EA011304B1 - Фосфорсодержащие производные пурина (варианты), лекарственное средство на их основе для воздействия на вирус папилломы человека и на опухолевые клетки (варианты) - Google Patents

Abstract

Описаны соединения и композиции формулы I, пригодные для использования в качестве антипролиферативных агентов и, прежде всего, агентов, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса папилломы человека (ПВЧ)

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицинской химии, а именно к фосфорсодержащим соединениям и композициям, а также к способам их применения для лечения вирусных инфекций, прежде всего вируса папилломы человека.

Сведения о предшествующем уровне техники

Вирус папилломы человека (ПВЧ) является одной из наиболее распространенных в мире инфекций, передающихся половым путем. Существует более 100 различных типов ПВЧ, большинство из которых являются безвредными. Однако приблизительно 30 типов вируса распространяются при половых контактах. Некоторые типы ПВЧ вызывают появление остроконечных кондилом, которые появляются в виде единичных или множественных наростов в половых органах мужчин и женщин, включая влагалище, шейку матки, вульву (область наружной стороны влагалища), пенис и прямую кишку. Однако, у многих людей, инфицированных ПВЧ, не наблюдается никаких симптомов.

В то время как большинство подтипов ПВЧ вызывает возникновение доброкачественных образований, некоторые подтипы вызывают более серьезные образования. Аногенитальные инфекции, возникающие при заражении вирусами ПВЧ-16 и ПВЧ-18, хотя и менее распространены, чем инфекции, вызванные ПВЧ-6 и ПВЧ-11, в большинстве случаев ассоциированы с образованиями в ткани шейки матки и анальных тканей, называемыми дисплазией. У пациентов, страдающих дисплазией, в большинстве случаев не наблюдается никаких симптомов, и заболевание выявляется только при обследовании пациентов. Дисплазия на более поздних стадиях развития при отсутствии лечения может трансформироваться в раковые ткани. Дисплазия на ранних стадиях может самопроизвольно регрессировать, в то время как на поздних стадиях развития может прогрессировать с образованием высокозлокачественных образований. Вирусы ПВЧ-16 и ПВЧ-18 в большинстве случаев связывают с дисплазией, несмотря на то, что некоторые другие трансформирующие подтипы ПВЧ также связаны с появлением дисплазии. Сравнительно недавно установлено, что до 89% гомосексуальных мужчин с положительной реакцией на ВИЧ инфицированы указанными подтипами ПВЧ высокого риска. Наиболее вероятно, что пациенты с положительной реакцией на ВИЧ инфицированы одновременно несколькими подтипами ПВЧ, что связывают с высоким риском прогрессивного развития дисплазии.

Остроконечные кондиломы являются наиболее распространенным в мире заболеванием, передающимся половым путем, и поражают людей в возрасте 17-33 лет. Вирусы ПВЧ-6 и ПВЧ-11 вызывают приблизительно 90% всех остроконечных кондилом, но они в редких случаях ассоциированы с ростом новообразований. Согласно данным Американской социальной ассоциации здравоохранения (Лшепсаи 8ос1а1 НеаНй Л88ос1а1юи) по крайней мере 20 млн людей в США в настоящее время инфицированы ПВЧ, причем ежегодно регистрируется 5,5 млн новых случаев инфицирования ПВЧ, передающимся половым путем. Остроконечные кондиломы обычно приводят к возникновению безболезненных и зудящих наростов, расположенных на гениталиях или в соседних тканях, но в отсутствии лечения заболевание может прогрессировать с образованием более выраженных больших кондилом наподобие цветной капусты. Приблизительно у двух третей людей, имевших сексуальный контакт с носителем остроконечных кондилом, развиваются кондиломы в течение трех месяцев после контакта. Спонтанная регрессия остроконечных кондилом происходит в 20-30% случаев. Однако, даже если происходит регрессия таких образований, в 50% случаев через год обычно происходит повторное образование остроконечных кондилом. Так как такие образования выглядят неэстетично, обычно проводят лечение такого заболевания.

За последние два десятилетия считается, что инфекция ПВЧ является необходимым, хотя и недостаточным фактором для развития рака шейки матки. Вирус ПВЧ присутствует в 99,7% случаев рака шейки матки. Полагают, что анальный рак аналогичным образом связан с инфекцией ПВЧ и развитием анальной дисплазии, так же как и в случае рака шейки матки. При обследовании пациентов с отрицательной реакцией на ВИЧ, страдающих анальным раком, инфекция ПВЧ обнаружена в 88% случаев. В США в 2003 году прогнозируют 12200 новых случаев заболевания раком шейки матки и 4100 случаев летального исхода от рака шейки матки наряду с 4000 новыми случаями заболевания анальным раком и 500 случаями летального исхода от анального рака. В то время как в последние четыре десятилетия заболеваемость раком шейки матки снижается благодаря широкому обследованию пациентов, заболеваемость анальным раком возрастает. Повышение заболеваемости анальным раком частично связывают с инфекцией ВИЧ, так как заболеваемость анальным раком выше для пациентов с положительной реакцией на ВИЧ по сравнению с общей популяцией. В то время как заболеваемость анальным раком составляет 0,9 случаев на 100000 человек в общей популяции, заболеваемость анальным раком составляет 35 случаев на 100000 человек в популяции гомосексуальных мужчин и 70-100 случаев на 100000 человек в популяции гомосексуальных мужчин с положительной реакцией на ВИЧ. Фактически благодаря высокой заболеваемости анальной дисплазией пациентов, инфицированных ВИЧ, и растущей заболеваемости анальным раком, в Руководство по лечению условно-патогенных инфекций у пациентов с положительной реакцией на ВИЧ 2003 (2003 υδΡΗΛΛΌδΆ Сшйе1ше8 1ог 1йе Тгеа1шеи1 о! Орройишзйс 1п1ес1юи8 ίη Ηΐν Ровйше Райеи18) включены инструкции по лечению пациентов, у которых диагностирована анальная дисплазия.

Способы лечения ПВЧ не известны. Существуют средства для лечения остроконечных кондилом,

- 1 011304 хотя кондиломы в большинстве случаев исчезают в отсутствии лечения. Способ лечения зависит от факторов, таких как размер и расположение остроконечных кондилом. Используемые средства лечения включают крем Ιιηκ.|ΐιίιηοά. 20%-ный антимитотический раствор подофиллина, 0,5%-ный раствор подофилокса, 5%-ный крем 5-фторурацила и трихлоруксусную кислоту. Применение подофиллина или подофилокса не рекомендуется беременным женщинам, поскольку указанные средства абсорбируются кожей и могут привести к пороку развития плода. Применение крема, содержащего 5-фторурацил, беременным женщинам также не рекомендуется. Небольшие остроконечные кондиломы можно удалить физическим методом при замораживании (криохирургия), прижигании (электрокаустика) или обработке лазером. Большие кондиломы, которые не поддаются другим способам лечения, удаляют хирургически. Известно, что остроконечные кондиломы появляются снова после физического удаления, в этих случаях используют α-интерферон, вводя его напрямую в кондиломы. Однако, α-интерферон является дорогостоящим препаратом, и его применение не снижает возможность повторного появления остроконечных кондилом.

Таким образом, в настоящее время существует острая потребность в эффективном лечении ПВЧ. Авторами неожиданно установлено, что соединения по настоящему изобретению можно использовать для такого лечения, и что такие соединения обладают также другими полезными свойствами.

Кроме того, в уровень техники данной области входят следующие документы: 8поек с! а1., ΑπΙίιη1сгоЬа1 Лдеп18 апб СБето1Бегару, т.46(11), с. 3356-3361 (ноябрь 2002); КейБ е! а1., ЛпйтюгоЬа1 Лдеп18 апб СБетоШегару, т. 47(7), с. 2193-2198 (июль 2003); СБпйепкеп е! а1., Лп1Мга1 КекеагсБ, т. 48, с. 131-142 (2000 г.); заявка на патент США № 2003/0072814 А1; патент США № 5798340; и заявка РСТ № РСТ/С296/00011.

Соединение формулы Ι

где Υ^1Α представляет собой -ΝΗ(Κ^Χ), а Υ^1Β означает Υ¹;

Κ^Χ1 означает Н, а К^Х2 означает V⁵;

Υ¹ означает =О, -О(К^Х), =8, -ΝΗ(Κ^Χ), -Ν(Θ)(Κ^Χ), -Ν(ΘΚ^Χ), -Ν(Θ)(ΘΚ^Χ) или -Ν(Ν(Κ^Χ)(Κ^Χ));

И^Х независимо означает К¹, К², К⁴, XV³’ или защитную группу;

Я¹ независимо означает -Η или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода;

К² независимо означает К³ или К⁴, причем каждый К⁴ независимо замещен 0-3 группами К³, или две группы К² объединены через атом углерода с образованием цикла, содержащего от 3 до 8 атомов углерода, причем указанный цикл замещен 0-3 группами К³;

К³ означает К^3а, К^3Ь, К^3с или К³⁶ при условии, что, если К³ присоединен к гетероатому, то К³ означает К^3с или К³⁶;

К^3а означает -Η, -Р, -С1, -Вг, -I, -СР₃, -ΟΝ, Ν₃, -ΝΘ₂ или -ОК⁴;

К^3Ь означает =Θ, Ю(К⁴), =8, -И(К⁴), -Ν^)^⁴), -Ы^К⁴), -Ν^ΧΘ^⁴) или -Ы(НК⁴)(К⁴));

К^3с означает -К⁴, -Н(К⁴)(К⁴), -8К⁴, ^(Θ^⁴, ^(Θ^⁴, -8(Θ)(ΘК⁴), -8(Θ)2(ΘК⁴), -ΘС(К^3Ь)К⁴, -ΘС(К^3Ь)ΘК⁴, -ΘС(К^3Ь)(N(К⁴)(К⁴)), -8С(К^3Ь)К⁴, -8С(К^3Ь)ΘК⁴, ^(К^ХНК⁴)^⁴)), -Н(К⁴)С(К^3Ь)К⁴,

-Ν^Ο^³¹^^ -НК^ССК^ХНК⁴)^⁴)), V³ или -К^³;

К³⁶ означает -С(К^3Ь)К⁴, -С^Ж⁴, -С(К^3Ь)№³, -С(К^3Ь^³ или -С(К^3ЬХБ[(К⁴)(К⁴));

К⁴ означает -Η или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

К⁵ означает алкилен, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

V³ означает V⁴ или V⁵;

V⁴ означает К⁶, -С(К^3Ь)К⁶, -С(К^3Ь^⁵, -8Θμ^⁶ или -8Θ_Μ2ν⁵, где К⁶ означает К⁴, причем каждый К⁴ замещен 0-3 группами К³;

V⁵ означает карбоцикл или гетероцикл, причем V⁵ независимо замещен 0-3 группами К²;

М2 равно 0, 1 или 2; и его фармацевтически приемлемые соли.

- 2 011304

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В настоящем изобретении предлагается соединение формулы

где А означает

Υ^1Α представляет собой -ΝΗ^^, а Υ^1Β означает Υ¹;

Β^ΧΙ означает Н, а Β^Χ2 означает V⁵;

Υ¹ означает =0, -О^), =8, -ΝΗ^), -^0)^), ^(ОВ^, ^(ОДОВ^ или -ΝΙΝ^)^));

В^X независимо означает В¹, В², В⁴, V³ или защитную группу;

В¹ независимо означает -Η или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода;

В² независимо означает В³ или В⁴, причем каждый В⁴ независимо замещен 0-3 группами В³, или две группы В² объединены через атом углерода с образованием цикла, содержащего от 3 до 8 атомов углерода, причем указанный цикл замещен 0-3 группами В³;

В³ означает В^3а, В^3Ь, В^3с или В³⁴ при условии, что, если В³ присоединен к гетероатому, то В³ означает В^3с или В³⁴;

В^3а означает -Η, -Р, -С1, -Вг, -I, -СР₃, -ΟΝ, Ν₃, -\О₂ или -ОВ⁴;

В^3Ь означает =О, -О(В⁴), =8, -Ы(В⁴), ^(О)(В⁴), -Ы(ОВ⁴), -Ы(О)(ОВ⁴) или -ЫЩ(В⁴)(В⁴));

В^3с означает -В⁴, -Ы(В⁴)(В⁴), -8В⁴, -8(О)В⁴, -8(ОЫГ -8(О)(ОВ⁴), -8(ОЬ(ОВ⁴), -ОС(В^3Ь)В⁴, -ОС(В^3Ь)ОВ⁴, -ОС(В^3Ь)Щ(В⁴)(В⁴)), -8С(В^3Ь)В⁴, -8С(В^3Ь)ОВ⁴, -8С(В^3Ь)Щ(В⁴)(В⁴)), -Ы(В⁴)С(В^3Ь)В⁴,

-Ы(В⁴)С(В^3Ь)ОВ⁴, -Ы(В⁴)С(В^3Ь)Щ(В⁴)(В⁴)), V³ или -В⁵№³;

В³⁴ означает -С(В^3Ь)В⁴, -С(В^3Ь)ОВ⁴, -С(1В' )А\ -С(1Г )(Ж^; или -С(В^3Ь)Щ(В⁴)(В⁴));

В⁴ означает -Η или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

В⁵ означает алкилен, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

V³ означает V⁴ или V⁵;

V⁴ означает В⁶, -С(В^3Ь)В⁶, -С(В^3ЬЖ⁵, -8ОМ2В⁶ или -8ОМ^⁵, где В⁶ означает В⁴, причем каждый В⁴ замещен 0-3 группами В³;

V⁵ означает карбоцикл или гетероцикл, причем V⁵ независимо замещен 0-3 группами В²;

М2 равно 0, 1 или 2;

и его фармацевтически приемлемые соли.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы I

где Υ^1Α представляет собой -ΝΗ(Β^Χ), а Υ^1Β означает Υ¹;

В^м означает Н, а В^ж означает V⁵;

Υ¹ означает =0, -О(К^Х). 8. -ΝΗ(Β^Χ), -Ν(Θ)(Β^Χ), -Ν(ΘΒ^Χ), -Ν(Θ)(ΘΒ^Χ) или -Ν(Ν(Β^Χ)(Β^Χ));

Β^Χ независимо означает К¹, В², В⁴, V³ или защитную группу;

В¹ независимо означает -Η или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода;

В² независимо означает В³ или В⁴, причем каждый В⁴ независимо замещен 0-3 группами В³, или две группы В² объединены через атом углерода с образованием цикла, содержащего от 3 до 8 атомов углерода, причем указанный цикл замещен 0-3 группами В³;

В³ означает В^3а, В^3Ь, В^3с или В³⁴ при условии, что, если В³ присоединен к гетероатому, то В³ означает В^3с или В³⁴;

- 3 011304

Β^3α означает -Н, -Г, -С1, -Вг, -I, -СГ₃, -СЫ, Ν₃, -ΝΟ₂ или -ΟΒ⁴;

Β³' означает =Ο, -Ο(Β⁴), =8, -Ν(Β⁴), -Ν(Ο)(Β⁴), -Ν(ΟΒ⁴), -Ν(Ο)(ΟΒ⁴) или -Ν(Ν(Β⁴)(Β⁴));

К_^3с означает -Β⁴, -Ν(Β⁴)(Β⁴), -81В. -8(Ο)Β⁴, -8(Ο)_;ΙΒ. -8(Ο)(ΟΒ⁴), -8(Ο)2(ΟΒ⁴), -Οί/ΙΒ' )ΙΒ.

-Ο^'ΐΟΒ⁴, -Ο^Β³¹')(Ν(Β')(Κ·')). -8С(1В')1В. -8С(1В')ΟΙΒ. -8С(1В')(\(ΙΒ)(ΙΒ)). -Ν(Β⁴)С(Н³¹)1Β. -Ν^^Β^ΟΒ⁴, -Ν(Β⁴)^Β^3|3)(Ν(Β⁴)(Β⁴)), V³ или -Β⁵ν³;

Β³⁴ означает -^Β^31,)Β⁴, Η(Β^31,)ΟΒ⁴, -С(1В')\\'\ -С(1В')Ο\\'^; или -С(1В' )(\(ΙΒ)(ΙΒ));

Β⁴ означает -Н или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

Β⁵ означает алкилен, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

V³ означает V⁴ или V⁵;

V⁴ означает Β⁶, -С(Β^3Ь)Β⁶, -С(Β^3Ь)V⁵, -8ΟΜ2Β⁶ или -8ΟΜ2\⁵, где Β⁶ означает Β⁴, причем каждый Β⁴ замещен 0-3 группами Β³;

V⁵ означает карбоцикл или гетероцикл, причем V⁵ независимо замещен 0-3 группами Β²;

М2 равно 0, 1 или 2;

и его фармацевтически приемлемые соли.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы ΙΑ

где Υ^1Α и Υ^1Β имеют значения, как определено выше.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

В другом варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

- 4 011304

В одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

НМ

В другом варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

В одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

- 5 011304

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

В другом варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

В одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение формулы

В другом варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение, пригодное для использования в качестве антипролиферативного агента.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение, пригодное для использования в качестве апоптотического агента.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение, пригодное для использования в качестве агента, обладающего противовирусной активностью в отношении ПВЧ.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения предлагается соединение, пригодное для использования в качестве агента местного применения, обладающего противовирусной активностью в отношении ПВЧ.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель.

- 6 011304

В одном аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция в виде геля.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция в виде мази.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и эффективное количество по крайней мере одного противовирусного агента, а также фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая дополнительный противовирусный агент и выполненная в виде геля.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая дополнительный противовирусный агент и выполненная в виде мази.

Определения

РМЕ6 означает соединение 9-(2-фосфонилметоксиэтил)гуанин

Термин

Термин

ергРМЕПЛРозначает соединение 9-(2-фосфонилметоксиэтил)-2-амино-6-(циклопропилТермин амино)пурин

Биодоступность означает количество фармацевтически активного агента, которое достигает ткани-мишени после введения агента в организм. Повышение биодоступности фармацевтически активного агента обеспечивает более результативное и эффективное лечение пациентов, так как при данной дозе осуществляется доставка большего количества фармацевтически активного агента в ткань-мишень.

Термины фосфонат и фосфонатная группа означают функциональные группы или фрагменты в составе молекулы, которая содержит атом фосфора, который 1) присоединен простой связью к атому углерода, 2) присоединен двойной связью к гетероатому, 3) присоединен простой связью к гетероатому и 4) присоединен простой связью к другому гетероатому, причем каждый гетероатом является одинаковым или различным. Термины фосфонат и фосфонатная группа включают также функциональные группы или фрагменты, которые содержат атом фосфора в таком же окисленном состоянии, как и атом фосфора, описанный выше, а также функциональные группы или фрагменты, которые содержат фрагмент пролекарства, который отщепляется от соединения таким образом, что в соединении остается атом фосфора, обладающий описанными выше характеристиками. Например, термины фосфонат и фосфонатная группа включают фосфоновую кислоту, сложный моноэфир фосфоновой кислоты, сложный диэфир фосфоновой кислоты, фосфонамидат и фосфонтиоатные функциональные группы. В одном варианте воплощения настоящего изобретения термины фосфонат и фосфонатная группа включают функциональные группы или фрагменты в составе молекулы, которая содержит атом фосфора, который 1) присоединен простой связью к атому углерода, 2) присоединен двойной связью к атому кислорода, 3) присоединен простой связью к атому кислорода и 4) присоединен простой связью к другому атому кислорода, а также функциональные группы или фрагменты, которые содержат фрагмент пролекарства, который отщепляется от соединения таким образом, что в соединении остается атом фосфора, обладающий такими характеристиками. В другом типичном варианте воплощения настоящего изобретения термины

- 7 011304 фосфонат и фосфонатная группа включают функциональные группы или фрагменты в составе молекулы, которая содержит атом фосфора, который 1) присоединен простой связью к атому углерода, 2) присоединен двойной связью к атому кислорода, 3) присоединен простой связью к атому кислорода или азота и 4) присоединен простой связью к другому атому кислорода или азота, а также функциональные группы или фрагменты, которые содержат фрагмент пролекарства, который отщепляется от соединения таким образом, что в соединении остается атом фосфора, обладающий описанными характеристиками.

В настоящее время известны методы и способы определения стабильности соединений в суррогатах желудочно-кишечных секретов. Термин стабильные соединения, использованный в данном контексте, означает стабильные в желудочно-кишечном тракте соединения, в которых при инкубации в суррогате кишечного или желудочного сока при 37°С в течение 1 ч удаляется приблизительно менее 50 мол.% защитных групп. Такие соединения пригодны для применения в указанном варианте способа. Следует отметить, что стабильность соединений в желудочно-кишечном тракте включает возможность их гидролиза ίη νίνο. Обычно пролекарства стабильны в пищеварительной системе, но они в значительной степени гидролизуются с образованием исходного лекарственного средства в просветах пищеварительного тракта, в печени или в другом метаболическом органе, или в основном внутри клеток.

Соединения по настоящему изобретению в некоторых случаях существуют также в форме таутомеров. Например, таутомеры типа ен-амино образуются в случае имидазола, гуанидина, амидина и систем тетразола, причем все их возможные таутомерные формы включены в объем настоящего изобретения.

Термин пролекарство, использованный в данном контексте, означает любое соединение, при введении которого в биологическую систему образуется лекарственное соединение, т.е. активный ингредиент, образующийся в результате спонтанной химической реакции(й); химической реакции(й), катализируемой ферментом, фотолиза и/или метаболической химической реакции(й). Таким образом, пролекарство является ковалентно модифицированным аналогом или латентной формой терапевтически активного соединения.

Фрагмент пролекарства означает лабильную функциональную группу, которая отщепляется от активного ингибирующего соединения в процессе метаболизма, при системном введении, внутри клетки при гидролизе, ферментативном расщеплении или при отщеплении по другому механизму (статья Н. Випйдаагй, Ωοδίβη апй Αρρίίοαίίοη о£ Ргойгид, в сборнике А Тех1Ьоок о£ Огид Ωοδίβη апй Ос\'с1ортсп1. 1991, Р. Кгодздаагй-Ьагвеп апй Н. Випйдаагй, Ейз. Напхоой Асайетю РиЬ118Еег8, с. 113-191). Ферменты, активирующие соединения фосфонатного пролекарства по настоящему изобретению, включают, без ограничения перечисленным, амидазы, эстеразы, микробиологические ферменты, фосфолипазы, холинэстеразы и фосфазы. Фрагменты пролекарства повышают растворимость, абсорбцию и липофильность для оптимизации доставки лекарственного средства, его биодоступности и эффективности. Фрагмент пролекарства может включать активный метаболит или лекарственное средство.

Примеры фрагментов пролекарства включают гидролитически чувствительные или лабильные ацилоксиметильные сложные эфиры -СН₂ОС(=О)Я и ацилоксиметильные карбонаты -СН₂ОС(=О)ОЯ, где Я в этом случае означает (С1-С₆)алкил, замещенный (С1-С₆)алкил, (С₆-С₂₀)арил или замещенный (С₆С₂₀)арил. Ацилоксиалкильный сложный эфир впервые был использован в качестве пролекарства при модификации карбоновых кислот и затем при модификации фосфатов и фосфонатов, как описано в статье ЕащиЕаг е1 а1., 1983, 1. РЕагт. 8сЕ, 72, с. 324; а также в патентах США № 4816570, 4968788, 5663159 и 5792756. Позднее ацилоксиалкильный сложный эфир был использован для доставки фосфоновых кислот через клеточные мембраны и для повышения пероральной биодоступности. Близкий аналог ацилоксиалкильного сложного эфира, алкоксикарбонилоксиалкильный сложный эфир (карбонат), использованный в качестве фрагмента пролекарства в комбинациях соединений по настоящему изобретению, также повышает пероральную биодоступность.

Пример ацилоксиметильного сложного эфира включает изопропилкарбонилоксиметокси, -ОСН2ОС(=О)С(СН3)2.

Пример фрагмента пролекарства ацилоксиметильного карбоната включает изопропилкарбонилоксиметилкарбонат, НОС(=О)ОСН2ОС(=О)С(СН3)2.

Фосфонатной группой является фрагмент фосфонатного пролекарства. Примеры фрагментов фосфонатного пролекарства, которые подвергаются гидролизу, включают, без ограничения перечисленным, изопропилкарбонилоксиметокси- или изопропилкарбонилоксиметилкарбонатную группу. В другом варианте, фрагмент пролекарства, который расщепляется под действием ферментов, включает сложноэфирную лактатную или сложноэфирную фосфонамидатную группу.

Установлено, что арильные сложные эфиры с фосфорсодержащими группами, прежде всего, фениловые сложные эфиры, повышают пероральную биодоступность (Ое ЬотЬаеЛ е1 а1., Т Мей. СЕет., 1994, 37, с. 498).

Описаны также фениловые сложные эфиры, содержащие сложные эфиры карбоновых кислот в орто-положении к фосфату (КЕатпе1 апй Тоггепсе, Т Мей. СЕет., 1996, 39, с. 4109-4115). Установлено, что бензиловые сложные эфиры образуют исходную фосфоновую кислоту. В некоторых случаях заместите

- 8 011304 ли, расположенные в орто- или пара-положении, ускоряют гидролиз. Бензиловые аналоги, содержащие ацилированный фенол или алкилированный фенол, образуют фенольное соединение под действием ферментов, например эстераз, оксидаз и т.п., которое в свою очередь подвергается расщеплению по бензиловой связи С-О с образованием фосфорной кислоты и промежуточного хинонметида. Примеры указанного класса пролекарств описаны в статье Мбс11е11 е! а1., 1. С11сш. Бос., Реткт Ттаик., 1992, II, с. 2345; и в заявке на выдачу патента С1а/1ег νθ 91/19721. Описаны и другие бензиловые пролекарства, содержащие сложноэфирную группу карбоновой кислоты, присоединенную к бензилметилену (заявка на выдачу патента С1а/1ег νθ 91/19721). Установлено, что пролекарства, содержащие тиогруппу, пригодны для внутриклеточной доставки фосфонатных лекарственных средств. Указанные предшественники сложных эфиров содержат этилтиогруппу, в которой тиольную группу либо этерифицируют ацильной группой, либо комбинируют с другой тиольной группой с образованием дисульфида. При омылении или восстановлении дисульфида получают свободное промежуточное тиосоединение, которое впоследствии расщепляется на фосфорную кислоту и эписульфид (Риесй е! а1., ΑηΙίνίΓαΙ Кек., 1993, 22, с. 155-174; Вепхапа е! а1., I. Меб. Сйеш.. 1996, 39, с. 4958). Циклические фосфонатные сложные эфиры описаны также в качестве пролекарств фосфорсодержащих соединений (Ετίοη е! а1., патент США № 6312662).

Защитная группа означает фрагмент соединения, который маскирует или изменяет свойства функциональной группы или свойства соединения в целом. Химические защитные группы и способы введения/удаления защитных групп известны в данной области техники. См., например, сборник Рго!есШ'е Сгоирк ίη Отдашс Сйет18!ту, Тйеобота V. Стеепе, Ιοίιη νίΚν апб Бопк, 1пс., №\ν Уотк, 1991. В большинстве случаев защитные группы используют для маскировки реакционноспособности определенных функциональных групп, что повышает эффективность требуемых химических реакций, например, для создания и расщепления химических связей по определенной схеме синтеза. Защита функциональных групп соединения изменяет его другие физические свойства, кроме реакционной способности защищенной функциональной группы, такие как полярность, липофильность (гидрофобность) и другие свойства, которые определяют известными методами. Химически защищенные промежуточные соединения сами по себе являются биологически активными или неактивными.

Защищенные соединения проявляют также измененные и в некоторых случаях оптимизированные свойства ίη νίΙΐΌ и ίη νίνΌ, такие как проницаемость через клеточные мемраны и устойчивость к деградации или секвестрации под действием ферментов. В связи с этим защищенные соединения с предназначенным терапевтическим действием можно использовать в качестве пролекарства.

Другая функция защитной группы заключается в превращении исходного лекарственного средства в пролекарство, причем исходное лекарственное средство высвобождается при превращении пролекарства ίη νί\Ό. Поскольку активные пролекарства абсорбируются более эффективно, чем исходное лекарственное средство, пролекарства обладают большей эффективностью ίη νί\Ό по сравнению с исходным лекарственным средством. Защитные группы удаляют либо ίη νίΙΐΌ в случае химических промежуточных соединений, либо ίη νί\Ό в случае пролекарств. При использовании химических промежуточных соединений не является необходимым, чтобы продукты после удаления защитных групп, например спирты, являлись физиологически приемлемыми, хотя предпочтительно использовать фармакологически безвредные продукты. Любая ссылка на любое из соединений по настоящему изобретению включает также ссылку на его физиологически приемлемую соль. Примеры физиологически приемлемых солей соединений по настоящему изобретению включают соли пригодного основания, такого как щелочной металл (например, натрий), щелочно-земельный металл (например, магний), аммоний и ΝΧ₄ ⁺ (где X означает (С1-С4)алкил). Физиологически приемлемые соли, образованные с участием атома водорода или аминогруппы, включают соли органических карбоновых кислот, таких как уксусная, бензойная, молочная, фумаровая, винная, малеиновая, малоновая, яблочная, изетионовая, лактобионовая и янтарная кислоты; органических сульфокислот, таких как метансульфокислота, этансульфокислота, бензолсульфокислота и пара-толуолсульфокислота; и неорганических кислот, таких как соляная, серная, фосфорная и сульфаминовая кислоты. Физиологически приемлемые соли соединения, полученные с участием гидроксигруппы, включают анион указанного соединения в комбинации с пригодным катионом, таким как №1' и ΝΧ4⁺ (где X независимо выбирают из Н или группы (С£-С₄)алкил).

Термин гель, использованный в данном контексте, означает полутвердые системы, состоящие либо из суспензий, образованных небольшими неорганическими частицами, либо из высокомолекулярных органических молекул, включающих или пропитанных жидкостью. Если гелиевая масса состоит из флоккул небольших частиц, гель называют двухфазной системой и в некоторых случаях магмой (густая водная суспензия). Примеры двухфазных систем включают гель гидроксида алюминия и бентонитовую магму. Однофазные гели состоят из органических макромолекул, равномерно распределенных во всей жидкости таким образом, что не существует видимых границ между диспергированными макромолекулами и жидкостью. Примерами таких гелей являются натрий карбоксиметилцеллюлоза и трагакант. Несмотря на то, что гели обычно получают на водной основе, в качестве непрерывной фазы используют спирты и масла.

Термин мази, использованный в данном контексте, означает полутвердый препарат для наружного применения с такой консистенцией, которая позволяет наносить его на кожу втиранием. Состав таких

- 9 011304 препаратов обычно размягчается, но не плавится при нанесении на кожу. Указанные препараты используют в качестве носителей при местном введении медицинских препаратов, а также они предназначены для защиты и смягчения кожи.

При терапевтическом применении соли активных ингредиентов соединений по настоящему изобретению должны быть физиологически приемлемыми, т.е. они должны представлять собой соли физиологически приемлемой кислоты или основания. Однако находят также применение соли кислот или оснований, которые не являются физиологически приемлемыми, например, при получении или очистке физиологически приемлемого соединения. Все соли, производные физиологически приемлемой или физиологически неприемлемой кислоты или основания, включены в объем настоящего изобретения.

Алкил означает (С1-С1₈)углеводород, содержащий первичные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода. Примеры включают метил (Ме, -СН₃), этил (Εΐ, -СН₂СН₃), 1-пропил (н-Рг, нпропил, -СН₂СН₂СН₃), 2-пропил (изо-Рг, изо-пропил, -СН(СН₃)₂), 1-бутил (н-Ви, н-бутил,

-СН₂СН₂СН₂СН₃), 2-метил-1-пропил (изо-Ви, изо-бутил, -СН₂СН(СН₃)₂), 2-бутил (втор-Ви, втор-бутил, -СН(СН₃)СН₂СН₃), 2-метил-2-пропил (трет-Ви, трет-бутил, -С(СН₃)₃), 1-пентил (н-пентил,

-СН2СН2СН2СН2СН3), 2-пентил (-СН(СН3)СН2СН2СН3), 3-пентил (-СН(СН2СН3)2), 2-метил-2-бутил (-С(СН₃)₂СН₂СН₃), 3-метил-2-бутил (-СН(СН₃)СН(СН₃)₂), 3-метил-1-бутил (-СН₂СН₂СН(СН₃)₂), 2-метил-1бутил (-СН2СН(СН3)СН2СН3), 1-гексил (-СН2СН2СН2СН2СН2СН3), 2-гексил (-СЩСВДСЩСЩСЩСЩ), 3-гексил (-СН(СН2СН3)(СН2СН2СН3)), 2-метил-2-пентил (-С(СН3)2СН2СН2СН3), 3-метил-2-пентил (-СН(СН₃)СН(СН₃)СН₂СН₃), 4-метил-2-пентил (-СН(СН₃)СН₂СН(СН₃)₂), 3-метил-3-пентил (-С(СН3)(СН2СН3)2), 2-метил-3-пентил (-СН(СН2СН3)СН(СН3)2), 2,3-диметил-2-бутил (-С(СН3)2СН(СН3)2), 3,3-диметил-2-бутил (-СН(СН3)С(СН3)3).

Алкенил означает (С₂-С₁₈)углеводород, содержащий первичные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода и по крайней мере одну ненасыщенную связь, т.е. углерод-углерод кр²двойную связь. Примеры включают, без ограничения перечисленным, этилен или винил (-СН=СН₂), аллил (-Сн₂СН=СН₂), циклопентенил (-С₅Н₇) и 5-гексенил (-СН₂СН₂СН₂СН₂СН=СН₂).

Алкинил означает (С₂-С₁₈)углеводород, содержащий первичные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода и по крайней мере одну ненасыщенную связь, т.е. углерод-углерод кр-тройную связь. Примеры включают, без ограничения перечисленным, ацетилен (-С^СН) и пропаргил (-СН₂С^СН).

Алкилен означает насыщенную, разветвленную или неразветвленную цепь или циклический углеводородный радикал, содержащий от 1 до 18 атомов углерода и две свободные валентности, образованные при удалении двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода исходного алкана. Примеры алкиленовых радикалов включают, без ограничения перечисленным, метилен (-СН₂-), 1,2-этил (-СН₂СН₂-), 1,3-пропил (-СН₂СН₂СН₂-), 1,4-бутил (-СН₂СН₂СН₂СН₂-) и т.п.

Алкенилен означает ненасыщенную, разветвленную или неразветвленную цепь или циклический углеводородный радикал, содержащий от 2 до 18 атомов углерода и две свободные валентности, образованные при удалении двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода исходного алкена. Примеры алкениленовых радикалов включают, без ограничения перечисленным, 1,2этилен (-СН=СН-).

Алкинилен означает ненасыщенную, разветвленную или неразветвленную цепь или циклический углеводородный радикал, содержащий от 2 до 18 атомов углерода и две свободные валентности, образованные при удалении двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода исходного алкина. Примеры алкиниленовых радикалов включают, без ограничения перечисленным, ацетилен (-С=С-), пропаргил (-СН₂С=С-) и 4-пентинил (-СН₂СН₂СН₂С=С-).

Арил означает моновалентный ароматический углеводородный радикал, содержащий от 6 до 20 атомов углерода, образованный при удалении одного атома водорода от одного атома углерода исходной ароматической циклической системы. Примеры арильных групп включают, без ограничения перечисленным, радикалы, образованные из бензола, замещенного бензола, нафталина, антрацена, бифенила и т. п.

Арилалкил означает ациклический алкильный радикал, в котором один из атомов водорода, присоединенный к атому углерода, обычно к концевому или кр³ атому углерода, заменен на арильный радикал. Примеры арилалкильных групп включают, без ограничения перечисленным, бензил, 2-фенилэтан-1ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан-1-ил и т. п. Арилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода, например, алкил, включая группы алкил, алкенил или алкинил, в составе группы арилалкил, содержит от 1 до 6 атомов углерода, а арил содержит от 5 до 14 атомов углерода.

Замещенный алкил, замещенный арил и замещенный арилалкил означают алкил, арил и арилалкил соответственно, в которых один или более атомов водорода каждый независимо заменены на заместитель, не являющийся водородом. Примеры заместителей включают, без ограничения перечисленным, -X, -В, -О^-, -ОН, -8В, -8^-, -ΝΒ2, -ΝΒ3, =ΝΒ, -СХ3, -СЫ, -ОСЫ, -8СЫ, -Ы=С=О, -ЫС8, -ΝΟ, -ΝΟ2, =Ν2, -Ν3, ЫС(=О)В, -С(=О)В, -С(=О)МКВ, -8(=О)2О^-, -8(=О)2ОН, -8(=О)₂К, -О8(=ОрОР. -8(=ОрХНР. -8(=О)В, -ОР( О)О_;РР. -Р( О)О_;РР. -Р(=О)(О^-)2, -Р(=О)(ОН)2, -С(=О)В, -С(=О)Х, -С(8)В, -С(О)ОВ, -С(О)О^-,

- 10 011304

-С(8)ОВ, -С(О)8В, -С(8)8В, -Ο(Θ)ΝΚΒ, -Ο(8)ΝΚΒ, -Ο(ΝΚ)ΝΚΒ, где X, каждый независимо, означает галоген: Р, С1, Вг или I, а В, каждый независимо, означает -Н, алкил, арил, гетероцикл, защитную группу или фрагмент пролекарства. Группы алкилен, алкенилен и алкинилен замещают аналогичным образом.

Термин гетероцикл, использованный в данном контексте, означает, например, но без ограничения перечисленным, указанные гетероциклы, описанные в сборнике Ь.Л. Радиейе, Ргтс1р1е8 ок Мойеги Нс1егосусйс СкетЩгу (\ν.Λ. Вещают, №\ν Уогк, 1968), прежде всего в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; в сборнике Тке СкетбИу ок Не1егосускс Сотроиийк, А 8епе§ ок Моиодгаркз (коки \νίΒ\· апй 8ои5, №\ν Уогк, с 1950 до настоящего времени), прежде всего в томах 13, 14, 16, 19 и 28; и в статье 1. Ат. Скет. 8ос., 1960, 82, с. 5566. В одном варианте воплощения настоящего изобретения термин гетероцикл означает карбоцикл, как определено в данном контексте, где один или более (например, 1, 2, 3 или 4) атома углерода заменены на гетероатом (например, О, N или 8).

Примеры гетероциклов включают, без ограничения перечисленным, пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиофенил, включающий атом серы, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталенил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6Н-1,2,5тиадиазинил, 2Н,6Н-1,2,5-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксатинил, 2Н-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, ЗН-индолил, 1Н-индазолил, пуринил, 4Н-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4аН-карбазолил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриазолил, бензизоксазолил, оксиндолил, бензоксазолинил, изатионил и бис-тетрагидрофуранил.

В качестве примера, без ограничения перечисленным, гетероциклы, присоединенные к атому углерода, означают гетероциклы, присоединенные в положении 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, в положении 3, 4, 5 или 6 пиридазина, в положении 2, 4, 5 или 6 пиримидина, в положении 2, 3, 5 или 6 пиразина, в положении 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, в положении 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, в положении 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, в положении 2 или 3 азиридина, в положении 2, 3 или 4 азетидина, в положении 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или в положении 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина. В большинстве случаев гетероциклы, присоединенные к атому углерода, включают 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 5-пиридил, 6-пиридил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 5-пиридазинил, 6-пиридазинил, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5пиримидинил, 6-пиримидинил, 2-пиразинил, 3-пиразинил, 5-пиразинил, 6-пиразинил, 2-тиазолил, 4тиазолил или 5-тиазолил.

В качестве примера, без ограничения перечисленным, гетероциклы, присоединенные к атому азота, означают гетероциклы, присоединенные в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1Н-индазола, в положении 2 изоиндола или изоиндолина, в положении 4 морфолина и в положении 9 карбазола или βкарболина. В большинстве случаев гетероциклы, присоединенные к атому азота, включают 1-азиридил, 1-азетидил, 1-пирролил, 1-имидазолил, 1-пиразолил и 1-пиперидинил.

Карбоцикл означает насыщенный, ненасыщенный или ароматический цикл, содержащий от 3 до 7 атомов углерода в качестве моноцикла, от 7 до 12 атомов углерода в качестве бицикла и вплоть до 20 атомов углерода в качестве полицикла. Моноциклические карбоциклы содержат от 3 до 6 атомов в цикле, более типично от 5 до 6 атомов в цикле. Бициклические карбоциклы содержат от 7 до 12 атомов в цикле, например, [4, 5], [5, 5], [5, 6] или [6, 6] бициклосистемы, или 9 или 10 атомов в цикле, например, [5, 6] или [6, 6] бициклосистемы. Примеры моноциклических карбоциклов включают циклопропил (сРгору1), циклобутил (сВи!у1), циклопентил (сРеи!у1), 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, фенил, спирил и нафтил.

Связующая группа или связующее звено означает химический фрагмент, содержащий ковалентную связь или цепь или группу атомов, которые ковалентно присоединены к фосфонатной группе пролекарства. Связующие группы включают фрагменты, такие как повторяющиеся звенья алкилокси (полиэтиленокси, ПЭГ, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, 1еккатте), и сложные эфиры двухосновных кислот и амидов, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат и капроамид.

Термин АЬа, использованный в данном контексте, означает двухвалентный остаток 2аминобутановой кислоты

- 11 011304

Термин А1а, использованный в данном контексте, означает двухвалентный остаток аланина

Термин Р11с. использованный в данном контексте, означает двухвалентный остаток фенилаланина

Термин РОС, использованный в данном контексте, означает двухвалентный остаток гидроксиметилизопропилкарбоната

где место присоединения обозначено символом звездочка

Заместители Υ^1Α и Υ^1Β названы с использованием номенклатуры, которая включает вышеупомянутые двухвалентные остатки аминокислоты и алкильные остатки, как указано в табл. 80-3.

Например, соединение формулы

названо с использованием номенклатуры формулы I, где Υ^1Α и Υ^1Β означают -ΝΗ(Β^Χ), где В^х означает В², В² означает В⁴, замещенный группой В³⁴, причем В⁴ означает пропил, замещенный группой В³⁴, где В³⁴ означает -С(В^3Ь)ОВ⁴, В^3Ь означает =0 и В⁴ означает этил. В другом варианте указанное соединение описано в табл. 80-3, как формула I, где Υ^1Α и Υ^1Β означают АЬа-Εΐ формулы (где символ звездочка * означает место присоединения)

в которой АЬа связан с Εΐ (этилом). Например, соединение формулы

- 12 011304

названо с использованием номенклатуры формулы I, где Υ^1Α и Υ^1Β означают -ΝΗ(Κ^Χ), где К^х означает К², причем К² означает К⁴, замещенный группой К³⁴, К⁴ означает этил, замещенный группой К³⁴, причем К³⁴ означает -С(К^3Ь)ОК⁴, К^3Ь означает =0 и К⁴ означает н-пропил. В другом варианте указанное соединение описано в табл. 80-3, как формула I, где Υ^1Α и Υ^1Β означают А1а-пРг формулы (где символ звездочка * означает место присоединения)

Термин хиральный относится к молекулам, зеркальные отражения которых являются несовместимыми, а термин ахиральный означает молекулы, зеркальные отражения которых совместимы.

Термин стереоизомеры означает соединения, которые характеризуются одинаковым химическим строением, но различаются расположением атомов или групп атомов в пространстве.

Термин диастереомер означает стереоизомер, содержащий два или более хиральных центра, и молекулы которого не являются зеркальными отражениями друг друга. Диастереомеры обладают различными физическими свойствами, например, температурами плавления, температурами кипения, спектральными характеристиками и реакционноспособностью. Смеси диастереомеров разделяют аналитическими методами высокого разрешения, такими как электрофорез и хроматография.

Термин энантиомеры означает два стереоизомера соединения, которые не являются совмещаемыми зеркальными отражениями друг друга.

Термин лечение в отношении заболевания или патологического состояния означает профилактику заболевания или патологического состояния, подавление заболевания или патологического состояния, устранение заболевания или патологического состояния и/или ослабление интенсивности одного или более симптомов заболевания или патологического состояния.

Термин антипролиферативный относится к активности, которую используют для ингибирования роста клетки, например, антипролиферативное действие на клетки новообразований или антипролиферативное действие на инфицированные вирусом клетки.

Термин апоптоз означает один из главных типов запрограммированной гибели клетки. В основном этот процесс означает преднамеренное самоуничтожение нежелательной клетки в многоклеточном организме. В отличие от некроза, при котором наблюдается гибель клеток в результате острого повреждения ткани, апоптоз представляет собой упорядоченный процесс, который, как правило, оказывает благоприятное действие в течение цикла жизни организма. Апоптоз означает тип гибели клеток, при котором клетка использует специальный клеточный механизм для самоуничтожения; механизм самоуничтожения клетки позволяет многоклеточному организму контролировать количество клеток и удалять клетки, которые угрожают долговечности животного. Апоптоз происходит, например, при повреждении клетки, которая не может быть восстановлена, или при инфицировании клетки вирусом. Стимулирование апоптоза осуществляется самой клеткой, из окружающей ее ткани или из клетки, которая является частью иммунной системы, причем указанный стимул может быть химическим, биологическим или физическим. Соответствующий термин апоптический относится к процессу апоптоза.

Стереохимические определения и условные обозначения, использованные в данном контексте, как правило, соответствуют правилам, приведенным в сборнике 8.Р. Рагкег, Е4., МсСга^-НШ ОюДопагу о£ С11ст1са1 Тегтк, МсСга^-НШ Воок Сотрапу, №\ν ΥοΑ, 1984; и Е. Е11е1 ап4 8. \УПеп. 81егеоскеш181гу о£ Огдашс Сошроип48, 1окп ^11еу ап4 8оп§, 1пс., №\ν Υο^к, 1994. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е. они обладают способностью вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно ее хирального центра(ов) используют буквы Ό и Ь или К и 8. Буквы 4 и I или (+) и (-) используют для обозначения направления вращения плоскополяризованного света соединением, причем (-) или I означает, что соединение является левовращающим. Соединение, обозначенное

- 13 011304 (+) или ά, является правовращающим. Для данной химической структуры указанные стереоизомеры являются одинаковыми за исключением того, что они являются зеркальными отражениями друг друга. Индивидуальный стереоизомер называют также энантиомером, а смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров состава 50:50 называют рацемической смесью или рацематом, причем указанная смесь образуется, если химическая реакция или процесс не обладает стереоселективностью или стереоспецифичностью. Термин рацемическая смесь или рацемат означает эквимолярную смесь двух энантиомерных соединений, не обладающую оптической активностью.

Защитные группы.

В контексте настоящего изобретения защитные группы означают фрагменты пролекарства и химические защитные группы.

Защитные группы являются коммерческими препаратами, общеизвестными и широко используемыми, и по выбору используются для предотвращения побочных реакций защищенных групп в ходе синтеза, т. е. при получении соединений по настоящему изобретению. В большинстве случаев при выборе защитных групп имеет значение природа химических защитных групп РС, которая зависит от типа используемой реакции, в условиях которой требуется защитить функциональную группу (например, кислотные, основные, окислительные, восстановительные или другие условия) и от предполагаемой схемы синтеза. Защитные группы не обязательно должны быть одинаковыми и в основном этого не требуется, если соединение замещено защитными группами различного типа. В основном защитные группы используют для защиты функциональных групп, таких как карбоксильные, гидроксильные, тио- или аминогруппы, чтобы исключить побочные реакции или иным образом повысить эффективность синтеза. Порядок удаления защитных групп с образованием свободных незащищенных групп зависит от схемы синтеза и условий используемой реакции, причем порядок удаления может изменяться по усмотрению специалиста в данной области органической химии.

Можно защищать различные функциональные группы в составе соединений по настоящему изобретению. Например, защитные группы для ОН-групп (гидроксильных, карбоксильных, фосфоновой кислоты или прочих) включают группы, образующие простые или сложные эфиры. Такие группы используют в качестве защитных групп в использованных в данном контексте схемах синтеза. Однако некоторые защитные группы для гидроксильных и тиогрупп не являются группами, образующими простые или сложные эфиры, как представляется очевидным для специалиста в данной области химии, причем такие группы включают амиды, как описано ниже.

Огромное множество защитных групп для гидроксильных групп и амидобразующих групп и соответствующие методы химического отщепления описаны в книге Рго1есЦуе Сгоирк ίη Огдашс БуиШекщ, Т.^. Сгееп, 1. ^11еу аий §оик, 1ис., Νο\ν Уогк, 1991, Ι8ΒΝ 0-471-62301-6 (далее Сгееп). См. также в книге Кос1еикк1 Р.к, Рго1ес1тд Сгоирк, Сеогд ТЫете Vе^1ад ЗШИдагк №е\у Уогк, 1994, которые включены в данное описание в качестве ссылок. Прежде всего, глава 1, РгоесЬид Сгоирк, обзор, с. 1-20, глава 2 Нуйгоху1 Рго1есйид Сгоирк, с. 21-94, глава 3, Ою1 Рго1есйид Сгоирк, с. 95-117, глава 4, СагЬоху1 Рго1есйид Сгои1к, с. 118-154, глава 5 СагЬоиу1 Рго1ес1шд Сгоирк с. 155-184. Защитные группы для карбоновой кислоты, фосфоновой кислоты, фосфоната, сульфоновой кислоты и другие защитные группы для кислотных групп также описаны в книге Сгееи. Такие группы включают, без ограничения перечисленным, сложные эфиры, амиды, гидразиды и т. п.

Защитные группы, образующие простые и сложные эфиры.

Группы, образующие сложные эфиры, включают (1) группы, образующие фосфонатные сложные эфиры, такие как фосфонамидатные сложные эфиры, фосфоротиоатные сложные эфиры, фосфонатные сложные эфиры и фосфон-бис-амидаты, (2) группы, образующие сложные эфиры карбоновых кислот, и (3) группы, образующие серосодержащие сложные эфиры, такие как сульфонат, сульфат и сульфинат.

Фосфонатные остатки в составе соединений по изобретению могут означать или не означать остатки пролекарства, т. е. могут проявлять или не проявлять чувствительность в условиях гидролиза или ферментативного расщепления или модификации. Некоторые фосфонатные остатки устойчивы в большинстве или практически в большинстве условий метаболизма. Например, диалкилфосфонат, в котором алкильные группы содержат 2 или более атомов углерода, проявляет заметную устойчивость 1и у1уо из-за низкой скорости гидролиза.

Соли и гидраты.

Композиции по настоящему изобретению необязательно включают соли соединений, описанных в данном контексте, прежде всего фармацевтически приемлемые нетоксичные соли, содержащие, например, №а⁺, Ь1⁺, К⁺, Са⁺⁺ и Мд⁺⁺. Такие соли включают соли, образующиеся при комбинации соответствующих катионов, таких как ионы щелочных и щелочно-земельных металлов или ионов аммония и четвертичного аммония, с остатком кислотного аниона. Одновалентные соли предпочтительны, если требуются водорастворимые соли.

Соли металлов обычно получают при взаимодействии соединения по настоящему изобретению в гидроксидом металла. Примеры солей металлов, которые получают указанным методом, включают соли, содержащие Ь1⁺, №а' и К⁺. Менее растворимую соль металла осаждают из раствора более растворимой соли при добавлении соединения пригодного металла.

- 14 011304

Кроме того, соли можно получить присоединением определенных органических и неорганических кислот, например, НС1, НВг, Н₂8О₄, или органических сульфоновых кислот к основным центрам или к кислотным группам. В конечном итоге специалисту в данной области химии представляется очевидным, что композиции включают соединения по изобретению в их неионизированной, а также в цвиттерионной форме, а также в комбинации со стехиометрическим количеством воды в виде гидратов.

В объем изобретения включены также соли исходных соединений и одной или более аминокислот. Пригодными являются любые аминокислоты, описанные выше, прежде всего природные аминокислоты, входящие в состав белков, однако, аминокислота обычно содержит боковую цепь основной или кислотной природы, например, лизин, аргинин или глутаминовая кислота, или нейтральную цепь, такую как глицин, серин, треонин, аланин, изолейцин или лейцин.

Способы подавления активности ПВЧ.

Другой аспект настоящего изобретения относится в способам подавления активности ПВЧ, включающим стадию обработки образца, предположительно инфицированного ПВЧ, соединением по изобретению.

Композиции по изобретению действуют как ингибиторы ПВЧ, в качестве промежуточных производных таких ингибиторов или находят применение в других областях.

Стадия обработки по изобретению включает добавление соединения по изобретению к образцу или включает добавление предшественника композиции к образцу. Стадия включает любой метод введения, как описано выше.

При необходимости активность ПВЧ после нанесения композиции можно определить любым методом, включающим прямые и косвенные методы детектирования активности ПВЧ. Используют количественные, качественные и полуколичественные методы определения активности ПВЧ. Обычно используют один из перечисленных выше методов анализа, однако можно также использовать любой другой метод, такой как оценка физиологических свойств живого организма.

Поиск ингибиторов ПВЧ.

Для соединений и композиций по настоящему изобретению определяют терапевтическую эффективность по величине ЕС₅₀, т.е. по концентрации соединения, при которой наблюдается ингибирование роста клеток на 50%. Соотношение ЕС₅₀ для неинфицированных ПВЧ клеток и ЕС₅₀ для инфицированных ПВЧ клеток является мерой селективности соединения в отношении инфицированных вирусом клеток. Методики для определения таких величин описаны в разделе Примеры.

Фармацевтические составы и способы введения.

Соединения по изобретению перерабатывают в смеси со стандартными носителями или компонентами, которые выбирают по известным методикам. Таблетки содержат компоненты, глиданты, наполнители, связующие и т.п. Водные составы получают в стерильной форме, и если предполагается вводить их не пероральным способом, то их получают в форме изотонических растворов. Все составы необязательно содержат компоненты, например описанные в справочнике Нап4Ьоок о£ Ркагтасеи11са1 ΕχοίρίοηΙδ (1986). Компоненты включают аскорбиновую кислоту и другие антиоксиданты, хелатирующие агенты, такие как ЭДТУ, углеводы, такие как декстрин, гидроалкилцеллюлоза, гидроксиалкилметилцеллюлоза, стеариновая кислота и т.п. рН составов находится в диапазоне от приблизительно 3 до приблизительно 11, но обычно в диапазоне от приблизительно 7 до приблизительно 10.

Одно или более соединений по изобретению (в данном контексте называется активным компонентом) вводят любым пригодным способом для лечения конкретного состояния. Пригодный способ включает пероральный, ректальный, назальный, местный (включая буккальный и сублингвальный), вагинальный и парентеральный способы (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, интратекальный и эпидуральный) способы и т.п. Следует понимать, что предпочтительный способ введения выбирают в зависимости от состояния реципиента. Преимущество соединений по изобретению заключается в их пероральной биодоступности и в возможности вводить их пероральным способом.

Несмотря на то, что активные компоненты можно вводить в отдельности, предпочтительно вводить их в виде фармацевтических составов. Составы для применения как в ветеринарии, так и в медицине по настоящему изобретению содержат по крайней мере один активный компонент, описанный выше, в смеси с одним или более приемлемых носителей и необязательно с другими терапевтическими агентами. Приемлемые носители означают совместимость с другими компонентами состава и физиологическую безопасность при действии на реципиента.

Составы должны быть пригодны для введения любым из указанных выше способов. Составы получают в виде лекарственной формы любым известным в фармацевтике методом. Методики и составы описаны в справочнике Веттд1оп'§ Рйагтасеи11са1 8с1епсе5 (Маск РиЬШЫпд Со., ЕаЧоп, РА). Такие методы включают стадию контактирования активного компонента с носителем, который содержит один или более вспомогательных компонентов. В основном составы получают при равномерном и тщательном перемешивании активного компонента с жидкими носителями или тонкодисперсными твердыми носителями, или с носителями обоих указанных типов и затем при необходимости формуют продукт.

Составы по изобретению, пригодные для перорального введения, получают в виде дискретных форм, таких как капсулы, пакетики или таблетки, в каждой из которых содержится предварительно оп

- 15 011304 ределенное количество активного компонента, в виде порошков или гранул, растворов или суспензий в водной или неводной жидкости, или в виде жидких эмульсий типа масло-в-воде или вода-в-масле. Активный компонент можно получить также в форме для вливания, электуария или пасты.

Таблетки получают прессованием или формованием, необязательно в смеси с одним или более вспомогательных компонентов. Прессованные таблетки получают прессованием в пригодной машине активного компонента в свободно текущей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанные со связующим, замасливателем, инертным разбавителем, консервантом, ПАВ или диспергирующим агентом. Формованные таблетки получают при формовании в пригодной машине смеси порошкообразного активного компонента, увлажненного инертным жидким разбавителем. На таблетки необязательно наносят покрытие или насечку или необязательно их получают в форме для замедленного или контролируемого высвобождения активного компонента.

При инфицировании глаз или других наружных тканей, например, ротовой полости или кожи, составы предпочтительно наносят в виде мази или крема местного назначения, содержащих активный компонент (компоненты) в количестве, например, от 0,075 до 20 мас.% (включая активные компоненты в диапазоне от 0,1 до 20% с приращением 0,1 мас.%, например 0,6, 0,7 мас.% и т.д.), предпочтительно от 0,2 до 15 мас.% и наиболее предпочтительно от 0,5 до 10 мас.%. При получении мази активные компоненты смешивают с парафиновой или смешиваемой с водой основой. В другом варианте активные компоненты получают в форме крема на основе типа масло-в-воде.

При необходимости водная фаза основы для крема включает, например, по крайней мере 30 мас.% многоатомного спирта, т.е. спирта, содержащего две или более гидроксильных групп, такого как гликоль, бутан-1,3-диол, маннит, сорбит, глицерин и полиэтиленгликоль (включая ПЭГ 400) и их смеси. При необходимости составы местного применения включают соединение, ускоряющее абсорбцию или проникновение активного компонента через кожу или другие обрабатываемые участки. Примеры таких ускорителей проникновения через кожу включают диметилсульфоксид и родственные аналоги.

Масляную фазу эмульсий по настоящему изобретению получают из известных компонентов по известной методике. Несмотря на то, что фаза может включать только эмульгатор, иногда необходимо использовать смесь по крайней мере одного эмульгатора с жиром или маслом или смесь жира и масла. Предпочтительно гидрофобный эмульгатор включают в смеси с липофильным эмульгатором, который действует в качестве стабилизатора. Предпочтительно также включать и жир, и масло. Смесь эмульгатора (эмульгаторов) в присутствии или отсутствии стабилизатора (стабилизаторов) называется эмульгирующим воском, а воск в смеси с маслом и жиром называется эмульгирующей основой мази, которая образует масляную диспергированную фазу в составах крема.

Эмульгаторы или стабилизаторы эмульсий, пригодные для применения в составах по изобретению, включают Твин 60, Спан 80, цетостеариловый спирт, бензиловый спирт, миристиловый спирт, глицерилмоностеарат и лаурилсульфат натрия.

Выбор пригодных масел или жиров для составов зависит от требуемых косметических свойств. Крем предпочтительно представляет собой нежирный продукт, не оставляющий пятен и смывающийся водой, причем консистенция указанного продукта должна исключить вытекание из тюбика или другого контейнера. Для этих целей используют моно- и двухосновные алкиловые сложные эфиры с прямой или разветвленной цепью, такие как диизоадипат, изоцетилстеарат, пропиленгликолевый диэфир жирных кислот из кокосового масла, изопропилмиристат, децилолеат, изопропилпальмитат, бутилстеарат, 2этилгексилпальмитат или смесь сложных эфиров с разветвленной цепью под названием Сгойато1 САР, причем три последних эфира являются предпочтительными. Такие эфиры используют каждый в отдельности или в комбинации в зависимости от требуемых свойств. В другом варианте можно использовать липиды с высокой температурой плавления, такие как бесцветный мягкий парафин и/или жидкий парафин или другие минеральные масла.

Композиции, предназначенные для местного введения в глаз, включают также глазные капли, в которых активный компонент растворен или суспендирован в пригодном носителе, прежде всего в водном растворителе для активного компонента. Содержание активного компонента в таких составах составляет концентрации от 0,5 до 20 мас.%, предпочтительно от 0,5 до 10 мас.% и прежде всего приблизительно 1,5 мас.%.

Композиции для местного введения в ротовую полость включают лепешки, содержащие активный компонент в ароматизированной основе, обычно такой как сахароза и аравийская камедь или трагакант, пастилки, включающие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и аравийская камедь, или средства для полоскания рта, включающие активный компонент в пригодном жидком носителе.

Композиции, предназначенные для ректального введения, получают в виде суппозитория в пригодной основе, включающей, например, масло какао или салицилат.

Композиции, предназначенные для внутрилегочного или назального введения, характеризуются размером частиц, например, в диапазоне от 0,1 до 500 мкм (включая частицы размером от 0,1 до 500 микрон (мкм) с приращением, таким как 0,5, 1, 30 мкм, 35 мкл и т.д.), которые вводят быстрым вдыханием через нос или вдыханием через рот, при этом достигается доставка в альвеолярные мешочки. Пригод

- 16 011304 ные составы включают водные или масляные растворы активного компонента. Составы для введения в виде аэрозоля или сухого порошка получают стандартными методами и их доставляют в смеси с другими терапевтическими агентами, такими как соединения для лечения или профилактики вирусов гриппа А или В, как описано ниже.

Композиции, предназначенные для вагинального введения, получают в форме пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих кроме активного компонента соответствующий стандартный носитель.

Композиции, предназначенные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекции, которые могут содержать антиоксиданты, буферные вещества, бактериостатики и растворимые вещества, которые придают составу изотонические свойства, совместимые с кровью реципиента; и водные или неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты и загустители.

Составы получают в виде лекарственных форм с одной дозой или в контейнерах с множеством доз, например, запаянные ампулы и флаконы; и их можно хранить в виде лиофилизированных продуктов, которые растворяют в стерильном жидком носителе, например, в воде для инъекций, непосредственно перед введением. Инъекционные растворы и суспензии, предназначенные для немедленного введения, получают из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных выше. Предпочтительные составы лекарственных форм содержат суточную дозу или суточную поддозу, как описано выше, или соответствующую долю суточной дозы активного соединения.

Следует понимать, что кроме перечисленных выше компонентов составы по настоящему изобретению могут включать другие стандартные агенты в зависимости от типа состава, например, составы для перорального введения могут включать, например, ароматизаторы.

В объем изобретения включены также ветеринарные композиции, содержащие по крайней мере один активный компонент, описанный выше, в смеси с ветеринарным носителем.

В качестве ветеринарных носителей и материалов для введения композиции можно использовать твердые, жидкие или газообразные материалы, которые являются инертными или приемлемыми для применения в ветеринарии и совместимыми с активным компонентом. Такие ветеринарные композиции можно вводить пероральным, парентеральным или любым другим требуемым способом.

Соединения по изобретению можно использовать для получения фармацевтических составов с контролируемым высвобождением, содержащих в качестве активного компонента одно или более соединений по изобретению (составы с контролируемым высвобождением), в которых высвобождение активного компонента контролируется или регулируется с целью снижения частоты введения дозы или для улучшения фармакокинетического или токсичного профиля данного активного компонента.

Эффективная доза активного компонента зависит по крайней мере от природы заболевания, которое требуется вылечить, от токсичности, от цели введения, т.е. при профилактике (низкие дозы) или при лечении активной инфекции вируса группа, от способа доставки и от фармацевтической композиции. Эффективную дозу определяет врач-клиницист с использованием стандартным методом постепенного увеличения дозы. Следует ожидать, что эффективная доза составляет от приблизительно 0,0001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела в сутки, обычно от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг/кг массы тела в сутки, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мг/кг массы тела в сутки, более типично от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5 мг/кг массы тела в сутки. Например, предполагаемая суточная доза для ингаляции взрослого человека массой тела приблизительно 70 кг составляет диапазон от приблизительно 1 до 1000 мг, предпочтительно от 5 до 500 мг в форме единой дозы или разделенных доз.

Активные компоненты по изобретению можно также использовать в комбинации с другими активными компонентами. Такие комбинации выбирают в зависимости от заболевания, которое требует вылечить, перекрестной реакционной способности компонентов и фармацевтических свойств комбинации. Например, при лечении вирусных инфекций респираторной системы, прежде всего инфекции вируса гриппа, композиции по изобретению смешивают с противовирусными агентами (такими как амантадин, римантадин и рибавирин), муколитическими агентами, отхаркивающими средствами, бронходилаторами, антибиотиками, жаропонижающими средствами или анальгетиками. Обычно в смеси с соединениями по изобретения вводят антибиотики, жаропонижающие средства и анальгетики.

Метаболиты соединений по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к продуктам метаболизма ίη νίνο соединений по изобретению, если эти продукты являются новыми и неочевидными по сравнению с предшествующим уровнем техники. Такие продукты могут образоваться, например, при окислении, восстановлении, гидролизе, амидировании, этерификации и т. п. введенного соединения, непосредственно при действии ферментов. В связи с этим изобретение включает новые и неочевидные соединения, образующиеся в процессе, включающем контактирование соединения по изобретению с организмом млекопитающего в течение достаточного времени для образования продуктов метаболизма. Такие продукты обычно идентифицируют при получении радиоактивно-меченного (например, С¹⁴ или Н³) соединения по изобретению, введении его парентеральным способом в детектируемой дозе (например, приблизительно 0,5 мг/кг) животному, тако

- 17 011304 му как крыса, мышь, морская свинка, обезьяна или человек, и обеспечивая достаточный период времени для метаболизма (обычно приблизительно от 30 с до 30 ч), и затем при выделении продуктов конверсии из мочи, крови или других биологических образцов. Такие продукты выделяют простым методом с использованием метки (другие продукты выделяют с использованием антител, узнающих эпитопы, содержащиеся в метаболите). Структуру метаболитов определяют стандартными методами, например с использованием МС или ЯМР. В основном, анализ метаболитов проводят стандартными методами, используемыми для изучения метаболизма лекарственного средства. Продукты конверсии, если они не найдены другим способом ίη νίνο, можно использовать для диагностики при определении терапевтических доз соединений по изобретению, даже если они не обладают ингибирующей активностью в отношении нейраминидазы.

Другие области применения соединений по настоящему изобретению.

Соединения по изобретению или биологически активные вещества, образующиеся из этих соединений при гидролизе или метаболизме ίη νίνο, можно использовать в качестве иммуногенов или для получения коньюгатов с белками, причем их можно использовать в качестве компонентов иммуногенных композиций, предназначенных для получения антител, способных специфически связываться с белком, с соединениями или продуктами их метаболизма, которые содержат иммунологически узнаваемые эпитопы (участки связывания с антителами). Иммуногенные композиции можно использовать в качестве промежуточных продуктов для получения антител, предназначенных для применения в диагностике, при контроле качества или при анализе соединений или их новых продуктов метаболизма. Соединения можно использовать для повышения уровня антител против неиммуногенных полипептидов, так как соединения содержат гаптеновые участки, которые стимулируют иммунный ответ, перекрестный с немодифицированным коньюгированным белком.

Исследуемые продукты гидролиза включают продукты гидролиза защищенных кислотных или основных групп, описанных выше. Как указано выше, в качестве иммуногенов используют кислотные или основные амиды, включающие иммуногенные полипептиды, такие как альбумин или гемоцианин из моллюска (ксу1ю1с ΙίιηροΙ). Продукты метаболизма, описанные выше, могут сохранять значительную степень иммунологической перекрестной активности в отношении соединений по изобретению. Таким образом, антитела по изобретению связываются с незащищенными соединениями по изобретению и не связываются с защищенными соединениями, в другом варианте продукты метаболизма связываются с защищенными соединениями и/или продукты метаболизма не связываются с защищенными соединениями по изобретению, или обладают связывающей способностью к любому одному или ко всем трем типам соединений. Антитела не должны обладать значительной перекрестной реакционной способностью с природными материалами. Значительной перекрестной реакционной способностью называется реакционная способность в специфических условиях анализа специфических анализируемых веществ, которая вносит существенный вклад в результаты анализа.

Иммуногены по настоящему изобретению содержат соединение по изобретению, содержащее требуемый эпитоп в сочетании с иммуногенным веществом. В контексте настоящего изобретения такое сочетание означает ковалентное связывание с образованием иммуногенного коньюгата (если присутствует) или смесь нековалентно связанных материалов или их комбинацию. Иммуногенные вещества включают адьюванты, такие как адьювант Фрейнда, иммуногенные белки, такие как полипептиды вирусов, бактерий, дрожжей, растений и животных, прежде всего гемоцианин из моллюска (1<су1ю1с ΙίιηροΙ). сывороточный альбумин, тироглобулин быка или ингибитор трипсина из сои, или иммуногенные полисахариды. Обычно соединение, включающее структуру требуемого эпитопа, ковалентно связывают с иммуногенным полипептидом или полисахаридом с использованием полифункционального (обычно бифункционального) сшивающего агента. Методы получения гаптеновых иммуногенов известны и любой из них можно использовать для получения коньюгатов гаптенов и иммуногенных полипептидов или подобных структур с учетом функциональных групп предшественников или продуктов гидролиза, которые могут образовывать поперечные связи и стимулировать образование антител, специфичных к исследуемым эпитопам, в отличие от иммуногенного вещества.

Обычно полипептид присоединяют к фрагменту соединения по изобретению, удаленному от узнаваемого эпитопа.

Коньюгаты получают по известным методикам. Например, для получения коньюгатов по изобретению используют сшивающие агенты Ν-гидроксисукцинимид, янтарный ангидрид или алкил-N=С=Nалкил. Коньюгаты включают соединение по изобретению, присоединенное через связь или связующую группу, содержащую 1-100, обычно 1-25, более предпочтительно 1-10 атомов углерода, к иммуногенному веществу. Коньюгаты отделяют от исходных материалов и продуктов с использованием хроматографии или подобных методов, а затем их фильтруют через стерилизующие фильтры и расфасовывают во флаконы для хранения.

Животных обычно иммунизируют иммуногенными коньюгатами или производными и получают антисыворотку или моноклональные антитела по стандартным методикам.

Соединения по изобретению используют в качестве связующих звеньев или спейсеров при получении аффинных сорбентов, иммобилизованных ферментов, предназначенных для контроля или для полу

- 18 011304 чения иммунно-ферментных систем анализа. Соединения по изобретению содержат множество функциональных групп, пригодных для образования поперечных связей с требуемыми веществами. Например, стандартным методом является связывание аффинных реагентов, таких как гормоны, пептиды, антитела, лекарственные средства и т.п., с нерастворимым субстратами. Такие иммобилизованные реагенты используют известным методом для сорбции связывающихся с аффинным реагентом компонентов из различных препаратов, диагностических образцов и других смесей. Аналогичным образом иммобилизованные ферменты используют для проведения каталитических превращений с простой регенерацией фермента. Бифункциональные соединения обычно используют для присоединения анализируемых веществ к детектируемым группам при получении диагностических реагентов.

При поиске активных соединений предпочтительно используют клетки из конкретных тканей, которые чувствительны к инфекции ПВЧ. Известные системы для анализа пригодны для определения ίη νΐνο биодоступности, включая стабильность в просвете кишечника, проницаемость в клетки, стабильность в гомогенате печени и стабильность в плазме. Однако, даже если сложные эфиры, амиды или другие защищенные производные не превращаются ίη νΐνο в свободные гидроксильные, амино или гидроксильные группы, их можно использовать в качестве промежуточных производных для химического синтеза.

Применение по настоящему изобретению подтверждают определением антипролиферативной активности. При определении антипролиферативной активности оценивают действие соединений на пролиферацию культуральных клеток. Клетки культивируют в течение 7 суток в присутствии различных концентраций соединений. В день 7 клетки проявляют и интенсивность окрашивания (пропорциональную числу клеток) определяют на спектрофотометре. Полученные данные откладывают на оси ординат, а концентрацию соединения - на оси абсцисс и получают кривую зависимости ответной реакции от дозы сигмоидального типа, по которой определяют концентрацию соединения, снижающую пролиферацию клеток на 50% (50% эффективная концентрация или ЕС₅₀). Активные соединения по данным определения антипролиферативной активности могут проявлять цитостатический эффект (ингибирование деления клеток) и/или цитоцидный эффект (гибель клеток). При определении антипролиферативной активности с использованием ПВЧ-положительных раковых клеток и нормальных клеток, выявляют соединения, которые ингибируют пролиферацию ПВЧ-положительных раковых клеток с большей эффективностью по сравнению с нормальными тканями человека.

Примеры способов получения соединений по настоящему изобретению.

Изобретение относится также к способам получения композиций по изобретению. Композиции получают любым пригодным методом органического синтеза. Известно множество таких методов. Однако современные методы описаны в следующих изданиях: Сотреп4шт οί Огдашс 8уп(Нс(1с Ме1Ьо48, 1ЖПеу ап4 8опк, Чей ΥοΑ, т. 1, 1ап Т.Иагпюп ап4 8Риуеп Иагпюп 1971; т. 2, 1ап ТЧаткоп ап4 8Риуеп Иагпюп 1974; т. 3, Ьошк 8.Ηеде4и8 ап4 Ьегоу Vа4е, 1977; т. 4, Ьегоу О. Vа4е, _)г., 1980; т. 5, Ьегоу О. Vа4е _)г., 1984, и т. 6, МюРае1 В.8шйБ; а также МагсР I. Α4νаηсе4 Огдашс СРетЦру, ТЫг4 Е4йюп, 1ЖПеу ап4 8опк, №\ν Уогк, 1985; СотргеНепДуе Огдашс 8уп111е515. 8е1ес1Рз1у 81га1еду ап4 ЕГПаепсу ш Мо4ет Огдашс СРетЦру, в 9 томах, Ватту М.ТгоЦ Е4йог-т-СЫе4, Регдатоп Ргекк, №\ν Υο±, издание 1993.

Примеры способов получения композиций по изобретению описаны ниже. Эти методики представлены для иллюстрации природы таких препаратов и не ограничивают объем изобретения.

Обычно реакции проводят в стандартных условиях при стандартных температуре, времени реакции, с использованием стандартных растворителей. Такие условия подробно описаны в цитированной литературе. Обычно реакцию проводят при температуре от -100 до 200°С, в апротонном или протонном растворителе в течение от 10 с до 10 суток. Обработка реакционной смеси обычно включает нейтрализацию любого непрореагировавшего реагента с последующим распределением смеси между водой и органическим растворителем и отделением слоя, содержащего продукт.

Окисление и восстановление обычно проводят при температуре, близкой к комнатной (приблизительно 20°С), однако реакции с использованием восстановления гидридами металлов в большинстве случаев проводят при пониженной температуре от 0 до -100°С, восстановление обычно в апротонном растворителе, а окисление в протонном или апротонном растворителе. Продолжительность реакции подбирают в зависимости от требуемого типа реакции.

Реакции конденсации обычно проводят при температуре, близкой к комнатной, однако неравновесные, кинетически контролируемые реакции конденсации проводят при пониженной температуре (от 0 до -100°С), в протонном (для равновесных реакций) или апротонном (для кинетически контролируемых реакций) растворителе.

При необходимости используют стандартные методики синтеза, такие как азеотропное удаление побочных продуктов реакции и использование безводной среды (например, в атмосфере инертного газа).

Примеры способов получения соединений по изобретению описаны ниже на следующих схемах. Подробное описание методик представлено в разделе Примеры со ссылкой на соответствующую схему.

- 19 011304

Схемы реакций.

Схема 1

- 20 011304

Схема 2

НС1Н₂1Ч'~'СО₂Ме/ТЭА

АИгйЬ«э1™-2 / РРИз

Пиридин, 60° С

НС|Н₂Ы'^СО₂1Ви/ТЭА

АМпй1ю1™-2 / РРЬ₃

Пиридин, 60° С

(1) ЗОС)₂ / ДМФА (катализатор) Сульфолан, 70° С, 1 ч (2) ΤΜ3ΟΡΪ1, 90 °С, 1 ч комн.темл.

ΗΟί Н;.гАсО_гМе / ТЭА _ АИг№!о1™-2 / ΡΡΙΊ₃’ Пиридин, 60° С

- 21 011304

Схема 3

I

ΗΟΙ.ΗίΝ·*⁴ΟΟ^Εί /ТЭА / РЬОН

А1бгЬЫо1™-21РРЬ₃

Пиридин, 60° С

ΗΟΗϊΝ

ΑΜπΐήΙθΙ™-2 / ΡΡΙί₃

Пиридин, 60° С

НС1Н₂

А)дгйЬю1™-2/РРК_э

Пиридин, 60° С

НС1Н_гН'^^,СО₂Ви/ТЭА / РЬОН

Мбг№ю1™-2/РРЬ₃ *

Пиридин, 60° С

- 22 011304

Схема 4

НС! Η₂Ν'^'θΟ₂(ΟΗ₂)₅0Η₃

ТЭА / РЬОН

АМгйЫо1™-2/РРЬ_э

Пиридин, 60° С

НС! НаМ^СОгССНа^Нз ТЭА / РЬОН

АЙпО1!о1™-2 / РРН₃ Пиридин, 60° С

нангы^со^ /тэа / рьон

АМгйЬ101™-2/РРЬ₃

Пиридин, 60° С на НгИ^ОгВи /ТЭА / РЬОН

ΑΙΰΓίϋιίοΙ™^ / ΡΡΕ₃

Пиридин, 60° С

- 23 011304 на НгИ^СОгССН^тСНз

ТЭЛ / РЬОН

А1ЛШио1™-2/РРГ1₃

Пиридин, 60° С

Х^₽ь на ΗϊΝ^ΟΟ^Ι / ТЭ А / РЬОН

ΑΙάΓίΙΗίοΙ™-2/ΡΡί?₃

Пиридин, 60° С

Г

На НгЫ^СОаВи / ТЭА / РЬОН АМг«Ыо1™-2 / РРЬд Пиридин, 60’ С

Схема 5

НаНгЫ СС^Ви/ТЭА/ РЬОН Ак)пОТо1™-2/РРК

Пиридин, 60° С

- 24 011304

Схема 6

НаНгИ'^СОгН/ ТЭЛ

АИгйЬю1™-2 / РРНз

Пиридин, 60° С ηοιΚ;Ν·^οο,ργ / тэа

АИп1КЮ1™-21 РРНз Пиридин, 60^ь С

НС1Н_;гЛ~СО_г1Рг /ТЭЛ.

АМг!Вмо1™-2 / РРЬэ Пиридин, 60° С

НС1Н₂Н^-СО₂Ви / ТЭА

АИп<Ыо1™-2 / ΡΡίι₃

Пиридин, 60’С на НзгАсадсНдЬСН, /ТЭА,

АИгИЫо1™-2 / ΡΡΙ13 Пиридин, 60’€ на нан^со^снз^тсн, / тэл_

А1<1г«Мо1™-2/РРЬз Пиридин, 60° С

НаНаМ^СОаЕОТЭА

Α1<Μ«ιΙοί™-2 / РРЬ₃

Пиридин, 60° С

НаН^^СОгВи /ТЭА

ΑΙ0πΙΝο1™-21РРЬ₃ Пиридин, 60’С

Схема 7

- 25 011304

Схема 8 на НгМ^СО^СН^гСНз /ТЭА

АкИ#1ю1™-21 РРй₃ Пиридин, 60° С

Схема 9

НаНг^СО^ У ТО А

А1б|Шо1™-2/РРЬ₃

Пиридин, 60° С

НС1Н₂ьЛсО₂Ви /ТЭЛ

АИг11Ь1о1™-2 / РРЙ₃

Пиридин, 60° С

ΗαΗ₂Ν^ΌΟ₂ΙΒυ /ТОА

АМп»1!о1™-2/РРй₃

Пиридин, 60° С

- 26 011304

Схема 10 нан_а>Асо_г!Рг/тэА

А№ЙЪк>1™-2 / РР»3

Пиридин, 60’С

(1) 5ОС!₂/ДМФА (катализатор) Сульфолан, 70’ С, 1^ч (2) ТМЗОРЪ, 90°С,1 ч комн .темп· в течет

Схема 11

НС1 Н-Х^СО₂Ви /ТЭА

АкМН1ю1™-2/ РРН

Схема 12

- 27 011304

(1) 80(¾ /ДМФА (катализатор) Сульфолан, 70° С, 1 ч_ (2) ТМ8ОРП,90°С. Ϊ

Схема 13

НС1 Η/ί'^ΌΟ,Βϋ ! ТЭА

АЙгйПю1™-2/РР»1з

Пиридин, 60° С

НС1

А1с1гПМо1™21 РРИз

Пиридин, 60“ С (1) ΗΟΙΗ^Ν АМгйЫо1™-2) ΡΡίι Пиридин, 60° с (2) Фумаровая кислота, СН

- 28 011304

Схема 14

НС1,Н₂М'^СР₂1Рг /ТЭА ί РЬОН

ΑΙάπ0ιϊο1™-2/ΡΡή₃

Пиридин, 60° С овп

- 29 011304

Схема 15

ТМЗВг, СН₃СЫ

наНзЫ^СОгВи 1^ ⁵⁶ АМп1Юо1™-2/РРЬ₃

Пиридил, 60’ С

АМпЙ1ю1™-2/РРЬ₃

Пиридин, 60° С

Схема 16

СйРг 01Рг

А1с1г1т!о1™-2 / РРИ₃

Пиридин, 60° С

НСЯНгЫ^СОаВи /ТЭА АИп1Ыо1™-2 / РРЬз Пиридин, 60° С

НС1 НабЛсОДРг IТЭА / РЬОН

- 30 011304

Схема 17

АИгйМо]™-2 / РРК₃

Пиридин, 60’ С

НаН^Н^СОгВи / ТЭА

А1<1п1Ыо1™-2/РР Пиридин. 60° С

НС1Н₂И'^СО_г(СН₁)_еСНз /ТЭА

А10К1Ыо1™-2 / РРЬ₃ Пиридин, 60° С

Схема 18

ООгЕ1/ТЭА

А)0гйМо1™-2/РРЬз

Пиридин, 60° С

- 31 011304

Схема 19 нан_гы

Схема 20

1^РИ

НаНгН СО_аЕ1/ТЭА А1бг11Й1о!™-2 / РРЬз Пиридин, 60° С

НС1Н_гМ^

А1бгйЫо1™-2 / ΡΡή

Пиридин, 60’С

НС1Н₂Н'^'СО₂1Ви /ТЭА

АЙпЩ|0|™-2 / РРК

Пиридин, 60

НаН_аН'^'СО₂Е( /И1ОН / ТЭА

АЮгИЫо1™~2 / РРЬ₃

Пиридин, 60’ С

НаНд)Л~СО_гВи 1^1>ЬОН I ТЭА

АИПИ11о1™-2/РРЬ₃

А10п1Ью1™-21 РРЪ₃

Пиридин,

НаНгьАсо^СНг^СНз /РЮНI ТЭА

АЙгШо1^тм-2/РРЬ₃

Пиридин, 60° С

- 32 011304

Схема 21 наНгИ'^СОгВи /РЬОН / ТЭА

А)ЛйЬк>)™-2 / РРГц

Пиридин, 60° С

х^рь

НС1 Н2» С0;Е< / Й1ОН / ТЭА

А1б(1й11о1™-2 / РРЬ₃

Пиридил, 60°С

I на Η₂Ν СОгВи /РЬОН / ТЭА

АИп1Ь!о1™-21РРЬ₃

Пирщшн, 60° С

х^ри

НС1НгН^СО_г1Ви/РЬОН / ТЭА

АИгйЫо^^г/РРЬз

Пиридин, бО’С

- 33 011304

Схема 22

АИгИЫо1™-2>РРЬ₃

Пиридин, 60^е С

АИгПЫо1™-21РРП_Э

Пиридин, 60’С

АИг№кй™-2 / РРГ1₃

Пиридин, <50°С

ηοιη₂ν

НС|Н_гН

Схема 23

НС1НгМ

АИгШо1™-21РРЬ₃

Пиридин, 60’С

I Уо I ТЭА

СР₃СН_гЫН₂

СНзСЙВО⁰?^ Н;

АИгШ11о1™-2/РРГ>₃

Пиридин, <Ю°С

Каждый из указанных продуктов необязательно отделяют, выделяют и/или очищают перед использованием на следующей стадии.

Термины обработанный, обработка, использованные в данном контексте при описании химических процессов, методики или препарата, означают контактирование, смешивание, взаимодействие, введение в реакцию, введение в контакт и другие известные термины, означающие, что одну или более химических структур обрабатывают для превращения в другие химические структуры. Словосочетание обработка соединения 1 соединением 2 является синонимом словосочетаний введение в реакцию соединения 1 с соединением 2, контактирование соединения 1 с соединением 2, взаимодействие соединения 1 с соединением 2 и других известных в органической химии словосочетаний, которые означают, что соединение 1 обрабатывают соединением 2, соединение 1 взаимодействует или его вводят в реакцию с соединением 2.

В контексте настоящего изобретения при описании способа, методики или препарата термин обработка означает надежный и стандартный метод взаимодействия химических реагентов. Для проведения

- 34 011304 реакций, если не указано иное, используют нормальные концентрации (от 0,01 до 10 М, обычно от 0,1 до 1 М), температуры (от -100 до 250°С, предпочтительно от -78 до 150°С, более предпочтительно от -78 до 100°С и еще более предпочтительно от 0 до 100°С), реакционные сосуды из стекла, пластика и металлов, растворители, давления, атмосферу в реакционном сосуде (обычно воздух для нечувствительных к кислороду или воде реакций, или азот или аргон для чувствительных к кислороду и воде реакций) и т. п. При выборе условий и приборов для обработки данного процесса используют известные реакции, описанные в учебниках по органической химии. Прежде всего, специалист в области органического синтеза выбирает условия реакции и приборы для эффективного проведения химических реакций с использованием известных в данной области данных.

При модификации каждой из указанных выше схем можно получить различные аналоги описанных выше материалов. Для модификации таких реакций можно использовать известные методы, описанные в цитированной литературе.

При осуществлении каждой из указанных выше схем необходимо отделять продукты реакции друг от друга и/или от исходных материалов. Требуемые продукты на каждой стадии или после серии стадий разделяют и/или очищают (после разделения) до требуемой степени гомогенности известными методами. Обычно такие методы разделения включают многофазную экстракцию, кристаллизацию их растворителя или смеси растворителей, перегонку, сублимацию или хроматографию. Хроматография включает любой из множества методов, например, молекулярно-ситовую хроматографию или ионно-обменную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого, среднего или низкого давления, аналитическую или препаративную тонко- или толстослойную хроматографию, а также низкомасштабные методы в тонком слое или экспресс-хроматографию.

Другой класс методов разделения включает обработку смеси реагентом, который связывает требуемый продукт или обеспечивает отделение требуемого продукта иным способом от непрореагировавшего исходного материала, побочных продуктов реакции и т. п. Такие реагенты включают адсорбенты или абсорбенты, такие как активированный уголь, молекулярные сита, ионнообменные среды или т. п. В другом варианте в качестве реагентов используют кислоты в случае основного материала, основания в случае кислотного материала, связывающие реагенты, такие как антитела, связывающие белки, селективные хелатирующие агенты, такие как краун-эфиры, реагенты для ионной экстракции типа жидкость/жидкость (ЫХ) или т.п.

Выбор соответствующих методов разделения зависит от природы использованных материалов, например, от температуры кипения и молекулярной массы при перегонке и сублимации, от присутствия или отсутствия полярных функциональных групп при хроматографии, от стабильности материалов в кислотных и основных средах при многофазной экстракции и т. п. Специалист в данной области химии может выбрать наиболее эффективный метод для осуществления требуемого разделения.

Все цитированные издания и патенты полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. В настоящее описание включены также специально указанные главы и страницы в указанных выше ссылках. Подробное описание изобретения можно использовать для осуществления и применения предмета изобретения, как определено в формуле изобретения. Представляется очевидным, что возможны модификации способов и композиций, описанных в следующих пунктах формулы изобретения, не выходя за пределы объема и сущности изобретения. Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают объем настоящего изобретения.

Примеры

Общие замечания.

Реакции некоторых примеров используются несколько раз. В повторяющихся примерах условия реакции, такие как продолжительность, температура, концентрация и т.п., а также выходы продуктов изменяются в нормальных пределах эксперимента. В повторяющихся примерах использованы значительные изменения, которые описаны, если полученные результаты значительно отличаются от полученных в других примерах. Если в примере используют другие исходные материалы, то эти материалы указаны. Если в повторяющихся примерах упомянут соответствующий аналог соединения, такой как соответствующий этиловый эфир, то это означает, что используют другую группу в аналогичном соединении, в данном случае обычно метиловый эфир, который заменяют на аналогичную указанную группу.

Примеры 1-35 относятся к схемам реакций 1-9.

Пример 1.

Ацетоксиэтилоксиметилхлорид 1.

В трехгорлую колбу объемом 5 л, снабженную механической мешалкой, термометром, капельной воронкой (500 мл) и входным отверстием для пропускания аргона, добавляют 1,3-диоксалан (140 мл, 2,00 моль) в безводном ЕьО (800 мл) и 1М Ζηί’Ρ/ΕΓΘ (7,5 мл, 0,007 моль). Раствор ацетилхлорида (157 мл, 2,20 моль) в Εΐ₂Θ (200 мл) добавляют по каплям через капельную воронку в течение 20 мин. Для поддержания температуры в диапазоне 19-27°С используют водяную баню с холодной водой. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч без наружного охлаждения, затем смесь нагревается в ходе реакции до 20-25°С в течение 1 ч. Прозрачный, бесцветный раствор выдерживают в течение ночи в атмосфе

- 35 011304 ре аргона. Через 3 суток раствор приобретает оранжевый цвет. Остаток ЕьО упаривают на роторном испарителе до прекращения упаривания при температуре водяной бани 35°С. Пи этом получают 318 г продукта (выход количественный, теоретический выход составляет 306 г).

Пример 2.

Диизопропилфосфонат 2.

В трехгорлую колбу объемом 50 мл загружают неочищенный хлорметиловый эфир 1 (317 г, 2,00 моль). В колбу через капельную воронку добавляют по каплям при интенсивном перемешивании триизопропилфосфит (494 мл) и содержимое колбы нагревают до 125°С на масляной бане. Перегнанный 2-хлорпропан собирают через короткую трубку в приемник, охлаждаемый сухим льдом и в атмосфере аргона, при этом собирают 140 г продукта (теоретический выход составляет 157 г). После добавления фосфита раствор приобретает желтый цвет, и нагревание продолжают в течение еще 2 ч при температуре 125°С на масляной бане, затем раствор перегоняют в вакууме с использованием вакуумного насоса. Собирают первую фракцию дистиллята желтого цвета (140 г, 1_кип. от 135 до 190°С), затем колбу-приемник заменяют на чистую. Основную фракцию собирают при температуре 178-187°С (в основном при 185187°С) в вакууме (вакуум не измеряли) при температуре бани 222-228°С. При этом получают 258 г продукта 2 (выход составляет 47% в расчете на исходный 1,3-диоксалан).

Пример 3.

Спирт 3.

Продукт 2 (125 г, 0,443 моль), растворенный в абсолютном МеОН (440 мл), обрабатывают концентрированной НС1 (11,2 мл, 0,112 моль) и нагревают с обратным холодильником в течение 6 ч в атмосфере аргона. Остаток МеОН упаривают на роторном испарителе при температуре 55°С и получают 115 г прозрачного масла, затем продукт снова упаривают с двукратным добавлением толуола (2x200 мл). Неочищенный продукт сушат в вакууме и получают 102 г масла (выход 96%).

Пример 4.

Диизопропилфосфонат 4.

Раствор, содержащий трифенилфосфин (25,57 г, 97,5 ммоль) и спирт 3 (18 г, 75 ммоль) в ДМФА (120 мл), обрабатывают 6-хлорпурином (12,72 г, 75 ммоль) и охлаждают до -15°С. Раствор диизопропилазодикарбоксилата (16,68 г, 82,5 ммоль) в ДМФА (50 мл) добавляют в полученную смесь по каплям через капельную воронку в течение 80 мин. Реакционную смесь выдерживают в течение 2 ч при температуре -15°С, затем смесь нагревают до комнатной температуры и снова перемешивают в течение 2 ч, при этом из мутной реакционной смеси образуется раствор ярко-желтого цвета. Растворитель упаривают при пониженном давлении с трехкратным добавлением толуола (3х) и сушат в вакууме в течение ночи. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают 18,52 г диизопропилфосфоната в виде твердого вещества белого цвета (выход 63%).

'Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,95 (8, 1Н), 4,70 (т, 2Н), 4,31 (т, 2Н), 3,93 (т, 2Н), 3,73 (т,2Н),1,29 (т, 12Н). ³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 18,42.

Пример 5.

Диизопропилфосфонат 5.

Смесь, состоящую из продукта 4 (11,00 г, 28,08 ммоль) и циклопропиламина (4,86 г, 85,16 ммоль) в СН₃СЫ (80 мл), загружают в реакционный автоклав и нагревают до 100°С в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют при пониженном давлении. Полученный продукт трижды распределяют между 15% МеОН/СН₂С1₂ и солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, отфильтровывают и концентрируют. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают 10,42 г продукта 5 в виде пены бледно-желтого цвета (выход 90%).

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,59 (8, 1Н), 5,83 (ушир., 8, 1Н), 4,88 (ушир., 8, 2Н), 4,70 (т, 2Н), 4,21 (т, 2Н), 3,88 (т, 2Н), 3,72 (й, 1=8,4 Гц, 2Н), 3,03 (ушир., 8, 1Н), 1,28 (т, 12Н), 0,84 (т, 2Н), 0,60 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 18,63.

Пример 6.

сРгРМЕЭАР 6.

Раствор продукта 5 (11,00 г, 26,67 ммоль) в безводном СН₃СЫ (120 мл) обрабатывают бромтриметилсиланом (21,1 мл, 160,02 ммоль). Колбу с реакционной смесью оборачивают в алюминиевую фольгу с целью защиты от света. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Легколетучие компоненты удаляют при пониженном давлении, остаток растворяют в воде (250 мл) и добавляют гидроксид аммония до рН 9. Реакционную смесь концентрируют и получают твердый продукт желтого цвета. Твердый продукт растворяют в воде (30 мл) и добавляют 10% НС1 до рН 2, затем тонкодисперсное твердое вещество собирают и сушат в вакууме, при этом получают 7,88 г продукта 6 в виде твердого вещества белого цвета (выход 90%).

Пример 7.

Гидрохлорид монофосфоновой кислоты 7.

Смесь, состоящую из кислоты 6 (3,00 г, 9,15 ммоль) и ДМФА (0,1 мл), в сульфолане (9,2 мл) нагре

- 36 011304 вают до 70°С. Тионилхлорид (1,66 мл, 22,76 ммоль) добавляют по каплям в течение 1 ч. Температуру увеличивают до 90°С, в реакционную смесь добавляют ТМ8ОРЙ (1,74 мл, 9,61 ммоль) и перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выдерживают в течение ночи. Затем реакционную смесь добавляют по каплям при интенсивном перемешивании в ледяной ацетон (100 мл). Полученный продукт выпадает в осадок. Твердый продукт отфильтровывают в атмосфере аргона, промывают ледяным ацетоном (100 мл) и сушат в вакууме, при этом получают 3,70 г гидрохлорида монофосфоновой кислоты в виде твердого вещества (выход 92%).

Пример 8.

Монофосфонамидат 8.

Смесь, состоящую из монофосфоновой кислоты 7 (0,22 г, 0,50 ммоль), гидрохлорида метилового эфира Ь-аланина (0,14 г, 1,00 ммоль) и триэтиламина (0,21 мл, 1,50 ммоль) в пиридине (3 мл), нагревают до температуры 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор 2,2'-дитиопиридина (на схемах реакций и далее в описании указывается под товарным знаком Α16π11ιίο1 (Олдритиол)) желтого цвета (0,39 г, 1,75 ммоль) и трифенилфосфина (0,46 г, 1,75 ммоль) в пиридине (2 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между ΕίΟΛο и насыщенным раствором ЫаНСОз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают 97 г монофосфонамидата в виде пены грязно-белого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 39%).

Пример 9.

Монофосфонамидат 9.

Смесь, состоящую из монофосфоновой кислоты 7 (0,88 г, 2,00 ммоль), гидрохлорида метилового этила Ό-аланина (0,84 г, 6,00 ммоль) и триэтиламина (0,84 мл, 6,00 ммоль) в пиридине (8 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (1,56 г, 7,00 ммоль) и трифенилфосфина (1,84 г, 7,00 ммоль) в пиридине (8 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между ЕЮАе и насыщенным раствором №1НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают 0,40 г монофосфонамидата в виде пены грязно-белого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 41%).

Пример 10.

Монофосфонамидат 10.

Смесь, состоящую из монофосфоновой кислоты 7 (0,88 г, 2,00 ммоль), гидрохлорида третбутилового эфира Ь-аланина (1,31 г, 6,00 ммоль) и триэтиламина (0,84 мл, 6,00 ммоль) в пиридине (8 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (1,54 г, 7,00 ммоль) и трифенилфосфина (1,84 г, 7,00 ммоль) в пиридине (8 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между ЕЮАе и насыщенным раствором №1НС.’О₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают 0,38 г монофосфонамидата в виде пены светло-оранжевого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 36%).

Пример 11.

Монофосфонамидат 11.

Смесь, состоящую из фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ьаланина (94 мг, 0,60 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,47 г, 2,13 ммоль) и трифенилфосфина (0,565 г, 2,13 ммоль) в пиридине (1,0 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между ЕЮАе и насыщенным раствором ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №ь8О₄. отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН2С12), при этом получают 74 мг монофосфонамидата в виде пены бледно-желтого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 48%).

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,61 (б, 1=4,2 Гц, 1Н), 7,26-7,08 (т, 5Н), 4,23 (т, 2Н), 4,13 (т, 2Н), 4,09 (т, 1Н), 3,92-3,85 (т, 4Н), 3,03 (ушир., 8, 1Н), 1,30-1,26 (т, 3Н), 1,24 (т, 3Н), 0,88 (т, 2Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,94, 20,68.

- 37 011304

Пример 12.

Монофосфонамидат 12.

Смесь, состоящую из фосфоновой кислоты 6 (1,50 г, 4,56 ммоль), гидрохлорида н-пропилового эфира Ь-аланина (1,59 г, 9,49 ммоль), фенола (2,25 г, 22,80 ммоль) и триэтиламина (10,50 мл, 54,72 ммоль) в пиридине (8 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (6,54 г, 31,92 ммоль) и трифенилфосфина (7,32 г, 31,92 ммоль) в пиридине (8,0 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным раствором NаΗСОз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают 0,43 г монофосфонамидата в виде пены бледно-желтого цвета (соединение Е, соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 18%).

Ή ЯМР (СБС1з): δ 7,61 (б, 1=5,1 Гц, 1Н), 7,27-7,09 (т, 5Н), 4,27-4,20 (т, 2Н), 4,16-4,00 (т, 3Н), 3,933,82 (т, 4Н), 3,04 (ушир., к, 1Н), 1,63 (т, 2Н), 1,30 (бб, 3Н), 0,92 (т, 3Н), 0,89 (т, 2Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,89, 20,66.

Пример 13.

Монофосфонамидат 13.

Смесь, состоящую из фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида изопропилового спирта Ь-аланина (0,10 г, 0,60 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,47 г, 2,13 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,13 ммоль) в пиридине (1,0 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным раствором NаНСОз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН2С12), при этом получают 87 мг монофосфонамидата в виде пены желтого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 55%).

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,60 (б, 1=2,1 Гц, 1Н), 7,26-7,09 (т, 5Н), 4,98 (т, 1Н), 4,23 (т, 2Н), 4,06 (т, 1Н), 3,91-3,83 (т, 4Н), 3,04 (ушир., к, 1Н), 1,29-1,21 (т, 9Н), 0,89 (т, 2Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1з): δ 21,85, 20,68.

Пример 14.

Монофосфонамидат 14.

Смесь, состоящую из фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-аланина (0,11 г, 0,60 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,47 г, 2,13 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,13 ммоль) в пиридине (1,0 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным раствором NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №ь8О₊ отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают 80 мг монофосфонамидата в виде пены бледно-желтого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 50%).

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,61 (б, 1=4,20 Гц, 1Н), 7,27-7,08 (т, 5Н), 5,93 (ушир., к, 1Н), 4,97 (ушир, к, 2Н), 4,23 (т, 2Н), 4,10-4,08 (т, 3Н), 3,91-3,84 (т, 4Н), 3,03 (ушир, к, 1Н), 1,58 (т, 2Н), 1,34-1,27 (т, 5Н), 0,920,89 (т, 5Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,94, 20,68.

Пример 15.

Монофосфонамидат 15.

Смесь, состоящую из фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-гексилового этила Ь-аланина (0,13 г, 0,60 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,47 г, 2,13 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,13 ммоль) в пиридине (1,0 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным раствором NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают 0,10 г монофосфонамидата в виде пены бледно-желтого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 59%).

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,59 (б, 1=4,20 Гц, 1Н), 7,26-7,08 (т, 5Н), 4,22 (т, 2Н), 4,11 (т, 1Н), 4,06 (т, 2Н),

- 38 011304

3,91-3,84 (т, 4Н), 3,01 (ушир., 8, 1Н), 1,59 (т, 2Н), 1,31-1,27 (т, 9Н), 0,89 (т, 3Н), 0,86 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,94, 20,68.

Пример 16.

Монофосфонамидат 16.

Смесь, состоящую из фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-октанилового эфира Ь-аланина (0,15 г, 0,60 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,47 г, 2,13 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,13 ммоль) в пиридине (1,0 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным раствором №1НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают 0,13 г монофосфонамидата в виде пены бледно-желтого цвета (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 73%).

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,59 (0, 1=4,2 Гц, 1Н), 7,25-7,07 (т, 5Н), 4,22 (т, 2Н), 4,10 (т, 1Н), 4,07 (т, 2Н), 3,90-3,84 (т, 4Н), 3,02 (ушир., 8, 1Н), 1,59 (т, 2Н), 1,29-1,26 (т, 13Н), 0,88 (т, 3Н), 0,85 (т, 2Н), 0,60 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,96, 20,69.

Пример 17.

Монофосфонамидат 17.

Смесь, состоящую из фосфоновой кислоты 6 (70 мг, 0,21 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь2-аминобутиловой кислоты (72 мг, 0,42 ммоль), фенола (0,10 г, 1,05 ммоль) и триэтиламина (0,36 мл, 2,52 ммоль) в пиридине (1,0 мл), нагревают до 60°С в течение 5 мин. Свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,33 г, 1,47 ммоль) и трифенилфосфина (0,39 г, 1,47 ммоль) в пиридине (1,0 мл) добавляют к вышеуказанной реакционной смеси. Полученную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным раствором ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №ь8О₄. отфильтровывают и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН2С12) и получают 66 мг монофосфонамидата (соотношение диастереоизомеров 1:1, выход 60%) смесь диастереомеров 1:1 в виде пены светло-желтого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,61 (а, 1=7,2 Гц, 1Н), 7,26-7,08 (т, 5Н), 5,91 (ушир. 8, 1Н), 4,97 (ушир. 8, 2Н), 4,22-4,12 (т, 4Н), 4,01-3,81 (т, 5Н), 3,03 (ушир. 8, 1Н), 1,71-1,60 (т, 2Н), 1,24 (т, 3Н), 0,89 (т, 2Н), 0,840,76 (т, 3Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 22,15, 20,93.

Пример 18.

Монофосфонамидат 18.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (1,00 г, 3,05 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-2аминомасляной кислоты (1,19 г, 6,09 ммоль), фенола (1,43 г, 15,23 ммоль) и триэтиламина (5,10 мл,

36.60 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (4,70 г, 21,32 ммоль) и трифенилфосфина (5,59 г, 21,32 ммоль) в пиридине (5,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №1НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают монофосфонамидат (0,7 г, 42%, соединение С, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,60 (а, 1=6,60 Гц, 1Н), 7,27-7,04 (т, 5Н), 5,89 (ушир. 8, 1Н), 4,94 (ушир. 8, 2Н),

4,22 (т, 2Н), 4,07-3,99 (т, 3Н), 3,91-3,84 (т, 4Н), 3,03 (ушир. 8, 1Н), 1,70-1,57 (т, 4Н), 1,35 (т, 2Н), 0,920,75 (т, 8Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 22,21, 20,95.

Пример 19.

Монофосфонамидат 19.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-октанилового эфира Ь-2аминомасляной кислоты (0,15 г, 0,60 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл,

3.60 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,13 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,13 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насы

- 39 011304 щенным NаΗСОз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфонамидат (0,12 г, 64%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены светло-желтого цвета.

¹Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,62 (4, 1=6,60 Гц, 1Н), 7,25-7,08 (т, 5Н), 4,24-4,21 (т, 2Н), 4,09-4,04 (т, 2Н), 4,00 (т, 1Н), 3,91-3,83 (т, 4Н), 3,01 (ушир. 8, 1Н), 1,70-1,58 (т, 4Н), 1,27 (т, 10Н), 0,89-0,76 (т, 8Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 22,22, 20,92.

Пример 20.

Монофосфонамидат 20.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (1,5 г, 4,57 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-фенилаланина (2,1 г, 9,14 ммоль), фенола (2,15 г, 22,85 ммоль) и триэтиламина (7,64 мл, 54,84 ммоль) в пиридине (8,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (7,05 г, 31,99 ммоль) и трифенилфосфина (8,39 г, 31,99 ммоль) в пиридине (7,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают твердое вещество светло-желтого цвета (1,32 г), содержащее приблизительно 10% примеси. Твердое вещество желтого цвета (1,32 г, 2,28 ммоль) растворяют в изо-РгОН (10 мл) и выливают в горячий раствор фумаровой кислоты (0,27 г, 2,28 ммоль) в изо-РгОН (30 мл) и перемешивают при 80°С в течение 30 мин. Реакционную смесь медленно охлаждают до комнатной температуры и соль фумаровой кислоты собирают при 0°С. Полученную соль фумаровой кислоты нейтрализуют распределением между двумя порциями NаΗСО₃ и ЕЮАс. Органический слой промывают солевым раствором, Н₂О, сушат над №₂8О₄, фильтруют и концентрируют. Продукт сушат в вакууме, при этом получают монофосфонамидат (0,7 г, 26%, соединение А, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены белого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,54 (4, 1=2,4 Гц, 1Н), 7,27-6,98 (т, 10Н), 4,35 (т, 1Н), 4,16 (т, 2Н), 4,08 (т, 2Н), 3,84-3,61 (т, 3Н), 3,33 (т, 1Н), 3,02 (ушир. 8, 1Н), 2,95-2,87 (т, 2Н), 1,17 (т, 3Н), 0,87 (т, 2Н), 0,61 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,88, 21,07.

Пример 21.

Монофосфонамидат 21.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (70 мг, 0,21 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ьфенилаланина (0,11 г, 0,42 ммоль), фенола (0,10 г, 1,05 ммоль) и триэтиламина (0,36 мл, 2,52 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,33 г, 1,47 ммоль) и трифенилфосфина (0,39 г, 1,47 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают монофосфонамидат (30 мг, 23%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,55 (4, 1=2,7 Гц, 1Н), 7,25-6,98 (т, 10Н), 4,36 (т, 1Н), 4,17 (т, 2Н), 4,02 (т, 2Н), 3,83-3,35 (т, 4Н), 3,02 (ушир. 8, 1Н), 2,94-2,86 (т, 2Н), 1,52 (т, 2Н), 1,29 (т, 2Н), 0,90 (т, 3Н), 0,88 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,85, 21,05.

Пример 22.

Монофосфонамидат 22.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (70 мг, 0,21 ммоль), гидрохлорида изобутилового эфира Ьфенилаланина (0,11 г, 0,42 ммоль), фенола (0,10 г, 1,05 ммоль) и триэтиламина (0,36 мл, 2,52 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,33 г, 1,47 ммоль) и трифенилфосфина (0,39 г, 1,47 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН2С12), при этом получают монофосфонамидат (65 мг, 50%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,56 (4, 1=3,6 Гц, 1Н), 7,26-6,98 (т, 10Н), 4,40 (т, 1Н), 4,17 (т, 2Н), 3,82 (т, 2Н), 3,75-3,62 (т, 3Н), 3,35 (т, 1Н), 3,04 (ушир. 8, 1Н), 2,96-2,87 (т, 2Н), 1,83 (т, 1Н), 0,90 (т, 2Н), 0,86 (т,

- 40 011304

6Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,82, 21,03.

Пример 23.

бис-Фосфонамидат 23.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,10 мг, 0,30 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-аланина (0,28 г, 1,80 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,10 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,10 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОΗ/СΗ₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (80 мг, 50%) в виде пены светло-желтого цвета.

^!Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,63 (к, 1Η), 5,88 (ушир. к, 1Η), 4,96 (ушир. к, 2Η), 4,24-4,16 (т, 6Н), 4,00 (т, 2Н),

3.86 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 3,01 (ушир. к, 1Η), 1,36 (т, 6Н), 1,26 (т, 6Н), 0,86 (т, 2Н), 0,61 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,63.

Пример 24.

бис-Фосфонамидат 24.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (1,00 г, 3,05 ммоль), гидрохлорида н-пропилового эфира Ь-аланина (3,06 г, 18,30 ммоль) и триэтиламина (5,10 мл, 36,50 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (4,70 г, 21,32 ммоль) и трифенилфосфина (5,59 г, 21,32 ммоль) в пиридине (5,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₊ фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОΗ/СΗ₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (1,13 г, 71%, соединение Р) в виде пены светло-желтого цвета.

^!Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,65 (к, 1Н), 5,92 (ушир. к, 1Н), 5,03 (ушир. к, 2Η), 4,24 (т, 2Н), 4,10-4,02 (т, 6Н),

3.87 (т, 2Н), 3,73 (т, 2Н), 3,03 (ушир. к, 1Η), 1,65 (т, 4Н), 1,37 (т, 6Н), 0,93 (т, 6Н), 0,88 (т, 2Н), 0,63 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,61.

Пример 25.

бис-Фосфонамидат 25.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,60 г, 1,83 ммоль), гидрохлорида изопропилового эфира Ь-аланина (1,84 г, 10,98 ммоль) и триэтиламина (3,06 мл, 21,96 ммоль) в пиридине (3,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (2,82 г, 12,80 ммоль) и трифенилфосфина (3,36 г, 12,80 ммоль) в пиридине (3,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОΗ/СΗ₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,53 г, 52%, соединение В) в виде пены светло-желтого цвета.

^!Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,65 (к, 1Η), 5,00 (т, 2Н), 4,24 (т, 2Η), 3,97 (т, 2Η), 3,87 (т, 2Н), 3,71 (т, 2Н), 3,01 (ушир. к, 1Н), 1,34 (т, 6Н), 1,23 (т, 12Н), 0,86 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,59.

Пример 26.

бис-Фосфонамидат 26.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-аланина (0,33 г, 1,82 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,10 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,10 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОΗ/СΗ₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (97 мг, 55%) в виде пены светло-желтого цвета.

^!Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,63 (к, 1Н), 4,24 (т, 2Н), 4,09 (т, 4Н), 4,01 (т, 2Н), 3,86 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 3,01 (ушир. к, 1Н), 1,61 (т, 4Н), 1,37 (т, 10Н), 0,93 (т, 6Н), 0,88 (т, 2Н), 0,61 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,59.

Пример 27.

бис-Фосфонамидат 27.

- 41 011304

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-гексилового эфира Ь-аланина (0,38 г, 1,80 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,10 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,10 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфонамидат (0,13 г, 65%) в виде пены светло-желтого цвета.

'Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,62 (8, 1Н), 4,23 (т, 2Н), 4,09 (т, 4Н), 4,01 (т, 2Н), 3,86 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 2,99 (ушир. 8, 1Н), 1,61 (т, 4Н), 1,36-1,29 (т, 18Н), 0,88 (т, 6Н), 0,84 (т, 2Н), 0,60 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,61.

Пример 28.

бис-Фосфонамидат 28.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-октанилового эфира Ь-аланина (0,43 г, 1,80 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,10 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,10 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфонамидат (0,13 г, 61%) в виде пены светло-желтого цвета.

'Н ЯМР (СОС1₃): δ 7,61 (8, 1Н), 4,21 (т, 2Н), 4,07-4,00 (т, 6Н), 3,84-3,70 (т, 4Н), 2,98 (ушир. 8, 1Н),

1,60 (т, 4Н), 1,34 (т, 6Н), 1,27 (т, 20Н), 0,87 (т, 6Н), 0,83 (т, 2Н), 0,58 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,63.

Пример 29.

бис-Фосфонамидат 29.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,70 г, 2,13 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-2аминомасляной кислоты (2,15 г, 12,80 ммоль) и триэтиламина (3,57 мл, 25,56 ммоль) в пиридине (3,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (3,29 г, 14,91 ммоль) и трифенилфосфина (3,92 г, 14,91 ммоль) в пиридине (3,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,71 г, 60%, соединение Ό) в виде пены светложелтого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,64 (8, 1Н), 4,24 (т, 2Н), 4,16 (т, 4Н), 3,89-3,87 (т, 4Н), 3,72 (б, 1=9,0 Гц, 2Н), 3,01 (ушир. 8, 1Н), 1,78-1,64 (т, 4Н), 1,26 (т, 6Н), 0,91 (т, 6Н), 0,87 (т, 2Н), 0,61 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,23.

Пример 30.

бис-Фосфонамидат 30.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,70 г, 21,32 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-2аминомасляной кислоты (2,50 г, 12,80 ммоль) и триэтиламина (3,57 мл, 25,56 ммоль) в пиридине (3,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (3,29 г, 14,91 ммоль) и трифенилфосфина (3,92 г, 14,91 ммоль) в пиридине (3,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,40 г, 31%, соединение С) в виде пены светложелтого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,64 (8, 1Н), 4,24 (т, 2Н), 4,11 (т, 4Н), 3,91 (т, 2Н), 3,87 (т, 2Н), 3,71 (б, 1=9,0 Гц, 2Н), 3,03 (ушир. 8, 1Н), 1,79-1,64 (т, 4Н), 1,60 (т, 4Н), 1,37 (т, 4Н), 0,94 (т, 6Н), 0,90 (т, 6Н), 0,86 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,25.

Пример 31.

бис-Фосфонамидат 31.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-октанилового эфира Ь-2аминомасляной кислоты (0,33 г, 1,82 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,60 ммоль) в пиридине (1,0 мл)

- 42 011304 нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,10 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,10 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №аНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №а₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,12 г, 55%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,64 (к, 1Н), 4,24 (т, 2Н), 4,13-4,05 (т, 4Н), 3,91 (т, 2Н), 3,87-3,72 (т, 4Н), 3,01 (ушир. к, 1Н), 1,78-1,65 (т, 4Н), 1,61-1,29 (т, 24Н), 0,91 (т, 6Н), 0,89 (т, 6Н), 0,86 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,20.

Пример 32.

бис-Фосфонамидат 32.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,60 г, 1,82 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-фенилаланина (2,51 г, 10,96 ммоль) и триэтиламина (3,06 мл, 21,84 ммоль) в пиридине (3,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (2,82 г, 12,74 ммоль) и трифенилфосфина (3,36 г, 12,74 ммоль) в пиридине (3,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №аНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №а₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфонамидат (0,53 г, 43%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,48 (к, 1Н), 7,22-7,06 (т, 10Н), 4,20 (т, 1Н), 4,12 (т, 4Н), 4,09 (т, 2Н), 4,04 (т, 1Н), 3,63 (т, 2Н), 3,33-3,21 (т, 2Н), 3,04-2,78 (т, 5Н), 1,20 (т, 6Н), 0,83 (т, 2Н), 0,58 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,38.

Пример 33.

бис-Фосфонамидат 33.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (70 мг, 0,21 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-фениланина (0,33 г, 1,26 ммоль) и триэтиламина (0,36 мл, 2,52 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,33 г, 1,47 ммоль) и трифенилфосфина (0,39 г, 1,47 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №аНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №а₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН2С12), при этом получают бис-фосфонамидат (0,11 г, 70%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,51 (к, 1Н), 7,23-7,06 (т, 10Н), 4,23 (т, 1Н), 4,11-4,05 (т, 7Н), 3,65 (т, 2Н), 3,35-

3,23 (т, 2Н), 3,01 (т, 1Н), 3,04-2,78 (т, 4Н), 1,57 (т, 4Н), 1,33 (т, 4Н), 0,92 (т, 6Н), 0,86 (т, 2Н), 0,61 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,35.

Пример 34.

бис-Фосфонамидат 34.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (70 мг, 0,21 ммоль), гидрохлорида изобутилового эфира Ьфениланина (0,33 г, 1,26 ммоль) и триэтиламина (0,36 мл, 2,52 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,33 г, 1,47 ммоль) и трифенилфосфина (0,39 г, 1,47 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №аНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №а₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (78 мг, 50%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,52 (к, 1Н), 7,24-7,07 (т, 10Н), 4,26 (т, 1Н), 4,11 (т, 2Н), 4,01 (т, 1Н), 3,85 (т, 4Н), 3,66 (т, 2Н), 3,35-3,25 (т, 2Н), 3,07-2,85 (т, 3Н), 2,97-2,79 (т, 2Н), 1,89 (т, 2Н), 0,90 (т, 12Н), 0,89 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,31.

Пример 35.

бис-РОС-производное сРгРМЕЭАР 35.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (0,20 г, 0,61 ммоль) и триэтиламина (0,42 мл, 3,01 ммоль) в 1-метил2-пирролидиноне (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 30 мин, затем добавляют РОСС1 (0,45 г, 2,92 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 3 ч, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №аНСО₃. Органический

- 43 011304 слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-РОС-производное сРгРМЕЬАР (0,13 г, 39%) в виде твердого вещества.

'Н ЯМР (СБС1з): δ 7,58 (к, 1Н), 5,66 (т, 4Н), 4,92 (т, 2Н), 4,22 (т, 2Н), 3,90-3,88 (т, 4Н), 3,01 (ушир. к, 1Н), 1,81 (т, 12Н), 0,86 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,93.

Примеры 36-38 относятся к схеме 10.

Пример 36.

бис-Фосфонамидат 37.

Смесь фосфоновой кислоты 36 (0,32 г, 1,00 ммоль), гидрохлорида бутилового эфира Ь-аланина (0,47 г, 2,60 ммоль) и триэтиламина (0,27 г, 2,60 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,77 г, 3,50 ммоль) и трифенилфосфина (0,92 г, 3,50 ммоль) в пиридине (2,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСΟ₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №1₂8О₄. фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,43 г, 75%) в виде пены светло-желтого цвета.

Пример 37.

Монофосфоновая кислота 38.

Смесь двухосновной кислоты 36 (1,30 г, 4,10 ммоль) и ДМФА (0,1 мл) в сульфолане (35 мл) нагревают до 70°С, затем добавляют по каплям тионилхлорид (0,54 мл, 7,38 ммоль) в течение 1 ч. Температуру реакционной смеси повышают до 90°С, добавляют ТМ8ОР11 (0,75 г, 4,51 ммоль) и перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь добавляют по каплям к ледяному ацетону (100 мл) при интенсивном перемешивании, при этом продукт выпадает в осадок. Твердое вещество фильтруют и растворяют в МеОН (40 мл), затем добавляют 45% КОН до рН 3. Твердое вещество фильтруют, затем продукт очищают растворением в МеОН, величину рН доводят 45% КОН до рН 6 и кристаллизуют из ледяного ацетона, при этом получают монофосфоновую кислоту (0,20 г, 12%) в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

Пример 38.

Монофосфонамидат 39.

Смесь монофосфоновой кислоты 38 (0,20 г, 0,50 ммоль), гидрохлорида изопропилового эфира Ьаланина (0,17 г, 1,00 ммоль) и триэтиламина (0,10 г, 1,00 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,39 г, 1,75 ммоль) и трифенилфосфина (0,46 г, 1,75 ммоль) в пиридине (2,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСΟ₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН2С12), при этом получают монофосфонамидат (0,14 г, 54%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены светло-желтого цвета.

Пример 39 относится к схеме 11.

Пример 39.

бис-Фосфонамидат 41.

Смесь фосфоновой кислоты 40 (0,36 г, 1,00 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-аланина (0,47 г, 2,60 ммоль) и триэтиламина (0,27 г, 2,60 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,77 г, 3,50 ммоль) и трифенилфосфина (0,92 г, 3,50 ммоль) в пиридине (2,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСΟ₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,32 г, 35%) в виде пены светло-желтого цвета.

Примеры 40-56 относятся к схемам 12-16.

Пример 40.

бис-Фосфонамидат 43.

Смесь фосфоновой кислоты 42 (0,37 г, 1,00 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-аланина (0,47 г, 2,60 ммоль) и триэтиламина (0,27 г, 2,60 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,77 г, 3,50 ммоль) и трифенилфосфина (0,92 г, 3,50 ммоль) в пиридине (2,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Про

- 44 011304 дукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,53 г, 85%) в виде пены светло-желтого цвета.

Пример 41.

бис-Фосфонамидат 45.

Смесь фосфоновой кислоты 44 (0,55 г, 2,00 ммоль), гидрохлорида бутилового эфира Ь-аланина (0,94 г, 5,20 ммоль) и триэтиламина (0,54 г, 5,20 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (1,54 г, 7,00 ммоль) и трифенилфосфина (1,84 г, 7,00 ммоль) в пиридине (5,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,48 г, 45%) в виде пены светло-желтого цвета.

Пример 42.

Монофосфоновая кислота 46.

Смесь двухосновной кислоты 44 (10,00 г, 36,30 ммоль) и ДМФА (0,2 мл) в сульфолане (50 мл) нагревают до 70°С, затем добавляют по каплям тионилхлорид (4,72 мл, 64,70 ммоль) в течение 1 ч. Температуру реакционной смеси повышают до 90°С, добавляют ТМ8ОР11 (6,65 г, 40,00 ммоль) и перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь добавляют по каплям к ледяному ацетону (100 мл) при интенсивном перемешивании, при этом продукт выпадает в осадок. Твердое вещество фильтруют и растворяют в МеОН (40 мл), затем добавляют 45% КОН до рН 3. Твердое вещество фильтруют и сушат в вакууме, при этом получают монофосфоновую кислоту (12,40 г, 97%) в виде твердого вещества.

Пример 43.

Монофосфонамидат 47.

Смесь монофосфоновой кислоты 46 (1,00 г, 2,86 ммоль), гидрохлорида метилового эфира Ь-аланина (0,80 г, 5,73 ммоль) и триэтиламина (0,58 г, 5,73 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (2,21 г, 10,00 ммоль) и трифенилфосфина (2,63 г, 10,00 ммоль) в пиридине (5,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают монофосфонамидат (0,80 г, 64%, смесь диастереомеров 1:1) в виде масла светло-желтого цвета.

Пример 44.

Монофосфонамидат 48.

Смесь монофосфоновой кислоты 46 (0,35 г, 1,00 ммоль), гидрохлорида изопропилового эфира Ьаланина (0,34 г, 2,00 ммоль) и триэтиламина (0,20 г, 2,00 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,77 г, 3,50 ммоль) и трифенилфосфина (0,92 г, 3,50 ммоль) в пиридине (2,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 7% МеОН/СН2С12), при этом получают монофосфонамидат, содержащий небольшое количество примеси. Полученное соединение обрабатывают фумаровой кислотой (77 мг) в горячем СН₃С№ (10 мл) и охлаждают до комнатной температуры. Продукт осаждают и сушат в вакууме, при этом получают фумарат монофосфонамидата (0,13 г, 22%, смесь диастереомеров 1:1) в виде твердого вещества.

Пример 45.

Бензиловый эфир РМЕ6 50.

Смесь двухосновной кислоты 49 (0,62 г, 2,00 ммоль) и бензилового спирта (10 мл) охлаждают до 0°С при перемешивании, добавляют порциями гидрид натрия (0,24 г, 10,00 ммоль) и реакционную смесь нагревают до 100°С в течение 1 ч, затем добавляют еще одну порцию бензилового спирта (20 мл) и гидрида натрия (0,12 г, 5,00 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 140°С в течение 1 ч и охлаждают до комнатной температуры. Летучие компоненты упаривают при пониженном давлении, добавляют воду (50 мл) и №ЮН до рН 11. Продукт распределяют между тремя порциями толуола и Н₂О. Водный слой подкисляют НС1 до рН 3, и перемешивают при 0°С в течение ночи. Продукт собирают и сушат в вакууме, при этом получают бензиловый эфир (0,18 г, 22%) в виде твердого вещества желто-коричневого

- 45 011304 цвета.

Пример 46.

Монофосфонамидат 51.

Смесь фосфоновой кислоты 50 (0,13 г, 0,34 ммоль), гидрохлорида изопропилового эфира Ь-аланина (0,11 г, 0,68 ммоль), фенола (0,16 г, 1,69 ммоль) и триэтиламина (0,28 мл, 2,03 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,52 г, 2,37 ммоль) и трифенилфосфина (0,62 г, 2,37 ммоль) в пиридине (2,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаНСΟз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Να₂8Ο₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5% ΜβΟΗ^Η^^), при этом получают монофосфонамидат (50 мг, 26%, смесь диастереомеров 1:1) в виде вязкого масла.

Пример 47.

Монофосфонамидат 52.

Смесь монофосфонамидата 51 (50 мг, 0,09 ммоль) и Рб^Н^/С (50 мг) в изо-РЮН (3 мл) перемешивают в атмосфере Н₂, подаваемого из баллона, при давлении 1 атм и комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют через слой целита и ратворитель удаляют на роторном испарителе при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5-15% ΜοΟ^^^), при этом получают монофосфонамидат (40 мг, 95%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

Пример 48.

бис-Фосфонамидат 54.

Смесь фосфоновой кислоты 53 (0,10 г, 0,35 ммоль), гидрохлорида бутилового эфира Ь-аланина (0,38 г, 2,10 ммоль) и триэтиламина (0,58 мл, 4,20 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,53 г, 2,45 ммоль) и трифенилфосфина (0,64 г, 2,45 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСΟз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Να₂8Ο₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 15% ΜеΟΗ/СΗ₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (25 мг, 13%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СВ^Б): δ 7,82 (8, 1Н), 4,26 (т, 2Н), 4,11 (т, 4Н), 3,94 (т, 2Н), 3,88 (т, 2Н), 3,78 (т, 2Н),

1,61 (т, 4Н), 1,39 (т, 4Н), 1,34 (т, 6Н), 0,95 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 23,39.

Пример 49.

Диизопропилфосфонат 55.

Смесь соединения 4 (3,00 г, 7,66 ммоль) и 10% Рб/С (0,60 г) в МеОН (30 мл) перемешивают в атмосфере Н2, подаваемого из баллона, при давлении 1 атм и комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют через слой целита и растворитель удаляют на роторном испарителе. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5% ΜеΟΗ/СΗС1₃), при этом получают диизопропилфосфонат (2,08 г, 76%) в виде вязкого масла, которое затем затвердевает при хранении.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 8,72 (8, 1Н), 7,94 (8, 1Н), 4,73 (т, 2Н), 4,33 (т, 2Н), 3,97 (т, 2Н), 3,73 (б, 6=8,1 Гц, 2Н), 1,31 (т, 12Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 18,47.

Пример 50.

Фосфоновая кислота 56.

Диизопропилфосфонат 55 (0,10 г, 0,28 ммоль) растворяют в СН₃С№ (1,5 мл) и охлаждают до 0°С, затем добавляют бромтриметилсилан (0,18 мл, 1,40 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 2 ч, нагревают до комнатной температуры и выдерживают при комнатной температуре в течение ночи, затем добавляют ДМФА (0,5 мл), при этом получают раствор, который перемешивают в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляют МеОН и перемешивают в течение 2 ч. Летучие компоненты упаривают при пониженном давлении. Полученный раствор ДМФА медленно добавляют к СΗ₃СN при охлаждении на бане лед/вода, при этом продукт выпадает в осадок. Твердое вещество собирают и сушат в вакууме, при этом получают фосфоновую кислоту (74 мг, 95%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 51.

бис-Фосфонамидат 57.

Смесь фосфоновой кислоты 56 (23 мг, 0,08 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-аланина (91 мг, 0,50 ммоль) и триэтиламина (0,14 мл, 0,96 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого

- 46 011304 цвета (0,11 г, 0,56 ммоль) и трифенилфосфина (0,12 г, 0,56 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСΘз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ν₂8Θ₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке I8СΘ (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфонамидат (17 мг, 38%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 8,65 (δ, 1Η), 7,94 (δ, 1Η), 5,20 (ушир. 8, 2Η), 4,35 (т, 2Н), 4,20-3,92 (т, 6Н), 3,89 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 3,42-3,19 (т, 2Н), 1,61 (т, 4Н), 1,32 (т, 8Н), 0,96 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,70.

Пример 52.

Монофосфонамидат 58.

Смесь фосфоновой кислоты 56 (20 мг, 0,07 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-фенилаланина (33 мг, 0,14 ммоль), фенола (33 мг, 0,35 ммоль) и триэтиламина (0,12 мл, 0,84 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,11 г, 0,56 ммоль) и трифенилфосфина (0,12 г, 0,56 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСΘ₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ν₂8Θ₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке I8СΘ (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфонамидат (13 мг, 34%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязнобелого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 8,69 (б, 6=15,0 Гц, 1Н), 7,84 (б, 1=4,2 Гц, 1 Н), 7,25-6,97 (т, 10Н), 4,35 (т, 1Η),

4,23 (т, 2Η), 4,08 (т, 2Η), 3,85 (т, 1Η), 3,72 (т, 1Η), 3,73-3,62 (т, 1Н), 3,38 (т, 1Н), 2,95-2,86 (т, 2Н),

1,17 (т, 3Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,67, 20,84.

Пример 53.

Диизопропилфосфонат 59.

В сцинтилляционный флакон добавляют смесь соединения 4 (1,00 г, 2,56 ммоль) и аллиламина (3 мл) в СН₃СК (3,0 мл) и нагревают при 65°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют при пониженном давлении. Продукт распределяют между ЕЮАс и солевым раствором, сушат над №₂8Θ₄, фильтруют и концентрируют. Продукт растворяют в минимальном количестве СН₃СК, добавляют Η₂Θ и лиофилизируют, при этом получают диизопропилфосфонат (1,00 г, 95%).

Пример 54.

Фосфоновая кислота 60.

Диизопропилфосфонат 59 (1,00 г, 2,43 ммоль) растворяют в ΟΗ₃ΟΝ (1,5 мл) и охлаждают до 0°С, затем добавляют бромтриметилсилан (0,31 мл, 12,15 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 2 ч, нагревают до комнатной температуры и выдерживают в течение ночи, затем добавляют ДМФА (0,5 мл), при этом получают раствор, который перемешивают в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляют МеОН и перемешивают в течение 2 ч. Летучие компоненты упаривают при пониженном давлении. Полученный раствор ДМФА медленно добавляют к ледяному ΟΗ^Ν, при этом продукт выпадает в осадок. Твердое вещество собирают и сушат в вакууме, при этом получают фосфоновую кислоту (0,48 г, 60%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 55.

Монофосфонамидат 61 и бис-фосфонамидат 62.

Смесь двухосновной кислоты 60 (0,40 г, 1,20 ммоль), гидрохлорида изопропилового эфира Ьаланина (0,49 г, 2,40 ммоль), фенола (0,68 г, 7,20 ммоль) и триэтиламина (1,0 мл, 7,20 ммоль) в пиридине (3,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (1,84 г, 8,40 ммоль) и трифенилфосфина (2,20 г, 8,40 ммоль) в пиридине (3,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСΘ₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8Θ₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 5-10% ΜеΘΗ/СΗ₂С1₂), при этом получают монофосфонамидат 61 (0,52 г, 37%, смесь диастереомеров 1:1) и бисфосфонамидат 62 (0,13 г, 20%).

Пример 56.

бис-Фосфонамидат 63.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,33 г, 1,00 ммоль), гидрохлорида бутилового эфира Ь-аланина (0,47 г, 2,60 ммоль) и триэтиламина (0,27 г, 2,60 ммоль) в пиридине (5,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,77 г, 3,50 ммоль) и трифенилфосфина (0,92 г, 3,50 ммоль) в пиридине (2,0 мл). Реакционную смесь

- 47 011304 перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №ь8О₊ фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 10% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфонамидат (0,32 г, 55%) в виде пены светло-желтого цвета.

Пример 57 относится к схеме 17.

Пример 57.

бис-РОС-производное б-аллил-ΡΜΕΌΑΡ 64.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,20 г, 0,61 ммоль) и триэтиламина (0,42 мл, 3,01 ммоль) в 1-метил2-пирролидиноне (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 30 мин, затем добавляют РОСС1 (0,45 г, 2,92 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение 3 ч, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №1НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-РОС-производное 6-аллил-РМЕЭАР 64 (0,11 г, 32%, 08 192727) в виде твердого вещества.

'Н ЯМР (СПС1₃): δ 7,60 (к, 1Н), 6,00 (т, 1Н), 5,66 (т, 4Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,17 (άά, 1Н), 4,92 (т, 2Н), 4,80 (к, 2Н), 4,22 (т, 4Н), 3,95 (т, 4Н), 1,35 (т, 12Н).

³¹Р ЯМР (СБС1з): δ 20,94.

Примеры 58-61 относятся к схеме 18.

Пример 58.

бис-Фосфоамидат 65.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-аланина (0,10 г, 0,65 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфоамидат (23 мг, 41%) в виде пены светло-желтого цвета.

'Н ЯМР (СОС1₃): δ 7,70 (к, 1Н), 6,00 (т, 1Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,17 (бб, 1Н), 4,30 (т, 4Н), 4,20-4,00 (т, 6Н), 3,89 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 3,42 (т, 1Н), 3,22 (т, 1Н), 1,45-1,25 (т, 12Н).

³¹Р ЯМР (СБС1з): δ 20,77.

Пример 59.

бис-Фосфоамидат 66.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида циклобутилового эфира Ьаланина (0,33 г, 0,91 ммоль) и триэтиламина (0,50 мл, 3,59 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,47 г, 2,12 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,14 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №1НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄. фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфоамидат (45 мг, 26%) в виде пены светло-желтого цвета.

'Н ЯМР (СОС1₃): δ 7,60 (к, 1Н), 6,00 (т, 1Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,18 (бб, 1Н), 5,00 (т, 2Н), 4,78 (к, 2Н), 4,30 (т, 4Н), 4,00 (т, 2Н), 3,89 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 3,38 (т, 1Н), 3,19 (т, 1Н), 2,38 (т, 4Н), 2,10 (т, 4Н), 1,85-1,60 (т, 4Н), 1,45 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1з): δ 20,61.

Пример 60.

бис-Фосфоамидат 67.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-гексилового эфира Ь-аланина (0,25 г, 1,21 ммоль) и триэтиламина (0,7 мл, 5,02 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,12 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,14 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным №НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфоамидат (80 мг, 41%) в виде пены светло-желтого цвета.

'|| ЯМР (СБС1з): δ 7,65 (к, 1Н), 6,00 (т, 1Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,17 (бб, 1Н), 4,80 (к, 2Н), 4,25 (т, 4Н),

- 48 011304

4,20-4,00 (т, 6Н), 3,85 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 3,42 (т, 1Н), 3,20 (т, 1Н), 1,70 (т, 4Н), 1,32 (т, 18Н), 0,96 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,61.

Пример 61.

бис-Фосфоамидат 68.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-2аминомасляной кислоты (0,13 г, 0,64 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфоамидат (32 мг, 49%) в виде пены светло-желтого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,68 (8, 1Н), 6,00 (т, 1Н), 5,70 (ушир. 8, 1Н), 5,30 (йй, 1Н), 5,18 (йй, 1Н), 4,80 (8, 2Н), 4,25 (т, 4Н), 4,20-4,05 (т, 6Н), 3,89 (т, 2Н), 3,72 (т, 2Н), 3,35 (т, 1Н), 3,15 (т, 1Н), 1,86-1,60 (т, 8Н), 1,40 (т, 4Н), 0,96 (т, 12Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,25.

Примеры 62-71 относятся к схеме 19.

Пример 62.

бис-Фосфоамидат 69.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-фенилаланина (0,15 г, 0,65 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфоамидат (28 мг, 39%) в виде пены светло-желтого цвета.

'|| ЯМР (СОС1₃): δ 7,58 (8, 1Н), 7,28-7,03 (т, 10Н), 6,00 (т, 1Н), 5,30 (йй, 1Н), 5,17 (йй, 1Н), 4,25-4,00 (т, 8Н), 3,65 (т, 2Н), 3,42-3,19 (т, 2Н), 3,15-2,77 (т, 6Н), 1,23 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,34.

Пример 63.

бис-Фосфоамидат 70.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ьфенилаланина (0,15 г, 0,58 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфоамидат (49 мг, 63%) в виде пены светло-желтого цвета.

'Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,58 (8, 1Н), 7,28-7,03 (т, 10Н), 6,00 (т, 1Н), 5,70 (ушир. 8, 1Н), 5,30 (йй, 1Н),

5,17 (йй, 1Н), 4,78 (8, 2Н), 4,25-4,03 (т, 8Н), 3,65 (т, 2Н), 3,42-3,19 (т, 2Н), 3,17-2,78 (т, 6Н), 1,61 (т, 4Н), 1,32 (т, 4Н), 0,96 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,35.

Пример 64.

бис-Фосфоамидат 71.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида изобутилового эфира Ьфенилаланина (0,31 г, 1,20 ммоль) и триэтиламина (0,7 мл, 5,02 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,44 г, 2,00 ммоль) и трифенилфосфина (0,53 г, 2,00 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфоамидат (94 мг, 42%) в виде пены светло-желтого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,55 (8, 1Н), 7,27-7,03 (т, 10Н), 6,00 (т, 1Н), 5,70 (ушир. 8, 1Н), 5,25 (йй, 1Н),

5,17 (йй, 1Н), 4,78 (8, 2Н), 4,25-4,08 (т, 4Н), 3,87 (т, 4Н), 3,65 (т, 2Н), 3,42-3,19 (т, 2Н), 3,17-2,78 (т,

- 49 011304

6Н), 1,97 (ш, 2Н), 0,96 (ш, 12Н).

³¹Р ЯМР (СОС1₃): δ 20,31.

Пример 65.

Монофосфоамидат 72.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-аланина (32 мг, 0,20 ммоль), фенола (50 мг, 0,53 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСОз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ν₂80₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке [8С.'О (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (12 мг, 22%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

'|| ЯМР (СОС1₃): δ 7,62 (4, 1Н), 7,30-7,04 (ш, 5Н), 6,00 (ш, 1Н), 5,30 (44, 1Н), 5,18 (4, 1Н), 4,30-4,05 (ш, 7Н), 3,90-3,80 (ш, 4Н), 1,23 (ш, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,89, 20,65.

Пример 66.

Монофосфоамидат 73.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-аланина (39 мг, 0,21 ммоль), фенола (50 мг, 0,53 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСОз. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ν₂80₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке КСО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (16 мг, 28%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

'|| ЯМР (СОС1₃): δ 7,61 (4, 1Н), 7,32-7,06 (ш, 5Н), 6,00 (ш, 1Н), 5,80 (ушир. 8, 1Н), 5,30 (44, 1Н), 5,20 (44, 1Н), 4,80 (ш, 2Н), 4,30-4,05 (ш, 7Н), 3,90-3,80 (ш, 4Н), 3,90-3,60 (ш, 2Н), 1,60 (ш, 2Н), 1,32 (ш, 5Н), 0,96 (ш, 3Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,96, 20,70.

Пример 67.

Монофосфоамидат 74.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида циклобутилового эфира Ьаланина (0,11 г, 0,61 ммоль), фенола (0,13 г, 1,39 ммоль) и триэтиламина (0,5 мл, 3,59 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,12 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,14 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке КСО (элюент: 2пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (28 мг, 17%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

'Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,60 (4, 1Н), 7,25-7,03 (ш, 5Н), 6,00 (ш, 1Н), 5,30 (44, 1Н), 5,18 (44, 1Н), 5,00 (ш, 2Н), 4,79 (4, 2Н), 4,28-4,05 (ш, 4Н), 3,90 (ш, 4Н), 3,70 (ш, 1Н), 3,57 (ш, 1Н), 2,30 (ш, 2Н), 2,00-1,60 (ш, 4Н), 1,25 (ш, 3Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,91, 20,64.

Пример 68.

Монофосфоамидат 75.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида н-гексилового эфира Ь-аланина (0,13 г, 0,61 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,7 мл, 5,02 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,12 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,14 ммоль) в пиридине (1,0 мл).

Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке КСО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (28 мг, 16%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

- 50 011304 '|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,60 (б, 1Н), 7,25-7,03 (т, 5Н), 6,00 (т, 1Н), 5,85 (8, 1Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,17 (бб, 1Н), 4,78 (б, 2Н), 4,35-4,05 (т, 7Н), 3,90 (т, 4Н), 3,70 (т, 1Н), 1,60 (т, 2Н), 1,30 (т, 9Н), 0,96 (т, 3Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,97, 20,69.

Примеры 69-72 относятся к схеме 21.

Пример 69.

Монофосфоамидат 76.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ь-2аминомасляной кислоты (42 мг, 0,21 ммоль), фенола (50 мг, 0,53 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАе и насыщенным №1НСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над Ыа₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (17 мг, 29%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,60 (б, 1Н), 7,25-7,03 (т, 5Н), 6,00 (т, 1Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,17 (бб, 1Н), 4,78 (б, 2Н), 4,30-4,03 (т, 7Н), 3,95-3,80 (т, 4Н), 3,62 (т, 1Н), 3,40 (т, 1Н), 1,80-1,60 (т, 4Н), 1,38 (т, 2Н), 0,980,75 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 22,26, 20,95.

Пример 70.

Монофосфоамидат 77.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида этилового эфира Ь-фенилаланина (48 мг, 0,21 ммоль), фенола (50 мг, 0,53 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАе и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄. фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (14 мг, 23%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

'|| ЯМР (СБС1₃): δ 7,60 (б, 1Н), 7,25-7,03 (т, 10Н), 6,00 (т, 1Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,17 (бб, 1Н), 4,80 (т, 2Н), 4,40-4,08 (т, 7Н), 3,85-3,65 (т, 4Н), 3,38-3,25 (т, 2Н), 2,95-2,86 (т, 2Н), 1,20 (т, 3Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,86, 21,06.

Пример 71.

Монофосфоамидат 78.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (35 мг, 0,11 ммоль), гидрохлорида н-бутилового эфира Ьфенилаланина (55 мг, 0,21 ммоль), фенола (50 мг, 0,53 ммоль) и триэтиламина (0,2 мл, 1,43 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,16 г, 0,74 ммоль) и трифенилфосфина (0,20 г, 0,75 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАе и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №ь8О₄. фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (18 мг, 28%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

'Н ЯМР (СБС1₃): δ 7,60 (б, 1Н), 7,25-6,97 (т, 10Н), 6,00 (т, 1Н), 5,80 (ушир. 8, 1Н), 5,30 (бб, 1Н),

5,17 (бб, 1Н), 4,78 (б, 2Н), 4,40-4,03 (т, 7Н), 3,85-3,65 (т, 4Н), 3,45-3,25 (т, 2Н), 2,95-2,86 (т, 2Н), 1,57 (т, 2Н), 1,30 (т, 2Н), 0,96 (т, 3Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 21,89, 21,09.

Пример 72.

Монофосфоамидат 79.

Смесь фосфоновой кислоты 60 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида изобутилового эфира Ьфенилаланина (0,16 г, 0,61 ммоль), фенола (0,14 г, 1,52 ммоль) и триэтиламина (0,7 мл, 5,02 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,12 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,14 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАе и насыщенным ЫаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №ь8О₄. фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2

- 51 011304 пропанол/СН₂С1₂), при этом получают монофосфоамидат (19 мг, 10%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

Ή ЯМР (СЭС1₃): δ 7,60 (б, 1Н), 7,25-7,03 (т, 10Н), 6,00 (т, 1Н), 5,30 (бб, 1Н), 5,17 (бб, 1Н), 4,78 (б, 2Н), 4,45 (т, 1Н), 4,35-4,18 (т, 4Н), 3,95-3,60 (т, 5Н), 3,35 (т, 1Н), 3,00-2,83 (т, 2Н), 1,85 (т, 1Н), 0,96 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СЭС1₃): δ 21,90, 21,07.

Примеры 73-76 относятся к схеме 22.

Пример 73.

Монофосфоамидат 80.

Смесь монофосфоновой кислоты 6 (0,10 г, 0,30 ммоль), гидрохлорида циклобутилового эфира Ьаланина (0,11 г, 0,61 ммоль), фенола (0,13 г, 1,4 ммоль) и триэтиламина (0,51 мл, 3,67 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,47 г, 2,12 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,14 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2пропанол/СН₂С1₂), затем очищают ВЭЖХ фирмы С11коп (СН_зС№Ш₂О), при этом получают монофосфоамидат (33 мг, 20%, смесь диастереомеров 1:1) в виде пены грязно-белого цвета.

Ή ЯМР (СЭС1₃): δ 7,60 (к, 1Н), 7,30-7,03 (т, 5Н), 5,80 (ушир. к, 1Н), 5,00 (т, 1Н), 4,80 (б, 2Н), 4,284,05 (т, 3Н), 3,90 (т, 4Н), 3,03 (ушир. к, 1Н), 2,35 (т, 2Н), 2,05 (т, 2Н), 1,80 (т, 2Н), 1,30 (т, 3Н), 0,90 (т, 2Н), 0,62 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СЭС1₃): δ 21,91, 20,61.

Пример 74.

бис-Фосфоамидат 81.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (60 мг, 0,18 ммоль), гидрохлорида циклобутилового эфира Ь-аланина (0,13 г, 0,72 ммоль) и триэтиламина (0,31 мл, 2,16 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,28 г, 1,26 ммоль) и трифенилфосфина (0,34 г, 1,26 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле (элюент: 5% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бисфосфоамидат (30 мг, 28%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СЭС1₃): δ 7,60 (к, 1Н), 5,70 (к, 1Н), 5,00 (т, 2Н), 4,90 (к, 2Н), 4,25 (т, 2Н), 4,00 (т, 2Н), 3,90 (т, 2Н), 3,78 (т, 2Н), 3,40 (т, 1Н), 3,21 (т, 1Н), 3,03 (ушир. к, 1Н), 2,35 (т, 4Н), 2,05 (т, 4Н), 1,90-1,65 (т, 4Н), 1,32 (т, 6Н), 0,90 (т, 2Н), 0,60 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СЭС1₃): δ 20,70.

Пример 75.

бис-Фосфоамидат 82.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (60 мг, 0,18 ммоль), гидрохлорида циклопентилового эфира Ьаланина (0,13 г, 0,72 ммоль) и триэтиламина (0,31 мл, 2,16 ммоль) в пиридине (1,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,28 г, 1,26 ммоль) и трифенилфосфина (0,34 г, 1,26 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле (элюент: 5% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфоамидат (30 мг, 27%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή-ЯМР (СЭС1₃): δ 7,62 (к, 1Н), 5,72 (к, 1Н), 5,20 (т, 2Н), 4,80 (к, 2Н), 4,25 (т, 2Н), 4,04-3,88 (т, 4Н), 3,74 (т, 2Н), 3,40 (т, 1Н), 3,23 (т, 1Н), 3,03 (ушир. к, 1Н), 1,95-1,58 (т, 16Н), 1,37 (т, 6Н), 0,90 (т, 2Н), 0,60 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СЭС1₃): δ 20,64.

Пример 76.

бис-Фосфоамидат 83.

Смесь фосфоновой кислоты 6 (40 мг, 0,12 ммоль), гидрохлорида циклобутилового эфира Ьфенилаланина (0,13 г, 0,48 ммоль) и триэтиламина (0,20 мл, 1,44 ммоль) в пиридине (0,5 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола ярко-желтого цвета (0,19 г, 0,85 ммоль) и трифенилфосфина (0,22 г, 0,85 ммоль) в пиридине (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между Е!ОАс и насыщенным NаНСО₃. Органический слой промы

- 52 011304 вают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле (элюент: 5% МеОН/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфоамидат (20 мг, 22%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,50 (8, 1Н), 7,28-7,05 (т, 10Н), 5,72 (8, 1Н), 5,00 (т, 2Н), 4,90 (8, 2Н), 4,23-4,03 (т, 4Н), 3,68 (т, 2Н), 3,42-3,19 (т, 2Н), 3,15-2,82 (т, 7Н), 2,38 (т, 4Н), 2,00 (т, 4Н), 1,85-1,55 (т, 4Н), 0,90 (т, 2Н), 0,60 (т, 2Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,31.

Примеры 77-78 относятся к схеме 23.

Пример 77.

Диизопропилфосфонат 84.

В автоклав добавляют смесь соединения 4 (5,0 г, 12,82 ммоль) и трифторэтиламина (6,35 г, 64,10 ммоль) в СΗ₃СN (40 мл) и нагревают при 80°С в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют при пониженном давлении. Продукт распределяют между тремя порциями 15% МеОН/СН₂С1₂ и солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и концентрируют. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), затем очищают ВЭЖХ фирмы 6Й8оп (СН₃С№/Н₂О), при этом получают соединение 84 (3,26 г, 56%) в виде пены светло-желтого цвета.

Пример 78.

бис-Фосфоамидат 85.

Смесь фосфоновой кислоты 42 (0,11 г, 0,29 ммоль), гидрохлорида циклобутилового эфира Ьаланина (0,31 г, 1,75 ммоль) и триэтиламина (0,52 мл, 3,67 ммоль) в пиридине (2,0 мл) нагревают до 60°С в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют свежеприготовленный раствор Олдритиола яркожелтого цвета (0,47 г, 2,12 ммоль) и трифенилфосфина (0,56 г, 2,12 ммоль) в пиридине (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Продукт распределяют между ЕЮАс и насыщенным NаΗСО₃. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над №₂8О₄, фильтруют и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке 18СО (элюент: 2-пропанол/СН₂С1₂), при этом получают бис-фосфоамидат (97 мг, 54%) в виде пены светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (СБС1₃): δ 7,65 (8, 1Н), 5,90 (ушир. 8, 1Н), 5,00 (т, 2Н), 4,80 (8, 2Н), 4,35-4,20 (т, 4Н), 4,00 (т, 2Н), 3,87 (т, 2Н), 3,70 (4, 2Н), 3,38 (т, 1Н), 3,20 (т, 1Н), 2,30 (т, 4Н), 2,00 (т, 4Н), 1,90-1,60 (т, 4Н), 1,35 (т, 6Н).

³¹Р ЯМР (СБС1₃): δ 20,61.

Пример 79.

В данном примере описана методика определения антипролиферативной активности.

Типы клеток, используемых для определения антипролиферации.

Для определения антипролиферативной активности использовали клеточные линии опухолевых клеток человека, включающие шесть линий клеток карциномы шейки матки с тремя типами ПВЧ (ПВЧ16, ПВЧ-18, ПВЧ-39), одну клеточную линию ПВЧ-отрицательной карциномы шейки матки и две линии клеток кератиноцитоподобной карциномы языка. Нормальные исследованные клетки человека включали кератиноциты кожи, кератиноциты шейки матки и фибробласты легких. Кератиноциты кожи и кератиноциты шейки матки приобретали на фирме СатЬгех (Еа81 Ви1кег£ог4, N1), все другие клетки приобретали на фирме Атепсап Туре Сикиге Со11есБоп (Мапа88а8, УА). В табл. 79-1 указаны характеристики каждого типа клеток и условия их культивирования. Определение антипролиферативной активности.

1. Клеточная культура.

Клетки извлекали из культуральных флаконов с использованием трипсина, подсчитывали их число и высеивали в лунки 96-луночного культурального планшета (по 250-1000 клеток в лунке в зависимости от типа клеток). На следующий день (обозначен, как день 0) после прикрепления клеток ко дну планшета готовили 5-кратные серийные разведения соединений и добавляли в лунки в двух повторах. В контрольные лунки соединения не добавляли и добавляли 10 мкМ колхицин (ингибитор клеточного деления), в этих лунках наблюдается 100% пролиферации и 0% пролиферации, соответственно.

2. Проявление клеток сульфородамином В.

Через 7 дней после добавления соединений культуральные планшеты обрабатывали 10% трихлоруксусной кислотой при 4°С в течение 1 ч, затем промывали водой. В этих условиях клеточные белки связываются поверхностью дна планшета. Белки проявляли 0,4% сульфородамином В в 1% уксусной кислоте в течение 10 мин, затем тщательно промывали 1% уксусной кислотой. Остатки красителя, связанного с дном планшета, растворяли в 10 мМ тризма-основании. Образующееся пурпурное окрашивание измеряли по поглощению при 510 нм на спектрофотометре.

3. Данные анализа.

По экспериментальным данным строят кривые зависимости ответной реакции от дозы сигмоидального типа и рассчитывают эффективную концентрацию (ЕС₅₀) с использованием программного обеспечения 6гаркРа4 Рл/т, версии 4,01 для \Ут4о\\'8 (6гаркРа4 8ой^аге, Сан-Диего, Калифорния, США).

- 53 011304

Таблица 79-1

Типы клеток, использованных для определения антипролиферативной активности

Название	Состояние ПВЧ	Источник	Среда для культивирования
ПВЧ положительные линии клеток карциномы
3|На	ПВЧ-16 (1-2 копии в лунке)	Плоскоклеточная карцинома шейки матки	Α1, А2
Са δει	ПВЧ-16 (600 копий в лунке)	Эпидермоидная карцинома, метастазированная в тонкую кишку из шейки матки	А1, А2
М8751	ПВЧ-18 (содержит также частичный геном ПВЧ-45)	Эпидермоидная карцинома, метастазированная в лифатический узел из шейки матки	А1, А2
Нека	ПВЧ-18	Эпителиальная аденокарцинома шейки матки	А1, А2
С-41	ПВЧ-18	Карцинома шейки матки	А1, А2
МЕ-180	ПВЧ-39	Эпидермоидная карцинома, метастазированная в сальник из шейки матки	А1, А2
ПВЧ отрицательные линии клеток карциномы
нт-з	Нет	Эпидермоидная карцинома, метастазированная в лифатический узел из шейки матки	А1, А2

Название	Состояние ПВЧ	Источник	Среда для культивирования
ЗСС-4	Нет	Плоскоклеточная карцинома языка	Α1, А2
ЗСС-9	Нет	Плоскоклеточная карцинома языка	А1, А2
Клетки из нормальной ткани человека
ΗΕΙ.299	Нет	Фибробласты в эмбриональном легком	А1, А2
РНК (кератиноциты кожи)	Нет	Кератиноциты из крайней плоти взрослого человека	В1, В2
СК (кератиноциты из шейки матки)	Нет	Кератиноциты из шейки матки взрослого человека	В1, В2

* - Среды для культивирования, клетки выдерживали во влажном инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО2, в следующих культуральных средах.

А1: среда для культивирования, среда Еад1е МЕМ, содержащая Еаг1е В88 (СатЬгех, Еа8( КиШегЕога, N1), и содержащая 10% фетальную сыворотку теленка, 2 мМ глутамин, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

А2: среда для определения антипролиферативной активности: среда Еад1е МЕМ, содержащая Еаг1е В88, и содержащая 5% фетальную сыворотку теленка, 2 мМ глутамин, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

В1: среда для культивирования, среда 1<егаНпосу1е-8ЕМ (1иуйгодеи, Саг18Ьа0, СА), содержащая 0,01 мг/мл экстракта из гипофиза быка, 0,001 мкг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

В2: среда для определения антипролиферативной активности, смесь В1 и А2, 4:1.

- 54 011304

Результаты.

1. Селективная антипролиферативная активность амидатных пролекарств в отношении ПВЧположительных клеток типа 81Иа по сравнению с нормальными фибробластами.

Целью настоящего анализа являлось выявление соединения, которое ингибирует рост ПВЧтрансформированных образований и при этом не влияет на нормальные клетки эпидермиса и кожи (такие как кератиноциты и фибробласты). Антипролиферативную активность ш νίΐτο определяли с использованием клеток 8!Иа и ИЕи которые являются моделью ПВЧ-трансформированных образований и нормальных фибробластов, соответственно. Клетки 81Иа получали из плоскоклеточной карциномы шейки матки, вызванной инфекцией ПВЧ-16, а фибробласты ИЕБ получали из нормального эмбрионального легкого человека (табл. 79-1). Как показано в табл. 79-2, величина 50% эффективной концентрации (ЕС₅₀) для семи амидатных пролекарств в отношении клеток 81Иа находится в диапазоне от 0,13 до 3,2 нМ, а ЕС₅₀ в отношении клеток ИЕБ находится в диапазоне от 12 до 727 нМ, что свидетельствует о том, что эти соединения ингибируют пролиферацию клеток 8!Иа более эффективно по сравнению с клетками ИЕБ. Коэффициент селективности ВЕБ^ИА (рассчитанный при делении ЕС₅₀ для ИЕБ на ЕС₅₀ для 8ίΗη) находится в диапазоне от 72 до 599 (табл. 79-2).

Все семь амидатных пролекарств образуют один и тот же метаболит, сргРМЕОАР, который затем превращается РМЕО (см. статьи Сотр1оп е1 а1., 1999; Шк1е е1 а1., 1999). Величина антипролиферативной активности ЕС₅₀ для указанных соединений в отношении клеток 8ίΗη значительно выше по сравнению с пролекарствами (табл. 79-2), что свидетельствует об увеличении эффективности за счет присоединения амидатных остатков. Более того, коэффициент селективности ЖЕ^МА для сргРМЕЭАР и РМЕО составляет 17 и 4,1, соответственно (табл. 79-2), что свидетельствует о том, что пролекарства обладают большей селективностью по сравнению с сргРМЕОАР, а селективность сргРМЕЭАР выше по сравнению с РМЕО.

Известно, что РМЕО фосфорилируется с образованием РМЕОрр, который действует как ингибитор обрыва цепи клеточной ДНК полимеразы (см. статьи Сотр1оп е1 а1., 1999; Шк1е е1 а1., 1999). Четыре известных ингибитора ДНК полимеразы (цидофовир, ара С, доксифлуридин и афидиколин) и другие противоопухолевые лекарственные средства, которые характеризуются различным механизмом действия, включая ингибиторы ДНКтопоизомеразы, (дакарбазин, эллиптицин), алкилирующие ДНК агенты (доксорубицин, митоксантрон, блеомицин, мехлоретанамин) и ингибиторы тубулина (викристин, винбластин, этопозид и инданоцин) исследовали в клетках 8ίΗη и ΗΞΕ (табл. 79-2). Антипролиферативная активность указанных соединений, ЕС50, изменяется, и в некоторых случаях равна или составляет более высокую величину по сравнению с семью амидатными пролекарствами. Тем не менее, все они характеризуются незначительными коэффициентами ΗЕ^/8^ΗΑ (0,01-3,98) по сравнению с семью амидатными пролекарствами.

С учетом полученных данных в настоящем изобретении предлагается уникальный набор соединений, которые характеризуются чрезвычайно низкими ЕС₅₀ (антипролиферативная активность) на уровне нМ в ПВЧ-положительных клетках 8ША карциномы, а селективность в 50 раз выше по сравнению с фибробластами ΗίΕ

2. Селективная антипролиферативная активность амидатных пролекарств в ПВЧ-положительных клетках 8ША. по сравнению с нормальными кератиноцитами.

Для определения действия соединений на нормальные клетки эпидермиса антипролиферативную активность определяли с использованием первичных кератиноцитов человека, выделенных из кожи (РНК) и шейки матки (СК). Величины ЕС₅₀ (антипролиферативная активность) для семи пролекарств в отношении РНК и СК ниже по сравнению с клетками ΗΗΕ, что свидетельствует о более высокой чувствительности кератиноцитов по сравнению с фибробластами (табл. 79-2 и 79-3). Тем не менее, коэффициенты селективности РКК/ЗЩа и ΕΚ/8ίΗη для указанных пролекарств и сргРМЕЭАР все еще выше по сравнению с контрольными соединениями РМЕО и ингибитором ДНК полимеразы араС (табл. 79-3). Таким образом, пролекарства предпочтительно ингибируют пролиферацию ПВЧ-16 положительных клеток 8ίΗη по сравнению с нормальными кератиноцитами из кожи и шейки матки.

3. Антипролиферативная активность в отношении других ПВЧ-положительных клеток.

Семь пролекарств исследовали с использованием пяти дополнительных клеточных линий, полученных из ПВЧ-индуцированной карциномы шейки матки (перечислены в табл. 79-1), методом антипролиферативного анализа, полученные данные представлены в табл. 4 наряду с данными по воздействию на клетки 8Ща. При действии на клетки 8Ща, С-41 и М8751 все соединения, кроме соединения С, характеризуются чрезвычайно низкой величиной ЕС50 (антипролиферативная активность) на уровне нМ. Однако, при действии на клетки Са8к1, ΗΤ;ι и МЕ-180, все соединения проявляют более низкую эффективность, величины ЕС50 составляют 7,8-410 нМ. По-видимому нет корреляции между устойчивостью и типом ПВЧ (16, 18 или 39) или устойчивостью и метастазированием (клетки Са8к1, ΗΤ;ι и МЕ-180 получены из метастазирующих участков). Контрольное соединение араС (ингибитор ДНК полимеразы) ингибирует в одинаковой степени все клеточные линии, величины ЕС₅₀ составляют 94-257 нМ.

4. Антипролиферативная активность в отношении ПВЧ-отрицательных клеток карциномы.

Для исследования действия соединений на ПВЧ-отрицательные линии клеток карциномы использо

- 55 011304 вали три линии клеток (НТ-3, 8СС4, 8СС9, табл. 79-1) и проводили определение антипролиферативной активности. Как показано в табл. 79-4, все семь пролекарств проявляли равную или более высокую эффективность по сравнению с контрольным соединением араС.

Таблица 79-2

Селективное ингибирование клеток ПВЧ-16+81На по сравнению с фибробластами НЕЬ

Соединение	Примечание	Селективность НЕ1_/3|На	Антипролиферативная активность ЕС50, нМ
5|‘На карцинома шейки матки ПВЧ16	Фибробласты легких НЕЬ
А		72	0,6	43
В		559	1,3	727
С		115	0,20	23
Э		135	3,2	431
Е		164	0,50	82
р		210	2,5	526
Θ		92	0,13	12
Контроли
сргРМЕОАР	Метаболит	17	284	4821
ΡΜΕΘ	Метаболит	4,1	207	861
АраС	Инг.ДНК полимеразы	0,113	257	29
Цидофовир	Инг.ДНК полимеразы	0,3	84013	27952
Доксифлури-дин	Инг.ДНК полимеразы	0,449	8755	3927
Афидиколин (+)	Инг.ДНК полимеразы	0,40	856	324
Да карбазин	Инг.ДНК полимеразы	3,98	7402	29481
Эллиптицин	Инг.ДНК полимеразы	1,02	478	486
Доксорубицин	Алкилир. агент ДНК	0,43	9,76	4,20

Соединение	Примечание	Селективность НЕ1_/8?На	Антипролиферативная активность ЕСМ, нМ
3|На карцинома шейки матки ПВЧ16	Фибробласты легких НЕЕ
Митоксантрон	Алкилир. агент ДНК	<0,37	8,67	<3,2
Гидрохлорид мехлоретамина	Алкилир. агент ДНК	1,02	21863	22203
Блеомицин	Алкилир. агент ДНК	0,01	3138	20,28
Винкристин	Инг. тублина	1,55	1,24	1,92
Винбластин	Инг. тублина	0,39	0,68	0,27
Этопозид	Инг. тублина	0,31	469	144
Инданозин	Инг. тублина	0,27	588	159

- 56 011304

Таблица 79-3

Селективное ингибирование клеток ПВЧ-16+81На по сравнению с первичными кератиноцитами

Соедине- ние	Примеча- ние	Селективность РНК/81На	Селективность СК/81На	Антипролиферативная активность ЕСЮ, нМ
81На карцинома шейки матки (ПВЧ 16)	РНК кератиноциты кожи	СК кератиноциты шейки матки
А		58	11	0.6	35	7
В		75	42	1.3	98	54
С		4	7	0.20	0.8	1.4
ϋ		12	7	3.2	39	22
Е		10	11	0.50	5.2	5.4
Р		31	3	2.5	78	7.1
С		22	15	0.13	2.9	1.9
Контроль
срг РМЕПАР	Метабо- лит	13	2.4	284	3698	694
РМЕС	Метаболит	0.48	2.4	207	101	501
АраС	Ингибитор ДНК полимеразы	0.57	0.4	257	147	107

Таблица 79-4

Антипролиферативная активность в других ПВЧ-положительных и отрицательных клетках карциномы

Соединение	Антипролиферативная активность ЕСМ (нМ) в ПВЧ положительных клетках карциномы	Антипролиферативная активность ЕС^ (нМ) в ПВЧ отрицательных клетках карциномы
5ιΗβ НРУ16	СаЗЮ НРУ16	Нека НРО18	М5-751 НР718	С-41 НРУ18	МЕ-180 НРУ39	нт-з шейка матки	5СС-4 язык	5СС-9 язык
А	Об	29	16	1 7	6 5	27	14	17	40
В	1 3	246	410	18	27	254	104	53	150
С	0 20	3 87	66	0 54	1 0	78	95	2 1	25
□	32	301	398	16	24	288	127	44	147
Е	0 50	38	19	2 40	3 1	27	17	8	13
Р	25	124	127	42	60	41	24	10	28
В	0 13	28	12	09	3 1	82	60	2 1	79
Кснтроли
4раС	257	94	174	144	123	101	214	74	68

Пример 80.

Анализ антипролиферативной активности.

Антипролиферативную активность соединений определяли по их действию на пролиферацию культуральных клеток. При использовании такого типа анализа активные соединения могут проявлять цитостатическую активность (ингибировать деление клеток) и/или цитоцидную активность (вызывать гибель клеток). При проведении антипролиферативного анализа с использованием ПВЧ-положительных клеток карциномы и нормальных клеток можно идентифицировать соединения, которые селективно ингибируют пролиферацию ПВЧ-положительных клеток карциномы в отличие от клеток из нормальных тканей человека. В табл. 80-1 приведены характеристики каждого типа клеток, включая шесть линий клеток карциномы шейки матки, трансформированных при действии ПВЧ, нормальных кератиноцитов кожи человека (РНК) и нормальных фибробластов легких (НЕЬ). Кератиноциты кожи получали на фирме

- 57 011304

СатЬгех (Еак! Ви!кегкогй, N1). Все остальные клетки получали на фирме Атепсап Туре Сикиге Со11есбоп (Мапаккак, УА).

Клетки снимали с поверхности культуральных флаконов обработкой трипсином, подсчитывали их число и высеивали в лунки 96-луночных планшетов (250-100 клеток в лунке) в зависимости от типа клеток. На следующий день (обозначен, как день 0) готовили 5-кратные серийные разведения соединений и добавляли в лунки в двух повторах. Через 7 дней после добавления соединений культуральные планшеты обрабатывали 10% трихлоруксусной кислотой при 4°С в течение 1 ч, затем промывали водой. В этих условиях клеточные белки связываются с поверхностью дна планшета. Белки проявляли 0,4% сульфородамином В в 1% уксусной кислоте в течение 10 мин, затем тщательно промывали 1% уксусной кислотой. Остатки красителя, связанного с дном планшета, растворяли в 10 мМ тризма-основании, при этом клетки окрашиваются в пурпурный цвет. Интенсивность окрашивания (пропорциональна числу клеток) измеряли по поглощению при 510 нм на спектрофотометре. Клетки, не обработанные лекарственным средством, характеризуются 100% пролиферацией, а клетки, обработанные 10 мкМ колхицином (ингибитор клеточного деления), характеризуются 0% пролиферации. Такие клетки использовали в качестве контролей для определения % ингибирования. Зависимость ингибирования в % от концентрации соединения соответствует кривой ответная реакция в зависимости от дозы сигмоидального типа. По этой кривой определяли концентрацию соединения, при которой наблюдается снижение скорости пролиферации на 50% (=ЕС₅₀). Эффективную концентрацию (ЕС₅₀) рассчитывали с использованием программного обеспечения СгаркРай Рл/т, версии 4,00 для \\'тйо\У8 (СгаркРай 8оШаге, Сан-Диего, Калифорния, США).

Определение апоптозной активности (метод индукции каспазы 3).

Индукция каспаз представляет собой одну из ранних стадий, ассоциированных с апоптозом или программированной гибелью клеток. Активность каспазы определяют количественно с использованием флуоресцентного субстрата. Соединения, которые непосредственно влияют на апоптозный путь, могут индуцировать каспазу в течение относительно короткого инкубационного периода (<24 ч). Для соединений, которые влияют на другие физиологические свойства клетки с последующей индукцией апоптоза, требуется более продолжительный инкубационный период (>48 ч) для индукции каспазы.

10000 клеток культивировали в 96-луночном культуральном планшете и инкубировали в присутствии 5-кратных серийных разведений соединений в течение 24, 48 и 72 ч. Клетки лизировали, в клеточных лизатах определяли активность каспазы с использованием флуоресцентного субстрата согласно инструкциям фирмы-производителя (набор для определения каспазы, Воске, 1пй1апарокк, ΙΝ).

Определение апоптозной активности (метод проявления аннексином V).

Перенос фосфатидилсерина из внутренней клеточной мембраны во внешнюю мембрану является одной из ранних/промежуточных стадий, ассоциированных с апоптозом или программированной гибелью клеток.

Перенесенный фосфатидилсерин детектировали при инкубации клеток с аннексином V, меченным Р1ТС, который является Са⁺⁺-зависимым фосфолипидсвязывающим белком. При проявлении клеток Р1ТС-аннексином и пропидий иодидом (который окрашивает мертвые клетки), живые клетки не проявляются в присутствии обоих красителей, мертвые клетки проявляются обоими красителями, в то время как апоптозные клетки проявляются только в присутствии Р1ТС-аннексина.

Клетки ПВЧ-16 81На культивировали в присутствии трех различных концентраций соединений в течение 3 или 7 суток и одновременно проявляли Р1ТС-аннексином и пропидий иодидом. Каждую проявленную клетку исследовали методом проточной цитофлуориметрии.

Результаты.

Селективная антипролиферативная активность.

Целью данного метода является идентификация соединений, которые ингибируют рост ПВЧтрансформированных образований и не оказывают влияния на нормальные клетки эпидермиса и кожи (такие как кератиноциты и фибробласты). Таким образом, соединения исследовали с использованием клеток 81На, РНК и НЕЬ, которые являются моделью ПВЧ-трансформированных клеток, нормальных кератиноцитов и нормальных фибробластов, соответственно.

Типичные соединения по настоящему изобретению, например, перечисленные в табл. 80-2, проявляют значительную антипролиферативную активность в отношении клеток 81На, при этом величина ЕС₅₀ составляет менее 25000 нМ. Активные соединения исследовали также в присутствии клеток НЕЬ. Во всех случаях ЕС₅₀ в отношении клеток НЕЬ выше по сравнению с ЕС₅₀ в отношении клеток 81На, что свидетельствует о более эффективном ингибировании активными соединениями пролиферации клеток 81На по сравнению с клетками НЕЬ. Другие аналоги нуклеотидов/нуклеозидов, такие как РМЕС (2фосфонометоксиэтилгуанин), ара-С (цитарабин, номер СА8 147-94-4) и гемцитабин (номер СА8 9505881-4) не проявляют такой селективности. Подофилокс (номер СА8 519-28-5), активный ингредиент средства для лечения бородавок, кондилокса, также не проявляет такой селективности.

Типичные пролекарства по настоящему изобретению, например, перечисленные в табл. 80-3, являются активными. В большинстве случаев пролекарства являются более эффективными, в некоторых случаях более селективными по сравнению с соответствующими исходными соединениями. Большинство фосфоамидатных пролекарств проявляют более высокую активность и селективность по сравнению с

- 58 011304 подофилоксом.

Таким образом, идентифицированы соединения, которые проявляют антипролиферативную активность на суб-нМ-уровне и в 50 раз более высокую селективность по сравнению с кератиноцитами РНК или фибробластами НЕЬ.

Антипролиферативная активность в отношении других клеточных линий ПВЧ+.

Некоторые соединения исследовали также с использованием пяти дополнительных клеточных линий, полученных из ПВЧ-индуцированной карциномы шейки матки (см. пример 79 и табл. 80-4). Каждое соединение проявляет различную величину активности в присутствии шести клеточных линий ПВЧ+, независимо от типа ПВЧ. В основном, соединения проявляют большую эффективность в отношении клеток 81На (ПВЧ-16), С-41 (ПВЧ-18) и М8751 (ПВЧ-18) по сравнению с клетками Са8к1 (ПВЧ-16), НеЬа (ПВЧ-18) и МЕ-180 (ПВЧ-39).

Индукция апоптоза (метод индукции каспазы 3).

Типичное соединение по настоящему изобретению исследовали в отношении индукции апоптоза в клетках 81На. При инкубации клеток в течение 72 ч (закрашенные столбики) наблюдается значительная дозозависимая индукция каспазы, что свидетельсвует об индукции соединением апоптоза (фиг. 80-1). Слабая индукция каспазы наблюдается при инкубации в течение 48 ч (заштихованные столбики) и индукции не наблюдается при инкубации в течение 24 ч (не показано).

Индукция апоптоза (метод проявления аннексином V).

Соединения РМЕС, N6-циклопропилРМЕРАР и типичное соединение по настоящему изобретению исследовали при трех различных концентрациях для оценки индукции апоптоза клеток 81На с использованием двойного проявления аннексином ν-пропидий иодидом. В присутствии всех трех соединений через 7 суток наблюдается более высокий процент апоптозных клеток по сравнению с инкубацией в течение 3 суток. Вышеуказанное типичное соединение по настоящему изобретению проявляет самую высокую активность при индукции апоптоза через 7 суток, т.е. через 7 суток при концентрации 0,2 мкг/мл указанного соединения в клеточной культуре наблюдается 63,8% апоптозных клеток. Напротив, в культурах, обработанных 0,2 мкг/мл РМЕС и 0,5 мкг/мл ^-циклопропилРМЕОАР, наблюдается только 1,2% и 15,9% апоптозных клеток соответственно.

Таблица 80-1 Типы клеток, использованных для определения антипролиферативной активности

Назва- ние	Состояние ПВЧ* **	Источник	Среда для культивирования
ПВЧ положительные линии клеток карциномы
3|На	ПВЧ-16	Плоскоклеточная карцинома шейки матки	А1, А2
Са 5οί	ПВЧ-16	Эпидермоидная карцинома, метастазированная в тонкую кишку из шейки матки	А1, А2
М3751	ПВЧ-18 (содержит также частичный геном ПВЧ-45)	Эпидермоидная карцинома, метастазированная в лифатический узел из шейки матки	А1, А2
Не1_а	ПВЧ-18	Эпителиальная аденокарцинома шейки матки	А1, А2
С-4|	ПВЧ-18	Кацинома шейки матки	А1, А2
МЕ-180	ПВЧ-39	Эпидермоидная карцинома, метастазированная в сальник из шейки матки	А1, А2
Клетки из нормальной ткани человека
НЕьгээ	Нет	Фибробласты в эмбриональном легком	А1, А2
РНК (кератин оциты кожи)	Нет	Кератиноциты из крайней плоти взрослого человека	В1, В2

* - Подтип ДНК ПВЧ интегрирован в клеточной ДНК.

** - среда для культивирования, клетки выдерживали во влажном инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО2, в следующих культуральных средах.

А1: среда для культивирования, среда Еад1е МЕМ, содержащая Еаг1е В88 (СатЬгех, Еак1 ВЩЬегТогб, Ν1), и содержащая 10% фетальную сыворотку теленка, 2 мМ глутамин, 100 ед./мл пенициллина и

- 59 011304

100 мкг/мл стрептомицина.

А2: среда для определения антипролиферативной активности: среда Еад1е МЕМ, содержащая Еаг1е В88, и содержащая 5% фетальную сыворотку теленка, 2 мМ глутамин, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

В1: Среда для культивирования, среда Кегабпосу1е-8РМ (Ιηνίΐτο^η, Саг18Ьаб, СА), содержащая 0,01 мг/мл экстракта из гипофиза быка, 0,001 мкг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

В2: среды для определения антипролиферативной активности, смесь В1 и А2, 4:1.

Таблица 80-2

Антипролиферативная активность Ж-замещенного РМЕБАР в отношении клеток ПВЧ-16+81На и фибробластов НЕЬ

где А^Х1 означает водород, а А^хг содержит следующие заместители, за исключением случаев, отмеченных знаком *, где А^х’ и В^Х2 вместе образуют Ν-гетероциклическое кольцо

метиламин

1-пропиламин

1 -бутиламин

диметиламин

метилэтиламин

2-метилпропан-1 -амин

аллиламин

2-пропиниламин

2-бутиленамин

2-изобутиленамин

циклопропиламин

циклопропилмета намин

1 -циклопропилэтанамин

ди циклопропиламин

циклобутиламин

циклопентанамин

циклогексанамин

циклогептанамин

- 60 011304

циклооктанамин

диэтаноламин

2-этаноламин

2-пропаноламин

1 -амино-2-пропаноламин

2-метоксиэтиламин

6-аминогексанамин

3-аминопропиламин

2-диметиламиноэтиламин

6-гексанатамин

бензиламин

мегилбензиламин

4-аминобензиламин

2-фенилэтанамин

2-пиридинил-1 -метанамин

З-пиридинил-1 -метанамин

4-пиридинил-1 -метанамин

1-нафтиламин

‘пирролидин (N6 входит в состав пирролидина)

‘пиперидин (N6 входит в состав пиперидина)

*μορΦοληη(Ν6 входит в состав морфолина)

2,2,2-трифторэтанамин

- 61 011304

Таблица 80-3

Антипролиферативная активность фосфоамидатных пролекарств, Ы6-замещенного РМЕОАР, в отношении клеток ПВЧ-16+81На, кератиноцитов РНК и фибробластов НЕЬ

-.Л Ал ЧА где ВХ1 и ВХ£ замещены, как указано в формуле, а Υ1Α и Υ1Β замещены, как указано ниже:
γ1Α	γ1Β
ОН	он
РОС	РОС
О-|Рг	О-|Рг
АГа-Εί	А1а-Е1
А1а-Рг	А1а-Рг
А1а-|Рг	А1ачРг
А1а-Ви	А1а-Ви
А1а-сВи	А1а-сВи
А1а-Циклопентил	А1а - Ци клопенти л
А!а-Гексил	А1а-Г ексил
А1а-Октил	А1а-Октил
АЬа-Εί	АЬа-Е1
АЬа-Ви	АЬа-Ви
АЬа-Ос1у1	АЬа-Октил
РЬе-Εΐ	РЬе-Εί

- 62 011304

РНе-Ви

РПе-ίΒιι

РНе-сВи

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

ΟΡΗ

где ΑΧ1 и ΒΧ2 замещены, как указанс как указан

у1Д

он

РНе-Ви

РНечВи

РНе-сВи

А1а-Ме

А1а-Е1

А1а-Рг

А1а-|Рг

А1а-Ви

А1а-1Ви

А1а-Гексил

А1а-0ктил

А1а-Е1

А1а-Ви

А1а-сВи

А1а-0ктил

А1а-Е1

А1а-Ви

А1а-|Ви

0-А1а-Ме

> о в формуле, а У1А и Υ1Β замещены, зо ниже:

γΙΒ

ОН

- 63 011304

	Ο-ίΡτ	О-|Рг
РОС	РОС
А1а-Е1	А1а-Е1
А1а-Ви	А1а-Ви
А1а-сВи	А1а-сВи
А1а-Гексил	А1а-Гексил
АЬа-Ви	АЬа-Ви
РИе-Εΐ	РПе-Εί
РЬе-Ви	РНе-Ви
РНечВи	РНечВи
ори	А1а-Е(
ори	А1а-Ви
ОРИ	А1а-сВи
ОРИ	А1а-Гексил
ОРИ	А1а-Ви
ОРИ	РНе-Е(
ОРИ	РИе-Ви
ОРИ	РИе-|Ви

где ВХ1 и А*2 замещены, как указано в формуле, а Υ1Α и Υ1Β замещены, как указано ниже:
γΐΑ	γΙΒ
он	он
Ο-ιΡγ	0-гРг
А1а-Ви	А1а-Ви
ОРИ	РИе-Εί
’ КА: где ВХ1 и НХ2 замещены, как указано в формуле, а Υ1Α и Υ1Β замещены, как указано ниже:
γΐΑ	γ1Β
он	он
А1а-Ви	А1а-Ви

- 64 011304

Таблица 80-4

Антипролиферативная активность Ж>-цик.топропил РМЕЭАР и его фосфоамидатных пролекарств в отношении шести различных ПВЧ-положительных клеток

Номер соединения	Антипролиферативная активность, ЕС50 (нМ) в отношении ПВЧ-положительных клеток карциномы
	3|На ПВЧ-16	СаЗк> ПВЧ-16	Неба ПВЧ-16	М3-751 ПВЧ-16	С-41 ПВЧ-16	МЕ-180 ПВЧ-16
А	0.6	29	16	1.7	6.5	27
В	1.3	246	410	18	27	254
С	0.2	3.9	6.6	0.5	1.0	7.8
ϋ	3.2	301	398	16	24	288
Е	0.5	38	19	2.4	3.1	27
Р	2.5	124	127	4.2	6.0	41
С	0.13	28	12	0.9	3.1	8.2
н	0.03	2.0	0.7	0.04	0.44	1.8
(сргРМЕОАР)	284	14149	6926	3313	1332	8315

Пример 81.

Испытание соединений А и В на раздражающее действие на кожу кролика.

Испытания проводили для оценки раздражающего эффекта двух соединений по настоящему изобретению при нанесении на кожу самцов кролика в течение 7 последовательных суток. В испытаниях использовали шесть самцов, как описано в таблице.

Описание групп
Номер группы	Исследуемое изделие3	Число животных (самцов)
1	Соединение Вь	3
2	Соединение Ас	3
3 - На кожу каждого животного наносили носитель (гель плацебо), положительное контрольное изделие и три концентрации соответствующего исследуемого изделия. На кожу каждого животного наносили одно исследуемое изделие при коцентрации 0,01, 0,03 и 0,1%. в - В качестве положительного контрольного изделия использовали 0,1% 9-(2-фосфонилметоксиэтил)гуанин (РМЕС). 0 - В качестве положительного контрольного изделия использовали 1% цидофовир

Носитель, положительные контрольные изделия и исследуемые изделия наносили на кожу один раз в сутки в течение 7 сут. Исследуемые изделия наносили при концентрации 0,01, 0,03 и 0,1%. В качестве положительного контрольного изделия использовали 0,1% РМЕС или 1% Цидофовир. Объем дозы для всех составов составляет постоянную величину - 100 мкл.

На исследуемых участках кожи животного сбривали шерсть до начала испытаний на раздражающее действие и по мере необходимости в ходе испытания. Готовили по два участка с левой стороны спины и три участка с правой стороны спины. Участок для каждой дозы отмечали несмываемыми чернилами (каждый приблизительно 1 кв.дюйм). Общая площадь подготовленных участков составляет менее 10% общей поверхности тела каждого животного. Носитель, соответствующее положительное контрольное изделие и исследуемое изделие наносили на кожу каждого животного площадью приблизительно 1 кв.дюйм. Носитель наносили на левый ростральный участок (участок дозы 1), а соответствующее контрольное изделие наносили на правый каудальный участок (участок дозы 2). Соответствующее исследуемое изделие наносили следующим образом: 0,01% на правый ростральный участок (участок дозы 3), 0,03% на правый средний участок (участок дозы 4) и 0,1% на правый каудальный участок (участок дозы 5). На животных немедленно одевали воротники и выдерживали в течение от 1 до 2 ч.

Участки исследовали на наличие покраснения и отека перед нанесением дозы в день 1 и затем ежедневно через 24 ч после введения каждой дозы и до нанесения следующей дозы. Каждый участок оценивали по шкале раздражения кожи с использованием шкалы Дрейза (см. Ога1/е РН., Vοοба^б С., Сакегу Н.О., МеШобк £ог 1Ие к!ибу о£ 1гг1(а(1ог1 анб !охюйу о£ кнЬкРтсек аррйеб !орюа11у !о 1Ие ккт анб тисоик тетЬта^к, I. Рйагтасо1. Ехр. Тйег., 1944, 82:377-90).

Всех животных обследовали два раза в сутки для определения смертности, заболеваемости и наличия корма и воды. Подробное клиническое обследование проводили до распределения животных в группы случайной выборкой, перед введением дозы в день 1 и затем ежедневно. Массу тела регистрировали через день после поступления животного, перед распределением и до введения дозы в дни 1, 3 и 7.

Эвтаназию осуществляли внутривенным введением сверхдозы раствора для эвтаназии на основе

- 65 011304 фенобарбитала, а обескровливание - разрезанием бедренных сосудов. Животных тщательно обследовали на наличие внешних аномальных изменений, включая массу тела. Кожу разрезали по средней брюшной линии и любые аномальные изменения выявляли и сравнивали с патолого-анатомическим исследованием. Брюшную, грудную и черепную полости исследовали на наличие аномальных изменений, органы извлекали, исследовали и при необходимости помещали в нейтральный буферный раствор формалина. У каждого животного собирали участки введения дозы, почки и любые образования большого размера и сохраняли их. Для всех животных из каждого участка введения дозы получали парафиновые срезы, фиксированные гематоксилином и проявленные эозином, и исследовали под микроскопом. Срезы исследовал также ветеринарный патологоанатом. Для оценки образований (для сравнения их между группами, получавшими различные дозы) использовали четырехступенчатую шкалу.

Выводы.

Два исследуемых изделия при любой дозе не оказывали заметного действия по данным клинических обследований, не вызывали раздражения кожи и не вызывали изменений массы тела или изменений по данными макроскопических и микроскопических исследований. Одно положительное контрольное изделие ассоциировалось с клиническими изменениями и вызывало макроскопические и микроскопические изменения от слабой до средней степени.

Пример 82.

Испытание соединений В и Н на раздражающее действие на кожу кролика.

Испытания проводили для оценки раздражающего эффекта двух соединений по настоящему изобретению при нанесении на кожу самцов кролика в течение 7 последовательных суток. В эксперименте использовали всего 24 самца.

Схема испытаний соединения В
	Группа 1	Группа 1, концентрация”	Группа 2	Группа 2, концентрация”
Уч. дозы	(п=6)а	%	мг/мл	(п=6)а	%	мг/мл
1	Конт, носитель	0,0	0,0	РМЕ6 (пол.контроль)	0,1	1,0
2	Низкая доза	0,03	0,3	Низкая доза	0,03	0,3
3	Средняя доза	0,1	1,0	Средняя доза	0,1	1,0
4	Высокая доза	0,3	3,0	Высокая доза	0,3	3,0
а - В каждую группу включали по 6 обычных кроликов ® - В качестве носителя для участка дозы 1 в группе 1 и для участва дозы 1 в группе 2 (РМЕС) использовали гель носителя. В качестве носителя для обработанного участка в группе 1 использовали гель носителя, а в качестве носителя для обработанного участка в группе 2 использовали мазь носителя.
Схема испытаний соединения Н
	Группа 3	Группа 3, концентрация”	Группа 4	Группа 4, концентрация8
Уч. дозы	(п=6)а	%	мг/мл	(п=6)а	%	мг/мл
1	Конт. носитель	0,0	0,0	РМЕС (пол. контроль)	0,1	1,0
2	Низкая доза	0,03	0,3	Низкая доза	0,03	0,3
3	Средняя доза	0,1	1,0	Средняя доза	0,1	1,0
4	Высокая доза	0,3	3,0	Высокая доза	0,3	3,0

^а - В каждую группу включали по 6 обычных кроликов ⁸ - В качестве носителя для участка дозы 1 в группе 3 использовали мазь носителя и для участка дозы 1 в группе 4 (сРгРМЕЭАР) использовали гель носителя. В качестве носителя для обработанного участка в группе 3 использовали гель носителя, а в качестве носителя для обработанного участва в группе 4 использовали мазь носителя.

- 66 011304

Исследуемое и контрольное изделия наносили на кожу каждого животного один раз в день в течение последовательных 7 дней испытаний. Дозы соединения В составляет 0,03, 0,1 и 0,3%. Дозы соединения Н составляют 0,03, 0,1 и 0,3%. Доза РМЕ6 (положительный контроль) составляла 0,1%. Доза соединения сРгРМЕИАР (положительный контроль) составляет 1,0%. Величина дозы в контрольном носителе составляет 0,0% (относится как к гелю, так и к мази). Объем дозы для всех участков дозы составляет постоянную величину 100 мкл. Менее чем за 24 ч до первого введения со спины животного сбривали шерсть. Подготовленные участки составляют не более 10% от общей площади тела животного. При этом следует исключить повреждение кожи.

Исследуемое, положительное контрольное изделия и изделия контрольного носителя наносили на участок дозы размером приблизительно 1 дюйм на 1 дюйм. Два участка доз расположены вдоль левой стороны спины. Носитель или положительное контрольное изделие наносили на ростральный участок, а низкую дозу исследуемого изделия на каудальный участок. Два участка дозы расположены вдоль правой стороны спины. Среднюю дозу наносили на ростральный участок, а высокую дозу исследуемого изделия наносили на каудальный участок. На животных немедленно одевали воротники и выдерживали в течение приблизительно 2 ч. Продолжительность выдерживания животных в воротнике регистрировали в необработанных данных.

Всех животных обследовали два раза в сутки для определения смертности, заболеваемости и наличия корма и воды. Участки исследовали на наличие покраснения и отека перед первым нанесением дозы и затем через 24 ч после введения каждой дозы (перед следующим введением дозы) и ежедневно в течение 7-дневного периода выздоровления. Обследование на наличие клинических симптомов проводили ежедневно в ходе испытаний одновремнно с обследованием кожи. Массу тела измеряли и регистрировали через день после поступления, до распределения по группам случайной выборкой, до введения исследуемого изделия в день 1, в день 7 и 14 и при вскрытии трупа (дни 8 и 15). Массы тела, измеренные при поступлении и перед распределением по группам, не показаны, но сохранены в файлах испытаний. Образцы крови (4-6 мл) отбирали у 6 животных в группе после завершения испытаний и у 3 животных в группе при выздоровлении из яремной вены или другой доступной вены для оценки параметров клинической патологии.

Дополнительные образцы крови (приблизительно 1 мл) отбирали у всех животных из яремной вены или другой доступной вены для определения концентрации в плазме исследуемого изделия через приблизительно 2 ч после введения дозы в день 7. Образцы крови отбирали в пробирки, содержащие калиевую соль ЭДТУ и хранили во льду перед центрифугированием. Животных не лишали корма перед отбором крови.

Образцы хранили при -70°С вплоть до исследования.

Полное паталого-анатомическое исследование всех животных проводили по методике, известной патологоанатомам. Эвтаназию осуществляли анастезией при введении сверхдозы раствора для эвтаназии на основе фенобарбитала через ушную вену/артерию или через другую доступную вену, а обескровливание - при разрезании бедренных сосудов. Животных тщательно обследовали на наличие внешних аномальных изменений, включая массу тела. Кожу разрезали по средней брюшной линии и любые аномальные изменения выявляли и сравнивали с патолого-анатомическим исследованием. Брюшную, грудную и черепную полости исследовали на наличие аномальных изменений, органы извлекали, исследовали и при необходимости помещали в нейтральный буферный раствор формалина. Для всех животных из каждого участка введения дозы получали парафиновые срезы ткани, фиксированные гематоксилином и проявленные эозином (по 4 на каждого животного), а также из почек и любых образований большого размера и исследовали под микроскопом.

При паталого-анатомическом исследовании в день 8 основного периода испытаний животных и в день 15 после выздоровления идентифицировали по четыре участка дозы у каждого животного. Приблизительно половину каждого участка дозы иссекали, образцы собирали и хранили, как описано выше для гистологического исследования. Так как другая половина участка оставалась на теле животного, то ее обрабатывали по следующей методике. Участки доз промокали тремя марлевыми тампонами, пропитанными 95% этанолом и полностью высушивали. На каждый участок дозы прикрепляли липкую ленту (типа 3М или аналогичную) по 10 раз. Чистый кусок пленки использовали для каждого нанесения. Остальные фрагменты участка иссекали ножницами. После каждого участка дозы и после каждого животного ножницы промывали ацетоном или этанолом. Фрагменты иссекали в следующем порядке: участок носителя или положительный контроль, участок низкой дозы, участок средней дозы и участок высокой дозы. Из каждого участка дозы иссекали по 1 см² ткани. Затем образец ткани взвешивали и регистрировали. Образцы кожи измельчали чистыми ножницами и помещали в сцинтилляционные флаконы соответствующего размера. В сцинтилляционный флакон добавляли холодный фосфатно-солевой раствор (5 мл). Затем ткань гомогенизировали в режиме 20 секундных импульсов на механическом гомогенизаторе. Гомогенаты быстро замораживали при приблизительно -20°С.

- 67 011304

Выводы.

Одно исследуемое изделие (поданным оценки раздражающего действия на кожу и микроскопических исследований) не оказывало раздражающего действия в составе геля носителя, оно оказывало раздражающее действие от слабой до средней степени интенсивности в составе мази носителя. Второе исследуемое изделие оказывало чрезвычайно слабое раздражающее действие в составе геля носителя, и оказывало слабое раздражающее действие в составе мази носителя.

Пример 83.

Получение фармацевтической композиции геля для местного нанесения.

В данном примере описано получение типичной композиции геля для местного применения, содержащей активное соединение формулы I.

Состав композиции геля местного применения представлен ниже.

Компоненты	мас.%
Активное соединение	X'
Буферный раствор, рН от 4,5 до 7	25
Пропиленгликоль, ΙΙ3Ρ	25
Гидроксиэтилцеллюлоза, ΝΕ	1,25
Пропилпарабен, ΝΡ	0,01
Метилпарабен, ΝΕ	0,09
Динатрия эдетат, иЗР	0,025
Глицерин, иЗР	10,00
Лимонная кислота, ΙΙ3Ρ	0,50
Стерильная вода для инъекций, 1)8Р	38,125

*Х означает количество соединения от 0,01 до 1,0%

Для получения гелей можно использовать другие соединения формулы I, полученные способом, описанным в данном контексте.

Следующие компоненты также использовали для получения указанного ниже состава: изопропилмиристат (растворитель/сорастворитель/усилитель проницаемости), полиэтиленгликоли, триацетин (растворители), цетиловый спирт и стеариловый спирт (агенты для придания жесткости), карбомер (усилитель вязкости) и Твин, Спан (эмульгирующие агенты).

Пример 84.

Получение фармацевтической композиции мази для местного применения.

В данном примере описано получение типичной композиции мази для местного применения, содержащей активное соединение формулы I. Состав композиции мази местного применения представлен ниже.

Компоненты	мас.%
Активное соединение	X’
Вазелин, ΙΙ3Ρ	94,0
Сесквиолеат сорбита, ΝΓ	0,5
Пропиленгликоль, ΙΙ3Ρ	4,5

*Х означает количество соединения от 0,01 до 1,0%

Для получения мазей можно использовать другие соединения формулы I, такие как полученные, как описано в данном описании, в качестве активного соединения для получения состава мази, как описанно в данном примере.

Следующие компоненты также использовали для получения указанного ниже состава: изопропилмиристат (растворитель/сорастворитель/усилитель проницаемости), полиэтиленгликоли, триацетин (растворители), цетиловый спирт и стеариловый спирт (агенты для придания жесткости), карбомер (усилитель вязкости) и

Твин, Спан (эмульгирующие агенты).

Claims (66)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение соединения формулы I

   Я*

   I где У^1А представляет собой -НН(К^Х), а Υ^1Β означает Υ¹;

   К^Х1 означает Н, а К^Х2 означает Ш⁵;

   Υ¹ означает =О, -О(К^Х), =8, -НН(К^Х), -И(О)(К^Х), -И(ОК^Х), -И(О)(ОК^Х) или -Ν(Ν(Κ^Χ)(Κ^Χ));

   К^Х независимо означает К¹, К², К⁴, Ш³ или защитную группу;

   К¹ независимо означает -Н или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода;

   К² независимо означает К³ или К⁴, причем каждый К⁴ независимо замещен 0-3 группами К³, или две группы К² объединены через атом углерода с образованием цикла, содержащего от 3 до 8 атомов углерода, причем указанный цикл замещен 0-3 группами К³;

   ό 3 г)3а т)3Ъ т-)3с т>3б τ') 3 г>3

   К означает К , К , К или К при условии, что, если К присоединен к гетероатому, то К означа_{ет К} ^3с или К^3б;

   К^3а означает -Н, -Р, -С1, -Вг, -I, -СР₃, -ΟΝ, Ν₃, -Νϋ₂ или -ОК⁴;

   К^3Ъ означает =О, -О(К⁴), =8, -Ν(К⁴), ^(О)(К⁴), -И(ОК⁴), -И(О)(ОК⁴) или -Ν(Ν(К⁴)(К⁴));

   К^3с означает -К⁴, ^(К⁴)(К⁴), -8К⁴, -8(О)К⁴, -8(О)2К⁴, -8(О)(ОК⁴), -8(О)2(ОК⁴), -ОС(К^3Ъ)К⁴, -ОС(К^3Ъ)ОК⁴, -ОС(К^3Ъ)(И(К⁴)(К⁴)), -8С(К^3Ъ)К⁴, -8С(К^3Ъ)ОК⁴, -8С(К^3Ъ)(Я(К⁴)(К⁴)), ^(К⁴)С(К^3Ъ)К⁴,

   -И(К⁴)С(К^3Ъ)ОК⁴, -К(К⁴)С(К^3Ъ)(И(К⁴)(К⁴)), Ш³ или -К⁵Ш³;

   К³⁶ означает -С(К^3Ъ)К⁴, -С(К^3Ъ)ОК⁴, -С(К^3Ъ)Ш³, -С(К^3Ъ)ОШ³ или -С(К^3Ъ)(И(К⁴)(К⁴));

   К⁴ означает -Н или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

   К⁵ означает алкилен, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинилен, содержащий от 2 до 18 атомов углерода;

   Ш³ означает Ш⁴ или Ш⁵;

   Ш⁴ означает К⁶, -С(К^3Ъ)К⁶, -С(К^3Ъ)Ш⁵, -8ОМ2К⁶ или -8ОМ2Ш⁵, где К⁶ означает К⁴, причем каждый К⁴ замещен 0-3 группами К³;

   Ш⁵ означает карбоцикл или гетероцикл, причем Ш⁵ независимо замещен 0-3 группами К²;

   М2 равно 0, 1 или 2;

   или его фармацевтически приемлемой соли в качестве активного компонента для изготовления лекарственного средства, предназначенного для воздействия на вирус папилломы человека (ПВЧ) или опухолевые клетки;

   при этом указанное соединение не является бис-(бутил Е-аланил)-9-(2-фосфонилметоксиэтил)-И6(циклопропил)-2,6-диаминопурином и (изопропил Е-аланил)фенил-9-(2-фосфонилметоксиэтил)-И6(циклопропил)-2,6-диаминопурином.
2. 2. Применение по п.1, в котором Υ^ и Υ^1Β означают -ЫН(К^Х).
3. 3. Применение по п.2, в котором К^Х означает К².
4. 4. Применение по п.3, в котором К² означает К⁴, замещенный группой К^3б.
5. 5. Применение по п.4, в котором К⁴ означает этил, замещенный группой К^3б.
6. 6. Применение по п.5, в котором К^3б означает -С(К^3Ъ)ОК⁴.
7. 7. Применение по п.6, в котором К^3Ъ означает =О.
8. 8. Применение по п.7, в котором К⁴ означает алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода.
9. 9. Применение по п.1, в котором К^3б означает -С(К^3Ъ)ОШ³.
10. 10. Применение по п.1, в котором К⁴ означает пропил, замещенный группой К^3б.
11. 11. Применение по п.1, в котором К^3б означает -С(К^3Ъ)ОК⁴.
12. 12. Применение по п.3, в котором К² означает К⁴, независимо замещенный двумя группами К³.
13. 13. Применение по п.12, в котором К⁴ означает метил, замещенный двумя группами К³.
14. 14. Применение по п.13, в котором одна группа К³ означает К^3с.
15. 15. Применение по п.1, в котором К⁵ означает метилен.
16. 16. Применение по п.1, в котором Ш³ означает Ш⁵.
17. 17. Применение по п.14, в котором одна группа К³ означает К^3б.
18. 18. Применение по п.1, в котором К^3с означает Ш³.
19. 19. Применение по п.1, в котором Υ^1Β означает -ЫН(К^Х).

    - 69 011304
20. 20. Применение по п.1, в котором К^3с означает -К^³.
21. 21. Применение по п.16, в котором V⁵ означает карбоцикл.
22. 22. Применение по п.1, в котором Υ^1Β означает -Θί^).
23. 23. Применение по п.22, в котором Υ^1Β означает -С)(\Т³).
24. 24. Применение по п.21, в котором упомянутый карбоцикл означает фенил.
25. 25. Применение по п.1, в котором К² означает К⁴, замещенный группами К^3с и К³⁶.
26. 26. Применение по п.25, в котором К⁴ означает этил, замещенный группами К^3с и К³⁶.
27. 27. Применение по п.1, в котором Ρ^Χ2 означает К⁴.
28. 28. Применение по п.1, в котором К² означает К⁴, замещенный одной группой К³.
29. 29. Применение по п.28, в котором К⁴ означает метил, замещенный одной группой К³.
30. 30. Применение по п.29, в котором К³ означает К^3а.
31. 31. Применение по п.30, в котором К^3а означает -СР₃.
32. 32. Применение по п.28, в котором К⁴ означает -СΗ2-СРз.
33. 33. Применение по п.1 в качестве активного компонента для изготовления лекарственного средства, предназначенного для воздействия на ПВЧ-положительные клетки карциномы.
34. 34. Применение по п.1 в качестве активного компонента для изготовления лекарственного средства, предназначенного для воздействия на ПВЧ-отрицательные клетки карциномы.
35. 35. Применение по п.1 в качестве активного компонента для изготовления лекарственного средства против инфекции ПВЧ.
36. 36. Применение по п.1, в котором воздействие на ПВЧ или опухолевые клетки является местным.
37. 37. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы ΙΑ

    ΙΑ
38. 38. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
39. 39. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы

    - 70 011304
40. 40. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
41. 41. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
42. 42. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
43. 43. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
44. 44. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы

    - 71 011304
45. 45. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
46. 46. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
47. 47. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
48. 48. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы

    - 72 011304
49. 49. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
50. 50. Применение по п.1, в котором соединением является соединение формулы
51. 51. Применение по п.1, в котором лекарственное средство представляет собой фармацевтическую композицию, а эффективное количество соединения формулы I по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли используют вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
52. 52. Применение по п.51, в котором фармацевтическая композиция приготовлена в форме геля.
53. 53. Применение по п.51, в котором фармацевтическая композиция приготовлена в форме мази.
54. 54. Применение по п.1, в котором лекарственное средство представляет собой фармацевтическую композицию, а эффективное количество соединения формулы I по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли используют вместе с эффективным количеством по крайней мере одного противовирусного агента и фармацевтически приемлемым носителем.
55. 55. Применение по п.54, в котором фармацевтическая композиция приготовлена в форме геля.
56. 56. Применение по п.54, в котором фармацевтическая композиция приготовлена в форме мази.
57. 57. Соединение формулы где Я⁴ означает Н или алкил, содержащий от 1 до 18 атомов углерода, алкенил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, или алкинил, содержащий от 2 до 18 атомов углерода, и фармацевтически приемлемые соли указанного соединения.
58. 58. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.57, приготовленная в форме геля или мази.
59. 59. Применение соединения по п.57 для получения лекарственного средства для применения в качестве антипролиферативного, апоптозного агента или противовирусного агента в отношении ПВЧ.

    - 73 011304
60. 60. Соединение формулы
61. 61. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.60 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.
62. 62. Применение соединения по п.60 в качестве активного компонента для изготовления лекарствен- ного средства, предназначенного для лечения опухоли.
63. 63. Соединение формулы
64. 64. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.63 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.
65. 65. Соединение формулы
66. 66. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.65 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.