JP2008297315A

JP2008297315A - Ｉｌ−６産生に起因する疾患の治療剤

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Publication number: JP2008297315A
Application number: JP2008193876A
Authority: JP
Inventors: Asao Katsume; 朝夫勝目; Hiroyuki Saito; 浩之斉藤; Chuzo Kishimoto; 忠三岸本
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 2008-07-28
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2015-10-20
Also published as: CN1535728A; AU689657B2; NO20073429L; FI122970B; NO20073432L; NO330589B1; PL182089B1; HU227708B1; HUT77035A; NO330582B1; NO971816L; CZ298790B6; CN100350973C; FI971669A; NO331944B1; EP1884524A3; EP2319535A3; US20070036785A1; NO20073430L; CN1164194A

Abstract

【課題】ＩＬ−６産生に起因する疾患の新規な予防・治療剤の提供。
【解決手段】インターロイキン−６レセプターに対する抗体（ＩＬ−６Ｒ抗体）を含んで成る、インターロイキン−６の産生に起因する疾患、特に悪液質又は貧血、の予防治療剤。ＩＬ−６Ｒ抗体としては、マウス、ラット等のヒト以外の動物の抗体、これらとヒト抗体との再構成ヒト抗体等が使用できる。
【選択図】なし

Description

本発明はインターロイキン−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）に対する抗体（抗ＩＬ−６Ｒ抗体）を含んで成る、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生に起因する疾患の予防又は治療剤に対する。

ＩＬ−６は多機能性を有するサイトカインで、免疫、血液、急性期反応等の様々な段階で作用し〔Taga, T.ら、Critical Reviews in Immunol.1992;11:265-280.〕、多発性骨髄種の増殖因子として作用するに加え種々の疾患、例えば、リウマチ〔Hirano, T.ら、Eur J Immunol.1988;18:1797-1801; Houssiau, F.A. らArth Rheum.1988;31:784-788. 〕Castleman's disease 〔Yoshizaki, K. らBlood 1989;74:1360-1367; Brant, S.J.らJ Clin Invest.1990;86:592-599.〕のようなプラズマサイト−シスがみられる病気、あるいはメサンギウム細胞増殖性腎炎〔Ohta, K.らClin Nephrol.(Germany)1992;38:185-189; Fukatsu, A.らLab Invest.1991;65:61-66; Horii, Y. らJ Immunol.1989;143:3949-3955. 〕、腫瘍増殖に伴う悪液質〔Strassmann, G.らJ Clin Invest.1992;89:1681-1684.〕などでも重要な役割をはたしていると考えられている。

遺伝子操作によってｈｕｍａｎＩＬ−６（ｈＩＬ−６）を過剰発現させたＨ−２Ｌ^d ｈＩＬ−６トランスジェニックマウス（ＩＬ−６Ｔｇｍ）ではＩｇＧ１プラズマサイト−シス、メサンギウム増殖性腎炎、貧血、血小板減少症、自己抗体の出現などが観察され〔宮井達也ら：第２１回日本免疫学会発表「Ｈ−２Ｌ^d ｈＩＬ−６トランスジェニックマウスの加齢に伴う血液および血清学的変化」；１９９１〕、ＩＬ−６の多彩な疾患に対する関与が示唆された。
しかしながら、インターロイキン−６レセプターに対する抗体が、インターロイキンの生産に対する疾患に対して有効であることは知られていない。

従って本発明は、インターロイキン−６の生産に起因する疾患の予防又は治療剤を提供しようとするものである。

上記の課題を解決するため、本発明はインターロイキン−６レセプターに対する抗体を含んで成る、インターロイキン−６の生産に起因する疾患の予防又は治療剤を提供する。
インターロイキン−６の生産に起因する疾患としては、例えばプラズマサイト−シス、例えばリウマチ、キャスルマン病（Ｃａｓｔｌｅｍａｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）；高イムノグロブリン血症；貧血；腎炎、例えばメサンギウム増殖性腎炎；悪液質等が挙げられる。

本発明で使用されるＩＬ−６レセプター抗体は、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来および種類（モノクローナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。この抗体はＩＬ−６Ｒと結合することにより、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害して、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗体である。

モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。

このようなＩＬ−６レセプター抗体としては、ＭＲ１６−１抗体（Tamura, T.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,11924-11928,1993）、ＰＭ−１抗体（Hirata, Y.ら、J.Immunol.143,2900-2906,1989）などが挙げられる。
モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、ＩＬ−６Ｒを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。

より具体的には、モノクローナル抗体を作成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗原としては、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示されたヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用いることによって得られる。ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６Ｒタンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６Ｒタンパク質を感作抗原として用いればよい。
また、マウス由来の前記感作抗原としては、日本特許出願公開番号特開平３−１５５７９５に開示されたマウスＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用い、上記ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用いたのと同様な方法にしたがえばよい。

ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものの他に細胞膜より離脱している可能性のもの（ｓＩＬ−６Ｒ）が抗原として使用できる。ｓＩＬ−６Ｒは細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒと異なっている。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。

このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（P3x63Ag8.653）(J.Immunol.123:1548, 1978), ｐ３−Ｕ１ (Current Topics in Micro-biology and Immunology 81:1-7, 1978), ＮＳ−１ (Eur.J.Immunol.6:511-519, 1976), ＭＰＣ−１１ (Cell, 8:405-415, 1976): ＳＰ２／０ (Nature, 276:269-270, 1978), ＦＯ (J.Immunol.Meth.35:1-21, 1980),Ｓ１９４ (J.Exp.Med.148:313-323, 1978), Ｒ２１０ (Nature, 277:131-133, 1979)等が好適に使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法 (Milsteinら、Methods Enzymol.73:3-46, 1981)等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、ＭＥＭ培養液、この他、その種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。

当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノブテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が行われる。

このようにして作成されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

さらに、前記の方法により得られるモノクローナル抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニテイークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高純度に精製することができる。
このようにして、作成されるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（Immunofluorescence Analysis）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度で認識することを確認することができる。

本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものであってよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。

さらに、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができる。

なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Satoら、Cancer Res.53:1-6, 1993)。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化ＰＭ−１（ｈＰＭ−１）抗体が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。

さらには抗原に結合し、ＩＬ−６の活性を阻害するかぎり抗体の断片、たとえばＦａｂあるいはＦｖ，Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる。（例えば、Birdら、TIBTECH, 9:132-137, 1991; Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 5879-5883, 1988 を参照) 。さらに、ｓｃＦｖを作成するために用いるＨ鎖およびＬ鎖のＦｖには、上記再構成された抗体のＶ領域を用いることができる。

本発明のＩＬ−６レセプター抗体を有効成分とするＩＬ−６の生産に起因する疾患の予防治療剤は、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生産に起因する疾患に有効である限り、本発明において使用することができる。
本発明の予防治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとることができる。

本発明の予防治療剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、およそ１−１０００mg／患者の範囲で４回以下の分割用量を選択することができる。また、１−１０mg／kg／週の用量で投与することができる。しかしながら、本発明の予防治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の予防治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製されたＩＬ−６Ｒ抗体を溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。

以下、参考例、および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１．Ｂ６Ｌ ^d −ＩＬ−６トランスジェニックマウスの作製
Ｈ−２Ｌ^d プロモーターと連結したヒトＩＬ−６ｃＤＮＡを含有する３．３kbp のＳｐｈＩ−ＸｈｏＩ断片（Ｌ^d −ＩＬ−６）（Suematsuら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,7547,1989）を、Yamamuraら、J.Biochem.96,357,1984 に記載されている方法に従ってＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウス（日本クレア）からの受精卵の前核にマイクロインジェクションにより注入した。

その受精卵を、疑妊娠処置した雌性ＩＣＲマウスの卵管内に移植した。その後、生まれたマウスについて、ヒトＩＬ−６ｃＤＮＡの組込みをＥｃｏＲＩ消化した尾部ＤＮＡのサザンブロット分析により、プローブとしてヒトＩＬ−６ｃＤＮＡの³²Ｐ−標識ＴａｑＩ−ＢａｎII断片を用いてスクリーニングした。組込みが認められた個体とＢ６マウスを交配して同じ遺伝子型を持つマウスのラインを確立した。

参考例２．ラット抗ＩＬ−６Ｒ抗体の調製
マウス可溶性ＩＬ−６Ｒ生産性ＣＨＯ細胞を Saitoら、J.Immunol.147,168-173,1991に記載されているようにして調製した。この細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ中で３７℃にて、空気中５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気下で培養した。馴化 (ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培地を回収し、そしてマウスｓＩＬ−６Ｒ調製物として使用した。培地中のマウスｓＩＬ−６Ｒの濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体ＲＳ１５（Saito ら、J.Immunol.147,168-173,1991）及びラビットポリクローナル抗−マウスＩＬ−６Ｒ抗体を用いて測定した。

マウスｓＩＬ−６ＲをマウスｓＩＬ−６Ｒ調製物から、モノクローナル抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体（ＲＳ１２）を吸着させたアフィニテイーカラムにより精製した。フロインドの完全アジュバント中５０μｇの精製マウスｓＩＬ−６ＲによりＷｉｓｔｅｒラットを皮下注射免疫し、次に２週間後から１週間に１回、フロインドの不完全アジュバント中５０μｇのマウスｓＩＬ−６Ｒにより４回皮下に追加免疫した。最後の追加免疫から１週間後、ラットに１００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中５０μｇのマウスｓＩＬ−６Ｒを静脈内投与した。

３日後にラットより脾臓を摘出し、そしてポリエチレングリコール（ベーリンガーマンハイム）を用いて、ラットの脾細胞とマウスｐ３Ｕ１ミエローマ細胞とを１０：１の比で融合処理した。９６−ウエルプレート（Falcon3075）のウエル中３７℃にて、１０％ＦＢＳを含有するRPMI1640培地１００μｌ中で一夜インキュベートした後、ヒトＩＬ−６を含有するヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）含有培地１００μｌを各ウエルに添加した。４日間にわたり毎日、培地の半分をＨＡＴ培地により置換した。

７日後、抗マウスｓＩＬ−６Ｒを産生するハイブリドーマをマウスｓＩＬ−６Ｒ−結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により選択した。要約すれば、ハイブリドーマの培養上清１００μｌを６０分間、ラビットポリクローナル抗−ラットＩｇＧ抗体を１μｇ／mlでコートしたプレート中でインキュベートした。プレートを洗浄し、そして１００μｇ／mlのマウスｓＩＬ−６Ｒと共にインキュベートした。洗浄後、ラビットポリクローナル抗−マウスＩＬ−６Ｒ抗体を２μｇ／mlで加え、そしてプレートを洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ−結合ヤギポリクローナル抗−ラビットＩｇＧ抗体（Ｔａｇｏ）と共に６０分間インキュベートした。

最後に、洗浄後、プレートを、アルカリホスファターゼの基質（Ｓｉｇｍａ１０４；ｐ−ニトロフェニルホスフェート）と共にインキュベートし、そして４０５nmにてプレートリーダー（東ソー）を用いて読み取った。マウスｓＩＬ−６Ｒを認識するハイブリドーマを限界希釈法により２回クローニングした。腹水の作製のため、ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスに０．５mlのプリスタンを２回注射し、そして３日後に３×１０⁶ 個の樹立されたハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。１０〜２０日後に腹水を集め、そして腹水からプロテインＧカラム（Oncogene Science）を用いてモノクローナル抗体ＭＲ１６−１を精製した。

ＭＲ１６−１により生産された抗体のＩＬ−６に対する中和効果を、ＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞 (Matsuda ら、Eur.J.Immunol.18:951-956, 1988) による ³Ｈ−チミジンの取り込みにより試験した。ＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を９６−ウエルプレートに１×１０⁴ 細胞／２００μｌ／ウエルの量で分配し、マウスＩＬ−６（１０pg／ml）とＭＲ１６−１又はＲＳ１２抗体とをウエルに加え、そして細胞を３７℃にて５％ＣＯ₂ 中で４４時間培養した。次に、各ウエルに ³Ｈ−チミジン（１ mci／ウエル）を加え、４時間後に ³Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。

実施例１．
参考例１において作製したＢ６ＩＬ−６トランスジェニックマウス（Ｂ６ＩＬ−６
Ｔｇｍ）を自家繁殖したヒトＩＬ−６ｃＤＮＡを持つトランスジェニックマウス３１匹及びヒトＩＬ−６ｃＤＮＡを持たない正常同腹仔１１匹（いずれも４週齢；雄性）を用いた。Ｂ６ＩＬ−６Ｔｇｍは６匹づつ５群（第１〜５群）に分け、第１群のみ７匹とした。また正常同腹仔に第６群５匹及び第７群６匹に分けた。

投与スケジュールは次の通りとした。
第１群（Ｂ６ＩＬ−６Ｔｇｍ）：４週齢（実験第１日）にラットＩｇＧ１抗体（ＫＨ５）（対照抗体）を２mg／０．２ml静脈内注射し、５週齢（実験第８日）以降、週２回づつ（３ないし、４日毎）１００μｇのＫＨ５抗体を皮下注射した。
第２群（Ｂ６ＩＬ−６Ｔｇｍ）：４週齢にＭＲ１６−１抗体を２mg／０．２ml静脈内注射し、５週齢以後週２回づつ１００μｇのＭＲ１６−１を皮下注射した。

第３群（Ｂ６ＩＬ−６Ｔｇｍ）：４週齢にリン酸緩衝液０．２mlを静脈内注射し、そして５週齢以降週２回づつ１００μｇのＭＲ１６−１を皮下注射した。
第４群（Ｂ６ＩＬ−６Ｔｇｍ）：４週齢に２mg／０．２mlのＭＲ１６−１を静脈内注射し、そして５週齢以降２週間ごとに４００μｇのＭＲ１６−１を皮下注射した。

第５群（Ｂ６ＩＬ−６Ｔｇｍ）：４週齢に２mg／０．２mlのＭＲ１６−１を静脈内注射し、そして５週齢以降２週間ごとに１mgのＭＲ１６−１を皮下注射した。
第６群（Ｂ６同腹仔）：４週齢に対照抗体ＫＨ５を２mg／０．２ml静脈内注射し、そして５週齢以降週２回づつ１００μｇのＫＨ５を皮下注射した。
第７群（Ｂ６同腹仔）：４週齢に２mg／０．２mlのＭＲ１６−１を静脈内注射し、そして５週齢以降週２回づつ１００μｇのＭＲ１６−１を皮下投与した。

本発明において使用した試験方法は次の通りである。
体重および尿蛋白測定：毎週体重測定ならびに尿蛋白試験紙（Combistics三共）による尿蛋白測定を行った。尿蛋白は３＋（１００−３００mg／dl）以上を陽性とした。
採血：実験開始時（４週齢）より隔週に眼窩静脈叢より採血を行い、実験終了時（１８週齢）には後大静脈より全採血を行った。

血球数測定：micro cell counter（Sysmex F-800）により、白血球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）、血小板数（ＰＬＴ）ならびにヘモグロビン量（ＨＧＢ）を測定した。また、実験終了時には一部の群（１，２，６，７群）について血液塗抹標本を作製し、白血球分画を行って百分比を算出した。

血中ＩｇＧ１濃度測定：standardとしてmyeloma proteinを用いたマウスＩｇＧ１特異的ＥＬＩＳＡで測定を行った。
血中ｈＩＬ−６濃度測定：ｈＩＬ−６特異的ＥＬＩＳＡで測定を行った。
血中抗ラットＩｇＧ抗体価（ＩｇＧｃｌａｓｓ）測定：投与抗体はマウスにとって異種抗体であるため投与抗体に対する抗体産生の有無をラットＩｇＧを抗原としたＥＬＩＳＡで測定を行った。測定はラット抗体を投与されたａｄｕｌｔのＩＬ−６Ｔｇｍ血清をstandardとし、ユニット化して表示した。

血清生化学値の測定
実験終了時の１，２，３，６および７群のマウスの血清について、総蛋白質（ＴＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、グルコース（Ｇｌｕ）、トリグリセライド（ＴＧ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、カルシウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、グルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の各値をオートアナライザー（ＣＯＢＡＳＦＡＲＡII，Ｒｏｃｈｅ社）で測定した。

骨髄および脾細胞のＦＡＣＳによる解析：実験終了時に１，２，６，７群各１匹づつの骨髄ならびに脾細胞を採取し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン）による細胞表面抗原の解析を実施した。使用した抗体は各々Ｇｒ−１（骨髄細胞）、ＣＤ４，ＣＤ８，Ｂ２２０（脾細胞）に対する抗体（ファーミンジェン社）である。
剖検：実験終了時に剖検を実施し、脾重量の測定ならびに主要臓器の肉眼的観察を行った。

結果
体重：各群の体重推移を図１に示した。１群および３群では体重増加が観察された。他の群には体重変化の違いは観察されなかった。
尿蛋白：１群では１３週齢より尿蛋白陽性個体が出現し（図２）、剖検時までに７匹中４匹（１６週齢で２匹、１７週齢で２匹）が死亡したが他の群では死亡例は観察されなかった。３群でも実験終了時までに６例中２例で尿蛋白陽性個体が出現したが、それ以外の群では認められなかった。

血液学的所見：１群では、ヘモグロンビン量（図３）および赤血球数（図４）の減少が認められ、加齢とともにその程度は著しいものとなった。血小板数（図５）は一端増加したのち急激に減少した。３群では、１群よりやや遅れて同様の傾向が観察された。一方、２，４，５群では何れの群においてもヘモグロビン量、赤血球数の減少、血小板数の増加およびそれに続く減少は認められなかった。末梢血塗抹による白血球分画の観察では、１群で好中球および単球の増加、それにともなうリンパ球比率の減少が認められたが２群はほぼ正常値を示した（表１）。また、６群と７群の間には有意な差は存在しなかった。

血中ＩｇＧ１濃度：１群では、実験開始直後より著明な血中ＩｇＧ１濃度の上昇が観察され最終的には正常マウスの１００倍程度の濃度に達した（図７）。３群は１群よりやや遅れてＩｇＧ１濃度の上昇が観察された。これに対し、２，４，５群ではＩｇＧ１濃度の上昇は観察されず、実験期間中ほぼ一定の濃度であった。また、正常マウスでは抗体投与にともなう変化は観察されなかった。

血中ｈＩＬ−６濃度：血中ｈＩＬ−６濃度（図８）は、ＩｇＧ１と同様に推移し、１群および３群で血中濃度の上昇が観察されたのに対し、他の群では実験期間中ほぼ一定であった。
血中抗ラットＩｇＧ抗体価：１，３および６群ではラットＩｇＧに対する抗体が検出された（表２）。１および３群では全例高い抗体価を示したが、６群で抗体価が上昇していたのは５匹中２匹であった。一方、その他の群では有意の上昇は観察されなかった。

血清生化学値の測定
１群と３群は、ＴＰの増加とＡｌｂの減少が認められた。ＴＧとＡＬＰは、１群と３群で低下し、１群ではＧｌｕの低下もみられた。２群ではこれらの変化はみられなかった。

ＦＡＣＳによる解析：１，２，６，７群のＦＡＣＳによる骨髄細胞（ＢＭ）および脾細胞（ｓｐ）の解析を行ったところ１群のＢＭ細胞では顆粒球系前駆細胞であるＧｒ−１陽性細胞の比率が極端に増加していた（図９、図１０）が２群では同腹仔と同様の値を示した。また、６群と７群の間にはほとんど差がなかった。ｓｐ中のＣＤ４，ＣＤ８，Ｂ２２０陽性細胞の比率は１群で形質細胞の増加によるＣＤ８およびＢ２２０陽性細胞の減少が認められた以外は各群間に差は認められなかった（表４）。

剖検所見：１群および３群では、全身リンパ節の腫脹、脾臓の膨張が顕著であり（図１１）、腎臓の退色も著明であった。一部、肝臓の腫大も観察された。これらの変化はその他の群では観察されず、２，４，５群は同腹仔とくらべて脾臓が軽度に腫脹している以外は著変はみられなかった。
次に、この実験の結果を説明する。コントロール抗体投与ＩＬ−６Ｔｇｍ（１群）では、ＩｇＧ１プラズマサイト−シス、貧血、血小板増加、血小板減少、腎不全、血清生化学値の異常など多彩な病態が観察されたが、これらの発症をＭＲ１６−１はほぼ完全に抑制し得ることが明らかとなった。

ＩＬ−６はＢ細胞を形質細胞へ最終分化させることが知られており〔Muraguchi, A. らJ Exp Med.1988;167:332-344. 〕、ＩＬ−６ＴｇｍはＩＬ−６産生により、血中のＩｇＧ１濃度が上昇し、血清中のＴＰ値の増加およびＡｌｂ値の低下がみられた。これらのことは、ＩｇＧ１プラズマサイト−シスが発症したことを示している。

これに伴い、全身のリンパ節や脾臓などのリンパ系組織が著明に腫大することが、１および３群で病状進行により全身状態が悪化しているにも関わらず体重増加が観察された原因であろう。ＭＲ１６−１はこれらの症状を完全に抑制すると同時に血中ＩＬ−６濃度の増加も抑制した。したがって、ＩＬ−６Ｔｇｍで認められる加齢に伴う血中ＩＬ−６濃度の増加はプラズマサイト−シスの進行と直接関係していることが確認された。すなわち、増殖した形質細胞自身がＩＬ−６を盛んに産生することによってさらに形質細胞が増殖し、結果的にＩＬ−６が大量に産生されることにあると考えられた。

ＩＬ−６の血液系に対する作用としては、血小板増加作用〔Ishibashi, T. らProc Natl Acad Sci USA 1989;86:5953-5957; Ishibashi, T. らBlood 1989;74:1241-1244.〕や小球性貧血を引き起こす作用〔Hawley, R.G.らJ Exp Med.1992;176:1149-1163. 〕が知られている。ＩＬ−６Ｔｇｍではこれらに加えて多クローン性Ｂ細胞活性化（polyclonal B cell activation）進行に関連した自己免疫性と考えられる〔宮井達也ら、前掲〕、加齢に伴う血小板減少が観察される。

ＭＲ１６−１はこのようなＩＬ−６の直接および間接的な血球系に対する作用を完全に抑制したが同腹仔の血球数には影響しなかった。したがって、正常状態において抗ＩＬ−６レセプター抗体は血球系になんら影響を及ぼさないことが確認できた。また、ＩＬ−６
Ｔｇｍでは骨髄中の顆粒球系前駆細胞と考えられるＧｒ−１陽性細胞比率の増加および末梢好中球比率の増加が観察された。ＩＬ−６が好中球を増加させることは知られているもののその詳細な機序は未だ明らかになっていない。今回の検討でこの作用が骨髄の前駆細胞レベルですでに起こっている現象であることが判明した。ここでもＭＲ１６−１はＩＬ−６の作用を完全に抑制し、骨髄と末梢血中の好中球レベルには影響を与えなかった。

ＭＲ１６−１はＩＬ−６Ｔｇｍで観察される腎炎の発症も抑制した。ＩＬ−６はメサンギウム細胞のオートクライン増殖因子としてメサンギウム増殖性腎炎の発症に密接に関与していると報告されており、ＩＬ−６Ｔｇｍの腎炎も組織学的にメサンギウム増殖性腎炎であることが確認されているが、ＩＬ−６によって亢進された免疫系の関与も否定できない〔勝目朝夫ら：第２１回日本免疫学会発表「ＳＣＩＤ×（ＳＣＩＤ×Ｈ−２Ｌ^d ｈＩＬ−６ transgenic mouse）マウスの特性」；１９９１〕。いずれにしても今回の実験で尿蛋白出現および腎炎による死亡の抑制がみられたことから、ＩＬ−６産生に起因する腎炎発症の抑制に抗ＩＬ−６レセプター抗体が有効であることが明らかとなった。

ＩＬ−６Ｔｇｍでは、悪液質の指標である血清中Ｇｌｕ値とＴｇ値の著しい低下が観察された。今回の実験では、１群ではＧｌｕ値とＴｇ値が低下し、２群ではこれらの値がほぼ正常と同程度に回復したことから、ＭＲ１６−１抗体の投与が悪液質の改善に効果があることが示された。
ＭＲ１６−１はラットＩｇＧ１で、マウスにとっては異種蛋白であるため投与抗体に対する抗体が産生され投与抗体が無効になることが容易に想像される。

今回の実験では初回感作時に大量の抗原に暴露されることによって免疫学的寛容が誘導されることを期待して初回に２mg／ｍｏｕｓｅの抗体を静脈内投与した群を設定した。ＭＲ１６−１投与群の内この処置を施した群（２，４，５群）では投与間隔、投与量に関係なく抗ラットＩｇＧ抗体は検出されず、完全な発症抑制効果が観察されたが、３群は抗ラットＩｇＧ抗体が上昇しコントロール抗体投与群である１群よりやや発症が遅れたのみで結局は同様の病態を呈した。

したがって、この処置が免疫学的寛容誘導に有効であったと考えられるが、抗ラットＩｇＧ抗体は同様のスケジュールでコントロール抗体を投与した１群の全例および６群の２／５例でも検出された。ＩＬ−６Ｔｇｍはプラズマサイト−シスが進行するとpolyclonal B cell activationが起こるため、１群および３群で検出された抗ラットＩｇＧ抗体が投与抗体特異的抗体であると断定はできないが、２，４，５群では初回感作時に大量の抗原に暴露されたことによる免疫学的寛容誘導効果と大量のＭＲ１６−１投与による特異抗体産生抑制作用〔斉藤浩之ら、前掲〕とが相まって完全な寛容が誘導されたのではないかと考えられた。
今回の実験で、抗ＩＬ−６レセプター抗体が正常レベルには影響を与えずにＩＬ−６産生に起因する種々の疾患に対して極めて有効であることが明らかとなった。

実施例２．
ｃｏｌｏｎ２６誘導悪液質モデルに対するマウスＩＬ−６レセプター抗体の効果を検討した。マウスは６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃを用い、実験開始日にｃｏｌｏｎ２６の２mm角のブロックをマウスの側腹部皮下に移植した。マウスＩＬ−６レセプター抗体ＭＲ１６−１（参考例２参照）は、実験開始日のｃｏｌｏｎ２６移植直前に２mg／マウスを静脈内投与し、それ以降７，１１，１４，１８日目に０．５mg／マウスを皮下投与した（ｎ＝７）。

この方法では、異種蛋白のラット抗体に対する中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認している。なお、担癌コントロール群には、ラットＩｇＧｌコントロール抗体（ＫＨ５）を同様のスケジュールで投与した（ｎ＝７）。また、非担癌コントロール群としてＰＢＳ投与群を設置した（ｎ＝７）。実験開始後、連日体重を測定し、実験開始１１および１５日目に血清生化学的値および血中イオン化カルシウム濃度を測定した。

担癌コントロール群では、１０日目以降、非担癌コントロール群に比べ著明な体重減少が観られたが、ＭＲ１６−１投与群では部分的な体重減少抑制効果を示した（図１２）。１１日目の血中トリグリセリド濃度および１５日目の血中グルコース濃度を各々、図１３、図１４に示す。これらの値は担癌コントロール群では非担癌コントロール群に比べ顕著に減少したが、ＭＲ１６−１投与群では、グルコースについては抑制傾向が、トリグリセリドについては有意な抑制効果が観察された。

１１日目の血中イオン化カルシウム濃度は、担癌コントロール群で非担癌コントロール群に比べ顕著に上昇したが、ＭＲ１６−１投与群では有意な抑制効果を示した（図１５）。
上記実験と同様のスケジュールで延命効果を確認する実験を行った（ｎ＝１０）。その結果、ＭＲ１６−１投与群では、延命効果があることが認められた（図１６）。

実施例３．
高カルシウム血症を伴うｏｃｃ−１誘導悪液質モデルに対するＩＬ−６レセプター抗体の効果を検討した。マウスは、６週齢の雄性ヌードマウスを用い、実験開始日にヒト口腔底癌細胞株ｏｃｃ−１をマウスの側腹部皮下に移植した。マウスＩＬ−６レセプター抗体ＭＲ１６−１（参考例２参照）は、実験開始日のｏｃｃ−１移植直前に２mg／マウスを静脈内投与し、それ以降７および１０日目に１００μｇ／マウスを皮下投与した。（ｎ＝６）。

この方法では、異種蛋白のラット抗体に対する中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認している。なお、担癌コントロール群には、ラットＩｇＧｌコントロール抗体（ＫＨ５）を同様のスケジュールで投与した（ｎ＝６）。また、非担癌コントロール群としてＰＢＳ投与群を設置した（ｎ＝７）。実験開始１０および１２日目に体重および血中イオン化カルシウム濃度を測定した。
担癌コントロール群では、体重減少が観察されたが、ＭＲ１６−１投与群では非担癌コントロール群と同様の体重の推移を示し、体重減少が抑制された（図１７）。
血中イオン化カルシウム濃度は、担癌コントロール群で非担癌コントロール群に比べ著明な上昇が認められたが、ＭＲ１６−１投与群では上昇が強く抑制された（図１８）。

図１は、各群の動物の推移の体重の増加を示すグラフである。図２は、各群の尿蛋白質の陽性率の推移を示すグラフである。１群及び３群以外の群では尿蛋白質の陽性率は０であった。図３は、各群のヘモグロビンレベルの推移を示すグラフである。図４は、各群の赤血球数の推移を示すグラフである。図５は、各群の血小板数の推移を示すグラフである。図６は、各群の白血球数の推移を示すグラフである。図７は、各群の血清ＩｇＧ１濃度の推移を示すグラフである。図８は、１〜５群でのヒトＩＬ−６濃度の推移を示すグラフである。図９は、１群及び２群における、対照抗体ＩｇＧ及びＧｒ−１抗体による、蛍光抗体セルソーティングの結果を示す図である。図１０は、６群及び７群における、対照抗体ＩｇＧ及びＧｒ−１抗体による、蛍光抗体セルソーティングの結果を示す図である。図１１は、実験終了後の各群の動物の脾臓重量を示すグラフである。図１２は、各群の動物の体重の推移を示すグラフである。図１３は、実験１１日目のマウスの血中トリグリセリド濃度を示すグラフである。図１４は、実験１５日目のマウスの血中グルコース濃度を示すグラフである。図１５は、実験１１日目のマウスの血中イオン化カルシウム濃度を示すグラフである。図１６は、担癌マウスの生存率を示すグラフである。図１７は、実験開始１０および１２日目のマウスの体重を示すグラフである。図１８は、実験開始１０および１２日目のマウスの血中イオン化カルシウム濃度を示すグラフである。

Claims

インターロイキン−６レセプターに対する抗体を含んでなる、悪液質の予防または治療剤。
インターロイキン−６レセプターに対する抗体を含んでなる、貧血の予防または治療剤。
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の予防または治療剤。
前記抗体が、再構成ヒト抗体である、請求項３に記載の予防または治療剤。
前記抗体が、再構成ヒトPM-1抗体である、請求項４に記載の予防または治療剤。