JP2007205954A - ３次元液体クロマトグラフィ - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、“溶液の干渉”を避けることに関する。
【解決手段】
本発明は、液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムと後段分離カラムの間に、中段分離カラムを追加接続することに関する。また、好ましくは、切り替え手段や複数の溶液を混合し送液する送液手段を追加し、分離能の向上を図る。本発明によれば、“溶液の干渉”を避けることができる３次元液体クロマトグラフィ装置を実現できる。これにより、親水性成分と疎水性成分が混ざり合った複雑な試料に対しても、オンラインで一斉分離分析することができる。
【選択図】図１
【解決手段】
本発明は、液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムと後段分離カラムの間に、中段分離カラムを追加接続することに関する。また、好ましくは、切り替え手段や複数の溶液を混合し送液する送液手段を追加し、分離能の向上を図る。本発明によれば、“溶液の干渉”を避けることができる３次元液体クロマトグラフィ装置を実現できる。これにより、親水性成分と疎水性成分が混ざり合った複雑な試料に対しても、オンラインで一斉分離分析することができる。
【選択図】図１
Description
本発明は、液体クロマトグラフィ装置に関する。例えば、順相，イオン交換，逆相分離カラムを有する３次元液体クロマトグラフィ装置に関する。
複雑な生体試料中には、親水的成分，疎水的成分，イオン性成分が混在しており、また成分分子量も幅広い分布を持っている。したがって、１種類のカラムでの分離には限界がある。そこで、２種の異なる分離モードのカラムを組み合わせた２次元液体クロマトグラフィ装置が使用されている（非特許文献１−４）。これらの従来の技術では、前段（１次元）と後段（２次元）カラムは、イオン交換（一部、サイズ排除）と逆相カラムの組み合わせに限定されている。
A. J. Link et al, Nat. Biotechnol. 17,676 (1999).
Y. Shen et al, Anal. Chem. 77, 3090 (2005).
T. Wehr, LC.GC Europe March, 2 (2003).
P. Dugo et al, Anal. Chem. 76, 2525 (2004).
本願発明者が鋭意検討した結果、以下のことが判明した。
表１は、３種（順相，イオン交換，逆相）の分離モードとサンプルの関係を示したものである。○は保持する（分離が可能）を、×は保持しない（分離が不可能）を意味している。実際は、その中間的なものもあるが、説明を簡単にするために省かれている。表１から分かるように、これらの組み合わせでは、サンプルグループ（Ｃ，Ｄ）のような親水的な成分の分離が損なわれてしまう。
サンプルＡ−Ｄが含まれる上述の生体試料の分離分析には、順相と逆相カラムの組み合わせが必要である。しかし、この場合、順相カラムの分離に用いる有機溶媒が逆相カラム分離を妨害する。即ち、順相カラムで分離された成分が、有機溶媒とともに逆相カラムに導入されると、成分は逆相カラムに保持されず、分離もされずに溶出してしまう。つまり、“溶液の干渉”が起こる。前段（１次元）のカラム分離に用いる溶液が、後段(２次元)カラム分離を阻害しない（溶液の不干渉）手段，工夫が必要不可欠である。
この“溶液の干渉”を避ける最も簡単な方法は、順相，逆相それぞれのカラムを装着した２台の液体クロマトグラフィ装置に、溶液試料を導入し分離分析するか、または、順相カラムを装着した液体クロマトグラフィ装置で分離された成分を、一定時間ごとにいったん分取（フラクション）して、脱有機溶媒した後、逆相カラムを装着した液体クロマトグラフィ装置で再度分離分析するものである。
または、脱有機溶媒の代わりに、順相カラムから溶出する有機溶媒を、流量比を４００倍で希釈してから逆相カラムに導入するといった方法も提案されている（文献４）。この場合、分離成分も４００倍希釈されてしまうので高感度分析に適さない。
本発明の目的は、“溶液の干渉”を避けることに関する。
本発明は、液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムと後段分離カラムの間に、中段分離カラムを追加接続することに関する。また、好ましくは切り替え手段や複数の溶液を混合し送液する送液手段を追加し、分離能の向上を図る。
本発明によれば、“溶液の干渉”を避けることができる３次元液体クロマトグラフィ装置を実現できる。これにより、親水性成分と疎水性成分が混ざり合った複雑な試料に対しても、オンラインで一斉分離分析することができる。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果を図面を参酌して説明する。尚、図面は説明のために用いられ、権利範囲を限定するものではない。
図１は、本発明の第１の実施形態であり、最も単純な３次元液体クロマトグラフィ装置の構成である。各構成ユニットの機能と動作原理を以下に記述する。
本実施例の３次元液体クロマトグラフィ装置では、グラジエントポンプ４と、試料注入手段と、前段分離カラムである順相カラム７と、後段分離カラムである逆相カラム１０と、６方流路切り替えバルブ８と、分離された成分を検出する検出手段である質量分析計
１１を含み、切り替え手段と後段分離カラムの間に中段分離カラムであるイオン交換カラム９が接続されている。
１１を含み、切り替え手段と後段分離カラムの間に中段分離カラムであるイオン交換カラム９が接続されている。
グラジエントポンプ４は、複数の溶液を混合し送液する送液手段であり、水溶液Ａ１，有機溶媒溶液Ｂ２及び水溶液Ｃ３を所定の割合で混合し、流路に送液できる。
試料注入手段は、オートサンプラ５とサンプル導入機６から構成される。
６方流路切り替えバルブ８は、前段分離カラムで分離された成分を後段分離カラムに導入するための切り替え手段である。図１の（Ａ）（Ｂ）は、６方流路切り替えバルブ８を切り替えた場合のそれぞれの流路を示す。図１の（Ａ）においては、試料注入手段，順相カラム７，イオン交換カラム９、及び逆相カラム１０が直列に繋がっている。また、図１の（Ｂ）においては、試料注入手段，イオン交換カラム９、及び逆相カラム１０が直列に繋がっている。
以下、本実施例の３次元液体クロマトグラフィ装置の動作を説明する。
ステップ１：グラジエントポンプ４は、水溶液Ａ１および有機溶媒溶液Ｂ２を混合（Ｂの組成比が高い）した溶液を一定流量で送液を行う。オートサンプラ５は、一定量の試料を流路に注入する。
ステップ２：注入された試料中の各成分は順相カラム７で分離される。相互作用の小さい順にカラム中を速く移動する。
ステップ３：順相カラム７から溶出した成分は、６方流路切り替えバルブ８を経由して、イオン交換カラム９に移動し保持される。保持されない成分はそのまま逆相カラム１０に移動する。
ステップ４：６方流路切り替えバルブ８を切り替え、流路を（Ａ）から（Ｂ）にする。同時に、グラジエントポンプ４は溶液組成を水溶液Ａ１００％にして、イオン交換カラム９と逆相カラム１０中の溶液を置換する。
ステップ５：グラジエントポンプ４は溶液組成を水溶液Ｃ１００％にして、イオン交換カラム９に保持されている成分を溶出させ、逆相カラム１０に導く。その後、溶液組成を水溶液Ａ１００％にしてから、徐々に有機溶媒溶液Ｂの組成比を高めていき、逆相カラム
１０での分離を行う。
ステップ６：逆相カラム１０での分離が完了したら、６方流路切り替えバルブ８を切り替え、流路を（Ｂ）から（Ａ）に戻す。同時に、グラジエントポンプ４は溶液組成をステップ１に戻す。そして、ステップ３−６を繰り返す。
ステップ１：グラジエントポンプ４は、水溶液Ａ１および有機溶媒溶液Ｂ２を混合（Ｂの組成比が高い）した溶液を一定流量で送液を行う。オートサンプラ５は、一定量の試料を流路に注入する。
ステップ２：注入された試料中の各成分は順相カラム７で分離される。相互作用の小さい順にカラム中を速く移動する。
ステップ３：順相カラム７から溶出した成分は、６方流路切り替えバルブ８を経由して、イオン交換カラム９に移動し保持される。保持されない成分はそのまま逆相カラム１０に移動する。
ステップ４：６方流路切り替えバルブ８を切り替え、流路を（Ａ）から（Ｂ）にする。同時に、グラジエントポンプ４は溶液組成を水溶液Ａ１００％にして、イオン交換カラム９と逆相カラム１０中の溶液を置換する。
ステップ５：グラジエントポンプ４は溶液組成を水溶液Ｃ１００％にして、イオン交換カラム９に保持されている成分を溶出させ、逆相カラム１０に導く。その後、溶液組成を水溶液Ａ１００％にしてから、徐々に有機溶媒溶液Ｂの組成比を高めていき、逆相カラム
１０での分離を行う。
ステップ６：逆相カラム１０での分離が完了したら、６方流路切り替えバルブ８を切り替え、流路を（Ｂ）から（Ａ）に戻す。同時に、グラジエントポンプ４は溶液組成をステップ１に戻す。そして、ステップ３−６を繰り返す。
本実施例の３次元液体クロマトグラフィ装置の性能について検証した。図２に示したグラジエントプログラムで溶液組成を時間と共に変更しながら、流量０.２ｍＬ／min で送液を行った。溶液は、水溶液Ａが水、有機溶媒溶液Ｂがアセトニトリル、水溶液Ｃが0.5Ｍ酢酸アンモニウムである。また、図２に示された（Ａ）,（Ｂ）は６方流路切り替えバルブ８の切り替えタイミングを示している。また、図３に、６方流路切り替えバルブ８を切り替えた場合のそれぞれの流路を示す。使用したサンプルは、表２に記載したリボヌクレアーゼＢをトリプシン消化したペプチドである。また、使用したカラムは、アミノ
(Amino)順相カラム１２（２.１×１００mm），陽イオン交換（ＣＥＸ）カラム１３(２.１×５０mm)，Ｃ３０逆相カラム１４（２.０×１５０mm）である。図５Ａ，Ｂは表２中の６成分の溶出時間の再現性を示したものである。
(Amino)順相カラム１２（２.１×１００mm），陽イオン交換（ＣＥＸ）カラム１３(２.１×５０mm)，Ｃ３０逆相カラム１４（２.０×１５０mm）である。図５Ａ，Ｂは表２中の６成分の溶出時間の再現性を示したものである。
本実施例により、原理的に“溶液の干渉”が避けられない順相カラムと逆相カラムの組み合わせを、２次元液体クロマトグラフィ装置の改良で実現にすることができた。
尚、中段分離カラムが陽イオン、または、陰イオン交換カラムであってもよい。また、中段分離カラムが、陽（陰）イオンと陰（陽）イオン交換カラムを直列に接続したものであってよい。また、陽（陰）イオン交換カラムと陰（陽）イオン交換カラムの間に、６方流路切り替えバルブと複数の溶液を混合し送液する送液手段である第２のグラジエントポンプを追加接続してもよい。
図５は、本発明の第２の実施形態である。第１の実施形態との違いは、６方流路切り替えバルブ２個と逆相トラップカラムを追加し、３台のポンプで各分離カラムに適した溶液組成で送液を行えるようにしたものである。以下、実施例１との相違点を中心に説明する。
本実施例の３次元液体クロマトグラフィ装置では、第１グラジエントポンプ２７と、第２グラジエントポンプ２８と、試料注入手段であるオートサンプラ３０と、前段分離カラムである順相カラム３１と、中段分離カラムである陰（陽）イオン交換カラム３２と、後段分離カラムである逆相カラム３６と、第１の６方流路切り替えバルブ３４と、及び質量分析計３７を含む。そして、中段分離カラムと後段分離カラムの間に、第２の６方流路切り替えバルブ３５と第３のグラジエントポンプ２９が接続されている。
第１のグラジエントポンプ２７は、水溶液Ａ２１，有機溶媒溶液Ｂ２２を所定の割合で混合した順相用溶液を流路に送液できる。
第２のグラジエントポンプ２８は、水溶液Ａ２３，水溶液Ｃ２４を所定の割合で混合したイオン交換用溶液を流路に送液できる。
第３のグラジエントポンプ２９は、水溶液Ｄ２５，有機溶媒溶液Ｅ２６を所定の割合で混合した逆相用溶液を流路に送液できる。
第１の６方流路切り替えバルブ３４は、第１のグラジエントポンプ２７，順相カラム
３１、及びイオン交換カラム３２を直列に繋いだ流路Ａと、第２のグラジエントポンプ
２８，イオン交換カラム３２、及び第２の６方流路切り替えバルブ３５（逆相トラップカラム３３）を直列に繋いだ流路Ｂとに、流路を切り替えできる。
３１、及びイオン交換カラム３２を直列に繋いだ流路Ａと、第２のグラジエントポンプ
２８，イオン交換カラム３２、及び第２の６方流路切り替えバルブ３５（逆相トラップカラム３３）を直列に繋いだ流路Ｂとに、流路を切り替えできる。
第２の６方流路切り替えバルブ３５は、第３のグラジエントポンプ２９，逆相トラップカラム３３、及び逆相カラム３６を直列に繋いだ流路Ａと、第１の６方流路切り替えバルブ３２（イオン交換カラム３２），逆相トラップカラム３３、及び逆相カラム３６を直列に繋いだ流路Ｂとに、流路を切り替えできる。
以下、本実施例の３次元液体クロマトグラフィ装置の動作を説明する。
ステップ１：第１のグラジエントポンプ２７は、水溶液Ａ２１および有機溶媒溶液Ｂ２２を混合（Ｂの組成比が高い）した溶液を一定流量で送液する。オートサンプラ３０は、一定量の試料を流路に注入する。この時、第１の６方流路切り替えバルブ３４及び，第２の６方流路切り替えバルブ３５はそれぞれ流路Ａとしておく。
ステップ２：注入された試料中の各成分は順相カラム３１で分離される。一相互作用の小さい順にカラム中を速く移動する。
ステップ３：順相カラム３１から溶出した成分は、第１の６方流路切り替えバルブ３４を経由して、イオン交換カラム３２に移動し保持される。保持されない成分はドレインに排出される。この間、第２のグラジエントポンプ２８は水溶液Ａ１００％をイオン交換カラム３２に、第３のグラジエントポンプ２９は水溶液Ｄ１００％を逆相カラム３６に送液する。第１のグラジエントポンプ２７はここで、一旦停止する。
ステップ４：第１の６方流路切り替えバルブ３４及び，第２の６方流路切り替えバルブ
３５をそれぞれ切り替え、流路を流路Ａから流路Ｂにする。同時に、第２のグラジエントポンプ２８は溶液組成を水溶液Ｃ１００％にして、イオン交換カラム３２にトラップされた成分を逆相トラップカラム３３に導く。その後、第１の６方流路切り替えバルブ３４を流路Ａに戻す。
ステップ５：第３のグラジエントポンプ２９は溶液組成を水溶液Ｄ１００％から、徐々に有機溶媒溶液Ｅの組成比を高めていき、逆相カラム３６での分離を行う。
ステップ６：逆相カラム３６での分離が完了したら、第２の６方流路切り替えバルブ３５を切り替え、流路を流路Ａに戻す。同時に、第１のグラジエントポンプ２７を動作させ、溶液組成をステップ１に戻す。そして、ステップ３−６を繰り返す。
ステップ１：第１のグラジエントポンプ２７は、水溶液Ａ２１および有機溶媒溶液Ｂ２２を混合（Ｂの組成比が高い）した溶液を一定流量で送液する。オートサンプラ３０は、一定量の試料を流路に注入する。この時、第１の６方流路切り替えバルブ３４及び，第２の６方流路切り替えバルブ３５はそれぞれ流路Ａとしておく。
ステップ２：注入された試料中の各成分は順相カラム３１で分離される。一相互作用の小さい順にカラム中を速く移動する。
ステップ３：順相カラム３１から溶出した成分は、第１の６方流路切り替えバルブ３４を経由して、イオン交換カラム３２に移動し保持される。保持されない成分はドレインに排出される。この間、第２のグラジエントポンプ２８は水溶液Ａ１００％をイオン交換カラム３２に、第３のグラジエントポンプ２９は水溶液Ｄ１００％を逆相カラム３６に送液する。第１のグラジエントポンプ２７はここで、一旦停止する。
ステップ４：第１の６方流路切り替えバルブ３４及び，第２の６方流路切り替えバルブ
３５をそれぞれ切り替え、流路を流路Ａから流路Ｂにする。同時に、第２のグラジエントポンプ２８は溶液組成を水溶液Ｃ１００％にして、イオン交換カラム３２にトラップされた成分を逆相トラップカラム３３に導く。その後、第１の６方流路切り替えバルブ３４を流路Ａに戻す。
ステップ５：第３のグラジエントポンプ２９は溶液組成を水溶液Ｄ１００％から、徐々に有機溶媒溶液Ｅの組成比を高めていき、逆相カラム３６での分離を行う。
ステップ６：逆相カラム３６での分離が完了したら、第２の６方流路切り替えバルブ３５を切り替え、流路を流路Ａに戻す。同時に、第１のグラジエントポンプ２７を動作させ、溶液組成をステップ１に戻す。そして、ステップ３−６を繰り返す。
本実施例によれば、イオン交換カラムから溶出する塩濃度が高い水溶液Ｄを、逆相カラムに導入しないようにできる。本実施例は、検出器として質量分析計を用いる場合、検出感度，装置のメインテナンス性向上に有効である。尚、イオン交換カラムで保持できない成分はドレイン３８に流出する可能性がある。
１，２１，２３…水溶液Ａ、２，２２…有機溶媒溶液Ｂ、３，２４…水溶液Ｃ、４…グラジエントポンプ、５，３０…オートサンプラ、６…サンプル導入機、７，３１…順相カラム、８…６方流路切り替えバルブ、９，３２…イオン交換カラム、１０，３６…逆相カラム、１１，３７…質量分析計、１２…アミノ(Amino)順相カラム（２.１×１００mm）、１３…陽イオン交換（ＣＥＸ）カラム(２.１×５０mm) 、１４…Ｃ３０逆相カラム、１５…ＵＶ、１６…ＭＳ、２５…水溶液Ｄ、２６…有機溶媒溶液Ｅ、２７…第１のグラジエントポンプ、２８…第２のグラジエントポンプ、２９…第３のグラジエントポンプ、３３…逆相トラップカラム、３４…第１の６方流路切り替えバルブ、３５…第２の６方流路切り替えバルブ。
Claims (6)
- 複数の溶液を混合し送液する手段と、試料注入手段と、前段分離カラムと、後段分離カラムと、前段分離カラムで分離された成分を後段分離カラムに導入するための切り替え手段と、分離された成分を検出する検出手段を含み、
切り替え手段と後段分離カラムの間に中段分離カラムが接続されている３次元液体クロマトグラフィ装置。 - 請求項１記載の３次元液体クロマトグラフィ装置において、
中段分離カラムが陽イオン交換カラム、または、陰イオン交換カラムであることを特徴とする３次元液体クロマトグラフィ装置。 - 請求項１記載の３次元液体クロマトグラフィ装置において、
中段分離カラムが、第１イオン交換カラムと第２イオン交換カラムを直列に接続したものであることを特徴とする３次元液体クロマトグラフィ装置。 - 請求項３記載の３次元液体クロマトグラフィ装置において、
第１イオン交換カラムと第２イオン交換カラムの間に、第２の切り替え手段と、複数の溶液を混合し送液する第２の送液手段が接続されていることを特徴とする３次元液体クロマトグラフィ装置。 - 請求項３記載の３次元液体クロマトグラフィ装置において、
第２イオン交換カラムと後段分離カラムの間に、第２の切り替え手段と、複数の溶液を混合し送液する第２の送液手段が接続されていることを特徴とする３次元液体クロマトグラフィ装置。 - 請求項１記載の３次元液体クロマトグラフィ装置において、
検出手段が質量分析計であることを特徴とする３次元液体クロマトグラフィ装置。
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