ES2689143T3 - Anticuerpo de unión a esclerostina - Google Patents

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ES2689143T3
ES2689143T3 ES10008795.6T ES10008795T ES2689143T3 ES 2689143 T3 ES2689143 T3 ES 2689143T3 ES 10008795 T ES10008795 T ES 10008795T ES 2689143 T3 ES2689143 T3 ES 2689143T3
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Alistair James Henry
Kelly Sue Hoffmann
John Latham
Alastair Lawson
Hsieng Sen Lu
Andy Popplewell
Wenyan Shen
David Winkler
Aaron George Winters
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Abstract

Un anticuerpo de unión a esclerostina que comprende las siguientes secuencias de CDR: CDR-H1: DYIMH (SEQ ID NO: 269); CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID NO: 270); CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID NO: 271); CDR-L1: RASQDISSYLN (SEC ID No: 239); CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID NO: 240); y CDR-L3: QQDIKHPT (SEQ ID NO: 241).

Description

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35
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55
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DESCRIPCION
Anticuerpo de unión a esclerostina.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a anticuerpos capaces de unirse a esclerostina o fragmentos de los mismos.
Antecedentes de la invención
Durante la vida de un individuo suceden dos o tres fases de cambios distintas en la masa ósea (véase Riggs, West J. Med. 154: 63-77 (1991)). La primera fase se produce tanto en hombres como en mujeres y continúa hasta la consecución de una masa de hueso máxima. Esta primera fase se consigue mediante crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondriales y crecimiento radial debido a una tasa de aposición perióstea. La segunda fase comienza aproximadamente a los 30 años para el hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y la pelvis) y aproximadamente a los 40 años para hueso cortical (por ejemplo, huesos largos hallados en las extremidades) y continúa hasta la vejez. Esta fase se caracteriza por pérdida de hueso lenta y se produce tanto en hombres como en mujeres. En mujeres, también se produce una tercera fase de pérdida de hueso, más probablemente debido a deficiencias de estrógenos posmenopáusicas. Durante esta fase solamente, las mujeres pueden perder una masa de hueso adicional del hueso cortical y del compartimento trabecular (véase, Riggs, mencionado anteriormente).
La pérdida de contenido mineral óseo puede estar provocada por una amplia diversidad de afecciones y puede dar como resultado problemas médicos significativos. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en seres humanos y está caracterizada por reducciones notables de la masa ósea esquelética y densidad mineral, deterioro estructural del hueso, incluyendo degradación de la microarquitectura del hueso y aumentos correspondientes de la fragilidad ósea (es decir, reducciones de la fuerza ósea), y susceptibilidad a fractura en individuos aquejados. La osteoporosis en seres humanos está generalmente precedida de osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor de una desviación típica pero menor de 2,5 desviaciones típicas por debajo del valor medio para hueso adulto joven), una afección hallada en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Se ha diagnosticado a otros 7-8 millones de pacientes en Estados Unidos con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral óseo mayor de 2,5 desviaciones típicas por debajo de la del hueso de adulto joven maduro). La frecuencia de osteoporosis en la población humana aumenta con la edad. Entre los caucásicos, la osteoporosis es predominante en mujeres quienes, en los Estados Unidos, comprenden el 80% del grupo de pacientes con osteoporosis. La fragilidad aumentada y susceptibilidad a fractura del hueso esquelético en los ancianos está agravada por el mayor riesgo de caídas accidentales en esta población. Las fracturas de caderas, muñecas y vértebras están entre las lesiones más habituales asociadas con la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente incómodas y caras para el paciente, y para las mujeres se correlacionan con altas tasas de mortalidad y morbilidad.
Aunque la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a la reducción de la masa ósea, pocos de los tratamientos actualmente disponibles para trastornos esqueléticos pueden aumentar la densidad ósea de los adultos, y la mayoría de los tratamientos disponibles en la actualidad actúa principalmente inhibiendo adicionalmente la resorción del hueso en lugar de estimular nueva formación de hueso. El estrógeno se está prescribiendo ahora para retardar la pérdida de hueso. Sin embargo, existe cierta controversia sobre si los pacientes obtienen algún beneficio a largo plazo y si el estrógeno tiene algún efecto en pacientes de más 75 años de edad. Además, se cree que el uso de estrógenos aumenta el riesgo de cáncer de mama y endometrio. También se ha sugerido calcitonina, osteocalcina con vitamina K o altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, para mujeres posmenopáusicas. Las altas dosis de calcio, sin embargo, tienen con frecuencia efectos secundarios gastrointestinales no deseados, y los niveles de calcio en suero y orina deben supervisarse continuamente (por ejemplo, Khosla y Riggs, Mayo Clin. Proc. 70: 978982, 1995).
Otros enfoques terapéuticos actuales para la osteoporosis incluyen bifosfonatos (por ejemplo, Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronato, neridronato, skelid, bonefos), hormona paratiroidea, calcilíticos, calcimiméticos (por ejemplo, cinacalcet), estatinas, esteroides anabólicos, sales de lantano y estroncio y fluoruro sódico. Dichos compuestos terapéuticos, sin embargo, se asocian con frecuencia con efectos secundarios indeseables (véase Khosla y Riggs, mencionado anteriormente).
La esclerostina, el producto del gen SOST, está ausente en esclerosteosis, una enfermedad esquelética caracterizada por sobrecrecimiento del hueso y huesos densos fuertes (Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet., 68: 577589, 2001; Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10: 537-543, 2001). La secuencia de aminoácidos de la esclerostina humana se ha presentado en Brunkow et al. en la referencia anterior y se divulga en el presente documento como SEQ ID NO: 1.
Los documentos WO 2005/014650, WO2005/003158 y WO00/32773 se refieren a anticuerpos específicos para
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esclerostina y métodos para aumentar la mineralización del hueso. Warmington et al (2004) Journal of Bone and Mineral Research, 19: S56-S57 se refiere a antagonismo de esclerostina en roedores adultos.
Breve sumario de la invención
Se divulgan en el presente documento composiciones y métodos que pueden usarse para aumentar al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea, y que puede por lo tanto usarse para tratar una amplia diversidad de afecciones en las que sea deseable un aumento de al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. La presente invención también ofrece otras ventajas relacionadas descritas en el presente documento.
La invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente con esclerostina. Los anticuerpos comprenden las siguientes secuencias de CDR: CDR-H1: DYIMH (SEQ ID NO:269); CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID NO:270); CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID NO:271); CDR-L1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO:239); CDR-L2: STSRlNs (SEQ ID NO:240); y CDR-L3: QQDIKHPT (SEQ ID NO:241). Los anticuerpos pueden caracterizarse por su capacidad para bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina y/o para bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento. Los anticuerpos también pueden caracterizarse por su patrón de unión con péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídico de esclerostina humana” como se divulga en el presente documento.
La invención se refiere a anticuerpos, que pueden aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.
La invención se refiere a anticuerpos que pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
La divulgación también se refiere a una parte inmunogénica de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 6).
La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 92-109 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96). La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 99-120 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
La divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24) con una proteína de esclerostina. El agente de unión a esclerostina también puede bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24). El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado que está bloqueado de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24); el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.
La divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado que muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” al que se muestra por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D; el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, o un anticuerpo quimérico.
La invención se refiere además adicionalmente al anticuerpo reivindicado para su uso en un método para aumentar al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, y baja fuerza ósea en un sujeto mamífero que comprende proporcionar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una cantidad del anticuerpo suficiente para aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea y fuerza ósea.
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina humana. Los anticuerpos tienen una capacidad de bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina humana y/o de bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina humana por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento.
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También se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que puede aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido de mineral del hueso, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.
También se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
También se describe un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257,
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También se describe un anticuerpo, que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257,
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También se describen regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína. Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 1A) (SEQ ID NO: 23) y cadena pesada (Figura 1B) (sEq ID NO: 27) para el anticuerpo Ab-A antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 2 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 2A) (SEQ ID NO: 31) y cadena pesada (Figura 2B) (sEq ID NO: 35) para el anticuerpo Ab-B antiesclerostina.
La Figura 3 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 3A) (SEQ ID NO: 15) y la cadena pesada (Figura 3B) (sEq ID NO: 19) para el anticuerpo Ab-C antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 4 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 4A) (SEQ ID NO: 7) y la cadena pesada (Figura 4B) (sEq ID NO: 11) para el anticuerpo Ab-D antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 5 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34), Ab-A o Ab-B.
La Figura 6 muestra la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 2 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34) o Ab-C.
La Figura 7 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo o Ab-D.
La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal escindido) de esclerostina humana (SEQ ID NO: 1). También se representa la secuencia de nucleótidos de la región codificante de esclerostina humana que codifica la forma madura de esclerostina humana. Las ocho cistinas están numeradas C1 a C8. El nudo de cistina está formado por tres enlaces disulfuro (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 y C6 también forman un enlace disulfuro, sin embargo este disulfuro no es parte del nudo de cistina.
La Figura 9 representa un esquema de la estructura básica de la esclerostina humana. Hay una rama N-terminal (del primer Q a C1) y una rama C-terminal (de C8 al Y terminal). Entre estas ramas está la estructura de nudo de cistina (formada por tres disulfuros: C1-C5; C3-C7; C4-C8) y tres bucles que están designados Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Las regiones distales del Bucle 1 y Bucle 3 están unidas por el disulfuro C2-C6. Se indican sitios de escisión de tripsina potenciales (arginina=R y lisina=K). Algunos de los sitios de escisión de AspN potenciales están indicados (solamente se muestran restos de ácido aspártico (D)).
La Figura 10 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina o AspN. Los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con tripsina están indicados (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) como lo están los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con AspN (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5).
La Figura 11 representa información de secuencia y masa para los péptidos con enlaces disulfuro de esclerostina humana aislados generados por digestión con tripsina. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó por análisis de ESI-LC-MS.
La Figura 12 representa la información de secuencia y masa para los péptidos de esclerostina humana aislados generados por digestión con AspN. El péptido AspN22,7-23,5 contiene los 4 enlaces disulfuro. Pos. sec. =
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La Figura 13 representa un esquema lineal de cuatro péptidos de esclerostina humana (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) generados por digestión con tripsina.
La Figura 14 muestra un esquema lineal de cinco péptidos de esclerostina humana (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5) generados por digestión con AspN. El pico de HPLC de AspN14,6 está compuesto de tres péptidos no unidos por ningún enlace disulfuro.
La Figura 15 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a la unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-A. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 16 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-B. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 17 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-C. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 18 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-D. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 19 muestra dos epítopos de unión a Mab de esclerostina humana. La Figura 19A muestra la secuencia del epítopo del Bucle 2 para unión de Ab-A y Ab-B con esclerostina humana (SEQ ID NO: 6). La Figura 19B muestra la secuencia, enlaces disulfuro y esquema del epítopo T20,6 para unión de Ab-C y Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 2-5).
La Figura 20 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina. La Figura 20A muestra la digestión del complejo de Ab-D de esclerostina humana. La Figura 20B muestra la digestión de la esclerostina humana sola. Se indican los picos de los péptidos T19,2, T20, T20,6 y T21-22.
La Figura 21 muestra la secuencia, enlace disulfuro y esquema del epítopo “derivado de T20,6 1 (nudo de cistina + 4 ramas)” para unión de Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 70-73).
La Figura 22 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) de ratón se usó a 1 |ig/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 y 5 |ig/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 23 representa resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1- BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina humana (Scl) se usó a 1 |ig/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 8 y 4 |ig/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 24 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) humana se usó a 1 |ig/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 |ig/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 25 representa resultados de un modelo de ratón SCID de pérdida de hueso inducida por inflamación. El tratamiento con Ab-A protegió a los ratones de pérdida de hueso relacionada con inflamación asociada con colitis cuando se midió como densidad mineral ósea total (Figura 25A), densidad de hueso vertebral (Figura 25B) y densidad de hueso fémur (Figura 25C).
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere a regiones de la proteína esclerostina humana que contienen epítopos reconocidos por anticuerpos que también se unen a esclerostina de longitud completa, y métodos para preparar y usar estos epítopos. La divulgación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina o partes de esclerostina, y métodos para usar dichos anticuerpos. Los anticuerpos son útiles para bloquear o afectar a la unión de esclerostina humana con uno o más ligandos.
La esclerostina humana recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1589-ST-025). Anticuerpos monoclonales de unión a esclerostina de uso en investigación están disponibles en el mercado de R&D
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Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; monoclonal de ratón 2006 cat. n° MAB1406; monoclonal de rata: 2006 cat. n° MAB1589). Las Patentes de Estados Unidos N° 6.395.511 y 6.803.453 y Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20040009535 y 20050106683 se refieren a anticuerpos anti-esclerostina en general.
Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión esclerostina humana incluya la proteína de SEQ ID NO: 1 y variantes alélicas de la misma. La esclerostina puede purificarse a partir de células hospedadoras 293T que se hayan transfectado por un gen codificante de esclerostina mediante elución de sobrenadante filtrado de fluido de cultivo de células hospedadoras usando una columna de Heparina HP, usando un gradiente salino. La preparación y purificación adicional usando cromatografía de intercambio catiónico se describen en los Ejemplos 1 y 2.
El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo. Un anticuerpo puede comprender una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonal, monoclonal, quimérica, humanizada o humana que tienen cadenas de longitud completa pesadas y/o ligeras) o comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos de cadena sencilla, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (Véase por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechonology, 23, 9, 1126-1136). También se desvelan polipéptidos de anticuerpo en la Patente de Estados Unidos N° 6.703.199, incluyendo monocuerpos de polipéptidos de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpos se desvelan en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2005/0238646, que son polipéptidos de cadena sencilla.
Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo con métodos convencionales. Como ejemplo, los fragmentos de anticuerpo puede producirse por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3,5S. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, Patente de Estados Unidos N° 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89; 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73; 119, 1959 Edelman et al., en Methods in Enzymology 1; 422 (Academic Press 1967); y en Andrews, S.M. y Titus, J.A. en Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley & Sons, Nueva York (2003), páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10A. 1-2.10A.5. También pueden usarse otros métodos para escindir anticuerpos, tales como separar cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes (Fd), escindir además fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que reconoce el anticuerpo intacto.
Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína modificada por ingeniería genética o sintética. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de cadena ligera, los fragmentos “Fv” que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligera y pesada están conectadas por un enlazador peptídico (proteínas scFv).
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Pueden obtenerse CDR (también denominadas “unidades de reconocimiento mínimas” o “región hipervariable”) construyendo polinucleótidos que codifiquen la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como un molde (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology 2; 106, 1991; Courtenay-Luck “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” en Monoclonal Antibodies; Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” en Monoclonal Antibodies; Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
El anticuerpo reivindicado comprende seis CDR como se describe en el presente documento. El anticuerpo puede comprender además al menos un dominio de región variable de las SEQ ID NO: 331, 341, 345 o 396. El dímero de región V comprende al menos una cadena Vh y al menos una Vl que pueden no estar asociadas covalentemente (denominado en lo sucesivo en el presente documento Fv). Si se desea, las cadenas pueden estar acopladas covalentemente bien directamente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador para formar un Fv de cadena sencilla (scFv).
El dominio de región variable puede ser un dominio variable de origen natural o una versión modificada por ingeniería genética del mismo. Por versión modificada por ingeniería genética se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones modificadas por ingeniería genética incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específico por
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inserciones, deleciones o cambios en o a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable modificados por ingeniería genética que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos marco de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de región variable puede estar unido covalentemente en un aminoácido C-terminal con al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Por lo tanto, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede estar unido a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De forma similar un dominio Vl puede estar unido a un dominio Ck o un fragmento del mismo. De este modo, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab donde el dominio de unión a antígeno contiene dominios Vh y Vl asociados unidos covalentemente en sus extremos C con un dominio CH1 y Ck, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo para proporcionar una región bisagra o una parte de un dominio de región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios CH2 y CH3 de anticuerpo.
Por ejemplo, pueden incorporarse CDR en regiones marco conservadas de anticuerpos conocidas (IgG1, IgG2, etc.) o conjugarse con un vehículo adecuado para potenciar la semivida del mismo. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, Fc, polietilenglicol (PEG), albúmina, transferrina y similares. Estos y otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. Dichos péptidos de CDR conjugados pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica u otra. En una realización, uno o más polímeros solubles en agua están enlazados en una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino, de un anticuerpo.
En ciertas realizaciones preferidas, un anticuerpo comprende una o más uniones de polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitación, polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. En ciertas realizaciones, un anticuerpo derivado comprende uno o más de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros. En ciertas realizaciones, uno o más polímeros solubles en agua están unidos aleatoriamente a una o más cadenas laterales. En ciertas realizaciones, PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica para un agente de unión, tal como un anticuerpo. Algunos de dichos procedimientos se analizan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 6.133.426.
Se apreciará que un anticuerpo descrito en el presente documento puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el anticuerpo conserve especificidad de unión. Por lo tanto, están abarcadas dentro del alcance de la divulgación modificaciones de las estructuras de anticuerpos. Estas pueden incluir sustituciones de aminoácidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyen la capacidad de unión esclerostina de un anticuerpo. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar restos de aminoácidos de origen no natural, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o revertidas de restos de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativa también puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto normativo de modo que haya poco o ningún efecto en la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición.
Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácidos o miméticos de aminoácidos por un miembro de otra clase con diferentes propiedades físicas (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homólogas de anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.
Además, un experto en la materia puede generar variantes de ensayo que contengan una sustitución de aminoácidos sencilla en cada resto de aminoácido deseado. Las variantes pueden después explorarse usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes podrían usarse para recopilar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubriera que un cambio en un resto de aminoácido particular diera como resultado actividad destruida, reducida de forma indeseable o inadecuada, podrían evitarse variantes con dicho cambio. En otras palabras, basándose en información recopilada de dichos experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos donde deberían evitarse sustituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones.
Un experto en la materia será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas. En ciertas realizaciones, un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En ciertas realizaciones, se pueden identificar restos y partes de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. En ciertas realizaciones, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura polipeptídica.
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Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de función estructural que identifican restos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de los restos de aminoácidos en una proteína que corresponden a restos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos restos de aminoácidos importantes predichos.
Un experto en la materia puede analizar también la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la materia puede predecir el alineamiento de restos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas realizaciones, un experto en la materia puede elegir no hacer cambios radicales a los aminoácidos que se ha predicho que están en la superficie de la proteína, puesto que dichos restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas.
Se han dedicado varias publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4); 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2); 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry 113(2); 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47; 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47; 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26; 367-384 (1979). Además, están disponibles en la actualidad programas informáticos para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en la realización de modelos de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tengan una identidad de secuencia mayor del 30% o similitud mayor del 40% tienen con frecuencia topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural proteica (PDB) ha proporcionado predictabilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1); 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3); 369-376 (1997)) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que se ha resuelto un número de estructuras crítico, la predicción estructural se hará drásticamente más precisa.
Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen “reconocimiento de pliegues” (Jones, D., Curr., Opin. Struct. Biol., 7(3); 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1); 15-19 (1996)), “análisis de perfil” (Bowie et al., Science, 253; 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183; 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13); 4355-4358 (1987)) y “enlace evolutivo” (Véase Holm, mencionado anteriormente (1999) y Brenner, mencionado anteriormente (1997)).
Las variantes de anticuerpos incluyen variantes de glicosilación donde el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. En ciertas realizaciones, las variantes comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación ligados a N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación ligado a N está caracterizado por la secuencia; Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde el resto de aminoácido designado como X puede ser cualquier resto de aminoácido excepto prolina. La sustitución de restos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidratos ligada a N. Como alternativa, las sustituciones que eliminen esta secuencia retirarán una cadena de carbohidratos ligada a N existente. También se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidratos ligadas a N donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación ligados a N (típicamente los que son de origen natural) y se crean uno o más nuevos sitios ligados a N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína donde uno o más restos de cisteína se suprimen de o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos restos de cisteína que la proteína nativa, y típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la materia en el momento en que se deseen dichas sustituciones. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar restos importantes de anticuerpos para esclerostina, o por aumentar o reducir la afinidad de los anticuerpos para esclerostina descritos en el presente documento.
Según determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que; (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (en determinadas realizaciones, en la parte del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). En determinadas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa puede típicamente no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparezca en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.,
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W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354; 105 (1991).
Los anticuerpos de la invención pueden enlazarse químicamente con polímeros, lípidos u otros restos.
Los anticuerpos pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura marco biocompatible comprende un polipéptido o parte del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable, o marco, o armazón, que es capaz de presentar las CDR, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o “pliegue” polipeptídico (un motivo estructural) o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en relación con un polipéptido o pliegue de origen natural. Estos armazones pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como un ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.
Se conocen estructuras marco biocompatibles que se basan en armazones proteicos o esqueletos distintos de dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, se conocen las basadas en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de cinc CP1, PST1, superenrollamiento, LACI-D1, dominio Z y dominios tendramisat (Véase por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
En realizaciones preferidas, se apreciará que los anticuerpos de la invención incluyen los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento. Pueden producirse anticuerpos humanizados tales como los descritos en el presente documento usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12); 1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36(1); 35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1); 43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21 (8); 397-402, 2000).
Un anticuerpo que comprende CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se ha descrito anteriormente, puede obtenerse por expresión de una célula hospedadora que contiene ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica cada secuencia de CDR puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos de la CDR y sintetizarse junto con cualquier secuencia de ADN de región constante y marco de región variable de anticuerpo deseada usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos, mutagénesis dirigida y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado. Está ampliamente disponible para los expertos en la materia ADN que codifica las regiones constantes y marcos de región variable a partir de bases de datos de secuencias genéticas tales como GenBank®. Cada una de las CDR anteriormente mencionadas se localizará típicamente en un marco de región variable en las posiciones 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) y 95-102 (CDR-H3) de la cadena pesada y las posiciones 24-34 (CdR-L1), 50-56 (CdR-L2) y 89-97 (CDR-L3) de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).
Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo puede propagarse y expresarse de acuerdo con cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos para escisión, ligación, transformación y transfección de ácido nucleico usando cualquier variedad de vectores de expresión conocidos. Por lo tanto, en determinadas realizaciones puede preferirse la expresión de un fragmento de anticuerpo en un hospedador procariota, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178; 497-515). En otras realizaciones determinadas, puede preferirse la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo en una célula hospedadora eucariota, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero) o células vegetales. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero sin limitación, mieloma (tal como una línea NSO de ratón), COS, CHO o células de hibridoma. Los ejemplos de células vegetales incluyen tabaco, maíz, soja y células de arroz.
Pueden prepararse uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o una bacteria, tal como E. coli, en la que se producirá producción del anticuerpo. Para obtener transcripción y traducción eficaz, la secuencia de ADN en cada vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y secuencia líder unidos operativamente con la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos de este modo se conocen generalmente bien y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo, se describen procedimientos de biología molecular básica en Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Maniatis et al, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). Puede realizarse secuenciación de ADN como se describe en Sanger et al. (PNAS 74; 5463, (1977)) y el manual de secuenciación de plc de Amersham International, y puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12; 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154; 367-82 (1987); el manual de Anglian Biotechnology Ltd). Adicionalmente, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación y cultivo de células
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apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).
Cuando se desee mejorar la afinidad de anticuerpos según la divulgación que contienen una o más de las CDR anteriormente mencionadas, pueden usarse varios protocolos de maduración de afinidad, incluyendo mantener las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), combinación de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), presentación de fagos (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 788, 1996) y PCR sexual (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos métodos de maduración de afinidad se analizan en Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Pueden obtenerse anticuerpos mediante inmunización convencional y procedimientos de fusión de células como se describen en el presente documento y se conocen en la técnica. Pueden generarse anticuerpos monoclonales usando una diversidad de técnicas conocidas. En general, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256; 495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1; 2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes de Estados Unidos N° RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," en DNA Cloning 2; Expression Systems, 2a Edición, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Pueden derivarse fragmentos de anticuerpo de los mismos usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica u, opcionalmente, mediante digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Como alternativa, dichos fragmentos también pueden generarse mediante técnicas de ingeniería genética recombinante como se describe en el presente documento.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando a un animal, por ejemplo, una rata, hámster, un conejo o preferentemente un ratón, incluyendo por ejemplo un transgénico o un knock-out, como se conoce en la técnica, con un inmunógeno que comprende esclerostina humana de SEQ ID NO; 1, o un fragmento de la misma, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. La presencia de producción de anticuerpos específica puede supervisarse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo obteniendo una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que se une a esclerostina humana o péptido usando uno cualquiera de varios métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. De animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran células linfoides, más habitualmente células del bazo o ganglio linfático, para obtener linfocitos B. Los linfocitos B se fusionan después con un compañero de fusión de célula de mieloma sensibilizado a fármaco, preferentemente uno que sea singénico con el animal inmunizado y que tenga opcionalmente otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad para expresar productos génicos de Ig endógenos, por ejemplo, P3X63 - Ag 8.653 (AtCc N° CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, que son líneas celulares eucariotas inmortales. Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante varios minutos con un agente promotor de fusión de membrana, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y después sembrarse a baja densidad en un medio selectivo que apoye el crecimiento de células de hibridoma pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente una a dos semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias individuales, y pueden ensayarse anticuerpos producidos por las células con respecto a actividad de unión con esclerostina humana, usando una cualquiera de una diversidad de inmunensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, mediante clonación de dilución limitada o mediante aislamiento en placa de agar suave) y se seleccionan y cultivan clones positivos que producen un anticuerpo específico para esclerostina. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de cultivos de hibridoma. Un método alternativo para producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, sensibilizado con pristano) para prolongar la formación de líquido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una diversidad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaños y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Pueden purificarse anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, una anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo y una proteína de unión a TGF-beta, o fragmento o variante de los mismos.
Un anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por cualquier variedad de técnicas que resultarán familiares para los expertos
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habituales en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, transformación por Virus de Epstein Barr (VEB) de células de sangre periférica humana (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de linfocitos B humanos, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fago de región V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la técnica y basados en la divulgación del presente documento. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos de ratones transgénicos que se han modificado por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a presentación antigénica. Se describen métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos, por ejemplo, por Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994; Patente de Estados Unidos N° 5.877.397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones dirigidas de los loci de cadena pesada y cadena ligera endógenos (véase también Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de minigenes, o transloci en cromosomas artificiales de levadura, que experimentan reordenación del ADN específica de linfocitos B e hipermutación en el tejido linfoide de ratón. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos inmunizando los ratones transgénicos, que pueden después producir anticuerpos humanos específicos para esclerostina. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden usarse para producir hibridomas que secreten anticuerpos humanos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. También pueden obtenerse sueros policlonales que contienen anticuerpos humanos de la sangre de los animales inmunizados.
Otro método para generar anticuerpos humanos incluye inmortalizar células de sangre periférica humana por transformación con VEB. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.646.456. Dicha línea de linfocitos B inmortalizada (o línea celular linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a esclerostina puede identificarse por métodos de inmunodetección como se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, un ELISA, y después aislarse por técnicas de clonación convencionales. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo antiesclerostina puede mejorarse fusionando la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ratón-humano de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Glasky et al., Hybridoma 8: 377-89 (1989)). Otro método más para generar anticuerpos monoclonales humanos es la inmunización in vitro, que incluye sensibilizar linfocitos B esplénicos humanos con esclerostina humana, seguido de fusión de los linfocitos B sensibilizados con un compañero de fusión heterohíbrido. Véase, por ejemplo, Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147: 86-95.
En ciertas realizaciones, se selecciona un linfocito B que produce un anticuerpo antiesclerostina humana y se clonan las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada a partir del linfocito B de acuerdo con técnicas de biología molecular conocidas en este campo (documento WO 92/02551; Patente de Estados Unidos 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)) y descritas en el presente documento. Pueden aislarse linfocitos B de un animal inmunizado del bazo, ganglio linfático o muestra de sangre periférica seleccionando una célula que produce un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina. Los linfocitos B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Se conocen bien en la técnica métodos para detectar linfocitos B individuales que producen un anticuerpo con la especificidad deseada, por ejemplo, mediante formación de placas, separación de células activadas por fluorescencia, estimulación in vitro seguida de detección de anticuerpo específico y similares. Los métodos para selección de linfocitos B productores de anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una única suspensión celular de linfocitos B en agar blando que contiene esclerostina humana. La unión del anticuerpo específico producido por el linfocito B con el antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que se seleccionen los linfocitos B que producen el anticuerpo deseado, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.
Un método adicional para obtener anticuerpos es por presentación de fagos. Véase, por ejemplo, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Pueden crearse bibliotecas combinatorias de región variable de inmunoglobulina humanas o murinas en vectores de fagos que pueden explorarse para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Huse et al., 1989 Science 246: 1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47-52 y referencias citadas en las mismas. Por ejemplo, puede insertarse una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de región variable de Ig en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en fase con la secuencia que codifica una proteína de cubierta de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de cubierta con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. De acuerdo con ciertas realizaciones, también pueden presentarse fragmentos Fab de inmunoglobulina en una partícula de fago (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N°: 5.698.426).
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También pueden prepararse bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en fago lambda, por ejemplo, usando vectores XImmunoZap™ (H) y XImmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, se aísla ARNm de una población de linfocitos B y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores XImmunoZap(H) y XImmunoZap (L). Estos vectores pueden explorarse individualmente o pueden expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse et al., mencionado anteriormente; véase también Sastry et al., mencionado anteriormente). Pueden convertirse posteriormente placas positivas en un plásmido no lítico que permita expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonales de E. coli.
En un hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal pueden amplificarse usando cebadores nucleotídicos. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden obtenerse de fuentes disponibles en el mercado. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón, incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, Vhc, VHd, Ch1, Vl y Cl). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que pueden después insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse después en sistemas de expresión basados en E. coli, levadura o mamífero. Pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla que contiene una fusión de los dominios Vh y Vl usando estos métodos (véase Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).
Una vez que se han obtenido células que producen anticuerpos usando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm del mismo de acuerdo con procedimientos convencionales como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos de los mismos pueden secuenciarse y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR pueden manipularse como se ha descrito previamente para generar otros anticuerpos de acuerdo con la invención.
Preferentemente los anticuerpos se unen específicamente a esclerostina. Como con todos los agentes y ensayos de unión, un experto en la materia reconoce que los diversos restos con los que un anticuerpo no debería unirse de forma detectable para ser terapéuticamente eficaz y adecuado serían extensos y difíciles de numerar. Por lo tanto, para un anticuerpo divulgado en el presente documento, la expresión “se une específicamente” se refiere a la capacidad de un anticuerpo para unirse a esclerostina, preferentemente esclerostina humana, con mayor afinidad que se une a una proteína de control no relacionada. Preferentemente la proteína de control es lisozima de clara de huevo de gallina. Preferentemente los anticuerpos se unen a esclerostina con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por una proteína de control. Un anticuerpo puede tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10"7 M, menos de o igual a 1 x 10"8 M, menos
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de o igual a 1 x 10 M, menos de o igual a 1 x 10 M, menos de o igual a 1 x 10 M o menos de o igual a 1 x 10' M.
La afinidad puede determinarse por un ensayo de ELIA de afinidad. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un ensayo de BIAcore. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método cinético. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método de equilibrio/solución. Dichos métodos se describen en más detalle en el presente documento o se conocen en la técnica.
Los anticuerpos de esclerostina preferentemente modulan la función de esclerostina en el ensayo basado en células descrito en el presente documento y/o el ensayo in vivo descrito en el presente documento y/o se unen a uno o más de los epítopos descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada la unión de uno de los anticuerpos descritos en el presente documento y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en el presente documento. En consecuencia, dichos anticuerpos pueden identificarse usando los ensayos descritos en el presente documento.
Pueden generarse anticuerpos identificando en primer lugar anticuerpos que se unan a uno o más de los epítopos proporcionados en el presente documento y/o se neutralizan en los ensayos basados en células y/o in vivo descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada los anticuerpos descritos en el presente documento y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en el presente documento. Las regiones CDR de estos anticuerpos se usan después para insertar en marcos biocompatibles apropiados para generar agentes de unión a esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, o puede ser una molécula no proteica. Los ensayos descritos en el presente documento permiten la caracterización de agentes de unión. Los agentes de unión de la presente invención son anticuerpos como se definen en el presente documento.
Se entenderá por un experto en la materia que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden experimentar una diversidad de modificaciones postraduccionales. El tipo y alcance de estas modificaciones depende con frecuencia de la línea celular hospedadora usada para expresar la proteína así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto básico carboxilo-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en
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Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).
Se describen posteriormente anticuerpos denominados Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1. “HC” se refiere a la cadena pesada y “LC” se refiere a la cadena ligera. Para algunos anticuerpos posteriores, las CDR están sombreadas en cajas y las regiones constantes (C) se muestran en negrita y cursiva.
Ab-D
El anticuerpo D (también denominado en el presente documento Ab-D y Mab-D) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-D se muestra en la Figura 18.
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena ligera de Ab-D:
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101 GTKLEIK/L4Z) AAPTVSIFPP SSEOLTSGGA SWCFLNNFYPKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:7)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-D es la siguiente:
1 GATGTCCAGA TGATTCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTTTGGGAGA 51 CATAGTCACC ATGACTTGCC AGGCAAGTCA GGGCACTAGC ATTAATTTAA 101 ACTGGTTTCA GCAAAAACCA GGGAAGGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGGT 151 TCAAGCAACT TGGAAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGT AGATA 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT GAAGATCTGG 251 CAACTTATTT CTGTCTACAA CATAGTTATC TCCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 8)
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-D incluyendo el péptido señal es la siguiente:
1 MNTRAPAEFL GFLLLWFLGA RCDVQMIQSP SSLSASLGDIVTMTCQASQG 51 TSINLNWFQQ KPGKAPKLLIYGSSNLEDGV PSRFSGSRYG TDFTLTISSL 101 EDEDLATYFC LQHSYLPYTF GGGTKLEIKR ADAAPTVSIF PPSSEQLTSG 151 GASWCFLNN FYPKDINVKW KIDGSERQNG VLNSWTDQDS KDSTYSMSST 201 LTLTKDEYER HNSYTCEATH KTSTSPIVKS FNRNEC (SEQ ID NO:9)
Secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-D incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal:
1 ATGAACACGA GGGCCCCTGC TGAGTTCCTT GGGTTCCTGT TGCTCTGGTT 51 TTTAGGTGCC AGATGTGATG TCCAGATGAT TCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTTT GGGAGACATA GTCACCATGA CTTGCCAGGC AAGTCAGGGC
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151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AGGCTCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGGTTCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 301 GAGGATGAAG ATCTGGCAAC TTATTTCTGT CTACAACATA GTTATCTCCC 351 GTACACGTTC GGAGGGGGGA CCAAGCTGGA AATAAAACGG GCTGATGCTG 401 CACCAACTGT ATCCATCTTC CCACCATCCA GTGAGCAGTT AACATCTGGA 451 GGTGCCTCAG TCGTGTGCTT CTTGAACAAC TTCTACCCCA AAGACATCAA 501 TGTCAAGTGG AAGATTGATG GCAGTGAACG ACAAAATGGC GTCCTGAACA 551 GTTGGACTGA TCAGGACAGC AAAGACAGCA CCTACAGCAT GAGCAGCACC 601 CTCACGTTGA CCAAGGACGA GTATGAACGA CATAACAGCT ATACCTGTGA 651 GGCCACTCAC AAGACATCAA CTTCACCCAT TGTCAAGAGC TTCAACAGGA 701 ATGAGTGTTA G (SEQ ID NO: 10)
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena pesada HC de Ab-D es la siguiente:
1 EVQLQQSGPE LVTPGASVKISCKASGYTFT &HYMSWVKQS HGKSLEWIGE}
51 Í|PyfSGEÍ^|íQKFKC|TATL TVDKSSSIAY MEIRGLTSED SAVYYCARDD 101 :YDAS#A|WG QGTLVTVSA4 KTTPPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG 151 YFPEPVTVTW NSGSLSSGVH TFPA VLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT 201 CNVAHPASSTKVDKK1VPRD CGCKPCICTVPEVSSVFIFP PKPKDVLTIT 251LTPKVTCVWDISKDDPEVQ FSWFVDDVEVHTAQTQPREE QFNSTFRSVS 301ELPIMHQDWL NGKEFKCRVN SPAFPAPIEK TISKTKGRPKAPQVYTIPPP 351KEQMAKDKVS LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMDTDGSY 401FIYSKLNVQK SNWEA GNTFT CSVLI1EGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ ID NO:ll)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-D es:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTGGTGACGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATA TCTTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACCACTACA 101 TGAGCTGGGT GAAGCAGAGT CATGGAAAAA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCCT ATTCTGGTGA AACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAC 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG TATAGCCTAC ATGGAGATCC 251 GCGGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGATGAT *
301 TACGACGCCT CTCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC TGGTCACTGT 351 CTCTGCAGCC AAAACGACAC CCCCATCTGT CTATCCACTG GCCCCTGGAT .
401 CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC TGGGATGCCT GGTCAAGGGC 451 TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG AACTCTGGAT CCCTGTCCAG 501 CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA GTCTGACCTC TACACTCTGA 551 GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT GGCCCAGCGA GACCGTCACC 601 TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC AAGGTGGACA AGAAAATTGT 651 GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT ATGTACAGTC CCAGAAGTAT 701 CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA AGGATGTGCT CACCATTACT 751 CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA GACATCAGCA AGGATGATCC 801 CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA TGTGGAGGTG CACACAGCTC 851 AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACTTTCCG CTCAGTCAGT 901 GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC AATGGCAAGG AGTTCAAATG 951 CAGGGTCAAC AGTCCAGCTT TCCCTGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA 1001 AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG TGTACACCAT TCCACCTCCC 1051 AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT CTGACCTGCA TGATAACAGA
1101 CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG GCAGTGQAAT GGGCAGCCAG 1151 CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA TGGACACAGA TGGCTCTTAC 1201 TTCATCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG AGCAACTGGG AGGCAGGAAA 1251 TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG CCTGCACAAC CACCATACTG 1301 AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT GA (SEQ ID NO: 12)
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-D incluyendo el péptido señal es:
1MRCRWIFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL VTPGASVKIS CKASGYTFTD 51 HYMSWVKQSH GKSLEWIGDINPYSGETTYN QKFKGTATLT VDKSSSIAYM 101 EIRGLTSEDS AYYYCARDDY DASPFAYWGQ GTLVTVSAAK TTPPSVYPLA 151 PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY 201 TLSSSVTVPS STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP 251EVSSVFIFPP KPKDVLTITL TPKVTCWVDISKDDPEVQF SWFVDDVEVH 301 TAQTQPREEQ FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS PAFPAPIEKT 351ISKTKGRPKA PQVYTIPPPK EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG 401 QPAENYKNTQ PIMDTDGSYFIYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH 451 HTEKSLSHSP GK (SEQ ID NO:13)
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-D incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1ATGAGATGCA GGTGGATCTT TCTCTTTCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTG GTGACGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATATCT TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 CACTACATGA GCTGGGTGAA GCAGAGTCAT GGAAAAAGCC TTGAGTGGAT 201 TGGAGATATT AATCCCTATT CTGGTGAAAC TACCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCACGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CTTCCAGTAT AGCCTACATG 301 GAGATCCGCG GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351AGATGATTAC GACGCCTCTC CGTTTGCTTA CTGGGGCCAA GGGACTCTGG 401 TCACTGTCTC TGCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC 451 CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT 501 CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC 551 TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC 601ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC 651 CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA 701AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA 751 GAAGTATCAT CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC 801 CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG 851 ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC 901 ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CTTTCCGCTC 951 AGTCAGTGAA CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT 1001 TCAAATGCAG GGTCAACAGT CCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC 1051 ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC 1101 ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA 1151 TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG 1201 CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG 1251 CTCTTACTTC ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG 1301 CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC 1351 CATACTGAGA AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID NO: 14)
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Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-D son las siguientes:
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CRD-H1: DHYMS (SEQ ID NO: 39)
CDR-H2: DINPYSGETTYNQKFKG (SEQ ID NO: 40)
CDR-H3: DDYDASPFAY (SEQ ID NO: 41)
10 Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-D son:
CDR-L1: QASQGTSINLN (SEQ ID NO: 42)
CDR-L2: GSSNLED (SEQ ID NO: 43)
CDR-L3: LQHSYLPYT (SEQ ID NO: 44)
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Ab-C
El anticuerpo C (también denominado en el presente documento Ab-C y Mab-C) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-C se muestra en la Figura 17. 20 La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la Cadena Ligera de Ab-C es la siguiente:
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1 DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCÍmQSVD'TOGBSYMNWY QQKPGQPPKL 51 LIYX$S$LÉS GIPARFSGNG SGTDFTLNIH PVÉEEDAVTY YCQgSÍSnEfíP^ 101 TFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLT SGGASWCFL NÑFYPKDINV 151KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTLIKDEY ERHNSYTCEA 201 THKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 15)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-C es:
1 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT CTCTAGGCCT 51 GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGGCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTG 101 ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC 151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG CCAGGTTTAG 201 TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG 251 AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA GGATCCGTGG 301 ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG ATGCTGCACC 351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG 401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC 451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG 501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA 551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC 601 ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA 651 GTGTTAG (SEQ ID NO:16)
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:
1METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCKASQSVD 51 YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLNIH 101 PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT 151 SGGASWCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID NO: 17)
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG 51 CTCCACTGGT GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT 101 CTCTAGGCCT GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT 151 TATGATGGTG ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG 251 CCAGGTTTAG TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA 351 GGATCCGTGG ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG 401ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA 501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC 551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC 601AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC 651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA 701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID NO: 18)
Cadena pesada de Ab-C
5 La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es:
imagen2
151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201PSETVTCNVAIIPASSTKVDK K1VPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251DVLTITLTPK VTCVWDISKDDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPIMHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDEVSLTCMITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE A GNTFTCSVL HEGLHNHHTE ESLSHSPGK (SEQ ID NO: 19)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es la siguiente:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGACTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTGCTACA 101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGGAAGA GCCTTGAATG GATTGGAGAT 151ATTAATCCTT TCAACGGTGG TACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC ATGCAGCTCA 251ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATCCCAT 301 TATTACTTCG ATGGTAGAGT CCCTTGGGAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA 351 AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA
501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT 551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG 601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA 651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT 701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG 751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA 801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG 851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC 901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA 951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG 1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 1151AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ ID NO:20)
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:
1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE YQLQQSGPEL VKPGTSVKMS CKASGYTFTD 51 CYMNÍWVKQSH GKSLEWIGDINPFNGGTTYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 QLNSLTSDDS AVYYCARSHY YFDGRVPWDA MDYWGQGTSV TVSSAKTTPP 151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDCGCKP 251 CICTYPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVWDISKD DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMITDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH 5 451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID NO:21)
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG 101 GGACTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151TGCTACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT GGGAAGAGCC TTGAATGGAT 201 TGGAGATATT AATCCTTTCA ACGGTGGTAC TACCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG 301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGACGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATCCCATTAT TACTTCGATG GTAGAGTCCC TTGGGATGCT ATGGACTACT 401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT 751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG
851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT 1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID NO:22) '
5 Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-C son como sigue:
CDR-H1: DCYMN (SEQ ID NO: 45)
CDR-H2: DINPFNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 46)
10 CDR-H3: SHYYFDGRVPWDAMDY (SEQ ID NO: 47)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-C son:
CDR-L1: KASQSVDYDGDSYN (SEQ ID NO: 48)
15 CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO: 49)
CDR-L3: QQSNEDPWT (SEQ ID NO: 50)
Ab-A
20 El anticuerpo A (también denominado en el presente documento Ab-A y Mab-A) es un anticuerpo quimérico de ratón-conejo que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-A se muestra en la Figura 15.
Cadena Ligera de Ab-A
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:
5
1 AQVLTQTPAS VSAAVGGTVTINCQSSQSVY DW^AWFQQ KPGQPPKLLI 51 YDÁSDtASGV PSRFSGSGSG TQFTLTISGV QCADAATYYC QGÁYNDYTYA 101 FGGGTEWVK RTDAAPTVSIFPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK 151 WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT 201HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NO:23)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:
1 GCGCAAGTGC TGACCCAGAC TCCAGCCTCC GTGTCTGCAG CTGTGGGAGG 51 CACAGTCACC ATCAATTGCC AGTCCAGTCA GAGTGTTTAT GATAACAACT 101 GGTTAGCCTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGC AGCCTCCCAA GCTCCTGATT 151 TATGATGCAT CCGATCTGGC ATCTGGGGTC CCATCGCGGT TCAGTGGCAG 201 TGGATCTGGG ACACAGTTCA CTCTCACCAT CAGCGGCGTG CAGTGTGCCG 251 ATGCTGCCAC TTACTACTGT CAAGGCGCTT ATAATGATGT TATTTATGCT 301 TTCGGCGGAG GGACCGAGGT GGTGGTCAAA CGTACGGATG CTGCACCAAC 351 TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT GGAGGTGCCT 401 CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT CAATGTCAAG 451 TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA ACAGTTGGAC 501 TGATCAGGAC AQCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC ACCCTCACGT 551 TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG TGAGGCCACT 601 CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA GGAATGAGTG 651TTAG (SEQ ID NO:24)
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:
1 MDTRAPTQLL GLLLLWLPGA TFAQVLTQTP ASVSAAVGGT VUNCQSSQS 51 VYDNNWLAWF QQKPGQPPKL LIYDASDLAS GVPSRFSGSG SGTQFTLTIS 101 GVQCADAATY YCQGAYNDVIYAFGGGTEW VKRTDAAPTV SIFPPSSEQL 151 TSGGASYVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGYLNSWTD QDSKDSTYSM 201 SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:25)
15
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1ATGGACACGA GGGCCCCCAC TCAGCTGCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC ACATTTGCGC AAGTGCTGAC CCAGACTCCA GCCTCCGTGT 101 CTGCAGCTGT GGGAGGCACA GTCACCATCA ATTGCCAGTC CAGTCAGAGT 151 GTTTATGATA ACAACTGGTT AGCCTGGTTT CAGCAGAAAC CAGGGCAGCC 201 TCCCAAGCTC CTGATTTATG ATGCATCCGA TCTGGCATCT GGGGTCCCAT 251 CGCGGTTCAG TGGCAGTGGA TCTGGGACAC AGTTCACTCT CACCATCAGC 301 GGCGTGCAGT GTGCCGATGC TGCCACTTAC TACTGTCAAG GCGCTTATAA 351 TGATGTTATT TATGCTTTCG GCGGAGGGAC CGAGGTGGTG GTCAAACGTA 401 CGGATGCTGC ACCAACTGTA TCCATCTTCC CACCATCCAG TGAGCAGTTA 451 ACATCTGGAG GTGCCTCAGT CGTGTGCTTC TTGAACAACT TCTACCCCAA 501 AGACATCAAT GTCAAGTGGA AGATTGATGG CAGTGAACGA CAAAATGGCG 551 TCCTGAACAG TTGGACTGAT CAGGACAGCA AAGACAGCAC CTACAGCATG 601 AGCAGCACCC TCACGTTGAC CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA 651 TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAAC TTCACCCATT GTCAAGAGCT 701 TCAACAGGAA TGAGTGTTAG (SEQ ID NO:26)
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A es:
5
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSSY%IN|WVRQAP GEGLEWIGTÍ 51 6sGGpI)YASWAKGRFTISR TSTTMDLKMT §LTTGDTARY FCAR^pliWG 101 QGTLVTVSSA STKGPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG YFPEPVTVTW 151NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASST 201KVDKKWPRD CGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCWV 251DISKDDPEVQ FSWFVDDVEVHTAQTQPREE QFNSTFRSVS ELPIMHQDWL 301NGKEFKCR VN SAAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP KEQMAKDKVS 351LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMNTNGSY FVYSKLNVOK 401SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ ID NO:27)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A:
1 CAGTCGCTGG AGGAGTCCGG GGGTCGCCTG GTCACGCCTG GGACACCCCT 51 GACACTCACC TGCACAGCCT CTGGATTCTC CCTCAGTAGT TATTGGATGA 101ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGGAGGGGC TGGAATGGAT CGGAACCATT 151 GATTCTGGTG GTAGGACGGA CTACGCGAGC TGGGCAAAAG GCCGATTCAC 201 CATCTCCAGA ACCTCGACTA CGATGGATCT GAAAATGACC AGTCTGACGA 251 CCGGGGACAC GGCCCGTTAT TTCTGTGCCA GAAATTGGAA CTTGTGGGGC 301 CAAGGCACCC TCGTCACCGT CTCGAGCGCT TCTACAAAGG GCCCATCTGT 351 CTATCCACTG GCCCCTGGAT CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC 401 TGGGATGCCT GGTCAAGGGC TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG 451 AACTCTGGAT CCCTGTCCAG CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA 501 GTCTGACCTC TACACTCTGA GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT 551 GGCCCAGCGA GACCGTCACC TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC 601 AAGGTGGACA AGAAAATTGT GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT 651 ATGTACAGTC CCAGAAGTAT CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA 701 AGGATGTGCT CACCATTACT CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA 751 GACATCAGCA AGGATGATCC CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA 801 TGTGGAGGTG CACACAGCTC AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA 851 GCACTTTCCG CTCAGTCAGT GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC 901AATGGCAAGG AGTTCAAATG CAGGGTCAAC AGTGCAGCTT TCCCTGCCCC 951 CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG 1001 TGTACACCAT TCCACCTCCC AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT 1051 CTGACCTGCA TGATAACAGA CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG 1101 GCAGTGGAAT GGGCAGCCAG CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA 1151 TGGACACAGA TGGCTCTTAC TTCGTCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG 1201 AGCAACTGGG AGGCAGGAAA TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG 1251 CCTGCACAAC CACCATACTG AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT 1301 GA (SEQ ID NO:28)
La secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:
1 METGLRWLLL VAVLKGVHCQ SLEESGGRLV TPGTPLTLTC TASGFSLSSY 51 WMNWVRQAPG EGLEWIGTDD SGGRTDYASW AKGRFTISRT STTMDLKMTS 101 LTTGDTARYF CARNWNLWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVYPLA PGSAAQTNSM 151 VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY TLSSSVTVPS 201 STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPP 251 KPKDVLTITL TPKVTCWVDISKDDPEVQF SWFVDDVEVH TAQTQPREEQ 301 FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS AAFPAPIEKTISKTKGRPKA 351 PQVYTIPPPK EQMAKDKV SL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ 401 PIMNTNGSYF VYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH HTEKSLSHSP 451 GK (SEQ ID NO:29)
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGAGACTG GGCTGCGCTG GCTTCTCCTG GTCGCTGTGC TCAAAGGTGT 51 CCACTGTCAG TCGCTGGAGG AGTCCGGGGG TCGCCTGGTC ACGCCTGGGA 101 CACCCCTGAC ACTCACCTGC ACAGCCTCTG GATTCTCCCT CAGTAGTTAT
151 TGGATGAACT GGGTCCGCCA GGCTCCAGGG GAGGGGCTGG AATGGATCGG 201 AACCATTGAT TCTGGTGGTA GGACGGACTA CGCGAGCTGG GCAAAAGGCC 251 GATTCACCAT CTCCAGAACC TCGACTACGA TGGATCTGAA AATGACCAGT 301 CTGACGACCG GGGACACGGC CCGTTATTTC TGTGCCAGAA ATTGGAACTT 351 GTGGGGCCAA GGCACCCTCG TCACCGTCTC GAGCGCTTCT ACAAAGGGCC 401 CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG 451 GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT 501 GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG 551 TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC 601 AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG 651 CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC 701 CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA 751 AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT 801 TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG 851 TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG 901 TTCAACAGCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA CTTCCCATCA TGCACCAGGA 951 CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG GGTCAACAGT GCAGCTTTCC 1001 CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT 1051 CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA 1101 AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG 1151 TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG 1201 CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC GTCTACAGCA AGCTCAATGT 1251 GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC 1301 ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA AGAGCCTCTC CCACTCTCCT 1351 GGTAAATGA (SEQ ID NO:30)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-A son las siguientes:
5
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO: 51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO: 52)
CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO: 53)
10 Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-A son:
CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO: 54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO: 55)
CDR-L3: QGAYNDVIYA (SEQ ID NO: 56)
15
Ab-A se humanizó y se denomina Anticuerpo 1 (también denominado en el presente documento Ab-1), que tiene las siguientes secuencias:
La secuencia de ácido nucleico de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido 20 señal es:
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGT
GCCACATTTGCTCAAGTTCTGACCCAGAGTCCAAGCAGTCTCTCCGCCAGCGTAGGC
5
10
15
20
25
30
35
GATCGTGTGACTATTACCTGTCAATCTAGTCAGAGCGTGTATGATAACAATTGGCTG
GCGTGGTACCAGCAAAAACCGGGCAAAGCCCCGAAGCTGCTCATCTATGACGCGTC
CGATCTGGCTAGCGGTGTGCCAAGCCGTTTCAGTGGCAGTGGCAGCGGTACTGACT
TTACCCTCACAATTTCGTCTCTCCAGCCGGAAGATTTCGCCACTTACTATTGTCAAG
GTGCTTACAACGATGTGATTTATGCCTTCGGTCAGGGCACTAAAGTAGAAATCAAA
CGT (SEQ ID NO:74)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:
imagen3
La secuencia de ácido nucleico de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCACTGT
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGAGGCGGGCTTGTCCAGCCTGGAGGGAGCCTGCG
TCTCTCTTGTGCAGCAAGCGGCTTCAGCTTATCCTCTTACTGGATGAATTGGGTGCG
GCAGGCACCTGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCACCATTGATTCCGGAGGCCGTA
CAGACTACGCGTCTTGGGCAAAGGGCCGTTTCACCATTTCCCGCGACAACTCCAAA
AATACCATGTACCTCCAGATGAACTCTCTCCGCGCAGAGGACACAGCACGTTATTA
CTGTGCACGCAACTGGAATCTGTGGGGTCAAGGTACTCTTGTAACAGTCTCGAGC
(SEQ ID NO:76 )
La secuencia de aminoácidos de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:
imagen4
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-1 son las siguientes:
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO: 51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO: 52)
CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO: 53)
Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-1 son:
CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO: 54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO: 55)
CDR-L3: QGAYNDVTYA (SEQ ID NO: 56)
Ab-B
El anticuerpo B (también denominado en el presente documento Ab-B y Mab-B) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-B se muestra en la Figura 16.
Cadena Ligera de Ab-B
1 QIVLTQSPTI VSASPGEKVT LIc£AS’SSv'S;; FVDWFQQKPG TSPKRWIYRT 51 SNL^GVPAR FSGGGSGTSH SLTÍSRMÉAE DAATYYCQQ^STÍPPTFGAG 101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS WCFLNNFYP KDINVKWKID 151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ED NO:31)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-B es:
1 CAAATTGTTC TCACCCAGTC TCCAACAATC GTGTCTGCAT CTCCAGGGGA 51 GAAGGTCACC CTAATCTGCA GTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TTCGTGGACT 101 GGTTCCAGCA GAAGCCAGGC ACTTCTCCCA AACGCTGGAT TTACAGAACA 151 TCCAACCTGG GTTTTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCG GTGGATCTGG 201 GACCTCTCAC TCTCTCACAA TCAGCCGAAT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAAAGG AGTACTTACC CACCCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AACTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA '
5 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID NO:32)
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-B incluyendo el péptido señal es:
1 MHFQVQIFSF LLISASVIVS RGQIVLTQSP TIVSASPGEK VTLICSASSS 51 VSFVDWFQQK PGTSPKRWIY RTSNLGFGVP ARFSGGGSGT SHSLTISRME 101 AEDAATYYCQ QRSTYPPTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 151 ASWCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO:33)
10
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-B incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGCATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT 51 CATAGTGTCC AGAGGGCAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA ACAATCGTGT 101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCCTAA TCTGCAGTGC CAGTTCAAGT 151 GTAAGTTTCG TGGACTGGTT CCAGCAGAAG CCAGGCACTT CTCCCAAACG 201 CTGGATTTAC AGAACATCCA ACCTGGGTTT TGGAGTCCCT GCTCGCTTCA 251 GTGGCGGTGG ATCTGGGACC TCTCACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG 301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCACC
351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAACT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AGTGTTAG (SEQ ID NO:34)
Cadena Pesada de Ab-B
5 La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:
1 QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLS '^MÍVgwiR HPSGKNLEWL 51 AHfWW'DDVKR YNPVlMSRLT ISKDTSNSQV FLKIANVDTA DTATYYCARI 101 pD.FpYÍÍE%Y^A&p|w'GQGTS VIVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPPDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251 DVLTITLTPK VTCVWDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPBEEQFNS 301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401 DTDGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ IDNO:35)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:
10
1 CAGGTTACTC TGAAAGAGTC TGGCCCTGGG ATATTGCAGC CCTCCCAGAC 51 CCTCAGTCTG ACTTGTTCTT TCTCTGGGTT TTCACTGAGC ACTTCTGGTA 101 TGGGTGTAGG CTGGATTCGT CACCCATCAG GGAAGAATCT GGAGTGGCTG 151 GCACACATTT GGTGGGATGA TGTCAAGCGC TATAACCCAG TCCTGAAGAG 201 CCGACTGACT ATCTCCAAGG ATACCTCCAA CAGCCAGGTA TTCCTCAAGA 251 TGGCCAATGT GGACACTGCA GATACTGCCA CATACTACTG TGCTCGAATA 301 GAGGACTTTG ATTACGACGA GGAGTATTAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA 351 AGGAACCTCA GTCATCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA 501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT 551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG 601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA 651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT 701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG 751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA 801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG 851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC 901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA 951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG 1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CGTCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ IDNO:36)
5
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-B incluyendo el péptido señal:
1 MGRLTSSFLL LIVPAYVLSQ VTLKESGPGI LQPSQTLSLT CSFSGFSLST 51 SGMGVGWIRH PSGKNLEWLA HIWWDDVKRY NPVLKSRLTI SKDTSNSQVF 101 LKIANVDTAD TATYYCARIE DFDYDEEYYA MDYWGQGTSV IVSSAKTTPP 151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP 251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCWVDISKD DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH 451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ IDNO:37)
1 ATGGGCAGGC TTACTTCTTC ATTCCTGCTA CTGATTGTCC CTGCATATGT 51 CCTGTCCCAG GTTACTCTGA AAGAGTCTGG CCCTGGGATA TTGCAGCCCT 101 CCCAGACCCT CAGTCTGACT TGTTCTTTCT CTGGGTTTTC ACTGAGCACT 151 TCTGGTATGG GTGTAGGCTG GATTCGTCAC CCATCAGGGA AGAATCTGGA 201 GTGGCTGGCA CACATTTGGT GGGATGATGT CAAGCGCTAT AACCCAGTCC 251 TGAAGAGCCG ACTGACTATC TCCAAGGATA CCTCCAACAG CCAGGTATTC 301 CTCAAGATCG CCAATGTGGA CACTGCAGAT ACTGCCACAT ACTACTGTGC 351 TCGAATAGAG GACTTTGATT ACGACGAGGA GTATTATGCT ATGGACTACT 401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ATCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT 751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG 851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT 1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCGT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID NO:38)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-B son las siguientes:
5
CDR-H1: TSGMGVG (SEQ ID NO: 57)
CDR-H2: HIWWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID NO: 58)
CDR-H3: EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID NO: 59)
10 Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-B son:
CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID NO: 60)
CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID NO: 61)
CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID NO: 62)
15
Los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen a regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína. La unión de un anticuerpo con esclerostina puede correlacionarse con aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea conseguida mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y en el Ejemplo 12 (mono). Los aumentos de al menos 20 uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea pueden también conseguirse mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y Ejemplo 12 (mono). Puesto que la unión de un anticuerpo con esclerostina se determina principalmente por sus secuencias
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de CDR, puede generarse un anticuerpo con todas las secuencias de CDR divulgadas en un marco apropiado, donde el anticuerpo conserva la capacidad para unirse específicamente con esclerostina, y puede esperarse conseguir aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea. Dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento de afecciones humanas o animales que están provocadas por, asociadas con, o dan como resultado al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, baja calidad ósea y baja fuerza ósea. Se conocen por los expertos en la materia métodos para construir y expresar anticuerpos y fragmentos de los mismos que comprenden CDR de la presente invención.
Se describen posteriormente anticuerpos anti-esclerostina adicionales. Para algunas de las secuencias de aminoácidos las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están sombreadas en cajas y las regiones constantes están en negrita y cursiva.
Ab-2
Las secuencias de la LC y HC del Anticuerpo 2 (también denominado Ab-2) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-2:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:
1 QIVLSQSPAILSTSPGEKVT MTC|g§S“SVY Y®WYQQKPG SSPKPWTY'AT 51 SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLT1TRVEAE DÁATYY C^jQW SSDÍÜEFGAG m 'TKLElXRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS WCFLNNFYP KDÍNVKWKID 151 GSERQNGVLNSWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ID NO: 117)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:
1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTACAT CTCCAGGGGA 51 GAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTATAT TACATGCACT 101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGTTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG 201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCACCAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGAC ATC A ATGTC AAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID NO: 118) i
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:
1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AILSTSPGEK VTMTCRASSS 51 VYYMHWYQQK PGSSPKPWIY ATSNLASGVP VRFSGSGSGT SYSLTITRVE 101AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 151ASWCFLNNF YPKD1NVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK: TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO:l 19)
1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT 51 CATTATGTCC AGGGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCAATCCTGT 101 CTACATCTCC AGGGGAGAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 GTATATTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACC 201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAC CAGAGTGGAG 301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AGTGTTAG (SEQ ID NO: 120)
Cadena Pesada de Ab-2
5 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:
imagen5
151KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPA VLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKKTVP RJDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKD VL T 251ITLTPKVTCV WDISKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKTISKTKGR PKAPQVYTIP 351PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYKNTQPIMDTDG 401SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID NO:121)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:
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1 GAGGTTCAGG TGCAGCAGTC TGGGCCAGAA CTTGTGAAGC CAGGGGCCTC 51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CAACATTAAA GACTACTTTA 101 TACACTGGGT GAAGCAGAGG CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG 151 CTTGATCCTG AGGATGGTGA AAGTGATTAT GCCCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGCCATTATG ACAGCAGACA CATCATCCAA CACAGCCTAT CTTCAGCTCA 251 GAAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTATTGTGA GAGAGAGGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTT TTITCCTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC 601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG 701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC 751ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ IDNO:122)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:
1 MKCSWVIFFL MAWTGVNSE VQVQQSGPEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD 51 YFTHWVKQRP EQGLEWIGRL DPEDGESDYA PKFQDKAIMT ADTSSNTAYL 101 QLRSLTSEDT AIYYCEREDY DGTYTFFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPYTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKTVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFEF PPKPKDVLTITLTPKVTCW VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO: 123)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-2 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
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1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAG GTTCAGGTGC AGCAGTCTGG GCCAGAACTT GTGAAGCCAG 101 GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC 151 TACTTTATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT 201TGGAAGGCTT GATCCTGAGG ATGGTGAAAG TGATTATGCC CCGAAGTTCC 251AGGACAAGGC CATTATGACA GCAGACACAT CATCCAACAC AGCCTATCTT 301 CAGCTCAGAA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ATTGTGAGAG 351 AGAGGACTAC GATGGTACCT ACACCTTTTT TCCTTACTGG GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA 451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG 501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG 551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC 601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG 651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG 701ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA 751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT 801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA 851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA 1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID NO: 124)
Ab-3
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 3 (también denominado en el presente documento Ab-3) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-3
Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:
1. EIVLTQSPAL MAASPGEKVTITCSVSSWSNHEHWFQQK SDTSPKPWIY 51 GTMÉASGVP VRFSGSGSGT S YSLTIS SME ÁEDAATYYC'QjQ WSS^LfFG 101AGTKLELR/L4 DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG ASWCFLNNF YPKDINVKWK 151IDGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTL TLTKDEYERHNSYTCEATHK 201 TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO:125)
1 GAAATTGTGC TCACCCAGTC TCCAGCACTC ATGGCTGCAT CTCCGGGGGA 51 GAAGGTCACC ATCACCTGCA GTGTCAGTTC AACTATAAGT TCCAACCACT 101 TGCACTGGTT CCAGCAGAAG TCAGACACCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT 151 GGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG 201 ATCTGGGACC TCTTATTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG GCTGAGGATG 251 CTGCCACTTA TTACTGTCAA CAGTGGAGTA GTTACCCACT CACGTTCGGC 301 GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAGACGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC 351 CATCTTCCCA CC ATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG 401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG 451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA 501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA 551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG 601 ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGTTAG (SEQ ID NO: 126)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-3 incluyendo el péptido señal:
1 MDFHVQIFSF MLISVTVILS SGEIVLTQSP ALMAASPGEK VTITCSVSST 51ISSNHLHWFQ QKSDTSPKPWIYGTSNLASG VPVRFSGSGS GTSYSLTISS 101 MEAEDAATYY CQQWSSYPLT FGAGTKLELR RADAAPTVSIFPPSSEQLTS 151 GGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NO: 127)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGATTTTC ATGTGCAGAT TTTCAGCTTC ATGCTAATCA GTGTCACAGT 51 CATTTTGTCC AGTGGAGAAA TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA GCACTCATGG 101 CTGCATCTCC GGGGGAGAAG GTCACCATCA CCTGCAGTGT CAGTTCAACT 151 ATAAGTTCCA ACCACTTGCA CTGGTTCCAG CAGAAGTCAG ACACCTCCCC 201 CAAACCCTGG ATTTATGGCA CATCCAACCT GGCTTCTGGA GTCCCTGTTC 251 GCTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACCTCTT ATTCTCTCAC AATCAGCAGC 301 ATGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGTCAACAGT GGAGTAGTTA 351 CCCACTCACG TTCGGCGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAGA CGGGCTGATG 401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT 451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT 501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA 551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC 601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG 651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA 701 GGAATGAGTG TTAG (SEQ ID NO: 128)
10
Cadena pesada de Ab-3
1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCTASDFNIK DraHWMRQR PEQGLDWIGK 51 DEE^pDKATL TTDTSSNTAY LQLSGLTSET TAVYYCSRfc^
101WWGAGTT ITVSSAJrTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTW 201PSETVTCNVA HPASSTKVDKEJVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251DVLT1TLTPK VTCVWDISKDDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPIMHOD WLNGKE FKCR VNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401DTDGSYFIYS ELNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ ID NO: 129)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-3:
1 GAGGTTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAA CTTGTGAGGC CAGGGGCCTT 51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGAT GAGGCAGCGG CCTGAACAGG GCCTGGACTG GATTGGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGCCACTCTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTGCAGCTCA 251 GCGGCCTGAC ATCTGAGACC ACTGCCGTCT ATTACTGTTC TAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCGC 351 AGGGACCACA ATCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA 501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT 5 551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG
601 CCCAGCGAGA CCüicACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA 651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT 701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG 751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA 801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG 851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC 901ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA 951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG 1051TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 1151AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ ID NO: 130)
1 MKCSWVIFFL MAWTGVNSE VQLQQSGAEL VRPGALVKLS CTASDFNIKD 51 FYLHWMRQRP EQGLDWIGRIDPENGDTLYD PKFQDKATLT TDTSSNTAYL 101 QLSGLTSETT AVYYCSREAD YFHDGTSYWY FDVWGAGTTITVSSAKTTPP 151 SYYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SYTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDCGCKP 251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TGWVDISKD DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMITDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH 451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID NO: 131)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCITCCTG ATGGC AGTGG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTT GTGAGGCCAG 101 GGGCCTTAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC 151 TTCTATCTAC ACTGGATGAG GCAGCGGCCT GAACAGGGCC TGGACTGGAT 201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCC 251 AGGACAAGGC CACTCTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG 301 CAGCTCAGCG GCCTGACATC TGAGACCACT GCCGTCTATT ACTGTTCTAG 351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT 401 GGGGCGCAGG GACCACAATC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT 751TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG 851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 5 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT
1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID NO: 132)
Ab-4
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 4 (también denominado en el presente documento Ab-4) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-4
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:
1 DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISC^SQDlpTO^WYQQKP DGTFKLLIFp 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQEDFATYFdQQ^TLPYTFGG 10 l GTKLEIKJMi) AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SWCFLNNFYPKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEA THKT 201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:133)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:
1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCÁ GGGC AAGTCA AGAC ATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 134)
10
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQUSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS 51NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SWCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 135)
15 Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-4 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTÜÜGAGA UAUüurCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO: 136)
Cadena Pesada de Ab-4
5 Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYMfflWVKQN QGKTLEWIGE 51 |Cí}PÍS^(^.NQjp^ATL TVDKSSTTAY MEIJRSLTSED SAVYYCARÍp “ 101 TOfetíD^^pyWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151LVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVJITFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHP ÁSSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 3OÍ RSVSELPIMH ODWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351IPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTOPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID NO: 137)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC Tí) í)í X'tT CÍbXCCT C(X AAGGAGC A GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO: 138) .
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:
5
1MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFID 51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL YKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKTV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO:139) .
1ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGAT 201AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca CCTTCCCAGC tgtcctgcag 601TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT gtgcagaaga 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACITTCACCT GCTCTGTQTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
Wí'X'(SÉ'Q'tb1ÑC5:r40)
Ab-4 se humanizó para generar Ab-5. 5
Ab-5
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 5 (también denominado en el presente documento Ab-5) son las siguientes:
10
Cadena Ligera de Ab-5
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCÍ^SQDISÑYLÍÍWYQQKP GKAPKLLIYY. 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD FTLUSSLQP EDFATYYC'QQ¿G0TLPYrFGG 101 GTKVEIOTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFYPREÁKVQ WKV 151DNALQSGNSQ ESVWQDSKD STYSLSSTL T LSKAD YEKHK VYACEVTHQG 201LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 141)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA 51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA 101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT 151ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC 201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG 251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC 301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT 351 CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT 401 GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG 451 GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA 501 CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG 551 CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC 601 CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT (SEQ ID NO: 142) •
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VHTCRASQD 51ISNYLNWYQQ KPGKAPKLLIYYTSRLLSGV PSRFSGSGSG TDFTLHSSL 101 QPEDFATYYC QQGDTLPYTF GGGTKVEIKR TVAAPSYFIF PPSDEQLKSG 151 TASWCLLNN FYPREAKV QW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO:143)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
10
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT 101 CCGCATCCGT AGGCGACCGC GTAACCATAA CATGTAGAGC ATCTCAAGAT 151 ATTTCCAACT ATTTGAATTG GTACCAACAA AAACCCGGCA AAGCACCTAA 201 ACTCCTCATT TACTATACAT CAAGACTCCT CTCCGGCGTT CCATCACGAT 251 TCTCAGGCTC CGGCTCCGGC ACAGATTTCA CACTCACTAT TTCCTCCCTC 301 CAACCAGAAG ATTTTGCAAC CTATTACTGT CAACAAGGCG ATACACTCCC 351 ATACACATTC GGCGGCGGCA CAAAAGTTGA AATTAAACGT ACGGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA
50 í AGÍAÜÁGfGG XAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGT (SEQ ID NO: 144)
Cadena Pesada de Ab-5
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5: 15
imagen6
151LVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSS WTVPSSNFG 201 TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK 251DTLMISRTPE VTCVWDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPJEKTISKTKGQPREPQV 351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 401DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTO KSLSLSPGK (SEQ IDNO:145)
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5 sin lisina carboxi-terminal:
imagen7
101 ¥DDp®DWYF,DWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 151LVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPA VL QSSGLYSLSS WTVPSSNFG 201 TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV 351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ 5 IDNO:392)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG 51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA 101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA 151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG 201AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC 251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG 301TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC 351AACAGTTACC GTCTCTAGTG CCTCCACCAA GGGCCCATCG GTCTTCCCCC 401 TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC CCTGGGCTGC 451 CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG 501 CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA CAGTCCTCAG 551 GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAACTTCGGC 601ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT 651 GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA CCGTGCCCAG 701CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG
751 GÁCACCCTCÁTGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG TGGTGGTGGA 801 CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG 851 TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC 901 ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG ACTGGCTGAA 951 CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC CCAGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG 1051 TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC AGGTCAGCCT 1101 GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG 1151 AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC TCCCATGCTG 1201 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG 1251 CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC 1301 TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAA (SEQ ID NO: 146)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:
1MDWTWRELFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEY KKPGASVKVS CKASGYTFTD 51 YNMHWVRQAP GQGLEWMGEINPNSGGAGYN QKFKGRVTMT TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYT CNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP 251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVQFNWYV 301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRWSYLTW HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV 401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLY SK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH 451 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 147)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
5
10
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTA AAAAAACCAG 101 GAGCAAGCGT TAAAGTTTCT TGTAAAGCAA GCGGATATAC ATTTACAGAT 151 TACAACATGC ATTGGGTAAG ACAAGCGCCA GGACAAGGAT TGGAATGGAT 201 GGGCGAAATT AACCCTAATA GTGGAGGAGC AGGCTACAAT CAAAAATTCA 251 AAGGGAGAGT TACAATGACA ACAGACACAA GCACTTCAAC AGCATATATG 301 GAACTGCGAT CACTTAGAAG CGACGATACA GCTGTATACT ATTGCGCACG 351 ACTTGGGTAT GATGATATAT ATGATGACTG GTATTTCGAT GTTTGGGGCC 401 AGGGAACAAC AGTTACCGTC TCTAGTGCCT CCACCAAGGG CCCATCGGTC 451TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG 601TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA 651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG 901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC 1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAQA CCACACCTCC 1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG 1401 TAAA (SEQ ID NO: 148)
Dominios variables de Ab-5:
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):
1DIQMTQSPSS LSASVGDRVT GKAPKLLIYY
51 ÍSRBLfSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP ÉDFÁTYYC|QQ(mmJPYTFGG 10rGTKVEIK(SEQIDNO:376) . ...................
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA 51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA 101ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT 151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC 201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG 251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC 301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA A (SEQ ID NO:377)
5
10
15
20
25
30
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):
imagen8
imagen9
La secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG 51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA 101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA 151ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG 201AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC 251 GATCACTTAG ÁAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG 301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC 351AACAGTTACC GTCTCTAGT (SEQ ID NO:379)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-5 son las siguientes:
CDR-H1: DYNMH (SEQ ID NO: 245)
CDR-H2: EINPNSGGAGYNQKFKG (SEQ ID NO: 246)
CDR-H3: LGYDDIYDDWYFDV (SEQ ID NO: 247)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-5 son:
CDR-L1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 78)
CDR-L2: YTSRLLS (SEQ ID NO: 79)
CDR-L3: QQGDTLPYT (SEQ ID NO: 80)
Ab-6
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 6 (también denominado en el presente documento Ab-6) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-6
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCÍASQDIS^ͧWFQQKP DGTLKLLIFpl 51 ff SRplSGVPS RFSGSGSGTP YSLÜSÑLÉQ ÉDIATYFCQ^GbllífYXFGG 101 GTKLEIR/L4D AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SWCFLNNFYPIWINVKWKl 151DGSERONGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEA THKT 201STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 149)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:
5
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TAC ATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT GATCTTCTAC 151ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA GAAGATATTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGGGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 150)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-6 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVTISCRASQDIS 51NYLNWFQQKP DGTLKLLIFY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ 101EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIRRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SWCFLNNFY PKDINVKWRIDGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 151)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT 201 GATCTTCTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC 351 GTTCGGGGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO: 152)
Cadena Pesada de Ab-6
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-6:
1 ^ ^ ^ .
51 Í^NS^GSGYÑQKFKtíKAlX TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARt^
101 ^jSSYÉft’^TODYWGÁG'l’TVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPA VL QSDLTTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPEAPQVYT 351TPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID NO: 153)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-6:
5
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAACAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TAGTGGCTAC AACCAAAAGT TCAAAGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGTC 301 TACGATGGCA GCTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC ,',9(TÍ tídfc'rcMtC'A GÍGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAQTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO: 154)
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKSLEWIGEINPNSQGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLVY DGSYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO:155)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
5
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA ACAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT 201AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTAG TGGCTACAAC CAAAAGTTCA 251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CTTCCAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGTCTAC GATGGCAGCT ACGAGGACTG GTACTTCGAT QTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT
"i‘25'1 "gSXcX'cX'Gát ggctcttact TCATCTACAG CAAGCTCAAT gtgcagaaga
1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID NO: 156)
Ab-7
10 Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 7 (también denominado en el presente documento Ab-7) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-7
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:
5
imagen10
101 GTKLEIKZWD AAPTVSIFPP SSEOLTSGGA SWCFLNNFYPKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTEDEYERHN SYTCEA THKT 201STSPTVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 157)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC AATTATTTAT 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT GATCTACTAC 151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG GAAGATATTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACQACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID NO:158)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVTICCRASQVIT 51NYLYWYQQKP DGTFKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ 101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SWCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:159)
15 Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-7 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC 151 AATTATTTAT ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC
351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA QAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GT (SEQ ED NO: 160)
Cadena Pesada de Ab-7
5 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:
1 EVQLQQSGPELÍvpíPGASVKM SCKASGYTFT DY^MHWMKQN QGKSLEWIGÉ
51INPNSQGAGY NQQFKGKATL TVDKSSRTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG 10 rYVGNYEDMnG7 DVWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC
151LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEOFNSTF 301RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTKGRPKAPQVYT 351IPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAGNTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID NO:161)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:
10
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAATG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGCAGT TCAAAGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG GACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACGTTGGTA ATTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TQAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTQTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA ' ' 130 Í ÁCCACCXtAÜ TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA A (SEQ ID NO: 162)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:
5
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGAGYN QQFKGKATLT VDKSSRTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY VGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRQCGCKPCI 251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD 301VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351IEKUSKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 163)
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAATGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGCAGTTCA 251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGGAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GTTGGTAATT ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG AGTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACÍAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAA
(SEQ IDNO:164)
Ab-8
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 8 (también denominado en el presente documento Ab-8) son las 5 siguientes:
Cadena Ligera de Ab-8
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:
10 __ __
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVSISCRASQDIS NYLNWYQQP DGTFKLLIFYj
51ITSRIXSJ3VPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQGDTLPYfFGG
101 GTKLEIK/MD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SWCFLNNFY PKDINVKWKI
151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTL TKDEYERHN SYTCEA THKT
201STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 165)
5
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA 101ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 166)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-8 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVSISCRASQDIS 51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLUYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SWCFLNNFY PKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 167)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO:168)
Cadena Pesada de Ab-8
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLDWIGE 51INPÑSGGÁGY ÑQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG " 101YDDIYDDWYF DYWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151LVKGYFPEPVTVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 291ETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351IPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEA G NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID
NO: 169)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-8:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGACTG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT gtgcccaggg attgtggttg TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID 5 NO: 170)
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKTLDWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSY 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKQYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ
' 201 SDWtLsSW tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci
251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL HTLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351IEKTISKTKG RPKAPQVYIIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 171)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
5
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTQAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGACTGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAQA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID NO: 172)
Ab-9
10 Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 9 (también denominado en el presente documento Ab-9) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-9
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:
5
imagen11
101 GTKVEIK&4D AAPTVSIFPP SSEOLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDE YERHN SYTCEA THKT 201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 173)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:
1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA gggcaagtca AGACATTAGC AATTATTTAA 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID NO: 174)
10
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:
1MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVSISCRASQDIS 51NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTTYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 175)
15 Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAQGG GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GT (SEQEDNQ:176)
Cadena Pesada de Ab-9
5 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:
1 EVQLQQSGPE LMKPGTSVKM SCKASGYTFT DYÑIvSíWVKQT QGKTLEWIGE 51 teNSGGÁGY NQ^KGlKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAKLp" 101 YDDIYDD^YF DVWGAGTTVT VSSAKTTAPS VYPLAPVCGD TTGSSVTLGC
151L VKGYFPEPV TLTWNSGSLS SD VHTFPALL QSGLYTLSSS VTVTTWPSQT 201ITCNVAHPAS STKVDKKIEP R GSPTHKPCP PCPAPNLLGG PSVFIFPPKI 251KDVLM1SLSPMVTCVWDVS EDDPDVHVSWFVNNVEVHTA QTQTHREDYN
"301 WlÉWSMPÍQHQDWMSGKEFKCKVNNKA LPAPIERT1S KPKGPVRAPQ
351 VYVLPPPEEE MTKKQVTLTC MITDFMPEDIYVE WTNNGQT ELNYKNTEPV 401LDSDGSYFMY SKLR VEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHT TKSFSRTPGK (SEQIDNO:177)
10 Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGACTTC 51AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAGCAGACC CAAGGAAAGA CCCTAGAQTG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAAATTGGGC 301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACAAC AGCCCCATCG GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGT GTGTGGAGAT ACAACTGGCT CCTCGGTGAC TCTAGGATGC 451 CTGGTCAAGG GTTATTTCCC TGAGCCAGTG ACCTTGACCT GGAACTCTGG 501ATCCCTGTCC AGTGATGTGC ACACCTTCCC AGCTCTCCTG CAGTCTGGCC 551 TCTACACCCT CAGCAGCTCA GTGACTGTAA CCACCTGGCC CAGCCAGACC 601 ATCACCTGCA ATGTGGCCCA CCCGGCAAGC AGCACCAAAG TGGACAAGAA 651 AATTGAGCCC AGAGGGTCCC CAACACATAA ACCCTGTCCT CCATGCCCAG 701 CTCCTAACCT CTTGGGTGGA CCATCCGTCT TCATCTTCCC TCCAAAGATC 751 AAGGATGTAC TCATGATCTC CCTGAGCCCC ATGGTCACGT GTGTGGTGGT 801 GGATGTGAGC GAGGATGACC CAGATGTCCA TGTCAGCTGG TTCGTGAACA 851ACGTGGAAGT ACACACAGCT CAGACACAAA CCCATAGAGA GGATTACAAC 901 AGTACTATCC GGGTGGTCAG TGCCCTCCCC ATCCAGCACC AGGACTGGAT 951 GAGTGGCAAG GAGTTCAAAT GCAAGGTCAA CAACAAAGCC CTCCCAGCGC 1001 CCATCGAGAG AACCATCTCA AAACCCAAAG GGCCAGTAAG AGCTCCACAG 1051 GTATATGTCT TGCCTCCACC AGAAGAAGAG ATGACTAAGA AACAGGTCAC 1101 TCTGACCTGC ATGATCACAG ACTTCATGCC TGAAGACATT TACGTGGAGT f 1151 GGACCAACAA CGGGCAAACA GAGCTAAACT ACAAGAACAC TGAACCAGTC 1201 CTGGACTCTG ATGGTTCTTA CTTCATGTAC AGCAAGCTGA GAGTGGAAAA 1251 GAAGAACTGG GTGGAAAGAA ATAGCTACTC CTGTTCAGTG GTCCACGAGG 1301 GTCTGCACAA TCACCACACG ACTAAGAGCT TCTCCCGGAC TCCGGGTAAA (SEQIDNO:178)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGTSVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQTQ GKTLEWIGEINPNSGQAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCAKLGY DDIYDDWYFD YWGAGTTVTV SSAKTTAPSV 151 YPLAPVCGDT TGSSVTLGCL VKGYFPEPVT LTWNSGSLSS DVHTFPALLQ 201 SGLYTLSSSV TVTTWPSQTITCNVAHPASS TKVDKfGEPR GSPTHKPCPP 251 CPAPNLLGGP SVFIFPPKIK DVLMISLSPM VTCVWDVSE DDPDVHVSWF 301 VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS TTRVYSALPIQHQDWMSGKE FKCKVNNKAL 3 51 PAPIERTISK PKGPVRAPQV YVLPPPEEEM TKKQVTLTCMITDFMPEPIY 401 VEWTNNGQTE LNYKNTEPVL DSDGSYFMYS KLRVEKKNWV ERNSYSCSW 5 451 HEGLHNHHTT KSFSRTPGK (SEQ ID NO: 179)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG
101 GGACTTCÁGf GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGAT 201AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAA 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACAACAGC CCCATCGGTC 451TATCCACTGG CCCCTGTGTG TGGAGATACA ACTGGCTCCT CGGTGACTCT 501AGGATGCCTG GTCAAGGGTT ATTTCCCTGA GCCAGTGACC TTGACCTGGA 551ACTCTGGATC CCTGTCCAGT GATGTGCACA CCTTCCCAGC TCTCCTGCAG 601 TCTGGCCTCT ACACCCTCAG CAGCTCAGTG ACTGTAACCA CCTGGCCCAG 651 CCAGACCATC ACCTGCAATG TGGCCCACCC GGCAAGCAGC ACCAAAGTGG 701ACAAGAAAAT TGAGCCCAGA GGGTCCCCAA CACATAAACC CTGTCCTCCA 751 TGCCCAGCTC CTAACCTCTT GGGTGGACCA TCCGTCTTCA TCTTCCCTCC 801AAAGATCAAG GATGTACTCA TGATCTCCCT GAGCCCCATG GTCACGTGTG 851 TGGTGGTGGA TGTGAGCGAG GATGACCCAG ATGTCCATGT CAGCTGGTTC 901GTGAACAACG TGGAAGTACA CACAGCTCAG ACACAAACCC ATAGAGAGGA 951 TTACAACAGT ACTATCCGGG TGGTCAGTGC CCTCCCCATC CAGCACCAGG 1001ACTGGATGAG TGGCAAGGAG TTCAAATGCA AGGTCAACAA CAAAGCCCTC 1051 CCAGCGCCCA TCGAGAGAAC CATCTCAAAA CCCAAAGGGC CAGTAAGAGC 1101 TCCACAGGTA TATGTCTTGC CTCCACCAGA AGAAGAGATG ACTAAGAAAC 1151AGGTCACTCT GACCTGCATG ATCACAGACT TCATGCCTGA AGACATTTAC 1201 GTGGAGTGGA CCAACAACGG GCAAACAGAG CTAAACTACA AGAACACTGA 1251ACCAGTCCTG GACTCTGATG GTTCTTACTT CATGTACAGC AAGCTGAGAG 1301TGGAAAAGAA GAACTGGGTG GAAAGAAATA GCTACTCCTG TTCAGTGGTC 1351 CACGAGGGTC TGCACAATCA CCACACGACT AAGAGCTTCT CCCGGACTCC 1401 GGGTAAA (SEQ ED NO: 180)
Ab-10
5
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 10 (también denominado en el presente documento Ab-10) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-10
10 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-10:
imagen12
15
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT
451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 182)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-10 incluyendo el péptido señal:
5
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS ESASLGDRVSISCRASQDIS 51NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTTYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA 151 SWCFLNNFY PKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 183)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 0 701 GTTAG (SEQ ID NO: 184)
Cadena Pesada de Ab-10
15
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNptWVKQN QGKTLEWIGÉ 51 Ñ^KFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARiJ
101 YDDIY^DWYF DVjWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151LVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301RSVSELPMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351IPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTOPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ H) NO: 185)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 5 101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAATG GATAGGAGAA
Í51 ATTÁATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATQGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCÁA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO: 186)
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 EERSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRJDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITP FFPEPITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 187)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTC AGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAATGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGÁCACC CCCATCTGTC 451TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 5 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA
ru«| ****** HIM#» f* ««<41 «r H<NI* •UM1 u «nw* ____
551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA ggtcacgtgt gttgtggtag 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID NO: 188)
Ab-11
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 11 (también denominado en el presente documento Ab-11) son las siguientes:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-11:
1 QIVLSQSPAF LSVSPGDKVT MTC^SSSIS^ÍHWFQQKPG SSPRSWTYAÍi 51 SNEÁ^GVPGR FSGSGSGTSY SLTÍSRVEAE DÁATYYC^#T^MLlFGÁG i o i tklfXkrada aptvsifpps seqltsggas wcflnnfyp KDINVKWKID 151 GSERQNGVLNSWTDODSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ID NO: 189)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-11:
1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCATTC CTQTCTGTAT CTCCAQGGGA 51 TAAGGTCÁCA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT 101 GGTTTCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA GATCCTGGAT TTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGGTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG 201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAG GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAQGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID NO: 190)
10
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:
1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AFLSVSPGDK VTMTCRASSS 51TSYIHWFQQK PGSSPRSWIY ATSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTISRVE 101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTYSIFP PSSEQLTSGG 151 ASWCFLNNF YPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO:191)
15
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-11 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT 51 CATAATGTCC AGAGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCATTCCTGT 101 CTGTATCTCC AGGGGATAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 ATAAGTTACA TACACTGGTT TCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAGATC 201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GGTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG 301 GCTGAGGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701AGTGTTAG (SEQ ID NO: 192)
Cadena Pesada de Ab-11
5 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:
imagen13
151KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPA VLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAIÍPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKDVLT 251ITLTPKVTCV WDISKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKTISKTKGR PKAPQVYTIP 351PPKEQMAKDK VSITCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYKNTQPIMDTDG 401SYFHSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID NO: 193)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:
10
1 GAAGTTCAGC TGCAACAGTC TGGGGCAGAC CTTGTGCAGC CAGGGGCCTC 51 AGTCAAGGTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CGACATTAAG GACTACTATA 101 TACACTGGAT GAAACAGAGG CCTGACCAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGCCACTTTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACÁGCCTAC CTACAACTCA 251 GAGGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTACTGTGG GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC
601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG 701AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC 751ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ ID NO:194)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:
1 MKCSWVIFFL MAWTGVNSE VQLQQSGADL VQPGASVKVS CTASGFDIKD 51YYIHWMKQRP DQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKATFT TDTSSNTAYL 101 QLRGLTSEDT AIYYCGREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCW VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSY SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KT1SKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 5 451NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO: 195)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-1
incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAA GTTCAGCTGC AACAGTCTGG GGCAGACCTT GTGCAGCCAG 101 GGGCCTCAGT CAAGGTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCGA CATTAAGGAC 151TACTATATAC ACTGGATGAA ACAGAGGCCT GACCAGGGCC TGGAGTGGAT 201 TGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC 251 CGGGCAAGGC CACTTTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA 301 CAACTCAGAG GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ACTGTGGGAG 351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA 451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATQ 501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG 551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC 601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAQ 651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG 701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA 751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT 801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA 851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA 1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG l05l'AAÁACC"ÁTCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID NO: 196)
Ab-12
5
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 12 (también denominado en el presente documento Ab-12) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-12
10
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-12:
1 DLQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC^QDIS Í^NWYQQKP DGTVKLLIFY.
51 píSTL^GVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLEQ DDAATYFC^QGflTÉPYTFGG 101 GTKLEIK/MZ) AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFYPKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201STSPTVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 197)
5
10
1 GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT GATCTTCTAC 151 ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AG¡GTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA GATGATGCTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 198)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-12 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGSRC DLQMTQTTSS LSASLGDRVTISCRASQDIS 51NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN. YSLTITNLEQ 101 DDAATYFCQQ GDTEPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SWCFLNNFY PKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPTVKSFN RNEC (SEQ ID NO:199)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TTCCAGATGT GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
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151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT 201 GATCTTCTAC ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA 301 GATGATGCTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC 351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACQ 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID N0:200)
Cadena Pesada de Ab-12
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYpiHWMKQN QGKSLEWIGE
51 ^Fs^sgF^qi^kg^tltvdkssstaymelrsltsed savyycarLQ i oí tcgnyedwyf dvwgagttvt vssakttpps vyplapgsaa qtnsmvtzgc
151LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEOFNSTF 301RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPOVYT 351FPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTOPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEA G NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ED NO-.201)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:
1 GAGGTCCAGT TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 ÁGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAG 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TTCTGGTTAC AACCAGAAGT TCAAAGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACTATGGTA ACTACGAGGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCTG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT QATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA QTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 5 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG
110 í CAIGATAAC A GÁCTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151ATGQGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO:202)
5
1 MGWSWTFLFL LSGTSGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY YGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRQCGCKPCI 251 CTVPEYSSVF EFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN YQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO:203)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTTCGGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGTTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT 201 AGGAGAGATT AATCCTAACA GTGGTGGTTC TGGTTACAAC CAGAAGTTCA 251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC TATGGTAACT ACGAGGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCTGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TQGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 gcccagcgag accgtcacct GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID NO:204)
Ab-13
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 13 (también denominado en el presente documento Ab-13) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-13
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-13:
1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVT SSYLNWYQQK PGSSPKLWIY 51STSNLÁSGVP ARFSGSGSGT SYSLTISSVE ÁEDAATYYCQ QYDFFPSTFG
101 GGTKLEDGL4 DAAPTVSIFP PSSEQLTSGQASWCFLNNF YPKDINVKWK 151LDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTL TLTKDEYERH NSYTCpA THK 201 TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO:205)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-13:
1 CAGATTGTTC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA 51 GAAGGTCACC ATGACCTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAACT TCCAGTTACT 101 TGAACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCTT CCCCCAAACT CTGGATTTAT 151 AGCACATCCA ACCTGGCTTC AGGAGTCCCA GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG 201 GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGTGTGGAG GCTGAGGATG 251 CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTATGATT TTTTCCCATC GACGTTCGGT 301 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC 351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG 401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG 451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA 501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA 551AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG 601ACATCAACTT CACCCATCGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGT (SEQ ID NO:206)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:
1 MDSQVQIFSF LLISALVKMS RGQIVLTQSP AIMSASPGEK VTMTCRASSS 51 VTSSYLNWYQ QKPGSSPRLWIYSTSNLASG VPARFSGSGS GTSYSLTISS 101 VEAEDAATYY CQQYDFFPST FGGGTKLEIK RADAAPTV SI FPPSSEQLTS 151 GGASWCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPTVK SFNRNEC (SEQ ID NO:207)
15 Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGATTCTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTTCTAATCA GTGCCTTAGT 51 CAAAATGTCC AGAGGACAGA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT 101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 GTAACTTCCA GTTACTTGAA CTGGTACCAG CAGAAGCCAG GATCTTCCCC 201 CAAACTCTGG ATTTATAGCA CATCCAACCT GGCTTCAGGA GTCCCAGCTC 251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGT 301 GTGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGCCAGCAGT ATGATTTTTT 351 CCCATCGACG TTCGGTGGAG GCACCAAGCT GGAAATCAAG CGGGCTGATG 401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT 451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT 501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA
551 ^Á^frd^AC'YÓATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTAC AG CATGAGC AGC
601ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG 651 TGAGGCCACT CACAAQACAT CAACTTCACC CATCGTCAAG AGCTTCAACA 701 GGAATGAGTG T (SEQ ID NO:208)
Cadena Pesada de Ab-13
5 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:
1 EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT pYYMNWVKQS HGESLEWIGpj 51 INPYNbDTTY NI®KGKATL TVDKSSNTAY MQLNSLTSED SAVYYCARET 101 AVITTNÁMDY WGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV 151KGYFPEPVTVTWNSGSLSSG VHTFPAVLQSDLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKIÚVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKDVLT 251ITLTPKVTCV WDISKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKTISKTKGR PKAPQVYTIP 351PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYKNTQPIMDTDG 401SYF1YSKLNV QKSNWEA GNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID NO:209)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:
10
1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC OTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACTACA 101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGAGAGA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCTT ACAACGATGA TACTACCTAC AACCACAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAA CACAGCCTAC ATGCAGCTCA 251 ACAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGAGACG 301 GCCGTTATTA CTACGAATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT 351 CACCGTCTCC TCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC 601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTQTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG 701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCÁA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC 751ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC ’ 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAA (SEQ ID NO:210)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:
1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YYMNWVKQSH GESLEWIGPINPYNDDTTYN HKFKGKATLT VDKSSNTAYM 101 QLNSLTSEDS AVYYCARETA VITTNAMDYW GQQTSVTVSS AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPYTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCW YDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401NGQPAENYKN TQPMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSYLHEGLH 451NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO:211)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 TACTACATGA ACTGGGTGAA GCAQAGCCAT GGAGAGAGCC TTGAGTGGAT 201 TGGAGATATT AATCCTTACA ACGATGATAC TACCTACAAC CACAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG 301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351AGAGACGGCC GTTATTACTA CGAATGCTAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA 401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA 451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG 501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG 551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC 601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG 651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAQGTGG 701ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA 751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT 801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA 851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT' 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA 1001AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG 1051AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AA (SEQ ID
NO:212)
Ab-13 se humanizó para generar Ab-14.
5 Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 14 (también denominado en el presente documento Ab-14) son las
siguientes:
Cadena Ligera de Ab-14
10 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-14:
1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVTITCRASSSVT SSmíWYQQK PGKAPKLLIY 51 SfSNLAS'GVP SRFSGSGSGT EFÍXTISSLQ PEDFATYYCQQYDFFPSTFG 101 GGTKVEDGRr VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQ WK 151 VDNALOSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQ 201 GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:213)
1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA 51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC 101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC 151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG 201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT 251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA 301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAGCGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT 351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG 401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG 451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA 501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA 551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID NO:214)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:
1MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VHTCRASSS 51 VTSSYLNWYQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASG VPSRFSGSGS GTEFTLTISS 101 LQPEDFATYY CQQYDFFPST FGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS 151 GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS 201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:215)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-14 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGCTGAC CCAGAGCCCC AGCTTCCTTT 101 CCGCATCCGT TGGTGACCGA GTAACAATCA CATGCCGCGC CTCATCTTCA 151 GTTACATCTT CTTATCTTAA TTGGTATCAA CAAAAACCAG GAAAAGCACC 201 TAAACTTCTT ATATACTCTA CATCTAATCT CGCATCAGGA GTTCCCTCTC 251 GATTTTCAGG ATCTGGATCA GGCACAGAAT TTACACTTAC TATATCATCA 301 CTCCAACCAG AAGACTTCGC CACTTATTAC TGCCAACAAT ACGATTTTTT 351 TCCAAGCACA TTCGGAGGAG GTACAAAAGT AGAAATCAAG CGTACGGTGG 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 701 GGGGAGAGTQ T (SEQ ID NO:216)
10
Cadena Pesada de Ab-14
imagen14
101ÁVTTTNAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCL V 151KDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSW TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF 301RWSVLTWH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA P1EKTISKTK GQPREPQVYT 351LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:217)
5
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14 sin lisina carboxilo- terminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT pYYÍÑIÑWVRQA PGQRLEWMGDj 51 fi^^WDtf|tN^KGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARÉT " 101 AYlirErAMl^Y WGQGITVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV
151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPA VLQS SGLYSLSSW TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF 301 RWSVLTWH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401 DGSFFLYSKL TVDKSR WQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO:393)
Secuencia de ácido de nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAQ CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG 51 CGTAAAGGTT AGTTGC AAAG CATCTGGATA C AC ATTTACC GACTACTAC A 101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC 151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG 201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT 251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT 301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGQTCAAG GAACCACTGT 3 51 TACCGTCTCT AGTGCCTCC A CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC CCCCTGGCGC 401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC 451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT 501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT 551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG 601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA 651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC 701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC 751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG 801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG 851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC 901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA 951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCÁTCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC 1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG 1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGC A 1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC 1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ID NO:218)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWIULFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD 51 YYMNWVRQAP GQRLEWMGDINPYNDDTTYN HKFKGRVTIT RDTSASTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARETA VTTTNAMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYPPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP 251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVQFNWYVDQ 301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR WSVLTWHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP 351IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAYEW 401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO:219)
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTC AAGAAACCTG 101 GAGCAAGCGT AAAGGTTAGT TGCAAAGCAT CTGGATACAC ATTTACCGAC 151 TACTACATGA ATTGGGTACG ACAAGCCCCT GGACAAAGAC TTGAATGGAT 201 GGGAGACATT AACCCTTATA ACGACGACAC TACATACAAT CATAAATTTA 251 AAGGAAGAGT TACAATTACA AGAGATACAT CCGCATCAAC CGCCTATATG 3 01 GAACTTTCCT CATTQAGATC TGAAGACACT GCTGTTTATT ACTGTGC AAG 3 51 AGAAACTGCC GTTATTACTA CTAACGCTAT GGATTACTGG GGTC AAGGAA 401 CCACTGTTAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG 651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA 751 GCACCACCTQ TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC QAAAACCCAA 801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG 851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GAC AAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA 1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCQAG AACCACAGGT 1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC 1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT 1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA 1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT QCTCCGTGAT GCATGAGGCT 1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTQTCTC CGGGTAAA
(SEQ ID NO:220)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-14 son:
5
CDR-H1: DYYNIN (SEQ ID NO: 296)
CDR-H2: DINPYNDDTTYNHKFKG (SEQ ID NO: 297)
CDR-H3: ETAVTTINAMD (SEQ ID NO: 298)
10 Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-14 son:
CDR-L1: RASSSVTSSYLN (SEQ ID NO: 284)
CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID NO: 285)
CDR-L3: QQYDFFPST (SEQ ID NO: 286)
15
Dominios variables de Ab-14
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):
imagen15
101 GGTKVEIK (SEQ ID NO:380)
Secuencia de ADN del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):
1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA 51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC 101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC 151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG 201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT 251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA 301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAG (SEQ ID NO:381)
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):
5 101 ^YITTNAMDY WGQGTTVTVS S (SEQ ID NO:382)
Secuencia de ADN del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG QTCAAGAAAC CTGGAGCAAG 51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTACA 101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC 151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG 201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT 251 cctcattgag ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT 301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT 10 351 TACCGTCTCT AGT (SEQ ID NO:383)
Ab-3 se humanizó para generar Ab-15.
Ab-15
15
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 15 (también denominado en el presente documento Ab-15) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-15:
20 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSVSS’TIS SÑHLHWFQQK PGKAPKSLIY 51 jGTSÑLASGVP SRFSGSGSGT DFTUTSSLQ PEDFATYYC^WSS^LTFG 101 GGTKVEIOr VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQWK 151 VDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHO 201 GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:221)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15: 25
5
10
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA 51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC 101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC 151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCQTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG 201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT 251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC 301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAACGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT 351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG 401 TGTGCCTGCT QAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG 451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA 501 ggacagcaag gacagcacct acagcctcag CAGCACCCTQ acgctgagca 551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAQCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID NO:222)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VITTCSVSST 51ISSNHLHWFQ QKPGKAPKSLIYGTSNLASG VPSRFSGSGS GTDFTLTISS 101 LQPEDFATYY CQQWSSYPLT FGGGTKYEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS 151 GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNAEQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS 201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:223)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-15 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAQATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT
'iol CAGCATCCGt AGGCGATAGA GTTACAATAA CATGCAGCGT ATCATCAACT 151ATATCATCAA ATCATCTTCA TTGGTTCCAA CAGAAACCCG GCAAAGCACC 201 TAAATCACTT ATATACGGCA CATCAAATCT CGCATCAGGC GTTCCTTCAA 251 GATTTTCAGG CTCTGGCTCA GGCACCGACT TTACTCTTAC AATATCCTCC 301 CTCCAACCCG AAGACTTCGC AACCTATTAC TGTCAACAAT GGTCCTCATA 351TCCACTCACA TTTGGCGGCG GCACAAAAGT AGAAATTAAA CGTACGGTGG 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 501 caaagtacag TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA QCACCTACAG CCTCAGCAGC 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAQ AAACACAAAG TCTACGCCTG 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID NO:224)
Cadena Pesada de A-15
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK pi®ÍWVRQA PGQGLEWIGÜ 51 ÍDPEÑfpfLY^PWQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARfeÁ1 101 DYEHDdtrSY^ YFD VWGRGTL VV/SSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL 151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSWTVPSSN 201 FGTQTYTCNVDHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK 251PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVQFN WYVDGVE VHN AKTKPREEQF 301NSTFRWSVL TWHODWLNGKEYKCKVSNK GLPAPIEKTISKTKGQPREP 351 QVYTLPPSRE EMTKNOVSLT CL VKGFYPSDIA VEWESNGQ PENNYKTTPP 401 MLDSDGSFFl YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 451K (SEQ ID NO:225) .
5
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15 sin lisina carboxilo- terminal:
imagen16
151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSWTVPSSN 201 FGTQTYTCNVDHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK 251 PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVQFN WYVD G VE VHN AKTKPREEQF 301 NSTFRWSVL TWHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP 351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPP 401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 451 (SEQ ID NO:394)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15:
10 1 GAGQTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC
51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTQ GATTGGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTQG TACTTCGATG TCTGGGGCCG 351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGTGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT 401 TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG 451 GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA 501 CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTQCACAC CTTCCCAGCT GTCCTACAGT 551 CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC 601 TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC 651 CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT 701 GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA 751 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGQTCA CGTGCGTGGT 801 GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC TGGTACGTGG 851 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC 901 AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG 951 GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG 1001 CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA 1051 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATQACQA AGAACCAGGT 1101 CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC ATCGCCGTGG 1151 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC 1201 ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA 1251 CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG 1301 AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT 1351 AAA(SEQÍDNO:226)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSQAEV KKPGASVKVS CKASDF3SHKD 51 FYLHWVRQAP GQGLEWIGRIDPENGDTLYD PKFQDKVTMT TDTSTSTAYM 101ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFEODGTSYWY FDVWGRGTLV TVSSASTKGP 151 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAE TSGVHTFPAV 201 LQSSGLYSLS SWTVPSSNF GTQTYTCNVP HKPSNTKVPK TVERKCCVEC 251 PPCPAPPVAQ PSVFLFPPKP KPTLMSRTP EVTCWVDVS HEDPEVQFNW 301YVDGVEYHNA KTKPREEQFN STFRWSVLT WHQDWLNGK EYKCKVSNKG 351 LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSPGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV 451 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:227)
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGQ TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC 151 TTCTATCTAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 tggaaggatt GATCCTGAGA atggtgatac tttatatgac ccgaagttcc 251 AGGACAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT CCACCAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT 401 GGGGCCGTGG CACCCTGGTC ACCGTCTCTA GTGCCTCCAC CAAGGGCCCA 451 TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAGCACAGC 501 GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 551 CGTGGAACTC AGGCGCTCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC 651 CAGCAACTTC GGCACCCAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA 701 GCAACACCAA GGTGGACAAG ACAGTTGAGC GCAAATGTTG TGTCGAGTGC 751 CCACCGTGCC CAGCACCACC TGTGGCAGGA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC 801 CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT 851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG 901 TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CACGGGAGGA 951 GCAGTTCAAC AGCACGTTCC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTTGTGCACC 1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACMGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC 1051 CTCCCAGCCC CCATQGAGAA AACCATCTCC AAAACCAAAG GGCAGCCCCG 1101 AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGGAGGAG ATGACCAAGA 1151ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC 1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC 1251 ACCTCCCATG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAAGCTCA 1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG 1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC 1401 TCCGGGTAAA (SEQ ID NO:228)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-15 son:
5
CDR-H1: DFYLH (SEQ ID NO: 290)
CDR-H2: RIDPENGDTLYDPKFQD (SEQ ID NO: 291)
CDR-H3: EADYEHDGTSYWYPDV (SEQ ID NO: 292)
10 Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-15 son:
CDR-L1: SVSSTTSSNHLH (SEQ ID NO: 278)
CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID NO: 279)
CDR-L3: QQWSSYPLT (SEQ ID NO: 280)
15
Dominios variables de Ab-15
20
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):
1DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCSV SS.TIS SÑHEEÍWFQQK PGKAPKSLIY 51 :GÍSÑLASGVP SRFSGSGSGT DFÜÍISSLQ PÉDFATYYGQpWSS^BTFG 101 GGTKVEÍK (SEQ ID NQ:384) ~
10
15
20
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):
1 QACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAQGCGA 51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC ToT TTCATTGGTT CCÁACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC 151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG 201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT 251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC 301 GGCGGCACAA MGTAGAAAT TAAA (SEQ U> NO:385)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):
1 EVQLVQSGAE VKRPGASVKV SCKASDFNIKbFYlHWVRQA PGQGLEWIG®
51 pPENGDTEY bf^QbKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSPD TAVYYCARfeA: 101 DYFHDGTSW YEDVWGRGTL VTVSS (SEQ ID NQ:386) ‘
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTQGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTQT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG 351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGT (SEQ ID NO:387)
Ab-11 se humanizó para generar Ab-16.
Ab-16
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 16 (también denominado en el presente documento Ab-16) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-16
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:
1 QIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCgASSSISlTHWYQQKPG KAPKLLlYÁT 51 SNLAgGVPSR FSGSGSGTEF TLnSSLQPEDFATYYC!QQpSíSp 101TKVEÍOrK4 APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD 151NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 201SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO:229)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:
1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT 101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAQCCCCTA AGCTCCTGAT ctatgccaca 151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGQATCTQG 201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA 251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AQTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG 301ACCAAGQTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTQ TCTTCATCTT 351CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC 401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT 451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG 501 CAAQGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG 551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG 601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID NO:230)
\
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:
5
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS 51ISYIHWYQQK PGKAPKLLIY ATSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ 101 PEDFATYYCQ QWSSDPLTFG GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLICSGT 151 ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:231)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-16 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
10
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTTCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151ATAAGTTACA TACACTGGTA TCAGCAAAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT 201 CCTGATCTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGGGTCCCA TCAAGGTTCA 251 GCGGCAGTGG ATCTGGGACA GAATTCACTC TCACAATCAG CAGCCTGCAG 301 CCTGAAGATT TTGCAACTTA TTACTGTCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC 401 CATCTQTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAQAG AGGCCAAAGT 501ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAQAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCQTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG 701AGTGT (SEQ ID NO:232)
Cadena Pesada de Ab-16
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16: 15
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIKpYYIHWVRQA PGQGLEWIGR:
51 lwppkgeeefapkfpgkvtm TTDTSISTAY melsrlrsdd TAVYYCAREP 101 ^GTYTWFPY wgqgtlvtvs sastkgpsvf plapcsrsts estaal gclv
151KDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQS SGLYSLSSW TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTF 301RWSVLTWH QDWLNGEEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS
401DGSFFL YSKLTVDKSR WQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ H) NO:233)
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16 sin lisina carboxilo- 5 terminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIKDYYÍHWVRQA PGQGLEWIGR 51VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED ÍOIYDGTYTWFPY; WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV 151 KDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSW TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVTCWVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTF 301 RWSVLTWH QDWLNGEEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401DGSFFLYSKL TVDKSR WQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO:395) •
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16:
10
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGQTCTTC CCCCTGGCGC 401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCQCTGGG CTGCCTGGTC 451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT 501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT 551ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG 601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA 651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC 701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC 751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG 801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG 851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGQAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC 901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA 951 GGAGTACAAG TQCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC 1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG 1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA 1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC 1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ID NO:234)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:
1MDWTWRILFR VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGFDIKD 51 YYIHWVRQAP GQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKVTMT TDTSISTAYM 101 ELSRLRSDDT AVYYCAREDY DGTYTWFPYW GQGILVTVSS ASHCGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP 251 APPVAGPSVF LFPPKPKjDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVQFNWYVDG 301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR WSVLTWHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP 351IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDK$RWQQGN VFSCSVMHEA 451 LHNHYTQKSL SLSPGIC (SEQ ID NO:235)
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTQ GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCAQTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATTCGA CATTAAGGAC 151 TACTATATAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 CGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC 251 CGGGCAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGCA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT AQTGTGCGAG 351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG 651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATQTTGTG TCQAGTGCCC ACCGTGCCCA 751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA 801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACQTGC GTGGTGQTGG 851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 901 GTGGAGGTGC ATAATQCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA 1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC 1051ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT 1101 GTACACCCTG CCCCQATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC
1151 tgacctgcctggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1201 gagagcaatg ggcagccgga qaacaactac aagaccacac ctcccatgct
1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA 1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT 1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ
IDNO:236)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-16 son:
5 CDR-H1: DYYMH (SEQ ID NO: 293)
CDR-H2: RVDPDNGETEFAPKFPG (SEQ ID NO: 294)
CDR-H3: EDYDGTYTWFPY (SEQ ID NO: 295)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-16 son:
10
CDR-L1: RASSSISYIH (SEQ ID NO: 281)
CDR-L2: ATSNLAS (SEQ ID NO: 282)
CDR-L3: QQWSSDPLT (SEQ ID NO: 283)
15 Dominios variables de Ab-16
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-16 (sin secuencia señal):
imagen17
20
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-16 (sin secuencia señal):
5
10
15
20
25
1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TAC ATACACT 101 GGTATCAGCA AAAACCAQGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAQCGGCA GTGGATCTGG 201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA 251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG 301 ACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID NO:389)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDDdDY^IHWVRQA PGQGLEWIGÍl 51 WJPDÑGÉTEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED lOÍpróGTYTWEfY! WGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:390)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGQCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAQCCTAC ATGGAGCTGA 251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACCGTCTCT AGT (SEQ ID NO:391)
Los anticuerpos adicionales se denominan en el presente documento Anticuerpos 17-22 (también denominados en el presente documento Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21 y Ab-22). La región constante Kappa para todas las regiones VK de Ab-17, Ab-19 y Ab-21 es la siguiente:
TDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQD SKDSTY SMSSTLTLTKPEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:323)
La Región Constante Pesada para todas las regiones VH de los anticuerpos, 17, 19 y 21 es la siguiente:
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS DLYTLSS S VTVPS STWPSETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEV SS VFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCWVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRS Y SELPIMHQD WLNGKEFKCRVNS AAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQ VYTEPPPKEQMAKD KVSLTCMTDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA GNTFTC S VLHEGLHNHHTEKSESHSPGK (SEQ ID NO:324)
En las siguientes secuencias de aminoácidos de anticuerpos, los aminoácidos sombreados en cajas representan regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los aminoácidos subrayados representan péptidos señal.
Ab-17
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
imagen18
SGTKLELKR (SEQ ID NO:299)
5
10
15
20
25
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCATGCTAATCAGTGTCACAÍjTCATATTCj TCCAGTGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCAGGG GÁGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAGCTCGAGTATAAGTTCCAGCAACTTACA CTGGTCCCAGCAGAAGTCAGGAACCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGGCACATCCA ACCTTGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTC TCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGT GGACTACTACGTATACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID NQ:300) .
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
imagen19
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCA
GAGGTGCAGTTGCGGCAGTCTGGGGCAGACCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAA
gttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgaa
GCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGATAATGGTG AAAGTACATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCA TCCAACACAGCCTACCTACAACTCAGAAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATCTA TTATTGTGGGAGAGAGGGGCTCGACTATGGTGACTACTATGCTGTGGACTACTGGG GTCAAGGAACCTCGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO:302)
Ab-17 se humanizó para generar Ab-18.
Ab-18
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
imagen20
GQGTKLEIKR (SEQ ID NQ:3Q3)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCQGG
CGCGCGCTGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGG
gcgatcgcgtgaccattacctgcagcgtgagcagcagcattagcagcagcaacctg
cattggtatcagcagaaaccgggcaaagcgccgaaactgctgatttatggcaccag
caacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgaat
ttaccctgaccattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccagc
AGTGGACCACCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT(SEQ
IDNO:304)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
5
10
15
20
25
imagen21
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
ATOGATTGGACCTOGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGCGCOqATAG
cgaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcgcgagcgtg
AAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGGT
GCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGATAACG
gcgaaagcacctatgtgccgaaatttcagggccgcgtgaccatgaccaccgatacc
AGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGT GTATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTATTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ IDNO:306)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):
imagen22
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):
GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGT
GACCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAACCTGCATTGGTATC
AGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAGCAACCTGGCG
AGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAATTTACCCTGAC
cattagcagcctgcagccggaagattttgcgacctattattgccagcagtggacca
CCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ ID NO:369)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal):
imagen23
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal):
GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA
AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGGTG
cgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggccgcattgatccggataacgg
CGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCA
GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTG
tattattgcgcgcgcgaaggcctggattatggcgattattatgcggtggattattgg
GGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:371)
Ab-19
5
10
15
20
25
imagen24
TKUELKR (SEQ ID NO:3Q7)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGAT
Gtgatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagag
TCAACATCAGCTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAGTTATTTAAACTGGTATCAG CAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTCCACATCAAGATTAAACTC AGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACTAT TAGCAACCTGGCACAAGAAGAIATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGATATTAAGC ATCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID NQ:308)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
MEWIWIFLFLLSGTAGVHSEyOLOQSGPELYKPGASVKMSCKASGFTETDYEVIHWVKO KPGQGLEWIGiYñ^Y^DTC^KFKGKAUTSDKSSSTAYMDLSSLTSEGSAVYYCA RSnTraÁPFAYjWGQGTLVWSS (SEQ ID NO:309)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
atggaatggatctggatatttctcttcctcctgtcaggaactgcaggtgtccactct
gaggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaa
GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGGTTCACATTCACTGACTACATTATGCACTGGGTGAA
GCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATQ
ATACTGAATACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCC
TCCAGCACAGCCTACATGGATCTCAGCAGTCTGACCTCTGAGGGCTCTGCGGTCTAT
TACTGTGCAAGATCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGG
ACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO:310)
Ab-19 se humanizó para generar el Anticuerpo 20 (también denominado en el presente documento Ab-20) y el Anticuerpo 23 (también denominado en el presente documento Ab-23).
Ab-20
Versión de IgG4
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
imagen25
TKVEIKR (SEQ ID NO:311)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
5
10
15
20
ATOATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGAT
gtgatatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggtgaccgtg
tcaccatcacttgccgcgcaagtcaggatattagcagctatttaaattggtatcagc
AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTACTTCCCGTTTGAATAGTG GQGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGATATTAAACACC CTACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGT (SEQ ID NO:312)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
MEWIWIFLFLLSGTAGWSEVQLVQSGAEVKKPGSSVICVSCKASGFTFTbYMíWVRQ APGQGLEM^gYINPYNDDÍlymi^KGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSÉDTAVYYCA RSlYY^AÍfA^^ (SEQ ID NO:313)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
ATGGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCT
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAA
ggtctcctqcaaggcttctggttttaccttcaccgactatattatqcactgggtgcg
TCAGGCCCCTGGTCAAGGGCTTGAGTGGATGGGCTATATCAACCCTTATAATGATG
ACACCGAATACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGTGTCACGATTACCGCGGACAAATCC
acgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgta
TTACTGTGCGCGTTCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGG GACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO:349)
Ab-23
Versión de IgG2 Cadena Ligera:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:
imagen26
101 TKVEmRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTÁS WCLLNNFYP REAKVQWKVD 151NALQSGNSQE SVTEODSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 201SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO:341)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:
5
10
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGTGA 51 CCGTGTCACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAA 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT 151 ACTTCCCGTT TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTC 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG 251 CAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGC 301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT 351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC 401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AQAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT 451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG 501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC cctgacgctg AGCAAAGCAG 551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGQGCCTG 601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID NO:342)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR YTITCRASQD 51ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYSTSRLNSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQDIKHPTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ QLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:343)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA gggtgcccgc TCAGCTCCTG gggctcctgc tgctgtggct 51 gagaggtgcc agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt 101 ctgcatctgt aggtgaccgt gtcaccatca cttgccgcgc aagtcaggat
151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAQGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATTCTACTT CCCGTTTGAA TAGTGGGGTC CCATCACGCT 251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 caacctgaag ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGGATA TTAAACACCC 351 TACGTTCGGT CAAGGCACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC 401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAQ AGGCCAAAGT 501 ACAQTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC gggtaactcc CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG 701 AGTGT (SEQ Ip NQ:344)
Cadena Pesada:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:
imagen27
101YY)^APFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK 151DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT 201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL 251MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEOFNSTFR
301 WSVLTWHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTL 351PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIA VEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 401 GSFFLYSKLT VDKSRWOQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO:345)
Secuencia de aminoácidos de forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23 sin lisina carboxilo-terminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT í|YMl|WVRQA PGQGLEWMG^ 51 pPWDDTE^NE^KG’RVTI TADKSTSTAY MÉLSSLRSED TAVYYCARSl '
GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPA VLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT 201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL 251 MISRTPEVTC VWD VSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR
301 WSVLTWHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL 351 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIA VE W ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 401 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPG (SEQ ID N0.396)
5 •
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC
51 ggtgaaggtc tcctgcaaggcttctggttttaccttcacc GAQTATATTA
101 TGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTAT 151ATCAACCCTT ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCG
201 TGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GCAGCCTGCGCTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATT 301 TATTACTACG ATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGA CTCTGGTCAC 351 CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCGCCCT 401 GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG 451 GACTACTTCC CCQAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCTCTGAC 501 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT 551 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC 601 TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC 651 AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCQAGTGCCC ACCGTGCCCA GCACCACCTG 701 TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC 751 ATGATCTCCC GQACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA 801 CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC 851ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAQC AGTTCAACAG CACGTTCCGT 9Q1 GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA ACGGCAAGGA 951 GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA 1001 CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG 1051 CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT 1101 GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGQ GAQAGCAATG 1151 GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT GGACTCCGAC 1201 GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA 1251 GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC 1301 ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO:346)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKASGFTFTD 51 YIMHWVRQAP GQGLEWMGYINPYNDDTEYN EKFKGRVTIT ADKSTSTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARSIY YYDAPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL 151 APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG 201 LYSLSSVYTV PSSNFGTQTY TCNVDHKPSN TKVDKTVERK CCYECPPCPA 251 PPVÁGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSHEDPE VQFNWYVDGV 301 EYHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTWHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPAPI 351 EKTISKTKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAYEWE 401 SNGQPENNYK TTPPMLDSDO SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO:347)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGTCCTCGGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTTTAC CTTCACCGAC 151 TATATTATGC ACTGGGTGCG TCAGGCCCCT GGTCAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGCTATATC AACCCTTATA ATGATGACAC CGAATACAAC GAGAAGTTCA 251 AGGGCCGTGT CACGATTACC GCGGACAAAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGCA GCCTGCGCTC TGAGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGCG 351 TTCGATTTAT TACTACGATG CCCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC 401 TGGTCACCGT CTCTAGTGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG 451 GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT 501 GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG 551 CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA 60ÍCTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC 651 CCAGACCTAC ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGQTGG 701 ACAAGACAGT TGAGQGCAAA TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCAGCA 751 CCACCTGTGG CAGGACCGTQ AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCC AAGGA 801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG 851 TGAGCCACGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG 901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCACGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC 951 GTTCCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTTGT GCACCAGGAC TGGCTGAACG 1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC AGCCCCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAAC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA 1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATQGGC AGCCQGAGAA CAACTACAAG ACCACACCTC CCATGCTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAA (SEQ ID NO.-348)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de 5 Ab-23 son las siguientes:
CDR-H1: DYIMH (SEQ ID NO: 269)
CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID NO: 270)
CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID NO: 271)
10
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-23 son:
CDR-L1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 239)
CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID NO: 240)
15 CDR-L3: QQDIKHPT (SEQ ID NO: 241)
Dominios variables de Ab-23:
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-23 (sin secuencia señal):
DIQMTQSPSS LSASVGPRVTITCRASQDIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYS TSRLNSGVPS RPSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ DIKHPTFGQG TKVFIK (SEQ IQ NO:364)
5
10
15
20
25
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGTGTC ACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA QGATATTAGC AGCTATTTAAATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCTACTTCCCGTT tgaatagtgg ggtcccatca cgcttcagtg GCAGTGGCTCTGGGACAGAT '
TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT QAAGATTTTGCAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT QGGTCAAGGCACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ED NO:365)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):
EVQEVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINFYNDPTEY NEKFKGRVTITADKSTSTAY MELSSLRSED TAYYYCARSIYYYPAPFAYW GQGTLVTYSS (SEQ ID NO:366)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAA GGTC TCCTGCAAGG CTTCTGQTTT TACCTTCACC GACTATATTATGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTATATCAACCCTT ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCQTGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACQGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATTTATTACTACG ATGCCCCGTT TGQTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGT (SEQ ID NQ:367)
Ab-21
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
imagen28
FGAGTKLELKR (SEQ IP NO:315)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
ATGAAGTCACAGACCCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAA
GGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACGTCAGTAGGAGACAG
GGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTCTTTACTGCTGTAGCCTGGTATCA
ACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACA
CTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA
TTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAACAATATAGCAGCT
ATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ IDNO:316)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
imagen29
5
10
15
20
25
ATOGQATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGOGTCAATTCA
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAA
gttgtcctgcaaagcttctggcttcaatattaaagactactatatgcactgggtgaa
gcagaggcctgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgagaatggtg
atattatatatgacccgaagttccagggcaaggccagtataacaacagacacatcc
TCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTQACQTCTGAGGACACTGCCGTCTAT TACTGTGCTTACGATGCTGGTGACCCCGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACT CTGGTCACCGTCTCQAGC (SEQ ID NO:318)
Ab-21 se humanizó para producir Ab-22.
Ab-22
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
MDMRWAOLLGLLLLWLRGARCDIQMTOSPSSLSASYGDRVTlTCKÁSÓDYFfÁVAW YQQKPGKAPKLLIYWASTpTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPÍ ■LTFGGGTKVEIKR (SEQ~ ID NÓ:319) ............
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCGCGG
CGCGCGCTGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGG
GCGATCGCGTGACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTGGCG
TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCAC
CCGCCATACCGGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTA
CCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGT
ATAGCAGCTATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT(SEQ
IDNO.-320)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
imagen30
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
ATGGATTGGACCTGGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGCGCGCATAG
CGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCQCGAGCGTG
aaagtgagctgcaaagcgagcggctttaacattaaagattattatatgcattgggt
GCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAAAAC
ggcgatattatttatgatccgaaatttcagggccqcgtgaccatgaccaccgatacc
AGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGT GTATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCGTGGTTTACCTATTGGGGCCAGGG CACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ IDNO:322)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-22 (sin secuencia señal):
5
10
15
20
25
30
PIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCKASQDVF TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSQSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSSYPLTFGG GTKVEKR (SÉQ ED NO:336)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-22 (sin secuencia señal):
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGT
GACCATTACCTGCAAAGCOAQCCAGGATGTGTUACCGCGGTQGCGTGGTATCAGC
AGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCACCCGCCATACC GGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCAT TAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTATAGCAGCT ATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ ID NO:337)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DYYMHWVRQA PGQGLEWIGRIDPENGDnY DPKFQGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYY CAYD AGDPAWFTYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO:338)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):
GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA
AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATGCATTGGGTG
cgccaggcgccgggccagggcctggaatggatcggccgcattgatccggaaaacg
gcgatattatttatgatccgaaatttcagggccgcgtgaccatgaccaccgatacca
GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTG
tattattgcgcgtatgatgcgggcgatccggcgtggtttacctattqgggccagggc
ACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:339).
Para Ab-18, Ab-20 y Ab-22, la región constante kappa humana de cadena ligera es la siguiente:
TVAAP S VFEFPPSDEQLKS GTAS WCLLNNF YPREAKYQWKVDNALQSGNSQES VTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKYYACEyTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID NQ:325)
y la región constante gamma-4 humana de cadena pesada es la siguiente:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV
flfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfns
tyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqee
mtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksr
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQICSLSLSLGK* (SEQ ID NO:326)
La región bisagra contiene la mutación Ser-241-Pro para mejorar la estabilidad de la bisagra (Angal S et al., (1993), Mol Immunol, 30 (1), 105-108).
Ab-24
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 24 (también denominado en el presente documento Ab-24) son las siguientes:
imagen31
10i Wgggtklei krádaaptvs ifppsseqlt sggaswcfl nnfypkdinv
151 KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STL TL TKDEY ERHNSYTCEA 201 THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID NO:3 50)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-24:
10
1 GACATTQTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA 51 GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTA 101 CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC 151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG CCAGGTTTAG 201 TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG 251 AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTTC 301 ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG ATGCTGCACC 351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TGTQGAGGTG 401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC 451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG 501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA 551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC 601 ACTCACAAQA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGQAATGA 651 GTGTTAG (SEQ ID NO:354)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:
1 METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LAVSLGQRATIACKASQSVD 51 YDGTSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES EIPARFSGTG SGTDFTLNIH 101 PVEEEDITTY YCQQSNEDPF TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT 1 151 SGGASWCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID NQ:355)
15
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
5
10
1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGQ 51 CTCCACTGGT GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT 101 CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCQCCTGCA AQGCCAQCCA AAGTGTTGAT 151 TATGATGGTA CTAGTTATAT QAATTQGTAC CAACAQAAAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTQCATCCAA TCTAGAATCT QAGATCCCAG 251 CCAGGTTTAG TGGCACTGGQ TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 3 01 CCTGTGGAGG AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC aaagtaatga 351 GGATCCGTTC ACGTTCGGAQ GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG 401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 451 tctggaggtg CCTCAGTCGT GTQCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA 501 CATCAATGTC AAGTQGAAGA TTGATGGCAG TGAACQACAA AATGGCGTCC 551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC 601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC 651 ctgtgaggcc AQTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAQAGCTTCA 701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID NO:3 56)
Cadena Pesada de Ab-24:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:
1 QVQLQQPGTE LVRPGTSVKL SCKASGYIFT jmVMNWVKQR PGQGLEWIGM 51 feSASEI^DQKFKDKATL TLDKSSSTAY MHLSGPTSVD SAVYYCARÍSQ "
10 ÍEWGSMDYWGQ GfÚVTVSSAK TTPPSVYPLA PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY 151 FPÉPVfVTWN SGSLSSGVHT FPA VLQSDLY TLSSSVTVPS STWPSETVTC 201 NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPP KPKDVITITL 251 TPKVTCVWDISKDDPEVQF SWFVDD VEVH TAQTQPREEQ FNSTFRSVSE 301 LPIMHQDWLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKTISKTKGRPEA PQVYTIPPPK 351 EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ PIMDTDGSYF 401 rYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNHHTEKSLSHSP GK (SEQ ID NO:357)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:
1 CAGGTCCAAC TACAGCAGCC TGGGACTGAG CTGGTGAGGC CTGGAACTTC 51 AGTGAAGTTG TCCTGTAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACC ACCTACTGGA 101 TGAACTGGGT GAAACAGAGG CCTGQACAAG GCCTTGAGTG GATTGGCATG 151 ATTCATCCTT CCGCAAGTGA AATTAGGTTG GATCAGAAAT TCAAGGACAA 201 GGCCACATTG ACTCTTGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAT ATQCACCTCA 251 GCGGCCCGAC ATCTGTGGAT TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGATCAGGG 301 GAATGGGGGT CTATGGACTA CTGQGGTCAA GGAACCTCAG TCACCGTCTC 351 CTCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG 401 CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT 451 TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG 501 TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA 551 QCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCQAGAC CGTCACCTGC 601 AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC 651 cagggattgt GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT 701 CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG 751 ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TQTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA 801 GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAQA 851 CGCAACCCCG GGAGQAGCAG TTCAACAQCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA 901 CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG 951 GGTCAACAGT GCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA 1001 CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG 1051 GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT 1101 CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG 1151 AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAQATGG CTCTTACTTC 1201 ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC 1251 TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCAGAACCAC CATACTGAGA 1301 AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID NO:361)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:
1 MGWSSÜLFL VATATGVHSQ VQLQQPGTEL VRPGTSVKLS CKASGYIFTT 51 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMIHPSASEIREP QKFKDKATLT EDKSSSTAYM 101 HLSGPTSVDS AVYYCARSGE WGSMDYWGQG TSVTVSSAKT TPPSVYPLAP 151 GSAAQTNSMV TLGCLVKGYF PEPVTVTWNS GSLSSGVHTF PAVLQSDLYT 201 LSSSVTVPSS TWPSETVTCN VAHPASSTKV DKKIVPRDCG CKPCICTVPE 251 VSSVFIFPPK PKDVLTITET PKVTCVWDISKDPPEVQFS WFVDDVEVHT 301 AQTQPREEQF NSTFRSVSEE PIMHQDWLNG KJsFKCRVNSA AFPAPIEKTI 3 51 SKTKGRPKAP QVYTIPPPKE QMAKDKVSLT CMITDFFPEDITVEWQWNGQ 401 PAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSN WEAGNTFTCS VLHEGLHNHH 451 TEKSLSHSPG K (SEQ ID NO:362)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
5
10
15
1 ATGGGATGGA GCTCTATCAT CCTCTTCTTG GTAGCAACAG CTACAGGTGT 51 CCACTCCCAG GTCCAACTAC AGCAGCCTGG GACTGAGCTG GTGAGGCCTG 101 GAACTTCAGT GAAQTTGTCC TGTAAGGCTT CTGGCTACAT CTTCACCACC 151 TACTGGATGA ACTGGGTGAA ACAGAGGCCT GGACAAGGCC TTGAQTGGAT 201 TGGCATGATT CATCCTTCCG CAAGTGAAAT TAGGTTGGAT CAGAAATTCA
251 aggacaaggc cacattgact cttgacaaat cctccagcac AGCCTATATG 301 CACCTCAGCG GCCCGACATC TGTGGATTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATCAGGGGAA TGGGGGTCTA TGGACTACTG GGGTCAAGGA ACCTCAGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCAAAACG ACACCCCCAT CTGTCTATCC ACTGGCCCCT 451 GGATCTGCTG CCCAAACTAA CTCCATGGTG ACCCTGGGAT GCCTGGTCAA 501 GGGCTATTTC CCTGAGCCAG TGACAGTGAC CTGGAACTCT GGATCCCTGT 551 CCAGCGGTGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TGCAGTCTGA CCTCTACACT 601 CTGAGCAGCT CAGTGACTGT CCCCTCCAGC ACCTGGCCCA GCGAGACCGT 651 CACCTGCAAC GTTGCCCACC CGGCCAGCAG CACCAAQGTG GACAAGAAAA 701 TTGTGCCCAG GGATTGTGGT TGTAAGCCTT GCATATGTAC AGTCCCAGAA 751 GTATCATCTG TCTTCATCTT CCCCCCAAAG CCCAAGGATG TGCTCACCAT 801 TACTCTGACT CCTAAGGTCA CGTGTGTTGT GGTAGACATC AGCAAGGATG 851 ATCCCGAGGT CCAGTTCAGC TGGTTTGTAG ATGATGTGGA GGTGCACACA 901 GCTCAGACGC AACCCCGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACTT TCCGCTCAGT 951 CAGTGAACTT CCCATCATGC ACCAGGACTG GCTCAATGGC AAGGAGTTCA 1001 AATGCAGGGT CAACAGTGCA GCTTTCCCTG CCCCCATCGA GAAAACCATC 1051 TCCAAAACCA AAGGCAGACC GAAGGCTCCA CAGGTGTACA CCATTCCACC 1101 TCCCAAGGAG CAGATGGCCA AGGATAAAGT CAGTCTGACC TGCATGATAA 1151 C AGACTTCTT CCCTGAAGAC ATTACTGTGG AQTGQC AGTG QAATGGGC AG 1201 CCAGCGGAGA ACTACAAGAA CACTCAGCCC ATCATGGACA CAGATGGCTC 1251 TTACTTCATC TACAGCAAGC TCAATGTGCA GAAGAGCAAC TGGQAGGCAG 1301 GAAATACTTT CACCTGCTCT GTGTTACATG AGGGCCTGCA CAACCACCAT 1351 ACTQAGAAGA GCCTCTCCCA CTCTCCTGQT AAATGA (SEQ ID NO:363)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena ligera de Ab-24 son las siguientes:
CDR-L1: KASQSVDYDGTSYMN (SEQ ID NO: 351)
CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO: 352)
CDR-L3: QQSNEDPFT (SEQ ID NO: 353)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-24 son las siguientes:
CDR-H1: TYWMN (SEQ ID NO: 358)
CDR-H2: MIHPSASEIRLDQKFKD (SEQ ID NO: 359)
CDR-H3: SGEWGSMDY (SEQ ID NO: 360)
La Tabla 1 a continuación proporciona la SEQ ID NO y secuencias de aminoácidos de las CDR de Ab-A, Ab-B, AbC, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24. L1, L2 y L3 se refieren a las CDR de cadena ligera 1,2 y 3 y H1, H2 y H3 se refieren a las CDR de cadena pesada 1,2 y 3 de acuerdo con el sistema de numeración Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).
Tabla 1
SEQ ID NO
DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
54
CDR-L1 de Ab-A y Ab-1 QSSQSVYDNNWLA
55
CDR-L2 de Ab-A y Ab-1 DASDLAS
Tabla 1
SEQ ID NO
DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
56
CDR-L3 de Ab-A y Ab-1 QGAYNDVIYA
51
CDR-H1 de Ab-A y Ab-1 SYWMN
52
CDR-H2 de Ab-A y Ab-1 TEDSGGRTDYASWAKG
53
CDR-H3 de Ab-A y Ab-1 NWNL
60
CDR-L1 de Ab-B SASSSVSFVD
61
CDR-L2 de Ab-B RTSNLGF
62
CDR-L3 de Ab-B QQRSTYPPT
57
CDR-H1 de Ab-B TSGMGVG
58
CDR-H2 de Ab-B HIWWDDVKRYNPVLKS
59
CDR-H3 de Ab-B EDFDYDEEYYAMDY
48
CDR-L1 de Ab-C KASQSVDYDGDSYMN
49
CDR-L2 de Ab-C AASNLES
50
CDR-L3 de Ab-C QQSNEDPWT
45
CDR-H1 de Ab-C DCYMN
46
CDR-H2 de Ab-C DINPFNGGTTYNQKFKG
47
CDR-H3 de Ab-C SHYYFDGRVPWDAMDY
42
CDR-L1 de Ab-D QASQGTSINLN
43
CDR-L2 de Ab-D GSSNLED
44
CDR-L3 de Ab-D LQHSYLPYT
39
CDR-H1 de Ab-D DHYMS
40
CDR-H2 de Ab-D DINPYSGETTYNQKFKG
41
CDR-H3 de Ab-D DDYDASPFAY
275
CDR-L1 de Ab-2 RASSSVYYYMH
276
CDR-L2 de Ab-2 ATSNLAS
277
CDR-L3 de Ab-2 QQWSSDPLT
287
CDR-H1 de Ab-2 DYFIH
288
CDR-H2 de Ab-2 RLDPEDGESDYAPKFQD
289
CDR-H3 de Ab-2 EDYDGTYTFFPY
278
CDR-L1 de Ab-3 y Ab-15 SVSSTISSNHLH
279
CDR-L2 de Ab-3 y Ab-15 GTSNLAS
280
CDR-L3 de Ab-3 y Ab-15 QQWSSYPLT
290
CDR-H1 de Ab-3 y Ab-15 DFYLH
291
CDR-H2 de Ab-3 y Ab-15 RIDPENGDTLYDPKFQD
292
CDR-H3 de Ab-3 y Ab-15 EADYFHDGTSYWYFDV
78
CDR-L1 de Ab-4 y Ab-5 RASQDISNYLN
79
CDR-L2 de Ab-4 y Ab-5 YTSRLLS
80
CDR-L3 de Ab-4 y Ab-5 QQGDTLPYT
245
CDR-H1 de Ab-4 y Ab-5 DYNMH
246
CDR-H2 de Ab-4 y Ab-5 EINPNSGGAGYNQKFKG
247
CDR-H3 de Ab-4 y Ab-5 LGYDDIYDDWYFDV
81
CDR-L1 de Ab-6 RASQDISNYLN
99
CDR-L2 de Ab-6 YTSRLHS
100
CDR-L3 de Ab-6 QQGDTLPYT
248
CDR-H1 de Ab-6 DYNMH
249
CDR-H2 de Ab-6 EINPNSGGSGYNQKFKG
250
CDR-H3 de Ab-6 LVYDGSYEDWYFDV
101
CDR-L1 de Ab-7 RASQVITNYLY
102
CDR-L2 de Ab-7 YTSRLHS
103
CDR-L3 de Ab-7 QQGDTLPYT
251
CDR-H1 de Ab-7 DYNMH
252
CDR-H2 de Ab-7 EINPNSGGAGYNQQFKG
253
CDR-H3 de Ab-7 LGYVGNYEDWYFDV
Tabla 1
SEQ ID NO
DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
104
CDR-L1 de Ab-8 RASQDISNYLN
105
CDR-L2 de Ab-8 YTSRLLS
106
CDR-L3 de Ab-8 QQGDTLPYT
254
CDR-H1 de Ab-8 DYNMH
255
CDR-H2 de Ab-8 EINPNSGGAGYNQKFKG
256
CDR-H3 de Ab-8 LGYDDIYDDWYFDV
107
CDR-L1 de Ab-9 RASQDISNYLN
108
CDR-L2 de Ab-9 YTSRLFS
109
CDR-L3 de Ab-9 QQGDTLPYT
257
CDR-H1 de Ab-9 DYNMH
258
CDR-H2 de Ab-9 EINPNSGGAGYNQKFKG
259
CDR-H3 de Ab-9 LGYDDIYDDWYFDV
110
CDR-L1 de Ab-10 RASQDISNYLN
111
CDR-L2 de Ab-10 YTSRLLS
112
CDR-L3 de Ab-10 QQGDTLPYT
260
CDR-H1 de Ab-10 DYNMH
261
CDR-H2 de Ab-10 EINPNSGGAGYNQKFKG
262
CDR-H3 de Ab-10 LGYDDIYDDWYFDV
281
CDR-L1 de Ab-11 y Ab-16 RASSSISYIH
282
CDR-L2 de Ab-11 y Ab-16 ATSNLAS
283
CDR-L3 de Ab-11 y Ab-16 QQWSSDPLT
293
CDR-H1 de Ab-11 y Ab-16 DYYIH
294
CDR-H2 de Ab-11 y Ab-16 RVDPDNGETEFAPKFPG
295
CDR-H3 de Ab-11 y Ab-16 EDYDGTYTWFPY
113
CDR-L1 de Ab-12 RASQDISNYLN
114
CDR-L2 de Ab-12 YTSTLQS
115
CDR-L3 de Ab-12 QQGDTLPYT
263
CDR-H1 de Ab-12 DYNMH
264
CDR-H2 de Ab-12 EINPNSGGSGYNQKFKG
265
CDR-H3 de Ab-12 LGYYGNYEDWYFDV
284
CDR-L1 de Ab-13 y Ab-14 RASSSVTSSYLN
285
CDR-L2 de Ab-13 y Ab-14 QQYDFFPST
286
CDR-L3 de Ab-13 y Ab-14 DYYMN
296
CDR-H1 de Ab-13 y Ab-14 DYYMN
297
CDR-H2 de Ab-13 y Ab-14 DINPYNDDTTYNHKFKG
298
CDR-H3 de Ab-13 y Ab-14 ETAVITTNAMD
116
CDR-L1 de Ab-17 y Ab-18 SVSSSISSSNLH
237
CDR-L2 de Ab-17 y Ab-18 GTSNLAS
238
CDR-L3 de Ab-17 y Ab-18 QQWTTTYT
266
CDR-H1de Ab-17 y Ab-18 CDR-H1 DYYIH
267
CDR-H2 de Ab-17 y Ab-18 RIDPDNGESTYVPKFQG
268
CDR-H3 de Ab-17 y Ab-18 EGLDYGDYYAVDY
239
CDR-L1 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 RASQDISSYLN
240
CDR-L2 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 STSRLNS
241
CDR-L3 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 QQDIKHPT
269
CDR-H1 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 DYIMH
270
CDR-H2 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 YINPYNDDTEYNEKFKG
271
CDR-H3 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 SIYYYDAPFAY
242
CDR-L1 de Ab-21 y Ab-22 KASQDVFTAVA
243
CDR-L2 de Ab-21 y Ab-22 WASTRHT
244
CDR-L3 de Ab-21 y Ab-22 QQYSSYPLT
272
CDR-H1 de Ab-21 y Ab-22 DYYMH
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tabla 1
SEQ ID NO
DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
273
CDR-H2 de Ab-21 y Ab-22 RIDPENGDIIYDPKFQG
274
CDR-H3 de Ab-21 y Ab-22 DAGDPAWFTY
351
CDR-L1 de Ab-24 KASQSVDYDGTSYMN
352
CDR-L2 de Ab-24 AASNLES
353
CDR-L3 de Ab-24 QQSNEDPFT
358
CDR-H1 de Ab-24 TYWMN
359
CDR-H2 de Ab-24 MIHPSASEIRLDQKFKD
360
CDR-H3 de Ab-24 SGEWGSMDY
Un oligopéptido o polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a al menos una de las CDR de la Tabla 1 anterior; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab- 3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab- 20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o está bloqueada de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24; y/o con una CDR de un agente de unión a esclerostina donde el agente de unión puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo de Bucle 2; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo T20,6; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina + 4 ramas)”.
Los polipéptidos y anticuerpos del agente de unión a esclerostina están dentro del alcance de la divulgación si tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab- 19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab- 2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o unirse a un epítopo de bucle 2; y/o unirse a un epítopo T20,6; y/o unirse a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina + 4 ramas)”.
Los polinucleótidos que codifican agentes de unión a esclerostina están dentro del alcance de la divulgación si tienen secuencias polinucleotídicas que son al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a un polinucleótido que codifica una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab- 13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21; Ab-22, Ab-23 y Ab-24 y donde los agentes de unión a esclerostina codificados bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab- 17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab- 5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o se unen a un epítopo de bucle 2; y/o se unen a un epítopo T20,6; y/o se unen a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina + 4 ramas)”.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10-7 M, menos de o igual a 1 x 10-8 M, menos de o igual a 1 x 10-9 M, menos de o igual a 1 x 10'1° M, menos de o igual a 1 x 10-11 M o menos de o igual a 1 x 10-12 M.
La afinidad de un agente de unión tal como un anticuerpo o compañero de unión, así como el grado en el que un agente de unión (tal como un anticuerpo) inhibe la unión, puede determinarse por un experto habitual en la materia usando técnicas convencionales, por ejemplo las descritas en Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660-672 (1949)) o por resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para resonancia de plasmón superficial, las moléculas diana se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que se desplaza a lo largo de una celda de flujo. Si se produce unión de ligando con la diana inmovilizada, el índice refractario local cambia, lo que conduce a un cambio en el ángulo de SPR, que puede supervisarse en tiempo
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real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las tasas de cambio de la señal de SPR pueden analizarse para producir constantes de velocidad aparente para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores proporciona la constante en equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-65 (1993)).
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA. Puede obtenerse o derivar de un animal, por ejemplo, ave de corral (por ejemplo, pollo) y mamíferos, que incluye pero sin limitación un ratón, rata, hámster, conejo u otro roedor, vaca, caballo, oveja, cabra, camello, ser humano u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de internalización. La producción de anticuerpos se divulga en general en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2004/0146888 A1.
Ensayos de caracterización
En los métodos descritos anteriormente para generar anticuerpos, incluyendo la manipulación de las CDR de Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Anticuerpo 1-24 (Ab-1 a Ab-24) específicas en nuevas regiones marco conservadas y/o constantes, están disponibles ensayos apropiados para seleccionar los anticuerpos deseados (es decir, ensayos para determinar la afinidad de unión con esclerostina; ensayos de bloqueo cruzado; “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore; ensayo basado en células MC3T3-E1; ensayos in vivo).
Ensayos de unión de epítopos
La esclerostina humana de forma madura es una glicoproteína de 190 aminoácidos con una estructura de nudo de cistina (Figuras 8 y 9). Además de la estructura en nudo de cistina, la proteína se caracteriza porque tiene tres bucles designados como Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. La esclerostina humana se sometió a digestión proteolítica para producir fragmentos. Brevemente, usando diferentes proteasas, incluyendo tripsina, aspN y lysC, se generaron fragmentos con diversos sitios de escisión y tamaños. Se determinaron las secuencias y la masa para diversos péptidos de esclerostina humana. Se evaluó la protección de anticuerpos para determinar el efecto sobre la accesibilidad para proteólisis, incluyendo el enmascaramiento de sitio cortado y desplazamiento peptídico. Finalmente, se realizó un “ensayo de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en BIAcore.
La exposición de esclerostina a escisión por tripsina dio como resultado un patrón de fragmentos peptídicos como se resumen en la Figura 13. Los fragmentos se denominan T19,2, T20, T20,6 y T21-22. Como se muestra de forma esquemática en la Figura 19B, el epítopo T20,6 es un complejo de cuatro secuencias peptídicas separadas que se unen por los tres enlaces disulfuro de la región del nudo de cistina. Dos de los péptidos están unidos por dos enlaces disulfuro. Los otros dos péptidos están unidos por un enlace disulfuro que, esquemáticamente, divide en dos los primeros dos polipéptidos.
El epítopo T20,6 que se generó por digestión con tripsina conserva la estructura de nudo de cistina del polipéptido nativo y está reconocido por los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Un derivado del epítopo T20,6 consiste en la región del nudo de cistina y los aminoácidos 58-64, 73-81, 112-117 y 138-141 en posición de secuencia con referencia a SEQ ID NO: 1. Este epítopo derivado se muestra en la Figura 21. Un epítopo que comprende la región de nudo de cistina puede tener uno o más aminoácidos que están presentes en el epítopo T20,6 (Figura 19B) pero no presentes en el epítopo derivado de T20,6 (Figura 21).
Otra región que contiene epítopos se identificó en la región de Bucle 2 de esclerostina humana (Figura 19A) y se reconoce por los anticuerpos Ab-A y Ab-B. Un epítopo de Bucle 2 comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, SEQ ID NO: 6). De forma estérica, con referencia a esclerostina de longitud completa de SEQ ID NO: 1, la estructura que contiene el Bucle 2 se define en un extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 86 (C4) y cisteína en la posición 144 (C8) y en el otro extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 111 (C5) y cisteína en la posición 57 (C1).
Los péptidos generados por escisión de aspN de esclerostina humana se muestran en la Figura 12. En la Figura, estos péptidos se designan AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5 y también se denominan en el presente documento N14,6, N18,6y N22,7-23,5, respectivamente.
Un grupo de anticuerpos muestra un patrón específico de unión con ciertos epítopos como se demuestra por un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Brevemente, el anticuerpo se preincuba con el epítopo para ensayar, a concentraciones que saturarán los sitios de unión a epítopo en el anticuerpo. El anticuerpo se expone después a esclerostina unida a una superficie de microplaca. Después de los procedimientos de incubación y lavado apropiados, se establece un patrón de unión competitiva. Como se muestra en la Figura 18, el anticuerpo ejemplar Ab-D se unió a moléculas de esclerostina unidas a la superficie de la microplaca. La preincubación del anticuerpo Ab-D con esclerostina redujo la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca hasta casi cero. La preincubación con un péptido que consistía en el epítopo T19,2 mostró que T19,2 no competía con la esclerostina por la unión con el anticuerpo. Sin embargo, la preincubación con uno
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cualquiera de los epítopos designados T20, T20,6, T21-22 o N22,7-23,5 suprimió una gran proporción de la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca. Por el contrario, la preincubación del anticuerpo con uno cualquiera de los epítopos designados T19,2, n14,6 o N18,6 no suprimió la capacidad del anticuerpo para unirse a esclerostina. Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 17) es Ab-C.
El anticuerpo Ab-D es por lo tanto ejemplar y representativo de un grupo de anticuerpos que se unen a los epítopos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, N14,6 y N18,6, como se mide por la capacidad para bloquear la unión del anticuerpo con esclerostina. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencia de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud del anticuerpo se determina funcionalmente tal como mediante la capacidad para unirse con esclerostina después de la preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Por “similar a” se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con cada uno de los polipéptidos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 por lo que esta unión superará en competición al menos el 50% de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2, N14,6 y N18,6, dando como resultado una reducción del 30% o menos de la unión que se produciría en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.
Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión del anticuerpo de la Figura 18 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-D y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión a epítopos de Ab-D se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de nudo de cistina de esclerostina.
Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19B, un epítopo T20,6 ejemplar comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (SEQ ID NO: 3) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8KRLTR (SEQ ID NO: 5) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica DVSEYSCIRELHFTR (SEQ ID NO: 2) está unida a la cadena peptídica WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SeQ ID NO: 4) por un enlace disulfuro de C1 a C5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 3 y 5 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 a 4 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 19B.
Como se desvela en el presente documento y con referencia a la Figura 21, un epítopo derivado ejemplar de T20,6 comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3 SGQC4 (SEQ ID NO: 70) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8 (SEQ ID NO: 71) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica C1RELHFTR (SEQ ID nO: 72) está unida a la cadena peptídica C5IPDRYR (SEQ ID NO: 73) por un enlace disulfuro de C1 a C5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 70 y 71 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 72 y 73 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 21.
El anticuerpo Ab-A es ejemplar y representativo de un segundo grupo de anticuerpos que tienen un patrón de unión característico con péptidos de esclerostina humana que es distinto del obtenido para los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Ab-A y el grupo de anticuerpos que representa se unen al epítopo N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, T20, T20,6, T21-22, N14,6 o N18,6, como se mide mediante la capacidad para bloquear la unión de anticuerpo con esclerostina (Fig. 15). Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 16) es Ab-B. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencias de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud de anticuerpo se determina funcionalmente tal como por la capacidad de unirse con esclerostina después de preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Por “similar a” se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con el polipéptido N22,7- 23,5 por la que esta unión superará por competición al menos el 50% de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2, t20, T20,6, T21-22, N14,6 y N18,6 dando como resultado una reducción del 30% o menos de la unión que se produciría en la ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.
Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión de anticuerpo de la Figura 15 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-A y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión de epítopo de Ab-A se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de Bucle 2 de la esclerostina. Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19A, la región de Bucle 2 puede describirse como un péptido lineal, pero adquiere una estructura terciaria cuando está presente en una esclerostina nativa o una parte que contiene nudo de cistina de esclerostina en la que la estructura de enlace disulfuro nativo se mantiene. La estructura lineal o terciaria del epítopo de Bucle 2 puede afectar a la unión del anticuerpo con el mismo, como se analiza en los Ejemplos. Una región de Bucle 2 puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos: C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID No: 6). “C4” se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 86 con referencia a SEQ ID NO: 1. “C5” se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 111 con referencia a SEQ ID NO: 1. En la proteína de esclerostina nativa, C4 está unido a una cisteína en la posición 144
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(C8) por un enlace disulfuro y C5 está ligado a una cisteína en la posición 57 (C1) por un enlace disulfuro. Los epítopos derivados de la región de Bucle 2 incluyen CGPaRlLPNAIGrGkWwRPS (SEQ ID NO: 63); GPARLLPNAIGRG KWWRPSG (SEQ ID NO: 64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID NO: 65); ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID NO: 66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (SEQ ID NO: 67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID NO: 68); y LP NAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 69).
ENSAYOS DE BLOQUEO CRUZADO
Las expresiones “bloqueo cruzado”, “bloqueado de forma cruzada” y “bloquear de forma cruzada” se usan de forma intercambiable en el presente documento para indicar la capacidad de un anticuerpo para interferir con la unión de otros anticuerpos con esclerostina.
El alcance en el que un anticuerpo es capaz de interferir con la unión de otro con esclerostina y por lo tanto si puede decirse que bloquea de forma cruzada, puede determinarse usando ensayos de unión competitiva. Un ensayo cuantitativo particularmente adecuado usa una máquina de Biacore que puede medir el alcance de las interacciones usando tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado usa un enfoque basado en ELISA para medir la competición entre anticuerpos con respecto a su unión con esclerostina.
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO DE BIACORE
A continuación se describe en general un ensayo de Biacore adecuado para determinar si un anticuerpo bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de forma cruzada. La máquina de Biacore (por ejemplo el Biacore 3000) se maneja en línea con las recomendaciones del fabricante.
Por lo tanto en un ensayo de bloqueo cruzado, la esclerostina se acopla a una microplaca CM5 Biacore usando química de acoplamiento de aminas convencional para generar una superficie recubierta con esclerostina. Típicamente se acoplarían 200-800 unidades de resonancia de esclerostina a la microplaca (una cantidad que proporciona niveles fácilmente medibles de unión pero que puede saturarse fácilmente por las concentraciones de reactivo de ensayo usadas).
Los anticuerpos (denominados A* y B*) para ensayar con respecto a su capacidad para bloquearse de forma cruzada entre sí se mezclan a una relación molar de uno a uno de sitios de unión en un tampón adecuado para crear la mezcla de ensayo. Cuando se calculan las concentraciones basándose en el sitio de unión, se asume que el peso molecular de un anticuerpo es el peso molecular total del anticuerpo dividido por el número de sitios de unión de esclerostina en ese anticuerpo.
La concentración de cada anticuerpo en la mezcla de ensayo debería ser suficientemente alta para saturar fácilmente los sitios de unión para ese anticuerpo en las moléculas de esclerostina capturadas en la microplaca de Biacore. Los anticuerpos en la mezcla están a la misma concentración molar (basándose en la unión) y esa concentración típicamente sería entre 1,00 y 1,5 micromolar (basándose en un sitio de unión).
También se preparan soluciones separadas que contienen anticuerpo A* solamente y anticuerpo B* solamente. El anticuerpo A* y anticuerpo B* en estas soluciones deberían estar en el mismo tampón y a la misma concentración que en la mezcla de ensayo.
La mezcla de ensayo se pasa sobre la microplaca de Biacore recubierta de esclerostina y se registra la cantidad total de unión. La microplaca se trata después de tal modo que se retiren los anticuerpos unidos sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca. Típicamente esto se realiza tratando a la microplaca con HCl 30 mM durante 60 segundos.
La solución de anticuerpo A* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión. La microplaca se trata de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca.
La solución de anticuerpo B* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión.
A continuación se calcula la unión teórica máxima de la mezcla de anticuerpo A* y anticuerpo B*, y es la suma de la unión de cada anticuerpo sobre la superficie de esclerostina solo. Si la unión registrada real de la mezcla es menor que este máximo teórico entonces los dos anticuerpos están bloqueándose de forma cruzada entre sí.
Por lo tanto, en general, un anticuerpo de bloqueo cruzado es uno que se unirá a esclerostina en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore anterior de modo que durante el ensayo y en presencia de un segundo anticuerpo la unión registrada sea entre 80% y 0,1% (por ejemplo, 80% a 4%) de la unión teórica máxima, específicamente entre 75% y 0,1% (por ejemplo, 75% a 4%) de la unión teórica máxima y más específicamente entre el 70% y 0,1% (por ejemplo 70% a 4%) de la unión teórica máxima (como se acaba de definir anteriormente) de los dos anticuerpos o
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El ensayo de Biacore descrito anteriormente es un ensayo primario usado para determinar si los anticuerpos se bloquean de forma cruzada entre sí. En pocas ocasiones los anticuerpos particulares pueden no unirse con esclerostina acoplada mediante química de amina a una microplaca de Biacore CM5 (esto sucede habitualmente cuando el sitio de unión relevante en la esclerostina se enmascara o se destruye por el acoplamiento a la microplaca). En dichos casos el bloqueo cruzado puede determinarse usando una versión marcada de Esclerostina, por ejemplo Esclerostina marcada con His N terminal (R & D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat. n° 1406-ST-025). En este formato particular, un anticuerpo anti-His se acoplaría a la microplaca de Biacore y después la Esclerostina marcada con His se pasaría sobre la superficie de la microplaca y se capturaría por el anticuerpo anti-His. El análisis de bloqueo cruzado se llevaría a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración de microplaca, se cargaría nueva esclerostina marcada con His de nuevo en la superficie recubierta con anticuerpo anti-His. Además del ejemplo proporcionado usando Esclerostina marcada con His N terminal, podría usarse como alternativa Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador que se conocen en la técnica para dicho análisis de bloqueo cruzado (por ejemplo marcador HA con anticuerpos anti-HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG; marcador de biotina con estreptavidina).
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA
Lo siguiente describe en general un ensayo de ELISA para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de formar cruzada. Por conveniencia, se hace referencia a dos anticuerpos (Ab-X y Ab-Y).
El principio general de del ensayo es tener un anticuerpo anti-esclerostina recubriendo los pocillos de una placa de ELISA. Se añade una cantidad en exceso de un segundo anticuerpo anti-esclerostina que potencialmente bloquea de forma cruzada en la solución (es decir, no unido a la placa de ELISA). Se añade después una cantidad limitada de esclerostina a los pocillos. El anticuerpo recubierto y el anticuerpo en solución compiten por la unión del número limitado de moléculas de esclerostina. La placa se lava para retirar esclerostina que no se haya unido al anticuerpo de recubrimiento y también para retirar el segundo anticuerpo en fase de solución así como cualquier complejo formado entre el segundo anticuerpo en fase de solución y la esclerostina. La cantidad de esclerostina unida se mide después usando un reactivo de detección de esclerostina apropiado. Un anticuerpo en solución que sea capaz de bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento será capaz de provocar una reducción del número de moléculas de esclerostina a las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en relación con el número de moléculas de esclerostina con las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en ausencia del segundo anticuerpo en fase de solución.
Este ensayo se describe en más detalle adicionalmente posteriormente con respecto a Ab-X y Ab-Y. En el caso en el que Ab-X se selecciona para ser el anticuerpo inmovilizado, este se usa para recubrir los pocillos de la placa de ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una solución de bloqueo adecuada para minimizar la unión no específica de reactivos que es añaden posteriormente. Se añade después una cantidad en exceso de Ab-Y a la placa de ELISA de modo que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-Y por pocillo sean al menos 10 veces mayores que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-X que se usaron, por pocillo, durante el recubrimiento de la placa de ELISA. Después se añade esclerostina de modo que los moles de esclerostina añadidos por pocillo sean al menos 25 veces menores que los moles de sitios de unión de esclerostina de Ab-X que se usaron para recubrir cada pocillo. Después de un periodo de incubación adecuado la placa de ELISA se lava y se añade un reactivo de detección de esclerostina para medir la cantidad de esclerostina unida específicamente por el anticuerpo anti-esclerostina de recubrimiento (en este caso Ab-X). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir, sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. El ensayo de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario procesar el ensayo de ELISA de tal manera que la señal de control positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.
Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultante de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:
1) formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo
competidor que está en solución
y
2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el
anticuerpo competidor que está en solución.
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Ab-X y Ab-Y se definen como bloqueadores cruzados si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo anti- esclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60% y el 100%, específicamente entre el 70% y el 100% y más específicamente entre el 80% y el 100%, de la señal de detección de esclerostina (es decir, la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir, los pocillos de control de positivo).
Un ejemplo de dicho ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA puede hallarse en el Ejemplo 7 (“ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA”).
ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS
Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modelo in vitro de formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de diferenciación de células de linaje de osteoblastos por uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de la matriz y finalmente deposición de mineral, que se refiere a cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.
Las células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) y subclones de la línea celular original pueden formar mineral en cultivo tras el crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275: 19992-20001). Tanto para el subclon MC3T3-E1-BF así como para las células originales MC3T3-E1, la esclerostina puede inhibir uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que son capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitan la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hay un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo). Los anticuerpos usados en los experimentos de ensayo de mineralización basado en células mostrados en las Figuras 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 Kd y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.
Cuando se ejecuta el ensayo con el objetivo de determinar si un anticuerpo anti-esclerostina particular puede neutralizar la esclerostina, es necesario que la cantidad de esclerostina usada en el ensayo sea la cantidad mínima de esclerostina que provoca al menos una reducción del 70%, estadísticamente significativa, en la deposición de fosfato cálcico (medida como calcio) en el grupo de solamente esclerostina, en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo sin esclerostina. Un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina se define como uno que provoca un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo). Para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina es neutralizante o no, la cantidad de anticuerpo anti- esclerostina usado en el ensayo debe ser tal que haya un exceso de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Dependiendo de la potencia del anticuerpo, el exceso en veces que puede requerirse puede ser de 24, 18, 12, 6, 3 o 1,5, y un experto en la materia está familiarizado con la práctica rutinaria de ensayos de más de una concentración de agente de unión. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina muy potente será capaz de neutralizar la esclerostina incluso cuando haya un exceso menor de 6 veces de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o agente de unión neutralizante anti-esclerostina menos potente será capaz de neutralizar la esclerostina solamente en un exceso de 12, 18 o 24 veces. Los anticuerpos de esclerostina con este intervalo completo de potencias son adecuados como anticuerpos de esclerostina neutralizantes. Se describen en detalle en el Ejemplo 8 ensayos de mineralización basados en células ejemplares.
Los anticuerpos anti-esclerostina que pueden neutralizar esclerostina humana pueden ser útiles en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea bajo y fuerza ósea baja.
ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN IN VIVO
Pueden medirse los aumentos de diversos parámetros asociados con, o que resultan de, la estimulación de nueva formación de hueso como un resultado de ensayos in vivo de anticuerpos de esclerostina para identificar los anticuerpos que son capaces de neutralizar esclerostina y por lo tanto son capaces de provocar estimulación de
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nueva formación de hueso. Dichos parámetros incluyen diversos marcadores anabólicos del suero [por ejemplo osteocalcina, P1NP (propéptido n-terminal de procolágeno de tipo 1)], marcadores histomorfométricos de formación del hueso (por ejemplo, superficie de osteoblasto/superficie de hueso; tasa de formación de hueso/superficie de hueso; grosor trabecular), densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. Un anticuerpo neutralizante de esclerostina se define como uno capaz de provocar un aumento estadísticamente significativo en comparación con animales tratados con vehículo, en cualquier parámetro asociado con, o que resulta de, la estimulación de nueva formación de hueso. Dicho ensayo in vivo puede realizarse en cualquier mamífero adecuado (por ejemplo ratón, rata, mono). Un ejemplo de dichos ensayos in vivo puede encontrarse en el Ejemplo 5 (“ensayos in vivo de anticuerpos monoclonales anti-esclerostina”).
Aunque la secuencia de aminoácidos de esclerostina no es 100% idéntica en todas las especies de mamífero (por ejemplo la esclerostina de ratón no es 100% idéntica a esclerostina humana), se apreciará por un experto en la materia que un anticuerpo de esclerostina que puede neutralizar, in vivo, la esclerostina de una cierta especie (por ejemplo, ratón) y que también puede unirse a esclerostina humana in vitro es muy probable que sea capaz de neutralizar la esclerostina humana in vivo. Por lo tanto, dicho anticuerpo anti-esclerostina humana puede ser útil en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea baja y fuerza ósea baja. Los ratones en los que se ha usado recombinación homóloga para suprimir el gen de esclerostina de ratón e insertar el gen de esclerostina humana en su lugar (es decir, ratones knock-in para el gen de esclerostina humana o ratones knock-in para SOST humana) serían un ejemplo de un sistema in vivo adicional.
Se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden uno de los anticuerpos descritos anteriormente tales como al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1 a Ab-24 para esclerostina humana, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutica o fisiológicamente aceptable. Se divulgan composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento en la Solicitud relacionada N° Serie N° 10/868.497, presentada el 16 de junio de 2004, que reivindica el beneficio de prioridad de N° de Serie 60/478.977.
Se conoce bien en la técnica, el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración subcutánea, oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular y formulación, algunos de los cuales se analizan brevemente posteriormente para fines generales de ilustración.
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden suministrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.
En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento por vía subcutánea, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intramuscular o incluso por vía intraperitoneal. Dichos enfoques se conocen bien por los expertos en la materia, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.543.158; Patente de Estados Unidos N° 5.641.515 y Patente de Estados Unidos N° 5.399.363. En ciertas realizaciones, pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como sales farmacológicamente aceptables o de base libre en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase Patente de Estados Unidos N° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administración parenteral en una solución acuosa, la solución debe tamponarse de forma adecuada si es necesario y el diluyente líquido en primer lugar se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular,
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subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la materia conocerán un medio acuoso estéril que puede emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., págs. 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá cierta variación en la dosificación necesariamente dependiendo de la afección del sujeto que se trate. Además, para administración humana, las preparaciones por supuesto preferentemente cumplirán los patrones de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales como se requiere por la Oficina de Patrones Biológicos de la FDA.
Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También pueden derivarse sales formadas por los grupos carboxilo libres de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en la cantidad que sea terapéuticamente eficaz.
Los vehículos pueden comprender además todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, tampones, soluciones transportadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conocen bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse principios activos complementarios en las composiciones. La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o desafortunada similar cuando se administra a un ser humano.
En determinadas realizaciones, se usan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en células/organismos hospedadores adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para el suministro encapsulado en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similar. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden unirse, covalente o no covalentemente, con la superficie de dichos vehículos transportadores.
La formación y uso de liposoma y preparaciones de tipo liposomal como vehículos farmacéuticos potenciales generalmente se conoce por los expertos en la materia (véase por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7): 307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56 (3):691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 35(8): 801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(23): 233-61, 1995; Patente de Estados Unidos N° 5.567.434; Patente de Estados Unidos N° 5.552.157; Patente de Estados Unidos N° 5.565.213; Patente de Estados Unidos N° 5.738.868 y Patente de Estados Unidos N° 5.795.587. El uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después del suministro sistémico. En ciertas realizaciones, se forman liposomas a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)).
Como alternativa, la divulgación proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos de un modo estable y reproducible (véase por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998). Para evitar efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de tamaños de aproximadamente 0,1 |im) pueden diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1): 1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3): 31-40, 1998; y Patente de Estados Unidos N° 5.145.684.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden situarse dentro de recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones con respecto al uso de dichas composiciones farmacéuticas. Generalmente, dichas instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como dentro de ciertas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, solución salina o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.
La dosis administrada puede variar de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. Como resultará evidente para un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que se trate, la respuesta deseada, la afección del paciente y así sucesivamente. Típicamente, las composiciones pueden administrarse por una diversidad de técnicas, como se ha observado anteriormente.
Los aumentos del contenido mineral óseo y/o densidad mineral ósea pueden determinarse directamente mediante el
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uso de rayos X (por ejemplo, Absorciometría de rayos X de Energía Dual o “DEXA”) o por interferencia mediante la medición de 1) marcadores de formación de hueso y/o actividad de osteoblastos, tales como, pero sin limitación, fosfatasa alcalina específica de osteoblastos, osteocalcina, propéptido C' de procolágeno de tipo 1 (PICP), fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7: 243(1995)) y propéptido N terminal de procolágeno 1 de suero (P1NP) y/o 2) marcadores de reabsorción de hueso y/o actividad de osteoclastos incluyendo, pero sin limitación, piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas resistentes a tartrato de plasma y galactosil hidroxilisina; (véase Comier, misma referencia), TRAP 5b de suero (fosfatasa ácida resistente a tartrato isoforma 5b) y telopéptido C reticulado en suero (sCTXI). La cantidad de masa ósea también puede calcularse a partir de los pesos corporales o mediante el uso de otros métodos (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5: 177-181, 1984). Se usan animales y modelos animales particulares en la técnica para ensayar el efecto de las composiciones de la invención en, por ejemplo, parámetros de pérdida de hueso, reabsorción del hueso, formación de hueso, fuerza ósea o mineralización del hueso que imitan las condiciones de enfermedad humana tales como osteoporosis y osteopenias. Los ejemplos de dichos modelos incluyen el modelo de rata ovariectomizada (Kalu, D.N., The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone and Mineral 15: 175192 (1991); Frost, H.M. y Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoponosis. Bone and Mineral 18: 227-236 (1992); y Jee, W.S.S. y Yao, W., Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1: 193-207 (2001)).
Las afecciones particulares que pueden tratarse por las composiciones de la presente invención incluyen una amplia diversidad de causas de osteopenia, osteoporosis y pérdida de hueso. Los ejemplos representativos de dichas afecciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exostosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis y osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de huesa inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de peso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrantes del hueso, pérdida ósea oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades ósea metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juvenil, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémico (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides, pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteopenia u osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, displasia fibrosa, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial. Más afecciones se relacionan con pérdida de hueso asociada con el envejecimiento, incluyendo pérdida de hueso facial asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con el envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con el envejecimiento.
Las composiciones de la presente invención también pueden ser útiles para mejorar resultados en procedimientos ortopédicos, procedimientos dentales, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto óseo, cirugía cosmética ósea y reparación del hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial. Puede administrarse una o más composiciones antes, durante y/o después del procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación.
La invención también proporciona un kit de diagnóstico que comprende al menos un anticuerpo anti-esclerostina según la presente invención. Además, dicho kit puede comprender opcionalmente uno o más de los siguientes:
(1) instrucciones para usar el o los agentes de unión para exploración, diagnóstico, pronóstico, supervisión
terapéutica o cualquier combinación de estas aplicaciones;
(2) un compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión anti-esclerostina;
(3) una fase sólida (tal como una tira de reactivo) sobre la que se inmovilizan el agente o agentes de unión anti-
esclerostina; y
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(4) un marcador o inserto que indica la aprobación reguladora para uso de exploración, diagnóstico, pronóstico o terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
Si no se proporciona compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión, el agente o los agentes de unión en sí mismos pueden marcarse con uno o más de un marcador o marcadores detectables, por ejemplo un resto quimioluminiscente, enzimático, fluorescente o radiactivo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1
Expresión recombinante de esclerostina
La esclerostina recombinante humana/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1589-ST-025).
Como alternativa, las diferentes especies de esclerostina pueden expresarse de forma transitoria en células 293T o 293EBNA adaptadas para suspensión sin suero. Pueden realizarse transfecciones como cultivos de 500 ml o 1 l. Los siguientes reactivos y materiales están disponibles de Gibco BRL (ahora Invitrogen, Carlsbad, CA). Los números de catálogo se enumeran entre paréntesis: DMEM sin suero (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); Complemento de Selenio-Transferrina-Insulina 1X (51500-056); Pen Strep Glut 1X (10378-016); I-Glutamina 2 mM (25030-081); HEPES 20 mM (15630-080); Pluronic F68 al 0,01% (24040-032). Brevemente, el inóculo celular (5,010,0 X 105 células/ml por volumen de cultivo) se centrifuga a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C para retirar el medio acondicionado.
Las células se resuspenden en DMEM sin suero y se centrifugan de nuevo a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C. Después de aspirar la solución de lavado, las células se resuspenden en medio de crecimiento [DMEM/F12 (3:1) + Complemento de Insulina-Transferrina-Selenio 1X + Pen Strep Glut 1X + L-Glutamina 2 mM + HEPES 20 mM + Pluronic F68 al 0,01%] en un cultivo de matraz en agitación de 1 l o 3 l. El cultivo del matraz en agitación se mantiene en una placa de agitación magnética a 125 RPM que se sitúa en un incubador humidificado mantenido a 37 °C y CO2 al 5%. El ADN plasmídico de expresión de mamífero (por ejemplo, pcDNA3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), que contiene la región codificante completa (y codón de parada) de esclerostina con una secuencia consenso de Kozak (por ejemplo, CCACC) directamente 5' del sitio de inicio ATG, está en complejo con el reactivo de transfección en un tubo cónico de 50 ml.
El complejo de reactivo de transfección de ADN puede prepararse en 5-10% del volumen de cultivo final en DMEM u OPTI-MEM sin suero. Los reactivos de transfección que pueden usarse para este fin incluyen X-tremeGene RO- 1539 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), FuGene6 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 293fectin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se añade en primer lugar 1,5 |ig de ADN plasmídico/ml de cultivo a DMEM sin suero, seguido de 1-5 |il de reactivo de transfección/ml de cultivo. Los complejos pueden incubarse a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-30 minutos y después añadirse a las células en el matraz de agitación. La transfección/expresión puede realizarse durante 4-7 días, después de lo cual el medio acondicionado (CM) se recoge por centrifugación a 4.000 RPM durante 60 minutos a 4 °C.
Ejemplo 2
PURIFICACIÓN DE ESCLEROSTINA RECOMBINANTE
La esclerostina recombinante se purificó de células hospedadoras de mamífero como sigue. Todos los procesos de purificación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se usó un esquema de purificación para purificar diversas especies de esclerostina, incluyendo esclerostina murina y humana. El esquema de purificación usó cromatografía de afinidad seguido de cromatografía de intercambio catiónico.
Cromatografía de heparina
El medio acondicionado de célula hospedadora de mamífero (CM) se centrifugó en una centrífuga Beckman J6-M1 a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C para retirar residuos celulares. El sobrenadante de CM se filtró después a través de un filtro de 0,2 |im estéril. (En este punto el CM filtrado estéril puede almacenarse opcionalmente congelado hasta su purificación). Si el CM se congeló, este se descongeló a las siguientes temperaturas, o combinación de las mismas: 4 °C, temperatura ambiente o agua templada. Después de la congelación el CM se filtró a través de un filtro de 0,2 |im estéril y se concentró opcionalmente por ultrafiltración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de punto de corte de 10 kD de peso molecular. El concentrado de CM se filtró a través de un filtro de 0,2 |im estéril y después
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se cargó en una columna de Alto Rendimiento de Heparina (Heparina HP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences) equilibrada en PBS. Como alternativa, el sobrenadante de CM filtrado puede cargarse directamente en la columna de Heparina HP equilibrada en PBS.
Después de cargar, la columna de Heparina HP se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal (es decir, absorbancia medida antes de cargar el sobrenadante de CM). La esclerostina se eluyó después de la columna usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 2 M en PBS. La absorbancia a 280 nm del eluato se supervisó y se recogieron las fracciones que contenían proteína. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de Heparina HP.
Cromatografía de Intercambio Catiónico
La esclerostina eluida de la columna de Heparina HP se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio catiónico usando medio de cromatografía de Alto Rendimiento SP (SPHP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences). Se cambió el tampón del grupo de heparina HP a PBS por diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). El grupo de Heparina HP dializado se cargó después en una columna de SPHP equilibrada en PBS. Después de cargar, la columna se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal. La esclerostina se eluyó después de la columna SPHP usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 1 M en PBS. La absorbancia a 280 nm de eluato se supervisó y se recogió la esclerostina eluida en fracciones. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de SPHP.
Formulación
Después de la purificación, el grupo de SPHP se formuló en PBS mediante diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). Si fue necesaria la concentración de esclerostina, se usó un dispositivo de centrífuga (Amicon Centricon o Centriprep) con una membrana de 10.000 de PCPM. Después de la formulación la esclerostina se filtró a través de un filtro de 0,2 |im estéril y se almacenó a 4 °C o se congeló.
Ejemplo 3
ELISA DE UNIÓN DE PÉPTIDOS
Se sintetizó una serie de péptidos solapantes (siendo cada péptido de aproximadamente 20-25 aminoácidos de longitud) basándose en la secuencia de aminoácidos conocida de la esclerostina de rata (SEQ ID NO: 98). Los péptidos se diseñaron de modo que todos contuvieran un resto de cisteína reducido; se incluyó una cisteína adicional en el extremo C terminal de cada péptido que no contenía ya una en su secuencia. Esto permitió a los péptidos unirse a las placas de ensayo mediante acoplamiento covalente, usando placas de unión de sulfhidrilo disponibles en el mercado (Costar), a una concentración de 1 |ig/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS: pH 6,5) que contenían EDTA 1 mM. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 0,5%. Las placas se bloquearon mediante incubación con una solución de PBS que contenía gelatina de piel de pescado 0,5% (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en PBS que contenía Tween 20 0,5%.
Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a 1 |ig/ml en PBS que contenía gelatina de piel de pescado al 0,5% y se incubaron con las placas recubiertas de péptido durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiró el anticuerpo en exceso mediante tres lavados con PBS, Tween 20 0,5%. Las placas se incubaron después con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (diluido de forma apropiada en PBS que contenía Tween 20 0,5%) y capaz de unirse al anticuerpo de interés. Las placas se lavaron después tres veces: una vez con PBS que contenía Tween 20 0,5% y dos veces con PBS. Finalmente las placas se incubaron con un sustrato cromogénico de peroxidasa de rábano rusticano (TMB-Stable Stop, RDI) durante 5 minutos a temperatura ambiente, el desarrollo del color se detuvo con ácido y se midió la densidad óptica de las placas a 450 nm.
Materiales
Placas de Unión de Sulfhidrilo de Costar (VWR n° 29442-278)
Tampón de recubrimiento: PBS 1X pH 6,5 + EDTA 1 mM
Tampón de bloqueo: PBS 1X + Gelatina de Piel de Pescado 0,5% (PBS de CS; FSG de Sigma n° G 7765) Tampón de lavado: PBS 1X + Tween 20 0,5%
Péptidos de Esclerostina de Rata
Muestras de anticuerpo: Ab transitorio, Ab recombinante Purificado, Suero de conejo, etc.
Ab secundario apropiado: de Cabra-anti-HRP de Ratón/Conejo (Jackson Immuno Research, 115-036-072) TMB-Stable Stop (RDI n° RDI-TMBSX-1L)
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1. Recubrir placas con 100 |il/pocillo de péptido de esclerostina de rata diluido en PBS 1x pH 6,5 + EDTA 1 mM a 1 |ig/ml. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. (Las placas deberían usarse en un periodo de 30 minutos desde la apertura).
2. Lavar placas 3X con tampón de lavado.
3. Bloquear las placas con 200 |il/pocillo de tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Repetir el lavado como se ha descrito en (2).
5. Incubar las placas con 50 |il/pocillo de muestras diluidas en tampón de bloqueo - los títulos de suero comienzan a 1:100; uso de Ab Recombinante Transitorio puro; uso de Ab recombinante Purificado a 1 |ig/ml (todas las muestras se procesan por duplicado). Incubar las placas durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Lavar las placas como se ha descrito en (2).
7. Incubar las placas con 50 |il/pocillo de Anticuerpo Secundario apropiado (marcado con HPR) diluido 1:1600 en Tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
8. Lavar las placas con tampón de lavado 1X, PBS 2X.
9. Incubar las placas con 50 |il/pocillo de TMB, 5 minutos a temperatura ambiente.
10. Detener la reacción con 50 |il/pocillo de HCl 0,5 M.
11. Leer placas a 450 nm de longitud de onda.
Las siguientes secuencias peptídicas se exploraron como se ha descrito anteriormente:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID NO: 82)
TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO: 83)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO: 84)
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO: 85)
CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID NO: 86)
CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (SEQ ID NO: 87)
CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID NO: 88)
CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 89)
RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID NO: 90)
PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO: 91)
KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO: 92)
IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID NO: 93)
SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO: 94)
KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO: 95)
PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96)
KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
Un anticuerpo neutralizante de alta afinidad (Ab-19) se unió a dos secuencias peptídicas solapantes: PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96) y KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
Este procedimiento permite el reconocimiento de epítopos por anticuerpos que reaccionan con epítopos aparentemente lineales. Los péptidos que contienen todo o parte del sitio de unión a anticuerpo se unirán al anticuerpo y de este modo se detectarán.
Ejemplo 4
IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS DE ESCLEROSTINA HUMANA Estructura de esclerostina
La esclerostina humana de forma madura (péptido señal retirado) es una proteína de 190 aminoácidos (Figura 8). La Figura 9 muestra un esquema de la estructura general de la esclerostina con una rama N terminal (de la Q N terminal a Cisteína 1) y una rama C terminal (de Cisteína 8 a la Y terminal). Intercalada entre estas dos ramas hay una estructura de nudo de cistina y tres bucles que se designan Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Los cuatro enlaces disulfuro en esclerostina son Cys1 en la posición de secuencia 57 unida a Cys5 en la posición de secuencia 111

(denominado C1-C5), Cys2 en la posición de secuencia 71 unida a Cys6 en la posición de secuencia 126

(denominado C2-C6), Cys3 en la posición de secuencia 82 unida a Cys7 en la posición de secuencia 142

(denominado C3-C7), Cys4 en la posición de secuencia 86 unida a Cys8 en la posición de secuencia 144
(denominado C4-C8). La estructura en anillo de ocho miembros se forma mediante enlaces disulfuro C3-C7 y C4- C8. Esa estructura en anillo, junto con el enlace disulfuro C1-C5 que penetra a través del anillo, forma un nudo de cistina típico. C2-C6, que no es parte del nudo de cistina, pone dos estructuras en bucle grandes, bucle 1 (restos 57 a 82) y bucle 3 (restos 111 a 142) juntos entre sí. El bucle 2 va de C4 (resto 86) a C5 (resto 111).
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El enfoque general para caracterizar los epítopos unidos por anticuerpos monoclonales anti-esclerostina implicó fragmentar la Esclerostina humana en péptidos con diferentes proteasas, determinar la secuencia de los diversos péptidos de esclerostina humana, aislar estos péptidos y ensayar cada uno de ellos con respecto a su capacidad para unirse a un anticuerpo monoclonal particular usando un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Los datos resultantes permitieron que se determinara la localización del epítopo de unión.
Las digestiones peptídicas se sometieron a mapeo de péptidos por HPLC; los picos individuales se recogieron y los péptidos se identificaron y se mapearon mediante espectrometría de masas por desorción de láser asistida por matriz (MALDI-MS) y análisis de LC-MS de ionización por electronebulización (ESI-LC-MS) y/o mediante secuenciación N terminal. Todos los análisis de HPLC para estos estudios se realizaron usando una columna C8 de fase inversa (2,1 mm i.d. x 15 cm de longitud). El mapeo de péptidos por HPLC se realizó con un gradiente lineal de ácido tricloroacético 0,05% (fase móvil A) a acetonitrilo al 90% en ácido trifluoroacético al 0,05%. Las columnas se desarrollaron durante 50 minutos a un caudal de 0,2 ml/min.
Digestiones con tripsina y AspN Endoproteinasa
La esclerostina humana en forma madura se digirió con tripsina, que escinde después de arginina y lisina, o con AspN. Se incubaron aproximadamente 200 |ig de esclerostina a 0,5-1,0 mg/ml en PBS (pH 7,2) durante 20 h a 37 °C con 8 |ig de tripsina o AspN.
Digestión de tripsina
La cromatografía de HPLC de las digestiones de tripsina produjo varios picos importantes (Fig. 10A). Se realizó análisis de secuencia en los picos peptídicos recuperados de HPLC después de digestión con tripsina. El análisis de ESI LC-MS en línea del producto de digestión peptídica también se realizó para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. Se determinó de este modo la identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos (Fig. 11). La Figura 13 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (T19,2, T20, T20,6, T21-22) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada T (por ejemplo, T19,2) refleja el tiempo de retención. T19,2 contiene dos péptidos (uno del bucle 1 y uno del bucle 3) unidos por el enlace disulfuro C2-C6. T20 contiene dos péptidos mantenidos juntos por la estructura de nudo de cistina, con los bucles intactos 1 y 3 mantenidos juntos por el disulfuro C2-C6 y con la mayor parte del bucle 2 ausente. T20,6 contiene cuatro secuencias mantenidas juntas por la estructura de nudo de cistina, pero carece de parte del bucle 1 y bucle 3 (la parte T19,2) y carece de la mayoría del bucle 2. T21-22 es casi idéntico a T20 pero tiene 3 aminoácidos adicionales en la región del bucle 2.
Digestión con AspN
La cromatografía de HPLC de los productos de digestión de AspN produjo varios picos principales (Fig. 10B). Se realizó análisis de secuencia de los picos peptídicos recuperados de HPLC. También se realizó análisis de ESI LC- MS en línea del producto de digestión peptídico para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. La identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos del producto de digestión de AspN se determinó de este modo (Fig. 12). La Figura 14 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (AspN14,6, AspN18,6, AspN22,7-23,5) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada AspN (por ejemplo AspN 18,6) refleja el tiempo de retención. AspN14,6 contiene tres péptidos cortos de las ramas tanto N como C terminales de esclerostina, mientras que AspN 18,6 es un péptido mayor de la rama N terminal de esclerostina. AspN22,7-23,5 contiene un único fragmento peptídico de 104 aminoácidos que abarca las ocho cisteínas (los cuatro enlaces disulfuro), el nudo de cistina y todos los bucles 1, 2 y 3.
La estrategia para caracterizar los epítopos fue usar estos diversos péptidos de esclerostina humana generados por tripsina y AspN y determinar qué péptidos podían aún unirse a los diversos anticuerpos (Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D). Específicamente esto se ensayó en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore donde la unión de un anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana inmovilizada en la microplaca de Biacore se determinó en presencia o ausencia de cada una de las diversas fracciones peptídicas de HPLC de tripsina y AspN aisladas. En ausencia de cualquier péptido competidor, el anticuerpo monoclonal particular fue capaz de unirse a la esclerostina humana en la microplaca y producir una respuesta en unidades de resonancia, UR. La preincubación del anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana intacta en solución, seguida de ensayo de la unión con la microplaca, demostró que la unión del Mab con esclerostina humana en solución evitó la unión del Mab con la esclerostina humana en la microplaca, validando de este modo el principio general de este ensayo de competición.
Este procedimiento general se repitió individualmente para cada péptido. Se interpretó que una respuesta de UR robusta indicaba que el péptido particular ensayado no podía unirse al Mab en solución (por lo tanto el Mab era libre para unirse a la esclerostina humana que se había inmovilizado en la microplaca). Por el contrario, la ausencia de
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una respuesta de UR robusta indicó que el Mab era capaz de unirse al péptido de esclerostina en solución. Estos patrones de unión, acoplados con la identidad conocida de los diversos péptidos de esclerostina, se usaron para determinar los epítopos de esclerostina que se unían a anticuerpos anti-esclerostina Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D.
ENSAYO DE UNIÓN COMPETITIVA DE EPÍTOPOS PEPTÍDICOS DE ESCLEROSTINA HUMANA BASADO EN BIACORE
Preparación de superficie de esclerostina humana:
Se realizó inmovilización de esclerostina humana en forma madura en una superficie de microplaca sensora BIAcore (CM5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se activaron grupos carboxilo en las superficies de la microplaca sensora inyectando 60 |il de una mezcla de contenía N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0,2 M y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M. La esclerostina humana se diluyó en acetato sódico 10 mM, pH 4,0 a una concentración de 20 |ig/ml seguido de inyección sobre la superficie de CM5 activada. Los grupos reactivos en exceso en la superficie se desactivaron inyectando 60 |il de etanolamina 1 M. Los niveles inmovilizados finales fueron de ~ 5000 unidades de resonancia (UR) para la superficie de esclerostina humana. También se preparó una superficie de referencia acoplada a simulación blanca en las microplacas sensoras.
Análisis de especificidad de unión:
La solución salina tamponada con fosfato 1X sin cloruro cálcico o cloruro de magnesio fue de Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA. La albúmina de suero bovino, fracción V, sin IgG fue de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Cada Mab (2 nM) se incubó por separado con esclerostina humana 20 nM o un péptido de esclerostina humana particular (nota: hay 3 péptidos no unidos en AspN14,6) en el tampón de muestra (PBS 1X + P-20 0,005% + BSA 0,1 mg/ml) antes de inyección sobre la superficie de esclerostina humana inmovilizada. El caudal para la inyección de muestra fue de 5 |il/min seguido de regeneración de superficie usando NaCl 1 M en Glicina 8 mM, pH 2,0 a 30 |il/min durante 30 segundos. Los datos se analizaron usando BIAevaluación 3.2 y se presentan en la Figura 15 (Ab-A), Figura 16 (Ab- B), Figura 17 (Ab-C) y Figura 18 (Ab-D).
Epítopos T20,6 y Bucle 2:
Los patrones de unión del péptido de esclerostina para dos anticuerpos representativos (Ab-A y Ab-B) fueron prácticamente idénticos (Fig. 15 y Fig. 16) y mostraron que ambos de estos Anticuerpos podían unirse solamente al péptido AspN22,7-23,5. La única diferencia entre AspN22,7-23,5 y todos los demás péptidos de esclerostina es que AspN22,7-23,5 contiene un bucle 2 intacto. Esto muestra que Ab-A y Ab-B se unen a la región de bucle 2 de esclerostina definiendo de este modo el epítopo de bucle 2 (Fig. 19a). Los patrones de unión del péptido de esclerostina para Ab-C y Ab-D fueron prácticamente idénticos entre sí (Fig. 17 y Fig. 18) pero completamente distintos del hallado para Ab-A y Ab-B. De los péptidos ensayados en este Ejemplo, el péptido más pequeño al que pudieron unirse Ab-C y Ab-D fue el péptido T20,6. Este resultado define el epítopo T20,6 (Fig. 19B).
Ensayo de protección de proteasa:
El principio general de este ensayo es que la unión de un Mab con esclerostina puede dar como resultado la protección de ciertos sitios de escisión de proteasa específicos y esta información puede usarse para determinar la región de esclerostina con la que se une el Mab.
Epítopo “derivado de T20,6 1 (nudo de cistina + 4 ramas)”:
La Figura 20 muestra los mapas peptídicos de HPLC para un complejo de Ab-D de esclerostina humana (Fig. 20A: la esclerostina humana se preincubó a una relación molar de 1:1 con Ab-D antes de digestión con tripsina como se ha descrito anteriormente) y esclerostina humana solamente (Fig. 20B: la esclerostina humana se digirió con tripsina como se ha descrito anteriormente). Los picos peptídicos de T19,2 y T20,6 en la Figura 20A mostraron una clara reducción de su altura de pico respectiva, en comparación con la Figura 20B. Esta reducción en las alturas de los picos se vio acompañada de un aumento de la altura de los picos para los péptidos T20 y T21-22. Esto datos indican que los restos de aminoácidos básicos en el bucle 1 y bucle 3, que en ausencia de Ab-D se escindieron mediante tripsina para generar los péptidos T19,2 y T20,6, fueron resistentes a escisión por tripsina cuando Ab-D se preunió a esclerostina. La presencia de T20, T20,6 y T21-22 indica que el bucle 2 aún se escindía eficazmente cuando Ab-D estaba preunido a esclerostina. Estos datos indican que Ab-D se unió al lado del bucle 1 y bucle 3 del epítopo T20,6 definiendo de este modo el epítopo más pequeño “derivado 1 de T20,6 (nudo de cistina + 4 ramas)” mostrado en la Figura 21.
Ejemplo 5
ENSAYOS IN VIVO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN RATONES
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Se obtuvieron ratones macho BDF1 de cuatro semanas de edad de Charles River Laboratories (Raleigh, NC) y se alojaron en jaulas limpias, con cinco animales por jaula. La temperatura ambiente se mantuvo entre 20 y 22,22 °C, y la humedad relativa se mantuvo entre 34 y 73%. El laboratorio que alojaba las jaulas tuvo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y cumplía todas las especificaciones de AAALAC. Se realizaron observaciones clínicas en todos los ratones en el estudio una vez al día.
Los anticuerpos monoclonales anti-esclerostina purificados (Ab-A Fig.1; Ab-B Fig.2; Ab-C Fig.3; Ab-D Fig.4) se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco estéril. Se inyectaron anticuerpos anti-esclerostina o vehículo PBS a los ratones por vía subcutánea a 21 |il por gramo de peso corporal, dos veces por semana (lunes y martes) a 25 mg/kg. Se diluyó PTH humano (1-34) en tampón de PTH (HCl 0,001, NaCl 0,15, bSa 2%) y se dosificó por vía subcutánea a 21 |il por gramo de peso corporal cinco veces a la semana (lunes, martes, miércoles, jueves, viernes) a 100 |ig/kg como un control positivo (Figuras 5 y 6). El número de ratones por grupo fue de N=5 en las Figs. 5 y 6, y N=6 en la Figura 7.
Densitometría de hueso in vivo PIXImus
La densidad mineral ósea (DMO) se determinó semanalmente en la metáfisis tibial proximal y vértebras lumbares mediante Absorciometría de rayos X de Energía Dual periférica (pDEXA) con el sistema PlXlmus2 de GE/Lunar Medical Systems, Madison, Wl. Se situó una región de interés (ROl) de 25 mm2 para incluir la superficie articular proximal, la epífisis y el extremo proximal en la metáfisis de la tibia. Se situó una región de interés (ROI) para incluir las vértebras lumbares (L1-L5). Las regiones lumbar y tibial proximales se analizaron para determinar la densidad mineral ósea total. Se presentaron las medidas de los grupos + Desviación Típica y se compararon con el grupo de tratamiento con vehículo para análisis estadístico.
Análisis estadístico
Se realizó análisis estadístico con un Dunnett y Tukey-Kramer (usando MS Excel y JMP v. 5.0 para los datos de DMO). Las medidas de los grupos para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05).
Actividad neutralizante de esclerostina de anticuerpos
Los aumentos estadísticamente significativos de DMO en comparación con el vehículo vistos para cada uno de Ab-A (Figura 5), Ab-B (Figura 5), Ab-C (Figura 6) y Ab-D (Figura 7) demuestran que estos cuatro anticuerpos son anticuerpos neutralizantes de esclerostina. Además estos datos muestran que, para anticuerpos anti-esclerostina que se unen a esclerostina de ratón, puede usarse tratamiento y análisis de ratones como se ha descrito anteriormente para identificar anticuerpos neutralizantes de esclerostina.
Ejemplo 6
ENSAYO DE EXPLORACIÓN PARA ANTICUERPOS QUE BLOQUEAN LA UNIÓN DE UN ANTICUERPO CON ESCLEROSTINA HUMANA
La esclerostina humana se acopló a una microplaca de Biacore CM5 usando química de acoplamiento de amina convencional para generar una superficie recubierta de esclerostina. Se acoplaron 300 unidades de resonancia de esclerostina a la superficie.
Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a una concentración de 200 |ig/ml en tampón HBS-EP (que es HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005% (v/v)) y después se mezcló en una relación molar de uno a uno (basándose en el sitio de unión) para generar la mezcla de ensayo. Esta mezcla de ensayo contenía por lo tanto cada anticuerpo a una concentración de 100 |ig/ml (1,3 |im basándose en un sitio de unión). También se prepararon soluciones separadas que contenían cada uno de los anticuerpos en la mezcla de ensayo solamente. Estas soluciones contenían los anticuerpos individuales en tampón HBS-EP a una concentración de 100 |ig/ml (1,3 |im basándose en un sitio de unión).
Se pasaron 20 |il de la mezcla de ensayo sobre la microplaca recubierta con esclerostina a un caudal de 10 |il/min y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató después con dos pulsos de 60 segundos de HCl 30 mM para retirar todo el anticuerpo unido. Después se pasó una solución que contenía solamente uno de los anticuerpos de la mezcla de ensayo (a 1,3 |iM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca del mismo modo que la mezcla de ensayo y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido y finalmente se pasó una solución que contenía el otro anticuerpo de la mezcla de ensayo solamente (a 1,3 |iM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca y se registró la cantidad de unión.
La tabla posterior muestra los resultados de ensayos de bloqueo cruzado en una serie de anticuerpos diferentes.
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Los valores en cada celda de la tabla representan la cantidad de unión (en UR) vista cuando los anticuerpos (a 1,3 |iM basándose en un sitio de unión) o tampón indicados en la fila superior de la tabla se mezclaron con los anticuerpos (a 1,3 |iM basándose en un sitio de unión) o tampón indicados en la primera columna de la tabla.
Tampón Ab-4 Ab-13 Ab-A Ab-3 Ab-19
Tampón
-0,5 693 428,5 707,3 316,1 649,9
Ab-4
687,7 795,1 1018,2 860,5 869,3 822,5
Ab-13
425,6 1011,3 442,7 1108,4 431,9 1042,4
Ab-A
692,4 833,1 1080,4 738,5 946,2 868,1
Ab-3
305,5 845,1 428,2 952,2 344,4 895,7
Ab-19
618,1 788,6 1022,5 863,3 891,5 658,7
Usando el valor de unión medio (en UR) para cada combinación de anticuerpos de la tabla anterior (puesto que cada combinación aparece dos veces) es posible calcular el porcentaje de la unión teórica mostrado por cada combinación de anticuerpos. La unión teórica se calcula como la suma de los valores medios para los componentes de cada mezcla de ensayo cuando se ensayan solos (es decir, anticuerpo y tampón).
Tampón Ab-4 Ab-13 Ab-A Ab-3 Ab-19
Tampón
Ab-4
90,75 60,45 85,4 60,75
Ab-13
96,9 58,0 97,0
Ab-A
93,5 65,0
Ab-3
94,4
Ab-19
A partir de los datos anteriores resulta evidente que Ab-4, Ab-A y Ab-19 se bloquean de forma cruzada entre sí. De forma similar Ab-13 y Ab-3 se bloquean de forma cruzada entre sí.
Ejemplo 7
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA
Los volúmenes líquidos usados en este ejemplo serían los usados típicamente en ELISA de placa de 96 pocillos (por ejemplo 50-200 |il/pocillo). En este ejemplo se supone que Ab-X y Ab-Y tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión de esclerostina por molécula de anticuerpo. Un anticuerpo anti- esclerostina (Ab-X) se usa para recubrir (por ejemplo 50 |i de 1 |ig/ml) una placa de ELISA de 96 pocillos [por ejemplo, Microplaca de Fondo Plano EIA/RIA de 96 Pocillos de Corning (Producto n° 3590), Corning Inc., Acton, MA] durante al menos una hora. Después de esta etapa de recubrimiento se retira la solución de anticuerpo, la placa se lava una vez o dos veces con solución de lavado (por ejemplo, PBS y Tween 20 0,05%) y después se bloquea usando una solución de bloqueo apropiada (por ejemplo, PBS, BSA 1%, suero de cabra 1% y Tween 20 0,5%) y procedimientos conocidos en la técnica. La solución de bloqueo se retira después de la placa de ELISA y se añade un segundo anticuerpo anti-esclerostina (Ab-Y) que se ensaya con respecto a su capacidad para bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento, en exceso (por ejemplo 50 |il de 10 |ig/ml) en solución de bloqueo a los pocillos apropiados de la placa de ELISA. A continuación, se añade después una cantidad limitada (por ejemplo 50 |il de 10 ng/m) de esclerostina en solución de bloqueo a los pocillos apropiados y la placa se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente en agitación. La placa se lava después 2-4 veces con solución de lavado. Se añade una cantidad apropiada de un reactivo de detección de esclerostina [por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-esclerostina biotinilado que se ha unido en complejo previamente con una cantidad apropiada de un conjugado de peroxidasa de rábano rusticano-esclerostina (hPr)] en solución de bloqueo a la placa de ELISA y se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente. La placa se lava después al menos cuatro veces con solución de lavado y se desarrolla con un reactivo apropiado [por ejemplo, sustratos de HRP tales como TMB (colorimétrico) o diversos sustratos luminiscentes de HRP]. La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario que el ensayo de ELISA se procese de tal modo que la señal de control de positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.
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Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultantes de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:
1) el formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución
y
2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.
Ab-X y Ab-Y se definen como de bloqueo cruzado si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo anti- esclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60% y el 100%, específicamente entre el 70% y el 100%, y más específicamente entre el 80% y 100%, de la señal de detección de esclerostina (es decir la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir los pocillos de control positivos).
En el caso de que se use una versión marcada de esclerostina en el ELISA, tal como una Esclerostina marcada con His N terminal (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat n° 1406-ST-025) entonces un tipo apropiado de reactivo de detección de esclerostina incluiría un anticuerpo anti-His marcado con HROP. Además de usar Esclerostina marcada con His N terminal, también podría usarse Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador conocidos en la técnica en este ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA (por ejemplo, marcador HA con anticuerpos antiHA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG, marcador de biotina con estreptavidina).
Ejemplo 8
ENSAYO DE MINERALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS PARA IDENTIFICAR AGENTES CAPACES DE ANTAGONIZAR LA ACTIVIDAD DE ESCLEROSTINA
Introducción
Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modelo in vitro de formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de la diferenciación de células de linaje de osteoblastos mediante uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de matriz y finalmente deposición de minerales, que se refiere a la cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición de mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.
La deposición de mineral tiene una fuerte característica biofísica, porque una vez que las “semillas” minerales comienzan a formarse, la cantidad total de mineral que se depositará en el cultivo completo puede en ocasiones depositarse con bastante rapidez, tal como en un periodo de unos pocos días después. El momento y alcance de la deposición mineral en cultivo están influidos, en parte, por las células/línea celular de linaje de osteoblastos particular que se use, las condiciones de crecimiento, la elección de agentes de diferenciación y el número de lote particular del suero usado en el medio de cultivo celular. Para cultivos de mineralización de línea celular/célula de linaje de osteoblastos, deberían ensayarse al menos de ocho a quince lotes de suero de más de un proveedor para identificar un lote de suero particular que permita que se produzca la mineralización.
Las células MC3T3-E1 (Sudo H et al., In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96: 191-198) y subclones de la línea cellular original pueden formar mineral en cultivo tras su crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J Biol Chem 275: 19992-20001).
Identificación de Anticuerpos Neutralizantes de Esclerostina
Se usaron células MC3T3-E1-BF para el ensayo de mineralización. Se usaron ácido ascórbico y B-glicerofosfato para inducir diferenciación de células MC3T3-E1-BF que conduzca a deposición mineral. El protocolo de exploración específico, en formato de 96 pocillos, implicó sembrar células en placas un miércoles, seguido de siete cambios de medio (como se describe adicionalmente posteriormente) durante un periodo de 12 días, teniendo lugar la mayor parte de la deposición mineral aproximadamente en las dieciocho horas finales (por ejemplo, del domingo por la noche al lunes). Para cualquier tratamiento dado, se usaron 3 pocillos (N=3). El momento y alcance específicos de la deposición mineral pueden variar dependiendo, en parte, del número de lote de suero particular que se use. Los
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experimentos de control permitirán explicar dichas variables, como se conoce bien en la técnica de la experimentación de cultivo celular en general.
En este sistema de ensayo la esclerostina inhibió uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducían a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibió la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que fueron capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitaron la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hubo un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medida en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir, sin anticuerpo). Para análisis estadístico (usando MS Excel y JMP) se usó un ANOVA de 1 vía seguido de comparación de Dunnett para determinar diferencias entre grupos. Las medias de grupo para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05). Se muestra un resultado representativo del procesamiento de este ensayo en la Figura 22. En ausencia de esclerostina de ratón recombinante, la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral sucedieron con normalidad. Se muestran los niveles de calcio en cada grupo de tratamiento como medias + Error Típico de la Media (ETM). En este experimento ejemplar los niveles de calcio del ensayo de calcio fueron ~31 |ig/ml. Sin embargo, la adición de esclerostina de ratón recombinante provocó inhibición de la mineralización y el calcio se redujo en ~85%. La adición de anticuerpo monoclonal anti-esclerostina Ab-19 o Ab-4 junto con la esclerostina recombinante dio como resultado un aumento estadísticamente significativo en la deposición mineral, en comparación con el grupo solamente de esclerostina, debido a que la actividad inhibidora de esclerostina se neutralizó por uno de los anticuerpos. Los resultados de este experimento indican que Ab-19 y Ab-4 son anticuerpos monoclonales neutralizantes de esclerostina (Mab).
La Figura 23 muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y dos Mab anti- esclerostina humanizados. La Figura 24 también muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y Mab anti-esclerostina de ratón y humanizados según se indica.
Los anticuerpos usados para los experimentos mostrados en la Fig. 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.
Se describe a continuación un protocolo de cultivo de células MC3T3-E1-BF.
Reactivos y Medios
Reactivos
Alfa-MEM Ácido ascórbico Beta-glicerofosfato PenStrepGlutamina 100X Dimetilsulfóxido (DMSO) Suero fetal bovino (FBS) o suero fetal bovino (FBS)
Compañía
Gibco-Invitrogen
Sigma
Sigma
Gibco-Invitrogen Sigma Cansera TerraCell Int.
N° de catálogo
12571-048 A4544 G6376 10378-016 D5879 o D2650
CS-C08-500 (n° de lote SF50310) CS-C08-1000A (n° de lote SF-20308)
Alfa-MEM se fabrica habitualmente con una fecha de caducidad de 1 año. Para el cultivo celular se usó Alfa-MEM que no tenía más de 6 meses después de la fecha de fabricación.
Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu) se preparó como sigue:
Se descongeló un frasco de 500 ml de FBS y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micrómetros.
Se añadieron 100 ml de este FBS a 1 litro de Alfa-MEM seguido de la adición de 10 ml de PenStrepGlutamina 100x.
El FBS no usado se separó en alícuotas y se volvió a congelar para uso posterior.
El Medio de Diferenciación (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu + ácido ascórbico 50 |ig/ml + beta-glicerofosfato 10 mM) se preparó como sigue:
Se prepararon 100 ml de Medio de Diferenciación complementando 100 ml de Medio de Expansión con ácido ascórbico y beta-glicerofosfato como sigue:
Conc. de reserva (véase posteriormente) Volumen Conc. Final Ácido ascórbico 10 mg/ml 0,5 ml 100 |ig/ml (50 |ig/ml + 50 |ig/ml)
P-glicerofosfato 1 M 1,0 ml 10 nM
Se preparó Medio de Diferenciación complementando Medio de Expansión solamente el día en que el Medio de Diferenciación iba a usarse para cultivo celular. La concentración final de ácido ascórbico en el Medio de Diferenciación es de 100 |ig/ml debido a que Alfa-MEM ya contiene ácido ascórbico 50 |ig/ml. Se preparó solución madre de ácido ascórbico (10 mg/ml) y se separó en alícuotas para congelar a -80 °C. Cada alícuota se usó
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solamente una vez (es decir no se volvió a congelar). Se preparó solución madre de betaglicerofosfato (1 M) y se separó en alícuotas para congelar a -20 °C. Cada alícuota se congeló y se descongeló un máximo de 5 veces antes de descartarse.
Cultivo Celular para expansión de células MC3T3-E1-BF.
Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO2 5%. Se generó un banco de células para los fines de explorar con respecto a anticuerpos neutralizantes de esclerostina. El banco de células se creó como sigue:
Se descongeló un recipiente de células MC3T3-E1-BF congeladas mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, se sembraron 1 x l06 células en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu en un matraz T175.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente a los 7 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 2 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 células en placas con 50 ml de medio Alfa- MEM/FBS 10%/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces de T175 usados para sembrar en este punto dependió del número de células totales disponible y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%. Este “pase final” de células congeladas fue el pase que se usó para el ensayo de exploración.
Cultivo celular para mineralizar células MC3T3-E1-BF.
Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO2 5%. Es deseable minimizar las fluctuaciones de temperatura y % de CO2 durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. Esto puede conseguirse minimizando el tiempo que las placas pasan fuera del incubador durante la alimentación y también minimizando el número de veces que se abre y se cierra la puerta del incubador durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. A este respecto puede ser útil tener un incubador de cultivo tisular que esté dedicado exclusivamente al cultivo celular de mineralización (y por lo tanto no se abra o cierre más de lo que es necesario).
Se descongeló un número apropiado de recientes de “pase final” preparados como se ha descrito anteriormente mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células por azul de tripano y hemacitómetro, se sembraron 2500 células en placas en 200 microlitros de medio de Expansión por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I (Becton Dickinson Labware, cat. n° 354407).
Para evitar un efecto de mineralización de borde de placa, las células no se sembraron en las placas en la columna/fila más externa en todo el borde de la placa. En su lugar se añadieron 200 microlitros de PBS a estos pocillos.
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Procedimiento de cultivo celular ejemplar
En el siguiente procedimiento, se indica que el día de partida para la siembra de las células en placas es un miércoles. Si se usa un día de la semana diferente como el día de partida para la siembra de las células en placas, ese día dará inicio al programa diario de retirada y adición de medio durante el proceso completo como se indica posteriormente. Por ejemplo, si las células se siembran un martes, el medio no debería retirarse y añadirse el primer viernes y sábado, ni el segundo viernes y sábado. Con un comienzo en martes, las placas se prepararían para el ensayo de calcio el domingo final.
Las células se sembraron un miércoles a 2500 células en 200 |il de medio de Expansión.
El jueves se retiró todo el medio de Expansión y se añadieron 200 |il de Medio de Diferenciación.
El viernes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El lunes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El martes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El miércoles se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El jueves se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El viernes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El lunes siguiente se prepararon placas para el ensayo de calcio como sigue:
Las placas se lavaron una vez con Tris 10 mM, HCl pH 7-8.
Trabajando bajo una campana de humos, se añadieron 200 |il de NHC 0,5 N por pocillo. Las placas se congelaron después a -80 °C.
Justo antes de medir el calcio, las placas se congelaron-descongelaron dos veces y después se usó trituración con una pipeta multicanal para dispersar los contenidos de la placa. Después se permitió que los contenidos de la placa reposaran a 4 °C durante 30 minutos momento en el cual se retiró una cantidad apropiada de sobrenadante para medir el calcio usando un kit de calcio disponible en el mercado. Un kit ejemplar y no limitante es Calcium (CPC) Liquicolor, Cat. N° 0150-250, Stanbio Laboratory, Boerne, TX.
En este ensayo basado en células, la esclerostina inhibe uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Por lo tanto, en experimentos en los que se indujo esclerostina en el experimento de cultivo celular particular, se añadió la esclerostina recombinante al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. En los casos en los que se ensaya un anticuerpo monoclonal anti-esclerostina (Mab) con respecto a la capacidad para neutralizar esclerostina, es decir, permitir la mineralización neutralizando la capacidad de la esclerostina para inhibir la mineralización, el Mab se añadió al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. De acuerdo con el protocolo, eso se consiguió como sigue: el Mab se preincubó con la esclerostina recombinante en medio de Diferenciación durante 45-60 minutos a 37 °C y después este medio se usó para alimentar a las células.
Se ha descrito anteriormente un protocolo de mineralización de 12 días para las células MC3T3-E1-BF. Usando los mismos reactivos y protocolo de alimentación, las células originales MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96: 191-198) que los inventores obtuvieron del Banco de Células RIKEN (RCB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsukubashi, Ibaraki 305-0074, Japón) tardaron más en mineralizarse (20 días totales para la mineralización) que las células MC3T3-E1-BF. La mineralización de las células MC3T3-E1 originales se inhibió mediante esclerostina recombinante y esta inhibición se bloqueó usando un anticuerpo neutralizante de esclerostina.
Ejemplo 9
EL ANTICUERPO ANTI-ESCLEROSTINA PROTEGE DE LA PÉRDIDA DE HUESO INDUCIDA POR INFLAMACIÓN EN EL MODELO DE TRANSFERENCIA DE CD4 CD45RBHI DE COLITIS EN RATONES SCID
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La inyección del subconjunto CD45RBalto de linfocitos T CD4+ en ratones scid C.B-17 da como resultado la inflamación intestinal crónica con características similares a las de enfermedad inflamatoria del intestino humana (IBD). Se observa diarrea y enfermedad de debilitamiento 3-5 semanas después de la transferencia celular con infiltración de leucocitos grave en el colon acompañado de hiperplasia de células epiteliales y formación de granuloma. Los ratones scid C.B-17 que reciben el subconjunto recíproco de células CD4+, las que expresan CD45RBbajo, no muestran colitis y tienen un aumento de peso indistinguible de ratones scid no inyectados. Además de los síntomas de colitis, el modelo de transferencia de linfocitos T CD4+ CD45RBalto de colitis está acompañado de una reducción de la densidad mineral ósea (DMO), que se cree que es principalmente mediante mecanismos inflamatorios en lugar de malabsorción dietética (Byrne, F. R. et al, Gut 54: 78-86, 2005).
Inducción de colitis y pérdida de hueso inducida por inflamación
Se tomaron bazos de ratones balb/c hembra y se rompieron mediante un tamiz celular de 70 |im. La población de CD4+ se enriqueció después mediante selección negativa con Dynabeads usando anticuerpos contra B220, MAC-1, CD8 e I-Ad. La población enriquecida se tiñó después con anti-CD4 conjugado con FITC y anti-CD45RB conjugado con PE y se fraccionó en poblaciones CD4+CD45RBalto y CD4+CD45RBbajo por separación de dos colores en un Moflo (Dakocytomation). Las poblaciones de CD45RBalto y CD45RBbajo se definieron como el 40% de tinción más brillante y el 20% de tinción más pálida de células CD4+ respectivamente. Se inyectaron después 5x105 células i.p. en ratones scid C.B-17 el día 0 y se supervisó el desarrollo de colitis mediante la aparición de heces blandas o diarrea y pérdida de peso. Se tomaron mediciones de densidad mineral ósea al final del estudio (día 88).
Efecto del tratamiento anti-Esclerostina en síntomas de colitis y DMO
Se dosificó IgG Ab-A a 10 mg/kg s.c. desde el día antes de la transferencia de células CD4+CD45RBalto y se comparó con ratones que recibieron el anticuerpo de control negativo 101.4 también dosificado a 10 mg/kg s.c. Los anticuerpos se dosificaron semanalmente a continuación. Un grupo de ratones que recibió células CD4+CD45RBbajo no patógenas y se dosificaron con 10 mg/kg de 101.4 se estudió como un control. Al final del estudio (día 88) se midió la densidad mineral ósea y se tomaron secciones del colon para análisis de infiltración celular y evaluación de daño histológico.
a) Sin efecto en síntomas de colitis
Los síntomas de colitis típicos tales como pérdida de peso e infiltración de células inflamatorias en el colon no se vieron afectados por el tratamiento con Ab-A. De forma similar no hubo mejora de daño histológico al colon después del tratamiento con Ab-A.
b) Inhibición de pérdida inducida por inflamación de densidad mineral ósea.
El día 88 después de la transferencia de células en ratones scid C.B-17, se midió la densidad mineral ósea (DMO total, DMO de vértebras y ^ DMO del fémur). En comparación con ratones de control que recibieron células no patógenas CD4+CD45RBbajo, los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y el anticuerpo de control negativo 101.4 tuvieron densidad mineral ósea reducida, como se muestra en la Figura 25. Por el contrario, no se observó reducción de DMO después de tratamiento con Ab-A. Las mediciones total, de vértebras y de fémur de DMO fueron significativamente mayores en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con Ab-A que los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con 101.4 (P<0,001 por ensayo de comparación múltiple de Bonferroni).
Ejemplo 10
DETERMINACIÓN BASADA EN KINEXA DE AFINIDAD (Kd) DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA POR ESCLEROSTINA HUMANA
La afinidad de varios anticuerpos anti-esclerostina por esclerostina humana se evaluó mediante un análisis de unión en equilibrio en solución usando KinExA® 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Para estas mediciones, se pre-recubrieron perlas Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) con esclerostina humana 40 |ig/ml en Na2C03 50 mM, pH 9,6 a 4 °C durante una noche. Las perlas se bloquearon después con BSA 1 mg/ml en Tris-HCl 1 M, pH 7,5 a 4 °C durante dos horas. Se mezclaron 10 pM, 30 pM o 100 pM del anticuerpo con diversas concentraciones de esclerostina humana, que varió en concentración de 0,1 |iM a 1 nM, y se equilibró a temperatura ambiente durante más de 8 horas en PBS con BSA 0,1 mg/ml y P20 0,005%. Las mezclas se pasaron después sobre las perlas recubiertas con esclerostina humana. La cantidad de anticuerpo anti esclerostina unido a perlas se cuantificó usando anticuerpos anti-IgG de ratón de cabra marcados con Cy5 fluorescente o anti-IgG humana de cabra marcados con Cy5 fluorescente (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) para las muestras de anticuerpo de ratón o humano, respectivamente. La cantidad de señal fluorescente medida fue proporcional a la concentración de anticuerpo anti- esclerostina libre en cada mezcla de reacción en equilibrio. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se obtuvo
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a partir de regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogénea de un sitio de curva n proporcionado en el software KinExA Pro. Los resultados de los ensayos de KinExA para los anticuerpos seleccionados se resumen en la siguiente tabla.
Anticuerpos
Antígeno Ko (pM) intervalo de confianza al 95 %
Ab-13
Esclerostina Humana 0,6 0,4 ~ 0,8 pM
Ab-4
Esclerostina Humana 3 1,8 ~ 4 pM
Ab-19
Esclerostina Humana 3 1,7 ~ 4 pM
Ab-14
Esclerostina Humana 1 0,5 ~ 2 pM
Ab-5
Esclerostina Humana 6 4,3 ~ 8 pM
Ab-23
Esclerostina Humana 4 2,1 ~ 8 pM
Ejemplo 11
MÉTODO DE BIACORE PARA DETERMINAR LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA HUMANIZADOS POR ESCLEROSTINA HUMANA.
La tecnología BIAcore supervisa la unión entre biomoléculas en tiempo real y sin la necesidad de marcaje. Uno de los que interaccionan, denominado el ligando, se inmoviliza directamente o se captura en la superficie inmovilizada mientras que el otro, denominado el analito, fluye en solución sobre la superficie capturada. El sensor detecta el cambio de masa en la superficie sensora a medida que el analito se une al ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al proceso de asociación. El proceso de disociación se supervisa cuando el analito se reemplaza por tampón. En el ensayo de BIAcore de afinidad, el ligando es el anticuerpo anti-esclerostina y el analito es esclerostina.
Instrumento
Biacore® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suecia Microplaca sensora
CM5 (uso de investigación) Número de Catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Las microplacas se almacenaron a 4 °C.
Solución de BIAnormalización
Glicerol al 70% (p/p). Parte del Kit de BIAmantenimiento Número de Catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. El kit de BIAmantenimiento se almacenó a 4 °C.
Kit de Acoplamiento de Amina
Número de Catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia.
Clorhidrato de etil-3-(e-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Compuesto hasta 75 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 |il a -70 °C.
N-hidroxisuccinimida (NHS). Compuesto hasta 11,5 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 |il a -70 °C.
Clorhidrato de etanolamina 1 M - NaOH pH 8,5. Almacenado en alícuotas de 200 |il a -70 °C.
Tampones
Tampón de ejecución para inmovilizar el anticuerpo de captura: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005%). Número de Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C. Tampón de inmovilización: Acetato 5.0 (que es acetato sódico 10 mM pH 5,0). Número de Catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C.
Tampón de ejecución para ensayo de unión: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005%, Número de Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia) con CM-Dextrano añadido a 1 mg/ml (Número de Catálogo 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Suiza). Tampón almacenado a 4 °C.
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Captura de ligando
IgG anti-humano de cabra fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fc. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, Estados Unidos) número de Catálogo: 109-006-098. Reactivo almacenado a 4 °C.
Ligando
Anticuerpos anti-esclerostina humana humanizados Ab5, Ab14 y Ab20.
Analito
Esclerostina humana recombinante. Alícuotas almacenadas a -70 °C y descongeladas una vez para cada ensayo. Solución de regeneración
HCl 40 mM preparado por dilución con agua destilada a partir de una solución madre 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra.
Número de catálogo: 101254H).
NaOH 5 mM preparado mediante dilución con agua destilada a partir de una solución madre 50 mM. Número de
catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suecia.
Método de Ensayo
El formato de ensayo fue captura del anticuerpo anti-esclerostina mediante Fc anti-IgG humano inmovilizado,
después valoración de la esclerostina sobre la superficie capturada.
Se proporciona a continuación un ejemplo del procedimiento:
Se realizó BIA (Análisis de Interacción Biamolecular) usando un BIAcore 3000 (BIAcore AB). Se inmovilizó IgG anti-humano de cabra Fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) en una microplaca sensora CM5 mediante química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ~4000 unidades de respuesta (UR). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005%, BIAcore AB) que contenía CM-Dextrano 1 mg/ml como el tampón de ejecución con un caudal de 10 |il/min. Se usó una inyección de 10 |il del anticuerpo anti-esclerostina a ~5 |ig/ml para captura por el Fc anti-IgG humano inmovilizado. Los niveles de captura de anticuerpo fueron típicamente 100-200 UR. La esclerostina se valoró sobre el anticuerpo anti-esclerostina capturado a diversas concentraciones a un caudal de 30 |il/min. La superficie se regeneró por dos inyecciones de 10 |il de HCl 40 mM, seguido de una inyección de 5 |il de NaOH 5 mM a un caudal de 10 |il/min.
Se analizaron curvas de unión con resta de fondo usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo
procedimientos convencionales. Se determinaron los parámetros cinéticos a partir del algoritmo de ajuste.
Los datos cinéticos y las constantes de disociación calculadas se proporcionan en la Tabla 2.
TABLA 2: Afinidad de anticuerpos anti-esclerostina para esclerostina
Anticuerpo
ka (1/Ms) k-d (1/s) Kd (pM)
Ab-5
1,78E+06 1,74E-04 97,8
Ab-14
3,30E+06 4,87E-06 1,48
Ab-20
2,62E+06 4,16E-05 15,8
Ejemplo 12
ENSAYOS IN VIVO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN MONOS CYNOMOLGUS
Se usaron treinta y tres monos cynomolgus hembra de aproximadamente 3-5 años de edad (Macaca fascicularis) en este estudio de 2 meses. El estudio contenía 11 grupos:
Grupo 1: vehículo (N=4)
Grupo 2: Ab-23 (N=2, dosis 3 mg/kg)
Grupo 3: Ab-23 (n=3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 4: Ab-23 (n=3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 5: Ab-5 (N=3, dosis 3 mg/kg)
Grupo 6: Ab-5 (n=3, dosis 10 mg/kg)
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Grupo 7: Ab-5 (N=3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 8: Ab-14 (N=3, dosis 3 mg/kg)
Grupo 9: Ab-14 (n=3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 10: Ab-14 (N=3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 11: Hormona paratiroidea (1-34) [PTH (1-34)] (N=3, dosis 10 |ig/kg)
Toda la dosificación fue subcutánea. Se dosificó PTH (1-34) cada día, los anticuerpos monoclonales (Mab) se dosificaron dos veces (primera dosis al comienzo del estudio y segunda dosis en el punto temporal de un mes). Para evaluación de parámetros de hueso (por ejemplo densidad mineral ósea) se realizaron exploraciones pQCT (tomografía computarizada cuantitativa periférica) y DXA (absorciometría de rayos X de energía dual) antes del comienzo del estudio (para obtener los valores de línea basal) y después de un mes (antes de la segunda dosis de Mab) y finalmente al final del estudio (punto temporal de 2 meses) momento en el cual se realizaron necropsias de los monos para análisis adicional (por ejemplo análisis histomorfométrico). Los animales se marcaron con fluorocromo (días 14, 24, 47 y 57) para histomorfometría dinámica. Se recogió suero en diversos puntos temporales durante el estudio [día 1 antes de la dosis (el día de la primera dosis de Mab), día 1 doce horas después de la dosis, día 2, día 3, día 5, día 7, día 14, día 21, día 28, día 29 doce horas después de la dosis (el día 29 fue el día de la segunda y última dosis de Mab), día 30, día 31, día 33, día 35, día 42, día 49 y día 56].
Se midieron tres biomarcadores de suero relacionados con hueso usando kits disponibles en el mercado:
Osteocalcina (OC) (Kit de Radioinmunoensayo de Osteocalcina DSL; Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX, Estados Unidos).
Propéptido N-terminal de Procolágeno de Tipo I (P1NP) (Kit de Radioinmunoensayo de P1NP; Orion Diagnostica, Espoo, Finlandia).
Fragmentos de C-telopéptido de cadenas al de colágeno de tipo I (sCTXI) (Serum CrossLaps® ELISA; Nordic Bioscience Diagnostics A/S, Herlev, Dinamarca).
Las exploraciones de pQCT y DXA produjeron datos sobre diversos parámetros del hueso (incluyendo densidad mineral ósea (DMO) y contenido mineral óseo) a lo largo de numerosos sitios esqueléticos (incluyendo metáfisis y diáfisis tibial, metáfisis y diáfisis radial, cuello femoral, vértebras lumbares). El análisis de estos datos de hueso (porcentaje de cambio de línea basal para cada animal) y los datos de biomarcadores de suero anabólicos (OC, P1NP) (porcentaje de cambio desde la línea basal para cada animal) revelaron aumentos estadísticamente significativos, frente al grupo de vehículo, en algunos parámetros en algunos de los puntos temporales y dosis para cada Mab. Estos datos de parámetros de hueso, datos de biomarcadores de suero, así como los datos histomorfométricos, indicaron que cada uno de los 3 Mab (Ab-23, Ab-5 y Ab-14) fue capaz de neutralizar la esclerostina en monos cynomolgus. Esta actividad fue más robusta para Ab-23 y Ab-5, particularmente a la dosis más alta (30 mg/kg), con un claro aumento en la formación del hueso (efecto anabólico) así como aumentos netos de hueso (por ejemplo, DMO). También se encontraron aumentos estadísticamente significativos en parámetros del hueso y parámetros histomorfométricos anabólicos para el grupo de control positivo (PTH (1-34)).
Se aumentaron los marcadores de formación de hueso en suero (P1NP, osteocalcina) (p<0,05 frente a vehículo (VEH)) en diversos puntos temporales y dosis, pero particularmente en los grupos de 30 mg/kg para Ab-23 y Ab-5. Los análisis histomorfométricos revelaron aumentos drásticos (p<0,05 frente a VEH) en las tasas de formación de hueso en hueso esponjoso en vértebras lumbares y tibia proximal (aumento de hasta 5 veces), así como en la superficie endocortical de la mitad del fémur (aumento de hasta 10 veces) a las dosis más altas de Ab-23 y Ab-5. El grosor trabecular se aumentó con dosis alta de Ab-23 y Ab-5 en vértebras lumbares (>60%, p<0,05 frente a VEH). Al final del estudio (2 meses), la DMO de área, como porcentaje de cambio desde la línea basal, aumentó (p<0,05 frente a VEH) en el cuello femoral, radio ultra-distal (Ab-23, 30 mg/kg) y vértebras lumbares (Ab-5, 30 mg/kg). Los aumentos de DMO de área en las vértebras lumbares estuvieron acompañados de aumentos en la fuerza vertebral (97% de aumento en la carga máxima vertebral para Ab-23, 30 mg/kg; p<0,05 frente VEH); los valores de línea basal para DMO de área lumbar antes de la dosificación de Mab fueron estadísticamente similares entre todos los grupos. En resumen, la administración a corto plazo de Mab neutralizantes de esclerostina en monos cynomolgus dio como resultado, en parte, aumentos de la formación de hueso, DMO y fuerza ósea vertebral.
Los siguientes son aspectos de la divulgación:
1. Un agente de unión a esclerostina que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab- 14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24 con esclerostina.
2. El agente de unión a esclerostina del aspecto 1 en el que la unión de dicho agente de unión a esclerostina con esclerostina es bloqueada de forma cruzada por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab- 2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab 15, Ab 16, Ab 17, Ab 18, Ab 19, Ab 20, Ab 21, Ab 22 y Ab 24.
3. Un agente de unión a esclerostina cuya unión con esclerostina es bloqueada de forma cruzada por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab -4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16 , Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24.
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4. El agente de unión a esclerostina del aspecto 1 o 3 en el que la capacidad de dicho agente de unión a
esclerostina para bloquear de forma cruzada o ser bloqueado de forma cruzada se detecta en un ensayo
Biacore.
5. El agente de unión a esclerostina del aspecto 1 o 3, en el que la capacidad de dicho agente de unión a
esclerostina para bloquear de forma cruzada o ser bloqueado de forma cruzada se detecta en un ensayo de
ELISA.
6. El agente de unión a esclerostina del aspecto 1 o 3 en el que dicho agente de unión a esclerostina es un anticuerpo.
7. El agente de unión a esclerostina del aspecto 1 o 3 en el que dicho agente de unión a esclerostina puede aumentar al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.
8. El agente de unión a esclerostina del aspecto 1 o 3 en el que dicho agente de unión a esclerostina puede bloquear el efecto inhibidor de la esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
9. Un agente de unión a esclerostina en el que dicho agente de unión a esclerostina puede bloquear el efecto inhibidor de la esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
10. Un agente de unión a esclerostina que se une con un epítopo de Bucle 2.
11. Un agente de unión a esclerostina que se une con un epítopo de T20.6.
12. Un agente de unión a esclerostina que se une con un epítopo de “derivado de T20.6 1 (nudo de cistina + 4 ramas)”.
13. El agente de unión a esclerostina de uno cualquiera de los aspectos 7-12 en el que dicho agente de unión a esclerostina es un anticuerpo.
14. Un agente de unión a esclerostina que comprende al menos una secuencia de CDR que tiene al menos 75 %
de identidad con una CDR seleccionada de las SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,

111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252,

253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274,

275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296,
297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360.
15. El agente de unión a esclerostina del aspecto 14 que comprende al menos dos de dichas CDR.
16. El agente de unión a esclerostina del aspecto 14 que comprende seis de dichas CDR.
17. El agente de unión a esclerostina según el aspecto 14 en el que dicho porcentaje de identidad es del 85 %.
18. El agente de unión a esclerostina según el aspecto 14 en el que dicho porcentaje de identidad es del 95 %.
19. El agente de unión a esclerostina según el aspecto 14 que comprende:
a) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 39, 40 y 41;
b) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 42, 43 y 44;
c) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 45, 46 y 47;
d) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 48, 49 y 50;
e) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 51, 52 y 53;
f) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 54, 55 y 56;
g) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 57, 58 y 59;
h) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 60, 61 y 62;
i) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 275, 276 y 277;
j) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 287, 288 y 289;
k) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 278, 279 y 280;
l) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 290, 291 y 292;
m) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 78, 79 y 80;
n) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 245, 246 y 247;
o) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 81, 99 y 100;
p) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 248, 249 y 250;
q) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 101, 102 y 103;
r) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 251,252 y 253;
s) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 104, 105 y 106;
t) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 254, 255 y 256;
u) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 107, 108 y 109;
v) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 257, 258 y 259;
w) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 110, 111 y 112;
x) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 260, 261 y 262;
y) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 281,282 y 283;
z) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 293, 294 y 295. aa) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 113, 114 y 115;
bb) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 263, 264 y 265;
cc) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 284, 285 y 286;
dd) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 296, 297 y 298;
ee) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 116, 237 y 238;
ff) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 266, 267 y 268;
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gg) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 239, 240 y 241; hh) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 269, 270 y 271; ii) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 272, 273 y 274; jj) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 242, 243 y 244; kk) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 351, 352 y 353; o II) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 358, 359 y 360.
20. El agente de unión a esclerostina según el aspecto 14 que comprende:
a) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 54, 55 y 56 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 51, 52 y 53;
b) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 60, 61 y 62 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 57, 58 y 59;
c) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 48, 49 y 50 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 45, 46 y 47;
d) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 42, 43 y 44 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 39, 40 y 41;
e) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 275, 276 y 277 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 287, 288 y 289;
f) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 278, 279 y 280 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 290, 291 y 292;
g) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 78, 79 y 80 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 245, 246 y 247.
h) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 81, 99 y 100 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 248, 249 y 250;
i) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 101, 102 y 103 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 251, 252 y 253;
j) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 104, 105 y 106 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 254, 255 y 256;
k) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 107, 108 y 109 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 257, 258 y 259;
l) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 110, 111 y 112 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 260, 261 y 262;
m) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 281, 282 y 283 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 293, 294 y 295;
n) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 113, 114 y 115 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 263, 264 y 265;
o) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 284, 285 y 286 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 296, 297 y 298;
p) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 116, 237 y 238 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 266, 267
y 268;
q) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 239, 240 y 241 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 269, 270 y 271;
r) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 242, 243 y 244 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 272, 273 y 274; o
s) secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 351, 352 y 353 y secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 358, 359 y 360.
21. El agente de unión a esclerostina de uno cualquiera de los aspectos 14-20 en el que dicho agente de unión a esclerostina es un anticuerpo.
22. Una composición farmacéutica que comprende un agente de unión a esclerostina según uno cualquiera de los aspectos 1-12 y 14-20.
23. La composición del aspecto 22 en la que dicho agente de unión a esclerostina es un anticuerpo.
24. Un agente de unión a esclerostina que comprende al menos una secuencia de CDR que tiene al menos 75 % de identidad con una CDR seleccionada de las SEQ ID NO: 245, 246, 247, 78, 79, 80, 269, 270, 271, 239, 240 y 241.
25. Un agente de unión a esclerostina que comprende al menos una secuencia de CDR que tiene al menos 75 % de identidad con una CDR seleccionada de cDr-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 en la que CDR-H1 tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 245 o SEQ ID NO: 269, CDR-H2 tiene la secuencia proporcionada en la SEQ iD NO: 246 o SEQ ID NO: 270, CDR-H3 tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 247 o SEQ ID NO: 271, CDR-L1 tiene la secuencia proporcionada en la SEQ Id NO: 78 o SEQ ID NO: 239, CDR-L2 tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 79 o SEQ ID NO: 240 y CDR-L3 tiene la secuencia proporcionada en la SEQ iD NO: 80 o SEQ ID NO 241.
26. Un agente de unión a esclerostina según el aspecto 25 que comprende tres CDR, CDR-H1, CDR-H2 y CDR- H3 en el que
(a) CDR-H1 es la SEQ ID NO: 245, CDR-H2 es la SEQ ID NO: 246 y CDR-H3 es la SEQ ID NO: 247 o
(b) CDR-H1 es la SEQ ID NO: 269, CDR-H2 es la SEQ ID NO: 270 y CDR-H3 es la SEQ ID NO: 271.
27. Un agente de unión a esclerostina según el aspecto 25 que comprende tres CDR, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-
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(a) CDRL1 es la SEQ ID NO: 78, CDR-L2 es la SEQ ID NO: 79 y CDR-L3 es la SEQ ID NO: 80; o
(b) CDRL1 es la SEQ ID NO: 239, CDR-L2 es la SEQ ID NO: 240 y CDR-L3 es la SEQ ID NO: 241.
28. Un agente de unión a esclerostina según el aspecto 25 que comprende seis CDR, CDRH-1, CDR-H2, CDR- H3, CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 en el que
(a) CDR-H1 es la SEQ ID NO: 245, CDR-H2 es la SEQ ID NO: 246, CDR-H3 es la SEQ ID NO: 247, CDR-L1 es la SEQ ID NO: 78, CDR-L2 es la SEQ ID NO: 79 y CDR-L3 es la SEQ ID NO: 80; o
(b) CDR-H1 es la SEQ ID NO: 269, CDR-H2 es la SEQ ID NO: 270, CDR-H3 es la SEQ ID NO: 271, CDR-L1
es la SEQ ID NO: 239, CDR-L2 es la SEQ ID NO: 240 y CDR-L3 es la SEQ ID NO: 241
29. El agente de unión a esclerostina de uno cualquiera de los aspectos 24-28 que es un anticuerpo.
30. El agente de unión a esclerostina del aspecto 29 que comprende una cadena pesada en el que dicha cadena
pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la
SEQ ID NO: 333; SEQ ID NO: 378; SEQ ID NO: 327; SEQ ID NO: 329; o SEQ ID NO: 366.
31. El agente de unión a esclerostina del aspecto 29 que comprende una cadena ligera en el que dicha cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 332; SEQ ID NO: 376; SEQ ID NO: 314; SEQ ID NO: 328; o SEQ ID NO: 364.
32. El agente de unión a esclerostina del aspecto 29 que comprende tanto una cadena pesada como una cadena ligera en el que
(a) la cadena pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 333 y la cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 332; o
(b) la cadena pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEC ID N°: 378 y la cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEC ID NO: 376; o
(c) la cadena pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEC ID N°: 327 y la cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEC ID NO: 314; o
(d) la cadena pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 329 y la cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 328; o
(c) la cadena pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 366 y la cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 364.
33. El agente de unión a esclerostina de uno cualquiera de los aspectos 24-32 que comprende una región constante de cadena ligera y/o cadena pesada
34. El agente de unión a esclerostina del aspecto 33 que comprende la región constante de IgG4 o IgG2.
35. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende H1, H2 y H3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 137 o una variante de la misma en el que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a las SEQ ID NO: 245, 246 y 247, respectivamente, y una cadena ligera que comprende L1, L2 y L3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 133 o una variante de la misma en el que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a las SEQ ID NO: 78, 79 y 80, respectivamente.
36. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende H1, H2 y H3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 145 o 392 o una variante de la misma en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a las SEQ ID NO: 245, 246 y 247, respectivamente, y una cadena ligera que comprende L1, L2 y L3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 141 o una variante de la misma en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a las SEQ ID NO: 78, 79 y 80, respectivamente.
37. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende HI, H2 y H3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 335 o una variante del mismo en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a la SEQ ID NO: 269, 270 y 271, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR L1, L2 y L3 y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 334 o una variante del mismo en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a SEQ ID NO: 239, 240 y 241, respectivamente.
38. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende H1, H2 y H3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 331 o una variante de la
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misma en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a las SEQ ID NO: 269, 270 y 271, respectivamente, y una cadena ligera que comprende L1, L2 y L3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 330 o una variante de la misma en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a las SEQ ID NO: 239, 240 y 241, respectivamente.
39. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende H1, H2 y H3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 345 o 396 o una variante de la misma en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a las SEQ ID NO: 269, 270 y 271, respectivamente, y una cadena ligera que comprende L1, L2 y L3 de CDR y que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 341 o una variante de la misma en la que dichas CDR son al menos 75 % idénticas a SEQ ID NO: 239, 240 y 241, respectivamente.
40. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 137, y una cadena ligera que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 133.
41. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 145 o 392, y una cadena ligera que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 141.
42. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 335, y una cadena ligera que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 334.
43. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 331, y una cadena ligera que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 330.
44. Un agente de unión a esclerostina que tiene una cadena pesada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 345 o 396, y una cadena ligera que comprende un polipéptido que tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 341.
45. Un agente de unión a esclerostina según uno cualquiera de los aspectos 24-44 con el que se unen una o más moléculas efectoras o indicadoras.
46. Una secuencia polinucleotídica aislada que codifica el agente de unión a esclerostina según uno cualquiera de los aspectos 24-44.
47. Un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias polinucleotídicas según el aspecto 46.
48. Un vector según el aspecto 47, en el que el vector comprende al menos una secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 308, 310, 312, 342, 344, 346, 348, 349, 365, 367, 373, 375 y 379.
49. Una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión según el aspecto 47 o el aspecto 48.
50. Un proceso para la producción del agente de unión a esclerostina de uno cualquiera de los aspectos 24-44, que comprende cultivar la célula hospedadora del aspecto 49 y aislar el agente de unión a esclerostina.
51. Una composición farmacéutica que comprende un agente de unión a esclerostina según uno cualquiera de los aspectos 24-45 en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
52. Una composición farmacéutica según el aspecto 51, que comprende adicionalmente otros principios activos.
53. Un agente de unión a esclerostina según uno cualquiera de los aspectos 24-45 o una composición farmacéutica según el aspecto 51 o el aspecto 52, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por esclerostina o que está asociado con un nivel aumentado de esclerostina.
54. Un método para tratar un trastorno relacionado con el hueso en un sujeto mamífero que comprende proporcionar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una composición farmacéutica del aspecto 22.
55. Un método para tratar un trastorno relacionado con el hueso en un sujeto mamífero que comprende proporcionar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una composición farmacéutica del aspecto 23.
56. Un método para tratar un trastorno relacionado con el hueso en un sujeto mamífero que comprende proporcionar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una composición farmacéutica del aspecto 51.
57. El método según el aspecto 54, en el que el trastorno relacionado con hueso es al menos uno de acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exotosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis, osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de hueso inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de hueso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrativos del hueso, pérdida de hueso oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades óseas metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juveniles, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémica (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides,
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pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteopenia idiopática, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, pérdida de hueso asociada con envejecimiento, pérdida de hueso facial asociada con envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con envejecimiento, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial.
58. El método según el aspecto 55, en el que el trastorno relacionado con hueso es al menos uno de acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exotosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis, osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de hueso inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de hueso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrativos del hueso, pérdida de hueso oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades óseas metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juveniles, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémica (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides, pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteopenia idiopática, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, pérdida de hueso asociada con envejecimiento, pérdida de hueso facial asociada con envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con envejecimiento, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial.
59. El método según el aspecto 56, en el que el trastorno relacionado con hueso es al menos uno de acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exotosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis, osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de hueso inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de hueso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrativos del hueso, pérdida de hueso oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades óseas metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juveniles, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémica (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides, pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteopenia idiopática, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, pérdida de hueso asociada con envejecimiento, pérdida de hueso facial asociada con envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con envejecimiento, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial.
60. Un método para aumentar al menos uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, densidad mineral ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero que comprende administrar al mamífero una composición farmacéutica del aspecto 22.
61. Un método para aumentar al menos uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, densidad mineral ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero que comprende administrar al mamífero una composición farmacéutica del aspecto 23.
62. Un método para aumentar al menos uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, densidad mineral ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero que comprende administrar al mamífero una composición farmacéutica del aspecto 51.
63. Un método para mejorar el resultado en un mamífero que se somete a uno o más de un procedimiento ortopédico, procedimiento dental, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto óseo, cirugía cosmética ósea y reparación del hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial, que comprende administrar a dicho mamífero una composición farmacéutica del aspecto 22 antes, durante y/o después de dicho procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación.
64. Un método para mejorar el resultado en un mamífero que se somete a uno o más de un procedimiento ortopédico, procedimiento dental, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto óseo, cirugía cosmética ósea y reparación del hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial, que comprende administrar a dicho mamífero una composición farmacéutica del aspecto 23 antes, durante y/o después de dicho procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación
65. Un método para mejorar el resultado en un mamífero que se somete a uno o más de un procedimiento ortopédico, procedimiento dental, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto óseo, cirugía cosmética ósea y reparación del hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial, que comprende administrar a dicho mamífero una composición farmacéutica del aspecto 51 antes, durante y/o después de dicho procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación.
66. Un anticuerpo, en el que dicho anticuerpo es Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 o Ab-24.
67. Un kit de diagnóstico que comprende un agente de unión a esclerostina según uno cualquiera de los aspectos 1, 3, 9-12 y 14-20.
68. Un kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo según el aspecto 6.
69. Un kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo según el aspecto 21.
70. Un kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo según el aspecto 29.
71. Un polipéptido que comprende al menos una de las SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,
51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,
110, 111, 112, 113, 114 , 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,
252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260 , 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273,
274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 , 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295,
296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360.
72. Un polipéptido según el aspecto 71 conjugado con al menos uno de Fc, PEG, albúmina y transferrina.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> UCB S.A.
Amgen, Inc.
<120> Agentes de unión <130> 60117-225 <150>
<151> <150>
<151>
5
10
15
20
25
30
35
<150> 60/782.244 <151>
<150> 60/776.847 <151>
<150> 60/667.583 <151>
<160> 396
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1 <211> 190 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
Gln i
Gly Trp Gln Ala c Phe Lys Asn Asp Ala 10 Glu Thr Glu He He pro Glu 15 Lys Thr
X Leu
Gl y Glu Tyr 20 Ala 3 Pro Glu pro pro Pro 25 Arg Leu Glu Asn Asn 30 His pro 45 His Phe
Met
Asn Arg 35 ASp Glu Asn Gly Gly 40 Ser pro Pro HÍS Phe Glu
Thr
Lys 50 Val val Ser Glu Tyr 55 Cys Cys Arg Glu Leu 60 Pro Thr Arg
Tyr 65
Thr Asp Gly Pro 70 Arg Ser Ala Lys 75 val Thr Glu Leu 80
val
Cys ser Gly Gln 85 Trp Cys Gly pro Ala Arg 90 Gly Leu Leu Pro Asn Ala lie 95 Cys He
Gly
Arg Gly Lys 100 Trp Arg Pro ser 105 pro Asp Phe Arg 110
Pro
ASp Arg 115 Pro Tyr Arg Ala Gln Arg 120 val Val Gln Leu Leu Cys pro 125 Ser Cys Gly Gly
Glu
Ala 130 Arg Arg Ala Arg Lys 135 HÍS Arg Leu val Ala 140 Leu Lys Cys
Lys 145
Leu Thr Arg Phe 150 Asn Gln Ser Glu 155 Lys ASp Phe Gly 160
Thr
Glu Ala Ala Arg 165 Pro Gln Lys Gly Arg 170 Lys Pro Arg Pro Arg Ala 175
Arg
Ser Ala Lys 180 Ala Asn Gln Ala Glu 185 Leu Glu Asn Ala Tyr 190
<210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg 15 10
<210>3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
Ser Ala Lys Pro val Thr Glu Leu val cys ser Gly Gln cys Gly pro 15 10 15
Ala Arg
<210>4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 4
Trp Trp Arg pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg cys lie Pro Asp Arg Tyr A#-c| 15 10 15
<210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 5
Leu val Ala ser Cys Lys cys Lys Arg Leu Thr Arg 1 5 . 10
<210>6 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400>6
Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp 15 10 15
Trp Arg Pro ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys 20 25
<210>7 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>7
ASp
val Gln Met lie Gln Ser Pro Ser ser Leu ser Ala Ser Leu Gly
1
5 10 15
ASp
He Val Thr 20 Phe Met Thr cys Gln Ala 25 Gly ser Gln Gly Thr ser 30 Leu lie Asn
Leu
Asn Trp Gln Gln Lys Pro Lys Ala Pro Lys Leu lie
35 40 45
Tyr
Gly Ser ser Asn Leu Glu Asp Gly val Pro ser Arg Phe ser Gly
50
55 60
ser 65 Glu
Arg Tyr Gly Thr Asp 70 Tyr Phe Thr Leu Thr lie 75 His ser Ser Leu Glu Asp 80 Tyr
ASp
Leu Ala Thr phe Cys Leu Gln ser Tyr Leu pro
85 90 95
Thr
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro
Thr val ser lie Phe pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr ser Gly
115 120 125
Gly
Ala 130 val Ser val val Cys Phe 135 ASp Leu Asn Asn phe Tyr 140 Gln Pro Lys Asp lie
Asn
Lys Trp Lys He Gly Ser Glu Arg Asn Gly val Leu
145
150 155 160
Asn
ser Trp Thr Asp Gln ASp Ser Lys Asp ser Thr Tyr ser Met Ser
165 170 175
Ser
Thr Leu Thr 180 Ala Leu Thr Lys Asp Glu 185 ser Tyr Glu Arg His Asn 190 val Ser Tyr
Thr
cys Glu 195 Arg Thr His Lys Thr 200 Thr ser Pro lie 205 Lys ser
Phe
Asn Asn Glu cys
210
<210>8 <211> 645 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400>8

gatgtccaga tgattcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctttgggaga catagtcacc 60

atgacttgcc aggcaagtca gggcactagc attaatttaa actggtttca gcaaaaacca 120

gggaaggctc ctaagctcct gatctatggt tcaagcaact tggaagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtagata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctggaggat 240

gaagatctgg caacttattt ctgtctacaa catagttatc tcccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 645
<210>9 <211> 236 <212> PRT
15 <213> Mus musculus
Met asn Thr Arg Ala Pro Ala Glu Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Trp
10
15
Phe Leu Gly Ala Arg cys Asp val Gln Met lie Gln ser Pro ser Ser
20
25
30
Leu ser Ala Ser Leu Gly Asp lie val Thr Met Thr cys Gln Ala ser
35
40
45
Gln Gly Thr ser lie Asn Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50
55
60
Ala pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly val
65
70
75
80
Pro Ser Arg Phe ser Gly ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85
90
95
lie ser ser Leu Glu Asp Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln
100
105
110
His ser Tyr Leu Pro Tyr Thr phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie
115
120
125
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr val ser lie Phe Pro Pro ser Ser
135
140
Glu Gln Leu Thr ser Gly Gly Ala Ser val val Cys Phe Leu Asn Asn
145
ISO
155
160
Phe Tyr Pro Lys Asp lie Asn val Lys Trp Lys lie Asp Gly ser Glu
165
170
175
aro Gln Asn Glv val Leu Asn ser Tr^ Thr Asp Gln Asp ser Lys Asp
190
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
200
205
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr
210
215
225
230
220
Ser Pro lie val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu cys
235
<210> 10 <211> 711 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 10
10
atgaacacga
agatgtgatg
gtcaccatga
aaaccaggga
ccatcaaggt
gaggatgaag
ggagggggga
ccaccatcca
ttctacccca
gtcctgaaca
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tcagtggcag
atctggcaac
ccaagctgga
gtgagcagtt
aagacatcaa
gttggactga
ccaaggacga
cttcacccat
tgagttcctt
tcagtctcca
aagtcagggc
gctcctgatc
tagatatggg
ttatttctgt
aataaaacgg
aacatctgga
tgtcaagtgg
tcaggacagc
gtatgaacga
tgtcaagagc
gggttcctgt
tcctccctgt
actagcatta
tatggttcaa
acagatttca
ctacaacata
gctgatgctg
ggtgcctcag
aagattgatg
aaagacagca
cataacagct
ttcaacagga
tgctctggtt
ctgcatcttt
atttaaactg
gcaacttgga
ctctcaccat
gttatctccc
caccaactgt
tcgtgtgctt
gcagtgaacg
cctacagcat
atacctgtga
atgagtgtta
tttaggtgcc 60 gggagacata 120 gtttcagcaa 180 agatggggtc 240 cagcagcctg 300 gtacacgttc 360 atccatcttc 420 cttgaacaac 480 acaaaatggc 540 gagcagcacc 600 ggccactcac 660 g 711
<210> 11 <211>443 <212> PRT <213> Mus musculus
5
Glu
val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu val Thr Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
val Lys lie Ser cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr
wet Ser Trp val Lys Gln ser His Gly Lys ser Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly
ASp lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys
Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser ser Ser lie Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu He Arg Gly 85 Tyr Leu Thr ser Glu ASp 90 phe Ser Ala val Tyr Tyr Cys 95 Gln Gly
Ala
Arg ASP Asp 100 Thr ASp Ala Ser Pro 105 Ala Lys Ala Tyr Trp Gly 110 ser
Thr
Leu val val ser Ala Thr Thr Pro Pro val Tyr
115 120 125
pro
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met val Thr Leu
130 135 140
Gly
cys Leu val Lys Gly Tyr Phe pro Glu Pro Val Thr val Thr Trp
145
150 155 160
Asn
ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala val Leu
165 170 175
Gln
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser ser Val Thr val pro Ser Ser
180 ■ 185 190
Thr
Trp pro ser Glu Thr val Thr cys Asn Val Ala His Pro Ála Ser
195 200 205
Ser
Thr 210 cys Lys Val ASp Lys Lys 215 pro He val pro Arg Asp 220 val Cys Gly cys Lys
Pro
ríe Cys Thr val Glu val ser Ser Phe lie Phe
Pro
225
230 Thr 235 240
Pro
Lys Pro Lys Asp val Leu Thr lie Leu Thr Pro Lys val Thr
245 250 255
Cys
val val val Asp lie ser Lys Asp ASp Pro Glu val Gln Phe Ser
265 270
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
280 285
Phe Arg Ser val ser 300 Glu Leu pro lie
Met
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305
310 315 320
Ser
pro Ala phe Pro Ala pro lie Glu Lys Thr He ser Lys Thr Lys
325 330 335
Gly Arg
Pro Lys 340 Lys Ala pro Gln Val Tyr Thr 345 ser Leu Thr lie Pro Pro Pro 350 Thr Lys Glu
Gln
Met Ala Asp Lys val Cys Met lie ASp Phe
355 360 365
Phe
pro 370 Asn Glu Asp lie Thr val 37C Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 3 O A Pro Ala
Glu
Tyr Lys Asn Thr Gln pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
385
390 395 400
Phe
lie Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405 410 415
Asn
Thr Phe Thr Cys ser Val Leu His Glu Gly Leu HÍS Asn His His
420 425 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His ser Pro Gly Lys 435 440
<210> 12
5 <211> 1332
<212>ADN <213> Mus musculus
gaggtccagc
tcttgtaagg
catggaaaaa
aaccagaagt
atggagatcc
tacgacgcct
aaaacgacac
atggtgaccc
aactctggat
tacactctga
tgcaacgttg
tgtggttgta
ccaaagccca
gacatcagca
cacacagctc
gaacttccca
agtccagctt
gctccacagg
ctgacctgca
gggcagccag
ttcatctaca
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cctggtaaat
tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgacgc ctggggcttc agtgaagata 60 cttctggata cacattcact gaccactaca tgagctgggt gaagcagagt 120 gccttgagtg gattggagat attaatccct attctggtga aactacctac 180 tcaagggcác ggccacattg actgtagaca agtcttccag tatagcctac 240 gcggcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagatgat 300 ctccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 360 ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 420 tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 480 ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 540 gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 600 cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 660 agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 720 aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 780 aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 840 agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 900 tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 960 tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1020 tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1080 tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1140 cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1200 gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1260 tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1320 ga 1332
<210> 13 <211> 462 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Met
Arg cys Arg Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu ser Gly Thr Ala Gly
1
5 10 15
val
Leu Ser Glu val Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Glu Leu Val Thr
20 25 30
Pro
Gly Ala Ser val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr
35 40 45
Asp 50 Trp
HÍS Tyr Met ser Trp 55 Asn val Lys Gln ser His 60 Glu Gly Lys Ser Leu
Glu 6S Gln
He Gly ASp He 70 Thr pro Tyr ser Gly 75 val Thr Thr Tyr Asn 80 ser
Lys
Phe Lys Gly Ala Thr Leu Thr Asp Lys Ser Ser
85 90 95
lie
Ala Tyr Met Glu lie Arg Gly Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala val
100 105 Ala 110
Tyr
Tyr
cys 115 Gly Ala Arg Asp Asp Tyr 120 val Asp ser Pro Phe 125 Thr Ala Tyr Trp
Gly
Gln Thr Leu val Thr Ser Ala Ala Lys Thr Pro Pro
130
135 140
Ser
val Tyr pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
145
150 155 160
Val
Thr Leu Gly cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe pro Glu Pro val Thr
165 170 val 175
val
Thr Trp Asn 180 Gln ser Gly ser Leu Ser 185 Thr Ser Gly His Thr 190 Val Phe Pro
Ala
val Leu ser Asp Leu Tyr Leu ser Ser Ser Thr Val
195 200 205
Pro
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr cys Asn val Ala His
210 215 220
Pro
Ala ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys He Val Pro Arg Asp Cys
225
230 235 240
Gly
Cys Lys Pro Cys lie, Cys Thr val Pro Glu Val Ser ser Val Phe
245 250 255
He
Phe Pro pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr He Thr Leu Thr pro
260 265 270
Lys
Val Thr 275 ser cys val val val Asp 280 Asp He ser Lys ASp Asp 285 Thr Pro Glu val
Gln
Phe 290 Pro Trp Phe val Asp 295 Phe val Glu val HÍS 300 Arg Ala Gln Thr
Gln
Arg Glu Glu Gln Asn Ser Thr Phe Ser Val Ser Glu
305
310 315 320
Leu
Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys cys
325 330 335
Arg
val Asn Ser Pro Ala Phe Pro Ala pro He Glu Lys Thr lie ser
340 345 350
Lys
Thr Lys 355 Glu Gly Arg Pro Lys Ala 360 ASp Pro Gln val Tyr Thr 365 Thr lie Pro Pro
Pro
Lys 370 Asp Gln Met Ala Lys 375 Asp Lys val Ser Leu 380 Trp Cys Met He
Thr
Phe Phe Pro Glu He Thr val Glu Gln Trp Asn Gly
385
390 395 400
Gln
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp Thr Asp
405 410 415
Gly
Ser Tyr Phe 420 Asn He Tyr Ser Lys Leu 425 Ser Asn Val Gln Lys Ser 430 Gly Asn Trp
Glu
Ala Gly Thr Phe Thr cys val Leu His Glu Leu His
His 435 440 445
Asn
HÍS Thr Glu Lys ser Leu Ser His ser Pro Gly Lys
450 455 460
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<213> Mus musculus
5
10
atgagatgca
gtccagctgc
tgtaaggctt
ggaaaaagcc
cagaagttca
gagatccgcg
gacgcctctc
acgacacccc
gtgaccctgg
tctggatccc
actctgagca
aacgttgccc
ggttgtaagc
aagcccaagg
atcagcaagg
acagctcaga
cttcccatca
ccagctttcc
ccacaggtgt
acctgcatga
cagccagcgg
atctacagca
tctgtgttac
ggtaaatga
ggtggatctt
aacagtctgg
ctggatacac
ttgagtggat
agggcacggc
gcctgacatc
cgtttgctta
catctgtcta
gatgcctggt
tgtccagcgg
gctcagtgac
acccggccag
cttgcatatg
atgtgctcac
atgatcccga
cgcaaccccg
tgcaccagga
ctgcccccat
acaccattcc
taacagactt
agaactacaa
agctcaatgt
atgagggcct
tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt acctgaactg gtgacgcctg gggcttcagt attcactgac cactacatga gctgggtgaa tggagatatt aatccctatt ctggtgaaac cacattgact gtagacaagt cttccagtat tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac caagggctat ttccctgagc cagtgacagt tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt
cctctctgag 60 gaagatatct 120 gcagagtcat ISO tacctacaac 240 agcctacatg 300 agatgattac 360 tgcagccaaa 420 taactccatg 480 gacctggaac 540 tgacctctac 600 cgtcacctgc 660 cagggattgt 720 cttcccccca 780 tgtggtagac 840
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ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900 ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 960 ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020 cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080 acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140 cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200- gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1260 gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320 gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380
1389
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ASp
lie val Leu Thr Gln ser Pro Ala Ser Leu Thr val Ser Leu Gly
1
5 10 15
Leu
Arg Ala Thr 20 Tyr He ser cys Lys Ala 25 Gln ser Gln ser val Asp 30 Gln Tyr Asp
Gly
ASp ser Met Asn Trp Tyr Gln Lys Pro Gly pro Pro
35
40 45
Lys
Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala
50
55 60
Arg
Phe Ser Gly Asn Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His
65
70 75 80
Pro
Val GlU Glu Glu 85 Thr ASp Ala Val Thr Tyr 90 Thr Tyr Cys Gln Gln Ser 95 Lys Asn
Glu
Asp Pro Trp Phe Gly Gly Gly Lys Leu Glu lie Arg
100 105 110
Ala
Asp Ala Ala Pro Thr val Ser lie Phe Pro Pro Ser ser Glu Gln
115 120 125
Leu
Thr 130 Lys Ser Gly Gly Ala Ser 135 Lys Val Val Cys Phe Leu 140 Gly Asn Asn Phe Tyr
Pro
Asp lie Asn val Trp Lys lie Asp Ser Gl u Arg Gln
145
150 155 160
Asn
Gly val Leu Asn 165 Ser ser Trp Thr ASp Gln 170 Thr Asp Ser Lys ASp Ser 175 Glu Thr
Tyr
Ser Met Ser 180 Tyr Thr Leu Thr Leu 185 Thr Lys ASp Glu Tyr 190 Thr Arg
His
Asn Ser Thr cys Glu Ala His Lys Thr ser Ser Pro
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lie
val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
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10 <400> 17
Met
Glu Thr Asp Thr lie Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1
5 10 15
Gly
ser Thr Gly 20 Gly ASp lie val Leu Thr 25 lie Gln Ser Pro Ala Ser 30 Ser Leu Thr
Val
Ser Leu Leu Arg Ala Thr Ser cys Lys Ala Gln Ser
35 40 45
val
ASp 50 Gln Tyr Asp Gly Asp Ser 55 Leu Tyr Met Asn Trp Tyr 60 ser Gln Gln Lys Pro
Gly
Pro Pro Lys Leu lie Tyr Ala Ala Asn Leu Glu ser
65
70 75 80
Gly
lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Asn Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu
Asn He HÍS 100 Asn Pro val Glu Glu Glu 105 Thr Asp Ala val Thr Tyr 110 Thr Tyr Cys
Gln
Gln
Ser 115 Lys Glu Asp Pro Trp 120 Ala Phe Gly Gly Gly 125 lie Lys Leu
Glu
lie Arg Ala ASp Ala Pro Thr val ser Phe Pro Pro
130 135 140
Ser
Ser
Glu Gln Leu Thr ser Gly Gly Ala Ser val val cys Phe Leu
145
150 155 160
Asn
Asn
Phe Tyr Pro Lys ASp He Asn Val Lys Trp Lys He Asp Gly
165 170 175
Ser
Glu Arg Gln 180 Thr Asn Gly Val Leu Asn 185 Ser Ser Trp Thr Asp Gln 190 Thr Asp
Ser
Lys
Asp ser 195 Glu Tyr ser Met Ser 200 Tyr Thr Leu Thr Leu 205 Thr Lys Asp
Glu
Tyr 210 Thr Arg His Asn ser 215 Lys Thr cys Glu Ala 220 Asn His Lys Thr
Ser
ser Pro lie val Ser Phe Asn Arg Glu Cys
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230 235
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15 <211>717
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atggagacag acacaatcct gctatgggtg gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct atctcctgca aggccagcca aagtgttgat cagcagaaac caggacagcc acccaaactc gggatcccag ccaggtttag tggcaatggg cctgtggagg aggaggatgc tgtaacctat acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc atcttcccac catccagtga gcagttaaca aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat actcacaaga catcaacttc acccattgtc
ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 ttgactgtgt ctctaggcct gagggccacc 120 tatgatggtg atagttatat gaactggtac 180 ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 240 tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 tactgtcaac aaagtaatga ggatccgtgg 360 aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
5
10
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<400> 19

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Gly Asp ile Asn Pro Phe Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Lys 65 Met
Gly Lys Ala Thr Leu 70 Leu Thr Val Asp Lys Ser 75 Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 80 cys
Gln
Leu Asn ser Thr Ser Asp Asp Ala val Tyr Tyr
85 90 95
Ala
Arg Ser His 100 Tyr Tyr Phe ASp Gly 105 Arg Val pro Trp Asp 110 Ala Met
ASp
Tyr Trp 115 Pro Gly Gln Gly Thr Ser 120 Leu val Thr Val Ser Ser 125 Ala Ala Lys Thr
Thr
Pro ser Val Tyr Pro Ala Pro Gly ser Ala Gln
Thr
130 135 140
Asn 145 Pro
ser Met Val Thr Leu 150 Trp Gly cys Leu val Lys 155 Leu Gly Tyr Phe pro Glu 160 His
val
Thr Val Thr Asn ser Gly Ser Ser Ser Gly
val
165 170 175
Thr
Phe Pro Ala val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser ser Ser
180 185 190
val
Thr val Pro Ser ser Thr Trp Pro ser Glu Thr val Thr Cys Asn
195 200 205
Val
Ala His Pro Ala Ser ser Thr Lys val ASp Lys Lys He val Pro
210 215 220
Arg
Asp Cys Gly Cys Lys Pro cys He cys Thr val Pro Glu val ser
225
230 235 240
Ser
Val Phe lie Phe 245 val Pro pro Lys Pro Lys 250 val Asp val Leu Thr lie 255 Asp Thr
Leu
Thr Pro Lys 260 Gln Thr Cys Val val 265 Val ASp lie Ser Lys 270 val Asp
Pro
Glu val 275 Thr Phe Ser Trp Phe 280 Glu Asp Asp Val Glu 285 Thr HÍS Thr
Ala
Gln Gln Pro Arg Glu Gln Phe Asn Ser Phe Arg Ser
290 295 300
Val
ser Glu Leu Pro XI e Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305
310 315 320
Phe
Lys Cys Arg val 325 Thr Asn Ser Ala Ala Phe 330 Lys pro Ala Pro lie Glu 335 Tyr Lys
Thr
lie Ser Lys Lys Gly Arg Pro Ala Pro Gln val
Thr
340 345 350
lie
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys ASp Lys Val Ser Leu Thr
355 360 365
cys
Met 370 Asn lie Thr Asp Phe Phe 375 Glu Pro Glu Asp lie Thr 380 Thr Val Glu Trp Gln
Trp
Gly Gln Pro Ala Asn Tyr Lys Asn Gln pro lie Met
385
390 395 400
Asp
Thr ASp Gly Ser 405 Ala Tyr Phe lie Tyr ser 410 Thr Lys Leu Asn val Gln 415 His Lys
ser
Asn Trp Glu Gly Asn Thr Phe Cys Ser Val Leu Glu
Gly
420 425 430
Leu
His Asn His His Thr Glu Lys ser Leu Ser His Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 20 <211> 1350 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 20
gaggtccagc
tcctgtaagg
catgggaaga
aaccagaagt
atgcagctca
tattacttcg
gtcaccgtct
gctgcccaaa
ccagtgacag
gtcctgcagt
tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctgggacttc agtgaagatg 60 cttctggata cacattcact gactgctaca tgaactgggt gaagcagagc 120 gccttgaatg gattggagat attaatcctt tcaacggtgg tactacctac 180 tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 acagcctgac atctgacgac tctgcagtct attactgtgc aagatcccat 300 atggtagagt cccttgggat gctatggact actggggtca aggaacctca 360 cctcagccaa aacgacaccc ccatctgtct atccactggc ccctggatct 420 ctaactccat ggtgaccctg ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag 480 tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct 540 ctgacctcta cactctgagc agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg 600

cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag 660

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tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca ccattactct gactcctaag 780

gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt 840

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<210> 21 <211> 468 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
Met 1
Gly Trp Asn Trp lie Phe Leu Phe Leu 10 Leu Ser Gly Thr Ala 15 Gly
val
Tyr ser Glu 20 Val Gln Leu Gln Gln 25 Ser Gly Pro Glu Leu 30 Val Lys
Pro
Gly Thr 35 Cys Ser Val Lys Met ser 40 val Cys Lys Ala Ser Gly 45 Gly Tyr Thr Phe
Thr
A5p 50 Trp Tyr Met Asn Trp 55 Asn Lys Gln Ser His 60 Gly Lys ser Leu
Glu 65 Gln
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Lys
Phe Lys Gly 85 Ala Thr Leu Thr 90 Asp Lys ser ser 95
Thr
Ala Tyr Met 100 Ala Gln Leu Asn Ser Leu 105 Tyr Thr Ser Asp Asp Ser 110 val Ala Val
Tyr
Tyr
Cys 115 Met Arg Ser His Tyr 120 Gln Phe Asp Gly Arg 125 Thr Pro Trp
Asp
Ala 130 ASP Tyr Trp Gly 135 Gly Thr Ser Val 140 val ser Ser
Ala 145
Lys Thr Thr Pro Pro 150 ser val Tyr pro Leu 155 Ala pro Gly ser Ala 160
Ala
Gln Thr Asn Ser 165 val Met val Thr Leu Gly 170 Asn cys Leu val Lys Gly 175 Ser Tyr
Phe
Pro Glu Pro 180 Thr val Thr Trp 185 Ser Gly Ser Leu 190 Ser
Gly
val HÍS 195 Thr Phe Pro Ala val 200 Leu Gln Ser Asp Leu 205 Tyr Thr Leu
Ser
ser 210 Ser val Thr val Pro 215 ser ser Thr Trp Pro 220 ser Glu Thr val
Thr 225
cys Asn val Ala His 230 Pro Ala Ser Ser Thr 235 Lys val Asp Lys Lys 240
He
val Pro Arg Asp 245 val cys Gly Cys Lys pro 250 Pro cys lie Cys Thr Val 255 val Pro
Glu
val ser Ser 260 Phe lie Phe Pro 265 Lys Pro Lys Asp 270 Leu
Thr
lie Thr 275 Leu Thr Pro Lys val 280 Thr cys val val val 285 Asp He Ser
Lys
Asp 290 HÍS Asp Pro Glu val Gln 295 Gln Phe ser Trp Phe val 300 Gln Asp Asp Val Glu
Val 305
Thr Ala Gln Thr 310 Pro Arg Glu Glu 315 Phe Asn Ser Thr 320
Phe
Arg Ser val Ser 325 Glu Leu Pro lie Met 330 HlS Gln Asp Trp Leu 335 Asn
Gly
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He
Glu Lys 355 lie Ser Lys Thr 360 Gly Arg Pro Lys 365 pro Gln
Val
Tyr 370 Thr lie pro pro Pro 375 Lys Glu Gln Met Ala 380 Lys Asp Lys val
ser 385
Leu Thr cys Met lie 390 Thr ASp Phe Phe Pro 395 Glu Asp He Thr val 400
Glu
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Pro
lie Met Asp 420 ser Thr Asp Gly ser Tyr 425 Gly Phe lie Tyr ser Lys 430 cys Leu Asn
Val
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Leu Ser 465
His 450 Pro Glu Gly Gly Lys Leu His Asn 455 His HÍS Thr Glu Lys 460 Ser Leu ser His
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<400> 22
5
10
atgggatgga
gtccagctgc
tgtaaggctt
gggaagagcc
cagaagttca
cagctcaaca
tacttcgatg
accgtctcct
gcccaaacta
gtgacagtga
ctgcagtctg
agcgagaccg
attgtgccca
gtcttcatct
acgtgtgttg
gatgatgtgg
ttccgctcag
aaatgcaggg
aaaggcagac
aaggataaag
gagtggcagt
acagatggct
ggaaatactt
agcctctccc
actggatctt
aacaatctgg
ctggatacac
ttgaatggat
aqqgcaaggc
gcctgacatc
gtagagtccc
cagccaaaac
actccatggt
cctggaactc
acctctacac
tcacctgcaa
gggattgtgg
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tggtagacat
aggtgcacac
tcagtgaact
tcaacagtgc
cgaaggctcc
tcagtctgac
ggaatgggca
cttacttcat
tcacctgctc
actctcctgg
tctcttcctc
acctgagctg
attcactgac
tggagatatt
cacattgact
tgacgactct
ttgggatgct
gacaccccca
gaccctggga
tggatccctg
tctgagcagc
cgttgcccac
ttgtaagcct
gcccaaggat
cagcaaggat
agctcagacg
tcccatcatg
agctttccct
acaggtgtac
ctgcatgata
gccagcggag
ctacagcaag
tgtgttacat
taaatga
ttgtcaggaa
gtgaagcctg
tgctacatga
aatcctttca
gtagacaaat
gcagtctatt
atggactact
tctgtctatc
tgcctggtca
tccagcggtg
tcagtgactg
ccggccagca
tgcatatgta
gtgctcacca
gatcccgagg
caaccccggg
caccaggact
gcccccatcg
accattccac
acagacttct
aactacaaga
ctcaatgtgc
gagggcctgc
ctgcaggtgt
ggacttcagt
actgggtgaa
acggtggtac
cctccagcac
actgtgcaag
ggggtcaagg
cactggcccc
agggctattt
tgcacacctt
tcccctccag
gcaccaaggt
cagtcccaga
ttactctgac
tccagttcag
aggagcagtt
ggctcaatgg
agaaaaccat
ctcccaagga
tccctgaaga
acactcagcc
agaagagcaa
acaaccacca
ctactctgag
gaagatgtcc
gcagagccat
tacctacaac
agcctacatg
atcccattat
aacctcagtc
tggatctgct
ccctgagcca
cccagctgtc
cacctggccc
ggacaagaaa
agtatcatct
tcctaaggtc
ctggtttgta
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caaggagttc
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gcagatggcc
cattactgtg
catcatggac
ctgggaggca
tactgagaag
60
120
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1080
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1200
1260
1320
1380
1407
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<213> Quimera de conejo-ratón <400> 23
Ala
Gln val Leu Thr Gln Thr Pro Ala ser val ser Ala Ala Val Gly
1
5 10 15
Gly
Thr val Thr lie Asn Cys Gln Ser Ser Gln ser val Tyr ASP Asn
20 25 30
Asn
Trp Leu 35 Tyr Ala Trp Phe Gln Gln 40 Leu Lys Pro Gly Gln Pro 45 Pro pro Lys Leu
Leu
He Asp Ala Ser ASp Ala Ser Gly Val ser Arg Phe
50 55 60
Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr He Ser Gly Val
65
70 75 80
Gln
cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ala Tyr Asn Asp
He 85 90 95
val
Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val val Lys Arg Thr
100 105 110
Asp
Ala Ala Pro Thr val Ser lie Phe pro pro Ser Ser Glu Gln Leu
Thr
115 120 125
ser
Gly Gly Ala Ser val val cys Phe Leu Asn Asn phe Tyr Pro
130 135 140 Gln
Lys
Asp lie Asn val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Asn
145
150 155 160
Gly
val Leu Asn Ser 165 Thr Trp Thr ASP Gln Asp 170 Lys Ser Lys Asp Ser Thr 175 Arg Tyr
ser
Met Ser ser 180 Thr Leu Thr Leu Thr 185 His Asp Glu Tyr Glu 190 Ser His
Asn
Ser Tyr Cys Glu Ala Thr Lys Thr ser Thr Pro lie
195 200 205
Val
Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
5
<210> 24 <211> 654 <212> ADN
<213> Quimera de conejo-ratón <400> 24
gcgcaagtgc tgacccagac tccagcctcc atcaattgcc agtccagtca gagtgtttat aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatt ccatcgcggt tcagtggcag tggatctggg cagtgtgccg atgctgccac ttactactgt ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cacaagacat caacttcacc cattgtcaag
gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 gataacaact ggttagcctg gtttcagcag 120 tatgatgcat ccgatctggc atctggggtc 180 acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240 caaggcgctt ataatgatgt tatttatgct 300 cgtacggatg ctgcaccaac tgtatccatc 360 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 420 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 480 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 540 cgacataaca gctatacctg tgaggccact 600 agcttcaaca ggaatgagtg ttag 654
10 <210> 25
<211>239 <212> PRT
<213> Quimera de conejo-ratón 15 <400> 25
Met 1
Asp Thr Arg Ala 5 pro Thr Gln Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Leu
Pro Gly Ala 20 Thr Phe Ala Gln val 25 Leu Thr Gln Thr Pro 30 Ala Ser
val
ser Ala 35 Ala val Gly Gly Thr 40 val Thr lie Asn r Gln ser Ser
Gln
ser 50 val Tyr Asp Asn Asn 55 Trp Leu Ala Trp Phe 60 Gln Gln Lys pro
Gly 65 Gly
Gln pro Pro Lys Leu 70 Phe Leu lie Tyr Asp Ala 75 Ser Ser Asp Leu Ala ser 80 Thr
val
Pro Ser Arg 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 ASp Gly Thr Gln Phe 95 Tyr
Leu
Thr lie Ser 100 Tyr val Gln Cys Ala 105 Tyr Ala Ala Thr Tyr 110 Gly cys
Gln
Gly Ala 115 Asn ASp val lie 120 Ala Phe Gly Gly 125 Thr Glu
val
val 130 Val Lys Arg Thr Asp 135 Ala Ala pro Thr Val 140 Ser He Phe pro
Pro 145
Ser ser Glu Gln Leu 150 Thr ser Gly Gly Ala 155 Ser val val cys Phe 160
Leu
Asn Asn Phe Tyr 165 Gln Pro Lys Asp lie Asn 170 Asn val Lys Trp Lys lie 175 Gln Asp
Gly
ser Glu Arg 180 ser Asn Gly val Leu 185 Ser ser Trp Thr Asp 190 Leu ASp
Ser
Lys Asp 195 Thr Tyr Ser Met 200 Ser Thr Leu Thr 205 Thr Lys
Asp
Glu 210 Tyr Glu Arg His Asn 215 Ser Tyr Thr Cys Glu 220 Ala Thr His Lys
Thr 225
Ser Thr Ser Pro lie 230 Val Lys Ser Phe Asn 235 Arg Asn Glu Cys
<210> 26
20 <211> 720
<212> ADN
<213> Quimera de conejo-ratón
<400> 26 25
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<210> 27 <211> 433 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Anticuerpo humanizado
10
<400> 27
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Gln 1
Ser Leu Glu Glu 5 ser Gly Gly Arg Leu 10 val Thr Pro Gly Thr 15 Pro
Leu
Thr Leu Thr 20 cys Thr Ala Ser Gly 25 Phe Ser Leu Ser Ser 30 Tyr Trp
Met
Asn Trp 35 ASp val Arg Gln Ala pro 40 Thr Gly Glu Gly Leu Glu 45 Trp Trp He Gly
Thr
lie 50 Phe ser Gly Gly Arg 55 Thr Asp Tyr Ala Ser 60 Asp Ala Lys Gly
Arg 65 Ser
Thr lie Ser Arg 70 Asp ser Thr Thr Met 75 Phe Leu Lys Met Thr 80 Trp
Leu
Thr Thr Gly 85 Thr Ala Arg Tyr 90 cys Ala Arg Asn 95
Asn
Leu Trp Gly 100 Ser Gln Gly Thr Leu val 105 Ala Thr val Ser Ser Ala 110 Ala Ser Thr
Lys
Gly pro 115 Met Val Tyr Pro Leu 120 Cys pro Gly Ser Ala 125 Tyr Gln Thr
Asn
Ser 130 Val Thr Leu Gly 135 Leu val Lys Gly 140 phe pro Glu
Pro 145
val Thr val Thr Trp 150 Asn Ser Gly Ser Leu 155 Ser Ser Gly val HÍS 160
Thr
Phe pro Ala val 165 Leu Gln ser Asp Leu 170 Tyr Thr Leu ser Ser 175 Ser
Val
Thr Val Pro 180 ser ser Thr Trp Pro 185 Ser Glu Thr val Thr 190 cys Asn
val
Ala His 195 Pro Ala ser ser Thr 200 Lys val Asp Lys Lys 205 lie val Pro
Arg
ASD 210 cys Gly Cys Lys Pro 215 cys lie cys Thr val 220 Pro Glu Val Ser
Ser 225
val Phe He Phe pro 230 pro Lys Pro Lys ASp 235 val Leu Thr lie Thr 240
Leu
Thr Pro Lys val 245 Phe Thr cys val val val 250 ASp ASp He Ser Lys ASp 255 His ASp
Pro
Glu val Gln 260 ser Trp Phe Val 265 ASp val Glu val 270 Thr
Ala
Gln Thr 275 Gln Pro Arg Glu Glu 280 Gln phe Asn Ser Thr 285 Phe Arg Ser
Val
ser 290 Glu Leu Pro lie Met 295 His Gln Asp Trp Leu 300 Asn Gly Lys Glu
5
10
Phe
Lys cys Arg val Asn Ser
305
310
Thr
He Ser Lys Thr Lys Gly
He
Pro Pro Pro Lys Glu Gln
cys
Met He Thr Asp Phe Phe
Trp
Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370
375
Asn
Thr Asn Gly ser Tyr Phe
385
390
Ser
Asn Trp Glu Ala Gly Asn
Gly
Leu His Asn His His Thr
420
Lys
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <400> 28
Ala
Ala
Phe pro Ala Pro He Glu Lys
315 320
Arg
pro Lys Ala pro Gln val Tyr 33S Thr
Met
Ala JJV Lys Asp Lys Val ser JJ J Leu Thr
345 350
Pro
Glu ASp lie Thr val Glu Trp Gln
360
365
Asn
Tyr Lys Asn Thr 3sn Gln Pro lie Met
Val
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
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Thr
Phe Thr cys Ser val Leu His Glu
410 415
Glu
Lys ser Leu ser His Ser Pro Gly
425 430
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg tgcacagcct ctggattctc cctcagtagt ggggaggggc tggaatggat cggaaccatt tgggcaaaag gccgattcac catctccaga agtctgacga ccggggacac ggcccgttat caaggcaccc tcgtcaccgt ctcgagcgct gcccctggat ctgctgccca aactaactcc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat ccagaagtat catctgtctt catcttcccc ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat cagcccatca tggacacaga tggctcttac agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc caccatactg agaagagcct ctcccactct
gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tattggatga actgggtccg ccaggctcca 120 gattctggtg gtaggacgga ctacgcgagc 180 acctcgacta cgatggatct gaaaatgacc 240 ttctgtgcca gaaattggaa cttgtggggc 300 tctacaaagg gcccatctgt ctatccactg 360 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc 420 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac 480 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc 540 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc 600 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc 660 ccaaagccca aggatgtgct caccattact 720 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag 780 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag 840 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc 900 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa 960 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc 1020 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct 1080 gggcagccag cggagaacta caagaacact 1140 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag 1200 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac 1260 cctggtaaat ga 1302
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<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Anticuerpo humanizado
<400> 29
Met
Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala val Leu Lys Gly
1
5 10 15
Val
His Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu val Thr Pro
20 25 30
Gly
Thr Pro Leu Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu ser
35 40 45
ser
Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
50 55 60
Trp 65 Ala
lie Gly Thr lie Asp 70 Thr Ser Gly Gly Arg Thr 75 Ser Asp Tyr Ala Ser Trp 80 Leu
Lys
Gly Arg Phe 85 Leu lie Ser Arg Thr 90 Thr Thr Thr Met Asp 95 Cys
uys
Met Thr Ser 100 Asn Thr Thr Gly Asp 105 Gly Ala Arg Tyr Phe 110 Val Ala
Arg
Asn Trp Leu Trp Gly Gln Thr Leu val Thr ser Ser
115 120 125
Ala
Ser Thr Lys Gly pro Ser Val Tyr pro Leu Ala Pro Gly Ser
Ala
130 135 140
Ala 145 Phe
Gln Thr Asn Ser Met 150 Thr val Thr Leu Gly cys 155 Ser Leu val Lys Gly Tyr 160 Ser
pro
Glu Pro val val Thr Trp Asn Gly ser Leu Ser
165 170 175
Gly
Val His Thr phe Pro Ala Val Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr Leu
180 185 190
ser
Ser Ser val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro ser Glu Thr val
195 200 205
Thr
Cys 210 val Asn val Ala His pro 215 Gly Ala Ser ser Thr Lys Val ASp Lys Lys
lie
pro Arg Asp Cys cys Lys Pro Cys ¿£U lie Cys Thr val Pro
225
230 235 240
Glu
val ser Ser val Phe He Phe Pro pro Lys pro Lys Asp Val Leu
245 250 255
Thr
lie Thr Leu 260 Pro Thr Pro Lys val Thr 265 ser cys val val Val Asp 270 Asp lie ser
Lys
Asp Asp 275 Thr Glu val Gln Phe 280 Pro Trp phe val Asp 285 Phe Val Glu
Val
HlS Ala Gln Thr Gln Arg Glu Glu Gln Asn Ser Thr
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Phe
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met HÍS Gln ASp Trp Leu Asn
305
310 315 320
Gly
Lys Glu Phe Lys 325 lie cys Arg val Asn ser 330 Gly Ala Ala Phe pro Ala 335 Pro Pro
lie
Glu Lys Thr 340 lie ser Lys Thr Lys 345 Glu Arg pro Lys Ala 350 Asp Gln
val
Tyr Thr 355 Thr Pro Pro Pro Lys 360 ASP Gln Met Ala Lys 365 ASp Lys
val
ser
Leu Cys Met lie Thr Phe phe pro GlU lie Thr val
370 375 380
Glu
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
385
390 395 400
Pro
He Met Asn Thr Asn Gly ser Tyr Phe val Tyr Ser Lys Leu Asn
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Val
Gln Lys Ser 420 Gly Asn Trp Glu Ala Gly 425 His Asn Thr Phe Thr Cys 430 Leu Ser
Val
Leu
His Glu Leu His Asn His Thr Glu Lys Ser ser His
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Ser
Pro Gly Lys
450
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<213> Secuencia artificial
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ggcaccctcg tcaccgtctc gagcgcttct cctggatctg ctgcccaaac taactccatg ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg gacattactg tggagtggca gtggaatggg cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc catactgaga agagcctctc ccactctcct 5
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<400> 31
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lie val Leu Thr Gln ser Pro Thr ríe val ser Ala ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu
Lys val Thr Leu lie cys Ser Ala Ser Ser Ser val ser Phe Val
20 25 30
ASP
Trp phe 35 ser Gln Gln Lys Pro Gly 40 Gly Thr Ser Pro Lys Arg 45 phe Trp He Tyr
Arg
Thr 50 Ser Asn Leu Gly Phe 55 Ser Val pro Ala Arg 60 Arg Ser Gly Gly
Gly 65 Asp
Gly Thr ser His 70 Tyr Leu Thr lie Ser 75 Arg Ser Met Glu Ala Glu 80 Thr
Ala
Ala
Thr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Pro Pro
85 90 95
Phe
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr
val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr ser Gly Gly
115 120 125
Ala
ser 130 Lys val val cys Phe Leu 135 Gly Asn Asn Phe Tyr Pro 140 Asn Lys ASp lie Asn
val
Trp Lys lie Asp ser Glu Arg Gln Gly val Leu Asn
145
150 155 160
Ser
Trp Thr ASp Gln 165 Thr Asp Ser Lys Asp Ser Thr 170 Glu Arg Tyr ser Met ser 175 Tyr
Ser
Thr
Leu Thr Leu Lys Asp Glu Tyr His Asn Ser
Thr
180 185 190
cys
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro lie Val Lys ser Phe
195 200 205
Asn
Arg Asn Glu Cys
210
5
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ctaatctgca
acttctccca
ttcagtggcg
gatgctgcca
accaagctgg
agtgagcagt
aaagacatca
tcacccagtc
gtgccagttc
aacgctggat
gtggatctgg
cttattactg
aactgaaacg
taacatctgg
atgtcaagtg
tccaacaatc
aagtgtaagt
ttacagaaca
gacctctcac
ccagcaaagg
ggctgatgct
aggtgcctca
gaagattgat
gtgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ttcgtggact ggttccagca gaagccaggc 120 tccaacctgg gttttggagt ccctgctcgc 180 tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 agtacttacc cacccacgtt cggtgctggg 300 gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360 gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420 ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480
agttggactg atcaggacag accaaggacg agtatgaacg acttcaccca ttgtcaagag
caaagacagc
acataacagc
cttcaacagg
acctacagca tgagcagcac cctcacgttg tatacctgtg aggccactca caagacatca aatgagtgtt ag
540
600
642
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15 <400> 33
Met
His phe Gln val Gln lie Phe Ser Phe Leu Leu lie Ser Ala ser
1
5 10 15
val
He val ser Arg Gly Gln He Val Leu Thr Gln ser Pro Thr lie
20 25 30
val
Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys val Thr Leu He Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser
Ser 50 Lys val Ser Phe val ASp 55 Arg Trp Phe Gln Gln Lys 60 Gly Pro Gly Thr
Ser
Pro
Arg Trp He Tyr Thr Ser Asn Leu Phe Gly val
Pro
65
70 75 80
Ala
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ser
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Ser
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115 120 125
Arg
Ala ASp Ala Ala Pro Thr Val Ser He Phe Pro Pro Ser ser Glu
130
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Gln
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser val val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
145
150 155 160
Tyr
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Gln
Asn Gly val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp ser
180 185 190
Thr
Tyr ser Met Ser ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
195 200 205
Arg
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Pro
val Lys Ser Phe Arg Asn Glu Cys
225
230 235
<210> 34
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5 <210> 35
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10 <400> 35
imagen32
1
5 10 15
Thr
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20 25 30
Gly
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Trp
Leu 50 Lys His lie Trp Trp 55 lie Asp val Lys Arg 60 ser Asn pro Val
Leu
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65
70 75 80
Phe
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cys
Ala Arg He 100 Gly Asp Phe Asp Tyr 105 Val Glu Glu Tyr Tyr 110 Ala Met
Asp
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Thr
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Thr
130 135 140
Asn
Ser Met val Thr Leu Gly cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe pro Glu
145
150 155 160
Pro
val Thr Val Thr Trp Asn ser Gly ser Leu Ser Ser Gly Val His
165 170 175
Thr
Phe pro Ala Val Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser ser Ser
180 185 190
val
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195 200 205
val
Ala 210 Asp HlS Pro Ala Ser ser 215 pro Thr Lys val Asp Lys 220 val Lys lie val Pro
Arg
Cys Gly cys Lys Cys lie cys Thr Pro Glu Val ser
225
230 235 240
ser
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245 250 255
Leu
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Pro
Glu Val 275 Thr Gln Phe ser Trp Phe 280 Glu Val ASp ASp val Glu 285 Thr val His Thr
Ala
Gln Gln Pro Arg Glu Gln Phe Asn Ser Phe Arg Ser
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val
ser Glu Leu Pro lie Met HÍS Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Phe
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lie
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cys
Met 370 Asn lie Thr Asp Phe phe 375 Glu Pro Glu Asp lie Thr 380 Thr val Glu Trp Gln
Trp
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ser
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Gly
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gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag 480

ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct 540

gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg 600

cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag 660

aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca 720

tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca ccattactct gactcctaag 780

gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt 840

gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc 900

actttccgct cagtcagtga acttcccatc atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag 960

ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg 1080

gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg ataacagact tcttccctga agacattact 1140

gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg gagaactaca agaacactca gcccatcatg 1200

gacacagatg gctcttactt cgtctacagc aagctcaatg tgcagaagag caactgggag 1260

gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta catgagggcc tgcacaacca ccatactgag 1320

aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1350
<210> 37 <211> 468 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 37
Met
Gly Arg Leu Thr ser Ser Phe Leu Leu Leu He val pro Ala Tyr
1
5 10 15
val
Leu ser Gln val Thr Leu Lys Glu ser Gly Pro Gly lie Leu Gln
20 25 30
Pro
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys ser Phe Ser Gly Phe ser Leu
35 40 45
Ser
Thr 50 Leu Ser Gly Met Gly val 55 HÍS Gly Trp He Arg His 60 ASp Pro Ser Gly Lys
Asn
Glu Trp Leu Ala lie Trp Trp ASp Val Lys Arg Tyr
65
70 75 80
Asn
Pro Val Leu Lys 85 Leu ser Arg Leu Thr lie Ser 90 val Asp Lys Asp Thr ser 95 Thr
Asn
Ser
Gln Val Phe Lys He Ala Asn Thr Ala Asp Ala
100 105 110
Thr
Tyr Tyr cys Ala Arg lie Glu Asp Phe Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr
115 120 125
Tyr
Ala 130 Lys Met Asp Tyr Trp Gly 135 Ser Gln Gly Thr ser val 140 Ala He val Ser Ser
Ala
Thr Thr pro Pro val Tyr Pro Leu Pro Gly ser
Ala
145
150 155 160
Ala
Gln Thr Asn ser 165 val Met Val Thr Leu Gly Cys 170 Asn Ser Leu val Lys Gly 175 Ser Tyr
Phe
Pro Glu Pro Thr Val Thr Trp Gly ser Leu Ser
180 185 190
Gly
val His Thr phe Pro Ala val Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr Leu
195 200 205
Ser
Ser
ser Val Thr Val pro Ser ser Thr Trp Pro ser Glu Thr Val
210 215 Ala 220
Thr
Cys Asn Val Ala His Pro ser Ser Thr Lys val ASp Lys Lys
225
230 235 240
lie
Val pro Arg Asp cys Gly Cys Lys Pro Cys He cys Thr val pro
245 Phe 250 255
Glu
val Ser ser Val lie Phe Pro Pro Lys pro Lys Asp val Leu
260 265 270
Thr
lie Thr Leu Thr Pro Lys val Thr Cys val Val val Asp He Ser
275 280 285
Lys
Asp Asp Pro Glu val Gln Phe ser Trp Phe Val Asp Asp val Glu
290 295 300
val
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
305
310 315 320
Phe
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 “ 335
Gly
Lys Glu Phe Lys Cys Arg val Asn ser Ala Ala Phe Pro Ala pro
340 345 350
lie
Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala pro Gln
355 360 365
val
Tyr 370 Leu Thr lie Pro Pro Pro 375 Thr Lys Glu Gln Met Ala 380 Glu Lys Asp Lys
val
Ser
Thr Cys Met He ASp Phe Phe Pro ASp lie Thr Val
385
390 395 400
Glu
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
405 410 415
Pro
He Met ASp 420 Ser Thr Asp Gly ser Tyr 425 Gly Phe Val Tyr ser Lys 430 Cys Leu Asn
val
Gln Lys 435 Glu Asn Trp Glu Ala 440 His Asn Thr Phe Thr 445 Ser Ser
val
Leu
His Gly Leu His Asn His Thr Glu Lys Leu ser His
450 455 460
Ser Pro Gly Lys 465
<210> 38 <211> 1407 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
5
10
15
20
25
30
35
atgggcaggc ttacttcttc attcctgcta gttactctga aagagtctgg ccctgggata tgttctttct ctgggttttc actgagcact ccatcaggga agaatctgga gtggctggca aacccagtcc tgaagagccg actgactatc ctcaagatcg ccaatgtgga cactgcagat gactttgatt acgacgagga gtattatgct atcgtctcct cagccaaaac gacaccccca gcccaaacta actccatggt gaccctggga gtgacagtga cctggaactc tggatccctg ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag acagatggct cttacttcgt ctacagcaag ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat agcctctccc actctcctgg taaatga
<210> 39
<211>5
<212> PRT
<213> Mus musculus
ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcccag 60 ttgcagccct cccagaccct cagtctgact 120 tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcac 180 cacatttggt gggatgatgt caagcgctat 240 tccaaggata cctccaacag ccaggtattc 300 actgccacat actactgtgc tcgaatagag 360 atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 420 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct 480 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca 540 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc 600 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc 660 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa 720 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct 780 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc 840 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta 900 caaccccggg aggagcagtt caacagcact 960 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1080 accattccac ctcccaagga gcagatggcc 1140 acagacttct tccctgaaga cattactgtg 1200 aactacaaga acactcagcc catcatggac 1260 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca 1320 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag 1380
1407
<400> 39
imagen33
<210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 40
Asp lie Asn Pro Tyr ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys phe Lys 15 10 15
Gly
<210> 41 <211> 10 <212>. PRT <213> Mus musculus
<400> 41
Asp Asp Tyr Asp Ala ser pro Phe Ala Tyr 15 10
<210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<210> 43 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 43
Gly ser ser Asn Leu Glu Asp 1 5
<210> 44 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 44
imagen34
<210> 45 <211>5 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 45
imagen35
<210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 46
Asp lie Asn Pro Phe Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys phe Lys 15 10 15
Gly
<210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 47
ser His Tyr Tyr Phe Asp Gly Arg val Pro Trp Asp Ala Met Asp Tyr 15 10 15
<210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<210> 49 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 49
Ala Ala Ser Asn Leu Glu ser 1 5
<210> 50 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 50
Gln Gln Ser Asn Glu Asp pro Trp Thr 1 5
<210> 51 <211>5 <212> PRT
<213> Quimera de conejo-ratón <400> 51
Ser Tyr Trp Met Asn 1 5
<210> 52 <211> 16 <212> PRT
<213> Quimera de conejo-ratón <400> 52
Thr ile Asp ser Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Ala ser Trp Ala Lys Gly 15 10 15
<210> 53 <211>4 <212> PRT
<213> Quimera de conejo-ratón <400> 53
Asn Trp Asn Leu 1
<210> 54 <211> 13 <212> PRT
<213> Quimera de conejo-ratón <400> 54
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<210> 55 <211>7 <212> PRT
<213> Quimera de conejo-ratón <400> 55
Asp Ala ser Asp Leu Ala ser
<210> 56 <211> 10 <212> PRT
<213> Quimera de conejo-ratón <400> 56
Gln Gly Ala Tyr Asn Asp val lie Tyr Ala 15 10
<210> 57 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 57
Thr Ser Gly Met Gly val Gly 1 5
<210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 58
imagen36
<210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 59
Glu Asp Phe Asp Tyr Asp Glu Glu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10
<210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<210> 61 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 61
Arg Thr Ser Asn Leu Gly phe 1 5
<210> 62 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 62
Gln Gln Arg ser Thr Tyr pro Pro Thr 1 5
<210> 63 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 63
Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp 15 10 15
Trp Arg pro Ser 20
<210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 64
Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp Trp 15 10 15
Arg Pro ser Gly 20
<210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 65
Pro Ala Arg Leu Leu pro Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg 15 10 15
Pro ser Gly Pro 20
<210> 66 <211> 20 <212> PRT
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<213> Homo sapiens <400> 66
Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arq Gly Lys Trp Tro Arg Pro 1 5 10 15
Ser Gly Pro Asp 20
<210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 67
Arg Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg pro ser 15 10 15
Gly Pro Asp Phe 20
<210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 68
Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro ser Gly
15 10 15
pro Asp Phe Arg 20
<210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 69
Leu Pro Asn Ala He Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro
1 5 10 . 15
Asp Phe Arg Cys 20
<210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 70
Ser Ala Lys Pro val Thr Glu Leu val Cys ser Gly Gln cys 15 10
<210> 71 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
Leu val Ala Ser Cys Lys cys 1 5
<210> 72 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 72
Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg X 5
<210> 73 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 73
Cys lie Pro Asp Arg Tyr Arg 1 5
<210> 74 <211>399 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 74

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgctc aagttctgac ccagagtcca agcagtctct ccgccagcgt aggcgatcgt 120

gtgactatta cctgtcaatc tagtcagagc gtgtatgata acaattggct ggcgtggtac 180

cagcaaaaac cgggcaaagc cccgaagctg ctcatctatg acgcgtccga tctggctagc 240

ggtgtgccaa gccgtttcag tggcagtggc agcggtactg actttaccct cacaatttcg 300

tctctccagc cggaagattt cgccacttac tattgtcaag gtgcttacaa cgatgtgatt 360

tatgccttcg gtcagggcac taaagtagaa atcaaacgt 399
<210> 75 <211> 133 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 75
5
10
15
20

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln val Leu Thr Gln Ser pro Ser Ser 20 25 30

Leu Ser Ala ser val Gly Asp Arg val Thr lie Thr Cys Gln ser ser 35 40 45

Gln Ser val Tyr Asp Asn Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Asp Ala ser Asp Leu Ala ser

65 70 75 80
Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr lie Ser ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110

Gln Gly Ala Tyr Asn Asp val lie Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125
Val Glu lie Lys Arg 130
<210> 76 <211> 393 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 76
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccactgtgag 60
gtgcagctgt tggagtctgg aggcgggctt gtccagcctg gagggagcct gcgtctctct 120 tgtgcagcaa gcggcttcag cttatcctct tactggatga attgggtgcg gcaggcacct 180 gggaagggcc tggagtgggt gggcaccatt gattccggag gccgtacaga ctacgcgtct 240 tgggcaaagg gccgtttcac catttcccgc gacaactcca aaaataccat gtacctccag 300 atgaactctc tccgcgcaga ggacacagca cgttattact gtgcacgcaa ctggaatctg 360 tggggtcaag gtactcttgt aacagtctcg age 393
<210> 77 <211> 131 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 77
5
10
15
20
25
30
35
40

Met G"lu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu val Ala val Leu Lys Gly 15 10 15

val His cys Glu val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gln 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ser Leu 35 40 45

Ser ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp val Gly Thr lie Asp ser Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Ser

65 70 75 80
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Met Tyr Leu Gln Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Arg Tyr 100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asn Trp Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu val Thr 115 120 125
val ser ser 130
<210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 78
Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10
<210> 79 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 79
Tyr Thr ser Arg Leu Leu ser 1 5
<210> 80 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 80
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5
<210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 81
Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10
<210> 82 <211> 24 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<400> 82
Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu lie lie pro Gly 15 10 15
Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro 20
<210> 83 <211> 20 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 83
Thr Glu lie lie Pro Gly Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gln Glu 15 10 15
Leu Glu Asn Asn 20
<210> 84 <211> 20 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 84
Pro Glu Pro Pro Gln Glu Leu Glu Asn Asn Gln Thr Met Asn Arg Ala 15 10 15
Glu Asn Gly Gly 20
<210> 85 <211> 20 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 85
Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp Thr Lys Asp val 15 10 15
ser Glu Tyr ser 20
<210> 86 <211> 14 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 86
Cys Arg Glu Leu His Tyr Thr Arg Phe val Thr Asp Gly Pro 1 5 10
<210> 87 <211> 25 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 87
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cys Arg Glu Leu His Tyr Thr Arg Phe val Thr Asp Gly Pro Ser Arg 15 10 15
Ser Ala Lys Pro val Thr Glu Leu val 20 25
<210> 88 <211> 23 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 88
Cys Arg ser Ala Lys Pro val Thr Glu Leu val Ser ser Gly Gln ser 15 10 15
Gly Pro Arg Ala Arg Leu Leu 20
<210> 89 <211> 25 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 89
Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arg val Lys Trp 15 10 15
Trp Arg pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg 20 25
<210> 90 <211> 20 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 90
Arg Alá Gln Arg val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Ala Ala Pro Arg 15 10 15
Ser Arg Lys val 20
<210> 91 <211> 16 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 91
pro Gly Gly Ala Ala Pro Arg Ser Arg Lys val Arg Leu val Ala Ser 15 10 15
<210> 92 <211> 23 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 92
Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 1 5 10 15
Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gln 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<210> 93 <211> 16 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 93
lie Pro Asp Arg Tyr Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Ser Pro Gly Gly 15 10 15
<210> 94 <211> 24 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 94
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu Thr Ala Arg Pro Gln Lys Gly 15 10 15
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg 20
<210> 95 <211> 23 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 95
Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Gly Ala Lys Ala Asn Gln 15 10 15
Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 20
<210> 96 <211> 18 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 96
Pro Asn Ala lie Gly Arg val Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp 15 10 15
Phe Arg
<210> 97 <211> 22 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 97
Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg cys lie Pro Asp Arg 15 10 15
Tyr Arg Ala Gln Arg val 20
<210> 98 <211> 213 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 98
5
10
15
20
25
30
Met
Gln Leu ser Leu Ala Pro cys Leu Ala Cys Leu Leu val His Ala
1
5 10 15
Ala
Phe val Ala val Glu Ser Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp
20 25 30
Ala
Thr Glu lie lie Pro Gly Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gln
35 40 45
Glu
Leu 50 pro Glu Asn Asn Gln Thr 55 ASp Met Asn Arg Ala Glu Asn 60 Ser Glu Gly Gly Arg
pro
HIS His Pro Tyr Thr Lys Asp Val Tyr Ser Cys
65
70 75 80
Arg
Glu Leu His Tyr 85 Thr Thr Arg Phe Val Thr 90 Ser ASp Gly Pro Cys Arg 95 Pro Ser
Ala
Lys pro Val Glu Leu val Cys Gly Gln cys Gly
Ala
100 105 110
Arg
Leu Leu 115 ASp Pro Asn Ala lie Gly 120 Pro Arg Val Lys Trp Trp 125 Arg Ala 140 Ser Arg Arg Pro Asn
Gly
Pro 130 Leu Phe Arg Cys He 135 Gly Asp Arg Tyr Gln Arg val
Gln
Leu cys Pro Gly Ala Ala pro Arg Lys Val Arg
145
150 155 160
Leu
val Ala ser Cys Lys cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln
165 170 175
ser
Glu Leu Lys 180 Arg Asp Phe Gly Pro Glu 185 Gly Thr Ala Arg Pro Gln 190 Gln Lys Gly
Arg
Lys Pro Pro Arg Ala Arg Ala Lys Ala Asn Ala Glu
195
200 205
Leu
Glu Asn Ala Tyr
210
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<400> 99
Tyr Thr ser Arg Leu His Ser 1 5
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<400> 100
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5
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<400> 101
Arg Ala Ser Gln Val lie Thr Asn Tyr Leu Tyr 15 10
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 102
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<400> 103
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr Thr
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<400> 104
Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10
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<400> 105
Tyr Thr ser Arg Leu Leu ser 1 5
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<400> 106
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr Thr
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<400> 107
Arg Ala Ser Gln Asp lie ser Asn Tyr Leu Asn 15 10
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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<400> 109
imagen37
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<400> 110
Arg Ala ser Gln Asp lie ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 io
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<400> 111
imagen38
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imagen39
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<400> 113
Arg Ala ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10
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5
10
15
20
25
30
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imagen40
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<400> 116
Ser Val Ser Ser Ser lie Ser Ser Ser Asn Leu His 1 5 10
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<400> 117
Gln
He val Leu ser Gln Ser Pro Ala He Leu Ser Thr Ser pro Gly
1
5 10 15
Glu
Lys val Thr 20 Gln Met Thr Cys Arg Ala 25 Gly Ser Ser ser Ser val Tyr 30 Trp Tyr Met
His
Trp Tyr Gln Lys Pro Ser pro Lys Pro lie Tyr
35 40 45
Ala
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro val Arg Phe ser Gly Ser
50 55 60
Gly
ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Thr Arg Val Glu Ala Glu
65
70 75 80
Asp
Ala Ala Thr Tyr 85 Thr Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Lys Ser ser Asp pro Leu Thr 95 Ala Pro
Phe
Gly Ala Gly 100 lie Lys Leu Glu Leu 105 ser ser Arg Ala Asp Ala 110 Ser
Thr
Val Ser Phe Pro Pro Glu Gln Leu Thr Gly Gly
1X5 120 125
Ala
ser 130 t-ys val Val cys Phe Leu 135 Gly Asn Asn Phe Tyr Pro 140 Asn Lys Asp lie Asn
val
Trp Lys He Asp Ser Glu Arg Gln Gly val Leu Asn
145
150 155 160
Ser
Trp Thr Asp Gln 165 Thr Asp Ser Lys Asp ser 170 Glu Thr Tyr Ser Met ser ser 175 Tyr Thr
Thr
Leu Thr Leu 180 Thr Lys Asp Glu Tyr 185 Ser Thr Arg His Asn ser 190 Lys
Cys
Glu Ala His Lys Thr Ser Pro He val Ser Phe
195 200 205
Asn
Arg Asn Glu Cys
210
<210> 118 <211>642 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 118
5
10
15
20
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc atgacttgca gggccagctc aagtgtatat tcctccccca aaccctggat ttatgccaca ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg accaagctgg agctgaaacg ggctgatgct agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat agttggactg atcaggacag caaagacagc accaaggacg agtatgaacg acataacagc acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg
ctgtctacat ctccagggga gaaggtcaca 60 tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180 tctctcacaa tcaccagagt ggaggctgaa 240 agtagtgacc cactcacgtt cggtgctggg 300 gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360 gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420 ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480 acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 540 tatacctgtg aggccactca caagacatca 600 aatgagtgtt ag 642
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<400> 119
Met
Asp Phe Gln Val Gln He Phe Ser Phe Leu Leu lie Ser Ala
1
5 10 15
Val
lie Met ser Arg Gly Gln He val Leu Ser Gln Ser pro Ala
20 Gly Glu 25 30
Leu
ser Thr Ser Pro Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala
35 40 45
ser
ser
Val Tyr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln í-ys Pro Gly
ser
50 55 60
Pro
Lys Pro Trp lie Tyr Ala Thr ser Asn Leu Ala Ser Gly val
65
70 75
Val
Arg Phe Ser Gly 85 Ala Ser Gly ser Gly Thr 90 Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 95 Gln
Thr
Arg val Glu Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr cys Gln
100 105 110
ser
Ser Asp 115 ASp pro Leu Thr Phe Gly 120 Val Ala Gly Thr Lys Leu 125 Pro Glu Leu
Arg
Ala Ala Ala Pro Thr ser He Phe Pro Ser Ser
130
135 140
Gln 145 Tyr
Leu Thr ser Gly Gly 150 Asn Ala ser val val cys 155 lie Phe Leu Asn Asn
Pro
Lys Asp lie 165 Leu val Lys Trp Lys 170 Asp Asp Gly ser Glu 175 ASp
Gln
Asn Gly Val 180 Met Asn ser Trp Thr 185 Thr Gln Asp Ser Lys 190 Glu
Thr
Tyr ser 195 Asn Ser Ser Thr Leu 200 Glu Leu Thr Lys Asp 205 Thr Tyr
Arg
His 210 lie Ser Tyr Thr cys 215 Asn Ala Thr His Lys 220 Ser Thr
Pro
val Lys Ser Phe Arg Asn GlU cys
225
230 235
<210> 120 <211>708 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 120
ser
lie
Ser
ser
pro
80
ne
Trp
Lys
Glu
Phe
160
Arg
ser
Glu
Ser
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aggggacaaa
gtcacaatga
ccaggatcct
gttcgcttca
gctgaagatg
gctgggacca
ccatccagtg
taccccaaag
ctgaacagtt
acgttgacca
acatcaactt
aagtgcagat tttcagcttc ttgttctctc ccagtctcca cttgcagggc cagctcaagt cccccaaacc ctggatttat gtggcagtgg gtctgggacc ctgccactta ttactgccag agctggagct gaaacgggct agcagttaac atctggaggt acatcaatgt caagtggaag ggactgatca ggacagcaaa aggacgagta tgaacgacat cacccattgt caagagcttc
ctgctaatca
gcaatcctgt
gtatattaca
gccacatcca
tcttactctc
cagtggagta
gatgctgcac
gcctcagtcg
attgatggca
gacagcacct
aacagctata
aacaggaatg
gtgcttcagt cattatgtcc 60 ctacatctcc aggggagaag 120 tgcactggta ccagcagaag 180 acctggcttc tggagtccct 240 tcacaatcac cagagtggag 300 gtgacccact cacgttcggt 360 caactgtatc catcttccca 420 tgtgcttctt gaacaacttc 480 gtgaacgaca aaatggcgtc 540 acagcatgag cagcaccctc 600 cctgtgaggc cactcacaag 660 agtgttag 708
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<213> Mus musculus
<400> 121
Glu
val Gln val Gln Gln Ser Gly Pro GlU Leu Val Lys Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
val Lys Leu 20 Trp Ser Cys Thr Ala Ser 25 Pro Gly phe Asn He Lys 30 Glu ASp Tyr
Phe
He His 35 Leu Val Lys Gln Arg 40 Gly Glu Gln Gly Leu 45 Ala Trp lie
Gly
Arg Asp Pro Glu Asp Glu ser Asp Tyr Pro Lys Phe
50 55 60
Gln
ASp Lys Ala He Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Leu
Gln Leu Arg Ser 85 Tyr Leu Thr Ser Glu ASp 90 Thr Thr Ala lie Tyr sr Trp cys
Glu
Arg Glu Asp Asp Gly Thr Tyr Phe Phe Pro Tyr Gly
100 105 110
Gln
Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
val
Tyr Pro Leu Ala pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met
val
130 Gly 135 140
Thr
Leu Cys Leu Val Lys Gly Tyr phe pro Glu Pro Val Thr Val
145
150 155 160
Thr
Trp Asn Ser Gly ser Leu ser Ser Gly Val His Tlir Phe Pro Ala
Gln 165 170 175
val
Leu ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser ser ser val Thr Val Pro
Thr 180 185 190
ser
Ser Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn val Ala His Pro
195 200 205
Ala
Ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie val pro Arg Asp cys Gly
210 215 220
Cys
Lys Pro Cys lie cys Thr val Pro Glu val Ser ser Val phe He
225
230 235 240
Phe
Pro Pro Lys Pro 245 val Lys Asp Val Leu Thr 250 Lys lie Thr Leu Thr pro 255 Val Lys
Val
Thr Cys val val Asp lie Ser Asp Asp Pro Glu Gln
260 265 270
Phe
Ser Trp Phe Val Asp Asp val Glu val HÍS Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro
Arg Glu Glu Gln phe Asn ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro
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305
310 315 320
val
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys
325 330 335
Thr
Lys Gly Arg 340 Met Pro Lys Ala Pro Gln 345 Val Val Tyr Thr lie pro 350 Met pro Pro
Lys
Glu Gln Ala Lys ASp Lys ser Leu Thr cys He Thr
355 360 365
ASp
Phe Phe Pro Glu ASp He Thr val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370
375 380
Pro
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln pro lie Met Asp Thr ASp Gly
385
390 395 400
Ser Tyr
Phe He Tyr 405 Phe ser Lys Leu Asn val 410 Leu Gln Lys Ser Asn Trp 415 His Glu
Ala Gly
Asn Thr Thr cys ser val His Glu Gly Leu Asn
420 425 430
His
His
Thr Glu Lys Ser Leu ser His ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<213> Mus musculus

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tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactacttta tacactgggt gaagcagagg 120

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cttcagctca gaagcctgac atctgaggac actgccatct attattgtga gagagaggac 300

tacgatggta cctacacctt ttttccttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360

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aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480

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<213> Mus musculus
<400> 123
Met i
Lys cys Ser Trp val lie Phe Phe Leu 10 Ser Met Ala val Val Thr 15 val Gly
val
Asn ser Glu 20 Ser val Gln val Gln Gln 25 Cys Gly Pro Glu Leu 30 Phe Lys
Pro
Gly Ala 35 Tyr val Lys Leu Ser 40 Val Thr Ala ser Gly 45 Glu Asn lie
Lys
Asp 50 Trp Phe lie HÍS Trp 55 ASp Lys Gln Arg Pro 60 Gl u Gln Gly Leu
Glu 65 Pro
He Gly Arg Leu 70 Lys pro Glu Asp Gly 75 Ala Ser Asp Tyr Ala 80 Asn
Lys
Phe Gln Asp 85 Gln Ala lie Met Thr 90 Thr Asp Thr Ser ser 95 Ala
Thr
Ala Tyr Leu Leu Arg Ser Leu Ser Glu Asp Thr lie
100 105 110
Tyr
Tyr
Cys 115 Gly Glu Arg Glu Asp Tyr 120 Val ASp Gly Thr Tyr Thr 125 Ala Phe Phe Pro
Tyr
Trp 130 Pro Gln Gly Thr Leu 135 Leu Thr val Ser Ala 140 Ala Lys Thr Thr
Pro
Ser Val Tyr pro Ala Pro Gly Ser Ala Gln Thr Asn
145
150 155 160
Ser
Met Val Thr Leu 165 Trp Gly cys Leu Val Lys 170 Leu Gly Tyr Phe Pro Glu 175 His pro
Val
Thr val Thr Asn ser Gly Ser Ser Ser Gly val Thr
180 185 190
Phe
Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser ser Val
195 200 205
Thr
val Pro Ser Ser Thr Trp Pro ser Glu Thr val Thr cys Asn val
210 215 220
Ala
HÍS Pro Ala Ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys He val Pro Arg
225
230 235 240
Asp
cys Gly cys Lys pro Cys lie Cys Thr Val Pro Glu val ser Ser
245 250 255
val
Phe lie Phe 260 Val Pro pro Lys Pro Lys 265 val ASp Val Leu Thr He 270 Asp Thr Leu
Thr
Pro Lys Thr cys val val ASp He Ser Lys ASp pro
275 280 285
Glu
Val 290 Thr Gln Phe Ser Trp Phe 295 Glu Val Asp ASp val Glu 300 Thr val His Thr Ala
Gln
Gln
Pro Arg Glu Gln Phe Asn Ser Phe Arg ser val
305
310 315 320
Ser
Glu Leu Pro lie 325 Asn Met His Gln Asp Trp 330 Pro Leu Asn Gly Lys Glu 335 Lys Phe
Lys
cys Arg val ser Ala Ala Phe Ala Pro lie Glu Thr
340
345 350
He
ser Lys 355 Pro Thr Lys Gly Arg Pro 360 Ala Lys Ala Pro Gln val 365 Ser Tyr Thr
He
Pro
Pro 370 He Lys Glu Gln Met 375 Pro Lys Asp Lys val 380 val Leu Thr cys
Met
Thr ASp Phe phe Glu Asp lie Thr Glu Trp Gln Trp
385
390 395 400
Asn
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp
Thr
405 410 415
Asp
Gly Ser 420 Ala Tyr Phe lie Tyr Ser 425 Thr Lys Leu Asn Val Gln 430 His Lys Ser
Asn
Trp Glu Gly Asn Thr Phe cys ser Val Leu Glu Gly
435 440 445
Leu
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
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<213> Mus musculus

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5
10
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<400> 125
Glu
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1
5 10 15
Glu
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Hi S
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35 40 45
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50 55 60
Gly 65 Ala
ser Gly Ser Gly Thr 70 Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 75 Gln He Ser ser Met Glu 80 Pro
Glu
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Leu
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Ala
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115 120 125
Gly
Gly 130 Asn Ala Ser Val val cys 135 He Phe Leu Asn Asn Phe 140 Arg Tyr Pro Lys Asp
lie
val Lys Trp Lys Asp Gly ser Glu Gln Asn Gly val
145
150 155 160
Leu
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ser
Ser Thr Leu 180 Glu Leu Thr Lys Asp 185 Thr Tyr Glu Arg His 190 He Ser
Tyr
Thr cys Ala Thr His Lys ser Thr ser Pro Val Lys
Phe 195 200 205
Ser
Asn Arg Asn Glu cys
210 215
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5
10
15
gaaattgtgc tcacccagtc tccagcactc atcacctgca gtgtcagttc aactataagt tcagacacct cccccaaacc ctggatttat gttcgcttca gtggcagtgg atctgggacc gctgaggatg ctgccactta ttactgtcaa gctgggacca agctggagct gagacgggct ccatccagtg agcagttaac atctggaggt taccccaaag acatcaatgt caagtggaag ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa acgttgacca aggacgagta tgaacgacat acatcaactt cacccattgt caagagcttc
<210> 127 <211> 237 <212> PRT <213> Mus musculus
atggctgcat ctccggggga gaaggtcacc 60 tccaaccact tgcactggtt ccagcagaag 120 ggcacatcca acctggcttc tggagtccct 180 tcttattctc tcacaatcag cagcatggag 240 cagtggagta gttacccact cacgttcggc 300 gatgctgcac caactgtatc catcttccca 360 gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 420 attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 480 gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 540 aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 600 aacaggaatg agtgttag 648
<400> 127
Met
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1
5 10 15
val
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20 25 30
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Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr He Thr cys Ser Val Ser
35 40 45
Ser
Thr lie Ser ser Asn His Leu His Trp Phe Gln Gln Lys ser Asp
50 55 60
Thr 65 Val
Ser pro Lys Pro Trp 70 Ser lie Tyr Gly Thr ser 75 Gly Asn Leu Ala ser Gly 80 Leu
Pro
val Arg Phe 85 Met Gly Ser Gly Ser 90 Ala Thr ser Tyr Ser 95 cys
Thr
lie Ser Ser 100 Ser Glu Ala Glu ASp 105 Phe Ala Thr Tyr Tyr 110 Lys Gln
Gln
Trp Ser Tyr Pro Leu Thr Gly Ala Gly Thr Leu Glu
115 120 125
Leu
Arg Arg Ala Asp Ala Ala pro Thr val Ser lie Phe Pro Pro ser
130 135 140
Ser
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala ser Val val cys Phe Leu Asn
145
150 155 160
Asn
Phe Tyr Pro Lys 165 Gly Asp He Asn val Lys 170 Trp Trp Lys lie Asp Gly 175 Ser Ser
Glu
Arg Gln Asn 180 Tyr val Leu Asn ser 185 Thr Thr ASp Gln Asp 190 Lys Lys
Asp
ser Thr ser Met Ser ser Leu Thr Leu Thr ASp Glu
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Tyr
Glu Arg His Asn ser Tyr Thr cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser
210
215 220
Thr
Ser Pro lie val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu cys
225
230 235
<210> 128 <211> 714 <212>ADN <213> Mus musculus
atggattttc atgtgcagat tttcagcttc atgctaatca gtgtcacagt cattttgtcc 60 agtggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca gcactcatgg ctgcatctcc gggggagaag 120 gtcaccatca cctgcagtgt cagttcaact ataagttcca accacttgca ctggttccag 180 cagaagtcag acacctcccc caaaccctgg atttatggca catccaacct ggcttctgga 240 gtccctgttc gcttcagtgg cagtggatct gggacctctt attctctcac aatcagcagc 300 atggaggctg aggatgctgc cacttattac tgtcaacagt ggagtagtta cccactcacg 360
ttcggcgctg ggaccaagct ggagctgaga cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 480 aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag tggaagattg atggcagtga acgacaaaat S40 ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 600 accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cgacataaca gctatacctg tgaggccact 660 cacaagacat caacttcacc cattgtcaag agcttcaaca ggaatgagtg ttag 714
<210> 129 <211> 449 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 129
61 u
val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu val Arg Pro Gly Ala
1
5 10 15
Leu
Val Lys Leu 20 Trp Ser Cys Thr Ala Ser 25 Pro ASp Phe Asn He Lys 30 Asp Asp Phe
Tyr
Leu His 35 lie Met Arg Gln Arg 40 Gly GlU Gln Gly Leu 45 ASp Trp He
Gly
Arg 50 Asp Asp Pro Glu Asn 55 Thr Asp Thr Leu Tyr 60 Ser Pro Lys Phe
Gln 65 Leu
Lys Ala Thr Leu 70 Leu Thr Asp Thr ser 75 Thr Asn Thr Ala Tyr 80 Cys
Gln
Leu ser Gly Thr ser Glu Thr Ala val Tyr Tyr
85 90 95
Ser
Arg Glu Ala 100 Gly Asp Tyr Phe His Asp 105 He Gly Thr Ser Tyr Trp 110 Ala Tyr phe
Asp
Val Trp Ala Gly Thr Thr Thr val Ser Ser Lys Thr
115 120 125
Thr
pro Pro Ser val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln
Thr
130 135 140
Asn 145 Pro
Ser Met Val Thr Leu 150 Trp Gly Cys Leu val Lys 155 Leu Gly Tyr Phe Pro Glu 160 HÍS
val
Thr val Thr Asn ser Gly ser Ser Ser Gly
val
165 170 175
Thr
Phe Pro Ala val Leu Gln Ser ASp Leu Tyr Thr Leu Ser ser Ser
180 185 190
Val
Thr val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr Cys Asn
195 200 205
val
Ala His Pro Ala Ser ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie Val Pro
210 215 220 Glu
Arg
Asp cys Gly cys Lys Pro cys lie cys Thr val Pro Val Ser
225
230 235 240
Ser
val Phe lie Phe pro Pro Lys Pro Lys Asp val Leu Thr lie Thr
245 250 255
Leu
Thr pro Lys 260 Gln Val Thr Cys val val 265 Val val Asp He Ser Lys 270 Val Asp Asp
pro
Glu Val Phe ser Trp Phe Asp ASp Val Glu His Thr
275 280 285
Ala
Gln Thr Gln pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg Ser
290 295 300 Glu
val
Ser Glu Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305
310 315 320
Phe
Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe pro Ala Pro He Glu Lys
325 330 335
Thr
He Ser Lys 340 Pro Thr Lys Gly Arg Pro 345 Ala Lys Ala Pro Gln val 350 Ser Tyr
Thr
He
pro Pro 355 lie Lys Glu Gln Met 360 Pro Lys Asp Lys Val 365 val Leu Thr
cys
Met Thr Asp Phe Phe Glu ASp He Thr Glu Trp Gln
370
375 380
Trp
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro He Met
385
Thr 390 395 400
Asp
Asp
Gly Ser Tyr Phe lie Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
405 410 415
Ser
Asn Trp Glu 420 Asn Ala Gly Asn Thr Phe 425 Lys Thr cys Ser Val Leu 430 Ser His Glu
Gly
Leu His His His Thr Glu Ser Leu Ser His Pro
Gly
435 440 445
Lys
<210> 130 <211> 1350 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
5

gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgaa cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctgactt caacattaaa gacttctatc tacactggat gaggcagcgg 120

cctgaacagg gcctggactg gattggaagg attgatcctg agaatggtga tactttatat 180

gacccgaagt tccaggacaa ggccactctt acaacagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcggcctgac atctgagacc actgccgtct attactgttc tagagaggcg 300

gattatttcc acgatggtac ctcctactgg tacttcgatg tctggggcgc agggaccaca 360

atcaccgtct cctcagccaa aacgacaccc ccatctgtct atccactggc ccctggatct 420

gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag 480

ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct 540

gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg 600

cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag 660

aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca 720

tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca ccattactct gactcctaag 780

gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt 840

gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc 900

actttccgct cagtcagtga acttcccatc atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag 960

ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg 1080

gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg ataacagact tcttccctga agacattact 1140

gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg gagaactaca agaacactca gcccatcatg 1200

gacacagatg gctcttactt catctacagc aagctcaatg tgcagaagag caactgggag 1260

gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta catgagggcc tgcacaacca ccatactgag 1320

aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1350
<210> 131 <211> 468 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 131
Met
Lys cys Ser Trp val He Phe Phe Leu Met Ala val val Thr Gly
1
5 10 15
val
Asn ser Glu val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu val Arg
20 25 30
Pro
Gly Ala Leu val Lys Leu ser Cys Thr Ala Ser Asp Phe Asn lie
35 40 45
Lys
Asp 50 Phe Tyr Leu His Trp 55 ASP Met Arg Gln Arg Pro 60 Asp Glu Gln Gly Leu
Asp
J V/ Trp He Gly Arg lie Pro Glu Asn Gly Thr Leu Tyr ASp
65
70 75 80
Pro
Lys Phe Gln Asp 85 Gln Lys Ala Thr Leu Thr 90 Thr Thr ASp Thr Ser Ser 95 Ala Asn
Thr
Ala Tyr Leu Leu ser Gly Leu Ser Glu Thr Thr val
100 105 110
Tyr
Tyr
cys 115 Phe Ser Arg Glu Ala Asp 120 Ala Tyr phe His ASP Gly 125 Thr Thr Ser
Tyr
Trp
Tyr 130 Asp val Trp Sí Gly Thr Thr He 140 Val Ser ser
Ala
Lys Thr Thr Pro pro ser val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly ser
Ala
145
Gln 150 155 160
Ala
Thr Asn Ser 165 Val Met Val Thr Leu Gly 170 Asn Cys Leu Val Lys Gly 175 Ser Tyr
Phe
Pro Glu Pro Thr val Thr Trp ser Gly Ser Leu ser
Gly
Val 180 185 190
His
Thr Phe pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
195 200 205
Ser
Ser
Ser
val Thr val pro Ser ser Thr Trp Pro ser Glu Thr Val
Thr
210 cys Asn Val Ala His 215 Pro Ala Ser Ser Thr 220 Lys val Asp Lys Lys
225 He
val Pro Arg Asp 245 val 230 Cys Gly cys Lys Pro 250 Pro 235 Cys lie Cys Thr Val 255 Val 240 Pro
Glu
Val Ser Ser Phe lie phe Pro Lys Pro Lys Asp Leu
Thr
He Thr 260 Leu Thr pro Lys val 265 Thr cys Val val val 270 Asp lie Ser
Lys
ASp 290 His 275 Asp pro Glu Val Gln 295 Gln 280 Phe ser Trp Phe val 300 Gln 285 Asp ASp val Glu
val
Thr Ala Gln Thr Pro Arg Glu Glu Phe Asn Ser Thr
305 Phe
Arg ser val Ser 310 Glu Leu pro lie Met 315 His Gln Asp Trp Leu 320 Asn
Gly
Lys Glu Phe 340 Thr 325 Lys cys Arg Val Asn 345 Lys 330 ser Ala Ala Phe Pro 350 Ala 335 Ala Pro
lie
Glu Lys 355 Thr lie ser Lys Thr 360 Lys Gly Arg Pro Lys 365 Lys Pro Gln
val
Tyr 370 Leü lie Pro Pro Pro 375 Thr Glu Gln Met Ala 380 Glu Asp Lys
val
ser
Thr cys Met He Asp Phe Phe Pro Asp lie Thr val
385 Glu
Trp Gln Trp Asn 390 Gly Gln pro Ala Glu 395 Asn Tyr Lys Asn Thr 400 Gln
Pro
lie Met ASp 420 Ser 405 Thr Asp Gly Ser- Tyr 425 Gly 410 Phe He Tyr ser Lys 430 Cys 415 Leu Asn
val
Gln Lys Asn Trp Glu Ala Asn Thr Phe Thr Ser
val
Leu
His 435 Glu Gly Leu His Asn 440 His His Thr Glu Lys 445 ser Leu ser HÍS
Ser 465
450 pro Gly Lys 455 460
<210> 132 <211> 1407 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 132
atgaaatgca gctgggtcat cttcttcctg gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactt tgcacagctt ctgacttcaa cattaaagac gaacagggcc tggactggat tggaaggatt ccgaagttcc aggacaaggc cactcttaca cagctcagcg gcctgacatc tgagaccact tatttccacg atggtacctc ctactggtac accgtctcct cagccaaaac gacaccccca gcccaaacta actccatggt gaccctggga gtgacagtga cctggaactc tggatccctg ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag acagatggct cttacttcat ctacagcaag ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat agcctctccc actctcctgg taaatga
atggcagtgg ttacaggggt caattcagag 60 gtgaggccag gggccttagt caagttgtcc 120 ttctatctac actggatgag gcagcggcct 180 gatcctgaga atggtgatac tttatatgac 240 acagacacat cctccaacac agcctacctg 300 gccgtctatt actgttctag agaggcggat 360 ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacaatc 420 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct 480 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca 540 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc 600 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc 660 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa 720 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct 780 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc 840 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta 900 caaccccggg aggagcagtt caacagcact 960 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1080 accattccac ctcccaagga gcagatggcc 1140 acagacttct tccctgaaga cattactgtg 1200 aactacaaga acactcagcc catcatggac 1260 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca 1320 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag 1380
1407
10
15
<211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 133
Asp
lie Gl n Met Thr Gln lie Thr
1 ASp
Arg val Ser 20 Tyr 5 lie Ser Cys Arg
Leu
Asn Trp 35 Thr Gln Gln Lys Pro 40 ser
Phe
Tyr 50 Gly ser Arg Leu Leu 55 Tyr
Ser 65 Glu
ser Gly Thr Asp 70 Tyr ser
Asp
Phe Ala Thr 85 Gly Phe cys
Thr
Phe Gly Gly 100 Ser Thr Lys Leu
Pro
Thr Val lie Phe
Pro
Pro
Gly
Ala 115 ser val Val Cys Phe 120 Leu
Asn 145 Asn
130 Val Lys Trp Lys He 150 Gln 135 Asp Gly
ser
Trp Thr Asp 165 Leu ASp Ser
Ser
Thr Leu Thr 180 Ala Thr Lys Asp
Thr
cys Gl u Thr His Lys
Thr
Phe
Asn 210 195 Arg Asn Glu Cys 200
<210> 134 <211 > 645 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 134
Ser
Ser 10 Leu Ser Ala ser Leu 15 Gly
Ala 25
Ser Gln Asp lie ser 30 Asn Tyr
Asp
Gly Thr Phe Lys 45 Leu Leu lie
Gly
val Pro Ser 60 Tyr Arg Phe Ser
Gly
Leu
Thr lie 75 Asn Leu Glu Gln 80
Gln
Gln 90 lie Gly Asp Thr Leu Pro 95 Ala Tyr
Glu 105
Lys Arg Ala Asp 110 Ala
ser
Ser Glu Gln Leu 125 Thr Ser Gly
Asn
Asn
Phe Tyr 140 Pro Lys Asp lie
ser
Glu Arg 155 Gln Asn Gly val Leu 160
Lys
Asp 170 Ser Thr Tyr Ser Met 175 Ser
Glu 185
Tyr Glu Arg His Asn 190 ser Tyr
ser
Thr ser Pro lie 205 val Lys Ser
gatatccaga
atcagttgca
gatggaactt
aggttcagtg
gaagattttg
gggaccaagc
tccagtgagc
cccaaagaca
aacagttgga
ttgaccaagg
tcaacttcac
tgacacagat
gggcaagtca
ttaaactcct
gcagtgggtc
ccacttactt
tggaaataaa
agttaacatc
tcaatgtcaa
ctgatcagga
acgagtatga
ccattgtcaa
tacatcctcc
agacattagc
tatcttctac
tggaacagat
ttgccaacag
acgggctgat
tggaggtgcc
gtggaagatt
cagcaaagac
acgacataac
gagcttcaac
ctgtctgcct
aattatttaa
acatcaagat
tattctctca
ggagatacgc
gctgcaccaa
tcagtcgtgt
gatggcagtg
agcacctaca
agctatacct
aggaatgagt
ctctgggaga
actggtatca
tactctcagg
ccatttacaa
ttccgtacac
ctgtatccat
gcttcttgaa
aacgacaaaa
gcatgagcag
gtgaggccac
gttag
cagggtctcc 60 gcagaaacca 120 agtcccatca 180 cctggagcaa 240 tttcggaggg 300 cttcccacca 360 caacttctac 420 tggcgtcctg 480 caccctcacg 540 tcacaagaca 600 645
<210> 135 <211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus
5
10
Met
Met
ser ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1
Thr 5 10 15
Gly
Arg Cys Asp lie Gln Met Thr Gln lie Thr ser ser Leu Ser
Ala
20 25 30
Ser
Leu 35 Asn Gly Asp Arg Val Ser 40 Tyr He Ser Cys Arg Ala 45 Asp Ser Gln Asp
lie
Ser Tyr Leu Asn Trp Gln Gln Lys Pro Gly Thr Phe
50 55 60
Lys 65
Leu Leu lie Phe Tyr 70 Thr Ser Arg Leu Leu 75 Ser Gly val Pro Ser 80
Arg
Phe ser Gly Ser 85 Glu Gly ser Gly Thr Asp 90 Tyr Tyr Ser Leu Thr lie 95 Gly Tyr
Asn
Leu Glu Gln Asp Phe Ala Thr Phe Cys Gln Gln Asp
100 105 110
Thr
Leu Pro 115 Ala Tyr Thr Phe Gly Gly 120 ser Gly Thr Lys Leu Glu 125 ser lie Lys Arg
Ala
Asp Ala Pro Thr val lie Phe Pro Pro Ser Glu Gln
130 135 140
Leu
Thr Ser Gly Gly Ala Ser val val cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145
ISO 155 160
Pro
Lys ASp lie Asn val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
¡Asn
Gly val Leu 180 ser Asn Ser Trp Thr Asp 185 Leu Gln Asp Ser Lys ASp 190 Tyr ser Thr
Tyr
Ser Met 195 ser ser Thr Leu Thr 200 Ala Thr Lys Asp Glu 205 Ser Glu Arg
His
Asn Tyr Thr cys Glu Thr HÍS Lys Thr Thr Ser Pro
210 215 220
lie
val Lys ser Phe Asn Arg Asn Glu cys
225
230
<210> 136 <211> 705 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 136
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ccttggtctc ctgttgctct tacatcctcc ctgtctgcct agacattagc aattatttaa tatcttctac acatcaagat tggaacagat tattctctca ttgccaacag ggagatacgc acgggctgat gctgcaccaa tggaggtgcc tcagtcgtgt gtggaagatt gatggcagtg cagcaaagac agcacctaca acgacataac agctatacct gagcttcaac aggaatgagt
gttttcaagg taccagatgt 60 ctctgggaga cagggtctcc 120 actggtatca gcagaaacca 180 tactctcagg agtcccatca 240 ccatttacaa cctggagcaa 300 ttccgtacac tttcggaggg 360 ctgtatccat cttcccacca 420 gcttcttgaa caacttctac 480 aacgacaaaa tggcgtcctg 540 gcatgagcag caccctcacg 600 gtgaggccac tcacaagaca 660 gttag 705
<210> 137 <211>447 <212> PRT <213> Mus musculus
Glu
val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys pro Gly Ala
1
5 10 15
ser
val Lys Met 20 Trp Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gln Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Glu ASP Tyr
Asn
Met His Val Lys Gln Asn Gly Lys Thr Leu Trp lie
35 40 45
Gly
Glu 50 Gly lie Asn Pro Asn Ser 55 Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Asn 60 ser Thr Gln Lys phe
Lys
Lys
Ala Thr Leu val Asp Lys Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Arg Ser 85 Tyr Leu Thr Ser Glu Asp 90 ASp Ser Ala Val Tyr Tyr 95 ASP Cys
Ala
Arg Leu Gly 100 Gly Asp Asp lie Tyr 105 val Asp Trp Tyr phe 110 Thr Val
Trp
Gly Ala 115 val Thr Thr val Thr 120 Pro Ser Ser Ala Lys 125 Ala Gln Thr Pro
Pro
ser Tyr Pro Leu Ala Gly ser Ala Thr Asn Ser
130 135 140
Met
Val Thr Leu Gly cys Leu val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro val
145
150 155 160
Thr
val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
val 165 170 175
Pro
Ala Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser val Thr
180 185 190
Val
Pro Ser Ser Thr Trp pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala
195 200 205
His
Pro 210 Gly Ala ser ser Thr Lys 215 lie Val Asp Lys Lys lie val 220 Glu Val Pro Arg Asp
cys
cys
Lys Pro Cys cys Thr val Pro Ser Ser val
225
230 235 240
Phe
lie Phe pro Pro Lys pro Lys Asp val Leu Thr lie Thr Leu Thr
245 250 255
Pro
Lys val Thr Cys Val val Val Asp lie Ser Lys Asp Asp pro Glu
260 265 270
val
Gln Phe 275 Pro Ser Trp Phe Val Asp 280 Phe ASp val Glu Val His 285 Phe Arg Thr Ala Gln
Thr
Gln Arg Glu Glu Gln Asn ser Thr Ser val Ser
290 295 300
Glu
Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
305
310 315 320
cys
Arg val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala pro lie Glu Lys Thr lie
325 330 335
ser
Lys Thr Lys 340 Glu Gly Arg pro Lys Ala 345 Asp Pro Gln Val Tyr Thr 350 Thr lie Pro
Pro
Pro
Lys 355 Asp Gln Met Ala Lys 360 ASp Lys val ser Leu 365 Glu Trp cys Met
lie
Thr Phe Phe Pro Glu lie Thr Val Gln Trp Asn
370 375 380
Gly
Gln pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp Thr
385
390 395 400
Asp
Gly Ser Tyr Phe 405 Asn lie Tyr Ser Lys Leu 410 ser Asn Val Gln Lys Ser 415 Gly Asn
Trp
Glu Ala Gly Thr phe Thr Cys val Leu His Glu Leu
420 425 His 430
HÍS
Asn His HÍS Thr Glu Lys Ser Leu ser Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<213> Mus musculus

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tcctgcaagg cttctggata tacattcact gactacaaca tgcactgggt gaagcagaac 120

caaggaaaga ccctagagtg gataggagaa attaatccta acagtggtgg tgctggctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagattgggc 300

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gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag 1140

tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca 1200

gatggctctt acttcatcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga 1260

aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc 1320

ctctcccact ctcctggtaa atga 1344
<210> 139 <211> 466 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 139
Met
Gly Trp Ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1
5 10 15
val
Leu ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys
20 25 30
Pro
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr phe
35 40 45
Thr
Asp 50 Trp Tyr Asn Met His Trp 55 Asn val Lys Gln Asn Gln 60 Gly Gly Lys Thr Leu
<31 u 65 Gln
lie Gly Glu lie 70 Lys pro Asn Ser Gly 75 val Ala Gly Tyr Asn 80 Thr
Lys
Phe Lys Gly 85 Glu Ala Thr Leu Thr 90 Thr Asp Lys ser ser 95 Ala
Thr
Ala Tyr Met Leu Arg Ser Leu Ser Glu Asp ser Val
100 105 110
Tyr
Tyr
cys 115 Val Ala Arg Leu Gly Tyr 120 Thr Asp Asp lie Tyr Asp 125 Ser Asp Trp
Tyr
Phe
Asp Trp Gly Ala Gly Thr val Thr Val Ser Ala Lys
130 135 140
Thr
Thr
Pro Pro ser val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly ser Ala Ala Gln
145
150 15 S 160
Thr
Asn Ser Met Val 165 val Thr Leu Gly Cys Leu 170 Gl y Val Lys Gly Tyr Phe 175 Gly Pro
Glu
Pro Val Thr 180 Pro Thr Trp Asn Ser 185 Ser Ser Leu Ser Ser 190 Leu val
His
Thr Phe Ala val Leu Gln Asp Leu Tyr Thr ser ser
195 200 205
ser
val Thr Val Pro Ser ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr cys
210 215 220
Asn
Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie Val
225
230 235 240
Pro
Arg Asp cys Gly 245 He Cys Lys Pro Cys lie 250 Pro Cys Thr val Pro Glu 255 Thr val
ser
ser
Val Phe 260 Pro Phe Pro Pro Lys 265 val Lys Asp Val Leu 270 Ser lie
Thr
Leu Thr Lys val Thr Cys val val Asp lie Lys ASp
275 280 285
Asp
Pro Glu val Gln Phe Ser Trp Phe val Asp Asp Val Glu Val HÍS
290
295 300
Thr 305
Ala Gln Thr Gln Pro 310 Arg Glu Glu Gln Phe 315 Asn Ser Thr Phe Arg 325
Ser
Val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gln ASp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu
Phe Lys Cys 340 Ser Arg val Asn Ser Ala 345 Arg Ala Phe Pro Ala Pro 350 Gln lie
Glu
Lys
Thr lie Lys Thr Lys Gly Pro Lys Ala Pro val Tyr
355 360 365
Thr
He pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys val ser Leu
370 375 380
Thr
cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr val Glu Trp
385
390 395 400
Gln
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro He
405 410 415
Met
Asp Thr ASp 420 Trp Gly Ser Tyr Phe lie 425 Thr Tyr Ser Lys Leu Asn 430 val val Gln
Lys
ser Asn Glu Ala Gly Asn Phe Thr Cys Ser Leu His
435 440 445
Glu
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu ser His ser Pro
450 455 460
Gly
Lys
465
<210> 140 <211> 1401 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
atgggatgga gctggacctt tctcttcctc gtccaactgc aacagtctgg acctgaacta tgcaaggctt ctggatatac attcactgac ggaaagaccc tagagtggat aggagaaatt cagaagttca agggcaaggc cacattgact gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gatgatatct acgacgactg gtacttcgat tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc actaactcca tggtgaccct gggatgcctg gtgacctgga actctggatc cctgtccagc tctgacctct acactctgag cagctcagtg accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac ggctcttact tcatctacag caagctcaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc tcccactctc ctggtaaatg a
<210> 141
<211> 214 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 atgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120 tacaacatgc actgggtgaa gcagaaccaa 180 aatcctaaca gtggtggtgc tggctacaac 240 gtagacaagt cctccaccac agcctacatg 300 gcagtctatt actgtgcaag attgggctac 360 gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa 480 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca 540 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 600 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag 660 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg 720 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc 780 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt 840 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat 900 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc 960 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc 1080 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat 1140 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg 1200 aagaacactc agcccatcat ggacacagat 1260 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat 1320 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc 1380
1401
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
10
<400> 141
ASp 1
lie Gln Met Thr 5 Gln ser
ASp
Arg Val Thr 20 Tyr lie Thr cys
Leu
Asn Trp 35 Thr Gln Gln Lys
Tyr
Tyr 50 Ser Arg Leu Leu 55
ser 65 Glu
Gly Ser Gly Thr Asp 70 Tyr phe
Asp
Phe Ala Thr 85 Tyr
Thr
Phe Gly Gly 100 Phe Gly Thr Lys
Pro
Ser Val 115 He Phe pro
Thr
Ala 130 Ser Val val cys Leu 135
Lys 145
val Gln Trp Lys val 150 Asp
Glu
Ser val Thr Glu 165 Leu Gln Asp
ser
Thr Leu Thr 180 Ser Lys
Ala
cys Glu 195 val Thr His Gln
Phe
Asn 210 Arg Gly Glu Cys
15 <210> 142
<211>642
Pro
Ser ser 10 Leu Ser Ala Ser val 15 Gly
Arg
Ala 25 ser Gln Asp He ser 30 Asn Tyr
Pro 40 Ser
Gly Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu Leu lie
Gly
val Pro Ser 60 ser Phe ser
Gly
Thr
Leu Thr lie 75 Ser Leu Gln Pro 80
Cys
Gln Gln 90 lie Gly Asp Thr Leu Pro 95 Ala Tyr
Val
Glu 105 Lys Arg Thr val 110 Ala
Pro 120
Ser ASp Glu Gln Leu 125 Lys Ser Gly
Leu
Asn Asn Phe Tyr 140 Ser Pro Arg Glu Ala
Asn
Ala Leu Gln 155 Gly Asn ser Gln 160
Ser
Lys Asp 170 Ser Thr Tyr Ser Leu 175
Ser
Ala
Asp 185 Leu Tyr Glu Lys His Lys 190 Thr Val Tyr
Gly 200
Ser ser Pro val 205 Lys Ser

<213> Secuencia artificial 5 <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 142
10

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctctccgcat ccgtaggcga ccgcgtaacc 60

ataacatgta gagcatctca agatatttcc aactatttga attggtacca acaaaaaccc 120

ggcaaagcac ctaaactcct catttactat acatcaagac tcctctccgg cgttccatca 180

cgattctcag gctccggctc cggcacagat ttcacactca ctatttcctc cctccaacca 240

gaagattttg caacctatta ctgtcaacaa ggcgatacac tcccatacac attcggcggc 300

ggcacaaaag ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 143 <211> 236 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
20
<400> 143
Met
Asp Met Arg val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1
5 10 15
Leu
Arg Gly Ala 20 Ser Arg cys ASp lie Gln 25 val Met Thr Gln ser Pro 30 Arg ser ser
Leu
ser Ala val Gly ASp Arg Thr He Thr Cys Ala ser
35 40 45
Gln
ASD 50 Pro lie Ser Asn Tyr Leu 55 Tyr Asn Trp Tyr Gln Gln 60 Leu Lys Pro Gly Lys
Ala
Lys Leu Leu lie Tyr Thr ser Arg Leu Ser Gly val
65
70 75 80
Pro
ser Arg Phe ser 85 Gln Gly Ser Gly Ser Gly 90 Ala Thr Asp Phe Thr Leu 95 Gln Thr
He
Ser Ser Leu pro Glu Asp Phe Thr Tyr Tyr cys Gln
100 105 110
Gly
Asp Thr 115 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe 120 ser Gly Gly Gly Thr Lys ■oe val Glu lie
Lys
Arg Val Ala Ala Pro Val Phe He Phe J Pro pro ser Asp
130
135 140
Glu
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val val Cys Leu Leu Asn Asn
145
150 155 160
Phe
Tyr Pro Arg Glu 165 Ser Ala Lys val Gln Trp 170 Thr Lys val Asp Asn Ala 175 Lys Leu
Gln
Ser Gly Asn 180 Ser Gln Glu Ser val 185 Leu GlU Gln Asp ser 190 Ala ASp
ser
Thr Tyr 195 HÍS Leu ser ser Thr 200 Cys Thr Leu ser Lys 205 Gln Asp Tyr
Glu
Lys Lys val Tyr Ala Glu Val Thr His Gly Leu Ser
210 215 220
Ser
Pro val Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225
230 235
25 <210> 144
<211> 708
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
5 <223> Secuencia de anticuerpo humanizado
<400> 144

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60

agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctct ccgcatccgt aggcgaccgc 120

gtaaccataa catgtagagc atctcaagat atttccaact atttgaattg gtaccaacaa 180

aaacccggca aagcacctaa actcctcatt tactatacat caagactcct ctccggcgtt 240

ccatcacgat tctcaggctc cggctccggc acagatttca cactcactat ttcctccctc 300

caaccagaag attttgcaac ctattactgt caacaaggcg atacactccc atacacattc 360

ggcggcggca caaaagttga aattaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660

cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 708
10
<210> 145 <211> 449 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 145
20
Glu 1
val Gln Leu val 5 Gln Ser
Ser
val Lys Val 20 Trp ser Cys Lys
Asn
Met HÍS 35 He Val Arg Gln
Gly
Glu 50 Asn Pro Asn ser 55
Lys 65 Met
Gly Arg Val Thr Met 70 Leu Thr
Glu
Leu Arg Ser 85 Tyr Arg
Ala
Arg Leu Gly 100 Gly ASp Asp
Trp
Gly Gln 115 val Thr Thr val
Pro
Ser 130 Phe Pro Leu Ala 135
Thr 145
Ala Ala Leu Gly cys ISO Leu
Thr
val ser Trp Asn 165 Gln Ser Gly
Pro
Ala val Leu 180 Ser Ser
Thr
val pro 195 Ser ser Asn Phe
Asp
His 210 Lys Pro Ser Asn Thr 215
íís
cys Val Glu Cys pro 230 Pro
Ser
val Phe Leu phe 245 Pro Pro
Arg
Thr Pro Glu 260 Gln val Thr Cys
Pro
Glu Val 275 phe Asn Trp
Ala
Lys 290 Thr Lys pro Arg Glu 295
val 305
Ser Val Leu Thr val 310 Val
Tyr
Lys Cys Lys val 325 Ser Asn
Thr
He ser Lys 340 Thr Lys Gly
Leu
Pro Pro 355 val Ser Arg Glu Glu
cys
Leu 370 Lys Gly Phe Tyr 375
ser 385
Asn Gly Gln Pro Glu 390 Asn
ASp
ser Asp Gly Ser 405 Gln Phe Phe
Ser
Arg Trp Gln 420 Asn Gly Asn
Ala Lys
Leu His 435 His Tyr Thr
<210> 146 <211> 1347 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
Gly
Ala Glu 10 Gly val Lys Lys Pro Gly 15 ASp Ala
Ala
ser 25 Pro Tyr Thr Phe Thr 30 Glu Tyr
Ala 40 Gly
Gly Gln Gly Leu 45 Asn Trp Met
Gly
Ala Gly Tyr 60 Thr Gln Lys Phe
Thr
Asp Thr ser 75 Thr ser Thr Ala Tyr 80 cys
Ser
Asp Asp 90 Asp Ala val Tyr IV
lie
Tyr 105 Asp Trp Tyr Phe 110 Asp Val
Thr 120
val Ser Ser Ala Ser 125 Thr Lys Gly
Pro
cys ser Arg Ser 140 Phe Thr ser GlU Ser
val
Lys Asp Tyr 155 Ser Pro Glu Pro Val 160 Phe
Ala
Leu Thr 170 Gly val His Thr 175
Gly
Leu 185 Tyr Ser Leu Ser Ser 190 val val
Gly 200
Thr Gln Thr Tyr Thr 205 cys Asn val
Lys
val Asp Lys Thr 220 Pro val Glu Arg
Lys
Cys
Pro Ala pro 235 val Ala Gly Pro 240
Lys
Pro Lys 250 Val Asp Thr Leu Met He 255 Glu Ser
Val
val 265 Asp val ser Hi s 270 Asp
Tyr 280
val Asp Gly Val Glu 285 Val His Asn
Glu
Gln Phe Asn Ser 300 Leu Thr Phe Arg val
His
Gln Asp Trp 315 Pro Asn Gly Lys Glu 320 Lys
Lys
Gly Leu 330 Ala Pro He Glu 335
Gln
pro 345 Thr Arg Glu Pro Gln Val 350 ser Tyr Thr
Met 360
Lys Asn Gln val 365 Leu Thr
pro
Ser Asp lie Ala 380 Val Glu Trp Glu
Asn
Tyr Lys Thr 395 Thr pro Pro Met Leu 400
Leu
Tyr ser 410 Lys Leu Thr val ASp 415 Lys
val
Phe 425 Ser cys Ser Val Met 430 His Glu
Gln 440
Lys Ser Leu ser Leu 445 Ser pro Gly
5
10
15
gaggtgcagc
tcttgtaaag
ccaggacaag
aatcaaaaat
atggaactgc
tatgatgata
gtctctagtg
acctccgaga
acggtgtcgt
cagtcctcag
acccagacct
gttgagcgca
tcagtcttcc
gtcacgtgcg
gtggacggcg
acgttccgtg
tacaagtgca
accaaagggc
accaagaacc
gtggagtggg
gactccgacg
caggggaacg
aagagcctct
tggtgcagag
caagcggata
gattggaatg
tcaaagggag
gatcacttag
tatatgatga
cctccaccaa
gcacagcggc
ggaactcagg
gactctactc
acacctgcaa
aatgttgtgt
tcttcccccc
tggtggtgga
tggaggtgca
tggtcagcgt
aggtctccaa
agccccgaga
aggtcagcct
agagcaatgg
gctccttctt
tcttctcatg
ccctgtctcc
cggcgccgag
tacatttaca
gatgggcgaa
agttacaatg
aagcgacgat
ctggtatttc
gggcccatcg
cctgggctgc
cgctctgacc
cctcagcagc
cgtagatcac
cgagtgccca
aaaacccaag
cgtgagccac
taatgccaag
cctcaccgtt
caaaggcctc
accacaggtg
gacctgcctg
gcagccggag
cctctacagc
ctccgtgatg
gggtaaa
gtaaaaaaac caggagcaag gattacaaca tgcattgggt attaacccta atagtggagg acaacagaca caagcacttc acagctgtat actattgcgc gatgtttggg gccagggaac gtcttccccc tggcgccctg ctggtcaagg actacttccc agcggcgtgc acaccttccc gtggtgaccg tgccctccag aagcccagca acaccaaggt ccgtgcccag caccacctgt gacaccctca tgatctcccg gaagaccccg aggtccagtt acaaagccac gggaggagca gtgcaccagg actggctgaa ccagccccca tcgagaaaac tacaccctgc ccccatcccg gtcaaaggct tctaccccag aacaactaca agaccacacc aagctcaccg tggacaagag catgaggctc tgcacaacca
cgttaaagtt 60 aagacaagcg 120 agcaggctac 180 aacagcatat 240 acgacttggg 300 aacagttacc 360 ctccaggagc 420 cgaaccggtg 480 agctgtccta 540 caacttcggc 600 ggacaagaca 660 ggcaggaccg 720 gacccctgag 780 caactggtac 840 gttcaacagc 900 cggcaaggag 960 catctccaaa 1020 ggaggagatg 1080 cgacatcgcc 1140 tcccatgctg 1200 caggtggcag 1260 ctacacgcag 1320 1347
<210> 147 <211> 468 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
<400> 147

Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Val Ala 15 10

Ala His ser Glu val Gln Leu val Gln ser Gly Ala 20 25

Pro Gly Ala Ser val Lys val Ser cys Lys Ala Ser 35 40

Thr Asp Tyr Asn Met His Trp val Arg Gln Ala Pro 50 55 60
Ala
Ala
Thr Gly
15 1
Glu
val Lys Lys
Gly
Tyr Thr Phe
45
Gly
Gln Gly Leu
Glu 65
Trp Met Gly GlU lie 70 Asn pro Asn Ser Gly 75 Gly Ala Gly Tyr Asn 80
Gln
Lys Phe Lys Gly 85 GlU Arg val Thr Met Thr 90 Arg Thr ASp Thr Ser Thr 95 Ala Ser
Thr
Ala Tyr Met 100 Ala Leu Arg ser Leu 105 Asp Ser Asp Asp Thr 110 Asp Val
Tyr
Tyr
cys 115 val Arg Leu Gly Tyr 120 Thr Asp lie Tyr Asp 125 Ser Trp
Tyr
Phe
Asp 130 Trp Gly Gln Gly 135 Thr Val Thr Val 140 ser Ala Ser
Thr 145
Lys Gly Pro Ser val 150 phe Pro Leu Ala Pro 155 cys Ser Arg ser Thr 160
Ser
Glu Ser Thr Ala 165 val Ala Leu Gly cys Leu 170 Gly Val Lys Asp Tyr phe 175 Gly Pro
Glu
pro Val Thr 180 ser Trp Asn Ser 185 Ala Leu Thr ser 190 val
His
Thr Phe 195 Pro Ala val Leu Gln 200 Ser Ser Gly Leu Tyr 205 ser Leu Ser
Ser
val 210 val Thr val Pro ser 215 Ser Asn Phe Gly Thr 220 Gln Thr Tyr Thr
CVS 225
Asn Val Asp His 230 Pro Ser Asn Thr Lys 235 val Asp Lys Thr val 240
Glu
Arg Lys Cys cys 245 Val val Glu cys Pro Pro 250 pro cys Pro Ala Pro pro 255 Thr Val
Ala
Gly Pro Ser 260 Arg Phe Leu Phe Pro 265 Thr Lys Pro Lys Asp 270 ASp Leu
Met
lie Ser 275 Thr Pro Glu val 280 Cys val Val val 285 val Ser
His
Glu 290 Asp Pro Glu val Gln 295 Phe Asn Trp Tyr val 300 Asp Gly val Glu
val 305
His Asn Ala Lys Thr 310 Lys Pro Arg Glu Glu 315 Gln Phe Asn ser Thr 320
Phe
Arg val val Ser 325 Val Leu Thr val Val 330 His Gln Asp Trp Leu 335 Asn
Gly
Lys Glu Tyr 340 Thr Lys cys Lys val Ser 345 Lys Asn Lys Gly Leu Pro 350 Glu Ala Pro
He
Glu Lys 355 Thr lie ser Lys Thr 360 Arg Gly Gln Pro Arg 365 Lys pro Gln
val
Tyr 370 Leu Pro Pro ser 375 Glu Glu Met Thr 380 Asn Gln
val
Ser 385 Glu
Leu Thr cys Leu val 390 Gly Lys Gly Phe Tyr Pro 395 Asn Ser Asp lie Ala val 400 Pro
Trp
Glu ser Asn 405 Gln Pro Glu Asn 410 Tyr Lys Thr Thr 415
Pro
Met Leu Asp 420 ser Asp Gly Ser Phe 425 Phe Leu Tyr ser Lys 430 Leu Thr
Val
Asp Lys 435 Glu Gly Ser Arg Trp Gln Gln 440 His Gly Asn val Phe ser 445 Ser Cys Ser val
Met Ser 465
His 450 Pro Ala Lys Leu His Asn 455 Tyr Thr Gln Lys 460 Leu Ser Leu
<210> 148 <211> 1404 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 148

atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactccgag 60

gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggta aaaaaaccag gagcaagcgt taaagtttct 120

tgtaaagcaa gcggatatac atttacagat tacaacatgc attgggtaag acaagcgcca 180

ggacaaggat tggaatggat gggcgaaatt aaccctaata gtggaggagc aggctacaat 240

caaaaattca aagggagagt tacaatgaca acagacacaa gcacttcaac agcatatatg 300

gaactgcgat cacttagaag cgacgataca gctgtatact attgcgcacg acttgggtat 360

gatgatatat atgatgactg gtatttcgat gtttggggcc agggaacaac agttaccgtc 420

tctagtgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480

tccgagagca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540

gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtcctacag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcaa cttcggcacc 660

cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagacagtt 720

gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg 960

ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgttgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaa 1404
5
<210> 149 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 149
ASD
He Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1
5 10 15
ASp
Arg val Thr 20 Phe He Ser Cys Arg Ala 25 Asp ser Gln ASp He Ser 30 Leu Asn Tyr
Leu
Asn Trp 35 Thr Gln Gln Lys pro 40 ser Gly Thr Leu Lys 45 Arg Leu He
Phe
Tyr 50 Gly Ser Arg Leu His 55 Tyr Gly Val Pro Ser 60 Ser Phe Ser Gly
Ser 65 Glu
Ser Gly Thr Asp 70 Tyr ser Leu Thr lie 75 Gly Asn Leu Glu Gln 80 Tyr
Asp
lie Ala Thr Phe cys Gln Gln Asp Thr Leu Pro
85 90 95
Thr
Phe Gly Gly 100 ser Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ser lie Arg Arg Ala Asp 110 Thr Ala Ala
Pro
Thr val lie Phe Pro pro Ser Glu Gln Leu Ser Gly
115 120 125
Gly
Ala 130 val ser val Val Cys Phe 135 ASp Leu Asn Asn Phe Tyr 140 Gln Pro Lys Asp lie
Asn
Lys Trp Lys lie Gly ser Glu Arg Asn Gly Val Leu
145
150 155 160
Asn
Ser Trp Thr ASp Gln ASp ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
ser
Thr Leu Thr 180 Ala Leu Thr Lys ASp Glu 185 Ser Tyr Glu Arg His Asn 190 val Ser Tyr
Thr
Cys Glu Thr His Lys Thr Thr Ser Pro lie Lys ser
195 200 205
Phe
Asn Arg Asn Glu cys
210
<210> 150 <211>645 <212> ADN
10
15
<400> 150
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc gatggaactc ttaaactcct gatcttctac aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat gaagatattg ccacttactt ttgccaacag gggaccaagc tggaaataag acgggctgat tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac
<210> 151 <211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus
ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 aattatttaa actggtttca gcagaaacca 120 acatcaagat tacactcagg agttccatca 180 tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 ggtgatacgc ttccgtacac gttcgggggg 300 gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360 tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420 gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480 agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540
agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600 aggaatgagt gttag 645
<400> 151
Met
Met
ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu cys phe Gln
1
5 10 15
Gly
Thr Arg Cys 20 Gly ASp lie Gln Met Thr 25 lie Gln Thr Thr Ser ser 30 ser Leu ser
Ala
Ser Leu 35 Asn Asp Arg Val Thr 40 phe Ser Cys Arg Ala 45 Asp Gln Asp
He
ser 50 Leu Tyr Leu Asn Trp 55 Thr Gln Gln Lys Pro 60 ser Gly Thr Leu
Lys 65 Arg
Leu lie Phe Tyr 70 Gly ser Arg Leu His 75 Tyr Gly val pro Ser 80 Ser
Phe
Ser Gly ser 85 Glu Ser Gly Thr Asp 90 Tyr ser Leu Thr ile 95 Gly
Asn
Leu Glu Gln 100 Tyr Asp lie Ala Thr 105 Gly Phe Cys Gln Gln 110 lie Asp
Thr
Leu Pro 115 Ala Thr Phe Gly Gly 120 Ser Thr Lys Leu Glu 125 Ser Arg Arg
Ala
Asp Ala Pro Thr val lie Phe pro Pro ser Glu Gln
130 135 140
Leu
Thr Ser Gly Gly Ala ser Val val cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145
150 155 160
Pro
Lys Asp lie Asn val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn
Gly Val Leu 180 Ser Asn ser Trp Thr ASP 185 Leu Gln Asp Ser Lys ASp 190 Tyr ser Thr
Tyr
Ser Met Ser Thr Leu Thr Thr Lys Asp Glu Glu Arg
195 200 205
His
Asn 210 val Ser Tyr Thr cys Glu 215 Arg Ala Thr His Lys Thr 220 ser Thr Ser Pro
He
Lys ser Phe Asn Asn Glu Cys
225
230
<210> 152 <211>705 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 152

atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtttca gcagaaacca 180

gatggaactc ttaaactcct gatcttctac acatcaagat tacactcagg agttccatca 240

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtgatacgc ttccgtacac gttcgggggg 360

gggaccaagc tggaaataag acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480

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ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 153 <211> 447 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 153
Glu val Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Glu Leu Met Lys pro Gly Ala 15 10 15
10
Ser
Val Lys Met 20 Trp ser Cys Lys Ala ser 25 Gln Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Glu Asp Tyr
Asn
Met His 35 lie Val Lys Gln Asn 40 Gly Gly Lys Ser Leu 45 Asn Trp lie
Gly
Glu 50 Gly Asn Pro Asn Ser 55 Thr Gly Ser Gly Tyr 60 Ser Gln Lys Phe
Lys
Lys
Ala Thr Leu Val Asp Lys ser Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Arg Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Glu ser Ala val Tyr W Asp cys
Ala
Arg Leu val Tyr Asp Gly Ser Tyr Asp Trp Tyr Phe val
100 105 110
Trp
Gly Ala 115 Val Gly Thr Thr val Thr 120 Pro Val Ser ser Ala Lys 125 Gln Thr Thr Pro
Pro
ser Tyr Pro Leu Ala Gly Ser Ala Ala Thr Asn Ser
130 135 140
Met
val Thr Leu Gly cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu pro val
145
150 155 160
Thr
Val Thr Trp Asn ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser val Thr
180 185 190
val
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr Cys Asn Val Ala
195 200 205
His
Pro Ala Ser ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg ASp
210 215 220
cys
Gly cys Lys Pro cys 230 lie cys Thr val pro Glu val Ser ser Val
225
235 240
Phe
lie Phe Pro Pro Lys pro Lys Asp val Leu Thr lie Thr Leu Thr
245 250 255
Pro
Lys Val Thr 260 Ser Cys val val val Asp 265 Asp lie ser Lys ASp Asp 270 Thr Pro Glu
val
Gln Phe Trp Phe val Asp val Glu val HÍS Ala Gln
275 280 285
Thr
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
290 295 300
Glu
Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
305
310 315 320
cys
Arg val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala pro lie Glu Lys Thr lie
325 330 335
Ser
Lys Thr Lys 340 Glu Gly Arg Pro Lys Ala 345 Asp Pro Gln Val Tyr Thr 350 Thr He Pro
Pro
Pro
Lys 355 ASp Gln Met Ala Lys 360 Asp Lys val Ser Leu 365 Trp cys Met
He
Thr Phe Phe Pro Glu He Thr val Glu Gln Trp Asn
370 375 380
Gly
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met ASp Thr
385
390 395 400
Asp
Gly Ser Tyr Phe lie Tyr ser Lys Leu Asn val Gln Lys Ser Asn
405 410 415
Trp
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr cys ser val Leu His Glu Gly Leu
420 425 430
His
Asn HÍS His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<213> Mus musculus
<400> 154
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caaactaact ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg 480

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<213> Mus musculus
<400> 155
Met
Gly Trp ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1
5 10 15
val
Leu ser Glu 20 Ser Val Gln Leu Gln Gln 25 Ser cys 40 val Lys ser Gly Pro Glu Leu 30 Tyr Met Lys
pro
Gly Ala 35 Tyr Val Lys Met Lys Ala ser Gly 45 Gly Thr Phe
Thr
ASp Asn Met His Trp Gln Asn Gln Lys Ser Leu
50 55 60
Glu
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65
70 75 80
Gln
Lys Phe Lys Gly Lys 85 Glu Leu Ala Thr Leu rhr 90 Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 95 Ala val
Thr
Ala Tyr Met 100 Ala Arg Ser Leu 105 Tyr Asp 120 Thr Thr Ser Glu ASp Ser 110 ASp
Tyr
Tyr
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Phe
Asp 130 Thr Trp Gly Ala Gly 135 Tyr val Thr val 140 Gly Ser Ala Lys
Thr
Pro pro ser val Pro Leu Ala Pro Ser Ala Ala Gln
145
150 155 160
Thr
Asn Ser Met val Thr 165 Val Thr Leu Gly Cys Leu 170 Gly Val Lys Gly Tyr phe Pro 175 Gly Val
Glu
Pro val Thr Trp Asn ser ser Leu Ser Ser
180 185 190
HlS
Thr Phe Pro Ala val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser ser
Val 195 200 205
Ser
Thr val Pro ser ser Thr Trp pro Ser Glu Thr val Thr Cys
210 215 220
Asn
Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie val
225
230 235 240
Pro
Arg Asp cys Gly cys 245 lie Phe Lys pro Cys lie 250 Pro Cys Thr val Pro Glu val 255 Thr He
Ser
ser Val Phe pro Pro Lys Lys ASp val Leu
Thr
260 265 270
Leu
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275 280 285
Asp
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Thr
290 295 300
Ala
Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
305
val 310 315 320
Ser
Ser
Glu Leu Pro 325 Arg val lie Met His Gln 330 Ala Asp Trp Leu Asn Gly Lys 335 lie Glu
Glu
Phe Lys cys Asn Ser Ala Phe Pro Ala pro
340 345 350
Lys
Thr He 355 pro Ser Lys Thr Lys Gly Arg 360 Gln Met Pro Lys Ala Pro 365 Lys Gln val Tyr
Thr
lie 370 Cys pro Pro Lys Glu 375 Phe Ala Lys Asp 380 lie Val Ser Leu
Thr
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385
390 395 400
Gln
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln pro lie
Thr 405 410 415
Met
Asp Asp 420 Trp Gly Ser Tyr Phe lie 425 Asn Thr Tyr Ser Lys Leu Asn 430 val val Gln
Lys
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435 440 445
Glu
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys ser Leu ser His ser pro
450 455 460
<31 y Lys 465
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<213> Mus musculus
<400> 156
5
10
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ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 atgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120 tacaacatgc actgggtgaa acagaaccaa 180 aatcctaaca gtggtggtag tggctacaac 240 gtagacaagt cttccagcac agcctacatg 300 gcagtctatt actgtgcaag attggtctac 360 gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa 480 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca 540 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 600 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag 660 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg 720 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc 780 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt 840 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat 900 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc 960 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc 1080 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat 1140 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg 1200 aagaacactc agcccatcat ggacacagat 1260 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat 1320 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc 1380
1401
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lie Gln Met
1
Asp
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20
Leu
Tyr Trp 35 Thr Tyr
Tyr
Tyr
ser
50
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100
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Gly
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145
Asn
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ser
Thr Leu Thr
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Thr
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195
Phe
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210
<210> 158
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Gln Thr Thr Ser Ser 10
lie
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Gln
Gln
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Arg
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Thr
Thr 85
Phe Cys Gln Gln 90
Gly
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He
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He 150 Gly Ser Glu
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Gln ASp ser Lys Asp 170
Leu
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Leu
Ser Ala ser Leu Gly
15
Gln
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Gly
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Glu
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Phe
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Arg
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155
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Ser
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205
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5 <400> 158
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Met 1
Met ser Ser Ala 5 Gln Phe Leu Gly Leu 10 Leu Leu Leu cys phe 15 Gln
Gly
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<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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Glu
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1
5 10 15
Ser
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Gly
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Lys 65 Met
Gly Lys Ala Thr Leu 70 Leu Thr val Asp Lys ser 75 Ser Ser Arg Thr Ala Tyr 80 cys
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Leu Arg ser 85 Tyr Thr Ser Glu ASp 90 Glu Ala Val Tyr w
Ala
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Trp
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pro
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165 170 175
Pro
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Pro
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195 200 205
His
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cys
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230 235 240
Phe
lie Phe Pro pro Lys pro Lys Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr
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pro
Lys Val Thr 260 Ser Cys val val Val Asp 265 ASp lie Ser Lys Asp Asp 270 Thr Pro Glu
val
Gln Phe Trp Phe val Asp val Glu Val His Ala Gln
275 280 285
Thr
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser val Ser
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10
15
Glu
Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu phe Lys
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310 315 320
Cys
Arg val Asn Ser Ala Ala Phe pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie
Thr
325 330 335
Ser
Lys Lys Gly Arg pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr He Pro
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Pro
Pro
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He
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ilí
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His
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<400> 162

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ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg 780

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gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc 900

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ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag 1080

gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag 1140

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aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc 1320

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Met
Gly Trp ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1
5 10 15
val
Leu Ser Glu val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys
Gly 20 25 30
Pro
Ala 35 Tyr ser val i-ys Met ser 40 Met cys Lys Ala Ser Gly 45 Gly Tyr Thr Phe
Thr
ASp 50 Trp Asn Met His Trp 55 Asn Lys Gln Asn Gln 60 Gly Lys ser Leu
Glu 65 Gln
lie Gly Glu lie 70 Lys Pro Asn Ser Gly 75 val Ala Gly Tyr Asn 80 Arg
Gln
Phe Lys Gly Ala Thr Leu Thr ASp Lys ser Ser
85 90 95
Thr
Ala Tyr Met Glu Leu Arg ser Leu Thr ser Glu Asp ser Ala val
100 105 110
Tyr
Tyr
cys 115 val Ala Arg Leu Gly Tyr 120 Thr val Gly Asn Tyr Glu 125 Ser Asp Trp
Tyr
Phe
ASp Trp Gly Ala Gly Thr val Thr val ser Ala Lys
130 135 140
Thr
Thr
pro Pro Ser val Tyr pro Leu Ala pro Gly Ser Ala Ala Gln
145
150 155 160
Thr
Asn ser Met val 165 Val Thr Leu Gly Cys Leu 170 Gly val Lys Gly Tyr Phe 175 Gly Pro
Glu
Pro val Thr Thr Trp Asn Ser ser Leu Ser ser val
180 185 190
His
Thr phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser ser
195 200 205
Ser
Val Thr Val Pro Ser ser Thr Trp pro Ser Glu Thr val Thr cys
210 Ala 215 220
Asn
val His Pro Ala Ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie Val
225
230 235 240
Pro
Arg Asp Cys Gly cys Lys Pro Cys He cys Thr Val pro Glu val
245 250 255
ser
ser
val Phe He Phe Pro Pro Lys pro Lys Asp Val Leu Thr Xle
260 265 270
Thr
Leu Thr Pro Lys val Thr cys val Val val ASp He Ser Lys Asp
275 280 285
ASp
Pro 290 Ala Glu val Gln Phe Ser 295 Arg Trp Phe val Asp Asp 300 Asn val Glu Val HÍS
Thr
Gln Thr Gln pro Glu Glu Gln Phe Ser Thr Phe Arg
305
310 315 320
Ser
val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu
Phe Lys Cys Arg val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala pro lie GlU
340 345 350
Lys
Thr xle ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln val Tyr
355 360 365
Thr
lie pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys val ser Leu
370 375 380
Thr
cys Met He Thr ASp Phe Phe Pro Glu ASp He Thr val Glu Trp
385
390 395 400
Gln
Trp Asn Gly Gln 405 Gly pro Ala Glu Asn Tyr 410 Tyr Lys Asn Thr Gln pro 415 Val lie
Met
Asp Thr Asp 420 Trp ser Tyr Phe lie 425 Thr Ser Lys Leu Asn 430 Val Gln
Lys
Ser Asn 435 Leu Glu Ala Gly Asn 440 Thr Phe Thr Cys ser 445 Ser Leu His
Glu
Gly His Asn His His Glu Lys Ser Leu His Ser Pro
450 455 460
Gly
i-ys
465
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5
10
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cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac ggctcttact tcatctacag caagctcaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc tcccactctc ctggtaaa
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1398
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Asp
lie Gln Met Thr Gln Thr Thr
1
5
ASp
Arg val ser 20 Tyr lie Ser cys Arg
Leu
Asn Trp 35 Thr Gln Gln Lys pro 40 Ser
Phe
Tyr Ser Arg Leu Leu
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Ser
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
Ser
65
70
Glu
Asp Phe Ala Thr 85 Gly Tyr Phe cys
Thr
Phe Gly Gly 100 Ser Thr Lys Leu
pro
Thr val lie Phe
pro
pro
115 120
Gly
Ala Ser Val val Cys Phe Leu
130
135
Asn 14^
val Lys Trp Lys lie 150 Gln ASp Gly
X*r J Asn
Ser Trp Thr Asp 165 Leu ASp ser
Ser
Thr Leu Thr Thr Lys Asp
180
Thr
cys Glu Ala Thr His Lys
Thr
Phe
195 200
Asn
Arg Asn Glu Cys
210
ser
ser 10 Leu Ser Ala Ser Leu 15 Gly
Ala 25
Ser Gln ASp ríe ser 30 Asn Tyr
Asp
Gly Thr Phe 4ÍS Leu Leu He
Gly
val Pro ser 60 Tyr Arg Phe ser
Gly
Leu
Thr lie 75 Asn Leu Glu Gln 80
Gln
Gln 90 Gly Asp Thr Leu pro 95 Tyr
Glu 105
He Lys Arg Ala ASp 110 Ala Ala
Ser
Ser
Glu Gln Leu 125 Pro Thr Ser Gly
Asn
Asn
Phe Tyr 140 Gln Lys Asp lie
Ser
Glu Arg 155 Asn Gly val Leu 160
Lys
Asp 170 Tyr ser Thr Tyr Ser Met 175 ser Ser
Glu 185
Glu Arg His Asn 190 Tyr
Ser
Thr Ser Pro He 205 Val Lys
Ser
5
10
15
20
25
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Met
Met
Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
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5 10 15
Gly
Thr Arg Cys 20 Gly Asp lie Gln Met Thr 25 lie Gln Thr Thr Ser ser 30 Ser Leu Ser
Ala
ser Leu 35 Asn Asp Arg Val Ser 40 Tyr Ser Cys Arg Ala 45 Asp Gln ASp
He
ser 50 Leu Tyr Leu Asn Trp 55 Thr Gln Gln Lys Pro 60 Ser Gly Thr Phe
Lys 65 Arg
Leu He Phe Tyr 70 Gly ser Arg Leu Leu 75 Tyr Gly val Pro ser 80 Tyr
Phe
ser Gly ser 85 Glu Ser Gly Thr Asp 90 Tyr Ser Leu Thr He 95 Gly
Asn
Leu Glu Gln 100 Tyr Asp Phe Ala Thr 105 Gly Phe cys Gln Gln 110 He Asp
Thr
Leu pro 115 Ala Thr Phe Gly Gly 120 ser Thr Lys Leu Glu 125 Ser Lys Arg
Ala
Asp Ala Pro Thr val He Phe pro Pro ser GlU Gln
130 135 140
Leu
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val val cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145
150 155 160
Pro
Lys ASp He Asn val Lys Trp Lys lie ASp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn
Gly val Leu 180 Ser Asn ser Trp Thr ASp 185 Leu Gln ASp ser Lys Asp 190 Tyr Ser Thr
Tyr
ser Met 195 ser Ser Thr Leu Thr 200 Ala Thr Lys Asp Glu 205 Ser Glu Arg
His
Asn 210 val Tyr Thr Cys Glu 215 Arg Thr His Lys Thr 220 Thr ser Pro
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Lys Ser Phe Asn Asn Glu Cys
225
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10
Gly
Glu 50 Gly He Asn Pro Asn ser 55 Thr Gly Gly Ala Gly Tyr 60 ser Asn Gln Lys Phe
Lys Ala Thr Leu 70 Leu Val Asp Lys ser 75 ser Thr Thr Ala Tyr 80 Cys
Met
Glu Leu Arg Ser 85 Tyr Thr Ser Glu Asp 90 Asp Ala val Tyr Tyr 95 Asp
Ala
Arg Leu Gly 100 Gly Asp Asp lie Tyr 105 val Asp Trp Tyr Phe 110 Thr Val
Trp
Gly Ala 115 val Thr Thr val Thr 120 Pro Ser Ser Ala Lys 125 Gln Thr Pro
Pro
Ser Tyr Pro Leu Ala Gly Ser Ala Ala Thr Asn Ser
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Met
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145
150 155 160
Thr
val Thr Trp Asn ser Gly ser Leu Ser Ser Gly val His Thr Phe
165 170 175
Pro
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser val Thr
180 185 190
val
Pro ser ser Thr Trp Pro ser Glu Thr Val Thr cys Asn Val Ala
195 200 205
His
pro 210 Gly Ala ser Ser Thr Lys 215 lie Val ASp Lys Lys lie 220 Glu Val Pro Arg ASp
cys
Cys Lys Pro cys cys Thr val Pro val ser Ser val
225
230 235 240
Phe
He Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp val Leu Thr lie Thr Leu Thr
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Pro
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val
Gln Phe 275 pro Trp Phe val Asp 280 Phe val Glu Val His 285 Arg Ala Gln
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Gln Arg Glu Glu Gln Asn Ser Thr Phe Ser val ser
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Glu 305
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cys
Arg val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie
325 330 335
Ser
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln val Tyr Thr He Pro
340 345 350
Pro
Pro
Lys 355 ASp Glu Gln Met Ala Lys 360 Asp ASp Lys val ser Leu 365 Trp Thr cys Met
He
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Gly
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp Thr
385
390 395 400
Asp
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Trp
Glu Ala Gly Thr Phe Thr 42Ü val Leu His Glu Leu
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His
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Gly Trp ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu ser Gly Thr Ala Gly
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val
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Pro
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Tyr
Tyr
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Tyr
Phe
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Pro Pro Ser val Pro Leu Ala Pro ser Ala Ala Gln
145
150 155 160
Thr
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165 170 175
Glu
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180 185 190
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Ser
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Asn
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230 235 240
Pro
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ser
ser
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Asp
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Ser
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Glu
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ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 atgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120 tacaacatgc actgggtgaa gcagaaccaa 180 aatcctaaca gtggtggtgc tggctacaac 240 gtagacaagt cctccaccac agcctacatg 300 gcagtctatt actgtgcaag attgggctac 360 gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa 480 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca 540 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 600 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag 660 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg 720 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc 780 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt 840 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat 900 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc 960 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc 1080 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat 1140 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg 1200 aagaacactc agcccatcat ggacacagat 1260 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat 1320 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc 1380
1401
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ASp
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Asn Trp 35 Gln Gln
Phe
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Ser 65 Glu
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ASp
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Thr
phe Gly Gly 100
Thr
Pro
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Gly
Ala 130 Ser val val Cys
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val Lys Trp Lys lie 150
Asn
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ser
Thr Leu Thr 180 Thr
Thr
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Phe
Asn 210 Arg Asn Glu Cys
lie
Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
10 15
cys
Arg Ala 25 Asp Ser Gln Asp lie Ser 30 Leu Asn Tyr
Lys
Pro Gly Thr Phe Lys Leu lie
40 45
Phe 55 Tyr
Ser Gly Val Pro Ser 60 Tyr Arg Phe Ser Gly
Ser
Leu Thr lie Asn Leu Glu Gln
75 80
Phe
Cys Gln Gln 90 lie Gly Asp Thr Leu Pro 95 Ala Tyr
Lys
Val Glu Lys Arg Ala Asp Ala
105 110
Pro
Pro
Ser Ser Glu Gln Leu Thr ser Gly
120 125
Phe
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys ASp He
135
140
Asp
Gly Ser Glu Arg 155 Ser Gln Asn Gly Val Leu 160 Ser
Asp
ser Lys Asp Thr Tyr Ser Met
170 Glu 175
Lys
Asp Glu Tyr Arg His Asn Ser Tyr
185 190
Lys
Thr Ser Thr Ser Pro lie Val Lys Ser
200
205
<210> 174 <211> 642 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 174

gatatccaga tgacacagat tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagggtctcc 60

atcagttgca gggcaagtca agacattagc aattatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactt ttaaactcct tatcttctac acatcaagat tattttcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccatttacaa cctggagcaa 240

gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggagatacgc ttccgtacac tttcggaggg 300

gggaccaagg tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540

ttgaccaagg acgaatatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642
10 <210> 175
<211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus
15 <400> 175
Met
Met
Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu cys Phe Gln
1
5 10 15
6ly
Thr Arg Cys 20 Gly Asp lie Gln Met Thr 25 lie Gln lie Thr Ser ser 30 Ser Leu ser
Ala
Ser Leu 3S Asn ASp Arg val Ser 40 Tyr Ser Cys Arg Ala 45 Asp Gln Asp
He
ser 50 Leu Tyr Leu Asn Trp 55 Thr Gln Gln Lys Pro 60 Ser Gly Thr Phe
Lys 65 Arg
Leu He Phe Tyr 70 Gly ser Arg Leu Phe 75 Tyr Gly val Pro Ser 80 Tyr
Phe
ser Gly ser 85 Glu Ser Gly Thr Asp 90 Tyr Ser Leu Thr lie 95 Gly
Asn
Leu Glu Gln 100 Tyr Asp Phe Ala Thr 105 Gly Phe Cys Gln Gln 110 lie Asp
Thr
Leu pro Thr Phe Gly Gly Thr Lys val Glu Lys Arg
115 120 125
Ala
Asp Ala Ala Pro Thr val ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu 145 Pro
Thr ser Gly Gly Ala 150 val Ser val Val Cys Phe 155 ASp Leu Asn Asn Phe Tyr 160 Gln
Lys
Asp He Asn 165 Asn Lys Trp Lys He 170 Gln Gly Ser Glu Arg 175 Ser
Asn
Gly val Leu 180 ser ser Trp Thr Asp 185 Leu ASp Ser Lys Asp 190 Tyr Thr
Tyr
Ser Met ser Thr Leu Thr Thr Lys Asp Glu Glu Arg
195 200 205 Thr
His
Asn Ser Tyr Thr cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Ser Pro
210 215 220
lie
val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu cys
225
230
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<212>ADN <213> Mus musculus
<400> 176 25
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc gatatccaga tgacacagat tacatcctcc atcagttgca gggcaagtca agacattagc gatggaactt ttaaactcct tatcttctac aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat gaagattttg ccacttactt ttgccaacag gggaccaagg tggaaataaa acgggctgat tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac ttgaccaagg acgagtatga acgacataac tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac
<210> 177 <211> 450 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 177
ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 ctgtctgcct ctctgggaga cagggtctcc 120 aattatttaa attggtatca gcagaaacca 180 acatcaagat tattttcagg agtcccatca 240 tattctctca ccatttacaa cctggagcaa 300 ggagatacgc ttccgtacac tttcggaggg 360 gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 aggaatgagt gt 702
Glu
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Thr
1
5 10 15
Ser
val Lys Met 20 Trp Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gln Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Glu ASp Tyr
Asn
Met His val Lys Gln Thr Gly Lys Thr Leu Trp lie
35 40 45
Gly
Glu 50 Gly He Asn Pro Asn Ser 55 Thr Gly Gly Ala Gly Tyr 60 Ser Asn Gln Lys Phe
Lys 65 Met
Lys Ala Thr Leu 70 Leu val Asp Lys ser 75 Ser Thr Thr Ala Tyr 80 Cys
Glu
Leu Arg ser 85 Tyr Thr Ser Glu Asp 90 ASp Ala Val Tyr Tyr 95 ASp
Ala
Lys Leu Gly 100 Gly ASp Asp lie Tyr 105 val Asp Trp Tyr Phe 110 Thr val
Trp
Gly Ala Thr Thr val Thr ser ser Ala 3! Thr Ala
115
120
Pro
ser val Tyr Pro Leu Ala Pro val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
130 135 140
Ser
val Thr Leu Gly Cys Leu val Lys Gly Phe pro Glu Pro val
145
150 160
Thr
Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu ser ser Asp val HÍS Thr Phe
165 170 175
Pro
Ala Leu Leu Gln ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser val Thr
180 185 190
val
Thr Thr Trp Pro ser Gln Thr lie Thr cys Asn val Ala HÍS Pro
195 200 205
Ala
ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie Glu Pro Arg Gly Ser Pro
210 215 220
Thr
HÍS Lys Pro Cys Pro Pro cys Pro Ala pro Asn Leu Leu Gly Gly
225
230 235 240
Pro
Ser val Phe lie Phe Pro Pro Lys lie Lys Asp val Leu Met He
245 250 255
Ser
Leu Ser pro Met val Thr Cys val val Val Asp val Ser Glu Asp
260 265 270
Asp
pro Asp val His val Ser Trp phe val Asn Asn val Glu Val HÍS
275 Gln 280 285
Thr
Ala Gln Thr Thr His Arg Glu ASp Tyr Asn Ser Thr He Arg
290 295 300
Val
val Ser Ala Leu Pro He Gln His Gln ASp Trp Met ser Gly Lys
305
310 315 320
Glu
phe Lys Cys Lys val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala pro lie
Glu
325 330 335
5
10
15
Arg
Thr
val
Leu
Thr
cys
370
Thr
Asn
385
Leu
Asp
Lys
Lys
Glu
Gly
Gly
Lys
450
lie
Ser 340 Pro Lys Pro Lys Gly Pro 345 Met Val Arg Ala Pro Gln 350 val val Tyr
Pro 355
Pro Glu Glu Glu 360 Thr Lys Lys Gln 365 Thr Leu
Met
lie Thr ASp Phe 375 Glu Met Pro Glu Asp lie 380 Asn Tyr Val Glu Trp
Asn
Gly Gln Thr 390 Leu Asn Tyr Lys 395 Thr Glu Pro val 400
Ser
Asp Gly 405 Ser Tyr Phe Met Tyr 410 ser Lys Leu Arg val 415 Glu
Asn
Trp 420 Val Glu Arg Asn Ser 425 Tyr Ser cys Ser Val 430 val His
Leu 435
His Asn His His Thr 440 Thr Lys Ser Phe ser 445 Arg Thr Pro
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tggacctgaa ctaatgaagc tacattcact gactacaaca gataggagaa attaatccta ggccacattg actgtagaca atctgaggac tctgcagtct ctggtatttc gatgtctggg agccccatcg gtctatccac tctaggatgc ctggtcaagg atccctgtcc agtgatgtgc cagcagctca gtgactgtaa cccggcaagc agcaccaaag accctgtcct ccatgcccag tccaaagatc aaggatgtac ggatgtgagc gaggatgacc acacacagct cagacacaaa tgccctcccc.atccagcacc caacaaagcc ctcccagcgc agctccacag gtatatgtct tctgacctgc atgatcacag cgggcaaaca gagctaaact cttcatgtac agcaagctga ctgttcagtg gtccacgagg tccgggtaaa
ctgggacttc
tgcactgggt
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gttatttccc
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ccacctggcc
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ctcctaacct
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cagatgtcca
cccatagaga
aggactggat
ccatcgagag
tgcctccacc
acttcatgcc
acaagaacac
gagtggaaaa
gtctgcacaa
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<400> 179
Met
Gly Trp Ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu 10 Ser Leu Ser Gly Thr Ala 15 Met Gly
val
Leu Ser Glu 20 Ser val Gln Leu Gln Gln 25 cys Gly Pro Glu Leu 30 Tyr Lys
Pro
Gly Thr 35 val Lys Met Ser 40 Lys Ala Ser Gly 45 Thr Phe
Thr
Asp 50 Trp Tyr Asn Met H1S Trp 55 Asn Val Lys Gln Thr Gln 60 Gly Gly Lys Thr Leu
Glu 65 Gln
lie Gly Glu lie 70 Lys Pro Asn Ser Gly 75 Val Ala Gly Tyr Asn 80 Thr
Lys
Phe Lys Gly 85 Glu Ala Thr Leu Thr 90 Thr Asp Lys Ser Ser 9S Ala
Thr
Ala Tyr Met 100 Leu Arg Ser Leu 105 Ser Glu Asp Ser 110 val
Tyr
Tyr
Cys 115 Val Ala Lys Leu Gly Tyr 120 Thr Asp Asp lie Tyr Asp 125 Ser Asp Trp
Tyr
Phe
Asp Trp Gly Ala Gly Thr Val Thr val Ser Ala Lys
130 135 140
Thr
Thr
Ala pro Ser val Tyr pro Leu Ala pro Val Cys Gly Asp
Thr
145
150 155 160
Thr
Gly ser Ser Val Thr Leu Gly cys Leu val Lys Gly Tyr Phe Pro
val Thr 165 Thr 170 175
Glu
Pro Leu Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser ASp Val
Phe 180 185 190
His
Thr pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser
195 200 205
Ser
val Thr Val Thr Thr Trp pro ser Gln Thr lie Thr cys Asn Val
210 Ala 215 220
Ala
His Pro ser Ser Thr Lys Val Asp Lys 235 Lys He Glu pro Arg
225
230 240
Gly
Ser pro Thr His 245 Ser Lys Pro cys Pro Pro 2 SO pro Cys Pro Ala pro Asn 255 ASp Leu
Leu
Gly Gly pro 260 ser val Phe lie Phe 265 Val pro Lys lie Lys 270 val val
Leu
Met lie Leu Ser pro Met Thr cys val val Asp val
275 280 285
Ser
Glu Asp Asp Pro Asp val His Val Ser Trp Phe val Asn Asn val
290 295 300
Glu
val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
305
310 315 320
Thr
He Arg Val val 325 Phe Ser Ala Leu Pro lie 330 Asn Gln His Gln Asp Trp 335 Pro Met
Ser
Gly Lys Glu 340 Arg Lys cys Lys Val 345 Pro Asn Lys Ala Leu 350 Arg Ala
Pro
He Glu 355 Tyr Thr lie Ser Lys 360 pro Lys Gly Pro val 365 Thr Ala pro
Gln
val val Leu pro pro Glu Glu Glu Met Lys Lys
Gln
370 375 380
val
Thr Leu Thr Cys Met lie Thr ASp Phe Met pro Gl u ASp lie Tyr
385
390 395 400
val
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Gln Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr
405 410 415
Glu
Pro val Leu 420 Lys Asp ser Asp Gly Ser 425 Glu Tyr Phe Met Tyr Ser 430 ser Lys Leu
Arg
val Glu Lys Asn Trp val Arg Asn Ser Tyr Cys ser
435 440 445
val
val
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys ser Phe Ser
450 455 460
Arg
Thr pro Gly Lys
465
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<213> Mus musculus
<400> 180
5
10
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tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 acctgaacta atgaagcctg ggacttcagt gaagatgtcc 120 attcactgac tacaacatgc actgggtgaa gcagacccaa ISO aggagaaatt aatcctaaca gtggtggtgc tggctacaac 240 cacattgact gtagacaagt cctccaccac agcctacatg 300 tgaggactct gcagtctatt actgtgcaaa attgggctac 360 gtatttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420 cccatcggtc tatccactgg cccctgtgtg tggagataca 480 aggatgcctg gtcaagggtt atttccctga gccagtgacc 540 cctgtccagt gatgtgcaca ccttcccagc tctcctgcag 600 cagctcagtg actgtaacca cctggcccag ccagaccatc 660 ggcaagcagc accaaagtgg acaagaaaat tgagcccaga 720 ctgtcctcca tgcccagctc ctaacctctt gggtggacca 780 aaagatcaag gatgtactca tgatctccct gagccccatg 840
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<210> 181 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 181

Asp lie Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser ser Leu Ser Ala ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg val ser lie ser cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Phe Lys Leu Leu lie 35 40 45

Phe Tyr Thr ser Arg Leu Leu ser Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr Asp Tyr ser Leu Thr lie Tyr Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110

Pro Thr Val Ser lie phe pro Leu Ser ser Glu Gln Leu Thr ser Gly 115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp lie 130 135 140
Asn val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly val Leu

145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp ser Lys Asp ser Thr Tyr ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn ser Tyr 180 185 190

Thr cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr ser Pro lie val Lys ser 195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu cys 210
<211> 645 <212>ADN <213> Mus musculus
5 <400> 182
10
15
gatatccaga
atcagttgca
gatggaactt
aggttcagtg
gaagattttg
gggaccaaac
tccagtgagc
cccaaagaca
aacagttgga
ttgaccaagg
tcaacttcac
tgacacagac tacatcctcc gggcaagtca agacattagc ttaaactcct tatcttctac gcagtgggtc tggaacagat ccacttactt ttgccaacag tggaaataaa acgggctgat agttaacatc tggaggtgcc tcaatgtcaa gtggaagatt ctgatcagga cagcaaagac acgagtatga acgacataac ccattgtcaa gagcttcaac
ctgtctgcct
aattatttaa
acatcaagat
tattctctca
ggagatacgc
gctgcaccaa
tcagtcgtgt
gatggcagtg
agcacctaca
agctatacct
aggaatgagt
ctctgggaga cagggtctcc 60 actggtatca gcagaaacca 120 tactctcagg agtcccatca 180 ccatttacaa cctggagcaa 240 ttccgtacac tttcggaggg 300 ctgtatccat cttcccacta 360 gcttcttgaa caacttctac 420 aacgacaaaa tggcgtcctg 480 gcatgagcag caccctcacg 540 gtgaggccac tcacaagaca 600 gttag 645
<210> 183 <211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 183
Met
Met
ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1
5 10 15
Gly
Thr Arg cys Asp lie Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala
ser Leu 35 Asn Gly Asp Arg val ser 40 Tyr lie Ser Cys Arg Ala 45 Asp Ser Gln Asp
lie
ser 50 Leu Tyr Leu Asn Trp 55 Thr Gln Gln Lys Pro 60 Ser Gly Thr Phe
Lys 65 Arg
Leu lie Phe Tyr 70 Gly ser Arg Leu Leu 75 Tyr Gly val Pro Ser 80 Tyr
phe
Ser Gly Ser 85 Glu Ser Gly Thr Asp 90 Tyr Ser Leu Thr lie 95 Gly
Asn
Leu Glu Gln Asp Phe Ala Thr Phe Cys Gln Gln Asp
100 105 110
Thr
Leu pro 115 Ala Tyr Thr Phe Gly Gly 120 Ser Gly Thr Lys Leu Glu 125 Ser lie Lys Arg
Ala
Asp Ala Pro Thr Val He Phe Pro Leu Ser Glu Gln
130 135 140
Leu
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145
150 155 Glu 160
Pro
Lys ASp lie Asn 165 Asn Val Lys Trp Lys He 170 Gln Asp Gly Ser Arg Gln
Asn
Gly val Leu 180 Ser Ser Trp Thr ASp 185 Leu Asp Ser Lys ASp 190 Tyr X/ J ser Thr
Tyr
Ser Met 195 Ser Ser Thr Leu Thr 200 Ala Thr Lys Asp Glu 205 Ser Glu Arg
His
Asn Tyr Thr Cys Glu Thr His Lys Thr Thr Ser Pro
210 215 220
lie
val Lys ser Phe Asn Arg Asn Glu cys
225
230
<210> 184 <211>705 <212>ADN <213> Mus musculus
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc gatatccaga tgacacagac tacatcctcc atcagttgca gggcaagtca agacattagc gatggaactt ttaaactcct tatcttctac aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat gaagattttg ccacttactt ttgccaacag gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac ttgaccaagg acgagtatga acgacataac tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac
<210> 185 <211> 447 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 185
ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 ctgtctgcct ctctgggaga cagggtctcc 120 aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180 acatcaagat tactctcagg agtcccatca 240 tattctctca ccatttacaa cctggagcaa 300 ggagatacgc ttccgtacac tttcggaggg 360 gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacta 420 tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 aggaatgagt gttag 705
Glu
val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
val Lys Met 20 Trp Ser Cys Lys Ala ser 25 Gln Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Glu ASp Tyr
Asn
Met His 35 He Val Lys Gln Asn 40 Gly Gly Lys Thr Leu 45 Asn Trp lie
Gly
Glu 50 Asn Pro Asn Ser 55 Gly Ala Gly Tyr 60 Gln Lys Phe
8*
Gly Lys Ala Thr Leu 70 Thr val Asp Lys Ser 75 Ser Thr Thr Ala Tyr 80
Met
Glu Leu Arg Ser 85 Tyr Leu Thr ser Glu Asp 90 Asp Ser Ala val Tyr Tyr 95 Asp Cys
Ala
Arg Leu Gly 100 Gly Asp ASp lie Tyr 105 val Asp Trp Tyr Phe 110 Thr val
Trp
Gly Ala 115 val Thr Thr val Thr 120 Pro Ser Ser Ala Lys 125 Gln Thr pro
Pro
ser Tyr Pro Leu Ala Gly Ser Ala Ala Thr Asn Ser
130 135 140
Met
val Thr Leu Gly cys Leu Val Lys Gly Tyr phe Pro Glu Pro val
145
val Thr 150 155 160
Thr
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser ser Gly val His Thr Phe
165 170 175
Pro
Ala val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser Ser Ser val Thr
180 185 190
val
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr cys Asn val Ala
195 200 205
His
Pro 210 Gly Ala Ser Ser Thr Lys 215 He Val Asp Lys Lys lie 220 Glu val Pro Arg ASp
Cys
cys Lys Pro cys Cys Thr Val Pro Val Ser Ser val
225
230 235 240
Phe
lie Phe Pro Pro 245 cys Lys Pro Lys Asp Val 250 He Leu Thr He Thr Leu 255 pro Thr
Pro
Lys Val Thr 260 Ser val Val Val Asp 265 Asp Ser Lys Asp Asp 270 Thr Glu
val
Gln Phe Trp Phe Val Asp val Glu val His Ala Gln
275 280 285
Thr
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg Ser val Ser
290 295 300 Glu Phe
Glu
Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Lys
305
310 315 320
Cys
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie
325 330 335
Ser
Lys Thr Lys Gly Arg pro Lys Ala Pro Gln val Tyr Thr He Pro
340 345 350
Pro
Pro
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr cys Met
355 360 365
lie
Thr ASp Phe Phe Pro Glu ASp lie Thr val Glu Trp Gln Trp Asn
370 375 380
Gly
Gln pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro He Met Asp Thr
385
390 395 400
Asp
Gly Ser Tyr Phe 405 Asn lie Tyr Ser Lys Leu 410 ser Asn Val Gln Lys ser 415 Gly Asn
Trp
Glu Ala Gly 420 HÍS Thr Phe Thr Cys Val Leu His Glu 430 Gly Leu
His
Asn HIS Thr Glu Lys Ser Leu ser His Ser Pro Lys
435 440 445
<210> 186 <211> 1344 5 <212>ADN
<213> Mus musculus

gaggtccaac tgcaacagtc tggacctgaa ctaatgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata tacattcact gactacaaca tgcactgggt gaagcagaac 120

caaggaaaga ccctagaatg gataggagaa attaatccta acagtggtgg tgctggctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagattgggc 300

tacgatgata tctacgacga ctggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360

gtctcctcag ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc 420

caaactaact ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg 480

acagtgacct ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg 540

cagtctgacc tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc 600

gagaccgtca cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt 660

gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc 720

ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg 780

tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat 840

gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc 900

cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa 960

tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 1020

ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag 1080

gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag 1140

tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca 1200

gatggctctt acttcatcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga 1260

aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc 1320

ctctcccact ctcctggtaa atga 1344
<210> 187 <211> 466 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 187
Met
Gly Trp Ser Trp Thr Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1
S 10 15
val
Leu ser Glu val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys
20 25 30
Pro
Gly Ala 35 Tyr Ser val Lys Met ser 40 val Cys Lys Ala Ser Gly 45 Gly Tyr Thr Phe
Thr
Asp 50 Trp Asn Met HÍS Trp 55 Asn Lys Gln Asn Gln 60 Gly Lys Thr Leu
Glu
He Gly Glu He pro Asn Ser Gly Ala Gly Tyr Asn
65
70 75 80
Gln
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Lys Ser ser Thr
85 90 95
Thr
Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr
Tyr
Cys 115 val Ala Arg Leu Gly Tyr 120 Thr ASp Asp He Tyr ASP 125 Ser Asp Trp
Tyr
Phe
Asp 130 Thr Trp Gly Ala Gly 135 Tyr Thr val Thr Val 140 Gly Ser Ala Lys
Thr
Pro Pro ser val pro Leu Ala Pro Ser Ala Ala Gln
145
150 155 160
Thr
Asn Ser Met val 165 val Thr Leu Gly cys Leu 170 Gly val Lys Gly Tyr phe 175 Gly Pro
Glu
Pro val Thr 180 pro Thr Trp Asn Ser 185 Ser ser Leu Ser ser 190 Leu Val
HÍS
Thr Phe Ala val Leu Gln Asp Leu Tyr Thr ser Ser
195 200 205
Ser
val Thr val Pro Ser Ser Thr Trp pro Ser Glu Thr val Thr Cys
210 215 220
Asn
val Ala HÍS Pro Ala Ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys lie Val
225
230 235 240
Pro
Arg Asp Cys Gly 245 He Cys Lys pro Cys lie 250 Pro Cys Thr val pro Glu 255 Thr val
Ser
ser val Phe Phe pro Pro Lys Lys Asp val Leu lie
260 265 270
Thr
Leu Thr Pro Lys val Thr Cys val val val Asp He Ser Lys Asp
275 280 285
Asp
Pro 290 Ala Glu val Gln Phe ser 295 Arg Trp Phe val Asp ASP 300 Asn val Glu val HÍS
Thr
Gln Thr Gln Pro Glu Glu Gln Phe Ser Thr phe Arg
305
310 315 320
Ser
val Ser Glu Leu 325 Arg Pro He Met His Gln 330 Ala ASp Trp Leu Asn Gly 335 lie Lys
Glu
phe Lys Cys val Asn ser Ala Phe Pro Ala pro
Glu
340 345 350
Lys
Thr He Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln val Tyr
355 Glu 360 365
Thr
lie Pro Pro Pro Lys Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu
370 375 380
Thr
cys Met lie Thr ASp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr Val Glu Trp
385
390 395 400
Gln
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie
405 410 415
Met
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe lie Tyr Ser Lys Leu Asn val Gln
420 425 430
Lys
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser val Leu His
435 440 445
Glu
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His ser pro
450 455 460
Gly 465
Lys
<210> 188 <211> 1401 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 188

atgggatgga gctggacctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60

gtccaactgc aacagtctgg acctgaacta atgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggatatac attcactgac tacaacatgc actgggtgaa gcagaaccaa 180

ggaaagaccc tagaatggat aggagaaatt aatcctaaca gtggtggtgc tggctacaac 240

cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccaccac agcctacatg 300

gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag attgggctac 360

gatgatatct acgacgactg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420

tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa 480

actaactcca tggtgaccct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtgaca 540

gtgacctgga actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 600

tctgacctct acactctgag cagctcagtg actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag 660

accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg 720

cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc 780

atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt 840

gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat 900

gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc cgggaggagc agttcaacag cactttccgc 960

tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag gactggctca atggcaagga gttcaaatgc 1020

agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc 1080

agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt ccacctccca aggagcagat ggccaaggat 1140

aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg 1200

cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac aagaacactc agcccatcat ggacacagat 1260

ggctcttact tcatctacag caagctcaat gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat 1320

actttcacct gctctgtgtt acatgagggc ctgcacaacc accatactga gaagagcctc 1380

tcccactctc ctggtaaatg a 1401
<210> 189 5 <211> 213
<212> PRT <213> Mus musculus
<400> 189
10
Gln
lie Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val ser Pro Gly
1
5 10 15
ASp
Lys val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser He Ser Tyr lie
20 25 30
HlS
Trp Phe 35 ser Gln Gln Lys Pro Gly 40 Gly Ser Ser Pro Arg Ser 45 Phe Trp lie Tyr
Ala
Thr 50 ser Asn Leu Ala Ser 55 ser val Pro Gly Arg 60 Arg Ser Gly ser
Gly 65 Asp
Gly Thr Ser Tyr 70 Tyr Leu Thr lie Ser 75 Ser val Glu Ala Glu 80 Thr
Ala
Ala
Thr Tyr 85 Thr cys Gln Gln Trp 90 Lys Ser Asp pro Leu 95 Ala
Phe
Gly Ala Gly 100 He Lys Leu Glu Leu 105 Ser Arg Ala Asp Ala 110 Ser Pro
Thr
val ser Phe pro Pro Ser Glu Gln Leu Thr Gly Gly
115 120 125
Ala
Ser val val cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys ASp He Asn
130 135 140
val
Lys Trp Lys lie ASp Gly ser Glu Arg Gln Asn Gly val Leu Asn
145
Thr 150 155 160
ser
Trp Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met ser Ser
165 170 175
Thr
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
Thr
Ala 180 185 190
Cys
Glu Thr His Lys Thr ser Thr Ser Pro lie val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn
Arg Asn Glu cys
210
<210> 190
<211> 642 <212>ADN <213> Mus musculus
5 <400> 190

caaattgttc tctcccagtc tccagcattc ctgtctgtat ctccagggga taaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtataagt tacatacact ggtttcagca gaagccagga 120

tcctccccca gatcctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctggtcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgag 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtgacc cactcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360

agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420

aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480

agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 340

accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 600

acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgtt ag 642
<210> 191 10 <211> 235
<212> PRT <213> Mus musculus
<400> 191 15
Met
Asp Phe Gln Val Gln He Phe Ser Phe Leu Leu lie Ser Ala Ser
1
5 10 15
val
lie Met ser 20 Ser Arg Gly Gln lie val 25 val Leu Ser Gln ser Pro 30 Cys Arg Ala Phe
Leu
Ser val Pro Gly Asp Lys Thr Met Thr Ala ser
35 40 Gln 45
Ser
ser 50 Arg lie ser Tyr lie HlS 55 Ala Trp Phe Gln Lys 60 Ala Pro Gly ser ser
Pro 65 Gly
Ser Trp lie Tyr 70 Gly Ser 85 Ala Glu Thr ser Asn Leu 75 Ser ser Gly val Pro 80 He
Arg
Phe Ser Gly Ser Gly Thr 90 Thr Tyr Ser Leu Thr 95 Gln
ser
Arg val Glu 100 Pro Asp Ala Ala 105 Ala Tyr Tyr Cys Gln 110 Leu Glu 125 Pro Ser Trp
Ser
Ser
Asp 115 Asp Leu Thr Phe Gly 120 val Gly Thr Lys Leu Lys
Arg
Ala Ala Ala Pro Thr Ser lie Phe Pro ser Glu
130
135 140
Gln
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser val val cys Phe Leu Asn Asn Phe
145
150 155 160
Tyr
Pro Lys Asp lie Asn val Lys Trp Lys lie Asp Gly ser Glu Arg
val 180 Met 165 Thr 185 Thr 170 Gln 175
Gln
Asn Gly Leu Asn ser Trp Asp Asp Ser Lys 190 ASp Glu 205 Thr ser Asp Ser
Thr
Tyr Ser 195 Asn Ser ser Thr Leu 200 Glu Leu Thr Lys Tyr Glu
Arg
His Ser Tyr'Thr Cys Ala Thr His Lys Thr ser
210
215 220
pro
lie val Lys ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225
230 235
<210> 192 <211>708 20 <212> ADN
<213> Mus musculus
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt ccaggatcct cccccagatc ctggatttat ggtcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc gctgaggatg ctgccactta ttactgccag gctgggacca agctggagct gaaacgggct ccatccagtg agcagttaac atctggaggt taccccaaag acatcaatgt caagtggaag ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa acgttgacca aggacgagta tgaacgacat acatcaactt cacccattgt caagagcttc
ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60 gcattcctgt ctgtatctcc aggggataag 120 ataagttaca tacactggtt tcagcagaag 180 gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240 tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300 cagtggagta gtgacccact cacgttcggt 360 gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420 gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480 attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540 gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600 aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660 aacaggaatg agtgttag 708
<210> 193 <211> 445 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 193
GlU 1
Val Gln Leu Gln 5 Gln ser Gly Ala Asp 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Ala
ser
val Lys val 20 Trp Ser cys Thr Ala Ser 25 Pro Gly Phe Asp He Lys 30 Glu ASp Tyr
Tyr
lie His 35 val Met Lys Gln Arg 40 Gly ASp Gln Gly Leu 45 Ala Trp lie
Gly
Arg 50 Gly ASp Pro Asp Asn 55 Thr Glu Thr Glu Phe 60 Ser pro Lys Phe
pro 65 Leu
Lys Ala Thr Phe 70 Leu Thr Asp Thr Ser 75 Thr Asn Thr Ala Tyr 80 cys
Gln
Leu Arg Gly 85 Tyr Thr ser Glu ASp 90 Thr Ala He Tyr 9?P
Gly
Arg Glu ASp 100 Asp Gly Thr Tyr 105 Trp Phe Pro Tyr 110 Trp
Gly
Gln
Gly Thr 115 Leu val Thr Val ser 120 Ala Ala Lys Thr Thr 125 pro pro Ser
Val
Tyr 130 Pro Leu Ala Pro Gly 135 ser Ala Ala Gln Thr 140 Asn ser Met val
Thr 145
Leu Gly Cys Leu Val 150 Lys Gly Tyr Phe pro 155 Glu Pro val Thr val 160
Thr
Trp Asn Ser Gly 165 ASp Ser Leu ser Ser Gly 170 Ser Val His Thr Phe pro 175 val Ala
Val
Leu Gln ser 180 Leu Tyr Thr Leu 185 ser ser vai Thr 190 Pro
Ser
Ser
Thr 195 Trp Pro ser Glu Thr 200 Val Thr cys Asn val 205 Ala His pro
Ala
ser 210 Lys Ser Thr Lys val Asp 215 Thr Lys Lys. lie val Pro 220 ser Arg ASp cys Gly
Cys 225
Pro cys lie cys 230 val Pro Glu val 235 Ser Val Phe lie 240
Phe
Pro Pro Lys Pro 245 Lys Asp val Leu Thr 250 lie Thr Leu Thr Pro 255 Lys
Val
Thr Cys val 260 val val Asp lie Ser 265 Lys Asp Asp Pro Glu 270 Val Gln
Phe
ser Trp 275 Phe val ASp ASp val 280 Glu val His Thr Ala 285 Gln Thr Gln
Pro
Arg 290 Glu Glu Gln Phe Asn 295 ser Thr Phe Arg Ser 300 Val ser Glu Leu
Pro 305
lie Met His Gln Asp 310 Trp Leu Asn Gly Lys 315 Glu Phe Lys Cys Arg 320
Val
Asn ser Ala Ala 325 Phe pro Ala Pro lie 330 Glu Lys Thr lie Ser 335 Lys
Thr
Lys Gly Arg 340 pro Lys Ala pro Gln 345 val Tyr Thr lie pro 350 pro Pro
5
10
15
Lys
Glu Gln 355 phe Met Ala Lys Asp Lys 360 Thr Val Ser Leu Thr Cys Met 365 Trp Asn lie Thr
Asp
Phe 370 Ala pro Glu Asp lie 375 Asn Val Glu Trp Gln 38Q Met Gly Gln
Pro
Glu Asn Tyr Lys Thr Gln Pro He Asp Thr Asp Gly
385
lie 390 395 400
Ser
Tyr phe Tyr ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His
His
Thr Glu Lys Ser Leu ser HiS Ser pro Gly Lys
435 440 445
<210> 194 <211> 1338 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 194

gaagttcagc tgcaacagtc tggggcagac cttgtgcagc caggggcctc agtcaaggtg 60

tcctgcacag cttctggctt cgacattaag gactactata tacactggat gaaacagagg 120

cctgaccagg gcctggagtg gattggaagg gttgatcctg acaatggtga gactgaattt 180

gccccgaagt tcccgggcaa ggccactttt acaacagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctacaactca gaggcctgac atctgaggac actgccatct attactgtgg gagagaagac 300

tacgatggta cctacacctg gtttccttat tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360

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aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480

acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 540

gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 600

gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 660

agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 720

ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 780

gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 840

gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 900

gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 960

gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1020

ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1080

gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1140

tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1200

tcttacttca tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1260

ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1320

cactctcctg gtaaatga 1338
<210> 195 <211>464 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 195
Met
Lys cys ser Trp val lie Phe Phe Leu Met Ala val val Thr Gly
1
5 10 15
val
Asn ser Glu val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu val Gln
Gly 20 25 30
pro
Ala 35 Tyr ser Val Lys val ser 40 Met Cys Thr Ala Ser Gly 45 Asp Phe Asp He
Lys
Asp 50 Tyr lie HÍS Trp 55 Asp Lys Gln Arg Pro 60 Glu Gln Gly Leu
Glu 65
Trp lie Gly Arg val 70 Lys Pro Asp Asn Gly 75 Thr Thr Glu Phe Ala 80 Asn
Pro
Lys Phe Pro Gly 85 Gln Ala Thr Phe Thr 90 Thr Asp Thr Ser Ser 95 Ala
Thr
Ala Tyr Leu Leu Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr He
100 105 110
Tyr
Tyr
cys 115 Gly Gly Arg Glu Asp Tyr 120 Val Asp Gly Thr Tyr Thr 125 Ala Trp Phe Pro
Tyr
Trp 130 Gln Gly Thr Leu 135 Thr val Ser Ala 140 Lys Thr Thr
Pro
Pro
ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly ser Ala Ala Gln Thr Asn
145
val 150 155 160
Ser
Met Thr Leu Gly cys Leu Val Lys Gly Tyr phe Pro Glu pro
165 170 175
val
Thr val Thr Trp Asn ser Gly ser Leu ser Ser Gly val His Thr
Ala 180 185 190
Phe
pro Val Leu Gln ser A5p Leu Tyr Thr Leu ser Ser Ser Val
195 200 205
Thr
val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
210 215 220
Ala
His pro Ala ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys He val Pro Arg
225
Gly 230 235 240
Asp
cys cys Lys 245 Pro Pro cys He Cys Thr 250 Asp Val Pro Glu val Ser 255 Thr ser
val
Phe lie Phe Pro Lys pro Lys val Leu Thr lie Leu
260 265 270
Thr
Pro Lys 275 Gln val Thr cys val val 280 Val val ASP lie Ser 2ÍÍ val Asp Asp pro
Glu
Val 290 Thr Phe Ser Trp Phe 295 Glu Asp Asp val Glu 300 Thr HÍS Thr Ala
Gln
Gln
Pro Arg Glu Gln Phe Asn Ser Phe Arg Ser Val
305
310 315 320
Ser
Glu Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
325 330 335
Lys
cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr
340
345 350
He
Ser Lys 355 Thr Lys Gly Arg Pro 360 Ala Lys Ala Pro Gln val 365 ser Tyr Thr lie
Pro
Pro
jjj pro Lys Glu Gln Met Lys Asp Lys val Leu Thr cys
370 375 380
Met
lie Thr Asp Phe phe pro Glu Asp lie Thr val Glu Trp Gln Trp
385
390 395 400
Asn
Gly Gln Pro Ala 405 Tyr Glu Asn Tyr Lys Asn 410 Lys Thr Gln Pro He Met 415 Lys ASp
Thr
Asp Gly ser 420 Ala phe He Tyr Ser 425 Thr Leu Asn val Gln 430 His Ser
Asn
Trp Glu 435 Asn Gly Asn Thr Phe 440 Lys cys Ser Val Leu 445 ser Glu Gly
Leu
His His His Thr Glu ser Leu ser His Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 196 <211> 1395 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
atgaaatgca gctgggtcat cttcttcctg gttcagctgc aacagtctgg ggcagacctt tgcacagctt ctggcttcga cattaaggac gaccagggcc tggagtggat tggaagggtt ccgaagttcc cgggcaaggc cacttttaca caactcagag gcctgacatc tgaggacact gatggtacct acacctggtt tccttattgg gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc gtgcacacag ctcagacgca accccgggag agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaggctccac aggtgtacac cattccacct agtctgacct gcatgataac agacttcttc
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac tacttcatct acagcaagct caatgtgcag acctgctctg tgttacatga gggcctgcac tctcctggta aatga
<210> 197 <211> 214 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
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1395
<400> 197
10
ASp
Leu Gln Met Thr Gln Thr Thr
1
5
ASp
Arg val Thr 20 Tyr lie Ser cys Arg
Leu
Asn Trp Gln Gln Lys Pro
35 40
Phe
Tyr Thr ser Thr Leu Gln Ser
50 55
ser 65 Asp
Gly ser Gly Thr Asn 70 Tyr Tyr Ser
Asp
Ala Ala Thr 85 Gly Phe Cys
Thr
Phe Gly Gly Thr Lys Leu
100
Pro
Thr val Ser lie Phe Pro pro
115 120
Gly
Ala ser Val val Cys Phe Leu
130
135
Asn
val Lys Trp Lys lie Asp Gly
145
150
Asn
ser Trp Thr Asp 165 Leu Gln Asp Ser
Ser
Thr Leu Thr Thr Lys ASp
180
Thr
Cys Glu Ala Thr His Lys
Thr
195 200
Phe
Asn Arg Asn Glu cys
210
Ser
Ser 10 Leu ser Ala Ser Leu 15 Gly
Ala 25
ser Gln Asp He Ser 30 Asn Tyr
Asp
Gly Thr Val Lys 45 Arg Leu Leu lie
Gly
val Pro ser 60 Thr Phe Ser
Gly
Leu
Thr lie 75 Asn Leu Glu Gln 80
Gln
Gln 90 lie Gly ASp Thr Leu pro 95 Ala Tyr
Glu 105
Lys Arg Ala Asp 110 Ala
Ser
Ser
Glu Gln Leu 125 Thr Ser Gly
Asn
Asn
Phe Tyr 140 Gln Pro Lys Asp lie
ser
Glu Arg 155 Asn Gly val Leu 160
Lys
Asp 170 Ser Thr Tyr ser Met 175 Ser
Glu 185
Tyr Glu Arg Hís Asn 190 Ser Tyr
ser
Thr Ser Pro lie 205 val Lys Ser
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5
10
15
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<210> 199 <211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 199
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Met
Met
Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu cys Phe Gln
1
5 10 15
Gly
Ser Arg cys Asp Leu Gln Met Thr Gln Thr Thr ser ser Leu Ser
20 25 - 30
Ala
Ser Leu 35 Asn Gly Asp Arg val Thr 40 Tyr lie ser Cys Arg Ala 45 Asp Ser Gln Asp
He
Ser 50 Leu Tyr Leu Asn Trp 55 Thr Gln Gln Lys Pro 60 ser Gly Thr Val
Lys
Leu He Phe Tyr Ser Thr Leu Gln Gly Val pro Ser
65
70 75 80
Arg
Phe Ser Gly Ser 85 ASp Gly Ser Gly Thr Asn 90 Tyr Tyr ser Leu Thr lie 95 Gly Thr
Asn
Leu Glu Gln 100 Tyr Asp Ala Ala Thr 105 Gly Phe Cys Gln Gln 110 He Asp
Thr
Leu Pro 115 Ala Thr Phe Gly Gly 120 ser Thr Lys Leu Glu 125 ser Lys Arg
Ala
Asp Ala Pro Thr Val He Phe Pro Pro ser Glu Gln
130 135 140
Leu 145 Pro
Thr ser Gly Gly Ala 150 val Ser val val cys Phe 155 Asp Leu Asn Asn Phe Tyr 160 Gln
Lys
ASp lie Asn 165 Asn Lys Trp Lys He 170 Gln Gly ser Glu Arg 175 Ser
Asn
Gly val Leu 180 Ser ser Trp Thr Asp 185 Leu Asp ser Lys Asp 190 Tyr Thr
Tyr
ser Met 195 Ser Ser Thr Leu Thr 200 Ala Thr Lys Asp Glu 205 Ser Glu Arg
His
Asn 210 val Tyr Thr cys Glu 215 Arg Thr His Lys Thr 220 Thr Ser Pro
He
Lys Ser Phe Asn Asn Glu cys
225
230
<210> 200 <211>705 <212>ADN <213> Mus musculus
5
10
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc gatctccaga tgacacagac tacttcctcc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc gatggaactg ttaagctcct gatcttctac aggttcagtg gcagtgggtc tggaacaaat gatgatgctg ccacttactt ttgccaacag gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac ttgaccaagg acgagtatga acgacataac tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac
ctgttgctct gttttcaagg ttccagatgt 60 ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120 aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180 acatcaacat tacagtcagg agtcccatcg 240 tattctctca ccattaccaa cctggagcaa 300 ggtgatacgc ttccgtacac gttcggaggg 360 gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 aggaatgagt gttag 705
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65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg Leu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp val 100 IOS 110

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pro Ser val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly ser Ala Ala Gln Thr Asn ser 130 135 140

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Thr Val Thr Trp Asn ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser ser ser val Thr 180 185 190

Val Pro ser ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr Cys Asn Val Ala 195 200 205

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cys Gly Cys Lys Pro cys lie cys Thr val Pro Glu val Ser ser val

225 230 235 240
Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr

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pro Lys Val Thr Cys Val Val val Asp lie ser Lys Asp Asp pro Glu 260 265 270

val Gln Phe ser Trp Phe val Asp Asp val Glu Val His Thr Ala Gln 275 280 285

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Cys Arg val Asn ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

325 330 335

ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala pro Gln val Tyr Thr lie Pro 340 345 350

pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys val ser Leu Thr cys Met 355 360 365

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Asp Gly ser Tyr Phe lie Tyr ser Lys Leu Asn Val Gln Lys ser Asn

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His Asn His His Thr Glu Lys ser Leu ser His ser Pro Gly Lys 435 440 445
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tgcaacagtc tggacctgaa etaatgaage ctggggcttc agtgaagatg 60 cttctggata cacattcact gactacaaca tgcactggat gaagcagaac 120 geetagagtg gataggagag attaatecta acagtggtgg ttctggttac 180 tcaaaggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagattgggc 300 actacgagga ctggtatttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc 420 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg 480 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg 540 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc 600 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt 660 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc 720 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg 780 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat 840 tgcacacagc teagaegeaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc 900 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa 960 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 1020 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag 1080
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val
Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Gly Pro Glu Leu Lys
20 25 30
Pro
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr
35 40 45
Asp 50 Trp
Tyr Asn Met His Trp 55 Asn Met Lys Gln Asn Gln 60 Gly Gly Lys Ser Leu
Glu 65 Gln
lie Gly Glu lie 70 Lys Pro Asn Ser Gly 75 Val Ser Gly Tyr Asn 80 ser
Lys
Phe Lys Gly 85 Glu Ala Thr Leu Thr 90 Thr Asp Lys ser Ser 95 Ala
Thr
Ala Tyr Met Leu Arg Ser Leu Ser Glu Asp ser val
100 105 110
Tyr
Tyr
Cys 115 val Ala Arg Leu Gly Tyr i?n Tyr Gly Asn Tyr Glu 125 Ser Asp Trp
Tyr
phe
Asp 130 Thr Trp Gly Ala Gly 135 Tyr J.£V Thr Thr Val Thr val 140 Gly Ser Ala Lys
Thr
Pro pro ser val pro Leu Ala pro Ser Ala Ala Gln
145
150 155 160
Thr
Asn Ser Met val Thr Leu Gly Cys Leu val Lys Gly Tyr Phe pro
165 170 175
Glu
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180 185 190
His
Thr Phe pro Ala val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser Ser
195 200 205
ser
val Thr val pro ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr cys
210 215 220
Asn
val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys val ASp Lys Lys lie val
225
230 235 240
Pro
Arg Asp cys Gly 245 lie Cys Lys pro cys He 250 Pro Cys Thr val pro Glu 255 Thr val
ser
Ser val Phe Phe Pro Pro Lys Lys Asp Val Leu lie
260 265 270
Thr
Leu Thr pro Lys val Thr Cys val Val val Asp lie Ser Lys Asp
275 280 285
Asp
pro Glu val Gln Phe ser Trp Phe val Asp Asp val Glu val His
290
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Thr
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
305
310 315 320
Ser
val Ser Glu Leu 325 Arg Pro He Met His Gln 330 Ala ASp Trp Leu Asn Gly 335 He Lys
Glu
Phe Lys Cys val Asn Ser Ala Phe Pro Ala pro
Glu
340 345 350
Lys
Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr
lie Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu
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Thr
Cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr val Glu Trp
385
390 395 400
Gln
Trp Asn Gly Gln 405 Gly Pro Ala Glu Asn Tyr 410 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro 415 val lie
Met
Asp Thr Asp Ser Tyr Phe lie Ser Lys Leu Asn Gln
420 425 430
Lys
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr cys Ser Val Leu His
435 440 445
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys ser Leu Ser His ser Pro 450 455 460
Gly Lys 465
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5
10

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Gln
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1
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Glu
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Tyr
Leu Asn 35 Ser Tyr Gln Gln Lys 40 Ala Gly Ser ser Pro 45 Ala Leu Trp
lie
Tyr 50 ser Thr ser Asn Leu 55 ser Ser Gly val Pro 60 lie Arg Phe Ser
Gly
Gly
Ser Gly Thr Tyr ser Leu Thr ser Ser val Glu
65
70 75 80
Ala
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp phe phe Pro
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ser
Thr Phe Gly 100 val Gly Gly Thr Lys Leu 105 Pro Glu lie Lys Arg Ala 110 Leu Asp Ala
Ala
Pro Thr ser lie Phe Pro Ser ser Glu Gln Thr ser
Gly
Gly
115 120 125
Ala
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lie
130 135 140
Asn
val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly val
145
150 155 160
Leu
Asn ser Trp Thr 165 Thr Asp Gln Asp Ser Lys 17A Asp Ser Thr Tyr ser 175 Asn Met
Ser
Ser
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Ser
Tyr
Thr Cys Ala Thr His Lys Ser Thr ser Pro val Lys
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1
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ser
ser
65
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Gln
He
ser
145
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Glu
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Tyr
Thr
225
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Lys
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Ser
Ala 35 Ser Pro Gly Glu Lys 40
ser 50
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Tyr
Asp 115 Phe Phe Pro Ser Thr 120
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Arg Ala Asp Ala Ala 135 Pro
Glu
Gln Leu Thr Ser 150 Gly Gly
Phe
Tyr Pro Lys 165 Gly Asp lie Asn
Arg
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ser
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Glu 210
Arg His Asn ser Tyr 215 Thr
ser
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Ser
Phe 10 Leu Leu He Ser Ala 15 Leu
val 25
Leu Thr Gln Ser Pro 30 Ala lie
val
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Trp Tyr Gln 60 Asn Lys Pro Gly
Ser
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Gly
ser 90 Ala Gly Thr Ser Tyr Ser 95 cys Leu
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Phe
Gly Gly Gly Thr 125 Phe Lys Leu Glu
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val Ser lie 140 Pro Pro ser
Ala
Ser val 155 Val Cys Phe Leu Asn 160
val
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Ser 185
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Thr
Leu Thr Leu Thr 205 His Cys Lys Asp Glu
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cttctaatca gtgccttagt caaaatgtcc 60
gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtaacttcca gttacttgaa ctggtaccag 180 atttatagca catccaacct ggcttcagga 240 gggacctctt actctctcac aatcagcagt 300 tgccagcagt atgatttttt cccatcgacg 360 cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 480 tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 540 agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 600 cgacataaca gctatacctg tgaggccact 660 agcttcaaca ggaatgagtg t 711
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X Ser
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Tyr
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Gly
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50 55 60
Lys
Gly Lys Ala Thr Leu Thr val ASp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
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70 75 80
Met
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Ala
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Gln
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Thr
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Leu Gln Ser ASp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser val Thr Val pro
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Ser
Ser
Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr Cys Asn val Ala His Pro
Ala
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Ser
Ser
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230 235 240
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val
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Ser Trp Phe val Asp Asp val Glu val His Thr Ala Gln Thr Gln
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405 410 415
Ala
Gly Asn Thr phe Thr cys Ser Val Leu His GlU Gly Leu His Asn
420 425 430
His
His
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly <-ys
435 440 445
<210> 210 <211> 1335 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 210

gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120

catggagaga gccttgagtg gattggagat attaatcctt acaacgatga tactacctac 180

aaccacaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccaa cacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagagacg 300

gccgttatta ctacgaatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 420

aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480

acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 540

gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 600

gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 660

agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 720

ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 780

gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 840

gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 900

gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 960

gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1020

ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1080

gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1140

tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1200

tcttacttca tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1260

ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1320

cactctcctg gtaaa 1335
<210> 211 <211> 464 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 211
Met 1
Gly Trp Asn Trp 5 lie Phe Leu Phe Leu 10 Leu Ser Gly Thr Ala 15 Gly
val
Tyr Ser Glu 20 val Gln Leu Gln Gln 25 Ser Gly Pro Glu Leu 30 val Lys
Pro
Gly Ala 35 Tyr Ser Val Lys Met Ser 40 val Cys Lys Ala Ser Gly 45 Gly Tyr Thr Phe
Thr
Asp 50 Tyr Met Asn Trp 55 Lys Gln Ser His 60 Glu ser Leu
Glu 65
Trp He Gly Asp lie 70 Asn Pro Tyr Asn Asp 75 ASP Thr Thr Tyr Asn 80
His
Lys Phe Lys Gly 85 Lys Ala Thr Leu Thr 90 val ASp Lys ser ser 95 Asn val
Thr
Ala Tyr Met 100 Gln Leu Asn Ser Leu 105 Thr Ser Glu Asp ser 110 Ala
Tyr
Tyr
Cys 115 Ala Arg Glu Thr Ala 120 val He Thr Thr Asn 125 Ala Met Asp
Tyr
Trp 130 Gly Gln Gly Thr ser 135 val Thr val ser Ser 140 Ala Lys Thr Thr
Pro 145
Pro Ser Val Tyr Pro 150 Leu Ala Pro Gly Ser 155 Ala Ala Gln Thr Asn 160
Ser
Met Val Thr Leu 165 Trp Gly cys Leu Val Lys 170 Leu Gly Tyr Phe pro Glu 175 His Pro
val
Thr val Thr 180 Asn ser Gly Ser 185 ser Ser Gly Val 190 Thr
5
10
Phe
Pro Ala val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser ser Ser val
195 200 205
Thr
val Pro Ser Ser Thr Trp pro ser Glu Thr val Thr cys Asn val
210 215 220 lie
Ala
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys val Pro Arg
225
230 235 240
Asp
cys Gly cys Lys 245 Pro Pro Cys lie Cys Thr 250 Asp val Pro Glu val Ser 255 Thr Ser
val
Phe lie Phe 260 val Pro Lys Pro Lys 265 Val val Leu Thr He 270 Asp Leu
Thr
Pro Lys Thr Cys val Val ASP lie Ser Lys ASp pro
275 280 285
Glli
val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp val Glu val HIS Thr Ala
290 295 300
Gln
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser val
305
310 315 320
ser
Glu Leu Pro He Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
325 330 335
Lys
Cys Arg val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr
340
345 350
lie
ser Lys 355 Pro Thr Lys Gly Arg pro 360 Ala Lys Ala pro Gln val 365 Ser Tyr Thr
lie
Pro
pro 370 lie Lys Glu Gln Met 375 pro Lys Asp Lys Val 380 Val Leu Thr cys
Met
Thr ASp Phe Phe Glu Asp lie Thr Glu Trp Gln Trp
385
390 395 400
Asn
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp
405 410 415
Thr
Asp Gly Ser Tyr Phe He Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys ser
420 425 430
Asn
Trp Glu 435 Asn Ala Gly Asn Thr Phe 440 Lys Thr cys ser Val Leu 445 ser HÍS Glu Gly
Leu
His HlS HlS Thr Glu Ser Leu Ser His Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 212 <211> 1392 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 212
atgggatgga
gtccagctgc
tgtaaggctt
ggagagagcc
cacaagttca
cagctcaaca
gttattacta
gccaaaacga
tccatggtga
tggaactctg
ctctacactc
acctgcaacg
gattgtggtt
cccccaaagc
gtagacatca
gtgcacacag
agtgaacttc
aacagtgcag
aaggctccac
agtctgacct
aatgggcagc
tacttcatct
acctgctctg
tctcctggta
actggatctt
aacaatctgg
ctggatacac
ttgagtggat
agggcaaggc
gcctgacatc
cgaatgctat
cacccccatc
ccctgggatg
gatccctgtc
tgagcagctc
ttgcccaccc
gtaagccttg
ccaaggatgt
gcaaggatga
ctcagacgca
ccatcatgca
ctttccctgc
aggtgtacac
gcatgataac
cagcggagaa
acagcaagct
tgttacatga
aa
tctcttcctc
acctgagctg
attcactgac
tggagatatt
cacattgact
tgaggactct
ggactactgg
tgtctatcca
cctggtcaag
cagcggtgtg
agtgactgtc
ggccagcagc
catatgtaca
gctcaccatt
tcccgaggtc
accccgggag
ccaggactgg
ccccatcgag
cattccacct
agacttcttc
ctacaagaac
caatgtgcag
gggcctgcac
ttgtcaggaa
gtgaagcctg
tactacatga
aatccttaca
gtagacaaat
gcagtctatt
ggtcaaggaa
ctggcccctg
ggctatttcc
cacaccttcc
ccctccagca
accaaggtgg
gtcccagaag
actctgactc
cagttcagct
gagcagttca
ctcaatggca
aaaaccatct
cccaaggagc
cctgaagaca
actcagccca
aagagcaact
aaccaccata
ctgcaggtgt ctactctgag 60 gggcttcagt gaagatgtcc 120 actgggtgaa gcagagccat 180 acgatgatac tacctacaac 240 cctccaacac agcctacatg 300 actgtgcaag agagacggcc 360 cctcagtcac cgtctcctca 420 gatctgctgc ccaaactaac 480 ctgagccagt gacagtgacc 540 cagctgtcct gcagtctgac 600 cctggcccag cgagaccgtc 660 acaagaaaat tgtgcccagg 720 tatcatctgt cttcatcttc 780 ctaaggtcac gtgtgttgtg 840 ggtttgtaga tgatgtggag 900 acagcacttt ccgctcagtc 960 aggagttcaa atgcagggtc 1020 ccaaaaccaa aggcagaccg 1080 agatggccaa ggataaagtc 1140 ttactgtgga gtggcagtgg 1200 tcatggacac agatggctct 1260 gggaggcagg aaatactttc 1320 ctgagaagag cctctcccac 1380
5
10
15
20
25
<210> 213 <211> 215 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 213
ASp 1
lie Gln Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ser Phe 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
ASp
Arg Val Thr .20 Asn Trp 35 ser Thr He Thr Cys Arg Ala 25 Pro ser Ser Ser val Thr 30 Lys Ser Ser
Tyr
Leu Tyr Gln Gln Lys 40 Ala Gly Lys Ala Pro 45 ser Leu Leu
lie
Tyr 50 ser Ser Asn Leu 55 Glu Ser Gly Val Pro 60 lie Arg Phe ser
Gly 65
Gly Ser Gly Thr 70 Phe Thr Leu Thr 75 Ser ser Leu Gln 80
Pro
Glu Asp Phe Ala 85* Thr Tyr Tyr cys Gln 90 Gln Tyr Asp Phe Phe 95
Pro
ser
Thr Phe Gly 100 ser val 115 Gly Gly Thr Lys Val 105 Pro Glu lie Lys Arg Thr 110 Leu val Ala
Ala
Pro Phe lie Phe pro 120 Ser ASp GlU Gln 125 Lys Ser
Gly
Thr 130 Ala ser val val cys 135 Leu Leu Asn Asn Phe 140 Tyr pro Arg Glu
Ala 145
Lys val Gln Trp Lys 150 val Asp Asn Ala Leu 155 Gln Ser Gly Asn Ser 160
Gln
Glu Ser Val Thr 165 Thr Glu Gln Asp ser Lys 170 Asp Asp Ser Thr Tyr Ser 175 Lys Leu
ser
Ser Thr Leu 180 Leu Ser Lys Ala 185 Tyr Glu Lys His 190 val
Tyr Ser
Ala Phe 210 Gys Glu 195 Asn Arg Val Gly Thr Glu His cys 215 Gln 200 Gly Leu Ser Ser Pro 205 val Thr Lys
<210> 214 <211>645 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 214
gacatccagc tgacccagag ccccagcttc atcacatgcc gcgcctcatc ttcagttaca ccaggaaaag cacctaaact tcttatatac tctcgatttt caggatctgg atcaggcaca ccagaagact tcgccactta ttactgccaa ggaggtacaa aagtagaaat caagcgtacg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact tatcccagag aggccaaagt acagtggaag caggagagtg tcacagagca ggacagcaag acgctgagca aagcagacta cgagaaacac ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc
ctttccgcat ccgttggtga ccgagtaaca 60 tcttcttatc ttaattggta tcaacaaaaa 120 tctacatcta atctcgcatc aggagttccc 180 gaatttacac ttactatatc atcactccaa 240 caatacgatt tttttccaag cacattcgga 300 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 aacaggggag agtgt 645
<210> 215 <211>237 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
<400> 215
Met
Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1
5 10 15
Leu
Pro Gly Ala 20 Ser Arg Cys Asp He Gln 25 val Leu Thr Gln Ser Pro 30 Arg ser phe
Leu
Ser Ala val Gly Asp Arg Thr lie Thr cys Ala Ser
35 40 45
Ser
ser 50 Ala Val Thr ser Ser ir Leu Asn Trp Tyr Gln 60 Asn Gln Lys pro Gly
Lys
Pro Lys Leu Leu J J He Tyr Ser Thr Ser Leu Ala ser Gly
65
70 75 80
Val
pro Ser Arg Phe 85 Leu ser Gly Ser Gly Ser 90 Phe Gly Thr Glu Phe Thr 95 cys Leu
Thr
lie ser Ser 100 Phe Gln Pro Glu Asp 105 Phe Ala Thr Tyr Tyr 110 Lys Gln
Gln
Tyr Asp 115 Arg Phe Pro ser Thr 120 Pro Gly Gly Gly Thr 125 Phe val Glu
He
Lys Thr val Ala Ala ser val Phe lie Pro pro ser
130 135 140
Asp
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145
150 155 160
Asn
Phe Tyr pro Arg 165 Asn Glu Ala Lys val Gln 170 val Trp Lys Val ASp Asn 175 Ser Ala
Leu
Gln ser Gly Ser Gln Glu Ser Thr Glu Gln Asp Lys
180 185 190 Ala
Asp
ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
Asp
195 200 205
Tyr
Glu 210 Ser Lys His Lys Val Tyr 215 Ser Ala cys Glu val Thr 220 Glu His Gln Gly Leu
Ser
Pro val Thr Lys Phe Asn Arg Gly cys
225
230 235
<210> 216 <211> 711 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 216

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct cccaggtgcc 60

agatgtgaca tccagctgac ccagagcccc agcttccttt ccgcatccgt tggtgaccga 120

gtaacaatca catgccgcgc ctcatcttca gttacatctt cttatcttaa ttggtatcaa 180

caaaaaccag gaaaagcacc taaacttctt atatactcta catctaatct cgcatcagga 240

gttccctctc gattttcagg atctggatca ggcacagaat ttacacttac tatatcatca 300

ctccaaccag aagacttcgc cacttattac tgccaacaat acgatttttt tccaagcaca 360

ttcggaggag gtacaaaagt agaaatcaag cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 711
<210> 217 <211>447 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
Glu val Gln Leu val Gln ser Gly Ala Glu val Lvs Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser val Lys val ser cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly
Asp 50 Gly lie Asn Pro Tyr Asn 55 Thr Asp ASP Thr Thr Tyr 60 Ala Asn His Lys Phe
Lys
Arg val Thr He Arg Asp Thr ser Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys
85 90 95
Ala
Arg Glu Thr Ala val lie Thr Thr Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln
Gly Thr Thr Val Thr val Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
val
Phe Pro Leu Ala Pro cys ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala
Leu Gly cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr val
145
150 155 160
Ser
Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
Val
Gln 165 170 175
Leu
Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu ser Ser Val val Thr val
180 185 190
Pro
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr cys Asn val Asp His
195 Val 200 205
Lys
Pro Ser Asn Thr Lys Asp Lys Thr val Glu Arg Lys Cys cys
210 215 220
Val
Glu cys pro Pro cys pro Ala Pro Pro val Ala Gly Pro Ser val
225
230 235 240
Phe
Leu Phe pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr
245 250 255
pro
Glu val Thr cys val val val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
val
Gln Phe Asn Trp Tyr Val ASp Gly Val Glu val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg val Val Ser
290 295 300
val
Leu Thr val val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305
310 315 320
cys
Lys val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala pro He Glu Lys Thr He
325 330 335
Ser
Lys Thr Lys Gly Gln pro Arg Glu Pro Gln val Tyr Thr Leu pro
340 345 350
Pro
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln val ser Leu Thr cys Leu
355 360 365
Val
Lys 370 Gln Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Tyr Asp lie Ala val Glu 380 Pro Trp Glu Ser Asn
Gly 385 Asp
pro Glu Asn Asn 390 Leu Lys Thr Thr Pro 395 Thr Met Leu Asp Ser 400 Arg
Gly
Ser Phe Phe 405 Asn Tyr Ser Lys Leu 410 ser Val ASp Lys Ser 415 Ala
Trp
Gln Gln Gly Val Phe ser cys val Met His Glu Leu
His
420 425 430
Asn
His Tyr Thr Gln Lys ser Leu ser Leu ser pro Gly Lys
435 440 445
5
<210> 218 <211> 1341 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 218

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtcaagaaac ctggagcaag cgtaaaggtt 60

agttgcaaag catctggata cacatttacc gactactaca tgaattgggt acgacaagcc 120

cctggacaaa gacttgaatg gatgggagac attaaccctt ataacgacga cactacatac 180

aatcataaat ttaaaggaag agttacaatt acaagagata catccgcatc aaccgcctat 240

atggaacttt cctcattgag atctgaagac actgctgttt attactgtgc aagagaaact 300

gccgttatta ctactaacgc tatggattac tggggtcaag gaaccactgt taccgtctct 360
5

agtgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420

gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 600

acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 660

cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 720

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac 840

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 1020

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320

ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 219 <211> 466 <212> PRT
10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado 15 <400> 219
Met 1
Asp Trp Thr Trp 5 Arg He
Ala
HÍS Ser Glu 20 val Gln Leu
Pro
Gly Ala 35 Tyr ser val Lys val
Thr
Asp 50 Trp Tyr Met Asn Trp 55 Asn
Glu 65 HÍS
Met Gly ASp lie 70 Arg
Lys
Phe Lys Gly 85 Glu val
Thr
Ala Tyr Met 100 Leu ser
Tyr
Tyr
cys 115 Gly Ala Arg Glu Thr
Tyr
Trp 130 Gln Gly Thr Thr 135
Gly 145
Pro Ser val Phe Pro 150 Leu
Ser
Thr Ala Ala Leu 165 Trp Gly Cys
Val
Thr val Ser 180 val Asn Ser
Phe
Pro Ala 195 Leu Gln Ser
val
Thr 210 val Pro ser Ser Asn 215
val 225
Asp HÍS Lys Pro Ser 230 Asn
Lys
cys cys val Glu 245 Cys Pro
Pro
Ser val Phe 260 Leu Phe
Pro
Ser
Arg Thr 275 Pro Glu val Thr
Asp
Pro 290 Glu Val Gln Phe Asn 295
Asn 305
Ala Lys Thr Lys pro 310 Arg
val
val
ser val Leu 325 Thr
val
Glu
Tyr Lys Cys 340 Ser Lys Val Ser
Lys
Thr He 355 Pro Lys Thr
Lys
Thr
Leu 370 Pro ser Arg Glu 375
Thr 385
Cys Leu val Lys Gly 390 Phe
Glu
ser Asn Gly Gln 405 pro
Glu
Leu
Asp Ser Asp 420 Trp Gly Ser Phe
Lys
ser Arg 435 Leu Gln Gln Gly
Glu qly 465
Ala 450 Lys His Asn His Tyr 455
<210> 220 <211> 1398 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
Leu
Phe Leu val Ala Ala Ala Thr Gly
10 15
val
Gln 25 cys Ser Gly Ala Glu val 30 Tyr Lys Lys
Ser
Lys Ala ser Gly Thr Phe
40
45
val
Arg Gln Ala Pro 60 ASp Gly Gln Arg Leu
pro
Tyr Asn ASp 75 Arg Thr Thr Tyr Asn 80 ser
Thr
lie Thr ASp Thr Ser Ala
90 95
Ser
Leu 105 Val Arg Ser Glu Asp Thr 110 Ala Ala val
Ala
lie Thr Thr Asn Met ASp
120
125
val
Thr val Ser ser 140 Arg Ala ser Thr Lys
Ala
Pro Cys Ser 155 Asp Ser Thr Ser Glu 160 pro
Leu
val Lys 170 Leu Tyr Phe pro Glu 175 HiS
Gly
Ala 185 Gly Thr Ser Gly val 190 Ser Thr
Ser
Leu Tyr Ser Leu Ser val
200
205
Phe
Gly Thr Gln Thr 220 Lys Tyr Thr Cys Asn
Thr
Lys val Asp 235 Ala Thr Val Glu Arg 240 Gly
Pro
Cys Pro 250 Pro Pro Pro val Ala 255 Met
Pro
Lys 265 Val Lys ASp Thr Leu 270 Ser lie
Cys
val val Asp val HiS Glu
280
285
Trp
Tyr val Asp Gly 300 Asn Val Glu val His
Glu
Glu
Gln Phe Ser Thr Phe Arg
315 320
val
His Gln ASp Trp Leu Asn Gly Lys
330 - 335
Asn
Lys 345 Gln Gly Leu pro Ala Pro 350 Gln lie Glu
Gly
pro Arg Glu Pro val Tyr
360
365
Glu
Met Thr Lys Asn Gln val ser Leu
380
Tyr
Pro ser ASp lie Ala Val Glu Trp
395 400
Asn
Asn
Tyr Lys Thr Thr Pro pro Met
410 415
Phe
Leu 425 val Tyr Ser Lys Leu Thr 430 val val Asp
Asn
Phe ser cys Ser Met His
440
445
Thr
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
460
<400> 220 5

atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactccgag 60

gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtc aagaaacctg gagcaagcgt aaaggttagt 120

tgcaaagcat ctggatacac atttaccgac tactacatga attgggtacg acaagcccct 180

ggacaaagac ttgaatggat gggagacatt aacccttata acgacgacac tacatacaat 240

cataaattta aaggaagagt tacaattaca agagatacat ccgcatcaac cgcctatatg 300

gaactttcct cattgagatc tgaagacact gctgtttatt actgtgcaag agaaactgcc 360

gttattacta ctaacgctat ggattactgg ggtcaaggaa ccactgttac cgtctctagt 420

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480

agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 660

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 720

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 780

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc.agttcaacag cacgttccgt 960

gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380

tccctgtctc cgggtaaa 1398
<210> 221
<211> 215 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado 15
<400> 221
Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro ser Ser Leu ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg val Thr lie Thr Cys Ser val ser Ser Thr He Ser Ser Asn 20 25 30
HÍS
Leu His 35 Trp phe Gln Gln
lie
Tyr 50 Gly Thr ser Asn Leu 55
Gly 65
ser Gly Ser Gly Thr 70 ASP
pro
Glu Asp Phe Ala 85 Thr Tyr
Leu
Thr Phe Gly 100 val Gly Gly Thr
Ala
Pro Ser 115 Phe He Phe
Gly
Thr 130 Ala Ser val val Cys 135
Ala 145
Lys val Gln Trp Lys 150 Val
Gln
GlU ser Val Thr 165 Glu
Gln
Ser
Ser
Thr Leu 180 Thr Leu
Ser
Tyr
Ala cys 195 Asn Glu val Thr His
Ser
Phe 210 Arg Gly Glu Cys 215
<210> 222 <211> 645 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
10
<400> 222
Lys 40
Pro Gly Lys Ala Pro 45 Lys Ser Leu
Ala
ser Gly Val Pro 60 Ser Arg Phe Ser
Phe
Thr Leu Thr 75 He Ser ser Leu Gln 80
Tyr
Cys Gln 90 Glu Gln Trp Ser ser Tyr 95 val Pro
Lys
val 105 Pro lie Lys Arg Thr 110 Leu Ala
pro 120 Leu
Ser ASp Glu Gln 125 Tyr Lys ser
Leu
Asn Asn Phe 140 Gln Pro Arg Glu
Asp
Asn Ala Leu 155 ASp ser Gly Asn Ser 160 Leu
Asp
Ser Lys 170 ser Thr Tyr ser 175
Lys
Ala 185 Gly ASp Tyr Glu Lys His 190 val Lys Val
Gln 200
Leu ser ser Pro 205 Thr Lys
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ataacatgca gcgtatcatc aactatatca cccggcaaag cacctaaatc acttatatac tcaagatttt caggctctgg ctcaggcacc cccgaagact tcgcaaccta ttactgtcaa ggcggcacaa aagtagaaat taaacgtacg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact tatcccagag aggccaaagt acagtggaag caggagagtg tcacagagca ggacagcaag acgctgagca aagcagacta cgagaaacac ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc
ctctcagcat ccgtaggcga tagagttaca 60 tcaaatcatc ttcattggtt ccaacagaaa 120 ggcacatcaa atctcgcatc aggcgttcct 180 gactttactc ttacaatatc ctccctccaa 240 caatggtcct catatccact cacatttggc 300 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 aacaggggag agtgt 645
15 <210> 223
<211>237 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 223
5
10
15
Met
Q. W < Met Arg val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1
5 10 15
Leu
Arg Gly Ala. Arg Cys Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu
Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg val Thr He Thr Cys Ser val Ser
35 40 45
Ser
Thr He Ser ser Asn His Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys
Ala Pro Lys Ser Leu lie Tyr Gly Thr ser Asn Leu Ala Ser Gly
65
70 75 80
Val
pro Ser Arg Phe 85 Ser Gly Ser Gly Ser 90 Gly Thr Asp Phe Thr 95 Leu
Thr
lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln
100 105 110
Gln
Trp ser ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu
115 120 125
He
Lys Arg Thr Val Ala Ala pro ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp
GlU Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala ser val val cys Leu Leu Asn
145
150 155 160
Asn
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gln Trp Lys val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu
Gln ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
Thr 180 185 190
Asp
Ser Tyr Ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp
195 200 205
Tyr
Glu n Lys HÍ S Lys val Tyr OIC Ala Cys Glu Val Thr 77Cl His Gln Gly Leu
Ser
ser Pro val Thr Lys ser phe Asn Arg Gly Glu Cys
225
230 235
<210> 224 <211> 711 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 224
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctct cagcatccgt gttacaataa catgcagcgt atcatcaact atatcatcaa atcatcttca cagaaacccg gcaaagcacc taaatcactt atatacggca catcaaatct gttccttcaa gattttcagg ctctggctca ggcaccgact ttactcttac ctccaacccg aagacttcgc aacctattac tgtcaacaat ggtcctcata tttggcggcg gcacaaaagt agaaattaaa cgtacggtgg ctgcaccatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg
ccgaggtgcc 60 aggcgataga 120 ttggttccaa 180 cgcatcaggc 240 aatatcctcc 300 tccactcaca 360 tgtcttcatc 420 cctgctgaat 480 ccaatcgggt 540 cctcagcagc 600 cgaagtcacc 660 t 71i
<210> 225 <211> 451 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
<400> 225
Glu i
val Gln Leu Val C Gln Ser Gly Ala Glu 10 Asp val Lys Lys Pro Gly 15 ASp Ala
Ser
val Lys val 20 Trp 0 Ser cys Lys Ala ser 25 Pro Phe Asn He Lys 30 Glu Phe
Tyr
Leu HIS val Arg Gln Ala Gly Gln Gly Leu Trp He
35 40 45
Gly
Arg He Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Leu Tyr A5P Pro Lys phe
50 55 60
Gln
ASp Lys Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Arg Ser 85 Asp Leu Arg Ser Asp Asp 90 Gly Thr Ala val Tyr Tyr 95 Tyr Cys
Ala
Arg Glu Ala Tyr phe His ASp Thr Ser Tyr Trp Phe
100 105 110
Asp
val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser ser Ala Ser Thr
115 Val 120 125
Lys
Gly Pro ser Phe Pro Leu Ala Pro cys Ser Arg Ser Thr ser
130 Thr 135 140
Glu
Ser Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr Phe pro
Glu
145
Thr 150 155 160
Pro
val Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr
Phe pro Ala val Leu Gl n Ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser Ser
180 185 190
val
val
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr cys
195 HÍS 200 205
Asn
val 210 Lys Asp Lys Pro Ser 215 cys Asn Thr Lys val Asp 220 Ala Lys Thr Val Glu
Arg
cys cys val Glu Pro pro cys Pro Pro Pro val Ala
225
230 235 240
Gly
Pro ser val Phe Leu phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
lie
ser Arg Thr 260 Glu Pro Glu val Thr cys 265 Trp Val Val val Asp val 270 val ser His
GlU
Asp Pro Val Gln Phe Asn Tyr val Asp Gly Glu val
275 280 285
HÍS
Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg
val Val ser Val Leu Thr Val val His Gln ASp Trp Leu Asn Gly
305
310 315 320
Lys
Glu Tyr Lys Cys 325 Ser Lys Val ser Asn Lys 330 Gln Gly Leu Pro Ala pro 335 Gln He
Glu
Lys Thr He 340 Pro Lys Thr Lys Gly 345 Glu Pro Arg Glu pro 350 Gln Val
Tyr
Thr Leu Pro Ser Arg Glu Met Thr Lys Asn val ser
355 360 365
Leu
Thr 370 Glu cys Leu Val Lys Gly 375 Pro Phe Tyr Pro Ser Asp 380 Lys lie Ala val Glu
Trp
ser Asn Gly Gln Glu Asn Asn Tyr Thr Thr pro Pro
385
390 395 400
Met
Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val
405 410 415
Asp
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn val Phe Ser Cys Ser val Met
420 425 430
HÍS
Glu Ala Leu HÍS Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser
435 440 445
Pro
Gly Lys
450
<210> 226 <211> 1353 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
5
10

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctgactt caacattaaa gacttctatc tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gattggaagg attgatcctg agaatggtga tactttatat 180

gacccgaagt tccaggacaa ggtcaccatg accacagaca cgtccaccag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaggcg 300

gattatttcc acgatggtac ctcctactgg tacttcgatg tctggggccg tggcaccctg 360

gtcaccgtct ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 420

aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480

ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct 540

gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcaac 600

ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accccgaggt ccagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccacggga ggagcagttc 900

aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc accgttgtgc accaggactg gctgaacggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc 1200 atgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 227 <211> 470 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 227
Met
Asp Trp Thr Trp Arg He Leu Phe Leu val Ala Ala Ala Thr Gly
1
5 10 15
Ala
His Ser Glu Val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro
Gly Ala Ser val Lys val ser Cys Lys Ala ser Asp phe Asn lie
35 40 45
Lys
Asp 50 Trp Phe Tyr Leu His Trp 55 Asp val Arg Gln Ala Pro 60 Asp Gly Gln Gly Leu
Glu 65 Pro
lie Gly Arg lie 70 Lys pro Glu Asn Gly 75 Thr Thr Leu Tyr Asp 80 Ser
Lys
Phe Gln Asp 85 Glu val Thr Met Thr 90 Arg Asp Thr Ser Thr 95 Ala
Thr
Ala Tyr Met 100 Ala Leu Arg ser Leu 105 Tyr ser Asp Asp Thr 110 Thr Val
Tyr
Tyr Cys 11C Arg Glu Ala Asp 120 Arg Phe His Asp Gly 125 Thr ser
Tyr
Trp
ISS Phe Asp Val Trp Gly Gly Thr Leu Val val Ser Ser
135 140
Ala
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala pro cys Ser Arg
145
150 155 160
Ser
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe
Pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser
180 185 190
Gly
val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr ser
195 200 205
Leu
Ser Ser Val Val Thr Val Pro ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr 225
Thr Cys Asn val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys
230 235 240
Thr
val Glu Arg Lys 245 Pro cys cys val Glu Cys 250 Phe Pro Pro cys Pro Ala 255 Lys pro
Pro
val Ala Gly ser val Phe Leu Pro Pro Lys Pro ASp
260 265 270
Thr
Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val Val val Asp
275 280 285
val
Ser His Glu ASp Pro Glu val Gln Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly
290 295 300
val
Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
305
310 315 320
Ser
Thr Phe Arg val val Ser val Leu Thr val Val His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys Val ser Asn Lys Gly Leu Pro
Ala
340 345 350
Pro
He Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln pro Arg Glu
Gln 355 360 365
Pro
val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
Gln
370 375 380
val
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr pro Ser Asp He
385
Val 390 395 400
Ala
Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr
Pro Pro Met 420 Asp Leu Asp Ser Asp Gly 425 Gln Ser Phe Phe Leu Tyr 430 phe Ser Lys
Leu
Thr val Lys Ser Arg Trp Gln Gly Asn Val Ser cys
435 440 His 445
Ser
val Met His Glu Ala Leu His Asn Tyr Thr Gln Lys ser Leu
450 455 460
ser 465
Leu Ser Pro Gly &
<210> 228 <211> 1410 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
<400> 228 5
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg tgcaaggctt ctgacttcaa cattaaagac ggacaagggc ttgagtggat tggaaggatt ccgaagttcc aggacaaggt caccatgacc gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg tatttccacg atggtacctc ctactggtac accgtctcta gtgcctccac caagggccca agcacctccg agagcacagc ggccctgggc gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg ctacagtcct caggactcta ctccctcagc ggcacccaga cctacacctg caacgtagat acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg ctggactccg acggctcctt cttcctctac cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa
<210> 229 <211> 213 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
gtggcagcag ccacaggagc ccactccgag 60 aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 ttctatctac actgggtgcg acaggcccct 180 gatcctgaga atggtgatac tttatatgac 240 acagacacgt ccaccagcac agcctacatg 300 gccgtgtatt actgtgcgag agaggcggat 360 ttcgatgtct ggggccgtgg caccctggtc 420 tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900 aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960 gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado 15
<400> 229
ASp 1
He Gln Leu Thr C Gln Ser Pro Ser Phe 10 ser Leu Ser Ala Ser Val 15 Tyr Gly
ASp
Arg Val Thr 20 Gln lie Thr Cys Arg Ala 25 pro Gly Lys 40 Ser ser He Ser 30 Leu He
HÍS
Trp Tyr 35 Gln Lys Ala pro Lys Leu 45 He Tyr
Ala
Thr 50 Ser ser Asn Leu Ala Ser Gly val 55 Thr Leu Thr pro ser Arg 60 Ser Phe ser Gly Ser
Gly 65
Gly Thr Glu Phe 70 lie ser 75 Leu Gln Pro Glu 80
Asp
Phe Ala Thr Tyr 85 Thr Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Lys Ser Ser Asp Pro Leu 95 Ala Thr
Phe
Gly Gly Gly 100 Lys val Glu lie 105 Arg Thr val Ala 110 Pro
Ser
val Phe lie Phe pro Pro
Ser
115 120
Ala
ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135
val
Glrt Trp Lys Val Asp Asn Ala
145
150
Ser
val Thr Glu Gln i a1: Asp ser Lys
Thr
Leu Thr Leu 1 ftfi IDJ Ser Lys Ala Asp
cys
Glu val xou Thr His Gln Gly Leu
195 200
Asn
Arg Gly Glu cys
210
ASp
Glu Gln Leu Lys 1 Ser Gly Thr
Asn
Phe Tyr Pro i dn Arg Glu Ala Lys
Leu
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
155 160
ASp
Ser Thr Tyr Ser Leu ser Ser
170
175
Tyr
Glu Lys His Lys val Tyr Ala
18 S
190
Ser
ser Pro val Thr Lys ser Phe
205
<210> 230
<211> 639 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
10
<400> 230
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc atcacttgca gggccagctc aagtataagt aaagccccta agctcctgat ctatgccaca ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg accaaggtgg agatcaaacg tacggtggct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat agtgtcacag agcaggacag caaggacagc agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg
ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 tacatacact ggtatcagca aaaaccaggg 120 tccaacctgg cttctggggt cccatcaagg 180 actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa 240 agtagtgacc cactcacgtt cggcggaggg 300 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 ggagagtgt 639
15 <210> 231
<211>235 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 231
5
10
15
Met i
Asp Met Arg val e Pro Ala Gln Leu Leu 10 Gln Leu 25 Val Thr Gly Leu Leu Leu Leu 15 ser Trp
X Leu
Pro Gly Ala 20 Ser j Arg Cys ASp lie Thr Gln ser pro 30 Arg Phe
Leu
Ser Ala 35 Val Gly Asp Arg 40 He Thr cys 45 Ala Ser
ser
ser 50 Lys lie Ser Tyr lie His 55 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 60 Ala pro Gly Lys Ala
Pro 65
Leu Leu He Tyr 70 Thr Ser Asn Leu 75 Ser Gly Val Pro 80
Ser
Arg Phe ser Gly 85 Pro ser Gly ser Gly Thr 90 Ala Thr 105 Gly Gly Glu Phe Thr Leu Thr 95 Gln lie
Ser
ser Leu Gln 100 Pro Glu Asp Phe Tyr Tyr Cys Gln 110 Glu Trp
Ser
Ser
Asp 115 val Leu Thr Phe Gly 120 val Thr Lys val 125 Pro He Lys
Arg
Thr 130 Ala Ala Pro ser 135 Phe lie Phe Pro 140 ser ASp Glu
Gln 145
Leu Lys ser Gly Thr 150 Ala Ser val val cys 155 Leu Leu Asn Asn Phe 160
Tyr
Pro Arg Glu Ala 165 Lys val Gln Trp Lys 170 Val Asp Asn Ala Leu 175 Gln
Ser
Gly Asn Ser 180 Leu Gln Glu ser Val Thr 185 Thr Glu Gln Asp Ser Lys 190 Asp Asp
Ser
Thr
Tyr Ser 195 Lys Ser Ser Thr Leu 200 Glu Leu Ser Lys Ala 205 Gly Tyr Glu
Lys
His 210 Val val Tyr Ala cys 215 Asn Val Thr His Gln 220 Leu Ser Ser
Pro 225
Thr Lys Ser Phe 230 Arg Gly Glu cys 235
<210> 232 <211> 705 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 232

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgaca tccagttgac ccagtctcca tccttcctgt ctgcatctgt aggagacaga 120

gtcaccatca cttgcagggc cagctcaagt ataagttaca tacactggta tcagcaaaaa 180

ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gccacatcca acctggcttc tggggtccca 240

tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gaattcactc tcacaatcag cagcctgcag 300

cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcag cagtggagta gtgacccact cacgttcggc 360

ggagggacca aggtggagat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705
<210> 233 <211>447 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 233
Gilí
val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
val Lys Val 20 Trp Ser Cys Lys Ala ser 25 Pro Gly phé Asp lie Lys 30 Glu Asp Tyr
Tyr
He His val Arg Gln Ala Gly Gln Gly Leu Trp lie
35 40 45
Gly
Arg 50 Gly val Asp Pro Asp Asn 55 Thr Gly Glu Thr Glu Phe 60 He Ala Pro Lys Phe
Pro
Lys Val Thr Met Thr Asp Thr Ser Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Glu Asp 100 Leu Tyr Asp Gly Thr Tyr 105 Ser Thr Trp Phe pro Tyr 110 Gly Trp Gly
Gln
Gly Thr val Thr Val Ser Ala ser Thr Lys pro Ser
115 120 125
val
Phe pro Leu Ala pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu ser Thr Ala
130 135 140
Ala
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu pro val Thr val
145
150 155 160
ser
Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe pro Ala
165 170 175
val
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser ser Val Val Thr
val
180 185 190
Pro
Ser ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn val Asp His
195 200 205
Lys
pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys Thr val Glu Arg Lys Cys cys
210 215 220
val
Glu Cys Pro Pro cys pro Ala pro Pro val Ala Gly Pro Ser
val
225
Phe 230 235 240
Phe
Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg Thr
245 250 255
Pro
Glu Val Thr 260 Asn Cys val val val Asp 265 Gly val Ser His Glu ASp 270 Asn Pro Glu
Val
Gln Phe 275 Pro Trp Tyr val Asp 280 Phe val Glu val His 285 Arg Ala Lys
Thr
Lys 290 Leu Arg Glu Glu Gln 295 Gln Asn Ser Thr phe 300 Gly Val val ser
val
Thr val Val His Asp Trp Leu Asn Lys GlU Tyr Lys
305
310 315 320
cys
Lys val Ser Asn 325 Gly Lys Gly Leu pro Ala 330 Pro Pro lie Glu Lys Thr 335 Leu lie
Ser
Lys Thr Lys 340 Glu Gln Pro Arg Glu 345 Asn Gln val Tyr Thr 350 Thr Pro
Pro
Ser Arg Glu Met Thr Lys Gln Val ser Leu Cys Leu
355 360 365
val
Lys 370 Gln Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Tyr Asp He Ala val Glu 380 pro Trp Glu Ser Asn
Gly
Pro Glu Asn Asn Lys Thr Thr Pro Met Leu Asp Ser
385
390 395 400
Asp
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg
405 410 - 415
Trp
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys ser val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
HlS
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 234 <211> 1341 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
5
10

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggatt cgacattaag gactactata tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatcggaagg gttgatcctg acaatggtga gactgaattt 180

gccccgaagt tcccgggcaa ggtcaccatg accacagaca cgtccatcag cacagcctac 240

atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaagac 300

tacgatggta cctacacctg gtttccttat tggggccaag ggactctggt caccgtctct 360

agtgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420

gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 600

acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 660

cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 720

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac 840

99cgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 1020

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320

ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 235 <211> 466 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 235
Met 1
ASp Trp Thr Trp 5 Arg lie Leu Phe Leu 10 val Ala Ala Ala Thr 15 Gly
Ala
HÍS ser Glu 20 ser val Gln Leu Val Gln 25 cys Ser Gly Ala Glu val 30 Phe Lys Lys
Pro
Gly Ala 35 val Lys Val ser 40 Lys Ala ser Gly 45 Asp lie
Lys
Asp 50 Trp Tyr Tyr lie His Trp 55 ASp val Arg Gln Ala Pro 60 Glu Gly Gln Gly Leu
Glu 65
lie Gly Arg val 70 Pro Asp Asn Gly 75 Thr Glu Phe Ala 80
Pro
Lys Phe Pro Gly 85 Glu Lys val Thr Met Thr 90 Arg Thr Asp Thr ser He 95 Ala Ser
Thr
Ala Tyr Met 100 Leu Ser Arg Leu 105 Ser Asp Asp Thr 110 Val
Tyr
Tyr
Cys 115 Gly Ala Arg Glu ASp Tyr 120 Val Asp Gly Thr Tyr Thr 125 Ala Trp Phe Pro
Tyr
Trp 130 Gln Gly Thr Leu 135 Thr Val ser Ser 140 Ser Thr Lys
Gly 145
pro Ser val Phe Pro 150 Leu Ala Pro cys Ser 155 Arg Ser Thr Ser Glu 160
Ser
Thr Ala Ala Leu 165 Trp Gly cys Leu Val Lys 170 Leu Asp Tyr Phe Pro Glu 175 His Pro
Val
Thr val Ser 180 val Asn Ser Gly Ala 185 Gly Thr ser Gly Val 190 Ser Thr
Phe
pro Ala 195 Leu Gln Ser ser 200 Leu Tyr ser Leu 205 Ser val
val
Thr 210 Val Pro ser Ser Asn 215 Phe Gly Thr Gln Thr 220 Tyr Thr Cys Asn
val 225
Asp HIS Lys Pro ser 230 Asn Thr Lys val Asp 235 Lys Thr val Glu Arg 240
Lys
Cys Cys val Glu 245 Leu cys Pro Pro Cys Pro 250 Pro Ala Pro Pro val Ala 255 Met Gly
Pro
Ser val Phe 260 Phe pro pro Lys 265 Lys Asp Thr Leu 270 He
ser
Arg Thr 275 Glu Pro Glu val Thr cys 280 Trp val val val ASp val 285 val ser His Glu
Asp
Pro 290 Ala val Gln Phe Asn 295 Arg Tyr val Asp Gly 300 Asn Glu val HiS
Asn 305 val
Lys Thr Lys Pro 310 Thr Glu Glu Gln Phe 315 ASp ser Thr Phe 328 Lys
val
Ser val Leu 325 Val val His Gln 330 Trp Leu Asn Gly 335
Glu
Tyr Lys Cys 340 Ser Lys val Ser Asn Lys 345 Gln Gly Leu pro Ala Pro 350 Gln lie
Glu
Lys
Thr lie 355 Pro Lys Thr Lys Gly 360 Glu Pro Arg Glu Pro 365 Gln val Tyr
Thr
Leu 370 pro Ser Arg Glu 375 Met Thr Lys Asn 380 Val ser Leu
Thr 385
Cys Leu val Lys Gly 390 Phe Tyr pro Ser Asp 395 He Ala Val Glu Trp 400
Glu
Ser Asn Gly Gln 405 Gly Pro Glu Asn Asn Tyr 410 Tyr Lys Thr Thr Pro pro 415 val Met
Leu
Asp ser Asp 420 Ser Phe Phe Leu 425 Ser Lys Leu Thr 430 Asp
Lys
Ser Arg 435 Trp Gln Gln Gly Asn 440 Val Phe Ser Cys Ser 445 val Met His
Glu Gly 465
Ala 450 Lys Leu His Asn His Tyr 455 Thr Gln Lys Ser Leu 460 Ser Leu Ser Pro
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
5
10
15
20
25
30
35
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg tgcaaggctt ctggattcga cattaaggac ggacaagggc ttgagtggat cggaagggtt ccgaagttcc cgggcaaggt caccatgacc gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gatggtacct acacctggtt tccttattgg gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct tccctgtctc cgggtaaa
gtggcagcag ccacaggagc ccactccgag 60 aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180 gatcctgaca atggtgagac tgaatttgcc 240 acagacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gccgtgtatt actgtgcgag agaagactac 360 ggccaaggga ctctggtcac cgtctctagt 420 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 600 gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 660 aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 720 gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840 gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900 cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 960 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380
1398
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Gly Thr Ser Asn Leu Ala ser 1 5
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imagen41
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Arg Ala ser Gln Asp lie ser Ser Tyr Leu Asn 15 10
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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Gln Gln Asp lie Lys His Pro Thr 1 5
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Trp Ala ser Thr Arg His Thr 1 5
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Gln Gln Tyr ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5
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10
15
20
25
30
35
40
45
50
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Leu Gly Tyr Asp Asp He Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp val 15 10
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Asp Tyr Asn Met His 1 5
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Gly
<210> 250 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus
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Leu val Tyr Asp Gly Ser Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10
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Asp Tyr Asn Met His
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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Leu Gly Tyr val Gly Asn Tyr Glu Asp Trp Tyr phe Asp val 15 10
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Gly
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Leu Gly Tyr Asp Asp lie Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp val 15 10
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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<400> 259
Leu Gly Tyr Asp Asp lie Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp val .1 5 10
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Asp Tyr Asn Met His 1 5
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Glu lie Asn pro Asn ser Gly Gly Ala Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15
Gly
<210> 262 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 262
Leu Gly Tyr Asp Asp lie Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp val 15 10
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Asp Tyr Asn Met His 1 5
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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Leu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp val 15 10
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imagen42
<210> 267 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 267
Arg lie Asp Pro Asp Asn Gly Glu Ser Thr Tyr val Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15
Gly
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Asp Tyr lie Met His 1 5
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
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Asp Tyr Tyr Met His
1 5
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Arg lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp lie lie Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 - 10 15
Gly
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Asp Ala Gly Asp Pro Ala Trp Phe Thr Tyr 15 10
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Arg Ala Ser ser Ser val Tyr Tyr Met His 15 10
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10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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Ala Thr ser Asn Leu Ala Ser 1 S
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imagen43
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<400> 279
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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Ala Thr ser Asn Leu Ala ser 1 5
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Gln Gln Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Thr 1 5
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Asp Tyr Phe lie His 1 5
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Arg Leu Asp Pro Glu Asp Gly Glu ser Asp Tyr Ala Pro Lys phe Gln 15 10 15
ASp
<210> 289 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 289
Glu Asp Tyr Asp Gly Thr Tyr Thr Phe Phe Pro Tyr 15 10
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Asp Phe Tyr Leu His 1 5
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Arg lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 15 10 15
Asp
<210> 292 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 292
Glu Ala Asp Tyr phe His Asp Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp val 15 10 15
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Asp Tyr Tyr ile His
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
Arg val Asp Pro Asp Asn Gly Glu Thr Glu Phe Ala Pro Lys Phe Pro 15 10 15
Gly
<210> 295 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 295
Glu Asp Tyr Asp Gly Thr Tyr Thr Trp Phe Pro Tyr 15 10
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<400> 296
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<400> 297
Asp lie Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Thr Tyr Asn His Lys Phe Lys 15 10 15
Gly
<210> 298 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 298
Glu Thr Ala val lie Thr Thr Asn Ala Met Asp 15 10
<210> 299 <211> 130 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 299
5
10
15
Met 1
Asp Phe Gln Val 5 Gln lie Phe Ser Phe 10 Met Leu He Ser val 15 Thr
val
lie Leu ser 20 Ser Gly Glu He Val 25 Leu Thr Gln Ser Pro 30 Ala Leu
Met
Ala Ala 35 lie Ser Pro Gly Glu Lys 40 Leu val Thr lie Thr Cys 45 Gln Ser Val ser
ser
ser SO Ser Ser ser Asn 55 His Trp Ser Gln 60 Lys ser Gly
Thr 65 Val
Ser Pro Lys Leu Trp 70 Ser lie Tyr Gly Thr Ser 75 Gly Asn Leu Ala Ser Gly 80 Leu
pro
val Arg Phe 85 Met Gly ser Gly ser 90 Ala Thr ser Tyr ser 95 cys
Thr
He Ser ser 100 Glu Ala Glu Asp 105 Ala Thr Tyr Tyr 110 Gln
Gln Lys
Trp Arg 130 Thr 115 Thr Thr Tyr Thr Phe 120 i Gly ser Gly Thr Lys 125 Leu Glu Leu
<210> 300 <211> 390 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 300

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc atgctaatca gtgtcacagt catattgtcc 60

agtggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca gcactcatgg ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcaccatca cctgcagtgt cagctcgagt ataagttcca gcaacttaca ctggtcccag 180

cagaagtcag gaacctcccc caaactctgg atttatggca catccaacct tgcttctgga 240

gtccctgttc gcttcagtgg cagtggatct gggacctctt attctctcac aatcagcagc 300

atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgtcaacagt ggactactac gtatacgttc 360

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<210> 301 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 301
Met
Gly Trp Asn Trp He lie Phe Phe Leu Met Ala Val val Thr Gly
1
5 10 15
val
Asn ser Glu val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Leu val Lys
20 25 30
Pro
Gly Ala 35 Tyr Ser val Lys Leu ser 40 val Cys Thr Ala Ser Gly 45 Glu phe Asn He
Lys
Asp 50 Trp Tyr He His Trp 55 Asp Lys Gln Arg pro 60 Glu Gln Gly Leu
Glu 65 Pro
lie Gly Arg lie 70 Lys Pro Asp Asn Gly 75 Ala Ser Thr Tyr val 80 Asn
Lys
Phe Gln Gly Ala Thr lie Thr Asp Thr Ser ser
Thr
Ala 85 90 95
Tyr
Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala lie
100 105 110
Tyr
Tyr
Cys 115 Trp Gly Arg Glu Gly Leu 120 Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr 125 Ser Tyr Ala Val
Asp
Tyr 130 Gly Gln Gly Thr val Thr val Ser
135 140
20
<210> 302 <211>423 <212>ADN <213> Mus musculus 25
5
10
15
20
25
30
<400> 302
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<210> 303 <211> 130 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 303
Met i
Asp Met Arg val c pro Ala Gln Leu Leu 10 Leu Gly Leu Leu Leu Leu 15 ser Trp
Leu
pro Gly Ala 20 J Arg cys Asp lie Gln 25 Thr Gln Ser pro 30 Phe
Leu
Ser Ala 35 Ser Val Gly ASp Arg 40 val Thr lie Thr cys 45 Ser val ser
ser
ser He 50 Ala Pro ser Ser ser Asn 55 lie Leu His Trp Tyr Gln 60 Ser Asn 75 Gly Thr Gln Lys Pro Gly
Uys 65 val
Lys Leu Leu 70 Ser Tyr Gly Thr Leu Ala Ser Gly 80 Leu
pro ser
Arg Phe 85 Leu Gly ser Gly Ser 90 Phe Glu Phe Thr 95 cys
Thr
lie Ser ser 100 Gln Pro Glu Asp 105 Ala Thr Tyr Tyr 110 Gln
Gln Lys
Trp Thr 115 Arg 130 Thr Thr Tyr Thr Phe 120 Gly Gln Gly Thr Lys 125 Leu Glu lie
<210> 304 <211>390 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 304

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ggccagggca ccaaactgga aattaaacgt 390
<210> 305 <211> 141 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
5
10
15
20
25
<400> 305
Met Asp Trp
Thr Trp Ser lie Leu Phe Leu val Ala Ala Pro Thr Gly
1
5 10 15
Ala His ser
Glu 20 ser Val Gln Leu val Gln 25 cys Ser Gly Ala Glu val 30 Phe Lys Lys
Pro Gly Ala 35 Lys Asp Tyr
val Lys val ser 40 val Lys Ala Ser Gly 45 Gly Asn He
Tyr
lie Hi S Trp Arg Gln Ala Pro Gln Gly Leu
50
55 60
Glu Trp Met
Gly Arg lie Asp pro Asp Asn Gly Glu Ser Thr Tyr val
65
70 75 80
Pro Lys Phe
Gln Gly 85 Glu Arg Val Thr Met Thr Thr 90 Arg ser Asp Thr Ser Thr 95 Ala ser
Thr Ala Tyr
Met Leu Arg ser Leu Asp Asp Thr val
100 105 110
Tyr Tyr Cys 115 Asp Tyr Trp
Ala Arg Glu Gly Leu 120 Leu Asp Tyr Gly ASp Tyr 125 ser Tyr Ala val
Gly
Gln Gly Thr val Thr val Ser
130
135 140
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 306

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age 423
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<400> 307

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Lys Leu Leu lie Tyr ser Thr ser Arg Leu Asn ser Gly val Pro ser

65 70 75 80
Arg Phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie ser

85 90 95

Asn Leu Ala Gln Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe cys Gln Gln Asp lie 100 105 110

Lys His pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125
5
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15 <400> 309

Met Glu Trp lie Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu ser Gly Thr Ala 15 10 15

val His ser Glu val Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Glu Leu Val 20 25 30

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Glu Trp lie Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Glu Tyr 65 70 75

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr ser Asp Lys Ser Ser 85 90 95

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Tyr Tyr Cys Ala Arg ser lie Tyr Tyr Tyr Asp Ala Pro Phe Ala 115 120 125

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Gly
Lys
Phe
Leu
Asn
80
Ser
val
Tyr
<210> 310 20 <211>417
<212>ADN <213> Mus musculus
<400> 310 25

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gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtaaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120

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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado 35
5
10
15
20
25
<400> 311
Met
Met
ser ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu cys Phe Gln
1
Thr 5 10 15
01 y
Arg cys ASp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
Ala
20 25 30
Ser
Val Gly ASp Arg val Thr lie Thr cys Arg Ala ser Gln Asp
He
35 40 45
ser
ser
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys
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65
70 75 80
Arg
Phe Ser Gly Ser ec Gly Ser Gly Thr Asp qn Phe Thr Leu Thr He QC Ser
Ser
Leu Gln Pro O J Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln y ^ ASp He
100 105 110
Lys
His Pro Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys val Glu lie Lys Arg
115 120 125
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 312

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gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggtga ccgtgtcacc 120

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gaagattttg caacttacta ctgtcaacag gatattaaac accctacgtt cggtcaaggc 360

accaaggtgg agatcaaacg t 381
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 313
5
10
15
Met
Glu Trp lie Trp C lie Phe Leu Phe Leu i n Leu ser Gly Thr Ala 1 K Gly
val
His Ser Glu val Gln Leu val Gln 1U ser Gly Ala Glu val Lys Lys
20 25 30
Pro
Gly ser Ser val Lys val ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr
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50 55 60
Glu
Trp Met Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp 7c Asp Thr Glu Tyr Asn fin
Glu
Lys Phe Lys Gl y ne ( U Arg val Thr lie Thr i 3 Ala Asp Lys ser Thr QC Ser
Thr
Ala Tyr Met Glu Leu Ser ser Leu Arg Ser GlU Asp Thr J J Ala val
100 105 110
Tyr
Tyr
Cys Ala Arg Ser He Tyr Tyr Tyr Asp Ala Pro Phe Ala
Tyr
115 120 125
Trp
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130
135
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<400> 314
Asp
lie Gln Met Thr c Gln Thr Thr Ser ser 10 Ala ser 25 Asp Gly Leu Ser Ala ser Leu 15 Ser Gly
ASp
Arg val Asn 20 Tyr lie Ser cys Arg Gln Asp lie ser 30 Leu Tyr
Leu
Asn Trp Gln Gln Lys Pro Thr val Lys Leu lie
35 40 45 Phe
Tyr
Ser 50 Thr Ser Arg Leu Asn 55 ser Gly val Pro Ser 60 Arg Ser Gly
Ser
Gly ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Ala Gln
65
70 75 80
Glu
Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp lie Lys His Pro Thr
85 90 95
Phe
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
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<400> 315
Met
Lys Ser Gln Thr Gln val Phe val Tyr Met Leu Leu Trp Leu ser
1
5 10 15
Gly
val Glu Gly 20 Gly Asp He val Met Thr 25 lie Gln ser His Lys Phe 30 ser Met ser
Thr
Ser Val 35 Thr Asp Arg val Thr 40 Tyr Thr cys Lys Ala 45 Gly Gln ASp
Val
Phe Ala val Ala Trp Gln Gln Lys Pro Gln ser Pro
50 55 60
Lys
Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg HÍS Thr Gly val Pro Asp
65
70 75 80
Arg
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser
85 90 Gln 95
Asn
Val Gln Ser Glu ASp Leu Ala Asp Tyr Phe cys Gln Tyr ser
100 105 110
Ser
Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
5
10
15
20
25
30
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tgttgaagga 60 cagggtcacc 120 acagaaacca 180 agtccctgat 240 tgtgcagtct 300 gttcggtgct 360 381
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<400> 317
Met
Gly Trp Asn Trp lie lie Phe phe Leu Met Ala Val val Thr Gly
1
5 10 15
val
Asn Ser Glu val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu val Arg
20 25 30
Pro
Gly Ala 35 Tyr Leu val Lys Leu ser 40 val Cys Lys Ala ser Gly 45 Glu Phe Asn lie
Lys
Asp Tyr Met His Trp Lys Gln Arg Pro Gln Gly Leu
50
55 60 He
Glu 65 pro
Trp He Gly Arg lie 70 Gly Lys Asp Pro Glu Asn Gly Asp 75 Thr Thr Asp He Tyr Asp 80 Asn
Lys
Phe Gln Ala ser lie Thr ser ser
85 90 95 val
Thr
Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr ser Glu ASp Thr Ala
100 105 Pro Ala Trp Phe 110
Tyr
Tyr
Cys Ala Tyr Asp Ala Gly ASP Thr Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu val Thr val ser Ser
130 135
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<210> 319 <211> 130 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
5
10
15
20
25
<400> 319
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Leu Arg Gly Ala 20
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lie Ser ser Leu 100
Tyr Ser Ser Tyr 115
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val
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Ala val 55 Trp Tyr Gln Gln 60 pro Gly Lys
Leu
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Ser 85 Gln
ser Gly Ser Gly 90 Ala Asp Phe Thr Leu 95 Gln
pro
Glu Asp Phe 105 Gly Thr Tyr Tyr cys 110 val Gln
Pro
Leu Thr Phe 120 Gly Gly Thr Lys 125 Glu lie
<210> 320 <211> 390 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado
<400> 320
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 321
5
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Met
Asp Trp Thr Trp Ser lie Leu Phe Leu val Ala Ala Pro Thr Gly
1
5 10 15
Ala
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Ala 20 25 30
Pro
Gly Ser val Lys val Ser 40 Val cys Lys Ala ser Gly Phe 45 Gly Gln Asn lie
Lys
Asp 50 jrp Tyr Tyr Met His Trp 55 Asp Arg Gln Ala pro 60 ASp Gly Leu
Glu 65 Pro
lie Gly Arg lie 70 Arg pro Glu Asn Gly 75 Thr Thr 90 Arg ser lie lie Tyr Asp 80 Ser
Lys
Phe Gln Gly 85 Glu val Thr Met ASp Thr ser Thr 95 Ala
Thr
Ala Tyr Met Leu Arg Ser Leu ASP Asp Thr Val
100 105 110
Tyr
Tyr
Cys 115 Gly Ala Tyr Asp Ala Gly 120 Val ASp pro Ala Trp Phe Thr 125 Tyr Trp
Gly
Gln Thr Leu Val Thr Ser ser
130
135
<210> 322 <211> 414 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 322

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gtgcagctgg tgcagagcgg cgcggaagtg aaaaaaccgg gcgcgagcgt gaaagtgagc 120

tgcaaagcga gcggctttaa cattaaagat tattatatgc attgggtgcg ccaggcgccg 180

ggccagggcc tggaatggat cggccgcatt gatccggaaa acggcgatat tatttatgat 240

ccgaaatttc agggccgcgt gaccatgacc accgatacca gcaccagcac cgcgtatatg 300

gaactgcgca gcctgcgcag cgatgatacc gcggtgtatt attgcgcgta tgatgcgggc 360

gatccggcgt ggtttaccta ttggggccag ggcaccctgg tgaccgtctc gagc 414
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<400> 323
Thr
ASp Ala Ala Pro Thr val Ser lie Phe Pro Pro ser ser Glu Gln
1
5 10 15
Leu
Thr Ser Gly Gly Ala ser val Val cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro
Lys Asp lie Asn Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn
Gly 50 ser Val Leu Asn ser Trp 55 Leu Thr Asp Gln Asp ser 60 ASp Lys ASp ser Thr
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Met Ser Ser Thr 70 cys Thr Leu Thr Lys 75 Lys Glu Tyr Glu Arg 80 Pro
Asn
ser Tyr Thr 85 Phe Glu Ala Thr His 90 Cys Thr Ser Thr Ser 95
lie
val Lys ser Asn Arg Asn Glu
100 105
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Ala 1
Lys Thr Thr Pro c Pro Ser val Tyr Pro 10 Gly Leu Ala Pro Gly Ser 15 Gly Ala
X Ala
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Phe
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35 40 45
Gly
Val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50
55 60
Ser
Ser
Ser
val Thr val pro ser ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65
70 75 80
Thr
Cys Asn val Ala 85 Asp His Pro Ala ser ser 90 Pro Thr Lys val Asp Lys 95 val Lys
lie
Val Pro Arg ion Cys Gly Cys Lys 105 Pro Cys lie cys Thr 110 Asp pro
Glu
val Ser IvV Ser val Phe lie phe Pro Lys pro Lys val Leu
115 120 125
Thr
He 130 Asp Thr Leu Thr Pro Lys 135 Gln val Thr cys Val Val 140 Val val ASp lie Ser
Lys
Asp Pro Glu val phe Ser Trp Phe Asp ASp val Glu
145
150 155 160
val
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Phe
Arg Ser Val 180 Phe Ser Glu Leu pro He 185 Asn Met His Gln Asp Trp 190 Pro Leu Asn
Gly
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He
Glu 210 Tyr Thr lie Ser Lys 215 pro Lys Gly Arg Pro 220 Ala Ala pro Gln
Val
Thr lie Pro Pro Lys Glu Gln Met Lys Asp Lys val
225
230 235 240
ser
Leu Thr cys Met 245 Asn lie Thr Asp Phe Phe 2S0 Glu Pro Glu Asp He Thr 255 Thr Val
Glu
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pro
lie Met 275 Lys Thr Asp Gly ser 280 Ala Phe val Tyr ser 285 Thr Leu Asn
val
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val
Leu
Glu Gly Leu His His His Thr Glu Ser Leu Ser His
305
310 315 320
ser
Pro Glv LVS
<210> 325 <211> 106 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 325
10
Thr val
Ala Ala Pro Ser val Phe
1
5
Leu
Lys Ser Gly 20 Ala Thr Ala ser Val
Pro Arg
Glu Lys val Gln Trp
35 40
Gly Asn
Ser Gln Glu Ser Val Thr
50 Thr 55
Tyr
Ser Leu Ser Ser Leu Thr
65
70
His
Lys val Tyr Ala 85 Phe Cys Glu val
Val
Thr Lys ser- Asn Arg Gly
100
lie
Phe 10 Pro Pro Ser Asp Glu 15 Gln
val 25
cys Leu Leu Asn Asn 30 Phe Tyr
Lys
val Asp Asn Ala 45 Lys Leu Gln Ser
Glu
Gln Asp ser 60 Ala Asp ser Thr
Leu
ser Lys 75 Asp Tyr Glu Lys 80
Thr Glu 105
His 90 cys Gln Gly Leu Ser ser 95 Pro
<210> 326 <211> 327 <212> PRT
5
10
<213> Homo sapiens <400> 326
Ala i
Ser Thr Lys Gly c Pro Ser val Phe Pro 10 Gly Leu Ala Pro cys ser 15 Asp Arg
ser
Thr Ser Glu 20 pro J Ser Thr Ala Ala Leu 25 Trp cys Leu val Lys 30 Leu Tyr
Phe
Pro Glu Val Thr Val Ser Asn Ser Gly Ala Thr Ser
35 40 45
Gly
val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50
55 60
Leu
Ser ser val Val Thr val Pro ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65
70 75 80
Tyr
Thr cys Asn val 85 Lys Asp His Lys Pro ser 90 Cys Asn Thr Lys val ASp 95 Ala Lys
Arg
val Glu Ser Tyr Gly Pro pro Pro Pro cys pro Pro
100 105 110
Glu
Phe Leu 115 Leu Gly Gly Pro ser Val 120 Thr phe Leu Phe Pro Pro 125 Cys Lys Pro Lys
Asp
Thr Met lie ser Arg pro Glu val Thr val Val val
130
135 140
Asp
val ser Gln Glu Asp Pro Glu val Gln Phe Asn Trp Tyr val
Asp
145
150 155 160
Gly
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp
Leu Asn 195 ser Gly Lys Glu Tyr Lys 200 He cys Lys val Ser Asn 205 Gly Lys Gly Leu
Pro
Ser lie Glu Lys Thr ser Lys Ala Lys Gln Pro Arg
210 215 220
Glu
Pro Gln val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225
230 235 240
Asn
Gln Val Ser Leu 245 Trp Thr cys Leu val Lys 250 Gln Gly Phe Tyr pro ser 255 Tyr Asp
lie
Ala val Glu Glu Ser Asn Gly Pro Glu Asn Asn Lys
260 265 270
Thr
Thr
pro 275 Thr pro Val Leu Asp Ser 280 Arg Asp Gly Ser Phe Phe 285 Asn Leu Tyr Ser
Arg
Leu 290 Ser Val Asp Lys Ser 295 Ala Trp Gln Glu Gly 300 Tyr Val Phe Ser
Cys
Val Met His Glu Leu His Asn His Thr Gln Lys Ser
305
310 315 320
Leu
ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 327 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 327

Glu val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys pro Gly Ala 15 10 15

Ser val Lys Met ser cys Lys Ala ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

lie Met His Trp val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys ser ser ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu ser ser Leu Thr ser Glu Gly ser Ala val Tyr Tyr cys

85 90 95
5
10
15
20
25
Ala Arg Ser lie Tyr Tyr Tyr Asp Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gl 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr val ser Ser
115
120
<210> 328 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 328
Glu val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu val Lys Pro Gly Ala
10
15
Ser val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20
25
30
lie Met His Trp val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie
35
40
45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50
55
60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr ser Asp Lys Ser Ser ser Thr Ala Tyr
65
70
75
80
Met Asp Leu ser Ser Leu Thr Ser Glu Gly Ser Ala val Tyr Tyr cys
85
90
95
Ala Arg ser lie Tyr Tyr Tyr Asp Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105
Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser
110
115
120
<210> 329 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 329
Glu val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly ser
10
15
Ser val Lys val Ser cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20
25
30
lie Met His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50
55
60
Lys Gly Arg val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr ser Thr Ala Tyr
65
70
75
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys
85
90
95
Ala Arg Ser lie Tyr Tyr Tyr Asp Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu val Thr val ser Ser
115
120
<210> 330 <211>226 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 330

Glu val Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Glu Leu val Lys pro Gly Ala 1 5 10 15

ser val Lys Met ser cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

lie Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr ser Asp Lys Ser ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Gly Ser Ala val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser lie Tyr Tyr Tyr Asp Ala pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu val Thr val ser ser Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125

lie Phe Pro Pro ser Asp Glu Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala ser val 130 135 140
val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gln Trp

145 150 155 160
Lys val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu ser val Thr

165 170 175

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu ser Ser Thr Leu Thr 180 185 190

Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr Ala cys Glu val 195 200 205

Thr His Gln Gly Leu ser ser Pro Val Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly 210 215 220
Glu Cys 225
<210> 331 <211> 447 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 331
Glu
Val Gln Leu val c Gln Ser Gly Ala Glu 10 Gly Val Lys Lys Pro Gly 15 Asp ser
X Ser
Val Lys val 20 Trp J ser cys Lys Ala ser 25 Pro Phe Thr Phe Thr 30 Glu Tyr
lie
Met HÍS 35 val Arg Gln Ala 40 Gly Gln Gly Leu 45 Trp Met
Gly
Tyr 50 Gly lie Asn Pro Tyr Asn 55 Thr ASp Asp Thr Glu Tyr 60 Thr Asn Glu Lys Phe
Lys 65 Met
Arg val Thr He 70 Leu Ala Asp Lys Ser 75 Thr ser Thr Ala Tyr 80 cys
Glu
Leu Ser Ser 85 Tyr Arg Ser Glu ASp 90 pro Ala val Tyr Tyr 95 Gly
Ala
Arg Ser lie 100 val Tyr Tyr Asp Ala 105 Ala Phe Ala Tyr Trp 110 Pro Gln
Gly
Thr Leu 115 Thr val Ser Ser 120 ser Thr Lys Gly 125 ser Val
Phe
Pro 130 Leu Ala Pro Cys ser 135 Arg Ser Thr ser Glu 140 ser Thr Ala Ala
Leu 145
Gly Cys Leu val Lys 150 ASp Tyr Phe Pro Glu 155 pro Val Thr Val ser 160
Trp
Asn ser Gly Ala 165 Leu Thr Ser Gly val 170 His Thr Phe Pro Ala 175 val
Leu
Gln ser ser 180 Gly Leu Tyr Ser Leu 185 ser ser Val val Thr 190 val Pro
Ser
ser Ser 195 Leu Gly Thr Lys Thr 200 Tyr Thr Cys Asn Val 205 Asp His Lys
Pro
ser 210 Asn Thr Lys val Asp 215 Lys Arg val Glu ser 220 Lys Tyr Gly
Pro
pro 225
cys Pro Pro cys pro 230 Ala Pro Glu phe Leu 235 Gly Gly pro Ser Val 240
Phe
Leu Phe Pro pro 245 Cys Lys Pro Lys Asp Thr 250 Val Leu Met lie ser Arg 255 pro Thr
Pro l
Glu val Thr 260 val Val val Asp 265 ser Gln Glu ASp 270 Glu
val
Gln Phe 275 Asn Trp Tyr val Asp 280 Gly Val Glu val HÍS 285 Asn Ala Lys
Thr
Lys 290 Pro Arg Glu Glu Gln 295 Phe Asn ser Thr Tyr 300 Arg val Val ser
val 305
Leu Thr Val Leu His 310 Gln Asp Trp Leu Asn 315 Gly Lys Glu Tyr 3S
Cys
Lys val Ser Asn 325 Lys Gly Leu Pro Ser 330 ser lie Glu Lys Thr 335 lie
Ser
Lys Ala Lys 340 Glu Gly Gln pro Arg Glu 345 Asn Pro Gln val Tyr Thr 350 Thr Leu pro
Pro
Ser Gln 355 Glu Met Thr Lys 360 Gln val Ser Leu 365 cys Leu
Val
Lys 370 Gln Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Tyr ASp lie Ala val Glu 380 Pro Trp Glu Ser Asn
Gly 385 ASp
Pro Glu Asn Asn 390 Leu Lys Thr Thr Pro 395 Thr val Leu Asp Ser 400
Gly
ser Phe Phe 405 Tyr Ser Arg Leu 410 val Asp Lys Ser 415 ~V V Arg
Trp
Gln Glu Gly 420 Asn Val Phe Ser Cys 425 ser Val Met His Glu 430 Ala Leu
HÍS
Asn His 435 Tyr Thr Gln Lys Ser 440 Leu ser Leu ser Leu 445 Gly Lys
<210> 332 <211> 107 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
5
10

Asp lie Gln Met Thr Gln lie Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg val ser lie Ser cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Phe Lys Leu Leu lie 35 40 45

Phe Tyr Thr ser Arg Leu Leu ser Gly val Pro ser Arg Phe ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Tyr Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80
Glu Asp phe Ala Thr Tyr Phe cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
<210> 333 <211> 324 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 333
Ala
Lys Thr Thr Pro Pro Ser val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser
Ala
1
5 10 15
Ala
Gln Thr Asn 20 Pro Ser Met Val Thr Leu 25 Trp Gly Cys Leu Val Lys 30 Leu Gly Tyr
Phe
pro Glu val Thr val Thr Asn Ser Gly ser Ser Ser
35 40 45
Gly
Val 50 Ser HiS Thr Phe Pro Ala 55 pro val Leu Gln ser Asp Leu 60 pro Ser Tyr Thr Leu
Ser
ser val Thr val ser Ser Thr Trp Glu Thr val
65
70 75 80
Thr
cys Asn val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys val Asp Lys Lys
85 90 95
lie
val Pro Arg 100 ASp Cys Gly cys Lys 105 Pro cys lie Cys Thr 110 val pro
Glu
val Ser ser Val Phe lie Phe Pro pro Lys Pro Lys Asp val Leu
115 120 125
Thr
lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys val Val val Asp He ser
130 135 140
Lys
Asp Asp Pro Glu val Gln Phe ser Trp Phe val Asp ASp val Glu
145
150 155 160
Val
His Thr Ala Gln Thr Gln pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
val 165 170 HÍS Gln Asp 175
Phe
Arg Ser Ser Glu Leu Pro He Met Trp Leu Asn
180 185 190
Gly
Lys Glu Phe Lys Cys Arg val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195
200 205
He
Glu 210 Tyr Lys Thr lie ser Lys 215 pro Thr Lys Gly Arg Pro Lys 220 Ala Lys Ala Pro Gln
val
Thr He Pro Pro Lys Glu Gln Met Asp Lys
val
225
230 235 240
Ser
Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe phe Pro Glu Asp lie Thr val
245 250 255
Glu
Trp Gln Trp 260 Asp Asn Gly Gln Pro Ala 265 Tyr Glu Asn Tyr Lys Asn 270 Lys Thr Gln
pro
lie Met Thr Asp Gly Ser Phe lie Tyr ser Leu Asn
275 280 285
val
Gln 290 His Lys Ser Asn Trp Glu 295 Asn Ala Gly Asn Thr Phe Thr 300 Lys Ser cys Ser
val
Leu
GlU Gly Leu His His His Thr Glu Leu Ser His
305
310 315 320
ser
pro Gly Lys
<211> 213 <212> PRT <213> Mus musculus
5 <400> 334

Asp lie Gln Met Thr Gln Thr Thr ser ser Leu ser Ala ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Asn lie Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr ser Thr Ser Arg Leu Asn ser Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Ala Gln

65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe cys Gln Gln Asp lie Lys His pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Ala Ala pro 100 105 110

Thr val ser lie Phe Pro Pro ser Ser Glu Gln Leu Thr ser Gly Gly 115 120 125

Ala Ser val Val cys Phe Leu Asn Asn phe Tyr Pro Lys Asp lie Asn 130 135 140
Val Lys Trp Lys lie Asp Gly ser Glu Arg Gln Asn Gly val Leu Asn

145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met ser ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn ser Tyr Thr 180 185 190

cys Glu Ala Thr His Lys Thr ser Thr ser Pro lie val Lys ser Phe 195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys 210
<210> 335 10 <211> 444
<212> PRT <213> Mus musculus
<400> 335 15
Glu
Val Gln Leu Gln Gln ser Gly pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
val Lys Met 20 Trp ser Cys Lys Ala Ser 25 Pro Gly Phe Thr Phe Thr 30 Glu Asp Tyr
He
Met His 35 He Val Lys Gln Lys 40 Asp Gly Gln Gly Leu 45 Asn Trp
He
Gly
Tyr 50 Gly Asn Pro Tyr Asn 55 Thr Asp Thr Glu Tyr 60 Ser Glu Lys phe
Lys 65 Met
Lys Ala Thr Leu 70 Leu Ser Asp Lys ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80 cys
Asp
Leu Ser Ser 85 Tyr Thr Ser Glu Gly 90 Pro Ala val Tyr Tyr 95 Gly
Ala
Arg Ser lie 100 val Tyr Tyr Asp Ala 105 Ala phe Ala Tyr Trp 110 Pro Gln
Gly
Thr Leu Thr val Ser ser Lys Thr Thr Pro ser val
115 120 125
Tyr
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130
135 140
Leu
Gly cys Leu val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr val Thr
145
150 155 160
Trp
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val HÍS Thr Phe Pro Ala val
165 170 175
Leu
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser ser Ser val Thr val Pro Ser
180 185 190
ser
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr cys Asn val Ala His Pro Ala
195 200 205
ser
ser 210 pro Thr Lys val Asp Lys 215 val Lys lie val pro 33 ser Asp cys Gly Cys
Lys
cys lie Cys Thr Pro Glu val ser Val Phe lie Phe
225
230 235 240
Pro
Pro
Lys pro Lys Asp val Leu Thr He Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr
Cys val Val 260 Val Val Asp He Ser Lys 265 Val Asp Asp Pro Glu Val 270 Thr Gln Phe
ser
Trp Phe 275 Glu Asp Asp val Glu 280 Thr HÍS Thr Ala Gln 285 Ser Gln Pro
Arg
Glu Gln Phe Asn ser Phe Arg Ser Val Glu Leu Pro
290
295 300
lie
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys cys Arg val
305
310 315 320
Asn
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr
325 330 335
Lys
Gly Arg pro 340 Ala Lys Ala pro Gln val 345 Ser Tyr Thr lie Pro Pro 350 lie Pro
Lys
Glu
Gln Met 355 pro Lys Asp Lys Val 360 Val Leu Thr Cys Met 365 Asn Thr Asp
Phe
phe Glu ASp He Thr Glu Trp Gln Trp Gly Gln Pro
370 375 380
Ala 385 Tyr
Glu Asn Tyr Lys Asn 390 Lys Thr Gln Pro He Met 395 Lys ASp Thr ASp Gly Ser 400 Ala
Phe
val Tyr ser Leu Asn val Gln Ser Asn Trp Glu
Gly
405 410 415
Asn
Thr Phe Thr Cys Ser val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
Thr 420 425 430
His
Glu Lys Ser Leu ser His Ser pro Gly Lys
435 440
<210> 336 <211> 108 5 <212> PRT
<213> Mus musculus

Asp lie Gln Met Thr Gln ser pro ser ser Leu ser Ala ser val Gly 15 10 15

Asp Arg val Thr lie Thr cys Lys Ala Ser Gln Asp val Phe Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val 100
Gly val Pro ser Arg Phe ser Gly 60
Leu Thr lie ser ser Leu Gln Pro 75 80
Gln Gln Tyr Ser ser Tyr Pro Leu 90 95
Glu lie Lys Arg 105
<210> 337 <211> 324 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 337
10
15
20
gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga attacctgca aagcgagcca ggatgtgttt accgcggtgg ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattgg gcgagcaccc cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gaagattttg cgacctatta ttgccagcag tatagcagct ggcaccaaag tggaaattaa acgt
gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 cgtggtatca gcagaaaccg 120 gccataccgg cgtgccgagt 180 ccattagcag cctgcagccg 240 atccgctgac ctttggcggc 300
324
<210> 338 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 338

Glu val Gln Leu val Gln ser 1 5
ser val Lys val ser cys Lys 20
Tyr Met His Trp Val Arg Gln

Gly Arg lie Asp Pro Glu Asn 50 55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr 65 70
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg 85
Ala Tyr Asp Ala Gly Asp Pro 100
Thr Leu val Thr Val Ser Ser 115
<210> 339 <211>357 <212>ADN <213> Mus musculus
Gly
Ala Glu 10 Gly val Lys Lys Pro Gly 15 Asp Ala
Ala
ser 25 Pro Phe Asn lie ms 30 Glu Tyr
Ala 40 Gly
Gly Gln Gly Leu 45 Asp Trp lie
Asp
lie He Tyr 60 Thr Pro Lys Phe
Thr
Asp Thr ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 cys
Ser
Asp Asp 90 Ala val Tyr Tyr 95
Ala
Trp 105 Phe Thr Tyr Trp Gly 110 Gln Gly
gaagtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac agctgcaaag cgagcggctt taacattaaa gattattata ccgggccagg gcctggaatg gatcggccgc attgatccgg gatccgaaat ttcagggccg cgtgaccatg accaccgata atggaactgc gcagcctgcg cagcgatgat accgcggtgt ggcgatccgg cgtggtttac ctattggggc cagggcaccc
cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 tgcattgggt gcgccaggcg 120 aaaacggcga tattatttat 180 ccagcaccag caccgcgtat 240 attattgcgc gtatgatgcg 300 tggtgaccgt ctcgagc 357
<210> 340 <211> 1395 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 340
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactccgag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaaqcctg ggtcctcggt gaaggtctcc 120
10
tgcaaggctt ctggttttac cttcaccgac ggtcaagggc ttgagtggat gggctatatc gagaagttca agggccgtgt cacgattacc gagctgagca gcctgcgctc tgaggacacg tactacgatg ccccgtttgc ttactggggc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ttccccccaa aacccaagga caccctcatg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc agcaatgggc agccggagaa caactacaag tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg ctgtctccgg gtaaa
tatattatgc actgggtgcg tcaggcccct 180 aacccttata atgatgacac cgaatacaac 240 gcggacaaat ccacgagcac agcctacatg 300 gccgtgtatt actgtgcgcg ttcgatttat 360 caagggactc tggtcaccgt ctctagtgcc 420 gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
1395
<210> 341 <211> 213 <212> PRT
15 <213> Mus musculus
<400> 341
5
10
15
Asp
lie Gln Met Thr Gln ser pro ser Ser Leu ser Ala Ser val Gly
1
5 10 15
Asp
Arg val Thr 20 Tyr He Thr Cys Arg Ala 25 Gly ser Gln Asp lie ser 30 Leu Ser Tyr
Leu
Asn Trp 35 Thr Gln Gln Lys Pro 40 Ser Lys Ala pro Lys 45 Arg Leu lie
Tyr
ser 50 Gly ser Arg Leu Asn 55 Phe Gly Val pro ser 60 ser Phe Ser Gly
ser
Ser Gly Thr Asp Thr Leu Thr lie Ser Leu Gln Pro
65
70 75 80
Glu
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Asp lie Lys His Pro Thr
85 90 95
Phe
Gly Gln Gly 100 He Thr Lys val Glu He 105 Asp Lys Arg Thr Val Ala 110 ser Ala pro
Ser
val Phe Phe pro Pro ser Glu Gln Leu Lys Gly Thr
115 120 125
Ala
ser 130 Gln Val val cys Leu Leu 135 Asn Asn Asn Phe Tyr Pro 140 Gly Arg Glu Ala Lys
val
Trp Lys val Asp Ala Leu Gln Ser Asn Ser Gln Glu
145
150 155 160
Ser
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
Ser
Ser
165 170 175
Thr
Leu Thr Leu 180 Thr ser Lys Ala ASp Tyr 185 Ser Glu Lys His Lys Val 190 Lys Tyr Ala
cys
Glu val His Gln Gly Leu Ser pro val Thr Ser Phe
195 200 205
Asn
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 342 <211> 639 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 342
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggtga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gcgcaagtca ggatattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattct acttcccgtt tgaatagtgg ggtcccatca 180
cgcttcagtg gcagtggctc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag gatattaaac accctacgtt cggtcaaggc 300 accaaggtgg agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639
<210> 343 <211>235 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 343
5
10
15
Met 1
Asp Met Arg val 5 Pro Ala Gln Leu Leu Gly 10 Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Leu
Arg Gly Ala 20 Ser Arg cys Asp lie Gln 25 Val Met Thr Gln Ser Pro 30 cys Arg 45 Lys Pro Ser ser
Leu
Ser Ala 35 lie Val Gly ASp Arg 40 Asn Thr He Thr Ala Ser
Gln
Asp 50 pro ser ser Tyr Leu 55 Tyr Trp Tyr Gln Gln 60 Leu Gly Lys
Ala 65 Pro
Lys Leu Leu He 70 Gly Ser Thr Ser Arg 75 Gly Thr 90 Ala Thr Asn Ser Gly val 80 Thr
ser
Arg Phe ser 85 Gln ser Gly ser Asp Phe Thr Leu 95 Gln
lie
ser ser Leu 100 Pro Glu Asp Phe 105 Tyr Tyr Cys 110 Gln
Asp
lie Lys US val His Pro Thr Phe Gly 120 val Gln Gly Thr Lys val Glu 125 Pro Ser lie Lys
Arg
Thr 130 Ala Ala Pro Ser 135 Phe lie Phe Pro 140 Asp Glu
Gln 145
Leu Lys Ser Gly Thr 150 Ala Ser val val Cys 155 Leu Leu Asn Asn Phe 160
Tyr
Pro Arg Glu Ala 165 Gln Lys val Gln Trp Lys val 170 Glu Gln Asp Asn Ala Leu 175 ASp Gln
ser
Gly Asn ser 180 Glu ser Val Thr 185 ASp ser Lys 190 Ser
Thr
Tyr ser 195 Lys Thr Leu Ser Ser Thr Leu 200 Glu Arg Thr Leu Ser Lys Ala Asp 205 Gly Leu Tyr Glu
Lys pro 225
His 210 val val Lys Tyr Ser Ala Phe 230 cys 215 Asn Val Gly Thr His Glu cys 235 Gln 220 Ser Ser
<210> 344 <211> 705 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 344
atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca gtcaccatca cttgccgcgc aagtcaggat aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ccatcacgct tcagtggcag tggctctggg caacctgaag attttgcaac ttactactgt caaggcacca aggtggagat caaacgtacg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact tatcccagag aggccaaagt acagtggaag caggagagtg tcacagagca ggacagcaag acgctgagca aagcagacta cgagaaacac ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc
gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcc 60 tcctccctgt ctgcatctgt aggtgaccgt 120 attagcagct atttaaattg gtatcagcag 180 tattctactt cccgtttgaa tagtggggtc 240 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacaggata ttaaacaccc tacgttcggt 360 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 aacaggggag agtgt 705
<210> 345 <211>446 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 345
GlU *1
Val Gln Leu val c Gln Ser Gly Ala Glu 10 Gly val Lys Lys Pro Gly 15 Asp ser
1 Ser
val Lys val 20 Trp Ser cys Lys Ala Ser 25 Pro Phe Thr Phe Thr 30 Gl U Tyr
He
Met His 35 He val Arg Gln Ala 40 ASp Gly Gln Gly Leu 45 Asn Trp Met
Gly
Tyr 50 Gly Asn Pro Tyr Asn 55 Thr Asp Thr Glu Tyr 60 Thr’ Glu Lys Phe
Lys
Arg val Thr He Ala Asp Lys ser Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Ser Ser 85 Tyr Leu Arg Ser Glu Asp 90 Pro Thr Ala val Tyr VT Gly cys
Ala
Arg Ser lie 100 val Tyr Tyr Asp Ala 105 Ala Phe Ala Tyr Trp 110 Pro Gln
Gly
Thr Leu Thr val Ser Ser Ser Thr Lys Gly Ser val
115 120 125
Phe
Pro Leu Ala Pro Cys ser Arg Ser Thr ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu
Gly cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe pro Glu pro val Thr val Ser
145
150 155 160
Trp
Asn Ser Gly Ala 165 Gly Leu Thr Ser Gly val 170 Ser His Thr Phe Pro Ala 175 val val
Leu
Gln ser ser Leu Tyr Ser Leu Ser val val Thr pro
180 185 190
Ser
Ser
Asn 195 Asn Phe Gly Thr Gln Thr 200 Lys Tyr Thr Cys Asn val 205 Lys Asp His Lys
Pro
Ser Thr Lys val ASp Thr Val Glu Arg Cys cys val
210 215 220
Glu
Cys pro Pro cys Pro Ala Pro Pro val Ala Gly Pro Ser val Phe
225
230 235 240
Leu
Phe Pro Pro Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr pro
245 250 255
Glu
val Thr cys Val Val val ASp val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln
Phe Asn 275 Arg Trp Tyr Val Asp Gly 280 Asn Val Glu Val HÍS Asn 285 val Ala Lys Thr
Lys
Pro Glu Glu Gln Phe Ser Thr Phe Arg Val Ser Val
290
295 300
Leu 305 Lys
Thr Val val His Gln 310 Gly Asp Trp Leu Asn Gly 315 He Lys Glu Tyr Lys cys
val
Ser Asn Lys Leu Pro Ala Pro Glu Lys Thr lie ser
325 330 335
Lys
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln val Tyr Thr Leu pro pro
340 345 350
ser
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr cys Leu Val
355 360 365
Lys
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu ser Asn Gly
370
375 380
Gln
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro pro Met Leu Asp ser ASp
385
390 Thr 395 400
Gly
Ser Phe phe Leu Tyr Ser Lys Leu val Asp Lys ser Arg Trp
405 410 415
Gln
Gln
Gly Asn val Phe Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 346 <211> 1338 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 346

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggttt taccttcacc gactatatta tgcactgggt gcgtcaggcc 120

cctggtcaag ggcttgagtg gatgggctat atcaaccctt ataatgatga caccgaatac 180

aacgagaagt tcaagggccg tgtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgcg ctctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgttcgatt 300

tattactacg atgccccgtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac cgtctctagt 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420

agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 600

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 660

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 720

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1020

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgaq 1200

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320

tccctgtctc cgggtaaa 1338
<210> 347 <211> 465 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 347
Met i
Asp Trp Thr Trp 5 Arg lie Leu Phe Leu 10 Ser val Ala Ala Ala Thr 15 Lys Gly
Ala
HlS Ser Glu val Gln Leu val Gln Gly Ala Glu val Lys
20 25 30
Pro
Gly Ser Ser val Lys val Ser cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr
Asp 50 Trp Tyr lie Met His Trp 55 Asn val Arg Gln Ala Pro 60 A5p Gly Gln Gly Leu
Glu
Met Gly Tyr He Pro Tyr Asn Asp Thr Glu Tyr Asn
65
70 75 80
Glu
Lys Phe Lys Gly 85 Glu Arg val Thr He Thr 90 Arg Ala Asp Lys ser Thr 95 Ala Ser
Thr
Ala Tyr Met Leu Ser Ser Leu Ser Glu ASp Thr Val
100 105 110
Tyr
Tyr
cys 115 Gln Ala Arg Ser lie Tyr 120 Thr Tyr Tyr Asp Ala Pro 125 Ser Phe Ala
Tyr
Trp
Gly Gly Thr Leu val val Ser Ser Ala Thr Lys Gly
130 135 140
Pro
ser val Phe Pro Leu Ala pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu ser
145
150 155 160
Thr
Ala Ala Leu Gly cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe
180 185 190
Pro
Ala val Leu Gln ser ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser val Val
Val 195 200 205
Thr
Pro Ser ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn val
210 215 220
Asp
His Lys pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys Thr val Glu Arg Lys
225
230 235 240
Cys
Cys
val Glu cys Pro Pro cys Pro Ala Pro Pro val Ala Gly Pro
val 245 250 255
Ser
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie
Ser
Thr 260 265 270
Arg
Pro Glu val Thr cys Val val val Asp val ser His Glu Asp
275 280 285
Pro
Glu val Gln phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val gIu val His Asn
290 295 300
Ala
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg val
305
310 315 320
Val
ser Val Leu Thr val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr
Lys Cys Lys 340 Lys Val Ser Asn Lys Gly 345 Pro Leu Pro Ala Pro He 350 Val Glu Lys
Thr
lie Ser 355 Pro Thr Lys Gly Gln 360 Met Arg Glu pro Gln 365 val Tyr
Thr
Leu
pro Ser Arg Glu Glu Thr Lys Asn Gln Ser Leu Thr
370 375 380
cys
Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASp He Ala val Glu Trp Glu
385
Gly Gln 390 395 400
Ser
Asn Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
405 410 415
ASp
Ser Asp Gly 420 Gln Ser Phe phe Leu Tyr 425 Phe Ser Lys Leu Thr Val 430 Met Asp Lys
Ser
Arg Trp Gln Gly Asn val ser Cys ser val His Glu
435 440 445
Ala
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 348 <211> 1395 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
atggactgga
gtgcagctgg
tgcaaggctt
ggtcaagggc
gagaagttca
gagctgagca
tactacgatg
tccaccaagg
acagcggccc
aactcaggcg
ctctactccc
acctgcaacg
tgttgtgtcg
ttccccccaa
gtggtggacg
gaggtgcata
gtcagcgtcc
gtctccaaca
ccccgagaac
gtcagcctga
agcaatgggc
tccttcttcc
ttctcatgct
ctgtctccgg
cctggaggat
tgcagtctgg
ctggttttac
ttgagtggat
agggccgtgt
gcctgcgctc
ccccgtttgc
gcccatcggt
tgggctgcct
ctctgaccag
tcagcagcgt
tagatcacaa
agtgcccacc
aacccaagga
tgagccacga
atgccaagac
tcaccgttgt
aaggcctccc
cacaggtgta
cctgcctggt
agccggagaa
tctacagcaa
ccgtgatgca
gtaaa
cctcttcttg
ggctgaggtg
cttcaccgac
gggctatatc
cacgattacc
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ttactggggc
cttccccctg
ggtcaaggac
cggcgtgcac
ggtgaccgtg
gcccagcaac
gtgcccagca
caccctcatg
agaccccgag
aaagccacgg
gcaccaggac
agcccccatc
caccctgccc
caaaggcttc
caactacaag
gctcaccgtg
tgaggctctg
gtggcagcag
aagaagcctg
tatattatgc
aacccttata
gcggacaaat
gccgtgtatt
caagggactc
gcgccctgct
tacttccccg
accttcccag
ccctccagca
accaaggtgg
ccacctgtgg
atctcccgga
gtccagttca
gaggagcagt
tggctgaacg
gagaaaacca
ccatcccggg
taccccagcg
accacacctc
gacaagagca
cacaaccact
ccacaggagc
ggtcctcggt
actgggtgcg
atgatgacac
ccacgagcac
actgtgcgcg
tggtcaccgt
ccaggagcac
aaccggtgac
ctgtcctaca
acttcggcac
acaagacagt
caggaccgtc
cccctgaggt
actggtacgt
tcaacagcac
gcaaggagta
tctccaaaac
aggagatgac
acatcgccgt
ccatgctgga
ggtggcagca
acacgcagaa
ccactccgag
gaaggtctcc
tcaggcccct
cgaatacaac
agcctacatg
ttcgatttat
ctctagtgcc
ctccgagagc
ggtgtcgtgg
gtcctcagga
ccagacctac
tgagcgcaaa
agtcttcctc
cacgtgcgtg
ggacggcgtg
gttccgtgtg
caagtgcaag
caaagggcag
caagaaccag
ggagtgggag
ctccgacggc
ggggaacgtc
gagcctctcc
60
120
180
240
300
360
420
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540
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660
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960
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1140
1200
1260
1320
1380
1395
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10
<400> 349
atggaatgga
gtgcagctgg
tgcaaggctt
ggtcaagggc
gagaagttca
gagctgagca
tactacgatg
tctggatatt
tgcagtctgg
ctggttttac
ttgagtggat
agggccgtgt
gcctgcgctc
ccccgtttgc
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cacgattacc
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ctgtcaggaa
aagaagcctg
tatattatgc
aacccttata
gcggacaaat
gccgtgtatt
caagggactc
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ggtcctcggt
actgggtgcg
atgatgacac
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actgtgcgcg
tggtcacagt
ccactctgag 60 gaaggtctcc 120 tcaggcccct 180 cgaatacaac 240 agcctacatg 300 ttcgatttat 360 ctcgagc 417
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20
<400> 350
5
5
10
15
20
25
30
35
Asp
lie val Leu Thr Gln Ser Pro Ala ser Leu Ala val ser Leu Gly
1
5 10 15
Gln
Arg Ala Thr 20 Tyr lie Ala cys Lys Ala 25 Gln Ser Gln ser Val Asp 30 Gln Tyr Asp
Gly
Thr ser Met Asn Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Pro pro
35 40 45
Lys
Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser GlU He pro Ala
50
55 60
Arg
Phe ser Gly Thr Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His
65
70 75 80
Pro
val Glu Glu Glu Asp lie Thr Thr Tyr Tyr cys Gln Gln ser Asn
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Glu
Asp Pro Phe 100 Ala Thr Phe Gly Gly Gly 105 He Thr Lys Leu Glu He 110 ser Lys Arg
Ala
Asp Ala Pro Thr val Ser Phe pro Pro ser Glu Gln
115 120 125
Leu
Thr Ser Gly Gly Ala ser Val val cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140 Glu Gln
Pro
Lys Asp lie Asn val Lys Trp Lys He Asp Gly Ser Arg
145
150 155 160
Asn
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Tyr
ser Met ser 180 Tyr Thr Leu Thr Leu 185 Thr Lys ASp Glu Tyr 190 Thr Arg
HÍ5
Asn ser Thr cys Glu Ala His Lys Thr Ser ser pro
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He
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ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 tatgatggta ctagttatat gaattggtac 120 ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 tactgtcagc aaagtaatga ggatccgttc 300 aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 360 tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 420 aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 480 gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 540 gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 600 aagagcttca acaggaatga gtgttag 657
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Met
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1
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Gly
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Val
Ser Leu Gln Arg Ala Thr Ala Cys Lys Ala Gln Ser
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val
Asp Tyr Asp Gly Thr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
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Gly
Gln pro pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65
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Glu
lie Pro Ala Arg 85 Pro Phe Ser Gly Thr Gly 90 Asp Ser Gly Thr Asp Phe 95 Tyr Thr
Leu
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Gln
Gln
Ser 115 Glu Asp Pro Phe 120 Phe Gly Gly Sí Lys Leu
Glu
lie Lys Arg Ala ASp Ala Ala pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro
130 135 140
Ser
Ser
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val val Cys Phe Leu
145
150 155 160
Asn
Asn
Phe Tyr Pro 165 Asn Lys Asp lie Asn val 170 Ser Lys Trp Lys lie Asp 175 Asp Gly
Ser
Glu Arg Gln Gly val Leu Asn Trp Thr Asp Gln
Ser
180 185 190
Lys
Asp ser Thr Tyr ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195
200 205
Glu
Tyr Glu Arg His Asn ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser
Thr Ser Pro lie val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu cys
225
230 235
10
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15 <213> Mus musculus
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atcttcccac catccagtga gcagttaaca aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat actcacaaga catcaacttc acccattgtc
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<213> Mus musculus
<400> 357
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tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
5
Gln
Val Gln Leu Gln Gln pro Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1
5 10 15
Ser
val Lys Leu 20 Trp Ser Cys Lys Ala Ser 25 pro Gly Tyr lie Phe Thr 30 Glu Thr Tyr
Trp
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Gly
Met 50 Asp His Pro Ser Ala 55 Thr Glu He Arg Leu 60 Ser Gln Lys Phe
Lys 65 Met
Lys Ala Thr Leu 70 Pro Leu Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80 Cys
HlS
Leu ser Gly Thr ser val Asp Ala val Tyr Tyr
85 90 95
Ala
Arg ser Gly 100 Val Glu Trp Gly ser Met 105 Thr ASp Tyr Trp Gly Gln 110 val Gly Thr
Ser
val Thr Ser Ser Ala Lys Thr Pro Pro Ser Tyr pro
115 120 125
Leu
Ala pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys 145
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Gly ser Leu Ser Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gln
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Ser
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser ser val Thr val Pro ser ser Thr
180 185 190
Trp
Pro Ser Glu Thr val Thr Cys Asn val Ala His Pro Ala ser Ser
195 200 205
Thr
Lys 210 lie val Asp Lys Lys lie 215 Glu val pro Arg ASp Cys 220 Phe Gly cys Lys Pro
cys
Cys Thr val Pro Val Ser Ser val lie Phe pro Pro
225
230 235 240
Lys
Pro Lys Asp val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr cys
245 250 255
Val
Val
val Asp lie Ser Lys ASp ASp Pro Glu val Gln phe Ser Trp
260 265 270
Phe
val Asp 275 ASP Val Glu val His 280 Thr Ala Gln Thr Gln 285 pro Arg Glu
Glu
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser val Ser Glu Leu pro lie Met
290 295 300
His
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys cys Arg Val Asn ser
305
310 315 320
Ala
Ala
Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg
pro Lys Ala Pro Gln val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gln
Ala 340 345 350
Met
Asp Lys Val ser Leu Thr Cys Met He Thr ASp phe Phe
Glu 360 365
Pro
Asp lie Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln pro Ala Glu
370 375 380
Asn
Tyr Lys Asn Thr Gln 390 Asn Pro lie Met Asp Thr 395 Asn Asp Gly Ser Tyr Phe 400 Asn
JO J He
Tyr Ser Lys Leu 405 ser val Gln Lys Ser 410 Gly Trp Glu Ala Gly 415 His
Thr
phe Thr Cys val Leu His Glu Leu His Asn His
Thr
Glu
420 425 430
Lys
ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 358 <211>5 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 358
Thr Tyr Trp Met Asn 1 5
5
10
15
20
25
30
<210> 359 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 359
Met lie His Pro ser Ala ser Glu lie Arg Leu Asp Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15
ASp
<210> 360 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 360
Ser Gly Glu Trp Gly Ser Met Asp Tyr
1
<210> 361 <211> 1329 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 361
caggtccaac tacagcagcc tgggactgag tcctgtaagg cttctggcta catcttcacc cctggacaag gccttgagtg gattggcatg gatcagaaat tcaaggacaa ggccacattg atgcacctca gcggcccgac atctgtggat gaatgggggt ctatggacta ctggggtcaa acgacacccc catctgtcta tccactggcc gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc aacgttgccc acccggccag cagcaccaag ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca aagcccaagg atgtgctcac cattactctg atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag acctgcatga taacagactt cttccctgaa cagccagcgg agaactacaa gaacactcag atctacagca agctcaatgt gcagaagagc tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac ggtaaatga
5
ctggtgaggc ctggaacttc agtgaagttg 60 acctactgga tgaactgggt gaaacagagg 120 attcatcctt ccgcaagtga aattaggttg 180 actcttgaca aatcctccag cacagcctat 240 tctgcggtct attactgtgc aagatcaggg 300 ggaacctcag tcaccgtctc ctcagccaaa 360 cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 420 ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480 ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540 agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600 gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660 gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720 actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780 agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840 ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900 ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960 atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1020 gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1080 gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1140 cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1200 aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1260 catactgaga agagcctctc ccactctcct 1320
<210> 362 <211> 461 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 362
Met
Gly Trp Ser Ser c He lie Leu Phe Leu 10 Pro Val Ala Thr Ala Thr 15 val Gly
val
His Ser Gln val Gln Leu Gln Gln Gly Thr Glu Leu Arg
20 25 30
Pro
Gly Thr 35 Tyr ser val Lys Leu ser 40 Val Cys Lys Ala ser Gly 45 Gly Tyr He Phe
Thr
Thr 50 Trp Trp Met Asn Trp 55 His Lys Gln Arg pro 60 Glu Gln Gly Leu
Glu 65 Gln
lie Gly Met lie 70 Lys pro Ser Ala ser 75 Leu He Arg Leu Asp 80 Ser
Lys
Phe Lys Asp Ala Thr Leu Thr ASp Lys ser Ser
85 90 95
Thr
Ala Tyr Met His Leg Ser Gly Pro Thr ser val Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr
Tyr
Cys 115 Thr Ala Arg Ser Gly Glu 120 Ser Trp Gly ser Met Asp 125 Thr Tyr Trp Gly
Gln
Gly ser Val Thr val Ser Ala Lys Thr Pro Pro Ser
130 135 140
Val
Tyr Pro Leu Ala pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
Val
145
150 155 160
Thr
Leu Gly cys Leu 165 Gly val Lys Gly Tyr Phe 170 Gly Pro Glu Pro Val Thr 175 pro val
Thr
Trp Asn ser 180 Ser Ser Leu Ser ser 185 Leu val His Thr Phe 190 Thr Ala
val
Leu Gln Asp Leu Tyr Thr Ser Ser Ser val val pro
195 200 205
ser
ser
Thr Trp Pro Ser Glu Thr val Thr cys Asn val Ala His Pro
210 215 220
Ala 225 Cys
Ser Ser Thr Lys val 230 Cys Asp Lys Lys He val 235 val Pro Arg Asp cys Gly 240 lie
Lys
pro Cys lie 245 Pro Thr val Pro Glu 250 Thr Ser Ser Val Phe 255 Pro
Phe
Pro Pro Lys 260 val Lys Asp Val Leu 265 ser He Thr Leu Thr 270 Glu Lys
val
Thr cys 275 Val val Asp lie 280 Lys Asp ASp Pro 285 Val Gln
Phe
Ser 290 Arg Trp Phe Val Asp Asp 295 Asn Val Glu val His Thr 300 Ser Ala Gln Thr Gln
Pro
Glu Glu Gln Phe Ser Thr Phe Arg val ser Glu Leu
305
310 315 320
Pro
He Met His Gln 325 Ala Asp Trp Leu Asn Gly 330 lie Lys Glu Phe Lys Cys 335 ser Arg
val
Asn ser Ala phe pro Ala Pro Gl u Lys Thr He Lys
340 345 350
Thr
Lys Gly 355 Gln Arg Pro Lys Ala pro 360 Lys Gln val Tyr Thr He 365 Cys Pro pro Pro
Lys
Glu 370 Phe Met Ala Lys Asp 375 lie val Ser Leu Thr 380 Gln Met lie Thr
Asp
Phe Pro Glu ASp Thr Val Glu Trp Trp Asn Gly Gln
385
390 395 400
Pro
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp Thr Asp Gly
405 410 415 Glu
Ser
Tyr Phe lie Tyr ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
420 425 430
Ala
Gly Asn Thr Phe Thr cys ser val Leu His Glu Gly Leu His Asn
His
435 440 445
His
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 363 <211> 1386 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 363
atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtccaactac agcagcctgg gactgagctg tgtaaggctt ctggctacat cttcaccacc ggacaaggcc ttgagtggat tggcatgatt cagaaattca aggacaaggc cacattgact cacctcagcg gcccgacatc tgtggattct tgggggtcta tggactactg gggtcaagga acacccccat ctgtctatcc actggcccct accctgggat gcctggtcaa gggctatttc ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa cccaaggatg tgctcaccat tactctgact agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc cccatcatgc accaggactg gctcaatggc gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac ccagcggaga actacaagaa cactcagccc tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac gtgttacatg agggcctgca caaccaccat aaatga
<210> 364 <211> 106 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 364
gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgaggcctg gaacttcagt gaagttgtcc 120 tactggatga actgggtgaa acagaggcct 180 catccttccg caagtgaaat taggttggat 240 cttgacaaat cctccagcac agcctatatg 300 gcggtctatt actgtgcaag atcaggggaa 360 acctcagtca ccgtctcctc agccaaaacg 420 ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480 cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540 ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600 acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660 gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720 gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780 cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840 tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900 aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960 aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020 tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080 cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140 attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200 atcatggaca cagatggctc ttacttcatc 1260 tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320 actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380
1386
10
15
ASD
lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly
1
5 10 15
ASp
Arg val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp He Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr
ser Thr Ser Arg Leu Asn Ser Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly
50
55 60
Ser
Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser ser Leu Gln Pro
65
70 75 80
Glu
Asp Phe Ala Thr QC Tyr Tyr cys Gln Gln QA ASp lie Lys His pro QC Thr
Phe
Gly Gln Gly O J Thr Lys val Glu He Lys
100 105
<210> 365 <211> 318 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 365
gacatccaga
atcacttgcc
gggaaagccc
cgcttcagtg
gaagattttg
accaaggtgg
tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggtga ccgtgtcacc 60 gcgcaagtca ggatattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 ctaagctcct gatctattct acttcccgtt tgaatagtgg ggtcccatca 180 gcagtggctc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 caacttacta ctgtcaacag gatattaaac accctacgtt cggtcaaggc 300 agatcaaa 318
<210> 366 <211> 120 <212> PRT
5
10
15
20
25
<400> 366
Glu val
Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly ser
1
5 10 15
Ser Val
Lys val 20 Trp Ser cys.Lys Ala Ser 25 pro Gly phe Thr Phe Thr 30 Glu Asp Tyr
lie Met
His 35 He val Arg Gln Ala 40 Asp Gly Gln Gly Leu 45 Asn Trp Met
Gly Tyr 50 Lys Gly 65 Met Glu
Asn Pro Tyr Asn 55 lie Thr 70 Leu Arg ASp Thr Glu Tyr 60 Thr Glu Lys Phe
Arg
val Thr Ala Asp Lys ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Tyr Cys
Leu
Ser Ser ser Glu Asp Ala val Tyr
lie 100 val 85 90 95
Ala Arg
Ser Tyr Tyr Tyr Asp Ala 105 pro Phe Ala Tyr Trp 110 Gly Gln
Gly Tbr
Leu Thr Val Ser ser
115 120
<210> 367 <211> 360 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 367

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggttt taccttcacc gactatatta tgcactgggt gcgtcaggcc 120

cctggtcaag ggcttgagtg gatgggctat atcaaccctt ataatgatga caccgaatac 180

aacgagaagt tcaagggccg tgtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgcg ctctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgttcgatt 300

tattactacg atgccccgtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac cgtctctagt 360
<210> 368 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 368
Asp lie Gln
Met Thr Gln Ser Pro Ser ser Leu ser Ala ser val Gly
1
5 10 15
Asp Arg val
Thr 20 Tyr lie Thr Cys Lys Ala 25 Gly ser Gln Asp val phe 30 Leu Thr Ala
val Ala Trp 35 Tyr Trp Ala 50 Ser Gly ser
Gln Gln Lys Pro 40 His Thr 55 Phe Thr Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu lie
Ser
Thr Arg Gly val Pro Ser 60 Ser Phe ser Gly
Gly
Thr Asp Leu Thr lie ser Leu Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp phe
Ala Thr 85 Gly Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 lie Tyr ser Ser Tyr pro 95 Leu
Thr Phe Gly
Gly Thr Lys val Glu Lys Arg
100
105
<210> 369 <211> 324 <212>ADN <213> Mus musculus
5
10
15
20
25

gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgca aagcgagcca ggatgtgttt accgcggtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattgg gcgagcaccc gccataccgg cgtgccgagt 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcag tatagcagct atccgctgac ctttggcggc 300

ggcaccaaag tggaaattaa acgt 324
<210> 370 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 370
Glu
Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala
1
val 5 10 15
Ser
Lys val 20 Trp Ser Cys Lys Ala Ser 25 Pro Gly Phe Asn lie Lys 30 Glu Asp Tyr
Tyr
Met His Val Arg Gln Ala Gly Gln Gly Leu Trp lie
35 40 45
Gly
Arg lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp lie lie Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln
Gly Arg val Thr Met Thr Thr Asp Thr ser Thr ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Arg ser 85 Gly Leu Arg ser Asp Asp Thr 90 Phe Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Gln Cys
Ala
Tyr Asp Ala Asp Pro Ala Trp Tyr Trp Gly Gly
100 105 110
Thr
Leu Val Thr val Ser Ser
115
<210> 371 <211>357 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 371

gaagtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggctt taacattaaa gattattata tgcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagg gcctggaatg gatcggccgc attgatccgg aaaacggcga tattatttat 180

gatccgaaat ttcagggccg cgtgaccatg accaccgata ccagcaccag caccgcgtat 240

atggaactgc gcagcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gtatgatgcg 300

ggcgatccgg cgtggtttac ctattggggc cagggcaccc tggtgaccgt ctcgagc 357
<210> 372 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 372
Asp lie Gln
Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu ser Ala ser val Gly
1
5 10 15
Asp Arg val
Thr 20 Trp He Thr Cys Ser val 25 Pro ser Ser Ser He Ser 30 Lys Ser Ser
Asn Leu His
Tyr Gln Gln Lys Gly Lys Ala Pro Leu Leu
35
40 45
lie Tyr Gly 50 Gly ser Gly
Thr ser Asn Leu 55 Glu Ala ser Gly val Pro 60 lie Ser Arg Phe Ser
ser
Gly Thr Phe Thr Leu Thr Ser Ser Leu Gln
65
70 75 80
Pro Glu Asp
Phe Ala Thr 85 Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln 90 lie Gln Trp Thr Thr Thr 95 Tyr
Thr Phe Gly
Gln Lys Leu Glu Lys Arg
100
105
<210> 373 <211> 324 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 373
10
15
20
25

gatattcagc tgacccagag cccgagcttt ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgca gcgtgagcag cagcattagc agcagcaacc tgcattggta tcagcagaaa 120

ccgggcaaag cgccgaaact gctgatttat ggcaccagca acctggcgag cggcgtgccg 180

agccgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gaatttaccc tgaccattag cagcctgcag 240

ccggaagatt ttgcgaccta ttattgccag cagtggacca ccacctatac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa acgt 324
<210> 374 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 374
Glu i
Val Gln Leu Val Gln c Ser Gly Ala Glu 10 Gly val Lys Lys Pro Gly 15 ASp Ala
j. Ser
val Lys Val 20 Trp J Ser cys Lys Ala Ser 25 Pro Phe Asn lie Lys 30 Glu Tyr
Tyr
lie His val Arg Gln Ala Gly Gln Gly Leu Trp Met
35 40 45
Gly
Arg lie Asp Pro Asp Asn Gly Glu Ser Thr Tyr val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln 65 Met
Gly Arg Val Thr Met 70 Ser Leu 85 Leu Asp Thr Thr Asp Thr ser 75 Thr Thr Ser Thr Ala Tyr 80 cys
Glu
Leu Arg Arg Ser Asp Asp 90 Tyr Ala val Tyr Tyr 95 Tyr
Ala
Arg Glu Gly 100 Thr Tyr Gly Asp 105 Ser Tyr Ala val Asp 110 Trp
Gly
Gln Gly Leu val Thr val ser
115 120
<210> 375 <211> 366 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 375
5
10
15
20
25

gaagtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggctt taacattaaa gattattata ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagg gcctggaatg gatgggccgc attgatccgg ataacggcga aagcacctat 180

gtgccgaaat ttcagggccg cgtgaccatg accaccgata ccagcaccag caccgcgtat 240

atggaactgc gcagcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gcgcgaaggc 300

ctggattatg gcgattatta tgcggtggat tattggggcc agggcaccct ggtgaccgtc 360

tcgagc 366
<210> 376 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 376
Asp lie Gln
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg val
Thr lie Thr Cys Arg Ala ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr
20
25 30
Leu Asn Trp
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35
40 45
Tyr Tyr Thr 50 Ser Gly ser 65 Glu Asp phe
Ser Arg Leu Leu 55 Phe Ser Gly val Pro Ser 60 Ser Arg phe Ser Gly
Gly
Thr Asp 70 Tyr Thr Leu Thr lie 75 Gly ser Leu Gln Pro 80 Tyr
Ala
Thr 85 Gly Tyr Cys Gln Gln 90 He Asp Thr Leu pro 95
Thr Phe Gly
Gly Thr Lys Val Glu Lys
100
105
<210> 377 <211 > 321 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 377
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctctccgcat ccgtaggcga ccgcgtaacc 60
ataacatgta gagcatctca agatatttcc aactatttga attggtacca acaaaaaccc 120 ggcaaagcac ctaaactcct catttactat acatcaagac tcctctccgg cgttccatca 180 cgattctcag gctccggctc cggcacagat ttcacactca ctatttcctc cctccaacca 240 gaagattttg caacctatta ctgtcaacaa ggcgatacac tcccatacac attcggcggc 300 ggcacaaaag ttgaaattaa a 321
<210> 378 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 378
5
10
15
20
25

Glu val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 15 10

Ser val Lys val ser cys Lys Ala ser Gly 20 25

Asn Met His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40

Gly Glu ríe Asn Pro Asn ser Gly Gly Ala 50 55

Lys Gly Arg val Thr Met Thr Thr Asp Thr 65 70

Met Glu Leu Arg ser Leu Arg ser Asp Asp 85 90

Ala Arg Leu Gly Tyr Asp Asp lie Tyr Asp 100 105

Trp Gly Gln Gly Thr Thr val Thr val ser 115 120
<210> 379 <211> 369 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 379
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtaaaaaaac caggagcaag cgttaaagtt 60 tcttgtaaag caagcggata tacatttaca gattacaaca tgcattgggt aagacaagcg 120 ccaggacaag gattggaatg gatgggcgaa attaacccta atagtggagg agcaggctac 180 aatcaaaaat tcaaagggag agttacaatg acaacagaca caagcacttc aacagcatat 240 atggaactgc gatcacttag aagcgacgat acagctgtat actattgcgc acgacttggg 300 tatgatgata tatatgatga ctggtatttc gatgtttggg gccagggaac aacagttacc 360 gtctctagt 369
<210> 380 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 380
Asp lie Gln
Leu Thr Gln Ser Pro ser Phe Leu Ser Ala ser val Gly
1
5 10 15
Asp Arg val
Thr 20 Trp lie Thr Cys Arg Ala 25 Lys Pro 40 Ala Ser Ser Ser Ser val Thr 30 Lys Ser Ser
Tyr Leu Asn 35 lie Tyr ser
Tyr Gln Gln Gly Lys Ala Pro 45 Ser Leu Leu
Thr
ser Asn Leu Gly val Pro Arg Phe Ser
50
55 60
Gly Ser Gly
Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu Gln
65
70 75 80
Pro Glu Asp
Phe Ala 85 Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln 90 Glu Gln Tyr Asp phe Phe 95 Pro
ser Thr phe
Gly Gly Thr Lys val lie Lys
100 105
<210> 381 <211> 324 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 381
Val Lys Lys pro Gly Ala
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 30
Gln Gly Leu Glu Trp Met 45
Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 60
ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80
Thr Ala val Tyr Tyr cys 95
Asp Trp Tyr phe Asp val 110
Ser
5
10
15
20
25

gacatccagc tgacccagag ccccagcttc ctttccgcat ccgttggtga ccgagtaaca 60

atcacatgcc gcgcctcatc ttcagttaca tcttcttatc ttaattggta tcaacaaaaa 120

ccaggaaaag cacctaaact tcttatatac tctacatcta atctcgcatc aggagttccc 180

tctcgatttt caggatctgg atcaggcaca gaatttacac ttactatatc atcactccaa 240

ccagaagact tcgccactta ttactgccaa caatacgatt tttttccaag cacattcgga 300

ggaggtacaa aagtagaaat caag 324
<210> 382 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 382
Glu
1
Ser
Tyr
Gly
Lys
65
Met
Ala
Gln
Val
val
Met
ASp
50
Gly
GlU
Arg
Gly
Gln
Leu Val c Gln Ser Gly Ala Glu 10 Gly Val Lys Lys Pro Gly 15 Asp Ala
Lys
val 20 Trp j Ser Cys Lys Ala ser 25 Pro Tyr Thr Phe Thr 30 Glu Tyr
Asn 35 lie
val Arg Gln Ala 40 ASp Gly Gln Arg Leu 45 Asn Trp Met
Asn
Pro Tyr Asn ASp Thr Thr Tyr HÍS Lys Phe
55 60
Arg
val Thr He 70 Leu Thr Arg Asp Thr ser 75 Thr Ala Ser Thr Ala Tyr 80 Cys
Leu
Ser Ser Arg ser Glu Asp Ala val Tyr Tyr
85 90 95
Glu
Thr Ala val lie Thr Thr Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Thr
Thr
val Thr val ser Ser
115
120
<210> 383 <211> 363 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 383
gaggtgcagc
agttgcaaag
cctggacaaa
aatcataaat
atggaacttt
gccgttatta
agt
tggtgcagag
catctggata
gacttgaatg
ttaaaggaag
cctcattgag
ctactaacgc
cggcgccgag
cacatttacc
gatgggagac
agttacaatt
atctgaagac
tatggattac
gtcaagaaac
gactactaca
attaaccctt
acaagagata
actgctgttt
tggggtcaag
ctggagcaag
tgaattgggt
ataacgacga
catccgcatc
attactgtgc
gaaccactgt
cgtaaaggtt 60 acgacaagcc 120 cactacatac 180 aaccgcctat 240 aagagaaact 300 taccgtctct 360
<210> 384 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 384
Asp
He Gln Met Thr Gln Ser pro ser ser Leu Ser Ala ser val Gly
1
5 10 15
Asp
Arg val Thr lie Thr cys ser val Ser ser Thr He ser Ser Asn
20 25 30
HÍS
Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu
35 40 45
lie
Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro ser Arg phe Ser
50 55 60
Gly
ser 01 y Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln
65
Glu 70 75 80
Pro
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Trp ser ser Tyr
Pro
85 90 95
Leu
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105
<210> 385 <211> 324 5 <212>ADN
<213> Mus musculus
<400> 385
10
15
20
25

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctctcagcat ccgtaggcga tagagttaca 60

ataacatgca gcgtatcatc aactatatca tcaaatcatc ttcattggtt ccaacagaaa 120

cccggcaaag cacctaaatc acttatatac ggcacatcaa atctcgcatc aggcgttcct 180

tcaagatttt caggctctgg ctcaggcacc gactttactc ttacaatatc ctccctccaa 240

cccgaagact tcgcaaccta ttactgtcaa caatggtcct catatccact cacatttggc 300

ggcggcacaa aagtagaaat taaa 324
<210> 386 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 386

Glu val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Asn lie Lys Asp Phe 20 25 30

Tyr Leu His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Arg lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Asp Lys val Thr Met Thr Thr Asp Thr ser Thr ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg ser Leu Arg ser Asp Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe His Asp Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe 100 105 110

Asp val Trp Gly Arg Gly Thr Leu val Thr val ser ser 115 120 125
<210> 387 <211>375 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 387
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag tcctgcaagg cttctgactt caacattaaa cctggacaag ggcttgagtg gattggaagg gacccgaagt tccaggacaa ggtcaccatg atggagctga ggagcctgag atctgacgac gattatttcc acgatggtac ctcctactgg gtcaccgtct ctagt
<210> 388 <211> 106 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 388
gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 gacttctatc tacactgggt gcgacaggcc 120 attgatcctg agaatggtga tactttatat 180 accacagaca cgtccaccag cacagcctac 240 acggccgtgt attactgtgc gagagaggcg 300 tacttcgatg tctggggccg tggcaccctg 360
10
15
Asp
He Gln Leu Thr Gln ser Pro ser phe Leu Ser Ala Ser val Gly
1
5 10 15
Asp
Arg val Thr lie Thr Cys Arg Ala ser Ser Ser lie ser Tyr lie
20 25 Ala 30
His
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly A{\ Lys pro Lys Leu ac Leu lie Tyr
Ala
Thr 33 Ser Asn Leu Ala ser Gly val pro Ser Arg •rj Phe Ser Gly ser
50 55 60
Gly
ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie ser Ser Leu Gln Pro Glu
65
70 75 80
Asp
Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Leu Thr
85 90 95
phe
Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie Lys
100 105
<210> 389 <211> 318 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 389

gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgca gggccagctc aagtataagt tacatacact ggtatcagca aaaaccaggg 120

aaagccccta agctcctgat ctatgccaca tccaacctgg cttctggggt cccatcaagg 180

ttcagcggca gtggatctgg gacagaattc actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa 240

gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtgacc cactcacgtt cggcggaggg 300

accaaggtgg agatcaaa 318
20
<210> 390 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus 25
<400> 390
5
10
15
20

Glu val Gln Leu val Gln ser Gly 1 5
Ser val Lys Val Ser cys Lys Ala 20

Tyr lie His Trp val Arg Gln Ala 35 40

Gly Arg val Asp Pro Asp Asn Gly 50 55

Pro Gly Lys val Thr Met Thr Thr 65 70
Met Glu Leu ser Arg Leu Arg ser 85
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Thr 100

Gln Gly Thr Leu val Thr val Ser 115 120

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Gly Phe Asp He Lys Asp Tyr 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 45
Glu Thr Glu Phe Ala Pro Lys Phe 60

Asp Thr ser lie Ser Thr Ala Tyr 75 80

Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95

Tyr Thr Trp Phe Pro Tyr Trp Gly 105 110
ser
<210> 391 <211> 363 <212>ADN <213> Mus musculus
<400> 391

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggatt cgacattaag gactactata tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatcggaagg gttgatcctg acaatggtga gactgaattt 180

gccccgaagt tcccgggcaa ggtcaccatg accacagaca cgtccatcag cacagcctac 240

atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaagac 300

tacgatggta cctacacctg gtttccttat tggggccaag ggactctggt caccgtctct 360

agt 363
<210> 392 <211>448 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 392
5
Glu i
Val Gln Leu Val c Gln ser Gly Ala Glu 10 Gly val Lys Lys Pro Gly 15 ASp Ala
X ser
Val Lys val 20 Trp J ser Cys Lys Ala Ser 25 pro Tyr Thr Phe Thr 30 Glu Tyr
Asn
Met HiS 35 lie val Arg Gln Ala 40 Gly Gly Gln Gly Leu 45 Asn Trp Met
Gly
Glu 50 Gly Asn pro Asn Ser 55 Thr Gly Ala Gly Tyr 60 Thr Gln Lys Phe
Lys 65 Met
Arg Val Thr Met 70 Leu Thr Asp Thr ser 75 Thr ser Thr Ala Tyr 80 cys
Glu
Leu Arg ser 85 Tyr Arg ser Asp ASp 90 Asp Ala Val Tyr Tyr 95 ASp
Ala
Arg Leu Gly 100 Gly ASp Asp lie Tyr 105 val Asp Trp Tyr Phe 110 Thr val
Trp
Gly Gln 115 Val Thr Thr Val Thr 120 Pro Ser Ser Ala ser 125 Thr Lys Gly
pro
ser 130 Phe Pro Leu Ala 135 cys ser Arg Ser 140 Ser Glu Ser
Thr 145 Thr
Ala Ala Leu Gly cys 150 Ser Leu Val Lys Asp Tyr 155 Ser Phe Pro Glu Pro val 160 Phe
val
Ser Trp Asn 165 Gly Ala Leu Thr 170 Gly val His Thr 175
Pro
Ala Val Leu 180 Gln Ser ser Gly Leu 185 Tyr Ser Leu Ser ser 190 val val
Thr
val Pro 195 ser ser Asn Phe Gly 200 Thr Gln Thr Tyr Thr 205 Cys Asn val
Asp
His 210 Lys Pro ser Asn Thr 215 Lys Val Asp Lys Thr 220 val Glu Arg Lys
Cys 225 Ser
Cys val Glu cys Pro 230 pro Pro Cys Pro Ala Pro 235 Asp Pro val Ala Gly Pro 240 ser
val
Phe Leu phe 245 Pro Lys Pro Lys 250 Thr Leu Met He 255
Arg
Thr Pro Glu 260 Gln val Thr cys Val val 265 Val val Asp val ser His 270 val Glu Asp
Pro
Glu Val 275 Thr Phe Asn Trp Tyr 280 Glu Asp Gly Val Glu 285 Thr His Asn
Ala
Lys 290 Lys Pro Arg Glu 295 Gln phe Asn Ser 300 Phe Arg val
Val 305
Ser Val Leu Thr val 310 Val His Gln ASp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu 320
Tyr
Lys cys Lys val 325 Thr Ser Asn Lys Gly Leu 330 Arg Pro Ala pro lie Glu 335 Tyr Lys
Thr
lie ser Lys 340 ser Lys Gly Gln Pro 345 Thr Glu Pro Gln val 350 Ser
Thr
Leu
pro Pro 355 Arg Glu Glu Met 360 Lys Asn Gln val 365 Leu Thr
Cys
Leu 370 Val Lys Gly Phe Tyr 375 Pro Ser ASp lie Ala 380 val Glu Trp Glu
Ser 385
Asn Gly Gln pro Glu 390 Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr Pro Pro Met Leu 400
ASp
Ser Asp Gly ser 405 Gln Phe Phe Leu Tyr ser 410 Ser Lys Leu Thr val Sí? His Lys
ser
Arg Trp Gln 420 Asn Gly Asn val Phe 425 Lys cys Ser val Met 430 Ser Glu
Ala
Leu His 435 His Tyr Thr Gln 440 Ser Leu ser Leu 445 Pro Gly
<210> 393 <211> 446 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia de anticuerpo humanizado <400> 393
Glu 1
Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 val Lys Lys pro Gly 15 Ala
ser
val Lys val 20 Trp Ser Cys Lys Ala Ser 25 Pro Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Glu ASp Tyr
Tyr
Met Asn 35 He val Arg Gln Ala 40 Asp Gly Gln Arg Leu 45 Asn Trp Met
Gly
Asp 50 Gly Asn Pro Tyr Asn 55 Thr Asp Thr Thr Tyr 60 Ser Ala 75 Thr Ala His Lys Phe
Lys 65 Het
Arg val Thr He 70 Leu Arg Asp Thr Ser Thr Ala Tyr 80 cys
Glu
Leu Ser Ser 85 Ala Arg Ser Glu Asp 90 Asn Val Tyr Tyr 95 Trp
Ala
Arg Glu Thr 100 Thr Val lie Thr Thr 105 Ser Ala Met Asp Tyr 110 Gly Gly
Gln
Gly Thr 115 val Thr Val ser 120 Ala ser Thr Lys 125 pro Ser
val
Phe 130 pro Leu Ala Pro cys 135 Ser Arg ser Thr ser 140 Glu Ser Thr Ala
Ala 145
Leu Gly cys Leu Val 150 Lys ASp Tyr Phe pro Glu 155 pro val Thr val 160
Ser
Trp Asn ser Gly 165 Ala Leu Thr Ser Gly 170 Val His Thr phe pro 175 Ala
Val
Leu Gln ser 180 Ser Gly Leu Tyr Ser 185 Leu ser ser Val Val 190 Thr val
Pro
Ser Ser 195 Ser Asn Phe Gly Thr Gln 200 Asp Thr Tyr Thr Cys Asn 205 Arg val ASp His
Lys
Pro 210 Asn Thr Lys Val 215 Lys Thr Val Glu 220 Lys cys Cys
val 225
Glu cys Pro Pro Cys 230 pro Ala Pro pro Val Ala 235 Gly Pro Ser val 240
Phe
Leu phe Pro Pro 245 cys Lys Pro Lys Asp Thr 250 val Leu Met He ser Arg 255 pro Thr
Pro
Glu val Thr 260 Asn Val val val Asp 265 Gly ser His Glu Asp 270 Asn Glu
val
Gln phe 275 Trp Tyr val Asp 280 val Glu val HÍS 285 Ala Lys
Thr
Lys 290 Leu Pro Arg Glu Glu Gln 295 Gln Phe Asn ser Thr Phe 300 Asn Gly 315 Arg val val Ser
val 305
Thr val val His 310 Asp Trp Leu Lys Gl u Tyr Lys 320
Cys
Lys val Ser Asn 325 Gly Lys Gly Leu Pro Ala 330 Pro Pro lie Glu Lys Thr 335 Leu lie
Ser
Lys Thr Lys 340 Glu Gln Pro Arg Glu 345 Asn Gln Val Tyr Thr 350 Thr Pro
Pro
Ser Arg 355 Glu Met Thr Lys 360 Gln Val Ser Leu 365 cys Leu
val
Lys 370 Gly Phe Tyr pro Ser 375 Asp lie Ala val Glu 380 Trp Glu Ser Asn
Gly 385
Gln pro Glu Asn Asn 390 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 395 Met Leu Asp ser 400
Asp
Gly Ser Phe Phe 405 Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Thr val Asp Lys Ser 415 Arg
Trp His
Gln Asn Gln His 435 Gly 420 Tyr Asn Thr val Gln Phe Lys ser Ser 440 cys 425 Leu Ser Ser val Met Leu Ser His Pro 445 Glu 430 Gly Ala Leu
<210> 394 <211> 450 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
Glu 1
Val Gln Leu val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
ser
val Lys Val ser 20 Trp Val cys Lys Ala Ser 25 Pro Asp Phe Asn lie Lys 30 Glu Asp Phe
Tyr
Leu His 35 lie Arg Gln Ala 40 Gly Gly Gln Gly Leu 45 Asp Trp He
Gly
Arg 50 ASp Asp Pro Glu Asn 55 Thr Asp Thr Leu Tyr 60 Thr pro Lys Phe
Gln 65
Lys Val Thr Met 70 Thr Asp Thr Ser 75 ser Thr Ala Tyr 80
Met
Glu Leu Arg ser 85 Ala Asp 100 Gly Arg Leu Arg Ser Asp Asp 90 Gly Thr Ala Val Tyr 3T Tyr cys
Ala
Arg Glu Tyr phe His ASp 105 val Thr Ser Tyr Trp 110 Ala Phe
Asp
Val Trp 115 pro Gly Thr Leu 120 Leu Thr val Ser Ser 125 Arg ser Thr
Lys
Gly 130 Ser Ser Val Phe pro 135 Gly Ala pro cys Ser 140 ASp Ser Thr Ser
Glu 145
Thr Ala Ala Leu 150 cys Leu val Lys 155 Tyr Phe pro Glu 160
Pro
val Thr val Ser 165 Ala Val 180 Trp Asn Ser Gly Ala 170 Gly Leu Thr ser Gly val 175 Ser HÍS
Thr
Phe pro Leu Gln Ser Ser 185 Leu Tyr Ser Leu 190 ser
Val
val Thr 195 Val Pro ser ser Asn 200 Phe Gly Thr Gln Thr 205 Tyr Thr cys
Asn
val 210 Asp His Lys Pro ser 215 Asn Thr Lys Val Asp 220 Lys Thr Val Glu
Arg 225
Lys cys Cys val Glu 230 cys Pro Pro cys Pro 235 Ala Pro Pro Val Ala 240
Gly
Pro ser val Phe 245 Leu Phe Pro Pro Lys 250 Pro Lys Asp Thr Leu 255 Met
lie
Ser Arg Thr Pro 260 Glu val Thr Cys 265 val val val Asp val 270 Ser His
GlU
Asp Pro 275 Ala Glu Val Gln Phe Asn 280 Arg Trp Tyr Val Asp Gly 285 Asn val Glu Val
HÍS
Asn 290 val Lys Thr Lys Pro 295 Thr Glu Glu Gln Phe 300 ASp Ser Thr Phe
Arg 305
val ser val Leu 310 val val HÍS Gln 315 Trp Leu Asn Gly 320
Lys
Glu Tyr Lys cys 325 lie Ser 340 Lys Val Ser Asn Lys 330 Gln Gly Leu Pro Ala Pro 335 Gln lie
Glu
Lys Thr Lys Thr Lys Gly 345 Pro Arg Glu pro 350 val
Tyr
Thr Leu 355 pro Pro Ser Arg Glu 360 Glu Met Thr Lys Asn 365 Gln val ser
Leu
Thr 370 Glu cys Leu val Lys Gly 375 pro Phe Tyr pro Ser Asp 380 Lys He Ala val Glu
Trp 385
Ser Asn Gly Gln 390 Glu Asn Asn Tyr 395 Thr Thr pro Pro 400
Met
Leu Asp Ser Asp 405 Gly Ser Phe Phe Leu 410 Tyr Ser Lys Leu Thr 415 val
Asp
Lys ser Arg Trp 420 Gln Gln Gly Asn 425 val Phe ser cys Ser 430 Val Met
His Pro
Glu Gly asn Ala 435 Leu His Asn His Tyr 440 Thr Gln Lys Ser Leu 445 Ser Leu ser
<210> 395 <211> 446 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
Glu 1
val Gln Leu Val 5 Gln Ser
Ser
val Lys val 20 Trp Ser Cys Lys
Tyr
lie His 35 val val Arg Gln
Gly
Arg 50 Gly Asp pro Asp Asn 55 Thr
Pro 65
Lys Val Thr Met 70
Met
Glu Leu ser Arg 85 Tyr Leu Arg
Ala
Arg Glu Asp 100 Leu Asp Gly
Gln
Gly Thr 115 pro val Thr val
val
Phe 130 Leu Ala Pro Cys 135
Ala 145
Leu Gly Cys Leu Val 150 Lys
Ser
Trp Asn Ser Gly 165 Ser Ala Leu
Val
Leu Gln Ser 180 Asn Gly Leu
Pro
Ser ser 195 Ser Phe Gly Thr
Lys
Pro 210 Asn Thr Lys Val 215
val 225
Glu Cys Pro Pro cys 230 pro
Phe
Leu Phe Pro Pro 245 Lys pro
Pro
Glu val Thr 260 Asn Cys val val
val
Gln Phe 275 pro Trp Tyr
val
Thr
Lys 290 Arg Gl u Glu Gln 295
val 305
Leu Thr val Val His 310 Gln
cys
Lys Val Ser Asn 325 Gly Lys Gly
Ser
Lys Thr Lys 340 Glu Gln pro
Pro
ser Arg 355 Glu Met Thr
val
Lys 370 Gly Phe Tyr Pro Ser 375
Gly 385
Gln Pro Glu Asn Asn 390 Tyr
Asp
Gly Ser Phe Phe 405 Leu Tyr
Trp
Gln Gln Gly Asn 420 Val Phe
His
Asn His 435 Tyr Thr Gln Lys
<210> 396 <211> 445 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
Gly
Ala Glu 10 Gly val Lys Lys pro Gly 15 ASp Ala
Ala
ser 25 Phe Asp lie Lys 30 Tyr
Ala 40
Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp He
Gly
Glu Thr Glu Phe 60 He Ala pro Lys Phe
Thr
Asp Thr Ser 75 Ser Thr Ala ¡T
Ser
Asp Asp 90 Thr Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Trp Cys
Thr
Tyr 105 Trp Phe Pro Tyr 110 Gly
ser 120
Ser Ala ser Thr & Gly Pro Ser
ser
Arg Ser Thr Ser 140 Glu Glu ser Thr Ala
Asp
Tyr Phe Pro 155 Val Pro val Thr val 160 Ala
Thr
Ser Gly 170 HÍS Thr phe Pro 175
Tyr
Ser 185 Leu Ser Ser val Val 190 Thr val
Gln 200
Thr Tyr Thr cys Asn 205 val Asp His
Asp
Lys Thr val Glu 220 Ala Arg Lys cys Cys
Ala
Pro Pro val 235 Gly pro Ser val 240
Lys
Asp Thr 250 Leu Met He Ser Arg 255 Thr
val
Asp 265 Val Ser His Glu Asp 270 Pro Glu
Asp 280 Phe
Gly val Glu val His 285 Arg Asn Ala Lys
Asn
Ser Thr Phe 300 Val Val ser
Asp
Trp Leu Asn 315 pro Gly Lys Glu Tyr Lys 320 lie
Leu
Pro Ala 330 lie Glu Lys Thr 335
Arg
Glu 345 pro Gln val Tyr Thr 350 Leu Pro
Lys 360 ASp
Asn Gln val Ser Leu 365 Trp Thr cys Leu
He
Ala val Glu 380 Pro Glu Ser Asn
Lys
Thr Thr pro 395 Met Leu Asp ser 400
Ser
Lys Leu 410 Ser Ser Thr val Asp Lys Ser 415 Ala Arg
Ser ser 440
Cys 425 Leu val Leu Met Ser His Pro 445 Glu 430 Gly Leu

Claims (21)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Un anticuerpo de unión a esclerostina que comprende las siguientes secuencias de CDR:
    CDR-H1: DYIMH (SEQ ID NO: 269);
    CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID NO: 270);
    CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID NO: 271);
    CDR-L1: RASQDISSYLN (SEC ID No: 239);
    CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID NO: 240); y CDR-L3: QQDIKHPT (SEQ ID NO: 241).
  2. 2. El anticuerpo de unión a esclerostina de la reivindicación 1 que comprende (a) una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 366 y/o (b) una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica que tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 364.
  3. 3. El anticuerpo de unión a esclerostina de la reivindicación 1 o 2, que comprende una región constante de cadena ligera y/o cadena pesada, preferentemente la región constante de IgG4 humana o IgG2 humana.
  4. 4. El anticuerpo de unión a esclerostina de la reivindicación 1 que tiene cadenas pesadas de la SEQ ID NO: 345 o 396 y cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 341.
  5. 5. El anticuerpo de unión a esclerostina de la reivindicación 1 que tiene cadenas pesadas de la SEQ ID NO: 331 y cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 341.
  6. 6. El anticuerpo de unión a esclerostina de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, opcionalmente un fragmento F(ab')2, Fab, Fab' o Fv.
  7. 7. El anticuerpo de unión a esclerostina de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
  8. 8. El anticuerpo de unión a esclerostina de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho anticuerpo tiene una afinidad de unión (Kd) por esclerostina humana como se mide por resonancia de plasmón superficial de menos de o igual a 1 x 10' M, menos de o igual a 1 x 10' M, menos de o igual a 1 x 10' M o menos de o igual a 1 x 10"12 M
  9. 9. El anticuerpo de unión a esclerostina de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho anticuerpo puede (a) aumentar al menos uno de formación ósea, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero; o (b) bloquear el efecto inhibidor de la esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
  10. 10. Una secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo de unión a esclerostina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  11. 11. Un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias polinucleotídicas según la reivindicación 10, en el que el vector comprende opcionalmente al menos una secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 308, 310, 312, 342, 344, 346, 348, 349, 365 y 367.
  12. 12. Una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión según la reivindicación 11.
  13. 13. Un proceso para la producción del anticuerpo de unión a esclerostina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 y aislar el anticuerpo de unión a esclerostina.
  14. 14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de unión a esclerostina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente y vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente que comprende adicionalmente otros principios activos.
  15. 15. El anticuerpo de unión a esclerostina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica de la reivindicación 14 para su uso en el tratamiento de osteopenia, osteoporosis o pérdida de hueso provocada por acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exotosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis, osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de hueso inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de hueso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrativos del hueso, pérdida de hueso oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades óseas metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juveniles, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémica (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides, pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, displasia fibrosa, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, pérdida de hueso asociada con envejecimiento, pérdida de hueso facial asociada con envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con envejecimiento, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial.
  16. 16. El anticuerpo de unión a esclerostina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de la osteoporosis.
  17. 17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica de la reivindicación 14 para su uso en un método para aumentar al menos uno de formación ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, densidad mineral ósea y fuerza ósea en un mamífero para tratar una afección en la que es deseable un aumento en al menos uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, densidad mineral ósea y fuerza ósea.
  18. 18. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en un método para mejorar el resultado en un mamífero que experimenta uno o más de un procedimiento ortopédico, procedimiento dental, cirugía de implantes, reemplazo de las articulaciones, injerto de hueso, cirugía cosmética ósea y reparación ósea tales como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial, comprendiendo dicho método administrar dicho anticuerpo o composición a dicho mamífero antes, durante y/o después de dicho procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación.
    319
    i AQVLTQTPAS VSAAVGGTVT INCQSSQSVY DNNWLAWFQQ KPGQPPKLLI 51 YDASDLASGV PSRFSGSGSG TQFTLTISGV QCADAATYYC QGAYNDVIYA 101 FGGGTEWVK RTDAAPTVSI FPPSSEQLTS GGASWCFLN NFYPKDINVK 151 WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT 201 HKTSTSPIVK SFMRNEC
    B. 1 QSLEESGGRL VTPGTPIíTLT CTASGFSLSS YWMNWVRQAP GEGLEWIGTI
    51 DSGGRTDYAS WAKGRFTISR TSTTMDLKMT SLTTGDTARY FCARNWNLWG 101 QGTLVTVSSA STKGPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG YFPEPVTVTW 151 NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT CNVAHPASST 201 KVDKKIVPRD CGCKPCICTV PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT LTPKVTCWV 251 DISKDDPEVQ FSWFVDDVEV HTAQTQPREE QFNSTFRSVS ELPIMHQDWL 301 NGKEFKCRVN SAAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP KEQMAKDKVS 351 LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMNTNGSY FVYSKLNVQK 401 SNWEAGNTFT CSV1HEGLHM HHTEKSLSHS PGK
    1 QIVLTQSPTI VSASPGEKVT LICSASSSVS FVDWFQQKPG TSPKRWIYRT 51 SNLGFGVPAR FSGGGSGTSH SLTISRMEAE DAATYYCQQR STYPPTFGAG 101 TK1ELKRADA APTVS1FPPS SEQLTSGGAS WCFLNNFYP KDINVKWKID 151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 TSPIVKSFNR NEC
    1 QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMGVGWIR HPSGKNLEWL 51 AHIWWDDVKR YNPVLKSRLT ISKDTSNSQV FLKIANVDTA DTATYYCARI 101 EDFDYDEEYY AMDYWGQGTS VIVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251 DVLTITLTPK VTCWVDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401 DTDGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFÜCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK
    321
    A
    1 DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPRL 51 LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFT1NIH PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW 101 TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT SGGASWCFL NNFYPKDINV 151 KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTLTKDEY ERHNSYTCEA 201 THKTSTSPIV KSFNRNEC
    B.
    1 EVQLQQSGPE LVKPGTSVKM SCKASGYTFT DCYMNWVKQS HGKSLEWIGD 51 INPFNGGTTY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MQLNSLTSDD SAVYYCARSH 101 YYFDGRVPWD AMDYWGQGTS VTVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KXVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFXFPPKPK 251 DVLTITLTPK VTCVWDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKT1SK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401 DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK
    322
    1 DVQMIQSPSS LSASLGDIVT MTCQASQGTS INLNWFQQKP GKAPKLLIYG 51 SSNLEDGVPS RFSGSRYGTD FTLTISSLED EDLATYFCLQ HSYLPYTFGG 101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SWCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201 STSPIVKSFN RNEC
    B.
    1 EVQLQQSGPE 51 INPYSGETTY 101 YDASPFAYWG 151 YFPEPVTVTW 201 CNVAHPASST 251 LTPKVTCVW 301 ELPIMHQDWL 351 KEQMAKDKVS 401 FIYSKLNVQK
    LVTPGASVKI SCKASGYTFT NQKFKGTATL TVDKSSSIAY QGTLVTVSAA KTTPPSVYPL NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL KVDKKIVPRD CGCKPCICTV DISKDDPEVQ FSWFVDDVEV NGKEFKCRVN SPAFPAPIEK LTCMITDFFP EDITVEWQWN SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN
    DHYMSWVKQS HGKSLEWIGD MEIRGLTSED SAVYYCARDD APGSAAQTNS MVTLGCLVKG YTLSSSVTVP SSTWPSETVT PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT HTAQTQPREE QFNSTFRSVS TISKTKGRPK APQVYTIPPP GQPAENYKNT QPIMDTDGSY HHTEKSLSHS PGK
    DMO (g/cm2)
    imagen1
    Vertebras lumbares
    imagen2
    Metáfisis tibial
    co
    ro
    co
    0,075 0,050 0,025 ■
    0,000
    I
    1
    I
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    *
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    *
    imagen3
    Y////////////Z*
    imagen4
    Vertebras lumbares
    imagen5
    Metáfisis tibial
    <N
    E
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    0,00
    imagen6
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    Q
    0,075 ■
    0,050 ■
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    0,025 ■
    0,000 -1
    imagen7
    co
    ro
    en
    imagen8
    Vertebras lumbares
    imagen9
    Metáfisis tibial
    imagen10
    O
    2
    O
    imagen11
    imagen12
    O
    2
    Q
    0,100 ■ 0,075 • 0,050 ’ 0,025 ■ 0,000 ■
    imagen13
    imagen14
    imagen15
    *
    imagen16
    326
    1 QGWQAFKNDA TEIIPELGEY PEPPPELENN KTMNRAENGG RPPHHPFETK
    51 DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR-LLPNAIGRGK
    Cl C2 C3 C4
    101 WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTRF
    C5 C6 C7 C8
    151 HNQSELKDFG TEAARPQKGR KPRPRARSAK ANQAELENAY
    1 CAGGGGTGGC AGGCGTTCAA GAATGATGCC ACGGAAATCA TCCCCGAGCT 51 CGGAGAGTAC CCCGAGCCTC CACCGGAGCT GGAGAACAAC AAGACCATGA 101 ACCGGGCGGA GAACGGAGGG CGGCCTCCCC ACCACCCCTT TGAGACCAAA 151 GACGTGTCCG AGTACAGCTG CCGCGAGCTG CACTTCACCC GCTACGTGAC 201 CGATGGGCCG TGCCGCAGCG CCAAGCCGGT CACCGAGCTG GTGTGCTCCG 251 GCCAGTGCGG CCCGGCGCGC CTGCTGCCCA ACGCCATCGG CCGCGGCAAG 301 TGGTGGCGAC CTAGTGGGCC CGACTTCCGC TGCATCCCCG ACCGCTACCG 351 CGCGCAGCGC GTGCAGCTGC TGTGTCCCGG TGGTGAGGCG CCGCGCGCGC 401 GCAAGGTGCG CCTGGTGGCC TCGTGCAAGT GCAAGCGCCT CACCCGCTTC 451 CACAACCAGT CGGAGCTCAA GGACTTCGGG ACCGAGGCCG CTCGGCCGCA 501 GAAGGGCCGG AAGCCGCGGC CCCGCGCCCG GAGCGCCAAA GCCAACCAGG 551 CCGAGCTGGA GAACGCCTAC
    imagen17
    Figura 9
    328
    imagen18
    329
    Péptidos
    Pos. sec Masa obs. Secuencia
    T19,2
    65-72 121-132 2146,34 1. (2145,8) 2. YVTDGP CR (910) C2 VQLLCPGGEA PR (1239) C6
    T20
    9620,8 (MALDI); 9638,41 (ESI-MS)
    T20,6
    51-90 104-149 (4419.1) 1. (5226.2) 2. 7105,7 (MALDI); DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR PSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLT R 7122,0 (ESI-MS)
    51-64 101-117 73-90 138-149 3944,5 1. 2. 3177,0 3. 4. DVSEYSCREL HFTR (1740,9) C1 WWRPSGPPFR CIPDRYR (2206,6) C5 SAKPVTELVC SGQCGPAR (1802,2) C3,C4 LVASCKCKRL TR (1378,5) C7,C8
    T21-22
    10.147 (MALDI); 10170,3 (ESI-MS)
    51-90 101-149 (4419,1) 1. (5754,8) 2. DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA
    PRARKVRLVA SCKCKRLTR
    AspNl4,6
    AspNl8,6
    34-47
    12-25
    158-184
    9-50
    1245,5
  19. 1585.4
  20. 2964.5
    AspN22,7-23,5 51-154
  21. 11.740
    Secuencia
    ENGGRPPHHPF
    EIIPELGFYP EPPP
    DFGTEAARPQ KGRKPRPRAR SAKANQA
    DATEIIPELG EYPEPPPELE NNKTMNRAEN GGRPPHHPFE TK (Glicopéptido)
    DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR LLPNAIGRGK WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTRF HNQS
    Figura 12
    331
    1 QGWQAFKNDA TEIIPELGEY PEPPPELENN KTMNRAENGG RPPHHPFETK
    I-
    C1
    Bucle 1 -
    C2
    Bucle 2
    C3 C4
    51 DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR LLPNAIGRGK
    * \ 11
    imagen19
    -----Bucle 2------\|
    s P1-22
    Bucle 3 -
    J5 \6 V\C8
    101 WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTRF
    IMIIIIIIIIIIII1IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII1III T19,2 T20
    imagen20
    151 HNQSELKDFG TEAARPQKGR KPRPRARSAK ANQAELENAY
    332
    1 QGWQAFKNDA TEIIPELGEY PEPPPELENN KTMNRAENGG RPPHHPFETK
    AspN18,6
    AspN14,6 un
    AspNi4,6
    el C2 C3 C4
    51 DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR LLPNAIGRGK
    AspN22,7-23,5
    cXcs
    101 WWRPSGPDFR fclPDRYRAQR VQLLifcPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTRF
    AspN22,7-23,5
    151 HNQSELKDFG TEAARPQKGR KPRPRARSAK ANQAELENAY
    m
    V///M
    AspN14,6
    333
    imagen21
    Mab-A + 2 nM
    334
    imagen22
    335
    imagen23
    336
    imagen24
    337
    A. Epítopo de bucle 2 para Mab-A y Mab-B
    C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5
    \
    1
    B. Epítopo T20,6 para Mab-C y Mab-0
    DVSEYSC1RELHFTR SAKPVTELVC3SGQC4GPAR
    imagen25
    WWRPSGPDFRC5IPDRYR LVASC7KC8KRLTR
    73
    imagen26
    imagen27
    339
    Epítopo “derivado de T20,6 1 {nudo de cistina + 4 ramas)" para Mab-Ú
    C1RELHFTR^
    CSÍPDRYR^ LVASC7KC8
    "derivado de T20.6 1 (nudo de cistina + 4 ramas)"
    73
    imagen28
    co
    O
    £
    U)
    3
    O
    O
    ro
    O
    imagen29
    Con esderostina de ratón ( 1 ug/ml)
    * = estadísticamente significativamente diferente del grupo Sel de ratón
    341
    imagen30
    Con esclerostina humana (1 ug/ml)
    * st estadísticamente significativamente diferente del grupo Sel humana
    co
    NJ
    £
    05
    3
    O
    O
    ro
    ü
    40
    35
    30
    25
    20
    15
    10
    5
    0
    imagen31
    *
    imagen32
    imagen33
    *
    imagen34
    *
    imagen35
    *
    imagen36
    *
    íígíí!
    gí«í;
    1
    a
    ii
    íí/íí/J
    ÍS88&2
    imagen37
    imagen38
    Con esclerostina humana (1 ug/ml)
    * - estadísticamente significativamente diferente del grupo Sel humana
    343
    Densidad mineral ósea total (mgfcm)
    imagen39
    DMO total
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