ES2347812T3

ES2347812T3 - Cepa de mycobacterium recombinante que expresa una proteina fap micobacteriana bajo el control de un promotor activo en hipoxia y su aplicacion para terapia de cancer.

Info

Publication number: ES2347812T3
Application number: ES06291205T
Authority: ES
Inventors: Gilles Marchal; Mohammad Abolhassani
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2006-07-25
Filing date: 2006-07-25
Publication date: 2010-11-04
Anticipated expiration: 2026-07-25
Also published as: EP2049667B1; EP1882741A1; ATE502110T1; JP2009544305A; US20120156169A1; DE602006015180D1; ATE472602T1; DK1882741T3; WO2008012693A3; WO2008012693A2; HK1112753A1; EP2049667A2; DE602007013248D1; EP1882741B1; US20090304637A1; CA2658713A1

Abstract

Una cepa BCG de Mycobacterium bovis recombinante, caracterizada por que comprende una secuencia codificante de proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia.

Description

La invención se refiere a una cepa de Mycobacterium recombinante que expresa un fragmento polinucloeotídico que codifica una proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de un promotor activo en condiciones de hipoxia y su uso para la prevención y tratamiento de tumores epiteliales.

El cáncer de vejiga está entre los cinco cánceres principales en hombres y es de tres a cuatro veces menos frecuente en mujeres. Más del 80% de estos cánceres son carcinomas celulares transicionales superficiales. La inmunoterapia intravesical con bacilo Calmette-Guerin (BCG) es, en la actualidad, la referencia para el tratamiento y profilaxis del carcinoma celular transicional superficial de la vejiga urinaria; es la terapia más eficaz para prevenir recurrencias tumorales superficiales y tratar tumores residuales de la vejiga después de una resección tumoral transuretral (Lamm et al., N. Engl. J. Med., 1991, 325, 1205-).

Mientras que el efecto antitumoral de BCG está bien establecido, el mecanismo a través del cual se produce está menos claro. Algunos estudios sugieren que la respuesta inmune mediada por células a BCG juega un papel crítico en el efecto antitumoral de BCG. Al mismo tiempo, otros estudios identifican un efecto antitumoral directo de BCG. La contribución relativa de estos dos posibles mecanismos a la actividad clínica antitumoral de BCG sigue siendo desconocida.

La instilación de BCG en la vejiga provoca una respuesta inflamatoria compleja durante la que se liberan linfocitos y diversas citoquinas a la orina. Se ha propuesto que los granulomas locales formados en el estroma suburotelial juegan un papel clave en el control de las células de carcinoma (Alexandroff et al, The Lancet, 1999, 353, 1689-1694). Se ha hipotetizado que las células NK median una parte de este control. La producción de diferentes citoquinas (IL-2, IL-12, IL-18 e interferones imagen1 ) se sobreexpresa después de terapia con BCG y puede activar las células NK (Suttmann et al., The Journal of Urology, 2004, 172, 1490-1495). Sin embargo, las respuestas inmunes intensas observadas en algunos pacientes no se correspondían con un mejor control de la enfermedad y los mecanismos inmunológicos que permiten el control de la proliferación de las células de carcinoma aun no están claros.

Varios estudios demuestran que BCG ejerce un efecto anti proliferativo directo en las células de carcinoma urotelial humano. La proteína secretada rica en alanina y prolina APA (también denominada FAP-B, antígeno MPT-32, glicoproteína de 45 kDa, o antígeno de 45/47-kDa) de la familia de la proteína de unión a fibronectina micobacteriana (FAP) es una proteína necesaria para la unión in vivo de BCG a las células epiteliales de vejiga y la mediación de actividad antitumoral inducida por BCG (Zhao et al., Int. J. Cancer, 2000, 86, 83-88). Las proteínas FAP micobacterianas constituyen una familia de proteínas altamente homologas que se unen a fibronectina de una manera específica. Las proteínas FAP de al menos cinco especies micobacterianas incluyen M. leprae (FAP-L), M. avium (FAP-A), M. bovis BCG (FAP-B; número de acceso GenBank AF013569), M. smegmatis (FAP-S) y M. tuberculosis (APA, antígeno MPT-32, glicoproteína de 45-kDa, o antígeno de 45/47-kDa; número de acceso de EMBL X80268) se han clonado y caracterizado. La región de unión a fibronectina (posiciones 269-292 de FAPA) contiene un tetrapéptido RWFV conservado (posiciones 273 a 276 de FAP-A) que es necesario para la función de unión a fibronectina. La secuencia de unión mínima es el péptido de 12 aminoácidos, 269-280 (posiciones 269 a 280 de FAP-A; Zhao et al., The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274, 45214526). La proteína APA funciona como una opsonina, uniendo BCG a las integrinas de superficie celular, mediante un puente de fibronectina. La adherencia de BCG mediada por FAP a la integrina imagen1 5 imagen1 1 de la superficie de carcinoma urotelial, que es el receptor de FAP predominante en las células uroteliales, induce rutas de señalización y de transactivacion génica que implican a NF-imagen1 B y AP-1. La detención del ciclo celular en la interfase G1/S, en lugar de la apoptosis, es el mecanismo que contribuye al efecto antiproliferativo de BCG (Chen et al., BMC Urology, 2005, 5:8).

Sin embargo, el uso de BCG para el cáncer de vejiga tiene inconvenientes, tanto en términos de eficacia como toxicidad. Primero, la respuesta a BCG es impredecible y no lineal. Como resultado, el 30% de los pacientes son refractarios a BCG y no existen factores de pronóstico fiables actualmente que predigan con precisión el éxito o el fracaso del tratamiento. Además, la durabilidad a largo plazo de la respuesta a BCG es limitada y el uso de mantenimiento (tres tratamientos semanales cada tres a seis meses) o la terapia de refuerzo (una vez al mes) hasta 36 meses es necesaria para reducir la recurrencia del cáncer de vejiga.

Segundo, BCG tiene efectos secundarios. La mayoría de los pacientes experimentan síntomas locales de cistitis incluyendo frecuencia, urgencia, disuria y ocasional hematuria. Los síntomas sistémicos leves de alta temperatura, malestar y una enfermedad de tipo gripe transitoria también son comunes. Aparecen efectos secundarios graves en el 5% de los pacientes, aproximadamente el 10% de los cuales implica sepsis franca de BCG (Alexandroff et al., citado anteriormente).

Recientes avances en la tecnología de micobacterias recombinantes han abierto nuevos horizontes para la inmunoterapia del cáncer de vejiga. Se han sugerido diversos enfoques para producir una alternativa recombinante al BCG que sea menos tóxica y/o más eficaz que la BCG existente (Alexandroff et al., citado anteriormente):

- un BCG recombinante que expresa citoquinas humanas de interés tales como interleuquina 2, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa; se espera que este BCG recombinante sea más inmunopotente y pueda de esta manera conducir al uso de dosis inferiores de BCG y minimizar la posibilidad de infección por BCG sistémica, -una cepa recombinante de BCG que es menos virulenta o que incorpora un gen suicida o sensibilidades a fármaco antimicrobiano que son menos tóxicas y más eficaces que otros fármacos antituberculosis convencionales; se espera que estos BCG recombinantes produzcan menos efectos secundarios.

Además, se ha sugerido usar una cepa no patógena de micobacterias, tal como M. smegmatis.

Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de estos enfoques ha proporcionado una alternativa a la inmunoterapia con BCG. Es en este contexto en el que se realizó la invención.

Sabiendo que la PO2 en orina es baja (Leonhardt et al., New Engl. J. Med., 1963, 269, 115-121), es decir, la PO2 local de la superficie del epitelio de la vejiga en la que crecen las células de carcinoma, los inventores han desarrollado por ingeniería genética un BCG recombinante (BCG Apa++) que sobreexpresa la proteína APA en condiciones hipóxicas. En esta construcción, la expresión del marco abierto de lectura de APA se conduce por el promotor de imagen1 -cristalina micobacteriana. La imagen1 -cristalina es una proteína que se sintetiza específicamente durante el crecimiento de fase exponencial tardía y estacionaria de M. tuberculosis in vitro, después de un cambio en las condiciones limitantes de oxígeno y puede jugar un papel en la supervivencia a largo plazo de M. tuberculosis in vivo (Yuan et al., J. Bacteriol., 1996, 178, 4484-4492). La administración in vivo de BCG Apa++ conduce a la sobreexpresión de la proteína APA en tejidos en los que la presión parcial de oxígeno es baja, tal como la vejiga (Leonhardt et al., N. England J. Medecine, 1963, 269, 115-121). Como resultado, BCG Apa++ es más activa que el BCG de tipo silvestre para controlar la proliferación de las células de carcinoma de vejiga humano, tanto in vitro como in vivo. Este BCG recombinante debería bajar las dosis de BCG usadas y minimizar los efectos secundarios asociados con la inmunoterapia de BCG.

Por lo tanto, la invención se refiere a un vector recombinante que comprende un fragmento polinucleotídico que codifica una proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia. Definiciones

-: Mediante “vector” se pretende una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido a una célula hospedadora.

-: Mediante “vector de expresión” se pretende un vector capaz de dirigir la expresión de un polinucleótido clonado.

-: Mediante “secuencia promotora” se pretende una secuencia de ácido nucleico que es necesaria para permitir que una ARN polimerasa inicie la transcripción de un polinucleótido. Dicho promotor también puede incluir secuencias reguladoras (potenciador, represor), que sirven para potenciar o reprimir la transcripción.

-: Mediante “control transcripcional” se pretende que el polinucleótido que codifica la proteína de FAP micobacteriana esté unido operativamente al promotor (es decir, en una posición que permite que la transcripción de dicho polinucleótido y la traducción de la proteína correspondiente se produzcan en las células hospedadoras modificadas por el vector de expresión recombinante.

-: Mediante “hipoxia” se pretende una presión parcial de oxígeno que es inferior a 30 mm de mercurio, como se determinó mediante técnicas convencionales, por ejemplo mediante el uso de un electrodo polarográfico.

-: Mediante “la proteína FAP micobacteriana” se pretende una proteína codificada por el gen apa de M. tuberculosis (número de acceso EMBL X80268), o su homólogo de otra especie de micobacterias, incluyendo por ejemplo el gen FAP-B de M. bovis (GenBank AF013569). La secuencia de aminoácidos de la proteína APA que corresponde al número de acceso de SwissProt Q50906. -Mediante “gen acr” o “gen hspX” se pretende el gen que codifica el homólogo de proteína de choque térmico imagen1 -cristalina HSPX (antígeno de 14 kDa; HSP16.3). En referencia a la secuencia de H37Rv M. tuberculosis (número de acceso NC_000962.2), el gen hspX (ID Génico: 887579; etiqueta de locus Rv2031c) corresponde a las posiciones 2278498 a 2278932 en la hebra menos. El gen hspX corresponde

también al número de acceso GenBank 579751. En referencia a la secuencia de M. bovis (número de acceso AF2122/97), el gen hspX (ID Génico: 1094114; etiqueta de locus MB2057C) corresponde a las posiciones 2262845 y 2262411 (5’ a 3’); dicho gen está en la hebra de ADN menos y la región promotora amplificada se incluye entre las posiciones 2263059 y 2262846(5’ a 3’).

De acuerdo con la presente invención la secuencia que codifica FAP puede ser el gen FAP, la secuencia de codificación de proteína FAP (CDS), que corresponde al marco abierto de lectura (ORF) de longitud completa de FAP o una secuencia codificante truncada, en la que la secuencia de señal N-terminal se ha eliminado.

En una primera realización, la invención presenta un vector recombinante, en el que dicho fragmento polinucleotídico codifica una proteína FAP de Mycobacterium tuberculosis (proteína APA de M. tuberculosis).

En una segunda realización, la invención presenta un vector recombinante en el que el promotor es un promotor micobacteriano que está activo en condiciones hipóxicas. Se describen ejemplos de dichos promotores en Florczyk et al., Infect. Immun., 2001, 69, 5777-5785 y Florczyk et al., Infect Immun., 2003, 71, 5332-5343. Entre dichos promotores, el especificado anteriormente aquí puede usarse ventajosamente (véase definiciones de los capítulos, gen hspX); otro promotor también puede usarse ventajosamente: éste se corresponde con el promotor del gen Rv2623 (número de acceso de la proteína correspondiente de M. tuberculosis: gi2104288); los cebadores usados para amplificar dicho promotor son los descritos en la Tabla 1 en Florczyk et al., (Infect. Immun., 2003, citado anteriormente), modificados para añadir los sitios de restricción BamHI o Ncol en el extremo 5’.

Preferiblemente, el promotor micobacteriano es el promotor del gen acr (promotor HSPX); la expresión del homólogo de proteína de choque térmico alfa cristalina HSPX (antígeno de 14 kDa; HSP 16,3) codificado por el gen arc micobacteriano, se induce específicamente a nivel muy alto en condiciones hipóxicas.

Más preferiblemente, el vector comprende un fragmento polinucleotídico que codifica la proteína APA de M. tuberculosis bajo el control transcripcional del promotor de HSPX.

Un vector de acuerdo con la presente invención comprende, pero no se limita a, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un BAC (artificial bacteriano), un fago, un fagémido, un cósmido, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN circular o lineal que puede consistir en ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Son vectores preferidos los capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que se unen. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra cromosómica. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes están con frecuencia en forma de “plásmidos” que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenario, en su forma de vector no se unen al cromosoma. Los expertos en la materia conocen grandes cantidades de vectores adecuados.

El vector de acuerdo con la presente invención comprende un casete de expresión, en el que la secuencia que codifica la proteína FAP se pone bajo el control de elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados para permitir la producción o síntesis de dicha proteína.

Más particularmente, el vector puede comprender elementos adicionales que se conocen bien en la técnica, incluyendo: -un sitio de clonación situado cadena abajo de la región promotora, para la inserción del ORF. El codón de iniciación ATG y/o el codón de terminación del ORF pueden incluirse en un sitio de restricción para permitir la inserción de la secuencia que codifica la proteína en fase con el vector. Opcionalmente, el vector puede comprender un sitio de clonación múltiple, que comprende múltiples sitios de clonación adyacentes que permiten que cualquier inserto se clone en el vector en fase con cualquier marco de lectura en el vector (proteínas de fusión). Por ejemplo, el extremo 5’ o 3’ del ORF puede fusionarse con una secuencia que codifica un marcador. El marcador puede usarse para la purificación (secuencia de polihistidina) o la detección (epítopo B, proteína fluorescente) de la proteína expresada. Opcionalmente, el extremo 5’ o 3’ del ORF y la secuencia que codifica el marcador se separan con un sitio de escisión para una secuencia de proteasa/endopeptidasa para permitir la retirada del marcador. -al menos un marcador seleccionable, por ejemplo un marcador auxótrofo, un gen de resistencia a antibiótico (resistencia a tetraciclina, rifampicina, ampicilina, kanamicina) o un gen de resistencia a mercurio, para la selección de bacterias recombinantes. -una señal de terminación de la transcripción (terminador), cadena abajo del ORF; para provocar que la ARN polimerasa del hospedador termine la transcripción del transcrito generado por el promotor. -al menos un origen de replicación para el mantenimiento del vector en el hospedador.

En una cuarta realización, la invención presenta un vector que es un plásmido (ADN bicatenario circular). Preferiblemente, dicho plásmido contiene un origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a antibiótico. En particular, la invención presenta un plásmido, identificado como pYAPA2031, en el que un fragmento polinucleotídico que codifica la proteína APA de M. tuberculosis bajo control transcripcional del promotor HSPX se inserta en el sitio EcoRV del plásmido pYUB295 (Dussurget et al., Infect. Immun., 2001, 69, 529-533; Gómez et al., Mol Microbiol., 1998, 29, 617-628).

La invención se refiere también a un casete de expresión derivado del vector recombinante de acuerdo con la presente invención, que consiste en un fragmento polinucleotídico que comprende la secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia unida operativamente al fragmento polinucleotídico que codifica una proteína FAP micobacteriana, como se ha definido anteriormente. Dicho casete de expresión puede comprender además elementos adicionales como se han definido anteriormente (sitio de clonación, marcador, señal de terminación cadena abajo).

La invención se refiere también a una célula hospedadora que está modificada genéticamente mediante un vector recombinante como se ha definido anteriormente (célula recombinante).

Particularmente, la invención se refiere a bacterias, preferiblemente micobacterias transformadas mediante un vector recombinante como se ha definido anteriormente.

Las micobacterias preferidas incluyen las del complejo M. tuberculosis, tales como las cepas BCG de M. bovis, por ejemplo la cepa BCG de Pasteur. Otras micobacterias preferidas son las de crecimiento rápido y no patógenas para seres humanos tales como por ejemplo, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium microti.

En particular, la invención presenta una cepa BCG de Mycobacterium bovis recombinante, transformada de manera estable con el plásmido pYAPA2031, depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, el 21 de julio de 2006, con el número de acceso 1-3659, identificada como BCG Apa++ .

La invención se refiere también a una composición antitumoral que comprende una cantidad adecuada de un vector recombinante o célula hospedadora como se ha definido anteriormente, en un transportador aceptable, tal como un estabilizador, un tampón y similares.

La composición de acuerdo con la presente invención puede comprender vectores/células vivos o muertos. Las composiciones de vector/célula muerto se preparan mediante cualquier medio conocido para los expertos habituales en la materia.

Una composición o formulación farmacéutica se refiere a una forma adecuada para su administración (oral, tópica, mediante inyección o inhalación) en un sujeto, por ejemplo un mamífero, y en particular un ser humano. Las formas adecuadas, en parte, dependen del uso o la ruta de entrada. Una formulación preferida es para la administración tópica, más preferiblemente para administración intravesical, intravaginal, rectal o para inhalación.

Una dosis farmacéuticamente eficaz es la dosis requerida para prevenir, inhibir la aparición o tratar (aliviar un síntoma hasta cierto grado, preferiblemente todos los síntomas) de una enfermedad o estado. La dosis farmacéuticamente eficaz del vector/célula hospedadora depende de la composición usada, la vía de administración, el tipo de mamífero tratado, las características físicas del mamífero específico bajo consideración, la medicación simultánea y otros factores, que los expertos en la materia reconocerán. Generalmente, la dosis eficaz de micobacteria recombinante para ser humano, está entre 106 y 1010 UFC (Unidad Formadora de Colonias) o UFC equivalente.

Preferiblemente, el tumor es un tumor epitelial. Más preferiblemente, el tumor es un tumor superficial. En particular, el tumor es un carcinoma celular transicional de la vejiga o un carcinoma de pulmón, colon o cérvix.

En una primera realización, la composición antitumoral de acuerdo con la presente invención, comprende una cepa micobacteriana como se ha definido anteriormente, en particular la cepa BCG Apa++ .

Preferiblemente, la cepa micobacteriana recombinante se mata, más preferiblemente mediante liofilización prolongada. El método de preparación de cepas de micobacterias liofilizadas de forma prolongada se describe en la solicitud internacional de PCT WO 03049752.

En una segunda realización, la composición antitumoral de acuerdo con la presente invención, comprende adicionalmente un agente inmunoestimulador.

La invención se refiere también al uso de un vector recombinante o célula hospedadora como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento dirigido a la prevención o el tratamiento de un tumor en un sujeto.

La invención se refiere también a un producto que contiene un vector recombinante o una célula hospedadora como se ha definido anteriormente y un agente inmunoestimulador, como preparaciones combinadas para su uso simultáneo, separado o secuencial en terapia antitumoral.

La invención se refiere también a un método para la prevención o el tratamiento de un tumor en un sujeto, que comprende: administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición, como se ha definido anteriormente, mediante cualquier medio apropiado. Particularmente, la composición se administra por via intravesical, intravaginal, rectal o por inhalación y comprende entre 106 y1010 UFC (Unidades Formadoras de Colonia) o UFC equivalente de micobacterias recombinantes.

La invención se refiere también al uso del casete de expresión o vector recombinante, como se ha definido anteriormente para la preparación de una célula hospedadora modificada, preferiblemente una cepa micobacteriana recombinante en la que el casete de expresión está integrado en el genoma de las micobacterias recombinantes.

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, métodos convencionales de microbiología, biología molecular e inmunobiología dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía.

El vector recombinante de acuerdo con la invención se construye e introduce en una célula hospedadora mediante las técnicas bien conocidas de ADN recombinante e ingeniería genética usando métodos clásicos, de acuerdo con procedimientos convencionales como los descritos en: Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Biblioteca del Congreso, Estados Unidos) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, (Sambrook et al., 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Además de las características precedentes, la invención comprende adicionalmente otras características que emergerán de la descripción a continuación, que se refiere a ejemplos que ilustran la cepa recombinante de BCG y su uso de acuerdo con la invención, así como a los dibujos anexos en los que: -La Figura 1 ilustra la inhibición de la activación de FGFR-3 mediante cepas de BCG, analizada mediante inmunotransferencia. Las células T24 se incubaron 48 h sin bacterias o con vacuna de BCG (A) o BCG Apa++ (B) 106 UFC/ml, se enfriaron a 4ºC durante 15 min y se trataron durante 2 h a 4ºC en ausencia (-) o presencia (+) de 50 ng/ml de FGF-1. Después de la reticulación covalente con bis-(sulfosuccinimidil)suberato y disuccinimidil-suberato, las células se lisaron, se inmunoprecipitaron con anticuerpo antiFGFR-3 C-terminal y se exploraron en una inmunotransferencia con un anticuerpo policlonal para el dominio citoplásmico de FGFR-3. Los valores representan la densidad obtenida para los dímeros (

imagen1 250 kDa) con relación a la suma de la densidad de monómeros ( imagen1 120 kDa) y dímeros. -La Figura 2 ilustra la estimulación de la ruta MAPK mediante cepas BCG. Las células T24 se incubaron 48 h sin bacterias o con vacuna de BCG o BCG Apa++ 106 UFC/ml, se incubaron durante 15 minutos en ausencia (-) o presencia (+) de 100 ng/ml de EGF y se lisaron. La presencia de proteína quinasa fosforilada activada por mitógeno p42/p44 (pMAPK) se determinó mediante ELISA. A. Datos presentados pocillo a pocillo. B. Datos presentados como media

: imagen1
e.c.m.: -La figura 3 ilustra la estimulación de la ruta de Aktl-2 mediante cepas BCG. Se incubaron células T24 48 h sin bacterias o con vacuna BCG o BCG Apa++ 106 UFC/ml, se incubaron durante 15 minutos en ausencia (-) o presencia (+) de 100 ng/ml de EGF y se lisaron. La presencia de Akt1-2 fosforilada se

determinó mediante ELISA. A. Datos presentados pocillo a pocillo. B. Datos presentados como media

e.c.m.: -La figura 4 es una vista de vejigas recogidas de rata que recibió BBN y tratada con PBS (panel izquierdo) o BCG Apa++ (panel derecho). -La figura 5 ilustra la activación de p53 de tipo silvestre en núcleo de células de tumores de vejiga inducidos por BBN de ratas que recibieron 6 instilaciones intravesicales semanales de 0,5 ml de PBS solo

imagen1

o PBS que contenía 108 UFC/ml de vacuna de BCG o BCG Apa++. Las ratas se sacrificaron en la semana 30 (un mes después del último tratamiento con BCG) y se midió el p53 de tipo silvestre activado mediante un Ensayo Inmunométrico Enzimático. A. Datos presentados pocillo a pocillo. B. Datos presentados como media

imagen1 e.c.m. -La figura 6 es el mapa del plásmido pYUB295. -La figura 7 ilustra la construcción de la cepa recombinante BCG Apa++ que contiene la secuencia que codifica APA bajo el control transcripcional del promotor HSPX (derivado del plásmido pYAPA2031), integrado en el genoma de BCG. Ejemplo 1: Construcción de una BCG recombinante (BCG Apa++) que sobreexpresa la proteína APA bajo el control del promotor de alfa cristalina.

Para construir un BCG recombinante capaz de producir moléculas APA cuando las bacterias están en hipoxia, se diseñó un plásmido que contiene las secuencias apropiadas. Este plásmido contiene el gen apa de M. tuberculosis (número de acceso EMBL X80268 y Laqueyrie et al., Infection and Immunity, 1995, 63, 4003-4010) que codifica la proteína APA, clonada bajo el control transcripcional del HSPX (número de acceso GenBank S79751; Yuan et al., J. Bacteriol., 1996, 178, 4484-4492; Florczyk et al., Infect. Immun., 2001, 69, 5777-5785 y Florczyk et al., Infect. Immun., 2003, 71, 5332-5343) y el gen aph (resistencia a kanamicina). Las bacterias de la cepa Pasteur silvestre BCG 1173P2, se electroporaron después con el plásmido y la BCG recombinante que sobreexpresaba APA (BCG Apa++) se aisló en medio Sauton que contenía kanamicina (Figura 7).

El ADN de apa de M. tuberculosis se amplificó mediante PCR a partir de pLA34-2 (Laqueyrerie et al., Infect. Immun. 1995, 63, 4003-4010). La secuencia apa se modificó para crear un sitio NcoI mediante el cebador directo (5’-catgccatggtacaggtggaccccaacttgaca-3’: SEC ID Nº 1) y un sitio BamHI en la secuencia inversa (5’-ttaggatccggccggtaaggtccgctgcggtgt-3’: SEC ID Nº 2) para subclonar el producto de PCR NcoI-BamHI en el vector de expresión pQE60 (Qiagen; (Horn et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 32023-32030).

Dos promotores BCG inducibles con extremos cohesivos BamHI y NcoI se generaron mediante PCR realizada en ADN de BCG M. bovis de Pasteur, usando cebadores BamhspX F (5'ttaggatccgtccggcatgatcaacctcc-3': SEC ID Nº 3) y NcohspX R (5'-catgccatggggtggccatttgatgcctcc-3': SEC ID Nº 4) para el promotor de alfa cristalina (acr) y los cebadores BamRv2623 F (5'ttaggatccgggccatggactggtcgtcg-3': SEC ID Nº 5) y NcoRV2623 R (5'-catgccatggacatcgcggtcctcctgtcg-3': SEC ID Nº 6) para el promotor Rv2623 (Florczyk et al., 2001 y 2003, citado anteriormente).

Estos fragmentos se ligaron a T4 y después de dos tratamientos con Klenow, se insertaron casetes arc-apa o Rv2623-apa en plásmido restringido con EcoRV pYUB295 (Dussurget et al.,

Infect Immun., 2001, 69, 529-533; Gómez et al., Mol. Microbiol. 1998, 29, 617-628; Figura 6). Esta inserción creó plásmidos de aproximadamente 5,5 kpb de pYAPA2031 y pYAPA2623. Después de la amplificación en E. coli (XL-1 Blue) y la siembra en placas de réplica con sensibilidad a tetraciclina. Los plásmidos se purificaron y electroporaron en BCG. No replican en BCG pero contiene el sitio de unión (attP) y el gen de la integrasa (int) del micobacteriófago L5 que dirige la integración del plásmido en el sitio attB del cromosoma micobacteriano con alta eficacia (Lee et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 29, 3111-3115). Se hicieron crecer cultivos líquidos de bajo oxígeno en matraces de cultivo tisular de tapón con ventilación (25 cm2 Corning) en un incubador que permitió el control de la tensión de oxígeno. Los matraces de cultivo tisular con tapón con ventilación posibilitaron el intercambio de gases entre los matraces y el ambiente controlado del incubador. Los niveles de oxígeno se mantuvieron mediante la inyección de mezcla de gas preparada (Carboxique) en los incubadores. Los cultivos de bajo oxígeno se cultivaron en atmósferas de 1,3 % de O2 total. Los cultivos de alto oxígeno se cultivaron en aire ambiental en matraces de cultivo tisular de 25 cm2 con los tapones firmemente sellados. Cuando fue necesario se usó kanamicina a 25 µg/ml.

La sobreexpresión se confirmó mediante transferencia de Western usando un anticuerpo policlonal de conejo cultivado contra Apa de BCG M. bovis (Laqueyrerie et al., Horn et al., citados anteriormente). Ejemplo 2: Efecto del BCG recombinante Apa++ en el crecimiento de células de carcinoma humano in vitro 1) Inhibición de la dimerización de FGFR3

Las células T24 derivadas de un carcinoma celular transicional humano (ATCC número HTB-4), se incubaron durante 48 h sin bacterias o con vacuna de BCG o BCG Apa++ 106 UFC/ml. Las células se enfriaron a 4ºC durante 15 min y se trataron durante 2 h a 4ºC en ausencia o presencia de 50 ng/ml de FGF-1 (PROMEGA). Después del entrecruzamiento covalente con bis-(sulfosuccinimidil)suberato 1mM y disuccinimidil-suberato (PIERCE) 15 mM durante 30 min a temperatura ambiente, las células se lisaron, se inmunoprecipitaron con anticuerpo C-terminal anti FGFR-3 (C-15), (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC, sc-123) y se exploró en una inmunotransferencia con un anticuerpo policlonal para el dominio citoplásmico de FGFR-3 (P-18) (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC., sc-31162). Se determinó la densidad obtenida para los dímeros ( imagen1 250 kDa) en relación a la suma de la densidad de monómeros ( 120 kDa) y dímeros.

El receptor FGF (FGFR-3) de las células de carcinoma T24 se activa mediante FGF. Esta activación disminuye en las células tratadas con vacuna BCG y se elimina totalmente en células tratadas con BCG Apa++ (figura 1). La inhibición de dimerización FGFR-3 observada en células estimuladas con FGF-1 pero incubadas con BCG Apa++, indicó que las células se inhibían en su crecimiento. 2) Análisis de las rutas MAPK y Akt 1-2

Se realizó un análisis de rutas de estimulación posteriores. Por lo tanto, se cultivaron células T24 en placas de seis pocillos. Después de 48 h en incubación con vacuna BCG o BCG Apa++ 106 UFC/ml en DMEM libre de suero, las células se incubaron durante 15 minutos con o sin 100 ng/ml de EGF y se lisaron. La presencia de proteína quinasa fosforilada activada por mitógeno p42/p44 (pMAPK) y Akt 1-2 fosforilada se determinó mediante ELISA de proteína total mediante kits de ELISA PhosphoDetect ERK ½ (pThr185/pTyr187) (CALBIOCHEM) y PhosphoDetect Akt (pSer473) (CALBIOCHEM) respectivamente.

imagen1

Los resultados que presentan fosforilación de MAPK (figura 2) y Akt ½ (figura 3) indican que la presencia de BCG Apa++ en la superficie de la célula T24 inhibe los primeros pasos de la estimulación con FGF y confirman la tendencia de BCG Apa++ a ser más potente que BCG para controlar in vitro el crecimiento celular del carcinoma. Ejemplo 3: Efecto del BCG Apa++ recombinante en crecimiento celular in vivo de carcinoma humano

Se usaron treinta hembras de rata Wistar (JANVIER), de 7 semanas de edad al principio del experimento, en este estudio. Se administró N-butil-N-(4-hidroxibutil)nitrosamina BBN (KASEI INDUSTRY COMPANY) a 0,05% en el agua para consumo de 24 ratas durante 19 semanas. 6 ratas se mantuvieron sin ningún tratamiento hasta 30 semanas. Una semana después del tratamiento de exposición a BBN (20ª semana) las ratas recibieron 6 instilaciones intravesicales semanales de 0,5 ml de PBS solo o PBS que contenía 108 UFC/ml de vacuna BCG o BCG Apa++. Las ratas se sacrificaron en la semana 30ª (un mes después del último tratamiento con BCG). Se extrajeron las vejigas, se homogenizaron y se prepararon extractos de proteína nuclear mediante kit de extracto nuclear Activemotif (Active motif, Carlsbad). Se midió el p53 de tipo silvestre activado mediante un Kit de Ensayo Inmunométrico de Enzimas (TiterZyme®, EIA900-117, Ann Arbor, MI).

Los BCG Apa++ que sobreexpresan moléculas de APA en condiciones de hipoxia leve observados en vejiga se descubrió que eran más activos que los BCG silvestres para controlar la proliferación celular del carcinoma en la vejiga de ratas que recibieron un agente químico promotor del carcinoma.

La observación clínica de las vejigas indicó la presencia de tumores en todos los animales del grupo tratado con PBS y la mitad de los animales del grupo tratado con vacuna BCG. Por el contrario, la vejiga era normal en todos los animales del grupo tratado con BCG Apa++ (figura 4).

El análisis de la concentración del factor supresor de tumores p53 en el núcleo de células tumorales, no demuestra una reducción en el grupo tratado con BCG Apa++, en comparación con una reducción del 50% en el grupo tratado con PBS y de un 25% a un 30% de reducción en el grupo tratado con vacuna BCG (figura 5).

En estos ensayos in vivo los resultados fueron más impactantes que in vitro, quizás debido a un nivel mayor de hipoxia en orina y vejiga que en el cultivo in vitro. LISTA DE SECUENCIAS

<110> INSTITUT PASTEUR MARCHAL, Gilles ABOLHASSANI, Mohammad

<120> CEPA DE MYCOBACTERIUM RECOMBINANTE QUE EXPRESA UNA PROTEÍNA FAP MICOBACTERIANA BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR ACTIVO EN HIPOXIA Y SU APLICACIÓN PARA TERAPIA DE CÁNCER

<130> HLPcp226-131

<160> 6

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador Directo

<400> 1 catgccatgg tacaggtgga ccccaacttg aca 33

<210> 2

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador Directo

<400> 2 ttaggatccg gccggtaagg tccgctgcgg tgt 33

<210> 3

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador Bamhspx F

<400> 3 ttaggatccg tccggcatga tcaacctcc 29

<210> 4

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador NcohspX R

<400> 4 catgccatgg ggtggccatt tgatgcctcc 30

<210> 5

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador BamRv2623 F

<400> 5 ttaggatccg ggccatggac tggtcgtcg 29

<210> 6

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador NcoRV2623 R

<400> 6 catgccatgg acatcgcggt cctcctgtcg 30

Claims

Reivindicaciones

1.

Una cepa BCG de Mycobacterium bovis recombinante, caracterizada por que comprende una secuencia codificante de proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia.
2.

La cepa BCG recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada por que dicha proteína FAP micobacteriana es la proteína APA de Mycobacterium tuberculosis.
3.

La cepa BCG recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizada por que dicho promotor es un promotor micobacteriano.
4.

La cepa BCG recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada por que dicho promotor es el promotor HSPX.
5.

La cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que comprende una secuencia codificante de proteína APA de Mycobacterium tuberculosis bajo el control transcripcional del promotor HSPX.
6.

La cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que se transforma de manera estable con el plásmido pYAPA2031, depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, el 21 de julio de 2006, con el número de acceso I-3659, identificada como BCG Apa++ .
7.

Una composición antitumoral, caracterizada por que comprende una cantidad adecuada de la cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un transportador aceptable.
8.

La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que dicha cepa BCG recombinante es BCG recombinante viva.
9.

La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que dicha cepa BCG recombinante es BCG recombinante muerta.
10.

La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que dicha BCG recombinante muerta es BCG recombinante liofilizada de forma prolongada.
11.

La composición antitumoral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada por que comprende entre 106 y 1010 UFC o UFC equivalente de cepa BCG recombinante.
12.

La composición antitumoral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizada por que comprende un agente inmunoestimulador.
13.

Un producto que contiene una cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente inmunoestimulador, como preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en terapia antitumoral.
14.

Uso de una cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de un medicamento dirigido a la prevención o el tratamiento de un tumor en un sujeto.
15.

El uso de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que dicho medicamento se dirige al tratamiento de tumores epiteliales.
16.

El uso de acuerdo con la reivindicación 14 o reivindicación 15, caracterizado por que dichos tumores se seleccionan del grupo que consiste en: carcinoma celular transicional de la vejiga, carcinoma pulmonar, carcinoma de cérvix y carcinoma de colon.
17.

El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado por que la cepa BCG recombinante es la cepa BCG Apa++ .
18.

Uso de un casete de expresión que consiste en un fragmento polinucleotídico que comprende una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, unida operativamente a una secuencia que codifica la proteína FAP micobacteriana, como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2 o de un vector recombinante que comprende dicho fragmento polinucleotídico, para la preparación de una cepa BCG Mycobacterium bovis de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
19.

El uso de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que dicho vector recombinante es un plásmido recombinante.
20.

El uso de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que el casete de expresión está integrado en el genoma de dicha cepa BCG de Mycobacterium bovis recombinante.