CN103826714B - 用于从鱼油中生产高纯度epa的smb方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于从进料混合物中回收多不饱和脂肪酸（PUFA）的色谱分离方法，所述进料混合物为鱼油或源于鱼油，所述方法包括以下步骤：（i）在色谱分离步骤中纯化所述进料混合物，以获得第一中间产物；和（ii）在模拟或真实移动床色谱分离步骤中纯化在（i）中获得的所述第一中间产物，以获得第二中间产物；和（iii）在模拟或真实移动床色谱分离步骤中纯化在（ii）中获得的所述第二中间产物，以获得所述PUFA产物；其中，在每个分离步骤中使用含水有机溶剂作为洗脱液；在所述第一分离步骤中，移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸；在步骤（ii）和（iii）中，将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离开；并且在第三分离步骤中获得的所述PUFA产物含有量大于90wt%的EPA或EPA衍生物。

Description

用于从鱼油中生产高纯度EPA的SMB方法
技术领域
本发明涉及一种用于纯化多不饱和脂肪酸EPA或其衍生物的改进的色谱分离方法。
背景技术
EPA及其衍生物是生物学上重要的分子的前体，它们在生物学功能（诸如血小板聚集、炎症和免疫反应）的调节中起到重要作用。因此，EPA及其衍生物可在治疗上用于治疗包括CNS病症的广泛的病理病症、包括糖尿病性神经病变的神经病变、心血管疾病、一般免疫系统和包括炎症性皮肤疾病的炎症状态。
已在天然原材料，且特别是鱼油中发现有EPA。然而，鱼油中的EPA与饱和脂肪酸和许多其它杂质掺和在一起存在于这种油中。
从鱼油中纯化EPA特别有挑战性。因此，鱼油是含有在色谱设备中具有非常相似的保留时间的大量不同组分的极其复杂的混合物。它们代表从中纯化EPA比例如藻油原料（feedstock）更具有挑战性的原料。然而，特别对于用于治疗应用和营养食品应用来说，需要非常高纯度的EPA。因此，在历史上，蒸馏已经用于纯化EPA，以用于治疗应用。
可惜的是，EPA极其不稳定。因此，当在氧存在下进行加热时，，EPA易于发生异构化反应、过氧化反应和低聚反应。因此，难以进行EPA的分馏和纯化来制备纯的脂肪酸。即使在真空条件下，蒸馏也可能导致不可接受的产物降解。
模拟和真实移动床色谱是本领域技术人员所熟悉的已知技术。操作原理涉及液体洗脱液相和固体吸附剂相的逆流运动。此操作允许溶剂的最小用量，从而使得该方法经济可行。这种分离技术已经发现在包括碳氢化合物、工业化学品、油、糖和API的不同领域中的几个应用。
众所周知，在常规的固定床色谱系统中，其组分待分离的混合物通过容器渗出。该容器典型地为圆柱形，并且典型地被称为柱子。该柱子含有对流体展示出高渗透性的多孔材料的填充（packing）（一般地称为固定相）。该混合物的各组分的渗透速率取决于该组分的物理性质，以便该组分依次地且有选择地从柱子中离去。因此，一些组分趋向于牢固地固定到固定相，并从而将缓慢地渗出，然而其它组分趋向于弱地固定并从柱子中迅速离去。已提出许多不同的固定床色谱系统，并均被用于分析和工业生产的目的。
与此相反，模拟移动床色谱设备由含有吸附剂的串联联接在一起的若干单独的柱子组成。洗脱液在第一方向上通过柱子。在系统中，原料和洗脱液的注入点以及已分离组分的收集点依靠一系列阀门而周期性地转变。整体效应将模拟含有固体吸附剂的移动床的单个柱子的操作，固体吸附剂以与洗脱液的流动相反的方向移动。因此，如在常规的固定床系统中，模拟移动床系统由含有洗脱液通过的固体吸附剂的固定床的柱子组成；但在模拟移动床系统中像这样的操作来模拟连续逆流移动床。
模拟移动床色谱的方法和装置被描述在几项专利中，包括：US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148和FR-A-2651149，以上全部通过引用而被并入本文。该主题还涉及由Ganetsos和Barker（MarcelDekker公司，纽约，1993年）所编辑的“制备规模和生产规模色谱法（PreparativeandProductionScaleChromatography）”的范围，以上全部通过引用而被并入本文。
真实移动床系统在操作上类似于模拟移动床系统。但不是借助于阀门系统来变换进料混合物和洗脱液的注入点与被分离开的组分收集点，而是使一系列吸附单元（即，柱子）相对于进料点和抽取点进行物理移动。再次，像这样操作以模拟连续逆流移动床。
用于真实移动床色谱的方法和装置被描述在几项专利中，包括：US6979402、US5069883和US4764276，以上全部通过引用而被并入本文。
参照图1来说明典型的模拟移动床色谱设备。通过考虑含有固定相S的垂直色谱柱来解释模拟或真实移动床色谱分离方法的概念，其中，该含有固定相S的垂直色谱柱从柱子的底部到顶部被分成多个区间（section），更精确地分成四个重叠的子区域I、II、III和IV。在底部在IE处依靠泵P来引入洗脱液。在子区域II和子区域III之间的IA+B处引入待分离的组分A和B的混合物。在子区域I和子区域II之间的SB处收集主要含有B的提取物（extract），并且在子区域III和子区域IV之间的SA处收集主要含有A的提余物（raffinate）。
在模拟移动床系统的情况下，通过引入点和收集点相对于固体相的移动来引起固定相S的模拟向下移动。在真实移动床系统的情况下，通过各种色谱柱相对于引入点和收集点的移动来引起固定相S的模拟向下移动。在图1中，洗脱液向上流动，并且在子区域II和子区域III之间注入混合物A+B。各组分将根据它们与固定相的色谱相互作用（chromatographicinteraction）（例如在多孔介质上的吸附）进行移动。展示对固定相有较强亲合性的组分B（运动较慢的组分）将被洗脱液较慢地冲走（entrain）并且将延迟地跟随该洗脱液。展示对固定相有较弱亲合性的组分A（运动较快的组分）将容易被该洗脱液冲走。如果正确地估计和控制正确的一组参数（therightsetofparameter）（特别是在每个子区域中的流速），那么将在子区域III和子区域IV之间收集展示对固定相有较弱亲合性的组分A作为提余物，并且在子区域I和子区域II之间收集展示对固定相有较强亲合性的组分B作为提取物。
为了获取大于90%（例如大于95%，或97%）的纯度的高纯度的EPA或EPA乙酯，利用执行两个同时发生的分离步骤的模拟移动床分离方法是可能的。这种方法被描述在国际专利申请PCT/GB10/002339中，以上全部通过引用而被并入本文。
一般而言，包括SMB方法的用于分离PUFA的所有色谱分离技术均利用大体积的有机溶剂作为洗脱液。在完成色谱分离方法后，必须从洗脱液中的溶液中回收PUFA。典型地，从洗脱液中的溶液中回收PUFA需要巨大的时间和精力支出。而且，在色谱分离方法中用作洗脱液的有机溶剂经常对环境或处理它们的技工是有害的。因此，需要一种减少需使用的有机溶剂的量的色谱分离方法。
现在已经有利地发现，可以通过一种三步分离方法来生产具有如PCT/GB10/002339中所描述的相似高纯度的EPA或EPA衍生物，该三步分离方法使用的溶剂体积比两步方法低很多。本发明的改进的方法利用比PCT/GB10/002339中所描述的两步方法少约50%的溶剂。这在成本、产物回收简便和环境影响方面上是明显有利的。
发明内容
已令人惊讶地发现，通过使用相对低的体积的含水有机溶剂洗脱液的模拟或真实移动床设备可以有效地从诸如鱼油的商用原材料中纯化EPA或EPA衍生物。因此，本发明提供一种用于从进料混合物中回收多不饱和脂肪酸（PUFA）的色谱分离方法，所述进料混合物为鱼油或源于鱼油，所述方法包括以下步骤：
（i）在色谱分离步骤中纯化所述进料混合物，以获得第一中间产物；和
（ii）在模拟或真实移动床色谱分离步骤中纯化在（i）中获得的所述第一中间产物，以获得第二中间产物；和
（iii）在模拟或真实移动床色谱分离步骤中纯化在（ii）中获得的所述第二中间产物，以获得所述PUFA产物；其中，
在每个分离步骤中使用含水有机溶剂作为洗脱液；
在所述第一分离步骤中，移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸；
在步骤（ii）和（iii）中，将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离开；并且
在第三分离步骤中获得的所述PUFA产物含有量大于90wt%的EPA或EPA衍生物。
本发明还提供了一种通过本发明的方法可获得的PUFA产物。
附图说明
图1示出用于分离二元混合物的模拟或真实移动床方法的基本原理。
图2示出可以进行本发明的色谱分离方法的三种方式。
图3示出适于生产高纯度EPA的本发明的优选实施方式。
图4更详细地示出图2的实施方式。
图5示出在图2中所示的实施方式的更优选的实施方式。
图6示出（没有按照本发明）用于生产EPA的两阶段分离方法。
图7显示用于在按照本发明的方法中使用的合适的原料的GC迹线。
图8显示按照本发明的方法所生产的第一中间产物的GC迹线。
图9显示按照本发明的方法所生产的第二中间产物的GC迹线。
图10显示按照本发明的方法所生产的PUFA产物的GC迹线。
具体实施方式
如本文所用的，术语“PUFA产物”是指包含一种或多种多不饱和脂肪酸（PUFA）和/或其衍生物，典型地具有营养或药物重要性的产物。本发明的方法中所获得的PUFA产物含有大于90wt%的量的EPA或EPA衍生物，即相对于不包括含水有机溶剂洗脱液的最终PUFA产物中的全部组分，EPA或EPA衍生物以90wt%的纯度存在。因此，基于起源于进料混合物的PUFA产物的全部组分，EPA或EPA衍生物存在于PUFA产物中的量为至少90wt%。
EPA衍生物是为甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、酯、磷脂、酰胺、内酯或盐的形式的EPA。甘油三酯和酯是优选的。酯是更优选的。酯典型地为烷基酯，优选C1～C6的烷基酯，更优选C1～C4的烷基酯。酯的实例包括甲酯和乙酯。乙酯是最优选的。
典型地，PUFA产物含有大于95wt%，优选大于97wt%的量的EPA或EPA衍生物。
在一个实施方式中，PUFA产物含有大于90wt%，优选大于95wt%，更优选大于97wt%的量的EPA。如上所述，EPA以相对于起源于进料混合物的PUFA产物的全部组分的总量的具体的wt%表示。
在另一个实施方式中，PUFA产物含有大于90wt%，优选大于95wt%，更优选大于97wt%的量的EPA乙酯。如上所述，EPA以相对于起源于进料混合物的PUFA产物的全部组分的总量的具体的wt%表示。
用于通过本发明的方法来分馏的合适的进料混合物是鱼油或源于鱼油的原料。用于在本发明的方法中使用的合适的鱼油为技术人员所熟知。典型的鱼油含有PEA、DHA、SDA，并且典型地含有比EPA极性更大和极性更小的一系列的其它PUFA、饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸。
在通过本发明的方法进行分馏之前，进料混合物可以经历化学处理。例如，它可以经历甘油酯的酯交换或甘油酯的水解，在某些情况下，接着经历选择性方法，诸如结晶、分子蒸馏、尿素分馏、使用硝酸银或其它金属盐溶液的提取、碘内酯化反应或超临界流体分馏。或者，可以不经过初始处理步骤而直接使用进料混合物。
进料混合物典型地含有PUFA产物以及至少一种极性更大的组分和至少一种极性更小的组分。极性更小的组分比PUFA产物具有对本发明的方法中使用的吸附剂的更强的吸附力。在操作期间，这种极性更小的组分典型地随着固体吸附剂相移动优先于随着液体洗脱液相移动。极性更大的组分比PUFA产物具有对本发明的方法中使用的吸附剂的更弱的吸附力。在操作期间，这种极性更大的组分典型地随着液体洗脱液相移动优先于随着固体吸附剂相移动。一般而言，极性更大的组分将被分离进入提余物流，而极性更大的组分将分离进入提取物流。
极性更大和极性更小的组分的实例包括（1）存在于天然油（例如，海洋油）中的其它化合物，（2）在贮藏、精炼和先前浓缩步骤期间形成的副产物，以及（3）来自在先前浓缩或纯化步骤期间利用的溶剂或试剂的污染物。
（1）的实例包括其它不需要的PUFA；饱和脂肪酸；固醇，例如胆固醇；维生素；以及环境致污物（pollutant），诸如多氯联苯（PCB）、聚芳烃（PAH）杀虫剂、有机氯杀虫剂、二噁英和重金属。PCB、PAH、二噁英和有机氯杀虫剂都是非极性极高的组分。
（2）的实例包括来自PUFA产物的同分异构体以及氧化产物或分解产物，例如，脂肪酸及其衍生物的自氧化聚合产物。
（3）的实例包括可以被加入以从进料混合物中移出饱和或单不饱和脂肪酸的尿素。
优选地，进料混合物是含PUFA的海洋油（例如，鱼油），更优选的是包含EPA和/或DHA的海洋油（例如，鱼油）。
用于通过本发明的方法制备浓缩的EPA（EE）的典型的进料混合物包含50～75%的EPA（EE）、0～10%的DHA（EE）以及包括其它必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其它组分。
用于通过本发明的方法制备浓缩的EPA（EE）的优选的进料混合物包含55%的EPA（EE）、5%的DHA（EE）以及包括其它必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其它组分。DHA（EE）比EPA（EE）极性更小。
本发明的方法需要多个色谱分离步骤。
第一分离步骤对于移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸是有效的，并且可以使用固定床或模拟或真实的移动床色谱设备来进行。
当第一分离步骤包含在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物时，有几种方式可以实现所述三个分离步骤。给出进行该方法的四个优选方式作为下面的第一、第二、第三和第四实施方式。
在第一实施方式中，在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第一、第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂。在第一、第二和第三区域中分别进行第一、第二和第三分离步骤，其中，每个区域均具有进料混合物流的一个或多个注入点、水和/或有机溶剂的一个或多个注入点、提余物输出流（raffinatetake-offstream）（从该提余物输出流中可以从所述区域收集液体）和提取物输出流（extracttake-offstream）（从该提取物输出流中可以从所述区域收集液体）。
典型地，每个区域仅具有一个进料混合物的注入点。在第一实施方式中，每个区域仅具有一个含水有机溶剂洗脱液的注入点。在另一个实施方式中，每个区域具有两个或更多个水和/或有机溶剂的注入点。
典型地，所使用的每个区域均具有单一列的含有作为洗脱液的含水有机溶剂的串联连接的色谱柱。典型地，区域中的每个色谱柱连接到设备中与该柱子相邻的两个柱子上。因此，来自区域中的给定的柱子的输出联接到例如在区域中相对于系统中的洗脱液的流动是下游的相邻柱子的输入。典型地，区域中没有色谱柱连接到相同区域中的不相邻的柱子上。
术语“提余物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟移动床色谱的上下文中，它是指与固体吸附剂相相比随液体洗脱液相移动更迅速的组分流。因此，与进料流相比，提余物流典型地富含极性更大的组分并缺乏极性更小的组分。
术语“提取物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟移动床色谱的上下文中，它是指与液体洗脱液相相比随固体吸附剂相移动更迅速的组分流。因此，与进料流相比，提取物流典型地富含极性更小的组分并缺乏极性更大的组分。
如本文所用的，术语“不相邻的”是指在例如相同设备中被一个或多个柱子，优选3个或多于3个柱子，更优选5个或多于5个柱子，最优选约5个柱子分离开的柱子。
在第二实施方式中，在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第一和第二分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂。在第一和第二区域中分别进行第一和第二分离步骤，其中，每个区域如本文所定义，而且其中，在分离的模拟或真实的移动床色谱设备中进行第三分离步骤。
在第二实施方式中，在包含多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中典型地进行第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，并且具有进料混合物流的一个或多个注入点、水和/或有机溶剂的一个或多个注入点、提余物流输出流（从该提余物流输出流中可以从所述多个链接色谱柱收集液体）和提取物流输出流（从提取物流输出流中可以从所述多个链接色谱柱收集液体）。该色谱设备典型地仅具有一个进料混合物的注入点。在一个实施方式中，该色谱设备仅具有一个含水有机溶剂洗脱液的注入点。在另一个实施方式中，该色谱设备具有两个或更多个水和/或有机溶剂的注入点。
在第二实施方式中的第三分离步骤中使用的色谱设备典型地具有单一列的含有作为洗脱液的含水有机溶剂的串联连接的色谱柱。典型地，每个色谱柱连接到设备中与该柱子相邻的两个柱子上。因此，来自给定的柱子的输出联接到相对于系统中的洗脱液的流动是下游的相邻柱子的输入。典型地，没有色谱柱连接到色谱设备中不相邻的柱子上。
第二实施方式中的第三分离步骤中使用的色谱设备是与第一和第二分离步骤中使用的设备相独立的设备。因此，使用两个独立的设备。洗脱液分别在独立的色谱设备中循环。因此，洗脱液不在独立的色谱设备之间共享，除了可以在第二步骤中产生的第二中间产物中作为溶剂而存在的，并且随后被引入到第三分离步骤中使用的色谱设备中的洗脱液。色谱柱不在独立的色谱设备之间共享。
在第二分离步骤中获得第二中间产物之后，在第三分离步骤中进一步纯化第二中间产物之前，可以部分或全部地移出含水有机溶剂洗脱液。或者，可以在第三步骤中进一步纯化中间产物，而不移出任何存在的溶剂。
在第二实施方式中的第三分离步骤中使用的色谱设备与图1中所示的色谱设备相似。
在第三实施方式中，在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂。在第一和第二区域中分别进行第二和第三分离步骤，其中，每个区域如本文所定义，而且其中，在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行第一分离步骤。
在第三实施方式中，在包含多个连接的色谱柱的模拟或真实的移动床色谱设备中典型地进行第一分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂并且具有进料混合物流的一个或多个注入点、水和/或有机溶剂的一个或多个注入点、提余物流输出流（从该提余物流输出流可以从所述多个连接的色谱柱收集液体）和提取物流输出流（从该提取物流输出流可以从所述多个连接的色谱柱收集液体）。该色谱设备典型地仅具有一个进料混合物的注入点。在一个实施方式中，该色谱设备仅具有一个含水有机溶剂洗脱液的注入点。在另一个实施方式中，该色谱设备具有两个或更多个水和/或有机溶剂的注入点。
在第三实施方式中的第一分离步骤中使用的色谱设备典型地具有单一列的含有作为洗脱液的含水有机溶剂的串联连接的色谱柱。典型地，每个色谱柱连接到设备中与该柱子相邻的两个柱子上。因此，来自给定的柱子的输出连接到相对于系统中洗脱液的流动是下游的相邻柱子的输入。典型地，没有色谱柱连接到色谱设备中的不相邻的柱子上。
在第三实施方式中的第一分离步骤中使用的色谱设备是与第二和第三分离步骤中使用的设备相独立的设备。因此，使用两个独立的设备。洗脱液不在独立的色谱设备之间共享，除了可以在第一步骤中产生的第一中间产物中作为溶剂而存在的，并且被引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的洗脱液。色谱柱不在独立的色谱设备之间共享。
在第一分离步骤中获得第一中间产物之后，在下一个分离步骤中进一步纯化中间产物之前，可以部分或全部地移出含水有机溶剂洗脱液。或者，可以在第二分离步骤中进一步纯化第一中间产物，而不移出任何存在的溶剂。
在第三实施方式中的第一分离步骤中使用的色谱设备与图1中所示的色谱设备相似。
应理解的是，在上面的第一、第二和第三实施方式中，在具有两个或三个如上所定义区域的单个模拟或真实的移动床色谱设备中可以同时发生两个或更多个分离步骤。具有两个或更多个区域，例如两个或三个区域的典型的色谱设备如在例如PCT/GB10/002339中所描述的，PCT/GB10/002339通过引用并入本文。
在第四实施方式中，（a）在相同的色谱设备上循序地进行第一、第二和第三分离步骤，在第一和第二分离步骤之间及在第二和第三分离步骤之间分别回收第一和第二中间产物，而且在第一和第二分离步骤之间及在第二和第三分离步骤之间调节色谱设备中的方法条件，以使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开；或者，（b）使用与第一分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行第二分离步骤；和/或使用与第二分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行第三分离步骤。
在第四实施方式中，用于进行第一、第二和第三分离设备的每个色谱设备典型地如上面的实施方式（2）中的第三分离步骤所定义。
在第四实施方式的选择（b）中，在独立的色谱设备上进行所有三个步骤。在两个或三个不同的独立的色谱设备上进行第一、第二和第三分离步骤中的两个或三个步骤。可以循序地或同时地操作这些色谱设备。
特别是，在第四实施方式的选择（b）中，可以循序地操作两个独立的色谱设备以进行第一和第二分离步骤。在此情况下，在第一和第二分离步骤之间回收第一中间产物，并且调节在第一和第二色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
特别是，在第四实施方式的选择（b）中，可以循序地操作两个独立的色谱设备以进行第二和第三分离步骤。在此情况下，在第二和第三分离步骤之间回收第二中间产物，并且调节在第二和第三色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
特别是，在第四实施方式的选择（b）中，可以循序地操作三个独立的色谱设备以进行第一、第二和第三分离步骤。在此情况下，在第一和第二分离步骤之间回收第一中间产物，在第二和第三分离步骤之间回收第二中间产物，并且调节在第一、第二和第三色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
特别是，在第四实施方式的选择（b）中，可以同时地操作两个独立的色谱设备以进行第一和第二分离步骤。在独立的色谱设备上进行在第一和第二分离步骤，在第一步骤中获得的第一中间产物被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中，并且调节色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
特别是，在第四实施方式的选择（b）中，可以同时地操作两个独立的色谱设备以进行第二和第三分离步骤。在独立的色谱设备上进行在第二和第三分离步骤，在第二步骤中获得的第二中间产物被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备中，并且调节色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
特别是，在第四实施方式的选择（b）中，可以同时地操作三个独立的色谱设备以进行第一、第二和第三分离步骤。在独立的色谱设备上进行第一、第二和第三分离步骤，在第一步骤中获得的第一中间产物被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中，在第二分离步骤中获得的第二中间产物被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备中，并且调节色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
特别是，在第四实施方式的选择（b）中，操作两个或三个独立的色谱设备。洗脱液分别在独立的色谱设备中循环。因此，洗脱液不在独立的色谱设备之间共享，除了可以在第一和/或第二步骤中纯化的中间产物中作为溶剂而存在的，并且随后被引入到下一个分离步骤中使用的色谱设备中的洗脱液。色谱柱不在第一和第二分离步骤和/或第二和第三分离步骤中使用的独立的色谱设备之间共享。
在第一和/或第二分离步骤中获得中间产物之后，在下一个分离步骤中进一步纯化中间产物之前，可以部分地或全部地移出含水有机溶剂洗脱液。或者，可以进一步纯化中间产物，而不移出任何存在的溶剂。可以考虑事项（consideration）也应用于在上面的实施方式（2）中的第二分离步骤中获得的第二中间产物以及上面的实施方式（3）中的第一分离步骤中获得的第一中间产物。
一般而言，任何已知的固定床或模拟或真实的移动床色谱设备只要该设备按照本发明的方法使用，就可以被利用于本发明的方法的目的。如果依照本发明的方法进行配置，PCT/GB10/002339、US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148、FR-A-2651149、US6979402、US5069883和US4764276中描述的那些设备都可以使用。
上面的第二、第三和第四实施方式是优选的。第三和第四实施方式是更优选的。对于某些应用，第三实施方式将是最合适的。在其它应用中，第四实施方式将是最合适的。
参考图2，更详细地解释第一至第四实施方式。在图2中的所有四个实施方式中，洗脱液的流动均为从右至左，而吸附剂的有效流动为从左至右。所有情况下可以看出，使用从第一分离步骤中获得的第一中间产物作为第二分离步骤的进料混合物，并且使用第二中间产物作为第三分离步骤的进料混合物。
现在参照图2A，这个解释上面的第一实施方式，即，其中在单个模拟或真实的移动床色谱设备中的第一、第二和第三区域中分别进行第一、第二和第三分离步骤。在第一区域中发生第一分离步骤。然后，来自在第一区域中进行的第一分离步骤的第一中间产物作为进料混合物进入第二区域。然后，在第二区域中进行第二分离步骤。然后，来自在第二区域中进行的第二分离步骤的第二中间产物作为进料混合物进入第三区域。然后，在第三区域中，进行第三分离步骤。
现在参照图2B，这个解释上面的第二实施方式，即，其中分别在单个模拟或真实的移动床色谱设备中的第一和第二区域中同时进行第一和第二分离步骤，并且在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行第三分离步骤。在第一区域中发生第一分离步骤。然后，来自在第一区域中进行的第一分离步骤的第一中间产物作为进料混合物进入第一区域。然后，在第二区域中进行第二分离步骤。从第二区域收集第二中间产物。然后，该第二中间产物作为第三分离步骤的进料混合物被引入到色谱设备中。
现在参照图2C，这个解释上面的第三实施方式，即，其中分别在单个模拟或真实的移动床色谱设备中的第一和第二区域中同时进行第二和第三分离步骤，并且在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行第一分离步骤。在色谱设备中发生第一分离步骤。从第一设备中收集第一中间产物。然后，该第一中间产物作为第二分离步骤的进料混合物被引入到独立的色谱设备中。在发生第二和第三分离步骤的色谱设备的第一区域中发生第二分离步骤。来自在第一区域中进行的第二分离步骤的第二中间产物作为第三分离步骤的进料混合物进入第二区域中。在第二区域中发生第三分离步骤。
现在参照图2D，这个解释上面的第四实施方式，即，其中（a）在相同色谱设备上循序进行第一、第二和第三分离步骤，在第一和第二分离步骤之间及第二和第三分离步骤之间分别回收第一和第二中间产物，并且在第一和第二分离步骤之间及在第二和第三分离步骤之间调节色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开；或者（b）在两个或三个不同的独立的设备上进行第一、第二和第三分离步骤中的两个或三个步骤；其中，使用与第一分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行第二分离步骤，和/或使用与第二分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行第三分离步骤。
当第一分离步骤包括在固定床色谱设备中纯化进料混合物时，有可以实现三个分离步骤的几个方式。因此，典型地，（a）在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一和第二区域中分别进行第二和第三分离步骤，其中，每个区域如本文所定义；或
（b）在相同的色谱设备上循序进行第二和第三分离步骤，在第二和第三分离步骤之间回收第二中间产物，并且在第二和第三分离步骤之间调节色谱设备中的方法条件，使得在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开；或
（c）在独立的色谱设备上分别进行第二和第三分离步骤，从第二分离步骤中获得的中间产物被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备中。
以与上面的实施方式（3）中的第二和第三分离步骤相似的方式来进行上面的实施方式（a）。
上面的实施方式（b）和（c）中使用的色谱设备典型地如上面的实施方式（2）中的第三分离步骤所定义的。以与上面的实施方式（4）相似的方式进行实施方式（b）和（c）。
应理解的是，在某些实施方式中，可以在分别具有两个或三个区域的单个色谱设备上同时进行两个或三个分离步骤。在两个区域中同时进行两个分离步骤的模拟或真实的移动床色谱设备中，从第一区域中的柱子中典型地收集提余物流或提取物流并且将该提余物流或提取物流引入到第二区域中的不相邻的柱子中。在三个区域中同时进行三个分离步骤的模拟或真实的移动床色谱设备中，从第一区域的柱子中典型地收集提余物流或提余物流并且将该提余物流或提取物流多个连接的色谱柱到第二区域中的不相邻的柱子中，并且从第二区域中的柱子中典型地收集提余物流和提余物流并且将该提余物流或提取物流引入到第三区域中的不相邻的柱子中。这个能够使用在第一和/或第二分离步骤中收集的第一和/或第二中间产物作为下一个分离步骤的进料混合物。
典型地，在第二分离步骤中收集第二中间产物作为提余物流，并且在第三分离步骤中收集PUFA产物作为提取物流；或在第二分离步骤中收集第二中间产物作为提取物流，并且在第三分离步骤中收集PUFA产物作为提余物流。
优选地，在第二分离步骤中收集第二中间产物作为提余物流，并且在第三分离步骤中收集PUFA产物作为提取物流。
典型地，分别在单个模拟或真实的移动床色谱设备中的第一和第二区域中同时进行第二和第三分离步骤的实施方式中，（a）从第一区域中的柱子中收集第二中间产物作为含有PUFA产物和极性更大的组分的提余物流，并且将该第二中间产物引入到第二区域中的不相邻的柱子中，然后，在第二区域中进行的第三分离步骤中收集PUFA产物作为提取物流；或（b）从第一区域中的柱子中收集第二中间产物作为含有PUFA产物和极性更小的组分的提取物流，并且将该第二中间产物引入到第二区域中的不相邻的柱子中，然后，在第二区域中进行的第三分离步骤中收集PUFA产物作为提余物流。
优选地，分别在单个模拟或真实的移动床色谱设备中的第一和第二区域中同时进行第二和第三分离步骤的实施方式中，从第一区域中的柱子中收集第二中间产物作为含有PUFA产物和极性更大的组分的提余物流，并且将该第二中间产物引入到第二区域中的不相邻的柱子中，然后，在第二区域中进行的第三分离步骤中收集PUFA产物作为提取物流。
当第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物时，在第一分离步骤中典型地收集第一中间产物作为提余物流。
当第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物时，在第一分离步骤中典型地收集第一中间产物作为提余物流，并且（a）在第二分离步骤中收集第二中间产物作为提余物流，并且在第三分离步骤中收集PUFA产物作为提取物流；或（b）在第二分离步骤中收集第二中间产物作为提取物流，并且在第三分离步骤中收集PUFA产物作为提余物流。
典型地，与进料混合物相比，在第一分离步骤中获得的第一中间产物富含PUFA产物；和/或与第一中间产物相比，在第二分离步骤中获得的第二中间产物富含PUFA产物。
优选地，与进料混合物相比，在第一分离步骤中获得的第一中间产物富含PUFA产物，并且，与第一中间产物相比，在第二分离步骤中获得的第二中间产物富含PUFA产物。
典型地，与进料混合物相比，在第一分离步骤中获得的第一中间产物缺乏饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸。
典型地，在第一步骤中，PUFA产物与进料混合物中的比PUFA产物极性更小的组分分离开，在第二步骤中，PUFA产物与进料混合物中的比PUFA产物极性更小但比在第一分离步骤中分离开的组分极性更大的组分分离开，并且在第三分离步骤中，PUFA产物与比PUFA产物极性更大的组分分离开。
或者，在第一步骤中，PUFA产物与进料混合物中的比PUFA产物极性更小的组分分离开，在第二步骤中，PUFA产物与进料混合物中的比PUFA产物极性更大的组分分离开，并且在第三分离步骤中，PUFA产物与比PUFA产物极性更小但比在第一分离步骤中分开的组分极性更大的组分分离开。
进料混合物中在第一步骤中分离开的且比PUFA产物极性更小的组分典型地为不饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸。
进料混合物中的比PUFA产物极性更小但比在第一分离步骤中分离开的组分极性更大的组分典型地包括：比PUFA产物极性更小但比在第一分离步骤中分离开的组分极性更大的DHA或DHA衍生物和/或其它PUFA或PUFA衍生物。
进料混合物中的比PUFA产物极性更大的组分包括：比PUFA产物极性更大的SDA或SDA衍生物和/或其它PUFA。
除EPA外的PUFA是众所周知的，并且包括ω-3和ω-6PUFA。ω-3PUFA的实例包括α-亚麻酸（ALA）、十八碳四烯酸（SDA）、二十碳三烯酸（ETE）、二十碳四烯酸（ETA）、二十二碳五烯酸（DPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。ω-6PUFA的实例包括亚麻酸（LA）、γ-亚麻酸（GLA）、二十碳二烯酸，二高-γ-亚麻酸（DGLA）、花生四烯酸（ARA）、二十二碳二烯酸、肾上腺酸和二十二碳五（ω-6）烯酸。
在每个分离步骤中使用的柱子的数量不受特别地限制。技术人员将能够容易地确定要使用的柱子的适当的数量。柱子的数量典型地为4或更多，优选为6或更多，更优选为8或更多，例如4、5、6、7、8、9或10个柱子。在优选的实施方式中，使用5个或6个柱子，更优选使用6个柱子。在另一优选实施方式中，使用7个或8个柱子，更优选使用8个柱子。典型地，有不超过25个柱子，优选不超过20个柱子，更优选不超过15个柱子。
分别在单个色谱设备中的第一和第二区域中同时发生两个分离步骤的实施方式中，每个区域中的柱子的数量典型地为4或更多，优选为6或更多，更优选为8或更多，例如4、5、6、7、8、9或10个柱子。
分别在单个色谱设备中的第一、第二和第三区域中同时发生三个分离步骤的实施方式中，每个区域中的柱子的数量典型地为4或更多，优选为6或更多，更优选为8或更多，例如4、5、6、7、8、9或10个柱子。
第一、第二和第三分离步骤典型地需要相同数量的柱子。对于某些应用，它们可以具有不同数量的柱子。
使用的柱子的尺寸不受特别的限制，并将取决于待纯化的进料混合物的体积。技术人员将能够容易地确定要使用的适当大小的柱子。每个柱子的直径典型地为10～1000mm，优选为10～500mm，更优选为25～250mm，甚至更优选为50～100mm，并最优选为70～80mm。每个柱子的长度典型地为10～300cm，优选为10～200cm，更优选为25～150cm，甚至更优选为70～110cm，并更优选为80～100cm。
第一、第二和第三分离步骤典型地需要具有相同尺寸的柱子，但对于某些应用可以具有不同的尺寸。
柱子的流速受限于跨越一系列柱中的最大压力，并且取决于柱子尺寸和固体相的颗粒大小。本领域技术人员将能够容易地建立每个柱子尺寸所需的流速以确保充分解吸。直径较大的柱子一般将需要较高的流动以保持穿过柱子的线性流动。
对于上面所概述的典型的柱子大小，典型地，进入在第一或第二分离步骤中使用的色谱设备中的洗脱液的流速为1～4.5L/min，优选为1.5～2.5L/min。典型地，来自在第一或第二分离步骤中使用的色谱设备的提取物的流速为0.1～2.5L/min，优选为0.5～2.25L/min。在来自第一或第二分离步骤的提取物的一部分循环回到在第一或第二分离步骤中使用的设备中的实施方式中，循环的流速典型地为0.7～1.4L/min，优选为约1L/min。典型地，来自在第一或第二分离步骤中使用的色谱设备的提余物的流速为0.2～2.5L/min，优选为0.3～2.0L/min。在来自第一或第二分离步骤的提余物的一部分循环回到在第一或第二分离步骤中使用的设备中的实施方式中，循环的流速典型地为0.3～1.0L/min，优选为约0.5L/min。典型地，将进料混合物引入在到第一或第二分离步骤中使用的色谱设备中的流速为5～150mL/min，优选为10～100mL/min，更优选为20～60mL/min。
对于上面所概述的典型的柱子大小，典型地，进入在第三分离步骤中使用的色谱设备中的洗脱液的流速为1～4L/min，优选为1.5～3.5L/min。典型地，来自在第三分离步骤中使用的色谱设备的提取物的流速为0.5～2L/min，优选为0.7～1.9L/min。在来自第三分离步骤的提取物的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中的实施方式中，循环的流速典型地为0.6～1.4L/min，优选为0.7～1.1L/min，更优选为约0.9L/min。典型地，来自在第三分离步骤中使用的色谱设备的提余物的流速为0.5～2.5L/min，优选为0.7～1.8L/min，更优选为约1.4L/min。在来自第三分离步骤的提余物的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中的实施方式中，循环的流速典型地为0.3～1.0L/min，优选为约0.5L/min。
如技术人员应理解的，提到经由各种提取物流和提余物流所收集或移出液体的速率是指一段时间中移出的液体的体积，典型地为L/min。相似地，提到液体循环回到设备中，典型地回到设备中的相邻柱子中的速率是指一段时间中循环的液体的体积，典型地为L/min。
步进时间（steptime）（即转变进料混合物和洗脱液的注入点与所收集的馏分（fraction）的各种输出点（takeoffpoint）之间的时间）不受特别地限制，并且将取决于所使用的柱子的数量和尺寸以及通过设备的流速。技术人员将能够容易地确定要在本发明的方法中使用的合适的步进时间。步进时间典型地为100～1000秒，优选为200～800秒，更优选为约250～约750秒。在一些实施方式中，合适的步进时间为100～400秒，优选为200～300秒，更有优选为约250秒。在其它实施方式中，合适的步进时间为600～900秒，优选为700～800秒，更优选为约750秒。
在本发明的方法中，真实移动床色谱是优选的。
本领域中已知的用于真实和模拟移动床系统的常规吸附剂可以用于本发明的方法中。每个色谱柱可以含有相同或不相同的吸附剂。典型地，每个柱子均含有相同的吸附剂。这种通常使用的材料的实例是聚合物珠粒，优选用DVB（二乙烯基苯）成网的聚苯乙烯；和硅胶，优选具有C8或C18烷烃、特别是C18烷烃的反相键合的硅胶。优选地是C18键合的反相硅胶。在本发明的方法中使用的吸附剂优选是非极性的。
吸附剂固定相材料的形状可以是，例如，球形的或非球形的珠粒，优选为基本上球形的珠粒。这种珠粒的直径典型地为5～500微米，优选为10～500微米，更优选为15～500微米，更优选为40～500微米，更优选为100～500微米，更优选为250～500微米，甚至更优选为250～400微米，最优选为250～350微米。在一些实施方式中，可以使用具有直径为5～35微米的珠粒，典型地为10～30微米，优选为15～25微米。一些优选的颗粒大小多少比在过去的模拟和真实移动床方法中使用的珠粒的颗粒大小更大。较大颗粒的使用能够使较低压力的洗脱液用于该系统中。依次地，这在设备的成本节约、效率和寿命方面上具有优势。已惊奇地发现，大的颗粒大小的吸附剂珠粒可以用于本发明的方法中（具有它们相关的优势），且在分辨率上没有任何损失。
吸附剂典型地具有10～50nm，优选15～45nm，更优选20～40nm，最优选25～35nm的孔隙大小。
典型地，在15～55℃下，优选在20～40℃下，更优选在约30℃下进行本发明的方法。因此，典型地在室温下进行该方法，但可以在高温下进行该方法。
如上所提及的，在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物中的不同组分分离开。典型地通过调节色谱设备或色谱设备中进行第一、第二和第三分离步骤的区域中的方法条件来影响上述过程。
因此，在第一、第二和第三分离步骤中的方法条件典型地发生变化。发生变化的方法条件可以包括：例如，使用的柱子的大小、使用的柱子的数量、柱子中使用的填充物（packing）、SMB设备的步进时间、设备的温度、在分离步骤中使用的洗脱液或在设备中使用的流速，特别是经由提余物流或提取物流所收集的液体的循环速率。
优选地，发生变化的方法条件是在分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例，和/或经由在分离步骤中的提取物流或提余物流所收集的液体的循环速率。下面对这两个选择进行更详细地讨论。
典型地，来自在第二分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第二分离步骤中使用的设备中；和/或，来自在第二分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第二分离步骤中使用的设备中；和/或，来自在第三分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中；和/或，来自在第三分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中。
优选地，来自在第二分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第二分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第二分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第二分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第三分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第三分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中。
当第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物时，典型地，来自在第一分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第一分离步骤中使用的设备中；和/或，来自在第一分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第一分离步骤中使用的设备中。
当第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物时，优选地，来自在第一分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第一分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第一分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第一分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第二分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第二分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第二分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第二分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第三分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中；并且，来自在第三分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在第三分离步骤中使用的设备中。
此循环需要将从在第一、第二或第三分离步骤中使用的色谱设备流出的提取物流或提余物流的一部分进料回到在该步骤中使用的设备中，典型地回到相邻的柱子中。此相邻的柱子是相对于系统中洗脱液的流动是下流的相邻的柱子。
当分别在单个色谱中的两个或三个区域中同时进行两个或三个分离步骤时，此循环需要从区域中移出的提取物流或提余物流循环回到相同区域中。
经由在特定的分离步骤中的提取物流或提余物流收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的色谱设备或区域中的速率是经由该流收集的液体被进料回到在该步骤中使用的设备中（典型地回到相邻的柱子，即，相对于系统中洗脱液的流动的下游柱子中）的速率。
参照图5中优选的实施方式可以看出。在第一分离步骤中的提取物流的循环速率是从在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子2的底部收集的提取物被进料到在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子3的顶部的速率，即，液体进入在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子3的顶部的流速。
在第二分离步骤中的提取物的循环速率是在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子10的底部处收集的提取物被进料到在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子11的顶部的速率，即，液体进入在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子11的顶部的流速。
在第三分离步骤中的提取物的循环速率是在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子19的底部处收集的提取物被进料到在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子19的顶部的速率，即，液体进入在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子19的顶部的流速。
典型地，通过经由第一、第二和/或第三分离步骤中的提取物流和/或提余物流收集的液体被进料到容器，并然后用泵将一定量的液体从容器中抽回到在该分离步骤中使用的设备或区域中，典型地抽回到相邻的柱子中来影响在第一、第二和/或第三分离步骤中的提取物流和/或提余物流的循环。在此情况下，经由在第一和/或第二分离步骤中特定的提取物流或提余物流收集的液体循环回到相邻的柱子的速率是用泵将液体从容器中抽回到色谱设备或区域中，典型地回到相邻的柱子中的速率。
如技术人员应理解的，经由洗脱液和原料流而被引入到色谱设备中的液体的量与从该设备中移出并且循环回到该设备中的液体的量相平衡。
因此，参照图5，对于提取物流，洗脱液（解吸剂）进入在第二和第三分离步骤中使用的色谱设备中的流速（D）等于经由在该分离步骤中的提取物流收集的液体积聚到容器中的速率（E2和E3）加上提取物循环回到在该特定的分离步骤中使用的色谱设备中的速率（D-E2和D-E3）。
对于来自分离步骤的提余物流，提取物循环回到在该特定的分离步骤中使用的色谱设备中的速率（D-E1和D-E2）加上原料被引入到在该特定的分离步骤中使用的色谱设备中的速率（F和R1）等于经由在该特定的分离步骤中的提余物流所收集的液体积聚到容器中的速率（R1和R2）加上提余物循环回到在该特定的分离步骤中使用的色谱设备中的速率（D+F-E1-R1和D+R1-E2-R2）。
从来自色谱设备或区域的特定的提取物流或提余物流所收集的液体积聚到容器中的速率也可以认为是从该色谱设备移出该提取物流或提余物流的净速率。
典型地，调节经由在第二分离步骤中的提取物流或提余物流中的一个或两个所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开；和/或，其中，调节经由在第三分离步骤中的提取物流和提余物流中的一个或两个流所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
优选地，调节经由在第二分离步骤中的提取物流或提余物流中的一个或两个所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开；并且其中，调节经由在第三分离步骤中的提取物流和提余物流中的一个或两个流所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
当第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物时，典型地调节经由在第一分离步骤中的提取物流或提余物流中的一个或两个所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
典型地，经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率；和/或，经由在第二分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由在第三分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率。
当第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物时，经由在第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率典型地不同于经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率；和/或，经由在第一分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由在第二分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率。
改变经由在第一、第二和/或第三分离步骤中的提取物流和/或提余物流所收集的液体循环回到在该特定的分离步骤中使用的设备中的速率具有改变存在于提取物流和提余物流中的极性更大和极性更小的组分的量的作用。因此，例如，较低的提取物循环速率导致在该分离步骤中较少的极性更小的组分被夹带至提余物流。较高的提取物循环速率导致在该分离步骤中较多的极性更小的组分被夹带至提余物流。
这可以例如在示于图5中的本发明的具体实施方式中看出。经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的色谱设备中的速率（D-E2）将影响在第二分离步骤中被夹带至提余物流的任何组分A的程度（R2）。
典型地，经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。优选地，从第二分离步骤收集含有PUFA产物和极性更大的组分的提余物流，并且在第三分离步骤中进行纯化，并且经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
或者，经由在第二分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在第三分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。优选地，从第二分离步骤收集含有PUFA产物和极性更小的组分的提取物流，并且在第三分离步骤中进行纯化，并且经由在第二分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在第三分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
当调节循环速率使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开时，在循环速率不同的分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例可以相同或不同。
在本发明的方法中使用的洗脱液是含水有机溶剂。
含水有机溶剂典型地包括水和一种或多种醇、醚、酯、酮或腈或者它们的混合物。
醇溶剂为本领域技术人员所众所周知。醇典型地为短链醇。醇典型地具有化学式ROH，其中，R是直链或支链C1～C6烷基。C1～C6烷基优选为未被取代的。醇的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。优选甲醇和乙醇。更优选甲醇。
醚溶剂为本领域技术人员所众所周知。醚典型地为短链醚。醚典型地具有化学式R-O-R'，其中R和R'相同或不同并且代表直链或支链的C1～C6烷基。C1～C6烷基优选为未被取代的。优选的醚包括二乙醚、二异丙醚和甲基叔丁基醚（MTBE）。
酯溶剂为本领域技术人员所众所周知。酯典型地为短链酯。酯典型地具有化学式R-(C=O)-O-R'，其中R和R'相同或不同并且代表直链或支链的C1～C6烷基。优选的酯包括乙酸甲酯和乙酸乙酯。
酮溶剂为本领域技术人员所众所周知。酮典型地为短链酮。酮典型地具有化学式R-(C=O)-R'，其中R和R'相同或不同并且代表直链或支链的C1～C6烷基。C1～C6烷基优选为未被取代的。优选的酮包括丙酮、甲乙酮和甲基异丁基酮（MIBK）。
腈溶剂为本领域技术人员所众所周知。腈典型地为短链腈。腈典型地具有化学式R-CN，其中R代表直链或支链的C1～C6烷基。C1～C6烷基优选为未被取代的。优选的腈包括乙腈。
典型地，含水有机溶剂是水性醇或水性乙腈。
含水有机溶剂优选为水性甲醇或水性乙腈。更优选水性甲醇。
典型地，洗脱液不处于超临界状态。典型地，洗脱液是液体。
典型地，在整个设备中的洗脱液的平均水:有机溶剂比例（例如水:甲醇比例）为0.1:99.9～9:91wt%，优选为0.25:99.75～7:93wt%，更优选为0.5:99.5～6:94wt%。
当含水有机溶剂是水性乙腈时，洗脱液典型地含有高达30wt%的水，余量为乙腈。优选地，洗脱液含有5～25wt%的水，余量为乙腈。更优选地，洗脱液含有10～20wt%的水，余量为乙腈。甚至更优选地，洗脱液含有15～25wt%的水，余量为乙腈。
典型地，调节在每个分离步骤中使用的水:有机溶剂比例，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸；并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开。
典型地，在两个或更多个分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有不同的水:有机溶剂比例。在一个实施方式中，在每个分离步骤中使用的水:有机溶剂比例具有不同的水:有机溶剂比例。
在两个或更多个分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力典型地不同。取决于有机溶剂的选择，洗脱液可以是比水更强的解吸剂。或者，洗脱液可以是比水更弱的解吸剂。例如，乙腈和醇是比水更强的解吸剂。
在优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有相同的水:有机溶剂比例，并且在第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有不同于在第二和第三分离步骤中使用的有机溶剂洗脱液的水:有机溶剂比例。
在此优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力相同；和/或，在第一分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力比在第二分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力更强。优选地，在此实施方式中，在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力相同；并且在第一分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力比在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力更强。在此实施方式中，当含水有机溶剂是水性醇或乙腈时，在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量典型地相同，并且在第一分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量典型地比在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量更大。因此，在此实施方式中，在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例典型地相同，并且在第一分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例典型地比在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例低。
在此优选的实施方式中，在第一分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例典型地为0:100～5:95wt%，优选为0.1:99.9～2.5:97.5wt%，更优选为0.1:99.9～2:98wt%，甚至更优选为0.1:99.9～1:99wt%，甚至更优选为0.25:99.75～0.75:99.25wt%，并且最优选为约0.5:99.5。在此优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例典型地为5:95～11:89wt%，优选为6:94～10:90wt%，更优选为7:93～9:91wt%，甚至更优选为7.5:92.5～8.5:91.5wt%，并且最优选为约8:92wt%。
在此优选的实施方式中，在第一分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例优选为0.1:99.9～1:99wt%，并且在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例优选为7:93～9:91wt%。
在可选的实施方式中，在每个分离步骤中使用的含水有机溶剂具有不同的水:有机溶剂比例。
在此可选的实施方式中，在第一分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力比在第二分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力更强；和/或，在第二分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力比在第三分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力更强。优选地，从第二分离步骤收集含有PUFA产物和极性更大的组分的提余物流，并在第三分离步骤中进行纯化，并且在第二分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力比在第三分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力更强。或者，从第二分离步骤收集含有PUFA产物和极性更小的组分的提取物流并在第三分离步骤中进行纯化，并且在第二分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力比在第三分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力低。
在实践中，这通过改变在每个分离步骤中使用的水和有机溶剂的相对量来获取。在此实施方式中，当含水有机溶剂是水性醇或乙腈时，在第一分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量典型地比在第二分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量更大；和/或，在第二分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量比在第三分离步骤中使用的洗脱液中醇或乙腈的量更大。因此，在此实施方式中，在第一分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例典型地比在第二分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例低；和/或，在第二分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例典型地比在第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例低。
应理解的是，上面所指的在每个分离步骤中的水和有机溶剂的比例是色谱设备整体中的平均比例。
典型地，通过将水和/或有机溶剂引入到在分离步骤中使用的色谱设备中的一个或多个柱子中来控制在每个分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例。因此，例如，为了实现在第一分离步骤中的水:有机溶剂比例比在第二和第三分离步骤中的低，典型地比在第二和第三分离步骤中的更缓慢地将水引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备中。
在一些实施方式中，可以在每个分离步骤中使用的色谱设备中的不同的点处，引入基本上纯的有机溶剂和基本上纯的水。这两个流的相对流速将确定色谱设备中的整体溶剂的组成分布（profile）。在其它实施方式中，可以在每个分离步骤中使用的每个色谱设备中的不同的点处，引入不同的有机溶剂/水混合物。这将需要将两种或更多种不同的有机溶剂/水混合物引入到在特定分离步骤中使用的色谱设备中，每种有机溶剂/水混合物具有不同的有机溶剂:水比例。在此实施方式中的有机溶剂/水混合物的相对流速和相对浓度将确定在s该分离步骤中使用的色谱设备中的整体溶剂的组成分别。
优选地，在第二和第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有相同的水:有机溶剂比例，并且在第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有与在第二和第三分离步骤中使用的有机溶剂洗脱液不同的水:有机溶剂比例；并且，经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率。
更优选地，在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例是相同的，并且在第一分离步骤中洗脱液的水:有机溶剂比例比在第二和第三分离步骤中洗脱液的水:有机溶剂比例低；并且经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
甚至更优选地，
第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物；
在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实移动床色谱中同时进行第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一和第二区域中分别进行第二和第三分离步骤，其中，每个区域如本文所定义，并且其中，在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行第一分离步骤；
在第一分离步骤中收集第一中间产物作为提余物流，在第二分离步骤中收集第二中间产物作为提余物流，并且在第三分离步骤中收集PUFA产物作为提取物流；
从第一区域中的柱子中收集含有PUFA产物和极性更大的组分的第二中间产物提余物流，并且将该第二中间产物提余物流引入到第二区域中的不相邻的柱子中；
在第二和第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有相同的水:有机溶剂比例，并且在第一分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例比在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例低；以及
经由在第二分离步骤中提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在第三分离步骤中提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
优选地，第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物；并且，在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一和第二区域中分别进行第二和第三分离步骤，其中，每个区域如本文所定义，并且其中，在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行第一分离步骤。这个优选的实施方式示于图3中。
在第一分离步骤中纯化包含PUFA产物（B）和极性更大（C）和极性更小（A'）和（A）的组分的进料混合物F。在第一分离步骤中，移出极性更小的组分（例如，饱和物和/或单不饱和物）（A'）作为提取物流E1。收集PUFA产物（B）、极性更大的组分（C）和极性更小（但比（A'）极性大）的组分（A）作为提余物流R1。提余物流R1是随后在第二分离步骤中被纯化的中间产物。
在第二分离步骤中，移出极性更小的组分（A）作为提取物流E2。收集PUFA产物（B）和极性更大的组分（C）作为提余物流R2。提余物流R2是随后在第三分离步骤中被纯化的中间产物。
在第三分离步骤中，收集极性更大的组分（C）作为提余物流R3。收集PUFA产物（B）作为提取物流E3。在单个SMB色谱设备中的两个区域中发生第二和第三分离步骤。
此实施方式更详细地示于图4中。除了示出含水有机溶剂解吸剂被引入到每个分离色谱中的点之外，图4和图2相同。
用于此最优选的实施方式的典型的溶剂是水性醇或水性乙腈，优选水性甲醇。
典型地，在此优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有相同的水:有机溶剂比例，并且在第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有与在第二和第三分离步骤中使用的有机溶剂洗脱液不同的水:有机溶剂比例；并且，经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率。
优选地，在此优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例是相同的，并且在第一分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例比在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例低；并且，经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
在此优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在进料混合物被引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游，典型地移出第一分离步骤中的第一提余物流。
在此特别优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在进料混合物被引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游，典型地移出第一分离步骤中的第一提取物流。
在此特别优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在第一中间产物被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游，典型地移出第二分离步骤中的第二提余物流。
在此特别优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在第一中间产物被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游，典型地移出第二分离步骤中的第二提取物流。
在此特别优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在第二中间产物被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游，典型地移出第三分离步骤中的第三提余物流。
在此特别优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在第二中间产物被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游，典型地移出第三分离步骤中的第三提取物流。
典型地，在此优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在移出第一提取物流的点的上游，含水有机溶剂被引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备中。
典型地，在此优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在移出第二提取物流的点的上游，含水有机溶剂被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中。
典型地，在此优选的实施方式中，相对于洗脱液的流动，在移出第三提取物流的点的上游，含水有机溶剂被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备中。
图3和图4中所示的本发明的更优选的实施方式示于图5中。这说明在每个分离步骤中使用的柱子的数量，并且示出引入进料混合物和洗脱液的典型的点和移出提取物流和提余物流的典型的点。
因此，在此更优选的实施方式中，在第一分离步骤中使用的SMB色谱设备由八个色谱柱1～8组成。在第二分离步骤中使用的SMB色谱设备由八个色谱柱9～16组成。在第三分离步骤中使用的SMB色谱设备由七个色谱柱17～23组成。
在每个设备中，典型地串联排列该柱子，使得（在第一分离步骤的情况下）柱子1的底部连接到柱子2的顶部，柱子2的底部连接到柱子3的顶部……等等……并且柱子8的底部连接到柱子1的顶部。这些连接（linkage）可以可选地经由保持（holding）容器，随着循环流进入下一个柱子中。洗脱液通过该系统的流动是从柱子1到柱子2到柱子3等等。吸附剂通过该系统的有效流动是从柱子8到柱子7到柱子6等等。
在此更优选的实施方式中，包含PUFA产物（B）和极性更大（C）和极性更小（A'）和（A）的组分的进料混合物F被引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备中的柱子5的顶部。含水有机溶剂解吸剂被引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子1的顶部。在第一分离步骤中，从柱子2的底部移出极性更小的组分（例如，饱和物和/或单不饱和物）（A'）作为提取物流E1。从柱子6的底部收集PUFA产物（B）、极性更大的组分（C）和极性更小（但比（A'）极性大）的组分（A）作为提余物流R1。
提余物流R1是第一中间产物，该第一中间产物随后在第二分离步骤中通过在柱在13的顶部处被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中被纯化。含水有机溶剂解吸剂被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的柱子D的顶部。
在第二分离步骤中，在柱子10的底部处移出极性更小的组分（A）作为提取物流E2。在柱子14的底部处收集PUFA产物（B）和极性更大的组分（C）作为提余物流R2。提余物流R2是中间产物，该中间产物随后在第三分离步骤中通过在柱子21的顶部处引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备中被纯化。
在第三分离步骤中，在柱子22的底部处移出极性更大的组分（C）作为提余物流R3。在柱子18的底部处收集PUFA产物（B）作为提取物流E3。在单个SMB色谱设备中的两个区域中发生第二和第三分离步骤。
在此更优选的实施方式中，含水有机溶剂典型地被引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子1的顶部。
在此更优选的实施方式中，含水有机溶剂典型地被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子9的顶部。
在此更优选的实施方式中，含水有机溶剂典型地被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备的柱子17的顶部。
在此更优选的实施方式中，进料流典型地被引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子5的顶部。
在此更优选的实施方式中，从在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子6的底部处典型地收集第一提余物流作为第一中间产物。然后，第一中间产物在第二分离步骤中被纯化并且典型地被引入到在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子13的顶部。第一提余物流在第二分离步骤中被纯化之前可以可选地被收集到容器中。
在此更优选的实施方式中，从在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子2的底部典型地移出第一提取物流。第一提取物流可以可选地被收集到容器中并且被再次引入到在第一分离步骤中使用的色谱设备的柱子3的顶部。
在此更优选的实施方式中，从在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子14的底部典型地收集第二提余物流作为第二中间产物。然后，该第二中间产物在第三分离步骤中被纯化并且典型地被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备的柱子21的顶部。第二提余物流在第二分离步骤中被纯化之前可以可选地被收集到容器中。
在此更优选的实施方式中，从在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱子10的底部典型地移出第二提取物流。
在此更优选的实施方式中，从在第三分离步骤中使用的色谱设备的柱子18的底部典型地收集第三提取物流。该第三提取物流典型地含有已纯化的PUFA产物。第三提取物流可以可选地被收集到容器中并且被再次引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备的柱子19的顶部。
在此更优选的实施方式中，从在第三分离步骤中使用的色谱设备的柱子22的底部典型地移出第三提余物流。
典型地，在此优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有相同的水:有机溶剂比例，并且在第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有与在第二和第三分离步骤中使用的有机溶剂不同的水:有机溶剂比例；并且，经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率。
优选地，在此更优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例是相同的，并且在第一分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例比在第二和第三分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例低；并且，经由在第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
在此更优选的实施方式中，在第二和第三分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例是相同的并且为7:93～9:91wt%，并且在第一分离步骤中的洗脱液的水:有机溶剂比例为0.1:99.9～1:99wt%。
虽然这些优选和更优选的实施方式如上所讨论的图2C所示，但是它们也可以用已配置的设备来进行，使得：
第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物，并且在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第一、第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一、第二和第三区域中分别进行第一、第二和第三分离步骤，其中，每个区域如本文所定义；或者
第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化进料混合物，并且在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一和第二区域中分别进行第二和第三分离步骤，其中，每个区域如本文所定义，并且其中，在独立的模拟或真实移动床设备中进行第一分离步骤；或者
第一分离步骤包括在模拟或真实移动床设备中纯化进料混合物，并且（a）在相同的色谱设备上循序进行第一、第二和第三分离步骤，在第一和第二分离步骤之间及在第二和第三分离步骤之间分别回收第一中间产物和第二中间产物，并且在第一和第二分离步骤之间和在第二和第三分离步骤之间调节色谱设备中的方法条件，使得在第一分离步骤中移出存在于进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开；或者
（b）使用与在第一分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行第二分离步骤，和/或使用与在第二分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行第三分离步骤；或者
第一分离步骤包括在固定床色谱设备中纯化进料混合物，并且在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第二和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一和第二区域中分别进行第二和第三分离步骤，其中，每个区域如本文所定义；或者
第一分离步骤包括在固定床色谱设备中纯化进料混合物，并且在相同的色谱设备上循序进行第二和第三分离步骤，在第二和第三分离步骤之间回收第二中间产物并且在第二和第三分离步骤之间调节色谱设备中的方法条件，使得在步骤（ii）和（iii）中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离开；或者
第一分离步骤包括在固定床色谱设备中纯化进料混合物，并且在独立的色谱设备上分别进行第二和第三分离步骤，从第二分离步骤中获得的中间产物被引入到在第三分离步骤中使用的色谱设备中。
本发明的方法使得待取得的PUFA产物的纯度远高于用传统色谱技术可能取得的纯度。通过本发明的方法所生产的PUFA产物也具有特别有利的杂质组成分布，很不同于通过已知技术所制备的油中观测到的那些杂质组成分布。因此，本发明也涉及包含PUFA产物（例如通过本发明的方法可获得的一种PUFA产物）的组合物。
在实践中，本发明的方法一般地将通过计算机来控制。因此本发明也提供了一种用于控制如本文所定义的色谱设备的计算机程序，该计算机程序含有代码模块（codemeans），当执行所述计算机程序时命令设备进行本发明的方法。
下面的实例解释本发明。
实施例
实施例1
根据图5示意性所示的系统，使用真实移动床色谱系统分馏源于鱼油的原料（55重量%的EPAEE，5重量%的DHAEE），该真实移动床色谱系统使用键合的C18硅胶作为固定相并使用水性甲醇作为洗脱液。进料混合物的GC迹线如图7所示。
在第一分离步骤中，进料混合物通过具有如图5所示串联连接的8个柱子1～8（直径：152mm，长度：813mm）的SMB设备。调节方法条件以从进料混合物中移出饱和组分和单不饱和组分作为提取物流。使用0.5:99.5wt%的水:甲醇洗脱液。保持提余物流作为第一中间产物。第一中间产物的GC迹线如图8所示。
第一中间产物通过具有两个区域的SMB设备，其中在第一区域中具有八个柱子（柱子9～16）且在第二区域中具有七个柱子（柱子17～23）。8:92wt%的水:甲醇洗脱液均用于第一和第二区域中，即，均用于第二和第三分离步骤中。调节第一区域中的方法条件以从诸如DHA的移动较慢的组分中纯化的EPA，该诸如DHA的移动较慢的组分被移出作为提取物流。保留提余物流作为第二中间产物。第二中间产物的GC迹线示于图9。
然后，第二中间产物被引入到第二区域中并且与移动较快的组分分离开，该移动较快的组分被移出作为提余物流。从第二区域中收集高纯度的EPA作为提取物流。EPAPUFA产物的GC迹线示于图10。
所生产的EPA具有大于97%的最终纯度。
结合三个分离步骤可以看出，提取物（E1+E2+E3）的整体积聚速率为3876ml/min。
每个分离步骤的方法条件如下：
第一分离步骤
原料进料速率：94ml/min
解吸剂进料速率：6250ml/min
提取物积聚速率：1250ml/min
提取物循环速率：5000ml/min
提余物积聚速率：1688ml/min
循环时间：600秒
第二分离步骤
第一中间产物进料速率：40ml/min
解吸剂进料速率：6313ml/min
提取物积聚速率：1188ml/min
提取物循环速率：5125ml/min
提余物积聚速率：1625ml/min
循环时间：1200秒
第三分离步骤
第二中间产物进料速率：40ml/min
解吸剂进料速率：6189ml/min
提取物积聚速率：1438ml/min
提取物循环速率：4750ml/min
提余物积聚速率：1438ml/min
循环时间：1080秒
比较实施例1
进行实验以从与在实施例1中使用的进料混合物相同的进料混合物生产含有大于97%EPA的PUFA产物。然而，仅使用两个分离步骤，而不是使用按照本发明的三个步骤分离的方法。因此，按照PCT/GB10/002339中公开的方法来进行该方法，并且如图6所示。
如图6所示，使用具有两个区域的单个色谱设备。第一区域含有8个柱子（直径：24"，长度：32"）并且第二区域含有7个柱子（直径：24"，长度：32"）。调节方法条件以在第一区域中将EPAPUFA产物与进料混合物的极性更小的组分分离开，并且在第二区域中与进料混合物的极性更大的组分分离开。8:92wt%的水:甲醇洗脱液用于两个区域。
所生产的EPA具有大于97%的最终纯度。
结合两个分离步骤可以看出，提取物（E1+E2）的整体积聚速率为10571ml/min。因此，可以看出，与本发明的三个步骤方法相比，需要高的多的含水有机溶剂的体积来回收PUFA产物。
用于每个分离步骤的方法条件如下：
第一分离步骤
进料混合物进料速率：34ml/min
解吸剂进料速率：14438ml/min
提取物积聚速率：9313ml/min
提取物循环速率：5125ml/min
提余物积聚速率：1688ml/min
循环时间：1200秒
第三分离步骤
中间产物进料速率：40ml/min
解吸剂进料速率：6189ml/min
提取物积聚速率：1438ml/min
提取物循环速率：4750ml/min
提余物积聚速率：1438ml/min
循环时间：1080秒

Claims (31)

1.一种用于从进料混合物中回收多不饱和脂肪酸的色谱分离方法，所述进料混合物为鱼油或源于鱼油，所述方法包括以下步骤：
(i)在色谱分离步骤中纯化所述进料混合物，以获得第一中间产物；和
(ii)在模拟或真实的移动床色谱分离步骤中纯化在(i)中获得的所述第一中间产物，以获得第二中间产物；和
(iii)在模拟或真实的移动床色谱分离步骤中纯化在(ii)中获得的所述第二中间产物，以获得多不饱和脂肪酸产物；其中，
在每个分离步骤中都使用含水有机溶剂作为洗脱液；
在第一分离步骤中，移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸；
在步骤(ii)和步骤(iii)中，将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物的不同组分分离开；并且
在第三分离步骤中获得的所述多不饱和脂肪酸产物含有大于90wt％的量的EPA或EPA衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在固定床色谱设备或者模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物；并且其中，在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行所述第一分离步骤、第二分离步骤和第三分离步骤，所述多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一区域、第二区域和第三区域中分别进行所述第一分离步骤、第二分离步骤和第三分离步骤，
其中，每个区域都具有：进料混合物流的一个或多个注入点；水和/或有机溶剂的一个或多个注入点；提余物输出流，由该提余物输出流中能从所述区域收集液体；以及，提取物输出流，由该提取物输出流中能从所述区域收集液体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物；并且其中，在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行所述第一分离步骤和第二分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一区域和第二区域中分别进行所述第一分离步骤和第二分离步骤，其中，每个区域都如权利要求3中所定义的，并且其中，在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行所述第三分离步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物；并且其中，在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行第二分离步骤和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一区域和第二区域中分别进行所述第二分离步骤和所述第三分离步骤，其中，每个区域都如权利要求3中所定义的，并且其中，在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行所述第一分离步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物；并且其中，
(a)在同一色谱设备上循序进行所述第一分离步骤、第二分离步骤和第三分离步骤，在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间以及在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤之间分别回收第一中间产物和第二中间产物，并且在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间以及在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤之间调节所述色谱设备中的方法条件，使得在所述第一分离步骤中移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤(ii)和步骤(iii)中将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物的不同组分分离开；或者
(b)使用与在所述第一分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行所述第二分离步骤，和/或使用与在所述第二分离步骤中使用的色谱设备不同的色谱设备来进行所述第三分离步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在固定床色谱设备中纯化所述进料混合物；并且其中，
(a)在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备上同时进行第二分离步骤和第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一区域和第二区域中分别进行所述第二分离步骤和所述第三分离步骤，其中，每个区域都如权利要求3中所定义的；或者
(b)在同一色谱设备上循序进行所述第二分离步骤和所述第三分离步骤，在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤之间回收所述第二中间产物，并且在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤之间调节所述色谱设备中的方法条件，使得在步骤(ii)和步骤(iii)中将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物的不同组分分离开；或者
(c)在独立的色谱设备上分别进行所述第二分离步骤和所述第三分离步骤，从所述第二分离步骤中获得的中间产物被引入到在所述第三分离步骤中使用的色谱设备中。
8.根据权利要求3～7中任意一项所述的方法，其中，在两个分离步骤同时在两个区域中进行的模拟或真实的移动床色谱设备中，从在第一区域中的柱子收集提余物流或提取物流并且将该提余物流或提取物流引入到第二区域中的不相邻的柱子中；和/或
其中，在三个分离步骤同时在三个区域中进行的模拟或真实的移动床色谱设备中，从在第一区域中的柱子收集提余物流或提取物流并且将该提余物流或提取物流引入到第二区域中的不相邻的柱子中，且从第二区域中的柱子收集提余物流或提取物流并且将该提余物流或提取物料引入到第三区域中的不相邻的柱子中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，与所述进料混合物相比，在所述第一分离步骤中获得的所述第一中间产物富含所述多不饱和脂肪酸产物；并且，与所述第一中间产物相比，在第二分离步骤中获得的所述第二中间产物富含所述多不饱和脂肪酸产物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，在第一步骤中，将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物中的比所述多不饱和脂肪酸产物极性小的组分分离开；在第二步骤中，将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物中的比所述多不饱和脂肪酸产物极性小但比在所述第一分离步骤中分离开的组分极性大的组分分离开；并且在第三分离步骤中，将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物中的极性更大的组分分离开。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，在第二分离步骤中与所述多不饱和脂肪酸产物分离开的组分包括：比所述多不饱和脂肪酸产物极性小的DHA或DHA衍生物和/或其它多不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸衍生物；和/或
在所述第三分离步骤中与所述多不饱和脂肪酸产物分离开的组分包括：比所述多不饱和脂肪酸产物极性大的十八碳四烯酸或十八碳四烯酸衍生物和/或其它多不饱和脂肪酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在第二分离步骤中收集所述第二中间产物作为提余物流，并且，在所述第三分离步骤中收集所述多不饱和脂肪酸产物作为提取物流。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物，并且其中，在所述第一分离步骤中收集所述第一中间产物作为提余物流。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述洗脱液是水与醇、醚、酯、酮或腈的混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述洗脱液是水和甲醇的混合物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸含有大于95wt％的量的EPA或EPA衍生物。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述EPA衍生物是EPA乙酯。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，
将来自在第二分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在所述第二分离步骤中使用的设备中；和/或
将来自在第二分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在所述第二分离步骤中使用的设备中；和/或
将来自在所述第三分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在所述第三分离步骤中使用的设备中；和/或
将来自在所述第三分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在所述第三分离步骤中使用的设备中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物，并且其中，
将来自在所述第一分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到在所述第一分离步骤中使用的设备中；和/或
将来自在所述第一分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到在所述第一分离步骤中使用的设备中。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，调节在每个分离步骤中使用的水:有机溶剂比例，使得：
在所述第一分离步骤中移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸；并且
在步骤(ii)和(iii)中将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物的不同组分分离开。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，在每个分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有不同的水:有机溶剂比例。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，在第二分离步骤和第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有相同的水:有机溶剂比例，并且在所述第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有与在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤中使用的有机溶剂洗脱液不同的水:有机溶剂比例。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，在所述第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液的水:有机溶剂比例比在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液的水:有机溶剂比例低。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，在所述第一分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例为0.1:99.9wt％～1:99wt％，并且在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例为7:93wt％～9:91wt％。
25.根据权利要求18～24中任意一项所述的方法，其中，调节经由在所述第二分离步骤中的提取物流和提余物流中的一个流或两个流所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在所述第一分离步骤中移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤(ii)和步骤(iii)中将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物的不同组分分离开；和/或
其中，调节经由在所述第三分离步骤中的提取物流和提余物流中的一个流或两个流所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在所述第一分离步骤中移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤(ii)和步骤(iii)中将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物的不同组分分离开。
26.根据权利要求22所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物；并且其中，调节经由在所述第一分离步骤中的提取物流和提余物流中的一个或两个流所收集的液体循环回到在该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在所述第一分离步骤中移出存在于所述进料混合物中的饱和脂肪酸和/或单不饱和脂肪酸，并且在步骤(ii)和步骤(iii)中将所述多不饱和脂肪酸产物与所述进料混合物的不同组分分离开。
27.根据权利要求18所述的方法，其中，经由在所述第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率与经由在所述第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同。
28.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物；并且其中，经由在所述第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率与经由在所述第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同。
29.根据权利要求18所述的方法，其中，经由在所述第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在所述第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
30.根据权利要求15所述的方法，其中，
所述第一分离步骤包括在模拟或真实的移动床色谱设备中纯化所述进料混合物；
在具有多个连接的色谱柱的单个模拟或真实的移动床色谱设备中同时进行所述第二分离步骤和所述第三分离步骤，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，在第一区域和第二区域中分别进行所述第二分离步骤和所述第三分离步骤，其中，每个区域都如权利要求3中所定义的，并且其中，在独立的模拟或真实的移动床色谱设备中进行所述第一分离步骤；
在所述第一分离步骤中收集所述第一中间产物作为提余物流，在所述第二分离步骤中收集所述第二中间产物作为提余物流，并且在所述第三分离步骤中收集所述多不饱和脂肪酸产物作为提取物流；
从所述第一区域中的柱子收集含有所述多不饱和脂肪酸产物与极性更大的组分的第二中间产物提余物流，并且将该第二中间产物提余物流引入到在所述第二区域中的不相邻的柱子中；
在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液具有相同的水:有机溶剂比例，并且在所述第一分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例比在所述第二分离步骤和所述第三分离步骤中使用的洗脱液的水:有机溶剂比例低；以及
经由在所述第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由在所述第三分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到在所述第三分离步骤中使用的色谱设备中的速率快。
31.根据权利要求16所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸含有大于97wt％的量的EPA或EPA衍生物。
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