ES2892123T3 - Derivados antivíricos de N4-hidroxicitidina - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un compuesto que tiene la fórmula I **(Ver fórmula)** o una sal del mismo, en la que Q-R7 es OH, W es O; X es CH2, CHMe, CMe2, CHF, CF2 o CD2; Y es N o CR"; Z es N o CR"; cada R" se selecciona independientemente de es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3; R1 es **(Ver fórmula)** halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, esterilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, fosforamidilo, en el que R1 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; Y1 es O o S; Y2 es OH, OR12, Oalquilo o BH3-M+; R2 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo, acido o heterociclilo, en el que R2 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R3 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R6 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, etinilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R6 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R8 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, benciloxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R8 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R9 es hidrógeno, metilo, etilo, terc-butilo, alquilo, alquilo(C6-C16), alquilo(C6-C22), halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, cicloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R9 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R10 es hidrógeno, alquilo, alquilo ramificado, cicloalquilo, lípido, metilo, etilo, isopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, butilo, pentilo, hexilo, neopentilo, bencilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R10 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R11 es hidrógeno, deuterio, alquilo, metilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R11 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R12 es hidrógeno, alquilo, arilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, aromático, heteroaromático, fenilo 4-sustituido, 4- fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromofenilo, naftilo o heterociclilo, en el que R12 es opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R13 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R13 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R14 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R14 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N- dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N- metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados antivíricos de N4-hidroxicitidina
Campo
La presente divulgación se refiere a derivados nucleosídicos de N4-hidroxicitidina, composiciones y procedimientos relacionados con los mismos. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento y profilaxis de infecciones víricas.
Antecedentes
Los agentes causantes de la encefalitis equina oriental, occidental y venezolana (EEE, WEE y VEE, respectivamente) y la fiebre chikungunya (CHIK) son virus transmitidos por vectores (familia Togaviridae, género Alphavirus) que se pueden transmitir a los humanos a través de picaduras de mosquitos. Los virus de la encefalitis equina son patógenos de categoría B de los CDC y el virus CHIK es de categoría C. Existe una preocupación considerable por el uso de cepas virulentas del virus de la VEE, administradas por medio de aerosol, como arma biológica contra los combatientes. Los estudios en animales han demostrado que la infección por el virus de la VEE por exposición a aerosoles da lugar rápidamente a una infección masiva del cerebro, con una alta mortalidad y morbilidad. Véase Roy et al., Pathogenesis of aerosolized Eastern equine encephalitis virus infection in guinea pigs. Virol J, 2009, 6:170.
Stuyver et al. informan que se encontró que la p-D-N(4)-bidroxicitidina (NHC) tiene actividades antipestivirus y antihepacivirus. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(1):244-54. Constantini et al. informan de evaluaciones sobre la eficacia de 2'-C-MeC, 2'-F-2'-C-MeC y NHC sobre el virus de Norwalk. Véase también Purohit et al. J Med Chem, 2012, 55(22):9988-9997. Ivanov et al., Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 2006, 71(7):1099-1106. Fox et al., JACS, 1959, 81:178-87. También se pueden encontrar divulgaciones similares en los documentos US 2003/087873, US 2014/235566, US 2009/105186, WO 2013/142525, EP 2615 101, Bonnac et al., "Structure-Activity Relationships and Design of Viral Muttagens and Application to Lethal Mutagenesis" J. Med Chem 2013, 56(23): 9403-9414 y Reynard et al., "Identification of a New Ribonucleoside Inhibitor of Ebola Virus Replication" Viruses, 2015, 7(12), 6233-6240.
Sumario
La presente divulgación se refiere a N4-hidroxicitidina y derivados, composiciones farmacéuticas y usos relacionados con los mismos. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene la fórmula I,
Figure imgf000002_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento.
En determinados modos de realización, la divulgación contempla derivados de compuestos divulgados en el presente documento, tales como los que contienen uno o más sustituyentes iguales o diferentes.
En determinados modos de realización, la divulgación contempla composiciones farmacéuticas que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y un compuesto divulgado en el presente documento. En determinados modos de realización, la composición farmacéutica está en forma de comprimido, cápsula, píldora o tampón acuoso, tal como una solución salina o tampón fosfato.
En determinados modos de realización, la composición farmacéutica comprende un compuesto divulgado en el presente documento y un propulsor. En determinados modos de realización, el propulsor es un propulsor aerosolizante es aire comprimido, etanol, nitrógeno, dióxido de carbono, óxido nitroso, hidrofluoroalcanos (HFA), 1,1,1,2,-tetrafluoroetano, 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano o combinaciones de los mismos.
En determinados modos de realización, la divulgación contempla un recipiente presurizado que comprende un compuesto o composición farmacéutica como se describe en el presente documento. En determinados modos de realización, el recipiente es un pulverizador de bomba manual, inhalador, inhalador dosificado por medidor, inhalador de polvo seco, nebulizador, nebulizador de malla vibratoria, nebulizador de chorro o nebulizador de ondas ultrasónicas.
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a procedimientos para tratar o prevenir una infección vírica que comprenden administrar una cantidad eficaz de un compuesto o composición farmacéutica divulgado en el presente documento a un sujeto que lo necesite.
En determinados modos de realización, la infección vírica es un alfavirus o coronavirus y flavivirus. En determinados modos de realización, la infección vírica es un ortomixovirus o paramixovirus. En determinados modos de realización, la infección vírica se selecciona de coronavirus del m ErS, virus de encefalitis equina oriental, virus de encefalitis equina occidental, virus de encefalitis equina venezolana, virus del río Ross, virus de Powassan, virus del bosque Barmah y virus de chikungunya.
En determinados modos de realización, el compuesto o la composición farmacéutica se administra por vía oral, intravenosa o a través de los pulmones.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 ilustra la preparación de p-D-N-hidroxicitidina. a. TBSCl, DMAP, DIPEA, DCM; b. (2,4,6-iPr)PhSO2Cl, DIPEA, DMAP, DCM; c. NH2OH-HC DIPEA, DCM; d. fuente de F-; e. NH2OH ac., AcOH, 50 °C.
La figura 2 ilustra compuestos de referencia.
La figura 3 ilustra compuestos de referencia.
La figura 4 muestra las concentraciones plasmáticas medias de EIDD-01931 y los parámetros farmacocinéticos de ratones a los que se les administró ElDD-01931
La figura 5 muestra la acumulación de nucleósidos de EIDD-01931 en órganos de ratón
La figura 6 muestra la acumulación de trifosfato de EIDD-01931 en órganos de ratón
La figura 7 muestra la reducción en la hinchazón de la almohadilla plantar en ratones expuestos a CHIKV tratados con EIDD-01931
La figura 8 muestra la reducción de copias de ARN de CHIKV por PCR en ratones expuestos a CHIKV tratados con EIDD-01931
Descripción detallada
En determinados modos de realización, un agente farmacéutico, que puede estar en forma de sal, se administra en los procedimientos descritos en el presente documento especificándose mediante un peso. Este se refiere al peso del compuesto mencionado. Si está en forma de sal, entonces el peso es el equivalente molar de la sal correspondiente.
"Sujeto" se refiere a cualquier animal, preferentemente un paciente humano, ganado o mascota doméstica. Como se usa en el presente documento, los términos "evitar" y "evitando" incluyen la prevención de la recidiva, propagación o aparición. No se pretende que la presente divulgación se limite a la prevención completa. En algunos modos de realización, se retrasa la aparición o se reduce la gravedad de la enfermedad.
Como se usan en el presente documento, los términos "tratar" y "tratando" no se limitan al caso en el que se cura al sujeto (por ejemplo, el paciente) y se erradica la enfermedad. Más bien, los modos de realización de la presente divulgación también contemplan un tratamiento que simplemente reduzca los síntomas y/o retrase la progresión de la enfermedad.
Como se usa en el presente documento, el término "combinación con", cuando se usa para describir la administración con un tratamiento adicional, significa que el agente se puede administrar antes, conjuntamente con o después del tratamiento adicional, o una combinación de los mismos.
Como se usa en el presente documento, "alquilo" significa un hidrocarburo no cíclico de cadena lineal o ramificada, insaturado o saturado, tal como los que contienen de 1 a 10 átomos de carbono. Un "alquilo superior" se refiere a un hidrocarburo insaturado o saturado que tiene 6 o más átomos de carbono. Un "C6-C16" se refiere a un alquilo que contiene de 6 a 16 átomos de carbono. Asimismo, un "C6-C22" se refiere a un alquilo que contiene de 6 a 22 átomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, npropilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-septilo, n-octilo y n-nonilo; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo e isopentilo. Los alquilos insaturados contienen al menos un doble o triple enlace entre átomos de carbono contiguos (denominados "alquenilo" o "alquinilo", respectivamente). Los alquenilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3 - metil- 1 -butenilo, 2-metil-2-butenilo y 2,3- dimetil-2-butenilo; mientras que los alquinilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo y 3- metil-1-butinilo.
Los alquilos mono- o policíclicos no aromáticos se denominan en el presente documento "carbociclos" o grupos "carbociclilos". Los carbociclos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo; mientras que los carbociclos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo.
Los "heterocarbociclos" o grupos "heterocarbociclilos" son carbociclos que contienen de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre que pueden ser saturados o insaturados (pero no aromáticos), monocíclicos o policíclicos, y en los que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. Los heterocarbociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo y tetrahidrotiopiranilo.
El término "arilo" se refiere a grupos aromáticos homocíclicos (es decir, hidrocarburo) que contienen anillos mono-, bi- o tricíclicos que tienen preferentemente de 6 a 12 miembros, tales como fenilo, naftilo y bifenilo. Fenilo es un grupo arilo preferente. El término "arilo sustituido" se refiere a grupos arilo sustituidos con uno o más grupos, preferentemente seleccionados de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo (opcionalmente sustituido), arilo (opcionalmente sustituido), heterociclo (opcionalmente sustituido), halo, hidroxi, alcoxi (opcionalmente sustituido), ariloxi (opcionalmente sustituido), alcanoílo (opcionalmente sustituido), aroílo (opcionalmente sustituido), alquiléster (opcionalmente sustituido), ariléster (opcionalmente sustituido), ciano, nitro, amino, amino sustituido, amido, lactama, urea, uretano, sulfonilo, donde opcionalmente uno o más pares de sustituyentes conjuntamente con los átomos a los que están unidos forman un anillo de 3 a 7 miembros.
Como se usa en el presente documento, "heteroarilo" o "heteroaromático" se refiere a un heterocarbociclo aromático que tiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y que contiene al menos 1 átomo de carbono, incluyendo los sistemas de anillo mono- y policíclicos. Los sistemas de anillo policíclicos pueden contener uno o más anillos no aromáticos, pero no es obligatorio, siempre que uno de los anillos sea aromático. Los heteroarilos representativos son furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo, indolilo, isoindolilo, azaindolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isooxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tiiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, piridacinilo, pirimidinilo, piracinilo, triacinilo, cinolinilo, ftalacinilo y quinazolinilo. Se contempla que el uso del término "heteroarilo" incluye derivados N-alquilados, tales como un sustituyente 1-metilimidazol- 5-ilo.
Como se usa en el presente documento, "heterociclo" o "heterociclilo" se refiere a sistemas de anillo mono- y policíclicos que tienen de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y que contienen al menos 1 átomo de carbono. Los sistemas de anillo mono- y policíclicos pueden ser aromáticos, no aromáticos o mezclas de anillos aromáticos y no aromáticos. El heterociclo incluye heterocarbociclos y heteroarilos.
"Alquiltio" se refiere a un grupo alquilo como se define anteriormente con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente de azufre. Un ejemplo de un alquiltio es metiltio, (es decir, - S-CH3).
"Alcoxi" se refiere a un grupo alquilo como se define anteriormente con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente de oxígeno. Los ejemplos de alcoxi incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, ipropoxi, n-butoxi, s-butoxi, t-butoxi, n-pentoxi y s-pentoxi. Los grupos alcoxi preferentes son metoxi, etoxi, npropoxi, i- propoxi, n-butoxi, s-butoxi, t-butoxi.
"Alquilamino" se refiere a un grupo alquilo como se define anteriormente con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente amino. Un ejemplo de un alquilamino es metilamino, (es decir, -NH-CH3). "Alcanoílo" se refiere a un alquilo como se define anteriormente con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente carbonilo (es decir, -(C=O)alquilo).
"Alquilsulfonilo" se refiere a un alquilo como se define anteriormente con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente sulfonilo (es decir, -S(=O)2alquilo) tal como mesilo, y "Arilsulfonilo" se refiere a un arilo unido a través de un puente sulfonilo (es decir, - S(=O)2arilo).
"Alquilsulfamoílo" se refiere a un alquilo como se define anteriormente con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente sulfamoílo (es decir, -NHS(=O)2alquilo), y "Arilsulfamoílo" se refiere a un alquilo unido a través de un puente sulfonilo (es decir, - NHS(=O)2arilo).
"Alquilsulfinilo" se refiere a un alquilo como se define anteriormente con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente sulfinilo (es decir, -S(=O)alquilo).
Los términos "cicloalquilo" y "cicloalquenilo" se refieren a grupos de anillo mono-, bi- o trihomocíclicos de 3 a 15 átomos de carbono que están, respectivamente, completamente saturados y parcialmente insaturados. El término "cicloalquenilo" incluye sistemas de anillo bi- y tricíclicos que no son aromáticos en su conjunto, pero que contienen partes aromáticas (por ejemplo, fluoreno, tetrahidronaftaleno y dihidroindeno). Los anillos de los grupos cicloalquilo multianillo pueden estar fusionados, unidos por puentes y/o unidos a través de una o más uniones espiro. Los términos "cicloalquilo sustituido" y "cicloalquenilo sustituido" se refieren, respectivamente, a grupos cicloalquilo y cicloalquenilo sustituidos con uno o más grupos, preferentemente seleccionados de arilo, arilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, carbociclo, carbociclo sustituido, halo, hidroxi, alcoxi. (opcionalmente sustituido), ariloxi (opcionalmente sustituido), alquiléster (opcionalmente sustituido), ariléster (opcionalmente sustituido), alcanoílo (opcionalmente sustituido), ariol (opcionalmente sustituido), ciano, nitro, amino, amino sustituido, amido, lactama, urea, uretano y sulfonilo.
Los términos "halógeno" y "halo" se refieren a flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "sustituido" se refiere a una molécula en la que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un sustituyente. Cuando están sustituidos, uno o más de los grupos son "sustituyentes". La molécula puede estar sustituida de forma múltiple. En el caso de un sustituyente oxo ("=O"), se reemplazan dos átomos de hidrógeno. Ejemplos de sustituyentes dentro de este contexto pueden incluir halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, nitro, ciano, oxo, carbociclilo, carbocicloalquilo, heterocarbociclilo, heterocarbocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb,-NRaC(=O)NRaNRb, -NRaC(=O)ORb, - NRaSO2Rb, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRb,-OC(=O)NRaRb, -ORa, -SRa, -SORa, - S(=O)2Ra, -OS(=O)2Ra y -S(=O)2ORa. Ra y Rb en este contexto pueden ser iguales o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno hidroxilo, alquilo, alcoxi, alquilo, amino, alquilamino, dialquilamino, carbociclilo, carbocicloalquilo, heterocarbociclilo, heterocarbocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo.
El término "opcionalmente sustituido", como se usa en el presente documento, significa que la sustitución es opcional y, por lo tanto, es posible que el átomo designado no esté sustituido.
Compuestos
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto de fórmula I,
Figure imgf000005_0001
o una sal del mismo, en la que
Q-R7 es OH; W es O;
X es CH2, CHMe, CMe2, CHF, CF2 o CD2;
Y es N o CR";
Z es N o CR";
cada R" se selecciona independientemente de H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R1 es
Figure imgf000006_0001
halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, esterilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, fosforamidilo, en el que R1 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
Y1 es O o S;
Y2 es OH, OR12, Oalquilo o BH I^VT;
Y3 es OH o BH3-M+;
R2 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R2 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R3 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R6 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, etinilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R6 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R8 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, benciloxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R8 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R9 es hidrógeno, metilo, etilo, terc-butilo, alquilo, alquilo(C6-C16), alquilo(C6-C22), halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, cicloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R9 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R10 es hidrógeno, alquilo, alquilo ramificado, cicloalquilo, lípido, metilo, etilo, isopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, butilo, pentilo, hexilo, neopentilo, bencilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R10 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R11 es hidrógeno, deuterio, alquilo, metilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R11 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R12 es hidrógeno, alquilo, arilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, aromático, heteroaromático, fenilo 4-sustituido, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromofenilo, naftilo o heterociclilo, en el que R12 es opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R13 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R13 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R14 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R14 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y
R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo;
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso derivado de ácidos grasos esenciales y/o no esenciales.
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso insaturado, poliinsaturado, omega insaturado u omega poliinsaturado derivado de ácidos grasos esenciales y/o no esenciales.
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso derivado de ácidos grasos esenciales y no esenciales que tienen una o más de sus unidades de carbono sustituidas con oxígeno, nitrógeno o azufre.
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso insaturado, poliinsaturado, omega insaturado u omega poliinsaturado derivado de ácidos grasos esenciales y/o no esenciales que tienen una o más de sus unidades de carbono sustituidas con oxígeno, nitrógeno o azufre.
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso derivado de ácidos grasos esenciales y/o no esenciales que está opcionalmente sustituido.
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso insaturado, poliinsaturado, omega insaturado u omega poliinsaturado derivado de ácidos grasos esenciales y/o no esenciales que está opcionalmente sustituido.
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso derivado de ácidos grasos esenciales y/o no esenciales que tienen una o más de sus unidades de carbono sustituidas con oxígeno, nitrógeno o azufre que está opcionalmente sustituido.
En determinados modos de realización, el lípido es un alcohol graso, amina grasa o tiol graso insaturado, poliinsaturado, omega insaturado u omega poliinsaturado derivado de ácidos grasos esenciales y/o no esenciales que tienen una o más de sus unidades de carbono sustituidas con oxígeno, nitrógeno o azufre que también está opcionalmente sustituido.
En determinados modos de realización, el lípido es hexadeciloxipropilo.
En determinados modos de realización, el lípido es 2-aminohexadeciloxipropilo.
En determinados modos de realización, el lípido es 2-aminoaraquidilo.
En determinados modos de realización, el lípido es 2-benciloxihexadeciloxipropilo.
En determinados modos de realización, el lípido es laurilo, miristilo, palmitilo, estearilo, araquidilo, behenilo o lignocerilo.
En determinados modos de realización, el lípido es un esfingolípido que tiene la fórmula:
Figure imgf000008_0001
en la que,
R8 del esfingolípido es hidrógeno, alquilo, C(=O)R12, C(=O)OR12 o C(=O)NHR12;
R9 del esfingolípido es hidrógeno, fluoro, OR12, OC(=O)R12, OC(=O)OR12 o OC(=O)NHR12;
R10 del esfingolípido es una cadena de alquilo saturada o insaturada de más de 6 y menos de 22 carbonos opcionalmente sustituida con uno o más halógenos o hidroxi o una estructura de la siguiente fórmula:
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0001
n es de 8 a 14 o de inferior o igual a 8 a inferior o igual a 14, o es de 9 a 15 o de inferior o igual a 9 a inferior o igual a 15, el total o m y n es de 8 a 14 o de inferior o igual a 8 a inferior o igual a 14, el total de m y o es de 9 a 15 o de inferior o igual a 9 a inferior o igual a 15; o
Figure imgf000009_0002
n es de 4 a 10 o de inferior o igual a 4 a inferior o igual a 10, o es de 5 a 11 o de inferior o igual a 5 a inferior o igual a 11, el total de m y n es de 4 a 10 o de inferior o igual a 4 a inferior o igual a 10, y el total de m y o es de 5 a 11 o de inferior o igual a 5 a inferior o igual a 11; o
Figure imgf000009_0003
n es de 6 a 12 o n es de inferior o igual a 6 a inferior o igual a 12, el total de m y n es de 6 a 12 o n es de inferior o igual a 6 a inferior o igual a 12;
R11 del esfingolípido es OR12, OC(=O)R12, OC(=O)OR12 o OC(=O)NHR12;
R12 del esfingolípido es hidrógeno, una cadena estrecha o ramificada de alquiloC-M2, alquiloC-i3-22, cicloalquilo o arilo seleccionado de bencilo o fenilo, en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno o más R13 iguales o diferentes; y R13 del esfingolípido es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo.
En determinados modos de realización, R12 del esfingolípido es H, alquilo, metilo, etilo, propilo, n-butilo, alquilo ramificado, isopropilo, 2-butilo, 1 -etilpropilo, 1 -propilbutilo, cicloalquilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, bencilo, fenilo, fenilo monosustituido, fenilo disustituido, fenilo trisustituido o alquilo de cadena larga C12-C19 saturado o insaturado.
En determinados modos de realización, el esfingolípido tiene la fórmula:
en la que,
R8 del esfingolípido es hidrógeno, hidroxi, fluoro, OR12, OC(=O)R12, OC(=O)OR12 o OC(=O)NHR12;
R9 del esfingolípido es hidrógeno, hidroxi, fluoro, OR12, OC(=O)R12, OC(=O)OR12 o OC(=O)NHR12;
R10 del esfingolípido es una cadena de alquilo saturada o insaturada de más de 6 y menos de 22 carbonos opcionalmente sustituida con uno o más halógenos o una estructura de la siguiente fórmula:
CH3(CH2)n/ V CF3(CF2)m(CH2)n/ V
n es de 8 a 14 o de inferior o igual a 8 a inferior o igual a 14, el total o m y n es de 8 a 14 o de inferior o igual a 8 a inferior o igual a 14;
R12 del esfingolípido es hidrógeno, una cadena estrecha o ramificada de alquiloC1-12, alquiloC13-22, cicloalquilo o arilo seleccionado de bencilo o fenilo, en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno o más R13 iguales o diferentes; y
R13 del esfingolípido es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo.
En determinados modos de realización, R12 del esfingolípido es H, alquilo, metilo, etilo, propilo, n-butilo, alquilo ramificado, isopropilo, 2-butilo, 1-etilpropilo, 1 -propilbutilo, cicloalquilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, bencilo, fenilo, fenilo monosustituido, fenilo disustituido, fenilo trisustituido o alquilo de cadena larga C12-C19 saturado o insaturado.
Los esfingolípidos adecuados incluyen esfingosina, ceramida o esfingomielina, o 2-aminoalquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes.
Otros esfingolípidos adecuados incluyen 2-aminooctadecano-3,5-diol; (2S,3S,5S)-2-aminooctadecano-3,5-diol; (2S,3R,5S)-2-aminooctadecano-3,5-diol; 2-(metilamino)octadecano-3,5-diol; (2S,3R,5S)-2-(metilamino)octadecano-3,5-diol; 2-(dimetilamino)octadecano-3,5-diol; (2R,3S,5S)-2-(dimetilamino)octadecano-3.5- diol; 1-(pirrolidin-2-il)hexadecano-1,3-diol; (1S,3S)-1-((S)-pirrolidin-2-il)hexadecano-1,3-diol; 2-amino-11,11-difluorooctadecano-3,5-diol; (2S,3S,5S)-2-amino-11,11-difluorooctadecano-3,5-diol; 11,11-difluoro-2-(metilamino)octadecano-3,5-diol; (2S,3S,5S)-11,11-difluoro-2-(metilamino)octadecano-3,5-diol; N-((2S,3S,5S)-3.5- dihidroxioctadecan-2-il)acetamida; N-((2S,3S,5S)-3,5-dihidroxioctadecan-2-il)palmitamida; 1-(1-aminociclopropil)hexadecano-1,3-diol; (1S,3R)-1-(1-aminociclopropil)hexadecano-1,3-diol; (1S,3S)-1-(1-aminociclopropil)hexadecano-1,3-diol; 2-amino-2-metiloctadecano-3,5-diol; (3S,5S)-2-amino-2-metiloctadecano-3.5- diol; (3S,5R)-2-amino-2-metiloctadecano-3,5-diol; (3S,5S)-2-metil-2-(metilamino)octadecano-3,5-diol; 2-amino-5-hidroxi-2-metiloctadecan-3-ona; oxima de (Z)-2-amino-5-hidroxi-2-metiloctadecan-3-ona; (2S,3R,5R)-2-amino-6,6-difluorooctadecano-3,5-diol; (2S,3S,5R)-2-amino-6,6-difluorooctadecano-3,5-diol; (2S,3S,5S)-2-amino-6.6- difluorooctadecano-3,5-diol; (2S,3R,5S)-2-amino-6,6-difluorooctadecano-3,5-diol; y (2S,3S,5s)-2-amino-18,18,18-trifluorooctadecano-3,5-diol; que pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. Q es O.
R7 es hidrógeno.
En determinados modos de realización, R1 es
Figure imgf000010_0001
En determinados modos de realización, R8 es hidrógeno, hidroxi o benciloxi.
En determinados modos de realización, R9 es alquilo(C6-C-i6) o alquilo(C6-C22).
En determinados modos de realización, R9 es terc-butilo o isobutilo.
W es O;
En determinados modos de realización, R1 es
Figure imgf000011_0001
En determinados modos de realización, R9 es alquilo(C6-C16) o alquilo(C6-C22).
En determinados modos de realización, R10 es isopropilo.
En determinados modos de realización, R11 es metilo.
En determinados modos de realización, R12 es fenilo.
En determinados modos de realización, R13 es hidrógeno.
En determinados modos de realización, R14 es hidrógeno.
En determinados modos de realización, R2 es hidrógeno.
En determinados modos de realización, R3 es hidroxi.
En determinados modos de realización, R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno o fluoro.
En determinados modos de realización, R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, metilo, etinilo o alenilo.
En determinados modos de realización, R6 es hidrógeno.
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto de fórmula I, teniendo la fórmula IA
Figure imgf000011_0002
X es CH2, CHMe, CMe2, CHF, CF2 o CD2;
Y es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R1 es
Figure imgf000012_0001
amino, mercapto, formilo, esterilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, fosforamidilo, en el que R1 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
Y1 es O o S;
Y2 es OH, OR12, Oalquilo o BH I^VT;
Y3 es OH o BH3-M+;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R7 es hidrógeno;
R8 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, benciloxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R8 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R9 es hidrógeno, metilo, etilo, terc-butilo, alquilo, alquilo(C6-C16), alquilo(C6-C22), halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, cicloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R9 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R10 es hidrógeno, alquilo, alquilo ramificado, cicloalquilo, lípido, metilo, etilo, isopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, butilo, pentilo, hexilo, neopentilo, bencilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R10 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R11 es hidrógeno, deuterio, alquilo, metilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R11 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R12 es hidrógeno, alquilo, arilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, aromático, heteroaromático, fenilo 4-sustituido, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromofenilo, naftilo o heterociclilo, en el que R12 es opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R13 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R13 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R14 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R14 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y
R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo;
el lípido es como se describe en el presente documento.
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto de fórmula I, teniendo la fórmula IE
Figure imgf000014_0001
o una sal del mismo, en la que
Q-R7 es OH;
W es O;
X es CH2, CHMe, CMe2, CHF, CF2 o CD2;
Y es N o CR";
Z es No CR";
cada R" se selecciona independientemente de es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R2 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo, acido o heterociclilo, en el que R2 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R3 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R6 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, etinilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R6 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R15 es hidrógeno, -(C=O)Oalquilo, -(C=O)alquilo, -(C=O)NHalquilo, -(C=O)N-dialquilo, -(C=O)Salquilo, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquilo (C6-C16), alquilo (C6-C22), halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R15 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R15' es hidrógeno, -(C=O)Oalquilo, -(C=O)alquilo, -(C=O)NHalquilo, -(C=O)N-dialquilo, -(C=O)Salquilo, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquilo (C6-C16), alquilo (C6-C22), halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que cada R15' está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R15 y R15' pueden formar un anillo que está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y
R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formulo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo.
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto de fórmula II,
Figure imgf000015_0001
o una sal del mismo, en la que
Q-R7 es OH;
W es O;
X es CH2 u O;
Y es N o CR";
Z es N o CR";
cada R" se selecciona independientemente de es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R1 es monofosfato, difosfato, trifosfato,
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
Y1 es O o S;
Y2 es OH, OR12, Oalquilo o BH I^VT;
Y3 es OH o BH3-M+;
R2 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo, acido o heterociclilo, en el que R2 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R3 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R6 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, etinilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R6 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R8 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, benciloxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R8 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R9 es hidrógeno, metilo, etilo, terc-butilo, alquilo, alquilo(C6-C16), alquilo(C6-C22), halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, cicloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R9 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R10 es hidrógeno, alquilo, alquilo ramificado, cicloalquilo, lípido, metilo, etilo, isopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, butilo, pentilo, hexilo, neopentilo, bencilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R10 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R11 es hidrógeno, deuterio, alquilo, metilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R11 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R12 es hidrógeno, alquilo, arilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, aromático, heteroaromático, fenilo 4-sustituido, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromofenilo, naftilo o heterociclilo, en el que R12 es opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R13 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R13 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R14 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R14 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes;
R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo; y
el lípido es como se describe en el presente documento. En determinados modos de realización, cualquier cita de alquilo superior, alquilo(C6-C16) se puede sustituir por alquilo(C6-C22).
En determinados modos de realización, cualquier cita de alquilo superior, alquilo(C6-C16) o alquilo (C6-C22) se puede sustituir por polietilenglicol o -CH2(CH2OCH2)nCH3, en el que n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20 o 30-100. Procedimientos de uso
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a procedimientos para tratar o prevenir una infección vírica que comprenden administrar una cantidad eficaz de un compuesto divulgado en el presente documento a un sujeto que lo necesite.
En determinados modos de realización, la infección vírica es, o está causada por, un alfavirus, flavivirus o coronavirus ortomixovirus o paramixovirus, o RSV, influenza, virus de Powassan o filovirus o virus del Ébola. En determinados modos de realización, la infección vírica es, o está causada por, un virus seleccionado de coronavirus del MERS, virus de encefalitis equina oriental, virus de encefalitis equina occidental, virus de encefalitis equina venezolana, virus del río Ross, virus del bosque Barmah, virus de Powassan y virus de chikungunya.
En determinados modos de realización, el compuesto se administra por inhalación a través de los pulmones. En algunos modos de realización, el sujeto corre el riesgo de presentar síntomas de o recibir un diagnóstico de virus de la gripe A, incluyendo el subtipo H1N1, H3N2, H7N9 o H5N1, virus de la gripe B, virus de la gripe C, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, rotavirus. D, rotavirus E, coronavirus humano, coronavirus del SARS, coronavirus del MERS, tipos de adenovirus humanos (HAdV-1 a 55), papilomavirus humano (VPH) tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59, parvovirus B19, virus del molusco contagioso, virus JC (j Cv ), virus BK, poliomavirus de células de Merkel, virus de Coxsackie A, norovirus, virus de la rubéola, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus del Dengue, virus de chikungunya, virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus de la encefalitis equina occidental (WEEV), virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), virus del río Ross, virus del bosque de Barmah, virus de la fiebre amarilla, virus del sarampión, virus de las paperas, virus respiratorio sincicial, virus de la peste bovina, virus de la encefalitis de California, hantavirus, virus de la rabia, virus del ébola, virus de Marburgo, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus de la varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus linfotrópico del herpes, roseolovirus o herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, virus de la hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E o de inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotrópico T humano tipo I (HTLV-1), virus de Friend formador de foco en el bazo (SFFV) o virus xenotrópico relacionado con MuLV (XMRV).
En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica virus de la gripe A, incluyendo los subtipos H1N1, H3N2, H7N9, H5N1 (ruta baja) y H5N1 (ruta alta) virus de la gripe B, virus de la gripe C, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, rotavirus. D, rotavirus E, coronavirus del SRAS, MERS-CoV, tipos de adenovirus humanos (HAdV-1 a 55), papilomavirus humano (VPH) tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59, parvovirus B19, virus del molusco contagioso, virus JC (JCV), virus BK, poliomavirus de células de Merkel, virus de Coxsackie A, norovirus, virus de la rubéola, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus de la fiebre amarilla, virus del sarampión, virus de las paperas, virus respiratorio sincicial, virus paragripales 1 y 3, virus de la peste bovina, virus de chikungunya, virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), virus de la encefalitis equina occidental (WEEV), virus de la encefalitis de California, virus de la encefalitis japonesa, virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV), hantavirus, virus del Dengue serotipos 1, 2, 3 y 4, virus del Nilo Occidental, virus Tacaribe, virus de Junín, virus de la rabia, virus del ébola, virus de Marburgo, adenovirus, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus de la varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus linfotrópico del herpes, roseolovirus o herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, virus de hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E o de inmunodeficiencia humana (VIH).
En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica gastroenteritis, enfermedad respiratoria aguda, síndrome respiratorio agudo grave, síndrome de fatiga posvírica, fiebres hemorrágicas víricas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida o hepatitis.
Se contempla que los compuestos y composiciones farmacéuticas divulgados en el presente documento se administren en combinación con otros agentes antivíricos tales como abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevir, cidofovir, combivir, daclatasvir, darunavir, dasabuvir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, interferón tipo III, interferón tipo II, interferón tipo I, lamivudina, ledipasvir, lopinavir, loviride, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, ombitasvir, oseltamivir, paritaprevir, peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, simeprevir, sofosbuvir, estavudina, telaprevir, telbivudina, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina zalcitabina, zanamivir o zidovudina y combinaciones de los mismos.
Formulaciones
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables, como se describe en general a continuación. Algunos ejemplos preferentes de ácidos orgánicos y/o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados son ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido acético y ácido cítrico, así como otros ácidos farmacéuticamente aceptables conocidos per se (para los cuales se hace referencia a las referencias mencionadas a continuación). Cuando los compuestos de la divulgación contienen un grupo ácido, así como un grupo básico, los compuestos de la divulgación también pueden formar sales internas, y dichos compuestos están dentro del alcance de la divulgación. Cuando un compuesto contiene un heteroátomo donante de hidrógeno (por ejemplo, NH), se contempla que las sales cubran los isómeros formados por transferencia de dicho átomo de hidrógeno a un grupo o átomo básico dentro de la molécula.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos incluyen las sales de adición de ácido y básicas de los mismos. Las sales de adición de ácido adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas. Los ejemplos incluyen las sales de acetato, adipato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, borato, camsilato, citrato, ciclamato, edisilato, esilato, formiato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hexafluorofosfato, hibenzato, clorhidrato/cloruro, bromhidrato/bromuro, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, 2-napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogenofosfato/dihidrogenofosfato, piroglutamato, sacarato, estearato, succinato, tanato, tartrato, tosilato, trifluoroacetato y xinofoato. Las sales básicas adecuadas se forman a partir de bases que forman sales no tóxicas. Los ejemplos incluyen las sales de aluminio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, trometamina y zinc. También se pueden formar hemisales de ácidos y bases, por ejemplo, sales de hemisulfato y hemicalcio. Para una revisión sobre las sales adecuadas, véase Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, 2002).
Los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar en forma de profármacos. Un profármaco puede incluir un vehículo unido covalentemente que libera el fármaco original activo cuando se administra a un sujeto mamífero. Se pueden preparar profármacos modificando grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escindan, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, en los compuestos originales. Los profármacos incluyen, por ejemplo, compuestos en los que un grupo hidroxilo está unido a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo libre. Los ejemplos de profármacos incluyen derivados de acetato, formiato y benzoato de grupos funcionales alcohol en los compuestos. Los procedimientos para estructurar un compuesto como profármacos se pueden encontrar en el libro de Testa y Mayer, Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley (2006). Los profármacos típicos forman el metabolito activo mediante la transformación del profármaco por enzimas hidrolíticas, la hidrólisis de amida, lactamas, péptidos, ésteres de ácidos carboxílicos, epóxidos o la escisión de ésteres de ácidos inorgánicos.
Las composiciones farmacéuticas para su uso en la presente divulgación comprenden típicamente una cantidad eficaz de un compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Se pueden preparar las preparaciones de una manera conocida per se, que normalmente implica mezclar el al menos un compuesto de acuerdo con la divulgación con el uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, si se desea, en combinación con otros compuestos activos farmacéuticos, cuando sea necesario bajo condiciones asépticas. De nuevo, se hace referencia a la patente de EE. UU. n.° 6.372.778, la patente de EE. UU. n.° 6.369.086, la patente de EE. UU. n.° 6.369.087 y la patente de EE. UU. n.° 6.372.733 y las referencias adicionales mencionadas anteriormente, así como a los manuales estándar, tales como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
En general, para uso farmacéutico, se pueden formular los compuestos como una preparación farmacéutica que comprende al menos un compuesto y al menos un vehículo, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Las preparaciones farmacéuticas de la divulgación están preferentemente en una forma farmacéutica de dosificación unitaria, y se pueden envasar adecuadamente, por ejemplo, en una caja, blíster, vial, frasco, sobre, ampolla o en cualquier otro soporte o recipiente adecuado de dosis única o multidosis (que puede estar apropiadamente etiquetado); opcionalmente con uno o más prospectos que contienen información del producto y/o instrucciones de uso. En general, dichas dosificaciones unitarias contendrán entre 1 y 1000 mg, y normalmente entre 5 y 500 mg, del al menos un compuesto de la divulgación, por ejemplo, aproximadamente 10, 25, 50, 100, 200, 300 o 400 mg por dosificación unitaria.
Se pueden administrar los compuestos mediante una variedad de vías, incluyendo la vía oral, ocular, rectal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular o intranasal, dependiendo principalmente de la preparación específica usada. En general, se administrará el compuesto en una "cantidad eficaz", lo que significa cualquier cantidad de un compuesto que, tras una administración adecuada, sea suficiente para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado en el sujeto al que se le administra. Normalmente, dependiendo de la afección que se vaya a prevenir o tratar y la vía de administración, dicha cantidad eficaz estará normalmente entre 0,01 y 1000 mg por kilogramo de peso corporal del paciente por día, más a menudo entre 0,1 y 500 mg, tal como entre 1 y 250 mg, por ejemplo aproximadamente 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200 o 250 mg, por kilogramo de peso corporal del paciente por día, que se pueden administrar como una dosis única diaria, dividida en una o más dosis diarias. El médico tratante puede determinar la(s) cantidad(es) que se van a administrar, la vía de administración y el régimen de tratamiento adicional, dependiendo de factores tales como la edad, el sexo y el estado general del paciente y la naturaleza y gravedad de la enfermedad o los síntomas que se van a tratar. De nuevo, se hace referencia a la patente de EE. UU. n.° 6.372.778, la patente de EE. UU. n.° 6.369.086, la patente de EE. UU. n.° 6.369.087 y la patente de EE. UU. n.° 6.372.733 y las referencias adicionales mencionadas anteriormente, así como a los manuales estándar, tales como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
Dependiendo de la forma de introducción, los compuestos descritos en el presente documento se pueden formular de una variedad de formas. Se pueden preparar formulaciones que contienen uno o más compuestos en diversas formas farmacéuticas, tales como gránulos, comprimidos, cápsulas, supositorios, polvos, formulaciones de liberación controlada, suspensiones, emulsiones, cremas, geles, pomadas, bálsamos, lociones o aerosoles. Preferentemente, estas formulaciones se emplean en formas farmacéuticas sólidas adecuadas para la administración simple, y preferentemente oral, de dosificaciones precisas. Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral incluyen comprimidos, cápsulas blandas o duras de gelatina o no gelatinosas y comprimidos oblongos. Sin embargo, también se pueden utilizar formas farmacéuticas líquidas, tales como soluciones, jarabes, suspensión, batidos, etc. En otro modo de realización, se administra la formulación por vía tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen lociones, pomadas, cremas y geles. En un modo de realización preferente, la formulación tópica es un gel. En otro modo de realización, se administra la formulación por vía intranasal.
Se pueden preparar formulaciones que contienen uno o más de los compuestos descritos en el presente documento usando un vehículo farmacéuticamente aceptable compuesto de materiales que se consideran seguros y eficaces y se pueden administrar a un individuo sin causar efectos secundarios biológicos indeseables o interacciones no deseadas. El vehículo son todos los componentes presentes en la formulación farmacéutica distintos del ingrediente o ingredientes activos. Como se usa en general en el presente documento, "vehículo" incluye, pero no se limita a, diluyentes, aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, cargas, agentes modificadores del pH, conservantes, antioxidantes, potenciadores de la solubilidad y composiciones de recubrimiento.
El vehículo también incluye todos los componentes de la composición de recubrimiento que pueden incluir plastificantes, pigmentos, colorantes, agentes estabilizantes y fluidificantes. Se pueden preparar formulaciones de dosificación de liberación retardada, liberación prolongada y/o liberación pulsátil como se describe en referencias estándar tales como "Pharmaceutical dosage form tablets", eds. Liberman et al. (Nueva York, Marcel Dekker, Inc., 1989), "Remington - The science and practice of pharmacy", 20.a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, y "Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems", 6.a edición, Ansel et al., (Media, PA: Williams y Wilkins, 1995). Estas referencias proporcionan información sobre vehículos, materiales, equipos y procedimientos para preparar comprimidos y cápsulas y formas farmacéuticas de liberación retardada de comprimidos, cápsulas y gránulos.
Ejemplos de materiales de recubrimiento adecuados incluyen polímeros de celulosa tales como acetato-ftalato de celulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa; acetato-ftalato de polivinilo, polímeros y copolímeros de ácido acrílico y resinas metacrílicas que están disponibles comercialmente con el nombre comercial EUDRAGIT® (Roth Pharma, Westerstadt, Alemania), zeína, goma laca y polisacáridos.
Además, el material de recubrimiento puede contener vehículos convencionales tales como plastificantes, pigmentos, colorantes, fluidificantes, agentes de estabilización, formadores de poros y tensioactivos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales presentes en los comprimidos, perlas, gránulos o partículas que contienen fármaco incluyen diluyentes, aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, colorantes, estabilizantes y tensioactivos. Los diluyentes, también denominados "cargas", son típicamente necesarios para incrementar el volumen de una forma farmacéutica sólida de modo que se proporcione un tamaño práctico para la compresión de comprimidos o la formación de perlas y gránulos. Los diluyentes adecuados incluyen dihidrato de fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, cloruro de sodio, almidón seco, almidones hidrolizados, almidón pregelatinizado, dióxido de silicona, óxido de titanio, silicato de aluminio y magnesio y azúcar en polvo.
Se usan aglutinantes para impartir cualidades cohesivas a una formulación de dosificación sólida y asegurar por tanto que un comprimido o perla o gránulo permanezca intacto después de la formación de las formas farmacéuticas. Los materiales aglutinantes adecuados incluyen almidón, almidón pregelatinizado, gelatina, azúcares (incluyendo sacarosa, glucosa, dextrosa, lactosa y sorbitol), polietilenglicol, ceras, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto, alginato de sodio, celulosa, incluyendo hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etilcelulosa y veegum, y polímeros sintéticos tales como copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, copolímeros de metacrilato de aminoalquilo, ácido poliacrílico/ácido polimetacrílico y polivinilpirrolidona.
Se usan lubricantes para facilitar la fabricación de comprimidos. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, behenato de glicerol, polietilenglicol, talco y aceite mineral.
Se usan desintegrantes para facilitar la desintegración o "ruptura" de la forma farmacéutica después de la administración y, en general, incluyen almidón, glicolato sódico de almidón, carboximetilalmidón sódico, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilcelulosa, almidón pregelatinizado, arcillas, celulosa, alginina, gomas o polímeros reticulados, tales como PVP reticulado (Polyplasdone XL de GAF Chemical Corp).
Se usan estabilizantes para inhibir o retardar reacciones de descomposición de fármacos que incluyen, a modo de ejemplo, reacciones oxidativas.
Los tensioactivos pueden ser agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos, anfóteros o no iónicos. Los tensioactivos aniónicos adecuados incluyen aquellos que contienen iones carboxilato, sulfonato y sulfato. Los ejemplos de tensioactivos aniónicos incluyen sodio, potasio, amonio o alquilsulfonatos y alquilarilsulfonatos de cadena larga tales como dodecilbencenosulfonato de sodio; dialquilsulfosuccinatos de sodio, tales como dodecilbencenosulfonato de sodio; dialquilsulfosuccinatos de sodio, tales como bis-(2-etiltioxil)-sulfosuccinato de sodio; y alquilsulfatos tales como lauril sulfato de sodio. Los tensioactivos catiónicos incluyen compuestos de amonio cuaternario tales como cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, bromuro de cetrimonio, cloruro de estearil dimetilbencil amonio, polioxietileno y amina de coco. Los ejemplos de tensioactivos no iónicos incluyen monoestearato de etilenglicol, miristato de propilenglicol, monoestearato de glicerilo, estearato de glicerilo, 4-oleato de poliglicerilo, acilato de sorbitán, acilato de sacarosa, PEG-150 laurato, PEG-400 monolaurato, polioxietileno monolaurato, polisorbatos, polioxietileno octilfeniléter, PEG-1000 cetil éter, polioxietileno tridecil éter, polipropilenglicol butil éter, Poloxamer® 401, estearoil monoisopropanolamida y polioxietilen amida de sebo hidrogenada. Los ejemplos de tensioactivos anfóteros incluyen N-dodecil-p-alanina sódica, N-lauril-piminodipropionato sódico, miristoanfoacetato, lauril betaína y lauril sulfobetaína.
Si se desea, los comprimidos, perlas, gránulos o partículas también pueden contener una cantidad menor de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tintes, agente de tamponación del pH o conservantes.
La concentración del compuesto con respecto al vehículo y/u otras sustancias puede variar de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 100% en peso (porcentaje en peso). Para uso oral, la formulación farmacéutica contendrá en general de aproximadamente un 5 a aproximadamente un 100 % en peso del material activo. Para otros usos, la formulación farmacéutica tendrá en general de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 50 % en peso del material activo.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden ser formulaciones para liberación modificada o controlada. Los ejemplos de formas farmacéuticas de liberación controlada incluyen formas farmacéuticas de liberación prolongada, formas farmacéuticas de liberación retardada, formas farmacéuticas de liberación pulsátil y combinaciones de las mismas.
Las formulaciones de liberación prolongada se preparan en general como sistemas osmóticos o de difusión, por ejemplo, como se describe en "Remington - The science and practice of pharmacy" (20.a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000). Un sistema de difusión típicamente consiste en dos tipos de dispositivos, un depósito y una matriz, y se conoce bien y se describe en la técnica. Los dispositivos de matriz se preparan en general comprimiendo el fármaco con un vehículo de polímero de disolución lenta en forma de comprimido. Los tres tipos principales de materiales usados en la preparación de dispositivos de matriz son plásticos insolubles, polímeros hidrófilos y compuestos grasos. Las matrices de plástico incluyen acrilato de metilo-metacrilato de metilo, cloruro de polivinilo y polietileno. Los polímeros hidrófilos incluyen polímeros celulósicos tales como metil y etilcelulosa, hidroxialquilcelulosas tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y Carbopol® 934, óxidos de polietileno y mezclas de los mismos. Los compuestos grasos incluyen diversas ceras, tales como cera de carnauba y triestearato de glicerilo y sustancias de tipo cera que incluyen aceite de ricino hidrogenado o aceite vegetal hidrogenado, o mezclas de los mismos.
En determinados modos de realización preferentes, el material plástico es un polímero acrílico farmacéuticamente aceptable, que incluye copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, metacrilato de metilo, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), copolímero de alquilamina y ácido metacrílico, poli(metacrilato de metilo), poli(ácido metacrílico) (anhídrido), polimetacrilato, poliacrilamida, poli(anhídrido de ácido metacrílico) y copolímeros de metacrilato de glicidilo.
En determinados modos de realización preferentes, el polímero acrílico está compuesto de uno o más copolímeros de metacrilato de amonio. Los copolímeros de metacrilato de amonio son bien conocidos en la técnica y se describen en NF XVII como copolímeros completamente polimerizados de ésteres de ácido acrílico y metacrílico con un bajo contenido de grupos amonio cuaternario.
En un modo de realización preferente, el polímero acrílico es una laca de resina acrílica tal como la que está disponible comercialmente en Rohm Pharma con el nombre comercial Eudragit®. En otros modos de realización preferentes, el polímero acrílico comprende una mezcla de dos lacas de resina acrílica disponibles comercialmente de Rohm Pharma con los nombres comerciales Eudragit® RL30D y Eudragit® RS30D, respectivamente. Eudragit® RL30D y Eudragit® RS30D son copolímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos con un bajo contenido de grupos amonio cuaternario, siendo la proporción molar entre los grupos amonio y los ésteres (met)acrílicos neutros restantes de 1:20 en Eudragit® RL30D y de 1:40 en Eudragit® RS30D. El peso molecular medio es de aproximadamente 150000. También son preferentes Edragit® S-100 y Eudragit® L-100. Las designaciones de código RL (alta permeabilidad) y RS (baja permeabilidad) se refieren a las propiedades de permeabilidad de estos agentes. Las mezclas de Eudragit® RL/RS son insolubles en agua y en los fluidos digestivos. Sin embargo, los sistemas multiparticulados formados para incluir los mismos son hinchables y permeables en soluciones acuosas y en los fluidos digestivos.
Los polímeros descritos anteriormente, tales como Eudragit® RL/RS, se pueden mezclar entre sí en cualquier proporción deseada para obtener finalmente una formulación de liberación mantenida que tenga un perfil de disolución deseable. Se pueden obtener sistemas multiparticulados de liberación mantenida deseables, por ejemplo, a partir de 100% de Eudragit® RL, 50% de Eudragit® RL y 50% de Eudragit® RS, y 10% de Eudragit® RL y 90 % de Eudragit® RS. Un experto en la técnica reconocerá que también se pueden usar otros polímeros acrílicos, tales como, por ejemplo, Eudragit® L.
De forma alternativa, se pueden preparar formulaciones de liberación prolongada usando sistemas osmóticos o aplicando un recubrimiento semipermeable a la forma farmacéutica. En el último caso, se puede lograr el perfil deseado de liberación del fármaco combinando materiales de recubrimiento de baja permeabilidad y alta permeabilidad en una proporción adecuada.
Se pueden combinar los dispositivos con diferentes mecanismos de liberación de fármacos descritos anteriormente en una forma farmacéutica final que comprende unidades únicas o múltiples. Los ejemplos de unidades múltiples incluyen comprimidos multicapa y cápsulas que contienen comprimidos, perlas o gránulos. Se puede añadir una parte de liberación inmediata al sistema de liberación prolongada por medio de la aplicación de una capa de liberación inmediata encima del núcleo de liberación prolongada usando un procedimiento de recubrimiento o compresión o en un sistema de unidades múltiples, tal como una cápsula que contiene perlas de liberación prolongada e inmediata.
Los comprimidos de liberación prolongada que contienen polímeros hidrófilos se preparan mediante técnicas comúnmente conocidas en la técnica tales como compresión directa, granulación húmeda o granulación en seco. Sus formulaciones normalmente incorporan polímeros, diluyentes, aglutinantes y lubricantes, así como el ingrediente farmacéutico activo. Los diluyentes normales incluyen sustancias inertes en polvo tales como almidones, celulosa en polvo, especialmente celulosa cristalina y microcristalina, azúcares tales como fructosa, manitol y sacarosa, harinas de granos y polvos comestibles similares. Los diluyentes típicos incluyen, por ejemplo, diversos tipos de almidón, lactosa, manitol, caolín, fosfato o sulfato de calcio, sales inorgánicas tales como cloruro de sodio y azúcar en polvo. También son útiles los derivados de celulosa en polvo. Los aglutinantes de comprimidos típicos incluyen sustancias tales como almidón, gelatina y azúcares tales como lactosa, fructosa y glucosa. También se pueden usar gomas naturales y sintéticas, que incluyen goma arábiga, alginatos, metilcelulosa y polivinilpirrolidona. También pueden servir como aglutinantes el polietilenglicol, polímeros hidrófilos, etilcelulosa y ceras. En la formulación de un comprimido es necesario un lubricante para evitar que el comprimido y los punzones se peguen al troquel. Se elige el lubricante entre sólidos resbaladizos tales como talco, estearato de magnesio y calcio, ácido esteárico y aceites vegetales hidrogenados.
Los comprimidos de liberación prolongada que contienen materiales de cera se preparan en general usando procedimientos conocidos en la técnica tales como un procedimiento de combinación directa, un procedimiento de solidificación y un procedimiento de dispersión acuosa. En el procedimiento de solidificación, se mezcla el fármaco con un material de cera y se solidifica por pulverización o se solidifica y se tamiza y procesa.
Las formulaciones de liberación retardada se crean recubriendo una forma farmacéutica sólida con una película de polímero, que es insoluble en el entorno ácido del estómago y soluble en el entorno neutro del intestino delgado.
Se pueden preparar las unidades de dosificación de liberación retardada, por ejemplo, recubriendo un fármaco o una composición que contiene un fármaco con un material de recubrimiento seleccionado. La composición que contiene un fármaco puede ser, por ejemplo, un comprimido para incorporar en una cápsula, un comprimido para su uso como núcleo interno en una forma farmacéutica de "núcleo recubierto" o una pluralidad de perlas, partículas o gránulos que contienen fármaco, para su incorporación en un comprimido o cápsula. Los materiales de recubrimiento preferentes incluyen polímeros bioerosionables, gradualmente hidrolizables, gradualmente solubles en agua y/o enzimáticamente degradables, y pueden ser polímeros "entéricos" convencionales. Los polímeros entéricos, como apreciarán los expertos en la técnica, se vuelven solubles en el entorno de mayor pH del tubo gastrointestinal inferior o se erosionan lentamente a medida que la forma farmacéutica pasa a través del tubo gastrointestinal, mientras que los polímeros enzimáticamente degradables se degradan por las enzimas bacterianas presentes en el tubo gastrointestinal inferior, en particular en el colon. Los materiales de recubrimiento adecuados para efectuar una liberación retardada incluyen polímeros celulósicos tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, ftalato-acetato de celulosa, trimelitato-acetato de celulosa y carboximetilcelulosa sódica; polímeros y copolímeros de ácido acrílico, preferentemente formados a partir de ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilato de metilo, acrilato de etilo, metacrilato de metilo y/o metacrilato de etilo y otras resinas metacrílicas que están disponibles comercialmente con el nombre comercial Eudragit® (Rohm Pharma; Westerstadt, Alemania), incluyendo Eudragit® L30D-55 y L100-55 (soluble a pH 5,5 y superior), Eudragit® L-100 (soluble a pH 6,0 y superior), Eudragit® S (soluble a pH 7,0 y superior, como resultado de un mayor grado de esterificación) y Eudragit® NE, RL y RS (polímeros insolubles en agua que tienen diferentes grados de permeabilidad y capacidad de expansión); polímeros y copolímeros de vinilo tales como polivinilpirrolidona, acetato de vinilo, ftalato de vinilacetato, copolímero de vinilacetato-ácido crotónico y copolímero de etileno-vinilacetato; polímeros enzimáticamente degradables tales como polímeros azo, pectina, quitosano, amilosa y goma guar; zeína y goma laca. También se pueden usar combinaciones de diferentes materiales de recubrimiento. También se pueden aplicar recubrimientos multicapa que usan diferentes polímeros.
Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los pesos de recubrimiento preferentes para materiales de recubrimiento particulares evaluando perfiles de liberación individuales para comprimidos, perlas y gránulos preparados con diferentes cantidades de diversos materiales de recubrimiento. Es la combinación de materiales, procedimiento y forma de aplicación lo que produce las características de liberación deseadas, que solo se pueden determinar a partir de los estudios clínicos.
La composición del recubrimiento puede incluir aditivos convencionales, tales como plastificantes, pigmentos, colorantes, agentes estabilizantes, fluidificantes, etc. Normalmente está presente un plastificante para reducir la fragilidad del recubrimiento, y en general representará aproximadamente un 10 % en peso a un 50 % en peso con respecto al peso seco del polímero. Los ejemplos de plastificantes típicos incluyen polietilenglicol, propilenglicol, triacetina, ftalato de dimetilo, ftalato de dietilo, ftalato de dibutilo, sebacato de dibutilo, citrato de trietilo, citrato de tributilo, citrato de trietilacetilo, aceite de ricino y monoglicéridos acetilados. Se usa preferentemente un agente estabilizante para estabilizar las partículas en la dispersión. Los agentes estabilizantes típicos son emulsionantes no iónicos tales como ésteres de sorbitán, polisorbatos y polivinilpirrolidona. Se recomiendan fluidificantes para reducir los efectos de adherencia durante la formación y el secado de la película y, en general, representan aproximadamente un 25% en peso a un 100% en peso del peso del polímero en la solución de recubrimiento. Un fluidificante eficaz es el talco. También se pueden usar otros fluidificantes tales como estearato de magnesio y monoestearatos de glicerol. También se pueden usar pigmentos tales como dióxido de titanio. También se pueden añadir a la composición de recubrimiento pequeñas cantidades de un agente antiespumante, como una silicona (por ejemplo, simeticona).
La formulación puede proporcionar un suministro pulsátil de uno o más compuestos. Por "pulsátil" se entiende que una pluralidad de dosis de fármaco se liberan a intervalos de tiempo espaciados. En general, tras la ingestión de la forma farmacéutica, la liberación de la dosis inicial es sustancialmente inmediata, es decir, el primer "pulso" de liberación del fármaco se produce en el plazo de aproximadamente una hora después de la ingestión. Este pulso inicial va seguido de un primer intervalo de tiempo (tiempo de retraso) durante el cual se libera muy poco o ningún fármaco de la forma farmacéutica, después del cual se libera una segunda dosis. De forma similar, se puede diseñar un segundo intervalo casi libre de liberación de fármaco entre el segundo y el tercer pulso de liberación de fármaco. La duración del intervalo de tiempo casi libre de liberación del fármaco variará dependiendo del diseño de la forma farmacéutica, por ejemplo, un perfil de dosificación dos veces al día, un perfil de dosificación tres veces al día, etc. Para las formas farmacéuticas que proporcionan un perfil de dosificación dos veces al día, el intervalo de tiempo casi libre de liberación del fármaco tiene una duración de aproximadamente 3 horas a 14 horas entre la primera y la segunda dosis. Para las formas farmacéuticas que proporcionan un perfil de tres veces al día, el intervalo casi libre de liberación del fármaco tiene una duración de aproximadamente 2 horas a 8 horas entre cada una de las tres dosis.
En un modo de realización, el perfil de liberación pulsátil se logra con formas farmacéuticas que son cápsulas cerradas y preferentemente selladas que alojan al menos dos "unidades de dosificación" que contienen fármaco, en las que cada unidad de dosificación dentro de la cápsula proporciona un perfil de liberación de fármaco diferente. El control de la(s) unidad(es) de dosificación de liberación retardada se consigue mediante un recubrimiento de polímero de liberación controlada en la unidad de dosificación, o mediante la incorporación del agente activo en una matriz de polímero de liberación controlada. Cada unidad de dosificación puede comprender un comprimido compactado o moldeado, en la que cada comprimido dentro de la cápsula proporciona un perfil de liberación de fármaco diferente. Para las formas farmacéuticas que imitan un perfil de dosificación dos veces al día, un primer comprimido libera el fármaco sustancialmente de inmediato después de la ingestión de la forma farmacéutica, mientras que un segundo comprimido libera el fármaco aproximadamente de 3 horas a menos de 14 horas después de la ingestión de la forma farmacéutica. Para las formas farmacéuticas que imitan un perfil de dosificación de tres veces al día, un primer comprimido libera el fármaco sustancialmente de inmediato después de la ingestión de la forma farmacéutica, un segundo comprimido libera el fármaco aproximadamente de 3 horas a menos de 10 horas después de la ingestión de la forma farmacéutica, y el tercer comprimido libera el fármaco de al menos 5 horas a aproximadamente 18 horas después de la ingestión de la forma farmacéutica. Es posible que la forma farmacéutica incluya más de tres comprimidos. Aunque la forma farmacéutica no incluirá en general más de un tercer comprimido, se pueden utilizar formas farmacéuticas que alojen más de tres comprimidos.
De forma alternativa, cada unidad de dosificación en la cápsula puede comprender una pluralidad de perlas, gránulos o partículas que contienen fármaco. Como se conoce en la técnica, "perlas" que contienen fármaco se refiere a perlas preparadas con fármaco y uno o más excipientes o polímeros. Se pueden producir perlas que contienen fármaco aplicando fármaco a un soporte inerte, por ejemplo, perlas de azúcar inerte recubiertas con fármaco o creando un "núcleo" que comprende tanto el fármaco como uno o más excipientes. Como también se conoce, "gránulos" y "partículas" que contienen fármaco comprenden partículas de fármaco que pueden o no incluir uno o más excipientes o polímeros adicionales. A diferencia de las perlas que contienen fármacos, los gránulos y las partículas no contienen un soporte inerte. En general, los gránulos comprenden partículas de fármaco y requieren un procesamiento adicional. En general, las partículas son más pequeñas que los gránulos y no se procesan adicionalmente. Aunque se pueden formular perlas, gránulos y partículas para proporcionar una liberación inmediata, en general se emplean perlas y gránulos para proporcionar una liberación retardada.
En un modo de realización, se formula el compuesto para administración tópica. Las formas farmacéuticas tópicas adecuadas incluyen lociones, cremas, pomadas y geles. Un "gel" es un sistema semisólido que contiene una dispersión del agente activo, es decir, un compuesto, en un vehículo líquido que se vuelve semisólido por la acción de un agente espesante o material polimérico disuelto o suspendido en el vehículo líquido. El líquido puede incluir un componente lipófilo, un componente acuoso o ambos. Algunas emulsiones pueden ser geles o incluir de otro modo un componente de gel. Sin embargo, algunos geles no son emulsiones porque no contienen una combinación homogeneizada de componentes inmiscibles. Los procedimientos para preparar lociones, cremas, pomadas y geles son bien conocidos en la técnica.
El compuesto descrito en el presente documento se puede administrar de forma complementaria a otros compuestos activos. Estos compuestos incluyen analgésicos, antiinflamatorios, antipiréticos, antidepresivos, antiepilépticos, antihistamínicos, antimigrañosos, antimuscarínicos, ansiolíticos, sedantes, hipnóticos, antipsicóticos, broncodilatadores, antiasmáticos, fármacos cardiovasculares, corticosteroides, dopaminérgicos, electrolitos, fármacos gastrointestinales, relajantes musculares, agentes nutricionales, vitaminas, parasimpaticomiméticos, estimulantes, anorexígenos y antinarcolépticos. "Administración complementaria", como se usa en el presente documento, significa que el compuesto se puede administrar en la misma forma farmacéutica o en formas farmacéuticas separadas con uno o más de otros agentes activos.
Los ejemplos específicos de compuestos que se pueden administrar de forma complementaria a los compuestos incluyen aceclofenaco, acetaminofeno, adomexetina, almotriptán, alprazolam, amantadina, amcinonida, aminociclopropano, amitriptilina, amolodipina, amoxapina, anfetamina, aripiprazol, aspirina, atomoxetina, azasetrón, azatadina, beclometasona, benacticina, benoxaprofeno, bermoprofeno, betametasona, bicifadina, bromocriptina, budesonida, buprenorfina, bupropión, buspirona, butorfanol, butriptilina, cafeína, carbamazepina, carbidopa, carisoprodol, celecoxib, clordiazepóxido, clorpromacina, salicilato de colina, citalopram, clomipramina, clonazepam, clonidina, clonitaceno, clorazepato, clotiazepam, cloxazolam, clozapina, codeína, corticosterona, cortisona, ciclobenzaprina, ciproheptadina, demexiptilina, desipramina, desomorfina, dexametasona, dexanabinol, sulfato de dextroanfetamina, dextromoramida, dextropropoxifeno, dezocine, diazepam, dibenzepina, sodio diclofenaco, diflunisal, dihidrocodeína, dihidroergotamina, dihidromorfina, dimetacrina, divalproxex, dizatriptán, dolasetrón, donepezilo, dotiepina, doxepina, duloxetina, ergotamina, escitalopram, estazolam, etosuximida, etodolac, femoxetina, fenamatos, fenoprofeno, fentanilo, fludiazepam, fluoxetina, flufenazina, flurazepam, flurbiprofeno, flutazolam, fluvoxamina, frovatriptán, gabapentina, galantamina, gepirona, ginko bilboa, granisetrón, haloperidol, huperzina A, hidrocodona, hidrocortisona, hidromorfona, hidroxizina, ibuprofeno, imipramina, indiplón, indometacina, indoprofeno, ipsapirona, ketaserina, ketoprofeno, ketorolac, lesopitrona, levodopa, lipasa, lofepramina, lorazepam, loxapina, maprotilina, mazindol, ácido mefenámico, melatonina, melitraceno, memantina, meperidina, meprobamato, mesalamina, metapramina, metaxalona, metadona, metadona, metanfetamina, metildopa, metilfenidato, metilsalicilato, metisergid(e), metoclopramida, mianserina, mifepristona, milnacipran, minaprina, mirtazapina, moclobemide, modafinil (un antinarcoléptico), molindona, morfina, clorhidrato de morfina, nabumetona, nadolol, naproxeno, naratriptán, nefazodona, neurontin, nomifensina, nortriptilina, olanzapina, olsalazina, ondansetrón, opipramol, orfenadrina, oxaflozano, oxipracina, oxazepam, oxitriptán, oxicodona, oximorfona, pancrelipasa, parecoxib, paroxetina, pemolina, pentazozina, pepsina, perfenacina, fenacetina, fendimetracina, fenmetracina, fenilbutazona, fenitoína, fosfatidilserina, pimozida, pirlindol, piroxicam, pizotifeno, pizotilina, pramipexol, prednisolona, prednisona, pregabalina, propanolol, propizepina, propoxifeno, protriptilina, quazepam, quinupramina, reboxitina, reserpina, risperidona, ritanserina, rivastigmina, rizatriptán, rofecoxib, ropinirol, rotigotina, salsalato, sertralina, sibutramina, sildenafil, sulfasalazina, sulindac, sumatriptán, tacrina, temazepam, tetrabenozina, tiacidas, tioridazina, tiotixeno, tiaprida, tiasipirona, tizanidina, tofenacina, tolmetina, toloxatona, topiramato, tramadol, trazodona, triazolam, trifluoperazina, trimetobenzamida, trimipramina, tropisetrón, valdecoxib, ácido valproico, venlafaxina, viloxacina, vitamina E, zimeldina, ziprasidona, zolmitriptán, zolpidem, zopiclona e isómeros, sales y combinaciones de los mismos.
El agente o agentes activos adicionales se pueden formular para liberación inmediata, liberación controlada o combinaciones de las mismas.
Ejemplos
Ejemplo 1. La síntesis de N4-hidroxicitidina o 1-(3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil) tetrahidrofuran-2-il)-4-(hidroxiamino)pirimidin-2-ona (EIDD-01931)
La protección de la uridina por persililación va seguida de la activación de la posición 4 de la nucleobase por un grupo arilsulfonilo impedido (véase la figura 1). El desplazamiento de este grupo con hidroxilamina instala el resto N-4-hidroxi. La desprotección global usando una de las numerosas fuentes de fluoruro disponibles proporciona el producto deseado.
El compuesto se puede preparar en una etapa a partir de citidina calentando en una solución de hidroxilamina de pH ajustado. A pesar de ser más corta, esta vía tiende a dar rendimientos menores y requiere purificación por cromatografía en columna ultrarrápida en fase inversa, lo que limita su uso a producir cantidades más pequeñas. Ejemplo 2. Procedimientos generales: Todas las reacciones químicas se realizaron en material de vidrio secado en horno bajo una atmósfera de nitrógeno, excepto donde se indique. Los productos químicos y los disolventes eran de grado reactivo y se adquirieron a proveedores comerciales (típicamente Aldrich, Fisher, Acros, Carbosynth Limited y Oakwood Chemical) y se utilizaron tal como se recibieron, excepto donde se indique. En particular, EIDD-1910, EIDD-1993 y EiDD-2003 se adquirieron a Carbosynth Limited. Los disolventes utilizados para las reacciones (tetrahidrofurano, metanol, acetonitrilo, diclorometano, tolueno, piridina, dimetilformamida) eran >99,9% anhidros en todos los casos. Todas las reacciones fueron seguidas por cromatografía en capa fina (TLC) hasta su finalización, a menos que se establezca de otro modo. El análisis por TLC se realizó sobre gel de sílice, usando iluminación con una lámpara UV (254 nm) o tinción con KMnO4 y calentamiento. Se realizó cromatografía en columna ultrarrápida manual con gel de sílice RediSep Rf de 40-60 micras (tamaño de partícula 60 A), adquirido a Teledyne Isco, como fase estacionaria. Se realizó cromatografía en columna ultrarrápida de gradiente automatizado en un Teledyne Isco CombiFlash Companion; las separaciones en fase normal se realizaron con gel de sílice RediSep Rf preempaquetado como fase estacionaria, y las separaciones en fase inversa se realizaron con la fase estacionaria RediSep Rf Ci8 High Performance Gold preempaquetada. Se realizaron las purificaciones de los trifosfatos usando cromatografía de intercambio iónico, con DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A-25 como fase estacionaria y TEAB (bicarbonato de trietilamonio) acuoso como fase móvil.
Se midieron los espectros de RMN de 1H en un instrumento Varian a 400 MHz y se procesaron utilizando el software MestReNova, versión 9.0.1. Se midieron los desplazamientos químicos en relación con el pico de disolvente apropiado: CDCh (87,27), DMSO-cfe (82,50), CD3OD (83,31), D2O (84,79). Se utilizaron las siguientes abreviaturas para describir el acoplamiento: s = singulete, d = doblete, t = triplete, c = cuadruplete, q = quintuplete, m = multiplete, an. = ancho. Se midieron los espectros de RMN de 13C en un instrumento Varian a 100 MHz con desplazamientos químicos en relación con el pico de disolvente apropiado: CDCh (877,0), DMSO-cfe (839,5), CD3OD (849,0). Se midieron los espectros de 19F en un instrumento Varian a 376 MHz, y se midieron los espectros de 31P en un instrumento Varian a 162 MHz. Se calibraron los desplazamientos químicos para los espectros de 19F, los espectros de 31P y los espectros de 13C (solo en D2O) mediante el software MestReNova usando una función de referencia absoluta con el correspondiente espectro de RMN de 1H en el mismo disolvente.
Se realizó la cromatografía líquida/espectrometría de masas nominal (de baja resolución) usando un instrumento CL Agilent serie 1200 (detector de absorción UV a 254 nm), usando una columna Zorbax Eclipse XDB C18 de 4,6 x 50 mm, 3,5 micrómetros, eluyendo con una mezcla MeOH/agua (típicamente 95/5 isocrático) y un instrumento CLEM cuadrupolo Agilent 6120. Se realizó la espectrometría de masas de alta resolución en el Centro de Espectrometría de Masas de la Universidad de Emory con un Thermo LTQ-FTMS usando IQPA o IES. Ejemplo 3.
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S1: Se cargó un matraz de 3 bocas de 2 l equipado con un agitador de hélice y una entrada de nitrógeno con uridina (25 g, 102mmol) y 1 l de diclorometano. Se enfrió la solución resultante a 0 °C y se añadieron secuencialmente 4-DMAP (1,251 g, 10,24 mmol) e imidazol (27,9 g, 409 mmol). Se añadió TBSCl (61,7 g, 409 mmol) durante 10 minutos y se permitió que la mezcla resultante alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 18 h. Se añadió agua (300 ml) a la mezcla de reacción y se agitó a t.a. durante 2 h, se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa con diclorometano adicional. Se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (1 x 300 ml), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 75 g de un aceite incoloro transparente. Purificación por cromatografía ultrarrápida (gradiente del 5 al 20 % de EtOAc en hexanos) para proporcionar S1 (45 g, 75 %) como un aceite transparente e incoloro, que solidificó cuando se secó a vacío: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 88,09 (s, 1H), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,87 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 5,67 (dd, J = 8,1, 2,2 Hz, 1H), 4,07 (c, J =3,8, 3,3 Hz, 1H), 3,98 (dd, J =11,7, 1,7 Hz, 1H), 3,75 (dd, J = 11,7, 1,1 Hz, 1H), 0,94 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,88 (s, 9H), 0,13 (s, 3H), 0,12 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H), 0,07 (s, 3H), 0,06 (s, 3H).
S2: Se cargó un matraz de fondo redondo de 1 l con S1 (28 g, 47,7 mmol) y diclorometano (700 ml). Se enfrió la solución a 0 °C usando un baño de hielo; se añadieron secuencialmente 4-DMAP (0,583 g, 4,77 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (41,7 ml, 239 mmol). Se añadió lentamente cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo (28,9 g, 95 mmol) al matraz y, una vez completada la adición, se permitió que el matraz alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 18 h. Se enfrió la solución naranja oscuro a 0 °C con un baño de hielo y se añadió N,N-diisopropiletilamina (24,66 g, 191 mmol) por medio de una jeringa, seguido de clorhidrato de hidroxilamina sólido (13,26 g, 191 mmol) de una vez. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 3 h. Se inactivó la reacción con agua (200 ml) y se separaron las capas resultantes. Se extrajo la capa acuosa con diclorometano (200 ml) y se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar un aceite naranja oscuro. Purificación por cromatografía ultrarrápida (gradiente del 15 al 50 % de EtOAc en hexanos) para proporcionar S2 (19,8 g, 69% en 2 etapas) como un aceite que solidificó a un semisólido al secarse a vacío: RMN de 1 H (400 MHz, CDCla) 88,15 (s, 1H), 6,31 (s, 1H), 5,91 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,56 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, 1H), 4,07 (m, 2H), 4,02 (m, 1H), 3,91 (dd, J =11,6, 2,4 Hz, 1H), 3,73 (dd, J =11,6, 2,4 Hz, 1H), 0,95 (s, 9H), 0,92 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,12 (s, 6H), 0,098 (s, 3H), 0,083 (s, 3H), 0,063 (s, 3H), 0,057 (s, 3H); CLEM m/z 602,3 [M+H]+.
EIDD-1931: Se cargó un matraz de fondo redondo de 50 ml con S2 (23,3 g, 38,7 mmol) y THF (50 ml). Se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (6,30 ml, 38,7 mmol) de una vez y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró la mezcla bajo presión reducida y se disolvió el residuo en una cantidad mínima de MeOH, y esta solución se añadió lentamente a un matraz Erlenmeyer que contenía diclorometano bajo agitación rápida (500 ml) para precipitar el producto; se agitó la mezcla a t.a. durante 15 minutos. Se recogió el sólido triturado mediante filtración a vacío y se lavó con diclorometano y, a continuación, con éter. Se secó el sólido a vacío para proporcionar el compuesto del título (7,10 g, 71 %) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 87,16 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,59 (d, J =8,2 Hz, 1H), 4,19 - 4,04 (m, 2H), 3,93 (c, J = 3,3 Hz, 1H), 3,77 (dd, J =12,2, 2,9 Hz, 1H), 3,68 (dd, J =12,1, 2,9 Hz, 1H); RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 8 9,95 (s, 1H), 9,46 (s, 1H), 7,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,54 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,02 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 4,98 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 3,95 (c, J = 5,9 Hz, 1H), 3,89 (td, J = 4,9 Hz, 3,0 Hz, 1H), 3,75 (c, J =3,4 Hz, 1H), 3,50 (cdd, J = 11,9 Hz, 5,2 Hz, 3,5 Hz, 2H); RMN de 13C (101 MHz, DMSO-Ó6) 8150,0, 143,9, 130,5, 98,89, 87,1, 85,0, 72,8, 70,8, 61,8. CLEM m/z 260,1 [M+H]+.
Ejemplo de referencia 4.
Figure imgf000026_0002
EIDD-2050: Se enfrió una solución de EIDD-1931 (124 mg, 0,478 mmol) en piridina anhidra (5 ml) a -20 °C y se trató gota a gota con cloruro de nonanoilo (95 ml, 0,528 mmol) durante un período de 5 min. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 15 h y, a continuación, se inactivó con metanol (2 ml). Después de 20 min a t.a., se concentró la mezcla a sequedad y, a continuación, se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gradiente del 1 al 5 % de MeOH en DCM). Se coevaporó el sólido purificado resultante con cloruro de metileno (3x10m l) y, a continuación, se secó a alto vacío durante 40 h para dar el compuesto del título (82 mg, 43 %) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 87,50 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,88 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,70 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,19 - 4,08 (m, 1H), 3,97 (c, J = 3,1 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 12,2, 2,9 Hz, 1H), 3,70 (dd, J =12,2, 3,3 Hz, 1H), 2,49 (t, J =7,4 Hz, 2H), 1,67 (q, J =7,4 Hz, 2H), 1,37 - 1,24 (m, 9H), 0,93 - 0,84 (m, 3H); RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) 8171,4, 149,7, 149,4, 134,6, 9597, 88,5, 84,9, 73,7, 70,2, 61,1, 31,8, 31,6, 28,9, 28,9, 28,8, 24,6, 22,3, 13,0; EMBR m/z 400,2 [M+H]+.
Ejemplo de referencia 5.
Figure imgf000027_0001
EIDD-1931 EIDD-2051
EIDD-2051: A una solución en agitación de EIDD-1931 (0,194 g, 0,75 mmol) en piridina (4,8 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió cloroformiato de heptilo (0,15 ml, 0,825 mmol) gota a gota por medio de una jeringa. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 4 h y, a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria. Se recogió la mezcla en DCM con una gota de MeOH y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 15 % de MeOH en DCM) dio el compuesto del título (0,126 g, 42 %) como un sólido blanco en polvo. El análisis por RMN muestra una mezcla de rotámeros 9:1 (la mayoría de las señales cercanas a la nucleobase están duplicadas o son simples pero ensanchadas): RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, solo rotámero principal) 8 7,50 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 5,69 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,23 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,13 (c, J = 5,1Hz, 1H), 4,10 (c, J = 4,0 Hz, 1H), 3,96 (c, J = 3,4 Hz, 1H), 3,79 (dd, J =12,2, 2,8 Hz, 1H), 3,69 (dd, J =12,2 Hz, 3,2 Hz, 1H), 1,77-1,65 (m, 2H), 1,45-1,25 (m, 8H), 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, solo rotámero principal) 8153,3, 149,0, 148,7, 133,9, 94,9, 88,0, 84,2, 73,1,69,5, 68,0, 60,5, 30,9, 28,0, 27,7, 24,7, 21,6, 12,4; EMAR calc. para C17H28N3O8 [M+H]+: 402,18709, hallado: 402,18774.
Ejemplo de referencia 6.
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S3: A una solución en agitación de S1 (2,20 g, 3,75 mmol) en DCM (37 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió secuencialmente 4-DMAP (0,460 g, 3,75 mmol), trietilamina (0,78 ml, 5,62 mmol) y cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo (1,70 g, 5,62 mmol). Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 16 h. Se volvió a enfriar la mezcla a 0 °C y se añadió trietilamina (2,60 ml, 18,75 mmol) por medio de una jeringa, seguido de clorhidrato de O-metilhidroxiamina (1,56 g, 18,75 mmol) de una vez. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante 3 h; a continuación, se inactivó mediante la adición de agua. Se retiró la capa orgánica y se lavó la capa orgánica con salmuera. Se extrajeron las capas acuosas combinadas con DCM (2 x 25 ml) y se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía ultrarrápida (gradiente del 10 al 20 % de EtOAc en hexanos) para dar S3 (1,72 g, 74 %) como una espuma blanca. Todos los picos de RMN eran anchos, probablemente debido a los rotámeros en N-OMe. No se deconvolucionó el espectro. CLEM m/z 617,3 [M+H]+.
EIDD-2052: A una solución en agitación de S3 (0,300 g, 0,487 mmol) en MeOH (5 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió una solución de HCl 1,25 M en MeOH (2,3 ml, 2,92 mmol) gota a gota por medio de una jeringa. Se agitó la mezcla a t.a. durante 24 h. Se añadió trietilamina (0,70 ml, 5,05 mmol) y se agitó la mezcla durante 2 h. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y la cromatografía ultrarrápida (gradiente del 5 al 20 % de iPrOH en EtOAc) dio el compuesto del título (85 mg, 64 %) como un sólido blanquecino: RMN de 1H (400 MHz, D2O) 8 7,19 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,82 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,55 (d, J =8,2 Hz, 1H), 4,15- 4,07 (m, 2H), 3,92 (c, J = 3,5 Hz, 1H), 3,76 (dd, J =12,2 Hz, 2,9 Hz, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,67 (dd, J = 12,1 Hz, 3,4 Hz, 1H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) 8151,4, 146,2, 133,0, 98,6, 89,8, 86,1, 74,7, 71,7, 62,7, 61,9, 25,2; EMBR m/z 274,1 [M+H]+. Ejemplo de referencia 7.
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S4: Se cargó un matraz de fondo redondo con 2'-metiluridina (0,850 g, 3,29 mmol), imidazol (0,896 g, 13,17 mmol) y DCM (6,5 ml) y se enfrió la mezcla a 0 °C bajo nitrógeno con agitación. Se añadió gota a gota triflato de trimetilsililo (2,24 ml, 12,34 mmol) por medio de una jeringa durante 15 min. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante la noche. Después de 16 h de agitación, se diluyó la mezcla con d Cm (200 ml) y se vertió en agua con hielo (100 ml). Se retiró la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con DCM (1 x 100 ml). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera con hielo (1 x 100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria para dar 1,8 g de producto bruto. Se recogió el material en hexanos y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 5 al 20 % de EtOAc en hexanos) dio S4 (1,50 g, 96 %) como un sólido blanco en escamas: RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 88,27 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,92 (s, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,64 (dd, J = 8,2 Hz, 2,3 Hz, 1H), 4,05-3,95 (m, 2H), 3,83 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 3,73 (d, J =11,2 Hz, 1H), 1,21 (s, 3H), 0,20 (s, 9H), 0,18 (s, 9H), 0,17 (s, 9H); EMBR m/z 475,2 [M+H]+.
S5: A una solución en agitación de S4 (1,50 g, 3,16 mmol) y 4-DMAP (0,039 g, 0,316 mmol) en DCM (20 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió W,A/-diisopropiletilamina (2,75 ml, 15,80 mmol) por medio de una jeringa, seguido de cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo sólido (1,91 g, 6,32 mmol) de una vez. Se permitió que la mezcla en agitación alcanzara t.a. Después de 16 h de agitación a t.a., se enfrió la mezcla a 0 °C y se lavó con NaHCO3 ac. sat. en hielo (3 x 25 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar 4,2 g de producto bruto como un aceite marrón. Se recogió el producto bruto en hexanos y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 1 al 10 % de EtOAc en hexanos) dio el producto deseado de activación de sulfonilo (~1,57g, ~2,12 mmol), mayormente puro por CLEM (identidad supuesta confirmada por RMN de 1H). La totalidad de esta mezcla se llevó inmediatamente a la siguiente etapa sin purificación o análisis adicionales.
A una solución en agitación del material recién preparado descrito anteriormente (~1,57 g, ~2,12 mmol) en MeCN (21 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió trietilamina (0,89 ml, 6,35 mmol) por medio de una jeringa, seguido de clorhidrato de O-metilhidroxilamina (0,531 g, 6,35 mmol) como un sólido de una vez. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante la noche. Después de 16 h de agitación, se vertió la mezcla en NaHcO3 ac. sat. (50 ml) y se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada en un CombiFlash (columna de 80 g, gradiente del 5 al 15 % de EtOAc en hexanos) dio S5 (0,571 g, 36 % en 2 etapas) como un aceite viscoso transparente, presente como una proporción de tautómeros 9:1 por RMN: RMN de 1H (400 MHz, CDCla, solo tautómero principal) 88,01 (s an., 1H), 7,59 (d, J =8,3 Hz, 1H), 5,88 (s, 1H), 5,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,03-3,93 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,82 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,71 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 1,20 (s, 3H), 0,23-0,15 (m, 27H); EMBR m/z 504,2 [M+H]+.
EIDD-2054: Se cargó un matraz de fondo redondo con S5 (0,510 g, 1,01 mmol) y una barra de agitación bajo nitrógeno a t.a. Se añadió una solución de HCl conc. al 1 % v/v en MeOH (10 ml, 1,20 mmol de HCl) por medio de una jeringa y se agitó la mezcla a t.a. durante 30 min. Se añadió Na2CO3 sólido (1 g) de una vez y se agitó la mezcla a t.a. durante 30 min. Se añadió Celite y se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria para dar el producto bruto inmovilizado sobre el sólido. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 0 al 10 % de MeOH en DCM) dio el compuesto del título (0,265 g, 91 %) como un sólido blanco en polvo: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 87,36 (d, J =8,3 Hz, 1H), 5,89 (s, 1H), 5,54 (d, J =8,2 Hz, 1H), 3,95 (dd, J =12,5 Hz, 2,2 Hz, 1H), 3,86 (dt, J = 9,2 Hz, 2,4 Hz, 1H), 3,82-3,72 (m, 2H), 3,78 (s, 3H), 1,17 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) 8 151,3, 146,2, 132,8, 98,2, 92,6, 83,4, 79,8, 73,8, 61,9, 60,7, 20,3; EMBR m/z 288,1 [M+H]+.
Ejemplo de referencia 8.
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S6: A una solución en agitación de S4 (1,67 g, 3,52 mmol) y 4-DMAP (0,043 g, 0,352 mmol) en DCM (25 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió W,A/-diisopropiletilamina (3,06 ml, 17,59 mmol) por medio de una jeringa, seguido de cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo sólido (1,92 g, 6,33 mmol) de una vez. Se permitió que la mezcla en agitación alcanzara t.a. Después de 16 h de agitación a t.a., se enfrió la mezcla a 0 °C y se lavó con NaHCO3 ac. sat. en hielo (3 x 25 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar 4,1 g de producto bruto como un aceite marrón. Se recogió el producto bruto en hexanos y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 1 al 10 % de EtOAc en hexanos) dio el producto deseado de activación de sulfonilo (~1,81 g, ~2,44 mmol), mayormente puro por CLEM (identidad supuesta confirmada por RMN de 1H). La totalidad de esta mezcla se llevó inmediatamente a la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una solución en agitación del material recién preparado descrito anteriormente (~1,81 g, ~2,44 mmol) en MeCN (25 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió trietilamina (1,02 ml, 7,33 mmol) por medio de una jeringa, seguido de clorhidrato de hidroxilamina (0,509 g, 7,33 mmol) como un sólido de una vez. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante 2 h. Se vertió la mezcla en NaHCO3 ac. sat. (50 ml) y se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 5 al 35 % de EtOAc en hexanos) dio S6 (0,931 g, 54 % en 2 etapas) como un sólido blanco en escamas, presente como una proporción de tautómeros 7:1 por RMN. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe, solo tautómero principal) 8 9,99 (s, 1H), 9,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,72 (s, 1H), 5,45 (dd, J = 8,2 Hz, 2,1 Hz, 1H), 3,92 (d, J =12,0 Hz, 1H), 3,85-3,75 (m, 2H), 3,66 (d, J =12,0 Hz, 1H), 1,13 (s, 3H), 0,15 (s, 9H), 0,14 (s, 9H), 0,12 (s, 9H); EMBR m/z 490,0 [M+H]+.
EIDD-2053: Se cargó un matraz de fondo redondo con S6 (0,200 g, 0,408 mmol) y una barra de agitación bajo nitrógeno a t.a. Se añadió una solución de HCl conc. al 1 % v/v en MeOH (6 ml, 0,72 mmol de HCl) por medio de una jeringa y se agitó la mezcla a t.a. durante 30 min. Se añadió Na2CO3 sólido (0,75 g) de una vez y se agitó la mezcla a t.a. durante 30 min. Se añadió Celite y se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria para dar el producto bruto inmovilizado sobre el sólido. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 4 g, gradiente del 5 al 25 % de MeOH en DCM) dio el compuesto del título (0,110 g, 99 %) como un sólido blanco en polvo: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 87,30 (d, J =8,3 Hz, 1H), 5,90 (s, 1H), 5,56 (d, J =8,2 Hz, 1H), 3,95 (dd, J =12,5 Hz, 2,1 Hz, 1H), 3,86 (dt, J = 9,2 Hz, 2,7 Hz, 1H), 3,80 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 3,75 (dd, J =12,5 Hz, 3,0 Hz, 1H), 1,18 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 8 151,6, 147,3, 131,8, 98,9, 91,7, 81,9, 79,5, 73,3, 60,4, 49,5, 19,6; EMBR m/z 274,1 [M+H]+.
Ejemplo de referencia 10.
Figure imgf000029_0002
EÍDD-2080
EIDD-2080: Se cargó un matraz de fondo redondo con 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-metilcitidina (120 mg, 0,463 mmol) y una solución acuosa de hidroxilamina 2 N ajustada a pH = 5 (1,1 ml, 2,2 mmol), y se calentó la mezcla a 50 °C. Después de 16 h, se concentró la mezcla a sequedad y, a continuación, se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (19mmx170mm de volumen de columna, MeOH al 10% en DCM). La goma resultante se coevaporó con DCM (3 x 4 ml) para dar un sólido blanco que se secó adicionalmente a alto vacío a 40 °C durante 24 h para proporcionar el compuesto del título (94 mg, 74%) como un polvo blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 87,23 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,07 (d, J = 19,8 Hz, 1H), 5,60 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,04 - 3,95 (m, 1H), 3,91 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 3,77 (dd, J =12,5, 2,3 Hz, 1H), 1,36 (d, J = 22,2 Hz, 3H); RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) 8150,0, 144,6, 129,9, 101,4, 99,6, 98,0, 88,7 (d, J =46,5 Hz), 81,5, 71,5 (d, J =18,1 Hz), 58,9, 15,5 (d, J = 25,8 Hz); EMAR calc. para C-i0H15FN3°5 [M+H]+: 276,09903, hallado: 276,09910.
Ejemplo de referencia 11.
Figure imgf000030_0001
EIDD-2085
EIDD-2085: Se preparó una solución ~2 N de clorhidrato de hidroxilamina (3,33 g, 48,0 mmol) en agua (24 ml) y se ajustó a pH = 5 con una pequeña cantidad de NaOH ac. (10 % p/p). Se cargó un tubo de presión sellable con esta solución y 2'-fluoro-2'desoxicitidina (0,736 g, 3,00 mmol), se selló el matraz y se calentó con agitación a 55 °C durante 16 h. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, se transfirió a un matraz de fondo redondo y se concentró mediante evaporación rotatoria. Se suspendió el material bruto en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 5 al 25 % de MeOH en DCM) dio el compuesto del título (0,365 g, 47 %) como un sólido blanquecino. El análisis por RMN mostró que el compuesto tenía una pureza de ~90 % en peso, siendo el resto DCM y MeOH ocluidos. Se disolvió una muestra (103 mg) en agua, se congeló en un baño de hielo seco y se liofilizó para dar 91 mg del compuesto del título, sin disolvente. Este material purificado se utilizó para todas las pruebas biológicas: RMN de 1H (400 MHz, D2O) 8 7,00 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,91 (dd, J = 21,0 Hz, 2,0 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,19 (ddd, J = 53,1 Hz, 5,0 Hz, 2,0 Hz, 1H), 4,36 (ddd, J = 20,0 Hz, 8,2 Hz, 5,0 Hz, 1H), 4,08-4,02 (m an., 1H), 3,95 (dd, J =12,9 Hz, 2,5 Hz, 1H), 3,78 (dd, J = 12,9 Hz, 4,6 Hz, 1H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 8 150,8, 146,7, 132,5, 98,4, 93,1 (d, J =183,1 Hz), 89,0 (d, J = 35,9 Hz), 82,1, 68,3 (d, J =16,5 Hz), 60,2 Hz; RMN de 19F (376 MHz, D2O) 8 -200,51 (dt, J = 53,1 Hz, 20,4 Hz); EMAR calc. para C9H13FN3O5 [M+H]+: 262,08338, hallado: 262,08332.
Ejemplo 13.
Figure imgf000030_0002
S8: A una suspensión en agitación de citidina (0,972 g, 4,00 mmol) en acetona seca (50,0 ml) se le añadió gota a gota una cantidad catalítica de H2SO4 (0,13 ml, 2,439 mmol). Se agitó la reacción resultante a t.a. durante la noche. Después de la filtración, se redisolvió el sólido blanco obtenido en MeOH con un ligero calentamiento; a continuación, se volvió a evaporar para dar un sólido blanco en forma de sal de sulfato del producto deseado (rendimiento >95 %), que se usó sin purificación adicional: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 88,23 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,90 (dd, Ji = 6,2 Hz, J 2 = 2,3 Hz, 1H), 4,82 (dd, Ji = 6,1Hz, J 2 = 2,7 Hz, 1H), 4,35 (c, J = 3,4 Hz, 1H), 3,80 (dd, Ji = 12,1 Hz, J 2 = 3,2 Hz, 1H), 3,71 (dd, Ji = 12,1 Hz, J 2 = 4,1 Hz, 1H), 1,54 (s, 3H), 1,35 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) 8 161,33, 148,49, 147 ,34 , 114 ,86 , 95,58, 94,22, 89,56, 86,59, 82,34, 62,85, 27,42, 25,41; EMAR calc. para C12H18O5N3 [M+H]+: 284,12410, hallado: 284,12424.
S9: A una suspensión de S8 (0,566 g, 2,00 mmol) en THF (20,0 ml) se le añadió gota a gota una solución 1 M de cloruro de f-butilmagnesio en THF (3,00 ml, 3,00 mmol) por medio de una jeringa a 0 °C bajo argón, y se agitó la mezcla resultante a la misma temperatura durante 1 h. Se añadió una solución de S7 (1,33 g, 3,00 mmol) en THF (20 ml) a 0 °C, tras lo cual se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante otras 27 h. Se inactivó la reacción cuidadosamente mediante la adición de NH4O ac. sat. a 0 °C. Se filtró la mezcla obtenida a través de un lecho de Celite y se lavó el lecho con MeOH. Se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria para dar un sólido marrón, que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (MeOH al 5 % en DCM) para dar un producto semipuro. Se purificó adicionalmente la mezcla mediante cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 25 % de MeOH en DCM) para dar S9 (0,744 g, 67 % en 2 etapas) como un sólido blanco presente como una mezcla de dos diastereómeros en un proporción 1:2 basada en la integración de RMN de 31P: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 87,61 (m, 1H), 7,34 (t, J = 7,9 Hz, 2H), 7,27 - 7,09 (m, 3H), 5,93 - 5,69 (m, 2H), 4,95 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 4,90 (dd, J = 6,4 Hz, 2,2 Hz, 1H), 4,84 - 4,71 (m, 1H), 4,46 - 4,20 (m, 3H), 3,88 (q, J = 7,8 Hz, 1H), 2,15 (s, 1H), 1,53 (s, 3H), 1,32 (m, 6H), 1,21 (m, 6H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, ambos diastereómeros) 8 210,06, 174,62, 174,57, 174,41, 174,35, 167,89, 157,81, 152,18, 152,11, 144,64, 144,38, 130,82, 130,78, 130,77, 126,24, 126,22, 126,17, 126,16, 121,48, 121,45, 121,43, 121,40, 115,18, 115,08, 96,18, 95,96, 87,13, 87,05, 86,96, 86,88, 86,23, 82,48, 82,47, 70,14, 68,02, 51,81, 51,67, 49,64, 49,43, 49,21, 49,00, 48,79, 48,57, 48,36, 30,68, 27,46, 27,43, 25,51, 25,46, 22,00, 21,98, 21,90, 20,56, 20,49, 20,30; RMN de 31P (162 MHz, CD3OD) 83,68, 3,45; EMAR calc. para C24H33O9N4NaP [M+Na]+: 575,18774, hallado: 575,18824.
S10: Se agitó una solución de S9 (0,289 g, 0,502 mmol) en HCOOH ac. al 80 % (12,40 ml) a t.a. durante 3,5 h. Se concentró la reacción mediante evaporación rotatoria y se coevaporó con MeOH (3x 10 ml). Se obtuvo el producto bruto S9 (0,257 g, cuant.) como un sólido marrón vidrioso que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 88,16 (s, 1H), 7,79 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,50 - 7,08 (m, 5H), 6,03 - 5,68 (m, 2H), 4,96 (septuplete, J = 8 Hz, 1H), 4,55 - 4,24 (m, 2H), 4,23 - 4,08 (m, 2H), 4,08 - 3,99 (m, 1H), 3,97 - 3,82 (m, 1H), 1,43 - 1,26 (m, 4H), 1,26 - 1,10 (m, 6H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, ambos diastereómeros) 8 174,65, 174,61, 174,38, 174,33, 166,90, 157,46, 152,15, 152,08, 142,73, 130,89, 130,88, 130,85, 130,85, 126,28, 126,26, 121,42, 121,40, 121,37, 121,36, 96,19, 92,05, 91,97, 83,49, 83,42, 75,90, 75,84, 70,70, 70,64, 70,18, 67,14, 67,08, 51,88, 51,87, 51,71, 51,70, 49,64, 49,43, 49,21, 49,00, 48,79, 48,57, 48,36, 21,98, 21,91, 21,89, 21,80, 20,61,20,55, 20,30; RMN de 31P (162 MHz, CD3OD) 83,91, 3,76; EMAR calc. para C21H30O9N4P [M+H]+: 513,17449, hallado: 513,17413.
EIDD-2088: A una solución de S10 (0,257 g, 0,502 mmol) en THF (5 ml) se le añadió hidroxilamina 2 N a pH 6 (6,27 ml, 12,54 mmol) y se agitó la mezcla resultante a 37 °C durante 1,5 días. Se concentró la mezcla de reacción mediante evaporación rotatoria. Se redisolvió el sólido amarillo obtenido en MeOH y se inmovilizó sobre gel de sílice, que se cargó en un tapón de sílice. La elución con MeOH al 10 % en CH2Ch través del tapón de sílice dio un líquido marrón claro después de la evaporación rotatoria de las fracciones que contenían el producto. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 2,5 al 15 % de MeOH en DCM) proporcionó el compuesto del título (0,155 mg, 59%) como una espuma blanquecina: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 87,89 (d, J = 8,0 Hz, 0,3H), 7,80 (d, J = 8,1 Hz, 0,65H), 7,48 - 7,31 (m, 2H), 7,31 - 7,13 (m, 3H), 6,02 - 5,79 (m, 2H), 4,97 (hept, J = 8 Hz, 1H), 4,55 - 4,08 (m, 6H), 3,90 (m, 1H), 1,44 - 1,26 (m, 4H), 1,22 (m, 6H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, ambos diastereómeros) 8174,72, 174,68, 174,36, 174,30, 155,25, 152,10, 152,03, 148,74, 148,68, 142,86, 130,92, 130,87, 126,33, 126,32, 121,43, 121,39, 91,71, 91,63, 91,58, 84,08, 84,02, 83,95, 75,48, 75,41, 70,71, 70,67, 70,20, 67,03, 51,90, 51,73, 51,71, 49,64, 49,43, 49,21, 49,00, 48,79, 48,57, 48,36, 21,98, 21,92, 21,89, 21,79, 20,59, 20,53, 20,31; RMN de 31P (162 MHz, CD3OD) 83,98, 3,81; EMAR calc. para C21H30O10N4P [M+H]+: 529,16941, hallado: 529,16900.
Ejemplo de referencia 15.
Figure imgf000031_0001
EIDD-2103: Se preparó una solución ~2 N de clorhidrato de hidroxilamina (1,11 g, 16,0 mmol) en agua (8 ml) y se ajustó a pH = 5 con una pequeña cantidad de NaOH ac. (10 % p/p). Se cargó un tubo de presión sellable con esta solución y 5-fluorocitidina (0,261 g, 1,00 mmol), se selló el matraz y se calentó con agitación a 55 °C durante 16 h. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, se transfirió a un matraz de fondo redondo y se concentró mediante evaporación rotatoria. Se suspendió el material bruto en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 20 % de MeOH en DCM) dio 600 mg de un sólido rosa semipuro. Se disolvió este sólido en 2 ml de agua y la cromatografía de fase inversa automatizada (columna de 43 g, gradiente del 5 al 100 % de MeOH en agua) dio el producto deseado libre de impurezas orgánicas e inorgánicas. Se disolvió el sólido en agua, se congeló en un baño de hielo seco/acetona y se liofilizó para proporcionar el compuesto del título (0,066 g, 0,238 mmol, rendimiento del 24 %) como un sólido blanco floculante. RMN de 1 H (400 MHz, D2O) 8 7,31 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,87 (dd, J = 5,5 Hz, 1,8 Hz, 1H), 4,26 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,19 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,07 (c, J = 3,8 Hz, 1H), 3,85 (dd, J = 12,8 Hz, 3,1 Hz, 1H), 3,77 (dd, J =12,7 Hz, 4,2 Hz, 1H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 8 150,0, 139,7, 137,4, 115,6 (d, J = 36,1 Hz), 88,0, 84,2, 72,8, 69,8, 61,0; RMN de 19F (376 MHz, D2O) 8 -164,70 (d, J = 7,6 Hz); EMAR calc. para C9H13FN3O6 [M+H]+: 278,07829, hallado: 278,07848.
Ejemplo de referencia 16.
Figure imgf000032_0001
S11: A una solución en agitación de S2 (0,903 g, 1,50 mmol) en DCM (15 ml) bajo nitrógeno a t.a. se le añadió isocianato de heptilo (0,266 ml, 1,65 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 2 minutos. Se agitó la reacción a t.a. durante 6 h; a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria para dar un residuo bruto. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 5 al 25 % de EtOAc en hexanos) dio S11 (0,930 g, 83 %) como un sólido rosa claro en escamas: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 88,26 (s an., 1H), 7,50 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,29 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,57 (dd, J = 8,2 Hz, 2,3 Hz, 1H), 4,10-4,00 (m, 3H), 3,93 (dd, J =11,6 Hz, 2,3 Hz, 1H), 3,74 (d, J =11,6 Hz, 1H), 3,28 (c, J = 6,7 Hz, 1H), 1,62-1,52 (m, 2H), 1,40-1,25 (m, 8 H), 0,96 (s, 9H), 0,91 (s, 9H), 0,91-0,86 (m, 3H), 0,89 (s, 9H), 0,13 (s, 6 H), 0,10 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,05 (s, 6 H).
EIDD-2107: A una solución en agitación de S11 (0,910 g, 1,22 mmol) en una mezcla de THF (18 ml) y DMF (6 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió ácido acético (0,350 ml, 6,12 mmol), seguido de fluoruro de tetraetilamonio sólido (0,877 g, 5,88 mmol) de una vez. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante 20 h. A continuación, se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria para dar un producto bruto como un aceite. Se recogió el aceite en DCM y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 1 al 10 % de MeOH en DCM) dio 300 mg de un sólido blanco en escamas, que consistía en el producto deseado y acetato de tetraetilamonio. Se recogió la mezcla en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. Una segunda cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 1 al 10 % de MeOH en DCM) dio el compuesto del título (0,228 g, rendimiento del 47 %) como un sólido blanco en polvo. El análisis por RMN mostró una proporción de señales 5:1, muy probablemente de rotámeros alrededor de uno de los enlaces del carbamato (la mayoría de las señales asociadas con la nucleobase están duplicadas o son simples pero ensanchadas) RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe, solo rotámero principal) 8 10,30 (s, 1H), 7,38 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,85 (t, J =5,8 Hz, 1H), 5,75 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,69 (dd, J =8,4 Hz, 2,2 Hz, 1H), 5,32 (d, J =5,9 Hz, 1H), 5,10­ 5,00 (m, 2H), 3,99 (c, J = 5,6 Hz, 1H), 3,94 (c, J = 4,7 Hz, 1H), 3,83-3,76 (m, 1H), 3,63-3,46 (m, 2H), 3,04 (c, J = 6,5 Hz, 1H), 1,46-1,36 (m, 2H), 1,32-1,19 (m, 8 H), 0,86 (t, J = 7,0 Hz, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, solo picos del rotámero principal) 8 157,5, 150,8, 149,3, 135,3, 97,5, 89,9, 86,1, 75,0, 71,5, 64,7, 62,5, 41,9, 32,9, 30,8, 30,1, 27,7, 23,6, 14,4; EMAR calc. para C17H29N4O7 [M+H]+: 401,20308, hallado: 401,20319.
Ejemplo 17.
Figure imgf000033_0001
S12: Se trato una solución de S8 en DMF anhidra (56 ml) con 1,1-dimetoxi-W,A/-dimetilmetanamina (9,4 ml, 70,6 mmol). Después de 18 h a t.a., se concentró la mezcla de reacción a sequedad y se trituró el sólido blanco bruto con éter (3 x 100 ml). Se recogió el sólido mediante filtración y se secó a alto vacío durante 12 h para proporcionar S12 (4,52 g, 95 %) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 8 8,67 (s, 1H), 7,99 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 5,87 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,92 (dd, J = 6,3, 2,4 Hz, 1H), 4,84 (dd, J = 6,3, 3.5 Hz, 1H), 4,25 (c, J = 4,7, 1H), 3,81 (dd, J =11,9, 3,6 Hz, 1H), 3,73 (dd, J =11,9, 4,6 Hz, 1H), 3,22 (s, 3H), 3,14 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,34 (s, 3H).
S13: Se trató gota a gota una suspensión de 3-hexadeciloxipropan-1-ol (1,58 g, 5,26 mmol) y DIPEA (0,92 ml, 5,26 mmol) en acetonitrilo anhidro (25 ml) durante un período de 10min con 3-((cloro(diisopropilamino)fosfino)oxi)-propanonitrilo (1,2 ml, 5,26 mmol). Después de 18 h a t.a., se inactivó la mezcla con NaHCO3 ac. sat. (15 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2x 100 ml). Se concentraron las fases orgánicas combinadas mediante evaporación rotatoria y la cromatografía ultrarrápida (volumen de columna de 25 mmx140 mm, gradiente del 10 al 20% de EtOAc en hexanos) proporcionó S13 (1,40 g, 53%) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 3,89 - 3,54 (m, 6 H), 3,49 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,39 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 2,64 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 1,87 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 1,57 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 1,25 (s, 26H), 1,18 (dd, J = 6 ,8 , 3.5 Hz, 12H), 0,87 (t, J = 6,6 Hz, 3H); RMN de 31P (162 MHz, CDCh) 8 147,40.
S14: Se trató gota a gota una solución de S12 (800 mg, 2,36 mmol) y S13 (2,15 g, 4,29 mmol) en THF anhidro (20 ml) con una solución de tetrazol (19 ml de una solución 0,45 M en acetonitrilo, 8,59 mmol). Después de 19 h a t.a., se trató la mezcla gota a gota con una solución en nonano de hidroperóxido de ferc-butilo (1,9 ml de una solución 5,5 M, 10,73 mmol) y se continuó agitando durante 1 h adicional. Se inactivó el exceso de hidroperóxido de ferc-butilo con una solución saturada de tiosulfato de sodio (50 ml), se agitó la mezcla durante 45 min y, a continuación, se extrajo con acetato de etilo (2x100ml). Se concentraron las fases orgánicas combinadas mediante evaporación rotatoria y la cromatografía ultrarrápida (volumen de columna de 25mmx180mm, gradiente del 0 al 5% de MeOH en DCM) dio S14 (1,2 g, 80%) como una espuma, una mezcla de diastereómeros: RMN de 1H (400 MHz, CDCh, mezcla diastereomérica) 8 7,38 (d, J = 7,6 Hz, 1H, diastereómero a), 7,37 (d, J = 7,6, 1H, diastereómero b), 5,78 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 5,54 (d, J = 5,6, 1H, diastereómero a), 5,53 (d, J = 5,6, 1H, diastereómero b), 5,14 (ddd, J = 6,5, 3,1, 1,4 Hz, 1H), 4,93 (dt, J =7,0, 3,6 Hz, 1H), 4,34 (td, J = 7,4, 6 ,8 , 4,8 Hz, 3H), 4,28 - 4,08 (m, 4H), 3,48 (t, J = 6,1, 2H), 3,38 (t, J = 6 ,8 , 2H), 2,78 (t, J = 6,5 Hz, 2H, diastereómero a), 2,75 (t, J = 6,5 Hz, 2H diastereómero b), 1,93 (m, 2H), 1,55 (s, 5H), 1,34 (s, 3H), 1,25 (s, 26H), 0,87 (t, J = 6 ,8 , 3H); RMN de 13C (101 MHz, CDCh, mezcla diastereomérica) 8 166,26, 155,40, 144,20, 144,16, 116,62, 116,59, 113,93, 97,45, 97,38, 95,74, 95,69, 86,73, 86,64, 86,54, 84,90, 84,80, 81,87, 81,66, 71,23, 67,84, 67,79, 67,69, 67,64, 66,25, 66,22, 66,03, 65,97, 62,08, 62,03, 31,90, 30,51, 30,50, 30,44, 30,43, 29,68, 29,67, 29,64, 29,61, 29,52, 29,34, 27,06, 27,04, 26,13, 25,23, 25,21, 22,67, 19,57, 19,50, 14,12; RMN de 31P (162 MHz, CDCl3, mezcla diastereomérica) 8 -1,75, -1,83; EMBR m/z 699,4 [M+H]+.
S15: Se trató una solución de S14 (310 mg, 0,44 mmol) en THF (4 ml) con una solución acuosa 2M de hidroxilamina a pH 5 (1,1 ml, 2,2 mmol) con agitación a 50 °C. Después de 19 h, la TLC (metanol al 10% en cloruro de metileno) indicó una conversión de aproximadamente un 50 % en un componente más apolar. La hidroxilamina adicional y el tiempo de reacción prolongado no aumentaron la conversión más allá de un 50 %. Después de enfriar a t.a., se repartió la mezcla entre acetato de etilo (100 ml) y salmuera (10 ml). Se concentró la fase orgánica y la cromatografía ultrarrápida del producto bruto (volumen de columna de 19 mm x 170 mm, gradiente del 1 al 5 % de MeOH en DCM) proporcionó S15 (70 mg, 22 %) como una espuma, en una mezcla 1:1 de diastereómeros: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 8,94 (s, 1H), 6,60 (d, J = 8,1, 1H, diastereómero a), 6,58 (d, J = 8,1, 1H, diastereómero b), 5,67 (d, J = 8,1, 1H, diastereómero a), 5,65 (d, J = 8,1, 1H, diastereómero b), 5,59 (d, J = 2,1 Hz, 1H, diastereómero a), 5,55 (d, J = 2,1 Hz, 1H, diastereómero b), 4,98 (m, 1H), 4,84 (m, 1H), 4,35 -4,10 (m, 6 H), 3,48 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,38 (t, J = 6,7, 2H), 2,76 (m, 2H), 1,94 (m, 2H), 1,59 - 1,49 (m, 5H), 1,34 (s, 3H), 1,24 (s, 26H), 0,87 (t, J = 6,7 Hz, 3H); RMN de 31P (162 MHz, CDCla, mezcla diastereomérica) 8 -1,57, -1,64. CLEM m/z 715,3 [M+H]+.
EIDD-2108: Se trató una solución de S15 (62 mg, 0,087 mmol) en metanol (4 ml) con una cantidad catalítica de ácido para-toluenosulfónico (3,3 mg, 0,017 mmol). Después de 16 h de agitación a t.a., se trató la mezcla con una solución acuosa saturada de hidróxido de amonio (1,5 ml) y se dejó agitar durante 4 h adicionales a t.a. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y se trituró el residuo resultante con acetonitrilo al 5 % en metanol (2x15m l). Se purificó el sólido blanco resultante mediante cromatografía ultrarrápida (volumen de columna de 11 mm x 45 mm, MeOH al 25 % en DCM, NH4OH ac. sat. al 2,5 % v/v) para dar el compuesto del título (25 mg, 46 %) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 8 7,21 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,22 -4,16 (m, 2H), 4,07 -3,98 (m, 3H), 3,94 (c, J = 6,3 Hz, 2H), 3,52 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,41 (t, J = 6 ,6 Hz, 2H), 1,87 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 1,53 (c, J = 6,9 Hz, 2H), 1,28 (s, 28H), 0,92 -0,85 (m, 3H); RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) 8 150,45, 144,99, 130,77, 98,13, 87,51, 83,39, 83,30, 72,98, 70,72, 70,55, 66,89, 64,80, 62,51, 62,46, 31,66, 30,71, 30,63, 29,38, 29,35, 29,24, 29,07, 25,87, 22,33, 13,07; RMN de 31P (162 MHz, CD3OD) 80,34; EMAR calc. para C28H51N3O10P [M-H]-: 620,33175; hallado, 620,33205.
Ejemplo 19.
Figure imgf000034_0001
S18: A una suspensión de 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina (0,526 g, 1,998 mmol) en THF (13,32 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió gota a gota por medio de una jeringa una solución en THF 1 M de cloruro de tbutilmagnesio. (4,00 ml, 4,00 mmol) y se agitó la mezcla resultante a la misma temperatura durante 30 min. Se añadió gota a gota una solución de S7 (1,770 g, 4,00 mmol) en THF (13,32 ml) a 0 °C por medio de una jeringa, se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante otras 24 h. Se enfrió la reacción a 0 °C y se inactivó cuidadosamente con NH4O ac. sat. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y se redisolvió el sólido obtenido en MeOH y se filtró a través de un tapón de Celite, enjuagando el tapón con MeOH. Se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 15 % de MeOH en DCM) dio S18 (0,620 g, 58 %) como una espuma marrón, como una mezcla diastereomérica. RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 8 7,60 (dd, J = 26,1 Hz, 7,4 Hz, 1H), 7,43 - 7,30 (m, 2H), 7,31 - 7,12 (m, 3H), 6,26 (c, J = 7,7 Hz, 1H), 5,92 (dd, J = 21,2 Hz, 7,2 Hz, 1H), 4,97 (m, 1H), 4,60 - 4,30 (m, 2H), 4,29 - 4,15 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,88 (m, 1H), 1,33 (t, J = 8,0 Hz, 3H), 1,22 (m, 6 H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 8 174,61, 174,57, 174,35, 174,30, 167,18, 154,42, 152,15, 152,08, 142,62, 142,52, 139,86, 130,84, 130,20, 126,30, 124,17, 121,49, 121,44, 80,45, 70,18, 69,95, 66,90, 65,69, 51,88, 51,72, 21,97, 21,94, 21,91, 21,89, 21,85, 21,25, 21,19, 20,52, 20,45, 20,34, 20,26, 15,44; RMN de 19F (376 MHz, CD3OD) 8 -118,20 (dd, J = 238,6 Hz, 73,5 Hz), -120,20 (d, J = 237,0 Hz); RMN de 31P (162 MHz, CD3OD) 8 3,81, 3,74; EMAR calc. para C21H28O8N4F2P [M+H]+: 533,16073, hallado: 533,16038.
EIDD-2091: A una suspensión de S18 (0,266 g, 0,500 mmol) en THF (5 ml) se le añadió una solución acuosa 2 N de hidroxilamina a pH 6 (6,3 ml, 12,49 mmol) y se agitó la mezcla resultante a 37 °C durante 1,5 días. Se repartió la reacción (incompleta por TLC) entre EtOAc y H2O. Se extrajo la capa acuosa con EtOAc (2 x 15 ml). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con H2O y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 24 g, gradiente del 0 al 10 % de MeOH en DCM) proporcionó el compuesto del título (34 mg, 12 %) como un sólido blanco, en una mezcla de diastereómeros. Rm N de 1H (400 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 8 7,36 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 7,28 - 7,12 (m, 3H), 6,78 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 6,09 (c, J = 8 Hz, 1H), 5,55 (dd, J =19,8 Hz, 8,3 Hz, 1H), 4,97 (sept, J = 6,3 Hz, 1H), 4,63 - 4,27 (m, 3H), 4,20 (m, 1H), 4,10 - 3,96 (m, 1H), 3,95 - 3,76 (m, 1H), 1,33 (t, J = 7,8 Hz, 3H), 1,22 (m, 6 H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 8 174,58, 174,54, 174,36, 174,31, 152,14, 152,07, 150,98, 145,48, 131,51, 131,34, 130,83, 126,26, 121,39, 121,37, 121,34, 121,32, 99,77, 85,24, 84,60, 80,02, 79,93, 79,88, 79,78, 71,52, 71,30, 71,05, 70,83, 70,18, 65,78, 65,72, 65,49, 65,44, 51,79, 51,66, 49,64, 49,43, 49,21, 49,00, 48,79, 48,57, 48,36, 21,97, 21,89, 20,54, 20,48, 20,39, 20,31; RMN de 19F (376 MHz, CD3OD) 8 -118,04 (dd, J = 240,8, 22,2 Hz), -119,47 (d, J = 242,6 Hz); RMN de 31P (162 MHz, CD3OD) 8 3,76, 3,69; EMAR calc. para C2-iH27OaN4F2NaP [M+Na]+: 571,13759, hallado: 571,13708.
Ejemplo de referencia 22.
Figure imgf000035_0001
S21: Se cargó un matraz de fondo redondo con 1-p-D-arabinofuranosiluracilo (4,88 g, 20,0 mmol) y diclorometano (40 ml). Se enfrió la mezcla resultante a 0°C y se añadieron 4-DMAP (0,244 g, 2,00 mmol) e imidazol (5,45 g, 80,0 mmol) de una vez. Se añadió TBSC1 (12,06 g, 80,0 mmol) de una vez como un sólido, se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas. Se añadió agua (100 ml) a la mezcla de reacción, se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa con diclorometano (2x 100 ml). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (1 x 100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria para dar ~12g de producto bruto. El análisis por RMN de 1H y CLEM mostró una proporción 3:1 de producto bis-sililado y persililado. Se redisolvió el producto bruto en diclorometano (40 ml) y se añadieron imidazol (2,04 g, 30,0 mmol) y 4-DMAP (0,122 g, 1,00 mmol) de una vez. Se añadió gota a gota triflato de TBS (6,89 ml, 30,0 mmol) por medio de una jeringa y se agitó la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente. Se añadió agua (100 ml) a la mezcla de reacción, se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa con diclorometano (2x100ml). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (1 x 100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria para dar ~25 g de producto bruto. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 330 g, gradiente del 5 al 60% de EtOAc en hexanos) dio S21 (2,90 g, 25%) como un aceite transparente incoloro: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 7,93 (s an., 1H), 7,51 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 5,67 (dd, J = 8,2 Hz, 2,8 Hz, 1H), 4,18 (s, 1H), 4,12 (dd, J =3,2 Hz, 1,3 Hz, 1H), 3,97 (dd, J = 8,6 Hz, 5,8 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 9,8 Hz, 5,7 Hz, 1H), 3,74 (dd, J = 9,7 Hz, 8,6 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,91 (s, 9H), 0,84 (s, 9H), 0,13 (s, 3H), 0,12 (s, 3H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H), -0,06 (s, 3H); EMBR m/z 587,3 [M+H]+, 609,3 [M+Na]+.
S22: A una solución en agitación de S21 (2,90 g, 4,94 mmol) y 4-DMAP (0,060 g, 0,49 mmol) en diclorometano (50 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió A/,W-diisopropiletilamina (4,30 ml, 24,70 mmol) por medio de una jeringa, seguido de cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo sólido (2,99 g, 9,88 mmol) en una parte. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 4 h; a continuación, se volvió a enfriar a 0 °C. Se lavó la mezcla con NaHCO3 ac. sat. enfriado con hielo (3 x 50 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. Se recogió el aceite bruto en diclorometano y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 1 al 10% de EtOAc en hexanos) dio S22 (3,30 g, 78 %) como un aceite transparente incoloro: RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 7,92 (d, J =7,3 Hz, 1H), 7,20 (s, 2H), 6,10 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 6,05 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,33-4,23 (m, 3H), 4,14 (s, 1H), 4,01 (dd, J = 8,8 Hz, 6,2 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 9,6 Hz, 6,2 Hz, 1H), 3,70 (t, J = 9,3 Hz, 1H), 2,90 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,32-1,22 (m, 21H), 0,91 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,72 (s, 9H), 0,10 (s, 6 H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H), -0,03 (s, 3H), -0,34 (s, 3H).
S23: A una solución en agitación de S22 (3,30 g, 3,87 mmol) en acetonitrilo (40 ml) bajo nitrógeno a 0 °C se le añadió trietilamina (1,08 ml, 7,73 mmol) por medio de una jeringa, seguido de clorhidrato de hidroxilamina sólido (0,537 g, 7,73 mmol) en una parte. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 16 h. Se volvió a enfriar la mezcla a 0 °C y se añadió NaHCO3 ac. sat. (80 ml). Se extrajo la mezcla con diclorometano (3 x 80 ml) y se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria. Se sometió el producto bruto a cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 5 al 20 % de EtOAc en diclorometano) para dar un material semipuro. Una segunda cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 5 al 50 % de EtoAc en hexanos) dio S23 (1,17 g, 50 %) como un sólido blanco en escamas: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 8,20 (s an., 1H), 6,90 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,42 (s, 1H), 6,12 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 5,51 (dd, J = 8,3 Hz, 1,8 Hz, 1H), 4,15 (m an., 1H), 4,07 (dd, J = 3,4 Hz, 1,4 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 8,2 Hz, 6,4 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 9,8 Hz, 5,6 Hz, 1H), 3,74 (dd, J = 9,8 Hz, 8,6 Hz, 1H), 0,91 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,86 (s, 9H), 0,12 (s, 3H), 0,11 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 6 H), -0,02 (s, 3H); EMBR m/z 602,3 [M+H]+.
EIDD-02200: A una solución en agitación de S23 (0,602 g, 1,00 mmol) en THF (8 ml) a temperatura ambiente bajo nitrógeno se le añadió trihidrofluoruro de trietilamina (0,163 ml, 1,00 mmol) gota a gota por medio de una jeringa. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 días. Se añadió Celite a la mezcla de reacción y la evaporación rotatoria inmovilizó el producto bruto sobre Celite. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 24 g, gradiente del 5 al 25 % de MeOH en diclorometano) dio 600 mg de producto semipuro. Se recogió la mezcla en agua y la cromatografía ultrarrápida de fase inversa automatizada (columna de 43 g, gradiente del 0 al 15 % de acetonitrilo en agua) dio el producto deseado libre de impurezas. Se disolvió el sólido en agua, se congeló en un baño de hielo seco/acetona y se liofilizó para proporcionar el compuesto del título (0,164 g, rendimiento del 63%) como un sólido blanco floculante: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 8 7,13 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,07 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,51 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 4,5 Hz, 1,3 Hz, 1H), 4,03 (t, J = 3,4 Hz, 1H), 3,87-3,72 (m, 3H); RMN de 1H (400 MHz, D2O) 8 7,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,33 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 3,89-3,86 (m, 2H), 3,76 (dd, J =13,1 Hz, 6,1 Hz, 1H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 8 150,9, 146,8, 132,8, 97,0, 84,1, 82,1, 75,8, 74,8, 60,4; EMBR m/z 260,1 [M+H]+.
Ejemplo 23.
Figure imgf000036_0001
S24: A una suspensión en agitación de EIDD-1931 (1,25 g, 4,82 mmol) en acetona seca (60 ml) bajo nitrógeno a temperatura ambiente se le añadió H2SO4 conc. (0,05 ml, 0,964 mmol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se neutralizó el ácido mediante adición de trietilamina (0,27 ml, 1,93 mmol) y se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 0 al 10 % de metanol en diclorometano) dio S24 (0,831 g, 58 %) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 8 7,03 (d, J =8,2 Hz, 1H), 5,81 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 5,58 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,86 (dd, J = 6,5 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,79 (dd, J = 6,4 Hz, 3,6 Hz, 1H), 4,10 (c, J = 4,0 Hz, 1H), 3,75 (dd, J = 11,9 Hz, 3,7 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 12,0 Hz, 4,5 Hz, 1H), 1,54 (s, 3H), 1,35 (s, 3H).
S25: A una suspensión en agitación de S24 (0,831 g, 2,78 mmol) en diclorometano (14 ml) a temperatura ambiente bajo nitrógeno se le añadió trietilamina (0,58 ml, 4,16 mmol) y 4-DMAP (3,4 mg, 0,028 mmol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15min. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (0,988 g, 2,92 mmol) en diclorometano (14 ml) y se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Se lavó la mezcla de reacción con salmuera (1 x 30 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida (hexanos:EtOAc 9:1, Et3N al 2,5% v/v) dio S25 (1,39 g, 83%) como una espuma amarilla: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 8 7,35-7,20 (m, 10H), 7,01 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,85-6,80 (m, 4H), 5,80 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 5,52 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,84 (dd, J = 6,4 Hz, 3,0 Hz, 1H), 4,77 (dd, J = 6,4 Hz, 3,6 Hz, 1H), 4,10 (c, J = 4,0 Hz, 1H), 3,73 (dd, J = 11,9 Hz, 3,6 Hz, 1H), 3,68 (dd, J =12,0 Hz, 4,6 Hz, 1H), 1,53 (s, 3H), 1,34 (s, 3H).
S27: A una solución en agitación de S26 (0,523 g, 2,56 mmol) y W,A/-diisopropiletilamina (0,46 ml, 2,64 mmol) en acetonitrilo (5 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió S25 (0,300 g, 0,499 mmol). Se permitió que la mezcla resultante alcanzara temperatura ambiente y se agitó 22 h; a continuación, se diluyó con EtOAc (50 ml), se lavó con salmuera (2 x 50 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró mediante evaporación rotatoria. El residuo bruto se llevó directamente a la siguiente etapa sin purificación adicional.
EIDD-2207: Se mezcló la totalidad del S27 bruto preparado en la etapa anterior con ácido fórmico ac. al 80 % p/p (10 ml) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria, y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 15 % de metanol en diclorometano) dio el compuesto del título (0,104 g, 48 % en 2 etapas) como una espuma amarilla, en una mezcla diastereomérica ~1:1 en el fósforo: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 8 7,41­ 7,35 (m, 1H), 7,26-7,18 (m, 2H), 7,12 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 8,3 Hz, 0,5 x1H), 6,69 (d, J = 8,3 Hz, 0,5 x 1H), 5,79 (d, J = 4,8 Hz, 0,5 x 1H), 5,75 (d, J = 4,8 Hz, 0,5 x 1H), 5,54-5,42 (m, 2H), 5,46 (d, J = 8,2 Hz, 0,5 x1H), 5,32 (d, J = 8,2 Hz, 0,5 x1H), 4,56-4,25 (m, 2H), 4,13-4,02 (m, 3H); RMN de 31P (162 MHz, CD3OD, mezcla diastereomérica) 8 -9,13, -9,33; EMAR calc. para C-^H-ia^OgPNa [M+Na]+: 450,06729; hallado: 450,06777.
Ejemplo de referencia 24.
Figure imgf000037_0001
EIDD-2216: Se preparó una solución ~5 N de clorhidrato de hidroxilamina (4,71 g, 67,8 mmol) en agua (13,5 ml) y se ajustó a pH = 6 con una pequeña cantidad de NaOH ac. (10 % p/p). Se cargó un tubo de presión sellable con esta solución y [1',2',3',4',5'-13C5]citidina (0,661 g, 2,26 mmol), se selló el matraz y se calentó con agitación a 37 °C durante 16 h. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, se transfirió a un matraz de fondo redondo y se concentró mediante evaporación rotatoria. Se recogió el material bruto en agua y la cromatografía ultrarrápida de fase inversa automatizada (columna C18 de 240 g, gradiente del 0 al 100% de acetonitrilo en agua) retiró las impurezas más voluminosas para dar 1,4 g de un sólido húmedo. Se disolvió este sólido en agua y una segunda cromatografía de fase inversa automatizada (columna C18 de 240 g, gradiente del 0 al 100 % de acetonitrilo en agua) retiró más impurezas para dar 400 mg de material semipuro. Se disolvió el material en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 24 g, gradiente del 5 al 25 % de MeOH en diclorometano) dio ~200 mg de producto casi puro. Se disolvió el sólido en agua y la cromatografía de fase inversa automatizada final (columna C18 de 48 g, gradiente del 0 al 100 % de acetonitrilo en agua) dio el producto deseado libre de impurezas orgánicas e inorgánicas. Se disolvió el sólido en agua, se congeló en un baño de hielo seco/acetona y se liofilizó para proporcionar el compuesto del título (0,119 g, 20 %) como un sólido floculante púrpura pálido, pureza de ~95 % por análisis por RMN/CLEM: RMN de 1H (400 MHz, D2O) 87,03 (dd, J = 8,2 Hz, 2,2 Hz, 1H), 5,82 (ddd, J = 167,5 Hz, 5,3 Hz, 2,9 Hz, 1H), 5,70 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,47-4,30 (m an., 1H), 4,23-4,03 (m an., 1H), 4,00-3,80 (m an., 2H), 3,65-3,50 (m an., 1H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 8 151,3, 146,6, 131,3, 98,7, 87,9 (dd, J = 43,1 Hz, 4,0 Hz), 84,0 (dd, J = 41,5 Hz, 38,0 Hz), 72,5 (dd, J = 43,3 Hz, 37,8 Hz), 69,8 (td, J = 37,9 Hz, 3,9 Hz), 61,1 (d, J = 41,5 Hz); EMBR m/z 265,1 [M+H]+.
Ejemplo de referencia 25.
Figure imgf000037_0002
S28: Se cargó un tubo de presión sellable con uridina (1,00 g, 4,09 mmol), K2CO3 (0,679 g, 4,91 mmol) y óxido de deuterio (8,2 ml). Se purgó la mezcla con nitrógeno durante 15 minutos, se selló el tubo y se calentó el contenido con agitación a 95 °C durante 16 h. Se enfrió la mezcla a t.a., se abrió el tubo y se transfirió la mezcla a un matraz de fondo redondo y se concentró mediante evaporación rotatoria. El producto bruto resultante se coevaporó con MeOH (x 3) para retirar el agua. El análisis por RMN mostró una incorporación de deuterio >95 % en la posición 5 de la nucleobase. El sólido marrón claro S28 (1,00 g, 100 %) se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 87,76 (s, 1H), 5,88 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 4,17-4,12 (m, 2H), 4,00-3,96 (m, 1H), 3,84 (dd, J =12,3 Hz, 2,8 Hz, 1H), 3,72 (dd, J = 12,3 Hz, 3,5 Hz, 1H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) 8185,6, 177,4, 160,4, 141,1, 91,8, 85,8, 75,9, 71,2, 62,4.
S29: Se cargó un matraz de fondo redondo con S28 (1,00 g, 4,09 mmol) y diclorometano (8 ml) bajo nitrógeno. Se enfrió la mezcla resultante a 0 °C y se añadieron 4-DMAP (0,050 g, 0,408 mmol) e imidazol (1,11 g, 16,3 mmol) de una vez. Se añadió TBSCl (2,15 g, 14,3 mmol) de una vez como un sólido, se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas. Se añadió agua (25 ml) a la mezcla de reacción, se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa con diclorometano (2 x 25 ml). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (1x25m l), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 35% de EtOAc en hexanos) dio S29 (2,52 g, 84%) como una espuma blanquecina: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 88,08 (s an., 1H), 8,03 (s, 1H), 5,89 (d, J =3,6 Hz, 1H), 4,12-4,06 (m, 3H), 3,99 (dd, J = 11,5 Hz, 1,8 Hz, 1H), 3,76 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 0,96 (s, 9H), 0,92 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,14 (s, 3H), 0,13 (s, 3H), 0,10 (s, 3H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 8 163,7, 150,3, 140,3, 89,0, 84,3, 76,1, 70,5, 61,6, 26,0 (3C), 25,8 (3C), 25,7 (3C), 18,4, 18,3, 17,9, -4,2, -4,6, -4,8, -4,9, -5,4, -5,6; EMAR calc. para C2/H54DN2NaO6Si [M+Na]+: 610,32446, hallado: 610,32482.
S30: A una solución en agitación de S29 (0,840 g, 1,43 mmol) en acetonitrilo (14,3 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió secuencialmente cloruro de p-toluenosulfonilo (0,545 g, 2,86 mmol), 4-DMAP (0,175 g, 1,43 mmol) y trietilamina (0,80 ml, 5,71 mmol). Se agitó la mezcla a 0 °C durante 2,5 h, momento en el que se añadió clorhidrato de hidroxilamina (0,993 g, 14,3 mmol) de una vez como un sólido. Se calentó la mezcla a 50 °C durante 3 días; a continuación, se enfrió a t.a. Se diluyó la mezcla de reacción con EtOAc (100 ml); a continuación, se lavó con agua (2 x 10 0 ml) y salmuera (1 x 10 0 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 5 al 35 % de EtOAc en hexanos) produjo una mezcla del material de partida y el producto deseado. Una segunda cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 24 g, gradiente del 10 al 40 % de EtOAc en hexanos) dio S30 (0,332 g, 39 %) como una espuma blanquecina: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 8,37 (s an., 1H), 5,92 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 4,10-4,05 (m, 2H), 4,04-4,00 (m, 1H), 3,91 (dd, J = 11,6 Hz, 2,4 Hz, 1H), 3,73 (dd, J =11,6 Hz, 1,8 Hz, 1H), 0,95 (s, 9H), 0,92 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,12 (s, 6 H), 0,10 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,06 (s, 3H), 0,05 (s, 3H).
EIDD-2261: Se cargó un matraz de fondo redondo con S30 (0,332 g, 0,551 mmol), fluoruro de tetrametilamonio (0,196 g, 2,64 mmol), THF (8,25 ml) y DMF (2,75 ml) bajo nitrógeno a 0 °C. Se añadió ácido acético (0,157 ml, 2,75 mmol) de una vez por medio de una jeringa. Se permitió que la mezcla alcanzara 45 °C y se calentó con agitación durante 4 días; a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 20 % de MeOH en DCM) dio el compuesto del título (0,106 g, 74%) como un sólido blanco. El análisis final por RMN mostró una incorporación de deuterio >95% en la posición 5 de la nucleobase: RMN de 1 H (400 MHz, D2O) 8 7,16 (s, 1H), 5,85 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,14 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,10 (dd, J =5,6 Hz, 3,8 Hz, 1H), 3,93 (c, J = 3,4 Hz, 1H), 3,77 (dd, J =12,2 Hz, 2,9 Hz, 1H), 3,68 (dd, J = 12,2 Hz, 3,4 Hz, 1H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) 8 151,8, 146,3, 132,1, 89,7, 86,1, 74,6, 71,8, 62,8; EMAR calc. para C9H13DN3O6 [M+H]+: 261,09399, hallado: 261,09371.
Ejemplo de referencia 26.
Figure imgf000038_0001
S31: Se cargó un matraz de fondo redondo con S8 (3,13 g, 11,0 mmol) y diclorometano (75 ml) bajo nitrógeno a temperatura ambiente. A esta mezcla en agitación se le añadió secuencialmente dicromato de piridinio (8,28 g, 22,0 mmol), anhídrido acético (10,4 ml, 110 mmol) y f-butanol (21,1 ml, 220 mmol) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla durante 22 horas a temperatura ambiente; a continuación, se lavó con agua (1 x 75 ml). Se extrajo la capa acuosa con diclorometano (2 x 75 ml) y se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (1 x 100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria. Se recogió el residuo obtenido en EtOAc y se filtró a través de un tapón de Celite, seguido de lavado con EtOAc. Se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 120 g, gradiente del 40 al 80 % de EtOAc en hexanos) dio S31 (3,10 g, 72 %) como una espuma blanquecina: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 8,36 (s an., 1H), 7,42 (d, J =8,0 Hz, 1H), 5,76 (dd, J = 8,0 Hz, 2,3 Hz, 1H), 5,59 (s, 1H), 5,27 (dd, J = 6,0 Hz, 1,8 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,62 (d, J =1,8 Hz, 1H), 1,56 (s, 3H), 1,48 (s, 9H), 1,39 (s, 3H).
S32: A una solución en agitación de S31 (2,61 g, 7,37 mmol) en EtOD (75 ml) a temperatura ambiente bajo nitrógeno se le añadió NaBD4 (1,234 g, 29,5 mmol) en una parte. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, se calentó a 55 °C durante 6 horas y, a continuación, durante la noche a temperatura ambiente. Se enfrió la mezcla a 0 °C y se inactivó el exceso de reactivo con AcOD. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria para dar S32 bruto (2,57 g) que se llevó directamente a la siguiente etapa sin purificación adicional.
S33: A una suspensión en agitación de S32 bruto (2,00 g de material impuro, ~5,74 mmol) en diclorometano (70 ml) a 0 °C se le añadió imidazol sólido (1,90 g, 27,9 mmol) y 4-DMAP (0,171 g, 1,40 mmol). Se añadió cloruro de í-butildimetilsMilo sólido (2,11 g, 14,0 mmol) y se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 4 días. Se lavó la mezcla secuencialmente con agua y salmuera (1 x 70 ml cada una), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 120 g, gradiente del 0 al 35% de EtOAc en hexanos) dio S33 (1,42 g, 66% en 2 etapas) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 8,30 (s an., 1H), 7,72 (m, 1H), 5,99 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,69 (dd, J = 8,2 Hz, 2,3 Hz, 1H), 4,77 (dd, J = 6,1 Hz, 2,9 Hz, 1H), 4,69 (dd, J = 6,2 Hz, 2,8 Hz, 1H), 4,33 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 1,60 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 0,91 (s, 9H), 0,11 (s, 3), 0,10 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CDCla) 8 162,7, 149,9, 140,5, 114,1, 102,1, 91,9, 86,5, 85,4, 80,3, 27,4, 25,9 (3C), 25,4, 18,4, -5,4, -5,5; EMAR calc. para C1sH29D2N2O6Si [M+H]+: 401,20714, hallado: 401,20663.
S34: A una solución en agitación de S33 (1,42 g, 3,55 mmol) en acetonitrilo (35 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió secuencialmente cloruro de p-toluenosulfonilo (1,35 g, 7,09 mmol), 4-DMAP (0,433 g, 3,55 mmol) y trietilamina (9,88 ml, 70,9 mmol). Se agitó la mezcla resultante a 0 °C durante 2,5 horas. Se añadió clorhidrato de hidroxilamina (2,46 g, 35,5 mmol) y se calentó la mezcla con agitación a 50 °C durante 2 días. Se volvió a enfriar la mezcla a t.a. y se diluyó con EtOAc (100 ml); a continuación, se lavó con agua (2x50m l) y salmuera (1 x 50 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 120 g, gradiente del 1 al 3,5 % de metanol en diclorometano) dio S34 (0,416 g, 28 %) como un sólido blanquecino: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 88,36 (s an., 1H), 7,00 (m, 1H), 5,97 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 5,58 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,77 (dd, J = 6,2 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,68 (dd, J = 6,3 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 0,92 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,10 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 8 149,0, 145,4, 131,4, 114,1, 98,3, 90,8, 85,5, 84,5, 80,2, 27,4, 25,9 (3C), 25,5, 18,4, -5,4, -5,5; EMAR calc. para C18H29D2NaO6S1 [M+H]+: 416,21804, hallado: 416,21827.
S35: A una solución en agitación de S34 (0,416 g, 1,00 mmol) en THF (5 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió una solución 1,0 M de TBAF en THF (1,50 ml, 1,5 mmol) y se mantuvo la mezcla resultante a 0°C durante 24 horas. Se concentró la mezcla de reacción mediante evaporación rotatoria y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 0 al 8 % de metanol en diclorometano) dio S35 (0,257 g, 85 %) como un sólido blanco: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 8 7,02 (m, 1H), 5,81 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 5,58 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,86 (dd, J = 6,4 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,79 (dd, J = 6,5 Hz, 3,6 Hz, 1H), 4,09 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 1,54 (s, 3H), 1,34 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) 8 151,3, 146,2, 133,4, 115,2, 99,4, 92,9, 87,2, 84,9, 82,1, 27.6, 25,6; EMAR calc. para C12H16D2N3O6 [M+H]+: 302,13157, hallado: 302,13130.
EIDD-2345: A una solución en agitación de S35 (0,140 g, 0,465 mmol) en metanol (8,4 ml) y agua (0,93 ml) a temperatura ambiente se le añadió Dowex 50WX8 forma hidrogenada (0,30 g) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 5 al 20 % de metanol en diclorometano) dio el compuesto del título (0,050 g, 41 %) como un sólido blanquecino. RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 8 7,17 (m, 1H), 5,86 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,60 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,15 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,11 (dd, J = 5,6 Hz, 3,5 Hz, 1H), 3,94 (d, J = 3,8 Hz, 1H); RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) 8 151,8, 146,3, 132,2, 99,3, 89.7, 86,0, 74,6,71,7, EMAR calc. para C9H10D2N3O6 [M+H]+: 260,08571, hallado: 260,08578.
Ejemplo de referencia 27.
Figure imgf000039_0001
S36: A una solución en agitación de S2 (0,090 g, 0,150 mmol) en DCM (1,5 ml) bajo nitrógeno a t.a. se le añadió isocianato de hexadecilo (0,051 ml, 0,165 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 2 minutos. Se agitó la reacción a t.a. durante 4 h; a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria para dar un residuo bruto. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 0 al 20 % de EtOAc en hexanos) dio S36 (0,120 g, 92 %) como una espuma blanquecina: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 88,27 (s an., 1H), 7,51 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,29 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 5,57 (dd, J = 8,2 Hz, 2,2 Hz, 1H), 4,09-4,02 (m, 3H), 3,93 (dd, J =11,7 Hz, 2,2 Hz, 1H), 3,73 (dd, J = 11,6 Hz, 1,6 Hz, 1H), 3,27 (c, J = 6,6 Hz, 2H), 1,56 (m, 2H), 1,26 (s an., 28H), 0,95 (s, 9H), 0,91 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,89 (m, 3H), 0,13 (s, 3H), 0,12 (s, 3H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 0,04 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 8154,6, 147,9, 146,9, 134,0, 96.0, 91,2, 87,9, 85,1, 75,5, 71,7, 62,5, 41,2, 31,9, 29,73, 29,70, 29,69 (2C, isocronía accidental), 29,67, 29,65 (2C, isocronía accidental), 29,60, 29,5, 29,4, 29,3, 26,8, 26,0 (3C), 25,8 (3C), 25,7 (3C), 22,7, 18,4, 18,1, 17,9, 14.1 , -4 ,4 , -4 ,6 , -4,7, -4,8, -5,5, -5,6; EMAR calc. para C44H8gN4OySi3 [M+H]+: 869,60336, hallado: 869,60408.
EIDD-2356: A una solución en agitación de S36 (0,120 g, 0,138 mmol) en THF (2,75 ml) bajo nitrógeno a 0 °C se le añadió una solución 1 M de TBAF en THF (0,483 ml, 0,483 mmol). Se agitó la solución a 0 °C durante 5 horas; a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 0 al 10 % de MeOH en diclorometano) dio el compuesto del título (0,055 g, 76 %) como un sólido blanquecino. RMN de 1H (400 MHz, CDCh con una gota de CD3OD) 8 7,26 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,62 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,55 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,14-4,06 (m, 2H), 3,96-3,92 (m, 1H), 3,82-3,76 (m, 1H), 3,65 (m, 1H, oculto por MeOH-d4), 3,15 (t, 7,0 Hz, 2H), 1,56 (m, 2H), 1,30-1,11 (s an., 28H), 0,79 (t, J = 6,9 Hz, 3H); EMAR calc. para C26H47N4O7 [M+H]+: 527,34393, hallado: 527,34396.
Ejemplo de referencia 28.
Figure imgf000040_0001
S37: A una solución en agitación de S2 (0,090 g, 0,150 mmol) en DCM (1,5 ml) bajo nitrógeno a t.a. se le añadió isocianato de octadecilo (0,057 ml, 0,165 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 2 minutos. Se agitó la reacción a t.a. durante 6 h; a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria para dar un residuo bruto. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 0 al 20% de EtOAc en hexanos) dio S37 (0,128 g, 95 %) como una espuma blanquecina: RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 8,27 (s an., 1H), 7,51 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,29 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,57 (dd, J = 8,2 Hz, 2,2 Hz, 1H), 4,10-4,00 (m, 3H), 3,93 (dd, J = 11,6 Hz, 2,1 Hz, 1H), 3,73 (dd, J = 11,7 Hz, 1,5 Hz, 1H), 3,28 (c, J = 6,6 Hz, 2H), 1,55 (m, 2H), 1,26 (s an., 30H), 0,95 (s, 9H), 0,91 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,89 (m, 3H), 0,13 (s, 3H), 0,12 (s, 3H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 0,04 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, CDClg) 8 154,6, 147,9, 146,9, 134,0, 96,0, 91,2, 87,9, 85,1, 75,5, 71,7, 62,5, 41,2, 31,9, 29,73, 29,70 (5C, isocronía accidental), 29,67, 29,66 (2C, isocronía accidental), 29,60, 29,5, 29,4, 29,3, 26,8, 26,0 (3C), 25,8 (3C), 25,7 (3C), 22,7, 18,4, 18,1, 17,9, 14,1, -4 ,4 , -4 ,6 , -4,7, -4,8, -5,5, -5,6; EMAR calc. para C46H93N4OySi3 [M+H]+: 897,63466, hallado: 897,63589.
EIDD-2357: A una solución en agitación de S37 (0,128 g, 0,143 mmol) en THF (2,85 ml) bajo nitrógeno a 0 °C se le añadió una solución 1 M de TBAF en THF (0,499 ml, 0,499 mmol). Se agitó la solución a 0 °C durante 5 horas; a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 0 al 10 % de MeOH en diclorometano) dio el compuesto del título (0,059 g, 74 %) como un sólido blanquecino. RMN de 1H (400 MHz, CDClg) 8 10,70 (s an., 1H), 7,47 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,56 (t, J = 6,2 Hz, 1H), 5,76 (s, 1H), 5,60 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,32-4,20 (m an., 2H), 4,12-4,02 (m an., 2H), 3,90 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 1,56 (m, 2H), 1,26 (s an, 30H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); EMAR calc. para C28H51N4O7 [M+H]+: 555,37523, hallado: 555,37531.
Ejemplo de referencia 29.
Figure imgf000040_0002
S38: A una mezcla en agitación vigorosa de trifosgeno (0,297 g, 1,00 mmol) y bicarbonato de sodio (0,370 g, 4,40 mmol) en acetonitrilo (5 ml) a -15 °C se le añadió gota a gota una solución mezclada de metilamina (2,0 M en THF, 0,600 ml, 1,20 mmol) y trietilamina (0,488 ml, 3,50 mmol) por medio de una jeringa. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 6 horas. Se preparó una solución de S2 (0,662 g, 1,10 mmol) y 4-DMAP (0,024 g, 0,200 mmol) en acetonitrilo (5 ml) y DCM (5 ml) y esta se añadió gota a gota a la mezcla de reacción por medio de una jeringa. Se agitó la mezcla completa a temperatura ambiente durante 16 h, se diluyó con diclorometano (50 ml) y se lavó con NaHCO3 ac. sat. y salmuera (1 x25 ml cada uno), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. Se recogió el producto bruto en diclorometano y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 24 g, gradiente del 5 al 35 % de EtOAc en hexanos) dio S38 (0,340 g, 52 %) como un sólido ceroso blanco. El análisis por RMN mostró una proporción de rotámeros ~8:1: RMN de 1H (400 MHz, D M S O d rotámero principal) 6 10,53 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,30 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,83 (c, J = 4,9 Hz, 1H), 5,80 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 5,67 (dd, J = 8,3 Hz, 2,2 Hz, 1H), 4,18 (dd, J = 6,4 Hz, 4,3 Hz, 1H), 4,05 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,82 (dd, J = 11,6 Hz, 4,0 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 11,5 Hz, 2,9 Hz, 1H), 2,64 (d, J = 4,7 Hz, 3H), 0,91 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,83 (s, 9H), 0,10 (s, 6 H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,02 (s, 3H), -0,03 (s, 3H).
EIDD-2422: A una solución en agitación de S38 (0,330 g, 0,500 mmol) en THF (3,75 ml) y DMF (1,25 ml) a 0 °C se le añadió ácido acético (0,143 ml, 2,50 mmol), seguido de fluoruro de tetraetilamonio (0,359 g, 2,40 mmol) de una vez. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 24 horas. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y el producto bruto se recogió en diclorometano. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 12 g, gradiente del 1 al 25 % de MeOH en diclorometano) dio 80 mg de material semipuro. Se recogió este material en agua y la cromatografía ultrarrápida de fase inversa automatizada (columna de 30 g, gradiente del 0 al 100 % de acetonitrilo en agua) dio el producto deseado libre de impurezas. Se disolvió el sólido en agua, se congeló en un baño de hielo seco/acetona y se liofilizó para proporcionar el compuesto del título (0,057 g, rendimiento del 36 %) como un sólido blanco floculante. El análisis por RMN mostró una proporción 13:1 de señales en D2O y una proporción 8:1 en MeOH-d4, lo que indica proporciones de rotámeros dependientes del disolvente de un único compuesto puro: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, rotámero principal) 6 7,45 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,69 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,16-4,08 (m, 2H), 3,96 (c, J = 3,2 Hz, 1H), 3,79 (dd, J = 12,2 Hz, 2,8 Hz, 1H), 3,69 (dd, J =12,2 Hz, 3,3 Hz, 1H), 2,79 (s, 3H); RMN de 1H (400 MHz, D2O, rotámero principal) 6 7,27 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,84 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,80 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,28 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 4,17 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 4,05 (c, J = 4,2 Hz, 1H), 3,82 (dd, J =12,8 Hz, 3,1 Hz, 1H), 3,73 (dd, J =12,8 Hz, 4,6 Hz, 1H), 2,76 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 6 157,6, 150,2, 148,8, 134,0, 97,1, 88,4, 84,1, 73,1, 69,7, 61,0, 26,9; EMBR m/z 315,1 [M-H]-.
Ejemplo de referencia 30.
Figure imgf000041_0001
S39: A una solución en agitación vigorosa de S2 (1,10 g, 1,82 mmol) en piridina (12 ml) bajo nitrógeno a 0 °C se le añadió cloruro de dimetilcarbamilo (0,184 ml, 2,00 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 5 minutos. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 4 horas; a continuación, se permitió que alcanzara temperatura ambiente y se agitó otras 16 horas. Se añadió metanol (2 ml), se agitó la mezcla durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente; a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria. Se recogió el producto bruto en diclorometano y la cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 40 g, gradiente del 5 al 50 % de EtOAc en hexanos) proporcionó S39 (1,16 g, 95%) como un sólido blanco esponjoso. El análisis por RMN mostró una proporción de rotámeros ~10:1: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6, rotámero principal) 6 10,76 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,80 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,70 (dd, J = 8,2 Hz, 2,2 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 6,3 Hz, 4,6 Hz, 1H), 4,05 (dd, J = 4,3 Hz, 2,3 Hz, 1H), 3,92 (c, J = 3,1 Hz, 1H), 3,83 (dd, J = 11,5 Hz, 4,0 Hz, 1H), 3,70 (dd, J =11,5 Hz, 2,8 Hz, 1H), 2,96 (s an., 3H), 2,83 (s an., 3H), 0,91 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,83 (s, 9H), 0,10 (s, 6 H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,02 (s, 3H), -0,01 (s, 3H).
EIDD-2423: A una solución en agitación de S39 (1,16 g, 1,72 mmol) en THF (12,9 ml) y DMF (4,3 ml) a 0 °C se le añadió ácido acético (0,493 ml, 8,62 mmol), seguido de fluoruro de tetraetilamonio (1,24 g, 8,27 mmol) de una vez. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y el producto bruto se recogió en diclorometano. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 1 al 15 % de MeOH en diclorometano) dio 400 mg de material semipuro. Se recogió este material en agua y la cromatografía ultrarrápida de fase inversa automatizada (columna de 100 g, gradiente del 0 al 100 % de acetonitrilo en agua) dio el producto deseado libre de impurezas. Se disolvió el sólido en agua, se congeló en un baño de hielo seco/acetona y se liofilizó para proporcionar el compuesto del título (0 ,200 g, rendimiento del 35 %) como un sólido blanco floculante. El análisis por RMN mostró una proporción 9:1 de señales en D2O y una proporción 5:1 en MeOH-d4, lo que indica proporciones de rotámeros dependientes del disolvente de un único compuesto puro: RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, rotámero principal) 6 7,46 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,85 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,18-4,11 (m, 2H), 3,97 (c, J = 3,5 Hz, 1H), 3,80 (dd, J =12,1 Hz, 2,8 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 12,2 Hz, 3,2 Hz, 1H), 3,05 (s an., 3H), 2,98 (s an., 3H); RMN de 1H (400 MHz, D2O, rotámero principal) □ 7,27 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,84 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,80 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,28 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 4,17 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,05 (c, J = 4,3Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 12,7 Hz, 3,2 Hz, 1H), 3,73 (dd, J = 12,7 Hz, 4,5 Hz, 1H), 2,99 (s an., 3H), 2,91 (s an., 3H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 8 156,2, 150,1, 149,4, 133,9, 97,2, 88,3, 84,1, 73,0, 69,7, 61,0, 36,5, 35,7; CLEM m/z 329,0 [M-H]-.
Ejemplo 31.
Figure imgf000042_0001
S40: Se enfrió una solución de S25 (0,50 g, 0,83 mmol) en diclorometano anhidro (5 ml) en un matraz de fondo redondo a 0 °C con un baño de hielo bajo nitrógeno y se trató con piridina (0,14 ml, 1,66 mmol) y DMAP (10 mg, 0,083 mmol), seguido de adición gota a gota de cloroformiato de heptilo (0,165 ml, 0,914 mmol). Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. Una vez completada la reacción, se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano (25 ml) y se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 5 % (25 ml) y bicarbonato de sodio acuoso (25 ml). Se secó la capa orgánica sobre Na2SO4 y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar S40. El producto bruto se llevó directamente a la siguiente etapa sin purificación adicional.
EIDD-2474: Se agitó la totalidad del S40 bruto preparado como anteriormente con ácido fórmico (10 ml) a temperatura ambiente durante 12 h. Se retiró el disolvente mediante evaporación rotatoria y se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida usando metanol y diclorometano para proporcionar el compuesto del título (0,140 g, 42% en dos etapas) como un sólido incoloro: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 8 10,05 (s, 1H), 9,61 (s, 1H), 6,85 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,75 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,57 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,42 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 4,31 (dd, J =11,7Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,20 (dd, J =11,8 Hz, 5,4 Hz, 1H), 4,14-4,08 (m, 1H), 4,02 (c, J = 5,7 Hz, 1H), 3,97-3,90 (m, 2H), 3,10 (m, 1H), 1,61-1,18 (m, 10H), 0,90-0,86 (m, 3H); RMN de 13C (100 MHz, DMSO-cfe) 8 154,9, 149,9, 143,6, 130,3, 99,2, 87,9, 81,0, 72,1, 70,4, 68,2, 67,8, 45,9, 31,6, 28,5, 25,6, 22,5, 14,4; EMBR m/z 402,1 [M+H]+.
Ejemplo de referencia 32.
Figure imgf000042_0002
S41: Se enfrió a 0 °C una solución de S25 (0,40 g, 0,66 mmol) en diclorometano anhidro (5 ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml con un baño de hielo bajo nitrógeno y se trató con piridina (0,10 ml, 1,33 mmol) y DMAP (0,080 g, 0,66 mmol), seguido de adición de isocianato de heptilo (0,16 ml, 0,99 mmol) y se agitó a 40 °C durante 12 h. Una vez completada la reacción, se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano (25 ml) y se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 5 % (25 ml) y bicarbonato de sodio acuoso (25 ml). Se secó la capa orgánica sobre Na2SO4 y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar S41 bruto. El producto bruto se llevó directamente a la siguiente etapa sin purificación adicional.
EIDD-2475: Se agitó la totalidad del S41 bruto preparado como anteriormente con ácido fórmico (10 ml) a temperatura ambiente durante 12 h. Se retiró el disolvente mediante evaporación rotatoria y se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida usando metanol y diclorometano para proporcionar el compuesto del título (0,150 g, 56 % en 2 etapas) como un sólido incoloro: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 8 9,98 (s, 1H), 9,53 (s, 1H), 7,26 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,52 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,19-3,77 (m, 5H), 2,94 (c, J = 6,2 Hz, 2H), 1,48-1,10 (m, 10H), 0,83 (t, J = 6,6 Hz, 3H); RMN de 13C (101 MHz, DMSO-cfe) 8 156,3, 150,0, 143,7, 130,4, 99,1, 87,4, 81,9, 72,1, 70,6, 64,2, 31,7, 29,9, 28,9, 26,6, 22,5, 14,4; EMBR m/z 401,1 [M+H]+.
Ejemplo 33.
Figure imgf000043_0001
S42: Se enfrió a 0 °C una solución de S25 (0,25 g, 0,41 mmol) en diclorometano anhidro (5 ml) en un matraz de fondo redondo de 50 ml con un baño de hielo bajo nitrógeno y se trató con piridina (0,068 ml, 0,83 mmol) y DMAP (0,073 g, 0,41 mmol), seguido de adición de cloruro de nonanoilo (0,082 ml, 0,45 mmol) y se agitó a 40 °C durante 12 h. Una vez completada la reacción, se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano (15 ml) y se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 5 % (20 ml) y bicarbonato de sodio acuoso (20 ml). Se secó la capa orgánica sobre Na2SO4 y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar S42 bruto. El producto bruto se llevó directamente a la siguiente etapa sin purificación adicional.
EIDD-2476: Se agitó la totalidad del S42 bruto preparado como anteriormente con ácido fórmico (5 ml) a temperatura ambiente durante 12 h. Se retiró el disolvente mediante evaporación rotatoria y se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida usando metanol y diclorometano para proporcionar el compuesto del título (0,080 g, 54 % en 2 etapas) como un sólido incoloro: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 8 9,99 (s, 1H), 9,54 (s, 1H), 6,81 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,69 (d, J = 5,6 Hz, 1H) (dd, J = 8,2 Hz, 1,8 Hz, 1H), 5,35 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 4,25-4,02 (m, 2H), 4,03-3,78 (m, 3H), 2,35-2,20 (m, 2H), 1,58-1,42 (m, 2H), 1,22 (m, 10H), 0,83 (t, J = 3,3 Hz, 3H); RMN de 13C (100 MHz, DMSO-cfe) 8 173,2, 149,9, 143,7, 130,3, 99,2, 88,0, 81,1, 72,3, 70,4, 64,3, 33,8, 31,7, 29,1, 29,0, 28,9, 24,9, 22,5, 14,4; EMBR m/z 400,2 [M+H]+.
Ejemplo de referencia 34.
Figure imgf000043_0002
S43: A una solución en agitación de S8 (5,87 g, 20,7 mmol) en piridina (20 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió fosforocloridato de dietilo (2,99 ml, 20,7 mmol) gota a gota por medio de una jeringa. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 30 minutos; a continuación, se permitió que alcanzara temperatura ambiente y se agitó 30 minutos adicionales. Se volvió a enfriar la mezcla a 0 °C, se añadió MeOH (20 ml), se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 15 minutos. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y se recogió en diclorometano. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 120 g, gradiente del 1 al 10 % de MeOH en diclorometano) dio S43 (4,25 g, 49%) como un sólido blanquecino en escamas: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 8 9,28 (s an., 1H), 8,39 (s an., 1H), 7,95 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 6,04 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,80 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 5,07 (dd, J = 6,4 Hz, 1,7 Hz, 1H), 4,79 (dd, J = 6,4 Hz, 3,7 Hz, 1H), 4,30-4,24 (m, 1H), 4,21­ 4,07 (m, 2H), 4,01 (dc, J =8,2 Hz, 7,1 Hz, 4H), 1,49 (s, 3H), 1,29 (s, 3H), 1,22 (tc, J = 7,0 Hz, 0,8 Hz, 6 H); RMN de 31P (162 MHz, CDCla) 8 -1,21; EMBR m/z 420,1 [M+H]+.
S44: Se preparó una solución ~5 N de clorhidrato de hidroxilamina (12,7 g, 182 mmol) en agua (volumen de solución de 36,4 ml) y se ajustó a pH = 6 con una pequeña cantidad de NaOH ac. (10 % p/p). Se cargó un tubo de presión sellable con esta solución, S43 (3,82 g, 9,11 mmol) y THF (18 ml), se selló el matraz y se calentó la mezcla con agitación a 37 °C durante 5 días. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, se transfirió a un matraz de fondo redondo y se concentró mediante evaporación rotatoria. Se recogió el material bruto en metanol y se inmovilizó sobre Celite. La cromatografía ultrarrápida automatizada (columna de 80 g, gradiente del 0 al 10% de MeOH en diclorometano) dio S44 (2,28 g, 58%) como un sólido blanco en escamas: RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 88,58 (s an., 1H), 7,72 (s an., 1H), 6 ,68 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,69 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,63 (dd, J = 7,8 Hz, 1,1 Hz, 1H), 4,93 (dd, J = 6,4 Hz, 2,4 Hz, 1H), 4,85 (dd, J = 6,5 Hz, 3,6 Hz, 1H), 4,30-4,20 (m, 3H), 4,20-4,10 (m, 5H), 1,57 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,35 (tdd, J = 7,0 Hz, 4,1 Hz, 1,0 Hz, 6 H); RMN de 31 P (162 MHz, CDCh) 8 -1,09; EMBR m/z 436,1 [M+H]+.
EIDD-2503: Se agitó una solución de S44 (0,25 g, 0,57 mmol) con ácido fórmico (5 ml) a temperatura ambiente durante 12 h bajo nitrógeno. Una vez completada la reacción, se retiró el disolvente mediante evaporación rotatoria y se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida usando metanol y diclorometano para proporcionar el compuesto del título (0,180 g, 79%) como un sólido incoloro: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 8 10,00 (s, 1H), 9,57 (s, 1H), 6,83 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,54 (dd, J = 8,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 5,38 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 4,16-3,86 (m, 8 H), 1,30-1,15 (m, 5H). RMN de 13C (100 MHz, DMSO-da) 8 149,9, 143,7, 130,3, 110,0, 99,1, 87,8, 82,0, 72,1, 70,2, 67,2, 63,9, 16,4; RMN de 31P (162 MHz, DMSO-d6) 8 -1,12; EMBR m/z 396,1 [M+H]+.
Ejemplo 36.
Protocolos de ensayo
(1) Ensayos de detección para DENV, JEV, POWV, WNV, YFV, PTV, RVFV, CHIKV, EEEV, VEEV, WEEV, TCRV, PCV, JUNV, MPRLV
Ensayo de reducción del efecto alopático (ECP) principal. Se realizan ensayos de inhibición de ECP a cuatro concentraciones. Se preparan monocapas de cultivo celular confluentes o casi confluentes en microplacas desechables de 96 pocillos. Se mantienen las células en MEM o DMEM complementado con FBS según se requiera para cada línea celular. Para los ensayos antivirales, se usa el mismo medio pero con FBS reducido al 2 % o menos y complementado con 50 pg/ml de gentamicina. Se prepara el compuesto de prueba a cuatro concentraciones log-10 finales, normalmente 0,1, 1,0, 10 y 100 pg/ml o pM. En cada microplaca hay pocillos de control vírico y control celular. Paralelamente, se somete a prueba un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando el mismo procedimiento que se aplica para los compuestos de prueba. El control positivo se somete a prueba con cada serie de pruebas. El ensayo se establece retirando primero el medio de crecimiento de las placas de células de 96 pocillos. A continuación, el compuesto de prueba se aplica a los pocillos en un volumen de 0,1 ml a una concentración 2X. El virus, normalmente en dosis infectiva al 50 % en cultivo celular (CCID50) < 100 en un volumen de 0 ,1 ml, se coloca en los pocillos designados para la infección por virus. Se coloca medio desprovisto de virus en los pocillos de control de toxicidad y en los pocillos de control celular. Los pocillos de control vírico se tratan de forma similar con virus. Se incuban las placas a 37 °C con 5 % de CO2 hasta que se observa el ECP máximo en los pocillos de control vírico. A continuación, se tiñen las placas con rojo neutro al 0,011 % durante aproximadamente dos horas a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. Se retira el medio rojo neutro por aspiración completa y se pueden enjuagar las células 1X con solución tamponada con fosfato (PBS) para retirar el tinte residual. Se retira completamente el PBS y se eluye el rojo neutro incorporado con tampón citrato de Sorensen al 50 %/etanol al 50 % (pH 4,2) durante al menos 30 minutos. El tinte rojo neutro penetra en las células vivas; por tanto, cuanto más intenso es el color rojo, mayor es el número de células viables presentes en los pocillos. Se cuantifica el contenido de tinte en cada pocillo usando un espectrofotómetro de 96 pocillos a una longitud de onda de 540 nm. Se convierte el contenido de tinte en cada conjunto de pocillos en un porcentaje de tinte presente en los pocillos de control sin tratar usando una hoja de cálculo basada en ordenador de Microsoft Excel. A continuación, se calculan las concentraciones eficaces al 50 % (EC50, inhibidora de virus) y las concentraciones citotóxicas al 50 % (CC50, inhibidora de células) mediante análisis de regresión lineal. El cociente de CC50 dividido por EC50 da el valor del índice de selectividad (SI).
Ensayo de reducción de rendimiento de virus (RRV)/ECP secundario. Este ensayo implica una metodología similar a la descrita en los párrafos previos usando microplacas de células de 96 pocillos. En esta sección se indican las diferencias. Se someten a prueba ocho concentraciones semilogarítmicas de inhibidor para determinar la actividad antivírica y la citotoxicidad. Después de que se produzca suficiente replicación del virus, se toma una muestra de sobrenadante de cada pocillo infectado (se combinan tres pocillos replicados) y se guarda para la parte de RRV de esta prueba, si es necesario. De forma alternativa, se puede preparar una placa separada y se puede congelar la placa para el ensayo de RRV. Después de que se observe el ECP máximo, se tiñen las placas viables con tinte rojo neutro. Se cuantifica el contenido de tinte incorporado como se describe anteriormente. Los datos generados a partir de esta parte de la prueba son valores de EC50, CC50 e SI de rojo neutro. Los compuestos que se ha observado anteriormente que son activos se evalúan adicionalmente mediante el ensayo de RRV. La prueba de RRV es una determinación directa de cuánto inhibe el compuesto de prueba la replicación del virus. Se titula el virus que se replicó en presencia del compuesto de prueba y se compara con el virus de los controles infectados no tratados. La titulación de muestras víricas agrupadas (recogidas como se describe anteriormente) se realiza mediante dilución de punto final. Esto se logra titulando diluciones log-10 de virus usando 3 o 4 micropocillos por dilución en monocapas recién preparadas de células por dilución de punto final. Se puntúan los pocillos en función de la presencia o ausencia de virus después de que se observe un ECP distintivo (medido por la captación de rojo neutro). Trazar el log-10 de la concentración de inhibidor frente al log-10 de virus producido a cada concentración permite calcular la concentración efectiva al 90 % (un log-10) mediante regresión lineal. Al dividir la EC90 por la CC50 obtenida en la parte 1 del ensayo da el valor de SI para esta prueba.
Ejemplo 37.
(2) Ensayos de detección del virus de la fiebre de Lassa (LASV)
Ensayo principal del virus de la fiebre de Lassa. Se preparan monocapas de cultivo celular confluentes o casi confluentes en placas de cultivo celular desechables de 12 pocillos. Se mantienen las células en DMEM complementado con FBS al 10 %. Para los ensayos antivirales, se usa el mismo medio pero con FBS reducido al 2 % o menos y complementado con penicilina/estreptomicina al 1 %. Se prepara el compuesto de prueba a cuatro concentraciones log-io finales, normalmente 0,1, 1,0, 10 y 100 pg/ml o pM. El control vírico y el control celular se ejecutarán en paralelo a cada compuesto sometido a prueba. Además, se somete a prueba un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando la misma configuración experimental que se describe para el control vírico y celular. El control positivo se somete a prueba con cada serie de pruebas. El ensayo se establece retirando primero el medio de crecimiento de las placas de células de 12 pocillos e infectando las células con 0,01 MOI de la cepa Josiah del LASV. Se incubarán las células durante 90 min: 500 pl de inóculo/pocillo M12, a 37 °C, 5 % de CO2 con oscilación suave constante. Se retirarán los inóculos y se lavarán las células 2 veces con medio. A continuación, se aplica el compuesto de prueba en 1 ml de volumen total de medio. Se recogerá el sobrenadante del cultivo tisular (SCT) en los puntos de tiempo apropiados. A continuación, se utilizará el SCT para determinar el efecto inhibidor de los compuestos sobre la replicación del virus. Se titula el virus que se replicó en presencia del compuesto de prueba y se compara con el virus de los controles infectados no tratados. Para la titulación de SCT, se prepararán diluciones seriadas 1:10 y se usarán para infectar monocapas recién preparadas de células. Se cubrirán las células con agarosa al 1 % mezclada 1:1 con 2X MEM complementado con FBS al 10 % y penicilina al 1 %, y se determinará el número de calvas. Trazar el log-10 de la concentración de inhibidor frente al log-10 de virus producido a cada concentración permite calcular la concentración efectiva al 90 % (un log-^) mediante regresión lineal.
Ensayo secundario del virus de la fiebre de Lassa. El ensayo secundario implica una metodología similar a la descrita en los párrafos previos usando placas de células de 12 pocillos. En esta sección se indican las diferencias. Se infectan las células como se describe anteriormente, pero esta vez se cubren con agarosa al 1 % diluida 1:1 con 2X MEM y complementada con FBS al 2 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y complementada con la concentración de fármaco correspondiente. Se incubarán las células a 37 °C con 5 % de CO2 durante 6 días. A continuación, se retira la cubierta y se tiñen las placas con violeta cristal al 0,05 % en formalina tamponada al 10 % durante aproximadamente veinte minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavan las placas, se secan y se hace un recuento del número de calvas. El número de calvas en cada conjunto de dilución de compuesto se convierte a un porcentaje con respecto al control vírico sin tratar. A continuación, se calculan las concentraciones eficaces al 50 % (EC50, inhibidora de virus) mediante análisis de regresión lineal.
Ejemplo 38.
(3) Ensayos de detección del virus del Ébola (EBOV) y el virus de Nipah (NIV)
Ensayo principal del virus del Ébola/Nipah. Se realizan ensayos de reducción de calvas a cuatro concentraciones. Se preparan monocapas de cultivo celular confluentes o casi confluentes en placas de cultivo celular desechables de 12 pocillos. Se mantienen las células en DMEM complementado con f Bs al 10 %. Para los ensayos antivirales, se usa el mismo medio pero con FBS reducido al 2 % o menos y complementado con penicilina/estreptomicina al 1 %. Se prepara el compuesto de prueba a cuatro concentraciones log-10 finales, normalmente 0,1, 1,0, 10 y 100 pg/ml o pM. El control vírico y el control celular se ejecutarán en paralelo a cada compuesto sometido a prueba. Además, se somete a prueba un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando la misma configuración experimental que se describe para el control vírico y celular. El control positivo se somete a prueba con cada serie de pruebas. El ensayo se establece retirando primero el medio de crecimiento de las placas de células de 12 pocillos. A continuación, el compuesto de prueba se aplica a los pocillos en un volumen de 0,1 ml a una concentración 2X. El virus, normalmente a aproximadamente 200 unidades formadoras de calvas en un volumen de 0,1 ml, se coloca en los pocillos designados para la infección por virus. Se coloca medio desprovisto de virus en los pocillos de control de toxicidad y en los pocillos de control celular. Los pocillos de control vírico se tratan de forma similar con virus. Se incuban las placas a 37 °C con 5 % de CO2 durante una hora. Se retirarán los inóculos de compuestos de virus, se lavarán las células y se cubrirán con tragacanto al 1,6% diluido 1:1 con 2X MEM y complementado con FBS al 2% y penicilina/estreptomicina al 1 % y complementado con la concentración de fármaco correspondiente. Se incubarán las células a 37 °C con 5 % de CO2 durante 10 días. A continuación, se retira la cubierta y se tiñen las placas con violeta cristal al 0,05 % en formalina tamponada al 10 % durante aproximadamente veinte minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavan las placas, se secan y se hace un recuento del número de calvas. El número de calvas en cada conjunto de dilución de compuesto se convierte a un porcentaje con respecto al control vírico sin tratar. A continuación, se calculan las concentraciones eficaces al 50 % (EC50, inhibidora de virus) mediante análisis de regresión lineal.
Ensayo secundario del virus del Ébola/Nipah con componente de RRV. El ensayo secundario implica una metodología similar a la descrita en los párrafos previos usando placas de células de 12 pocillos. En esta sección se indican las diferencias. Se someten a prueba ocho concentraciones semilogarítmicas de inhibidor para determinar la actividad antivírica. Se somete a prueba un fármaco de control positivo por lote de compuestos evaluados. Para este ensayo, se infectan las células con virus. Se infectan las células como se describe anteriormente, pero esta vez se incuban con DMEM complementado con FBS al 2 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y complementada con la concentración de fármaco correspondiente. Se incubarán las células durante 10 días a 37 °C con 5% de CO2, observando todos los días bajo el microscopio el número de células fluorescentes verdes. Se tomarán diariamente alícuotas de sobrenadante de las células infectadas y se agrupan los tres pocillos replicados. A continuación, se usan los sobrenadantes combinados para determinar el efecto inhibidor de los compuestos sobre la replicación del virus. Se titula el virus que se replicó en presencia del compuesto de prueba y se compara con el virus de los controles infectados no tratados. Para la titulación de muestras virales agrupadas, se prepararán diluciones seriadas 1 : 10 y se usarán para infectar monocapas recién preparadas de células. Se cubren las células con tragacanto y se determina el número de calvas. Trazar el log-10 de la concentración de inhibidor frente al log-10 de virus producido a cada concentración permite calcular la concentración efectiva al 90 % (un log™) mediante regresión lineal.
Ejemplo 39.
Ensayo de citoprotección contra el virus del Dengue:
Preparación de las células: se pasaron células BHK21 (células renales de hámster dorado sirio, n.° de catálogo ATCC CCL-I 0), células Vero (células renales de mono verde africano, n.° de catálogo ATCC CCL-81) o células Huh-7 (carcinoma hepatocelular humano) en DMEM complementado con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 3x 103 (5x 105 para células Vero y células Huh-7) células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 pl. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de C02 durante la noche para permitir la adherencia celular. Se observó que las monocapas tenían aproximadamente un 70 % de confluencia.
Preparación del virus: se obtuvo la cepa C de Nueva Guinea del virus del Dengue tipo 2 del ATCC (n.° de catálogo VR-1584) y se cultivó en células LLC-MK2 (células renales de macaco de la India; n.° de catálogo CCL-7.1) para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada en células BHK21 y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con FBS inactivado por calor al 2 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 pl fuera la cantidad determinada para proporcionar de un 85 a un 95 % de muerte celular 6 días después de la infección.
Formato de placas: cada placa contiene pocillos de control celular (solo células), pocillos de control vírico (células más virus), pocillos de toxicidad de fármaco triplicados por compuesto (células más fármaco solo), así como pocillos experimentales triplicados (fármaco más células más virus).
Eficacia y toxicidad XTT: después de la incubación a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %, se tiñeron las placas de prueba con el tinte de tetrazolio XTT (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazolio hidróxido). El tetrazolio del XTT fue metabolizado por las enzimas mitocondriales de las células metabólicamente activas para dar un producto de formazán soluble, lo que permitió un análisis cuantitativo rápido de la inhibición de la muerte celular inducida por virus mediante sustancias de prueba antivíricas. La solución de XTT se preparó diariamente como una solución madre de 1 mg/ml en RPMI 1640. Se preparó una solución de metosulfato de fenacina (PMS) a 0,15 mg/ml en PBS y se almacenó en oscuridad a -20 °C. Se preparó solución madre de XTT/PMS inmediatamente antes de su uso mediante la adición de 40 pl de PMS por ml de solución de XTT. Se añadieron cincuenta microlitros de XTT/PMS a cada pocillo de la placa y se volvió a incubar la placa durante 4 horas a 37 °C. Se sellaron las placas con selladores de placas adhesivos y se agitaron suavemente o se invirtieron varias veces para mezclar el producto de formazán soluble y se leyó la placa espectrofotométricamente a 450/650 nm con un lector de placas Vmax de Molecular Devices.
Análisis de datos: se recopilaron datos sin procesar del software Softmax Pro 4.6 y se importaron a una hoja de cálculo de Microsoft Excel para su análisis. Se calculó el porcentaje de reducción del efecto citopático vírico en comparación con los controles víricos no tratados para cada compuesto. Se calculó el valor de control celular en porcentaje para cada compuesto comparando las células no infectadas tratadas con fármaco con las células no infectadas en medio solo.
Ejemplo 40.
Ensayo de citoprotección contra el RSV:
Preparación de las células: se pasaron células HEp2 (células epiteliales humanas, n.° de catálogo A TCC CCL-23) en DMEM complementado con FBS al 10%, L-glutamina 2mM, 100 U/ml de penicilina y 100|jg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM, y NEAA 0,1 mM en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 1 x 104 células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 jl. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche para permitir la adherencia celular. Preparación del virus: se obtuvo la cepa Long de RSV y la cepa 9320 de RSV de ATCC (n.° de catálogo VR-26 y n.° de catálogo VR-955, respectivamente) y se cultivaron en células HEp2 para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con FBS inactivado por calor al 2 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM y NEAA 0,1 mM)) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 j l fuera la cantidad determinada para proporcionar de un 85 a un 95% de muerte celular 6 días después de la infección. Eficacia y toxicidad: se tiñeron las placas XTT y se analizaron como se describe previamente para el ensayo de citoprotección contra el virus del Dengue.
Ejemplo 41.
Ensayo de citoprotección contra el virus de la gripe:
Preparación de las células: se pasaron células MOCK (células renales caninas, n.° de catálogo ATCC CCL-34) en DMEM complementado con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM, y NEAA 0,1 mM en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 1 x 104 células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 jl. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche para permitir la adherencia celular.
Preparación del virus: se obtuvieron cepas de gripe A/PR/8/34 (A TCC n.° VR-95), A/CA/05/09 (CDC), A/NY/18/09 (CDC) y A/NWS/33 (ATCC n.° VR-219) de ATCC o del Centro de Control de Enfermedades de EE. UU. y se cultivaron en células MDCK para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con BSA al 0,5%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM, NEAA 0,1 mM y tripsina tratada con TPCK 1 jg/ml) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 j l fue la cantidad determinada para proporcionar 85 a 95 % de muerte celular a los 4 días después de la infección. Eficacia y toxicidad: se tiñeron las placas XTT y se analizaron como se describe previamente para el ensayo de citoprotección contra el virus del Dengue.
Ejemplo 42.
Ensayo contra el virus de la hepatitis C:
Cultivo celular: se obtuvo la línea celular indicadora Huh-luc/neo-ET del Dr. Ralf Bartenschlager (Departamento de Virología Molecular, Instituto de Higiene, Universidad de Heidelberg, Alemania) por ImQuest BioSciences a través de un acuerdo de licencia específico. Esta línea celular alberga el replicón I389luc-ubi-neo/NS3 -3 '/ET de replicación persistente que contiene la proteína de fusión del gen luciferasa de luciérnaga-ubiquitina-neomicina fosfotransferasa y secuencias codificantes de VHC NS3-5B impulsadas por EMCV IRES que contienen las mutaciones adaptativas de cultivo tisular ET (E1202G, Tl2081 y K1846T). Se expandió un cultivo madre de Huhluc/neo-ET mediante cultivo en DMEM complementado con FCS al I 0 %, glutamina 2 mM, penicilina (100 jU/ml)/estreptomicina (100 jg/ml) y I X aminoácidos no esenciales más 1 mg/ml de G418. Se dividieron las células 1:4 y se cultivaron durante dos pases en el mismo medio más 250 jg/ml de G418. Se trataron las células con tripsina y se enumeraron por tinción con azul tripano y se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de cultivo celular de 7,5 x 103 células por pocillo y se incubaron a 37 °C 5 % de CO2 durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se retiró el medio y se reemplazó con el mismo medio menos el G418 más los compuestos de prueba por triplicado. Seis pocillos de cada placa recibieron medio solo como control sin tratamiento. A continuación, se incubaron las células 72 horas adicionales a 37 °C 5 % de CO2, y se midió la actividad anti-VHC por punto final de la luciferasa. Se trataron placas duplicadas y se incubaron en paralelo para evaluar la toxicidad celular mediante tinción con XTT.
Viabilidad celular: se tiñeron las monocapas de cultivo celular de las células tratadas con el tinte de tetrazolio XTT para evaluar la viabilidad celular de la línea celular indicadora Huh-luc/neo-ET en presencia de los compuestos.
Medición de la replicación del virus: se midió la replicación del VHC a partir del sistema de ensayo de replicón mediante la actividad luciferasa usando el kit del gen indicador de luminiscencia más Britelite de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer, Shelton, CT). En resumen, se solubilizó un vial de Britelite más sustrato liofilizado en 10 ml de tampón de reconstitución de Britelite y se mezcló suavemente por inversión. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió Britelite más el reactivo a las placas de 96 pocillos a 100 pl por pocillo. Se sellaron las placas con una película adhesiva y se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos para lisar las células. El contenido de los pocillos se transfirió a una placa blanca de 96 pocillos y se midió la luminiscencia en los siguientes 15 minutos usando el contador de centelleo líquido Wallac 1450 Microbeta Trilux. Se importaron los datos a una hoja de cálculo personalizada de Microsoft Excel 2007 para determinar la concentración de inhibición al 50 % del virus (EC50).
Ejemplo 43.
Ensayo de citoprotección contra el virus paragripal 3:
Preparación de las células: se pasaron células HEp2 (células epiteliales humanas, n.° de catálogo ATCC CCL-23) en DMEM complementado con FBS al 10%, L-glutamina 2mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM, y NEAA 0,1 mM en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 1 x 104 células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 pl. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche para permitir la adherencia celular.
Preparación del virus: se obtuvo la cepa SF4 del virus paragripal tipo 3 de ATCC (n.° de catálogo VR-281) y se cultivó en células HEp2 para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con FBS inactivado por calor al 2%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 pl fuera la cantidad determinada para proporcionar de un 85 a un 95 % de muerte celular 6 días después de la infección.
Formato de placas: cada placa contiene pocillos de control celular (solo células), pocillos de control vírico (células más virus), pocillos de toxicidad de fármaco triplicados por compuesto (células más fármaco solo), así como pocillos experimentales triplicados (fármaco más células más virus). Eficacia y toxicidad XTT: después de la incubación a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %, se tiñeron las placas de prueba con el tinte de tetrazolio XTT (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazol hidróxido). El tetrazolio del XTT fue metabolizado por las enzimas mitocondriales de las células metabólicamente activas para dar un producto de formazán soluble, lo que permitió un análisis cuantitativo rápido de la inhibición de la muerte celular inducida por virus mediante sustancias de prueba antivíricas. La solución de XTT se preparó diariamente como una solución madre de 1 mg/ml en RPMI1640. Se preparó una solución de metosulfato de fenacina (PMS) a 0,15 mg/ml en PBS y se almacenó en oscuridad a -20 °C. Se preparó la solución madre de XTT/PMS inmediatamente antes de su uso mediante la adición de 40 pl de PMS por ml de solución de XTT. Se añadieron 50 microlitros de XTT/PMS a cada pocillo de la placa y se volvió a incubar la placa durante 4 horas a 37 °C. Se sellaron las placas con selladores de placas adhesivos y se agitaron suavemente o se invirtieron varias veces para mezclar el producto de fomlazan soluble y se leyó la placa espectrofotométricamente a 450/650 nm con un lector de placas Vmax de Molecular Devices.
Análisis de datos: se recopilaron datos sin procesar del software Softmax Pro 4.6 y se importaron a una hoja de cálculo de Microsoft Excel para su análisis. Se calculó el porcentaje de reducción del efecto citopático vírico en comparación con los controles víricos no tratados para cada compuesto. Se calculó el valor de control celular en porcentaje para cada compuesto comparando las células no infectadas tratadas con fármaco con las células no infectadas en medio solo.
Ejemplo 44.
Ensayo de inhibición de la polimerasa de la gripe:
Preparación del virus: se obtuvo el virus de la gripe A/PR/8/34 purificado (1 ml) de Advanced Biotechnologies, Inc. (Columbia, MD), se descongeló y se dispensó en cinco alícuotas para su almacenamiento a -80 °C hasta su uso. El día de la preparación del ensayo, se añadieron 20 pl de Triton N-101 al 2,5 % a 180 pl de virus purificado.
Se diluyó 1:2 el virus alterado en una solución que contenía Tritón al 0,25 % y PBS. La alteración proporcionó la fuente de ribonucleoproteína (RNP) de la gripe que contiene la ARN polimerasa dependiente del ARN de la gripe y el ARN molde. Se almacenaron las muestras en hielo hasta su uso en el ensayo.
Reacción de la polimerasa: cada reacción de la polimerasa de 50 pl contenía lo siguiente: 5 pl de la RNP alterada, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), KCl 100 mM, MgCh 5 mM. Ditiotreitol 1 mM, Triton N-101 al 0,25 %, 5 pCi de [a-32P] GTP, ATP 100 pM, (CTP, UTP) 50 pM cada uno, GTP 1 pM y adenil (3'-5')guanosina 200 pM. Para someter a prueba el inhibidor, las reacciones contenían el inhibidor y lo mismo se hizo para las reacciones que contenían el control positivo (2-desoxi-2-fluoroguanosina-5-trifosfato). Otros controles incluyeron RNP mezcla de reacción y RNP DMSO al I %. Se incubó la mezcla de reacción sin el cebador ApG y los NTP a 30 °C durante 20 minutos. Una vez que se añadieron el ApG y los NTP a la mezcla de reacción, se incubaron las muestras a 30 °C durante 1 hora y, a continuación, seguido inmediatamente de la transferencia de la reacción a placas de filtro de fibra de vidrio y la posterior precipitación con ácido tricloroacético (TCA) al 10%. A continuación, se lavó la placa cinco veces con TCA al 5 %, seguido de un lavado con etanol al 95 %. Una vez que el filtro se hubo secado, se midió la incorporación de [a-32P]-GTP usando un contador de centelleo líquido (Micro beta).
Formato de placas: cada placa de prueba contenía muestras por triplicado de los tres compuestos (6 concentraciones), además de muestras por triplicado de RNP mezcla de reacción (RNP solo), RNP DMSO al 1 % y mezcla de reacción sola (sin RNP).
Análisis de datos: se recopilaron los datos son procesar del contador de centelleo Micro Beta. La incorporación de GTP radiactivo se correlaciona directamente con los niveles de actividad polimerasa. Se obtuvieron los "valores de inhibición en porcentaje" dividiendo el valor medio de cada compuesto de prueba por el control de RNP DMSO al 1 %. Se comparó la media obtenida a cada concentración de 2DFGTP con el control de RNP reacción. A continuación, se importaron los datos a una hoja de cálculo Microsoft Excel para calcular los valores de IC50 mediante análisis de regresión lineal.
Ejemplo 45.
Ensayo de inhibición de la polimerasa del VHC:
Se evaluó la actividad de los compuestos para la inhibición de la polimerasa del VHC usando procedimientos previamente descritos (Lam eta!. 2010. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54(8):3187-3196). Los ensayos de polimerasa de VHC NS5B se realizaron en volúmenes de 20 pl en placas de reacción de 96 pocillos. Cada reacción contenía 40 ng/pl de polimerasa NS5BA22 de genotipo-lb recombinante purificada, 20 ng/pl de molde IRES complementaria del genotipo-lb del VHC, 1 pM de cada uno de los cuatro ribonucleótidos naturales, 1 U/ml de inhibidor de ARNasa Optizyme (Promega, Madison, WI), MgCh 1 mM, MnCh 0,75 mM y ditiotreitol (DTT) 2 mM en tampón HEPES 50 mM (pH 7,5). Se combinaron las mezclas de reacción sobre hielo en dos etapas. La etapa 1 consistió en combinar todos los componentes de la reacción excepto los nucleótidos naturales y el UTP marcado en una mezcla de reacción de polimerasa. Se dispensaron diez microlitros (10 pl) de la mezcla de polimerasa en pocillos individuales de la placa de reacción de 96 pocillos sobre hielo. se incluyeron mezclas de reacción de polimerasa sin polimerasa NS5B como controles sin enzima. Se prepararon diluciones semilogarítmicas sucesivas de los compuestos de prueba y de control, 2'-O-Metil-CTP y 2'-O-Metil-GTP (Trilink, San Diego, CA) en agua y se añadieron 5 pl de los compuestos diluidos de forma sucesiva o solo agua (sin control de compuesto) a los pocillos que contenían la mezcla de polimerasa. A continuación, se añadieron cinco microlitros de mezcla de nucleótidos (nucleótidos naturales y UTP marcado) a los pocillos de la placa de reacción y se incubó la placa a 27 °C durante 30 minutos. Se desactivaron las reacciones mediante la adición de 80 pl de solución de parada (EDTA 12,5 mM, NaCl 2,25 M y citrato de sodio 225 mM) y los productos de ARN se aplicaron a una membrana Hybond-N+ (GE Healthcare, Piscataway, NJ) bajo presión de vacío usando un aparato de inmunotransferencia por puntos. Se retiró la membrana del aparato de inmunotransferencia por puntos y se lavó cuatro veces con 4X SSC (NaCl 0,6 M y citrato de sodio 60 mM) y, a continuación, se enjuagó una vez con agua y una vez con etanol al 100 %. Se secó la membrana al aire y se expuso a una pantalla de fosfoimagen y se capturó la imagen usando un generador de imágenes Typhoon 8600 Phospho. Después de la captura de la imagen, se colocó la membrana en un casete Micro beta junto con fluido de centelleo y se realizó un recuento del CPM en cada reacción en un Micro beta 1450. Datos de CPM se importaron a una hoja de cálculo Excel personalizada para la determinación de las IC50 de los compuestos.
Ejemplo 46.
Condiciones de reacción de la ARN polimerasa dependiente de ARN NS5B
Se sometieron a ensayo los compuestos para determinar la inhibición de NS5B-521 de GT-1b Con-1 de VHC. Las reacciones incluyeron enzima recombinante purificada, molde de ARN IRES del VHC de cadena negativa 1 U/pl y sustratos de NTP 1 pM que incluían [32P]-CTP o [32P]-UTP. Se incubaron las placas de ensayo a 27 °C durante 1 hora antes desactivarlas. Se evaluó la incorporación de [32P] en el producto macromolecular mediante la unión al filtro.
Ejemplo 47.
Ensayo de inhibición de ADN polimerasas humanas:
La alfa (n.° de catálogo 1075), beta (n.° de catálogo 1077) y gamma (n.° de catálogo 1076) ADN polimerasa humana se adquirieron de CHIMERx (Madison, WI). La inhibición de la actividad beta y gamma ADN polimerasa se sometió a ensayo en placas de microtitulación en una mezcla de reacción de 50 ul que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,7), KCl (10 mM para beta y 100 mM para gamma), MgCh 10 mM, 0,4 mg/ml de BSA, DTT 1 mM, glicerol al 15 %, 0,05 mM de dCTP, dTTP y dATP, 10 uCi de [32P]-alfa-dGTP (800 Ci/mmol), 20 ug de ADN de timo de ternera activado y el compuesto de prueba a las concentraciones indicadas. La mezcla de reacción de la alfa ADN polimerasa fue como sigue en un volumen de 50 ul por muestra: Tris-HCl 20 mM (pH 8 ), acetato de magnesio 5 mM, 0,3 mg/ml de BSA, DTT 1 mM, espermina 0,1 mM, 0,05 mM de dCTP, dTTP y dATP, 10 uCi de [32P]-alfa-dGTP (800 Ci/mmol), 20 ug de ADN de timo de ternera activado y el compuesto de prueba a las concentraciones indicadas. Para cada ensayo, se dejó que las reacciones enzimáticas prosiguieran durante 30 minutos a 37 °C, seguido de la transferencia a placas de filtro de fibra de vidrio y posterior precipitación con ácido tricloroacético (TCA) al 10 %. A continuación, se lavó la placa con TCA al 5 %, seguido de un lavado con etanol al 95 %. Una vez que el filtro se hubo secado, se midió la incorporación de radiactividad usando un contador de centelleo líquido (Microbeta).
Ejemplo 48.
Ensayo de PBMC infectados por VIH:
Se obtuvieron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) frescos de una fuente comercial (Biological Specialty) y se determinó que eran seronegativos para VIH y VHB. Dependiendo del volumen de sangre de donante recibida, los glóbulos sanguíneos leucoforetizados se lavaron varias veces con PBS. Después del lavado, se diluyó la sangre leucoforetizada 1:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco y se colocó en capas sobre 15 ml de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Estos tubos se centrifugaron durante 30 min a 600 x g. Los PBMC en bandas se aspiraron suavemente de la interfase resultante y se lavaron tres veces con PBS. Después del lavado final, se determinó el número de células mediante exclusión del tinte azul tripano y se resuspendieron las células a 1 x 10A6 células/ml en RPMI 1640 con suero fetal bovino (FBS) al 15 %, 2 mmol/l de L-glutamina, 2 ug/ml de PHA-P, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina y se dejó incubar durante 48-72 horas a 37 °C. Después de la incubación, se centrifugaron los PBMC y se resuspendieron en medio de cultivo tisular. Se mantuvieron los cultivos hasta su uso mediante cambios de cultivo de medio volumen con medio de cultivo tisular fresco que contenía IL-2 cada 3 días. Los ensayos se iniciaron con PBMC a las 72 horas después de la estimulación con PHA-P.
Para minimizar los efectos debidos a la variabilidad del donante, los PBMC empleados en el ensayo eran una mezcla de células derivadas de 3 donantes. Inmediatamente antes de su uso, se resuspendieron las células diana en medio de cultivo tisular fresco a 1 x 10 A6 células/ml y se sembraron en los pocillos interiores de una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos a 50 ul/pocillo. A continuación, se transfirieron 100 ul de concentraciones 2X de medio que contenía el compuesto a la placa de 96 pocillos que contenía las células en 50 ul del medio. Se empleó AZT como estándar interno del ensayo.
Después de la adición del compuesto de prueba a los pocillos, se añadieron 50 ul de una dilución predeterminada de virus VIH (preparada a partir de 4X de la concentración final deseada en el pocillo) y se mezcló bien. Para la infección, se añadieron 50-150 TCID50 de cada virus por pocillo (MOI final aproximadamente 0,002). Los PBMC se expusieron por triplicado al virus y se cultivaron en presencia o ausencia del material de prueba a concentraciones variables como se describe anteriormente en las placas de microtitulación de 96 pocillos. Después de 7 días en cultivo, se cuantificó la replicación del VIH-1 en el sobrenadante del cultivo tisular midiendo la actividad retrotranscriptasa (RT). Los pocillos con células y virus solo sirvieron como controles víricos. Se prepararon de forma idéntica placas separadas sin virus para los estudios de citotoxicidad de fármaco.
Ensayo de actividad retrotranscriptasa: se midió la actividad retrotranscriptasa en sobrenadantes libres de células usando un ensayo de polimerización por incorporación radiactiva estándar. Se adquirió trifosfato de timidina tritiado (TTP; New England Nuclear) a 1 Ci/ml y se utilizó 1 ul por reacción enzimática. Se preparó una solución madre de rAdT mezclando 0,5 mg/ml de poli rA y 1,7 U/ml de oligo-dT en agua destilada y se almacenó a -20 °C. El tampón de reacción de RT se preparó diariamente y consiste en 125 ul de EGTA 1 mol/l, 125 ul de dH2O, 125 ul de Triton X-100 al 20 %, 50 ul de Tris 1 mol/l (pH 7,4), 50 ul de DTT 1 mol/l y 40 ul de MgCh 1 mol/l. Para cada reacción, se mezclaron 1 ul de TTP, 4 ul de dH2O, 2,5 ul de rAdT y 2,5 ul de tampón de reacción. Se colocaron diez microlitros de esta mezcla de reacción en una placa de microtitulación de fondo redondo y se añadieron y mezclaron 15 ul de sobrenadante que contenía virus. Se incubó la placa a 37 °C en una incubadora humidificada durante 90 minutos. Después de la incubación, se colocaron 10 ul del volumen de reacción sobre una estera filtrante de DEAE en el formato de placa apropiado, se lavaron 5 veces (5 minutos cada una) en un tampón de fosfato de sodio al 5 %, 2 veces (1 minuto cada una) en agua destilada, 2 veces (1 minuto cada una) en etanol al 70 %, y, a continuación, se secaron al aire. La estera filtrante seca se colocó en una funda de plástico y se añadieron 4 ml de Opti-Fluor O a la funda. Se cuantificó la radiactividad incorporada utilizando un contador de centelleo líquido Wallac 1450 Microbeta Trilux.
Ejemplo 49.
VHB:
Se añadieron células HepG2.2.15 (100 ml) en medio RPMI1640 con suero fetal bovino al 10% a todos los pocillos de una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo y se incubó la placa a 37 °C en un entorno con 5 % de CO2 durante 24 horas. Después de la incubación, a los pocillos individuales de la placa se añadieron por triplicado seis diluciones sucesivas 1:10 del compuesto de ensayo preparado en medio RPMI1640 con suero fetal bovino al 10 %. Seis pocillos de la placa recibieron medio solo como control de virus solo. Se incubó la placa durante 6 días a 37 °C en un entorno con 5 % de CO2. El día 3, se cambió el medio de cultivo por un medio que contenía la concentración indicada de cada compuesto. Se recogieron cien microlitros de sobrenadante de cada pocillo para el análisis del ADN vírico mediante qPCR y se evaluó la citotoxicidad mediante tinción con XTT de la monocapa de cultivo celular en el sexto día.
Se diluyeron diez microlitros de sobrenadante de cultivo celular recogidos el sexto día en tampón de dilución de qPCR (40 |jg/ml de ADN de esperma de salmón cortado) y se hirvieron durante 15 minutos. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real en placas de 386 pocillos usando un sistema de detección de secuencias Applied Biosystems 7900HT y el software de soporte SDS 2.4. Cinco microlitros (5 jl) de ADN hervido para cada muestra y diluciones 1:10 sucesivas de un estándar de ADN cuantitativo se sometieron a Q-PCR en tiempo real usando Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen) y cebadores de oligonucleótidos de a Dn específicos (IDT, Coralville, ID) HBV-AD38-qF1 (5'-CCGTCT GTGCCT TCT CAT CTG-3'), HBV-AD38-qR1 (5'-AGT CCA AGA GTY CTC TTA TRY AAG ACC TT-3') y HBV-AD38-qP1 (5'-FAM CCG TGT GCA /ZEN/CTT CGC TTC ACC TCT GC3'BHQ1) a una concentración final de 0,2 mM para cada cebador en un volumen de reacción total de 15 jl. Se interpoló el número de copias de ADN del VHB en cada muestra a partir de la curva estándar mediante el software SDS.24 y se importaron los datos a una hoja de cálculo de Excel para su análisis.
La concentración citotóxica del 50 % para los materiales de prueba se obtiene midiendo la reducción del tinte de tetrazolio XTT en las placas de cultivo tisular tratadas. El XTT es metabolizado por la enzima mitocondrial NADPH oxidasa para dar un producto de formazán soluble en células metabólicamente activas. Se preparó diariamente la solución de XTT como una solución madre de 1 mg/ml en PBS. Se preparó una solución madre de metosulfato de fenacina (PMS) a 0,15 mg/ml en PBS y se almacenó en oscuridad a -20 °C. Se preparó la solución de XTT/PMS inmediatamente antes de su uso mediante la adición de 40 j l de PMS por 1 ml de solución de XTT. Se añadieron cincuenta microlitros de XTT/PMS a cada pocillo de la placa y se incubó la placa durante 2-4 horas a 37 °C. Se ha determinado empíricamente que la incubación durante 2-4 horas está dentro del intervalo de respuesta lineal para la reducción del tinte XTT con el número de células indicado para cada ensayo. Se utilizaron selladores de placas adhesivos en lugar de las tapas, la placa sellada se invirtió varias veces para mezclar el producto de formazán soluble y se leyó la placa a 450 nm (longitud de onda de referencia de 650 nm) con un espectrofotómetro SpectraMax Plus 384 de Molecular Devices. Se recogieron los datos con el software Softmax 4,6 y se importaron a una hoja de cálculo Excel para su análisis.
Ejemplo 50.
Condiciones de reacción de la ARN polimerasa dependiente de ARN del Dengue
El ensayo de ARN polimerasa se realizó a 30 °C usando 100 j l de mezcla de reacción en un tubo de 1,5 ml. Las condiciones de reacción finales fueron Hepes 50 mM (pH 7,0), DTT 2 mM, MnCh ImM, KCl 10 mM, UTR-Poli A 100 nM (cebador de autohibridación), UTP 10 jM, enzima RdRp 26 nM. Se incubó la mezcla de reacción con diferentes compuestos (inhibidores) a 30 °C durante 1 hora. Para evaluar la cantidad de pirofosfato generado durante la reacción de la polimerasa, se mezclaron 30 j l de mezcla de reacción de polimerasa con una mezcla de reacción de enzima acoplada a luciferasa (70 jl). Las condiciones de reacción finales de la reacción de luciferasa fueron MgCh 5 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, ATP sulfurilasa 200 jU, APS 5 jM, luciferasa 10 nM, D-luciferina 100 jM. Se transfirieron de inmediato las placas blancas que contenían las muestras de reacción (100 jl) al luminómetro Veritas (Turner Biosystems, CA) para la detección de la señal lumínica.
Ejemplo 51.
Procedimiento para incubación y análisis de las células
Se sembraron células Huh-7 a 0,5 x 10A6 células/pocillo en 1 ml de medio completo en placas de 12 pocilios tratadas con cultivo tisular. Se permitió la adherencia de las células durante la noche a 37°/5 % de CO2. Se preparó una solución madre 40 pM del artículo de prueba en DMSO al 100%. A partir de la solución madre 40 pM, se preparó una solución 20 pM del artículo de prueba en 25 ml de medio DMEM completo. Para el tratamiento del compuesto, se aspiró el medio de los pocillos y se añadió 1 ml de la solución 20 pM en medio DMEM completo a los pocillos apropiados. También se preparó una placa separada de células sin adición del compuesto. Se incubaron las placas a 37°/5 % de CO2 para los siguientes puntos temporales: 1, 3, 6 y 24 horas. Después de la incubación en los puntos de tiempo deseados, se lavaron las células 2X con 1 ml de DPBS. Se extrajeron las células añadiendo 500 pl de metanol al 70 %/agua al 30 % enriquecido con el estándar interno a cada pocillo tratado con el artículo de prueba. Se extrajo la placa del blanco no tratada con 500 ul de metanol al 70 %/agua al 30% por pocillo. Se centrifugaron las muestras a 16000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Se analizaron las muestras por CL-EM/EM utilizando un sistema ABSCIEX 5500 QTRAP CL-EM/EM con una columna Hypercarb (PGC).
Ejemplo 52:
Procedimiento para el experimento farmacocinético en roedores
Se aclimataron ratones DBA-1J (6 -8 semanas de edad, hembras) durante >2 días después de la recepción. Se pesaron los ratones el día antes de la dosificación para calcular los volúmenes de dosificación. Los ratones recibieron mediante sonda gástrica oral una dosis de fármaco a 30 mg/kg, 100 mg/kg y 300 mg/kg. Se tomaron muestras de los ratones en 8 puntos temporales: 0,5, 1, 2, 3, 4, 8 y 24 horas (3 ratones por punto temporal para el fármaco de prueba). Se sacrificó a los ratones y se recogieron sus órganos (véase a continuación). Para extraer la sangre, se sacrificó a los ratones con CO2 en el punto temporal apropiado enumerado anteriormente. La sangre se obtuvo mediante punción cardíaca (0,3 ml) en cada punto temporal. Después de la extracción de sangre, se extrajeron los órganos de los ratones (véase a continuación). Se procesó la sangre invirtiendo suavemente el tubo de Li-Heparina con sangre 2 o 3 veces para mezclar bien. A continuación, se colocaron los tubos en una gradilla en agua con hielo hasta que se pudieron centrifugar (<1 hora). Tan pronto como fue posible, se centrifugó la sangre a ~2000 x g durante 10 min en una centrífuga refrigerada para obtener plasma. A continuación, usando una pipeta de 200 pl, se transfirió el plasma a un tubo Eppendorf de 1,5 ml etiquetado en agua con hielo. A continuación, se congeló el plasma en un congelador o en hielo seco. Se almacenaron las muestras a -80 °C antes de su análisis. Se extrajeron los órganos de los ratones sacrificados. Se extrajeron los órganos (pulmones, hígado, riñón, bazo y corazón), se colocaron en un tubo y se congelaron de inmediato en nitrógeno líquido. A continuación, se transfirieron los tubos a hielo seco. Se guardaron las muestras en viales de tejido criogénicos. Se analizaron las muestras por CL-EM/EM usando un sistema de CL-EM/EM ABSCIEX 5500 QTRAP con una columna Hypercarb (PGC).
Parámetros farmacocinéticos:
• La Tmáx. Después de la dosificación oral es de 0,25 - 0,5 h
• Las Cmáx. son 3,0, 7,7 y 11,7 ng/ml después de la dosificación PO con 30, 100 y 300 mg/kg;
• La biodisponibilidad (frente a la administración I.P.) es de un 65% a 30 mg/kg y de un 39-46% a las dosificaciones PO de 100 y 300 mg/kg;
• La T1/2 plasmática de EIDD-1931 es de 2,2 h después de la dosificación IV y de 4,1-4,7 h después de la dosificación PO.
• Después de una dosis PO de 300 mg/kg, los niveles plasmáticos a 24 horas son ~0,4 pM; ~0,1 pM después de una dosis de 100 mg/kg
Ejemplo 53:
Protocolo para la infección por Chikungunya del modelo de ratón
A ratones C57BL-6J se les inyectaron 100 pfus de virus CHIK en la almohadilla plantar. Los grupos de prueba consistieron en un grupo no infectado y no tratado, un grupo infectado y no tratado, un grupo infectado que recibió una dosis alta de 35 mg/kg i.p. de EIDD-01931 y un grupo infectado que recibió una dosis baja de 25 mg/kg i.p. de EIDD-01931. Los dos grupos de prueba que recibieron EIDD-01931 recibieron el compuesto 12 horas antes de la exposición y, a continuación, diariamente durante 7 días. Se evaluó diariamente la inflamación de las almohadillas plantares (grosor de la pata) durante 7 días. Se evaluó la artritis inducida por el virus CHIK (histología) en las articulaciones del tobillo usando PCR después de 7 días.
Ejemplo 54:
N(4)-hidroxicitidina para la profilaxis y el tratamiento de infecciones por alfavirus
Las pruebas de actividad en modelos de infección con efecto citopático (ECP) en células Vero han demostrado que el análogo de ribonucleósido N(4)-hidroxicitidina (EIDD-01931) tiene actividad contra los virus del río Ross, EEE, WEE, VEE y CHIK con valores de EC50 de 2,45 pM, 1,08 pM, 1,36 pM, 1,00 pM y 1,28 pM, respectivamente. El perfil de citotoxicidad del compuesto es aceptable, con índices de selectividad que varían desde un mínimo de 8 en células CEM hasta un máximo de 232 en células Huh7 (hígado).
Ejemplo 55:
Dado que se pueden desarrollar títulos elevados de virus de la VEE en el cerebro a las pocas horas de la exposición al aerosol, es deseable un agente antivírico de acción directa si puede alcanzar rápidamente niveles terapéuticos de fármaco en el cerebro. Se llevó a cabo un estudio farmacocinético piloto en ratas SD macho a las que se les administraron por sonda gástrica oral 5 y 50 mg/kg de EIDD-01931, para determinar los parámetros farmacocinéticos y el perfil de distribución tisular del compuesto en sistemas de órganos clave, incluyendo el cerebro. EIDD-01931 está disponible por vía oral y es proporcional a la dosis con una biodisponibilidad calculada (% F) del 28 %. Se recogieron muestras de órganos (cerebro, pulmón, bazo, riñón e hígado) a las 2,5 y 24 horas después de la dosis del grupo de dosis de 50 mg/kg. EIDD-01931 se distribuyó bien en todos los tejidos sometidos a prueba; cabe destacar que se distribuyó fácilmente al tejido cerebral a niveles terapéuticos del fármaco, en base a las estimaciones de los datos celulares. Una vez en el cerebro, EIDD-01931 se metabolizó rápidamente a su forma activa 5'-trifosfato para dar niveles cerebrales de 526 y 135 ng/g a 2,5 y 24 horas, respectivamente. Incluso después de 24 horas, los niveles de EIDD-01931 y de su 5'-trifosfato en el cerebro son considerables, lo que sugiere que la dosificación oral una vez al día puede ser adecuada para el tratamiento. De forma alternativa, la administración del fármaco mediante administración en aerosol (pulverizador nasal) puede alcanzar de inmediato niveles terapéuticos del fármaco en la mucosa nasal y el cerebro. EIDD-01931 tiene un perfil toxicológico aceptable después de 6 días de inyecciones intraperitoneales (IP) diarias en ratones, con el NOEL (nivel sin efecto observable) de 33 mg/kg; se observó pérdida de peso con la dosis más alta sometida a prueba (100 mg/kg), que revirtió al cesar la dosificación.
Ejemplo 56:
Varios derivados de EIDD-01931 han mostrado actividad antivírica en el cribado frente a diversos virus. Los datos de actividad se muestran en las tablas a continuación.
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Figure imgf000058_0002
Figure imgf000058_0001
Ejemplo 58:
Compuestos cribados en un ensayo de ECP en CHIKV
Figure imgf000058_0003
Ejemplo 59:
Compuestos cribados en un ensayo de ECP en CHIKV
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000060_0002
Ejemplo 61:
Compuestos cribados en un ensayo de ECP en CHIKV
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 62:
Figure imgf000061_0002
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un compuesto que tiene la fórmula I
Figure imgf000063_0001
o una sal del mismo, en la que
Q-R7 es OH,
W es O;
X es CH2, CHMe, CMe2, CHF, CF2 o CD2;
Y es N o CR";
Z es N o CR";
cada R" se selecciona independientemente de es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R1 es
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halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, esterilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, fosforamidilo, en el que R1 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
Y1 es O o S;
Y2 es OH, OR12, Oalquilo o BH3IM+;
R2 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo, acido o heterociclilo, en el que R2 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R3 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R6 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, etinilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R6 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R8 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, benciloxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R8 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R9 es hidrógeno, metilo, etilo, terc-butilo, alquilo, alquilo(C6-C16), alquilo(C6-C22), halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, cicloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R9 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R10 es hidrógeno, alquilo, alquilo ramificado, cicloalquilo, lípido, metilo, etilo, isopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, butilo, pentilo, hexilo, neopentilo, bencilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R10 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R11 es hidrógeno, deuterio, alquilo, metilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R11 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R12 es hidrógeno, alquilo, arilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, aromático, heteroaromático, fenilo 4-sustituido, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromofenilo, naftilo o heterociclilo, en el que R12 es opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R13 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R13 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R14 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R14 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que R1 es
Figure imgf000065_0001
R8 es hidrógeno, hidroxi o benciloxi, y
R9 es alquilo(C6-C22).
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el compuesto es (((3,4-dihidroxi-5-(4-(hidroxiamino)-2-oxopirimidin-1(2H)il)tetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)alaninato de isopropilo.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el compuesto de fórmula I tiene la fórmula IE.
Figure imgf000065_0002
Fórmula IE,
o una sal del mismo, en la que
Q-R7 es OH
W es O;
X es CH2, CHMe, CMe2, CHF, CF2 o CD2;
Y es N o CR";
Z es N o CR";
cada R" se selecciona independientemente de es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R2 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo, acido o heterociclilo, en el que R2 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R3 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R6 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, etinilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R6 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R15 es hidrógeno, -(C=O)Oalquilo, -(C=O)alquilo, -(C=O)NHalquilo, -(C=O)N-dialquilo, -(C=O)Salquilo, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquilo (C6-C16), alquilo (C6-C22), halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R15 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R15' es hidrógeno, -(C=O)Oalquilo, -(C=O)alquilo, -(C=O)NHalquilo, -(C=O)N-dialquilo, -(C=O)Salquilo, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquilo (C6-C16), alquilo (C6-C22), halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que cada R15' está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R15 y R15' pueden formar un anillo que está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes; R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo.
5. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un compuesto que tiene la fórmula II,
Figure imgf000067_0001
Fórmula II
o una sal del mismo, en la que
Q-R7 es OH,
W es O;
X es CH2 u O;
Y es N o CR";
Z es N o CR";
cada R" se selecciona independientemente de es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R1 es monofosfato, difosfato, trifosfato,
Figure imgf000068_0001
Y1 es O o S;
Y2 es OH, OR12, Oalquilo o BH3IM+;
Y3 es OH o BHa-M+;
R2 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo, acido o heterociclilo, en el que R2 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R3 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R3 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R6 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, etinilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R6 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R8 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, benciloxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R8 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R9 es hidrógeno, metilo, etilo, terc-butilo, alquilo, alquilo(C6-Ci6), alquilo(C6-C22), halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, cicloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R9 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R10 es hidrógeno, alquilo, alquilo ramificado, cicloalquilo, lípido, metilo, etilo, isopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, butilo, pentilo, hexilo, neopentilo, bencilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R10 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R11 es hidrógeno, deuterio, alquilo, metilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R11 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R12 es hidrógeno, alquilo, arilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, aromático, heteroaromático, fenilo 4-sustituido, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromofenilo, naftilo o heterociclilo, en el que R12 es opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R13 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R13 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R14 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R14 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y
R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo;Lípido es un alquilo C6-22, alcoxi, polietilenglicol o arilo sustituido con un grupo alquilo.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 5, que comprende además un propulsor.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en la que el propulsor es aire comprimido, etanol, nitrógeno, dióxido de carbono, óxido nitroso, hidrofluoroalcanos (HFA), 1,1,1,2,-tetrafluoroetano, 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano o combinaciones de los mismos.
8. Un recipiente presurizado que comprende una composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 5.
9. El recipiente de la reivindicación 8 que es un pulverizador de bomba manual, inhalador, inhalador dosificado por medidor, inhalador de polvo seco, nebulizador, nebulizador de malla vibratoria, nebulizador de chorro o nebulizador de ondas ultrasónicas.
10. La composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 1 o 5 para su uso en el tratamiento o prevención de una infección vírica, por ejemplo, en la que la infección vírica es un alfavirus o coronavirus del MERS, o en la que el virus se selecciona de coronavirus del MERS, virus de encefalitis equina oriental, virus de encefalitis equina occidental, virus de encefalitis equina venezolana, virus de chikungunya y virus del río Ross.
11. La composición farmacéutica para su uso como se reivindica en la reivindicación 10, en la que la composición se administra a través de los pulmones.
12. Un compuesto con la estructura:
Figure imgf000070_0001
para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones causadas por el virus de encefalitis equina oriental, virus de encefalitis equina occidental, virus de encefalitis equina venezolana, virus de chikungunya, infección por el virus del río Ross, filovirus, infección por el virus del Ébola, en el que el compuesto se administra a través de los pulmones, por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía transdérmica o por vía rectal.
13. La composición de la reivindicación 1, en la que el compuesto tiene una estructura de acuerdo con la fórmula IA
Figure imgf000070_0002
o una sal del mismo, en la que
R7 es H,
X es CH2, CHMe, CMe2, CHF, CF2 o CD2;
Y se selecciona independientemente de es H, D, F, Cl, Br, I, CH3, CD3, CF3, alquilo, acilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, formilo o SCH3;
R1 es
Figure imgf000071_0001
, amino, mercapto, formilo, esterilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, fosforamidilo, en el que R1 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes,
Y1 es O o S;
Y2 es OH, OR12, Oalquilo o BH3IM+;
Y3 es OH o BHa-M+;
R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R4 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, etinilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, hidroximetilo, alenilo, halógeno, nitro, ciano, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R5 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R8 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, benciloxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R8 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R9 es hidrógeno, metilo, etilo, terc-butilo, alquilo, alquilo(C6-C16), alquilo(C6-C22), halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, cicloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R9 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R10 es hidrógeno, alquilo, alquilo ramificado, cicloalquilo, lípido, metilo, etilo, isopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, butilo, pentilo, hexilo, neopentilo, bencilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquil)2amino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R10 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R11 es hidrógeno, deuterio, alquilo, metilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R11 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R12 es hidrógeno, alquilo, arilo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, aromático, heteroaromático, fenilo 4-sustituido, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromofenilo, naftilo o heterociclilo, en el que R12 es opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R13 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R13 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R14 es hidrógeno, deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, lípido, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R14 está opcionalmente sustituido con uno o más R20 iguales o diferentes;
R20 es deuterio, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, amino, amido, mercapto, formilo, carboxi, carbamoílo, acido, alcoxi, alquiltio, alquilamino, (alquilamino, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, carbociclilo, arilo o heterociclilo, en el que R20 está opcionalmente sustituido con uno o más R21 iguales o diferentes; y
R21 es halógeno, nitro, ciano, hidroxi, trifluorometoxi, trifluorometilo, amino, formilo, carboxi, carbamoílo, mercapto, sulfamoílo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, acetilo, acetoxi, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, N-metil-N-etilamino, acetilamino, N-metilcarbamoílo, N-etilcarbamoílo, N,N-dimetilcarbamoílo, N,N-dietilcarbamoílo, N-metil-N-etilcarbamoílo, metiltio, etiltio, metilsulfinilo, etilsulfinilo, mesilo, etilsulfonilo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, N-metilsulfamoílo, N-etilsulfamoílo, N,N-dimetilsulfamoílo, N,N-dietilsulfamoílo, N-metil-N-etilsulfamoílo, carbociclilo, arilo o heterociclilo.
14. La composición de la reivindicación 1, en la que R4 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, halógeno o fluoro.
15. La composición de la reivindicación 1, en la que R5 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, alquilo, metilo, etinilo o alenilo.
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