NO330582B1 - Anvendelse av et antistoff mot interleukin-6-reseptor som blokkerer signal-transduksjonen til IL-6 for fremstilling av et farmasoytisk preparat for behandling av nefritt. - Google Patents

Abstract

SAMMENDRAG Det beskrives anvendelse av et antistoff mot interleukin-6-reseptor, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring eller behandling av nefritt. ?? ?? ?? ?? 1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et antistoff mot interleukin-6-reseptor som blokkerer signal-transduksjonen til IL-6 og inhibere den biologiske aktiviteten til IL-6 ved inhibering av bindingen av IL-6 til IL-6 reseptoren, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring eller behandling av nefritt. IL-6 er et multi-funksjonelt cytokin som menes å virke ved forskjellige stadier i immunologiske, hematologiske og akutt-fase-reaksjoner [Taga, T. et al., Critical Reviews in Immunol. 11:265-280, 1992], og å spille betydelige roller i multiple myeloma som vekstfaktor såvel som i sykdommer som ledsages av plasmacytose, f.eks. reumatisme [Hirano, T. et al., Eur. J. Immunol. 18:1797-1801, 1988; Houssiau, F.A. et al., Arth. Rheum. 31:784-788, 1988], i Castleman's sykdom [Yoshizaki, K. et al., Blood 74:1360-1367, 1989; Brant, S.J. et al., J. Clin. Invest. 86:592-599, 1990], mesangiumcelle-proliferativ nefritt [Ohta, K. et al., Clin. Nephrol. (Tyskland) 38:185-189, 1992; Fukatsu, A. et al., Lab. Invest. 65:61-66, 1991; Horii, Y. et al., J. Immunol. 143: 3949-3955, 1989], cachexi ledsaget av tumorvekst [Strassmann, G. et al., J. Clin. Invest. 89:1681-1684, 1992] etc.

Hos H-2 L hIL-6-transgen mus (IL-6 Tgm) som har uttrykt human-IL-6 (hIL-6) i overdrevne mengder ved genspleising, IgGl-plasmacytose, mesangiumcelle-proliferativ nefritt, anami, trombocytopeni, fremkomst av auto-antistoffer o.s.v. er blitt observert [Miyai, T. et al., en presentasjon på det 21. møte i Japan Immunology Society "Hematological change in H-2 L hIL-6 transgenic mice with age", 1991], som foreslår å involvere IL-6 i en rekke sykdommer. Imidlertid er det ikke kjent at antistoff mot interleukin-6-reseptor er effektiv for sykdommer forårsaket av interleukinproduksjon.

EP 0409607 beskriver antistoffer mot human IL-6-R, deriblant PM-1.

EP 0628639 beskriver rekonstrukjon av anti-IL-6-R antistoffer, deriblant PM-1.

EP 0413908 beskriver isolering av naturlig human Interferon-(32 (IFN-(32)/IL-6-R og farmasøytiske sammensetninger.

FR 2694767 beskriver monoklonale og kimære anti-IL-6-R antistoffer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig anvendelse av et antistoff mot interleukin-6-reseptor som blokkerer signal-transduksjonen til IL-6 og inhibere den biologiske aktiviteten til IL-6 ved inhibering av bindingen av IL-6 til IL-6 reseptoren, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring eller behandling av nefritt. Idet nevnte nefritt er mesangium proliferativ nefritt. Fig. 1 viser kurver som viser endring i økninger i kroppsvekten til dyr i hver gruppe. Fig. 2 bringer en kurve som viser endring i positivt forhold for urinprotein i hver gruppe. Det positive forhold i urinprotein var null i de andre grupper enn gruppe 1 og 3. Fig. 3 bringer kurver som viser endring i hemoglobin-nivå i hver gruppe. Fig. 4 bringer kurver som viser endring i rød blodcelle-telling i hver gruppe. Fig. 5 bringer kurver som viser endring i blodplate-telling i hver gruppe. Fig. 6 bringer kurver som viser endring i hvit blodcelle-telling i hver gruppe. Fig. 7 bringer kurver som viser endring i IgGl-konsentrasjon i serum i hver gruppe. Fig. 8 bringer kurver som viser endring i human-IL-6-konsentrasjon i gruppe 1 til gruppe 5. Fig. 9 representerer et resultat av cellesortering ved en teknikk med fluorescerende antistoff hvor det anvendes kontroll-antistoff IgG og Gr-l-antistoff i gruppe 1 og 2. Fig. 10 representerer et resultat av cellesortering ved en teknikk med fluorescerende antistoff hvor det anvendes kontroll-antistof f IgG og Gr-l-antistoff i gruppe 6 og 7. Fig. 11 er et diagram som viser vekten av milten hos dyrene i hver gruppe ved slutten av forsøket. Fig. 12 bringer kurver som viser endring i kroppsvekten hos dyrene i hver gruppe. Fig. 13 er et diagram som viser konsentrasjonen av triglycerid i blodet til musene på dag 11 av forsøket. Fig. 14 er et diagram som viser konsentrasjonen av glukose i blodet hos musene på dag 15 av forsøket. Fig. 15 er et diagram som viser konsentrasjonen av ionisert kalsium i blodet hos musene på dag 11 av forsøket. Fig. 16 er et diagram som viser overlevelsesraten hos de tumorbærende kontrollmus. Fig. 17 er et diagram som viser kroppsvekten til musene på dag 10 og 12 etter forsøkets start. Fig. 18 er et diagram som viser konsentrasjonen av ionisert kalsium i blodet hos musene på dag 10 og 12 etter forsøkets start.

Spesifikk forklaring

Antistoffet mot interleukin-6-reseptor som skal anvendes i foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff som stammer fra et pattedyr. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff. Antistoffet som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være et PM-l-antistoff, et kimært antistoff eller et omformet human-antistoff. Idet det omformede humane antistoffet er et omformet human-PM-l-antistoff.

Antistoffet blokkerer signal-transduksjon ved IL-6 og inhiberer den biologiske aktivitet hos IL-6 ved å inhibere bindingen av IL-6 til IL-6R.

Dyreartene av cellen for produksjon av det monoklonale antistoff kan være hvilken som helst dyreart som tilhører pattedyrene og kan være human-antistoff eller antistoff som stammer fra et annet dyr enn mennesket. De monoklonale antistoffer som stammer fra et annet dyr enn mennesket, er fortrinnsvis monoklonale antistoffer som stammer fra en kanin eller en gnager på grunn av at de er lette å produsere. Fortrinnsvis inkluderer gnageren mus, rotter, hamstere o.s.v.

Et slikt antistoff for interleukin-6-reseptor inkluderer f.eks. MR16-l-antistoff (Tamura, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 90:11924-11928, 1993), PM-l-antistoff (Hirata, Y. et al., J. Immunol. 143:2900-2906, 1989) etc.

De monoklonale antistoffer kan produseres i alt vesentlig ved den fremgangsmåte som er kjent på fagområdet som følger. Således kan de bli fremstilt ved anvendelse av IL-6R som det immuniserende antigen som anvendes for immunisering ved den konvensjonelle metode, og deretter underkastes de oppnådde immunocytter for cellefusjon med en kjent opphavscelle ved den konvensjonelle cellefusjonsmetode for å klassifisere de antistoff-produserende celler ved den konvensjonelle screening-metode.

Mer spesifikt blir de monoklonale antistoffer produsert ved den følgende metode. For eksempel kan det nevnte immuniserende antigen bli oppnådd ved anvendelse av gensubstansen fra human IL-6R som angitt i EP-patentsøknad EP 325474. Etter at gensekvensen til human-IL-6R blir innfelt i et kjent ekspresjons-vektorsystem for å transformere en passende vertscelle blir det ønskede IL-6R-protein renset for vertscellene eller

kultursupernatanten derav for anvendelse av det nevnte rensede IL-6R-protein som det immuniserende antigen.

Videre kan det nevnte immuniserende antigen som stammer fra musen bli oppnådd ved anvendelse av gensekvensen til musens IL-6R som ble beskrevet i japansk ikke-gransket patentpublikasjon 3(1991)-155795 ved den samme metode som ble anvendt for den ovennevnte gensekvens av human-IL-6R.

Som IL-6R, i tillegg til dem som er uttrykt på cellmembranen, kan de (SIL-6R) som eventuelt er løsnet fra cellemembranen bli anvendt som antigen. SIL-6R er hovedsakelig sammensatt av den ekstracellulære domene av IL-6R bundet til cellemembranen, som er forskjellig fra det membran-bundne IL-6R ved det at førstnevnte mangler transmembrandomenen eller både transmembrandomenen og den intracellulære domene.

Blant pattedyrene som er immunisert med det immuniserende antigen er det å foretrekke å ta med i betraktningen dets forlikelighet med den opphavscelle som anvendes for cellefusjon, og vanligvis anvendes mus, rotter, hamstere, kaniner o.s.v.

Immunisering av dyret med det immuniserende antigen kan utføres i overensstemmelse med en metode som er kjent for fagmannen på området. En generell metode omfatter f.eks. å administrere intraperitonealt eller subkutant nevnte immuniserende antigen til pattedyret. Spesifikt blandes et immuniserende antigen som er fortynnet eller oppsluttet i PBS (fosfatbufret saltvann), fysiologisk saltvann o.s.v., til et egnet volum, etter ønske, med en passende mengde av en adjuvant, f.eks. komplett Freund's adjuvant, og blir emulgert, og deretter administreres fortrinnsvis den nevnte emulsjon til et pattedyr flere ganger hver 4. til 21. dager. Videre kan en passende bærer anvendes på tidspunktet for immunisering med det immuniserende antigen.

Etter at dyret ble immunisert som ovenfor og antistoff-nivået i serum var bekreftet å ha steget til det ønskede nivå, blir immunocytter fjernet fra pattedyret og underkastet celle-fusjon. Som foretrukken immunocytt nevnes miltcellen spesielt.

Den foretrukne myelomacelle som anvendes i foreliggende oppfinnelse som partner-opphavsceller som smelter sammen med nevnte immunocytt, inkluderer diverse kjente cellelinjer, f.eks. P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. 123:1548, 1978), p3-Ul (Current Topics i Micro-biology and Immunology 81:1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976), MPC-11 (Cell 8:405-415, 1976), SP2/0 (Nature 276:269-270, 1978), FO (J. Immunol. Meth. 35:1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med. 148:313-323, 1978), R210 (Nature 277:131-133, 1979) etc.

Cellefusjon av nevnte immunocytt med myelomacellen kan utføres i alt vesentlig i overensstemmelse med en kjent metode som f.eks. er beskrevet av Milstein et al., (Milstein et al., Methods Enzymol. 73:3-46, 1981) etc.

Mer spesifikt kan nevnte cellefusjon bli utført i nærævr av f.eks. et cellefusjons-akselererende middel i et ordinært nærings-medium. Som cellefusjons-akselererende middel kan polyetylen-glykol (PEG), Sendai virus (HVJ) etc. anvendes, og en adjuvant, f.eks. dimetylsulfoksyd etc. kan tilsettes direkte etter ønske for å forsterke effektiviteten av cellefusjon.

Forholdet mellom immunocyttene og myelomacellene som anvendes er fortrinnsvis 1-10 ganger mer immunocytt enn myelomacellene.

Som det flytende dyrkningsmedium som anvendes for ovennevnte cellefusjon nevnes f.eks. RPMI 1640 flytende medium og MEM flytende medium som er mest egnet for vekst av myelomacellelinjen, og de vanlige dyrkningsvæsker som anvendes for cellekultur, og videre et serumsupplement, f.eks. føtalt kalveserum (FCS) etc. kan anvendes.

De ønskede sammensmeltede celler (hybridomer) kan dannes ved å blande godt en gitt mengde av de ovennevnte immunocytter med myelomacellene i den ovennevnte næringsvæske, og ved å tilsette en PEG-løsning som på forhånd er oppvarmet til 37°C, f.eks. en løsning av PEG som har en gjennomsnittlig molekylvekt i området 1.000-6.000, ved en konsentrasjon på 30-60 vekt/vol%. Så, etter sekvensiell tilsetning av passende dyrkningsmedier fulgt av sentrifugering derav for å fjerne supernatanten, kan celle-fusjonsmidler etc. som er uønsket for vekst av hybridomer, bli fjernet.

De nevnte hybridomer kan utvelges ved dyrkning i et konvensjonelt utvelgelsesmedium, f.eks. HAT flytende dyrkningsmedium (et flytende dyrkningsmedium som inneholder hypoxantin, aminopterin og tymidin). Dyrkning i nevnte HAT-medium fortsettes i et tidsrom som er tilstrekkelig til at andre celler (ikke-sammensmeltede celler) enn de ønskede hybridomer vil dø, vanligvis i noen dager og opp til noen uker. Etterpå blir en konvensjonell begrensende fortynningsmetode utført for å klassifisere og monoklone hybridomene som produserer det ønskede antistoff.

Hybridomene som produserer monoklonale antistoffer som således er fremstilt, kan bli subdyrket i et konvensjonelt flytende medium og lagres i flytende nitrogen i et forlenget tidsrom.

For å oppnå et monoklonalt antistoff fra nevnte hybridomer anvendes metoder som f.eks. den hvor de nevnte hybridomer blir dyrket i overensstemmelse med den konvensjonelle metode for oppnåelse av en dyrkningssupernatant, eller den hvor hybridomene blir implantert til og dyrket i et pattedyr som er forlikelig dermed, fulgt av oppnåelse av antistoffet som ascites fluid, og lignende. Den førstnevnte metode er egnet for oppnåelse av et høy-rent antistoff, mens sistnevnte metode er egnet for produksjon av antistoff i stor mengde.

Videre kan de monoklonale antistoffer som oppnås ved de ovennevnte metoder bli renset ved de konvensjonelle prosesser for rensning som f.eks. utsalting, gelfiltrering, affinitets-kromatografi etc.

Evnen hos de således fremstilte monoklonale antistoffer til å gjenkjenne antigenet med høy affinitet og høy presisjon kan bekreftes ved de konvensjonelle immunologiske metoder, f.eks. radioimmunoassay, enzymimmunoassay (EIA, ELISA), den fluorescerende antistoffmetode (immunofluorescensanalyse) etc. Det monoklonale antistoff som anvendes i foreliggende oppfinnelse kan også være det monoklonale antistoff som produseres av et hybridom, og kan være ett som er kunstig endret for formålet med å redusere heteroantigenisitet hos mennesket. F.eks. kan det anvendes et chimera-antistoff som omfatter varierende regioner av et monoklonalt muse-antistoff og konstante regioner av et human-antistoff. Et slikt chimera-antistoff kan bli produsert ved anvendelse av en kjent metode for produksjon av chimera-antistof f er, spesielt en gensløydmetode.

Videre kan et omformet human-antistoff anvendes i foreliggende oppfinnelse. Dette er et antistoff i hvilket de komplementaritets-bestemmende regioner i et human-antistoff er blitt erstattet av de komplementaritets-bestemmende regioner fra et annet pattdyr-antistoff enn human-antistoff, f.eks. et muse-antistoff, og den generelle metode for gensløyd er derfor kjent på fagområdet. Anvendelse av en slik kjent metode gjør at et omformet human-antistoff kan oppnås som er nyttig for foreliggende oppfinnelse.

Etter behov kan aminosyrer i rammeverkregionene (FR) i den varierende region i et antistoff bli utbyttet slik at den komplementaritets-bestemmende region i et rekonstituert human-antistof f kan danne et passende antigenbindingspunkt (Sato et al., Cancer Res. 53:1-6, 1993). Som et slikt omformet human-antistoff kan et humanisert PM-1 (hPM-1) antistoff fortrinnsvis bli eksemplifisert (se International Patent Application WO 9219759).

Gener som koder fragmentene av et antistoff, f.eks. Fab eller Fv, en enkelt kjede Fv (scFv) hvor Fv'ene i en H-kjede og en L-kjede er blitt forenet ved hjelp av en passende linker, kan konstrueres og uttrykkes i passende vertsceller, slik at fragmentene binder seg til antigenet og inhiberer aktiviteten av IL-6 (se f.eks. Bird et al., TIBTECH 9:132-137, 1991; Huston et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-5883, 1988). Videre kan den ovennevnte omformede V-region av antistoffet anvendes for Fv av H-kjeden og L-kjeden for å lage en scFv.

De farmasøytiske preparater for forhindring eller behandling av nefritt kan fortrinnsvis bli administrert parenteralt, f.eks. via intravenøs, intramuskulær, intraperitoneal eller subkutan injeksjon etc., både systemisk og lokalt. Videre kan de ta en form av et farmasøytisk preparat eller et sett i kombinasjon med

minst én farmasøytisk bærer eller et fortynningsmiddel.

Selv om dosering av de farmasøytiske preparater kan variere i avhengighet av pasientens sykdomstilstand, alder eller metoden for administrering, er det nødvendig å utvelge en passende mengde som egnet. F.eks. kan en mengde i området 1-1.000 mg pr. pasient gis i opp til fire oppdelte doser. Alternativt kan de administreres i en mengde av 1-10 mg/kg/uke.

Farmasøytiske preparater slik som parenterale preparater kan bli fremstilt ved å oppløse et renset IL-6-antistoff i et løsningsmiddel, f.eks. fysiologisk saltvann, bufferløsning etc, som er tilsatt anti-adsorpsjonsmiddel, f.eks. Tween 80, gelatin, human-serum-albimin (HSA) etc. eller de kan være i en lyofilisert form som kan bli rekonstituert ved oppløsning før bruk. Eksipienter for lyofilisering inkluderer f.eks. en sukkeralkohol, f.eks. mannitol, glukose etc, eller sakkarider.

Eksempler

Oppfinnelsen vil nå bli forklart mer i detalj med henvisning til de følgende eksempler.

Eksempel 1. Konstruksjon av den B6L -IL-6-transgene

mus

Et 3,3 kbp av Sphl-XhoI-fragment (L -IL-6) med human-IL-6-cDNA forbundet med H-2L -promoteren (Suematsu et al., Proe Nati. Acad. Sei. U.S.A. 86:7547, 1989) ble injisert inn i pronukleus til et fertilisert egg av en C57BL/6J (B6) mus (Nihon Clea) ved mikroinjeksjon i henhold til den metode som er beskrevet av Yamamura et al., i J. Biochem. 96:357, 1984.

Det befruktede egg ble transplantert til egglederen i en hunn-ICR-mus som var blitt utsatt for pseudogestasjonsbehandling.

Deretter ble, for den nyfødte mus, integreringen av hIL-6-cDNA klassifisert ved Southern blot-analyse av den EcoRI-fordøyde hale-DNA ved anvendelse av<32>P-merket TaqI-BanII-fragment av human-IL-6-cDNA som probe. Dyrene som testet positivt for integreringen ble avlet med en B6-mus for å etablere en linje av musen som hadde

den samme genotype.

Eksempel 2. Fremstilling av rotte-anti-IL-6R-

antistoff

CHO-celler som produserer muse-løselig IL-6R ble fremstilt som angitt av Saito et al., i J. Immunol. 147:168-173, 1991. Cellene ble inkubert i aMEM som inneholdt 5% føtalt bovinserum (FBS) ved 37°C i fuktet luft som inneholdt 5% C02. Det kondisjonerte medium ble gjenvunnet og ble anvendt som et preparat av muse-sIL-6R. Konsentrasjonen av muse-sIL-6R i mediet ble bestemt ved en sandwich-ELISA ved anvendelse av monoklonalt antimuse-IL-6R-antistoff-RS15 (Saito et al., J. Immunol. 147:168-173, 1991) og kanin-polyklonal-antimus-IL-6R-antistoff.

Muse-sIL-6R ble renset for muse-sIL-6R-preparatet ved anvendelse av en affinitetskolonne som var blitt adsorbert med monoklonalt anti-muse-IL-6R-antistoff (RS12). 50 ug renset muse-SIL-6R i komplett Freund's adjuvant ble injisert subkutant til en Wistar-rotte, og deretter ble dyret forsterket fire ganger med subkutan injeksjon av 50 ug av muse-sIL-6R i komplett Freund's adjuvant én gang pr. uke fra etter 2 uker. 1 uke etter den første forsterkede injeksjon ble rottene administrert intravenøst med 50 ug muse-sIL-6R i 100 ul av fosfatbufret saltvann (PBS). 3 dager senere ble milten fjernet fra rottene, og rottenes splenocytter ble underkastet fusjonsbehandling med muse-p3Ul-myelomaceller ved et forhold på 10:1. Cellene ble inkubert ved 37°C natten over i 100 ul av RPMI 1640-medium som inneholdt 10% FBS i brønner av 96-brønnplater (Falcon 3075), og deretter ble 100 ul av et medium som inneholdt hypoxantin/-aminopterin/tymidin (HAT) tilsatt. Halvparten av mediet ble daglig erstattet med HAT-mediet i 4 dager. 7 dager senere ble et hybridom som produserer anti-muse-sIL-6R utvalgt ved en muse-sIL-6R-bindingsassay (ELISA). Kort sagt ble 100 ul av kultursupernatanten av hybridomet inkubert i en plate som på forhånd var belagt med 1 ug/ml av kanin-polyklonal-antirotte-IgG-antistoff. Platen ble vasket og deretter inkubert med 100 ug/ml av muse-sIL-6R. Etter vasking ble kanin-polyklonal-antimuse-IL-6R-antistoff tilsatt til 2 ug/ml, platen ble vasket og ble deretter inkubert med alkalisk fosfatase-konjugert geite-polyklonal-antikanin-IgG-antistoff (Tago) i 60 minutter.

Til slutt, etter vasking, ble platen inkubert med et substrat av alkalisk fosfatase (Sigma 104; p-nitrofenylfosfat) og avlest ved 405 nm ved anvendelse av en plateleser (Toso). Hybridomet som gjenkjenner muse-sIL-6R ble klonet to ganger ved den begrensende fortynningsmetode. For fremstilling av ascites ble en BALB/c nu/nu-mus injisert to ganger med 0,5 ml pristan, og 3 dager senere ble 3 x 10 celler av de etablerte hybridomceller injisert intraperitonealt. 10-20 dager senere ble ascites oppsamlet, og et monoklonalt antistoff MR16-1 ble renset for dette ved anvendelse av en protein G-kolonne (Oncogene Science).

Den nøytraliserende effekt på IL-6 av antistoffet produsert ved MR16-1 ble testet ved inkorporering av •aH-tymidin ved MH60.BSF2-celler (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988). MH60.BSF2-celler ble alikvotert i en mengde av 1 x IO<4>celler/200 ul/brønn inn i 96-brønnplaten, og deretter ble muse-IL-6 (10 pg/ml) og MR16-1 eller RS12-antistoff tilsatt i brønnene fulgt av inkubering av cellene ved 37°C i 5% CC>2 i 44 timer.

Etterpå ble H-tymidin (1 mCi/brønn) tilsatt i hver brønn, og 4 timer senere testet for inkorporering av H-tymidin.

Eksempel 3

31 transgene mus som hadde human-IL-6-cDNA som var repro-dusert fra den B6 IL-6-transgene mus (B6 IL-6 Tgm) som ble fremstilt i Eksempel 1, og 11 normale "littermates" som ikke hadde noe human-IL-6-cDNA ble anvendt (begge er 4 uker gamle; hanner). B6 IL-6 Tgm ble inndelt i 5 grupper (gruppe 1 til gruppe 5) med 6 dyr i hver gruppe, og bare gruppe 1 besto av 7 dyr. De normale "littermates" ble inndelt i gruppe 6 med fem mus og gruppe 7 med seks mus.

Administreringsplanen var som følger:

Gruppe 1 (B6 IL-6 Tgm): Ved 4 ukers alder (den første dag av eksperimentet) ble rotte-IgGl-antistoff (KH5) (kontroll-antistoff) injisert intravenøst ved en dose på 2 mg/0,2 ml, og ved 5 ukers alder (dag 8 av eksperimentet) og senere ble 100 ug av KH5-antistoff injisert subkutant 2 ganger hver uke (hver tredje til fjerde dag).

Gruppe 2 (B6 IL-6 Tgm): Ved 4 ukers alder ble MR16-l-antistoff injisert ved en dose på 2 mg/0,2 ml, og ved 5 ukers alder og senere ble 100 ug av MR16-1 injisert subkutant to ganger hver uke.

Gruppe 3 (B6 IL-6 Tgm): Ved 4 ukers alder ble 0,2 ml av fosfatbufret saltvann injisert intravenøst, og ved 5 ukers alder og senere ble 100 ug av MR16-1 injisert subkutant to ganger hver uke.

Gruppe 4 (B6 IL-6 Tgm): Ved 4 ukers alder ble 2 mg/0,2 ml av MR16-1 injisert intravenøst, og ved 5 ukers alder og senere ble 4 00 ug av MR16-1 injisert subkutant én gang hver annen uke.

Gruppe 5 (B6 IL-6 Tgm): Ved 4 ukers alder ble 2 mg/0,2 ml av MR16-1 injisert intravenøst, og ved 5 ukers alder og senere ble 1 mg av MR16-1 injisert subkutant annen hver uke.

Gruppe 6 (B6 normale littermates): Ved 4 ukers alder ble 2 mg/0,2 ml av kontroll-antistoffet KH5 injisert intravenøst, og ved 5 ukers alder og senere ble 100 ug av KH5 injisert subkutant to ganger hver uke.

Gruppe 7 (B6 normale littermates): Ved 4 ukers alder ble 2 mg/0,2 ml av MR16-1 injisert intravenøst, og ved 5 ukers alder og senere ble 100 ug av MR16-1 injisert subkutant to ganger hver uke. De testmetoder som ble anvendt her er som følger: Bestemmelse av kroppsvekt og av urinprotein: Bestemmelse av kroppsvekt og av urinprotein ved urinprotein-testpapir (Combistics Sankyo) ble utført hver uke. Avlesningene av urinprotein av 3 pluss (100-300 mg/dl) eller høyere ble tatt som positivt.

Oppsamling av blod: Blod ble oppsamlet fra den retro-orbitale sinus annen hver uke fra starten av eksperimentet (4-uker gammel), og det totale blod ble oppsamlet fra vena cava inferior ved slutten av eksperimentet (18 uker gammel).

Blodcelletellinger: Ved anvendelse av mikrocelle-telleren (Sysmex F-800) ble tellinger av hvite blodceller (WBC), røde blodceller (RBC), og blodplater (PLT) såvel som mengden av hemoglobin (HGB) bestemt. Ved slutten av eksperimentet ble det laget blod- utsmøringer for visse grupper (gruppene 1, 2, 6 og 7), og differensielle tellinger av hvite blodceller ble beregnet som prosent.

Bestemmelse av IgGl-konsentrasjon i blodet: Den ble målt ved en muse-IgGl-spesifikk ELISA under anvendelse av et myelomaprotein som standard.

Bestemmelse av IL-6-konsentrasjon i blodet: Den ble målt ved en hIL-6-spesifikk ELISA.

Bestemmelse av titer av antirotte-IgG-antistoff (IgG-klasse) i blodet: Siden antistoffet som ble administrert er et heterogent antistoff til musen, ble produksjonen av antistoff til det antistoff som var gitt, målt ved en ELISA under anvendelse av et rotte-IgG som antigen. Et resultat ble uttrykt som enheter ved anvendelse av IL-6 Tgm-serum av et voksent dyr som ble gitt rotte-antistoffet som standard.

Bestemmelse av blod-kjemiske parametere: På sera fra musen i gruppene 1, 2, 3, 6 og 7 ved slutten av eksperimentet ble totalt protein (TP), albumin (Alb), glukose (Glu), triglycerid (TG), kreatinin (CRE), blod-urea-nitrogen (BUN), kalsium (Ca), alkalisk fosfatase (ALP), glutamin/pyruvat-transaminase (GOT) og glutamat/ pyruvat-transaminase (GPT) målt under anvendelse av en auto-analyzer (COBAS FARA II, Roche).

FACS-analyse av benmarg og splenocytter: Ved slutten av eksperimentet ble benmarg og splenocytter oppnådd fra ett dyr hver fra gruppene 1, 2, 6 og 7 og ble underkastet analyse av celle-overflate-antigener ved FACScan (Beckton Dickensian). De antistoffer som ble anvendt er antistoffer (Pharmingen) dirigert henholdsvis til Gr-1 (benmargceller), CD4, CD8 og B220 (splenocytter). Autopsi: Ved slutten av eksperimentet ble autopsi utført, og vekten av milten ble målt og hovedorganer visuelt inspisert.

Kroppsvekter: Endringer i kroppsvekter for hver gruppe ble vist i fig. 1. Det var en økning i vektene i gruppene 1 og 3. Ingen forskjell ble observert i endringer i kroppsvekter blant andre grupper.

Urinprotein: I gruppe 1 begynte urinprotein-positive dyr å vise seg fra 13 ukers alder (fig. 2), og fire (2 ved 16 ukers alder, og 2 ved 17 ukers alder) av syv dyr døde ved tidspunktet for autopsi. Imidlertid ble ingen dødsfall observert i de andre grupper. I gruppe 3 ble også to av seks dyr positive med hensyn på urinprotein ved slutten av eksperimentet, men ingen dyr testet postivt i de andre grupper.

Hematologiske funn: I gruppe 1 ble det observert reduksjon i nivået av hemoglobin (fig. 3) og RBC-tellinger (fig. 4), idet graden ble alvorlig med alderen. Blodplatetellingene (fig. 5) viste en forbigående økning, men avtok hurtig deretter. I gruppe 3 ble en lignende tendens observert, selv om den var litt forsinket i forhold til gruppe 1. På den annen side var det hverken nedgang i nivået av hemoglobin og i RBC og heller ikke en økning i blodplatetellinger og påfølgende nedgang i noen av gruppene 2, 4 og 5. Ved observasjon av differensielle blodcelletellinger fra blodutsmøringene har gruppe 1 vist forhøyelse i neutrofiler og monocytter, og relevante nedganger i lymfocytt-fraksjon ble observert, men gruppe 2 har vist normale verdier (tabell 1). Det var heller ikke noen signifikant forskjell mellom gruppene 6 og 7.

IgGl-konsentrasjon i blodet: I gruppe 1 har IgGl-konsentrasjon i blod vist en betydelig økning fra umiddelbart etter starten av eksperimentet og nådde til slutt ca. 100 ganger konsentrasjonen av de normale mus (fig. 7). I gruppe 3 ble økninger i IgGl-konsentrasjon merket litt senere enn i gruppe 1. Derimot var det ingen økning i IgGl-konsentrasjon i gruppene 2, 4 og 5, idet de holdt seg nesten på samme nivå under eksperimentet.

På den annen side ble ingen endring som var relatert til antistoff-administrering observert i de normale mus.

hIL-6-konsentrasjon i blodet: hIL-6-konsentrasjon i blodet (fig. 8) varierte på samme måte som IgGl, idet det viste økninger i gruppene 1 og 3, mens det holdt seg på nesten samme nivå i de andre grupper under eksperimentet.

Titer av anti-rotte-IgG-antistoff i blodet: Antistoff mot anti-rotte-IgG ble påvist i gruppe 1, 3 og 6 (tabell 2). Alle dyrene i gruppe 1 og 3 har vist høy titer, mens i gruppe 6 bare to av fem dyr har vist en økning i titer. På den annen side var det ingen signifikant økning som ble observert i de andre grupper.

FACS-analyse: Analyse på benmargceller (BM) og splenocytter (sp) for gruppene 1, 2, 6 og 7 viste at det var en ekstrem økning i forholdet av Gr-l-positive celler som er granulocytiske forløperceller, i BM-cellene i gruppe 1 (fig. 9 og fig. 10), men de i gruppe 2 har vist lignende verdier som normale "littermates".

Det var i alt vesentlig ingen forskjell mellom gruppene 6 og 7.

Med hensyn til forholdet av CD-4-, CD8- og B220-positive celler i sp var det ingen forskjeller mellom gruppene med unntagelse av at i gruppe 1 var CD8- og B220-positive celler senket på grunn av en økning i plasmaceller (tabell 4).

Autopsifunn: I gruppene 1 og 3 var svelling av systemiske lymfenoder og forstørrelse av milten påfallende (fig. 11), og det var også avfarvning av nyren. Til dels ble også forstørrelse av leveren notert. Disse endringer ble ikke observert i de andre grupper, og det var ingen merkbare endringer med unntagelse av at i gruppene 2, 4 og 5 ble det notert forstørrelse av milten sammenlignet med de normale littermater.

Resultatene fra dette eksperiment skal nå forklares. I det IL-6 Tgm (gruppe 1) som var blitt administrert kontrollantistoffet ble et utvalg av symptomer observert såsom IgGl-plasmacytose, anemi, trombocytose, trombocytopeni, renal svikt, abnormale blod-kjemiske parametere o.s.v. Imidlertid ble det klart at disse symptomer fullstendig kan bli undertrykket av MR16-1.

Det er kjent at IL-6 for B-celler til terminalt å differen-siere inn i plasmaceller [Muraguchi, A. et al., J. Exp. Med. 167:332-344, 1988], og når det gjelder IL-6 Tgm, forårsaket IL-6-produksjon en økning i IgGl-konsentrasjon i blodet og en økning i TP-konsentrasjon og nedgang i Alb-konsentrasjon i serum. Disse fakta indikerer at start av IgGl-plasmacytose har funnet sted.

Bemerkelsesverdig forstørring av systemisk lymfatisk vev såsom lymfenodene og milten forårsaket av dette ville være

ansvarlig for en økning i kroppsvekt til tross for at de generelle tilstander blir alvorligere, forårsaket av progresjon av sykdommen i gruppene 1 og 3. MR16-1 ikke bare undertrykket disse tilstander fullstendig, men undertrykket også økningen av IL-6-konsentrasjon i blodet. Det ble således bekreftet at økningen i IL-6-konsentrasjon i blodet som er assosiert med aldring som observert med IL-6 Tgm er direkte relatert til plasmacytosens gang. Det menes derfor at de prolifererte plasmaceller selv aktivt produserer IL-6 som videre øker veksten av plasmacellene, med et resultat at IL-6 blir produsert i store mengder.

I likhet med effektene av IL-6 på hemocyttene er effekten av økende blodplater [Ishibashi, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 86:5953-5957, 1989; Ishibashi, T. et al., Blood 74:1241-1244, 1989] og effekten av indusering av makrocytisk anemi [Hawley, R.G. et al., J. Exp. Med. 176:1149-1163, 1992] kjent.

I tillegg til ovenstående er det, i IL-6 Tgm, observert trombocytopeni assosiert med aldring, som menes å være autoimmunitets-relatert til polyklonal B-celle-aktivering [Miyai, Tatsuya et al., ibid].

MR16-1 inhiberte fullstendig de direkte og indirekte effekter av IL-6 på hemocytten, men hadde ikke innvirkning på blodcelle-tellingene til den normale littermate. Det ble derfor bekreftet at IL-6-reseptor-antistoff ikke påvirker hematocyttene i det hele tatt. I IL-6 Tgm ble det observert økninger i forholdet av Gr-1-positive celler, som ansees som granulocytiske forløperceller, og i forholdet av perifere neutrofiler. Selv om IL-6 er kjent for å øke neutrofiler, er dets detaljerte mekanisme ikke blitt klarlagt ennå. Det ble funnet i denne studie at denne effekt er et fenomen som finner sted ved nivået av forløpercellene i benmargen. I denne studie ble det også funnet at MR16-1 fullstendig undertrykket effektene av IL-6, men påvirket ikke nivået av neutro-filene i benmargen og det perifere blod.

MR16-1 undertrykket også igangsettelse av nefritt observert i IL-6 Tgm. Det er blitt rapportert at IL-6 er nær beslektet til igangsettelse av mesangium-proliferativ nefritt som en autokrin vekstfaktor på mesangiumcellene. Selv om nefritt i IL-6 Tgm også er blitt bekreftet å være en mesangium-proliferativ nefritt, kan ikke involveringen av det immune system forsterket av IL-6 benektes [Katsume, Asao et al., a presentation at the 21st Meeting of Japan Immunology Society, "Characterization of SCID x (SCID x H-2L<d>hIL-6 transgenic mice)," 1991]. I alle fall, siden det var undertrykkelse av fremkomsten av urinprotein og av dødsfall, ble det gjort klart at anti-IL-6-reseptor-antistoff er effektivt med hensyn til å undertrykke igangsettelsen av nefritt forårsaket av IL-6-produksjon.

I IL-6 Tgm ble det observert en signifikant reduksjon i Glu-og Tg-konsentrasjoner i serum, som er indikatorer for cachexi. I det foreliggende eksperiment viste administrering av MR16-l-antistoff seg å være effektivt med hensyn til å mildne cachexi fordi Glu- og Tg-verdier ble nedsatt i gruppe 1 mens i gruppe 2 disse verdier returnerte til nesten det samme nivå som det normale.

Siden MR16-1 er et rotte-IgGl, et heteroprotein til mus, kan det lett forventes at antistoffer mot det administrerte antistoff kan produseres som ville gjøre antistoffene som var gitt ineffektive.

I et forsøk på å indusere immunologisk toleranse ved å eksponere for en stor mengde av antigen ved den første sensitise-ring i foreliggende eksperiment, ble det satt opp grupper som intravenøst ble gitt 2 mg/mus av antistoff ved første administrering. Blant gruppene som fikk administrert MR16-1, produserte de grupper som ble utsatt for denne behandling (gruppene 1, 4 og 5) intet påviselig anti-rotte-IgG-antistoff uten hensyntagen til intervallet og dosen av administrering, hvilket førte til fullstendig undertrykkelse av igangsettelsen av sykdommen. Men gruppe 3 har til slutt vist de samme symptomer som gruppe 1 som er kontroll-antistoff-administrerings-gruppen, skjønt gruppen har vist en økning i anti-rotte-IgG-antistoff, og igangsettelse av sykdommen var svakt forsinket i forhold til gruppe 1.

Derfor menes det at behandlingen var effektiv for å indusere immunologisk toleranse, men anti-rotte-IgG-antistoffet ble også påvist i alle dyr i gruppe 1 og 2/5 dyr i gruppe 6 som ble gitt kontroll-antistoffet i samme program. Siden fremgangen av plasmacytose induserer polyklonal B-celle-aktivering i IL-6 Tgm, kan det ikke konkluderes at anti-rotte-IgG-antistoffet som er påvist i gruppene 1 og 3 er et antistoff som er spesifikt for det gitte antistoff. Imidlertid ble det trukket den slutning at den induserende effekt av immunologisk toleranse ved å bli eksponert for en stor mengde av antigen ved første sensibilisering i gruppene 2, 4 og 5 kombinert med den inhiberende effekt av produksjon av spesifikke antistoffer som skyldes administrering av en stor mengde av MR16-1 tjente til å indusere fullstendig toleranse.

Det ble klarlagt i foreliggende eksperiment at anti-IL-6-reseptor-antistoffet er ekstremt effektivt mot et utvalg av sykdommer forårsaket av IL-6-produksjon uten å påvirke det normale nivå.

Eksempel 4

Effekten av muse-IL-6-reseptor-antistoff på den colon 26-induserte cacheximodell ble undersøkt. Musene som ble anvendt, var 6-uker gamle hann-BALB/c-mus, til hvilke det subkutant ble implantert en 2 mm blokk av colon 26 inn i latus hos musen på den første dag av eksperimentet. Muse-IL-6-reseptor-antistoffet MR16-1 (se referanse i eks. 2) ble gitt intravenøst i en dose av 2 mg/mus umiddelbart før implantering av colon 26 på første dag av eksperimentet og deretter gitt subkutant i en dose av 0,5 mg/mus på dag 7, 11, 14 og 18 (n=7). Det er allerede blitt fastslått i det foregående eksperiment at nøytraliserende antistoffer mot heteroproteinet ikke viser seg lett i denne metode. Til den tumor-bærende kontrollgruppe ble rotte-IgGl-kontroll-antistoffet (KH5) administrert i et maken program (n=7). Videre ble en PBS- administreringsgruppe satt opp som en ikke-tumorbærende kontrollgruppe (n=7). Etter start av eksperimentet ble kroppsvekten fastslått hver dag, og blodkjemiske parametere og konsentrasjonene av ionisert kalsium i blodet ble målt på dag 11 og 15 etter start av eksperimentet.

Det var en bemrkelsesverdig reduksjon i kroppsvekt i den tumor-bærende gruppe på dag 10 og senere, sammenlignet med den ikke-tumorbærende gruppe, mens en delvis effekt av undertrykkelse av reduksjonen i kroppsvekt ble vist i MR16-l-administrerings-gruppen (fig. 12). Konsentrasjonen av triglycerid i blodet på dag 11 og for glukose i blodet på dag 15 er vist henholdsvis i fig. 13 og fig. 14. Disse verdier var bemerkelsesverdig redusert i den tumor-bærende kontrollgruppe, sammenlignet med den ikke-tumor-bærende kontrollgruppe, mens i MR16-l-administreringsgruppen en undertrykkende tendens for glukose og en signifikant undertrykkende effekt for triglycerid ble observert.

Konsentrasjonen av ionisert kalsium i blodet på dag 11 var bemerkelsesverdig forhøyet i den tumor-bærende kontrollgruppe, sammenlignet med den ikke-tumorbærende kontrollgruppe, mens en signifikant undertrykkende effekt ble observert i MR16-1-administreringsgruppen (fig. 15).

Et eksperiment for å fastslå en effekt på overlevelsestid ble utført i et lignende program som ovenfor (n=10). Som et resultat ble en effekt på overlevelsestid observert i MR16-l-administre-ringsgruppen (fig. 16).

Eksempel 5

Effekten av IL-6-reseptor-antistoff på den occ-l-induserte cacheximodell ledsaget av hypercalcemi ble undersøkt. Musene som ble anvendt, var 6 uker gamle nakne hannmus. På den første dag av eksperimentet ble squamøs karsinomacellelinje, occ-1, implantert subkutant i latus hos musen. Muse-IL-6-reseptor-antistoffet MR16-1 (se referanse i eks. 2) ble gitt intravenøst ved en dose av 2 mg/mus umiddelbart før implantering av occ-1 på den første dag av eksperimentet, og deretter ble 100 ug/mus gitt subkutant på dag 7 og 10 (n=6). Det er allerede blitt bekreftet i det foregående eksperiment at nøytraliserende antistoffer mot heteroproteinet, rotte-antistoff, ikke lett viser seg i denne metode. Til den tumor-bærende kontrollgruppe ble rotte-IgGl-kontroll-antistoffet (KH5) administrert i et maken program (n=6). Videre ble en PBS-administreringsgruppe satt opp som en ikke-tumorbærende kontrollgruppe (n=7). Etter starten av eksperimentet ble kroppsvekt og konsentrasjonene av ionisert kalsium i blodet målt på dag 10 og 12 etter start av eksperimentet.

Det var en reduksjon i kroppsvekt i den tumor-bærende gruppe, men MR16-l-administreringsgruppen har vist en lignende endring i kroppsvekt som den ikke-tumorbærende kontrollgruppe, hvilket indikerer undertrykkelse av reduksjon i kroppsvekt (fig. 17).

Konsentrasjonen av ionisert kalsium i blodet var bemerkelsesverdig forhøyet i den tumor-bærende kontrollgruppe, sammenlignet med den ikke-tumorbærende kontrollgruppe, mens forhøyelsen var sterkt undertrykket i MR16-l-administrerings-gruppen (fig. 18).

Claims (7)

1. Anvendelse av et antistoff mot interleukin-6-reseptor som blokkerer signal-transduksjonen til IL-6 og inhibere den biologiske aktiviteten til IL-6 ved inhibering av bindingen av IL-6 til IL-6 reseptoren, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring eller behandling av nefritt.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor antistoffet er et PM-l-antistof f .

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antistoffet er et kimært antistoff.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antistoffet er et omformet human-antistoff.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det omformede humane antistoffet er et omformet human-PM-l-antistoff.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte nefritt er mesangium proliferativ nefritt.