PL212403B1 - Pochodna fosfonianowa, kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ten zwiazek oraz jego zastosowanie w leczeniu guzów - Google Patents

Description

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy nowych pochodnych fosfonianowych. Związki te są użyteczne w leczeniu chorób wirusowych, w szczególności zaś zakażeń ludzkim papillomawirusem. Ponadto, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających związki według wynalazku, a także zastosowania tych związków do wytwarzania leku do leczenia guzów.

Stan techniki

Ludzki papillomawirus (HPV) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych na świecie wirusów przenoszonych drogą płciową. Istnieje ponad 100 różnych typów HPV, przy czym większość z nich jest nieszkodliwa. Jednakże, istnieje około 30 typów, które są przenoszone poprzez kontakty seksualne. Pewne typy HPV powodują tworzenie się kłykcin na genitaliach, przy czym kłykciny mają postać pojedynczych lub licznych guzów w okolicach genitalnych mężczyzn i kobiet, włącznie z pochwą, szyjką macicy, sromem (obszarem na zewnętrz pochwy), prąciem i odbytnicą. U wielu osób zakażonych wirusem HPV nie występują żadne objawy.

Podczas, gdy większość podtypów HPV powoduje występowanie łagodnych zmian chorobowych, pewne podtypy mogą prowadzić do pojawienia się poważniejszych zmian chorobowych. Zakażenia odbytowo-płciowe wirusami HPV-16 i HPV-18, choć mniej powszechne niż zakażenia wirusami HPV-6 i HPV-11, są najczęściej związane ze zmianami przedrakowymi w tkankach w okolicy szyjki macicy i odbytnicy, które to zmiany określa się jako dysplazje. Pacjenci z dysplazjami są na ogół pacjentami bezobjawowymi, a zmiany chorobowe u nich występujące mogą być wykryte jedynie w badaniu przesiewowym. Nieleczone zaawansowane dysplazje mogą przekształcać się w tkanki nowotworowe, dysplazje o niedużym stopniu zaawansowania mogą samorzutnie ustąpić, ale mogą również przekształcać się w dysplazje zaawansowane. HPV-16 i HPV-18 stanowią typy najczęściej związane z występowaniem dysplazji, jednak szereg innych przekształcających podtypów HPV jest również związanych z powstawaniem dysplazji. Ostatnie badania wskazują, że do 89% zakażonych wirusem HIV mężczyzn o orientacji homoseksualnej, może być również zakażona tymi podtypami HPV związanymi z dużym ryzykiem wystąpienia dysplazji. W przypadku pacjentów zakażonych wirusem HIV bardziej prawdopodobne jest również zakażenie wieloma podtypami HPV jednocześnie, co jest związane ze zwiększonym ryzykiem postępu dysplazji.

Kłykciny na genitaliach są najbardziej rozpowszechnioną na świecie chorobą przenoszoną drogą płciową, która najczęściej występuje u osób w wieku od 17 do 33 lat. HPV-6 i HPV-11 są odpowiedzialne za prawie 90% wszystkich przypadków występowania kłykcin na genitaliach, ale rzadko są związane z powstawaniem nowotworów. Według Amerykańskiego Towarzystwa Zdrowia Społecznego (American Social Health Association) co najmniej 20 milionów osób w USA jest obecnie zakażonych HPV, przy czym rocznie pojawia się 5,5 miliona nowych przypadków zakażeń HPV przenoszonych drogą płciową. Kłykciny na genitaliach zwykle powodują powstawanie bolesno-swędzących guzów na lub w okolicach genitaliów, przy czym nieleczone guzy mogą przekształcić się w twory o wyglądzie przypominającym kalafior. U około dwóch trzecich spośród osób, które miały kontakt seksualny z osobą zakażoną kłykcinami na genitaliach, kłykciny pojawiają się w przeciągu trzech miesięcy od kontaktu. Samorzutne ustąpienie kłykcin na genitaliach występuje w 10-20% przypadków kłykcin na genitaliach. Jednakże, nawet, jeśli zmiana chorobowa ustąpi, nawrót kłykcin na genitaliach jest następuje po jednym roku w około 50%. Ze względu na niezauważalne zmiany chorobowe leczenie kłykcin na genitaliach jest powszechne.

Dowody zebrane w ciągu dwóch ostatnich dekad doprowadziły do powszechnej akceptacji stwierdzenia, że zakażenie HPV jest konieczne, choć nie wystarczające, do wystąpienia raka szyjki macicy. Obecność HPV u pacjentek z rakiem macicy szacuje się na 99,7%. Uważa się, że rak odbytnicy wykazuje podobne powiązania pomiędzy zakażeniem HPV i rozwojem dysplazji analnej a rakiem odbytnicy, jak w przypadku raka szyjki macicy. W jednym badaniu nie zakażonych wirusem HIV pacjentów cierpiących na raka odbytnicy, zakażenie wirusem HPV stwierdzono w 88% przypadków. W USA w 2003 roku przewiduje się wystąpienie 12200 nowych przypadków raka szyjki macicy i 4100 przypadków śmierci w wyniku raka szyjki macicy oraz 4000 nowych przypadków raka odbytnicy i 500 przypadków śmierci w wyniku raka odbytnicy. Podczas, gdy liczba przypadków raka szyjki macicy uległa zmniejszeniu w ciągu ostatnich czterech dekad w wyniku rozpowszechnionych badań przesiewowych, liczba przypadków raka odbytnicy rośnie. Wzrost liczby przypadków raka odbytnicy można

PL 212 403 B1 przypisać po części zakażeniom wirusem HIV, ponieważ u pacjentów zakażonych wirusem HIV częstość występowania przypadków raka odbytnicy jest większa niż w całej populacji ogółem. Podczas, gdy częstość występowania raka odbytnicy wynosi 0,9 przypadku na 100000 w całej populacji ogółem, to w populacji mężczyzn o orientacji homoseksualnej częstość występowania raka odbytnicy wynosi 35 przypadków na 100000, zaś w populacji mężczyzn o orientacji homoseksualnej, zakażonych wirusem HIV częstość występowania raka odbytnicy wynosi 70-100 przypadków na 100000. W rzeczywistości, ze względu na dużą powszechność występowania dysplazji analnej u pacjentów zakażonych wirusem HIV oraz rosnącą liczbę przypadków raka odbytnicy opracowane przez USPHA/IDSA Wskazówki dla Leczenia Możliwych Zakażeń u Pacjentów Zakażonych HIV na 2003 rok będą obejmowały zalecenia dotyczące leczenia pacjentów ze zdiagnozowaną dysplazją analną.

Nieznany jest żaden lek na HPV. Istnieją sposoby leczenia kłykcin na genitaliach, chociaż kłykciny te znikają nawet bez leczenia. Sposób leczenia zależy od takich czynników, jak wielkość i położenie kłykcin na genitaliach. Wśród stosowanych sposobów leczenia znajdują się krem imikwimodowy, 20-procentowy antymiotyczny roztwór podofiliny, 0,5- procentowy roztwór podofiloxu, 5-procentowy krem 5-fluorouracylowy oraz kwas trichlorooctowy. Zastosowanie podofiliny lub podofiloxu nie jest zalecane dla kobiet w ciąży, ponieważ substancje te są wchłaniane przez skórę i mogą powodować występowanie braków wrodzonych u dzieci. Również zastosowanie kremu 5-fluorouracylowego nie jest zalecane dla kobiet w ciąży. Małe kłykciny na genitaliach mogą być usuwane fizycznie poprzez wymrażanie (kriochirurgicznie), wypalanie (elektrokauteryzację) lub działanie laserem. Duże kłykciny, na które nie podziałały inne sposoby leczenia trzeba usuwać chirurgicznie. Wiadomo było, że kłykciny na genitaliach pojawiają się ponownie po ich fizycznym usunięciu, więc w tych przypadkach stosowano α-interferon do wstrzykiwania bezpośrednio w te kłykciny. Jednakże, α-interferon jest kosztowny, a jego zastosowanie nie zmniejsza liczby przypadków ponownego pojawiania się kłykcin na genitaliach.

Istnieje niezaspokojone zapotrzebowanie na skuteczny sposób leczenia HPV. Obecnie nieoczekiwanie otrzymano związki, które odpowiadają na to zapotrzebowanie, jak również zapewniają inne korzyści. Odpowiednie dokumenty ze stanu techniki to: Snoeck i wsp., „Antimicrobial Agents and

Chemotherapy”, tom 46 (11), str. 3356-3361 (listopad 2002); Keith i wsp., „Antimicrobial Agents and Chemotherapy”, tom 47 (7), str. 2193-2198 (lipiec 2003); Christensen i wsp., „Antiviral Research”, tom 48, str. 131-142 (2000); publikacja patentowa US nr 2003/0072814 A1; patent US nr 5 798 340; oraz zgłoszenie PCT nr PCT/CZ96/00011.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne fosfonianowe o wzorze IA:

w którym:

Y^1A i Y^1b oznaczają -NH(R^X);

R^x oznacza R²;

R² oznacza:

(a) grupę etylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴, przy czym R⁴ oznacza grupę metylową, etylową, n-propylową, izopropylową, n-butylową, izobutylową, sec-butylową, tert-butylową, 1-pentylową,

PL 212 403 B1

2-pentylową, 3-pentylową, 2-metylo-2-butylową, 3-metylo-2-butylową, 3-metylo-1-butylową, 2-metyl-1-butylową, 1-heksylową, 2-heksylową, 3-heksylową, 2-metylo-2-pentylową, 3-metylo-2-pentylową, 4-metylo-2-pentylową, 3-metylo-3-pentylową, 2-metylo-3-pentylową, 2,3-dimetylo-2-butylową, 3,3-dimetylo-2-butylową, winylową, allilową, cyklopentenylową, 5-heksenylową, etynylową lub propargilową;

(b) grupę propylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴, przy czym R⁴ oznacza grupę alkilową zawierającą od 1 do 18 atomów węgla, grupę alkenylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla lub grupę alkinylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla; lub (c) grupę metylową podstawioną dwoma podstawnikami R³, przy czym jeden podstawnik R³ oznacza grupę -R⁵W³, zaś drugi podstawnik R³ oznacza grupę C(=O)OR⁴; R⁴ oznacza grupę alkilową zawierającą od 1 do 18 atomów węgla, grupę alkenylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla lub ₅ grupę alkinylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla; R⁵ oznacza grupę metylenową;

W³ oznacza grupę fenylową;

lub ich farmaceutycznie akceptowalne sole.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji wynalazku związki według wynalazku wybrane są spośród związków o wzorach:

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji związek według wynalazku jest określony wzorem:

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek czynny według wynalazku określony powyżej oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik. W szczególnie korzystnym przypadku kompozycja według wynalazku zawiera skuteczną ilość związku według wynalazku określonego powyżej lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli, skuteczną ilość co najmniej jednego innego środka przeciwwirusowego oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze IA:

w którym:

Y^1A i Y^1B oznaczają -NH(R^X); x2

R^x oznacza niezależnie R²;

₂

R² oznacza:

(a) grupę etylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴;

(b) grupę propylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴; lub (c) grupę metylową podstawioną dwoma podstawnikami R³, przy czym jeden podstawnik R³ oznacza grupę -R⁵W³, zaś drugi podstawnik R³ oznacza grupę C(=O)OR⁴;

R⁴ oznacza grupę alkilową zawierającą od 1 do 18 atomów węgla, grupę alkenylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla lub grupę alkinylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla;

₅

R⁵ oznacza grupę metylenową;

W³ oznacza grupę fenylową;

lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli H do wytwarzania leku do leczenia guzów.

PL 212 403 B1

W jednym z korzystnych wariantów zastosowania według wynalazku związek o wzorze IA jest wybrany spośród związków o wzorach:

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

W innym korzystnym wariancie zastosowania według wynalazku związek o wzorze IA jest związkiem określony wzorem:

PL 212 403 B1

W jeszcze innym korzystnym wariancie zastosowania według wynalazku związek o wzorze IA jest związkiem określony wzorem:

W kolejnym korzystnym wariancie zastosowania według wynalazku lek zawiera skuteczną ilość związku o wzorze IA lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli, skuteczną ilość co najmniej jednego innego środka przeciwwirusowego oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

W następnym korzystnym wariancie zastosowania według wynalazku lek ma postać kompozycji żelowej lub maści. Przedmiotem wynalazku jest również związek określony powyżej do zastosowania w leczeniu guzów.

Definicje

Określenie „PMEG” odnosi się do 9-(2-fosfonylometoksyetylo)guaniny:

Określenie „PMEDAP” odnosi się do 9-(2-fosfonylometoksyetylo)-2,6-diaminopuryny:

Określenie „cprPMEDAP” odnosi się do 9-(2-fosfonylometoksyetylo)-2-amino-6-(cyklopropylo)puryny:

PL 212 403 B1 „Biodostępność” oznacza stopień, w jakim środek farmaceutycznie czynny jest dostarczony do tkanek docelowych po wprowadzeniu go do organizmu. Zwiększenie biodostępności środka farmaceutycznie czynnego może zapewnić pacjentom wydajniejsze i skuteczniejsze leczenie, ponieważ przy danej dawce większa ilość środka farmaceutycznie czynnego jest dostępna w miejscach tkanek docelowych.

Określenia „fosfonian” i „grupa fosfonianowa” obejmują grupy funkcyjne lub reszty w obrębie cząsteczki, która zawiera atom fosforu, który:

1) jest przyłączony pojedynczym wiązaniem do atomu węgla,

2) jest przyłączony wiązaniem podwójnym do heteroatomu,

3) jest przyłączony wiązaniem pojedynczym do heteroatomu oraz

4) jest przyłączony pojedynczym wiązaniem do innego heteroatomu, przy czym heteroatomy mogą być takie same lub różne.

Określenia „fosfonian” i „grupa fosfonianowa” obejmują również grupy funkcyjne lub reszty, które zawierają atom fosforu na tym samym stopniu utlenienia co atom fosforu opisany powyżej, a także grupy funkcyjne lub reszty, które zawierają resztę prolekową, która może oddzielić się od związku tak, że związek zachowa atom fosforu o charakterystyce opisanej powyżej. Przykładowo, określenia „fosfonian” i „grupa fosfonianowa” obejmują kwas fosfonowy, monoester kwasu fosfonowego, diester kwasu fosfonowego, amidofosfonianowe oraz tiofosfonianowe grupy funkcyjne.

W jednym szczególnym wariancie realizacji wynalazku określenia „fosfonian” i „grupa fosfonianowa” obejmują grupy funkcyjne lub reszty w obrębie cząsteczki, która zawiera atom fosforu, który jest:

1) przyłączony pojedynczym wiązaniem do atomu węgla,

2) przyłączony podwójnym wiązaniem do atomu tlenu,

3) przyłączony pojednyczym wiązaniem do atomu tlenu oraz

4) przyłączony pojedynczym wiązaniem do innego atomu tlenu, jak również grupy funkcyjne lub reszty, które zawierają resztę prolekową, która może oddzielić się od związku tak, że związek zachowa atom fosforu o takiej charakterystyce.

W innym szczególnym wariancie realizacji wynalazku określenia „fosfonian” i „grupa fosfonianowa” obejmują grupy funkcyjne lub reszty w obrębie cząsteczki, która zawiera atom fosforu, który jest:

1) przyłączony pojedynczym wiązaniem do atomu węgla,

2) przyłączony podwójnym wiązaniem do atomu tlenu,

3) przyłączony pojednyczym wiązaniem do atomu tlenu lub azotu oraz

4) przyłączony pojedynczym wiązaniem do innego atomu tlenu lub azotu, jak również grupy funkcyjne lub reszty, które zawierają resztę prolekową, która może oddzielić się od związku tak, że związek zachowa atom fosforu o takiej charakterystyce.

Przepisy i metody wyznaczania trwałości związków w środkach zastępujących wydzieliny przewodu pokarmowego są znane. Związki określono tutaj jako trwałe w przewodzie pokarmowym, jeśli mniej niż około 50 procent grup zabezpieczonych zostaje odbezpieczonych w środku zastępującym sok jelitowy lub żołądkowy po inkubacji przez 1 godzinę w 37°C. Takie związki są odpowiednie do zastosowania w tym wariancie realizacji wynalazku. Należy zauważyć, że stwierdzenie, iż związki są trwałe w przewodzie pokarmowym nie oznacza, ze nie mogą one ulegać hydrolizie in vivo. Proleki typowo są trwałe w układzie trawiennym, ale w zasadniczej części ulegają hydrolizie do leku głównego w świetle jelita, wątrobie lub innym narządzie, w którym zachodzą procesy metaboliczne, lub ogólnie w komórkach.

Związki według wynalazku mogą również występować w pewnych przypadkach jako odmiany tautormeryczne. Przykładowo tautomery enaminowe mogą występować dla układów imidazolowych, guanidynowych, amidynowych i tetrazolowych, przy czym ich wszystkie możliwe odmiany tautomeryczne mieszczą się w zakresie przedmiotowego wynalazku.

Stosowane tutaj określenie „prolek” odnosi się do dowolnego związku, który przy podawaniu do układu biologicznego wytwarza substancję stanowiącą lek, tj. składnik czynny, w wyniku samorzutnej/ych reakcji chemicznej, reakcji chemicznej/ych katalizowanej/ych enzymatycznie, fotolizy i/lub metabolicznej/ych reakcji chemicznej/ych. Prolek jest zatem kowalencyjnie zmodyfikowanym analogiem lub formą utajoną związku wykazującego działanie lecznicze.

„Reszta prolekowa” odnosi się do labilnej grupy funkcyjnej, która oddziela się od związku czynnego (inhibitora) podczas procesów metabolicznych, ogólnoustrojowo, we wnętrzu komórki, na drodze hydrolizy, rozszczepienia enzymatycznego lub w innych procesach (Bundgaard, Hans, „Design and Application of Prodrugs” w „A Textbook of Drug Design and Development” (1991), P. KrogsgaardPL 212 403 B1

-Larsen i H. Bundgaard, Eds. Harwood Academic Publishers, str. 113-191). Enzymy zdolne do wzięcia udziału w mechanizmie enzymatycznej aktywacji fosfonianowych proleków związków według wynalazku, obejmują, nie będąc ograniczone jedynie do nich, amidazy, esterazy, enzymy bakteryjne, fosfolipazy, cholinoesterazy i fosfazy. Reszty prolekowe mogą służyć do zwiększania rozpuszczalności, absorpcji i lipofilowości w celu optymalizacji dostarczania leku, biodostępności i skuteczności. Reszta prolekową może zawierać aktywny metabolit lub sam lek.

Przykładowe reszty prolekowe obejmują wrażliwe na hydrolizę lub labilne estry acyloksymetylowe -CH2OC(=O)R oraz węglany acyloksymetylowe -CH2OC(=O)R, gdzie R oznacza grupę alkilową C1-C6, podstawioną grupę alkilową C1-C6, grupę arylową C6-C20 lub podstawioną grupę arylową C6-C20. Ester acyloksyalkilowy został po raz pierwszy użyty jako prolek w strategii opracowanej dla kwasów karboksylowych a następnie zastosowany został do fosforanów (V) i fosfonianów przez Farquhar i wsp. (1983) J. Pharm. Sci. 72: 324; por. także patenty USA o numerach 4 816 570, 4 968 788, 5 663 159 i 5 792 756. Następnie, ester acyloksyalkilowy zastosowano do dostarczania kwasów fosfonowych przez błony komórkowe oraz do zwiększania biodostępności w ustach. Zbliżony wariant estru acyloksyalkilowego, ester alkoksykarbonyloksyalkilowy (węglan) również może zwiększać biodostępność w ustach jako reszta prolekową w związkach według wynalazku.

Przykładowym estrem acyloksymetylowym jest ester izopropylokarbonyloksymetoksylowy, -OCH2OC(=O)C(CH3)2. Przykładową resztą prolekową, będącą węglanem acyloksymetylowym jest węglan izopropylokarbonyloksymetylowy, HOC(=O)-OCH2OC(=O)C(CH3)2.

Grupa fosfonianowa może stanowić fosfonianową resztę prolekową. Reszta prolekową może być wrażliwa na hydrolizę, tak jak, ale nie ograniczając się jedynie do niej, grupa izopropylokarbonyloksymetoksylowa lub izopropylokarbonyloksymetylowęglanowa. Alternatywnie, reszta prolekowa może być wrażliwa na rozszczepienie wywoływane enzymatycznie, tak jak mleczanowa grupa estrowa lub amidofosfonianowa grupa estrowa.

Stwierdzono, że estry arylowe grup fosforowych, w szczególności estry fenylowe zwiększają biodostępność w ustach (De Lombaert i wsp.; (1994) J. Med. Chem. 37: 498). Opisano również estry fenylowe zawierające grupę karboksylową ugrupowania estrowego w położeniu orto względem grupy fosforanowej (Khamnei and Torrence, (1996) J. Med. Chem. 39: 4109-4115). Stwierdzono, że estry benzylowe uwalniają pierwotny kwas fosfonowy. W pewnych przypadkach podstawniki w położeniu orto lub para mogą powodować przyspieszenie hydrolizy. Analogi benzylowe z acylowanym fenolem lub alkilowanym fenolem mogą tworzyć związek fenolowy wskutek działania enzymów, np. esteraz, oksydaz, itp., który to związek z kolei podlega rozszczepieniu wiązania benzylowego C-O z utworzeniem kwasu fosforowego (V) i produkt pośredni w postaci metydu chinonowego. Przykłady proleków tej klasy opisane zostały przez Mitchell i wsp. (1992) J. Chem. Soc. Perkin Trans. II 2345; Glazier WO 91/19721. Opisano także inne proleki benzylowe, zawierające grupę obejmującą ester karboksylowy, przyłączoną do grupy benzylometylenowej (Glazier WO 91/19721). Stwierdzono, że proleki zawierające grupę tio (-S-) są użyteczne w dostarczaniu leków fosfonianowych do wnętrza komórek. Te proestry zawierają grupę etylotio, w której grupa tiolowa bądź jest zestryfikowana grupą acylową, bądź połączona z inną grupą tiolową z utworzeniem dwusiarczku. Rozerwanie wiązania estrowego lub redukcja dwusiarczku prowadzi do utworzenia produktu pośredniego zawierającego wolną grupę tio (-S-), który następnie rozpada się na kwas fosforowy (V) i episiarczek (Puech i wsp. (1993) Antiviral Res., 22: 155-174; Benzaria i wsp. (1996) J. Med. Chem. 39: 4958). Również pierścieniowe estry fosfonianowe opisano jako proleki związków zawierających fosfor (Erion i wsp., patent US nr 6 312 662).

Określenie „grupa zabezpieczająca” odnosi się do reszty związku, która ukrywa lub zmienia właściwości grupy funkcyjnej lub właściwości związku jako całości.

Chemiczne grupy zabezpieczające oraz strategie zabezpieczania/odbezpieczania są dobrze znane w dziedzinie wynalazku, patrz np. „Protective Groups in Organic Chemistry” Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork, 1991. Grupy zabezpieczające są często wykorzystywane do ukrywania reaktywności pewnych grup funkcyjnych w celu zwiększenia wydajności pożądanych reakcji chemicznych, np. tworzenia i rozrywania wiązań chemicznych w sposób założony i zaplanowany. Poza reaktywnością zabezpieczonej grupy funkcyjnej zabezpieczenie grup funkcyjnych związku zmienia inne jego właściwości fizyczne takie, jak polarność, lipofilowość (hydrofobowość) oraz inne własności, które można zmierzyć za pomocą typowych urządzeń analitycznych. Zabezpieczone chemicznie produkty pośrednie same mogą być biologicznie czynne lub nieaktywne.

Związki zabezpieczone mogą również wykazywać zmienione, a w niektórych przypadkach - zoptymalizowane właściwości in vitro i in vivo, takie jak przechodzenie przez błony komórkowe i odporność

PL 212 403 B1 na rozkład enzymatyczny lub sekwestrację. Występujące w tej roli związki zabezpieczone, wykazujące zamierzone efekty lecznicze mogą być określane jako proleki.

Inną funkcją grupy zabezpieczającej jest przekształcanie leku głównego w prolek, przy czym lek główny jest uwalniany po konwersji z proleku in vivo. Ponieważ czynne proleki mogą ulegać absorpcji skuteczniej niż lek główny, mogą one wykazywać in vivo silniejsze działanie od leku głównego. Grupy zabezpieczające są usuwane bądź in vitro, w przypadku chemicznych produktów pośrednich lub in vivo, w przypadku proleków. W przypadku chemicznych produktów pośrednich nie jest szczególnie istotne, aby produkty uzyskane po odbezpieczeniu, np. alkohole, były fizjologicznie akceptowalne, choć generalnie bardziej pożądane jest, jeśli produkty te są farmakologicznie nieszkodliwe.

Dowolne odniesienie do któregokolwiek związku według przedmiotowego wynalazku obejmuje również odniesienie do jego fizjologicznie akceptowalnej soli. Przykłady fizjologicznie akceptowalnych soli związków według wynalazku obejmują sole pochodzące od odpowiedniej zasady, takiej jak metal alkaliczny (na przykład sód), metal ziem alkalicznych (na przykład magnez), amoniak i NX4⁺ (gdzie X oznacza grupę alkilową C1-C4).

Fizjologicznie akceptowalne sole atomu wodoru lub grupy aminowej obejmują sole organicznych kwasów karboksylowych takich, jak kwas octowy, kwas benzoesowy, kwas mlekowy, kwas fumarowy, kwas winowy, kwas maleinowy, kwas malonowy, kwas jabłkowy, kwas 2-hydroksyetanosulfonowy, kwas laktobionowy i kwas bursztynowy; organicznych kwasów sulfonowych, takich jak kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas benzenosulfonowy i kwas p-toluenosulfonowy; oraz kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny, kwas siarkowy (VI), kwas fosoforowy (V) i kwas amidosulfonowy.

Fizjologicznie akceptowalne sole związku zawierającego grupę hydroksylową obejmują anion tego związku w połączeniu z odpowiednim kationem takim, jak Na⁺ i NX4⁺ (przy czym X jest niezależnie wybrany spośród H lub grupy C1-C4-alkilowej).

Stosowane tutaj określenie „żel” odnosi się do układów półstałych, składających się bądź z zawiesin małych cząstek nieorganicznych, bądź z dużych cząsteczek organicznych zamykających ciecz w swoim wnętrzu i przenikanych przez nią. Gdy masa żelu składa się z kłaczków złożonych z małych cząstek, żel klasyfikuje się jako układ dwufazowy i niekiedy określa się go jako magmę. Przykładami układów dwufazowych są żel wodorotlenku glinu i magma bentonitowa. Żele jednofazowe składają się z organicznych makrocząsteczek jednorodnie rozproszonych w cieczy w taki sposób, że nie istnieją żadne widoczne granice pomiędzy rozproszonymi makrocząsteczkami i cieczą. Przykładami takich żelów są sól sodowa karboksymetylocelulozy i tragakant. Chociaż żele są na ogół wodne, jako faza ciągła mogą być również stosowane alkohole i oleje.

Stosowane tutaj określenie „maść” odnosi się do półstałego preparatu do stosowania zewnętrznego o takiej konsystencji, że może być od razu nakładany na skórę przez wcieranie. Preparaty takie powinny mieć taki skład, aby ulegały zmiękczeniu, ale niekoniecznie stopieniu po nałożeniu na skórę. Powinny służyć jako nośniki przy miejscowym podawaniu substancji leczniczych, a także działać jako środki chroniące i zmiękczające skórę.

Do zastosowań leczniczych jako sole składników czynnych związków według wynalazku stosuje się sole fizjologicznie akceptowalne, tj. sole uzyskane z fizjologicznie akceptowalnych kwasów lub zasad. Jednakże, sole kwasów lub zasad, które nie są fizjologicznie akceptowalne, również mogą znaleźć zastosowanie, na przykład przy otrzymywaniu lub oczyszczaniu związku akceptowalnego fizjologicznie. W zakresie przedmiotowego wynalazku mieszczą się wszystkie sole, zarówno te pochodzące od fizjologicznie akceptowalnych kwasów lub zasad, jak i te pochodzące od innych kwasów lub zasad.

Określenie „grupa alkilowa” oznacza węglowodór zawierający od 1 do 18 pierwszorzędowych, drugorzędowych, trzeciorzędowych lub pierścieniowych atomów węgla. Przykładami są: grupa metylowa (Me, -CH3), etylowa (Et, -CH2CH3), 1-propylowa (n- Pr, n-propylowa, -CH2CH2CH3), 2-propylowa (i-Pr, izopropylowa, -CH2CH3)2), 1-butylowa (n-Bu, n-butylowa, -CH2CH2CH2CH3), 2-metylo-1-propylowa (i-Bu, izobutylowa, CH2CH(CH3)2), 2-butylowa (s-Bu, sec-butylowa, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metylo-2-propylowa (t-Bu, tert-butylowa, -C(CH3)3), 1-pentylowa (n-pentylowa, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentylowa (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentylowa (-CH(CH2CH3)2), 2-metylo-2-butylowa (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metylo-2-butylowa (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metylo-1-butylowa (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metylo-1-butylowa (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-heksylowa (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-heksylowa (-CH(CH3)CH2-CH2CH2CH3), 3-heksylowa (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metylo-2-pentylowa (-C(CH3)2CH2CH2-CH3), 3-metylo-2-pentylowa (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metylo-2-pentylowa (-CH(CH3)CH2CHPL 212 403 B1

-(CH3)2), 3-metylo-3-pentylowa (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metylo-3-pentylowa (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetylo-2-butylowa (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetylo-2-butylowa (-CH(CH3)C(CH3)3.

Określenie „grupa alkenylowa” oznacza węglowodór zawierający od 2 do 18 pierwszorzędowych, drugorzędowych, trzeciorzędowych lub pierścieniowych atomów węgla, z co najmniej jednym ₂ miejscem nienasyconym, tj. wiązaniem podwójnym sp² węgiel-węgiel. Przykłady obejmują, ale nie są ograniczone jedynie do nich: grupę etylenową lub winylową (-CH=CH2), allilową (-CH2CH=CH2), cyklopentenylową (-C5H7) oraz 5-heksenylową (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2).

Określenie „grupa alkinylowa” oznacza węglowodór zawierający od 2 do 18 pierwszorzędowych, drugorzędowych, trzeciorzędowych lub pierścieniowych atomów węgla, z co najmniej jednym miejscem nienasyconym, tj. wiązaniem potrójnym sp węgiel- węgiel. Przykłady obejmują, ale nie są ograniczone jedynie do nich: grupę acetylenową (-Cech) oraz propargilową (-CH₂CecH).

Określenie „grupa alkilenowa” odnosi się do nasyconego, rozgałęzionego lub prostołańcuchowego lub pierścieniowego rodnika węglowodorowego złożonego z 1 do 18 atomów węgla i posiadającego dwa jednowartościowe centra rodnikowe powstałe przez usunięcie dwóch atomów wodoru z bezpośredniego otoczenia tego samego lub dwóch różnych atomów węgla macierzystego alkanu. Typowe rodniki alkilenowe obejmują, ale nie są ograniczone jedynie do nich: grupę metylenową (-CH2-), 1,2-etylową (-CH2CH2-), 1,3-propylową (-CH2CH2CH2-), 1,4-butylową (-CH2CH2CH2CH2-) i tym podobne.

Określenie „grupa alkenylenowa” odnosi się do nienasyconego, rozgałęzionego lub prostołańcuchowego lub pierścieniowego rodnika węglowodorowego złożonego z 2 do 18 atomów węgla i posiadającego dwa jednowartościowe centra rodnikowe powstałe przez usunięcie dwóch atomów wodoru z bezpośredniego otoczenia tego samego lub dwóch różnych atomów węgla macierzystego alkenu. Typowe rodniki alkenylenowe obejmują, ale nie są ograniczone jedynie do niej: grupę 1,2-etylenową (-CH=CH-).

Określenie „grupa alkinylowa” odnosi się do nienasyconego, rozgałęzionego lub prostołańcuchowego lub pierścieniowego rodnika węglowodorowego złożonego z 2 do 18 atomów węgla i posiadającego dwa jednowartościowe centra rodnikowe powstałe przez usunięcie dwóch atomów wodoru z bezpośredniego otoczenia tego samego lub dwóch różnych atomów węgla macierzystego alkinu. Typowe rodniki alkinylenowe obejmują, ale nie są ograniczone jedynie do nich: grupę acetylenową (-CeC-), propargilową (-CH2CeC-) oraz 4-pentynylową (-CH2CH2CH2CeCH-).

Określenie „łącznik” lub „grupa łącząca” odnosi się do reszty chemicznej, obejmującej wiązanie kowalencyjne lub łańcuch lub grupę atomów, które kowalencyjnie łączą grupę fosfonianową z cząsteczką leku. Łączniki obejmują takie reszty, jak: powtarzające się jednostki alkoksylowe (np. poli(etylenooksy), PEG, poli(metylenooksy)) i alkiloaminowe (np. poli(etylenoamino), Jeffamine™); oraz dwuwodorotlenowe estry i amidy, włącznie z bursztynianem, sukcynoamidem, diglikolanem, malonianem i amidem kwasu kapronowego.

Stosowane tutaj określenie „Aba” odnosi się do dwuwartościowej reszty kwasu 2- aminobutanowego:

przy czym punkty przyłączenia oznaczono znakiem „*”

Stosowane tutaj określenie „Ala” odnosi się do dwuwartościowej reszty alaniny:

O przy czym punkty przyłączenia oznaczono znakiem „*”.

PL 212 403 B1

Stosowane tutaj określenie „Phe” odnosi się do dwuwartościowej reszty fenyloalaniny:

przy czym punkty przyłączenia oznaczono znakiem „*”.

Stosowane tutaj określenie „POC” odnosi się do dwuwartościowej reszty węglanu hydoroksymetylo-izopropylowego:

ο

przy czym punkt przyłączenia oznaczono znakiem „*”.

Podstawniki Y^1A i Y^1B mogą być opisane z zastosowaniem nomenklatury, która włącza wspomniane powyżej dwuwartościowe reszty aminokwasowe i reszty alkilowe, tak jak w tabeli 80-3. Przykładowo, związek o wzorze:

1A może być opisany przy zastosowaniu nomenklatury wzoru I, w którym Y^1A i Y1B oznaczają

-N(R^X), gdzie R^x oznacza R², gdzie R² oznacza R⁴ podstawiony przez R^3d, gdzie R⁴ oznacza grupę etylową podstawioną przez R^3d, a gdzie dalej R^3d oznacza -C(R^3b)OW³, gdzie R^3b oznacza =O, gdzie W³ oznacza W⁵, gdzie W⁵ oznacza grupę karbocykliczną, gdzie R⁴ oznacza grupę propylową podstawioną przez R^3d, gdzie R^3d oznacza -C(R^3c)OR⁴, gdzie R^3b oznacza =O, zaś R⁴ oznacza grupę etylową. Alternatywnie, wspomniany związek może być opisany tak, jak w tabeli 80-3, jako związek o wzorze I, 1A 1B w którym Y^1A i Y^1B oznaczają „Aba-Et”, co opisuje resztę (gdzie znak „*” wskazuje punkt przyłączenia):

przy czym „Aba” jest przyłączony do „Et” (grupa etylowa).

PL 212 403 B1

1A 1B x może być opisany przy zastosowaniu nomenklatury wzoru I, w którym Y^1A i Y^1B oznaczają -N(R^x), gdzie R^x oznacza R², gdzie R² oznacza R⁴ podstawiony przez R^3d, gdzie R⁴ oznacza grupę etylową podstawioną przez R^3c, gdzie R^3c oznacza -C(R^3b)OR⁴, gdzie R^3b oznacza =O oraz gdzie R⁴ oznacza grupę n-propylową. Alternatywnie, wspomniany związek może być opisany tak, jak w tabeli 80-3, jako 1A 1B związek o wzorze I, w którym Y^1A i Y^1B oznaczają „Ala-nPr”, co opisuje resztę (gdzie znak „*” wskazuje punkt przyłączenia):

Η

Ο przy czym „Ala” jest przyłączony do „nPr” (grupa n-propylowa).

Określenie „chiralna” odnosi się do cząsteczek, które mają właściwość polegającą na nienakładalności względem odpowiednich cząsteczek stanowiących ich odbicia lustrzane, podczas, gdy określenie „achiralna” odnosi się do cząsteczek, które są nakładalne na cząsteczki stanowiące ich odbicia lustrzane.

Określenie „stereoizomery” odnosi się do związków, które mają identyczną budowę chemiczną, ale różnią się w zakresie rozmieszczenia atomów lub grup atomów w przestrzeni.

Określenie „diastereoizomer” odnosi się do stereoizomeru z dwoma lub większą liczbą centrów chiralności, którego cząsteczki nie stanowią dla siebie wzajemnie odbić lustrzanych. Diastereoizomery mają różne właściwości fizyczne, np. temperaturę topnienia, temperaturę wrzenia, własności spektralne i reaktywność. Mieszaniny diastereoizomerów można rozdzielać przy wykorzystaniu technik analitycznych o wysokiej rozdzielczości, takich, jak elektroforeza i chromatografia.

Określenie „enancjomery” odnosi się do dwóch stereoizomerów związku, które dla siebie nawzajem stanowią nienakładalne odbicia lustrzane.

Określenie „leczenie” w zakresie, w jakim odnosi się do choroby lub stanu chorobowego, obejmuje zapobiegania wystąpieniu choroby lub stanu chorobowego, hamowanie rozwoju choroby lub stanu chorobowego, wyeliminowanie choroby lub stanu chorobowego i/lub łagodzenie jednego lub większej liczby objawów choroby lub stanu chorobowego.

Określenie „antyproliferacyjne” odnosi się do działania zmierzającego do lub sprzyjającego hamowaniu wzrostu komórek, takiego jak działanie antyproliferacyjne wywierane na komórki nowotworowe lub działanie antyproliferacyjne wywierane na komórki zakażone wirusem.

PL 212 403 B1

Określenie „apoptoza” odnosi się do jednego z głównych typów zaprogramowanej śmierci komórki. Jako taka, stanowi ona proces zamierzonego samobójstwa niechcianej komórki w organizmie wielokomórkowym. W przeciwieństwie do martwicy, która stanowi formę śmierci komórki, która jest skutkiem poważnego uszkodzenia tkanki, apoptoza zachodzi w zamierzonym procesie, który generalnie uznaje się za korzystny podczas cyklu życia organizmu. Apoptoza jest typem śmierci komórki, w którym komórka wykorzystuje wyspecjalizowany mechanizm komórkowy do uśmiercenia samej siebie; mechanizm samobójstwa komórki, który umożliwia organizmom wielokomórkowym kontrolowanie liczby komórek i usuwanie komórek, które zagrażają przeżyciu zwierzęcia. Apoptoza może wystąpić na przykład, gdy komórka jest zniszczona w stopniu uniemożliwiającym jej uzdrowienie, lub jest zakażona wirusem. Bodźce do wystąpienia apoptozy mogą pochodzić z samej komórki, z otaczającej ją tkanki lub z komórki, która stanowi część układu odpornościowego, przy czym mogą to być bodźce chemiczne, biologiczne lub fizyczne. Związane określenie „apoptotyczny” odnosi się do procesu apoptozy.

Definicje stereochemiczne i przyjęte tutaj konwencje nazewnicze generalnie są zgodne z P. Parker, Ed., „McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms” (1984) McGraw-Hill Book Company, Nowy Jork; oraz Eliel, E. i Wilen, S., „Stereochemistry of Organic Compounds” (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork. Wiele związków występuje w formach optycznie czynnych, tj. wykazujących zdolność do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo. Przy opisywaniu związku optycznie czynnego stosuje się przedrostki D i L lub R i S do oznaczenia absolutnej konfiguracji cząsteczki wokół jej centrum chiralnego (centrów chiralnych). Przedrostki d i I lub (+) i (-) stosuje się do oznaczania znaku skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo przez związek, przy czym (-) lub I oznacza, że związek jest lewoskrętny. Związek, w którego nazwie występuje przedrostek (+) lub d jest prawoskrętny. Dla danej struktury chemicznej, te stereoizomery są identyczne z wyjątkiem tego, że stanowią lustrzane odbicia siebie nawzajem. Specyficzny stereoizomer może być również określany jako enancjomer, zaś mieszanina takich izomerów często jest nazywana mieszaniną enancjomeryczną. Mieszaninę enancjomerów, zawierającą dwa enancjomery w stosunku 50:50 określa się jako mieszaninę racemiczną lub racemat, przy czym może ona powstać, gdy reakcja chemiczna lub proces nie wykazuje żadnej stereoselektywności ani stereospecyficzności.

Określenia „mieszanina racemiczna” i „racemat” odnoszą się do równomolowej mieszaniny dwóch enancjomerów, pozbawionej czynności optycznej.

Grupy zabezpieczające

W kontekście przedmiotowego wynalazku grupy zabezpieczające obejmują reszty prolekowe i chemiczne grupy zabezpieczające.

Grupy zabezpieczające są dostępne, powszechnie znane i stosowane, i opcjonalnie wykorzystuje się je do zapobiegania reakcjom ubocznym z udziałem zabezpieczonych grup podczas procedur syntezy, tj. dróg syntezy lub sposobów wytwarzania związków według wynalazku. W przypadku przeważającej części grup, decyzja dotycząca tego, które grupy zabezpieczyć, kiedy tego dokonać oraz charakter chemicznej grupy zabezpieczającej „PG” będzie zależała od chemii reakcji, przed którą należy daną grupę zabezpieczyć (np. warunki kwasowe, zasadowe, utleniające, redukujące lub inne) oraz od zamierzonego kierunku przebiegu syntezy.

Grupy PG nie muszą być i na ogół nie są takie same, jeśli związek jest podstawiony wieloma PG. Generalnie, PG stosuje się do zabezpieczania grup funkcyjnych takich, jak grupa karboksylowa, hydroksylowa, tio lub aminowa, aby w ten sposób zapobiec reakcjom ubocznym lub w inny sposób zwiększyć wydajność syntezy. Porządek usuwania zabezpieczenia w celu otrzymania wolnych, niezabezpieczonych grup zależy od zamierzonego kierunku syntezy i stosowanych warunków reakcji, przy czym usuwanie zabezpieczeń może następować w dowolnej kolejności zgodnie z tym, co zostało wyznaczone przez osobę biegłą w dziedzinie wynalazku.

Różne grupy funkcyjne związków według wynalazku mogą być zabezpieczane. Przykładowo, grupy zabezpieczające grupy -OH (w przypadku grup hydroksylowych, kwasów karboksylowych, kwasów fosfonowych lub w innych układach grup funkcyjnych) obejmują „grupy tworzące etery lub estry”. Grupy tworzące etery lub estry są zdolne do pełnienia funkcji chemicznych grup zabezpieczających w schematach syntezy przedstawionych w przedmiotowym opisie. Jednakże, pewne grupy zabezpieczające grupy hydroksylowe i tio nie są ani grupami tworzącymi etery ani grupami tworzącymi estry, jak to będzie zrozumiane przez osobę biegłą w dziedzinie wynalazku i należą do amidów, omówionych poniżej.

PL 212 403 B1

Bardzo duża liczba grup zabezpieczających grupy hydroksylowe i grup tworzących amidy, a także odpowiednie reakcje chemiczne rozszczepiania opisano w rozdziale „Protective Groups” w „Organic Synthesis”, Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork, 1991, ISBN 0-471-62301-6) („Greene”), por. także Kocienski Philip J.; „Protecting Groups” (Georg Thieme Verlag Stuttgart, Nowy Jork, 1994), które to publikacje włącza się niniejszym w całości jako odnośniki, a w szczególności rodział 1, „Protecting Groups: An Overview”, strony 1-20, rozdział 2, „Hydroxyl Protecting Groups”, strony 21-94, rozdział 3, „Diol Protecting Groups”, strony 95-117, rozdział 4, „Carboxyl Protecting Groups”, strony 118-154, rozdział 5, „Carbonyl Protecting Groups”, strony 155-184. Odnośnie grup zabezpieczających kwasy karboksylowe, kwasy fosfonowe, fosforany, kwasy sulfonowe oraz odnośnie innych grup zabezpieczających dla kwasów - por. Greene, jak przedstawiono powyżej. Takie grupy przykładowo, ale bez ograniczania się jedynie do nich, obejmują estry, amidy, hydrazydy i tym podobne.

Grupy zabezpieczające tworzące etery i estry

Grupy tworzące estry obejmują:

(1) grupy tworzące estry fosfonianowe, takie jak estry amidofosfonianowe, estry tiofosforanowe, estry fosfonianowe i bis-amidofosfoniany;

(2) grupy tworzące estry karboksylowe oraz (3) grupy tworzące estry siarkowe, takie, jak sulfoniany, siarczany i sulfoniany.

Reszty fosfonianowe związków według wynalazku mogą stanowić reszty prolekowe lub nie, tj. mogą być podatne na rozszczepienie lub modyfikację w wyniku hydrolizy lub procesów enzymatycznych lub nie. Pewne reszty fosfonianowe są trwalsze w większości lub prawie we wszystkich warunkach zachodzenia procesów metabolicznych. Przykładowo, dialkilofosfonian, w którym grupy alkilowe zawierają po dwa lub większą liczbę atomów węgla, może wykazywać znaczną trwałość in vivo ze względu na niewielką szybkość zachodzenia hydrolizy.

Sole i hydraty

Kompozycje według wynalazku opcjonalnie zawierają sole związków według wynalazku, a w szczególności farmaceutycznie akceptowalne, nietoksyczne sole zawierające na przykład jony Na⁺, Li⁺, K⁺, Ca²⁺ i Mg²⁺. Takie sole mogą obejmować sole otrzymane w wyniku połączenia odpowiednich kationów takich, jak jony metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych lub jon amoniowy lub czwartorzędowe jony amoniowe, z anionem reszty kwasowej. Preferowane są sole jednowartościowe, jeśli pożądana jest sól rozpuszczalna w wodzie.

Sole metali zwykle otrzymuje się przez przeprowadzenie reakcji związku według wynalazku z wodorotlenkiem metalu. Przykłady soli metali otrzymanych w ten sposób to sole zawierające kationy Li⁺, Na⁺ i K⁺. Sole o mniejszej rozpuszczalności można wytrącać z roztworu soli o większej rozpuszczalności poprzez dodanie związku odpowiedniego metalu.

Dodatkowo, sole można otrzymywać w wyniku addycji kwasowej pewnych kwasów organicznych i nieorganicznych, np. HCI, HBr, H2SO4 lub organicznych kwasów sulfonowych, do centrów zasadowych lub do grup kwasowych. Wreszcie, należy rozumieć, że opisane tutaj kompozycje zawierają związki według wynalazku zarówno w postaci niezjonizowanej, jak i w postaci jonów obojnaczych oraz w postaci połączeń ze stechiometrycznymi ilościami wody jako hydraty.

W zakres przedmiotowego wynalazku wchodzą również sole związków do podawania pozajelitowego z jednym lub większą liczbą aminokwasów. Do tego celu nadaje się dowolny aminokwas opisany powyżej, w szczególności zaś aminokwasy występujące w przyrodzie jako składniki białek, chociaż zwykle aminokwas posiada łańcuch boczny zawierający grupę zasadową lub kwasową, np. lizyna, arginina lub kwas glutaminowy, bądź grupę obojętną, tak jak glicyna, seryna, treonina, alanina, izoleucyna lub leucyna.

Metody hamowania działania HPV

Inny aspekt wynalazku dotyczy metod hamowania działania HPV, obejmujących etap poddawania próbki podejrzanej o zawieranie HPV działaniu związku według wynalazku.

Kompozycje według wynalazku działają jako inhibitory HPV, jako produkty pośrednie do uzyskania takich inhibitorów lub mają inne zastosowania opisane poniżej.

Etap poddawania próbki działaniu związku według wynalazku obejmuje dodawanie kompozycji według wynalazku do próbki lub dodawanie prekursora kompozycji do próbki. Etap dodawania obejmuje dowolną metodę podawania, tak, jak to opisano powyżej.

PL 212 403 B1

Jeśli pożądane, aktywność HPV po podaniu kompozycji może być obserwowana za pomocą dowolnej metody, włącznie z bezpośrednimi i pośrednimi metodami wykrywania aktywności HPV. Pod uwagę bierze się przy tym wszystkie ilościowe, jakościowe i półilościowe metody wyznaczania aktywności HPV. Typowo stosuje się jedną z metod badania przesiewowego opisanych poniżej, chociaż stosować można dowolną inną metodę taką, jak obserwacja właściwości fizjologicznych żywego organizmu.

Badania przesiewowe inhibitorów HPV

Związki i kompozycje według wynalazku poddaje się badaniom przesiewowym pod kątem zastosowań terapeutycznych przez pomiar wartości EC50, to jest stężenia związku, które umożliwia osiągnięcie 50% zahamowania wzrostu komórek. Stosunek wartości EC50 dla komórek nie zakażonych HPV do wartości EC50 dla komórek zakażonych stanowi miarę selektywności związku względem komórek zakażonych wirusem. Protokoły stosowane do uzyskania tych pomiarów przedstawiono w przykładach.

Preparaty farmaceutyczne i drogi podawania

Związki według wynalazku stosuje się do wyrobu preparatów razem z typowymi nośnikami i zarobkami, które mogą być wybrane zgodnie ze zwykłą praktyką. Tabletki zawierają zaróbki, środki poślizgowe, wypełniacze, środki wiążące i tym podobne. Preparaty wodne przygotowuje się w postaci sterylnej, a jeżeli przeznaczone są do podawania drogami innymi niż doustnie, generalnie są izotoniczne. Wszystkie preparaty opcjonalnie zawierają zarobki takie, jak przedstawiono w „Handbook of Pharmaceutical Excipients” (1986). Zaróbki obejmują kwas askorbinowy i inne przeciwutleniacze, środki chelatujące, takie jak EDTA, węglowodany, takie jak dekstryna, hydroksyalkiloceluloza, hydroksyalkilometyloceluloza, kwas stearynowy i tym podobne. Wartość pH preparatów mieści się w zakresie od około 3 do około 11, ale zwykle wynosi około 7 do 10.

Jeden lub większą liczbę związków według wynalazku (w przedmiotowym opisie w tym kontekście określanych jako składniki czynne) podaje się dowolną drogą podawania odpowiednią do leczonego stanu chorobowego. Odpowiednie drogi podawania obejmują podawanie doustne, doodbytnicze, donosowe, miejscowe (włącznie z podawaniem dopoliczkowym i podjęzykowym), dopochwowe i pozajelitowe (włącznie z podawaniem podskórnym, domięśniowym, dożylnym, śródskórnym, dooponowym i nadtwardówkowym) i tym podobne. Należy zauważyć, że preferowana droga podawania może się zmieniać w zależności od stanu pacjenta. Zaletą związków według wynalazku jest fakt, że biodostępne przy podawaniu doustnym i mogą być dawkowane doustnie.

Chociaż możliwe jest podawanie samych składników czynnych, preferowane może być stosowanie ich w postaci preparatów farmaceutycznych. Preparaty według wynalazku, zarówno do zastosowań weterynaryjnych, jak i do leczenia ludzi, zawierają co najmniej jeden składnik czynny, taki jak określono powyżej, razem z jednym lub większą liczbą akceptowalnych nośników i opcjonalnie - z innymi składnikami leczniczymi. Nośnik(i) musi być „akceptowalny” w takim znaczeniu, że jest on kompatybilny z innymi składnikami preparatu i fizjologicznie nieszkodliwy dla pacjenta.

Preparaty obejmują te, które są odpowiednie do powyższych dróg podawania. Preparaty mogą dogodnie mieć formę jednostkowych postaci dawkowania i mogą być wytwarzane dowolnym ze sposobów dobrze znanych w dziedzinie farmacji.

Techniki i preparaty generalnie opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Takie sposoby obejmują etap połączenia składnika czynnego z nośnikiem, który składa się z jednego lub większej liczby składników pomocniczych. Generalnie, preparaty wytwarza się przez jednorodne i dokładne połączenie składnika czynnego z nośnikami ciekłymi lub nośnikami w postaci bardzo rozdrobnionych ciał stałych lub w obu postaciach, a następnie, jeśli jest to konieczne, ukształtowanie produktu.

Preparaty według wynalazku odpowiednie do podawania doustnego wytwarza się w postaci oddzielnych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki lub tabletki, z których każda zawiera uprzednio wyznaczoną ilość składnika czynnego; w postaci proszku lub granulek; w postaci roztworu lub zawiesiny w cieczy wodnej lub niewodnej; lub w postaci ciekłej emulsji typu „olej w wodzie” lub w postaci ciekłej emulsji typu „woda w oleju”. Składnik czynny można również podawać w postaci dużej pigułki, powidełka lub pasty.

Tabletkę wytwarza się przez sprasowanie lub formowanie, opcjonalnie z jednym lub większą liczbą składników pomocniczych. Sprasowane tabletki można wytwarzać przez sprasowywanie, w odpowiednim urządzeniu, składnika czynnego w postaci o dużej plastyczności prasowniczej takiej, jak proszek lub granulki, opcjonalnie wymieszanej ze środkiem wiążącym, środkiem poślizgowym, obojętnym rozpuszczalnikiem, środkiem konserwującym, środkiem powierzchniowo czynnym lub dysPL 212 403 B1 pergującym. Tabletki formowane można wytwarzać przez formowanie, w odpowiednim urządzeniu, mieszaniny sproszkowanego składnika czynnego zwilżonego obojętnym ciekłym rozcieńczalnikiem. Tabletki opcjonalnie można powlekać lub nacinać, i opcjonalnie można je przygotowywać w taki sposób, aby zapewnić powolne lub kontrolowane uwalnianie składnika czynnego.

W przypadku zakażeń oczu lub innych tkanek zewnętrznych, np. ust i skóry, preparaty korzystnie stosuje się miejscowo w postaci maści lub kremu zawierającego składnik(i) czynny(e) w ilości wynoszącej, na przykład, 0,075 do 20% wagowych (włącznie z ilością składnika(ów) czynnego(ych) mieszczącą się w zakresie pomiędzy 0,1% i 20%, przy wartości zmiennej wynoszącej 0,1% wagowych, takiej, jak 0,6% wagowych, 0,7% wagowych, itp.), korzystnie od 0,2 do 15% wagowych, zaś najkorzystniej - od 0,5 do 10% wagowych. W przypadku stosowania w postaci maści, składniki czynne mogą być stosowane parafinową lub rozpuszczalną w wodzie podstawą. Alternatywnie, składniki czynne można stosować w postaci kremu z podstawą kremu typu „olej w wodzie”.

Jeśli jest to pożądane, faza wodna podstawy kremu może zawierać, na przykład, co najmniej 30% wagowych alkoholu wielowodorotlenowego, tj. alkoholu zawierającego dwie lub większą liczbę grup hydroksylowych, takiego jak glikol propylenowy, butan-1,3-diol, mannit, sorbit, glicerol i poli(glikol etylenowy) (włącznie z PEG 400) oraz ich mieszaniny. Preparaty do stosowania miejscowego korzystnie mogą zawierać związek, który zwiększa absorpcję składnika czynnego lub penetrację przez niego skóry lub innych powierzchni poddanych, których zastosowano preparat. Przykłady takich środków zwiększających penetrację przez skórę obejmują dimetylosulfotlenek i powiązane analogi.

Faza olejowa emulsji otrzymanej zgodnie z wynalazkiem może składać się ze znanych składników i może być przygotowana w znany sposób. Chociaż faza olejowa może zawierać jedynie emulgator (określany inaczej jako środek emulgujący), korzystnie zawiera ona mieszaninę co najmniej jednego emulgatora z tłuszczem lub olejem, lub z oboma tymi składnikami jednocześnie. Korzystnie, faza olejowa zawiera emulgator hydrofilowy razem z emulgatorem hydrofobowym, który działa jako stabilizator. Korzystne jest również, aby faza olejowa zawierała zarówno olej, jak i tłuszcz. Emulgator(y) z lub bez stabilizatora(ów) tworzą tak zwany wosk emulgujący, zaś wosk ten, razem z olejem i tłuszczem tworzą tak zwaną emulgującą podstawę maści, która tworzy rozproszoną fazę olejową preparatów kremowych.

Emulgatory i stabilizatory emulsji odpowiednie do zastosowania w preparatach według wynalazku obejmują Tween^® 60, Span^® 80, alkohol cetostearylowy, alkohol benzylowy, alkohol mirystylowy, monostearyma gliceryny i laurylosiarczan sodu.

Dobór odpowiednich olejów lub tłuszczów do zastosowania w konkretnym preparacie opiera się na możliwości uzyskania pożądanych własności kosmetycznych. Krem korzystnie powinien stanowić produkt, który nie jest mazisty, barwiący i który daje się zmyć, a przy tym cechujący się odpowiednią konsystencją, pozwalającą uniknąć wycieku z tubek lub innych pojemników. Można stosować prostołańcuchowe lub rozgałęzione jedno- lub dwuzasadowe estry alkilowe takie, jak diizoadypinian, stearynian izocetylowy, diester glikolu propylenowego z kwasami tłuszczowymi pochodzącymi z orzechów kokosowych, mirystynian izopropylu, oleinian decylu, palmitynian izopropylu, stearynian butylu, palmitynian 2-etyloheksylu lub mieszankę estrów o rozgałęzionych łańcuchach znaną jako Crodamol CAP, przy czym preferowane są trzy ostatnie. Mogą być one stosowane oddzielnie lub w połączeniach, w zależności od wymaganych właściwości produktu. Alternatywnie, stosuje się lipidy o wysokiej temperaturze topnienia takie, jak miękka parafina i/lub parafina ciekła lub inne oleje mineralne.

Do preparatów odpowiednich do stosowania miejscowego w oku należą również krople do oczu, w których składnik czynny jest rozpuszczony lub ma postać zawiesiny w odpowiednim nośniku, w szczególności w rozpuszczalniku wodnym składnika czynnego. Składnik czynny korzystnie jest obecny w takich preparatach w stężeniu od 0,5 do 20%, korzystnie od 0,5 do 10%, szczególnie w stężeniu około 1,5% wagowych.

Preparaty odpowiednie do podawania miejscowego w ustach obejmują pastylki do ssania zawierające składnik czynny w aromatyzowanym podłożu, zwykle w sacharozie i gumie arabskiej lub tragakantowej; pastylki zawierające składnik czynny w podłożu obojętnym, takim jak żelatyna i gliceryna lub sacharoza i guma arabska; oraz płyny do płukania ust zawierające składnik czynny w odpowiednim nośniku ciekłym.

Preparaty odpowiednie do podawania doodbytniczego mogą mieć postać czopków z odpowiednim podłożem zawierającym na przykład masło kakaowe lub salicylan.

Preparaty odpowiednie do podawania śródpłucnego lub donosowego mają wielkość cząstek mieszczącą się na przykład w zakresie od 0,1 do 500 mikronów (włącznie z cząstkami o wielkości

PL 212 403 B1 pomiędzy 0,1 i 500 mikronów przy wartości zmiennej takiej, jak 0,5 μm, 1,30 μm, 35 μm, itp.), które są podawane przez szybką inhalację przez przewód nosowy lub przez inhalację przez usta, tak, aby dostać się do pęcherzyków płucnych. Odpowiednie preparaty obejmują wodne lub olejowe roztwory składnika czynnego. Preparaty odpowiednie do podawania w postaci aerozolu lub suchego proszku mogą być wytwarzane typowymi metodami i mogą być podawane razem z innymi środkami leczniczymi takimi, jak związki stosowane w leczeniu lub do zapobiegania zakażeniom grypą A lub B, tak, jak opisano poniżej.

Preparaty odpowiednie do podawania dopochwowego mogą mieć postać pesariów, tamponów, kremów, żelów, past, pianek lub preparatów do rozpylania, zawierających - oprócz składnika czynnego - takie nośniki, które w stanie techniki uznaje się za odpowiednie.

Preparaty odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne, sterylne roztwory do zastrzyków, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, które nadają preparatowi charakter izotoniczny z krwią pacjenta, dla którego przewidziany jest preparat; oraz wodne i niewodne, sterylne zawiesiny, które mogą obejmować środki tworzące zawiesinę i środki zagęszczające.

Preparaty przygotowuje się w pojemnikach zawierających jedną lub więcej dawek jednostkowych, na przykład w uszczelnionych ampułkach i fiolkach i mogą być przechowywane w stanie liofilizatów, wymagającym jedynie dodania tuż przed użyciem sterylnego nośnika ciekłego, na przykład wody do zastrzyków. Roztwory lub zawiesiny do zastrzyków, przygotowywane bezpośrednio przed użyciem, przygotowuje się z proszków sterylnych, granulek i tabletek takich typów, jak opisano powyżej. Preferowanymi preparatami zawierającymi dawki jednostkowe są preparaty zawierające dawkę dzienną lub jednostkową dzienną dawkę cząstkową, takie, jak opisano powyżej lub ich odpowiedniki zawierające odpowiednią część składnika czynnego.

Należy rozumieć, że poza składnikami wymienionymi w szczególności powyżej, preparaty według przedmiotowego wynalazku mogą zawierać inne środki typowo stosowane w dziedzinie, w zależności od konkretnego preparatu, na przykład preparaty odpowiednie do podawania doustnego mogą zawierać dodatki smakowe.

Wynalazek umożliwia ponadto wytwarzanie kompozycji weterynaryjnych zawierających co najmniej jeden składnik czynny określony tak jak powyżej, razem z odpowiednim nośnikiem weterynaryjnym.

Nośniki weterynaryjne stanowią materiały użyteczne do podawania kompozycji i mogą mieć postać produktów stałych, ciekłych lub gazowych, które są obojętne lub akceptowalne pod względem weterynaryjnym oraz są kompatybilne ze składnikiem czynnym. Te kompozycje weterynaryjne mogą być podawane do pyska, pozajelitowo lub inną pożądaną drogą.

Związki według wynalazku stosuje się do przygotowania preparatów farmaceutycznych do kontrolowanego uwalniania leku, zawierających jako składnik czynny jeden lub większą liczbę związków według wynalazku („preparaty do kontrolowanego uwalniania leku”), w których uwalnianie składnika czynnego jest kontrolowane i regulowane aby umożliwić mniejszą częstotliwość dawkowania lub aby poprawić profil farmakokinetyczny lub toksykologiczny danego składnika czynnego.

Dawka skuteczna składnika czynnego zależy co najmniej od charakteru leczonego stanu chorobowego, toksyczności, od tego, czy związek jest stosowany profilaktycznie (mniejsze dawki) czy przeciwko czynnemu zakażeniu grypą, od sposobu podawania oraz od preparatu farmaceutycznego i jest określana przez lekarza klinicznego na podstawie typowych badań ze zwiększaniem dawki. Można oczekiwać, że dawka skuteczna będzie wynosiła od około 0,0001 do około 100 mg/kg masy ciała na dzień; typowo od około 0,01 do około 10 mg/kg masy ciała na dzień; bardziej typowo od około 0,01 do około 5 mg/kg masy ciała na dzień; najbardziej typowo od około 0,05 do około 0,5 mg/kg masy ciała na dzień.

Przykładowo, do inhalacji, proponowana dawka dzienna dla człowieka dorosłego o masie ciała wynoszącej około 70 kg mieści się w zakresie od 1 mg do 1000 mg, korzystnie pomiędzy 5 mg i 500 mg i może mieć postać jednej lub wielu dawek.

Składniki czynne według wynalazku stosuje się również w połączeniu z innymi składnikami czynnymi. Takie połączenia są wybierane w zależności od leczonego stanu chorobowego, reaktywności krzyżowej składników i własności farmakokinetycznych połączenia. Przykładowo, przy leczeniu zakażeń wirusowych układu oddechowego, w szczególności zakażenia grypą, kompozycje według wynalazku łączy się ze środkami przeciwwirusowymi (takimi, jak amantydyna, rimantadyna i rybawirina), środkami mukolitycznymi, środkami wyksztuśnymi, środkami rozszerzającymi oskrzela, antybiotykami, środkami przeciwgorączkowymi lub środkami przeciwbólowymi. Zazwyczaj antybiotyki, środki

PL 212 403 B1 przeciwgorączkowe i środki przeciwbólowe podaje się razem ze związkami według przedmiotowego wynalazku.

Metabolity związków według wynalazku

Związki według wynalazku w sposób jasny podlegają procesom metabolicznym zachodzącym in vivo, w wyniku których postają odpowiednie metabolity. Takie produkty mogą stanowić na przykład wynik utleniania, redukcji, hydrolizy, amidowania, estryfikacji i tym podobnych reakcji podawanego związku, przede wszystkim w wyniku procesów enzymatycznych.

Takie produkty typowo identyfikuje się przez przygotowanie znakowanego promieniotwórczo 14 3 (np. ¹⁴C lub ³H) związku według wynalazku, podawanie go pozajelitowo w wykrywalnej dawce (tj. większej niż około 0,5 mg/kg) zwierzęciu, takiemu jak szczur, mysz, świnka morska, małpa lub człowiekowi, odczekiwanie czasu wystarczającego dla zajścia przemian metabolicznych (typowo od około 30 sekund do około 30 godzin) i wyodrębnienie produktów konwersji związku według wynalazku z moczu, krwi lub innych próbek biologicznych.

Produkty te są łatwe do wyodrębnienia, ponieważ są znakowane (inne wyodrębnia się przy zastosowaniu przeciwciał zdolnych do wiązania epitopów, które przetrwały przemiany metaboliczne).

Strukturę metabolitów wyznacza się w typowy sposób, np. za pomocą analizy technikami MS lub NMR. Generalnie, analizy metabolitów dokonuje się w ten sam sposób, w jaki prowadzi się typowe badania metabolizmu leków, dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie wynalazku.

Produkty konwersji, o ile nie występują in vivo w inny sposób, są użyteczne w badaniach diagnostycznych dotyczących dawkowania leczniczego związków według wynalazku, nawet wtedy, gdy same nie wykazują działania hamującego działanie neuroaminidazy.

Dodatkowe zastosowania związków według przedmiotowego wynalazku

Związki według przedmiotowego wynalazku lub substancje biologicznie czynne otrzymane z tych związków w wyniku hydrolizy lub przemian metabolicznych zachodzących in vivo, stosuje się jako immunogeny lub do koniugacji z białkami, gdzie związki te służą jako składniki kompozycji immunogennych do wytwarzania przeciwciał zdolnych do specyficznego wiązania się z białkiem, ze związkami lub z produktami ich metabolizmu, które wychwytują immunologicznie rozpoznawalne epitopy (miejsca wiązania przeciwciała).

Kompozycje immunogenne są więc użyteczne jako produkty pośrednie przy wytwarzaniu przeciwciał do zastosowania w diagnostyce, kontroli jakości i tym podobnych metodach lub badaniach związków lub nowych produktów ich metabolizmu. Związki są użyteczne do hodowania przeciwciał przeciw polipeptydom, które w innym przypadku są nieimmunogenne, przy czym związki te służą jako miejsca haptenowe, stymulujące odpowiedź immunologiczną, które wykazują reaktywność krzyżową z niezmodyfikowanym białkiem sprzężonym.

Produkty hydrolizy stanowiące przedmiot zainteresowania obejmują produkty hydrolizy zabezpieczonych grup kwasowych i zasadowych omówionych powyżej. Jak wspomniano powyżej, immunogenne polipeptydy zawierające amidy kwasowe lub zasadowe, takie, jak albumina lub hemocyjanina szkarłatki, generalnie są użyteczne jako immunogeny.

Produkty przemian metabolicznych opisane powyżej mogą utrzymywać znaczący poziom immunologicznej reaktywności krzyżowej ze związkami według wynalazku. Tak więc, przeciwciała uzyskane z wykorzystaniem wynalazku będą zdolne do wiązania się z niezabezpieczonymi związkami według wynalazku bez wiązania się ze związkami zabezpieczonymi; alternatywnie, produkty przemian metabolicznych będą zdolne do wiązania się ze związkami zabezpieczonymi i/lub produktami przemian metabolicznych bez wiązania się z zabezpieczonymi związkami według wynalazku lub będą zdolne do specyficznego wiązania się z dowolną spośród tych trzech grup lub ze wszystkimi trzema.

Przeciwciała korzystnie nie wykazują znaczącej reaktywności krzyżowej z substancjami występującymi w przyrodzie. Znacząca reaktywność krzyżowa oznacza reaktywność w specyficznych warunkach prowadzenia oznaczenia dla specyficznych analitów, wystarczającą do zaburzania wyników oznaczenia.

Immunogeny otrzymane z wykorzystaniem przedmiotowego wynalazku zawierają związek według wynalazku wykazujący obecność pożądanego epitopu w powiązaniu z substancją immunogenną. W kontekście przedmiotowego wynalazku takie powiązanie oznacza wiązanie kowalencyjne z utworzeniem koniugatu immunogennego (gdy jest to możliwe) lub mieszaniny substancji nie powiązanych kowalencyjnie ze sobą, lub kombinację powyższych.

Do substancji immunogenych należą adiuwanty takie, jak adiuwant Freund'a, białka immunogenne takie, jak polipeptydy pochodzenia wirusowego, bakteryjnego, drożdżowego, roślinnego i zwie24

PL 212 403 B1 rzęcego, w szczególności hemocyjanina szkarłatki, albumina surowicy krwi, tyroglobulina bydlęca lub inhibitor trypsyny z ziaren soi, oraz polisacharydy immunogenne. Typowo, związek posiadający strukturę pożądanego epitopu jest kowalencyjnie związany z polipeptydem lub polisacharydem immunogennym za pomocą wielofunkcyjnego (zwykle dwufunkcyjnego) środka sieciującego.

Sposoby wytwarzania immunogenów haptenowych są typowe i znane per se, przy czym może być stosowany również dowolny spośród wymienionych powyżej sposobów tworzenia koniugatów haptenów z polipeptydami immunogennymi i im podobnymi, a przy tym należy wziąć pod uwagę grupy funkcyjne na prekursorach lub produktach hydrolizy, które mogą brać udział w procesie sieciowania, a także prawdopodobieństwo wytworzenia przeciwciał specyficznych względem pożądanego epitopu w przeciwieństwie do substancji immunogenne.

Typowo polipeptyd jest przyłączony do miejsca w związku według wynalazku odległego od epitopu, który ma być rozpoznany.

Koniugaty otrzymuje się w typowy sposób. Przykładowo, przy otrzymywaniu koniugatów otrzymanych z wykorzystaniem wynalazku użyteczne są środki sieciujące: N-hydroksysukcynoimid, bezwodnik kwasu bursztynowego lub alkN=C=Nalk.

Koniugaty zawierają związek według wynalazku przyłączony do substancji immunogennej poprzez wiązanie lub grupę łącznikową, zawierającą 1-100, typowo 1-25, bardziej typowo 1-10 atomów węgla.

Koniugaty oddziela się od substratów i produktów ubocznych przy wykorzystaniu chromatografii lub podobnych technik, a następnie poddaje się je filtracji w warunkach sterylnych i umieszcza w fiolkach do przechowywania.

Zwierzęta typowo poddaje się immunizacji przeciw koniugatom lub pochodnym immunogennym, zaś surowice odpornościowe lub przeciwciała monoklonalne otrzymuje się w typowy sposób.

Związki według przedmiotowego wynalazku są użyteczne jako fragmenty łączące lub rozdzielające przy wytwarzaniu matryc do absorpcji na zasadzie powinowactwa, immobilizowanych enzymów do kontroli procesów lub reagentów do badań immunologicznych.

Opisane tutaj związki zawierają dużą liczbę grup funkcyjnych, które nadają się jako miejsca do związania pożądanych substancji poprzez sieciowanie. Przykładowo, do typowych metod należy przyłączanie reagentów powinowactwa takich, jak hormony, peptydy, przeciwciała, leki i tym podobne, do substratów nierozpuszczalnych.

Te reagenty, które w ten sposób pozbawiono rozpuszczalności stosuje się w sposób znany do absorpcji partnerów wiążących dla reagentów powinowactwa z wytworzonych preparatów, próbek diagnostycznych lub innych zanieczyszczonych mieszanin.

Podobnie, immobilizowane enzymy stosuje się do prowadzenia katalitycznych procesów konwersji z ułatwionym odzyskiwaniem enzymu. Związki dwufunkcyjne są często wykorzystywane do przyłączania analitów do grup wykrywalnych podczas przygotowywania reagentów wykorzystywanych w celach diagnostycznych.

W badaniach przesiewowych korzystnie stosuje się komórki z konkretnych tkanek, które są podatne na zakażenie HPV. Oznaczenia znane w dziedzinie wynalazku są odpowiednie do wyznaczania in vivo biodostępności, włączając w to oznaczenia trwałości w jelicie, przenikania przez błonę komórkową, trwałości w homogenacie wątrobowym i trwałości w osoczu.

Jednakże, nawet jeśli ester, amid lub inne zabezpieczone pochodne me ulegają in vivo konwersji do wolnych grup karboksylowych, aminwych lub hydroksylowych, to nadal pozostają one użyteczne jako chemiczne produkty pośrednie.

Użyteczność przedmiotowego wynalazku wykazano przy pomocy testów na występowanie własności antyproliferacyjnych. W testach na występowanie własności antyproliferacyjnych mierzy się wpływ związków na proliferację hodowanych komórek. Komórki hoduje się przez 7 dni w obecności różnych stężeń związków.

W siódmym dniu komórki barwi się barwnikiem, przy czym natężenie zabarwienia (proporcjonalne do liczby komórek) mierzy się za pomocą spektrofotometru.

Dane nanosi się na wykresie względem stężeń związku, dopasowuje do sigmoidalnej krzywej zależności dawka-odpowiedź, a następnie z tego wyznacza się stężenie związku, które powoduje zmniejszenie szybkości proliferacji komórek o 50% (50% stężenie skuteczne lub EC50).

Związki czynne w testach na występowanie własności antyproliferacyjnych mogą wykazywać działanie cytostatyczne (hamowanie podziału komórek) i/lub cytocydowe (uśmiercanie komórek).

PL 212 403 B1

Poprzez poddanie testom na występowanie własności antyproliferacyjnych zarówno komórek zakażonych wirusem HPV, jak i komórek zdrowych, można zidentyfikować związki, które hamują proliferację komórek zakażonych wirusem HPV skuteczniej niż komórek z normalnych, zdrowych tkanek ludzkich.

Przykładowe sposoby wytwarzania związków według wynalazku

Wynalazek dotyczy również sposobów wytwarzania związków według wynalazku. Związki te otrzymuje się dowolnymi nadającymi się do zastosowania technikami syntezy organicznej. Wiele takich technik jest dobrze znanych w dziedzinie wynalazku. Jednakże, wiele z tych znanych technik zostało opracowanych w „Compendium of Organic Synthetic Methods” (John Wiley & Sons, Nowy Jork), tom 1, Ian T. Harrison i Shuyen Harrison, 1971; tom 2, Ian T. Harrison i Shuyen Harrison, 1974; tom 3, Louis S. Hegedus i Leroy Wade, 1977; tom 4, Leroy G. Wade jr., 1980; tom 5, Leroy G. Wade Jr., 1984; oraz tom 6, Michael B. Smith; jak również przez March, J., „Advanced Organic Chemistry, Third Edition” (John Wiley & Sons, Nowy Jork, 1985), „Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry. In 9 Volumes”, Barry M. Trost, redaktor naczelny (Pergamon Press, Nowy Jork, wydanie z 1993).

Szereg przykładowych sposobów wytwarzania związków według wynalazku przedstawiono poniżej. Sposoby te mają służyć do zilustrowania charakteru takich sposobów otrzymywania, natomiast nie mają służyć ograniczeniu zakresu sposobów możliwych do zastosowania.

Generalnie, warunki prowadzenia reakcji takie, jak temperatura, czas reakcji, rozpuszczalniki, procedury obróbki i tym podobne, są takie, jak typowo stosowane w dziedzinie wynalazku w odniesieniu do konkretnych typów reakcji.

Cytowane odnośniki literaturowe oraz opis przedmiotowego wynalazku zawierają szczegółowe opisy takich warunków.

Typowo, temperatura wynosi od -100°C do 200°C, rozpuszczalniki są aprotonowe lub protonowe, zaś czas reakcji wynosi od 10 sekund do 10 dni.

Obróbka produktów zwykle obejmuje wymuszone zakończenie reakcji dowolnych nieprzereagowanych reagentów, a następnie rozdzielenie pomiędzy warstwy układu woda/warstwa organiczna (ekstrakcję) i oddzielenie warstwy zawierającej produkt.

Reakcje utleniania i redukcji typowo prowadzi się w temperaturze zbliżonej do temperatury pokojowej (około 20°C), chociaż przy redukcji z wodorkami metali często obniża się temperaturę do 0°C do -10°C, przy czym zwykle do reakcji redukcji stosuje się rozpuszczalniki aprotonowe, zaś do reakcji utleniania można stosować rozpuszczalniki protonowe lub aprotonowe. Czas trwania reakcji dostosowuje się do osiągnięcia pożądanych stopni konwersji.

Reakcje kondensacji typowo prowadzi się w temperaturze zbliżonej do temperatury pokojowej, chociaż w przypadku kondensacji nierównowagowej, kontrolowanej kinetycznie często stosuje się również temperaturę obniżoną (0°C do -10°C).

Rozpuszczalniki mogą być protonowe (powszechne w reakcjach równowagowych) lub aprotonowe (powszechne w reakcjach kontrolowanych kinetycznie).

Standardowe techniki syntetyczne, takie jak azeotropowe usuwanie produktów ubocznych reakcji i zastosowanie warunków bezwodnych (np. środowiska gazu obojętnego) są powszechne w dziedzinie wynalazku i stosuje się je wtedy, kiedy można.

Na schematach poniżej przedstawiono przykładowe sposoby wytwarzania związków według przedmiotowego wynalazku.

Szczegółowe opisy tych sposobów zamieszczono w części doświadczalnej poniżej, w odniesieniu do konkretnych schematów.

PL 212 403 B1

Schematy Schemat 1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

Schemat 4

HCt H₂N CO₂(CH₂}_sCH₃ TEA/PhOH

Aldrithioi™-2 / PPh₃ pirydyna, 60 °C k:

O(CH₂)₅CH₃ o

NH

R

O

OPh

HCl.HjN COJCHjbCFb TEA/PhOH

Afdrittiioł pirydyna

TM '-2 / PPh₃ 60 °C

O(CH₂)₇CH₃

NH

O

TEA

PhOH

Afdrithiol™

PPh₃ pirydyna

OPh

X

HC! H_;N CO,B'J / TEA / PhOH

Aidnthiol™· pirydyna

2/PPh₃ 60 ^aC

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

Schemat 9

PL 212 403 B1

Schemat 13

OBu (1) SOCI₂ / DMF(^kat-) Sulfolane, 70 °C, 1 h (2) TMSOPh, 90 °C, 1 h * temp. pok. przez całą noc

Q

OH

OPh

HCl.HąN^CO_£Me / TEA_

Aldrithiol™-2 / PPh₃ * pirydyna, 60°C

OMe

O

NH

OPh

HO

OiPr

O

NH

OPh

X

TEA

HCIH,N

Bu

CO

Aldrithioi™

PPh

60°C pirydyna j

(1) HCiH,N^CO₂iPr /TEA Aldrithioi ™~2 / PPh₃ pirydyna, 60°C (2) kwas fumarowy, CH₃CN

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

Schemat 20

I

PhOH

TEA

CO₂(CH₂)_eCH₃ hcjh₂n

O(CH₂)_sCH₃

Atririthinl™

PPh

NH

O pirydyna

60°C

Ha.HąN^OOaa / PhOH / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃ pirydyna, 60°C

Ϊ HCI H₂N^CO₂Bu Z PhOH Z TEA^

Ałdrithiol™-2 / PPb₃ pirydyna, 60°C

OBu ko o

NH

O

OPh

TEA

PhOH

Aldrithiol™-2/PPb₃ pirydyna, 60°C

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

Schemat 23

Cl

NHCHoCFo

H₂N

h₂n

Każdy z produktów następujących procesów jest opcjonalnie rozdzielany, wydzielany i/lub oczyszczany przed jego zastosowaniem w następnych procesach.

Określenia „poddany działaniu”, „poddanie działaniu”, „poddawanie działaniu” i tym podobne, gdy są używane w kontekście procesu chemicznego, protokołu lub otrzymywania, oznaczają kontaktowanie, mieszanie, poddawanie reakcji, umożliwianie zajścia reakcji, doprowadzanie do kontaktu oraz inne określenia powszechne w dziedzinie wynalazku, stosowane dla wskazania, że jedno lub większa liczba indywiduów chemicznych jest poddawana działaniu w taki sposób, aby przekształcić je w jedno lub większą liczbę innych indywiduów chemicznych. Oznacza to, że „poddanie związku „jeden” działaniu związku „dwa”„ jest równoznaczne ze stwierdzeniem „umożliwienie związkowi „jeden” przereagowania ze związkiem „dwa”„, „skontaktowanie związku „jeden” ze związkiem „dwa” „przeprowadzenie reakcji związku „jeden” ze związkiem „dwa”„ oraz inne wyrażenia powszechne w dziedzinie syntezy organicznej dla rozsądnego wskazania, że związek „jeden” został „poddany działaniu” związku „dwa”, „poddany reakcji” ze związkiem „dwa”, ze związku „jeden” „umożliwiono reakcję” ze związkiem „dwa”, itp.

W kontekście procesów chemicznych, protokołów lub otrzymywania „poddanie działaniu” wskazuje rozsądny i zwykły sposób, w jaki związkom organicznym umożliwia się reagowanie. O ile nie wskazano inaczej, rozumie się przez to normalne stężenia (od 0,01 M do 10 M, typowo od 0,1 M do 1 M), temperaturę (od -100°C do 250°C, typowo od -78°C do 150°C, bardziej typowo od -78°C do 100°C, jeszcze bardziej typowo od 0°C do 100°C), naczynia reakcyjne (typowo szklane, wykonane z tworzyw sztucznych, metalowe), rozpuszczalniki, zakres ciśnienia, rodzaje atmosfery (typowo powietrze dla reakcji niewrażliwych na obecność tlenu i wody lub azot bądź argon dla reakcji wrażliwych na obecność tlenu lub wody), itp.

Wiedzę dotyczącą podobnych reakcji znanych w dziedzinie syntezy organicznej wykorzystuje się przy doborze warunków i aparatury do przeprowadzenia danego procesu. W szczególności, przecięna osoba biegła w dziedzinie syntezy organicznej dobiera warunki i aparaturę, co do których ma uzasadnione oczekiwania, oparte na wiedzy z dziedziny wynalazku, że umożliwią one udane przeprowadzenie reakcji chemicznych opisanych procesów.

Modyfikacje każdego z powyższych schematów prowadzą do uzyskania różnych analogów szczególnych, przykładowych substancji otrzymanych tak, jak opisano powyżej. Zacytowane powyżej odnośniki opisujące specyficzne metody syntezy organicznej mają zastosowanie do takich modyfikacji.

W każdym z powyższych schematów korzystne może być oddzielenie produktów reakcji od siebie i/lub od substratów. Pożądane produkty na każdym etapie lub po każdej serii etapów są oddzielane i/lub oczyszczane (a potem oddzielane) do pożądanego stopnia jednorodności za pomocą typowych technik w dziedzinie wynalazku.

PL 212 403 B1

Typowo, takie rozdzielanie obejmuje ekstrakcję w układzie wielofazowym, krystalizację z rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników, destylację, sublimację lub chromatografię. Chromatografia może obejmować dowolną liczbę metod, obejmując, na przykład, chromatografię wykluczania lub chromatografię jonowymienną, wysoko-, średnio- lub niskociśnieniową chromatografię cieczową, chromatografię cienko- lub grubowarstwową w małej skali i w skali preparatywnej, jak również techniki chromatografii cienkowarstwowej w małej skali i chromatografii kolumnowej z wymuszonym przepływem.

Inna klasa metod rozdzielania obejmuje poddawanie mieszaniny działaniu reagenta wybranego w taki sposób, aby wiązał się z lub w inny sposób wychwytywał i umożliwiał oddzielenie pożądanego produktu, nieprzereagowanego substratu, ubocznego produktu reakcji lub tym podobnych. Takie reagenty obejmują adsorbenty lub absorbenty takie, jak węgiel aktywowany, sita molekularne, wymienniki jonowe i tym podobne. Alternatywnie, reagentami mogą być kwasy w przypadku substancji zasadowych, zasady - w przypadku substancji kwasowych, reagenty wiążące takie, jak przeciwciała, białka wiążące, selektywne środki chelatujące takie, jak etery koronowe, środki do ekstrakcji jonowej w układzie ciecz/ciecz (LIX) lub tym podobne.

Wybór odpowiednich metod rozdzielania zależy od natury substancji poddawanych rozdziałowi, na przykład od temperatury wrzenia i ciężaru cząsteczkowego w przypadku destylacji i sublimacji, od obecności lub braku polarnych grup funkcyjnych w przypadku chromatografii, trwałości substancji w środowisku kwasowym i zasadowym w przypadku ekstracji w układzie wielofazowym, i tym podobnych. Osoba biegła w dziedzinie wynalazku zastosuje techniki, w przypadku których prawdopodobieństwo osiągnięcia pożądanego stopnia rozdziału jest największe.

Wszystkie cytaty z literatury i dokumentów patentowych wspomniane powyżej niniejszym włącza się do przedmiotowego opisu jako odnośniki w miejscach, w których zostały przytoczone. Zacytowane szczególne rozdziały lub strony z przytoczonych powyżej prac niniejszym włącza się jako specyficzne odnośniki. Wynalazek opisano szczegółowo w stopniu umożliwiającym osobie przeciętnie biegłej w dziedzinie wynalazku otrzymanie i zastosowanie przedmiotu poniższych zastrzeżeń. Jest oczywiste, że pewne modyfikacje sposobów i kompozycji opisanych w poniższych zastrzeżeniach mogą być dokonane w ramach zakresu i istoty wynalazku. Następujące przykłady podano w celu przykładowego przedstawienia przedmiotowego wynalazku, i w żaden sposób nie należy ich interpretować jako ograniczenia tego wynalazku.

Przykłady - ogólnie

Pewne przykłady powtarzano wielokrotnie. W powtarzanych przykładach, warunki reakcji takie, jak czas, temperatura, stężenie i tym podobne, a także wydajności mieściły się w granicach zwykłych zakresów doświadczalnych. W powtarzanych przykładach, w których dokonano istotnych modyfikacji, zwrócono na nie uwagę tam, gdzie wyniki znacząco różniły się od opisanych. W przykładach, w których stosowano różne substraty umieszczono odpowiednie uwagi. W powtarzanych przykładach dotyczących „odpowiadającego” analogu związku, tak, jak „odpowiadający ester etylowy”, oznacza to, że grupą obecną w innym przypadku, a w tym przypadku typowo - ester metylowy, traktuje się tak samo, jak grupę zmodyfikowaną.

Przykłady 1 do 35 odnoszą się do schematów 1 do 9 przedstawionych powyżej.

P r z y k ł a d 1

Chlorek acetoksyetyloksymetylu 1: Kolbę trójszyjną o pojemności 5 I zaopatrzono w mieszadło mechaniczne, termometr, wkraplacz o pojemności 500 ml i przepłukano argonem. Dodano 1,3-dioksolanu (140 ml, 2,00 mole) w bezwodnym Et2O (800 ml) i 1,0 M ZnCI2/Et2O (7,5 ml, 0,007 mola). W ciągu 20 minut z wkraplacza wkroplono roztwór chlorku acetylu (157 ml, 2,20 mola) w Et2O (200 ml). Do utrzymania podczas wkraplania temperatury pomiędzy 19 i 27°C wykorzystano zimną łaźnię wodną. Mieszano w sposób ciągły przez 4 godziny bez zewnętrznego chłodzenia, mieszanina ogrzała się sama do temperatury 20-25°C przez około 1 godzinę. Klarowny, bezbarwny roztwór pozostawiono przez noc w atmosferze argonu. Po odstawieniu na 3 dni roztwór zabarwił się na pomarańczowo. Et2O usunięto na obrotowej wyparce próżniowej (podłączonej do pompki wodnej) aż do momentu, gdy nic już nie destylowało w środowisku ogrzewnym łaźnią o temperaturze 35°C. Produkt uzyskano z wydajnością ilościową wynoszącą 318 g (wydanośc teoretyczna 306 g).

P r z y k ł a d 2

Fosfonian diizopropylu 2: W kolbie trójszyjnej o pojemności 5 I umieszczono nieoczyszczony eter chlorometylowy 1 (317 g, 2,00 mole). Z wkraplacza wkroplono fosforan (III) triizopropylowy (494 ml) jednocześnie ogrzewając w łaźni olejowej o temperaturze 125°C i mieszając intensywnie. Przez nasadkę destylacyjną do odbieralnika z płaszczem argonowym chłodzonego suchym lodem zebrano 140 g

PL 212 403 B1 destylatu 2-chloropropanu (wydajność teoretyczna 157 g). Za pomocą fosforanu (III) doprowadzono mieszaninę reakcyjną do uzyskania barwy żółtej, po czym kontynuowano ogrzewanie przez kolejne 2 godziny w łaźni olejowej o temperaturze 125°C, a następnie przygotowano układ do destylacji próżniowej z wykorzystaniem pompy próżniowej. Przedestylowano żółtą frakcję początkową (140 g, 135°C na głowicy kolumny, 190°C na dole kolumny), następnie zmieniono odbieralnik na czysty. Główną frakcję zebrano przy temperaturze na głowicy kolumny 178-187°C (głównie 185-187°C) pod nieznaną próżnią przy temperaturze łaźni 222-228°C. Uzyskano 258 g produktu 2 (47% wydajności z 1,3-dioksolanu).

P r z y k ł a d 3

Alkohol 3: Roztwór 2 (125 g, 0,443 mola) w absolutnym MeOH (440 ml) poddano działaniu stężonego HCI (11,2 ml, 0,112 mola) i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w atmosferze agronu. MeOH usunięto na obrotowej wyparce próżniowej (podłączonej do pompki wodnej) do 55°C pozostawiając 115 g klarownego oleju, który współod parowa no z toluenem (2 x 200 ml). Nieoczyszczony produkt suszono pod próżnią do uzyskania oleju (102 g, 96%).

P r z y k ł a d 4

Fosfonian diizopropylu 4: Roztwór trifenylofosfiny (25,57 g, 97,5 mmola) i alkoholu 3 (18 g, 75 mmoli) w DMF (120 ml) poddano działaniu 6-chloropuryny (12,72 g, 75 mmoli) i schłodzono do -15°C. W ciągu 80 minut przez wkraplacz wkroplono roztwór azodikarboksylanu diizopropylu (16,68 g, 82,5 mmol) w DMF (50 ml). Mieszaninę reakcyjną utrzymywano -15°C przez 2 godziny, a następnie ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez dodatkowe 2 godziny. Zmętniała mieszanina reakcyjna przekształciła się w jasnożółty roztwór. Rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem, pozostałość współodparowano z toluenem (3 x) i suszono pod próżnią przez całą noc przed oczyszczaniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem fosfonianu diizopropylu (18,52 g, 63%) w postaci białego ciała stałego.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,95 (s, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,31 (m, 2H), 3,93 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 1,29 (m, 12H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 18,42.

P r z y k ł a d 5

Fosfonian diizopropylu 5: Mieszaninę 4 (11,00 g, 28,08 mmola) i cyklopropyloaminy (4,86 g, 85,16 mmola) w CH3CN (80 ml) umieszczono w bombie reakcyjnej i ogrzewano do 100°C przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną schłodzono następnie do temperatury pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt rozdzielono przez wytrząsanie z 15% MeOH/CH2CI2 (3 x) i solanką, wysuszono z Na2SO4, przesączono i zatężono. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) do uzyskania 5 (10,42 g, 90%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,59 (s, 1H), 5,83 (szeroki, s, 1H), 4,88 (szeroki, s, 2H), 4,70 (m, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,72 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,03 (szeroki, s, 1H), 1,28 (m, 12H), 0,84 (m, 2H), 0,60 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 18,63.

P r z y k ł a d 6 cPrPMEDAP 6: Roztwór 5 (11,00 g, 26,67 mmola) w bezwodnym CH3CN (120 ml) poddano działaniu bromotrimetylosilan (21,1 ml, 160,02 mmola). Mieszaninę reakcyjną chroniono przed światłem przez owinięcie kolby folią aluminiową. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez całą noc. Składniki lotne odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w H2O (250 ml), a pH doprowadzono do 9 przy użyciu wodorotlenku amonu. Mieszaninę reakcyjną zatężono i uzyskano żółte ciało stałe. Ciało stałe rozpuszczono w H2O (30 ml), a pH doprowadzono do 2 przy użyciu 10% HCI. Ciało stałe w postaci miałkiego osadu zebrano i wysuszono pod próżnią do uzyskania 6 (7,88 g, 90%) w postaci białego ciała stałego.

P r z y k ł a d 7

Chlorowodorek kwasu monofosfonowego 7: Mieszaninę kwasu 6 (3,00 g, 9,15 mmola) i DMF (0,1 ml) w sulfolanie (9,2 ml) ogrzano do 70°C. W ciągu 1 godziny wkroplono chlorek tionylu (1,66 ml, 22,76 mmola). Temperaturę zwiększono do 90°C, dodano TMSOPh (1,74 ml, 9,61 mmola) i całość mieszano przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej na całą noc. Następnie mieszaninę reakcyjną wkroplono do intensywnie mieszanego, schłodzonego lodem acetonu (100 ml), Produkt wytrącił się. Ciało stałe odsączono pod Ar, przemyto zimnym acetonem (100 ml),

PL 212 403 B1 wysuszono pod próżnią z uzyskaniem chlorowodorku kwasu monofosfonowego (3,70 g, 92%) w postaci ciała stałego

P r z y k ł a d 8

Amidomonofosfonian 8: Mieszaninę kwasu monofosfonowego 7 (0,22 g, 0,50 mmola), chlorowodorku estru metylowego L-alaniny (0,14 g, 1,00 mmol) oraz trietyloaminy (0,21 ml, 1,50 mmola) w pirydynie (3 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do wspomnianej powyżej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,39 g, 1,75 mmola) i trifenylofosfiny (0,46 g, 1,75 mmola) w pirydynie (2 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (97 mg, 39%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

P r z y k ł a d 9

Amidomonofosfonian 9: Mieszaninę kwasu monofosfonowego 7 (0,88 g, 2.00 mmol), chlorowodorku estru metylowego D-alaniny (0,84 g, 6,00 mmoli) i trietyloaminy (0,84 ml, 6,00 mmoli) w pirydynie (8 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do wspomnianej powyżej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (1,56 g, 7,00 mmoli) i and trifenylofosfiny (1,84 g, 7,00 mmoli) w pirydynie (8 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (0,40 g, 41%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

P r z y k ł a d 10

Amidomonofosfonian 10: Mieszaninę kwasu monofosfonowego 7 (0,88 g, 2,00 mmole), chlorowodorku estru tert-butylowego L-alaniny (1,31 g, 6,00 mmoli) i trietyloaminy (0,84 ml, 6,00 mmoli) w pirydynie (8 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do wspomnianej powyżej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (1,54 g, 7,00 mmoli) i trifenylofosfiny (1,84 g, 7,00 mmoli) w pirydynie (8 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (0,38 g, 36%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci jasnopomarańczowej piany.

P r z y k ł a d 11

Amidomonofosfonian 11: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-alaniny (94 mg, 0,60 mmola), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,13 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,13 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (74 mg, 48%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,61 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,26-7,08 (m, 5H), 4,23 (m, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,09 (m, 1H), 3,92-3,85 (m, 4H), 3,03 (szeroki, s, 1H), 1,30-1,26 (m, 3H), 1,24 (m, 3H), 0,88 (m, 2H), 0,63 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,94, 20,68.

P r z y k ł a d 12

Amidomonofosfonian 12: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (1,50 g, 4,56 mmola), chlorowodorku estru n-propylowego L-alaniny (1,59 g, 9,49 mmola), fenolu (2,25 g, 22,80 mmola) i trietyloaminy (10,50 ml, 54,72 mmola) w pirydynie (8,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (6,54 g, 31,92 mmola) i trifenylofosfiny (7,32 g, 31,92 mmol) w pirydynie (8,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez

PL 212 403 B1 całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (0,43 g, 18%, związek E, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,61 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,27-7,09 (m, 5H), 4,27-4,20 (m, 2H), 4,16-4,00 (m, 3H), 3,93-3,82 (m, 4H), 3,04 (szeroki, s, 1H), 1,63 (m, 2H), 1,30 (dd, 3H), 0,92 (m, 3H), 0,89 (m, 2H), 0,63 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,89, 20,66.

P r z y k ł a d 13

Amidomonofosfonian 13: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru izopropylowego L-alaniny (0,10 g, 0,60 mmola), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,13 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,13 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (87 mg, 55%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci żółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,26-7,09 (m, 5H), 4,98 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 3,91-3,83 (m, 4H), 3,04 (szeroki, s, 1H), 1,29-1,21 (m, 9H), 0,89 (m, 2H), 0,63 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,85, 20,68.

P r z y k ł a d 14

Amidomonofosfonian 14: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-alaniny (0,11 g, 0,60 mmola), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi^TM-u (0,47 g, 2,13 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,13 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (80 mg, 50%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,61 (d, J = 4,20 Hz, 1H), 7,27-7,08 (m, 5H); 5,93 (szeroki, s, 1H), 4,97 (szeroki, s, 2H), 4,23 (m, 2H), 4,10-4,08 (m, 3H), 3,91-3,84 (m, 4H), 3,03 (szeroki, s, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,34-1,27 (m, 5H), 0,92-0,89 (m, 5H), 0,63 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,94, 20,68.

P r z y k ł a d 15

Amidomonofosfonian 15: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-heksylowego L-alaniny (0,13 g, 0,60 mmola), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,13 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,13 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (0,10 g, 59%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,59 (d, J = 4,20 Hz, 1H), 7,26-7,08 (m, 5H), 4,22 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 4,06 (m, 2H), 3,91-3,84 (m, 4H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,31-1,27 (m, 9H), 0,89 (m, 3H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,94, 20,68.

P r z y k ł a d 16

Amidomonofosfonian 16: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola) i chlorowodorku estru n-oktylowego L-alaniny (0,15 g, 0,60 mmol), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy

PL 212 403 B1 (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,13 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,13 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (0,13 g, 73%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,59 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,25-7,07 (m, 5H), 4,22 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 4,07 (m, 2H), 3,90-3,84 (m, 4H), 3,02 (szeroki, s, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,29-1,26 (m, 13H), 0,88 (m, 3H), 0,85 (m, 2H), 0,60 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,96, 20,69.

P r z y k ł a d 17

Amidomonofosfonian 17: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (70 mg, 0,21 mmola), chlorowodorku estru etylowego kwasu L-2-aminomasłowego (72 mg, 0,42 mmola), fenolu (0,10 g, 1,05 mmola) i trietyloaminy (0,36 ml, 2,52 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,33 g, 1,47 mmola) i trifenylofosfiny (0,39 g, 1,47 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (66 mg, 60%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,26-7,08 (m, 5H), 5,91 (szeroki, s, 1H), 4,97 (szeroki, s, 2H), 4,22-4,12 (m, 4H), 4,01-3,81 (m, 5H), 3,03 (szeroki, s, 1H), 1,71-1,60 (m, 2H), 1,24 (m, 3H), 0,89 (m, 2H), 0,84-0,76 (m, 3H), 0,63 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 22,15, 20,93.

P r z y k ł a d 18

Amidomonofosfonian 18: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (1,00 g, 3,05 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego kwasu L-2-aminomasłowego (1,19 g, 6,09 mmola), fenolu (1,43 g, 15,23 mmola) i trietyloaminy (5,10 ml, 36,60 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (4,70 g, 21,32 mmola) i trifenylofosfiny (5,59 g, 21,32 mmola) w pirydynie (5,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (0,7 g, 42%, związek G, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, J = 6,60 Hz, 1H), 7,27-7,04 (m, 5H), 5,89 (szeroki, s, 1H), 4,94 (szeroki, s, 2H), 4,22 (m, 2H), 4,07-3,99 (m, 3H), 3,91-3,84 (m, 4H), 3,03 (szeroki, s, 1H), 1,70-1,57 (m, 4H), 1,35 (m, 2H), 0,92-0,75 (m, 8H), 0,63(m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 22,21, 20,95.

P r z y k ł a d 19

Amidomonofosfonian 19: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-oktylowego kwasu L-2-aminomasłowego (0,15 g, 0,60 mmola), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyzszej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,13 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,13 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (0,12 g, 64%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,62 (d, J = 6,60 Hz, 1H), 7,25-7,08 (m, 5H), 4,24-4,21 (m, 2H), 4,09-4,04 (m, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,91-3,83 (m, 4H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,70-1,58 (m, 4H), 1,27 (m, 10H), 0,89-0,76 (m, 8H), 0,62 (m, 2H);

PL 212 403 B1 ³¹P NMR (CDCI3) δ = 22,22, 20,92.

P r z y k ł a d 20

Amidomonofosfonian 20: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (1,5 g, 4,57 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-fenyloalaniny (2,10 g, 9,14 mmol), fenolu (2,15 g, 22,85 mmola) i trietyloaminy (7,64 ml, 54,84 mmola) w pirydynie (8,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (7,05 g, 31,99 mmola) i trifenylofosfiny (8,39 g, 31,99 mmola) w pirydynie (7,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) z bladożółtego ciała stałego w ilości 1,32 g, zawierającego około 10% zanieczyszczeń. Żółte ciało stałe (1,32 g, 2,28 mmola) rozpuszczono w iPrOH (10 ml) i przeniesiono do gorącego roztworu kwasu fumarowego (0,27 g, 2,28 mmola) w iPrOH (30 ml), po czym mieszano w 80°C przez 30 minut. Mieszaninę reakcyjną stopniowo schłodzono do temperatury pokojowej i zebrano fumaran w temperaturze 0°C. Otrzymany fumaran został zobojętniony przez rozdział z NaHCO3 (2 x) i EtOAc. Fazę organiczną przemyto solanką, wodą, wysuszono z Na2SO4, odsączono i zatężono. Produkt suszono pod próżnią do uzyskania amidomonofosfonianu (0,70 g, 26%, związek A, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,54 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,27-6,98 (m, 10H), 4,35 (m, 1H), 4,16 (m, 2H), 4,08 (m, 2H), 3,84-3,61 (m, 3H), 3,33 (m, 1H), 3,02 (szeroki, s, 1H), 2,95-2,87 (m, 2H), 1,17 (m, 3H), 0,87(m, 2H), 0,61 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,88, 21,07.

P r z y k a d 21

Amidomonofosfonian 21: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (70 mg, 0,21 mmola), chlorowodorku estru n- butylowego L-fenyloalamny (0,11 g, 0,42 mmola), fenolu (0,10 g, 1,05 mmola) i trietyloaminy (0,36 ml, 2,52 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,33 g, 1,47 mmola) i trifenylofosfiny (0,39 g, 1,47 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (30 mg, 23%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,55 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7,25-6,98 (m, 10H), 4,36 (m, 1H), 4,17 (m, 2H), 4,02 (m, 2H), 3,83-3,35 (m, 4H), 3,02 (szeroki, s, 1H), 2,94-2,86 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,29 (m, 2H), 0,90 (m, 3H), 0,88 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,85, 21,05.

P r z y k ł a d 22

Amidomonofosfonian 22: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (70 mg, 0,21 mmola), chlorowodorku estru izobutylowego L-fenyloalaniny (0,11 g, 0,42 mmola), fenolu (0,10 g, 1,05 mmola) i trietyloaminy (0,36 ml, 2,52 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,33 g, 1,47 mmola) i trifenylofosfiny (0,39 g, 1,47 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (65 mg, 50%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,56 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,26-6,98 (m, 10H), 4,40 (m, 1H), 4,17 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,75-3,62 (m, 3H), 3,35 (m, 1H), 3,04 (szeroki, s, 1H), 2,96-2,87 (m, 2H), 1,83 (m, 1H), 0,90 (m, 2H), 0,86 (m, 6H), 0,63 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,82, 21,03.

P r z y k ł a d 23

Amidobisfosfonian 23: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-alaniny (0,28 g, 1,80 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany

PL 212 403 B1 jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,10 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,10 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (80 mg, 50%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,63 (s, 1H), 5,88 (szeroki, s, 1H), 4,96 (szeroki, s, 2H), 4,24-4,16 (m, 6H), 4,00 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,36 (m, 6H), 1,26 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,61 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,63.

P r z y k ł a d 24

Amidobisfosfonian 24: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (1,00 g, 3,05 mmola), chlorowodorku estru n-propylowego L-alaniny (3,06 g, 18,30 mmola) i trietyloaminy (5,10 ml, 36,50 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (4,70 g, 21,32 mmola) i trifenylofosfiny (5,59 g, 21,32 mmola) w pirydynie (5,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (1,13 g, 71%, związek F) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,65 (s, 1H), 5,92 (szeroki, s, 1H), 5,03 (szeroki, s, 2H), 4,24 (m, 2H), 4,10-4,02 (m, 6H), 3,87 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 3,03 (szeroki, s, 1H), 1,65 (m, 4H), 1,37 (m, 6H), 0,93 (m, 6H), 0,88 (m, 2H), 0,63 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,61.

P r z y k ł a d 25

Amidobisfosfonian 25: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,60 g, 1,83 mmola), chlorowodorku estru izopropylowego L-alaniny (1,84 g, 10,98 mmola) i trietyloaminy (3,06 ml, 21,96 mmola) w pirydynie (3,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (2,82 g, 12,80 mmola) i trifenylofosfiny (3,36 g, 12,80 mmola) w pirydynie (3,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,53 g, 52%, związek B) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,65 (s, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,24 (m, 2H), 3,97 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,71 (m, 2H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,34 (m, 6H), 1,23 (m, 12H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,59.

P r z y k ł a d 26

Amidobisfosfonian 26: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-alaniny (0,33 g, 1,82 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,10 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,10 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (97 mg, 55%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,63 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 4,01 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,61 (m, 4H), 1,37 (m, 10H), 0,93 (m, 6H), 0,88 (m, 2H), 0,61 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,59.

P r z y k ł a d 27

Amidobisfosfonian 27: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-heksylowego L-alaniny (0,38 g, 1,80 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo

PL 212 403 B1 otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,10 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,10 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,13 g, 65%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,62 (s, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 4,01 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 2,99 (szeroki, s, 1H), 1,61 (m, 4H), 1,36-1,29 (m, 18H), 0,88 (m, 6H), 0,84 (m, 2H), 0,60 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,61.

P r z y k ł a d 28

Amidobisfosfonian 28: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-oktylowego L-alaniny (0,43 g, 1,80 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,10 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,10 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,13 g, 61%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,61 (s, 1H), 4,21 (m, 2H), 4,07-4,00 (m, 6H), 3,84-3,70 (m, 4H), 2,98 (szeroki, s, 1H), 1,60 (m, 4H), 1,34 (m, 6H), 1,27 (m, 20H), 0,87 (m, 6H), 0,83 (m, 2H), 0,58 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,63.

P r z y k ł a d 29

Amidobisfosfonian 29: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,70 g, 2,13 mmola), chlorowodorku estru etylowego kwasu L-2-aminomasłowego (2,15 g, 12,80 mmola) i trietyloaminy (3,57 ml, 25,56 mmola) w pirydynie (3,0 ml) ogrzewano w 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (3,29 g, 14,91 mmola) i trifenylofosfiny (3,92 g, 14,91 mmola) w pirydynie (3,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,71 g, 60%, związek D) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,16 (m, 4H), 3,89-3,87 (m, 4H), 3,72 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,78-1,64 (m, 4H), 1,26 (m, 6H), 0,91 (m, 6H), 0,87 (m, 2H), 0,61 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,23.

P r z y k ł a d 30

Amidobisfosfonian 30: Mieszanina kwasu fosfonowego 6 (0,70 g, 21,32 mmol), chlorowodorku estru n-butylowego kwasu L-2-aminomasłowego (2,50 g, 12,80 mmola) i trietyloaminy (3,57 ml, 25,56 mmola) w pirydynie (3,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (3,29 g, 14,91 mmola) i trifenylofosfiny (3,92 g, 14,91 mmola) w pirydynie (3,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nie oczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,40 g, 31%, związek C) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,11 (m, 4H), 3,91 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,71 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 3,03 (szeroki, s, 1H), 1,79-1,64 (m, 4H), 1,60 (m, 4H), 1,37 (m, 4H), 0,94 (m, 6H), 0,90 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,25.

P r z y k ł a d 31

Aminobisfosfonian 31: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-oktylowego kwasu L-2-aminomasłowego (0,33 g, 1,82 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,60 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,10 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g,

PL 212 403 B1

2,10 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,12 g, 55%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,13-4,05 (m, 4H), 3,91 (m, 2H), 3,87-3,72 (m, 4H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,78-1,65 (m, 4H), 1,61-1,29 (m, 24H), 0,91 (m, 6H), 0,89 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,20.

P r z y k ł a d 32

Amidobisfosfonian 32: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,60 g, 1,82 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-fenyloalaniny (2,51 g, 10,96 mmola) i trietyloaminy (3,06 ml, 21,84 mmola) w pirydynie (3,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (2,82 g, 12,74 mmola) i trifenylofosfiny (3,36 g, 12,74 mmola) w pirydynie (3,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem, Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,53 g, 43%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,48 (s, 1H), 7,22-7,06 (m, 10H), 4,20 (m, 1H), 4,12 (m, 4H), 4,09 (m, 2H), 4,04 (m, 1H), 3,63 (m, 2H), 3,33-3,21 (m, 2H), 3,04-2,78 (m, 5H), 1,20 (m, 6H), 0,83 (m, 2H), 0,58 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,38.

P r z y k ł a d 33

Amidobisfosfonian 33: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (70 mg, 0,21 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-fenyloalaniny (0,33 g, 1,26 mmola) i trietyloaminy (0,36 ml, 2,52 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyzszej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,33 g, 1,47 mmola) i trifenylofosfiny (0,39 g, 1,47 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidobisfosfonianu (0,11 g, 70%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,51 (s, 1H), 7,23-7,06 (m, 10H), 4,23 (m, 1H), 4,11-4,05 (m, 7H), 3,65 (m, 2H), 3,35-3,23 (m, 2H), 3,01 (m, 1H), 3,04-2,78 (m, 4H), 1,57 (m, 4H), 1,33 (m, 4H), 0,92 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,61 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,35.

P r z y k ł a d 34

Amidobisfosfonian 34: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (70 mg, 0,21 mmola), chlorowodorku estru izobutylowego L-fenyloalaniny (0,33 g, 1,26 mmola) i trietyloaminy (0,36 ml, 2,52 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,33 g, 1,47 mmola) i trifenylofosfiny (0,39 g, 1,47 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidobisfosfonianu (78 mg, 50%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,52 (s, 1H), 7,24-7,07 (m, 10H), 4,26 (m, 1H), 4,11 (m, 2H), 4,01 (m, 1H), 3,85 (m, 4H), 3,66 (m, 2H), 3,35-3,25 (m, 2H), 3,07-2,85 (m, 3H), 2,97-2,79 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 0,90 (m, 12H), 0,89 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,31.

P r z y k ł a d 35

BisPOC cPrPMEDAP 35: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (0,20 g, 0,61 mmola) i trietylaminy (0,42 ml, 3,01 mmola) w 1-metylo-2-pirolidonie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 30 minut. Dodano POCCI (0,45 g, 2,92 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez 3 godziny, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę

PL 212 403 B1 organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem bisPOC cPrPMEDAP (0,13 g, 39%) w postaci ciała stałego.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,58 (s, 1H), 5,66 (m, 4H), 4,92 (m, 2H), 4,22 (m, 2H), 3,90-3,88 (m, 4H), 3,01 (szeroki, s, 1H), 1,81 (m, 12H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,93.

Przykłady 36 do 38 odnoszą się do schematu 10.

P r z y k ł a d 36

Amidobisfosfonian 37: Mieszaninę kwasu fosfonowego 36 (0,32 g, 1,00 mmola), chlorowodorku estru butylowego L-alaniny (0,47 g, 2,60 mmola) i trietyloaminy (0,27 g, 2,60 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,77 g, 3,50 mmola) i trifenylofosfiny (0,92 g, 3,50 mmola) w pirydynie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidobisfosfonianu (0,43 g, 75%) w postaci bladożółtej piany.

P r z y k ł a d 37

Kwas monofosfonowy 38: Mieszaninę dikwasu 36 (1,30 g, 4,10 mmola) i DMF (0,1 ml) w sulfolanie (35 ml) ogrzewano do 70°C. W ciągu 1 godziny wkroplono chlorek tionylu (0,54 ml, 7,38 mmola). Temperaturę zwiększono do 90°C, dodano TMSOPh (0,75 g, 4,51 mmola), mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę. Następnie mieszaninę reakcyjną schłodzono w ciągu całej nocy do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną wkroplono do intensywnie mieszanego, schłodzonego lodem acetonu (100 ml). Produkt wytrącił się. Ciało stałe odsączono i rozpuszczono w MeOH (40 ml), po czym pH doprowadzono do wartość, 3 przy użyciu 45%-owego roztworu KOH. Ciało stałe zebrano poprzez odsączenie. Produkt oczyszczano dalej przez rozpuszczenie w MeOH, doprowadzenie pH do 6 przy użyciu 45% roztworu KOH oraz wykrystalizowanie ze schłodzonego lodem acetonu do uzyskania kwasu monofosfonowego (0,20 g, 12%) w postaci białawego ciała stałego.

P r z y k ł a d 38

Amidomonofosfonian 39: Mieszaninę kwasu monofosfonowego 38 (0,20 g, 0,50 mmola), chlorowodorku estru izopropylowego L-alaniny (0,17 g, 1,00 mmola) i trietyloaminy (0,10 g, 1,00 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,39 g, 1,75 mmola) i trifenylofosfiny (0,46 g, 1,75 mmola) w pirydynie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4 odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidomonofosfonianu (0,14 g, 54%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtej piany.

Przykład 39 odnosi się do schematu 11.

P r z y k ł a d 39

Amidobisfosfonian 41: Mieszaninę kwasu fosfonowego 40 (0,36 g, 1,00 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-alaniny (0,47 g, 2,60 mmola) i trietyloaminy 0,27 g, 2,60 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,77 g, 3,50 mmola) i trifenylofosfiny (0,92 g, 3,50 mmola) w pirydynie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,32 g, 35%) w postaci bladożółtej piany.

Przykłady 40 do 56 odnoszą się do schematów 12 do 16.

P r z y k ł a d 40

Amidobisfosfonian 43: Mieszaninę kwasu fosfonowego 42 (0,37 g, 1,00 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-alaniny (0,47 g, 2,60 mmola) i trietyloaminy (0,27 g, 2,60 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,77 g, 3,50 mmola) i trifenylofosfiny (0,92 g, 3,50 mmola)

PL 212 403 B1 w pirydynie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nie oczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,53 g, 85%) w postaci bladożółtej piany.

P r z y k ł a d 41

Amidobisfosfonian 45: Mieszaninę kwasu fosfonowego 44 (0,55 g, 2,00 mmola), chlorowodorku estru butylowego L-alaniny (0,94 g, 5,20 mmola) oraz trietyloaminy (0,54 g, 5,20 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (1,54 g, 7,00 mmoli) i trifenylofosfiny (1,84 g, 7,00 mmoli) w pirydynie (5,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (0,48 g, 45%) w postaci bladożółtej piany.

P r z y k ł a d 42

Kwas monofosfonowy 46: Mieszaninę dikwasu 44 (10,00 g, 36,30 mmola) i DMF (0,2 ml) w sulfolanie (50 ml) ogrzewano do 70°C. W ciągu 1 godziny wkroplono chlorek tionylu (4,72 ml, 64,70 mola). Temperaturę zwiększono do 90°C, dodano TMSOPh (6,65 g, 40,00 mmoli) i całość mieszano przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i pozostawiono na całą noc. Następnie mieszaninę reakcyjną wkroplono do intensywnie mieszanego, lodowatego acetonu (100 ml). Produkt wytrącił się. Ciało stałe odsączono i rozpuszczono w MeOH (40 ml), po czym pH doprowadzono do wartości 3 przy pomocy 45%-owego roztworu KOH. Ciało stałe zebrano poprzez odsączenie i suszono pod próżnią do uzyskania kwasu monofosfonowego (12,40 g, 97%) w postaci ciała stałego.

P r z y k ł a d 43

Amidomonofosfonian 47: Mieszaninę kwasu monofosfonowego 46 (1,00g, 2,86 mmola), chlorowodorku estru metylowego L-alaniny (0,80 g, 5,73 mmola) i trietyloaminy (0,58 g, 5,73 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (2,21 g, 10,00 mmoli) i trifenylofosfiny (2,63 g, 10,00 mmoli) w pirydynie (5,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidomonofosfonianu (0,80 g, 64%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci bladożółtego oleju.

P r z y k ł a d 44

Amidomonofosfonian 48: Mieszaninę kwasu monofosfonowego 46 (0,35 g, 1,00 mmol), chlorowodorku estru izopropylowego L-alaniny (0,34 g, 2,00 mmole) i trietyloaminy (0,20 g, 2,00 mmole) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,77 g, 3,50 mmola) i trifenylofosfiny (0,92 g, 3,50 mmola) w pirydynie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (7% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidomonofosfonianu zawierającego pewną ilość zanieczyszczeń. Otrzymany związek poddano działaniu kwasu fumarowego (77 mg) w gorącym CH3CN (10 ml) i schłodzono do temperatury pokojowej. Produkt wytrącono z roztworu i suszono pod próżnią do uzyskania fumaranu amidomonofosfonianu (0,13 g, 22%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci ciała stałego.

P r z y k ł a d 45

Eter benzylowy PMEG 50: Mieszaninę dikwasu 49 (0,62 g, 2,00 mmole) i alkoholu benzylowego (10 ml) mieszając schłodzono do 0°C. Porcjami dodano wodorek sodu (0,24 g, 10,00 mmoli), po czym mieszaninę ogrzewano do 100°C przez 1 godzinę. Dodano dodatkową ilość alkoholu benzylowego (20 ml) i wodorku sodu (0,12 g, 5,00 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 140°C przez 1 godzinę i schłodzono do temperatury pokojowej. Składniki lotne usunięto przez odparowanie pod obniżonym

PL 212 403 B1 ciśnieniem, dodano wodę (50 ml) i dostosowano pH do wartości 11 za pomocą NaOH. Produkt rozdzielono pomiędzy toluen (3 x) i H2O. Fazę wodną zakwaszono przy użyciu HCI do pH = 3 i utrzymywano przez całą noc. Produkt zebrano i suszono pod próżnią do uzyskania eteru benzylowego (0,18 g, 22%) w postaci brązowawego ciała stałego.

P r z y k ł a d 46

Amidomonofosfonian 51: Mieszaninę kwasu fosfonowego 50 (0,13 g, 0,34 mmola), chlorowodorku estru izopropylowego L-alaniny (0,11 g, 0,68 mmola), fenolu (0,16 g, 1,69 mmola) i trietyloaminy (0,28 ml, 2,03 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyzszej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,52 g, 2,37 mmola) i trifenylofosfiny (0,62 g, 2,37 mmola) w pirydynie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidomonofosfonianu (50 mg, 26%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci gęstego oleju.

P r z y k ł a d 47

Amidomonofosfonian 52: Mieszaninę amidomonofosfonianu 51 (50 mg, 0,09 mmola) i Pd(OH)2/C (50 mg) w iPrOH (3 ml) mieszano w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem 1 atm H2 (balon) przez całą noc. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez wkładkę celitową i usunięto rozpuszczalnik na wyparce obrotowej pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5-15% MeOH/CHCI3) do uzyskania amidomonofosfonianu (40 mg, 95%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

P r z y k ł a d 48

Amidobisfosfonian 54: Mieszaninę kwasu fosfonowego 53 (0,10 g, 0,35 mmola), chlorowodorku estru butylowego L-alaniny (0,38, 2,10 mmola) i trietyloaminy (0,58 ml, 4,20 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,53 g, 2,45 mmola) i trifenylofosfiny (0,64 g, 2,45 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (15% MeOH/CH2CI2) do uzyskania amidobisfosfonianu (25 mg, 13%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CD3OD) δ = 7,82 (s, 1H), 4,26 (m, 2H), 4,11 (m, 4H), 3,94 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,78 (m, 2H), 1,61 (m, 4H), 1,39 (m, 4H), 1,34 (m, 6H), 0,95 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 23,39.

P r z y k ł a d 49

Fosfonian diizopropylowy 55: Mieszaninę związku 4 (3,00 g, 7,66 mmola) oraz 10% Pd/C (0,60 g) w MeOH (30 ml) mieszano w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem 1 atm H2 (balon) przez całą noc. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez wkładkę celitową i usunięto rozpuszczalnik na wyparce obrotowej. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (5% MeOH/CHCI3) do uzyskania fosfonianu diizopropylowego (2,08 g, 76%) w postaci gęstego oleju, który zestalił się po odstaniu:

¹H NMR (CDCI3) δ = 8,72 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 4,73 (m, 2H), 4,33 (m, 2H), 3,97 (m, 2H), 3,73 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 1,31 (m, 12H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 18,47.

Pr z y k ł a d 50

Kwas fosfonowy 56: Fosfonian diizopropylowy 55 (0,10 g, 0,28 mmola) rozpuszczono w CH3CN (1,5 ml) i schłodzono do 0°C. Dodano bromotrimetylosilan (0,18 ml, 1,40 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 2 godziny i pozostawiono na całą noc do ogrzania do temperatury pokojowej. Dodano DMF (0,5 ml) do utworzenia roztworu i mieszano przez 2 godziny. Składniki lotne usunięto przez odparowanie pod obniżonym ciśnieniem. Pozostały roztwór w DMF powoli dodano do lodowatego CH3CN, w wyniku czego wytrącił się produkt. Ciało stałe zebrano i suszono pod próżnią do uzyskania kwasu fosfonowego (74 mg, 95%) w postaci białego ciała stałego.

P r z y k ł a d 51

Amidobisfosfonian 57: Mieszaninę kwasu fosfonowego 56 (23 mg, 0,08 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-alaniny (91 mg, 0,50 mmola) i trietyloaminy (0,14 ml, 0,96 mmola) w pirydynie

PL 212 403 B1 (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,11 g, 0,56 mmola) i trifenylofosfiny (0,12 g, 0,56 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (17 mg, 38%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 8,65 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 5,20 (s, szeroki, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,20-3,92 (m, 6H), 3,89 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 1,61 (m, 4H), 1,32 (m, 8H), 0,96 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,70.

P r z y k ł a d 52

Amidomonofosfonian 58: Mieszaninę kwasu fosfonowego 56 (20 mg, 0,07 mma), chlorowodorku estru etylowego L-fenyloalaniny (33 mg, 0,14 mmola), fenolu (33 mg, 0,35 mmola) i trietyloaminy (0,12 ml, 0,84 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,11 g, 0,56 mmola) i trifenylofosfiny (0,12 g, 0,56 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (13 mg, 34%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 8,69 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,84 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,25-6,97 (m, 10H), 4,35 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,08 (m, 2H), 3,85 (m, 1H), 3,72 (m, 1H), 3,73-3,62 (m, 1H), 3,38 (m, 1H), 2,95-2,86 (m, 2H), 1,17 (m, 3H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,67, 20,84.

P r z y k ł a d 53

Fosfonian diizopropylowy 59: Mieszaninę związku 4 (1,00 g, 2,56 mmola) i alliloaminy (3 ml) w CH3CN (3 ml) umieszczono w fiolce scyntylacyjnej i ogrzewano do 65°C przez 5 godzin. Mieszaninę schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i solankę, wysuszono z Na2SO4, odsączono i zatężono. Następnie, produkt rozpuszczono w minimalnej ilości CH3CN, dodano H2O i poddano produkt liofilizacji do uzyskania fosfonianu diizopropylowego (1,00 g, 95%).

P r z y k ł a d 54

Kwas fosfonowy 60: Fosfonian diizopropylowy 59 (1,00 g, 2,43 mmola) rozpuszczono w CH3CN (1,5 ml) i schłodzono do 0°C. Dodano bromotrimetylosilan (0,31 ml, 12,15 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 2 godziny i pozostawiono na całą noc do ogrzania się do temperatury pokojowej. Dodano DMF (0,5 ml) do utworzenia roztworu i mieszano przez 2 godziny. Dodano MeOH i mieszano przez 2 godziny. Składniki lotne usunięto przez odparowanie pod obniżonym ciśnieniem. Pozostały roztwór w DMF powoli dodano do lodowatego CH3CN w wyniku czego wytrącił się produkt. Ciało stałe zebrano i suszono pod próżnią do uzyskania kwasu fosfonowego (0,48 g, 60%) w postaci białego ciała stałego.

P r z y k ł a d 55

Amidomonofosfonian 61 i amidobisfosfonian 62: Mieszaninę dikwasu 60 (0,40 g, 1,20 mmola), chlorowodorku estru izopropylowego L-alaniny (0,49 g, 2,40 mmola), fenolu (0,68 g, 7,20 mmola) i trietyloaminy (1,0 ml, 7,20 mmola) w pirydynie (3,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (1,84 g, 8,40 mmola) i trifenylofosfiny (2,20 g, 8,40 mmola) w pirydynie (3,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nie oczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5-10% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidomonofosfonianu 61 (0,52 g, 37%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) i amidobisfosfonianu 62 (0,13 g, 20%).

P r z y k ł a d 56

Amidobisfosfonian 63: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,33 g, 1,00 mmola), chlorowodorku estru butylowego L-alaniny (0,47 g, 2,60 mmola) i trietyloaminy (0,27 g, 2,60 mmola) w pirydynie (5,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany

PL 212 403 B1 jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,77 g, 3,50 mmola) i trifenylofosfiny (0,92 g, 3,50 mmola) w pirydynie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (10% MeOH/CH2CI2) z uzyskaniem amidobisfosfonianu (0,32 g, 55%) w postaci bladożółtej piany.

Przykład 57 odnosi się do schematu 17.

P r z y k ł a d 57

BisPOC 6-allilo-PMEDAP 64: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,20 g, 0,61 mmola) i trietyloaminy (0,42 ml, 3,01 mmola) w 1-metylo-2-pirolidonie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 30 minut. Dodano POCCI (0,45 g, 2,92 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez 3 godziny, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem bisPOC 6-allilo-PMEDAP 64 (0,11 g, 32%, GS 192727) w postaci ciała stałego.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,66 (m, 4H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,92 (m, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,22 (m, 4H), 3,95 (m, 4H), 1,35 (m, 12H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,94.

Przykłady 58 do 61 odnoszą się do schematu 18.

P r z y k ł a d 58

Amidobisfosfonian 65: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-alaniny (0,1 g, 0,65 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (23 mg, 41%) w postaci bloadożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,70 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,30 (m, 4H), 4,20-4,00 (m, 6H), 3,89 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,42 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 1,45-1,25 (m, 12H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,77.

P r z y k ł a d 59

Amidobisfosfonian 66: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru cyklobutylowego L-alaniny (0,33 g, 0,91 mmola) i trietyloaminy (0,50 ml, 3,59 mmola) w pirdynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,12 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,14 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (45 mg, 26%) w postaci bladożótłej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,78 (s, 2H), 4,30 (m, 4H), 4,00 (m, 2H), 3,89 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,38 (m, 1H), 3,19 (m, 1H), 2,38 (m, 4H), 2,10(m, 4H), 1,85-1,60 (m, 4H), 1,45 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,61.

P r z y k ł a d 60

Amidobisfosfonian 67: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-heksylowego L-alaniny (0,25 g, 1,21 mmola) i trietyloaminy (0,7 ml, 5,02 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,12 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,14 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem.

PL 212 403 B1

Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (80 mg, 41%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,65 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,80 (s, 2H), 4,25 (m, 4H), 4,20-4,00 (m, 6H), 3,85 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,42 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 1,70 (m, 4H), 1,32 (m, 18H), 0,96 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,61.

P r z y k ł a d 61

Amidobisfosfonian 68: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego kwasu L-2-aminomasłowego (0,13 g, 0,64 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (32 mg, 49%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,68 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,70 (s, szeroki, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 4,80 (s, 2H), 4,25 (m, 4H), 4,20-4,05 (m, 6H), 3,89 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,35 (m, 1H), 3,15 (m, 1H), 1,86-1,60 (m, 8H), 1,40 (m, 4H), 0,96 (m, 12H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,25.

Przykłady 62 do 71 odnoszą się do schematu 19.

P r z y k ł a d 62

Amidobisfosfonian 69: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-fenyloalaniny (0,15 g, 0,65 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,5 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (28 mg, 39%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,58 (s, 1H), 7,28-7,03 (m, 10H), 6, 00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,25-4,00 (m, 8H), 3,65 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 3,15-2,77 (m, 6H), 1,23 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,34.

P r z y k ł a d 63

Amidobisfosfonian 70: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-fenyloalaniny (0,15 g, 0,58 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (49 mg, 63%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,58 (s, 1H), 7,28-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,70 (s, szeroki, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (s, 2H), 4,25-4,03 (m, 8H), 3,65 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 3,17-2,78 (m, 6H), 1,61 (m, 4H), 1,32 (m, 4H), 0,96 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,35.

P r z y k ł a d 64

Amidobisfosfonian 71: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru izobutylowego L-fenyloalaniny (0,31 g, 1,20 mmola) i trietyloaminy (0,7 ml, 5,02 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,44 g, 2,00 mmola) i trifenylofosfiny (0,53 g, 2,00 mmole) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem.

PL 212 403 B1

Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (94 mg, 42%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,55 (s, 1H), 7,27-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,70 (s, szeroki, 1H), 5,25 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (s, 2H), 4,25-4,08 (m, 4H), 3,87 (m, 4H), 3,65 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 3,17-2,78 (m, 6H), 1,97 (m, 2H), 0,96 (m, 12H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,31.

P r z y k ł a d 65

Amidomonofosfonian 72: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-alaniny (32 g, 0,20 mmola), fenolu (50 mg, 0,53 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (12 mg, 22%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,62 (d, 1H), 7,30- 7,04 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 4,30-4,05 (m, 7H), 3,90-3,80 (m, 4H), 1,23 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,89, 20,65.

P r z y k ł a d 66

Amidomonofosfonian 73: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-alaniny (39 mg, 0,21 mmola), fenolu (50 mg, 0,53 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (16 mg, 28%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,61 (d, 1H), 7,32- 7,06 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,80 (s, szeroki, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,20 (dd, 1H), 4,80 (m, 2H), 4,30-4,05 (m, 7H), 3,90- 3,80 (m, 4H), 3,90-3,60 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 1,32 (m, 5H), 0,96 (m, 3H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,96, 20,70.

P r z y k ł a d 67

Amidomonofosfonian 74: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru cyklobutylowego L-alaniny (0,11 g, 0,61 mmola), fenolu (0,13 g, 1,39 mmola) i trietyloaminy (0,5 ml, 3,59 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,12 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,14 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (28 mg, 17%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, 1H), 7,25- 7,03 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,79 (d, 2H), 4,28-4,05 (m, 4H), 3,90 (m, 4H), 3,70 (m, 1H), 3,57 (m, 1H), 2,30 (m, 2H), 2,00-1,60 (m, 4H), 1,25 (m, 3H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,91, 20,64.

P r z y k ł a d 68

Amidomonofosfonian 75: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru n-heksylowego L-alaniny (0,13 g, 0,61 mmola), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy (0,7 ml, 5,02 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,12 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,14 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą

PL 212 403 B1 noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (28 mg, 16%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, 1H), 7,25-7,03 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,35-4,05 (m, 7H), 3,90 (m, 4H), 3,70 (m, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,30 (m, 9H), 0,96 (m, 3H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,97, 20,69.

Przykłady 69 do 72 odnoszą się do schematu 21.

P r z y k ł a d 69

Amidomonofosfonian 76: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego kwasu L-2-aminomasłowego (42 mg, 0,21 mmola), fenolu (50 mg, 0,53 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (17 mg, 29%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, 1H), 7,25-7,03 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,30-4,03 (m, 7H), 3,95-3,80 (m, 4H), 3,62 (m, 1H), 3,40 (m, 1H), 1,80-1,60 (m, 4H), 1,38 (m, 2H), 0,98-0,75 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 22,26, 20,95.

P r z y k ł a d 70

Amidomonofosfonian 77: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru etylowego L-fenyloalaniny (48 mg, 0,21 mmola), fenolu (50 mg, 0,53 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (14 mg, 23%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, 1H), 7,25-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,80 (m, 2H), 4,40- 4,08 (m, 7H), 3,85-3,65 (m, 4H), 3,38-3,25 (m, 2H), 2,95-2,86 (m, 2H), 1,20 (m, 3H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,86, 21,06.

P r z y k ł a d 71

Amidomonofosfonian 78: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (35 mg, 0,11 mmola), chlorowodorku estru n-butylowego L-fenyloalaniny (55 mg, 0,21 mmola), fenolu (50 mg, 0,53 mmola) i trietyloaminy (0,2 ml, 1,43 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,16 g, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (0,20 g, 0,75 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (18 mg, 28%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, 1H), 7,25- 0 6,97 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,80 (s, szeroki, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,40-4,03 (m, 7H), 3,85-3,65 (m, 4H), 3,45-3,25 (m, 2H), 2,95-2,86 (m, 2H), 1,57 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 0,96 (m, 3H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,89, 21,09.

PL 212 403 B1

P r z y k ł a d 72

Amidomonofosfonian 79: Mieszaninę kwasu fosfonowego 60 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru izobutylowego L-fenyloalaniny (0,16 g, 0,61 mmola), fenolu (0,14 g, 1,52 mmola) i trietyloaminy (0,7 ml, 5,02 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,12 mmola) i trimetylofosfiny (0,56 g, 2,14 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) z otrzymaniem amidomonofosfonianu (19 mg, 10%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (d, 1H), 7,25-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,45 (m, 1H), 4,35-4,18 (m, 4H), 3,95-3,60 (m, 5H), 3,35 (m, 1H), 3,00-2,83 (m, 2H), 1,85 (m, 1H), 0,96 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,90, 21,07.

P r z y k ł a d 73

Amidomonofosfonian 80: Mieszaninę kwasu monofosfonowego 6 (0,10 g, 0,30 mmola), chlorowodorku estru cyklobutylowego L-alaniny (0,11 g, 0,61 mmola), fenolu (0,13 g, 1,4 mmola) i trietyloaminy (0,51 ml, 3,67 mmola) w pirydynie (2 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,12 mmola) i trimetylofosfiny (0,56 g, 2,14 mmola) w pirydynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2), a następnie oczyszczano go metodą HPLC na urządzeniu firmy (CH3CN/H2O) do uzyskania amidomonofosfonianu (33 mg, 20%, mieszanina diastereoizomerów 1:1) w postaci białawej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (s, 1H), 7,30-7,03 (m, 5H), 5,80 (s, szeroki, 1H), 5,00 (m, 1H), 4,80 (d, 2H), 4,28-4,05 (m, 3H), 3,90 (m, 4H), 3,03 (s, szeroki, 1H), 2,35 (m, 2H), 2,05 (m, 2H), 1,80 (m, 2H), 1,30 (m, 3H), 0,90 (m, 2H), 0,62 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 21,91, 20,61.

P r z y k ł a d 74

Amidobisfosfonian 81: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (60 mg, 0,18 mmola), chlorowodorku estru cyklobutylowego L-alaniny (0,13 g, 0,72 mmola) i trietyloaminy (0,31 ml, 2,16 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyzszej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,28 g, 1,26 mmola) i trifenylofosfiny (0,34 g, 1,26 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (30 mg, 28%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,60 (s, 1H), 5,70 (s, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,90 (s, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,00 (m, 2H), 3,90 (m, 2H), 3,78 (m, 2H), 3,40 (m, 1H), 3,21 (m, 1H), 3,03 (s, szeroki, 1H), 2,35 (m, 4H), 2,05 (m, 4H), 1,90-1,65 (m, 4H), 1,32 (m, 6H), 0,90 (m, 2H), 0,60 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,70.

P r z y k ł a d 75

Amidobisfosfonian 82: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (60 mg, 0,18 mmola), chlorowodorku estru cyklopentylowego L-alaniny (0,13 g, 0,72 mmola) i trietyloaminy (0,31 ml, 2,16 mmola) w pirydynie (1,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej « mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,28 g, 1,26 mmola) i trifenylofosfiny (0,34 g, 1,26 mmola) w pirydynie (0,5 ml) dodano do powyższej mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (30 mg, 27%) w postaci bladożółtej piany.

PL 212 403 B1 ¹H NMR (CDCI3) δ = 7,62 (s, 1H), 5,72 (s, 1H), 5,20 (m, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,25(m, 2H), 4,04-3,88 (m, 4H), 3,74 (m, 2H), 3,40 (m, 1H), 3,23 (m, 1H), 3,03 (s, szeroki, 1H), 1,95-1,58 (m, 16H), 1,37 (m, 6H), 0,90 (m, 2H), 0,60 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,64.

P r z y k ł a d 76

Amidobisfosfonian 83: Mieszaninę kwasu fosfonowego 6 (40 mg, 0,12 mmola), chlorowodorku estru cyklobutylowego L-fenyloalaniny (0,13 g, 0,48 mmola) i trietyloaminy (0,20 ml, 1,44 mmola) w pirydynie (0,5 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,19 g, 0,85 mmola) i trifenylofosfiny (0,22 g, 0,85 mmola) w pirydynie (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatęzono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (5% MeOH/CH2CI2) z otrzymaniem amidobisfosfonianu (20 mg, 22%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,50 (s, 1H), 7,28-7,05 (m, 10H), 5,72 (s, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,90 (s, 2H), 4,23-4,03 (m, 4H), 3,68 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 3,15-2,82 (m, 7H), 2,38 (m, 4H), 2,00 (m, 4H), 1,85-1,55 (m, 4H), 0,90 (m, 2H), 0,60 (m, 2H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,31.

Przykłady 77 i 78 odnoszą się do schematu 23.

P r z y k ł a d 77

Fosfonian diizopropylowy 84: Mieszaninę 4 (5,0 g, 12,82 mmola) i trifluoroetyloaminy (6,35 g, 64,10 mmola) w CH3CN (40 ml) umieszczono w bombie reakcyjnej i ogrzewano do 80°C przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną schłodzono następnie do temperatury pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt rozdzielono przez wytrząsanie z 15% MeOH/CH2CI2 (3 x) i solanką, wysuszono z Na2SO4, przesączono i zatężono. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2), a następnie oczyszczano go metodą HPLC za pomocą urządzenia z firmy Gilson (CH3CN/H2O) do uzyskania związku 84 (3,26 g, 56%) w postaci bladożółtej piany.

P r z y k ł a d 78

Amidobisfosfonian 85: Mieszaninę kwasu fosfonowego 42 (0,11 g, 0,29 mmola), chlorowodorku estru cyklobutylowego L-alaniny (0,31 g, 1,75 mmola) i trietyloaminy (0,52 ml, 3,67 mmola) w pirydynie (2,0 ml) ogrzewano do 60°C przez 5 minut. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodano świeżo otrzymany jasnożółty roztwór Aldrithioi™-u (0,47 g, 2,12 mmola) i trifenylofosfiny (0,56 g, 2,12 mmola) w piridynie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 60°C przez całą noc, schłodzono do temperatury pokojowej i zatężono. Produkt rozdzielono pomiędzy EtOAc i nasycony NaHCO3. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono z Na2SO4, odsączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Nieoczyszczony produkt oczyszczono metodą chromatografii na ISCO (2-propanol/CH2CI2) do uzyskania amidobisfosfonianu (97 mg, 54%) w postaci bladożółtej piany.

¹H NMR (CDCI3) δ = 7,65 (s, 1H), 5,90 (s, szeroki, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,35-4,20 (m, 4H), 4,00 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,70 (d, 2H), 3,38 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 2,30 (m, 4H), 2,00 (m, 4H), 1,90-1,60 (m, 4H), 1,35 (m, 6H);

³¹P NMR (CDCI3) δ = 20,61.

P r z y k ł a d 79

W tym przykładzie przedstawiono testy wykorzystywane do wykazywania działania antyproliferacyjnego.

Typy komórek stosowane w testach na występowanie własności antyproliferacyjnych

Linie ludzkich komórek rakowych stosowane w testach na występowanie własności antyproliferacyjnych obejmują sześć linii komórkowych raka szyjki macicy z trzema typami HPV (HPV-16, HPV-18, HPV-39), jedną linią linię komórkową raka szyjki macicy nie wykazującą obecności HPV i dwiema liniami komórkowymi rakowych podobnych do keratynocytów, pobranych z języka.

Zwykłe komórki ludzkie poddane testowi obejmowały keratynocyty skóry, keratynocyty szyjki macicy i fibroblasty z płuc.

Keratynocyty skóry i keratynocyty szyjki macicy uzyskano z firmy Cambrex (East Rutherford, NJ), zaś wszystkie pozostałe komórki uzyskano z kolekcji szczepów i linii komórkowych American Type Culture Collection (Manassas, VA).

W tabeli 79-1 przedstawiono streszczenie charakterystyki każdego z typów komórek i warunki hodowli.

PL 212 403 B1

Procedura testu na występowanie własności antyproliferacyjnych

1. Hodowla komórek

Komórki pobrano z kolb, w których prowadzono hodowlę za pomocą trypsyny, następnie zliczono i umieszczono na 96-studzienkowych płytkach do hodowli (250-1000 komórek na studzienkę, w zależności od typu komórek. Następnego dnia (określonego jako dzień 0), po przylgnięciu komórek do dna studzienek, dodano serie pięciokrotnie rozcieńczonych roztworów związków, każdy roztwór do dwóch studzienek. Do studzienek kontrolnych nie wprowadzono związku bądź wprowadzono 10 μΜ kolchicyny (inhibitora podziału komórek) - co przedstawiało - odpowiednio - 100% proliferacji i 0% proliferacji.

2. Barwienie komórek sulforodaminą B

Siedem dni po dodaniu związków, płytki do hodowli poddano działani 10% kwasu trichlorooctowego w 4°C przez 1 godzinę, a następnie przemyto wodą. Procedura ta umożliwiła białkom pochodzącym z komórek na przyłączenie się do powierzchni dna płytek. Białka barwiono 0,4% roztworem sulforodaminy B w 1% kwasie octowym przez 10 minut, po czym obficie przemywano 1% kwasem octowym. Pozostały barwnik przyłączony do dna płytek rozpuszczono w 10 mM zasadzie Trizma. Spowodowało to pojawienie się barwy purpurowej, którą określono ilościowo przez pomiar absorbancji przy długości fali 510 nm przy zastosowaniu spektrofotometru.

3. Analiza danych

Na podstawie danych doświadczalnych stworzono sigmoidalną krzywą zależności dawka- odpowiedź i przy pomocy programu GraphPad Prism, wersja 4.01 dla systemu Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA) wyliczono wartość skutecznego stężenia dla 50% (EC50).

T a b e l a 79-1

Typy komórek stosowane w testach na występowanie własności antyproliferacyjnych

Nazwa	Status wzgl. HPV	Pochodzenie	Pożywki hodowlane*
Linie komórek rakowych zakażonych wirusem HPV
SiHa	HPV-16 (1-2 kopie na komórkę)	Rak komórek płaskich nabłonka w szyjce macicy	A1, A2
CaSki	HPV-16 (600 kopii na komórkę)	Rak płaskonabłonkowy, przerzut z jelita cienkiego do szyjki macicy	A1, A2
MS751	HPV-18 (zawiera również cząstkowy genom HPV-45)	Rak płaskonabłonkowy, przerzut z szyjki macicy do węzła chłonnego	A1, A2
HeLa	HPV-18	Gruczolakorak nabłonkowy w szyjce macicy	A1, A2
C-4 I	HPV-18	Rak szyjki macicy	A1, A2
ME-180	HPV-39	Rak płaskonabłonkowy, przerzut z szyjki macicy do sieci	A1, A2
Linie komórek rakowych nie zakażonych wirusem HPV
HT-3	Brak	Rak, przerzut z szyjki macicy do węzła chłonnego	A1, A2
SCC-4	Brak	Rak komórek płaskich nabłonka języka	A1, A2
SCC-9	Brak	Rak komórek płaskich nabłonka języka	A1, A2
Komórki ze zwykłych tkanek ludzkich
HEL299	Brak	Fibroblasty z płuca embriona	A1, A2
PHK (keratynocyty skóry)	Brak	Keratynocyty w napletku osobnika dorosłego	B1, B2
CK (keratynocyty brak szyjki macicy)	Brak	Keratynocyty w szyjce macicy osobnika dorosłego	B1, B2

* pożywki hodowlane

PL 212 403 B1

Komórki trzymano w nawilżanych inkubatorach w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2, w następujących pożywkach hodowlanych.

A1: pożywka do utrzymania komórek przy życiu: Eagle MEM z BSS Earle'a (Cambrex, East Rutherford, NJ), z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

A2: pożywka do testów na występowanie własności antyproliferacyjnych: Eagle MEM z BSS Earle'a, z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

B1: pożywka do utrzymania komórek przy życiu: Keratinocyte-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA), z dodatkiem 0,01 mg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej, 0,001 μg/ml rekombinowanego nabłonkowego czynnika wzrostu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

B2: pożywka do testów na występowanie własności antyproliferacyjnych: mieszanka B1 i A2 w stosunku 4:1.

Wyniki

1. Selektywne działanie antyproliferacyjne proleków amidowych w przypadku komórek SiHa zakażonych wirusem HPV porównane z działaniem w przypadku normalnych fibroblastów.

Celem badania było odkrycie związku hamującego wzrost tkanek zmienionych patologicznie w wyniku działania HPV bez wpływu na normalne komórki naskórka i skóry właściwej (takich, jak keratynocyty i fibroblasty). Testy na występowanie własności antyproliferacyjnych in vitro prowadzono z wykorzystaniem komórek SiHa i komórek HEL, które stanowiły model - odpowiednio - tkanki zmienionej patologicznie w wyniku działania HPV oraz normalnych fibroblastów. Komórki SiHa uzyskano z raka komórek płaskich nabłonka w szyjce macicy wywołanego przez zakażenie wirusem HPV-16, zaś fibroblasty HEL uzyskano z normalnego płuca embriona ludzkiego (tabela 79-1). Jak pokazano w tabeli 79-2, 50% stężenie skuteczne (EC50) dla siedmiu proleków amidowych w komórkach SiHa mieściło się w zakresie 0,13-3,2 nM, podczas, gdy EC50 w komórkach HEL mieściło się w zakresie 12-727 nM, co wskazuje, ze związki te hamowały proliferację komórek SiHa skuteczniej niż komórek HEL. Wskaźnik selektywności HEL/SiHa (wartość EC50 dla HEL podzielona przez wartość EC50 dla SiHa) mieścił się w zakresie 72-559 (tabela 79-2).

Wszyskie siedem proleków amidowych wytwarza ten sam metabolit, cprPMEDAP, cprPMEDAP jest następnie metabolizowany do PMEG [Compton i wsp., 1999; Haste i wsp., 1999]. Wartości EC50 działania antyproliferacyjnego tych związków w przypadku komórek SiHa były znacznie wyższe niż odpowiednie wartości dla proleków (tabela 79-2), co wskazuje na to, że przyłączenie reszt amidowych zwiększyło siłę działania tych związków. Ponadto, wskaźniki selektywności HEL/SiHa dla cprPMEDAP i PMEG wynosiły odpowiednio 17 i 4,1 (tabela 79-2), co wskazuje, że proleki wykazują lepszą selektywność niż cprPMEDAP, zaś cprPMEDAP wykazuje lepszą selektywność niż PMEG.

Wiadomo, że PMEG ulega fosforylacji do PMEGpp, który działa jako kończący łańcuch inhibitor polimerazy komórkowego DNA [Compton i wsp., 1999; Haste i wsp., 1999]. W przypadku komórek SiHa i HEL przeprowadzono testy z użyciem czterech znanych inhibitorów polimerazy DNA (cidofowir, Ara C, doksyflurydyna i afidikolina) oraz innych leków przeciwrakowych o różnych mechanizmach działania, włącznie z inhibitorami topoizomerazy DNA (dakarbazyna, eliptycyna), środkami alkilującymi DNA (doksorubicyna, mitoksantron, bleomycyna, bis-(2-chloroetylo)metyloamina) i inhibitorami polimeryzacji tubulin (winkrystyna, winblastyna, etopozyd i indanocyna) (tabela 79-2). Wartości EC50 działania antyproliferacyjnego tych związków w komórkach SiHa różniły się, przy czym część z badanych związków wykazywała działanie równie silne lub silniejsze niż siedem proleków amidowych. Niemniej, wszystkie spośród tych związków wykazywały niskie wskaźniki selektywności HEL/SiHa (0,01-3,98) w porównaniu do wskaźników dla siedmiu proleków amidowych.

Podsumowując, wybrano unikatowy zestaw związków, które wykazują wartości EC50 działania antyproliferacyjnego niższe niż na poziomie nM w przypadku komórek rakowych SiHa zakażonych wirusem HPV-16 oraz ponad 50-krotnie większą selektywność niż w przypadku fibroblastów HEL.

2. Selektywne działanie antyproliferacyjne proleków amidowych w przypadku komórek SiHa zakażonych wirusem HPV porównane z działaniem w przypadku normalnych keratynocytów.

W celu przetestowania wpływu związków na normalne komórki naskórka, przeprowadzono testy na występowanie własności antyproliferacyjnych przy użyciu pierwotnych ludzkich keratynocytów, wyizolowanych ze skóry (PHK) i szyjki macicy (CK). Wartości EC50 działania antyproliferacyjnego uzyskane dla siedmiu proleków w komórkach PHK i CK były niższe niż odpowiednie wartości w komórkach HEL, co wskazuje, że keratynocyty są bardziej podatne niż fibroblasty (tabela 79-2 i 79-3). Nie66

PL 212 403 B1 mniej, wskaźniki selektywności PHK/SiHa i CK/SiHa dla tych proleków i cpr MEDAP były wciąż lepsze niż dla związków kontrolnych: PMEG oraz inhibitora polimerazy DNa AraC (tabela 79-3). Tak więc, proleki w sposób preferowany hamowały proliferację komórek SiHa zakażonych wirusem HPV-16 w porównaniu do normalnych keratatynocytów ze skóry i szyjki macicy.

3. Działanie antyproliferacyjne w przypadku innych komórek zakażonych wirusem HPV.

Siedem proleków przetestowano w przypadku pięciu dodatkowych linii komórkowych pochodzących z komórek raka szyjki macicy wywołanego przez HPV (wymienione w tabeli 79-1) w testach na występowanie własności antyproliferacyjnych, zaś uzyskane dane przedstawiono w tabeli 4 razem z danymi dotyczącymi komórek SiHa. W przypadku komórek SiHa, C-4I i MS751 wszystkie związki poza związkiem C wykazywały wartości EC50 działania antyproliferacyjnego poniżej nM. Jednakże, w przypadku komórek CaSki, HeLa i ME-180, wszystkie związki wykazywały znacząco słabsze działanie, z wartościami EC50 mieszczącymi się w zakresie 7,8-410 nM. Wydaje się, że nie ma korelacji pomiędzy opornością i typem HPV (16, 18 lub 39) lub pomiędzy opornością i przerzutem (CaSki, MS751 i ME180 pochodzą z miejsca przerzutu). Związek kontrolny AraC (inhibitor polimerazy DNA) w sposób równomierny hamował proliferację komórek wszystkich linii z wartościami EC50 mieszczącymi się w zakresie 94-257 nM.

4. Działanie antyproliferacyjne w przypadku komórek rakowych nie zakażonych HPV.

W celu zbadania wpływu związków na rakowe linie komórkowe nie zakażone HPV, trzy linie komórkowe (HT-3, SCC4, SCC9, tabela 79-1) poddano testom na występowanie własności antyproliferacyjnych. Jak przedstawiono w tabeli 79-4, wszystkie siedem proleków wykazywało taką samą lub większą moc niż związek kontrolny AraC.

T a b e l a 79-2

Selektywne hamowania działania HPV16 w komórkach SiHa w porównaniu z fibroblastami HEL

ID związku	Uwagi	Selektywność (HEL/SiHa)	EC50 działania antyproliferacyjnego (nM)
Komórki raka macicy SiHa (HPV16)	Fibroblasty płucne HEL
1	2	3	4	5
A		72	0,6	43
B		559	1,3	727
C		115	0,20	23
D		135	3,2	431
E		164	0,50	82
F		210	2,5	526
G		92	0,13	12
Związki kontrolne
cprPMEDAP	Metabolit	17	284	4821
PMEG	Metabolit	4,1	207	861
AraC	Inhibitor polimerazy DNA	0,113	257	29
Cydofowir	Inhibitor polimerazy DNA	0,3	80413	27952
Doksyflurydyna	Inhibitor polimerazy DNA	0,449	8755	3927
Afidikolina (+)	Inhibitor polimerazy DNA	0,40	856	324
Dakarbazyna	Inhibitor polimerazy DNA	3,98	7402	29481
Eliptycyna	Inhibitor polimerazy DNA	1,02	478	486

PL 212 403 B1 cd tabeli 79-2

1	2	3	4	5
Doksorubicyna	Środek alkilujący DNA	0,43	9,76	4,20
Mitoksantron	Środek alkilujący DNA	< 0,37	8,67	< 3,2
Chlorowodorek bis-(2-chloroetylo)metyloaminy	Środek alkilujący DNA	1,02	21863	22203
Bleomycyna	Środek alkilujący DNA	0,01	3138	20,28
Winkrystyna	Inhibitor polimeryzacji tubuliny	1,55	1,24	1,92
Winblastyna	Inhibitor polimeryzacji tubuliny	0,39	0,68	0,27
Etopozyd	Inhibitor polimeryzacji tubuliny	0,31	469	144
Indanozyna	Inhibitor polimeryzacji tubuliny	0,27	588	159

T a b e l a 79-3

Selektywne hamowania działania HPV16 w komórkach SiHa w porównaniu z pierwotnymi keratynocytami

ID związku	Uwagi	Selektywność (PHK/SiHa)	Selektywność (CK/SiHa)	EC50 działania antyproliferacyjnego (nM)
Komórki raka szyjki macicy (HPV16)	Kreatynocyty skóry (PHK)	Kreatynocyty szyjki macicy (CK)
A		58	11	0,6	35	7
B		75	42	1,3	98	54
C		4	7	0,20	0,8	1,4
D		12	7	3,2	39	22
E		10	11	0,50	5,2	5,4
F		31	3	2,5	78	7,1
G		22	15	0,13	2,9	1,9
Związki kontrolne
cprPMEDAP	Metabolit	13	2,4	284	3698	694
PMEG	Metabolit	0,48	2,4	207	101	501
AraC	Inhibitor polimerazy DNA	0,57	0,4	257	147	107

T a b e l a 79-4

Działanie antyproliferacyjne w inych komórkach rakowych zakażonych wirusem HPV i nie zakażonych

ID związku	EC50 działania antyproliferacyjnego (nM) dla komórek rakowych zakażonych HPV	EC50 działania antyproliferacyjnego (nM) dla komórek rakowych nie zakażonych HPV
	SiHa HPV16	CaSki HPV16	HeLa HPV18	MS-751 HPV18	C-4I HPV18	ME-180 HPV39	HT-3 z szyjki macicy	SCC-4 z języka	SCC-9 z języka
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
A	0,6	29	16	1,7	6,5	27	14	17	40
B	1,3	246	410	18	27	254	104	53	150
C	0,20	3,87	6,6	10,54	1,0	7,8	9,5	2,1	2,5

PL 212 403 B1 cd tabeli 79.4

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
D	3,2	301	398	16	24	288	127	44	147
E	0,50	38	19	2,40	3,1	27	17	8	13
F	2,5	124	127	4,2	6,0	41	24	10	28
G	0,13	28	12	0,9	3,1	8,2	6,0	2,1	7,9
Związki kontrolne
AraC	257	94	174	144	123	101	214	74	68

P r z y k ł a d 80

Test na występowanie własności antyproliferacyjnych

W testach na występowanie własności antyproliferacyjnych mierzy się wpływ związków na proliferację hodowanych komórek. Związki czynne w testach na występowanie własności antyproliferacyjnych mogą wykazywać działanie cytostatyczne (hamowanie podziału komórek) i/lub cytocydowe (uśmiercanie komórek). Poprzez poddanie testom na występowanie własności antyproliferacyjnych zarówno komórek zakażonych wirusem HPV, jak i komórek zdrowych, można zidentyfikować związki, które hamują proliferację komórek zakażonych wirusem HPV skuteczniej niż komórek z normalnych, zdrowych tkanek ludzkich. W tabeli 80-1 streszczono charakterystykę dla każdego z typów komórek, włączając w to sześć linii komórkowych raka szyjki macicy przekształconych przez HPV, zwykłe ludzkie keratynocyty skóry (PHK) i zwykłe fibroblasty z płuc (HEL). Keratynocyty skóry uzyskano z firmy Cambrex (East Rutherford, NJ). Wszystkie pozostałe komórki uzyskano z kolekcji szczepów i linii komórkowych American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Komórki oddzielono od kolb, w których prowadzono hodowlę, za pomocą trypsyny, policzono oraz umieszczono w 96-studzienkowych płytkach do hodowli (250-100 komórek na studzienkę, w zależności od typu komórek). Następnego dnia (oznaczonego jako dzień „0”) dodano serię pięciokrotnie rozcieńczonych roztworów związków, przy czym każdy roztwór dodano do dwóch studzienek. Siedem dni po dodaniu związków płytki do hodowli poddano działaniu 10% kwasu trichlorooctowego w 4°C przez 1 godzinę i przemyto wodą. Procedura ta pozwala białkom komórkowym na związanie się z dolną powierzchnią płytek.

Białka barwiono przy użyciu 0,4% roztworu sulforodaminy B 1% w kwasie octowym przez 10 minut, a następnie obficie przemyto 1% kwasem octowym. Pozostały barwnik związany z dolną powierzchnią płytek rozpuszczono w 10 nM zasadzie Trizma, uzyskując purpurowe zabarwienie. Natężenie barwy (proporcjonalne do liczby komórek) określono ilościowo przez pomiar absorbancji przy długości fali 510 nm przy zastosowaniu spektrofotometru.

Komórki nie poddane działaniu leku (= 100% proliferacji) i komórki poddane działaniu 10 mM kolchicyny (inhibitora podziału komórkowego) (= 0% proliferacji) użyto jako próbki kontrolne przy wyznaczaniu wartości hamowania proliferacji wyrażonej w %. Procentowe wartości hamowania proliferacji naniesiono na wykres w zależoności od zastosowanego stężenia związku, dopasowano do sigmoidalnej krzywej zależności dawka-odpowiedż, z której wyznaczono stężenie związku, które spowodowało zmniejszenie szybkości proliferacji o 50% (= EC50). Do dopasowania krzywej i wyliczenia wartości EC50 wykorzystano program GraphPad Prism, wersja 4.00 dla systemu Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA).

Badanie apoptozy (metoda indukcji przez kaspazę 3)

Indukcja kaspaz stanowi jeden z wczesnych objawów związanych z apoptozą lub zaprogamowaną śmiercią komórki. Aktywność kaspazy można wykrywać ilościowo przy użyciu substratu fluorescencyjnego. Związki, które działają bezpośrednio na szlaku apoptozy mogą indukować kaspazę w relatywnie krótkim okresie inkubacji (< 24 godzin). Związki, które zaburzają fizjologię inych komórek, co w końcowym rezultacie wywołuje apoptozę, mogą wymagaćdłuzszego okresu inkubacji (> 48 godzin) dla indukcji kaspazy.

10000 komórek umieszczono na 96-studzienkowych płytkach do hodowli i inkubowano z serią pięciokrotnie rozcieńczonych roztworów związków przez 24, 48 i 72 godziny. Komórki poddano lizie

PL 212 403 B1 i zmierzono aktywność kaspazy w lizatach komórkowych przy użyciu substatu fluorescencyjnego, zgodnie z instrukcją producenta (Caspases Assay Kit, Roche, Indianapolis, IN).

Badanie apoptozy (metoda barwienia z użyciem anneksyny V)

Przenikanie fosfatydyloseryny z wewnętrznej strony błony komórkowej na zewnątrz stanowi jeden z wczesnych/pośrednich procesów związanych z apoptozą lub zaprogramową śmiercią komórki. Fosfatydyloseryna, która przenikła, może być wykryta przez inkubację komórek z anneksyną V znakowanym przy użyciu FITC, który to barwnik jest zależnym od jonów Ca²⁺ białkiem wiążącym fosfolipidy. Gdy komórki są barwione przy użyciu anneksyny-FITC i jodku propidyny (który barwi martwe komórki), komórki żywe nie są barwione przez żaden z tych barwników, komórki martwe są barwione przez oba, zaś komórki apoptotyczne są barwione jedynie przez anneksynę-FITC.

Komórki SiHa zakażone wirusem HPV-16 hodowano w trzech różnych stężeniach związków przez 3 do 7 dni i jednocześnie barwiono przy użyciu anneksyny-FITC i jodku propidyny. Zabarwienie każdej komórki z osobna badano metodą cytometrii przepływowej.

Wyniki

Selektywne działanie antyproliferacyjne

Celem tej procedury było zidentyfikowanie związków hamujących wzrost zmian chorobowych przekształconych w wyniku działania HPV bez wywierania wpływu na normalne koomórki w naskórku i skórze właściwej (takich jak keratynocyty i fibroblasty).

W związku z tym związki testowano w przypadku komórek SiHa, PHK i HEL, które stanowiły model - odpowiednio - komórek przekształconych w wyniku działania HPV, normalnych keratynocytów i normalnych fibroblastów.

Przykładowe związki według wynalazku, takie, jak przedstawiono w tabeli 80-2, wykazywały wykrywalny poziom działania antyproliferacyjnego w komórkach SiHa, z wartościami 50% stężenia skutecznego (EC50) poniżej 25000 nM.

Związki czynne testowano również w komórkach HEL. We wszystkich przypadkach wartości EC50 w komórkach HEL były wyższe niż wartości EC50 w komórkach SiHa, wskazując, że związki czynne hamowały proliferację komórek SiHa skuteczniej niż komórek HEL.

Inne analogi nukleotydowe/nukleozydowe takie, jak PMEG (2-fosfonometoksyetyloguanina), AraC (cytarabina, nr CAS 147-94-4) oraz gemcytabina (nr CAS 95058-81-4) nie wykazywały takiej selektywności.

Podofilox (nr CAS 518-28-5), składnik czynny przeciwbrodawkowego leku Condylox, również nie wykazywał selektywności.

Przykładowe proleki związków według przedmiotowego wynalazku, takie jak przedstawiono w tabeli 80-3 wykazują aktywność.

W większości przypadków proleki były silniejsze, a w pewnych przypadkach bardziej selektywne niż ich odpowiednie związki macierzyste.

Większość proleków amidofosfonianowych była bardziej aktywna i selektywna niż podofilox.

Podsumowując, zidentyfikowano związki wykazujące wartości EC50 działania antyproliferacyjnego poniżej nM w przypadku komórek SiHa zakażonych wirusem HPV-16 oraz selektywność wynoszącą powyżej 50-krotności w porównaniu z keratynocytami PHK i fibroblastami HEL.

Działanie antyproliferacyjne w innych liniach komórkowych zakażonych wirusem HPV

Wybrane związki poddano również testowi w pięciu dodatkowych linii komórkowych pochodzących z komórek raka szyjki macicy wywołanego przez HPV (por. przykład 79 i tabela 80-4).

Każdy ze związków wykazywał różne poziomy aktywności w sześciu liniach komórek zakażonych HPV, niezależnie od typu obecnego HPV.

Generalnie, związki wykazywały większą siłę działania w komórkach SiHa (HPV-16), C-41 (HPV-18) i MS751 (HPV-18) niż w komórkach CaSki (HPV-16), HeLa (HPV-18) i ME-180 (HPV-39).

Indukcja apoptozy (metoda indukcji przez kaspazę 3)

Reprezentatywne związki wedłu przedmiotowego wynalazku poddano testowi na indukcję apoptozy w komórkach SiHa.

Gdy komórki inkubowano przez 72 godziny (stałe paski), zaobserwowano znaczącą indukcję kaspazy w zależności od zastosowanej dawki, co wskazuje, ze związek indukował apoptozę (fig. 80-1).

Indukcja kaspazy była mniej oczywista w przypadku inkubacji przez 48 godzin (paski cieniowane), zaś w przypadku inkubacji przez 24 godziny nie zaobserwowano jej w ogóle (dane nie przedstawione).

PL 212 403 B1

Indukcja apoptozy (metoda barwienia z użyciem anneksyny V)

PMEG, N6-cyklopropylo-PMEDAP i reprezentatywny związek według przedmiotowego wynalazku poddano, w trzech różnych stężeniach, testowi na indukcję apoptozy w komórkach SiHa, stosując metodę podwójnego barwienia przy użyciu anneksyny i jodku propidyny.

W przypadku wszystkich trzech związków w dniu 7 zaobserwowano większy udział procentowy komórek apoptotycznych niz w dniu 3.

Wspomniany powyżej reprezentatywny związek według przedmiotowego wynalazku był najbardziej aktywny w indukowaniu apoptozy; w 7 dniu 63,8% komórek w hodowli poddawanej działaniu 0,2 μg/ml tego związku było apoptotyczne.

W kontraście z tym, hodowle poddawane działaniu 0,2 μg/ml PMEG i 0,5 μg/ml N6-cyklopropylo-PMEDAP wykazywały obecność jedynie - odpowiednio - 1,2% i 15,9% komórek apoptotycznych.

T a b e l a 80-1

Typy komórek stosowanych w testach na występowanie właśności antyproliferacyjnych

Nazwa	Status wzgl. HPV*	Pochodzenie	Pożywki hodowlane**
Linie komórek rakowych zakażonych wirusem HPV
SiHa	H PV-16	Rak komórek płaskich nabłonka w szyjce macicy	A1, A2
Ca Ski	HPV-16	Rak płaskonabłonkowy, przerzut z jelita cienkiego do szyjki macicy	A1, A2
MS751	ThPV-18 (zawiera również cząstkowy genom HPV-45)	Rak płaskonabłonkowy, przerzut z szyjki macicy do węzła chłonnego	A1, A2
HeLa	HPV-18	Gruczolakorak nabłonkowy w szyjce macicy	A1, A2
C-4 I	HPV-18	Rak szyjki macicy	A1, A2
ME-180	HPV-39	Rak płaskonabłonkowy, przerzut z szyjki macicy do sieci	A1, A2
	Komórki ze zwykłych tkanek ludzkich
HEL299	Brak	Fibroblasty w płucu embriona	A1, A2
PHK (keratynocyty skóry)	Brak	Keratynocyty w napletku osobnika dorosłego	B1, B2

* Podtyp DNA z HPV zintegrowany w DNA komórkowym ** Pożywki hodowlane

Komórki trzymano w nawilżanych inkubatorach w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2, w następujących pożywkach hodowlanych.

A1: pożywka do utrzymania komórek przy życiu: Eagle MEM z BSS Ear!e'a (Cambrex, East Rutherford, NJ), z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

A2: pożywka do testów na występowanie własności antyproliferacyjnych: Eagle MEM z BSS Earle'a, z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

B1: pożywka do utrzymania komórek przy życiu: Keratinocyte-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA), z dodatkiem 0,01 mg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej, 0,001 μg/ml rekombinowanego nabłonkowego czynnika wzrostu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

B2: pożywka do testów na występowanie własności antyproliferacyjnych: mieszanka B1 i A2 w stosunku 4:1

PL 212 403 B1

T a b e l a 80-2

Działanie antyproliferacyjne N6-podstawionych PMEDAP w przypadku komórek SiHa zakażonych HPV16 i fibroblastów HEL gdzie R^X1 ozna zaznaczonych

metyloamina

1-propyloamina

1-butyloamina

dimetyloamina

metyloetyloamina

2-metylopropano-1-amina

alliloamina

2-propynyloamina

2-butylenoamina

2-izobutylenoamina

cyklopropyloamina

cyklopropylometanoamina

1-cyklopropyloetanoamina

dicyklopropyloamina

cyklobutyloamina

cyklopentanoamina

cykloheksanoamina

cykloheptanoamina

cyklooktanoamina

dietanoloamina

2-etanoloamina

2-propanoloamina

1-amino-2-propanoloamina

2-metoksyetyloamina

6-aminoheksanoamina

PL 212 403 B1 cd tabeli 80.2

3-aminopropyloamina

2-dimetyloaminoetyloamina

6-heksanianoamina

benzyloamina

metylobenzyloamina

4-aminobenzyloamina

2-fenyloetanoamina

2-pirydynylo-1 -metanoamina

3-pirydynylo-1 -metanoamina

4-pirydynylo-1 -metanoamina

1-naftyloamina

*pirolidyna (N6 tworzy pirolidynę)

*piperydyna (N6 tworzy piperydynę)

*morfolina (N6 tworzy mofrolinę)

2,2,2-trifluoroetanoamina

T a b e l a 80-3

Działanie antyproliferacyjne amidofosfonianowych proleków N6- podstawionych PMEDAP w przypadku komórek SiHa zakażonych wirusem HPV16, keratynocytów PHK i fibroblastów HEL

H A 'N''' Λ X > μΑΑΧ N 0 ! 1 || ,y- Χ1 ΧΏ 1A 1 R gdzie RX1 i RX2 są podstawione tak, jak przedstawiono we wzorze, zaś Y1A i Y1B są podstawione tak, jak pokazano
Y1A	Y1B
1	2
OH	OH
POC	POC
O-iPr	O-iPr
Ala-Et	Ala-Et
Ala-Pr	Ala-Pr
Ala-iPr	Ala-iPr
Ala-Bu	Ala-Bu
Ala-cBu	Ala-cBu
Ala-cPentyl	Ala-cPentyl

PL 212 403 B1 cd tabeli 80.3

1	2
Ala-Heksyl	Ala-Heksyl
Ala-Oktyl	Ala-Oktyl
Aba-Et	Aba-Et
Aba-Bu	Aba-Bu
Aba-Oktyl	Aba-Oktyl
Phe-Et	Phe-Et
Phe-Bu	Phe-Bu
Phe-iBu	Phe-iBu
Phe-cBu	Phe-cBu
OPh	Ala-Me
OPh	Ala-Et
OPh	Ala-Pr
OPh	Ala-iPr
OPh	Ala-Bu
OPh	Ala-tBu
OPh	Ala-Heksyl
OPh	Ala-Oktyl
OPh	Aba-Et
OPh	Aba-Bu
OPh	Aba-cBu
OPh	Aba-Oktyl
OPh	Phe-Et
OPh	Phe-Bu
OPh	Phe-iBu
OPh	D-Ala-Me

PL 212 403 B1 cd tabeli 80.3

γ1Α	γ1Β
OH	OH
O-iPr	O-iPr
POC	POC
Ala-Et	Ala-Et
Ala-Bu	Ala-Bu
Ala-cBu	Ala-cBu
Ala-Heksyl	Ala-Heksyl
Aba-Bu	Aba-Bu
Phe-Et	Phe-Et
Phe-Bu	Phe-Bu
Phe-iBu	Phe-iBu
OPh	Ala-Et
OPh	Ala-Bu
OPh	Ala-cBu
OPh	Ala-Heksyl
OPh	Aba-Bu
OPh	Phe-Et
OPh	Phe-Bu
OPh	Phe-iBu

Χ1 ΧΟ 1Α gdzie R^X1 i R^X2 są podstawione tak, jak przedstawiono we wzorze, zaś Y^1A i Y^1B są podstawione tak, jak pokazano

Y1A	Y1B
OH	OH
O-iPr	O-iPr
Ala-Bu	Ala-Bu
OPh	Phe-Et

PL 212 403 B1

Działanie antyproliferacyjne N6-cycloprolilowych PMEDAP i jego amidofosfonianowych proleków w przypadku sześciu różnych typów komórek zakażonych HPV

ID związku	Antyproliferacja - wartość EC50 (nM) dla komórek rakowych zakażonych wirusem HPV
SiHa HPV16	CaSki HPV16	HeLa HPV18	MS-751 HPV18	C-4 I HPV18	ME-180 HPV39
A	0,6	29	16	1,7	6,5	27
B	1,3	246	410	18	27	254
C	0,2	3,9	6,6	0,5	1,0	7,8
D	3,2	301	398	16	24	288
E	0,5	38	19	2,4	34	27
F	2,5	124	127	4,2	6,0	41
G	0,13	28	12	0,9 1	34	8,2
H	0,03	2,0	0,7	0,04	0,44	1,8
(cprPMEDAP)	284	14149	6926	3313	1332	8315

P r z y k ł a d 81

Badanie podrażnienia skóry u królików przez związki A i B

Badanie przeprowadzono w celu oceny możliwości wywoływania podrażnienia przez dwa związki według przedmiotowego wynalazku przy stosowaniu ich na skórę w przypadku samców królika przez siedem kolejnych dni. Całowitą liczbę sześciu samców w celu przeprowadzenia badania przyporządkowano sposób taki, jak przedstawiono w tabeli poniżej.

Przyporządkowanie grup

Numer grupy	Testowana substancja3	Liczba zwierząt (samców)
1	związek Bb	3
2	związek Ac	3

^a Każdemu zwierzęciu nanoszono na skórę nośnik (żel placebo), jedną pozytywną substancję kontrolną oraz odpowiednią substancję testowaną w trzech różnych stężeniach. Wobec każdgo ze zwierząt zastosowano jedną z substancji testowanych w stężeniu 0,01, 003 i 0,1% ^b Zastosowaną pozytywną substancją kontrolną była 9-(2-fosfonylometoksyetylo)guanina (PMEG) w stężeniu 0,1% ^c Zastosowaną pozytywną substancją kontrolną był Cidofovir^® w stężeniu 1%

PL 212 403 B1

Podczas badania raz dziennie przez siedem dni podawano na skórę nośnik, pozytywne substancje kontrolne i substancje testowane. Substancje testowane podawano w stężeniu 0,01, 003 i 0,1%. Pozytywne substancje kontrolne podawano w stężeniu 0,1% (PMEG) lub 1% (Cidofovir^®).

Objętość dawki dla wszystkich preparatów ustalono na 100 μ|.

Miejsca przeprowadzania testu u każdego ze zwierząt wygolono przed początkowym podaniem oraz w miarę potrzeby podczas badania. Dwa miejsca wygolono po lewej stronie grzbietu i trzy miejsca wygolono po prawej stronie grzbietu. Zakres powierzchni każdego dawkowania (każdy o powierzchni wynoszącej w przybliżeniu 1 cal kwadratowy) oznaczono niezmywalnym atramentem. Całkowita powierzchnia obszaru wygolonego obejmowała nie mniej niż 10% całkowitej powierzchni ciała każdego ze zwierząt.

Nośnik i odpowiednią pozytywną substancję kontrolną oraz substancję testowaną stosowano w przypadku każdego zwierzęcia w obrębie miejsca dawkowania wynoszącego około 1 cal kwadratowy. Nośnik stosowano w miejscu po lewej stronie grzbietu bliżej głowy (miejsce dawkowania 1), zaś odpowiednią pozytywną substancję kontrolną stosowano w miejscu po lewej stronie grzbietu bliżej ogona (miejsce dawkowania 2). Odpowiednią substancję kontrolną stosowano następująco: 0,01% w miejscu po prawej stronie grzbietu od strony głowy (miejsce dawkowania 3), 0,03% w miejscu po prawej stronie grzbietu pośrodku (miejsce dawkowania 4) oraz 0,1% w miejscu po prawej stronie grzbietu od strony ogona (miejsce dawkowania 5). Zwierzętom od razu po zastosowaniu ww substancji na okres 1 do 2 godzin założono kołnierze.

Miejsca oceniano pod kątem występowania rumienia i obrzęku przed dawkowaniem w dniu 1 i następnie codziennie, około 24 godziny po podaniu każdej dawki, a przed podaniem kolejnej. Każdemu miejscu przypisano wynik określający stopień podrażnienia, w oparciu o skalę Draize'a służącą do oceny podrażnień skóry. (Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O., „Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes”. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1944; 82: 377-90).

Obserwacje pod kątem śmiertelności, chorobowości i przyswajaIności pożywienia i wody prowadzono dwa razy dziennie wobec wszystkich zwierząt. Szczegółowe badania kliniczne przeprowadzono przed randomizacją, przed dawkowaniem w dniu 1, a następnie codziennie.

Pomiar masy ciała wraz z zarejestrowaniem wyników przeprowadzono dzień po przyjeździe, przed randomizacją oraz przed dawkowaniem w dniu 1, 3 i 7.

Uśmiercenia zwierząt dokonano przez dożylne znieczulenie przy użyciu nadmiernej dawki roztworu pentobarbitalu sodu przeznaczonego do znieczulania i wykrwawienie przez uszkodzenie udowych naczyń krwionośnych. Zwierzęta poddano dokładnemu badaniu pod kątem zewnętrznych nieprawidłowości włącznie z guzami. Skóra została wywinęta od cięcia na brzuchu wzdłuż linii środkowej ciała, zaś wszystkie nieprawidłowości zostały zidentyfikowane i porównane z wynikiem badania przed uśmierceniem zwierząt. Wnętrze jamy brzusznej, klatki piersiowej i czaszki zbadano pod kątem nieprawidłowości, po czym narządy usunięto, zbadano oraz, jeśli było to wymagane, umieszczono w formalinie zbuforowanej do odczynu obojętnego. Miejsca dawkowania, nerki oraz wszystkie makroskopowe zmiany chorobowe od każdego ze zwierząt zebrano i zakonserwowano. Dla każdego miejsca dawkowania u wszystkich zwierząt przeprowadzono badanie mikroskopowe skrawków parafinowych utrwalonych za pomocą hematoksyliny i zabarwionych eozyną. Preparaty mikroskopowe zostały zbadane przez weterynarza patologa. Do zdefiniowania stopniowych zmian chorobowych zastosowano czterostopniowy system oceny w celu porównywania pomiędzy grupami, w których stosowano różne dawki.

Wnioski

Dwie testowane substancje nie wywołały znaczących, stwierdzonych zmian klinicznych, podrażnienia skóry, zmian w masie ciała lub zmian dających się wykryć przez obserwację makroskopową i mikroskopową dla żadnego ze stężeń stosowanych dawek. Jedna z pozytywnych substancji kontrolnych spowodowała pojawienie się stwierdzonych zmian klinicznych oraz słaby do średniego stopień zmian dających się wykryć przez obserwację makroskopową i mikroskopową.

P r z y k ł a d 82

Badanie podrażnienia skóry u królików przez związki B i H

Badanie przeprowadzono w celu oceny możliwości wywoływania podrażnienia przez dwa związki według przedmiotowego wynalazku przy stosowaniu ich na skórę w przypadku samców królika przez siedem kolejnych dni. Całowitą liczbę 24 samców w celu przeprowadzenia badania przyporządkowano w sposób taki, jak przedstawiono w tabeli poniżej.

PL 212 403 B1

Plan badania dla związku B

Grupa 1	Stężenie dla grupy 1b	Grupa 2	Stężenie dla grupy 2b
Miejsce dawkowania	(n = 6)a	%	(mg/ml)	(n = 6)a	%	(mg/ml)
1	Próbka kontrolna nośnik	0,0	0,0	PMEG (pozytywna substancja kontrolna)	0,1%	1,0
2	Mała dawka	0,03	0,3	Mała dawka	0,03	0,3
3	Średnia dawka	0,1	1,0	Średnia dawka	0,1	1,0
4	Duża dawka	0,3	3,0	Duża dawka	0,3	3,0

^a Każda grupa składała się z sześciu królików, które dotą nie były wystawiane na działanie tego bodźca ^b Nośnik w przypadku miejsca dawkowania 1 w grupie 1 oraz miejsca dawkowania 1 w grupie 2 (PMEG) stanowił żel nośnikowy. Nośnikiem w przypadku miejsc leczonych w grupie 1 był żel nośnikowy, zaś nośnikiem w przypadku miejsc leczonych w grupie 2 była maść nośnikowa

Plan badania dla związku H

Grupa 3	Stężenie dla grupy 3b	Grupa 4	Stężenie dla grupy 4b
Miejsce dawkowania	(n = 6)a	%	(mg/ml)	(n = 6)a	%	(mg/ml)
1	Próbka kontrolna nośnik	0,0	0,0	PMEG (pozytywna substancja kontrolna)	0,1%	1,0
2	Mała dawka	0,03	0,3	Mała dawka	0,03	0,3
3	Średnia dawka	0,1	1,0	Średnia dawka	0,1	1,0
4	Duża dawka	0,3	3,0	Duża dawka	0,3	3,0

^a Każda grupa składała się z sześciu królików, które dotą nie były wystawiane na działanie tego bodźca b Nośnikiem w przypadku miejsca dawkowania 1 w grupie 3 była maść nośnikowa, zaś nośnikiem w przypadku miejsca dawkowania 1 w grupie 4 (cPrPMEDAP) był żel nośnikowy. Nośnikiem w przypadku miejsc leczonych w grupie 3 był żel nośnikowy, zaś nośnikiem w przypadku miejsc leczonych w grupie 4 była maść nośnikowa

Podczas badania substancje testowane i substancje kontrolne podawano na skórę raz dziennie przez 7 kolejnych dni. Wielkość dawek dla związku B wynosiła 0,03, 0,1 i 0,3%. Wielkość dawek dla związku H wynosiła 0,03, 0,1 i 0,3%. Wielkość dawki PMEG (pozytywna substancja kontrolna) wynosiła 0,1%. Wielkość dawki cPrPMEDAP (pozytywna substancja kontrolna) wynosiła 1,0%. Wielkość dawki w przypadku nośnika kontrolnego wynosiła 0,0% (nośnik ten stosowano zarówno w postaci preparatów żelowych, jak i maści). Objętość dawki w przypadku wszystkich miejsc była stała i wynosiła 100 μ!. Mniej niż 24 godziny przed pierwszym podaniem, włosy wygolono z grzbietu zwierzęcia. Ten wygolony obszar obejmował nie mniej niż 10% całkowitej powierzchni ciała. Zwrócono uwagę na to, aby unikać otarcia skóry. Substancję testowaną, pozytywną substancję kontrolną i kontrolną substancję nośnikową stosowano w obrębie miejsca dawkowania o wymiarach wynoszących w przybliżeniu 1 cal kwadratowy. Dwa miejsca dawkowania ustalono wzdłuż lewej powierzchni grzbietu. Substancję nośnikową lub pozytywną substancję kontrolną stosowano w miejscu od strony głowy, zaś małą dawkę substancji testowanej stosowano w miejscu od strony ogona. Dwa miejsca dawkowania ustalono wzdłuż prawej strony grzbietu. Średnią dawkę substancji testowanej stosowano w miejscu od strony głowy, zaś dużą dawkę substancji testowanej stosowano w miejscu od strony ogona. Zwierzętom od razu po zastosowaniu ww. substancji na około dwie godziny założono kołnierze. Długość okresu przebywania zwierząt w kołnierzach udokumentowano w danych nie poddanych obróbce.

Obserwacje pod kątem śmiertelności, chorobowości i przyswajaIności pożywienia i wody prowadzono dwa razy dziennie wobec wszystkich zwierząt. Miejsca badane oceniano pod kątem występowania rumienia i obrzęku przed pierwszym podaniem leku, i następnie około 24 godziny po podaniu każdej dawki (przed podaniem kolejnej zaplanowanej dawki) oraz codziennie przez okres rekonwalescencji trwający siedem dni. Obserwacje pod kątem występowania objawów klinicznych prowadzono codziennie, w tym samym czasie, co obserwacje dotyczące stanu skóry. Masę ciała mierzono i rejestrowano w dzień po otrzymaniu, przed randomizacją, przed podaniem substancji testowanej w dniu 1, 7 i 14, oraz przy nekropsji (dzień 8 i 15). Masy ciała zarejestowane przy przyjęciu i przed randomizacją nie zostały tutaj podane, ale są zachowane w dokumentacji badania. Próbki krwi (4-6 ml) od

PL 212 403 B1 zwierząt na grupę przy zakończeniu i od 3 zwierząt na grupę w trakcie rekonwalescencji pobrano z żyły szyjnej lub z innej odpowiedniej żyły w celu oceny klinicznych parametrów patologicznych.

Dodatkowe próbki krwi (w przybliżeniu 1 ml) od wszystkich zwierząt pobrano z żyły szyjnej lub z innej odpowiedniej żyły w celu wyznaczenia stężenia substancji testowanej w osoczu około 2 godziny po podaniu dawki w dniu 7. Próbki umieszczono w probówkach zawierających sól potasową EDTA i przechowywano w bloku lodu, aż do odwirowania na wirówce. Zwierząt nie poddawano postowi przed pobraniem krwi. Próbki przechowywano w temperaturze -70°C do czasu zbadania.

Pełne badania nekropsyjne przeprowadzono w stosunku do wszystkich zwierząt zgodnie z procedurami zaakceptowanymi przez weterynarza patologa. Uśmiercenia zwierząt dokonano przez wstrzyknięcie do żyły/tęnicy usznej, lub innej odpowiedniej żyły, znieczulenia w postaci nadmiernej dawki roztworu pentobarbitalu sodu przeznaczonego do znieczulania i wykrwawienie przez uszkodzenie udowych naczyń krwionośnych. Zwierzęta poddano dokładnemu badaniu pod kątem zewnętrznych nieprawidłowości włącznie z guzami. Skóra została wywinięta od cięcia na brzuchu wzdłuż linii środkowej ciała, zaś wszystkie nieprawidłowości zostały zidentyfikowane i porównane z wynikiem badania przed uśmierceniem zwierząt. Wnętrze jamy brzusznej, klatki piersiowej i czaszki zbadano pod kątem nieprawidłowości, po czym narządy usunięto, zbadano oraz, jeśli było to wymagane, umieszczono w formalinie zbuforowanej do odczynu obojętnego. Wycinki tkanek z miejsc dawkowania (4 na zwierzę), nerek i wszystkich większych miejsc zmian chorobowch poddano badaniu mikroskopowe skrawków parafinowych utrwalonych za pomocą hematoksyliny i zabarwionych eozyną.

W czasie nekropsji, tj. w dniu 8 w przypadku zwierząt z głównej grupy poddanej badaniu oraz w dniu 15 w przypadku zwierząt po rekonwalescencji zidentyfikowano po cztery miejsca dawkowania na zwierzę. Około połowa każdego z miejsc dawkowania została wycięta, dołączona do zbioru i zakonserwowana tak, jak wspomniano powyżej dla celów badań histologicznych. Ponieważ w przybliżeniu druga połowa każdego z miejsc dawkowania pozostała wciąż nietknięta na zwierzęciu, zrealizowano następujące procedury. Miejsca dawkowania przetarto trzykrotnie gazą nasączoną etanolem (95%) i pozostawiono do całkowitego wyschnięcia. Na każde z miejsc dawkowania dziesięciokrotnie _® nalepiono taśmę samoprzylepną (3M^®; taśma do pakowania lub ekwiwalent). Do każdego nalepiania używano czystego kawałka taśmy. Pozostałe części miejsc dawkowania wycięto następnie nożyczkami. Nożyczki umyto acetonem lub etanolem przed kontaktem z każdym z miejsc dawkowania i każdym ze zwierząt. Porządek usuwania miejsc dawkowania był następujący: miejsce stosowania nośnika lub pozytywnej substancji kontrolnej, miejsce stosowania małej dawki, miejsce stosowania średniej ₂ dawki i miejsce stosowania dużej dawki. Z każdego miejsca dawkowania wycięto 1 cm² tkanki. Próbi tkanek zważono i zarejestrowano wyniki. Wycinki skóry pocięto czystymi nożyczkami i umieszczono w fiolkach do badań scyntylacyjnych o odpowiednich rozmiarach. Do każdej fiolki dodano zimną solankę zawierającą bufor fosforanowy (5 ml). Tkankę poddano następnie homogenizacji za pomocą 20-sekundowych impulsów przy użyciu mechanicznego homogenizatora. Homogenaty szybko zamrożono w temperaturze około -20°C.

Wnioski

Na podstawie wyników badania podrażnienia skóry i badania mikroskopowego stwierdzono, że jedna z substancji testowanych nie powodowała podrażnienia przy zastosowaniu w żelu nośnikowym, ale przy stosowaniu w maści nośnikowej powodowała podrażenia w stopniu łagodnym do umiarkowanego. Druga substancja testowana przy zastosowaniu w żelu nośnikowym wykazywała bardzo niewielkie własności drażniące, zaś przy zastosowaniu w maści nośnikowej powodowała łagodne podrażnienia.

P r z y k ł a d 83

Wytwarzanie farmaceutycznej kompozycji żelowej do stosowania miejscowego

Przykład ten ilustruje wytwarzanie przykładowej kompozycji żelowej do stosowania miejscowego, zawierającej związek czynny o wzorze I.

Kompozycja żelowa do stosowania miejscowego ma następujący skład
Składniki	% w/w
Związek czynny	X*
Bufor o pH = 4,5 lub 7	25
Glikol propylenowy, USP	25
Hydroksyetyloceluloza, NF	1,25
Propyloparaben, NF	0,01
Metyloparaben, NF	0,09

PL 212 403 B1

Dihydroetylenodiaminotetraoctan disodowy, USP 0,025

Gliceryna, USP 10,00

Kwas cytrynowy, USP 0,50 ; Sterylna woda do zastrzyków, USP, 38,125 ^*X = ilość związku w zakresie od 0,01% do 1,0%

Inne związki o wzorze I takie, jak związki otrzymane według niniejszego opisu mogą być stosowane jako związki czynne do otrzymywania preparatów żelowych opisanych w tym przykładzie.

Poniższe składniki również poddano ocenie pod względem ich odpowiedniości podczas przygotowywania tego preparatu:

- mirystynian izopropylowy (rozpuszczalnik/współrozpuszczalnik/środek zwiększający penetrację),

- poli(glikole etylenowe), trioctan glicerolu (rozpuszczalniki),

- alkohol cetylowy i alkohol stearylowy (środki zwiększające sztywność),

- karbomer (środek zwiększający lepkość) oraz

- substancje typu Tween, Span (emulgatory).

P r z y k ł a d 84

Wytwarzanie kompozycji farmaceutycznej w postaci maści do stosowania miejscowego Przykład ten ilustruje wytwarzanie przykładowej kompozycji w postaci maści do stosowania miejscowego, zawierającej związek czynny o wzorze I.

Kompozycja w postaci maści do stosowania miejscowego ma następujący skład:

Składniki % w/w Związek czynny X^*

Wazelina żółta, USP 94,0

Półtoraoleinian sorbitanowy, NF 0,5

Glikol propylenowy, USP 4,5 *X = ilość związku w zakresie od 0,01% do 1,0%

Jako substancje czynne do wytwarzania preparatów w postaci maści według tego przykładu można stosować inne związki o wzorze I, takie, jak otrzymano według przedmiotowego opisu.

Następujące składniki również oceniano podczas przygotowywania tego preparatu pod względem ich odpowiedniości:

- mirystynian izopropylu (rozpuszczalnik/współrozpuszczalnik/środek zwiększający penetrację)

- poli(glikole etylenowe), trioctan glicerolu (rozpuszczalniki),

- alkohol cetylowy i alkohol stearylowy (środki zwiększające sztywność),

- karbomer (środek zwiększający lepkość) oraz

- substancje typu Tween, Span (emulgatory).

Claims (12)

1. Pochodna fosfonianowa o wzorze IA:

PL 212 403 B1 w którym:

Y^1A i Y^1b oznaczają -NH(R^X);

R^x oznacza R²;

₂

R² oznacza:

(d) grupę etylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴, przy czym R⁴ oznacza grupę metylową, etylową, n-propylową, izopropylową, n-butylową, izobutylową, sec-butylową, tert-butylową, 1-pentylową,

2-pentylową, 3-pentylową, 2-metylo-2-butylową, 3-metylo-2-butylową, 3-metylo-1-butylową, 2-metyl-1-butylową, 1-heksylową, 2-heksylową, 3-heksylową, 2-metylo-2-pentylową, 3-metylo-2-pentylową,

4-metylo-2-pentylową, 3-metylo-3-pentylową, 2-metylo-3-pentylową, 2,3-dimetylo-2-butylową, 3,3-dimetylo-2-butylową, winylową, allilową, cyklopentenylową, 5-heksenylową, etynylową lub propargilową;

(e) grupę propylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴, przy czym R⁴ oznacza grupę alkilową zawierającą od 1 do 18 atomów węgla, grupę alkenylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla lub grupę alkinylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla; lub (f) grupę metylową podstawioną dwoma podstawnikami R³, przy czym jeden podstawnik R³ oznacza grupę -R⁵W³, zaś drugi podstawnik R³ oznacza grupę C(=O)OR⁴; R⁴ oznacza grupę alkilową zawierającą od 1 do 18 atomów węgla, grupę alkenylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla lub ₅ grupę alkinylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla; R⁵ oznacza grupę metylenową;

W³ oznacza grupę fenylową;

lub ich farmaceutycznie akceptowalna sól.

2. Związek według zastrzeżenia 1 wybrany spośród związków o wzorach:

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

4. Związek według zastrzeżenia 1, znamienny tym, ze jest określony wzorem:

5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek czynny oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że związkiem czynnym jest związek określony w jednym z zastrzeżeń od 1 do 4.

6. Kompozycja według zastrzeżenia 5, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość związku określonego w jednym z zastrzezeń od 1 do 4 lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli, skuteczną ilość co najmniej jednego innego środka przeciwwirusowego oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

PL 212 403 B1

7. Zastosowanie związku o wzorze IA:

w którym:

Y^1A i Y^1B oznaczają -NH(R^X); x2

R^x oznacza niezależnie R²;

₂

R² oznacza:

(d) grupę etylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴;

(e) grupę propylową podstawioną grupą C(=O)OR⁴; lub (f) grupę metylową podstawioną dwoma podstawnikami R³, przy czym jeden podstawnik R³ oznacza grupę -R⁵W³, zaś drugi podstawnik R³ oznacza grupę C(=O)OR⁴;

R⁴ oznacza grupę alkilową zawierającą od 1 do 18 atomów węgla, grupę alkenylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla lub grupę alkinylową zawierającą od 2 do 18 atomów węgla;

R⁵ oznacza grupę metylenową;

₃

W³ oznacza grupę fenylową;

lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli H do wytwarzania leku do leczenia guzów.

8. Zastosowanie według zastrzeżenia 7, znamienne tym, że związek o wzorze IA jest wybrany spośród związków o wzorach:

PL 212 403 B1

PL 212 403 B1

9. Zastosowanie według zastrzeżenia 7, znamienne tym, że związek związkiem określony wzorem:

PL 212 403 B1

10. Zastosowanie według zastrzezenia 7, znamienne tym, że związek o wzorze IA jest związkiem określony wzorem:

11. Zastosowanie według jednego z zastrzezeń od 7 do 10, znamienne tym, że lek zawiera skuteczną ilość związku o wzorze IA lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli, skuteczną ilość co najmniej jednego innego środka przeciwwirusowego oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

12. Zastosowanie według jednego z zastrzezeń od 7 do 11, znamienne tym, że lek ma postać kompozycji żelowej lub maści.

13. Związek określony w jednym z zastrzezeń 1-4 lub 7-12 do zastosowania w leczeniu guzów.