PT2204374E - Fosfonatos nucleosídeos e seus análogos para o tratamento de infecções com hpv - Google Patents

Fosfonatos nucleosídeos e seus análogos para o tratamento de infecções com hpv Download PDF

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Xiaqin Cheng
Gary P Cook
Manoj C Desai
Edward Doerffler
Gong-Xin He
Choung U Kim
William A Lee
John C Rohloff
Jianying Wang
Zheng-Yu Yang
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Gilead Sciences Inc
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Description

1
DESCRIÇÃO
"FOSFONATOS NÚCLEOSÍDEOS E SEUS ANÁLOGOS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES COM HPV"
Antecedentes da Invenção
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a compostos úteis para tratar infecções virais, em particular o papilomavírus humano.
Antecedentes 0 papilomavírus humano (HPV) é uma das infecções sexualmente transmitidas mais predominantes no mundo. Existem mais do que 100 diferentes tipos de HPV, sendo a sua maioria inofensiva. No entanto, existem cerca de 30 tipos que são disseminados através do contacto sexual. Alguns tipos de HPV causam verrugas genitais, que surgem como um único ou múltiplos inchaços nas áreas genitais dos homens e mulheres incluindo a vagina, colo do útero, vulva (área externa da vagina), pénis, e recto. No entanto, existem muitas pessoas infectadas com HPV e que não apresentam qualquer sintoma.
Enquanto a maioria dos subtipos de HPV resulta em lesões benignas, certos subtipos podem induzir a lesões mais sérias. Infecções ano-genitais provenientes do HPV-16 e HPV-18, embora menos comuns do que o HPV-β e HPV-11, são mais frequentemente associadas a lesões pré-cancerosas em tecidos cervicais e anais, as quais são denominadas displasias. Os doentes com displasias são frequentemente assintomáticos e podem apenas descobrir as lesões após um exame de rastreio. As displasias de grau elevado, se não 2 forem devidamente tratadas, podem transformar-se em tecidos cancerosos. As lesões de baixo-grau podem regredir espontaneamente, enquanto outras podem progredir para lesões de grau elevado. 0 HPV-16 e HPV-18 são mais frequentemente associados a displasias, embora diversos outros subtipos de HPV transformantes sejam também associados a displasias. Estudos recentes indicam que até 89% de homens homossexuais HIV positivos podem ser infectados com estes subtipos de risco elevado de HPV. Os doentes HIV positivos têm igualmente maior probabilidade de ser infectados com múltiplos subtipos de HPV ao mesmo tempo, facto que é associado a um risco mais elevado de progressão de displasia.
As verrugas genitais são a doença sexualmente transmitida mais comum no mundo e são mais predominantes em indivíduos com idades compreendidas entre 17-33 anos de idade. 0 HPV-6 e o HPV-11 são responsáveis por quase 90% de todas as verrugas genitais, porém estas são raramente associadas a crescimentos neoplásicos. De acordo com a American Social Health Association, pelo menos 20 milhões de pessoas nos Estados Unidos encontram-se actualmente infectadas com HPV, com 5,5 milhões de novos casos de infecções de HPV sexualmente transmitidas que ocorrem anualmente. As verrugas genitais produzem normalmente inchaços indolores que provocam comichão e que se encontram localizados na ou próximo da zona genital, as quais, no entanto, sem tratamento, podem progredir para crescimentos tipo couve-flor mais pronunciados. Aproximadamente dois terços de pessoas que têm contacto sexual com uma pessoa infectada com verrugas genitais irão desenvolver verrugas dentro de um período de contacto de três meses. A regressão espontânea de verrugas genitais ocorre em 10 a 20% de casos 3 de verruga genital. No entanto, mesmo que a lesão regrida, a recorrência de verrugas genitais é comum em 50% após um ano. Como resultado das lesões disformes, é comum o tratamento de verrugas genitais. A evidência durante as últimas duas décadas deu lugar a uma ampla aceitação de que a infecção de HPV é necessária, todavia não suficiente, para o desenvolvimento de cancro cervical. Estima-se que a presença de HPV cancro cervical é de 99,7%. Pensa-se que o cancro anal tem uma associação similar entre a infecção de HPV e o desenvolvimento de displasia anal e cancro anal, como é o caso do cancro cervical. Num estudo em doentes HIV negativos com cancro anal, foi encontrada infecção por HPV em 88% de cancros anais. Nos Estados Unidos, em 2003, são previstos 12.200 novos casos de cancro cervical e 4.100 mortes por cancro cervical juntamente com 4.000 novos casos de cancro anal e 500 mortes por cancro anal. À medida que a incidência de cancro cervical tem vindo a diminuir nas últimas quatro décadas devido à existência de um rastreio mais alargado e abrangente, a incidência de cancro anal tem vindo a crescer. O aumento da incidência do cancro anal pode ser atribuída em parte à infecção de HIV, uma vez que doentes HIV positivos têm uma maior predisposição ao cancro anal comparativamente à população geral. Enquanto o cancro anal tem uma incidência de 0,9 casos por 100,000 na população geral, o cancro anal tem uma incidência de 35 casos por 100,000 na população masculina homossexual e 70 a 100 casos por 100,000 na população masculina homossexual HIV positiva. De facto, devido à prevalência elevada de displasia anal entre doentes infectados com HIV e uma tendência crescente de cancros anais, as Normas de USPHA / IDSA 2003 para o Tratamento de Infecções Oportunistas em 4
Doentes com HIV Positivo irão incluir linhas de orientação de tratamento para doentes diagnosticados com displasia anal. Não existe nenhuma cura conhecida para HPV. Existem tratamentos para verrugas genitais, embora estas desapareçam frequentemente, mesmo sem tratamento. 0 método de tratamento depende de factores, tais como o tamanho e localização das verrugas genitais. Entre os tratamentos utilizados é possível encontrar, creme Imiquimod, solução antimicótica de podofilina a 20 por cento, a solução de podofilox a 0,5 por cento, creme de 5-fluorouracilo a 5 por cento, e ácido tricloroacético. O uso de podofilina ou podofilox não é recomendado em mulheres grávidas, uma vez que estas substâncias são absorvidas pela pele e podem causar defeitos congénitos. O uso de creme de 5-fluorouracilo não é também recomendado em mulheres grávidas. Pequenas verrugas genitais podem ser fisicamente removidas por tratamento por congelamento (criocirurgia), electrocauterização ou laser. As grandes verrugas que não responderam a outro tratamento podem ter que ser removidas por cirurgia. Sabe-se que as verrugas genitais reapareceram após remoção física das mesmas e, nestes casos, tem sido utilizado α-interferão por injecção directa nas verrugas. Entretanto, α-interferão é dispendioso, e a sua utilização não reduz a taxa de reaparecimento das verrugas genitais. R. Snoeck, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, 3356-3361, avaliaram uma série de nucleosídeos acíclicos derivados do fosfonato considerando a sua capacidade para inibir o crescimento do vírus vaccinia nas monocamadas da célula epitelial e foram testados os derivados mais potentes nas culturas organotipicas. K.A Keith et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 2193.2198 5 avaliaram uma série de fosfonatos nucleosídeos (análogos para cidofovir, adefovir e tenofovir) relativamente à sua capacidade para inibir a replicação de vírus vaccinia ou vírus da varíola bovina em cultura de células no tecido. N. D. Christensen et al. Antiviral Research 48 (2000), 131-142, testou uma série de análogos nucleosídeos para a actividade do vírus anti-papiloma in vivo e descobriu que muitos desses análogos possuem uma actividade forte. A patente norte-americana 2003/0072814 divulga uma composição farmacêutica tópica para o tratamento de verrugas que contêm fosfonatos nuclesídeos e outros análogos nucleosídeos como compostos activos, tais como ciclopropil-9-(2-fosfonilmetoxietil)-2,6-diaminopurina.
Como tal, existe uma necessidade inadequada de tratamento eficaz de HPV. Foram surpreendentemente descobertos compostos que satisfazem esta necessidade, e que oferecem igualmente outros benefícios também.
Sumário da Invenção A invenção refere-se a um composto da fórmula IA para utilização no tratamento de infecções com papilomavirus (HPV)
IA em que: 6 Y1A e Υ1Β são NH(RX);
Rx é independentemente R2; R2 é (a) etilo substituído por C(=0)0R4, em que R4 é metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, i-butilo, s-butilo, t-butilo, 1- pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil- 2- butilo, 3-metil-l-butilo, 2-metil-l-butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, vinilo, alilo, ciclopentenilo, 5-hexenilo, etinilo ou propargilo; (b) propilo substituído por C(=0)0R4 em que R4 é um alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 18 átomos de carbono ou alcinilo de 2 a 18 átomos de carbono ou «5 3 x· 5 3 (c) metilo substituído por dois R em que um R e -R W e o outro R3 é C(=0)0R4 é um alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 18 átomos de carbono, ou alcinilo de 2 a 18 átomos de carbono; R5 é metileno; W3 é fenilo; ou um sal dos mesmos farmaceuticamente aceitável.
Descrição Detalhada da Invenção
Uma realização da presente invenção apresenta um composto da fórmula, 7
um
Uma realizaçao da presente invenção apresenta composto da fórmula,
um composto da fórmula,
Uma realizaçao da presente invenção apresenta um composto da fórmula,
um
Uma realizaçao da presente invenção apresenta composto da fórmula,
um
Uma realizaçao da presente invenção apresenta composto da fórmula, 9
Uma realizaçao da presente invenção composto da fórmula, apresenta um
um 10
Uma realização da presente invenção apresenta um composto da fórmula,
O
Um aspecto da presente realizaçao apresenta um composto utilizável como agente tópico anti-HPV.
Numa realização da presente invenção os compostos estão presentes sob a forma de uma composição farmacêutica que inclui uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula IA ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Um aspecto da presente realização apresenta uma composição farmacêutica, onde a composição é uma composição em gel.
Outro aspecto da presente realização apresenta uma composição farmacêutica, onde a composição é uma composição de pomada.
Uma realização da presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que inclui uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula IA ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, e uma quantidade eficaz de, pelo menos, um agente antiviral, e um veiculo farmaceuticamente aceitável. 11
Um aspecto da presente realizaçao apresenta composição farmacêutica, onde a composição é uma compos em gel.
Outro aspecto da presente realização apresenta composição farmacêutica, onde a composição é uma compos de pomada.
Definições 0 termo "PMEG" refere-se ao composto 9 fosfonilmetoxietil) guanina, uma ição uma ição -(2-
0 termo "PMEDAP" refere-se ao composto 9 fosfonilmetoxietil)-2,6-diaminopurina, -(2-
0 termo "cprPMEDAP" refere-se ao composto 9 fosfonilmetoxietil)-2-amino-6-(ciclopropil)-purina, 12
A "biodisponibilidade" é o grau no qual o agente farmaceuticamente activo se torna disponível para o tecido alvo após a introdução do agente no corpo. A intensificação da biodisponibilidade de um agente farmaceuticamente activo pode proporcionar um tratamento eficaz e mais eficiente para os doentes, uma vez que para uma determinada dose, parte do agente farmaceuticamente activo estará mais disponível nos sítios do tecido alvo.
Os termos "fosfonato" e "grupo de fosfonato" incluem fracções ou grupos funcionais dentro de uma molécula que compreende um fósforo que é 1) ligado por ligação simples a um carbono, 2) ligado por ligação dupla a um heteroátomo, 3) ligado por ligação simples a um heteroátomo, e 4) ligado por ligação simples a outro heteroátomo, em que cada heteroátomo pode ser igual ou diferente. Os termos "fosfonato" e "grupo de fosfonato" incluem também fracções ou grupos funcionais que compreendem um fósforo no mesmo estado de oxidação, tal como o fósforo acima descrito, assim como fracções ou grupos funcionais que compreendem uma fracção de pro-fármaco que pode ser separada de um composto de modo a que este possa reter um fósforo com as características acima descritas. Por exemplo, os termos "fosfonato" e "grupo de fosfonato" incluem ácido fosfónico, monoéster fosfónico, diéster fosfónico e fosfonamidato e grupos funcionais de fosfontioato. Numa realização 13 específica da invenção, os termos "fosfonato" e "grupo de fosfonato" incluem fracções ou grupos funcionais dentro de uma molécula que compreende um fósforo que é 1) ligado por ligação simples a um carbono, 2) ligado por ligação dupla a um oxigénio, 3) ligado por ligação simples a um oxigénio, e 4) ligado por ligação simples a outro oxigénio, assim como fracções ou grupos funcionais que compreendem uma fracção de um pró-fármaco que pode separar-se de um composto de modo a que este possa reter um fósforo com tais características. Numa outra realização específica da invenção, os termos "fosfonato" e "grupo de fosfonato" incluem fracções ou grupos funcionais dentro de uma molécula que compreende um fósforo que é 1) ligado por ligação simples a um carbono, 2) ligado por ligação dupla a um oxigénio, 3) ligado por ligação simples a um oxigénio ou azoto, e 4) ligado por ligação simples a outro oxigénio ou azoto, assim como fracções ou grupos funcionais que compreendem uma fracção de um pró-fármaco que pode separar-se de um composto de modo a que o mesmo possa reter um fósforo com tais características. São conhecidos métodos e receitas para determinar a estabilidade de compostos em secreções gastrointestinais substitutas. Os compostos são presentemente definidos como estáveis no tracto gastrointestinal onde menos do que cerca de 50% mol dos grupos protegidos são desprotegidos no suco gástrico ou intestinal substituto na incubação durante 1 hora a 37 °C. Estes compostos são adequados para a utilização nesta realização. De salientar que o facto destes compostos serem simplesmente estáveis para o tracto gastrointestinal não significa que os mesmos não possam ser hidrolisados in vivo. Os pro-fármacos serão tipicamente estáveis no sistema digestivo, mas são substancialmente 14 hidrolisados para o fármaco parental no lúmen digestivo, fígado ou outro órgão metabólico, ou dentro das células em geral.
Em determinados casos, os compostos da invenção podem também existir como isómeros tautoméricos. Por exemplo, os tautómeros eno-amino podem existir para sistemas de imidazol, guanidina, amidina, e tetrazol. 0 termo "pró-fármaco", tal como presentemente utilizado, refere-se a qualquer composto que quando administrado a um sistema biológico gera a substância do fármaco, isto é, ingrediente activo, como um resultado de reacção(ões) química(s) espontânea(s); reacção(ões) química(s) catalisada(s) por enzima, fotólise, e/ou reacção(ões) química(s) metabólica(s). Um pró-fármaco é, deste modo, uma forma latente ou análoga covalentemente modificada de um composto terapeuticamente activo. "Fracção de pro-fármaco" refere-se a um grupo funcional lábil que se separa do composto inibitório activo durante o metabolismo, sistemicamente, dentro de uma célula, por hidrólise, clivagem enzimática, ou por algum outro processo (Bundgaard, Hans, "Design and Application of Prodrugs" em A Textbook of Drug Design and Development (1991), P. Krogsgaard-Larsen e H. Bundgaard, Eds. Harwood Academic Publishers, pp. 113-191). As enzimas que têm capacidade para um mecanismo de activação enzimático com os compostos de pró-fármaco de fosfonato da invenção incluem, não se limitando, no entanto, a, amidases, esterases, enzimas microbianas, fosfolipases, colinesterases, e fosfases. As fracções de pro-fármacos podem servir para intensificar a solubilidade, a absorção e a lipofilicidade de forma a optimizar a libertação, a biodisponibilidade e a eficácia 15 do fármaco. A fracçao do pró-fármaco pode incluir um metabólito activo ou o próprio fármaco.
As fracções de pró-fármaco exemplificativas incluem -CH20C(=0)R de ésteres de aciloximetilo lábil ou hidroliticamente sensível e -CH20C(=0)0R de carbonatos de aciloximetilo onde, neste caso, R é alquilo-Ci-C6, alquilo-C1-C6 substituído, arilo-C6-C2o ou arilo-C6-C2o substituído. 0 éster de aciloxialquilo foi primeiro utilizado como uma estratégia de pró-fármaco para ácidos carboxílicos e em seguida aplicado a fosfatos e fosfonatos por Farquhar et al. (1983) J. Pharm. Sei. 72: 324; assim como nas patentes norte-americanas. nos 4816570, 4968788, 5663159 e 5792756. Subsequentemente, o éster de aciloxialquilo foi utilizado para transportar os ácidos fosfónicos através das membranas celulares e para intensificar a biodisponibilidade oral. Uma variante próxima do éster de aciloxialquilo, do éster de alcoxicarboniloxialquilo (carbonato), pode também intensificar a biodisponibilidade oral como uma fraeção do pró-fármaco nos compostos das combinações da invenção. Um éster de aciloximetilo exemplar é isopropilearboniloximetoxi, -OCH2OC(=0)C(CH3) 2 · Uma fraeção do pró-fármaco de carbonato de aciloximetilo exemplar é o carbonato de isopropilearboniloximetilo, HOC(=0)0CH20C(=0)C(M)2. 0 grupo de fosfonato pode ser uma fraeção do pro-fármaco de fosfonato. A fraeção do pró-fármaco pode ser sensível a hidrólise, tal como, embora não se limitando a, um grupo de carbonato de isopropilcarbonil-oximetoxi ou isopropilearboniloximetilo. Alternativamente, a fraeção do pró-fármaco pode ser sensível a clivagem potencializada enzimática, tal como um éster de lactato ou um grupo de éster de fosfonamidato. 16 Ésteres de arilo de grupos de fósforo, principalmente ésteres de fenilo, são apresentados para intensificar a biodisponibilidade oral (De Lombaert e outros (1994) J. Med. Chem. 37:498). Foram também descritos ésteres de fenilo que contêm um orto éster carboxilico para o fosfato (Khamnei and Torrence, (1996) J. Med. Chem. 39:4109-4115). Os ésteres de benzilo são apresentados para gerar o ácido fosfónico parental. Em alguns casos, os substituintes na posição orto ou para podem acelerar a hidrólise. Os análogos de benzilo com um fenol acilado ou um fenol alquilado podem gerar o composto fenólico através da acção de enzimas, por exemplo, esterases, oxidases, etc., a qual, por sua vez, é submetida a clivagem na ligação C-0 benzilico para gerar o ácido fosfórico e o intermediário de meteto de quinona. Os exemplos desta classe de pro-fármacos são descritos por Mitchell e outros (1992) J. Chem. Soc. Perkin Trans. II 2345; Glazier WO 91/19721. Foram ainda descritos outros pro-fármacos benzilicos que incluem um grupo que contém éster carboxilico ligado ao metileno benzilico. (Glazier WO 91/19721). Os pro-fármacos que contêm Tio são apresentados como úteis para o transporte intracelular de fármacos de fosfonato. Estes proésteres contêm um grupo de etiltio no qual o grupo de tiol é esterificado com um grupo de acilo ou combinado com outro grupo de tiol para formar um dissulfeto. A de-esterificação ou redução do dissulfeto gera o intermediário de tio livre que subsequentemente se desfazem em ácido fosfórico e epissulfeto (Puech e outros (1993) Antiviral Res., 22: 155-174; Benzaria e outros (1996) J. Med. Chem. 39: 4958). Os ésteres cíclicos de fosfonato têm sido igualmente descritos como pro-fármacos de compostos que contêm fósforo (Erion e outros, patente norte-americana. n° 6312662). 17 "Grupo de protecção" refere-se a uma fracção de um composto que mascara ou altera as características de um grupo funcional ou as características do composto como um todo. As estratégias e grupos de protecção químicos para protecção/desprotecção são bem conhecidos na técnica. Vide por exemplo, Protective Groups in Organic Chemistry, Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991. Os grupos de protecção são frequentemente utilizados para mascarar a reactividade de certos grupos funcionais, para ajudar na eficácia de reacções químicas desejadas, por exemplo, preparar e quebrar ligações químicas num modelo ordenado e planeado. A protecção de grupos funcionais de um composto altera outras características físicas para além da reactividade do grupo funcional protegido, tal como a polaridade, lipofilicidade (hidrofobicidade) , e outras características que podem ser medidas por instrumentos analíticos comuns. Os intermediários quimicamente protegidos podem ser inactivos ou biologicamente activos.
Os compostos protegidos podem também exibir características alteradas e, em alguns casos, optimizadas, in vitro e in vivo, tais como, a passagem através de membranas celulares e resistência a degradação enzimática ou sequestro. Neste caso, os compostos protegidos com efeitos terapêuticos intencionais podem ser referidos como pro-fármacos.
Outra função de um grupo de protecção é converter o fármaco parental num pró-fármaco, através da qual o fármaco parental é liberto na conversão do pró-fármaco in vivo. Considerando que os pro-fármacos activos podem ser absorvidos de modo mais eficaz comparativamente ao fármaco parental, os pro-fármacos podem possuir maior potência in vivo do que o fármaco parental. Os grupos de protecção são 18 removidos in vitro, no exemplo de intermediários quimicos, ou in vivo, no caso de pro-f ármacos. No caso dos intermediários quimicos, não é particularmente importante que os produtos resultantes após a desprotecção, por exemplo, os álcoois, sejam fisiologicamente aceitáveis, embora normalmente seja mais desejável que os produtos sejam farmacologicamente inócuos.
Exemplos de sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos da invenção incluem sais derivados de uma base apropriada, tais como um metal alcalino (por exemplo, sódio), um alcalino terroso (por exemplo, magnésio), amónio e NX4+ (em que X é alquilo-Ci-C4) . Os sais fisiologicamente aceitáveis de um átomo de hidrogénio ou um grupo de amino incluem sais de ácidos carboxilicos orgânicos, tais como ácidos acéticos, benzóicos, lácticos, fumáricos, tartáricos, maleicos, malónicos, málicos, isetiónicos, lactobiónicos e sucinicos; ácidos sulfónicos orgânicos, tais como ácidos metanossulfónicos, etanossulfónicos, benzenossulfónicos e p-toluenossulfónicos; e ácidos inorgânicos, tais como ácidos clorídricos, sulfúricos, fosfóricos e sulfâmicos. Os sais fisiologicamente aceitáveis de um composto de um grupo de hidroxi incluem o anião do referido composto em combinação com um catião adequado tal como Na+ e NX4+ (em que X é independentemente seleccionado de H ou de um grupo alquilo-Ci—C4) .
Tal como presentemente utilizado, o termo "gel" refere-se a sistemas semi-sólidos que consiste em suspensões preparadas com partículas inorgânicas pequenas ou moléculas orgânicas grandes delimitadas e interpenetradas por um líquido. Onde a massa de gel consiste em flocos de pequenas partículas, o gel é classificado como um sistema de duas fases e é algumas vezes denominado de magma. Aluminum 19
Hydroxide Gel e Bentonite Magma são exemplos de sistemas de duas fases. Os géis de fase única consistem em macro moléculas orgânicas uniformemente distribuídas através de um líquido de modo a que não se verifique qualquer limite aparente entre as macro moléculas dispersas e o líquido. Os exemplos de tais géis são Carboximetilcelulose Sódica e Tragacanto. Embora os géis sejam comummente aquosos, álcoois e óleos podem também ser utilizados como uma fase contínua.
Tal como presentemente utilizado, o termo "pomada" refere-se a uma preparação semi-sólida para aplicação externa de uma tal consistência que pode ser facilmente aplicada na pele por inunção. Estas preparações deve ter uma tal composição que possa amolecer e não necessariamente derreter quando aplicada ao corpo. Esta preparação serve como veículo para aplicação tópica de substâncias medicinais e funciona igualmente como protectores e emolientes para a pele.
Em termos de utilização terapêutica, os sais dos ingredientes activos dos compostos da invenção serão fisiologicamente aceitáveis, isto é, serão sais derivados de uma base ou de um ácido fisiologicamente aceitáveis. No entanto, os sais de ácidos ou bases que não são fisiologicamente aceitáveis podem também ter a sua utilização, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto fisiologicamente aceitável. "Alquilo" é um hidrocarboneto-Ci-Ci8 que contém átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos. Como exemplos, há que referir o metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n- 20 butilo, -CH2CH2CH2 CH3), 2-metil-l-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-meti1-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2 CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-meti1-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-meti1-1-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-l-butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2 CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3) , 3-hexilo (-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3) , 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH2CH3) CH(CH3) 2) r 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3. "Alcenilo" é um hidrocarboneto-C2-Ci8 que contém átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos, com, pelo menos, um local de insaturação, isto é, uma ligação dupla carbono-carbono, sp2. Exemplos deste incluem, embora não se limitem a, etileno ou vinilo (-CH=CH2) , alilo (-CH2CH=CH2) , ciclopentenilo (-C5H7) , e 5-hexenilo (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2). "Alcinilo" é hidrocarboneto-C2-Ci8 que contém átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos, com, pelo menos, um local de insaturação, isto é, uma ligação tripla carbono-carbono, sp. Exemplos deste incluem, embora não se limitem a, acetileno (-C=CH) e propargilo (-CH2Ce=CH) . 21
Tal como presentemente utilizado, o termo "Aba" refere-se a uma fracção divalente de ácido 2-aminobutanóico, 21
onde os pontos de ligaçao são designados por " *
Tal como presentemente utilizado, o termo "Ala" refere-se a uma fracção divalente de alanina,
onde os pontos de ligação são designados por " * ".
Tal como presentemente utilizado, o termo "Fe" refere-se a uma fracção divalente de fenilalanina,
onde os pontos de ligação são designados pelo " * ".
Tal como presentemente utilizado, o termo "POC" refere-se à fracção divalente de carbonato de isopropilo de hidroximetilo,
u * u onde o ponto de ligação é designado por 22
Os grupos subst ituintes Y1A e Y1B podem ser descritos utilizando-se a nomenclatura que incorpora as fracções de aminoácido divalente acima mencionadas e as porções de alquilo, tal como indicado na Tabela 37-3.
Por exemplo, o composto da fórmula,
pode ser descrito utilizando-se a nomenclatura da Fórmula I, onde Y1A e Y1B são -N(RX), onde Rx é R2, onde R2 é R4 substituído por R3d, onde R4 é etilo substituído por R3d e também onde R3d é -C(R3b)OW3, onde R3b é =0, onde W3 é W5, onde W5 é um carboxilo, onde R4 é propilo substituído por R3d, onde R3d é -C(R3b)OR4, onde R3b é =0, e onde R4 é etilo. Alternativamente, o referido composto pode ser descrito, como na Tabela 3 7-3, como Fórmula I, onde Y1A e Y1B são "Aba-Et", que descreve a fracção (onde " * " indica o ponto de ligação),
* o qual é "Aba" ligado a "Et" (etilo).
Por exemplo, o composto da fórmula
23 HjN
Ο' pode ser descrito utilizando-se a nomenclatura da Fórmula I, onde Y1A e Y1B são -N(RX), onde Rx é R2, onde R2 é R4 substituído por R3d, onde R4 é etilo substituído por R3d, onde R3d é -C(R3b)OR4, onde R3b é =0, e onde R4 é n-propilo. Alternativamente, o referido composto pode ser descrito, como na Tabela 3 7-3, como Fórmula I, onde Y1A e Y1B são "Ala-nPr", que descreve a fracção (onde " * " indica o ponto de ligação),
que é "Ala" ligado a "nPr" (n-propilo). 0 termo "quiral" refere-se a moléculas que têm a característica da não sobreposição da imagem de parceiro em espelho, ao mesmo tempo que o termo "aquiral" refere-se a moléculas que podem ser sobrepostas em parceiros simétricos. 0 termo "estereoisómeros" refere-se a compostos que possuem uma constituição química idêntica, mas que diferem no que se refere à disposição dos átomos ou grupos no espaço. 24 "Diaestereómero" refere-se a um estereoisómero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens de espelho uma da outra. Diaestereómeros têm caracteristicas físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, caracteristicas espectrais, e reactividades. As misturas de diaestereómeros podem separar-se sob procedimentos analíticos de alta resolução tais como electroforese e cromatografia.
Os "enantiómeros" referem-se a dois estereoisómeros de um composto que são imagens de espelho não sobrepostas uma da outra. 0 termo "tratamento" ou "tratando", no âmbito a que o mesmo se refere, a uma doença ou condição, inclui a prevenção da ocorrência da doença ou condição, inibição da doença ou condição, eliminação da doença ou condição, e/ou alívio de um ou mais sintomas da doença ou condição. 0 termo "antiproliferativo" refere-se a actividades utilizadas para, ou que tendem a inibir o crescimento celular, tal como efeitos antiproliferativos sobre células tumorais, ou efeitos antiproliferativos sobre células viralmente infectadas. 0 termo "apoptose" refere-se a um dos principais tipos de morte celular programada. Como tal, é um processo suicida deliberado por uma célula indesejada num organismo multicelular. Ao contrário da necrose, que é uma forma de morte celular que resulta da lesão de tecido aguda, a apoptose é realizada num processo ordenado que geralmente confere vantagens durante um ciclo de vida dum organismo. A apoptose é um tipo de morte celular em que a célula emprega um mecanismo celular especializado para se matar a si própria; um mecanismo suicida da célula que permite que os metazoários controlem o número de células e eliminem 25 células que ameacem a sobrevivência do animal. A apoptose pode ocorrer, por exemplo, quando uma célula é danificada e consequentemente irreparável, ou infectada com um virus. Os estímulos para a apoptose podem vir da própria célula, do seu tecido circundante ou de uma célula que é parte do sistema imune, a qual pode ser química, biológica ou física. 0 termo "apoptídico" refere-se ao processo de apoptose.
Definições estereoquímicas e convenções presentemente utilizadas seguem geralmente S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Muitos compostos orgânicos existem em formas opticamente activas, isto é, com capacidade de rodar o plano de luz polarizada no plano. Na descrição de um composto opticamente activo, os prefixos D e L ou R e S são utilizados para denotar a configuração absoluta da molécula à volta do(s) seu(s) centro(s) quiral(ais). Os prefixos d e 1 ou ( + ) e (-) são utilizados para designar o sinal de rotação da luz polarizada no plano pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levógiro. Um composto pré-fixo com ( + ) ou d é dextrógiro. Para uma determinada estrutura química, esses estereoisómeros são idênticos excepto os que são imagens de espelho um do outro. Um estereoisómero específico pode também ser referido como um enantiómero, e uma mistura de tais isómeros é frequentemente denominada de mistura enantiomérica. Uma mistura de 50:50 de enantiómeros é referida como uma mistura racémica ou um racemato, que pode ocorrer onde não existe nenhuma estéreo-selecção ou estéreo-especificidade num processo ou reacção química. Os termos "mistura 26 racémica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovidas de actividade óptica.
Grupos de Protecção
No âmbito da presente invenção, os grupos de protecção incluem fracções de pró-fármaco e grupos de protecção quimicos.
Os grupos de protecção encontram-se disponíveis e são comummente conhecidos e utilizados assim como são opcionalmente utilizados para prevenir reacções colaterais com o grupo protegido durante procedimentos sintéticos, isto é vias ou métodos para preparar os compostos da invenção. Em geral, a decisão de qual o grupo a proteger, o momento de tomar tal decisão, e a natureza do grupo de protecção quimica "PG" dependerá da química da reacção a ser protegida contra (por exemplo, condições acídicas, básicas, oxidativas, redutivas ou outras) e a direcção pretendida da síntese. Os grupos PG não necessitam ser, e geralmente não são, os mesmos se o composto for substituído com PG múltiplo. Em geral, PG será utilizado para proteger grupos funcionais, tais como grupos de carboxilo, hidroxilo, tio, ou amino para deste modo prevenir reacções colaterais ou para de outra maneira facilitar a eficácia sintética. A ordem de desprotecção para produzir grupos desprotegidos livres depende da direcção pretendida da síntese e das condições de reacção a serem encontradas, e pode ocorrer em qualquer ordem como determinado pelo técnico.
Podem ser protegidos vários grupos funcionais dos compostos da invenção. Por exemplo, grupos de protecção para grupos de -OH (se hidroxilo, ácido carboxílico, ácido fosfónico, ou outras funções) incluem "grupos formadores de 27 éter ou éster". Grupos formadores de éter ou éster são capazes de funcionar como grupos de protecção química nos esquemas sintéticos aqui mencionados. No entanto, alguns grupos de protecção de tio e hidroxilo não são grupos formadores de éter nem de éster, como será entendido pelos especialistas na técnica, e são incluídos com amidas, tal como abaixo discutido.
Um número muito grande de grupos de protecção de hidroxilo e grupos formadores de amida e reacções de clivagem química correspondentes são descritos em Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991, ISBN 0-471-62301-6) ("Greene"). Ver também Kocienski, Philip J.; Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1994), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em particular Capítulo 1, Protecting Groups: An OverView, páginas 1-20, Capítulo 2, Hydroxyl Protecting Groups, páginas 21-94, Capítulo 3, Diol Protecting Groups, páginas 95-117, Capítulo 4, Carboxyl Protecting Groups, páginas 118-154, Capítulo 5, Carbonyl Protecting Groups, páginas 155-184. Para grupos de protecção para ácido carboxílico, ácido fosfónico, fosfonato, ácido sulfónico e outros grupos de protecção para ácidos, ver Greene como mencionado abaixo. Estes grupos incluem, a título de exemplo e não de limitação, ésteres, amidas, hidrazidas, e outros.
Grupos de protecção formadores de éter e éster
Grupos formadores de éster incluem: (1) grupos formadores de éster de fosfonato, tais como ésteres de fosfonamidato, ésteres de fosforotioato, ésteres de fosfonato, e fosfon-bis-amidatos; (2) grupos formadores de éster de carboxilo, e (3) grupos formadores de éster de enxofre, tais como sulfonato, sulfato, e sulfinato. 28
As fracções de fosfonato dos compostos da invenção podem ou não ser fracções do pró-fármaco, isto é, podem ou não ser susceptíveis de modificação ou clivagem hidrolítica ou enzimática. Certas fracções de fosfonato são estáveis sob a maior parte ou quase todas as condições metabólicas. Por exemplo, um dialquilfosfonato, onde os grupos de alquilo têm dois ou mais carbonos, podem ter estabilidade apreciável in vivo devido a uma baixa taxa de hidrólise.
Sais e Hidratos
As composições desta invenção compreendem opcionalmente sais dos compostos aqui presentes, especialmente sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis que contêm, por exemplo, Na+, Li + , K+' Ca++ e Mg++. Estes sais podem incluir os sais derivados por combinação de catiões apropriados, tais como iões de metal alcalino e de metal alcalino-terroso ou iões de amino quaternário e amónio com uma fracção de anião de ácido. Os sais monovalentes são os preferidos se um sal solúvel em água for desejado.
Sais de metal são tipicamente preparados por reacção de um composto desta invenção com um hidróxido de metal. Os exemplos de sais de metal que são preparados desta maneira são os sais que contêm Li + , Na+, e K+. Um sal de metal menos solúvel pode ser precipitado da solução de um sal mais solúvel por adição do composto de metal adequado.
Além disso, os sais podem ser formados pela adição de ácido de certos ácidos orgânicos e inorgânicos, por exemplo, HC1, HBr, H2SO4, ou ácidos sulfónicos orgânicos, a centros básicos, ou a grupos acidicos. Finalmente, deve entender-se que as composições aqui incluídas compreendem compostos da invenção na sua forma não ionizada, bem como 29 híbrida, e combinações com quantidades estequiométricas de áqua como em hidratos.
Os sais dos compostos parentais com um ou mais aminoácidos estão iqualmente incluídos no âmbito desta invenção. Quaisquer dos aminoácidos acima descritos são adequados, especialmente os aminoácidos de ocorrência natural encontrados como componentes de proteína, embora o aminoácido seja tipicamente um suporte de cadeia simples com um grupo básico ou acídico, por exemplo, lisina, arginina ou ácido glutâmico, ou um grupo neutro, tal como glicina, serina, treonina, alanina, isoleucina, ou leucina.
Métodos de Inibição de HPV
Outro aspecto da invenção refere-se aos compostos da invenção para utilização em métodos para inibir a actividade de HPV incluindo a fase de tratamento de uma amostra suspeita de conter HPV com um composto da invenção.
As composições da invenção actuam como inibidores de HPV, como intermediários de tais inibidores ou têm outras utilidades como abaixo descrito. A fase de tratamento da invenção compreende a adição da composição da invenção à amostra ou compreende a adição de um precursor da composição à amostra. A fase de adição compreende qualquer método de administração como acima descrito.
Se desejado, a actividade de HPV após aplicação da composição pode ser observada por qualquer método incluindo métodos directos e indirectos de detecção da actividade de HPV. Métodos quantitativos, qualitativos, e semiquantitativos de determinação da actividade de HPV são todos contemplados. Um dos métodos de avaliação descritos acima é tipicamente aplicado. No entanto, é também 30 aplicável qualquer outro método, tal como observação das propriedades fisiológicas de um organismo vivo.
Rastreio para Inibidores de HPV
Os compostos e composições da invenção são avaliados quanto à utilidade terapêutica por meio de avaliação do EC50, que é a concentração do composto que obtém 50% de inibição de crescimento celular. A relação de EC5q em células infectadas e não infectadas por HPV apresenta uma medida da selectividade do composto para as células infectadas pelo vírus. Os protocolos utilizados para obter essas medidas são apresentados nos Exemplos.
Formulações Farmacêuticas e Vias de Administração
Os compostos desta invenção são formulados com excipientes e veículos convencionais, que serão seleccionados de acordo com a prática usual. Os comprimidos conterão excipientes, deslizantes, cargas, aglutinantes e similares. As formulações aquosas são preparadas em forma estéril, e quando destinadas a libertação por administração excepto oral, serão geralmente isotónicas. Todas as formulações conterão opcionalmente excipientes, tais como aqueles mencionados no "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (1986). Os excipientes incluem ácido ascórbico e outros antioxidantes, agentes quelantes, tal como EDTA, hidratos de carbono, tais como dextrina, hidroxialquilcelulose, hidroxialquilmetilcelulose, ácido esteárico e outros. O pH das formulações varia de cerca de 3 a cerca de 11, sendo normalmente cerca de 7 a 10.
Um ou mais compostos da invenção (aqui referidos neste contexto como os ingredientes activos) são administrados por qualquer via apropriada à condição a ser tratada. As vias de administração adequadas incluem oral, rectal, 31 nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal e parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural), e similares. Será apreciado que a rotina preferida possa variar com a condição do recipiente. Uma vantagem dos compostos desta invenção é que estes encontram-se oralmente biodisponíveis e podem ser doseados oralmente.
Ao mesmo tempo que é possível para os ingredientes activos serem administrados sozinhos, pode ser preferível apresentá-los como formulações farmacêuticas. As formulações, ambas para uso veterinário e humano, da invenção compreendem pelo menos um ingrediente activo, como definido acima, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos. Os portadore(s) devem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e fisiologicamente inócuos ao receptor dos mesmos.
As formulações incluem as adequadas para as vias de administração anteriormente referidas. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Técnicas e formulações são geralmente encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Estes métodos incluem a fase de associar o ingrediente activo com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral as formulações são preparadas uniforme e intimamente associando o ingrediente activo a veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, modelam o produto. 32
As formulações da invenção adequadas para administração oral são preparadas como unidades discretas, tais como cápsulas ou comprimidos, sendo que cada um destes contém uma quantidade pré-determinada do ingrediente activo; como um pó ou grânulos; como solução ou uma suspensão num liquido aquoso ou liquido não aquoso; ou como uma emulsão liquida oleosa em água ou uma emulsão liquida aquosa em óleo. 0 ingrediente activo pode também ser apresentado como um bólus, eletuário ou pasta.
Um comprimido é preparado por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos prensados podem ser preparados por compressão, numa máquina adequada, do ingrediente activo em uma forma de fluxo livre, tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, conservante, agente tenso-activo ou agente de dispersão. Os comprimidos moldados podem ser preparados por moldagem, numa máquina adequada, de uma mistura do ingrediente activo em pó humedecido com um diluente liquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou com ranhura e opcionalmente formulados a fim de facultar uma libertação lenta ou controlada do ingrediente activo do mesmo.
Para infecções oculares ou outros tecidos externos, por exemplo boca e pele, as formulações são preferivelmente aplicadas como uma pomada ou creme tópico contendo o(s) ingrediente(s) activo(s) numa quantidade de, por exemplo, 0,075 a 20% peso/peso (incluindo ingrediente(s) activo(s) numa ordem entre 0,1% e 20% em incrementos de 0,1% peso/peso, tal como 0,6% peso/peso, 0,7% peso/peso, etc), preferivelmente 0,2 a 15% peso/peso e mais preferivelmente 0,5 a 10% peso/peso. Quando formulados em forma de pomada, 33 os ingredientes activos podem ser utilizados com uma base de pomada miscivel em água ou parafina. Alternativamente, os ingredientes activos podem ser formulados em forma de creme com uma base de creme oleoso em água.
Se desejado, a fase aquosa da base de creme pode incluir, por exemplo, pelo menos 30% peso/peso de um álcool poli hidrico, isto é um álcool que contém dois ou mais grupos de hidroxilo, tal como propileno glicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol e glicol de polietileno (incluindo PEG 400) e misturas dos mesmos. As formulações tópicas podem incluir desejavelmente um composto que intensifique a absorção ou penetração do ingrediente activo através da pele ou outras áreas afectadas. Exemplos de tais intensificadores de penetração dérmica incluem o sulfóxido de dimetilo e análogos relacionados. A fase oleosa das emulsões desta invenção pode ser constituída por ingredientes conhecidos de uma maneira conhecida. Enquanto esta fase pode compreender simplesmente um emulsificante (também conhecido como um emulgente), pode também desejavelmente compreender uma mistura de, pelo menos, um emulsif icante com uma gordura ou um óleo ou com ambos, uma gordura e um óleo. Preferivelmente, um emulsificante hidrofílico é incluído juntamente com um emulsificante lipofílico que actua como um estabilizador. É também preferido incluir ambos, um óleo e uma gordura. Juntos, o(s) emulsificante(s) com ou sem estabilizadores(s) constituem a assim chamada cera emulsificante, e a cera juntamente com o óleo e gordura constituem a assim chamada base de pomada emulsificante que forma a fase oleosamente dispersa das formulações de creme.
Os emulgentes e estabilizadores de emulsão adequados para utilização na formulação da invenção incluem Tween® 34 60, Span® 80, álcool cetoestearílico, álcool benzílico, álcool miristílico, monoestearato de glicerilo e sulfato de laurilo de sódio. A escolha de óleos ou gorduras adequada para a formulação é baseada na obtenção das propriedades cosméticas desejadas. O creme deve preferivelmente ser um produto não gorduroso, não manchável e lavável com consistência adequada para evitar fugas nos tubos ou noutros recipientes. Cadeia linear ou ramificada, ésteres de alquilo mono- ou dibásico, tal como di-isoadipato, estearato de isocetilo, diéster de glicol de propileno de ácidos gordurosos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilexilo ou uma mistura de ésteres de cadeia ramificada conhecidos como Crodamol CAP pode ser utilizada, sendo os três últimos ésteres os preferidos. Esses podem ser utilizados sozinhos ou em combinação, dependendo das propriedades requeridas. Alternativamente, lipidios de ponto de fusão elevado, tal como parafina macia branca e/ou parafina liquida ou outros óleos minerais são empregados.
As formulações adequadas para administração tópica para o olho também incluem colirios em que o ingrediente activo é dissolvido ou suspenso num veiculo adequado, especialmente num solvente aquoso para o ingrediente activo. O ingrediente activo está preferivelmente presente em tais formulações numa concentração de 0,5 a 20%, vantajosamente 0,5 a 10% particularmente cerca de 1,5% peso/peso.
As formulações adequadas para administração tópica na boca incluem losangos compreendendo o ingrediente activo numa base aromatizada, usualmente sacarose e acácia ou 35 tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente activo numa base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e anti-sépticos bucais compreendendo o ingrediente activo num veiculo liquido adequado.
As formulações para administração rectal podem ser apresentadas como um supositório com uma base adequada compreendendo, por exemplo manteiga de cacau ou um salicilato.
As formulações adequadas para administração intrapulmonar ou nasal têm um tamanho de partícula, por exemplo, na ordem de 0,1 a 500 micrones (incluindo tamanhos de partícula, numa ordem entre 0,1 e 500 micrones em incrementos mícrons, tais como 0,5, 1, 30 micrones, 35 mícrons, etc.), que são administradas por inalação rápida através da passagem nasal ou por inalação através da boca a fim de alcançar os sacos alveolares. As formulações adequadas incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente activo. As formulações adequadas para administração por aerossol ou pó seco podem ser preparadas de acordo com métodos convencionais e podem ser libertadas com outros agentes terapêuticos, tais como compostos até agora utilizados no tratamento ou profilaxia de infecções por influenza A ou B como descrito abaixo.
As formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como formulações de pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou spray, que, para além do ingrediente activo, contêm estes veículos que na técnica são conhecidos como apropriados para o efeito.
As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injecção estéril aquosa e não aquosa que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do 36 receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes.
As formulações são apresentadas em recipientes de dose única ou múltiplas doses, por exemplo, frascos e ampolas seladas, e podem ser armazenadas numa condição seca por congelamento (liofilizadas) que requerem apenas a adição do veiculo liquido estéril, por exemplo água para injecção, imediatamente antes de utilização. Suspensões e soluções de injecção improvisadas são preparadas de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito. As formulações de dosagem única preferidas são aquelas que contêm uma dose diária ou subdose diária única, como acima mencionado, ou uma fracção apropriada da mesma, do ingrediente activo.
Deve entender-se que além dos ingredientes particularmente acima mencionados, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica relacionados com o tipo de formulação em questão, por exemplo os agentes adequados para administração oral podem incluir agentes de aromatização. A invenção apresenta também composições veterinárias compreendendo pelo menos um ingrediente activo como acima definido juntamente com um veiculo veterinário.
Os veiculos veterinários são materiais úteis para efeitos de administração da composição e podem ser materiais sólidos, líquidos ou gasosos que são de outro modo inertes ou aceitáveis na técnica veterinária e que são compatíveis com o ingrediente activo. Essas composições veterinárias podem ser administradas oralmente, parentéricamente ou por qualquer outra via desejada. 37
Os compostos da invenção são utilizados para fornecer formulações farmacêuticas de libertação controlada contendo como ingrediente activo um ou mais compostos da invenção ("formulações de libertação controlada") em que a libertação do ingrediente activo é controlada e regulada de modo a permitir uma dosagem de menor frequência ou para melhorar o perfil de toxicidade ou farmacocinético de um determinado ingrediente activo. A dose eficaz de ingrediente activo depende, pelo menos, da natureza da condição a ser tratada, toxicidade, em que medida o composto está a ser utilizado profilaticamente (doses menores) ou contra uma infecção por influenza activa, o método de libertação e a formulação farmacêutica, e será determinado pelo clinico utilizando estudos de escala de dose convencional. Pode estimar-se que esta formulação seja de cerca de 0,0001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia; tipicamente, de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia; mais tipicamente, de cerca de 0,01 a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dia; mais tipicamente, de cerca de 0,05 a cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal por dia. Por exemplo, para inalação a dose candidata diária para um ser humano adulto de aproximadamente 70 kg de peso corporal irá variar entre 1 mg e 1000 mg, preferivelmente entre 5 mg e 500 mg, e pode tomar a forma de doses únicas ou múltiplas.
Os ingredientes activos da invenção são também utilizados em combinação com outros ingredientes activos. Tais combinações são seleccionadas com base na condição a ser tratada, reactividades cruzadas de ingredientes e fármaco-propriedades da combinação. Por exemplo, quando se tratam infecções virais do sistema respiratório, em particular infecção por influenza, as composições da 38 invenção são combinadas com antivirais (tais como amantidina, rimantadina e ribavirina), mucolíticos, expectorantes, broncodilatadores, antibióticos, antipiréticos, ou analgésicos. Ordinariamente, antibióticos, antipiréticos, e analgésicos são administrados juntamente com os compostos desta invenção.
Utilizações Adicionais para os Compostos desta Invenção
Os compostos desta invenção, ou as substâncias biologicamente activas produzidas a partir destes compostos por hidrólise ou metabolismo in vivo, são utilizados como imunogénicos ou para conjugação para proteínas, onde servem como componentes de composições imunogénicas para preparar anticorpos capazes de se ligarem especificamente às proteínas, aos compostos ou aos seus produtos metabólicos que retêm epítopos imunologicamente reconhecidos (locais de ligação de anticorpo). As composições imunogénicas são, portanto, úteis como intermediários na preparação de anticorpos para utilização em métodos de diagnóstico, de controlo de qualidade, ou outros, ou em ensaios para os compostos ou seus novos produtos metabólicos. Os compostos são úteis para o aumento dos anticorpos contra polipeptídeos que não imunogénicos, em que os compostos funcionam como locais hapténicos que estimulam uma resposta imune, a qual interage com a proteína conjugada não modificada.
Os produtos de hidrólise de interesse incluem produtos da hidrólise dos grupos acídicos e básicos protegidos acima descritos. Como observado acima, as amidas acídicas ou básicas que compreendem polipeptídeos imunogénicos, tais como albumina ou hemocianina de Megathura são geralmente úteis como imunogénicos. Os produtos metabólicos acima descritos podem reter um grau substancial de reactividade 39 cruzada imunológica com os compostos da invenção. Desse modo, os anticorpos desta invenção serão capazes de se ligar aos compostos não protegidos da invenção sem se ligarem aos compostos protegidos; alternativamente os produtos metabólicos, serão capazes de se ligar aos compostos protegidos e/ou aos produtos metabólicos sem se ligarem aos compostos protegidos da invenção, ou serão capazes de se ligar especificamente a qualquer um ou todos os três. Os anticorpos desejáveis não irão interagir substancialmente com materiais de ocorrência natural. A interactividade substancial é a reactividade sob condições de ensaio especificas para analisados específicos suficientes para interferir com os resultados do ensaio.
Os imunogénicos desta invenção contêm o composto desta invenção apresentando o epítopo desejado em associação com uma substância imunogénica. Dentro do contexto da invenção, esta associação significa uma ligação covalente para formar um conjugado imunogénico (quando aplicável) ou uma mistura de materiais não covalentemente ligados, ou uma combinação dos acima indicados. As substâncias imunogénicas incluem adjuvantes, tais como adjuvante de Freund, proteínas imunogénicas, tal como polipeptídeos virais, bacterianos, de levedura, planta e animal, em particular hemocianina de Megathura, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, e polissacarídeos imunogénicos. Tipicamente, o composto que possui a estrutura do epítopo desejado é covalentemente conjugado a um polipeptídeo imunogénico ou polissacarídeo por meio da utilização de um agente de reticulação polifuncional (usualmente bifuncional). Os métodos para a produção de imunogénios de hapteno são, eles próprios, convencionais, e quaisquer dos métodos utilizados até agora, para conjugação 40 de haptenos com polipeptídeos imunogénicos ou similares são adequadamente utilizados aqui também, tendo em consideração os grupos funcionais dos produtos hidrolíticos ou precursores que se encontram disponíveis para reticulação assim como a probabilidade de produção de anticorpos específicos para o epítopo em questão como opostos à substância imunogénica.
Tipicamente o polipeptídeo é conjugado para um local no composto da invenção distante do epítopo a ser reconhecido.
Os conjugados são preparados num modelo convencional. Por exemplo, os agentes de reticulação N-hidroxissucinimida, anidreto succínico ou alqN=C=Nalq são úteis na preparação dos conjugados desta invenção. Os conjugados compreendem um composto da invenção ligado por uma ligação ou um grupo de ligação de 1-100, tipicamente, 1-25, mais tipicamente 1-10 átomos de carbono à substância imunogénica. Os conjugados são separados de materiais de partida e de produtos secundários utilizando a cromatografia ou método similar, e em seguida são filtrados estéreis e colocados em frascos para armazenagem.
Os animais são tipicamente imunizados contra os derivados ou conjugados imunogénicos e contra anticorpos anti-soro ou monoclonais preparados em modelo convencional.
Os compostos desta invenção são úteis como ligantes ou espaçadores na preparação de matrizes de absorção de afinidade, enzimas imobilizadas para o controlo do processo, ou reagentes de imunoensaio. Os compostos presentemente incluídos contêm uma multiplicidade de grupos funcionais que são adequados como sítios para reticulação das substâncias desejadas. Por exemplo, é convencional ligar reagentes de afinidade tais como hormonas, peptídeos, anticorpos, fármacos, e similares a substratos insolúveis. 41
Estes reagentes insolúveis são utilizados em modelos conhecidos para absorver parceiros de ligação para os reagentes de afinidade de preparações produzidas, amostras diagnósticas e outras misturas impuras. Similarmente, as enzimas imobilizadas são utilizadas para executar conversões catalíticas com recuperação fácil da enzima. Os compostos bifuncionais são comummente utilizados para ligar analitos a grupos detectáveis na preparação de reagentes diagnósticos.
Os ensaios de rastreio utilizam preferivelmente células de determinados tecidos susceptíveis a infecção por HPV. Os ensaios conhecidos na técnica são adequados para determinar a biodisponibilidade in vivo incluindo ensaios de estabilidade de lúmen intestinal, permeação celular, estabilidade de fígado homogeneizado e ensaios de estabilidade de plasma. No entanto, mesmo se o éster, amida ou outros derivados protegidos não forem convertidos in vivo para os grupos de carboxilo livre, amino ou hidroxilo, a sua utilidade como intermediários químicos mantém-se. A utilidade para a presente invenção foi explicada por meio de ensaios antiproliferação. Os ensaios antiproliferação avaliam o efeito de compostos sobre a proliferação de células cultivadas. As células são cultivadas durante 7 dias na presença de várias concentrações de compostos. Ao 7° dia, as células são coradas com tinta, e intensidade da coloração (proporcional ao número de célula) é avaliada por espectrofotómetro. Os dados são registados em função das concentrações de composto, ajustados à curva de resposta de dose sigmóide, da qual a concentração de composto que reduz a taxa de proliferação celular por 50% (50% de concentração eficaz ou EC50) é determinada. Os compostos activos em ensaios 42 antiproliferação podem ser citostáticos (inibem a divisão celular) e/ou citocidas (mata células). Ao se realizarem os ensaios antiproliferação em células de cancro HPV positivas e células normais, identificamos compostos que inibem a proliferação de células de cancro HPV positivas de modo mais eficaz do que células de tecidos humanos normais. Métodos Exemplificativos de Preparação dos Compostos da Invenção. A invenção refere igualmente métodos de preparação das composições da invenção. As composições são preparadas por quaisquer das técnicas aplicáveis de síntese orgânica. Muitas destas técnicas são bem conhecidas na técnica. No entanto, muitas das técnicas conhecidas são elaboradas em "Compendium of Organic Synthetic Methods" (John Wiley & Sons, New York), Vol. 1, Ian T. Harrison e Shuyen Harrison, 1971; Vol. 2, Ian T. Harrison e Shuyen Harrison, 1974; Vol. 3, Louis S. Hegedus e Leroy Wade, 1977; Vol. 4, Leroy G. Wade, jr., 1980; Vol. 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; e Vol. 6, Michael B. Smith; bem como March, J., "Advanced Organic Chemistry, Terceira Edição", (John Wiley & Sons, New York, 1985), "Comprehensive Organic Synthesis. Selectivity, Strategy & Efficiency em Modern Organic Chemistry. Em 9 Volumes", Barry M. Trost, Editor-in-Chief (Pergamon Press, Nova Iorque, impressão em 1993).
Abaixo indicado encontra-se um número de métodos exemplares para a preparação das composições da invenção. Estes métodos destinam-se a ilustrar a natureza destas preparações e não se destinam a limitar o âmbito dos métodos aplicáveis.
Geralmente, as condições de reacção, tais como temperatura, tempo de reacção, solventes, procedimentos de preparação, e similares, serão aquelas comuns na técnica 43 para a reacção específica ser realizada. 0 material de referência citado, juntamente com o material presentemente citado, contém descrições detalhadas destas condições. Normalmente as temperaturas serão -100°C a 200°C, os solventes serão apróticos ou próticos, e os tempos de reacção serão 10 segundos a 10 dias. A preparação consiste tipicamente em atenuar quaisquer reagentes não reagidos seguindo-se a divisão entre um sistema de camada orgânica/água (extracção) e a separação da camada que contém o produto.
As Reacções de redução e de oxidação são tipicamente realizadas em temperaturas próximas da temperatura ambiente (cerca de 20°C), embora no que se refere às reduções de hidreto de metal a temperatura seja frequentemente reduzida para 0°C a -100°C, e os solventes são tipicamente apróticos para reduções e podem ser próticos ou apróticos para oxidações. Os tempos de reacção são ajustados para se obterem conversões desejadas.
As reacções de condensação são tipicamente realizadas em temperaturas próximas da temperatura ambiente, embora sejam também comuns para temperaturas reduzidas de condensações cineticamente controladas não equilibradas (0°C a -100°C) . Os solventes podem ser próticos (comuns em reacções equilibradas) ou apróticos (comuns em reacções cineticamente controladas).
As técnicas sintéticas padrão, tais como remoção azeotrópica de subprodutos de reacção e utilização de condições de reacção anidrosa (por exemplo, ambientes de gás inerte) são comuns na técnica e serão utilizadas quando aplicáveis.
Os métodos exemplares de preparação dos compostos da invenção são apresentados nos esquemas abaixo. As 44 descrições detalhadas dos métodos são encontradas na secção experimental abaixo, e são referenciadas aos esquemas específicos.
Esquemas
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Esquema 10
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53
Cada dos produtos dos seguintes processos é opcionalmente separado, isolado, e/ou purificado antes da respectiva utilização em processos subsequentes.
Os termos "tratado", "tratando", "tratamento", e similares, quando utilizados no contexto de um processo químico, protocolo, ou preparação significam contactar, misturar, reagir, permitir reagir, colocar em contato, e outros termos comuns na técnica para indicar que uma ou mais entidades químicas é tratada de modo a converter a mesma em uma ou mais outras entidades químicas. Isto significa que "tratar o composto um com o composto dois" é sinónimo de "deixar o composto um reagir com o composto dois", "contactar o composto um com o composto dois", "reagir o composto um com o composto dois", e outras expressões comuns na técnica de síntese orgânica para razoavelmente indicar que o composto um foi "tratado", "feito reagir", "deixado reagir", etc., com o composto dois.
No contexto de um processo químico, protocolo, ou preparação, "tratando" indica a maneira razoável e usual em que produtos químicos orgânicos são feitos reagir. Salvo indicação contrária, pretendem-se concentrações normais (0,01M a 10M, tipicamente 0,1M a 1M) , temperaturas (-100°C a 250°C, tipicamente -78°C a 150°C, mais tipicamente -78°C a 100°C, ainda mais tipicamente 0°C a 100°C), vasos de reacção (tipicamente vidro, plástico, metal), solventes, pressões, atmosferas (tipicamente ar para reacções insensíveis a água e oxigénio ou azoto ou árgon para reacções sensíveis a água e oxigénio) etc. O conhecimento de reacções similares conhecidas na técnica de síntese orgânica é utilizado na selecção de condições e aparelhos para "tratamento" num determinado processo. Em particular, 54 um especialista na técnica de síntese orgânica selecciona condições e aparelhos razoavelmente preparados para o sucesso na realização das reacções químicas dos processos descritos com base no conhecimento da técnica.
As modificações de cada um dos esquemas acima indicados originam vários análogos dos materiais exemplares específicos produzidos acima. As citações acima mencionadas que descrevem os métodos adequados de síntese orgânica são aplicáveis a tais modificações.
Em cada um dos esquemas exemplares acima referidos, pode ser vantajoso separar os produtos de reacção entre si e/ou dos materiais de partida. Os produtos desejados de cada fase ou séries de fases são separados e/ou purificados (doravante separados) para se obter o grau desejado de homogeneidade pelas técnicas comuns na técnica. Tipicamente estas separações envolvem uma extracção de fases múltiplas, cristalização de um solvente ou mistura de solvente, destilação, sublimação, ou cromatografia. Cromatografia pode envolver qualquer número de métodos incluindo, por exemplo, exclusão por tamanho ou cromatografia de permuta iónica, cromatografia líquida de pressão elevada, média, ou baixa, escala pequena e cromatografia preparativa de camada fina ou grossa, bem como técnicas de camada fina de escala pequena e cromatografia instantânea.
Outra classe de métodos de separação envolve tratamento de uma mistura com um reagente seleccionado para se ligar a ou tornar de outro modo separável um produto desejado, material de partida não reagido, reacção por produto, ou similares. Estes reagentes incluem adsorventes ou absorventes, tais como carbono activado, peneiras moleculares, veículo de permuta iónica, ou similares. Alternativamente, os reagentes podem ser ácidos no caso de 55 um material básico, bases no caso de um material acidico, reagentes de ligação, tais como anticorpos, proteínas de ligação, quelantes selectivos, tais como éteres coroa, reagentes de extracção iónica líquida/líquida (LIX), ou similares. A selecção de métodos apropriados de separação depende da natureza dos materiais envolvidos, por exemplo, ponto de ebulição, e peso molecular em destilação e sublimação, presença ou ausência de grupos funcionais polares em cromatografia, estabilidade de materiais em veículos acídicos e básicos em extracção de fases múltiplas, e similares. Um especialista na técnica aplicará técnicas com maior probabilidade para se obter a separação desejada. A invenção foi descrita em detalhes suficientes para permitir que um especialista na matéria pudesse produzir e utilizar a matéria objecto das reivindicações seguintes. Os seguintes exemplos são apresentados para exemplificar a presente invenção, e de modo algum podem ser construídos no sentido de limitar a presente invenção, a qual é definida exclusivamente pelas reivindicações anexas.
Exemplos
Gerais
Alguns exemplos foram realizados inúmeras vezes. Em exemplos repetidos, as condições de reacção, tais como tempo, temperatura, concentração e similares, e produções encontravam-se dentro dos trâmites experimentais normais. Em exemplos repetidos onde se registaram modificações significativas, estas foram observadas nos casos em que os resultados apresentavam uma variação significativa comparativamente aos descritos. Em exemplos onde diferentes materiais de partida foram utilizados, estes foram 56 observados. Quando os exemplos repetidos se referem a um análogo "correspondente" de um composto, tal como um "éster de etilo correspondente", isto pressupõe que um grupo de outro modo presente, tipicamente neste caso um éster de metilo, é considerado ser o mesmo grupo modificado tal como indicado.
Exemplos 1 a 35 referem-se aos Esquemas 1 a 9 acima.
Exemplo 1
Acetoxietiloximetilcloreto 1: Um balão de três gargalos de 5 L foi equipado com misturador mecânico, termómetro, funil adicional de 500 mL e purgado com árgon. Foi adicionado 1,3-Dioxalano (140 mL, 2,00 moles) em Et20 anidroso (800 mL) e 1,0 M de ZnCl2/Et20 (7,5 mL, 0,007 mol). Foi adicionada uma solução de cloreto de acetilo (157 mL, 2,2 0 moles) em Et20 (200 mL) em gotas através de um funil adicional durante 20 minutos. Foi utilizado um banho de água fria para manter a temperatura entre 19 - 27 °C. Agitação continua sem arrefecimento externo durante 4 horas, auto aquecimento da reacção em 20 - 25 °C durante cerca de 1 hora. Uma solução incolor transparente mantida sob árgon durante a noite. Em repouso durante 3 dias formou uma solução laranja. Separar o Et20 em rotavap (aspirador de água) até não destilar mais em banho a 35°C. Foi obtida uma produção quantitativa do produto 318 g (rendimento teórico 306 g).
Exemplo 2
Fosfonato de di-isopropilo 2: Um frasco de três gargalos de 500 mL foi carregado com o clorometiléter 1 bruto (317 g, 2,00 moles). Foi adicionado triisopropilfosfito (494 mL) em gotas através de um funil adicional ao mesmo tempo que era aquecido num banho de óleo 57 a 125 °C e agitado vigorosamente. Recolha de 2-cloropropano destilado por meio um caminho curto terminava num recipiente arrefecido por gelo seco, manta de árgon, recolheu-se 140 g de destilado (157 g teóricas). Reacção de fosfito aclarou para amarelo, continuou a aquecer durante mais 2 horas em banho de óleo a 125 °C, e foi depois preparada para destilação a vácuo utilizando-se uma bomba a vácuo. Destilado um corte frontal amarelo (140 g, cabeça a 135°C, pé a 190°C), em seguida trocado para um recipiente limpo. A fracção principal foi recolhida a temperatura de cabeça de 178 - 187°C (principalmente 185 - 187°C) sob vácuo desconhecido e temperatura de banho de 222 - 228°C. 258 g do produto 2 foram fornecidas (47% de produção de 1,3-dioxolano).
Exemplo 3
Álcool 3: Uma solução de 2 (125 g, 0, 443 mol) em MeOH absoluto (440 mL) foi tratada com HC1 concentrado (11,2 mL, 0,112 mol) e aquecida até se obter refluxo durante 6 horas sob árgon. Separar MeOH em rotavap (aspirador de água) a 55°C deixando 115 g de um óleo claro que foi co-evaporado com tolueno (2 x 200 mL). O produto bruto foi seco em vácuo para se obter um óleo (102 g, 96%).
Exemplo 4
Fosfonato de di-isopropilo 4: Uma solução de trifenilfosfina (25,57 g, 97,5 mmoles) e álcool 3 (18 g, 75 mmoles) em DMF (120 mL) foi tratada com 6-cloropurina (12,72 g, 75 mmoles) e arrefecida para -15°C. Uma solução de azodicarboxilato de di-isopropilo (16,68 g, 82,5 mmoles) em DMF (50 mL) foi adicionada em gotas através de um funil adicional durante 80 minutos. A mistura da reacção foi mantida a -15°C durante 2 horas e em seguida aquecida para temperatura ambiente e agitada durante mais 2 horas. Uma 58 mistura de reacção turva acabou por se tornar numa solução amarela-brilhante. 0 solvente da reacção foi evaporado sob pressão reduzida, co-evaporado com tolueno (3 x), e seco sob vácuo durante a noite antes da purificação. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (5% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o fosfonato de di-isopropilo (18,52 g, 63%) como um sólido branco:
3Η RMN (CDCI3) δ 7,95 (s, k·. 1—1 4, 70 (m, 2H), 4,31 (m, 2H) , 3,93 (m, 2H), 3,73 (m, 2H) , 1,29 (m, 12H) ; 31P RMN (CDC13) δ 18,42.
Exemplo 5
Fosfonato de Diisopropilo 5: Uma mistura de 4 (11,00 g, 28,08 mmoles) e ciclopropilamina (4,86 g, 85,16 mmoles) em CH3CN (80 mL) foi colocada em uma bomba de reacção e aquecida a 100 °C durante 4 h. A mistura da reacção foi arrefecida à temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O produto foi dividido ao meio 15% de MeOH/CH2Cl2 (3 x) e salmoura, seco com Na2S04, filtrado, e concentrado. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (5% de MeOH/CH2Cl2) para se obter 5 (10,42 g, 90%) como uma espuma amarela-clara: 3H RMN (CDCI3) δ 7,59 (s, 1H), 5,83 (amplo, s, 1H), 4,88 (amplo, s, 2H) , 4,70 (m, 2H) , 4,21 (m, 2H) , 3,88 (m, 2H) , 3,72 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,03 (amplo, s, 1H), 1,28 (m, 12H), 0,84 (m, 2H) , 0,60 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 18,63.
Exemplo 6 cPrPMEDAP 6: Uma solução de 5 (11,00 g, 26,67 mmoles) em CH3CN anidroso (120 mL) foi tratada com bromotrimetilsilano (21,1 mL, 160,02 mmoles). A reacção foi protegida da luz envolvendo o frasco com folha de alumínio. A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente 59 durante a noite. Os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. 0 resíduo foi dissolvido em H2O (250 mL) e pH foi ajustado para 9 com hidróxido de amónio. A mistura da reacção foi concentrada e obteve-se um sólido amarelo. O sólido foi dissolvido em H20 (30 mL) e pH foi ajustado para 2 com 10% HC1. Um sólido fino foi recolhido e seco em vácuo para se obter 6 (7,88 g, 90%) como um sólido branco.
Exemplo 7
Cloridrato de Ácido Monofosfónico 7: Uma mistura de ácido 6 (3,00 g, 9,15 mmoles) e DMF (0,1 mL) em sulfolano (9,2 mL) foi aquecida a 70 °C. Foi adicionado tionilcloreto (1,66 mL, 22,76 mmoles) em gotas durante um período de 1 h. A temperatura foi aumentada para 90 °C e TMSOPh (1,74 mL, 9,61 mmoles) foi adicionado e agitado durante 1 h. A mistura da reacção foi arrefecida à temperatura ambiente durante a noite. A mistura da reacção foi adicionada em gotas a uma acetona gelada bem agitada (100 mL). O produto foi evaporado. O sólido foi filtrado sob Ar, lavado com acetona gelada (100 mL), seco em vácuo para se obter o Cloridrato de Ácido Monofosfónico (3,70 g, 92%) como um sólido.
Exemplo 8
Monofosfonamidato 8: Uma mistura de ácido monofosfónico 7 (0,22 g, 0,50 mmol), Cloridrato de éster de metilo de L-alanina (0,14 g, 1,00 mmol), e trietilamina (0,21 mL, 1,50 mmol) em piridina (3 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,39 g, 1,75 mmol) e trifenilfosfina (0,46 g, 1,75 mmol) em piridina (2 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio 60
EtOAc e NaHCC>3 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monof osf onamidato (97 mg, 39% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma esbranquiçada.
Exemplo 9
Monofosfonamidato 9: Uma mistura de ácido monofosfómico 7 (0,88 g, 2,00 mmoles), cloridrato de éster de metilo de D-alanina (0,84 g, 6,00 mmoles), e trietilamina (0,84 mL, 6,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (1,56 g, 7,00 mmoles) e trifenilfosfina (1,84 g, 7,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monof osf onamidato (0,40 g, 41% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma branca.
Exemplo 10
Monofosfonamidato 10: Uma mistura de ácido monofosfónico 7 (0,88 g, 2,00 mmoles), Cloridrato de éster de terc-butilo de L-alanina (1,31 g, 6,00 mmoles), e trietilamina (0,84 mL, 6,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (1,54 g, 7,00 mmoles) e trifenilfosfina (1,84 g, 7,00 mmoles) em piridina (8 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção 61 foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SC>4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monof osf onamidato (0,38 g, 36% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma laranja clara.
Exemplo 11
Monofosfonamidato 11: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de etilo de L-alanina (94 mg, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2CI2) para se obter o monof osf onamidato (74 mg, 48% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,61 (d, J = 4,2 Hz, 1H),
7, 26 - 7, 08 (m, 5H) , 4,23 (m, 2H) , 4,13 (m, 2H) , 4,09 (m, 1H), 3, 92 - 3,85 (m, 4H), 3,03 (amplo, s, 1H) , 1,30 - 1,26 (m, 3H), 1,24 (m, 3H) , 0,88 (m, 2H) , 0,63 (m, 2H) ; 31P RMN (CDCI3) δ 21, 94, 20,68.
Exemplo 12 62
Monofosfonamidato 12: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (1,50 g, 4,56 mmoles), Cloridrato de éster de n-propilo de L-alanina (1,59 g, 9,49 mmoles), fenol (2,25 g, 22,80 mmoles) e trietilamina (10,50 mL, 54,72 mmoles) em piridina (8,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (6,54 g, 31,92 mmoles) e trifenilfosfina (7,32 g, 31,92 mmoles) em piridina (8,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monof osf onamidato (0,43 g, 18%, Composto E, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: XH RMN (CDC13) δ 7,61 (d, J = 5,1 Hz, 1H) , 7,27 - 7, 09 (m, 5H) , 4,27 - 4, 20 (m, 2H) , 4,16 - 4,00 (m, 3H), 3,93 - 3,82 (m, 4H), 3,04 (amplo, s, 1H) , 1,63 (m, 2H) , 1,30 (dd, 3H), 0,92 (m, 3H) , 0,89 (m, 2H) , 0,63 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21, 89, 20,66.
Exemplo 13
Monofosfonamidato 13: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de isopropilo de L-alanina (0,10 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto 63 foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCg saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SC>4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monofosfonamidato (87 mg, 55% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela: ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,60 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,26 - 7,09 (m, 5H) , 4,98 (m, 1H) , 4,23 (m, 2H) , 4,06 (m, 1H) , 3,91 - 3,83 (m, 4H), 3,04 (amplo, s, 1H), 1,29 - 1,21 (m, 9H), 0,89 (m, 2H) , 0,63 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21,85, 20,68.
Exemplo 14
Monofosfonamidato 14: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-butilo de L-alanina (0,11 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2CI2) para se obter o monof osf onamidato (80 mg, 50% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: XH RMN (CDC1 3) δ 7,61 (d, J = 4, 20 Hz, 1H) 7,27 - 7,08 (m, 5H); 5,93 (amplo, s, 1H) , 4, 97 (amplo, s 2H) , 4,23 (m, 2H), 4,10 - 4,08 (m, 3H) , 3, 91 - 3,84 (m 4H) , 3,03 (amplo, s, 1H) , 1,58 (m, 2H) , 1,34 - 1,27 (m 64 5Η) , 0, 92 - 0, 89 (m, 5H) , 0,63 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21,94, 20,68.
Exemplo 15
Monofosfonamidato 15: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-hexilo de L-alanina (0,13 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2.13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCh saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatograf ia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o monofosfonamidato (0,10 g, 59% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: 3Η RMN (CDC13) δ 7,59 (d, J = 4,20 Hz, 1H), 7,26 - 7, 08 (m, 5H) , 4,22 (m, 2H) , 4,11 (m, 1H) , 4,06 (m, 2H) , 3,91 - 3,84 (m, 4H) , 3,01 (amplo, s, 1H) , 1,59 (m, 2H), 1,31 - 1,27 (m, 9H), 0,89 (m, 3H), 0,86 (m, 2H) , 0,62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDCI3) δ 21, 94, 20,68.
Exemplo 16
Monofosfonamidato 16: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanilo de L-alanina (0,15 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2.13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em 65 piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatograf ia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o monofosfonamidato (0,13 g, 73% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: 3Η RMN (CDC13) δ 7,59 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,25 - 7, 07 (m, 5H) , 4,22 (m, 2H) , 4,10 (m, 1H) , 4,07 (m, 2H) , 3,90 - 3,84 (m, 4H) , 3,02 (amplo, s, 1H) , 1,59 (m, 2H), 1,29 - 1,26 (m, 13H), 0,88 (m, 3H), 0,85 (m, 2H), 0,60 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21, 96, 20,69.
Exemplo 17
Monofosfonamidato 17: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol) , Cloridrato de éster de etilo de ácido L-2-aminobutírico (72 mg, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monof osf onamidato (66 mg, 60% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 66 7, 26 - 7, 08 (m, 5H) , 5,91 (amplo, s, 1H) , 4,97 (amplo, s 2H), 4,22- 4, 12 (m, 4H), 4,01- 3, 81 (m, 5H), 3,03 (amplo S, 1H), 1,71 - 1,60 (m, 2H), 1,24 (m, 3H), 0,89 (m, 2H) 0,84 - 0, 76 (m, 3H) , 0,63 (m, 2H); 31P RMN (CDC13) δ 22,15 20,93.
Exemplo 18
Monofosfonamidato 18: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (1,00 g, 3,05 mmoles), Cloridrato de éster de n-butilo de ácido L-2-aminobutírico (1,19 g, 6,09 mmoles), fenol (1,43 g, 15,23 mmoles) e trietilamina (5,10 mL, 36,60 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (4,70 g, 21,32 mmoles) e trifenilfosfina (5,59 g, 21,32 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCh saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (5% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monof osf onamidato (0,7 g, 42%, Composto G, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma branca: 3Η RMN (CDC1 3) δ 7,60 (d, J = 6,60 Hz, 1H), 7,27 - 7, 04 (m, 5H) , 5, 89 (amplo, s , 1H) , 4 ,94 (amplo, s, 2H) , 4,22 (m, 2H), 4 ,07 - 3,99 (m, 3H) , • 3, 91 - 3,84 (m, 4H) , 3,03 (amplo, s, 1H) , 1,70 - 1 ,57 (m, 4H) , 1,35 (m, 2H) , 0,92 - 0,75 (m, 8H) , 0,63 (m, 2H) ; 3 lp RMN (CDCI3) δ 22,21, 20,95.
Exemplo 19
Monofosfonamidato 19: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanilo de ácido L-2-aminobutirico (0,15 g, 0,60 mmol), fenol (0,14 g, 67 1,52 mmol) e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,13 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,13 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCL saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatograf ia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o monofosfonamidato (0,12 g, 64% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,62 (d, J = 6,60 Hz, 1H) 7, 25 - 7,08 (m, 5H), 4,24 - 4,21 (m 2H), 4,09 - 4,04 (m 2H) , 4,00 (m, 1H), 3 ,91 - 3,83 (m, 4H) , 3,01 (amplo, r s 1H) , 1, 70 - 1,58 (m, 4H), 1,27 (m, 10H), 0,89 - 0,76 (m co 0,62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDCI3 ) δ 22,22, 20,92.
Exemplo 20
Monofosfonamidato 20: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (1,5 g, 4,57 mmoles), Cloridrato de éster de etilo de L-fenilalanina (2,10 g, 9,14 mmoles), fenol (2,15 g, 22,85 mmoles) e trietilamina (7,64 mL, 54,84 mmoles) em piridina (8,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (7,05 g, 31,99 mmoles) e trifenilfosfina (8,39 g, 31,99 mmoles) em piridina (7,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto 68 foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (5% de MeOH/CH2CÍ2) para se obter um sólido amarelo-claro 1,32 g contendo aproximadamente 10% de impureza. O sólido amarelo (1,32 g, 2,28 mmoles) foi dissolvido em iPrOH (10 mL) e transferido para uma solução de iPrOH quente (30 mL) de ácido fumárico (0,27 g, 2,28 mmoles) e agitado a 80 °C por 30 min. A mistura de reacção foi gradualmente arrefecida à temperatura ambiente e o sal de fumarato foi recolhido a 0 °C. O sal de fumarato resultante foi
neutralizado pela divisão de NaHCCh (2 x) e EtOAc. A fase orgânica foi lavada com salmoura, H20, seca com Na2SC>4, filtrado, e concentrado. O produto foi seco sob vácuo para se obter o monofosfonamidato (0,70 g, 26%, Composto A, 1:1 mistura diastereomérica) como uma espuma branca: ΤΗ RMN
(CDC1 3) δ 7,54 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,27 - 6,98 (m, 10H), 4,35 (m, 1H) , 4, 16 (m, 2H), 4,08 (m, 2H) , 3,84 - 3,61 (m, 3H) , 3,33 (m, 1H) , 3,02 (amplo, s, 1H) , 2,95 - 2,87 (m, 2H) , 1,17 (m, 3H) , 0,87 (m, 2H) , 0,61 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21,88, 21,07.
Exemplo 21
Monofosfonamidato 21: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), Cloridrato de éster de n-butilo de L-fenilalanina (0,11 g, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, 69 filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monofosfonamidato (30 mg, 23% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: 3H RMN (CDCI3) δ 7,55 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7.25 - 6, 98 (m, 10H), 4,36 (m, 1H), 4,17 (m, 2H) , 4,02 (m, 2H), 3,83 - 3,35 (m, 4H), 3,02 (amplo, s, 1H) , 2,94 - 2,86 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,29 (m, 2H), 0,90 (m, 3H) , 0,88 (m, 2H) , 0,62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21,85, 21,05.
Exemplo 22
Monofosfonamidato 22: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), Cloridrato de éster de isobutilo de L-fenilalanina (0,11 g, 0,42 mmol), fenol (0,10 g, 1,05 mmol) e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCb saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SC>4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (7% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o monof osf onamidato (65 mg, 50% e 1:1 da mistura diastereomérica) como uma espuma amarela-clara: 3H RMN (CDCI3) δ 7,56 (d, J = 3,6 Hz, 1H) , 7.26 - 6,98 (m, 10H), 4,40 (m, 1H), 4,17 (m, 2H), 3,82 (m, 2H) , 3, 75 - 3,62 (m, 3H) , 3,35 (m, 1H) , 3,04 (amplo, s, 1H), 2, 96 - 2, 87 (m, 2H), 1,83 (m, 1H) , 0,90 (m, 2H), 0,86 (m, 6H), 0,63 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21, 82, 21,03.
Exemplo 23 70
Bisfosfonamidato 23: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de etilo de L- alanina (0,28 g, 1,80 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (10% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o bisf osf onamidato (80 mg, 50%,) como uma espuma amarela-clara: ΧΗ RMN (CDCI3) δ 7,63 (s, 1H) , 5,88 (amplo, s, 1H) , 4,96 (amplo, s, 2H) , 4,24 - 4,16 (m, 6H) , 4,00 (m, 2H) , 3,86 (m, 2H) , 3,72 (m, 2H) , 3,01 (amplo, s, 1H) , 1,36 (m, 6H), 1,26 (m, 6H) , 0,86 (m, 2H) , 0,61 (m, 2H) ; 31P RMN (CDCI3) δ 20,63.
Exemplo 24
Bisfosfonamidato 24: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (1,00 g, 3,05 mmoles), Cloridrato de éster de n-propilo de L-alanina (3,06 g, 18,30 mmoles), e trietilamina (5,10 mL, 36,50 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (4,70 g, 21,32 mmoles) e trifenilfosfina (5,59 g, 21,32 mmoles) em piridina (5,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com 71 salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o bisfosfonamidato (1,13 g, 71%, Composto F) como uma espuma amarela- clara: 3H RMN (CDCI3) δ 7, 65 (s, \—1 5,92 (amplo, s, 1H) , 5,03 (amplo, s, 2H) , 4, 24 (m, 2H) , 4,10 - 4,02 (m, 6H), 3,87 (m, 2H) , 3,73 (m, 2H) , 3,03 (amplo, s, 1H) , 1,65 (m, 4H) , 1,37 (m, 6H), 0,93 (m, 6H) , 0,88 (m, 2H), 0,63 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 20,61.
Exemplo 25
Bisfosfonamidato 25: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,60 g, 1,83 mmol), Cloridrato de éster de isopropilo de L-alanina (1,84 g, 10,98 mmoles), e trietilamina (3,06 mL, 21,96 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (2,82 g, 12,80 mmoles) e trifenilfosfina (3,36 g, 12,80 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura de reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCU saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SC>4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o bisfosfonamidato (0,53 g, 52%, Composto B) como uma espuma amarela-clara: λΕ RMN (CDCI3) δ 7,65 (s, 1H) , 5, 00 (m, 2H) , 4,24 (m, 2H) , 3,97 (m, 2H) , 3,87 (m, 2H) , 3, 71 (m, 2H), 3,01 (amplo, s, 1H) , 1,34 (m, 6 H), 1,23 (m, 12H) , 0,86 (m, 2H) , 0,62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDCI3) δ 20,59.
Exemplo 26 72
Bisfosfonamidato 26: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-butilo de L-alanina (0,33 g, 1,82 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (10% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o bisf osf onamidato (97 mg, 55%) como uma espuma amarela-clara: ΧΗ RMN (CDC13) δ 7,63 (s, 1H) , 4,24 (m, 2H) , 4,09 (m, 4H ), 4, 01 (m, 2H) , 3,86 (m, 2H) , 3,72 (m, 2H) , . 3, 01 (amplo, s, 1H) , 1, 61 (m, 4H), 1,37 (m, 10H), 0 ,93 (m, 6H G 00 00 o 2H) , 0, 61 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 20,59 .
Exemplo 27
Bisfosfonamidato 27: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-hexilo de L-alanina (0,38 g, 1,80 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com 73 salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatograf ia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o bisf osf onamidato (0,13 g, 65: %) como uma espuma amarela- clara: ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,62 (s, 1H) , 4, 23 (m, 2H) , 4,09 (m, 4H) , 4,01 (m, 2H) , 3,86 (m, 2H) , 3, 72 (m, 2H) , 2,99 (amplo, s, 1H) , 1,61 (m, 4H) , 1,36 - 1,29 (m, 18H), 0,88 (m, 6H) , 0,84 (m, 2H) , 0,60 (m, 2H) ; 31p RMN (CDCI3) δ 20,61.
Exemplo 28
Bisfosfonamidato 28: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanilo de L-alanina (0,43 g, 1,80 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aguecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura de reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. 0 produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCu saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SC>4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o bisfosfonamidato (0,13 g, 61%) como uma espuma amarela- clara : ΤΗ RMN (CDCI3) δ 7,61 (s, 1H), 4,21 (m, 2H) , 4, 07 4,00 (m, 6H) , 3,84 - 3, 70 (m, 4H) , 2,98 (amplo, s, 1H) 1,60 (m, 4H) , 1,34 (m, 6H), 1,27 (m, 20H) , 0,87 (m, 6H) 0,83 (m, 2H) , 0,58 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 20,63.
Exemplo 29
Bisfosfonamidato 29: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,70 g, 2,13 mmoles), Cloridrato de éster de etilo de 74 ácido L-2-aminobutírico (2,15 g, 12,80 mmoles), e trietilamina (3,57 mL, 25,56 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (3,29 g, 14.91 mmoles) e trifenilfosfina (3,92 g, 14,91 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH2C12) para se obter o bisfosfonamidato (0,71 g, 60%, Composto D) como uma espuma amarela-clara: ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,64 (s, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,16 (m, 4H), 3,89 - 3,87 (m, 4H) , 3,72 (d, J = 9,0 Hz, 2H) , 3,01 (amplo, s, 1H), 1,78 - 1,64 (m, 4H), 1,26 (m, 6H), 0,91 (m, 6H), 0,87 (m, 2H) , 0,61 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 21,23.
Exemplo 30
Bisfosfonamidato 30: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,70 g, 21,32 mmoles), Cloridrato de éster de n-butilo de ácido L-2-aminobutírico (2,50 g, 12,80 mmoles), e trietilamina (3,57 mL, 25,56 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (3,29 g, 14.91 mmoles) e trifenilfosfina (3,92 g, 14,91 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto 75
foi purificado por cromatografia de coluna de silica-gel (10% de MeOH/CH2CI2) para se obter o bisfosfonamidato (0,40 g, 31%, Composto C) como uma espuma amarela-clara: λΕ RMN (CDC13) δ 7,64 (s, 1H ) , 4,24 (m, 2H ), 4,11 (m, 4H) , 3 ,91 (m, 2H) t 3,87 (m, 2H ) , 3, 71 (d, J = 9,0 Hz, 2H) , 3 , 03 (amplo, s, 1H), 1,79 - 1, 6 4 (m , 4H) f 1,60 (m, 4H) , 1, 37 (m, 4H) , 0, 94 (m, 6H) , 0, 90 (m, 6 H) , o, r 86 (m, 2H) , 0, 62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDCI3) δ 21, 25.
Exemplo 31
Bisfosfonamidato 31: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,10 g, 0,30 mmol), Cloridrato de éster de n-octanilo de ácido L-2-aminobutírico (0,33 g, 1,82 mmol), e trietilamina (0,51 mL, 3,60 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,47 g, 2,10 mmoles) e trifenilfosfina (0,56 g, 2,10 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCU saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SC>4, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatograf ia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o bisfosfonamidato (0,12 g, 55%) como uma espuma amarela- clara: ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,64 (s, 1H) , 4, 24 (m, 2H), 4, 13 - 4,05 (m, 4H) , 3, 91 (m, 2H), 3 ,87 - 3, 72 (m , 4H) , 3,01 (amplo, s , 1H) , 1,78 - 1,65 (m, 4H) , 1,61 - 1, 29 (m, 24H), 0,91 (m, 6H) , 0,89 (m , 6H), 0,86 (m, 2H) , 0 , 62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC1 3) δ ; 21,20.
Exemplo 32
Bisfosfonamidato 32: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,60 g, 1,82 mmol), Cloridrato de éster de etilo de L- 76 fenilalanina (2,51 g, 10,96 mmoles), e trietilamina (3,06 mL, 21,84 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (2,82 g, 12,74 mmoles) e trifenilfosfina (3,36 g, 12,74 mmoles) em piridina (3,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHCCp saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o bisfosfonamidato (0 , 53 g, 43%) como uma espuma amarela clara: ΧΗ RMN (CDC13 ) δ 7, 48 (s, 1H) , 7,22 - 7, 06 (m, 10 H) 4,20 (m, 1H) , 4, 12 (m , 4H) , 4,09 (m , 2 H) 4,04 (m, 1H) 3,63 (m, 2H) , 3,33 - 3,21 (m, 2H) , 3, 04 - 2, 78 (m, 5H) 1,20 (m, 6H) , 0, 83 (m, 2H) , 0,58 (m, 2H) ; 31P RMN (CDCI3) 20,38.
Exemplo 33
Bisfosfonamidato 33: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 irtmol), Cloridrato de éster de n-butilo de L-fenilalanina (0,33 g, 1,26 iranol) , e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por 77 cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o bisf osf onamidato (0,11 g, 70%) como uma espuma amarela-clara: 1R RMN (CDC13) δ 7,51 (s, 1H), 7,23 -7,06 (m, 10H), 4,23 (m, 1H) , 4,11 - 4,05 (m, 7H) , 3,65 (m, 2H) , 3,35 - 3,23 (m, 2H) , 3,01 (m, 1H), 3, 04 - 2, 78 (m 4H) , 1,57 (m, 4H) , 1,33 (m, 4H) , 0,92 (m, 6H) , 0, 86 (m 2H) , 0,61 (m, 2H); 31P RMN (CDC13) δ 20,35.
Exemplo 34
Bisfosfonamidato 34: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (70 mg, 0,21 mmol), Cloridrato de éster de isobutilo de L-fenilalanina (0,33 g, 1,26 mmol), e trietilamina (0,36 mL, 2,52 mmoles) em piridina (1,0 mL) foi aquecida a 60 °C durante 5 min. Uma solução de aldritiol amarela-brilhante recentemente preparada (0,33 g, 1,47 mmol) e trifenilfosfina (0,39 g, 1,47 mmol) em piridina (1,0 mL) foi adicionada à mistura da reacção acima. A reacção foi agitada a 60 °C durante a noite, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel (10% de MeOH/CH2Cl2) para se obter o bisf osf onamidato (78 mg, 50%) como uma espuma amarela-clara: XH RMN (CDC13) δ 7,52 (s, 1H), 7,24 - 7,07 (m, 10H), 4,26 (m, 1H) , 4,11 (m, 2H) , 4,01 (m, 1H) , 3.85 (m, 4H) , 3,66 (m, 2H) , 3,35 - 3,25 (m, 2H) , 3,07 - 2.85 (m, 3H) , 2, 97 - 2, 79 (m, 2H) , 1,89 (m, 2H) , 0,90 (m, 12H), 0,89 (m, 2H) , 0,62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) δ 20,31.
Exemplo 35
BisPOC de cPrPMEDAP 35: Uma mistura de ácido fosfónico 6 (0,20 g, 0,61 mmol) e trietilamina (0,42 mL, 3,01 mmoles) em 1-metil-2-pirrolidinona (2,0 mL) foi aquecida a 60 °C 78 durante 30 min. POCC1 (0,45 g, 2,92 mmoles) foi adicionado. A mistura de reacção foi agitada a 60 °C durante 3 h, arrefecida à temperatura ambiente, e concentrada. O produto foi dividido ao meio EtOAc e NaHC03 saturado. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2S04, filtrada, e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatograf ia na ISCO (2-propanol/CH2Cl2) para se obter o bisPOC de cPrPMEDAP (0,13 g, 39%) como um sólido: ΤΗ RMN (CDCI3) δ 7,58 (s, 1H), 5,66 (m, 4H) , 4,92 (m, 2H) , 4,22 (m, 2H) , 3,90 - 3, 88 (m, 4H) , 3,01 (amplo, s, 1H), 1,81 (m, 12H), 0,86 (m, 2H) , 0,62 (m, 2H) ; 31P RMN (CDC13) b 20,93.
Exemplo 36
Este exemplo explica ensaios utilizados para demonstrar a actividade de antiproliferação.
Tipos de células utilizados para ensaios anti- proliferação
As linhas celulares cancerígenas humanas utilizadas em ensaios antiproliferação incluíram seis linhas celulares de carcinoma cervical com três tipos de HPV (HPV-16, HPV-18, HPV-39), uma linha celular de carcinoma cervical de HPV negativo, e dois carcinomas tipo ceratinócito de língua. As células humanas normais testadas incluíram ceratinócitos de pele, ceratinócitos cervicais, e fibroblastos de pulmão. Os ceratinócitos de pele e ceratinócitos cervicais foram obtidos de Cambrex (East Rutherford, NJ) e todas as outras células foram obtidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA).
Tabela 36-1 sumariza características de cada tipo celular e condições de cultura.
Procedimento de ensaio antiproliferaçao 79 1. Cultura celular
As células foram separadas em frascos de cultura utilizando tripsina, medidas e colocadas em placas para cultura de células de 96 poços (250 - 1000 células por poço, dependendo do tipo celular) . No dia seguinte (definido como o dia 0), após as células se ligarem à base das placas, foram adicionadas, em duplicado, diluições em séries de 5 vezes dos compostos. Não foi adicionado nenhum composto e 10 μΜ colquicina (inibidor de divisão celular) às cavidades de controlo, que representariam 100% de proliferação e 0% de proliferação, respectivamente.
2. A coloração de células com Sulforodamina B
Sete dias após a adição de compostos, as placas de cultura foram tratadas com 10% de ácido tricloroacético a 4°C durante 1 hora, e posteriormente lavadas com água. Este procedimento permite que as proteínas derivadas da célula se liguem à superfície de base das placas. As proteínas foram coloridas com 0,4% de Sulforodamina B em 1% de ácido acético durante 10 minutos, seguindo-se uma lavagem exaustiva com 1% de ácido acético. A tinta que permaneceu ligada à base das placas foi dissolvida em 10 mM de base Trizma. Tal deu lugar a uma cor púrpura que foi quantificada ao se medir a absorção a 510 nm de comprimento de onda utilizando-se um espectrofotómetro. 3. Análise de Dados
Dos dados experimentais, a curva de resposta de dose sigmoidal foi gerada e calculou-se 50% de concentração eficaz (EC5o) utilizando-se GraphPad Prism versão 4.01 para Windows (GraphPad Software, San Diego Califórnia USA). 80
Tabela 36-1. Tipos de célula utilizados em ensaios antiproliteração
Nome Estado do HPV Origem Meio de Cultura * Linhas celulares de carcinoma HPV positivo SiHa HPV-16 (1-2 cópias por célula) Carcinoma de célula escamosa no colo do útero Ai, A2 Ca Ski HPV-16 (600 cópias por célula) Carcinoma epidermóide, metastatizado para o intestino pequeno de cérvix Ai, A2 MS 751 HPV-18 (também contém um genoma de HPV-45 parcial) Carcinoma epidermóide, metastatizado para gânglio linfático do colo do útero Ai, A2 HeLa HPV-18 Carcinoma epitelial em cérvix Ai, A2 C-4 I HPV-18 Carcinoma em cérvix Ai, A2 81 ME-18 0 HPV-39 Carcinoma epidermóide, metastatizado para omento do colo do útero Al, A2 Linhas celulares de carcinoma HPV negativo HT-3 Nenhum Carcinoma, metastatizado para gânglio linfático do colo do útero Al, A2 SCC-4 Nenhum Carcinoma de célula escamosa na língua Al, A2 SCC-9 Nenhum Carcinoma de célula escamosa na língua Al, A2 Células de tecidos humanos normais HEL299 Nenhum Fibroblastos em pulmão embriónico Al, A2 PHK (ceratinóc itos de pele) Nenhum Ceratinócitos em prepúcio no adulto Bl, B2 CK (ceratinóc itos cervicais) Nenhum Ceratinócitos em cérvix no adulto Bl, B2 * Meios de cultura 82
As células foram mantidas em incubadoras humidificadas a 37°C com 5% de CO2, nos seguintes meios de cultura.
Ai: Meios para manutenção de cultura: Eagle MEM com Earle's BSS (Cambrex, East Rutherford, NJ) , suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL estreptomicina. A2: Meio para ensaios antiproliferação: Eagle MEM com Earle's BSS, suplementado com 5% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina. BI: Meio para manutenção de cultura: Ceratinócito-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 0,01 de mg/mL de extracto de pituitária bovina, 0,001 de pg/mL de factor de crescimento epidérmico recombinante, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina. B2: Meio para ensaios antiproliferação: 4:1 de mistura de BI e A2.
Resultados 1. Actividade antiproliferação selectiva dos pro-fármacos de amidato em células SiHa HPV positivo em comparação com fibroblastos normais. O objectivo era descobrir um composto que inibisse o crescimento de lesão transformada por HPV sem afectar as células normais na epiderme e derme (tal como, ceratinócitos e fibroblastos). Os ensaios antiproliferação in vitro foram estabelecidos utilizando células SiHa e células HEL, que moldam a lesão transformada por HPV e fibroblastos normais, respectivamente. As células SiHa derivam do carcinoma de célula escamosa em cérvix causado por infecção de HPV-16 e os fibroblastos HEL 3G derivam de pulmão embriónico humano normal (Tabela 36-1). Como 83 demonstrado na Tabela 36-2, 50% de concentração eficaz (EC50) dos sete pro-fármacos de amidato em células SiHa apresentavam uma variaçao de 0,13 - 3,2 mm, enquanto EC50 em células HEL a variação era de 12 - 727 nM, indicando que estes compostos inibiam a proliferação de células SiHa de modo mais eficaz comparativamente às células HEL. O indice de selectividade de HEL/SiHa (EC50HEL dividido por EC50 de SiHa) apresentou uma variação de 72 - 559 (Tabela 36-2).
Todos os sete pro-fármacos de amidato produzem o mesmo metabólito, cprPMEDAP. cprPMEDAP é também metabolizado para PMEG [Compton e outros, 1999; Haste e outros, 1999]. O EC5o antiproliferação destes compostos em células SiHa foi muito maior do que aqueles dos pro-fármacos (Tabela 36-2), indicando que a ligação de fracções de amidato melhorou a potência. Além disso, os índices de selectividade de HEL/SiHa de cprPMEDAP e PMEG foram de 17 e 4,1, respectivamente (Tabela 36-2), indicando que as pro-fármacos apresentam maior selectividade do que cprPMEDAP e cprPMEDAP uma maior selectividade do que PMEG. PMEG é conhecido ser fosforilado para PMEGpp que actua como um inibidor de terminação de cadeia de polimerase de ADN celular [Compton e outros, 1999; Haste e outros, 1999]. Quatro inibidores de ADN polimerase conhecidos (Cidofovir, Ara C, doxifluridina, e Afidicolina) e outros fármacos anticancro com diferentes mecanismos de acção, incluindo inibidores de ADN topoisomerase (Dacarbazina, Ellipticine), alquilantes de ADN (Doxorubicina, Mitoxantrona, Bleomicina, Mecloretanmina), e inibidores de tublina (Vincristina, Vinblastina, Etoposida, e Indanocina) foram testados em células SiHa e HEL (Tabela 36-2). O EC50 antiproliferação destes compostos em células SiHa apresentou uma variação, e alguns foram igualmente ou mais potentes do que os sete 84 pro-fármacos de amidato. Não obstante, todos eles exibiram índices de selectividade fraca de HEL/SiHa (0,01 - 3,98), em comparação com os sete pro-fármacos de amidato.
Tomado em conjunto, foi explicado um único grupo de compostos, que mostra nM de EC5o antiproliferação sub-baixo em células de carcinoma SiHa HPV-16 positivas e mais do que 50 vezes a selectividade comparativamente aos fibroblastos de HEL. 2. A actividade antiproliferação selectiva dos pro-fármacos de amidato em células SiHa HPV positivo em comparação com ceratinócitos normais. A fim de testar o efeito dos compostos em células normais de epiderme, foram realizados ensaios antiproliferação utilizando ceratinócitos humanos primários, isolados da pele (PHK) e cérvix (CK). Os valores EC50 antiproliferação obtidos com os sete pro-fármacos em PHK e CK foram menores do que aqueles em HEL, indicando que os cerat inócitos são mais susceptíveis do que os fibroblastos (Tabela 36-2 e 36-3). Não obstante, os índices de selectividade de PHK/SiHa e CK/SiHa destes pro-fármacos e cprPMEDAP foram ainda melhores do que os compostos de controlo PMEG e um inibidor de ADN polimerase AraC (Tabela 36-3). Deste modo, os pro-fármacos inibiram preferencialmente a proliferação de células SiHa HPV-16 positivo, em comparação com os ceratinócitos normais de pele e cérvix. 3. Actividades antiproliferação em outras células HPV positivo.
Os sete pro-fármacos foram então testados em cinco linhas celulares adicionais derivadas de carcinoma cervical induzido por HPV (listados na Tabela 36-1) em ensaios 85 antiproliferação e os dados são apresentados na Tabela 4 juntamente com os dados de SiHa. Em células SiHa, C-4I, e MS751, todos os compostos excepto o Composto C apresentou nM de EC5o antiproliferação subbaixo. No entanto, em CaSki, HeLa, e ME-180, todos os compostos foram significantemente menos potentes, com o EC50 variando de 7,8 a 410 nM. Parece não existir qualquer correlação entre a resistência e o tipo de HPV (16, 18 ou 39), ou resistência e metástase (CaSki, MS751, e ME180 são derivados de local metastatizado). Composto de controlo AraC (inibidor de DNA polimerase) inibiu uniformemente todas as linhas celulares com valores de EC5q variando de 94 a 257 nM. 4. Actividades antiproliferação em células de carcinoma de HPV negativo.
Para investigar o efeito dos compostos sobre linhas celulares de carcinoma HPV negativo, foram testadas três linhas celulares (HT-3, SCC4, SCC9, Tabela 36-1) em ensaios antiproliferação. Como demonstrado na Tabela 36-4, todos os sete pro-fármacos foram igualmente ou mais potentes do que o composto de controlo AraC.
Tabela 36-2. Inibição selectiva de células SiHa HPV16+ em comparação com fibroblastos de HEL.
Composto ID. Nota Selectivid ade (HEL/SiHa) Antiproliferação EC50 (nM) Carcinoma cervical de SiHa (HPV16) Fibroblasto de pulmão de HEL A 72 0,3 43 86
Composto ID. Nota Selectivid ade (HEL/SiHa) Antiproliferação EC50 (nM) Carcinoma cervical de SiHa (HPV16) Fibroblasto de pulmão de HEL B 559 1,3 727 C 115 0,20 23 D 135 3,2 431 E 164 0,50 82 F 210 2,5 526 G 92 0,13 12 Controles cprPMEDAP Metabólito 17 284 4821 PMEG Metabólito 4, 1 207 861 AraC inib. ADN pol 0, 113 257 29 Cidofovir inib. ADN pol 0,3 84013 27952 Doxifluridina inib. ADN pol 0,449 8755 3927 Afidicolina ( + ) inib. ADN pol 0,40 856 324 87
Composto ID. Nota Selectivid ade (HEL/SiHa) Antiproliferação EC50 (nM) Carcinoma cervical de SiHa (HPV16) Fibroblasto de pulmão de HEL Dacarbazina Inib. topo ADN 3,98 7402 29481 Elipticina Inib. topo ADN 1,02 478 486 Doxorubicina Alquilador de ADN 0,43 9, 76 4,20 Mitoxantrona Alquilador de ADN <0,37 8,67 <3,2 Cloridrato de Mecloretamina Alquilador de ADN 1,02 21863 22203 Bleomicina Alquilador de ADN 0,01 3138 20,28 Vincristina Inib. de Tublina 1,55 1,24 1,92 Vinblastina Inib. de Tublina 0,39 0,68 0,27 Etoposida Inib. de Tublina 0,31 469 144 Indanosina Inib. de Tublina 0,27 588 159
Tabela 36-3. Inibição Selectiva de células SiHa de HPV16+ em comparaçao com ceratinócitos primários.
Comp ID. Nota Selecti- vidade (PHK/ /SiHa) Selectivi dade (CK/SiHa) Antiproliferação EC50 (nM) SiHa cervical carcinoma (HPV16) PHK ceratinó-citos de pele CK cervical ceratinó- citos A 58 11 0,6 35 7 B 75 42 1,3 98 54 C 4 7 0,20 0,8 1,4 D 12 7 3,2 39 22 E 10 11 0,50 5,2 5,4 F 31 3 2,5 78 7, 1 G 22 15 0,13 2,9 1,9 Con trolos cprP ME DA P Metabó -lito 13 2,4 284 3698 694 PMEG Metabó -lito 0,48 2,4 207 101 501 AraC inib. DNA pol 0,57 0,4 257 147 107 89
Tabela 36-4. Actividades antiproliferação em outras células de carcinoma de HPV positivo e negativo. EC50 (nM) antiproliferação em células de carcinoma de HPV positivo EC50 (nM) antiproliferação em células de carcinoma de HPV negativo SiHa CaSki HeLa MS-751 C-4I ME—180 HT-3 SCC-4 SCC-9 Comp ID. HPV16 HPV16 HPV18 HPV18 HPV18 HFV39 cérvix lingua lingua A 0,6 29 16 1,7 6,5 27 14 17 40 B 1,3 246 410 18 27 254 104 53 150 C 0,20 3,87 6,6 0,54 1,0 7,8 9,5 2,1 2,5 D 3,2 301 398 16 24 288 127 44 147 E 0,50 38 19 2,40 3,1 27 17 8 13 F 2,5 124 127 4,2 6,0 41 24 10 28 G 0,13 28 12 0,9 3,1 8,2 6, 0 2,1 7,9 Contro los AraC 257 94 174 144 123 101 214 74 68
Exemplo 37
Ensaio antiproliferação
Ensaios antiproliferação medem o efeito de compostos sobre a proliferação de células cultivadas. Compostos activos em ensaios antiproliferação podem ser citostáticos (inibem a divisão celular) e/ou citocidas (matam células). Ao se realizarem ensaios antiproliferação utilizando células de carcinoma HPV positivo e células normais, é 90 possível identificar compostos que inibem selectivamente a proliferação de células de carcinoma de HPV positivo em comparação com células de tecidos humanos normais. A Tabela 37-1 sumariza as características de cada tipo celular, incluindo seis linhas celulares de carcinoma cervical transformadas por HPV, ceratinócitos de pele de humanos normais (PHK), e fibroblastos de pulmão normal (HEL). Ceratinócitos de pele foram obtidos pela Cambrex (East Rutherford, NJ). Todas as outras células foram obtidas pela American Type Culture Collection (Manassas, VA).
As células foram separadas em frascos de cultura utilizando tripsina, calculadas e colocadas em placas de cultura para células de 96 poços (250 - 100 células por poço, dependendo do tipo celular) . No dia seguinte (definido como o dia 0), foram adicionadas em duplicado diluições em séries de 5 vezes de compostos. Sete dias após a adição de compostos, as placas de cultura foram tratadas com 10% de ácido tricloroacético a 4°C durante 1 hora e lavadas com água. Este procedimento permite que as proteínas celulares se liguem à superfície de base das placas. As proteínas foram coloridas com 0,4% de Sulforodamina B em 1% de ácido acético durante 10 minutos, seguindo-se uma lavagem exaustiva com 1% de ácido acético. A tinta restante ligada à base das placas foi solubilizada em 10 mM de base Trizma, dando lugar a uma cor púrpura. A intensidade da cor (proporcional ao número de células) foi quantificada medindo-se a absorção a 510 nm de comprimento de onda, utilizando um espectrofotómetro. Células sem tratamento com fármaco (=100% de proliferação) e células tratadas com 10 μΜ de colquicina (inibidor de divisão celular) (= 0% de proliferação) foram utilizadas como controlo, para determinar o percentual de inibição. Os 91 valores de % de inibição foram registados em função das concentrações de compostos, adaptadas a uma curva de resposta de dose sigmoidal, da qual a concentração de composto que reduziu a taxa de proliferação celular em 50% (= EC50) foi determinada. GraphPad Prism versão 4.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego Califórnia USA) foi utilizado para adaptar a curva e cálculo de EC50.
Ensaio de Apoptose (método de indução de caspase 3)
Indução de caspases é um dos eventos precoces associados à apoptose ou morte celular programada. A actividade de caspase pode ser quantitativamente detectada utilizando substrato fluorescente. Os compostos que actuam directamente sobre a via apoptótica podem induzir a caspase num periodo de incubação relativamente curto (< 24 horas). Os compostos que perturbam outra fisiologia celular, que eventualmente causa a apoptose, podem requerer um periodo de incubação mais longo (> 48 horas) para indução de caspase.
Foram semeadas 10.000 células em placas de cultura de 96 poços e incubadas com diluições em séries de 5 vezes de compostos durante 24, 48, e 72 horas. As células foram lisadas e a actividade de caspase em lisados celulares foi medida utilizando-se substrato fluorescente, de acordo com a instrução do fabricante (Kit de ensaio de caspases, Roche, Indianápolis, IN).
Ensaio de Apoptose (Método de coloração com Anexina V) A translocação de fosfatidilserina do interior da membrana celular para o exterior é a dos eventos precoce / intermediários associados com apoptose ou morte celular programada. A fosfatidilserina translocada pode ser detectada ao se incubarem as células com Anexina V marcada 92 com FITC, que é uma proteína de ligação a fosfolipídeo dependente de Ca++. Quando as células são coloridas com Anexina-FITC e iodeto de propídio (que colora as células mortas), as células vivas são negativas para ambas as tintas, as células mortas são positivas para ambas, enquanto as células apoptóticas são positivas apenas para Anexina-FITC.
As células SiHa de HPV-16 foram cultivadas com três diferentes concentrações de compostos durante 3 ou 7 dias e simultaneamente coloridas com Anexina-FITC e iodeto de propídio. A coloração de cada célula individual foi examinada por citometria de fluxo.
Resultados
Actividade antiproliferação selectiva 0 propósito para este procedimento implicava identificar os compostos que inibem o crescimento de lesão transformada por HPV sem afectar as células normais na epiderme e derme (tal como, ceratinócitos e fibroblastos). Portanto, os compostos foram testados em células SiHa, PHK, e HEL, que servem de modelo para células transformadas por HPV, ceratinócitos normais, e fibroblastos normais, respectivamente.
Os compostos representativos da presente invenção apresentavam níveis detectáveis de actividade
antiproliferação em células SiHa, com 50% de concentração eficaz (EC50) menor do que 25.000 nM. Os compostos activos foram também testados em células HEL. Em todos os casos, EC50 em células HEL foi maior do que o EC50 em células SiHa, indicando que os compostos activos inibiram a proliferação de células SiHa, de modo mais eficaz do que as células HEL. Outros análogos de nucleótido/nucleosídeo, tais como PMEG 93 (guanina de 2-fosfonometoxietilo) , Ara-C (citarabina, CAS# 147-94-4), e gemcitabina (CAS# 95058-81-4) não apresentaram tal selectividade. Podofilox (CAS# 518-28-5), o ingrediente activo do fármaco anti-verruga Condylox, também não apresentou qualquer selectividade.
Os compostos de pró-fármaco representativos da presente invenção, tais como aqueles indicados na Tabela 37-3 apresentam actividades. Na maioria dos casos, os pro-fármacos foram mais potentes e em alguns casos, mais selectivos do que seus respectivos compostos de origem. A maioria dos pro-fármacos de fosfoamidato foi mais activa e selectiva do que o podofilox.
Tomados em conjunto, os compostos foram identificados como tendo sub nM de EC50 antiproliferação em células SiHa HPV-16 positivo e mais do que 50 vezes a selectividade quando comparados com os ceratinócitos de PHK ou com fibroblastos de HEL.
Actividade antiproliferação em outras linhas celulares HPV+
Os compostos seleccionados foram também testados em cinco linhas celulares adicionais derivadas de carcinoma cervical induzido por HPV (veja o Exemplo 36 e Tabela 37-3) . Cada composto apresentou diferentes níveis de actividades nas seis linhas celulares HPV+, independentemente do tipo de HPV presente. Em geral, os compostos foram mais potentes em células SiHa (HPV-16), C-41 (HPV-18), e MS751 (HPV-18) do que em células CaSki (HPV-16), HeLa (HPV-18), e ME-180 (HPV-39).
Indução de apoptose (método de indução de caspase 3)
Um composto representativo da presente invenção foi testado quanto à indução de apoptose em células SiHa. 94
Quando as células foram incubadas durante 72 horas (barras sólidas), foi observada a indução responsiva de dosagem caspase significativa, indicando que o composto induziu à apoptose (Tabela 37-1). Indução de caspase foi menos óbvia com 48 horas de incubação (barras sombreadas) e não foi observada com 24 horas de incubação (dados não apresentados).
Indução de apoptose (Método de coloração por Anexina V) PMEG, N6-ciclopropil PMEDAP, e um composto representativo da presente invenção foram testados em três diferentes concentrações, quanto à indução de apoptose em células SiHa, utilizando-se o método de coloração dupla por Anexina V-iodeto de propídio. Com todos os três compostos, foi observada uma percentagem maior de células apoptóticas ao dia 7 do que ao dia 3. Composto representativo anteriormente mencionado da presente invenção foi o mais activo na indução de apoptose; ao dia 7, 63,8% de células na cultura tratadas com 0,2 pg/m deste composto foram apoptóticas. Por contraste, as culturas tratadas com 0,2 pg/mL de PMEG e 0,5 pg/mL de Νβ-ciclopropilo PMEDAP apenas, apresentaram 1,2 % e 15,9 % de células apoptóticas, respectivamente. 95
Tabela 37-1. Tipos celulares utilizados em ensaios antiproliteração
Nome estado de HPV * Origem Meios de cultura * * Linhas celulares de carcinoma HPV positivo SiHa HPV-16 Carcinoma de célula escamosa em cérvix Al, A2 Ca Ski HPV-16 Carcinoma epidermóide, metastatizado para o intestino delgado de cérvix Al, A2 MS751 HPV-18 (também contém um genoma de HPV-45 parcial) Carcinoma epidermóide, metastatizado para gânglio linfático do colo do útero Al, A2 HeLa HPV-18 Carcinoma epitelial em cérvix Al, A2 C-4 I HPV-18 Carcinoma em cérvix Al, A2 ME-180 HPV-39 Carcinoma epidermóide, metastatizado para omento do colo do útero Al, A2 Células de tecidos humanos normais HEL299 nenhum Fibroblastos em pulmão embriónico Al, A2 96 PHK (ceratinó eitos de Ceratinócitos em prepúcio pele) nenhum de adulto Bl, B2 * 0 subtipo ADN de HPV integrado no ADN celular. ** Meios de cultura
As células foram mantidas em incubadoras humidificadas a 37°C com 5% de CO2, nos seguintes meios de cultura. AI: Meio para manutenção de cultura: Eagle MEM com
Earle's BSS (Cambrex, East Rutherford, NJ) , suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL penicilina, e 100 pg/mL estreptomicina. A2: Meio para ensaios antiproliferação: Eagle MEM com
Earle's BSS, suplementado com 5% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina.
BI: Meio para manutenção de cultura: Ceratinócito-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 0,01 mg/mL de extracto de pituitária bovina, 0,001 pg/mL de factor de crescimento epidérmico recombinante, 100 unidades/mL de penicilina, e 100 pg/mL de estreptomicina. B2: Meio para ensaios antiproliferação: 4:1 mistura de BI e A2. 97
Tabela 37-2. Actividade antiproliferação de pro-fármacos de fosfoamidato de PMEDAP N6-substituído em células SiHa de HPV16+, ceratinócitos PHK, e em fibroblastos HEL. JÓC> ^ 1 i| -y* onde RX1 e Rx2 são substituídos como representado na fórmula, e Y1A e Y1B são substituídos como indicado, γΙΑ γΙΒ OH OH POC POC Hipo O-iPr Ala-Et Ala-Et Ala-Pr Ala-Pr Ala-iPr Ala-iPr Ala-Bu Ala-Bu Ala-cBu Ala-cBu Ala-cPen Ala-cPentilo Ala-Hexilo Ala-Hexilo 98 Ν XX) . Ν/ Ν/ ^ytA onde RX1 e Rx2 são substituídos como representado na fórmula, e Y1A e Y1B são substituídos como indicado, Ala-Octilo Ala-Octilo Aba-Et Aba-Et Aba-Bu Aba-Bu Aba-Octilo Aba-Octilo Phe-Et Phe-Et Phe-Bu Phe-Bu Phe-iBu Phe-iBu Phe-cBu Phe-cBu OPh Ala-Me OPh Ala-Et OPh Ala-Pr OPh Ala-iPr OPh Ala-Bu OPh Ala-tBu 99 Ν XX) . Ν/ Ν/ ^ytA onde RX1 e Rx2 são substituídos como representado na fórmula, e Y1A e Y1B são substituídos como indicado, OPh Ala-Hexilo OPh Ala-Octilo OPh Aba-Et OPh Aba-Bu OPh Aba-cBu OPh Aba-Octilo OPh Phe-Et OPh Phe-Bu OPh Phe-iBu OPh D-Ala-Me 100
Tabela 37-3. Actividades antiproliferação de PMEDAP de N6-cicloprolilo e seus pro-fármacos de fosfoamidato em seis diferentes células de HPV positivo.
Compos to ID. EC50 (nM) Antiproliferaçao em células de carcinoma de HPV positivo. SiHa HPV16 CaSki HPV16 HeLa HPV18 MS-751 HPV18 C-4I HPV18 ME-18 0 HPV3 9 A 0,6 29 16 1, 7 6,5 27 B 1,3 246 410 18 27 254 C 0,2 3,9 6,6 0,5 1,0 7,8 D 3,2 301 398 16 24 288 E 0,5 38 19 2,4 3,1 27 F 2,5 124 127 4,2 6,0 41 G 0,13 28 12 0,9 3,1 8,2 H 0,03 2,0 0,7 0,04 0,44 1,8 (cprPM EDAP) 284 14149 6926 3313 1332 8315
Exemplo 38
Estudo de Irritação de Pele de Coelho de Compostos A e B.
Foi conduzido um estudo para avaliar o potencial de dois compostos da presente invenção para produzir irritação quando administrados por meio de aplicação dérmica a coelhos macho durante sete dias consecutivos. Um total de 101 seis machos foi designado para o estudo como apresentado na Tabela abaixo.
Designações de Grupo
Grupo Número Artigo de Testea Número de Animais (machos) 1 Composto Bb 3 2 Composto Ac 3 aCada animal recebeu tratamentos dérmicos de veiculo (gel de placebo), um artigo de controlo positivo, e três concentrações do artigo de teste apropriado. Cada animal recebeu um artigo de teste em concentrações de 0,01, 0,03, e 0,1%. b0 artigo de controlo positivo utilizado foi de 0,1% de guanina de 9-(2-fosfonilmetoxietilo) (PMEG). cO artigo de controlo positivo empregado foi de 1% de Cidofovir®. O veículo, artigos de controlo positivo, e artigos de teste foram administrados dermicamente uma vez ao dia durante sete dias durante o estudo. Os artigos de teste foram administrados em concentrações de 0,01, 0,03, e 0,1%. Os artigos de controlo positivo foram administrados em concentrações de 0,1% (PMEG) ou 1% de (Cidofovir®) . O volume de dose para todas as formulações foi um volume fixo de 10 0 μύ.
Os locais de teste para cada animal foram desbastados antes da administração inicial e quando necessário durante o estudo. Dois locais foram desbastados sobre o lado dorsal 102 esquerdo, e três foram desbastados sobre o local dorsal direito. O contorno de cada dosagem (aproximadamente 2,54 cm2 (1" quadrada) cada) foi marcado com tinta indelével. A área total desbastada compreendeu não menos do que 10% da superfície corporal total de cada animal. O veículo e controlo positivo apropriado e artigo de teste foram administrados a cada animal dentro do local de dosagem de aproximadamente 2,54 cm2 (1" quadrada). O veículo foi administrado sobre o local rostral esquerdo (Local de Dosagem 1), e o artigo de controlo positivo apropriado foi administrado no local caudal esquerdo (Local de Dosagem 2) . O artigo de teste apropriado foi administrado como segue: 0,01% para o local rostral direito (Local de Dosagem 3), 0,03% para o local médio direito (Local de Dosagem 4), e 0,1% para o local caudal direito (Local de Dosagem 5) . Colares foram colocados nos animais imediatamente após a dosagem durante 1 a 2 horas.
Os locais foram avaliados quanto ao eritema e edema antes da dosagem no Dia 1 e posteriormente diariamente, aproximadamente 24 horas após cada dose e antes da dose seguinte. A cada local foi atribuída uma classificação de irritação com base na escala Draize para classificar a irritação da pele (Draize JH, Woodard G, Calvery HO, Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J Pharmacol Exp Ther 1944; 82:377-90).
As observações relativamente à mortalidade, morbidade e disponibilidade de alimento e água foram conduzidas duas vezes ao dia para todos os animais. Os exames clínicos detalhados foram conduzidos antes da randomização, antes da dosagem ao Dia 1, e posteriormente conduzidos diariamente. Os pesos corporais foram medidos e registados no dia após a 103 chegada, antes da randomização, e antes da dosagem aos Dias 1, 3, e 7. A eutanásia foi realizada por dose excessiva de anestesia intravenosa com solução de eutanásia com base pentobarbital de sódio e sangramento cortando os vasos femorais. Os animais foram examinados cuidadosamente quanto às anormalidades externas incluindo massas. A pele foi reflectida a partir de uma incisão mediana ventral e quaisquer anormalidades foram identificadas e correlacionadas com descobertas antes da morte. As cavidades abdominal, toráxica, e craniana foram examinadas quanto às anormalidades e os órgãos removidos, foram examinados, e, onde requerido, colocados em formalina tamponada neutra. Os locais de dosagem, rins, e quaisquer lesões volumosas de cada animal foram recolhidos e preservados. Foi realizado um exame microscópico de hematoxilina fixada e secções de parafina coloridas por eosina para cada local de dosagem para todos os animais. Os diapositivos foram examinados por um patologista veterinário. Foi utilizado um sistema de classificação de quatro fases para definir lesões graduáveis para comparação entre os grupos de dosagem.
Conclusões
Os dois artigos de teste não produziram descobertas clinicas notáveis, irritação dérmica, mudanças no peso corporal ou observações macroscópicas e microscópicas em quaisquer concentrações de dosagem. Um dos controlos positivos foi associado a descobertas clínicas e observações macroscópicas e microscopias leves e moderadas. 104
Exemplo 39
Estudo de Irritação de Pele de Coelho de Compostos B e
H
Foi conduzido um estudo para avaliar o potencial de dois compostos da presente invenção de modo a produzir irritação quando administrado por meio de aplicação dérmica a coelhos macho durante sete dias consecutivos. Um total de 24 machos foi designado para o estudo. b0 veículo para o Local de Dosagem 1, Grupo 1, e Local de Dosagem 1, Grupo 2 (PMEG) era o gel de veículo. O Veículo dos locais tratados de Grupo 1 foi o gel de veiculo, e o veículo para os locais tratados de Grupo 2 foi a pomada de veículo.
Projecto de Estudo para o Composto B
Grupo 1 Grupo 1 Concentração Grupo 2 Grupo 2 Concentração Local de Dosagem (n=6)a o, o (mg/mL) (n=6)â o "o (mg/mL) 1 Veículo de controlo 0,0 O O PMEG (controlo positivo) 0,1% 1,0 2 Dose Baixa 0,03 0,3 Dose Baixa 0,03 0,3 3 Dose Média 0,1 1,0 Dose Média 0,1 1,0 4 Dose Elevada 0,3 3, 0 Dose Elevada 0,3 3,0 aCada grupo consistiu em seis coelhos virgens. 105 105 Projecto de Estudo para o Composto H Grupo 3 Grupo 3 Concentraçãob Grupo 4 Grupo 4 Concentração13 Local de Dosagem (n=6)a o, o (mg/mL) (n=6)a o, o (mg/mL) 1 Veículo de controlo 0,0 0,0 PMEG (controlo) positivo) 1,0% 10,0 2 Dose Baixa 0, 03 0,3 Dose Baixa 0,03 0,3 3 Dose Média 0,1 1,0 Dose Média 0,1 1,0 4 Dose Elevada 0,3 3, 0 Dose Elevada 0,3 3,0 a Cada grupo consistiu em seis coelhos virgens. bO veiculo para o Local de Dosagem 1, Grupo 3 foi a pomada de veículo, e o veiculo para o Local de Dosagem 1, Grupo 4 (cPrPMEDAP) foi o gel de veiculo. O Veiculo para os sítios tratados com o Grupo 3 foi o gel de veículo, e o veículo para os sítios tratados com o Grupo 4 foi a pomada de veículo.
0 teste e artigos de controlo foram administrados dermicamente uma vez por dia durante 7 dias consecutivos durante o estudo. Os niveis de dose para o Composto B foram 0,03, 0,1, e 0,3%. Os niveis de dosagem para o Composto H
foram 0,03, 0,1, e 0,3%. O nivel de dosagem para PMEG (controlo positivo) foi de 0,1%. O nivel de dosagem para cPrPMEDAP (controlo positivo) foi de 1,0%. O nível de dosagem para o controlo de veículo foi de 0,0% (este foi doseado como ambas as formulações de gel e pomada) . O volume de dosagem para todos os locais foi uma constante ΙΟΟμΐ,. Menos do que 24 horas antes da primeira 106 administração, o pelo das costas do animal foi rapado. Esta área rapada compreendia não menos do que 10% da área de superfície corporal total. Foram tomados os devidos cuidados para evitar esfolar a pele.
Os artigos de teste, controlo positivo, e controlo de veículo foram administrados dentro de um local de dosagem de aproximadamente 1" x 1". Dois locais de dosagem foram colocados ao longo da superfície dorsal esquerda. O artigo de veículo ou controlo positivo foi administrado ao local rostral, e a dose baixa do artigo teste foi administrada ao local caudal. Dois locais de dosagem foram colocados ao longo da superfície dorsal direita. A dose média do artigo teste foi administrada no local rostral, e a dose elevada do artigo de teste foi administrada no local caudal. Foram colocados colares nos animais durante aproximadamente duas horas imediatamente após a dosagem. A duração de permanência do colar foi documentada nos dados brutos.
As observações quanto à mortalidade, morbidade, e a disponibilidade de alimento e água foram conduzidas duas vezes diariamente para todos os animais. Os locais de teste foram avaliados quanto a eritema e edema antes da primeira administração e em aproximadamente 24 horas após cada administração (antes da seguinte dosagem determinada) e diariamente durante o período de recuperação de 7 dias. As observações quanto aos sinais clínicos foram conduzidas diariamente durante o estudo simultaneamente com observações dérmicas. Os pesos corporais foram medidos e registados no dia após administração, antes da randomização, antes da administração do artigo de teste ao Dia 1, e aos Dias 7 e 14, e em necropsia (Dias 8 e 15) . Os pesos corporais avaliados à chegada e antes da randomização não são referidos. No entanto, são mantidos no arquivo de 107 estudo. As colheitas de amostras de sangue (4-6 mL) serão efectuadas em 6 animais/grupo em estado terminal e 3 animais/grupo em recuperação através da jugular ou outra veia adequada para avaliação de parâmetros de patologia clinica.
As amostras de sangue adicionais (aproximadamente 1 mL) foram recolhidas de todos os animais pela jugular ou outra veia adequada para a determinação das concentrações de plasma do artigo teste em aproximadamente 2 horas após a dose ao Dia 7. As amostras foram colocadas em tubos contendo EDTA de potássio e armazenadas num bloco de gelo até serem centrifugadas. Os animais não se encontravam em jejum antes da colheita de sangue. As amostras foram armazenadas a -70° até o exame.
Os exames de necropsia completa foram realizados sob procedimentos aprovados por um patologista veterinário em todos os animais. A eutanásia foi realizada por dose excessiva de anestesia com solução de eutanásia com base em pentobarbital de sódio por meio da veia/artéria da orelha ou outra veia adequada e sangramento por corte dos vasos femorais. Os animais foram cuidadosamente examinados quanto às anormalidades externas incluindo massas. A pele foi reflectida a partir de uma incisão mediana ventral e quaisquer anormalidades foram identificadas e correlacionadas com descobertas antes da morte. As cavidades abdominal, toráxica, e craniana foram examinadas quanto a anormalidades e os órgãos removidos, examinados, e, onde requerido, colocados em formalina tamponada neutra. O exame microscópico de hematoxilina fixa e secções de parafina coloridas com eosina foi realizado em secções de tecidos nos locais de dosagem (4 por animal), rins, e quaisquer lesões volumosas. 108
No momento da necropsia, os quatro locais de dosagem por animal foram identificados: ao Dia 8, para os animais principais do estudo e ao Dia 15 para animais em convalescença. Aproximadamente metade de cada local de dosagem foi excisado e em seguida recolhido e preservado como mencionado acima para processamento histológico. Enquanto a outra metade próxima de cada local de dosagem, no animal, ficou também intacta, os seguintes procedimentos são realizados. Os locais de dosagem foram esfregados com três gazes de etanol (95%) e deixados secar completamente. Fita (3M® fita de empacotamento ou equivalente) foi aplicada a cada local de dosagem dez vezes. Foi utilizado um pedaço limpo de fita para realizar a aplicação. As restantes fracções dos locais de dosagem foram então excisadas com tesouras. As tesouras foram lavadas entre cada local de dosagem e o animal com acetona ou etanol. A ordem de remoção do local de dosagem foi veículo ou local de controlo positivo, local de dosagem baixo, local de dosagem suave, e local de dosagem elevado. Um tecido de 1 cm2 foi rapado em cada local de dosagem. A amostra de tecido foi pesada e registada. As punções da pele foram picadas com tesouras limpas e colocadas em frascos de cintilação de tamanhos apropriados individuais. Foi adicionada salina tamponada por fosfato frio (5 mL) ao frasco de cintilação. 0 tecido foi então homogeneizado em intervalos de 20 segundos utilizando um homogeneizador mecânico. Os homogenados foram rapidamente congelados em aproximadamente -20°C.
Conclusões
Com base nas classificações de irritação dérmica e descobertas microscópicas, um dos artigos de teste era não irritante no gel de veículo, porém era suave a 109 moderadamente irritante na pomada de veiculo. O segundo artigo de teste era bastante ligeiramente irritante no gel de veículo e suavemente irritante quando formulado na pomada de veículo.
Exemplo 40
Preparação de Composição Farmacêutica Tópica de Gel
Este Exemplo ilustra a Preparação de uma composição tópica de gel representativa contendo um composto activo de Fórmula I.
Uma composição tópica de gel é preparada tendo a seguinte composição:
Componentes % peso/peso Composto activo X1 Tampão de pH 4,5 ou 7 25 Propileno Glicol, USP 25 Hidroxietilcelulose, NF 1,25 Propilparabeno, NF 0,01 yietilparabeno, NF 0,09 Edetato de Dissódio, USP 0,025 Glicerina, USP 10,00 Ácido Cítrico, USP 0,50 Água Estéril para Injecção, USP 38,125 1 X = Composto variando de 0,01% a 1,0%
Outros compostos de Fórmula I, tal como aqueles preparados de acordo com a presente especificação podem ser 110 utilizados como o composto activo na preparaçao das formulações de gel deste exemplo.
Os seguintes ingredientes foram também avaliados quanto à adequabilidade durante o desenvolvimento desta formulação:
Miristato de isopropilo (solvente/cossolvente/realçador de penetração),
Polietileno glicóis, Triacetina (solventes), Álcool cetilico e Álcool estearilico (Agentes de endurecimento),
Carbómero (Realçador de viscosidade), e
Tweens, Spans (emulsificantes).
Exemplo 41
Preparação de Composição Farmacêutica Tópica de Pomada
Este Exemplo ilustra a preparação de uma composição tópica de pomada representativa contendo um composto activo de Fórmula I.
Uma composição de pomada tópica é preparada tendo a seguinte composição:
Componentes % w/w Composto activo X1 ^etrolato, USP 94, 0 Cesquioleato de Sorbitano, NF 0,5 3ropileno Glicol, USP 4,5 1 X = Composto variando de 0,01% a 1,0% 111
Outros compostos de Fórmula I, tal como aqueles preparados de acordo com a presente Especificação podem ser utilizados como o composto activo em uma Preparação das formulações de pomada deste exemplo.
Os seguintes ingredientes foram também avaliados para adequabilidade durante o desenvolvimento desta formulação:
Miristato de isopropilo (solvente/cossolvente/realçador de penetração),
Polietileno glicóis, Triacetina (solventes), Álcool cetílico e Álcool estearílico (Agentes de endurecimento),
Carbômero (Realçador de viscosidade), e
Tweens, Spans (emulsificantes). 112
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.
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Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto da Fórmula IA ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável para utilização num método para o tratamento de infecções com papilomavírus (HPV),
em que: Y1A e Y1B são -NH(RX); Rx é independentemente R2; R2 é a) etilo substituído por C(=0)0R4, em que R4 é metilo etilo, n-propilo, i-propilo, i-butilo, s-butilo, t-butilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-l-butilo, 2-metil-l butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2 pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-fenilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, vinilo, alilo, ciclopentenilo, 5-hexenilo, etinilo ou propargilo; b) propilo substituído por C(=0)0R4 em que R4 é um alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 18 átomos de carbono ou alcinilo de 2 a 18 átomos de carbono; ou contém átomos de c) metilo substituído por dois R3 em que um R3 é -RSW3 e o outro R3 é C(-0)0R4; R4 é um alquilo de 1 a 18 átomos de carbono, alcenilo de 2 a 18 átomos de carbono, ou alcinilo de 2 a 18 átomos de carbono, em que "alquilo" contém átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos, "alcenilo" 2 2 carbono normais, secundários, terciários com pelo menos um local de insaturação contém átomos de carbono normais, ou cíclicos , "alcenilo" secundários, um local de terciários ou cíclicos com pelo menos instauração; R5 é metileno; W3 é fenilo.
2. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 1 sendo seleccionado de:
3
4
3. Composto utilizável de acordo com a reivindicação 1 com a fórmula 4
4. Composto utilizável de acordo com a reivindicação 1 com a fórmula
Q
5. Composto utilizável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o qual compreende ainda a utilização pelo menos de um outro agente antiviral.
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