逆転写酵素緩衝液と、２μlのdNTP(５mM)と、２μlのオリゴ20T(５μM)と、0.5μlのRNasin(40IU/μl)と、1.5μlのAMV-RT(10IU/μl Promega)とを含有する反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件：42℃にて45分間、55℃にて15分間、95℃にて５分間の条件下でインキュベートし、次いで＋４℃に維持した。
第１のPCR増幅を、プライマー対S/N/F3/+/28023及びS/N/R3/-/29480で実施した。
S1フラグメント及びS2フラグメントの増幅についての上記のような反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件下でインキュベートした：94℃にて２分間の最初の変性工程に続いて、94℃にて20秒間の変性工程と、55℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて１分30秒間の伸長工程(各サイクルで10秒間の追加の伸長を伴う)とを含んでなる40サイクル、次いで72℃にて５分間の最終の伸長工程。
第１のPCR増幅で取得したアンプリコンを、第１の増幅の条件と同一の条件下で、プライマー対S/N/F4/+/28054及びS/N/R4/-/29430で第２のPCR増幅工程(ネステッドPCR)に付した。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のＮタンパク質をコードするcDNAに相当する取得した増幅産物を、プライマー：S/N/F4/+/28054、S/N/R4/-/29430、S/N/+/28468、S/N/+/28918及びS/N/-/28607を用いて配列決定し、他のORFについての上記のようにクローニングして、SARS-Nと呼ぶプラスミドを得た。これらクローンのDNAを、ユニバーサルプライマーM13センス及びM13アンチセンス並びにプライマーS/N/+/28468、S/N/+/28918及びS/N/-/28607を用いて、単離し、配列決定した。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF-Nに相当しORF13及びORF14を含むcDNAを表すアンプリコンの配列(配列番号36)は、単離株AY274119.3-Tor2及びAY278741-Urbaniの対応配列に関して差異を含有しない。サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のＮタンパク質の配列は、添付の配列表の配列番号37の配列に相当する。
サンプルNo.031589に由来するSARS-CoV系統のORF13及び14の配列はそれぞれ、添付の配列表の配列番号32及び34の配列に相当する。
SARS-Nと呼ぶプラスミドは、2003年６月５日に、No.I-3048で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記で規定したように、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＮタンパク質をコードするcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、28054位〜29430位のヌクレオチド(配列番号38)に相当する。
2.5）非コード5'末端及び3'末端
ａ）非コード5'末端(5'NC)
a1）cDNAの合成
上記のように抽出したサンプル031589に由来するRNAを、以下の条件下で逆転写に付した：
RNA(15μl)及びプライマーS/L/-/443(５μmの濃度で３μl)を、75℃にて10分間インキュベートした。
次に、５×逆転写酵素緩衝液(６μl、INVITROGEN)、10Mm dNTP(１μl)、0.1Ｍ DTT(３μl)を加え、混合物を50℃にて３分間インキュベートした。
最後に、逆転写酵素(３μlのSuperscript(登録商標)、INVITROGEN)を前記混合物に加え、50℃にて１時間30分間、次いで90℃にて２分間インキュベートした。
このようにして取得したcDNAを、QIAquick PCR purification kit(QIAGEN)を製造業者の推奨に従って用いて精製した。
b1）ターミナルトランスフェラーゼ反応(TdT)
cDNA(10μl)を100℃にて２分間インキュベートし、氷中で保存し、次いで以下のものを加えた：H2O(2.5μl)、５×TdT緩衝液(４μl、AMERSHAM)、５mM dATP(２μl)及びTdT(1.5μl、AMERSHAM)。このように取得した混合物を、37℃にて45分間、次いで65℃にて２分間インキュベートする。
取得した産物を、プライマー：S/L/-225-206及びアンカー14T：5'-AGATGAATTCGGTACCTTTTTTTTTTTTTT-3'(配列番号68)を用いる第１のPCR反応により増幅する。増幅条件は以下のとおりである：94℃にて２分間の最初の変性工程に続いて、94℃にて10秒間の変性工程と、45℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて30秒間の伸長工程とを含んでなる10サイクル、その後94℃にて10秒間の変性工程と、50℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて30秒間の伸長工程とを含んでなる30サイクル、次いで72℃にて５分間の最終の伸長工程。
第１のPCR増幅の産物を、第１の増幅の条件と同一の条件下で、プライマー：S/L/-/204-185及び上記アンカー14Tを用いる第２の増幅工程に付した。このように取得したアンプリコンを精製し、プライマーS/L/-/182-163を用いて配列決定し、次いで異なるORFについての上記のようにクローニングして、SARS-5'NCと呼ばれるプラスミドを得た。このクローンのDNAを単離し、ユニバーサルプライマーM13センス及びM13アンチセンス並びに上記のプライマーS/L/-/182-163を用いて配列決定した。
No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統の5'NC末端に相当するcDNAを表すアンプリコンは、添付の配列表の配列番号72の配列に相当する；この配列は、単離株AY274119.3-Tor2及びAY278741-Urbaniの対応配列に関して差異を含有しない。
SARS-5'NCと呼ぶプラスミドは、2003年11月７日に、No.I-3124で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記で規定したように、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムの非コード5'末端に相当するcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、１位〜204位のヌクレオチド(配列番号39)に相当する。
ｂ）非コード3'末端(3'NC)
a1）cDNAの合成
上記のように抽出したサンプル031589に由来するRNAを、以下のプロトコルに従って逆転写に付した：RNA(５μl)と、H2O(５μl)と、５×逆転写酵素緩衝液(４μl)と、５mM dNTP(２μl)と、５μMオリゴ20T(２μl)と、40U/μl RNasin(0.5μl)と、10IU/μl RT-AMV(1.5μl、PROMEGA)とを含有する反応混合物を、サーモサイクラー中、以下の条件：42℃にて45分間、55℃にて15分間、95℃にて５分間の条件下でインキュベートし、次いで＋４℃に維持した。
取得したcDNAを、プライマーS/N/+/28468-28487及び上記のアンカー14Tを用いて第１のPCR反応により増幅した。増幅条件は以下のとおりである：94℃にて２分間の最初の変性工程に続いて、94℃にて20秒間の変性工程と、45℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて50秒間の伸長工程とを含んでなる10サイクル、その後94℃にて20秒間の変性工程と、50℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて50秒間の伸長工程とを含んでなる30サイクル、72℃にて５分間の最終の伸長工程。
第１のPCR増幅の産物を、第１の増幅の条件と同一の条件下で、プライマーS/N/+/28933-28952及び上記のアンカー14Tを用いて第２の増幅工程に付した。このように取得したアンプリコンを精製し、プライマーS/N/+/29257-29278を用いて配列決定し、異なるORFについての上記のようにクローニングして、SARS-3'NCとよぶプラスミドを得た。このクローンのDNAを単離し、ユニバーサルプライマーM13センス及びM13アンチセンス並びに上記のプライマーS/N/+/29257-29278を用いて配列決定した。
No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統の3'NC末端に相当するcDNAを表すアンプリコンは、添付の配列表の配列番号73の配列に相当する；この配列は、単離株AY274119.3-Tor2及びAY278741-Urbaniの対応配列に関して差異を含有しない。
SARS-3'NCと呼ぶプラスミドは、2003年11月７日に、No.I-3123で、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した；これは、上記で規定したように、No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムの非コード3'末端に相当するcDNA配列を含有する。この配列は、Genbank配列受理No.AY274119.3を参照にして、28933位のヌクレオチドと29727位のヌクレオチドとの間に位置する配列(配列番号40)に相当し、一連のヌクレオチドａで終結する。
2.6）ORF1a及びORF1b
サンプル031589に由来するSARS-CoVゲノムのORF1a及びORF1bを含有する5'領域の増幅を、他のORFについて上記で記載されたものと同じ原理に従って、RT-PCR反応に続いてネステッドPCRを行うことにより実施した。増幅したフラグメントは数十の塩基が重複し、したがってゲノムのこの部分の完全配列のコンピュータによる再構築が可能である。平均すると、増幅したフラグメントは２キロベースである。
14の重複フラグメント(L0〜L12と呼ぶ)を、以下のプライマーを用いてこのように増幅した：
Figure 0005090741
上記でORF-Mについて記載したように増幅したフラグメントL0を除き、全てのフラグメントを以下の条件下で増幅した：
− RT-PCR：42℃にて30分間、55℃にて15分間、94℃にて２分間、次いで取得したcDNAを以下の条件下で増幅する：94℃にて15秒間の変性工程と、58℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで68℃にて１分30秒間の伸長工程とを含んでなる40サイクル(各サイクルで５秒間の追加の伸長を伴う)、次いで68℃にて７分間の最終の伸長工程。
− ネステッドPCR：94℃にて２分間の最初の変性工程に続いて、94℃にて15秒間の変性工程と、60℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて１分30秒間の伸長工程とを含んでなる35サイクル(各サイクルで５秒間の追加の伸長を伴う)、次いで72℃にて７分間の最終の伸長工程。
増幅産物を下記の表IIIに規定のプライマーを用いて配列決定した：
Figure 0005090741
Figure 0005090741
No.031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のフラグメントL0〜L12の配列はそれぞれ、添付の配列表の配列番号41〜配列番号54の配列に相当する。これら配列のうち、フラグメントL5に相当するものだけが、単離株AY278741-Urbaniの対応配列に関してヌクレオチドの差異を含有する。
7919位のこのt/c変異は、ORF1aによりコードされる対応タンパク質のアミノ酸配列の改変を生じる：2552位で、バリン(gttコドン；AY278741)は、SARS-CoV系統031589ではアラニン(gctコドン)に変化している。対照的に、単離株AY274119.3-Urbaniの対応配列に関しては変異は同定されなかった。その他のフラグメントは、単離株Tor2及びUrbaniの対応配列に関して差異を示さない。
実施例２：番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統の組換えのＮタンパク質及びＳタンパク質の産生及び精製
番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のＮタンパク質全体及びＳタンパク質の２つのポリペプチドフラグメントを、E.coli中で、Ｎ末端又はＣ末端のポリヒスチジンを含んでなる融合タンパク質の形態で産生した。２つのＳポリペプチドでは、Ｓタンパク質のＮ末端及びＣ末端の疎水性配列(シグナルペプチド：１位〜13位及び膜貫通ヘリックス：1196位〜1218位)が欠失している一方で、Ｓタンパク質のβヘリックス(565位〜687位)及びコイルドコイル型の２つのモチーフ(895位〜980位及び1155位〜1186位)は保存されていた。これら２つのポリペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸配列の14位〜1193位に相当する長いフラグメント(SL)及びＳタンパク質のアミノ酸配列の475位〜1193位に相当する短いフラグメント(SC)からなる。
１）発現ベクターpIVEX2.3及びpIVEX2.4中へのＮ、SL及びSCのcDNAのクローニング
Ｎタンパク質に対応するcDNA並びにSLフラグメント及びSCフラグメントに対応するcDNAを、DNAポリメラーゼPlatinium Pfx(登録商標)(INVITROGEN)を用いて、標準的な条件下でPCRにより増幅した。プラスミドSARS-N及びSARS-Sを鋳型として使用し、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた：
5'-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3' (Ｎセンス、配列番号55)
5'-CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3' (Ｎアンチセンス、配列番号56)
5'-CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3' (SCセンス、配列番号57)
5'-CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3' (SLセンス、配列番号58)
5'-CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3' (SC及びSLアンチセンス、配列番号29)。
センスプライマーはNdeI部位(下線)を導入する一方、アンチセンスプライマーはXmaI部位又はSmaI部位(下線)を導入する。３つの増幅産物をカラム精製し(QIAquick PCR Purification kit、QIAGEN)、適切なベクターにクローニングした。３つの構築物から精製した(QIAFilter Midi Plasmid kit、QIAGEN)プラスミドDNAを配列決定により検証し、酵素NdeI及びXmaIで消化した。Ｎ、SL及びSCのcDNAに対応する３つのフラグメントをアガロースゲル上で精製し、次いで同じ酵素で事前に消化していたプラスミドpIVEX2.3MCS(Ｃ末端ポリヒスチジンタグ)及びpIVEX2.4d(Ｎ末端ポリヒスチジンタグ)中に挿入した。構築物の検証後、このように取得した６つの発現ベクター(pIV2.3N、pIV2.3SC、pIV2.3SL、pIV2.4N、pIV2.4SC(pIV2.4S1とも呼ばれる)、pIV2.4SL)を使用して、一方でインビトロでのタンパク質の発現を検査し、他方で細菌系統BL21(DE3)pDIA17(NOVAGEN)を形質転換した。これら構築物は、その予想分子量が以下：pIV2.3N(47174Da)、pIV2.3SC(82897Da)、pIV2.3SL(132056Da)、pIV2.4N(48996Da)、pIV2.4S1(81076Da)及びpIV2.4SL(13387Da)であるタンパク質をコードする。pIV2.3Nで形質転換した細菌は、2003年10月23日に、番号I-3117でCNCMに寄託した。pIV2.4S1で形質転換した細菌は、2003年10月23日に、番号I-3118でCNCMに寄託した。
２）インビトロ及びインビボでの組換えタンパク質の発現の分析
６つの組換えベクターからの組換えタンパク質の発現を、第１の例では、インビトロ系(RTS100、Roche)で検査した。RTS100系で30℃にて４時間の組換えベクターpIVEXのインキュベーション後にインビトロで産生したタンパク質を、ペルオキシダーゼにカップリングした抗(his)6抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。インビトロ発現の結果(図１)は、Ｎタンパク質のみがポリヒスチジンタグの位置(Ｎ末端又はＣ末端)にかかわらず大量に発現されることを示す。第２の工程で、Ｎタンパク質及びＳタンパク質の発現を、LB培地中、誘導剤(１mM IPTG)の存在下又は非存在下で30℃にて、インビボで検査した。Ｎタンパク質はこの細菌系では非常に良好に産生され(図２)、細菌の溶解後に主として可溶画分に見出される。対照的に、長いバージョンのＳ(SL)は、非常に貧弱に産生され、完全に不溶性である(図３)。短いバージョン(SC)もまた非常に弱い可溶性を示すが、発現レベルは、長いバージョンのレベルよりずっと高い。更に、Ｃ末端位でポリヒスチジンタグと融合した構築物SCは、予測されるものより小さいサイズを有する。抗ポリヒスチジン抗体での免疫検出実験は、この構築物が不完全であったことを示している。まとめると、２つの構築物pIV2.3N及びpIV2.4S1(これらはそれぞれ、Ｃ末端ポリヒスチジンタグと融合した全体Ｎタンパク質及びＮ末端ポリヒスチジンタグと融合した短いＳタンパク質を発現する)を、この２つのタンパク質を大量に産生して精製するために選択した。プラスミドpIV2.3N及びpIV2.4S1は、2003年10月23日に、それぞれNo.I-3117及びI-3118でCNCM(25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS 15)に寄託した。
３）組換えタンパク質の抗原活性の分析
Ｎタンパク質、SLタンパク質及びSCタンパク質の抗原活性を、SARS-CoVに感染した同じ患者から得た、SARS症状の発症後８日目(M12)及び29日目(M13)に収集した２つの血清サンプルを用いるウェスタンブロッティングにより検査した。実験プロトコルは実施例３に記載のとおりである。図４に示す結果は、（ｉ）患者のセロコンバージョン、及び（ii）Ｎタンパク質が短いＳタンパク質より高い抗原反応性を保有することを示す。
４）pIV2.3NからのＮタンパク質の精製
ベクターpIV2.3Nから産生したＮタンパク質を精製するための幾つかの実験を、以下のプロトコルに従って行った。発現ベクターpIV2.3Nで形質転換した細菌BL21(DE3)pDIA17を、0.1mg/mlのアンピシリンを含有する１リットルの培養培地中で30℃にて培養し、A600 = 0.8に等しい細胞密度に到達したとき(約３時間)に１mM IPTGで誘導した。誘導剤の存在下での２時間の培養後、細胞を遠心分離(5000rpmにて10分間)により回収し、溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、0.3Ｍ NaCl、20mMイミダゾール、pH８、プロテアーゼ阻害剤の混合物Complete(登録商標)(Roche)を含有)中に再懸濁し、French press(12,000psi)で溶解した。細菌溶解物の遠心分離(12,000rpmにて15分間)後、上清(50ml)を、溶解緩衝液で平衡化した金属キレートカラム(15ml)(Ni-NTA superflow、Qiagen)上で１ml/分の流量にて堆積させた。カラムを200mlの溶解緩衝液で洗浄後、Ｎタンパク質を10カラム容量のイミダゾール勾配(20→250mM)で溶出させた。Ｎタンパク質を含有する画分を集め、変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動に続くクーマシーブルーでの染色により分析した。図５に示す結果は、使用したプロトコルにより、非常に満足な均質性(95％)及び１リットルの培養物当たり15mgのタンパク質の平均収量でＮタンパク質を精製することが可能になることを示す。
５）pIV2.4SC(pIV2.4S1)からのSCタンパク質の精製
短いＳタンパク質を精製するために従ったプロトコルは、上記のものとは非常に異なる。なぜなら、このタンパク質は、細菌系において高度に凝集するからである(封入体)。発現ベクターpIV2.4S1で形質転換した細菌BL21(DE3)pDIA17を、0.1mg/mlのアンピシリンを含有する１リットルの培養培地中で30℃にて培養し、A600 = 0.8に等しい細胞密度に到達したとき(約３時間)に１mM IPTGで誘導した。誘導剤の存在下での２時間の培養後、細胞を遠心分離(5000rpmにて10分間)により回収し、溶解緩衝液(0.1Ｍ Tris-HCl、１mM EDTA、pH7.5)中に再懸濁し、French press(12,000psi)で溶解した。細菌溶解物の遠心分離(12,000rpmにて15分間)後、ペレットを、２％Triton X100及び10mMβ-メルカプトエタノールを含有する25mlの溶解緩衝液中に再懸濁し、次いで12,000rpmにて20分間遠心分離した。ペレットを、7Ｍ尿素を含有する10mM Tris-HCl緩衝液中に再懸濁し、室温にて30分間穏やかに撹拌した。7Ｍ尿素での封入体のこの最終洗浄は、凝集したSCタンパク質と共に沈降するE.coli膜タンパク質のほとんどを除去するために必要である。12,000rpmにて20分間の最後の遠心分離後、最終ペレットを10mM Tris-HCl緩衝液中に再懸濁する。この調製物の電気泳動分析(図６)により、短いＳタンパク質は、封入体(不溶性抽出物)から満足する均質性(約90％)で精製され得ることが示される。
実施例３：Ｎタンパク質の免疫優性
SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)により引き起こされた異型肺炎に罹患している患者の血清中に存在する抗体の、このウイルスの種々のタンパク質に対する反応性を、下記の条件下でのウェスタンブロッティングにより分析した。
１）材料
ａ）SARS-CoVに感染した細胞の溶解物
Vero E6細胞(２×106)にSARS-CoV(番号FFM/MA104で記録した単離株)を10-1又は10-2の感染多重度(M.O.I.)で感染させ、次いで５％CO2を含有する雰囲気下で２％FCSを含有するDMEM培地中35℃にてインキュベートした。48時間後、細胞ローン(cellular lawn)をPBSで洗浄し、次いでLaemmliに従って調製したβ-メルカプトエタノールを含有する500μlのローディング緩衝液で溶解した。次いでサンプルを10分間煮沸し、次いで20秒間で３回超音波処理をした。
ｂ）抗体
b1）異型肺炎に罹患している患者からの血清
National Reference Center for Influenza Viruses(Northern region)の参照によりNo.20033168で指称される血清は、症状の発症後38日目に収集したSARS-CoVにより引き起こされた異型肺炎に罹患しているフランス人患者からのものである；SARS-CoV感染の診断はネステッドRT-PCR及び定量PCRにより行った。
b2）Ｎタンパク質又はＳタンパク質を指向する単一特異性ウサギポリクローナル血清
血清は、実施例４に記載の免疫プロトコルに従い、組換えのＮタンパク質及びSCタンパク質(実施例２)で作成したものである；これらは、ウサギP13097血清(抗Ｎ血清)及びウサギP11135血清(抗Ｓ血清)である。
２）方法
SARS-CoVに10-1及び10-2のM.O.I.値で感染した細胞の20μlの溶解物、及びコントロールとして、非感染細胞の20μlの溶解物(mock)を、10％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでニトロセルロース膜上に移した。PBS/５％ミルク/0.1％Tweenの溶液中でのブロッキング及びPBS/0.1％Tween中での洗浄後、この膜を、以下：（ｉ）緩衝液PBS/１％BSA/0.1％Tween中で１/300、１/1000及び１/3000希釈した免疫血清No.20033168、（ii）同じ緩衝液中で１/50,000希釈したウサギP13097血清(抗Ｎ血清)、及び（iii）同じ緩衝液中で１/10,000希釈したウサギP11135血清(抗Ｓ血清)と一晩４℃にてハイブリダイズさせた。PBS/Tween中での洗浄後、ヒト免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖を指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたヒツジポリクローナル抗体(NA933V、Amersham)、又はウサギ免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖を指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)のいずれかを用いて二次ハイブリダイゼーションを実施した。結合した抗体を、ECL+ kit(Amersham)及びHyperfilm MPオートラジオグラフィーフィルム(Amersham)を用いて可視化した。分子量ラダー(kDa)を図に示す。
３）結果
図７は、見かけの分子量35、55及び200kDaの３つのポリペプチドが、SARS-CoVに感染した細胞の抽出物中で特異的に検出されることを示す。
これらポリペプチドを同定するために、２つの他のイムノブロット(図８)を同じサンプルについて同じ条件下で、核タンパク質Ｎに特異的なウサギポリクローナル抗体(ウサギP13097、図8A)及び針状タンパク質Ｓに特異的なウサギポリクローナル抗体(ウサギP11135、図8B)を用いて調製した。この実験により、200kDaポリペプチドがSARS-CoV針状糖タンパク質Ｓに相当し、55kDaポリペプチドが核タンパク質Ｎに相当し、35kDaポリペプチドはおそらくＮの短縮形態又は分解形態を表すことが示される。
したがって、図７に示すデータは、血清20033168がＮと強力に反応し、SARS-CoV Sとは非常に弱くにしか反応しないことを示す。なぜなら、35kDaポリペプチド及び55kDaポリペプチドは、１/300、１/1000及び１/3000の希釈率の免疫血清については強いバンドの形態で可視化される一方で、200kDaポリペプチドは、１/300の希釈率について弱く可視化されるのみであるからである。また、他のSARS-CoVポリペプチドは、１/300より高い希釈率の血清20033168に関しては検出されないことに気付く。
この実験は、SARS-CoV Nに特異的な抗体応答がその他のSARS-CoVポリペプチドに特異的な抗体応答、特にＳ糖タンパク質を指向する抗体応答より優勢であることを示す。このことは、SARS-CoVへのヒト感染の間の核タンパク質Ｎの免疫優性を示す。
実施例４：SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)のＮタンパク質及びＳタンパク質を指向する単一特異性ポリクローナル抗体の製造
１）材料及び方法
３匹のウサギ(P13097、P13081、P13031)を、実施例２に記載のプロトコルに従って製造した核タンパク質(Ｎ)全体に対応する精製した組換えポリペプチドで免疫した。完全フロイントアジュバント中で乳化した、ウサギ当たり0.35mgのタンパク質の第１回目の注射(皮内経路)の後、動物に、不完全フロイントアジュバント中で乳化した0.35mgの組換えタンパク質を３週間の間隔で、次いで４週間の間隔で３回の追加免疫の注射をした。
３匹のウサギ(P11135、P13042、P14001)を、実施例２に記載のように製造したＳタンパク質の短いフラグメント(SC)に対応する組換えポリペプチドで免疫した。このポリペプチドは、細菌の細胞質で封入体の形態で主として見出されるので、動物に、３〜４週間の間隔で、不完全フロイントアジュバント中で乳化した0.5mgの組換えタンパク質に対応する封入体の調製物を４回皮内注射した。最初の３回の注射は、実施例２に記載のプロトコルに従って製造した封入体の調製物で行い、４回目の注射は、実施例２に記載のプロトコルに従って製造し、次いでスクロース勾配で精製し、２％Triton X100中で洗浄した封入体の調製物で行った。
各ウサギについて、免疫前(p.i.)血清を第１の免疫の前に調製し、免疫血清(I.S.)を第４の免疫の５週間後に調製した。
第１の例では、血清の反応性を、免疫に使用したものと同様な組換えタンパク質の調製物に対するELISA検査により分析した；ELISA検査を、実施例６に記載のプロトコルに従い、そこに記載の試薬を用いて行った。
第２の例では、血清の反応性を、実施例３に記載のプロトコルに従い、SARS-CoVに感染した細胞の溶解物のイムノブロット(ウェスタンブロット)を作成することにより分析した。
２）結果
ELISA検査(図９)は、組換えＮタンパク質の調製物及びＳタンパク質の短いフラグメント(SC)の封入体の調製物が動物において免疫原性であること、及び免疫血清の力価が高い(１/25,000より高い)ことを証明する。
イムノブロット(図８)は、ウサギP13097免疫血清がSARS-CoVに感染した細胞の溶解物中に存在する２つのポリペプチドを認識することを示す：見かけの分子量(実験に基づいて50〜55kDa)が核タンパク質Ｎのもの(422残基、予想分子量46kDa)に匹敵するポリペプチド、及びおそらくＮの短縮されたか又は分解された形態を表す35kDaのポリペプチド。
この実験はまた、ウサギP11135血清が、主に、見かけの分子量(実験に基づいて180〜220kDa)がグリコシル化形態のＳ(1255残基、139kDaの非グリコシル化ポリペプチド鎖)に匹敵するポリペプチド、及びおそらく短縮された形態及び/又は非グリコシル化形態のＳを表すより軽いポリペプチドを認識することを示す。
まとめると、これら全ての実験は、E.coli中で発現され、SARS-CoVのＮタンパク質及びＳタンパク質に相当する組換えポリペプチドにより、動物において、これらタンパク質の天然型形態を認識し得るポリクローナル抗体を誘導することが可能になることを証明する。
実施例５：SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)のＭタンパク質及びＥタンパク質を指向する単一特異性ポリクローナル抗体の調製
１）Ｍタンパク質及びＥタンパク質の構造の分析
ａ）Ｅタンパク質
SARS-CoV Ｅタンパク質(76アミノ酸)の構造を、種々のソフトウェアパッケージ、例えばsignalP v1.1、NetNGlyc 1.0、THMM 1.0及び2.0(Kroghら、2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580)、或いはTOPPRED(von Heijne、1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494)を用いてコンピュータで分析した。分析により、この非グリコシル化ポリペプチドは、単一膜貫通ヘリックス(THMMに従うaa12〜34)を含有し、そこで親水性ドメイン(42残基)の大部分がＣ末端部、おそらくウイルス粒子内部(エンドドメイン)に位置するタイプ１膜タンパク質であることが示される。THMMソフトウェアのバージョン1.0(N-terは外部)及びバージョン2.0(N-terは内部)により予測されるトポロジーは正反対であるが、他のアルゴリズム、特にTOPPRED及びTHUMBUP(Zhou et Zhou、2003, Protein Science 12:1547-1555)は、ＥのＮ末端部の外部配置を確証することに気付く。
ｂ）Ｍタンパク質
SARS-CoV Ｍタンパク質(221アミノ酸)で行った同様な分析は、このポリペプチドがシグナルペプチド(ソフトウェアsignalP v1.1による)を保有しないが、３つの膜貫通ドメイン(THMM2.0により残基15〜37、50〜72、77〜99)及びウイルス粒子内部に位置する大きな親水性ドメイン(aa100〜221)(エンドドメイン)を保有することを示す。これは、おそらく４位(NetNGlyc 1.0による)のアスパラギンでグリコシル化されている。
このように、他のコロナウイルスについての既知の実験データと一致して、２つのＭタンパク質及びＥタンパク質が、このポリペプチドの大部分に相当するエンドドメインを示し、エクトドメインはサイズが非常に小さいことは驚くべきことである。
− Ｅのエクトドメインは、おそらく、このタンパク質の残基１〜11又は１〜12に相当する：MYSFVSEETGT(L)、配列番号70。確かに、残基12が膜貫通配置に関係する確率は中程度である(THMM 2.0により0.56)。
− Ｍのエクトドメインは、おそらく、このタンパク質の残基２〜14に相当する：ADNGTITVEELKQ、配列番号69。確かに、ＭのＮ末端メチオニンは非常に高い確率で成熟ポリペプチドから切断される。なぜなら、２位の残基はアラニンであるからである(Varshavsky、1996, 93:12142-12149)。
更に、Ｅタンパク質の疎水性分析(Kyte & Doolittle、Hopp & Woods)は、ＥのエンドドメインのＣ末端部は親水性であり、したがっておそらくこのドメインの表面に露出していることを証明する。したがって、この末端部に相当する合成ペプチドは、動物において、Ｅのエンドドメインを指向する抗体を誘導するために、良好な免疫原性の候補物である。この結果、ＥのＣ末端の24残基に相当するペプチドを合成した。
２）Ｍタンパク質及びＥタンパク質のエクトドメインを指向する抗体及びＥタンパク質のエンドドメインを指向する抗体の製造
ペプチドM2-14(ADNGTITVEELKQ、配列番号69)、E1-12(MYSFVSEETGTL、配列番号70)及びE53-76(KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV、配列番号71)をNeosystemにより合成した。これらを、MBS(m-マレイミド-ベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を用いてKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と、ペプチドのＮ末端(E53-76の場合)又はＣ末端(M2-14及びE1-12の場合)のいずれかで、合成の間に付加したシステインを介してカップリングした。
２匹のウサギを、以下の免疫プロトコルに従って、各々の接合体を用いて免疫した：完全フロイントアジュバント中に乳化した、KLHにカップリングした0.5mgのペプチドの最初の注射(皮内経路)後、動物に３又は４週間の間隔で、不完全フロイントアジュバント中に乳化したKLHにカップリングした0.5mgのペプチドの２〜４のブースター注射をする。
各ウサギについて、免疫前(p.i.)血清を第１の免疫の前に調製し、免疫血清(I.S.)をブースター注射の３〜５週間後に調製した。
血清の反応性を、SARS-CoVに感染した細胞の抽出物(図43B)、又はSARS-CoV 031589単離株のタンパク質Ｅ若しくはＭを発現する組換えワクシニアウイルス(VV-TG-E又はVV-TN-M)に感染した細胞の抽出物(図43A又は図43C)を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。
接合体KLH-E53-76で免疫したウサギ22234及び22240の免疫血清は、SARS-CoVに感染した細胞の抽出物中に存在するが非感染細胞の抽出物には存在しない約９〜10kDのポリペプチドを認識する(図43B)。このポリペプチドの見かけの分子量は、Ｅタンパク質の予測される分子量8.4kDに匹敵する。同様に、接合体KLH-E1-12で免疫したウサギ20047の免疫血清は、VV-TG-Eウイルスに感染した細胞の抽出物中に存在するポリペプチドを認識する。そのポリペプチドの見かけの分子量は、Ｅタンパク質のものに匹敵する(図43A)。
接合体KLH-M2-14で免疫したウサギ20013及び20080の免疫血清は、VV-TN-Mウイルスに感染した細胞の抽出物中に存在するポリペプチドを認識する(図43C)。そのポリペプチドの見かけの分子量(約18kD)は、25.1kDであり高等電点(裸のポリペプチドに関して9.1)を有する糖タンパク質Ｍのものに匹敵する。
これら結果は、一方でペプチドE1-12及びE53-76により、他方でペプチドM2-14により、動物において、それぞれSARS-CoVのＥタンパク質及びＭタンパク質の天然型形態を認識し得るポリクローナル抗体を誘導することが可能となることを証明する。
実施例６：SARSに罹患している患者からの血清に対する組換えＮタンパク質のELISA反応性の分析
１）材料
固相の調製に使用した抗原は、実施例２に記載のプロトコルに従って調製した精製した組換え核タンパク質Ｎである。
検査すべき血清(表IV)を、SARS-CoVに感染した細胞に対する免疫蛍光(IF-SARS力価)による反応性の分析結果に基づいて選択した。
Figure 0005090741
 *na：適用なし。**nt：検査せず。***：示された日にちは、SARS症状の発症後の日数に対応。
２）方法
0.1Ｍ炭酸塩緩衝液(pH9.6)中に種々の濃度(１、２又は４μg/ml)で希釈したＮタンパク質(100μl)をELISAプレートのウェルに分配し、次いでプレートを一晩実験室温度でインキュベートする。プレートをPBS-スキムミルク-スクロース(５％)緩衝液で飽和したPBS-Tween緩衝液で洗浄する。予め希釈(１/50、１/100、１/200、１/400、１/800、１/1600及び１/3200)した検査血清(100μl)を加え、次いでプレートを１時間37℃にてインキュベートする。３回の洗浄後、１/18,000希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG接合体(参照209-035-098、JACKSON)を加え、次いでプレートを１時間37℃にてインキュベートする。４回の洗浄後、色素原(TMB)及び基質(H2O2)を加え、プレートを、遮光して30分間室温でインキュベートする。次いで、反応を停止し、その後450nmの吸光度を自動化リーダーを用いて測定する。
３）結果
ELISA検査(図10)は、組換えＮタンパク質調製物が感染の後期(症状の発症の17日以上後)に収集したSARSに罹患している患者からの血清の抗体に特異的に認識される一方、感染の初期(症状の発症の３日後)に収集した患者の血清の抗体にも、SARSに罹患していない患者からのコントロール血清にも有意には認識されないことを証明する。
実施例７：患者の血清からのSARS関連コロナウイルス感染の非常に特異的で高感度な検出のために準備したELISA検査
１）間接ELISA IgG検査
ａ）試薬
プレートの調製
プレートを、10mM PBS緩衝液(pH7.2)中２μg/mlのＮタンパク質の溶液、0.25ml/lのフェノールレッドで感作する。100μlの溶液をウェル中に堆積し、放置して室温で一晩インキュベートする。10mM PBS/0.1％Tween緩衝液中で予備洗浄し、続いて飽和溶液PBS、25％ミルク/スクロースで洗浄することによって、飽和を得る。
血清希釈剤
緩衝液0.48g/l TRIS、10mM PBS、3.7g/l EDTA、15％v/vミルク、pH6.7
接合体希釈剤
クエン酸緩衝液(15g/l)、0.5％Tween、25％ウシ血清、12％NaCl、６％v/vスキムミルク pH6.5
接合体
50×抗ヒトIgG接合体(Bio-Radより市販：Platelia H. pylori kit ref 72778)
他の溶液：
洗浄溶液R2、TMBを含む可視化用溶液R8、希釈剤、R9色素原、R10停止溶液：Bio-Radより市販されている試薬(例えば：Platelia pylori kit、ref 72778)
ｂ）手順
血清をサンプル希釈剤中に１/200に希釈する
100μl/ウェルで分配する
37℃にて１時間のインキュベーション
脱塩水に予め10倍に希釈した10×洗浄溶液R2(すなわち１×洗浄溶液)中での３回の洗浄
100μlの接合体(提供された接合体希釈剤中で50×接合体を使用直前に希釈)を分配
37℃にて１時間のインキュベーション
１×洗浄溶液中での４回の洗浄
200μl/ウェルの可視化溶液(使用直前に希釈、例えば10mlのR8中に１mlのR9)を分配
暗所で、室温にて30分間のインキュベーション
100μl/ウェルのR10で反応を停止
450/620nmでの読み取り
結果は、検査された血清を陽性とみなす応答を超える応答を与える閾値血清を採用することにより解釈することができる。この血清は、バックグランドノイズより有意に高いシグナルを与えるように選択され、希釈される。
２）二重エピトープELISA検査
ａ）試薬
プレートの調製
プレートを、10mM PBS緩衝液(pH7.2)中１μg/mlのＮタンパク質の溶液、0.25ml/lのフェノールレッドで感作する。100μlの溶液をウェル中に堆積し、放置して室温で一晩インキュベートする。10mM PBS/0.1％Tween緩衝液中で予備洗浄し、続いて飽和溶液10mM PBS、25％(V/V)ミルクで洗浄することによって、飽和を得る。
血清及び接合体の希釈剤
緩衝液50mM TRIS生理食塩水、pH８、２％ミルク
接合体
これは、Nakaneのプロトコル(Nakane P.K. and Kawaoi A.；(1974)：Peroxidase-labeled antibody, a new method of conjugation. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry Vol.22, N) 23, pp.1084-1091)に従い、それぞれのモル比２/１で、ペルオキシダーゼにカップリングした精製した組換えＮタンパク質である。このProtN POD接合体は、血清/接合体希釈剤中２μg/mlの濃度で使用する。
他の溶液：
洗浄溶液R2、TMBを含む可視化用溶液R8、希釈剤、R9色素原、R10停止溶液：Bio-Radより市販されている試薬(例えば：Platelia pylori kit、ref 72778)
ｂ）手順
「予備希釈」プレートにおける第１工程
・ 各血清を予備希釈プレート中で１/５に希釈(48μlの希釈剤＋12μlの血清)。
・ 全ての血清を希釈後、60μlの接合体を分配。
・ 適切な場合には、血清＋接合体ミックスを放置してインキュベートする。
「反応」プレートにおける第２工程
・ 100μlの混合物/ウェルを反応プレート中に移す
・ 37℃にて１時間のインキュベーション
・ 予め脱塩水中で10倍に希釈した10×洗浄溶液R2(→ １×洗浄溶液)中での５回の洗浄
・ 200μl/ウェルの可視化溶液(使用直前に希釈、例えば10mlのR8中に１mlのR9)を分配
・ 遮光し、室温にて30分間のインキュベーション
・ 100μl/ウェルのR10で反応を停止
・ 450/620nmでの読み取り
間接ELISA検査についてと同様に、結果は「閾値」血清を用いて解釈することができる。閾値血清より大きな応答を有する血清を陽性とみなす。
２）結果
ハノイ(ベトナム)のフランス病院(French hospital of Hanoi)からの、又はハノイのフランス病院に関連して(JYK)、SARSの可能性が高い症例として分類された患者の血清を、間接IgG-N検査及び二重エピトープＮ検査を使用して分析した。
間接IgG-N検査(図14及び15)及び二重エピトープＮ検査(図16及び17)の結果は、これら検査とSARS-CoVに感染したか又は感染していないVeroE6細胞の溶解物に対する血清の反応性を比較する間接ELISA検査(ELISA-SARS-CoV溶解物；下記の表Ｖを参照)との間の格別良好な相関を示す。症状の発症の12日後又はそれ以上後に収集した全ての血清は、陽性であることが分かった(おそらくサンプルが感染の非常に後期(≧D12)に収集されたために、呼吸器サンプルをRT-PCRにより分析することによっては、SARS-CoVウイルス感染を証拠付けることができなかった患者が含まれている)。D7に収集された鼻サンプルがRT-PCRにより陰性であるとされた患者TTHの症例では、サンプルの質が問題であるかもしれない。
陰性であるとされたが、SARS-CoVの存在がRT-PCRにより検出された血清もあった。これらは、全ての症例で、症状の発症後10日未満で収集された初期血清である(例えば：血清#032637)。患者PTTH(血清#032673)の症例では、サンプルが収集された時点で初めてSARSの疑いが生じた。
まとめると、間接IgG-N検査及びN-二重エピトープ血清学的検査により、全ての患者で、感染の12日又はそれ以上後に収集された血清に関してSARS-CoV感染を証拠付けることが可能になる。
Figure 0005090741
Figure 0005090741
備考：
（１）：鼻スワブ又は咽頭スワブについてネステッドRT-PCR BNI、LC Artus及びLC-NによりRT-PCR分析を行った；POSは、少なくとも１つのサンプルがこの患者において陽性であるとされたことを意味する。
（２）：SARS-CoVに感染した細胞の溶解物を用いるELISA検査における血清の反応性は、検査した希釈率で得られたOD値に従って、非常に高い反応性(+++)、高い反応性(++)、反応性(+)及び陰性と分類された。
実施例８：RT-PCRによるSARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)の検出
１）ヌクレオキャプシドタンパク質の遺伝子に特異的なプライマーを用いるリアルタイムRT-PCR条件の開発 − 「Light Cycler N」検査
ａ）プライマー及びプローブの設計
プライマー及びプローブを、番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノム配列から、プログラム「Light Cycler Probe Design(Roche)」を用いて設計した。したがって、以下の２つのシリーズのプライマー及びプローブを選択した：
− シリーズ１(配列番号60、61、64、65)：
− センスプライマー：N/+/28507：5'-GGC ATC GTA TGG GTT G-3' [28507〜28522]
− アンチセンスプライマー：N/-/28774：5'-CAG TTT CAC CAC CTC C-3' [28774〜28759]
− プローブ１：5'-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-フルオレセイン 3' [28561〜28586]
− プローブ２：5' Red705-GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-ホスフェート [28588〜28608]
− シリーズ２(配列番号62、63、66、67)
− センスプライマー：N/+/28375：5'-GGC TAC TAC CGA AGA G-3' [28375〜28390]
− アンチセンスプライマー：N/-/28702：5'-AAT TAC CGC GAC TAC G 3' [28702〜28687]
− プローブ１：SARS/N/FL：5'-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC-フルオレセイン 3' [28541〜28563]
− プローブ２：SARS/N/LC705：5' Red705-CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C-ホスフェート 3' [28565〜28589]
ｂ）２つのプライマー対の効力の分析
２つのプライマー対のそれぞれの効力を検査するため、番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムのヌクレオチド28054〜29430に相当し、Ｎ遺伝子の配列を含有する合成RNAに対してRT-PCR増幅を行った。
より具体的には：
この合成RNAを、T7ファージRNAポリメラーゼ、酵素Bam H1でのプラスミドSRAS-Nの線状化により取得したDNA鋳型を用いるインビトロ転写により調製した。DNAse 1を用いる消化によりDNA鋳型を排除した後、フェノール−クロロホルム抽出、続いて酢酸アンモニウム及びイソプロパノール中での２連続の沈降により合成RNAを精製する。次いで、これらを260nmでの吸光度を測定することにより定量し、それらの質を260nm及び280nmの吸光度の比並びにアガロースゲル電気泳動により確認した。こうして、これらの研究に使用する合成RNA調製物の濃度は1.6mg/mlであり、これは2.1×1015コピー/mlのRNAに相当する。
「SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum(登録商標) Taq」キット並びにプライマー対No.1(N/+/28507、N/-/28774)(図11A)及びNo.2(N/+/28375、N/-/28702)(図11B)を供給業者の指示に従って用いて漸減量の合成RNAをRT-PCRにより増幅した。使用した増幅条件は以下である：cDNAを45℃にて30分間、55℃にて15分間、次いで94℃にて２分間のインキュベーションにより合成し、次いでこれを以下によって増幅した：94℃にて15秒間の変性工程と、45℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて30秒間の伸長工程とを含んでなる５サイクル、続いて、94℃にて15秒間の変性工程と、55℃にて30秒間のアニーリング工程と、次いで72℃にて30秒間の伸長工程(各サイクルに２秒間の追加の伸長を伴う)とを含んでなる35サイクル、及び72℃にて５分間の最終の伸長工程。得られた増幅産物を次いで10℃に維持した。
図11に示した結果は、プライマー対No.2(N/+/28375、N/-/28702)により、プライマー対No.1(N/+/28507、N/-/28774)の104コピーに対して、10コピーまでのRNA(弱い輝度のバンド)又は102コピー(良好な輝度のバンド)を検出することが可能になることを示す。アンプリコンはそれぞれ268bp(対１)及び328bp(対２)である。
ｃ）リアルタイムRT-PCRの開発
プライマー対No.2並びにSRAS/N/FL及びSRAS/N/LC705からなる一対のプローブを用いて、リアルタイムRT-PCRを開発した(図12)。
「Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes」キット(reference 2 015 145、Roche)を用い、LightCyclerTM (Roche)で、以下の最適化された条件で増幅を行った。H2O(6.8μl)と、25mM MgCl2(0.8μl、４μM Mg2+最終)と、５×反応混合物(４μl)と、３μmプローブSRAS/N/FL(0.5μl、0.075μM最終)と、３μMプローブSRAS/N/LC705(0.5μl、0.075μM最終)と、10μMプライマーN/+/28375(１μl、0.5μM最終)と、10μMプライマーN/-/28702(１μl、0.5μM最終)と、酵素混合物(0.4μl)と、サンプル(ウイルスRNA、５μl)とを含有する反応混合物を、以下のプログラムに従って増幅した：
− 逆転写：50℃ 10:00分間 分析モード：none
− 変性：95℃ 30秒間×１ 分析モード：none
− 増幅：95℃ ２秒間 ]
50℃ 15秒間 分析モード：quantification* ] ×45
72℃ 13秒間 熱ランプ 2.0℃/秒 ]
− アニーリング： 40℃ 30秒間×１ 分析モード：none
* 蛍光は、アニーリングの終了時及び各サイクルに測定する(SINGLEモードで)。
図12に示す結果は、このリアルタイムRT-PCRにより、分析した５サンプルの100％(８つの実験で29/29サンプル)で102コピーの合成RNAを、分析した５サンプルの100％(８つの実験で40/45サンプル)で10コピーまでのRNAを検出することが可能になるので、このリアルタイムRT-PCRが非常に高感度であることを示す。結果はまた、このRT-PCRにより、サンプル中のSARS-CoVゲノムの存在を検出することが可能になり、存在するゲノムの数を定量することが可能になることを示す。例として、Vero E6細胞上で培養したSARS-CoVストックのウイルスRNAを、「Qiamp viral RNA extraction」キット(Qiagen)を用いて抽出し、0.05×10-14に希釈し、上記に記載のプロトコルに従ってリアルタイムRT-PCRにより分析した；図12に示す分析は、この値は、ウイルスストックが6.5×109ゲノム等価物/ml(geq/ml)を含有していることを示す、これはArtusより市販されている「RealArtTM HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents」キットを用いて測定した値1.0×1010geq/mlに全く類似している。
２）RNAポリメラーゼの遺伝子を標的とするネステッドRT-PCR条件の開発 − 「CDC(Centers for Disease Control and Prevention)/IPネステッドRT-PCR」検査
ａ）ウイルスRNAの抽出
臨床サンプル：製造業者の指示に従いQIAmp viral RNA Mini kit(QIAGEN)、又は等価の技法。RNAを60μlの容量で溶出させる。
ｂ）「SNE/SAR」ネステッドRT-PCR
第１工程：「SNE」カップルドRT-PCR
Invitrogenの「SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum(登録商標)Taq」キットを使用したが、Roche Boehringerの「Titan」キットも同様な結果を伴って適切に使用可能である。
オリゴヌクレオチド：
− SNE-S1 5' GGT TGG GAT TAT CCA AAA TGT GA 5'
− SNE-AS1 5' GCA TCA TCA GAA AGA ATC ATC ATG 5'
→ 予想サイズ：440bp
１．以下のミックスを調製：
H2O 6.5μl
反応ミックス ２× 12.5μl
オリゴSNE-S1 50μM 0.2μl
オリゴSNE-AS1 50μM 0.2μl
RNAsin 40U/μl 0.12μl
RT/Platinum Taqミックス 0.5μl
２．20μlのミックスに、５μlのRNAを加え、サーモサイクラーで増幅を行う(ABI 9600条件)：
2.1 45℃ 30分間
55℃ 15分間
94℃ ２分間
2.2. 94℃ 15秒間 ]
45℃ 30秒間 ] ×５サイクル
72℃ 30秒間 ]
2.3. 94℃ 15秒間 ]
55℃ 30秒間 ] ×35サイクル
72℃ 30秒間 ＋ ２秒間/サイクル ]
2.4. 72℃ ５分間
2.5. 10℃ ∞
＋４℃で貯蔵
PromegaのRNAsin(N2511/N2515)をRNase阻害剤として使用した。
合成RNAは陽性コントロールとして働いた。コントロールとして、103、102及びa10コピーの合成RNA RSNEを各実験で増幅した。
第２工程：「SAR」ネステッドPCR
オリゴヌクレオチド:
− SAR1-S 5' CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA 3'
− SAR1-AS 5' TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG 3'
→ 予想サイズ：121bp
１．以下のミックスを調製：
H2O 35.8μl
Taq緩衝液 10× ５μl
MgCl2 25mM ４μl
ミックスdNTPs ５mM ２μl
オリゴSAR1-S 50 μM 0.5μl
オリゴSAR1-AS 50 μM 0.5μl
Taq DNA pol ５U/μl 0.25μl
Applied BiosystemsのAmpliTaq DNA Polを使用した(MgCl2を含まない10×緩衝液、ref 27216601)。
２．48μlのミックスに、第１のPCRの産物２μlを加え、増幅を行う(ABI 9600条件)：
2.1. 94℃ ２分間
2.2. 94℃ 30秒間 ]
45℃ 45秒間 ] ×５サイクル
72℃ 30秒間 ]
2.3. 94℃ 30秒間 ]
55℃ 30秒間 ] ×35サイクル
72℃ 30秒間 ＋ １秒間/サイクル ]
2.4. 72℃ ５分間
2.5. 10℃ ∞
３．３％アガロースを含有する「low-melting」ゲル(Seakem GTGタイプ)上で10μlの反応産物を分析する
ネステッド検査の感度は、通常、記載した条件下で10コピーのRNAである。
４．次いで、オリゴSAR1-S及びSAR1-ASを用いて、フラグメントをQIAquick PCR kit(QIAGEN)で精製し配列決定することができる。
３）呼吸器サンプルからのPCRによるSARS-CoV RNAの検出
ａ）第１の比較研究
National Reference Center for the Influenza Virus(Northern region)が受け取り、SARS-CoVを含有する可能性が高い一連の呼吸器サンプルについて比較研究を行った。これを行うために、「Qiamp viral RNA extraction」キット(Qiagen)を用いてサンプルからRNAを抽出し、一方でNo.2シリーズのプライマー対及びプローブを上記の条件下で用い、他方でRocheにより市販されているキット「LightCycler SARS-CoV quantification kit」(reference 03 604 438)を用いるリアルタイムRT-PCRにより分析した。結果を下記の表VIにまとめる。結果は、２つのキットについて26サンプル中18サンプルが陰性であり、26サンプル中５サンプルが陽性である一方で、１つのサンプルがRocheのキットのみで、２つが「シリーズ２」Ｎ試薬のみで陽性であることを示す。加えて、３つのサンプル(20032701、20032712、20032714)について、検出したRNAの量は、No.2シリーズの試薬(プローブ及びプライマー)で、驚く程より高い。これらの結果は、「シリーズ２」Ｎプライマー及びプローブが、生物学的サンプル中のSARS-CoVゲノムの検出について、現在入手可能なキットより高感度であることを示す。
表VI：No.2シリーズ(「シリーズ２」Ｎ)のプラーマー対及びプローブ、又はキット「Lightcycler SARS-CoV quantification kit」(Roche)を用いた、５人の患者からの一連のサンプルから抽出したRNAのリアルタイムRT-PCR分析。サンプルの型及び２回の検査の各々で測定されたウイルスゲノムのコピー数を示す。NEG：陰性RT-PCR。
Figure 0005090741
ｂ）第２の比較研究
次いで、種々のネステッドRT-PCR法及びリアルタイムRT-PCR法の性能を、ハノイ(ベトナム)のフランス病院でSARSの可能性がある症例から症状の発症後４日目〜17日目に採取した121の呼吸器サンプルについて比較した。これらサンプルのうち、14サンプルが、Bernhard Nocht Instituteにより最初に記載されたORF1b(レプリカーゼをコードする)を標的にするネステッドRT-PCR法(BNIネステッドRT-PCR)を用いる第１の検査の間に陽性であるとされた。この検査に関連する情報は、インターネット上(アドレスhttp://www15.bni-hamburg.de/ bni2/neu2/getfile.acgi?area_engl=diagnostics&pid=4112)で入手可能である。
この研究において比較した種々の検査は：
− 上記の「シリーズ２」Ｎプライマー及びプローブを用いる、本発明による定量RT-PCR法(LightCycler Nの列)、
− CDC、BNI及びInstitut Pasteurにより開発された、上記のRNAポリメラーゼ遺伝子を標的するネステッドRT-PCR検査(CDC/IPネステッドRT-PCR)、
− 「HPA Corona LC RT-PCR kit #5601-02」で参照されるARTUSキット(これはORF1b遺伝子を標的するリアルタイムRT-PCR検査である)、
− BNIネステッドRT-PCR検査(これもまた上記のRNAポリメラーゼ遺伝子を標的する)。
本発明者らは以下を観察した：
１）繰り返しの解凍の間のRNA調製物(特に最低量のRNAを含有するサンプルについて)の分解に関連する同じ技法の検査間のバラツキ、
２）BNIネステッドRT-PCRと比較したCDC/IPネステッドRT-PCRの減少した感度、及び
３）Artus LightCycler(LC)検査と比較した本発明による定量RT-PCR検査(LightCycler N)の匹敵する感度。
下記の表VIIに示すこれら結果は、本発明による定量RT-PCR検査が現在利用可能な検査に対する格別良好な付加を構成するか、又は現在利用可能な検査の代替を構成することを示す。確かに、SARS関連コロナウイルスは、急速に変化し得る新出のウイルスである。特に、SARS関連コロナウイルスのRNAポリメラーゼ遺伝子(これが現在利用可能な検査のほとんどで標的とされている)は、SARSに関連しない他のコロナウイルスのものと組換えが可能である。この遺伝子を標的とする検査の使用は、絶対的に、擬陰性が生じることを導き得る。
本発明による定量RT-PCR検査は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子を標的とするので、ARTUSキットと同じゲノム領域を標的としない。SARS関連コロナウイルスの２つの異なる遺伝子を標的とする診断検査を実施することにより、ウイルスの遺伝的進化に起因し得る擬陰性タイプの結果を避けられると期待できる。
更に、ヌクレオキャプシドタンパク質の遺伝子を標的とすることは特に有利であるようである。なぜなら、この遺伝子は、このタンパク質に関する高い構造的制約に連関する高い選択圧のために非常に安定であるからである。
表VII：ハノイ(ベトナム)のフランス病院でのSARSの可能性が高い症例(2003年の流行)の121サンプルからの遺伝子増幅による種々の分析方法の比較。
Figure 0005090741
 (１) P = 咽頭スワブ
N = 鼻スワブ
実施例９：Ｎタンパク質を指向するモノクローナル抗体の産生及び特徴付け
Balb Cマウスを精製した組換えＮタンパク質で免疫し、Kohler and Milsteinの技法に従い、脾臓細胞を適切なマウスミエローマと融合させた。
抗Ｎ抗体を分泌する19のハイブリドーマを予備選択し、それらの免疫反応性を決定した。これら抗体は確かに、種々の強度で組換えＮタンパク質を認識し(ELISAで)、ELISA及び/又はウェスタンブロッティングで天然のウイルスＮタンパク質を認識する。図18〜20は、これら19のモノクローナル抗体のうちの15についてのこれら検査の結果を示す。
高い反応性のクローン12、17、28、57、72、76、86、87、98、103、146、156、166、170、199、212、218、219及び222をサブクローニングした。認識したエピトープを決定し、他のヒトコロナウイルス及び或る種の呼吸器ウイルスに対する反応性がないことを検証するために、適切なツールを用いて特異性研究を行った。
エピトープマッピング研究(15aaの重複ペプチドを用いて、スポット膜上で実施した)及びウェスタンブロッティングで天然のＮタンパク質について実施した追加研究により、４群のモノクローナル抗体の存在が明らかになった：
１．N-ter位の主要リニアエピトープ(75〜81、配列：INTNSVP)に特異的なモノクローナル抗体。
この群の代表は抗体156である。この抗体を産生するハイブリドーマは、パスツール研究所(Paris、France)のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に、2004年12月１日、番号I-3331で寄託した。この同じエピトープはまた、この同じＮタンパク質を用いる従来の免疫によって取得したウサギ血清(抗Ｎポリクローナル)により認識される。
２．中央位に位置する主要リニアエピトープ(217位〜224位、配列：ETALALL)に特異的なモノクローナル抗体；この群の代表はモノクローナル抗体87及び166である。抗体87を産生するハイブリドーマは2004年12月１日に、番号I-3328でCNCMに寄託した。
３．Ｃ末端位に位置する主要リニアエピトープ(403位〜408位、配列：DFFRQL)に特異的なモノクローナル抗体。この群の代表は抗体28、57及び143である。抗体57を産生するハイブリドーマは2004年12月１日に、番号I-3330でCNCMに寄託した。
４．不連続構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体。この群の抗体は、Ｎタンパク質の配列にわたる(spanning)ペプチドをいずれも認識しないが、変性していない天然のタンパク質に対して強力に反応する。この最後の群の代表は抗体86である。この抗体を産生するハイブリドーマは2004年12月１日に、番号I-3329でCNCMに寄託した。
下記の表VIIIに得られたエピトープマッピング結果をまとめる：
表VIII：モノクローナル抗体のエピトープマッピング
Figure 0005090741
加えて、特に図18及び19に示したように、これら抗体は、ELISA及び/又はWBで、ヒトコロナウイルス229 EのＮタンパク質に対する反応性を示さない。
実施例10：SARS-CoVウイルスに感染した患者の血清又は生物学的流体におけるウイルスＮ抗原に特異的な高感度免疫捕捉検査の開発のためのモノクローナル抗体の組合せ
非常に特異的な性質であるので、対象者又は患者の血清におけるウイルスＮタンパク質の追加の捕捉・検出研究用に、下記に列挙した抗体を選択した。
これら抗体をマウスの腹水中で産生し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、単独で又は組み合せて、捕捉抗体として、またシグナル抗体として使用した。
選択した抗体のリスト：
− Ab 抗C-ter領域(No.28、57、143)
− Ab 抗中央領域(No.87、166)
− Ab 抗Ｎ-ter領域(No.156)
− Ab 抗不連続構造エピトープ(86)
１）試薬の調製：
ａ）免疫捕捉ELISAプレート
プレートを、0.1Ｍ炭酸塩緩衝液(pH9.6)中５μg/mlの抗体溶液で感作する。(一価又は多価の)溶液をウェル中に100μlの容量で堆積し、一晩室温にてインキュベートする。これらプレートを次いで、PBS緩衝液(10mM pH7.4、0.1％Tween 20を補充し、次いで0.3％BSA及び５％スクロースを補充したPBS溶液で飽和)で洗浄する。次いで、プレートを乾燥させた後、乾燥剤の存在下でバッグに入れる。これらは直ぐに使用できる。
ｂ）接合体
精製した抗体は、Nakaneのプロトコル(Nakaneら- 1974、J. of Histo and cytochemistry, vol.22, pp.1084-1091)に従い、３分子のペルオキシダーゼ当たり１分子のIgGの比でペルオキシダーゼにカップリングした。これら接合体を排除クロマトグラフィーにより精製し、50％グリセロールの存在下に−20℃にて濃縮して貯蔵した(１〜２mg/mlの濃度)。これらは、アッセイにおいて、１％BSAを補充したPBS緩衝液(pH7.4)中１又は２μg/mlの最終濃度で使用するために希釈される。
ｃ）他の試薬
− HIV、HBV、HCV及びTHLVウイルスの全ての血清マーカーについて陰性であるヒト血清
− 0.5％Triton X 100を補充した陰性ヒト血清のプール
− 不活化ウイルスAg：照射により不活化し、不活化を感受性細胞での培養後に確認したウイルス培養上清 − 不活化前の懸濁液の力価 約107感染粒子/ml抗原、或いは約５×109物理的ウイルス粒子/ml抗原
− 陰性ヒト血清で希釈したAgサンプル：これらサンプルは、１:100希釈、次いで５倍系列希釈により調製した。
これら非感染性サンプルは、低濃度〜非常に低い濃度のウイルス核タンパク質Ｎを含有すると考えられるヒトサンプルを模擬する。このようなサンプルは、ルーチンの作業では入手できない。
− 洗浄溶液R2、可視化用溶液TMB R8、色素原R9及び停止溶液R10は、Bio-Radにより、そのELISAキット(例えば：Platelia pylori kit、ref 72778)として市販されている一般試薬である。
２）手順
不活化ウイルスAgを過剰に負荷したヒト血清サンプルを、100μl/ウェルの量で、使用の準備が整っている感作済みプレートに直接分配し、次いで37℃にて１時間インキュベートする(Bio-Rad IPSインキュベーション)。
固相に結合しなかった材料を、３回の洗浄により除去する(希R2溶液で洗浄、自動LP 35洗浄機)。
適切な接合体(１又は２μg/mlの最終濃度に希釈)を100μl/ウェルの量で分配し、再度プレートを37℃にて１時間インキュベートする(IPSインキュベーション)。
過剰の接合体を４回の連続洗浄により除去する(希R2溶液 − LP 35洗浄機)。
プレートに付着した接合体の存在は、使用前に調製した100μlの可視化溶液(１mlのR9及び10mlのR8)を加え、室温にて30分間の遮光下でのインキュベーションの後に可視化する。
酵素反応は、最終的に、100μlのR10試薬(１Ｎ H2SO4)を全てのウェルに加えることによりブロックする。
読み取りは、適切なマイクロプレートリーダーを用いて、２つの波長(450/620nm)で行う。
結果は、仮の閾値として、少なくとも２つの陰性コントロールの平均の２倍、或いは100の陰性血清の平均に6 SD(その100の個々の測定値について算出した標準偏差)に相当する増加分を補ったものを使用して解釈することができる。
３）結果
種々の捕捉抗体とシグナル抗体との組合せを、選択した抗体の性質に基づいて検査した。その際、固相中の抗体と接合体としての抗体に同じエピトープに特異的な抗体の組合せを避けた。
最良の結果を下記に列挙する４つの組合せで得た。これら結果を下記の表IXに示す。
１．組合せF/28
固相(Ab166 ＋ 87 中央領域)：接合抗体28(C-ter)

２．組合せG/28
固相(Ab86 − 構造エピトープ)：接合抗体28(C-ter)

３．組合せH/28
固相(Ab86、166及び87 中央領域及び構造エピトープ)：接合抗体28(C-ter)

４．組合せH/28 ＋ 87
固相(Ab86、166及び87 中央領域及び構造エピトープ)：混合の接合抗体28(C-ter)及び87(中央)

５．組合せG/87
固相(Ab86 − 構造エピトープ)：接合抗体87(中央領域)
この最初の４つの組合せは、使用した他の組合せ(例えば組合せG/87のような)より大きな、等価で再現される性能レベルを示す。当然のことながら、これら組合せで、モノクローナル抗体は、同じエピトープを認識する別の抗体で置換できる。したがって、以下の変形を挙げることができる：
６．組合せF/28の変形
固相(Ab87のみ)：接合抗体57(C-ter)

７．組合せG/28の変形
固相(Ab86 − 構造エピトープ)：接合抗体57(C-ter)

８．組合せH/28の変形
固相(Ab86及び87 中央領域及び構造エピトープ)：接合抗体57(C-ter)

９．組合せH/28 ＋ 87の変形
固相(Ab86及び87 中央領域及び構造エピトープ)：混合の接合抗体57(C-ter)及び87(中央)
表IX：抗SARS-CoV核タンパク質Abの免疫反応性の検査：不活化したウイルス抗原の希釈率に従い抗体の各組合せを用いて測定した光学密度
Figure 0005090741
これら４つの実験的試行の検出限界は、陰性血清中の抗原希釈率１:62,500に相当する。迅速外挿(rapid extrapolation)により、１mlの血清当たり103感染粒子未満の検出が示唆される。
この研究から、天然型ウイルス核タンパク質の捕捉に最も適切な抗体は、中央領域及び/又は構造エピトープに特異的な抗体であることが明らかである。両抗体は、天然型抗原に対する高い親和性について選択された抗体でもある。
固相の組成物のために最良の抗体が決まると、固相に付着した抗原の検出のために優先的に選択される抗体は、C-ter領域中の優勢なエピトープに特異的な相補抗体である。当該タンパク質のN-ter領域に位置するエピトープに特異的な他の相補抗体の使用は、平均的か又は貧弱な結果を導く。
実施例11：SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)針状(Ｓ)タンパク質用の原核生物発現系
１）哺乳動物細胞でのSARS-CoV Sの発現条件の最適化
SARS-CoV針状(Ｓ)タンパク質の一過性発現の条件を、哺乳動物細胞(293T、VeroE6)中で最適化した。
このために、SARS-CoV SのcDNAを含有するDNAフラグメントを、プラスミドpSARS-S(C.N.C.M. No.I-3059)からのオリゴヌクレオチド5'-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3'及び5'-ATACTCGAGTT ATGTGTAATG TAATTTGACA CCCTTG-3'を用いるPCRにより増幅し、次いでプラスミドpTRIP-Sを取得するために、レンチウイルスベクターTRIP(Sirven、2001、Mol. Ther., 3, 438-448)を含有するプラスミドpTRIPΔU3-CMVのBamH1部位とXho1部位との間に挿入した。ＳのcDNAを含有するBamH1〜Xho1フラグメントを、次いで、プラスミドpcDNA-Sを取得するために、原核生物発現プラスミドpcDNA3.1(+)(Clontech)のBamH1とXho1との間にサブクローニングした。ＳのcDNAを含有するNhe1〜Xho1フラグメントを、次いで、プラスミドpCI-Sを取得するために、発現プラスミドpCI(Promega)の対応する部位間にサブクローニングした。ウッドチャック肝炎ウイルスのWPRE配列(「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」)及びマソン-ファイザーシミアンレトロウイルスのCTE配列(「構成性輸送エレメント」)を、プラスミドpcDNA-S-CTE、pcDNA-S-WPRE、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPRE(図21)を取得するために、２つのプラスミドpcDNA-S及びpCI-Sの各々に、Xho1部位とXba1部位との間で挿入した。プラスミドpCI-S-WPREは、2004年11月22日、番号I-3323でCNCMに寄託した。BigDye Terminator v1.1 kit(Applied Biosystems)及び自動化配列決定機ABI377を用いて全ての挿入物を配列決定した。
哺乳動物細胞におけるSARS-CoV Sの発現を導くプラスミド構築物の能力を、VeroE6細胞のトランスフェクション後に評価した(図22)。この実験では、35mmペトリ皿中の５×105の単層VeroE6細胞を、２μgのプラスミドpcDNA(コントロールとして)、pcDNA-S、pCI及びpCI-Sで、６μlのFugene6試薬を製造業者(Roche)の指示に従って用いてトランスフェクトした。37℃にて５％CO2下での48時間のインキュベーション後、細胞抽出物をLaemmliに従うローディング緩衝液中に調製し、８％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでPVDF膜(BioRad)に移した。このイムノブロット(ウェスタンブロット)の検出を、抗Ｓウサギポリクローナル血清(ウサギP11135からの免疫血清：上記実施例４を参照)及びウサギIgGを指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いて行った。結合した抗体を、ECL+キット(Amersham)を用いる発光及びオートラジオグラフィーフィルムHyperfilm MP(Amersham)により可視化した。
この実験(図22)は、プラスミドpcDNA-Sは、検出可能なレベルでのSARS-CoV Sの発現を導けない一方、プラスミドpCI-Sは検出限界(フィルムを過剰露出したときに検出され得る)に近い弱い発現を可能にすることを示す。同様な結果が、Ｓの発現を免疫蛍光により探索したときに得られた(データは示さず)。このように有効なＳの発現を検出できなかったことを、使用した検出技法に帰することはできない。なぜなら、Ｓタンパク質は、SARS-CoVに感染した細胞の抽出物又は組換えワクシニアウイルスVV-TF7.3に感染しプラスミドpcDNA-SでトランスフェクトしたVeroE6細胞の抽出物において予想サイズ(180kDa)で検出することができるからである。この後者の実験では、ウイルスVV-TF7.3はT7ファージのRNAポリメラーゼを発現し、効率的に翻訳され得る非キャップ化RNAの細胞質転写を可能にする。この実験により、上記の発現欠損は、ＳのcDNAが、本質的に、メッセンジャーRNAへの転写工程が核レベルで行われるとき効率的に発現する能力がないことに起因することが示唆される。
第２の実験では、Ｓの発現に対するCTEシグナル及びWPREシグナルの効果を、VeroE6細胞(図23A)及び293T細胞(図23B)のトランスフェクション後に、上記で記載したものと同様なプロトコルに従って評価した。Ｓの発現は、pcDNA-Sに由来するプラスミドpcDNA-S-CTE及びpcDNA-S-WPREのトランスフェクション後に検出することができない一方、WPREシグナル及びCTEシグナルの挿入は、発現プラスミドpCI-Sに関して、Ｓの発現を大いに改善する。
この結果を具体的にするため、イムノブロットを発光及びディジタル画像化デバイス(FluorS、BioRad)上への獲得により定量的に可視化する第２シリーズの実験を行った。得られた結果をQuantityOne v4.2.3ソフトウェア(BioRad)で分析することにより、WPRE配列及びCTE配列はそれぞれ、Vero E6細胞で、Ｓの発現を20〜42倍及び10〜26倍に増加させることが示される(表Ｘ)。293T細胞(表Ｘ)では、CTE配列の効果はより穏やか(４〜５倍)である一方、WPRE配列の効果は高いままである(13〜28倍)。
表Ｘ SARS-CoV Sの発現に対するCTEシグナル及びWPREシグナルの効果の定量分析：細胞抽出物を、プラスミドpCI、pCI-S、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREでのVeroE6細胞又は293T細胞のトランスフェクションの48時間後に調製し、図22の説明に記載のようにウェスタンブロッティングにより分析した。ウェスタンブロットは、発光(ECL+、Amersham)及びディジタル画像化デバイス(FluorS、BioRad)上への獲得により可視化する。発現レベルは、１の値がプラスミドpCI-Sのトランスフェクション後に測定したレベルを表す任意のスケールに従って示す。
２つの独立した実験を２つの細胞型の各々について行った。VeroE6細胞についての実験１では、トランスフェクションを２連で行った。結果を、測定した発現レベルの平均値及び標準偏差値の形で示す。
Figure 0005090741
まとめると、これら結果はすべて、哺乳動物細胞において、RNAポリメラーゼIIプロモーター配列の制御下でのSARS-CoV SのcDNAの発現は、効率的であるために、スプライスシグナルの発現並びに配列WPRE及びCTEのいずれかの発現を必要とすることを示す。
２）SARS-CoV Sの発現を可能にする安定株の作製
プラスミドpTRIP-Sを取得するために、SARS-CoV Ｓタンパク質のcDNAを、BamH1-Xho1フラグメントの形態で、中央DNAフラップを有する欠損レンチウイルスベクターTRIPを含有するプラスミドpTRIPΔU3-CMV中にクローニングした(Sirvenら、2001, Mol. Ther., 3: 438-448)(図24)。293T細胞における、このプラスミド、キャプシド形成プラスミド(p8.2)及びVSVエンベロープ糖タンパク質Ｇ(pHCMV-G)発現用プラスミドのZennouら(2000, Cell, 101: 173-185)に従う一過性の同時トランスフェクションにより、ベクターTRIP-Sを含有しエンベロープタンパク質Ｇで偽型化したレトロウイルス偽粒子の製造を可能にした。これら偽型化TRIP-Sベクターを使用して、293T細胞及びFRhK-4細胞に形質導入した：Ｓタンパク質の発現は、形質導入した細胞で、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光により検出することができなかった(データは示さず)。
CMVウイルス即時/初期プロモーターと、スプライスシグナルと、ＳのcDNAと、上記の転写後シグナルWPRE又はCTEのいずれかとからなる最適発現カセットを、次いで、中央DNAフラップTRIPΔU3-EF1α(Sirvenら、2001, Mol. Ther., 3: 438-448)を有する欠損レンチウイルス発現ベクターのEF1α-EGFPカセットと置換した(図25)。これら置換を、それぞれプラスミドpCT-S-CTE又はpCI-S-WPREから切り出したＳ発現カセット(BglII-Apa1又はBglII-Sal1)の一連の連続サブクローニングにより行い、次いでプラスミドpTRIP-SD/SA-S-CTE及びpTRIP-SD/SA-S-WPRE(2004年12月１日に、それぞれ番号I-3336及びI-3334でCNCMに寄託)を取得するために、プラスミドTRIPΔU3-EF1αのそれぞれMlu1部位とKpn1部位との間又はMlu1部位とXho1部位との間に挿入した。偽型化ベクターは、Zennouら(2000, Cell, 101: 173-185)に従って作製し、１サイクル当たり25ng(TRIP-SD/SA-S-CTE)又は22ng(TRIP-SD/SA-S-WPRE)のp24に対応する量のベクターでの一連の５連続形質導入サイクルにより、293T細胞(10,000細胞)及びFRhK-4細胞(15,000細胞)に形質導入するために使用した。
形質導入した細胞を、限界希釈によりクローニングし、一連のクローンをSARS-CoV Sの発現について、免疫蛍光により定性分析し(データは示さず)、次いで抗Ｓウサギポリクローナル血清を用いるウェスタンブロッティングにより定量分析した(図25)。図25に示す結果により、TRIP-SD/SA-S-CTEで形質導入したFrhK4-s-CTE細胞クローン２及び15並びにTRIP-SD/SA-S-WPREで形質導入したFRhK4-S-WPRE細胞のクローン４、９及び12は、SARS-CoVへの感染の間に観察されるレベルと比較して、それぞれ低レベル又は中程度レベルでSARS-CoV Sの発現を可能にすることが示される。
まとめると、ベクターTRIP-SD/SA-S-CTE及びTRIP-SD/SA-S-WPREは、SARS-CoV Sを発現するFRhK-4細胞、同様に293T細胞の安定なクローンの作製を可能にする一方、「親」ベクターTRIP-Sを用いて行ったアッセイは成功しないままであった。このことは、Ｓタンパク質を発現する安定な細胞クローンの作製に、スプライスシグナル並びに配列CTE及びWPRのいずれかが必要であることを証明する。
加えて、ベクターTRIPのこれら改変(スプライスシグナル並びにCTE及びWPREのような転写後シグナルの挿入)は、Ｓの発現より他のcDNAの発現を改善するに有利であることを証明し得る。
３）可溶形態のSARS-CoV Sの発現を可能にする安定株の作製。この組換え抗原の精製。
可溶形態のＳタンパク質(Ssol)をコードするcDNAを、このタンパク質のエクトドメイン(アミノ酸１〜1193)をコードする配列とタグ(FLAG:DYKDDDDK)の配列とをSGジペプチドをコードするBspE1リンカーを介して融合することにより取得した。実際には、プラスミドpcDNA-Ssolを取得するために、SARS-CoV SのエクトドメインをコードするDNAフラグメントを、プラスミドpcDNA-Sからのオリゴヌクレオチド5'-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3'及び5'-ACCTCCGGAT TTAATATATT GCTCATATTT TCCCAA-3'を用いるPCRにより増幅し、次いでそのBamH1部位とXho1部位との間にタグ配列FLAGを含有する改変した原核生物発現プラスミドpcDNA3.1(+)(Clontech)の独特なBamH1部位とBspE1部位との間に挿入した：
Figure 0005090741
ＳのcDNAを含有するNhe1-Xho1フラグメント及びBamH1-Xho1フラグメントを、次いでプラスミドpcDNA-Ssolから切り出し、プラスミドpTRIP-SD/SA-Ssol-CTE及びpTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE(2004年12月１日に、それぞれ番号I-3337及びI-3335でCNCMに寄託)を取得するために、それぞれプラスミドpTRIP-SD/SA-S-CTE及びプラスミドpTRIP-SD-SA-S-WPREの対応する部位間にサブクローニングした。
偽型化ベクターを、Zennouら(2000, Cell, 101:173-185)に従って作製し、１サイクル当たり24ng(TRIP-SD/SA-Ssol-CTE)又は40ng(TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE)のp24に対応する量のベクターでの一連の５連続形質導入サイクル(15000細胞)に従ってFRhK-4細胞(15,000細胞)に形質導入するために使用した。形質導入した細胞を限界希釈によりクローニングし、TRIP-SD/SA-Ssol-CTEで形質導入した一連の16クローン及びTRIP-SD/SA-Ssol-WPREで形質導入した一連の15クローンを、Ssolポリペプチドの発現について、抗FLAGモノクローナル抗体で可視化したウェスタンブロッティング(図26、データは示さず)及びこの目的のために開発したSsolポリペプチドに特異的な捕捉ELISAにより分析した(表XI、データは示さず)。最良の分泌性クローンを選択するプロセスの部分を図26に示す。捕捉ELISAは、精製し不活化したSARS-CoVで免疫したウサギのポリクローナル抗体をコートした固相を使用することに基づく。これら固相は、細胞上清中に分泌されたSsolポリペプチドの捕捉を可能にする。次いで、その存在を、抗FLAGモノクローナル抗体(M2、SIGMA)、抗マウスIgG(H+L)ビオチン化ウサギポリクローナル抗体(Jackson)及びストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ接合体(Amersham)の付着、次いで色素原及び基質(TMB + H2O2、KPL)の添加を逐次含む一連の工程で可視化する。
表XI：レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE及びTRIP-SD/SA-Ssol-CTEを形質導入した細胞株によるSsolポリペプチドの発現の分析。Ssolポリペプチドの分泌を、レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE及びTRIP-SD/SA-Ssol-CTEでのFRhK-4細胞の形質導入後に単離した一連の細胞クローンの上清中で評価した。１/50希釈した上清をSARS-CoV Sに特異的な捕捉ELISA検査により分析した。
Figure 0005090741
培養上清中に最高量のSsolポリペプチドを分泌する細胞株はFRhK4-Ssol-CTE3株である。これを、上記のものと同様な条件下で、第２シリーズの５サイクルのベクターTRIP-SD/SA-Ssol-CTEでの形質導入に付し、次いでクローニングした。最高量のSsolを分泌するサブクローンをウェスタンブロットと捕捉ELISA分析との組合せにより選択した：これはサブクローンFRhK4-Ssol-30(2004年11月22日に、I-3325の名称でCNCMに寄託)である。
FRhK4-Ssol-30株は、組換えSsolポリペプチドの定量的な産生及び精製を可能にする。増殖、産生及び精製の実験条件が最適化された典型的な実験では、FRhK4-Ssol-30株の細胞を標準的な培養培地(4.5g/lのグルコースを含有し、５％FCS、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンが補充されたピルビン酸塩フリーDMEM)に、サブコンフルエントの単層(20mlの培地中で各100cm2当たり１百万細胞)の形態で接種する。コンフルエントになったとき、FCSの量が0.5％に減じられ、培地の量が各100cm2当たり16mlに減じられている標準培地を分泌培地と交換する。培養上清を、35℃にて５％CO2下での４〜５日のインキュベーション後に取り出す。組換えポリペプチドSsolを、上清から、0.1μmポリエーテルスルホン(PES)膜上での濾過工程、50kDカットオフを有するPES膜上での限外濾過による濃縮工程、TBS(50mM tris、pH7.4、150mM NaCl)中100μg/mlのFLAGペプチド(DYKDDDDK)の溶液で抽出する抗FLAGマトリクス上でのアフィニティークロマトグラフィー工程、次いでsephadex G-75ビーズ(Pharmacia)上でのTBS中のゲル濾過クロマトグラフィー工程の一連の工程により精製した。精製した組換えSsolポリペプチドの濃度をmicro-BCA検査(Pierce)により決定し、次いでその生化学的特性を分析した。
硝酸銀で染色した８％SDSアクリルアミドゲルによる分析は、優勢なポリペプチドの分子量が約180kDであり、その純度が98％と評価され得ることを証明する(図27A)。２つの主要なピークがSELDI-TOF質量分析(Cyphergen)により検出される：これらは、優勢なポリペプチドの単一荷電形態及び二重荷電形態に対応し、その分子量は182.6±3.7kDと決定される(図27B及びC)。Prosorb膜上に移し0.1％TFA中で濯いだ後、SsolポリペプチドのＮ末端部を、液相中で、Edman分解により５残基について配列決定し(ABI494、Applied Biosystems)、SDLDRと決定した(図27D)。このことは、ソフトウェアsignalP v2.0(Nielsenら、1997, Protein Engineering, 10:1-6)を用いて実施した分析によればaa１〜13(MFIFLLFLTLTSG)から構成される、SARS-CoV Ｓタンパク質のＮ末端部に位置するシグナルペプチドが、成熟Ssolポリペプチドから切断されることを証明する。したがって、組換えSsolポリペプチドは、FLAGタグ(下線を付した)の配列を含有する配列SGDYKDDDDKとＣ末端で融合したSARS-CoV Ｓタンパク質のアミノ酸14〜1193からなる。裸のSsolポリペプチドの理論上のモル質量(132.0kD)と成熟ポリペプチドの現実のモル質量(182.6kD)との間の差は、Ssolポリペプチドがグリコシル化されていることを示唆する。
精製したSsolポリペプチドの調製物(タンパク質濃度をmicro-BCA検査により決定した)により、上記の捕捉ELISA検査を用いて、培養上清中に存在するSsolの濃度を測定するため、及び分泌性株の特徴を検討するための較正シリーズを調製することが可能になる。この検査によれば、４〜５日のコンフルエンスでの培養後に、FRhK4-Ssol-CT3株は４〜６μg/mlのポリペプチドSsolを分泌する一方で、FRhK4-Ssol-30株は９〜13μg/mlのSsolを分泌する。加えて、上記の精製スキームにより、１リットルの培養上清当たり１〜２mgのSsolポリペプチドをルーチンで精製することが可能になる。
実施例12：SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)針状(Ｓ)タンパク質を含む遺伝子免疫
スプライスシグナルの効果並びに転写後シグナルWPRE及びCTEの効果をBALB/cマウスの遺伝子免疫後に分析した(図28)。
このため、BALB/cマウスを、pcDNA-S及びpCI-Sの50μgのプラスミドDNAの生理食塩水溶液、コントロールとして、pcDNA-N(SARS-CoV Nの発現を導く)又はpCI-HA(インフルエンザウイルスA/PR/8/34のHAの発現を導く)の50μgのプラスミドDNAの生理食塩水溶液を前脛骨筋中に４週間の間隔で注射することにより免疫し、免疫血清を２回目の注射の３週間後に収集した。SARS-CoV Sを指向する抗体の存在を、抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を使用し、コントロールとして非感染VeroE6細胞の溶解物を使用する間接ELISAにより評価した。抗SARS-CoV抗体力価(TI)を、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgGポリクローナル抗体(NA931V、Amersham)及びH2O2を補充したTMB(KPL)での可視化後に、0.5の比OD(感染細胞の溶解物で測定したODと非感染細胞の溶解物で測定したODとの差)を生じる希釈率の逆数として算出する(図28A)。
これら条件下、発現プラスミドpcDNA-Sのみが、６匹のマウス中３匹においてSARS-CoV Sを指向する低い抗体力価(LOG10(TI)= 1.9±0.6)の誘導を可能にする一方、プラスミドpcDNA-Nは、全ての動物において高い力価(LOG10(TI)= 3.9±0.3)での抗Ｎ抗体の誘導を可能にし、コントロールプラスミド(pCI、pCI-HA)は、検出可能な抗体を生じない(LOG10(TI)＜1.7)。スプライスシグナルを備えたプラスミドpCI-Sは、高い力価(LOG10(TI)= 3.7±0.2)での抗体の誘導を可能にし、この力価は、プラスミドpcDNA-Sの注射後に観察される力価の約60倍である(p＜10-5)。
免疫原として使用したプラスミドDNAの量(２μg、10μg及び50μg)の関数としてBALB/cマウスで誘導された抗Ｓ抗体力価の用量-応答研究を行うことにより、転写後シグナルの効率を研究した。この研究(図28B)は、転写後シグナルWPREが、少ない用量のDNAを使用する場合に遺伝子免疫の効率を大いに向上させる(用量２μgのDNAについてp＜10-5、用量10μgについてp＜10-2)一方、CTEシグナルの効果はほんの僅かのままである(用量２μgのDNAについてp=0.34)ことを証明する。
最後に、遺伝子免疫後のマウスで誘導された抗体は、インビトロで、ELISAにより測定される力価と一致する力価で、SARS-CoVの感染性を中和する(図29A及び29B)。
まとめると、スプライスシグナルの使用及びウッドチャック肝炎ウイルスの転写後シグナルWPREの使用は、SARS-CoV SのcDNAの発現を導くプラスミドDNAを用いての遺伝子免疫後に、SARS-CoVを指向する中和化抗体の誘導をかなり改善する。
実施例13：Ｓタンパク質の診断適用
SARSに罹患している患者からの血清に関して組換えSsolポリペプチドのELISA反応性を分析した。
SARS-CoVに感染したVeroE6細胞についての免疫蛍光検査及び/又は抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を用いる間接ELISA検査によりSARS-CoVの天然型抗原に対する特異的反応性の分析の結果(陽性又は陰性)に基づいて、SARSの可能性が高い症例からの検査血清を選択した。これら患者の血清は、National Reference Center for Influenza Virusesの通し番号並びに患者のイニシャル及び症状の発症からの経過日数により特定した。３、８及び12日目の呼吸器サンプルについて実施したRT-PCRによりSARS-CoV感染を確証できなかった患者VTTの血清032552を除き、可能性が高い症例の全ての血清(表XIIを参照)がSARS-CoVの天然型抗原を認識する。コントロール血清のパネルをコントロールとして使用した(TV血清)：これらは、2003年に発生したSARS流行の前にフランスで収集した血清である。
Figure 0005090741
組換えSsolポリペプチドで感作した固相を、ELISAプレートのウェルでPBS中２μg/mlの精製したSsolポリペプチドの溶液の吸着により調製し、次いでプレートを４℃にて一晩インキュベートし、PBS-Tween緩衝液(PBS、0.1％Tween 20)で洗浄する。ELISAプレートをPBS-10％スキムミルク(重量/容量)の溶液で飽和させ、PBS-Tween中で洗浄した後、検査すべき血清(100μl)をPBS-スキムミルク-Tween緩衝液(PBS、３％スキムミルク、0.1％Tween)中で１/400希釈し、次いで感作したELISAプレートのウェルに加える。プレートを37℃にて１時間インキュベートする。PBS-Tween緩衝液での３回の洗浄後、PBS-スキムミルク-Tween緩衝液中で１/4000希釈したペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG接合体(ref.NA933V、Amersham)を加え、次いでプレートを37℃にて１時間インキュベートする。PBS-Tween緩衝液での６回の洗浄後、色素原(TMB)及び基質(H2O2)を加え、プレートを遮光して10分間インキュベートする。１Ｎ H3PO4溶液を添加して反応を停止し、次いで吸光度を、620nmを参照にして、450nmで測定する。
ELISA検査(図30)は、組換えSsolポリペプチドが、感染の中期又は後期(症状の発症の10日以上後)に収集したSARSに罹患している患者の血清抗体によって特異的に認識される一方で、感染の初期(症状の発症の３〜８日後)に収集した２人の患者(JLB及びJCM)の血清抗体にも、SARSに罹患していない患者のコントロール血清にも有意には認識されないことを証明する。患者JLB及びJCMの血清抗体は、前者については症状発症後３〜27日目の間、後者については症状発症後８〜29日目の間のセロコンバージョンを証明する。このことは、Ssolポリペプチドに対するこれら血清の反応性の特異性を確証する。
結論として、これら結果は、組換えSsolポリペプチドが、SARS-CoVの感染の血清学的診断用のELISA検査の開発に抗原として使用できることを証明する。
実施例14：組換え可溶性Ｓタンパク質のワクチン適用
組換えSsolポリペプチドの免疫原性をマウスにおいて研究した。
このため、１群の６匹のマウスを、３週間の間隔で、PBSに希釈した１mgの水酸化アルミニウム(Alu-gel-S、Serva)をアジュバントとして10μgの組換えSsolポリペプチドで免疫した。３回の連続免疫を実施し、免疫血清を免疫(IS1、IS2、IS3)の各々の３週間後に収集した。コントロールとして、１群のマウス(mock群)に、同じプロトコルに従って水酸化アルミニウムのみを与えた。
免疫血清を、プールごとに、２群の各々について、SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を抗原として、非感染VeroE6細胞の溶解物をコントロールとして使用する間接ELISAにより分析した。抗SARS-CoV抗体力価は、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA931V、Amersham)及びH2O2を補充したTMB(KPL)での可視化後に、0.5の比ODを生じる希釈率の逆数として算出する。この分析(図31)は、Ssolポリペプチドでの免疫が、マウスで、１回目の免疫から、感染VeroE6細胞の溶解物中に存在する天然型形態のSARS-CoV針状タンパク質を指向する抗体を誘導することを示す。２回、それから３回の免疫後、抗Ｓ抗体力価は非常に高くなる。
免疫血清を、２群の各々について、SARS-CoVの感染性を血清中和化する能力についてプールごとに分析した。FRhK-4細胞についての４点の血清中和化(100 TCID50のSARS-CoV)を、１/20から検査した２倍希釈物のそれぞれに関して作製した。血清中和化力価は、Reed and Munschの方法に従って、４ウェル中２ウェルの感染性を中和する希釈率の逆数として算出する。この分析は、Ssolポリペプチドによりマウスで誘導された抗体が中和化抗体であることを示す：２回、それから３回の免疫後に観察された力価は非常に高い(それぞれ2560及び5120より大きい、表XIII)。
表XIII：組換えSsolポリペプチドでの免疫後のSARS-CoVを指向する抗体の誘導。免疫血清を、２つの群の各々について、FRhK-4細胞に対する100 TCID50のSARS-CoVの感染性を血清中和化する能力についてプールごとに分析した。１/20から検査した２倍希釈物の各々について４点を作成する。血清中和化力価は、Reed and Munschの方法に従って、４ウェル中２ウェルの感染性を中和する希釈率の逆数として算出する。
Figure 0005090741
Ssolポリペプチドで免疫したマウスで観察される中和化力価は、マウスでYangら(2004, Nature, 428:561-564)により観察された力価及びハムスターでBuchholz(2004, PNAS 101:9804-9809)により観察された力価(これら力価はそれぞれ、マウス及びハムスターをSARS-CoVの感染から保護する)より遥かに大きいレベルに達する。したがって、Ssolポリペプチドでの免疫後にマウスで誘導される中和化抗体は、おそらく、これら動物をSARS-CoVの感染から保護する。
実施例15：哺乳動物細胞におけるSARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)針状(Ｓ)タンパク質の発現のための最適化合成遺伝子
１）合成遺伝子の設計
SARS-CoV針状タンパク質をコードする合成遺伝子を、哺乳動物細胞、特にヒト起源の細胞における高レベル発現を可能にするように、単離株031589の遺伝子(プラスミドpSARS-S、C.N.C.M. No.I-3059)から設計した。
このために：
− 単離株031589の野生型遺伝子のコドンの使用を、ヒトにおいて観察される偏りに近くなるように、そして対応するmRNAの翻訳の効率が向上するように改変した
− この遺伝子の全体GC含量を、対応するmRNAの半減期を延長するように増加させた
− この遺伝子の効率的な発現に干渉し得る随意の潜在モチーフ(optionally cryptic motif)を欠失させた(スプライスドナー及びアクセプター部位、ポリアデニル化シグナル、GCが非常にリッチな(＞80％)又は非常に低い(＜30％)配列、反復配列、RNA二次構造の形成に関与する配列、TATAボックス)
− 第２の停止コドンを付加して、翻訳の効率的な終結を可能にした。
加えて、CpGモチーフを、DNAワクチンとしての免疫原性を増加させるように、この遺伝子中に導入した。合成遺伝子の操作を容易にするため、２つのBamH1及びXho1制限部位をＳタンパク質のオープンリーディングフレームのいずれの側にも配置し、合成遺伝子中でBamH1、Xho1、Nhe1、Kpn1、BspE1及びSal1の制限部位を避けた。
設計した合成遺伝子(遺伝子040530)の配列を配列番号140に示す。
合成遺伝子040530と、C.N.C.M.に番号I-3059で寄託したSARS-CoVの単離株031589の野生型遺伝子の配列(配列番号４、プラスミドpSRAS-S)とのアラインメントを図32に示す。
２）プラスミド構築物
合成遺伝子(配列番号140)を合成オリゴヌクレオチドから組み立て、プラスミド040530pUC-Kanaを取得するために、プラスミドpUC-KanaのKpn1部位とSac1部位との間にクローニングした。プラスミド040530pUC-Kanaの挿入物のヌクレオチド配列を自動化配列決定(Applied)により確認した。
合成遺伝子040530を含有するKpn1-Xho1フラグメントを、プラスミド040530pUC-Kanaから切り出し、プラスミドpCI-SSYNTH(2004年12月１日に、番号I-3333でCNCMに寄託)を取得するために、発現プラスミドpCI(Promega)のNhe1部位とXho1部位との間にサブクローニングした。
次いで、Ｓタンパク質のエクトドメイン(アミノ酸１〜1193)をコードする合成配列を、タグ(FLAG：DYKDDDDK)の配列と、ジペプチドSGをコードするリンカーBspE1を介して融合することにより、可溶形態のＳタンパク質をコードする合成遺伝子を取得した。実際には、SARS-CoV SのエクトドメインをコードするDNAフラグメントを、プラスミド040530pUC-Kanaからのオリゴヌクレオチド5'-ACTAGCTAGC GGATCCACCATGTTCATCTT CCTG-3'及び5'-AGTATCCGGAC TTG ATGTACT GCTCGTACTTGC-3'を用いるPCRにより増幅し、Nhe1及びBspE1で消化し、次いでプラスミドpCI-Ssolの独特なNhe1部位とBspE1部位との間に挿入して、プラスミドpCI-SCUBE(2004年12月１日に、番号I-3332でCNCMに寄託)を得た。プラスミドpCI-Ssol、pCI-Ssol-CTE及びpCI-Ssol-WPRE(2004年11月22日に、番号I-3324でCNCMに寄託)は、プラスミドpcDNA-Ssol(DI 2004-106のテクニカルノートを参照)から切り出したKpn1-Xho1フラグメントを、プラスミドpCI、pCI-S-CTE及びpCI-S-WPREのそれぞれのNhe1部位とXho1部位との間にサブクローニングすることにより予め得ていた。
プラスミドpCI-Scube及びpCI-Ssolは同じ組換えSsolポリペプチドをコードする。
３）結果
Ｓタンパク質をコードする合成遺伝子が哺乳動物細胞におけるSARS-CoV Sの発現を効率的に導く能力を、霊長類細胞(VeroE6)及びヒト細胞(293T)の一過性トランスフェクション後に、野生型遺伝子の能力と比較した。
図33及び表XIVに示した実験において、35mmペトリ皿中の５×105の単層VeroE6細胞又は７×105の単層293T細胞を、２μgのプラスミドpCI(コントロールとして)、pCI-S、pCI-S-CTE、pCI-S-WPRE及びpCI-S-Ssynthで、６μlのFugene6試薬を製造業者(Roche)の指示に従って用いてトランスフェクトした。37℃にて５％CO2下での48時間のインキュベーション後、細胞抽出物をLaemmliに従うローディング緩衝液中に調製し、８％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでPVDF膜(BioRad)に移した。このイムノブロット(ウェスタンブロット)の検出を、抗Ｓウサギポリクローナル血清(ウサギP11135の免疫血清：上記実施例４を参照)及びウサギIgGを指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いて行った。イムノブロットを、ECL+キット(Amersham)を用いる発光及びディジタル画像化デバイス(FluorS、BioRad)上への獲得により定量的に可視化した。
得られた結果をソフトウェアQuantityOne v4.2.3(BioRad)で分析することにより、この実験において、プラスミドpCI-SynthがVeroE6細胞及び293T細胞で高いレベルでのＳタンパク質の一過性発現を可能にする一方、プラスミドpCI-Sは、検出されるべき十分なレベルでの発現を誘導することができないことが示される。観察された発現レベルは、プラスミドpCI-S-WPREで観察された発現レベルの２倍のオーダー程度高い。
表XIV：SARS-CoV Sの発現のための合成遺伝子の使用。プラスミドpCI、pCI-S、pCI-S-CTE、pCI-S-WPRE及びpCI-S-SsynthでのVeroE6細胞又は293T細胞のトランスフェクションの48時間後に調製した細胞抽出物を、８％SDSアクリルアミドゲル上で分離し、抗Ｓウサギポリクローナル血清及びペルオキシダーゼにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。ウェスタンブロットは、発光(ECL+、Amersham)及びディジタル画像化デバイス(FluorS、BioRad)上への獲得により可視化する。Ｓタンパク質の発現レベルを、画像上(図33を参照)で同定される２つの優勢なバンドを定量することにより測定し、値１がプラスミドpCI-S-WPREのトランスフェクション後に測定したレベルを表す任意のスケールに従って示した。
Figure 0005090741
第２の例では、合成遺伝子Scubeが哺乳動物細胞によるSsolポリペプチドの合成及び分泌を効率的に導く能力を、ハムスター細胞(BHK-21)及びヒト細胞(293T)の一過性トランスフェクション後に、野生型遺伝子の能力と比較した。
表XVに示した実験において、35mmペトリ皿中の６×105の単層BHK-21細胞及び７×105の単層293T細胞を、２μgのプラスミドpCI(コントロールとして)、pCI-Ssol、pCI-Ssol-CTE、pCI-Ssol-WPRE及びpCI-Scubeで、６μlのFugene6試薬を製造業者(Roche)の指示に従って用いてトランスフェクトした。37℃にて５％CO2下での48時間のインキュベーション後、細胞上清を収集し、Ssolポリペプチドに特異的な捕捉ELISA検査によりSsolポリペプチドの分泌について定量的に分析した。
結果の分析は、この実験において、プラスミドpCI-Scubeが、プラスミドpCI-Ssolより８倍(BHK-21細胞)〜20倍(293T細胞)高いレベルでSsolポリペプチドの発現を可能にすることを示す。観察された発現レベルは、プラスミドpCI-Ssol-WPREで観察された発現レベルの２倍(293T細胞)〜５倍(BHK-21細胞)のオーダー程度高い。
表XV：Ssolポリペプチドの発現のための合成遺伝子の使用。上清を、プラスミドpCI、pCI-Ssol、pCI-Ssol-CTE、pCI-Ssol-WPRE及びpCI-ScubeでのBHK細胞又は293T細胞のトランスフェクションの48時間後に採集し、Ssolポリペプチドに特異的なELISA検査によりSsolポリペプチドの分泌について定量的に分析した。トランスフェクションは２連で行った。結果は、上清中で測定したSsolポリペプチドの濃度(ng/ml)の平均及び標準偏差の形で示す。
Figure 0005090741
まとめると、これら結果は、哺乳動物細胞における、RNAポリメラーゼIIプロモーター配列の制御下でのSARS-CoV Sをコードする合成遺伝子040530の発現が、031589単離株の野生型遺伝子の発現よりずっと効率的であることを示す。この発現は、ウッドチャック肝炎ウイルスのWPRE配列の存在下で、野生型遺伝子により導かれる発現よりずっと効率的である。
４）適用
SARS-CoV Sをコードする合成遺伝子040530又はポリペプチドSsolをコードするそのScube変種の使用は、高レベルでのＳの発現が必要である多くの適用において野生型遺伝子を有利に置換することができる。より詳細には、以下のために：
− pCI-Ssynth型のプラスミド(pCI-Ssynth-CTE型又はpCI-Ssynth-WPRE型のプラスミドでさえ)での遺伝子免疫の効率を改善するため
− それぞれSsynth遺伝子又はScube遺伝子を有する組換えレンチウイルスベクターを用いて、より高量のＳタンパク質又はSsolポリペプチドを発現する新規細胞株を樹立するため
− Ｓタンパク質の発現又はSsolポリペプチドの発現を可能にする組換えレンチウイルスベクターの免疫原性を改善するため
− Ｓタンパク質の発現又はSsolポリペプチドの発現を可能にする、組換えワクシニアウイルス又は組換え麻疹ウイルスのような生ベクターの免疫原性を改善する(下記実施例16及び17を参照)のため。
実施例16：組換えワクシニアウイルスを用いるSARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)針状(Ｓ)タンパク質の発現
ワクチン適用
可溶形態の針状(Ｓ)タンパク質の製造及びSARSについての血清学的検査の設計への適用
１）導入
この実施例の目的は、種々のSARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)抗原を発現する組換えワクシニアウイルス(VV)がSARSに対する新規ワクチン候補及び哺乳動物細胞で組換え抗原を産生する手段を構成する能力を評価することである。
このために、本発明者らは、遺伝子免疫後に、動物で、SARS-CoVの感染性を中和する抗体を誘導することができるSARS-CoV針状(Ｓ)タンパク質及びこのタンパク質の可溶性で分泌される形態であるSsolポリペプチド(これは、C-ter端部で、SGジペプチドをコードするBspE1リンカーを介してタグFLAG(DYKDDDDK)と融合したＳのエクトドメイン(aa１〜1193)から構成される)に着目した。このSsolポリペプチドは、Ｓタンパク質の抗原性と同様の抗原性を示し、アジュバントとして水酸化アルミニウムと組み合せた精製したタンパク質の形態でのマウスへの注射後に、SARS-CoVに対する高い中和化抗体力価の誘導を可能にする。
種々の形態のＳ遺伝子を、7.5K遺伝子のプロモーターの制御下に配置し、次いでインビボでの二重相同組換えにより、コペンハーゲン系統のワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ(TK)遺伝子座中に導入した。組換えワクシニアウイルスの免疫原性を改善するために、7.5Kプロモーターに代えて合成後期プロモーターを選択し、ウイルスサイクルの後期の間のＳ及びSsolの産生を増加させた。
組換えワクシニアウイルスを単離し、SARS-CoV S抗原を発現する能力を確認した後、マウスでSARSに対する免疫応答を誘導する能力を検査した。感染細胞の上清からSsol抗原を精製した後、SARSの血清診断についてのELISA検査を設計し、SARSの可能性が高い症例からの血清を用いてその効率を検査した。
２）組換えウイルスの構築
7.5Kプロモーターの制御下でのSARS-CoVの031589単離株のＳ糖タンパク質の発現及びこのタンパク質の可溶性で分泌される形態であるSsolポリペプチドの発現を導く組換えワクシニアウイルスを取得した。Ｓの発現レベル及びSsolの発現レベルを増大させるために、ＳのcDNA及びSsolのcDNAが後期合成プロモーターの制御下に配置された組換えウイルスもまた取得した。
プラスミドpTG186polyは、組換えワクシニアウイルスの構築のためのトランスファープラスミドである(Kieny、1986, Biotechnology, 4:790-795)。そうなので、これは、7.5K遺伝子のプロモーターに続いて異種遺伝子の挿入を可能にする多クローニング部位が挿入されているVVチミジンキナーゼ遺伝子を含有する(図34A)。7.5K遺伝子のプロモーターは、事実、縦一列の２つのプロモーター配列を含有する。これらは、それぞれワクシニアウイルス複製サイクルの初期(PE)及び後期(PL)の間に活性である。BamH1-Xho1フラグメントをそれぞれプラスミドpTRIP-S及びpcDNA-Ssolから切り出し、プラスミドpTG-S及びpTG-Ssolを取得するために、プラスミドpTG186polyのBamH1部位とSma1部位との間に挿入した(図34A)。プラスミドpTG-S及びpTG-Ssolは、2004年12月２日に、それぞれ番号I-3338及びI-3339でCNCMに寄託した。
7.5Kプロモーターを含有するNde1-Pst1フラグメントを、合成後期プロモーター480を含有するDNAフラグメントで置換することにより、プラスミドpTG186poly、pTG-S及びpTG-Ssolから、それぞれプラスミドpTN480、pTN-S及びpTN-Ssolを取得した。合成後期プロモーター480を含有するDNAフラグメントは、オリゴヌクレオチド5'- TATGAGCTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGGC ATATAAATAG ACTCGGCGCG CCATCTGCA-3'と5'- GATGGCGCGCCGAGTCTATT TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TCA-3'とのハイブリダイゼーションにより得た(図34B)。BigDye Terminator v1.1 kit(Applied Biosystems)及び自動化配列決定機ABI377を用いて挿入物を配列決定した。pTNシリーズのトランスファープラスミド中にクローニングした後期合成プロモーター480の配列を図34Cに示す。プラスミドpTN-S及びpTN-Ssolは、2004年12月２日に、番号I-3340及びI-3341でCNCMに寄託した。
組換えワクシニアウイルスは、Kienyら(1984, Nature, 312:163-166)により記載された手順に従って、シリーズpTG及びpTNのトランスファープラスミドのTKカセットとワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統のTK遺伝子との間のインビボでの二重相同組換えにより取得した。簡潔には、CV-1細胞を、DOTAP(Roche)を用いて、コペンハーゲン系統のワクシニアウイルスのゲノムDNAと上記pTG及びpTNシリーズのトランスファープラスミドの各々とでトランスフェクトし、次いで33℃にて24時間ヘルパーワクシニアウイルスVV-ts7に重複感染させる。ヘルパーウイルスは、40℃にて２日間のインキュベーションにより対抗選択し、次いで組換えウイルス(TK表現型)を、BuDr(25μg/ml)の存在下に143Btk-細胞について寒天培地下で２つのクローニングサイクルにより選択する。６つのウイルスVV-TG、VV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN、VV-TN-S、及びVV-TN-Ssolを、それぞれトランスファープラスミドpTG186poly、pTG-S、pTG-Ssol、pTN480、pTN-S、pTN-Ssolを用いて取得した。ウイルスVV-TG及びVV-TNは異種遺伝子を発現しない。これらを、本実験においてTKコントロールとして使用した。組換えウイルスの調製物を単層のCV-1細胞又はBHK-21細胞について実施し、プラーク形成単位(p.f.u)での力価を、Earl and Moss(1998, Current Protocols in Molecular Biology, 16.16.1- 16.16.13)に従って、CV-1細胞について決定した。
３）組換えウイルスの特徴付け
Ｓタンパク質及びSsolポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現をウェスタンブロッティングにより評価した。
単層のCV-1細胞を、種々の組換えワクシニアウイルスVV-TG、VV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN、VV-TN-S及びVV-TN-Ssolに多重度２で感染させた。37℃にて５％CO2下での18時間のインキュベーション後、細胞抽出物をLaemmliに従うローディング緩衝液中に調製し、８％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでPVDF膜(BioRad)に移した。このイムノブロット(ウェスタンブロット)の検出を、抗Ｓウサギポリクローナル血清(ウサギP11135からの免疫血清：実施例４を参照)及びウサギIgGを指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いて行った。結合した抗体を、ECL+キット(Amersham)を用いる発光及びオートラジオグラフィーフィルムHyperfilm MP(Amersham)により可視化した。
図35Aに示されるように、組換えウイルスVV-TN-Sは、SARS-CoVの感染の８時間後に観察され得るレベルに匹敵するが、VV-TG-Sの感染後に観察され得るレベルよりずっと高いレベルでＳタンパク質の発現を導く。第２の実験(図35B)において、種々の量の細胞抽出物の分析により、TNシリーズのウイルス(VV-TN-S及びVV-TN-Ssol)の感染後に観察される発現レベルは、TGシリーズのウイルス(それぞれVV-TG-S及びVV-TG-Ssol)で観察される発現レベルの約10倍高いことが示される。加えて、Ssolポリペプチドは、VV-TN-Ssolウイルスに感染したCV-1細胞の上清中に、VV-TG-Ssolに感染した細胞の上清より高い効率で分泌される(図36A)。この実験では、VV-TN-Sflagウイルスをコントロールとして使用した。なぜなら、これは、そのC-ter端部でFLAGタグと融合した膜形態のＳタンパク質を発現するからである。Sflagタンパク質はVV-TN-Sflagに感染した細胞の上清中で検出されない。このことは、Ssolポリペプチドが確かにVV-TN-Ssolの感染後に能動的に分泌されることを証明する。
これら結果は、組換えワクシニアウイルスが確かに導入遺伝子のキャリアであり、膜形態(Ｓ)で又は可溶性若しくは分泌される形態(Ssol)でのSRAS糖タンパク質の発現を可能にすることを証明する。合成プロモーター480を有するワクシニアウイルスは、7.5K遺伝子のプロモーターを有するウイルスよりずっと高いレベルで、Ｓの発現及びSsolの分泌を可能にする。
４）可溶形態のSARS-CoV Sの製造への適用。この組換え抗原の精製及び診断適用
BHK-21株は、検査した株(BHK-21、CV1、293T及びFrhK-4、図36B)のうち、VV-TN-Ssolウイルスの感染後に最高量のSsolポリペプチド分泌する細胞株である；これは、組換えSsolポリペプチドの定量的産生及び精製を可能にする。感染、産生及び精製の実験条件が最適化された典型的な実験では、BHK-21細胞を標準培養培地(4.5g/lのグルコースを含有し５％TPB、５％FCS、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンを補充したピルビン酸塩フリーDMEM)に、サブコンフルエント単層(25mlの培地中各100cm2について10百万細胞)の形態で接種する。37℃にて５％CO2下での24時間のインキュベーション後、細胞を0.03のM.O.I.で感染させ、標準培地を、FCSの量が0.5％に減じられ、TPBが排除されている分泌培地に交換する。培養上清を35℃にて５％CO2下での2.5日のインキュベーション後に取り出し、ワクシニアウイルスをTriton X-100(0.1％)の添加により不活化する。0.1μmポリエーテルスルホン(PES)膜上での濾過後、TBS(50mM tris、pH7.4、150mM NaCl)中100μg/mlのFLAGペプチド(DYKDDDDK)の溶液で抽出する抗FLAGマトリクス上でのアフィニティークロマトグラフィーにより組換えSsolポリペプチドを精製する。
硝酸銀で染色した８％SDSアクリルアミドゲルによる分析は、分子量が約180kDであり、純度が90％より大きい優勢なポリペプチドを同定した(図37)。精製したSsol組換えポリペプチドの濃度を、分子量マーカーとの比較により決定し、24ng/μlと推定した。
この精製したSsolポリペプチド調製物により、捕捉ELISA検査を用いて、培養上清中に存在するSsol濃度を測定するための較正シリーズを製造することが可能になる。この検査によれば、BHK-21株は上記の産生条件下で約１μg/mlのSsolポリペプチドを分泌する。加えて、提示の精製スキームにより、１リットルの培養上清当たり160μgのオーダーのSsolポリペプチドを精製することが可能になる。
組換えSsolポリペプチドのELISA反応性を、SARSに罹患している患者からの血清に対して分析した。
検査したSARSの可能性が高い症例の血清を、SARS-CoVに感染したVeroE6細胞に対する免疫蛍光検査及び/又は抗原としてSARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を使用する間接ELISA検査によるSARS-CoVの天然型抗原に対する特異的反応性の分析の結果(陽性又は陰性)に基づいて選択した。これら患者の血清は、National Reference Center for Influenza Virusesの通し番号並びに患者のイニシャル及び症状の発症からの経過日数により同定する。３、８及び12日目の呼吸器サンプルについて実施したRT-PCRによりSARS-CoV感染が確証できなかった患者VTTの血清032552を除き、可能性が高い症例の全ての血清(表XVIを参照)がSARS-CoVの天然型抗原を認識する。コントロール血清のパネルをコントロールとして使用した(TV血清)：これらは、2003年に発生したSARS流行の前にフランスで収集した血清である。
Figure 0005090741
組換えSsolポリペプチドで感作した固相を、ELISAプレートのウェルにおけるPBS中４μg/mlの精製したSsolポリペプチドの溶液の吸着により調製した。プレートを４℃にて一晩インキュベートし、次いでPBS-Tween緩衝液(PBS、0.1％Tween 20)で洗浄する。PBS-Tweenでの洗浄後、検査すべき血清(100μl)をPBS-スキムミルク-Tween緩衝液(PBS、３％スキムミルク、0.1％Tween)中１/100及び１/400希釈し、次いで感作したELISAプレートのウェルに加える。次いでプレートを37℃にて１時間インキュベートする。PBS-Tween緩衝液での３回の洗浄後、PBS-スキムミルク-Tween緩衝液中１/4000希釈したペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG接合体(ref.NA933V、Amersham)を加え、次いでプレートを37℃にて１時間インキュベートする。PBS-Tween緩衝液での６回の洗浄後、色素原(TMB)及び基質(H2O2)を加え、プレートを遮光して10分間インキュベートする。H3PO4の１Ｍ溶液を添加して反応を停止し、次いで吸光度を、620nmを参照にして、450nmで測定した。
ELISA検査(図38)は、組換えSsolポリペプチドは、感染の中期又は後期(症状の発症の10日以上後)に収集したSARSに罹患している患者の血清抗体によって特異的に認識される一方、SARSに罹患していない患者のコントロール血清の血清抗体によって有意には認識されないことを証明する。
結論として、これら結果は、組換えSsolポリペプチドを、組換えワクシニアウイルスVV-TN-Ssolに感染した哺乳動物細胞の上清から精製することが可能であり、SARS-CoV感染の血清学的診断用のELISA検査を開発するための抗原として使用できることを証明する。
５．ワクチン適用
組換えワクシニアウイルスの免疫原性をマウスで研究した。
このため、１群の７匹のBALB/cマウスを、４週間の間隔で２回、i.v.経路により、106 p.f.u.の組換えワクシニアウイルスVV-TG、VV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN、VV-TN-S及びVV-TN-Ssol並びにコントロールとして、A/PR/8/34系統のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの発現を導くVV-TG-HAで免疫した。免疫血清を免疫(IS1、IS2)の各々の３週間後に回収した。
免疫血清を、群の各々について、SARS-CoVに感染したVeroE6細胞の溶解物を抗原として、非感染VeroE6細胞の溶解物をコントロールとして使用する間接ELISAにより、プールごとに分析した。抗SARS-CoV抗体力価(TI)は、ペルオキシダーゼにカップリングした抗マウスIgG(H+L)ポリクローナル抗体(NA931V、Amersham)及びH2O2を補充したTMB(KPL)での可視化後に、0.5の比ODを生じる希釈率の逆数として算出する。この分析(図39A)は、ウイルスVV-TG-S及びVV-TN-Sでの免疫が、マウスで、１回目の免疫から、感染VeroE6細胞の溶解物中に存在する天然型形態のSARS-CoV針状タンパク質を指向する抗体を誘導することを示す。VV-TN-Sウイルスにより誘導される応答は、１回目の免疫後にVV-TG-Sウイルスにより誘導される応答より高く(それぞれTI = 740及びTI = 270)、また２回目の免疫後にVV-TG-Sウイルスにより誘導される応答より高い(それぞれTI = 3230及びTI = 600)。VV-TN-Ssolウイルスは、２回の免疫後に高い抗SARS-CoV抗体力価を誘導する(TI = 640)一方、ウイルスVV-TG-Ssolは検出限界の応答を誘導する(TI = 40)。
免疫血清を、群の各々について、SARS-CoVの感染性を血清中和化する能力についてプールごとに分析した。FRhK-4細胞についての４つの血清中和化点(100 TCID50のSARS-CoV)を、１/20から検査した２倍希釈物のそれぞれについて作成する。血清中和化力価は、Reed and Munschの方法に従って、４ウェル中２ウェルの感染性を中和する希釈率の逆数として算出する。この分析は、Ｓタンパク質又はSsolポリペプチドを発現するワクシニアウイルスによりマウスで誘導された抗体が中和化抗体であること、及び合成プロモーターを有するウイルスが7.5Kプロモーターを有するウイルスより効率的な免疫原であることを示す：最高力価(640)は、ウイルスVV-TN-Sでの２回の免疫後に観察される(図39B)。
組換えワクシニアウイルスでの免疫後にマウスで誘導された中和化抗体の保護力は、SARS-CoVへの攻撃感染を用いて評価する。
６）他の適用
第３世代組換えワクシニアウイルスは、上記のように、Ｓ遺伝子及びSsol遺伝子の野生型配列を哺乳動物細胞での発現に最適化した合成遺伝子で置換することにより構築する。これら組換えワクシニアウイルスは、より大量のＳ抗原及びSsol抗原を発現することができ、したがって増大した免疫原性を示すことができる。
組換えワクシニアウイルスVV-TN-Ssolは、診断適用(ELISAによる血清学)及びワクチン適用(サブユニットワクチン)のためのSsol抗原の定量的産生及び精製に使用することができる。
実施例17：SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)針状(Ｓ)タンパク質を発現する組換え麻疹ウイルス。ワクチン適用。
１）導入
麻疹ワクチン(MV)は、単回注射後にヒトで持続性保護免疫を誘導する(Hilleman、2002, Vaccine, 20: 651-665)。付与された保護は非常に強く、抗体応答の誘導並びにCD4及びCD8細胞応答の誘導に基づく。MVゲノムは非常に安定であり、ワクチン系統の毒性への復帰は今まで観察されていない。麻疹ウイルスは、Paramyxoviridae科のMorbillivirus属に属する；これは、ゲノムが16kbの一本鎖RNA(マイナス鎖)であり(図40A)、専ら細胞質で行われる複製サイクルが宿主ゲノムへの組み込みの可能性を排除する、エンベロープに被われたウイルスである。したがって、麻疹ワクチンは、ヒト集団に使用される最も効果的で最も安全な生ワクチンの１つである。Frederic Tangyのチームは、最近、最も安全な減弱系統であり、麻疹に対するワクチンとしてヒトで最も広く使用されているSchwarz系統の麻疹ウイルスに基づいて発現ベクターを開発した。このワクチン系統は、感染性分子クローンから単離され得るが、感染に対して感受性である霊長類及びマウスで免疫原性を保存している。これは、追加の転写ユニットの挿入後、異種配列の発現用ベクター構成する(Combredet、2003, J. Virol. 77: 11546-11554)。加えて、西ナイルウイルス(WNV)のエンベロープ糖タンパク質を発現する組換えMV Schwarzは、マウスをWNVの致死性攻撃感染から保護する効果的で持続性の抗体応答を誘導する(Despresら、2004, J. Infect. Dis.、印刷中)。これら特徴のすべてが、この減弱Schwarz系統の麻疹ウイルスを、新規組換え生ワクチンの構築に大いに見込みのある候補ベクターとする。
この実施例の目的は、種々のSARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)抗原を発現する組換え麻疹ウイルス(MV)がSARSに対する新規候補ワクチンを構成する能力を評価することである。
本発明者らは、遺伝子免疫後に動物でSARS-CoVの感染性を中和する抗体を誘導することができるSARS-CoV針状(Ｓ)タンパク質、及びこのタンパク質の可溶性で分泌される形態であるSsolポリペプチド(これは、C-ter端部で、SGジペプチドをコードするBspE1リンカーを介してFLAGタグ(DYKDDDDK)の配列と融合したＳのエクトドメイン(aa１〜1193)から構成される)に着目した。このSsolポリペプチドは、Ｓタンパク質の抗原性と同様の抗原性を示し、アジュバントとして水酸化アルミニウムと組み合せた精製したタンパク質の形態でのマウスへの注射後に、SARS-CoVに対する高い中和化抗体力価の誘導を可能にする。
種々の形態のＳ遺伝子を、以前に記載されたSchwarz系統のMV(Combredet、2003, J. Virol. 77: 11546-11554；2002年６月20日のEP出願No.02291551.6及び2002年６月20日のEP出願No.02291550.8)のcDNA中に、追加の転写ユニットの形態で、Ｐ(リンタンパク質)遺伝子とＭ(マトリクス)遺伝子との間に導入した。組換えウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolを単離し、SARS-CoV S抗原を発現する能力について確認した後、マウス次にサルでSARSに対する保護免疫応答を誘導する能力を検査した。
２）組換えウイルスの構築
プラスミドpTM-MVSchw-ATU2(図40B)は、追加の転写ユニット(ATU)がＰ(リンタンパク質)遺伝子とＭ(マトリクス)遺伝子との間に導入されたSchwarzワクチン系統の麻疹ウイルス(MV)のアンチゲノムに相当する感染性cDNAを含有する(Combredet、2003, Journal of Virology, 77: 11546-11554)。Ｓタンパク質及びSsolポリペプチドのORFをMVSchw-ATU2ベクターの追加の転写ユニット中に挿入することによって麻疹ウイルスの組換えゲノムMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolを構築した。
このために、SARS-CoV SのcDNAを含有するDNAフラグメントを、鋳型としてプラスミドpcDNA-Sを使用しオリゴヌクレオチド5'-ATACGTACGA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3'及び5'-ATAGCGCGCT CATTATGTGT AATGTAATTT GACACCCTTG-3'を用いるPCRにより増幅し、次いでプラスミドpTOPO-S-MVを取得するために、プラスミドpCR(登録商標)2.1-TOPO(Invitrogen)中に挿入した。使用した２つのオリゴヌクレオチドは、麻疹ベクター中への後続の挿入を可能にする制限部位BsiW1及びBssHIIを含有しており、麻疹ウイルスのゲノムの長さは６で割り切れなければならないことを定める６のルール(the rule of 6)(Calain & Roux、1993, J. Virol., 67: 4822-4830；Schneiderら、1997, Virology, 227: 314-322)を観察するために、開始コドン及び終結コドンを含む3774ntの配列を作製するように設計した。BigDye Terminator v1.1 kit(Applied Biosystems)及び自動化配列決定機ABI377を用いて挿入物を配列決定した。
SARS-CoV Sの可溶性で分泌される形態を発現するため、次いで、SGジペプチドをコードするBspE1リンカーを介してFLAGタグ(DYKDDDDK)の配列とC-ter端部で融合したSARS-CoV Sのエクトドメイン(aa１〜1193)に相当するSsolポリペプチドのcDNAを含有するプラスミドを取得した。このため、DNAフラグメントを、プラスミドpCDNA-Ssolからのオリゴヌクレオチド5'-CCATTTCAAC AATTTGGCCG-3'及び5'-ATAGGATCCG CGCGCTCATT ATTTATCGTC GTCATCTTTA TAATC-3'を用いて増幅し、次いでプラスミドpTOPO-S-MV-SFを取得するために、プラスミドpTOPO-S-MV中にSal1部位とBamH1部位との間で挿入した。生成した配列は、BsiW1部位とBssHII部位との間で3618nt長であり、６のルールが観察される。上記のように挿入物を配列決定した。
次いでＳタンパク質及びSsolポリペプチドのcDNAを含有するBsiW1-BssHIIフラグメントを、プラスミドpTOPO-S-MV及びpTOPO-S-MV-SFの消化により切り出し、次いでプラスミドpTM-MVSchw2-SARS-S及びpTM-MVSchw2-SARS-Ssolを取得するために、プラスミドpTM-MVSchw-ATU2の対応する部位間にサブクローニングした(図40B)。これら２つのプラスミドは、2004年12月1日に、それぞれ番号I-3326及びI-3327でC.N.C.M.に寄託した。
プラスミドpTM-MVSchw2-SARS-S及びpTM-MVSchw2-SARS-Ssolに対応する組換え麻疹ウイルスは、Radeckeら(1995, Embo J., 14: 5773-5784)により記載されParksら(1999, J. Virol., 73: 3560-3566)により改変されたヘルパー細胞株の使用に基づくシステムに従う逆遺伝学により取得した。簡潔には、ヘルパー細胞293-3-46を、リン酸カルシウム法に従い、５μgのプラスミドpTM-MVSchw2-SARS-S又はpTM MVSchw2-SARS-Ssolと、MV Lポリメラーゼの発現を導く0.02μgのプラスミドpEMC-La(M.A. Billeterからの寄贈)とでトランスフェクトする。37℃にて一晩インキュベートした後、43℃にて２時間熱ショックを生じ、トランスフェクトした細胞を単層のVero細胞上に移した。２つのプラスミドの各々について、２〜３日の共培養の後にシンシチウムが現れ、これを、35mmペトリ皿中次いで25cm2フラスコ及び75cm2フラスコ中で70％コンフルエンスの単層Vero細胞上に連続して移した。シンシチウムが80〜90％コンフルエンスに達したときに、細胞をスクレーパを用いて回収し、次いで一度凍結・解凍する。低速遠心分離後、ウイルスを含有する上清を小分けして−80℃で貯蔵する。組換えウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolの力価は、Vero細胞に対して限界希釈により決定し、力価を、ウェルの50％を感染させる用量(TCID50)として、Karberの方法に従って算出した。
３）組換えウイルスの特徴付け
Ｓタンパク質及びSsolポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現をウェスタンブロッティング及び免疫蛍光により評価した。
T-25フラスコ中の単層Vero細胞を、種々の継代の２つのウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssol並びにコントロールとしての野生型ウイルスMWSchwに多重度0.05で感染させた。シンシチウムが80〜90％コンフルエンスに達したときに、細胞質抽出物を抽出緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.2、１％Triton X-100、0.１％SDS、１％DOC)中に調製し、次いでLaemmliに従うローディング緩衝液中に希釈し、８％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、PVDF膜(BioRad)上に移した。このイムノブロット(ウェスタンブロット)の検出を、抗Ｓウサギポリクローナル血清(ウサギP11135の免疫血清：上記実施例４を参照)及びウサギIgGを指向し、ペルオキシダーゼにカップリングしたロバポリクローナル抗体(NA934V、Amersham)を用いて行った。結合した抗体を、ECL+キット(Amersham)を用いる発光及びHyperfilm MPオートラジオグラフィーフィルム(Amersham)により可視化した。
スライドグラス上の単層のVero細胞を、２つのウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssol並びにコントロールとしての野生型ウイルスMWSchwに、0.05の感染多重度で感染させた。シンシチウムが90〜100％コンフルエンス(MVSchw2-SARS-Ssolウイルス)又は30〜40％コンフルエンス(MVSchw2-SARS-S、MWSchw)に達したときに、細胞を４％PBS-PFA溶液中で固定し、0.2％Tritonを含有するPBS溶液で透過化し、次いで精製し不活化したSARS-CoVビリオンで超免疫化したウサギポリクローナル抗体及びFITCにカップリングした抗ウサギIgG(H+L)ヤギ抗体接合体(Jackson)で標識した。
図41及び42に示すように、組換えウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolは、SARS-CoVの感染の８時間後に観察することができるレベルに匹敵するレベルで、それぞれＳタンパク質及びSsolポリペプチドの発現を導く。これらポリペプチドの発現は、細胞培養中での組換えウイルスの３継代後でも安定である。これら結果は、組換え麻疹ウイルスが確かに導入遺伝子のキャリアであり、膜形態(Ｓ)又は可溶形態(Ssol)でのSARS糖タンパク質の発現を可能にすることを証明する。Ssolポリペプチドは、この同じポリペプチドが対応する配列の一過性トランスフェクション後に哺乳動物細胞で発現される場合(上記実施例11を参照)と同様に、MVSchw2-SARS-Ssolウイルスに感染した細胞により分泌されると予測される。
４）適用
ウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-SsolがSARS-CoV Sの発現を可能にすることが示されたので、MVによる感染に感受性である
Figure 0005090741
 マウスでSARS-CoVに対する保護免疫応答を誘導する能力を評価する。免疫したマウスの抗体応答を、SARS-CoVの天然型抗原に対するELISA検査により評価し、上記の方法論を使用してインビトロでSARS-CoVの感染性を中和する能力について評価する。応答の保護力は、SARS-CoVの非致死性攻撃感染の２日後に、肺のウイルス量(viral load)の減少を測定することにより評価する。
第２世代組換え麻疹ウイルスは、上記実施例15に記載のように、Ｓ遺伝子及びSol遺伝子の野生型配列を、哺乳動物細胞での発現に最適化された合成遺伝子に置換することにより構築する。これら組換え麻疹ウイルスは、より大量のＳ抗原及びSsol抗原を発現することが可能であり、したがって増大した免疫原性を示すことができる。
或いは、Ｓタンパク質又はSsolポリペプチドをコードする野生型又は合成の遺伝子は、麻疹ベクターMVSchw-ATU3中に、Ｈ遺伝子とＬ遺伝子との間に位置する追加の転写ユニットの形態で挿入し、次いで組換えウイルスを同様な様式で作製し特徴付けてもよい。この挿入は、異なる特徴(ウイルスの増殖、導入遺伝子の発現レベル)を有する組換えウイルスを生成することができ、おそらくＰ遺伝子とＮ遺伝子との間の導入遺伝子の挿入後に得られる免疫原性と比較して向上した免疫原性を生じることができる。
組換え麻疹ウイルスMVSchw2-SARS-Ssolは、診断適用及びワクチン適用のためのSsol抗原の定量的産生及び精製に使用できる。
実施例18：Ｓタンパク質に関連する他の適用
ａ）Ｓ又はSsolの発現を(Ｓのフラグメントの発現でさえ)可能にするレンチウイルスベクターは、ヒト又は獣医学上の予防に使用されるべきSARS-CoVに対する組換えワクチンを構成することができる。このようなワクチンの実現可能性を証明するために、組換えレンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-S-WPRE及びTRIP-SD/SA-Ssol-WPREの免疫原性をマウスで研究する。
ｂ）モノクローナル抗体は、組換えSsolポリペプチドを用いて産生する。上記の実施例14で提示した結果によれば、これら抗体又はその少なくとも大部分は天然型形態のSARS-CoV Sを認識し、診断及び/又は予防に適用することができる。
ｃ）SARSについての血清学的検査を、抗原として使用するSsolポリペプチド及び二重エピトープ法で開発する。
発現ベクターpIVEXからの組換えタンパク質Ｎ、SC及びSLのインビトロでの発現のウェスタンブロット分析を説明する。 発現ベクターpIVEXからのＮタンパク質のインビボでの発現の、変性条件(SDS-PAGE)下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクーマシーブルーでの染色による分析を説明する。 発現ベクターpIVEXからのSL及びSCポリペプチドのインビボでの発現の、変性条件(SDS-PAGE)下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクーマシーブルーでの染色による分析を説明する。 組換えベクターpIVEXで形質転換したE.coli BL21(DE3)pDIA17系統中で産生した組換えＮ、SL及びSCタンパク質の抗原活性を説明する。 ベクターpIV2.3Nからの、E.coli BL21(DE3)pDIA17系統中で産生した組換えＮタンパク質のNi-NTAアガロースカラムでの精製を説明する。 pIV2.4S1で形質転換したE.coli BL21(DE3)pDIA17系統中で産生した封入体からの組換えSCタンパク質の精製を説明する。 SARS-CoVに感染した細胞の溶解物及び異型肺炎に罹患している患者からの血清を用いて作成したイムノブロットを表す。 SARS-CoVに感染した細胞の溶解物と核タンパク質Ｎ(Ａ)に特異的なウサギ免疫血清及び針状タンパク質Ｓ(Ｂ)に特異的なウサギ免疫血清とを用いて作成したイムノブロットを表す。 免疫に使用した対応する組換えタンパク質に対する、Ｎタンパク質又はＳタンパク質の短いフラグメント(Sc)を指向するウサギ単一特異性ポリクローナル血清のELISA反応性を説明する。 SARS-CoVにより引き起こされた異型肺炎に罹患している患者からの血清に対する、精製した組換えＮタンパク質のELISA反応性を説明する。 SARS-CoVにより引き起こされた異型肺炎に罹患している患者からの血清に対する、精製した組換えＮタンパク質のELISA反応性を説明する。 プライマー対No.１(N/+/28507、N/-/28774)(Ａ)及びプライマー対No.２(N/+/28375、N/-/28702)(Ｂ)を用いた漸減量(107〜１コピー)のSARS-CoV Ｎ遺伝子の合成RNAのRT-PCRによる増幅を説明する。 SARS-CoV Ｎ遺伝子の合成RNAのリアルタイムでのRT-PCRによる増幅を説明する。 番号031589で記録されたサンプルに由来するSARS-CoV系統のゲノムのDNA等価物に相当する配列番号１の配列の制限地図を表す。 間接N ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す。 間接N ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す。 二重エピトープN ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す。 二重エピトープN ELISAによるSARS血清学検査の結果を示す。 SARS-CoVの天然型核タンパク質Ｎに対するELISAによる抗Ｎモノクローナル抗体の反応性の検査を説明する。 ヒトコロナウイルス229E(HCoV-229E)の天然型抗原に対するELISAによるSARS-CoVのＮに対するモノクローナル抗体の反応性の検査を説明する。 SARS-CoVの変性した天然型核タンパク質Ｎに対するウェスタンブロッティングによるSARS-CoVのＮに対するモノクローナル抗体の反応性の検査を示す。 SARS-CoV Ｓタンパク質の哺乳動物細胞での発現用のプラスミドを示す。 VeroE6細胞のトランスフェクション後のＳタンパク質の発現を説明する。 VeroE6細胞及び293T細胞のトランスフェクション後のＳタンパク質の発現に対するCTE配列及びWPRE配列の効果を示す。 SARS-CoV Sの発現のための中央DNAフラップを有する欠損レンチウイルスベクターを示す。 レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-S-WPRE及びTRIP-SD/SA-S-CTEで形質導入した細胞株によるSARS-CoV Sの発現のウェスタンブロット分析を示す。 レンチウイルスベクターTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE及びTRIP-SD/SA-Ssol-CTEで形質導入した細胞株によるSsolポリペプチドの発現の分析に関する。 精製したSsolポリペプチドの分析に関連する結果を示す。 精製したSsolポリペプチドの分析に関連する結果を示す。 SARS-CoV SをコードするプラスミドDNAを用いる遺伝子免疫の効力に対する、スプライシングシグナル並びにCTE配列及びWPRE配列の影響を説明する。 SARS-CoV SをコードするプラスミドDNAを用いる遺伝子免疫後にマウスで誘導された抗体でのSARS-CoVの感染性の血清中和化を示す。 SARSに罹患している患者からの血清に対する組換えSsolポリペプチドの免疫反応性を説明する。 組換えSsolポリペプチドでの免疫後のSARS-CoVを指向する抗体の誘導を示す。 合成遺伝子040530の配列とSARS-CoV単離株031589の野生型遺伝子の配列とのヌクレオチドアラインメントを表す。 SARS-CoV Sの発現のための合成遺伝子の使用を説明する。 組換えワクシニアウイルスVV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN-S及びVV-TN-Ssolの構築のための図解を示す。 組換えワクシニアウイルスVV-TG-S、VV-TG-Ssol、VV-TN-S及びVV-TN-Ssolの構築のための図解を示す。 ウェスタンブロッティングにより分析した、組換えワクシニアウイルスによるＳタンパク質の発現を説明する。 組換えワクシニアウイルスによるSsolポリペプチドの分泌のウェスタンブロット分析の結果を示す。 SDSポリアクリルアミドゲル上で精製したSsolポリペプチドの分析を示す。 SARSに罹患している患者の血清に対する、組換えワクシニアウイルスVV-TN-Ssolにより産生された組換えSsolポリペプチドの免疫反応性を説明する。 組換えワクシニアウイルスでの免疫後のマウスにおける抗SARS-CoV抗体応答を示す。 組換えウイルスMVSchw2-SARS-S及びMVSchw2-SARS-Ssolの構築を記載する。 ウェスタンブロッティングにより分析した、組換え麻疹ウイルスによるＳタンパク質の発現を説明する。 免疫蛍光により分析した、組換え麻疹ウイルスによるＳタンパク質の発現を示す。 ペプチドE1-12、E53-76及びM2-14を指向するウサギ血清の免疫反応性のウェスタンブロット分析を説明する。

Claims (8)

  1. 配列番号３の配列を有するＳタンパク質又は配列番号３の配列の１位〜1193位若しくは14位〜1193位に相当するアミノ酸からなるＳタンパク質のエクトドメインをコードし、
    Ｓタンパク質又はエクトドメインをコードする配列の上流に位置するスプライスシグナル配列、及び
    前記Ｓタンパク質又はエクトドメインをコードする配列の下流に位置する、ウッドチャック肝炎ウイルスのWPRE配列(「ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント」)又はマソン-ファイザーシミアンレトロウイルスのCTE配列(「構成性輸送エレメント」)
    を含んでなることを特徴とする組換え発現ベクター。
  2. Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に寄託した以下の細菌系統：
    ａ）2004年11月22日に寄託した系統No.I-3323、
    ｂ）2004年11月22日に寄託した系統No.I-3324、
    ｃ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3334、
    ｄ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3335、
    ｅ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3336、及び
    ｆ）2004年12月１日に寄託した系統No.I-3337
    に含有されているベクターから選択されることを特徴とする請求項１に記載の組換え発現ベクター。
  3. ウイルス粒子の形態又は組換えゲノムの形態のウイルスベクターであることを特徴とする請求項１又は２に記載の発現ベクター。
  4. SARS関連コロナウイルスＳタンパク質又はそのエクトドメインの真核生物系での産生のための、請求項１に記載のベクターの使用。
  5. 培養中の真核細胞を、請求項２に記載のベクターでトランスフェクトする工程を含んでなる、真核生物系でＳタンパク質又はそのエクトドメインを産生する方法。
  6. 請求項２のｃ)〜ｆ)に規定の細菌系統に含有されているベクターのいずれか１つでの安定トランスフェクションにより取得することができ、SARS関連コロナウイルスＳタンパク質又はそのエクトドメインを発現する遺伝的に改変された真核細胞。
  7. 2004年11月22日に、No.I-3325で、CNCMに寄託した細胞FRhK4-Ssol-30であることを特徴とする請求項６に記載の細胞。
  8. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えベクターを含んでなることを特徴とする免疫原性及び/又はワクチン組成物。
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