JP2022516092A - クローン性造血由来の無細胞ｄｎａ変異の断片サイズ特性評価 - Google Patents
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Abstract
無細胞ＤＮＡサンプル中の造血細胞由来の癌変異体と体細胞変異体とを識別するための方法及びシステムが提供される。いくつかの実施形態では、癌変異体は、断片サイズ分布に基づいて、造血細胞由来の体細胞変異体と区別することができる。
Description
本明細書で提供される方法及びシステムのいくつかの実施形態は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルから得られるシーケンスデータからの変異体コールに関する。いくつかの実施形態では、造血細胞由来の体細胞変異体は、複数の変異体の断片サイズ分布に基づいて癌変異体と区別することができる。
ヒトのＤＮＡにおける変異は癌の原因であることが知られており、これらの変異は現在、癌の研究及び治療の焦点である。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、非侵襲的なリアルタイムのバイオマーカーであり、治療前後の癌患者に診断及び予後情報を提供できる。しかしながら、腫瘍細胞に由来する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）はごく一部であり、断片の大部分は造血細胞から生じる。造血細胞によって保有される体細胞変異は、臨床決定に影響を及ぼすｃｆＤＮＡにおける偽陽性変異の主要な原因であり得る。
本開示は、ｃｆＤＮＡサンプルからの造血細胞由来の癌変異体と体細胞変異体とを区別するための方法及びシステムに関する。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）サンプル中の癌変異体を造血細胞変異体と識別するための方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）複数の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片を含むｃｔＤＮＡサンプルを得ること、又は得られたサンプルを有することと；（ｂ）サンプルから、複数の変異体を含むｃｆＤＮＡ断片を抽出することと；（ｃ）複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行することと；（ｄ）同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定することと；を含む。いくつかの実施形態では、複数の変異体のそれぞれに対する分子プロファイリングの実行は、（ｉ）癌変異体及び造血細胞変異体を含む、複数の変異体のそれぞれについて変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定することと、（ｉｉ）断片サイズ分布プロファイルを生成して、造血細胞変異体を同定することと、を含む。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、腫瘍の腫瘍変異負荷を判定する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、腫瘍細胞を含む生体サンプルからシーケンスデータを得ることと；シーケンスデータから複数の変異体を判定することと；本明細書に記載の方法のいずれかを使用して複数の変異体における癌変異体の数を判定することであって、癌変異体の数が腫瘍の腫瘍変異負荷と等しい、癌変異体の数を判定することと；を含む。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、腫瘍を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載される方法のいずれかによる１０以上の癌変異体の腫瘍変異負荷を有する腫瘍を判定することと、有効量のチェックポイント阻害剤を投与することによって腫瘍を治療することと、を含む。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、遺伝的多型データを分析するための電子システムに関する。いくつかの実施形態では、システムは、プロセッサ上で実行され、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンスデータから複数の変異体を同定するように適合されたインフォマティクスモジュールであって、複数の変異体は癌変異体及び造血細胞変異体を含む、インフォマティクスモジュールと；複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行するための分析器であって、複数の変異体のそれぞれについての変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定するように構成され、また、断片サイズ分布プロファイルを生成するように構成されている、分析器と；同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定するための分析器と；複数の変異体から除去されない変異体を返すように適合されたディスプレイモジュールと；を備える。
以下の詳細な説明では、添付の図面を参照し、添付の図面は本明細書の一部をなす。図面において、同様の記号は、文脈上特に指示されない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加え得る。本開示の態様は、本明細書に全般的に記載され、図面に例示されるように、多種多様な異なる構成で配置され、置換され、組み合わされ、分離され、及び設計され得ることが容易に理解され、それらの全てが本明細書で明示的に企図されている。
本明細書で提供されるシステム、方法、及び組成物の実施形態は、ユーザー又は患者から採取した無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルから得られるシーケンスデータからの核酸変異体（「変異体コール」）を判定するための方法及びシステムに関する。いくつかの実施形態では、方法及びシステムは、断片サイズ分布に基づいて、癌に関係しない異なる細胞起源からの体細胞変異を腫瘍変異と区別することができる。いくつかの実施形態では、造血細胞由来の体細胞変異体は、変異体の断片サイズ分布に基づいて、両方ともｃｆＤＮＡサンプルから得られた腫瘍細胞由来の変異と識別することができる。ｃｆＤＮＡサンプルには、腫瘍細胞及び他の原因に由来する、例えばクローン性造血に由来するＤＮＡ断片が含まれる。腫瘍細胞由来のＤＮＡの断片サイズは、造血細胞の断片サイズとは異なるので、ｃｆＤＮＡサンプルからの断片を、断片サイズ分布プロファイルに適用して、腫瘍細胞と造血細胞とを区別することができ、このことにより、サンプル中の腫瘍変異負荷の改善された判定を提供することができる。より具体的には、いくつかの実施形態では、固形腫瘍からの体細胞変異を保有する断片は、クローン性造血又は白血病由来の体細胞変異を保有する断片と比較して小さいサイズを有する。
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、本明細書に照らして、また本開示が属する当業者によって理解されるような通常の意味を有するものとする。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されるものではなく、したがって変化する可能性があることを理解されたい。免疫学及び分子生物学における共通の用語の定義は、Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，２０１８（ＩＳＢＮ ０９１１９１０１９０，９７８－０９１１９１０４２１）により出版された、Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）；及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ ｗｅａｖｅｒ （ｅｄｓ．），Ｗ．Ｗ．Ｎｏｒｔｏｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，２０１６（ＩＳＢＮ ０８１５３４５０５４，９７８－０８１５３４５０５３）；Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、その内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用するとき、「無細胞ＤＮＡ」又は「ｃｆＤＮＡ」は、本明細書に照らして理解される通常の意味を有し、血流を自由に循環するＤＮＡを指すが、必ずしも腫瘍に由来するものとは限らない。ｃｆＤＮＡは、正常及び異常の両方のアポトーシス事象、細胞排泄、壊死を含む様々なプロセスの結果として、細胞から放出され得る。ｃｆＤＮＡの特定の形態は、様々な医学的状態、疾患状態、又は妊娠の結果として、循環器系内に存在し得る。癌を含む固形組織はまた、血漿ｃｆＤＮＡプールに寄与する。ｃｆＤＮＡは、ヌクレオソーム内断片化による核酸断片の長さによって特徴付けられ、断片は、長さ約１００～２００ｂｐ、例えば、長さ１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０若しくは２００ｂｐ、又は前述の値のいずれか２つによって規定される範囲内の長さであってもよい。いくつかの実施形態では、断片は、１６６ｂｐの長さである。
本明細書で使用するとき、「循環腫瘍ＤＮＡ」又は「ｃｔＤＮＡ」は、本明細書に照らして理解されるその通常の意味を有し、細胞に関連し得ない腫瘍由来の断片化されたＤＮＡを指す。ｃｔＤＮＡは、血漿又は血清中に見出されるｃｆＤＮＡの一部分に由来するものである場合があり、腫瘍又は循環腫瘍細胞に由来するものである場合がある。ｃｔＤＮＡは、腫瘍細胞ゲノムの分子シグネチャーを有する。腫瘍内の遺伝的多様性の一部の注目点を精査する腫瘍組織のマイクロダイセクションに対して、ｃｔＤＮＡを使用して、灌流サンプリングにより、原発部位及び転移部位の両方のクローン種をサンプリングすることができる。しかしながら、豊富で正常なｃｆＤＮＡによる希釈により、ｃｔＤＮＡは、低対立遺伝子頻度で存在する場合がある。いくつかの実施形態では、低対立遺伝子頻度は、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、若しくは０．２％未満の量、又は前述の値のいずれか２つによって規定される範囲内の量である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及びシステムは、造血細胞に由来する体細胞多型と、腫瘍細胞に由来する変異とを識別することができる。
本明細書で使用するとき、「変異体」は、核酸分子内に多形を含み得る。多形には、挿入、欠失、可変長タンデムリピート、単一ヌクレオチド変異、及び転座、コピー数多型、又はこれらの組み合わせなどの構造的変異体が含まれ得る。変異体には、生殖細胞系変異体又は体細胞変異体が含まれる場合がある。本明細書で使用するとき、「生殖細胞系変異体」には、生殖細胞及び個体の全ての細胞に存在する変異体が含まれる場合があり、子孫に受け継がれる場合がある。本明細書で使用するとき、「体細胞変異体」には、腫瘍細胞内に存在するか、又は造血細胞によって保有される変異体が含まれる場合があり、個体の他の細胞には存在せず、遺伝されない場合がある。
遺伝子変異の分析は、遺伝性障害及び癌などの特定の体細胞疾患を含む様々な表現型の研究において有益な情報を提供することができる。変異体対立遺伝子は、そのＤＮＡシーケンス中の特定の位置にある遺伝子の変異体型を含み得る。遺伝子シーケンスの一部には、個人ごとに異なり、結果として影響を与えないものもあるが、他には劇的に異なる表現型をもたらすものもある。例えば、ＤＮＡシーケンスにおける単一の変異は、遺伝子のオン／オフの切り換え、又は代謝鎖におけるタンパク質の機能を変化させることができる。遺伝的多様性が存在する集団にわたる遺伝子データは、遺伝子と表現型との間の関係にのみならず、変異体に関連する表現型の進化の歴史にも洞察を提供することができる。例えば、腎臓、毛髪、又は筋肉組織の変化などの、時間の経過と共に発生する生体器官又はシステムの変化は、体細胞変異と関連付けることができる。
本明細書で使用するとき、「変異体対立遺伝子頻度」又は「ＶＡＦ」は、本明細書に照らして理解されるような通常の意味を有し、変異体にマッチングするシーケンシングされたリードを標的位置での全体的なカバレッジで除した比率を指す。ＶＡＦには、変異体を保有するシーケンシングされたリードの割合の測定値が含まれる場合がある。
「造血細胞」は、本明細書に照らして理解される通常の意味を有し、造血系のあらゆるタイプの細胞を指す。例としては、限定するものではないが、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）などの未分化細胞、並びに巨核球、血小板、赤血球、白血球、顆粒球、単球、リンパ球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの分化細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、「クローン性造血」は、本明細書に照らして理解される通常の意味を有し、１つ以上の体細胞変異を有する造血細胞の亜集団のクローン成長を指す。クローン性造血（ＣＨ）は、ｃｆＤＮＡにおいて同定された偽陽性変異の主要な原因であり得、したがって臨床決定に影響を及ぼし得る。したがって、本開示は、体細胞変異が、ＣＨ又は腫瘍細胞に由来するかどうかを判定するための方法及びシステムに関する。
未確定の潜在能を持つクローン性造血（Clonal hematopoiesis of indeterminate potential、ＣＨＩＰ）は、共通の老化関連現象であり得、造血幹細胞（ＨＳＣ）又は他の初期の血液細胞前駆細胞が、遺伝的に異なる血液細胞の亜集団の形成に寄与する。いくつかの実施形態では、体細胞変異体起源を判定することにより、腫瘍の腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）を示すことができる。いくつかの実施形態では、体細胞変異体起源の判定は、標的療法の判定に使用することができる。
本明細書で使用するとき、「腫瘍変異負荷」又は「ＴＭＢ」は、本明細書に照らして理解されるその通常の意味を有し、腫瘍細胞によって保有される変異の測定値を指す。最近の研究でＴＭＢとチェックポイント阻害剤免疫療法の有効性との相関関係が示された後、癌療法の選択のための重要なバイオマーカーとしてＴＭＢが浮上している。ＴＭＢを計算する際には、生殖細胞系変異体を同定してフィルタリングすることが有用であり得る。生殖細胞系変異体には、個体がそれを有して生まれた（又は腫瘍と正常な細胞の間で共有される）変異体が含まれる場合があるが、これらは参照ゲノムと比較して変異体として検出される。これらの変異体は、腫瘍細胞を正常細胞と区別することには寄与しないため、正しくフィルタリングしないと、ＴＭＢの過大評価につながる可能性がある。更に、造血細胞（例えば、クローン性造血）由来の体細胞変異体をフィルタリングして、腫瘍細胞をクローン性造血と区別することもできる。実施形態は、ｃｆＤＮＡサンプルのＴＭＢを判定することと、ＴＭＢに従って腫瘍の治療を選択することと、それを必要とする対象に治療を施すことと、を含む。
いくつかの実施形態では、適格変異体を有効パネルサイズで除して求めることによって、ＴＭＢを計算することができる。適格変異体としては、例えば、コーディング領域における変異体、低信頼領域に出現しない変異体、０．４％を超え４０％未満の頻度を有する変異体、５００倍を超えるカバレッジを有する変異体、単一ヌクレオチド変異体（複数のヌクレオチド変異体を除く）、挿入及び欠失変異体（Ｉｎｄｅｌ）、非同義及び同義変異体が挙げられ、５０を超えるＣＯＳＭＩＣ（癌における体細胞変異のカタログ）数を有する変異体は除かれ、並びに／又はクローン性造血の影響を受けた遺伝子における変異を有する変異体、例えば、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）、ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、及び／又はカシータスＢ系統リンパ腫（ＣＢＬ）は除かれる。有効パネルサイズには、例えば、５００倍を超えるカバレッジを有する総コーディング領域を含めることができる。
方法
方法
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、体細胞変異体の起源を判定するための方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、クローン性造血（ＣＨ）由来のＤＮＡ変異を、ｃｆＤＮＡサンプル中の腫瘍変異体を示すＤＮＡ変異と識別することを含む。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡ中のＤＮＡ断片の断片サイズ分布を分析することによって、ＣＨを腫瘍変異体と識別することができる。
本明細書で使用するとき、「断片サイズ分布」は、本明細書に照らしてその通常の意味を有し、断片サイズプロファイルを生成するためのサイズで分布するｃｆＤＮＡの断片を指す。生成された断片サイズプロファイルを使用して、体細胞変異を異なる細胞起源と識別することができる。
体細胞変異を異なる細胞起源と識別するための例示的な方法を、図１に概略的に示す。方法１００は、サンプルを得る、又は得られたサンプルを有するステップ１０５を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、生体サンプルである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、腫瘍細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、血清サンプル、糞便サンプル、血液サンプル、及び腫瘍サンプルを含み得る。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、固定されている。いくつかの実施形態では、サンプルは、ｃｆＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、ｃｔＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、複数の変異体、例えば体細胞変異体及び生殖細胞系変異体などを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生殖細胞系変異体を除去することを含む。
生体サンプルの量は、生体サンプルが分析のために十分な核酸を含有する限り、特に要件がない。したがって、生体サンプルの量は、約１μＬ～約５００μＬ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００μＬ、又は前述の値のうちいずれか２つによって規定される範囲内の量を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象からサンプルを得ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象から得られたサンプルを有することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプルを提供することができ、又は別個の実体は、生体サンプルを提供することができる。生体サンプルは、対象によって生成される任意の物質であり得る。概して、生体サンプルは、対象から採取された任意の組織、又は対象によって生成された任意の物質であってもよい。生体サンプルの例としては、血液、血漿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、頬組織、尿、糞、皮膚、毛髪、器官組織を挙げることができる。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、固形腫瘍又は固形腫瘍の生検である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルである。生体サンプルは、核酸を含む任意の生体サンプルであり得る。生体サンプルは、対象に由来する場合がある。対象は、哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類、又は魚類であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、本方法は、マッチングした腫瘍サンプルを得ることを更に含む。腫瘍及びｃｆＤＮＡ変異体の結果をマッチングさせることにより、腫瘍造血細胞、健康な造血細胞、及び異常な造血細胞に由来する断片サイズプロファイルを構築することができる。
いくつかの実施形態では、方法１００は、サンプルからＤＮＡを抽出するステップ１１０を含む。生体サンプルのＤＮＡは、任意の好適な抽出方法によって抽出され得る。これを達成する方法は、当業者に周知であり、例えば、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿、塩化セシウム勾配、ＣＨＥＬＥＸ又はシリカカラム、又はビーズ法が挙げられる。当該技術分野において既知の方法及び／又は市販のキットを使用して、例えば、ＱＩＡＧＥＮにより供給されるＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ又はＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用することによって、細胞からＤＮＡを抽出することができる。
いくつかの実施形態では、方法１００は、ライブラリーの調製及び濃縮のステップ１１５を含む。ライブラリーの調製及び濃縮は、当該技術分野において既知の方法に従って実施することができる。例えば、ライブラリー調製及び濃縮の方法には、末端修復及びＡテーリング、アダプターライゲーション、ライゲーションクリーンアップ、インデックスＰＣＲ、第１のハイブリダイゼーション、第１の標的捕捉、第２のハイブリダイゼーション、第２の標的捕捉、ライブラリーの増幅、増幅されたライブラリーのクリーンアップ、ライブラリーの定量化、及び／又はライブラリーの正規化のステップを含む標準プロトコルが含まれる場合がある。
いくつかの実施形態では、方法１００は、シーケンシングのステップ１２０を更に含む。ＤＮＡライブラリーのシーケンシングは、例えば、ＨｉＳｅｑを使用して行うことができる。ＨｉＳｅｑは、１５１ｂｐのペアエンドリードを用いて行うことができる。ペアエンドシーケンシングは、反復シーケンスを含有するＤＮＡ領域にわたって高品質のアラインメントを提供し、コンセンサスシーケンスのギャップを埋めることによって、ｄｅ ｎｏｖｏシーケンシングのための長いコンティグを生成する。ペアエンドＤＮＡシーケンシングはまた、挿入、欠失、及び反転などの共通のＤＮＡ再構成も検出する。いくつかの実施形態では、シーケンシングは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を使用した分子プロファイリングを含む。
いくつかの実施形態では、方法１００は、変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）分析のステップ１２５を更に含む。ＶＡＦ分析は、当該技術分野において確立された方法に従って実施することができ、変異体対立遺伝子を含む部位におけるリードの割合が判定される。ｃｆＤＮＡでは、腫瘍の割合が低い（典型的には２０％未満の量）ため、生殖細胞系と体細胞系との間で、ＶＡＦが大幅に異なる場合がある。ｃｔＤＮＡには、０．２％～０．４％の量で低ＶＡＦ変異体の高感度検出が含まれる場合がある。
変異体頻度分析には、シーケンサから収集されたシーケンスデータから変異体データを取り出すことが含まれる場合がある。例えば、データベースフィルタ又は近接フィルタなどの、複数の変異体を表すデータにフィルタを適用することにより、生殖細胞系変異体を除去することができる。データベースフィルタを使用して、変異体を生殖細胞系変異体として同定し、サンプル中の複数の変異体を表すデータから変異体を取り出すことができる。データベースフィルタは、複数の変異体における特定の変異体について、データベース内の対応する変異体の対立遺伝子数に関連し得る。近接フィルタは、複数の変異体における特定の変異体の対立遺伝子頻度、ゲノムの領域における変異体の位置、及びゲノムの同じ領域における同定された生殖細胞系変異体の対立遺伝子頻度に対する変異体の対立遺伝子頻度の近接性に関連し得る。いくつかの実施形態では、データベースフィルタの適用は、複数の変異体における第１の生殖細胞系変異体を判定することを含み、第１の生殖細胞系変異体はそれぞれ、変異体の第１の参照セットにおける対立遺伝子数が閾値対立遺伝子数以上である。いくつかの実施形態では、近接フィルタの適用は、（ｉ）複数の変異体の変異体を複数のビンにビニングすることであって、ゲノムの同じ領域に位置する変異体は同じビンにビニングされる、ビニングすること；（ｉｉ）複数の変異体におけるデータベース変異体を判定することであって、データベース変異体は変異体の第２の参照セット内に存在する、判定すること；及び／又は（ｉｉｉ）複数の変異体における第２の生殖細胞系変異体を判定すること；を含み、第２の生殖細胞系変異体はそれぞれ、第２の生殖細胞系変異体と同じビンにおける少なくとも１つのデータベース変異体の対立遺伝子頻度の近接範囲内の対立遺伝子頻度を有する。
いくつかの実施形態では、複数の変異体の変異体を複数のビンに分類又はビニングすることにより、ゲノムの同じ領域に位置する変異体が同じビンに分類又はビニングされるようにすることができる。いくつかの実施形態では、ゲノムの同じ領域は、同じ染色体内、染色体の同じアーム内、同じ染色体サイトバンド（cytoband）内にあり得る。いくつかの実施形態では、ゲノムの同じ領域は、同じ連続する１００Ｍｂ、５０Ｍｂ、４０Ｍｂ、３０Ｍｂ、２０Ｍｂ、１０Ｍｂ、５Ｍｂ、１Ｍｂ内、又は前述の数字のいずれか２つの間の任意の範囲内であり得る。
いくつかの実施形態では、近接フィルタはまた、どのビニングされた変異体が生殖細胞系変異体として容易に同定可能であるかを判定するための命令又はコマンドも含む。例えば、ビニングされた変異体は、１つ以上の参照データベースに存在する対応する変異体を有することができ、生殖細胞系変異体として同定され得る。
いくつかの実施形態では、近接フィルタは、サンプル中の閾値頻度以上の対立遺伝子頻度を有する変異体が生殖細胞系変異体であると判定するための命令を含む。いくつかのこのような実施形態では、０．７、０．８、０．９、又は１．０以上の対立遺伝子頻度を有する変異体を生殖細胞系変異体として同定することができるが、より高い又はより低い対立遺伝子頻度が依然として本開示の範囲内であることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、近接フィルタは、生殖細胞系変異体として同定されていない変異体の対立遺伝子頻度の近接範囲を判定するための命令を含む。変異体の対立遺伝子頻度の近接範囲は、変異体の対立遺伝子頻度の上方及び下方における対立遺伝子頻度の範囲を含み得る。いくつかの実施形態では、近接範囲は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、又は前述の数のいずれか２つの間の範囲内における任意の数の変異体の対立遺伝子頻度からの最大値及び最小値を有する範囲である。例えば、０．２の対立遺伝子頻度及び０．０５の近接範囲を有する変異体については、近接範囲の最小及び最大は、それぞれ０．１５及び０．２５の対立遺伝子頻度である。
いくつかの実施形態では、近接範囲は、所与の変異体の補強エビデンスが二項プロセスによって生まれると仮定して、二項分布の２つの（ｎ）標準偏差の値によって判定される。例えば、対立遺伝子頻度（ｘ）を有し、カバレッジ（ｙ）を有する変異体の場合、近接範囲（ｚ）は、次のようになる：
ｚ＝ｎ＊ｓｑｒｔｆｙ＊ｘ＊（１－ｘ））／ｙ
ｚ＝ｎ＊ｓｑｒｔｆｙ＊ｘ＊（１－ｘ））／ｙ
例えば、対立遺伝子頻度が０．２、カバレッジ／シーケンシング深度が１００の変異体の場合、近接範囲は０．０８になり、近接範囲の最小及び最大は、それぞれ０．１２及び０．２８の対立遺伝子頻度になる。いくつかの実施形態において、近接範囲は、変異体の対立遺伝子頻度の上方及び下方における変異体の対立遺伝子頻度の二項分布からの０．０５又は２（ｎ）標準偏差のいずれか高い方である。
いくつかの実施形態では、変異体が、変異体と同じビン内の１つ以上の同定された生殖細胞系変異体の近接範囲内の対立遺伝子頻度を有する場合、変異体は生殖細胞系変異体として同定することができる。いくつかの実施形態では、変異体が、変異体と同じビン内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０を超える同定された生殖細胞系変異体の近接範囲内に対立遺伝子頻度を有する場合、変異体は、生殖細胞系変異体として同定することができる。いくつかの実施形態では、変異体が、変異体と同じビン内に５つを超える同定された生殖細胞系変異体の近接範囲内の対立遺伝子頻度を有する場合、変異体は生殖細胞系変異体として同定することができる。例えば、変異体が、変異体と同じビン内に５つを超える同定された生殖細胞系変異体の近接範囲内の対立遺伝子頻度を有する場合、変異体が生殖細胞系変異体として同定される実施形態では：対立遺伝子頻度が０．２、近接範囲が０．０５、したがって０．１５の最小範囲及び０．２５の最大範囲を有し、染色体７を表すビン内でビニングされている変異体は、生殖細胞系変異体として同定され、５つを超える同定された生殖細胞系変異体が、変異体の近接範囲内の対立遺伝子頻度を有し、染色体７を表すビンにおいてビニングされる。
いくつかの実施形態では、近接フィルタは、生殖細胞系変異体として同定されない変異体である体細胞変異体を同定する。いくつかの実施形態では、腫瘍からのシーケンシングデータから得られる体細胞変異体の数は、腫瘍の腫瘍変異負荷である。
いくつかの実施形態では、データベースフィルタ又は近接フィルタを複数の変異体に適用して、複数の変異体から生殖細胞系変異体を同定及び除去することができる。いくつかの実施形態では、データベースフィルタ及び近接フィルタを連続的に適用することができる。例えば、このようなデータベースフィルタの出力は、近接フィルタの入力に使用することができる。逆に、近接フィルタの出力をデータベースフィルタの入力として使用することができる。
いくつかの実施形態では、ステップ１２５で変異体対立遺伝子頻度分析を実施した後、方法１００は、断片サイズ分布のステップ１３０を更に含む。ゲノム座標を使用し、リード崩壊後のコンセンサスシーケンスを使用して断片サイズを推測することができる。いくつかの実施形態では、断片サイズ分布は、異なる細胞起源の変異体タイプに基づいて断片サイズのプロファイルを生成することを含み、それにより、異なる細胞起源又は異なる変異体タイプが別個の断片サイズプロファイルを生成するようにする。いくつかの実施形態では、提供される断片サイズは、細胞系統に依存する。
いくつかの実施形態では、方法１００は、癌変異体を同定するステップ１３５を含む。断片サイズ分布を分析し、ＣＨに関連することが知られている断片サイズ分布を取り出すことによって、癌変異体を同定することができる。いくつかの実施形態では、癌変異体の同定は、断片サイズ分布を尤度モデルにフィッティングすることを含む。いくつかの実施形態では、マッチングした腫瘍サンプルは、図１に記載された方法１００を使用して分析され、腫瘍及びｃｆＤＮＡ変異体の結果をマッチングさせることにより、腫瘍造血細胞、健康な造血細胞、及び異常な造血細胞に由来する断片サイズプロファイルの構築を可能にする。ＣＨからの体細胞変異を同定するために、異なる細胞起源の観察された断片サイズをフィッティングする尤度比検定を行うことができる。いくつかの実施形態では、癌変異体の同定は、７５％超、例えば、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％超の感度で、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲内の感度で実施される。
治療方法
治療方法
方法及びシステムのいくつかの実施形態は、腫瘍を有する対象、又は腫瘍を有する疑いのある対象を治療する方法を含む。いくつかのこのような実施形態では、ｃｆＤＮＡサンプル中に存在する癌変異体の数は、本明細書で提供される方法及びシステムによって判定することができる。例えば、シーケンスデータをｃｆＤＮＡサンプルから得ることができ、複数の変異体をシーケンスデータから同定することができ、断片サイズ分布プロファイルを確立して、癌変異体からＣＨを同定及び描写することができ、それによって、複数の変異体における癌変異体を同定することができる。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンシングデータから得られる癌変異体の数は、ＴＭＢである。いくつかの実施形態では、ＴＭＢは、ゲノム領域当たりの癌変異体、例えば、５０ｋｂ、１００ｋｂ、１Ｍｂ、１０Ｍｂ、１００Ｍｂ当たりの変異などの平均数として計算される。ＴＭＢは、ゲノム全体又はその一部をシーケンシングすることによってサンプリングすることができる。例えば、ゲノムの一部は、腫瘍遺伝子パネル、完全エキソーン、部分エクソームなど、対象とする１つ以上のゲノム領域を濃縮することによってシーケンシングされ得る。
腫瘍を有する対象、又は腫瘍を有する疑いのある対象を治療するいくつかの実施形態は、ｃｆＤＮＡサンプルがＴＭＢ閾値以上のＴＭＢを有することを判定することと、腫瘍を有効量の治療剤と接触させることと、を含み得る。いくつかの実施形態は、腫瘍を有する対象を治療することを含み、ｃｆＤＮＡサンプルがＴＭＢ閾値以上のＴＭＢを有することを判定することと、有効量の治療剤を対象に投与することと、を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＭＢ閾値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又は前述の数値のいずれか２つの間の範囲内における任意の数値であり得る。
いくつかの実施形態では、ＴＭＢは、適格変異体を有効パネルサイズで除して求めることによって計算される。適格変異体としては、例えば、コーディング領域における変異体、低信頼領域にない変異体、０．４％を超え４０％未満の頻度を有する変異体、５００倍を超えるカバレッジを有する変異体、単一ヌクレオチド変異体（複数のヌクレオチド変異体を除く）、挿入及び欠失変異体（Ｉｎｄｅｌ）、非同義及び同義変異体が挙げられ、５０を超えるＣＯＳＭＩＣ数を有する変異体は除かれ、並びに／又は‘Ｉ’Ｅ Ｔ２、ＴＰ５３、ＤＮＭＴ３Ａ、及び／又はＣＢＬにおける変異を有する変異体は除かれる。有効パネルサイズには、例えば、５００倍を超えるカバレッジを有する総コーディング領域を含めることができる。
治療剤の例としては、化学療法剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療剤には、チェックポイント阻害剤を含めることができる。チェックポイント阻害剤の例としては、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤としては、イピリムマブ（Ipilimumab）、ニボルマブ（Nivolumab）、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）、スパルタイズマブ（Spartalizumab）、アテゾイツマブ（Atezolizumab）、アベルマブ（Avelumab）、及びドゥルバイウマブ（Durvalumab）を挙げることができる。腫瘍の例としては、大腫瘍、肺腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮腫瘍、胃の腫瘍、黒色腫、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、膀胱腫瘍、及び脳腫瘍が挙げられる。本明細書に含まれる方法及びシステムで治療され得る癌の更なる例は、米国特許出願公開第２０１８／０２１８７８９号に列挙されており、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
システム
システム
いくつかの実施形態は、本明細書に記載される方法を実行するためのコンピュータベースのシステム及びコンピュータ実装方法を含む。いくつかの実施形態では、システムは、ＣＨ変異体と癌変異体とを識別するための断片サイズ分布プロファイルを判定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、システムは、生殖細胞系変異体を同定及び除去するために、多型データに適用されるデータベースフィルタ及び／又は近接フィルタを更に備える。本明細書で提供される方法及びシステムのいくつかの実施形態は、多型データを分析するための電子システムを含む。いくつかのこのような実施形態では、システム及びコンピュータ実装方法は、変異体対立遺伝子頻度及び断片サイズ分布の分析器を含む。いくつかの実施形態は、プロセッサ上で実行され、生体サンプルからのシーケンスデータから複数の変異体を同定するように適合された、インフォマティクスモジュールを含むことができ、複数の変異体はＣＨ及び癌変異体を含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、複数の変異体においてＣＨを特定するためのコンピュータ実装方法を含む。いくつかのこのような実施形態は、生体サンプルからのシーケンスデータから複数の変異体を受け取ることを含むことができ、複数の変異体は、ＣＨ及び癌変異体を含み得る。いくつかの実施形態は、腫瘍造血細胞、健康な造血細胞、及び異常な造血細胞に由来する断片サイズプロファイルを構築するために、腫瘍及びｃｆＤＮＡ変異体の結果をマッチングさせることを含む。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンシングデータから得られた腫瘍変異体は、ＴＭＢである。
システムは、１つ以上のクライアントコンポーネントを備え得る。１つ以上のクライアントコンポーネントは、ユーザーインターフェースを含み得る。システムは、１つ以上のサーバーコンポーネントを備え得る。サーバーコンポーネントは、１つ以上のメモリロケーションを含み得る。１つ以上のメモリロケーションは、データ入力を受信するように構成することができる。データ入力は、シーケンシングデータを含み得る。シーケンシングデータは、対象からの核酸サンプルから生成することができる。システムは、１つ以上のコンピュータプロセッサを更に備え得る。１つ以上のコンピュータプロセッサは、１つ以上のメモリロケーションに動作可能に結合することができる。１つ以上のコンピュータプロセッサをプログラムして、シーケンシングデータを参照シーケンスにマッピングすることができる。１つ以上のコンピュータプロセッサを更にプログラムして、シーケンシングデータから複数の変異体の存在又は不在を判定することができる。１つ以上のコンピュータプロセッサを更にプログラムして、変異体対立遺伝子頻度を判定することができる。１つ以上のコンピュータプロセッサを更にプログラムして、断片サイズ分布プロファイルを判定することができる。１つ以上のコンピュータプロセッサを更にプログラムして、断片サイズ分布による異なる起源の変異の分類を判定することができる。１つ以上のコンピュータプロセッサを更にプログラムして、画面上に表示するための出力を生成することができる。出力は、ＣＨ及び／又は癌変異体を同定する１つ以上のレポートを含み得る。
方法及びシステムのいくつかの実施形態は、１つ以上のクライアントコンポーネントを備え得る。１つ以上のクライアントコンポーネントは、１つ以上のソフトウェアコンポーネント、１つ以上のハードウェアコンポーネント、又はこれらの組み合わせを含み得る。１つ以上のクライアントコンポーネントは、１つ以上のサーバーコンポーネントを介して１つ以上のサービスにアクセスすることができる。１つ以上のサービスは、ネットワークを介して１つ以上のクライアントコンポーネントによってアクセスすることができる。本明細書では、「サービス」は、システムのあらゆる製品、方法、機能、又は使用を指すために使用される。例えば、ユーザーは、遺伝子検査の申し込みをすることができる。システムの１つ以上のクライアントコンポーネントを介して申し込みを行うことができ、ネットワークを介してシステムの１つ以上のサーバーコンポーネントに要求を送信することができる。ネットワークは、インターネット、インターネット及び／若しくはエクストラネット、又はインターネットと通信しているイントラネット及び／若しくはエクストラネットであり得る。場合によっては、ネットワークは、電気通信及び／又はデータネットワークである。ネットワークには、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする１つ以上のコンピュータサーバーを含めることができる。ネットワークは、場合によってはコンピュータシステムの支援によって、ピアツーピアネットワークを実装することができ、このピアツーピアネットワークは、コンピュータシステムに結合されたデバイスがクライアント又はサーバーとして動作することを可能にし得る。
システムのいくつかの実施形態は、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリなどの１つ以上のメモリロケーション；ハードディスクなどの電子ストレージユニット；１つ以上の他のシステムと通信するためのネットワークアダプタなどの通信インターフェース；並びに／又はキャッシュ、他のメモリ、データストレージ及び／若しくは電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイスを備え得る。メモリ、ストレージユニット、インターフェース、及び／又は周辺デバイスは、マザーボードなどの通信バスを介してＣＰＵと通信することができる。ストレージユニットは、データを記憶するためのデータストレージユニット又はデータリポジトリであり得る。一例では、１つ以上のメモリのロケーションに、受信したシーケンシングデータを記憶することができる。
方法及びシステムのいくつかの実施形態は、１つ以上のコンピュータプロセッサを備え得る。１つ以上のコンピュータプロセッサは、１つ以上のメモリロケーションに動作可能に結合されてもよく、例えば、記憶されたシーケンシングデータにアクセスすることができる。１つ以上のコンピュータプロセッサは、本明細書に記載される方法を実行するための機械実行可能なコードを実装することができる。例えば、１つ以上のコンピュータプロセッサは、機械可読コードを実行して、シーケンシングデータ入力を参照シーケンスにマッピングし、かつ／又はＣＨ変異体及び／若しくは癌変異体を同定することができる。
本明細書で提供される方法及びシステムのいくつかの実施形態は、機械実行可能コード又は機械可読コードを含み得る。いくつかのこのような実施形態では、機械実行可能コード又は機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用中、コードはプロセッサによって実行され得る。場合によっては、コードは、ストレージユニットから取得され、プロセッサによるアクセス準備が整ったメモリに記憶され得る。いくつかの実施形態では、電子ストレージユニットは、除外されてもよく、機械実行可能命令はメモリに記憶される。コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを備えたマシンで使用するように事前にコンパイル及び構成することができ、実行時にコンパイルすることも、実行時に解釈することもできる。コードは、事前にコンパイルされた形式、コンパイル又は解釈された状態の形式で、コードを実行できるように選択され得るプログラミング言語で提供できる。
コンピュータシステムなど、本明細書で提供されるシステム及び方法のいくつかの実施形態は、プログラミングで具現化することができる。本技術の様々な態様は、典型的には、ある種の機械可読媒体に保持又は組み込まれる機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの形態である「製品」又は「製造物品」と見なすことができる。機械実行可能コードは、電子ストレージユニット、例えばメモリ又はハードディスクに記憶され得る。「ストレージ」タイプの媒体には、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリ、又はそれらの関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのいずれか又は全てを含めることができ、これはソフトウェアプログラミングのために、常に持続的なストレージ領域を提供することができる。ソフトウェアの全て又は一部は、場合によっては、インターネット又は様々な他の電気通信ネットワークを介して通信されてもよい。このような通信は、例えば、あるコンピュータ又はプロセッサから別のものへの、例えば、管理サーバー又はホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を有し得る別のタイプの媒体には、ローカルデバイス間の物理的インターフェース全体、有線及び光地上回線ネットワーク、並びに様々なエアリンクを介して使用されるものなどの、光波、電波、及び電磁波が含まれる。有線又は無線リンク、光リンクなどのような波を運ぶ物理的要素もまた、ソフトウェアを有する媒体と見なすことができる。本明細書で使用するとき、固定有形「ストレージ」媒体に限定されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」などの用語は、実行のためのプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
本明細書に開示される方法及びシステムのいくつかの実施形態は、１つ以上の電子ディスプレイを備えるか、又はそれと通信することができる。電子ディスプレイは、コンピュータシステムの一部であってもよく、直接又はネットワークを介してコンピュータシステムに結合されてもよい。コンピュータシステムは、本明細書に開示される様々な特徴及び機能を提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）を備え得る。ＵＩの例としては、限定するものではないが、グラフィカルユーザーインターフェース（graphical user mterfaces、ＧＵＴ）及びウェブベースのユーザーインターフェースが挙げられる。ＵＩは、本明細書に記載される方法及びシステムを使用することができる対話型ツールを提供することができる。例として、本明細書で想定されるＵＩは、医療従事者が遺伝子検査を申し込みし、検査される遺伝子変異体のリストをカスタマイズし、生物医学的レポートを受信及び閲覧することができる、ウェブベースのツールであり得る。
本明細書に開示される方法及びシステムのいくつかの実施形態は、生物医学データベース、ゲノムデータベース、生物医学的レポート、疾患レポート、症例管理分析、並びに、１つ以上のデータベース、１つ以上のアッセイ、１つ以上のデータ若しくは結果からのデータ及び／又は情報に基づく希少変異体確認分析、１つ以上のアッセイに基づく若しくは由来する１つ以上の出力、１つ以上のデータ若しくは結果に基づく若しくは由来する１つ以上の出力、又はこれらの組み合わせを含み得る。
本発明の実施形態は、以下の実施例において更に特定される。これらの実施例は、例示のｗ３／４ｙのみによって与えられることを理解されたい。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合させるために本発明の実施形態の様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、本明細書に示され説明されるものに加えて、本発明の実施形態の様々な変更は、前述の説明から当業者には明らかである。このような変更はまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることも意図される。本明細書に記載される各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書で参照される開示についても組み込まれる。
実施例１
ＦＦＰＥ対血漿サンプルの変異体対立遺伝子頻度判定
実施例１
ＦＦＰＥ対血漿サンプルの変異体対立遺伝子頻度判定
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及びマッチングした腫瘍サンプルからシーケンスデータを得た。固形腫瘍及び白血病などのサンプルを、様々な腫瘍ステージ別に、４つの元の組織タイプにわたって収集した。表１に示すように、４つの組織タイプにわたる合計８５個の血漿サンプルを分析し、１５の膀胱サンプル及びＦＦＰＥ組織とマッチングした３２の肺サンプルを分析した。
図２は、ＦＦＰＥと血漿サンプル間の変異体対立遺伝子頻度の判定を示す。図２に示すように、マッチングしたＦＦＰＥ及び血漿を有する４７のサンプルの中で、３３のＣＯＳＭＩＣホットスポット変異体が血漿中で検出された。３３の変異体のうち、１７の変異体がＦＦＰＥで検出され、ＶＡＦが３％超、６つはＶＡＦが３％以下、１０の野生型ＦＦＰＥが検出された。示されるように、ＦＦＰＥサンプルではなく血漿サンプル内でのみ見つかったほとんどの変異は、クローン性造血（ＣＨ）に関連することが知られているＴＰ５３、ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＳＦ３Ｂ１、及びＣＢＬに集まった。また、ＦＦＰＥサンプルにおいてＣＨ変異も検出し、変異体対立遺伝子頻度は低かった。
図３は、体細胞変異とＣＨ変異との間のＶＡＦの比較を示す。図３に示されるように、体細胞変異のＶＡＦは、ＦＦＰＥにおいて有意に高く（ｐ＝２ｅ－５）、これは腫瘍排出による可能性が高いのに対し、ＣＨ変異のＶＡＦは血漿サンプルにおいて有意に高い（ｐ＝０．０１）。
実施例２
断片サイズ分布
実施例２
断片サイズ分布
実施例１に示されるＶＡＦの判定を使用して、断片サイズプロファイルを構築した。断片サイズプロファイルは、腫瘍造血細胞、健康な造血細胞、及び異常な造血細胞に由来する。３つの主要な変異体のタイプは、血漿、体細胞、ＣＨ、及び生殖細胞系に存在する。これらは、表２に示すように、異なる組織起源に由来する。
変異体と異なる組織起源との間の断片サイズの違いは、変異対立遺伝子を保有するシーケンシングデータから断片を抽出することによって判定された。結果を全てのサンプルにわたって集計した。図４に示されるように、変異の断片サイズ分布は、異なる起源によって異なることが見出された。固形腫瘍（１３８ｂｐのピーク）からの体細胞変異を保有する断片のサイズ分布は、ＣＨ又は白血病（１６６ｂｐのピーク）からの体細胞変異を保有する断片と比較してシフトした。体細胞変異を保有する断片と健康な造血細胞との間では、サイズ分布の有意差は見られなかった（ｐ値＝０．８６）。
図５に示されるように、異なる起源の変異が、断片サイズ分布によって分類された。異なる起源の断片を混合することにより、異なるＶＡＦの１０，０００のＣＨ変異又は体細胞変異を、２０００倍のカバレッジにてｉｎ ｓｉｌｉｃｏでシミュレートした。尤度モデルによって断片サイズ分布をフィッティングすることにより、８１．５％、９２．５％、９８．３％、及び９９．８％の感度が達成され、１％、２．５％、５％、１０％のＣＨ変異に対してそれぞれ、８２％、９２．５％、９７．５％、及び９９．９％の特異性が達成された。
これらの実施例は、悪性又は健康な造血細胞によって放出されるｃｆＤＮＡの断片サイズ分布が、固形腫瘍によって放出されたｃｆＤＮＡとは異なることを実証している。加えて、断片サイズ分布を使用して、体細胞変異と異なる細胞起源とを識別することができる。
実施例３
ｃｆＤＮＡ中のクローン性造血変異体
実施例３
ｃｆＤＮＡ中のクローン性造血変異体
図１に記載の方法を用いて、ｃｆＤＮＡ及びバフィーコート（白血球）ＤＮＡの４０対をプロファイルした。変異体は、ｃｆＤＮＡ及びバフィーコートの両方において、非生殖細胞系列（低ＶＡＦを有する）として観察された。結果は１０６の変異体を含み、そのうち９２が非同義であり、１４が同義であった。図６に示すように、ｃｆＤＮＡについて判定されたＶＡＦは、バフィーコートについて判定されたＶＡＦと相関する。
実施例４
腫瘍変異負荷の測定
実施例４
腫瘍変異負荷の測定
実施例３について分析したサンプルを用いて腫瘍変異負荷を測定した。サンプルには、４０対のｃｆＤＮＡ及びバフィーコートＤＮＡが含まれており、これは図１に記載された方法を用いてプロファイリングされた。
適格変異体を有効パネルサイズで除して求めることにより、未処理のＴＭＢを計算した。適格変異体としては、コーディング領域における変異体、低信頼領域にない変異体、０．４％を超え４０％未満の頻度を有する変異体、５００倍を超えるカバレッジを有する変異体、単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）、挿入及び欠失変異体（Ｉｎｄｅｌ）、非同義及び同義変異体が挙げられ、５０を超えるＣＯＳＭＩＣ数を有する変異体は除かれ、複数ヌクレオチド変異体（ＭＮＶ）は除かれ、並びに‘Ｉ’Ｅ Ｔ２、ＴＰ５３、ＤＮＭＴ３Ａ、及び／又はＣＢＬにおける変異を有する変異体は除かれる。有効パネルサイズには、５００倍を超えるカバレッジを有する総コーディング領域が含まれている。この実施例では、合計変異体には１０２５が含まれ、生殖細胞系列のフィルタリング後の変異体には１２１が含まれ、適格領域の変異体には８６が含まれ、適格領域のＳＮＶ及びＩｎｄｅｌには８１が含まれ、ＣＯＳＭＩＣ除去後の変異体数には８０が含まれ、約０．４％の変異体数には７８が含まれ、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＣＢＬ遺伝子を除く変異体数には７５の変異体が含まれていた。したがって、適格変異体は合計７６であった。有効パネルサイズは１．３０７２９１Ｍｂであった。未処理のＴＭＢは、７６／１．３０７２９＝５７．４変異／Ｍｂであった。調節後ＴＭＢは、（５７．３７０５５－１．５）／０．９１＝６１．４であった。
図７Ａに示すように、全血球ＴＭＢ（Ｔ／Ｎ ＴＭＢ）と比較して、腫瘍限定のＴＭＢ（Ｔ限定のＴＭＢ）のＴＭＢは、０．９１のＲ２で相関し、腫瘍限定のＴＭＢは、ＣＨ変異体により腫瘍の正常なＴＭＢよりも高い。図７Ｂに示すように、クローン性造血調整後Ｔ限定のＴＭＢと比較して、Ｔ／Ｎ ＴＭＢ中のＴＭＢは、０．９３４のＲ２で相関し、腫瘍限定のＴＭＢは、腫瘍の正常なＴＭＢと類似している。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
上記の説明は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示するものである。本発明は、方法及び材料の修正、並びに製造方法及び設備の変更を受け入れる余地がある。このような修正は、本開示又は本明細書に開示される本発明の実施を考慮することで当業者に明らかになるであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び趣旨に含まれる全ての修正及び代替をカバーすることを意図する。
公開及び未公開の出願、特許、並びに文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する及び／又はより上位にあることを意図する。
公開及び未公開の出願、特許、並びに文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する及び／又はより上位にあることを意図する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）サンプル中の癌変異体を造血細胞変異体と識別する方法であって、
（ａ）複数の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片を含むｃｔＤＮＡサンプルを得ること、又は得られた前記サンプルを有することと、
（ｂ）前記サンプルから、複数の変異体を含むｃｆＤＮＡ断片を抽出することと、
（ｃ）前記複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行することであって、
（ｉ）癌変異体及び造血細胞変異体を含む、前記複数の変異体のそれぞれについて変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定することと、
（ｉｉ）断片サイズ分布プロファイルを生成して、造血細胞変異体を同定することと、を含む、実行することと、
（ｄ）前記同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定することと、を含む、方法。
（項目２）
前記複数の変異体から生殖細胞系変異体を除去することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生殖細胞系変異体が、データベースフィルタ又は近接フィルタを前記複数の変異体に適用することによって除去される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ｃｆＤＮＡ断片をシーケンシングして、シーケンスデータを得ることを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記シーケンスデータを参照シーケンスと整列させることと、前記シーケンスデータ中の変異体を同定することと、を更に含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ｃｔＤＮＡサンプルが、固形サンプル又は血漿サンプルに由来する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記固形サンプルが、固定されている、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記サンプルが、腫瘍細胞を含む、項目６記載の方法。
（項目９）
前記サンプルが、血清サンプル、糞便サンプル、血液サンプル、又は腫瘍サンプルを含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記方法が、コンピュータ実装方法である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
腫瘍の腫瘍変異負荷を判定する方法であって、
腫瘍細胞を含む生体サンプルからシーケンスデータを得ることと、
前記シーケンスデータから複数の変異体を判定することと、
項目１に記載の方法による複数の変異体における癌変異体の数を判定することであって、癌変異体の数が前記腫瘍の前記腫瘍変異負荷と等しい、癌変異体の数を判定することと、を含む、方法。
（項目１２）
腫瘍を治療する方法であって、
項目１１に記載の方法による、１０以上の癌変異体の腫瘍変異負荷を有する腫瘍を判定することと、
有効量のチェックポイント阻害剤を投与することによって、前記腫瘍を治療することと、を含む、方法。
（項目１３）
前記腫瘍が、大腫瘍、肺腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮腫瘍、胃の腫瘍、黒色腫、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、膀胱腫瘍、及び脳腫瘍からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記チェックポイント阻害剤が、イピムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、スパルタイズマブ、アテゾイツマブ、アベルマブ、及びドゥルバイウマブからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
遺伝的多型データを分析するための電子システムであって、
プロセッサ上で実行され、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンスデータから複数の変異体を同定するように適合されたインフォマティクスモジュールであって、前記複数の変異体は癌変異体及び造血細胞変異体を含む、インフォマティクスモジュールと、
前記複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行するための分析器であって、前記複数の変異体のそれぞれについての変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定するように構成され、また、断片サイズ分布プロファイルを生成するように構成されている、分析器と、
同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定するための分析器と、
前記複数の変異体から除去されない変異体を返すように適合された、ディスプレイモジュールと、を備える、電子システム。
（項目１７）
前記複数の変異体から生殖細胞系変異体を除去するように構成された、データベースフィルタモジュール又は近接フィルタモジュールを更に備える、項目１６に記載のシステム。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）サンプル中の癌変異体を造血細胞変異体と識別する方法であって、
（ａ）複数の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片を含むｃｔＤＮＡサンプルを得ること、又は得られた前記サンプルを有することと、
（ｂ）前記サンプルから、複数の変異体を含むｃｆＤＮＡ断片を抽出することと、
（ｃ）前記複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行することであって、
（ｉ）癌変異体及び造血細胞変異体を含む、前記複数の変異体のそれぞれについて変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定することと、
（ｉｉ）断片サイズ分布プロファイルを生成して、造血細胞変異体を同定することと、を含む、実行することと、
（ｄ）前記同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定することと、を含む、方法。
（項目２）
前記複数の変異体から生殖細胞系変異体を除去することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生殖細胞系変異体が、データベースフィルタ又は近接フィルタを前記複数の変異体に適用することによって除去される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ｃｆＤＮＡ断片をシーケンシングして、シーケンスデータを得ることを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記シーケンスデータを参照シーケンスと整列させることと、前記シーケンスデータ中の変異体を同定することと、を更に含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ｃｔＤＮＡサンプルが、固形サンプル又は血漿サンプルに由来する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記固形サンプルが、固定されている、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記サンプルが、腫瘍細胞を含む、項目６記載の方法。
（項目９）
前記サンプルが、血清サンプル、糞便サンプル、血液サンプル、又は腫瘍サンプルを含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記方法が、コンピュータ実装方法である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
腫瘍の腫瘍変異負荷を判定する方法であって、
腫瘍細胞を含む生体サンプルからシーケンスデータを得ることと、
前記シーケンスデータから複数の変異体を判定することと、
項目１に記載の方法による複数の変異体における癌変異体の数を判定することであって、癌変異体の数が前記腫瘍の前記腫瘍変異負荷と等しい、癌変異体の数を判定することと、を含む、方法。
（項目１２）
腫瘍を治療する方法であって、
項目１１に記載の方法による、１０以上の癌変異体の腫瘍変異負荷を有する腫瘍を判定することと、
有効量のチェックポイント阻害剤を投与することによって、前記腫瘍を治療することと、を含む、方法。
（項目１３）
前記腫瘍が、大腫瘍、肺腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮腫瘍、胃の腫瘍、黒色腫、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、膀胱腫瘍、及び脳腫瘍からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記チェックポイント阻害剤が、イピムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、スパルタイズマブ、アテゾイツマブ、アベルマブ、及びドゥルバイウマブからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
遺伝的多型データを分析するための電子システムであって、
プロセッサ上で実行され、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンスデータから複数の変異体を同定するように適合されたインフォマティクスモジュールであって、前記複数の変異体は癌変異体及び造血細胞変異体を含む、インフォマティクスモジュールと、
前記複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行するための分析器であって、前記複数の変異体のそれぞれについての変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定するように構成され、また、断片サイズ分布プロファイルを生成するように構成されている、分析器と、
同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定するための分析器と、
前記複数の変異体から除去されない変異体を返すように適合された、ディスプレイモジュールと、を備える、電子システム。
（項目１７）
前記複数の変異体から生殖細胞系変異体を除去するように構成された、データベースフィルタモジュール又は近接フィルタモジュールを更に備える、項目１６に記載のシステム。
Claims (17)
- 循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）サンプル中の癌変異体を造血細胞変異体と識別する方法であって、
（ａ）複数の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片を含むｃｔＤＮＡサンプルを得ること、又は得られた前記サンプルを有することと、
（ｂ）前記サンプルから、複数の変異体を含むｃｆＤＮＡ断片を抽出することと、
（ｃ）前記複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行することであって、
（ｉ）癌変異体及び造血細胞変異体を含む、前記複数の変異体のそれぞれについて変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定することと、
（ｉｉ）断片サイズ分布プロファイルを生成して、造血細胞変異体を同定することと、を含む、実行することと、
（ｄ）前記同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定することと、を含む、方法。 - 前記複数の変異体から生殖細胞系変異体を除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記生殖細胞系変異体が、データベースフィルタ又は近接フィルタを前記複数の変異体に適用することによって除去される、請求項２に記載の方法。
- 前記ｃｆＤＮＡ断片をシーケンシングして、シーケンスデータを得ることを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記シーケンスデータを参照シーケンスと整列させることと、前記シーケンスデータ中の変異体を同定することと、を更に含む、請求項４に記載の方法。
- 前記ｃｔＤＮＡサンプルが、固形サンプル又は血漿サンプルに由来する、請求項１に記載の方法。
- 前記固形サンプルが、固定されている、請求項６に記載の方法。
- 前記サンプルが、腫瘍細胞を含む、請求項６記載の方法。
- 前記サンプルが、血清サンプル、糞便サンプル、血液サンプル、又は腫瘍サンプルを含む、請求項６に記載の方法。
- 前記方法が、コンピュータ実装方法である、請求項１に記載の方法。
- 腫瘍の腫瘍変異負荷を判定する方法であって、
腫瘍細胞を含む生体サンプルからシーケンスデータを得ることと、
前記シーケンスデータから複数の変異体を判定することと、
請求項１に記載の方法による複数の変異体における癌変異体の数を判定することであって、癌変異体の数が前記腫瘍の前記腫瘍変異負荷と等しい、癌変異体の数を判定することと、を含む、方法。 - 腫瘍を治療する方法であって、
請求項１１に記載の方法による、１０以上の癌変異体の腫瘍変異負荷を有する腫瘍を判定することと、
有効量のチェックポイント阻害剤を投与することによって、前記腫瘍を治療することと、を含む、方法。 - 前記腫瘍が、大腫瘍、肺腫瘍、子宮内膜腫瘍、子宮腫瘍、胃の腫瘍、黒色腫、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、膀胱腫瘍、及び脳腫瘍からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、及びＰＤ－Ｌ１阻害剤からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤が、イピムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、スパルタイズマブ、アテゾイツマブ、アベルマブ、及びドゥルバイウマブからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
- 遺伝的多型データを分析するための電子システムであって、
プロセッサ上で実行され、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンスデータから複数の変異体を同定するように適合されたインフォマティクスモジュールであって、前記複数の変異体は癌変異体及び造血細胞変異体を含む、インフォマティクスモジュールと、
前記複数の変異体のそれぞれについて分子プロファイリングを実行するための分析器であって、前記複数の変異体のそれぞれについての変異体対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を判定するように構成され、また、断片サイズ分布プロファイルを生成するように構成されている、分析器と、
同定された造血細胞変異体を除去することによって癌変異体を同定するための分析器と、
前記複数の変異体から除去されない変異体を返すように適合された、ディスプレイモジュールと、を備える、電子システム。 - 前記複数の変異体から生殖細胞系変異体を除去するように構成された、データベースフィルタモジュール又は近接フィルタモジュールを更に備える、請求項１６に記載のシステム。
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