NO338001B1

NO338001B1 - Fosfonater, monofosfonamidater og bisfosfonamidater, farmasøytisk preparat derav, og anvendelse derav for fremstilling av et medikament for behandling av tumorer

Info

Publication number: NO338001B1
Application number: NO20063479A
Authority: NO
Inventors: Gong-Xin He; William A Lee; Choung U Kim; Jianying Wang; Zheng-Yu Yang; Manoj Desai; Xiaqin Cheng; Gary P Cook; Edward Doerffler; John C Rohloff
Original assignee: Gilead Sciences Inc
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2016-07-18
Also published as: SG149075A1; PL212403B1; IL176407A0; US20090149400A1; JP4949852B2; AU2011200141B2; ATE478082T1; CN1950383A; HRP20060254A2; RS52433B; NO338040B1; KR20120080240A; AU2004312546A1; DK1716162T3; US8268802B2; AU2004312546B2; WO2005066189A1; CN1950383B; PL380828A1; NO20150615L

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser og preparater, og anvendelse derav, som er nyttige ved behandling av virusinfeksjoner, særlig humant papillomvirus.

Bakgrunn

Humant papillomvirus (HPV) er en av de hyppigst seksuelt overførte infeksjoner i verden. Det finnes mer enn hundre forskjellige typer HPV, hvorav de fleste er ufarlige. Det finnes imidlertid ca. 30 typer som spres gjennom seksuell kontakt. Noen typer HPV forårsaker kjønnsvorter som fremkommer som enkle eller multiple kuler i kjønnsområdene til menn og kvinner, inkludert vagina, livmorhals, vulva (området utenfor vagina), penis og rektum. Likevel har mange mennesker infisert med HPV ingen symptomer.

Selv om de fleste HPV-undertypene resulterer i godartede lesjoner, kan visse undertyper føre til mer alvorlige lesjoner. Anogenitalinfeksjoner som oppstår fra HPV-16 og HPV-18, er, selv om de er mindre vanlige enn HPV-6 og HPV-11, som oftest forbundet med precancerøse lesjoner i livmorhals- og analvev, kalt dysplasier. Pasienter med dysplasier er ofte asymptomatiske, og deres lesjon kan bare oppdages etter screening. Høygradsdysplasier kan, dersom de ikke behandles, omdannes til kreftvev. Lavgradslesjoner kan gå tilbake spontant, mens andre kan utvikle seg til høygradslesjoner. HPV-16 og HPV-18 er svært ofte forbundet med dysplasier, selv om flere andre omdannende HPV-undertyper også er forbundet med dysplasier. Nye studier indikerer at opptil 89 % av HIV-positive homoseksuelle menn kan være infisert med disse høyrisikoundertypene av HPV. HIV-positive pasienter vil også mest sannsynlig bli infisert med flere undertyper av HPV samtidig, noe som er forbundet med en høyere risiko for dysplasiutvikling.

Kjønnsvorter er den mest vanlige seksuelt overførte sykdom i verden, og er mest vanlig hos mennesker i alderen 17-33 år. HPV-6 og HPV-11 er ansvarlig for nesten 90 % av alle kjønnsvorter, men er sjelden forbundet med neoplasmavekst. I henhold til American Social Health Association er minst 20 millioner mennesker i USA fortiden smittet med HPV, idet 5,5 millioner nye tilfeller av seksuelt overførte HPV-infeksjoner oppstår årlig. Kjønnsvorter gir vanligvis smertefrie, kløende kuler lokalisert på eller nær kjønnsorganene, men uten behandling kan de utvikle seg til større, mer uttalte blomkållignende utvekster. Grovt sett vil to tredjedeler av mennesker som har seksuell kontakt med en person smittet med kjønnsvorter utvikle vorter innen 3 måneder etter kontakten. Spontan regresjon av kjønnsvorter inntrer hos 10-20 % av kjønnsvortetilfeller. Selv om en lesjon går tilbake, er imidlertid nydannelse av kjønnsvorter vanlig, med 50 % nydannelse etter 1 år. Som et resultat av de usynlige lesjonene er behandling av kjønnsvorter vanlig.

Bevismateriale som har fremkommet i løpet av de siste to tiårene, har ført til en bred aksept om at HPV-infeksjon er nødvendig, men likevel ikke tilstrekkelig, for utviklingen av livmorhalskreft. Tilstedeværelsen av HPV i livmorhals er beregnet til 99,7 %. Analkreft antas å ha en lignende forbindelse mellom HPV-infeksjon og utviklingen av analdysplasi og analkreft som i tilfellet med livmorhalskreft. I én studie av HIV-negative pasienter med analkreft ble HPV-infeksjon funnet i 88 % av analkrefttilfellene. I USA ble det i 2003 forutsett 12 200 nye tilfeller livmorhalskreft, 4100 livmorhalskreftdødsfall sammen med 4000 nye tilfeller av analkreft og 500 analkreftdødsfall. Selv om hyppigheten av livmorhalskreft har avtatt i løpet av de siste fire tiårene på grunn av omfattende screening, er hyppigheten av analkreft økende. Økningen i analkrefttilfeller kan delvis tilskrives HIV-infeksjon, ettersom HIV-positive pasienter har en høyere hyppighet av analkreft enn den generelle befolkning. Mens analkreft har en hyppighet på 0,9 tilfeller pr. 100 000 i den generelle befolkning, har analkreft en hyppighet på 35 tilfeller pr. 100 000 i den homoseksuelle mannlige befolkning og 70-100 tilfeller pr. 100 000 i den HIV-positive homoseksuelle mannlige befolkning. På grunn av den høye forekomsten av analdysplasi blant HIV-infiserte pasienter og en økende tendens til analkreft ville faktisk 2003 USPHA/IDSA Guidelines for the Treatment of Opportunistic Infections in HIV Positive Patients omfatte behandlingsretningslinjer for pasienter diagnostisert med analdysplasi.

Det finnes ikke noe kjent middel mot HPV. Det finnes behandlinger for kjønnsvorter, selv om de ofte forsvinner også uten behandling. Fremgangsmåten for behandling avhenger av slike faktorer som størrelsen på og lokaliseringen til kjønnsvortene. Blant behandlingene som brukes, er Imiquimodkrem, 20 % podofyllinantimitotisk oppløsning, 0,5 % podofiloxoppløsning, 5 % 5-fluoruracilkrem og trikloreddiksyre. Bruken av podofyllin eller podofilox er ikke anbefalt for gravide kvinner, ettersom de absorberes av huden og kan forårsake fødselsskader. Bruken av 5-fluoruracilkrem er heller ikke anbefalt for gravide kvinner. Små kjønnsvorter kan fjernes fysisk ved nedfrysing (kryokirurgi), brenning (elektrokauterium) eller laserbehandling. Store vorter som ikke gir respons på annen behandling, kan måtte fjernes ved hjelp av kirurgi. Kjønnsvorter har vært kjent for å vende tilbake etter fysisk fjerning, i disse tilfellene har a-interferon vært brukt til direkte injeksjon i disse vortene, a-interferon er imidlertid kostbart, og dets anvendelse reduserer ikke graden av tilbakevending av kjønnsvortene.

Som sådant foreligger det et ikke imøtekommet behov for effektiv HPV-behandling. Overraskende er det nå oppdaget forbindelser som imøtekommer dette behovet og også gir andre fordeler. Relevant bakgrunnsteknikk: Snoeck et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 46(11), s. 3356-3361 (nov. 2002); Keith et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 47(7), s. 2193-2198 (juli 2003); Christensen et al., Antiviral Research, vol. 48, s. 131-142 (2000); US patentpublikasjon nr. 2003/0072814 Al; US-patent 5 798 340; og PCT-søknad nr. PCT/CZ96/00011.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelse gjelder en forbindelse kjennetegnet ved at den har formel IA

hvor:

<yia>og<yib>er -nh(R<x>);

Rx er uavhengig av hverandre R<2>;

R2 er

a) etyl substituert med (C(=0)OR<4>, hvor R<4>er, etyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, syklobutyl, syklopentyl, n-heksyl eller n-oktyl; b) propyl substituert med (C(=0)OR<4>, hvor R<4>er, etyl, n-butyl, eller n-oktyl; eller c) metyl substituert med to R<3>hvor én R<3>er benzyl og den andre R<3>er C(=0)OR<4>, hvor R<4>er, etyl, n-butyl, iso-butyl, eller syklo-butyl,

eller farmasøytisk akseptable salter derav.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse med formel

En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse med formel En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse med formel En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse med formel

En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse med formel En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse med formel

En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et farmasøytisk preparat som omfatter en effektiv mengde av en forbindelse med formel IA eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Et aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et farmasøytisk preparat, hvor preparatet er et gelpreparat.

Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et farmasøytisk preparat, hvor preparatet er et salvepreparat.

En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et farmasøytisk preparat som omfatter en effektiv mengde av en forbindelse med formel IA eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og en effektiv mengde av minst ett antiviralt middel, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Definisjoner

Uttrykket "PMEG" henviser til forbindelsen 9-(2-fosfonylmetoksyetyl)guanin

Uttrykket "PMEDAP" henviser til forbindelsen 9-(2-fosfonylmetoksyetyl)-2,6-diaminopurin Uttrykket "cprPMEDAP" henviser til forbindelsen 9-(2-fosfonylmetoksyetyl)-2-amino-6-(syklopropyl)purin

"Biotilgjengelighet" er den graden som det farmasøytisk aktive middel blir tilgjengelig i for målvevet etter midlets innføring i kroppen. Økning av biotilgjengeligheten

av et farmasøytisk aktivt middel kan gi en mer virkningsfull og effektiv behandling for pasienter, ettersom det for en bestemt dose vil bli tilgjengelig mer av det farmasøytisk aktive middel i målvevsstedene.

Uttrykkene "fosfonat" og "fosfonatgruppe" omfatter funksjonelle grupper eller rester i et molekyl som omfatter et fosforatom som er 1) enkeltbundet til et karbonatom, 2) dobbeltbundet til et heteroatom, 3) enkeltbundet til et heteroatom, og 4) enkeltbundet til et annet heteroatom, hvor hvert heteroatom kan være det samme eller forskjellig. Uttrykkene "fosfonat" og "fosfonatgruppe" inkluderer også funksjonelle grupper eller rester som omfatter et fosforatom i den samme oksidasjonstilstand som fosforatomet beskrevet ovenfor, samt funksjonelle grupper eller rester som omfatter en prolegemiddelrest som kan skilles ut fra en forbindelse slik at forbindelsen bibeholder et fosforatom som har karakteristikaene beskrevet ovenfor. For eksempel omfatter uttrykkene "fosfonat" og "fosfonatgruppe" funksjonelle fosfonsyre-, fosfonsyremonoester-, fosfonsyrediester-, fosfonamidat- og fosfontioatgrupper. Ved én bestemt utførelsesform av oppfinnelsen inkluderer uttrykkene "fosfonat" og "fosfonatgruppe" funksjonelle grupper eller rester i et molekyl som omfatter et fosforatom som er 1) enkeltbundet til et karbonatom, 2) dobbeltbundet til et oksygenatom, 3) enkeltbundet til et oksygenatom, og 4) enkeltbundet til et annet oksygenatom, samt funksjonelle grupper eller rester som omfatter en prolegemiddelrest som kan skilles ut fra en forbindelse slik at forbindelsen bibeholder et fosforatom som har slike kjennetegn. Ved en annen bestemt utførelsesform av oppfinnelsen inkluderer uttrykkene "fosfonat" og "fosfonatgruppe" funksjonelle grupper eller rester i et molekyl som omfatter et fosforatom som er 1) enkeltbundet til et karbonatom, 2) dobbeltbundet til et oksygenatom, 3) enkeltbundet til et oksygen- eller nitrogenatom, og 4) enkeltbundet til et annet oksygen- eller nitrogenatom, samt funksjonelle grupper eller rester som omfatter en prolegemiddelrest som kan skilles ut fra en forbindelse slik at forbindelsen bibeholder et fosforatom som har slike kjennetegn.

Oppskrifter og fremgangsmåter for å bestemme stabiliteten av forbindelser i gastrointestinale surrogatsekresjoner er kjent. Forbindelser defineres her som stabile i mage- og tarmkanalen når mindre enn ca. 50 mol% av de beskyttede gruppene av-beskyttes i tarm- og -magesaftsurrogatsaft etter inkubasjon i 1 time ved 37 °C. Slike forbindelser er egnet for anvendelse ved denne oppfinnelsen. Legg merke til at bare fordi forbindelsene er stabile i mage- og tarmkanalen, betyr det ikke at de ikke kan hydrolyseres in vivo. Prolegemidler vil vanligvis være stabile i fordøyelsessystemet, men hydrolyseres i vesentlig grad til moderlegemidlet i fordøyelseskanalen, leveren eller annet metabolsk organ, eller i celler generelt.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også foreligge som tautomerisomerer i visse tilfeller. For eksempel kan enamintautomerer foreligge for imidazol-, guanidin-, amidin- og tetrazolsystemer, og alle deres mulige tautomerformer er innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Uttrykket "prolegemiddel" henviser, slik det her er brukt, til hvilken som helst forbindelse som når den administreres til et biologisk system, genererer legemiddelstoffet, det vil si den aktive bestanddel, som et resultat av spontan(e) kjemisk(e) reaksjon(er); enzymkatalysert(e) kjemisk(e) reaksjon(er), fotolyse og/eller metabolsk(e) kjemisk(e) reaksjon(er). Et prolegemiddel er således en kovalent modifisert analog eller en latent form av en terapeutisk aktiv forbindelse.

"Prolegemiddelrest" henviser til en labil funksjonell gruppe som skilles ut fra den aktive inhibitorforbindelse under metabolisme, systemisk, inne i en celle, ved hydrolyse, enzymatisk spalting eller ved hjelp av en annen prosess (Bundgaard, Hans, "Design and Application of Prodrugs" i ATextbook of Drug Design and Development (1991), P. Krogsgaard-Larsen og H. Bundgaard, red., Harwood Academic Publishers, s. 113-191). Enzymer som er i stand til å gi en enzymatisk aktiveringsmekanisme med fosfonat-prolegemiddelforbindelsene ifølge oppfinnelsen, omfatter, men er ikke begrenset til, amidaser, esteraser, mikrobielle enzymer, fosfolipaser, kolinesteraser og fosfaser. Prolegemiddelrester kan tjene til å øke oppløselighet, absorpsjon og lipofilisitet for å optimalisere legemiddelavlevering, biotilgjengelighet og effektivitet. En prolegemiddelrest kan omfatte en aktiv metabolitt eller selve legemidlet.

Eksempelvise prolegemiddelrester omfatter de hydrolytisk sensitive eller labile acyloksymetylesterne -CH2OC(=0)R og acyloksymetylkarbonatene -CH2OC(=0)OR, hvor R i dette tilfellet er Ci-C6-alkyl, substituert Ci-C6-alkyl, C6-C2o-aryl eller substituert C6-C2o-aryl. Acyloksyalkylesteren ble først brukt som en prolegemiddelstrategi for karboksylsyrer, og så anvendt på fosfater og fosfonater av Farquhar et al. (1983), J. Pharm. Sei., 72:324; også US patentskrifter nr. 4 816 570, 4 968 788, 5 663 159 og 5 792 756. Deretter ble acyloksyalkylesteren brukt til å avlevere fosfonsyrer over cellemembraner og til å øke oral biotilgjengelighet. En nær variant av acyloksyalkylesteren, alkoksykarbonyloksyalkylesteren (karbonatet), kan også øke oral biotilgjengelighet som en prolegemiddelrest i forbindelsene i kombinasjonene ifølge oppfinnelsen. En eksempelvis acyloksymetylester er isopropyl-karbonyloksymetoksy, -OCH2OC(=0)C(CH3)2. En eksempelvis acyloksymetylkarbonat-prolegemiddelrest er isopropylkarbonyloksymetylkarbonat, HOC(=0)OCH2OC(=0)C(CH3)2.

Fosfonatgruppen kan være en fosfonatprolegemiddelrest. Prolegemiddelresten kan være sensitiv overfor hydrolyse, slik som, men ikke begrenset til, en isopropyl karbonyl-oksymetoksy- eller isopropylkarbonyloksymetylkarbonatgruppe. Alternativt kan prolegemiddelresten være sensitiv overfor enzymatisk potensiert spalting, slik som en laktatester- eller fosfonamidatestergruppe.

Arylestere av fosforgrupper, spesielt fenylestere, er rapportert å øke oral biotilgjengelighet (DeLambert et al. (1994), J. Med. Chem., 37:498). Fenylestere som inneholder en karboksylsyreester i ortostilling til fosfatet, er også blitt beskrevet (Khamnei og Torrence (1996), J. Med. Chem., 39:4109-4115). Benzylestere er rapportert å generere moderfosfonsyren. I noen tilfeller kan substituenter i orto- eller parastillingen akselerere hydrolysen. Benzylanaloger med en acylert fenol eller en alkylert fenol kan generere fenolforbindelsen gjennom virkningen av enzymer, f.eks. esteraser, oksidaser etc, som igjen gjennomgår spalting i benzyl-O-bindingen slik at fosforsyren og kinonmetidmellom-produktet genereres. Eksempler på denne klassen av prolegemidler er beskrevet av Mitchell et al. (1992), J. Chem. Soc. Perkin Trans. II, 2345; Glazier, WO 91/19721. Det er blitt beskrevet ytterligere andre benzylprolegemidler som inneholder en karboksylsyre-esterholdig gruppe bundet til benzyl metylenet (Glazier, WO 91/19721). Tioholdige prolegemidler er rapportert å være anvendbare til den intracellulære avlevering av fosfonat-legemidler. Disse proesterne inneholderen etyltiogruppe hvor tiolgruppen er enten forestret med en acylgruppe eller kombinert med en annen tiolgruppe slik at det dannes et disulfid. Avestringen eller reduksjonen av disulfidet genererer det frie tiomellomprodukt, som deretter brytes ned til fosforsyren og episulfidet (Puech et al. (1993), Antiviral Res., 22:155-174; Benzaria et al. (1996), J. Med. Chem., 39:4958). Sykliske fosfonatestere er også blitt beskrevet som prolegemidler for fosforholdige forbindelser (Erion et al., US-patent nr. 6 312 662).

"Beskyttelsesgruppe" henviser til en rest av en forbindelse som maskerer eller endrer egenskapene til en funksjonell gruppe eller egenskapene til forbindelsen som et hele. Kjemiske beskyttelsesgrupper og strategier for beskyttelse/avbeskyttelse er godt kjent på fagområdet. Se f.eks. Protective Groups in Organic Chemistry, Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991. Beskyttelsesgrupper benyttes ofte til å maskere reaktiviteten til visse funksjonelle grupper for å hjelpe på effektiviteten av ønskede kjemiske reaksjoner, f.eks. fremstilling og nedbrytning av kjemiske bindinger på en ordnet og planlagt måte. Beskyttelse av funksjonelle grupper i en forbindelse endrer andre fysiske egenskaper ved siden av reaktiviteten til den beskyttede funksjonelle gruppe, slik som polariteten, lipofilisiteten (hydrofobisiteten) og andre egenskaper som kan måles ved hjelp av vanlige analytiske redskaper. Kjemisk beskyttede mellomprodukter kan selv være biologisk aktive eller inaktive.

Beskyttede forbindelser kan også oppvise endrede og i noen tilfeller optimaliserte egenskaper in vitro og in vivo, slik som passering gjennom cellemembraner og resistens overfor enzymatisk nedbrytning eller sekvestrering. I denne rollen kan beskyttede forbindelser med påtenkte terapeutiske effekter henvises til som prolegemidler.

En annen funksjon til en beskyttelsesgruppe er å omdanne moderlegemidlet til et prolegemiddel, hvorved moderlegemidlet frigjøres etter omdannelse av prolegemidlet in vivo. Ettersom aktive prolegemidler kan absorberes mer effektivt enn moderlegemidlet, kan prolegemidler ha større styrke in vivo enn moderlegemidlet. Beskyttelsesgrupper fjernes enten in vitro, i tilfellet med kjemiske mellomprodukter, eller in vivo, i tilfellet med prolegemidler. Med kjemiske mellomprodukter er det ikke særlig viktig at de resulterende produkter etter avbeskyttelse, f.eks. alkoholer, er fysiologisk akseptable, selv om det generelt er mer ønskelig dersom produktene er farmakologisk ufarlige.

Enhver henvisning til hvilken som helst av forbindelsene ifølge oppfinnelsen omfatter også en henvisning til et fysiologisk akseptabelt salt derav. Eksempler på fysiologisk akseptable salter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen omfatter salter avledet fra en passende base, slik som et alkalimetall (f.eks. natrium), et jordalkalimetall (f.eks. magnesium), ammonium og NX4<+>(hvor X er C!-C4-alkyl). Fysiologisk akseptable salter av et hydrogenatom eller en aminogruppe omfatter salter av organiske karboksylsyrer, slik som eddiksyre, benzosyre, melkesyre, fumarsyre, vinsyre, maleinsyre, malonsyre, eplesyre, isetionsyre, laktobionsyre og ravsyre; organiske sulfonsyrer, slik som metansulfonsyre, etansulfonsyre, benzensulfonsyre og p-toluensulfonsyre; og slike uorganiske syrer som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre og sulfaminsyre. Fysiologisk akseptable salter av en forbindelse med en hydroksygruppe omfatter anionet av forbindelsen i kombinasjon med et egnet kation, slik som Na<+>og NX4<+>(hvor X er uavhengig valgt blant H og en C!-C4-alkyl-gruppe).

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "gel" til halvfaste systemer bestående av enten suspensjoner laget opp av små uorganiske partikler eller store organiske molekyler som innelukker og interpenetreres av en væske. Når gelmassen består av flokkuler av små partikler, klassifiseres gelen som et tofasesystem og kalles noen ganger et magma. Aluminiumhydroksidgel og bentonittmagma er eksempler på tofasesystemer. Enkeltfasegeler består av organiske makromolekyler jevnt fordelt gjennom en væske på en slik måte at det ikke foreligger noen åpenbare bindinger mellom de dispergerte makromolekylene og væsken. Eksempler på slike geler er karboksymetylcellulosenatrium og tragant. Selv om geler vanligvis er vandige, kan alkoholer og oljer brukes som en kontinuerlig fase.

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "salve" til et halvfast preparat for ekstern applikasjon av slik konsistens at det lett kan appliseres til hud ved inngnidning. Det bør være av en slik sammensetning at det mykner, men ikke nødvendigvis smelter når det påføres kroppen. Det tjener som bærer for den topiske applikasjon av medisinske stoffer, og virker også som beskyttelsesmiddel og bløtgjørende middel for huden.

For terapeutisk anvendelse vil salter av aktive bestanddeler av forbindelsene ifølge oppfinnelsen være fysiologisk akseptable, det vil si de vil være salter avledet fra en fysiologisk akseptabel syre eller base. Salter av syrer eller baser som ikke er fysiologisk akseptable, kan imidlertid også finne anvendelse, f.eks. ved fremstillingen eller rensingen av en fysiologisk akseptabel forbindelse.

"Alkyl" er C!-C18-hydrokarbonholdige normale, sekundære, or tertiære karbonatomer. Eksempler er metyl (Me, -CH3), etyl (Et, -CH2CH3), 1-propyl (n-Pr, ri-propyl, -CH2CH2CH3), 2-propyl Q-Pr, hpropyl, -CH(CH3)2), 1-butyl (n-Bu, n.-butyl,

-CH2CH2CH2CH3), 2-metyl-l-propyl Q-Bu, hbutyl, -CH2CH(CH3)2), 2-butyl (s-Bu, s-butyl, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metyl-2-propyl (t-Bu, t-butyl, -C(CH3)3), 1-pentyl (n-pentyl, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentyl (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentyl (-CH(CH2CH3)2), 2-metyl-2-butyl (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metyl-2-butyl (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metyl-l-butyl (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metyl-l-butyl (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-heksyl (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-heksyl (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-heksyl (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metyl-2-pentyl (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metyl-2-pentyl (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metyl-2-pentyl (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metyl-3-pentyl (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metyl-3-pentyl (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetyl-2-butyl (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetyl-2-butyl (-CH(CH3)C(CH3)3). "Alkenyl" er C2-C18-hydrokarbon som inneholder normale, sekundære, eller tertiære karbonatomer med minst ett umettet sted, det vil si en karbon-karbon-sp<2->dobbelt-binding. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, etylen eller vinyl (-CH=CH2), allyl (-CH2CH=CH2), syklopentenyl (-C5H7) og 5-heksenyl (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2). "Alkynyl" er C2-C18-hydrokarbon som inneholder normale, sekundære, eller tertiære karbonatomer med minst ett umettet sted, det vil si en karbon-karbon-sp-trippel-binding. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, acetylen (-OCH) og propargyl (-CH2OCH). Slik det her er brukt, henviser uttrykket "Aba" til en toverdig rest av 2- aminobutansyre

hvor bindingspunktene er betegnet ved hjelp av "<*>".

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "Ala" til en toverdig rest av alanin

hvor bindingspunktene er betegnet ved hjelp av "<*>".

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "Phe" til en toverdig rest av fenylalanin

hvor bindingspunktene er betegnet ved hjelp av "<*>".

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "POC" til den toverdige rest av hydroksymetylisopropylkarbonat

hvor bindingspunktet er betegnet ved hjelp av "<*>".

Substituentgrupper Y<1A>og Y<1B>kan beskrives ved å anvende nomenklatur som inkorporerer de ovenfor nevnte toverdige aminosyrerestene og alkylrestene, slik som i tabell 80-3.

For eksempel kan forbindelsen med formel

beskrives ved å anvende nomenklaturen til formel I, hvor Y<1A>og Y<1A>er -N(R<X>), hvor Rx erR<2>, hvorR2 erR<4>substituert medR3d, hvor R<4>er etyl substituert med R<3d>, videre hvor R<3d>er -C(R<3b>)OW<3>, hvor R<3b>er =0, hvorW<3>erW<5>, hvorW<5>er en karboring, hvor R4 er propyl substituert med R<3d>, hvor R<3d>er -C(R<3b>)OR<4>, hvor R<3b>er =0, og hvor R<4>er etyl. Alternativt kan forbindelsen beskrives som i tabell 80-3, som formel I, hvor Y<1A>og Y<1B>er "Aba-Et", som beskriver resten (hvor "<*>" angir bindingspunktet)

som er "Aba" bundet til "Et" (etyl).

For eksempel kan forbindelsen med formel

beskrives ved å anvende nomenklaturen til formel I, hvor Y<1A>og Y1Ber -N(R<X>), hvor Rx erR<2>, hvor R<2>erR4 substituert med R<3d>, hvor R4 er etyl substituert med R<3d>, hvor R<3d>er - C(R<3b>)OR<4>, hvor R<3b>er =0, og hvor R<4>er n-propyl. Alternativt kan forbindelsen beskrives som i tabell 80-3, som formel I, hvor Y<1A>og Y<1B>er "Ala-nPr", som beskriver resten (hvor "<*>" angir bindingspunktet)

som er "Ala" bundet til "nPr" (n-propyl).

Uttrykket "kiralt" henviser til molekyler som har egenskapen med ikke-superpomerbarhet til speilbildepartneren, mens uttrykket "akiralt" henviser til molekyler som er superpomerbare på sin speilbildepartner.

Uttrykket "stereoisomerer" henviser til forbindelser som har identisk kjemisk konstitusjon, men atskiller seg med hensyn til ordningen av atomene eller gruppene i rommet.

"Diastereomer" henviser til en stereoisomer med to eller flere kiralitetssentre, og hvis molekyler ikke er speilbilder av hverandre. Diastereomerer har forskjellige fysiske egenskaper, f.eks. smeltepunkter, kokepunkter, spektralegenskaper og reaktiviteten Blandinger av diastereomerer kan separere under analytiske fremgangsmåter med høy oppløsning, slik som elektroforese og kromatografi.

"Enantiomerer" henviser til to stereoisomerer av en forbindelse som er ikke-superpomerbare speilbilder av hverandre.

Uttrykket "behandling" eller "behandle" omfatter, i den utstrekning det vedrører en sykdom eller tilstand, å forhindre sykdommen eller tilstanden fra å inntre, inhibere sykdommen eller tilstanden, eliminere sykdommen eller tilstanden og/eller lindre ett eller flere symptomer på sykdommen eller tilstanden.

Uttrykket "antiproliferativ" henviser til aktiviteter som brukes for, eller er tibøyelige til, å inhibere cellevekst, slik som antiproliferative effekter på tumorceller, eller antiproliferative effekter på virusinfiserte celler.

Utrykket "apoptose" henviser til en av hovedtypene av programmert celledød. Som sådan er den en fremgangsmåte for tilsiktet selvmord av en uønsket celle i en flercelleorganisme. I motsetning til nekrose, som er en form for celledød som skriver seg fra akutt vevsskade, utføres apoptose i en ordnet prosess som generelt gir fordeler under en organismes livssyklus. Apoptose er en type celledød hvor cellen gjør bruk av spesialisert cellulært maskineri for å drepe seg selv, en celleselvmordsmekanisme som gjør det mulig for metazoaner å regulere celleantall og fjerne celler som truer dyrets overlevelse. Apoptose kan f.eks. inntre når en celle skades etter reparasjon eller infiseres med et virus. Stimulusen for apoptose kan komme fra selve cellen, fra dens omgivende vev eller fra en celle som er del av immunsystemet, den kan være kjemisk, biologisk eller fysisk. Det beslektede uttrykk "apoptotisk" henviser til apoptoseprosessen.

Stereokjemiske definisjoner og konvensjoner som er brukt her, følger generelt S.P. Parker, red., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984), McGraw-Hill Book Company, New York; og Eliel, E. og Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds

(1994), John Wiley & Sons, Inc., New York. Mange organiske forbindelser foreligger i optisk aktive former, det vil si de har evnen til å rotere planet i planpolarisert lys. Ved beskrivelse av en optisk aktiv forbindelse brukes innledningstegnene D og L, eller R og S, for å betegne den absolutte konfigurasjon til molekylet rundt dets kirale senter eller sentre, prefiksene d og I, eller (+) og (-), anvendes for å betegne rotasjonstegnet til planpolarisert lys ved hjelp av forbindelsen, idet (-) eller I betyr at forbindelsen er levorotatorisk. En forbindelse med fortegnet (+) eller d er dekstrorotatorisk. For en bestemt kjemisk struktur er disse stereo-isomerene identiske, bortsett fra at de er speilbilder av hverandre. En bestemt stereoisomer kan også henvises til som en enantiomer, og en blanding av slike isomerer kalles ofte en enantiomerblanding. En 50:50-blanding av enantiomerer henvises til som en racemisk blanding eller et racemat, som kan inntre når det ikke har vært noen stereoutvelgelse eller stereospesifisitet i en kjemisk reaksjon eller prosess. Uttrykkene "racemisk blanding" og "racemat" henviser til en ekvimolar blanding av to enantiomerarter som ikke har optisk aktivitet.

Beskyttelsesgrupper

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng omfatter beskyttelsesgrupper prolegemiddelrester og kjemiske beskyttelsesgrupper.

Beskyttelsesgrupper er tilgjengelige, vanlig kjent og brukt, og anvendes eventuelt til å forhindre bireaksjoner med den beskyttede gruppe under syntesefremgangsmåter, det vil si veier eller metoder for å fremstille forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Som oftest gjelder avgjørelsen hvilke grupper som skal beskyttes, når man skal gjøre det, og typen til den kjemiske beskytelsesgruppe "PG" vil avhenge av kjemien i reaksjonen som det skal beskyttes mot (f.eks. sure, basiske, oksidative, reduktive eller andre betingelser) og den påtenkte synteseretning. PG-gruppene trenger ikke å være, og er vanligvis ikke, de samme dersom forbindelsen er substituert med flere PG. Generelt vil PG anvendes til å beskytte funksjonelle grupper, slik som karboksyl-, hydroksyl-, tio- eller aminogrupper, og således forhindre bireaksjoner eller på annen måte bedre synteseeffek-tiviteten. Rekkefølgen for avbeskyttelse for å oppnå frie, avbeskyttede grupper er avhengig av den påtenkte synteseretning og reaksjonsbetingelsene som man støter på, og kan opptre i hvilken som helst rekkefølge, som bestemt av utøveren.

Forskjellige funksjonelle grupper i forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan beskyttes. For eksempel omfatter beskyttelsesgrupper for -OH-grupper (uansett om det er hydroksyl-, karboksylsyre-, fosfonsyre- eller andre funksjoner) "eter- eller esterdannende grupper". Eter- eller esterdannende grupper er i stand til å virke som kjemiske beskyttelsesgrupper i synteseskjemaene som er angitt her. Noen hydroksyl- og tio-beskyttelsesgrupper er imidlertid verken eter- eller esterdannende grupper, slik det vil forstås av fagfolk på fagområdet, og er inkludert sammen med amider, omtalt nedenunder.

Et svært stort antall hydroksylbeskyttelsesgrupper og amiddannende grupper og tilsvarende kjemiske spaltingsreaksjoner er beskrevet i Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991, ISBN 0-471-62301-6) ("Greene"). Se også Kocienski, Philip J., Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1994); særlig kapittel 1, Protecting Groups: An Overview, s. 1-20; kapittel 2, Hydroxyl Protecting Groups, s. 21-94; kapittel 3, Diol Protecting Groups, s. 95-117; kapittel 4, Carboxyl Protecting Groups, s. 118-154; kapittel 5, Carbonyl Protecting Groups, s. 155-184. Når det gjelder beskyttelsesgrupper for karboksylsyre, fosfonsyre, fosfonat, sulfonsyre og andre beskyttelsesgrupper for syrer, se Greene som angitt nedenunder. Slike grupper omfatter som eksempel estere, amider, hydrazider og lignende.

Eter- og esterdannende beskyttelsesgrupper

Esterdannende grupper omfatter: (1) fosfonatesterdannende grupper, slik som fosfonamidatestere, fosfortioatestere, fosfonatestere og fosfon-bis-amidater; (2) karboksyl-esterdannende grupper og (3) svovelesterdannende grupper, slik som sulfonat, sulfat og sulfinat.

Fosfonatrestene i forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan, men behøver ikke, være prolegemiddelrester, det vil si de kan, eller behøver ikke, være mottakelige for hydrolytisk eller enzymatisk spalting eller modifikasjon. Visse fosfonatrester er stabile under de fleste eller nesten alle metabolske betingelser. For eksempel kan et dialkylfosfonat hvor alkylgruppene har to eller flere karbonatomer, ha en vesentlig stabilitet in vivo på grunn av en lav hydrolysehastighet.

Salter og hydrater

Preparatene ifølge denne oppfinnelsen omfatter eventuelt salter av forbindelsene her, spesielt farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske salter som f.eks. inneholder Na<+>, Li<+>, K<+>, Ca<++>og Mg<++>. Slike salter kan omfatte dem avledet ved å kombinere passende kationer, slik som alkali- og jordalkalimetallioner eller ammoniumioner og kvaternære aminoioner, med en syreanionrest. Enverdige salter er foretrukket dersom det er ønsket et vannoppløselig salt.

Metallsalter fremstilles vanligvis ved å omsette en forbindelse ifølge denne oppfinnelsen med et metallhydroksid. Eksempler på metallsalter som fremstilles på denne måten, er salter som inneholder Li<+>, Na<+>og K<+>. Et mindre oppløselig metallsalt kan utfelles fra oppløsningen av et mer oppløselig salt ved tilsetning av den egnede metallforbindelse.

I tillegg kan salter dannes fra syreaddisjon av visse organiske og uorganiske syrer, f.eks. HCI, HBr, H2S04, eller organiske sulfonsyrer, til basiske sentre, eller til sure grupper. Endelig skal det forstås at preparatene her omfatter forbindelser ifølge oppfinnelsen i deres ikke-ioniserte samt zwitterioniske form, og kombinasjoner med støkiometriske mengder vann som i hydrater.

Innenfor omfanget av oppfinnelsen er det også inkludert saltene av moderforbindelsene med én eller flere aminosyrer. Hvilken som helst av aminosyrene som er beskrevet ovenfor, er egnet, spesielt de naturlig forekommende aminosyrer som finnes i proteinkomponenter, selv om aminosyren vanligvis er en som bærer en sidekjede med en basisk eller sur gruppe, f.eks. lysin, arginin eller glutaminsyre, eller en slik nøytral gruppe som glysin, serin, treonin, alanin, isoleucin eller leucin.

Fremgangsmåter for inhiberino av HPV

Et annet aspekt av oppfinnelsen vedrører forbindelsene i følge oppfinnelsen for anvendelse ifremgangsmåter for inhibering av aktiviteten til HPV, som omfatter trinnet med å behandle en prøve mistenkt for å inneholde HPV med en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Preparater ifølge oppfinnelsen virker som inhibitorer for HPV, som mellomprodukter for slike inhibitorer, eller har andre anvendeligheter, som beskrevet nedenunder.

Behandlingstrinnet ifølge oppfinnelsen omfatter tilsetning av preparatet ifølge oppfinnelsen til prøven, eller det omfatter å tilsette en forløper for preparatet til prøven. Til-setningstrinnet omfatter hvilken som helst administreringsmetode, som beskrevet ovenfor.

Om ønsket kan aktiviteten til HPV etter applikasjon av preparatet observeres ved hjelp av hvilken som helst metode, inkludert direkte og indirekte metoder for påvisning av HPV- aktivitet. Kvantitative, kvalitative og halvkvantitative metoder for bestemmelse av HPV-aktivitet er alle omfattet. Vanligvis anvendes en av screeningsmetodene beskrevet ovenfor; hvilken som helst annen metode, slik som observasjon av de fysiologiske egenskapene til en levende organisme, er imidlertid også anvendbar.

Screenin<g>er etter HPV- inhibitorer

Forbindelser og preparater ifølge oppfinnelsen screenes med hensyn på terapeutisk utnyttbarhet ved å måle EC50-verdien, det vil si den konsentrasjonen av forbindelse som oppnår 50 % inhibering av cellevekst. Forholdet mellom EC50hos HPV-ikke-infiserte og infiserte celler gir et mål for selektiviteten til forbindelsen for de virusinfiserte celler. Protokollene som brukes for å oppnå disse målene, fremgår av eksemplene.

Farmasøytiske formuleringer og administreringsveier

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen formuleres med vanlige bærere og eksipienser som vil bli valgt i overensstemmelse med vanlig praksis. Tabletter vil inneholde eksipienser, glidemidler, fyllstoffer, bindemidler og lignende. Vandige formuleringer fremstilles i steril form, og når de er påtenkt for avlevering ved hjelp av noe annet enn oral administrering, vil de generelt være isotoniske. Alle formuleringer vil eventuelt inneholde slike eksipienser som dem angitt i "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (1986). Eksipienser omfatter askorbinsyre og andre antioksidanter, slike chelateringsmidler som EDTA, slike karbohydrater som dekstrin, hydroksyalkylcellulose, hydroksyalkylmetyl-cellulose, stearinsyre og lignende. pH-verdien i formuleringene varierer fra ca. 3 til ca. 11, men er vanligvis ca. 7-10.

Én eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen (her henvist til i denne sammenheng som de aktive bestanddelene) administreres ved hjelp av hvilken som helst vei som er passende for tilstanden som skal behandles. Egnede veier omfatter oral, rektal, nasal, topisk (inkludert bukkal og sublingual), vaginal og parenteral (inkludert subkutan, intra-muskulær, intravenøs, intradermal, intratekal og epidural) og lignende. Det vil forstås at den foretrukne vei kan variere med tilstanden til mottakeren. En fordel ved forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er at de er oralt biotilgjengelige og kan doseres oralt.

Selv om det er mulig for de aktive bestanddelene å bli administrert alene, kan det være fordelaktig å presentere dem som farmasøytiske formuleringer. Formuleringene ifølge oppfinnelsen, både for veterinærmedisinsk og human bruk, omfatter minst én aktiv bestanddel, som definert ovenfor, sammen med én eller flere akseptable bærere for denne, og eventuelt andre terapeutiske bestanddeler. Bæreren eller bærerne må være "akseptabel" eller "akseptable" i den betydning at de er kompatible med de øvrige bestanddelene i formuleringen og fysiologisk uskadelig for mottakeren derav.

Formuleringene omfatter dem som er egnet for de ovenfor omtalte administreringsveier. Formuleringene kan passende presenteres i enhetsdoseringsform og kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst av metodene som er godt kjent innen farma-sien. Teknikker og formuleringer finnes generelt i Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Slike metoder omfatter det trinn å bringe den aktive bestanddel sammen med bæreren som utgjør én eller flere tileggsbestanddeler. Generelt fremstilles formuleringene ved jevnt og intimt å bringe den aktive bestanddel sammen med flytende bærere eller fint oppdelte, faste bærere eller begge deler, og så om nødvendig forme produktet.

Formuleringer ifølge oppfinnelsen som er egnet for oral administrering, fremstilles som atskilte enheter, slik som kapsler, kapsler med pulver eller tabletter som hver inneholder en forutbestemt mengde av den aktive bestanddel; som et pulver eller granuler; som en oppløsning eller en suspensjon i en vandig væske eller ikke-vandig væske; eller som en flytende olje-i-vann-emulsjon eller en flytende vann-i-olje-emulsjon. Den aktive bestanddel kan også presenteres som en bolus, "electuary" eller pasta.

En tablett lages ved pressing eller støping, eventuelt med én eller flere tileggsbestanddeler. Pressede tabletter kan fremstilles ved å presse den aktive bestanddel i en egnet maskin i en frittflytende form, slik som et pulver eller granuler, eventuelt blandet med et bindemiddel, smøremiddel, inert fortynningsmiddel, konserveringsmiddel, overflate-aktivt middel eller dispergeringsmiddel. Støpte tabletter kan lages ved å støpe en blanding av den oppmalte aktive bestanddel fuktet med et inert, flytende fortynningsmiddel i en egnet maskin. Tablettene kan eventuelt belegges eller forsynes med et hakk, og formuleres eventuelt slik at de gir sakte eller regulert frigivelse av den aktive bestanddel.

For infeksjoner i øyet eller andre utvendige vev, f.eks. munn og hud, appliseres preparatene fortrinnsvis som en topisk salve eller krem som inneholder den eller de aktive bestanddel(er) i en mengde på f.eks. 0,075-20 vekt% (inkludert aktiv(e) bestanddel(er) i et område mellom 0,1 og 20 % i trinn på 0,1 vekt%, slik som 0,6 vekt%, 0,7 vekt% etc), fortrinnsvis 0,2-15 vekt%, og mest foretrukket 0,5-10 vekt%. Når de er formulert i en salve, kan de aktive bestanddeler anvendes enten med en parafinisk eller vannblandbar salvebasis. Alternativt kan de aktive bestanddelene formuleres i en krem med en olje-i-vann-krembasis.

Om ønsket kan vannfasen i krembasisen omfatte f.eks. minst 30 vekt% av en flerbasisk alkohol, det vil si en alkohol som har to eller flere hydroksylgrupper, slik som propylenglykol, butan-l,3-diol, mannitol, sorbitol, glyserol og polyetylenglykol (inkludert PEG 400) og blandinger derav. De topiske preparatene kan om ønskelig omfatte en forbindelse som øker absorpsjon eller penetrasjon av den aktive bestanddel gjennom huden eller andre berørte områder. Eksempler på slike dermale penetrasjonsfremmere omfatter dimetylsulfoksid og beslektede analoger.

Oljefasen i emulsjonene ifølge denne oppfinnelsen kan settes sammen av kjente bestanddeler på en kjent måte. Selv om fasen kan omfatte bare et emulgeringsmiddel (ellers kjent som en emulgent), omfatter den på ønskelig måte en blanding av minst ett emulgeringsmiddel sammen med et fett eller en olje, eller med både et fett og en olje. Fortrinnsvis er det inkludert et hydrofilt emulgeringsmiddel sammen med et lipofilt emulgeringsmiddel som virker som et stabiliseringsmiddel. Det er også foretrukket å inkludere både en olje og et fett. Til sammen utgjør emulgeringsmidlet eller emulgerings-midlene med eller uten stabiliseringsmiddel eller stabiliseringsmidler den såkalte emulgerende voks, og voksen sammen med oljen og fettet utgjør den såkalte emulgerende salvebasis som danner den oljedispergerte fase i krempreparatene.

Emulgeringsmidler og emulgeringsstabiliseringsmidler som er egnet for anvendelse i preparatet ifølge oppfinnelsen, omfatter Tween 60, Span 80, cetostearylalkohol, benzylalkohol, myristylalkohol, glyserylmonostearat og natriumlauryl-sulfat.

Valget av egnede oljer eller fett til preparatet er basert på å oppnå de ønskede kosmetiske egenskaper. Kremen bør fortrinnsvis være et ikke-fettende, ikke-fargende og vaskbart produkt med egnet konsistens for å unngå lekkasje fra tuber eller andre beholdere. Det kan anvendes rettkjedede eller forgrenede, mono- eller dibasiske alkyl-estere, slik som diisoadipat, isocetylstearat, propylenglykoldiester av kokosnøttfettsyrer, isopropylmyristat, dekyloleat, isopropylpalmitat, butylstearat, 2-etylheksylpalmitat eller en blanding av estere med forgrenet kjede kjent som Crodamol CAP, og kan anvendes, idet de tre sistnevnte er foretrukne estere. Disse kan anvendes alene eller i kombinasjon, avhengig av de nødvendige egenskaper. Alternativt anvendes lipider med høyt smeltepunkt, slik som hvit vaselin og/eller flytende parafin eller andre mineraloljer.

Preparater som er egnet for topisk administrering til øyet, omfatter også øyedråper hvor den aktive bestanddel er oppløst eller oppslemmet i en egnet bærer, spesielt et vandig oppløsningsmiddel for den aktive bestanddel. Den aktive bestanddel presenteres fortrinnsvis i slike preparater i en konsentrasjon på 0,5-20 vekt%, fordelaktig 0,5-10 %, særlig ca. 1,5 vekt%.

Preparater som er egnet for topisk administrering i munnen, omfatter sugetabletter som omfatter den aktive bestanddel i en smakstilsatt basis, vanligvis sukrose og akasie eller tragant; pastiller som omfatter den aktive bestanddel i en inert basis, slik som gelatin og glyserol, eller sukrose og akasie; og munnvann som omfatter den aktive bestanddel i en egnet flytende bærer.

Preparater for rektal administrering kan presenteres som et suppositorium med en egnet basis som omfatter f.eks. kakaosmør eller salisylat.

Preparater som er egnet for intrapulmonal eller nasal administrering, har en partikkelstørrelse f.eks. i området 0,1-500 \ im (inkludert partikkelstørrelser i området mellom 0,1 og 500 \ im i slike^m-trinn som 0,5, 1, 30^m, 35 etc.) som administreres ved hjelp av hurtig inhalasjon gjennom nesegangen eller ved inhalasjon gjennom munnen for å nå alveolene. Egnede preparater omfatter vandige eller oljeholdige oppløsninger av den aktive bestanddel. Preparater som er egnet for aerosol- eller tørrpulveradministrering, kan fremstilles i henhold til vanlige metoder, og kan avleveres sammen med andre terapeutiske midler, slik som forbindelser som hittil har vært brukt ved behandlingen eller profylaksen av influensa A- eller B-infeksjoner, som beskrevet nedenunder.

Preparater som er egnet for vaginal administrering, kan presenteres som pessarer, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller sprayformuleringer, som i tillegg til den aktive bestanddel inneholder slike bærere som er kjent på området for å være passende.

Preparater som er egnet for parenteral administrering, omfatter vandige og ikke-vandige, sterile injeksjonsoppløsninger som kan inneholde antioksidanter, bufferstoffer, bakteriostater og oppløste stoffer som gjør preparatet isotonisk sammen med blodet til den påtenkte mottaker; og vandige og ikke-vandige, sterile suspensjoner som kan omfatte oppslemmingsmidler og fortykningsmidler.

Preparatene presenteres i endose- eller flerdosebeholdere, f.eks. lukkede ampuller og glass, og kan lagres i en frysetørket (lyofilisert) tilstand som bare krever tilsetning av den sterile, flytende bærer, f.eks. vann for injeksjon, umiddelbart før bruk. Injeksjonsoppløsninger og suspensjoner laget på bestilling fremstilles fra sterile pulvere, granuler og tabletter av den typen som er beskrevet tidligere. Foretrukne enhetsdoser-ingspreparater er de som inneholder en daglig dose eller daglig enhetsunderdose, som angitt ovenfor, eller en passende fraksjon derav, av den aktive bestanddel.

Det skal forstås at i tillegg til bestanddelene som er spesielt nevnt ovenfor, kan preparatene ifølge denne oppfinnelsen omfatte andre midler som er vanlige på området under hensyntagen til den aktuelle formuleringstype, f.eks. kan de som er egnet for oral administrering, omfatte smaksmidler.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre veterinærmedisinske preparater som omfatter minst én aktiv bestanddel, som definert ovenfor, sammen med en veterinærmedisinsk bærer for denne.

Veterinærmedisinske bærere er materialer som er anvendbare for det formål å administrere preparatet, og de kan være faste, flytende eller gassformige materialer som ellers er inerte eller akseptable innen veterinærmedisinen, og som er kompatible med den aktive bestanddel. Disse veterinærmedisinske preparatene kan administreres oralt, parenteralt eller ved hjelp av hvilken som helst annen ønsket vei.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen anvendes for å tilveiebringe farmasøytiske preparater med regulert frigivelse, som inneholder som aktiv bestanddel én eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen ("preparater med regulert frigivelse"), hvor frigivelsen av den aktive bestanddel kontrolleres og reguleres for å muliggjøre mindre hyppig dosering, eller for å forbedre farmakokinetikk- eller toksisitetsprofilen til en bestemt aktiv bestanddel.

Effektiv dose av aktiv bestanddel avhenger minst av egenskapene til tilstanden som behandles, toksisiteten, hvorvidt forbindelsen anvendes profylaktisk (lavere doser) eller mot en aktiv influensainfeksjon, avleveringsmetoden og den farmasøytiske formulering, og vil bli bestemt av klinikeren under anvendelse av vanlige doseeskaleringsstudier. Den kan forventes å være fra ca. 0,0001 til ca. 100 mg/kg kroppsvekt pr. dag, vanligvis fra ca. 0,01 til ca. 10 mg/kg kroppsvekt pr. dag, mer typisk fra ca. 0,01 til ca. 5 mg/kg kroppsvekt pr. dag, mest vanlig fra ca. 0,05 til ca. 0,5 mg/kg kroppsvekt pr. dag. For eksempel vil dosen for inhalasjon av den daglige kandidatdose for et voksent menneske på omtrent 70 kg kroppsvekt variere fra 1 mg til 1000 mg, fortrinnsvis mellom 5 mg og 500 mg, og kan ha form av enkelt- eller multippeldoser.

Aktive bestanddeler ifølge oppfinnelsen anvendes også i kombinasjon med andre aktive bestanddeler. Slike kombinasjoner velges basert på tilstanden som skal behandles, kryssreaktiviteter til bestanddeler og farmakoegenskaper til kombinasjonen. For eksempel kombineres, når det behandles virusinfeksjoner i åndedrettssystemet, særlig influensainfeksjon, preparatene ifølge oppfinnelsen med antivirusmidler (slik som amantidin, rimantadin og ribavirin), mukolytika, slimdrivende midler, bronkialdilatorer, antibiotika, antipyretika eller analgetika. Vanligvis administreres antibiotika, antipyretika og analgetika sammen med forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen.

Metabolitter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen

In vivo metabolske produkter av forbindelsene beskrevet her kan fås f.eks. fra oksidasjonen, reduksjonen, hydrolysen, amideringen, forestringen og lignende av den administrerte forbindelse, hovedsakelig på grunn av enzymatiske prosesser. Slike produkter identifiseres vanligvis ved å fremstille en radioaktivt merket (f.eks. C<14>eller H<3>) forbindelse ifølge oppfinnelsen, administrere den parenteralt i en påvisbar dose (f.eks. mer enn ca. 0,5 mg/kg) til et slikt dyr som rotte, mus, marsvin, apekatt eller et menneske, la det gå tilstrekkelig tid for metabolisme (vanligvis fra ca. 30 sekunder til 30 timer), og isolere omdannelsesproduktene fra urinen, blodet eller andre biologiske prøver. Disse produktene isoleres lett, ettersom de er merket (andre isoleres ved bruk av antistoffer som er i stand til å binde epitoper som overlever i metabolitten). Metabolittstrukturene bestemmes på vanlig måte, f.eks. ved hjelp av MS- eller NMR-analyse. Generelt gjøres analyse av metabolitter på samme måte som vanlige legemiddelmetabolismestudier som er godt kjent for fagpersoner på området. Omdannelsesproduktene er, så lenge de ikke ellers finnes in vivo, anvendbare i diagnostiske analyser for terapeutisk dosering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, selv om de i seg selv ikke har noen neuroamidase-inhibitoraktivitet.

Ytterligere anvendelser for forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen eller de biologisk aktive stoffene fremstilt fra disse forbindelsene ved hydrolyse eller metabolisme in vivo, anvendes som immunogener eller for konjugasjon til proteiner, hvorved de tjener som bestanddeler i immunogene preparater for å fremstille antistoffer egnet for å binde spesifikt til proteinet, til forbindelsene eller til deres metabolske produkter som bibeholder immunologisk anerkjente epitoper (seter for antistoffbinding). De immunogene preparatene for dette er anvendbare som mellomprodukter ved fremstillingen av antistoffer for bruk i diagnose, kvalitetskontroll eller lignende, fremgangsmåter eller ved analyser for forbindelsene eller deres nye metabolske produkter. Forbindelsene er anvendbare for å frembringe antistoffer mot ellers ikke-immunogene polypeptider, ved at forbindelsene tjener som hapteniske seter som stimulerer en immunrespons som kryssreagerer med det ikke-modifiserte konjugerte protein.

Hydrolyseproduktene av interesse omfatter produkter fra hydrolysen av de beskyttede sure og basiske gruppene som er omtalt ovenfor. Som angitt ovenfor, er de sure og basiske amidene som omfatter immunogene polypeptider, slik som albumin eller albuskjellhemocyanin, generelt anvendbare som immunogener. De metabolske produktene som er beskrevet ovenfor, kan bibeholde en vesentlig grad av immunologisk kryssreaktivitet med forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Antistoffene ifølge denne oppfinnelsen vil således være i stand til å binde seg til de ubeskyttede forbindelsene ifølge oppfinnelsen uten å binde seg til de beskyttede forbindelsene; alternativt vil de metabolske produktene være i stand til å binde seg til de beskyttede forbindelsene og/eller de metabolske produktene uten å binde seg til de beskyttede forbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller vil være i stand til å binde seg spesifikt til hvilke som helst av alle tre. Antistoffene vil på ønskelig måte ikke i vesentlig grad kryssreagere med naturlig forekommende materialer. Vesentlig kryssreaktivitet er reaktivitet under spesifikke analysebetingelser for spesifikke analytter som er tilstrekkelig til å virke inn på analyseresultatene.

Immunogenene ifølge denne oppfinnelsen inneholder forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen som presenterer den ønskede epitop i forbindelse med et immunogent stoff. Innenfor oppfinnelsens sammenheng betyr slik forbindelse kovalent binding for å danne et immunogent konjugat (når dette er passende) eller en blanding av ikke-kovalent bundne materialer, eller en kombinasjon av det ovenfor nevnte. Immunogene stoffer omfatter slike adjuvanser som Freunds adjuvans, immunogene proteiner, slik som virus-, bakterie-, gjær-, plante- og dyrepolypeptider, særlig albuskjellhemocyanin, serumalbumin, bovint tyroglobulin eller soyabønnetrypsininhibitor, og immunogene polysakkarider. Vanligvis konjugeres forbindelsen som har strukturen til den ønskede epitop kovalent til et immunogent polypeptid eller polysakkarid ved bruk av et polyfunksjonelt (vanligvis bifunksjonelt) kryssbindingsmiddel. Metoder for fremstillingen av haptenimmunogener er i og for seg vanlig kjent, og hvilken som helst av metodene som brukes til dette for konjugering av haptener til immunogene polypeptider eller lignende, anvendes passende også her, idet man tar i betraktning de funksjonelle gruppene på forløperne eller de hydrolytiske produktene som er tilgjengelige for kryssbinding, og sannsynligheten for å fremstille antistoffer som er spesifikke for den aktuelle epitop, i motsetning til det immunogene stoff.

Vanligvis konjugeres polypeptidet til et sete på forbindelsen ifølge oppfinnelsen som er langt borte fra epitopen som skal gjenkjennes.

Konjugatene fremstilles på vanlig måte. For eksempel er kryssbindingsmidlene N-hydroksysuksinimid, ravsyreanhydrid eller alkN=C=Nalk anvendbare ved fremstilling av konjugatene ifølge denne oppfinnelsen. Konjugatene omfatteren forbindelse ifølge oppfinnelsen bundet ved hjelp av en binding eller en sammenbindende gruppe med 1-100, vanligvis 1-25, mer typisk 1-10, karbonatomer, til det immunogene stoff. Konjugatene skilles fra utgangsmaterialer og separeres etter produkter ved å anvende kromatografi eller lignende, og sterilfiltreres så og lagres i ampuller.

Dyr immuniseres vanligvis mot de immunogene konjugatene eller derivatene, og antisera eller monoklonale antistoffer fremstilles på vanlig måte.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er anvendbare som linkere eller mellomledd ved fremstilling av affinitetsabsorpsjonsmatrikser, immobiliserte enzymer for prosesskontroll eller immunanalysereagenser. De foreliggende forbindelser inneholder flere funksjonelle grupper som er egnet for seter for kryssbinding av ønskede stoffer. For eksempel er det vanlig å binde affinitetsreagenser, slik som hormoner, peptider, antistoffer, legemidler og lignende, til uoppløselige substrater. Disse uoppløseliggjorte reagenser anvendes på kjent måte for å absorbere bindingspartnere for affinitetsreagensene fra frem-stilte preparater, diagnostiske prøver og andre urene blandinger. Likeledes anvendes immobiliserte enzymer for å utføre katalytiske omdannelser med lettvint gjenvinning av enzym. Bifunksjonelle forbindelser brukes vanligvis for å binde analytter til påvisbare grupper ved fremstilling av diagnostiske reagenser.

Screeningsanalyser gjør fortrinnsvis bruk av celler fra bestemte vev som er mottakelige for HPV-infeksjon. Analyser kjent på fagområdet er egnet for å bestemme biotilgjengelighet in vivo, inkludert tarmhulromsstabilitets-, cellepermeasjons-, leverhomogenatstabilitets- og plasmastabilitetsanalyser. Selv om esteren, amidet eller de øvrige beskyttede derivatene ikke omdannes in vivo til de frie karboksyl-, amino- eller hydroksylgrupper, forblir de imidlertid anvendbare som kjemiske mellomprodukter.

Utnyttbarhet for den foreliggende oppfinnelse var tenkt ved å anvende antiproliferasjonsanalyser. Antiproliferasjonsanalyser måler effekt av forbindelser på proliferasjon av dyrkede celler. Celler dyrkes i 7 dager i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av forbindelser. På den sjuende dag farges celler med fargestoff, og fargestyrken (proporsjonal med celleantall) måles ved hjelp av spektrofotometer. Data plottes mot forbindelseskonsentrasjoner tilpasset den S-formede doseresponskurve, hvorfra forbindelseskonsentrasjonen som reduserer celleproliferasjonshastighet med 50 % (50 % effektiv konsentrasjon eller EC50) bestemmes. Aktive forbindelser i antiproliferasjonsanalyser kan være cytostatiske (inhiberer celledeling) og/eller cytocidale (dreperceller). Ved å utføre antiproliferasjonsanalyser på HPV-positive kreftceller og normale celler, identifiseres forbindelser som inhiberer proliferasjon av HPV-positive kreftceller mer effektivt enn celler fra normale menneskevev.

Eksempelvise fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen

Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåter for fremstilling av preparatene ifølge oppfinnelsen. Preparatene fremstilles ved hjelp av hvilken som helst av de anvendbare teknikker innen organisk syntese. Mange slike teknikker er godt kjent på fagområdet. Mange av de kjente teknikkene er imidlertid belyst i "Compendium of Organic Synthetic Methods" (John Wiley & Sons, New York), vol. 1, lan T. Harrison og Shuyen Harrison, 1971; vol. 2, lan T. Harrison og Shuyen Harrison, 1974; vol. 3, Louis S. Hegedus og Leroy Wade, 1977; vol. 4, Leroy G. Wade jr., 1980; vol. 5, Leroy G. Wade jr., 1984; og vol. 6, Michael B. Smith; samt March, J., "Advanced Organic Chemistry", 3. utg. (John Wiley & Sons, New York, 1985), "Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry", i 9 bind, Barry M. Trost, sjefredaktør (Pergamon Press, New York, trykt i 1993).

En rekke eksempelvise fremgangsmåter for fremstillingen av preparatene ifølge oppfinnelsen er gitt nedenunder. Disse fremgangsmåtene er ment å illustrere typen av slike fremstillinger, og er ikke mente å begrense omfanget av de anvendbare fremgangsmåter.

Vanligvis vil reaksjonsbetingelsene, slik som temperatur, reaksjonstid, oppløsningsmidler, opparbeidelsesprosedyrer og lignende, være de som er vanlige innenfor fagområdet for den bestemte reaksjon som skal utføres. Det siterte litteratur-henvisningsmateriale inneholder, sammen med materialet som er sitert der, nærmere beskrivelser av slike betingelser. Vanligvis vil temperaturene være -100 °C til 200 °C, oppløsningsmidler vil være aprotiske eller protiske, og reaksjonstider vil være 10 sekunder til 10 dager. Opparbeidelse består vanligvis av å nøytralisere eventuelle ikke-omsatte reagenser, etterfulgt av fordeling mellom et system med vannlag og organisk lag (ekstrak-sjon) og separering av laget som inneholder produktet.

Oksidasjons- og reduksjonsreaksjoner utføres vanligvis ved temperaturer nær romtemperatur (ca. 20 °C), selv om temperaturen for metallhydridreduksjoner ofte reduseres til 0 °C til -100 °C, oppløsningsmidler er vanligvis aprotiske for reduksjoner og kan være enten protiske eller aprotiske for oksidasjoner. Reaksjonstider reguleres for å oppnå ønskede omdannelser.

Kondensasjonsreaksjoner utføres vanligvis ved temperaturer nær romtemperatur, selv om det for ikke-ekvilibrerende, kinetisk kontrollerte kondensasjoner også er vanlig med reduserte temperaturer (0 °C til -100 °C). Oppløsningsmidler kan være enten protiske (vanlig ved ekvilibrerende reaksjoner) eller aprotiske (vanlig ved kinetisk kontrollerte reaksjoner).

Standard synteseteknikker, slik som azeotrop fjerning av reaksjons-biprodukter, og bruk av vannfrie reaksjonsbetingelser (f.eks. inertgassomgivelser), er vanlige på fagområdet og vil bli anvendt når det er passende.

Eksempelvise fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er vist i reaksjonsskjemaene nedenunder. Nærmere beskrivelser av fremgangsmåtene finnes i forsøksdelen nedenunder, og henviser til de bestemte reaksjonsskjemaene.

Reaksionss kiemer

Hvert av produktene i de etterfølgende fremgangsmåter separeres, isoleres og/eller renses eventuelt før anvendelsen i de etterfølgende fremgangsmåter.

Uttrykkene "behandlet", "behandle", "behandling" og lignende betyr når de anvendes i sammenheng med en kjemisk fremgangsmåte, protokoll eller fremstilling, å kontakte, blande, omsette, la reagere, bringe i kontakt og andre uttrykk som er vanlige på fagområdet for å angi at én eller flere kjemiske enheter behandles på en slik måte som å omdanne dem til én eller flere andre kjemiske enheter. Dette betyr at "behandling av forbindelse 1 med forbindelse 2" er synonymt med "la forbindelse 1 reagere med forbindelse 2", "bringe forbindelse 1 i kontakt med forbindelse 2", "omsette forbindelse 1 med forbindelse 2" og andre uttrykk som er vanlige på fagområdet organisk syntese for på rimelig måte å angi at forbindelse 1 ble "behandlet", "omsatt", "fikk reagere" etc. med forbindelse 2.

I sammenheng med en kjemisk fremgangsmåte, protokoll eller fremstilling angir "å behandle" den rimelige og vanlige måte hvorved organiske kjemikalier får reagere. Normale konsentrasjoner (0,01 M til 10 M, vanligvis 0,1 M til 1 M), temperaturer (-100 °C til 250 °C, vanligvis -78 °C til 150 °C, mer vanlig -78 °C til 100 °C, enda mer vanlig 0 °C til 100 °C), reaksjonsbeholdere (vanligvis glass, plast, metall), oppløsningsmidler, trykk, atmosfærer (vanligvis luft for oksygen- og vannufølsomme reaksjoner, eller nitrogen eller argon for oksygen- eller vannfølsomme reaksjoner) etc. er ment, med mindre annet er angitt. Kunnskapen om lignende reaksjoner som er kjent på fagområdet organisk syntese, brukes ved utvelgelse av betingelsene og apparatet for "å behandle" i en bestemt fremgangsmåte. Nærmere bestemt velger en person med vanlige kunnskaper på området organisk syntese betingelser og apparat som med rimelighet forventes med hell å utføre de kjemiske reaksjonene i de beskrevne fremgangsmåter, basert på kunnskapen på fagområdet.

Modifikasjoner av hvert av de ovenfor nevnte reaksjonsskjemaer fører til forskjellige analoger av de bestemte, eksempelvise materialer som fremstilles ovenfor. De ovenfor angitte henvisninger som beskriver egnede metoder innen organisk syntese, er anvendbare for slike modifikasjoner.

I hvert av de eksempelvise reaksjonsskjemaer ovenfor kan det være fordelaktig å separere reaksjons produkter fra hverandre og/eller fra utgangsmaterialer. De ønskede produkter fra hvert trinn eller hver serie av trinn fraskilles og/eller renses (heretter separeres) til den ønskede grad av homogenitet ved hjelp av teknikkene som er vanlige på fagområdet. Vanligvis involverer slike separasjoner multifaseekstraksjon, krystallisering fra et oppløsningsmiddel eller en oppløsningsmiddelblanding, destillasjon, sublimasjon eller kromatografi. Kromatografi kan involvere ethvert antall metoder, inkludert f.eks. størrelses-utelukkelses- eller ionebytterkromatografi, væskekromatografi med høyt, middels og lavt trykk, småskala- eller preparativ tynn- eller tykksjiktkromatografi, samt teknikker med småskalatynnsjikt- og -hurtigkromatografi.

En annen klasse separasjonsmetoder involverer behandling av en blanding med et reagens valgt ut til å binde seg til eller på annen måte gjøre et ønsket produkt, uomsatt utgangsmateriale, reaksjonsbiprodukt eller lignende separerbart. Slike reagenser omfatter adsorberingsmidler eller absorberingsmidler, slik som aktivt karbon, molekylsikter, ionebyttermedier eller lignende. Alternativt kan reagensene være syrer i tilfellet med et basisk materiale, baser i tilfellet med et surt materiale, slike bindingsreagenser som antistoffer, bindingsproteiner, selektive chelatorer, slik som kroneetere, reagenser for væske-/væskeioneekstraksjon (LIX) eller lignende.

Utvelgelse av passende metoder for separasjon avhenger av typen materialer som er involvert, f.eks. kokepunkt, og molekylvekt ved destillasjon og sublimasjon, tilstedeværelse eller fravær av polare funksjonelle grupper ved kromatografi, stabilitet til materialer i sure og basiske medier ved flerfaseekstraksjon og lignende. En person med fagkunnskaper på området vil anvende teknikker som mest sannsynlig vil utføre den ønskede separasjon.

Oppfinnelsen er blitt beskrevet i tilstrekkelig detalj til å gjøre det mulig for en person med vanlige kunnskaper på området å lage og bruke gjenstanden ifølge de etterfølgende krav. De følgende eksempler er gitt for å eksemplifisere den foreliggende oppfinnelse.

Eksempler

Generelt

Noen eksempler er blitt utført flere ganger. I gjentatte eksempler var reaksjonsbetingelser, slik som tid, temperatur, konsentrasjon og lignende, og utbytter innenfor normale forsøksområder. I gjentatte eksempler ble det gjort betydelige modifikasjoner, disse er blitt angitt der hvor resultatene varierte signifikant fra dem som er beskrevet. I eksempler hvor forskjellige utgangsmaterialer ble brukt, er disse angitt. Når de gjentatte eksempler henviser til en "tilsvarende" analog av en forbindelse, slik som en "tilsvarende etylester", menes dette at den ellers tilstedeværende gruppe, i dette tilfellet vanligvis en metylester, tas for å være den samme gruppe modifisert som angitt.

Eksempler 1-35 henviser til reaksjonsskjemaene 1-9 ovenfor.

Eksempel 1

Acetoksyetyloksymetylklorid 1: En 5 I trehalset kolbe ble utstyrt med mekanisk rører, termometer, 500 ml tilsetningstrakt, og argon ble gjennomboblet. 1,3-dioksalan (140 ml, 2,00 mol) i vannfritt Et20 (800 ml) og 1,0 M ZnCl2/Et20 (7,5 ml, 0,007 mol) ble tilsatt. En oppløsning av acetylklorid (157 ml, 2,20 mol) i Et20 (200 ml) ble tilsatt dråpevis gjennom en tilsetningstrakt i løpet av 20 minutter. Et kaldtvannsbad ble brukt for å holde temperaturen mellom 19 og 27 °C hele tiden. Omrøring ble fortsatt uten utvendig avkjøling i 4 timer, idet reaksjonen selv varmet opp til 20-25 °C i ca. 1 time. En klar, fargeløs oppløsning ble holdt under argon over natten. Den fikk stå i 3 dager og dannet en oransje oppløsning. Det ble strippet med Et20 på rotavap (vannaspirator) inntil ikke noe mer destillerte ved 35 °C i badet. Det ble erholdt et kvantitativt utbytte med produkt, 318 g (teoretisk utbytte 306 g).

Eksempel 2

Diisopropylfosfonat 2: En 500 ml trehalset kolbe ble påfylt den urensede klormetyleter 1 (317 g, 2,00 mol). Triisopropylfosfitt (494 ml) ble tilsatt dråpevis gjennom en tilsetningstrakt mens det ble varmet opp i et 125 °C oljebad og omrørt kraftig. 2-klorpropandestillat ble samlet opp via en kortveishette i en tørrisavkjølt mottaker med argonteppe - det ble samlet opp 140 g destillat (teoretisk 157 g). Reaksjonsblandingen ble fosfittbleket til gult, og oppvarming fortsatte i ytterligere 2 timer ved 125 °C oljebad, så ble det ordnet med vakuumdestillasjon under anvendelse av en vakuumpumpe. Det ble fradestillert en gul første porsjon (140 g, topp til 135 °C, bunn til 190 °C), og så skiftet til ren mottaker. Hovedfraksjonen ble samlet opp ved topptemperatur på 178-187 °C (meste-parten 185-187 °C) med vakuum ukjent ved badtemperatur på 222-228 °C. Det ble erholdt 258 g av produkt 2 (47 % utbytte fra 1,3-dioksolan).

Eksempel 3

Alkohol 3: En oppløsning av 2 (125 g, 0,443 mol) i absolutt MeOH (440 ml) ble behandlet med konsentrert HCI (11,2 ml, 0,112 mol), og det ble varmet opp til refluks i 6 timer under argon. Det ble strippet med MeOH på rotavap (vannaspirator) til 55 °C, hvorved man fikk 115 g av en klar olje som ble samfordampet med toluen (2 x 200 ml). Råproduktet ble tørket under vakuum, hvorved man fikk en olje (102 g, 96 %).

Eksempel 4

Diisopropylfosfonat 4: En oppløsning av trifenylfosfin (25,57 g, 97,5 mmol) og alkohol 3 (18 g, 75 mmol) i DM F (120 ml) ble behandlet med 6-klorpurin (12,72 g, 75 mmol), og det ble avkjølt til -15 °C. En oppløsning av diisopropylazodikarboksylat (16,68 g, 82,5 mmol) i DMF (50 ml) ble tilsatt dråpevis gjennom en tilsetningstrakt i løpet av 80 minutter. Reaksjonsblandingen ble holdt ved -15 °C i 2 timer og så varmet opp til romtemperatur og omrørt i ytterligere 2 timer. En uklar reaksjonsblanding skiftet over til å bli en lysegul oppløsning. Reaksjonsoppløsningsmidlet ble fordampet under redusert trykk, samfordampet med toluen (3 x) og tørket under vakuum over natten før rensing. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (5 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk diisopropylfosfonatet (18,52 g, 63 %) som et hvitt fast stoff.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,95 (s, 1 H), 4,70 (m, 2 H), 4,31 (m, 2 H), 3,93 (m, 2 H), 3,73 (m, 2 H), 1,29 (m, 12 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 18,42,

Eksempel 5

Diisopropylfosfonat 5: En blanding av 4 (11,00 g, 28,08 mmol) og syklo-propylamin (4,86 g, 85,16 mmol) i CH3CN (80 ml) ble plassert i en reaksjonsbeholder og varmet opp til 100 °C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og konsentrert under redusert trykk. Produktet ble fordelt mellom 15 % MeOH/CH2CI2(3 x) og saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og konsentrert. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (5 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk 5 (10,42 g, 90 %) som et lysegult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,59 (s, 1 H, 5,83 (bred, s, 1 H), 4,88 (bred, s, 2 H), 4,70 (m, 2 H), 4,21 (m, 2 H), 3,88 (m, 2 H), 3,72 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 3,03 (bred, s, 1 H), 1,28 (m, 12 H), 0,84 (m, 2 H), 0,60 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 18,63.

Eksempel 6

cPrPMEDAP 6: En oppløsning av 5 (11,00 g, 26,67 mmol) i vannfritt CH3CN (120 ml) ble behandlet med bromtrimetylsilan (21,1 ml, 160,02 mmol). Reaksjonsblandingen ble beskyttet mot lys ved innpakning av kolben med aluminiumsfolie. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten. De flyktige stoffene ble fordampet under redusert trykk. Resten ble oppløst i H20 (250 ml), og pH ble regulert til 9 med ammoniumhydroksid. Reaksjonsblandingen ble konsentrert, og det ble erholdt et gult, fast stoff. Det faste stoffet ble oppløst i H20 (30 ml), og pH ble regulert til 2 med 10 % HCI. Fint, fast stoff ble samlet opp og tørket under vakuum, hvorved man fikk 6 (7,88 g, 90 %) som et hvitt, fast stoff.

Eksempel 7

Monofosfonsyrehydroklorid 7: En blanding av syre 6 (3,00 g, 9,15 mmol) og DMF (0,1 ml) i sulfolan (9,2 ml) ble varmet opp til 70 °C. Tionylklorid (1,66 ml, 22,76 mmol) ble tilsatt dråpevis i løpet av et tidsrom på 1 time. Temperaturen ble økt til 90 °C, og TMSOPh (1,74 ml, 9,61 mmol) ble tilsatt, og det ble omrørt i 1 time. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur over natten. Reaksjonsblandingen ble tilsatt dråpevis til godt omrørt, iskaldt aceton (100 ml). Produktet ble utfelt. Det faste stoffet ble filtrert under Ar, vasket med kaldt aceton (100 ml) og tørket under vakuum, hvorved man fikk monofosfon-syrehydrokloridet (3,70 g, 92 %) som et fast stoff.

Eksempel 8

Monofosfonamidat 8: En blanding av monofosfonsyre 7 (0,22 g, 0,50 mmol), L-alaninmetylesterhydroklorid (0,14 g, 1,00 mmol) og trietylamin (0,21 ml, 1,50 mmol) i pyridin (3 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,39 g, 1,75 mmol) og trifenylfosfin (0,46 g, 1,75 mmol) i pyridin (2 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (97 mg, 39 %, 1:1 diastereomerblanding) som et gråhvitt skum.

Eksempel 9

Monofosfonamidat 9: En blanding av monofosfonsyre 7 (0,88 g, 2,00 mmol), D-alaninmetylesterhydroklorid (0,84 g, 6,00 mmol) og trietylamin (0,84 ml, 6,00 mmol) i pyridin (8 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (1,56 g, 7,00 mmol) og trifenylfosfin (1,84 g, 7,00 mmol) i pyridin (8 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,40 g, 41 %, 1:1 diastereomerblanding) som et gråhvitt skum.

Eksempel 10

Monofosfonamidat 10: En blanding av monofosfonsyre 7 (0,88 g, 2,00 mmol), L-alanin-tert.-butylesterhydroklorid (1,31 g, 6,00 mmol), og trietylamin (0,84 ml, 6,00 mmol) i pyridin (8 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (1,54 g, 7,00 mmol) og trifenylfosfin (1,84 g, 7,00 mmol) i pyridin (8 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,38 g, 36 %, 1:1 diastereomerblanding) som et lyseoransje skum.

Eksempel 11

Monofosfonamidat 11: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alaninetylesterhydroklorid (94 mg, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,13 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (74 mg, 48 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,61 (d, J = 4,2 Hz, 1 H), 7,26-7,08 (m, 5 H), 4,23 (m, 2 H), 4,13 (m, 2 H), 4,09 (m, 1 H), 3,92-3,85 (m, 4 H), 3,03 (bred, s, 1 H), 1,30-1,26 (m, 3 H), 1,24 (m, 3 H), 0,88 (m, 2 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 21,94, 20,68.

Eksempel 12

Monofosfonamidat 12: En blanding av fosfonsyre 6 (1,50 g, 4,56 mmol), L-alanin-n-propylesterhydroklorid (1,59 g, 9,49 mmol), fenol (2,25 g, 22,80 mmol) og trietylamin (10,50 ml, 54,72 mmol) i pyridin (8,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (6,54 g, 31,92 mmol) og trifenylfosfin (7,32 g, 31,92 mmol) i pyridin (8,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,43 g, 18 %, forbindelse E, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,61 (d, J = 5,1 Hz, 1 H), 7,27-7,09 (m, 5 H), 4,27-4,20 (m, 2 H), 4,16-4,00 (m, 3 H), 3,93-3,82 (m, 4 H), 3,04 (bred, s, 1 H), 1,63 (m, 2 H), 1,30 (dd, 3 H), 0,92 (m, 3 H), 0,89 (m, 2 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 21,89, 20,66.

Eksempel 13

Monofosfonamidat 13: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alaninisopropylesterhydroklorid (0,10 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) og

trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,13 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble

fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med salt-oppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (87 mg, 55 %, 1:1 diastereomerblanding) som et gult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,60 (d, J = 2,1 Hz, 1 H), 7,26-7,09 (m, 5 H), 4,98 (m, 1 H), 4,23 (m, 2 H), 4,06 (m, 1 H), 3,91-3,83 (m, 4 H), 3,04 (bred, s, 1 H), 1,29-1,21 (m, 9 H), 0,89 (m, 2 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,85, 20,68.

Eksempel 14

Monofosfonamidat 14: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alanin-n-butylesterhydroklorid (0,11 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) og

fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (80 mg, 50 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,61 (d, J = 4,20 Hz, 1 H, 7,27-7,08 (m, 5 H), 5,93 (bred, s, 1 H), 4,97 (bred, s, 2 H), 4,23 (m, 2 H), 4,10-4,08 (m, 3 H), 3,91-3,84 (m, 4 H), 3,03 (bred, s, 1 H), 1,58 (m, 2 H), 1,34-1,27 (m, 5 H), 0,92-0,89 (m, 5 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,94, 20,68,

Eksempel 15

Monofosfonamidat 15: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alanin-n-heksylesterhydroklorid (0,13 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,13 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjons blandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,10 g, 59 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,59 (d, J = 4,20 Hz, 1 H), 7,26-7,08 (m, 5 H), 4,22 (m, 2 H), 4,11 (m, 1 H), 4,06 (m, 2 H), 3,91-3,84 (m, 4 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,59 (m, 2 H), 1,31-1,27 (m, 9 H), 0,89 (m, 3 H), 0,86 (m, 2 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,94, 20,68.

Eksempel 16

Monofosfonamidat 16: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alanin-n-oktanylesterhydroklorid (0,15 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,13 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,13 g, 73 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,59 (d, J = 4,2 Hz, 1 H), 7,25-7,07 (m, 5 H), 4,22 (m, 2 H), 4,10 (m, 1 H), 4,07 (m, 2 H), 3,90-3,84 (m, 4 H), 3,02 (bred, s, 1 H), 1,59 (m, 2 H), 1,29-1,26 (m, 13 H), 0,88 (m, 3 H), 0,85 (m, 2 H), 0,60 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,96, 20,69.

Eksempel 17

Monofosfonamidat 17: En blanding av fosfonsyre 6 (70 mg, 0,21 mmol), L-2-aminosmørsyreetylesterhydroklorid (72 mg, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) og

trietylamin (0,36 ml, 2,52 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) og trifenylfosfin (0,39 g, 1,47 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble

fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med salt-oppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (66 mg, 60 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 7,26-7,08 (m, 5 H), 5,91 (bred, s, 1 H), 4,97 (bred, s, 2 H), 4,22-4,12 (m, 4 H), 4,01-3,81 (m, 5 H), 3,03 (bred, s, 1 H), 1,71-1,60 (m, 2 H), 1,24 (m, 3 H), 0,89 (m, 2 H), 0,84-0,76 (m, 3 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 22,15, 20,93.

Eksempel 18

Monofosfonamidat 18: En blanding av fosfonsyre 6 (1,00 g, 3,05 mmol), L-2-aminosmørsyre-n-butylesterhydroklorid (1,19 g, 6,09 mmol), fenol (1,43 g, 15,23 mmol) og trietylamin (5,10 ml, 36,60 mmol) i pyridin (5,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (4,70 g, 21,32 mmol) og trifenylfosfin (5,59 g, 21,32 mmol) i pyridin (5,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (5 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,7 g, 42 %, forbindelse G, 1:1 diastereomerblanding) som et gråhvitt skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,60 (d, J = 6,60 Hz, 1 H), 7,27-7,04 (m, 5 H), 5,89 (bred, s, 1 H), 4,94 (bred, s, 2 H), 4,22 (m, 2 H), 4,07-3,99 (m, 3 H), 3,91-3,84 (m, 4 H), 3,03 (bred, s, 1 H), 1,70-1,57 (m, 4 H), 1,35 (m, 2 H), 0,92-0,75 (m, 8 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 22,21, 20,95.

Eksempel 19

Monofosfonamidat 19: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-2-aminosmørsyre-n-oktanylesterhydroklorid (0,15 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,13 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,13 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,12 g, 64 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,62 (d, J = 6,60 Hz, 1 H), 7,25-7,08 (m, 5 H), 4,24-4,21 (m, 2 H), 4,09-4,04 (m, 2 H), 4,00 (m, 1 H), 3,91-3,83 (m, 4 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,70-1,58 (m, 4 H, 1,27 (m, 10 H), 0,89-0,76 (m, 8 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 22,22, 20,92.

Eksempel 20

Monofosfonamidat 20: En blanding av fosfonsyre 6 (1,5 g, 4,57 mmol), L-fenylalaninetylesterhydroklorid (2,10 g, 9,14 mmol), fenol (2,15 g, 22,85 mmol) og trietylamin (7,64 ml, 54,84 mmol) i pyridin (8,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (7,05 g, 31,99 mmol) og trifenylfosfin (8,39 g, 31,99 mmol) i pyridin (7,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (5 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk et blekgult, fast stoff, 1,32 g, inneholdende ca. 10 % urenhet. Det gule, faste stoff (1,32 g, 2,28 mmol) ble oppløst i iPrOH (10 ml) og overført til en varm oppløsning i iPrOH (30 ml) av fumarsyre (0,27 g, 2,28 mmol), og det ble omrørt ved 80 °C i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble gradvis avkjølt til romtemperatur, og fumaratsaltet ble samlet opp ved 0 °C. Det resulterende fumaratsalt ble nøytralisert ved fordeling fra NaHC03(2 x) og EtOAc. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, H20, tørket med Na2S04, filtrert og konsentrert. Produktet ble tørket under vakuum, hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,70 g, 26 %, forbindelse A, 1:1 diastereomerblanding) som et hvitt skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,54 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,27-6,98 (m, 10 H), 4,35 (m, 1 H), 4,16 (m, 2 H), 4,08 (m, 2 H), 3,84-3,61 (m, 3 H), 3,33 (m, 1 H), 3,02 (bred, s, 1 H), 2,95-2,87 (m, 2 H), 1,17 (m, 3 H), 0,87 (m, 2 H), 0,61 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 21,88, 21,07.

Eksempel 21

Monofosfonamidat 21: En blanding av fosfonsyre 6 (70 mg, 0,21 mmol), L-fenylalanin-n-butylesterhydroklorid (0,11 g, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) og

fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med salt-oppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (30 mg, 23 %,1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,55 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 7,25-6,98 (m, 10 H), 4,36 (m, 1 H), 4,17 (m, 2 H), 4,02 (m, 2 H), 3,83-3,35 (m, 4 H), 3,02 (bred, s, 1 H), 2,94-2,86 (m, 2 H), 1,52 (m, 2 H), 1,29 (m, 2 H), 0,90 (m, 3 H), 0,88 (m, 2 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 21,85, 21,05.

Eksempel 22

Monofosfonamidat 22: En blanding av fosfonsyre 6 (70 mg, 0,21 mmol), L-fenylalaninisobutylesterhydroklorid (0,11 g, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) og

fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (65 mg, 50 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCls) 8 7,56 (d, J = 3,6 Hz, 1 H, 7,26-6,98 (m, 10 H), 4,40 (m, 1 H), 4,17 (m, 2 H), 3,82 (m, 2 H), 3,75-3,62 (m, 3 H), 3,35 (m, 1 H), 3,04 (bred, s, 1 H), 2,96-2,87 (m, 2 H), 1,83 (m, 1 H), 0,90 (m, 2 H), 0,86 (m, 6 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 21,82, 21,03.

Eksempel 23

Bisfosfonamidat 23: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alaninetylesterhydroklorid (0,28 g, 1,80 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,10 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (80 mg, 50 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,63 (s, 1 H), 5,88 (bred, s, 1 H), 4,96 (bred, s, 2 H), 4,24-4,16 (m, 6 H), 4,00 (m, 2 H), 3,86

(m, 2 H), 3,72 (m, 2 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,36 (m, 6 H), 1,26 (m, 6 H), 0,86 (m, 2 H), 0,61 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 20,63.

Eksempel 24

Bisfosfonamidat 24: En blanding av fosfonsyre 6 (1,00 g, 3,05 mmol), L-alanin-n-propylesterhydroklorid (3,06 g, 18,30 mmol) og trietylamin (5,10 ml, 36,50 mmol) i pyridin (5,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (4,70 g, 21,32 mmol) og trifenylfosfin (5,59 g, 21,32 mmol) i pyridin (5,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (1,13 g, 71 %, forbindelse F) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,65 (s, 1 H), 5,92 (bred, s, 1 H), 5,03 (bred, s, 2 H), 4,24 (m, 2 H), 4,10-4,02 (m, 6 H), 3,87 (m, 2 H), 3,73 (m, 2 H), 3,03 (bred, s, 1 H), 1,65 (m, 4 H), 1,37 (m, 6 H), 0,93 (m, 6 H), 0,88 (m, 2 H), 0,63 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 20,61.

Eksempel 25

Bisfosfonamidat 25: En blanding av fosfonsyre 6 (0,60 g, 1,83 mmol), L-alaninisopropylesterhydroklorid (1,84 g, 10,98 mmol) og trietylamin (3,06 ml, 21,96 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (2,82 g, 12,80 mmol) og trifenylfosfin (3,36 g, 12,80 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,53 g, 52 %, forbindelse B) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,65 (s, 1 H), 5,00 (m, 2 H), 4,24 (m, 2 H), 3,97 (m, 2 H), 3,87 (m, 2 H), 3,71 (m, 2 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,34 (m, 6 H), 1,23 (m, 12 H), 0,86 (m, 2 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 20,59.

Eksempel 26

Bisfosfonamidat 26: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alanin-n-butylesterhydroklorid (0,33 g, 1,82 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,10 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (97 mg, 55 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,63 (s, 1 H), 4,24 (m, 2 H), 4,09 (m, 4 H), 4,01 (m, 2 H), 3,86 (m, 2 H), 3,72 (m, 2 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,61 (m, 4 H), 1,37 (m, 10 H), 0,93 (m, 6 H), 0,88 (m, 2 H), 0,61 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 20,59.

Eksempel 27

Bisfosfonamidat 27: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alanin-n-heksylesterhydroklorid (0,38 g, 1,80 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,10 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,13 g, 65 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,62 (s, 1 H), 4,23 (m, 2 H), 4,09 (m, 4 H), 4,01 (m, 2 H), 3,86 (m, 2 H), 3,72 (m, 2 H), 2,99 (bred, s, 1 H), 1,61 (m, 4 H), 1,36-1,29 (m, 18 H), 0,88 (m, 6 H), 0,84 (m, 2 H), 0,60 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 20,61.

Eksempel 28

Bisfosfonamidat 28: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-alanin-n-oktanylesterhydroklorid (0,43 g, 1,80 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,10 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,13 g, 61 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,61 (s, 1 H), 4,21 (m, 2 H), 4,07-4,00 (m, 6 H), 3,84-3,70 (m, 4 H), 2,98 (bred, s, 1 H), 1,60 (m, 4 H), 1,34 (m, 6 H), 1,27 (m, 20 H), 0,87 (m, 6 H), 0,83 (m, 2 H), 0,58 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 20,63.

Eksempel 29

Bisfosfonamidat 29: En blanding av fosfonsyre 6 (0,70 g, 2,13 mmol), L-2-aminosmørsyreetylesterhydroklorid (2,15 g, 12,80 mmol) og trietylamin (3,57 ml, 25,56 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (3,29 g, 14,91 mmol) og trifenylfosfin (3,92 g, 14,91 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,71 g, 60 %, forbindelse D) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,64 (s, 1 H, 4,24 (m, 2 H), 4,16 (m, 4 H), 3,89-3,87 (m, 4 H), 3,72 (d, J = 9,0 Hz, 2 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,78-1,64 (m, 4 H), 1,26 (m, 6 H), 0,91 (m, 6 H), 0,87 (m, 2 H), 0,61 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,23.

Eksempel 30

Bisfosfonamidat 30: En blanding av fosfonsyre 6 (0,70 g, 21,32 mmol), L-2-aminosmørsyre-n-butylesterhydroklorid (2,50 g, 12,80 mmol) og trietylamin (3,57 ml,

25,56 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (3,29 g, 14,91 mmol) og trifenylfosfin (3,92 g, 14,91 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,40 g, 31 %, forbindelse C) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,64 (s, 1 H), 4,24 (m, 2 H), 4,11 (m, 4 H), 3,91 (m, 2 H), 3,87 (m, 2 H), 3,71 (d, J = 9,0 Hz, 2 H), 3,03 (bred, s, 1 H), 1,79-1,64 (m, 4 H), 1,60 (m, 4 H), 1,37 (m, 4 H), 0,94 (m, 6 H), 0,90 (m, 6 H), 0,86 (m, 2 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 21,25.

Eksempel 31

Bisfosfonamidat 31: En blanding av fosfonsyre 6 (0,10 g, 0,30 mmol), L-2-aminosmørsyre-n-oktanylesterhydroklorid (0,33 g, 1,82 mmol) og trietylamin (0,51 ml, 3,60 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,47 g, 2,10 mmol) og trifenylfosfin (0,56 g, 2,10 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,12 g, 55 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,64 (s, 1 H), 4,24 (m, 2 H), 4,13-4,05 (m, 4 H), 3,91 (m, 2 H), 3,87-3,72 (m, 4 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,78-1,65 (m, 4 H), 1,61-1,29 (m, 24 H), 0,91 (m, 6 H), 0,89 (m, 6 H), 0,86 (m, 2 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,20.

Eksempel 32

Bisfosfonamidat 32: En blanding av fosfonsyre 6 (0,60 g, 1,82 mmol), L-fenylalaninetylesterhydroklorid (2,51 g, 10,96 mmol) og trietylamin (3,06 ml, 21,84 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (2,82 g, 12,74 mmol) og trifenylfosfin (3,36 g, 12,74 mmol) i pyridin (3,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,53 g, 43 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,48 (s, 1 H), 7,22-7,06 (m, 10 H), 4,20 (m, 1 H), 4,12 4 H (m, 4 H), 4,09 (m, 2 H), 4,04 (m, 1 H), 3,63 (m, 2 H), 3,33-3,21 (m, 2 H), 3,04-2,78 (m, 5 H), 1,20 (m, 6 H), 0,83 (m, 2 H), 0,58 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 20,38.

Eksempel 33

Bisfosfonamidat 33: En blanding av fosfonsyre 6 (70 mg, 0,21 mmol), L-fenylalanin-n-butylesterhydroklorid (0,33 g, 1,26 mmol) og trietylamin (0,36 ml, 2,52 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) og trifenylfosfin (0,39 g, 1,47 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,11 g, 70 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 5 7,51 (s, 1 H), 7,23-7,06 (m, 10 H), 4,23 (m, 1 H), 4,11-4,05 (m, 7 H), 3,65 (m, 2 H), 3,35-3,23 (m, 2 H), 3,01 (m, 1 H), 3,04-2,78 (m, 4 H), 1,57 (m, 4 H), 1,33 (m, 4 H), 0,92 (m, 6 H), 0,86 (m, 2 H), 0,61 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 20,35.

Eksempel 34

Bisfosfonamidat 34: En blanding av fosfonsyre 6 (70 mg, 0,21 mmol), L-fenylalaninisobutylesterhydroklorid (0,33 g, 1,26 mmol) og trietylamin (0,36 ml, 2,52 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,33 g, 1,47 mmol) og trifenylfosfin (0,39 g, 1,47 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (78 mg, 50 %) som et blekgult skum.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,52 (s, 1 H), 7,24-7,07 (m, 10 H), 4,26 (m, 1 H), 4,11 (m, 2 H), 4,01 (m, 1 H), 3,85 (m, 4 H), 3,66 (m, 2 H), 3,35-3,25 (m, 2 H), 3,07-2,85 (m, 3 H), 2,97-2,79 (m, 2 H), 1,89 (m, 2 H), 0,90 (m, 12 H), 0,89 (m, 2 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 5 20,31.

Eksempel 35

BisPOC av cPrPMEDAP 35: En blanding av fosfonsyre 6 (0,20 g, 0,61 mmol) og trietylamin (0,42 ml, 3,01 mmol) i l-metyl-2-pyrrolidinon (2,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 30 minutter. POCCI (0,45 g, 2,92 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C i 3 timer, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kromatografi på ISCO (2-propanol/CH2CI2), hvorved man fikk bisPOC av cPrPMEDAP

(0,13 g, 39 %) som et fast stoff.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 7,58 (s, 1 H), 5,66 (m, 4 H), 4,92 (m, 2 H), 4,22 (m, 2 H), 3,90 -3,88 (m, 4 H), 3,01 (bred, s, 1 H), 1,81 (m,12 H), 0,86 (m, 2 H), 0,62 (m, 2 H).

<31>P-NMR (CDCI3) 8 20,93.

Eksemplene 36-38 henviser til reaksjonsskjema 10.

Eksempel 36

Bisfosfonamidat 37: En blanding av fosfonsyre 36 (0,32 g, 1,00 mmol), L-alaninbutylesterhydroklorid (0,47 g, 2,60 mmol) og trietylamin (0,27 g, 2,60 mmol) i pyridin (5,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,77 g, 3,50 mmol) og trifenylfosfin (0,92 g, 3,50 mmol) i pyridin (2,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (10 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk bisfosfonamidatet (0,43 g, 75 %) som et blekgult skum.

Eksempel 37

Monofosfonsyre 38: En blanding av disyre 36 (1,30 g, 4,10 mmol) og DMF (0,1 ml) i sulfolan (35 ml) ble varmet opp til 70 °C. Tionylklorid (0,54 ml, 7,38 mmol) ble tilsatt dråpevis i løpet av et tidsrom på 1 time. Temperaturen ble økt til 90 °C, og TMSOPh (0,75 g, 4,51 mmol) ble tilsatt, og det ble omrørt i 1 time. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur over natten. Reaksjonsblandingen ble tilsatt dråpevis til godt omrørt, iskaldt aceton (100 ml). Produktet ble utfelt. Det faste stoffet ble filtrert og oppløst i MeOH (40 ml), og pH ble regulert til 3 med 45 % KOH. Fast stoff ble samlet opp ved filtrering. Produktet ble renset videre ved hjelp av oppløsning i MeOH, regulering av pH til 6 med 45 % KOH og krystallisering fra iskaldt aceton, hvorved man fikk monofosfonsyren (0,20 g,

12 %) som et gråhvitt, fast stoff.

Eksempel 38

Monofosfonamidat 39: En blanding av monofosfonsyre 38 (0,20 g,

0,50 mmol), L-alaninisopropylesterhydroklorid (0,17 g, 1,00 mmol) og trietylamin (0,10 g, 1,00 mmol) i pyridin (2,0 ml) ble varmet opp til 60 °C i 5 minutter. En nyfremstilt lysegul oppløsning av aldritiol (0,39 g, 1,75 mmol) og trifenylfosfin (0,46 g, 1,75 mmol) i pyridin (2,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60 °C over natten, avkjølt til romtemperatur og konsentrert. Produktet ble fordelt mellom EtOAc og mettet NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket med Na2S04, filtrert og inndampet under redusert trykk. Råproduktet ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel (7 % MeOH/CH2CI2), hvorved man fikk monofosfonamidatet (0,14 g, 54 %, 1:1 diastereomerblanding) som et blekgult skum.

Eksempel 39

Dette eksemplet angir prøver brukt til å demonstrere antiproliferasjons-akti vitet.

Celletyper brukt til antiproliferasjonsanalyser

Humankreftcellelinjer som ble brukt i antiproliferasjonsprøver, inkluderte seks livmorhalskarsinomcellelinjer med tre typer HPV (HPV-16, HPV-18, HPV-39), én HPV-negativ livmorhalskarsinomcellelinje og to keratinocyttlignende karsinomer fra tunge. Normale menneskeceller som ble testet, omfattet hudkeratinocytter, livmorhalskeratinocytter og lungefibroblaster. Hudkeratinocytter og livmorhalskeratinocytter ble erholdt fra Cambrex (East Rutherford, NJ), og alle andre celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Tabell 39-1 oppsummerer kjennetegn for hver celletype og dyrkningsbetingelser.

Antiproliferasionsprøvefremqanqsmåte

1. Cellekultur

Celler ble løsnet fra dyrkningskolber under anvendelse av trypsin, telt og platet ut i 96-brønners dyrkningsplater (250-1000 celler pr. brønn, avhengig av celletype). Pa den neste dag (definert som dag 0) ble det etter at celler hadde festet seg til bunnen av platene, tilsatt 5 gangers seriefortynninger av forbindelser in duplo. Ingen forbindelse og 10 uM kolchicin (celledelingsinhibitor) ble tilsatt til kontroll brønner, noe som ville representere 100 % proliferasjon og 0 % proliferasjon.

2. Farging av celler med sulforodamin B

Sju dager etter tilsetning av forbindelser ble dyrkningsplater behandlet med 10 % trikloreddiksyre ved 4 °C i 1 time og så vasket med vann. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for celleavledede proteiner å binde seg til bunnoverflatene i platene. Proteiner ble farget med 0,4 % sulforodamin B i 1 % eddiksyre i 10 minutter, etterfulgt av grundig vasking med 1 % eddiksyre. Gjenværende fargestoff bundet til bunnen i platene ble oppløst i 10 mM Trizma-base. Dette genererte purpurfarge som ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 510 nm bølgelengde under anvendelse av spektrofotometer.

3. Dataanalyse

Ut fra forsøksdataene ble den S-formede dose-responskurve generert, og 50 % effektiv konsentrasjon (EC50) ble beregnet under anvendelse av GraphPad Prism, versjon 4.01 for Windows (GraphPad Software, San Diego California, USA).

Celler ble oppbevart i fuktede inkubatorer ved 37 °C med 5 % C02i de følgende dyrkningsmedier: Al: Medium for opprettholdelse av kultur: Eagle-MEM med Earles BSS

(Cambrex, East Rutherford, NJ), supplert med 10 % føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin.

A2: Medium for antiproliferasjonsanalyser: Eagle-MEM med Earles BSS,

supplert med 5 % føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin.

Bl: Medium for opprettholdelse av kultur: Keratinocytt-SFM (Invitrogen,

Carlsbad, CA), supplert med 0,01 mg/ml bovin hypofyseekstrakt, 0,001 ug/ml rekombinant epidermvekstfaktor, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin.

B2: Medium for antiproliferasjonsanalyser: 4:l-blanding av Bl og A2.

Resultater

1. Selektiv antiproliferasionsaktivitet til amidatproleqemidlene i HPV- positive SiHa- celler sammenlignet med normale fibroblaster

Malet var å oppdage en forbindelse som inhiberer vekst av HPV-transformert lesjon uten å påvirke normale celler i epidermis og dermis (slik som keratinocytter og fibroblaster). In Wtro-antiproliferasjonsanalyser ble satt opp under anvendelse av SiHa-celler og HEL-celler, som modellerer henholdsvis HPV-omdannet lesjon og normale fibroblaster. SiHa-celler avledes fra plateepitelkarsinom i livmorhals forårsaket av HPV-16-infeksjon, og HEL-fibroblaster avledes fra normal human embryonlunge (tabell 39-1). Som vist i tabell 39-2, lå 50 % effektiv konsentrasjon (EC50) for de sju amidatprolegemidlene i SiHa-celler i området 0,13-3,2 nM, mens EC50i HEL-celler lå i området 12-727 nM, noe som indikerer at disse forbindelsene inhiberte proliferasjon av SiHa-celler mer effektivt enn HEL-celler. HEL/SiHa-selektivitetsindeks (HEL-EC50dividert med SiHa-EC50) lå i området fra 72 til 559 (tabell 39-2).

Alle sju amidatprolegemidlene gir den samme metabolitt, cprPMEDAP. cprPMEDAP metaboliseres videre til PMEG [Compton et al., 1999; Haste et al., 1999]. Antiproliferasjons-EC50for disse forbindelsene i SiHa-celler var mye høyere enn dem til prolegemidlene (tabell 39-2), noe som indikerer at festing av amidatrester forbedret styrke. Dessuten var HEL/SiHa-selektivitetsindekser for cprPMEDAP og PMEG henholdsvis 17 og 4,1 (tabell 39-2), noe som indikerer at prolegemidlene har bedre selektivitet enn cprPMEDAP, og cprPMEDAP har bedre selektivitet enn PMEG.

PMEG er kjent for å bli fosforylert til PMEGpp, som virker som en kjede-terminerende inhibitor for cellulær DNA-polymerase [Compton et al., 1999; Haste et al., 1999]. Fire kjente DNA-polymeraseinhibitorer (cidofovir, AraC, doksifluridin og afidikolin) og andre antikreftlegemidler med forskjellige virkningsmekanismer, inkludert DNA-topo-isomaraseinhibitorer (dakarbazin, ellipticin), DNA-alkylater (doksorubicin, mitoksantron, bleomycin, mekloretanamin) og tublininhibitorer (vinkristin, vinblastin, etoposid og indanocin) ble testet i SiHa- og HEL-celler (tabell 39-2). Antiproliferasjons-EC50for disse forbindelsene i SiHa-celler varierte, og noen var lik med eller sterkere enn de sju amidatprolegemidlene. Ikke desto mindre oppviste alle svake HEL/SiHa-selektivitetsindekser (0,01-3,98) sammenlignet med de sju amidatprolegemidlene.

Til sammen ble det funnet et unikt sett av forbindelser som oppviser sublave nM-antiproliferasjons-EC50i HPV-16-positive SiHa-karsinomceller, og mer enn 50 gangers selektivitet sammenlignet med HEL-fibroblaster.

2. Selektiv antiproliferasionsaktivitet til amidatprolegemidlene i HPV- positive SiHa- celler sammenlignet med normale keratinocytter

For å teste effekt av forbindelsene i normale celler fra epidermis ble det utført antiproliferasjonsanalyser under anvendelse av primære humankeratinocytter isolert fra hud (PHK) og livmorhals (CK). Antiproliferasjons-EC50-verdier erholdt med de sju prolegemidlene i PHK og CK var lavere enn dem i HEL, noe som indikerer at keratinocytter er mer følsomme enn fibroblaster (tabellene 39-2 og 39-3). Ikke desto mindre var PHK/SiHa- og CK/SiHa-selektivitetsindekser for disse prolegemidlene og cprPMEDAP enda bedre enn for kontroll-forbindelsene PMEG og en DNA-polymeraseinhibitor AraC (tabell 39-3). Prolegemidlene inhiberte således fortrinnsvis proliferasjon av HPV-16-positive SiHa-celler sammenlignet med normale keratinocytter fra hud og livmorhals.

3. Antiproliferasionsaktiviteter i andre HPV- positive celler

De sju prolegemidlene ble så testet i fem ytterligere cellelinjer avledet fra HPV-indusert livmorhalskarsinom (oppstilt i tabell 39-1) i antiproliferasjonsanalyser, og data er vist i tabell 4 sammen med SiHa-data. I SiHa-, C-41- og MS751-celler oppviste alle forbindelser bortsett fra forbindelse C sublave nM-antiproliferasjons-EC50. I CaSki, HeLa og ME-180 var imidlertid alle forbindelsene signifikant mindre sterke, idet EC50varierte fra 7,8 til 410 nM. Det synes ikke å være noen korrelasjon mellom resistens og HPV-type (16,18 eller 39) eller resistens og metastase (CaSki, MS751 og ME180 er avledet fra metastasert sted). Kontrollforbindelsen AraC (DNA-polymeraseinhibitor) inhiberte enhetlig alle cellelinjer med EC50-verdier i området 94-257 nM.

4. Antiproliferasionsaktiviteter i HPV- neqative karsinomceller

For å undersøke effekten av forbindelsene på HPV-negative karsinomcellelinjer ble tre cellelinjer (HT-3, SCC4, SCC9, tabell 39-1) testet i antiproliferasjonsanalyse. Som vist i tabell 39-4, var alle sju prolegemidler like eller mer sterke enn kontrollforbindelsen AraC.

Eksempel 40

Antiproliferasionsprøve

Antiproliferasjonsanalyser måler effekt av forbindelser på proliferasjon av dyrkede celler. Aktive forbindelser i antiproliferasjonsanalyser kan være cytostatiske (inhiberer celledeling) og/eller cytocidale (dreperceller). Ved å utføre antiproliferasjonsanalyser under anvendelse av HPV-positive karsinomceller og normale celler, identifiserer vi forbindelser som selektivt inhiberer proliferasjon av HPV-positive karsinomceller sammenlignet med celler fra normale humanvev. Tabell 40-1 oppsummerer karakteristika for hver celletype, inkludert seks livmorhalskarsinomcellelinjer omdannet ved hjelp av HPV, normale humanhudkeratinocytter (PHK) og normale lungefibroblaster (HEL). Hudkeratinocytter ble erholdt fra Cambrex (East Rutherford, NJ). Alle andre celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Celler ble løsnet fra dyrkningskolber under anvendelse av trypsin, telt og platet ut i 96-brønners dyrkningsplater (250-100 celler pr. brønn, avhengig av celletype). På den neste dag (definert som dag 0) ble 5 gangers seriefortynninger av forbindelser tilsatt in duplo. Sju dager etter tilsetning av forbindelser ble dyrkningsplater behandlet med 10 % trikloreddiksyre ved 4 °C i 1 time og vasket med vann. Denne fremgangsmåten gjorde det mulig for celleproteiner å binde seg til bunnoverflaten i plater. Proteiner ble farget med 0,4 % sulforodamin B i 1 % eddiksyre i 10 minutter, etterfulgt av grundig vasking med 1 % eddiksyre. Gjenværende fargestoff bundet til bunnen i plater ble oppløseliggjort i 10 mM Trizma-base, noe som genererte purpurfarge. Fargestyrken (proporsjonal med celleantall) ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 510 nm bølgelengde under anvendelse av spektrofotometer. Celler uten legemiddelbehandling (= 100 % proliferasjon) og celler behandlet med 10 uM kolchicin (celledelingsinhibitor) (= 0 % proliferasjon) ble brukt som kontroller for å bestemme % inhibering. % inhiberingsverdier ble plottet mot forbindelseskonsentrasjoner tilpasset en S-formet dose-responskurve, hvorfra forbindelseskonsentrasjonen som reduserte celleproliferasjonsgraden med 50 % (= EC50) ble bestemt. GraphPad Prism, versjon 4.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA) ble brukt til kurvetilpasningen og EC50-beregningen.

Apoptoseprøve ( kaspase 3- induksionsmetode)

Induksjon av kaspaser er en av de tidlige hendelsene forbundet med apoptose eller programmert celledød. Kaspaseaktivitet kan fastlegges kvantitativt ved å anvende fluorescerende substrat. Forbindelser som virker direkte på det apoptotiske reaksjonsspor kan indusere kaspase i en forholdsvis kort inkubasjonsperiode (< 24 timer). Forbindelser som forstyrrer annen cellefysiologi, som til sist forårsaker apoptose, kan kreve lengre inkubasjonsperiode (> 48 timer) for induksjon av kaspase. 10 000 celler ble platet ut i 96-brønners dyrkningsplater og inkubert med 5 gangers seriefortynninger av forbindelser i 24, 48 og 72 timer. Celler ble lysert, og aktivitet til kaspase i cellelysater ble målt under anvendelse av fluorescerende substrat i henhold til produsentens instruksjon (kaspase-prøvesett, Roche, Indianapolis, IN).

Apoptoseprøve ( annexin V- farqemetode)

Translokasjon av fosfatidylserin fra innersiden av cellemembranen til utsiden er en av de tidlige/mellomliggende hendelser forbundet med apoptose eller programmert celledød. Translokert fosfatidylserin kan fastlegges ved å inkubere celler med FITC-merket annexin V, som er et Ca<++->avhengig fosfolipidbindende protein. Når celler farges med annexin-FITC og propidiumjodid (som farger døde celler), er levende celler negative for begge fargestoffene, døde celler er positive for begge, mens apoptotiske celler er positive bare for annexin-FITC.

HPV-16-SiHa-celler ble dyrket med tre forskjellige konsentrasjoner av forbindelser i 3 eller 7 dager og samtidig farget med annexin-FITC og propidiumjodid. Farging av hver enkelt celle ble undersøkt ved hjelp av flow-cytometri.

Resultater

Selektiv antiproliferasionsaktivitet

Formålet ved denne fremgangsmåte var å identifisere forbindelser som inhiberer vekst av HPV-transformert lesjon uten å påvirke normale celler i epidermis og dermis (slik som keratinocytter og fibroblaster). Forbindelser ble derfor testet i SiHa-, PHK-og HEL-celler, som er modell for henholdsvis HPV-transformerte celler, normale keratinocytter og normale fibroblaster.

Representative forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelse oppviste påvisbare nivåer av antiproliferasjonsaktivitet i SiHa-celler, med 50 % effektiv konsentrasjon (EC50) som er lavere enn 25 000 nM. Aktive forbindelser ble også testet i HEL-celler. I alle tilfeller var EC50i HEL-celler høyere enn EC50i SiHa-celler, noe som indikerer at de aktive forbindelsene inhiberte proliferasjon av SiHa-celler mer effektivt enn HEL-celler. Andre nukleotid-/nukleosidanaloger, slik som PMEG (2-fosfono-metoksyetylguanin), Ara-C (cytarabin, CAS nr. 147-944) og gemcitabin (CAS nr. 95058-81-4), oppviste ikke slik selektivitet. Podofiloks (CAS nr. 518-28-5), den aktive bestanddel i antivortelegemidlet condyloks, oppviste heller ingen selektivitet.

Representative prolegemiddelforbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelse, slik som dem angitt i tabell 40-2, har aktiviteter. I de fleste tilfeller var prolegemidlene sterkere, og i noen tilfeller mer selektive, enn deres respektive moderforbindelser. Hoveddelen av fosfoamidatprolegemidlene var mer aktive og selektive enn podofiloks.

Til sammen ble det identifisert forbindelser som har sub-nM-antiproliferasjons-EC50i HPV-16-positive SiHa-celler og mer enn 50 gangers selektivitet sammenlignet med PHK-keratinocytter eller med HEL-fibroblaster.

Antiproliferasionsaktivitet i andre HPV+- cellelinjer

Utvalgte forbindelser ble også testet i fem ytterligere cellelinjer avledet fra HPV-indusert livmorhalskarsinom (se eksempel 39 og tabell 40-3). Hver forbindelse hadde forskjellige nivåer av aktiviteter i de seks HPV<+->cellelinjene, uansett typen av HPV som er til stede. Generelt var forbindelser sterkere i SiHa(HPV-16)-, C-41(HPV-18)- og MS751(HPV-18)-celler enn i CaSki(HPV-16)-, HeLa(HPV-18)- og ME-180(HPV-39)-celler.

Induksjon av apoptose ( kaspase 3- induksionsmetode)

En representativ forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelse ble testet for induksjon av apoptose i SiHa-celler. Når celler ble inkubert i 72 timer, ble det observert signifikant dose-responsinduksjon av kaspase, noe som indikerer at forbindelsen induserte apoptose. Induksjon av kaspase var mindre tydelig med 48 timers inkubasjon og ble ikke observert med 24 timers inkubasjon.

Induksjon av apoptose ( annexin V- farqemetode)

PMEG, N6-syklopropyl-PMEDAP og en representativ forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelse ble testet ved tre forskjellige konsentrasjoner med hensyn på induksjon av apoptose i SiHa-celler ved å anvende annexin V-propidiumjodiddobbelt-fargingsmetode. Med alle tre forbindelsene ble det observert en større prosentandel apoptoseceller på dag 7 enn på dag 3. Den ovenfor nevnte representative forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelse var den mest aktive når det gjelder å indusere apoptose; på dag 7 var 63,8 % av celler i kulturen behandlet med 0,2 ug/m av denne forbindelsen apoptotiske. I motsetning til dette hadde kulturer behandlet med 0,2 ug/ml PMEG og 0,5 ug/ml N6-syklopropyl-PMEDAP bare henholdsvis 1,2 % og 15,9 % apoptotiske celler.

(Cambrex, East Rutherford, NJ), supplert med 10 % føtalt bovint

serum, 2 mM glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml

streptomycin.

A2: Medium for antiproliferasjonsanalyser: Eagle-MEM med Earles BSS,

supplert med 5 % føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 enheter/ml

penicillin og 100 ug/ml streptomycin.

Bl: Medium for opprettholdelse av kultur: Keratinocytt-SFM (Invitrogen,

Carlsbad, CA), supplert med 0,01 mg/ml bovin hypofyseekstrakt, 0,001 ug/ml rekombinant epidermvekstfaktor, 100 enheter/ml

penicillin og 100 ug/ml streptomycin.

B2: Medium for antiproliferasjonsanalyser: 4:l-blanding av Bl og A2.

Eksempel 41

Kaninhudirritasionsstudie av forbindelser A og B

En studie ble utført for å evaluere potensialet til to forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelse når det gjelder å frembringe irritasjon ved administrering via dermal applikasjon til hannkaniner i sju på hverandre følgende dager. I alt seks hanner ble tatt med i studien, som vist i tabellen nedenunder.

Vehikkelet, de positive kontrollartiklene og testartiklene ble administrert dermalt én gang daglig i 7 dager under studien. Testartiklene ble administrert ved konsentrasjoner på 0,01, 0,03 og 0,1 %. De positive kontrollartiklene ble administrert ved konsentrasjoner på 0,1 % (PMEG) eller 1 % (cidofovir). Dosevolumet til alle formuleringene var et fast volum på 100 ul.

Teststedene for hvert dyr ble barbert før den første administrering og etter behov under studien. To steder ble klemt sammen på den venstre ryggside, og tre ble klemt sammen på den høyre ryggside. Omrisset av hver dosering (ca. 1 kvadrattomme hver) ble markert med merkeblekk. Det totale sammenklemte området omfattet ikke mindre enn 10 % av hele kroppsoverflaten til hvert dyr. Vehikkelet og den passende positive kontroll- og testartikkel ble administrert til hvert dyr innenfor et doseringssted på ca. 1 kvadrattomme. Vehikkel ble administrert på det venstre fremre sted (dosested 1), og den passende positive kontrollartikkel ble administrert til det venstre bakre sted (dosested 2). Den passende testartikkel ble administrert som følger: 0,01 % til det høyre fremre sted (dosested 3), 0,03 % til det høyre midtsted (dosested 4) og 0,1 % til det høyre bakre sted (dosested 5). Klemmer ble plassert på dyrene umiddelbart etter dosering i 1-2 timer.

Stedene ble evaluert med hensyn på erytem og ødem før dosering på dag 1 og daglig deretter, ca. 24 timer etter hver dose og før den neste dose. Hvert sted ble tildelt et irritasjonsresultat basert på Draize-skalaen for bedømmelse av hudirritasjon (Draize, J.H., Woodard, G., Calvery, H.O., Methods for the study of irritation of toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1944, 82:377-90).

Observasjoner med hensyn på dødelighet, sykelighet og tilgjengeligheten på for og vann ble utført to ganger daglig for alle dyrene. Nærmere kliniske undersøkelser ble utført før randomisering, før dosering på dag 1 og daglig deretter. Kroppsvekter ble målt og registrert dagen etter ankomst, før randomisering og før dosering på dagene 1, 3 og 7.

Avliving skjedde ved hjelp av intravenøs narkoseoverdose med natriumpentobarbitalbasert eutanasioppløsning og blodtømming ved å klippe over femoralkar. Dyrene ble undersøkt forsiktig med hensyn på utvendige unormaliteter, inkludert klumper. Huden ble løftet tilbake fra et bukmidtlinjesnitt, og eventuelle unormaliteter ble identifisert og korrelert med ante-mortemfunn. Buk-, bryst- og kraniehulene ble undersøkt med hensyn på unormaliteter, og organene ble fjernet, undersøkt og der hvor det var nødvendig, plassert i nøytralbufret formalin. Doseringsstedene, nyrene og eventuelle store lesjoner hos hvert dyr ble tatt ut og konservert. Mikroskopisk undersøkelse av fikserte hematoksylin- og eosinfargede parafinsnitt ble utført for hvert doseringssted for alle dyrene. Objektglassene ble undersøkt av en veterinærpatolog. Et firetrinns graderingssystem ble brukt for å definere graderbare lesjoner for sammenligning mellom dosegrupper.

Konklusjoner

De to testartiklene ga ikke merkbare kliniske funn, dermal irritasjon, endringer i kroppsvekt eller makroskopiske og mikroskopiske observasjoner ved noen dosekonsentrasjoner. Én av de positive kontrollene ble assosiert med kliniske funn og svake til middels makroskopiske og mikroskopiske observasjoner.

Eksempel 42

Kaninhudirritasjonsstudie av forbindelser B og H

En studie ble utført for å evaluere potensialet til to forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelse når det gjelder å frembringe irritasjon ved administrering via dermal applikasjon til hannkaniner i sju på hverandre følgende dager. I alt 24 hanner ble tatt med i studien.

Test- og kontrollartiklene ble administrert dermalt én gang pr. dag i sju på hverandre følgende dager under studien. Dosenivåene for forbindelse B var 0,03, 0,1 og 0,3 %. Dosenivåene for forbindelse H var 0,03, 0,1 og 0,3 %. Dosenivået for PMEG (positiv kontroll) var 0,1 %. Dosenivået for cPrPMEDAP (positiv kontroll) var 1,0 %. Dosenivået for vehikkelkontrollen var 0,0 % (dette ble dosert som både gel- og salveformuleringer). Dosevolumet for alle stedene var konstant 100 ul. Mindre enn 24 timer før den første administreringen ble håret klippet fra ryggen til dyret. Det klipte området omfattet ikke mindre enn 10 % av det totale kroppsoverflateareal. Man var forsiktig med å unngå å skade huden.

Test-, de positive kontroll- og vehikkelkontrollartiklene ble administrert innenfor et doseringssted på ca. 1" x 1". To doseringssteder ble plassert langs den venstre ryggoverflaten. Vehikkel- og den positive kontrollartikkelen ble administrert til det fremre sted, og lavdosen av testartikkelen ble administrert til det bakre sted. To doseringssteder ble plassert langs den høyre ryggoverflate. Midtdosen av testartikkelen ble administrert til det fremre sted, og høydosen av testartikkelen ble administrert til det bakre sted. Klemmer ble plassert på dyrene i ca. 2 timer umiddelbart etter dosering. Varigheten av klemming ble dokumentert i rådataene.

Observasjoner med hensyn på dødelighet, sykelighet og tilgjengeligheten på for og vann ble utført to ganger daglig for alle dyrene. Teststedene ble evaluert med hensyn på erytem og ødem før den første administreringen, og omtrent 24 timer etter hver administrering (før den neste planlagte dosering), og daglig i løpet av den 7 dager lange rekonvalesensperioden. Observasjoner med hensyn på kliniske tegn ble utført daglig under studien, samtidig som dermalobservasjonene. Kroppsvekter ble målt og registrert dagen etter mottak, før randomisering, før testartikkeladministrering på dag 1 og dagene 7 og 14, og ved nekropsi (dagene 8 og 15). Kroppsvekter målt ved mottak og før vilkårlig fordeling er ikke rapportert, men beholdt i studiefilen. Blodprøver (4-6 ml) vil bli tatt fra 6 dyr/gruppe ved avslutning og 3 dyr/gruppe ved rekonvalesens fra halsvenen og annen egnet vene for evaluering av kliniske patologiparametere.

Ytterligere blodprøver (ca. 1 ml) ble tatt fra alle dyrene, fra halsvenen og annen egnet vene for bestemmelse av plasmakonsentrasjonene av testartikkelen ca. 2 timer etter dosering på dag 7. Prøver ble plassert i rør inneholdende kalium-EDTA og lagret på isblokk inntil det ble sentrifugert. Dyr ble ikke fastet før blodprøvetaking. Prøver ble lagret ved -70 °C inntil undersøkelse.

Fullstendige nekropsiundersøkelser ble utført under fremgangsmåter godkjent av en veterinærpatolog på alle dyrene. Avliving skjedde ved hjelp av narkoseoverdose med natriumpentobarbitalbasert eutanasioppløsning via ørevenen/-arterien eller annen egnet vene og blodtappinger ved å klippe over femoralkarene. Dyrene ble undersøkt forsiktig med hensyn på utvendige unormaliteter, inkludert klumper. Huden ble løftet tilbake fra et bukmidtlinjesnitt, og eventuelle unormaliteter ble identifisert og korrelert med ante-mortemfunn. Buk-, bryst- og kraniehulene ble undersøkt med hensyn på unormaliteter, og organene ble fjernet, undersøkt og der hvor det var nødvendig, plassert i nøytralbufret formalin. Mikroskopisk undersøkelse av fikserte hematoksylin- og eosinfargede parafinsnitt ble utført på snitt av vev fra doseringsstedene (fire pr. dyr), nyrene og eventuelle store lesjoner.

På tidspunktet for nekropsi, dag 8 for hovedstudiedyr og dag 15 for rekonvalesensdyr, ble de fire doseringsstedene pr. dyr identifisert. Omtrent halvparten av hvert doseringssted ble skåret ut og så samlet sammen og konservert som nevnt ovenfor for histologisk prosessering. Mens den andre omtrent halvparten av hvert doseringssted fortsatt var intakt på dyret, ble de følgende fremgangsmåtes utført. Doseringsstedene ble tørket med tre gassbind med etanol (95 %) og fikk tørke fullstendig. Tape (3M-innpaknings-tape eller lignende) ble påført hvert doseringssted ti ganger. Et rent stykke tape ble brukt for hver anvendelse. De gjenværende deler av doseringsstedene ble så fjernet med sakser. Saksene ble vasket mellom hvert doseringssted og dyrene med aceton eller etanol. Rekkefølgen for dosestedfjerning var vehikkel- eller positivt kontrollsted, lavdosested, midt- dosested og høydosested. Et 1 cm<2>stykke vev ble fjernet fra hvert dosested. Vevsprøven ble veid og registrert. Hudstykkene ble oppstykket med rene sakser i individuelle scintillasjonsglass med passende størrelse. Kald fosfatbufret saltoppløsning (5 ml) ble tilsatt til scintillasjonsglasset. Vevet ble så homogenisert med 20 sekunders pulser under anvendelse av et mekanisk homogeniseringsapparat. Homogenatene ble hurtig nedfryst ved ca. -20 °C.

Konklusjoner

Basert på poengtall for dermal irritasjon og mikroskopiske funn var en av testartiklene ikke-irriterende i vehikkelgelen, men var et svakt til middels irritasjonsmiddel i vehikkelsalven. Den andre testartikkelen var et svært svakt irritasjonsmiddel i vehikkelgelen og et svakt irritasjonsmiddel når den ble formulert i vehikkelsalven.

Eksempel 43

Fremstilling av topisk farmasøytisk gelpreparat

Dette eksemplet illustrerer fremstillingen av et representativt topisk gelpreparat som inneholder en aktiv forbindelse med formel I. Et topisk gelpreparat fremstilles med den følgende sammensetning:

Andre forbindelser med formel I, slik som dem fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende beskrivelse, kan brukes som den aktive forbindelse ved fremstillingen av gelformuleringene i dette eksemplet.

De følgende bestanddeler er også blitt evaluert med hensyn på egnethet under utviklingen av denne formuleringen: isopropylmyristat (oppløsningsmiddel/kooppløsnings- middel/penetrasjonsfremmer),

polyetylenglykoler, triacetin (oppløsningsmidler),

cetylalkohol og stearylalkohol (stivelsesmidler),

karbomer (viskositetsfremmer) og

Tweens, Spans (emulgeringsmidler).

Eksempel 44

Fremstilling av topisk farmasøytisk salvepreparat

Dette eksemplet illustrerer fremstillingen av et representativt topisk salvepreparat som inneholder en aktiv forbindelse med formel I. Et topisk salvepreparat fremstilles med den følgende sammensetning:

Andre forbindelser med formel I, slik som dem fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende beskrivelse, kan brukes som den aktive forbindelse ved fremstillingen av salveformuleringene ifølge dette eksemplet.

polyetylenglykoler, triacetin (oppløsningsmidler),

cetylalkohol og stearylalkohol (stivelsesmidler),

karbomer (viskositetsfremmer) og

Tweens, Spans (emulgeringsmidler).

Claims

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har formel IA

hvor:Y1Aog Y<1B>er<->NH(R<X>); Rx er uavhengig av hverandre R<2>; R2 er a) etyl substituert med (C(=0)OR<4>, hvor R<4>er, etyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, syklobutyl, syklopentyl, n-heksyl eller n-oktyl; b) propyl substituert med (C(=0)OR<4>, hvor R<4>er, etyl, n-butyl, eller n-oktyl; eller c) metyl substituert med to R<3>hvor én R3 er benzyl og den andre R3 er C(=0)OR<4>, hvor R<4>er, etyl, n-butyl, iso-butyl, eller syklo-butyl, eller farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, som er valgt fra:

Forbindelse ifølge krav 1 eller 2 som har formel Forbindelse ifølge krav 1 eller 2 som har formel

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

6. Farmasøytisk preparat i følge krav 5 som omfatter en effektiv mengde av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, en effektiv mengde av minst ett antiviralt middel, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

7. Anvendelse av en forbindelse med formel IA eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av tumorer.

8. Anvendelse i følge krav 7 hvor forbindelsen med formel IA er valgt fra forbindelsene ifølge krav 2.

9. Anvendelse i følge krav 7 hvor forbindelsen med formel IA er forbindelsen ifølge krav 3.

10. Anvendelse i følge krav 7 hvor forbindelsen med formel IA er forbindelsen ifølge krav 4.

11. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 10, hvor medikamentet omfatter en effektiv mengde av en forbindelse med formel IA eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, en effektiv mengde av minst ett antiviralt middel, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

12. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 11, hvor medikamentet er et gelpreparat eller et salvepreparat.

13. Forbindelse som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 4 for anvendelse i en metode for behandling av tumorer.