ES2877404T3 - Derivados de indol mono o disustituidos como inhibidores de la replicación viral del dengue - Google Patents

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Abstract

Un compuesto o su forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en el que dicho compuesto es **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de indol mono o disustituidos como inhibidores de la replicación viral del dengue
La presente invención se refiere a compuestos de indol mono o disustituidos y también se refiere a dichos compuestos para su uso como un medicamento, más preferiblemente para su uso como una medicina para tratar o prevenir infecciones virales por dengue. La presente invención se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas o preparaciones de combinación de los compuestos, a las composiciones o preparaciones para su uso como un medicamento, más preferiblemente para la prevención o tratamiento de infecciones virales por dengue. La invención también se refiere a procesos para la preparación de los compuestos.
Antecedentes de la invención
Los flavivirus, que son transmitidos por mosquitos o garrapatas, provocan infecciones que amenazan la vida de seres humanos, tales como encefalitis y fiebre hemorrágica. Se conocen cuatro serotipos distintos, pero estrechamente relacionados, del flavivirus dengue, denominados DENV-1, -2, -3 y -4. El dengue es endémico en la mayoría de las regiones tropicales o subtropicales en todo el mundo, predominantemente en áreas urbanas y semiurbanas. De acuerdo con la organización mundial de la salud (OMS), 2.5 mil millones de personas, de las que mil millones son niños, están en riesgo de infección por DENV (OMS, 2002). De 50 a 100 millones de casos estimados de fiebre por dengue [DF], medio millón de casos de enfermedad por dengue grave (es decir, fiebre hemorrágica por dengue [DHF] y síndrome del shock por dengue [DSS]), y más de 20000 muertes ocurren en todo el mundo cada año. El DHF se ha vuelto una causa líder de hospitalización y muerte entre los niños en regiones endémicas. Por todo ello, el dengue representa la causa más común de muerte por enfermedad arboviral. Debido a grandes brotes recientes en países situados en américa latina, sudeste asiático y pacífico occidental (incluyendo Brasil, Puerto Rico, Venezuela, Camboya, Indonesia, Vietnam, Tailandia), el número de casos de dengue ha aumentado dramáticamente en los últimos años. No es solo el número de casos de dengue, que aumenta según la enfermedad se propaga a nuevas áreas, si no que los brotes tienden a ser más graves.
Para prevenir y/o controlar la enfermedad asociada con infección viral por dengue, los únicos métodos disponibles en el presente son estrategias de erradicación del mosquito para controlar el vector. Aunque se están haciendo avances en el desarrollo de vacunas frente al dengue, se han encontrado muchas dificultades. Estas incluyen la existencia de un fenómeno denominado potenciación dependiente de anticuerpos (ADE). La recuperación de una infección mediante un serotipo proporciona inmunidad de por vida frente a ese serotipo pero únicamente confiere una protección parcial y transitoria frente a una infección posterior por uno de los otros tres serotipos. Después de la infección con otro serotipo, los anticuerpos heterólogos preexistentes forman complejos con el serotipo de virus del dengue de nueva infección pero no neutralizan el patógeno. En su lugar, se cree que se facilita la entrada del virus en las células, dando como resultado una replicación incontrolada del virus y picos más altos de títulos virales. Tanto en infecciones primarias como secundarias, títulos virales mayores están asociados con enfermedad del dengue más grave. Puesto que los anticuerpos maternos pueden transmitirse fácilmente a los niños por la lactancia materna, esta puede ser una de las razones por las que los niños se ven más afectados que los adultos por enfermedad grave por dengue.
En localizaciones en las que circulan simultáneamente dos o más serotipos, también denominadas regiones hiperendémicas, el riesgo de enfermedad severa por dengue es significativamente superior debido a un riesgo elevado de experimentar una infección secundaria incluso más grave. Además, en una situación de hiperendemia, se aumenta la probabilidad de emergencia de cepas más virulentas, que a su vez aumenta la probabilidad de fiebre hemorrágica por dengue (DHF) o síndrome del shock por dengue.
Los mosquitos, incluyendo Aedes aegyptiy Aedes albopictus (mosquito tigre), se están trasladando al hemisferio norte. De acuerdo con los Centros para el Control y Prevención (CDC) de Estados Unidos (US), ambos mosquitos están actualmente omnipresentes en el sur de Texas. La propagación hacia el norte de mosquitos que portan el dengue no está confinada a US, si no que también se ha observado en Europa.
El documento WO2013/045516 (Universidad Católica de Lovaina) describe una serie de derivados de indol para su uso en la prevención o el tratamiento de infecciones virales, en particular infecciones con el virus del Dengue.
Recientemente (Diciembre 2015), la vacuna por dengue producida por Sanofi Pasteur se aprobó en primer lugar en México. La vacuna también se ha aprobado en Brasil, Las Filipinas y El Salvador. Los procesos de revisión regulatoria están continuando en otros países en los que el dengue es una prioridad de salud pública. Sin embargo, la vacuna deja un espacio de mejora considerable debido a la eficacia limitada, especialmente frente a DENV-1 y -2, baja eficacia en sujetos no tratados previamente para el flavivirus y la prolongada pauta de dosificación.
Pese a estas limitaciones, la vacuna es un revulsivo en las zonas endémicas puesto que ofrecerá protección a gran parte de la población, pero no probablemente a bebés muy pequeños, quienes portan la carga de dengue más grande. Además, la pauta de dosificación y la eficacia muy limitada en sujetos no tratados previamente para el flavivirus la hace inadecuada y probablemente inútil/no económica para viajeros desde áreas no endémicas a áreas endémicas de dengue. Las limitaciones mencionadas anteriormente de las vacunas contra el dengue son la razón por la que existe una necesidad de un antiviral contra el dengue profiláctico preexposición.
Además, adicionalmente a día de hoy, no están disponibles fármacos antivirales específicos para el tratamiento o prevención de infección por virus de la fiebre del dengue. Claramente, todavía hay una gran necesidad médica no cubierta de productos terapéuticos para la prevención o tratamiento de infecciones virales en animales, más en particular en seres humanos y especialmente de infecciones virales causadas por Flavivirus, más en particular virus del Dengue. Son altamente necesarios compuestos con buena potencia antiviral, ningún o bajos niveles de efectos secundarios, una actividad de amplio espectro frente a múltiples serotipos del virus del Dengue, una baja toxicidad y/o buenas propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas.
Ahora, la presente invención proporciona compuestos, derivados de indol mono o disustituidos, que muestran una actividad muy potente frente a los cuatro (4) serotipos del virus del Dengue. También, los compuestos de acuerdo con la invención poseen un buen perfil farmacocinético y sorprendentemente estos compuestos específicos muestran una estabilidad quiral mejorada.
Sumario de la invención
La presente invención está basada en el hallazgo inesperado de que al menos uno de los problemas mencionados anteriormente puede resolverse mediante los compuestos actuales de la invención.
La presente invención proporciona compuestos que ha observado que poseen una potente actividad antiviral frente a los cuatro (4) serotipos conocidos actualmente. La presente invención demuestra además que estos compuestos inhiben eficazmente la proliferación del virus del Dengue virus (DENV). Por lo tanto, estos compuestos constituyen una clase útil de compuestos potentes que pueden usarse en el tratamiento y/o prevención de infecciones virales en animales, mamíferos y seres humanos, más específicamente para su uso en el tratamiento y/o prevención de infección con virus del Dengue.
La presente invención se refiere además a los compuestos como medicamentos y a su uso para la fabricación de medicamentos para tratar y/o prevenir infecciones virales, en particular con virus que pertenecen a la familia de los virus del Dengue en animales o mamíferos, más en particular en seres humanos. La presente invención también se refiere a métodos para la preparación de todos estos compuestos y a composiciones farmacéuticas que los comprenden en una cantidad eficaz.
La presente invención también se refiere a compuestos para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones virales por dengue en seres humanos mediante la administración de una cantidad eficaz de uno o más de tales compuestos, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos opcionalmente en combinación con uno o más de otros medicamentos, como otro agente antiviral o vacuna contra el dengue o ambos, a un paciente que lo necesita.
Un aspecto de la invención es la provisión de un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000003_0001
una forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo;
en el que:
R1 es OCF3, R2 es H y R3 es H.
En la presente, se describen compuestos de fórmula (I)
Figure imgf000004_0001
una forma estereoisomérica, una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptables del mismo que comprende un grupo indol mono o disustituido; dicho compuesto se selecciona del grupo en el que:
R1 es H, R2 es F y R3 es H o CH3 ,
R1 es H, CH3 o F, R2 es OCH3 y R3 es H,
R1 es H, R2 es OCH3 y R3 es CH3 ,
R1 es CH3 , R2 es F y R3 es H,
R1 es CF3 , R2 es H y R3 es H,
R1 es OCF3 , R2 es OCH3 y R3 es H y
R1 es OCF3 , R2 es H y R3 es CH3.
En particular, el compuesto de la invención o su forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables de los mismo es:
Figure imgf000004_0002
En particular, en la presente se describen compuestos o su forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos seleccionados entre el grupo:
Figure imgf000005_0001
Otro aspecto de la invención es un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural (I)
Figure imgf000006_0001
una forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo; en el que:
R1 es OCF3 , R2 es H y R3 es H,
para su uso en la inhibición de la replicación del virus del dengue en una muestra biológica o paciente.
Otro aspecto de la descripción es un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural (I)
Figure imgf000006_0002
una forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo; dicho compuesto se selecciona del grupo en el que:
R1 es H, R2 es F y R3 es H o CH3 ,
R1 es H, CH3 o F, R2 es OCH3 y R3 es H y
R1 es H, R2 es OCH3 y R3 es CH3 ,
R1 es CH3 , R2 es F y R3 es H,
R1 es CF3 , R2 es H y R3 es H,
R1 es OCF3 , R2 es OCH3 y R3 es H y
R1 es OCF3 , R2 es H y R3 es CH3
para su uso en la inhibición de la replicación del virus del dengue en una muestra biológica o paciente.
También forma parte de la presente invención una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) o una forma isomérica, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, junto con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula (I) incluyen sus sales de adición de ácido y de base. Las sales de adición de ácido adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales atóxicas. Las sales de adición de base adecuadas se forman a partir de bases que forman sales atóxicas.
Los compuestos de la invención también pueden existir en formas solvatadas y no solvatadas. El término "solvato" se utiliza en la presente para describir un complejo molecular que comprende el compuesto de la invención y una o más moléculas de disolvente farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, etanol.
El término "polimorfo" se refiere a la capacidad del compuesto de la invención de existir en más de una forma o estructura cristalina.
Los compuestos de la presente invención se pueden administrar como productos amorfos o cristalinos. Se pueden obtener, por ejemplo, como masas compactas sólidas, polvos o películas mediante métodos tales como la precipitación, cristalización, liofilización, secado por pulverización o secado por evaporación. Se pueden administrar solos o combinados con uno o más compuestos de la invención diferentes o combinados con uno o más fármacos diferentes. En general, se administrarán como una formulación asociados con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" se utiliza en la presente para describir cualquier ingrediente que no sea el o los compuestos de la invención. La selección del excipiente depende en gran medida de factores tales como la vía particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad, y la naturaleza de la forma farmacéutica.
Los compuestos de la presente invención o cualquier subgrupo de estos se pueden formular en varias formas farmacéuticas con el fin de poderlos administrar. Como composiciones adecuadas, se pueden citar todas las composiciones empleadas normalmente para administrar fármacos por vía sistémica. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, se combina una cantidad eficaz del compuesto particular, opcionalmente en forma de sal de adición, como principio activo, en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, pudiendo adoptar dicho portador una gran variedad de formas dependiendo de la forma del preparado que se desee para la administración. Estas composiciones farmacéuticas se encuentran deseablemente en una forma de dosificación unitaria adecuada, por ejemplo, para administración oral o rectal. Por ejemplo, en la preparación de las composiciones en una forma farmacéutica oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparados líquidos orales tales como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y soluciones; o portadores sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos. Debido a su fácil administración, los comprimidos y las cápsulas representan las formas farmacéuticas unitarias orales más convenientes, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. También se incluyen los preparados en forma sólida que se pueden convertir, poco antes de su uso, en formas líquidas.
Es especialmente conveniente formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en formas farmacéuticas unitarias debido a la uniformidad de la dosis y a que se pueden administrar fácilmente. La expresión "forma farmacéutica unitaria", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociada con el portador farmacéutico requerido. Algunos ejemplos de las formas farmacéuticas unitarias de este tipo son los comprimidos (que incluyen los comprimidos ranurados o recubiertos), cápsulas, pastillas, sobres de polvos, obleas, supositorios, suspensiones o soluciones inyectables y similares, y múltiplos segregados de estos.
Los expertos en el tratamiento de enfermedades infecciosas serán capaces de determinar la cantidad eficaz a partir de los resultados de las pruebas que se presentan posteriormente en la presente. En general, se considera que una cantidad diaria eficaz sería de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Podría resultar adecuado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis en intervalos adecuados a lo largo del día. Dichas subdosis se pueden formular como formas farmacéuticas unitarias, por ejemplo, que contengan de 1 a 1000 mg y, en particular, de 5 a 200 mg de principio activo por forma farmacéutica unitaria.
La dosis exacta y la frecuencia de administración dependen del compuesto particular de fórmula (I) utilizado, la afección particular que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, la edad, el peso y el estado físico general del paciente particular, así como también de otra medicación que el individuo pueda estar tomando, como bien sabrán los expertos en la técnica. Además, es obvio que la cantidad eficaz se puede reducir o incrementar dependiendo de la respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del médico que prescriba los compuestos de la presente invención. Por consiguiente, los intervalos de la cantidad eficaz que se han mencionado anteriormente son solamente orientativos y no se pretende que limiten el alcance ni el uso de la invención de ningún modo.
También se pretende que la presente divulgación incluya cualquiera de los isótopos de los átomos presentes en los compuestos de la presente invención. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio y los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14.
Los presentes compuestos usados en la presente invención también pueden existir en sus formas estereoquímicamente isoméricas, que definen todos los posibles compuestos hechos de los mismos átomos enlazados mediante la misma secuencia de enlaces pero que tienen estructuras tridimensionales diferentes, que no son intercambiables. A menos que se mencione o indique lo contrario, la designación química de compuestos engloba la mezcla de todas las formas estereoquímicamente isoméricas posibles que dichos compuestos puedan poseer.
Dicha mezcla puede contener todos los diastereómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho compuesto. Se pretende que todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos usados en la presente invención, tanto en forma pura como en mezcla con las otras, estén abarcadas dentro del alcance de la presente invención, incluyendo cualquiera de las mezclas racémicas o racematos.
Las formas estereoisoméricas puras de los compuestos y los intermedios que se mencionan en el presente documento se definen como isómeros sustancialmente exentos de otras formas enantioméricas o diastereoméricas de la misma estructura molecular básica de dichos compuestos o intermedios. En particular, la expresión "estereoisoméricamente puro" se refiere a compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico de al menos un 80% (es decir, un mínimo de un 90% de un isómero y un máximo de un 10% de los otros isómeros posibles) y hasta un exceso estereoisomérico de un 100% (es decir, un 100% de un isómero y nada de los demás), más concretamente, compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico desde un 90% hasta un 100%, aún más concretamente que tienen un exceso estereoisomérico desde un 94% hasta un 100% y, aún más concretamente, que tienen un exceso estereoisomérico desde un 97% hasta un 100%. Las expresiones "enantioméricamente puro" y "diastereoméricamente puro" se deben interpretar de un modo similar, pero haciendo referencia al exceso enantiomérico y el exceso diastereomérico de la mezcla en cuestión, respectivamente.
Pueden obtenerse formas estereoisoméricas puras de compuestos e intermedios usados en esta invención mediante la aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los enantiómeros se pueden separar unos de otros mediante la cristalización selectiva de sus sales diastereoméricas con ácidos o bases ópticamente activos. Algunos ejemplos de estos son el ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluoiltartárico y ácido alcanforsulfónico. Como alternativa, los enantiómeros se pueden separar mediante técnicas cromatográficas utilizando fases estacionarias quirales. Dichas formas estereoquímicamente isoméricas puras también pueden obtenerse a partir de las formas estereoquímicamente isoméricas puras correspondientes de los materiales de partida adecuados, siempre que la reacción tenga lugar de manera estereoespecífica. Preferentemente, si se desea obtener un estereoisómero específico, dicho compuesto se sintetizará mediante métodos de preparación estereoespecíficos. En estos métodos, se emplearán convenientemente materiales de partida enantioméricamente puros.
Enfoques sintéticos generales
La síntesis de compuestos de fórmula general I puede realizarse como se indica en el Esquema 1. Puede convertirse ácido 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acético (II) en el cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo (III) correspondiente con un reactivo de cloración como, por ejemplo, cloruro de tionilo. La reacción de Friedel-Crafts del cloruro de ácido III con un indol sustituido de fórmula general IV puede realizarse usando un reactivo de ácido de Lewis como, por ejemplo, Et2AlCl o TiCl4 , en un disolvente adecuado como, por ejemplo, CH2CL o 1,2-dicloroetano, y en unas condiciones de reacción adecuadas que implican típicamente (pero no exclusivamente) refrigeración, para proporcionar el indol 3-acilado de la fórmula general V . La introducción de un resto de anilina en posición alfa con respecto al resto carbonilo de los compuestos de la fórmula V puede completarse mediante una secuencia de reacción que implica, por ejemplo, bromación de V con un reactivo como, por ejemplo, tribromuro de feniltrimetilamonio en un disolvente adecuado como, por ejemplo, THF, para proporcionar los compuestos de la fórmula general VI, y reacción posterior de los compuestos de fórmula general VI con 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina (VII) en un disolvente adecuado como, por ejemplo, CH3CN, y usando típicamente una base como, por ejemplo, TEA o DIPEA, para proporcionar los compuestos de la fórmula general I en forma de mezclas racémicas. La separación quiral de los compuestos de la fórmula general I puede realizarse mediante, por ejemplo, cromatografía quiral para proporcionar los Enantiómeros A y B de fórmula general I.
Figure imgf000009_0001
Esquema 1
En algunos casos, la síntesis del intermedio de fórmula general V mediante el enfoque de síntesis de Friedel-Crafts, se beneficia de la presencia de un grupo protector (PG) en el indol-N durante la etapa de reacción de Friedel-Crafts, como se indica en el Esquema 2. A este fin, el indol sustituido de fórmula general IV puede convertirse en primer lugar en un intermedio N-protegido de fórmula general VIII, tal como, por ejemplo, un intermedio N-tosilado de fórmula general VIII (PG = Ts), usando un reactivo como, por ejemplo, cloruro de tosilo, en presencia de una base como, por ejemplo, hidruro sódico. La reacción de Friedel-Crafts del indol sustituido de fórmula general IV con cloruro de ácido III puede realizarse usando un reactivo de ácido de Lewis como, por ejemplo, Et2AlCl o TiCk en un disolvente adecuado como, por ejemplo, CH2Cl2 o 1,2-dicloroetano, y en condiciones de reacción adecuadas que implican típicamente (pero no exclusivamente) refrigeración, para proporcionar el indol 3-acilado N-protegido de fórmula general IX. La retirada del grupo N protector de indol PG del intermedio de fórmula general IX puede completarse con un reactivo como, por ejemplo LiOH (para PG = Ts) en una mezcla de disolventes como, por ejemplo THF/agua y a una temperatura de reacción adecuada, para proporcionar el indol 3-acilado de fórmula general V .
Figure imgf000009_0002
Esquema 2
Como un enfoque alternativo, el intermedio de fórmula general V también puede prepararse como se indica en el Esquema 3: El indol-3-carbaldehído sustituido protegido con N-Boc de fórmula general X puede convertirse en el tipo de intermedio Strecker correspondiente de fórmula general XI mediante reacción con morfolina en presencia de reactivos como, por ejemplo, cianuro sódico y bisulfito potásico y en un disolvente adecuado como, por ejemplo, una mezcla de agua y un disolvente orgánico miscible en agua como, por ejemplo, dioxano. La alquilación del compuesto de fórmula general XI con 4-cloro-2-metoxi-bencilcloruro puede conseguirse en presencia de una base como, por ejemplo, hexametildisilazano potásico y en un disolvente adecuado como, por ejemplo, DMF para proporcionar el compuesto de fórmula general XII. La sumisión del compuesto de fórmula general XII a una condición hidrolítica ácida acuosa como, por ejemplo, mediante tratamiento con una solución acuosa de ácido clorhídrico a temperatura elevada, proporciona el intermedio de fórmula general V .
Figure imgf000010_0001
Esquema 3
Ejemplos
Métodos de LC-MS
La medición por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se llevó a cabo utilizando una bomba de LC, un haz de diodos (DAD) o un detector de UV y una columna, según se especifique en los métodos respectivos. Cuando fue necesario, se incluyeron detectores adicionales (remítase a la tabla de los métodos que se presenta más adelante). El flujo procedente de la columna se introdujo en un espectrómetro de masas (MS), el cual estaba configurado con una fuente de iones a presión atmosférica. Un experto en la técnica será capaz de fijar los parámetros ajustables (p. ej., intervalo de barrido, tiempo de permanencia, etc.) para obtener iones que permitan identificar el peso molecular monoisotópico nominal del compuesto (PM). La adquisición de datos se llevó a cabo con el software adecuado. Los compuestos se describen según sus iones y tiempos de retención experimentales (tR). Si no se especifica de otro modo en la tabla de datos, el ión molecular descrito corresponde a [M+H]+ (molécula protonada) y/o [M-H]- (molécula desprotonada). En el caso de que el compuesto no se pueda ionizar directamente, se especifica el tipo de aducto (es decir, [M+NH4]+, [M+HCOO]- , etc.). Para moléculas con patrones isotópicos múltiples (Br, Cl), el valor indicado es el obtenido para la masa de isótopo más baja. Todos los resultados se obtuvieron con las incertidumbres experimentales que se asocian habitualmente con el método utilizado.
En lo sucesivo en la presente, “SQD” significa detector de cuadrupolo único, “MSD” detector selectivo de masas, “TA” temperatura ambiente, “BEH” híbrido con puente de etilsiloxano/sílice, “DAD” detector de haz de diodos, “HSS” sílice de alta resistencia.
Códigos del método de LCMS(Flujo expresado en mL/min; temperatura de la columna (T) en °C; Tiempo de análisis en minutos)
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000011_0001
Métodos de SFC-MS
La medición de SFC se realizó usando un sistema de cromatografía analítica de fluidos supercrtíticos (SFC) compuesto de una bomba binaria para liberar dióxido de carbono (CO2) y un modificador, un automuestreador, un horno de columna, un detector de matriz de diodos equipado con una célula de flujo de alta presión que se mantiene a 400 bar. Si se configura con un espectrómetro de masas (MS) el flujo desde la columna se lleva al (MS). Un experto en la técnica será capaz de fijar los parámetros ajustables (p. ej., intervalo de barrido, tiempo de permanencia, etc.) para obtener iones que permitan identificar el peso molecular monoisotópico nominal del compuesto (PM). La adquisición de datos se llevó a cabo con el software adecuado.
Métodos de SFC-MS analíticos (Flujo expresado en mL/min; temperatura de la columna (T) en °C; Tiempo de análisis en minutos, Contrapresión (BPR) en bares.
Figure imgf000012_0001
Puntos de fusión
Los valores son valores pico o en rangos de fusión, y se obtienen con incertidumbre experimentales que están comúnmente asociadas con este método analítico.
DSC823e (indicado como DSC)
Para varios compuestos, los puntos de fusión se determinaron con un DSC823e (Mettler-Toledo). Se midieron los puntos de fusión con un gradiente de temperatura de 10 °C/minuto. La temperatura máxima fue 300 °C.
Rotaciones ópticas:
Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro 341 de Perkin-Elmer con una lámpara de sodio y se presentan como se indica a continuación: [a]° (A, c g/100 mL, disolvente, T °C).
[a]iT = (100a) / (l x c) : donde l es la longitud de recorrido dm y c es la concentración en g/100 ml para una muestra a una temperatura T (°C) y una longitud de onda A (en nm). Si la longitud de onda de la luz utilizada es de 589 nm (la línea D del sodio), entonces podría utilizarse el símbolo D en su lugar. El signo de rotación (+ o -) debería proporcionarse siempre. Cuando se utiliza esta ecuación, la concentración y el disolvente siempre se proporcionan entre paréntesis después de la rotación. La rotación se indica utilizando grados y no se proporcionan unidades de concentración (se asume que son g/100 mL).
Ejemplo_______i : Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 1) y separación quiral en Enantiómeros 1A y 1B .
Figure imgf000013_0001
Síntesis del intermedio 1a:
Se añadió ácido 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acético [CAS 170737-95-8] (5.8 g, 28.9 mmol) en pequeñas porciones a cloruro de tionilo (50 mL) y la solución resultante se agitó durante una noche a 60°C. El disolvente se concentró a presión reducida y se co-evaporó con tolueno para dar cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (6.5 g) en forma de un residuo oleoso que se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis del intermedio 1b:
Se añadió gota a gota cloruro de dietilaluminio 1 M en hexano (37.1 mL, 37.1 mmol) a 0°C, a una solución de 6-fluoro-1H-indol [CAS 399-51-9] (3.34 g, 24.76 mmol) en ChbCb (100 mL). Después de 30 min a 0°C, se añadió lentamente una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (6.3 g, 28.76 mmol) en ChbCb (100 mL) a 0°C. La reacción se agitó a 0°C durante 3 h. Se añadió agua enfriada con hielo y el precipitado se retiró por filtración, se lavó con agua y una pequeña cantidad de CH2Cl2. Los sólidos se secaron al vacío a 70°C durante una noche para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1b (4.9 g).
Síntesis del intermedio 1c:
A 0°C, una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (5.8 g, 15.4 mmol) en THF (65 mL) se añadió gota a gota a una mezcla de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1b (4.9 g, 15.4 mmol) en THF (60 mL). La mezcla se agitó a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 2.5 h. El precipitado se retiró por filtración y se lavó con EtOAc. Los filtrados combinados se concentraron a presión reducida. El residuo se recogió con EtOAc y se lavó con agua. Un precipitado apareció en la capa orgánica y se retiró por filtración y se secó para proporcionar un primer lote de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1c (4.6 g). La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se cristalizó en EtOAc, el precipitado se retiró por filtración, se lavó con Et2O y se secó al vacío para proporcionar una segunda fracción de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-1 H-indol-3-il)etanona 1c (1.6 g).
Síntesis del Compuesto 1 y separación quiral de los Enantiómeros 1A y 1B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1c (3 g, 7.56 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2.28 g, 11.35 mmol) y diisopropiletilamina (1.95 mL, 11.35 mmol) en CH3CN (60 mL) y THF (30 mL) se agitó a 70°C durante 24 h. La reacción se diluyó con EtOAc. La fase orgánica se lavó con HCl 1 N (dos veces) y agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (15-40 gm, 80 g, Fase móvil: 99.5/0.5 de CH2Cl2/MeOH). Se realizó una segunda purificación por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (15-40 gm, 80 g, Fase móvil: 99.7/0.3 de CH2Cl2/MeOH). Las fracciones puras se combinaron y se concentraron a presión reducida para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 1, 2 g) en forma de una mezcla racémica.
Los enantiómeros del Compuesto 1 se separaron mediante SFC quiral (Fase estacionaria: Chiralpak® AD-H 5 gm 20 x 250 mm, Fase móvil: 50% CO2, 50% MeOH) produciendo 740 mg del primer enantiómero eluido y 720 mg del segundo enantiómero eluido. El primer enantiómero eluido se cristalizó en CH3CN/Et2O. El precipitado se retiró por filtración y se secó para dar el Enantiómero 1A (645 mg). El segundo enantiómero eluido se cristalizó en CH3CN/Et2O. El precipitado se retiró por filtración y se secó para dar el Enantiómero 1B (632 mg).
Compuesto 1:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.24 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.58 (s, 2 H) 6.91 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.7, 1.9 Hz, 1 H) 7.02 - 7.09 (m, 2 H) 7.12 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.27 (dd, J=9.5, 1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.14 (dd, J=8.7, 5.5 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.10 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.08 min, MH+ 517
Punto de fusión: 174°C
Enantiómero 1A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.24 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.59 (s, 2 H) 6.91 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.8, 2.2 Hz, 1 H) 7.02 - 7.10 (m, 2 H) 7.12 (d, J=2.2 Hz, 1 H) 7.27 (dd, J=9.6, 2.2 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.14 (dd, J=8.8, 5.7 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.10 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.09 min, MH+ 517
[a]D20 : 130.3° (c 0.277, DMF)
SFC quiral (método SFC-D): TR 3.41 min, MH+ 517, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 220°C
Enantiómero 1B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.24 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.53 - 6.65 (m, 2 H) 6.91 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1 H) 7.01 - 7.09 (m, 2 H) 7.12 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.27 (dd, J=9.6, 2.0 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.14 (dd, J=8.6, 5.6 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 12.09 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.09 min, MH+ 517
[a]D20 : -135.3° (c 0.283, DMF)
SFC quiral (método SFC-D): TR 4.89 min, MH+ 517, pureza quiral 99.35%.
Punto de fusión: 218°C
Ejemplo 1.1: Estabilidad quiral del Enantiómero 1A a pH 7.4
La estabilidad quiral del Enantiómero 1A (R = OMe) se evaluó por determinación del exceso enantiomérico (%ee) después de incubación durante 24 h y 48 h en una solución tamponada a pH 7.4 a 40°C y 60°C. Para asegurar la influencia del sustituyente metoxi del Enantiómero 1A (R = OMe) sobre la estabilidad frente a racemización, la estabilidad quiral del Enantiómero 1’A (R = H) se sometió a ensayo en las mismas condiciones.
A este fin, se prepararon 5 pM de soluciones tamponadas (pH = 7.4) de 1A y 1’A mezclando 25 pL de una solución 100 pM de 1A o 1’A en DMSO con 475 pL de tampón acuoso a pH 7.4. Las muestras se recogieron 24 h y 48 h después de la incubación a 40 °C y 60 °C. Las muestras analíticas se analizaron mediante SFC quiral (detección MS) y la pureza quiral se expresó como el exceso enantiomérico (%ee = %enantiómero A - %enantiómero B). Ambos enantiómeros 1A y 1’A tenían una pureza quiral del 100% antes de su incubación.
Figure imgf000015_0001
1A (R = OMe)
1 'A (R = H)
%ee
Compuesto Temperatura Momentos temporales del muestreo
(h)
24 48
40°C 100 100
1A
60°C 95 88
40°C 21 10
1’A
60°C 0 0
Ejemplo 2 : síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1 H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 2) y separación quiral en los Enantiómeros 2A y 2B .
Figure imgf000015_0002
Síntesis del intermedio 2a:
Se añadió gota a gota cloruro de dimetilaluminio 1 M en hexano (20 mL, 20.0 mmol) a 0°C a una solución de 6-fluoro--metil-1 H-indol [CAS 57817-10-4] (1.50 g, 10.1 mmol) en CH2Cl2 (45 mL). Después de 30 min a 0°C, se añadió lentamente una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo (3.30 g, 15.1 mmol, síntesis: véase Ejemplo 1) en diclorometano (30 mL). La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 3 h. Se añadió una solución 1 M de sal de la Rochelle (50 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Los sólidos se retiraron por filtración y se repartieron entre EtOAc y HCl 1 N. Las fases se separaron. La fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se trituró con EtOAc y heptano. El precipitado se retiró por filtración para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-fluoro-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona 2a (2.00 g).
Síntesis del intermedio 2b:
Una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (2.49 g, 6.6 mmol) en THF (45 mL) se añadió gota a gota a 0°C a una solución de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-fluoro-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona 2a (2.00 g, 6.0 mmol) en THF (65 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. El precipitado se retiró por filtración y se lavó con EtOAc. Los filtrados combinados se concentraron a presión reducida. El residuo se recogió con una cantidad mínima de acetonitrilo. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con acetonitrilo y se secó a alto vacío para dar un primer lote de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2b (1.51 g). El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se recogió con una cantidad mínima de acetonitrilo. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con acetonitrilo y se secó a alto vacío para dar una segunda fracción de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-fluoro-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona 2b (0.70 g).
Síntesis del Compuesto 2 y separación quiral de los Enantiómeros 2A y 2B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2b (1.8 g, 4.36 mmol) y 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2.6 g, 13.0 mmol) en THF (9 mL) y CH3CN (9 mL) se calentó a 100 °C en radiación de microondas durante 50 min. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 1 N. Las fases se separaron. La fase orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 y samuera, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se recogió con una cantidad mínima de acetonitrilo. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con acetonitrilo y se secó a alto vacío para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1 H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 2 , 1.7 g) en forma de una mezcla racémica.
La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 2 (1.59 g) se realizó mediante SFC preparativa(Fase estacionaria: (S,S)-Whelk-O1 5 gm 250 x 21.1 mm, Fase móvil: 50% de CO2 , 50% de MeOH). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron a presión reducida. El primer enantiómero eluido (746 mg) se purificó adicionalmente por cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 gm, 24 g, Fase móvil: 99.5/0.5 de CH2Cl2/MeOH). Las fracciones se combinaron y se evaporaron a presión reducida (560 mg). El residuo se solidificó mediante trituración con una mezcla de Et2O y unas pocas gotas de CH3CN. Los sólidos se retiraron por filtración y se secaron a alto vacío para dar el Enantiómero 2A (473 mg). El segundo enantiómero eluido (732 mg) se purificó adicionalmente por cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 gm, 24 g, Fase móvil: 99.5/0.5 de CH2Cl2/MeOH). Las fracciones se combinaron y se evaporaron a presión reducida (550 mg). El residuo se solidificó mediante trituración con una mezcla de Et2O y unas pocas gotas de CH3CN. Los sólidos se retiraron por filtración y se secaron a alto vacío para dar el Enantiómero 2B (457 mg).
Compuesto 2:
1H RMN (300 MHz, DMSO-ds ) 5 ppm 2.38 (d, J=1.5 Hz, 3 H) 3.10 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.27 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.55 - 6.63 (m, 2 H) 6.93 (m, 1 H) 6.94 - 7.09 (m, 3 H) 7.13 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 7.97 (dd, J=8.7, 5.3 Hz, 1 H) 8.45 (s, 1H) 12.23 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-D): TR 1.68 min, MH+ 531
Enantiómero 2A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 2.37 - 2.39 (m, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.26 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.54 - 6.63 (m, 2 H) 6.92 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.4, 1.9 Hz, 1 H) 7.02 (dd, J=9.9, 9.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.96 (dd, J=8.5, 5.4 Hz, 1 H) 8.45 (s, 1 H) 12.24 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-C): TR 3.20 min, MH+ 531
[a]D20 : 104.5° (c 0.2545, DMF)
SFC quiral (método SFC-A): TR 4.22 min, MH+ 531, pureza quiral 100%.
Enantiómero 2B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 2.36 - 2.41 (m, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.26 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.57 - 6.64 (m, 2 H) 6.92 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 6.99 - 7.04 (m, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.96 (dd, J=8.7, 5.2 Hz, 1 H) 8.45 (s, 1 H) 12.24 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.20 min, MH+ 531
[a]D20 : -104.1° (c 0.2536, DMF)
SFC quiral (método SFC-A): TR 5.12 min, MH+ 531, pureza quiral 99.53%.
Ejemplo_______3: síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 3) y separación quiral en los Enantiómeros 3A y 3B .
Figure imgf000017_0001
Síntesis del intermedio 3a:
Una solución de NaHSO3 (5.7 g, 54.5 mmol) en agua (45 mL) se añadió a una solución en agitación de 3-formil-6-metoxi-1 H-indol-1-carboxilato de ferc-butilo [CAS 847448-73-1] (10 g, 36.3 mmol) en dioxano (45 mL). Después de 15 min, se añadió morfolina (4.8 mL, 54.5 mmol) y 35 min después, se añadió cianuro sódico (NaCN) (1.96 g, 40 mmol). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, hasta que finalizó la reacción. El producto se retiró por filtración y se lavó con una mezcla 1/1 de dioxano/agua (3x 35 mL), y posteriormente con agua (3x 45 mL) y se secó al vacío a 60 °C. Los sólidos se agitaron en Et2O (125 mL), se retiraron por filtración, se lavaron con Et2O (3x) y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar 3-(ciano(morfolino)metil)-6-metoxi-1 H-indol-1 -carboxilato de ferc-butilo 3a (12.3 g).
Síntesis del intermedio 3b:
Una mezcla de 3-(ciano(morfolino)metil)-6-metoxi-1 H-indol-1-carboxilato de ferc-butilo 3a (6.0 g, 16.2 mmol) en DMF seca (80 mL) se agitó en una atmósfera de N2 mientras se enfriaba en un baño de hielo. Se añadió gota a gota una solución de KHMDS 0.5 M en tolueno (35.5 mL, 17.8 mmol) durante 10 min. Después de agitar durante 10 min más, se añadió 4-cloro-1-(clorometil)-2-metoxibenceno [CAS 101079-84-9] (3.09 g, 16.2 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La mezcla de reacción se vertió en agua fría (400 mL) y el producto se extrajo con Et2O (2x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se evaporaron a presión reducida y se co-evaporaron con xileno. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (Fase estacionaria: Grace Reveleris® sílice 120 g, Fase móvil: heptano/EtOAc gradiente de 100/0 a 20/80). Las fracciones deseadas se combinaron, se evaporaron a presión reducida y se co-evaporaron con dioxano para dar 3-(2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-ciano-1-morfolinoetil)-6-metoxi-1H-indol-1-carboxilato de ferc-butilo 3b (7.75 g).
Síntesis del intermedio 3c:
A una suspensión agitada de 3-(2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-ciano-1-morfolinoetil)-6-metoxi-1H-indol-1-carboxilato de ferc-butilo 3b (7.75 g, 14.7 mmol) en dioxano (40 mL) y agua (20 mL) se añadió una solución de HCl 6 M en isopropanol (36.8 mL, 220 mmol). La mezcla resultante se agitó a 60 °C durante 4 h y posteriormente a 80 °C durante 1 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se dejó reposar durante 20 h para permitir la cristalización del producto de reacción. El producto se retiró por filtración, se lavó con una mezcla 1/1/1 de /PrOH/H2O/dioxano (2x 15 mL) y se secó al vacío a 50 °C para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-1 H-indol-3-il)etanona 3c (3.67 g).
Síntesis del Compuesto 3 y separación quiral de los Enantiómeros 3A y 3B:
Una mezcla agitada de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-1 H-indol-3-il)etanona 3c (2 g, 6.07 mmol) en THF (80 mL) se enfrió en un baño de hielo en una atmósfera de N2. Se añadió tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (2.39 g, 6.37 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 1 h y posteriormente a temperatura ambiente durante 1.5 h. Se añadió 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (3.66 g, 18.2 mmol) y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en CH3CN (100 mL). Se añadió diisopropiletilamina (2.09 mL, 12.1 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 55 °C durante 27 h. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en agua en agitación (400 mL). El producto se extrajo con 2-MeTHF (2x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSÜ4 , se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El residuo (8 g) se purificó por cromatografía ultrarrápida (fase estacionaria: Grace Reveleris® sílice 120 g, Fase móvil: heptano/EtOAc gradiente de 100/0 a 0/100). Las fracciones deseadas se combinaron y evaporaron a presión reducida. El residuo (5.4 g) se purificó por HPLC preparativa (Fase estacionaria: RP XBridge® Prep C18 OBD - 10 pm, 50 x 150 mm, Fase móvil: solución de NH4HCO3 al 0.25% en agua, CH3CN). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron a presión reducida y posteriormente se co-evaporaron con MeOH. El residuo se cristalizó en una mezcla de EtOAc (15 mL), CH3CN (2 mL) y MeOH (2 mL). Los sólidos se retiraron por filtración, se lavaron con EtOAc (3x) y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 3 , 681 mg) en forma de una mezcla racémica.
La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 3 (0.63 g) se realizó mediante separación quiral de fase normal (Fase estacionaria: AS 20 pM, Fase móvil: 100% de metanol). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron a presión reducida. El primer enantiómero eluido se purificó por cromatografía ultrarrápida (Fase estacionaria: Grace Reveleris® sílice 12 g, Fase móvil: gradiente desde 100/0/0 hasta 40/45/15 de heptano/EtOAc/EtOH). Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron, y se co-evaporaron con EtOAc. El aceite restante se solidificó mediante agitación en H2O (4 mL) y adición lenta de MeOH (1.6 mL). Después de agitar durante 20 minutos, el producto se retiró por filtración, se lavó (3x) con una mezcla 1/2 de MeOH/H2O y se secó al vacío a 50 °C para proporcionar el Enantiómero 3A (168 mg) en forma de un sólido amorfo. El segundo enantiómero eluido se purificó por cromatografía ultrarrápida (Fase estacionaria: Grace Reveleris® sílice 12 g, Fase móvil: gradiente desde 100/0/0 hasta 40/45/15 de heptano/EtOAc/EtOH). Las fracciones deseadas se combinaron, se evaporaron a presión reducida y se co-evaporaron con EtOAc. La espuma restante se solidificó mediante agitación en H2O (4 mL) y adición lenta de MeOH (2 mL). Después de agitar durante 15 minutos, el producto se retiró por filtración, se lavó (3x) con una mezcla 1/2 de MeOH/H2O y se secó a 50 °C al vacío para proporcionar el Enantiómero 3B (146 mg) en forma de un sólido amorfo.
Compuesto 3:
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.77 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.21 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.54 - 6.64 (m, 2 H) 6.83 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1 H) 6.91 (t, J=1.4 Hz, 1 H) 6.94 - 6.99 (m, 2 H) 7.04 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.12 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.30 (s, 1 H) 11.84 (s, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.20 min, MH+ 529
Enantiómero 3A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.77 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.22 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.55 - 6.61 (m, 2 H) 6.84 (dd, J=8.8, 2.2 Hz, 1 H) 6.91 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.94 - 7.00 (m, 2 H) 7.07 (d, J=7.0 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.32 (d, J=2.9 Hz, 1 H) 11.87 (d, J=2.6 Hz, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 1.08 min, MH+ 529
[a]D20 : 134.9° (c 0.545, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 4.31 min, MH+ 529, pureza quiral 100%.
Enantiómero 3B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.77 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.21 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.54 - 6.62 (m, 2 H) 6.83 (dd, J=8.6, 2.4 Hz, 1 H) 6.91 (t, J=1.5 Hz, 1 H) 6.94 - 6.99 (m, 2 H) 7.07 (d, J=7.0 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.32 (d, J=2.9 Hz, 1 H) 11.87 (d a, J=2.2 Hz, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 1.08 min, MH+ 529
[a]D20 : -116.7° (c 0.51, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 4.63 min, MH+ 529, pureza quiral 94.7%.
Ejemplo 4 : Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-metoxi-5-metil-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 4) y separación quiral en los Enantiómeros 4A y 4B .
Figure imgf000019_0001
Síntesis del intermedio 4a:
Se añadió gota a gota cloruro de dimetilamonio 1 M en hexano (13.5 mL, 13.5 mmol) a 0 °C a una solución de 6-metoxi-5-metil-1 H-indol [CAS 1071973-95-9] (1.45 g, 9 mmol) en CH2Cl2 (45 mL). Después de 30 min a 0 °C, se añadió lentamente una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (2.4 g, 10.9 mmol) en CH2Cl2 (45 mL) a 0 °C. La reacción se agitó a 0 °C durante 3 h. Se añadió agua enfriada con hielo y el precipitado se retiró por filtración y se lavó con agua. El sólido se secó al vacío para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 4a (2.1 g).
Síntesis del intermedio 4b:
A 0 °C, se añadió gota a gota una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (2.4 g, 6.4 mmol) en THF (65 mL) a una mezcla de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-5-metil-1 H-indol-3-il)etanona 4a (2.1 g, 6.1 mmol) en THF (60 mL). La mezcla se agitó a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 2.5 h. El precipitado se retiró por filtración y se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se recogió con el mínimo de diisopropiléter. El precipitado se retiró por filtración y se secó a alto vacío para dar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-5-metil-1 H-indol-3-il)etanona 4b (2.36 g).
Síntesis del Compuesto 4 y separación quiral de los Enantiómeros 4A y 4B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 4b (4.0 g, 9.46 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2.86 g, 14.2 mmol) y diisopropiletilamina (2.44 mL, 14.2 mmol) en CH3CN/THF (1/1) (100 mL) se agitó a 45 °C durante 72 h. Los disolventes se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc. La fase orgánica se lavó dos veces con HCl 1 N, se lavó con agua, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró a presión reducida. El compuesto se cristalizó en CHsCN/diisopropiléter para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoxi-5-metil-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 4 , 1.1 g) en forma de una mezcla racémica.
La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 4 se realizó mediante SFC quiral preparativa (Fase estacionaria: (S,S)-Whelk-O15 gm 250 x 21.1 mm, Fase móvil: 45% CO2 , 55% MeOH) produciendo 500 mg del primer enantiómero eluido y 531 mg del segundo enantiómero eluido. El primer enantiómero eluido se cristalizó en CH3CN/Et2O para proporcionar el Enantiómero 4A (401 mg). El segundo eluido se cristalizó en CH3CN/Et2O para proporcionar el Enantiómero 4B (396 mg).
Compuesto 4:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 2.21 (s, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.79 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.20 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.58 (s, 2 H) 6.88 - 6.93 (m, 2 H) 6.96 (dd, J=8.5, 1.9 Hz, 1 H) 7.02 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.12 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.89 (s, 1 H) 8.24 (s, 1 H) 11.78 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.16 min, MH+ 543
Punto de fusión: 208°C
Enantiómero 4A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 2.21 (s, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.79 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.20 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.58 (d, J=1.6 Hz, 2 H) 6.87 - 6.93 (m, 2 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.02 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.12 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.89 (s, 1 H) 8.25 (s, 1 H) 11.78 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.15 min, MH+ 543
[a]D20 : 141.8° (c 0.3936, DMF)
SFC quiral (método SFC-C): TR 4.95 min, MH+ 543, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 173°C
Enantiómero 4B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-dfe) 5 ppm 2.21 (s, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.79 (s, 3 H) 4.01 (s, 3 H) 6.20 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.58 (s, 2 H) 6.88 - 6.93 (m, 2 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.02 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.12 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.90 (s, 1 H) 8.25 (s, 1 H) 11.79 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.15 min, MH+ 543
[a]D20 : -142.2° (c 0.3909, DMF)
SFC quiral (método SFC-C): TR 6.84 min, MH+ 543, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 174°C
Ejemplo 5 : Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 5) y separación quiral en los Enantiómeros 5A y 5B .
Figure imgf000020_0001
Síntesis del intermedio 5a:
Se añadió gota a gota cloruro de dimetilaluminio 1 M en hexano (15.7 mL, 15.7 mmol) a 0°C a una solución de 5-fluoro-6-metoxi-1 H-indol [CAS 1211595-72-0] (2 g, 12.1 mmol) en CH2Cl2 (50 mL). Después de 30 min a 0°C, se añadió lentamente una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (3.2 g, 14.6 mmol) en CH2Cl2 (50 mL) a 0°C. La reacción se agitó a 0°C durante 3 h. Se añadió agua enfriada con hielo y el precipitado se retiró por filtración, se lavó con agua y el mínimo de CH2Cl2. El sólido se secó al vacío para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(5-fluoro-6-metoxi-1 H-indol-3-il)etanona 5a (2.82 g).
Síntesis del intermedio 5b:
A 0°C, una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (3.5 g, 8.1 mmol) en THF (20 mL) se añadió gota a gota a una solución de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(5-fluoro-6-metoxi-1 H-indol-3-il)etanona 5a (2.82 g, 8.1 mmol) en THF (46 mL). La mezcla se agitó a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 4 h. El precipitado se retiró por filtración y se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó con agua. La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se recogió con el mínimo de EtOAc. El precipitado se retiró por filtración y se secó a alto vacío para dar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1 H-indol-3-il)etanona 5b (2.5 g).
Síntesis del Compuesto 5 y separación quiral de los Enantiómeros 5A y 5B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)etanona 5b (2.5 g, 5.86 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1.415 g, 7.03 mmol) y diisopropiletilamina (1.515 mL, 8.79 mmol) en CH3CN (55 mL) y THF (100 mL) se agitó a 50°C durante 10 días. Se eliminaron los disolventes a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (15-40 gm, 80 g, Fase móvil: CH2Cl2/CH3OH 99.25/0.75). Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron. El compuesto se disolvió en EtOAc y se agitó con HCl 1 N durante 15 min. Apareció un precipitado y se retiró por filtración y se secó a alto vacío para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 5 , 1.3 g) en forma de una mezcla racémica.
La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 5 se realizó mediante SFC quiral preparativa (Fase estacionaria: Chiralpak® IC 5 gm 250 x 20 mm, Fase móvil: 55% de CO2 , 45% de MeOH). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron. El primer enantiómero eluido se solidificó por trituración con heptano/diisopropiléter. Los sólidos se retiraron por filtración y se secaron al vacío para proporcionar el Enantiómero 5A (502 mg) en forma de un polvo amorfo de color blanco. El segundo enantiómero eluido se solidificó por trituración con heptano/diisopropiléter. Los sólidos se retiraron por filtración y se secaron al vacío para proporcionar el Enantiómero 5B (490 mg) en forma de un polvo amorfo de color blanco.
Compuesto 5:
1H RMN (500 MHz, DMSO-dfe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.85 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.21 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.58 (d, J=1.3 Hz, 2 H) 6.90 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.06 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.10 - 7.18 (m, 2 H) 7.34 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.82 (d, J=12.0 Hz, 1 H) 8.35 (s, 1 H) 11.98 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.01 min, MH+ 547
Punto de fusión: 182°C
Enantiómero 5A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-dfe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.85 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.21 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.58 (d, J=1.3 Hz, 2 H) 6.90 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.11 - 7.17 (m, 2 H) 7.34 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.82 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 8.35 (s, 1 H) 11.98 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.00 min, MH+ 547
[a]D20 : 136.4° (c 0.28, DMF)
SFC quiral (método SFC-B): TR 3.43 min, MH+ 547, pureza quiral 100%.
Enantiómero 5B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-dfe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.85 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.21 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.58 (d, J=1.3 Hz, 2 H) 6.90 (s, 1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.11 - 7.19 (m, 2 H) 7.34 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.82 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 8.35 (s, 1 H) 11.95 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.00 min, MH+ 547
[a]D20 : -126.3° (c 0.2755, DMF)
SFC quiral (método SFC-B): TR 4.80 min, MH+ 547, pureza quiral 98.06%.
Ejemplo 6: Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-metoxi-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 6) y separación quiral en los Enantiómeros 6A y 6B .
Figure imgf000022_0001
Síntesis del intermedio 6a:
Se añadió gota a gota cloruro de dietilaluminio 1 M en hexano (32.8 mL, 32.8 mmol) se añadió gota a gota a una solución enfriada (-30°C) de 6-metoxi-7-metil-1 H-indol [CAS 19500-05-1] (3.53 g, 21.9 mmol) en CH2Cl2 (150 mL). Después de agitar durante 15 min a -30°C, se añadió lentamente una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (6.71 g, 30.6 mmol) en CH2Cl2 (150 mL) a -30°C. La reacción se agitó a -30°C durante 1 h y se dejó calentar a temperatura ambiente mientras se agitaba durante 2 h. La mezcla de reacción se vertió en agua enfriada con hielo/sal de la Rochelle. La mezcla se filtró sobre un lecho corto de dicalite® y la torta de filtro se enjuagó varias veces con THF. Se separaron las capas. La fase acuosa se extrajo con THF. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, agua, se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El residuo sólido se suspendió en CH2Cl2 (50 mL) y los sólidos se retiraron por filtración y se lavaron con una pequeña cantidad de CH2Cl2 y se secaron al vacío a 50°C para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona 6a (6.85 g) en forma de un sólido blanquecino.
Síntesis del intermedio 6b:
A 0°C, una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (8.2 g, 21.8 mmol) en THF (150 mL) se añadió gota a gota a una solución de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona 6a (6.8 g, 19.8 mmol) en THF (250 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El precipitado se retiró por filtración y se lavó con THF. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se cristalizó en CH2Cl2. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con CH2Cl2 (2x) y se secó al vacío a 50°C para dar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona 6b (5.38 g).
Síntesis del Compuesto 6 y separación quiral de los Enantiómeros 6A y 6B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-metoxi-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona 6b (1.96 g, 4.65 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1.40 g, 6.97 mmol) y diisopropiletilamina (1.20 mL, 6.97 mmol) en CH3CN (50 mL) se calentó durante una noche a reflujo. Se eliminaron los disolventes a presión reducida. El residuo se disolvió en CH2Cl2 y se lavó con HCl 0.5 N y agua, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (Fase estacionaria: Biotage® SNAP Ultra 100 g, Fase móvil: gradiente de 0/100 a 50/50 de EtOAc:EtOH(3:1)/heptano). Las fracciones se combinaron y se evaporaron a presión reducida para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-metoxi-7-metil-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 6 , 1.0 g) en forma de una mezcla racémica.
La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 6 (1.0 g) se realizó mediante SFC quiral preparativa (Fase estacionaria: Chiralcel® Diacel OD 20 x 250 mm, Fase móvil: CO2 , EtOH que contenía 0.2% /PrNH2). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron. El primer enantiómero eluido se solidificó por trituración con una mezcla de MeOH/agua (1/1). Los sólidos se retiraron por filtración y se secaron al vacío a 50°C para proporcionar el Enantiómero 6A (368 mg) en forma de un polvo amorfo de color blanco. El segundo enantiómero eluido se solidificó por trituración con una mezcla de MeOH/agua (1/1). Los sólidos se retiraron por filtración y se secaron al vacío a 50°C para proporcionar el Enantiómero 6B (303 mg) en forma de un polvo amorfo de color blanco.
E nantiómero 6A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-ds ) 5 ppm 2.29 (s, 3 H) 3.10 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.80 (s, 3 H) 4.02 (s, 3 H) 6.24 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.56 - 6.59 (m, 1 H) 6.59 - 6.62 (m, 1 H) 6.92 (t, J=1.6 Hz, 1 H) 6.93 - 6.99 (m, 2 H) 7.06 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.94 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.35 (s, 1 H) 11.91 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 1.18 min, MH+ 543
[a]D20 : 122.9° (c 0.48, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 4.15 min MH+ 543, pureza quiral 100%.
Enantiómero 6B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-ds ) 5 ppm 2.29 (s, 3 H) 3.10 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.80 (s, 3 H) 4.02 (s, 3 H) 6.24 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.57 - 6.59 (m, 1 H) 6.59 - 6.62 (m, 1 H) 6.92 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.93 - 7.00 (m, 2 H) 7.06 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.94 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.35 (d, J=2.2 Hz, 1 H) 11.91 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.22 min, MH+ 543
[a]D20 : -120.6° (c 0.2755, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 4.50 min, MH+ 543, pureza quiral 99.35%.
Ejemplo_____ 7: Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 7) y separación quiral en los Enantiómeros 7A y 7B .
Figure imgf000023_0001
Una solución de 6-fluoro-5-metil-1 H-indol [CAS 162100-95-0] (1.7 g, 11.4 mmol) en CH2Cl2 (100 mL) se enfrió a 0°C en una atmósfera de N2. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de dietilaluminio 1 M en hexano (17.1 mL, 17.1 mmol) y la mezcla resultante se mantuvo a 0°C durante 15 min. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (3.50 g, 16 mmol) en CH2Cl2 (50 mL). Se continuó agitando a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se vertió en una solución en agitación de hielo/sal de la Rochelle. Después de haberse fundido el hielo, la mezcla se filtró sobre dicalite® y la torta de filtro se lavó varias veces con THF. Los filtrados se combinaron. Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo sólido se suspendió en CH2Cl2 (30 mL), el precipitado se retiró por filtración y se secó al vacío a 50°C para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 7a (2.76 g).
Síntesis del intermedio 7b:
Una solución en agitación de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-fluoro-5-metil-1 H-indol-3-il)etanona 7a (2.76 g, 8.32 mmol) en THF (350 mL) se enfrió a 0 °C. Se añadió gota a gota una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207 56-1] (3.44 g, 9.15 mmol) en THF (50 mL). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 2 h y a temperatura ambiente durante 2 h. Los sólidos se retiraron por filtración y se lavaron con THF. Los filtrados combinados se evaporaron a presión reducida. El residuo se mezcló con EtOAc (50 mL). Los sólidos se aislaron por filtración, se lavaron con una pequeña cantidad de EtOAc y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1 H-indol-3-il)etanona 7b (3.21 g) en forma de un sólido de color blanco, que se usó si purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis del Compuesto 7 y separación quiral de los Enantiómeros 7A y 7B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 7b (1.6 g, 3.90 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1.18 g, 5.84 mmol) y diisopropiletilamina (671 pL, 3.90 mmol) en CH3CN (100 mL) se agitó durante una noche a 85 °C. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en CH2CL (100 mL), se lavó con HCl 1 N (100 mL) y agua (100 mL), se secó sobre MgSO4 , se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (Fase estacionaria: sílice Grace Reveleris® 120 g, Fase móvil: gradiente de 0/100 a 50/50 de EtOAc:EtOH(3:1)/heptano). Las fracciones deseadas se combinaron y evaporaron a presión reducida. El residuo se precipitó en CH2Cl2/heptano. Los sólidos se aislaron por filtración y se lavaron con CH2Cl2/heptano (1/1). El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa (Fase estacionaria: Uptisphere® C18 ODB - 10 pm, 200 g, 5 cm, Fase móvil: solución de NH4HCO3 al 0.25% en agua, CH3CN). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron a presión reducida. El residuo sólido se mezcló con EtOAc (20 mL) y los sólidos se aislaron por filtración y se lavó con una pequeña cantidad de EtOAc para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(6-fluoro-5-metil-1 H-indol-3-il)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Compuesto 7, 341 mg) en forma de una mezcla racémica. El filtrado se evaporó a presión reducida y el residuo se recogió con MeOH. Después de agitar durante 30 min, los sólido se aislaron por filtración para proporcionar un segundo cultivo del Compuesto 7 (92 mg).
La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 7 (402 mg) se realizó mediante separación quiral de fase normal (Fase estacionaria: (S,S)-Whelk-O1, Fase móvil: 100% de metanol). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron para proporcionar el Enantiómero 7A como el primer producto eluido y el Enantiómero 7B como se segundo producto eluido. El Enantiómero 7A se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (Fase estacionaria: Sílice Grace Reveleris® sílice 12 g, Fase móvil: de 100/0/0 a 40/45/15 de heptano/EtOAc/EtOH). Las fracciones deseadas se combinaron y evaporaron a presión reducida. El residuo se trituró con H2O (1.75 mL) y MeOH (0.75 mL). Los sólidos se retiraron por filtración, se lavaron (2x) con H2O/MeOH 7/3, y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar el Enantiómero 7A (48 mg). El Enantiómero 7B se purificó adicionalmente por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (Fase estacionaria: Sílice Grace Reveleris® sílice 12 g, Fase móvil: de 100/0/0 a 40/45/15 de heptano/EtOAc/EtOH). Las fracciones deseadas se combinaron y evaporaron a presión reducida. El residuo se trituró con H2O (1.75 mL) y MeOH (0.75 mL). Los sólidos se retiraron por filtración, se lavaron (2x) con H2O/MeOH 7/3, y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar el Enantiómero 7B (43 mg).
Compuesto 7:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 2.30 (d, J=0.9 Hz, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.22 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.54 - 6.63 (m, 2 H) 6.92 (t, J=1.5 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.3, 1.9 Hz, 1 H) 7.01 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.12 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.22 (d, J=10.2 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 8.37 (s, 1 H) 11.97 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.19 min, MH+ 531
Enantiómero 7A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 2.30 (d, J=1.5 Hz, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.22 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.56 - 6.60 (m, 2 H) 6.91 (t, J=1.7 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.3, 2.1 Hz, 1 H) 7.01 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.12 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.22 (d, J=10.1 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 8.37 (s, 1 H) 11.96 (s, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.15 min, MH+ 531
[a]D20: -163.2° (c 0.435, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 4.26 min, MH+ 531, pureza quiral 100%.
Enantiómero 7B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 2.30 (d, J=1.5 Hz, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.22 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.57 - 6.61 (m, 2 H) 6.92 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.1,2.0 Hz, 1 H) 7.01 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.12 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.22 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 8.37 (d, J=2.4 Hz, 1 H) 11.97 (s, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.15 min, MH+ 531
[a]D20 : 166.6° (c 0.5, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.78 min, MH+ 531, pureza quiral 100%.
Ejemplo 8: síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(5-(trifluorometil)-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 8) y separación quiral en los Enantiómeros 8A y 8B .
Figure imgf000025_0001
Síntesis del intermedio 8a:
A 0 °C, en un flujo de N2, se añadió en porciones hidruro sódico (2.48 g, 64.8 mmol) a una mezcla de 5-(trifluorometil)-1H-indol [CAS 100846-24-0] (10 g, 54.0 mmol) en DMF (150 mL) y la mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 30 min. Se añadió en porciones una solución de cloruro de tosilo (11.3 g, 59.4 mmol) en DMF (50 mL) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. A 0 °C, la mezcla se inactivó mediante la adición de agua. El precipitado se retiró por filtración y se secó durante una noche al vacío a 70 °C para dar 1-tosil-5-(trifluorometil)-1H-indol 8a (18.4 g).
Síntesis del intermedio 8b:
Se añadió gota a gota cloruro de titanio (IV) (2.4 mL, 21.9 mmol), a temperatura ambiente, a una solución de 1 -tosil-5-(trifluorometil)-1 H-indol 8a (3.7 g, 10.95 mmol) y cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (4.8 g, 21.9 mmol, síntesis: véase el Ejemplo 1) en 1,2-dicloroetano (120 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se añadió agua enfriada con hielo. Se extrajo la mezcla de reacción con EtOAc. La fase orgánica se secó sobre MgSÜ4, se filtró y el disolvente se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 pm, 80 g, Fase móvil: 99.5/0.5 de CH2Cl2/MeOH). Las fracciones que contenían el Compuesto 8b se combinaron y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se recogió con CHaCN/diisopropiléter. El precipitado se retiró por filtración y se secó para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(1-tosil-5-(trifluorometil)-1 H-indol-3-il)etanona 8b (2.8 g).
Síntesis del intermedio 8c:
Se añadió hidróxido de litio (0.64 g, 15.3 mmol) a una solución de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(1-tosil-5-(trifluorometil)-1 H-indol-3-il)etanona 8b (3.2 g, 6.13 mmol) en THF (18 mL) y agua (6 mL). La mezcla se agitó a 30 °C durante 1 h. Se añadieron agua y EtOAc. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a presión reducida. El sólido se recogió con diisopropiléter. El precipitado se retiró por filtración y se secó para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(5-(trifluorometil)-1 H-indol-3-il)etanona 8c (2.1 g).
Síntesis del intermedio 8d:
A 0 °C, una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (2.1 g, 5.7 mmol) en THF (60 mL) se añadió gota a gota a una mezcla de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanona 8c (2.15 g, 5.7 mmol) en THF (60 mL). La mezcla se agitó a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 4 h. El precipitado se retiró por filtración y se lavó con EtOAc. Los filtrados combinados se concentraron a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre MgSO4 , se filtró y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se recogió con diisopropiléter. El precipitado se retiró por filtración y se secó para dar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanona 8d (2.5 g).
Síntesis del Compuesto 8 y separación quiral en los Enantiómeros 8A y 8B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanona 8d (1 g, 2.24 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (496 mg, 2.46 mmol) y diisopropiletilamina (0.38 mL, 2.24 mmol) en CH3CN (50 mL) y THF (25 mL) se agitó a 70 °C durante 24 h. La solución se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc y la solución se lavó con HCl 1 N. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 , se filtró y del disolvente se evaporó a presión reducida. El compuesto se cristalizó en diisopropiléter/CHaCN para dar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(5-(trifluorometil)-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 8 , 310 mg) en forma de una mezcla racémica.
Los enantiómeros del Compuesto 8 se separaron mediante SFC quiral preparativa (Fase estacionaria: Chiralpak® AD-H 5 gm 250 x 20 mm, Fase móvil: 70% de CO2 , 30% de /PrOH 0.3% de /PrNH2) para dar, después de cristalización en éter de petróleo/diisopropiléter, 122 mg del primer Enantiómero 8A eluido y 128 mg del segundo Enantiómero 8B eluido.
Compuesto 8:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.29 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.56 - 6.62 (m, 2 H) 6.92 (s, 1 H) 6.98 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.54 (dd, J=8.5, 1.6 Hz, 1 H) 7.69 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.48 (s, 1 H) 8.61 (s, 1 H) 12.45 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.19 min, MH+ 567
Punto de fusión: 168°C
Enantiómero 8A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds ) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.29 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.60 (s a, 2 H) 6.92 (s, 1 H) 6.98 (dd, J=8.3, 1.8 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.54 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.69 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 8.49 (s, 1 H) 8.60 (s, 1 H) 12.41 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.25 min, MH+ 567
[a]D20 : -119.2° (c 0.2727, DMF)
SFC quiral (método SFC-F): TR 2.64 min, MH+ 567, pureza quiral 100%.
Enantiómero 8B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.29 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.60 (s, 2 H) 6.92 (s, 1 H) 6.98 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 7.54 (dd, J=8.6, 1.5 Hz, 1 H) 7.69 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 8.49 (s, 1 H) 8.60 (s, 1 H) 12.40 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-C): TR 3.25 min, MH+ 567
[a]D20 : 125.1° (c 0.2455, DMF)
SFC quiral (método SFC-F): TR 3.44 min, MH+ 567, pureza quiral 100%.
Ejemplo 9 : Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 9) y separación quiral en los Enantiómeros 9A y 9B .
Figure imgf000027_0001
Síntesis del intermedio 9a:
Una solución de 5-(trifluorometoxi)-1 H-indol [CAS 262593-63-5] (3 g, 14.9 mmol) en CH2CI2 (150 mL) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de N2. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de dietilaluminio 1 M en hexano (22.4 mL, 22.4 mmol) y la mezcla resultante se mantuvo a 0°C durante 15 min. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (4.57 g, 20.9 mmol) en CH2Cl2 (100 mL). Se continuó agitando a 0 °C durante 1 h y posteriormente la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se vertió en una solución en agitación de hielo/sal de la Rochelle. Después de haberse fundido el hielo, la mezcla se filtró sobre dicalite® y la torta de filtro se lavó varias veces con THF. Los filtrados se combinaron. Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se trituró con CH2Cl2 (50 mL). El precipitado resultante se retiró por filtración y se secó al vacío a 50 °C para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona 9a (4.39 g).
Síntesis del intermedio 9b:
Una solución en agitación de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona 9a (4.39 g, 11.4 mmol) en THF (200 mL) se enfrió a 0°C. Se añadió gota a gota una solución de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (4.73 g, 12.6 mmol) en THF (100 mL). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Los sólidos se retiraron por filtración y se lavaron con THF. Los filtrados combinados se evaporaron a presión reducida. El residuo se mezcló con EtOAc (30 mL). Los sólidos se aislaron por filtración, se lavaron con una pequeña cantidad de EtOAc y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona 9b (5.0 g) en forma de un sólido de color blanco, que se usó si purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis del Compuesto 9 y separación quiral de los Enantiómeros 9A y 9B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1 -(5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona 9b (2.5 g, 5.40 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1.49 g, 7.38 mmol) y diisopropiletilamina (931 pL, 5.40 mmol) en CH3CN (100 mL) se agitó durante una noche a 90°C. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en CH2Cl2 (100 mL), se lavó con HCl 1 N (100 mL) y agua (100 mL), se secó sobre MgSO4 , se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (Fase estacionaria: sílice Grace Reveleris® 120 g, Fase móvil: gradiente de 0/100 a 50/50 de EtOAc:EtOH(3:1)/heptano). Las fracciones deseadas se combinaron y evaporaron a presión reducida. El residuo se precipitó en EtOAc (10 mL) mientras se agitaba. Los sólidos se aislaron por filtración y se lavaron con una pequeña cantidad de EtOAc para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona (Compuesto 9 , 477 mg) en forma de una mezcla racémica. El filtrado se evaporó a presión reducida y el residuo se recogió con EtOAc (5 mL). Después de agitar durante una noche, los sólidos se aislaron por filtración y se lavaron con EtOAc para proporcionar un segundo cultivo del Compuesto 9 (216 mg).
La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 9 (663 mg) se realizó mediante separación quiral de fase normal (Fase estacionaria: AS 20 pm, Fase móvil: 100% de metanol). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron para proporcionar el Enantiómero 9A como el primer producto eluido y el Enantiómero 9B como el segundo producto eluido. El Enantiómero 9A se agitó en H2O (2 mL) y MeOH (3 mL) a 40 °C. Los sólidos se retiraron por filtración, se lavaron (3x) con 1/1 de H2O/MeOH y se secaron al vacío a 45 °C para proporcionar el Enantiómero 9A (151 mg). El Enantiómero 9B se purificó adicionalmente por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (Fase estacionaria: Sílice Grace Reveleris® sílice 12 g, Fase móvil: de 100/0/0 a 40/45/15 de heptano/EtOAc/EtOH). Las fracciones deseadas se combinaron, se evaporaron a presión reducida y se co-evaporaron con EtOAc. El residuo se agitó en MeOH (5 mL) y se precipitó mediante adición lenta de H2 O (4 mL). Los sólidos se retiraron por filtración, se lavaron (3x) con H2O/MeOH 1/1 y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar el Enantiómero 9B (132 mg).
Compuesto 9:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds ) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.26 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.57 - 6.62 (m, 2 H) 6.91 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 6.98 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.22 (dd, J=8.6, 2.2 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.59 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.06 (d, J=0.9 Hz, 1 H) 8.55 (s, 1 H) 12.28 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.31 min, MH+ 583
Enantiómero 9A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds ) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.26 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.55 - 6.62 (m, 2 H) 6.91 (t, J=1.5 Hz, 1 H) 6.98 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.21 (dd, J=8.8, 1.8 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.59 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=0.9 Hz, 1 H) 8.55 (s, 1 H) 12.29 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.20 min, MH+ 583
[a]D20 : 130.3° (c 0.555, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.10 min, MH+ 583, pureza quiral 100%.
Enantiómero 9B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.26 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.56 - 6.62 (m, 2 H) 6.92 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 6.98 (dd, J=8.1,2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.22 (dd, J=8.8, 1.8 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.59 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=0.9 Hz, 1 H) 8.55 (s, 1 H) 12.30 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.20 min, MH+ 583
[a]D20 : -133.2° (c 0.5, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.50 min, MH+ 583, pureza quiral 100%.
Ejemplo 10: Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 10) y separación quiral en Enantiómero 10A y 10B.
Síntesis del intermedio 10a:
A una solución enfriada (-15 °C) de 3-metoxi-4-(trifluorometoxi)benzaldehído [CAS 853771-90-1] (50 g, 230 mmol) y azidoacetato de etilo (89 g, 690 mmol) en EtOH (400 mL) se añadió gota a gota, durante un periodo de 2 h, una solución de NaOEt (0.69 mol, preparada a partir de 15.9 g de Na y 700 mL de EtOH). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Después de enfriar en un baño de hielo, la reacción se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl (1.2 L) y se agitó durante 10 min. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con agua y se agitó para dar 2-azido-3-(3-metoxi-4-(trifluorometoxi)fenil)acrilato de (Z)-etilo 10a (32 g) en forma de un sólido amarillento.
Síntesis del intermedio 10b:
Una solución de 2-azido-3-(3-metoxi-4-(trifluorometoxi)fenil)acrilato de (Z)-etilo 10a (3 g, 10 mmol) en xileno (40 mL) se calentó a reflujo durante una noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, el disolvente se evaporó a sequedad. El residuo se trituró con hexano (50 mL) y el precipitado se retiró por filtración para proporcionar 6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-2-carboxilato de metilo 10b (rendimiento: 1.4-1.6 g) en forma de un sólido de color amarillo.
Síntesis del intermedio 10c:
A una mezcla de 6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-2-carboxilato de metilo 10b (25 g, 87 mmol) en MeOH/H2O (2/1, 300 mL) se añadió NaOH (7 g, 175 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo hasta que se obtuvo una solución transparente. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mayoría del metanol se retiró a presión reducida y la solución acuosa restante se acidificó con HCl conc. a pH 3-4. El producto se extrajo con EtOAc (2x 250 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron y se evaporaron a presión reducida para dar ácido 6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-2-carboxílico 10c (22.7 g) en forma de un sólido de color gris.
Síntesis del intermedio 10d:
Una suspensión de ácido 6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-2-carboxílico 10c (7.5 g, 27 mmol) y Cu (1.22 g, 0.7 equiv.) en quinolina (150 mL) se calentó a 220-230 °C en una atmósfera inerte durante 12 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con metil ferc-butil éter (MTBE, 400 mL) y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHSO4 (2x 500 mL). La fase orgánica se secó sobre MgSO4 , se filtró a través de un lecho corto de gel de sílice y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna para proporcionar 6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol 10d (3.75 g) en forma de un sólido de color amarillo.
Síntesis del intermedio 10e:
Una solución de 6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol 10d (1.61 g, 6.96 mmol) en CH2Cl2 (150 mL) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de N2. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de dietilaluminio 1 M en hexano (10.4 mL, 10.4 mmol) y la mezcla resultante se mantuvo a 0°C durante 30 min. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (2.28 g, 10.4 mmol) en CH2Cl2 (75 mL). Se continuó agitando a 0 °C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se añadió gota a gota una solución de tetrahidrato de tartrato potásico (sal de la Rochelle, 3.93 g, 13.9 mmol) en agua (6 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min a 0 °C. Se añadió THF (200 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. Se añadió Na2SO4 (25g), la mezcla se agitó durante una noche, se filtró sobre dicalite® y la torta de filtro se lavó varias veces con THF (4 x 150 mL). Los filtrados e combinaron y se evaporaron a presión reducida. El residuo sólido se agitó en una mezcla de diisopropil éter (25 mL) y EtOAc (2 mL). Los sólidos se retiraron por filtración, se lavaron con DIPE (3x) y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona 10e (3.6 g).
Síntesis del intermedio 10f:
Una solución en agitación de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona 10e (3.6 g, 6.53 mmol) en THF (130 mL) se enfrió a 0 °C, en una atmósfera de N2. Se añadió tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1 ] (2.58 g, 6.85 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 45 min y a temperatura ambiente durante 1.5 h. Los sólidos se retiraron por filtración y se lavaron con THF (2x). Los filtrados combinados se evaporaron a presión reducida para proporcionar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona 10f (4.16 g), que se usó si purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis del Compuesto 10 y separación quiral de los Enantiómeros 10A y 10B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona 10f (4.16 g, 6.50 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2.62 g, 13.0 mmol) y diisopropiletilamina (2.24 mL, 13.0 mmol) en CH3CN se agitó a temperatura ambiente durante 2 días en una atmósfera de N2. Se añadió agua (250 mL) y el producto se extrajo con Et2O (2x). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (Fase estacionaria: sílice Grace Reveleris® 100 g, Fase móvil: gradiente de 100/0/0 a 40/45/15 de heptano/EtOAc/EtOH). Las fracciones deseadas se combinaron y evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa (Fase estacionaria: RP XBridge® Prep C18 OBD - 10 pm, 50 x 150 mm, Fase móvil: solución de NH4HCO3 al 0.25% en agua, CH3CN). Las fracciones deseadas se combinaron y evaporaron a presión reducida. El residuo, que contenía 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoxi-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona racémica (Compuesto 10, 380 mg), se sometió a separación quiral mediante SFC preparativa (Fase estacionaria: Chiralpak® Diacel AS 20 x 250 mm, Fase móvil: CO2 , EtOH 0.4% de iPrNH2). Las fracciones de producto se combinaron, se evaporaron a presión reducida y se co-evaporaron con MeOH para proporcionar el Enantiómero 10A como el primer producto eluido y el Enantiómero 10B como el segundo producto eluido. Ambos enantiómeros se precipitaron en una mezcla de disolventes de MeOH y agua, se retiraron por filtración y se secaron a 50 °C al vacío para proporcionar el Enantiómero 10A (135 mg) y el Enantiómero 10B (144 mg).
Enantiómero 10A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.87 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.22 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.55 - 6.59 (m, 2 H) 6.88 - 6.91 (m, 1 H) 6.98 (dd, J=8.1, 1.8 Hz, 1 H) 7.08 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.2 Hz, 1 H) 7.21 (s, 1 H) 7.34 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 12.05 (s a, 1 H)
LC/MS (método método LC-A): TR 1.20 min, MH+ 613
[a]D20 : 81.4° (c 0.29, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.34 min, MH+ 613, pureza quiral 100%.
Enantiómero 10B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-dfe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.87 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.22 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.55 - 6.60 (m, 2 H) 6.90 (t, J=1.6 Hz, 1 H) 6.98 (dd, J=8.2, 2.0 Hz, 1 H) 7.08 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.2 Hz, 1 H) 7.21 (s, 1 H) 7.34 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=1.1 Hz, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 12.08 (s a, 1 H)
LC/MS (método método LC-A): TR 1.20 min, MH+ 613
[a]D20 : -99.6° (c 0.261, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.69 min, MH+ 613, pureza quiral 100%.
Ejemplo 11: Síntesis de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(7-metil-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona (Compuesto 11) y separación quiral en los Enantiómeros 11A y 11B.
Figure imgf000030_0001
del intermedio 11a:
Una mezcla de cloruro de boro (III) 1 M en CH2Cl2 (25.5 mL, 25.5 mmol) y cloruro de aluminio (III) (3.40 g, 25.5 mmol) se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y se enfrió en un baño de hielo en una atmósfera de N2. Se añadió gota a gota una solución de 2-metil-4-(trifluorometoxi)anilina [CAS 86256-59-9] (4.88 g, 25.5 mmol) y cloroacetonitrilo (3.24 mL, 51.0 mmol) en CH2Cl2 (7.5 mL). Después de la adición, el baño de hielo se retiró y la mezcla se calentó a reflujo durante 8 h. La mezcla se enfrió de nuevo a 0 °C usando un baño de hielo. Se añadió gota a gota HCl 2 N (75 mL), provocando una precipitación pesada. La suspensión resultante se calentó a reflujo durante 90 min, y se enfrió a temperatura ambiente. Los sólidos se retiraron por filtración. La torta de filtro se lavó con CH2Cl2 (4x). Los filtrados se combinaron y las fases se separaron. La fase orgánica se aisló, se lavó con una solución acuosa de NaHCÜ3, se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (Fase estacionaria: Biotage® Sn A p Ultra Silica 100 g, Fase móvil: gradiente de 100/0 a 0/100 de heptano/CH2Ch). Las fracciones deseadas se combinaron y se concentraron a un volumen residual de 30 mL. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con heptano y CH2Cl2, y se secó al vacío a 50°C para proporcionar 1-(2-amino-3-metil-5-(trifluorometoxi)fenil)-2-cloroetanona 11a (1.37 g). El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo sólido se agitó en una mezcla de heptano (20 mL) y diisopropil éter (3 mL), se retiró por filtración, se lavó con heptano (3x) y se secó al vacío a 50 °C para proporcionar una segunda fracción de 11a (0.24 g).
Síntesis del intermedio 11b:
Se añadió borohidruro sódico (326 mg, 8.61 mmol) a una solución en agitación de 1-(2-amino-3-metil-5-(trifluorometoxi)fenil)-2-cloroetanona 11a (1.92 g, 7.17 mmol) en ferc-butanol (50 mL) y agua (5 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y a 90 °C durante 2.5 h. Se añadió agua (50 mL) y el producto se extrajo con éter dietílico (2x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSÜ4, se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (Fase estacionaria: Sílice Biotage® SNAP Ultra 25 g, Fase móvil: gradiente de 100/0 a 20/80 de heptano/EtOAc). Las fracciones deseadas se combinaron, se concentraron a presión reducida, se co-evaporaron con heptano y se secaron al vacío a 50 °C para proporcionar 7-metil-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol 11b (1.2 g).
Síntesis del intermedio 11c:
Una solución agitada mecánicamente de 7-metil-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol 11b (1.5 g, 6.97 mmol) en CH2Cl2 (100 mL) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de N2. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de dietilaluminio 1 M en hexano (10.5 mL, 10.5 mmol) y la mezcla resultante se mantuvo a 0 °C durante 25 min. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo 1a (2.29 g, 10.5 mmol) en CH2Cl2 (40 mL) mientras se mantenía la temperatura de reacción por debajo de 6 °C. Se continuó agitando a 0 °C durante 1 h y posteriormente la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió gota a gota una solución de sal de la Rochelle [CAS 6100-16-9] (3.94 g, 13.9 mmol) en agua (4 mL). Después de agitar durante 1 h, la mezcla de reacción se filtró sobre dicalite® y la torta de filtro se lavó con THF (5x 100 mL). Los filtrados combinados se evaporaron a presión reducida. El residuo se solidificó después de reposar durante una noche. Los sólidos se agitaron en CH3CN (5 mL), se retiraron por filtración, se lavaron con CH3CN (3x 1.5 mL) y se secaron al vacío a 50°C para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona 11c (1.9 g).
Síntesis del intermedio 11d:
Una solución agitada de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona 11c (2.13 g, 5.35 mmol) en THF (80 mL) se enfrió a 0 °C, en una atmósfera de N2. Se añadió tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (2.11 g, 5.62 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 40 min y a temperatura ambiente durante 2 h. Los sólidos se retiraron por filtración y se lavaron con THF (2x). Los filtrados combinados se evaporaron a presión reducida para proporcionar 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoxi)-1H-indol-3-il)etanona 11d (3.45 g), que se usó si purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis del Compuesto 11 y separación quiral de los Enantiómeros 11A y 11B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-cloro-2-metoxifenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona 11d (3.45 g, 6.87 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2.76 g, 13.7 mmol) y diisopropiletilamina (2.37 mL, 13.7 mmol) en CH3CN (60 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 2 días en una atmósfera de N2. Se añadió agua (125 mL) y el producto se extrajo con Et2O (2x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (Fase estacionaria: RP XBridge® Prep C18 OBD - 10 gm, 50 x 150 mm, Fase móvil: solución de NH4HCO3 al 0.25% en agua, CH3CN). Las fracciones que contenían producto se combinaron y se evaporaron a presión reducida para proporcionar 2-(4-cloro-2-metoxifenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(7-metil-5-(trifluorometoxi)-1 H-indol-3-il)etanona racémica (Compuesto 11, 1.74 g). La separación quiral de los enantiómeros del Compuesto 11 (1.74 g) se realizó mediante SFC preparativa(Fase estacionaria: Chiralpak® Diacel AS 20 x 250 mm, Fase móvil: CO2 , EtOH 0.4% de iPrNH2). Las fracciones de producto se combinaron y se evaporaron a presión reducida para proporcionar el Enantiómero 11A como el primer producto eluido y el Enantiómero 11B como el segundo producto eluido. Ambos enantiómeros se precipitaron en una mezcla de disolventes de MeOH y agua, se retiraron por filtración y se secaron a 50 °C al vacío para proporcionar el Enantiómero 11A (777 mg) y el Enantiómero 11B (712 mg).
Enantiómero 11A:
1H RMN (600 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 2.50 (s, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.28 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.56 - 6.63 (m, 2 H) 6.92 (s a, 1 H) 6.97 (dd, J=8.4, 1.9 Hz, 1 H) 7.05 (s a, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.90 (s a, 1 H) 8.53 (s, 1 H) 12.41 (s a, 1 H)
LC/MS (método método LC-A): TR 1.26 min, MH+ 597
[a]D20: 81.3° (c 0.3455, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 2.96 min, MH+ 597, pureza quiral 100%.
Enantiómero 11B:
1H RMN (600 MHz, DMSO-cfe) 5 ppm 2.51 (s, 3 H) 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 4.00 (s, 3 H) 6.28 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.58 - 6.60 (m, 2 H) 6.92 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.4, 1.9 Hz, 1 H) 7.05 (s a, 1 H) 7.06 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.1 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.89 (s a, 1 H) 8.53 (s, 1 H) 12.37 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 1.26 min, MH+ 597
[a]D20: -87.4° (c 0.342, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.44 min, MH+ 597, pureza quiral 100%.
ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN
Ensayo antiviral de DENV-2
La actividad antiviral de todos los compuestos de la invención se ensayó frente a la cepa 16681 de DENV-2, que se marcó con proteína fluorescente de color verde potenciado (eGPF; Tabla 1). El medio de cultivo consiste en un medio esencial mínimo complementado con 2% de suero bovino fetal inactivado con calor, 0.04% de gentamicina (50 mg/mL) y 2 mM de L-glutamina. Se suspendieron células vero, obtenidas de ECACC, en el medio de cultivo y se añadieron 25 pL a placas de 384 pocillos (2500 células/pocillo), que todavía contenían los compuestos antivirales. Típicamente, estas placas contienen diluciones en serie con un factor de 5, de 9 etapas de dilución del compuesto de ensayo a 200 veces la concentración final en DMSO a 100% (200 nL). Además, cada concentración de compuesto se ensaya por cuadruplicado (intervalo de concentración final: 25 pM - 0.000064 pM o 2.5 pM - 0.0000064 pM para los compuestos más activos). Finalmente, cada placa contiene pocillos que están asignados como controles de virus (que contienen células y virus en ausencia del compuesto), controles de células (que contienen células en ausencia de virus y compuesto) y controles de medio (que contiene medio en ausencia de células, virus y compuestos). A los pocillos asignados como control de medio, se añadieron 25 pL de medio de cultivo en lugar de células Vero. Una vez que se añadieron las células a las placas, la placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se distribuyeran de manera homogénea dentro de los pocillos. A continuación, las placas se incubaron (37 °C, 5% de CO2) hasta el día siguiente. Después, se añadió la cepa 16681 de DENV-2, marcada con eGFP, a una multipicidad de infección (MOI) de 0.5. Por lo tanto, se añadieron 15 pL de suspensión de virus a todos los pocillos que contenían compuestos de ensayo y a los pocillos asignados como control de virus. En paralelo, se añadieron 15 pL de medio de cultivo a controles de medio y de célula. A continuación, las placas se incubaron durante 3 días en un un incubador totalmente humidificado (37 °C, 5% de CO2). El día de la lectura, la fluorescencia de eGFP se midió usando un microscopio de fluorescencia automatizado a 488 nm (láser azul). Usando un sistema de LIMS propio, se calcularon las curvas de respuesta a la dosis de inhibición para cada compuesto y se determinó la concentración eficaz que produce la mitad del efecto máximo (CE50). Por lo tanto, la inhibición porcentual (I) para cada concentración de ensayo se calcula usando la siguiente fórmula: I = 100*(St -Sc c )/(Sv c -Sc c ); St , Sc c y Sv c son las cantidades de señal de eGFP en los pocillos de compuesto de ensayo, control de célula y control de virus, respectivamente. El CE50 representa la concentración de un compuesto en el que se inhibe la replicación del virus en un 50%, según se mide como una reducción del 50% de la intensidad de fluorescencia de eGFP en comparación con el control de virus. El CE50 se calcula usando una interpolación lineal lineal.
En paralelo, se ensaya la toxicidad de los compuestos sobre las mismas placas. Una vez que se realiza la lectura de la señal de eGFP, se añaden 40 pL de ATPlite, un tinte de viabilidad celular, a todos los pocillos de las placas de 384 pocillos. ATP está presente en todas las células metabólicamente activas y la concentración se reduce muy rápidamente cuando las células experimentan necrosis o apoptosis. El sistema de ensayo ATPLite se basa en la producción de luz provocada por la reacción de ATP con adición de luciferasa y D-luciferina. Las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se midieron en un ViewLux. También se determinó la mitad de la concentración citotóxica máxima (CC50), definida como la concentración requerida para reducir la señal de luminiscencia en un 50% en comparación con la de los pocillos de control celular. Finalmente, se determinó el índice de selectividad (SI) para los compuestos, que se calculó de la siguiente manera: SI = CC50/CE50.
Tabla 1: CEso. CCso y SI para los compuestos de la invención en los ensayos antivirales de DENV-2
compuesto# EC50 (uM) N CC5 0 (uM) N SI
1 0.00052 5 5.5 4 11500
1A 0.00026 8 4.3 8 19700
1B 0.012 6 6.5 6 530
2 0.00060 4 5.0 4 8410
2A 0.00026 4 4.8 4 22000
2B 0.026 4 7.4 4 285
3 0.00058 4 >11 6 37700
3A 0.00025 5 7.2 5 29800
3B 0.0038 3 >9.7 5 2480
4 0.00039 4 5.9 4 14900
4A 0.00027 11 4.2 13 16900
4B 0.036 5 12 5 341
5 0.00062 4 5.5 4 8780
5A 0.00041 5 5.0 5 12900
5B 0.068 4 13 4 206
6A 0.000068 8 >25 8 >65500
6B 0.019 4 11 4 603
7 0.00047 4 3.2 3 >7040
7A 0.013 3 6.8 3 538
7B 0.00020 5 3.2 5 18500
8 0.00013 6 2.9 7 30400
8A 0.0030 3 7.4 3 2510
8B 0.000069 5 3.4 5 >40900
9 0.000074 6 3.1 8 >39100
9A 0.000067 9 2.9 9 >37500
9B 0.0038 5 6.2 6 1480
10A 0.00012 3 2.6 3 22600
10B 0.0039 3 9.8 3 2530
11A 0.000085 3 2.6 3 30100
11B 0.0041 3 9.2 3 2220
N = el número de experimentos independientes en los que se ensayaron los compuestos.
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Ensayo de transcriptasa inversa tetravalente-PCR cuantitativa(RT-qPCR): Protocolo A.
La actividad antiviral de los compuestos de la invención se ensayó frente a la cepa TC974#666 de DENV-1 (NCPV; Tabla 6), la cepa 16681 de DENV-2 (Tabla 7), la cepa H87 de DENV-3 (NCPV; Tabla 8) y las cepas H241 de DENV-4 (NCPV; Tabla 9A) y SG/06K2270DK1/2005 (Eden; Tabla 9B) en un ensayo RT-qPCR. Por lo tanto, se infectaron células Vero tanto con DENV-1 como -2, o -3, o -4 en presencia o ausencia de compuestos de ensayo. A día 3 después de la infección, las células se lisaron y los lisatos celulares se usaron para preparar ADNc de una diana viral (la 3’UTR de DENV; Tabla 2) y un gen de referencia celular (p-actina, Tabla 2). Posteriormente, se realizó una PCR híbrida en tiempo real en un instrumento Lightcycler480. EL valor de Cp generado es inversamente proporcional a la cantidad de expresión de ARN de estas dianas. La inhibición de la replicación de DENV por el compuesto de ensayo da como resultado un desplazamiento de Cp para el gen 3’UTR. Por otra parte, si un compuesto de ensayo es tóxico para las células, se observará un efecto similar en la expresión de p-actina. El método de AACp comparativo se usa para calcular CEso, que se basa en la expresión de gen relativa del gel diana (3’UTR) normalizada con el gen constitutivo celular (p-actina).
Tabla 2: Cebadores y sondas usadas para la RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
Cebador/sonda Diana Secuencia^ b
F3utr258 DENV 3’-UTR 5'-CGGTTAGAGGAGACCCCTC-3'
R3utr425 DENV 3’-UTR
Figure imgf000033_0002
5'-GAGACAGCAGGATCTCTGGTC-3'
P3utr343 DENV 3’-UTR F4M -5'-AAGGACTAG-ZEN-AGGTTAGAGGAGACCCCCC-3'-MB#FQ
Factin743 p-actina 5'-GGCCAGGTCATCACCATT-3'
Ractin876
Figure imgf000033_0004
p-actina
Figure imgf000033_0005
5'-ATGTCCACGTCACACTTCATG-3'
Figure imgf000033_0003
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El medio de cultivo consistió en un medio esencial mínimo complementado con 2% de suero bovino fetal inactivado con calor, 0.04 % de gentamicina (50 mg/mL) y 2 mM de L-glutamina. Se suspendieron células Vero, obtenidas a partir de ECACC, en el medio de cultivo y se añadieron 75 qL/pocillo en placas de 96 pocillos (10000 células/pocillo), que ya contenían los compuestos antivirales. Típicamente, estas placas contienen diluciones en serie con un factor de 5 de 9 etapas de dilución del compuesto de ensayo a 200 veces la concentración final en DMSO a 100% (500 nL; intervalo de concentración final: 25 qM - 0.000064 qM o 2.5 qM - 0.0000064 qM para los compuestos más activos). Además, cada placa contiene pocillos que están asignados como controles de virus (que contienen células y virus en ausencia de compuesto) y controles de células (que contienen células en ausencia de virus y compuesto). Una vez se añadieron las células en las placas, las placas se incubaron en un incubador totalmente humidificado (37 °C, 5% CO2) hasta el día siguiente. Se diluyeron los serotipos -1,2, 3 y 4 del virus del dengue para obtener un Cp de ~22-24 en el ensayo. Por lo tanto, se añadieron 25 qL de suspensión de virus a todas las placas que contenían compuesto de ensayo y a los pocillos asignados como control de virus. En paralelo, se añadieron 25 qL de medio de cultivo a los controles de células. A continuación, las placas se incubaron durante 3 días en un un incubador totalmente humidificado (37 °C, 5% de CO2). Después de 3 días, el sobrenadante se retiró de los pocillos y las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo (~100 qL). Los pellets de células dentro de las placas de 96 pocillos se almacenaron a -80 °C durante al menos 1 día. A continuación, se extrajo ARN usando el kit de lisis Cells-to-CTTM, de acuerdo con las directrices del fabricante (Life Technologies). Los lisatos de células pueden almacenarse a -80 °C o usarse inmediatamente en la etapa de transcripción inversa.
En la preparación de la etapa de transcripción inversa, se preparó la mezcla A (tabla 3A) y 7.57 qL/pocillo se dispensó en una placa de 96 pocillos. Después de la adición de 5 qL de lisatos de célula, se realizó una etapa de desnaturalización de cinco minutos a 75 °C (tabla 3B). Después, se añadieron 7.43 qL de mezcla B (tabla 3C) y se inició la etapa de transcripción inversa (tabla 3D) para generar ADNc.
Finalmente, se preparó una mezcla de RT-qPCR, mezcla C (tabla 4A), y se dispensaron 22.02 qL/pocillo en placas LightCycler qPCR de 96 pocillos en las que se añadieron 3 qL de ADNc y la qPCR se realizó de acuerdo con las condiciones de la tabla 4B en un LightCycler 480.
Usando el software LightCycler y un sistema LIMS propio, se calcularon las curvas de respuesta a la dosis para cada compuesto y se determinaron la concentración eficaz que produce la mitad del efecto máximo (CE50) y la mitad de la concentración citotóxica máxima (CC50).
Tabla 3: síntesis de ADNc usando la Mezcla A, desnaturalización, La Mezcla B y transcripción inversa. A Mezcla A
Figure imgf000035_0003
Volumen mezcla/pocillo
7.57 (Pl) Lisatos de célula
Figure imgf000035_0002
5.00
Figure imgf000035_0001
B Eta a de desnaturalización:
Figure imgf000035_0004
C Mezcla B
Figure imgf000035_0005
D Protocolo de síntesis de ADNc
Figure imgf000035_0006
Tabla 4: Protocolo y mezcla de qPCR.
A Mezcla C
Figure imgf000035_0007
Figure imgf000036_0007
B Protocolo qPCR3
Etapa Temp. Tiempo Índice de rampa
preincub./desnat. 95°C 10 min 4.4
Desnaturalización 95°C 10 sec 4.4
Hibridación 58°C 1 min 2.2
Alargamiento 72°C 1 sec 4.4
Refrigeración
Figure imgf000036_0004
40°C
Figure imgf000036_0002
10 sec
Figure imgf000036_0003
1.5
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Ensayo de transcriptasa inversa tetravalente-PCR cuantitativa (RT-qPCR): Protocolo B.
La actividad antiviral de los compuestos de la invención se ensayó frente a la cepa Djibouti de DENV-1 (D1/H/IMTSSA/98/606; Tabla 6), la cepa NGC de DENV-2 (Tabla 7), la cepa H87 de De Nv -3 (Tabla 8) y la cepa SG/06K2270DK1/2005 de DEn V-4 (Tabla 9B) en un ensayo RT-qPCR. Se sembraron células Vero-B o Vero-M (5 x 104) en placas de 96 pocillos. Un día después, el medio de cultivo se reemplazó por 100 pL de medio de ensayo que contenía una dilución en serie 2x, 3x o 5x del compuesto (intervalo de concentración: 50 pg/mL - 0.00038 pg/mL, 50 pg/mL - 0.0076 pg/mL y 50 pg/mL - 0.00013 pg/mL, respectivamente) y 100 pL de inóculo de virus del dengue (DENV). Después de un periodo de incubación de 2 horas, la monocapa de células se lavó 3 veces con medio de ensayo para retirar virus no adsorbido residual y los cultivos se incubaron adicionalmente durante 4 días (DENV-2 NGC) o 7 días (cepa D1/H/IMTSSA/98/606 de Djibouti de DENV-1, prototipo de cepa H87 de DENV-3, cepa H241 de DENV-4 y cepa EDEN de DENV-4) en presencia del inhibidor. El sobrenadante se recolectó y se determinó la carga de ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. La concentración eficaz a un 50% (CE50), que se define como la concentración de compuesto que se necesita para inhibir la replicación de ARN viral en un 50%, se determinó usando interpolación logarítmica.
Se aisló ARN de 100 pL (o en algunas circunstancias de 150 pL) de sobrenadante con kit NucleoSpin 96 Virus (Filter Service, Düren, Alemania) según se describe por el fabricante. Las secuencias de los cebadores TaqMan (DENV-For, DENV-Rev; Tabla 5) y las sondas TaqMan (DENV-Probe Tabla 5) se seleccionaron entre gen 3 no estructural (NS3) o NS5, de los flavivirus respectivos usando el software Primer Express (versión 2.0; Applied Biosystems, Lennik, Bélgica). LA sonda TaqMan se marcó flurescentemente con 6-carboxifluoresceína (FAM) en el extremo 5’ como el colorante marcador, y con ligando de surco menor (MGB) en el extremo 3’ como el inactivador (Tabla 5). Se realizó RT-PCR cuantitativa de una etapa en un volumen total de 25 pL, que contenía 13.9375 pL de H2O, 6.25 pL de mezcla maestra (Eurogentec, Seraing, Bélgica), 0.375 pL de cebador directo, 0.375 pL de cebador inverso, 1 pL de sonda, 0.0625 pL de transcriptasa inversa (Eurogentec) y 3 pL de muestra. Se realizó RT-PCR usando el sistema ABI 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Branchburg, Nueva Jersey, Estados Unidos) usando las siguientes condiciones: 30 min a 48 °C y 10 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C. Los datos se analizaron usando el software ABI PRISM 7500 SDS (versión 1.3.1; Applied Biosystems). Para la cuantificación, se generaron curvas patrón usando diluciones con un factor de dilución 10 de preparaciones modelo de concentraciones conocidas.
Tabla 5: Cebadores sondas usadas ara RT-PCR cuantitativa en tiem o real.
C
Figure imgf000036_0005
Figure imgf000036_0006
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Ensayo citotóxico
Se evaluaron los efectos citotóxicos potenciales de los compuestos en células Vero-B o Vero-M inactivadas no infectadas. Se sembraron células a 5 x 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en presencia de diluciones en serie de con factor de dilución dos, tres o cinco (variando de 50 pg/mL - 0.0038 pg/mL, 50 pg/mL - 0.0076 pg/mL y 50 pg/mL - 0.00013 pg/mL, respectivamente) de compuesto y se incubaron durante 4 a 7 días. Se descartó el medio de cultivo y se añadieron 100 pL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio/fenazinmetosulfato (MTS/PMS; Promega, Leiden, Países Bajos) en PBS a cada pocillo. Después de un periodo de incubación de 2 horas a 37 °C, se determinó la densidad óptica 498 nm. Se calculó la actividad citotóxica usando la siguiente fórmula: % de viabilidad celular = 100 x (ODCompuesto/ODC C ), donde ODCompuesto y ODc c corresponden a la densidad óptica a 498 nm de los cultivos celulares no infectados tratados con compuesto y a la de cultivos celulares no tratados sin infectar, respectivamente. La concentración citotóxica al 50% (es decir, la concentración que reduce el número total de células en un 50%; CC50) se calculó usando interpolación lineal. T l E n n I r l m fr n r i 1 n l n RT- P R
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Tabla 8: CEso. CCso y SI para los compuestos frente a serotipo 3 en los ensayos RT-qPCR
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Tabla 9: CEso. CCso y SI para los compuestos frente a serotipo 4 en los ensayos RT-qPCR A
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B
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto o su forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en el que dicho compuesto es
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2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es: Enantiómero 9A,
en el que
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.26 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.55 - 6.62 (m, 2 H) 6.91 (t, J=1.5 Hz, 1 H) 6.98 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.21 (dd, J=8.8, 1.8 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.59 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=0.9 Hz, 1 H) 8.55 (s, 1 H) 12.29 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.20 min, MH+ 583
[a]D20: 130.3° (c 0.555, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.10 min, MH+ 583, pureza quiral 100%.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es: Enantiómero 9B,
en el que
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.99 (s, 3 H) 6.26 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.56 - 6.62 (m, 2 H) 6.92 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 6.98 (dd, J=8.1,2.0 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.13 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.22 (dd, J=8.8, 1.8 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.59 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=0.9 Hz, 1 H) 8.55 (s, 1 H) 12.30 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 1.20 min, MH+ 583
[a]D20: -133.2° (c 0.5, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.50 min, MH+ 583, pureza quiral 100%.
4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o una forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, junto con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
5. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o una forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso como un medicamento.
6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 o una forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento del dengue.
7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el compuesto se administra como un producto amorfo o cristalino.
8. Un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural (I)
Figure imgf000046_0001
una forma estereoisomérica, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo; en el que:
Ri es OCF3, R2 es H y R3 es H,
para su uso en la inhibición de la replicación del virus del dengue en una muestra biológica o en un paciente.
9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende además co-administrar un agente terapéutico adicional.
10. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 en el que dicho agente terapéutico adicional se selecciona entre un agente antiviral o una vacuna contra el dengue, o ambos.
11. Un método para la síntesis de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende las etapas de:
a) convertir el ácido 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acético (II) en el correspondiente cloruro de 2-(4-cloro-2-metoxifenil)acetilo (III) con un reactivo de cloración;
b) reacción de Friedel-Crafts del cloruro de ácido (III) con un indol sustituido de fórmula general (IV) llevada a cabo utilizando un reactivo ácido de Lewis en un disolvente adecuado y en unas condiciones de reacción adecuadas, para proporcionar el indol 3-acilado de fórmula general (V), en el que R1 es OCF3, R2 es H y R3 es H;
c) bromación de (V) con un reactivo en un disolvente adecuado, para proporcionar los compuestos de fórmula general (VI);
d) reacción de los compuestos de fórmula general (VI) con 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina (VII) en un disolvente adecuado y utilizando una base para proporcionar los compuestos de fórmula general I como mezclas racémicas; e) separación quiral de los compuestos de fórmula general I para proporcionar los enantiómeros A y B de fórmula general I, en los que R1 es OCF3, R2 es H y R3 es H.
Figure imgf000047_0001
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