BR112014000162B1 - processo de separação cromatográfica - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA, PRODUTO DE PUFA, E, MEIO DE ARMAZENAMENTO A presente invenção fornece um processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA) a partir de uma mistura de alimentação que é um óleo de peixe ou que é derivada de óleo de peixe, processo este que compreende as etapas de: (i) purificar a mistura de alimentação em um etapa de separação cromatográfica, para se obter um primeiro produto intermediário; e (ii) purificar o primeiro produto intermediário obtido em (i) em uma etapa de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real, para se obter um segundo produto intermediário; e (iii) purificar o segundo produto intermediário obtido em (ii) em uma etapa de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real, para obter o produto de PUFA; em que um solvente orgânico aquoso é usado como eluente em cada etapa de separação; ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação; o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); e o produto de PUFA obtido na terceira etapa de separação contém EPA ou um (...).

Description

[0001] A presente invenção diz respeito a um processo de separação cromatográfica melhorado para purificar o ácido graxo poli-insaturado EPA ou um derivado do mesmo.

[0002] EPA e seus derivados são precursores para moléculas biologicamente importantes, que desempenham um papel importante na regulagem de funções biológicas tais como agregação de plaqueta, inflamação e respostas imunológicas. Assim, EPA e seus derivados podem ser terapeuticamente úteis no tratamento de uma ampla faixa de condições patológicas que incluem condições do CNS; neuropatias, que incluem neuropatia diabética; doenças cardiovasculares; condições gerais do sistema imune e inflamatórias, que incluem doenças de pele inflamatórias.

[0003] EPA é encontrado em matérias primas naturais, e em particular em óleos de peixe. O EPA em óleos de peixe, entretanto, está presente em tais óleos em mistura com ácidos graxos saturados e numerosas outras impurezas.

[0004] A purificação de EPA a partir de óleos de peixe é particularmente desafiador. Assim, óleos de peixe são mistura extremamente complexas que contêm um grande número de os componentes diferentes com tempos de retenção muito similares em aparelhos de cromatografia. E1es representam um estoque de alimentação muito mais desafiador do que para purificar EPA do que, por exemplo, um estoque de alimentação de óleo de alga. Entretanto, um grau muito alto de pureza de EPA é requerido, particularmente para aplicações farmacêuticas e nutracêuticas. Historicamente, portanto, a destilação tem sido usada para purificar EPA para aplicações terapêuticas.

[0005] Infelizmente, EPA é extremamente frágil. Assim, quando aquecido na presença de oxigênio, o mesmo é propenso à isomerização, peroxidação e oligomerização. O fracionamento e purificação de EPA para preparar ácidos graxos puros é, portanto, difícil. A destilação, mesmo sob vácuo, pode levar à degradação não aceitável do produto.

[0006] A cromatografia de leito móvel simulado e real são técnicas conhecidas, familiares a aqueles de habilidade na técnica. O princípio de operação envolve movimento em contracorrente de uma fase eluente líquida e uma fase absorsora sólida. Esta operação permite uso mínimo de solvente tornando o processo economicamente viável. Tal tecnologia de separação tem encontrado várias aplicações em diversas áreas, que incluem hidrocarbonetos, produtos químicos industriais, óleos, açúcares e APIs.

[0007] Como é bem conhecido, em um sistema cromatográfico de leito estacionário convencional, uma mistura cujos componentes devem ser separados percola através de um recipiente. O recipiente é no geral cilíndrico, e é tipicamente aludido como a coluna. A coluna contém um empacotamento de um material poroso (no geral chamado a fase estacionária) que exibe uma alta permeabilidade aos fluidos. A velocidade de percolação de cada componente da mistura depende das propriedades físicas deste componente de modo que os componentes saiam da coluna sucessiva e seletivamente. Assim, alguns dos componentes tendem a se fixar fortemente à fase estacionária e assim percolarão lentamente, ao passo que outros tendem a se fixar fracamente e saem da coluna mais rapidamente. Muitos sistemas cromatográficos de leito estacionário diferentes têm sido propostos e são usados tanto para propósitos analíticos quanto de produção industrial.

[0008] Ao contrário, um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado consiste de várias colunas individuais que contêm absorsores que são conectadas juntas em série. O eluente é passado através das colunas em uma primeira direção. Os pontos de injeção do estoque de alimentação e do eluente, e os pontos de coleta de componente separados no sistema, são periodicamente mudados por meio de uma série de válvulas. O efeito global é simular a operação de uma única coluna que contêm um leito móvel do absorsor sólido, o absorsor sólido movendo-se em uma direção em contracorrente ao fluxo de eluente. Assim, um sistema de leito móvel simulado consiste de colunas que, como em um sistema de leito estacionário convencional, contêm leitos estacionários de absorsor sólido através dos quais o eluente é passado, mas em um sistema de leito móvel simulado a operação é tal como simular um leito móvel em contracorrente contínuo.

[0009] Os processos e equipamento para a cromatografia de leito móvel simulado são descritos em várias patentes, que incluem US 2.985.589, US 3.696.107, US 3.706.812, US 3.761.533, FR-A-2103302, FR-A-2651148 e FR-A-2651149, a totalidade das quais é aqui incorporada por referência. O tópico também é tratado detalhadamente em “Preparative and Production Scale Chromatography”, editado pela Ganetsos and Barker, Marcel Dekker Inc, Nova Iorque, 1993, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência.

[00010] Um sistema de leito móvel real é similar em operação a um sistema de leito móvel simulado. Entretanto, ao invés de mudar os pontos de injeção da mistura de alimentação e do eluente, e os pontos de coleta de componente separados por meio de um sistema de válvulas, ao invés de uma série de unidades de absorção (isto é, colunas) são fisicamente movidas em relação aos pontos de alimentação e remoção. Mais uma vez, a operação é tal como simular um leito móvel em contracorrente contínuo.

[00011] Os processos e equipamento para a cromatografia de leito móvel real são descritos em várias patentes, que incluem US 6.979.402, US 5.069.883 e US 4.764.276, a totalidade das quais é aqui incorporada por referência.

[00012] Um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado típico é ilustrado com referência à Figura 1. O conceito de um processo de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real é explicado considerando-se uma coluna cromatográfica vertical que contém a fase estacionária S dividida em seções, mais precisamente em quatro subzonas sobrepostas I, II, III e IV indo do fundo para o topo da coluna. O eluente é introduzido no fundo em IE por meio de uma bomba P. A mistura dos componentes A e B que devem ser separados é introduzida em IA + B entre a subzona II e subzona III. Um extrato que contém principalmente B é coletado em SB entre a subzona I e a subzona II, e um rafinato que contém principalmente A é coletado em SA entre a subzona III e a subzona IV.

[00013] No caso de um sistema de leito móvel simulado, um movimento descendente simulado da fase estacionária S é causado pelo movimento dos pontos de introdução e coleta em relação à fase sólida. No caso de um sistema de leito móvel real, o movimento descendente simulado da fase estacionária S é causado pelo movimento das várias colunas cromatográficas em relação aos pontos de introdução e coleta. Na Figura 1, os fluxos de eluente ascendentes e a mistura A + B é injetada entre a subzona II e a subzona III. Os componentes mover-se-ão de acordo com as suas interações cromatográficas com a fase estacionária, por exemplo adsorção em um meio poroso. O componente B que exibe afinidade mais forte à fase estacionária (o componente que se desloca mais lento) será mais lentamente aprisionado pelo eluente e seguirá o mesmo com demora. O componente A que exibe a afinidade mais fraca com a fase estacionária (o componente que se desloca mais rápido) será facilmente aprisionado pelo eluente. Se o conjunto da direita de parâmetros, especialmente a taxa de fluxo em cada subzona, é corretamente estimado e controlado, o componente A que exibe a afinidade mais fraca com a fase estacionária será coletado entre a subzona III e a subzona IV como um rafinato e o componente B que exibe a afinidade mais forte com a fase estacionária será coletado entre a subzona I e a subzona II como um extrato.

[00014] Para se obter EPA de alta pureza ou éster etílico de EPA em purezas de mais do que 90 %, por exemplo maiores do que 95 ou 97 %, é possível utilizar um processo de separação de leito móvel simulado que realiza duas etapas de separação simultâneas. Tal processo é descrito no pedido de patente internacional no. PCT/GB10/002339, a totalidade do qual é aqui incorporada por referência.

[00015] No geral, todas as técnicas de separação cromatográfica para separar PUFAs, que incluem processos SMB, utilizam volumes grandes de solventes orgânicos como eluentes. Depois que o processo de separação cromatográfica é completado os PUFAs devem ser recuperados da solução no eluente. Tipicamente um grande gasto de tempo e energia está envolvido na recuperação de PUFAs da solução no eluente. Além disso, os solventes orgânicos usados como eluentes nos processos de separação cromatográfica são frequentemente nocivos para o ambiente ou para os operários que os manuseiam. Portanto, um processo de separação cromatográfica que reduza a quantidade de solvente orgânico que necessita ser usado é requerido.

[00016] Foi agora vantajosamente descoberto que EPA ou um derivado de EPA pode ser produzido em uma pureza similarmente alta como descrito na PCT/GB10/002339 por um processo de separação de três etapas que usa um volume muito mais baixo de solvente que o processo de duas etapas. O processo melhorado da presente invenção utiliza quase 50 % menos solvente do que o processo de duas etapas descrito na PCT/GB10/002339. Isto é claramente vantajoso em termos de custo, facilidade de recuperação de produto, e impacto ambiental.

Sumário da invenção

[00017] Foi surpreendentemente descoberto que EPA ou um derivado de EPA podem ser eficazmente purificados a partir de estoques de alimentação comercialmente disponíveis tais como óleos de peixe pelo aparelho de leito móvel simulado ou real usando um volume relativamente baixo de um eluente de solvente orgânico aquoso. A presente invenção, portanto fornece um processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA) a partir de uma mistura de alimentação que é um óleo de peixe ou que é derivada de óleo de peixe, processo este que compreende as etapas de:

[00018] (i) purificar a mistura de alimentação em uma etapa de separação cromatográfica, para se obter um primeiro produto intermediário; e

[00019] (ii) purificar o primeiro produto intermediário obtido em (i) em uma etapa de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real, para se obter um segundo produto intermediário; e

[00020] (iii) purificar o segundo produto intermediário obtido em (ii) em uma etapa de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real, para obter o produto de PUFA; em que um solvente orgânico aquoso é usado como eluente em cada etapa de separação;

[00021] os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação;

[00022] o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); e

[00023] o produto de PUFA obtido na terceira etapa de separação contém EPA ou um derivado de EPA em uma quantidade maior do que 90 % em peso.

[00024] Também é fornecido um Produto de PUFA obtenível pelo processo da presente invenção.

Descrição das Figuras

[00025] A Figura 1 ilustra os princípios básicos de um processo de leito móvel simulado ou real para separar uma mistura binária.

[00026] A Figura 2 ilustra três modos em que o processo de separação cromatográfica da invenção pode ser realizado.

[00027] A Figura 3 ilustra uma forma de realização preferida da invenção que é adequada para produzir EPA de alta pureza.

[00028] A Figura 4 ilustra em mais detalhes a forma de realização da Figura 2.

[00029] A Figura 5 ilustra uma forma de realização mais preferida da forma de realização mostrada na Figura 2.

[00030] A Figura 6 ilustra um processo de separação de dois estágios para produzir EPA (não de acordo com a presente invenção).

[00031] A Figura 7 mostra um traço de GC de um estoque de alimentação adequado para o uso de acordo com o processo da presente invenção.

[00032] A Figura 8 mostra um traço de GC de um primeiro produto intermediário produzido de acordo com o processo da presente invenção.

[00033] A Figura 9 mostra um traço de GC de um segundo produto intermediário produzido de acordo com o processo da presente invenção.

[00034] A Figura 10 mostra um traço de GC de um produto de PUFA produzido de acordo com o processo da presente invenção.

Descrição detalhada da invenção

[00035] Como aqui usado, o termo “produto de PUFA” refere-se a um produto que compreende um ou mais ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), e/ou derivados dos mesmos, tipicamente de significância nutricional ou farmacêutica. O produto de PUFA obtido no processo da presente invenção contém EPA ou um derivado de EPA em uma quantidade maior do que 90 % em peso, isto é, EPA ou um derivado de EPA estão presentes em 90 % em peso de pureza em relação a todos os componentes no produto de PUFA final não incluindo o eluente de solvente orgânico aquoso. Assim EPA ou um derivado de EPA estão presentes no produto de PUFA em uma quantidade de pelo menos 90 % em peso com base em todos os componentes do produto de PUFA que originaram na mistura de alimentação.

[00036] Um derivado de EPA é EPA na forma de um mono-, di- ou triglicerídeo, éster, fosfolipídeo, amida, lactona, ou sal. Triglicerídeos e ésteres são preferidos. Os ésteres são mais preferidos. Os ésteres são tipicamente ésteres alquílicos, preferivelmente ésteres alquílicos C1-C6, mais preferivelmente ésteres alquílicos C1-C4. Os exemplos de ésteres incluem ésteres metílicos e etílicos. Os ésteres etílicos são os mais preferidos.

[00037] Tipicamente, o produto de PUFA contém EPA ou um derivado de EPA em uma quantidade maior do que 95 % em peso, preferivelmente maior do que 97 % em peso.

[00038] Em uma forma de realização, o produto de PUFA contém EPA em uma quantidade maior do que 90 % em peso, preferivelmente maior do que 95 % em peso, mais preferivelmente maior do que 97 % em peso. Como explicado acima, os EPAs estão presentes na % em peso especificada em relação à quantidade total de todos os componentes do produto de PUFA que se originaram na mistura de alimentação.

[00039] Em outra forma de realização, o produto de PUFA contém éster etílico de EPA em uma quantidade maior do que 90 % em peso, preferivelmente maior do que 95 % em peso, mais preferivelmente maior do que 97 % em peso. Como explicado acima, EPAs estão presentes na % em peso especificada em relação à quantidade total de todos os componentes do produto de PUFA que se originaram na mistura de alimentação.

[00040] As misturas de alimentação adequadas para o fracionamento pelo processo da presente invenção são óleos de peixe, ou estoques de alimentação derivados de óleos de peixe. Os óleos de peixe adequados para o uso no processo da presente invenção são bem conhecidos pela pessoa habilitada. Os óleos de peixe típicos contêm EPA, DHA, SDA, e tipicamente uma faixa de outros PUFAs tanto mais quanto menos polares do que o EPA, ácidos graxos saturados e ácidos graxos monoinsaturados.

[00041] A mistura de alimentação pode sofrer tratamento químico antes do fracionamento pelo processo da invenção. Por exemplo, a mesma pode sofrer transesterificação de glicerídeo ou hidrólise de glicerídeo seguido em certos casos pelos processos seletivos tais como cristalização, destilação molecular, fracionamento de ureia, extração com nitrato de prata ou outras soluções de sal metálico, iodolactonização ou fracionamento de fluido supercrítico. Alternativamente, uma mistura de alimentação pode ser usada diretamente sem nenhuma etapa de tratamento inicial.

[00042] As misturas de alimentação tipicamente contêm o produto de PUFA e pelo menos um componente mais polar e pelo menos um componente menos polar. Os componentes menos polares têm uma aderência mais forte ao absorsor usado no processo da presente invenção do que o produto de PUFA. Durante a operação, tais componentes menos polares tipicamente se movem com a fase absorsor sólida em preferência à fase eluente líquida. Os componentes mais polares têm uma aderência mais fraca ao absorsor usado no processo da presente invenção do que o produto de PUFA. Durante a operação, tais componentes mais polares tipicamente se movem com a fase eluente líquida em preferência à fase absorsora sólida. No geral, os componentes mais polares serão separados em uma corrente de rafinato, e os componentes menos polares serão separados em uma corrente de extrato.

[00043] Os exemplos dos componentes mais e menos polares incluem (1) outros compostos que ocorrem em óleos naturais (por exemplo, óleos marinhos), (2) subprodutos formados durante a armazenagem, refino e etapas de concentração anteriores e (3) contaminantes de solventes ou reagentes que são utilizados durante as etapas de concentração ou purificação anteriores.

[00044] Os exemplos de (1) incluem outros PUFAs não desejados; ácidos graxos saturados; esteróis, por exemplo, colesterol; vitaminas; e poluentes ambientais, tais como policlorobifenila (PCB), pesticidas de hidrocarboneto poliaromático (PAH), pesticidas clorados, dioxinas e metais pesados. PCB, PAH, dioxinas e pesticidas clorados são todos componentes altamente não polares.

[00045] Os exemplos de (2) incluem isômeros e produtos da oxidação ou decomposição do produto de PUFA, por exemplo, produtos poliméricos de auto-oxidação de ácidos graxos ou seus derivados.

[00046] Os exemplos de (3) incluem ureia que pode ser adicionada para remover ácidos graxos saturados ou monoinsaturados da mistura de alimentação.

[00047] Preferivelmente, a mistura de alimentação é um óleo marinho que contém PUFA (por exemplo um óleo de peixe), mais preferivelmente um óleo marinho (por exemplo um óleo de peixe) que compreende EPA e/ou DHA.

[00048] Uma mistura de alimentação típica para preparar EPA concentrado (EE) pelo processo da presente invenção compreende de 50 a 75 % EPA (EE), de 0 a 10 % DHA (EE), e outros componentes que incluem outros ácidos graxos w-3 e co-6 essenciais.

[00049] Uma mistura de alimentação preferida para preparar EPA concentrado (EE) pelo processo da presente invenção compreende 55 % de EPA (EE), 5 % de DHA (EE), e outros componentes que incluem outros ácidos graxos w-3 e co-6 essenciais. DHA (EE) é menos polar do que o EPA (EE).

[00050] O processo da presente invenção envolve etapas de separação de cromatografia múltiplas.

[00051] A primeira etapa de separação é eficaz para remover ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação e pode ser realizada usando um aparelho de cromatografia de leito estacionário ou de leito móvel simulado ou real.

[00052] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, existem vários modos em que as três etapas de separação podem ser realizadas. Quatro modos preferidos de realizar o processo são dados como primeira, segunda, terceira e quarta formas de realização abaixo.

[00053] Em uma primeira forma de realização, a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a primeira, segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira, segunda e terceira zonas respectivamente, em que cada zona tem um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona.

[00054] Tipicamente, cada zona tem apenas um ponto de injeção para uma mistura de alimentação. Em uma forma de realização, cada zona tem apenas um ponto de injeção para o eluente de solvente orgânico aquoso. Em outra forma de realização, cada zona tem dois ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico.

[00055] Tipicamente cada zona usada tem um único arranjo de colunas de cromatografia ligadas em série que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso. Tipicamente, cada uma das colunas de cromatografia em uma zona é ligada às duas colunas no aparelho adjacentes a esta coluna. Assim, a saída de uma dada coluna em uma zona é conectada à entrada da coluna adjacente, por exemplo, na zona, que está a jusante com respeito ao fluxo de eluente no sistema. Tipicamente, nenhuma das colunas de cromatografia em uma zona são ligadas a colunas não adjacentes na mesma zona.

[00056] O termo “rafinato” é bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica. No contexto da cromatografia de leito móvel real e simulado o mesmo refere-se à corrente de os componentes que se movem mais rapidamente com a fase eluente líquida comparada com a fase absorsora sólida. Assim, uma corrente de rafinato é tipicamente enriquecida com componentes mais polares, e esgotada de os componentes menos polares comparada com uma corrente de alimentação.

[00057] O termo “extrato” é bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica. No contexto da cromatografia de leito móvel real e simulado o mesmo refere-se à corrente de os componentes que se movem mais rapidamente com a fase absorsora sólida comparada com a fase eluente líquida. Assim, uma corrente de extrato é tipicamente enriquecida com componentes menos polares, e esgotada de os componentes mais polares comparada com uma corrente de alimentação.

[00058] Como aqui usado o termo “não adjacente” refere-se a colunas, por exemplo, no mesmo aparelho, separadas por uma ou mais colunas, preferivelmente 3 ou mais colunas, mais preferivelmente 5 ou mais colunas, o mais preferivelmente em torno de 5 colunas.

[00059] Em uma segunda forma de realização, a primeira e segunda etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a primeira e segunda etapas de separação sendo realizada na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida, e em que a terceira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado.

[00060] Na segunda forma de realização, a terceira etapa de separação é tipicamente realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real que compreende uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, e tendo um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas. Este aparelho de cromatografia tipicamente tem apenas um ponto de injeção para uma mistura de alimentação. Em uma forma de realização, este aparelho de cromatografia tem apenas um ponto de injeção para o eluente de solvente orgânico aquoso. Em outra forma de realização, este aparelho de cromatografia tem dois ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico.

[00061] O aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação na segunda forma de realização tipicamente tem um único arranjo de colunas de cromatografia ligadas em série que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso. Tipicamente, cada uma das colunas de cromatografia é ligada às duas colunas no aparelho adjacentes a esta coluna. Assim, a saída de uma dada coluna é conectada à entrada da coluna adjacente, que está a jusante com respeito ao fluxo de eluente no sistema. Tipicamente, nenhuma das colunas de cromatografia são ligadas a colunas não adjacentes no aparelho de cromatografia.

[00062] O aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação na segunda forma de realização é um aparelho separado do aparelho usado na primeira e segunda etapas de separação. Assim, dois aparelhos separados são usados. O eluente circula separadamente nos aparelhos cromatográficos separados. Assim, o eluente não é compartilhado entre os aparelhos cromatográficos separados além daquele eluente que possa estar presente como solvente no segundo produto intermediário que é produzido na segunda etapa, e que é depois introduzido no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação. As colunas cromatográficas não são compartilhadas entre os aparelhos cromatográficos separados.

[00063] Depois que o segundo produto intermediário é obtido na segunda etapa de separação, o eluente de solvente orgânico aquoso pode ser parcial ou totalmente removido antes que o segundo produto intermediário seja purificados ainda na terceira etapa de separação. Alternativamente, o produto intermediário pode ser purificado ainda na terceira etapa sem a remoção de qualquer solvente presente.

[00064] O aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação na segunda forma de realização é similar ao aparelho de cromatografia ilustrado na Figura 1.

[00065] Em uma terceira forma de realização, a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida, e em que a primeira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado.

[00066] Na terceira forma de realização, a primeira etapa de separação é tipicamente realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real que compreende uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, e tendo um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas. Este aparelho de cromatografia tipicamente tem apenas um ponto de injeção para uma mistura de alimentação. Em uma forma de realização, este aparelho de cromatografia tem apenas um ponto de injeção para o eluente de solvente orgânico aquoso. Em outra forma de realização, este aparelho de cromatografia tem dois ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico.

[00067] O aparelho de cromatografia usado na primeira etapa de separação na terceira forma de realização tipicamente tem um único arranjo de colunas de cromatografia ligadas em série que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso. Tipicamente, cada uma das colunas de cromatografia é ligada às duas colunas no aparelho adjacentes a esta coluna. Assim, a saída de uma dada coluna é conectada à entrada da coluna adjacente, que está a jusante com respeito ao fluxo de eluente no sistema. Tipicamente, nenhuma das colunas de cromatografia são ligadas a colunas não adjacentes no aparelho de cromatografia.

[00068] O aparelho de cromatografia usado na primeira etapa de separação na terceira forma de realização é um aparelho separado do aparelho usado na segunda e terceira etapas de separação. Assim, dois aparelhos separados são usados. O eluente não é compartilhado entre os aparelhos cromatográficos separados além daquele eluente que pode estar presente como solvente no primeiro produto intermediário que é produzido na primeira etapa, e que é introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. As colunas cromatográficas não são compartilhadas entre os aparelhos cromatográficos separados.

[00069] Depois que o primeiro produto intermediário é obtido na primeira etapa de separação, o eluente de solvente orgânico aquoso pode ser parcial ou totalmente removido antes que o produto intermediário seja purificado ainda na etapa de separação seguinte. Alternativamente, o primeiro produto intermediário pode ser purificado ainda na segunda etapa de separação sem a remoção de qualquer solvente presente.

[00070] O aparelho de cromatografia usado na primeira etapa de separação na terceira forma de realização é similar ao aparelho de cromatografia ilustrado na Figura 1.

[00071] Será avaliado que na primeira, segunda e terceira formas de realização acima duas ou mais etapas de separação podem ocorrer simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo duas ou três zonas, em que uma zona é como definida acima. Um aparelho de cromatografia típico tendo duas ou mais zonas, por exemplo duas ou três zonas, é como descrito, por exemplo, na PCT/GB10/002339, que é aqui incorporada por referência.

[00072] Em uma quarta forma de realização, (a) a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o primeiro e segundo produtos intermediários sendo recuperados entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação respectivamente, e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação tal que os ácidos graxos saturados e/ou presentes monoinsaturados na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); ou (b) a segunda etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na primeira etapa de separação, e/ou a terceira etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na segunda etapa de separação.

[00073] Na quarta forma de realização, cada um dos aparelhos de cromatografia usados para realizar a primeira, segunda e terceira etapas de separação é tipicamente como definido acima para a terceira etapa de separação na forma de realização (2).

[00074] Na opção (b) da quarta forma de realização, todos as três etapas são realizadas em aparelhos cromatográficos separados. Duas ou três da primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas em dois ou três aparelhos cromatográficos separados diferentes. Estes podem ser operados de modo sequencial ou simultaneamente.

[00075] Em particular, na opção (b) da quarta forma de realização dois aparelhos de cromatografia separados podem ser operados sequencialmente para realizar a primeira e segunda etapas de separação. Neste caso, o primeiro produto intermediário é recuperado entre a primeira e segunda etapas de separação e as condições de processo no primeiro e segundo aparelhos de cromatografia são ajustadas tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[00076] Em particular, na opção (b) da quarta forma de realização dois aparelhos de cromatografia separados podem ser operados sequencialmente para realizar a segunda e terceira etapas de separação. Neste caso, o segundo produto intermediário é recuperado entre a segunda e terceira etapas de separação e as condições de processo no segundo e terceiro aparelhos de cromatografia são ajustadas tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[00077] Em particular, na opção (b) da quarta forma de realização três aparelhos de cromatografia separados podem ser operados sequencialmente para realizar a primeira, segunda e terceira etapas de separação. Neste caso, o primeiro produto intermediário é recuperado entre a primeira e segunda etapas de separação, o segundo produto intermediário é recuperado entre a segunda e terceira etapas de separação e as condições de processo no primeiro, segundo e terceiro aparelhos de cromatografia são ajustadas tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[00078] Em particular, na opção (b) da quarta forma de realização, dois aparelhos de cromatografia separados podem ser operados simultaneamente para realizar a primeira e segunda etapas de separação. A primeira e segunda etapas de separação são realizadas em aparelhos de cromatografia separados, o primeiro produto intermediário obtido na primeira etapa sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação, e as condições de processo nos aparelhos de cromatografia sendo ajustadas tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[00079] Em particular, na opção (b) da quarta forma de realização, dois aparelhos de cromatografia separados podem ser operados simultaneamente para realizar a segunda e terceira etapas de separação. A segunda e terceira etapas de separação são realizadas em aparelhos de cromatografia separados, o segundo produto intermediário obtido na segunda etapa sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação, e as condições de processo nos aparelhos de cromatografia sendo ajustadas tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[00080] Em particular, na opção (b) da quarta forma de realização, três aparelhos de cromatografia separados podem ser operados simultaneamente para realizar a primeira, segunda e terceira etapas de separação. A primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas em aparelhos de cromatografia separados, o primeiro produto intermediário obtido na primeira etapa sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação, o segundo produto intermediário obtido na segunda etapa sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação, e as condições de processo nos aparelhos de cromatografia sendo ajustadas tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[00081] Em particular, na opção (b) da quarta forma de realização, dois ou três aparelhos cromatográficos separados são operados. O eluente circula separadamente nos aparelhos cromatográficos separados. Assim, o eluente não é compartilhado entre os aparelhos cromatográficos separados além daquele eluente que pode estar presente como solvente no produto intermediário que é purificado na primeira e/ou segunda etapas, e que é introduzido no aparelho cromatográfico usado na etapa de separação seguinte. As colunas cromatográficas não são compartilhadas entre os aparelhos cromatográficos separados usados na primeira e segunda e/ou segunda e terceira etapas de separação.

[00082] Depois que o produto intermediário é obtido na primeira e/ou segunda etapas de separação, o eluente de solvente orgânico aquoso pode ser parcial ou totalmente removido antes que o produto intermediário seja purificado ainda na etapa de separação seguinte. Alternativamente, o produto intermediário pode ser purificado ainda sem a remoção de qualquer solvente presente. Estas considerações também se aplicam para o segundo produto intermediário obtido na segunda etapa de separação na forma de realização (2) acima, e para o primeiro produto intermediário obtido na primeira etapa de separação na forma de realização (3) acima.

[00083] No geral, qualquer aparelho de cromatografia de leito estacionário ou de leito móvel simulado ou real conhecido pode ser utilizado para os propósitos do método da presente invenção, contanto que o aparelho seja usado de acordo com o processo da presente invenção. Aqueles aparelhos descritos na PCT/GB10/002339, US 2.985.589, US 3.696.107, US 3.706.812, US 3.761.533, FR-A-2103302, FR-A2651148, FR-A-2651149, US 6.979.402, US 5.069.883 e US 4.764.276 podem ser todos usados se configurados de acordo com o processo da presente invenção.

[00084] A segunda, terceira e quarta formas de realização acima são preferidas. A terceira e quarta formas de realização são mais preferidas. Para certas aplicações, a terceira forma de realização será a mais adequada. Em outras aplicações, a quarta forma de realização será a mais adequada.

[00085] A primeira até a quarta formas de realização são ilustradas em mais detalhes com referência à Figura 2. Em todas as quatro formas de realização na Figura 2, o fluxo de eluente é da direita para a esquerda, e o fluxo de absorsor eficaz é da esquerda para a direita. Pode ser observado em todos os casos que o primeiro produto intermediário obtido da primeira etapa de separação é usado como a mistura de alimentação para a segunda etapa de separação, e o segundo produto intermediário é usado como a mistura de alimentação para a terceira etapa de separação.

[00086] Referindo-se agora à Figura 2A, esta ilustra a primeira forma de realização acima, isto é, onde a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real na primeira, segunda e terceira zonas respectivamente. A primeira etapa de separação ocorre na primeira zona. Depois o primeiro produto intermediário da primeira etapa de separação realizada na primeira zona é passado para dentro da segunda zona como a mistura de alimentação. A segunda etapa de separação é depois realizada na segunda zona. O segundo produto intermediário é depois passado da segunda etapa de separação realizada na segunda zona para dentro da terceira zona como a mistura de alimentação. A terceira etapa de separação é depois realizada na terceira zona.

[00087] Referindo-se agora à Figura 2B, esta ilustra a segunda forma de realização acima, isto é, onde a primeira e segunda etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real na primeira e segunda zonas respectivamente, e a terceira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado. A primeira etapa de separação ocorre na primeira zona. Depois o primeiro produto intermediário da primeira etapa de separação realizada na primeira zona é passado para dentro da segunda zona como a mistura de alimentação. A segunda etapa de separação é realizada na segunda zona. O segundo produto intermediário é coletado da segunda zona. Este é depois introduzido dentro de um aparelho de cromatografia como a mistura de alimentação para a terceira etapa de separação.

[00088] Referindo-se agora à Figura 2C, esta ilustra a terceira forma de realização acima, isto é, onde a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real na primeira e segunda zonas respectivamente, e a primeira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado. A primeira etapa de separação ocorre em um aparelho de cromatografia. O primeiro produto intermediário é coletado do primeiro aparelho. Este é depois introduzido dentro de um aparelho de cromatografia separado como a mistura de alimentação para a segunda etapa de separação. A segunda etapa de separação é realizada na primeira zona do aparelho cromatográfico em que a segunda e terceira etapas de separação ocorrem. O segundo produto intermediário da segunda etapa de separação realizada na primeira zona é passado para dentro da segunda zona como a mistura de alimentação para a terceira etapa de separação. A terceira etapa de separação ocorre na segunda zona.

[00089] Referindo-se agora à Figura 2D, esta ilustra a quarta forma de realização acima, isto é, onde (a) a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o primeiro e segundo produtos intermediários sendo recuperados entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação respectivamente, e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); ou (b) duas ou três da primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas em dois ou três aparelhos separados diferentes; em que a segunda etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na primeira etapa de separação, e/ou a terceira etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na segunda etapa de separação.

[00090] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito estacionário, existem vários modos em que as três etapas de separação podem ser realizadas. Assim tipicamente, (a) a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida; ou (b) a segunda e terceira etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o segundo produto intermediário sendo recuperado entre a segunda e terceira etapas de separação e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a segunda e terceira etapas de separação tal que o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); ou (c) a segunda e terceira etapas de separação são realizadas em aparelhos de cromatografia separados respectivamente, o produto intermediário obtido da segunda etapa de separação sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

[00091] A forma de realização (a) acima é realizada em uma maneira similar à segunda e terceira etapas de separação na forma de realização (3) acima.

[00092] Os aparelhos de cromatografia usados nas formas de realização (b) e (c) acima são tipicamente como definidos acima para a terceira etapa de separação na forma de realização (2). As formas de realização (b) e (c) são tipicamente realizadas em uma maneira similar à forma de realização (4) acima.

[00093] Será avaliado que em certas formas de realização, duas ou três etapas de separação podem ser realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia tendo duas ou três zonas respectivamente. Nos aparelhos de cromatografia de leito móvel simulado ou real em que duas etapas de separação são realizadas simultaneamente em duas zonas, uma corrente de rafinato ou extrato é tipicamente coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona. Nos aparelhos de cromatografia de leito móvel simulado ou real em que três etapas de separação são realizadas simultaneamente em três zonas, uma corrente de rafinato ou extrato é tipicamente coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, e uma corrente de rafinato ou extrato é tipicamente coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na terceira zona. Isto permite que o primeiro e/ou segundo produtos intermediários coletados na primeira e/ou segunda etapas de separação sejam usados como a mistura de alimentação para a etapa de separação seguinte.

[00094] Tipicamente, o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação; ou o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de extrato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de rafinato na terceira etapa de separação.

[00095] Preferivelmente, o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação.

[00096] Tipicamente, nas formas de realização onde a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real na primeira e segunda zonas respectivamente, (a) o segundo produto intermediário é coletado como uma corrente de rafinato que contém o produto de PUFA junto com os componentes mais polares de uma coluna na primeira zona e introduzido em uma coluna não adjacente na segunda zona, onde o produto de PUFA é depois coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação realizada na segunda zona; ou (b) o segundo produto intermediário é coletado como uma corrente de extrato que contém o produto de PUFA junto com os componentes menos polares de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, onde o produto de PUFA é depois coletado como a corrente de rafinato na terceira etapa de separação realizada na segunda zona.

[00097] Preferivelmente, nas formas de realização onde a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real na primeira e segunda zonas respectivamente, o segundo produto intermediário é coletado como uma corrente de rafinato que contém o produto de PUFA junto com os componentes mais polares de uma coluna na primeira zona e introduzido em uma coluna não adjacente na segunda zona, onde o produto de PUFA é depois coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação que é realizada na segunda zona.

[00098] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, o primeiro produto intermediário é tipicamente coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação.

[00099] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, o primeiro produto intermediário é tipicamente coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação e (a) o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação; ou (b) o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de extrato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de rafinato na terceira etapa de separação.

[000100] Tipicamente, o primeiro produto intermediário obtido na primeira etapa de separação é enriquecido no produto de PUFA comparado com a mistura de alimentação; e/ou o segundo produto intermediário obtido na segunda etapa de separação é enriquecido no produto de PUFA comparado ao primeiro produto intermediário.

[000101] Preferivelmente o primeiro produto intermediário obtido na primeira etapa de separação é enriquecido no produto de PUFA comparado com a mistura de alimentação e o segundo produto intermediário obtido na segunda etapa de separação é enriquecido no produto de PUFA comparado com o primeiro produto intermediário.

[000102] Tipicamente, o primeiro produto intermediário obtido na primeira etapa de separação é esgotado em ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados comparado com a mistura de alimentação.

[000103] Tipicamente, na primeira etapa o produto de PUFA é separado de os componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o produto de PUFA, na segunda etapa o produto de PUFA é separado de os componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o produto de PUFA porém mais polares do que os componentes separados na primeira etapa de separação, e na terceira etapa de separação o produto de PUFA é separado de os componentes que são mais polares do que o produto de PUFA.

[000104] Alternativamente, na primeira etapa o produto de PUFA é separado de os componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o produto de PUFA, na segunda etapa o produto de PUFA é separado de os componentes da mistura de alimentação que são mais polares do que o produto de PUFA, e na terceira etapa de separação o produto de PUFA é separado de os componentes que são menos polares do que o produto de PUFA, porém mais polares do que os componentes separados na primeira etapa de separação.

[000105] Os componentes da mistura de alimentação separados na primeira etapa que são menos polares do que o produto de PUFA são tipicamente ácidos graxos insaturados e/ou monoinsaturados.

[000106] Os componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o produto de PUFA, porém mais polares do que os componentes separados na primeira etapa de separação tipicamente incluem DHA ou um derivado de DHA e/ou outros PUFAs ou derivados de PUFA que são menos polares do que o produto de PUFA, porém mais polares do que os componentes separados na primeira etapa de separação.

[000107] Os componentes da mistura de alimentação que são mais polares do que o produto de PUFA incluem SDA ou um derivado de SDA e/ou outros PUFAs que são mais polares do que o produto de PUFA.

[000108] Os PUFAs outros que não o EPA são bem conhecidos e incluem PUFAs o-3 e o-6. Os exemplos de PUFAs w-3 incluem ácido alfa- linolênico (ALA), ácido estearidônico (SDA), ácido eicosatrienóico (ETE), ácido eicosatetraenóico (ETA), ácido docosapentaenóico (DPA) e ácido docosahexaenóico (DHA). Os exemplos de PUFAs w-6 incluem ácido linoléico (LA), ácido gama-linolênico (GLA), ácido eicosadienóico, ácido dihomo-gama-linolênico (DGLA), ácido araquidônico (ARA), ácido docosadienóico, ácido adrênico e ácido docosapentaenóico (w-6).

[000109] O número de colunas usadas em cada etapa de separação não é particularmente limitado. Uma pessoa habilitada facilmente seria capaz de determinar um número apropriado de colunas para o uso. O número de colunas é tipicamente de 4 ou mais, preferivelmente de 6 ou mais, mais preferivelmente de 8 ou mais, por exemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 colunas. Na forma de realização preferida, 5 ou 6 colunas, mais preferivelmente 6 colunas são usadas. Em uma outra forma de realização preferida, 7 ou 8 colunas, mais preferivelmente 8 colunas são usadas. Tipicamente, não existe mais do que 25 colunas, preferivelmente não mais do que 20, mais preferivelmente não mais do que 15.

[000110] Nas formas de realização onde duas etapas de separação ocorrem simultaneamente em um único aparelho de cromatografia na primeira e segunda zonas respectivamente, o número de colunas em cada zona é tipicamente 4 ou mais, preferivelmente 6 ou mais, mais preferivelmente 8 ou mais, por exemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 colunas.

[000111] Nas formas de realização onde três etapas de separação ocorrem simultaneamente em um único aparelho de cromatografia na primeira, segunda e terceira zonas respectivamente, o número de colunas em cada zona é tipicamente 4 ou mais, preferivelmente 6 ou mais, mais preferivelmente 8 ou mais, por exemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 colunas.

[000112] A primeira, segunda e terceira etapas de separação tipicamente envolve o mesmo número de colunas. Para certas aplicações elas podem ter números diferentes de colunas.

[000113] As dimensões das colunas usadas não são particularmente limitadas, e dependerão do volume da mistura de alimentação a ser purificado. Uma pessoa habilitada facilmente seria capaz de determinar colunas apropriadamente dimensionadas para o uso. O diâmetro de cada coluna está tipicamente entre 10 e 1000 mm, preferivelmente entre 10 e 500 mm, mais preferivelmente entre 25 e 250 mm, ainda mais preferivelmente entre 50 e 100 mm, e o mais preferivelmente entre 70 e 80 mm. O comprimento de cada coluna está tipicamente entre 10 e 300 cm, preferivelmente entre 10 e 200 cm, mais preferivelmente entre 25 e 150 cm, ainda mais preferivelmente entre 70 e 110 cm, e o mais preferivelmente entre 80 e 100 cm.

[000114] A primeira, segunda e terceira etapas de separação tipicamente envolvem colunas tendo dimensões idênticas mas, para certas aplicações, podem ter dimensões diferentes.

[000115] As taxas de fluxo para a coluna são limitadas pelas pressões máximas através da série de colunas e dependerão das dimensões da coluna e do tamanho de partícula das fases sólidas. Uma pessoa habilitada na técnica facilmente será capaz de estabelecer a taxa de fluxo requerida para cada dimensão de coluna para garantir a dessorção eficiente. As colunas de diâmetro maior no geral necessitarão de fluxos mais altos para manter o fluxo linear através das colunas.

[000116] Para os tamanhos de coluna típicos esboçados acima, tipicamente a taxa de fluxo de eluente no aparelho cromatográfico usado na primeira ou segunda etapas de separação é de 1 a 4,5 L/min., preferivelmente de 1,5 a 2,5 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do extrato do aparelho cromatográfico usado na primeira ou segunda etapas de separação é de 0,1 a 2,5 L/min., preferivelmente de 0,5 a 2,25 L/min. Nas formas de realização onde parte do extrato da primeira ou segunda etapas de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na primeira ou segunda etapas de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,7 a 1,4 L/min., preferivelmente de cerca de 1 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do rafinato do aparelho cromatográfico usado na primeira ou segunda etapas de separação é de 0,2 a 2,5 L/min., preferivelmente de 0,3 a 2,0 L/min. Nas formas de realização onde parte do rafinato da primeira ou segunda etapas de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na primeira ou segunda etapas de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,3 a 1,0 L/min., preferivelmente de cerca de 0,5 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira ou segunda etapas de separação é de 5 a 150 ml/min.., preferivelmente de 10 a 100 ml/min.., mais preferivelmente de 20 a 60 ml/min..

[000117] Para os tamanhos de coluna típicos esboçados acima, tipicamente a taxa de fluxo de eluente no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação é de 1 a 4 L/min., preferivelmente de 1,5 a 3,5 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do extrato do aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação é de 0,5 a 2 L/min., preferivelmente de 0,7 a 1,9 L/min. Nas formas de realização onde parte do extrato da terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,6 a 1,4 L/min., preferivelmente de 0,7 a 1,1 L/min., mais preferivelmente de cerca de 0,9 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do rafinato do aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação é de 0,5 a 2,5 L/min., preferivelmente de 0,7 a 1,8 L/min., mais preferivelmente de cerca de 1,4 L/min. Nas formas de realização onde parte do rafinato da terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,3 a 1,0 L/min., preferivelmente de cerca de 0,5 L/min.

[000118] Como a pessoa habilitada avaliará, referências às taxas nas quais o líquido é coletado ou removido por intermédio dos vários extratos e correntes de rafinato referem-se aos volumes de líquido removidos em uma quantidade de tempo, tipicamente L/minuto. Similarmente, referências às taxas nas quais o líquido é reciclado de volta para dentro de um aparelho, tipicamente para uma coluna adjacente no aparelho, referem-se aos volumes de líquido reciclados em uma quantidade de tempo, tipicamente L/minuto.

[000119] O tempo da etapa, isto é, o tempo entre a mudança dos pontos de injeção da mistura de alimentação e eluente, e os vários pontos de coleta das frações coletadas, não é particularmente limitado, e dependerão do número e dimensões das colunas usadas, e da taxa de fluxo através do aparelho. Uma pessoa habilitada facilmente seria capaz de determinar tempos de etapa apropriados para o uso no processo da presente invenção. O tempo da etapa é tipicamente de 100 a 1000 segundos, preferivelmente de 200 a 800 segundos, mais preferivelmente de cerca de 250 a cerca de 750 segundos. Em algumas formas de realização, um tempo de etapa de 100 a 400 segundos, preferivelmente de 200 a 300 segundos, mais preferivelmente de cerca de 250 segundos, é apropriado. Em outras formas de realização, um tempo de etapa de 600 a 900 segundos, preferivelmente de 700 a 800 segundos, mais preferivelmente de cerca de 750 segundos é apropriado.

[000120] No processo da presente invenção, a cromatografia de leito móvel real é preferida.

[000121] Os absorsores convencionais conhecidos na técnica para os sistemas de leito móvel real e simulado podem ser usados no processo da presente invenção. Cada coluna cromatográfica pode conter o mesmo ou um absorsor diferente. Tipicamente, cada coluna contém o mesmo absorsor. Os exemplos de tais materiais habitualmente usados são talões poliméricos, preferivelmente poliestireno reticulado com DVB (divinilbenzeno); e gel de sílica, preferivelmente gel de sílica ligado em fase reversa com alcanos C8 ou C18, especialmente C18. o gel de sílica ligado em fase reversa C18 é preferido. O absorsor usado no processo da presente invenção é preferivelmente não polar.

[000122] A forma do material absorsor da fase estacionária pode ser, por exemplo, de talões esféricos ou não esféricos, preferivelmente talões substancialmente esféricos. Tais talões tipicamente têm um diâmetro de 5 a 500 mícron, preferivelmente de 10 a 500 mícron, mais preferivelmente de 15 a 500 mícron, mais preferivelmente de 40 a 500 mícron, mais preferivelmente de 100 a 500 mícron, mais preferivelmente de 250 a 500 mícron, ainda mais preferivelmente de 250 a 400 mícron, o mais preferivelmente de 250 a 350 mícron. Em algumas formas de realização, os talões com um diâmetro de 5 a 35 mícron podem ser usadas, tipicamente de 10 a 30 mícron, preferivelmente de 15 a 25 mícron. Alguns tamanhos de partícula preferidos são um pouco maiores que os tamanhos de partícula dos talões usadas no passado em processos de leito móvel simulado e real. O uso de partículas maiores permite que uma pressão mais baixa de eluente seja usada no sistema. Isto, por sua vez, tem vantagens em termos de economias de custo, eficiência e tempo de vida do aparelho. Foi surpreendentemente descoberto que os talões absorsores de tamanho de partícula grande podem ser usados no processo da presente invenção (com as suas vantagens associadas) sem nenhuma perda em resolução.

[000123] O absorsor tipicamente tem um tamanho de poro de 10 a 50 nm, preferivelmente de 15 a 45 nm, mais preferivelmente de 20 a 40 nm, o mais preferivelmente de 25 a 35 nm.

[000124] Tipicamente, o processo da presente invenção é conduzido de 15 a 55 °C, preferivelmente de 20 a 40 °C, mais preferivelmente em torno de 30 °C. Assim, o processo é tipicamente realizado na temperatura ambiente, mas pode ser conduzido em temperaturas elevadas.

[000125] Como mencionado acima, os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii). Isto é tipicamente efetuado pelo ajuste das condições de processo no aparelho de cromatografia, ou zona em um aparelho de cromatografia em que a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas.

[000126] Assim, as condições de processo na primeira, segunda e terceira etapas de separação tipicamente variam. As condições de processo que variam podem incluir, por exemplo, o tamanho das colunas usadas, o número de colunas usadas, o empacotamento usado nas colunas, o tempo da etapa do aparelho de SMB, a temperatura do aparelho, o eluente usado nas etapas de separação, ou as taxas de fluxo usadas no aparelho, em particular a taxa de reciclagem do líquido coletado por intermédio das correntes de extrato ou rafinato.

[000127] Preferivelmente as condições de processo que variam são a razão de água:solvente orgânico do eluente usado nas etapas de separação, e/ou a taxa de reciclagem do líquido coletado por intermédio das correntes de extrato ou rafinato nas etapas de separação. Ambas destas opções são debatidas em mais detalhes abaixo.

[000128] Tipicamente, parte da corrente de extrato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e/ou parte da corrente de rafinato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e/ou parte da corrente de extrato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação; e/ou parte da corrente de rafinato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação.

[000129] Preferivelmente, parte da corrente de extrato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e parte da corrente de rafinato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e parte da corrente de extrato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação; e parte da corrente de rafinato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação.

[000130] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, tipicamente parte da corrente de extrato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e/ou parte da corrente de rafinato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação.

[000131] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, preferivelmente parte da corrente de extrato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e parte da corrente de rafinato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e parte da corrente de extrato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e parte da corrente de rafinato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e parte da corrente de extrato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação; e parte da corrente de rafinato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação.

[000132] Esta reciclagem envolve alimentar parte da corrente de extrato ou rafinato fora do aparelho de cromatografia usado na primeira, segunda ou terceira etapas de separação de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa, tipicamente dentro de uma coluna adjacente. Esta coluna adjacente é a coluna adjacente que está a jusante com respeito ao fluxo de eluente no sistema.

[000133] Quando duas ou três etapas de separação são realizadas simultaneamente em uma única cromatografia em duas ou três zonas respectivamente, esta reciclagem envolve reciclar o extrato ou corrente de rafinato particulares removidos de uma zona de volta para dentro da mesma zona.

[000134] A taxa na qual o líquido coletado por intermédio do extrato ou corrente de rafinato em uma etapa de separação particular é reciclado de volta para dentro de um aparelho de cromatografia ou zona usados nesta etapa de separação é a taxa na qual o líquido coletado por intermédio desta corrente é alimentado de volta dentro do aparelho usado nesta etapa, tipicamente dentro de uma coluna adjacente, isto é, a coluna a jusante com respeito ao fluxo de eluente no sistema.

[000135] Isto pode ser observado com referência a uma forma de realização preferida na Figura 5. A taxa de reciclo de extrato na primeira etapa de separação é a taxa na qual o extrato coletado do fundo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é alimentado no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, isto é, a taxa de fluxo do líquido no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.

[000136] A taxa de reciclo de extrato na segunda etapa de separação é a taxa na qual o extrato coletado no fundo da coluna 10 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é alimentado no topo da coluna 11 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, isto é, a taxa de fluxo do líquido no topo da coluna 11 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.

[000137] A taxa de reciclo de extrato na terceira etapa de separação é a taxa na qual o extrato coletado no fundo da coluna 19 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é alimentado no topo da coluna 19 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, isto é, a taxa de fluxo do líquido no topo da coluna 19 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.

[000138] A reciclagem das correntes de extrato e/ou rafinato na primeira, segunda e/ou terceira etapas de separação é tipicamente efetuada pela alimentação do líquido coletado por intermédio desta corrente nesta etapa de separação dentro de um recipiente, e depois bombeando uma quantidade deste líquido do recipiente de volta para dentro do aparelho ou zona usados nesta etapa de separação, tipicamente dentro de uma coluna adjacente. Neste caso, a taxa de reciclo de líquido coletado por intermédio de uma corrente de extrato ou rafinato particular na primeira e/ou segunda etapas de separação, tipicamente de volta para dentro de uma coluna adjacente, é a taxa na qual o líquido é bombeado para fora do recipiente de volta para dentro do aparelho de cromatografia ou zona, tipicamente dentro de uma coluna adjacente.

[000139] Como a pessoa habilitada avaliará, a quantidade de líquido que é introduzido dentro de um aparelho de cromatografia por intermédio das correntes de eluente e estoque de alimentação é equilibrada com a quantidade de líquido removida do aparelho, e reciclado de volta para dentro do aparelho.

[000140] Assim, com referência à Figura 5, para a corrente de extrato, a taxa de fluxo de eluente (dessorvente) no(s) aparelho(s) cromatográfico(s) usado(s) na segunda e terceira etapas de separação (D) é igual à taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato nesta etapa de separação acumula em um recipiente (E2 e E3) adicionado na taxa na qual o extrato é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (D-E2 e D-E3).

[000141] Para a corrente de rafinato de uma etapa de separação, a taxa na qual o extrato é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (D-E l e D-E2) adicionado à taxa na qual o estoque de alimentação é introduzido no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (F e R1) é igual à taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato nesta etapa de separação particular acumula em um recipiente (R1 e R2) adicionada na taxa na qual o rafinato é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (D+F-E1-R1 e D+R1-E2-R2).

[000142] A taxa na qual o líquido coletado de uma corrente de extrato ou rafinato particular a partir de um aparelho de cromatografia ou zona acumula em um recipiente também pode ser considerada como a taxa líquida de remoção deste extrato ou corrente de rafinato deste aparelho de cromatografia.

[000143] Tipicamente, a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é ajustada tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); e/ou em que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é ajustada tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[000144] Preferivelmente, a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é ajustada tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); e em que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é ajustada tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[000145] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na primeira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é tipicamente ajustada tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[000146] Tipicamente, a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação; e/ou a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

[000147] Quando a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na primeira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na primeira etapa de separação tipicamente difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação; e/ou a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na primeira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na primeira etapa de separação tipicamente difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação

[000148] Variando a taxa na qual o líquido coletado por intermédio das correntes de extrato e/ou rafinato na primeira, segunda e/ou terceira etapas de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação particular tem o efeito de variar a quantidade de os componentes mais polares e menos polares presentes nas correntes de extrato e rafinato. Assim, por exemplo, uma taxa de reciclagem de extrato mais baixa resulta em menos dos componentes menos polares nesta etapa de separação sendo carregados através da corrente de rafinato. Uma taxa de reciclagem de extrato mais alta resulta em mais dos componentes menos polares nesta etapa de separação sendo carregados através da corrente de rafinato.

[000149] Isto pode ser observado, por exemplo, na forma de realização específica da invenção mostrada na Figura 5. A taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação (D-E2) afetará até que ponto qualquer um dos componentes A são carregados através da corrente de rafinato na segunda etapa de separação (R2).

[000150] Tipicamente, a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação. Preferivelmente, uma corrente de rafinato que contém o produto de PUFA junto com os componentes mais polares é coletado da segunda etapa de separação e purificados na terceira etapa de separação, e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000151] Alternativamente, a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação. Preferivelmente, uma corrente de extrato que contém o produto de PUFA junto com os componentes menos polares é coletada da segunda etapa de separação e purificada na terceira etapa de separação, e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000152] Onde as taxas de reciclagem são ajustadas tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii), a razão de água:solvente orgânico do eluente usado nas etapas de separação onde as taxas de reciclagem diferem pode ser a mesma ou diferente.

[000153] O eluente usado no processo da presente invenção é um solvente orgânico aquoso.

[000154] O solvente orgânico aquoso tipicamente compreende água e um ou mais alcoóis, éteres, ésteres, cetonas ou nitrilas, ou misturas dos mesmos.

[000155] Os solventes de álcool são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os alcoóis são tipicamente alcoóis de cadeia curta. Os alcoóis tipicamente são da fórmula ROH, em que R é um grupo alquila C1-C6 reto e ramificado. O grupo alquila C1-C6 é preferivelmente não substituído. Os exemplos de alcoóis incluem metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, n- butanol, i-butanol, s-butanol e t-butanol. Metanol e etanol são preferidos. O metanol é o mais preferido.

[000156] Os solventes de éter são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os éteres são tipicamente éteres de cadeia curta. Os éteres tipicamente são da fórmula R-O-R’, em que R e R’ são os mesmos ou diferentes e representam um grupo alquila C1-C6 reto e ramificado. O grupo alquila C1-C6 é preferivelmente não substituído. Os éteres preferidos incluem éter dietílico, éter diisopropílico, e éter metil t-butílico (MTBE).

[000157] Os solventes de éster são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os ésteres são tipicamente ésteres de cadeia curta. Os ésteres tipicamente são da fórmula R-(C=O)O-R’, em que R e R’ são os mesmos ou diferentes e representam um grupo alquila C1-C6 reto e ramificado.

[000158] Os ésteres preferidos incluem acetato de metila e acetato de etila.

[000159] Os solventes de cetona são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. As cetonas são tipicamente cetonas de cadeia curta. As cetonas tipicamente são da fórmula R-(C=O)-R’, em que R e R’ são os mesmos ou diferentes e representam um grupo alquila C1-C6 reto e ramificado. O grupo alquila C1-C6 é preferivelmente não substituído. As cetonas preferidas incluem acetona, metil etil cetona e metil isobutil cetona (MIBK).

[000160] Os solventes de nitrila são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. As nitrilas são tipicamente nitrilas de cadeia curta. As nitrilas tipicamente são da fórmula R-CN, em que R representa um grupo alquila C1-C6 reto e ramificado. O grupo alquila C1-C6 é preferivelmente não substituído. As nitrilas preferidas incluem acetonitrila.

[000161] Tipicamente, o solvente orgânico aquoso é álcool aquoso ou acetonitrila aquosa.

[000162] O solvente orgânico aquoso é preferivelmente metanol aquoso ou acetonitrila aquosa. Metanol aquoso é o mais preferido.

[000163] Tipicamente, o eluente não está em um estado supercrítico. Tipicamente, o eluente é um líquido.

[000164] Tipicamente, a razão de água:solvente orgânico média, por exemplo a razão de água:metanol, do eluente no aparelho inteiro é de 0,1:99,9 a 9:91 % em peso, preferivelmente de 0,25:99,75 a 7:93 % em peso, mais preferivelmente de 0,5:99,5 a 6:94 % em peso.

[000165] Quando o solvente orgânico aquoso é acetonitrila aquosa, o eluente tipicamente contém até 30 % em peso de água, o resto acetonitrila. Preferivelmente, o eluente contém de 5 a 25 % em peso de água, o resto acetonitrila. Mais preferivelmente, o eluente contém de 10 a 20 % em peso de água, o resto acetonitrila. Ainda mais preferivelmente, o eluente contém de 15 a 25 % em peso de água, o resto acetonitrila.

[000166] Tipicamente, a razão de água:solvente orgânico usada em cada etapa de separação é ajustada tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação; e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

[000167] Tipicamente, o eluente de solvente orgânico aquoso usado em duas ou mais das etapas de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente. Em uma forma de realização, a razão de água:solvente orgânico usada em cada etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente.

[000168] A força de eluição do eluente usado em duas ou mais das etapas de separação é tipicamente diferente. Dependendo da escolha do solvente orgânico, eles podem ser dessorvedores mais poderosos do que a água. Alternativamente, eles podem ser dessorvedores menos poderosos do que a água. Acetonitrila e alcoóis, por exemplo, são dessorvedores mais poderosos do que a água.

[000169] Em uma forma de realização preferida, o eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação tem a mesma razão de água:solvente orgânico, e o eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente do eluente de solvente orgânico usado na segunda e terceira etapas de separação.

[000170] Nesta forma de realização preferida, a força de eluição do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação é a mesma; e/ou a força de eluição do eluente usado na primeira etapa de separação é maior do que aquela do eluente usado na segunda etapa de separação. Preferivelmente nesta forma de realização, a força de eluição do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação é a mesma; e a força de eluição do eluente usado na primeira etapa de separação é maior do que aquela do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação. Nesta forma de realização, quando o solvente orgânico aquoso é álcool aquoso ou acetonitrila, a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na segunda e terceira etapas de separação é tipicamente a mesma, e a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na primeira etapa de separação é tipicamente maior do que a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na segunda e terceira etapas de separação. Assim, nesta forma de realização, a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação é tipicamente a mesma, e a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é tipicamente mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação.

[000171] Nesta forma de realização preferida, a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é tipicamente de 0:100 a 5:95 % em peso, preferivelmente de 0,1:99,9 a 2,5:97,5 % em peso, mais preferivelmente de 0,1:99,9 a 2:98 % em peso, ainda mais preferivelmente de 0,1:99,9 a 1:99 % em peso, ainda mais preferivelmente de 0,25:99,75 a 0,75:99,25 % em peso, e o mais preferivelmente em torno de 0,5:99,5. Nesta forma de realização preferida, a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação é tipicamente de 5:95 a 11:89 % em peso, preferivelmente de 6:94 a 10:90 % em peso, mais preferivelmente de 7:93 a 9:91 % em peso, ainda mais preferivelmente de 7,5:92,5 a 8,5:91,5 % em peso, e o mais preferivelmente em torno de 8:92 % em peso.

[000172] Nesta forma de realização preferida, a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na primeira etapa de separação é preferivelmente de 0,1:99,9 a 1:99 % em peso, e a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação é preferivelmente de 7:93 a 9:91 % em peso.

[000173] Em uma forma de realização alternativa, o eluente de solvente orgânico aquoso usado em cada etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente.

[000174] Nesta forma de realização alternativa, a força de eluição do eluente usado na primeira etapa de separação é maior do que aquela do eluente usado na segunda etapa de separação; e/ou a força de eluição do eluente usado na segunda etapa de separação é maior do que aquela do eluente usado na terceira etapa de separação. Preferivelmente, uma corrente de rafinato que contém o produto de PUFA junto com os componentes mais polares é coletada da segunda etapa de separação e purificada na terceira etapa de separação e a força de eluição do eluente usado na segunda etapa de separação é maior do que aquela do eluente usado na terceira etapa de separação. Alternativamente, uma corrente de extrato que contém o produto de PUFA junto com os componentes menos polares é coletada da segunda etapa de separação e purificada na terceira etapa de separação e a força de eluição do eluente usado na segunda etapa de separação é mais baixa do que aquela do eluente usado na terceira etapa de separação.

[000175] Na prática isto é obtido pela variação das quantidades relativas de água e solvente orgânico usadas em cada etapa de separação. Nesta forma de realização, quando o solvente orgânico aquoso é álcool aquoso ou acetonitrila, a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na primeira etapa de separação é tipicamente maior do que a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na segunda etapa de separação; e/ou a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na segunda etapa de separação é tipicamente maior do que a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na terceira etapa de separação. Assim, nesta forma de realização, a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é tipicamente mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda etapa de separação; e/ou a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda etapa de separação é tipicamente mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente na terceira etapa de separação.

[000176] Será avaliado que as razões de água e solvente orgânico em cada etapa de separação aludida acima são razões médias dentro da totalidade do aparelho cromatográfico.

[000177] Tipicamente, a razão de água:solvente orgânico do eluente em cada etapa de separação é controlada pela introdução de água e/ou solvente orgânico dentro de uma ou mais colunas nos aparelhos cromatográficos usados nas etapas de separação. Assim, por exemplo, para se obter uma razão de água:solvente orgânico mais baixa na primeira etapa de separação do que na segunda e terceira etapas de separação, água é tipicamente introduzida mais lentamente no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação do que na segunda e terceira etapas de separação.

[000178] Em algumas formas de realização, solvente orgânico essencialmente puro e água essencialmente pura podem ser introduzidos em pontos diferentes no aparelho cromatográfico usado em cada etapa de separação. As taxas de fluxo relativas destas duas correntes determinarão o perfil global do solvente no aparelho cromatográfico. Em outras formas de realização, misturas de solvente orgânico/água diferentes podem ser introduzidas em pontos diferentes em cada aparelho cromatográfico usado em cada etapa de separação. Isto envolverá introduzir duas ou mais misturas de solvente orgânico/água diferentes no aparelho cromatográfico usado em um etapa de separação particular, cada mistura de solvente orgânico/água tendo uma razão de solvente orgânico:água diferente. As taxas de fluxo relativas e as concentrações relativas das misturas de solvente orgânico/água nesta forma de realização determinarão o perfil de solvente global no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação.

[000179] Preferivelmente, o eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação tem a mesma razão de água:solvente orgânico, e o eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente do eluente de solvente orgânico usado na segunda e terceira etapas de separação; e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

[000180] Mais preferivelmente, a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação é a mesma, e a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação; e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000181] Ainda mais preferivelmente,

[000182] a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real;

[000183] a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida, e em que a primeira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado;

[000184] o primeiro produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação, o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação;

[000185] a segunda corrente de rafinato de produto intermediário que contém o produto de PUFA junto com os componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida dentro de uma coluna não adjacente na segunda zona;

[000186] o eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação tem a mesma razão de água:solvente orgânico, e a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação; e

[000187] a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000188] É preferido que a primeira etapa de separação compreenda purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real; e a segunda e terceira etapas de separação sejam realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida, e em que a primeira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado. Uma forma de realização preferida disto é ilustrada na Figura 3.

[000189] Uma mistura de alimentação F que compreende o produto de PUFA (B) e o mais polar (C) e o menos polar (A’) e os componentes (a) são purificados na primeira etapa de separação. Na primeira etapa de separação, os componentes menos polares (por exemplo saturados e/ou monoinsaturados) (A’) são removidos como corrente de extrato E1. O produto de PUFA (B), os componentes mais polares (C) e os componentes menos polar (porém mais polares do que (A’)) (a) são coletados como corrente de rafinato R1. A corrente de rafinato R1 é o produto intermediário que é depois purificado na segunda etapa de separação.

[000190] Na segunda etapa de separação, os componentes menos polares (a) são removidos como corrente de extrato E2. O produto de PUFA (B) e os componentes mais polares (C) são coletados como corrente de rafinato R2. A corrente de rafinato R2 é o produto intermediário que é depois purificado na terceira etapa de separação.

[000191] Na terceira etapa de separação, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato R3. O produto de PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E3. A segunda e terceira etapas de separação ocorrem em duas zonas em um único aparelho cromatográfico SMB.

[000192] Esta forma de realização é ilustrada em mais detalhes na Figura 4. A Figura 4 é idêntica à Figura 2, exceto que os pontos de introdução do solvente orgânico aquoso dessorvente (D) dentro de cada aparelho cromatográfico são mostrados.

[000193] Os solventes típicos para o uso nesta forma de realização mais preferida são alcoóis aquosos ou acetonitrila aquosa, preferivelmente metanol aquoso.

[000194] Tipicamente nesta forma de realização preferida, o eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação tem a mesma razão de água:solvente orgânico, e o eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente do eluente de solvente orgânico usado na segunda e terceira etapas de separação; e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

[000195] Preferivelmente, nesta forma de realização preferida, a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação é a mesma, e a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação; e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000196] Nesta forma de realização preferida a primeira corrente de rafinato na primeira etapa de separação é tipicamente removida a jusante do ponto de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.

[000197] Nesta forma de realização particularmente preferida, a primeira corrente de extrato na primeira etapa de separação é tipicamente removida a montante do ponto de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.

[000198] Nesta forma de realização particularmente preferida, a segunda corrente de rafinato na segunda etapa de separação é tipicamente removida a jusante do ponto de introdução do primeiro produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.

[000199] Nesta forma de realização particularmente preferida, a segunda corrente de extrato na segunda etapa de separação é tipicamente coletada a montante do ponto de introdução do primeiro produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.

[000200] Nesta forma de realização particularmente preferida, a terceira corrente de rafinato na terceira etapa de separação é tipicamente removida a jusante do ponto de introdução do segundo produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.

[000201] Nesta forma de realização particularmente preferida, a terceira corrente de extrato na terceira etapa de separação é tipicamente coletada a montante do ponto de introdução do segundo produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.

[000202] Tipicamente nesta forma de realização preferida, o solvente orgânico aquoso é introduzido no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação a montante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.

[000203] Tipicamente nesta forma de realização preferida, o solvente orgânico aquoso é introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação a montante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.

[000204] Tipicamente nesta forma de realização preferida, o solvente orgânico aquoso é introduzido no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação a montante do ponto de remoção da terceira corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.

[000205] Uma forma de realização mais preferida da invenção ilustrada nas Figuras 3 e 4 é mostrada na Figura 5. Esta ilustra o número de colunas usadas em cada etapa de separação, e mostra pontos típicos de introdução de misturas de alimentação e eluentes, e pontos típicos de remoção de extrato e correntes de rafinato.

[000206] Assim, nesta forma de realização mais preferida, o aparelho de cromatografia SMB usado na primeira etapa de separação consiste de oito colunas cromatográficas, de 1 a 8. O aparelho de cromatografia SMB usado na segunda etapa de separação consiste de oito colunas cromatográficas, de 9 a 16. O aparelho de cromatografia SMB usado na terceira etapa de separação consiste de sete colunas cromatográficas, de 17 a 23.

[000207] Em cada aparelho as colunas são tipicamente dispostas em série de modo que (no caso da primeira etapa de separação) o fundo da coluna 1 é ligado ao topo da coluna 2, o fundo da coluna 2 é ligado ao topo da coluna 3...etc... e o fundo da coluna 8 é ligado ao topo da coluna 1. Estas ligações podem ser opcionalmente por intermédio de um recipiente de contensão, com uma corrente de reciclagem dentro da coluna seguinte. O fluxo de eluente através do sistema é da coluna 1 para a coluna 2 para a coluna 3 etc. O fluxo de absorsor eficaz através do sistema é da coluna 8 para a coluna 7 para a coluna 6 etc.

[000208] Nesta forma de realização mais preferida, uma mistura de alimentação F que compreende o produto de PUFA (B) e o mais polar (C) e o menos polar (A’) e os componentes (a) são introduzidos no topo da coluna 5 no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. O solvente orgânico aquoso dessorvente é introduzido no topo da coluna 1 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. Na primeira etapa de separação, os componentes menos polares (por exemplo, saturados e/ou monoinsaturados) (A’) são removidos como corrente de extrato E1 do fundo da coluna 2. O produto de PUFA (B), os componentes mais polares (C) e os componentes menos polares (porém mais polares do que (A’)) (a) são coletados como corrente de rafinato R1 do fundo da coluna 6.

[000209] A corrente de rafinato R1 é o primeiro produto intermediário que é depois purificado na segunda etapa de separação, sendo introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação no topo da coluna 13. O solvente orgânico aquoso dessorvente é introduzido no topo da coluna D no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.

[000210] Na segunda etapa de separação, os componentes menos polares (a) são removidos como corrente de extrato E2 no fundo da coluna 10. O produto de PUFA (B) e os componentes mais polares (C) são coletados como corrente de rafinato R2 no fundo da coluna 14. A corrente de rafinato R2 é o produto intermediário que é depois purificado na terceira etapa de separação, sendo introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação no topo da coluna 21.

[000211] Na terceira etapa de separação, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato R3 no fundo da coluna 22. O produto de PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E3 no fundo da coluna 18. A segunda e terceira etapas de separação ocorrem em duas zonas em um único aparelho cromatográfico SMB.

[000212] Nesta forma de realização mais preferida, o solvente orgânico aquoso é tipicamente introduzido no topo da coluna 1 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.

[000213] Nesta forma de realização mais preferida, o solvente orgânico aquoso é tipicamente introduzido no topo da coluna 9 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.

[000214] Nesta forma de realização mais preferida, o solvente orgânico aquoso é tipicamente introduzido no topo da coluna 17 do aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000215] Nesta forma de realização mais preferida, a corrente de alimentação é tipicamente introduzida no topo da coluna 5 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.

[000216] Nesta forma de realização mais preferida, uma primeira corrente de rafinato é tipicamente coletada como o primeiro produto intermediário do fundo da coluna 6 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. este primeiro produto intermediário é depois purificado na segunda etapa de separação e é tipicamente introduzido no topo da coluna 13 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. a primeira corrente de rafinato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente antes de ser purificada na segunda etapa de separação.

[000217] Nesta forma de realização mais preferida, uma primeira corrente de extrato é tipicamente removida do fundo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. a primeira corrente de extrato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente e reintroduzida no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.

[000218] Nesta forma de realização mais preferida, uma segunda corrente de rafinato é tipicamente coletada como o segundo produto intermediário do fundo da coluna 14 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. Este segundo produto intermediário é depois purificado na terceira etapa de separação e é tipicamente introduzido no topo da coluna 21 do aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação. a segunda corrente de rafinato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente antes de ser purificada na segunda etapa de separação.

[000219] Nesta forma de realização mais preferida, uma segunda corrente de extrato é tipicamente removida do fundo da coluna 10 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.

[000220] Nesta forma de realização mais preferida, uma terceira corrente de extrato é tipicamente coletada do fundo da coluna 18 do aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação. esta terceira corrente de extrato tipicamente contém o produto de PUFA purificado. A terceira corrente de extrato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente e reintroduzida no topo da coluna 19 do aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000221] Nesta forma de realização mais preferida, uma terceira corrente de rafinato é tipicamente removida do fundo da coluna 22 do aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000222] Tipicamente nesta forma de realização mais preferida, o eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação tem a mesma razão de água:solvente orgânico, e o eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente do eluente de solvente orgânico usado na segunda e terceira etapas de separação; e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

[000223] Preferivelmente nesta forma de realização mais preferida, a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação é a mesma, e a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda e terceira etapas de separação; e a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

[000224] Nesta forma de realização mais preferida, a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação é a mesma e é de 7:93 a 9:91 % em peso, e a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é de 0,1:99,9 a 1:99 % em peso.

[000225] Embora estas formas de realização preferidas e mais preferidas sejam mostradas como para a Figura 2C debatida acima, elas também podem ser realizadas com aparelhos configurados tal que:

[000226] a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, e a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a primeira, segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira, segunda e terceira zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida; ou

[000227] a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, e a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida, e em que a primeira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado; ou

[000228] a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, e (a) a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o primeiro e segundo produtos intermediários sendo recuperados entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação respectivamente, e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); ou

[000229] (b) a segunda etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na primeira etapa de separação, e/ou a terceira etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na segunda etapa de separação; ou

[000230] a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito estacionário, e a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona é como aqui definida; ou

[000231] a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito estacionário, e a segunda e terceira etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o segundo produto intermediário sendo recuperado entre a segunda e terceira etapas de separação e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a segunda e terceira etapas de separação tal que o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); ou

[000232] a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito estacionário, e a segunda e terceira etapas de separação são realizadas em aparelhos de cromatografia separados respectivamente, o produto intermediário obtido da segunda etapa de separação sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

[000233] O processo da invenção permite que purezas muito mais altas de produto de PUFA sejam obtidas do que tem sido possível com as técnicas cromatográficas convencionais. Os produtos de PUFA produzidos pelo processo da invenção também têm perfis de impureza particularmente vantajosos, que são muito diferentes daqueles observados em óleos preparados pelas técnicas conhecidas. A presente invenção portanto também diz respeito às composições que compreendem um produto de PUFA, por exemplo um obtenível pelo processo da presente invenção.

[000234] Na prática, o processo da presente invenção no geral será controlado por um computador. A presente invenção, portanto também fornece um programa de computador para controlar um aparelho cromatográfico como aqui definido, o programa de computador contendo meios de codificação que quando executado instrui o aparelho para realizar o processo da invenção.

[000235] Os Exemplos que seguem ilustram a invenção. EXEMPLOS Exemplo 1

[000236] Um estoque de alimentação derivado de óleo de peixe (55 % em peso de EPA EE, 5 % em peso de DHA EE) é fracionado usando um sistema de cromatografia de leito móvel real usando gel de sílica C18 ligado como fase estacionária e metanol aquoso como eluente de acordo com o sistema esquematicamente ilustrado na Figura 5. Um traço de GC da mistura de alimentação é mostrado como Figura 7.

[000237] Em uma primeira etapa de separação, a mistura de alimentação foi passada através de um aparelho SMB tendo 8 colunas de 1 a 8 (diâmetro: 152 mm, comprimento: 813 mm) conectadas em série como mostrado na Figura 5. As condições de processo foram ajustadas para remover os componentes saturados e monoinsaturados da mistura de alimentação como a corrente de extrato. Um eluente a 0,5:99,5 % em peso de água:metanol foi usado. A corrente de rafinato foi retida como o primeiro produto intermediário. Um traço de GC do primeiro produto intermediário é mostrado como Figura 8.

[000238] O primeiro produto intermediário foi passado através de um aparelho SMB tendo duas zonas com oito colunas, colunas de 9 a 16, na primeira zona e sete colunas, colunas 17 a 23, na segunda zona. Um eluente a 8:92 % em peso de água:metanol foi usado tanto na primeira quanto na segunda zonas, isto é, tanto na segunda quanto na terceira etapas de separação. As condições de processo na primeira zona foram ajustadas para purificar EPA dos componentes que se deslocam mais lento tais como DHA, que foram removidos como a corrente de extrato. A corrente de rafinato foi retida como o segundo produto intermediário. Um traço de GC do segundo produto intermediário é mostrado como Figura 9.

[000239] O segundo produto intermediário foi depois introduzido dentro da segunda zona e separado dos componentes que se deslocam mais rápido, que foram removidos como uma corrente de rafinato. EPA de alta pureza foi coletado como a corrente de extrato da segunda zona. Um traço de GC do produto EPA de PUFA é mostrado como Figura 10.

[000240] EPA foi produzido com uma pureza final de mais do que 97 %.

[000241] Pode ser observado que para as três etapas de separação quanto juntas, a taxa global de acúmulo de extrato (E1+E2+E3) 3876 ml/min..

[000242] As condições de processo para cada etapa de separação são como segue: Primeira etapa de separação

[000243] Taxa de alimentação do estoque de alimentação: 94 ml/min.

[000244] Taxa de alimentação do dessorvente: 6250 ml/min.

[000245] Taxa de acúmulo de extrato: 1250 ml/min.

[000246] Taxa de reciclagem de extrato: 5000 ml/min.

[000247] Taxa de acúmulo de rafinato: 1688 ml/min.

[000248] Tempo de ciclo: 600 s Segunda etapa de separação

[000249] Taxa de alimentação do primeiro produto intermediário: 40 ml/min.

[000250] Taxa de alimentação do dessorvente: 6313 ml/min.

[000251] Taxa de acúmulo de extrato: 1188 ml/min.

[000252] Taxa de reciclagem de extrato: 5125 ml/min.

[000253] Taxa de acúmulo de rafinato: 1625 ml/min.

[000254] Tempo de ciclo: 1200 s Terceira etapa de separação

[000255] Taxa de alimentação do segundo produto intermediário: 40 ml/min.

[000256] Taxa de alimentação do dessorvente: 6189 ml/min.

[000257] Taxa de acúmulo de extrato: 1438 ml/min.

[000258] Taxa de reciclagem de extrato: 4750 ml/min.

[000259] Taxa de acúmulo de rafinato: 1438 ml/min.

[000260] Tempo de ciclo: 1080 s Exemplo Comparativo 1

[000261] Um experimento foi realizada para produzir um produto de PUFA que contenha mais do que 97 % de EPA a partir da mesma mistura de alimentação como foi usada no Exemplo 1. Entretanto, ao invés de usar um processo de separação de três etapas de acordo com a presente invenção, apenas duas etapas de separação foram usadas. Assim, o processo foi realizado de acordo com o processo divulgado na PCT/GB10/002339, e como ilustrado na Figura 6.

[000262] Um único aparelho cromatográfico tendo duas zonas foi usado como mostrado na Figura 6. A primeira zona contém 8 colunas (diâmetro: 24” (61 cm), comprimento: 32” (81 cm)) e a segunda zona 7 colunas (diâmetro: 24” (61 cm), comprimento: 32” (81 cm)). As condições de processo foram ajustadas para separar o produto de PUFA de EPA dos componentes menos polares da mistura de alimentação na primeira zona, e os componentes mais polares da mistura de alimentação na segunda zona. Um eluente de 8:92 % em peso de água:metanol foi usado em ambas as zonas.

[000263] EPA foi produzido com uma pureza final de mais do que 97 %.

[000264] Pode ser observado que para as duas etapas de separação quando juntas, a taxa global de acúmulo de extrato (E1+E2) foi de 10571 ml/min.. Assim, pode ser observado que um volume muito mais alto de solvente orgânico aquoso é requerido para recuperar o produto de PUFA comparado com o processo de três etapas da invenção.

Claims (29)

1. Processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA) a partir de uma mistura de alimentação que é um óleo de peixe ou que é derivada de óleo de peixe, caracterizado pelo fato de que o processo compreende as etapas de: (i) purificar a mistura de alimentação em uma etapa de separação cromatográfica de leito estacionário ou leito móvel simulado ou real, para se obter um primeiro produto intermediário; e (ii) purificar o primeiro produto intermediário obtido em (i) em uma etapa de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real, para se obter um segundo produto intermediário; e (iii) purificar o segundo produto intermediário obtido em (ii) em uma etapa de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real, para obter o produto de PUFA; em que um solvente orgânico aquoso é usado como eluente em cada etapa de separação; os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação; o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); na primeira etapa o produto de PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o produto de PUFA, na segunda etapa o produto de PUFA é separado dos componentes da mistura de alimentação que são menos polares do que o produto de PUFA porém mais polares do que os componentes separados na primeira etapa de separação, e na terceira etapa de separação o produto de PUFA é separado dos componentes mais polares da mistura de alimentação; e o produto de PUFA obtido na terceira etapa de separação contém EPA ou um derivado de EPA em uma quantidade maior do que 90 % em peso.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real; e em que a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a primeira, segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira, segunda e terceira zonas respectivamente, em que cada zona tem um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real; e em que a primeira e segunda etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a primeira e segunda etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona tem um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e em que a terceira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real; e em que a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona tem um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e em que a primeira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real; e em que (a) a primeira, segunda e terceira etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o primeiro e segundo produtos intermediários sendo recuperados entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação respectivamente, e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda, e segunda e terceira etapas de separação tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); ou (b) a segunda etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na primeira etapa de separação, e/ou a terceira etapa de separação é realizada usando um aparelho cromatográfico diferente daquele usado na segunda etapa de separação.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito estacionário; e em que (a) a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona tem um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona; ou (b) a segunda e terceira etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o segundo produto intermediário sendo recuperado entre a segunda e terceira etapas de separação e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a segunda e terceira etapas de separação tal que o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); ou (c) a segunda e terceira etapas de separação são realizadas em aparelhos de cromatografia separados respectivamente, o produto intermediário obtido da segunda etapa de separação sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 6, caracterizado pelo fato de que nos aparelhos de cromatografia de leito móvel simulado ou real em que duas etapas de separação são realizadas simultaneamente em duas zonas, uma corrente de rafinato ou extrato é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona; e/ou em que nos aparelhos de cromatografia de leito móvel simulado ou real em que três etapas de separação são realizadas simultaneamente em três zonas, uma corrente de rafinato ou extrato é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, e uma corrente de rafinato ou extrato é coletado de uma coluna na segunda zona e introduzido em uma coluna não adjacente na terceira zona.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o primeiro produto intermediário obtido na primeira etapa de separação é enriquecido no produto de PUFA comparado com a mistura de alimentação; e o segundo produto intermediário obtido na segunda etapa de separação é enriquecido no produto de PUFA comparado com o primeiro produto intermediário.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os componentes separados do produto de PUFA na segunda etapa de separação incluem DHA ou um derivado de DHA e/ou outros PUFAs ou derivados de PUFA que são menos polares do que o produto de PUFA; e/ou os componentes separados do produto de PUFA na terceira etapa de separação incluem SDA ou um derivado de SDA e/ou outros PUFAs que são mais polares do que o produto de PUFA.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, e em que o primeiro produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o eluente é uma mistura de água e um álcool, um éter, um éster, uma cetona ou uma nitrila.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o eluente é uma mistura de água e metanol.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o produto de PUFA contém EPA ou um derivado de EPA em uma quantidade maior do que 95 % em peso.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o produto de PUFA contém EPA ou um derivado de EPA em uma quantidade maior do que 97 % em peso.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o derivado de EPA é éster etílico de EPA (EE).

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que - parte da corrente de extrato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e/ou - parte da corrente de rafinato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e/ou - parte da corrente de extrato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação; e/ou - parte da corrente de rafinato do aparelho usado na terceira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na terceira etapa de separação.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, e em que - parte da corrente de extrato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e/ou - parte da corrente de rafinato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a razão de água:solvente orgânico usada em cada etapa de separação é ajustada tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação são removidos na primeira etapa de separação; e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o eluente de solvente orgânico aquoso usado em cada etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação tem a mesma razão de água:solvente orgânico, e o eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente do eluente de solvente orgânico usado na segunda e terceira etapas de separação.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a razão de água:solvente orgânico do eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na primeira etapa de separação é de 0,1:99,9 a 1:99 % em peso, e a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação é de 7:93 a 9:91 % em peso.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 23, caracterizado pelo fato de que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é ajustado tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii); e/ou em que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é ajustado tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

25. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, e em que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio de uma ou tanto na corrente de extrato quanto na de rafinato na primeira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação é ajustado tal que os ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados presentes na mistura de alimentação sejam removidos na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação nas etapas (ii) e (iii).

26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 25, caracterizado pelo fato de que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na terceira etapa de separação.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 26, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real, e em que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na primeira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na primeira etapa de separação difere da taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 27, caracterizado pelo fato de que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

29. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que: - a primeira etapa de separação compreende purificar a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real; - a segunda e terceira etapas de separação são realizadas simultaneamente em um único aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, a segunda e terceira etapas de separação sendo realizadas na primeira e segunda zonas respectivamente, em que cada zona tem um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita zona; e em que a primeira etapa de separação é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real separado; - o primeiro produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação, o segundo produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na terceira etapa de separação; - a segunda corrente de rafinato de produto intermediário que contêm o produto de PUFA junto com os componentes mais polares é coletado de uma coluna na primeira zona e introduzido dentro de uma coluna não adjacente na segunda zona; - o eluente de solvente orgânico aquoso usado na segunda e terceira etapas de separação tem a mesma razão de água:solvente orgânico, e a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente usado na segunda e terceira etapas de separação; e - a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na segunda etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é mais rápida do que a taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na terceira etapa de separação é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado na terceira etapa de separação.

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