JP2019536466A - 核酸分子を同定するための組成物と方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年12月7日に出願された米国特許出願第15/372,279号の利益を主張し、前記出願は参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されている配列リストを含み、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。2017年11月14日に作製された前記ASCIIコピーは、N_018_WO_01_SL.txtという名前で、サイズは5,069バイトである。
開示された本開示は、一般的に核酸を分析するための方法に関する。
本開示は、試料核酸分子の集団の増幅後に、個々の試料核酸から生じる増幅生成物を同定するために、分子指標タグ(「MIT」)を使用して核酸分子をタグ付けするための、改良された方法及び組成物を提供する。さらに、試料核酸分子の配列を決定し、試料調製又は塩基呼び出しの間に生じたエラーを同定し、そして染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定するために、MITを使用する方法が本明細書で提供される。さらに、試料核酸分子とMITの反応混合物を含む組成物と、タグ付き核酸分子の集団と、MITのライブラリーと、MITを使用してタグ付き核酸分子を生成するためのキットとが本明細書に提供される。従って本開示は、試料調製及び塩基呼び出しの間に、特に高スループット配列決定ワークフローの間に導入されるエラーを、出発試料中の核酸分子中に存在する実際の差異から区別するための方法及び組成物を提供する。
試料核酸分子の集団と分子指標タグ(MIT)のセットとを含む反応混合物を形成する工程であって、ここで前記MITは核酸分子であり、MITのセット中の異なるMITの数は10〜1,000であり、試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数と、MITのセット中のMITの多様性の比又はMITのセット中の任意の2種のMITの多様性の比は、少なくとも500:1、1,000:1、10,000:1、又は100,000:1である上記工程;
MITのセットからの少なくとも1種のMITを、試料核酸分子の少なくとも50%の試料核酸セグメントに結合させて、タグ付き核酸分子の集団を生成する工程であって、ここで前記少なくとも1種のMITは、各タグ付き核酸分子上の試料核酸セグメントに対して5’及び/又は3’に位置し、前記タグ付き核酸分子の集団はMITのセットの各MITの少なくとも1つのコピーを含む上記工程;
タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;及び、
タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の結合されたMITの配列と試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定し、こうして試料核酸分子の集団を配列決定する工程。反応混合物中のMIT分子の総数は、典型的には反応混合物中の試料核酸分子の総数よりも大きい。
試料核酸分子の集団と分子指標タグ(MIT)のセットとを含む反応混合物を形成する工程であって、ここでMITは2本鎖核酸分子であり、MITのセット中の異なるMITの数は、10〜100、250、500、1,000、2,000、2,500、又は5,000であり、及び試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数とMITのセット中のMITの多様性の比は、500:1、1,000:1、10,000:1、又は100,000:1を超える上記工程;
MITのセットからの少なくとも1種のMITを試料核酸分子の集団の少なくとも1種の試料核酸分子の試料核酸セグメントに結合させて、タグ付き核酸分子の集団を生成する工程であって、ここで前記少なくとも1種のMITは、各タグ付き核酸分子上の試料核酸セグメントに対して5’及び/又は3’に位置し、そして前記タグ付き核酸分子の集団は、MITのセット中の各MITの少なくとも1つのコピーを含む上記工程;
前記タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;
高スループット配列決定法を使用して、前記タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の、結合MITの配列と試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定する工程であって、ここで、各タグ付き核酸分子上の少なくとも1種のMITの配列は、前記タグ付き核酸分子を生じた個々の試料核酸分子を特定する上記工程;及び
同じ初期試料核酸分子に由来するタグ付き核酸分子の25%未満に見出されるヌクレオチド配列を有する核酸セグメントを同定することにより、増幅エラーを有するタグ付き核酸分子を同定する工程。前記反応混合物中のMIT分子の総数は、典型的には反応混合物中の試料核酸分子の総数よりも大きい。
試料核酸分子の集団を核酸分子指標タグ(MIT)のセットと反応させることにより、タグ付き核酸分子の集団を生成する工程であって、ここで、前記MITのセット中の異なるMITの数は、10〜10,000又は10〜1,000であり、前記試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数と前記MITのセット中のMITの多様性の比は、500:1、1,000:1、10,000:1、又は100,000:1よりも大きく、前記試料核酸分子の少なくともいくつかは、目的の染色体又は染色体セグメント上の複数の標的遺伝子座のうちの1つ又はそれ以上の標的遺伝子座を含み、そして前記試料は、1.0ml以下の血液又は1.0ml以下の血液に由来する血液の画分である工程;
濃縮されたタグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;
タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の結合MITの配列及び試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定して、タグ付き核酸を生じた試料核酸分子の同一性を決定する工程;
決定された同一性を使用して、各標的遺伝子座を含む試料核酸分子の数を数えることにより、各標的遺伝子座についてDNAの量を測定する工程;及び、
コンピュータ上で、前記試料核酸分子中の各標的遺伝子座におけるDNAの量を使用して、目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する工程。反応混合物中のMIT分子の総数は、典型的には反応混合物中の試料核酸分子の総数よりも大きい。
試料由来の試料核酸分子の集団と少なくとも32の分子指標タグ(MIT)のセットとを含む反応混合物を生成する工程であって、MITのセット中の各MITは異なる核酸配列を含む2本鎖核酸分子であり、試料は1.0ml以下の血液に由来し、試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数とMITのセット中のMITの多様性の比は1,000:1より大きく、そして試料核酸分子の少なくともいくつかは、目的の染色体又は染色体セグメント上に少なくとも1,000の標的遺伝子座のうちの1つ又はそれ以上の標的遺伝子座を含む上記工程;
MITのセットからの少なくとも2種のMITを試料核酸分子の集団の各試料核酸分子の試料核酸セグメントに結合させて、タグ付き核酸分子の集団を生成する工程であって、少なくとも2種のMITのそれぞれは、各タグ付き核酸分子上の試料核酸セグメントに対して5’及び/又は3’に位置し、そしてタグ付き核酸分子の集団は、MITのセットの各MITの少なくとも1種のコピーを含む上記工程;
タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;
タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の結合されたMITの配列及び試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定する工程であって、各タグ付き核酸分子上の結合されたMITの配列及び核酸セグメントの少なくとも一部の配列を使用して、同じ対になったMIT核酸セグメントファミリーに属するタグ付き核酸分子を同定し、対になったMIT核酸セグメントファミリーの各メンバー上の少なくとも2種のMITは同一であるか又は相補的であり、MIT核酸セグメントファミリーの各メンバーの核酸分子セグメントは、試料核酸分子の集団の供給源のゲノム上の同じ座標にマッピングされ、そして、試料核酸分子の少なくとも25%は、その配列が決定されるタグ付き核酸分子のライブラリー中に表される上記工程;
試料核酸分子について、各標的遺伝子座に及ぶMIT核酸セグメントファミリーの数を数えることにより、各標的遺伝子座のDNA量を決定する工程;及び
試料核酸分子中の各標的遺伝子座におけるDNA量を使用して、コンピュータ上で、目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する工程。反応混合物中のMIT分子の総数は、典型的には反応混合物中の試料核酸分子の総数よりも大きい。MIT核酸セグメントファミリーは、核酸セグメントに対する同じ相対位置、ならびに同じ断片末端位置及び同じ配列方向(ヒトゲノムに対して正又は負)で、同一のMITを共有する。MITライブラリー調製プロセスに入った各試料核酸分子は、2つのファミリー(1つを正又は負の配向のそれぞれにマッピングすることができる)を生成することができる。MIT核酸セグメントファミリーが、同じ核酸セグメントに対して同じ相対位置及び相補的断片末端位置に相補的MITを含む場合、2種のMIT核酸セグメントファミリーを対にすることができ、一方は正の配向を有し、他方は負の配向を有する。いくつかの実施態様において、対になったMIT核酸セグメントファミリーを使用して、試料核酸分子中の配列の違いの存在を確認することができる。
試料核酸分子の集団と分子指標タグ(MIT)のセットとを反応させることにより、タグ付き核酸分子の集団を生成する工程であって、ここで、試料は2.5、2.0、1.0、又は0.5ml以下であり、MITのセット中の異なるMITの数は、10〜100、200、250、500、1,000、2,000、2,500、5,000、又は10,000の間であり、試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数とMITのセット中のMITの多様性の比は、少なくとも100:1、500:1、1,000:1、10,000:1、又は100,000:1であり、各タグ付け核酸分子は、核酸分子の集団からの核酸セグメントに対して、5’及び3’に位置する1又は2種のMIT、例えばそれぞれ5’及び3’に位置する2種のMITを含み、試料核酸分子の一部は、目的の染色体又は染色体セグメント上の複数の遺伝子座のうちの1つ又はそれ以上の標的遺伝子座を含む上記工程;
タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;
タグ付き核酸分子のライブラリー中の、タグ付き核酸分子の結合MITの配列及び試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定する工程、例えば少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は95%、又は100%の配列を決定する工程であって、各タグ付き核酸分子上の結合MITの配列及び核酸セグメントの少なくとも一部の配列を使用して、同じ対になったMIT核酸セグメントファミリーに属するタグ付き核酸分子を同定し、対になったMIT核酸セグメントファミリーの各メンバー上の少なくとも2種のMITは同一又は相補的であり、及びMIT核酸セグメントファミリーの各メンバーの核酸分子セグメントは試料核酸分子の集団の供給源のゲノム上の同じ座標にマッピングされる上記工程;
試料核酸分子について、各標的遺伝子座に及ぶMIT核酸セグメントファミリーの数を数えることにより、各標的遺伝子座についてDNA量を決定する工程:そして
コンピュータ上で、試料核酸分子中の各標的遺伝子座におけるDNA量を使用して、目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する工程。
反応混合物中のMIT分子の総数は、典型的には、反応混合物中の試料核酸分子の総数よりも大きい。
本開示は、本明細書中で分子指標タグ(MIT)と呼ばれるオリゴヌクレオチドタグを含む方法及び組成物に関し、このタグは、配列決定反応のための試料処理後に、核酸分子の集団から個々の試料核酸分子(すなわち集団のメンバー)を同定するために、試料由来の核酸分子の集団に結合される。いくつかの実施態様において配列決定反応は、試料核酸分子に由来するタグ付き核酸分子に対して行われる高スループット配列決定反応である。独特の識別子に関し、試料中の試料核酸分子の数よりも大きい独特の識別子の多様性を有して、各試料核酸分子を独特の識別子でタグ付けすることを教示する先行技術の方法とは異なり、本開示は典型的には、MITのセット中のMITの多様性よりも多くの試料核酸分子を含む。実際、本明細書の方法及び組成物は、MITのセット中の各異なるMITについて1,000超、1×106超、1×109超、又はさらにそれ以上の出発分子を含むことができる。それでもなおこの方法は、増幅後にタグ付き核酸分子を生じさせる個々の試料核酸分子を同定することができる。
従って1つの態様において、試料核酸分子の集団から個々の試料核酸分子を同定するために配列決定を使用することを場合によりさらに含み得る、試料核酸分子の集団を配列決定する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施態様において、核酸分子の集団は、MITを結合する前にインビトロで増幅されておらず、1×108〜1×1013、又はいくつかの実施態様において1×109〜1×1012、又は1×1010〜1×1012の試料核酸分子を含み得る。いくつかの実施態様において本方法は、核酸分子の集団及びMITのセットを含む反応混合物を形成することを含み、ここで、核酸分子の集団中の核酸分子の総数はMITのセット中のMITの多様性より大きく、少なくとも3種のMITがそのセット内にある。いくつかの実施態様において、MITのセットを使用した結合MITの可能な組み合わせの多様性は、標的遺伝子座に及ぶ試料核酸分子の総数よりも多く、集団中の試料核酸分子の総数よりも小さい。いくつかの実施態様において、MITのセットの多様性は、異なる配列を有する10〜500のMITを含み得る。本明細書の特定の方法及び組成物において、試料中の核酸分子の集団中の核酸分子の総数とセット中のMITの多様性の比は、1,000:1〜1,000,000,000:1であり得る。MITのセットを使用した結合MITの可能な組み合わせの多様性と標的遺伝子座に及ぶ試料核酸分子の総数との比は、1.01:1〜10:1であり得る。本明細書でさらに詳細に論じるように、MITは典型的には、少なくとも部分的に4〜20ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドから構成される。MITのセットは、そのセット中の全てのMITの配列が、少なくとも2、3、4、又は5ヌクレオチドだけ互いに異なるように設計することができる。
本明細書で提供される様々な実施態様において、試料は天然又は非天然の供給源由来であり得る。いくつかの実施態様において、試料中の核酸分子は、生物又は細胞に由来してもよい。任意の核酸分子を使用することができ、例えば試料は、生物又は細胞由来の全ゲノムの一部をカバーするゲノムDNA、mRNA、又はmiRNAを含み得る。ある点では、試料中の全ゲノム又はDNA配列の全長を核酸分子の平均サイズで割ったものを使用して、試料中の核酸分子の数を決定し、全ゲノム又は全DNA配列を表すことができる。さらなる点において、この数を使用して、試料中の標的遺伝子座に及ぶ核酸分子の数を決定することができる。遺伝子座は、単一のヌクレオチド又は1〜1,000、10,000、100,000、100万、又はそれ以上のヌクレオチドのセグメントを含むことができる。非限定的な例として遺伝子座は、単一ヌクレオチド多型、イントロン、又はエクソンでもよい。いくつかの実施態様において、遺伝子座は挿入、欠失、又は転位を含み得る。いくつかの実施態様において、試料は血液、血清、又は血漿試料を含み得る。いくつかの実施態様において、試料は、血液、血清、又は血漿中に浮遊性DNA(例えば、循環性無細胞腫瘍DNA又は循環性無細胞胎児DNA)を含み得る。これらの実施態様において、試料は、典型的には哺乳動物又はヒトなどの動物由来であり、典型的には長さ約160ヌクレオチドの長さの断片で存在する。いくつかの実施態様において、浮遊性DNAは、遠心分離による細胞破片及び血小板の除去後に、EDTA−2Na管を使用して血液から単離される。血漿試料は、例えばQIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用してDNAが抽出されるまで−80°Cで保存することができる(例えばHamakawa et al., Br J Cancer. 2015; 112:352-356)。しかし試料は他の供給源に由来してもよく、そしていかなる生物由来の核酸分子もこの方法に使用することができる。いくつかの実施態様において、細菌及び/又はウイルスに由来するDNAを使用して、特に環境及び生物多様性サンプリングなどの混合集団内の真の配列変異体を分析することができる。
本明細書に提供される方法においてMITを試料核酸分子又は核酸セグメントに結合させる工程は、典型的には反応混合物を形成することを含む。そのような方法中に形成された反応混合物は、それ自体が本開示の特有の態様であり得る。本明細書に提供される反応混合物は、本明細書に詳細に開示されるように試料核酸分子を含み、及び本明細書に詳細に開示されるようにMITのセットを含むことができ、ここで、試料中の核酸分子の総数はMITのセット中のMITの多様性より大きい。いくつかの実施態様において、試料中の核酸分子の総数はまた、結合MITの可能な組み合わせの多様性よりも大きい。
本明細書でより詳細に考察される分子指標タグ(MIT)は、当業者が認識する方法を使用して反応混合物中の試料核酸分子に結合させることができる。いくつかの実施態様において、MITは、単独で、すなわち追加のオリゴヌクレオチド配列なしで結合することができる。いくつかの実施態様において、MITは、本明細書でより詳細に考察されるように他のヌクレオチド配列をさらに含み得るより大きなオリゴヌクレオチドの一部であり得る。例えばこのオリゴヌクレオチドはまた、核酸セグメントに特異的なプライマー又はユニバーサルプライマー結合部位、Yアダプターなどの配列決定アダプター、ライブラリータグ、連結アダプタータグなどのアダプター、及びこれらの組み合わせも含み得る。当業者は、配列決定、特に高スループット配列決定に有用なタグ付き核酸分子を生成するために、様々なタグをオリゴヌクレオチドに組み込む方法を認識するであろう。本開示のMITは、核酸分子の多様性が小さいため、それらがYアダプター及び/又はユニバーサル配列などの追加の配列と共により容易に使用され、従って、アダプター上の追加の配列とより容易に組み合わせて、より小さい従ってより費用効果の高いMIT含有アダプターのセットを生み出すことができるという点で有利である。
いくつかの実施態様において、本開示の方法は、タグ付き核酸分子の配列を決定する前に、タグ付き核酸分子を増幅することを含む。典型的には、当該分野で知られているように、高スループット配列決定のための試料調製中に複数回の増幅が行われる。これらの増幅工程は全て、一般にMITが核酸分子に結合された後に行われるが、試料核酸分子の増幅は、いくつかの実施態様においてMIT結合の前に行われてもよい。特定の実施態様において、MITが試料核酸分子の試料核酸セグメントに結合した後、少なくとも1、2、3、4、5、又は6回の増幅反応が行われる。高スループット配列決定法では、例えば増幅反応は、試料中の最初の核酸を増幅して配列決定すべきライブラリーを生成し、典型的には固体支持体上でライブラリーをクローン増幅し、そして追加の増幅反応により、試料識別バーコードなどの追加の情報又は機能を付加することを含み得る。後述するように、バーコードは、増幅過程中に及び標的濃縮の前及び/又は後にいつでも加えることができる。タグ付けされた試料核酸分子は、一方又は両方の末端に1つ又はそれ以上のバーコードを有することができる。各増幅反応は典型的には、温度サイクリング又は等温増幅中に起きるような天然の生化学反応サイクルのいずれかによる複数のサイクル(例えば、サイクル数が範囲の下端の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20回から、範囲の上端の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、又は100回まで)の増幅を含む。いくつかの例において、本明細書に提供される実施態様のいずれの方法も、少なくとも10、15、20、25、又は30サイクル(例えば、PCR増幅における熱サイクル)の増幅が行われる増幅工程を含み得る。
本開示の方法は、特定の実施態様において、試料核酸分子の配列を決定する工程の前に標的濃縮工程を含むことができる。いくつかの実施態様において標的濃縮は、多重PCR反応、特に片側PCR反応を使用して行われる。これらの実施態様において、ユニバーサルプライマー及び標的試料核酸セグメントの内部配列に結合する複数の標的特異的プライマーが使用されて、ユニバーサルプライマー結合配列と標的特異的の両方を使用して、タグ付き核酸分子からアンプリコンを生成するが、これらの配列のいずれか又は両方を欠くタグ付き核酸分子からはアンプリコンは生成されない。いくつかの実施態様において、ユニバーサルプライマーは、DNAの一方の鎖の5’ユニバーサルプライマー結合部位に結合することができ、標的特異的プライマーは、相補的DNAのもう一方の鎖の上のユニバーサルプライマー結合部位に対して3’の核酸セグメント内のDNA鎖の相補体に結合することができる。結合方向は逆にすることができ、ユニバーサルプライマーが一方の鎖の3’ユニバーサルプライマー結合部位に結合して、標的特異的プライマーが、相補的DNAのもう一方の鎖上のユニバーサルプライマー結合部位の5’の核酸セグメント内のDNA鎖の相補体に結合することができる。
いくつかの実施態様において、核酸分子を増幅することは、増幅反応混合物を形成することを含むことができる。本開示に有用な増幅反応混合物は、特にPCR増幅のために、当該分野において公知の成分を含み得る。例えば、反応混合物は、典型的にはヌクレオチド三リン酸などのヌクレオチドの供給源、ポリメラーゼ、マグネシウム、及びプライマー、ならびに任意選択で1つ又はそれ以上のタグ付き核酸分子を含む。特定の実施態様における反応混合物は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、タグ付き核酸分子、ならびに前進及び/又は逆進プライマーのセットを組み合わせることによって形成される。従って、特定の実施態様において、タグ付き核酸分子の集団及びプライマーのプールを含む反応混合物が本明細書で提供され、それらの少なくともいくつかは、タグ付き核酸分子の集団内のタグ付き核酸分子に結合する。MIT配列に加えて、タグ付き核酸分子は、例えば配列決定反応及び/又はユニバーサル増幅反応のための結合プライマーのためのアダプター配列を含み得る。いくつかの実施態様において、タグ付き核酸配列を増幅するための前進及び逆進プライマーは、全てのタグ付き核酸配列が増幅されるように、タグ付き核酸分子に結合しているユニバーサルプライマー結合配列に結合するように設計することができる。いくつかの実施態様において、前進及び逆進プライマーは、一方がユニバーサルプライマー結合配列に結合し、例えば片側PCRにおけるように、他方が試料核酸セグメント内の標的特異的配列に結合するように設計することができる。他の実施態様において、前進及び逆進プライマーは両方とも、例えば両側PCRにおけるように、試料核酸セグメントの配列内の標的特異的配列に結合するように設計することができる。
いくつかの実施態様において、PCR熱サイクリングの前に重合を低減又は防止するためにホットスタートPCRが使用される。例示的なホットスタートPCR法は、反応混合物がより高い温度に達するまで、DNAポリメラーゼの初期阻害又は反応成分反応物の物理的分離を含む。いくつかの実施態様において、マグネシウムの徐放が使用される。DNAポリメラーゼは活性のためにマグネシウムイオンを必要とし、従ってマグネシウムは化合物に結合することによって反応物から化学的に分離され、そして高温でのみ溶液中に放出される。いくつかの実施態様において、阻害剤の非共有結合が使用される。この方法では、ペプチド、抗体、又はアプタマーを低温で酵素に非共有結合されて、その活性を阻害することができる。高温でインキュベートした後、阻害剤が放出されて反応が始まる。いくつかの実施態様において、低温でほとんど活性を示さない修飾DNAポリメラーゼなどの低温感受性Taqポリメラーゼが使用される。いくつかの実施態様において、化学修飾が用いられる。この方法では、分子はDNAポリメラーゼの活性部位のアミノ酸の側鎖に共有結合される。分子は、反応混合物を高温でインキュベートすることによって酵素から放出される。分子が放出されると、酵素は活性化される。
いくつかの実施態様において、タグ付き核酸分子の配列は、当該分野において公知の方法、特に高スループット配列決定法によって直接決定される。より典型的には、タグ付き核酸分子の配列は、高スループット配列決定法のための試料調製中に行われる1回以上の増幅ラウンドの後に決定される。このような増幅は、典型的にはライブラリー調製、クローン増幅、及び試料バーコードなどのさらなる配列又は機能を試料核酸分子に付加するための増幅を含む。高スループット配列決定法の試料調製中に、タグ付き核酸分子は典型的には1つ又はそれ以上の固体支持体上でクローン的に増幅される。次にこれらのモノクローナル又は実質的にモノクローナルのコロニーは配列決定反応に供される。さらに、次世代配列決定法の試料調製は、典型的にはライブラリー調製後及びクローン増幅前の標的化増幅反応を含み得る。このような標的化増幅は多重増幅反応であり得る。
タグ付き核酸分子の配列を決定する工程は、試料核酸分子、試料核酸セグメント、又は標的遺伝子座の少なくとも一部の配列、及び試料核酸セグメントに結合したままであるタグの配列(MITの配列を含む)を決定することを含む。いくつかの実施態様において、同じ最初のタグ付き核酸分子に由来するタグ付き核酸分子のコピーは、タグ付き核酸分子に結合したMIT配列を比較することによって同定することができる。同じ初期タグ付き核酸分子に由来するコピーは、試料核酸セグメントに対して同じ位置に結合した同じMITを有するであろう。いくつかの実施態様において、断片特異的挿入体末端は生物のゲノム内の特定の位置にマッピングされ、これらのマッピングされた位置又は本明細書で考察されるような断片特異的挿入体末端自体の配列は、MITの配列と共に使用されて、コピーが由来する最初のタグ付き核酸分子が同定される。いくつかの実施態様において、相補的MIT及び相補的核酸セグメント配列を含むタグ付き核酸分子、すなわち、同じ核酸分子に由来し試料核酸分子のプラス鎖及びマイナス鎖を表すタグ付き核酸分子が同定され、対になる。いくつかの実施態様において、対になったMITファミリーは、元の配列中の差異を証明するために使用される。配列におけるいかなる変化も、試料核酸分子に由来するタグ付き核酸分子の全てのコピーに存在するはずである。この情報は、試料のプラス鎖及びマイナス鎖に由来するタグ付き核酸分子の配列が試料核酸分子の配列の違いを表し、試料調製中に導入された変化でも又は配列決定中の塩基呼び出しエラーでもないというさらなる確信を提供する。
本明細書に開示される様々な実施態様において使用される構成要素のいずれも、キットに組み立てることができる。キットは、本明細書に開示されるMITのセットのいずれかを収容する容器を含み得る。MITは、範囲の下端の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15ヌクレオチドの長さから、範囲の上端の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、及び30ヌクレオチドの長さまでであり得る。MITは2本鎖核酸アダプターであり得る。これらのアダプターは、塩基対合2本鎖ポリヌクレオチドセグメントと少なくとも1つの非塩基対合1本鎖ポリヌクレオチドセグメントとを有する、Yアダプター核酸分子の一部をさらに含み得る。これらのYアダプターは、MITの配列以外に同一の配列を含み得る。Yアダプターの2本鎖ポリヌクレオチドセグメントは、範囲の下端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、及び25ヌクレオチドの長さから、範囲の上端の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、及び100ヌクレオチドの長さまでであり得る。Yアダプターの1本鎖ポリヌクレオチドセグメントは、範囲の下端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、及び25ヌクレオチドの長さから、範囲の上端の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、及び100ヌクレオチドの長さまでであり得る。
いくつかの実施態様において、MITを使用して個々の試料核酸分子を同定するために本明細書で提供される方法は、試料中の目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する方法の一部として使用され得る。実施例3に提供される数学的証拠によって証明されるように、試料中の目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定するための方法の一部として、個々の試料核酸分子を同定するためのMITを含む方法を使用することにより、大幅なコスト節約と試料節約を達成することができる。例えば、実施例1に示された個々の試料核酸分子を同定するためのMITの使用で得られたノイズの減少及び精度の向上に基づいて、わずか100μlの血漿を使用して、許容し得る信頼性のある結果を得ることができる。さらに、許容し得る信頼性のある結果は、わずか1,780,000の配列決定法読み取りで達成することができる。従って、現在の方法における2つの重要な制限、すなわち試料量とコストとを克服することができる。
試料核酸分子と分子指標タグ(MIT)のセットとの反応混合物を形成してタグ付き核酸分子の集団を生成する工程であって、ここで、試料核酸分子の少なくともいくつかは、目的の染色体又は染色体セグメント上の複数の標的遺伝子座のうちの1つ又はそれ以上の標的遺伝子座を含む上記工程と;
タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程と;
タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の結合したMITの配列及び試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定して、タグ付き核酸を生じた試料核酸分子の同一性を決定する工程と;
決定された同一性を使用して、各標的遺伝子座を含む試料核酸分子の数を数えることにより、各標的遺伝子座についてDNAの量を測定する工程と;
試料核酸分子中の各標的遺伝子座におけるDNAの量を使用して、コンピュータ上で、目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する工程であって、ここで、標的遺伝子座の数及び試料の容量は、コピー数決定のための所望の感度及び所望の特異性を達成するのに有効な量の全標的遺伝子座を提供する上記工程と、を含む。
全標的遺伝子座TLは、試料中の各標的遺伝子座に及ぶ試料核酸分子の総数Cと、試料中の標的遺伝子座の数Lとの積として定義することができ、TL=C×Lである。有効量EAは、目標感度及び特異性について特定の数の全標的遺伝子座を得るのに必要な量として定義することができる。いくつかの実施態様において、全標的遺伝子座の数は、範囲の下端の100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、及び100,000の全標的遺伝子座から、範囲の上端の500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000、及び10,000,000の全標的遺伝子座までであり得る。有効量は、試料調製効率及び混合試料中のDNAの割合、例えば母体血液試料中の胎児の割合を考慮することができる。実施例3の表1及び3は、本開示の異なる方法について目標感度及び特異性を得るために必要とされる全標的遺伝子座と同じである配列決定リードの総数を示す。いくつかの実施態様において、試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数は、MITのセット中のMITの多様性よりも大きい。さらなる態様において、試料は2つの遺伝的に異なるゲノムの混合物を含む。例えば混合物は、循環性無細胞腫瘍DNA及び正常DNA、又は母体DNA及び胎児DNAを含む血液又は血漿試料であり得る。
生物学的現象又は医学的状態の存在又は非存在を検出するための当該分野において公知のほとんどの方法は、単一仮説棄却検定の使用を含み、ここでは、状態と相関する計量値が測定され、計量値がある閾値の片側にある場合、その状態が存在し、計量値が閾値の反対側にある場合は、その状態が存在しない。単一仮説棄却検定では、帰無仮説と対立仮説で決定を行うときに帰無仮説のみを調べる。代替分布を考慮しないと、観察データが与えられたときに各仮説の尤度を推定することはできず、従って呼び出しに対する信頼度を計算することはできない。従って単一仮説棄却検定では、特定のケースに関連する感情無しで、「はい」又は「いいえ」の答えを得る。
2種のMITを組み込むことによって各試料核酸分子からタグ付き核酸分子を生成することにより試料中のDNA分子の数を決定するための方法が、本明細書に開示される。上記の目的を達成するための手順、続いて単一分子又はクローン配列決定法が本明細書で開示される。
現在の配列決定アプローチを使用して、試料中の対立遺伝子の分布を推定することができる。そのような方法の1つは、ショットガン配列決定と呼ばれるプールDNAから配列を無作為にサンプリングすることを含む。配列決定データ中の特定の対立遺伝子の比率は、典型的には非常に低く、単純な統計により決定され得る。ヒトゲノムは約30億の塩基対を含む。そのため、使用した配列決定法が100bpのリードを作製する場合、3,000万回の配列読み取り毎に特定の対立遺伝子が約1回測定される。
試料核酸分子を同定するための例示的ワークフロー
高スループット配列決定法ワークフローにおいて試料核酸分子の増幅後に、試料核酸分子を同定するための方法の例が本明細書に提供される。そのような方法を使用して作製される非限定的な例示的アンプリコンの構造を図3に示す。核酸源のセットは、天然の供給源から核酸を単離することによって調製される。例えば循環性無細胞DNAは、既知の方法を使用して標的患者からの血液又はその画分の試料から単離することができる。血液中の試料核酸のいくつかは、1つ又はそれ以上の標的部位を含み得る。試料核酸分子は、クレノウラージ断片を用いた平滑末端修復反応において全てのオーバーハングが除去されるように処理され、全ての5’末端がリン酸化されることを確実にするためにポリヌクレオチドキナーゼが用いられる。クレノウ断片(エキソ)を使用して平滑末端を修復した試料核酸分子に3’アデノシン残基を付加して、連結効率を高める。6ヌクレオチドの長さで、それぞれが他の全てのMITと少なくとも2塩基の相違を有する206のMITのセットは、図1に例示されるように、標準的な高スループット配列決定Yアダプターの3’Tオーバーハングに隣接する2本鎖ポリヌクレオチド配列に含まれるように設計される。次に、それぞれが異なるMITを含むYアダプターのセットを、連結反応においてリガーゼを使用して各試料核酸分子の両端に連結して、タグ付き核酸分子の集団を生成する。連結反応のために、10,000の試料核酸分子を206のMIT含有Yアダプターのライブラリーでタグ付けする。得られたタグ付き核酸分子の集団は、図1に示すように、試料核酸分子の両端に連結したMITを有するYアダプターを含み、その結果、MITは、タグ付き核酸分子の挿入体とも呼ばれる試料核酸セグメントの末端に連結される。
試料核酸分子に対するMITを使用するエラー率の減少
高スループット配列決定用試料調製ワークフローにおいて増幅エラーを同定するためにMITを使用することによって提供されるエラー率の減少を証明する例が、本明細書に提供される。各実験において、58μl(最終濃度5.75nM)中にヒトゲノムの10,000の投入コピー(10,000コピー×(3,000,000,000bp/ゲノム)/(150bp/核酸分子)=2×1011全試料核酸分子)を含む2×1011全試料核酸分子を有する2つの独立したDNA試料を使用して、本明細書に開示されたように5’末端にMIT及び3’末端にMITを有するタグ付き核酸分子のライブラリーを作製する、3つの実験を実施した。この実験のために、0.5〜2μMの濃度の196のMITのセットを使用して、反応混合物中のMITの総数と反応混合物中の試料核酸分子の総数との比が約85:1〜約350:1になるようにした。示されたように2×1011の全試料核酸分子を有する試料に対して、196のMITのみ、又は2種のMITの約40,000の組み合わせが使用された。
MITを使用してコピー数を決定するための少ない試料量を示す数学的分析
この実施例は、MITを使用するコピー数決定について所望の感度及び所望の特異性を達成するために有効量の全標的遺伝子座を提供する標的遺伝子座の数及び血漿試料容量の分析を提供する。2つのゲノムであるG1及びG2の混合物を有する試料において、目的の染色体又は染色体セグメントのコピー数を、ゲノムのうちの1つについて決定することができる。G1及びG2は目的の染色体の様々なコピー数、例えば染色体のセット中の各染色体の2つのコピー、別のセットの1つのコピーなどを有することができる。G2が、既知のコピー数(典型的には、2染色体性であると予想される1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメント)を有するゲノム上に1つ以上の参照染色体又は染色体セグメントを有し、及び未知のコピー数(可能なコピー数は既知であると仮定されるが)を有するゲノム上に1つ又はそれ以上の目的の染色体又は染色体セグメントを有すると仮定する。真のコピー数が未知である目的の染色体又は染色体セグメントのG2のコピー数を推定することができる(可能なコピー数のセットが知られている場合)。参照染色体又は染色体セグメント及び目的の染色体又は染色体セグメントの両方の上の、G1のコピー数は知られていることに留意されたい。測定技術は、核酸分子を捕捉し、それが1つ又はそれ以上の参照染色体もしくは染色体セグメント、又は1つ又はそれ以上の目的の染色体もしくは染色体セグメントに属するかどうかを同定することとしてモデル化され、ここにエラーの可能性がある。
この方法では、試料核酸分子の数が、1つ又はそれ以上の参照染色体又は染色体セグメントと1つ又はそれ以上の目的の染色体又は染色体セグメントに対して比較される。タグ付き核酸分子が配列決定されると、1つ又はそれ以上の参照染色体又は染色体セグメント及び1つ又はそれ以上の目的の染色体又は染色体セグメントから、タグ付き核酸分子を配列決定する等しい確率があると仮定する。この確率をpで表し、p=0.5である。使用可能な検定統計量の例は、1つ又はそれ以上の目的の染色体又は染色体セグメントからの核酸分子の数(nt)と観察された核酸分子の総数(n)との比率である。
方法1で説明した定量的アプローチと同様に、既知のSNPでヘテロ接合率を調べる分子ベースの方法を使用できる。このアプローチでは、1つ又はそれ以上の目的の染色体又は染色体セグメント上のSNPについて、A又はBの対立遺伝子値をとることができるの検定統計量は、参照対立遺伝子の観察された比率となる。特に、所定のSNPについて、A及びBがそれぞれA及びB対立遺伝子を有する観察された分子の数を示すとする。こうしてヘテロ接合率を定義することができる。
上記で分析した方法ならびに試料調製とライブラリー調製の効率を使用して、特定の感度及び特異性について、特定の数の独特の配列決定リードを得るのに必要な試料の量を計算することが可能である。例示的なワークフローは、試料採取→試料調製→ライブラリー調製→ハイブリッド捕捉→バーコード化→配列決定であろう。このワークフローに基づいて、各工程の効率に関するいくつかの仮定を前提として、逆方向に作業して試料要件を決定することが可能である。この例では、バーコード工程は大きな影響を与えないと想定される。染色体又は染色体セグメントからのN個の独特の配列決定リードが必要とされる場合、好ましいアプローチは核酸分子を徹底的に配列決定することである。「クーポンコレクターの問題(Coupon Collector’s Problem)」に基づく結果(例えば、Dawkins, Brian (1991), "Siobhan's problem: the coupon collector revisited", The American Statistician, 45 (1): 76-82を参照)を、全ての核酸分子を配列決定する特定の確率を有するために、どれだけの配列リードが必要であるかについての指針として使用することができる。下の表を参照されたい。例えば、配列決定すべき1,000の独特のタグ付き核酸分子がある場合、全ての核酸分子を観察する99%の確率を有するためには、約12倍のリード深度が必要である。この推定は、各配列リードが、1,000のタグ付き核酸分子のうちのいずれかである可能性が等しいと仮定する。そうでない場合、計算された係数12は経験的に測定されたものと置き換えることができる。ライブラリー調製及びハイブリッド捕捉工程中に、血管内に存在する試料核酸分子のいくらかは失われる。これらの過程で75%の分子が失われる(すなわち、25%の試料核酸分子が保持される)と仮定すると、バーコード化のために十分なタグ付き核酸分子が残っていることを確かめるために、元の試料中により多くの核酸分子が必要とされる。ここで二項分布を使用して、ライブラリー及びハイブリッド捕捉工程の後に、ある確率で特定の数の核酸分子を有するのに必要な試料中の核酸分子の数を推定することができる。
Claims (30)
- 試料核酸分子の集団を配列決定する方法であって、以下の工程:
試料核酸分子の集団と分子指標タグ(MIT)のセットとを含む反応混合物を形成する工程であって、ここで前記MITは核酸分子であり、MITのセット中の異なるMITの数は10〜1,000であり、試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数と、MITのセット中のMITの多様性の比は、少なくとも1,000:1である上記工程;
MITのセットからの少なくとも1種のMITを、試料核酸分子の少なくとも50%の試料核酸セグメントに結合させて、タグ付き核酸分子の集団を形成する工程であって、ここで前記少なくとも1種のMITは、各タグ付き核酸分子上の試料核酸セグメントに対して5’及び/又は3’に位置し、前記タグ付き核酸分子の集団はMITのセットの各MITの少なくとも1つのコピーを含む上記工程;
タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;及び、
タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の結合されたMITの配列と試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定し、これにより、試料核酸分子の集団を配列決定する工程、を含む方法。 - 各タグ付き核酸分子上の少なくとも1種のMITの配列を使用して、タグ付き核酸分子を生じさせた個々の試料核酸分子を同定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記個々の試料核酸分子を同定する前に、前記試料核酸セグメントのうちの少なくとも1つの前記決定された配列を、前記試料の供給源のゲノム内の位置にマッピングする工程と、マッピングされたゲノム位置を少なくとも1種のMITの配列と共に使用して、タグ付き核酸分子を生じさせる個々の試料核酸分子を同定する工程とをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 2種のMITが各試料核酸セグメントに結合しており、反応混合物中のMIT分子の総数は試料核酸分子の総数より少なくとも2倍多く、前記MITは少なくとも2種の異なる試料核酸分子に結合してタグ付き核酸分子の集団を形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記MITが2本鎖核酸分子である、請求項1に記載の方法。
- 各MITがYアダプター核酸分子のセットのYアダプター核酸分子の一部を含み、前記セットの各Yアダプターは、塩基対合した2本鎖ポリヌクレオチドセグメント及び少なくとも1種の塩基対合していない1本鎖ポリヌクレオチドセグメントを含み、前記MIT配列以外の前記セット中の各Yアダプター核酸分子の配列が同一であり、そして前記MITが、前記塩基対合2本鎖ポリヌクレオチドの一部である2本鎖配列である、請求項5に記載の方法。
- 前記2本鎖ポリヌクレオチドセグメントが5〜25ヌクレオチドの長さであり、MITを含まず、そして1本鎖ポリヌクレオチドセグメントが5〜25ヌクレオチドの長さである、請求項6に記載の方法。
- 前記MITが4〜8ヌクレオチドの長さであり、前記MITのセット中の各MITの配列が、前記セット中の他の全てのMIT配列と少なくとも2ヌクレオチド異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物中のMIT分子の総数が、前記反応混合物中の試料核酸分子の総数より多く、前記少なくとも1種のMITの結合は連結反応によって行われ、前記方法は、前記配列を決定し、ハイブリッド捕捉を使用して標的試料核酸分子を含むタグ付き核酸分子を濃縮することをさらに含み、そして前記方法は、ハイブリッド捕捉後かつ配列を決定する前に、タグ付き核酸分子のライブラリーを固体支持体又は複数の固体支持体上にクローン増幅することをさらに含み、配列の決定は高スループット配列決定法を使用して行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記同定は、前記決定された配列を使用してタグ付き核酸分子のライブラリー中の対になったMIT核酸セグメントファミリーを同定することを含み、対になったMIT核酸セグメントファミリーの各メンバー上の前記少なくとも1種のMITは同一であるか又は相補的であり、MIT核酸セグメントファミリーの各メンバーの核酸セグメントは、試料核酸分子の集団の供給源のゲノム上の同じ座標にマッピングされ、そして対になったMIT核酸セグメントの各メンバーは、同じ個々の試料核酸分子から生成され、これにより、同じ個々の試料核酸分子から生じた増幅核酸分子が同定される、請求項1に記載の方法。
- 試料核酸分子の集団が哺乳動物試料に由来し、MITのセット中の任意の2種のMITの組み合わせの多様性は、哺乳動物試料の供給源である哺乳動物のゲノムの複数の標的遺伝子座の各標的遺伝子座に及ぶ試料核酸分子の総数を超える、請求項1記載の方法。
- 試料核酸分子の集団がヒト血液又はその画分の試料に由来し、前記試料核酸分子の少なくとも一部が、目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメント由来の複数の標的遺伝子座のうちの少なくとも1つの標的遺伝子座を含む、請求項2記載の方法であって、前記方法は、
前記同定された試料核酸分子を使用して、各標的遺伝子座を含む試料核酸分子の数を数えることにより、各標的遺伝子座についてDNAの量を測定する工程;及び
コンピュータ上で、試料核酸分子中の各標的遺伝子座におけるDNAの量を使用して、目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する工程をさらに含む、上記方法。 - 前記試料が0.5ml以下の血漿を含む、請求項12に記載の方法。
- 試料核酸分子の集団が循環性無細胞ヒトDNAを含む試料に由来し、MITのセット中の任意の2種のMITの組み合わせの多様性が、ヒトゲノム内の各標的遺伝子座に及ぶ試料核酸分子の総数を超え、反応混合物中のMIT分子の総数が、反応混合物中の試料核酸分子の総数より少なくとも2倍大きい、請求項1に記載の方法。
- 高スループット配列決定法のための試料調製からの増幅エラーを同定するための、又は試料由来のタグ付き核酸分子の集団の高スループット配列決定反応における塩基呼び出しエラーを同定するための方法であって、以下の工程:
試料核酸分子の集団と分子指標タグ(MIT)のセットとを含む反応混合物を形成する工程であって、ここでMITは2本鎖核酸分子であり、MITのセット中の異なるMITの数は、10〜1,000であり、及び試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数とMITのセット中のMITの多様性の比は、1,000:1を超える上記工程;
MITのセットからの少なくとも1種のMITを試料核酸分子の集団の少なくとも1種の試料核酸分子の試料核酸セグメントに結合させて、タグ付き核酸分子の集団を形成する工程であって、ここで前記少なくとも1種のMITは、各タグ付き核酸分子上の試料核酸セグメントに対して5’及び/又は3’に位置し、そして前記タグ付き核酸分子の集団は、MITのセット中の各MITの少なくとも1つのコピーを含む上記工程;
前記タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;
高スループット配列決定法を使用して、前記タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の、結合MITの配列と試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定する工程であって、ここで、各タグ付き核酸分子上の少なくとも1種のMITの配列は、前記タグ付き核酸分子を生じた個々の試料核酸分子を特定する上記工程;及び
同じ初期試料核酸分子に由来するタグ付き核酸分子の25%未満に見出されるヌクレオチド配列を有する核酸セグメントを同定することにより、増幅エラーを有するタグ付き核酸分子を同定する工程、を含む方法。 - 前記試料が、長さが50ヌクレオチドを超えかつ500ヌクレオチド以下であるゲノムDNAの断片を有し、前記MITのセット中の任意の2種のMITの組み合わせの数が、ゲノム中の標的遺伝子座に及ぶDNA断片の総数を超える、請求項15に記載の方法。
- 2種のMITが各試料核酸セグメントに結合しており、反応混合物中のMIT分子の総数が試料核酸分子の総数より少なくとも2倍多く、及び前記セット中のMITは少なくとも2種の異なる試料核酸分子に結合してタグ付き核酸分子の集団を形成する、請求項15に記載の方法。
- 各MITがYアダプター核酸分子のセットのYアダプター核酸分子の一部を含み、前記セットの各Yアダプターが、塩基対合した2本鎖ポリヌクレオチドセグメントと少なくとも1種の塩基対合していない1本鎖ポリヌクレオチドセグメントとを含み、前記MIT配列以外の、セット中の各Yアダプター核酸分子の配列が同一であり、そしてMITが、前記塩基対合した2本鎖ポリヌクレオチドセグメントの一部である2本鎖配列である、請求項15に記載の方法。
- 前記2本鎖ポリヌクレオチドセグメントが5〜25ヌクレオチドの長さであり、MITを含まず、そして1本鎖ポリヌクレオチドセグメントが5〜25ヌクレオチドの長さである、請求項18に記載の方法。
- 標的個体からの又は標的個体の母親からの血液又はその画分の試料中の、標的個体からの目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する方法であって、以下の工程:
試料核酸分子の集団を核酸分子指標タグ(MIT)のセットと反応させることにより、タグ付き核酸分子の集団を形成する工程であって、ここで、前記MITのセット中の異なるMITの数は10〜1,000であり、前記試料核酸分子の集団中の試料核酸分子の総数と前記MITのセット中のMITの多様性の比は、1,000:1よりも大きく、前記試料核酸分子の少なくともいくつかは、目的の染色体又は染色体セグメント上の複数の標的遺伝子座のうちの1つ又はそれ以上の標的遺伝子座を含み、そして前記試料は、1.0ml以下の血液又は1.0ml以下の血液に由来する血液の画分である工程;
タグ付き核酸分子の集団を増幅して、タグ付き核酸分子のライブラリーを作製する工程;
タグ付き核酸分子のライブラリー中のタグ付き核酸分子の結合MITの配列及び試料核酸セグメントの少なくとも一部の配列を決定して、タグ付き核酸を生じた試料核酸分子の同一性を決定する工程;
決定された同一性を使用して、各標的遺伝子座を含む試料核酸分子の数を数えることにより、各標的遺伝子座についてDNAの量を測定する工程;及び
コンピュータ上で、前記試料核酸分子中の各標的遺伝子座におけるDNAの量を使用して、目的の1つ又はそれ以上の染色体又は染色体セグメントのコピー数を決定する工程、を含む方法。 - 標的遺伝子座の数及び試料の容量が、コピー数を決定するための所望の感度及び所望の特異性を達成するための有効量の全標的遺伝子座を提供する、請求項20に記載の方法。
- 前記複数の標的遺伝子座が1,000の標的遺伝子座を含み、前記試料が1.0ml以下の血漿を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記反応混合物中のMIT分子の総数が前記反応混合物中の試料核酸分子の総数よりも多く、前記タグ付き核酸分子の集団が連結反応を使用して形成され、試料中の前記全標的遺伝子座は、所望の特異性及び所望の感度を満たすのに必要な全標的遺伝子座の数より少なくとも4倍大きい請求項21に記載の方法。
- 標的遺伝子座の数及び試料の容量が試料中に少なくとも500,000の全標的遺伝子座を提供し、MITのセットが少なくとも32のMITを含み、試料が母親由来であり、かつ母体核酸と比較して少なくとも3%の胎児核酸を含み、そして所望の特異性が99%であり、所望の感度が99%である、請求項21に記載の方法。
- 前記試料が0.5ml以下の血液であるか、又は前記試料が0.5ml以下の血液に由来する血液の画分である、請求項24に記載の方法。
- 長さが10〜1,000ヌクレオチドの少なくとも500,000,000の試料核酸分子の集団;
長さが4から8ヌクレオチドの10〜1,000の分子指標タグ(MIT)のセット;及び
リガーゼ、を含む反応混合物であって、
ここで、MITは前記試料核酸分子とは別の核酸分子であり、
前記反応混合物中の試料核酸分子の総数と前記反応混合物中のMITのセット中のMITの多様性の比は、少なくとも10,000:1であり、
前記MITのセット中の各MITの配列は、前記セット中の他の全てのMIT配列と少なくとも2ヌクレオチド異なり、そして
前記反応混合物は各MITの少なくとも2つのコピーを含む、上記反応混合物。 - 各MITが2本鎖核酸アダプター分子の少なくとも一部を含む、請求項26に記載の反応混合物。
- 各MITは、Yアダプター核酸分子のセットのYアダプター核酸分子の一部を含み、前記セットの各Yアダプターは、塩基対合した2本鎖ポリヌクレオチドセグメント及び少なくとも1つの塩基対合していない1本鎖ポリヌクレオチドセグメントを含み、前記MIT配列以外の前記セット中の各Yアダプター核酸分子の配列は同一であり、そして前記MITは塩基対合した2本鎖ポリヌクレオチドセグメントの一部である2本鎖配列である、請求項26に記載の反応混合物。
- 前記2本鎖ポリヌクレオチドセグメントが5〜25ヌクレオチドの長さであり、MITを含まず、そして1本鎖ポリヌクレオチドセグメントが5〜25ヌクレオチドの長さである、請求項28に記載の反応混合物。
- 前記反応混合物が循環性無細胞ヒトDNAを含み、前記MITのセット中の任意の2種のMITの組み合わせの数が、前記ヒトゲノム中の標的遺伝子座に及ぶ反応混合物中の試料核酸分子の総数を超え、前記反応混合物中のMIT分子の総数が、前記反応混合物中の試料核酸分子の総数より少なくとも2倍大きい、請求項28に記載の反応混合物。
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