CN1950383B

CN1950383B - 用于治疗病毒性疾病的膦酸酯、单膦酸酰胺化物、双膦酸酰胺化物

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Publication number: CN1950383B
Application number: CN2004800394690A
Authority: CN
Inventors: 程小勤; G·P·库克; M·C·德赛; E·多尔夫勒; 何公欣; C·U·金; W·A·李; J·C·罗洛夫; 王建英; 杨征宇
Original assignee: Gilead Sciences Inc
Current assignee: Gilead Sciences Inc
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-29
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2024-12-29
Also published as: SI2204374T1; US8268802B2; NO20150615L; AP2212A; SI1716162T1; AU2011200141B2; KR20120080240A; IL176407A0; NZ548771A; ZA200606049B; DE602004028763D1; US8088754B2; CA2550222A1; CA2550222C; JP4949852B2; CY1111050T1; KR20060129360A; WO2005066189A1; EP1716162A1; PL1716162T3

Abstract

描述了式(I)的化合物和组合物，适用作抗增殖剂，特别是抗-HPV药物。

Description

用于治疗病毒性疾病的膦酸酯、单膦酸酰胺化物、双膦酸酰胺化物

发明背景

发明领域

本发明涉及适用于治疗病毒性感染，特别是人乳头瘤病毒的化合物和组合物及其使用方法。

背景

人乳头瘤病毒(HPV)是世界上最流行的性传播的传染病之一。有100多种不同种类的HPV，其中大多数是无害的。然而，大约有30种是通过性接触传播的。一些种类的HPV导致生殖器疣，其在包括阴道、宫颈、外阴(阴道外的区域)、阴茎和直肠的男人和女人的生殖器区域以单个或多个肿块出现。不过很多感染了HPV的人并没有症状。

尽管大多数HPV亚型会导致良性损害，但某些亚型可以导致更严重的损害。由HPV-16和HPV-18引起的肛殖感染虽然不如由HPV-6和HPV-11引起的常见，但是其最常见地与宫颈和肛门组织中称为发育异常的癌变前损害有关。发育异常的患者经常没有症状，只有在筛查后可能发现他们的损害。如果不进行治疗，则高度发育异常可能会转变成癌组织。轻度损害可能自发消退，而其他的可能发展成高度损害。HPV-16和HPV-18最常见地与发育异常有关，尽管一些其他的转化性HPV亚型也与发育异常有关。最近的研究显示，高达89％的HIV阳性同性恋男子会感染这些危险性高的HPV亚型。HIV阳性患者还更可能同时感染多种与危险性较高的发育异常进程有关的HPV亚型。

生殖器疣是世界上最常见的性传播疾病，在17-33岁的人群中最流行。所有生殖器疣中近90％产生的原因是HPV-6和HPV-11，但与肿瘤的生长几乎无关。根据美国社会健康协会所说，现在在美国至少有2千万人感染了HPV，每年出现550万性传播的HPV感染新病例。生殖器疣通常形成无痛发痒的肿块，其位于生殖器上或附近，但是不治疗的话可能发展成更大更显著的菜花样生长。与感染生殖器疣的人进行性接触的人大约有三分之二会在接触后的3个月内生长疣。在10-20％生殖器疣的病例中发生生殖器疣的自发消退。然而，即使损害消退，生殖器疣的复发是常见情况，一年后50％复发。难看的损害的结果是，需要经常治疗生殖器疣。

最近二十年来的证据使得人们普遍接受了HPV感染对于宫颈癌的形成尽管不是充分的却是必需的观点。宫颈癌中HPV存在率估计为99.7％。据信肛门癌有类似的HPV感染和形成肛门发育异常之间的关系，并且肛门癌与子宫癌是同样的情况。在一项对HIV阴性的患有肛门癌患者的研究中，发现88％的肛门癌中有HPV感染。在美国，2003年预计有12200个宫颈癌新病例和4100个宫颈癌死者，以及4000个肛门癌新病例和500个肛门癌死者。虽然近四十年来由于广泛筛查而使宫颈癌的发生率下降，但是肛门癌的发生率升高。肛门癌发生率的升高可能部分归因于HIV感染，因为HIV阳性患者比普通人群的肛门癌发生率更高。在普通人群中肛门癌的发生率为0.9例/100000人，而在同性恋男性人群中肛门癌的发生率为35例/100000人，在HIV阳性同性恋男性人群中肛门癌的发生率为70-100例/100000人。事实上，由于在感染HIV患者中肛门发育异常的高发病率和肛门癌的增长趋势，所以对于治疗在HIV阳性患者中机会致病性感染的2003USPHA/IDSA准则将包括用于诊断为肛门发育异常的患者的治疗准则。

对于HPV没有已知的治疗。有生殖器疣的治疗方案，尽管它们即使不进行治疗也经常消失。治疗方法取决于诸如生殖器疣的尺寸和部位等因素。在所采用的治疗方案中，使用咪喹莫特乳膏、20％的鬼臼树脂抗有丝分裂剂溶液、0.5％普达非洛溶液、5％的5-氟尿嘧啶乳膏和三氯乙酸。对于孕妇不推荐使用鬼臼树脂或普达非洛，因为它们被皮肤吸收，并可能导致分娩缺陷。5-氟尿嘧啶乳膏也不推荐孕妇使用。小的生殖器疣可以通过冷冻(冷冻破坏法)、灼烧(电烙术)或激光治疗而物理去除。对其他治疗无反应的大疣可能只能通过手术去除。已知生殖器疣在物理去除后会复发，在这些情况下使用α-干扰素直接注入这些疣中。然而，α-干扰素是昂贵的，并且其使用不能降低生殖器疣的复发率。

因此对于有效的HPV治疗存在未满足的需求。现在已令人惊讶地发现了满足该需求并且还具有其他益处的化合物。相关的背景技术为：Snoeck等人，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，vol.46(11)，3356-3361页(2002年11月)；Keith等人，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，vol.47(7)，2193-2198页(2003年7月)；Christensen等人，Antiviral Research，vol.48，131-142页(2000)；美国专利公开号2003/0072814 A1；美国专利5798340；和PCT申请号PCT/CZ96/00011。

发明概述

式I的化合物及其药学上可接受的盐，

其中：

Y^1A和Y¹⁸独立地为Y¹；

R^X1和R^X2独立地为R^X；

Y¹为＝O、-O(R^X)、＝S、-N(R^X)、-N(O)(R^X)、-N(OR^X)、-N(O)(OR^X)或-N(N(R^X)(R^X))；

R^X独立地为R¹、R²、R⁴、W³或保护基；

R¹独立地为-H或1～18个碳原子的烷基；

R²独立地为R³或R⁴，其中每个R⁴独立地被O～3个R³基团所取代或者两个R²基团在碳原子上结合在一起，形成3～8个碳的环，并且该环可以被0～3个R³基团所取代；

R³为R^3a、R^3b、R^3c或R^3d，条件是，当R³连接到杂原子上时，R³为R^3c或R^3d；

R^3a为-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CF₃、-CN、N₃、-NO₂或-OR⁴；

R^3b为＝O、-O(R⁴)、＝S、-N(R⁴)、-N(O)(R⁴)、-N(OR⁴)、-N(O)(OR⁴)或-N(N(R⁴)(R⁴))；

R^3c为-R⁴、-N(R⁴)(R⁴)、-SR⁴、-S(O)R⁴、-S(O)₂R⁴、-S(O)(OR⁴)、-S(O)₂(OR⁴)、-OC(R^3b)R⁴、-OC(R^3b)OR⁴、-OC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、-SC(R^3b)R⁴、-SC(R^3b)OR⁴-SC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、-N(R⁴)C(R^3b)R⁴、-N(R⁴)C(R^3b)OR⁴、-N(R⁴)C(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、W³或-R⁵W³；

R^3d为-C(R^3b)R⁴、-C(R^3b)OR⁴、-C(R^3b)W³、-C(R^3b)OW³或-C(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))；

R⁴为-H或1～18个碳原子的烷基；2～18个碳原子的烯基或2～18个碳原子的炔基；

R⁵为1～18个碳原子的亚烷基、2～18个碳原子的亚烯基或2～18个碳原子的亚炔基；

W³为W⁴或W⁵；

W⁴为R⁶、-C(R^3b)R⁶、-C(R^3b)W⁶、-SO_M2R⁶或-SO_M2W⁵，其中R⁶为R⁴，其中每个R⁴被0～3个R³基团所取代；

W⁵为碳环或杂环，其中W⁵独立地被0～3个R²基团所取代；和

M2为0、1或2。

发明详述

本发明提供了下式的化合物及其药学上可接受的盐，

其中：

A为

Y^1A和Y^1B独立地为Y¹；

R^X1和R^X2独立地为R^X；

R^X独立地为R¹、R²、R⁴、W³或保护基；

R¹独立地为-H或1～18个碳原子的烷基；

R²独立地为R³或R⁴，其中每个R⁴独立地被0～3个R³基团所取代或者两个R²基团在碳原子上结合在一起，形成3～8个碳的环，并且该环可被0～3个R³基团所取代；

R^3a为-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CF₃、-CN、N₃、-NO₂或-OR⁴；

R^3c为-R⁴、-N(R⁴)(R⁴)、-SR⁴、-S(O)R⁴、-S(O)₂R⁴、-S(O)(OR⁴)、-S(O)₂(OR⁴)、-OC(R^3b)R⁴、-OC(R^3b)OR⁴、-OC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、-SC(R^3b)R⁴、-SC(R^3b)OR⁴、-SC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、-N(R⁴)C(R^3b)R⁴、-N(R⁴)C(R^3b)OR⁴、-N(R⁴)C(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、W³或-R⁵W³；

R⁴为-H或者1～18个碳原子的烷基、2～18个碳原子的烯基或2～18个碳原子的炔基；

W³为W⁴或W⁵；

W⁴为R⁶、-C(R^3b)R⁶、-C(R^3b)W⁵、-SO_M2R⁶或-SO_M2W⁵，其中R⁶为R⁴，其中每个R⁴被0～3个R³个基团所取代；

W⁵为碳环或杂环，其中W⁵独立地被0～3个R²基团所取代；和

M2为0、1或2。

本发明的实施方案提供了式I的化合物及其药学上可接受的盐，

其中：

Y^1A和Y^1B独立地为Y¹；

R^X1和R^X2独立地为R^X；

R^X独立地为R¹、R²、R⁴、W³或保护基；

R¹独立地为-H或1～18个碳原子的烷基；

R²独立地为R³或R⁴，其中每个R⁴独立地被0～3个R³基团所取代或者两个R²基团在碳原子上结合在一起，形成3～8个碳的环，并且该环可以被0～3个R³基团所取代；

R³为R^3a、R^3b、R^3c或R^3d，条件是，当R³连接到杂原子上时，R³为R^3c或^3d；

R^3a为-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CF₃、-CN、N₃、-NO₂或-OR⁴；

R^3c为-R⁴、-N(R⁴)(R⁴)、-SR⁴、-S(O)R⁴、-S(O)₂R⁴、-S(O)(OR⁴)、-S(O)₂(OR⁴)、-OC(R^3b)R⁴、-OC(R^3b)OR⁴、-OC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、-SC(R^3b)R⁴、-SC(R^3b)OR⁴、-SC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴))、-N(R⁴)C(R^3b)R⁴、-N(R⁴)C(R^3b)OR⁴、-N(R⁴)C(R^3b)(N(R⁴)（R⁴))、W³或-R⁵W³；

R⁵为1～18个碳原子的的亚烷基、2～18个碳原子的亚烯基或2～18个碳原子的亚炔基；

W³为W⁴或W⁵；

W⁴为R⁶、-C(R^3b)R⁶、-C(R^3b)W⁵、-SO_M2R⁶或-SO_M2W⁵，其中R⁶为R⁴，其中每个R⁴被0～3个R³基团所取代；

W⁵为碳环或杂环，其中W⁵独立地被0～3个R²基团所取代；和

M2为0、1或2。

本发明的实施方案提供了式IA的化合物，

其中Y^1A和Y^1B如上所定义。

本发明实施方案提供了下式的化合物，

本发明实施方案提供了下式的化合物，

本发明实施方案提供了下式的化合物，

本发明实施方案提供了下式的化合物，

本发明实施方案提供了下式的化合物，

本发明实施方案提供了下式的化合物，

本发明实施方案提供了适用作抗增殖药物的化合物。

本发明实施方案提供了适用作细胞凋亡药物的化合物。

本发明实施方案提供了适用作抗-HPV药物的化合物。

本实施方案一方面提供了适用作局部抗-HPV药物的化合物。

本发明的实施方案提供了含有有效量的式1化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受载体的药物组合物。

本实施方案一方面提供了药物组合物，其中该组合物为凝凝胶组合物。

本实施方案另一方面提供了药物组合物，其中该组合物为软膏组合物。

本发明实施方案提供了含有有效量的式1化合物或其药学上可接受的盐和有效量的至少一种抗病毒药物和药学上可接受载体的药物组合物。

本实施方案另一方面提供了药物组合物，其中该组合物为软膏组合物。定义

术语“PMEG”是指化合物9-(2-膦酰基甲氧基乙基)鸟嘌呤，

术语“PMEDAP”是指化合物9-(2-膦酰基甲氧基乙基)-2，6-二氨基嘌呤，

术语“cprPMEDAP”是指化合物9-(2-膦酰基甲氧基乙基)-2-氨基-6-(环丙基)嘌呤，

“生物利用度”是指药物活性剂在该药剂引入躯体后对于目标组织而言可利用的程度。药物活性剂生物利用度的提高可以为患者提供更有效率和有效的治疗，因为，对于给定剂量而言，在目标组织位置上可以使用更多的药物活性剂。

术语“膦酸酯”和”膦酸酯基团”包括含亚磷的分子里的官能团或部分，所述亚磷1)单键键合到碳上、2)双键键合到杂原子上、3)单键键合到杂原子上和4)单键键合到另一个杂原子上，其中每个杂原子可以相同或不同。术语“膦酸酯”和“膦酸酯基”还包括含有与上述亚磷相同氧化态的亚磷的官能团或部分，以及含有前药部分的官能团或部分，所述前药部分可以从化合物分离，使得该化合物保留具有上述特征的亚磷。例如，术语“膦酸酯”和“膦酸酯基”包括膦酸、膦酸单酯、膦酸二酯、膦酸酰胺化物(phosphonamidate)和硫代磷酸酯(phosphonthioate)官能团。在本发明的一个具体实施方案中，术语“膦酸酯”和“膦酸酯基”包括含亚磷的分子内的官能团或部分，所述亚磷1)单键键合到碳上、2)双键键合到氧上、3)单键键合到氧上和4)单键键合到另一个氧上，以及含有前药部分的官能团或部分，所述前药部分可以从化合物分离，使得该化合物保留具有这样特征的亚磷。在本发明的另一个具体实施方案中，术语“膦酸酯”和“膦酸酯基”包括含亚磷的分子内的官能团或部分，所述亚磷1)单键键合到碳上、2)双键键合到氧上、3)单键键合到氧或氮上和4)单键键合到另一个氧或氮上，以及含有前药部分的官能团或部分，所述前药部分可以从化合物分离，使得该化合物保留具有这样特征的亚磷。

测定化合物在肠胃分泌物替代品中稳定性的配方和方法是已知的。化合物在这里定义为在肠胃道中是稳定的，当在37℃培养1小时后低于50摩尔％的被保护基团在肠或胃液替代品中被脱保护。这样的化合物适合用于该实施方案中。注意的是，仅仅因为该化合物对肠胃道是稳定的并不意味着它们不能在体内被水解。前药一般在消化系统中是稳定的，但通常在消化腔、肝脏或其他代谢器官中或者在细胞内部基本上水解成母体药物。

本发明化合物在某些情况下还可以以互变异构体存在。例如，对于咪唑、胍、脒和四唑体系可以存在烯-胺互变异构体，它们所有可能的互变形式都在本发明的范围内。

文中所用术语”前药”是指向生物系统给药时，由于自发化学反应；酶催化的化学反应；光解作用和/或代谢性化学反应而产生的药物物质，即活性成分的任何化合物。因此前药是治疗活性化合物的共价修饰类似物或潜在形式。

“前药部分”是指不稳定的官能团，其在细胞内部的代谢期间通过水解、酶裂解或者通过一些其他过程从活性抑制化合物中系统性分离出来(Bundgaard，Hans，“Des ign and Application of Prodrugs”在A Textbook of Drug Design and Development(1991)，P.Krogsgaard-Larsen and H.Bundgaard，Eds.Harwood Academic Publishers，第113-191页)。对本发明膦酸酯前药化合物具有酶激活机理的酶包括但不限于，酰胺酶、酯酶、微生物酶、磷脂酶、胆碱酯酶和磷酶(phosphases)。前药部分可以用来提高溶解性、吸收性和亲油性，从而优化药物传递、生物利用度和功效。前药部分可以包括活性代谢物或药物自身。

示例性前药部分包括水解敏感的或不稳定的酰氧基甲基酯-CH₂OC(＝O)R和酰氧基甲基碳酸酯-CH₂OC(＝O)OR，其中在这种情况下R为C₁-C₆烷基、C₁-C₆取代烷基、C₆-C₂₀芳基或C₆-C₂₀取代芳基。酰氧基烷基酯首先用作羧酸的前药策略，然后由Farquhar等人(1983)J.Pharm.Sci.72：324以及美国专利第4816570、No.4968788、No.5663159和No.5792756号用于磷酸酯和膦酸酯。然后，酰氧基烷基酯被用于穿过细胞膜传递膦酸，并提高口服生物利用度。酰氧基烷基酯的相近变体、烷氧基羰基氧基烷基酯(碳酸酯)作为本发明组合的化合物中的前药部分也可以提高口服生物利用度。示例性酰氧基甲基酯是异丙基羰基氧基甲氧基-OCH₂OC(＝O)C(CH₃)₂。示例性酰氧基甲基碳酸酯前药部分是异丙基羰基氧基甲基碳酸酯HOC(＝O)OCH₂OC(＝O)C(CH₃)₂。

膦酸酯基可以是膦酸酯前药部分。前药部分可以对水解敏感，例如，但不限于，异丙基羰基-氧基甲氧基或异丙基羰基氧基甲基碳酸酯基。或者，前药部分可以对酶强化的裂解敏感，例如乳酸酯或膦酸酰胺化物-酯基。

据报道，磷的芳基酯基团，特别是苯基酯能提高口服生物利用度(DeLombaert等人(1994)J.Med.Chem.37：498)。还描述了在磷酸酯邻位包含羧酸酯的苯基酯(Khamnei和Torrence，(1996)J.Med.Chem.39：4109-4115)。据报道，苄基酯产生母体膦酸。在某些情况下，处于邻位或对位的取代基可以促进水解。具有酰化酚或烷基化酚的苄基类似物通过酶，例如酯酶、氧化酶等的作用可以产生酚类化合物，其依次经历苄型C-O键裂解而产生磷酸和醌甲基化物中间体。这类前药的实例由Mitchell等人(1992)J.Chem.Soc.Perkin Trans.II 2345；Glazier WO 91/19721所描述。还描述了其他苄型前药，其包含连接至苄型亚甲基的含有羧酸酯的基团(Glazier WO 91/19721)。据报道，含硫前药可用于膦酸酯药物的细胞内传递。这些前酯包含乙硫基，其中硫醇基或者被酰基酯化，或者与另一个硫醇基结合形成二硫化物。二硫化物脱酯或者还原产生游离的硫中间体，其随后分解成磷酸和环硫化物(Puech等人(1993)AntiviralRes.，22：155-174；Benzaria等人(1996)J.Med.Chem.39：4958)。环状的膦酸酯也被描述为含磷化合物的前药(Erion等人，美国专利No.6312662)。

“保护基”是指屏蔽或改变官能团性质或者化合物整体性质的化合物的部分。在本领域中化学保护基和用于保护/脱保护的策略是众所周知的。例如参见Protect ive Groups in Organic Chemi stry，Theodora W.Greene，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1991。保护基经常用于屏蔽某些官能团的反应性，以助于所期望化学反应的效率，例如，胺安排和计划的方式形成和断裂化学键。对化合物官能团的保护除了改变被保护官能团的反应性外还改变其他物理性质，例如极性、亲油性(疏水性)和可以通过常规分析工具测量的其他性质。被化学保护的中间体本身可以是生物活性的或非活性的。

被保护的化合物在体外和体内还可以显示出改变的、在某些情况下优化的性能，例如穿过细胞膜的通过性和对酶降解或螯合的耐受性。在这个角色中，具有预料的治疗效果的被保护化合物被称为前药。

保护基的另一功能是将母体药物转化成前药，因此，母体药物在前药在体内转化时被释放出来。因为活性前药可以比母体药物更有效地吸收，因此前药在体内可能比母体药物具有更大的效价。保护基或者在化学中间体情况下在体外除去，或者在前药情况下在体内除去。对于化学中间体，脱保护之后所得产物，例如醇，是生理可接受的并不是特别重要的，不过一般更希望该产物是药理上无害的。

对本发明任意化合物的任何提及还包括提及其生理可接受的盐。本发明化合物生理可接受的盐的实例包括从合适的碱例如碱金属(例如钠)、碱土金属(例如镁)、铵和NX₄ ⁺(其中X为C₁-C₄烷基)衍生的盐。氢原子或氨基的生理可接受的盐包括如下酸的盐：有机羧酸，例如乙酸、安息香酸、乳酸、富马酸、酒石酸、马来酸、丙二酸、苹果酸、羟乙磺酸、乳糖酸和琥珀酸；有机磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对-甲苯磺酸；和无机酸，例如盐酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸。羟基化合物生理可接受的盐包括与适宜阳离子例如Na⁺和NX₄ ⁺(其中X独立选自H或C₁-C₄烷基)结合的所述化合物的阴离子。

文中所用术语“凝胶”是指由用小无机粒子构成的悬浮液组成或者由较大有机分子(环绕并被液体所渗透)所组成的半固体系统。其中凝胶块由絮状小粒子组成，凝胶被分类为两相系统，有时称作浆糊。氢氧化铝凝胶和皂土乳浆是两相系统的实例。单相凝胶由均匀分布于液体中的有机大分子组成，其分布方式使得在分散的大分子和该液体之间无明显界限。这样的凝胶实例是羧甲基纤维素钠和黄蓍胶。尽管凝胶通常是水性的，但醇和油可以用作连续相。

文中所用术语“软膏”是指供外部涂抹的半固体制剂，其稠度使得它们通过涂抹易于涂敷在皮肤上。它们应该是这样的组合物，当被涂敷到身体时它们软化但不必熔化。他们作为媒介物用于局部涂敷药用物质，对皮肤还起到保护和润肤的作用。

为了治疗使用，本发明化合物活性成分的盐应该是生理可接受的，即，它们将是从生理可接受的酸或碱衍生的盐。然而，生理上不可接受的酸或碱的盐也可以有用，例如，用于制备或纯化生理可接受的化合物。所有的盐，不管其是否由生理可接受的酸或碱衍生的，都在本发明范围内。

“烷基”是包含正构、仲、叔或环状碳原子的C₁-C₁₈烃。实例是甲基(Me，-CH₃)、乙基(Et，-CH₂CH₃)、1-丙基(n-Pr，正-丙基，-CH₂CH₂CH₃)、2-丙基(i-Pr，i-丙基，-CH(CH₃)₂)、1-丁基(n-Bu，正-丁基，-CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，i-丁基，-CH₂CH(CH₃)₂)、2-丁基(s-Bu，s-丁基，-CH(CH₃)CH₂CH₃)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，t-丁基，-C(CH₃)₃)、1-戊基(n-戊基，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₃)、3-戊基(-CH(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH₃)CH(CH₃)₂)、3-甲基-1-丁基(-CH₂CH₂CH(CH₃)₂)、2-甲基-1-丁基(-CH₂CH(CH₃)CH₂CH₃)、1-己基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-己基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃)、3-己基(-CH(CH₂CH₃)(CH₂CH₂CH₃))、2-甲基-2-戊基(-C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH(CH₃)CH₂CH₃)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)₂)、3-甲基-3-戊基(-C(CH₃)(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH(CH₃)₂)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH₃)C(CH₃)₃。

“烯基”是包含正构、仲、叔或环状碳原子的具有至少一个不饱和位，即碳-碳、sp²双键的C₂-C₁₈烃。实例包括但不限于，乙烯或乙烯基(-CH＝CH₂)、烯丙基(-CH₂CH＝CH₂)、环戊烯基(-C₅H₇)和5-己烯基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH＝CH₂)。

“炔基”是包含正构、仲、叔或环状碳原子的至少一个不饱和位，即碳-碳、sp三键的C₂-C₁₈烃。实例包括但不限于，乙炔基(-C≡CH)和炔丙基(-CH₂C≡CH)。

“亚烷基”是指饱和的、支链或直链或环状1-18个碳原子的烃基，并具有通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子衍生得到的两个单价基团中心。典型的亚烷基包括但不限于，亚甲基(-CH₂-)、1，2-乙基(-CH₂CH₂-)、1，3-丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、1，4-丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)等。

“亚烯基”是指不饱和的、支链或直链或环状2-18个碳原子的烃基，并具有通过从母体烯烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子衍生得到的两个单价基团中心。典型的亚烯基包括但不限于，1，2-乙烯基(-CH＝CH-)。

“亚炔基”是指不饱和的、支链或直链或环状2-18个碳原子的烃基，并具有通过从母体炔烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子衍生得到的两个单价基团中心。典型的亚炔基包括但不限于，乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH₂C≡C-)和4-戊炔基(-CH₂CH₂CH₂C≡CH-)。

“芳基”是指6-20个碳原子的单价芳香烃基，其是通过从母体芳香环体系的单个碳原子上除去一个氢原子而衍生得到的。典型的芳基包括但不限于，从苯、取代苯、萘、蒽、联苯基等衍生的基团。

“芳烷基”是指其中键合到碳原子、一般为末端或sp³碳原子的氢原子之一被芳基所取代的非环烷基。典型的芳烷基包括但不限于，苄基、2-苯乙烷-1-基、萘甲基、2-萘基乙烷-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。芳烷基含有6～20个碳原子，例如，芳烷基的烷基部分，包括烷基、烯基、烯基或炔基，为1～6个碳原子并且芳基部分为5～14个碳原子。

“取代烷基”、“取代芳基”和“取代芳烷基”分别是指其中一个或多个氢原子分别独立地被非氢取代基所替代的烷基、芳基和芳烷基。典型的取代基包括但不限于，-X、-R、-O^-、-OR、-SR、-S^-、-NR₂、-NR₃、＝NR、-CX₃、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO₂、＝N₂、-N₃、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NRR-S(＝O)₂O^-、-S(＝O)₂OH、-S(＝O)₂R、-OS(＝O)₂OR、-S(＝O)₂NHR、-S(＝O)R、-OP(＝O)O ₂RR、-P(＝O)O₂RR-P(＝O)(O^-)₂、-P(＝O)(OH)₃、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(S)R、-C(O)OR、-C(O)O^-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NRR、-C(S)NRR、-C(NR)NRR，其中每个X独立地为卤素：F、Cl、Br或I；且每个R独立地为-H、烷基、芳基、杂环、保护基或前药部分。亚烷基、亚烯基和亚炔基也可以类似地被取代。

文中所用“杂环”例如包括但不限于在Paquette，Leo A.；Principles of Modern Heterocyclic Chemi stry(W.A.Benjamin，New York，1968)，特别是第1、3、4、6、7和9章；The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A Series of Monographs”(John Wiley&Sons，New York，1950至今)，特别是在第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中所描述的这些杂环。在本发明的一个具体实施方案中，“杂环”包括文中所定义的“碳环”，其中一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如O、N或S)所替代。

杂环的实例例如包括但不限于吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基、硫氧化的四氢噻吩基、嘧定基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫代萘、吲哚基、indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、吩噁啉基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、中氮茚基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、1，5-二氮杂萘基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基、isatinoyl和双-四氢呋喃基。

碳键合的杂环例如但不限于键合在吡啶的2、3、4、5或6位，哒嗪的3、4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氢呋喃、硫呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位，氮杂环丁烷的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或者异喹啉的1、3、4、5、6、7或者8位。更典型地，碳键合的杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。

氮键合的杂环例如但不限于键合在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢引哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，以及咔唑或β-咔啉的9位。更典型地，氮键合的杂环包括1-氮丙啶基(aziridyl)、1-氮杂环丁烷基(azetedyl)、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。

“碳环”是指饱和、不饱和或芳香环，作为单环具有3～7个碳原子、作为双环具有7～12个碳原子和作为多环具有至多约20个碳原子。单环状碳环具有3～6个环原子，更典型地为5或6个环原子。双环状碳环具有7～12个环原子，例如排列为双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系，或者排列为双环[5，6]或[6，6]体系的9或10个环原子。单环状碳环的实例包括环丙基(c丙基)、环丁基(c丁基)、环戊基(c戊基)、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、苯基、螺烷基和萘基。

“连接物”或“键”是指含有将膦酸酯基共价连接到药物上的共价键或链或原子基团的化学部分。连接物包括以下部分：烷氧基的重复单元(例如，聚乙烯氧、PEG、聚亚甲基氧)和烷基氨基(例如，聚乙烯氨、Jeffamine^TM)的重复单元；和包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二羟乙酸酯、丙二酸酯和己酰胺的二酸酯和酰胺。

文中所用术语“Aba”是指2-氨基丁酸的二价部分，

其中连接点由“*”指出。

文中所用术语“Ala”是指丙氨酸的二价部分，

其中连接点由“*”指出。

文中所用术语“Phe”是指丙氨酸二价部分，

其中连接点由“*”指出。

文中所用术语“POC”是指碳酸羟甲基异丙基酯的二价部分，

其中连接点由“*”指出。

取代基Y^1A和Y^1B可使用合并上述二价氨基酸部分和二价烷基部分的命名法来描述，例如表80-3中所述。

例如，下式的化合物

可以使用式I的命名法来描述，其中Y^1A和Y^1B为-N(R^X)，其中R^X为R²，其中R²为R^3d所取代的R⁴，其中R⁴为R^3d所取代的乙基，此外其中R^3d为-C(R^3b)OW³，其中R^3b为＝O，其中W³为W⁵，其中W⁵为碳环，其中R⁴为R^3d所取代的丙基，其中R^3d为-C(R^3b)OR⁴，其中R^2b为＝O，并且其中R⁴为乙基。或者，如表80-3所示，所述化合物可以以式I来描述，其中Y^1A和Y^1B为“Aba-Et”，其描述以下部分(其中“*”表示连接点)，

其是连接到“Et”(乙基)的“Aba”。

例如，下式的化合物可以使用式I的命名法来描述，

其中Y^1A和Y^1B为-N(R^X)，其中R^X为R²，其中R²为R^3d所取代的R⁴，其中R⁴为R^3d所取代的乙基，其中R^3d为-C(R^3b)OR⁴，其中R^3b为＝O，并且其中R⁴为正-丙基。或者，如表80-3所示，所述化合物可以以式I来描述，其中Y^1A和Y^1B为“Ala-nPr”，其描述以下部分(其中“*”表示连接点)，

其是连接到“nPr”(正-丙基)的“Ala”。

术语“手性的”是指具有镜像对子不重叠性质的分子，而术语“非手性的”是指它们的镜像对子可重叠的分子。

术语“立体异构体”是指具有相同的化学结构、但是原子或者基团的空间排列不同的化合物。

“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子不是互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可以借助高分辨率的分析方法例如电泳和色谱法进行分离。

“对映体”是指化合物的两个立体异构体，它们是彼此非重叠的镜像。

术语“治疗”或“进行治疗”在某种程度上涉及疾病或病情，包括预防疾病或病情出现、抑制疾病或病情、消除疾病或病情和/或缓解疾病或病情的一种或多种症状。

术语“抗增殖”是指用于或倾向于抑制细胞生长的活性，例如对肿瘤细胞的抗增殖作用，或者对病毒感染细胞的抗增殖作用。

术语“细胞凋亡”是指程序性细胞死亡的主要类型之一。如本意所示，其是在多细胞生物中不需要的细胞的故意自杀过程。与坏死(其是一种由于急性组织损伤导致的细胞死亡形式)不同，细胞凋亡是在生物体的生命周期内以有次序的过程进行的，通常带来优点。细胞凋亡是一种细胞死亡类型，其中细胞使用特定细胞工具来杀死自身；是一种细胞自杀机制，使得多细胞动物能控制细胞数量并消除威胁动物生存的细胞。例如当细胞不能修复地受损害或者感染了病毒时会发生细胞凋亡。细胞凋亡的刺激可以来自细胞本身、其周围的组织或者来自作为免疫系统部分的细胞，其可以是化学性、生物性或物理性的。相关术语“细胞凋亡的”是指凋亡的过程。

文中所用的立体化学定义和协定通常依照S.P.Parker，Ed.，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；以及Eliel，E.和Wilen，S.，Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons，Inc.，New York。很多有机化合物以光学活性的形式存在，即，它们具有使平面偏振光的平面旋转的能力。在描述光学活性的化合物时，前缀D和L或者R和S用来表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和1或者(+)和(-)用来指明由化合物引起的平面偏振光的旋转方向，(-)或1意指化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，除了它们互为镜像外，这些立体异构体是相同的。特定的立体异构体还可以被称为对映体，这样的异构体的混合物经常被称为对映体混合物。50∶50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，它们可以出现在化学反应或过程中没有立体选择性或立体专一性情况下。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两个对映体类型的等摩尔量混合物，没有光学活性。

保护基

在本发明内容中，保护基包括前药部分和化学保护基。

可以使用通常已知和惯用的保护基，并任选用于防止合成过程中，即制备本发明化合物的途径或方法期间与被保护基团发生的副反应。至于决定要保护哪些基团、何时加以保护以及化学保护基“PG”的性质，在很大程度上取决于所要防止的反应的化学性质(例如，酸性、碱性、氧化性、还原性或其他情形)和所要合成的方向。如果化合物被多个PG取代的话，则PG基团不必相同，而且通常也是不相同的。一般而言，PG用来保护诸如羧基、羟基、硫基或氨基的官能团，因此用于预防副反应或者另外用于促进合成效率。脱保护从而产生游离的脱保护基团的顺序取决于所要的合成方向以及所要遇到的反应条件，可以以技术人员所决定的任何顺序进行。

可以保护本发明化合物的不同官能团。例如，用于-OH基团(无论羟基、羧酸、膦酸或其他官能团)的保护基包括“成醚或成酯的基团”。成醚或成酯的基团能够起到文中所述合成方案中的化学保护基的作用。然而，有些羟基和硫基保护基既不是成醚基团也不是成酯基团，这点可以被本领域技术人员所理解，并包括以下所讨论的酰胺。

大量羟基保护基和形成酰胺的基团和相应的化学裂解反应描述在Protective Groups in Organic Synthesis，Theodora W.Greene(John Wiley&Sons，Inc.，New York，1991，ISBN 0-471-62301-6)(“Greene”)。还参见Kocienski Philip J.；Protecting Groups(Georg Thieme Verlag Stuttgart，New York，1994)，通过引用将其全部内容并入本文。特别是第1章，保护基：综述，第1-20页，第2章，羟基保护基，第21-94页，第3章，二醇保护基，第95-117页，第4章，羧基保护基，第118-154页，第5章，羰基保护基，第155-184页。对于羧酸、膦酸、膦酸酯、磺酸的保护基以及酸的其他保护基参见以下提及的Greene。这样的基团例如包括但不限于酯、酰胺、酰肼等。

成醚和成酯的保护基

成酯的基团包括：(1)形成膦酸酯的基团，例如膦酸酰胺化物酯、硫代磷酸酯、膦酸酯和膦酸双酰胺化物；(2)形成羧基酯的基团，和(3)形成硫酯的基团，例如磺酸酯、硫酸酯和亚磺酸酯。

本发明化合物的膦酸酯部分可以是或者不是前药部分，即，它们对于水解或者酶裂解或修饰可以是敏感的或者可以不是敏感的。某些膦酸酯部分在大多数或者几乎所有代谢作用条件下，是稳定的。例如，烷基有两个或更多个碳的膦酸二烷基酯由于缓慢的水解速率而在体内具有合适的稳定性。

盐和水合物

本发明组合物任选含有本申请的本发明化合物的盐，特别是包含例如Na⁺、Li⁺、K⁺、Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的药物可接受的非毒性盐。这样的盐可以包括通过合适的阳离子例如碱金属和碱土金属离子或铵和季铵离子与酸阴离子部分结合而衍生的那些。如果想得到水溶性的盐，则优选单价盐。

金属盐一般是通过本发明化合物与金属氢氧化物进行反应而制备的。以此方式制备的金属盐实例是包含Li⁺、Na⁺和K⁺的盐。溶解性较差的金属盐可以通过添加合适的金属化合物而从溶解性较高的盐溶液中沉淀出来。

此外，盐可以从某些有机和无机酸例如HCl、HBr、H₂SO₄或有机磺酸向碱性中心或者向酸性基团进行酸加成而形成。最后，可以理解，此处的组合物以非离子化以及两性离子形式含有本发明化合物，以及与如水合物中的化学计算量的水的结合物。

母体化合物与一个或多个氨基酸的盐也包括在本发明范围内。上述的任何氨基酸都适合，尤其是作为蛋白质成分发现的天然存在的氨基酸，尽管该氨基酸典型地是带有具有碱性或酸性基团的侧链的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸或谷氨酸，或者具有中性基团的氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。

抑制HPV的方法

本发明另一方面涉及抑制HPV活性的方法，包括用本发明化合物治疗怀疑包含有HPV的样品的步骤。

本发明组合物作为HPV的抑制剂、这类抑制剂的中间体，或者具有如下所述的其他用途。

本发明的治疗步骤包括向样品中加入本发明组合物，或者它包括向样品中加入该组合物的前体。该加入步骤包括上述的任何给药方法。

如果需要，使用本发明组合物后的HPV活性可以通过任何包括直接和间接检测HPV活性的方法来观察。测量HPV活性的定量、定性和半定量方法都是可以的。通常使用上述的筛查方法之一，然而，也可以使用任何其他方法，例如观察活生物体的生理特性。

HPV抑制剂的筛选

通过测量EC₅₀，也就是达到50％抑制细胞生长的化合物浓度来筛选本发明化合物和组合物的治疗实用性。在未感染和感染了HPV细胞中的EC₅₀比例提供了化合物对病毒感染细胞选择性的度量。实施例中教导了用于获得这些度量方法的规程。

药物制剂和给药途径

本发明的化合物是用常规的载体和赋形剂来配制的，根据一般实践来选择载体和赋形剂。片剂包含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。含水制剂以无菌形式制成，当希望通过非口服方式传递时一般是等渗的。所有制剂任选含有例如在“Handbook of Pharmaceutical Excipient s”(1986)中所提及的赋形剂。赋形剂包括抗坏血酸和其他抗氧验剂、诸如EDTA的螯合剂、诸如糊精的糖类、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸等。制剂的pH范围为约3～约11，但是通常约为7～10。

本发明的一种或多种化合物(在本文中，这里称作活性成分)通过适于所要治疗的病情的任何途径进行给药。合适的途径包括经口、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道和胃肠道外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等给药。可以理解，优选的途径可以随接受者的病情而变化。本发明化合物的优点在于，它们是口服可生物利用的，并且可以是口服给药的。

虽然对于活性成分可以单独给药，但它们优选作为药用制剂存在。兽用和人类用的本发明制剂含有至少一种如上所定义的活性成分，还包括一种或多种可接受的载体和任选的其他治疗成分。载体必须是“可接受的”，意指与制剂的其他成分是相容的，并且对其接受者生理上是无害的。

制剂包括适用于上述给药途径的那些。制剂可以以单位剂型便利地存在，并可以通过制药领域众所周知的任何方法进行制备。技术和制剂一般在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)中可找到。这样的方法包括使活性成分与形成一种或多种附加成分的载体结合的步骤。通常，通过使活性成分均匀且紧密地与液体载体或细碎的固体载体或者两者结合而制得制剂，然后，如果需要的话，将产品成形。

适合于口服给药的本发明制剂被制成分离的单元，例如各自含有预定量活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂；被制成粉末或颗粒；被制成水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者被制成水包油型液体乳剂或者油包水型液体乳剂。活性成分还可以作为一次性推剂(bolus)、药糖剂或糊剂存在。

通过压缩或模压而制得片剂，任选含有一种或多种附加成分。压制的片剂是通过在合适的机器中将自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合进行压缩而制备的。模压的片剂是通过在合适的机器中将被惰性液体稀释剂所润湿的粉末状活性成分的混合物模压而成的。片剂可以任选被包衣或划痕，并且任选进行配制，从而从其中提供缓释或控释活性成分。

对于眼睛或其他外部组织例如嘴和皮肤的感染，该制剂优选作为局部软膏或乳膏涂用，所述软膏或乳膏含有的活性成分量例如，为0.075～20％w/w(包括0.1～20％的活性成分，0.1％w/w的增量，例如0.6％w/w、0.7％w/w等)，优选为0.2～15％w/w，最优选为0.5～10％w/w。当在软膏中配制时，活性成分可以与石蜡或水可混溶的软膏基质一起使用。或者，活性成分可以在含有水包油型乳膏基质的乳膏中进行配制。

如果希望，乳膏基质的水相可以包括例如至少30％w/w的多元醇，即具有两个或更多羟基的醇，例如丙二醇、丁烷1，3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)及其混合物。局部制剂理想地可以包括能增强活性成分通过皮肤或其他受影响部位的吸收性或渗透性的化合物。这样皮肤渗透增强剂的实例包括二甲亚砜和有关类似物。

本发明乳剂的油相可以从已知成分用已知方法形成。虽然该相可以只含有乳化剂(或者称为乳化剂)，但理想地该相含有至少一种乳化剂与脂肪或油或者与脂肪和油两者所形成的混合物。优选地，包括亲水性乳化剂和起稳定剂作用的亲脂性乳化剂。还优选包括油和脂肪两者。总之，具有或不具有稳定剂的乳化剂形成所谓的乳化蜡，并且该蜡与油和脂肪一起形成所谓的乳化软膏基质，其形成乳膏制剂的油性分散相。

适用于本发明制剂的乳化剂和乳剂稳定剂包括吐60、司

80、十八十六醇、苯甲醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。

选择适合于制剂的油或脂肪以达到所希望的美容性能为准。乳膏应该优选为非油脂性、非着色并可洗掉的产品，其具有合适的稠度以防止从管或其他容器中泄漏。可以使用直链或支链、单或二代烷基酯，例如二-异己二酸酯、硬脂酸异十六烷基酯、椰子油脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己基酯或者称为Crodamol CAP的支链酯混合物，后三者是优选的酯。这些酯根据所需要的性能可单独使用或组合使用。或者，使用高熔点的脂质，例如白色软石蜡和/或液体石蜡或其他矿物油。

适于向眼睛局部给药的制剂还包括滴眼液，其中活性成分溶解或悬浮于合适的载体中，对于活性成分而言优选水性溶剂。活性成分在这些制剂中的浓度优选为0.5～20％，有利地为0.5～10％，特别是约1.5％w/w。

适于在口中局部给药的制剂包括糖锭，其含有在调味基质、通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性成分；锭剂，其含有在惰性基质例如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分；和漱口剂，其含有在合适液体载体中的活性成分。

直肠给药的制剂可以以具有合适基质(例如包含可可脂或水杨酸酯)的栓剂形式存在。

适于肺内或经鼻给药的制剂的粒径例如为0.1～500微米(包括0.1到500微米的粒径，增量为微米，例如0.5、1、30微米、35微米等)，其通过经由鼻部通道快速吸入或者通过经口吸入进行给药，从而到达肺泡。合适的制剂包括活性成分的水性或油性溶液。适于气雾剂或干粉给药的制剂可以根据常规方法进行制备，并且可以与其他治疗药物例如下述用于治疗或预防流感A或B感染的化合物一起传递。

适于阴道给药的制剂可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂存在，除了含有活性成分之外还含有本领域已知的适当载体。

适于胃肠道外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得该制剂与想要接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。

制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干的)条件下贮存，只是需要在使用前立刻加入无菌的液体载体，例如注射用水。临时注射液和悬浮液从前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制得。优选的单位剂量制剂是含有活性成分如上所述的日剂量或单位日亚剂量，或者其合适分量的那些。

应该理解的是，除了成分，特别是上述成分之外，考虑到所讨论制剂的类型，本发明的制剂还可以包括本领域常用的其他试剂，例如适于口服给药的那些制剂可以包括调味剂。

本发明还提供了兽用组合物，其含有至少一种以上所定义的活性成分和兽用的载体。

兽用的载体是适用于对组合物进行给药目的的材料，可以是固体、流体或气体材料，此外其在兽医领域是惰性或可接受的，并且与活性成分相容。这些兽用组合物可以口服、胃肠道外或者通过所希望的任何其他途径进行给药。

本发明的化合物被用于提供包含作为活性成分的一种或多种本发明化合物的控释型药用制剂(“控释制剂”)，其中活性成分的释放受到控制和调整，使得给定的活性成分低频率给药，或者改善其药物动力学或毒性特征。

活性成分的有效剂量至少取决于要治疗的病情性质、毒性(无论该化合物是否预防性使用(低剂量)还是抗活性的流感传染、传递方法和药物制剂，通过临床医生使用常规剂量逐步上升研究进行确定。可以预计为，约0.0001～约100mg/kg体重/天；典型的为约0.01～约10mg/kg体重/天；更典型的为约0.01～约5mg/kg体重/天；最典型的为约0.05～约0.5mg/kg体重/天。例如，对于吸入剂，约70kg体重的成年人每天候选剂量为1mg～1000mg，优选为5mg到500mg，可以以单剂量或多剂量形式进行服用。

本发明的活性成分还与其他的活性成分组合使用。这样的组合是根据要治疗的病情、成分的交叉反应性和组合的药学性质来选择的。例如，治疗呼吸系统的病毒性感染时，特别是流感感染时，本发明的组合物与抗病毒药(例如金刚烷胺、金刚烷乙胺和病毒唑)、粘液溶解药、化痰剂、支气管扩张药、抗生素、退热药或止痛药组合使用。通常，抗生素、退热药和止痛药与本发明化合物一起给药。

本发明化合物的代谢产物

本发明还提供了文中所述化合物在体内的代谢产物，在一定程度上这些产物相对于现有技术是新颖的和非显而易见的。这样的产物例如可以由所给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等，主要由于酶解过程而得到。因此，本发明包括通过包括将本发明化合物与哺乳动物接触足够长时间以产生其代谢产物的方法所产生的新颖并且非显而易见的化合物。这样的产物一般通过如下步骤进行鉴别：制备用同位素标记(例如，C¹⁴或H³)的本发明化合物，将其以可检测到的剂量(例如大于约0.5mg/kg)向动物例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或向人进行胃肠道外给药，使其进行足够长时间的代谢(一般约30秒～30小时)，并从尿、血液或其他生物样品中分离出其转化产物。这些产物易于分离，因为它们是被标记的(其他的则通过使用能与代谢产物中存活的表位结合的抗体进行分离)。通过常规方法，例如通过MS或NMR分析来确定代谢产物的结构。一般说床，以与本领域技术人员熟知的那些常规药物代谢研究相同方法来分析代谢产物。转化产物，只要它们没有在体内被另外发现，就可以用于本发明化合物治疗性给药的诊断试验中，即使它们本身不具有神经氨酸酶抑制活性。

本发明化合物的其他用途

本发明的化合物，或从这些化合物在体内通过水解或代谢所产生的生物活性物质，被用作免疫原或者用来与蛋白质结合，从而它们作为免疫原性组合物的成分用于制备能与蛋白质、化合物或它们的代谢产物特异结合的抗体，该代谢产物保留有免疫识别表位(抗体结合的部位)。因此，该免疫原性组合物适用作抗体制备中的中间体，用于诊断、质量控制等方法中，或者用于该化合物或其新颖的代谢产物的测定中。这些化合物适用于培养抗其他非免疫原性多肽的抗体，因为该化合物用作刺激免疫应答的半抗原位点，与未修饰的缀合蛋白进行交叉反应。

有意义的水解产物包括以上所讨论的被保护的酸性和碱性基团解产物。如上所提及的，含有免疫原性多肽例如白蛋白或钥

形血蓝蛋白的酸性或碱性酰胺一般适用作免疫原。上述的代谢产物可以保留有与本发明化合物实质程度的交叉反应性。因此，本发明的抗体能够与未保护的本发明化合物结合，而不与被保护的本发明化合物结合；或者，代谢产物能够与被保护的本发明化合物和/或代谢产物结合，不与被保护的本发明化合物结合，或者能与任何一个特异结合或者与三者全部特异结合。该抗体理想地基本上不与自然存在的材料进行交叉反应。物质的交叉反应性是在特定试验条件下对于特定分析物足以干扰试验结果的反应性。

本发明的免疫原包含本发明的化合物，其具有与免疫原性物质相结合的所希望的表位。在本发明内容中，这样的结合是指共价键结合，以形成免疫原性共轭物(当可适用时)或者非共价键结合物质的混合物，或者上述的组合。免疫原性物质包括佐剂例如Freund′s佐剂疫原性蛋白例如病毒、细菌、酵母、植物和动物多肽、特别是钥孔

形血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，以及免疫原性多糖。通常，具有所希望表位结构的化合物通过使用多官能(一般是双官能)交联剂而共价缀合到免疫原性多肽或多糖上。用来生产半抗原免疫原的方法本身是常规方法，任可此前所用的将半抗原缀合到免疫原性多肽等上的方法都适合使用于此，要考虑适用于交联的前体或水解产物上的官能团以及生产抗免疫原性物质的所讨论表位的特异抗体的可能性。

通常，多肽缀合到远离要识别的表位的本发明化合物的位点上。

以常规方法制备该缀合物。例如，交联剂N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸酐或alkN＝C＝Nalk适用于制备本发明的缀合物。该缀合物含有本发明的化合物，其通过键或者1-100个，通常1-25个，更特别是1-10个碳原子的连接基团连接到免疫原性物质上。使用色谱法等将该缀合物从原料和副产物中分离出来，然后无菌过滤并用小瓶贮存。

通常，将动物对所述免疫原性缀合物或衍生物和以常规方式制得的抗血清或单克隆抗体进行免疫。

本发明的化合物在制备亲和性吸收基体、用于过程控制的固化酶或免疫测定试剂中适用作连接物或隔离物。此处的化合物包含许多官能团，这些官能团适合作为用于交联所希望物质的位点。例如，通常将亲合性试剂，例如激素、肽、抗体、药物等连接到不溶性基质上。这些不溶性试剂以已知方式用于从生产得到的制剂、诊断样品和其他不纯净的混合物中吸收亲合性试剂的结合配偶体。相似地，固化酶用来进行用酶易于恢复的催化转化。双官能的化合物通常在制备诊断试剂中用来连接分析物至可检出基团上。

筛查试验优选使用来自对HPV感染敏感的特定组织的细胞。本领域已知的试验适用于测定体内的生物利用度，包括肠腔稳定性、细胞渗透、肝脏匀浆稳定性和血浆稳定性试验。然而，即使酯、酰胺或其他被保护的衍生物在体内不能转化成游离的羧基、氨基或羟基，但它们仍然适用作化学中间体。

使用抗增殖试验教导了本发明的实用性。抗增殖试验测量化合物对所培养细胞的增殖的作用。在各种浓度化合物的存在下培养细胞7天。在第7天，用染料对细胞进行着色，并通过分光光度计测量着色强度(与细胞数量成比例)。将数据相对于化合物浓度制图，拟合成S型剂量响应曲线，从该曲线测定降低细胞增殖率50％的化合物浓度(50％有效浓度或EC₅₀)。在抗增殖试验中的活性化合物可以是抑制细胞生长的(抑制细胞分裂)和/或杀细胞的(杀死细胞)。通过在HPV阳性癌细胞和正常细胞中进行抗增殖试验，我们鉴别出抑制HPV阳性癌细胞增殖比抑制来自正常人组织细胞更有效的化合物。

制造本发明化合物的示例性方法

本发明还涉及制造本发明组分的方法。该组分是通过任何可用的有机合成技术制得的。很多这样的技术是本领域熟知的。然而，多种熟知技术描述在“Compendium of Organic Synthetic Methods”(John Wiley&Sons，New York)，第1卷，Ian T.Harrison and Shuyen Harrison，1971；第2卷，Ian T.Harrisonand Shuyen Harrison，1974；第3卷，Louis S.Hegedus and Leroy Wade，1977；第4卷，Leroy G.Wade，jr.，1980；第5卷，Leroy G.Wade，Jr.，1984；和第6卷，Michael B.Smith；以及March，J.，“Advanced OrganicChemistry，第三版”，(John Wiley&SonS，New York，1985)，“ComprehensiveOrganic Synthesis.Selectivity，Strategy&Efficiency in Modern OrganicChemistry.第9卷”，Barry M.Trost，主编(Pergamon Press，New York，1993出版)。

以下给出多种用于制备本发明组分的示例性方法。这些方法是用来说明这些制备法的本质，而不是要限制可用方法的范围。

一般而言，反应条件例如温度、反应时间、溶剂、后处理过程等采用通常在本领域中用于进行特定反应的那些条件。所引用的参考材料与其中所引用的材料一起都包含这些条件的详细描述。通常的温度为-100℃到200℃，溶剂为非质子或质子性溶剂，反应时间为10秒到10天。后处理通常包括淬灭任何未反应的试剂，然后分配在水/有机层体系之间(萃取)，并分离含有产物的层。

氧化和还原反应通常在接近室温(约20℃)的温度下进行，不过对应金属氢化物还原而言，温度通常降低至0℃到-100℃，还原用的溶剂通常是非质子性的，氧化用的溶剂可以是质子性的或非质子性的。调节还原时间以获得理想的转化率。

缩合反应通常在接近室温的温度下进行，不过对于非平衡的、动力学控制的缩合而言，降低的温度(0℃到-100℃)也是常见的。溶剂可以是质子性的(常见于平衡反应)或非质子性的(常见于动力学控制的反应)。

标准合成技术例如共沸除去反应副产物和使用无水反应条件(例如惰性气体环境)在本领域中是常见的，并可在需要时进行使用。

以下流程给出本发明化合物的示例性制备方法。这些方法的详细描述在以下实验部分可以找到，并参考特定的流程。

流程

流程1

流程2

流程3

流程4

流程5

流程6

流程7

流程8

流程9

流程10

流程11

流程12

流程13

流程14

流程15

流程16

流程17

流程18

流程19

流程20

流程21

流程22

流程23

以下过程中的每种产物在其用于随后过程中之前任选被分离、分开、和/或纯化。

术语”被处理”、”进行处理”、”处理”等，当用于化学过程、规程或制备方面时，意指接触、混合、反应、允许反应、进行接触，以及本领域中通常用于表示一种或多种化学实体以此方式被处理，使得将其转化为一种或多种其他化学实体的其他术语。这意味着“用化合物二处理化合物一”与以下是同义的：“允许化合物一与化合物二反应”、“使化合物一与化合物二接触”、“使化合物一与化合物二反应”以及有机合成领域中通常用于合理地表示用化合物二使化合物一被“处理”、“反应”、”允许反应”等的其他表达方式。

在化学处理、规程或制备方面中，“处理”表示其中有机化学品被允许进行反应的合理和常用方式。如果没有其他说明，是指正常的浓度(0.01M到10M，通常为0.1M到1M)、温度(-100℃到250℃，通常为-78℃到150℃，更常见为-78℃到100℃，最常见为0℃到100℃)、反应容器(通常为玻璃、塑料、金属制的)、溶剂、压力、气氛(通常是空气，用于对氧和水不敏感的反应，或者氮气或氩气，用于对氧或水敏感的反应)等。使用有机合成领域已知的相似反应的知识来选择给定过程中用于“处理”条件和设备。特别地，有机合成领域的普通技术人员基于本领域知识来合理地选择条件和设备预期它成功进行所述过程的化学反应。

对以上每个流程的改进得到以上制得的具体示例性物质的各种类似物。描述合适的有机合成方法的以上引用的引文可用于这些改进中。

在每个以上示例性的流程中，有利地可以将反应产物彼此分离和/或从原料中分离反应产物。每步骤或者系列步骤的目标产物通过本领域常用技术被分离和/或纯化(以下为分离)到所希望的均化程度。通常这样的分离包括多相萃取、从溶剂或溶剂混合物进行结晶、蒸馏、升华或色谱法。色谱法可以包括任意数目的方法，例如包括：尺寸排除或离子交换色谱法、高压、中压或低压液相色谱法、小规模和制备性薄层或厚层色谱法，以及小规模薄层和急骤色谱法的技术。

另一类型的分离方法包括用试剂处理混合物，选择该试剂以结合至或者以其它方式使目标产物、未反应的原料、反应副产物等可分离。这样的试剂包括吸附剂或吸收剂，例如活性炭、分子筛、离子交换介质等。或者，所述试剂可以是酸(在碱性物质情况下)、碱(在酸性物质情况下)、结合试剂，例如抗体、结合蛋白、选择性螯合剂，例如冠醚、液/液离子萃取剂(LIX)等。

选择合适的分离方法取决于所涉及物质的本性，例如，蒸馏和升华中的沸点和分子量，色谱法中存在或不存在极性官能团，多相萃取中酸性和碱性介质中物质的稳定性，等等。本领域普通技术人员将应用最可能实现所希望的分离的技术。

以上引用的所有文献和专利在它们的引用位置确切地通过参考而并入本文。以上引用著作特别引用的部分或页数特别地通过引入而并入。本发明已经进行了详细描述，足以使得本领域普通技术人员能够实现并利用以下权利要求的主题。显然，在本发明的范围内和精神下可以对以下权利要求的方法和组合物进行一定的改进。以下实施例用于示范本发明，而绝不能将其解释为限制本发明。

实施例

通则

多次进行某些实施例。在重复的实施例中，反应条件如时间、温度、浓度等，以及产率在正常的实验范围内。在进行了明显改进的重复性实施例中，注意结果与所述的那些结果明显不同的这些改进。在使用不同原料的实施例中，注意这些原料。当重复的实施例涉及化合物的“相应的”类似物例如“相应的乙基酯”时，这意指其他还存在的基团，在此情况下通常是甲基酯，被认为是如所述改性的相同基团。

实施例1到35参见以上流程1到9。

实施例1

乙酰氧基乙氧基甲基氯1∶5L三颈烧瓶装配有机械搅拌器、温度计、500mL附加的漏斗和吹扫用氩气。加入在无水Et₂O(800mL)中的1，3-二氧戊环(dioxalane)(140mL，2.00mol)和1.0M ZnCl₂/Et₂O(7.5mL，0.007mol)。在20分钟内，通过附加的漏斗滴加乙酰氯(157mL，2.20mol)在Et ₂O(200mL)中的溶液。使用冷水浴维持温度始终在19-27℃之间。无外部冷却下持续搅拌4h，反应在20-25℃自加热约1h。澄清、无色的溶液在氩气下保持过夜。静置3天，形成橙色溶液。在rotavap(水泵)上除去Et₂O，直到在35℃浴中不再蒸馏。所得的产物的定量化产量为318g(理论产量306g)。

实施例2

膦酸二异丙酯2∶500mL三颈烧瓶中装有粗制的氯甲基醚1(317g，2.00mol)。通过附加的漏斗滴加亚磷酸三异丙酯(494mL)，同时在125℃油浴中加热，并剧烈搅拌。在干冰冷却的收集器中经短径头收集2-氯丙烷馏出液，氩气覆盖(blanket)，收集140g馏出液(理论值157g)。亚磷酸酯漂白反应成黄色，在125℃油浴中再连续加热2h，然后使用真空泵进行真空蒸馏。蒸馏出黄色的前馏分(140g，头135℃，底190℃)，然后改用干净的收集器。在头温度178-187℃(主要是185-187℃)和浴温度222-228℃的未知真空下收集主馏分。得到258g产物2(从1，3-二氧戊环计产率为47％)。

实施例3

醇3：用浓HCl(11.2mL，0.112mol)处理2(125g，0.443mol)在纯MeOH(440mL)中的溶液，并在氩气下加热至回流6h。在rotavap(水泵)上除去MeOH到55℃，剩下115g澄清的油状物，其与甲苯(2×200mL)共蒸发。粗产物真空干燥，得到油状物(102g，96％)。

实施例4

膦酸二异丙酯4：用6-氯嘌呤(12.72g，75mmoL)处理三苯基膦(25.57g，97.5mmol)和醇3(18g，75mmol)在DMF(120mL)中的溶液，并冷却到-15℃。在80分钟内，通过附加的漏斗滴加二异丙基偶氮二羧酸酯(16.68g，82.5mmol)在DMF(50mL)中的溶液。该反应混合物在-15℃保持2h，然后加热到室温，并再搅拌2h。浑浊的反应混合物变为亮黄色溶液。在减压下蒸发反应溶剂，用甲苯(3×)进行共蒸发，并在纯化前真空干燥过夜。通过硅胶柱色谱法(5％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到膦酸二异丙酯(18.52g，63％)，为白色固体：¹H NMR(CDCl₃)δ7.95(s，1H)，4.70(m，2H)，4.31(m，2H)，3.93(m，2H)，3.73(m，2H)，1.29(m，12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ18.42。

实施例5

膦酸二异丙酯5：将4(11.00g，28.08mmol)和环丙胺(4.86g，85.16mmol)在CH₃CN(80mL)中的混合物放入反应高压容器中，并加热到100℃达4h。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。产物分配在15％MeOH/CH₂Cl₂(3×)和盐水之间，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(5％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到5(10.42g，90％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.59(s，1H)，5.83(宽，s，1H)，4.88(宽，s，2H)，4.70(m，2H)，4.21(m，2H)，3.88(m，2H)，3.72(d，J＝8.4Hz，2H)，3.03(宽，s，1H)，1.28(m，12H)，0.84(m，2H)，0.60(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ18.63。

实施例6

cPrPMEDAP 6：用溴三甲基硅烷(21.1mL，160.02mmol)处理5(11.00g，26.67mmol)在无水CH₃CN(120mL)中的溶液。通过用铝箔包裹烧瓶而使反应避光。反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发挥发物。剩余物溶于H₂O(250mL)中，并用氢氧化铵将pH调节到9。浓缩反应混合物，获得黄色固体。该固体溶于H₂O(30mL)，并用10％HCl将pH调节到2。收集细固体，并真空干燥，得到6(7.88g，90％)，为白色固体。

实施例7

单膦酸盐酸盐7：将酸6(3.00g，9.15mmol)和DMF(0.1mL)在环丁砜(9.2mL)中的混合物加热到70℃。在1h时间内滴加亚硫酰二氯(1.66mL，22.76mmol)。将温度升高到90℃，加入TMSOPh(1.74mL，9.61mmol)，并搅拌1h。将反应混合物冷却到室温过夜。将该反应混合物滴加到充分搅拌的、冰冷丙酮(100mL)中。产物沉淀出来。在氩气下过滤固体，用冷丙酮(100mL)洗涤，真空干燥，得到单膦酸盐酸盐(3.70g，92％)，为固体。

实施例8

单膦酸酰胺化物8：将单膦酸7(0.22g，0.50mmol)、L-丙氨酸甲酯盐酸盐(0.14g，1.00mmol)和三乙胺(0.21mL，1.50mmol)在吡啶(3mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.39g，1.75mmol)和三苯基膦(0.46g，1.75mmol)在吡啶(2mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(97mg，39％，1：1非对映异构体混合物)，为米色泡沫。

实施例9

单膦酸酰胺化物9：将单膦酸7(0.88g，2.00mmol)、D-丙氨酸甲酯盐酸盐(0.84g，6.00mmol)和三乙胺(0.84mL，6.00mmol)在吡啶(8mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(1.56g，7.00mmol)和三苯基膦(1.84g，7.00mmol)在吡啶(8mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。该产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.40g，41％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫。

实施例10

单膦酸酰胺化物10：将单膦酸7(0.88g，2.00mmol)、L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1.31g，6.00mmol)和三乙胺(0.84mL，6.00mmol)在吡啶(8mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(1.54g，7.00mmol)和三苯基膦(1.84g，7.00mmol)在吡啶(8mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.38g，36％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅橙色泡沫。

实施例11

单膦酸酰胺化物11：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸乙酯盐酸盐(94mg，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(74mg，48％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.61(d，J＝4.2Hz，1H)，7.26-7.08(m，5H)，4.23(m，2H)，4.13(m，2H)，4.09(m，1H)，3.92-3.85(m，4H)，3.03(宽，s，1H)，1.30-1.26(m，3H)，1.24(m，3H)，0.88(m，2H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.94，20.68。

实施例12

单膦酸酰胺化物12：将膦酸6(1.50g，4.56mmol)、L-丙氨酸正丙基酯盐酸盐(1.59g，9.49mmol)、酚(2.25g，22.80mmol)和三乙胺(10.50mL，54.72mmol)在吡啶(8.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(6.54g，31.92mmol)和三苯基膦(7.32g，31.92mmol)在吡啶(8.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.43g，18％，化合物E，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.61(d，J＝5.1Hz，1H)，7.27-7.09(m，5H)，4.27-4.20(m，2H)，4.16-4.00(m，3H)，3.93-3.82(m，4H)，3.04(宽，s，1H)，1.63(m，2H)，1.30(dd，3H)，0.92(m，3H)，0.89(m，2H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.89，20.66。

实施例13

单膦酸酰胺化物13：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(0.10g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(87mg，55％，1∶1非对映异构体混合物)，为黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，J＝2.1Hz，1H)，7.26-7.09(m，5H)，4.98(m，1H)，4.23(m，2H)，4.06(m，1H)，3.91-3.83(m，4H)，3.04(宽，s，1H)，1.29-1.21(m，9H)，0.89(m，2H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.85，20.68。

实施例14

单膦酸酰胺化物14：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正丁酯盐酸盐(0.11g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(80mg，50％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.61(d，J＝4.20Hz，1H)，7.27-7.08(m，5H)；5.93(宽，s，1H)，4.97(宽，s，2H)，4.23(m，2H)，4.10-4.08(m，3H)，3.91-3.84(m，4H)，3.03(宽，s，1H)，1.58(m，2H)，1.34-1.27(m，5H)，0.92-0.89(m，5H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.94，20.68。

实施例15

单膦酸酰胺化物15：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯盐酸盐(0.13g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.10g，59％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.59(d，J＝4.20Hz，1H)，7.26-7.08(m，5H)，4.22(m，2H)，4.11(m，1H)，4.06(m，2H)，3.91-3.84(m，4H)，3.01(宽，s，1H)，1.59(m，2H)，1.31-1.27(m，9H)，0.89(m，3H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.94，20.68。

实施例16

单膦酸酰胺化物16：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正辛酯盐酸盐(0.15g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.13g，73％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.59(d，J＝4.2Hz，1H)，7.25-7.07(m，5H)，4.22(m，2H)，4.10(m，1H)，4.07(m，2H)，3.90-3.84(m，4H)，3.02(宽，s，1H)，1.59(m，2H)，1.29-1.26(m，13H)，0.88(m，3H)，0.85(m，2H)，0.60(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.96，20.69。

实施例17

单膦酸酰胺化物17：将膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-2-氨基丁酸乙酯盐酸盐(72mg，0.42mmol)、酚(0.10g，1.05mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(66mg，60％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.61(d，J＝7.2Hz，1H)，7.26-7.08(m，5H)，5.91(宽，s，1H)，4.97(宽，s，2H)，4.22-4.12(m，4H)，4.01-3.81(m，5H)，3.03(宽，s，1H)，1.71-1.60(m，2H)，1.24(m，3H)，0.89(m，2H)，0.84-0.76(m，3H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ22.15，20.93。

实施例18

单膦酸酰胺化物18：将膦酸6(1.00g，3.05mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯盐酸盐(1.19g，6.09mmol)、酚(1.43g，15.23mmol)和三乙胺(5.10mL，36.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(4.70g，21.32mmol)和三苯基膦(5.59g，21.32mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(5％MeOH/CH ₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.7g，42％，化合物G，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，J＝6.60Hz，1H)，7.27-7.04(m，5H)，5.89(宽，s，1H)，4.94(宽，s，2H)，4.22(m，2H)，4.07-3.99(m，3H)，3.91-3.84(m，4H)，3.03(宽，s，1H)，1.70-1.57(m，4H)，1.35(m，2H)，0.92-0.75(m，8H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ22.21，20.95。

实施例19

单膦酸酰胺化物19：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-2-氨基丁酸正辛酯盐酸盐(0.15g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.12g，64％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.62(d，J＝6.60Hz，1H)，7.25-7.08(m，5H)，4.24-4.21(m 2H)，4.09-4.04(m，2H)，4.00(m，1H)，3.91-3.83(m，4H)，3.01(宽，s，1H)，1.70-1.58(m，4H)，1.27(m，10H)，0.89-0.76(m，8H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ22.22，20.92。

实施例20

单膦酸酰胺化物20：将膦酸6(1.5g，4.57mmol)、L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(2.10g，9.14mmol)、酚(2.15g，22.85mmol)和三乙胺(7.64mL，54.84mmol)在吡啶(8.0mL)中的混合物加热到60℃达5分中。将aldrithiol(7.05g，31.99mmol)和三苯基膦(8.39g，31.99mmol)在吡啶(7.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO ₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(5％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到浅黄色固体1.32g，含有约10％杂质。该黄色固体(1.32g，2.28mmol)溶于iPrOH(10mL)，并转入热的富马酸(0.27g，2.28mmol)iPrOH(30mL)溶液中，并在80℃下搅拌30分钟。将反应混合物逐渐冷却到室温，并在0℃收集富马酸盐。所得的富马酸盐通过从NaHCO₃(2×)和EtOAc分配而被中和。用盐水、H₂O洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。真空干燥产物，得到单膦酸酰胺化物(0.70g，26％，化合物A，1∶1非对映异构体混合物)，为白色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.54(d，J＝2.4Hz，1H)，7.27-6.98(m，10H)，4.35(m，1H)，4.16(m，2H)，4.08(m，2H)，3.84-3.61(m，3H)，3.33(m，1H)，3.02(宽，s，1H)，2.95-2.87(m，2H)，1.17(m，3H)，0.87(m，2H)，0.61(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.88，21.07。

实施例21

单膦酸酰胺化物21：将膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯盐酸盐(0.11g，0.42mmol)、酚(0.10g，1.05mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(30mg，23％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.55(d，J＝2.7Hz，1H)，7.25-6.98(m，10H)，4.36(m，1H)，4.17(m，2H)，4.02(m，2H)，3.83-3.35(m，4H)，3.02(宽，s，1H)，2.94-2.86(m，2H)，1.52(m，2H)，1.29(m，2H)，0.90(m，3H)，0.88(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.85，21.05。

实施例22

单膦酸酰胺化物22：将膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸异丁酯盐酸盐(0.11g，0.42mmol)、酚(0.10g，1.05mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60C下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂C l₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(65mg，50％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.56(d，J＝3.6Hz，1H)，7.26-6.98(m，10H)，4.40(m，1H)，4.17(m，2H)，3.82(m，2H)，3.75-3.62(m，3H)，3.35(m，1H)，3.04(宽，s，1H)，2.96-2.87(m，2H)，1.83(m，1H)，0.90(m，2H)，0.86(m，6H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.82，21.03。

实施例23

双膦酸酰胺化物23：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸乙酯盐酸盐(0.28g，1.80mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(80mg，50％，)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.63(s，1H)，5.88(宽，s，1H)，4.96(宽，s，2H)，4.24-4.16(m，6H)，4.00(m，2H)，3.86(m，2H)，3.72(m，2H)，3.01(宽，s，1H)，1.36(m，6H)，1.26(m，6H)，0.86(m，2H)，0.61(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.63。

实施例24

双膦酸酰胺化物24：将膦酸6(1.00g，3.05mmol)、L-丙氨酸正丙酯盐酸盐(3.06g，18.30mmol)和三乙胺(5.10mL，36.50mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(4.70g，21.32mmol)和三苯基膦(5.59g，21.32mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(1.13g，71％，化合物F)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.65(s，1H)，5.92(宽，s，1H)，5.03(宽，s，2H)，4.24(m，2H)，4.10-4.02(m，6H)，3.87(m，2H)，3.73(m，2H)，3.03(宽，s，1H)，1.65(m，4H)，1.37(m，6H)，0.93(m，6H)，0.88(m，2H)，0.63(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.61。

实施例25

双膦酸酰胺化物25：将膦酸6(0.60g，1.83mmol)、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.84g，10.98mmol)和三乙胺(3.06mL，21.96mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(2.82g，12.80mmol)和三苯基膦(3.36g，12.80mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.53g，52％，化合物B)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.65(s，1H)，5.00(m，2H)，4.24(m，2H)，3.97(m，2H)，3.87(m，2H)，3.71(m，2H)，3.01(宽，s，1H)，1.34(m，6H)，1.23(m，12H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.59。

实施例26

双膦酸酰胺化物26：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正丁酯盐酸盐(0.33g，1.82mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(97mg，55％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.63(s，1H)，4.24(m，2H)，4.09(m，4H)，4.01(m，2H)，3.86(m，2H)，3.72(m，2H)，3.01(宽，s，1H)，1.61(m，4H)，1.37(m，10H)，0.93(m，6H)，0.88(m，2H)，0.61(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.59。

实施例27

双膦酸酰胺化物27：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯盐酸盐(0.38g，1.80mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.13g，65％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.62(s，1H)，4.23(m，2H)，4.09(m，4H)，4.01(m，2H)，3.86(m，2H)，3.72(m，2H)，2.99(宽，s，1H)，1.61(m，4H)，1.36-1.29(m，18H)，0.88(m，6H)，0.84(m，2H)，0.60(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.61。

实施例28

双膦酸酰胺化物28：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正辛酯盐酸盐(0.43g，1.80mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.13g，61％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.61(s，1H)，4.21(m，2H)，4.07-4.00(m，6H)，3.84-3.70(m，4H)，2.98(宽，s，1H)，1.60(m，4H)，1.34(m，6H)，1.27(m，20H)，0.87(m，6H)，0.83(m，2H)，0.58(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.63。

实施例29

双膦酸酰胺化物29：将膦酸6(0.70g，2.13mmol)、L-2-氨基丁酸乙酯盐酸盐(2.15g，12.80mmol)和三乙胺(3.57mL，25.56mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(3.29g，14.91mmol)和三苯基膦(3.92g，14.91mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.71g，60％，化合物D)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.64(s，1H)，4.24(m，2H)，4.16(m，4H)，3.89-3.87(m，4H)，3.72(d，J＝9.0Hz，2H)，3.01(宽，s，1H)，1.78-1.64(m，4H)，1.26(m，6H)，0.91(m，6H)，0.87(m，2H)，0.61(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.23。

实施例30

双膦酸酰胺化物30：将膦酸6(0.70g，21.32mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯盐酸盐(2.50g，12.80mmol)和三乙胺(3.57mL，25.56mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(3.29g，14.91mmol)和三苯基膦(3.92g，14.91mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.40g，31％，化合物C)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.64(s，1H)，4.24(m，2H)，4.11(m，4H)，3.91(m，2H)，3.87(m，2H)，3.71(d，J＝9.0Hz，2H)，3.03(宽，s，1H)，1.79-1.64(m，4H)，1.60(m，4H)，1.37(m，4H)，0.94(m，6H)，0.90(m，6H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.25。

实施例31

双膦酸酰胺化物31：将膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-2-氨基丁酸正辛酯盐酸盐(0.33g，1.82mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.12g，55％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.64(s，1H)，4.24(m，2H)，4.13-4.05(m，4H)，3.91(m，2H)，3.87-3.72(m，4H)，3.01(宽，s，1H)，1.78-1.65(m，4H)，1.61-1.29(m，24H)，0.91(m，6H)，0.89(m，6H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.20。

实施例32

双膦酸酰胺化物32：将膦酸6(0.60g，1.82mmol)、L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(2.51g，10.96mmol)和三乙胺(3.06mL，21.84mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(2.82g，12.74mmol)和三苯基膦(3.36g，12.74mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.53g，43％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.48(s，1H)，7.22-7.06(m，10H)，4.20(m，1H)，4.12(m，4H)，4.09(m，2H)，4.04(m，1H)，3.63(m，2H)，3.33-3.21(m，2H)，3.04-2.78(m，5H)，1.20(m，6H)，0.83(m，2H)，0.58(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.38。

实施例33

双膦酸酰胺化物33：将膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯盐酸盐(0.33g，1.26mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldri thiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.11g，70％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.51(s，1H)，7.23-7.06(m，10H)，4.23(m，1H)，4.11-4.05(m，7H)，3.65(m，2H)，3.35-3.23(m，2H)，3.01(m，1H)，3.04-2.78(m，4H)，1.57(m，4H)，1.33(m，4H)，0.92(m，6H)，0.86(m，2H)，0.61(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.35。

实施例34

双膦酸酰胺化物34：将膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸异丁酯盐酸盐(0.33g，1.26mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(78mg，50％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.52(s，1H)，7.24-7.07(m，10H)，4.26(m，1H)，4.11(m，2H)，4.01(m，1H)，3.85(m，4H)，3.66(m，2H)，3.35-3.25(m，2H)，3.07-2.85(m，3H)，2.97-2.79(m，2H)，1.89(m，2H)，0.90(m，12H)，0.89(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.31。

实施例35

cPrPMEDAP的BisPOC 35：将膦酸6(0.20g，0.61mmol)和三乙胺(0.42mL，3.01mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(2.0mL)中的混合物加热到60℃达30分钟。加入POCCl(0.45g，2.92mmol)。反应混合物在60℃下搅拌3h，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到cPrPMEDAP的bisPOC(0.13g，39％)，为固体：¹H NMR(CDCl₃)δ7.58(s，1H)，5.66(m，4H)，4.92(m，2H)，4.22(m，2H)，3.90-3.88(m，4H)，3.01(宽，s，1H)，1.81(m，12H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.93。

实施例36到38参见流程10。

实施例36

双膦酸酰胺化物37：将膦酸36(0.32g，1.00mmol)、L-丙氨酸丁酯盐酸盐(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.43g，75％)，为浅黄色泡沫。

实施例37

单膦酸38：将二酸36(1.30g，4.10mmol)和DMF(0.1mL)在环丁砜(35mL)中的混合物加热到70℃。在1h时间内滴加亚硫酰二氯(0.54mL，7.38mmol)。将温度升高到90℃，加入TMSOPh(0.75g，4.51mmol)，并搅拌1h。反应混合物冷却到室温过夜。将该反应混合物滴加到充分搅拌的、冰冷丙酮(100mL)中。产物沉淀出来。过滤固体，并溶于MeOH(40mL)中，用45％KOH将pH调节到3。通过过滤收集固体。进一步纯化产物，将其溶于MeOH中，用45％KOH调节pH到6，并从冰冷丙酮中结晶，得到单膦酸(0.20g，12％)，为米色固体。

实施例38

单膦酸酰胺化物39：将单膦酸38(0.20g，0.50mmol)、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(0.17g，1.00mmol)和三乙胺(0.10g，1.00mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.39g，1.75mmol)和三苯基膦(0.46g，1.75mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.14g，54％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色泡沫。

实施例39参见流程11

实施例39

双膦酸酰胺化物41：将膦酸40(0.36g，1.00mmol)、L-丙氨酸正丁酯盐酸盐(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.32g，35％)，为浅黄色泡沫。

实施例40到56参见流程12到16。

实施例40

双膦酸酰胺化物43：将膦酸42(0.37g，1.00mmol)、L-丙氨酸正丁酯盐酸盐(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.53g，85％)，为浅黄色泡沫。

实施例41

双膦酸酰胺化物45：将膦酸44(0.55g，2.00mmol)、L-丙氨酸丁酯盐酸盐(0.94g，5.20mmol)和三乙胺(0.54g，5.20mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrit hiol(1.54g，7.00mmol)和三苯基膦(1.84g，7.00mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.48g，45％)，为浅黄色泡沫。

实施例42

单膦酸46：将二酸44(10.00g，36.30mmol)和DMF(0.2mL)在环丁砜(50mL)中的混合物加热到70℃。在1h时间内滴加亚硫酰二氯(4.72mL，64.70mmol)。将温度升高到90℃，并加入TMSOPh(6.65g，40.00mmol)，并搅拌1h。将该反应混合物冷却到室温过夜。将该反应混合物滴加到充分搅拌的、冰冷丙酮(100mL)中。产物沉淀出来。过滤固体并溶于MeOH(40mL)，并用45％KOH将pH调节到3。通过过滤收集固体，并真空干燥，得到单膦酸(12.40g，97％)，为固体。

实施例43

单膦酸酰胺化物47：将单膦酸46(1.00g，2.86mmol)、L-丙氨酸甲酯盐酸盐(0.80g，5.73mmol)和三乙胺(0.58g，5.73mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(2.21g，10.00mmol)和三苯基膦(2.63g，10.00mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(0.80g，64％，1∶1非对映异构体混合物)，为浅黄色油状物。

实施例44

单膦酸酰胺化物48：将单膦酸46(0.35g，1.00mmol)、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(0.34g，2.00mmol)和三乙胺(0.20g，2.00mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(7％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物，含有一些杂质。用在热CH₃CN(10mL)中的富马酸(77mg)处理所得的化合物，并冷却到室温。产物沉淀出来，并真空干燥，得到单膦酸酰胺化物的富马酸盐(0.13g，22％，1∶1非对映异构体混合物)，为固体。

实施例45

PMEG的苄基醚50：将二酸49(0.62g，2.00mmol)和苄基醇(10mL)的混合物在搅拌下冷却到0℃。分批加入氢化钠(0.24g，10.00mmol)，在1h内将反应混合物加热到100℃。加入额外的苄基醇(20mL)和氢化钠(0.12g，5.00mmol)。该反应在140℃下搅拌1h，并冷却到室温。在减压下蒸发挥发物，加入水(50mL)，并用NaOH将pH调节为11。产物分配在甲苯(3×)和H₂O之间。水相用HCl酸化为pH＝3，并保持0℃过夜。收集产物并真空干燥，得到苄基醚(0.18g，22％)，为褐色固体。

实施例46

单膦酸酰胺化物51：将膦酸50(0.13g，0.34mmol)、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(0.11g，0.68mmol)、酚(0.16g，1.69mmol)和三乙胺(0.28mL，2.03mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.52g，2.37mmol)和三杠基膦(0.62g，2.37mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(5％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(50mg，26％，1∶1非对映异构体混合物)，为粘稠油状物。

实施例47

单膦酸酰胺化物52：将单膦酸酰胺化物51(50mg，0.09mmol)和Pd(OH)₂/C(50mg)在iPrOH(3mL)中的混合物在室温下在1大气压H₂(气球)下搅拌过夜。反应混合物通过硅藻土(celite)塞进行过滤，并在减压下在rotavap上除去溶剂。通过硅胶柱色谱法(5-15％MeOH/CHCl₃)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(40mg，95％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫。

实施例48

双膦酸酰胺化物54：将膦酸53(0.10g，0.35mmol)、L-丙氨酸丁酯盐酸盐(0.38g，2.10mmol)和三乙胺(0.58mL，4.20mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.53g，2.45mmol)和三苯基膦(0.64g，2.45mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(15％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(25mg，13％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CD₃OD)δ7.82(s，1H)，4.26(m，2H)，4.11(m，4H)，3.94(m，2H)，3.88(m，2H)，3.78(m，2H)，1.61(m，4H)，1.39(m，4H)，1.34(m，6H)，0.95(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ23.39。

实施例49

膦酸二异丙酯55：将4(3.00g，7.66mmol)和10％Pd/C(0.60g)在MeOH(30mL)中的混合物在室温下在1大气压H₂(气球)下搅拌过夜。该反应混合物通过硅藻土塞过滤，并在rotavap上除去常人剂。通过硅胶柱色谱法(5％MeOH/CHCl₃)纯化粗产物，得到膦酸二异丙酯(2.08g，76％)，为粘稠油状物，静置会固化：¹H NMR(CDCl₃)δ8.72(s，1H)，7.94(s，1H)，4.73(m，2H)，4.33(m，2H)，3.97(m，2H)，3.73(d，J＝8.1Hz，2H)，1.31(m，12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ18.47。

实施例50

膦酸56：将膦酸二异丙酯55(0.10g，0.28mmol)溶于CH₃CN(1.5mL)中，并冷却到0℃。加入溴三甲基硅烷(0.18mL，1.40mmol)。该反应混合物在0℃下搅拌2h，并升温到室温过夜。加入DMF(0.5mL)，以形成溶液，并搅拌2h。加入MeOH并搅拌2h。在减压下蒸发挥发物。将剩余的DMF溶液缓慢加入冰冷CH₃CN中，产物沉淀出来。收集固体并真空干燥，得到膦酸(74mg，95％)，为白色固体。

实施例51

双膦酸酰胺化物57：将膦酸56(23mg，0.08mmol)、L-丙氨酸正丁酯盐酸盐(91mg，0.50mmol)和三乙胺(0.14mL，0.96mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.11g，0.56mmol)和三苯基膦(0.12g，0.56mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO ₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(17mg，38％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ8.65(s，1H)，7.94(s，1H)，5.20(s，宽，2H)，4.35(m，2H)，4.20-3.92(m，6H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，1.61(m，4H)，1.32(m，8H)，0.96(m，6H)；³¹PNR(CDCl₃)δ20.70。

实施例52

单膦酸酰胺化物58：将膦酸56(20mg，0.07mmol)、L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(33mg，0.14mmol)、酚(33mg，0.35mmol)和三乙胺(0.12mL，0.84mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.11g，0.56mmol)和三苯基膦(0.12g，0.56mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(13mg，34％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ8.69(d，J＝15.0Hz，1H)，7.84(d，J＝4.2Hz，1H)，7.25-6.97(m，10H)，4.35(m，1H)，4.23(m，2H)，4.08(m，2H)，3.85(m，1H)，3.72(m，1H)，3.73-3.62(m，1H)，3.38(m，1H)，2.95-2.86(m，2H)，1.17(m，3H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.67，20.84。

实施例53

膦酸二异丙酯59：将化合物4(1.00g，2.56mmol)和烯丙基胺(3mL)在CH₃CN(3.0mL)中的混合物放入闪烁管中，并加热到65℃达5h。将反应混合物冷却到室温，并减压浓缩。产物分配在EtOAc和盐水中，用Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。产物溶于最少量CH ₃CN中，加入H₂O，并冻干，得到膦酸二异丙酯(1.00g，95％)。

实施例54

膦酸60：将膦酸二异丙酯59(1.00g，2.43mmol)溶于CH₃CN(1.5mL)中，并冷却到0℃。加入溴三甲基硅烷(0.31mL，12.15mmol)。该反应混合物在0℃下搅拌2h，并升温到室温过夜。加入DMF(0.5mL)以形成溶液，并搅拌2h。加入MeOH并搅拌2h。在减压下蒸发挥发物。将剩余的DMF溶液缓慢加入冰冷CH₃CN中，产物沉淀出来。收集固体并真空干燥，得到膦酸(0.48g，60％)，为白色固体。

实施例55

单膦酸酰胺化物61和双膦酸酰胺化物62：将二酸60(0.40g，1.20mmol)、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(0.49g，2.40mmol)、酚(0.68g，7.20mmol)和三乙胺(1.0mL，7.20mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(1.84g，8.40mmol)和三苯基膦(2.20g，8.40mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(5-10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物61(0.52g，37％，1∶1非对映异构体混合物)和双膦酸酰胺化物62(0.13g，20％)。

实施例56

双膦酸酰胺化物63：将膦酸60(0.33g，1.00mmol)、L-丙氨酸丁酯盐酸盐(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(10％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(0.32g，55％)，为浅黄色泡沫。

实施例57涉及流程17。

实施例57

6-烯丙基PMEDAP的BisPOC 64：将膦酸60(0.20g，0.61mmol)和三乙胺(0.42mL，3.01mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(2.0mL)中的混合物加热到60℃达30分钟。加入POCCl(0.45g，2.92mmol)。该反应混合物在60℃下搅拌3h，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO ₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到6-烯丙基PMEDAP的bisPOC 64(0.11g，32％，GS 192727)，为固体：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(s，1H)，6.00(m，1H)，5.66(m，4H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.92(m，2H)，4.80(s，2H)，4.22(m，4H)，3.95(m，4H)，1.35(m，12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.94。

实施例58到61涉及流程18。

实施例58

双膦酸酰胺化物65：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-丙氨酸乙酯盐酸盐(0.1g，0.65mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(23mg，41％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.70(s，1H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.30(m，4H)，4.20-4.00(m，6H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.42(m，1H)，3.22(m，1H)，1.45-1.25(m，12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.77。

实施例59

双膦酸酰胺化物66：将膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸环丁酯盐酸盐(0.33g，0.91mmol)和三乙胺(0.50mL，3.59mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(45mg，26％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(s，1H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，5.00(m，2H)，4.78(s，2H)，4.30(m，4H)，4.00(m，2H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.38(m，1H)，3.19(m，1H)，2.38(m，4H)，2.10(m，4H)，1.85-1.60(m，4H)，1.45(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.61。

实施例60

双膦酸酰胺化物67：将膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯盐酸盐(0.25g，1.21mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(80mg，41％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.65(s，1H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.80(s，2H)，4.25(m，4H)，4.20-4.00(m，6H)，3.85(m，2H)，3.72(m，2H)，3.42(m，1H)，3.20(m，1H)，1.70(m，4H)，1.32(m，18H)，0.96(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.61。

实施例61

双膦酸酰胺化物68：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯盐酸盐(0.13g，0.64mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(32mg，49％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.68(s，1H)，6.00(m，1H)，5.70(s，宽，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，4.80(s，2H)，4.25(m，4H)，4.20-4.05(m，6H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.35(m，1H)，3.15(m，1H)，1.86-1.60(m，8H)，1.40(m，4H)，0.96(m，12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.25。

实施例62到71涉及流程19。

实施例62

双膦酸酰胺化物69：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(0.15g，0.65mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入以反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl ₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(28mg，39％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.58(s，1H)，7.28-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.25-4.00(m，8H)，3.65(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.15-2.77(m，6H)，1.23(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.34。

实施例63

双膦酸酰胺化物70：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯盐酸盐(0.15g，0.58mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(49mg，63％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl ₃)δ7.58(s，1H)，7.28-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.70(s，宽，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(s，2H)，4.25-4.03(m，8H)，3.65(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.17-2.78(m，6H)，1.61(m，4H)，1.32(m，4H)，0.96(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.35。

实施例64

双膦酸酰胺化物71：将膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-苯丙氨酸异丁酯盐酸盐(0.31g，1.20mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.44g，2.00mmol)和三苯基膦(0.53g，2.00mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(94mg，42％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl ₃)δ7.55(s，1H)，7.27-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.70(s，宽，1H)，5.25(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(s，2H)，4.25-4.08(m，4H)，3.87(m，4H)，3.65(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.17-2.78(m，6H)，1.97(m，2H)，0.96(m，12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.31。

实施例65

单膦酸酰胺化物72：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-丙氨酸乙酯盐酸盐(32mg，0.20mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(12mg，22％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.62(d，1H)，7.30-7.04(m，5H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，4.30-4.05(m，7H)，3.90-3.80(m，4H)，1.23(m，6H)；³¹PNMR(CDCl₃)δ21.89，20.65。

实施例66

单膦酸酰胺化物73：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-丙氨酸正丁酯盐酸盐(39mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(16mg，28％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.61(d，1H)，7.32-7.06(m，5H)，6.00(m，1H)，5.80(s，宽，1H)，5.30(dd，1H)，5.20(dd，1H)，4.80(m，2H)，4.30-4.05(m，7H)，3.90-3.80(m，4H)，3.90-3.60(m，2H)，1.60(m，2H)，1.32(m，5H)，0.96(m，3H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.96，20.70。

实施例67

单膦酸酰胺化物74：将膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸环丁酯盐酸盐(0.11g，0.61mmol)、酚(0.13g，1.39mmol)和三乙胺(0.5mL，3.59mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(28mg，17％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，5H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，5.00(m，2H)，4.79(d，2H)，4.28-4.05(m，4H)，3.90(m，4H)，3.70(m，1H)，3.57(m，1H)，2.30(m，2H)，2.00-1.60(m，4H)，1.25(m，3H)；³¹P NMR (CDCl₃)δ21.91，20.64。

实施例68

单膦酸酰胺化物75：将膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯盐酸盐(0.13g，0.61mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)的混合物中加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间，用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(28mg，16％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，5H)，6.00(m，1H)，5.85(s，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.35-4.05(m，7H)，3.90(m，4H)，3.70(m，1H)，1.60(m，2H)，1.30(m，9H)，0.96(m，3H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.97，20.69。

实施例69到72涉及流程21。

实施例69

单膦酸酰胺化物76：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯盐酸盐(42mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(17mg，29％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，5H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.30-4.03(m，7H)，3.95-3.80(m，4H)，3.62(m，1H)，3.40(m，1H)，1.80-1.60(m，4H)，1.38(m，2H)，0.98-0.75(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ22.26，20.95。

实施例70

单膦酸酰胺化物77：将膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(48mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(14mg，23％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.80(m，2H)，4.40-4.08(m，7H)，3.85-3.65(m，4H)，3.38-3.25(m，2H)，2.95-2.86(m，2H)，1.20(m，3H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.86，21.06。

实施例71

单膦酸酰胺化物78：将膦酸60(35mg，0.1mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯盐酸盐(55mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(18mg，28％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，1H)，7.25-6.97(m，10H)，6.00(m，1H)，5.80(s，宽，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.40-4.03(m，7H)，3.85-3.65(m，4H)，3.45-3.25(m，2H)，2.95-2.86(m，2H)，1.57(m，2H)，1.30(m，2H)，0.96(m，3H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.89，21.09。

实施例72

单膦酸酰胺化物79：将膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-苯丙氨酸异丁酯盐酸盐(0.16g，0.61mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(19mg，10％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.45(m，1H)，4.35-4.18(m，4H)，3.95-3.60(m，5H)，3.35(m，1H)，3.00-2.83(m，2H)，1.85(m，1H)，0.96(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.90，21.07。

实施例73到76涉及流程22。

实施例73

单膦酸酰胺化物80：将单膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸环丁酯盐酸盐(0.11g，0.61mmol)、酚(0.13g，1.4mmol)和三乙胺(0.51mL，3.67mmol)在吡啶(2mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)，然后通过Gilson HPLC纯化法(CH₃CN/H₂O)纯化粗产物，得到单膦酸酰胺化物(33mg，20％，1∶1非对映异构体混合物)，为米色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(s，1H)，7.30-7.03(m，5H)，5.80(s，宽，1H)，5.00(m，1H)，4.80(d，2H)，4.28-4.05(m，3H)，3.90(m，4H)，3.03(s，宽，1H)，2.35(m，2H)，2.05(m，2H)，1.80(m，2H)，1.30(m，3H)，0.90(m，2H)，0.62(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ21.91，20.61。

实施例74

双膦酸酰胺化物81：将膦酸6(60mg，0.18mmol)、L-丙氨酸环丁酯盐酸盐(0.13g，0.72mmol)和三乙胺(0.31mL，2.16mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.28g，1.26mmol)和三苯基膦(0.34g，1.26mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶色谱法(5％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(30mg，28％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl ₃)δ7.60(s，1H)，5.70(s，1H)，5.00(m，2H)，4.90(s，2H)，4.25(m，2H)，4.00(m，2H)，3.90(m，2H)，3.78(m，2H)，3.40(m，1H)，3.21(m，1H)，3.03(s，宽，1H)，2.35(m，4H)，2.05(m，4H)，1.90-1.65(m，4H)，1.32(m，6H)，0.90(m，2H)，0.60(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.70。

实施例75

双膦酸酰胺化物82：将膦酸6(60mg，0.18mmol)、L-丙氨酸环戊酯盐酸盐(0.13g，0.72mmol)和三乙胺(0.31mL，2.16mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.28g，1.26mmol)和三苯基膦(0.34g，1.26mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na ₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶色谱法(5％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(30mg，27％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.62(s，1H)，5.72(s，1H)，5.20(m，2H)，4.80(s，2H)，4.25(m，2H)，4.04-3.88(m，4H)，3.74(m，2H)，3.40(m，1H)，3.23(m，1H)，3.03(s，宽，1H)，1.95-1.58(m，16H)，1.37(m，6H)，0.90(m，2H)，0.60(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.64。

实施例76

双膦酸酰胺化物83：将膦酸6(40mg，0.12mmol)、L-苯丙氨酸环丁酯盐酸盐(0.13g，0.48mmol)和三乙胺(0.20mL，1.44mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.19g，0.85mmol)和三苯基膦(0.22g，0.85mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过硅胶色谱法(5％MeOH/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(20mg，22％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.50(s，1H)，7.28-7.05(m，10H)，5.72(s，1H)，5.00(m，2H)，4.90(s，2H)，4.23-4.03(m，4H)，3.68(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.15-2.82(m，7H)，2.38(m，4H)，2.00(m，4H)，1.85-1.55(m，4H)，0.90(m，2H)，0.60(m，2H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.31。

实施例77和78涉及流程23。

实施例77

膦酸二异丙酯84：将4(5.0g，12.82mmol)和三氟乙基胺(6.35g，64.10mmol)在CH₃CN(40mL)中的混合物被放入反应高压容器中，并加热到80℃达4h。将反应混合物冷却到室温，并减压浓缩。产物分配在15％MeOH/CH₂Cl₂(3×)和盐水中，用Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)，然后通过Gilson HPLC纯化法(CH₃CN/H₂O)纯化粗产物，得到84(3.26g，56％)，为浅黄色泡沫。

实施例78

双膦酸酰胺化物85：将膦酸42(0.11g，0.29mmol)、L-丙氨酸环丁酯盐酸盐(0.31g，1.75mmol)和三乙胺(0.52mL，3.67mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加热到60℃达5分钟。将aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.12mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黄色溶液加入上述反应混合物中。该反应在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并浓缩。产物分配在EtOAc和饱和的NaHCO₃之间。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发。通过ISCO色谱法(2-丙醇/CH₂Cl₂)纯化粗产物，得到双膦酸酰胺化物(97mg，54％)，为浅黄色泡沫：¹H NMR(CDCl₃)δ7.65(s，1H)，5.90(s，宽，1H)，5.00(m，2H)，4.80(s，2H)，4.35-4.20(m，4H)，4.00(m，2H)，3.87(m，2H)，3.70(d，2H)，3.38(m，1H)，3.20(m，1H)，2.30(m，4H)，2.00(m，4H)，1.90-1.60(m，4H)，1.35(m，6H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ20.61。

实施例79

此实施例教导用于证明抗增殖活性的试验。

用于抗增殖试验的细胞类型

在抗增殖试验中使用的人类癌细胞系包括具有三类HPV(HPV-16、HPV-18、HPV-39)的六种宫颈癌细胞系、一种HPV阴性宫颈癌细胞系和两种来自舌的角质细胞癌。所测试的正常人类细胞包括皮肤角质细胞、宫颈角质细胞和肺成纤维细胞。皮肤角质细胞和宫颈角质细胞从Cambrex(East Rutherford，NJ)获得，所有其他细胞从American Type Culture Collection (Manas sas，VA)获得。表79-1概括了每种细胞类型的特性和培养条件。

抗增殖试验过程

1.细胞培养

用胰蛋白酶将细胞从培养烧瓶中分离，计数，并制板于96-孔培养板(250-1000个细胞/孔，取决于细胞类型)中。下一天(定义为第0天)，细胞依附于板底部后，一式两份加入5倍连续稀释的化合物。不加化合物和将10μM秋水仙碱(细胞分裂抑制剂)加入对照孔中，其分别代表100％增殖和0％增殖。

2.用磺酰罗丹明B使细胞着色

加入化合物后七天，在4℃用10％三氯乙酸处理培养板1小时，然后用水洗涤。该过程使得来自细胞的蛋白质结合到板的底表面。用在1％乙酸中的0.4％磺酰罗丹明B使蛋白质着色10分钟，然后用1％乙酸剧烈洗涤。结合到板底部的剩余染料溶于10mMTrizma碱中。这产生紫色，使用分光光度计，通过测量在510nm波长的吸光度进行量化。

3.数据分析

从实验数据，产生S形剂量响应曲线，并使用Windows用的GraphPad Prism4.01版(GraphPad Software，San Diego California USA)计算50％有效浓度(EC₅₀)。

表79-1.在抗增殖试验中使用的细胞类型

*培养基

在以下培养基中，在37℃和5％CO₂下，细胞供养在加湿的培养箱中。

A1：用于培养维持的培养基：Eagle MEM，含有Earle′s BSS(Cambrex，EastRutherford，NJ)，补加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

A2：用于抗增殖试验的培养基：Eagle MEM，含有Earle′s BSS，补加有5％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

B1：用于培养维持的培养基：角质细胞-SFM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，补加有0.01mg/mL牛垂体提取物，0.001μg/mL重组表皮生长因子，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

B2：用于抗增殖试验的培养基：B1和A2的4∶1混合物。

结果

1.与正常成纤维细胞相比，酰胺化物前药在HPV阳性SiHa细胞中的选择性抗增殖活性。

目标是发现能抑制HPV转化的损害生长而不影响表皮和真皮中正常细胞(例如角质细胞和成纤维细胞)的化合物。体外抗增殖试验使用SiHa细胞和HEL细胞建立，它们分别作为HPV-转化的损害和正常成纤维细胞的模型。SiHa细胞来自由HPV-16感染引起的宫颈中的鳞状细胞癌，HEL成纤维细胞来自正常人的胚胎肺(表79-1)。如表79-2所示，SiHa细胞中七种酰胺化物前药的50％有效浓度(EC₅₀)为0.13-3.2nM，而HEL细胞中的EC₅₀为12-727nM，表明这些化合物抑制SiHa细胞的增殖比抑制HEL细胞更有效。HEL/SiHa选择性指数(HEL EC₅₀除以SiHa EC₅₀)为72-559(表79-2)。

所有七种酰胺化物前药产生相同的代谢物，cprPMEDAP。cprPMEDAP进一步代谢为PMEG[Compton等人，1999；Haste等人，1999]。这些化合物在SiHa细胞中的抗增殖EC₅₀远高于前药中的那些值(表79-2)，这表明酰胺化物部分的连接提高了效价。而且，cprPMEDAP和PMEG的HEL/SiHa选择性指数分别为17和4.1(表79-2)，表明前药比cprPMEDAP具有更好的选择性，并且cprPMEDAP比PMEG具有更好的选择性。

已知PMEG被磷酸化为PMEGpp，其起到细胞DNA聚合酶的链终止抑制剂的作用[Compton等人，1999；Haste等人，1999]。在SiHa和HEL细胞中测试了四种已知的DNA聚合酶抑制剂(西多福韦、阿糖胞苷、去氧氟尿苷和阿非迪霉素)和具有不同的作用机理的其他抗癌药物，包括DNA拓扑异构酶抑制剂(达卡巴嗪、椭圆玫瑰树碱)、DNA烷化剂(阿霉素、米妥蒽醌、博莱霉素、氦芥)和微管蛋白抑制剂(长春新碱、长春碱、依托泊苷和Indanocine)(表79-2)。这些化合物在SiHa细胞中的抗增殖EC₅₀不同，一些与所述七种酰胺化物前药相当或者比之更有效。但是，与所述七种酰胺化物前药相比，所有这些都显示出差的HEL/SiHa选择性指数(0.01-3.98)。

总之，教导了独特的一组化合物，它们在HPV-16阳性SiHa癌细胞中表现出亚低(sub-low)nM的抗增殖EC₅₀，和当与HEL成纤维细胞相比时其表现出大于50倍的选择性。

2.与正常角质细胞相比，酰胺化物前药在HPV阳性SiHa细胞中的选择性抗增殖活性。

为了测试这些化合物在来自表皮的正常细胞中的作用，使用从皮肤(PHK)和宫颈(CK)分离的初级人类角质细胞进行抗增殖试验。用所述七种前药在PHK和CK中获得的抗增殖EC₅₀低于HEL中的EC₅₀，表明角质细胞比成纤维细胞更易受影响(表79-2和79-3)。但是，这些前药和cprPMEDAP的PHK/SiHa和CK/SiHa选择性指数仍好于对照化合物PMEG和DNA聚合酶抑制剂阿糖胞苷(表79-3)。因此，与来自皮肤和宫颈的正常角质细胞相比，所述前药优先抑制HPV-16阳性SiHa细胞的增殖。

3.在其他HPV阳性细胞中的抗增殖活性

然后在抗增殖试验中，在来自HPV诱导的宫颈癌的五种其他细胞系(列于表79-1中)中测试了这七种前药，数据与SiHa数据一起显示在表4中。在SiHa、C-4I和MS751细胞中，除了化合物C外的所有化合物都表现出亚低nM抗增殖EC₅₀。不过，在CaSki、HeLa和ME-180中，所有化合物的效价明显较差，EC₅₀为7.8-410nM。看起来，抗性和HPV类型(16、18或39)或者抗性和转移(来自转移部位的CaSki、MS751和ME180)之间没有相关性。对照化合物阿糖胞苷(DNA聚合酶抑制剂)均匀抑制所有细胞系，EC₅₀值为94-257nM。

4.HPV阴性癌细胞中的抗增殖活性

为了研究这些化合物对HPV阴性癌细胞系的作用，在抗增殖试验中测试了三种细胞系(HT-3、SCC4、SCC9，表79-1)。如表79-4所示，与对照化合物阿糖胞苷相比，所有七种前药是相当的或者比之更有效。

表79-2.与HEL成纤维细胞相比，HPV16+SiHa细胞的选择性抑制

表79-3.与初级角质细包相比，HPV16+SiHa细胞的选择性抑制

表79-4.在其他HPV阳性和阴性癌细胞中的抗增殖活性

实施例80

抗增殖试验

抗增殖试验测量化合物对所培养的细胞增殖的作用。抗增殖试验中的活性化合物可以是抑制细胞生长的(抑制细胞分裂)和/或杀细胞的(杀死细胞)。通过使用HPV阳性癌细胞和正常细胞进行抗增殖试验，我们鉴别了与来自正常人组织的细胞相比，选择性抑制HPV阳性癌细胞增殖的化合物。表80-1概括了每种细胞类型的特性，包括六种由HPV转化的宫颈癌细胞系、正常人皮肤角质细胞(PHK)和正常肺成纤维细胞(HEL)。皮肤角质细胞是从Cambrex(EastRutherford，NJ)获得的。所有其他细胞从American Type Culture Collection(Manassas，VA)获得。

用胰蛋白酶将细胞从培养烧瓶中分离，计数，并制板于96-孔培养板(250-100个细胞/孔，取决于细胞类型)。下一天(定义为第0天)，一式两份加入5倍连续稀释的化合物。加入化合物后七天，在4℃用10％三氯乙酸处理培养板1小时，并用水洗涤。该过程使得细胞的蛋白质结合到板的底表面。用在1％乙酸中的0.4％磺酰罗丹明B使蛋白质着色10分钟，然后用1％乙酸剧烈洗涤。结合到板底部的剩余染料溶于10mM Trizma碱中，产生紫色。色强度(与细胞数成比例)是通过使用分光光度计测量在510nm波长的吸光度而量化。用没有进行药物处理的细胞(＝100％增殖)和用10μM秋水仙碱(细胞分裂抑制剂)处理的细胞(＝0％增殖)作对照物，用于确定抑制％。将抑制％值相对于化合物浓度作图，拟合成S形剂量响应曲线，从该曲线确定减少细胞增殖率50％(＝EC₅₀)的化合物浓度。使用Windows用的GraphPad Prism 4.00版(GraphPad Software，San Diego California USA)用于曲线拟合和EC₅₀计算。

细胞凋亡试验(半胱天冬酶3诱导方法)

半胱天冬酶诱导是一种与细胞凋亡或程序性细胞死亡有关的早期事件。半胱天冬酶活性可以使用荧光底物定量检测。直接对细胞凋亡路径起作用的化合物可以在较短培养时间(＜24小时)内诱导半胱天冬酶。干扰其他细胞生理(其最终导致细胞凋亡)的化合物为了诱导半胱天冬酶可能需要更长的培养时间(＞48小时)。

将10000个细胞制板于96-孔培养板中，并用5倍连续稀释的化合物培养24、48和72小时。细胞发生细胞溶解，根据生产商的用法说明(半胱天冬酶试验试剂盒，Roche，Indianapolis，IN)，使用荧光底物来测量细胞溶解物中半胱天冬酶的活性。

细胞凋亡试验(膜联蛋白V着色方法)

磷脂酰丝氨酸从细胞膜内部向外部的易位是一种与细胞凋亡或者程序性细胞死亡有关的早期/中间事件。易位的磷脂酰丝氨酸可以通过用FITC-标记的膜联蛋白V(一种Ca++依赖性磷脂-结合蛋白)培养细胞来检测。当用膜联蛋白-FITC和碘化丙锭(其着色死亡的细胞)为细胞着色时，活细胞对两种染料都呈阴性，死亡的细胞对两者都呈阳性，而细胞凋亡的细胞只对膜联蛋白-FITC呈阳性。

用三种不同浓度的化合物培养HPV-16SiHa细胞3天或7天，同时用膜联蛋白-FITC和碘化丙锭进行着色。通过流式细胞仪检查每个单个细胞的着色。

结果

选择性抗增殖活性

该方法的目的是鉴别抑制HPV转化的损害生长而不影响表皮和真皮中正常细胞(例如角质细胞和成纤维细胞)的化合物。因此，在SiHa、PHK和HEL细胞中测试化合物，这些细胞分别作为HPV-转化的细胞、正常角质细胞和正常成纤维细胞的模型。

本发明的代表性化合物，例如在表80-2中所列举的那些，在SiHa细胞中表现出可检测水平的抗增殖活性，50％有效浓度(EC₅₀)小于25000nM。也在HEL细胞中测试了活性化合物。所有情况下，HEL细胞中的EC₅₀高于SiHa细胞中的EC₅₀，表明活性化合物抑制SiHa细胞增殖比抑制HEL细胞更有效。其他核苷酸/核苷类似物，例如PMEG(2-膦酰基甲氧基乙基鸟嘌呤)、Ara-C(阿糖胞苷，CAS#147-94-4)和吉西他滨(CAS#95058-81-4)没有表现出这样的选择性。普达非洛(CAS#518-28-5)，即抗-疣药物普达非洛乙醇溶液的活性成分，也没有表现出选择性。

本发明的代表性前药化合物，例如在表80-3中所列举的那些，表观出活性。多数情况下，这些前药比它们各自的母体化合物更有效，某些情况下更有选择性。大多数膦酸酰胺化物前药比普达非洛更有活性和选择性。

总之，鉴定出这些化合物在HPV-16阳性SiHa细胞中具有亚nM抗增殖EC₅₀，并且当与PHK角质细胞或者与HEL成纤维细胞相比时具有大于50倍的选择性。

在其他HPV+细胞系中的抗增殖活性

在五种来自HPV-诱导的宫颈癌的其他细胞系中也测试了所选择的化合物(参见实施例79和表80-4)。每种化合物在六种HPV+细胞系中表现出不同水平的活性，不管存在的HPV类型。通常，这些化合物在SiHa(HPV-16)、C-4I(HPV-18)和MS751(HPV-18)细胞中比在CaSki(HPV-16)、HeLa(HPV-18)和ME-180(HPV-39)细胞中更有效。

细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶3诱导方法)

测试了本发明代表性化合物对于SiHa细胞中细胞凋亡的诱导。当细胞被培养72小时(实心条)时，观察到明显的剂量响应性半胱天冬酶的诱导，表明该化合物诱导细胞凋亡(图80-1)。48小时培养(阴影条)的半胱天冬酶诱导不太明显，24小时培养(没有显示数据)则没有观察到。

细胞凋亡的诱导(膜联蛋白V着色方法)

使用膜联蛋白V-碘化丙锭双着色法，以三种不同浓度测试PMEG、N6-环丙基PMWDAP和本发明代表性化合物对SiHa细胞中细胞凋亡的诱导。对所有三种化合物，在第7天比在第3天观察到更大百分数的细胞凋亡的细胞。上述本发明代表性化合物在诱导细胞凋亡中最有效；在第7天，在用0.2μg/m该化合物处理的培养基中63.8％的细胞是细胞凋亡的。与之相比，用0.2μg/mL PMEG和0.5μg/mL N6-环丙基PMEDAP处理的培养基分别只有1.2％和15.9％细胞凋亡的细胞。

表80-1.在抗增殖试验中使用的细胞类型

*在细胞DNA中整合的HPV DNA亚型。

**培养基

B2：用于抗增殖试验的培养基：B1和A2的4∶1混合物。

表80-2.N6取代的PMEDAP在HPV16+SiHa细胞和HEL成纤维细胞中的抗增殖活性

表80-3.N6-取代的PMEDAP的膦酸酰胺化物前药在HPV16+SiHa细胞、PHK角质细胞和HEL成纤维细胞中的抗增殖活性

表80-4.N6-环脯氨酰PMEDAP及其膦酸酰胺化物前药在六种不同HPV阳性细胞中的抗增殖活性

实施例81

化合物A和B的兔皮肤刺激研究

进行研究以评价本发明的两种化合物当通过皮肤涂抹给予雄兔连续七天时产生刺激的可能性。共分配了六只雄兔进行研究，如下表所示。

在研究期间，媒介物、阳性对照物和测试物每天一次皮呋给药，共七天。测试物以浓度0.01、0.03和0.1％给药。阳性对照物以浓度0.1％(PMEG)或者1％给药。所有制剂的给药体积是固定体积100μL。

每个动物的测试位点在最初给药前被剃毛，并在研究期间根据需要进行剃毛。背左侧的两个位点被剪短，背右侧的三个位点被剪短。各给药处轮廓(各约1平方英寸)以不消去的墨水标记。各动物的总剪短区域含有不少于总体表的10％。媒介物和合适阳性对照物和测试物在约1平方英寸的给药位点范围内向各动物给药。媒介物在嘴左侧位点(给药位点1)给药，合适阳性对照物向尾左侧位点(给药位点2)给药。合适测试物如下述进行给药：0.01％给药于嘴右侧位点(给药位点3)，0.03％给药于中间右侧位点(给药位点4)，和0.1％给药于尾右侧位点(给药位点5)。给药后立即将颈放在动物上1到2小时。

在第1天给药前和以后每天给药前，各剂量之后约24小时和下次剂量之前，评价位点的红斑和水肿。给各位点赋予一个刺激分值，基于用来为皮肤刺激打分的Draize等级(Draize JH，Woodard G，Calvery HO，Methods for the studyof irritation and toxicity of substances applied topically to the skinand mucous membranes.J Pharmacol Exp Ther 1944；82：377-90)。

对所有动物每天两次观察死亡率、发病率以及对食物和水的利用率。在随机选择前、第1天给药前以及之后每天给药前进行详细临床检查。测量并记录到达那天、随机选择前和第1、3和7天给药前的体重。

通过过量用基于戊巴比要钠安乐死溶液静脉内麻醉和通过切断股血管放血实行安乐死。仔细检查动物的外部异常性，包括质量(masses)。从腹部中线切口反映皮肤，鉴别任何异常性，并与临死前发现相关联。检查腹腔、胸腔和颅腔的异常性，并取出该器官、检查、如果需要，放在中性缓冲的福尔马林中。收集并保存各动物的给药位点、肾和任何显著的损害部位。对于所有动物的各给药位点进行固定的苏木精和曙红-着色的石蜡切片微观检查。由兽医病理学者检查这些切片。为了在剂量组之间进行比较，利用四步分级系统来定义可分级的损害。

结论

在任何剂量浓度下，两种测试物都没有产生显著的临床发现、皮肤刺激、体重改变或者宏观和微观观察现象。一种阳性对照与临床发现有关，有轻微到中等的宏观和微观观察现象。

实施例82

化合物B和H的兔皮肤刺激研究

进行研究以评价本发明的两种化合物当通过皮肤涂抹给予雄性兔连续七天后产生刺激的可能性。共分配了24个雄兔进行研究。

在研究期间，测试物和对照物每天一次皮肤给药，连续七天。化合物B的剂量水平为0.03、0.1和0.3％。化合物H的剂量水平为0.03、0.1和0.3％。PMEG(阳性对照)的剂量水平为0.1％。cPrPMEDAP(阳性对照)的剂量水平为1.0％。媒介物对照的剂量水平为0.0％(其以凝胶和软膏制剂给药)。所有位点的给药体积恒定为100μL。第一次给药前不到24小时，从该动物的背部剪短毛发。该剪短区域含有不少于总体表面积的10％。小心避免擦伤皮肤。

测试物、阳性照物和媒介物对照物在约1”×1”的给药位点进行给药。两个给药位点沿着左侧背面排布。媒介物或阳性对照物在嘴位处给药，低剂量的测试物在尾位处给药。两个给药位点沿着右侧背面排布。中剂量的测试物在嘴位处给药，高剂量的测试物在尾位处给药。给药后立即将颈圈放在动物上约2小时。加轭持续时间记录在原始数据中。

对所有动物每天两次观察死亡率、发病率以及对食物和水的利用率。在第1次给药前和每次给药后约24小时(在下次预定的给药前)和在7天恢复期间每天都评价测试位点的红斑和水肿。在皮肤观察的同时，研究期间每天都观察临床体征。测量并记录收到后那天、随机化前、在第1天以及在第7和第14天测试物给药之前以及验尸时(第8和第15天)的体重。收到时和随机前测得的体重没有报导，但保留在研究文件中。从结束时的6个动物/组和恢复时的3个动物/组，从颈静脉或者其他合适的静脉收集血样(4-6mL)，用于评价临床病理学参数。

在第7天给药后约2小时，从所有动物，从颈静脉或者其他合适的适宜静脉取额外的血样(约1mL)，用于测定测试物的血浆浓度。将试样放于含有EDTA钾的管中，并存放在冰块上，直到进行离心。在取血前动物没有被禁食。试样存放在-70°，直到检查。

在兽医病理学者认可的程序下，对所有动物进行完全验尸检查。通过经耳静脉/动脉或者其他合适的静脉过量用基于戊巴比妥钠的安乐死溶液麻醉和通过切断股血管放血实行安乐死。仔细检查动物的外部异常性，包括质量。从腹部中线切口反映皮肤，鉴别任何异常性，并与临死前发现相关联。检查腹腔、胸腔和颅腔的异常性，并除去该器官、检查、如果需要，放在中性缓冲的福尔马林中。对来自给药位点(4个/动物)、肾和任何显著的损害的组织切片，微观检查固定的苏木精和曙红-着色的石蜡切片。

在验尸时，对于主要研究的动物在第8天，对于恢复动物在第15天，鉴别每个动物的四个给药位点。各给药位点的约一半被切离，然后按如上关于组织学处理所述收集并保存。而各给药位点的另外约一半仍未受损地在动物上，进行以下过程。用三块乙醇(95％)纱布擦给药位点，并使之完全干燥。胶带(包装带或等效物)用于各给药位点十次。一条干净的胶带用于区域外敷(reachapplication)。然后用剪刀剪掉给药位点的剩余部分。在各给药位点和动物之间，用丙酮或乙醇清洗剪刀。给药位点除去的次序为：媒介物或阳性对照位点、低剂量位点、中剂量位点和高剂量位点。从各给药位点切除1cm2组织。称重并记录组织试样。皮肤试样(punch)用干净剪刀剪碎在单个适当尺寸的闪烁管中。将冷磷酸盐缓冲的盐水(5mL)加入闪烁管中。然后用机械匀浆器以20秒脉冲使组织均化。在约-20℃使匀浆迅速冷冻。

结论

基于皮肤刺激分值和微观发现，一种测试物在媒介物凝胶中是非刺激的，但在媒介物软膏中是温和到中等刺激的。第二种测试物在媒介物凝胶中是非常轻微刺激的，当在媒介物软膏中配制时是温和刺激的。

实施例83

局部凝胶药物组合物的制备

该实施例说明含式I活性化合物的代表性局部凝胶组合物的制备。

制备具有以下组成的局部凝胶组合物：

组分	％w/w
组分	％w/w	活性化合物	X*
pH 4.5或7缓冲液	25	活性化合物	X*
pH 4.5或7缓冲液	25	丙二醇，USP	25
羟乙基纤维素，NF	1.25	丙二醇，USP	25
羟乙基纤维素，NF	1.25	对羟基苯甲酸丙酯，NF	0.01
对羟基苯甲酸甲酯，NF	0.09	对羟基苯甲酸丙酯，NF	0.01
对羟基苯甲酸甲酯，NF	0.09	依地酸二钠，USP	0.025
甘油，USP	10.00	依地酸二钠，USP	0.025
甘油，USP	10.00	柠檬酸，USP	0.50
无菌注射用水，USP	38.125	柠檬酸，USP	0.50

*X＝化合物范围为0.01％到1.0％

其他式I化合物，例如根据本说明书制备的那些，可以作为活性化合物用于制备该实施例的凝胶制剂。

在开发该制剂过程中也可以评价以下成分的适用性：

异丙基肉豆蔻酸酯(mysritate)(溶剂/助溶剂/渗透增强剂)，

聚乙二醇，三醋精(溶剂)，

鲸蜡醇和硬脂醇(硬化剂)，

卡波姆(粘度增强剂)，和

吐温，司盘(乳化剂)。

实施例84

局部软膏药物组合物的制备

该实施例说明含有式I活性化合物的代表性局部软膏组合物的制备。

制备具有以下组成的局部软膏组合物：

组分	％w/w
组分	％w/w	活性化合物	X*

组分	％w/w
组分	％w/w	凡士林，USP	94.0
脱水山梨糖醇倍半油酸酯，NF	0.5	凡士林，USP	94.0
脱水山梨糖醇倍半油酸酯，NF	0.5	丙二醇，USP	4.5

*X＝化合物范围为0.01％到1.0％

其他式I化合物，例如根据本说明书制备的那些，可以作为活性化合物用于制备该实施例的软膏制剂。

在开发该制剂过程中也可以评价以下成分的适用性：

异丙基肉豆蔻酸酯(溶剂/助溶剂/渗透增强剂)，

聚乙二醇，三醋精(溶剂)，

鲸蜡醇和硬脂醇(硬化剂)，

卡波姆(粘度增强剂)，和

吐温，司盘(乳化剂)。

Claims

1.式IA的化合物及其药学上可接受的盐，

其中：

Y^1A和Y^1B独立地为Y¹；

Y¹为-NH(R^X)；

R^X独立地为R²；

R²独立地为R⁴，其中每个R⁴独立地被0～3个R³基团所取代；

R³为R^3b、R^3c或R^3d；

R^3b为＝O；

R^3c为-R⁵W³；

R^3d为-C(R^3b)OR⁴；

R⁴为-H或1～18个碳原子的烷基、2～18个碳原子的烯基或2～18个碳原子的炔基；

R⁵为1～18个碳原子的亚烷基；

W³为W⁵；

W⁵为苯基。

2.权利要求1的化合物，其中R²为1～18个碳原子的烷基，其中所述烷基被0～3个R³基团所取代。

3.权利要求2的化合物，其中R²为甲基、乙基或丙基，其中所述基团被0～3个R³基团所取代。

4.权利要求1的化合物，其中R⁵为亚甲基。

5.权利要求1的化合物，其选自下组化合物：

6.权利要求1的化合物，其具有下式结构：

7.权利要求1的化合物，其具有下式结构：

8.药物组合物，其包含有效量的权利要求1至7任一项的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。

9.权利要求1-7中任一项的化合物在制备用于抑制细胞增殖的药物中的用途。