BRPI0418251B1

BRPI0418251B1 - Fosfonatos, monofosfonamidatos, bisfosfonamidatos, e, composição farmacêutica os compreendendo

Info

Publication number: BRPI0418251B1
Application number: BRPI0418251-0A
Authority: BR
Inventors: Xiaqin Cheng; Gary P. Cook; Manoj C. Desai; Edward Doerffler; Gong-Xin He; Choung U. Kim; William A. Lee; John C. Rohloff; Jianying Wang; Zheng-Yu Yang
Original assignee: Gilead Sciences, Inc.
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-29
Publication date: 2019-09-24
Also published as: PT2204374E; NO338040B1; RS51476B; HRP20060254A2; US20090149400A1; JP2011137029A; NO338001B1; ATE478082T1; ZA200606049B; AP2212A; DK2204374T3; IS2994B; EP2204374B1; US20060046981A1; HK1097276A1; KR20120080240A; EA011304B1; CN1950383B; WO2005066189A1; NO20063479L

Abstract

"fosfonatos, monofosfonamidatos, bisfosfonamidatos para o tratamento de doenças virais". compostos e composições da fórmula (i) são descritos, úteis como agentes antiproliferativos, e em particular anti-hpv.

Description

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a compostos e composições e métodos de uso destes, úteis para tratar infecções virais, em particular papilomavírus humano .

Antecedentes

O papilomavírus humano (HPV) é uma das infecções sexualmente transmitidas mais predominantes no mundo. Existem mais do que 100 diferentes tipos de HPV, a maioria dos quais é inofensiva. Entretanto, existem cerca de 30 tipos que são disseminados através do contato sexual. Alguns tipos de HPV causam verrugas genitais, que surgem como uma única ou múltiplas inchações nas áreas genitais de homens e mulheres incluindo a vagina, cérvix, vulva (área externa da vagina), pênis, e reto. Embora muitas pessoas infectadas com HPV não tenham nenhum sintoma.

Enquanto que a maioria dos subtipos de HPV resulta em lesões benignas, certos subtipos podem induzir a lesões mais sérias. Infecções anogenitais que surgem de HPV-16 e HPV-18, embora menos comum do que o HPV-6 e HPV11, são mais frequentemente associados com lesões pré-cancerosas em tecidos cervicais e anais chamados displasias. Pacientes com displasias são frequentemente assintomáticos e podem apenas descobrir sua lesão após exame. As displasias de grau elevado, se deixadas não tratadas, podem transformar-se em tecidos cancerosos. As lesões de baixo-grau podem regredir espontaneamente, enquanto outras podem progredir para lesões de grau elevado. HPV-16 e HPV-18 são mais frequentemente associadas com displasias, embora diversos outros subtipos de HPV transformantes sejam também associados com displasias. Recentes estudos indicam que até 89% de homens homossexuais HIV positivo podem ser infectados com estes subtipos de risco elevado de HPV. Os pacientes HIV positivo são também mais prováveis de serem infectados com múltiplos subtipos

Petição 870180072216, de 17/08/2018, pág. 9/15 de HPV ao mesmo tempo, que é associado com um risco mais elevado de progressão de displasia.

As verrugas genitais são a doença sexualmente transmitida mais comum no mundo e são mais predominantes em pessoas com 17-33 anos de idade. HPV-6 e HPV-11 são responsáveis por quase 90% de todas as verrugas genitais, porém são raramente associadas com crescimentos neoplásicos. De acordo com a American Social Health Association, pelo menos 20 milhões de pessoas nos Estados Unidos são atualmente infectadas com HPV, com 5,5 milhões de novos casos de infecções de HPV sexualmente transmitidas que ocorrem anualmente. As verrugas genitais usualmente produzem inchações que coçam indolor localizadas sobre Ou próxima da genitália, porém sem tratamento, pode progredir para crescimentos tipo couve-flor mais pronunciado maior. Aproximadamente dois terços de pessoas que têm contato sexual com uma pessoa infectada com verrugas genitais desenvolverão verrugas dentro de três meses de contato. A regressão espontânea de verrugas genitais ocorre em 10 a 20% de casos de verruga genital. Entretanto, mesmo que a lesão regrida, a recorrência de verrugas genitais é comum com 50% de recorrência após um ano. Como um resultado das lesões de má aparência, tratamento de verrugas genitais é comum.

Evidência durante as últimas duas décadas tem induzido a uma ampla aceitação de que a infecção de HPV é necessária, todavia não suficiente, para o desenvolvimento de câncer cervical. A presença de HPV em câncer cervical é estimada em 99,7%. O câncer anal é suposto ter uma associação similar entre a Infecção de HPV e o desenvolvimento de displasia anal e câncer anal como é o caso de câncer cervical. Em um estudo de pacientes de HIV negativo com câncer anal, infecção de HPV foi encontrado em 88% de cânceres anais. Nos Estados Unidos em 2003, 12.200 novos casos de câncer cervical e 4.100 mortes por câncer cervical são prognosticadas juntamente com 4.000 novos casos de câncer anal e 500 mortes por câncer anal. Ao mesmo tempo que a incidência de câncer cervical tem diminuído nas últimas quatro décadas, devido à avaliação difundida, a incidência de câncer anal é crescente. O aumento em incidência de câncer anal pode ser atribuído em parte à infecção de HIV uma vez que pacientes HIV positivo têm uma maior incidência de câncer anal do que a população geral. Enquanto o câncer anal tem uma incidência de 09 casos por 100000 na população geral, o câncer anal tem uma incidência de 35 casos por 100000 na popula5 ção masculina homossexual e 70 a 100 casos por 100000 na população masculina homossexual HIV positivo. De fato, devido à prevalência elevada de displasia anal entre pacientes infectados com HIV e uma tendência ao desenvolvimento de cânceres anais, as Normas 2003 USPHA / IDSA para o Tratamento de Infecções Oportunísticas em Pacientes HIV Positivo incluirá 10 normas de tratamento para pacientes diagnosticados com displasia anal.

Não existe nenhuma cura conhecida para HPV. Existem tratamentos para verrugas genitais, embora elas freqüentemente desapareçam mesmo sem tratamento. O método de tratamento depende e fatores, tais como o tamanho e localização das verrugas genitais. Entre os tratamentos 15 empregados estão, creme Imiquimod, solução antimitótico de podofllina a 20 por cento, o solução de podofilox a 0,5 por cento, creme de 5-fluorouracila a 5 por cento, e ácido tricloroacético. O uso de podofllina ou podofilox não é recomendado para mulheres grávidas porque eles são absorvidos pela pele e podem causar defeitos de nascimento. O uso de creme de 5-fluorouracila 20 também não é recomendado para mulheres grávidas. Pequenas verrugas genitais podem ser fisicamente removidas por tratamento com congelamento (criocirurgia), queima (eletrocauterização) ou leiser. Grandes verrugas que não responderam a outro tratamento podem ter que ser removidas por cirurgia. As verrugas genitais foram conhecidas retomarem após a remoção físi25 ca, nestes casos α-interferon tem sido empregado para diretamente injetar nestas verrugas. Entretanto, α-interferon é caro, e seu uso não reduz a taxa de retorno das verrugas genitais.

Como tal, aí existe uma necessidade inconveniente de tratamento de HPV eficaz. Foi atualmente surpreendentemente descoberto compos30 tos que atendem a esta necessidade, e fornecem outros benefícios também.

Sumário da Invenção

Composto da fórmula I, ^RX< /^rX2

N

I em que:

γΐΛ θ _γΐΒ _são independentemente Y¹;

rXi θ _RX2 _são jndependentemente R^x;

Y¹ é =0, -O(R^X), =S, -N(R^X), -N(O)(R^X), -N(OR^X), -N(O)(OR^X), ou -N(N(R^X) (R^x));

R^x é independentemente R¹, R², R⁴, W³, ou um grupo de proteção;

R¹ é independentemente -H ou alquila de 1 a 18 átomos de carbono;

R² é independentemente R³ ou R⁴ em que cada R⁴ é independentemente substituído com 0 a 3 grupos de R³ ou tomado junto em um átomo de carbono, dois grupos de R² formam um anel de 3 a 8 carbonos e o anel pode ser substituído com 0 a 3 grupos de R³;

R³ é R^3a, R^3b, R^3c ou R^3d, contanto que quando R³ for ligado a um heteroátomo, então R³ é R^3c ou R^3d;

R^3a é -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CF₃, -CN, N₃,-NO₂, ou -OR⁴;

R^3b é =0, -O(R⁴), =S, -N(R⁴), -N(O)(R⁴), -N(0R⁴), -N(O)(OR⁴), ou -N(N(R⁴) (R⁴));

R^3c é -R⁴, -N(R⁴)(R⁴), -SR⁴, -S(O)R⁴, -S(O)2R⁴, -S(O)(OR⁴), S(O)2(OR⁴),

-OC(R^3b)R⁴, -OC(R^3b)OR⁴, -OC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴)), -SC(R^3b)R⁴, SC(R^3b)OR⁴,

-SC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴)), -N(R⁴)C(R^3b)R⁴, -N(R⁴)C(R^3b)OR⁴, -N(R⁴)C(R^3b)(N(R⁴)(R⁴)), W³ ou -R⁵W³ ;

R^3d é -C(R^3b)R⁴, -C(R^3b)OR⁴, -C(R^3b)W³, -C(R^3b)OW³ ou C(R^3b)(N(R⁴)(R⁴));

R⁴ é -H, ou uma alquila de 1 a 18 átomos de carbono, alquenila de 2 a 18 átomos de carbono, ou alquinila de 2 a 18 átomos de carbono;

R⁵ é alquileno de 1 a 18 átomos de carbono, alquenileno de 2 a átomos de carbono, ou alquinileno de 2 a 18 átomos de carbono;

W³ é W⁴ ou W⁵;

W⁴ é R⁶, -C(R^3b)R⁶, -C(R^3b)W⁵, -SOM2R⁶, ou -SOM2W⁵, em que R^e é R⁴ em que cada R⁴ é substituído com 0 a 3 grupos de R³;

W⁵ é carbociclo ou heterociclo em que W⁵ é independentemente substituído com 0 a 3 grupos de R²; e

M2 é 0, 1 ou 2;

e sais farmaceuticamente aceitáveis deste.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece um composto da fórmula, γ1Β em que:

R^x ,R^X2

c.

,c.

Aé '' '' ’ ’^or ;

γΐΛ θ γΐΒ _sg₀ jndependentemente Y¹;

R^X1 e R^X2 são independentemente R^x;

Y¹ é =0, -O(R^X), -S, -N(R^X), -N(O)(R^X), -N(OR^X), -N(O)(OR^X), ou

-N(N(R^X)( R^x));

R^x é independentemente R¹, R², R⁴, W³, ou um grupo de proteção;

R¹ é independentemente -H ou alquila de 1 a 18 átomos de carbono;

R^3a é -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CF₃, -CN, N₃, -NO₂. ou -OR⁴;

R^3b é =0, -O(R⁴), =S, -N(R⁴), -N(O)(R⁴), -N(OR⁴), -N(0)(OR⁴), ou -N(N(R⁴)( R⁴));

_r3° _é __R^ _n(R⁴)(R⁴), -SR⁴, -S(O)R⁴, -S(O)2R⁴, -S(O)(OR⁴), S(O)2(OR⁴),

-SC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴)), -N(R⁴)C(R^3b)R⁴, -N(R⁴)C(R^3b)OR⁴, N(R⁴)C(R^3b)(N(R⁴)(R⁴)), W³ ou -R^SW³ ;

R⁵ é alquileno de 1 a 18 átomos de carbono, alquenileno de 2 a 18 átomos de carbono, ou alquinileno de 2 a 18 átomos de carbono;

W³ é W⁴ ou W^s;

W⁴ é R⁶, -C(R^3b)R⁶, -C(R^3b)W⁵, -SOM2R⁶, ou -SOM2W⁵, em que R⁶ é R⁴ em que cada R⁴ é substituído com 0 a 3 grupos de R³;

M2 é 0,1 ou 2;

e sais farmaceuticamente aceitáveis deste..

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da

Fórmula I,

R<’

em que:

Y^1AeY^1B são independentemente Y¹;

R^X1 e R^X2 são independentemente R^x;

Y¹ é =O, -O(R^X), =S, -N(R^X), -N(O)(R^X), -N(OR^X), -N(O)(OR^X), ou

-N(N(R^X)( R^x));

R^x é independentemente R¹, R², R⁴, W³, ou um grupo de proteção;

R¹ é independentemente -H ou alquila de 1 a 18 átomos de car10 bono;

R³ é R^3a, R^3b, R³⁰ ou R^3d, contanto que quando R³ for ligado a um heteroátomo, então R³ é R^3c ou R^3d;

R^3a é -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CF₃₎ -CN, N₃, -NO₂, ou -OR⁴;

R^3b é =0, -0(R⁴), =S, -N(R⁴), -N(O)(R⁴), -N(OR⁴), -N(O)(OR⁴), ou -N(N(R⁴)( R⁴));

-SC(R^3b)(N(R⁴)(R⁴)), -N(R⁴)C(R^3b)R⁴, -N(R⁴)C(R^3b)OR⁴, 25 N(R⁴)C(R^3b)(N(R⁴)(R⁴)), W³ ou -R⁵W³ ;

W³ é W⁴ ou W⁵;

W⁴ é R⁶, -C(R^3b)R⁶, -C(R^3b)W⁵, -SOM2R⁶, or -SOM2W⁵, em que

R⁶ é R⁴ em que cada R⁴ é substituído com 0 a 3 grupos de R³;

W^s é carbociclo ou heterociclo em que W⁵ é independentemente substituído com 0 a 3 grupos de R²; e

M2 é 0, 1 ou 2;

e sais farmaceuticamente aceitáveis deste.

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da Fórmula IA,

onde Y^1A e Y^1B são como acima definidos.

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da fórmula,

HN‘

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da fórmula,

fórmula,

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da fórmula,

fórmula, fórmula, fórmula, fórmula,

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto da fórmula,

HN

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto útil como um agente antiproliferativo.

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto útil como um agente apoptótico.

Uma modalidade da presente invenção fornece um composto útil como um agente anti-HPV.

Um aspecto da presente modalidade fornece um composto útil como um agente anti-HPV tópico.

Uma modalidade da presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Um aspecto da presente modalidade fornece uma composição farmacêutica, onde a composição é uma composição em gel.

Outro aspecto da presente modalidade fornece uma composição farmacêutica, onde a composição é uma composição de ungüento.

Uma modalidade da presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, e uma quantidade eficaz de pelo menos um agente antiviral, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Definições

O termo “PMEG refere-se ao composto 9-(2fosfonilmetoxietiljguanina, o

O termo “PMEDAP refere-se ao composto 9-(2fosfonilmetoxietil)-2,6-diaminopurina,

O termo “cprPMEDAP” refere-se ao composto 9-(2fosfonilmetoxietÍI)-2-amino-6-(ciclopropil)purina,

NH

“Biodisponibilidade” é o grau ao qual o agente farmaceuticamente ativo torna-se disponível ao tecido alvo após a introdução dos agentes no corpo. O realce da biodisponibilidade de um agente farmaceuticamente ativo pode fornecer um tratamento eficaz e mais eficiente para pacientes por que, para uma dose fornecida, mais do agente farmaceuticamente ativo estará disponível nos sítios do tecido alvejado.

Os termos “fosfonato” e grupo de fosfonato incluem porções ou grupos funcionais dentro de uma molécula que compreende um fósforo que é 1) único ligado a um carbono, 2) duplo ligado a um heteroátomo, 3) único ligado a um heteroátomo, e 4) único ligado a outro heteroátomo, em que ca da heteroátomo pode ser igual ou diferente. Os termos “fosfonato e “grupo de fosfonato” também incluem porções ou grupos funcionais que compreendem um fósforo no mesmo estado de oxidação como o fósforo descrito acima, bem como porções ou grupos funcionais que compreendem uma porção de pró-fármaco que pode ser separada de um composto a fim do composto reter um fósforo tendo as características acima descritas. Por exemplo, os termos “fosfonato e “grupo de fosfonato” incluem grupos funcionais de fosfontioato, ácido fosfônico, monoéster fosfônico, diéster fosfônico e fosfonamidato. Em uma modalidade específica da invenção, os termos “fosfonato” e “grupo de fosfonato” incluem porções ou grupos funcionais dentro de uma molécula que compreende um fósforo que é 1) único ligado a um carbono, 2) duplo ligado a um oxigênio, 3) único ligado a um oxigênio, e 4) único ligado a outro oxigênio, bem como porções ou grupos funcionais que compreendem uma porção de pró-fármaco que pode separar de um composto a fim do composto reter um fósforo tendo tais características. Em outra modalidade específica da invenção, os termos “fosfonato” e “grupo de fosfonato” incluem porções ou grupos funcionais dentro de uma molécula que compreende um fósforo que é 1) único ligado a um carbono, 2) duplo ligado a um oxigênio, 3) único ligado a um oxigênio ou nitrogênio, e 4) único ligado a outro oxigênio ou nitrogênio, bem como porções ou grupos funcionais que compreendem uma porção de pró-fármaco que pode separar de um composto a fim do composto reter um fósforo tendo tais características.

Métodos e receitas para determinar a estabilidade de compostos em secreções gastrointestinais adotivas são conhecidos. Os compostos são definidos aqui como estáveis no trato gastrointestinal onde menos do que cerca de 50% mol dos grupos protegidos são desprotegidos no suco gástrico ou intestinal substituto na incubação durante 1 hora a 37 °C. Tais compostos são adequados para o emprego nesta modalidade. Apesar dos compostos simplesmente serem estáveis ao trato gastrointestinal não significa que eles não possam ser hidrolizados in vivo. Os pró-fármacos tipicamente serão estáveis no sistema digestivo porém são substancialmente hidrolizados ao fármaco parental no lúmen digestivo, fígado ou outro órgão metabólico, ou den14 tro das células em geral.

Os compostos da invenção podem também existir como isômeros tautoméricos em certos casos. Por exemplo, os tautômeros eno-amina podem existir para sistemas de imidazol, guanidina, amidina, e tetrazol e to5 das as suas possíveis formas tautoméricas estão inclusas no escopo da invenção.

O termo “pró-fármaco como empregado aqui refere-se a qualquer composto que quando administrado a um sistema biológico gera a substância fármaco, isto é, ingrediente ativo, como um resultado de reações 10 químicas espontâneas; reações químicas catalisadas por enzima, fotólise, e/ou reações químicas metabólicas. Um pró-fármaco é desse modo uma forma latente ou análoga covalentemente modificada de um composto terapeuticamente ativo.

“Porção de pró-fármaco” refere-se a um grupo funcional lábil que 15 separa-se do composto inibitório ativo durante o metabolismo, sistemicamente, dentro de uma célula, por hidrólise, divagem enzimática, ou por algum outro processo (Bundgaard, Hans, “Design and Application of Prodrugs” in A Textbook of Druq Design and Develooment (1991), P. KrogsgaardLarsen and H. Bundgaard, Eds. Harwood Academic Publíshers, pp. 11320 191). As enzimas que são capazes de um mecanismo de ativação enzimático com os compostos de pró-fármaco de fosfonato da invenção incluem, porém não são limitadas a, amidases, esterases, enzimas microbianas, fosfolipases, colinesterases, e fosfases. As porções de pró-fármacos podem servir para realçar a solubilidade, a absorção e a lipofilicidade para otimizar a libe25 ração da fármaco, a biodisponibilidade e a eficácia. A porção de pró-fármaco pode incluir um metabólito ativo ou fármaco.

As porções de pró-fármaco exemplares incluem -CH₂OC(=O)R de ésteres de aciloximetila lábil ou hidroliticamente sensível e -CH2OC(=O)OR de carbonatos de aciloximetila onde R neste exemplo é 30 C-t-Ce alquila, Ci-Ce alquila substituída, Ce-C₂o arila ou C₆-C₂₀ arila substituída. O éster de aciloxialquila foi primeiro empregado como uma estratégia de pró-fármaco para ácidos carboxílicos e em seguida aplicado a fosfatos e fosfonatos por Farquhar et al. (1983) J. Pharm. Sei. 72: 324; também Patentes U.S. n^os 4816570, 4968788, 5663159 e 5792756. Subseqüentemente, o éster de aciloxialquila foi empregado para liberar os ácidos fosfônicos através das membranas celulares e para realçar a biodisponibilidade oral. Uma variante próxima do éster de aciloxialquila, do éster de alcoxicarboniloxialquila (carbonato), pode também realçar a biodisponibilidade oral como uma porção de pró-fármaco nos compostos das combinações da invenção. Um éster de aciloximetila exemplar é isopropilcarboniloximetóxi, -OCH₂OC(=O)C(CH₃)₂. Uma porção de pró-fármaco de carbonato de aciloximetila exemplar é carbonato de isopropilearboniloximetila, HOC(=O)OCH₂OC(=O)C(CH₃)₂.

O grupo de fosfonato pode ser uma porção de pró-fármaco de fosfonato. A porção de pró-fármaco pode ser sensível a hidrólise, tal como, porém não limitada a um grupo de carbonato de isopropilcarbonil-oximetóxi ou isopropilearboniloximetila. Alternativamente, a porção de pró-fármaco pode ser sensível a divagem potencializada enzimática, tal como um éster de lactato ou um grupo de éster de fosfonamidato.

Ésteres de arila de grupos de fósforo, especialmente ésteres de fenila, são apresentados para realçar a biodisponibilidade oral (De Lombaert e outros (1994) J. Med. Chem. 37:498). Ésteres de fenila contendo um orto de éster carboxílico ao fosfato foram também descritos (Khamnei and Torrence, (1996) J. Med. Chem. 39:4109-4115).

Ésteres de benzila são apresentados para gerar o ácido fosfônico origem. Em alguns casos, os substituintes na posição orto ou para podem acelerar a hidrólise. Os análogos de benzila com um fenol acilado ou um fenol alquilado podem gerar o composto fenólico através da ação de enzimas, por exemplo, esterases, oxidases, etc., que por sua vez suporta a divagem na ligação C-O benzílíca para gerar o ácido fosfórico e o intermediário de meteto de quinona. Os exemplos desta classe de pró-fármacos são descritos por Mitchell e outros (1992) J. Chem. Soc. Perkin Trans. II 2345; Glazier WO 91/19721. Ainda outros pró-fármacos benzílicos foram descritos contendo um grupo contendo éster carboxílico ligado ao metileno benzílico.

(Glazier WO 91/19721). Os pró-fármacos contendo Tio são reportados ser úteis para a liberação intracelular de fármacos de fosfonato. Estes proésteres contêm um grupo de etiltio no qual o grupo de tiol é esterificado com um grupo de acila ou combinado com outro grupo de tiol para formar um dissulfito. A desesterificação ou redução do dissulfito gera o intermediário de tio livre que subseqüentemente rompe-se em ácido fosfórico e epissuifito (Puech e outros (1993) Antiviral Res., 22: 155-174; Benzaria e outros (1996) J. Med. Chem. 39: 4958). Os ésteres de fosfonato cíclicos também foram descritos como pró-fármacos de compostos contendo fósforo (Erion e outros, Patente U.S. n° 6312662).

“Grupo de proteção refere-se a uma porção de um composto que mascara ou altera as propriedades de um grupo funcional ou as propriedades do composto como um todo. As estratégias e grupos de proteção químicos para proteção/desproteção são bem conhecidos na técnica. Ver por exemplo, Protectlve Groups in Qrganic Chemistry. Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991. Os grupos de proteção são frequentemente utilizados para mascarar a reatividade de certos grupos funcionais, para ajudar na eficiência de reações químicas desejadas, por exemplo, preparar e romper ligações químicas em um modelo ordenado e planejado. A proteção de grupos funcionais de um composto altera outras propriedades físicas em comparação com a reatividade do grupo funcional protegido, tal como a polaridade, lipofilicidade (hidrofobicidade), e outras propriedades que podem ser medidas por instrumentos analíticos comuns. Os intermediários quimicamente protegidos podem eles mesmos ser inativos ou biologicamente ativos.

Os compostos protegidos podem também exibir propriedades otimizadas alteradas, e em alguns casos, in vitro e in vivo, tais como passagem através de membranas celulares e resistência a degradação enzimática ou sequestro. Neste caso, os compostos protegidos com efeitos terapêuticos intencionais podem ser referidos como pró-fármacos.

Outra função de um grupo de proteção é converter o fármaco parental em um pró-fármaco, pela qual o fármaco parental é liberado na con versão do pró-fármaco in vivo. Por que pró-fármacos ativos podem ser absorvidos mais efetivamente do que a fármaco origem, as pró-fármacos podem possuir maior potência in vivo do que o fármaco origem. Os grupos de proteção são removidos in vitro, no exemplo de intermediários químicos, ou in vivo, no caso de pró-fármacos. Com intermediários químicos, não é particularmente importante que os produtos resultantes após a desproteção, por exemplo, os álcoois, sejam fisiologicamente aceitáveis, embora em geral seja mais desejável se os produtos forem farmacologicamente inócuos.

Qualquer referência a qualquer dos compostos da invenção também incluem uma referência a um sal fisiologicamente aceitável destes. Exemplos de sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos da invenção incluem sais derivados de uma base apropriada, tais como um metal de álcali (por exemplo, sódio), um alcalino terroso (por exemplo, magnésio), amônio e NXf (em que X é C-t-CU alquila). Os sais fisiologicamente aceitáveis de um átomo de hidrogênio ou um grupo de amino incluem sais de ácidos carboxílicos orgânicos, tais como ácidos acéticos, benzóicos, lácticos, fumáricos, tartáricos, maléicos, malônicos, málicos, isetiônicos, lactobiônicos e sucínicos; ácidos sulfônicos orgânicos, tais como ácidos metanossulfônicos, etanossulfônicos, benzenossulfônicos e p-toluenossulfônicos; e ácidos inorgânicos, tais como ácidos hidroclóricos, sulfúricos, fosfóricos e sulfâmicos. Os sais fisiologicamente aceitáveis de um composto de um grupo de hidróxi incluem o ânion do referido composto em combinação com um cátion adequado tais como Na⁺ e NX4⁺ (em que X é independentemente selecionado de H ou um grupo de C1-C4 alquila).

Como empregado aqui, 0 termo “gel” refere-se a sistemas semisólidos consistindo em suspensões preparadas de partículas inorgânicas pequenas ou moléculas orgânicas grandes rodeadas e interpenetradas por um líquido. Onde a massa de gel consiste em flocos de pequenas partículas, 0 gel é classificado como um sistema de duas fases e é algumas vezes chamado de magma. Aluminum Hydroxide Gel and Bentonite Magma são exemplos de sistemas de duas fases. Os géis de fase única consistem em macromoléculas orgânicas uniformemente distribuídas através de um líquido de uma tal maneira que nenhum limite aparente exista entre as macromoléculas dispersas e o líquido. Os exemplos de tais géis são Carboximetilcelulose Sódica e Tragacanto. Embora os géis sejam comumente aquosos, álcoois e óleos podem ser empregados como uma fase contínua.

Como empregado aqui, o termo “ungüento” refere-se a uma preparação semi-sólida para aplicação externa de uma tal consistência que pode ser facilmente aplicada à pele por inunção. Ela deve ser de uma tal composição que ela amoleça porém não necessariamente derreta quando aplicada ao corpo. Ela serva como veículo para aplicação tópica de substâncias medicinais e também funciona como protetores e emolientes para a pele.

Para o emprego terapêutico, os sais dos ingredientes ativos dos compostos da invenção serão fisiologicamente aceitáveis, isto é, eles serão sais derivados de uma base ou ácido fisiologicamente aceitável. Entretanto, sais de ácidos ou bases que não são fisiologicamente aceitáveis podem também encontrar emprego, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto fisiologicamente aceitável. Todos os sais, sejam ou não derivados, formam uma base ou ácido fisiologicamente aceitável, e incluem-se no escopo da presente invenção.

“Alquila” é C1-C18 hidrpcarboneto contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos. Exemplos são metila (Me, -CH3), etila (Et, -CH2CH3), 1-propila (n-Pr, n-propila, -CH2CH2CH3), 2propila (i-Pr, i-propila, -CH(CH3)2), 1-butila (n-Bu, n-butila, -CH2CH2CH2 CH3), 2-metil-1-propila (i-Bu, j-butila, -CH2CH(CH3)2), 2-butila (s-Bu, sbutila, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propila (t-Bu, t-butila, -C(CH3)3), 1pentila (n-pentila, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentíla (-CH(CH3)CH2CH2 CH3), 3-pentila (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butila (-C(CH3)2CH2CH3), 3metil-2-butila (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butila (-CH2CH2CH(CH3)2),

2- metil-1-butila (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexlla (-CH2CH2CH2CH2CH2 CH3), 2-hexila (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexila (-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentila (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentila (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentila (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2),

3- metil-3-pentila (-Ο(ΟΗ3)(ΟΗ2θΗ3)2), 2-metil-3-pentila (-CH(CH2CH3)

CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butila (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butila (-CH(CH3)C(CH3)3.

“Alquenila” é C2-C18 hidrocarboneto contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, uma ligação dupla carbono-carbono, sp². Exemplos incluem, porém não são limitados a, etileno ou vinila (-CH=CH₂), alila (-CH₂CH=CH2), ciclopentenila (-C₅H₇), e 5-hexenila (-CH₂ CH₂CH₂CH₂CH=CH₂).

“Alquinila” é C2-C18 hidrocarboneto contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, uma ligação tripla carbono-carbono, sp. Exemplos incluem, porém não são limitados a, acetilênico (-CsCH) e propargila (-CH₂C=CH), “Alquileno refere-se a um radical de hidrocarboneto cíclico, de cadeia reta ou ramificada ou saturado de 1 -18 átomos de carbono, e tendo dois centros de radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio de iguais ou dois diferentes átomos de carbono de um alcano origem. Os radicais de Alquileno típicos incluem, porém não são limitados a, metíleno (-CH₂-) 1,2-etila (-CH₂CH₂-), 1,3-propila (-CH₂CH₂CH₂-), 1,4-butila (-CH₂CH₂CH₂CH₂-), e similares.

“Alquenileno” refere-se a um radical de hidrocarboneto insaturado, de cadeia reta ou ramificada ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e tendo dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio de iguais ou dois diferentes átomos de carbono de um alqueno origem. Os radicais de alquenileno típicos incluem, porém não são limitados a, 1,2-etileno (-CH=CH-).

“Alquinileno” refere-se a um radical de hidrocarboneto insaturado, de cadeia reta ou ramificada ou cíclico de 2 - 18 átomos de carbono, e tendo dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio de iguais ou dois diferentes átomos de carbono de um alquina origem. Os radicais de alquinileno típicos incluem, porém não são limitados a, acetileno (-0=0-), propargila (-CH₂CsC-), e 4-pentinila

2l (-CH2CH2CH2CSCH-).

Arila significa um radical de hidrocarboneto aromático monovalente de 6 - 20 átomos de carbono derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático origem. Os grupos de arila típicos incluem, porém não são limitados a, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila, e similares.

“Arilaiquila refere-se a um radical de alquila acíclica no qual um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono sp³ ou terminal, é substituído com um radical de arila. Os grupos de arilaiquila típicos incluem, porém não são limitados a, benzila, 2feniletan-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, naftobenzila, 2-naftofeniletan-1ila e similares. O grupo de arilaiquila compreende de 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a porção de alquila, incluindo grupos de alquila, alquenila ou alquinila, do grupo de arilaiquila é de 1 a 6 átomos de carbono e a porção de arila é de 5 a 14 átomos de carbono.

Alquila substituída, “arila substituída”, e “arilaiquila substituída” significa alquila, arila, e arilaiquila respectivamente, em que um ou mais átomos de hidrogênio são cada qual independentemente substituídos com um substituinte de não hidrogênio. Substituintes típicos incluem, porém não são limitados a, -X, -R, -O', -OR, -SR, -S’, -NR₂, -NR₃, =NR, -CX₃, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO₂, =N₂, -N₃, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NRR -S(=O)₂O’, -S(=O)₂OH, -S(=O)₂R, -OS(=O)₂OR, -S(=O)₂NHR, -S(=O)R, -OP(=O)O₂RR. -P(=O)O₂RR -P(=O)(O-)₂,

-P(=O)(OH)₂, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O-, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR, -C(NR)NRR, onde cada X é independentemente um halogênio: F, Cl, Br, ou I; e cada R é independentemente -H, alquila, arila, heterociclo, grupo de proteção ou porção de pró-fármaco. Os grupos de Alquileno, alquenileno e alquinileno podem também ser similarmente substituídos.

“Heterociclo como empregado aqui inclui como forma de exemplo e não limitação destes heterociclos descritos em Paquette, Leo A.; Prin ciples of Modem Heterocvclic Chemistry (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, e 9; The Chemistry of Heterocyclic Compounds. A Series of MonograDhs^l> (John Wiley & Sons, New York, 1950 a atualidade), em particular Volumes 13, 14, 16, 19, e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. Em uma modalidade específica da invenção “heterociclo” inclui um “carbociclo como definido aqui, em que um ou mais (por exemplo 1,2, 3, ou 4) átomos de carbono foram substituídos com um heteroátomo (por exemplo O, N, ou S).

Exemplos de heterociclos incluem como forma de exemplo e não limitação piridila, diidropiridila, tetraidropiridila (piperidila), tiazolila, tetraidrotl· ofenila, tetraidrotiofenila oxidada por enxofre, pirimidinila, furanila, tienila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tetrazolila, benzofuranila, tianaftalenila, indolila, indolenila, quinolinila, isoquínolinila, benzimidazolila, piperidinila, 4piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, pirrolinila, tetraidrofuranila, tetraidroquinolinila, tetraidroisoquinolinila, decaidroquinolinila, octaidroisoquinolinila, azocinila, tríazíníla, 6H-1,2,5-tiadiazinila, 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, tienila, tiantrenila, piraniia, isobenzofuranila, cromenila, xantenila, fenoxatinila, 2Hpirrolila, isotiazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazinila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, 1 H-indazolila, purinila, 4H-quinolizinila, ftalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, pteridinila, 4aH-carbazolila, carbazolila, β-carbolinila, fenantridinila, acridinila, pirimidinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, piperazinila, indolinila, isoindolinila, quinuclidinila, morfolinila, oxazolidinila, benzotriazolila, benzisoxazolila, oxindolila, benzoxazolinila, isatinoila, e bis-tetraidrofuranila.

Como exemplo e não limitação, heterociclos ligados por carbono são ligados na posição 2, 3, 4, 5, ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5, ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5, ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5, ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4, ou 5 de um furano, tetraidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetraidropirrol, posição 2, 4, ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4, ou 5 de um isoxazol, pirazol, ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridína, posição 2, 3, ou 4 de uma azetídina, posi22 ção 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma quinolina ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por carbono incluem 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 5-piridila, 6-piridila, 3-piridazinila, 4piridazinila, 5-piridazinila, 6-piridazinila, 2-pirimidinila, 4-pirimidinila, 55 pirimidinila, 6-pirimidinila, 2-pirazinila, 3-pirazinila, 5-pirazinila, 6-pirazinila, 2tiazolila, 4-tiazolila, ou 5-tiazolila.

Como exemplo e não limitação, os heterociclos ligados por nitrogênio são ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirroltna, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-ímidazolina, 10 pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1 H-indazol, posição 2 de um isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina, e posição 9 de um carbazol, ou β-carbolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por nitrogênio incluem 1 -aziridila, 1-azetedila, 1-pírrolila, 1-imidazolila, 1-pirazoiila, e 1-piperidinila.

“Carbociclo” refere-se a um anel aromático, saturado ou insaturado tendo de 3 a 7 átomos de carbono como um monociclo, de 7 a 12 átomos de carbono como um biciclo, e até cerca de 20 átomos de carbono como um policiclo. Os carbociclos monocíclicos possuem de 3 a 6 átomos de anel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos de anel. Os carbociclos bicícli20 cos possuem de 7 a 12 átomos de anel, por exemplo, dispostos como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos de anel dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6]. Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropila (cPropil), ciclobutila (cButil), ciclopentila (cPentil), 1ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3-enila, cicloexila, 1-cicloex25 1-enila, 1-cicloex-2-eníla, 1-cicloex-3-enila, fenila, espirila e naftila.

Ligante” ou “ligação refere-se a uma porção química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia ou grupo de átomos que covalentemente liga um grupo de fosfonato a um fármaco. Os ligantes incluem porções tais como: unidades de repetição de alquilaóxi (por exemplo, polieti30 lenoóxi, PEG, polimetilenoóxi) e alquilaamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine®); e éster de diácido e amidas incluindo sucinato, sucinamida, diglicolato, malonato e caproamida.

•2H

Como empregado aqui o termo “Aba” refere-se a uma porção divalente de ácido 2-aminobutanóico,

onde os pontos de ligamento são designados pelo “ * “

Como empregado aqui o termo “Ala” refere-se a uma porção divalente de alanina,

onde os pontos de ligamento são designados pelo * “

Como empregado aqui o termo “Fe” refere-se a uma porção divalente de alanina,

onde os pontos de ligamento são designados pelo “ * “

onde os pontos de ligamento são designados pelo “ *

Como empregado aqui o termo “POC refere-se à porção divalente de carbonato de isopropila de hidroximetila,

onde o ponto de ligamento é designado por “ * “.

Os grupos substituintes Y^1A e Y^1B podem ser descritos empregando-se a nomenclatura que incorpora as porções de aminoácido divalente acima mencionadas e as porções de alquila, tal como na Tabela 80-3.

Por exemplo, o composto da fórmula,

pode ser descrito empregando-se a nomenclatura da Fórmula I, onde Y^1A e Y^1B são -N(R^X), onde R^x é R², onde R² é R⁴ substituído com R^3d, onde R⁴ é etila substituída com R^3d também onde R^3d é -C(R^3b)OW³, onde R^3b é =O, onde W³ é W⁵, onde W⁵ é um carbociclo, onde R⁴ é propila substituída com 10 R^3d, onde R^3d é -C(R^3b)OR⁴, onde R^3b é =0, e onde R⁴ é etila. Altemativamente, o referido composto pode ser descrito, como na Tabela 80-3, como

Fórmula I, onde Y^1A e Y^1B são “Aba-Et”, que descreve a porção (onde “ * “ indica o ponto de ligamento),

o que é “Aba ligado a “Et” (etila).

pode ser descrito empregando-se a nomenclatura da Fórmula I, onde Y^1A e

Y^1B são -N(R^X), onde R^x é R², onde R² é R⁴ substituído com R^3d, onde R⁴ é etila substituída com R^3d, onde R^3d é -C(R^3b)OR⁴, onde R^3b é =0, e onde R⁴é n-propila. Alternativamente, o referido composto pode ser descrito, como na Tabela 80-3, como Fórmula I, onde Y^1A e Y^1B são “Ala-nPr”, que descreve 5 a porção (onde “ * “ indica o ponto de ligamento),

O que é “Ala” ligado a nPf (n-propila).

O termo “quiral refere-se a moléculas que possuem a propriedade da não capacidade de sobreposição do parceiro de imagem de espelho, ao mesmo tempo que o termo “aquiral” refere-se a moléculas que po10 dem ser sobrepostas em seu parceiro de imagem de espelho.

O termo “estereoisômeros” refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, porém diferem-se com referência à disposição dos átomos ou grupos no espaço.

“Diaestereômero” refere-se a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens de espelho uma da outra. Diaestereômeros têm propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais, e reatividades. Misturas de diaestereômeros podem separar-se sob procedimentos analíticos de alta resolução tais como eletroforese e cromatografia.

“Enantiômeros” referem-se a dois estereoisômeros de um composto que são imagens de espelho não sobrepostas uma da outra.

O termo “tratamento” ou “tratando”, para a extensão a que ele se refere a uma doença ou condição inclui prevenção da ocorrência da doença ou condição, inibição da doença ou condição, eliminação da doença ou con25 dição, e/ou alívio de um ou mais sintomas da doença ou condição.

O termo “antiproliferativo” refere-se a atividades empregadas para, ou tendendo a inibir o crescimento celular, tal como efeitos antiproliferativos sobre células de tumor, ou efeitos antiproliferativos sobre células vi26

- ralmente infectadas.

O termo “apoptose” refere-se a um dos principais tipos de morte celular programada. Como tal, é um processo de deliberar suicida por uma célula indesejada em um organismo multicelular. Ao contrário da necrose, 5 que é uma forma de morte celular que resulta de lesão de tecido aguda, apoptose é realizada em um processo ordenado que geralmente confere vantagens durante um ciclo de vida do organismo. Apoptose é um tipo de morte celular em que a célula emprega mecanismo celular especializado para matar a si própria; um mecanismo suicida da célula que possibilita que metazo10 ários controlem o número de célula e eliminem células que desafiem a sobrevivência do animal. Apoptose pode ocorrer, por exemplo, quando uma célula é danificada além de reparada, ou infectada com um vfrus. Os estímu. los para apoptose podem vir da própria célula, de seu tecido circundante ou . de uma célula que é parte do sistema imune, pode ser química, biológica ou física. O termo relatado “apoptídica” refere-se ao processo de apoptose.

’ Definições estereoquímicas e convenções empregadas aqui ge* ’ ralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-HilI Dictionary of Chemical

Terms (1984) McGraw-HilI Book Company, New York; e Eliel, E. e Wilen, S., * Stereochemistry of Organlc Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc.,

New York. Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente atívas, isto é, eles têm a capacidade de girar o plano de luz polarizada por plano. Na descrição de um composto oticamente ativo, os prefixos D e L ou R e S são empregados para denotar a configuração absoluta da molécula a cerca de seu centro(s) quiral. Os prefixos d e I ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação da luz polarizada por plano pelo composto, com (-) ou I significando que o composto é levogiratório. Um composto pré-fixado com (+) ou d é dextrogiratório. Para uma determinada estrutura química, esses estereoisômeros são idênticos exceto os que são imagens de espelho um do outro. Um estereoisômero específico pode também ser referido como 30 um enantiômero, e uma mistura de tais isômeros é freqüentemente chamada de uma mistura enantiomérica. Uma mistura de 50:50 de enantiômeros é referida como uma mistura racêmica ou um racemato, que pode ocorrer on de não existe nenhuma estereosseleção ou estereoespecificidade em um processo ou reação química. Os termos mistura racêmica” e “racemato” referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovida de atividade ótica.

Grupos de Proteção

No contexto da presente invenção, grupos de proteção incluem porções de pró-fármaco e grupos de proteção químicos.

Grupos de proteção são disponíveis, comumente conhecidos e empregados, e são opcionalmente empregados para prevenir reações cola10 terais com o grupo protegido durante procedimentos sintéticos, isto é rotinas ou métodos para preparar os compostos da invenção. Em geral a decisão de qual grupo proteger, quando feita desse modo, e a natureza do grupo de proteção química “PG” será dependente da química da reação a ser protegida contra (por exemplo, condições acídicas, básicas, oxidativas, redutivas ou 15 outras) e a direção pretendida da síntese. Os grupos PG não necessitam ser, e geralmente não são, o mesmo se o composto for substituído com PG múltiplo. Em geral, PG será empregado para proteger grupos funcionais, tais comò grupos de carboxila, hidroxila, tio, ou amino e para deste modo prevenir reações colaterais ou para de outra maneira facilitar a eficiência sintética. 20 A ordem de desproteção para produzir grupos desprotegidos lívres é dependente da direção pretendida da síntese e das condições de reação a serem encontradas, e pode ocorrer em qualquer ordem como determinado pelo técnico.

Vários grupos funcionais dos compostos da invenção podem ser 25 protegidos. Por exemplo, grupos de proteção para grupos de -OH (se hidroxila, ácido carboxílico, ácido fosfônico, ou outras funções) incluem “grupos formadores de éter ou éster”. Grupos formadores de éter ou éster são capazes de funcionar como grupos de proteção química nos esquemas sintéticos mencionados aqui. Entretanto, alguns grupos de proteção de tio e hidroxila 30 são grupos formadores nem de éter nem de éster, como será entendido por aqueles versados na técnica, e são incluídos com amidas, discutidas abaixo.

Um número muito grande de grupos de proteção de hidroxila e grupos formadores de amida e reações de divagem química correspondentes são descritas em Protectíve Grouos in Organic Synthesis. Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991, ISBN 0-471-62301-6) (Greene”). Ver também Kocienski, Philip J.; Protecting Grouos (Georg Thi5 eme Verlag Stuttgart, New York, 1994), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em particular Capítulo 1, Protecting Groups: An Overview, páginas 1-20, Capítulo 2, Hydroxyl Protecting Groups, páginas 21-94, Capítulo 3, Diol Protecting Groups, páginas 95-117, Capítulo 4, Carboxyl Protecting Groups, páginas 118-154, Capítulo 5, Carbonyl Protecting 10 Groups, páginas 155-184. Para grupos de proteção para ácido carboxílico, ácido fosfônico, fosfonato, ácido sulfônico e outros grupos de proteção para ácidos, ver Greene como mencionado abaixo. Tais grupos incluem a título de exemplo e não de limitação, ésteres, amidas, hidrazidas, e outros.

. Grupos de proteção formadores de éter e éster

Grupos formadores de éster incluem: (1) grupos formadores de *

éster de fosfonato, tais como ésteres de fosfonamidato, ésteres de fosforoti- oato, ésteres de fosfonato, e fosfon-bis-amidatos; (2) grupos formadores de éster de carboxila, e (3) grupos formadores de éster de súlfur, tais como sulfonato, enxofre, e sulfinato.

As porções de fosfonato dos compostos da invenção podem ou não ser porções de pró-fármaco, isto é elas podem ou não ser suscetíveis a modificação ou divagem hidrolítica ou enzimática. Certas porções de fosfonato são estáveis sob a maior parte ou quase todas as condições metabólicas. Por exemplo, um dialquilfosfonato, onde os grupos de alquila têm dois 25 ou mais carbonos, podem ter estabilidade apreciável in vivo devido a uma baixa taxa de hidrólise.

Saís e Hidratos

As composições desta invenção opcionalmente compreendem sais dos compostos inclusos, especialmente sais não tóxicos farmaceutica30 mente aceitáveis contendo, por exemplo, Na⁺, Li⁺, K⁺> Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺. Tais sais podem incluir aqueles derivados por combinação de cátions apropria dos, tais como íons de metal alcalino terroso e álcali ou íons de amino qua29 . ternário e amônio com uma porção de ânion de ácido. Sais monovalentes são preferidos se um sal solúvel em água for desejado.

Sais de metal tipicamente são preparados por reação de um composto desta invenção com um hidróxido de metal. Exemplos de sais de 5 metal que são preparados desta maneira são sais contendo Li⁺, Na⁺, e K⁺. Um sal de metal menos solúvel pode ser precipitado da solução de um sal mais solúvel por adição do composto de metal adequado.

Além disso, saís podem ser formados pela adição de ácido de certos ácidos orgânicos e inorgânicos, por exemplo, HCI, HBr, H2SO4, ou 10 ácidos sulfônicos orgânicos, a centros básicos, ou a grupos acídicos. Finalmente, deve-se entender que as composições inclusas compreendem compostos da invenção em sua forma não ionizada, bem como híbrida, e combi* nações com quantidades estequiométricas de água como em hidratos.

, Também inclusos no escopo desta invenção estão os sais dos compostos origem com um ou mais aminoácidos. Quaisquer dos aminoáci¹ dos descritos acima são adequados, especialmente os aminoácidos de ocore . rência natural encontrados como componentes de proteína, embora o aminoácido tipicamente seja um que transporte uma cadeia lateral com um gru* po básico ou acídico, por exemplo, lisina, arginina ou ácido glutâmico, ou um grupo neutro, tal como glicina, serina, treonina, alanina, isoleucina, ou leucina.

Métodos de Inibição de HPV

Outro aspecto da invenção refere-se aos métodos de inibição da atividade de HPV compreendendo a etapa de tratamento de uma amostra 25 suspeita de conter HPV com um composto da invenção.

Composições da invenção agem como inibidores de HPV, como intermediários de tais inibidores ou têm outras utilidades como descrito abaixo.

A etapa de tratamento da invenção compreende adição da com30 posição da invenção à amostra ou compreende adição de um precursor da composição à amostra. A etapa de adição compreende qualquer método de administração como descrito acima.

22l

Se desejado, a atividade de HPV após aplicação da composição pode ser observada por qualquer método incluindo métodos diretos e indiretos de detecção da atividade de HPV. Métodos quantitativos, qualitativos, e semiquantitativos de determinação da atividade de HPV são todos contemplados. Tipicamente um dos métodos de avaliação descritos acima são aplicados, entretanto, qualquer outro método, tal como observação das propriedades fisiológicas de um organismo vivo são também aplicáveis. Avaliação quanto a Inibidores de HPV

Compostos e composições da invenção são avaliados quanto a utilidade terapêutica por avaliação do EC₅₀, que é a concentração de composto que obtém 50% de inibição de crescimento celular. A relação de EC50 em células infectadas e não infectadas por HPV fornece uma medida da seletividade do composto para as células infectadas pelo vírus. Os protocolos empregados para obter essas medidas são ensinados nos Exemplos. Formulações Farmacêuticas e Rotinas de Administração.

Os compostos desta invenção são formulados com excipientes e veículos convencionais, que serão selecionados de acordo com a prática usual. Comprimidos conterão excipientes, deslizantes, cargas, aglutinantes e similares. Formulações aquosas são preparadas em forma estéril, e quando destinadas a liberação por administração exceto oral, geralmente serão isotônicas. Todas as formulações opcionalmente conterão excipientes, tais como aqueles mencionados no Handbook of Pharmaceutical Excipients” (1986). Excipientes incluem ácido ascórbico e outros antioxidantes, agentes de quelação, tal comoÊDTA, carboidratos, tais como dextrina, hidroxialquilcelulose, hidroxialquilmetilcelulose, ácido esteárico e outros. O pH das formulações varia de cerca de 3 a cerca de 11, porém é usualmente cerca de 7 a 10.

Um ou mais compostos da invenção (aqui referidos neste contexto como os ingredientes ativos) são administrados por qualquer rotina apropriada à condição a ser tratada. Rotinas adequadas incluem oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublinguai), vaginal e parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural), e

22.^ similares. Será apreciado que a rotina preferida pode variar com a condição do recipiente. Uma vantagem dos compostos desta invenção é que eles são oralmente biodisponíveis e podem ser dosados oralmente.

Ao mesmo tempo que é possível para os ingredientes ativos se5 rem administrados sozinhos, pode ser preferível apresentá-los como formulações farmacêuticas. As formulações, ambas para uso veterinário e humano, da invenção compreendem pelo menos um ingrediente ativo, como definido acima, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis portanto e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos. Os portadore(s) devem ser 10 “aceitáveis” no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e fisiologicamente inócuos ao recipiente destes.

As formulações incluem aquelas adequadas para as rotinas de administração anteriores. As formulações podem convenientemente ser apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por 15 quaisquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Técnicas e formulações geralmente são encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tais métodos incluem a etapa de trazer em associação o ingrediente ativo com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral as formulações são preparadas 20 uniformemente e intimamente trazendo em associação o ingrediente ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, modelando o produto.

Formulações da invenção adequadas para administração oral são preparadas como unidades discretas, tais como cápsulas, selos ou com25 primidos cada contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo em água ou uma emulsão líquida água em óleo. O ingrediente ativo pode também ser apresentado como um bólus, eletuário ou pasta.

Um comprimido é preparado por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos prensados podem ser preparados por compressão em uma máquina adequada do

2Ζ3 ingrediente ativo em uma forma de fluxo livre, tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, conservante, agente tensoativo ou agente de dispersão. Comprimidos moldados podem ser preparados por moldagem em um máquina adequada de uma mistura do ingrediente ativo em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem opcionalmente ser revestidos ou entalhados e opcionalmente são formulados a fim de fornecer liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo dele.

Para infecções do olho ou outros tecidos externos, por exemplo boca e pele, as formulações são preferivelmente aplicadas como um ungüento ou creme tópico contendo os ingrediente(s) ativos em uma quantidade de, por exemplo, 0,075 a 20% peso/peso (incluindo ingrediente(s) ativos em uma faixa entre 0,1% e 20% em incrementos de 0,1% peso/peso, tal como 0,6% peso/peso, 0,7% peso/peso, etc), preferivelmente 0,2 a 15% peso/peso e mais preferivelmente 0,5 a 10% peso/peso. Quando formulados em um ungüento, os ingredientes ativos podem ser empregados com uma base de ungüento miscível em água ou parafínica. Aitemativamente, os ingredientes ativos podem ser formulados em um creme com uma base de creme óleo em água.

Se desejado, a fase aquosa da base de creme pode incluir, por exemplo, pelo menos 30% peso/peso de um álcool poliídrico, isto é um álcool tendo dois ou mais grupos de hidroxila, tal como propíleno glicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol e glicol de polietileno (incluindo PEG 400) e misturas destes. As formulações tópicas podem desejavelmente incluir um composto que realce a absorção ou penetração do ingrediente ativo através da pele ou outras áreas afetadas. Exemplos de tais realçadores de penetração dérmica incluem sulfóxido de dimetila e análogos relacionados.

A fase oleosa das emulsões desta invenção pode ser constituída de ingredientes conhecidos de uma maneira conhecida. Ao mesmo tempo que a fase pode compreender simplesmente um emulsificador (de outra maneira conhecido como um emulgente), desejavelmente compreende uma mistura de pelo menos um emulsificador com uma gordura ou um óleo ou com ambos uma gordura e um óleo. Preferivelmente, um emulsificador hidrofílico é incluído juntamente com um emulsificador lipofílico que age como um estabilizador. É também preferido incluir ambos um óleo e uma gordura. Juntos, os emulsificadores(s) com ou sem estabilizadores(s) constituem a 5 assim chamada cera emulsificante, e a cera juntamente com o óleo e gordura constituem a assim chamada base de ungüento emulsificante que forma a fase oleosamente dispersa das formulações de creme.

Emulgentes e estabilizadores de emulsão adequados para uso na formulação da invenção incluem Tween® 60, Span® 80, álcool de ceto10 estearila, álcool de benzila, álcool de miristila, monoestearato de glicerila e sulfato de laurila de sódio.

A escolha de óleos ou gorduras adequados para a formulação é baseada na obtenção das propriedades cosméticas desejadas. O creme deve preferivelmente ser um produto não graxo, não manchável e lavável com 15 consistência adequada para evitar o vazamento de tubos ou outros recipientes. Cadeia linear ou ramificada, ésteres de alquila mono- ou dibásica, tal como diisoadipato, estearato de isocetila, diéster de glicol de propileno de ácidos graxos de coco, miristato de isopropila, oleato de decila, palmitato de isopropila, estearato de butila, palmitato de 2-etilexila ou uma mistura de és20 teres de cadeia ramificada conhecidos como Crodamol CAP pode ser empregada, os três últimos sendo ésteres preferidos. Esses podem ser empregados sozinhos ou em combinação dependendo das propriedades requeridas. Alternativamente, lipídíos de ponto de fusão elevado, tal como parafina macia branca e/ou parafina líquida ou outros óleos minerais são emprega25 dos.

Formulações adequadas para administração tópica para o olho também incluem colírios em que o ingrediente ativo é dissolvido ou suspenso em um veículo adequado, especialmente um solvente aquoso para o ingrediente ativo. O ingrediente ativo está preferivelmente presente em tais 30 formulações em uma concentração de 0,5 a 20%, vantajosamente 0,5 a 10% particularmente cerca de 1,5% peso/peso.

Formulações adequadas para administração tópica na boca in cluem losangos compreendendo o ingrediente ativo em uma base aromatizada, usual mente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e anti-sépticos bucais compreendendo o ingrediente ativo em um veículo líquido adequado.

Formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com uma base adequada compreendendo, por exemplo manteiga de cacau ou um salicilato.

Formulações adequadas para administração intrapulmonar ou nasal têm um tamanho de partícula por exemplo na faixa de 0,1 a 500 mícrons (incluindo tamanhos de partícula, em uma faixa entre 0,1 e 500 mícrons em incrementos mícrons, tais como 0,5, 1, 30 mícrons, 35 mícrons, etc.), que são administradas por inalação rápida através da passagem nasal ou por inalação através da boca a fim de alcançar os sacos alveolares. Formulações adequadas incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo. Formulações adequadas para administração por aerossol ou pó seco podem ser preparadas de acordo com métodos convencionais e podem ser liberadas com outros agentes terapêuticos, tais como compostos até agora empregados no tratamento ou profilaxia de infecções por influenza A ou B como descrito abaixo.

Formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como formulações de pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou spray contendo além do ingrediente ativo, tais veículos que são como conhecidos na técnica serem apropriados.

Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéril aquosa e não aquosa que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes.

As formulações são apresentadas em recipientes de dose única ou múltiplas doses, por exemplo, frasconetes e ampolas seladas, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizadas) requerendo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo água para injeção, imediatamente antes do uso. Suspensões e soluções de injeção improvisadas são preparadas de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito. Formulações de dosagem única preferidas são aquelas contendo uma dose diária ou subdose diária única, como aqui acima mencionado, ou uma fração apropriada desta, do ingrediente ativo.

Deve-se entender que além dos ingredientes particularmente mencionados acima as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica tendo relação com o tipo de formulação em questão, por exemplo aqueles adequados para administração oral podem incluir agentes de aromatização.

A invenção também fornece composições veterinárias compreendendo pelo menos um ingrediente ativo como acima definido juntamente com um veículo veterinário portanto.

Veículos veterinários são materiais úteis para o propósito de administração da composição e podem ser materiais sólidos, líquidos ou gasosos que são de outro modo inertes ou aceitáveis na técnica veterinária e são compatíveis com o ingrediente ativo. Essas composições veterinárias podem ser administradas oralmente, parenteralmente ou por qualquer outra rotina desejada.

Compostos da invenção são empregados para fornecer formulações farmacêuticas de liberação controlada contendo como ingrediente ativo um ou mais compostos da invenção (formulações de liberação controlada”) em que a liberação do ingrediente ativo é controlada e regulada para permitir dosagem de menor frequência ou para melhorar o perfil de toxicidade ou farmacocinética de um dado ingrediente ativo.

A dose eficaz de ingrediente ativo depende pelo menos da natureza da condição a ser tratada, toxicidade, se o composto estiver sendo empregado profilaticamente (doses menores) ou contra uma infecção por influenza ativa, o método de liberação, e a formulação farmacêutica, e será determinado pelo clínico empregando-se estudos de escalação de dose con36 vencional. Pode ser esperado ser de cerca de 0,0001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia; tipicamente, de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia; mais tipicamente, de cerca de 0,01 a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dia; mais tipicamente, de cerca de 0,05 a cerca 5 de 0,5 mg/kg de peso corporal por dia. Por exemplo, para inalação a dose candidata diária para um humano adulto de aproximadamente 70 kg de peso corporal variará de 1 mg a 1000 mg, preferivelmente entre 5 mg e 500 mg, e pode tomar a forma de doses únicas ou múltiplas.

Ingredientes ativos da invenção são também empregados em 10 combinação com outros ingredientes ativos. Tais combinações são selecionadas com base na condição a ser tratada, reatividades cruzadas de ingredientes e fármaco-propriedades da combinação. Por exemplo, quando tratando infecções virais do sistema respiratório, em particular infecção por influenza, as composições da invenção são combinadas com antivirais (tais 15 como amantidina, rimantadina e ribavirina), mucolíticos, expectorantes, broncodilatadores, antibióticos, antipiréticos, ou analgésicos. Ordinariamente, antibióticos, antipiréticos, e analgésicos são administrados juntamente com os compostos desta invenção.

Metabólitos dos Compostos da Invenção

A presente invenção também fornece os produtos metabólicos in vivo dos compostos descritos aqui, para extensão em que tais produtos são novos e não óbvios sobre a técnica anterior. Tais produtos podem resultar por exemplo da oxidação, redução, hidrólise, amidação, esterificação e similares do composto administrado, primariamente devido ao processo enzimá25 tico. Desta maneira, a invenção inclui novos e não óbvios compostos produzidos por um processo compreendendo contatar um composto desta invenção com um mamífero durante um período de tempo suficiente para produzir um produto metabólico deste. Tais produtos tipicamente são identificados por preparação de um composto radiorrotulado (por exemplo C4⁴ ou FÉ) da invenção, administração dele parenteralmente em uma dose detectável (por exemplo maior do que cerca de 0,5 mg/kg) a um animal, tal como rato, camundongo, cobaia, macaco, ou ao homem, deixando tempo suficiente para o metabolismo ocorrer (tipicamente cerca de 30 segundos a 30 horas) e isolar seus produtos de conversão da urina, sangue ou outras amostras biológicas. Esses produtos são facilmente isolados visto que eles são rotulados (outros são isolados pelo uso de anticorpos capazes de ligar epítopos sobreviventes 5 no metabólito). As estruturas metabólicas são determinadas de modo convencional, por exemplo por análise de MS ou RMN. Em geral, análise de metabólitos é feita da mesma maneira como estudos de metabolismo de fármaco convencionais bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os produtos de conversão, contanto que eles não sejam de outra maneira encon10 trados in vivo, são úteis em ensaios diagnósticos para a dosagem terapêutica dos compostos da invenção mesmo que eles não possuam nenhuma atividade inibidora de neuraminidase deles próprios.

Empregos Adicionais para os Compostos desta Invenção.

Os compostos desta invenção, ou as substâncias biologicamen15 te ativas produzidas desses compostos por hidrólise ou metabolismo in vivo, são empregados como imunógenos ou para conjugação às proteínas, pelas quais eles servem como componentes de composições imunogênicas para preparar anticorpos capazes de ligarem-se especificamente às proteínas, aos compostos ou a seus produtos metabólicos que retêm epítopos imuno20 logicamente reconhecidos (sítios de ligação de anticorpo). As composições imunogênicas, portanto, são úteis como intermediários na preparação de anticorpos para uso em métodos diagnósticos, de controle de qualidade, ou outros, ou em ensaios para os compostos ou seus novos produtos metabólicos. Os compostos são úteis para aumento dos anticorpos contra polipeptí25 deos de outra maneira não imunogênicos, em que os compostos funcionam como sítios haptênicos de estimulação de uma resposta imune que interagem com a proteína conjugada não modificada.

Os produtos de hidrólise de interesse incluem produtos da hidrólise dos grupos acídicos e básicos protegidos descritos acima. Como obser30 vado acima, as amidas acídicas ou básicas compreendendo polipeptídeos imunogênicos, tais como albumina ou hemocianina de lapa de buraco de fechadura geralmente são úteis como imunógenos. Os produtos metabólicos • descritos acima podem reter um grau substancial de reatividade cruzada imunológica com os compostos da invenção. Desse modo, os anticorpos desta invenção serão capazes de ligar-se aos compostos não protegidos da invenção sem ligarem-se aos compostos protegidos; alternativamente os 5 produtos metabólicos, serão capazes de ligar-se aos compostos protegidos e/ou aos produtos metabólicos sem ligarem-se aos compostos protegidos da invenção, ou serão capazes de ligar-se especificamente a qualquer um ou todos os três. Os anticorpos desejavelmente não interagirão substancialmente com materiais de ocorrência natural. Interatividade substancial é a reativi10 dade sob condições de ensaio específicas para analisados específicos suficientes para interferir com os resultados do ensaio.

Os imunógenos desta invenção contêm o composto desta inven. ção apresentando o epítopo desejado em associação com uma substância

- imunogênica. Dentro do contexto da invenção tal associação significa liga_M 15 ção covalente para formar um conjugado imunogênico (quando aplicável) ou uma mistura de materiais não covalentemente ligados, ou uma combinação • * dos acima. Substâncias imunogênicas incluem adjuvantes, tais como adjuvante de Freund, proteínas imunogênicas, tal como polipeptídeos virais, bacterianos, de levedura, planta e animal, em particular hemocianina de lapa de ’ 20 buraco de fechadura, albumina de soro, tiroglobulína bovina ou inibidor de tripsina de soja, e polissacarídeos imunogênicos. Tipicamente, o composto tendo a estrutura do epítopo desejado é covalentemente conjugado a um polipeptídeo imunogênico ou polissacarídeo pelo uso de um agente de reticulação polifuncional (usualmente bifuncional). Métodos para a fabricação de 25 imunógenos de hapteno são convencionais por si próprio, e quaisquer dos métodos empregados até agora para conjugação de haptenos a polipeptídeos imunogênicos ou similares são adequadamente empregados aqui também, levando em consideração os grupos funcionais dos produtos hidrolíticos ou precursores que são disponíveis para reticulação e a probabilidade 30 de produzir anticorpos específicos para o epítopo em questão como opostos à substância imunogênica.

Tipicamente o polipeptídeo é conjugado ao sítio do composto da invenção distante do epítopo a ser reconhecido.

Os conjugados são preparados em modelo convencional. Por exemplo, os agentes de reticulação N-hidroxissucinimida, anidreto sucínico ou alqN=C=Nalq são úteis na preparação dos conjugados desta invenção.

Os conjugados compreendem um composto da invenção ligado por uma ligação ou um grupo de ligação de 1-100, tipicamente, 1-25, mais tipicamente 1-10 átomos de carbono à substância imunogênica. Os conjugados são separados de materiais de partida e por produtos empregando-se cromatografia ou similares, e em seguida são filtrados estéreis e colocados em frasco10 netes para armazenagem.

Animais são tipicamente imunizados contra os derivados ou conjugados imunogênicos e anticorpos anti-soro ou monoclonais preparados em modelo convencional.

Os compostos desta invenção são úteis como ligantes ou espa15 çadores na preparação de matrizes de absorção de afinidade, enzimas imobilizadas para o controle do processo, ou reagentes de imunoensaio. Os compostos inclusos contêm uma multiplicidade de grupos funcionais que são adequados como sítios para reticulação das substâncias desejadas. Por exemplo, é convencional ligar reagentes de afinidade tais como hormônios, 20 peptídeos, anticorpos, fármacos, e similares a substratos insolúveis. Esses reagentes insolúveis são empregados em modo conhecido para absorver parceiros de ligação para os reagentes de afinidade de preparações fabricadas, amostras diagnosticas e outras misturas impuras. Similarmente, enzimas imobilizadas são empregadas para executar conversões catalíticas com 25 recuperação fácil da enzima. Compostos bifuncionais são comumente empregados para ligar analisados ao grupos detectáveis na preparação de reagentes diagnósticos.

Ensaios de avaliação preferivelmente empregam células de tecidos particulares que são suscetíveis a infecção por HPV. Ensaios conheci30 dos na técnica são adequados para determinar a biodisponibilidade in vivo incluindo ensaios de estabilidade de lúmen intestinal, permeação celular, estabilidade de fígado homogeneizado e ensaios de estabilidade de plasma.

Entretanto, mesmo se o éster, amida ou outros derivados protegidos não são convertidos in vivo aos grupos de carboxila livre, amino ou hidroxila, eles permanecem úteis como intermediários químicos.

Utilidade para a presente invenção foi ensinada empregando-se ensaios anti-proliferação. Ensaios antiproliferação avaliam o efeito de compostos sobre a proliferação de células cultivadas. As células são cultivadas durante 7 dias na presença de várias concentrações de compostos. No 7° dia, as células são manchadas com tintura, e intensidade de manchamento (proporcional ao número de célula) é avaliada por espectrofotômetro. Os dados são plotados contra as concentrações de composto, ajustados à curva de resposta de dose sigmóide, da qual a concentração de composto que reduz a taxa de proliferação celular por 50% (50% de concentração eficaz ou EC₅₀) é determinada. Compostos ativos em ensaios antiproliferação podem ser citostáticos (inibem a divisão celular) e/ou citocidais (matam as células). Realizando-se os ensaios antiproliferação em células de câncer HPV positivas e células normais, identificamos compostos que inibem a proliferação de células de câncer HPV positivas mais eficientemente do que células de tecidos humanos normais.

Métodos Exemplares de Preparação dos Compostos da Invenção.

A invenção também refere-se a métodos de preparação das composições da invenção. As composições são preparadas por quaisquer das técnicas aplicáveis de síntese orgânica. Muitas de tais técnicas são bem conhecidas na técnica. Entretanto, muitas das técnicas conhecidas são elaboradas em “Compendium of Organic Synthetic Methods” (John Wiley & Sons, New York), Vol. 1, lan T. Harrison e Shuyen Harrison, 1971; Vol. 2, lan T. Harrison e Shuyen Harrison, 1974; Vol. 3, Louis S. Hegedus e Leroy Wade, 1977; Vol. 4, Leroy Θ. Wade, jr., 1980; Vol. 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; e Vol. 6, Michael B. Smith; bem como March, J., “Advanced Organic Chemistry, Terceira Edição”, (John Wiley & Sons, New York, 1985), “Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efflciency em Modem Organic Chemistry. Em 9 Volumes”, Barry M. Trost, Editor-in-Chief (Pergamon Press, Nova Iorque, impressão em 1993).

232

Um número de métodos exemplares para a preparação das composições da invenção é fornecido abaixo. Esses métodos são destinados a ilustrar a natureza de tais preparações e não são destinados a limitar o escopo dos métodos aplicáveis.

Geralmente, as condições de reação, tais como temperatura, tempo de reação, solventes, procedimentos de preparação, e similares, serão aquelas comuns na técnica para a reação particular ser realizada. O material de referência citado, juntamente com o material citado aqui, contém descrições detalhadas de tais condições. Tipicamente as temperaturas serão 10 -100°C a 200°C, os solventes serão apróticos ou próticos, e os tempos de reação serão 10 segundos a 10 dias. A preparação tipicamente consiste em saciar quaisquer reagentes não reagidos seguida por divisão entre um sistema de camada orgânica/água (extração) e separação da camada contendo o produto.

Reações de redução e oxidação são tipicamente realizadas em temperaturas próximas a temperatura ambiente (cerca de 20°C), embora para as reduções de hidreto de metal freqüentemente a temperatura seja reduzida para 0°C a -100°C, solventes são tipicamente apróticos para reduções e podem ser próticos ou apróticos para oxidações. Tempos de reação 20 são ajustados para alcançar conversões desejadas.

Reações de condensação são tipicamente realizadas em temperaturas próximas a temperatura ambiente, embora para condensações cinetlcamente controladas não equilibradas temperaturas reduzidas (0°C a . 100°C) sejam também comuns. Solventes podem ser próticos (comuns em 25 reações equilibradas) ou apróticos (comuns em reações cineticamente controladas).

Técnicas sintéticas padrões, tais como remoção azeotrópica de subprodutos de reação e emprego de condições de reação anidrosa (por exemplo, ambientes de gás inerte) são comuns na técnica e serão emprega30 das quando aplicáveis.

Métodos exemplares de preparação dos compostos da invenção são mostrados nos esquemas abaixo. Descrições detalhadas dos métodos são encontradas na seção experimental abaixo, e são referenciadas aos es· quemas específicos.

Esquemas

Esquema 1 ^CO°

AcCI, ZnCI₂.Et₂O

Et₂o?7t

P(OiPr)₃, Heat

O £„OiPr

AcO'^XXxx' ^xoiPr

HCI, MeOH_r reflux, 6 h

Ο Ζ-, Γ, ILOiPr

HO'

OiPr

C!

N η₂ν^Λν n /diad, PPh₃

DMF, -15°Ctor.t. *

TMSBr, CH₃CN ---------’-----2---->.

Legendas das Figuras:

Heat = Aquecimento

Reflux = Refluxo to r.t = a temperatura ambiente

Cyclopropylamine = Ciclopropilamina

Esquema 2 (1) SOCI₂/DMF (cat.) Sulfolane, 70 °C, 1 h (2) TMSOPh, 90 °C, 1h* r.t. overnight

HCI H₂N^CO₂Me/ TEA^ Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI.HzN^COzMs/TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI,H₂N CO₂tBu / TEA^

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Sulfolane = Sulfolano

r.t. overnight = Temperatura ambiente durante a noite

Aldrithiot = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 3

HCI,H₂Ni CO₂Et /TEA / PhOH^ Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIH₂N CO₂Pr / TEA / PhOH^ Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIH₂N CO₂iPr / TEA/ PhOH

Aldrithiol™-2 / PPh₃

Pyridine, 60 °C

HCI.H₂N^CO₂Bu / TEA / PhOH

Aldrithiol™-2 / PPh₃ ’ Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritioí

Pyridine = Piridina

Esquema 4

HCI.H₂N CO₂(CH₂)₅CH₃TEA/PhOH

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

hci.h₂n

CO^CHíJtCHs

TEA/PhOH

Aldrithlol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI,H₂N CO₂Et / TEA / PhOH Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI.HzN-^COzBu / TEA / PhOH Aldrithlol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

2.51

Esquema 5 hci.h₂n

CO₂(CH₂)₇CH₃ __TEA/PhOH

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI.H₂N'^A'CO₂Et / TEA / PhOH Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

hcih₂n

Ph

CO₂Bu/TEA/PhOH

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIH₂N CO₂IBu / TEA / PhOH Aidrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 6

HCI,H₂hi CO₂Et /TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI.HzN^CO₂Pr/TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI HzN^COziPr / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIH₂N'^A,CO₂Bu /TEA* Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 7 _e HCI H₂N'^'CO₂(CH₂)₅CH₃ / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI.H₂N^CO₂(CH₂)₇CH₃ / TEA Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIHzN CO₂Et/TEA_r

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HQH₂N^CO₂Bu / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 8

HCIH₂N CO₂(CH₂)₇CH₃ / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyrídine, 60 °C

^.Ph

HCI HzN^COzEt /TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyrídine, 60 °C í^Ph

HCI H₂N CO₂Bu / TEA^ Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyrídine, 60 °C .Ph

HCyjzN_CO₂IBu / TEA Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyrídine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 9 ° I ci^o^Ao>K /tea ~

-Methyl-2-pyrrolidinone °C, 3 h

Legenda da Figura: 1-Methyl-2-pyrrolidinone = 1-Metil-2-pirrolidinona

Esquema 10 h₂n

HCIH₂N CO₂Bu /TEA Aldrithiol™-2 / PPh_{3 H N}'p-θΗ pyridine, 60 °C ^{X X}OH

(1) SOCI₂/DMF (cat.)

Sulfolane, 70 °C, 1 h (2) TMSOPh, 90 °C, 1h

r.t ovemight

HCI,H₂N CO_z)Pr / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Sulfolane = Sulfolano

r.t. ovemight = Temperatura ambiente durante a noite

242

Esquema 11

HCI,H₂N CO₂Bu /tea

Aldrithiol™-2 / PPh₃ΌΗ Pyridine, 60 °C 'OH

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 12

HCI,H₂N-^CO₂Bu /TEA

Aldrithloí™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

243

Esquema 13

HCIH₂N CO₂Bu /TEA

Aldrithíol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

(1) SOCI₂/DMF(cat.)

Sulfolane, 70 °C, 1 h.

(2) TMSOPh, 90 °C, 1h^rr.t. ovemight

HCIH₂N CO₂Me / TEA^

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C (1) HCI.H₂N CO₂iPr / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C________; (2) Fumaric Acid, GH₃CN

Legendas das Figuras:

Ald rithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Sulfolane = Sulfolano

r.t. ovemight = Temperatura ambiente durante a noite Fumaric Acid = Ácido fumárico

Esquema 14

Cl jAa ^ΗιΝ^^Ν Ϊ. O >

BnOH, NaH

H₂N

OBn

N

N °AU £<^0H50

HCI HzN^COj.iPr / TEA / PhOH Aldrithlol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Pd(OH)₂/ C, H₂iPrOH, r.t.

_o Aldrfthiol™-2 / PPh₃yOH Pyridine, 60 °C ^XOH hcih₂n

CO₂Bu / TEA

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine - Piridina

2Μ

Esquema 15

TMSBr, CH₃CN

HCI.H₂N CO₂Bu /TEA~

Aldrithíol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Ph

HCI.HzN^COjEt /TEA/PhOH Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 16

Allylamine

CH₃CN, 65 °C

TMSBr, CH₃CN

HCI.H₂N CO₂IPr / TEA / PtlOH Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIHzN^COzBu /TEA

Aldrithíol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras: Aldrithiol = Aldritiol Pyridine = Piridina Allylamine = Alilamina

29?

Esquema 17

H_ZN

⁰ I α^ο^ρΆ /tea

1-Methyl-2-pyrrolidinor®

OH 60 °C, 3h CL

OH

Legenda da Figura:

1-Methyl-2-pyrrolidinone = 1-Metil-2-pirrolidinona

Esquema 18

HCIH;N CO₂E1 / TEA

Aldrlthiol™-2 / PPh₃O Q_H Pyridine, 60 °C Sdh

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIH_ZN CO^CH^laCHa / TEA Aldrithlol™-2 / PPh₃ ” Pyridine, 60 °C

HCI,H₂N^CO₂Bu/TEA,

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridína

Esquema 19 ί^ΡΚ

HCIH₂N CO₂Et / TEA* Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

g-Ph

HCIH₂N'^AxCO₂Bu / TEA Aldrithiol™-2 / PPh₃

Pyridine, 60 °C

X^PhHCI,H₂N^CO₂iBu / TEA Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 20

HCII^N CO₂Et / PhOH / TEA Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCI,H₂N CO_zBu I PhOH / TEA^

Aldrithiol™-2 / PPh₃

Pyridine, 60 °C

/PhOH/TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃

Pyridine, 60 °C

HCI,H₂N ^ACO₂(CH_a)₆CH₃ / PhOH / TEA.

Aldrithlol™-2 / PPh₃ h₂N Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 21

HCIH₂N CO₂Bu / PhOH / TEA —--------------->

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

-Ph

HCI H₂N^CO₂Et / PhOH / TEA^

Aldrithiol™-2 / PPh₃

Pyridine, 60 °C

r^Ph

HCI.HzN^-COzBu / PhOH / TEA Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

X^Ph

HCI H₂N CO₂iBu/ PhOH / TEA

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithíol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Esquema 22 ^HC'H*^NVX>_/TEA;Ph0H

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

h₂n

.O.

οΛ'^ΝίΠο

OPh

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

HCIH₂N'^>Tf

O

Aldrithiol™-2 / PPh₃Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

2SZ

Esquema 23

cf₃ch₂nh₂

CH₃CN, 80 °C

TMSBr

CH₃ChT

NHCH₂CF₃ ΗΟΙ.Η,Ατθχλ™ n Ari ---------L, JL / Aldrithiol™-2 / PPh₃

H₂N N N Q,_xoh Pyridine, 60 °C

Legendas das Figuras:

Aldrithiol = Aldritiol

Pyridine = Piridina

Cada dos produtos dos seguintes processos é opcionalmente separado, isolado, e/ou purificado antes de seu uso em processos subsequentes.

Os termos “tratado, “tratando, “tratamento, e similares, quando empregados no contexto de um processo químico, protocolo, ou preparação significam contatar, misturar, reagir, deixar reagir, trazer em contato, e outros 10 termos comuns na técnica para indicar que uma ou mais entidades químicas é tratada de uma tal maneira a convertê-la em uma ou mais outras entidades químicas. Isto significa que “tratar o composto um com o composto dois é sinônimo de deixar o composto um reagir com o composto dois”, “contatar o composto um com o composto dois, “reagir o composto um com o composto 15 dois, e outras expressões comuns na técnica de síntese orgânica para razoavelmente indicar que o composto um foi “tratado”, “reagido, “deixado reagir'’, etc., com o composto dois.

No contexto de um processo químico, protocolo, ou preparação, “tratando indica a maneira razoável e usual em que produtos químicos or20 gânicos são deixados reagir. Concentrações normais (0,01 M a 10M, tipíca mente 0,1 M a 1M), temperaturas (-100°C a 250°C, tipicamente -78°C a 150°C, mais tipicamente -78°C a 100°C, ainda mais tipicamente 0°C a 100°C), vasos de reação (tipicamente vidro, plástico, metal), solventes, pressões, atmosferas (tipicamente ar para reações insensíveis a água e oxigênio ou nitrogênio ou argônio para reações sensitivas a água e oxigênio) etc, são pretendidos a menos que de outra maneira indicado. O conhecimento de reações similares conhecidas na técnica de síntese orgânica é empregado na seleção de condições e aparatos para “tratamento” em um dado processo. Em particular, alguém versado na técnica de síntese orgânica seleciona condições e aparatos razoavelmente esperados para bem sucedidamente realizar as reações químicas dos processos descritos com base no conhecimento da técnica.

Modificações de cada dos esquema(s) acima levam a vários análogos dos materiais exemplares específicos produzidos acima. As citações mencionadas acima descrevendo métodos adequados de síntese orgânica são aplicáveis a tais modificações.

Em cada dos esquemas exemplares acima pode ser vantajoso separar os produtos de reação de um outro e/ou de materiais de partida. Os produtos desejados de cada etapa ou séries de etapas são separados e/ou purificados (a seguir separados) para o grau desejado de homogeneidade pelas técnicas comuns na técnica. Tipicamente tais separações envolvem extração de múltiplas fases, cristalização de um solvente ou mistura de solvente, destilação, sublimação, ou cromatografia. Cromatografia pode envolver qualquer número de métodos incluindo, por exemplo, exclusão por tamanho ou cromatografia de permuta de íon, cromatografia líquida de pressão elevada, média, ou baixa, escala pequena e cromatografia de camada fina ou grossa preparativa, bem como técnicas de camada fina de escala pequena e cromatografia instantânea.

Outra classe de métodos de separação envolve tratamento de uma mistura com um reagente selecionado para ligar-se a ou tomar de outro modo separável um produto desejado, material de partida não reagido, reação por produto, ou similares. Tais reagentes incluem adsorventes ou absor ventes, tais como carbono ativado, peneiras moleculares, veículo de permuta de íon, ou similares. Alternativamente, os reagentes podem ser ácidos no caso de um material básico, bases no caso de um material acídico, reagentes de ligação, tais como anticorpos, proteínas de ligação, quelantes seletivos, tais como éteres coroa, reagentes de extração de íon líquido/líquido (LIX), ou similares.

A seleção de métodos apropriados de separação depende da natureza dos materiais envolvidos, por exemplo, ponto de ebulição, e peso molecular em destilação e sublimação, presença ou ausência de grupos funcionais polares em cromatografia, estabilidade de materiais em veículos acídico e básico em extração de múltiplas fases, e similares. Alguém versado na técnica aplicará técnicas mais prováveis para alcançar a separação desejada.

Todas as literaturas e citações de patente acima são por meio desta expressamente incorporadas por referência nas locações de sua citação. Páginas ou seções especificamente citadas dos trabalhos acima citados são incorporados por referência com especificidade. A invenção foi descrita em detalhes suficientes para permitir alguém versado na técnica fazer e empregar a matéria objeto das reivindicações seguintes. É evidente que certas modificações dos métodos e composições das seguintes reivindicações podem ser feitas dentro do escopo e espírito da invenção. Os seguintes exemplos são fornecidos para exemplificar a presente invenção, e de nenhum modo podem ser construídos para limitar a presente invenção.

Exemplos

Gerais

Alguns exemplos foram realizados múltiplas vezes. Em exemplos repetidos, condições de reação, tais como tempo, temperatura, concentração e similares, e produções foram dentro das faixas experimentais normais. Em exemplos repetidos onde modificações significantes foram feitas, essas foram observadas onde os resultados variavam significantemente daqueles descritos. Em exemplos onde diferentes materiais de partida foram empregados, esses são observados. Quando os exemplos repetidos refe rem-se a um análogo “correspondente” de um composto, tal como um “éster de etila correspondente”, isto quer dizer que um grupo de outro modo presente, neste caso tipicamente um éster de metila, é considerado ser o mesmo grupo modificado como indicado.

Exemplos 1 a 35 referem-se aos Esquemas 1 a 9 acima. Exemplo 1

Acetoxietiloximetilcloreto 1: Um frasco de três gargalos de 5 L foi equipado com agitador mecânico, termômetro, funil adicional de 500 mL e purgado com argônio. 1,3-Dioxalano (140 mL, 2,00 moles) em Et₂O anidroso (800 mL) e 1,0 M de ZnCfe/EtzO (7,5 mL, 0,007 mol) foram adicionados. Uma solução de cloreto de acetila (157 mL, 2,20 moles) em Et₂O (200 mL) foi adicionada em gotas através de um funil adicional durante 20 minutos. Um banho de água fria foi empregado para manter a temperatura entre 19 - 27 °C totalmente. Agitação contínua sem resfriamento externo durante 4 horas, auto aquecimento da reação em 20 - 25 °C durante cerca de 1 hora. Uma solução incolor transparente mantida sob argônio durante a noite. Permaneceu durante 3 dias e formou uma solução laranja. Separar o Et₂O em rotavap (aspirador de água) até não estar mais destilado em banho a 35°C. Uma produção quantitativa do produto 318 g (produção teórica 306 g) foi obtida. Exemplo 2

Fosfanato de diisopropila 2: Um frasco de três gargalos de 500 mL foi carregado com o clorometiléter 1 bruto (317 g, 2,00 moles). Triisopropilfosfito (494 mL) foi adicionado em gotas através de um funil adicional ao mesmo tempo que aquecendo em um banho de óleo a 125 °C e agitando vigorosamente. Coletar destilado de 2-cloropropano por meio de cabeça de trilha curta em um recipiente resfriado por gelo seco, manta de argônio, coletou-se 140 g de destilado (157 g teóricas). Reação descolorida de fosfito para amarelo, continuar aquecendo durante mais 2 horas em banho de óleo a 125 °C, então preparar para destilação a vácuo empregando-se uma bomba a vácuo. Destilado um corte frontal amarelo (140 g, cabeça a 135°C, base a 190°C), em seguida trocado para recipiente limpo. A fração principal foi coletada em temperatura de cabeça de 178 - 187°C (principalmente 185 - 187°C) com vácuo desconhecido em temperatura de banho de 222 - 228°C. 258 g do produto 2 foram fornecidas (47% de produção de 1,3-dioxolano). Exemplo 3

Álcool 3: Uma solução de 2 (125 g, 0,443 mol) em MeOH absoluto (440 ml_) foi tratada com HCI concentrado (11,2 mL, 0,112 mol) e aquecida até o refluxo durante 6 horas sob argônio. Separar MeOH em rotavap (aspirador de água) a 55°C deixando 115 g de um óleo claro que foi coevaporado com tolueno (2 x 200 mL). O produto bruto foi seco sob vácuo para fornecer um óleo (102 g, 96%).

Exemplo 4

Fosfanato de diisopropila 4: Uma solução de trifenilfosfina (25,57 g, 97,5 mmoles) e álcool 3 (18 g, 75 mmoles) em DMF (120 mL) foi tratada com 6-cloropurina (12,72 g, 75 mmoles) e resfriada para -15°C. Uma solução de azodicarboxilato de diisopropila (16,68 g, 82,5 mmoles) em DMF (50 mL) foi adicionada em gotas através de um funil adicional durante 80 minutos. A mistura de reação foi mantida a -15°C durante 2 horas e em seguida aquecida para temperatura ambiente e agitada durante mais 2 horas. Uma mistura de reação turva girada para ficar uma solução amarela-brilhante. O solvente de reação foi evaporado sob pressão reduzida, co-evaporado com tolueno (3 x), e seco sob vácuo durante a noite antes da purificação. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (5% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o fosfanato de diisopropila (18,52 g, 63%) como um sólido branco:

’H RMN (CDCI₃) δ 7,95 (s, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,31 (m, 2H), 3,93 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 1,29 (m, 12H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 18,42.

Exemplo 5

Fosfanato de Diisopropila 5: Uma mistura de 4 (11,00 g, 28,08 mmoles) e ciclopropilamina (4,86 g, 85,16 mmoles) em CH₃CN (80 mL) foi colocada em uma bomba de reação e aquecido a 100 °C por 4 h. A mistura de reação foi resfriada a temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O produto foi dividido ao meio 15% de MeOH/CH₂CI₂ (3 x) e salmoura, seco com Na₂SO4, filtrado, e concentrado. O produto bruto foi purifi cado por cromatografia de coluna de sílica-gel (5% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer 5 (10,42 g, 90%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCl₃) Õ 7,59 (s, 1H), 5,83 (amplo, s, 1H), 4,88 (amplo, s, 2H), 4,70 (m, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,72 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,28 (m, 12H), 0,84 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 18,63.

Exemplo 6 cPrPMEDAP 6: Uma solução de 5 (11,00 g, 26,67 mmoles) em CH₃CN anidroso (120 mL) foi tratada com bromotrimetilsilano (21,1 mL, 160,02 mmoles ). A reação foi protegida de luz envolvendo 0 frasco com folha de alumínio. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em H₂O (250 mL) e pH foi ajustado para 9 com hidróxido de amônio. A mistura de reação foi concentrada e um sólido amarelo foi obtido. O sólido foi dissolvido em H₂O (30 mL) e pH foi ajustado para 2 com 10% HCI. Um sólido fino foi coletado e seco sob vácuo para fornecer 6 (7,88 g, 90%) como um sólido branco.

Exemplo 7

Cloridrato de Ácido Monofosfônico 7: Uma mistura de ácido 6 (3,00 g, 9,15 mmoles) e DMF (0,1 mL) em sulfolano (9,2 mL) foi aquecida a 70 °C. Tionilcloreto (1,66 mL, 22,76 mmoles) foi adicionado em gotas sobre um período de 1 h. A temperatura foi aumentada para 90 °C e TMSOPh (1,74 mL, 9,61 mmoles) foi adicionado e agitado por 1 h. A mistura de reaÇão foi resfriada a temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi adicionada em gotas até bem agitada, acetona gelada (100 mL). O produto foi precipitado até o fim. O sólido foi filtrado sob Ar, lavado com acetona gelada (100 mL), seco sob vácuo para fornecer 0 Cloridrato de Ácido Monofosfônico (3,70 g, 92%) como um sólido.

Exemplo 8

Monofosfonamidato 8: Uma mistura de ácido monofosfônico 7 (0,22 g, 0,50 mmol), Cloridrato de éster de metila de L-alanina (0,14 g, 1,00 mmol), e trietilamina (0,21 mL, 1,50 mmol) em piridina (3 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,39 g, 1,75 mmol) e trifenilfosfina (0,46 g, 1,75 mmol) em piridina (2 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (97 mg, 39% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada. Exemplo 9

Monofosfonamidato 9: Uma mistura de ácido monofosfômico 7 (0,88 g, 2,00 mmoles), cloridrato de éster de metila de D-alanina (0,84 g, 6,00 mmoles), e trietilamina (0,84 mL, 6,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (1,56 g, 7,00 mmoles) e trifenilfosfina (1,84 g, 7,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (0,40 g, 41% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma branca.

Exemplo 10

Monofosfonamidato 10: Uma mistura de ácido monofosfônico 7 (0,88 g, 2,00 mmoles), Cloridrato de éster de terc-butila de L-alanina (1,31 g, 6,00 mmoles), e trietilamina (0,84 mL, 6,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (1,54 g, 7,00 mmoles) e trifenilfosfina (1,84 g, 7,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evapo 'ΖΤί rada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (0,38 g, 36% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma laranja clara.

Exemplo 11

Monofosfonamidato 11: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de etila de L-alanina (94 mg, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarelabrilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO3 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (74 mg, 48% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,61 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,26 - 7,08 (m, 5H), 4,23 (m, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,09 (m, 1H), 3,92 - 3,85 (m, 4H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,30 -1,26 (m, 3H), 1,24 (m, 3H), 0,88 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,94, 20,68.

Exemplo 12

Monofosfonamidato 12: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (1,50 g, 4,56 mmoles), Cloridrato de éster de n-propila de L-alanina (1,59 g, 9,49 mmoles), fenol (2,25 g, 22,80 mmoles) e trietilamina (10,50 mL, 54,72 mmoles) em piridina (8,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (6,54 g, 31,92 mmoles) e trifenilfosfina (7,32 g, 31,92 mmoles) em piridina (8,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (0,43 g, 18%, Composto E, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,61 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,27 - 7,09 (m, 5H), 4,27 - 4,20 (m, 2H), 4,16 - 4,00 (m, 3H), 3,93 - 3,82 (m, 4H), 3,04 (amplo, s, 1H), 1,63 (m, 2H), 1,30 (dd, 3H), 0,92 (m, 3H), 0,89 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,89, 20,66. Exemplo 13

Monofosfonamidato 13: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de isopropila de L-alanina (0,10 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer 0 monofosfonamidato (87 mg, 55% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,60 (d, J = 2,1 Hz, 1H),

7,26 - 7,09 (m, 5H), 4,98 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 3,91 - 3,83 (m, 4H), 3,04 (amplo, s, 1H), 1,29 -1,21 (m, 9H), 0,89 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,85, 20,68.

Exemplo 14

Monofosfonamidato 14: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-butila de L-alanina (0,11 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (80 mg, 50% e 1:1 da mistura diastereoméri5 ca) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCh) δ 7,61 (d, J = 4,20

Hz, 1H), 7,27 - 7,08 (m, 5H); 5,93 (amplo, s, 1H), 4,97 (amplo, s, 2H), 4,23 (m, 2H), 4,10 - 4,08 (m, 3H), 3,91 - 3,84 (m, 4H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,34 - 1,27 (m, 5H), 0,92 - 0,89 (m, 5H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,94, 20,68.

Exemplo 15

Monofosfonamidato 15: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-hexila de L-alanina (0,13 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol 15 amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido aó meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com 20 Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer 0 monofosfonamldato (0,10 g, 59% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,59 (d, J = 4,20 Hz, 1H), 7,26 7,08 (m, 5H), 4,22 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 4,06 (m, 2H), 3,91 - 3,84 (m, 4H), 25 3,01 (amplo, s, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,31-1,27 (m, 9H), 0,89 (m, 3H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,94, 20,68.

Exemplo 16

Monofosfonamidato 16: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanila de L-alanina (0,15 g, 0,60 30 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenil fosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com NagSCU, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografla na ISCO (2-propanol/CH2CÍ2) para fornecer o monofosfonamidato (0,13 g, 73% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,59 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,25 7,07 (m, 5H), 4,22 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 4,07 (m, 2H), 3,90 - 3,84 (m, 4H), 3,02 (amplo, s, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,29 - 1,26 (m, 13H), 0,88 (m, 3H), 0,85 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,96,20,69.

Exemplo 17

Monofosfonamidato 17: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (70 mg, 0,21 mmol), Cloridrato de éster de etila de ácido L-2-aminobutírico (72 mg, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografla de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (66 mg, 60% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,26 - 7,08 (m, 5H), 5,91 (amplo, s, 1H), 4,97 (amplo, s, 2H), 4,22 - 4,12 (m, 4H), 4,01 - 3,81 (m, 5H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,71 - 1,60 (m, 2H), 1,24 (m, 3H), 0,89 (m, 2H), 0,84 - 0,76 (m, 3H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 22,15,20,93.

Exemplo 18

Monofosfonamidato 18: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (1,00 g, 3,05 mmoles), Cloridrato de éster de n-butila de ácido L-2-aminobutírico (1,19 g, 6,09 mmoles), fenol (1,43 g, 15,23 mmoles) e trietilamina (5,10 mL, 36,60 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amareia-brilhante recentemente preparada (4,70 g, 21,32 mmoles) e trifenilfosfina (5,59 g, 21,32 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (5% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (0,7 g, 42%, Composto G, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma branca: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,60 (d, J = 6,60 Hz, 1H), 7,27 - 7,04 (m, 5H), 5,89 (amplo, s, 1H), 4,94 (amplo, s, 2H), 4,22 (m, 2H), 4,07 - 3,99 (m, 3H), 3,91 - 3,84 (m, 4H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,70 - 1,57 (m, 4H), 1,35 (m, 2H), 0,92 - 0,75 (m, 8H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 22,21, 20,95.

Exemplo 19

Monofosfonamidato 19: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanila de ácido L-2-aminobutírico (0,15 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 “C por 5 min. Uma solução de aldritiol amareia-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (0,12 g, 64% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,62 (d, J = 6,60 Hz, 1H), 7,25 - 7,08 (m, 5H), 4,24 - 4,21 (m 2H), 4,09 - 4,04 (m, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,91 - 3,83 (m, 4H), 3,01 (amplo, s, 1H), 1,70 -1,58 (m, 4H), 1,27 (m, 10H), 0,89 - 0,76 (m, 8H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 22,22, 20,92.

Exemplo 20

Monofosfonamidato 20: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (1,5 g, 4,57 mmoles), Cloridrato de éster de etila de L-fenilalanina (2,10 g, 9,14 mmoles), fenol (2,15 g, 22,85 mmoles) e trietilamina (7,64 mL, 54,84 mmo5 les) em piridina (8,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (7,05 g, 31,99 mmoles) e trifenilfosfina (8,39 g, 31,99 mmoles) em piridina (7,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio 10 EtOAc e NaHCOs saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (5% de MeOH/CLfeCk) para fornecer uma sólido amarelo-claro 1,32 g contendo aproximadamente 10% de impureza. O sólido amarelo (1,32 g, 2,28 mmoles) foi dissolvido em 15 iPrOH (10 mL) e transferido a um iPrOH quente (30 mL) solução de ácido fumárico (0,27 g, 2,28 mmoles) e agitado a 80 °C por 30 min. A mistura de reação foi gradualmente resfriada a temperatura ambiente e o sal de fumarato foi coletado a 0 °C. O sal de fumarato resultante foi neutralizado pela divisão de NaHCO₃ (2 x) e EtOAc. A fase orgânica foi lavada com salmoura, 20 H2O, seca com Na2SO₄, filtrado, e concentrado. O produto foi seco sob vácuo para fornecer o monofosfonamidato (0,70 g, 26%, Composto A, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma branca: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,54 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,27 - 6,98 (m, 10H), 4,35 (m, 1H), 4,16 (m, 2H), 4,08 (m, 2H), 3,84 - 3,61 (m, 3H), 3,33 (m, 1H), 3,02 (amplo, s, 1H), 2,95 - 2,87 (m, 25 2H), 1,17 (m, 3H), 0,87 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,88, 21,07.

Exemplo 21

Monofosfonamidato 21: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (70 mg, 0,21 mmol), Cloridrato de éster de n-butila de L-fenilalanina (0,11 g, 0,42 30 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfi na (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (30 mg, 23% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,55 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7,25

- 6,98 (m, 10H), 4,36 (m, 1H), 4,17 (m, 2H), 4,02 (m, 2H), 3,83 - 3,35 (m, 4H), 3,02 (amplo, s, 1H), 2,94 - 2,86 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,29 (m, 2H), 0,90 (m, 3H), 0,88 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,85, 21,05. Exemplo 22

Monofosfonamidato 22: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (70 mg, 0,21 mmol), Cloridrato de éster de isobutila de L-fenilalanina (0,11 g, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (65 mg, 50% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,56 (d, J ~ 3,6 Hz, 1H), 7,26

- 6,98 (m, 10H), 4,40 (m, 1H), 4,17 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,75 - 3,62 (m, 3H), 3,35 (m, 1H), 3,04 (amplo, s, 1H), 2,96 - 2,87 (m, 2H), 1,83 (m, 1H), 0,90 (m, 2H), 0,86 (m, 6H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,82, 21,03. Exemplo 23

Bisfosfonamidato 23: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de etila de L-alanina (0,28 g, 1,80 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (80 mg, 50%,) como uma espuma amãrela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,63 (s, 1H), 5,88 (amplo, s, 1H), 4,96 (amplo, s, 2H), 4,24 - 4,16 (m, 6H), 4,00 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,01 (amplo, s, 1H), 1,36 (m, 6H), 1,26 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,63.

Exemplo 24

Bisfosfonamidato 24: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (1,00 g, 3,05 mmoles), Cloridrato de éster de n-propila de L-alanina (3,06 g, 18,30 mmoles), e trietilamina (5,10 mL, 36,50 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (4,70 g, 21,32 mmoles) e trifenilfosfina (5,59 g, 21,32 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (1,13 g, 71%, Composto F) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,65 (s, 1H), 5,92 (amplo, s, 1H), 5,03 (amplo, s, 2H), 4,24 (m, 2H), 4,10 - 4,02 (m, 6H), 3,87 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,65 (m, 4H), 1,37 (m, 6H), 0,93 (m, 6H), 0,88 (m, 2H), 0,63 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,61.

Exemplo 25

Bisfosfonamidato 25: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,60 g, 1,83 mmol), Cloridrato de éster de isopropila de L-alanina (1,84 g, 10,98

Λ mmoles), e trietilamina (3,06 mL, 21,96 mmoles) em piridina (3,0 ml_) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (2,82 g, 12,80 mmoles) e trifenilfosfma (3,36 g, 12,80 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,53 g, 52%, Composto B) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,65 (s, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,24 (m, 2H), 3,97 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,71 (m, 2H), 3,01 (amplo, s, 1H), 1,34 (m, 6H), 1,23 (m, 12H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,59.

Exemplo 26

Bisfosfonamidato 26: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-butila de L-alanina (0,33 g, 1,82 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCOs saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (97 mg, 55%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,63 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 4,01 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,01 (amplo, s, 1H), 1,61 (m, 4H), 1,37 (m, 10H), 0,93 (m, 6H), 0,88 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,59.

Exemplo 27

Bisfosfonamidato 27: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-hexila de L-alanina (0,38 g, 1,80 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2propanol/CH2Q₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,13 g, 65%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,62 (s, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 4,01 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 2,99 (amplo, s, 1H), 1,61 (m, 4H), 1,36 - 1,29 (m, 18H), 0,88 (m, 6H), 0,84 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,61.

Exemplo 28

Bisfosfonamidato 28: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanila de L-alanina (0,43 g, 1,80 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,13 g, 61%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,61 (s, 1H), 4,21 (m, 2H), 4,07 -4,00 (m, 6H), 3,84 - 3,70 (m, 4H), 2,98 (amplo, s, 1H), 1,60 (m, 4H), 1,34 (m, 6H), 1,27 (m, 20H), 0,87 (m, 6H), 0,83 (m, 2H), 0,58 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCIs) δ 20,63.

Exemplo 29

Bisfosfonamidato 29: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,70 g, 2,13 mmoles), Cloridrato de éster de etila de ácido L-2-aminobutírico (2,15 g,

12,80 mmoles), e trietilamina (3,57 ml_, 25,56 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (3,29 g, 14,91 mmoles) e trifenilfosfma (3,92 g, 14,91 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,71 g, 60%, Composto D) como uma espuma amarelaclara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,16 (m, 4H), 3,89 - 3,87 (m, 4H), 3,72 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 3,01 (amplo, s, 1H), 1,78 - 1,64 (m, 4H),

1,26 (m, 6H), 0,91 (m, 6H), 0,87 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,23.

Exemplo 30

Bisfosfonamidato 30: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,70 g, 21,32 mmoles), Cloridrato de éster de n-butila de ácido L-2-aminobutírico (2,50 g, 12,80 mmoles), e trietilamina (3,57 mL, 25,56 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarelabrilhante recentemente preparada (3,29 g, 14,91 mmoles) e trifenilfosfina (3,92 g, 14,91 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. Õ produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCOs saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,40 g, 31%, Composto C) como uma espuma amarelaclara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,11 (m, 4H), 3,91 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,71 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,79 - 1,64 (m, 4H), 1,60 (m, 4H), 1,37 (m, 4H), 0,94 (m, 6H), 0,90 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m,2H);³¹P RMN (CDCI3) Õ 21,25.

Exemplo 31

Ζ4θ

Bisfosfonamidato 31: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanila de ácido L-2-aminobutírico (0,33 g, 1,82 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarelabrilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH₂Cl2) para fornecer o bisfosfonamidato (0,12 g, 55%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,13 - 4,05 (m, 4H), 3,91 (m, 2H), 3,87 - 3,72 (m, 4H), 3,01 (amplo, s, 1H), 1,78 -1,65 (m, 4H), 1,61 - 1,29 (m, 24H), 0,91 (m, 6H), 0,89 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,20.

Exemplo 32

Bisfosfonamidato 32: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,60 g, 1,82 mmol), Cloridrato de éster de etila de L-fenilalanina (2,51 g, 10,96 mmoles), e trietilamina (3,06 mL, 21,84 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (2,82 g, 12,74 mmoles) e trifenilfosfina (3,36 g, 12,74 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao melo EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer 0 bisfosfonamidato (0,53 g, 43%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,48 (s, 1H), 7,22 - 7,06 (m, 10H), 4,20 (m, 1H), 4,12 (m, 4H), 4,09 (m, 2H), 4,04 (m, 1H), 3,63 (m, 2H), 3,33 - 3,21 (m, 2H), 3,04 - 2,78 (m, 5H), 1,20 (m, 6H), 0,83 (m, 2H), 0,58 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,38.

Exemplo 33

2PH

Bisfosfonamidato 33: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (70 mg, 0,21 mmol), Cloridrato de éster de n-butila de L-fenilalanina (0,33 g, 1,26 mmol), e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,11 g, 70%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCfe) δ 7,51 (s, 1H),

7.23 - 7,06 (m, 10H), 4,23 (m, 1H), 4,11 - 4,05 (m, 7H), 3,65 (m, 2H), 3,35 -

3.23 (m, 2H), 3,01 (m, 1H), 3,04 - 2,78 (m, 4H), 1,57 (m, 4H), 1,33 (m, 4H), 0,92 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,61 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 20,35.

Exemplo 34

Bisfosfonamidato 34: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (70 mg, 0.21 mmol), Cloridrato de éster de isobutila de L-fenilalanina (0,33 g, 1,26 mmol), e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (78 mg, 50%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,52 (s, 1H),

7.24 - 7,07 (m, 10H), 4,26 (m, 1H), 4,11 (m, 2H), 4,01 (m, 1H), 3,85 (m, 4H), 3,66 (m, 2H), 3,35 - 3,25 (m, 2H), 3,07 - 2,85 (m, 3H), 2,97 - 2,79 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 0,90 (m, 12H), 0,89 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 20,31.

2T-Z

Exemplo 35

BisPOC de cPrPMEDAP 35: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (0,20 g, 0,61 mmol) e trietilamina (0,42 mL, 3,01 mmoles) em 1-metil-2pirrolidinona (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 30 min. POCCI (0,45 g, 2,92 mmoles) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a 60 °C por 3 h, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o bisPOC de cPrPMEDAP (0,13 g, 39%) como um sólido: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,58 (s, 1H), 5,66 (m, 4H), 4,92 (m, 2H), 4,22 (m, 2H), 3,90 - 3,88 (m, 4H), 3,01 (amplo, s, 1H), 1,81 (m, 12H), 0,86 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,93.

Exemplos 36 a 38 referentes ao esquema 10.

Exemplo 36

Bisfosfonamidato 37: Uma mistura de ácido fosfônico 36 (0,32 g, 1,00 mmol), Cloridrato de éster de butila de L-alanina (0,47 g, 2,60 mmoles), e trietilamina (0,27 g, 2,60 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,77 g, 3,50 mmoles) e trifenilfosfina (0,92 g, 3,50 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi Ia-, vada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer 0 bisfosfonamidato (0,43 g, 75%) como uma espuma amarela-clara.

Exemplo 37

Ácido monofosfômico 38: Uma mistura de diácido 36 (1,30 g, 4,10 mmoles) e DMF (0,1 mL) em sulfoiano (35 mL) foi aquecida a 70 °C. Tionílcloreto (0,54 mL, 7,38 mmoles) foi adicionado em gotas sobre um período de 1 h. A temperatura foi aumentada para 90 °C e TMSOPh (0,75 g,

4,51 mmoles) foi adicionado e agitado por 1 h. A mistura de reação foi resfriada a temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi adicionada em gotas até bem agitada, acetona gelada (100 mL). O produto foi precipitado até o fim. O sólido foi filtrado e dissolvido em MeOH (40 mL) e pH foi ajustado para 3 com 45% KOH. O sólido foi coletado por filtração. O produto foi em seguida purificado enquanto dissolvido em MeOH, ajustando pH para 6 com 45% KOH, e cristalizando proveniente da acetona gelada para fornecer o ácido monofosfômico (0,20 g, 12%) como um sólido esbranquiçado.

Exemplo 38 _ Monofosfonamidato 39: Uma mistura de ácido monofosfômico 38 (0,20 g, 0,50 mmol), Cloridrato de éster de isopropila de L-alanina (0,17 g, 1,00 mmol) e trietilamina (0,10 g, 1,00 mmol) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,39 g, 1,75 mmol) e trifenilfosfina (0,46 g, 1,75 mmol) em piridina (2,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com saimoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (0,14 g, 54% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarelaclara.

Exemplo 39 referente ao esquema 11

Exemplo 39 Bisfosfonamidato 41: Uma mistura de ácido fosfônico 40 (0,36 g, 1,00 mmol), Cloridrato de éster de n-butila de L-alanina (0,47 g, 2,60 mmoles), e trietilamina (0,27 g, 2,60 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,77 g, 3,50 mmoles) e trifenilfosfina (0,92 g, 3,50 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentra da. Ο produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCOs saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,32 g, 35%) como uma espuma amarela-clara.

Exemplos 40 a 56 referem-se aos esquemas 12 a 16.

Exemplo 40

Bisfosfonamidato 43: Uma mistura de ácido fosfônico 42 (0,37 g, 1,00 mmol), Cloridrato de éster de n-butila de L-alanina (0,47 g, 2,60 mmoles), e trietilamina (0,27 g, 2,60 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,77 g, 3,50 mmoles) e trifenilfosfina (0,92 g, 3,50 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCOs saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,53 g, 85%) como uma espuma amarela-clara.

Exemplo 41

Bisfosfonamidato 45: Uma mistura de ácido fosfônico 44 (0,55 g, 2,00 mmoles), Cloridrato de éster de butila de L-alariina (0,94 g, 5,20 mmoles), e trietilamina (0,54 g, 5,20 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (1,54 g, 7,00 mmoles) e trifenilfosfina (1,84 g, 7,00 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCOs saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,48 g, 45%) como uma espuma amarela-clara.

2Ί

Exemplo 42

Ácido monofosfômico 46: Uma mistura de diácido 44 (10,00 g, 36,30 mmoles) e DMF (0,2 mL) em sulfolano (50 mL) foi aquecida a 70 °C. Tionilcloreto (4,72 mL, 64,70 mmoles) foi adicionado em gotas sobre um pe5 ríodo de 1 h. A temperatura foi aumentada para 90 °C e TMSOPh (6,65 g, 40,00 mmoles) foi adicionado e agitado por 1 h. A mistura de reação foi resfriada a temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi adicionada em gotas até bem agitada, acetona gelada (100 mL). O produto foi precipitado até o fim. O sólido foi filtrado e dissolvido em MeOH (40 mL) e 10 pH foi ajustado para 3 com 45% KOH. O sólido foi coletado por filtração e seco sob vácuo para fornecer o ácido monofosfômico (12,40 g, 97%) como um sólido.

Exemplo 43

Monofosfonamidato 47: Uma mistura de ácido monofosfômico 46 15 (1,00 g, 2,86 mmoles), Cloridrato de éster de metila de L-alanina (0,80 g, 5,73 mmoles) e trietilamina (0,58 g, 5,73 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (2,21 g, 10,00 mmoles) e trifenilfosfina (2,63 g, 10,00 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A 20 reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CHsCh) para fornecer o monofosfona25 mldato (0,80 g, 64% e 1:1 da mistura diastereomérica) como um óleo amarelo-claro.

Exemplo 44

Monofosfonamidato 48: Uma mistura de ácido monofosfômico 46 (0,35 g, 1,00 mmol), Cloridrato de éster de isopropila de L-alanina (0,34 g, 30 2,00 mmoles) e trietilamina (0,20 g, 2,00 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi

- aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,77 g, 3,50 mmoles) e trifenilfosfina (0,92 g, 3,50

27<2 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evapo5 rada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (7% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato contendo mais impureza. O composto resultante foi tratado com ácido fumárico (77 mg) em CH₃CN quente (10 mL) e resfriada a temperatura ambiente. O produto foi precipitado até 0 fim e seco sob vácuo para fornecer 10 o sal de fumarato de monofosfonamidato (0,13 g, 22% e 1:1 da mistura diastereomérica) como um sólido.

Exemplo 45 ‘

Éter de Benzila de PMEG 50: Uma mistura de diácido 49 (0,62 g,

2,00 mmoles) e álcool de benzila (10 mL) foi resfriado a 0 °C por agitação. 15 Hidreto de sódio (0,24 g, 10,00 mmoles) foi adicionado em porções e a mistura de reação foi aquecida a 100 °C durante 1 hora. Álcool de benzila adicional (20 mL) e hidreto de sódio (0,12 g, 5,00 mmoles) foram adicionados. A reação foi agitada a 140 °C por 1 hora e resfriada a temperatura ambiente.

Os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida, água (50 mL) foi adi20 cionado, e o pH foi ajustado para 11 com NaOH. O produto foi dividido ao meio tolueno (3 x) e H₂O. A fase aquosa foi acidificada com HCI para pH = 3 e conservada a 0 °C durante a noite. O produto foi coletado e seco sob vácuo para fornecer o éter de benzila (0,18 g, 22%) como um sólido-castanho. Exemplo 46

Monofosfonamidato 51: Uma mistura de ácido fosfônico 50 (0,13 g , 0,34 mmol), Cloridrato de éster de isopropila de L-alanina (0,11 g, 0,68 mmol), fenol (0,16 g, 1,69 mmol) e trietilamina (0,28 mL, 2,03 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,52 g, 2,37 mmoles) e trifenil30 fosfina (0,62 g, 2,37 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc zA?

e NaHCOâ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (5% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfonamidato (50 mg, 26% e 1:1 da mistura diastereomérica) como um óleo denso.

Exemplo 47

Monofosfonamidato 52: Uma mistura de monofosfonamidato 51 (50 mg, 0.09 mmol) e Pd(OH)₂/C (50 mg) em iPrOH (3 mL) foi agitada em temperatura ambiente sob 1 atm de H₂ (balão) durante a noite. A mistura de reação foi filtrada através de um tampão de celita e o solvente foi removido em rotavap sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (5 - 15% de MeOH/CHCI₃) para fornecer o monofosfonamidato (40 mg, 95% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma branca.

Exemplo 48

Bisfosfonamidato 54: Uma mistura de ácido fosfônico 53 (0,10 g, 0,35 mmol), Cloridrato de éster de butila de L-alanina (0,38 g, 2,10 mmoles), e trietilamina (0,58 mL, 4,20 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,53 g, 2,45 mmoles) e trifenilfosfina (0,64 g, 2,45 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (15% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (25 mg, 13%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CD₃OD) δ 7,82 (s, 1H),

4,26 (m, 2H), 4,11 (m, 4H), 3,94 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,78 (m, 2H), 1,61 (m, 4H), 1,39 (m, 4H), 1,34 (m, 6H), 0,95 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 23,39. Exemplo 49

Fosfanato de Diisopropila 55: Uma mistura de 4 (3,00 g, 7,66 mmoles) e 10% Pd/C (0,60 g) em MeOH (30 mL) foi agitada em temperatura ambiente sob 1 atm de H₂ (balão) durante a noite. A mistura de reação foi filtrada através de um tampão de celita e o solvente foi removido em rotavap. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gei (5% de MeOH/CHCI₃) para fornecer o Fosfanato de Diisopropila (2,08 g, 76%) como um óleo denso que foi solidificado no local: ¹H RMN (CDCI3) δ 8,72 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 4,73 (m, 2H), 4,33 (m, 2H), 3,97 (m, 2H), 3,73 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 1,31 (m, 12H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 18,47.

Exemplo 50

Ácido fosfônico 56: Fosfanato de Diisopropila 55 (0,10 g, 0,28 mmol) foi dissolvido em CH3CN (1,5 mL) e resfriado a 0 °C. Bromotrimetilsilano (0,18 mL, 1,40 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a 0 °C por 2 h e aquecido a temperatura ambiente durante a noite. DMF (0,5 mL) foi adicionado para formar uma solução e agitado por 2 h. MeOH foi adicionado e agitado por 2 h. Voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. A solução DMF permanecida foi adicionada lentamente para CH3CN gelado e 0 produto precipitado até 0 fim. O sólido foi coletado e seco sob vácuo para fornecer o ácido fosfônico (74 mg, 95%) como um sólido branco.

Exemplo 51

Bisfosfonamidato 57: Uma mistura de ácido fosfônico 56 (23 mg, 0,08 mmol), Cloridrato de éster de n-butila de L-alanina (91 mg, 0,50 mmol), e trietilamina (0,14 mL, 0,96 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,11 g, 0,56 mmol) e trifenilfosfina (0,12 g, 0,56 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2propanol/CH₂CI₂) para fornecer 0 bisfosfonamidato (17 mg, 38%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 8,65 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 5,20 (s, amplo, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,20 - 3,92 (m, 6H), 3,89 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,42 - 3,19 (m, 2H), 1,61 (m, 4H), 1,32 (m, 8H), 0,96 (m, 6H); ³¹P RMN (CD•ZIS

Cl₃) δ 20,70.

Exemplo 52

Monofosfonamidato 58: Uma mistura de ácido fosfônico 56 (20 mg, 0,07 mmol), Cloridrato de éster de etila de L-fenilalanina (33 mg, 0,14 mmol), fenol (33 mg, 0,35 mmol) e trietilamina (0,12 mL, 0,84 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C por 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,11 g, 0,56 mmol) e trifenilfosfina (0,12 g, 0,56 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada a temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCO₃saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer 0 monofosfonamidato (13 mg, 34% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma branca; ¹H RMN (CDCI3) δ 8,69 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,84 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,25 - 6,97 (m, 10H), 4,35 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,08 (m, 2H), 3,85 (m, 1H), 3,72 (m, 1H), 3,73 - 3,62 (m, 1H), 3,38 (m, 1H), 2,95 - 2,86 (m, 2H), 1,17 (m, 3H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,67, 20,84.

Exemplo 53

Fosfanato de Diísopropila 59: Uma mistura de composto 4 (1,00 g, 2,56 mmoles) e alilamina (3 mL) em CH₃CN (3,0 mL) foi colocada em um frasconete de cíntilação e aquecido a 65 °C por 5 h. A mistura de reação foi resfriada a temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O produto foi dividido ao meio EtOAc e salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrado, e concentrado. O produto foi dissolvido em no mínimo CH₃CN e H₂O foi adicionado e liofilizado para fornecer 0 Fosfanato de Diisopropila (1,00 g, 95%). Exemplo 54

Ácido fosfônico 60: Fosfanato de Diisopropila 59 (1,00 g, 2,43 mmoles) foi dissolvido em CH₃CN (1,5 mL) e resfriado a 0 °C. Bromotrimetilsilano (0,31 mL, 12,15 mmoles) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a 0 °C por 2 h e aquecido em temperatura ambiente durante a noite. DMF (0,5 mL) foi adicionado para formar uma solução e agitado por 2 h.

MeOH foi adicionado e agitado por 2 h. Voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. A solução DMF permanecida foi adicionada lentamente a CH₃CN gelado e o produto precipitado até o fim. O sólido foi coletado e seco sob vácuo para fornecer o ácido fosfônico (0,48 g, 60%) como um sólido branco.

Exemplo 55

Monofosfonamidato 61 e Bisfosfonamidato 62: Uma mistura de diácido 60 (0,40 g, 1,20 mmol), Cloridrato de éster de isopropila de L-alanina (0,49 g, 2,40 mmoles), fenol (0,68 g, 7,20 mmoles), e trietilamina (1,0 mL, 7,20 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (1,84 g, 8,40 mmoles) e trifenilfosfina (2,20 g, 8,40 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna em silica-gel (5-10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer monofosfonamidato 61 (0,52 g, 37%, 1:1 de mistura diastereomérica) e bisfosfonamidato 62 (0,13 g, 20%).

Exemplo 56

Bisfosfonamidato 63: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,33 g, 1,00 mmol), cloridrato de éster de butila de L-alanina (0,47 g, 2,60 mmoles), e trietilamina (0,27 g, 2,60 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,77 g, 3,50 mmoles) e trifenilfosfina (0,92 g, 3,50 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (10% de MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o bisfosfonamidato (0,32 g, 55%) como uma espuma amarela-clara.

Ο Exemplo 57 refere-se ao Esquema 17. a» fw .

Exemplo 57

BisPOC de 6-alilPMEDAP 64: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,20 g, 0,61 mmol) e trietilamina (0,42 mL, 3,01 mmoles) em 1-metü-25 pirrolidinona (2,0 mL) foi aquecida a 60°C durante 30 minutos. POCCI (0,45 g, 2,92 mmoles) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a 60°C durante 3 horas, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com. salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O 10 produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o bisPOC de 6-alilPMEDAP 64 (0,11 g, 32%, GS 192727) como um sólido: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,60 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,66 (m, 4H), ’ 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,92 (m, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,22 (m, 4H), 3,95 (m, 4H), 1,35 (m, 12H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 20,94.

Os Exemplos 58 a 61 referem-se ao Esquema 18.

? Exemplo 58 .

. Bisfosfoamidato 65: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, a . ’

0,11 mmol), Cloridrato de éster de etila de L-alanina (0,1 g, 0,65 mmol), e * trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60°C du20 rante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de

I aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60°C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi Ia25 vada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2propanol/CH₂CI₂) para fornecer o Bisfosfoamidato (23 mg, 41%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,70 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,30 (m, 4H), 4,20-4,00 (m, 6H), 3,89 (m, 2H), 3,72 30 (m, 2H), 3,42 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 1,45-1,25 (m, 12H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 20,77.

Exemplo 59

Bisfosfoamidato 66: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,10 g, 0,30 mmol), cloridrato de éster de ciclobutila de L-alanina (0,33 g, 0,91 mmol), e trietilamina (0,50 mL, 3,59 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente 5 preparada de aldritiol (0,47 g, 2,12 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,14 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evapo10 rada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o Bisfosfoamidato (45 mg, 26%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,60 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,78 (s, 2H), 4,30 (m, 4H), 4,00 (m, 2H), 3,89 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,38 (m, 1H), 3,19 (m, 1H), 2,38 (m, 15 4H), 2,10 (m, 4H), 1,85-1,60 (m, 4H), 1,45 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,61.

Exemplo 60

Bisfosfoamidato 67: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,10 g, 0,30 mmol), cloridrato de éster de n-hexila de L-alanina (0,25 g, 1,21 mmol), 20 e trietilamina (0,7 mL, 5,02 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,47 g, 2,12 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,14 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °Ç durante á noite, resfriada à temperatura ambiente, econcentra25 da. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2propanol/CH₂CI₂) para fornecer o Bisfosfoamidato (80 mg, 41 %) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,65 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,30 30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,80 (s, 2H), 4,25 (m, 4H), 4,20-4,00 (m, 6H), 3,85 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,42 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 1,70 (m, 4H), 1,32 (m, 18H), 0,96 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,61.

Exemplo 61

Bisfosfoamidato 68: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 0,11 mmol), cloridrato de éster n-butila de ácido L-2-aminobutírico (0,13 g, 0,64 mmol), e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aque5 cida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgâni10 ca foi lavada com salmoura, seca com NazSO^ filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para fornecer o Bisfosfoamidato (32 mg, 49%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,68 (s, 1H), 6,00 (m, 1H), 5,70 (s, amplo, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 4,80 (s, 2H), 4,25 (m, 4H), 15 4,20-4,05 (m, 6H), 3,89 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,35 (m, 1H), 3,15 (m, 1H),

1,86-1,60 (m, 8H), 1,40 (m, 4H), 0,96 (m, 12H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,25.

Os Exemplos 62 a 71 são relacionados ao Esquema 19. Exemplo 62

Bisfosfoamidato 69: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 20 0,11 mmol), cloridrato de éster de etila de L-fenilalanina (0,15 g, 0,65 mmol), e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 25 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2propanolZChFCh) para fornecer o Bisfosfoamidato (28 mg, 39%) como uma 30 espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,58 (s, 1H), 7,28-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, ÍH), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,25-4,00 (m, 8H), 3,65 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 3,15-2,77 (m, 6H), 1,23 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) δ

20,34.

Exemplo 63

Bisfosfoamidato 70: lima mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 0,11 mmol), cloridrato de éster de n-butila de L-fenilalanina (0,15 g, 0,58 mmol), e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2propanol/CH₂Cl2) para fornecer o Bisfosfoamidato (49 mg, 63%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,58 (s, 1H), 7,28-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,70 (s, amplo, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (s, 2H), 4,25-4,03 (m, 8H), 3,65 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 3,17-2,78 (m, 6H), 1,61 (m, 4H), 1,32 (m, 4H), 0,96 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,35.

Exemplo 64

Bisfosfoamidato 71: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,10 g, 0,30 mmol), cloridrato de éster de isobutila de L-fenilalanina (0,31 g, 1,20 mmol), e trietilamina (0,7 mL, 5,02 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,44 g, 2,00 mmoles) e trifenilfosfina (0,53 g, 2,00 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o Bisfosfoamidato (94 mg, 42%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,55 (s, 1H), 7,27-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,70 (s, amplo, 1H), 5,25 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (s, 2H), 4,25-4,08 (m, 4H), 3,87 (m, 4H), 3,65 (m, 2H), 3,42-3,19 (m, 2H), 3,1794

2,78 (m, 6H), 1,97 (m, 2H), 0,96 (m, 12H); ³¹P RMN (CDCI₃) δ 20,31. Exemplo 65

Monofosfoamidato 72: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 0,11 mmol), Cloridrato de éster de etila de L-alanina (32 mg, 0,20 mmol), fenol (50 mg, 0,53 mmol) e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfoamidato (12 mg, 22%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,62 (d, 1H), 7,30-7,04 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 4,30-4,05 (m, 7H), 3,90-3,80 (m, 4H), 1,23 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,89, 20,65.

Exemplo 66

Monofosfoamidato 73: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 0,11 mmol), cloridrato de éster de n-butila de L-alanina (39 mg, 0,21 mmol), fenol (50 mg, 0,53 mmol) e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarelaclara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografla em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer 0 monofosfoamidato (16 mg, 28%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,61 (d, 1H), 7,32-7,06 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,80 (s, amplo, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,20 (dd, 1H), 4,80 (m, 2H), 4,30-4,05 (m, 7H),

3,90-3,80 (m, 4Η), 3,90-3,60 (m, 2Η), 1,60 (m, 2H), 1,32 (m, 5H), 0,96 (m, 3H);³¹P RMN (CDCI₃) δ 21,96, 20,70.

Exemplo 67

Monofosfoamidato 74: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de ciclobutila de L-alanina (0,11 g, 0,61 mmol), fenol (0,13 g, 1,39 mmol) e trietilamina (0,5 mL, 3,59 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,47 g, 2,12 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,14 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer 0 monofosfoamidato (28 mg, 17%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,60 (d, 1H), 7,25-7,03 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,18 (dd, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,79 (d, 2H), 4,28-4,05 (m, 4H), 3,90 (m, 4H), 3,70 (m, 1H), 3,57 (m, 1H), 2,30 (m, 2H), 2,00-1,60 (m, 4H), 1,25 (m, 3H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,91,20,64.

Exemplo 68

Monofosfoamidato 75: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-hexila de L-alanina (0,13 g, 0,61 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,7 mL, 5,02 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,47 g, 2,12 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,14 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer 0 monofosfoamidato (28 mg, 16%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espu ma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,60 (d, 1H), 7,25-7,03 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,35-4,05 (m, 7H), 3,90 (m, 4H), 3,70 (m, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,30 (m, 9H), 0,96 (m, 3H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,97, 20,69.

Exemplos 69 a 72 são relacionados ao esquema 21.

Exemplo 69

Monofosfoamidato 76: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 0,11 mmol), cloridrato de éster de n-butila de ácido L-2-aminobutírico (42 mg, 0,21 mmol), fenol (50 mg, 0,53 mmol) e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfoamidato (17 mg, 29%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,60 (d, 1H), 7,25 - 7,03 (m, 5H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,30 - 4,03 (m, 7H), 3,95 3,80 (m, 4H), 3,62 (m, 1H), 3,40 (m, 1H), 1,80 - 1,60 (m, 4H), 1,38 (m, 2H), 0,98 - 0,75 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 22,26, 20,95.

Exemplo 70

Monofosfoamidato 77: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 0,11 mmol), cloridrato de éster de etila de L-fenilalanina (48 mg, 0,21 mmol), fenol (50 mg, 0,53 mmol) e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarelaclara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfoamidato (14 mg, 23%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI3) Ô 7,60 (d, 1H), 7,25 - 7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,80 (m, 2H), 4,40 - 4,08 (m, 7H), 3,85 - 3,65 (m, 4H), 3,38 - 3,25 (m, 2H), 2,95 - 2,86 (m, 2H), 1,20 (m, 3H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,86,21,06.

Exemplo 71

Monofosfoamidato 78: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (35 mg, 0,11 mmol), cloridrato de éster de n-butila de L-fenilalanina (55 mg, 0,21 mmol), fenol (50 mg, 0,53 mmol) e trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarelaclara recentemente preparada de aldritiol (0,16 g, 0,74 mmol) e trifenilfosfina (0,20 g, 0,75 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfoamidato (18 mg, 28%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,60 (d, 1H), 7,25 - 6,97 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,80 (s, amplo, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,40 - 4,03 (m, 7H), 3,85 - 3,65 (m, 4H), 3,45 - 3,25 (m, 2H), 2,95 - 2,86 (m, 2H), 1,57 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 0,96 (m, 3H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,89, 21,09.

Exemplo 72

Monofosfoamidato 79: Uma mistura de ácido fosfônico 60 (0,10 g, 0,30 mmol), cloridrato de éster de isobutila de L-fenilalanina (0,16 g, 0,61 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,7 mL, 5,02 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,47 g, 2,12 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,14 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) para fornecer o monofosfoamidato (19 mg, 10%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,60 (d, 1H), 7,25-7,03 (m, 10H), 6,00 (m, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,17 (dd, 1H), 4,78 (d, 2H), 4,45 (m, 1H), 4,35-4,18 (m, 4H), 3,95-3,60 (m, 5H), 3,35 (m, 1H), 3,00-2,83 (m, 2H), 1,85 (m, 1H), 0,96 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,90, 21,07.

Os Exemplos 73 a 76 são relacionados ao Esquema 22. Exemplo 73

Monofosfoamidato 80: Uma mistura de monoácido fosfônico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), cloridrato de éster de ciclobutila de L-alanina (0,11 g, 0,61 mmol), fenol (0,13 g, 1,4 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,67 mmoles) em piridina (2 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,47 g, 2,12 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,14 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) seguido por purificação Gilson HPLC (CH₃CN/H₂O) para fornecer o monofosfoamidato (33 mg, 20%, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,60 (s, 1H), 7,30 - 7,03 (m, 5H), 5,80 (s, amplo, 1H), 5,00 (m, '1H), 4,80 (d, 2H), 4,28 - 4,05 (m, 3H), 3,90 (m, 4H), 3,03 (s, amplo, 1H), 2,35 (m, 2H), 2,05 (m, 2H), 1,80 (m, 2H), 1,30 (m, 3H), 0,90 (m, 2H), 0,62 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 21,91, 20,61.

Exemplo 74

Bisfosfoamidato 81: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (60 mg, 0,18 mmol), cloridrato de éster de ciclobutila de L-alanina (0,13 g, 0,72 mmol), e trietilamina (0,31 mL, 2,16 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aqueci2^0 da a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,28 g, 1,26 mmol) e trifenilfosfina (0,34 g, 1,26 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60°C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílicagel (5% MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o Bisfosfoamidato (30 mg, 28%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) δ 7,60 (s, 1H), 5,70 (s, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,90 (s, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,00 (m, 2H), 3,90 (m, 2H), 3,78 (m, 2H), 3,40 (m, 1H), 3,21 (m, 1H), 3,03 (s, amplo, 1H), 2,35 (m, 4H), 2,05 (m, 4H), 1,90-1,65 (m, 4H), 1,32 (m, 6H), 0,90 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,70.

Exemplo 75

Bisfosfoamidato 82: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (60 mg, 0,18 mmol), cloridrato de éster de ciclopentila de L-alanina (0,13 g, 0,72 mmol), e trietilamina (0,31 mL, 2,16 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60°C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,28 g, 1,26 mmol) e trifenilfosfina (0,34 g, 1,26 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °Ç durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCOs saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO₄, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílica-gel (5% MeOH/CH₂CI₂) para fornecer 0 Bisfosfoamidato (30 mg, 27%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,62 (s, 1H), 5,72 (s, 1H), 5,20 (m, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,04 - 3,88 (m, 4H), 3,74 (m, 2H), 3,40 ( m, 1H), 3,23 (m, 1H), 3,03 (s, amplo, 1H), 1,95 - 1,58 (m, 16H), 1,37 (m, 6H), 0,90 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,64.

Exemplo 76

Bisfosfoamidato 83: Uma mistura de ácido fosfônico 6 (40 mg, 0,12 mmol), cloridrato de éster de ciclobutila de L-fenilalanina (0,13 g, 0,48

100 mmol), e trietilamina (0,20 mL, 1,44 mmol) em piridina (0,5 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,19 g, 0.85 mmol) e trifenilfosfina (0,22 g, 0,85 mmol) em piridina (0,5 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílica-gel (5% MeOH/CH₂CI₂) para fornecer o Bisfosfoamidato (20 mg, 22%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI₃) δ 7,50 (s, 1H), 7,28 - 7,05 (m, 10H), 5,72 (s, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,90 (s, 2H), 4,23 - 4,03 (m, 4H), 3,68 (m, 2H), 3,42 - 3,19 (m, 2H), 3,15 - 2,82 ( m, 7H), 2,38 (m, 4H), 2,00 (m, 4H), 1,85 -1,55 (m, 4H), 0,90 (m, 2H), 0,60 (m, 2H); ³¹P RMN (CDCI3) δ 20,31.

Os Exemplos 77 e 78 referem-se ao Esquema 23.

Exemplo 77

Fosfonato de diisopropila 84: Uma mistura de 4 (5,0 g, 12,82 mmoles) e trifluoroetilamina (6,35 g, 64,10 mmoles) em CH₃CN (40 mL) foi colocada em uma bomba de reação e aquecida a 80 °C durante 4 horas. A mistura de reação foi resfriada à temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O produto foi dividido entre 15% de MeOH/CH₂CI₂ (3 x) e salmoura, seco com Na₂SO₄, filtrado e concentrado. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂CI₂) seguido por purificação Gilson HPLC (CH₃CN/H₂O) para fornecer 84 (3,26 g, 56%) como uma espuma amarela-clara.

Exemplo 78

Bisfosfoamidato 85: Uma mistura de ácido fosfônico 42 (0,11 g, 0,29 mmol), cloridrato de éster de ciclobutila de L-alanina (0,31 g, 1,75 mmol), e trietilamina (0,52 mL, 3,67 mmoles) em piridina (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 minutos. Uma solução amarela-clara recentemente preparada de aldritiol (0,47 g, 2,12 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,12 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reação acima. A reação foi agitada a 60 °C durante a noite, resfriada à temperatura ambiente,

101 e concentrada. O produto foi dividido entre EtOAc e NaHCO₃ saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na₂SO4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em ISCO (2-propanol/CH₂Cl2) para fornecer o Bisfosfoamidato (97 mg, 54%) como uma espuma amarela-clara: ¹H RMN (CDCI3) □ 7,65 (s, 1H), 5,90 (s, amplo, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,35-4,20 (m, 4H), 4,00 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 3,70 (d, 2H), 3,38 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 2,30 (m, 4H), 2,00 (m, 4H), 1,90-1,60 (m, 4H), 1,35 (m, 6H); ³¹P RMN (CDCI3) □ 20,61.

Exemplo 79

Este exemplo ensina ensaios empregados para demonstrar a atividade antiproliferação.

Tioos de células empregadas para ensaios anti-proliferação

As linhagens de célula de câncer humano empregadas em ensaios antiproliferação incluíram seis linhagens de célula de carcinoma cervical com três tipos de HPV (HPV-16, HPV-18, HPV-39), uma linhagem de célula de carcinoma cervical de HPV negativo, e dois carcinomas tipo ceratinócito de língua. Células humanas normais testadas incluíram ceratinócitos de pele, ceratinócitos cervicais, e flbroblastos de pulmão. Ceratinócitos de pele e ceratinócitos cervicais foram obtidos de Cambrex (East Rutherford, NJ) e todas as outras células foram obtidos de American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Tabela 79-1 sumariza características de cada tipo celular e condições de cultura.

Procedimento de ensaio antiproliferação

1. Cultura celular

Células foram destacadas de de frascos de cultura empregandose tripsina, contadas, e colocadas em placas de cultura de 96 cavidades (250 - 1000 células por cavidade, dependendo do tipo celular). No dia seguinte (definido como o dia 0), após as células destacarem-se da base das placas, diluições seriais de 5 vezes dos compostos foram adicionadas em duplicata. Nenhum composto e 10 μΜ colquicina (inibidor de divisão celular) foram adicionados às cavidades de controle, que representariam 100% de

102 proliferação e 0% de proliferação, respectivamente.

2. O manchamento de células com Sulforodamina B

Sete dias após a adição de compostos, as placas de cultura foram tratadas com 10% de ácido tricloroacético a 4°C durante 1 hora, em se5 guida lavadas com água. Este procedimento permite as proteínas derivadas de célula ligarem-se à superfície de base das placas. As proteínas foram manchadas com 0,4% de Sulforodamina B em 1 % de ácido acético durante 10 minutos, seguido por lavagem extensa com 1% de ácido acético. A tinta que permaneceu ligada à base das placas foi dissolvida em 10 mM de base 10 Trizma. Esta cor púrpura gerada que foi quantificada medindo-se a absorvência a 510 nm de comprimento de onda, empregando-se espectrofotômetro.

3, Análise de Dados

Dos dados experimentais, a curva de resposta de dose sigmoi15 dal foi gerada e 50% de concentração eficaz (EC₅o) foram calculados empregando-se GraphPad Prism versão 4.01 para Windows (GraphPad Software, San Diego Califórnia USA).

Tabela 79-1. Tipos de célula empregados em ensaios antiproliferacão

Nome	Estado do HPV	Origem	Meio de Cultura*
Linhagens de célula de carcinoma HPV positivo
SiHa	HPV-16 (1-2 cópias por célula)	Carcinoma de célula escamosa em cérvix	A1,A2
Ca Ski	HPV-16 (600 cópias por célula)	Carcinoma epidermóide, metastatizado para o intestino pequeno de cérvix	A1, A2
MS751	HPV-18 (também contém um genoma de HPV-45 parcial)	Carcinoma epidermóide, metastatizado para linfonodo de cérvix	A1,A2
HeLa	HPV-18	Carcinoma epitelial em cérvix	A1, A2

103

C-4 I	HPV-18	Carcinoma em cérvix	A1, A2
ME-180	HPV-39	Carcinoma epidermóide, metastatizado para omento de cérvix	A1, A2
Linhagens de céiuia de carcinoma HPV negativo
HT-3	Nenhum	Carcinoma, metastatizado para linfonodo de cérvix	A1, A2
SCC-4	Nenhum	Carcinoma de célula escamosa em língua	A1,A2
SCC-9	Nenhum	Carcinoma de célula escamosa em língua	A1, A2
Células de tecidos humanos normais
HEL299	Nenhum	Fibroblastos em pulmão embriônico	A1, A2
PHK (ceratinócitos de pele)	Nenhum	Ceratinócitos em prepúcio de adulto	B1.B2
CK (ceratinócitos cervicais)	Nenhum	Ceratinócitos em cérvix de adulto	B1, B2

* Meios de cultura

As células foram mantidas em Incubadores umidificados a 37°C com 5% de CO₂, nos seguintes Meios de cultura.

A1: Meios para manutenção de cultura: Eagle MEM com Earle’s

BSS (Cambrex, East Rutherford, NJ), suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL estreptomicina.

A2: Meio para ensaios antiproliferação: Eagle MEM com Earle’s BSS, suplementado com 5% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 10 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina.

B1: Meio para manutenção de cultura: Ceratinócito-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 0,01 de mg/mL de extrato de pituitária bovina, 0,001 de pg/mL de fator de crescimento epidérmico recombinante, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina.

2A

104

Β2: Meio para ensaios antiproliferação: 4:1 de mistura de B1 e A2.

Resultados

1. Atividade antiproliferação seletiva dos pró-fármacos de amidato em células SiHa HPV positivas em comparação com fibroblastos normais. O objetivo era descobrir um composto que iniba o crescimento de lesão transformada por HPVsem afetar as células normais em epiderme e derme (tal como, ceratinócitos e fibroblastos). Os ensaios antiproliferação In vitro foram estabelecidos empregando-se células SiHa e células HEL, que modelam a lesão transformada por HPV e fibroblastos normais, respectivamente. As células SiHa são derivadas de carcinoma de célula escamosa em cérvix causada por infecção de HPV-16 e fibroblastos HEL são derivados de pulmão embriônico humano normal (Tabela 79-1). Como mostrado na Tabela 79-2, 50% de concentração eficaz (EC_S0) das sete pró-fármacos de amidato em células SiHa variadas de 0,13 - 3,2 nM, enquanto EC₅₀ em células HEL variou de 12 - 727 nM, indicando que estes compostos inibiram a proliferação de células SiHa mais eficientemente do que as células HEL. O índice de seletividade de HEL/SiHa (EC50HEL dividido por EC₅₀ de SiHa) variou de 72 - 559 (Tabela 79-2).

Todas os sete pró-fármacos de amidato produzem o mesmo metabólito, cprPMEDAP. cprPMEDAP é também metabolizado para PMEG [Compton e outros, 1999; Haste e outros, 1999]. O EC₅₀ antiproliferação destes compostos em células SiHa foi muito maior do que aqueles dos prófármacos (Tabela 79-2), indicando que a ligação de porções de amidato melhorou a potência. Além disso, os índices de seletividade de HEL/SiHa de cprPMEDAP e PMEG foram de 17 e 4,1, respectivamente (Tabela 79-2), indicando que as pró-fármacos têm melhor seletividade do que cprPMEDAP e cprPMEDAP tem melhor seletividade do que PMEG.

PMEG é conhecido ser fosforilado para PMEGpp que age como um inibidor de terminação de cadeia de polimerase de DNA celular [Compton e outros, 1999; Haste e outros, 1999]. Quatro inibidores de DNA polimerase conhecidos (Cidofovir, Ara C, doxifluridina, e Afidícolina) e outros fár

105 macos anticâncer com diferentes mecanismos de ação, incluindo inibidores de DNA topoisomerase (Dacarbazina, Ellipticine), alquiladores de DNA (Doxorubicina, Mitoxantrona, Bleomicina, Mecloretanmina), e inibidores de tublina (Vincristina, Vinblastina, Etoposida, e Indanocina) foram testados em células SiHa e HEL (Tabela 79-2). O EC₅q antiproliferação destes compostos em células SiHa variou, e alguns foram igualmente ou mais potentes do que os sete pró-fármacos de amidato. Não obstante, todos eles exibiram índices de seletividade fraco de HEL/SiHa (0,01 - 3,98), em comparação com os sete pró-fármacos de amidato.

Tomados junto, um único grupo de compostos foi ensinado, que mostra sub-baixo nM de EC₅o antiproliferação em células de carcinoma SiHa HPV-16 positivas e mais do que 50 vezes a seletividade quando comparado aos fibroblastos de HEL.

2. A atividade antiproliferação seletiva dos pró-fármacos de amidato em células SiHa HPV positivas em comparação com ceratinócitos normais.

A fim de testar o efeito dos compostos em células normais de epiderme, ensaios antiproliferação foram realizados empregando-se ceratinócitos humanos primários, isolados da pele (PHK) e cérvix (CK). Os valores EC₅₀ antiproliferação obtidos com os sete pró-fármacos em PHK e CK foram menores do que aqueles em HEL, indicando que os ceratinócitos são mais suscetíveis do que os fibroblastos (Tabela 79-2 e 79-3). Não obstante, os índices de seletividade de PHK/SiHa e CK/SiHa destes pró-fármacos e cprPMEDAP foram ainda melhores do que o compostos de controle PMEG e um inibidor de DNA polimerase AraC (Tabela 79-3). Desse modo, as prófármacos preferenciaimente inibiram a proliferação de células SiHa HPV-16 positivo, em comparação com os ceratinócitos de pele e cérvix.

3. Atividades antiproliferação em outras células HPV positivo.

Os sete pró-fármacos foram então testados em cinco linhagens de célula adicionais derivadas de carcinoma cervical induzido por HPV (listados na Tabela 79-1) em ensaios antiproliferação e os dados são mostrados na Tabela 4 juntamente com os dados de SiHa. Em células SiHa, C-4I, e ζ<=)?

106

MS751, todos os compostos exceto o Composto C mostrou subbaixo nM de EC₅₀ antiproliferação. Em CaSki, HeLa, e ME-180, entretanto, todos os compostos foram significantemente menos potente, com o EC₅₀ variando de 7,8 a 410 nM. Parece não haver Nenhuma correlação entre a resistência e o tipo 5 de HPV (16,18 ou 39), ou resistência e metástase (CaSki, MS751, e ME180 são derivados de sítio metastatizado). O composto de controle AraC (inibidor de DNA polimerase) uniformemente inibiu todas as linhagens celulares com valores de EC50 variando de 94 a 257 nM.

4. Atividades antiproliferação em células de carcinoma de HPV 10 negativo.

Para investigar o efeito dos compostos sobre linhagens de célula de carcinoma HPV negativo, três linhagens celulares (HT-3, SCC4, SCC9, Tabela 79-1) foram testadas em ensaios antiproliferação. Como mostrado na Tabela 79-4, todas as sete pró-fármacos foram igualmente ou mais potentes 15 do que o composto de controle AraC.

Tabela 79-2. Inibição seletiva de células SiHa HPV16+ em comparação com fibroblastos de HEL.

Composto ID.	Nota	Seletividade (HEL/SiHa)	Antiproliferação EC50 (nM)
Carcinoma cervical de SiHa (HPV16)	Fibroblasto de pulmão de HEL
A		72	0,6	43
B		559	1,3	727
C		115	0,20	23
D		135	3,2	431
E		164	0,50	82
F		210	2,5	526
G		92	0,13	12
Controles
cprPMEDAP	Metabólito	17	284	4821

107

PMEG	Metabólito	4.1	207	861
AraC	inib. DNA pol	0.113	257	29
Cidofovir	inib. DNA pol	0.3	84013	27952
Doxifluridina	inib. DNA pol	0.449	8755	3927
Afidicolina (+)	inib. DNA pol	0.40	856	324
Dacarba-zina	Inib. topo DNA	3.98	7402	29481
Elipticina	Inib. topo DNA	1.02	478	486
Doxorubicina	Alquilador de DNA	0.43	9,76	4,20
Mitoxantrona	Alquilador de DNA	<0.37	8,67	<3,2
Cloridrato de Mecloretamina	Alquilador de DNA	1.02	21863	22203
Bleomicina	Alquilador de DNA	0.01	3138	20.28
Vincristina	Inib. de Tublina	1.55	1,24	1,92
Vinblastina	inib. de Tublina	0.39	0,68	0,27
Etoposida	Inib. de Tublina	0.31	469	144
Indanosina	Inib. de Tublina	0.27	588	159

Tabela 79-3. Inibição Seletiva de células SiHa de HPV16+ em comparação com ceratinócitos primários. _:

Comp ID.	Note	Seletividade (PHK/SiHa)	Seletividade (CK/SiHa)	Antiproliferação EC50 (nM)
SiHa cervical carcinoma (HPV16)	PHK ceratinócitos de pele	CK cervical ceratinócitos
A		58	11	0,6	35	7
B		75	42	1,3	98	54
C		4	7	0,20	0,8	1,4
D		12	7	3,2	39	22
E		10	11	0,50	5,2	5,4
F		31	3	2,5	78	7,1
G		22	15	0,13	2,9	1,9

108

Controles
cprP- ME- DAP	Metabó- lito	13	2,4	284	3698	694
PMEG	Metabóllto	0,48	2,4	207	101	501
AraC	inib. DNApol	0,57	0,4	257	147	107

Tabela 79-4. Atividades antiproliferação em outras células de carcinoma de HPV positivo e negativo.

Com plD.	EC50 (nM) antiproliferação em células de carcinoma de HPV positivo	EC50 (nM) antiproliferação em células de carcinoma de HPV negativo
SiHa HPV16	CaSki HFV16	HeLa HPV18	MS-751 HPV18	O4I HPV18	ME-180 HPV39	HT-3 cérvix	SCC4 língua	SCC9 língua
A	0,6	29	16	1,7	6,5	27	14	17	40
B	1,3	246	410	18	27	254	104	53	150
C	0,20	3,87	6,6	0,54	1,0	7,8	9,5	2,1	2,5
D	3,2	301	398	16	24	288	127	44	147
E	0,50	38	19	2,40	3,1	27	17	8	13
F	2,5	124	127	4,2	6,0	41	24	10	28
G	0,13	28	12	0,9	3,1	8,2	6,0	2,1	7,9
Controles
AraC	257	94	174	144	123	101	214	74	68

Exemplo 80

Ensaio antiproliferação

Ensaios antiproliferação medem o efeito de compostos sobre a proliferação de células cultivadas. Compostos ativos em ensaios antiproliferação podem ser citostáticos (inibem a divisão celular) e/ou citocidas (matam as células). Realizando ensaios antiproliferação empregando células de carcinoma HPV positivo e células normais, identificamos compostos que seleti109 vamente inibem a proliferação de células de carcinoma de HPV positivo em comparação com células de tecidos humanos normais. A Tabela 80-1 sumariza as características de cada tipo celular, incluindo seis linhagens de célula de carcinoma transformadas por HPV, ceratinócitos de pele de humanos 5 normais (PHK), e fibroblastos de pulmão normal (HEL). Ceratinócitos de pele foram obtidos de Cambrex (East Rutherford, NJ). Todas as outras células foram obtidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA).

As células foram destacadas de frascos de cultura empregando tripsina, contadas, e colocadas em placas de cultura de 96 cavidades (250 10 100 células por cavidade, dependendo do tipo celular). No dia seguinte (definido como o dia 0), diluições seriais de 5 vezes de compostos foram adicionadas em duplicata. Sete dias após a adição de compostos, as placas de cultura foram tratadas com 10% de ácido tricloroacético a 4°C durante 1 hora e lavadas com água. Este procedimento permite as proteínas celulares liga15 rem-se à superfície de base das placas. As proteínas foram manchadas com 0,4% de Sulforodamina B em 1% de ácido acético durante 10 minutos, seguido por lavagem extensiva com 1% de ácido acético. A tinta restante ligada à base das placas foi solubilizada em 10 mM de base Trizma, gerando cor púrpura. A intensidade da cor (proporcional ao número de células) foi 20 quantificada medindo-se a absorvência a 510 nm de comprimento de onda, empregando espectrofotômetro. Células sem tratamento com fármaco (=100% de proliferação) e células tratadas com 10 μΜ de colquicina (inibidor de divisão celular) (= 0% de proliferação) foram usadas como controle, para determinar o percentual de inibição. Os valores de % de inibição foram plo25 tados contra as concentrações de composto, adaptadas a uma curva de resposta de dose sigmoidal, da qual a concentração de composto que reduziu a taxa de proliferação celular em 50% (= EC₅₀) foi determinada. GraphPad Prism versão 4.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego Califórnia USA) foi empregado para adaptar a curva e cálculo de EC50 ·

Ensaio de Apootose (método de indução de caspase 3)

Indução de caspases é um dos eventos precoces associados com apoptose ou morte celular programada. Atividade de caspase pode ser

110 quantitativamente detectada empregando-se substrato fluorescente. Os compostos que diretamente agem sobre a trilha apoptótica podem induzir a caspase em um período de incubação relativamente curto (< 24 horas). Os compostos que atrapalham outra fisiologia celular, que eventualmente causa a apoptose, pode requerer o período de incubação mais longo (> 48 horas) para indução de caspase.

10.000 células foram semeadas em placas de cultura de 96 cavidades e incubadas com diluições seriais de 5 vezes de compostos durante 24, 48, e 72 horas. As células foram lisadas e a atividade de caspase em lisados celulares foi medida empregando-se substrato fluorescente, de acordo com a instrução do fabricante (Kit de ensaio de caspases, Roche, Indianápolis, IN).

Ensaio de Apoptose (Método de manchamento com Anexina V)

A translocação de fosfatidilserina do interior da membrana celular para o exterior é aquela dos eventos precoce / intermediários associados com apoptose ou morte celular programada. A fosfatidilserina translocada pode ser detectada incubando-se as células com Anexina V rotulada com FITC, que é uma proteína de ligação a fosfolipídeo dependente de Ca++. Quando as células são manchadas com Anexina-FITC e iodeto de propídio (que mancha as células mortas), as células vivas são negativas para ambas as tintas, as células mortas são positivas para ambas, enquanto as células apoptóticas são positivas apenas para Anexina-FITC.

As células SiHa de HPV-16 foram cultivadas com três diferentes concentrações de compostos durante 3 ou 7 dias e simultaneamente manchadas com Anexina-FITC e iodeto de propídio. O manchamento de cada célula individual foi examinado por citometria de fluxo.

Resultados

Atividade antiproliferação seletiva

O propósito para este procedimento era identificar os compostos que inibem o crescimento de lesão transformada por HPV sem afetar as células normais em epiderme e derme (tal como, ceratinócitos e fibroblastos). Portanto, os compostos foram testados em células SiHa, PHK, e HEL, que

111 modelam as células transformadas por HPV, ceratinócitos normais, e fibroblastos normais, respectivamente.

Os compostos representativos da presente invenção, tais como aqueles listados na Tabela 80-2, mostraram níveis detectáveis de atividade 5 antiproliferação em células SiHa , com 50% de concentração eficaz (EC₅₀) menor do que 25.000 nM. Os compostos ativos foram também testados em células HEL . Em todos os casos, EC₅o em células HEL foi maior do que o EC₅o em células SiHa , indicando que os compostos ativos inibiram a proliferação de células SiHa, mais eficientemente do que as células HEL. Outros 10 análogos de nucleotídeo/nucleosídeo, tais como PMEG (guanina de 2fosfonometoxietila), Ara-C (citarabina, CAS# 147-94-4), e gemcitabina (CAS# 95058-81-4) não mostraram tal seletividade. Podofilox (CAS# 518-285), o ingrediente ativo do fármaco anti-verruga Condylox, também não mostrou nenhuma seletividade, ,

Os compostos de pró-fármaco representativos da presente invenção, tais como aqueles listados na Tabela 80-3 mostram atividades. Na maioria dos casos, os pró-fármacos foram mais potentes e em alguns casos, mais seletivas do que seus respectivos compostos de origem. A maioria dos pró-fármacos de fosfoamidato foi mais ativa e seletiva do que o podofilox.

Tomados juntos, os compostos foram identificados possuírem sub nM de EC50 antiproliferação em células SiHa HPV-16 positivo e mais do que 50 vezes a seletividade quando comparados com os ceratinócitos de PHK ou com fibroblastos de HEL.

Atividade antiproliferação em outras linhagens de célula HPV+

Os compostos selecionados foram também testados em cinco linhagens celulares adicionais derivadas de carcinoma cervical induzido por HPV (veja o Exemplo 79 e Tabela 80-4). Cada composto mostrou diferentes níveis de atividades nas seis linhagens celulares HPV+, independente do tipo de HPV presente. Em gerai, os compostos foram mais potentes em célu30 Ias SiHa (HPV-16), C-4I (HPV-18), e MS751 (HPV-18) do que em células CaSki (HPV-16), HeLa (HPV-18), e ME-180 (HPV-39).

Indução de apoptose (método de indução de caspase 3)

112

Um composto representativo da presente invenção foi testado quanto à indução de apoptose em células SiHa. Quando as células foram incubadas durante 72 horas (barras sólidas), indução de caspase responsiva à dose significante foi observada, indicando que a apoptose induzida pelo composto (Figura 80-1). Indução de caspase foi menos obvia com 48 horas de incubação (barras sombreadas) e não foi observada com 24 horas de incubação (dados não mostrados).

Indução de apoptose (Método de manchamento por Anexina V)

PMEG, N6-ciclopropil PMEDAP, e um composto representativo da presente invenção foram testados em três diferentes concentrações, quanto à indução de apoptose em células SiHa, empregando-se o método de manchamento duplo por Anexina V-Propídio. Com todos os três compostos, uma porcentagem maior de células apoptóticas foi observada no dia 7 do que no dia 3. O composto representativo anteriormente mencionado da presente invenção foi o mais ativo na indução de apoptose; no dia 7, 63,8% de células na cultura tratadas com 0,2 pg/m deste composto foram apoptóticas. A contrário, as culturas tratadas com 0,2 pg/mL de PMEG e 0,5 pg/mL de N6-ciclopropila PMEDAP apenas, teve 1,2 % e 15,9 % de células apoptóticas, respectivamente.

Tabela 80-1. Tipos celulares empregados em ensaios antiproliferação

Nome	estado de HPV*	Origem	Meios de cultura**
Linhagens celulares de carcinoma HPV positivo
SiHa	HPV-16	Carcinoma de célula escamosa em cérvix	A1,A2
CaSki	HPV-16	Carcinoma epidermóide, metastatizado para o intestino pequeno de cérvix	A1,A2
MS751	HPV-18 (também contém um genoma de HPV-45 parcial)	Carcinoma epidermóide, metastatizado para linfonodo de cérvix	A1,A2

113

HeLa	HPV-18	Carcinoma epitelial em cérvix	A1,A2
041	HPV-18	Carcinoma em cérvix	A1,A2
ME-180	HPV-39	Carcinoma epidermóide, metastatizado pana omento de cérvix	A1,A2
Células de tec	idos humanos normais
HEL299	nenhum	Fibroblastos em pulmão embriônico	A1,A2
PHK (ceratinócitosdepele)	nenhum	Ceratinócitos em prepúcio de adulto	B1,B2

* O subtipo DNA de HPV integrado no DNA celular. ** Meios de cultura

As células foram mantidas em incubadores umidiflcados a 37°C com 5% de CO₂, nos seguintes Meios de cultura .

A1: Meio para manutenção de cultura: Eagle MEM com Earle’s BSS (Cambrex, East Rutherford, NJ), suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL penicilina, e 100 pg/mL estreptomicina.

A2: Meio para ensaios antiproliferação: Eagle MEM com Earle’s

BSS, suplementado com 5% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina.

B1: Meio para manutenção de cultura: Ceratinócito-SFM (Invitrogen,

Carlsbad, CA), suplementado com 0,01 mg/mL de extrato de pituitária bovina, 0,001 pg/mL de fator de crescimento epidérmico recombinante, 100 uni15 dades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina.

B2: Meio para ensaios antiproliferação: 4:1 mistura de B1 e A2.

114

Tabela 80-2. Atividade antiproliferacão de PMEDAP N6-substituído em céluas SiHa HPV16+ e fibroblastos de HEL.

η₂ν

R^x’ .R»

onde R^X1 é hidrogênio, e R^X2 é um dos seguintes substituintes, exceto nos casos indicados (*), onde R^X1 e R^X2 juntos formam um anel Nheterocíclico.·

metilamina

1 -propilamina

1-butilamina

dimetilamina

metiletilamina

2-metilpropan-1 -amina

alilamina

2-propinil amina

2-butileno amina

2-isobutileno amina

cíclopropilamina

ciclopropilmetanamina

1-ciclopropiletanamina

diciclopropilamtna

ciclobutilamina

ciclopentanamina

ciclohexanoamina

cicloheptanamina

ciclooctanamina

dietanolamina

2-etanolamina

115

2-propanol amina

1-amino 2-propanol amina

2-metoxietilamina

6-aminoexanoamina

3-aminopropilamina

2-dimetilaminoetilamina

6-hexanatoamina

benzilamina

metilbenzilamina

4-aminobenzilamina

2-feniletanamina

1 -metanamina de 2-piridinila

3-piridinila de 1-metanamina

1-metanamina de 4-piridinila

1-naftilamina

•pirrolidina (N6 forma pirrolidina)

*piperidina (N6 forma piperidina)

•morfolina (N6 forma morfolina)

2,2,2-trifluoroetanamina

Tabela 80-3. Atividade antiproliferacão de pró-fármacos de fosfoamidato de

PMEDAP N6-substituído em células SiHa de HPV16+, ceratinócitos PHK, e em fibroblastos HEL.

XX) onde R^X1 é R^X2 são substituídos como representado na fórmula, e Y^1A e Y^1B são substituídos como indicado,
γ1Α	Y^1B
OH	OH
POC	POC
O-iPr	O-iPr

116

Ala-Et	Ala-Et
Ala-Pr	Ala-Pr
Ala-iPr	Ala-iPr
Ala-Bu	Ala-Bu
Ala-cBu	Ala-cBu
Ala-cPen	Ala-cPentila
Ala-Hexila	Ala-Hexila
Ala-Octila	Ala-Octila
Aba-Et	Aba-Et
Aba-Bu	Aba-Bu
Aba-Octila	Aba-Octila
Phe-Et	Phe-Et
Phe-Bu	Phe-Bu
Phe-iBu	Phe-iBu
Phe-cBu	Phe-cBu
OPh	Ala-Me
OPh	Ala-Et
OPh	Ala-Pr
OPh	Ala-iPr
OPh	Ala-Bu
OPh	Ala-tBu
OPh	Ala-Hexila
OPh	Ala-Octila
OPh	Aba-Et
OPh	Aba-Bu
OPh	Aba-cBu
OPh	Aba-Octila
OPh	Phe-Et
OPh	Phe-Bu
OPh	Phe-iBu
OPh	D-Ala-Me

117

ν Η,Ν'^Ν^'ί 9 _γ10 ^γ1Α onde R^X1 e R^X2 são substituídos como representado na fórmula, e Y^1A e Y^1Bsão substituídos como indicado,
γ1Α	γ1Β
OH	OH
O-iPr	O-iPr
POC	POC
Ala-Et	Ala-Et
Ala-Bu	Ala-Bu
Ala-cBu	Ala-cBu
Ala-Hexyl	Ala-Hexila
Aba-Bu	Aba-Bu
Phe-Et	Phe-Et
Phe-Bu	Phe-Bu
Phe-iBu	Phe-iBu
OPh	Ala-Et
OPh	Ala-Bu
OPh	Ala-cBu
OPh	Ala-Hexila
OPh	Aba-Bu
OPh	Phe-Et
OPh	Phe-Bu
OPh	Phe-iBu

118

H₂rT ⁿ 9 _γ1Β L .o. ^γ1Α onde R^X1 e R^X2 são substituídos como representado na fórmula, e Y^1A e Y^1B são substituídos como indicado,
γ1Α	γ1Β
OH	OH
O-iPr	O-iPr
Ala-Bu	Ala-Bu
OPh	Phe-Et

ο

onde R^X1 e R^X2 são substituídos como representado na fórmula, e Y^1A e

Y^1B são substituídos como indicado,
γ1Α	γ1Β
OH	OH
Ala-Bu	Ala-Bu

Tabela 80-4. Atividades antiproliferação de PMEDAP de N6-cicloprollla e suas pró-fármacos de fosfoamidato em seis diferentes células de HPV positivo.

Composto ID.	EC50 (nM) Antiproliferação em células de carcinoma de HPV positivo.
	SiHa HPV16	CaSki HPV16	HeLa HPV18	MS-751 HPV18	C-4I HPV18	ME-180 HPV39
A	0,6	29	16	1,7	6,5	27

119

B	1,3	246	410	18	27	254
C	0,2	3,9	6,6	0,5	1,0	7,8
D	3.2	301	398	16	24	288
E	0.5	38	19	2.4	3,1	27
F	2.5	124	127	4.2	6,0	41
G	0.13	28	12	0.9	3,1	8,2
H	0.03	2,0	0,7	0,04	0,44	1,8
(cprP- ME- DAP)	284	14149	6926	3313	1332	8315

Exemplo 81

Estudo de Irritação de Pele de Coelho de Compostos A e B.

Um estudo foi conduzido para avaliar o potencial de dois compostos da presente invenção para produzir irritação quando administrado por 5 meio de aplicação dérmica a coelhos macho durante sete dias consecutivos. Um total de seis machos foi designado para o estudo como apresentado na Tabela abaixo. _________ _________

Designações de Grupo
Grupo Número	Artigo de Teste^a	Número de Animais (machos)
1	Composto B^b	3
2	Composto A^c	3
^aCada animal recebeu tratamentos dérmicos de veículo (gel de placebo), um artigo de controle positivo, e três concentrações do artigo de teste apropriado. Cada animal recebeu um artigo de teste em concentrações de 0,01, 0,03, e 0,1%. ^bO artigo de controle positivo empregado foi de 0,1% de guanina de 9-(2fosfonilmetoxietila) (PMEG). ^CO artigo de controle positivo empregado foi de 1% de Cidofovír®.

O veículo, artigos de controle positivo, e artigos de teste foram administrados dermicamente uma vez ao dia durante sete dias durante o 10 estudo. Os artigos de teste foram administrados em concentrações de 0,01,

120

0,03, e 0,1%. Os artigos de controle positivo foram administrados em concentrações de 0,1% (PMEG) ou 1% de (Cídofovir®). O volume de dose para todas as formulações foi um volume fixo de 100 μ!_.

Os sítios de teste para cada animal foram barbeados antes da administração inicial e quando necessário durante o estudo. Dois sítios foram grampeados sobre o lado dorsal esquerdo, e três foram grampeados sobre o sítio dorsal direito. O contorno de cada dosagem (aproximadamente 2,54 cm² (1 quadrada) cada) foi marcado com tinta indelével. A área total grampeada compreendeu não menos do que 10% da superfície corporal total de cada animal.

O veículo e controle positivo apropriado e artigo de teste foram administrados a cada animal dentro do sítio de dosagem de aproximadamente 2,54 cm²(1 quadrada). O veículo foi administrado sobre o sítio rostral esquerdo (Sítio de Dose 1), e o artigo de controle positivo apropriado foi administrado ao sítio caudal esquerdo (Sítio de Dose 2). O artigo de teste apropriado foi administrado como segue: 0,01 % para o sítio rostral direito (Sítio de Dose 3), 0,03% para o sítio médio direito (Sítio de Dose 4), e 0,1% para o sítio caudal direito (Sítio de Dose 5). Colares foram colocados nos animais imediatamente após a dosagem durante 1 a 2 horas.

Os sítios foram avaliados quanto ao eritema e edema antes da dosagem no Dia 1 e diariamente a seguir, aproximadamente 24 horas após cada dose e antes da dose seguinte. Cada sítio foi designado um escore de irritação com base na escala Draize para classificar a irritação da pele (Draize JH, Woodard G, Calvery HO, Methods for the study of irrítation and toxícity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J Pharmacol Exp Ther 1944;82:377-90).

As observações quanto à mortalidade, morbidez, e a disponibilidade de alimento e água foram conduzidas duas vezes ao dia para todos os animais. Os exames clínicos detalhados foram conduzidos antes da aleatorização, antes da dosagem no Dia 1, e diariamente a seguir. Os pesos corporais foram medidos e registrados no dia após a chegada, antes da aleatorização, e antes da dosagem nos Dias 1, 3, e 7.

31Z·

121

A eutanásia foi por overdose de anestesia intravenosa com solução de eutanásia com base pentobarbital de sódio e exsanguinações cortando os vasos femorais. Os animais foram examinados cuidadosamente quanto às anormalidades externas incluindo massas. A pele foi refletida de 5 uma incisão mediana ventral e quaisquer anormalidades foram identificadas e correlacionadas com descobertas antes da morte. As cavidades abdominal, toráxica, e craniana foram examinadas quanto às anormalidades e os órgãos removidos, examinados, e, onde requerido, colocado em formalina tamponada neutra. Os sítios de dosagem, rins, e quaisquer lesões volumo10 sas de cada animal foram coletados e preservados. Exame microscópico de hematoxilina fixada e seções de parafina manchada por eosina foram realizadas para cada sítio de dosagem para todos os animais. Os slides foram examinados por um patologista veterinário. Um sistema de classificação de quatro etapas foi utilizado para definir lesões graduáveis para comparação 15 entre os grupos de dose.

Conclusões

Os dois artigos de teste não produziram descobertas clínicas notáveis, irritação dérmica, mudanças em peso corporal ou observações macroscópicas e microscópicas em quaisquer concentrações de dose. Um 20 dos controles positivos foi associado com descobertas clínicas e observações macroscópicas e microscopias leves e moderadas.

Exemplo 82 Estudo de Irritação de Pele de Coelho de Compostos B e H

Um estudo foi conduzido para avaliar o potencial de dois com25 postos da presente invenção para produzir a irritação quando administrado por meio de aplicação dérmica a coelhos macho durante sete dias consecutivos. Um total de 24 machos foi designado para o estudo.

122

Projeto de Estudo quanto ao Composto B
	Grupo 1	Grupo 1 Concentração⁶	Grupo 2	Grupo 2 Concentração¹³
Sítio de Dose	(n=6)^a	%	(mg/mL)	(n=6)^a	%	(mg/mL)
1	Veículo de controle	0,0	0,0	PMEG (controle positivo)	0,1%	1,0
2	Dose Baixa	0,03	0,3	Dose Baixa	0,03	0,3
3	Dose Média	0,1	1,0	Dose Média	0,1	1,0
4	Dose Elevada	0,3	3,0	Dose Elevada	0,3	3,0
^aCada grupo consistiu de seis coelhos virgens. ^bO veículo para o Sítio de Dose 1, Grupo 1, e Sítio de Dose 1, Grupo 2 (PMEG) era o gel de veículo. 0 Veículo dos sítios tratados de Grupo 1 foi o gel de veículo, e o veículo para os sítios tratados de Grupo 2 foi o ungüento de veículo.

Projeto de Estudo para o Composto H
	Grupo 3	Grupo 3 Concentração⁶	Grupo 4	Grupo 4 Concentração⁶
Sítio de Dose	(n=6)^a	%	(mg/mL)	(n=6)^a	%	(mg/mL)
1	Veículo de controle	0,0	0,0	PMEG (controle positivo)	1,0%	10,0
2	Dose Baixa	0,03	0,3	Dose Baixa	0,03	0,3
3	Dose Média	0,1	1,0	Dose Média	0,1	1,0
4	Dose Elevada	0,3	3,0	Dose Elevada	0,3	3,0
^aCada grupo consistiu em seis coelhos virgens. ^bO veículo para o Sítio de Dose 1, Grupo 3 foi o ungüento de veículo, e o veículo para o Sítio de Dose 1, Grupo 4 (cPrPMEDAP) foi o gel de veículo. O Veículo para os sítios tratados com o Grupo 3 foi o gel de veículo, e o veículo para os sítios tratados como Grupo 4 foi o ungüento de veículo.

O teste e artigos de controle foram administrados dermicamente

3(9

123 uma vez por dia durante 7 dias consecutivos durante o estudo. Os níveis de dose para o Composto B foram 0,03, 0,1, e 0,3%. Os níveis de dose para o Composto H foram 0,03, 0,1, e 0,3%. O nível de dose para PMEG (controle positivo) foi de 0,1%. O nível de dose para cPrPMEDAP (controle positivo) 5 foi de 1,0%. O nível de dose para o controle de veículo foi de 0,0% (este foi dosado como ambas as formulações de gel e ungüento). O volume de dose para todos os sítios foi uma constante 100μΙ_. Menos do que 24 horas antes da primeira administração, o cabelo foi raspado das costas do animal. Esta área raspada compreendia não menos do que 10% da área de superfície corporal total. Cuidados foram tomados para evitar esfolar a pele.

Os artigos de teste, controle positivo, e controle de veículo foram administrados dentro de um sítio de dosagem de aproximadamente 1” x 1”. Dois sítios de dosagem foram colocados ao longo da superfície dorsal esquerda. O artigo de veículo ou controle positivo foi administrado ao sítio ros15 trai, e a dose baixa do artigo teste foi administrada ao sítio caudal. Dois sítios de dosagem foram colocados ao longo da superfície dorsal direita. A * dose média do artigo teste foi administrada ao sítio rostral, e a dose elevada do artigo de teste foi administrada ao sítio caudal site. Colares foram colocados nos animais durante aproximadamente duas horas imediatamente após 20 a dosagem. A duração de permanência do calor foi documentada nos dados brutos.

As observações quanto à mortalidade, morbidez, e a disponibilidade de alimento e água foi conduzida duas vezes diariamente para todos os animais. Os sítios de teste foram avaliados quanto a eritema e edema 25 antes da primeira administração e em aproximadamente 24 horas após cada administração (antes da seguinte dosagem escalonada) e diariamente durante o período de recuperação de 7 dias. As observações quanto aos sinais clínicos foram conduzidas diariamente durante o estudo ao mesmo tempo das observações dérmicas. Os pesos corporais foram medidos e registrados 30 no dia após o recebimento, antes da aleatorização, antes da administração do artigo de teste no Dia 1, e nos Dias 7 e 14, e em necropsia (Dias 8 e 15). Os pesos corporais tomados na chegada e antes do acaso não são reporta124 dos, porém mantidos no arquivo de estudo. As amostras de sangue (4-6 mL) serão coletadas de 6 animais/grupo no término e 3 animais/grupo em recuperação da jugular ou outra veia adequada para avaliação de parâmetros de patologia clinicai.

Amostras de sangue adicionais (aproximadamente 1 mL) foram tiradas de todos os animais da jugular ou outra veia adequada para a determinação das concentrações de plasma do artigo teste em aproximadamente 2 horas após a dose no Dia 7. As amostras foram colocadas em tubos contendo EDTA de potássio e armazenadas em um bloco de gelo até ser centri10 fugado. Os animais não foram jejuados antes da coleção de sangue. Amostras foram armazenadas a -70° até o exame.

Exames de necropsia completa foram realizados sob procedimentos aprovados por um patologista veterinário em todos os animais. A eutanásia foi por overdose de anestesia com solução de eutanásia com base 15 em pentobarbital de sódio por meio da veia/artéria da orelha ou outra veia adequada e exsanguinações por corte dos vasos femprais. Os animais fo* ram cuidadosamente examinados quanto às anormalidades externas incluindo massas. A pele foi refletida de uma incisão mediana ventral e quaisquer anormalidades foram identificadas e correlacionadas com descobertas antes 20 da morte. As cavidades abdominal, toráxica, e craniana foram examinadas quanto à anormalidades e os órgãos removidos, examinados, e, onde requerido, colocados em formalina tamponada neutra. O exame microscópico de hematoxilina fixa e seções de parafina manchadas com eosina foi realizado em seções de tecidos dos sítios de dosagem (4 por animal), rins, e quais25 quer lesões volumosas.

No momento da necropsia, Dia 8, para os animais de estudo principal e Dia 15 para animais em convalescência, os quatro sítios de dosagem por animal foram identificados. Aproximadamente metade de cada sítio de dosagem foi excisado e em seguida coletado e preservado como men30 cionado acima para processamento histológico. Enquanto a outra metade aproximada de cada sítio de dosagem ficou também intacta sobre o animal, os seguintes procedimentos são realizados. Os sítios de dosagem foram es125 fregados com três gazes de etanol (95%) e deixados secar completamente. Fita (3M® fita de empacotamento ou equivalente) foi aplicada a cada sítio de dosagem dez vezes. Um pedaço limpo de fita foi empregado para realizar a aplicação. As porções restantes dos sítios de dosagem foram então excisa5 das com tesouras. As tesouras foram lavadas entre cada sítio de dose e o animal com acetona ou etanol. A ordem de remoção do sítio de dose foi veículo ou sítio de controle positivo, sítio de dose baixa, sítio de dose suave, e sítio de dose elevada. Um tecido de 1 cm² foi excisado de cada sítio de dose. A amostra de tecido foi pesada e registrada. As punções da pele foram 10 picadas com tesouras limpas em frasconetes de cintilação de tamanhos apropriados individuais. Salina tamponada por fosfato frio (5 mL) foi adicionada ao frasconete de cintilação. O tecido foi então homogeneizado com pulsos de 20 segundos empregando um homogeneizador mecânico. Os homogenados foram rapidamente congelados em aproximadamente -20°C.

Conclusões

Com base nas classificações de irritação dérmica e descobertas microscópicas, um dos artigos de teste era não irritante no gel de veículo, porém era suave a moderadamente irritante no ungüento de veículo. O segundo artigo de teste era muito ligeiramente irritante no gel de veículo e sua20 vemente irritante quando formulado no ungüento de veículo.

Exemplo 83

Preparação de Composição Farmacêutica de Gel Tópica

Este Exemplo ilustra a Preparação de uma composição de gel tópica representativa contendo um composto ativo de Fórmula I.

Uma composição de gel tópica é preparada tendo a seguinte composição:___________________________________

Componentes	% peso/peso
Composto ativo	X*
Tampão de pH 4,5 ou 7	25
Propileno Glicol, USP	25
Hidroxietllcelulose, NF	1,25
Propilparabeno, NF	0,01

126

Metilparabeno, NF	0,09
Edetato de Dissódio, USP	0,025
Glicerina, USP	10,00
Ácido Cítrico, USP	0,50
Água Estéril para Injeção, USP	38,125

*Χ = Composto variando de 0,01% a 1,0%

Outros compostos de Fórmula I, tal como aqueles preparados de acordo com as presente Especificação podem ser empregados como o composto ativo in a preparação das formulações de gel deste exemplo.

Os seguintes ingredientes foram também avaliados quanto à adequabilidade durante o desenvolvimento desta formulação:

Miristato de isopropila (solvente/cossolvente/realçador de penetração),

Polietileno gllcóis, Triacetina (solventes),

Álcool cetílico e Álcool estearílico (Agentes de endurecimento),

Carbômero (Realçador de viscosidade), e

Tweens, Spans (emulsificantes).

Exemplo 84

Preparação de Composição Farmacêutica de Ungüento Tópica

Este Exemplo ilustra a preparação de uma composição de ungüento tópica representativa contendo um composto ativo de Fórmula I.

Uma composição de ungüento tópica é preparada tendo a seguinte compo-

Componentes	% w/w
Composto ativo	X*
Petrolato, USP	94,0
Sesquioleato de Sorbitan, NF	0,5
Propileno Glicol, USP	4,5

*X = Composto variando de 0,01% a 1,0%

Outros compostos de Fórmula I, tal como aqueles preparados de acordo com a presente Especificação podem ser empregados como o composto ativo em uma Preparação das formulações de ungüento deste exem127 pio.

Os seguintes ingredientes também foram avaliados para adequabilidade durante o desenvolvimento desta formulação:

Miristato de isopropila (solvente/cossolvente/realçador de pene5 tração),

Polietileno glicóis, Triacetina (solventes),

Álcool cetílico e Álcool estearílico (Agentes de endurecimento), Carbômero (Realçador de viscosidade), e

Tweens, Spans (emulsificantes).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser da Fórmula IA,

em que:

Y^1A e Y^1B são -NH(R^X);

R^x é independentemente R²;

R²é

a) etilo substituído por C(=O)OR⁴, em que R⁴ é metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, s-butilo, t-butilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-l-butilo, 2-metil-lbutilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3dimetil-2-butilo, vinilo, alilo, ciclopentenilo, 5-hexenilo, etinilo ou propargilo;

b) propilo substituído por C(=O)OR⁴ em que R⁴ é um alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 18 átomos de carbono ou alcinilo de 2 a 18 átomos de carbono; ou

c) metilo substituído por dois R³ em que um R³ é -R⁵W³ e o outro R³ é C(=O)OR⁴; R⁴ é um alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 18 átomos de carbono, ou alcinilo de 2 a 18 átomos de carbono; R⁵ é metileno; W³ é fenilo;

ou um sal dos mesmos farmaceuticamente aceitável.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado de:

Petição 870190051122, de 31/05/2019, pág. 7/10

Petição 870190051122, de 31/05/2019, pág. 8/10
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser da fórmula:
4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

Petição 870190051122, de 31/05/2019, pág. 9/10 pelo fato de ser da fórmula:
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que inclui um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um ou mais agentes antivirais selecionados de amantadina, rimantadina e ribavirina, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. Composição de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de ser uma composição em gel ou uma composição em pomada.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso como um agente antiproliferativo.
9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para o uso no tratamento de tumores.