JP2014518313A - 魚油から高純度のｅｐａを生成するためのｓｍｂ方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、魚油であるまたは魚油に由来する供給混合液から多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生成物を回収するためのクロマトグラフィー分離方法であって、（ｉ）クロマトグラフィー分離ステップで供給混合液を精製して、第一中間生成物を得るステップと、（ｉｉ）（ｉ）で得られた第一中間生成物を擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離ステップで精製して、第二中間生成物を得るステップと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた第二中間生成物を擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離ステップで精製して、ＰＵＦＡ生成物を得るステップとを含み、水性有機溶媒が各分離ステップで溶離剤として使用され、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、第三分離ステップで得られたＰＵＦＡ生成物が、９０重量％を超える量でＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体を含む方法を提供する。

Description

本発明は、多価不飽和脂肪酸ＥＰＡまたはその誘導体を精製するための改善されたクロマトグラフィー分離方法に関する。

ＥＰＡおよびその誘導体は生物学的に重要な分子の前駆物質であり、それらは、血小板凝集、炎症および免疫応答などの生物機能の調節において重要な役割を果たす。したがって、ＥＰＡおよびその誘導体は、ＣＮＳ状態；糖尿病性神経症を含めた神経障害；心血管疾患；炎症性皮膚疾患を含めた全身免疫系および炎症状態が含まれる幅広い病態を治療する上で、治療的に有用であり得る。

ＥＰＡは、天然原料、特に魚油に見出される。しかし、魚油のＥＰＡは、飽和脂肪酸および多くの他の不純物との混合状態でそうした油中に存在する。

魚油からのＥＰＡの精製は特に難易度が高い。したがって、魚油はクロマトグラフィー装置において非常に類似した保持時間を有する多くの異なる成分を含む、極めて複雑な混合液である。それらは、例えば藻類油の供給原料よりも一層難易度が高い、ＥＰＡを精製するための供給原料であることを意味する。しかし非常に高純度のＥＰＡが、特に医薬品および栄養補助食品適用のために必要とされる。したがって歴史的に、蒸留を使用して治療適用のためのＥＰＡが精製されてきた。

残念ながらＥＰＡは極めて脆弱である。したがって、酸素の存在下で加熱すると、それは、異性化、過酸化およびオリゴマー化しやすい。したがって、純粋な脂肪酸を調製するためのＥＰＡの分画および精製は困難である。真空下でさえ、許容できない生成物分解が蒸留によって起こり得る。

擬似および実移動床式クロマトグラフィーは既知の手法であり、当業者に熟知されている。動作の原理は、液体溶離剤相および固体吸着剤相の向流移動を含む。この動作によって、この方法を経済的に実行可能なものとする、溶媒の最小限の使用が可能になる。そうした分離技術は、炭化水素、工業化学物質、油、糖およびＡＰＩを含めた多様な分野において、いくつかの適用を見出してきた。

良く知られているように、従来の固定床式クロマトグラフィーシステムでは、成分が分離される混合液が容器に浸透する。この容器は、通常円筒形であり、典型的にはカラムと称される。カラムは、高い流体透過性を示す、（通常、固定相と呼ばれる）多孔性材料の充填物を含む。混合液の各成分の浸透速度はその成分の物理的性質に依存し、その結果連続的におよび選択的にカラムから成分が出る。したがって、固定相に強く固定する傾向があるために緩徐に浸透する成分もあれば、弱く固定する傾向があり、カラムからより急速に出る成分もある。多くの異なる固定床式クロマトグラフィーシステムが提案されており、分析および工業生産の両方の目的に使用されている。

それとは対照的に、擬似移動床式クロマトグラフィー装置は、互いに連続してつながれた、吸着剤を含むいくつかの個々のカラムからなる。溶離剤は、第一の方向でカラムを通過させられる。このシステムの供給原料および溶離剤の注入ポイントならびに分離した成分の収集ポイントは、一連の弁によって周期的にシフトされる。全体的な効果は、固形吸着剤の移動床を含む単一カラムの動作を擬似することであり、固形吸着剤は溶離剤の流れに対して向流方向に移動する。したがって、擬似移動床システムは、従来の固定床式システムのように、溶離剤が通過させられる固形吸着剤の固定床を含むカラムからなるが、擬似移動床システムでは、動作は、連続向流移動床を擬似するようなものである。

擬似移動床式クロマトグラフィーのための方法および設備は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２，９８５，５８９、ＵＳ３，６９６，１０７、ＵＳ３，７０６，８１２、ＵＳ３，７６１，５３３、ＦＲ−Ａ−２１０３３０２、ＦＲ−Ａ−２６５１１４８およびＦＲ−Ａ−２６５１１４９を含めたいくつかの特許に記載されている。このトピックは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、「Preparative and Production Scale Chromatography」、GanetsosおよびBarker編、Marcel Dekker Inc、New York、1993においても詳細に論じられている。

実移動床式システムは、擬似移動床システムに動作が類似している。しかし、供給混合液および溶離剤の注入ポイントならびに分離した成分の収集ポイントを弁のシステムによってシフトするのではなく、その代わりに、一連の吸着ユニット（すなわちカラム）を供給および排出ポイントに対して物理的に移動する。重ねて、動作は連続向流移動床を擬似するようなものである。

実移動床式クロマトグラフィーのための方法および設備は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，９７９，４０２、ＵＳ５，０６９，８８３およびＵＳ４，７６４，２７６を含めたいくつかの特許に記載されている。

典型的な擬似移動床式クロマトグラフィー装置を、図１を参照して例示する。擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離方法のコンセプトは、複数のセクションに、より正確には、カラムの底部から頂部に至る、重ねられた４つのサブゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに分けられた固定相Ｓを含む垂直のクロマトグラフィーカラムを考えることによって説明される。溶離剤は、ポンプＰによってＩＥにおいて底部で導入される。分離すべき成分ＡおよびＢの混合液は、サブゾーンＩＩとサブゾーンＩＩＩの間のＩＡ＋Ｂで導入される。主にＢを含む抽出液は、サブゾーンＩとサブゾーンＩＩの間のＳＢで収集され、主にＡを含む抽残液はサブゾーンＩＩＩとサブゾーンＩＶの間のＳＡで収集される。

擬似移動床システムの場合は、固定相Ｓの擬似下方移動は、導入および収集ポイントが固相に対して移動することによって引き起こされる。実移動床式システムの場合は、固定相Ｓの擬似下方移動は、様々なクロマトグラフィーカラムが導入および収集ポイントに対して移動することによって引き起こされる。図１では、溶離剤は上方に流れ、混合液Ａ＋ＢはサブゾーンＩＩとサブゾーンＩＩＩの間に注入される。成分は、クロマトグラフィーの固定相とのその相互作用、例えば多孔性媒体への吸着に従って移動することになる。固定相に対してより強い親和性を示す成分Ｂ（より緩徐な移動成分）はより緩徐に溶離剤によって引きずられ、遅れてその後に続くことになる。固定相に対してより弱い親和性を示す成分Ａ（より速い移動成分）は、溶離剤によって容易に引きずられることになる。適切なパラメーターセット、特に各サブゾーンの流速が正確に推定および制御される場合は、固定相に対してより弱い親和性を示す成分Ａは、サブゾーンＩＩＩとサブゾーンＩＶの間に抽残液として収集されることになり、固定相に対してより強い親和性を示す成分Ｂは、サブゾーンＩとサブゾーンＩＩの間に抽出液として収集されることになる。

９０％を超える、例えば９５％または９７％を超える純度で高純度のＥＰＡまたはＥＰＡエチルエステルを実現するためには、２つの同時の分離ステップを行う擬似移動床分離方法を利用することができる。そうした方法は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２３３９号に記載されている。

一般に、ＳＭＢ方法を含めた、ＰＵＦＡを分離するためのクロマトグラフィー分離手法は全て、溶離剤として大量の有機溶媒を利用する。クロマトグラフィー分離工程が完了した後、ＰＵＦＡを溶離剤中の溶液から回収しなければならない。典型的には、時間およびエネルギーの大きな消費が溶離剤中の溶液からＰＵＦＡを回収するのに必要となる。さらに、クロマトグラフィー分離方法で溶離剤として使用される有機溶媒は、環境またはそれを取り扱っている作業者にしばしば有害である。したがって、使用する必要がある有機溶媒の量を低減するクロマトグラフィー分離方法が必要とされる。

２ステップ方法よりもずっと低い溶媒量しか使用しない３ステップの分離方法によって、ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２３３９に記載されているようにＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体を同様に高純度で生成できることが、今や好都合なことに見出されている。本発明の改善された方法は、ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２３３９に記載されている２ステップ方法よりも大体５０％少ない溶媒しか利用しない。これは、費用、生成物回収の容易さおよび環境影響の点から明らかに好都合である。

比較的低容積の水性有機溶媒の溶離剤を使用する擬似または実移動床式装置を使用して、ＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体が魚油などの市販品として入手可能な供給原料から効率的に精製できることが、驚いたことに見出されている。したがって、本発明は、魚油であるまたは魚油に由来する供給混合液から多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生成物を回収するためのクロマトグラフィー分離方法であって、
（ｉ）クロマトグラフィー分離ステップで供給混合液を精製して、第一中間生成物を得るステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた第一中間生成物を擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離ステップで精製して、第二中間生成物を得るステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた第二中間生成物を擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離ステップで精製して、ＰＵＦＡ生成物を得るステップと
を含み、
水性有機溶媒が各分離ステップで溶離剤として使用され、
供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、
ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、
第三分離ステップで得られたＰＵＦＡ生成物が、９０重量％を超える量でＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体を含む方法を提供する。

本発明の方法によって得られるＰＵＦＡ生成物も提供する。

二成分混合液を分離するための擬似または実移動床式方法の基本原理を図示する図である。 本発明のクロマトグラフィー分離方法を行うことができる３つのやり方を図示する図である。 高純度のＥＰＡを生成するのに適した本発明の好ましい実施形態を図示する図である。 図２の実施形態をより詳細に図示する図である。 図２に示す実施形態のより好ましい実施形態を図示する図である。 ＥＰＡを生成するための２段階分離方法（本発明によるものではない）を図示する図である。 本発明の方法に従って使用するための適切な供給原料のＧＣトレースを示す図である。 本発明の方法に従って生成される第一中間生成物のＧＣトレースを示す図である。 本発明の方法に従って生成される第二中間生成物のＧＣトレースを示す図である。 本発明の方法に従って生成されるＰＵＦＡ生成物のＧＣトレースを示す図である。

本明細書で使用する場合、用語「ＰＵＦＡ生成物」は、典型的には栄養学的または医薬的に有効な、１種もしくは複数の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および／またはそれらの誘導体を含む生成物を指す。本発明の方法で得られるＰＵＦＡ生成物は、９０重量％を超える量でＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体を含む。すなわちＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体は、水性有機溶媒の溶離剤を含まない最終的なＰＵＦＡ生成物中の全成分に対して、９０重量％の純度で存在する。したがってＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体は、供給混合液に由来したＰＵＦＡ生成物の全成分に基づいて少なくとも９０重量％の量でＰＵＦＡ生成物中に存在する。

ＥＰＡ誘導体は、モノ、ジもしくはトリグリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトンまたは塩の形のＥＰＡである。トリグリセリドおよびエステルが好ましい。エステルがより好ましい。エステルは、典型的にはアルキルエステル、好ましくはＣ_１〜Ｃ_６アルキルエステル、より好ましくはＣ_１〜Ｃ_４アルキルエステルである。エステルの例としては、メチルおよびエチルエステルが挙げられる。エチルエステルが最も好ましい。

典型的には、ＰＵＦＡ生成物は、９５重量％を超える、好ましくは９７重量％を超える量で、ＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体を含む。

一実施形態では、ＰＵＦＡ生成物は、９０重量％を超える、好ましくは９５重量％を超える、より好ましくは９７重量％を超える量で、ＥＰＡを含む。上記で説明したように、ＥＰＡは、供給混合液に由来したＰＵＦＡ生成物の全成分の全量に対して、特定の重量％で存在する。

別の実施形態では、ＰＵＦＡ生成物は、９０重量％を超える、好ましくは９５重量％を超える、より好ましくは９７重量％を超える量で、ＥＰＡエチルエステルを含む。上記で説明したように、ＥＰＡは、供給混合液に由来したＰＵＦＡ生成物の全成分の全量に対して、特定の重量％で存在する。

本発明の方法によって分画するための適切な供給混合液は、魚油または魚油に由来する供給原料である。本発明の方法で使用するための適切な魚油は当業者に周知である。典型的な魚油は、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＳＤＡおよび典型的にはＥＰＡよりも高い極性および低い極性の両方の様々な他のＰＵＦＡ、飽和脂肪酸ならびに一不飽和脂肪酸を含む。

供給混合液は、本発明の方法によって分画する前に化学的な処理を受けてもよい。例えばそれは、グリセリドのエステル転移反応またはグリセリドの加水分解を受けてもよく、続いてある場合には、結晶化、分子蒸留、尿素分画、硝酸銀または他の金属塩溶液を用いる抽出、ヨードラクトン化または超臨界流体分画などの選択的方法を受けてもよい。あるいは、最初の処理ステップなしで供給混合液を直接使用してもよい。

供給混合液は、ＰＵＦＡ生成物ならびに少なくとも１種のより極性が高い成分および少なくとも１種のより極性が低い成分を典型的には含む。より極性が低い成分は、本発明の方法で使用する吸着剤への固着性がＰＵＦＡ生成物よりも強い。動作中に、そうしたより極性が低い成分は、液体溶離剤相に優先して、固体吸着剤相とともに典型的には移動する。より極性が高い成分は、本発明の方法で使用する吸着剤への固着性がＰＵＦＡ生成物よりも弱い。動作中に、そうしたより極性が高い成分は、固体吸着剤相に優先して、液体溶離剤相とともに典型的には移動する。一般に、より極性が高い成分は抽残液流中に分離されることになり、より極性が低い成分は抽出液流中に分離されることになる。

より極性が高い成分およびより極性が低い成分の例としては、（１）天然油（例えば海産油）に存在する他の化合物、（２）貯蔵、精製および前の濃縮ステップの間に形成される副産物ならびに（３）前の濃縮または精製ステップの間に利用される溶媒または試薬からの混入物が挙げられる。

（１）の例としては、他の望ましくないＰＵＦＡ；飽和脂肪酸；ステロール、例えばコレステロール；ビタミン；ならびにポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、ポリ芳香族炭化水素（ＰＡＨ）殺虫剤、塩素系殺虫剤、ダイオキシンおよび重金属などの環境汚染物質が挙げられる。ＰＣＢ、ＰＡＨ、ダイオキシンおよび塩素系殺虫剤は、全て極めて非極性の成分である。

（２）の例としては、ＰＵＦＡ生成物からの異性体、および酸化または分解生成物、例えば脂肪酸の自己酸化ポリマー生成物またはその誘導体が挙げられる。

（３）の例としては、供給混合液から飽和または一不飽和脂肪酸を除去するために添加され得る尿素が挙げられる。

好ましくは、供給混合液はＰＵＦＡ含有海産油（例えば魚油）、より好ましくはＥＰＡおよび／またはＤＨＡを含む海産油（例えば魚油）である。

本発明の方法によって濃縮ＥＰＡ（ＥＥ）を調製するための典型的な供給混合液は、５０〜７５％のＥＰＡ（ＥＥ）、０から１０％のＤＨＡ（ＥＥ）ならびに他の必須ω−３およびω−６脂肪酸を含めた他の成分を含む。

本発明の方法によって濃縮ＥＰＡ（ＥＥ）を調製するための好ましい供給混合液は、５５％のＥＰＡ（ＥＥ）、５％のＤＨＡ（ＥＥ）ならびに他の必須ω−３およびω−６脂肪酸を含めた他の成分を含む。ＤＨＡ（ＥＥ）はＥＰＡ（ＥＥ）よりも極性が低い。

本発明の方法は、複数のクロマトグラフィー分離ステップを含む。

第一分離ステップは、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸を除去するのに効果的であり、固定床式または擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置を使用して行うことができる。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、３つの分離ステップが実現可能ないくつかのやり方がある。この方法を行う４つの好ましいやり方を、第一、第二、第三および第四の実施形態として以下に示す。

第一の実施形態では、第一、第二および第三分離ステップは、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第一、第二および第三分離ステップは、第一、第二および第三ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは、供給混合液流に対する１つまたは複数の注入ポイント、水および／または有機溶媒に対する１つまたは複数の注入ポイント、前記ゾーンから液体が収集され得る抽残液分岐流、ならびに前記ゾーンから液体が収集され得る抽出液分岐流を有する。

典型的には、各ゾーンは供給混合液に対する注入ポイントを１つだけ有する。一実施形態では、各ゾーンは水性有機溶媒の溶離剤に対する注入ポイントを１つだけ有する。別の実施形態では、各ゾーンは水および／または有機溶媒に対する注入ポイントを２つ以上有する。

典型的には、使用される各ゾーンは、溶離剤として水性有機溶媒を含む、連続して連結した単一配列のクロマトグラフィーカラムを有する。典型的には、あるゾーン中の各クロマトグラフィーカラムは、そのカラムに隣接した、装置中の２個のカラムに連結している。したがって、あるゾーンの所与のカラムからのアウトプットは隣接したカラムのインプットにつながり、例えばそのゾーンにおいて、隣接したカラムはシステムにおける溶離剤の流れに対して下流にある。典型的には、あるゾーンのどのクロマトグラフィーカラムも同一ゾーンの隣接していないカラムに連結していない。

用語「抽残液」は当業者に周知である。実および擬似移動床式クロマトグラフィーとの関係においては、それは、固体吸着剤相と比較して、液体溶離剤相とともにより急速に移動する成分の流れを指す。したがって抽残液流は、供給流と比較して、典型的には、より極性が高い成分が豊富であり、より極性が低い成分が欠乏している。

用語「抽出液」は当業者に周知である。実および擬似移動床式クロマトグラフィーとの関係においては、それは、液体溶離剤相と比較して、固体吸着剤相ともにより急速に移動する成分の流れを指す。したがって、抽出液流は、供給流と比較して、典型的には、より極性が低い成分が豊富であり、より極性が高い成分が欠乏している。

本明細書で使用する場合、用語「隣接していない」は、例えば同じ装置の、１個または複数のカラム、好ましくは３個以上のカラム、より好ましくは５個以上のカラム、最も好ましくは約５個のカラムによって隔てられたカラムを指す。

第二の実施形態では、第一および第二分離ステップは、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第一および第二分離ステップは第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りであり、第三分離ステップは別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われる。

第二の実施形態では、第三分離ステップは、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを備え、供給混合液流に対する１つまたは複数の注入ポイント、水および／または有機溶媒に対する１つまたは複数の注入ポイント、前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽残液分岐流、ならびに前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽出液分岐流を有する擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で、典型的には行われる。このクロマトグラフィー装置は、供給混合液に対する注入ポイントを１つだけ典型的には有する。一実施形態では、このクロマトグラフィー装置は、水性有機溶媒の溶離剤に対する注入ポイントを１つだけ有する。別の実施形態では、このクロマトグラフィー装置は、水および／または有機溶媒に対する注入ポイントを２つ以上有する。

第二の実施形態の第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置は、溶離剤として水性有機溶媒を含む、連続して連結した単一配列のクロマトグラフィーカラムを典型的には有する。典型的には、各クロマトグラフィーカラムは、そのカラムに隣接した、装置中の２個のカラムに連結している。したがって、所与のカラムからのアウトプットは隣接したカラムのインプットにつながり、隣接したカラムはシステムにおける溶離剤の流れに対して下流にある。典型的には、どのクロマトグラフィーカラムも、クロマトグラフィー装置の隣接していないカラムに連結していない。

第二の実施形態の第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置は、第一および第二分離ステップで使用する装置と別の装置である。したがって、２つの別々の装置を使用する。溶離剤は、別々のクロマトグラフィー装置中を別々に循環する。したがって、第二ステップで生成され、次いで第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される第二中間生成物中に溶離剤が溶媒として存在し得るもの以外は、溶離剤は、別々のクロマトグラフィー装置間で共有されない。クロマトグラフィーカラムは、別々のクロマトグラフィー装置間で共有されない。

第二中間生成物を第二分離ステップで得た後は、第二中間生成物が第三分離ステップでさらに精製される前に、水性有機溶媒の溶離剤を部分的にまたは完全に除去することができる。あるいは、存在する任意の溶媒を除去することなしに、中間生成物を第三ステップでさらに精製することができる。

第二の実施形態の第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置は、図１で図示するクロマトグラフィー装置と類似している。

第三の実施形態では、第二および第三分離ステップは、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップは第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りであり、第一分離ステップは、別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われる。

第三の実施形態では、第一分離ステップは、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを備え、供給混合液流に対する１つまたは複数の注入ポイント、水および／または有機溶媒に対する１つまたは複数の注入ポイント、前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽残液分岐流、ならびに前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽出液分岐流を有する擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で、典型的には行われる。このクロマトグラフィー装置は、供給混合液に対する注入ポイントを１つだけ典型的には有する。一実施形態では、このクロマトグラフィー装置は、水性有機溶媒の溶離剤に対する注入ポイントを１つだけ有する。別の実施形態では、このクロマトグラフィー装置は、水および／または有機溶媒に対する注入ポイントを２つ以上有する。

第三の実施形態の第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置は、溶離剤として水性有機溶媒を含む、連続して連結した単一配列のクロマトグラフィーカラムを典型的には有する。典型的には、各クロマトグラフィーカラムは、そのカラムに隣接した、装置中の２個のカラムに連結している。したがって、所与のカラムからのアウトプットは隣接したカラムのインプットにつながり、隣接したカラムはシステムにおける溶離剤の流れに対して下流にある。典型的には、どのクロマトグラフィーカラムも、クロマトグラフィー装置の隣接していないカラムに連結していない。

第三の実施形態の第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置は、第二および第三分離ステップで使用する装置とは別の装置である。したがって、２つの別々の装置を使用する。第一ステップで生成され、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される第一中間生成物中に溶離剤が溶媒として存在し得るもの以外は、溶離剤は、別々のクロマトグラフィー装置間で共有されない。クロマトグラフィーカラムは、別々のクロマトグラフィー装置間で共有されない。

第一分離ステップで第一中間生成物を得た後で、中間生成物が次の分離ステップでさらに精製される前に、水性有機溶媒の溶離剤を部分的にまたは完全に除去することができる。あるいは、存在する任意の溶媒を除去することなしに、第一中間生成物を第二分離ステップでさらに精製することができる。

第三の実施形態の第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置は、図１で図示するクロマトグラフィー装置と類似している。

上記の第一、第二および第三の実施形態では、２つ以上の分離ステップを、上記で定義された通りである２つまたは３つのゾーンを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行うことができることが認識されるであろう。２つ以上のゾーン、例えば２つまたは３つのゾーンを有する典型的なクロマトグラフィー装置は、例えば参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２３３９に記載されている通りである。

第四の実施形態では、（ａ）第一、第二および第三分離ステップは、同じクロマトグラフィー装置で順次行われ、第一および第二中間生成物は、第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間でそれぞれ回収され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように、第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間で調整される、または（ｂ）第二分離ステップは、第一分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して行われ、かつ／または第三分離ステップは、第二分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して行われる。

第四の実施形態では、第一、第二および第三分離ステップを行うために使用する各クロマトグラフィー装置は、典型的には、実施形態（２）の第三分離ステップのために上記で定義された通りである。

第四の実施形態のオプション（ｂ）では、３つのステップ全てが別々のクロマトグラフィー装置で行われる。第一、第二および第三分離ステップの２つまたは３つが、２つまたは３つの異なる別々のクロマトグラフィー装置で行われる。これらは、順次操作してもよいし、同時に操作してもよい。

特に、第四の実施形態のオプション（ｂ）では、２つの別々のクロマトグラフィー装置を順次操作して、第一および第二分離ステップを行うことができる。この場合、第一中間生成物は第一と第二の分離ステップの間で回収され、第一および第二のクロマトグラフィー装置のプロセス条件は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

特に、第四の実施形態のオプション（ｂ）では、２つの別々のクロマトグラフィー装置を順次操作して、第二および第三分離ステップを行うことができる。この場合、第二中間生成物は第二と第三の分離ステップの間で回収され、第二および第三のクロマトグラフィー装置のプロセス条件は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

特に、第四の実施形態のオプション（ｂ）では、３つの別々のクロマトグラフィー装置を順次操作して、第一、第二および第三分離ステップを行うことができる。この場合、第一中間生成物は第一と第二の分離ステップの間で回収され、第二中間生成物は第二と第三の分離ステップの間で回収され、第一、第二および第三のクロマトグラフィー装置のプロセス条件は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

特に、第四の実施形態のオプション（ｂ）では、２つの別々のクロマトグラフィー装置を同時に操作して、第一および第二分離ステップを行うことができる。第一および第二分離ステップは別々のクロマトグラフィー装置で行われ、第一ステップで得られた第一中間生成物は第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

特に、第四の実施形態のオプション（ｂ）では、２つの別々のクロマトグラフィー装置を同時に操作して、第二および第三分離ステップを行うことができる。第二および第三分離ステップは別々のクロマトグラフィー装置で行われ、第二ステップで得られた第二中間生成物は第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

特に、第四の実施形態のオプション（ｂ）では、３つの別々のクロマトグラフィー装置を同時に操作して、第一、第二および第三分離ステップを行うことができる。第一、第二および第三分離ステップは別々のクロマトグラフィー装置で行われ、第一ステップで得られた第一中間生成物は第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入され、第二ステップで得られた第二中間生成物は第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

特に、第四の実施形態のオプション（ｂ）では、２つまたは３つの別々のクロマトグラフィー装置を操作する。溶離剤は別々のクロマトグラフィー装置中を別々に循環する。したがって、第一および／または第二ステップで精製され、次の分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される中間生成物中に溶離剤が溶媒として存在し得るもの以外は、溶離剤は別々のクロマトグラフィー装置間で共有されない。第一および第二のならびに／または第二および第三の分離ステップで使用するクロマトグラフィーカラムは、別々のクロマトグラフィー装置間で共有されない。

第一および／または第二分離ステップで中間生成物を得た後で、中間生成物が次の分離ステップでさらに精製される前に、水性有機溶媒の溶離剤を部分的にまたは完全に除去することができる。あるいは、存在する任意の溶媒を除去することなしに、中間生成物をさらに精製することができる。こうした考慮は、上記の実施形態（２）の第二分離ステップで得られた第二中間生成物および上記の実施形態（３）の第一分離ステップで得られた第一中間生成物に関しても適用する。

一般に、装置が本発明の方法に従って使用される限り、本発明の方法の目的として、任意の既知の固定床式または擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置を利用することができる。ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２３３９、ＵＳ２，９８５，５８９、ＵＳ３，６９６，１０７、ＵＳ３，７０６，８１２、ＵＳ３，７６１，５３３、ＦＲ−Ａ−２１０３３０２、ＦＲ−Ａ−２６５１１４８、ＦＲ−Ａ−２６５１１４９、ＵＳ６，９７９，４０２、ＵＳ５，０６９，８８３およびＵＳ４，７６４，２７６に記載されているそうした装置は、本発明の方法に従って構成されれば、全て使用することができる。

上記の第二、第三および第四の実施形態が好ましい。第三および第四の実施形態がより好ましい。ある種の適用に関しては、第三の実施形態が最も適切である。他の適用では、第四の実施形態が最も適切である。

第一から第四の実施形態を、図２を参照してより詳細に例示する。図２の４つ全ての実施形態では、溶離剤の流れは右から左であり、吸着剤の有効な流れは左から右である。第一分離ステップから得られた第一中間生成物を第二分離ステップ用の供給混合液として使用すること、および第二中間生成物を第三分離ステップ用の供給混合液として使用することは、全ての場合で見られる。

ここで図２Ａを参照すると、これは上記の第一の実施形態を図示し、すなわち、第一、第二および第三分離ステップが、単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置において、第一、第二および第三ゾーンでそれぞれ行われる。第一分離ステップが第一ゾーンで行われる。次いで、第一ゾーンで行われた第一分離ステップからの第一中間生成物が、供給混合液として第二ゾーンに送られる。次いで、第二分離ステップが第二ゾーンで行われる。次いで、第二中間生成物が、第二ゾーンで行われた第二分離ステップから第三ゾーンへ、供給混合液として送られる。次いで、第三分離ステップが第三ゾーンで行われる。

ここで図２Ｂを参照すると、これは上記の第二の実施形態を図示し、すなわち、第一および第二分離ステップが、単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置において、第一および第二ゾーンでそれぞれ同時に行われ、第三分離ステップが別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われる。第一分離ステップが第一ゾーンで行われる。次いで、第一ゾーンで行われた第一分離ステップからの第一中間生成物が、供給混合液として第二ゾーンに送られる。第二分離ステップが第二ゾーンで行われる。第二中間生成物が第二ゾーンから収集される。次いで、これは、第三分離ステップ用の供給混合液としてクロマトグラフィー装置に導入される。

ここで図２Ｃを参照すると、これは上記の第三の実施形態を図示し、すなわち、第二および第三分離ステップが、単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置において、第一および第二ゾーンでそれぞれ同時に行われ、第一分離ステップが別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われる。第一分離ステップが、あるクロマトグラフィー装置で行われる。第一中間生成物が第一の装置から収集される。次いで、これは、第二分離ステップ用の供給混合液として別のクロマトグラフィー装置に導入される。第二分離ステップが、第二および第三分離ステップが行われるクロマトグラフィー装置の第一ゾーンで行われる。第一ゾーンで行われた第二分離ステップからの第二中間生成物が、第三分離ステップ用の供給混合液として第二ゾーンに送られる。第三分離ステップは第二ゾーンで行われる。

ここで図２Ｄを参照すると、これは上記の第四の実施形態を図示し、すなわち、（ａ）第一、第二および第三分離ステップが同じクロマトグラフィー装置で順次行われ、第一および第二中間生成物が第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間でそれぞれ回収され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件が、供給混合液に存在する飽和および／もしくは一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように、第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間で調整される、または（ｂ）第一、第二および第三分離ステップの２つもしくは３つが、２つもしくは３つの異なる分離した装置で行われ、第一分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して第二分離ステップが行われ、かつ／もしくは第二分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して第三分離ステップが行われる。

第一分離ステップが固定床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、３つの分離ステップが実現可能ないくつかの方法がある。したがって典型的には、（ａ）第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りである、または
（ｂ）第二および第三分離ステップが同じクロマトグラフィー装置で順次行われ、第二中間生成物が第二と第三の分離ステップの間で回収され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件が、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように、第二と第三の分離ステップの間で調整される、または
（ｃ）第二および第三分離ステップが別々のクロマトグラフィー装置でそれぞれ行われ、第二分離ステップから得られた中間生成物が、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される。

上記の実施形態（ａ）は、上記の実施形態（３）の第二および第三分離ステップと同様の方法で行われる。

上記の実施形態（ｂ）および（ｃ）で使用するクロマトグラフィー装置は、典型的には実施形態（２）の第三分離ステップのために上記で定義された通りである。実施形態（ｂ）および（ｃ）は、上記の実施形態（４）と同様の方法で典型的には行われる。

ある種の実施形態において、２つまたは３つの分離ステップを２つまたは３つのゾーンを有する単一のクロマトグラフィー装置でそれぞれ同時に行うことができることが認識されるであろう。２つの分離ステップが２つのゾーンで同時に行われる擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置において、抽残液または抽出液流は、典型的には、第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入される。３つの分離ステップが３つのゾーンで同時に行われる擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置において、抽残液または抽出液流は、典型的には、第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、抽残液または抽出液流は、典型的には、第二ゾーンのカラムから収集され、第三ゾーンの隣接していないカラムに導入される。これによって、第一および／または第二分離ステップで収集された第一および／または第二中間生成物が、次の分離ステップ用の供給混合液として使用可能になる。

典型的には、第二中間生成物は第二分離ステップで抽残液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物は第三分離ステップで抽出液流として収集される。または、第二中間生成物は第二分離ステップで抽出液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物は第三分離ステップで抽残液流として収集される。

好ましくは、第二中間生成物は第二分離ステップで抽残液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物は第三分離ステップで抽出液流として収集される。

典型的には、第二および第三分離ステップが、単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置において、第一および第二ゾーンでそれぞれ同時に行われる実施形態では、（ａ）第二中間生成物は、第一ゾーンのカラムからのより極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流として収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、次いでそこで、ＰＵＦＡ生成物は、第二ゾーンで行われる第三分離ステップで抽出液流として収集される、または（ｂ）第二中間生成物は、第一ゾーンのカラムからのより極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流として収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、次いでそこで、ＰＵＦＡ生成物は、第二ゾーンで行われる第三分離ステップで抽残液流として収集される。

好ましくは、第二および第三分離ステップが、単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置において、第一および第二ゾーンでそれぞれ同時に行われる実施形態では、第二中間生成物は、第一ゾーンのカラムからのより極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流として収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、次いでそこで、ＰＵＦＡ生成物は第二ゾーンで行われる第三分離ステップで抽出液流として収集される。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、第一中間生成物は、第一分離ステップで抽残液流として典型的には収集される。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、第一中間生成物は、第一分離ステップで抽残液流として典型的には収集され、（ａ）第二中間生成物は第二分離ステップで抽残液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物は第三分離ステップで抽出液流として収集される、または（ｂ）第二中間生成物は第二分離ステップで抽出液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物は第三分離ステップで抽残液流として収集される。

典型的には、第一分離ステップで得られた第一中間生成物は供給混合液と比較してＰＵＦＡ生成物が豊富であり、かつ／または第二分離ステップで得られた第二中間生成物は第一中間生成物と比較してＰＵＦＡ生成物が豊富である。

好ましくは、第一分離ステップで得られた第一中間生成物は、供給混合液と比較してＰＵＦＡ生成物が豊富であり、第二分離ステップで得られた第二中間生成物は、第一中間生成物と比較してＰＵＦＡ生成物が豊富である。

典型的には、第一分離ステップで得られた第一中間生成物は飽和および／または一不飽和脂肪酸が供給混合液と比較して欠乏している。

典型的には、第一ステップでは、ＰＵＦＡ生成物より極性が低い供給混合液成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、第二ステップでは、ＰＵＦＡ生成物より極性が低いが第一分離ステップで分離された成分より極性が高い供給混合液成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、第三分離ステップでは、ＰＵＦＡ生成物より極性が高い成分からＰＵＦＡ生成物が分離される。

あるいは、第一ステップでは、ＰＵＦＡ生成物より極性が低い供給混合液成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、第二ステップでは、ＰＵＦＡ生成物より極性が高い供給混合液成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、第三分離ステップでは、ＰＵＦＡ生成物より極性が低いが第一分離ステップで分離された成分より極性が高い成分からＰＵＦＡ生成物が分離される。

ＰＵＦＡ生成物より極性が低い、第一ステップで分離された供給混合液成分は、典型的には不飽和および／または一不飽和脂肪酸である。

ＰＵＦＡ生成物より極性が低いが第一分離ステップで分離された成分より極性が高い供給混合液成分としては、典型的には、ＤＨＡもしくはＤＨＡ誘導体および／またはＰＵＦＡ生成物より極性が低いが第一分離ステップで分離された成分より極性が高い他のＰＵＦＡもしくはＰＵＦＡ誘導体が挙げられる。

ＰＵＦＡ生成物より極性が高い供給混合液成分としては、ＳＤＡもしくはＳＤＡ誘導体および／またはＰＵＦＡ生成物より極性が高い他のＰＵＦＡが挙げられる。

ＥＰＡ以外のＰＵＦＡは周知であり、これには、ω−３およびω−６ＰＵＦＡが含まれる。ω−３ＰＵＦＡの例としては、αリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。ω−６ＰＵＦＡの例としては、リノール酸（ＬＡ）、γリノレン酸（ＧＬＡ）、エイコサジエン酸、ジホモγリノレン酸（ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ドコサジエン酸、アドレン酸およびドコサペンタエン（ω−６）酸が挙げられる。

各分離ステップで使用するカラム数は特に制限されない。当業者なら、使用するのに適したカラム数を容易に決定することができるであろう。カラム数は、典型的には４個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは８個以上、例えば４、５、６、７、８、９または１０個のカラムである。好ましい実施形態では、５または６個のカラム、より好ましくは６個のカラムが使用される。別の好ましい実施形態では、７または８個のカラム、より好ましくは８個のカラムが使用される。典型的には、２５個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下のカラムが存在する。

２つの分離ステップが、単一のクロマトグラフィー装置において、第一および第二ゾーンでそれぞれ同時に行われる実施形態では、各ゾーンのカラム数は、典型的には４個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは８個以上、例えば４、５、６、７、８、９または１０個のカラムである。

３つの分離ステップが、単一のクロマトグラフィー装置において、第一、第二および第三ゾーンでそれぞれ同時に行われる実施形態では、各ゾーンのカラム数は、典型的には４個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは８個以上、例えば４、５、６、７、８、９または１０個のカラムである。

第一、第二および第三分離ステップは、典型的には同じカラム数を含む。ある種の適用に関しては、それらは異なる数のカラムを有してもよい。

使用するカラムの寸法は特に制限されておらず、精製される供給混合液の容積に依存することになる。当業者なら、使用するのに適したサイズのカラムを容易に決定することができるであろう。各カラムの直径は、典型的には１０から１０００ｍｍの間、好ましくは１０から５００ｍｍの間、より好ましくは２５から２５０ｍｍの間、さらにより好ましくは５０から１００ｍｍの間、最も好ましくは７０から８０ｍｍの間である。各カラムの長さは、典型的には１０から３００ｃｍの間、好ましくは１０から２００ｃｍの間、より好ましくは２５から１５０ｃｍの間、さらにより好ましくは７０から１１０ｃｍの間、最も好ましくは８０から１００ｃｍの間である。

第一、第二および第三分離ステップは、典型的には同じ寸法を有するカラムを含むが、ある種の適用に関しては、それらは異なる寸法を有してもよい。

カラムの流速は、一連のカラムにわたる最大圧力によって制限され、カラムの寸法および固相の粒径に依存することになる。当業者なら、効率的な脱着を確実にするために各カラム寸法について必要とされる流速を容易に確立することができるであろう。一般に、より大きな直径のカラムは、カラムを通る直線的な流動を維持するのにより大きな流速を必要とする。

上記で概要を述べた典型的なカラムサイズに関しては、典型的には、第一または第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置中への溶離剤の流速は、１から４．５Ｌ／分、好ましくは１．５から２．５Ｌ／分である。典型的には、第一または第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置からの抽出液の流速は、０．１から２．５Ｌ／分、好ましくは０．５から２．２５Ｌ／分である。第一または第二分離ステップからの抽出液の一部を第一または第二分離ステップで使用した装置中に再循環させる実施形態では、再循環の流速は、典型的には０．７から１．４Ｌ／分、好ましくは約１Ｌ／分である。典型的には、第一または第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置からの抽残液の流速は、０．２から２．５Ｌ／分、好ましくは０．３から２．０Ｌ／分である。第一または第二分離ステップからの抽残液の一部を第一または第二分離ステップで使用した装置中に再循環する実施形態では、再循環の流速は、典型的には０．３から１．０Ｌ／分、好ましくは約０．５Ｌ／分である。典型的には、第一または第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置中への供給混合液の導入の流速は、５から１５０ｍＬ／分、好ましくは１０から１００ｍＬ／分、より好ましくは２０から６０ｍＬ／分である。

上記で概要を述べた典型的なカラムサイズに関しては、典型的には、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置中への溶離剤の流速は、１から４Ｌ／分、好ましくは１．５から３．５Ｌ／分である。典型的には、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置からの抽出液の流速は、０．５から２Ｌ／分、好ましくは０．７から１．９Ｌ／分である。第三分離ステップからの抽出液の一部を第三分離ステップで使用した装置中に再循環する実施形態では、再循環の流速は、典型的には０．６から１．４Ｌ／分、好ましくは０．７から１．１Ｌ／分、より好ましくは約０．９Ｌ／分である。典型的には、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置からの抽残液の流速は、０．５から２．５Ｌ／分、好ましくは０．７から１．８Ｌ／分、より好ましくは約１．４Ｌ／分である。第三分離ステップからの抽残液の一部を第三分離ステップで使用した装置中に再循環する実施形態では、再循環の流速は、典型的には０．３から１．０Ｌ／分、好ましくは約０．５Ｌ／分である。

当業者なら認識するように、様々な抽出液および抽残液流を介して液体が収集されるまたは除去される速度への言及は、ある時間内に除去される液体の容積、典型的にはＬ／分を指す。同様に、液体が装置中に、典型的には装置の隣接したカラムに再循環される速度への言及は、ある時間内に再循環される液体の容積、典型的にはＬ／分を指す。

ステップ時間、すなわち、供給混合液および溶離剤の注入ポイントと収集画分の様々な分岐ポイントとをシフトする間の時間は、特に制限されず、使用するカラムの数および寸法ならびに装置を通る流速に依存することになる。当業者なら、本発明の方法で使用するのに適したステップ時間を容易に決定することができるであろう。ステップ時間は、典型的には１００から１０００秒、好ましくは２００から８００秒、より好ましくは約２５０から約７５０秒である。いくつかの実施形態では、１００から４００秒、好ましくは２００から３００秒、より好ましくは約２５０秒のステップ時間が適する。他の実施形態では、６００から９００秒、好ましくは７００から８００秒、より好ましくは約７５０秒のステップ時間が適する。

本発明の方法では、実移動床式クロマトグラフィーが好ましい。

実および擬似移動床システム用の当技術分野で既知の従来の吸着剤を本発明の方法で使用できる。各クロマトグラフィーカラムは、同一または異なる吸着剤を含んでいてもよい。典型的には、各カラムは同じ吸着剤を含む。一般に使用されるそうした材料の例としては、ポリマービーズ、好ましくはＤＶＢ（ジビニルベンゼン）と網状化したポリスチレン；およびシリカゲル、好ましくはＣ８またはＣ１８アルカン、特にＣ１８と結合した逆相シリカゲルがある。Ｃ１８結合逆相シリカゲルが好ましい。本発明の方法で使用する吸着剤は、好ましくは非極性である。

吸着剤固定相材料の形状は、例えば、球状のまたは非球状のビーズ、好ましくは実質的に球状のビーズであってもよい。そうしたビーズは、５から５００ミクロン、好ましくは１０から５００ミクロン、より好ましくは１５から５００ミクロン、より好ましくは４０から５００ミクロン、より好ましくは１００から５００ミクロン、より好ましくは２５０から５００ミクロン、さらにより好ましくは２５０から４００ミクロン、最も好ましくは２５０から３５０ミクロンの直径を典型的には有する。いくつかの実施形態では、５から３５ミクロン、典型的には１０から３０ミクロン、好ましくは１５から２５ミクロンの直径を有するビーズを使用することができる。いくつかの好ましい粒径は、擬似および実移動床式方法で過去に使用されたビーズの粒径よりも幾分大きい。より大きな粒子を使用することによって、システムで使用される溶離剤の圧力をより低くすることができる。ひいては、これは、費用節約、効率および装置の寿命の点から利点を有する。より大きな粒径の吸着剤ビーズが、（その付随する利点を伴って）分解能を少しも低下させることなしに、本発明の方法で使用できることが驚いたことに見出された。

吸着剤は、１０から５０ｎｍ、好ましくは１５から４５ｎｍ、より好ましくは２０から４０ｎｍ、最も好ましくは２５から３５ｎｍの孔径を典型的には有する。

典型的には、本発明の方法は、１５から５５℃、好ましくは２０から４０℃、より好ましくは約３０℃で行われる。したがって、本方法は典型的には室温で行われるが、高温で行うこともできる。

前述のように、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離される。これは、第一、第二および第三分離ステップが行われるクロマトグラフィー装置またはクロマトグラフィー装置のゾーンのプロセス条件を調整することによって、典型的にはもたらされる。

したがって、第一、第二および第三分離ステップのプロセス条件は典型的には変化する。変化させるプロセス条件としては、例えば、使用するカラムのサイズ、使用するカラム数、カラムで使用する充填物、ＳＭＢ装置のステップ時間、装置の温度、分離ステップで使用する溶離剤または装置で使用する流速、特に抽出液または抽残液流を介して収集された液体の再循環速度を挙げることができる。

好ましくは変化させるプロセス条件は、分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率および／または分離ステップにおいて抽出液もしくは抽残液流を介して収集された液体の再循環速度である。これらのオプションの両方を以下により詳細に論じる。

典型的には、第二分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または第二分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または第三分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第三分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または第三分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第三分離ステップで使用した装置に再循環される。

好ましくは、第二分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、第二分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、第三分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第三分離ステップで使用した装置に再循環され、第三分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第三分離ステップで使用した装置に再循環される。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、典型的には、第一分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第一分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または第一分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第一分離ステップで使用した装置に再循環される。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、好ましくは、第一分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第一分離ステップで使用した装置に再循環され、第一分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第一分離ステップで使用した装置に再循環され、第二分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、第二分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、第三分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部は、第三分離ステップで使用した装置に再循環され、第三分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部は、第三分離ステップで使用した装置に再循環される。

この再循環は、抽出液または抽残液流の一部を、第一、第二または第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置からそのステップで使用した装置、典型的には隣接したカラムに再供給することを含む。この隣接したカラムは、システムにおける溶離剤の流れに対して下流にある隣接したカラムである。

２つまたは３つの分離ステップが単一のクロマトグラフィーで２つまたは３つのゾーンでそれぞれ同時に行われる場合は、この再循環は、あるゾーンから除去された特定の抽出液または抽残液流を同一ゾーンに再循環することを含む。

特定の分離ステップで抽出液または抽残液流を介して収集された液体がその分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置またはゾーンに再循環される速度は、その流れを介して収集された液体がそのステップで使用した装置に、典型的には隣接したカラム、すなわち、システムにおける溶離剤の流れに対して下流のカラムに再供給される速度である。

このことは、図５の好ましい実施形態を参照することで理解することができる。第一分離ステップにおける抽出液の再循環の速度は、第一分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム２の底部から収集された抽出液が第一分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム３の頂部に供給される速度、すなわち、第一分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム３の頂部への液体の流速である。

第二分離ステップにおける抽出液の再循環の速度は、第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム１０の底部で収集された抽出液が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム１１の頂部に供給される速度、すなわち、第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム１１の頂部への液体の流速である。

第三分離ステップにおける抽出液の再循環の速度は、第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム１９の底部で収集された抽出液が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム１９の頂部に供給される速度、すなわち、第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム１９の頂部への液体の流速である。

第一、第二および／または第三分離ステップにおける抽出液および／または抽残液流の再循環は、その分離ステップでその流れを介して収集された液体を容器に供給し、次いで、ある量のその液体を、その分離ステップで使用した装置またはゾーン、典型的には隣接したカラムにその容器からポンプで戻すことによって典型的にはもたらされる。この場合、第一および／または第二分離ステップで特定の抽出液または抽残液流を介して収集された液体の、典型的には隣接したカラムに戻される再循環の速度は、液体が、クロマトグラフィー装置またはゾーン、典型的には隣接したカラムに容器からポンプで戻される速度である。

当業者なら認識するように、溶離剤および供給原料流を介してクロマトグラフィー装置に導入される液体の量は、装置から除去され、その装置に再循環される液体の量と釣り合っている。

したがって、図５を参照すると、抽出液流については、第二および第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置（複数可）への溶離剤（脱着剤）の流速（Ｄ）は、その分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が容器に蓄積する速度（Ｅ２およびＥ３）を、その特定の分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される抽出液の速度（Ｄ−Ｅ２およびＤ−Ｅ３）に加えたものに等しい。

ある分離ステップからの抽残液流については、その特定の分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に抽出液が再循環される速度（Ｄ−Ｅ１およびＤ−Ｅ２）を、供給原料がその特定の分離ステップで使用されるクロマトグラフィー装置に導入される速度（ＦおよびＲ１）に加えた速度は、その特定の分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が容器に蓄積する速度（Ｒ１およびＲ２）を、その特定の分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に抽残液が再循環される速度（Ｄ＋Ｆ−Ｅ１−Ｒ１およびＤ＋Ｒ１−Ｅ２−Ｒ２）に加えたものに等しい。

クロマトグラフィー装置またはゾーンからの特定の抽出液または抽残液流から収集された液体が容器に蓄積する速度は、そのクロマトグラフィー装置からその抽出液または抽残液流が除去される正味の速度と考えることもできる。

典型的には、第二分離ステップで抽出液および抽残液流の片方もしくは両方を介して収集された液体がその分離ステップで使用した装置に再循環される速度は、供給混合液に存在する飽和および／もしくは一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整され、かつ／または収集された液体が第三分離ステップで抽出液および抽残液流の片方もしくは両方を介してその分離ステップで使用した装置に再循環される速度は、供給混合液に存在する飽和および／もしくは一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

好ましくは、第二分離ステップで抽出液および抽残液流の片方もしくは両方を介して収集された液体がその分離ステップで使用した装置に再循環される速度は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整され、第三分離ステップで抽出液および抽残液流の片方もしくは両方を介して収集された液体がその分離ステップで使用した装置に再循環される速度は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、第一分離ステップで抽出液および抽残液流の片方もしくは両方を介して収集された液体がその分離ステップで使用した装置に再循環される速度は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように典型的には調整される。

典型的には、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは異なり、かつ／または第二分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは異なる。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む場合は、第一分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第一分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは典型的には異なり、かつ／または第一分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第一分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第二分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは典型的には異なる。

第一、第二および／または第三分離ステップで抽出液および／または抽残液流を介して収集された液体がその特定の分離ステップで使用した装置に再循環される速度を変化させることは、抽出液および抽残液流に存在するより極性が高いおよびより極性が低い成分の量を変化させる効果がある。したがって、例えば、抽出液の再循環速度が低下すると、抽残液流まで運ばれる、その分離ステップのより極性が低い成分が少なくなる。抽出液の再循環速度が高くなると、抽残液流まで運ばれる、その分離ステップのより極性が低い成分が多くなる。

このことは、例えば本発明の図５に示す特定の実施形態で理解することができる。第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体がその分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度（Ｄ−Ｅ２）は、任意の成分Ａが第二分離ステップで抽残液流まで運ばれる程度（Ｒ２）に影響を及ぼす。

典型的には、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。好ましくは、より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流は、第二分離ステップから収集されて第三分離ステップで精製され、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。

あるいは、第二分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。好ましくは、より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流は、第二分離ステップから収集されて第三分離ステップで精製され、第二分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽残液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。

供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように再循環速度が調整される場合は、再循環速度が異なる分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率は、同じでもよいし、異なっていてもよい。

本発明の方法で使用する溶離剤は、水性有機溶媒である。

水性有機溶媒は、水および１種もしくは複数のアルコール、エーテル、エステル、ケトンもしくはニトリルまたはそれらの混合液を典型的には含む。

アルコール溶媒は当業者に周知である。アルコールは、典型的には短鎖アルコールである。アルコールは典型的には式ＲＯＨのものであり、式中、Ｒは直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基である。Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、好ましくは無置換である。アルコールの例としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、ｓ−ブタノールおよびｔ−ブタノールが挙げられる。メタノールおよびエタノールが好ましい。メタノールがより好ましい。

エーテル溶媒は当業者に周知である。エーテルは、典型的には短鎖エーテルである。エーテルは典型的には式Ｒ−Ｏ−Ｒ’のものであり、式中、ＲおよびＲ’は同一または異なっており、直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、好ましくは無置換である。好ましいエーテルとしては、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）が挙げられる。

エステル溶媒は当業者に周知である。エステルは、典型的には短鎖エステルである。エステルは典型的には式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’のものであり、式中、ＲおよびＲ’は同一または異なっており、直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。好ましいエステルとしては、酢酸メチルおよび酢酸エチルが挙げられる。

ケトン溶媒は当業者に周知である。ケトンは典型的には短鎖ケトンである。ケトンは典型的には式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ’のものであり、式中、ＲおよびＲ’は同一または異なっており、直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、好ましくは無置換である。好ましいケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）が挙げられる。

ニトリル溶媒は当業者に周知である。ニトリルは典型的には短鎖ニトリルである。ニトリルは典型的には式Ｒ−ＣＮのものであり、式中、Ｒは直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、好ましくは無置換である。好ましいニトリルとしては、アセトニトリルが挙げられる。

典型的には、水性有機溶媒は水性アルコールまたは水性アセトニトリルである。

水性有機溶媒は、好ましくは水性メタノールまたは水性アセトニトリルである。水性メタノールがより好ましい。

典型的には、溶離剤は超臨界状態でない。典型的には、溶離剤は液体である。

典型的には、水：有機溶媒の平均比率、例えば装置全体の溶離剤の水：メタノールの比率は、０．１：９９．９から９：９１重量％、好ましくは０．２５：９９．７５から７：９３重量％、より好ましくは０．５：９９．５から６：９４重量％である。

水性有機溶媒が水性アセトニトリルである場合は、溶離剤は、３０重量％までの水、残りのアセトニトリルを典型的には含む。好ましくは、溶離剤は、５から２５重量％の水、残りのアセトニトリルを含む。より好ましくは、溶離剤は、１０から２０重量％の水、残りのアセトニトリルを含む。さらにより好ましくは、溶離剤は、１５から２５重量％の水、残りのアセトニトリルを含む。

典型的には、各分離ステップで使用する水：有機溶媒比率は、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される。

典型的には、２つ以上の分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、異なる水：有機溶媒比率を有する。一実施形態では、各分離ステップで使用する水：有機溶媒比率は、異なる水：有機溶媒比率を有する。

２つ以上の分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は、典型的には異なる。有機溶媒の選択によっては、それらは水よりも強力な脱着試薬であり得る。あるいは、それらは、水よりも強力でない脱着試薬であり得る。例えば、アセトニトリルおよびアルコールは水よりも強力な脱着試薬である。

好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、同じ水：有機溶媒比率を有し、第一分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、第二および第三分離ステップで使用する有機溶媒の溶離剤と異なる水：有機溶媒比率を有する。

この好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は同じであり、かつ／または第一分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は第二分離ステップで使用する溶離剤の溶離力より大きい。好ましくは、本実施形態では、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は同じであり、第一分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の溶離力より大きい。本実施形態では、水性有機溶媒が水性アルコールまたはアセトニトリルである場合は、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤中のアルコールまたはアセトニトリルの量は典型的には同じであり、第一分離ステップで使用する溶離剤中のアルコールまたはアセトニトリルの量は、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤中のアルコールまたはアセトニトリルの量より典型的には多い。したがって、本実施形態では、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は典型的には同じであり、第一分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率より典型的には低い。

この好ましい実施形態では、第一分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、典型的には０：１００から５：９５重量％、好ましくは０．１：９９．９から２．５：９７．５重量％、より好ましくは０．１：９９．９から２：９８重量％、さらにより好ましくは０．１：９９．９から１：９９重量％、さらにより好ましくは０．２５：９９．７５から０．７５：９９．２５重量％、最も好ましくは約０．５：９９．５である。この好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、典型的には５：９５から１１：８９重量％、好ましくは６：９４から１０：９０重量％、より好ましくは７：９３から９：９１重量％、さらにより好ましくは７．５：９２．５から８．５：９１．５重量％、最も好ましくは約８：９２重量％である。

この好ましい実施形態では、第一分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率は、好ましくは０．１：９９．９から１：９９重量％であり、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率は、好ましくは７：９３から９：９１重量％である。

代替の実施形態では、各分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、異なる水：有機溶媒比率を有する。

この代替の実施形態では、第一分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は、第二分離ステップで使用する溶離剤の溶離力より大きく、かつ／または第二分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は、第三分離ステップで使用する溶離剤の溶離力より大きい。好ましくは、より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流は、第二分離ステップから収集されて第三分離ステップで精製され、第二分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は、第三分離ステップで使用する溶離剤の溶離力より大きい。あるいは、より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流は、第二分離ステップから収集されて第三分離ステップで精製され、第二分離ステップで使用する溶離剤の溶離力は第三分離ステップで使用する溶離剤の溶離力より低い。

実際には、これは、各分離ステップで使用する水および有機溶媒の相対量を変化させることによって達成される。本実施形態では、水性有機溶媒が水性アルコールまたはアセトニトリルである場合は、第一分離ステップで使用する溶離剤中のアルコールもしくはアセトニトリルの量は、第二分離ステップで使用する溶離剤のアルコールもしくはアセトニトリルの量より典型的には多く、かつ／または第二分離ステップで使用する溶離剤のアルコールもしくはアセトニトリルの量は、第三分離ステップで使用する溶離剤のアルコールもしくはアセトニトリルの量より典型的には多い。したがって、本実施形態では、第一分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率より典型的には低く、かつ／または第二分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率より典型的には低い。

上記で言及した各分離ステップの水と有機溶媒の比率はクロマトグラフィー装置全体の平均比率であることが認識されるであろう。

典型的には、各分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置の１個または複数のカラムに水および／または有機溶媒を導入することによって制御される。したがって、例えば、第二および第三分離ステップよりも低い、第一分離ステップの水：有機溶媒比率を達成するためには、水は、典型的には、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に第二および第三分離ステップよりもゆっくりと導入される。

いくつかの実施形態では、実質的に純粋な有機溶媒および実質的に純粋な水を、各分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置の異なるポイントで導入することができる。これら２つの流れの相対的な流速は、クロマトグラフィー装置の全体的な溶媒プロファイルを決定する。他の実施形態では、異なる有機溶媒／水混合液を、各分離ステップで使用する各クロマトグラフィー装置の異なるポイントで導入することができる。それは、異なる有機溶媒：水の比率を有する２つ以上の異なる有機溶媒／水混合液を、特定の分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入することを含む。本実施形態の有機溶媒／水混合液の相対的な流速および相対的な濃度は、その分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置の全体的な溶媒プロファイルを決定する。

好ましくは、第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、同じ水：有機溶媒比率を有し、第一分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、第二および第三分離ステップで使用する有機溶媒の溶離剤とは異なる水：有機溶媒比率を有し、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは異なる。

より好ましくは、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は同じであり、第一分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率より低く、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。

さらにより好ましくは、
第一分離ステップは擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、
第二および第三分離ステップは、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップは第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りであり、第一分離ステップは別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われ、
第一中間生成物は第一分離ステップで抽残液流として収集され、第二中間生成物は第二分離ステップで抽残液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物は第三分離ステップで抽出液流として収集され、
より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む第二中間生成物抽残液流は、第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、
第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、同じ水：有機溶媒比率を有し、第一分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率より低く、
第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。

第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りであり、第一分離ステップは別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われることが好ましい。このことの好ましい実施形態を図３に図示する。

ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）ならびにより極性が高い（Ｃ）およびより極性が低い（Ａ’）および（Ａ）成分を含む供給混合液Ｆが、第一分離ステップで精製される。第一分離ステップでは、最も極性が低い成分（例えば、飽和脂肪酸および／または一不飽和脂肪酸）（Ａ’）が、抽出液流Ｅ１として除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）、より極性が高い成分（Ｃ）およびより極性が低い（しかし（Ａ’）より極性が高い）成分（Ａ）が、抽残液流Ｒ１として収集される。抽残液流Ｒ１は、次いで第二分離ステップで精製される中間生成物である。

第二分離ステップでは、より極性が低い成分（Ａ）が抽出液流Ｅ２として除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）およびより極性が高い成分（Ｃ）が、抽残液流Ｒ２として収集される。抽残液流Ｒ２は、次いで第三分離ステップで精製される中間生成物である。

第三分離ステップでは、より極性が高い成分（Ｃ）が抽残液流Ｒ３として除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）が、抽出液流Ｅ３として収集される。第二および第三分離ステップが、単一のＳＭＢクロマトグラフィー装置の２つのゾーンで行われる。

本実施形態を、図４でより詳細に図示する。図４は、各クロマトグラフィー装置への水性有機溶媒の脱着剤の導入ポイント（Ｄ）が示されていることを除いて、図２と同じである。

この最も好ましい実施形態で使用するための典型的な溶媒は、水性アルコールまたは水性アセトニトリル、好ましくは水性メタノールである。

典型的には、この好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、同じ水：有機溶媒比率を有し、第一分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、第二および第三分離ステップで使用する有機溶媒の溶離剤とは異なる水：有機溶媒比率を有し、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは異なる。

好ましくは、この好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は同じであり、第一分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率より低く、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。

この好ましい実施形態では、第一分離ステップの第一抽残液流は、溶離剤の流れに対して、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置へ供給混合液を導入するポイントの下流で典型的には除去される。

この特に好ましい実施形態では、第一分離ステップの第一抽出液流は、溶離剤の流れに対して、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置へ供給混合液を導入するポイントの上流で典型的には除去される。

この特に好ましい実施形態では、第二分離ステップの第二抽残液流は、溶離剤の流れに対して、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置へ第一中間生成物を導入するポイントの下流で典型的には除去される。

この特に好ましい実施形態では、第二分離ステップの第二抽出液流は、溶離剤の流れに対して、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置へ第一中間生成物を導入するポイントの上流で典型的には収集される。

この特に好ましい実施形態では、第三分離ステップの第三抽残液流は、溶離剤の流れに対して、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置へ第二中間生成物を導入するポイントの下流で典型的には除去される。

この特に好ましい実施形態では、第三分離ステップの第三抽出液流は、溶離剤の流れに対して、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置への第二中間生成物を導入するポイントの上流で典型的には収集される。

典型的には、この好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、溶離剤の流れに対して、第一抽出液流を除去するポイントの上流で、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される。

典型的には、この好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、溶離剤の流れに対して、第二抽出液流を除去するポイントの上流で、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される。

典型的には、この好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、溶離剤の流れに対して、第三抽出液流を除去するポイントの上流で、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される。

図３および４に図示される本発明のより好ましい実施形態を図５に示す。これは、各分離ステップで使用するカラム数を図示し、供給混合液および溶離剤の典型的な導入ポイントならびに抽出液および抽残液流の典型的な除去ポイントを示す。

したがって、このより好ましい実施形態では、第一分離ステップで使用するＳＭＢクロマトグラフィー装置は、８個のクロマトグラフィーカラム、１から８からなる。第二分離ステップで使用するＳＭＢクロマトグラフィー装置は、８個のクロマトグラフィーカラム、９から１６からなる。第三分離ステップで使用するＳＭＢクロマトグラフィー装置は、７個のクロマトグラフィーカラム、１７から２３からなる。

各装置では、カラムは、（第一分離ステップの場合は）カラム１の底部がカラム２の頂部に連結し、カラム２の底部がカラム３の頂部に連結し、．．．など．．．、カラム８の底部がカラム１の頂部に連結するように、典型的には連続して配置される。こうした連結は、場合によっては保持容器を介して、再循環流を次のカラムに入れてもよい。このシステムを通じての溶離剤の流れは、カラム１からカラム２、カラム２からカラム３などである。このシステムを通じての吸着剤の有効な流れは、カラム８からカラム７、カラム７からカラム６などである。

このより好ましい実施形態では、ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）ならびにより極性が高い（Ｃ）およびより極性が低い（Ａ’）および（Ａ）成分を含む供給混合液Ｆは、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム５の頂部に導入される。水性有機溶媒の脱着剤は、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１の頂部に導入される。第一分離ステップでは、最も極性が低い成分（例えば、飽和脂肪酸および／または一不飽和脂肪酸）（Ａ’）は、抽出液流Ｅ１としてカラム２の底部から除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）、より極性が高い成分（Ｃ）およびより極性が低い（しかし（Ａ’）より極性が高い）成分（Ａ）は、抽残液流Ｒ１としてカラム６の底部から収集される。

抽残液流Ｒ１は、次いで第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置にカラム１３の頂部で導入されることによって第二分離ステップで精製される、第一中間生成物である。水性有機溶媒の脱着剤は、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラムＤの頂部に導入される。

第二分離ステップでは、より極性が低い成分（Ａ）は、抽出液流Ｅ２としてカラム１０の底部で除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）およびより極性が高い成分（Ｃ）は、抽残液流Ｒ２としてカラム１４の底部で収集される。抽残液流Ｒ２は、次いで第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置にカラム２１の頂部で導入されることによって第三分離ステップで精製される、中間生成物である。

第三分離ステップでは、より極性が高い成分（Ｃ）は、抽残液流Ｒ３としてカラム２２の底部で除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）は、抽出液流Ｅ３としてカラム１８の底部で収集される。第二および第三分離ステップは、単一のＳＭＢクロマトグラフィー装置の２つのゾーンで行われる。

このより好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１の頂部に典型的には導入される。

このより好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム９の頂部に典型的には導入される。

このより好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１７の頂部に典型的には導入される。

このより好ましい実施形態では、供給流は、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム５の頂部に典型的には導入される。

このより好ましい実施形態では、第一抽残液流は、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム６の底部から、第一中間生成物として典型的には収集される。この第一中間生成物は、次いで第二分離ステップで精製され、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１３の頂部に典型的には導入される。第一抽残液流は、第二分離ステップで精製される前に、場合によっては容器に収集されてもよい。

このより好ましい実施形態では、第一抽出液流は、第一分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム２の底部から、典型的には除去される。第一抽出液流は、場合によっては容器に収集され、第一分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置のカラム３の頂部に再導入されてもよい。

このより好ましい実施形態では、第二抽残液流は、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１４の底部から第二中間生成物として典型的には収集される。この第二中間生成物は、次いで第三分離ステップで精製され、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム２１の頂部に典型的には導入される。第二抽残液流は、第二分離ステップで精製される前に、場合によっては容器に収集されてもよい。

このより好ましい実施形態では、第二抽出液流は、第二分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１０の底部から、典型的には除去される。

このより好ましい実施形態では、第三抽出液流は、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１８の底部から典型的には収集される。この第三抽出液流は、精製されたＰＵＦＡ生成物を典型的には含む。第三抽出液流は、場合によっては容器に収集され、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム１９の頂部に再導入されてもよい。

このより好ましい実施形態では、第三抽残液流は、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置のカラム２２の底部から、典型的には除去される。

典型的には、このより好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、同じ水：有機溶媒比率を有し、第一分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤は、第二および第三分離ステップで使用する有機溶媒の溶離剤とは異なる水：有機溶媒比率を有し、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは異なる。

好ましくは、このより好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は同じであり、第一分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二および第三分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率より低く、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度は、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い。

このより好ましい実施形態では、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率は同じであり、それは７：９３から９：９１重量％であり、第一分離ステップの溶離剤の水：有機溶媒比率は、０．１：９９．９から１：９９重量％である。

こうした好ましいおよびより好ましい実施形態は、上記で論じた図２Ｃに関して示されるが、それらは、以下のように設計された装置を用いて行うことができる：
第一分離ステップが擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第一、第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第一、第二および第三分離ステップが第一、第二および第三ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りである、または
第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りであり、第一分離ステップは、別の擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置で行われる、または
第一分離ステップが擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、（ａ）第一、第二および第三分離ステップが同じクロマトグラフィー装置で順次行われ、第一および第二中間生成物が、第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間でそれぞれ回収され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件が、供給混合液に存在する飽和および／もしくは一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように、第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間で調整される、もしくは
（ｂ）第一分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して第二分離ステップが行われ、かつ／もしくは第二分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して第三分離ステップが行われる、または
第一分離ステップが固定床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは本明細書で定義した通りである、または
第一分離ステップが固定床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第二および第三分離ステップが同じクロマトグラフィー装置で順次行われ、第二中間生成物が第二と第三の分離ステップの間で回収され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件が、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように第二と第三の分離ステップの間で調整される、または
第一分離ステップが固定床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第二および第三分離ステップが別々のクロマトグラフィー装置でそれぞれ行われ、第二分離ステップから得られた中間生成物が、第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される。

本発明の方法によって、従来のクロマトグラフィー手法を用いて可能であったよりもはるかに高い純度のＰＵＦＡ生成物を実現することができる。本発明の方法によって生成されるＰＵＦＡ生成物は、特に好都合な不純物プロファイルも有し、それは、既知の手法によって調製された油で観察されるものとは全く異なる。したがって、本発明は、ＰＵＦＡ生成物、例えば本発明の方法によって得られるＰＵＦＡ生成物を含む組成物にも関する。

実際には、本発明の方法は、通常、コンピューターによって制御される。したがって、本発明は、本明細書で定義したようにクロマトグラフィー装置を制御するためのコンピュータープログラムであって、実行時に、装置に指示して本発明の方法を実施させるコード手段を含むコンピュータープログラムを提供する。

以下の実施例は、本発明を例示するものである。
実施例

図５に概略的に図示するシステムによって、固定相として結合Ｃ１８シリカゲルおよび溶離剤として水性メタノールを用いる実移動床式クロマトグラフィーシステムを使用して、魚油に由来する供給原料（５５重量％ＥＰＡ ＥＥ、５重量％ ＤＨＡ ＥＥ）を分画する。供給混合液のＧＣトレースを図７として示す。

図５に示すように、第一分離ステップでは、供給混合液を、連続してつながった８個のカラム１から８（直径：１５２ｍｍ、長さ：８１３ｍｍ）を有するＳＭＢ装置を通過させた。プロセス条件を調整して、飽和および一不飽和成分を供給混合液から抽出液流として除去した。０．５：９９．５重量％の水：メタノール溶離剤を使用した。抽残液流を第一中間生成物として保持した。第一中間生成物のＧＣトレースを図８として示す。

第一中間生成物を、第一ゾーンに８個のカラム、カラム９から１６を、および第二ゾーンに７個のカラム、カラム１７から２３を持つ２つのゾーンを有するＳＭＢ装置を通過させた。８：９２重量％の水：メタノール溶離剤を、第一および第二ゾーンの両方、すなわち、第二および第三分離ステップの両方で使用した。第一ゾーンのプロセス条件を調整して、ＤＨＡなどの緩徐な移動成分からＥＰＡを精製し、緩徐な移動成分を抽出液流として除去した。抽残液流を第二中間生成物として保持した。第二中間生成物のＧＣトレースを図９として示す。

次いで、第二中間生成物を第二ゾーンに導入し、より急速な移動成分から分離し、より急速な移動成分を抽残液流として除去した。高純度のＥＰＡを抽出液流として第二ゾーンから収集した。ＥＰＡ ＰＵＦＡ生成物のＧＣトレースを図１０として示す。

９７％を超える最終的な純度でＥＰＡを生成した。

３つの分離ステップを総合した場合、抽出液の蓄積の全体的な速度（Ｅ１＋Ｅ２＋Ｅ３）は３８７６ｍｌ／分であったと理解することができる。

各分離ステップのためのプロセス条件は以下の通りである。

第一分離ステップ
供給原料の供給速度：９４ｍｌ／分
脱着剤の供給速度：６２５０ｍｌ／分
抽出液の蓄積速度：１２５０ｍｌ／分
抽出液の再循環速度：５０００ｍｌ／分
抽残液の蓄積速度：１６８８ｍｌ／分
サイクル時間：６００秒

第二分離ステップ
第一中間生成物の供給速度：４０ｍｌ／分
脱着剤の供給速度：６３１３ｍｌ／分
抽出液の蓄積速度：１１８８ｍｌ／分
抽出液の再循環速度：５１２５ｍｌ／分
抽残液の蓄積速度：１６２５ｍｌ／分
サイクル時間：１２００秒

第三分離ステップ
第二中間生成物の供給速度：４０ｍｌ／分
脱着剤の供給速度：６１８９ｍｌ／分
抽出液の蓄積速度：１４３８ｍｌ／分
抽出液の再循環速度：４７５０ｍｌ／分
抽残液の蓄積速度：１４３８ｍｌ／分
サイクル時間：１０８０秒

比較例１
実施例１で使用したものと同じ供給混合液から９７％を超えるＥＰＡを含むＰＵＦＡ生成物を生成する目的で、実験を行った、しかし、本発明による３ステップ分離を使用する代わりに、２つの分離ステップのみを使用した。したがって、この方法は、ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２３３９に開示される方法によって、図６に図示するように行った。

図６に示すように、２つのゾーンを有する単一のクロマトグラフィー装置を使用した。第一ゾーンは８個のカラム（直径：２４インチ、長さ：３２インチ）を含み、第二ゾーンは７個のカラム（直径：２４インチ、長さ：３２インチ）を含む。プロセス条件を調整して、第一ゾーンでより極性が低い供給混合液成分から、および第二ゾーンでより極性が高い供給混合液成分から、ＥＰＡ ＰＵＦＡ生成物を分離した。８：９２重量％の水：メタノール溶離剤を両方のゾーンで使用した。

９７％を超える最終的な純度でＥＰＡを生成した。

２つの分離ステップを総合した場合、抽出液の蓄積の全体的な速度（Ｅ１＋Ｅ２）は１０５７１ｍｌ／分であったと理解することができる。したがって、本発明の３ステップ方法と比較してはるかに高い容積の水性有機溶媒がＰＵＦＡ生成物を回収するのに必要とされることを理解することができる。

分離ステップのためのプロセス条件は以下の通りである。

第一分離ステップ
供給混合液の供給速度：３４ｍｌ／分
脱着剤の供給速度：１４４３８ｍｌ／分
抽出液の蓄積速度：９３１３ｍｌ／分
抽出液の再循環速度：５１２５ｍｌ／分
抽残液の蓄積速度：１６８８ｍｌ／分
サイクル時間：１２００秒

第三分離ステップ
中間生成物の供給速度：４０ｍｌ／分
脱着剤の供給速度：６１８９ｍｌ／分
抽出液の蓄積速度：１４３８ｍｌ／分
抽出液の再循環速度：４７５０ｍｌ／分
抽残液の蓄積速度：１４３８ｍｌ／分
サイクル時間：１０８０秒

Ａ より極性が低い成分
Ａ’ より極性が低い成分、最も極性が低い成分
Ｂ ＰＵＦＡ生成物
Ｃ より極性が高い成分
Ｄ 脱着剤の導入ポイント
Ｅ１ 抽出液流
Ｅ２ 抽出液流
Ｅ３ 抽出液流
Ｒ１ 抽残液流
Ｒ２ 抽残液流
Ｒ３ 抽残液流
Ｆ 供給混合液

Claims (31)

1. 魚油であるまたは魚油に由来する供給混合液から多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生成物を回収するためのクロマトグラフィー分離方法であって、
   （ｉ）クロマトグラフィー分離ステップで供給混合液を精製して、第一中間生成物を得るステップと、
   （ｉｉ）（ｉ）で得られた第一中間生成物を擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離ステップで精製して、第二中間生成物を得るステップと、
   （ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた第二中間生成物を擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離ステップで精製して、ＰＵＦＡ生成物を得るステップと
   を含み、
   水性有機溶媒が各分離ステップで溶離剤として使用され、
   供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、
   ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、
   第三分離ステップで得られたＰＵＦＡ生成物が、９０重量％を超える量でＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体を含む、方法。
2. 第一分離ステップが固定床式または擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含む、請求項１に記載の方法。
3. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第一、第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第一、第二および第三分離ステップが第一、第二および第三ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンが、供給混合液流に対する１つまたは複数の注入ポイント、水および／または有機溶媒に対する１つまたは複数の注入ポイント、前記ゾーンから液体が収集され得る抽残液分岐流、ならびに前記ゾーンから液体が収集され得る抽出液分岐流を有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第一および第二分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第一および第二分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは請求項３で定義された通りであり、第三分離ステップが別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われる、請求項１または２に記載の方法。
5. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは請求項３で定義された通りであり、第一分離ステップが別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われる、請求項１または２に記載の方法。
6. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、
   （ａ）第一、第二および第三分離ステップが同じクロマトグラフィー装置で順次行われ、第一および第二中間生成物が第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間でそれぞれ回収され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件が、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように、第一と第二の分離ステップの間および第二と第三の分離ステップの間で調整される、または
   （ｂ）第一分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して第二分離ステップが行われ、かつ／または第二分離ステップで使用したものと異なるクロマトグラフィー装置を使用して第三分離ステップが行われる、請求項１または２に記載の方法。
7. 第一分離ステップが固定床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、
   （ａ）第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは請求項３で定義された通りである、または
   （ｂ）第二および第三分離ステップが同じクロマトグラフィー装置で順次行われ、第二中間生成物が第二と第三の分離ステップの間で回収され、クロマトグラフィー装置のプロセス条件が、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように第二と第三の分離ステップの間で調整される、または
   （ｃ）第二および第三分離ステップが別々のクロマトグラフィー装置でそれぞれ行われ、第二分離ステップから得られた中間生成物が第三分離ステップで使用するクロマトグラフィー装置に導入される、請求項１または２に記載の方法。
8. ２つの分離ステップが２つのゾーンで同時に行われる擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置において、抽残液もしくは抽出液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、かつ／または
   ３つの分離ステップが３つのゾーンで同時に行われる擬似もしくは実移動床式クロマトグラフィー装置において、抽残液もしくは抽出液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、抽残液もしくは抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第三ゾーンの隣接していないカラムに導入される、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 第一分離ステップで得られた第一中間生成物が、供給混合液と比較してＰＵＦＡ生成物が豊富であり、第二分離ステップで得られた第二中間生成物が、第一中間生成物と比較してＰＵＦＡ生成物が豊富である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 第一ステップで、ＰＵＦＡ生成物より極性が低い供給混合液成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、第二ステップで、ＰＵＦＡ生成物より極性が低いが第一分離ステップで分離された成分より極性が高い供給混合液成分からＰＵＦＡ生成物が分離され、第三分離ステップで、より極性が高い供給混合液成分からＰＵＦＡ生成物が分離される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 第二分離ステップでＰＵＦＡ生成物から分離した成分が、ＤＨＡもしくはＤＨＡ誘導体および／もしくはＰＵＦＡ生成物より極性が低い他のＰＵＦＡもしくはＰＵＦＡ誘導体を含み、かつ／または
    第三分離ステップでＰＵＦＡ生成物から分離した成分が、ＳＤＡもしくはＳＤＡ誘導体および／もしくはＰＵＦＡ生成物より極性が高い他のＰＵＦＡを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
12. 第二中間生成物が第二分離ステップで抽残液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物が第三分離ステップで抽出液流として収集される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
13. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第一中間生成物が第一分離ステップで抽残液流として収集される、請求項１２に記載の方法。
14. 溶離剤が、水とアルコール、エーテル、エステル、ケトンまたはニトリルとの混合液である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
15. 溶離剤が水とメタノールの混合液である、請求項１４に記載の方法。
16. ＰＵＦＡ生成物が、９５重量％を超える、好ましくは９７重量％を超える量で、ＥＰＡまたはＥＰＡ誘導体を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. ＥＰＡ誘導体がＥＰＡエチルエステル（ＥＥ）である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
18. − 第二分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部が、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または
    − 第二分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部が、第二分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または
    − 第三分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部が、第三分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または
    − 第三分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部が、第三分離ステップで使用した装置に再循環される、
    前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
19. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、
    − 第一分離ステップで使用した装置からの抽出液流の一部が、第一分離ステップで使用した装置に再循環され、かつ／または
    − 第一分離ステップで使用した装置からの抽残液流の一部が、第一分離ステップで使用した装置に再循環される、請求項１８に記載の方法。
20. 各分離ステップで使用する水：有機溶媒比率が、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、
    ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
21. 各分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤が異なる水：有機溶媒比率を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
22. 第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤が、同じ水：有機溶媒比率を有し、第一分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤が、第二および第三分離ステップで使用する有機溶媒の溶離剤とは異なる水：有機溶媒比率を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 第一分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤の水：有機溶媒比率が、第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤の水：有機溶媒比率より低い、請求項２２に記載の方法。
24. 第一分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率が０．１：９９．９から１：９９重量％であり、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率が７：９３から９：９１重量％である、請求項２３に記載の方法。
25. 第二分離ステップで抽出液および抽残液流の片方または両方を介して収集された液体がその分離ステップで使用した装置に再循環される速度が、供給混合液に存在する飽和および／もしくは一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される、かつ／または
    第三分離ステップで抽出液および抽残液流の片方もしくは両方を介して収集された液体がその分離ステップで使用した装置に再循環される速度が、供給混合液に存在する飽和および／もしくは一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第一分離ステップで抽出液および抽残液流の片方または両方を介して収集された液体がその分離ステップで使用した装置に再循環される速度が、供給混合液に存在する飽和および／または一不飽和脂肪酸が第一分離ステップで除去され、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物が分離されるように調整される、請求項２２に記載の方法。
27. 第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度が、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは異なる、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 第一分離ステップが擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、第一分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第一分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度が、第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度とは異なる、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度が、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. − 第一分離ステップが、擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置での供給混合液の精製を含み、
    − 第二および第三分離ステップが、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で同時に行われ、第二および第三分離ステップが第一および第二ゾーンでそれぞれ行われ、各ゾーンは請求項３で定義された通りであり、第一分離ステップは別の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置で行われ、
    − 第一中間生成物が第一分離ステップで抽残液流として収集され、第二中間生成物が第二分離ステップで抽残液流として収集され、ＰＵＦＡ生成物は第三分離ステップで抽出液流として収集され、
    − より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む第二中間生成物抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、
    − 第二および第三分離ステップで使用する水性有機溶媒の溶離剤が、同じ水：有機溶媒比率を有し、第一分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率が、第二および第三分離ステップで使用する溶離剤の水：有機溶媒比率より低く、
    − 第二分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第二分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度が、第三分離ステップで抽出液流を介して収集された液体が第三分離ステップで使用したクロマトグラフィー装置に再循環される速度より速い、
    請求項１５に記載の方法。
31. 前記請求項のいずれか一項に定義されたクロマトグラフィー装置を制御するためのコンピュータープログラムであって、実行時に、前記請求項のいずれか一項に記載の方法を実施するように装置に指示するコード手段を含む、コンピュータープログラム。
    

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