FI121455B - Farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n tuoton aiheuttamien sairauksien hoitoon - Google Patents

Description

5

Farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n tuoton aiheuttamien sairauksien hoitoon - Farmaceutiska kompiositioner för behandling av sjukdomar förorsakade av IL-6-produktion

Tekninen alue Tämä keksintö koskee farmaseuttisia koostumuksia sellaisten sairauksien estämiseen tai hoitoon, joita interleukiini-6:n 10 (IL-6) tuotto aiheuttaa, jolloin sairaus on kakeksia, ja mainitut koostumukset sisältävät vasta-aineen interleukiini-6:n reseptoria (IL-6R) kohtaan (anti-IL-6R-vasta-aine).

Keksinnön tausta 15 IL-6 on monifunktionaalinen sytokiini, jonka uskotaan toimivan immunologisten, hematologisten ja akuutin faasin reaktioiden eri tasoilla Taga, T. et ai., Critical Rewiews in Immunol. 11:265 - 280, 1992] sekä esittävän tärkeitä rooleja multippe- 20 lissa myeloomassa kasvutekijänä sekä sairauksissa, joihin plasmasytoosi liittyy, kuten reumatismissa [Hirano, T. et ai., Eur. J. Immunol. 18:1797 - 1801, 1988; Houssiau, F. A. et ai., Arth. Rheum. 31:784 - 788, 1988], Castlemanin taudissa [Yoshi-zaki, K. et ai., Blood 74:1360 - 1367, 1989; Brant, S. J. et 25 ai., J. Clin. Invest. 86:592 - 599, 1990], nefriitissä eli munuaistulehduksessa, jossa mesangiaalisolut lisääntyvät [Ohta, K. et ai., Clin. Nephrol. (Saksa) 38:185 - 189, 1992;

Fukatsu, A. et ai., Lab. Invest. 65:61 - 66, 1991; Horii, Y. et ai., J. Immunol. 143:3949 - 3955, 1989], kakeksiassa, johon 30 liitty kasvaimen kasvu [Strassmann, G. et ai., J. Clin. Invest. 89:1681 - 1684, 1992], jne..

Sellaisissa transgeenisissä H-2 Ld hIL-6 -hiirissä (IL-6 Tgm), joissa geenitekniikan avulla on ilmennetty liiallisia määriä 35 ihmisen IL-6:tta, on havaittu IgGl-plasmasytoosi, nefriitti, jossa mesangiaalisolut lisääntyvät, anemia, trombosytopeniaa eli verihiutaleniukkuutta, autovasta-aineiden esiintymistä 2 jne. [Miyai, T. et ai., esitys Japan Immunology Societyn 21. kokouksessa, "Hematological Change in H-2 Ld hIL-6 transgenic mice with age", 1991], mikä viittaa siihen, että IL-6 liittyy suureen määrän sairauksia. Ei tiedetä kuitenkaan, että inter-5 leukiini-6-reseptorin vasta-aine on tehokas sairauksissa, joita interleukiinin tuotto aiheuttaa.

Keksinnön kuvaus 10 Tämän keksinnön mukaan annetaan täten käyttöön farmaseuttinen koostumus sellaisten sairauksien estämiseen ja hoitoon, joita interleukini-6:n tuotto aiheuttaa, jolloin sairaus on kakeksia.

15 Edellä esitettyjen ongelmien ratkaisemiseksi tämä keksintö saa aikaan farmaseuttisia koostumuksia sellaisten sairauksien estämiseksi tai hoitoon, joita interleukiini-6:n tuotto aiheuttaa, jolloin sairaus on kakeksia, ja mainitut farmaseuttiset koostumukset sisältävät interleukiini-6-reseptorin vasta-20 ainetta.

Piirrosten lyhyt selitys

Kuvio 1 on graafinen esitys, joka osoittaa muutoksen kunkin 25 ryhmän eläinten ruumiinpainon lisääntymisessä.

Kuvio 2 on graafinen esitys, joka osoittaa muutoksen virtsa-proteiinin positiivisessa suhteessa kullakin ryhmällä. Virtsan proteiinin positiivinen suhde oli nolla muissa ryhmissä kuin 30 ensimmäisessä ja kolmannessa.

Kuvio 3 on graafinen esitys, joka osoittaa hemoglobiinitason muutoksen kullakin ryhmällä. 1

Kuvio 4 on graafinen esitys, joka osoittaa punasolujen lukumäärän muutoksen kullakin ryhmällä.

3

Kuvio 5 on graafinen esitys, joka osoittaa verihiutaleiden lukumäärän muutoksen kullakin ryhmällä.

Kuvio 6 on graafinen esitys, joka osoittaa valkoisten ve-5 risolujen lukumäärän muutoksen kullakin ryhmällä.

Kuvio 7 on graafinen esitys, joka osoittaa seerumin IgGlm pitoisuuden muutoksen kullakin ryhmällä.

10 Kuvio 8 on graafinen esitys, joka osoittaa humaani IL-6-pitoi-suuden muutoksen ryhmillä 1-5.

Kuvio 9 esittää tulksen solulajittelusta, joka on toteutettu fluoresenssivasta-ainetekniikalla, jossa käytettiin kontrolli-15 vasta-ainetta IgG ja Gr-1 ryhmissä 1 ja 2.

Kuvio 10 edustaa tulosta solulajittelusta, joka toteutettiin fluoresenssivasta-ainetekniikalla, jossa käytettiin kontrolli-vasta-ainetta IgG ja Gr-1 ryhmässä 6 ja 7.

20

Kuvio 11 on graafinen esitys, joka osoittaa kunkin ryhmän eläinten pernan painon kokeen lopussa.

Kuvio 12 on graafinen esitys, joka osoittaa eläinten ruumiin-25 painon muutoksen kussakin ryhmässä.

Kuvio 13 on graafinen esitys, joka osoittaa triglyseridipitoi-suuden hiirien veressä 11. koepäivänä.

30 Kuvio 14 on graafinen esitys, joka osoittaa glukoosipitoisuu-den hiirien veressä 15. koepäivänä.

Kuvio 15 on graafinen esitys, joka osoittaa ionisoidun kalsiumin pitoisuuden hiirien veressä 11. koepäivänä.

35

Kuvio 16 on graafinen esitys, joka osoittaa sellaisten henkiinjääneiden kontrollihiirien määrän, joissa on kasvain.

4

Kuvio 17 on graafinen esitys, joka osoittaa hiirien ruumiinpainon 10. ja 12. päivänä kokeen alusta.

5 Kuvio 18 on graafinen esitys, joka osoittaa ionisoidun kalsiumin pitoisuuden hiirien veressä 10. ja 12. päivänä kokeen aloittamisesta.

Yksityiskohtainen selvitys 10

Interleukiini-6:n tuoton aiheuttamiin sairauksiin kuuluu esimerkiksi kakeksia.

Interleukiini-6:n reseptori vasta-aine, jota on käytettävä 15 tässä keksinnössä, voi olla mitä tahansa alkuperää tai tyyppiä (monoklonaalinen, polyklonaalinen), sikäli kuin se voi estää signaalitransduktion, joka tapahtuu IL-6:n avulla, ja inhiboi IL-6:n biologisen aktiivisuuden. Se on kuitenkin mieluummin monoklonaalinen vasta-aine, joka on peräisin nisäkkäästä. 20 Vasta-aine estää signaalitransduktion, joka tapahtuu IL-6:n avulla, ja se inhiboi IL-6:n biologisen aktiivisuuden, siten että se inhiboi IL-6:n sitoutumisen IL-6R:ään.

Monoklonaalista vasta-ainetta tuottava solu voi olla minkä 25 tahansa sellaisen eläinlajin solu, joka kuuluu nisäkkäisiin, tai vasta-aine voi olla ihmisen vasta-aine tai se voi olla peräisin eläimestä, muusta kuin ihmisestä. Muusta eläimestä kuin ihmisestä peräisin olevat monoklonaaliset vasta-aineet ovat mieluummin sellaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka 30 ovat peräisin kaniinista tai jyrsijästä, koska tällaisten vasta-aineiden tuottaminen on helppoa. Termiin jyrsijä kuuluu mieluummin hiiriä, rottia, hamstereita jne., mutta termi ei rajoitu niihin. 1

Termiin interleukiini-6-reseptorin vasta-aine kuuluvat esimerkiksi MR16-l-vasta-aine (Tamura, T. et ai., Proc. Natl. Acad.

5

Sei. U.S.A. 90:11924 - 11928, 1993), PM-l-vasta-aine (Hirata, Y. et ai., J. Immunol. 143:2900 - 2906, 1989, jne..

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tuottaa olennaisesti 5 tekniikan tason mukaisin, tunnetuin menetelmin seuraavasti. Täten niitä voidaan tuottaa, siten että käytetään IL-6R:ää immunisoivana antigeeninä, jolla immunisoidaan tavanomaista me-telmää käyttämällä, ja saatuihin immunosyytteihin käytetään sitten solufuusiomenetelmää vasta-aineita tuottavien solujen 10 seulomiseksi tavanomaisella seulontamenetelmällä.

Yksityiskohtaisemmin esitettynä tuotetaan monoklonaalisia vasta-aineita seuraavalla menetelmällä. Mainittu immunisoiva antigeeni voidaan saada esimerkiksi, siten että käytetään 15 humaani IL-6R:n geenisekvenssiä, joka esitetään Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EP 325474. Sen jälkeen kun ihmisen IL-6R:n geenisekvenssi on insertoitu tunnettuun ekspressiovek-torijärjestelmään sopivan isäntäsolun transformointia varten, puhdistetaan haluttu IL-6R-proteiini isäntäsoluista tai niiden 20 viljelmäsupernatantista mainitun puhdistetun IL-6R-proteiinin käyttöä varten immunisoivana antigeeninä.

Mainittu immunisoiva antigeeni, joka on peräisin hiirestä, voidaan tämän lisäksi saada, siten että käytetään hiiren IL-25 6R:n geenisekvenssiä, joka kuvattiin Japanilaisessa, tutkimattomassa patenttijulkaisussa 3 (1991)-155795, samalla mene telmällä, kuin käytettiin humaani IL-6R:n edellä mainitulle geenisekvenssille. 1 2 3 4 5 6

Koska IL-6R:ää niiden lisäksi, jotka ilmentyvät solumem- 2 braanilla, niitä (sIL-6R), jotka ovat mahdollisesti erillään 3 solumembraanista, voidaan käyttää antigeeninä. SIL-6R koostuu 4 pääasiassa solun membraaniin sidotun IL-6R:n solunulkopuoli- 5 sesta domainista, ja se eroaa membraaniin sidotusta IL-6R:stä 6 siinä, että ensiksi mainitulta puuuttuu transmembraanidomaini eli kalvodomaini tai sekä transmembraanidomaini että solun-sisäinen domaini.

6

Sellaisten nisäkkäiden piirissä, jotka on immunisoitu immunisoivalla antigeenillä, on suotavaa ottaa huomioon nisäkkään yhteensopivuus solufuusioon käytetyn isäntäsolun kanssa, 5 ja tavallisesti käytetään hiiriä, rottia, hamstereita, kaniineja jne., mutta niihin ei ole välttämättä rajoituttava.

Eläimen immunisointi immunisoivalla antigeenillä voidaan saada aikaan ammattimiehen tuntemin menetelmin. Yleisessä menetel-10 mässä annetaan mainittua immunisoivaa antigeeniä nisäkkäälle vatsaonteloon tai ihonalaisesti. Immunisoiva antigeeni tarkemmin sanottuna laimennetaan tai lietetään sopivaan tilavuuteen PBS:ää (fosfaatilla puskuroituun keittosuolaliuokseen) , fysiologista keittosuolaliuosta jne. ja sekoitetaan, jos niin 15 halutaan, sopivan määrän kanssa täydellistä Freundin adjuvant-tia sekä emulgoidaan ja sitten mainittu emulsio annetaan nisäkkäälle, mieluummin useita kertoja, joka neljäs - 21. päivä. Immunisoinnin yhteydessä voidaan tämän lisäksi immunisoivan antigeenin kanssa käyttää sopivaa kantajaa.

20

Sen jälkeen kun eläin on immunisoitu edellä kuvatulla tavalla ja on varmistettu, että seerumin vasta-ainetaso on noussut halutulle tasolle, immunosyytit poistetaan nisäkkäästä ja ne käytetään solufuusioon. Edullisena immunosyyttinä mainitaan 25 erityisesti pernasolu.

Sellaisiin edullisiin myeloomasoluihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa kantasolujen partnerina, joka yhdistetään mainitun immunosyytin kanssa, kuuluu erilaisia tunnettuja solulin-30 joja, esimerkiksi P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. 123:1548, 1978) , p3-Ul (Curren Topics i Micro-biology and Immunology 81:1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6:511 - 519, 1976), MPC-11 (Cell 8:405 - 415, 1976), SP2/0 (Nature 276:269 - 270, 1978), FO (J. Immunol. Meth. 35:1 - 21, 1980), S194 (J. Exp.

35 Med. 148:313 - 323, 1978), R210 (Nature 277:131 - 133, 1979), jne. .

7

Mainittu immunosyytti voidaan sulauttaa myeloomasolun kanssa olennaisesti tunnetun menetelmän mukaan, jota Milstein et ai. kuvaavat (Milstein et ai., Methods Enzymol. 73:3 - 46, 1981), jne. .

5

Mainittu solufuusio voidaan toteuttaa tarkemmin sanottuna esimerkiksi solufuusiota kiihdyttävän agenssin läsnäollessa tavallisessa ravintoalustassa. Solufuuusiota jouduttavana agenssina voidaan käyttää polyetyleeniglykolia (PEG), Sendai-10 virusta (HVJ) jne. ja solufuusion tehokkuuden lisäämiseksi voidaan lisätä suoraan adjuvanttia, kuten dimetyylisulfoksi-dia.

Immunosyyttien suhde käytettyihin myeloomasoluihin on mie-15 luummin yhdestä kymmeneen kertaa enemmän immunosyyttejä kuin myeloomasoluja. Edellä esitettyyn solufuusioon käytettynä nestemäisenä viljelyalustana mainitaan esimerkiksi nestemäinen RPMI 1640 -alusta ja nestemäinen MEM-alusta, jotka sopivat parhaiten myeloomasolulinjan kasvatukseen, sekä tavalliset 20 soluviljelyyn käytettävät viljelyliemet, ja tämän lisäksi voidaan käyttää seerumitäydennystä, kuten vasikan sikiön seerumia (FCS) jne..

Halutut sulautetut solut (hybridoomat) voidaan muodostaa, 25 siten että sekoitetaan annettu määrä edellä mainittuja im-munosyyttejä myeloomasolujen kanssa edellä mainitussa ravinto-liemessa ja lisätään PEG-liuosta, joka on edeltä käsin lämmitetty 37 °C:seen, esimerkiksi PEG-liuosta, jonka keskimääräinen molekyylipaino on alueella 1000 - 6000, 30 - 60 prosentin 30 (paino/tilavuus) pitoisuutena. Sitten, sen jälkeen kun peräk käin on lisätty sopivaa viljelyaluetaa ja tämän jälkeen on poistettu supernatantti, voidaan poistaa solunsulauttamis-agenssit jne., jotka eivät ole suotavia hybridooman kasvun kannalta.

35

Mainittu hybridooma voidaan valita viljelemällä tavanomaisessa valinta-alustassa, kuten nestemäisessä HAT-viljelyalustassa 8 (nestemäisessä viljelyalustassa, joka sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä). Jatketaan viljelä mainitussa HAT-alustassa ajan verran, joka on riittävä siihen, että muut solut (sulautumattomat solut),kuin halutut hybridoomasolut, 5 kuolevat, tavallisesti joistakin päivistä muutamaan viikkoon. Tämän jälkeen toteutetaan tavanomainen rajalaimennusmenetelmä haluttua vasta-ainetta tuottavan hybridooma seulomiseksi ja monokloonausta varten.

10 Hybridoomaa, joka tuottaa täten valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita, voidaan alaviljellä tavanomaisessa, nestemäisessä alustassa ja säilyttää nestetypessä pitkähköjä ajanjaksoja.

15 Jotta monoklonaalinen vasta-aine saadaan mainitusta hybri-doomasta, käytetään esimerkiksi menetelmää, jossa mainittua hybridoomaa viljellään tavanomaisen menetelmän mukaan, jotta saadaan viljelysupernatantti, tai menetelmällä, jossa hybridooma siirretään nisäkkääseen, joka on hybridooman kanssa 20 yhteen sopiva, ja viljellään tässä nisäkkäässä, jotta saadaan vasta-aine askitesnesteenä tai muuna sen tapaisena nesteenä. Edellinen menetelmä soveltuu erittäin puhtaan vasta-aineen saantiin, kun taas viimeksi mainittu menetelmä sopii vasta-aineen suurten määrien tuottoon.

25

Edellä mainituilla menetelmillä saadut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan tämän lisäksi puhdistaa tavanomaisilla puhdis-tusmenettelytavoilla, kuten suolautuksella irti liuoksesta, geelisuodatuksella, affiniteettikromatografiällä, jne..

30 Täten valmistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden kyky tunnistaa antigeeni suurella affiniteetilla ja erittäin tarkasti, voidaan varmistaa tavanomaisilla immunologisilla menetelmillä, kuten radioimmunologisella määritysmenetelmällä, 35 entsyymi-immunologisella määritysmenetelmällä (EIA, ELISA), menetelmällä, jossa käytetään fluoroivaa vasta-ainetta (im-munofluoresenssianalyysillä) jne..

9 Tässä kokeessa käytetty monoklonaalinen vasta-aine ei rajoitu hybridooman tuottamaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen, ja se voi olla keinotekoisesti muutettu vasta-aine, jonka tarkoituk-5 sena on vähentää heteroantigeenisyyttä ihmistä kohtaan. Voidaan käyttää esimerkiksi kimeeravasta-ainetta, jossa on hiiren monoklonaalisen vasta-aineen vaihtelevia alueita ja ihmisen vasta-aineen muuttumattomia alueita. Tällainen kimeeravasta-aine voidaan valmistaa, siten että käytetään tunnettua kimee-10 ravasta-aineiden tuottamismenetelmää, erityisesti geenitek-ni ikkamene telmää.

Tämän lisäksi tässä keksinnössä voidaan käyttää uudelleen muotoiltua ihmisen vasta-ainetta. Tämä on vasta-aine, jossa 15 ihmisen vasta-aineen komplementaarisuutta määräävät alueet on korvattu nisäkkään vasta-aineen, muun kuin ihmisen vasta-aineen, esimerkiksi hiiren vasta-aineen, komplementaarisuutta määräävillä alueilla, ja yleiset menetelmät sitä varten ovat tekniikan tason mukaan tunnettuja. Tällaista menetelmää käyt-20 tämällä voidaan saada uudelleen muodostettu ihmisen vasta-aine, joka on tässä keksinnössä käyttökelpoinen.

Kun on välttämätöntä, voidaan korvata vasta-aineen vaihtelevan alueen runkoalueissa (FR) aminohapot, siten että ihmisen 25 uudelleen muodostetun vasta-aineen komplementaarisuutta määräävä alue voi muodostaa sopivan, antigeeniä sitovan kohdan (Sato et ai., Cancer Res. 53: 1 - 6, 1993) . Tällaisen uudelleen muodostetun humaani vasta-aineen esimerkkinä voidaan esittää edullisesti humanisoitu PM-1 (hPM-1) (katso Kansainvä-30 linen patenttihakemus WO 9219759).

Voidaan muodostaa sellaisia geenejä, jotka koodittavat vasta-aineen fragmentteja, esimerkiksi Fab:tä tai Fv:tä, yksinkertaista ketjua Fv (scFv), jossa Fv:n H- ja L-ketju on yhdistet-35 ty sopivalla linkkerillä, ja ne voidaan ilmentää sopivissa isäntäsoluissa, sikäli kuin fragmentit sitouvat antigeeniin ja inhiboivat IL-6:n aktiivisuutta (katso esimerkiksi julkaisua 10

Bird et ai., Tibtech 9:132 - 137, 1991; Huston et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879 - 5883, 1988). Tämän lisäksi scFv:n tekemiseen voidaan käyttää vasta-aineen uudelleen muodostettua V-aluetta H- ja L-ketjun Fv-aluetta varten.

5 Tässä keksinnössä voidaan käyttää sellaisia farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n tuoton aiheuttamien sairauksien estämiseen ja hoitoon, joissa on tämän keksinnön mukainen IL-6-reseptorin vasta-aine, sikäli kuin mainitut koostumukset estävät IL-6:n 10 signaalitransmission ja ovat tehokkaista IL-6:n tuoton aiheut-tamiasairauksia vastaan.

Farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n aiheuttamia sairauksien estämiseen ja hoitoon voidaan antaa mieluummin parenteraali-15 sesti, esimerkiksi ruiskeena laskimoon, lihakseen, vatsaonteloon tai ihon alle jne., sekä systeemisesti että paikallisesti . Ne voivat olla tämän lisäksi farmaseuttisen koostumuksen tai pakkauksen muodossa yhdistettyinä ainakin yhteen farmaseuttiseen kantajaan tai laimentimeen.

20

Vaikka tämän keksinnön farmaseuttisten koostumusten annos voi vaihdella potilaan sairauden tilan, iän tai antomenetelmän mukaan, on välttämätöntä valita sopiva määrä soveltuvalla tavalla. Niitä voidaan antaa vaihtoehtoisesti määränä, joka on 25 1 - 1000 mg potilaan painon kilogrammaa kohti viikossa. Tämän keksinnön farmaseuttisia koostumuksia ei rajoiteta kuitenkaan edellä mainittuihin annoksiin.

Tämän keksinnön farmaseuttiset koostumukset voidaan formuloida 30 tavanomaisella menetelmällä. Parenteraaliset valmisteet voidaan valmistaa esimerkiksi, siten että puhdistettu IL-6R-vasta-aine liuotetaan liuottimeen, esimerkiksi fysiologiseen keittosuolaliuokseen, puskuriliuokseen jne., johon lisätään adsorption estävää ainetta, esimerkiksi Tween 80:ntä, gelatii-35 nia, ihmisen seerumin albumiinia (HSA), jne., tai ne voivat olla lyofilisoidussa muodossa, joka voidaan muodostaa uudelleen liuottamalla se ennen käyttöä. Lyofilisoinnin lisäainei- 11 siin siältyvät esimerkiksi sokerialkoholi, kuten mannitoli, glukoosi, jne. tai sakkarideja.

ESIMERKIT

5

Keksintöä kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin esimerkkien avulla viittamalla seuraaviin viite-esimerkkeihin ja esimerkkeihin, joita ei ole tarkoitettu rajoittamaan tämän keksinnön piiriä.

10 Viite-esimerkki 1. Transgeenisen B6Ld-IL-6-hiiren konstruointi

Sellainen 3,3 kbp:n suuruinen fragmentti (Ld-IL-6) , jossa oli ihmisen IL-6-cDNA kytkettynä H-2Ld-promoottoriin (Suematsu et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:7547, 1989), ruiskutet- 15 tiin C57BL/6J (B6) -hiiren (Nihon Clea) hedelmöitetyn munan esitumaan mikroinjektion avulla, menetelmän mukaan, jota kuvataan julkaisussa Yamuara et ai., J. Biochem. 96:357, 1984.

Hedelmöitetty muna siirrettiin sellaisen naaraspuolisen hiiren 20 munanjohtimeen, joka oli saanut hoitoa valeraskauden vuoksi. Tämän jälkeen tutkittiin vastasyntyneestä hiirestä hIL-6-cDNA:n integroituminen Southern blot - analyysin avulla, joka toteutettiin EcoRI:llä pilkotulle häntä-DNA:lie, siten että käytettiin koettimena 32P:llä leimattua ihmisen IL-6-cDNA:n 25 TaqI-Banll-fragmenttia. Sellaiset eläimet, joissa tutkimuksen mukaan integraatio oli toteutunut, käytettiin siitokseen B6-hiirien kanssa, jotta saatiin aikaan hiirisuku, jolla oli sama genotyyppi.

30 Viite-esimerkki 2. Rotan anti-IL-6R-vasta-aineen valmistus CHO-soluja tuottavaa hiiren liukoista IL-6R:ää valmistettiin tavalla, jota Saito et ai. kuvaavat julkaisussa J. Immunol. 147:168 - 173, 1991. Soluja inkuboitiin aMEM:ssä, joka sisälsi 35 viisi prosenttia härän sikiön seerumia (FBS), 37 °C:ssa, kostutetussa ilmassa, joka sisälsi viisi prosenttia C02:a. Ilmastoitu alusta otettiin talteen ja käytettiin hiiren sIL-6R:n 12 valmistukseen. Hiiren sIL-6R:n pitoisuus alustassa määritettiin kerroksittaisella eli "sandwitch"-ELISAlla, siten että käytettiin monoklonaalista anti-hiiri-IL-6R-vasta-ainetta RS15 (Saito et ai., J. Immunol. 147:168 - 173, 1991) sekä kaniinin 5 polyklonaalista anti-hiiri-IL-6R-vasta-ainetta.

Hiiren sIL-6R puhdistettiin hiiren sIL-6R-valmisteesta, siten että käytettiin affiniteettipylvästä, johon oli adsorboitu monoklonaalista hiiren anti-hiiri-IL-6R-vasta-ainetta (RS12). 10 Puhdistettua hiiren sIL-6R:ää, joka oli Freundin adjuvantissa, ruiskutettiin Wistar-rotan ihon alle ja eläimelle annettiin kahden viikon kuluttua ihonalle neljä kertaa kerran viikossa tehosterokotus, joka oli 50 pg hiiren sIL-6R:ää Freundin epätäydellisessä adjuvantissa. Viikon kuluttua ensimmäisestä 15 tehosterokotuksesta annettiin rotille laskimoon 50 pg hiiren sIL-6R:ää, joka oli 100 plitrassa fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta (PBS).

Kolme päivää myöhemmin rotista poistetiin perna ja niiden 20 splenosyyteille eli pernasoluille toteutettiin fuusiokäsitte-ly hiiren p3Ul-myeloomasolujen kanssa, siten että solujen suhde oli 10:1. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa, yön ajan, 100 plitrassa RPMI 1640 -alustaa, joka sisälsi 10 prosenttia FBS:ää 96-kammioisten levyjen kammioissa (Falcon 3075), ja 25 sitten niihin lisättiin 100 plitraa alustaa, joka sisälsi hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT). Puolet alustasta korvattiin HAT-alustalla päivittäin, neljän päivän ajan. 1 2 3 4 5 6

Seitsemän päivää myöhemmin valittiin hiiren sIL-6R:ää sito 2 valla määrityksellä (ELISA) hybridooma, joka tuotti anti- 3 hiiri-sIL-6R:ää. Lyhyesti sanottuna inkuboitiin 100 plitraa 4 hybridooman viljelmäsupernatanttia levyssä, joka aiemmin oli 5 päällystetty kaniinin polyklonaalisella rotan anti-IgG:n 6 vasta-aineella (1 pg millitrassa). Levy pestiin ja sitten sitä inku- boitiin hiiren sIL-6R:n kanssa (100 pg millitrassa). Pesun jälkeen lisättiin kaniinin polyklonaalista anti-hiiri- 13 IL-6R-vasta-ainetta 2 pg:aan saakka millitrassa, levy pestiin ja sitten sitä inkuboitiin alkaliseen fosfatasiin konjugoidun, vuohen polyklonaalisen anti-kaniini-IgG-vasta-aineen kanssa (Tago) 60 minuutin ajan.

5

Lopuksi pesun jälkeen levyä inkuboitiin alkalisen fosfataasin substraatin kanssa (Sigma 194; p-nitrofenyylifosfaatti) ja se luettiin 405 nm:ssä levylukijaa käyttämällä (Toso). Hybridoo-ma, joka tunnistaa hiiren sIL-6R:n, kloonattiin kaksi kertaa 10 rajalaimennusmenetelmällä. Askitesnesteiden valmistusta varten ruiskutettiin BALB/c nu/nu -hiireen kaksi kertaa 0,5 millitraa pristaania ja kolme päivää myöhemmin ruiskutettiin sen vatsaonteloon 3 x 106 hybridoomasolua, jotka oli saatu aikaan. Kymmenen - kaksikymmentä päivää myöhemmin koottiin askitesnes-15 te ja siitä puhdistettiin monoklonaalinen vasta-aine MR16-1, siten että käytettiin proteiini-G-pylvästä (Oncogene Science).

Neutraloiva vaikutus MR16-l:llä tuotettuun IL-6:n vasta-aineeseen tutkittiin liittämällä 3H-tymidiiniä MH60.BSF2-solujen 20 avulla (Matsuda et ai., Eur. J. Immunol. 18:951 - 956, 1988). MH60.BSF2-soluja annosteltiin 96-kammioisen levyn kammioihin 1 x 104 solua 200 pl:ssa kammiota kohti ja sitten kammioihin lisättiin hiiren IL-6:tta (10 pg/ml)ja kammioihin lisättiin MR16-1- tai RS12-vasta-ainetta, minkä jälkeen soluja inkuboi-25 tiin 37 °C:ssa, 5-prosenttisessa C02:ssa, 44 tunnin ajan. Tämän jälkeen lisättiin kuhunkin kammioon 3H-tymidiiniä (yksi mCi/kammio) ja neljä tuntia myöhemmin niistä tutkittiin 3H-tymidiinin liittyminen.

30 Esimerkki 1

Kokeessa yksi käytettiin 31 transgeenistä hiirtä, joissa oli ihmisen IL-6-cDNA:ta ja jotka oli lisätty transgeenisestä B6 IL-6 -hiiristä (B6 IL-6 Tgm), ja käytettiin 11 normaalia 35 poikueen jälkeläistä, joissa ei ollut ihmisen IL-6 cDNA:ta (molemmat olivat neljän viikon ikäisiä; koiraspuolisia). B6 IL-6 Tgm:t jaettiin viiteen ryhmään (ryhmä 1 - ryhmä 5), 14 joissa kussakin oli kuusi eläintä ja joista vain ryhmä 1 koostui seitsemästä eläimestä. Normaalit poikueen jälkeläiset jaettiin viiden hiiren muodostamaan ryhmään kuusi ja ryhmään seitsemän, jossa oli kuusi hiirtä.

5

Anto-ohjelma oli seuraava:

Ryhmä 1 (B6 IL-6 Tgm): Neljän viikon ikäiselle hiirelle (ko keen ensimmäinen päivä) ruiskutettiin laskimoon rotan IgGl-vasta-ainetta (KH5) (kontrollivasta-aine) annoksena, joka oli 10 2 mg 0,2 millitrassa, ja viiden viikon ikäiselle (kokeen kahdeksas päivä) ja sitä vanhemmalle hiirelle ruiskutettiin ihon alle 100 μg KH5-vasta-ainetta kahdesti viikossa (joka kolmas ja neljäs päivä).

15 Ryhmä 2 (B6 IL-6 Tgm): neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon MR16-l-vasta-ainetta annoksena, joka oli 2 mg 0,2 millitrassa, ja viiden viikon ikäisille sekä sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg MR16-l:htä kaksi kertaa viikossa.

20

Ryhmä 3 (B6 IL-6 Tgm): Neljän viikon ikäisille hiirille ruis kutettiin laskimoon 0,2 millitraa fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg MR16-l:htä kaksi 25 kertaa joka viikko.

Ryhmä 4 (B6 1-6 Tgm): Neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon MR16-l:htä 2 mg 0,2 millilitrassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin 30 ihon alle 400 pg MR16-l:htä kerran joka toinen viikko.

Ryhmä 5 (B6 IL-6 Tgm): Neljän viikon ikäsille hiirille Ruiskutettiin laskimoon MR16-l:htä 2 mg 0,2 millitrassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin 35 ihon alle 1 mg MR16-l:htä joka toinen viikko.

15

Ryhmä 6 (normaaleita B6-poikueen jälkeläisiä): Neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon kontrollivasta-ainetta KH5 2 mg 0,2 millitrassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg 5 KH5:ttä kaksi kertaa joka viikko.

Ryhmä 7 (normaaleita B6-poikueen jälkeläisiä): Neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon MR16-l:htä 2 mg 0,2 millitrassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vähemmälle 10 hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg MR16-l:htä kaksikertaa joka viikko.

Tässä yhteydessä käytetyt koemenetelmät olivat seuraavat: 15 Ruumiin painon mittaus ja virtsan proteiinin määrittäminen: Joka viikko mitattiin ruumiin paino ja määritettiin virtsan proteiini virtsanproteiinitestipaperilla (Combistics Sakyo). Virtsan proteiinin lukemat, jotka olivat kolme plussaa (100 -300 mg desilitrassa) tai sitä enemmän, otettiin positiivisiksi 20 arvoiksi.

Veren keräys: Veri koottiin silmäkuopantakaisesta veriviemä- ristä joka toinen viikko kokeen alusta lähtien (neljän viikon ikäisiltä hiiriltä) ja kokonaisveri koottiin alaonttolaskimos-25 ta kokeen lopussa (18 viikon ikäisiltä hiiriltä).

Verisolujen laskemiset: Mikrosolulaskijaa (Sysmex F-800) käyttäen määritettiin veren valkosolut (WBC), punasolut (RBC) sekä verihiutaleet (PLT) samoin kuin hemoglobiinin (HBG) 30 määrä. Kokeen lopussa valmistettiin tiettyjä ryhmiä vastaavat (ryhmä 1, 2, 6 ja 7) mikroskoopin tippamaiset preparaatit ja toteutettiin valkoisten verisolujen erittelylaskenta prosentteina. 1

IgGl-pitoisuuden määrittäminen verestä: Se mitattiin hiiren IgGl:lle spesifisellä ELISAlla, siten että standardina käytettiin myeloomaproteiinia.

16

Veren IL-6:n pitoisuuden määritys: Se mitattiin hIL-6:lle spesifisellä ELISAlla.

Rotan anti-IgG:n vasta-aineen (IgG-luokka) tiitterin määrittäminen verestä: Koska annettu vasta-aine on hiirelle hetero- 5 geeninen vasta-aine, vasta-aineen tuotto annettua vasta-ainetta vastaan mitattiin ELISAlla, siten että antigeeninä käytettiin rotan IgG:tä. Tulos ilmaistiin yksiköinä, siten että standardina käytettiin aikuisen eläimen IL-6-Tgm-seerumia, joka oli annettu, rotalla kehitetty vasta-aine.

10

Veren kemiallisten parametrien määritys: Ryhmien 1, 2, 3, 6 ja 7 hiirien seerumeista määritettiin kokeen lopussa kokonaispro-teiini (TP), albumiini (Alb), glukoosi (Glu), triglyseridi (TG) , kreatiniini (CRE), veren ureatyppi (BUN), kalsium (Ca), 15 akalinen fosfataasi (ALP), glutamiini-pyruvaattitransaminaasi (GOT) sekä glutamaatti-pyruvaattitransaminaasi (GTP), siten että käytettiin autoanlysaattoria (COBAS FARA II, Roche).

Luuytimen ja splenosyyttien FACS-analyysi: Kokeen lopussa 20 analysoitiin solun pinta-antigeenit FACScanillä (Beckton Dickensian) luuytimestä ja splenosyyteistä, jotka oli saatu yhdeltä eläimeltä kustakin ryhmistä 1, 2, 6 ja 7. Käytetyt vasta-aineet ovat vasta-aineita (Pharmingen), jotka on kohdistettu vastaavasti Gr-l:hteen (luuydinsolut), CD4:ään, CD8:aan 25 sekä B220:een (splenosyytit).

Autopsia eli ruumiinavaus: Kokeen lopussa toteutettiin autop-sia ja mitattiin pernan paino ja pääelimet tutkittiin visuaalisesti.

30

Ruumiinpainot: Kunkin ryhmän ruumiinpainojen muutokset esitetään kuviossa 1. Ryhmissä 1 ja 3 ruumiinpainot kasvoivat. Muiden ryhmien piirissä ei havaittu mitään eroa ruumiinpainojen muutoksissa.

Virtsan proteiini: Ryhmässä 1, 13 viikon iästä lähtien, eläimillä alkoi ilmetä virtsan proteiinin positiivisuutta (kuvio 35 17 2), neljä (kaksi 16 viikon ikäistä ja kaksi 17 viikon ikäistä) eläintä seitsemästä kuoli ruumiinavaukseen mennessä. Kuolemia ei kuitenkaan ilmennyt muissa ryhmissä. Myös ryhmässä 3 kahdella kuudesta eläimestä virtsan proteiini tuli positiiviseksi 5 kokeen lopussa, mutta tutkimusten perusteella positiivista virtsan proteiinin tulosta ei ollut yhdelläkään eläimellä muissa ryhmissä.

Hematologiset havainnot: Ryhmässä 1 havaittiin vähenemistä 10 hemoglobiinin määrässä (kuvio 3) ja RBC-lukumäärissä (kuvio 4) , ja aste tuli vakavammaksi iän myötä. Verihiutaleiden lukumäärä (kuvio 5) lisääntyi ohimenevästi, mutta laski nopeasti sen jälkeen. Ryhmässä 3 havaittiin samanlainen suuntaus, vaikka se viivästyi vähän ryhmään 1 verrattuna. Toisaal-15 ta hemoglobiinin taso eikä RBC vähentyneet, eivätkä verihiutaleet lisääntyneet eivätkä vähentyneet myöhemmin missään ryhmissä 2, 4 ja 5. Verinäytteiden mikroskooppisessa solujen erittelylaskennassa ilmeni, että ryhmässä 1 neutroliilit ja monosyytit lisääntyivät ja lyfosyyttijakeessa ilmeni merkityk-20 sellistä vähenemistä, mutta ryhmällä 2 on ilmennyt normaaliarvoja (taulukko 1). Myös ryhmien 6 ja 7 välillä ei ollut mitään merkittävää eroa.

CO (M

[" CD

4J ooorocoocMcoocD

3 OOinLOOHCMOCMCO

p ..........

5 oooooooooo Γ"

1 4J CO CM

0-H O O CM O OCX) in CM

MM -U OLD 0CX)0 dl O h σι O

6 £ co cd H ^ o h h1 m H o Q cq in oo roro I Ο ·ςμ >i cm h< ί>ι nro ο oo Η ο^μ ro cd co imu ro cd o cm o mo in h* h 0 0 -H - . ... .. ...

S £ -U CD H* CM CM O HH OOO

4-> CO

1 „ ( j ? I

0 i—1 oooo oooooro CQ-H OOOO OOOCMro rd -h .... .....

ffl IH OOOO OOOOO

0 -U f- H

p -h in ο -h I—I roro ro ro in oh cmo^h cq-h roin rooo oocd -m* cd in 0 -H .. ... .. ...

H MM HO (MHO CM O (MOO

I o in 4J 0 JJ Ο Ο =<d M -h rocD ro ι> o oo i> cm

CQ 4-0 i—I roi> COHO H co comH

Pi p -H . . ... .. ...

Scd-h Hro ro^o ^μ^μ ocmo

K ö MM Π H H H

ii co h1 P 0 -P t> 00 p Im-h oo rocMco o in cmoo^ SmP-uh oo roino ro ro co 0 :(ti P -H ... .. ... ^ P -H CD -H CM CM OOO OO OOO c

a ra ö MM

-----Φ

X

0 0 oo -¾

> > > > X

>m Sm -h Sm !m -H S

rtf* td * -P cd * (d -x 4-J y4

-HQ -H Q m -HQ -H Q CQ

X en m co a) x w m m φ P

01 CQ 4J CQ Λί 4M y . Φ φ I Φ Φ I 3

H a a U Ϊ4 X U X

0-----rtf

X U

M . cd W

P g H CM CO l> *H cl ·» g >, p a oi m

Eh II 11 -x 19

IgGl-pitoisuus veressä: On osoitettu, että ryhmässä 1 IgGl- pitoisuus lisääntyy huomattavasti, välittömästi kokeen alun jälkeen, ja se saavuttaa lopulta noin 100-kertaisesti pitoisuuden, joka on normaalilla hiirellä (kuvio 7). IgGl:n pitoi-5 suuden nousu huomattiin ryhmässä 3 vähän myöhemmin kuin ryhmässä 1. Ryhmissä 2, 4 ja 5 IgGl:n pitoisuus ei sitä vastoin noussut yhtään, ja se pysyi lähes samalla tasolla kokeen ajan. Toisaalta normaalissa hiiressä ei havaittu mitään muutosta, joka liittyi vasta-aineen antoon.

10

Veren hIL-6-pitoisuus: Veren hIL-6-pitoisuus vaihteli samalla tavalla kuin IgGl, siten että se osoitti lisääntyvän ryhmissä 1 ja 3, kun taas se pysyi lähes samana muissa ryhmissä kokeen ajan.

15

Anti-rotta-IgG-vasta-aineen tiitteri veressä: Vasta-aine rotan IgG:n vasta-ainetta vastaan havaittiin ryhmissä 1, 3 ja 6 (taulukko 2). Kaikilla eläimillä ryhmissä 1 ja 3 on osoitettu suuri tiitteri, kun taas ryhmässä 6 vain kahdella viidestä 20 eläimestä osoitettiin tiitterin suurentuneen. Toisaalta muissa ryhmissä ei havaittu mitään merkittävää lisäystä.

\

«3* Γ~- CO LO O

00 V O (N LO CM LO CN

H O Γ0

-O O'HOOCOO

S H O ^

CQ

cd

M

4J LO

-H LO V en CM

H ΗΟΓΟ-ΡΡ ΡΡ H O v ^

-H HO H S S S S

S

!(Ö

-P

in V O ^ >4 ^oloi>pppp -H HO......

to ho^SSSS

,¾ >.-------- v co o

mZ CNO-^CMPPPP

Π H O

^ HOCMSSiSS

*4

-H

-H

λ

H CO O

® o^mlopppq M J_j s s s , , , , H 0 0.0¾¾¾¾ <o <d

4J

DU en LO <T>

(d TOLO^LOPPQQ

> .......

H O O ¾ ¾ ¾ S

ö <D________ O)

.S 00 H

„j LOOfOLOppPQ

Cd 000¾¾¾¾

4J

CQ-------- ξ > M ^ β -H 4-1 o > LO CM ^ — ^Hojnpppp $ ·** =(ti -n o o 0' ¾ ¾ Jg ¾ ’[] λ; o .¾ u_i V ·ίυ rq ^ :fÖ o--------ε Λ! Ή M =(d w

P g HCNfO^LOLOO

H rt 3 & p «J Pi

Eh I I I I I I I II 1¾ 21

Veren kemiallisten parametrien määritys: TP lisääntyi ja Alb väheni ryhmissä 1 ja 3. TG ja ALP vähenivät ryhmissä 1 ja 3 ja vieläpä Glu väheni ryhmässä 1. Ryhmässä 2 ei havaittu mitään tällaisia muutoksia.

Ε-< Λ ΓΟ sf rO CM H CO

CMr1 r- vo Hoo vo oo tn o O ö - - - - - ~ ' - '-'VO H LO H VO H OI LOVO ro —. ro vo η ro LO en r-fro oo in cm ro vo cm enin oo E-* "ie· - - - - -- - - - - - O h rO in r- oo r- ui ro oo sf sf 0 — ro ro cm ro ro r~ en H t— cm sf ro oo vo voin roH vo cm oo vo

mvo sf sf (MH H vo H

J a cm in hio sf co (M m cm

(¾ — H H H

in in o oo cm ro sf oo cm Όνο ro vo in co oo en r- en oo nj'c- - - - - - - - - -

Ug ooocoocriooooooo

VO

„ CO CO CM 00 CM

i—I CO Γ" CO O sf CM OI ro-

Bo - - - - - - - -vo m ^ sf rooo sf vo vo r- vocm PQ g ro cm cm cm cm

H CM H C- r- CM LD

sf CM lii CM VO H CO CMC- CM

H - ' - ' ' - ' - ' - H Ό O oo oo oo oo o e*; ^ Π en υ ϋ ro m O ro ro en ro co Ό - - - - - 0^0 CO CM OH VO lii co sf o

Β g CM VO H sf HO CM OI CM

S H

ί-Η sf ΙΠ LO CM Oi LT} R Ό - - H^[> vf oi en ro o en ooo in 0g t> Hen cm lii vooo eno cm — H cm cm ro — H H en sf sf vo ro sf il h ^ roro cm cm voco sf vo ro H 5 - - - - - - - - - pii öi CM oro o cm oco o ro o ro oo in — rovo ro vo ooen invo ro fc h - - - - -o vooo in

Eh^h h in o cm cm - - - öi h in o in o I ill

i Vh O 1 Vi I in I M

m rorö ifli> enrö co rö ωπί Φ -H O R Φ-HVifl D-hOR <D -H O Q Φ-HOR « ,ν; > to w ιί to « .¾ > co « λ: > to m .¾ > to O______

M

,¾ 0 =g H S H CM ro VO t> s £ (O Pi

Eh II I

23 FACS-analyysi: Ryhmien 1, 2, 6 ja 7 luuydinsolujen (BM) ja splenosyyttien (sp) analyysi paljasti, että voimakas lisäys oli Gr-l:n sellaisten positiivisten solujen suhteessa, jotka olivat granulosyyttien esiastesoluja, ryhmän 1 BM-soluissa 5 (kuvio 9 ja kuvio 10) , mutta ryhmän 2 solujen arvot olivat samanlaiset kuin normaalien poikueiden jälkeläisillä. Ryhmien 6 ja 7 välillä ei ollut mitään olennaista eroa. Mitä tulee CD4-, CD8- ja B220-positiivisten solujen suhteeseen splenosyy-teissä, ei ollut mitään eroa ryhimen välillä, paitsi että 10 ryhmässä 1 CD8- ja B220-positiiviset solut vähenivät, mikä johtui plasmasolujen lisääntymisestä (taulukko 4).

Taulukko 4 15 Splenosyyttien pinta-antigeenien analyysi

Ryhmä CD4+ CD8+ B220+ % % % 1 13,2 5,4 23,1 2 18,5 14,3 50,0 3 19,9 15,0 53,1 4 13,9 10,6 57,3

Ruumiinavaushavainnot: Systeemisten lymfasolmukkeiden turpo- 20 aminen ja pernan suurentuminen olivat selviä ryhmissä 1 ja 3 (kuvio 11), ja samoin munuaisten värin poistuminen oli helposti havaittavissa. Havaittiin myös osittaisesti maksan laajentumista. Näitä muutoksia ei havaittu muissa ryhmissä, eikä ollut mitään huomattavia muutoksia paitsi, että havaittiin 25 vähäistä pernan laajentumista ryhmissä 2, 4 ja 5 normaaleihin poikueiden jälkeläisiin verrattuina.

Tämän kokeen tulokset selitetään nyt seuraavalla tavalla. IL-6 Tgm:ssä (ryhmä 1), jolle oli annettu kontrollivasta-ainetta, 24 havaittiin moninaisia oireita, kuten IgGl-plasmasoluverisyys eli plasmasytoosi, anemia, verihiutalerunsaus, verihiutale-niukkuus, munuaisvika, veren epänormaaleja kemiallisia parametreja, jne. . Tuli kuitenkin ilmeiseksi, että MR16-1 voi 5 tukahduttaa täydellisesti nämä oireet.

On tunnettua, että IL-6 aiheuttaa sen, että B-solut erilaistuvat lopuksi plasmasoluiksi [Muraguchi, A. et ai., J. Exp. Med. 167:332 - 344, 1988], ja IL-6 Tgm:n tapauksessa IL-6:n tuotto 10 aiheutti lisääntymisen veren IgGl-pitoisuudessa ja seerumin TP:n pitoisuus pieneni ja Alb:n pitoisuus väheni. Nämä seikat osoittavat, että IgGl-plasmaverisyys on puhjennut.

Tämän aiheuttama systeemisten lymfakudosten, kuten lymfasol-15 mukkeiden ja pernan, laajentuminen voisivat olla vastuussa siitä, että ruumiinpaino lisääntyy huolimatta yleisen tilan huononemisesta, jonka sairauden jatkuva paheneminen aiheuttaa ryhmissä 1 ja 3. MR16-1 ei vain tukahduttanut täydellisesti tällaisia tiloja, vaan se esti myös veren IL-6-pitoisuuden 20 lisääntymisen. Täten vamistuttiin siitä, että veren IL-6-pitoisuuden lisääntyminen iän mukana, kuten havaittiin IL-6 Tgm:n yhteydessä, liittyy suoraan plasmaoluverisyyden jatkuvaan pahenemiseen. Uskottiin sen tähden, että lisääntyneet plasmasolut tuottavat itse aktiivisesti IL-6:tta, joka lisää 25 edelleen plasmasolujen kasvua, josta seuraa, että IL-6:tta tuotetaan suuria määriä.

Kuten IL-6:n vaikutukset hemosyytteihin, lisääntyvien verihiutaleiden vaikutus [Ishibashi, T. et ai., Proc. Natl. Acad. 30 Sei. U.S.A. 86:5953 - 5957, 1989; Ishibashi, T. et ai., Blood 74:1241 - 1244, 1989] ja indusoituvan makrosytaarisen (iso- punasoluisen) anemian vaikutus [Hawley, R. G. et ai., J. Exp. Med. 176:1149 - 1163, 1992] ovat tunnettuja. Sen lisäksi, mitä edellä esitettiin IL-6 Tgm:stä, havaitaan verihiutaleniukkuut-35 ta, joka liittyy ikääntymiseen ja jonka uskotaan liittyvän autoimmuniteetin kautta polyklonaalisen B solun aktivoitumiseen [Miyai, Tatsuya et ai., samassa julkaisussa].

25 MR16-1 inhiboi täydellisesti IL-6:n suorat ja epäsuorat vaikutukset hemosyyttiin, mutta se si vaikuttanut normaalien poikueiden jälkeläisten verisolujen lukumäärään. Täten varmistut-5 tiin siitä, että IL-6-reseptorin vasta-aineen vasta-aine ei vaikuttanut ollenkaan hematosyytteihin. IL-6 Tgm:ssä havaittiin lisääntymistä Gr-l-positiivisten solujen suhteessa, joita soluja pidetään granulosyyttien prekursorisoluina, sekä perifeeristen neutrofiilien suhteessa. Vaikka tiedetään, että IL-6 10 lisää neutrofiilejä, sen yksityiskohtaista mekanismia ei vielä tunneta. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että tämä vaikutus on ilmiö, joka tapahtuu luuytimessä prekursorisolujen tasolla. Tässä tutkimuksessa havaittiin myös, että MR16-1 tukahdutti IL-6:n vaikutukset täydellisesti, mutta sillä ei ollut vaiku-15 tusta neutrofiilien tasoon luuytimessä eikä perifeerisessä veressä.

M16-1 tukahdutti myös nefriitin puhkeamisen, joka havaittiin IL-6 Tgm:ssä. On raportoitu, että IL-6-liittyy läheisesti 20 mesangiumsoluja tuottavaan nefriittiin mesangiumsolujen auto-kriinisenä kasvutekijänä. Vaikka nefriitti IL-6 Tgm:ssä on varmistettu myös mesngiumsoluja tuottavaksi nefriitiksi, ei voida kieltää, että immuunijärjestelmän voimistuminen IL-6:11a liittyy mainittuun nefriittiin [Katsume, Asao et ai., A pre-25 sentation at the 21st Meeting of Japan Immunology Society, "Characterization of SCID x (SCID x H-21d hIL-6 transgenic mice"), 1991]. Joka tapuksessa, koska virtsan proteiinin ilmestyminen ja kuolemat tukahtuivat, tehtiin selväksi, että anti-IL-6-reseptorivasta-aine on tehokas tukahdutettaessa 30 sellaisen nefriitin puhkeamista, jonka IL-6:n tuotaminen aiheuttaa.

IL-6 Tgm:ssä havaittiin merkittävä väheneminen seerumin Glu-ja Tg-pitoisuuksissa, jotka ovat kakeksian indikaattoreita. 35 Tässä kokeessa havaittiin, että MR16-l-vasta-aineen anto oli tehokasta kakeksian parantamiseksi, koska Glu- ja Tg-arvot 26 pienenivät ryhmässä 1, kun taas ryhmässä 2 nämä arvot pienenivät lähes normaalien arvojen tasolle.

Koska MR16-1 on rotan IgGl, joka on hiirelle heteroproteiini, 5 on helposti otaksuttavissa, että annettua vasta-ainetta vastaan voidaan tuottaa sellaisia vasta-aineita, jotka tekisivät annetut vasta-aineet tehottomiksi.

Kun yritettiin saada aikaan immunologinen sietokyky, siten 10 että kokeen ensimmäisessä herkistyksessä asetettiin alttiiksi suurelle antigeenimäärälle, muodostettiin ryhmiä, joille ensimmäisessä annossa annettiin laskimoon vasta-ainetta 2 mg hiirtä kohti. Sellaisten ryhmien joukossa, joille annettiin MR16-1:htä, tälle hoidolle alistetut ryhmät (ryhmä 1, 4 ja 5) 15 eivät tuottaneet yhtään havaittavaa rotan anti-IgG:n vasta-ainetta antovälistä ja käytetystä annoksesta huolimatta. Mutta ryhmällä 3 on lopulta esiintynyt samoja oireita kuin ryhmällä 1, joka on ryhmä, jolle annetaan kontrollivasta-ainetta, vaikka rotan IgG-vasta-aineen vasta-aineen on tässä ryhmässä 20 havaittu lisääntyvän ja sairauden puhkeamisen on havaittu vähän viivästyvän ryhmään 1 verrattuna.

Uskotaan sen tähden, että hoito oli tehokasta immunologisen sietokyvyn aikaansaamiseksi, mutta rotan anti-IgG:n vasta-25 ainetta havaittiin myös kaikissa ryhmän 1 eläimissä ja kahdella viidestä ryhmän 5 eläimistä, joille annettiin kontrollivasta-ainetta saman ohjelman mukaan. Koska plasmasoluverisyyden jatkuva paheneminen saa aikaan polyklonaalisen B-solun aktivoitumisen IL-6 Tgmrssä, ei voida päätellä, että ryhmissä 1 ja 30 3 havaittu rotan anti-IgG:n vasta-aine on annetulle vasta- aineelle spesifinen vasta-aine. Tehtiin kuitenkin johtopäätös, että immunologisen vastustuskyvyn aikaansaava vaikutus, kun on altistettu suurelle määrälle antigeeniä ryhmien 2, 4 ja 5 ensimmäisessä herkistyksessä yhdistettynä spesifisten vasta-35 aineiden tuoton inhiboivaan vaikutukseen, johtuu suuren määrän annosta MR16-l:htä, joka oli käytössä täydellisen vastustuskyvyn aikaansaamiseksi.

27 Tässä kokeessa selvitettiin, että Il-6-reseptorin vasta-aineen vasta-aine on erittäin tehokas erilaisia, sellaisia sairauksia vastaan, joita IL-6:n tuotto aiheuttaa, vaikuttamatta noormaa-5 liin tasoon.

Esimerkki 2

Tutkittiin hiiren IL-6-reseptorivasta-aineen vaikutusta koolo-.10 ni 26:n indusoimaan kakeksiamalliin. Kokeeseen käytetyt hiiret olivat kuuden viikon ikäisiä, koiraspuolisia BALB/c-hiiriä, joihin implantoitiin kylkeen ihon alle kooloni 26:n muodostama kahden millimetrin este kokeen ensimmäisenä päivänä. Hiiren IL-6:n reseptorin vasta-ainetta MR16-l:htä (katso viite-esi-15 merkki 2) annettiin laskimoon annoksena, joka oli 2 mg hiirtä kohti, ensimmäisenä koepäivänä, välittömästi ennen kooloni 26 :n implantaatiota ja sitten ihon alle annoksena, joka oli 0,5 mg hiirtä kohti seitsemäntenä, 11., 14. ja 18. päivänä (n=7). Aiemmassa kokeessa on jo varmistettu, että neutraloivat 20 heteroproteiinin vasta-aineet eivät tule esiin tällä meneetel-mällä. Rotan IgGl-kontrollivasta-ainetta (KH5) annettiin kasvainta kantavalle kontrolliryhmälle saman ohjelman mukaan (n=7). Muodostettiin ryhmä, jolle annettiin PBS:ää, sellaisena kontrolliryhmänä (n=7), jolla oli kasvain. Kokeen alun jälkeen 25 ruumiinpaino mitattiin joka päivä ja kokeen alusta 11. ja 15. päivänä mitattiin veren kemialliset parametrit ja ionisoidun kalsiumin määrä.

Sellaisessa ryhmässä, jolla oli kasvain, ruumiin paino laski 30 huomattavasti kymmenentenä päivänä ja sen jälkeen, kun verrattiin ryhmään, jossa ei ollut kasvainta, kun taas ruumiin painon vähenemistä tukahduttava vaikutus ilmaistiin ryhmässä, jolle annettiin MR16-l:htä. Veren triglyseridipitoisuus 11. päivänä ja veren glukoosipitoisuus 15. päivänä esitetään 35 vastaavasti kuvioissa 13 ja 14. Nämä arvot vähenivät huomattavasti kontrolliryhmässä, jossa oli kasvain verrattuna sellaiseen kontrolliryhmään, jolla ei ollut kasvainta, kun taas 28 ryhmässä, jolle annettiin MR16-1:htä, havaittiin glukoosia tukahduttava taipumus ja triglyseridejä merkittävästi tukahduttava taipumus.

Ionisoituneen kalsiumin pitoisuus nousi huomattavasti 11.

5 päivänä kontrolliryhmässä, jossa oli kasvain, verrattuna sellaiseen kontrolliryhmään, jossa ei ollut kasvainta, kun taas ryhmässä, jolle annettiin MR16-l:htä, havaittiin merkittävä tukahduttava vaikutus (kuvio 15).

10 Toteutettiin koe eloonjäämisaikaan kohdistuvan vaikutuksen varmistamiseksi ja käytettiin samaa ohjelmaa kuin edellä on esitetty (n=10). Tulos oli, että havaittiin eloonjäämisaikaan kohdistuva vaikutus ryhmässä, jolle annettiin MR16-1:htä.

15 Esimerkki 3

Tutkittiin IL-6-reseptorivasta-aineen vaikutus occ-l:llä indusoituun kakeksiamalliin, johon liittyi hyperkalsemia eli veren liiallinen kalsiumpitoisuus. Kokeeseen käytetyt hiiret 20 olivat kuuden viikon ikäisiä, koiraspuolisia, karvattomia hiiriä. Ensimmäisenä koepäivänä implantoitiin suomuista kar-sinoomasolulinjaa occ-1 hiiren kylkeen ihon alle. Ensimmäisenä koepäivänä, välittömästi ennen occ-1:n implantaatiota annettiin kullekin hiirelle laskimoon 2 mg:n annos hiiren IL-6-25 reseptorin vasta-ainetta MR16-1 ja sitten sitä annettiin 100 pg:aa hiirtä kohti ihon alle seitsemäntenä ja kymmenentenä päivänä (n=6). Aiemmassa kokeessa on jo varmistettu, että heteroproteiinin, rotan vasta-aineen vastaiset, neutraloivat vasta-aineet eivät tule helposti esiin tässä menetelmässä. 30 Kontrolliryhmälle, jonka koe-eläimillä oli kasvain, annettiin rotan IgGl:n kontrollivasta-ainetta (KH5) saman ohjelman mukaan (n=6). Tämän lisäksi annettiin PBS:ää sellaiselle muodostetulle kontrolliryhmälle, jonka koe-eläimillä ei ollut kasvainta (n=7). Kokeen alun jälkeen mitattiin ruumiin paino 35 ja ionisoituneen kalsiumin pitoisuus veressä 10. ja 12. päivänä kokeen aloittamisesta.

29

Ruumiin paino laski ryhmässä, jonka jäsenillä oli kasvain, mutta MR16-l:htä saaneessa ryhmässä ei ilmennyt ruumiin painon muutosta kuin kontrolliryhmässä, jonka jäsenillä oli kasvain, mikä ilmaisee, että ruumiin painon väheneminen tukahtui (kuvio 5 17) .

Veren ionisoidun kalsiumin pitoisuus lisääntyi huomattavasti kontrolliryhmällä, jolla oli kasvain, verrattuna sellaiseen kontrolliryhmään, jonka jäsenillä ei ollut kasvainta, kun taas 10 MR16-l:htä saaneessa ryhmässä ruumiin painon lisääntyminen tukahtui voimakkaasti (kuvio 18).

Claims (3)

1. Användning av en antikropp av interleukin-6-reseptor för framställning av en farmaceutisk komposition för att förhindra och värda sädana sjukdomar som produktion av interleukin-6 förorsakar, varvid sjukdomen är kakexi. 25

1. Interleukiini-6-reseptorin vasta-aineen käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistukseen sellaisten sairauksien estämi- 5 seksi ja hoitamiseksi, joita interleukiini-6:n tuotto aiheuttaa, jolloin sairaus on kakeksia.

2. Användning enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den nämnda antikroppen är en monoklonal antikropp.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine. 10

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on PM-1-vasta-aine, kimeerinen vasta-aine tai uudelleen muodostettu humaani vasta-aine.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on uudelleen muodostettu humaani PM-1-vasta-aine. 20

3. Användning enligt patentkrav 2, kännetecknad av att den 30 nämnda antikroppen är en PM-1-antikropp, en kimerisk antikropp eller en omarbetad human antikropp. 1 Användning enligt patentkrav 3, kännetecknad av att den nämnda antikroppen är en omarbetad human PM-1-antikropp.