JP2018118968A - ペプチド化合物の環化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
一方、ペプチドの環化方法としてドラックライクな環化法であるアミド環化が実現できた画期的な報告もなされている(非特許文献21、非特許文献25、非特許文献26、非特許文献27)が、それらはいずれも、主鎖アミド結合を切断させた結果得られる活性種とアミノ酸主鎖アミノ基を化学反応させた構造を生成させるため、本方法を、そのままDisplay libraryにおける環化方法としては適用することはできない。これらの手法は、シクロスポリンAなど多くの天然物の、主鎖のカルボン酸と主鎖のアミノ基で縮合環化させる手法として有用である。一方、Display libraryでは、主鎖カルボン酸末端はmRNAと結合させる必要があるため、このように主鎖アミド結合の分解により活性種を発生させる手法を用いることはできない。
また、環化部位の構造を変化させると、当該環化部位を有するペプチドが持つ活性(薬効の強度)が大きく低下してしまうことが報告されている(非特許文献24)。この例では、環化部位を有するペプチドを取得した後、膜透過性と代謝安定性に優れたペプチドとするために、その環化部位を改変することが困難であることが示されている。
医薬品の開発に利用できる膜透過性と代謝安定性に優れた環状部位を有するペプチドライブラリーが求められるが、そのようなペプチドライブラリーの確立には様々な点で改善の余地がある。
一方、中分子ペプチドdisplayの限られた規模(ドラックライクネスを考慮するとペプチド鎖長に制限があることを指す)を有効に利用するためには、ライブラリーに全く異なる構造のペプチド(非天然型アミノ酸を含んだペプチド)を多く含ませることが肝要である。側鎖の性質の異なるアミノ酸を多種類導入することも然ることながら、制限された分子量の中で固定された部位を少なくして可変領域を拡大すること、主鎖構造の異なるペプチドを含ませることにより様々な標的に対して結合ペプチドが得られる可能性が高められることになり価値がある。この観点から有効な方法として例えば、様々な環化部位を有するペプチド、分枝ペプチドをディスプレイさせることなどが挙げられる。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、本発明はペプチドディスプレイライブラリー構築のための、ペプチド化合物の新規な環化方法、分枝ペプチド合成法を提供し、また、これらを用いてドラッグライクなディスプレイライブラリーおよびドラッグライクなペプチド化合物を提供することを課題とする。
〔1〕
環状部を有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチド化合物は、C末端側に側鎖の1つに反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程;
2)N末端側のアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体の反応点と、C末端側の側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の反応点とを結合させ、アミド結合又は炭素−炭素結合を形成させる工程
を含む、前記方法。
〔2〕
環状部を有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチド化合物は、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基、及び、アミン近傍に反応補助基を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程;
2)前記反応補助基を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体と、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基をアミド結合させて環状化合物を得る工程
を含む、〔1〕に記載の方法。
〔3〕
活性エステルがチオエステルである、〔2〕に記載の方法。
〔4〕
前記反応補助基が、SH基である、〔2〕又は〔3〕に記載の方法。
〔5〕
前記環状化合物を得る工程の後、反応補助基を除去する工程を含む、〔3〕または〔4〕に記載の方法。
〔6〕
前記アミン近傍に反応補助基を有するアミノ酸、アミノ酸類縁体又はN末端カルボン酸類縁体が、下記一般式で表される化合物N−1または化合物N−2である、〔2〕から〔5〕のいずれかに記載の方法;
(式中、R1は、水素原子、S−R23(R23は、置換基を有していてもよいアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基を示す。)、またはHS基の保護基を示し;
R2、R3は、それぞれ独立して、水素原子、または、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基もしくはシクロアルキル基を示し;またはR2とR3が環を形成した置換基、またはR2もしくはR3がR4と環を形成した置換基を示し;
R4は、置換基を有していてもよいアルキレン基、置換基を有していてもよいアリーレン基または置換基を有していてもよい2価のアラルキル基を示し;
R11、R12は、それぞれ独立して、単結合、置換基を有していてもよいアルキレン基、置換基を有していてもよいアリーレン基または置換基を有していてもよい2価のアラルキル基を示す。)。
〔7〕
前記活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体が、下記一般式で表される化合物C−1である、〔2〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法;
(式中、R25は、OH、ハロゲン原子、OR、またはSR1を示し(RはBt、At、NSuまたはPfpを示し、R1は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキレン基を示す。);
R26は、置換基を有していてもよいアルキレン基、置換基を有していてもよいアリーレン基または置換基を有していてもよい2価のアラルキル基を示し;
R2、R3は、それぞれ独立して、水素原子または置換基を有していてもよいアルキル基を示す。)。
〔8〕
前記環状部を有するペプチド化合物の環状部を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、あるいは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体の総数が、5〜12である、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕
前記環状部を有するペプチド化合物を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、あるいは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体の総数が、9〜13である、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕
環状部を有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、あるいは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチド化合物は、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基、及び、N末端の主鎖アミノ基を有するアミノ酸残基、あるいは、主鎖もしくは側鎖にアミノ基を有するアミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程;
2)N末端のアミノ酸残基、N末端のアミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体と活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体をアミド結合させて環状化合物を得る工程
を含む、〔1〕に記載の方法。
〔11〕
活性エステル基がアルキルチオエステル基又はアラルキルチオエステル基であって、工程1)の翻訳合成後に活性化剤を添加させることにより、より活性な活性エステル基に変換させる工程を含む、〔10〕に記載の方法。
〔12〕
活性剤が、アリールチオール又はN−ヒドロキシスクシンイミドである、〔11〕に記載の方法。
〔13〕
翻訳されたチオエステルとの反応性が高い活性化剤と、環化させるアミンとの反応性が高い活性化剤を添加させ、より活性の高い活性エステル基に変換させる工程である、〔12〕に記載の方法。
〔14〕
アリールチオエステルで活性エステル基に変換させた後、オキシマおよびその誘導体で更に活性の高いエステル基に変換させる工程である、〔13〕に記載の方法。
〔15〕
工程1)のN末端部位の翻訳合成が、フォルミルメチオニン以外の翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体をアシル化した翻訳開始tRNAを用いて導入する方法にて行われる、〔1〕から〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔16〕
工程1)のN末端部位の翻訳合成が、開始コドンを読み飛ばし、N末端にMet以外の翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体を導入する方法を用いて行われる、〔10〕から〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔17〕
工程1)のN末端部位の翻訳合成が、アミノペプチダーゼにてN末端のアミノ酸、アミノ酸類縁体又はカルボン酸類縁体を切断する方法を用いて行われる、〔10〕から〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔18〕
前記N末端部位の翻訳合成が、メチオニン アミノペプチダーゼにて処理することによりN末端のフォルミルMetを除去しN末端に他のの翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体を導入する方法を用いて行われる、〔17〕に記載の方法。
〔19〕
前記N末端部位の翻訳合成が、Metの代わりにノルロイシンを含む翻訳系にて翻訳され、メチオニン アミノペプチダーゼにて処理することによりN末端のフォルミルノルロイシンを除去しN末端に他のの翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体を導入する方法を用いて行われる、〔10〕〜〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔20〕
前記N末端のアミノ酸、アミノ酸類縁体又はカルボン酸類縁体の除去に、さらに、ペプチドデフォルミラーゼが用いられる、〔17〕から〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔21〕
前記環状部を有するペプチド化合物が、さらに直鎖部を有する、〔1〕から〔2〕0のいずれかに記載の製造方法。
〔22〕
前記非環状ペプチド化合物がα−ヒドロキシカルボン酸、及び、側鎖に保護されていてもよいアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体を含み、工程2)の環状化合物を形成する工程の後で、工程3)α―ヒドロキシカルボン酸部位と側鎖に保護されていてもよいアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体部位を化学反応させて分枝部位を形成させる工程を含む、〔1〕から〔21〕のいずれかに記載の方法。
〔23〕
環状部と直鎖部とを有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、N末端カルボン酸類縁体並びにα−ヒドロキシカルボン酸により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、該非環状のペプチド化合物が、
i)C末端側に側鎖の1つに反応点を有するアミノ酸残基(又はアミノ酸類縁体残基)、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含み、
ii)前記i)に記載の2つの反応点の間にα位にRf5を有するα−ヒドロキシカルボン酸(Rf5は水素原子、置換されてもよいアルキル基、アラルキル基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、アリケニル基、アルキニル基から選択される)、及び、非環状ペプチド化合物中に保護されていてもよいアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基を含む、
非環状のペプチド化合物である、工程;
2)N末端側のアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体の反応点と、C末端側の側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の反応点とを結合させる、環化反応工程;
3)工程1)のii)に記載のα−ヒドロキシカルボン酸のエステル結合を切断してチオエステル基を発生させる工程
4)工程3)において発生させたチオエステル基と工程1)のii)に記載のアミノ基を結合させる環化反応工程、
を含む、方法。
〔24〕
工程1)のii)に記載のα−ヒドロキシカルボン酸とアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の間に含まれるアミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基の数が7つ以下である、〔23〕に記載の方法。
〔25〕
工程1)のii)に記載のα−ヒドロキシカルボン酸が、Cys−Pro−α−ヒドロキシカルボン酸として非環状ペプチド化合物中に含まれる、〔23〕又は〔24〕に記載の方法。
〔26〕
工程1)のi)に記載のN末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体が反応補助基を有している、〔23〕から〔25〕のいずれかに記載の方法。
〔27〕
工程1)のi)に記載のN末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体が反応補助基を有さず、ii)に記載のアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基のアミノ基が保護基を有し、活性化剤を添加することによって、工程2)の環化反応が行われ、工程2)の環化反応後、工程3)の環化反応前に、前記ii)に記載のアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基のアミノ基の保護基を除去する工程を含む、〔23〕から〔26〕のいずれかに記載の方法。
〔28〕
環状部を有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチド化合物は、側鎖の1つに反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基、及び、N末端にもう1つの反応点を有するアミノ酸、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程;
2)N末端のアミノ酸残基、N末端のアミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体の反応点と、側鎖に1つの反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体の反応点とを炭素‐炭素結合させる工程
を含む、〔1〕に記載の方法。
〔29〕
N末端のアミノ酸残基、N末端のアミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体の反応点として炭素‐炭素2重結合を選択し、側鎖に1つの反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の反応点としてアリールハライドを選択して、遷移金属を触媒とした炭素−炭素結合反応により環化反応を実施する工程を含む、〔28〕に記載の方法。
〔30〕
遷移金属を触媒とした炭素−炭素結合反応が、Pdを触媒としたHeck型の化学反応である、〔29〕に記載の方法。
〔31〕
前記環状部を有するペプチド化合物の環状部を形成するアミノ酸又はアミノ酸類縁体の合計が5〜12となる位置に環化反応を実施するための反応点を有する、〔1から〔30〕のいずれかに記載の方法。
〔32〕
前記環状部を有するペプチド化合物のアミノ酸及びアミノ酸類縁体残基の総数が9〜13である、〔31〕に記載の方法。
〔33〕
ペプチド化合物のC末端と翻訳合成に用いた鋳型とがスペーサーを介して結合しているペプチド化合物−核酸複合体を製造することを特徴とする、〔1〕〜〔32〕のいずれかに記載の方法。
〔34〕
ペプチド化合物−核酸複合体が、翻訳合成に用いられる非環状ペプチド化合物をコードする核酸の3'末端にリンカーを介してピューロマイシンが結合している核酸を用いて合成される、〔33〕に記載の方法。
〔35〕
スペーサーがペプチド、RNA、DNA、またはヘキサエチレングリコールのポリマー、又は、これらの組合せである、〔33〕又は〔34〕に記載の方法。
〔36〕
ペプチド化合物を、互いに異なる配列を有する複数の核酸から成る核酸ライブラリーを翻訳して製造することを特徴とする、〔1〕から〔35〕のいずれかに記載の方法。
〔37〕
〔1〕から〔36〕のいずれかに記載の製造方法により作製されるペプチド化合物又はペプチド化合物−核酸複合体。
〔38〕
異なる構造を有する複数の〔37〕記載のペプチド化合物又はペプチド化合物−核酸複合体からなるライブラリー。
〔39〕
以下の(i)〜(iv)を有することを特徴とする、環状部を有するペプチド化合物;
(i)アミノ酸及びアミノ酸類縁体残基数の合計が5〜12からなる環状部を含み、アミノ酸及びアミノ酸類縁体の総数が9〜13である、
(ii)N置換アミノ酸を少なくとも2つ含み、N置換されていないアミノ酸を少なくとも1つ含む、
(iii)ClogP値が6以上である、
(iv)環状部を形成しているアミノ酸又はアミノ酸類縁体の結合が、アミノ酸又はアミノ酸類縁体の側鎖にある活性エステル基と、他のアミノ酸又はアミノ酸類縁体のアミン基とからなる結合を少なくとも1つ有する。
〔40〕
ペプチド化合物に含まれるアミノ酸及びアミノ酸類縁体が、翻訳合成可能なアミノ酸又はアミノ酸類縁体、若しくは、翻訳可能なアミノ酸又はアミノ酸類縁体の側鎖またはN置換部位を化学修飾することによって得られるアミノ酸又はアミノ酸誘導体から選択されるアミノ酸又はアミノ酸類縁体である、〔39〕に記載のペプチド化合物。
〔41〕
さらに、アミノ酸及びアミノ酸類縁体残基数の合計が1〜8からなる直鎖部を少なくとも1つ含む、〔39〕又は〔40〕に記載のペプチド化合物。
〔42〕
環状部を形成しているアミノ酸又はアミノ酸類縁体の結合がアミド結合又は炭素−炭素結合である、〔39〕から〔41〕のいずれかに記載のペプチド化合物。
〔43〕
環状部が下記一般式(I)で示される交差ユニットを含む、〔39〕から〔42〕のいずれかに記載のペプチド化合物;
(式中の記号は以下の意味を示す;
R51は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、C5−C10アリール基、アラルキル基、エステル基、又は式1で示されるアミドであり、
R52は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、アリール基、またはアラルキル基であり、
R53は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、もしくは水素原子であるか、または、R53とR51とが互いに結合してC3−C5のアルキレン基を形成し窒素原子を含む5員〜7員環を形成していてもよく、
R54は、0−8アミノ酸残基より構成されるペプチドであり、
R55は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、C5−C10アリール基、アラルキル基、エステル基、置換基を有していても良いアミド基であり、
*は、環状部における結合部位を示す。)。
〔44〕
〔39〕から〔43〕のいずれかに記載のペプチド化合物を含む医薬組成物。
〔45〕
前記医薬組成物が経口剤である、〔44〕の医薬組成物。
〔46〕
〔39〕から〔45〕のいずれかに記載のペプチド化合物の製造方法であって、工程(i)〜(v)を含む方法:
(i)アミノ酸及びアミノ酸類縁体の総数が9〜13である非環状ペプチド化合物を翻訳合成して、当該非環状ペプチド化合物とそれをコードする核酸配列を有する複合体がリンカーを介して結合している非環状ペプチド化合物−核酸複合体を形成する工程;
(ii)工程(i)で翻訳合成された複合体の非環状ペプチド化合物をアミド結合又は炭素−炭素結合によって環化し、環状部のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の残基数の合計が5〜12となる環状化合物を形成する工程;および、
(iii)工程(ii)で得られた環状部を有するペプチド化合物−核酸複合体ライブラリーと生体内分子とを接触させ、当該生体内分子に対して結合活性を有する複合体を選択する工程。
〔47〕
さらに、以下の工程を含む、〔46〕に記載の製造方法;
(iv)前記工程(iii)で選択された複合体の核酸配列からペプチド化合物の配列情報を得る工程、および、
(v)前記工程(iv)で得られた配列情報に基づきペプチド化合物を化学合成する工程。
〔48〕
前記非環状ペプチド化合物がα−ヒドロキシカルボン酸、及び、保護されていてもよい側鎖にアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体を含み、工程(ii)の環状化合物を形成する工程の後で、α―ヒドロキシカルボン酸部位と側鎖にアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体部位を化学反応させて分枝部位を形成させる工程を含む、〔46〕又は〔47〕に記載の方法。
〔49〕
生体内分子が、分子量500未満の化合物が結合し得る領域を有していない分子である、〔46〕から〔48〕いずれかに記載の製造方法。
〔50〕
生体内分子に対して結合活性を有する複合体が、さらに該生体内分子が他の生体内分子との結合を阻害する活性を有する、〔46〕から〔49〕のいずれかに記載の製造方法。
〔51〕
環化反応するN末端側のアミノ酸又はアミノ酸類縁体が、前記化合物N−1または化合物N−2で表わされる化合物から選択されるアミノ酸又はアミノ酸類縁体であり、C末端側のアミノ酸又はアミノ酸類縁体が前記化合物C−1で表わされる化合物から選択されるアミノ酸又はアミノ酸類縁体であり、工程(ii)の環状化合物を得る工程の後、反応補助基を除去する工程を含む、〔46〕から〔50〕のいずれかに記載の製造方法。
〔52〕
核酸配列が3'末端にスペーサーを有し、翻訳合成されるペプチド化合物のC末端が、当該スペーサーを介して、当該核酸配列と複合体を形成する、〔46〕から〔51〕のいずれかに記載の製造方法。
〔53〕
ペプチド化合物−核酸複合体が、翻訳合成に用いられる非環状ペプチド化合物をコードする核酸の3'末端にリンカーを介してピューロマイシンが結合している核酸を用いて合成される、〔52〕に記載の方法。
〔54〕
スペーサーがペプチド、RNA、DNA、またはヘキサエチレングリコールのポリマーである、〔52〕又は〔53〕に記載の製造方法。
・環状部を有するペプチド化合物
本発明の環状部を有するペプチド化合物とは、アミノ酸あるいはアミノ酸類縁体がアミド結合あるいはエステル結合して形成される化合物であり、環状部がアミド結合あるいは炭素‐炭素結合形成反応などの共有結合を介して環化された化合物である。当該化合物をさらに化学修飾して得られる化合物も本発明のペプチド化合物に含まれる。本発明のペプチド化合物は直鎖部を有していてもよく、例えば、スキームA(スキームA−1、A−2)のように記載することができる。環状部を有するペプチド化合物は、さらに、直鎖部を有していてもよい。アミド結合あるいはエステル結合の数(アミノ酸又はアミノ酸類縁体の数・長さ)を特に限定しないが、直鎖部を有する場合、環状部と直鎖部を併せて30残基以内が好ましい。高い膜透過性を獲得するためには、環化部位と直鎖部位を併せた総アミノ酸数は13残基以下であることがより好ましい。高い代謝安定性を獲得するためには、総アミノ酸数が9以上であることがより好ましい。膜透過性と代謝安定性の両立(ドラックライクネス)を考慮すると上記に加えて環状部を構成するアミノ酸及びアミノ酸類縁体の数は5〜12であることが好ましい。さらに、上の記載に加えて環状部を構成するアミノ酸及びアミノ酸類縁体の数はより好ましくは5〜11、さらに7〜11残基が好ましい。特に9〜11残基が好ましい。直鎖部のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の数(ユニットの数)は0〜8であることが好ましい。さらに、0〜3が好ましい。尚、本願では特に限定しない限り、アミノ酸にはアミノ酸類縁体も含まれる場合があるものとする。また、ここで、「ドラックライクネス」あるいは「ドラックライク」とは、ペプチド化合物が、少なくとも経口剤、あるいは、細胞内蛋白、核酸、膜蛋白の細胞内領域又は膜蛋白の膜貫通ドメインを標的とした場合に、医薬品として利用できる程度の膜透過性と代謝安定性を有することを意味する。
翻訳後修飾とは、翻訳後にリボゾームの作用以外で自動的あるいは別試薬を添加させて生じさせる化学反応を指し、例えば環化反応や脱保護反応を挙げることができる。
翻訳後環化とは、翻訳後修飾の中で環形成反応を伴うものである。(スキームA:本発明のペプチド化合物を説明したスキームである。白丸ユニット、黒丸ユニット、三角ユニット、四角ユニットはそれぞれアミノ酸あるいはアミノ酸類縁体を意味する。また、それぞれのユニットは同一あるいは別々のアミノ酸あるいはアミノ酸類縁体を意味する。三角ユニットはN末端カルボン酸類縁体の場合もあり得る。例えば、8個の黒丸ユニットはそれぞれ別種類のアミノ酸あるいはアミノ酸類縁体であってもよく、その中のいくつか、あるいは全てが同一のものであってもよい。また、翻訳後に実施可能な化学修飾により、アミノ酸あるいはアミノ酸類縁体は、別骨格を有する化合物へ化学変換や骨格変換されていてもよい。ここで、1ユニットとは、翻訳後修飾が終了した時点でのアミノ酸あるいはアミノ酸類縁体が、これに該当するが、1つのtRNAによって翻訳されたアミノ酸あるいはアミノ酸類縁体が、翻訳後修飾により、別骨格を有する化合物へ化学変換や骨格変換されたものも、これに含まれる。ユニットの数についても同様に計算される。尚、本願では特に限定しない限り、アミノ酸にはアミノ酸類縁体も含まれるものとする。また、本明細書中において、翻訳後環化は単に環化という場合がある。
アミノ酸とはα、βおよびγアミノ酸であり、天然型アミノ酸(本願では天然型アミノ酸とはタンパク質に含まれる20種類のアミノ酸を指す。具体的にはGly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Proを指す。)に限定されず、非天然型アミノ酸であってもよい。α−アミノ酸の場合、L型アミノ酸でもD型アミノ酸でもよく、α,α−ジアルキルアミノ酸でもよい。アミノ酸側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基から自由に選択される。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も例えば、N原子、O原子、S原子、B原子、Si原子、P原子を含む任意の官能基の中から自由に選択される(すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基など)。
ペプチド化合物を構成する「アミノ酸」、「アミノ酸類縁体」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」、「アミノ酸類縁体」の同位体は、少なくとも1つの原子が、原子番号(陽子数)が同じで,質量数(陽子と中性子の数の和)が異なる原子で置換されたものである。本発明ペプチド化合物を構成する「アミノ酸」、「アミノ酸類縁体」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl等が含まれる。
本発明のペプチド化合物が良好な膜透過性を有するためには、ペプチド化合物中に含まれる総アミノ酸数が13以下であることが好ましい。
それぞれのユニット(アミノ酸残基)の選択に特に制限はないが、翻訳後化学修飾が全て完了した形式の分子の形(主鎖構造)に考慮し直して、形成される分子のCLogP(コンピューターで計算した分配係数であって、Daylight Chemical Information Systems, Inc. 社のDaylight Version 4.9を用いて計算した)が6を超えるように選択することが好ましい。特に良好な膜透過性を確保するために、CLogPは8を超え、15を超えないように選択することが好ましい。
本発明のペプチド化合物が良好な代謝安定性を有するためには、ペプチド化合物中に含まれる総アミノ酸数が9以上であることが好ましく、11以上であることがより好ましい。総アミノ酸数が9以上のペプチド化合物であれば、上述の膜透過性を有するための条件は、当該ペプチド化合物の代謝安定性に影響しない。
本発明の環状部を有するペプチド化合物は、以下に記載の方法を利用して製造することが可能である。
例えば、以下の製造方法を含む製造方法を挙げることができる。
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチド化合物は、C末端側に側鎖の1つに反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程;
2)N末端側のアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体の反応点と、C末端側の側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の反応点とを結合させ、アミド結合又は炭素-炭素結合を形成させる工程
を含む、前記方法。
本発明の翻訳合成には、公知の方法を利用することができる。
本来は、一般的に翻訳開始アミノ酸としてメチオニンをN末端アミノ酸として翻訳されるが、他の所望のアミノ酸をアミノアシル化した翻訳開始tRNAを用いて翻訳させることによってN末端を所望のアミノ酸として翻訳させる方法を使用することもできる。非天然アミノ酸のN末端導入ではアミノ酸の許容度が伸長時よりも高く、天然型アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸、アミノ酸類縁体を利用することが知られている(非特許文献:J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y, Suga H.)。例えば、本発明において、メチオニン以外の翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸誘導体をN末端に導入する方法としては、以下の方法がある。翻訳開始tRNAとして、三角ユニットをアシル化したtRNAをメチオニン、フォルミルドナーもしくはメチオニルトランスフェラーゼを抜いた翻訳系に添加し、翻訳開始コドン(例えばATG)に三角ユニットをコードさせ翻訳させることによって末端を三角ユニットとする環化前のペプチド化合物又はペプチド化合物ライブラリーを構築する。アンチコドンがCAUでない翻訳開始tRNAと当該アンチコドンに対応するコドンの様々な組み合わせを翻訳開始tRNA及び開始コドンの組み合わせとして利用するとN末端に多様性をもたせることが可能である。つまり、アンチコドンの異なる複数種類の翻訳開始tRNAに所望のアミノ酸、アミノ酸類縁体又はN末端カルボン酸類縁体をそれぞれアミノアシル化し、これに対応するコドンを開始コドンとしたmRNA又はmRNAライブラリーを翻訳させることによってN末端残基が一種類に限定されない環化前のペプチド化合物又はペプチド化合物のライブラリーを作製することができる。具体的には例えば、Mayer C,et al. Anticodon sequence mutants of Escherichia coli initiator tRNA: effects of overproduction of aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA formyltransferase, and initiation factor 2 on activity in initiation.Biochemistry. 2003, 42, 4787-99.(CAU以外のanticodonを持つ開始tRNAの変異大腸菌によるf-Met以外のアミノ酸からの翻訳開始と同codonを途中に含む蛋白の発現。)に記載の方法を用いて環化前のペプチド化合物又はペプチド化合物ライブラリーを作製することができる。
R5〜R10は、前記R13〜R18の定義と同様である。
R3はドラックライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義されるが、例えばC1−C4アルキル基、ハロゲンなどで置換されてもよいC1−C4アルキル基から選択されるが、特に水素原子が好ましい。なお、R3基の立体はR3基が水素原子と仮定した場合のL型、D型アミノ酸に対応するもの両方が許容されるが、L型アミノ酸に対応するものが好ましい。
化合物C-1、化合物C-2、化合物C-3と同様に、化合物COH-1、化合物COH−2、化合物COH−3から選択することもできる。
R101、R102のうち1つが水素原子、R103、R104のうち1つが水素原子、R106、R107のうち1つが水素原子であることがより好ましい。また水素原子の配置はこれらがL型アミノ酸と同じ立体配置になるように配置されることが好ましい。
スキームB
交差ユニットに活性エステル基を有するユニットが選択される場合、交差ユニットは化合物C-1、あるいは化合物C-2、化合物C-3やあるいは化合物COH−1、化合物COH−2、化合物COH−3から選択することもできる。これら6種類の化合物を選択する場合には常に、そのC末端側直後のアミノ酸はN-アルキル化されたユニットの中から選択することが好ましい。この制限は、アスパルチミド形成の副反応を避ける目的であり、これら6種類の化合物が選択された場合の共通の好ましい選択となる。代謝安定性の観点から、化合物C-1、あるいは化合物C-2、化合物C-3がより好ましい。このような場合、三角ユニットは化合物Na-1、化合物Na-2、化合物Na-3の中から選択することもできる。三角ユニットとして、N末端(三角ユニット)を固定させない場合には、これらの化合物から複数個を同時に選択することもできる。
化合物Na-1および化合物Na-2、化合物Na−3のどちらでも側鎖アミノ基は保護されていてもよい。保護されている場合には、環化反応と同時あるいは事前に脱保護させてから環化反応を行う。保護基あるいは脱保護の条件は本明細書に記載の方法を利用することができる。
例えば化合物Na−4や化合物Na−5が選択された場合、三角ユニットには化合物COH−1、化合物COH−2、化合物COH−3などを選択することもできる。この場合、三角ユニットがN末端に存在してもよく、あるいは三角ユニットよりN末端側にも直鎖部が存在して、かつN末端にはN末端カルボン酸誘導体から選択されることが、ドラックライクの点から好ましい。
直鎖部2を発生させる手法として、α―ヒドロキシカルボン酸などの主鎖にアミノ基を持たずにエステル結合を翻訳合成により形成できるアミノ酸類縁体と保護されていてもよいアミノ基側鎖(保護基はアミノ基の保護基として作用し、翻訳合成されるアミノ酸を与えるものであれば、特に限定されない)を有するアミノ酸の両方を翻訳導入して翻訳後修飾させる手法を用いることが可能である(スキームE)。ディスプレイライブラリーへの適用時には、翻訳されるユニットから選択される。しかし、その後の最適化により得られるペプチド化合物では、当該ペプチド化合物そのものが翻訳合成されなくても、翻訳合成後の翻訳後修飾により得られるものも含まれる。α―ヒドロキシカルボン酸部位の側鎖は特に限定はされないが、スキームEに記載の手法では、特に、翻訳合成の点ではRe1が水素原子(グリコール酸(HOGly)そのもの)あるいは、側鎖にチオール基(SH基)あるいは保護されたチオール基を有しているものが好ましい。側鎖の立体配置も特に限定されないが、α位に水素原子が存在する場合にはL型アミノ酸と同様な立体配置を取ることがより好ましい。チオール基あるいは保護されたチオール基の配置も特に限定されないが、OH基のβ位、もしくはγ位に配置されていること(すなわち、Re1が保護されていてもよいメルカプトメチル基あるいはメルカプトエチル基)が特に好ましい。これらのチオール基もしくは保護されたチオール基は、α―ヒドロキシカルボン酸側鎖の置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、から配置(付加)される。これらα―ヒドロキシカルボン酸側鎖の置換基としては、付加されたチオール基あるいは保護されたチオール基を除けば、ドラックライクなアミノ酸の側鎖で定義された置換基であることがより好ましい。
上記のようにヒドロキシカルボン酸とアミン側鎖部位の両方にSH基あるいは保護されたSH基などの反応補助基を有してもよく、もしくはいずれか片方のみに反応補助基を有していてもよく、もしくは両方ともに反応補助基を有していなくともよい。また、アミン側鎖部位に保護基を有していてもよく、保護基を有していなくてもよい。
またいずれの場合でも、反応を加速させる添加剤を加えてもよい。添加剤としては、例えば置換していてもよいアルキルチオール、置換されていてもよいアルケニルチオール基、置換されてもよいアルキニルチオール基、置換されていてもよいアラルキルチオール、置換されていてもよいアリールチオール、置換されてもよいヘテロアリールチオール基、置換されてもよいシクロアルキルチオール基でもよい。また、HOBt、HONSu、HOAt、パラニトロフェノールなど通常活性エステル化させる試薬、あるいはその誘導体でもよい。添加剤を加える場合には、翻訳後環化部の環化反応を実施後に本直鎖部2形成反応を実施することが好ましい。添加剤の置換基は、前記"アミノ酸"の側鎖で定義したのと同様、自由な置換基を選択することができる。
化合物F5のRf2基は保護されても良いメルカプトアルキル基から選択される。Rf2を含むアミノ酸の立体配置はL型が好ましい。さらに好ましくは保護されてもよいメルカプトメチル基あるいは2−メルカプトエチル基から選択される。Rf3基はRa13と同様に選択させることができる。好ましくはRa1と同様に選択させることができる。特に好ましくはメチル基あるいは、Rf4とで環を形成することが好ましい。環のサイズは3〜8員環が好ましく、より好ましくは4〜6員環である。これら環を形成する炭素原子はドラックライクなアミノ酸の側鎖で定義される置換基にて置換されていてもよい。5員環の代表例としてプロリンなどが好ましい。Rf4はRa4と同様に選択させることができる。
ここで記載されるアミノ基の保護基とは、単一の1級アミンもしくは2級アミンの反応性を不活性化もしくは低下させる官能基だけでなく、1つの官能基で複数のアミノ基もしくは他のヘテロ原子を同時に不活性する構造も保護基として定義する。例えば、チアゾリジン環、チアジナン環、オキサゾリジン環、イミダゾリジン環もアミノ基の保護基として含まれる。これらの保護基を形成する炭素原子は置換されていてもよい。
チオールの求核性を利用するNative Chemical Ligation(NCL)によるアミド化反応は、ペプチドおよびタンパク質の化学合成において有用な手法である。連続的なアミド化反応や任意のタイミングでNCLを行う場合、アミノ基およびチオール基にあらかじめ保護をしておくのは有用な手段であり、例えば非特許文献v1に記載されているペプチド鎖の多段階アミド化によるタンパク質合成や、非特許文献v2に記載されているタンパク質の化学修飾では、システインのアミノ基およびチオール基を同時に保護する構造としてチアゾリジン環が報告されている。
本手法は、酸性条件下でチアゾリジン環およびチアジナン環を開環し、アミノジスルフィド構造へと導くことを特徴としており、続く還元剤の添加によりアミノチオールへと導くことが可能である。
本手法は、水中、緩衝液中、もしくは水と混和した有機溶媒中で行う。使用する有機溶媒は、水と混和が可能で、基質と反応もしくは析出しないものを選択する。例えばN,N−ジメチルアセトアミド、N、N−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルを使用する。水と有機溶媒の比率は、基質およびジスルフィド化合物の溶解性によって決まるが、例えば10mMのジチオジピリジンで反応を行う場合、ジチオジピリジンの溶解性の観点から、5%以上のN,N−ジメチルアセトアミドを使用するのが好ましい。
チアゾリジン環を開環するための反応温度は、反応を12時間以内に完結させることを目的とした場合、15℃以上が好ましい。更に熱に不安定なチアゾリジン環を有する化合物を取り扱う場合、15〜50℃の範囲が好ましい。
Products and Designed Biomolecules Synthesis. Chem. Rev. 2008, 108, 3054)。
L型、D型、α―α―ジアルキル型のいずれも許容されるが、α位に水素原子が存在する場合にはL型アミノ酸もしくはアミノ酸類縁体が好ましい。
本発明のペプチド化合物は、化学合成することによって製造することも可能である。
例えば、Fmoc合成と呼ばれる方法とBoc合成と呼ばれる方法が挙げられる。Fmoc合成では、主鎖アミノ基をFmoc基により保護され、側鎖官能基を必要に応じてピペリジンなどの塩基性で切断されない保護基で保護され、主鎖カルボン酸を保護しないアミノ酸を基本単位とする。その他、Fmoc保護されたアミノ基とカルボン酸基を有する組み合わせであれば、特に限定されない。例えばジペプチドを基本単位としてもよい。N末端に配置させる基本単位には、Fmocアミノ酸以外であってもよい。例えば、Bocアミノ酸であってもよく、アミノ基を有しないカルボン酸類縁体であってもよい。主鎖カルボン酸基を固相担体の官能基との化学反応により固相に担持させる。続いてピペリジンやDBUなどの塩基によりFmoc基を脱保護し、新たに生じたアミノ基と続いて添加される基本単位のカルボン酸を有する保護アミノ酸とを縮合反応させることで、ペプチド結合を生成させる。縮合反応では、DICとHOBtの組み合わせ、DICとHOAtの組み合わせ、HATUとDIPEAとの組み合わせなど様々な組み合わせが可能である。脱Fmoc基とそれに続くペプチド結合生成反応の繰り返しにより、望みのペプチド配列を生成させることができる。望みの配列が得られた後、固相からの切り出しと必要に応じて導入した側鎖官能基の保護基の脱保護が行われる。また、固相からの切り出しを行う前にペプチドの構造変換や環化を行うことも可能である。固相からの切り出しと、脱保護は同一の条件、例えば90:10のTFA/H2Oで行っても良いし、必要に応じて別々の条件で脱保護しても良い。固相からの切り出しは、1% TFAなどの弱酸での切り出しが可能なものもあれば、保護基としてPdなどを利用して、両者の化学反応の直行性を利用することが可能である。これらの工程の間もしくは最後に、環化などの工程を実施することもできる。例えば、側鎖カルボン酸とN末端主鎖のアミノ基とを縮合させることや、側鎖アミノ基とC末端主鎖のカルボン酸を縮合させることができる。この際、C末端側のカルボン酸と環化させる側鎖カルボン酸の間、もしくはN末端側の主鎖アミノ基またはヒドロキシル基と環化させる側鎖アミノ基の間で反応直行性が必要であり、前述のとおり保護基の直行性を考慮して保護基の選択が行われる。このようにして得られた反応物を逆相カラムや、分子ふるいカラムなどで精製することができる。これらの詳細は、例えばメルク株式会社が平成14年5月1日に発行した固相合成ハンドブックなどに記載されている。
さらに本発明は、所望の活性を有するドラックライクなペプチド化合物又はペプチド化合物-核酸複合体を製造する方法を提供する。
(i)アミノ酸及びアミノ酸類縁体の総数が9〜13残基である非環状ペプチド化合物を翻訳合成して、当該非環状ペプチド化合物とそれをコードする核酸配列がリンカーを介して結合している複合体からなる非環状ペプチド化合物-核酸複合体を形成する工程
(ii)工程(i)で翻訳合成された複合体の非環状ペプチド化合物をアミド結合又は炭素-炭素結合によって環化し、環状部のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の残基数の合計が5〜12となる環状化合物を形成する工程
(iii)工程(ii)で得られた環状部を有するペプチド化合物-核酸複合体ライブラリーと生体内分子とを接触させ、当該生体内分子に対して結合活性を有する複合体を選択する工程。
例えば以下の工程を含む製造方法を挙げることができる:
(iv)前記工程(iii)で選択された複合体の核酸配列からペプチド化合物の配列情報を得る工程、および、
(v)前記工程(iv)で得られた配列情報に基づきペプチド化合物を化学合成する工程
さらに、上記の製造工程において、前記非環状ペプチド化合物がα-ヒドロキシカルボン酸、及び、保護されていてもよい側鎖にアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体を含み、工程(ii)の環状化合物を形成する工程の前又は後で、α―ヒドロキシカルボン酸部位と側鎖にアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体部位を化学反応させて分枝部位を形成させる工程を含んでいてもよい。当該工程により、環状部の様々な位置に上述の直鎖部2を有するペプチド化合物を製造することが可能である。
具体的には例えば、STAT, AP1, CREB, SREBPなどの転写因子、ムスカリン性アセチルコリン受容体, カンナビノイド受容体、GLP−1受容体、PTH受容体などのGタンパク質共役型受容体(GPCR)、TNF、TNFR、IL-6、IL-6R等のサイトカインやそのレセプター、P2X受容体, ニコチン性アセチルコリン受容体などのイオンチャネル型受容体、イオンチャネル、トランスポーター、miR-21, miR206などのmicroRNAなどが挙げられる。
また、環状部の形成には、例えば、上述の環化反応を利用して形成することが可能であり、当該環化反応によって、アミド結合や炭素-炭素結合を形成させることが可能である。
〔I〕 本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、以下の1又は複数の工程を含むことができる。
A) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと前記の工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程
D) 工程C)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
E) プロモーターの下流に、翻訳開始ATGに続いてシステインコドンUGUもしくはUGCを、その下流に工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを含むペプチド配列をコードした鋳型DNAライブラリーを提供する工程
F) 工程E)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
G) 工程F)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
H) 工程D)の無細胞翻訳系に工程G)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
I) 環状構造を形成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。また本発明においては、工程G)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。
さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
J) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
K) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
L) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと前記の工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程
D) 工程C)のtRNAを含む無細胞翻訳系を提供する工程
E) プロモーターの下流に、翻訳開始ATGに続いてシステインコドンUGUもしくはUGCを、その下流に工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを含むペプチド配列をコードした鋳型DNAライブラリーを提供する工程
F) 工程E)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
G) 工程F)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
H) 工程D)の無細胞翻訳系に工程G)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
I) 工程H)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
H,Iの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
J) 環状構造を形成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。また本発明においては、工程H)ないし工程I)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。
さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
J) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
K) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
L) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物C−3(R2=R3=R28=R29=H、L-アスパラギン酸誘導体)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−3をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程
D) 工程C)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
E) プロモーターの下流に、翻訳開始コドンATGの次にシステインコドンを有し、さらにその下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを有する鋳型DNAライブラリーであって、ペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
F) 工程E)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
G) 工程F)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
H) 工程D)の無細胞翻訳系に工程G)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
I) 環状構造を形成させた後、脱硫反応をさせる工程
本発明においては、工程G)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。J) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
K) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
L) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物C−3(R2=R3=R28=R29=H、L-アスパラギン酸誘導体)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−3をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程
D) 工程C)のtRNAを含む無細胞翻訳系を提供する工程
E) プロモーターの下流に、翻訳開始コドンATGの次にシステインコドンを有し、さらにその下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを有する鋳型DNAライブラリーであって、ペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
F) 工程E)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
G) 工程F)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
H) 工程D)の無細胞翻訳系に工程G)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
I) 工程H)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
H,Iの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
I) 環状構造を形成させた後、脱硫反応をさせる工程
本発明においては、工程G)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。J) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
K) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
L) 塩基配列を解析する工程
あるいは本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、翻訳伸長反応で許容されにくいtBSSEtGABA、tBSSEtβAlaをN末端とすることで実施可能となるアミド環化ペプチド化合物ライブラリーを構築する方法であって、以下の1又は複数の工程を含む方法に関する。
A) tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) 化合物C-1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)の3'末端のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、ATGを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程L) 環状部位および直鎖部位2を形成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
あるいは本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、翻訳伸長反応で許容されにくいtBSSEtGABA、tBSSEtβAlaをN末端とすることで実施可能となるアミド環化ペプチド化合物ライブラリーを構築する方法であって、以下の1又は複数の工程を含む方法に関する。
A) tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) 化合物C-1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)の3'末端のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供し、任意のN−メチルアミノ酸をアミノアシル化したpdCpAを提供した後、3'末端のCAを欠損するtRNAを提供し、これらpdCpAとtRNAを連結させ、N−メチルアミノ酸をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、ATGを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側に工程F)のN−メチルアミノアシル化tRNAに対するコドンをを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程L) 環状部位および直鎖部位2を形成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
あるいは本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、翻訳伸長反応で許容されにくいtBSSEtGABA、tBSSEtβAlaをN末端とすることで実施可能となるアミド環化ペプチド化合物ライブラリーを構築する方法であって、以下の1又は複数の工程を含む方法に関する。
A) tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) Asp(SBn)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)の3'末端のtRNAを連結させ、Asp(SBn)をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、ATGを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程L) 環状部位および直鎖部位2を形成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
あるいは本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、翻訳伸長反応で許容されにくいtBSSEtGABA、tBSSEtβAlaをN末端とすることで実施可能となるアミド環化ペプチド化合物ライブラリーを構築する方法であって、以下の1又は複数の工程を含む方法に関する。
A) tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、tBSSEtGABAもしくはtBSSEtβAlaをアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) Asp(SBn)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)の3'末端のtRNAを連結させ、Asp(SBn)をアミノアシル化したtRNAを提供し、任意のN−メチルアミノ酸をアミノアシル化したpdCpAを提供した後、3'末端のCAを欠損するtRNAを提供し、これらpdCpAとtRNAを連結させ、N−メチルアミノ酸をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、ATGを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側に工程F)のN−メチルアミノアシル化tRNAに対するコドンをを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程L) 環状部位および直鎖部位2を形成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
あるいは本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、翻訳伸長反応で許容されにくいアミノ酸をN末端とすることで実施可能となるアミド環化ペプチドライブラリーを構築する方法であって、以下の1又は複数の工程を含む方法に関する。
A) 化合物N−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)の pdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、化合物N−1又は化合物N−2の中をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程 D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程C)の翻訳開始tRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環状部位を形成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
あるいは本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、翻訳伸長反応で許容されにくいアミノ酸をN末端とすることで実施可能となるアミド環化ペプチドライブラリーを構築する方法であって、以下の1又は複数の工程を含む方法に関する。
A) 化合物N−2をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)の pdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、化合物N−1又は化合物N−2の中をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程 D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程C)の翻訳開始tRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンをを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環状部位を形成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
あるいは本発明の環状部を有するペプチド化合物の製造方法は、翻訳伸長反応で許容されにくいアミノ酸をN末端とすることで実施可能となるアミド環化ペプチドライブラリーを構築する方法であって、以下の1又は複数の工程を含む方法に関する。
A) 化合物N−2をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)の pdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、化合物N−1又は化合物N−2の中をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程 D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、さらに、任意のN−メチルアミノ酸をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程、さらに3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程、さらにこれらpdCpAとtRNAを連結させ、N−メチルアミノ酸をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程C)の翻訳開始tRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側に工程F)のN−メチルアミノアシル化tRNAに対するコドンをを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環状部位を形成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物C−X(本明細書において「化合物C−X」とは化合物C−1、化合物C−2および化合物C―3から選択されるいずれかの化合物を指す。本明細において以下同じ)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと前記の工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−Xをアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程
D) 工程C)のtRNAを含む無細胞翻訳系を提供する工程
E) プロモーターの下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを途中に含むペプチド配列をコードした鋳型DNAライブラリーを提供する工程
F) 工程E)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
G) 工程F)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
H) 工程D)の無細胞翻訳系に工程G)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
I) 工程H)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
H,Iの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
J) 環状構造を形成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。また本発明においては、工程H)ないし工程I)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。
さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
J) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
K) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
L) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物C−Xをアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと前記の工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−Xをアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程
D) 工程C)のtRNAを含む無細胞翻訳系を提供する工程
E) プロモーターの下流に、翻訳開始ATGの直後にグリシン、アラニン、フェニルアラニンのいずれかのコドンを、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを途中に含むペプチド配列をコードした鋳型DNAライブラリーを提供する工程
F) 工程E)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
G) 工程F)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
H) 工程D)の無細胞翻訳系に工程G)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
I) 工程H)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
H,Iの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
J) 環状構造を形成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。また本発明においては、工程H)ないし工程I)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。
さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
J) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
K) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
L) 塩基配列を解析する工程
A) Asp(SBn)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと前記の工程B)のtRNAを連結させ、Asp(SBn)をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程
D) 工程C)のtRNAを含む無細胞翻訳系を提供する工程
E) プロモーターの下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを途中に含むペプチド配列をコードした鋳型DNAライブラリーを提供する工程
F) 工程E)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
G) 工程F)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
H) 工程D)の無細胞翻訳系に工程G)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
I) 工程H)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
H,Iの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
J) 環状構造を形成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。また本発明においては、工程H)ないし工程I)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。
さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
J) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
K) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
L) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化した開始tRNAを提供する工程、
D) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始tRNAと工程F)のtRNAを含みメチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程C)の翻訳開始tRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとして有し、その下流にHOGlyのコドンとリジンのコドンとで挟んだ0個から2個の任意のコドンを(アラニンがよりN末端側)、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、化合物N-1もしくは化合物N-2のSH基が保護されている場合には、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程J)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環を形成させる工程
M) HOGlyと直前のN末端側のアミノ酸とで形成されるエステルを活性化させてチオエステルを生成させる工程
N) リジン側鎖アミノ基とアミド結合形成させて直鎖部位2を生成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
O) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
P) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
Q) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)のtRNAを連結させ、化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
D) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)のtRNAと工程F)のtRNAと乳酸を含む無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを2番目のコドンとして有し、その下流にシステイン、プロリン、乳酸と連なるコドンを、さらにその下流にリジンを、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、化合物N-1もしくは化合物N-2のSH基が保護されている場合には、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程J)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環を形成させる工程
M) システイン、プロリン、乳酸部位から活性チオエステルを発生させる工程
N) 生成した活性チオエステルを、リジン側鎖アミノ基とアミド結合形成させて直鎖部位2を生成させる工程、さらに続いて脱硫反応を実施させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
O) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
P) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
Q) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)のtRNAを連結させ、化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
D) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)のtRNAと工程F)のtRNAと乳酸を含む無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを2番目のコドンとして有し、その下流にシステイン、プロリン、乳酸と連なるコドンを、その下流にリジンのコドンを、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程J)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 工程K)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
K, Lの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
M) 環状構造を形成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。
N) システイン、プロリン、乳酸ユニットから活性チオエステルを発生させる工程
O) 生成したカルボン酸を活性エステル化し、リジン側鎖アミノ基とアミド結合形成させて直鎖部位2を生成させる工程、続いて必要に応じて脱硫反応させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
P) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
P) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
Q) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)のtRNAと工程F)のtRNAと乳酸を含む無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、システインコドンを2番目のコドンとして有し、その下流にシステイン、プロリン、乳酸と連なるコドンを、さらに保護されたアミン化合物Na-4のコドンを、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンをを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程J)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環を形成させる工程
M) 化合物Na-4の側鎖アミノ基を脱保護させる工程、およびシステイン、プロリン、乳酸ユニットから、活性チオエステルを発生させる工程
N) 生成した活性チオエステルを化合物Na-4の側鎖アミノ基とアミド結合形成させて直鎖部位2を生成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
O) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
P) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
Q) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)のtRNAを連結させ、化合物N−1又は化合物N−2をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
D) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
H) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
I) 工程G)のpdCpAと工程H)のtRNAを連結させ、アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
J) 工程C)のtRNAと工程F)のtRNAと工程I)のtRNAを含む無細胞翻訳系を提供する工程
K) プロモーターの下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを2番目のコドンとして有し、その下流のCys、Pro、乳酸のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その下流に工程G)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを、さらにその下流に工程D)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
L) 工程K)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
M) 工程L)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
N) 工程M)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程
O) 工程K)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
K, Lの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
P) 環状構造を形成させる工程
Q) アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)を脱保護する工程
R) 直鎖部位2を生成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
S) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
T) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
U) 塩基配列を解析する工程
A) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
D) 化合物アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)のtRNAと工程F)のtRNAと工程I)のtRNAを含む無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを、その下流にCys、Pro、乳酸のtRANのアンチコドンに対応するコドンを、さらにその下流に工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程J)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 工程K)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
K, Lの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
L) 環状構造を形成させる工程
M) アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)を脱保護する工程
N) 直鎖部位2を生成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
O) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
P) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
Q) 塩基配列を解析する工程
工程G)にてメチオニンの代わりにノルマルロイシンを加えることもできる。
A) 化合物C−1をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpAと工程B)のtRNAを連結させ、化合物C−1をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
D) 化合物アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)をアミノアシル化したpdCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程D)のpdCpAと工程E)のtRNAを連結させ、化合物アミノ基および必要に応じてチオール基も保護された化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)をアミノアシル化したtRNAを提供する工程、
G) 工程C)のtRNAと工程F)のtRNAと乳酸を含む無細胞翻訳系を提供する工程
H) プロモーターの下流に、工程C)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを2番目のコドンとして有し、その下流にシステイン、プロリン、乳酸と連なるコドンを、さらにその下流に工程F)のtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にスペーサーを結合させる工程
K) 工程J)の無細胞翻訳系に工程J)のスペーサーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前ペプチド化合物-mRNA複合体ペプチドディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 工程K)のライブラリーにペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを作用させる工程
K, Lの工程は翻訳時にペプチドデフォルミラーゼ、メチオニン アミノペプチダーゼを系に加えることにより同時に実施することもできる。
M) 環状構造を形成させる工程
環状構造の形成においては、必要に応じて脱硫反応を行うことができる。
N) 化合物Na−4もしくは化合物Na−10(Na−7基)もしくは化合物Na−11(Na−7基)の側鎖保護基を脱保護させる工程、およびCys、Pro、乳酸ユニットから活性チオエステルを発生させる工程
O) 生成した活性チオエステル化と側鎖アミノ基とアミド結合形成させて直鎖部位2を生成させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
P) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
Q) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
R) 塩基配列を解析する工程
工程G)にてメチオニンの代わりにノルマルロイシンを加えることもできる。
アミノアシルtRNAの調製は、pdCpAの利用に限らずアミノアシルtRNA合成酵素、フレキシザイム、カチオンミセル中超音波混合法、PNAアミノ酸活性エステル法などの利用も含む。
アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する場合、C末端側直後のアミド結合に水素原子と反応してアスパルチミドを形成してしまうため、アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する際に直後のアミノ酸残基をN−アルキル基を有するアミノ酸(例えばプロリン)にすることによって望みのチオエステルを含む全長ペプチドを翻訳合成する方法
本明細書において前記「アルキル基」は、下記の「アルケニル基」、「アルキニル基」が含まれる場合がある。
本明細書において前記「アリール基」は、下記の「ヘテロアリール」が含まれる場合がある。
ヘテロアリールとしては具体的には、たとえば、フリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、トリアジニル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ベンゾチアジアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾオキサジアゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、ベンゾジオキソリル基、インドリジニル基、イミダゾピリジル基などが挙げられる。
「通常アミン」とは、反応補助基により活性化されていないアミンを意味する。
本発明における「核酸」には、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)あるいは、人工塩基を有するヌクレオチド誘導体を含むこともできる。また、ペプチド核酸(PNA)を含むこともできる。本発明の核酸は、目的とする遺伝情報が保持される限り、これらの核酸のいずれか、あるいは混成とすることもできる。すなわち、DNA−RNAのハイブリッドヌクレオチドやDNAとRNAのような異なる核酸が1本鎖に連結されたキメラ核酸も本発明における核酸に含まれる。
本発明においては、これら核酸を鋳型として含む、displayライブラリーなどの核酸ライブラリーを好適に用いることができる。
本発明のペプチド化合物の製造方法では、無細胞翻訳系などのタンパク質製造システムを使用することが好ましい。無細胞翻訳系とは、細胞より抽出したribosomeの他、翻訳に関与する蛋白因子群、tRNA、アミノ酸、ATPなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたものでmRNAを蛋白に翻訳することが出来る。本発明の無細胞翻訳系には、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルtRNA合成酵素、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼなどを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。
ライブラリーを構成するペプチドに含まれるN-メチルアミノ酸の数は、DNAライブラリーを合成する際にN-メチルアミノ酸に当てたコドンの出現頻度にて調整することができる。例えば10のアミノ酸残基可変箇所を含むペプチドのライブラリーではアミノ酸の種類が20種類から選択されると仮定された場合、N-Meアミノ酸を10種類選択すると、N-Meアミノ酸のコドンユニットが可変箇所1箇所当り10/20(50%)を占めるように合成することによってライブラリーのペプチドに含まれるN-メチルアミノ酸の数は平均5個になる。
実際に我々の実施例24に記載の通り、このルールに則ると、可変領域のアミノ酸の種類は21種類であり、そのうち10種類がNメチルなどのNアルキルアミノ酸が選定された。Initiation read through法では固定アミノ酸2つのうち、両方ともがNH2であったため、平均のN-アルキル数は4.4と計算された。Inhitiation suppression法では2つの固定アミノ酸のうち1つがNアルキルであり、また交差ユニットのC末端側もN-アルキルアミノ酸の中から選定されたこともあり平均のN−アルキルアミノ酸数は6.0と計算された。
同様に両者の平均のCLogP値は、それぞれ5.97と6.12であった。
本発明に使用できる非天然型アミノ酸(翻訳アミノ酸)を以下に例示するが、それらに限定されない。これらの非天然型アミノ酸の多くは側鎖が保護あるいは無保護、アミン部位が保護あるいは無保護の状態で購入される。購入されないものは、既知の方法によって合成される。
N−メチルアラニン、N−メチルグリシン、N−メチルフェニルアラニン、N−メチルチロシン、N−メチルー3−クロロフェニルアラニン、N−メチルー4―クロロフェニルアラニン、N−メチルー4−メトキシフェニルアラニン、N−メチルー4−チアゾールアラニン、N−メチルヒスチジン、N−メチルセリン、N−メチルアスパラギン酸、
アミノ酸及びアミノ酸類縁体は、pdCpAと反応させるために、例えば活性エステルに変換することができる。これらの活性エステルは多くはシアノメチルエステルとして単離することができる。
カルボン酸と一級および二級アミンとの反応によるアミド結合形成反応は、広く有機合成化学一般に使用されている。例えば、カルボン酸を予め活性化された活性エステルなどとして単離してからアミンと混合させる方法、直接カルボン酸とアミンを混合させた後にカルボン酸を活性化させてアミド結合を形成させる方法などを用いることができる。カルボン酸の活性体として酸クロライドや酸アオイダイドなどの酸ハライド群や、HOBt、HOAt、HOSu、HOPfp、チオエステルなどの活性エステル群が広く知られている。
チオエステルとしては、好ましくは、−C(=O)SR1で表されるものが挙げられる。
また、望みの位置で選択的にカルボン酸とアミノ基を反応させるため、カルボン酸とアミノ基側のいずれか、あるいは両方に反応補助基を導入させることも可能である。
カルボン酸側とアミノ基側の両方に反応補助基を導入させる例として、以下スキームが挙げられる(Liら, Org. Lett. 2010, 12, 1724)。
この反応は、比較的温和な反応条件(60℃、36時間)、水中で適用可能である。
本発明は、本発明の方法で製造されたペプチド化合物を含有する医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、本発明の方法で製造されたペプチド化合物に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化される。
例えば、経口製剤を製造するには、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩と賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
チオエステルを有する一連の活性エステル(化合物1g)の合成を実施し、Rex1=Me、Et、iPr、tBu、Bn、Ph、Phenetyl基の合成を図1の方法に従って行った。
なお、実施例中では以下の略号を使用した。
DCM ジクロロメタン
DIC N,N−ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DMAP 4−ジメチルアミノピリジン
DMF ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオスレイロール
FA ギ酸
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
HFIP 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール
HOBT 1H−ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール−1−オール
WSCI・HCl 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミド塩酸塩
TCEP トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
NMP N-メチル‐2‐ピロリドン
DBU 1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン
なお、ペプチド合成及び、固相合成に用いる反応溶媒はペプチド合成用(関東化学、和光純薬あるいは渡辺化学から購入)を用いた。例えばDCM、DMF、DMSO、2% DBU in DMF,20% piperidine in DMFなどである。また、水を溶媒として加えない反応では脱水溶媒や無水溶媒(関東化学、和光純薬などから購入)を用いた。
LCMS(ESI) m/z = 322 (M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 361 (M+H)+
保持時間:0.91分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 336 (M+H)+
保持時間:0.83分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 375 (M+H)+
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 260 (M+H)+
保持時間:0.58分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =299(M+H)+
保持時間:0.69分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 274 (M+H)+
保持時間:0.70分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 313 (M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 288 (M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 327 (M+H)+
保持時間:0.90分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 364 (M+H)+
保持時間:1.01分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 302 (M+H)+
保持時間:0.90分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 246 (M+H)+
保持時間:0.51分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 285 (M+H)+
保持時間:0.69分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 336 (M+H)+
保持時間:0.82分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 375 (M+H)+
保持時間:0.93分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 316 (M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 260(M+H)+
保持時間:0.54分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =299(M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =378(M+H)+
保持時間:1.03分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 361 (M+H)+
保持時間:0.89分(分析条件SQDAA05)
実施例1で合成した側鎖カルボン酸が活性エステル化された化合物(化合物1g)を用いてアミノアシル化pdCpA(化合物1i)の合成を行った。
緩衝液A(113ml)にリン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h)(200mg、0.314mmol)の水溶液(6.25ml)と4−(ベンジルチオ)−4−オキソ−2−(ペンタ−4−エンアミド)ブタン酸 (S)−シアノメチル(化合物1g−ID)(454mg、1.26mmol)のテトラヒドロフラン(3.15ml)溶液を加え、室温で1時間攪拌した。その後、トリフルオロ酢酸(2.52ml、33.9mmol)を加えた後に、凍結乾燥させた。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液=100/0→60/40)にて精製し、4−(ベンジルチオ)−4−オキソ−2−(ペンタ−4−エンアミド)ブタン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(化合物1i−ID)(70.9mg、24%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 940 (M+H)+
保持時間:0.53分(分析条件SQDFA05)
N,N,N−トリメチルヘキサデカン−1−アミニウム 塩化物(6,40g、20mmol)とイミダゾール(6.81g、100mmol)の水溶液に酢酸を添加し、pH8、20mM N,N,N−トリメチルヘキサデカン−1−アミニウム、100mMイミダゾールの緩衝液A(1L)を得た。
LCMS(ESI) m/z =954(M+H)+
保持時間:0.80分(分析条件SMDmethod1)
LCMS(ESI) m/z =878(M+H)+
保持時間:0.66分(分析条件SMDmethod1)
LCMS(ESI) m/z =892(M+H)+
保持時間:0.70分(分析条件SMDmethod1)
LCMS(ESI) m/z =906(M+H)+
保持時間:0.74分(分析条件SMDmethod1)
LCMS(ESI) m/z =864(M+H)+
保持時間:0.40分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =954(M+H)+
保持時間:0.55分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =878(M+H)+
保持時間:0.43分(分析条件SQDFA05)
(化合物1i−IIF)
LCMS(ESI) m/z =940(M+H)+
保持時間:0.70分(分析条件SQDFA05)
(1i−IIF−B1)
LCMS(ESI) m/z =828(M−H)−
保持時間:0.65分(分析条件SQDFA05)
(1i−IIF−B2)
LCMS(ESI) m/z =828(M−H)−
保持時間:0.66分(分析条件SQDFA05)
これまで示してきたように、Rex1=Me、Et,iPr,Ph,Bz、Phenetyl基を有する側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化pdCpA(化合物1i)を合成した。
以下の方法に従って、側鎖カルボン酸がチオエステル化されたアミノアシル化tRNAの合成を行なった。
鋳型DNA(配列番号D−1)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAEnAsnGAG (-CA)(配列番号R−1)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAEnAsnGAG (-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTgagAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
tRNAEnAsnGAG (-CA) RNA配列:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUgagAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
50μM 転写tRNAEnAsnGAG (-CA)(配列番号R−1) 10μLに、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2, 10 mM ATP) 2μL、Nuclease free water 4μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 20unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)2μLおよび、5mMの側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化pdCpA(化合物1i)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液 20μLに、3M酢酸ナトリウム 4μLと125mM ヨウ素(水:THF=1:1溶液)24μLを加え、室温で1時間、脱保護を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−1)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−1)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
Glu(SMe)−tRNAEnAsnGAG
Glu(SBn)−tRNAEnAsnGAG
様々なアミノ酸によりアミノアシル化されたtRNAを、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、鋳型DNAからの転写系を含む原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、転写翻訳液(5%(v/v) T7 RNA polymerase RiboMAX Enzyme Mix (Promega社,P1300),2mM GTP,2mM ATP,1mM CTP,1mM UTP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM グルタミン酸カリウム,12mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF−G,0.25μM RF1,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF−Tu,84μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的はHisタグ付加タンパクとして調製した))に、0.02μM 鋳型DNA、それぞれの鋳型DNAにコードされているタンパク質性アミノ酸群をそれぞれ300μMずつ、ならびに50μMの側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化tRNA(化合物AT−1)を翻訳反応混合物に添加し、37℃で30分から1時間静置することで行った。
20nM 鋳型DNA Mtyg_R(配列番号D−2)に、0.3mM Gly,0.3mM Met,0.3mM Arg,0.3mM Thr,0.3mM Tyrおよび、50μM Glu(SBn)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT−1−IID)を含む前述の転写翻訳液を37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析した。しかしながら、図2に示すように分子量799から2000の範囲に翻訳ペプチドに由来するマススペクトルのピークをMALDI−MSにて確認することが出来なかった。例えば、分子量882、918、1256付近に検出されたピークは、陰性対照として鋳型DNAを加えないPURESystemを分析したときにも観測されるピークであることから、翻訳ペプチド由来のピークではない。
Mtyg_R DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgACTACAACGCGActttactaccgtcgtggcggcTAATAAATAGATAG
MetThrThrThrArg[Glu(SBn)]TyrTyrArgArgGlyGly
Not detected (calc. 1595.7)
2−1.Asp(SMe)を含むモデルペプチドの翻訳合成
20nM 鋳型DNA Mtryg3(配列番号D−3)、Leuを除く各0.3mMの19種類のタンパク質性アミノ酸、50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT−1−IA)を加えた転写翻訳液を、37℃で60分間保温した。SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析した。その結果、チオエステルを含む全長ペプチドから、脱MeSHされた分子量を示すマススペクトル(MS)が主生成物として観測された(図3)。
Mtryg3 DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgACTACAACGCGActttactaccgtggcggcTAGTAGATAGATAG
MetThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGly
m/z: [H+M]+ = 1302.5 (チオエステル含む全長ペプチドCalc. 1349.6, 脱MeSHペプチドCalc. 1301.6) (観測された分子量1302の化合物をペプチドP−3とする)
20nM 鋳型DNA Ft02A_dR(配列番号D−4)に、前述の転写翻訳液に、Leuを除く各0.3mMの19種類のタンパク質性アミノ酸,および前記の方法で調製した50μM 化合物AT-1-ID(Asp(SBn)-tRNAEnAsnGAG)を加え、37℃で60分間翻訳した。翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析したところ、チオエステルアミノ酸を含む全長ペプチドP−5が生成した後に、脱BnSH化されたMSスペクトルが同様に主生成物として確認された(ペプチドP−6)。このことから脱BnSH化される反応点としてはフェノール性水酸基では無いことが確認された(図5)。
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAgaaggagatatacatATGACTACAACGgcgggcggcCTTttttttggcggcAAATAATAA
MetThrThrThrAlaGlyGly[Asp(SBn)]PhePheGlyGlyLys
前述の翻訳反応物P−6を、333mM Bicine KOH pH9.0中で、95℃で15分間加水分解を行い、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析した。その結果、脱BnSHペプチドP−6が加水分解され18分子量の増加が確認された(ペプチド化合物P−4)。想定されるチオエステル部位の縮合反応はアミノ基とのアミド形成反応ではなく、比較的加水分解され易いOH基やSH基とのエステル化反応やチオエステル化反応などであると示唆された(図4)。
ペプチド化合物P−4
MALDI-MS:
m/z: [H+M]+ = 1289.6 (P-6の加水分解体Calc. 1288.7)
N末端にアミノ基を持たないペプチドの翻訳合成を行い、以下のように解析した。
保持時間:0.609分 (分析条件 SMDmethod1)
鋳型DNA(配列番号D−5)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAfMetCAU(-CA)(配列番号R−5)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAAC
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC
50μM 転写tRNAfMetCAU(-CA)(配列番号R−5) 10μLに、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2, 10 mM ATP)2μL、Nuclease free water 4μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)2μLおよび、5mMのN末端アミノ基を含まないアシル化pdCpA(化合物7c)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。アシル化tRNA(化合物AT−2)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アシル化tRNA(化合物AT−2)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物AT−2
MeOFlac−tRNAfMetCAU(配列番号:33)
[MeOFlac]ThrThrThrArg[Asp(SBn)]TyrTyrArgArgGlyGly
MALDI-MS:
m/z: [H+M]+ = 1489.6 (ペプチド配列P-7から脱BnSH化されたペプチドP−8 Calc. 1488.6)
20nM 鋳型DNA KA03(配列番号 D−6)に、前述の転写翻訳液、0.1mM 10-HCO-H4folate(10-formyl-5, 6, 7, 8, -tetrahydrophilic acid、特開2003−102495参照)、Leuを除く各0.3mMの19種類のタンパク質性アミノ酸,および前記の方法で調製した50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT−1−IA)を加え、37℃で60分間翻訳した。翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析したところ、チオエステルを含む全長ペプチドのMSが主生成物として観測され、脱MeSH化されたピークは認められなくなった。
以上の結果により、アスパラギン酸型のチオエステル残基は、直後のアミド結合に水素原子が存在する場合、これと反応してアスパルチミドを形成したことが明らかとなった(翻訳ペプチドP−3、P−6、P−8ではいずれもチオエステルのC末端側となりのアミド結合の水素原子と反応してアスパルチミドを形成していた)。一方で、直後のアミノ酸残基をN−アルキルのアミノ酸にすることによって望みのチオエステルを含む全長ペプチドの翻訳に成功した(図7)。
KA03 DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgACTAGAACTaaggcgTACTGGAGCcttCCGggcggctaa
MetThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGly
MALDI-MS: m/z: [H+M]+ = 1527.7 (翻訳ペプチドP−9 Calc. 1526.7,)
MALDI-MS:
m/z: [H+M]+ = 1302.5 (チオエステル含む全長ペプチドCalc. 1348.6, 脱MeSHペプチドCalc. 1301.6) (観測された分子量1302の化合物をペプチドP−3とする)
チオエステルアミノ酸を含む全長ペプチドP−5が生成した後に、脱BnSH化されたペプチド
MALDI-MS: m/z: [H+M]+ = 1271.8 (ペプチドP−5が脱BnSH化されたペプチド Calc. 1270.6)
MALDI-MS:m/z: [H+M]+ = 1639.7 (Calc. 1638.7)
チオエステルの翻訳合成が可能となったため、これとアミド結合縮合させるアミノ基側のユニットとして良好な要件を特定するための実験を以下のような手順で行った。
図8に記載の方法に従って、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のチオエステルを有するペプチドモデルとして化合物5b−1および5b−2を合成した。
1−1. 4−(ベンジルチオ)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−オキソブタン酸 (S)−ベンジル(化合物5b−1)の合成
LCMS(ESI) m/z = 430 (M+H)+
保持時間:1.10分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 444 (M+H)+
保持時間:1.11分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 448 (M+H)+
保持時間:1.09分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 498 (M+H)+
保持時間:1.12分(分析条件SQDAA05)
図8に示すように、チオエステルモデル化合物5bまたは5e、5fと、システインあるいはグリシン誘導体モデル化合物とを反応させることで、チオエステルと容易にアミド結合を生成する基質を選択した。
2−1. 2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−4−オキソブタン酸 (S)−ベンジル(化合物5c−1)の合成
LCMS(ESI) m/z = 455 (M+H)+
保持時間:0.98分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 469 (M+H)+
保持時間:0.99分(分析条件SQDAA05)
トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(1.0g、3.49mmol)の水(6.8ml)溶液にトリエチルアミン(1.64ml)加え、pH7とし、0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液を得た。
化合物5d−1
LCMS(ESI) m/z = 472 (M+H)+
保持時間:0.99分(分析条件SQDAA05)
化合物5d−1b
LCMS(ESI) m/z = 380(M+H)+
保持時間:0.90分(分析条件SQDAA05)
化合物5d−2
LCMS(ESI) m/z = 485 (M+H)+
保持時間:1.01分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 485 (M+H)+
保持時間:2.80分(分析条件ZQAA05)
LCMS(ESI) m/z = 485 (M+H)+
保持時間:2.80分(分析条件ZQAA05)
Yangmeiらの文献(Journal of combinatorial chemistry2009, 11, 1066-1072)に従い、アセトニトリル−1.5Mイミダゾール水溶液(7:1)の条件下で反応を行った(図9)。
液性はpH6.4、pH7.4の2条件で、反応温度を37度、70度、100度と3条件行った。最も反応転化率が良好な反応条件(pH7.4、100度)では、望みのアミド化反応の進行が46LC area%程度確認された。
チオエステル部位と翻訳後環化させるN末端に使用するアミノ酸として、CysおよびMeCysなどのSH基にて活性化されたアミノ酸の合成及びそれらを用いたアミノアシル化pdCpAの合成を、図10に示す手法に従って以下のように行った。
LCMS(ESI) m/z = 347 (M−H)−
保持時間:1.00分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =928(M+H)+
保持時間:0.58分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =828(M+H)+
保持時間:0.35分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 444 (M+H)+
保持時間:1.16分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 446 (M+H)+
保持時間:1.02分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 322 (M−H)−
保持時間:0.88分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =363(M+H)+
保持時間:1.05分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =942(M+H)+
保持時間:0.62分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =842(M+H)+
保持時間:0.36分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =331(M+H)+
保持時間:0.94分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =910(M+H)+
保持時間:0.53分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 444 (M−H)−
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 289 (M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =868(M+H)+
保持時間:0.45分(分析条件SQDFA05)
5−1. 3−(tert−ブチルジスルファニル)−2−((((4,5−ジメトキシ−2−ニトロベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸 (R)−シアノメチル(化合物2l−E)の合成
LCMS(ESI) m/z = 486 (M−H)−
保持時間:0.99分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =1067(M+H)+
保持時間:0.62分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 294(M+H)+
保持時間:0.98分(分析条件SQDAA05)
4−((エチルジスルファニル)メチル)−5−オキソオキサゾリジン−3−カルボン酸 (R)−tert−ブチル(化合物2e−F)(819mg、2.79mmol)のジクロロメタン(14ml)溶液にトリエチルシラン(4.46ml、27.9mmol)、トリフルオロ酢酸(6.88ml、89.0mmol)を0℃で加え、室温で1時間攪拌した。その後、反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム水溶液/メタノール=100/0→60/40)にて精製し、(R)−3−(エチルジスルファニル)−2−(メチルアミノ)プロパン酸(化合物2f−F)(232mg、43%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 196 (M+H)+
保持時間:0.39分(分析条件SQDAA05)
(R)−3−(エチルジスルファニル)−2−(メチルアミノ)プロパン酸(化合物2f−F)(232mg,1.19mmol)と炭酸ナトリウム(252mg、2.38mmol)のジオキサン(3ml)、水(3ml)溶液に、カルボノクロリド酸 4,5−ジメトキシ−2−ニトロベンジル(394mg、1.43mmol)を加え、室温で30分攪拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液(3ml)を加えた後に、酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その後、有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧濃縮後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム水溶液/メタノール=70/30→0/100)にて精製し、(R)−2−((((4,5−ジメトキシ−2−ニトロベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)−3−(エチルジスルファニル)プロパン酸(化合物2k−F)(483mg、93%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 435 (M+H)+
保持時間:0.82分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 474 (M+H)+
保持時間:0.97分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =1053(M+H)+
保持時間:0.59分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 224 (M+H)+
保持時間:0.63分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 411 (M+H)+
保持時間:1.11分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z =990(M+H)+
保持時間:0.65分(分析条件SQDFA05)
50μM 転写tRNAfMetCAU(-CA)(配列番号R−5) 10μlに、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2, 10 mM ATP) 2μl、Nuclease free water 4μlを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 10unit/μl T4 RNAリガーゼ(New england bio lab.社) 2μLおよび、5mMのCys(StBu)のアミノアシル化pdCpA (化合物2n−A)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−2−A)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−2−A)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
1.ペプチド配列P−10の翻訳合成
20nM 鋳型DNA Mtryg3(配列番号 D−3)に、前述の転写翻訳液、0.1mM 10-HCO-H4folate、0.3mM Gly,0.3mM Arg, 0.3mM Thr, 0.3mM Tyr, 0.3mM Leu,および前記の方法で調製した50μM Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AT−2−A)を加え、37℃で60分間翻訳した。翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析したところ、標的分子であるペプチド配列P−10を観測することはできなかった(図12)。すなわち、開始AUGからの翻訳ペプチドは検出されなかった。Cys誘導体をN末端に配置させて翻訳導入させるには工夫が必要である。一方で、2番目コドンにコードされるアミノ酸であるThrから全長にわたって翻訳されたペプチド(ペプチドP−11)のMSが特異的に観測される興味深い現象が確認された。
[Cys(StBu)]ThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
MALDI-MS: m/z: Not detected (Calc. 1345.7)
ThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
MALDI-MS: m/z: [M+H]+ = 1300.7 (Calc. 1299.7)
20nM 鋳型DNA(配列番号 D−7)に、前述の転写翻訳液、0.1mM 10-HCO-H4folate、MetとLysを除く各0.3mMの18種類のタンパク質性アミノ酸,および前記の方法で調製した50μM Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AT−2−A)を加え、37℃で60分間翻訳した。翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析したところ、標的分子であるペプチド配列P−12を観測することが出来た。一方で、2番目コドンにコードされるアミノ酸であるThrから全長にわたって翻訳されたペプチドP―13のMSが主生成物として観測された。Cys(StBu)をN末端に配置させたペプチド翻訳合成が可能であることが示されたが、その効率は低く改良検討を以下行った。
AKC17 DNA配列 (配列番号D−31と同一) (配列番号:7)
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTAGAACTGCCTACTGGAGCcttTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGC
[Cys(StBu)]ThrArgThrAlaTyrTrpSerLeuCysGlySerGlySerGlySer
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1723.7 (Calc.1722.7)
ThrArgThrAlaTyrTrpSerLeuCysGlySerGlySerGlySer
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1532.7 (Calc.1531.7)
pdCpA法によるN末端Cys(StBu)導入効率が低い原因を特定するために以下の実験を行った。
前駆体である化合物2n−Aを用いてpdCpA−Cysの側鎖StBuの脱保護および脱保護された化合物2e−Aの安定性を調べる以下の実験を行った。250μM の化合物2n−A、pH7の50mM Tris・HCl buffer、DTT 10mMの条件下、室温で側鎖の脱保護を行い、その経時変化をLC−MS(SQD)を用いて観測した。目的の化合物2e−Aは観測されず、アミノ酸が加水分解し脱離したpdCpAが観測された。5分後、化合物2n−A 51%、化合物2e−A 0%,pdCpA49%であり、2時間後に脱保護は完了し化合物2n−Aが 0%になったが、化合物2e−Aは0%で、全てpdCpA100%に加水分解された(図13)。
以上のことから、pdCpA−Cys(化合物2e−A)は通常翻訳条件下で不安定であり、ほぼ生成と同時に加水分解されるため、翻訳に不利であることが判明した。
CysのSH基を保護した化合物2n−Aの安定性を評価した。以下の表2の通りに5条件の保存サンプルをそれぞれ調整し、LC−MSを用いて分析した。
以上のことからpdCpA法によるN末端Cys(StBu)導入効率が低い原因の一つとして、側鎖SH基の存在によるアミノアシル化tRNAの不安定化を特定した。
実施例9で観測された2番目のコドンからの翻訳開始が効率的に得られた現象(Intiation read through)を積極的に活用することで、ペプチドのN末端にCysの導入を以下のように試みた。
以下の方法により翻訳を行った。20nM 鋳型DNA Mctryg3(配列番号D−8)に、前述の転写翻訳液、0.3mM Gly,0.3mM Arg,0.3mM Thr, 0.3mM Tyr,0.3mM Leu、0.3mM Cysを加え、37℃で60分間翻訳した。翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析したところ、開始コドンであるAUGからではなく、AUGの次にコードされるコドン(TGC、Cysに相当)から翻訳された標的ペプチドP−14のMSが期待どおり主生成物として観測された(図14参照)。
Mctryg3 DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgtgcACTACAACGCGTctttactaccgtggcggcTAGTAGATAGATAG
CysThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
MALDI-MS: m/z: [M+H]+ = 1290.6 (Calc. 1289.6)
三文字目のコドンがinitiation read throughにどのように影響するか評価した。20nM 鋳型DNA IniRt_XXX_am(配列番号D−9からD−28まで)に、前述の大腸菌由来の再構成無細胞転写翻訳液、Metを除く各0.3mMの19種類のタンパク質性アミノ酸を加え、37℃で60分間翻訳した。対照実験としてMetを含む翻訳も別途行った。翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析したところ、開始のAUGの次にコードされるCysから翻訳されたペプチドのMSが観測された。
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGtgcXXXACTACAACGctttactaccgtggcggcTAGTAGATAGATAG
(XXX: TTT(配列番号D−9(配列番号:9)), TTG(配列番号D−10(配列番号:10)), TAC(配列番号D−11(配列番号:11)), TGC(配列番号D−12(配列番号:12)), TGG(配列番号D−13(配列番号:13)), CTT(配列番号D−14(配列番号:14)), CTA(配列番号D−15(配列番号:15)), CCG(配列番号D−16(配列番号:16)), CAT(配列番号D−17(配列番号:17)), CAG(配列番号D−18(配列番号:18) CGT(配列番号D−19(配列番号:19)), CGG(配列番号D−20(配列番号:20)), ATT(配列番号D−21(配列番号:21)), ACT(配列番号D−23(配列番号:22)), AAC(配列番号D−24(配列番号:23)), AGT(配列番号D−25(配列番号:24)), AGG(配列番号D−26(配列番号:25)), GTT(配列番号D−27(配列番号:26)), GCT(配列番号D−28(配列番号:27))
CysXaaThrThrThrLeuTyrTyrArgGlyGly(配列番号:39〜57)
天然型アミノ酸であるCysは、ARSを活用したIntiation read through法により効率的に翻訳導入されたが、非天然型アミノ酸をARS導入するには限界があるため、アミノアシル化pdCpAのうち、活性エステル部分の加水分解速度を遅くする工夫をした化合物を合成・評価した。すなわち、SH基をカルボン酸活性エステル部位からより離した一連の化合物群を合成・評価した。
1.化合物6i−Aの合成
1−1.(2−(tert−ブチルジスルファニル)エチル)カルバミン酸 tert−ブチル(化合物6b−A)の合成
LCMS:m/z 266 (M+H)+
保持時間:1.05分(分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 166 (M+H)+
保持時間:0.63分(分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 352 (M+H)+
保持時間:1.11分(分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 322(M−H)−
保持時間:0.89分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 363(M+H)+
保持時間:1.04分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 942(M+H)+
保持時間:0.89分 (分析条件 SMDmethod1)
LCMS:m/z 842(M+H)+
保持時間:0.39分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 352(M+H)+
保持時間:1.11分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 336(M−H)−
保持時間:0.96分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 377(M+H)+
保持時間:1.09分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 856(M+H)+
保持時間:0.629分 (分析条件 SMDmethod1)
LCMS:m/z 380(M+H)+
保持時間:1.15分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 352(M+H)+
保持時間:0.99分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 391(M+H)+
保持時間:1.05分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS:m/z 870(M+H)+
保持時間:0.641分 (分析条件 SMDmethod1)
50μM 転写tRNAfMetCAU(-CA) (配列番号R−5) 10μlに、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2, 10 mM ATP)2μl、Nuclease free water 4μlを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μl T4 RNAリガーゼ(New england bio lab.社)2μLおよび、5mMのアミノアシル化pdCpA(化合物6i−A、B、C、2n−A、2m−c、2m−E)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−2−A、C、E、AT−6−A、B、C)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−2−A、C、E、AT−6−A、B、C)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
以下の実験で示すとおり、CysのSH基や主鎖アミノ基を保護すると、Cys自身と比較してアミノアシル化pdCpAの翻訳液モデル系中(HEPES buffer)の安定性が向上し、翻訳合成効率も向上することが示された。また、SH基の位置をα―カルボン酸部位から遠くに配置させた、各種新規SH基含有各種非天然型アミノ酸の翻訳導入効率も向上された。
結果、Cysと比較して、SH基やNを保護すると、pdCpA−アミノ酸体の安定性が向上し、かつ翻訳合成効率も向上することが示された。また、Cysをより安定化させたSH含有各種非天然型アミノ酸の翻訳導入効率も向上された(図25、26参照)。
AKC17 DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTAGAACTGCCTACTGGAGCcttTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGC
KA03 ペプチド配列
[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGlyGly
AKC17 ペプチド配列
[Xaa]ThrArgThrAlaTyrTrpSerLeuCysGlySerGlySerGlySer
1.側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシルtRNAの合成
以下の方法に従って、側鎖カルボン酸がチオエステル化されたアミノアシル化tRNAの合成を行なった。
鋳型DNA(配列番号D−33)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAEnAsnGAG(-CA)(配列番号R−33)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAEnAsnGAG(-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTgagAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
tRNAEnAsnGAG(-CA) RNA配列:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUgagAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
50μM 転写tRNAEnAsnGAG(-CA)(配列番号R−33)10μLに、10X ligation buffer (500mM HEPES-KOH pH7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μL、Nuclease free water 4μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)2μLおよび、5mMの側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化pdCpA(化合物1i)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液 20μLに、125mM ヨウ素(水:THF=1:1溶液)4μLを加え、室温で1時間、脱保護を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−1)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−1)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG
Asp(SiPr)-tRNAEnAsnGAG
Asp(StBu)-tRNAEnAsnGAG
Asp(SBn)-tRNAEnAsnGAG
Asp(SPhenetyl)-tRNAEnAsnGAG
Asp(SEt)-tRNAEnAsnGAG
鋳型DNAとしてKA03 DNA配列(配列番号 D−6)を用いて翻訳反応を行った。
鋳型DNAに、前述の転写翻訳液、MetおよびLeuを除く各0.3mMの18種類のタンパク質性アミノ酸,および前記の方法で調製した25μM tBuSSEtGABA-tRNAfMetCAU(化合物番号 AT−6−C)と50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物番号 AT−1−IA2)を加え37℃で3時間翻訳した。翻訳産物に、1/20(v/v)量の200mM TCEP(pH6.6)を添加し、37℃で15分反応させ、Asp(SMe)部位と分子内環化反応を行った。その結果、目的の環状ペプチド(ペプチド配列P−43)がMSスペクトルで確認された(図27)。チオエステルに続くアミノ酸をN−アルキルアミノ酸とすることで効率的に翻訳・環化が実現された。
[tBuSSEtGABA]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGly
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1601.7 (Calc.1601.0)
[HSEtGABA]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGlyのGABAの主鎖窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1465.6 (Calc.1465.0)
1.NCL(Native Chemical Ligation)を介したアミド型環化ペプチドの合成
鋳型DNAとしてKA02.5U DNA配列(配列番号 D−32)を用いて翻訳反応を行った。
鋳型DNAに、前述の転写翻訳液、MetおよびAla、Leuを除く各0.3mMの17種類のタンパク質性アミノ酸,3 mM乳酸、および前記の方法で調製した50μM Asp(SRex2)-tRNAEnAsnGAG (Rex2:ベンジル,メチル,エチル,イソプロピル、ターシャリーブチル、フェネチル)(化合物番号 AT−1−IA2、IB2、IC2、ID2、IE2,IG2)を加え37℃で3時間翻訳した。その結果、環化した全長ペプチドがMSスペクトルで確認された(図28〜図29)。
KA02.5U DNA配列:
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG
tgcACTAGAACTaaggcgTACTGGAGCcttCCGggctaa
CysThrArgThrLys[Lac]TyrTrpSer[Asp(SRex2)]ProGly
(Rex2:ベンジル、メチル、エチル、イソプロピル、ターシャリーブチル、フェネチル、Lac:乳酸)
翻訳後、環化したペプチドの化学構造(ペプチド配列番号P−44からP−49)
CysThrArgThrLys[Lac]TyrTrpSer[Asp(SRex2)]ProGlyのCysの主鎖アミノ基とAspの側鎖カルボン酸との分子内アミド化された化合物
2−1.LC-MS分析用翻訳ペプチド調製
20nM 鋳型DNA Mctryg3(配列番号D−8)に、前述の転写翻訳液、0.1mM 10-HCO-H4folate(10-formyl-5, 6, 7, 8, -tetrahydrophilic acid)、MetおよびLeuを除く各0.3mMの18種類のタンパク質性アミノ酸,および前記の方法で調製した50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT−1−IA)を加え、37℃で3時間翻訳した。翻訳反応物に1mM ジチオスレイトールを添加し、37℃で30分間還元を行った後、10mM ヨードアセトアミドを添加し、遮光・室温で40分間、チオールのカルボキシアミドメチル化を行った。
CysThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGly
CysThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGlyのCysの主鎖アミノ基とAspの側鎖カルボン酸が分子内アミド環化された化合物 massスペクトル calc. 1273.6
CysThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGly(ペプチド配列P−52)のCysの主鎖アミノ基とAspの側鎖カルボン酸が分子内アミド環化されたペプチド配列P−53のCysのSH基がアセトアミド化された化合物
2−2−1.自動合成機によるペプチド固相合成の一般法
ペプチド合成機(Multipep RS; Intavis社製)を用いて、Fmoc法によりペプチド合成を行った。Fmoc-Cys(Mmt)-OHをノバビオケム社から購入し、Fmoc-Cys(Mmt)-OHを除く他のFmocアミノ酸を渡辺化学工業から購入した。なお、操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
合成機にC末端のFmocアミノが結合した2−クロロトリチルレジン(1カラムあたり250−300mg)と、各種Fmocアミノ酸(0.6mol/L)と1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)(0.375mol/L)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液と、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)のN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液(10%v/v)をセットし、Fmoc脱保護溶液として、5%(wt/v)の尿素を含むピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド溶液(20%v/v)、またはジアザビシクロウンデセン(DBU)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(2%v/v)を用いて合成を行った。レジンはDMF溶液で洗浄した後、Fmoc脱保護に次いでFmocアミノ酸の縮合反応を1サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでレジン表面上にペプチドを伸長させた。このような実験例としてRamon Subiros-funosasらの非特許文献(Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 3665-3673)などを参考にして合成した。
伸長終了後、レジンをジクロロメタンで洗浄し、トリフルオロ酢酸/トリイソプロピルシラン/ジクロロメタン(=2/5/93, 100mL)を加え、レジンからペプチドの切り出しとS−メトキシトリチル基の脱保護を行った。1.5時間後、チューブ内溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、反応液に2−ヨードアセトアミド(252mg、1.36mmol),DIPEA(15mL),DMF(15mL)を加え、Sのアルキル化を行った。1.5時間後、減圧濃縮し得られた残渣を逆相シリカゲルクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液=95/5→0/100)にて精製し、直鎖ペプチドH-Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp-Arg(Pbf)-Asp-OBn(ペプチドP−55)を得た。(180mg、10%)
LCMS(ESI) m/z =1262(M−H)−
保持時間:0.71分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =1246(M+H)+
保持時間:1.02分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =1156(M+H)+
保持時間:0.93分(分析条件SQDFA05)
上記レジンに、c(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-OH(ペプチドP−57、46mg、0.04mmol)、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)(5.4mg、0.04mmol)ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(0.075mL0.048mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液を加えた。17時間後、レジンをジクロロメタンで洗浄し、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン(=1/99, 4mL)を加え、レジンからペプチドの切り出しを行った。1.5時間後、チューブ内溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、減圧濃縮し得られた残渣を逆相シリカゲルクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム水溶液/メタノール=50/50→0/100)にて精製し、C(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-OH(ペプチドP−58)を得た。(6.2mg、7.3%)
LCMS:1059 m/z (M+2H)2+
保持時間:0.83分 (分析条件SQDAA50)
LCMS:664 m/z (M−2H)2−、1329.4(M−H)−
LCMS:1331.4 m/z (M+H)+
保持時間:0.49分 (分析条件SQDAA05)
翻訳合成品(ペプチドP−54)と同一の配列を有する有機合成品を作製したので、高分解能LC/MS装置(Orbitrap Velos、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、USA)を用いて比較分析した。翻訳品については、翻訳溶液約30uLに0.5%トリフルオロ酢酸60uLを加え攪拌後、遠心分離上清をOasis HLBカートリッジ(30mg、1cc、Waters Corporation、USA)にアプライした。0.5%トリフルオロ酢酸含有5%アセト二トリル溶液1mLで洗浄後、0.5%トリフルオロ酢酸含有60%アセト二トリル溶液1mLで溶出した。溶出液を窒素乾固し、0.5%トリフルオロ酢酸含有20%アセト二トリル溶液60uLに再溶解しLC/MS分析に付した。翻訳産物の精密質量をポジティブイオンモードで測定した結果、m/z 666.2937に2価のプロトン化分子[M+2H]2+を与え、理論値m/z 666.2935と良く一致していた。高速液体クロマトグラフにおける保持時間ならびにMS/MSスペクトルパターンを有機合成品と比較した結果、いずれも良く一致していた。以上の結果、翻訳合成産物は有機合成による環化ペプチドと同一のものであることが確認された(図30)。
翻訳合成にてアミド環化反応が進行した一方、我々の目的のためには反応補助基のSH基の除去が必要となる。SH基は様々なタンパクと共有結合を形成することが知られているため、SH基依存的な結合化合物が得られる可能性が高い一方で、そのような化合物は高い反応性のため薬剤になりにくい。
SH基の除去には分子間反応が必要である。既に述べたように分子間反応を1uM濃度にて、かつ様々な反応性官能基が共存する条件下での実現の難易度は高い。このような反応を実現させる手法として、以下の2つが考えられる。(i)過剰に用いる試薬は、望みの反応点以外では可逆的な反応(例えば配位結合)のみが生じ、反応完結後の後処理により除去される。(ii)過剰に用いる試薬はRNAには全く影響を与えない。
このような各種条件をクリアできる反応基質と反応条件を様々検討した結果を以下に示す。
モデル基質2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)を用いてWanら(Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 9248)と同様の方法でラジカル脱硫反応が進行することを確認した(図31および図32)。ラジカル脱硫反応としてMethodA及びMethodBを行った。
以下、図32に記載の実験を行った。
1−1−1.図32 Entry 1の実験
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b) の合成
LCMS(ESI) m/z = 437 (M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液の調整
トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(1.0g、3.49mmol)の水(6.8ml)溶液にトリエチルアミン(1.64ml)加え、pH7とし、0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液を得た。
2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)塩酸塩(100mg、0.309mmol)に水(0.309ml)加え1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液を調整した。
2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)塩酸塩(100mg、0.309mmol)に水(3,09ml)加え0.1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液を調整した。
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)のDMF(0.5ml)あるいはメタノール(0.5ml)溶液に、グルタチオン(19.7mg、0.064mmol)と0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.214ml、0.0852mmol)を加え室温で10分間攪拌後、1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol) を室温で加え、50度で2時間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、entry2は2時間で原料化合物3aがすべて消失し、目的の化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z = 437 (M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)のメタノール(4.66ml)、水(2.06ml)溶液に0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)を加え室温で10分間攪拌後、1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol) を室温で加え、50度で1時間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全には消失されなかったが、目的化合物3bが観測された。さらに、副生成物として、推定化合物3c、3dもまた観測された。その割合は、LCMS UVエリア強度比より、原料化合物3a:目的化合物3b:3c:3d=7:20:16:11であった。
化合物3b
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
構造推定化合物3c
LCMS(ESI) m/z =453(M+H)+
保持時間:0.91分(分析条件SQDAA05)
構造推定化合物3d
LCMS(ESI) m/z =337(M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)のメタノール(4.66ml)、水(0.20ml)溶液にグルタチオン(196mg、0.639mmol)と0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)を加え室温で10分間攪拌後、1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol) を室温で加え、50度で1時間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全には消失され、目的化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)のメタノール(4.66ml)、水(2.06ml)溶液にグルタチオン(19。6mg、0.0639mmol)と0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)を加え室温で10分間攪拌後、1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol) を室温で加え、50度で1時間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全には消失され、目的化合物3bが観測された。さらに、副生成物として、推定化合物3c、3dもまた観測された。その割合は、LCMS UVエリア強度比より、原料化合物3a:目的化合物3b:3c:3d=0:79:14:6であった。
化合物3b
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
構造推定化合物3c
LCMS(ESI) m/z =453(M+H)+
保持時間:0.91分(分析条件SQDAA05)
構造推定化合物3d
LCMS(ESI) m/z =337(M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)のメタノール(0.5ml)溶液に0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)を加え室温で10分間攪拌後、1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol)を室温で加え、50度で1時間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全に消失され、目的化合物3bが観測された。さらに、副生成物として、推定化合物3c、3dもまた観測された。その割合は、LCMS UVエリア強度比より、原料化合物3a:目的化合物3b:3c:3d=0:24:32:19であった。
化合物3b
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
構造推定化合物3c
LCMS(ESI) m/z =453(M+H)+
保持時間:0.91分(分析条件SQDAA05)
構造推定化合物3d
LCMS(ESI) m/z =337(M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDAA05)
Method Aとほぼ同様の製造方法であるが、2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)のMeOH−H2O溶液に0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液、グルタチオンを加え、目的の反応温度30度、40度あるいは50度に加熱後 1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液を加え、そのまま30度、40度あるいは50度の反応温度で攪拌した。反応の経時変化をLC−MSを用いて観測した。
トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(1.0g、3.49mmol)の水(6.8ml)溶液にトリエチルアミン(1.64ml)加え、pH7とし、0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液を得た。
2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)塩酸塩(100mg、0.309mmol)に水(0.309ml)加え1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液を調整した。
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)のメタノール(0.5ml),水(0.06ml)溶液に0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)を加え50度で10分間攪拌後、0.1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol) を50度で加え、その後、50度で30分間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全に消失され、目的化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)のメタノール(0.5ml),水(0.06ml)溶液にグルタチオン(21.2mg、0.069mmol)と0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)を加え50度で10分間攪拌後、0.1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol) を50度で加え、その後、50度で30分間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全に消失され、目的化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)のメタノール(0.5ml),水(0.06ml)溶液に0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)を加え40度で15分間攪拌後、0.1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)を40度で加え、40度で30分間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全に消失され、目的化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)のメタノール(0.5ml),水(0.06ml)溶液にグルタチオン(21.2mg、0.069mmol)と0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)を加え40度で15分間攪拌後、0.1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)を40度で加え、その後40度で30分間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全に消失され、目的化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)のメタノール(0.5ml),水(0.06ml)溶液に0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)を加え30度で15分間攪拌後、0.1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)を30度で加え、その後30度で1時間30分間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全に消失され、目的化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((S)−1−エトキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3b)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)のメタノール(0.5ml),水(0.06ml)溶液にグルタチオン(21.2mg、0.069mmol)と0.4Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)を加え30度で15分間攪拌後、0.1M 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン(VA−044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)を30度で加え、その後30度で1時間30分間攪拌した。反応の変化をLCMSを用いて観測したところ、原料3aが完全に消失され、目的化合物3bが観測された。
LCMS(ESI) m/z =437(M+H)+
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
RNA化合物を脱硫反応の条件に付し、安定性の確認を行った。
グレンリサーチ社製ピューロマイシンCPG(22.7mg、0.999μmol)を用い、DNA合成機によりRNA結合伸長を行った。A、G、C、Uの伸長反応に用いるアミダイド試薬はグレンリサーチ社製A−TOM−CEホスホアミダイド、G−TOM−CEホスホアミダイド、C−TOM−CEホスホアミダイド、U−TOM−CEホスホアミダイドを使用し、縮合活性化剤として5−ベンジルチオ−1H−テトラゾールを使用し実施した。縮合後の固相担体を乾燥後、エタノール(0.25mL)、40%メチルアミン水溶液(0.25mL)を加え65℃にて1時間攪拌した。固相担体を濾別し、メタノール(0.5mL)で洗浄した。得られた溶液を濃縮しメタノール(1.0mL)に溶解し、そのうち0.8mLを濃縮しテトラメチルアンモニウムフルオライド水和物(50μL)に溶かし65℃にて15分間攪拌した。反応液に0.1M酢酸アンモニウム水溶液を加え逆相カラムで精製した。濃縮後、得られた化合物を再度逆相カラムで精製した。得られた溶液に水を加え逆相カラムに添着後、水(30mL)で洗浄したのちメタノール(50mL)で目的物を溶出した。得られた溶液を濃縮し水(1.0mL)に溶解し5´-AGCUUAGUCA-ピューロマイシン-3´(化合物RP-1)水溶液を得た。
LCMS(ESI) m/z = 1224.6 (M−3H)3−
保持時間:0.38分(分析条件SQDAA05)
5´-AGCUUAGUCA-ピューロマイシン-3´(化合物RP-1)水溶液(10μL)、標準物質として5mM 3−フェニル安息香酸メタノール溶液(10μL)、5mM 2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−4−オキソブタン酸 (S)−ベンジル(化合物5c−2)メタノール溶液(5μL)、100mM グルタチオン水溶液(15μL)、トリエチルアミンを使用しpHを7.1に事前調整した0.4M トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(5μL)、10mM 2,2'−アゾビス−2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン水溶液(5μL)を混合し50℃にて2時間反応した。反応液をLC/MSで分析し5´-AGCUUAGUCA-ピューロマイシン-3´(化合物RP-1)の残存量に変化がないことが確認された。この条件において2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(((R)−1−エトキシ−3−メルカプト−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−5−オキソペンタン酸 (S)−ベンジル(化合物5c−2)は消失し脱硫反応の生成物である2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-5-(((S)-1-エトキシ-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-5-オキソペンタン酸 (S)-ベンジル(化合物5e−2)が確認された。
LCMS(ESI) m/z = 437.3 (M+H)+
保持時間:0.96分(分析条件SQDAA05)
以下の方法により翻訳を行った。
鋳型DNA配列番号D−34として以下の配列を用いて翻訳反応を行った。
Mctryg3_08U05U: GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGtgc
ACTACAACGCGTctttactaccgtggcggcTAGTAGATAGATA
CysThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
(Calc. 1289.6)
AlaThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
m/z: [M+H]+ = 1258.7 (Calc. 1257.7)
脱硫反応液によるタンパク質変性の評価を行った(図34)。モデル系として、電気化学発光免疫測定法によるIL−6およびIL−6Rの相互作用検出系において、脱硫反応条件が、IL−6Rに対して、どのような影響を及ぼすか評価した。まず、MSD Multi-array 384 well (MSD社)に750ngの抗IL−6R抗体クローン番号17506(R&D biosystems社)を4度で一晩保存し、抗体の固相化を行った。80μlのPBSTでプレートを三回洗浄し、未反応の抗体を除いた後、2%スキムミルクで1時間ブロッキングを行った。ブロッキング剤を80μlのPBSTでプレートを三回洗浄後、10μlのsoluble human IL−6R(IL−6R)を25nM加え、室温で50分間振とうした。80μlのPBSTでプレートを三回洗浄し、脱硫反応液(25mM HEPES−K(pH7.6),200mM TCEP,250mM VA−044,10mM Cys)を添加し、室温で50分間振とうした。80μlのPBSTでプレートを三回洗浄し、10μlのhuman IL−6−BAP(500nM)を添加し、室温で50分間振とうした。80μlのPBSTでプレートを三回洗浄し、10μL SULFO-TAG StAv(MSD社,cat#R32AD−5,1μg/mL)を添加後、室温で50分間振とうした。80μlのPBSTでプレートを三回洗浄し、35μlの2X read buffer (MSD社,R92SC−3)を添加後、SECTOR Imager 2400 (MSD社)で測定した(図34)。
その結果、脱硫反応液を添加することで、IL6−Rが影響を受け、IL−6との相互作用が弱まることが示された。また、脱硫反応液に、酸化型のDTT(DTTox)を添加することで、IL−6Rへの影響が弱まり、IL−6との相互作用が回復することが示された。
チオエーテル環化法と本発明の環化法の比較を行った。脂質膜透過速度が速いと考えられる脂溶性が高いチオエーテル環化ペプチドを合成した。
1.チオエーテル環化ペプチドの合成
Fmocアミノ酸として、Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-MeIle-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc−Ser(Trt)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Bip−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Cha−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Cys(Mmt)OHなどを用いてペプチドの伸長を行った(略語は渡辺化学カタログによる)。ペプチドの伸長後、N末端のFmoc基を脱保護し、HOAt,DICを縮合剤としてクロロ酢酸を縮合させた後、レジンをジクロロメタンにて洗浄した。レジンにトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/2,2,2−トリフルオロエタノール/トリイソプロピルシラン(=1/62/31/6,v/v/v/v、4mL)を加えて2時間反応させ、レジンからのペプチドの切り出しと同時にO−トリチル基、S−ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。反応終了後、チューブ内溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、反応液をジイソプロピルエチルアミン(1mL)溶液を入れたチューブに反応液を加え、クロロアセチル基とシステインとの環化反応を行った。反応終了後、溶媒を留去した。得られた租生成物を、DMF中、ピペリジン(1.9eq.)O−(7−アザー1Hベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N,Nテトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)(1.7eq.)にてC末端カルボン酸のピペリジンアミド化を行った。反応終了後、Genevacにて溶媒留去した。得られた租生成物はジメチルスルホキシドに溶解し、得られたペプチド溶液は高速逆相クロマトグラフィー(HPLC)で精製した。
Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1063 m/z (M+H)+
保持時間:0.77分 (分析条件 SQDAA50)
Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1045 m/z (M+H)+
保持時間:0.76分 (分析条件 SQDAA50)
Ac*-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1087 m/z (M+H)+
保持時間:2.72分 (分析条件 ZQAA50)
Ac*-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser-MeIle-Bip-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1093 m/z (M+H)+
保持時間:2.52分 (分析条件 ZQAA50)
Ac*-MePhe-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1049 m/z (M+H)+
保持時間:0.77分 (分析条件 SQDAA50)
Ac*-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1031 m/z (M+H)+
保持時間:0.74分 (分析条件 SQDAA50)
Ac*-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1073 m/z (M+H)+
保持時間:0.82分 (分析条件 SQDAA50)
Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1206 m/z (M+H)+
保持時間:2.60分 (分析条件 ZQAA50)
Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1172 m/z (M+H)+
保持時間:2.75分 (分析条件 ZQAA50)
Ac*-MePhe-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1192 m/z (M+H)+
保持時間:0.81分 (分析条件 SQDAA50)
Ac*-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1158 m/z (M+H)+
保持時間:2.75分 (分析条件 ZQAA50)
Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1333 m/z (M+H)+
保持時間:2.87分 (分析条件 ZQAA05)
Ac*-Leu-MeAla-Cha-Thr-Thr-Ala-Cys*-Cha-piperidine
(2つの*部位にて環化)
LCMS:1007 m/z (M+H)+
保持時間:2.46分 (分析条件 ZQAA50)
2−1.チオエーテル環化ペプチドのSerum安定性、肝ミクロソーム中安定性試験
得られた化合物を2uMの濃度にてマウス血清(雄雌混合、Valley Biomedical社、USA)(33.5mM HEPES緩衝液によりpH7.4に調製)と2時間代謝反応させた。経時的にアセトニトリルによる除タンパク処理を施し、LC/MSを用いて残存する未変化体量を分析し、代謝半減期(t1/2)を算出した。NADPH存在下および非存在下、マウス肝ミクロソームならびに小腸ミクロソーム(雄、XENOTECH社、USA)を100mM リン酸緩衝液(pH7.4)を用いて0.5mg protein/mLになるよう調製したミクロソーム溶液と化合物を1uMの濃度にて30分間代謝反応させた。経時的にアセトニトリルによる除タンパク処理を施し、LC/MSを用いて残存する未変化体量を分析し,肝固有クリアランス(CLh,int)ならびに小腸固有クリアランス(CLg,int)を算出した。(表7)。これらのペプチドはマウス血清中並びにミクロソーム中においてペプチダーゼなどの加水分解による代謝を受ける速度は十分遅く、脂溶性の低い天然アミノ酸からなるペプチドと比較して対照的な結果となった。これらの結果と比較し、ミクロソーム中NADPH存在下における代謝速度は高く、代謝の主な経路は酸化代謝であることが明らかとなった。
2−1.にて示したのと同様の実験にて、代謝安定性試験を行った。
マウスにて比較的代謝安定性の高かったチオエーテル化合物の小腸での代謝安定性試験と、ヒトでの肝ミクソーム中での代謝安定性試験を実施した(化合物P−112、103、102、109)。ヒトでの肝ミクロソームでの代謝安定性は、マウスの場合と比較しておよそ3倍程度悪化した。
続いて化合物P−112(配列 Ac*-MeA-MeF-MeL-Thr-MeG-MeL-SertBu-MeI-Cys*- piperidine)のS原子を酸化させたスルホキシド体(化合物P−114)の肝および小腸酸化代謝速度を測定した結果、化合物P−112と比較してそれぞれマウス肝0.6倍、ヒト肝およそ0.3倍、小腸0.2倍となり、ヒト肝および小腸代謝に改善が観測された(表8)。スルホン体P−115の小腸酸化代謝速度は0.5倍となった。
チオエーテルからスルホキシドへの変換での代謝安定化はマウスの肝ミクロソームでいくつか他の合成検体でも観測された(表9)。
化合物P−113環化ペプチドを10uMの濃度にてNADPH存在下、マウス肝臓(雄、XENOTECH社製、USA)を100mMリン酸緩衝液(pH7.4)を用いて0.5mg protein/mLになるよう調製したミクロゾーム溶液と1時間代謝反応させた(図35)。反応後アセト二トリルによる除タンパク処理を施し、得られた代謝産物を高分解能LC/MS装置(Q-TOF Ultima API、Waters Corporation社製、USA)にて分析した。代謝産物のマスクロマトグラムを以下に示した。比較的強度の強い代謝産物として、水酸化体に相当するピークが4本検出された。各ピークのMS/MSスペクトルを下記に示した。Peak1およびPeak2の代謝物については高い脂溶性側鎖のシクロヘキシル基を含む部分構造に水酸化を受けていることが推察された。Peak3の代謝物についてはピペリジン環に水酸化を受けた際の特徴的なイオンをm/z 102に与えたが、Peak1およびPeak2と類似のフラグメントイオンも与えており、Peak3中にはPeak1とPeak2の類縁体が存在するか、もしくは分離不十分によりPeak1およびPeak2が混入している可能性が示唆された。Peak4の代謝物はチオールを含む部位が酸化されていることが推察されたが、この部位での酸化容易度を考慮すると硫黄原子が代謝部位である可能性が高いと考えられた。
代謝部位をより特定させるために、得られたチオエーテル環化ペプチドを直接酸化反応した。チオエーテル体誘導体に対し、オキソンを用いて直接酸化させるとメチオニン誘導体(ペプチドP−130)が選択的に酸化され、一方トリプトファン誘導体(ペプチドP−132)は同一条件下で酸化反応が進行しないことを確認した。本条件を用いていくつかのチオエーテル体(ペプチドP−109、P−112、P−111、P−103)のチオエーテル部分を選択的に酸化させたペプチドP−114、P−115、P−116、P−117、P−118が得られた。
Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine化合物(2つの*にて環化、化合物P−109)のスルホキシド体
LCMS(ESI) m/z = 1187 (M+H)+
保持時間:2.48分、2.62分(分析条件ZQAA50)
Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)‐MeIle-Cys*-piperidine化合物(2つの*にて環化、化合物P−109)のスルホン体
LCMS(ESI) m/z = 1203 (M+H)+
保持時間:0.82分(分析条件SQDAA50)
Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine(化合物P−112)の直接酸化によるスルホキシド体
LCMS(ESI) m/z = 1348 (M+H)+
保持時間:0.84分(分析条件SQDAA50)
Ac*-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-piperidine(化合物P-111)の直接酸化によるスルホキシド体(化合物P−117)
LCMS(ESI) m/z = 1173 (M+H)+
保持時間:2.57分(分析条件ZQAA50)
化合物P−103の直接酸化反応による合成
LCMS(ESI) m/z = 1102 (M+H)+
保持時間:0.80分(分析条件SQDAA50)
(S)−2−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニルアミノ)−4−メチルスルファニル−酪酸(ペプチドP−130)
LCMS(ESI) m/z = 372 (M+H)+
保持時間:0.94分(分析条件SQDAA05)
生成物P-131
LCMS(ESI) m/z = 388 (M+H)+
保持時間:0.86分(分析条件SQDAA05)
(S)−2−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニルアミノ)−3−(1H−インドール−3−イル)−プロピオン酸(ペプチドP−132)
LCMS(ESI) m/z = 427 (M+H)+
保持時間:0.95分(分析条件SQDAA05)
脂溶性が高いチオエーテル環化ペプチド群の中で、比較的代謝安定性の高かったチオエーテル3種類を選択し、環化部位以外は同じ配列(MeAla-MePhe-MeLeu−Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)、MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle、MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle)のアミド環化ペプチドを合成し、それらの代謝安定性を比較した。下表のようにマウス、ヒトともにミクロゾーム代謝安定性はマウスで2倍程度、ヒトで3倍程度向上した。一連の化合物で安定して代謝安定化が得られたことから、Displayされる全ての化合物に含まれていたチオエーテル部分構造が除去されたアミド環化法では、Displayされる化合物の多くがより代謝安定化された、よりDruglikeなDisplay手法であると考えられた。
Ala-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Asp-piperidine
N末端アミンとAsp側鎖がアミド環化
LCMS: 1067.8 m/z (M-H)-
保持時間:0.72分 (分析条件 SQDAA50)
MeAla-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Asp-piperidine
N末端アミンとAsp側鎖がアミド環化
LCMS: 1081.9 m/z (M-H)-
保持時間:0.73分 (分析条件 SQDAA50)
Ala-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Glu-piperidine
N末端アミンとGlu側鎖がアミド環化
LCMS: 1082.0 m/z (M-H)-
保持時間:0.73分 (分析条件 SQDAA50)
MeAla-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Glu-piperidine
N末端アミンとGlu側鎖がアミド環化
LCMS: 1096.0 m/z (M-H)-
保持時間:0.73分 (分析条件 SQDAA50)
Ala-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Asp-piperidine
N末端アミンとAsp側鎖がアミド環化
LCMS: 1110.0 m/z (M-H)-
保持時間:0.82分 (分析条件 SQDAA50)
MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)- MeIle-Glu-piperidine
N末端アミンとGlu側鎖がアミド環化
LCMS: 1137.8 m/z (M-H)-
保持時間:0.81分 (分析条件 SQDAA50)
Ala-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Asp-piperidine
N末端アミンとAsp側鎖がアミド環化
LCMS: 1194.7 m/z (M-H)-
保持時間:0.81分 (分析条件 SQDAA50)
N末端でない位置のシステインと側鎖カルボン酸が活性化されたアミノ酸を含むペプチドを翻訳し、両官能基が反応したチオエステル環化ペプチドを調製した。続いて、同システインよりもN末端部に位置するアミノ酸を酵素的に除去することで、システイン残基のα-アミノ基を露出させ、それを用いたペプチドのアミド環化が進行するかを以下のように試みた。
1. 転写によるtRNA(CA欠損)の合成
鋳型DNA(配列番号DT−E1)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAGluAAG (-CA)(配列番号RT−E1)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAGluAAG (-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluAAG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
50μM 転写tRNAGluAAG (-CA)(配列番号RT−E1) 10μLに、10X ligation buffer(500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2) 2μL、10 mM ATP 2μL、Nuclease free water 2.8μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 20unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)1.2μLおよび、5mMのアミノアシル化pdCpA(化合物1i−IA)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液 20μLに、3M酢酸ナトリウム 4μLと125mM ヨウ素(水:THF=1:1溶液)24μLを加え、室温で1時間、脱保護を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−E1)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−E1)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
側鎖カルボン酸をチオエステルにより活性化したアスパラギン酸誘導体でアミノアシル化されたtRNAを、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、翻訳液,1%(v/v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega社,N2111), 1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,2mM ジチオスレイトール,0.1mM 10−HCO−H4folate, 1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF−G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF−Tu,93μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にはHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型RNA、それぞれの鋳型DNAにコードされているタンパク質性アミノ酸群をそれぞれ250μMずつ、ならびに50μMの側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化tRNA(化合物AT−E1)を翻訳反応混合物に添加し、37℃で1時間静置することで行った。
1μM 鋳型RNA OT43 RNA(配列番号RM−E1)に、0.25mM Met,0.25mM Cys,0.25mM Thr,0.25mM Arg,0.25mM Tyr,0.25mM Pro,0.25mM Glyおよび、50μM Asp(SMe)−tRNAGluAAG(化合物AT−E1)を含む前述の翻訳液を37℃で60分間保温した。得られた翻訳溶液1μLに9μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート上乾固し、MALDI−MSで分析した。その結果、N末端フォルミルメチオニンを含み、側鎖チオール基とカルボン酸でチオエステル環化したペプチドP−E1に相当するピークが観測された(図62、ピークI)。続いて、上記翻訳反応物に終濃度がそれぞれ2μM、14μMとなるように酵素ペプチドデフォルミラーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼを加え、37℃で5分間保温した。得られた反応物を上述したようにMALDI−MSで分析したところ、原料のチオエステル環化ペプチドのピークは小さくなり、その代わりに、N末端フォルミルメチオニンが除去され、その結果露出したN末端アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物P−E2に相当するピークが観測された(図62、ピークII)。このことから、チオエステル環化が進行した後でも、CysよりN末端部を除去することで、目的のアミド環化ペプチドが得られる事が示された。
OT43 RNA
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUaugUGCACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUGGCGGCuaagcuucg
fMetCysThrThrThrArgAspProTyrArgGlyGlyの側鎖硫黄原子とAspの側鎖カルボン酸でチオエステル環化した化合物
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1367.5 (Calc.1367.6)
CysThrThrThrArgAspProTyrArgGlyGlyのN末端アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1208.3 (Calc.1208.6)
1.アミド環化ペプチドの合成
以下に示す環化ペプチドを合成した(表11−1:合成したペプチド化合物例(計965化合物))。特に明示しない限り表中の1に位置するアミノ酸が前記スキームAなどで示した白丸○に対応する交差ユニットに対応し、アミノ酸配列中左端に表記したアミノ酸が同じく▲ユニットに対応する。これら2つの部位が結合を形成し環化ペプチドを構成する。また、表中H-1からH-6で示したアミノ酸は前記スキームAなどで示した直鎖部に相当する。ここで、表中右端に存在する部位がC末端を形成する。ここで表記したpipとはC末端カルボン酸がピペリジンとアミド結合を形成してピペリジンアミドを形成したことを意味している。また、H-1に何も記載されていない環化ペプチドはC末端カルボン酸が削除された化合物を意図する。この場合、1に位置するアミノ酸の持つ1つのカルボン酸とN末端のアミンとがアミド化反応して環化され、C末端カルボン酸部位が削除された誘導体、例えばメチル基やトリフルオロメチル基に置換された化合物がC末端に位置される。表11−1に示した略号は表11−2(アミノ酸略号が意図する構造との関連表)に表記したアミノ酸を意味する。
既に記載の方法と同様の手法を用いて表11−1に表記した環化ペプチドを合成し、それぞれの化合物の同定を行った(表11−3−1、表11−3−2:合成したペプチド化合物の同定(計965化合物))。
C末端部位の主鎖部位がアミドにて化学修飾(多くの実施例ではピペリジンアミド)され、かつアスパラギン酸の側鎖カルボン酸部位(交差ユニット)がN末端側のアミノ基(三角ユニット)とアミド結合させた様々な化合物を合成する目的で、以下のアミノ酸もしくはペプチドの担持レジンを合成した。以下に合成例のより詳細な内容を述べる。なお、以下の方法に限定されず、本明細書の他に記載の部分や、一般的なペプチドの合成法によっても合成できる。
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブトキシ)-4-オキソブタン酸(化合物SP404、Fmoc-Asp(OtBu)-OH)(30g、72.9mmol)をDMF(243mL)に溶解させ、0℃にてN-メチルモルホリン(9.6ml、87mmol)、ついでO−(7−アザー1Hベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N,Nテトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)(33.3g、87mmol)を加え、10分間攪拌した。さらにピペリジン(7.1ml、71.5mmol)を滴下し、30分間攪拌した。反応混合物をヘキサン/酢酸エチル=1/1(1500ml)で希釈し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下に濃縮をし、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=2/1)にて精製し、(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-オキソ-4-(ピペリジン-1-イル)ブタン酸 tert-ブチル(化合物SP403)(35.2g、99%)を得た。
LCMS(ESI) m/z =479.5(M+H)+
保持時間:1.10分(分析条件SQDAA05)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-オキソ-4-(ピペリジン-1-イル)ブタン酸 tert-ブチル(化合物SP403)(9.3g、19.4mmol)をトルエン(300mL)に溶解させ、これを減圧下に濃縮した。この操作をさらに2回繰り返し行い、減圧下に終夜乾燥させた。反応容器に脱水ジクロロメタン(8.6ml)を入れ、窒素雰囲気下、0℃にて5分間攪拌した後、トリフルオロ酢酸(8.6ml、116mmol)を滴下した。室温にて4時間攪拌した後、0℃にてトリエチルアミン(16.2ml、116mmol)を滴下した。反応混合物をジクロロメタン(100ml)で希釈し、有機層を5%リン酸2水素ナトリウム水溶液で6回洗浄した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下に濃縮をし、得られた残渣を再度ジクロロメタン(100ml)で希釈し、有機層を5%リン酸二水素ナトリウム水溶液で2回洗浄した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下に濃縮をし、(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-オキソ-4-(ピペリジン-1-イル)ブタン酸(Fmoc-Asp-pip、化合物SP401)(7.8g、96%)を得た。この化合物はこれ以上の精製操作をせずに次の工程に使用した。
LCMS(ESI) m/z =423(M+H)+
保持時間:0.88分(分析条件SQDAA05)
なお、本明細書では、ポリマーやレジンと化合物が結合した場合、ポリマーやレジン部位を○にて表記する場合がある。また、レジン部位の反応点を明確にさせる目的で、○に接続させて反応部位の化学構造を表記させる場合がある。下の構造では、レジンの2−クロロトリチル基がAspの側鎖カルボン酸とエステル結合を介して結合している様子を示している。
(吸光度(301.2nm)x1000x50)/(13.42x7800)=0.267mmol/g
0.267mmol/gx100/(33.4/34.8)=27.8%
以下のスキームに従い、(3S)−3−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニルアミノ)−4−[メチル−[(2S)−1−オキソ−1−[[(2S)−1−オキソ−1−ピペリジン−1−イルプロパン−2−イル]アミノ]−3−フェニルプロパン−2−イル]アミノ]−4−オキソブタン酸−2−クロロトリチルレジン(化合物SP455,Fmoc−Asp(O−Trt(2−Cl)−Resin)−MePhe−Ala−pip)の合成を行った。
LCMS(ESI) m/z = 678.6 (M+H)+
保持時間:0.65分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 745.7 (M+H)+
保持時間:0.82分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 655.6 (M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDAA50)
ローディング率:0.317mmol/g、25.7%
LCMS(ESI) m/z = 839.6(M+H)+
保持時間:0.71分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 906.7 (M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 816.7 (M+H)+
保持時間:0.69分(分析条件SQDAA50)
ローディング率:0.285mmol/g、21.0%
ローディング率:0.234mmol/g、15.6%
ドラックライクネスを評価するための多くのアミノ酸誘導体は購入可能もしくは文献既知であり、定法により合成することができる。以下には文献未知のアミノ酸誘導体の合成法を記載した。
以下のスキームに従い、合成を行った
LCMS(ESI) m/z = 620.3 (M-H)-
保持時間:1.06分(分析条件SQDAA05)
(S)−2−(エチルアミノ)−3−フェニルプロパン酸(化合物SP442)(4.00g、20.7mmol)を1,4−ジオキサン(100ml)と水(100ml)の混合液に溶解させ、炭酸カリウム(8.69g、62.9mmol)および炭酸 (2,5−ジオキソピロリジン−1−イル) (9H−フルオレン−9−イル)メチル(6.98g、20.7mol)を加え、室温で8時間攪拌した。水層を硫酸水素カリウム水溶液でpH4に調整し、減圧下で1,4−ジオキサンを留去した。得られた水溶液を酢酸エチルにて抽出し、得られた有機抽出物を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後に減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィ(酢酸エチル:石油エーテル=1:1)で精製し、(2S,4R)−1−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)−4−エトキシピロリジン−2−カルボン酸(化合物SP443)(3.2g、37%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 416 (M+H)+
保持時間:1.97分(分析条件SMDmethod11)
以下のスキームに従って合成した。
LCMS(ESI) m/z = 439 (M+H)+
保持時間:1.05分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 383 (M+H)+
保持時間:2.07分(分析条件ZQAA05)
LCMS(ESI) m/z = 453 (M+H)+
保持時間:3.00分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 397 (M+H)+
保持時間:2.18分(分析条件ZQAA05)
LCMS(ESI)m/z =420.3(M−H)−
保持時間:0.39分 (分析条件 SQDAA50)
1−3−1. C末端のAspが交差ユニットとして機能し、すなわち主鎖カルボン酸がピペリジンなどによりアミド化され、側鎖カルボン酸でN末端の主鎖アミン(三角ユニット)とアミド環化したアスパラギン酸を有するペプチド群の合成例
固定された直鎖部(MePhe−Ala−pip及び、MePhe−MePhe−Ala−pip)を有するペプチドの合成
C末端がアミド化(本例ではピペリジン化)され、C末端以外に配置されたアスパラギン酸側鎖カルボン酸とN末端アミノ基がアミド結合により環化された合成例を述べる。本例を1つの代表例として述べるが、ペプチド化学合成については、本明細書の異なる場所(例えば142、512(実施例15の2−2)、553(実施例18)など)の各所に記載されているどの手法を用いてもよい。以下のスキームXにその合成の一例を示した。
C末端がアミド化(本例ではピペリジン化)され、C末端以外に配置されたアスパラギン酸側鎖カルボン酸とN末端アミノ基がアミド結合により環化された合成例を述べる。本例を1つの代表例として述べるが、ペプチド化学合成については、本明細書の異なる場所の各所に記載されているどの手法を用いてもよい。以下のスキームG2にその合成の一例を示した。
C末端以外に配置されたアスパラギン酸側鎖カルボン酸がアミド化され(本例ではピペリジンであるが直鎖部1を構成するペプチドが結合していてもよい)、N末端以外に配置されたアミノ基側鎖を有するアミノ酸の側鎖アミノ基とC末端に配置されたアミノ酸のカルボン酸とで環化したペプチドの化学合成例を述べる。ここでは直鎖部1および2を有するペプチドの例として、交差ユニット(○ユニット)としてAsp−pip、アミノ基ソースとして保護基のついたアミノ基側鎖を有するアミノ酸、N末端にカルボン酸類縁体を用いたケースを代表例として示した。本例でN末端に用いたHOGlyはヒドロキシル基を保護した化合物を用いても良い。ペプチド化学合成については、本明細書の異なる場所の各所に記載されているどの手法を用いてもよい。以下のスキームG3にその合成の一例を示した。
HOGly−Pro−MeLeu−*Lys−MeAla−Leu−MeLeu−MeLeu−Asp−piperidine−MeLeu−MePhe(3−Cl)−Ile*
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1479(M−H)−
保持時間:0.85分 (分析条件 SQDAA50)
化合物SP402と同様の手法にて合成したFmoc−Asp(O−Trt(2−Cl)−Resin)−pip(100mg)を用い、Fmocアミノ酸としてFmoc−MePhe−OH、Fmoc−MeAla−OH、Fmoc−MeLeu−OH、Fmoc−D−MeAla−OH、Fmoc−MeGly−OH、Fmoc−MeVal−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−D−Val−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(Trt)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−D−Leu−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−D−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Mmt)−OH, Fmoc−Ala(5−Tet(Trt))−OH(化合物409)などを用いてペプチドの伸長を行った(アミノ酸の略語は表11−2に記載)。既に実施例に記載のFmoc法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った。例えば、化合物DP−908の合成の場合、N末端のFmoc基を脱保護し、レジンにジクロロメタン/トリフルオロエタノール(=2/1、v/v、2ml)を加えて2時間振盪させ、レジンからのペプチドの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除いた。さらにレジンにジクロロメタン/トリフルオロエタノール(=2/1、v/v、1ml)を加えて15分間振盪させ、上記の溶液とあわせて溶媒留去した。得られた残渣をDCM(8ml)に溶解し、DIPEA(17μL、0.096mmol)を加えた。これに1M−O−(7−アザー1Hベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N,Nテトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)(30mg,0.08mmol)in DMSO(250μL)を加えてN末アミンとAsp側鎖カルボン酸との環化反応を行った。反応終了後、溶媒留去した。得られた残渣をトリフルオロエタノール(1.0ml)に溶解した。これにTFA/トリイソプロピルシラン/DCM(1/5/94、v/v/v、1.0ml)を加えて10分間攪拌し、保護基の脱保護を行った。反応終了後、DIPEA(50μL,0.286mmol)を加えてTFAを中和し、溶媒留去した。得られた粗生成物はジメチルスルホキシドに溶解し、得られたペプチド溶液は高速逆相クロマトグラフィー(HPLC)で精製し、溶媒留去した。得られた残渣をトリフルオロエタノール(1.5ml)に溶解し、水(0.5ml)とヘキサン(2ml)を加えて攪拌し、ヘキサン層を除去した。もう一度ヘキサン(2ml)を加えて攪拌し、ヘキサン層を除去した後に溶媒留去し,化合物DP−908(1.92mg,4.8%)を得た。上述と同様の方法、もしくはFmoc−Asp(O−Trt(2−Cl)−Resin)−pipの代わりに化合物SP455と同様に調製したFmoc−Asp(O−Trt(2−Cl)−Resin)−MePhe−Ala−pipを用い、表題のアミド環化ドラックライクペプチドの合成を行った。DP−585〜586、DP−592、DP−676、DP−904〜909が本合成法に準拠した方法で合成可能である。各化合物のマススペクトルの値と液体クロマトグラフィーの保持時間は表11−3−2に記載した。
化合物SP455と同様の手法にて合成したFmoc−Asp(O−Trt(2−Cl)−Resin)−MePhe−Ala−pip(100mg)を用い、Fmocアミノ酸としてFmoc−MePhe−OH、Fmoc−MeAla−OH、Fmoc−MeLeu−OH、Fmoc−MeGly−OH、Fmoc−MeVal−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−D−Val−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(Trt)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−D−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OAl)−OHなどを用いてペプチドの伸長を行った(アミノ酸の略語は表11−2に記載)。既に実施例に記載のFmoc法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った。例えば、化合物DP−595の合成の場合、N末端のFmoc基を脱保護し、レジンにジクロロメタン/トリフルオロエタノール(=2/1、v/v、2ml)を加えて2時間振盪させ、レジンからのペプチドの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除いた。さらにレジンにジクロロメタン/トリフルオロエタノール(=2/1、v/v、1ml)を加えて15分間振盪させ、上記の溶液とあわせて溶媒留去した。得られた残渣をDCM(8ml)に溶解し、DIPEA(20μL、0.115mmol)を加えた。これに1M O−(7−アザー1Hベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N,Nテトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)(37mg,0.096mmol)in DMSO(200μL)を加えてN末端アミンとAsp側鎖カルボン酸との環化反応を行った。反応終了後、溶媒留去した。得られた粗生成物をDMFに溶解し、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(Pd(PPh3)4)(7mg、0.006mmol)のジクロロメタン(1ml)溶液を加えた。続いてフェニルシラン(7.4ul, 0.06mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液を濾過後、有機層を減圧濃縮し、得られた粗生成物をDMSOに溶解し、得られたペプチド溶液は高速逆相クロマトグラフィー(HPLC)で精製後、溶媒を留去し、化合物DP−595(14.7mg,22%)を得た。上述と同様の方法でアミド環化ドラックライクペプチドDP−589、DP−596の合成を行った。各化合物のマススペクトルの値と液体クロマトグラフィーの保持時間は表11−3−2に記載した。
C末端にベータアミノ酸誘導体を用い、C末端のベータアミノ酸誘導体とN末端アミノ基がアミド結合により環化された、直鎖部を有さない化合物の合成例を述べる。ペプチド化学合成については、本明細書の異なる場所の各所に記載されているどの手法を用いてもよい。
1H−NMR(Varian 400−MR,400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.72 (3H, s),2.50−2.60 (4H, m), 1.99 (1H, m)
1H−NMR(Varian 400−MR,400 MHz, CDCl3) δ ppm 6.02 (1H, dt,18, 5.6Hz), 5.48 (1H, d, 18Hz), 3.68 (3H, s), 2.40−2.53 (4H, m), 1.28 (12H, s)
1H−NMR(Varian 400−MR,400 MHz, D2O) δ ppm 6.59 (1H, m), 5.51 (1H, d, 18Hz), 2.44−2.51 (4H, m)
2−2−1. *Phe−MeLeu−MeVal−MeGly−Thr−MeAla−Ala−MeLeu−Leu−Phe*−piperidine(2つの*の間でC−C結合されている)(化合物DCC−1)の合成
LCMS:m/z 1268.8(M+H)+
保持時間:0.75分 (分析条件 SQDAA50)
LCMS:m/z 1268.8(M+H)+
保持時間:0.78分 (分析条件 SQDAA50)
C−C結合環化ペプチド合成の別法も述べる。C−C結合環化を利用したDisplay libraryでは、例えばN末端側の三角ユニット部位に炭素−炭素二重結合、C末端側の交差ユニットのアミノ酸の側鎖にヨードフェニル基を有するペプチドを翻訳合成した後(スキームC−2)、Pdを使用したHeck反応によりC−C結合環化生成物を得ることができる。
上記手法で得られるC−C結合環化生成物のドラックライクネスを評価するために、C−C結合環化ペプチドの合成を行った。以下のスキームHにその合成の一例を示した。環化ペプチドの合成に際して、Pdによる環化反応ではなく、アミド化反応で環化ペプチドを合成した。すなわち、交差ユニットであるC末端フェニルアラニンの主鎖カルボン酸がアミドにて化学修飾(ピペリジンアミド化)され、かつ側鎖上のカルボン酸部位でレジンに結合させたフェニルアラニン誘導体を合成し、このレジンを用いて、Fmoc合成法に従いペプチドの伸張反応を行った。伸張後、ペプチドをレジンから切り出し、N末端側のアミノ基(三角ユニット)とC末端フェニルアラニン誘導体側鎖上のカルボン酸部位(交差ユニット)をアミド結合で縮合させて環化体とすることで、Display libraryの生成物に相当するC−C結合環化ペプチドの合成を行った。スキームHではC-C結合によりC-Cの2重結合が得られる場合のみを記載したが、C-Cの1重結合や3重結合も可能であり、その場合に応じて化合物群を合成した。
ドラックライクネス評価に使用した交差ユニット部位のフェニルアラニン誘導体として、以下に示すアミノ酸およびそのレジン結合化合物を合成した。
(S)−(3−(4−ヨードフェニル)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)カルバミン酸 tert−ブチル(化合物SP413、Boc-Phe(4-I)-pip)の合成
LCMS(ESI)m/z =459.5(M+H)+
保持時間:1.05分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI)m/z =459.4(M+H)+
保持時間:0.99分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =487.6(M+H)+
保持時間:1.05分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =553.4(M+H)+
保持時間:0.89分 (分析条件 SQDFA05)
(吸光度(301nm)x1000x50)/(用いたレジン量x7800)=0.265mmol/g
0.265mmol/gx100/(2.68/2.53)=25.0%
LCMS(ESI)m/z =459.2(M+H)+
保持時間:0.95分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =459.6(M+H)+
保持時間:0.99分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =487.6(M+H)+
保持時間:1.05分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =553.5(M+H)+
保持時間:0.90分 (分析条件 SQDFA05)
ローディング率:0.278mmol/g、26.1%
1H−NMR(Varian 400−MR, 400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.39 (2H, t,7.2 Hz), 2.28 (2H, m), 2.08 (1H, s), 1.85 (2H, m), 1.49(9H, s)
LCMS(ESI)m/z =499.4(M+H)+
保持時間:1.07分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =503.6(M+H)+
保持時間:1.14分 (分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI)m/z =569.6(M+H)+
保持時間:1.02分 (分析条件 SQDAA05)
ローディング率:0.217mmol/g、21.3%
1H−NMR(Varian 400−MR, 400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.48−2.50 (4H, m), 2.00 (1H, s), 1.49(9H, s)
LCMS(ESI)m/z =485.6(M+H)+
保持時間:1.03分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =489.6(M+H)+
保持時間:1.08分 (分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI)m/z =555.6(M+H)+
保持時間:0.92分 (分析条件 SQDFA05)
ローディング率:0.326mmol/g、35.3%
合成した環化ペプチドの膜透過性を比較検討する目的でPAMPA(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay)による試験を実施した。
ミリポア96穴メンブレンフィルター(疎水性PVDF(ポリビニリデンジフルオリド)、pore size 0.45μm)(日本ミリポア社より購入)に、Egg lecithin10%(w/v)、コレステロール0.5%(w/v)、ドデカン(以上Fluka社より購入)からなるリン脂質有機溶媒溶液を4μL添加することで、人工リン脂質膜を作製した。
合成した環化ペプチドの代謝安定性を比較検討する目的で、ヒト肝ミクロソーム中代謝安定性試験を実施した。(方法は既に記載済み、結果は表11−6:ヒト肝ミクロソーム中代謝安定性試験結果)。
我々が明らかにしたドラッグライクを兼ね備えるためのペプチドの条件(鎖長、N−メチルアミノ酸数、ClogP)を満たす8種のペプチドのマウスにおける静脈内ならびに経口投与後の血漿中濃度推移を評価した。雄性マウス(C57BL/6J、6週齢、日本クレア社製:1群3匹)に化合物を20 mg/kgの用量で静脈内ならびに経口投与し、投与後24時間までの血液を抗凝固剤としてヘパリン処理済みのヘマトクリット管を用い、背中足静脈より経時的に採取した。血液は遠心分離により血漿を分離し、アセト二トリルによる除タンパク処理後、LC/MS/MS装置(API3200、AB SCIEX社製、USA)を用いて血漿中濃度を測定した。得られた血漿中濃度推移より、解析ソフトPhoenix WinNonlin 6.1(Pharsight Corporation社製、USA)を用いて、ノンコンパートメント解析により薬物動態パラメータを算出した。
1.反応補助基を持たないN末端アミノ基と活性エステルとの翻訳液中でのアミド化反応
1−1.比較的安定な活性エステルを翻訳合成しておき、翻訳後に活性エステル部分を活性化させ、同時に系外から活性化剤を添加させて、反応補助基を有さないアミンと反応させる手法例
1−1−1.モデル反応原料化合物の合成
(9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S)−30−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−(tert−ブトキシ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−12,27−ジベンジル−18−イソブチル−24−イソプロピル−2,2,9,11,17,21−ヘキサメチル−4,7,10,13,16,19,22,25,28−ノナオキソ−3−オキサ−5,8,11,14,17,20,23,26,29−ノナアザドトリアコンタン−32−酸(Boc-Gly-Ala- Me Phe-Gly- Me Leu-Ala-Val-Phe-Asp- Me Ala-Ser(tBu)-Gly−NH2)の合成
保持時間:1.09分 (分析条件 SQD AA05)
(9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S)−30−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−(tert−ブトキシ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−12,27−ジベンジル−18−イソブチル−24−イソプロピル−2,2,9,11,17,21−ヘキサメチル−4,7,10,13,16,19,22,25,28−ノナオキソ−3−オキサ−5,8,11,14,17,20,23,26,29−ノナアザドトリアコンタン−32−チオ酸 S−ベンジル(Boc-Gly-Ala- Me Phe-Gly- Me Leu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)- Me Ala-Ser(tBu)-Gly−NH2)の合成
保持時間:1.08分 (分析条件 SQD AA05)
(4S,7S,13S,16S,19S,22S,25S)−1−アミノ−25−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−7,22−ジベンジル−13−イソブチル−19−イソプロピル−4,6,12,16−テトラメチル−2,5,8,11,14,17,20,23−オクタオキソ−3,6,9,12,15,18,21,24−オクタアザヘプタコサン−27−チオ酸 S−ベンジル(Gly-Ala- Me Phe-Gly- Me Leu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)- Me Ala-Ser-Gly−NH2)の合成
LCMS:m/z 1258.6(M+H)+
保持時間:0.58分 (分析条件 SQD FA05)
(6S,9S,12S,15S,18S,24S,27S,30S,33S)−18,30−ジベンジル−12,24−ジイソブチル−9,27−ジイソプロピル−2,2,6,11,17,23,26−ヘプタメチル−33−(メチル((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)カルバモイル)−4,7,10,13,16,19,22,25,28,31−デカオキソ−15−((R)−1−(トリチルオキシ)エチル)−3−オキサ−5,8,11,14,17,20,23,26,29,32−デカアザペンタトリアコンタン−35−酸(Boc-Ala-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp-MePhe-Ala-piperidine)の合成
なお、本明細書ではAla-piperidineもしくはAla-pipとは、ピペリジンの窒素原子とAlaの主鎖カルボン酸部位とでアミド結合を形成した化合物とする。この部分構造をペプチド部位に有する場合にも、同様の表記を用いる。
LCMS:m/z 1777.6(M−H)−
保持時間:0.86分 (分析条件 SQD AA50)
(6S,9S,12S,15S,18S,24S,27S,30S,33S)−18,30−ジベンジル−12,24−ジイソブチル−9,27−ジイソプロピル−2,2,6,11,17,23,26−ヘプタメチル−33−(メチル((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)カルバモイル)−4,7,10,13,16,19,22,25,28,31−デカオキソ−15−((R)−1−(トリチルオキシ)エチル)−3−オキサ−5,8,11,14,17,20,23,26,29,32−デカアザペンタトリアコンタン−35−チオ酸 S−ベンジル(Boc-Ala-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(SBn)-MePhe-Ala-piperidine)の合成
LCMS:m/z 1883.3(M−H)−
保持時間:0.93分 (分析条件 SQD AA50)
(3S,6S,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S)−30−アミノ−6,18−ジベンジル−21−((R)−1−ヒドロキシエチル)−12,24−ジイソブチル−9,27−ジイソプロピル−10,13,19,25−テトラメチル−3−(メチル((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)カルバモイル)−5,8,11,14,17,20,23,26,29−ノナオキソ−4,7,10,13,16,19,22,25,28−ノナアザヘントリアコンタン−1−チオ酸 S−ベンジル(Ala-Val-MeLeu-Thr-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(SBn)-MePhe-Ala-piperidine)の合成
LCMS:m/z 1541.0(M−H)−
保持時間:0.77分 (分析条件 SQD FA05)
LCMS(ESI) m/z =1959.2(M―H)―
保持時間:1.05分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z =1620(M+H)+
保持時間:0.88分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI)m/z =1306.4(M−H)−
保持時間:0.74分 (分析条件 SQD FA05)
LCMS(ESI)m/z =1412.6(M−H)−
保持時間:0.87分 (分析条件 SQD FA05)
LCMS(ESI)m/z =1256.8(M−H)−
保持時間:0.58分 (分析条件 SQD FA05)
LCMS(ESI)m/z =1382.6(M−H)−
保持時間:0.80分 (分析条件 SQD FA05)
LCMS(ESI)m/z =1490.6(M+H)+
保持時間:0.93分 (分析条件 SQD FA05)
LCMS(ESI)m/z =1332.7(M−H)−
保持時間:0.60分 (分析条件 SQD FA05)
N末端がGlyである場合の反応例を示す。
(化合物P−136)
(5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−8,23−ジベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,13,17−ペンタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミドの合成
4−(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール(0.018g、0.10mmol)およびトリエチルアミン(10.1mg、0.10mmol)を100mMのリン酸水素2ナトリウム水溶液(80μL)およびNMP(10μL)に溶解させた。この溶液に(4S,7S,13S,16S,19S,22S,25S)−1−アミノ−25−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−7,22−ジベンジル−13−イソブチル−19−イソプロピル−4,6,12,16−テトラメチル−2,5,8,11,14,17,20,23−オクタオキソ−3,6,9,12,15,18,21,24−オクタアザヘプタコサン−27−チオ酸 S−ベンジル(化合物P−147)のNMP溶液(10mM、10μL、0.10μmol)を加えて、室温で5時間攪拌した。反応液をLCMSで分析し、標題化合物の生成を確認した。なお、標題化合物と原料(保持時間0.58分、分析条件 SQDFA05)およびAspのチオエステルが加水分解されたカルボン酸体(保持時間:0.51分、分析条件 SQDFA05)の生成比はLCMSのUVエリア比でおおよそ74:11:15であった。結果を図36に示す。
LCMS:m/z 1134.6(M+H)+
保持時間:0.64分 (分析条件 SQDFA05)
ベンゼンチオール(0.110mg、0.001mmol)およびトリエチルアミン(0.202mg、0.002mmol)を100mMリン酸水素2ナトリウム水溶液(80μL)およびNMP(10μL)に溶解させた。この溶液に(4S,7S,13S,16S,19S,22S,25S)−1−アミノ−25−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−7,22−ジベンジル−13−イソブチル−19−イソプロピル−4,6,12,16−テトラメチル−2,5,8,11,14,17,20,23−オクタオキソ−3,6,9,12,15,18,21,24−オクタアザヘプタコサン−27−チオ酸 S−ベンジル(化合物P−147)のNMP溶液(10mM、10μL、0.10μmol)を加えて、室温で8時間攪拌した。反応液をLCMSで分析し、標題化合物の生成を確認した。なお、標題化合物と原料(保持時間0.58分、分析条件 SQDFA05)およびAspのチオエステルが加水分解されたカルボン酸体(保持時間:0.50分、分析条件 SQDFA05)の生成比はLCMSのUVエリア比でおおよそ89:8:3であった。結果を図37に示す。
LCMS:m/z 1134.6(M+H)+
保持時間:0.63分 (分析条件 SQDFA05)
(化合物P−137)
(2R,5S,8S,11S,14S,20S,23S,26S,29S)−14,26−ジベンジル−11−((R)−1−ヒドロキシエチル)−8,20−ジイソブチル−5,23−ジイソプロピル−N,2,7,13,19,22−ヘキサメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,27,31−デカオキソ−N−((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)−1,4,7,10,13,16,19,22,25,28−デカアザシクロヘントリアコンタン−29−カルボキサミドの合成
4−(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール(8.91mg、0.05mmol)およびトリエチルアミン(5.06mg、0.05mmol)の水溶液(25μL)と(3S,6S,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S)−30−アミノ−6,18−ジベンジル−21−((R)−1−ヒドロキシエチル)−12,24−ジイソブチル−9,27−ジイソプロピル−10,13,19,25−テトラメチル−3−(メチル((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)カルバモイル)−5,8,11,14,17,20,23,26,29−ノナオキソ−4,7,10,13,16,19,22,25,28−ノナアザヘントリアコンタン−1−チオ酸 S−ベンジル(化合物P−135)のNMP溶液(5mM、20μL、0.1μmol)を混合し、さらに水(25μL)とNMP(30μL)を加え、50度で終夜攪拌した。LCMS測定により、原料の消失とともに標題化合物の生成を確認した。なお、標題化合物とAspのチオエステルが加水分解されたカルボン酸体(保持時間:0.68分、分析条件 SQDFA05)の生成比はLCMSのUVエリア比で、おおよそ72:28であった。結果を図38に示す。
LCMS:m/z 1417(M−H)−
保持時間:1.04分 (分析条件 SQDFA05)
(3S,6S,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S)−30−アミノ−6,18−ジベンジル−21−((R)−1−ヒドロキシエチル)−12,24−ジイソブチル−9,27−ジイソプロピル−10,13,19,25−テトラメチル−3−(メチル((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)カルバモイル)−5,8,11,14,17,20,23,26,29−ノナオキソ−4,7,10,13,16,19,22,25,28−ノナアザヘントリアコンタン−1−酸 2−(エチルジスルファニル)−6−メチルフェニル(0.162mg, 0.1umol)(化合物P−139)と1−ヒドロキシピロリジン−2,5−ジオン(0.575mg、5umol)のDMF−400mMリン酸緩衝溶液(pH8.5)1:1混合溶液(95ul)に1Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)水溶液(5ul)を加え、室温で30分攪拌した後、LCMSを用いて反応を観測したところ、環化前駆体は完全に消失し、標題化合物P−137と加水分解体P−140が3:1(LCMS:UVエリア比)で観測された。
LCMS(ESI) m/z =1417.2(M−H)―
保持時間:1.04分(分析条件SQDFA05)
(3S,6S,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S)−30−アミノ−6,18−ジベンジル−21−((R)−1−ヒドロキシエチル)−12,24−ジイソブチル−9,27−ジイソプロピル−10,13,19,25−テトラメチル−3−(メチル((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)カルバモイル)−5,8,11,14,17,20,23,26,29−ノナオキソ−4,7,10,13,16,19,22,25,28−ノナアザヘントリアコンタン−1−酸
LCMS(ESI) m/z =1435.3(M−H)―
保持時間:0.67分(分析条件SQDFA05)
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・標題化合物
LCMS(ESI) m/z =1210.4(M+H)+
保持時間:1.04分(分析条件SMDmethod1)
(3S,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)−27−アミノ−3−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−6,21−ジベンジル−15−イソブチル−9−イソプロピル−12,22,24−トリメチル−5,8,11,14,17,20,23,26−オクタオキソ−28−フェニル−4,7,10,13,16,19,22,25−オクタアザオクタコサン−1−酸
LCMS(ESI) m/z =1228.5(M+H)+
保持時間:0.89分(分析条件SMDmethod1)
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−8,23−ジベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,2,5,7,17−ペンタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−511)の合成
(3S,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)−27−アミノ−3−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−6,21−ジベンジル−15−イソブチル−9−イソプロピル−12,22,24−トリメチル−5,8,11,14,17,20,23,26−オクタオキソ−4,7,10,13,16,19,22,25−オクタアザオクタコサン−1−チオ酸 S−ベンジル(化合物SP−504)のNMP溶液(10mM、5.0μl、0.050μmol)に内部標準として4−プロピル安息香酸のNMP溶液(11mM、2.25μl)を加えた。次に翻訳用緩衝液(6.25μl)、PURESYSTEM(r) classic II Sol. B(バイオコゥマー社、製品番号PURE2048C)(10μl)、20種の天然アミノ酸溶液(それぞれ5mM,2.5μl)を加えた。
なお翻訳用緩衝液の成分は8mM GTP,8mM ATP,160mMクレアチンリン酸,400mM HEPES−KOH pH7.6,800mM 酢酸カリウム,48mM 酢酸マグネシウム,16mMスペルミジン,8mM ジチオスレイトール,0.8mM 10−HCO−H4folate, 12mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社)である。これにトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン水溶液(pH=7.5、1.25M、2.0μl)および先に調整したチオール溶液を加えた。この時点での反応液のpHは7.8であった。
反応液を30℃で20時間攪拌した後、LC/MSで分析し、標題化合物の生成を確認した。20時間攪拌後の反応液のpHは9.4であった。また、標題化合物(SP−511)と加水分解体(化合物SP−512)との生成比はUVエリア比で1:1.6であった。
標題化合物
LCMS(ESI)m/z =1134.4(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件 SQDFA05)
加水分解体(化合物SP−512)
(3S,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)−27−アミノ−3−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−6,21−ジベンジル−15−イソブチル−9−イソプロピル−12,22,24−トリメチル−5,8,11,14,17,20,23,26−オクタオキソ−4,7,10,13,16,19,22,25−オクタアザオクタコサン−1−酸
LCMS(ESI)m/z =1152.5(M+H)+
保持時間:0.48分(分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 167 (M+H)+
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 139 (M−H)−
保持時間:0.70分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 277 (M−H)−
保持時間:0.95分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 199 (M−H)−
保持時間:0.92分(分析条件SQDFA05)
LC 保持時間:1.12分(分析条件SQDAA05)
1H−NMR(Varian 400−MR, 400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.76 (2H, d, 7.6 Hz), 7.49 (2H, d, 7.2 Hz), 7.41−7.24. (9H, m),5.90(1H, m) 5.77 (1H,d, 8.4Hz), 5.29(2H, m), 4.62(3H, m), 4.37(2H, m), 4.21(1H, t, 6.8Hz),3.08(1H, dd, 17.2, 4.4Hz), 2.90(1H, dd, 17.2, 4.8Hz), 1.80 (3H, s), 1.78 (3H, s)
LCMS(ESI) m/z = 390(M−H)−
保持時間:0.63分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 350(M−H)−
保持時間:0.80分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 532(M−H)−
保持時間:1.15分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 453(M−H)−
保持時間:1.04分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 932 (M−H)−
保持時間:0.70分(分析条件SQDAA05)
翻訳合成後の反応補助基を利用しないアミド化反応をTOF-MSにて生成を確認した。
2−1. 転写によるtRNA(CA欠損)の合成
鋳型DNA(配列番号D−40)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAGluAAG (-CA)(配列番号R−40)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAGluAAG (-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluAAG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
50μM 転写tRNAGluAAG (-CA)(配列番号R−40) 10μLに、10X ligation buffer(500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2, 10 mM ATP)2μL、Nuclease free water 4μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 20unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)2μLおよび、5mMの側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化pdCpA(化合物1i−ID)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液 20μLに、3M酢酸ナトリウム 4μLと125mM ヨウ素(水:THF=1:1溶液)24μLを加え、室温で1時間、脱保護を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−7−A)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−7−A)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
側鎖カルボン酸をチオエステルにより活性化したアスパラギン酸誘導体でアミノアシル化されたtRNAを、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、翻訳液,1%(v/v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega社,N2111), 1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.1mM 10−HCO−H4folate, 1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF−G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF−Tu,93μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にはHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型RNA、それぞれの鋳型DNAにコードされているタンパク質性アミノ酸群をそれぞれ250μMずつ、ならびに50μMの側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化tRNA(化合物AT−7−A)を翻訳反応混合物に添加し、37℃で1時間静置することで行った。
1μM 鋳型RNAMgtp_R(配列番号R−41(配列番号:67))に、0.25mM Gly,0.25mM Pro,0.25mM Arg,0.25mM Thr,0.25mM Tyrおよび、50μM Asp(SBn)−tRNAGluAAG(化合物AT−7−A)を含む前述の翻訳液を37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI−MSで分析した。その結果、開始メチオニン直後のGlyから翻訳開始された、N末端α―アミノ基とチオエステルを含むペプチドP-141(図39、ピークI)、及びそのGly直後に位置するThrから翻訳開始されたペプチドP-142(図39、ピークII)が主生成物として観測された(図39)
Mgtp_R RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUaugGGUACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUGGCGGCuaagcuucg
GlyThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
ThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
m/z: [H+M]+ = 1286.6(配列P-141に対応するペプチド。Calc.1286.6)
m/z: [H+M]+ = 1229.6(配列P-142に対応するペプチド。Calc.1229.6)
前述の翻訳反応物P−141を含む翻訳溶液3.5μL、1μLチオフェノール溶液(5M 4−トリフルオロメチルチオフェノール、5Mトリエチルアミンを等量混合したもの)、0.5μL 500mM トリカルボキシエチルホスフィン溶液 (pH7.5)を混合し、50℃で2時間保温した。その結果、出発物質であるP−141のピークは消失し、代わりにN末端α―アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物P-143に相当するピークを観測した(図40、ピークI)。
GlyThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGlyのN末端アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1162.4 (Calc.1162.6)
側鎖カルボン酸をチオエステルにより活性化したアスパラギン酸誘導体でアミノアシル化されたtRNAと、開始メチオニンを除いたタンパク質性アミノ酸混合物を無細胞翻訳系に加えて翻訳することで、所望の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、翻訳液,1%(v/v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega社,N2111), 1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,0.1mM 10−HCO−H4folate, 1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF−G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF−Tu,93μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にはHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型RNA、タンパク質性アミノ酸群をそれぞれ250μMずつ、ならびに50μMの側鎖カルボン酸が活性エステル化されたアミノアシル化tRNA(化合物AT−7−A)を翻訳反応混合物に添加し、37℃で1時間静置することで行った。
1μM 鋳型RNA OT89(配列番号RM−D1)に、0.25mM Phe,0.25mM Gly,0.25mM Pro,0.25mM Arg,0.25mM Thr,0.25mM Tyrおよび、50μM Asp(SBn)−tRNAGluAAG(化合物AT−7−A)を含む前述の翻訳液を37℃で60分間保温した。同様に別容器にて1μM 鋳型RNA OT90(配列番号RM−D2)に、0.25mM Ala,0.25mM Gly,0.25mM Pro,0.25mM Arg,0.25mM Thr,0.25mM Tyrおよび、50μM Asp(SBn)−tRNAGluAAG(化合物AT−7−A)を含む前述の翻訳液を37℃で60分間保温した。得られた2つの翻訳反応物1μLにそれぞれ9μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLずつをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート上乾固した。MALDI−MS分析の結果、RM−D1、RM−D2それぞれの鋳型から、開始メチオニン直後のPheもしくはAlaから翻訳開始された望みのペプチドP−D1(図44、ピークI)及びペプチドP−D2(図45、ピークI)が主生成物として観測された。
OT89 RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUaugUUUACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUGGCGGCuaagcuucg
PheThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
OT90 RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUaugGCUACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUGGCGGCuaagcuucg
AlaThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
m/z: [H+M]+ = 1376.4(配列P−D1に対応するペプチド。Calc.1376.6)
m/z: [H+M]+ = 1300.4(配列P−D2に対応するペプチド。Calc.1300.6)
前述の翻訳反応物P−D1を含む翻訳溶液3.5μLそれぞれに、1μLチオフェノール溶液(5M 4−トリフルオロメチルチオフェノール、5Mトリエチルアミンを等量混合したもの)、0.5μL 500mM トリカルボキシエチルホスフィン溶液 (pH7.5)を混合し、50℃で2時間保温した。得られた反応液2μLに12μLの2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート乾固した後、MALDI−MSにて解析を行った。その結果、出発物質であるP−D1のピークは消失し、代わりにN末端α―アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物P-D3に相当するピークを観測した(図44、ピークII)。前述の翻訳反応物P−D2を含む翻訳溶液についても、上記と同様な操作を行いMALDI−MSにて解析したところ、N末端α―アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物P-D4に相当するピークを観測した(図45、ピークII)
PheThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGlyのN末端アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1252.3 (Calc.1252.6)
AlaThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGlyのN末端アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物
MALDI-MS:m/z: [M+H]+ = 1176.3 (Calc.1176.6)
反応補助基を利用しないアミド化環化反応条件においてRNAが分解しないことを評価するため、反応条件に伏したRNAをゲル電気泳動により解析した。
1uM Mgtp_R RNA(配列番号R−41)を含む溶液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.1mM 10−HCO−H4folate,)3.5μL、1μLチオフェノール溶液(5M 4−トリフルオロメチルチオフェノール、5Mトリエチルアミンを等量混合したもの)、0.5μL 500mM トリカルボキシエチルホスフィン溶液 (pH7.6)を混合し、50℃で0.5〜2時間保温した。その後反応液をRNeasy minelute(qiagen社)により精製した。環化条件に付していない対照実験として、保温時間をなくしたもの、チオフェノール溶液の代わりに水を加えたもの、それらに加えて精製操作を行わなかったものも同様の操作を施した。得られたRNA溶液は、6M尿素を含む10%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った後、SYBR gold nucleic acid stain (Invitrogen社)により染色を行った。
その結果、対象実験として環化条件に付していないRNA (lane 1−3)と比べても、反応条件に付したRNA(lane 6)はバンドパターンやバンド濃さに変化がなく、環化反応条件においてもRNAが安定であることが明らかとなった(図46)。
翻訳ペプチドでの環化反応例と合成ペプチドでの翻訳合成液中での反応例では類似の結果を得たことから、合成ペプチドでの翻訳合成液中での反応収率向上が確認されれば、翻訳ペプチドの環化反応収率向上が得られたと解釈できる。以下、合成ペプチドでの翻訳液中での反応最適化検討を行った。
pHを9から10付近で反応を実施していたが、pH7.8, 8.1, 9.2の3点で環化反応を行った結果、pHが小さい方が環化:加水分解の比が目的の方向に向上することが明らかとなった。
・標題化合物
LCMS(ESI)m/z =1132.3(M−H)−
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
・加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI) m/z =1150.4(M−H)−
保持時間:0.49分(分析条件SQDFA05)
従って、このような観点から、反応のpH上昇を抑えるため、反応液中の緩衝剤の濃度を62mMから500mMに上げ、還元剤としてトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン50mM を添加した条件で実験した。以下、環化体(標題化合物)/加水分解体の選択性に対するpHの影響を確認する為に、反応のpHは、pH7.8, 8.1, 9.2の3点で実施した。
水(10.9ul)、4−(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール(6.80ul、0.050mmol)とトリエチルアミン(6.97ul、0.050mmol)の混合溶液を調整した。その混合溶液に1.9M HEPES緩衝溶液(pH=7.5, 13.1ul)、0.5Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン水溶液(pH=7.6、5.0ul)を加えた。さらに、(3S,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)−27−アミノ−3−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−6,21−ジベンジル−15−イソブチル−9−イソプロピル−12,22,24−トリメチル−5,8,11,14,17,20,23,26−オクタオキソ−28−フェニル−4,7,10,13,16,19,22,25−オクタアザオクタコサン−1−チオ酸 S−ベンジル(化合物SP−504)の10mM N−メチルピロリドン溶液5ulと11mMの内部標準(4−プロピル安息香酸)N−メチルピロリドン溶液(2.25ul)を加え30℃で6時間攪拌した。反応開始時のpHは7.8であった。LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、標題化合物の生成を確認した。6時間で内部標準とのエリア面積比より転化率は96%であり、標題化合物(SP−511)と加水分解体(化合物SP−512)の生成比はLCMSのUVエリア比でおおよそ38:1であった。
・標題化合物
LCMS(ESI)m/z =1132.3(M−H)−
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
・加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI) m/z =1150.5(M−H)−
保持時間:0.48分(分析条件SQDFA05)
上記のpH7.8における化合物SP−511の合成と同様の方法で、1.9M HEPES緩衝溶液(pH=7.5, 13.1ul)の代わりに1.9M HEPES緩衝溶液(pH=8.1, 13.1ul)を用い反応を行った。30℃で6時間攪拌した。反応開始時のpHは8.1であった。LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、標題化合物の生成を確認した。6時間で内部標準とのエリア面積比より転化率は93%であり、標題化合物(SP−511)と加水分解体(化合物SP−512)の生成比はLCMSのUVエリア比でおおよそ40:1であった。
・標題化合物(SP−511)
LCMS(ESI) m/z =1132.3(M−H)−
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
・加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI) m/z =1150.4(M−H)−
保持時間:0.48分(分析条件SQDFA05)
上記のpH7.8における化合物SP−511の合成と同様の方法で、1.9M HEPES緩衝溶液(pH=7.5, 13.1ul)の代わりに1.9M Bicine緩衝溶液(pH=9.5, 13.1ul)を用い反応を行った。30℃で6時間攪拌した。反応開始時のpHは9.2であった。LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、標題化合物の生成を確認した。6時間で内部標準とのエリア面積比より転化率は87%であり、標題化合物(SP−511)と加水分解体(化合物SP−512)の生成比はLCMSのUVエリア比でおおよそ22:1であった。
・標題化合物(SP−511)
LCMS(ESI) m/z =1132.4(M−H)−
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
・加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI) m/z =1150.3(M−H)−
保持時間:0.48分(分析条件SQDFA05)
濃度1Mではなく100mMとした場合には、加水分解比率が増加することが明らかとなった。
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−8,23−ジベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,2,5,7,17−ペンタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−511)の合成
・標題化合物(SP−511)
LCMS(ESI) m/z =1132.3(M−H)−
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
・加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI) m/z =1150.2(M−H)−
保持時間:0.48分(分析条件SQDFA05)
有機溶媒比率は向上させる方が有利である結果を得た。
添加剤(4-(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール)濃度1M、有機溶媒(NMP):水=50:50での反応例
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−8,23−ジベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,2,5,7,17−ペンタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−511)の合成
・標題化合物(SP−511)
LCMS(ESI)m/z =1134.5(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−8,23−ジベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,2,5,7,17−ペンタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−511)の合成
・標題化合物
LCMS(ESI)m/z =1134.5(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・標題化合物(SP−509)
LCMS(ESI)m/z =1210.4(M+H)+
・加水分解体(化合物SP−510)
LCMS(ESI)m/z =1228.4(M+H)+
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・標題化合物(SP−509)
LCMS(ESI)m/z =1210.4(M+H)+
・加水分解体(化合物SP−510)
LCMS(ESI)m/z =1228.4(M+H)+
(3S,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)−27−アミノ−3−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−6,21−ジベンジル−15−イソブチル−9−イソプロピル−12,22,24−トリメチル−5,8,11,14,17,20,23,26−オクタオキソ−28−フェニル−4,7,10,13,16,19,22,25−オクタアザオクタコサン−1−チオ酸 S−(4−ニトロフェニル)
LCMS(ESI)m/z =1365.3(M+H)+
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・原料化合物(化合物SP−508)
LCMS(ESI)m/z =1334.4(M+H)+
・加水分解体(化合物SP−510)
LCMS(ESI)m/z =1228.4(M+H)+
・チオエステル交換体(化合物SP−514)
LCMS(ESI)m/z は観測されなかった。
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・標題化合物(SP−509)
LCMS(ESI)m/z =1208.9(M−H)−
・加水分解体(化合物SP−510)
LCMS(ESI)m/z =1226.3(M−H)−
・チオエステル交換体(化合物SP−515)
LCMS(ESI)m/z =1362.1(M−H)−
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・標題化合物(SP−509)
LCMS(ESI)m/z =1210.4(M+H)+
・加水分解体(化合物SP−510)
LCMS(ESI)m/z =1228.4(M+H)+
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・標題化合物(SP−509)
LCMS(ESI)m/z =1208.1(M−H)−
・加水分解体(化合物SP−510)
LCMS(ESI)m/z =1226.2(M−H)−
・エステル交換体(化合物SP−516)
LCMS(ESI)m/z =1436.4(M−H)−
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−2,8,23−トリベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,5,7,17−テトラメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−509)の合成
・加水分解体(化合物SP−510)
LCMS(ESI)m/z =1226.7(M−H)−
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−8,23−ジベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,2,5,7,17−ペンタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−511)の合成
・標題化合物(SP−511)
LCMS(ESI) m/z =1132.3(M−H)−
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
・加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI) m/z =1150.2(M−H)−
保持時間:0.48分(分析条件SQDFA05)
(2S,5S,8S,14S,17S,20S,23S,26S)−N−((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)−8,23−ジベンジル−14−イソブチル−20−イソプロピル−N,2,5,7,17−ペンタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,28−ノナオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25−ノナアザシクロオクタコサン−26−カルボキサミド(化合物SP−511)の合成
・標題化合物(SP−511)
LCMS(ESI) m/z =1132.3(M−H)−
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
・加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI) m/z =1150.4(M−H)−
保持時間:0.48分(分析条件SQDFA05)
また、活性エステルへの交換反応を単一の添加剤を加えて実施するのではなく、複数の添加剤を加えて実現させることも可能である。2−シアノ−2−(ヒドロキシイミノ)酢酸 (S,Z)−(2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−イル)メチル(化合物SP−517)での活性化は、翻訳可能なチオエステルからの直接変換は達成できなかったが、まず、2−メルカプトフェノールにて翻訳可能なチオエステルを活性化した後、ここからのさらなる活性化が可能であることが明らかとなった。2−シアノ−2−(ヒドロキシイミノ)酢酸 (S,Z)−(2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−イル)メチル(化合物SP−517)では、水中で高効率でN-メチル化されたアミノ酸やペプチドへの高効率なアミド化反応が報告されており(Organic Letter, 2012,14, 3372−3375)、2段階の活性化を経て本活性種への活性化が達成された事実は、注目に値する。
上に述べた反応条件最適化に伴い、反応翻訳液中で環化反応を実施した結果、翻訳ペプチドの環化実験実施条件と比較して加水分解比率を低下させ、目的化合物割合を向上させることができた。
(3S,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)−27−アミノ−3−(((S)−1−(((S)−1−((2−アミノ−2−オキソエチル)アミノ)−3−ヒドロキシ−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)(メチル)カルバモイル)−6,21−ジベンジル−15−イソブチル−9−イソプロピル−12,22,24−トリメチル−5,8,11,14,17,20,23,26−オクタオキソ−4,7,10,13,16,19,22,25−オクタアザオクタコサン−1−チオ酸 S−ベンジル(化合物SP−504)のNMP溶液(10mM、5.0μl、0.050μmol)に内部標準として4−プロピル安息香酸のNMP溶液(11mM、2.25μl)を加えた。次に翻訳用緩衝液(6.25μl)、PURESYSTEM(r) classic II Sol. B(バイオコゥマー社、製品番号PURE2048C)(10μl)、20種の天然アミノ酸溶液(それぞれ5mM,2.5μl)を加えた。
反応液を30℃で22時間攪拌した後、LC/MSで分析し、標題化合物の生成を確認した。22時間攪拌後の反応液のpHは9.4であった。また、標題化合物(化合物SP−511)と加水分解体(化合物SP−512)との生成比はUVエリア比で2.6:1であった。
標題化合物(SP−511)
LCMS(ESI)m/z =1134.4(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件 SQDFA05)
加水分解体(化合物SP−512)
LCMS(ESI)m/z =1152.5(M+H)+
保持時間:0.48分(分析条件 SQDFA05)
N末端をAlaやPheに続き、N−アルキルアミノ酸であるMeAlaのモデル反応も実施し、環化体の生成を確認した。
(6S,9S,12S,15S,18S,24S,27S,30S,33S)−18,30−ジベンジル−12,24−ジイソブチル−9,27−ジイソプロピル−2,2,5,6,11,17,23,26−オクタメチル−33−(メチル((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)カルバモイル)−4,7,10,13,16,19,22,25,28,31−デカオキソ−15−((R)−1−(トリチルオキシ)エチル)−3−オキサ−5,8,11,14,17,20,23,26,29,32−デカアザペンタトリアコンタン−35−酸 (Boc−MeAla−Val−MeLeu−Thr(Trt)−MePhe−Gly−MeLeu−MeVal−Phe−Asp−MePhe−Ala−piperidine)(化合物SP−518)の合成
LCMS(ESI)m/z =1790.9(M−H)−
保持時間:0.87分(分析条件 SQDAA50)
LCMS(ESI)m/z =1897.3(M−H)−
保持時間:0.99分(分析条件 SQDAA50)
LCMS(ESI)m/z =1555.1(M−H)−
保持時間:0.79分(分析条件 SQDFA05)
なお、本明細書では、Aspの側鎖カルボン酸が2-(エチルジスルファニル)-6-メチルフェニルエステル基にて置換された化合物をAsp(O(2-EtSS-6-Me-Ph))と記載する。この部位がペプチドに含まれる場合にも同様に記載することとする。
LCMS(ESI) m/z =1973.5(M―H)−
保持時間:1.01分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z =1632.9(M+H)+
保持時間:0.83分(分析条件SQDFA05)
(2R,5S,8S,11S,14S,20S,23S,26S,29S)−14,26−ジベンジル−11−((R)−1−ヒドロキシエチル)−8,20−ジイソブチル−5,23−ジイソプロピル−N,1,2,7,13,19,22−ヘプタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,27,31−デカオキソ−N−((S)−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−(ピペリジン−1−イル)プロパン−2−イル)アミノ)−3−フェニルプロパン−2−イル)−1,4,7,10,13,16,19,22,25,28−デカアザシクロヘントリアコンタン−29−カルボキサミドの(化合物SP−524)合成
LCMS(ESI)m/z =1432.8(M+H)+
保持時間:1.06分(分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z =1432.9(M+H)+
保持時間:1.09分(分析条件SQDFA05)
RNA−ペプチド複合体において反応補助基を利用しないペプチド環化反応を施し、生成物を電気泳動にて解析した。
PCRにより調製した3つのDNA(配列番号 DM−D1、DM−D2、DM−D3)を鋳型に、それぞれIn vitro転写によりmRNA(配列番号 RM−D3、R−D4、R−D5)を調整し、RNeasy mini kit (Qiagen社)を用いて精製した。各々に対し、10μMのmRNAに、50μMのピューロマイシンリンカー(Sigma社)(配列番号C−D1) 1X T4 RNAライゲースリアクションバッファー(NEB社)、1mM DTT、1mM ATP、0.02%BSA(Takara社)、510μM (PEG2000)(Wako社)、10% DMSO、1%(v/v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega社,N2111)0.85 unit/μl T4 RNAライゲース(NEB社)を加え、15℃で一晩ライゲーション反応させた後、RNeasy MinElutekit(Qiagen社)により精製した。次に、上記で調製した3つのmRNA-ピューロマイシンリンカー連結体1 μMそれぞれを鋳型に、前述の無細胞翻訳液と0.25mM Ser、0.25mM Gly,0.25mM Pro,0.25mM Arg,0.25mM Thr,0.25mM Tyrおよび、50μM Asp(SBn)−tRNAGluAAG(化合物AT−7−A)を加え、37℃で60分間保温した後、続けて室温で12分間保温した。また、OT98RNA(配列番号 RM−D4)、OT99RNA(配列番号 RM−D5)由来のmRNA-ピューロマイシンを鋳型にする場合、それぞれ0.25mMのPhe, 0.25mM のAlaを加えて翻訳を行った。その後、反応液をRNeasy minelute(qiagen社)により精製し、RNA-ペプチド複合体を得た。
OT-97 DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTACTACAACGCGTCTTCCGTACCGTAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTAAAAAAA
OT-98 DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTTTACTACAACGCGTCTTCCGTACCGTAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTAAAAAAA
OT-99 DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTACTACAACGCGTCTTCCGTACCGTAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTAAAAAAA
OT-97 RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGGGUACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUAGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUAAAAAAA
OT-98 RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUUUACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUAGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUAAAAAAA
OT-99 RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGGCUACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUAGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUAAAAAAA
[P]dCdC [Fluorecein-dT][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]dCdC[puromycin] ([P]:5'リン酸化)
窒素雰囲気下、上記で調整したOT-97 RNA配列(配列番号RM−D3)に由来する70μLのRNA-ペプチド複合体に、20.1μLのチオフェノール溶液(5M 4−トリフルオロメチルチオフェノール水溶液、5Mトリエチルアミン水溶液を等量混合したもの)、10μL 500mM トリカルボキシエチルホスフィン溶液 (pH7.5)を混合し、50℃で2時間反応させた。また、HEPES緩衝液(pH7.6)を用いて5M 4−トリフルオロメチルチオフェノール溶液および5M トリエチルアミン溶液を調整し、これらを等量混合してチオフェノール溶液を調整した後、OT-98 RNA配列(配列番号RM−D4)、OT-99 RNA配列(配列番号RM−D5)に由来するRNA-ペプチド複合体70μLそれぞれに対し、20.1μLのNMP、上述のチオフェノール溶液20.1μL、500mM トリカルボキシエチルホスフィン溶液 (pH7.5) 10μL を窒素雰囲気下で混合し、30℃で22時間攪拌した。
得られた3つの反応液それぞれから、RNeasy minelute(qiagen社)を用いてペプチドーRNA複合体を精製し、純水70μLにてカラムから溶出した。続けて、8.4μLの10xRNase ONE ribonuclease反応バッファー(promega社)、2.8μLのRNase ONE ribonuclease (promega社)、2.8μLのRNase H (Life technologies社)を加え、37度にて一晩保温した。続いて、得られた反応溶液と何も反応させていないピューロマイシンリンカー(配列番号C-D1)をpeptide-PAGE mini(TEFCO社)にて電気泳動し、ピューロマイシンリンカーに由来するFluoreceinにてバンドを可視化した。その結果、いずれの反応溶液に関してもピューロマイシンリンカーにペプチドが結合したことに由来するバンド移動度の差が観測された((図47)。このことから、目的の環化ペプチド−RNA複合体の存在が示された。
翻訳後に、N末端のフォルミル化された翻訳開始アミノ酸をメチオニンアミノペプチダーゼ、及びペプチドデフォルミラーゼにて切断し、それにより露出したα-アミノ基を用いてペプチド環化反応を施し、MALDI-MSにて分析した。なお、翻訳開始アミノ酸としては、メチオニンの代わりに、酸化されやすい硫黄原子を含まないアミノ酸であるノルロイシン(CAS番号327−57−1)を使用した。
1μM 鋳型RNA Mgtp_R(配列番号R−41)に、0.25mM Pro,0.25mM Gly,0.25mM Thr,0.25mM Arg,0.25mM Tyr,2.5mM ノルロイシン(Nle)および、50μM Asp(SBn)−tRNAGluAAG(化合物AT−7−A)を含む前述の翻訳液を37℃で60分間保温した。得られた翻訳溶液1μLに9μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート上乾固した。MALDI-MSの結果、フォルミルノルロイシンより翻訳開始された目的のペプチドP−D5に由来するピークが観測された(図48、ピークI)。続いて上記で得られた翻訳溶液4μLに、Hisタグ付加タンパクとして調製した150μM メチオニンアミノペプチダーゼ、20μM ペプチドデフォルミラーゼをそれぞれ0.5μLずつ加え、37℃で30分間保温した。得られた反応液1μLを前述したように前処理し、MALDI-MSにて分析したところ、開始フォルミルノルロイシンが外れ、N末端にGlyが露出したペプチドP−141に相当するピークが観測された(図48、ピークII)。最後に、このP−141を含む翻訳溶液3.5μL、1μLチオフェノール溶液(5M 4−トリフルオロメチルチオフェノール、5Mトリエチルアミンを等量混合したもの)、0.5μL 500mM トリカルボキシエチルホスフィン溶液 (pH7.6)を混合し、50℃で2時間保温した。得られた反応溶液2μLを使って、12μLの2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート乾固した後、MALDI−MSにて解析を行った。その結果N末端α―アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した目的の化合物P-143に相当するピークを観測した(図48、ピークIII)。
fNleGlyThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
m/z: [H+M]+ = 1427.4(配列P-D5に対応するペプチド。Calc.1427.7)
m/z: [H+M]+ = 1286.4(配列P-141に対応するペプチド。Calc.1286.6)
m/z: [H+M]+ = 1162.3(配列P-143に対応するペプチド。Calc1162.6)
1.分枝ペプチドの翻訳産物からの生成を可能とするユニットの選択および、反応条件検討
1−1.分子間モデル反応によるアミド化反応
以下に示す1-(2-メルカプトエチルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルカルバミン酸 (S)-tert-ブチル(化合物10)の合成検討の結果、エステル官能基を水中でチオールの添加によりチオエステルに活性化させることが出来、かつ活性化させたチオエステルからアミンとの縮合反応によりアミド結合を選択的に生成させることができることが明らかとなった。
以下の反応の結果を図41に示す。
2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム(33mg、 0.200mmol)と2-アミノエタンチオール 塩酸塩(22.7mg、 0.200mmol)にpH7.7の0.2M HEPES緩衝液(1.60ml)、DMF(0.400ml)を加えpH7.4に調整し、室温で5分間攪拌した。その後、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-3-フェニルプロパン酸 (S)-2-アミノ-2-オキソエチル(化合物11)(6.4mg、 0.02mmol)を加え、50度で24時間攪拌した。
LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、24時間で1-(2-メルカプトエチルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルカルバミン酸 (S)-tert-ブチル(化合物10)が生成していることを確認した。加水分解物と目的化合物10との生成比は、LCMSのUVエリア比で46:43であった。
2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム(164mg、 1.000mmol)と2-アミノエタンチオール 塩酸塩(11.4mg、 0.100mmol)にpH7.0の0.2M HEPES緩衝液(0.250ml)、DMF(0.200ml)、水(0.500ml)を加え室温で5分間攪拌した。さらに1M 水酸化ナトリウム水溶液(0.050ml)を加えてpH7.6に調整した後に、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-3-フェニルプロパン酸 (S)-2-アミノ-2-オキソエチル(化合物11)(3.2mg、 0.01mmol)を加え、40度で24時間攪拌した。
LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、24時間で1-(2-メルカプトエチルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルカルバミン酸 (S)-tert-ブチル(化合物10)が生成していることを確認した。加水分解物と目的化合物10との生成比は、LCMSのUVエリア比で24:60であった。
2-ジメチルアミノエタンチオール塩酸塩(142mg、 1.000mmol)と2-アミノエタンチオール 塩酸塩(11.4mg、 0.100mmol)にpH7.0の0.2M HEPES緩衝液(0.750ml)、DMF(0.200ml)、水(0.100ml)を加え室温で5分間攪拌した。さらに1M 水酸化ナトリウム水溶液(0.150ml)を加えてpH7.3に調整した後に、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-3-フェニルプロパン酸 (S)-2-アミノ-2-オキソエチル(化合物11)(3.2mg、 0.01mmol)を加え、40度で24時間攪拌した。
LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、24時間で1-(2-メルカプトエチルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルカルバミン酸 (S)-tert-ブチル(化合物10)が生成していることを確認した。加水分解物と目的化合物10との生成比は、LCMSのUVエリア比で23:71であった。
2-ジメチルアミノエタンチオール塩酸塩(425mg、 3.000mmol)と2-アミノエタンチオール 塩酸塩(11.4mg、 0.100mmol)にpH7.0の0.5M HEPES緩衝液(0.300ml)、DMF(0.200ml)、水(0.200ml)を加え室温で5分間攪拌した。さらに1M 水酸化ナトリウム水溶液(0.300ml)を加えてpH6.9に調整した後に、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-3-フェニルプロパン酸 (S)-2-アミノ-2-オキソエチル(化合物11)(3.2mg、 0.01mmol)を加え、40度で24時間攪拌した。
LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、24時間で1-(2-メルカプトエチルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルカルバミン酸 (S)-tert-ブチル(化合物10)が生成していることを確認した。加水分解物と目的化合物10との生成比は、LCMSのUVエリア比で15:84であった。
LCMS(ESI) m/z = 325 (M+H)+
保持時間:0.71分(分析条件SQDFA05)
既に環化されたペプチド(1回目のアミド環化)が生成後のペプチドを想定したモデルからの反応にて分枝化(直鎖部2の生成)を確認した。以下のスキームに従い、アミド環化(アミド環化部も主鎖環化を用いた)され、かつ主鎖にエステル官能基を有し、アミノ酸側鎖に反応補助基を有するアミノ基を有するモデル化合物の合成を行った。続いて分枝化実験を行い、環状ペプチドからRNAが安定に存在できる温和な反応条件にて水中にて分枝化が観測された。
(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-6-((R)-2-(アリルオキシカルボニルアミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸(Fmoc−Lys(Alloc-Cys(StBu))-OH)(化合物150a)の合成
LCMS(ESI) m/z = 644.6 (M+H)+
保持時間:0.91分(分析条件SQD FA05)
LCMS(ESI) m/z = 1433 (M+H)+
保持時間:0.66分(分析条件SQD FA50)
(R)−2−アミノ−3−(tert−ブチルジスルファニル)−N−(4−((5S,8S,11S,14S,20S,23S,26S,29S)−5,14,20,29−テトラベンジル−11−イソブチル−4,10,16,19,23,25,26−ヘプタメチル−3,6,9,12,15,18,21,24,27,30−デカオキソ−1−オキサ−4,7,10,13,16,19,22,25,28−ノナアザシクロトリアコンタン−8−イル)ブチル)プロパンアミドの合成
LCMS(ESI) m/z = 1349 (M+H)+
保持時間:0.74分(分析条件SQD FA05)
化合物P−151
(S)-2-(2-ヒドロキシ-N-メチルアセトアミド)-3-フェニル-N-((3R,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)-6,15,21-トリベンジル-24-イソブチル-3-(メルカプトメチル)-9,10,12,16,19,25-ヘキサメチル-2,5,8,11,14,17,20,23,26-ノナオキソ-1,4,7,10,13,16,19,22,25-ノナアザシクロヘントリアコンタン-27-イル)プロパンアミドの合成
LCMS(ESI) m/z = 1261 (M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDFA05)
2−1.自動合成機による主鎖にエステル基を含むペプチドの固相合成一般法
合成機にSieber Amide resin(1カラムあたり160−200mg、Novabiochemより購入)と、各種Fmocアミノ酸(0.6mol/L)と1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)(0.375mol/L)のN−メチル−2−ピロリドン(NMP)溶液と、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)のN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液(10%v/v)をセットし、Fmoc脱保護溶液として、ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド溶液(20%v/v)を用い、Fmoc脱保護反応時間を5分として合成を行った。DMF溶液で洗浄した後、Fmoc脱保護に次いでFmocアミノ酸の縮合反応を1サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでレジン表面上にペプチドを伸長させた。このような実験例として相本らの非特許文献(Tetrahedron 2009, 65, 3871−3877)を参考にして合成することもできる。なお、本法は、他ペプチドの合成法としても、本明細書一般に渡って適切なケースに使用できる。
2−2−1.翻訳ペプチドモデル化合物SP605の合成
以下のスキームに従い、N末端にCysを有し、C末端側の1回目の環化ユニットとしてAsp(SBn)を有し、2回目の分枝化ユニットとして、活性チオエステル発生パートとしてCys-Pro-HOGlyを有し、側鎖アミン反応部位としてLysを有するモデルペプチド合成を行った。
LCMS(ESI) m/z = 618 (M+H)+
保持時間:0.93分(分析条件SQD FA05)
Acbz: 4−アジドベンジルオキシカルボニル基
HOGly: グリコール酸
Fmoc-Lys(Me2)-OH・HCl: N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N-ε,N-ε-ジメチル-L-リシン 塩酸塩
Fmoc-Asp(OPis)-OH: N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-L-アスパラギン酸 β-(2-フェニル)イソプロピル エステル
LCMS(ESI) m/z = 1645 (M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQD FA05)
LCMS(ESI) m/z = 1751 (M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQD FA05)
LCMS(ESI) m/z = 1401 (M+H)+
保持時間:0.46分(分析条件SQD FA05)
保持時間:0.36分(分析条件SQD FA05)
2−2にて合成されたペプチドが緩衝液中(水中)にてRNAが安定である温和な反応条件にて分枝させる反応条件が得られたため、翻訳合成後でも同様に分子内分枝ペプチドが生成することをMALDI−MSにて確認した。
2つの鋳型DNA(配列番号DT−H1、配列番号DT−H2)から、それぞれRiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAGluAAG (-CA)(配列番号RT−H1)、tRNAGluCUG (-CA)(配列番号RT−H2)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAGluAAG (-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluCTG (-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluAAG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluCUG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
50μM 転写tRNAGluAAG (-CA)(配列番号RT−H1) 10μLに、10X ligation buffer(500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2) 2μL、10 mM ATP 2μL、Nuclease free water 2.8μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 20unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)1.2μLおよび、5mMのアミノアシル化pdCpA(化合物1i−IA)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液 20μLに、3M酢酸ナトリウム 4μLと125mM ヨウ素(水:THF=1:1溶液)24μLを加え、室温で1時間、脱保護を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−H1)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−H1)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
50μM 転写tRNAGluCTG (-CA)(配列番号RT−H2) 10μLに、10X ligation buffer(500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2) 2μL、10 mM ATP 2μL、Nuclease free water 2.8μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 20unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)1.2μLおよび、5mMのグリコール酸でアシル化されたpdCpA(化合物20)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−H2)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−H2)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
前述したアシル化されたtRNA(化合物AT−H1、化合物AT−H2)を、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。
OT86b RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUaugUGCACUACAUGGUUCCGUUGGUGCCCACAGUUCAAGUGGCUUCCUCGUAGUUAAGG
CysThrThrTrpPheArgTrpCysProHOGlyPheLysTrp[Asp(SMe)]ProArgSerのN末端アミノ基の窒素原子とAspの側鎖カルボン酸でアミド環化した化合物(HOGlyはグリコール酸を指す)
m/z: [H+M]+ = 2155.6(配列P−H1に対応するペプチド。Calc.2156.0)
前述の翻訳反応物P−H1を含む翻訳溶液5μLと、pH8.5に調整した5μLの環化反応試薬溶液(0.3M HEPES−KOH、0.1M TCEP、0.1M p−メルカプトフェニル酢酸)を混合し、30℃で17時間保温した。その後、得られた反応溶液を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、マトリックスとしてα−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸を用いてMALDI−MSで分析した。対象実験として、前述した鋳型RNAOT86b(配列番号RM−H1)を含まない翻訳溶液に対しても同様の操作を施し、両者を比較することで、鋳型RNA依存的に合成される翻訳産物由来のピークを判別し、解析を行った。その結果、鋳型RNAOT86b(配列番号RM−H1)を含む翻訳反応液には、目的の分子内分枝骨格をもつ化合物H1に相当するピークが観測され、翻訳ペプチドを用いた分子内分枝ペプチド(直鎖部2)の生成が確認された(図51、ピークI)。
化合物H1
上に示したとおり、合成ペプチド化合物SP605から化合物SP606への変換にて設定した分枝化反応条件を翻訳ペプチドに適用した結果、翻訳ペプチドでも分枝化反応の進行が確認された。以下の実験では、化合物SP605から化合物SP606への合成ペプチドをモデルとした反応最適化である。水中での反応、および翻訳液中での反応を実施し、翻訳ペプチドによる分枝化反応の最適化を行った結果、反応選択性に優れた反応条件の設定に至った。
有機溶媒の効果の比較実験
変更点として、1回目の環化反応では有機溶媒(DMA)含有率を5%から50%へと増大させ、2回目の分枝化反応では2.5%から50%へと増大させた結果を示す。
以上の結果から、1回目の環化反応には有機溶媒含有率の向上が有利であることがわかり、加水分解が抑制されて目的化合物を得る選択性が高まった。一方、2回目の分枝化反応では、目的化合物を得るための化学反応速度が低下するため、さらに改良検討を継続した。
検討の結果、以下に示す反応条件が上の条件(2−2−2)よりも優れていることを見出した。変更点として、1回目の環化反応では有機溶媒含有率増大(50%)し、2回目の分枝化反応でも有機溶媒含有率増大(50%)と共に、添加剤のチオールを変更(4−(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール)と共に添加剤濃度の増大(500mM)とした。さらに緩衝溶液としてHEPES 150mMから、Bicine(N,N-ビスー(2―ヒドロキシルエチル)グリシン)360mMに変更した。0.5M HEPES緩衝液(pH7.0, 10μl)、水(33μl)、1M水酸化ナトリウム水溶液(5μl)、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)(45μl),0.5M TCEP塩酸塩水溶液(2μl)をそれぞれ加えて溶液を調製した。この溶液に、1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-インドール-3-イル)メチル)-6-アミノ-18-((tert-ブチルジスルファニル)メチル)-12-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-2,2-ジメチル-7,10,13,16-テトラオキソ-3,4-ジチア-8,11,14,17-テトラアザノナデカン)ピロリジン-2-カルボン酸 (S)-2-((S)-6-アミノ-1-((S)-4-(ベンジルチオ)-1-((S)-2-カルバモイルピロリジン-1-イル)-1,4-ジオキソブタン-2-イルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-2-オキソエチル(化合物SP605、 H−Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(20mM, 0.10μmol)と内部標準として4-ブチル安息香酸(20mM, 0.10μmol)のNMP溶液(5μl)を室温下で添加し、反応液を37℃で30分間静置した。その後、4-(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール(6.8μl, 50μmol)にNMP(40μl),2M Bicine(N,N-ビス-(2-ヒドロキシエチル)グリシン) 緩衝液(pH8.7, 18μl)、0.5M TCEP塩酸塩水溶液(10μl)をそれぞれ加え5M 水酸化ナトリウム水溶液(12μl)により溶液を調整した後に、反応液(20μl)を室温下で添加し(反応液を加えた後の混合溶液のpH 8.2)、反応液を30℃で24時間静置し、LCMSを用いて反応の変化を観測した。24時間で(S)-1-((3S,6S,12R,16S,19S)-3-((1H-インドール-3-イル)メチル)-6-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-19-(2-ヒドロキシアセトアミド)-12-(メルカプトメチル)-2,5,8,11,14,18-ヘキサオキソ-1,4,7,10,13,17-ヘキサアザシクロトリコサン-16-カルボニル)ピロリジン-2-カルボキサミド(化合物SP606)が生成していることを確認した。化合物SP606と加水分解物(副生成物)との生成比は、LCMSのUVエリア比で98:2であった。 (図52、加水分解化合物 保持時間:0.31分)
翻訳用緩衝液(6.25μl)、水(1.25μl)、PURESYSTEM(r) classic II Sol. B(バイオコゥマー社、製品番号PURE2048C)(10μl)、20種類の天然型アミノ酸溶液(それぞれ5mM,2.5μl)を混合しジメチルアセトアミド(DMA)(22.5μl), TCEP水溶液(100mM、5μl)、をそれぞれ加えて溶液を調製した。翻訳用緩衝液の成分は8mM GTP,8mM ATP,160mMクレアチンリン酸,400mM HEPES−KOH pH7.6,800mM 酢酸カリウム,48mM 酢酸マグネシウム,16mMスペルミジン,8mM ジチオスレイトール,0.8mM 10−HCO−H4folate, 12mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社)である。この溶液に、1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-インドール-3-イル)メチル)-6-アミノ-18-((tert-ブチルジスルファニル)メチル)-12-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-2,2-ジメチル-7,10,13,16-テトラオキソ-3,4-ジチア-8,11,14,17-テトラアザノナデカン)ピロリジン-2-カルボン酸 (S)-2-((S)-6-アミノ-1-((S)-4-(ベンジルチオ)-1-((S)-2-カルバモイルピロリジン-1-イル)-1,4-ジオキソブタン-2-イルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-2-オキソエチル(化合物SP605、H−Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(20mM, 0.05μmol)と内部標準として4-ブチル安息香酸(20mM, 0.05μmol)のDMA溶液(2.5μl)を室温下で添加し、反応液を37℃で30分間静置した。4-(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール(6.8μl, 50μmol)にDMA(40μl)、2M Bicine(N,N-ビス-(2-ヒドロキシエチル)グリシン) 緩衝液(pH8.7, 18μl)、0.5M TCEP塩酸塩水溶液(10μl)をそれぞれ加え5M 水酸化ナトリウム水溶液(12μl)により溶液を調整した後に、反応液(20μl)を室温下で添加し(反応液を加えた後の混合溶液のpH 8.2)、反応液を30℃で24時間静置し、LCMSを用いて反応の変化を観測した。24時間で(S)-1-((3S,6S,12R,16S,19S)-3-((1H-インドール-3-イル)メチル)-6-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-19-(2-ヒドロキシアセトアミド)-12-(メルカプトメチル)-2,5,8,11,14,18-ヘキサオキソ-1,4,7,10,13,17-ヘキサアザシクロトリコサン-16-カルボニル)ピロリジン-2-カルボキサミド(化合物SP606)が生成していることを確認した。化合物SP606と加水分解物(副生成物)との生成比は、LCMSのUVエリア比で91:9であった。(図53、加水分解化合物 保持時間:0.30分)
翻訳ペプチドでディスプレイライブラリーを実施する際には、翻訳液に直接試薬を追加した翻訳後修飾を実施することもできる一方、ペプチドーRNA複合体を一度精製した後に、一部あるいは全ての翻訳後修飾を実施することもできる。そのような精製過程の1つとして、RNeasy(r) MinEluteTM Cleanup Kit(キアゲン社)を用いた精製が挙げられる。そのような精製を実施した後の翻訳後修飾の例として以下の実験を実施した。
LCMS(ESI) m/z = 900 (M+H)+
保持時間:0.36分(分析条件SQDFA05)
三角ユニットに反応補助基を有するアミノ基が配置された場合、1回目の環化反応は高選択に進行して、2回目の分枝化のためのCys-Pro-HOGlyの活性化との選択性が獲得できた。特に水と混じり合う有機溶媒含有率が高いと反応選択性に優れる。2回目の分枝化では、添加剤としてチオール存在下(好ましくはアリールチオール)にて、水と混じるあう有機溶媒存在下が好ましく、反応溶液のpHが7.0から9.0の間が好ましく、反応温度は0℃から100℃(より好ましくは15℃から50℃)が好ましい。これまで示した結果から、本条件は緩衝液(水中)のみならず、翻訳液中(PureSystem)でも同様の結果を与える。
(S)-1-((3S,6S,12S,16S,19S)-3-((1H-インドール-3-イル)メチル)-6-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-19-(2-ヒドロキシアセトアミド)-12-メチル-2,5,8,11,14,18-ヘキサオキソ-1,4,7,10,13,17-ヘキサアザシクロトリコサン-16-カルボニル)ピロリジン-2-カルボキサミド(化合物SP607)の合成
上述の3−2.に記載の翻訳ペプチドモデル化合物(化合物SP605)からの分子内分枝ペプチド生成反応に用いた反応溶液(10μl)に0.5M トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩水溶液(10μl)を加えた。混合溶液をヘキサン(200μl)にて洗浄した後に(ヘキサンによる洗浄を7回実施)、得られた水層に、500mM グルタチオン水溶液(4μl)、1M 2、2−アゾビス[2−(2−イミダゾリンー2−イル)プロパン]二塩酸塩(VA−044)水溶液(2μl)、5M 水酸化ナトリウム水溶液(2μl)を室温にて加え、40℃で3時間静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、3時間後に原料である化合物SP606が完全に消費され、目的物である(S)-1-((3S,6S,12S,16S,19S)-3-((1H-インドール-3-イル)メチル)-6-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-19-(2-ヒドロキシアセトアミド)-12-メチル-2,5,8,11,14,18-ヘキサオキソ-1,4,7,10,13,17-ヘキサアザシクロトリコサン-16-カルボニル)ピロリジン-2-カルボキサミド(化合物SP607)に変換されていることを確認した。(図55、56)
LCMS(ESI) m/z = 868(M+H)+
保持時間:0.35分(分析条件SQD FA05)
LCMS(ESI) m/z = 868(M+H)+
保持時間:0.35分(分析条件SQD FA05)
3にて記載と同様の考え方で、有効性を確認した。
4−1.翻訳ペプチドモデル化合物(化合物SP616)の合成
以下のスキームに従い、1回目の環化としてN末端にCysを用い、C末端側にAsp(SBn)を用いてアミド化環化反応を行い、2回目の分枝化として、活性エステルをグリコール酸のエステルの活性化にて実施し、Lysの側鎖アミノ基にN原子とS原子を保護させたCysを配置させた化合物のS原子とN原子を脱保護してアミド化反応を行う例を実施する目的で、以下のモデル化合物SP616の合成を行った。
LCMS(ESI) m/z = 307 (M―H)―
保持時間:0.68分(分析条件SQDFA05)
なお、本明細書中では、他の例と同様Fmoc-Lys-OHの側鎖アミノ基とAcbz-Thz−OHのカルボキシル基がアミド結合した化合物をFmoc-Lys(Acbz-Thz)−OHと定義する。
LCMS(ESI) m/z = 659 (M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 485 (M+H)+
保持時間:0.83分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1511.4 (M+H)+
保持時間:0.69分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1617.4 (M+H)+
保持時間:0.74分(分析条件SQDFA05)
なお、本明細書中では他の例と同様、Lysの側鎖アミノ基とH−Cys−Lys(Me2)−Trp−Cys−OHのC末端のカルボキシル基がアミド結合した化合物を、H−Lys(H−Cys−Lys(Me2)−Trp−Cys)−OHと記載する。
以下のスキームに従い反応を行った。すなわち、化合物SP616からステップ1では2つのアミノ基の保護基を脱保護した後(この時点で反応を構成するための各ユニットは翻訳ペプチドと同様の構造となる。C末端がカルボン酸ではなく、カルボン酸アミドとなっている他は翻訳ペプチドと同様)、そのまま1回目の環化反応を実施したところ、選択的に目的化合物SP618を得ることができた。続いて、化合物618から分枝化反応で用いるためのアミン側のユニットの脱保護をステップ2およびステップ3にて実施し、反応補助基を有するアミノ基の脱保護が達成された化合物SP620が得られた。RNAに安定な化学反応条件にて、アミンの保護基を脱保護することができた。エステル官能基から直接チオエステルを発生させる手法にて分枝化ペプチド化合物SP617が得られた。
窒素雰囲気下、50mM HEPES緩衝液(70μl、pH=7.5)に4mM 4−(((S)−5−((S)−1−((6R,9S,12S)−12−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−((((4−アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)−9−(4−(ジメチルアミノ)ブチル)−2,2−ジメチル−7,10,13−トリオキソ−14−オキサ−3,4−ジチア−8,11−ジアザヘキサデカン−16−オイル)ピロリジン−2−カルボキサミド)−6−(((S)−4−(ベンジルチオ)−1−((S)−2−カルバモイルピロリジン−1−イル)−1,4−ジオキソブタン−2−イル)アミノ)−6−オキソヘキシル)カルバモイル)チアゾリジン−3−カルボン酸(R)−4−アジドベンジル(化合物SP616、Acbz−Cys(StBu)−Lys(Me2)−Trp−HOGly−Pro−Lys(Acbz−Thz)−Asp(SBn)−Pro−NH2)のジメチルアセトアミド(DMA)溶液(25μl、0.1μmol)、内部標準として用いた20mM 2、4−ジメチル安息香酸のジメチルアセトアミド(DMA)溶液(5.0μl、0.1μmol)、別途調整した200mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液(10μl、2.0μmol、pH=7.4)を室温にて加え、pH=7.4にて、同温度で1時間30分静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、1時間30分後目的物SP618が主要生成物であり、副反応は観測されなかった(目的化合物SP618(LCMS保持時間0.38分)と内部標準(LCMS保持時間0.64分)はLCMSのUVエリア比で54:46であった)。(図59)
LCMS(ESI) m/z = 1053 (M―H)―
保持時間:0.38分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、step1で調整した反応液(90μl)に80mM 2,2'−ジチオジピリジン(化合物SP622、2,2'−PySSPy)溶液(90μl)を室温にて加え、pH=3.0にてサーマルサイクラー中、37度で12時間静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、12時間後目的物が生成していることを確認した。目的化合物(化合物SP619、LCMS保持時間0.43分)と加水分解体(副生成物、LCMS保持時間0.41分)はLCMSのUVエリア比で97:3であった。(図60)
LCMS(ESI) m/z = 1261.3 (M+H)+
保持時間:0.43分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、step2で調整した反応液(90μl)に別途調整した600mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液(10μl、6.0μmol、pH=7.2)を室温にて加え、pH=4.6にて同温度で1時間間静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、1時間後目的物(化合物SP620)が生成していることを確認した。
600mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液の調整法は以下の通りである。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(13.8mg、48μmol)に2N 水酸化ナトリウム水溶液(80μl)を加え、pH=7.2に調整した。
LCMS(ESI) m/z = 1041 (M―H)―(図61)
保持時間:0.36分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、step3で調整した反応液(30μl)に別途調整した5.0M 2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム溶液(30μl、pH=8.5)を室温にて加え、pH=8.5にてサーマルサイクラー中、30度で15時間間静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、15時間後目的物である(S)−N−((3R,6S,9S,12R,16S,19S)−6−((1H−インドール−3−イル)メチル)−16−((S)−2−カルバモイルピロリジン−1−カルボニル)−9−(4−(ジメチルアミノ)ブチル)−3,12−ビス(メルカプトメチル)−2,5,8,11,14,18−ヘキサオキソ−1,4,7,10,13,17−ヘキサアザシクロトリコサン−19−イル)−1−(2−ヒドロキシアセチル)ピロリジン−2−カルボキサミド(HOGly−Pro−Lys(*Cys−Lys(Me2)−Trp−Cys)−Asp*−Pro−NH2、2つの*部位にて環化)(化合物SP617)が生成していることを確認した。
LCMS(ESI) m/z = 1043 (M+H)+
保持時間:0.40分(分析条件SQDFA05)
実際に行われる翻訳条件を模擬して、以下の条件で反応を行った。脱保護(化合物SP620)までPURE SYSTEMの翻訳系において反応を実施した。その後の分枝ペプチド生成反応において、ディスプレイライブラリー実験ではRNeasy(r) MinEluteTM Cleanup Kit(キアゲン社)での精製を行うこともできる。この精製過程で、RNAとペプチドの複合体の精製が可能で、特にたんぱく成分や低分子成分が除去される。本実験では、化合物SP620が得られた時点で、精製を実施することを仮定して化合物SP620を単離し、分枝化反応を実施した。そのために、使用する反応溶媒としてディスプレイライブラリーでの精製を考慮してPURE SYSTEMの翻訳系溶媒をRNeasy(r) MinEluteTM Cleanup Kit(キアゲン社)を用い精製した溶出液を用いた。なお、化合物SP620の精製中にペプチドに存在する2つのSH基が分子内にてS-S結合を形成した化合物SP623に変換された。よって化合物SP623から、再びディスプレイライブラリー模擬中で化合物SP620を再発生させてから分枝化反応を行い、化合物SP617を得た。
窒素雰囲気下、翻訳用緩衝液(12.5μl)、PURESYSTEM(r) classic II Sol. B(バイオコゥマー社、製品番号PURE2048C)(20μl)、20種の天然アミノ酸溶液(それぞれ5mM,5.0μl)、水(32.5μl)を混合し、ジメチルアセトアミド(DMA)(26.25μl)を加えて溶液を調製した。4mM 4−(((S)−5−((S)−1−((6R,9S,12S)−12−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−((((4−アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)−9−(4−(ジメチルアミノ)ブチル)−2,2−ジメチル−7,10,13−トリオキソ−14−オキサ−3,4−ジチア−8,11−ジアザヘキサデカン−16−オイル)ピロリジン−2−カルボキサミド)−6−(((S)−4−(ベンジルチオ)−1−((S)−2−カルバモイルピロリジン−1−イル)−1,4−ジオキソブタン−2−イル)アミノ)−6−オキソヘキシル)カルバモイル)チアゾリジン−3−カルボン酸(R)−4−アジドベンジル(Acbz−Cys(StBu)−Lys(Me2)−Trp−HOGly−Pro−Lys(Acbz−Thz)−Asp(SBn)−Pro−NH2)(化合物SP616)のジメチルアセトアミド(DMA)溶液(2.5μl、0.01μmol)、内部標準として用いた8mM 2、4−ジメチル安息香酸のジメチルアセトアミド(DMA)溶液(1.25μl、0.01μmol)、別途調整した100mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液(10μl、1.0μmol、pH=7.6)を室温にて加え、pH=7.5にて、同温度で1時間静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、1時間後目的物(化合物SP618)が生成していることを確認した。目的化合物(LCMS保持時間0.37分)と内部標準(LCMS保持時間0.64分)はLCMSのUVエリア比で45:55であったことから、翻訳液中でも緩衝液と同等の反応の選択性と速度が得られていることがわかる。(図63)
LCMS(ESI) m/z = 1053 (M―H)―
保持時間:0.37分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、step1で調整した反応液(80μl)に80mM 2,2'−ジチオジピリジン(化合物SP622、2,2'−PySSPy)溶液(80μl)を室温にて加え、500mM 水酸化ナトリウム水溶液(2.0μl)を室温にて加え、pH=4.0にてサーマルサイクラー中、37度で13時間静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、13時間後目的物(化合物SP619)が生成していることを確認した。目的化合物(LCMS保持時間0.44分)と加水分解体(LCMS保持時間0.40分)はLCMSのUVエリア比で90:10であった。(図64)
80mM 2,2'−ジチオジピリジン(化合物SP622、2,2'−PySSPy)溶液の調整法は以下の通りである。400mM 2,2'−ジチオジピリジン(化合物SP622、2,2'−PySSPy)のジメチルアセトアミド(DMA)溶液(20μl、8.0μmol)にジメチルアセトアミド(DMA)(10μl)230mMの塩酸水溶液(70μl)を加えた。
LCMS(ESI) m/z = 1261.3 (M+H)+
保持時間:0.44分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、step2で調整した反応液(81μl)に別途調整した600mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液(9.0μl、pH=7.2)を室温にて加え、pH=5.1にて同温度で1時間間静置した。反応の変化をLCMSで追跡し、1時間後目的物(化合物SP620)が生成していることを確認した。HEPES 緩衝液中での反応と比較し、PURE SYSTEMの使用による新たな副生成物は観測されなかった。(図65)
600mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液の調整法は以下の通りである。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(17.6mg、61μmol)に2N 水酸化ナトリウム水溶液(102μl)を加え、pH=7.2に調整した。
LCMS(ESI) m/z = 1041 (M―H)―保持時間:0.36分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1043 (M+H)+
保持時間:0.40分(分析条件SQDFA05)
4−2−2で用いた、化合物617を含むPure SYSTEMの翻訳系溶媒をRNeasy(登録商標)MinElute(登録商標) Cleanup Kit(キアゲン社)を用い精製した溶出液中での分枝ペプチド精製反応で用いた反応溶液に対し脱硫反応を行った。
(S)−N−((3S,6S,9S,12S,16S,19S)−6−((1H−インドール−3−イル)メチル)−16−((S)−2−カルバモイルピロリジン−1−カルボニル)−9−(4−(ジメチルアミノ)ブチル)−3,12−ジメチル−2,5,8,11,14,18−ヘキサオキソ−1,4,7,10,13,17−ヘキサアザシクロトリコサン−19−イル)−1−(2−ヒドロキシアセチル)ピロリジン−2−カルボキサミド(化合物SP624、 HO Gly−Pro−Lys(*Ala−Lys(Me 2 )−Trp−Ala)−Asp*−Pro−NH 2 、2つの*部位にて環化)の合成
なお、本明細書中では他の例と同様、Lysの側鎖アミノ基とH−Ala−Lys(Me2)−Trp−Ala−OHのC末端のカルボキシル基がアミド結合した化合物を、H−Lys(H−Ala−Lys(Me2)−Trp−Ala)−OHと記載する。
1.5M トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液の調整法は以下の通りである。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(24.5mg、85.5μmol)5N 水酸化ナトリウム水溶液(57μl)を加え、pH=7.4に調整した。
LCMS(ESI) m/z = 979(M+H)+
保持時間:0.36分(分析条件SQDFA05)
分枝ペプチド生成反応に使用した(S)−1−((3S,10R,15R,18S,21S,29aS,33S)−21−((1H−インドール−3−イル)メチル)−10−アミノ−18−(4−(ジメチルアミノ)ブチル)−1,9,16,19,22,25,31,35−オクタオキソヘキサコサヒドロ−15,3−(エピミノプロパノイミノメタノ)ピロロ[2,1−x][1,11,12,4,7,16,22,25]オキサジチアペンタアザシクロヘプタコシン−33−カルボニル)ピロリジン−2−カルボキサミド(*Cys#−Lys(Me 2 )−Trp− HO Gly−Pro−Lys(H−Cys#)−Asp*−Pro−NH 2 、2つの*部位、#部位にて環化、#部位で2つのSH基がジスルフィド結合を形成している)(化合物SP623)の合成
精製した結果、SP620のままでは精製できず、化合物SP623となった。化合物SP623は容易にSP620へと還元条件にて再び変換可能なため、化合物SP623を精製し、単離した。なお、精製には化合物重量が多く必要なため、上記実験とは別に再合成を行った。
1M トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液の調整法は以下の通りである。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(39mg、0.136mmol)を5N 水酸化ナトリウム水溶液(91μl)、水(45μl)で溶解させ、pH=7.4に調整した。
330mM 2,2'−ジチオジピリジン(化合物SP622、2,2'−PySSPy)溶液の調整法は以下の通りである。400mM 2,2−ジチジオピリジン(化合物SP622、2,2'−PySSPy)のジメチルアセトアミド(DMA)溶液(1.5ml、0.6mmol)に2N 塩酸水溶液(238μl)、水(80μl)を加えた。
LCMS(ESI) m/z = 1261.4 (M+H)+
保持時間:0.43分(分析条件SQDFA05)
600mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液の調整法は以下の通りである。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(22.5mg、78.5mmol)を1N 水酸化ナトリウム水溶液(131μl)で溶解させ、pH=3.7に調整した。
LCMS(ESI) m/z = 1039 (M―H)―
保持時間:0.34分(分析条件SQDFA05)
Cys-Pro-HOGlyからチオエステルが発生させる反応条件は温和でpH=7.3でもゆっくりと進行することが明らかとなった(後述)。1回目の環化反応との選択性を最大化する目的、さらには1回目の環化反応でより温和でない反応条件を使用できるようにすることを目的として、Cys-Pro-HOGlyよりも安定で、反応進行のスイッチオンーオフが可能なユニットを探索した結果、より好ましいユニットの条件が明らかとなった。望ましいCys-Pro-Lacユニットを用いて、翻訳液中での環化反応および分枝化反応が進行することを確認した。
Cys-Pro-HOGlyおよびその代替ユニットを含む5残基ペプチドの合成を、そのチオエステル発生の条件を得るためのモデルペプチドとした。そのモデル化合物を合成した。
LCMS(ESI) m/z = 396 (M−tBu+H)+
保持時間:1.02分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 396 (M+H)+
保持時間:0.77分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 410 (M+H)+
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 486 (M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDFA05)
なお、PhLacとは、本明細書では(S)−ヒドロキシ‐3−フェニルプロパン酸のヒドロキシル基とカルボン酸官能基を形成するヒドロキシル基を取り除いた部分構造とする。
LCMS(ESI) m/z = 486 (M+H)+
保持時間:0.91分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 424 (M+H)+
保持時間:0.85分(分析条件SQDFA05)
なお、HOGly(Me)2とは、本明細書では2−ヒドロキシ‐2−メチルプロパン酸のヒドロキシル基とカルボン酸官能基を形成するヒドロキシル基を取り除いた部分構造とする。
LCMS(ESI) m/z = 370 (M−tBu+H)+
保持時間:0.99分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 370 (M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 396 (M+H)+
保持時間:0.49分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 438 (M+H)+
保持時間:0.66分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 210 (M+H)+
保持時間:0.56分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 618 (M+H)+
保持時間:0.94分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 396 (M+H)+
保持時間:0.83分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 438 (M+H)+
保持時間:0.67分(分析条件SQDFA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度洗浄した後、5%ピペリジン/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)を混合し、室温にて1時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)にて4度洗浄した後、(R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH) (化合物SP640)(170mg、0.388mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt(39.6mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.8mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(1.0mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。
固相と液相を分離し、固相を塩化メチレン(1.0mL)で洗浄し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)−2−(2−(((S)−1−((R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパノイル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)アセトアミド)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Ala-OH) (化合物SP646)(37.8mg、57μmol、70%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 664 (M+H)+
保持時間:0.80分(分析条件SQDAA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)にて4度洗浄した後、(R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH) (化合物SP640)(170mg、0.388mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.8mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(1.0mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。
固相と液相を分離し、固相を塩化メチレン(1.0mL)で洗浄し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)−2−((S)−2−(((S)−1−((R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパノイル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)プロパンアミド)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Ala-OH) (化合物SP647)(51.4mg、76μmol、94%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 678 (M+H)+
保持時間:0.82分(分析条件SQDAA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度洗浄した後、5%ピペリジン/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)を混合し、室温にて1時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)にて4度洗浄した後、(R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH) (化合物SP640)(170mg、0.388mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt(39.6mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.8mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(1.0mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。
固相と液相を分離し、固相を塩化メチレン(1.0mL)で洗浄し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)−2−((S)−2−(((S)−1−((R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパノイル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)−3−フェニルプロパンアミド)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-PhLac-Ala-OH) (化合物SP648)(51.2mg、68μmol、84%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 754 (M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDAA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度洗浄した後、5%ピペリジン/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)を混合し、室温にて1時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)にて4度洗浄した後、(R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH) (化合物SP640)(170mg、0.388mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.8mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(1.0mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。
固相と液相を分離し、固相を塩化メチレン(1.0mL)で洗浄し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)−2−((R)−2−(((S)−1−((R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパノイル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)−3−フェニルプロパンアミド)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-D-PhLac-Ala-OH) (化合物SP649)(50.0mg、66.0μmol、82%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 754 (M+H)+
保持時間:0.93分(分析条件SQDAA05)
調製したFmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)にDMF(0.8mL)を加え、室温にて15分間振とうし、固相と液相を分離した。得られた樹脂に2%DBU/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)を加え、室温にて30分間振とうし、液相を取り除くという作業を2度繰り返した。得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度洗浄し、続いて(S)−2−((1−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)−2−メチルプロパン酸(Fmoc-Pro-HOGly(Me)2-OH) (化合物SP636)(164mg、0.388mmol)と1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて3時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度洗浄した後、5%ピペリジン/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)を混合し、室温にて1時間振とうした。
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)にて4度洗浄した後、(R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH) (化合物SP640)(170mg、0.388mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.8mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(1.0mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。固相と液相を分離し、固相を塩化メチレン(1.0mL)で洗浄し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)−2−(2−(((S)−1−((R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパノイル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)−2−メチルプロパンアミド)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly(Me)2-Ala-OH) (化合物SP650)(46.4mg、67μmol、83%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 692 (M+H)+
保持時間:0.84分(分析条件SQDAA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度洗浄した後、5%ピペリジン/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)を混合し、室温にて1時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)にて4度洗浄した後、(R)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(170mg、0.388mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.8mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(1.0mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。固相と液相を分離し、固相を塩化メチレン(1.0mL)で洗浄し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(4S,7R,16S)−4−((1H−インドール−3−イル)メチル)−7−((tert−ブチルジスルファニル)メチル)−9,16−ジメチル−2,5,8,11,14−ペンタオキソ−12−オキサ−3,6,9,15−テトラアザヘプタデカン−17−酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-MeGly-HOGly-Ala-OH)(化合物SP651)(26.7mg、42μmol、52%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 638 (M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDAA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度洗浄した後、5%ピペリジン/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)を混合し、室温にて1時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.8mL)にて4度洗浄した後、(S)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP644)(170mg、0.388mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)のNMP溶液(0.64mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(65μL、0.417mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.52mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.8mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.8mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(1.0mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。固相と液相を分離し、固相を塩化メチレン(1.0mL)で洗浄し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(4S,7S,16S)−4−((1H−インドール−3−イル)メチル)−7−((tert−ブチルジスルファニル)メチル)−9,16−ジメチル−2,5,8,11,14−ペンタオキソ−12−オキサ−3,6,9,15−テトラアザヘプタデカン−17−酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)- MeGly-HOGly-Ala-OH) (化合物SP652)(36.5mg、57μmol、71%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 638 (M+H)+
保持時間:0.81分(分析条件SQDAA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.2mL)にて4度洗浄した後、(S)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP644)(42.5mg、0.097mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt)(9.9mg、60.8mol)のNMP溶液(0.160mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(16μL、0.104mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.13mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.2mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.2mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(0.25mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム水溶液/メタノール)にて精製し、(S)−2−(2−(((S)−1−((S)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパノイル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)アセトアミド)プロパン酸(Ac-Trp-D-Cys (StBu)-Pro-HOGly-Ala-OH)(化合物SP653)(3.0mg、4.5μmol、22%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 664 (M+H)+
保持時間:0.85分(分析条件SQDAA05)
固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.2mL)にて4度洗浄した後、5%ピペリジン/N,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.2mL)を混合し、室温にて1時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.2mL)にて4度洗浄した後、(S)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパン酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH) (化合物SP644)(42.5mg、0.097mmol)と3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシー4−オキソー1,2,3−ベンゾトリアジン(HOObt)(9.9mg、60.8mol)のNMP溶液(0.160mL)とジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(16μL、0.104mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(0.13mL)を混合し、室温にて15時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(0.2mL)にて4度、続いて塩化メチレン(0.2mL)にて4度洗浄した後、50%2,2,2−トリフルオロエタノール/塩化メチレン溶液(0.5mL)を混合し、室温にて2時間振とうした。固相と液相を分離し、得られた液相を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム/メタノール)にて精製し、(S)−2−((S)−2−(((S)−1−((S)−2−((S)−2−アセトアミド−3−(1H−インドール−3−イル)プロパンアミド)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパノイル)ピロリジン−2−カルボニル)オキシ)プロパンアミド)プロパン酸(Ac-Trp-D-Cys (StBu)-Pro-Lac-Ala-OH) (化合物SP654)(3.0mg、4.4μmol、22%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 678 (M+H)+
保持時間:0.86分(分析条件SQDAA05)
各pH中での安定性(1回目の環化反応中では反応せず安定に存在することが望まれる)および、pHを向上させた場合の反応選択性(メルカプトエチルアミンとの反応にて確認した)を評価した。
各pH中での安定性(1回目の環化反応中では反応せず安定に存在することが望まれる。)および、pHを向上させた場合の反応選択性(2−アミノエタンチオールとの反応にて確認した)を評価した。
従って、指定されたpHにて1回目の環化反応が実施されることが想定される場合、基質回収割合が高いほど望ましい。また、指定されたpHにて2回目の環化反応が想定される場合には相本反応の割合が高いほど望ましい。
Entry 6
(8時間)基質回収:27% 相本反応:39% 直接アミド化:33% 加水分解:0%
(24時間)基質回収:13% 相本反応:31% 直接アミド化:56% 加水分解:0%
Entry 7
(8時間)基質回収:12% 相本反応:50% 直接アミド化:38% 加水分解:0%
(24時間)基質回収:0% 相本反応:50% 直接アミド化:50% 加水分解:0%
10mM Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-RRR-Ala-OH/25%DMA水溶液(5.0μL)、10mM4−ペンチル安息香酸/25%DMA水溶液(5.0μL、内部標準として使用)、100mMTCEP/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.6、5.0μL)を混合させ、システイン残基側鎖保護基を素早く脱保護し、窒素雰囲気下、室温にて1時間静置した。続いて、翻訳用緩衝液(9.5μL)、PURESYSTEM(登録商標) classic II Sol. B(バイオコゥマー社、製品番号PURE2048C)(10μL)、50mM1,2−ジチアン−4,5−ジオール水溶液(10.5μL)、500mM2−アミノエタンチオール/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.6、5.0μL)を混合し、さらに1N水酸化ナトリウム水溶液(1.0μL)を混合して反応液をpH7.8に調整して、窒素雰囲気下、37度にて静置した。なお翻訳用緩衝液の成分の反応溶液中での濃度はそれぞれ次のとおりである。2mM GTP,2mM ATP,1mM CTP,1mM UTP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,14mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),アミノ酸(Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Trpがそれぞれ0.3mM)。反応の進行状況はLCMS測定によって確認した。
10mM Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-RRR-Ala-OH/25%DMA水溶液(5.0μL)、10mM4−ペンチル安息香酸/25%DMA水溶液(5.0μL、内部標準として使用)、100mMTCEP/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.8、5.0μL)を混合させ、システイン残基側鎖保護基を素早く脱保護し、窒素雰囲気下、室温にて1時間静置した。続いて、100mMBicine緩衝液(pH8.9、19.5μL)、50mM1,2−ジチアン−4,5−ジオール/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.9、10.5μL)、500mM2−アミノエタンチオール/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.5、5.0μL)を混合し、さらに0.5N水酸化ナトリウム水溶液(1.0μL)を混合して反応液をpH8.5に調整して、窒素雰囲気下、37度もしくは57度にて静置した。反応の進行状況はLCMS測定によって確認した。
10mM Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-RRR-Ala-OH/25%DMA水溶液(5.0μL)、10mM4−ペンチル安息香酸/25%DMA水溶液(5.0μL、内部標準として使用)、100mMTCEP/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.8、5.0μL)を混合させ、システイン残基側鎖保護基を素早く脱保護し、窒素雰囲気下、室温にて1時間静置した。続いて、100mMBicine緩衝液(pH8.9、19.5μL)、50mM1,2−ジチアン−4,5−ジオール/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.9、10.5μL)、500mM2−アミノエタンチオール/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.5、5.0μL)を混合し、さらに0.5N水酸化ナトリウム水溶液(2.0μL)を混合して反応液をpH9.0に調整して、窒素雰囲気下、37度もしくは57度にて静置した。反応の進行状況はLCMS測定によって確認した。
5−3−1.翻訳ペプチドモデル化合物SP655の合成
以下のスキームに従い、1回目の環化としてN末端にCysを用い、C末端側にAsp(SBn)を用いてアミド化環化反応を行い、2回目の分枝化として、活性チオエステル発生パートとしてCys-Pro-Lacを有し、Lysの側鎖アミノ基にN原子とS原子を保護させたCysを配置させた化合物のS原子とN原子を脱保護してアミド化反応を行う例を実施する目的で、以下のモデル化合物SP655の合成を行った。
本明細書では、Lysの側鎖のアミノ基とAcbz-Thzの有するカルボキシル基とでアミド結合した化合物をLys(Acbz-Thz)と表記する。
ペプチドの伸長後、レジンをジメチルホルムアミド(DMF)、ジクロロメタン(DCM)で洗浄した。レジンに2%トリフルオロ酢酸(TFA)のジクロロメタン(DCM)/2,2,2−トリフルオロエタノール(TFE)(=1/1、v/v、4.0ml)溶液を加えて室温にて3時間反応させ、レジンからのペプチドの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをジクロロメタン(DCM)/2,2,2−トリフルオロエタノール(TFE)(=1/1,v/v、4.0mL)にて4回洗浄した。得られた溶液を減圧濃縮し、残渣を逆相シリカゲルクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(S)-3-((S)-2-((S)-2-((S)-1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-インドール-3-イル)メチル)-6-((4-アジドベンジルオキシ)カルボニルアミノ)-18-((tert-ブチルジスルファニル)メチル)-12-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-2,2-ジメチル-7,10,13,16-テトラオキソ-3,4-ジチア-8,11,14,17-テトラアザノナデカン)ピロリジン-2-カルボニルオキシ)プロパンアミド)-6-((R)-3-((4-アジドベンジルオキシ)カルボニル)チアゾリジン-4-カルボキサミド)ヘキサンアミド)-4-((S)-2-カルバモイルピロリジン-1-イル)-4-オキソブタン酸(Acbz−Cys(StBu)−Gly−Lys(Me2)−Trp−Cys(StBu)−Pro−Lac−Lys(Acbz−Thz)−Asp−Pro−NH2)(化合物SP681)(184.6mg、24%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 1773.9 (M+H)+
保持時間:0.76分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1880.0 (M+H)+
保持時間:0.80分(分析条件SQDFA05)
Cys-Pro-Lacユニットでは、1回目の環化反応中、反応補助基の有無にかかわらず安定に存在することが可能であり、また2回目の分枝化反応では高い選択性で望みの分枝化反応が実現できることが明らかとなったため、モデルペプチドにて分枝化反応を翻訳液中にて確認した。
LCMS(ESI) m/z = 1227 (M−H)−
保持時間:0.76分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1215 (M−H)−(図69)
保持時間:0.73分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1017 (M+H)+
保持時間:0.65分(分析条件SQDAA05)(図70)
2回目の分枝化のコンセプト証明のための別実験である。1回目の環化が終了済であることを想定している。従って、Aspの側鎖のカルボン酸とN末端のアミノ基によるアミド環化を実施せず、主鎖環化したモデル化合物とした。2回目の分枝化にてCys-Pro-HOGlyから活性エステルを発生させ、その前後にて保護されたアミンを脱保護させて分枝化させるモデル反応性を以下のように実施した。
LCMS(ESI) m/z = 579 (M+H)+
保持時間:0.97分(分析条件SQD FA05)
(HOGlyはグリコール酸を示す)
用語の定義
Fmoc-Lys(N3)-OH: (S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-6-アジドヘキサン酸
LCMS(ESI) m/z = 1509 (M+H)+
保持時間:0.63分(分析条件SQD FA50)
(S)-N-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S)-3,12-ジベンジル-18,24-ジイソブチル-6,9,10,13,15,19,21,22-オクタメチル-2,5,8,11,14,17,20,23,26-ノナオキソ-1,4,7,10,13,16,19,22,25-ノナアザシクロヘントリアコンタン-27-イル)-2-(2-ヒドロキシアセトアミド)-3-フェニルプロパンアミド(化合物SP664)の合成
0.5M HEPES緩衝液(pH7.0、 60μl)と1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(DMI)(40μl)の混合溶液に、TCEP塩酸塩(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)(2.9mg、 0.010mmol)、2-(4-メルカプトフェニル)酢酸(1.7mg、 0.010mmol)を加えた。さらにこの溶液に2N水酸化ナトリウム水溶液(35μl)と水(45μl)を加えてpH8.5に調整し、室温で5分攪拌した。
その後、(6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36R,41aS)-9-(4-アジドブチル)-6,24,33-トリベンジル-36-((tert-ブチルジスルファニル)メチル)-12,18-ジイソブチル-14,15,17,21,23,26,27,30-オクタメチルヘキサコサヒドロピロロ[2,1-c][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37]オキサドデカアザシクロノナトリアコンチン-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37(3H)-トリデカオン(c(HOGly-Phe-Lys(N3)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe-Cys(StBu)-Pro)) (化合物SP662)の0.01M 1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(DMI)溶液(20μl、 0.2μmol)を加え、反応液を30℃で24時間攪拌した。LCMSを用いて反応の変化を観測したところ、24時間で(S)-N-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S)-3,12-ジベンジル-18,24-ジイソブチル-6,9,10,13,15,19,21,22-オクタメチル-2,5,8,11,14,17,20,23,26-ノナオキソ-1,4,7,10,13,16,19,22,25-ノナアザシクロヘントリアコンタン-27-イル)-2-(2-ヒドロキシアセトアミド)-3-フェニルプロパンアミド(化合物SP664)が生成していることを確認した。加水分解物と化合物SP664との生成比は、LCMSのUVエリア比で12:88であった。(図71、加水分解化合物 保持時間:0.62分)
LCMS(ESI) m/z = 1195 (M+H)+
保持時間:0.77分(分析条件SQD FA05)
コンセプト証明のための別実験である。1回目の環化反応終了後を想定した。従ってAspの側鎖カルボン酸とN末端アミンとの環化ではなく、C末端Alaのカルボン酸とN末端アミンとをアミド環化させた。2回目の分枝化のためのアミノ基の保護基もディスプレーライブラリーでの使用を想定したものではない。反応補助基を有するエステルからの分枝化反応が進行することを確認することを目的としたコンセプト証明のためのモデル実験である。
なお、本明細書中では、化合物SP666のヒドロキシル基上の水素原子とカルボン酸上のヒドロキシル基を除いた2価の構造をtBuSSlacとする。
LCMS(ESI) m/z = 209 (M―H)―
保持時間:0.60分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 580.5 (M+H)+
保持時間:1.05分(分析条件SQDFA05)
なお、本明細書中では、他の例と同様H−Lys−OHの側鎖アミノ基とAlloc−Cys(StBu)−OHのカルボキシル基とがアミド結合した化合物をH−Lys(Alloc−Cys(StBu))−OHと記載する。
LCMS(ESI) m/z = 1844.6 (M+H)+
保持時間:0.84分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 1622 (M+H)+
保持時間:0.30分、0.34分(分析条件SQDFA50)
tBuSSlac部位が光学異性体混合物であるため、化合物としてジアステレオマーが存在し、2本のピークを観測した。
LCMS(ESI) m/z = 1604.5 (M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA50)
LCMS(ESI) m/z = 1520 (M+H)+
保持時間:0.83分(分析条件SQDFA05)
(2S)−N−((3R,6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30S)−6,15−ジベンジル−21,27−ジイソブチル−3−(メルカプトメチル)−9,12,13,16,18,22,24,25−オクタメチル−2,5,8,11,14,17,20,23,26,29−デカオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25,28−デカアザシクロテトラトリアコンタン−30−イル)−2−(2−ヒドロキシ−3−メルカプトプロパンアミド)−3−フェニルプロパンアミド(H−HSlac−Phe−Lys(*Cys)−Leu−MeAla−MeLeu−Ala−MePhe−MeAla−Ala−Phe*、2つの*部位にて環化)(化合物SP672)の合成
なお、本明細書では、HSlacとは化合物SP666の側鎖tBuS基が脱保護されたもので、ヒドロキシル基上の水素原子とカルボン酸上のヒドロキシル基を除いた2価の構造を意味する。
LCMS(ESI) m/z = 1342 (M―H)―
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
(2S)−N−((3S,6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30S)−6,15−ジベンジル−21,27−ジイソブチル−3,9,12,13,16,18,22,24,25−ノナメチル−2,5,8,11,14,17,20,23,26,29−デカオキソ−1,4,7,10,13,16,19,22,25,28−デカアザシクロテトラトリアコンタン−30−イル)−2−(2−ヒドロキシプロパンアミド)−3−フェニルプロパンアミド(H−lac−Phe−Lys(*Ala)−Leu−MeAla−MeLeu−Ala−MePhe−MeAla−Ala−Phe*、2つの*部位にて環化)(化合物SP673)の合成
670mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩溶液の調整法は以下の通りである。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩(29mg、101μmol)に水(100μl)、トリエチルアミン(Et3N)(50μl)を加え、pH=7.1に調整した。
LCMS(ESI) m/z = 1280(M+H)+
保持時間:0.77分(分析条件SQDFA05)
8.ペプチドーRNA複合体を用いた分子内分枝ペプチド(直鎖部2)生成反応
RNA−ペプチド複合体において分子内分枝ペプチド反応を施し、生成物を電気泳動により分析した。
PCRにより調製したDNA(配列番号 DM-H1)を鋳型に、In vitro転写によりmRNA(配列番号RM−H2)を調整し、RNeasy mini kit (Qiagen社)を用いて精製した。10μMのmRNAに、15μMのピューロマイシンリンカー(Sigma社)(配列番号C-H1) 1X T4 RNAライゲースリアクションバッファー(NEB社)、1mM ATP、10% DMSO、0.63 unit/μl T4 RNAライゲース(NEB社)を加え、室温で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy MiniElutekit(Qiagen社)により精製した。次に、前述した翻訳系の鋳型RNAOT86b(配列番号RM−H1)の代わりに上記で調製した1 μMのmRNA-ピューロマイシンリンカー連結体を鋳型として用い、さらに0.25mM Glyを追加した翻訳反応液を調製し、37℃で60分間保温した後、続けて室温で12分間保温した。その後、反応液をRNeasy minelute(qiagen社)により精製し、ペプチド−RNA複合体分子を得た。
OT-104 DNA配列
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgTGCACTACATGGTTCCGTTGGTGCCCACAGTTCAAGTGGCTTCCTCGTAGTGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
OT-104 RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUaugUGCACUACAUGGUUCCGUUGGUGCCCACAGUUCAAGUGGCUUCCUCGUAGUGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
[P]CCCGTCCCCGCCGCCC [Fluorecein-dT][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin] ([P]:5'リン酸化)
上記で調製したペプチドーRNA複合体溶液100μLに対して100μLのN, N‐ジメチルアセトアミド(DMA)、5.5μLの2M HEPES−KOH(pH7.6)、2.1μLの1M トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(pH7.6)を加え、37℃で2時間保温した。続けて848μLの試薬溶液(59mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、425mM N,N−ビス−(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)(pH8.7)、590mM 水酸化ナトリウム、47%(v/v)N,N-ジメチルアセトアミド(DMA)、593mM 4−(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール)を反応溶液に加え、37℃でさらに20時間保温した。得られた反応液から、RNeasy minelute (qiagen社)を用いてペプチド−RNA複合体を精製し、純水100μLにてカラムから溶出した。続けて、12μLの10xRNase ONE ribonuclease反応バッファー(promega 社)、6μLのRNase ONEribonuclease (promega社)、6μLのRNase H (Life Technologies社)を加え、室温にて3日間保温した。得られた反応溶液と何も反応させていないピューロマイシンリンカー(配列番号C-H1)をpeptide-PAGE mini(TEFCO社)にて電気泳動し、ピューロマイシンリンカーに由来するFluoreceinにてバンドを可視化した(図74)。その結果、分枝ペプチド(直鎖部2) 生成反応を行ったサンプルに関して、ピューロマイシンリンカーにペプチドが 結合したことに由来するバンド移動度の差が観測された(図74、レーン2、バンドI)。このことから、目的の分子内分枝ペプチド−RNA複合体の存在が示された。
なお、本明細書では、アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体、アミノ酸類縁体の主鎖カルボン酸とpdCpAのヒドロキシル基(2位あるいは3位)とエステル結合を形成した化合物をアミノ酸−pdCpAと記載する。アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミノ酸類縁体部位は略称で示しており、各略称は以下のように定義する。
粗生成物(1.53g)にアセトニトリル(6.7ml)とDMF(6.7ml)を加えて、混合物を0度に冷却した後に、ジイソプロピルエチルアミン(3.51mL、20.1mmol)と2−ブロモアセトニトリル(0.93ml、13.4mmol)を加え、反応液を室温で6時間攪拌した。反応混合物をジエチルエーテル/水で抽出操作を行い、有機層を25wt%食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、2−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)酢酸シアノメチル(化合物21)(556mg、52%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 230 (M+H)+
保持時間:0.54分(分析条件SQDAA50)
2−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)−2−((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−(ホスホノオキシメチル)テトラヒドロフラン−3−イルオキシ)(ヒドロキシ)ホスホリルオキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イルの合成
LCMS(ESI) m/z = 809.5 (M+H)+
保持時間:0.52分(分析条件SQDFA05)
2−ヒドロキシ酢酸 (2R,3S,4R,5R)−2−((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−(ホスホノオキシメチル)テトラヒドロフラン−3−イルオキシ)(ヒドロキシ)ホスホリルオキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル( HO Gly−pdCpA)の合成
LCMS(ESI) m/z = 695 (M+H)+
保持時間:0.28分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 364 (M+H)+
保持時間:0.84分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 829 (M+H)+
保持時間:0.41分(分析条件SQDFA05)
L-アリルグリシン(化合物28)(25.0g、 217mmol)の1,4−ジオキサン (250 ml)/水(125ml)懸濁液を0℃に冷却した後、二炭酸ジ-tert-ブチル(52.1g、 239mol)および炭酸水素ナトリウム(36.5g、434mol)を加え、反応液を室温で12時間攪拌した。反応が完結した後、反応液を0℃に冷却し、液性がpH4になるまで1M塩酸を加えた。この混合物を酢酸エチルで抽出操作を行い、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ペンタ-4-エン酸を得た。得られた(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ペンタ-4-エン酸をトルエン(200ml)に溶解させ、N,N-ジメチルホルムアミドジ-tert-ブチルアセタール(130ml)を加え、90℃で4時間攪拌した。更にN,N-ジメチルホルムアミドジ-tert-ブチルアセタール(25ml)を加え90℃で2時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ペンタ-4-エン酸 tert-ブチルエステル(化合物29)(33.16g、56%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 294 (M+Na)+
保持時間:1.05分(分析条件SQDAA05)
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ペンタ-4-エン酸 tert-ブチルエステル(化合物29)(32.0g、 118mmol)のジクロロメタン(384ml)溶液にメタクロロ過安息香酸(40.7g、 236mmol)を加え、室温で15時間攪拌した。反応混合物を0℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム(20g)水溶液(300ml)および飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液(100ml)を加え、反応を終了させた。混合物を酢酸エチルで抽出操作を行い、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム水溶液/メタノール)にて精製し、(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-オキシラニル-プロピオン酸 tert-ブチルエステル(化合物30)(18.53g、55%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 310 (M+Na)+
保持時間:1.03分(分析条件SQDAA05)
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-オキシラニル-プロピオン酸 tert-ブチルエステル(化合物30)(315mg、 1.096mmol)にメタノール (4ml)およびチオ尿素(83mg、 1.096mmol)を加え、反応液を1.5時間加熱還流した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-チイラニル-プロピオン酸 tert-ブチルエステル(化合物31)(278mg、84%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 326 (M+Na)+
保持時間:0.59分(分析条件SQDAA50)
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-チイラニル-プロピオン酸 tert-ブチルエステル(化合物31)(2.28g、 7.51mmol)のジクロロメタン(35ml)溶液にテトラメチル尿素(1.06ml、 9.02mmol)を加え、−78℃に冷却した。非特許文献(J.Org.Chem.2001、66、910−914)に掲載されている手法に従い、別途調製した1.60Mメタンスルフェニルブロミド 1,2−ジクロロエタン溶液(5.17ml)を加えた。反応液を2時間かけて攪拌しながら−78℃から0℃まで昇温させた。反応液を減圧下濃縮し、 (S)-5-ブロモ-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 tert-ブチルエステル(化合物32)を粗生成物として得た。
LCMS(ESI) m/z = 430 (M+H)+
保持時間:0.74分(分析条件SQDAA50)
前述で得られた未精製の(S)-5-ブロモ-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 tert-ブチルエステル(化合物32)のN,N−ジメチルホルムアミド(100ml)溶液にアジ化ナトリウム(2.44g、 37.6mmol)を加え、反応混合物を室温で6時間攪拌した。反応終了後、不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 tert-ブチルエステル(化合物33)(1.87g、64%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 415 (M+Na)+
保持時間:0.80分(分析条件SQDAA50)
(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 tert-ブチルエステル(化合物33)(92mg、 0.234mmol)の2,2,2−トリフルオロエタノール (0.9ml)溶液にクロロトリメチルシラン(297μl、 2.344mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。更にクロロトリメチルシラン(150μl、 1.184mmol)を加え、反応液を室温で12時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をヘキサン/酢酸エチル/ジクロロメタン(3:1:0.1)の混合溶媒で洗浄し、(S)-2-アミノ-5-アジド-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 塩酸塩(化合物34)(58mg、91%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 237 (M+H)+
保持時間:0.36分(分析条件SQDFA05)
(S)-2-アミノ-5-アジド-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 塩酸塩(化合物34)(70mg、 0.257mmol)の1,4−ジオキサン (0.7 ml)/水(0.35ml)懸濁液に二炭酸ジ-tert-ブチル(112mg、 0.513mmol)および炭酸水素ナトリウム(54mg、0.642mmol)を加え、反応液を室温で3時間攪拌した。反応が完結した後、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム水溶液/メタノール)にて精製し、(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸(化合物35)(79mg、92%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 335 (M−H)−
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸(化合物35)(75mg、 0.223mmol)のアセトニトリル (2 ml)溶液にブロモアセトニトリル(45μl、 0.669mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(58μl、0.334mmol)を加え、反応液を室温で5時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル/飽和塩化アンモニウムで抽出操作を行い、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 シアノメチルエステル(化合物36)(81mg、97%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 374 (M−H)−
保持時間:0.87分(分析条件SQDFA05)
緩衝液A(29mL)にリン酸二水素((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h)(45mg、0.071mmol)の水溶液(1ml)と(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 シアノメチルエステル(化合物36)(80mg、0.213mmol)のテトラヒドロフラン(1ml)溶液を加え、室温で3時間撹拌した。凍結乾燥後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル 5-アジド-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(メチルジスルファニル)ペンタノエート(化合物37)(15mg、22%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 955 (M+H)+
保持時間:0.55分(分析条件SQDFA05)
(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル 5-アジド-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(メチルジスルファニル)ペンタノエート(化合物37)(10mg、10.47μmol)に室温にてトリフルオロ酢酸(0.2mL)を添加し、同温度で20分間撹拌した。減圧濃縮後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、2-アミノ-5-アジド-4-(メチルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(Orn(N3)(4-SSMe)-pdCpA)(化合物27)(2mg、26%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 855 (M+H)+
保持時間:0.32分(分析条件SQDFA05)
(2S,2'S)-ジ-tert-ブチル 4,4'-ジスルファンジイルビス(5-アジド-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタノエート) (化合物38)の合成
前述した(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-メチルジスルファニル-ペンタン酸 tert-ブチルエステル(化合物33)の合成において、副生成物として、(2S,2'S)-ジ-tert-ブチル 4,4'-ジスルファンジイルビス(5-アジド-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタノエート) (化合物38)(414mg)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 691.7 (M+H)+
保持時間:0.80分(分析条件SQDAA50)
(2S,2'S)-ジ-tert-ブチル 4,4'-ジスルファンジイルビス(5-アジド-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタノエート)(化合物38)(312mg、0.452mmol)にジ-tert-ブチルジスルフィド(5.67ml、29.4mmol)およびヨウ素(57mg、0.226mmol)を加え、60度で18時間攪拌した。反応液を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸 tert-ブチルエステル(化合物39)(161mg、81%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 435.5 (M+H)+
保持時間:0.77分(分析条件SQDAA50)
(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸 tert-ブチルエステル(化合物39)(160mg、 0.368mmol)の2,2,2−トリフルオロエタノール (3.2ml)溶液にクロロトリメチルシラン(467μl、 2.344mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。更にクロロトリメチルシラン(467μl、 2.344mmol)を加え、反応液を室温で3時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をヘキサン/酢酸エチル/ジクロロメタン(3:1:0.1)の混合溶媒で洗浄し、(S)-2-アミノ-5-アジド-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸 塩酸塩(化合物40)(113mg、97%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 279 (M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDAA05)
(S)-2-アミノ-5-アジド-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸 塩酸塩(化合物40)(110mg、 0.349mmol)の1,4−ジオキサン (1 ml)/水(0.5ml)溶液に二炭酸ジ-tert-ブチル(152mg、 0.699mmol)および炭酸水素ナトリウム(73mg、0.873mmol)を加え、反応液を室温で1.5時間攪拌した。更に二炭酸ジ-tert-ブチル(152mg、 0.699mmol)および炭酸水素ナトリウム(73mg、0.873mmol)を加え、反応液を室温で2時間攪拌した。反応が完結した後、反応液を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール)にて精製し、(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸(化合物40a)(120mg、91%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 377 (M−H)−
保持時間:0.89分(分析条件SQDFA05)
(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸(化合物40a)(115mg、 0.304mmol)のアセトニトリル (1 ml)溶液にブロモアセトニトリル(62μl、 0.911mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(79μl、0.456mmol)を加え、反応液を室温で2時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル/飽和塩化アンモニウムで抽出操作を行い、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸 シアノメチルエステル(化合物41)(120mg、95%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 416 (M−H)−
保持時間:0.97分(分析条件SQDFA05)
緩衝液A(29mL)にリン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h)(56mg、0.088mmol)の水溶液(1ml)と(S)-5-アジド-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジスルファニル-ペンタン酸 シアノメチルエステル(化合物41)(110mg、0.263mmol)のテトラヒドロフラン(1ml)溶液を加え、室温で3時間撹拌した。凍結乾燥後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル 5-アジド-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ペンタノエートの粗精製物(化合物42)(55mg)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 997 (M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
前述した(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル 5-アジド-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ペンタノエート(化合物42)の粗精製物(53mg)にジクロロメタン(2ml)を加えて懸濁させ、室温にてトリフルオロ酢酸(0.5mL)を添加し、同温度で30分間撹拌した。減圧濃縮後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液)にて精製し、2-アミノ-5-アジド-4-(tert-ブチルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(Orn(N3)(4-SStBu)-pdCpA)(化合物43)(24mg、2ステップ 31%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 897 (M+H)+
保持時間:0.41分(分析条件SQDFA05)
以下に述べる手法により、化合物36のSHの保護基を1工程にて変更でき、容易にpdCpA誘導体を合成する手法を確立した。
5−アジド−2−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−4−(メチルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−シアノメチル(化合物36)(110mg、0.293mmol)にジイソプロピルジスルフィド(4.67ml、29.3mmol)およびヨウ素(30mg、0.117mmol)を加え、60度で24時間攪拌した。反応液を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、5−アジド−2−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−4−(イソプロピルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−シアノメチル(化合物45)(89mg、75%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 402 (M−H)−
保持時間:0.61分(分析条件SQDAA50)
5−アジド−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−(イソプロピルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン-1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イルの合成
緩衝液A(12mL)にリン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h、43.6mg、0.069mmol)の水溶液(0.3mL)と5−アジド−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−(イソプロピルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−シアノメチル(化合物45)(83mg、0.206mmol)のテトラヒドロフラン(0.2mL)溶液を加え、室温で55分間撹拌した。凍結乾燥後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液)にて精製し、5−アジド−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−(イソプロピルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン-1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(化合物46)(27.7mg、41%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 981.6 (M−H)−
保持時間:0.58分(分析条件SQDFA05)
2−アミノ−5−アジド−4−(イソプロピルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(Orn(N3)(4-SSiPr)-pdCpA)の合成
5−アジド−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−(イソプロピルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン-1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(化合物46)(27.7mg、28μmol)のジクロロメタン(0.4mL)溶液にトリフルオロ酢酸(0.1mL)を添加し、室温で35分間撹拌した。減圧濃縮後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液)にて精製し、2−アミノ−5−アジド−4−(イソプロピルジスルファニル)ペンタン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(Orn(N3)(4-SSiPr)-pdCpA)(化合物47)(21.5mg、86%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 881.4 (M−H)−
保持時間:0.39分(分析条件SQDFA05)
L(+)−リジン一塩酸塩(3.08g、 16.86mmol)を氷浴で冷却後、アンモニア水(15mL)を添加した。反応液を同温度で25分間撹拌後、減圧濃縮して得た粗生成物(3.20g)をそのまま次工程に用いた。
窒素雰囲気下、(S)−2,6−ジアミノヘキサン酸, ジアンモニア塩 塩酸塩(化合物56)(3.20g、14.77mmol)及び9−BBNダイマー(4.11g、16.98mmol)のメタノール(40mL)懸濁液を1時間加熱還流した。室温に冷却後、溶媒を減圧留去して得た粗生成物をそのまま次工程に用いた。
LCMS(ESI) m/z = 265 (M−H)−
保持時間:0.43分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、(1R,4'S,5S)−4'−(4−アミノブチル)−5'−オキソスピロ[ビシクロ[3.3.1]ノナン−9,2'−[1,3,2]オキサザボロリジン]−3'−イウム−11−ウイド(化合物49)(3.73g、14mmol)及びBoc−Cys(StBu)−OH(4.33g、14mmol)のDMF(10mL)懸濁液に室温で撹拌しながら、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(3.66mL、21mmol)を添加した。得られた混合物にHATU(5.86g、15.4mmol)を添加後、室温にて1日間撹拌した。反応混合物に飽和食塩水を添加し、酢酸エチルにて抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/酢酸エチル)にて精製し、(1R,4'S,5S)−4'−(4−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ブチル)−5'−オキソスピロ[ビシクロ[3.3.1]ノナン−9,2'−[1,3,2]オキサザボロリジン]−3'−イウム−11−ウイド(化合物50)(7.34g、94%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 558.5 (M+H)+
保持時間:0.98分(分析条件SQDFA05)
(1R,4'S,5S)−4'−(4−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ブチル)−5'−オキソスピロ[ビシクロ[3.3.1]ノナン−9,2'−[1,3,2]オキサザボロリジン]−3'−イウム−11−ウイド(化合物50)(715.8mg、1.28mmol)の1,4−ジオキサン(3mL)溶液に室温にて濃塩酸(1.1mL)を添加し、得られた反応混合物を40℃で13時間15分間撹拌した。室温に冷却後、減圧濃縮して得られた粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10mM酢酸アンモニウム水溶液/メタノール)にて精製し、(S)−2−アミノ−6−((R)−2−アミノ−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸(Lys(Cys(StBu)))(化合物51)(394.1mg、91%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 336 (M−H)−
保持時間:0.67分(分析条件SQDAA05)
(S)−2−アミノ−6−((R)−2−アミノ−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸(Lys(Cys(StBu)))(化合物51)(390mg、1.16mmol)の1,4−ジオキサン(5mL)及び水(6mL)混合物を氷浴にて冷却し、炭酸水素ナトリウム(388mg、4.62mmol)、続いてBoc2O(807mg、3.70mmol)を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌した。氷浴にて冷却後、硫酸水素カリウム(157mg、1.16mmol)及び飽和硫酸水素カリウム水溶液(1mL)を添加して、pH2に調整した。得られた混合物を酢酸エチルにて抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル)にて精製し、(S)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−6−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸(化合物52)(579.5mg、93%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 536 (M−H)−
保持時間:0.86分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下室温にて、(S)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−6−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸(化合物52)(206mg、0.383mmol)のアセトニトリル(0.3mL)溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.073mL、0.421mmol)、続いてブロモアセトニトリル(0.080mL、1.15mmol)を添加した。反応混合物を同温度にて5時間撹拌後、減圧濃縮して得られた粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−6−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸 (S)−シアノメチル(化合物53)(172.2mg、78%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 577.6 (M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDFA05)
緩衝液A(11mL)にリン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h)(37.9mg、0.060mmol)の水溶液(0.3mL)と2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−6−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸 (S)−シアノメチル(化合物53)(103mg、0.179mmol)のテトラヒドロフラン(0.3mL)溶液を加え、室温で2時間撹拌した。凍結乾燥後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液)にて精製し、2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−6−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(化合物55)(12mg、17%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 1156.7 (M+H)+
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−6−((R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(化合物55)(12mg、10.38μmol)のジクロロメタン(0.4mL)溶液に室温にてトリフルオロ酢酸(0.1mL)を添加し、同温度で15分間撹拌した。減圧濃縮後、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液)にて精製し、2−アミノ−6−((R)−2−アミノ−3−(tert−ブチルジスルファニル)プロパンアミド)ヘキサン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(Lys(Cys(StBu))-pdCpA)(化合物48)(9.3mg、94%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 956 (M+H)+
保持時間:0.29分(分析条件SQDFA05)
翻訳合成可能であり、かつRNAに安定な反応条件にて脱保護できる保護基の探索、およびアミノ酸ユニットとの組み合わせ例を以下に示す。また、以下に示すように、本明細書中に使用する各アミノ酸の略称も化合物番号と共に示した。これらの略称はペプチド内に含有されても、あるいはpdCpAなどのRNAやDNAに含有されても同じユニットが含まれるものとする。また、例えばH-Gly-OHなどの場合、N末端もしくはC末端が化学修飾されてない場合には、HやOH基の記載を省略して単にGlyなどとすることもある。
また、翻訳合成可能なアミノ酸として、本明細書中に使用する各アミノ酸の略称を以下の様に定義する。
LCMS(ESI) m/z = 389 (M−H)−
保持時間:0.83分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 428.1 (M−H)−
保持時間:0.85分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1007.7 (M−H)−
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
5−((3S)−4−(((2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)−3−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−オキソブチル)チアゾリジン−3−カルボン酸 (5S)−tert−ブチル(化合物tk4)(8.5mg、8.43μmol)のジクロロメタン(0.2mL)溶液に、10%トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液(0.16mL)を添加し、室温で1.25時間撹拌した。減圧濃縮後、2−アミノ−4−((S)−チアゾリジン−5−イル)ブタン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(Ala(Tzm)-pdCpA)(化合物tk5)(10.6mg、quant.)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 807.5 (M−H)−
保持時間:0.14分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 398 (M−H)−
保持時間:0.85分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 498.4 (M−H)−
保持時間:0.91分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 537.6 (M−H)−
保持時間:0.91分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1116.7 (M−H)−
保持時間:0.62分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1016.5 (M−H)−
保持時間:0.45分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 841.4 (M−H)−
保持時間:0.20分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 138 (HOC6H4NO2−H)−
保持時間:1.03分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 398 (M−H)−
保持時間:0.85分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 498 (M−H)−
保持時間:0.90分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 539.5 (M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1116.2 (M−H)−
保持時間:0.65分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1016.0 (M−H)−
保持時間:0.44分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 383 (M−H)−
保持時間:0.84分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 631.5 (M−H)−
保持時間:1.01分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 513 (M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 611 (M−H)−
保持時間:0.88分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 650.6 (M−H)−
保持時間:0.95分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1231.7 (M+H)+
保持時間:0.90分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1130.1 (M−H)−
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 273.3 (M+H)+
保持時間:0.71分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 850.3 (M−H)−
保持時間:0.41分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 750.4 (M−H)−
保持時間:0.34分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 542 (M−H)−
保持時間:0.89分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 320 (M−H)−
保持時間:0.47分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 420 (M−H)−
保持時間:0.76分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 459 (M−H)−
保持時間:0.84分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1040.8 (M+H)+
保持時間:0.56分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 938.5 (M−H)−
保持時間:0.39分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 420 (M−H)−
保持時間:0.76分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 459.5 (M−H)−
保持時間:0.84分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1038.6 (M−H)−
保持時間:0.58分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 938.5 (M−H)−
保持時間:0.39分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 418 (M−H)−
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 999.7 (M+H)+
保持時間:0.53分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 897.4 (M−H)−
保持時間:0.35分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 271 (M−H)−
保持時間:0.66分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 310 (M−H)−
保持時間:0.77分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 889.4 (M−H)−
保持時間:0.47分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 789.4 (M−H)−
保持時間:0.27分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 379.9 (M−H)−
保持時間:0.70分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 959.5 (M−H)−
保持時間:0.44分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 859.4 (M−H)−
保持時間:0.26分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 406 (M−H)−
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 445 (M−H)−
保持時間:0.82分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1024.5 (M−H)−
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 924.3 (M−H)−
保持時間:0.37分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 406 (M−H)−
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 445.4 (M−H)−
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1024.5 (M−H)−
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 924.4 (M−H)−
保持時間:0.37分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 404 (M−H)−
保持時間:0.77分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 983.4 (M−H)−
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 883.3 (M−H)−
保持時間:0.33分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 257 (M−H)−
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 296 (M−H)−
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 875.4 (M−H)−
保持時間:0.44分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 775.4 (M−H)−
保持時間:0.25分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 462 (M+H)+
保持時間:0.66分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 501.5(M+H)+
保持時間:0.76分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1078(M−H)−
保持時間:0.55分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 878(M−H)−
保持時間:0.17分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 401(M+H)+
保持時間:0.74分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 440(M+H)+
保持時間:0.83分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1017(M−H)−
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 917(M−H)−
保持時間:0.34分(分析条件SQDFA05)
RNAが安定な反応条件にてアミノ基保護基が脱保護されることを確認、もしくは新条件を探索する目的で以下の実験を行い、RNAが安定に存在する反応条件でのアミノ基脱保護反応を得た。
LCMS(ESI) m/z = 399 (M+H)+
保持時間:0.93分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 297 (M−H)−
保持時間:0.93分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 453 (M+H)+
保持時間:1.03分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 299 (M+H)+
保持時間:0.90分(分析条件SQDAA05)
既知のNpys基の脱保護手法として、有機溶媒中、求核剤2−メルカプトピリジンを用い、更に反応液中に酢酸を添加することで脱保護反応を加速させる条件が報告されている(非特許文献 International journal of peptide and protein research, 1990, 35, 545-549)。本発明者らは、従来法の改良を行った結果、RNAが安定して存在する条件で、かつNpys基の脱保護反応が容易に進行する手法を見出した。実際にRNAを本反応条件に伏した結果、RNAは安定性して存在することが確認され(表19 反応条件E、および図80 レーン5)、本反応条件の有用性が証明された。
LCMS(ESI) m/z = 474.4 (M+H)+
保持時間:0.97分(分析条件SQDFA05)
化合物tk99のLCMSの保持時間と質量電荷比は以下のとおりである。
LCMS(ESI) m/z = 211(M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDAA05)
窒素雰囲気下、Boc−Lys(Tfa)−OH(化合物tk96)(104mg、0.304mmol)及び1H−ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール−1−オール(HOBT)(61.6mg、0.456mmol)のDMF(0.5mL)溶液を氷浴で冷却後、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)(87mg、0.456mmol)を添加した。反応混合物を同温度で5分間撹拌後、ベンジルアミン(40μL、0.365mmol)を添加した。反応混合物を室温にて17.5時間撹拌後、酢酸エチル、ヘキサン及び食塩水を添加した。得られた混合物を酢酸エチルにて抽出し、有機相を食塩水(1mLで2回)にて洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)にて精製し、(1−(ベンジルアミノ)−1−オキソ−6−(2,2,2−トリフルオロアセトアミド)ヘキサン−2−イル)カルバミン酸 (S)−tert−ブチル(化合物tk97)(134.4mg、quant.)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 430.4 (M−H)−
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
17時間後:化合物tk98:化合物tk97=19:81
93.5時間後:化合物tk98:化合物tk97=70:30
LCMS(ESI) m/z = 336.4 (M+H)+
保持時間:0.74分(分析条件SQDAA05)
solA: 次の成分を含んだ混合物 8mM GTP,8mM ATP,160mMクレアチンリン酸,400mM HEPES−KOH pH7.6,800mM 酢酸カリウム,48mM 酢酸マグネシウム,16mMスペルミジン,8mM ジチオスレイトール,0.8mM 10−HCO−H4folate, 12mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社)
solB: PURESYSTEM(r) classic II Sol. B(バイオコゥマー社、製品番号PURE2048C)
20種天然アミノ酸溶液: 20種の天然アミノ酸溶液(それぞれ5mM)
HO Gly:グリコール酸
Lac:L−(+)−乳酸
PhLac:(S)−2−ヒドロキシ−3−フェニルプロパン酸
D PhLac: (R)−2−ヒドロキシ−3−フェニルプロパン酸
HO Gly(Me) 2 :2−ヒドロキシ−2−メチルプロパン酸
環状化反応と続く分枝骨格生成反応の二つの反応を厳密に制御することを可能にする、温和な条件下で脱保護可能な側鎖アミノ基を含むアミノ酸の翻訳導入、及びMALDI−MSによる解析を行った。
3−1. 転写によるtRNA(CA欠損)の合成
鋳型DNA(配列番号DT−H3)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAAsn-E2GUU(-CA)(配列番号RT−H3)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAAsn-E2GUU (-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTgttAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
tRNAAsn-E2GUU (-CA) RNA配列:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUguuAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
50μM 転写tRNAAsn-E2GUU (-CA)(配列番号RT−H3) 20μLに、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2) 4μL、, 10 mM ATP 4μL、Nuclease free water 5.6μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 T4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)2.4μLおよび、5mMの側鎖アミノ基が保護されたアミノアシル化pdCpA(化合物tk5、tk60、tk64、tk90、tk38、tk11のいずれか一種類)のDMSO溶液 4μLを加え、16℃で45分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AT−H3)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−H3)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
様々なアミノ酸によりアミノアシル化されたtRNA(化合物AT−H3)を、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、翻訳液,1%(v/v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega社,N2111), 1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,0.1mM 10−HCO−H4folate, 1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF−G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF−Tu,93μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型RNA、タンパク質性アミノ酸群をそれぞれ250μMずつ、ならびに50μMずつアシル化tRNAを翻訳反応混合物に添加し、37℃で1時間静置することで行った。
1μM 鋳型RNA CT32(配列番号RM−H3)、0.25mM Met、0.25mM Arg,0.25mM Asp、0.25mM Tyr、0.25mM Lys、1mM ジチオスレイトール、50μM Ala(Tzm)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3A)を含む前述の翻訳液を37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物1μLに9μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート上乾固した。MALDI−MS分析の結果、Ala(Tzm)を含む全長ペプチド(ペプチド配列P−H2)が主生成物として観測された(図75、ピークI)。
CT32 RNA配列
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUaacCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
fMetArg[Ala(Tzm)] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
m/z: [H+M]+ = 1656.4 (Calc. 1656.7)
1μM 鋳型RNA CT32(配列番号RM−H3)、0.25mM Met、0.25mM Arg,0.25mM Asp、0.25mM Tyr、0.25mM Lys、及び前記の方法で調製した50μMのOrn(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3B)、Orn(oAcbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3C)、Lys (Npys)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3D)をそれぞれ1種類含む前述の翻訳液、計3反応溶液を37℃で60分間保温した。Orn(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3B)を含む翻訳サンプルに関して、得られた翻訳溶液1μLに9μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート乾固した後、MALDI−MSにて解析を行った。その結果、目的の全長ペプチドに由来するピークでなく、側鎖Acbz基が外れたペプチドP−H3Aに対応するピークが主生成物として観測された(図75ピークII)。これは上述の測定前処理操作あるいは測定中のレーザー照射により側鎖脱保護反応が進行したことに由来すると考え、測定をLC-ESI-MSに変更して続けて同翻訳産物の解析をおこなった。上述のOrn(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3B)を含む翻訳溶液5μLと水5μLを混合したものを用いLC-MS分析した結果、Acbz基を有する全長の目的ペプチド(Orn(Acbz):ペプチド配列P−H3)に由来するピークを確認することができた(図76 ピークI)。その一方で、側鎖脱保護されたP−H3Aに由来するピークは観測されなかったことから、上述したように側鎖Acbz基の脱保護反応はMALDI測定あるいは分析前処理過程で起こっていることが明らかとなった(図77)。同様に、Orn(oAcbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3C)、Lys (Npys)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3D)を含む翻訳溶液に関しても、LC-MSによる分析を行った結果、目的どおりOrn(oAcbz):ペプチド配列P−H4、Lys (Npys):ペプチド配列P−H5)に相当するピークが観測された(図78ピークI及び図79ピークI)。
fMetArg[Orn(Acbz)] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
保持時間:4.99分(分析条件 OrbitrapHFIP−Et3N−3)
fMetArgOrn ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
m/z: [H+M]+ = 1598.5 (Calc. 1598.7)
fMetArg[Orn(oAcbz)] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
保持時間:5.23分(分析条件 OrbitrapHFIP−Et3N−3)
fMetArg[Lys(Npys)] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
保持時間:4.34分(分析条件 OrbitrapHFIP−Et3N−3)
1μM 鋳型RNA CT32(配列番号RM−H3)、0.25mM Met、0.25mM Arg,0.25mM Asp、0.25mM Tyr、0.25mM Lys、及び前記の方法で調整した50μMのLys(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3E)、Lys(5S-SSMe)( Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT−H3F)、をそれぞれ1種類含む前述の翻訳液、計3反応溶液を37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物1μLに9μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加え、そのうち1μLをMALDIターゲットプレート上に載せた後、1μLのCHCA溶液(10mg/ml α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液)と混和し、プレート上乾固した。MALDI−MS分析の結果、いずれにおいても側鎖Acbz基がMALDI測定中及び前処理中に外れたことに由来するペプチド配列P−H6,P−H7が観測された(それぞれ図75ピークIII、IV)。
fMetArgLysArgAspTyrLysAspAspAspAspLys(配列番号:98)
m/z: [H+M]+ = 1612.4(Calc. 1612.7)
m/z: [H+M]+ = 1690.1 (Calc. 1690.7)
前述した側鎖アミノ基の保護基各々の脱保護条件下においてRNAが安定に存在するかを確認するため、RNAをそれぞれの脱保護条件に伏した後、ゲル電気泳動による解析を行った。
表19に示す反応条件にあるように各反応溶液を調製し、各々の反応温度、反応時間に従ってRNAを保温した。反応条件B−Eに伏した反応溶液それぞれに対しては、その後RNeasy minelute(qiagen社)を用いてRNAを精製し、10μLの水にて溶出した。これらと、反応溶液Aの各々10μLの溶液に対して10μLのTBE−Ureaサンプルバッファー(2x)(Invitrogen社)を加え、そのうち1μLを使って10%TBE−ウレアゲルにて電気泳動を行い、SYBR gold nucleic acid stain (Invitrogen社)により染色を行った(図80)。
その結果、対照実験として電気泳動した反応条件AのRNAと比べ反応条件B-Eに伏したRNAはバンドパターンやバンド濃さに大きな変化は観測されず、(図80、レーン1vsレーン2−5)、RNAがこれらの反応条件にて安定に存在することが示された。なおB−Eの条件とは、それぞれ、B:4−アジドベンジルオキシカルボニル基(Acbz)、C:2−アジドベンジルオキシカルボニル基(oAcbz)、D:チアゾリジン環、E:3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル基(Npys)の脱保護条件を模している。
OT95 RNA配列
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGCACUACAACGCGUCUUCCGUACCGUAGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
実際にディスプレイライブラリー構築で合成される化合物はmRNAの長さが約100のmRNA−ペプチドフュージョンであり、そのような高分子化合物の反応の詳細な解析は困難である。そこで分子内に分子量分析可能な長さのRNA構造を有し、かつ分子内に金属触媒による環化反応が可能なペプチド構造を有するモデル化合物を用いmRNA−ペプチドフュージョンでの環化反応条件特定を実施した。
Pdを用いた翻訳後修飾でディスプレイライブラリーに適用させるためにはRNAに影響を与えることなく、望みの化学修飾反応を進行させる必要がある。その目的を達するため、以下のような実験を行った。(1)tRNAなどが混在した系(PureSystem)中でのHeck反応を実施し、tRNAに影響を与えることなく、Heck反応が進行する反応条件を見出した。(2)ペプチドとRNAのコンジュゲートを作成の上、Heck反応を実施し、ペプチドとRNAが結合していてもRNAに影響を与えることなくHeck反応が進行する反応条件を見出した。
モデル化合物として使用したのは以下の3種類の化合物である。
4-mer RNA-ペプチドコンジュゲート
10-mer RNA-ペプチドコンジュゲート
20-mer RNA-ペプチドコンジュゲート
以下の一般製法‐1に従って、モデル反応実施のための原料合成を行った。
(一般製法−1)RNA−ペプチドコンジュゲートの合成
(2S、4R)−4−ヒドロキシ−2−[2−(2−ヒドロキシ―エトキシ)−エチルカルバモイル]−ピロリジン−1−カルボン酸 9H−フルオレン―9−イルメチルエステル(化合物72)の合成
FMOC-L-ヒドロキシプロリン(化合物71)(2.12g、6.00mmol)、2−(2−アミノエトキシ)エタノール(0.661mg、6.60mmol)をDMSO(4.0mL)に溶解し室温にて4-(4,6-ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(1.98g、6.60mmol)を加え5時間攪拌した。反応液を逆相シリカ(ギ酸0.1%、H2O、CH3CN、グラジエント)で精製し、標題化合物(化合物72)(1.69g、64%)を淡黄色アモルファスとして得た。
LCMS(ESI) 441.2(M+H)+
保持時間:1.57分(分析条件ZQAA05)
(2S、4R)−4−ヒドロキシ−2−[2−(2−ヒドロキシ―エトキシ)−エチルカルバモイル]−ピロリジン−1−カルボン酸 9H−フルオレン―9−イルメチルエステル(化合物72)(1.69g、3.83mmol)、4、4'−ジメトキシトリチルクロライド(2.47g、7.66mmol)をピリジン(5.0mL)に溶解し室温にて3時間攪拌した。反応液を逆相シリカ(酢酸アンモニウム0.1%、H2O、CH3OH、グラジエント)で精製し、標題化合物(化合物73)(2.24g、79%)を淡黄色アモルファスとして得た。
LCMS(ESI) 760.8(M+NH4)+、765.7(M+Na)+
保持時間:1.15分(分析条件SQDAA05)
(2S、4R)−2−(2−{2−[ビス−(4−メトキシ−フェニル)−フェニル−メトキシ]−エトキシ}−エチルカルバモイル)−4−ヒドロキシ−ピロリジン−1−カルボン酸 9H−フルオレン−9−イルメチルエステル(化合物73)(1.00g、1.35mmol)、無水コハク酸(192mg、2.02mmol)、N、N−ジメチルアミノピリジン(246mg、2.02mmol)をアセトニトリル(3.0mL)に溶解し室温にて2.5時間攪拌した。反応液を逆相シリカ(酢酸アンモニウム0.1%、H2O、CH3OH、グラジエント)で精製し、標題化合物(化合物74)(349mg、31%)を無色アモルファスとして得た。
LCMS(ESI) 860.5(M+NH4)+、865.5(M+Na)+
保持時間:1.11分(分析条件SQDAA05)
コハク酸 モノ−[(3R,5S)−5−(2−{2−[ビス−(4―メトキシ−フェニル)−フェニル−メトキシ]−エトキシ}−エチルカルバモイル)−1−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル)−ピロリジン−3−イル]エステル(化合物74)(85.1mg、0.101mmol)、Custom Primer Support 200 Amino(GE Healthcare、1.01g)にアセトニトリル(5.0mL)を加えた。これに酢酸(5.8μL、0.101mmol)のアセトニトリル(0.1mL)溶液を加えたのち、室温にて4-(4,6-ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(60.6mg、0.202mmol)を加え室温にて1.5時間攪拌した。その後、反応液に4-(4,6-ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドn水和物(300mg、1.01mmol)を加え15分攪拌の後、酢酸(58μL、1.01mmol)のアセトニトリル(0.5mL)溶液を加え1時間攪拌した。反応物をろ取し得られた固体(化合物75)を乾燥した。固体取得物に20%ピペリジンDMF溶液(10mL)を加え1時間反応させた。反応物をろ取し、DMF、アセトニトリルで洗浄し、減圧乾燥し固相担持FMOC脱保護ピロリジン誘導体(化合物76)(1.05g)を得た。
Fmoc−3−ヨード−L-フェニルアラニン(622mg、1.21)、HOAt(136mg、0.909)、N,N'−ジイソプロピルカルボジイミド(0.206mL、1.33)をDMF(5.0mL)に溶解し、固相担持FMOC脱保護ピロリジン誘導体化合物76(1.05g)を加えた。室温にて3時間攪拌した。得られた固相担体をろ取、DMF(10mL)で3回洗浄し、続いて20%ピペリジンDMF溶液(10mL)を加え室温にて1時間攪拌した。得られた固相担体をDMF(10mL)、アセトニトリル(10mL)でそれぞれ3回ずつ洗浄し減圧下乾燥し、3−ヨード−L-フェニルアラニンが結合された固相担持ヨードフェニルアラニン誘導体化合物78(1.00g)を得た。
化合物78を得る手法と同様の方法により、固相担持ヨードフェニルアラニン誘導体(化合物78)(1.00g)、Fmoc−L-フェニルアラニン(234mg、0.606)との縮合、それに続くFmocの脱保護によりL-フェニルアラニンが結合された固相担持フェニルアラニン誘導体(化合物80)(1.00g)を得た。
化合物78を得る手法と同様の方法により、L-フェニルアラニンが結合された固相担持フェニルアラニン誘導体(化合物80)(250mg)、4−ペンテン酸(30.6μL、0.300mm)の縮合により4−ペンテン酸が結合された固相担持4−ペンテン酸誘導体(化合物81)(249mg)を得た。
固相担持4−ペンテン酸誘導体(化合物81)(8.0mg、0.8μmol)を用い、DNA合成機によりRNA結合伸長を行った。A、G、C、Uの伸長反応に用いるアミダイド試薬はグレンリサーチ社製A−TOM−CEホスホアミダイド、G−TOM−CEホスホアミダイド、C−TOM−CEホスホアミダイド、U−TOM−CEホスホアミダイドを使用し、縮合活性化剤として5−ベンジルチオ−1H−テトラゾールを使用し実施した。縮合後の固相担体を乾燥後、エタノール(0.10mL)、40%メチルアミン水溶液(0.10mL)を加え65℃にて15分間攪拌した。溶媒を減圧留去しテトラメチルアンモニウムフルオライド水和物(10mg)、DMSO(0.10mL)を加え65℃にて15分間攪拌した。反応液に0.1M酢酸アンモニウム水溶液を加え逆相カラムで精製した。濃縮後、得られた化合物を精製水(0.50mL)に溶かし4-mer RNA-ペプチドコンジュゲート(化合物70a)(5'-AGCU-3'-Peptide)水溶液を得た。紫外分光計により得られた溶液の濃度は0.736mM、収率は46%であった。
LCMS(ESI) 668.0(M−3H)3−、1002.4(M−2H)2−
保持時間:5.15分(分析条件ZQHFIP−Et3N)
化合物70aを得る手法と同等の方法により表記化合物水溶液(化合物70b)を得た。濃度0.33mMの水溶液0.50mLが得られた。収率は21%であった。
LCMS(ESI) 784.8(M−5H)5−、981.2(M−4H)4−、1308.5(M−3H)3−
保持時間:4.87分(分析条件ZQHFIP−Et3N)
化合物70aを得る手法と同等の方法により表記化合物水溶液(化合物70c)を得た。濃度0.147mMの水溶液0.30mLが得られた。収率は15%であった。
LCMS(ESI) 887.9(M−8H)8−、1015.0(M−7H)7−、1184.3(M−6H)6−、1421.0(M−5H)5−、1776.6(M−4H)4−
保持時間:4.60分(分析条件ZQHFIP−Et3N)
2−1−1. 10-mer RNA−ペプチドコンジュゲート(化合物70b)のHeck環化反応(化合物83b)の合成
10-mer RNA−ペプチドコンジュゲート(化合物70b)(0.33mM水溶液 3.7μL、1.2nmol)、内部標準(10mM p−n−プロピル安息香酸DMF溶液 3μL、30nmol)、リン酸バッファー(K2HPO4 1.0mmolとK3PO4 0.10mmolの水10mLの水溶液 10μL)、5%PTS(Polyoxyethanyl―α―tocopheryl sebacate)水溶液(30μL)を混合し、逆相LCにより分析の後、PdCl2(MeCN)2(1.0mg、3.9μmol)、2,2'−ビス(ジフェニルフォスフィノ)−1,1'−ビフェニル(6.2mg、12.0μmol)をN−メチルピロリジノン(0.2mL)に窒素雰囲気下溶解したPd溶液(8.0μL)を加え50℃にて窒素雰囲気下3時間攪拌した。反応液(5.0μL)に1Mジチオスレイトール水溶液(10.0μL)を加えLC分析サンプルとし分析した。反応前のLC分析結果との比較から生成物(化合物83b)の収率は57%であった。
LCMS(ESI) 759.4(M−5H)5−、949.5(M−4H)4−、1265.9(M−3H)3−
保持時間:3.40分(分析条件ZQHFIP−Me2NEt)
20-mer RNA−ペプチドコンジュゲート(化合物70c)(0.15mM水溶液 2.0μL、0.29nmol)、内部標準(10mM p−n−ブチル安息香酸DMF溶液 2μL、20nmol)、100mM トリエチルアミン水溶液(5μL、500mmol)、5%PTS(Polyoxyethanyl―α―tocopheryl sebacate)水溶液(30μL)を混合し、逆相LCにより分析の後、PdCl2(MeCN)2(0.5mg、1.9μmol)、2,2'−ビス(ジフェニルフォスフィノ)−1,1'−ビフェニル(3.1mg、6.0μmol)をN−メチルピロリジノン(0.4mL)に窒素雰囲気下溶解したPd溶液(8.0μL)を加え50℃にて窒素雰囲気下2時間攪拌した。反応液(5.0μL)に0.1Mジチオスレイトール水溶液(10.0μL)を加えLC分析サンプルとし分析した。反応前のLC分析結果との比較から生成物(化合物83c)の収率は61%であった。
LCMS(ESI) 997.0(M−7H)7−、1163.0(M−6H)6−、1395.5(M−5H)5−、1745.0(M−4H)4−
保持時間:4.08分(分析条件ZQHFIP−Et3N)
1.翻訳合成に活用させるためのC-C結合ユニットの合成
1−1.pdCpAアミノアシル化化合物85の合成
1−1−1.ブタ−3−エン酸シアノメチル(化合物86)の合成
ブタ−3−エン酸(0.500g、5.81mmol)をアセトニトリル(20ml)に溶解し、2−ブロモアセトニトリル(3.33g、27.76mmol)およびトリエチルアミン(1.40g、13.86mmol)を室温でゆっくり加えた。室温で30分攪拌した後、反応液を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィ(石油エーテル:酢酸エチル=20:1)で精製し、標題化合物86(0.550g、75%)を得た。
1H−NMR(Bruker, avanceIII, 400 MHz, CDCl3) δ ppm 5.92 (1H, m), 5.22−5.26 (2H, m), 4.75 (2H, s), 3.21 (2H, m)
リン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル テトラブチルアンモニウム塩(化合物1h)(0.20g、0.150mmol)のDMF溶液(1.0ml)にブタ−3−エン酸シアノメチル(化合物86)(0.050g、0.400mmol)を加えて室温で1時間攪拌した。反応液に0.05%TFA水溶液を加え、凍結乾燥して得られた残渣をpreparative−HPLC(0.05%TFA水溶液:アセトニトリル)で精製し、標題化合物85(0.010g、10%)を得た。
LCMS:m/z 705(M+H)+
保持時間:0.461、0.488分 (分析条件 SMDmethod1)
1−2−1.ペンタ−4−エン酸シアノメチル(化合物88)の合成
ブタ−3−エン酸の代わりにペンタ−4−エン酸(0.500g、4.99mmol)を原料とし、化合物86の合成と同様の手法で、標題化合物88(0.52g、75%)を得た。
1H−NMR(Bruker, avanceII, 300 MHz, CDCl3) δ ppm 5.82 (1H, m), 5.04−5.32 (2H, m), 4.74 (2H, s), 2.39−2.57 (4H, m)
ブタ−3−エン酸シアノメチルの代わりにペンタ−4−エン酸シアノメチル(化合物88)(0.066g、0.480mmol)を原料とし、化合物85を得る手法と同様の方法により、標題化合物87(0.010g、12%)を得た。
LCMS:m/z 719(M+H)+
保持時間:0.506、0.523分 (分析条件 SMDmethod1)
1−3−1. 2−(アリルオキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(化合物89)の合成
2−(アリルオキシ)酢酸(0.500g、4.31mmol)をジクロロメタン(20ml)に溶解し、2−ブロモアセトニトリル(2.06g、17.18mmol)およびトリエチルアミン(0.87g、8.61mmol)を室温でゆっくり加えた。室温で3時間攪拌した後、反応液を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィ(石油エーテル:酢酸エチル=20:1)で精製し、2−(アリルオキシ)酢酸シアノメチル(0.40g、60%)を得た。
イミダゾール(1.0g、15.7mmol)およびN,N,N−トリメチルヘキサデカン−1−アミニウム 塩化物(1.0g、3.14mmol)を溶かし、酢酸でpH8に調節した緩衝液(100ml)にリン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h)(100mg、0.157mmol)を加えた後、上記方法で得られた2−(アリルオキシ)酢酸シアノメチル(93mg、0.628mmol)のTHF(3.0ml)溶液を加えて室温で30分攪拌した。反応液に酢酸を加えて凍結乾燥し、得られた残渣をpreparative−HPLC(0.05%TFA水溶液:アセトニトリル)で精製し、標題化合物89(24.7mg、22%)を得た。
LCMS:m/z 735(M+H)+
保持時間:0.473、0.491分 (分析条件 SMDmethod1)
1−4−1.2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(4−ヨードフェニル)プロパン酸 (S)−シアノメチル(化合物91)の合成
ブタ−3−エン酸の代わりに(S)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(4−ヨードフェニル)プロパン酸(1.0g、2.56mmol)を原料とし、化合物86を得る手法と同様の手法で標題化合物91(0.40g、36%)を得た。
保持時間:1.59分 (分析条件 SMDmethod4)
1H−NMR(Bruker, avanceII, 300 MHz, CDCl3) δ ppm 7.67 (2H, d,8.1 Hz), 6.93 (2H, d, 8.1 Hz), 4.62−4.94 (4H, m), 2.98−3.14 (2H, m), 1.44 (9H, s)
2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−(4−ヨードフェニル)プロパン酸 (S)−シアノメチル(化合物91)(0.89g、2.07mmol)をジエチルエーテル(20.0ml)に溶解させた。この溶液に塩酸ガスを吹き込んだ後、室温で2時間攪拌した。反応液中の固体をろ過し、減圧乾燥させることで2−アミノ−3−(4−ヨードフェニル)プロパン酸 (S)−シアノメチル(0.65g、86%)を得た。
窒素雰囲気下、2−アミノ−3−(4−ヨードフェニル)プロパン酸 (S)−シアノメチル(0.65g、1.78mmol)をジクロロメタン(25.0ml)に溶解し、氷冷下でトリエチルアミン(0.45g、4.45mmol)を滴下した。その後、氷冷下で塩化ペンタ−4−エノイル(0.25g, 2.14mmol)のジクロロメタン溶液(25.0ml)を滴下し、室温で2時間半攪拌した。反応液を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィ(石油エーテル:酢酸エチル=50:50〜33:67)で精製し、3−(4−ヨードフェニル)−2−(ペンタ−4−エンアミド)プロパン酸 (S)−シアノメチル(化合物92)(0.57g、78%)を得た。
LCMS:m/z 413.2(M+H)+
保持時間:1.51分 (分析条件 SMDmethod5)
イミダゾール(680.8mg、10.00mmol)およびN,N,N−トリメチルヘキサデカン−1−アミニウム 塩化物(640.0mg、2.00mmol)を溶かし、酢酸でpH8に調節した緩衝液(100ml)にリン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h)(96mg、0.150mmol)を加えた後、3−(4−ヨードフェニル)−2−(ペンタ−4−エンアミド)プロパン酸 (S)−シアノメチル(化合物92)(249mg、0.60mmol)のTHF溶液(1.0ml)を加えて室温で2時間攪拌した。反応液にTFA(1.0ml)を加えて凍結乾燥した後、得られた残渣をpreparative−HPLC(0.05%TFA水溶液:アセトニトリル=80:20〜60:40)で精製し、標題化合物90(35mg、23%)を得た。
LCMS:m/z 990(M−H)−
保持時間:1.45分 (分析条件 ZQFA05)
1−5−1. 3−(3−ヨードフェニル)−2−(ペンタ−4−エンアミド)プロパン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イル(化合物93、pdCpA−Phe(3−I))の合成
窒素雰囲気下、2−クロロトリチルクロライドレジン(100−200mesh、1%DVB、渡辺化学から購入、2.78g)をジクロロメタン(30ml)に浸し、室温で20分攪拌して膨潤させた。ジクロロメタンを除いた後、(S)−2−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)−3−(3−ヨードフェニル)プロパン酸(Fmoc−Phe(3−I)−OH、1.50g、2.92mmol)およびDIPEA(1.50g、11.7mmol)のジクロロメタン溶液(30ml)を加えて室温で5時間攪した。その後、メタノール(3ml)を加えて室温でさらに1時間攪拌した。反応液を除去して得られたレジンをジクロロメタン(30ml×3回)およびDMF(30ml×2回)で洗浄し、化合物93aを得た。
Fmoc基の脱保護のために、化合物93aに20%ピペリジンのDMF溶液(20ml)を加えて室温で2時間攪拌した後、反応液を除去した。このレジンをDMF(30ml×4回)で洗浄し、化合物93bを得た。
化合物93bにペンタ−4−エン酸(0.39g、3.90mmol)、DIC(0.550g、4.29mmol)、HOAt(0.870g、4.29mmol)のDMF溶液(20ml)を加えて室温で5時間攪拌した。反応液を除去し、レジンをDMF(30ml×4回)およびジクロロメタン(50ml×4回)で洗浄して化合物93cを得た。
化合物93cに2%TFAのジクロロメタン溶液(20ml)を加えて、室温で1時間攪拌し、レジンをろ過して除いた。同様の操作をさらに3回繰り返し、得られた反応液をまとめて減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ(ジクロロメタン:メタノール=30:1)で精製し、(S)−3−(3−ヨードフェニル)−2−(ペンタ−4−エンアミド)プロパン酸(化合物93d)(0.494g、68%)を得た。
化合物93d(0.494g、1.324mmol)をDMF(10ml)に溶解し、2−ブロモアセトニトリル(0.63g、5.30mmol)およびDIPEA(0.341g、2.65mmol)を室温でゆっくり加えた。室温で30分攪拌した後、反応液を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィ(石油エーテル:酢酸エチル=5:1)で精製し、(S)−3−(3−ヨード−フェニル)−2−ペンタ−4−エノイルアミノ−プロピオン酸 シアノメチル エステル(化合物93e)(0.392g、72%)を得た。
イミダゾール(476.6mg、7.0mmol)およびN,N,N−トリメチルヘキサデカン−1−アミニウム 塩化物(448.0mg、1.4mmol)を溶かし、酢酸でpH8に調節した緩衝液(70ml)にリン酸二水素 ((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3−(((((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−2−イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)テトラヒドロフラン−2−イル)メチル(化合物1h、pdCpA)(70mg、0.11mmol)を加えた後、(S)−3−(3−ヨード−フェニル)−2−ペンタ−4−エノイルアミノ−プロピオン酸 シアノメチル エステル(化合物93e)(181.3mg、0.44mmol)のTHF溶液(3.0ml)を加えて室温で2時間攪拌した。反応液にTFA(1.0ml)を加えて凍結乾燥した後、得られた残渣をpreparative−HPLC(0.05%TFA水溶液:アセトニトリル=80:20〜60:40)で精製し、標題化合物93(17.9mg、16%)を得た。
LCMS:m/z 992(M+H)+
保持時間:0.75分 (分析条件 SQDAA05)
1−6−1.3−(2−ヨードフェニル)−2−(ペンタ−4−エンアミド)プロパン酸 (2S)−(2R,3S,4R,5R)−2−((((((2R,3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−2−((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−4−ヒドロキシテトラヒドロフラン−3−イルの合成
(S)−2−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)−3−(3−ヨードフェニル)プロパン酸の代わりに(2S)−2−[[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ]−3−(2−ヨードフェニル)プロパン酸(1.50g、2.92mmol)を原料とし、化合物93を得る手法と同様の手法で標題化合物94(14.2mg、13%)を得た。
LCMS:m/z 992(M+H)+
保持時間:0.71、0.73分 (分析条件 SQDAA05)
pdCpA−PenteA(化合物87)とtRNA(CA欠損)(配列番号:R−5)のligationによるアシル化tRNA(化合物AT−2−IIIA)の合成
50μM 転写tRNAfMetCAU(-CA)(配列番号R−5) 10μLに、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2, 10 mM ATP)2μL、Nuclease free water 4μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)2μLおよび、5mMのpdCpA−PenteA(化合物87)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。アシル化tRNA(化合物AT−2−IIIA)は、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アシル化tRNA(化合物AT−2−IIIA)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
50μM 転写tRNAEnAsnGAG (-CA)(配列番号R−1) 10μLに、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2, 10 mM ATP) 2μL、Nuclease free water 4μLを加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。 20unit/μLのT4 RNAリガーゼ(New England Bio Lab.社)2μLおよび、5mMのpdCpA−Phe(3−I)(化合物93)のDMSO溶液 2μLを加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液 20μLに、3M酢酸ナトリウム 4μLと125mM ヨウ素(水:THF=1:1溶液)24μLを加え、室温で1時間、脱保護を行った。アミノアシル化tRNAは、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AT−1−IIIA)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
GGGUUAACUUUAAgaaggagauauacauAUGUUUCUUCCGagcggcucuggcucuggcucuUAGGGCGGCGGGGACAAA
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[PenteA]Phe[Phe(3-I)]ProSerGlySerGlySerGlySer
[PenteA] ThrThrThrSerGlySerGlySerPhe[Phe(3-I)]ProGlySer
[PenteA]AsnAsnAsnAsnAsnThrThrThrGly[Phe(3-I)]ProGlySer
Met、Leuを除く各0.3mMの18種類のタンパク質性アミノ酸、20μM Phe(3-I)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT―1−IIIA)、20μM PenteA-tRNAfMetCAU(化合物AT−2−IIIA)を加えた翻訳液に、1μM 鋳型mRNA Hc1、Hc2、もしくはHc3(配列番号R−41'、R−42、R−43)を添加し、37℃で60分間保温した。続いて、以下に示す方法でHeck型の環化反応を行った。
リン酸バッファー(K2HPO4 1.0mmolとK3PO4 0.2mmolの水10mLの水溶液 80μL)、5%PTS(Polyoxyethanyl―α―tocopheryl sebacate)水溶液(200μL)を混合し配列番号R−41'により得られた翻訳生成物(Hc1, 20μL)を加え窒素置換した。得られた混合物にPdCl2(MeCN)2(1.0mg、3.9μmol)、2,2'−ジフェニルフォスフィノ−1,1'−ビフェニル(6.2mg、12μmol)をN−メチルピロリジノン(0.2mL)に窒素雰囲気下溶解したPd溶液(60.0μL)を加え50℃にて窒素雰囲気下12時間攪拌した。反応液に0.2Mチオシアヌル酸 1.5カリウム塩水溶液(73.5μL)を加えた。
得られた反応溶液に水を加え2mLとし、遠心を行った(10000rpm、6分間、室温)。上清について凍結乾燥を行い、得られた残渣を水:アセトニトリル=9:1溶液 100μLに再溶解させLC/MS分析を行い、環化体の生成をを確認した。
LC―HRMS:m/z 1007.4149(M−H)−,(Calcd for C46H59N10O16:1007.4116)
保持時間:6.43分 (分析条件 OrbitrapHFIP−Et3N)
Hc1の場合と同様の方法により環化反応を実施した。得られた生成物をHc1の場合と同様の方法によりLC/MS分析を行い、環化体を示す二種類の化合物の生成を確認した。
LC―HRMS:m/z 1310.5579(M−H)−,(Calcd for C58H80N13O22:1310.5546)
保持時間:4.91分
LC―HRMS:m/z 1310.5570(M−H)−,(Calcd for C58H80N13O22:1310.5546)
保持時間:5.17分
(分析条件 OrbitrapHFIP−Et3N)
Hc1の場合と同様の方法により環化反応を実施した。得られた生成物をHc1の場合と同様の方法によりLC/MS分析を行い、環化体の生成を確認した。
LC―HRMS:m/z 1415.5860(M−H)−, Calcd for C58H83N18O24:1415.5833)
保持時間:3.35分 (分析条件 OrbitrapHFIP−Et3N)
mRNA−ペプチドフュージョンをHeck環化反応条件に付し回収したmRNA−ペプチドフュージョンを逆転写し逆転写が問題なく進行することを確認しmRNAがHeck環化反応条件において安定であることを確認した。
PCRにより調製したDNA(配列番号 D-50)を鋳型に、In vitro転写によりmRNAを調整し、RNeasy mini kit (Qiagen社)を用いて精製した。1μMのmRNAに、1.5 μMのピューロマイシンリンカー(Sigma社)(配列番号C-1) 1X T4 RNAライゲースリアクションバッファー(NEB社)、20% DMSO、2 unit/μl T4 RNAライゲース(NEB社)を加え、37℃で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy MiniElutekit(Qiagen社)により精製した。次に、1 μMのmRNA-ピューロマイシンリンカー連結体(以下、mRNA-Pu)を鋳型に、前述の無細胞翻訳液からRF1を除いたものを加え、37℃で30分間翻訳し、mRNA-ペプチドフュージョン分子(化合物Fusion-1)を得た。
KA03S2 DNA配列:
gtaatacgactcactataGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgACTAGAACTaaggcgTACTGGAGCcttCCGggcggcAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUaUgACUAGAACUaaggcgUACUGGAGCcUUCCGggcggcAGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
S2PuFLin配列:
[P]CCCGTCCCCGCCGCCC[Fluorecein-dT][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin] ([P]:5'リン酸化)
得られたmRNA-ペプチドフュージョン分子(化合物Fusion-1, 11.0μL)に10-mer RNA−ペプチドコンジュゲート(化合物70b)(0.33mM水溶液 5.0μL、1.65nmol)、リン酸バッファー(K2HPO4 1.0mmolとK3PO4 0.20mmolの水10mLの水溶液 40μL)、5%PTS(Polyoxyethanyl―α―tocopheryl sebacate)水溶液(100μL)を混合し、PdCl2(MeCN)2(1.0mg、3.9μmol)、2,2'−ジフェニルフォスフィノ−1,1'−ビフェニル(6.2mg、12μmol)をN−メチルピロリジノン(0.2mL)に窒素雰囲気下溶解したPd溶液(30.0μL)を加え50℃にて窒素雰囲気下12時間攪拌した。得られた反応液に0.2Mチオシアヌル酸 1.5カリウム塩水溶液(37.0μL)を加え室温にて30分間放置し、環化反応液を得た。反応液(5.0μL)を水(10.0μL)で希釈しLC分析サンプルとし分析し10-mer RNA−ペプチドコンジュゲート(化合物70b)の消失および10-mer RNA−ペプチドコンジュゲートの環化体(化合物83b)の生成を確認した。
LCMS(ESI) 1265.9(M−3H)3−
保持時間:3.48分(分析条件ZQHFIP−Me2NEt)
環化反応後のmRNA-ペプチドフュージョン分子をRNeasy MiniElute Kit(Qiagen社)で精製した。0.5 μM mRNA-ペプチドフュージョン分子を鋳型に、逆転写反応液(1X M-MLV逆転写反応バッファー(Promega社), 各0.5 mMのdNTP mix, 4 unit/μl M-MLV逆転写酵素RNaseHマイナス点変異, 3 μM 逆転写プライマー(配列番号C-2))を添加し、42°Cで20分間逆転写反応を行った。反応産物を、TGX gel anykD(Biorad社)を用いて電気泳動を行い、ピューロマイシンリンカーに付加されたフルオレセインの蛍光を検出した。その結果、環化反応の有無にかかわらず、効率良く逆転写反応が進行していることが確認された。結果を図43に示す。
逆転写プライマー
TTTGTCCCCGCCGCCCTAAGAGCCAGAGCCAGAGCCGCT
RNA-複合体のHeck反応
mRNA−ペプチド複合体溶液調製
6μMのmRNA(Hc1 mRNA配列(配列番号R−41))に、9 μMのピューロマイシンリンカー(Sigma社)(配列番号C-1) 1X T4 RNAライゲースリアクションションバッファー(New England Biolab社、カタログ番号M0204L)、10% DMSO、0.63 unit/μl T4 RNAライゲース(New England Biolab社、カタログ番号M0204L)を加え、37℃で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy MiniElute kit(Qiagen社)によりmRNA-ピューロマイシンリンカー連結体(以下、mRNA-Pu)を精製した。精製した1 μMのmRNA-Puを鋳型に、無細胞翻訳液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,9mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF−G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF−Tu,84μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的はHisタグ付加タンパクとして調製した),各300μMのメチオニンとロイシンを除く18種類のタンパク質性アミノ酸),20μMの化合物AT−1−IIIA、20μM 4−PenteA-tRNAfMetCAU(化合物AT−2−IIIA)を加え、37℃で30分間翻訳し、18mM EDTA pH8.0を加え、mRNA-ペプチド複合体を得た。
得られたmRNA-ペプチド複合体(20.0μL)に、リン酸バッファー(K2HPO4 1.0mmolとK3PO4 0.40mmolの水10mLの水溶液 120μL)、15%PTS(Polyoxyethanyl―α―tocopheryl sebacate)水溶液(200μL)を混合し、PdCl2(MeCN)2(4.0mg、15.4μmol)、2,2'−ジフェニルフォスフィノ−1,1'−ビフェニル(24.8mg、47.5μmol)をN−メチルピロリジノン(0.8mL)に窒素雰囲気下溶解したPd溶液(60.0μL)を加え50℃にて窒素雰囲気下24時間攪拌した。得られた反応液に0.2Mチオシアヌル酸 1.5カリウム塩水溶液(73.5μL)を加え室温にて30分間放置し、環化反応液を得た。
上記の環化反応液を卓上遠心機で遠心分離し、上澄みをRNeasy miniElute Cleanup kit(Qiagen社、Catalog No.74204)で精製し、RNaseフリー水で溶出した。溶出液を、1×Reaction buffer (Promega社、Catalog No.M217A、10mM TrisHCl pH7.5, 5mM EDTA, 0.2M AcONa)、0.5unit/μl RNaseONE ribonuclease(Promega社、Catalog No.M425A)、0.1Unit/μl RNaseH(LifeTechnologies社Catalog No.18021-014)を用いて37℃で3時間反応させ、以下の化合物(化合物Fusion-2)を得た。
RNase処理済みサンプル(10μL)に400mM HFIP、15mM トリエチルアミン水溶液を90μL加えた後、Oasis HLB μElution(Waters社)を用いて固相抽出を行った。50%アセトニトリル溶出画分について凍結乾燥を行い、水に再溶解したサンプルについてLC/MS分析を行い、ペプチドフュージョン環化生成物の生成を確認した。(図81)
LC―HRMS:m/z 666.2124(M−14H)14−,621.7293(M−15H)15−,582.8100(M−16H)16−(Calcd for C333H466N80O188P24:Molecular Weight 9341)
保持時間:29.74分 (分析条件 OrbitrapHFIP−Et3N−2)
pdCpA-アミノ酸群の合成、続いてtRNA−アミノ酸複合体の合成により、導入される非天然型アミノ酸のうち、ARSによらずに導入されるものの準備を行った。続いて、多様性が高いランダムDNAの準備を行った。転写、翻訳、化学修飾によるRNAと環化ペプチドとの複合体作製に続き、パニングを実施してTNFα、TNFR1、IL-6Rに対する結合ペプチドを取得するための実験を行った
pdCpAとの複合体として、以下の非天然型アミノ酸(MeGly、Phg、Phe(4−CF3)、Met(O2)、βAla、MeAla(4−Thz)、MePhe(3−Cl)、nPrGly、MeSer、Hyp(Et))を翻訳導入するための合成を行った。すなわち、以下のスキームに従い、化合物SP705(Pen−MeGly−pdCpA)、化合物SP710(Pen−Phg−pdCpA)、化合物SP715(Pen−Phe(4−CF3)−pdCpA)、化合物SP720(Pen−Met(O2)−pdCpA)、化合物SP725(Pen−βAla−pdCpA)、化合物SP731(Pen−MeAla(4−Thz)−pdCpA)、化合物SP737(Pen−MePhe(3−Cl)−pdCpA)、化合物SP742(Pen−nPrGly−pdCpA)、化合物SP754(Pen−Hyp(Et)−pdCpA)を合成した。化合物6i−C(tBuSSEtGABA)、化合物1i−IAの合成は既に記載済である。
LCMS(ESI) m/z = 251 (M+Na)+
保持時間:1.82分(分析条件SMDmethod6)
なお、本明細書では、4−ペンテノイル基をPen基と略称し、シアノメチル基をCH2CNと記載する。
LCMS(ESI) m/z = 211 (M+H)+
保持時間:1.50分(分析条件SMDmethod6)
LCMS(ESI) m/z = 790.5 (M+H)+
保持時間:0.46分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 273 (M+H)+
保持時間:1.88分(分析条件SMDmethod7)
LCMS(ESI) m/z = 852.5 (M+H)+
保持時間:0.42分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 355 (M+H)+
保持時間:1.47分(分析条件SMDmethod7)
LCMS(ESI) m/z = 934.6 (M+H)+
保持時間:0.73分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 303 (M+H)+
保持時間:1.28分(分析条件SMDmethod7)
LCMS(ESI) m/z = 882.3 (M+H)+
保持時間:0.40分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 211 (M+H)+
保持時間:1.37分(分析条件SMDmethod8)
LCMS(ESI) m/z = 790.6 (M+H)+
保持時間:0.41分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 287 (M+H)+
保持時間:1.24分(分析条件SMDmethod7)
LCMS(ESI) m/z = 308 (M+H)+
保持時間:1.28分(分析条件SMDmethod7)
LCMS(ESI) m/z = 887.4 (M+H)+
保持時間:0.40分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 335 (M+H)+
保持時間:1.67分(分析条件SMDmethod4)
LCMS(ESI) m/z = 914.6 (M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQDAA05)
1H−NMR(Bruker AVANCE II、300MHz、CDCl3) δ ppm 6.19−6.32 (1H、m)、5.38−5.49 (2H、m)、5.17−5.22 (2H、m)、4.49−4.55 (2H、m)、3.70−3.78 (2H、m)、2.78−2.90 (4H、m)、1.84−2.07 (2H、m)、1.34 (3H、t、J = 8.1 Hz)
LCMS(ESI) m/z = 818.4 (M+H)+
保持時間:0.57分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 281 (M+H)+
保持時間:1.45分(分析条件SMDmethod4)
LCMS(ESI) m/z = 860.4 (M+H)+
保持時間:0.55分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 258 (M+H)+
保持時間:0.71分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 297.6 (M+H)+
保持時間:0.77分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 876.7 (M+H)+
保持時間:0.47分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 820.5 (M+H)+
保持時間:0.31分(分析条件SQDFA05)
パニングに使用する転写tRNAおよび転写tRNA(CA欠損)を以下の通り調製した。
tRNAGluCUG (-CA) CAG DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTctgACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluACG (-CA) CGU DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTacgACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluUUC (-CA) GAA DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTttcACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluCCU (-CA) AGG DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcctACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluCAA (-CA) UUG DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcaaACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluUAG (-CA) CUA DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTtagACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluCUA (-CA) UAG DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTctaACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluCCG (-CA) CGG DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTccgACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluAAG (-CA) CUU DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaagACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluGCA (-CA) UGC DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTgcaACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluCAU (-CA) AUG DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcatACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAAsn-E2GUU (-CA) AAC DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTgttAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
tRNAAla1B DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTAGCACGCAGGAGGTCTGCGGTTCGATCCCGCATAGCTCCACCA
tRNATyr1 DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGTGGGGTTCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACTGTAAATCTGCCGTCATCGACTTCGAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCACCA
tRNAGluCUG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcugACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluACG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUacgACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluUUC (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUuucACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluCCU (-CA) RNA配列:(配列番号:116)
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUccuACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluCAA (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcaaACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluUAG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUuagACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluCUA (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcuaACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluCCG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUccgACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluAAG (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaagACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluGCA (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUgcaACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluCAU (-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcauACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAAsn-E2GUU (-CA) RNA配列:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUguuAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNAAla1B RNA配列:
GGGGCUAUAGCUCAGCUGGGAGAGCGCCUGCUUAGCACGCAGGAGGUCUGCGGUUCGAUCCCGCAUAGCUCCACCA
tRNATyr1 RNA配列:
GGUGGGGUUCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACUGUAAAUCUGCCGUCAUCGACUUCGAAGGUUCGAAUCCUUCCCCCACCACCA
まず、個別にアミノアシル化tRNA(化合物ATL-1〜13)を調製した。ライゲーションは、ligation buffer (50mM HEPES-KOH pH7.5, 20mM MgCl2, 1mM ATP)、25μM転写tRNA (-CA)(配列番号MTL−1〜12、R−5)、0.6U/μl T4 RNAリガーゼ(New england bio lab.社)、0.5mM アミノアシル化pdCpAの条件で行った。25μM転写tRNA (-CA) と0.5 mM アミノアシル化pdCpAの組み合わせは、以下の表20〜22の通りに行った。
ライゲーションを行う前に、ligation buffer、転写tRNA (-CA)(配列番号MTL−1〜12、R−5)およびNuclease free waterを混合したものを、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、予めtRNAのリフォールディングを行った。その後、T4 RNAリガーゼ、アミノアシル化pdCpAのDMSO溶液を上述の通り加え、15℃で45分間ライゲーション反応を行った。
ライゲーション反応液に、0.3M 酢酸ナトリウムと、62.5mMヨウ素(水:THF=1:1溶液)を加え、室温で1時間(ただし、化合物SP749を用いる際は室温で5分間)、ペンテノイル基の脱保護を行い、化合物ATL-1〜12を得た。ペンテノイル基を持たない化合物6i−Cを用いる際は、脱保護は行わず、ライゲーション反応まで行い、化合物ATL-13を得た。
次に、翻訳液S用アミノアシル化tRNA 混合物(Initiation suppression翻訳に使用)、翻訳液S用Initiatorアミノアシル化tRNA(Initiation suppression翻訳に使用)、および翻訳液T用アミノアシル化tRNA混合物(Read through翻訳に使用)を調製した。得られた化合物 ATL-1〜13を、表20〜22に示す混合比で混合し、翻訳液S用アミノアシル化tRNA混合物、翻訳液S用Initiatorアミノアシル化tRNA、翻訳液T用アミノアシル化tRNA混合物として、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により回収した。調製したアミノアシル化tRNAは、翻訳液に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。以降、翻訳で使用する際には、表20〜22に示す最終濃度となるよう翻訳液を調製した。
LCMS(ESI) m/z = 341.3 (M+H)+
保持時間:0.52分(分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 850.4 (M+H)+
保持時間:0.62分(分析条件 SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1581.8 (M+H)+
保持時間:1.11分(分析条件 SQDAA05)
保持時間:1.17分(分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 435.9 (M+H)+
保持時間:1.205分(分析条件 SMDMethod9)
LCMS(ESI) m/z = 454.2 (M+H)+
保持時間:1.177分(分析条件 SMDMethod4)
LCMS(ESI) m/z = 430.2 (M+H)+
保持時間:3.193分(分析条件 SMDMethod10)
LCMS(ESI) m/z = 1668.8 (M+H)+
保持時間:1.15分(分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1662.4 (M+H)+
保持時間:1.18分(分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1775.9 (M+H)+
保持時間:1.20分(分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1781.9 (M+H)+
保持時間:1.17分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1573.8 (M+H)+
保持時間:1.15分(分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1686.4 (M+H)+
保持時間:1.16分(分析条件 SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 1852.5 (M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件 SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 1876.5 (M+H)+
保持時間:0.84分(分析条件 SQDAA50)
上記載の方法もしくは購入して得たコドンユニットを用いて、以下のような手法でランダム化された多様性の高いDNAを合成した。
化合物SP791
5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG (PPP)7 CGT (XXX) (PPP) AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(配列番号:140)
DNA/RNA合成機(NTS H-6、日本テクノサービス株式会社製)を用いて、ホスホロアミダイト法によりランダムDNA合成を行った。脱水アセトニトリルおよびデブロッキング溶液-1(3w/v% トリクロロ酢酸 ジクロロメタン溶液)は和光純薬から購入し、ホスホロアミダイト試薬(dA, dC, dG, dT-CE phosphoramidite)、Cap Mix A(THF/Pyridine/Acetic anhydride)、Cap Mix B(16% 1-Me-Imidazole/THF)、Oxidizing Solution(0.02M I2 in THF/Pyridine/H2O)、Activator(5-Benzylthio-1H-tetrazole in MeCN)、トリマーホスホロアミダイト試薬(GTT、CCG、ACT、ATG、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、TGC、GAA Trimer Phosphoramidite)についてはGlen Research社から購入した。また、トリマーホスホロアミダイト試薬(TTT(化合物SP779)、ATT(化合物SP780)、AGT(化合物SP768)、CGG(化合物SP781)、AGG(化合物SP782)、TTG(化合物SP775)、CTT(化合物SP776)、CTA(化合物SP777)、TAG(化合物SP778) Trimer Phosphoramidite)については、上記載のとおり合成したものを用いた。
なお、操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
伸長反応終了後、固相担体をスクリューキャップ付きガラスチューブに移し、30%アンモニア水溶液(0.4ml)を加え、60℃にて6時間攪拌することによりCPGからDNAの切り出しと脱保護を行い、反応混合液を分取HPLCにて精製した(分析条件LC05)。HPLCフラクションを凍結乾燥して得られた残渣を水(0.8ml)に溶かし、これに酢酸(3ml)を加え、室温にて10分間攪拌することにより、5'末端水酸基のDMT基を脱保護した。反応液を水(10ml)で希釈し、酢酸エチル(10ml)で5回抽出操作を行った後、得られた水層を凍結乾燥することにより、目的とするランダム化DNA(化合物SP791)(6.7%)を得た。なお収率については260nmにおける吸光度から算出した。
保持時間:8.55分(分析条件LC04)
5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG (PPP)8 CGT (XXX) (PPP) AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(配列番号:141)
保持時間:8.71分(分析条件LC04)
5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG (PPP)9 CGT (XXX) (PPP) AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(配列番号:142)
保持時間:8.67分(分析条件LC04)
5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG TGC (QQQ)7 CGT (QQQ)2 AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(配列番号:143)
保持時間:8.56分(分析条件LC04)
5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG TGC (QQQ)8 CGT (QQQ)2 AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(配列番号:144)
保持時間:8.54分(分析条件LC04)
5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG TGC (QQQ)9 CGT (QQQ)2 AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(配列番号:145)
保持時間:8.80分(分析条件LC04)
合成オリゴDNA(化合物SP791、SP792、SP793、SP794、SP795、SP796)と合成オリゴDNA(配列番号 DOL−1)を用いて、ExTaq (Takara社)により伸長反応を行った。95℃で二分間変性した後、50℃で一分、72℃で一分のサイクルを5ないし10回繰り返した。続いて、この伸長反応産物を鋳型に合成オリゴDNA(配列番号DOL−1)と合成オリゴDNA(配列番号DOL−2)を用いて、ExTaq (Takara社)によりPCRを行った。95℃で二分間変性した後、95℃で一分、50℃で一分、72℃で一分のサイクルを5から10回繰り返し、DNAライブラリー(配列番号DML−1〜DML−6)を構築した。
配列中に(PPP)と示した箇所は、TTT、ATT、GTT、AGT、CCG、ACT、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、CGG、AGG、TTG、CTT、CTA、TAG、TGC、GAA がランダムに出現することを、(XXX)と示した箇所には、TTT、CCG、GCT、CAT、AAC、CGG、AGG、TTG、TAG、GAAがランダムに出現することを、(QQQ)と示した箇所には、TTT、ATT、ATG、GTT、AGT、CCG、ACT、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、CGG、AGG、TTG、CTT、CTA、TAG、GAAがランダムに出現することを意味する。
TTTGTCCCCGCCGCCCTAAGAGCCAGAGCCAGAGCCGCT
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(PPP)7 CGT(XXX)(PPP)AGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(PPP)8CGT(XXX)(PPP)AGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(PPP)9CGT(XXX)(PPP)AGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGC(QQQ)7CGT(QQQ)2AGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGC(QQQ)8CGT(QQQ)2AGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGC(QQQ)9CGT(QQQ)2AGCGGCTCTGGCTCTGGCTCTTAGGGCGGCGGGGACAAA
PCRにより調製したDNAライブラリー(配列番号 DML−1〜DML−3(Initiation suppression翻訳用)、DML−4〜DML−6(Read throuth翻訳用)) を鋳型に、in vitro転写により以下のmRNA(配列番号MML−1〜MML−3(Initiation suppression翻訳用)、配列番号MML−4〜MML−6(Read throuth翻訳用))を調製し、RNeasy mini kit (Qiagen社)を用いて精製した。10μMのmRNAに、15μMのピューロマイシンリンカー (Sigma社)(配列番号C−1)、 1X T4 RNAライゲースリアクションバッファー(New england bio lab.社)、1mM ATP、10% DMSO、0.625unit/μl T4 RNAライゲース(New england bio lab.社)を加え、37℃で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。配列番号MML−1とMML−4は30μlスケール、配列番号MML−2とMML−5は60μlスケール、配列番号MML−3とMML−6は240μlスケールで、ライゲーションを行い、精製した。ピューロマイシンリンカー(配列番号C−1)と連結したMML−1,MML−2,MML−3をそれぞれモル比1:21:441となるように、ピューロマイシンリンカー(配列番号C−1)と連結したMML−4,MML−5,MML−6をそれぞれモル比1:21:441となるように混合し、前者をinitiation suppression翻訳用mRNA−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物と、後者をRead throuth 翻訳用mRNA−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物とした。
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUG(RRR)7CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUG(RRR)8CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUG(RRR)9CGU(YYY)(RRR)AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(SSS)7CGU(SSS)2 AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(SSS)8CGU(SSS)2 AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(SSS)9CGU(SSS)2 AGCGGCUCUGGCUCUGGCUCUUAGGGCGGCGGGGACAAA
パニングに使用する標的タンパク質として、インターロイキン6受容体(IL−6R)、Tumor Necrosis Factor-α(TNFα)、Tumor Necrosis Factor Receptor1(TNFR1)を用いた。IL−6Rのビオチン化は非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41、および非特許文献Protein Science,1999,8,921-929の方法を用いた。IL−6Rの調製は非特許文献J Biochem. 1990;108(4):673-6.に従って行った。TNFαはProspec社のRcombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha(Catalog Number #CYT-223)を、TNFR1はSinoBiological社のRecombinant Human TNFR1/Fc Chimera(Catalog Number 10872-H03H)を購入した。それぞれThermo scientific社のEZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Catalog Number 21329)を用いてビオチン化を行った。
パニングに使用した翻訳液Sは以下の組成で構成される。1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,10mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.26μM EF−G,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF−Tu,84μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,2.73μM AlaRS,0.09μM GlyRS,0.4μM IleRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.22μM TyrRS,0.02μM ValRS、3μM 転写tRNA Ala1B(配列番号MTL−13)、3μM 転写tRNA Tyr1(配列番号MTL−14)、250μMグリシン、250μMイソロイシン、250μMプロリン、250μMスレオニン、250μMトリプトファン、250μMバリン、100μMセリン、5mM N−メチルアラニン、5mM N−メチルフェニルアラニン、2mM D−チロシン。さらに翻訳液S用アミノアシル化tRNA混合物および翻訳液S用Initiatorアミノアシル化tRNAを加えて調製した。また翻訳液Tは上記の翻訳液S用アミノアシル化tRNA混合物および翻訳液S用Initiatorアミノアシル化tRNAを含まない翻訳液Sに0.02μM CysRS、250μMシステイン、および翻訳液T用アミノアシル化tRNA混合物を加えて調製した。
1μM initiation suppression翻訳用もしくはRead throuth 翻訳用mRNA−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物混合物を含む前述のS用、T用それぞれ2ml翻訳液を調製し、37℃で120分間保温後、室温で12分間放置した。この翻訳混合物に対して、200μlの200mM EDTA溶液(pH8.0、Nacalai社、14362-24)および100μlの200mM TCEP溶液(pH7.0)を加え、37℃で120分間保温し、環化反応を行った。その後、翻訳混合物に対して、260μlの250mM Cys溶液および4000μlの400mM TCEP溶液(pH7.0)を加え、40℃で5分間保温した。続けて、1600μlの1M VA−044(Wako社、CAS No.27776-21-2)を加えて、40℃で1時間脱硫反応後、RNeasy mini kit(Qiagen社)により精製し、1mlのペプチド−mRNA複合体溶液を調製した。この溶液に、3μM プライマー(配列番号DOL−3)、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer(Promega社、M368B)、0.5mM dGTP,0.5mM dATP,0.5mM dCTP,0.5mM dTTP、8U/μl M-MLV Reverse transcriptase (H-) (Promega社、M368B)を加えNuclease free waterで2mlにメスアップし、42℃、1時間保温し、逆転写反応を行った。逆転写溶液に対してブロッキング剤SuperBlock T20(Pierce社、37516)を等量加え、4mlのペプチド−mRNA複合体溶液とした。
TTTGTCCCCGCCGCCCTAAGAGCCAGAGCCAGAGCCGCT
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGA
TTTGTCCCCGCCGCCcta
ラウンド1で増幅したcDNAから、RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (Promega社,P1320)を用いてmRNAを合成し、RNeasy MinElute kit(Qiagen社)により精製した。次にT4 RNA ligase(NEB, M0204L)を利用してmRNAとピューロマイシンリンカーを連結し、RNeasy MinElute kit(Qiagen社)により精製した。1μM mRNA−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物を含む前述の100μl翻訳液を調製し、37℃で60分間保温後、室温で12分間放置した。この翻訳混合物に対して環化反応のために、10μlの200mM EDTA溶液(pH8.0、Nacalai社、14362-24)および5μlの200mM TCEP溶液(pH7.0)を加え、37℃で120分間保温した。翻訳液Sに0.5M KOHを加えて、pH10に調整後、42℃で30分間保温した。その後、0.5M HClを加えて、pH7に調整した。その後、それぞれの翻訳混合物に対して、13μlの250mM Cys溶液および200μlの400mM TCEP溶液(pH7.0)を加え、40℃で1分間保温した。続けて、80μlの1M VA−044(Wako社、CAS No.27776-21-2)を加えて、40℃で1時間脱硫反応後、RNeasy MinElute kit(Qiagen社)により精製し、100μlのペプチド−mRNA複合体溶液を調製した。この溶液に、3μM プライマー(配列番号DOL−3)、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer(Promega社、M368B)、0.5mM dGTP,0.5mM dATP,0.5mM dCTP,0.5mM dTTP、8U/μl M-MLV Reverse transcriptase (H-) (Promega社、M368B)を加えNuclease free waterでメスアップし、200μl溶液で42℃、15分間保温し、逆転写反応を行った。逆転写溶液に対してブロッキング剤SuperBlock T20(Pierce社、37516)を等量加え、400μlのペプチド−mRNA複合体溶液とした。
ラウンド2で増幅したcDNAから、RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (Promega社,P1320)を用いてmRNAを合成し、RNeasy MinElute kit(Qiagen社)により精製した。次にT4 RNA ligase(NEB, M0204L)を利用してmRNAとピューロマイシンリンカーを連結し、RNeasy MinElute kit(Qiagen社)により精製した。1μM mRNA−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物を含む前述の10μl翻訳液を調製し、37℃で60分間保温後、室温で12分間放置した。この翻訳混合物に対して環化反応のために、1μlの200mM EDTA溶液(pH8.0、Nacalai社、14362-24)および0.5μlの200mM TCEP溶液(pH7.0)を加え、37℃で120分間保温した。翻訳液Sに0.5M KOHを加えて、pH10に調整後、42℃で30分間保温した。その後、0.5M HClを加えて、pH7に調整した。その後、それぞれの翻訳混合物に対して、1.3μlの250mM Cys溶液および20μlの400mM TCEP溶液(pH7.0)を加え、40℃で1分間保温した。続けて、8μlの1M VA−044(Wako社、CAS No.27776-21-2)を加えて、40℃で1時間脱硫反応後、RNeasy MinElute kit(Qiagen社)により精製し、10μlのペプチド−mRNA複合体溶液を調製した。この溶液に、3μM プライマー(配列番号DOL−3)、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer(Promega社、M368B)、0.5mM dGTP,0.5mM dATP,0.5mM dCTP,0.5mM dTTP、8U/μl M-MLV Reverse transcriptase (H-)(Promega社、M368B)を加えNuclease free waterで200μlにメスアップし、42℃、15分間保温し、逆転写反応を行った。逆転写溶液に対してブロッキング剤SuperBlock T20(Pierce社、37516)を等量加え、40μlのペプチド−mRNA複合体溶液とした。
ラウンド4−6においても、ラウンド3と同じ操作を繰り返すことで標的タンパク質特異的な結合を示すcDNAの濃縮を行った。濃縮されたDNAプールの塩基配列解析を行い、濃縮されたペプチド配列を同定した。
今回設計されたディスプレイライブラリーのドラックライクネスの程度を評価した。すなわち、選択されたアミノ酸が均等にランダムにディスプレイされた場合のCLogP値、NMeアミノ酸が1つのペプチドに含まれる数の分布を計算によりシミュレーションした。
パニングにて濃縮されたクローンの一部について、各クローンの翻訳産物ペプチドを用いたイムノアッセイを実施した。その際、低濃度のペプチド産物を高感度に検出するため、電気化学発光法(ECL)測定装置(SECTOR Imager 2400)を利用した。その結果、IL-6R、TNFα、TNFR1に対する結合ペプチドが同定された。
得られたCPG担体にdC−CE Phosphoramidite(Glen Research社製、250mg、0.300mmol)のアセトニトリル溶液(3.0ml)とActivator(Glen Research社製、5−Benzylthio−1H−tetrazole in Acetonitrile、3ml)を加えて室温で10分間振とうさせた後、反応液を除去し、CPG担体をアセトニトリルで洗浄(3ml×4)し、乾燥させた。
次いでOxidizing Solution(Glen Research社製、0.02M Iodine in THF/Pyridine/Water、3ml)を加えて室温で振とうさせた後、反応液を除去した。担体をアセトニトリルで洗浄(3ml×4)後、乾燥させて標題のdC−Puromycin CPG(化合物SP802)(450mg)を得た。
少量のdC−Puromycin CPGに25%アンモニア水溶液を加えて60℃で1時間半攪拌して担体から切り出し、反応液をLC/MSで分析することで、反応の進行、およびdC−Puromycin(化合物SP803)の生成を確認した。
LCMS(ESI)m/z =1061.4(M−H)−
保持時間:0.53分 (分析条件 SQDAA50)
得られたCPG担体にFluorescein Phosphoramidite(Glen Research社製、125mg、0.104mmol)のアセトニトリル溶液(1.0ml)とActivator(Glen Research社製、5−Benzylthio−1H−tetrazole in Acetonitrile、1.0ml)を加えて室温で30分間振とうさせた後、反応液を除去し、CPG担体をアセトニトリルで洗浄し、乾燥させた。
次いでOxidizing Solution(Glen Research社製、0.02M Iodine in THF/Pyridine/Water、3ml)を加えて室温で振とうさせた後、反応液を除去した。CPG担体をアセトニトリルで洗浄後、乾燥させて標題のFl−dC−Puromycin CPG(450mg)を得た。
少量のFl−dC−Puromycin CPGに25%アンモニア水溶液を加えて60℃で1時間半攪拌して担体から切り出し、反応液をLC/MSで分析することで、反応の進行、およびFl−dC−Puromycin(化合物SP805)の生成を確認した。
その後、CPG担体をDeblocking Mix(Glen Research社製、3%トリクロロ酢酸/DCM)で処理(3ml×4)した後、ジクロロメタンで洗浄し、乾燥させた。
次いでCPG担体に25%アンモニア水溶液(1.0ml)を加えて60℃で1時間半攪拌した。放冷後、反応液をカラムクロマトグラフィ(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)で精製し、標題化合物(化合物SP806)(2.1mg、33.8%)を黄色固体として得た。
LCMS(ESI)m/z =1341.8(M−H)−
保持時間:0.44分 (分析条件 SQDFA05)
配列解析の結果をもとに、配列番号DME-2からDME−11,DME−13からDME−15に示す鋳型DNAを合成した。これらをECL用転写翻訳液に加えて翻訳によるペプチド合成を行った。ECL用転写翻訳液の組成は下記の通りである。5%(v/v) T7 RNA polymerase RiboMAX Enzyme Mix (Promega社,P1300),2mM GTP,2mM ATP,1mM CTP,1mM UTP,20mM クレアチンリン酸,50mM HEPES−KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,15mM 酢酸マグネシウム,2mM スペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),3μM 転写tRNA Ala1B(配列番号MTL−13)、3μM 転写tRNA Tyr1(配列番号MTL−14)、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.26μM EF−G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,53μM EF−Tu,112μM EF−Ts,1.2μM リボソーム,2.73μM AlaRS,0.09μM GlyRS,0.4μM IleRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.22μM TyrRS,0.02μM ValRS,250μM グリシン、250μM イソロイシン、250μM プロリン、250μM スレオニン、250μM トリプトファン、250μM バリン、100μM セリン、5mM N−メチルアラニン、5mM N−メチルフェニルアラニン、2mM D−チロシン,さらにS用ECL転写翻訳液には、翻訳液S用アミノアシル化tRNA混合物および翻訳液S用Initiatorアミノアシル化tRNAを、T用ECL転写翻訳液には0.02μM CysRS、250μMシステイン、および翻訳液T用アミノアシル化tRNA混合物を加えて調製した。
各サンプルの測定値を表24に示した。
配列番号DME−2(配列番号:164)
(IL-6R binder) DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCCCGATTATTTTTATGCCGAGGTACGTTCGTAGTACTAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
(IL-6R binder) DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCCCGATTATTTGGAGGATGCCGAGGTACCGTGTTTACAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
(TNFR1 binder) DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCTACATTTGGATGAGTATGAGGGTTTTTCGTACTAGGAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
(TNFR1 binder) DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCCCGTTGATTATTGTTAGTCGGCTTCTTCGTGAAACTAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
(TNFR1 binder) DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCCCGTTGGTTATTACTGTTCGGCTTAGTCGTGCTAGGAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
TNFα binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTCTTATTGAATGGTGGCTATACAGGCGTCCGTTGAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
TNFα binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCCTATGGTGGGTTTTGGGTCCGTAGAGTCGTCGGATGAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
TNFα binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCGAAATTCCGGTTTGGTGGCTAATGGTTCGTTGGGAAAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
TNFα binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCACTATTCCGTACTGGTGGCTAATGGTTCGTTGGGAAAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
TNFα binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCACTTGGATTTTTCTTTGGCAGCTACTTCGTGTTACTAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
IL−6R binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCCCGGTTATTTTTATGCCGAGGGTTATGCGTCCGTTGAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
IL−6R binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCATTATTGAATGGCCGAGGATGTACCAGCGTCCGAGGAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
IL−6R binder DNA配列
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATTGTTTGGAGGTGCCCGAGGTACTGCCGTGAAGCTAGCGGCTCTGGCTCTGGCTCT
MePhe(3−Cl):(S)−3−(3−クロロフェニル)−2−(メチルアミノ)プロパン酸
Hyp(Et):(2S,4R)−4−エトキシピロリジン−2−カルボン酸
γEtAbu:4−(エチルアミノ)ブタン酸
nPrGly:2−(プロピルアミノ)酢酸
MePhe:(S)−2−(メチルアミノ)−3−フェニルプロパン酸
MeAla:(S)−2−(メチルアミノ)プロパン酸
MeGly:2−(メチルアミノ)酢酸
Pro:(S)−ピロリジン−2−カルボン酸
Thr:(2S,3R)−2−アミノ−3−ヒドロキシブタン酸
Phg:(S)−2−アミノ−2−フェニル酢酸
Ile:(2S,3S)−2−アミノ−3−メチルペンタン酸
Val:(S)−2−アミノ−3−メチルブタン酸
Asp:(S)−2−アミノコハク酸
Trp:(S)−2−アミノ−3−(1H−インドール−3−イル)プロパン酸
DTyr:(R)−2−アミノ−3−(4−ヒドロキシフェニル)プロパン酸
Phe(4−CF3):(S)−2−アミノ−3−(4−(トリフルオロメチル)フェニル)プロパン酸
Ser:(S)−2−アミノ−3−ヒドロキシプロパン酸
Met(O2):(S)−2−アミノ−4−(メチルスルホニル)ブタン酸
βAla:3−アミノプロパン酸
Ala:(S)−2−アミノプロパン酸
Gly:2−アミノ酢酸
MeSer:(S)−3−ヒドロキシ−2−(メチルアミノ)プロパン酸
FlPu(urea):化合物SP806
(IL-6R binder) ペプチド配列
Ala−Pro−Ile−Ile−MePhe−Met(O2)−Pro−MePhe(3-Cl)−DTyr−Val−Asp−Ser−Thr−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−FlPu(urea)
(IL-6R binder) ペプチド配列
Ala−Pro−Ile−Ile−Trp−MePhe(3-Cl)−Met(O2)−Pro−MePhe(3-Cl)−DTyr−Asp−Val−DTyr−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−FlPu(urea)
(TNFR1 binder)ペプチド配列
Ala−DTyr−Ile−Trp−Met(O2)−Ser−Met(O2)−MePhe(3-Cl)−Val−MePhe−Asp−Thr−MePhe(3-Cl)−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−FlPu(urea)
(TNFR1 binder)ペプチド配列
Ala−Pro−MeGly−Ile−Ile−Val−Ser−MeSer−Phg−Phg−Asp−MeAla(4-Thz)−Thr−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−FlPu(urea)
(TNFR1 binder) ペプチド配列
Ala−Pro−MeGly−Val−Ile−Thr−Val−MeSer−Phg−Ser−Asp−MeAla−MePhe(3-Cl)−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−FlPu(urea)
(TNFα binder) ペプチド配列
γEtAbu-Thr-Phg-Ile-MeAla(4-Thz)-Trp-Trp-Phe(4-CF3)-DTyr-MePhe(3-Cl)-Asp-Pro-MeGly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
(TNFα binder) ペプチド配列
Ala-Phe(4-CF3)-Trp-Trp-Val-MeGly-Gly-Pro-Hyp(Et)-Ser-Asp-MeSer-Met(O2)-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
(TNFα binder) ペプチド配列
Ala-MeAla(4-Thz)-Ile-Pro-Val-Trp-Trp-Phe(4-CF3)-Met(O2)-Val-Asp-Trp-MeAla(4-Thz)-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
(TNFα binder) ペプチド配列
Ala-Thr-Ile-Pro-DTyr-Trp-Trp-Phe(4-CF3)-Met(O2)-Val-Asp-Trp-MeAla(4-Thz)-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
(TNFα binder) ペプチド配列
Ala-Thr-Trp-Ile-MePhe-Phg-Trp-βAla-Phe(4-CF3)-Phg-Asp-Val-Thr-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
(IL−6R binder) ペプチド配列
Ala-Pro-Val-Ile-MePhe-Met(O2)-Pro-MePhe(3-Cl)-Val-Met(O2)-Asp-Pro-MeGly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
(IL−6R binder) ペプチド配列
Ala-Ile-Ile-MeAla(4-Thz)-Trp-Pro-MePhe(3-Cl)-Met(O2)-DTyr-βAla-Asp-Pro-MePhe(3-Cl)-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
(IL−6R binder)ペプチド配列
γEtAbu-Ile-Val-Trp-MePhe(3-Cl)-Met(O2)-Pro-MePhe(3-Cl)-DTyr-Met(O2)-Asp-MeAla(4-Thz)-MeAla-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser−FlPu(urea)
ペプチド合成はスキームJ−1に示すFmoc固相ペプチド合成法に従って行った。実施例中のアミノ酸の略号は、通常文献や商品カタログ(渡辺化学)などに記載の略号を用いているが、詳細を以下に示す。
MeAla(4−Thz):(S)−2−(メチルアミノ)−3−(チアゾール−4−イル)プロパン酸
MePhe(3−Cl):(S)−3−(3−クロロフェニル)−2−(メチルアミノ)プロパン酸
Hyp(Et):(2S,4R)−4−エトキシピロリジン−2−カルボン酸
γEtAbu:4−(エチルアミノ)ブタン酸
nPrGly:2−(プロピルアミノ)酢酸
MePhe:(S)−2−(メチルアミノ)−3−フェニルプロパン酸
MeAla:(S)−2−(メチルアミノ)プロパン酸
MeGly:2−(メチルアミノ)酢酸
Pro:(S)−ピロリジン−2−カルボン酸
Thr:(2S,3R)−2−アミノ−3−ヒドロキシブタン酸
Phg:(S)−2−アミノ−2−フェニル酢酸
Ile:(2S,3S)−2−アミノ−3−メチルペンタン酸
Val:(S)−2−アミノ−3−メチルブタン酸
Asp:(S)−2−アミノコハク酸
Trp:(S)−2−アミノ−3−(1H−インドール−3−イル)プロパン酸
DTyr:(R)−2−アミノ−3−(4−ヒドロキシフェニル)プロパン酸
Phe(4−CF3):(S)−2−アミノ−3−(4−(トリフルオロメチル)フェニル)プロパン酸
Ser:(S)−2−アミノ−3−ヒドロキシプロパン酸
Met(O2):(S)−2−アミノ−4−(メチルスルホニル)ブタン酸
βAla:3−アミノプロパン酸
Ala:(S)−2−アミノプロパン酸
Gly:2−アミノ酢酸
MeSer:(S)−3−ヒドロキシ−2−(メチルアミノ)プロパン酸
LCMS(ESI) m/z = 409 (M+H)+
保持時間:0.44分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 436 (M+H)+
保持時間:0.66分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI) m/z = 382 (M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 354 (M+H)+
保持時間:0.93分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 340 (M+H)+
保持時間:0.94分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 342 (M+H)+
保持時間:0.67分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 642 (M−H)−
保持時間:0.72分(分析条件SQDAA50)
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
1H−NMR (Varian 400−MR,400 MHz,DMSO−D6) δ ppm 7.69 (2H, d, 8.7 Hz), 7.65(2H,8.7Hz),5.24 (1H, s), 1.45 (6H, s)
保持時間:0.75分(分析条件SQDAA50)
1H−NMR (Varian 400−MR,400 MHz,DMSO−D6) δ ppm 9.17 (1H, s), 7.73 (2H, d, 8.5 Hz), 7.63 (2H, d, 8.5 Hz), 1.84 (6H, s)
LCMS(ESI) m/z = 536 (M+Na)+
保持時間:0.72分(分析条件SQDAA50)
なお、本明細書ではポリマー(例えばレジン)と化合物を結合させた場合、構造式ではポリマー部を○で示す場合がある。○が有する反応性官能基(下の場合にはトリチル基)を示してポリマーと化合物の反応点が理解しやすいように記載する場合がある。以下の例ではレジンのトリチル基とセリンのヒドロキシル基がエーテル結合にて結合しているため、レジンのトリチル基とセリンのエーテル結合部位を記載した。
ポリスチレンレジン(化合物SP828)を用い、Fmocアミノ酸として、Fmoc−MeAla(4−Thz)−OH(化合物SP811)、Fmoc−MePhe(3−Cl)−OH(化合物SP812)、Fmoc−MePhe−OH、Fmoc−MeSer(DMT)−OH(化合物SP816)、Fmoc−MeAla−OH、Fmoc−nPrGly−OH(化合物SP815)、Fmoc−MeGly−OH、Fmoc−Hyp(Et)−OH(化合物SP813)、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Thr(Trt)−OH、Fmoc−Phg−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(Pis)−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−DTyr(tBu)−OH、Fmoc−Phe(4−CF3)−OH、Fmoc−Ser(Trt)−OH、Fmoc−Met(O2)−OH、Fmoc−γEtAbu−OH(化合物SP814)、Fmoc-βAla-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OHを用いて合成を行った。
得られた残渣をジクロロエタンに溶解し、t−ブチルメチルエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。遠心分離にて上清を除き、残渣にトリフルオロ酢酸/トリイソプロピルシラン/ジクロロエタン(=5/5/90)を加え、Pis(4−CF3)を含む側鎖保護基の脱保護を行った。減圧下で溶媒留去し、得られた粗生成物を高速逆相クロマトグラフィー(HPLC)で精製を行った。
配列番号PE−7に由来するペプチド
γEtAbu*−Thr−Phg−Ile−MeAla(4−Thz)−Trp−Trp−Phe(4−CF3)−DTyr−MePhe(3−Cl)−Asp*−Pro−MeGly−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1945 (M+H)+
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
配列番号PE−8に由来するペプチド
Ala*−Phe(4−CF3)−Trp−Trp−Val−MeGly−Gly−Pro−Hyp(Et)−Ser−Asp*−MeSer−Met(O2)−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1678 (M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
配列番号PE−9に由来するペプチド
Ala*−MeAla(4−Thz)−Ile−Pro−Val−Trp−Trp−Phe(4−CF3)−Met(O2)−Val−Asp*−Trp−MeAla(4−Thz)−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1955 (M+H)+
保持時間:0.82分(分析条件SQDFA05)
配列番号PE−10に由来するペプチド
Ala*−Thr−Ile−Pro−DTyr−Trp−Trp−Phe(4−CF3)−Met(O2)−Val−Asp*−Trp−MeAla(4−Thz)−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1952 (M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQDFA05)
配列番号PE−11に由来するペプチド
Ala*−Thr−Trp−Ile−MePhe−Phg−Trp−βAla−Phe(4−CF3)−Phg−Asp*−Val−Thr−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1774 (M+H)+
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
配列番号PE−13に由来するペプチド
Ala*−Pro−Val−Ile−MePhe−Met(O2)−Pro−MePhe(3−Cl)−Val−Met(O2)−Asp*−Pro−MeGly−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1630 (M+H)+
保持時間:0.70分(分析条件SQDFA05)
配列番号PE−14に由来するペプチド
Ala*−Ile−Ile−MeAla(4−Thz)−Trp−Pro−MePhe(3−Cl)−Met(O2)−DTyr−βAla−Asp*−Pro−MePhe(3−Cl)−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1836 (M+H)+
保持時間:0.80分(分析条件SQDFA05)
配列番号PE−15に由来するペプチド
γEtAbu*−Ile−Val−Trp−MePhe(3−Cl)−Met(O2)−Pro−MePhe(3−Cl)−DTyr−Met(O2)−Asp*−MeAla(4−Thz)−MeAla−Ser−OH
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1944 (M+H)+
保持時間:0.76分(分析条件SQDFA05)
Ala*−Pro−Val−Ile−MePhe−Met(O2)−Pro−MePhe(3−Cl)−Val−Met(O2)−Asp*−Pro−MeGly−Ser−NH(CH2)2NMe2
(2つの*部位にて環化)
LCMS(ESI) m/z = 1698 (M−H)−
保持時間:0.59分(分析条件SQDFA05)
4−1.TNFαへの結合評価
試薬として、以下のものを使用した。Dimethylsulfoxyde (DMSO), phosphate buffered saline (以上Sigma-Aldrich Co. LLC.),surfactant P-20 (GE healthcare)
合成ペプチドとTNFαとの相互作用解析のSPR実験はBiacoreT200 (GE healthcare) を用いて、20 oCにて実施した。固定化したタンパク質に対して、合成ペプチドを添加し、相互作用を評価した。
ランニングバッファーとして上述のphosphate buffered salineにSurfactant P-20およびDMSOをそれぞれ終濃度0.01vol%, 5vol%となるように添加したものを用いた。ビアコア用センサーチップ Series S sensor chip CAP (GE healthcare) 上に取扱指示書にしたがってCAP reagentを固定化し, ビオチン化したTNFαを固定化させた。解離定数(KD)を測定するため、各合成ペプチドを複数の濃度で添加し、固定化TNFαに対する結合のセンサーグラムを得た。
以上のように解析して得られたKDを以下の表26に示す。
試薬として、以下のものを使用した。Dimethylsulfoxyde (DMSO) (Sigma-Aldrich Co. LLC.), HBS-EP, Surfactant P-20 (以上GE healthcare)
合成ペプチドとIL-6Rとの相互作用解析のSPR実験は、BiacoreT200 (GE healthcare) を用いて、20 oCにて実施した。固定化したIL-6Rに対して、合成ペプチドを添加し、相互作用を評価した。
ランニングバッファーとして、上述のHBS-EPにSurfactant P-20およびDMSOをそれぞれ終濃度0.01vol%, 1vol%となるように添加したものを用いた。
ビアコア用センサーチップ Series S sensor chip CAP, (GE healthcare) 上に取扱指示書にしたがってCAP reagentを固定化し, さらにビオチン化IL-6Rを固定化した。
解離定数(KD)を測定するため、各合成ペプチドを複数の濃度で添加し、固定化IL-6Rに対する結合のセンサーグラムを得た。
得られたセンサーグラムの解析は、T200 evaluation software (GE healthcare)またはScrubber2 (Biologic software) を用いて行った。まず、DMSOに対する溶媒補正およびダブルリファレンス (IL-6Rが固定化されていないフローセルへのセンサーグラム、およびバッファーを添加した場合のセンサーグラムを差し引くことによる補正) を行い、次に、補正後のセンサーグラムに対するカーブフィッティングから、結合速度定数(kon)、解離速度定数(koff)を算出し、KDをKD=koff/konの関係式を用いて決定した。
以上のように解析して得られたKDを以下の表27に示す。
[実施例27]Human gp130発現Ba/F3細胞を用いた合成ペプチドの中和活性評価
実施例26にて確認されたhuman IL-6 receptor(hIL-6R)結合活性を有する合成ペプチドの阻害活性は、human gp130 cDNAを導入し強制発現させることによってhIL-6及び可溶型hIL-6R(shIL-6R)用量依存的に増殖するBa/F3細胞株(gp130 Ba/F3細胞)を用いて評価した。また、カウンターアッセイとしてgp130 Ba/F3細胞のmouse IL-3 (mIL-3)用量依存的な増殖に対する合成ペプチドの影響を評価した。
阻害率(%)=(B−C)/(B−A) x 100
その結果、実施例26にて選択、合成した合成ペプチドはgp130 Ba/F3細胞のhIL-6及びshIL-6Rによる細胞増殖を濃度依存的に抑制することが明らかになり、ヒトIL-6シグナリングに対する特異的な阻害活性を有することが示された(図73)。
Claims (43)
- 環状部を有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチド化合物は、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基、及び、アミン近傍に反応補助基を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程;
2)前記反応補助基を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体と、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の活性エステル基をアミド結合させて環状化合物を得る工程
を含み、
前記環状部を有するペプチド化合物の環状部を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体の総数が、5〜12であり、
前記環状部を有するペプチド化合物を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体の総数が、9〜13であり、
前記環状部を有するペプチド化合物がN置換アミノ酸を少なくとも2つ含み、かつ、N置換されていないアミノ酸を少なくとも1つ含み、
ClogP値が6以上である、前記方法。 - 活性エステルがチオエステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記反応補助基が、SH基である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記環状化合物を得る工程の後、反応補助基を除去する工程を含む、請求項2または3に記載の方法。
- 前記アミン近傍に反応補助基を有するアミノ酸、アミノ酸類縁体又はN末端カルボン酸類縁体が、下記一般式で表される化合物N−1または化合物N−2である、請求項1から4のいずれかに記載の方法;
(式中、R1は、水素原子、S−R23(R23は、置換基を有していてもよいアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基を示す。)、またはHS基の保護基を示し;
R2、R3は、それぞれ独立して、水素原子、または、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基もしくはシクロアルキル基を示し;またはR2とR3が環を形成した置換基、またはR2もしくはR3がR4と環を形成した置換基を示し;
R4は、置換基を有していてもよいアルキレン基、置換基を有していてもよいアリーレン基または置換基を有していてもよい2価のアラルキル基を示し;
R11、R12は、それぞれ独立して、単結合、置換基を有していてもよいアルキレン基、置換基を有していてもよいアリーレン基または置換基を有していてもよい2価のアラルキル基を示す。)。 - 前記活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体が、下記一般式で表される化合物C−1である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法;
(式中、R25は、OH、ハロゲン原子、OR、またはSR1を示し(RはBt、At、NSuまたはPfpを示し、R1は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキレン基を示す。);
R26は、置換基を有していてもよいアルキレン基、置換基を有していてもよいアリーレン基または置換基を有していてもよい2価のアラルキル基を示し;
R2、R3は、それぞれ独立して、水素原子または置換基を有していてもよいアルキル基を示す。)。 - 環状部を有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、あるいは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチド化合物は、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基、及び、N末端の主鎖アミノ基を有するアミノ酸残基、あるいは、主鎖もしくは側鎖にアミノ基を有するアミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含む、工程;
2)N末端のアミノ酸残基、N末端のアミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体と活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体の活性エステル基をアミド結合させて環状化合物を得る工程
を含み、
前記環状部を有するペプチド化合物の環状部を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、あるいは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体の総数が、5〜12であり、
前記環状部を有するペプチド化合物を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、あるいは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基並びにN末端カルボン酸類縁体の総数が、9〜13であり、
前記環状部を有するペプチド化合物がN置換アミノ酸を少なくとも2つ含み、かつ、N置換されていないアミノ酸を少なくとも1つ含み、
ClogP値が6以上である、前記方法。 - 活性エステル基がアルキルチオエステル基又はアラルキルチオエステル基であって、工程1)の翻訳合成後に活性化剤を添加させることにより、より活性な活性エステル基に変換させる工程を含む、請求項7に記載の方法。
- 活性剤が、アリールチオール又はN−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項8に記載の方法。
- 翻訳されたチオエステルとの反応性が高い活性化剤と、環化させるアミンとの反応性が高い活性化剤を添加させ、より活性の高い活性エステル基に変換させる工程である、請求項9に記載の方法。
- アリールチオエステルで活性エステル基に変換させた後、オキシマおよびその誘導体で更に活性の高いエステル基に変換させる工程である、請求項10に記載の方法。
- 工程1)のN末端部位の翻訳合成が、フォルミルメチオニン以外の翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体をアシル化した翻訳開始tRNAを用いて導入する方法にて行われる、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 工程1)のN末端部位の翻訳合成が、開始コドンを読み飛ばし、N末端にMet以外の翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体を導入する方法を用いて行われる、請求項7から11のいずれかに記載の方法。
- 工程1)のN末端部位の翻訳合成が、アミノペプチダーゼにてN末端のアミノ酸、アミノ酸類縁体又はカルボン酸類縁体を切断する方法を用いて行われる、請求項7から11のいずれかに記載の方法。
- 前記N末端部位の翻訳合成が、メチオニン アミノペプチダーゼにて処理することによりN末端のフォルミルMetを除去しN末端に他の翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体を導入する方法を用いて行われる、請求項14に記載の方法。
- 前記N末端部位の翻訳合成が、Metの代わりにノルロイシンを含む翻訳系にて翻訳され、メチオニン アミノペプチダーゼにて処理することによりN末端のフォルミルノルロイシンを除去しN末端に他の翻訳可能なアミノ酸、翻訳可能なアミノ酸類縁体又は翻訳可能なN末端カルボン酸類縁体を導入する方法を用いて行われる、請求項7〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記N末端のアミノ酸、アミノ酸類縁体又はカルボン酸類縁体の除去に、さらに、ペプチドデフォルミラーゼが用いられる、請求項14から16のいずれかに記載の方法。
- 前記環状部を有するペプチド化合物が、さらに直鎖部を有する、請求項1から17のいずれかに記載の製造方法。
- 前記非環状ペプチド化合物がα−ヒドロキシカルボン酸、及び、側鎖に保護されていてもよいアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体を含み、工程2)の環状化合物を形成する工程の後で、工程3)α―ヒドロキシカルボン酸部位と側鎖に保護されていてもよいアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体部位を化学反応させて分枝部位を形成させる工程を含む、請求項1から18のいずれかに記載の方法。
- 環状部と直鎖部とを有するペプチド化合物の製造方法であって、
1)アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、N末端カルボン酸類縁体並びにα−ヒドロキシカルボン酸により構成される非環状のペプチド化合物を、該ペプチド化合物をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、該非環状のペプチド化合物が、
i)C末端側に側鎖の1つに反応点を有するアミノ酸残基(又はアミノ酸類縁体残基)、及び、N末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体を含み、
ii)前記i)に記載の2つの反応点の間にα位にRf5を有するα−ヒドロキシカルボン酸(Rf5は水素原子、置換されてもよいアルキル基、アラルキル基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、アリケニル基、アルキニル基から選択される)、及び、非環状ペプチド化合物中に保護されていてもよいアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基を含む、
非環状のペプチド化合物である、工程;
2)N末端側のアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体の反応点と、C末端側の側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の反応点とを結合させる、環化反応工程;
3)工程1)のii)に記載のα−ヒドロキシカルボン酸のエステル結合を切断してチオエステル基を発生させる工程
4)工程3)において発生させたチオエステル基と工程1)のii)に記載のアミノ基を結合させる環化反応工程、
を含み、
前記環状部と直鎖部とを有するペプチド化合物の環状部を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、N末端カルボン酸類縁体並びにα−ヒドロキシカルボン酸の総数が、5〜12であり、
前記環状部と直鎖部とを有するペプチド化合物を構成する、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、もしくは、アミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基、N末端カルボン酸類縁体並びにα−ヒドロキシカルボン酸の総数が、9〜13であり、
前記環状部と直鎖部とを有するペプチド化合物がN置換アミノ酸を少なくとも2つ含み、かつ、N置換されていないアミノ酸を少なくとも1つ含み、
ClogP値が6以上である、前記方法。 - 工程1)のii)に記載のα−ヒドロキシカルボン酸とアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の間に含まれるアミノ酸残基及び/又はアミノ酸類縁体残基の数が7つ以下である、請求項20に記載の方法。
- 工程1)のii)に記載のα−ヒドロキシカルボン酸が、Cys−Pro−α−ヒドロキシカルボン酸として非環状ペプチド化合物中に含まれる、請求項20又は21に記載の方法。
- 工程1)のi)に記載のN末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体が反応補助基を有している、請求項20から22のいずれかに記載の方法。
- 工程1)のi)に記載のN末端側にもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はN末端カルボン酸類縁体が反応補助基を有さず、ii)に記載のアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基のアミノ基が保護基を有し、活性化剤を添加することによって、工程2)の環化反応が行われ、工程2)の環化反応後、工程3)の環化反応前に、前記ii)に記載のアミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基のアミノ基の保護基を除去する工程を含む、請求項20から23のいずれかに記載の方法。
- 前記環状部を有するペプチド化合物の環状部を形成するアミノ酸又はアミノ酸類縁体の合計が5〜12となる位置に環化反応を実施するための反応点を有する、請求項1から24のいずれかに記載の方法。
- ペプチド化合物のC末端と翻訳合成に用いた鋳型とがスペーサーを介して結合しているペプチド化合物−核酸複合体を製造することを特徴とする、請求項1〜25のいずれかに記載の方法。
- ペプチド化合物−核酸複合体が、翻訳合成に用いられる非環状ペプチド化合物をコードする核酸の3'末端にリンカーを介してピューロマイシンが結合している核酸を用いて合成される、請求項26に記載の方法。
- スペーサーがペプチド、RNA、DNA、またはヘキサエチレングリコールのポリマー、又は、これらの組合せである、請求項26又は27に記載の方法。
- ペプチド化合物を、互いに異なる配列を有する複数の核酸から成る核酸ライブラリーを翻訳して製造することを特徴とする、請求項1から28のいずれかに記載の方法。
- 以下の(i)〜(iv)を有することを特徴とする、環状部を有するペプチド化合物;
(i)アミノ酸及びアミノ酸類縁体残基数の合計が5〜12からなる環状部を含み、アミノ酸及びアミノ酸類縁体の総数が9〜13である、
(ii)N置換アミノ酸を少なくとも2つ含み、N置換されていないアミノ酸を少なくとも1つ含む、
(iii)ClogP値が6以上である、
(iv)環状部を形成しているアミノ酸又はアミノ酸類縁体の結合が、アミノ酸又はアミノ酸類縁体の側鎖にある活性エステル基と、他のアミノ酸又はアミノ酸類縁体のアミン基とからなる結合を少なくとも1つ有する。 - ペプチド化合物に含まれるアミノ酸及びアミノ酸類縁体が、翻訳合成可能なアミノ酸又はアミノ酸類縁体、若しくは、翻訳可能なアミノ酸又はアミノ酸類縁体の側鎖またはN置換部位を化学修飾することによって得られるアミノ酸又はアミノ酸誘導体から選択されるアミノ酸又はアミノ酸類縁体である、請求項30に記載のペプチド化合物。
- さらに、アミノ酸及びアミノ酸類縁体残基数の合計が1〜8からなる直鎖部を少なくとも1つ含む、請求項30又は31に記載のペプチド化合物。
- 環状部を形成しているアミノ酸又はアミノ酸類縁体の結合がアミド結合である、請求項30から32のいずれかに記載のペプチド化合物。
- 環状部が下記一般式(I)で示される交差ユニットを含む、請求項30から33のいずれかに記載のペプチド化合物;
(式中の記号は以下の意味を示す;
R51は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、C5−C10アリール基、アラルキル基、エステル基、又は式1で示されるアミドであり、
R52は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、アリール基、またはアラルキル基であり、
R53は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、もしくは水素原子であるか、または、R53とR51とが互いに結合してC3−C5のアルキレン基を形成し窒素原子を含む5員〜7員環を形成していてもよく、
R54は、0−8アミノ酸残基より構成されるペプチドであり、
R55は、置換基を有していても良いC1−C6アルキル基、C5−C10アリール基、アラルキル基、エステル基、置換基を有していても良いアミド基であり、
*は、環状部における結合部位を示す。)。 - 請求項30から34のいずれかに記載のペプチド化合物の製造方法であって、工程(i)〜(iii)を含む方法:
(i)アミノ酸及びアミノ酸類縁体の総数が9〜13である非環状ペプチド化合物を翻訳合成して、当該非環状ペプチド化合物とそれをコードする核酸配列を有する複合体がリンカーを介して結合している非環状ペプチド化合物−核酸複合体を形成する工程;
(ii)工程(i)で翻訳合成された複合体の非環状ペプチド化合物をアミド結合によって環化し、環状部のアミノ酸及びアミノ酸類縁体の残基数の合計が5〜12となる環状化合物を形成する工程;および、
(iii)工程(ii)で得られた環状部を有するペプチド化合物−核酸複合体ライブラリーと生体内分子とを接触させ、当該生体内分子に対して結合活性を有する複合体を選択する工程。 - さらに、以下の工程を含む、請求項35に記載の製造方法;
(iv)前記工程(iii)で選択された複合体の核酸配列からペプチド化合物の配列情報を得る工程、および、
(v)前記工程(iv)で得られた配列情報に基づきペプチド化合物を化学合成する工程。 - 前記非環状ペプチド化合物がα−ヒドロキシカルボン酸、及び、保護されていてもよい側鎖にアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体を含み、工程(ii)の環状化合物を形成する工程の後で、α―ヒドロキシカルボン酸部位と側鎖にアミノ基を有するアミノ酸又はアミノ酸類縁体部位を化学反応させて分枝部位を形成させる工程を含む、請求項35又は36に記載の方法。
- 生体内分子が、分子量500未満の化合物が結合し得る領域を有していない分子である、請求項35から37いずれかに記載の製造方法。
- 生体内分子に対して結合活性を有する複合体が、さらに該生体内分子が他の生体内分子との結合を阻害する活性を有する、請求項35から38のいずれかに記載の製造方法。
- 環化反応するN末端側のアミノ酸又はアミノ酸類縁体が、前記化合物N−1または化合物N−2で表わされる化合物から選択されるアミノ酸又はアミノ酸類縁体であり、C末端側のアミノ酸又はアミノ酸類縁体が前記化合物C−1で表わされる化合物から選択されるアミノ酸又はアミノ酸類縁体であり、工程(ii)の環状化合物を得る工程の後、反応補助基を除去する工程を含む、請求項35から39のいずれかに記載の製造方法。
- 核酸配列が3'末端にスペーサーを有し、翻訳合成されるペプチド化合物のC末端が、当該スペーサーを介して、当該核酸配列と複合体を形成する、請求項35から40のいずれかに記載の製造方法。
- ペプチド化合物−核酸複合体が、翻訳合成に用いられる非環状ペプチド化合物をコードする核酸の3'末端にリンカーを介してピューロマイシンが結合している核酸を用いて合成される、請求項41に記載の方法。
- スペーサーがペプチド、RNA、DNA、またはヘキサエチレングリコールのポリマーである、請求項41又は42に記載の製造方法。
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