NO346914B1 - Monoklonalt antistoff og farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff. - Google Patents

Monoklonalt antistoff og farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff. Download PDF

Info

Publication number
NO346914B1
NO346914B1 NO20201120A NO20201120A NO346914B1 NO 346914 B1 NO346914 B1 NO 346914B1 NO 20201120 A NO20201120 A NO 20201120A NO 20201120 A NO20201120 A NO 20201120A NO 346914 B1 NO346914 B1 NO 346914B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
sclerostin
antibody
seq
binding
cdr
Prior art date
Application number
NO20201120A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20201120A1 (no
Inventor
John Latham
Christopher Paszty
Martyn Kim Robinson
Kevin Graham
Alistair James Henry
Kelly Sue Hoffmann
Alastair Lawson
Hsieng Sen Lu
Andy Popplewell
Wenyan Shen
David Winkler
Aaron George Winters
Original Assignee
Amgen Inc
Ucb Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36992590&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO346914(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc, Ucb Pharma Sa filed Critical Amgen Inc
Publication of NO20201120A1 publication Critical patent/NO20201120A1/no
Publication of NO346914B1 publication Critical patent/NO346914B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Description

TEKNISK OMRÅDE
Foreliggende oppfinnelse relaterer generelt til antistoffer i stand til å binde til sklerostin. Mer spesifikt vedrører oppfinnelsen monoklonalt antistoff og en farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff.
OPPFINNELSENS BAKGRUNN
To eller tre distinkte faser av forandringer til beinmasse skjer i løpet av livet til et individ (se Riggs, West J. Med.154:63-77 (1991)). Den første fasen skjer i både menn og kvinner og fortsetter til man oppnår et tap av beinmasse. Den første fasen er oppnådd gjennom lineær vekst av de endokondrale vekstplatene og radial vekst på grunn av en rate av periosteal økning. Den andre fasen begynner rundt 30 års alderen for trabekulært bein (flate beine slik som ryggvirvel og bekken) og omtrent ved 40 års alderen for kortikalt bein (for eksempel lange bein funnet i lemmene) og forstetter til alderdommen. Denne fasen er karakterisert ved sakte beintap og skjer i både menn og kvinner. I kvinner skjer også en tredje fase av beintap, høyst sannsynlig på grunn av postmenopausale østrogenmangler. I løpet av denne fasen alene kan kvinner tape en ekstra beinmasse fra kortikalbeinet og fra det trabekulære feltet (se Riggs, supra).
Tap av beinmineralinnhold kan bli forårsaket av et stort utvalg av tilstander og kan resultere i signifikante medisinske problemer. For eksempel er osteoporose en svekkende sykdom i mennesker og er karakterisert ved markert minkning i skjelettbeinmasse og mineraltetthet, strukturelle nedbrytninger av bein, inkludert degradering av beinmikroarkitektur og korresponderende økninger i beinskjørhet (det vil si minkninger i beinstyrke) og mottakelighet mot brudd i hardt rammede individer. Osteoporose i mennesker er generelt innledet ved klinisk osteopenia (beinmineraltetthet som er større enn et standardavvik men mindre enn 2,5 standardavvik under gjennomsnittverdien for ung voksent bein), en tilstand funnet i omtrent 25 millioner mennesker i de forente stater. Ytterligere 7-8 millioner pasienter i de forente stater har blitt diagnostisert med klinisk osteoporose (definert som beinmineralinnhold større enn 2,5 standardavvik under det til modent ungt voksent bein). Frekvensen av osteoporose i den menneskelige populasjonen øker med alderen. Blant kaukasiere er osteoporose dominerende i kvinner som, i de forente stater, omfatter 80 % av osteoporosepasientpoolen. Den økende skjørbarheten og mottakeligheten for brudd i skjelettbein i alderen er forverret ved den høyere risikoen for tilfeldige fall i denne populasjonen. Brukne hofter, håndledd, og ryggvirvler er blant de mest vanlige skadene assosiert med osteoporose. Spesielt er hoftebrudd ekstremt ukomfortabelt og kostbart for pasienten, og for kvinner korrelert med høye rater av dødelighet og morbiditet.
Selv om osteoporose har blitt ansett som en økning i risikoen for brudd på grunn av minket beinmasse kan få av dagens tilgjengelige behandlinger for skjelettforstyrrelser øke beintettheten til voksne, og flesteparten av dagens tilgjengelige behandlinger fungerer primært ved å inhibere videre beinresorpsjon i stedet for å stimulere ny beindannelse. Østrogen er nå blitt forordnet for å forsinke beintap. Imidlertid eksisterer noe kontrovers over hvorvidt pasienter vinner noen som helst langsfordel og hvorvidt østrogen har noen som helst effekter på pasientene over 75 års alder. Imidlertid er bruk av østrogen antatt å øke risikoen for bryst og livmorkreft. Kalcitonin, osteokalsin med vitamin K eller høye doser av kostkalsium, med eller uten vitamin D har også blitt foreslått for postmenopausale kvinner. Imidlertid har høye doser av kalsium ofte uønskede gastrointestinale bivirkninger og serum og urinkalsiumnivåer må bli kontinuerlig monitorert (for eksempel Khosla and Riggs, Mayo Clin. Proc. 70:978982, 1995).
Andre nåværende terapeutiske tilnærmelser til osteoporose inkluderer bifosfonater (for eksempel Fosfamax<TM>, Actonel<TM>, Bonvia<TM>, Zometa<TM>, olpadronat, neridronat, skelid, bonefos), paratyroidhormon, kalcilytiks, kalsimimetika (for eksempel cinacalcet), statiner, anabole steroider, lantanum og strontiumsalter, og natriumfluorid. Imidlertid er slike terapeutika ofte assosiert med uønskede bivirkninger (se Khosla and Riggs, supra).
Sklerostin, produktet av SOST genet, er fraværende i sklerosteose, en skjelettsykdom karakterisert ved for sterk vekst av bein og sterke tette bein (Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet., 68:577-589, 2001; Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10:537-543, 2001). Aminosyresekvensen til humant sklerostin er rapportert av Brunkow et al. ibid og er lagt frem heri som SEQ ID NO:1.
WO 2005014650 A2 vedrører antistoffer som spesifikt bindes til et TGF-beta bindende protein, herav sklerostin. Sammensetninger inneholdende antistoffene kan anvendes til å øke mineraltettheten i ben, for eksempel i forbindelse med behandling av en rekke forskjellige sykdommer og forstyrrelser i ben slik som osteopeni, osteoporose og brist og benbrudd.
WO 2005003158 A2 angir TGF-beta bindende proteiner og humane monoklonale antistoffer som bindes spesifikt til TGF-beta bindende proteiner. Sammensetninger inneholdende antistoffene øker benmineraltettheten ved å interferere med interaksjonen mellom det TGF-beta bindende proteinet sklerostin og et TGF-beta superfamilie medlem, fortrinnsviset ben morfogenisk protein.
KORT SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN
Beskrevet heri er sammensetninger som kan bli benyttet for å øke minst en av beindannelse, beinmineraltetthet, beinmineralinnhold, beinmasse, bein-kvalitet eller beinstyrke, og at de derfor kan bli benyttet for å behandle et stort utvalg av tilstander der en økning i minst en av beindannelse, beinmineraltetthet, beinmineral-innhold, beinmasse, beinkvalitet og beinstyrke ønskelig. Den foreliggende oppfinnelse tilbyr også andre relaterte fordeler beskrevet heri.
I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et monoklonalt antistoff som binder seg til human sklerostin i SEQ ID NO: 1 med en dissosiasjonskonstant på mindre enn eller lik 1 x 10<-9 >M, bestemt av overflate-plasmonresonans og øker minst én av bendannelse, benmineraltetthet, benmineralinnhold, benmasse, benkvalitet og benstyrke hos et pattedyr; og
a) omfatter CDR-L1 av SEQ ID NO: 48, CDR-L2 av SEQ ID NO: 49, CDR-L3 av SEQ ID NO: 50, CDR-H1 av SEQ ID NO: 45, CDR-H2 av SEQ ID NO: 46 og CDR-H3 av SEQ ID NR: 47;
b) omfatter CDR-L1 av SEQ ID NO: 42, CDR-L2 av SEQ ID NO: 43, CDR-L3 av SEQ ID NO: 44, CDR-H1 av SEQ ID NO: 39, CDR-H2 av SEQ ID NO: 40, og CDR-H3 av SEQ ID NO: 41; eller
c) kryssblokkerer bindingen av nevnte antistoff til (a) eller (b) til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 eller er kryss-blokkert fra binding til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 av nevnte antistoff (a) eller (b), hvor kryssblokkering bestemmes av overflateplasmonresonans eller ELISA.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, som binder seg til polypeptidene T20, T20.6, T21-22 og N22.7-23.5 og har minimal påviselig binding til polypeptidene T19.2, N14.6 og N18.6,
hvor polypeptid T20 har sekvenser DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR og PSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLT R;
hvor polypeptid T20.6 har sekvenser DVSEYSCREL HFTR, WWRPSGPPFR CIPDRYR, SAKPVTELVC SGQCGPAR og LVASCKCKRL TR;
hvor polypeptid T21-22 har sekvenser DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR og WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTR;
hvor polypeptid N22.7-23.5 har sekvensen DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR LLPNAIGRGK WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTRF HNQS;
hvor polypeptid T19.2 har sekvenser YVTDGP CR og VQLLCPGGEA PR;
hvor polypeptid N14.6 har sekvenser ENGGRPPHHPF, EIIPELGFYP EPPP og DFGTEAARPQ KGRKPRPRAR SAKANQA; og
hvor polypeptid N18.6 har sekvensen DATEIIPELG EYPEPPPELE NNKTMNRAEN GGRPPHHPFE TK.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, som er et F(ab')2, Fab, Fab' eller Fv fragment.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, som er et humanisert antistoff eller et humant antistoff.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, som binder seg til human sklerostin i SEQ ID NO: 1 med dissosiasjonskonstant på mindre enn eller lik 1 x 10<-9 >M, bestemt av overflateplasmonresonans.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, som binder seg til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 med en dissosiasjonskonstant på mindre enn eller lik 1 x 10<-10 >M, mindre enn eller lik 1 x 10<-11 >M, eller mindre enn eller lik 1 x 10<-12 >M.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, som binder seg til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 med en affinitet som er minst 50, 100, 250, 500, 1000 eller 10000 ganger større enn affiniteten for hønseeggehvite lysozym.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, hvori det kryssblokkerende antistoff binder seg til sklerostin i en Biacore-analyse slik at i nærvær av det kryssblokkerte antistoff er den registrerte bindingen fra 75% til 4% av den maksimale teoretiske binding av de to antistoffene i kombinasjon.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, hvori det kryssblokkerende antistoffet i oppløsningsfasen i ELISA forårsaker en reduksjon på mellom 60% og 100% i mengden sklerostin bundet av antistoff belagt på ELISA-platen sammenlignet med mengden sklerostin bundet av det belagte antistoff i fravær av oppløsningsfaseantistoffet.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, hvori antistoffet til (a) har lette kjeder med SEQ ID NO: 15 og tunge kjeder med SEQ ID NO: 19.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff, hvori antistoffet til (b) har lette kjeder med SEQ ID NO: 7 og tunge kjeder med SEQ ID NO: 11.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff for anvendelse ved behandling av osteoporose eller osteopeni.
I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse det ovennevnte monoklonale antistoff for anvendelse for å forbedre utfallet i ortopediske prosedyrer, tannbehandlinger, implantatkirurgi, leddbytte, bentransplantasjon, benkosmetisk kirurgi eller benreparasjon som bruddheling, ikke-organisert helbredelse, forsinket organisert helbredelse eller ansiktsrekonstruksjon.
I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning omfattende et antistoff som nevnt over, og en farmasøytisk eller fysiologisk akseptabel bærer, hjelpestoff eller fortynningsmiddel.
Disse og andre aspekter av den foreliggende oppfinnelsen vil bli tydelige ved referanse til de følgende detaljerte beskrivelser og vedlagte tegninger.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 avbilder aminosyresekvensene til den modne formen (signalpeptider kløyvet av) av den lette kjeden (figur 1A) (SEQ ID NR.: 23) og tung kjede (figur 1B) (SEQ ID NR.: 27) for anti-humant sklerostin og anti-musesklerostinantistoff Ab-A.
Figur 2 avbilder aminosyresekvensene til den modne formen (signalpeptider kløyvet av) av den lette kjeden (figur 1A) (SEQ ID NR.: 31) og tung kjede (figur 2B) (SEQ ID NR.: 35) for anti-humant sklerostin og anti-musesklerostinantistoff Ab-A.
Figur 3 avbilder aminosyresekvensene den til modne formen (signalpeptider kløyvet av) av den lette kjeden (figur 3A) (SEQ ID NR.: 15) og tung kjede (figur 3B) (SEQ ID NR.: 19) for anti-humant sklerostin og anti-musesklerostinantistoff Ab-C.
Figur 4 avbilder aminosyresekvensene til den modne formen (signalpeptider kløyvet av) av den lette kjeden (figur 4A) (SEQ ID NR.: 7) og tung kjede (figur 4B) (SEQ ID NR.: 11) for anti-humant sklerostin og anti-musesklerostinantistoff Ab-D.
Figur 5 avbilder beinmineraltetthet i mus målt ved to skjelettsteder (lumbar ryggvirvel og tibial metafyse) etter 3 uker med behandling med vehikkel, PTH (1-34), Ab-A eller Ab-B.
Figur 6 avbilder beinmineraltetthet i mus målt ved to skjelettsteder (lumbar ryggvirvel og tibial metafyse) etter 2 uker med behandling med vehikkel, PTH (1-34) eller Ab-C.
Figur 7 avbilder beinmineraltetthet i mus målt ved to skjelettsteder (lumbar ryggvirvel og tibial metafyse) etter 3 uker med behandling med vehikkel eller Ab-D.
Figur 8 avbilder aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid kløyvet av) av humant sklerostin (SEQ ID NR.:1). Også avbildet er nukleotidsekvensen til det humane sklerostinkodende område som koder for den modne formen av humant sklerostin. De åtte cysteinene er nummeret C1 til C8. Cystein-knuten er dannet ved tre disulfidbindinger (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 og C6 danner også en disulfidbinding, imidlertid er denne disulfid ikke del av cysteinknuten.
Figur 9 avbilder en skjematisk fremstilling av grunnstrukturen til humant sklerostin. Det er en stor N-terminal arm (fra den første Q til C1) og en C-terminal arm (fra C8 til den terminale Y). Mellom disse armene er det en cysteinknutestruktur (dannet av tre disulfider: C1-C5; C3-C7; C4-C8) og tre luper som er betegnet Loop1, Loop 2 og Loop 3. Områdene lengst borte av Loop 1 og Loop 3 er koblet med C2-C6 disulfid.
Potensielle trypsinkløyvningsseter er indikert (arginin=R og lysin=K). Noen av de potensielle AspN kløyvingsseter er indikert (kun asparaginsyre (D) rester er vist).
Figur 10 avbilder HPLC peptidkartene av humant sklerostin etter fordøyelse med enten trypsin eller AspN. De humane sklerostinpeptidene generert ved trypsinfordøyelse er indikert (T19.2, T20, T20.6 og T21-22) likeså er de humane sklerostinpeptidene generert ved AspN fordøyelse (AspN14.6, AspN18.6 og AspN22.7-23.5).
Figur 11 avbilder sekvens og masseinformasjon for de isolerte humane sklerostindisulfidkoblede peptidene generert ved trypsinfordøyelse. Seq. pos. = sekvensposisjon. Obs. = observert. Observert masse ble bestemt ved ESI-LC-MS analyse.
Figur 12 avbilder sekvens og masseinformasjon for de isolerte humane sklerostinpeptidene generert ved AspN fordøyelse. AspN22.7-23.5 peptidet inneholder de 4 bisulfidbindingene. Seq. pos. = sekvensposisjon. Obs. = observert. Observert masse ble bestemt ved ESI-LC-MS analyse.
Figur 13 viser en lineær fremstilling av fire humane sklerostinpeptider (T19.2, T20, T20.6 og T21-22) dannet ved trypsinfordøying.
Figur 14 viser en lineær fremstilling av fem humane sklerostinpeptider (AspN14.6, AspN18.6 og AspN22.7-23.5) generert ved AspN fordøying. AspN14.6 HPLC topp er tatt sammen av tre peptider som ikke er koblet med noen som helst disulfidbindinger.
Figur 15 viser resonansenhet (Ru) signalet fra Biacore-basert "human sklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalyse". Relativ Mab binding til ulike humane sklerostinpeptider (i løsning) versus Mab binding til intakte modne former av humant sklerostin (immobilisert på Biacore chip) ble bestemt. Data vist er for Ab-A. Humane sklerostinpeptider benyttet var T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 og AspN22.7-23.5.
Figur 16 viser resonansenhet (Ru) signalet fra den Biacore-baserte "humane sklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalysen". Relativ Mab binding til ulike humane sklerostinpeptider (i løsning) versus Mab binding til intakt moden form av humant sklerostin (immobilisert på Biacore chip) ble bestemt. Data vist er for Ab-B. Humane sklerostinpeptider benyttet var T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 og AspN22.7-23.5.
Figur 17 viser resonansenhet (Ru) signalet fra den Biacore-baserte "humane sklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalysen". Relativt Mab binding til ulike humane sklerostinpeptider (i løsning) versus Mab binding til intakt moden form av humant sklerostin (immobilisert på Biacore chip) ble bestemt. Data vist er for Ab-C. Humansklerostinpeptider benyttet var T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 og AspN22.7-23.5.
Figur 18 viser resonansenhet (Ru) signalet fra den Biacore-baserte "humansklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalysen." Relativ Mab binding til ulike humane sklerostin-peptider (i løsning) versus Mab binding til intakt moden form av humant sklerostin (immobilisert på Biacore chip) ble bestemt. Data vist er for Ab-D. Humane sklerostin-peptider benyttet var T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 og AspN22.7-23.5.
Figur 19 viser to Mab bindingsepitoper på humant sklerostin. Figur 19A viser sekvens av Loop 2 epitopen for binding av Ab-A og Ab-B til humant sklerostin (SEQ ID NR.: 6). Figur 19 viser sekvens, disulfidbinding og skjematisk fremstilling av T20.6 epitopen for binding av Ab-C og Ab-D til humant sklerostin (SEQ ID NR.: 2-5).
Figur 20 avbilder HPLC peptidkartene til humant sklerostin etter fordøyelse med trypsin. Figur 20A viser fordøyelse av det humane sklerostin Ab-D komplekset. Figur 20B viser fordøyelse av humant sklerostin alene. T19.2, T20, T20.6 og T21-22 peptidtopper er indikert.
Figur 21 viser sekvensen, disulfidbinding og skjematisk fremstilling av "T20.6 derivat 1 (cystein-knute 4 armer)" epitopen for binding av Ab-D til humant sklerostin. (SEQ ID NR.: 70-73).
Figur 22 viser resultater fra MC3T3-E1-BF osteoblastcellelinjemineraliseringsanalyse benyttet for å identifisere anti-sklerostinnøytraliserende Mabs. Musesklerostin (Scl) ble benyttet ved 1 µg/ml. Monoklonale antistoffer ble benyttet ved 10 og 5 µg/ml. Grad av mineralisering (ulike typer av uløselig kalsiumfosfat) ble kvantitert ved å måle kalsium.
Figur 23 avbilder resultater fra MC3T3-E1-BF osteoblastcellelinjemineraliseringsanalyse benyttet for å identifisere anti-sklerostinnøytralierende Mabs. Humant sklerostin (Scl) ble benyttet ved 1 µg/ml. Monoklonale antistoffer ble benyttet ved 8 og 4 µg/ml. Grad av mineralisering (ulike typer av uløselig kalsiumfosfat) ble kvantitert ved å måle kalsium.
Figur 24 viser resultater fra MC3T3-E1-BF osteoblastcellelinjemineraliseringsanalyse benyttet for å identifisere anti-sklerostinnøytraliserende Mabs. Humant sklerostin (Scl) ble benyttet ved 1 µg/ml. Monoklonale antistoffer ble benyttet ved 10 µg/ml. Grad av mineralisering (ulike typer av uløselig kalsiumfosfat) ble kvantitert ved å måle kalsium.
Figur 25 avbilder resultater fra et betennelsesindikert beintap SCID musemiddel. Ab-A behandling beskyttet mus fra betennelsesrelatert beintap assosiert med kolitt når målt som total beinmineraltetthet (figur 25A), ryggvirvelbeintetthet (figur 25B) og lårbeinsbeintetthet (figur 25C).
DETALJERT BESKRIVELSE
Foreliggende beskrivelse relaterer til områder av det humane sklerostinprotein som inneholder epitoper gjenkjent av antistoffer som også binder til fullengdesklerostin og fremgangsmåter for å lage og benytte disse epitopene. Beskrivelsen gir også bindingsmidler (slik som antistoffer) som spesifikt binder til sklerostin eller deler av sklerostin og fremgangsmåter for å benytte slike bindingsmidler. Bindingsmidlene er nyttige for å blokkere eller svekke binding av humant sklerostin til en eller flere ligander.
Rekombinant humant sklerostin/SOST er kommersielt tilgjengelig fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 kat# 1406-ST-025). I tillegg er rekombinant musesklerostin/SOST kommersielt tilgjengelig fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 kat# 1589-ST-025). Forskningsgradsklerostinbindingsmonoklonale antistoffer er kommersielt tilgjenglige fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; musemonoklonal: 2006 kat# MAB1406; rottemonoklonal: 2006 kat# MAB1589). U.S. patentnr.6 395 511 og 6803 453 og U.S. patentpublikasjoner 20040009535 og 20050106683 refererer til antisklerostinantistoffer generelt.
Som benyttet heri er betegnelsen humant sklerostin ment å inkludere proteinet med SEQ ID NO:1 og alleliske varianter derav. Sklerostin kan bli renset fra 293T vertsceller som har blitt transfektert med et gen som koder for sklerostin ved å eluere filtrert supernatant fra vertscellekulturvæske ved å benytte en heparin HP kolonne, ved å benytte en saltgradient. Fremstillingen og videre rensing ved å benytte kationutbyttekromatografi er beskrevet i eksemplene 1 og 2.
Bindingsmidler er fortrinnsvis antistoffer, som definert heri. Betegnelsen "antistoff" refererer til et intakt antistoff, eller et bindingsfragment derav. Et antistoff kan omfatte et fullstendig antistoffmolekyl (inkludert polyklonale, monoklonale, kimeriske, humaniserte eller humane versjoner som har fullengde tung og/eller lette kjeder) eller omfatte et antigenbindingsfragment derav. Antistoffragmenter inkluderer F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc og Fd fragmenter, og kan bli inkorporert inn i enkeltdomeneantistoffer, enkeltkjedeantistoffer, maksistoffer, ministoffer, intrastoffer, diastoffer, triastoffer, tetrastoffer, v-NAR og bis-scFv (se for eksempel Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Antistoffpolypeptider er også beskrevet i U.S. pantentnr. 6 703 199, inkludert fibronektinpolypeptidmonostoffer. Andre antistoffpolypeptider er beskrevet i U.S. patentpublikasjon 2005/0238646, som er enkeltkjedepolypeptider.
Antigenbindingsfragmenter avledet fra et antistoff kan oppnås, for eksempel ved proteolytisk hydrolyse av antistoffet, for eksempel pepsin- eller papinfordøyelse av hele antistoffer ifølge konvensjonelle fremgangsmåter. Som et eksempel kan antistoffragmenter bli produsert ved enzymatisk kløyving av antistoffer med pepsin for å gi et 5S fragment betegnet F(ab')2. Dette fragmentet kan videre bli kløyvet ved å benytte et tiolreduserende virkemiddel for å produsere 3.5S Fab'monovalente fragmenter. Valgfritt kan kløyvingsreaksjonen bli utført ved å benytte en blokkerende gruppe for sulfhydrylgruppene som resulterer fra kløyving av disulfidkoblingene. Som et alternativ produserer en enzymatisk kløyving ved å benytte papain to monovalente Fab fragmenter og et stort Fc fragment direkte. Disse fremgangsmåter er beskrevet, for eksempel, ved Goldenberg, U.S.4 331 647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J.73:119, 1959; Edelman et al., i Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); og av Andrews, S.M. og Titus, J.A. i Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., utg.), John Wiley & Sons, New York (2003) s.2.8.1-2.8.10 og 2.10A.1-2.10A.5. Andre fremgangsmåter for kløyving av antistoffer, slik som å separere tungkjeder for å danne monovalente lett-tunge kjedefragmenter (Fd), videre kløyving av fragmenter, eller andre enzymatiske, kjemiske, eller genetiske teknikker kan også bli benyttet så lenge som fragmentene binder til antigenet som er gjenkjent av det intakte antistoffet.
Et antistoffragment kan også være et hvilket som helst syntetisk eller genetisk fremstilt protein. For eksempel inkluderer antistoffragmenter isolerte fragmenter bestående av lettkjedevariabelregionen, "Fv" fragmenter bestående av de variable regionene av tungog lettkjeder, rekombinante enkeltkjedepolypeptidmolekyler der lett- og tungvariable områder er koblet med en peptidlinker (scFv proteiner).
En annen form av et antistoffragment er et peptid bestående av en eller flere komplementaritetsbestemmende områder (CDR'er) av et antistoff. CDR'er (også betegnet "minimale gjenkjennelsesenheter" eller "hypervariabelt område") kan skaffes ved å konstruere polynukleotider som koder for CDR av interesse. Slike polynukleotider er fremstilt, for eksempel, ved å benytte polymerasekjedereaksjon for å syntetisere det variable området ved å benytte mRNA av antistoffproduserende celler som et templat (se for eksempel Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," i Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (utg.), s. 166 (Cambridge University Press 1995); og Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," i Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (utg.), s.137 (Wiley-Liss, Inc.1995)).
Derfor kan bindingsvirkemidlet omfatte minst en CDR som beskrevet heri.
Bindingsmidlet kan omfatte minst to, tre, fire, fem eller seks CDR'er som beskrevet heri. Bindingsmidlet kan videre omfatte minst et variabelt områdedomene av et antistoff beskrevet heri. Det variable områdedomenet kan være av en hvilken som helst størrelse eller aminosyresammensetning og vil generelt omfatte minst en CDR sekvens ansvarlig for binding til humant sklerostin, for eksempel CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 og/eller de lettkjede CDR'ene spesifikt beskrevet heri og som er tilstøtende til eller i leseramme med en eller flere struktursekvenser. I generelle betingelser kan det variable (V) områdedomene være et hvilket som helst passende arrangement av immunoglobulin tung (VH) og/eller lett (VL) kjedevariable domener. Derfor for eksempel kan V områdedomenet være monomerisk og være et VH eller VL domene, som er i stand til uavhengig å binde humant sklerostin med en affinitet på minst lik 1 x 10<-7>M eller minst som beskrevet under. Alternativt kan V områdedomenet være dimerisk og inneholde VH-VH, VH-VL eller VL-VL, dimerer. V områdedimeren omfatter minst en VH og minst en VL kjede som kan være ikke-kovalent assosiert (heretter referert til som FV). Hvis ønskelig kan kjedene være kovalent koblet enten direkte, for eksempel via en disulfidbinding mellom de to variable domenene, eller gjennom en linker, for eksempel en peptidlinker, for å danne en enkel kjede Fv (scFv).
Det variable områdedomenet kan være et hvilket som helst naturlig forekommende variabelt domene eller en konstruert versjon derav. Ved konstruert versjon er det ment et variabelt områdedomene som har blitt dannet ved å benytte rekombinant DNA konstruksjonsteknikker. Slike konstruerte versjoner inkluderer de dannet, for eksempel, fra et spesifikt antistoffvariabelt område ved insersjoner, delesjoner, eller forandringer i eller til aminosyresekvensene til det spesifikke antistoffet. Spesielle eksempler inkluderer konstruerte variable områdedomener som inneholder minst en CDR og eventuelt en eller flere strukturaminosyrer fra et første antistoff og det gjenværende av det variable områdedomenet fra et andre antistoff.
Det variable områdedomenet kan være kovalent festet ved en C-terminal aminosyre til minst et annet antistoffdomene eller et fragment derav. Derfor, for eksempel kan et VH domene som er til stede i det variable områdedomenet være koblet til et immunoglobulin CH1 domene, eller et fragment derav. På liknende måte kan et VL domene være koblet til et CK domene eller et fragment derav. På denne måten kan for eksempel antistoffet være et Fab fragment hvori antigenbindingsdomenet inneholder assosierte VH og VL domener kovalent koblet ved deres C-termini til et CH1 og CK domene, henholdsvis. CH1 domenet kan være forlenget med ytterligere aminosyrer, for eksempel for å gi et hengselsområde eller en del av et hengselsområdedomene som funnet i et Fab' fragment, eller for å gi ytterligere domener, slik som antistoff CH2 og CH3 domener.
Som beskrevet heri omfatter bindingsmidler minst en av disse CDR'ene. For eksempel kan en eller flere CDR bli inkorporert inn i kjente antistoffstrukturområder (IgG1, IgG2, et cetera), eller konjugert til en passende vehikkel for å øke halveringstiden derav.
Passende vehikler inkluderer, men er ikke begrenset til Fc, polyetylenglykol (PEG), albumin, transferrin og liknende. Disse og andre passende vehikler er kjent innen fagfeltet. Slike konjugerte CDR peptider kan være i monomeriske, dimeriske, tetrameriske, eller andre former. En eller flere vannløselige polymerer kan være bundet ved en eller flere spesifikke posisjoner, for eksempel ved amino-terminus, av et bindingsmiddel.
Et bindingsmiddel kan omfatte ett eller flere vannløselige polymertilbehør, inkludert, men ikke begrenset til, polyetylenglykol, polyoksyetylen-glykol, eller polypropylenglykol. Se for eksempel U.S.4 640 835, 4496 689, 4301 144, 4670 417, 4 791 192 og 4179 337. Et derivatbindingsmiddel kan omfatte en eller flere av monometoksy-polyetylenglykol, dekstran, cellulose eller andre karbohydratbaserte polymerer, poly-(N-vinylpyrrolidon)-poly-etylenglykol, propylenglykolhomopolymerer, en polypropylenoksid/etylenoksid ko-polymer, polyoksyetylert polyoler (for eksempel glycerol) og polyvinylalkohol, likeså som blandinger av slike polymerer. En eller flere vannløselige polymerer kan være tilfeldig festet til en eller flere sidekjeder. PEG kan fungere for å forbedre den terapeutiske kapasiteten for et bindings-middel, slik som et antistoff. Visse slike fremgangsmåter er diskutert, for eksempel, i U.S.6 133 426.
Det vil bli verdsatt at et bindingsmiddel kan ha minst en aminosyresubstitusjon, gitt at bindingsmidlet beholder bindingsspesifisitet. Derfor er modifikasjoner til bindingsmiddelstrukturene omfattet innen definisjonsområdet til beskrivelsen. Disse kan inkludere aminosyresubstitusjoner, som kan være konservative eller ikkekonservative, og som ødelegger sklerostinbindingsevnen til et bindings-middel.
Konservative aminosyresubstitusjoner kan omfatte ikke-naturlige forekommende aminosyrerester, som er typisk inkorporert ved kjemisk peptidsyntese i stedet for ved syntese i biologiske systemer. Disse inkluderer peptidomimetika og andre reverserte eller inverterte former av aminosyredeler. En konservert aminosyre-substitusjon kan også involvere en substitusjon av en nativ aminosyrerest med en normativ rest slik at det er liten eller ingen effekt på polariteten eller ladningen av aminosyreresten ved den posisjonen.
Ikke-konservative substitusjoner kan involvere utbyttet av et medlem av en klasse av aminosyrer eller aminosyremimetika, for et medlem fra en annen klasse med ulike fysiske egenskaper (for eksempel størrelse, polaritet, hydrofobisitet, ladning). Slike substituerte rester kan være introdusert inn i områder til det humane antistoffet som er homologe med ikke-humane antistoffer, eller inn i de ikke-homologe områdene av molekylet.
Videre kan en trent innen fagfeltet danne testvarianter som inneholder en enkel aminosyresubstitusjon med hver ønskede aminosyrerest. Variantene kan så bli screenet ved å benytte aktivitetsanalyser kjent for de trenet innen fagfeltet. Slike varianter kan bli benyttet for å samle informasjon om passende varianter. For eksempel, hvis man oppdager at en forandring på en bestemt aminosyrerest resulterte i ødelagt, uønsket redusert, eller upassende aktivitet, kan varianter med en slik forandring bli unngått. Med andre ord kan en trenet innen fagfeltet lett bestemme aminosyrene hvor videre substitusjoner bør unngås enten alene eller i kombinasjon med andre mutasjoner basert på informasjon samlet fra slike rutineeksperimenter.
En trenet fagmann vil være i stand til å bestemme passende varianter av polypeptidet som er satt fram heri ved å benytte velkjente teknikker. En trenet innen fagfeltet kan identifisere passende områder av molekylet som kan bli forandret uten å ødelegge aktivitet ved å målrettet velge områder som ikke er antatt å være viktige for aktivitet.
Man kan identifisere rester og deler av molekylene som er konservert blant like polypeptider. Til og med områder som kan være viktige for biologisk aktivitet eller for struktur kan være utsatt for konservative aminosyresubstitusjoner uten å ødelegge den biologiske aktiviteten eller uten å negativt påvirke polypeptidstrukturen.
I tillegg kan en trenet innen fagfeltet vise struktur-funksjonsstudier som identifiserer rester i liknende polypeptider som er viktige for aktivitet eller struktur. I lys av en slik sammenlikning, kan man prediktere viktigheten av aminosyrerester i et protein som korresponderer til aminosyrerester som er viktige for aktivitet eller struktur i liknende proteiner. En trenet innen fagfeltet kan velge kjemisk liknende aminosyresubstitusjoner for slike predikterte viktige aminosyrerester.
En trenet innen fagfeltet kan også analysere den tredimensjonale strukturen og aminosyresekvens i relasjon til den struktur i liknende polypeptider. I lys av slik informasjon kan en trenet innen fagfeltet predikere oppstillingen av aminosyrerester til et antistoff med hensyn til dets tredimensjonale struktur. En trenet innen fagfeltet kan velge ikke å lage radikale forandringer i aminosyrerestene prediktert å være på overflaten av proteinet siden slike rester kan være involvert i viktige interaksjoner med andre molekyler.
En rekke vitenskapelige publikasjoner har blitt viet til prediksjonen av sekundær struktur. Se Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas MoI. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 og Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979).
Videre er computerprogrammer for tiden tilgjengelige for å hjelpe til å prediktere sekundær struktur. En fremgangsmåte for å prediktere sekundær struktur er basert på homologimodelering. For eksempel har ofte to polypeptider eller proteiner som har en sekvensidentitet på større enn 30 %, eller likheter større enn 40 % ofte like strukturelle topologier. Den nylige veksten av proteinstrukturdatabasen (PDB) har gitt økt predikterbarhet av sekundær struktur, inkludert det potensielle antall av foldinger innen et polypeptids eller proteins struktur. Se Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(l):244-247 (1999). Det har blitt forslått (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369- 376 (1997)) at det er et begrenset antall foldinger i et gitt polypeptid eller protein og at med en gang et kritisk antall strukturer har blitt løst vil strukturell prediksjon bli dramatisk mer nøyaktig.
Ytterligere fremgangsmåter for å prediktere sekundær struktur inkluderer "gjenging" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "profil analyse" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), og "evolusjonskobling" (se Holm, supra (1999) og Brenner, supra (1997)).
Varianter av bindingsmidler kan inkludere glykosylerings-varianter hvori antallet og/eller typen av glykosyleringsseter blitt forandret sammenliknet med aminosyresekvensene til et forelderpolypeptid. Varianter kan omfatte et større eller et mindre antall av N-koblede glykosyleringsseter enn det native proteinet. Et N-koblet glykosyleringssete er karakterisert ved sekvensen: Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, hvori aminosyreresten designert som X kan være en hvilken som helst aminosyrerest bortsett fra prolin. Erstatningen av aminosyreresten for å danne denne sekvensen gir et potensielt nytt sete for tilføyelsen av en N-koblet karbohydratkjede. Alternativt vil substitusjoner som eliminerer denne sekvensen fjerne en eksisterende N-koblet karbohydratkjede. Også gitt er et rearrangement av N-koblede karbohydratkjeder hvori en eller flere N-koblede glykosyleringsseter (typisk de som er naturlig forekommende) eliminert og en eller flere nye N-koblede seter er dannet. Ytterligere foretrukne antistoffvarianter inkluderer cysteinvarianter hvori en eller flere cysteinrester er deletert fra eller erstattet for en annen aminosyre (for eksempel serin) som sammenliknet med forelderaminosyre-sekvensen. Cysteinvarianter kan være nyttige når antistoffer må bli refoldet inn i en biologisk aktiv konformasjon slik som etter isoleringen av uløselige inklusjonskropper. Cysteinvarianter har generelt færre cysteinrester enn det native proteinet, og har typisk et likt antall for å minimalisere interaksjoner resulterende fra uparrede cysteiner.
Ønskede aminosyresubstitusjoner (enten konservative eller ikke-konservative) kan bli bestemt av de trenet innen fagfeltet på det tidspunkt når slike substitusjoner er ønskelig. Aminosyresubstitusjoner kan bli benyttet for å identifisere viktige rester av antistoffer mot sklerostin, eller for å øke eller minke affiniteten av antistoffene til sklerostin beskrevet heri.
Foretrukne aminosyresubstitusjoner kan være de som: (1) reduserer mottakelighet for proteolyse, (2) reduserer mottakelighet for oksidering, (3) forandrer bindingsaffinitet for å danne proteinkomplekser, (4) forandrer bindingsaffiniteter, og/eller (4) overdrar eller modifiserer andre fysiokjemiske eller funksjonelle egenskaper på slike polypeptider.
Enkle eller multiple aminosyresubstitusjoner (f.eks. konservative aminosyresubstitusjoner) kan bli lagd i den naturlig forekommende sekvens (f.eks. i delen av polypeptidet på utsiden av domene(r) som danner intermolekylære kontakter). En konservativ aminosyresubstitusjon kan typisk ikke vesentlig forandre de strukturelle karakteristika til foreldersekvensen (for eksempel en erstatningsaminosyre bør ikke tendere til å bryte en heliks som skjer i foreldersekvensen, eller ødelegge andre typer av sekundær struktur som karakteriserer foreldersekvensen). Eksempler på artsgjenkjennende polypeptid-sekundær- og tertiærstrukturer er beskrevet i Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, utg., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, utg., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); og Thornton et al. Nature 354:105 (1991).
Bindingsmidler kan bli kjemisk bundet med polymerer, lipider, eller andre deler.
Bindingsmidlene kan omfatte minst en av CDR'ene beskrevet heri inkorporert inn i en biokompatibel skjelettstruktur. I et eksempel omfatter den biokompatible skjelettstrukturen et polypeptid eller deler derav som er tilstrekkelige for å danne en konformasjonsstabil strukturell støtte, eller rammeverk, eller stillas som er i stand til å fremvise en eller flere sekvenser av aminosyrer som binder til et antigen (for eksempel CDR'er, et variabelt område, et cetera) i et lokalisert overflateområde. Slike strukturer kan være et naturlig forekommende polypeptid eller polypeptid "fold" (et strukturmotiv), eller kan ha en eller flere modifikasjoner, slik som addisjoner, delesjoner eller substitusjoner av aminosyrer, relativt til et naturlig forekommende polypeptid eller fold. Disse stillasene kan bli derivert fra et polypeptid av hvilke som helst arter (eller av mer enn en art), slik som et menneske, andre pattedyr, andre virveldyr, invertebrat, planter, bakterier eller virus.
Typisk er de biokompatible rammeverkstrukturene basert på proteinstillaser eller skjelett andre enn immunoglobulindomener. For eksempel kan de basert på fibronektin, ankyrin, lipokalin, neokarzinostain, cytokrom b, CP1 sinkfinger, PST1, koiled koil, LACI-D1, Z domene og tendramisatdomener bli benyttet (se for eksempel Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
Bindingsmidlene kan inkludere de humaniserte antistoffene beskrevet heri. Humaniserte antistoffer slik som de beskrevet heri kan bli produsert ved å benytte teknikker kjent for de trenet innen fagfeltet (Zhang, W., et al., Molecular Immunology.42(12):1445-1451, 2005; Hwang W. et al, Methods.36(l):35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1):43-60, 2005; og Clark, M., Immunology Today.21(8):391-402, 2000).
Ytterligere vil en trenet innen fagfeltet gjenkjenne at passende bindingsmidler inkluderer deler av disse antistoffene, slik som en eller flere av CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-Ll, CDR-L2 og CDR-L3 som spesifikt beskrevet heri. Minst et av områdene av CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-Ll, CDR-L2 og CDR-L3 kan ha minst en aminosyresubstitusjon, gitt at bindingsmidlet bibeholder bindingsspesifisiteten av det ikke-substituerte CDR. Den ikke-CDR delen av bindingsmidlet kan være et ikkeproteinmolekyl, hvori bindingsmidlet kryssblokkerer bindingen av et antistoff beskrevet heri til sklerostin og/eller nøytralisere sklerostin. Ikke-CDR delen av bindingsmidlet kan være et ikke-proteinmolekyl der bindingsmidlet innehar et liknende bindingsmønster til humansklerostinpeptider i en "human sklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalyse" som det utøvd av minst et av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab- 7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-1l, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab- 20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24 og/eller nøytraliserer sklerostin. Ikke-CDR delen av bindingsmidlet kan være sammensatt av aminosyrer, hvori bindingsmidlet er et rekombinant bindingsprotein eller et syntetisk peptid, og det rekombinante bindingsproteinet kryssblokkerer bindingen av et antistoff beskrevet heri til sklerostin og/eller nøytraliserer sklerostin. Ikke-CDR delen av bindingsmidlet kan være sammensatt av aminosyrer, hvori bindingsmidlet er et rekombinant bindings-protein, og det rekombinante bindingsproteinet innehar et liknende bindingsmønster til humansklerostinpeptider i den humane sklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalysen (beskrevet heri under) som de fremvist av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24 og/eller nøytraliserer sklerostin.
Hvor et antistoff omfatter en eller flere av CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 og CDR-L3 som beskrevet over, kan det bli ervervet ved ekspresjon fra en vertscelle som inneholder DNA kodende for disse sekvenser. Et DNA kodende for hver CDR sekvens kan bli bestemt på grunnlaget av aminosyresekvensen av CDR'en og syntetisert sammen med et hvilket som helst ønskelig antistoffvariabelt områderammeverk og konstant område DNA sekvenser ved å benytte oligonukleotidsynteseteknikker, setedirigert mutagenese og polymerasekjedereaksjon (PCR) teknikker som passende. DNA kodende for variable områderammeverk og konstante områder er vidt tilgjengelig for de trenet innen fagfeltet fra genetiske sekvensdatabaser slik som GenBank®. Hver av de ovenfor nevnte CDR'ene vil bli typisk lokalisert i et variabelt områderammeverk ved posisjoner 31-35 (CDR-Hl), 50-65 (CDR-H2) og 95-102 (CDR-H3) av den tunge kjeden og posisjoner 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) og 89-97 (CDR-L3) av den lette kjeden ifølge Kabat nummereringssystemet (Kabat et al., 1987 i Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA).
Med en gang DNA'et som koder for et antistoff eller et fragment derav er syntetisert kan det bli oppformert og uttrykt ifølge et hvilket som helst av en rekke utvalg av godt kjente fremgangsmåter for nukleinsyreeksisjon, ligering, transformasjon, og transfeksjon ved å benytte et hvilket som helst antall av kjente ekspresjonsvektorer. Derfor kan ekspresjon av et antistoffragment være foretrukket i en prokaryot vert, slik som Escherichia coli (se for eksempel , Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol.
178:497-515). Ekspresjonen av antistoffet eller et fragment derav kan være foretrukket i en eukaryot vertscelle, inkludert gjær (for eksempel Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe og Pichia pastoris), dyreceller (inkludert pattedyrceller) eller planteceller. Eksempler på passende dyreceller inkluderer, men er ikke begrenset til, myeloma (slik som en muse NSO linje), COS, CHO, eller hybridomaceller.
Eksempler på planteceller inkluderer tobakk, korn, soyabønne og risceller.
En eller flere replikerbare ekspresjonsvektorer som inneholder DNA som koder for et antistoffvariabelt og/eller konstant område kan bli fremstilt og benyttet for å transformere en passende cellelinje, for eksempel en ikke-produserende myelomacellelinje, slik som en muse NSO linje eller en bakterie, slik som E. coli, i hvilket produksjon av antistoffet vil skje. For å oppnå effektiv transkripsjon og translasjon bør DNA sekvensen i hver vektor inkludere passende regulatoriske sekvenser, spesielt en promoter og ledersekvens operativt koblet til den variable domenesekvensen. Spesielle fremgangsmåter for å produsere antistoffer på denne måten er generelt godt kjent og rutinemessig benyttet. For eksempel er grunnleggende molekylærbiologifremgangsmåter beskrevet av Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; se også Maniatis et al., 3. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)). DNA sekvensering kan bli utført som beskrevet i Sanger et al. (PNAS 74:5463, (1977)) og setedirigert mutagenese kan bli utført ifølge fremgangsmåtene kjent innen fagfeltet (Kramer et al., Nucleic Acids Res.
12:9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol.154:367-82 (1987); the Anglian Biotechnology Ltd handbook). I tillegg beskriver tallrike publikasjoner teknikker passende for fremstillingen av antistoffer ved manipulering av DNA, dannelsen av ekspresjonsvektorer og transformasjon og dyrkning av passende celler (Mountain A and Adair, J R i Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (utg. Tombs, M P, 10, kapittel 1, 1992, Intercept, Andover, UK); "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (utg.), Wiley Interscience, New York).
Der det er ønskelig å forbedre affiniteten av antistoffene som inneholder ett eller flere av de ovenfor nevnte CDR'ene kan det bli oppnådd ved en rekke affinitetsmodningsprotokoller inkludert å opprettholde CDR'ene (Yang et al., J. MoI. Biol, 254, 392-403, 1995), kjedeombytting (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), bruk av mutasjonsstammer av E. coli (Low et al., J. MoI. Biol, 250, 350-368, 1996), DNA ombytting (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), phage display (Thompson et al., J. Mol Biol, 256, 7-88, 1996) og kjønns PCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Alle disse fremgangsmåtene av affinitetsmodning er diskutert av Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Andre antistoffer kan bli oppnådd ved konvensjonell immunisering og cellefusjonsfremgangsmåter som beskrevet heri og kjent innen fagfeltet. Monoklonale antistoffer kan bli generert ved å benytte et utvalg av kjente teknikker. Generelt kan monoklonale antistoffer som binder til spesifikke antigener skaffes ved fremgangsmåter kjent for de trenet innen fagfeltet (se for eksempel Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (utg.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); U.S. RE 32,011, 4902 614, 4543 439 og 4411 993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (utg.) (1980); og Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (utg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," i DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. utg., Glover et al. (utg.), s.93 (Oxford University Press 1995)). Antistoffragmenter kan bli derivert derav ved å benytte en hvilken som helst passende standardteknikk slik som proteolytisk fordøyning, eller valgfritt, ved proteolytisk fordøyning (for eksempel ved å benytte papain eller pepsin) etterfulgt av mild reduksjon av disulfidbindinger og alkylering. Alternativt kan slike fragmenter også bli generert ved rekombinante genetiske teknikker som beskrevet heri.
Monoklonale antistoffer kan skaffes ved injeksjon av et dyr, for eksempel, en rotte, en hamster, en kanin, eller fortrinnsvis en mus, inkludert for eksempel en transgen eller en knock-out, som kjent innen fagfeltet, med et immunogen som omfatter humant sklerostin av SEQ ID NO:1, eller et fragment derav, ifølge fremgangsmåter kjente innen fagfeltet og beskrevet heri. Nærværet av spesifikk antistoffproduksjon kan bli monitorert etter den initielle injeksjon og/eller etter en boosterinjeksjon ved å skaffe en serumprøve og detektere nærværet av et antistoff som binder til humant sklerostin eller peptid ved å benytte en hvilken som helst en av flere immunodeteksjonsfremgangsmåter kjent innen fagfeltet og beskrevet heri. Fra dyr som produserer de ønskede antistoffene blir lymfoide celler, mest vanlig celler fra milten eller lymfeknute, fjernet for å skaffe B-lymfocytter. B lymfocyttene er så fusert med en medikamentsensibilisert myelomacellefusjonspartner, fortrinnsvis en som er syngenisk med det immuniserte dyret og som valgfritt har andre ønskede egenskaper (for eksempel udugelighet til å uttrykke endogene Ig genprodukter, for eksempel P3X53 – Ag 8.653 (ATCC nr. CRL 1580); NSO, SP20) for å produsere hybridomaer, som er udødelige eukaryotiske cellelinjer, de lymfoide (for eksempel milt) cellene og myelomacellene kan bli blandet i et par minutter, med et membranfusjonsfremmende virkemiddel, slik som polyetylenglykol eller en ikke-ionisk detergens og så platet med lav tetthet på et selektivt medium som fremmer veksten av hybridomaceller men ikke ufuserte myelomaceller. Et foretrukket seleksjonsmedium er HAT (hypoksantin, aminopterin, tymidin). Etter en tilstrekkelig tid, vanligvis omtrent en til to uker, er kolonier av celler observert. Enkeltkolonier er isolert, og antistoffene produsert av cellene kan bli testet for bindingsaktivitet til humant sklerostin ved å benytte en hvilken som helst av et utvalg av immunoanalyser kjent innen fagfeltet og beskrevet heri. Hybridomaene er klonet (for eksempel ved begrenset fortynningskloning eller ved soft agar plakkisolering) og positive kloner som produserer et antistoff spesifikt til sklerostin er selektert og dyrket. De monoklonale antistoffene fra hybridomakulturene kan bli isolert fra supernatantene av hybridomakulturer. En alternativ fremgangsmåte for produksjon av et murint monoklonalt antistoff er å injisere hybridomacellene inn i bukhinnehulerommet til en syngen mus, for eksempel, en mus som har blitt behandlet (for eksempel pistan-primet) for å promotere dannelse av ascitesvæske som inneholder det monoklonale antistoffet. Monoklonale antistoffer kan bli isolert og renset ved et utvalg av veletablerte teknikker. Slike isoleringsteknikker inkluderer affinitetskromatografi med protein-A sefarose, størrelseseksklusjonskromatografi, og ioneutvekslingskromatografi (se for eksempel Coligan på sidene 2.7.1-2.7.12 og sidene 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," i Methods in Molecular Biology, bind 10, sider 79-104 (The Humana Press, Inc.1992)). Monoklonale antistoffer kan bli renset ved affinitetskromatografi ved å benytte en passende ligand selektert basert på bestemte egenskaper til antistoffet (for eksempel tung- eller lettkjedeisotype, bindingsspesifisitet, et cetera). Eksempler på en passende ligand, immobilisert på en fast støtte, inkluderer protein A, protein G, et antikonstant område (lett kjede eller tung kjede) antistoff, et anti-idiotypisk antistoff, og et TGF- β bindingsprotein, eller fragment eller variant derav.
Et antistoff til den foreliggende oppfinnelsen kan være et humant monoklonalt antistoff. Humane monoklonale antistoffer kan bli dannet ved et hvilket som helst antall av teknikker med hvilke de som har vanlige evner innen fagfeltet vil være familiære med. Slike fremgangsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til, Epstein Barr virus (EBV) transformasjon av humane perifere blodceller (for eksempel inneholdende B lymfocytter), in vitro immunisering av humane B celler, fusjon av miltceller fra immuniserte transgene mus som bærer innsatte humane immunolgobulingener, isolering fra humane immunoglobulin V område phage bibliotek, eller andre fremgangsmåter som kjent innen fagfeltet og basert på redegjørelsen heri. For eksempel kan humane monoklonale antistoffer skaffes fra transgene mus som har blitt manipulert for å produsere spesifikke humane antistoffer i respons til antigenisk utfordring.
Fremgangsmåter for å oppnå humane antistoffer fra transgene mus er beskrevet, for eksempel av Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int. Immun.6:579, 1994; U.S.5 877 397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci.
764:525-35. I denne teknikken er elementer av den humane tung- og lettkjedelokusen introdusert inn i stammer av mus derivert fra embryoniske stamcellelinjer som inneholder målødeleggelse av det endogene tungkjede og lettkjede loki (se også Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58 (1997)). For eksempel kan humane immunoglobulintransgener bli mini-genkonstrukter, eller transloki på gjærkunstig kromosomer, som gjennomgår B-cellespesifikk DNA rearrangement og hypermutasjon i det muselymfoide vevet. Humane monoklonale antistoffer kan bli skaffet ved å immunisere de transgene musene, som kan så produsere humane antistoffer spesifikt for sklerostin. Lymfoide celler av de immuniserte transgene musene kan bli benyttet for å produsere humane antistoffutskillende hybridomaer ifølge fremgangsmåter beskrevet heri. Polyklonale serum som inneholder humane antistoffer kan også skaffes fra blodet til de immuniserte dyrene.
En annen fremgangsmåte for å generere humane antistoffer inkluderer å udødeliggjøre humane perifere blodceller ved EBV transformasjon. Se for eksempel U.S.4 464 456. Slik en udødeliggjort B cellelinje (eller lymfoblastoid cellelinje) som produserer et monoklonalt antistoff som spesifikt binder til sklerostin kan bli identifisert ved immunodeteksjonsfremgangsmåter gitt heri, for eksempel, en ELISA, og så isolert ved standardkloningsteknikker. Stabiliteten av den lymfoblastoide cellelinjen som produserer et anti-sklerostinantistoff kan bli forbedret ved å fusere den transformerte cellelinjen med en murin myeloma for å produsere en muse-human hybrid cellelinje ifølge fremgangsmåter kjente innen fagfeltet (se for eksempel Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Enda en annen fremgangsmåte for å generere humane monoklonale antistoffer er in vitro immunisering, som inkluderer å prime humane milt B celler med humant sklerostin, etterfulgt av fusjon av primede B celler med en heterohybrid fusjonspartner. Se for eksempel Boerner et al., 1991 J. Immunol 147:86-95.
En B celle som produserer et anti-humant sklerostinantistoff kan velges og de lett- og tungkjedevariable områdene kan være klonet fra B cellen ifølge molekylærbiologiteknikker kjent innen fagfeltet (WO 92/02551; US 5627 052;
Babcook et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) og beskrevet heri. B celler fra et immunisert dyr kan bli isolert fra milten, lymfeknute, eller perifere blodprøver ved å selektere en celle som produserer et antistoff som spesifikt binder til sklerostin. B celler kan også bli isolert fra mennesker, for eksempel, fra en perifer blodprøve. Fremgangsmåter for å detektere enkle B celler som produserer et antistoff med den ønskede spesifisiteten er godt kjent innen fagfeltet, for eksempel, ved plakkdannelse, fluorescensaktivert cellesortering, in vitro stimulering etterfulgt av deteksjon av spesifikt antistoff, og liknende. Fremgangsmåter for seleksjon av spesifikke antistoffproduserende B-celler inkluderer, for eksempel, fremstilling av enkel cellesuspensjon av B celler i soft agar som inneholder humant sklerostin. Binding av det spesifikke antistoffet produsert av B cellen til antigenet resulterer i dannelsen av et kompleks, som kan være synlig som et immunoprecipitat. Etter at B-cellene som produserer det ønskede antistoffet er selektert kan de spesifikke antistoffgenene klones ved å isolere og oppkonsentrere DNA eller mRNA ifølge fremgangsmåter kjent innen fagfeltet og beskrevet heri.
En ytterligere fremgangsmåte for å oppnå antistoffer er ved phage display. Se for eksempel Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol.12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Humane eller murine immunoglobulinvariable områdegenkombinatoriske biblioteker kan dannes i phage vektorer som kan bli screenet for å selektere Ig fragmenter (Fab, Fv, sFv eller multimerer derav) som spesifikt binder til TGF- β bindingsprotein eller varianter eller fragmenter derav. Se for eksempel 5223 409; Huse et al., 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J.
Molec. Biol 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 og referanser sitert deri. For eksempel kan et bibliotek som inneholder et flertall av polynukleotidsekvenser som koder for Ig variable områdefragmenter bli satt inn i genomet til en filamentøs bakteriofag, slik som M13 eller en variant derav, i leseramme med sekvensen som koder for et phagekappeprotein. Et fusjonsprotein kan være en fusjon av kappeproteinet med det lettkjedevariable områdedomenet og/eller med det tungkjedevariable områdedomenet.
Immunoglobulin Fab fragmenter kan også bli fremvist på en phage partikkel (se for eksempel U.S. 5 698 426).
Tung- og lettkjedeimmunoglobulin cDNA ekspresjonsbiblioteker kan også bli fremstilt i λ phage, for eksempel, ved å benytte λlmmunoZap™(H) og λImmunoZap™(L) vektorer (Stratagene, La Jolla, California). I korthet blir mRNA isolert fra en stor B cellepopulasjon, og benyttet for å danne tung- og lettkjedeimmunoglobulin cDNA ekspresjonsbiblioteker i λΙmmunoZap(H) og λΙmmunoZap(L) vektorer. Disse vektorene kan bli screenet individuelt eller ko-uttrykt for å danne Fab fragmenter eller antistoffer (se Huse et al., supra; se også Sastry et al., supra). Positive plakk kan så etterfølgende bli konvertert til et ikke-lytisk plasmid som tillater høyt nivå av ekspresjon av monoklonale antistoffragmenter fra E. coli.
I en hybridoma kan de variable områdene av et gen som uttrykker et monoklonalt antistoff av interesse være amplifisert ved å benytte nukleotidprimere. Disse primerne kan bli syntetisert av en med vanlig dyktighet innen fagfeltet, eller kan bli kjøpt fra kommersielt tilgjengelige kilder. (se for eksempel Stratagene (La Jolla, California), som selger primere for muse- og humane variable områder inkludert, blant andre, primere for VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL og CL områder.). Disse primerne kan bli benyttet for å amplifisere tung- eller lettkjedevariable områder, som så kan bli satt inn i vektorer slik som ImmunoZAP™H eller ImmunoZAP™L (Stratagene), henholdsvis. Disse vektorene kan så bli introdusert inn i E. coli, gjær, eller pattedyrbaserte systemer for ekspresjon. Store mengder av et enkeltkjedeprotein som inneholder en fusjon av VH og VL domener kan bli produsert ved å benytte disse fremgangsmåtene (se Bird et al., Science 242:423-426, 1988).
Når cellene som produserer antistoffer har blitt oppnådd ved anvendelse av en hvilken som helst av de ovenfor nevnte beskrevne immunserings- og andre teknikker, kan de spesifikke antistoffgenene bli klonet ved å isolere og amplifisere DNA eller mRNA derfra ifølge standardfremgangsmåter som beskrevet heri. Antistoffene produsert derfra kan bli sekvensert og CDR'ene identifisert og DNA'et som koder for CDR'ene kan bli manipulert som beskrevet tidligere for å generere andre antistoffer.
Fortrinnsvis binder bindingsmidlene spesifikt til sklerostin. Som med alle bindingsmidler og bindingsanalyser vil en trenet innen fagfeltet gjenkjenne at de ulike delene til hvilket et bindingsmiddel ikke detekterbart skulle binde for å være terapeutisk effektiv og passende være unngående og upraktisk å oppliste. Derfor refererer betegnelsen "spesifikt binder" for et bindingsmiddel beskrevet heri til evnen hos et bindemiddel til å binde til sklerostin, fortrinnsvis humant sklerostin, med større affinitet enn det binder til et urelatert kontrollprotein. Fortrinnsvis er kontrollproteinet høneegghvitt lysozym. Fortrinnsvis binder bindingsmidlene til sklerostin med en affinitet som er minst 50, 100, 250, 500, 1000 eller 10000 ganger større enn affiniteten for et kontrollprotein. Et bindingsmiddel kan ha en bindingsaffinitet for humant sklerostin på mindre enn eller lik 1 x 10<-7>M, mindre enn eller lik 1 x 10<-8>M, mindre enn eller lik 1 x 10<-9>M, mindre enn eller lik 1 x 10<-10>M, mindre enn eller lik 1 x 10<-11 >M, eller mindre enn eller lik
1 x 10<-12 >M.
Affiniteten kan bli bestemt ved en affinitets ELISA analyse. I visse utførelsesformer kan affiniteten bli bestemt ved en BIAcore analyse. I visse utførelsesformer kan affiniteten bli bestemt ved en kinetisk fremgangsmåte. I visse utførelsesformer kan affiniteten bli bestemt ved en ekvilibrium/løsningsfremgangsmåte. Slike fremgangsmåter er beskrevet i ytterligere detalj heri eller kjent innen fagfeltet.
Sklerostinbindingsmidler modulerer fortrinnsvis sklerostinfunksjon i den cellebaserte analysen beskrevet heri og/eller in vivo analysen beskrevet heri og/eller binder til en eller flere av epitopene beskrevet heri og/eller kryssblokkerer bindingen av et av antistoffene beskrevet i denne applikasjonen og/eller er kryssblokkert fra binding til sklerostin av et av antistoffene beskrevet i denne applikasjonen. Følgelig kan slike bindingsmidler bli identifisert ved å benytte analysene beskrevet heri.
Bindingsmidlene kan være generert ved først å identifisere antistoffer som binder til en eller flere av epitopene gitt heri og/eller nøytralisere i de cellebaserte og/eller in vivo analysene beskrevet heri og/eller kryssblokkere antistoffene beskrevet i denne applikasjonen og/eller er kryssblokkert fra å binde til sklerostin av et av antistoffene beskrevet i denne applikasjonen. CDR områdene fra disse antistoffene er så benyttet for å settes inn i egnede biokompatible rammeverk for å danne sklerostin-bindingsmidler.
Ikke-CDR delen av bindingsmidlet kan være satt sammen av aminosyrer, eller kan være et ikke-proteinmolekyl. Analysene beskrevet heri tillater karakteriseringen av bindingsmidler. Fortrinnsvis er bindingsmidlene antistoffer som definert heri.
Det vil være forstått av en trenet innen fagfeltet at noen proteiner, slik som antistoffer, kan gjennomgå et utvalg av posttranslasjonelle modifikasjoner. Typen og omfanget av disse modifikasjonene avhenger ofte av vertscellelinjen benyttet for å uttrykke proteinet likeså som dyrkningsbetingelsene. Slike modifikasjoner kan inkludere variasjoner i glykosylering, metioninoksidering, diketopiperizindannelse, aspartatisomerisering og asparagindeamidering. En hyppig modifikasjon er tapet av karboksy-terminal basisk rest (slik som lysin eller arginin) noe som skyldes virkningen av karboksypeptidaser (som beskrevet i Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).
Antistoffer referert til som Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D og Ab-1 er beskrevet under. "HC" refererer til tungkjede og "LC" refererer til lettkjeden. For noen antistoffer under er CDR'ene boksskyggelagt og de konstante (C) områdene er vist i fet italic.
Ab-D
Antistoff D (også referert til heri som Ab-D og Mab-D) er et museantistoff som fremviser høyaffinitetsbinding til sklerostin. BIAcore bindingsmønsteret til Ab-D er vist i figur 18.
Aminosyresekvensen til den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-D lettkjede:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-D LC er som følger:
Aminosyresekvensen til Ab-D LC inkludert signalpeptid er som følger:
Nukleinsyresekvens av Ab-D LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Aminosyresekvensen til den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-D HC tungkjede er som følger:
Nukleinsyresekvensen som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-D-HC er:
Aminosyresekvensen av Ab-D HC inkludert signalpeptid er:
Nukleinsyresekvensen av Ab-D HC inkludert signalpeptidkodende sekvens er:
CDR (komplementaritetsbestemmende område) sekvenser i det variable området av tungkjeden av Ab-D er som følger:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-D er:
Ab-C
Antistoff C (også referert til heri som Ab-C og Mab-C) er et museantistoff som fremviser høyaffinitetsvinding til sklerostin. BIAcore bindingsmønster av Ab-C er vist i figur 17. Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-C lettkjede er som følger:
Nukleinsyresekvensen som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-C LC er:
Aminosyresekvensen av Ab-C LC inkludert signalpeptid er:
Nukleinsyresekvensen av Ab-C LC inkludert signalpeptidkodende sekvens er:
Ab-C tungkjede
Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-C HC er:
Nukleinsyresekvensen som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-C HC er som følger:
31
Aminosyresekvensen av Ab-C HC inkludert signalpeptid er:
Nukleinsyresekvensen av Ab-C HC inkludert signalpeptidkodende sekvens er:
CDR (komplementaritetsbestemmende område) sekvensene i det variable området av tungkjeden av Ab-C er som følger:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-C er:
Ab-A
Antistoff A (også referert til heri som Ab-A og Mab-A) er et kanin-musekimerisk antistoff som fremviser høy affinitetsbinding til sklerostin. BIAcore bindingsmønstret av Ab-A er vist i figur 15.
Ab-A lettkjede
Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-A-LC:
Nukleinsyresekvensen som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-A LC:
Aminosyresekvensen av Ab-A LC inkludert signalpeptid er:
Nukleinsyresekvensen av Ab-A LC inkludert signalpeptidkodende sekvens er:
Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-A HC er:
Nukleinsyresekvensen som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-A HC:
Aminosyresekvensen av Ab-A HC inkludert signalpeptid er:
Nukleinsyresekvensen av Ab-A HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
CDR (komplementaritetsbestemmende område) sekvensene i det variable området av tungkjeden Ab-A er som følger:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-A er:
Ab-A var humanisert, og er referert til som antistoff 1 (også referert til heri som Ab-1), og har de følgende sekvenser:
Nukleinsyresekvensen av Ab-1 LC variable området inkludert signalpeptidkodende sekvens er
Aminosyresekvensen av Ab-1 LC variable området inkludert signalpeptid er:
Nukleinsyresekvensen av Ab-1 HC variable området inkludert signalpeptidkodende sekvens er:
Aminosyresekvensen av Ab-1 HC variable området inkludert signalpeptid
CDR (komplementaritetsbestemme område) sekvensene i det variable området av ringkjeden av Ab-1 er som følger:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-1 er:
Ab-B
Antistoff B (også referert til heri som Ab-B og Mab-B) er et museantistoff som fremviser høy affinitetsbinding til sklerostin. BIAcore bindingsmønsteret av Ab-B er vist i figur 16.
Ab-B lettkjede
Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-B LC er:
Nukleinsyresekvensen som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-B LC er:
Aminosyresekvensen av Ab-B LC inkludert signalpeptid er:
Nukleinsyresekvensen av Ab-B LC inkludert signalpeptidkodende sekvens er:
Ab-B tungkjede
Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-B HC:
Nukleinsyresekvensen som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-B-
Aminosyresekvensen av Ab-B HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvensen av Ab-B HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
CDR (komplementaritetsbestemmende område) sekvenser i det variable området av tungkjeden av Ab-B er som følger:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-B er:
Antistoffer beskrevet heri binder til områder av humant sklerostin som er viktige for in vivo aktiviteten av proteinet. Binding av et antistoff til sklerostin kan bli korrelert med økning i, for eksempel, beinmineraltettheten oppnådd ved bruk av antistoffet in vivo slik som beskrevet i eksempler 5 og 9 (mus) og eksempel 12 (ape). Økning i minst en av beindannelse, beinmineralinnhold, beinmasse, beinkvalitet og beinstyrke kan også bli oppnådd ved bruk av antistoffet in vivo slik som beskrevet i eksemplene 5 og 9 (mus) og eksempel 12 (ape). Siden bindingen av et antistoff til sklerostin er primært bestemt av dets CDR sekvenser, kan et antistoff bli generert med alle eller noen av de beskrevne CDR sekvenser i et passende rammeverk, hvori antistoffet bibeholder evnen til å binde spesifikt til sklerostin, og kan være forventet å oppnå økning i, for eksempel, beinmineraltetthet. Slike antistoffer er nyttige i behandlingen av humane eller dyretilstander som er forårsaket av, assosiert med, eller resulterer i minst et av lav beindannelse, lav beinmineraltetthet, lavt beinmineral-innhold, lav beinmasse, lav beinkvalitet og lav beinstyrke. Fremgangsmåter for å konstruere og uttrykke antistoffer og fragmenter derav som omfatter CDR'ene til den foreliggende oppfinnelsen er kjent for de som er trenet innen fagfeltet.
Foreliggende beskrivelse relaterer derfor i en utførelsesform til et isolert antistoff, inkludert Ab-A, eller et antigenbindende fragment derav, som spesifikt binder til sklerostin og hvori det variable området av ringkjeden omfatter minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:51 for CDR-H1, SEQ ID NO:52 for CDR-H2 og SEQ ID NO:53 for CDR-H3. Antistoffer eller antigenbindende fragment derav kan omfatte et tungkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst et av peptidene av SEQ ID NO: 51 for CDR-H1, SEQ ID NO:52 for CDR-H2 og SEQ ID NO:53 for CDR-H3.
Når en lettkjede i antistoffene er til stede kan lettkjeden være en hvilken som helst passende komplementaritetskjede og kan spesielt være selektert fra en lettkjede hvori det variable området omfatter minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:54 for CDR-L1, SEQ ID NO:55 for CDR-L2 og SEQ ID NO:56 for CDR-L3. Antistoffet eller anigenbindende fragmenter derav kan omfatte et lettkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst et av peptidene av SEQ ID NO:54 for CDR-L1, SEQ ID NO:55 for CDR-L2 og SEQ ID NO:56 for CDR-L3.
Den foreliggende beskrivelse relaterer videre til et isolert antistoff, inkludert Ab-B, eller et antigenbindingsfragment herav, som spesifikt binder til sklerostin og hvori det variable området av tungkjeden omfatter minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:57 for CDR-H1, SEQ ID NO:58 for CDR-H2 og SEQ ID NO:59 for CDR-H3. Antistoffet eller antigenbindende fragment derav kan omfatte et tungkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst et av peptidene av SEQ ID NO:57 for CDR-H1, SEQ ID NO:58 for CDR-H2 og SEQ ID NO:59 for CDR-H3.
Når en lettkjede er til stede i antistoffene kan lettkjeden være en hvilken som helst passende komplementaritetskjede og kan spesielt være selektert fra en lettkjede hvori det variable området består av minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:60 for CDR-L1, SEQ ID NO:61 for CDR-L2 og SEQ ID NO:62 for CDR-L3. Antistoffet eller antigenbindende fragment derav kan omfatte et lettkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst en av peptidene SEQ ID NO:60 for CDR-L1, SEQ ID NO:61 for CDR-L2 og SEQ ID NO:62 for CDR-L3.
Den foreliggende oppfinnelsen relaterer videre til et isolert antistoff, inkludert Ab-C, eller et antigenbindende fragment derav, som spesifikt binder til sklerostin og hvori det variable området av tungkjeden omfatter minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:45 for CDR-H1, SEQ ID NO:46 for CDR-H2 og SEQ ID NO:47 for CDR-H3. Antistoffet eller antigenbindende fragment derav kan omfatte et tungkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst et av peptidene av SEQ ID NO:45 for CDR-H1, SEQ ID NO:46 for CDR-H2 og SEQ ID NO:47 for CDR-H3.
Når en lett kjede er til stede i antistoffene til oppfinnelsen kan den lette kjeden være en hvilken som helst passende komplementaritetskjede og kan spesielt være selektert fra en lettkjede hvori det variable området består av minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:48 for CDR-L1, SEQ ID NO:49 for CDR-L2 og SEQ ID NO:50 for CDR-L3. Antistoffet eller antigenbindende fragment derav kan omfatte et lettkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst et av peptidene av SEQ ID NO:48 for CDR-L1, SEQ ID NO:49 for CDR-L2 og SEQ ID NO:50 for CDR-L3.
Den foreliggende oppfinnelsen relaterer også til et isolert antistoff, inkludert Ab-D, eller et antigenbindende fragment herav, som spesifikt binder til sklerostin og hvori det variable området av tungkjeden omfatter minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:39 for CDR-H1, SEQ ID NO:40 for CDR-H2 og SEQ ID NO:41 for CDR-H3. Antistoffet eller antigenbindende fragment derav kan omfatte et tungkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst et av peptidene av SEQ ID NO: 39 for CDR-H1, SEQ ID NO: 40 for CDR-H2 og SEQ ID NO:41 for CDR-H3.
Når en lettkjede er til stede i antistoffene til oppfinnelsen kan den lette kjeden være en hvilken som helst passende komplementaritetskjede og kan spesielt være selektert fra en lettkjede hvori det variable området omfatter minst en CDR som har sekvensene gitt i SEQ ID NO:42 for CDR-L1, SEQ ID NO:43 for CDR-L2 og SEQ ID NO:44 for CDR-L3. Antistoffet eller antigenbindende fragment derav kan omfatte et lettkjedevariabelt område der CDR'ene består av minst et av peptidene av SEQ ID NO:42 for CDRL-L1, SEQ ID NO: 43 for CDR-L2 og SEQ ID NO:44 for CDR-L3.
Ytterligere antisklerostinantistoffer er beskrevet under. For noen av aminosyresekvensene er komplementaritetsbestemmende områder (CDR'ene) bokset-skyggelagt og de konstante områdene er i fet skrift-kursiv.
Ab-2
Sekvensene av antistoff 2 (også referert til som Ab-2) LC og HC er som følger:
Ab-2 lettkjede:
Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-2 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-2 LC:
Aminosyresekvens av Ab-2 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-2 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-2 tungkjede
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-2 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-2 HC:
Aminosyresekvens av Ab-2 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-2 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-3
Sekvensene av antistoff 3 (også referert til heri som Ab-3) LC og HC er som følger: Ab-3 lettkjede
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-3 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-3 LC:
Aminosyresekvens av Ab-3 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-3 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-3 tungkjede
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-3 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-3 HC:
Aminosyresekvens av Ab-3 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-3 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-4
Sekvensene av antistoffet 4 (også referert til heri som Ab-4) LC og HC er som følger: Ab-4 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-4 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-4 LC:
Aminosyresekvens av Ab-4 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-4 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-4 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-4 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-4 HC:
Aminosyresekvens av Ab-4 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-4 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-4 var humanisert for å danne Ab-5.
Ab-5
Sekvensene av antistoff 5 (også referert til heri som Ab-5) LC og HC er som følger: Ab-5 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-5 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-5 LC:
Aminosyresekvens av Ab-5 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-5 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-5 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-5 HC:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-5 HC uten karboksyterminallysin:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-5 HC:
Aminosyresekvens av Ab-5 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-5 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-5 variable domener:
Ab-5 lettkjedevariabelt område aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-5 lettkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-5 tungkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-5 tungkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
CDR (komplementaritetsbestemmende område) sekvenser i det variable området av den tunge kjeden av Ab-5 er som følger:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-5 er:
Ab-6
Sekvensene av antistoff 6 (også referert til heri som Ab-6) LC og HC er som følger: Ab-6 lettkjede:
Aminos resekvens av den modne form si nal e tid f ernet av Ab-6 LC:
Nukleinsyresekvensen kodet for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-6 LC:
Aminosyresekvens av Ab-6 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-6 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-6 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-6 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-6 HC:
Aminosyresekvens av Ab-6 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-6 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-7
Sekvensene av antistoff 7 (også referert til heri som Ab-7) LC og HC er som følger: Ab-7 lettkjede:
Aminosresekvens av den modne form sinale tid fernet av Ab-7 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-7 LC:
Aminosyresekvens av Ab-7 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-7 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-7 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-7 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-7 HC:
Aminosyresekvens av Ab-7 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-7 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-8
Sekvensene av antistoff 8 (også referert til heri som Ab-8) LC og HC er som følger: Ab-8 lettkjede:
Aminosyresekvensen av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-8 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-8 LC:
Aminosyresekvens av Ab-8 inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-8 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-8 tungkjede
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-8 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-8 HC:
Aminosyresekvens av Ab-8 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-8 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-9
Sekvensene av antistoff 9 (også referert til heri som Ab-9) LC og HC er som følger: Ab-9 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-9 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-9 LC:
Aminosyresekvens av Ab-9 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-9 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-9 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-9 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-9 HC:
Aminosyresekvens av Ab-9 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-9 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-10
Sekvensene av antistoff 10 (også referert til heri som Ab-10) LC og HC er som følger: Ab-10 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-10 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-10 LC:
Aminosyresekvens av Ab-10 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-10 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-10 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-10 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-10 HC:
Aminosyresekvens av Ab-10 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-10 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-11
Sekvensene av antistoff 11 (også referert til heri som Ab-11) LC og HC er som følger: Ab-11 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-11 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-11 LC:
Aminosyresekvens av Ab-11 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-11 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-11 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-11 HC: Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-11 HC:
Aminosyresekvens av Ab-11 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-11 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-12
Sekvensene av antistoff 12 (også referert til heri som Ab-12) LC og HC er som følger: Ab-12 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-12 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-12 LC:
Aminosyresekvens av Ab-12 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-12 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-12 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-12 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-12 HC:
Aminosyresekvens av Ab-12 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-12 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-13
Sekvensene av antistoff 13 (også referert til heri som Ab-13) LC og HC er som følger:
Ab-13 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-13 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-13 LC:
Aminosyresekvens av Ab-13 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-13 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-13 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-13 HC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-13 HC:
Aminosyresekvens av Ab-13 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-13 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-13 ble humanisert for å danne Ab-14.
Sekvensene av antistoff 14 (også referert til heri som Ab-14) LC og HC er som følger: Ab-14 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-14 LC:
Nukleinsyresekvens som koder den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-14 LC:
Aminos resekvens av Ab-14 LC inkludert si nal e tid:
Nukleinsyresekvens av Ab-14 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-14 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-14 HC:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-14 HC uten karboksyterminalt lysin:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-14 HC:
Aminosyresekvens av Ab-14 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-14 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
CDR sekvensene i det variable området av tungkjeden Ab-14 er:
De lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-14 er:
Ab-14 variable domener:
Ab-14 lettkjedevariabledomeneaminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-14 lettkjedevariable domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-14 tungkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-14 tungkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-3 ble humanisert for å generere Ab-15.
Ab-15
Sekvensene til antistoff 15 (også referert til heri som Ab-15) LC og HC er som følger: Ab-15 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-15 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-15 LC:
Aminosyresekvens av Ab-15 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-15 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-15 tungkjede
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-15 HC.
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-15 HC uten karboksyterminalt lysin:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-15 HC:
Aminosyresekvens av Ab-15 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-15 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
CDR sekvensene i det variable området av tungkjeden av Ab-15 er:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-15 er:
Ab-15 variable domener:
Ab-15 lettkjedevariabel domeneaminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-15 lettkjedevariabel domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-15 tungkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-15 tungkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-11 ble humanisert for å generere Ab-16.
Ab-16
Sekvensene av antistoff 16 (også referert til heri som Ab-16) LC og HC er som følger: Ab-16 lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-16 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-16 LC:
Aminosyresekvens av Ab-16 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-16 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-16 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-16 HC:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-16 HC uten karboksyterminalt lysin:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-16 HC:
Aminosyresekvens av Ab-16 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-16 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
CDR sekvensene i det variable området av tungkjeden av Ab-16 er:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-16 er:
Ab-16 variable domener:
Ab-16 lettkjedevariabel domeneaminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-16 lettkjedevariabel domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-16 tungkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-16 tungkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ytterligere antistoffer er referert til heri som antistoffer 17-22 (også referert til heri som Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21 og Ab-22). χ konstantområdet for alle VK områder av Ab-17, Ab-19 og Ab-21 er som følger:
Tungkonstante området for alle VH områder av antistoffene 17, 19 og 21 er som følger:
I de følgende antistoffaminosyresekvenser representerer de boksede-skyggelagte aminosyrene komplement-bestemmende områder (CDR'er) og de understrekede aminosyrene representerer signalpeptid:
Ab-17
Aminosyresekvens av Ab-17 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-17 LC inkludert signalpeptid:
Aminosyresekvens av Ab-17 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-17 HC inkludert signalpeptid:
Ab-17 ble humanisert for å danne Ab-18.
Ab-18
Aminosyresekvens av Ab-18 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-18 LC inkludert signalpeptid:
Aminosyresekvens av Ab-18 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-18 HC inkludert signalpeptid:
Ab-18 lettkjedevariabel domeneaminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-18 lettkjedevariabelt område DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-18 tungkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-18 tungkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-19
Aminosyresekvens av Ab-19 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-19 LC inkludert signalpeptid:
Aminosyresekvens av Ab-19 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-19 HC inkludert signalpeptid:
Ab-19 ble humanisert for å generere antistoff 20 (også referert til heri som Ab-20) og antistoff 23 (også referert til heri som Ab-23).
Ab-20
IgG4 versjon
Aminosyresekvens av Ab-20 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-20 LC inkludert signalpeptid:
Aminosyresekvens av Ab-20 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-20 HC inkludert signalpeptid:
Ab-23
IgG2 versjon
Lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-23 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-23 LC:
Aminosyresekvens av Ab-23 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-23 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-23 HC:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-23 HC uten karboksyterminalt lysin:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-23 HC:
Aminosyresekvens av Ab-23 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-23 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
CDR (komplementaritetsbestemmende område) sekvenser i det variable området av tungkjeden av Ab-23 er som følger:
Lettkjedevariable område CDR sekvensene av Ab-23 er:
Ab-23 variable områder:
Ab-23 lettkjedevariabelt område aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-23 lettkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-23 tungkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-23 tungkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-21
Aminosyresekvens av Ab-21 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-21 LC inkludert signalpeptid:
Aminosyresekvens av Ab-21 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-21 HC inkludert signalpeptid:
Ab-21 ble humanisert for å gi Ab-22.
Ab-22
Aminosyresekvens av Ab-22 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-22 LC inkludert signalpeptid:
Aminosyresekvens av Ab-22 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-22 HC inkludert signalpeptid:
Ab-22 lettkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-22 lettkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
Ab-22 tungkjedevariabelt domene aminosyresekvens (uten signalsekvens):
Ab-22 tungkjedevariabelt domene DNA sekvens (uten signalsekvens):
For Ab-18, Ab-20 og Ab-22 er lettkjedehumant χ konstant område som følger:
og tungkjedehumant γ-4 konstant område er som følger:
Hengselsområdet inneholder Ser-241-Pro mutasjonen for å forbedre hengselstabilitet (Angal S et al, (1993), Mol Immunol, 30(1), 105-108).
Ab-24
Sekvensene av antistoff 24 (også referert til heri som Ab-24) LC og HC er som følger:
Lettkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-24 LC:
Nukleinsyresekvens som koder for den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab 24 LC:
Aminosyresekvens av Ab-24 LC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-24 LC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
Ab-24 tungkjede:
Aminosyresekvens av den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-24 HC:
Nukleinsyresekvens som koder den modne form (signalpeptid fjernet) av Ab-24 HC:
Aminosyresekvens av Ab-24 HC inkludert signalpeptid:
Nukleinsyresekvens av Ab-24 HC inkludert signalpeptidkodende sekvens:
CDR sekvensene i det variable området av lettkjeden av Ab-24 er som følger:
CDR sekvensene i det variable området av tungkjeden av Ab-24 er som følger:
Tabell 1 nedenfor gir SEQ ID NO'er og aminosyresekvenser av CDR'ene av Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24. L1, L2 og L3 refererer til lettkjede CDR'er 1, 2 og 3, og H1, H2 og H3 refererer til tungkjede CDR'er 1, 2 og 3, ifølge Kabat nummereringssystem (Kabat et al., 1987 i Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA).
Et oligopeptid eller polypeptid kan ha en aminosyresekvens som er minst 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %,
83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 % eller 99 % identisk til minst en av CDR'ene i tabell 1 over; og/eller til en CDR av et sklerostinbindingsmiddel som kryssblokkerer bindingen av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16 Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24 til sklerostin, og/eller er kryssblokkert fra å binde til sklerostin av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16 Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24; og/eller til en CDR av et sklerostinbindingsmiddel hvori bindingsmidlet kan blokkere den inhibitoriske effekten av sklerostin i en cellebasert mineraliseringsanalyse (det vil si et sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel); og/eller til en CDR av et sklerostinbindingsmiddel som binder til en Loop 2 epitop; og/eller til en CDR av et sklerostinbindingsmiddel som binder til en T20.6 epitop; og/eller til en CDR av et sklerostinbindingsmiddel som binder til en "T20.6 derivat (cystein-knute 4 armer)" epitop.
Sklerostinbindingsmiddelpolypeptider og antistoffer kan ha aminosyresekvenser som er minst 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,
91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identisk til et variabelt område av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10 Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab- 21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24 og kryssblokkerer bindingen av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24 til sklerostin, og/eller er kryssblokkert fra å binde til sklerostin av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab- 22, Ab-23 og Ab-24; og/eller kan blokkere den inhibitoriske effekten av sklerostin i en cellebasert mineraliseringsanalyse (det vil si et sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel); og/eller binde til en Loop 2 epitop; og/eller binde til en T20.6 epitop; og/eller binde til en "T20.6 derivat (cystein-knute 4 armer)" epitop.
Polynukleotider som koder for sklerostinbindende midler kan ha polynukleotidsekvenser som er minst 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identisk til et polynukleotid som koder for et variabelt område av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab- 16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24, og hvori de kodede sklerostinbindingsmidlene kryssblokkerer bindingen av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-1l, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24 til sklerostin, og/eller er kryssblokkert fra å binde til sklerostin av minst ett av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 og Ab-24; og/eller kan blokkere den inhibitoriske effekten av sklerostin i en cellebasert mineraliseringsanalyse (det vil si et sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel) og/eller binde til en Loop 2 epitop; og/eller binde til en T20.6 epitop og/eller binde til et "T20.6 derivat (cysteinknute 4 armer)" epitop.
Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan ha en bindingsaffinitet for humant sklerostin på mindre enn eller lik 1 x 10<-9 >M, mindre enn eller lik 1 x 10<-10 >M, mindre enn eller lik 1 x 10<-11 >M, eller mindre enn eller lik 1 x 10<-12 >M.
Affiniteten av et bindingsmiddel slik som et antistoff eller bindingspartner likeså som omfanget til hvilket et bindingsmiddel (slik som et antistoff) inhiberer binding, kan bli bestemt av en med vanlig dyktighet innen fagfeltet ved å benytte konvensjonelle teknikker, for eksempel de beskrevet av Scatchard et al. {Ann. N.Y. Acad. Sci.51:660672 (1949)) eller ved overflateplasmonresonans (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). For overflateplasmonresonans er målmolekyler immobilisert på en faststoffase og eksponert til ligander i en mobil fase som passerer langs en strømningscelle. Hvis ligandbinding til det immobiliserte målet skjer forandres den lokale refraktive indeks, noe som fører til en forandring i SPR vinkel, noe som kan bli monitorert i reell tid ved å detektere forandringer i intensiteten av det reflekterte lyset. Ratene av forandring av SPR signalet kan bli analysert for å gi tilsynelatende ratekonstanter for assosiasjon og dissosiasjonsfasene av bindingsreaksjonen. Forholdet av disse verdier gir den tilsynelatende ekvilibriumkonstanten (affinitet) (se for eksempel Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)).
Et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse kan tilhøre en hvilken som helst immunoglobulinklasse, for eksempel IgG, IgE, IgM, IgD eller IgA. Det kan skaffes fra eller deriveres fra et dyr, for eksempel, fjærkre (for eksempel kylling) og pattedyr, som inkluderer, men ikke er begrenset til en mus, rotte, hamster, kanin, eller andre gnagere, ku, hest, sau, geit, kamel, menneske eller andre primater. Antistoffet kan være et internaliserende antistoff. Produksjon av antistoffer er beskrevet generelt i
U.S. 2004/0146888 A1.
Karakteriseringsanalyse
I fremgangsmåtene beskrevet over for å danne antistoffer inkludert manipuleringen av de spesifikke Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D og antistoff 1-24 (Ab-1 til Ab-24) CDR'er i nye rammeverk og/eller konstante områder, er passende analyse tilgjengelige for å selektere de ønskede antistoffer eller bindingsmidler (det vil si analyse for å bestemme bindingsaffiniteten til sklerostin; kryssblokkerende analyse; Biacore-baserte "humansklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalyse", MC3T3-E1 cellebaserte analyser; in vivo analyse).
Epitopbindingsanalyse
Moden form av humant sklerostin er et 190 aminosyreglykoprotein med en cysteinknutestruktur (figurene 8 og 9). I tillegg til cystein-knutestrukturen er proteinet karakterisert til å ha tre looper betegnet som Loop 1, Loop 2 og Loop 3. Humant sklerostin ble utsatt for proteolytisk fordøyelse for å produsere fragmenter. I korthet ved å benytte ulike proteaser inkludert trypsin, aspN og lysC ble fragmenter med ulike kløyvingseter og størrelser generert. Sekvensene og massen for ulike humansklerostinpeptider ble bestemt. Antistoffbeskyttelse ble evaluert for å bestemme effekten på tilgjengelighet for proteolyse, inkludert forkortet setemaskering og peptidskifting.
Endelig var en BIAcore-basert "human sklerostinpeptidepitopkonkurranseanalyse" utført.
Eksponering av sklerostin til trypsinkløyving resulterte i et mønster av peptidfragmenter som oppsummert i figur 13. Fragmentene er referert til som T19.2, T20, T20.6 og T21-22. Som vist skjematisk i figur 19B er T20.6 epitopen et kompleks av fire separate peptidsekvenser som er koblet av tre disulfidbindinger av cystein-knuteområdet. To av peptidene er koblet av to disulfidbininger. De andre to peptider er koblet av en disulfidbinding som, skjematisk, deler de to første polypeptidene i to.
T20.6 epitopen som var generert ved trypsinfordøyelse bibeholder cystein-knutestrukturen til det native polypeptidet og er gjenkjent av antistoffene Ab-C og Ab-D. Et derivat av epitop T20.6 består av cystein-knuteområdet og aminosyrene 58-64, 73-81, 112-117 og 138-141 i sekvensposisjon med referanse til SEQ ID NO:1. Denne derivatepitop er vist i figur 21. En epitop som omfatter cysteinknuteområdet kan ha en eller flere aminosyrer som er til stede i T20.6 epitopen (figur 19B) men ikke til stede i T20.6 derivatepitopen (figur 21).
Et annet epitopinneholdende område var identifisert i Loop-2 området av humant sklerostin (figur 19A) og er gjenkjent av antistoffene Ab-A og Ab-B. En loop 2 epitop omfatter aminosyrene 86-111 av SEQ ID NO:1 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, SEQ ID NO:6). Sterisk, med referanse til fullengdesklerostin av SEQ ID NO:1, er Loop 2-inneholdende strukturen definert ved en ende av en disulfidbinding mellom cystein ved posisjon 86 (C4) og cystein ved posisjon 144 (C8) og på den andre enden av en disulfidbinding mellom cystein ved posisjon 111 (C5) og cystein ved posisjon 57 (C1).
Peptidene generert ved aspN kløyving av humant sklerostin er vist i figur 12. I figuren er disse peptidene betegnet som AspN14.6, AspN18.6 og AspN22.7-23.5 og er også referert til heri som N14.6, N18.6 og N22.7-23.5 henholdsvis.
En gruppe av antistoffer fremviser et spesifikt mønster av binding til visse epitoper som bevist av en Biacore-basert "humansklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalyse". I korthet er antistoffet pre-inkubert med epitopen som skal testes, med konsentrasjoner som vil mette det epitopbindende sete på antistoffet. Antistoffet blir så eksponert til sklerostin bundet på en chipoverflate. Etter passende inkubering og vaskingsprosedyrer, er et konkurransebindingsmønster etablert. Som vist i figur 18 er antistoff Ab-D som skal fungere som eksempel, bundet til sklerostinmolekyler festet til overflaten av chipen. Pre-inkubering av antistoff Ab-D med sklerostin minker bindingen av antistoffet til sklerostinet på chipen nær til null. Pre-inkubering med et peptid som består av epitop T19.2 viste at T19.2 ikke konkurrerte med sklerostin for antistoffbinding. Imidlertid opphevet pre-inkubering med et hvilket som helst av epitopene betegnet T20, T20.6, T21-22 eller N22.7-23.5 en stor andel av bindingen av antistoff til sklerostin på chipen. I kontrast opphevet ikke pre-inkubering av antistoffet med et hvilket som helst av epitopene betegnet T19.2, N14.6 eller N18.6 evnen til antistoffet til å binde til sklerostin. Et andre antistoff brukt som eksempel med denne bindingsprofilen (figur 17) er Ab-C.
Antistoff Ab-D er derfor brukt som eksempel og representant for en gruppe av antistoffer som binder til epitopene T20, T20.6, T21-22 og N22.7-23.5, og har minimal detekterbar binding til epitopene T19.2, N14.6 og N18.6, som målt ved evnen til å blokkere antistoffbinding til sklerostin. Antistoffer som har dette karakteristiske bindingsmønster kan eller kan ikke dele aminosyresekvens i ett eller flere områder av antistoffmolekylet. Antistofflikhet er bestemt funksjonelt slik som av evnen til å binde til sklerostin etter pre-inkubering med hver av epitopene beskrevet over. Antistoffene som innehar et bindingsmønster lik eller identisk til det til antistoff Ab-D er inkludert i oppfinnelsen. Ved "lik til" er ment å bety for eksempel, at antistoffet vil fremvise binding til hvert av polypeptidene T20, T20.6, T21-22 og N22.7-23.5 hvorved denne bindingen vil spesifikt konkurrere ut minst 50 % av antistoffets binding til sklerostin som på en annen måte vil skje i fravær av pre-inkubering med sklerostin eller et sklerostinpeptid. Antistoffet vil også fremvise liten eller ingen detekterbar binding til polypeptidene T19.2, N14.6 og N18.6, noe som resulterer i en reduksjon på 30 % eller mindre av bindingen som vil skje i fravær av pre-inkubering med sklerostin eller et sklerostinpeptid.
For eksempel, uten å være bundet av en spesiell mekanisme foreslår antistoffbindingsmønsteret til figur 18 at epitopklassen til hvilket antistoff Ab-D og andre antistoffer som har epitopbindingsmønsteret til Ab-D binder, består av et polypeptid som omfatter cystein-knuteområdet av sklerostin.
Derfor, som beskrevet heri og med referanse til figur 19B, omfatter en T20.6 epitop som fungerer eksempelvis fire peptidkjeder festet via tre separate disulfidbindinger. Peptidkjeden SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (SEQ ID NO:3) er festet til peptidkjeden LVASC7KC8KRLTR (SEQ ID NO:5) ved disulfidbindinger fra C3 til C7, og fra C4 til C8. Peptidkjede DVSEYSC1RELHFTR (SEQ ID NO:2) er festet til peptidkjede WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SEQ ID NO:4) ved en disulfidbinding fra C1 til C5. Polypeptidene til SEQ ID NO'er:3 og 5 forblir assosiert med polypeptidene til SEQ ID NO'er:2 og 4 gjennom en sterisk konstruksjon hvorved C1-C5 bindingen krysser planet til C4-C8 og C3-C7 bindingene og er lokalisert mellom dem, som illustrert i figur 19B.
Som beskrevet heri og med referanse til figur 21, omfatter en derivatepitop av T20.6 som fungerer som eksempel, fire peptidkjeder festet via tre separate disulfidbindinger. Peptidkjede SAKPVTELVC3SGQC4 (SEQ ID NO:70) er festet til peptidkjede LVASC7KC8 (SEQ ID NO:71) ved disulfidbindinger fra C3 til C7, og fra C4 til C8. Peptidkjede C1RELHFTR (SEQ ID NO:72) er festet til peptidkjede C5IPDRYR (SEQ ID NO:73) med en disulfidbinding fra Cl til C5. Polypeptidene til SEQ ID NO'er:70 og 71 forblir assosiert med polypeptidene til SEQ ID NO'er:72 og 73 gjennom et sterisk konstrukt hvorved C1-C5 bindingen krysser planet til C4-C8 og C3-C7 bindingene og er lokalisert mellom dem, som illustrert i figur 21.
Antistoff Ab-A er et eksempel og en representant til en andre gruppe av antistoffer som har et karakteristisk bindingsmønster til humane sklerostinpeptider som er forskjellig fra det oppnådd for antistoffene Ab-C og Ab-D. Ab-A og gruppen av antistoffer det representerer binder til N22.7-23.5 epitopen og har minimal detekterbar binding til epitopene T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 eller N18.6, som målt ved evnen til å blokkere antistoffbinding til sklerostin (figur 15). Et andre antistoff som fungerer som eksempel med denne bindingsprofilen (figur 16) er Ab-B. Antistoffene som har dette karakteristiske bindingsmønsteret kan eller kan ikke dele aminosyresekvens i en eller flere områder av antistoffmolekylet. Antistofflikhet er bestemt funksjonelt slik som av evnen til å binde til sklerostin etter pre-inkubering med hvert av epitopene beskrevet over. Antistoffene kan vise et bindingsmønster lik eller identisk til det til antistoff Ab-A. Ved "lik til" er ment, for eksempel at antistoffet vil fremvise binding til N22.7-23.5 polypeptidet hvorved denne bindingen vil spesifikt konkurrere ut minst 50 % av antistoffets binding til sklerostin som ellers ville skje i fraværet av pre-inkubering med sklerostin eller et sklerostinpeptid. Antistoffet vil også fremvise liten eller ingen detekterbar binding til polypeptidene T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 og N18.6, noe som resulterer i en reduksjon på 30 % eller mindre av bindingen som ville skje i fraværet av pre-inkubering med sklerostin eller et sklerostin-peptid.
For eksempel uten å være bundet av en bestemt mekanisme foreslår antistoffbindingsmønsteret i figur 15 at epitopplassen til hvilket antistoff Ab-A og andre antistoffer som har epitopbindingsmønster til Ab-A binder, bestående av et polypeptid som omfatter Loop 2 området av sklerostin. Derfor, som beskrevet heri og med referanse til figur 19A, kan Loop 2 området bli beskrevet som et lineært peptid, men det erverver en tertiær struktur når det er til stede i nativ sklerostin eller en cystein-knute inneholdende del av sklerostin i hvilket den native disulfidbindingsstrukturen er opprettholdt. Den lineære eller tertiære struktur av Loop 2 epitopen kan påvirke antistoffbinding dertil, som diskutert i eksemplene. Et Loop 2 område kan omfatte den følgende aminosyresekvens: C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID N0:6). "C4" refererer til en cysteinrest lokalisert ved posisjon 86 med referanse til SEQ ID NO:1. "C5" refererer til en cysteinrest lokalisert ved posisjon 111 med referanse til SEQ ID NO:1. I nativt sklerostinprotein er C4 koblet til et cystein ved posisjon 144 (C8) ved en disulfidbinding, og C5 er koblet til et cystein med posisjon 57 (Cl) ved en disulfidbinding. Epitoper derivert fra Loop 2 området inkluderer CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID NO:63); GPARLLPNAIGRGKWWRPSG (SEQ ID NO:64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID NO:65);
ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID NO:66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (SEQ ID NO:67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID NO:68); og LPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO:69).
KRYSSBLOKKERENDE ANALYSE
Betegnelsene "kryssblokke", "kryssblokkert" og "kryssblokkering" er benyttet om hverandre heri for å bety evnen til et antistoff eller andre bindingsmidler å interferere med bindingen av andre antistoffer eller bindingsmidler til sklerostin.
Omfanget til hvilket et antistoff eller andre bindingsmidler er i stand til å interferere med bindingen av et annet til sklerostin, og derfor hvorvidt det kan bli sagt å kryssblokkere, kan bli bestemt ved å benytte konkurransebindings-analyser. En spesielt passende kvantitativ analyse benytter en Biacoremaskin som kan måle omfanget av interaksjoner ved å benytte overflateplasmonresonansteknologi. En annet passende kvantitativ kryssblokkerende analyse benytter en ELISA-basert tilnærmelse for å måle konkurranse mellom antistoffer eller andre bindingsmidler i form av deres binding til sklerostin.
BIACORE KRYSSBLOKKERENDE ANALYSE
Det følgende beskriver generelt en passende Biacore analyse for å bestemme hvorvidt et antistoff eller annet bindingsmiddel kryssblokkerer eller er i stand til kryssblokkering ifølge oppfinnelsen. For bekvemmelighet er referanse gjort til to antistoffer, men det vil bli verdsatt at analysen kan bli benyttet ved et hvilket som helst av sklerostinbindingsmidlene beskrevet heri. Biacoremaskinen (for eksempel Biacore 3000) er betjent i samsvar med fremstillerens anbefalinger.
Derfor i et kryssblokkeringsanalyse er sklerostin koblet til en CM5 Biacorechip ved å benytte standard aminkoblingskjemi for å danne en sklerostinbelagt overflate. Typisk vil 200-800 resonansenheter av sklerostin bli koblet til chipen (en mengde som gir lett målbare nivåer av binding, men som er hurtig mettet av konsentrasjonene av testreagens som blir benyttet).
De to antistoffene (betegnet A* og B*) som skal bedømmes for deres evne til å kryssblokkere hverandre er blandet med en til et molart forhold av bindingsseter i en passende buffer som skal danne testblandingen. Når man beregner konsentrasjonene på en bindingssetebasis er den molekylære vekten av et antistoff antatt å være den totale molekylære vekt av antistoffet delt på antallet sklerostinbindingsseter på det antistoffet.
Konsentrasjonen av hvert antistoff i testblandingen bør være høy nok til å lett mette bindingssetene for det antistoffet på sklerostinmolekylene fanget på Biacore chipen. Antistoffene i blandingen er ved den samme molare konsentrasjon (på en bindingsbasis) og konsentrasjonen vil typisk vil være mellom 1,00 og 1,5 mikromolar (på en bindingssetebasis).
Separate løsninger som inneholder antistoff A* alene og B* alene er også fremstilt. Antistoff A* og antistoff B* i disse løsningene bør være i den samme buffer og ved den samme konsentrasjon som i testblandingen.
Testblandingen er sendt over den sklerostinbelagte Biacore chipen og den totale mengden av binding registrert. Chipen blir så behandlet på en slik måte for å fjerne de bundede antistoffene uten å ødelegge det chip-bundede sklerostin. Typisk er dette gjort ved å behandle chipen med 30 mM HCl i 60 sekunder.
Oppløsningen av antistoff A* alene er så sendt over den sklerostinbelagte overflaten og mengden av binding registrert. Chipen blir igjen behandlet for å fjerne all bundet antistoff uten å ødelegge det chip-bundede sklerostinet.
Oppløsningen av antistoff B* alene blir så sendt over den sklerostinbelagte overflaten og mengden av binding registrert.
Maksimal teoretisk binding av blandingen av antistoff A* og antistoff B* blir så beregnet, og er summen av bindingen av hvert antistoff når det passerer over sklerostinoverflaten alene. Hvis den egentlige registrerte bindingen av blandingen er mindre enn dette teoretiske maksimum så kryssblokkerer de to antistoffene hverandre.
Derfor generelt er et kryssblokkerende antistoff eller annet bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen et som vil binde til sklerostin i den ovenfor nevnte Biacore kryssblokkerende analyse slik at under analysen og i nærvær av et andre antistoff eller annet bindingsmiddel til oppfinnelsen er den registrerte bindingen mellom 80 % og 0,1 % (for eksempel 80 % til 4 %) av den maksimale teoretiske binding, spesifikt mellom 75 % og 0,1 % (for eksempel 75 % til 4 %) av den maksimale teoretiske binding, og mer spesifikt mellom 70 % og 0,1 % (for eksempel 70 % til 4 %) av maksimal teoretisk binding (som akkurat definert over) av de to antistoffer eller bindingsmidler i kombinasjon.
Biacoreanalysen beskrevet over er en primær analyse benyttet for å bestemme om antistoffer eller andre bindingsmidler kryssblokkerer hverandre ifølge oppfinnelsen. I sjeldne tilfeller kan bestemte antistoffer eller andre bindingsmidler ikke binde til sklerostin koblet via aminkjemi til en CM5 Biacorechip (dette skjer vanligvis når det relevante bindingssete på sklerostin er maskert eller ødelagt ved koblingen til chipen). I slike tilfeller kan kryssblokkering bli bestemt ved å benytte en merket versjon av sklerostin, for eksempel N-terminalt His-merket sklerostin (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA; 2005; kat# 1406-ST-025). I dette spesielle formatet vil et anti-His antistoff være koblet til Biacorechipen og så vil et His-merket sklerostin bli sendt over overflaten av chipen og fanget av anti-His antistoffet. Kryssblokkeringsanalysen vil bli utført essensielt som beskrevet over, bortsett fra at etter hver chipregenereringscyklus vil et nytt His-merket sklerostin bli lastet tilbake på den anti-His antstoffbelagte overflaten. I tillegg til eksempelet gitt ved å benytte N-terminalt His-merket sklerostin kan C-terminal His-merket sklerostin alternativt bli benyttet. Videre kan ulike andre merkelapper og merkebindingsproteinkombinasjoner som er kjent innen fagfeltet bli benyttet for en slik kryssblokkeringsanalyse (for eksempel HA merkelapp med anti-HA antistoffer; FLAG merkelapp med anti-FLAG antistoffer; biotinmerkelapp med streptavidin).
ELISA-BASERT KRYSSBLOKKERINGSANALYSE
Det følgende beskriver generelt en ELISA analyse for å bestemme hvorvidt et antisklerostinantistoff eller andre sklerostinbindende virkemidler kryssblokkerer eller er i stand til å kryssblokkere. For bekvemmelighet er referanse gjort til to antistoffer (Ab-X og Ab-Y), men det vil bli verdsatt at analysen kan bli benyttet ved en hvilket som helst av sklerostinbindingsmidlene beskrevet heri.
Det generelle prinsippet til analysen er å ha et anti-sklerostinantistoff belagt over i brønnene på en ELISA plate. En overskuddsmengde av et andre, potensielt kryssblokkerende, anti-sklerostinantistoff blir så tilsatt i løsning (det vil si ikke bundet til ELISA platen). En begrenset mengde av sklerostin blir så tilsatt til brønnene. Det belagte antistoffet og antistoffet i løsning konkurrerer for binding av det begrensede antall av sklerostinmolekyler. Platen blir vasket for å fjerne sklerostin som ikke har litt bundet av det belagte antistoffet og for også å fjerne det andre, løsningsfaseantistoffet likeså som hvilke som helst komplekser dannet mellom det andre, løsningsfaseantistoffet og sklerostin. Mengden av bundet sklerostin blir så målt ved å benytte en passende sklerostindeteksjonsreagens. Et antistoff i løsning som er i stand til å kryssblokkere det belagte antistoffet vil være i stand til å forårsake en minkning av antall sklerostinmolekyler som det belagte antistoffet kan binde relativt til antallet sklerostinmolekyler som det belagte antistoffet kan binde i fravær av det andre, løsningsfaseantistoffet.
Denne analysen er beskrevet i mer detalj videre under for Ab-X og Ab-Y. I tilfellet hvor Ab-X er valgt til å være det immobiliserte antistoffet er det belagt over i brønnene til ELISA platen etter hvilke platene blir blokkert med en passende blokkeringsløsning for å minimalisere uspesifikk binding av reagenser som er etterfølgende tilsatt. En overskuddsmengde av Ab-Y er så tilsatt til ELISA platen slik at molene av Ab-Y sklerostinbindingsseter per brønn er minst 10 ganger høyere enn molene av Ab-X sklerostinbindingsseter som ble benyttet per brønn, under belegningen av ELISA platen. Sklerostin ble så tilsatt slik at mol av sklerostin tilsatt per brønn er minst 25 ganger lavere enn mol av Ab-X sklerostinbindingsseter som ble benyttet for å belegge hver brønn. Etter en passende inkuberingsperiode er ELISA platen vasket og en sklerostindeteksjonsreagens blir tilsatt for å måle mengden av sklerostin spesifikt bundet av det belagte anti-sklerostinantistoffet (i dette tilfellet Ab-X). Bakgrunnssignalet for analysen er definert som signalet oppnådd i brønner med det belagte antistoff (i dette tilfellet Ab-X), andre løsningsfaseantistoff (i dette tilfellet Ab-Y), kun sklerostinbuffer (det vil si ikke noe sklerostin) og sklerostindeteksjonsreagenser. Det positive kontrollsignalet for analysen er definert som signalet oppnådd i brønner med det belagte antistoff (i dette tilfellet Ab-X), kun andre løsningsfaseantistoffbuffer (det vil si ikke noe andre løsningsfaseantistoff), sklerostin og sklerostindeteksjonsreagenser. ELISA analysen trenger å bli kjørt på en slik måte at det positive kontrollsignalet er minst 6 ganger bakgrunnssignalet.
For å unngå noen som helst artefakter (for eksempel signifikant forskjellige affiniteter mellom Ab-X og Ab-Y for sklerostin) resulterende fra valget av hvilket antistoff for å benytte som belegningsantistoffet og hvilke som benyttes for det andre (konkurranse) antistoffet, trenger kryssblokkeringsanalysen å bli kjørt i to formater:
1) format 1 hvor Ab-X er antistoffet som er belagt over i ELISA platen og Ab-Y er konkurranseantistoffet som er i løsning, og
2) format 2 er hvor Ab-Y er antistoffet som er belagt over i ELISA platen og Ab-X er konkurranseantistoffet som er i løsning.
Ab-X og Ab-Y er definert som kryssblokkerende hvis, enten i format 1 eller i format 2, løsningsfaseanti-sklerostinantistoffet er i stand til å forårsake en reduksjon på mellom 60 % og 100 %, spesifikt mellom 70 % og 100 %, og enda mer spesifikt mellom 80 % og 100 %, av sklerostindeteksjonssignalet (det vil si mengden av sklerostin bundet av det belagte antistoffet) som sammenliknet med sklerostindeteksjonssignalet oppnådd i fraværet av løsningsfaseanti-sklerostinantistoffet (det vil si de positive kontrollbrønnene).
Et eksempel på slik en ELISA-basert kryssblokkeringsanalyse kan bli funnet i eksempel 7 ("ELISA-basert kryssblokkeringsanalyse").
CELLEBASERT NØYTRALISERINGSANALYSE
Mineralisering ved osteoblastlinjeceller i kultur, enten primærceller eller cellelinjer, er benyttet som en in vitro modell på beindannelse. Mineralisering tar fra omtrent en til seks uker å skje, begynnende med induksjon av osteoblastlinejcelledifferensiering med en eller flere differensieringsmisler. Den totale sekvens av hendelser involverer celleproliferasjon, differensiering, ekstracellulær matriksproduksjon, matriksmodning og endelig deponering av mineral, som refererer til krystallisering og/eller deponering av kalsiumfosfat. Denne sekvens av hendelser som starter med celleproliferasjon og differensiering, og ender med deponering av mineraler er referert til heri som mineralisering. Målinger av kalsium (mineral) er utbyttet av analysen.
MC3T3-E1 celler (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S.1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol.96:191-198) og subkloner av den opprinnelige cellelinjen kan danne mineraler i kultur ved vekst i nærvær av differensieringsmidler. Slike subkloner inkluderer MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B.2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem.275:19992-20001). For både MC3T3-E1-BF subklon likeså som de originale MC3T3-E1 cellene, kan sklerostin inhibere en eller flere av sekvensen av hendelser som fører opp til og inkluderer mineraldeponering (det vil si sklerostin inhiberer mineralisering). Anti-sklerostinantistoffer som er i stand til å nøytralisere sklerostins inhibitoriske aktivitet tillater mineralisering av kulturen i nærværet av sklerostin slik at det er en statistisk signifikant økning i deponeringen av kalsiumfosfat (målt som kalsium) sammenliknet med mengden av kalsium målt i kun sklerostin (det vil ikke noe antistoff) behandlingsgruppen. Antistoffene benyttet i de cellebaserte mineraliseringsanalyseeksperimentene vist i figur 22, 23 og 24 har molekylærvekter på omtrent 145 Kd og har 2 sklerostinbindingsseter per antistoffmolekyl.
Når man kjører analysen med målet av å bestemme hvorvidt et bestemt anti-sklerostinantistoff eller anti-sklerostinbindingsmiddel kan nøytralisere sklerostin (det vil si er et sklerostinnøytraliserende antistoff eller derivat derav, eller er et sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel), trenger mengden av sklerostin benyttet i analysen å være den minimale mengden av sklerostin som forårsaker minst en 70 % statistisk signifikant reduksjon i deponeringen av kalsiumfosfat (målt som kalsium) i kun sklerostingruppen, sammenliknet med mengden av kalsium målt i ikke-sklerostingruppen. Et anti-sklerostinnøytraliserende antistoff eller et anti-sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel er definert som et som forårsaker en statistisk signifikant økning i deponeringen av kalsiumfosfat (målt som kalsium) sammenliknet med mengden av kalsium målt i kun sklerostin (det vil si ikke noe antistoff, ikke noe bindingsmiddel) behandlingsgruppen. For å bestemme hvorvidt et anti-sklerostinantistoff eller et anti-sklerostinbindingsmiddel er nøytraliserende eller ikke trenger mengden av anti-sklerostinantistoff eller anti-sklerostinbindingsmiddel benyttet i analysen å være slik at det er et overskudd av mol av sklerostinbindingsseter per brønn sammenliknet med antallet av mol av sklerostin per brønn. Avhengig av kraften av antistoffet kan grad av overskudd som kan være nødvendig være 24, 18, 12, 6, 3 eller 1,5, og en trenet innen fagfeltet er familiær med rutinepraksisen for å teste mer enn en konsentrasjon av bindingsmidlet. For eksempel vil et veldig potent anti-sklerostinnøytraliserende antistoff eller anti-sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel være i stand til å nøytralisere sklerostin selv om det er mindre enn seks ganger overskudd mol av sklerostinbindingsseter per brønn sammenliknet med antall mol sklerostin per brønn. Et mindre potent anti-sklerostinnøytraliserende antistoff eller anti-sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel vil være i stand til å nøytralisere sklerostin kun ved 12, 18 eller 24 gangers overskudd. Sklerostinbindingsmidler innen denne fulle rekkevidden av virkeevne er passende som nøytraliserende sklerostinbindingsmidler. Cellebaserte mineraliseringsanalyser som fungerer som eksempler er beskrevet i detalj i eksempel 8.
Anti-sklerostinantistoffer og derivater derav som kan nøytralisere humant sklerostin, og sklerostinbindingsmidler som kan nøytralisere humant sklerostin kan være av bruk i behandlingen av humane tilstander/forstyrrelser som er forårsaket av, assosiert med, eller resulterer i minst en av lav beindannelse, lav beinmineraltetthet, lavt beinmineralinnhold, lav beinmasse, lav beinkvalitet og lav beinstyrke.
IN VIVO NØYTRALISERINGSANALYSE
Økning i ulike parametere assosiert med, eller som resulterer fra stimuleringen av ny beindannelse kan bli målt som et utbytte fra in vivo testing av sklerostinbindingsmidler for å identifisere de bindingsmidlene som er i stand til å nøytralisere sklerostin og derfor i stand til å forårsake stimulering av ny beindannelse. Slike parametere inkluderer ulike serumanabolske markører [for eksempel osteokalsin, P1NP (n-terminalt propeptid av type 1 prokollagen), histomorfometriske markører av beindannelse (for eksempel osteoblastoverflate/beinoverflate; beindannelserate/beinoverflate; trabekulær tykkelse), beinmineraltetthet, beinmineralinnhold, beinmasse, beinkvalitet og beinstyrke. Et sklerostinnøytraliserende bindingsmiddel er definert som et som er i stand til å forårsake et statistisk signifikant økning, sammenliknet med vehikkelbehandlede dyr, i en hvilken som helst parameter assosiert med, eller som resulterer fra, stimuleringen av ny beindannelse. Slik in vivo testing kan bli utført i et hvilket som helst passende pattedyr (for eksempel mus, rotte, ape). Et eksempel på slik in vivo testing kan bli funnet i eksempel 5 ("In vivo testing av anti-sklerostin monoklonale antistoffer").
Selv om aminosyresekvensen til sklerostin ikke er 100 % identisk over de mammalske artene (for eksempel er musesklerostin ikke 100 % identisk til humant sklerostin), vil det bli verdsatt av en trenet innen fagfeltet at et sklerostinbindingsmiddel som kan nøytralisere, in vivo, sklerostinet av en viss art (for eksempel mus) og som også kan binde humant sklerostin in vitro er veldig sannsynlig til å kunne nøytralisere humant sklerostin in vivo. Derfor kan et slikt humanbindingsvirkemiddel (for eksempel antihumant sklerostinantistoff) være av bruk i behandling av humane tilstander/forstyrrelser som er forårsaket av, assosiert med, eller resulterer i minst en av lav beindannelse, lav beinmineraltetthet, lavt beinmineralinnhold, lav beinmasse, lav beinkvalitet og lav beinstyrke. I mus der homolog rekombinasjon har blitt benyttet for å deletere musesklerostingenet og der det humane sklerostingenet er satt inn i dets sted (det vil si humant sklerostingen knock-in mus eller humant SOST knock-in mus) vil være et eksempel på et ytterligere in vivo system.
Farmasøytiske sammensetninger er gitt, som omfatter en av de ovenfor nevnte beskrevne bindingsmidler slik som minst et av antistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D og Ab-1 til Ab-24 til humant sklerostin, sammen med en farmasøytisk eller fysiologisk aksepterbar bærer, eksipient, eller diluent. Farmasøytiske sammensetninger og fremgangsmåter for behandling er beskrevet i ko-pågående søknadsserienr. 10/868 497, arkivert 16. juni 2004, som krever prioritet til serienr.60/478 977.
Utviklingen av passende doserings- og behandlingsregimer for å bruke de bestemte sammensetninger beskrevet heri i et utvalg av behandlingsregimer inkludert for eksempel subkutan, oral, parenteral, intravenøs, intranasal, og intramuskulær administrasjon og formulering, er godt kjent innen fagfeltet, noen av hvilke er kort diskutert under for generelle illustrasjonsformål.
I visse anvendelser kan de farmasøytiske sammensetningene beskrevet heri bli levert via oral administrasjon til et dyr. Som sådan kan disse sammensetningene bli formulert med et inert fortynningsmiddel eller med en assimilerbar spiselig bærer, eller de kan bli innkapslet i hard- eller soft-skall gelatinkapsel, eller de kan være komprimert inn i tabletter, eller de kan være inkorporert direkte med maten til dietten.
I visse omstendigheter vil det være ønskelig å levere de farmasøytiske sammensetningene beskrevet heri subkutant, parenteralt, intravenøst, intramuskulært, eller til og med intraperitonealt. Slike tilnærmelser er godt kjent for den trente fagperson, noen av hvilke er ytterligere beskrevet, for eksempel i U.S.5 543 158; U.S.5 641 515 og 5399 363. Løsninger av de aktive forbindelser som fri base eller farmakologisk aksepterbare salter kan være fremstilt i vann passende blandet med en surfaktant, slik som hydroksypropylcellulose. Dispersjoner kan også fremstilles i glycerol, væskepolyetylenglykoler, og blandinger derav og i oljer. Under vanlige betingelser for lagring og bruk vil disse fremstillingene generelt inneholde et konserveringsmiddel for å forhindre veksten av mikroorganismer.
Illustrative farmasøytiske former passende for injiserbar bruk inkluderer sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for den ekstemporane fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner (for eksempel se U.S.5 466 468). I alle tilfeller må formen være steril og må være flytende til det omfanget som lett sprøytbarhet eksisterer. Det må være stabilt under tilstandene for fremstilling og lagring og må være konservert mot den kontaminerende virkningen av mikroorganismer, slik som bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispersjonsmedium inneholdende, for eksempel, vann, etanol, polyol (for eksempel glycerol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol, og liknende), egnede blandinger derav, og/eller vegetabilske oljer. Passende fluiditet må bli opprettholdt, for eksempel, ved bruk av et belegg, slik som lecitin, ved opprettholdelsen av den påkrevde partikkelstørrelse i tilfellet av dispersjon og/eller ved bruk av surfaktanter. Forebyggelsen av virkningen av mikroorganismer kan bli fremmet ved ulike antibakterielle og antifungale midler, for eksempel, parabener, klorbutanol, fenol, sorbinsyre, timerosal og liknende. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotone virkemidler, for eksempel sukre eller natriumklorid. Forlenget absorpsjon av de injiserbare sammensetningene kan bli gjennomført ved bruken i sammensetningene av midler som forsinker absorpsjon, for eksempel, aluminiummonosterat og gelatin.
Løsningen bør være passende bufret hvis nødvendig og væske-fortynningsmidlet først gjort isotonisk med tilstrekkelig saltløsning eller glukose for parenteral administrasjon i en vandig løsning. Disse bestemte vandige løsningene er spesielt passende for intravenøs, intramuskulær, subkutan og intraperitoneal administrasjon. I denne forbindelse vil et sterilt vandig medium som kan bli benyttet være kjent for den trenet innen fagfeltet i lys av den foreliggende redegjørelse. For eksempel kan en dosering bli oppløst i 1 ml av isoton NaCl løsning og enten tilsatt til
1 000 ml hypodermolysevæske eller injisert ved det foreslåtte setet for infusjon (se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. utg., s.1035-1038 og 1570-1580). Noen variasjon i dosering vil nødvendigvis skje avhengig av tilstanden til emnet som blir behandlet. Videre vil fremstillinger for human administrasjon selvfølgelig fortrinnsvis møte sterilitet, pyrogenisitet og de generelle sikkerhets- og renhetsstandardene som påkrevd av FDA Kontor for biologiske standarder.
Sammensetningene beskrevet heri kan bli formulert i en nøytral eller saltform.
Illustrative farmasøytiske aksepterbare salter inkluderer de syretilsatte salter (dannet med de frie aminogruppene av proteinet) og som er dannet med uorganiske syrer slik som, for eksempel, saltsyre- eller fosforsyrer, eller slike organiske syrer som eddiksyre, oksalsyre, tartarsyre, mandelsyre og liknende. Salter dannet med de fire karboksylgruppene kan også bli derivert fra uorganiske baser slik som, for eksempel, natrium, kalium, ammonium, kalsium eller jernhydroksider, og slike organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, histidin, prokain og liknende. Ved formulering vil løsningen bli administrert på en måte kompatibel med doserings-formuleringen og i en slik mengde som er terapeutisk effektiv.
Bærerne kan videre omfatte en hvilken som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, vehikler, belegg, fortynningsmidler, antibakterielle og antifungale midler, isotone og absorpsjonsforsinkende virkemidler, bufre, bærerløsninger, suspensjoner, kolloider, og liknende. Bruken av slike medier og virkemidler for farmasøytisk aktive substanser er godt kjent innen fagfeltet. Bortsett for så vidt som et hvilket som helst konvensjonelt medium eller middel inkompatibelt med den aktive ingrediensen, er dets bruk i de terapeutiske sammensetningene overveid. Supplerende aktive ingredienser kan også bli inkorporert inn i sammensetningene. Frasen "farmasøytisk aksepterbar" refererer til molekylære enheter og sammensetninger som ikke produserer en allergisk eller liknende uheldig reaksjon når det administreres til et menneske.
Liposomer, nanokapsler, mikropartikler, lipidpartikler, vesikler og liknende kan være benyttet for introduksjonen av sammensetningene beskrevet heri inn i passende verstceller/organismer. Spesielt kan sammensetningene til den foreliggende oppfinnelse bli formulert for levering enten innkapslet i en lipidpartikkel, et liposom, en vesikkel, en nanosfære, eller en nano-partikkel eller liknende. Alternativt kan sammensetningene til den foreliggende oppfinnelsen bli bundet, enten kovalent eller ikke-kovalent til overflaten av slike bærervehikler.
Dannelsen og bruk av liposom og liposomliknende fremstillinger som potensielt medikamentbærere er generelt kjent for de trenet inne fagfeltet (se for eksempel Lasic, Trends Biotechnol.16(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol.55(8): 801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.12(2- 3):233-61, 1995; U.S.5 567 434; U.S.5 552 157; U.S.5 565 213; U.S.5 738 868 og U.S.5 795 587). Bruken av liposomer ser ikke ut til å være assosiert med autoimmune responser eller uaksepterbar toksisitet etter systemisk levering. Liposomer kan være dannet fra fosfolipider som er spredd i et vandig medium og spontant danner multilammelerte konsentriske bisjiktvesikler (også betegnet multilamellære vesikler (MLV'er)).
Alternativt er det tilveiebrakt farmasøytisk-aksepterbare nanokapselformuleringer i sammensetningene beskrevet heri. Nanokapsler kan generelt stenge inne forbindelser på en stabil og reproduserbar måte (se for eksempel Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12):1113-28, 1998). For å unngå bieffekter på grunn av intracellulær polymerisk overlasting kan slike ultrafine partikler (størrelse rundt 0,1 µm) bli designet ved å benytte polymerer som er i stand til å bli degradert in vivo. Slike partikler kan bli gjort som beskrevet, for eksempel av Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(l):l-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2):149~55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(l-3):31-40, 1998; og U.S.5 145 684.
I tillegg kan farmasøytiske sammensetninger bli plassert innen containere, sammen med pakningsmateriale som gir instruksjoner med hensyn til bruken av slike farmasøytiske sammensetninger. Generelt vil slike instruksjoner inkludere et konkret uttrykk som beskriver reagenskonsentrasjonen, likeså som innen visse utførelsesformer, relative mengder av eksipientingredienser eller fortynninger (for eksempel vann, saltløsning eller PBS) som vil være nødvendig for å rekonstituere den farmasøytiske sammensetning.
Dosen administrert kan variere fra 0,01 mg/kg til 100 mg/kg kroppsvekt. Det vil være innlysende for en trenet innen fagfeltet at mengden og frekvensen av administrasjon vil avhenge selvfølgelig på slike faktorer som naturen og alvorlighetsgraden til indikasjonen som blir behandlet, den ønskede respons, tilstanden til pasienten, og så videre. Typisk kan sammensetningene bli administrert ved et utvalg av tekniker, som bemerket over.
Økninger i beinmineralinnhold og/eller beinmineraltetthet kan bli bestemt direkte gjennom bruk av røntgenstråler (for eksempel dobbelt energi røntgenstråleabsorptometri eller "DEXA"), eller ved slutning gjennom målingen av 1) markører for beindannelse og/eller osteoblastaktivitet, slik som, men ikke begrenset til, osteoblastspesifikk alkalisk fosfatase, osteokalsin, type 1 prokollagen C' propeptid (PICP), total alkalisk fosfatase (se Comier, Curr. Opin. in Rheu.7:243(1995)) og serumprokollagen 1 N-terminal propeptid (P1NP) og/eller 2) markører for beinresorpsjon og/eller osteoklastaktivitet inkludert, men ikke begrenset til, pyridinolin, deoksypyridinolin, N-telopeptid, urinhydroksyprolin, plasmatartratresistente syrefosfataser og galaktosylhydroksylysin; (se Comier, id), serum TRAP 5b (tartrat-resistent syrefosfatase isoforn 5b) og serumkrysskoblet C-telopeptid (sCTXI). Mengden av beinmasse kan også bli kalkulert fra kroppsvekter eller ved å benytte andre fremgangsmåter (se Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res.5:177-181, 1984). Dyr og spesielt dyremodeller er benyttet i fagfeltet for å teste effekten av sammensetningene og fremgangsmåtene beskrevet heri på, for eksempel, parametere av beintap, beinresorpsjon, beindannelse, beinstyrke eller beinmineralisering som etterlikner betingelser til humane sykdommer slik som osteoporose og osteopenia. Eksempler på slike modeller inkluderer den ovariektomiserte rottemodellen (Kalu, D.N., The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone and Mineral 15:175-192 (1991); Frost, H.M. and Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoporosis. Bone and Mineral 18:227-236 (1992); og Jee, W.S.S. and Yao, W., Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J.
Musculoskel. Neuron. Interact.1:193-207 (2001)).
Spesielle tilstander som kan bli behandlet av antistoffene beskrevet heri inkluderer dysplasier, hvori vekst eller utvikling av bein er unormalt og et stort utvalg av årsaker til osteopenia, osteoporose og beintap. Representative eksempler på slike tilstander inkluderer akondroplasia, kleidokranial dysostose, enkondromatose, fibrøs dysplasi, Gauchers sykdom, hypofosfatemiske rickets, Marfans syndrom, multippelt arvelig eksotose, neurofibromatose, osteogenese imperfekta, osteopetrose, osteopoikilose, sklerotiske lesjoner, pseudoartrose og pyogenisk osteomyelitt, periodontal sykdom, antiepileptisk medikamentindusert beintap, primær og sekundær hyperparatyroidisme, familiær hyperparatyroidismesyndromer, vektløshetsindusert beintap, osteoporose i menn, postmenopausalt beintap, osteoartritt, nyreosteodystrofi, infiltrative forstyrrelser i bein, oralt beintap, osteonekrose i kjeven, ungdoms Pagets sykdom, melorheosteose, metabolske beinsykdommer, mastocytose, sigdcelle-anemi/sykdom, organtransplantert relatert beintap, nyretransplantert relatert beintap, systemisk lupus erytematose, ankyloserende spondylitt, epilepsi, barndoms-artrititt, talasemi, mukopolysakkaridoser, Fabrys sykdom, Turners syndrom, Downs syndrom, Klinefeltersyndrom, spedalskhet, Perthes sykdom, ungdomsidiopatisk skoliose, barnebegynnende multisystem inflammatorisk system, Winchester syndrom, Menkes sykdom, Wilsons sykdom, iskemisk beinsykdom (slik som Legg-Calve-Perthes sykdom, regional migratorisk osteoporose), anemiske tilstander, tilstander forårsaket av steroider, glukokortikoidindusert beintap, heparinindusert beintap, beinmargsforstyrrelser, skjørbuk, feilernæring, kalsiummangler, idiopatisk osteopeni eller osteoporose, medfødt osteopeni eller osteoporose, alkoholisme, kronisk leversykdom, postmenopausal tilstand, kronisk betennelsestilstander, reumatoid artritt, betennelsestarmsykdom, ulcerativ kolitt, betennelseskolitt, Crohns sykdom, oligomenorea, amenorea, graviditet, diabetes mellitus, hypertyroidisme, tyroidforstyrrelser, paratyroidforstyrrelser, Cushings sykdom, akromegali, hypogonadisme, immobilisering eller disbruk, refleks sympatetisk dystrofisyndrom, regional osteoporose, osteomalasia, beintap assosiert med ledderstatning, HIV assosiert beintap, beintap assosiert med tap av veksthormon, beintap assosiert med cystisk fibrose, fibrøs dysplasi, kjemoterapi assosiert beintap, tumorindusert beintap, cancerrelatert beintap, hormonablativt beintap, multippel myeloma, medikamentindusert beintap, anoreksia nervosa, sykdomsassosiert ansiktsbeintap, sykdomsassosiert kraniebeintap, sykdomsassosiert beintap av kjeven, sykdomsassosiert beintap av skallen og beintap assosiert med romferd. Ytterligere tilstander relaterer til beintap assosiert med aldring, inkludert ansiktsbeintap assosiert med aldring, kraniebeintap assosiert med aldring, kjevebeintap assosiert med aldring og skallebeintap assosiert med aldring.
Antistoffer beskrevet heri kan også være nyttige for å forbedre resultatene i ortopediske fremgangsmåter, tannfremgangsmåter, implantkirurgi, ledderstatning, beintransplantering, beinkosmetisk kirurgi og beinreparasjon slik som bruddhelbredelse, uorganisert helbredelse, forsinket organisert helbredelse og ansiktsrekonstruksjon. En eller flere antistoffer kan være administrert før, under og/eller etter prosedyren, utskiftning, transplantasjon, kirurgi eller reparasjon.
Det er også beskrevet et diagnostisk sett omfattende minst ett anti-sklerostinbindingsmiddel. Bindingsmidlet kan være et antistoff. I tillegg omfatter et slik sett valgfritt en eller flere av det følgende:
(1) instruksjoner for å bruke ett bindingsmiddel eller flere bindingsmidler for screening, diagnose, prognose, terapeutisk monitorering eller en hvilken som helst kombinasjon av disse anvendelser;
(2) en merket bindingspartner til anti-skletrostinbindingsmidlet- eller midlene;
(3) en fast fase (slik som en reagensstrip) ved hvilket anti-sklerostinbindingsmidleteller midlene er immobilisert; og
(4) en merkelapp eller pakning som indikerer regulatorisk godkjenning for screening, diagnostikk, prognostikk eller terapeutisk bruk eller en hvilken som helst kombinasjon derav.
Hvis ingen merket bindingspartner til bindingsmidlet- eller midlene er gitt kan bindingsmidlet- eller midlene i seg selv bli merket med en eller flere av en detekterbar markør, for eksempel en kjemiluminescent, enzymatisk, fluorescent eller radioaktiv enhet.
De følgende eksempler er tilbudt for illustrasjonsformål og ikke for begrensningsformål.
EKSEMPLER
EKSEMPEL 1
Rekombinant uttrykk av sklerostin
Rekombinant humant sklerostin/SOST er kommersielt tilgjengelig fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 kat# 1406-ST-025). I tillegg er rekombinant musesklerostin/SOST kommersielt tilgjengelig fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA; 2006 kat# 1589-ST-025).
Alternativt kan de ulike artene av sklerostin bli uttrykkt forbigående i serumfri suspensjon adapterte 293T- eller 293EBNA celler. Transfeksjoner kan bli utført som 500 ml eller IL kulturer. De følgende reagenser og materialer er tilgjengelig fra Gibco BRL (nå Invitrogen, Carlsbad, CA). Katalognumre er ført opp i parenteser: serumfritt DMEM (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); IX insulin-transferrinseleniumsupplement (51500-056); IX Pen Strep Glut (10378-016); 2 mM 1-glutamin (25030-081); 20 mM HEPES (15630-080); 0,01 % pluronisk F68 (24040-032). I korthet er celleinokulatet (5,0-10,0 x 10<5 >celler/ml X kulturvolum) sentrifugert ved 2500 omdreininger per minutt i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne betingelsesmediumet.
Cellene er resuspendert i serumfritt DMEM og sentrifugert igjen ved 2500 omdreininger per minutt i 10 minutter ved 4 ºC. Etter avsugning av vaskeløsningen er cellene resuspendert i vekstmedium [DMEM/F12 (3:1) 1X insulin-transferrinseleniumsupplement IX Pen Strep Glut 2 mM L-glutamin 20 mM HEPES 0,01 % pluronisk F68] i en IL eller 3L spinnerflaskekultur. Spinnerflaskekulturen er opprettholdt på magnetisk røreplate ved 125 omdreininger per minutt som er plassert i en fukteinkubator opprettholdt ved 37 °C og 5 % CO2. Det mammalske ekspresjonsplasmid DNA (for eksempel pcDNA 3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), som inneholder det komplette kodende området (og stoppkodon) av sklerostin med en Kozak konsensussekvens (for eksempel CCACC) direkte 5' til startsetet ATG, er kompleksert til transfeksjonsreagensen i et 50 ml konisk rør.
DNA-transfeksjonsreagenskomplekset kan bli fremstilt i 5-10 % av det endelige dyrkningsvolumet i serumfritt DMEM eller OPTI-MEM. Transfeksjonsreagensene som kan bli benyttet for dette formålet inkluderer X-tremeGene RO-1539 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), FuGeneό (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 293fektin (Invitrogen, Carlsbad, CA).
1-5 μg plasmid DNA/ml kultur er først tilsatt til serumfritt DMEM, etterfulgt av 1-5 μl transfeksjonsreagens/ml kultur. Kompleksene kan bli inkubert ved romtemperatur i omtrentlig 10-30 minutter og så tilsatt til cellene i spinnerflasken.
Transfeksjon/ekspresjonen kan bli utført i 4-7 dager, etter hvilket betingelsesmedium (CM) er høstet ved sentrifugering ved 4000 omdreininger per minutt i 60 minutter ved 4 ºC.
EKSEMPEL 2
RENSING AV REKOMBINANT SKLEROSTIN
Rekombinant sklerostin ble renset fra mammalske vertsceller som følger. Alle renseprosesser ble utført ved romtemperatur. Et renseskjema ble benyttet for å rense ulike arter av sklerostin, inkludert murint og humant sklerostin. Renseskjemaet benyttet affinitetskromatografi etterfulgt av kationutbyttekromatografi.
Heparinkromatografi
Det mammalske vertscellebetingelsesmedium (CM) ble sentrifugert i en Beckman J6-M1 sentrifugert ved 4000 omdreininger per minutt i 1 time ved 4 ºC for å fjerne celledebris. CM supernatantene ble så filtrert gjennom et sterilt 0,2 µm filter (ved dette punktet kan det sterilfiltrerte CM valgfritt lagres frossent inntil opprensing). Hvis CM var fryst, ble det tint ved de følgende temperaturer, eller kombinasjon derav; 4 ºC, romtemperatur eller varmt vann. Etter tining var CM filtrert gjennom et sterilt 0,2 µm filter og valgfritt konsentrert ved flyktig strømningsultrafiltrering (TFF) ved anvendelse av en 10 kD molekylvekt cut-off membran. CM konsentratet ble filtrert gjennom et sterilt 0,2 µm filter og så lastet over i en heparin høyytelses (heparin HP) kolonne (GE Healthcare, tidligere Amersham Biosciences) ekvilibrert i PBS. Alternativt kan den filtrerte CM supernatant bli lastet direkte over i heparin HP kolonnen ekvilibrert i PBS.
Etter lasting ble heparin HP kolonnen vasket med PBS inntil absorbansen ved 280 nm av strøm-trau returnert til grunnlinje (det vil absorbans målt før lasting av CM supernatant). Sklerostinet ble så eluert fra kolonnen ved å benytte en lineær gradient fra 150 mM til 2M natriumklorid i PBS. Absorbansen ved 280 nm av eluatet ble monitorert og fraksjoner som inneholder protein ble samlet. Fraksjonene ble så analysert ved Coomassie-farget SDS-PAGE for å identifisere fraksjoner som inneholder et polypeptid som migrerer ved størrelsen til glykosylert sklerostin. De passende fraksjonene fra kolonnen ble kombinert for å lage heparin HP pool.
Kationutbyttekromatografi
Sklerostinet eluert fra heparin HP kolonnen ble videre renset ved kationutbyttekromatografi ved å benytte SP High Performance (SPHP) kromatografimedium (GE Healthcare, tidligere Amersham Biosciences). Heparin HP poolen ble bufferutvekslet over i PBS ved dialyse ved å benytte 10000 MWCO membraner (Pierce Slide-A-Lyzer). Den dialyserte heparin HP poolen ble så lastet over i en SPHP kolonne ekvilibrert i PBS. Etter lasting ble kolonnen vasket med PBS inntil absorbansen ved 280 nm av strøm-trauen returnerte til grunnlinje. Sklerostinet ble så eluert fra SPHP kolonnen ved å benytte en lineær gradient fra 150 mM til 1 M natriumklorid i i PBS. Absorbansen ved 280 nm av eluatet ble monitorert og det eluerte sklerostinet ble samlet i fraksjoner. Fraksjonene ble så analysert ved Coomassie-farget SDS-PAGE for å identifisere fraksjoner inneholdende et polypeptid som migrerer med størrelsen til glykosylert sklerostin. De passende fraksjoner fra kolonnen ble slått sammen for å lage SPHP poolen.
Formulering
Etter opprensing ble SPHP poolen formulert i PBS ved dialyse ved å benytte 10000 MWCO membraner (Pierce Slide-A-Lyzer). Hvis konsentrering av sklerostin var nødvendig ble en sentrifugal anordning (Amicon Centricon eller Centriprep) med en 10 000 MWCO membran benyttet. Etter formulering ble sklerostinet filtrert gjennom et sterilt 0,2 µm filter og lagret ved 4 ºC eller fryst.
EKSEMPEL 3
PEPTIDBINDING ELISA
En serie av overlappende peptider (hvert peptid er omtrentlig 20-25 aminosyrer lange) ble syntetisert basert på den kjente aminosyresekvensen av rottesklerostin (SEQ ID NO:98). Peptidene ble designet slik at de alle inneholdt en redusert cysteinrest; en ytterligere cystein ble inkludert ved C-terminus ved hvert peptid som ikke allerede inneholdt en i dets sekvens. Dette gjorde peptidene i stand til å bli bundet til analyseplatene ved kovalent kobling, ved å benytte kommersielt tilgjengelig sulfhydrylbindingsplater (Costar), ved en konsentrasjon på 1 µg/ml, i fosfatbufret saltløsning (PBS: pH 6,5) som inneholdt 1 mM EDTA. Etter inkubering i 1 time ved romtemperatur ble platene vasket tre ganger med PBS som inneholdt 0,5 % Tween 20. Platene ble blokkert ved inkubering med en PBS løsning som inneholdt 0,5 % fiskeskinngelatin (Sigma) i 30 minutter ved romtemperatur og så vasket tre ganger i PBS som inneholdt 0,5 % Tween 20.
Antistoffer som skulle bli testet ble fortynnet til 1 µg/ml i PBS som inneholdt 0,5 % fiskeskinngelatin og inkubert med de peptidbelagte platene i 1 time ved romtemperatur. Overskudd antistoff ble så fjernet ved tre vaskinger med PBS, 0,5 % Tween 20. Platene ble så inkubert med et passende sekundært antistoff konjugert til pepperotperoksidase (fortynnet passende i PBS som inneholdt 0,5 % Tween 20) og i stand til å binde til antistoffet av interesse. Platene ble så vasket tre ganger: en gang med PBS som inneholdt 0,5 % Tween 20, og to ganger med PBS. Endelig ble platene inkubert med et pepperotperoksidasekromogent substrat (TMB-Stable Stop, RDI) i 5 minutter ved romtemperatur, fargeutviklingen ble stoppet med syre, og platenes optiske tetthet målt ved 450 nm.
Materialer
Costars sulfhydrylbindingsplater (VWR # 29442-278)
Belegningsbuffer: IXPBS pH 6,5 1 mM EDTA
Blokkeringsbuffer: 1X PBS 0,5 % fiskeskinngelatin (PBS fra CS; FSG fra Sigma# G 7765)
Vaskebuffer: 1X PBS 0,5 % Tween 20 rottesklerostinpeptider
Antistoffprøver: Transient Ab, renset rekombinant Ab, kaninserum, et cetera.
Passende sekundært Ab: Geite-anti-kanin/mus-HRP (Jackson Immuno Research, 115-036-072)
TMB-Stable Stop (RDI# RDI-TMBSX-IL)
Fremgangsmåter var som følger:
1. Belegg plater med l00 μl/brønn av rottesklerostinpeptid fortynnet i 1XPBS pH 6,5 1 mM EDTA ved 1 μg/ml. Inkuber platene i 1 time ved romtemperatur. (Plater bør bli benyttet innen 30 minutter etter åpning).
2. Vask plater 3X med vaskebuffer.
3. Blokker platene med 200 µl/brønn blokkeringsbuffer. Inkuber platene i 30 min. ved romtemperatur.
4. Repeter vasking som beskrevet i (2).
5. Inkuber platene med 50 µl/brønn av prøver fortynnet i blokkeringsbuffer –serumtitere startende ved 1:100; transient rekombinant Ab bruk ren; renset rekombinant Ab bruk ved 1 µg/ml (alle prøver kjørt i duplikater). Inkuber platene i 1 time ved romtemperatur.
6. Vask platene som beskrevet i (2).
7. Inkuber platene med 50 µl/brønn av passende sekundært antistoff (HRP merket) fortynnet 1:1600 I blokkeringsbuffer. Inkuber platene i 1 time ved romtemperatur. 8. Vask plater 1 x vaskebuffer, 2 x PBS.
9. Inkuber plater med 50 µl/brønn av TMB, 5 minutter ved romtemperatur.
10. Stopp reaksjon med 50 µl/brønn 0,5 M HCl.
11. Les plater ved 450 nm bølgelengde.
De følgende peptidsekvenser ble screenet som beskrevet over:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID NO:82) TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO:83)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO:84) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO:85)
CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID NO:86)
CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (SEQ ID NO:87) CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID NO:88)
CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:89) RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID NO:90)
PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO:91)
KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO:92)
IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID NO:93) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO:94) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO:95) PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:96) KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO:97).
Et høyaffinitetsnøytraliserende antistoff (Ab- 19) bandt til to overlappende peptidsekvenser: PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO:96) og KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO:97).
Denne fremgangsmåten tillater gjenkjennelsen av epitoper for antistoffer som reagerer med tilsynelatende lineære epitoper. Peptider som inneholder alle eller deler av antistoffbindingssetet vil binde antistoff og dermed bli detektert.
EKSEMPEL 4
IDENTIFIKASJON AV HUMANE SKLEROSTINEPITOPER
Sklerostinstruktur
Moden form (signalpeptid fjernet) av humant sklerostin er et 190 aminosyreprotein (figur 8). Figur 9 viser en skjematisk fremstilling av den generelle strukturen av sklerostin med en N-terminal arm (fra N-terminal Q til cystein 1) og en C-terminal arm (fra cystein 8 til terminal Y). Sandwiched i mellom disse to armene er det en cysteinknutestruktur og tre looper som er betegnet Loop 1, Loop 2 og Loop 3. De fire disulfidbindinger i sklerostin er Cys1 ved sekvensposisjon 57 koblet til Cys5 ved sekvensposisjon 111 (referert til som C1-C5), Cys2 ved sekvensposisjon 71 koblet til Cys6 ved sekvensposisjon 125 (referert til som C2-C6), Cys3 ved sekvensposisjon 82 koblet til Cys7 ved sekvensposisjon 142 (referert til som C3-C7), Cys4 ved sekvensposisjon 86 koblet til Cys8 ved sekvensposisjon 144 (referert til som C4-C8). Ringstrukturen med åtte medlemmer er dannet via C3-C7 og C4-C8 disulfidbinding. Denne ringstrukturen sammen med C1-C5 disulfidbinding som penetrerer gjennom ringen danner en typisk cystein-knute. C2-C6, hvilket er del av cysteinknuten, bringer to store loopstrukturer, loop 1 (restene 57 til 82) og loop 3 (restene 111 til 142) nært sammen. Loop 2 går fra C4 (rest 86) til C5 (rest 111).
Eksperimentelt
Den generelle tilnærmelsen for å karakterisere epitopene bundet av anti-sklerostinmonoklonale antistoffer involverte fragmentering av humant sklerostin over i peptider med ulike proteaser, å bestemme sekvensen av de ulike humansklerostinpeptidene, å isolere disse peptidene og teste hver av dem for deres evne til å binde til et bestemt monoklonalt antistoff ved å benytte en Biacore-basert "human sklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalyse". De resulterende data muliggjorde lokalisasjonen av bindingsepitopen å bli bestemt.
Peptidfordøyelsene ble utsatt for HPLC peptidkartlegging; de individuelle toppene ble samlet, og peptidene identifisert og kartlagt ved matriksassistert laserdesorpsjonmassespektrometri (MALDI-MS) og elektrosprayionisering LC-MS (ESI-LC-MS) analyser og/eller ved N-terminal sekvensering. Alle HPLC analysene for disse studiene ble utført ved å benytte en reversfase C8 kolonne (2,1 mm i.d. x 15 cm lengde). HPLC peptidkartlegging ble utført med en lineær gradient fra 0,05 % trifluoreddiksyre (mobil fase A) til 90 % acetonitril i 0,05 % trifluoreddiksyre. Kolonner ble utviklet i løpet av 50 minutter ved en strømningshastighet på 0,2 ml/min.
Trypsin og AspN endoproteinasefordøyninger
Moden form av humant sklerostin ble fordøyd med trypsin, som kløyver etter arginin og lysin, eller med AspN. Omtrent 200 µg sklerostin ved 0,5-1,0 mg/ml ble inkubert i PBS (pH 7,2) i 20 timer ved 37 ºC med 8 µg av enten trypsin eller AspN.
Trypsinfordøyning
HPLC kromatografi av trypsinfordøyningene ga flere store topper (figur 10A).
Sekvensanalyse ble gjennomført på peptidtoppene gjenopprettet fra HPLC etter trypsinfordøyning. On-line ESI LC-MS analyse av peptidfordøyningen ble også gjennomført for å bestemme den nøyaktige massen av peptidene som ble separert ved HPLC. Identiteten til peptidene til stede i peptidtoppene ble således bestemt (figur 11). Figur 13 viser oppstillingen av ulike peptidsekvenser (T19.2, T20, T20.6, T21-22) langs sklerostinsekvensen. Nummeret som følger hver T (for eksempel T19.2) reflekterer retensjonstiden. T19.2 inneholder to peptider (en fra Loop 1 og en fra Loop 3) koblet av C2-C6 disulfidbinding. T20 inneholder to peptider holdt sammen av cysteinknutestrukturen med intakte Looper 1 og 3 holdt sammen av C2-C6 disulfidet og med mesteparten av Loop 2 fraværende. T20.6 inneholder fire sekvenser holdt sammen av cystein-knutestrukturen, men mangler del av Loop 1 og 3 (T19.2 delen) og mangler mesteparten av Loop 2. T21-22 er nesten identisk til T20 men har 3 ytterligere aminosyrer i Loop 2 området.
AspN fordøyning
HPLC kromatografi av AspN fordøyninger ga flere store topper (figur 10B).
Sekvensanalyse ble gjennomført på peptidtoppene gjenvunnet fra HPLC. In-line ESI LC-MS analyse av peptidfordøyningen ble også gjennomført for å bestemme den nøyaktige massen av peptidene som ble separert ved HPLC. Identiteten av peptidene til stede i peptidtoppene fra AspN fordøyningen ble derfor bestemt (figur 12). Figur 14 viser oppstillingen av ulike peptidsekvenser (AspN14.6, AspN18.6, AspN22.7-23.5) langs sklerostinsekvensen. Antallet som følger hver AspN (for eksempel AspN18.6) reflekterer retensjonstiden. AspN14.6 inneholder tre korte peptider fra både N- og C-terminale armer av sklerostin, mens AspN18.6 er et stort peptid fra N-terminal arm av sklerostin. AspN22.7-23.5 inneholder et enkeltpeptidfragment på 104 aminosyrer som omfatter alle åtte cysteiner (de fire disulfidbindingene), cysteinknuten og alle loopene 1, 2 og 3.
Strategien for å karakterisere epitopene var å benytte de ulike trypsin- og AspN genererte humansklerostinpeptidene og bestemme hvilke peptider som fremdeles kunne bli bundet av de ulike antistoffene (Ab-A, Ab-B, Ab-C og Ab-D). Spesifikt ble dette testet i en Biacore-basert "human sklerostinpeptidepitopkonkurransebindingsanalyse" hvor bindingen av et bestemt monoklonalt antistoff til humant sklerostin immobilisert på Biacorechipen ble bestemt i nærværet eller fraværet av hver av de ulike isolerte trypsin og AspN HPLC peptidfraksjoner. I fraværet av hvilke som helst konkurransepeptider var det bestemte monoklonale antistoffet i stand til å binde humant sklerostin på chipen og produsere en resonansenhet, RU, respons. Preinkubering av det bestemte monoklonale antistoffet med intakt humant sklerostin i løsning, etterfulgt av testing av binding til chipen, demonstrerte at bindingen av Mab til humant sklerostin i løsning forhindret bindingen av Mab til det humane sklerostin på chipen, noe som validerte det generelle prinsippet i denne konkurranseanalysen.
Denne generelle prosedyren ble repetert individuelt for hvert peptid. En robust RU respons ble tatt til å indikere at det bestemte peptidet som ble testet ikke kunne binde Mab'en i løsning (derfor var Mab fri til å binde humant sklerostin som hadde blitt immobilisert på chipen). Omvendt indikerte fraværet av en robust RU respons at Mab'en var i stand til å binde sklerostinpeptidet i løsning. Disse bindingsmønstre, koblet med den kjente identiteten til de ulike sklerostinpeptidene, ble benyttet for å bestemme epitopene av sklerostin som ble bundet av anti-sklerostinantistoffene Ab-A, Ab-B, Ab-C og Ab-D.
BIACORE-BASERT
HUMANSKLEROSTINPEPTIDEPITOPKONKURRANSEBINDINGSANALYSE
Fremstilling av human sklerostinoverflate:
Immobilisering av moden form av humant sklerostin til en BIAcore sensorchip (CM5) overflate ble utført ifølge fremstillerens instruksjoner. I korthet ble karboksylgruppene på sensorchipoverflatene aktivert ved å injisere 60 µl av en blanding som inneholdt 0,2 M N-etyl-N'(dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) og 0,05 M N-hydroksysuksinimid (NHS). Humant sklerostin ble fortynnet i 10 mM natriumacetat, pH 4,0 ved en konsentrasjon på 20 µg/ml etterfulgt av injeksjon over den aktiverte CM5 overflaten. Overskudd av reaktive grupper på overflatene ble deaktivert ved å injisere 60 µl av 1 M etanolamin. Endelig immobiliserte nivåer var ~ 5000 resonansenheter (RU) for den humane sklerostinoverflaten. En blank, mock-koblet referanseoverflate ble også fremstilt på sensorchipene.
Bindingsspesifisitetsanalyse:
1X fosfatbufret saltløsning uten kalsiumklorid eller magnesiumklorid var fra Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA. Bovinserumalbumin, fraksjon V, IgG-fri var fra Sigma Aldrich, St. Louis, MO. Hver Mab (2 nM) ble separat inkubert med 20 nM humant sklerostin eller et bestemt humant sklerostinpeptid (bemerk: det er 3 ukoblede peptider i AspN14.6) i prøvebuffer (1X PBS 0,005 % P-20 0,1 mg/ml BSA) før injeksjon over den immobiliserte humane sklerostinoverflaten. Strømningshastigheten for prøveinjeksjon var 5 µl/min. etterfulgt av overflateregenerering ved å benytte 1 M NaCl i 8 mM glycin, pH 2,0 ved 30 µl/min. i 30 sekunder. Dataene ble analysert ved å benytte BIA evaluering 3.2 og er presentert i figur 15 (Ab-A), figur 16 (Ab-B), figur 17 (Ab-C) og figur 18 (Ab-D).
Loop 2 og T20.6 epitoper:
Sklerostinpeptidbindingsmønsteret for to representative antistoffer (Ab-A og Ab-B) var praktisk talt identiske (figur 15 og figur 16) og viste at begge av disse antistoffene kunne kun binde AspN22.7-23.5 peptidet. Den unike forskjellen mellom AspN22.7-23.5 og alle de andre sklerostinpeptidene er at AspN22.7-23.5 inneholder en intakt Loop 2. Dette viser at Ab-A og Ab-B binder Loop 2 området av sklerostin og derved definerer Loop 2 epitopen (figur 19A). Sklerostinpeptidbindingsmønsteret for Ab-C og Ab-D var praktisk talt identiske til hverandre (figur 17 og figur 18) men fullstendig forskjellig fra det funnet for Ab-A og Ab-B. Av peptidene testet i dette eksempelet var det mest minimale peptidet som Ab-C og Ab-D kunne binde til T20.6 peptidet. Dette resultatet definerer T20.6 epitopen (figur 19B).
Proteasebeskyttelsesanalyse:
Det generelle prinsippet til denne analysen er at binding av et Mab til sklerostin kan resultere i beskyttelse av visse spesifikke proteasekløyvingsseter og denne informasjon kan bli benyttet for å bestemme området av sklerostin til hvilket Mab binder.
T20.6 derivat 1 (cystein-knute 4 armer)" epitop:
Figur 20 viser HPLC peptidkartene for et humant sklerostin Ab-D kompleks (figur 20A: humant sklerostin var preinkubert ved et 1:1 molart forhold med Ab-D før fordøyelse med trypsin som beskrevet over) og humant sklerostin alene (figur 20B: humant sklerostin ble fordøyd med trypsin som beskrevet over). Peptidtoppene av T19.2 og T20.6 i figur 20A viste en klar reduksjon i deres respektive topphøyder, som sammenliknet med figur 20B. Denne reduksjon i topphøyder ble fulgt av en økning i topphøyder for peptidene T20 og T21-22. Disse data indikerer at basiske aminosyrerester i Loop 1 og Loop 3, som i fraværet av Ab-D ble kløyvet av trypsin for å generere peptidene T19.2 og T20.6, var resistente mot kløyving av trypsin når Ab-D var prebundet til sklerostin. Nærværet av T20, T20.6 og T21-22 indikerer at Loop 2 fremdeles var kløyvet effektivt når Ab-D var rebundet til sklerostin. Disse data indikerer at Ab-D bundet på Loop 1 og Loop 3 siden av T20.6 epitopen derfor definerer den indre "T20.6 derivat 1 (cystein-knute 4 armer)" epitopen vist i figur 21.
EKSEMPEL 5
IN VIVO TESTING AV ANTI-SKLEROSTINMONOKLONALE ANTISTOFFER
I MUS
Fire uker gamle BDF1 hannmus ble skaffet fra Charles River Laboratories (Raleigh, NC) og huset i rene bur, fem dyr per bur. Romtemperatur ble opprettholdt mellom 68 og 72 ºF og relativ fuktighet ble opprettholdt mellom 34-73 %. Laboratoriet som huset burene hadde en 12-timers lys/mørkecyklys og møtte alle AAALAC spesifikasjoner. Kliniske observasjoner av alle mus på studiet skjedde en gang daglig.
Rensede anti-sklerostin monoklonale antistoffer (Ab-A figur 1; Ab-B figur 2; Ab-C figur 3; Ab-D figur 4) ble fortynnet i sterilt Dulbeccos fosfatbufrede saltløsning. Mus ble injisert med anti-sklerostinantistoffer eller PBS vehikkel subkutant ved 21 ml per gram kroppsvekt, to ganger per uke (mandag og torsdag) ved 25 mg/kg. Humant PTH (1-34) ble fortynnet i PTH buffer (0,001 N HCl, 0,15 M NaCl, 2 % BSA) og dosert subkutant ved 21 µl per gram kroppsvekt fem ganger per uke (mandag, tirsdag, onsdag, torsdag, fredag) ved 100 µg/kg som en positiv kontroll (figurene 5 og 6). Antall mus per gruppe var N=5 i figur 5 og 6, og N=6 i figur 7.
PIXImus in vivo beindensitometri
Beinmineraltetthet (BMD) ble bestemt ukentlig ved den proksimale tibiale metafyse og lumbal ryggvirvel ved perifer dobbelt energi røntgenabsorptometri (pDEXA) med PIXImus2 system fra GE/Lunar Medical Systems, Madison, WI. Et 25 mm<2 >område av interesse (ROI) ble plassert for å inkludere den proksimale leddoverflaten, epifysen, og den proksimale enden på metafysen av tibiaet. Et område av interesse (ROI) ble plassert for å inkludere lumbalryggvirvelen (L1-L5). De proksimale tibia og lumbale områdene ble analysert for å bestemme total beinmineraltetthet. Gruppegjennomsnitt ble rapportert ± standardavvik og sammenliknet med vehikkelbehandlingsgruppen for statistisk analyse.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med en Dunnetts og Tukey-Kramer (ved å benytte MS Excel og JMP v.5.0. for BMD dataene). Gruppegjennomsnitt for hvert datasett ble antatt signifikant forskjellig når P verdien var mindre enn 0,05 (P < 0,05).
Sklerostinnøytraliserende aktivitet av antistoffer
De statistisk signifikante økningene i BMD sammenliknet med vehikkel sett for hver av Ab-A (figur 5), Ab-B (figur 5), Ab-C (figur 6) og Ab-D (figur 7) demonstrerer at disse fire antistoffene er sklerostinnøytraliserende antistoffer. Videre viser disse dataene at for sklerostinantistoffer som binder musesklerostin kan behandling og analyse av mus som beskrevet over bli benyttet for å identifisere sklerostinnøytraliserende antistoffer.
EKSEMPEL 6
SCREENINGSANALYSE FOR ANTISTOFFER SOM BLOKKERER BINDING
AV ET ANTISTOFF TIL HUMANT SKLEROSTIN
Humant sklerostin ble koblet til en CM5 Biacore chip ved å benytte standard aminkoblingskjemi for å generere en sklerostinbelagt overflate.300 resonansenheter av sklerostin ble koblet til overflaten.
Antistoffene som skulle bli testet ble fortynnet til en konsentrasjon på 200 µg/ml i HBS-EP buffer (som er 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % (v/v) surfaktant P20) og så blandet i et en til en molart forhold (på en bindingssetebasis) for å generere testblandingen. Denne testblandingen inneholdt derfor hvert antistoff ved en konsentrasjon på 100 µg/ml (1,3 µm på en bindingssetebasis). Separate løsninger som inneholdt hvert av antistoffene i testblandingen alene ble også fremstilt. Disse løsningene inneholdt de individuelle antistoffene i HBS-EP buffer ved en konsentrasjon på 100 µg/ml (1,3 µm på en bindingssetebasis).
20 µl av testblandingen ble sendt over den sklerostinbelagte chipen med en strømningshastighet på 10 µl/min. og mengden binding ble registrert. Chipen ble så behandlet med to 60 sekunders pulser på 30 mM HCl for å fjerne alt av det bundne antistoffet. En løsning som inneholdt kun ett av antistoffene av testblandingen (ved 1,3 µM i den sammen bufferen som testblandingen på en bindingssetebasis) ble så sendt over chipen på den samme måten som testblandingen og mengden av binding ble registrert. Chipen ble igjen behandlet for å fjerne alt av det bundne antistoffet og endelig ble en løsning som inneholdt det andre antistoffet fra testblandingen alene (ved 1,3 µM i den samme bufferen som testblandingen på en bindingssetebasis) sendt over chipen og mengden av binding registrert.
Tabellen under viser resultatene fra kryssblokkeringsanalysene på et utvalg av ulike antistoffer. Verdiene i hvert kvadrat i tabellen representerer mengden av binding (i RU) sett når antistoffene (ved 1,3 µM på et bindingssetebasis) eller buffer indikert i toppraden av tabellen ble blandet med antistoffene (ved 1,3 µM på en bindingssetebasis) eller buffer indikert i den første kolonnen i tabellen.
Ved å benytte gjennomsnittsbindingsverdien (i RU) for hver kombinasjon av antistoffer i den ovenfor nevnte tabell (siden hver kombinasjon forekommer to ganger) er det mulig å beregne prosenten av den teoretiske binding vist ved hver kombinasjon av antistoffer. Den teoretiske binding ble beregnet som summen av gjennomsnittverdiene for komponentene i hver testblanding når de er analysert alene (det vil si antistoff og buffer).
Fra de ovenfor nevnte data er det klart at Ab-4, Ab-A og Ab-19 kryssblokkerer hverandre. På liknende mate kryssblokkerer Ab-13 og Ab-3 hverandre.
EKSEMPEL 7
ELISA-BASERT KRYSSBLOKKERINGSANALYSE
Væskevolumer benyttet i dette eksempelet vil være de typisk benyttet i 96-brønners plate ELISA'er (for eksempel 50-200 µl/brønn). Ab-X og Ab-Y, i dette eksempelet er antatt å ha molekylære vekter på omtrent 145 Kd og å ha 2 sklerostinbindingsseter per antistoffmolekyl. Et anti-sklerostinantistoff (Ab-X) er belagt (for eksempel 50 µg/ av 1 µg/ml) over i en 96-brønners ELISA plate [for eksempel Corning 96 brønns EIA/RIA Flat Bottom Microplate (produkt # 3590), Corning Inc., Acton, MA] i minst en time. Etter dette belegningstrinnet er antistoffløsningen fjernet, platen er vasket en eller to ganger med vaskeløsning (for eksempel PBS og 0,05 % Tween 20) og er så blokkert ved å benytte en passende blokkeringsløsning (for eksempel PBS, 1 % BSA, 1 % geiteserum og 0,5 % Tween 20) og fremgangsmåter kjent innen fagfeltet. Blokkeringsløsning blir så fjernet fra ELISA platen og et sekundært anti-sklerostinantistoff (Ab-Y), som blir testet for dets evne til å kryssblokkere det belagte antistoffet, er tilsatt i overskudd (for eksempel 50 µl av 10 mg/ml) i blokkeringsløsning til de passende brønnene i ELISA-platen. Etter dette blir en begrenset mengde (for eksempel 50 µl av 10 µg/ml) av sklerostin i blokkeringsløsning tilsatt til de passende brønnene og platen er inkubert i minst en time ved romtemperatur mens den ristes. Platen blir så vasket 2-4 ganger med vaskeløsning. En passende mengde av en sklerostindeteksjonsreagens [for eksempel biotinylert anti-sklerostinpolyklonalt antistoff som har blitt pre-kompleksert med en passende mengde av et streptavidin-pepperotperoksidase (HRP) konjugat] i blokkeringsløsning ble tilsatt til ELISA platen og inkubert i minste en time ved romtemperatur. Platen ble så vasket minst 4 ganger med vaskeløsning og fremkalt med en passende reagens [for eksempel HRP substratet slik som TMB (kolorimetrisk) eller ulike HRP luminescenssubstrater]. Bakgrunnssignalet for analysen er definert som signalet oppnådd i brønnene med det belagte antistoffet (i dette tilfellet Ab-X), andre løsningsfaseantistoff (i dette tilfellet Ab-Y), kun sklerostinbuffer (det vil si intet sklerostin) og sklerostindeteksjonsreagenser. Det positive kontrollsignalet for analysen er definert som signalet oppnådd i brønner med det belagte antistoff (i dette tilfellet Ab-X), kun den andre løsningsfaseantistoffbufferen (det vil si intet annet løsningsfaseantistoff), sklerostin og sklerostindeteksjonsreagenser. ELISA analysen trenger å bli kjørt på en slik måte at det positive kontrollsignalet skal være minst 6 ganger bakgrunnssignalet.
For å unngå noen som helst artefakter (for eksempel signifikant forskjellige affiniteter mellom Ab-X og Ab-Y for sklerostin) resulterende fra valget av hvilket antistoffet å benytte som belegningsantistoffet og hvilket som skal benyttes som det andre (konkurranse) antistoffet, trenger kryssblokkeringsanalysen å bli kjørt i to formater:
1) format 1 hvor Ab-X er antistoffet som er belagt over ELISA platen og Ab-Y er konkurranseantistoffet som er i løsning, og
2) format 2 er hvor Ab-Y er antistoffet som er belagt over ELISA platen og Ab-X er konkurranseantistoffet som er i løsning.
Ab-X og Ab-Y er definert som kryssblokkerende hvis, enten i format 1 eller i format 2, løsningsfaseanti-sklerostinantistoffet er i stand til å forårsake en reduksjon på mellom 60 % og 100 %, spesifikt mellom 70 % og 100 %, og mer spesifikt mellom 80 % og 100 %, av sklerostindeteksjonssignalet (det vil si mengden av sklerostin bundet av det belagte antistoffet) som sammenliknet med sklerostindeteksjonssignalet oppnådd i fraværet av løsningsfaseanti-sklerostinanstoffet (det vil si de positive kontrollbrønnene). I det tilfellet at en merket versjon av sklerostin er benyttet i ELISA'et, slik som et N-terminalt His-merket sklerostin (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA; 2005 kat# 1406-ST-025) vil en passende type sklerostindeteksjonsreagens inkludere et HRP merket anti-His antistoff. I tillegg til å benytte N-terminalt His-merket sklerostin, kan man også benytte C-terminalt His-merket sklerostin. Videre kan ulike andre merkelapper og merkelappbindende proteinkombinasjoner som er kjent innen fagfeltet også bli benyttet i denne ELISA-baserte kryssblokkeringsanalysen (for eksempel HA merkelapp med anti-HA antistoffer; FLAG merkelapp med anti-FLAG antistoffer; biotinmerkelapp med streptavidin).
EKSEMPEL 8
CELLEBASERT MINERALISERINGSANALYSE FOR Å IDENTIFISERE
MIDLER I STAND TIL Å ANTAGONISERE SKLEROSTINAKTIVITET
Introduksjon
Mineralisering ved osteoblastlinjeceller i kultur, enten primærceller eller cellelinjer, er benyttet som en in vitro modell for beindannelse. Mineralisering tar fra omtrent en til seks uker å skje og begynner med induksjonen av osteoblastlinjecelledifferensiering ved en eller flere differensieringsmidler. Det totale hendelsesforløpet involverer celleproliferasjon, differensiering, ekstracellulær matriksproduksjon, matriksmodning og endelig deponering av mineral, som refererer til krystallisering og/eller deponering av kalsiumfosfat. Denne sekvensen av hendelser som starter med celleproliferasjon og differensiering og ender med deponering av mineral er referert til heri som mineralisering. Måling av kalsium (mineral) er utbytett av analysen.
Deponering av mineral har en sterk biofysisk karakteristikk, ved at med en gang mineral "sår" begynner å skje vil den totale mengden av mineral som vil bli avsatt i hele kulturen noen ganger bli avsatt ganske raskt, slik som innen et par dager deretter.
Timingen og omfanget av mineralavsetning i kulturen er påvirket delvis ved den bestemte osteoblastlinjecellene/cellelinjen som blir benyttet, vekstbetingelsene, valget av differensieringsmidler og det bestemte serienummer av serum benyttet i cellekulturmediumet. For osteoblastlinjecelle/cellelinjemineraliseringskulturer bør minst åtte til femten serumserier fra en eller flere leverandører bli testet for å identifisere en bestemt serumserie som tillater mineralisering å finne sted.
MC3T3-E1 celler (Sudo H et al., In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol.96:191-198) og subkloner av den opprinnelige cellelinjen kan danne mineral i kultur ved vekst i nærværet av differensieringsmidler. Slike subkloner inkluderer MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B.2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J Biol Chem 275:19992-20001).
Identifikasjon av sklerostinnøytraliserende antistoffer
MC3T3-E1-BF celler ble benyttet for mineraliseringsanalysen. Askorbinsyre og B-glycerofosfat ble benyttet for å indusere MC3T3-E1-BF celledifferensiering noe som fører til mineralavsetning. Den spesifikke screeningsprotokollen i 96-brønners format involverte å så ut celler på en onsdag, etterfulgt av syv mediumbytter (som beskrevet videre nedenfor) i løpet av en 12 dagers periode der mesteparten av mineralavsetningen fant sted i de endelige omtrentlige atten timer (for eksempel søndag natt til gjennom mandag). For en hvilken som helst gitt behandling ble 3 brønner benyttet (N=3). Den spesifikke timingen og omfanget av mineralavsetning kan variere avhengig delvis av det bestemte serumserienummeret som ble benyttet. Kontrolleksperimenter vil tillate slike variabler å bli tatt hensyn til da det er velkjent innen fagfeltet av cellekultureksperimentering generelt.
I dette analysesystemet inhiberte sklerostin en eller flere av hendelsessekvensene som fører opp til og inkluderer mineralavsetning (det vil si sklerostininhibert mineralisering).
Anti-sklerostinantistoffer som var i stand til å nøytralisere sklerostins inhibitoriske aktivitet tillatte mineralisering av kulturen i nærværet av sklerostin slik at det var en statistisk signifikant økning i avsetningen av kalsiumfosfat (målt som kalsium) sammenliknet med mengden av kalsium målt i kun sklerostin (det vil intet antistoff) behandlingsgruppen. For statistisk analyse (ved å benytte MS Excel og JMP) ble en 1-veis-ANOVA fulgt av Dunnetts sammenlikning benyttet for å bestemme forskjeller mellom gruppene. Gruppegjennomsnitt for hvert datasett ble ansett som signifikant forskjellig når P verdien var mindre enn 0,05 (P < 0,05). Et representativt resultat fra gjennomkjøringen av denne analysen er vist i figur 22. I fraværet av rekombinant musesklerostin fortsetter hendelsesforløpet som fører opp til å inkludere mineralavsetning normalt. Kalsiumnivåer i hver behandlingsgruppe er vist som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). I dette eksperimentet som fungerer som eksempel var kalsiumnivåene fra kalsiumanalysen ~ 31 µg/ml. Imidlertid forårsaket tilsetning av rekombinant musesklerostin inhibering av mineralisering, og kalsium ble redusert ved ~ 85 %. Tilsetning av anti-sklerostinmonoklonalt antistoff Ab-19 eller Ab-4 sammen med det rekombinante sklerostinet resulterte i en statistisk signifikant økning i mineralavsetning sammenliknet med sklerostin-kun gruppen, fordi den inhibitoriske aktiviteten av sklerostin ble nøytralisert av begge antistoffene. Resultatene fra dette eksperimentet indikerer at Ab-19 og Ab-4 er sklerostinnøytraliserende monoklonale antistoffer (Mabs).
Figur 23 viser et veldig likt resultat ved å benytte rekombinant humant sklerostin og to humaniserte anti-sklerostin Mabs. Figur 24 viser også et veldig likt resultat ved å benytte rekombinant humant sklerostin og muse og humanisert anti-sklerostin Mabs som indikert.
Antistoffene benyttet for eksperimentene vist i figur 22, 23 og 24 har molekylære vekter på omtrent 145 Kd og har 2 sklerostinbindingsseter per antistoffmolekyl.
En detaljert MC3T3-E1-BF cellekulturprotokoll er beskrevet nedenfor.
Reagenser og medier
Reagenser Firma Katalog #
α-MEM Gibco-Invitrogen 12571-048 Askorbinsyre Sigma A4544
β-glycerofosfat Sigma G6376
100X PenStrepGlutamin Gibco-Invitrogen 10378-016 Dimetylsulfoksid (DMSO) Sigma D5879 eller D2650 Føtalt bovinserum (FBS) Cansera CS-C08-500 (lot# SF50310) eller føtalt bovinserum (FBS) TerraCell Int. CS-C08-1000A (lot # SF-20308)
α-MEM er vanligvis fremstilt med en 1 års utløpsdato. α-MEM som ikke var eldre enn 6 måneder før fremstillingsdatoen ble benyttet for cellekulturen.
Ekspansjonsmedium ( α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu) ble fremstilt som følger:
En 500 ml flaske av FBS ble tint og sterilfiltrert gjennom et 0,22 mikronfilter.100 ml av denne FBS ble tilsatt til 1 liter av α-MEM etterfulgt av tilsetningen av 10 ml av 100 x PenStrepGlutamin. Benyttet FBS ble alikvotert og refryst for senere bruk.
Differensieringsmedium ( α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu, 50 µg/ml askorbinsyre, 10 mM β-glycerofosfat) ble fremstilt som følger:
100 ml differensieringsmedium ble fremstilt ved å supplementere 100 ml ekspansjonsmedium med askorbinsyre og β-glycerofosfat som følger:
Forrådskons. Volum Endelig konsentrasjon
(se under)
Askorbinsyre 10 mg/ml 0,5 ml 100 µg/ml (50 µg/ml 50 µg/ml) β-glycerosfosfat 1 M 0,1,0 ml 10 mM
Differensieringsmedium ble laget ved å supplementere ekspansjonsmedium kun på dagen da differensieringsmediet var tenkt å bli benyttet for celledyrkning. Den endelige konsentrasjon av askorbinsyre i differensieringsmedium er 100 µg/ml fordi α-MEM allerede inneholder 50 µg/ml askorbinsyre. Askorbinsyreforrådsløsning (10 mg/ml) ble lagd og alikvotert for frysing ved -80 ºC. Hver alikvot ble kun benyttet en gang (det vil si ikke refryst). β-glycerofosfatforrådsløsning (1 M) ble lagd og alikvotert for frysing ved -20 ºC. Hver alikvot ble fryst og tint maks 5 ganger før den ble kastet.
Celledyrkning for ekspansjon av MC3T3-E1-BF celler
Celledyrkning ble utført ved 37 ºC og 5 % CO2. En cellebank ble etablert for formålet å screene for sklerostinnøytraliserende antistoffer. Cellebanken ble lagd som følger:
En flaske av frosne MC3T3-E1-BF celler ble tint ved røring i et 37 ºC vannbad. De tinte cellene ble puttet over i 10 ml ekspansjonsmedium ( α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu) i et 50 ml rør og forsiktig spunnet ned i 5 minutter. Cellene ble så resuspendert i 5 ml α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu. Etter at antall celler var bestemt ved å benytte trypan blå og hemacytometer, ble 1 x 10<6 >celler sådd ut i 50 ml α-MEM/10 %FBS/PenStrep-Glu medium i en T175 flaske.
Når denne passasjen var konfluent (ved ca.7 dager) ble cellene trypsinert med trypsin/EDTA (0,05 % trypsin; 0,53 mM EDTA), forsiktig spunnet ned i 5 minutter og så resuspendert i 5 ml α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu. Etter at antall celler var bestemt ved å benytte trypan blå og hemacytometer ble cellene sådd ut ved 1 x 10<6 >celler i 50 ml α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu medium per en T175 flaske. Antallet av T175 flasker benyttet for utsåing ved dette punktet var avhengig av det totale celleantall tilgjengelig og det ønskede antall av flakser som skulle bli tatt videre til neste passasje. Ekstra celler ble fryst ned ved 1-2 x 10<6 >levende celler/ml i 90 % FBS/10 % DMSO.
Når denne passasjen var konfluent (omtrent 3-4 dager) ble cellene trypsinert med trypsin/EDTA (0,05 % trypsin; 0,53 mM EDTA), forsiktig spunnet ned i 5 minutter og så resuspendert i 5 ml α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu. Etter at antall celler var bestemt ved å benytte trypan blå og hemacytometer ble 1 x 10<6 >celler sådd ut i 50 ml α-MEM/ 10 % FBS/PenStrepGlu medium per en T175 flaske. Antallet T175 flasker benyttet for utsåing ved dette punktet var avhengig av det totale celleantall tilgjengelig og det ønskede antall av flasker som skulle bli tatt videre til neste passasje. Ekstra celler ble fryst ned ved 1-2 x 10<6 >levende celler/ml i 90 % FBS/10 % DMSO.
Når denne passasjen var konfluent (omtrent 3-4 dager) ble cellene trypsinert med trypsin/EDTA (0,05 % trypsin; 0,53 mM EDTA) forsiktig spunnet ned i 5 minutter og så resuspendert i 5 ml α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu. Etter at antallet celler var bestemt ved å benytte trypan blå og hemacytometer ble cellene fryst ned ved 1-2 x 10<6 >levende celler/ml i 90 % FBS/10 % DMSO. Denne "endelige passasjen" av frosne celler var passasjen som ble benyttet for screeningsanalysen.
Celledyrkning for mineralisering av MC3T3-E1-BF celler
Celledyrkning ble utført ved 37 ºC og 5 % CO2. Det er ønskelig å minimalisere temperaturen og 5 CO2 svingninger under mineraliseringscelledyrkningsprosedyren. Dette kan bli oppnådd ved å minimalisere tiden som platene tilbringer på utsiden av inkubatoren under matning og også ved å minimalisere antall ganger inkubatordøren åpnes og stenges under mineraliseringscelledyrkningsfremgangsmåten. I dette henseende kan det være nyttig å ha en vevsdyrkningsinkubator som er dedikert kun for mineraliseringscelledyrkningen (og således ikke åpnet og lukket mer enn nødvendig).
Et passende antall av "endelige passasje" flasker fremstilt som beskrevet over ble tint ved røring i et 37 ºC vannbad. De tinte cellene ble puttet over i 10 ml ekspansjonsmedium ( α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu) i et 50 ml rør og forsiktig spunnet ned i 5 minutter. Cellene ble så resuspendert i 4 ml α-MEM/10 % FBS/PenStrepGlu. Etter at antall celler var bestemt ved å benytte trypan blå og hemacytometer ble 2500 celler sådd ut i 200 mikroliter ekspansjonsmedium per brønn og kollagen i belagte 96-brønners plater (Becton Dickinson Labware, kat # 354407).
For å unngå en mineraliseringsplate-kanteffekt ble cellene ikke sådd ut i den ytterste rad/kolonne hele veien rundt platen. I stedet ble 200 mikroliter PBS tilsatt til disse brønnene.
Eksempel på celledyrkningsfremgangsmåte
I den følgende fremgangsmåten er startdatoen for utsåing av cellene indikert å være en onsdag. Hvis en ulik ukedag er benyttet som startdatoen for utsåing av cellene vil den dagen utløse det daglige skjemaet for å fjerne og tilsette medium under hele prosessen som indikert under. For eksempel hvis cellene er sådd ut en tirsdag bør medium ikke bli fjernet og tilsatt på den første fredagen og lørdagen, heller ikke på den andre fredagen og lørdagen. Med en tirsdag som start vil platene bli fremstilt for kalsiumanalyse på den endelige søndagen.
Celler ble sådd ut på en onsdag ved 2500 celler i 200 µl ekspansjonsmedium.
På torsdag ble alt ekspansjonsmedium fjernet og 200 ml differensieringsmedium ble tilsatt.
På fredag ble 100 µl medium fjernet og 100 µl frisk differensieringsmedium ble tilsatt. På mandag ble 100 µl medium fjernet og 100 µl friskt differensieringsmedium ble tilsatt.
På tirsdag ble 100 µl medium fjernet og 100 µl friskt differensieringsmedium ble tilsatt. På onsdag ble 100 µl medium fjernet og 100 µl friskt differensieringsmedium ble tilsatt. På torsdag ble 100 µl medium fjernet og 100 µl friskt differensieringsmedium ble tilsatt. På fredag ble 100 µl medium fjernet og 100 µl friskt differensieringsmedium ble tilsatt. På den følgende mandag ble platene fremstilt for kalsiumanalyse som følger:
Platene ble vasket en gang med 10 mM Tris, HCl pH 7-8.
200 µl 0,5 N HCl ble tilsatt per brønn når man jobbet under en avtrykkshette.
Platene ble så fryst ved -80 ºC.
Rett før man skulle måle kalsium ble platene fryst-tint to ganger og så ble triturering med en multikanalpipette benyttet for å spre ut innholdene av platen. Innholdene av platen ble så tillatt å sette ved 4 ºC i 30 minutter, ved hvilket punkt en passende mengde av supernatant ble fjernet for å måle kalsium ved å benytte et kommersielt tilgjengelig kalsiumsett. Et eksempel og ikke-begrensende sett er kalsium (CPC) Liquicolor, kat. nr.
0150-250, Stanbio Laboratory, Boerne, TX.
I denne cellebaserte analyse inhiberer sklerostin en eller flere av hendelsessekvensene som fører opp til å inkludere mineralavsetning (det vil si sklerostin inhiberer mineralisering). Derfor, i eksperimentene hvor sklerostin ble inkludert i det bestemte celledyrkningseksperimentet, ble rekombinant sklerostin tilsatt til medium på den første torsdagen og hver tilsetningsdag deretter. I tilfeller hvor et anti-sklerostin monoklonalt antistoff (Mab) ble testet for evnen til å nøytralisere sklerostin, det vil si tillate for mineralisering ved å nøytralisere sklerostins evne til å inhibere mineralisering, ble Mab tilsatt til mediet på den første torsdagen og hver foringsdag deretter. Ifølge protokollen ble dette utført som følger: Mab ble preinkubert med det rekombinante sklerostin i differensieringsmedium i 45-60 minutter ved 37 ºC og så ble dette mediet benyttet for foring av cellene.
Beskrevet over er en 12 dagers mineraliseringsprotokoll for MC3T3-E1-BF celler. Ved å benytte de samme reagensene og foringsprotokoll brukte de opprinnelige MC3T3-E1 celler (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S.1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96:191-198) som ble skaffet fra RIKEN Cell Bank (RCB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0074 Japan) lenger tid å mineralisere (20 dager totalt for mineralisering) enn MC3T3-E1-BF cellene. Mineralisering av de opprinnelige MC3T3-E1 cellene var inhibert med rekombinant sklerostin og denne inhiberingen ble blokkert ved å benytte et sklerostinnøytraliserende antistoff.
EKSEMPEL 9
ANTI-SKLEROSTINANTISTOFF BESKYTTER FRA
BETENNELSESINDUSERT BEINTAP I CD4
CD45RB<HI >OVERFØRINGSMODELL AV KOLITT I SCID MUS
Sammendrag av modell
Injeksjon av CD45RB<høy >delmengden av CD4+ T celler over i C.B-17 scid mus resulterer i kronisk trambetennelse med karakteristika lik til de av human betennelsestarmsykdom (IBD). Diaré og "wasting" sykdom er bemerket 3-5 uker etter celleoverføring med alvorlig leukocyttinfiltrering inn i tykktarmen fulgt av epitelialcellehyperplasi og granulomadannelse. C.B-17 scid mus som mottok den motsvarende delmengden av CD4+ cellene, de som uttrykker CD45RB<lav>, som ikke fremviser kolitt og har en vektgevinst uskillbar fra uinjiserte scid mus. I tillegg til kolittsymptomer er CD4+ CD45RB<høy >T-celle overføringsmodellen av kolitt forbundet med en reduksjon i beinmineraltetthet (BMD), antatt å være primær gjennom betennelsesmekanismer i stedet for diettfeilernæring (Byrne, F.R. et al., Gut 54:78-86, 2005).
Induksjon av kolitt og betennelsesindusert beintap
Milter ble tatt fra hunn balb/c mus og ødelagt gjennom en 70 µm cellefil. CD4+ populasjonen ble så beriket ved negativ seleksjon med Dynabeads ved å benytte antistoffer mot B220, MAC-1, CD8 og I-A<d>. Den berikede populasjon ble så farget med FITC konjugert anti-CD4 og PE konjugert anti-CD45RB og fraksjonert over i CD4+CD45RB<høy >og CD4+CD45RB<lav >populasjoner ved to-fargesortering på en Moflo (Dakocytomation). CD45RB<høy >og CD45RB<lav >populasjoner ble definert som den klarest fargede 40 % og den dårligst fargede 20 % av CD4+ cellene henholdsvis. 5 x 10<5 >celler ble så injisert i.p. inn i C.B-17 scid mus på dag 0 og uviklingen av kolitt ble monitorert gjennom tilsynekomsten av bløt avføring eller diaré og vekttap. Beinmineraltetthetsmålinger ble tatt ved slutten av studien (dag 88).
Effekt av anti-sklerostinbehandling på kolittsymptomer og BMD
Ab-A IgG ble dosert ved 10 mg/kg s.c. fra dagen før CD4+CD45RB<høy >celleoverføring og sammenliknet med mus som mottok det negative kontrollantistoffet 101.4 også dosert ved 10 mg/kg s.c. Antistoffene ble dosert ukentlig deretter. En gruppe mus som mottok ikke-patogeniske CD4+CD45RB<lav >celler og ble dosert med 10 mg/kg 101.4 ble studert som en kontroll. Ved slutten av studien (dag 88) ble beinmineraltettheten målt og seksjoner av tarmen tatt for analyse av celleinfiltrasjon og bedømmelse av histologisk skade.
a) Ingen effekt på kolittsymptomer
Typiske kolittsymptomer slik som vekttap og infiltrasjon av betennelsesceller inn i tykktarmen var upåvirket av behandlingen med Ab-A. På liknende måte var det ingen forbedring i histologisk skade til tykktarmen etter behandling med Ab-A.
b) Inhibering av betennelsesindusert tap av beinmineraltetthet.
På dag 88 etter overføring av celler inn i C.B-17 scid mus, ble beinmineraltettheten målt (total BMD, ryggvirvel BMD og lårbein BMD). I sammenlikning med kontrollmus som mottok CD4+CD45RB<lav >ikke-patogene celler hadde mus som mottok CD4+ CD45RB<høy >T-celler og det negative kontrollantistoffet 101.4 redusert beinmineraltetthet, som vist i figur 25. I motsetning ble ingen reduksjon i BMD bemerket etter behandling med Ab-A. Totalt, ryggvirvel og lårbeinsmålinger av BMD var signifikant høyere i mus som mottok CD4+CD45RB<høy >T-celler og behandlet med Ab-A enn mus som mottok CD4+CD45RB<høy >T-celler og behandlet med 101.4 (P<0.001) ved Bonferronimultippelsammenlikningstest).
EKSEMPEL 10
KINEXA-BASERT BESTEMMELSE AV AFFINITET (KD) AV ANTI-
SKLEROSTINANTISTOFFER FOR HUMANT SKLEROSTIN
Affiniteten av flere anti-sklerostinantistoffer til humant sklerostin ble bedømt ved en løsningslikevektsbindingsanalyse ved å benytte KinExA<® >3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). For disse målingene ble Reacti-Gel 6x kuler (Pierce, Rockford, IL) prebelagt med 40 µg/ml humant sklerostin i 50 mM Na2CO3, pH 9,6 ved 4 ºC over natten. Kulene ble så blokkert med 1 mg/ml BSA i 1 M Tris-HCl, pH 7,5 ved 4 ºC i 2 timer. 10 pM, 30 pM eller 100 pM av antistoffet ble blandet med ulike konsentrasjoner av humant sklerostin, i konsentrasjonsområdet fra 0,1 pM til 1 pM og ekvilibrert ved romtemperatur i 8 timer i PBS med 0,1 mg/ml BSA og 0,005 % P20. Blandingene ble så sendt over de humansklerostinbelagte kulene. Mengden av kule-bundet anti-sklerostinantistoff ble kvantifisert ved å benytte fluorescent Cy5-merket geiteanti-mus-IgG eller fluorescent Cy5-merket geiteanti-human-IgG antistoffer (Jackson Immuno Research, West Grove, for muse- eller humane antistoffprøver, henholdsvis. Mengden av fluorescent signal målt var proporsjonalt til konsentrasjonen av fritt anti-sklerostinantistoff i hver reaksjonsblanding ved likevekt. Dissosiasjonslikevektskonstanten (KD) ble oppnådd fra ikke-lineær regresjon av konkurransekurvene ved å benytte en n-kurve en-sete homogen bindingsmodell gitt i KinExA Pro-softwaret. Resultater av KinExA analysene for de valgte antistoffene er oppsummert i tabellen under.
EKSEMPEL 11
BIACOREFREMGANGSMÅTE FOR Å BESTEMME AFFINITETEN AV
HUMANISERTE ANTI-SKLEROSTINANTISTOFFER FOR HUMANT
SKLEROSTIN
Biacoreteknologien monitorerer bindingen mellom biomolekyler i sanntid og uten kravet for merking. En av interaktantene, betegnet liganden, er enten immobilisert direkte eller fanget på den immobiliserte overflaten mens den andre, betegnet analytten, strømmer i løsning over den fangede overflate. Sensoren detekterer forandring i masse på sensoroverflaten ettersom analytten binder til liganden for å danne et kompleks på overflaten. Dette korresponderer til assosiasjonsprosessen. Dissosiasjonsprosessen er monitorert når analytten er erstattet av buffer. I affinitets BIAcore analysen er liganden anti-sklerostinantistoffet og analytten er sklerostin.
Instrument
Biacore ® 3000, Biacore AB, Uppsala, Sverige.
Sensorchip
CM5 (forskningsgrad) katalognummer: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Sverige. Chipene ble lagret ved 4 ºC.
BIA normaliseringsløsning
80 % (vekt/vekt) glycerol. Del av BIA vedlikeholdssettkatalognummer: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Sverige. BIA vedlikeholdssettet ble lagret ved 4 ºC.
Aminkoblingssett
Katalognummer: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Sverige.
Etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (EDC). Lagd opp til 75 mg/ml i destillert vann og lagret i 200 µl alikvoter ved -70 ºC.
N-hydroksysuksinimid (NHS). Lagd opp til 11,5 mg/ml i destillert vann og lagret i 200 µl alikvoter ved -70 ºC.
1 M etanolaminhydroklorid-NaOH pH 8,5. Lagret i 200 µl alikvoter ved -70 ºC.
Bufre
Kjørende buffer for immobilisert fanget antistoff: HBS-EP (som er 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % surfaktant P20). Katalognummer: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Sverige. Buffer lagret ved 4 ºC.
Immobiliseringsbuffer: acetat 5,0 (som er 10 mM natriumacetat pH 5,0). Katalognummer: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Sverige. Buffer lagret ved 4 ºC.
Kjørende buffer for bindingsanalyse: HBS-EP (som er 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % surfaktant P20, katalognummer: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Sverige) med CM-dekstran tilsatt ved 1 mg/ml (katalognummer 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Sveits). Buffer lagret ved 4<0>C.
Liganderobring
Affinipur F(ab')2 fragment geiteanti-humant IgG, Fc fragmentspesifikk. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, USA) katalognummer:109-006-098. Reagens lagret ved 4 ºC.
Ligand
Humanisert anti-humane sklerostinantistoffer Ab5, Ab14 og Ab20.
Analytt
Rekombinant humant sklerostin. Alikvoter lagret ved -70 ºC og tint en gang per analyse.
Regenereringsløsning
40 mM HCl fremstilt ved fortynning med destillert vann fra en 11,6 M forrådsløsning (BDH, Poole, England. Katalognummer: 101254H).
5 mM NaOH fremstilt ved fortynning med destillert vann fra en 50 mM forrådsløsning. Katalognummer: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Sverige.
Analysefremgangsmåte
Analyseformatet ble fanget av anti-sklerostinantistoff av immobilisert anti-humant IgG-Fc og så titrerer sklerostinet over den fangede overflate. Et eksempel på fremgangsmåten er gitt under:
BIA (biamolekylær interaksjonsanalyse) ble utført ved å benytte en BIAcore 3000 (BIAcore AB). Affinipur F(ab')2 fragment geiteanti-humant IgG, Fc fragmentspesifikk (Jackson Immunoresearch) ble immobilisert på en CM5 sensorchip via aminkoblingskjemi til et fangenivå på ≈ 4000 responsenheter (RU'er). HBS-EP buffer (10 mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % surfaktant P20, BIAcore AB) inneholdende 1 mg/ml CM-dekstran ble benyttet som kjørende buffer med en strømningshastighet på 10 µl/min. En 10 µl injeksjon av anti-sklerostinantistoffet ved ~ 5 µg/ml ble benyttet for fanging av det immbobiliserte anti-humane IgG-Fc.
Antistoffangenivåer var typisk 100-200 RU. Sklerostin ble titrert over det fangede antisklerostinantistoffet ved ulike konsentrasjoner ved en strømningshastighet på 30 µl/min. Overflaten ble regenerert ved to 10 µl injeksjoner av 40 mM HCl, etterfulgt av en 5 µl injeksjon av 5 mM NaOH ved en strømningshastighet på 10 µl/min.
Bakgrunnssubtraksjonsbindingskurver ble analysert ved å benytte BIA evalueringssoftware (versjon 3.2) og ved å følge standardfremgangsmåter. Kinetikkparametre ble bestemt fra den tilpassende algoritmen.
Kinetikkdataene og beregnede dissosiasjonskonstanter er gitt i tabell 2.
TABELL 2: Affinitet av anti-sklerostinantistoffer for sklerostin
EKSEMPEL 12
IN VIVO TESTING AV ANTI-SKLEROSTINMONOKLONALE ANTISTOFFER
I CYNOMOLGE APER
33, ca.3-5 år gamle hunncynomolge aper (Macaca fascicularis) ble benyttet i denne 2-måneders studien. Studien inneholdt 11 grupper:
Gruppe 1: Ab-23 (N=2, dose 3 mg/kg)
Gruppe 2: Ab-23 (N=2, dose 3 mg/kg)
Gruppe 3: Ab-23 (N=3, dose 10 mg/kg)
Gruppe 4: Ab-23 (N=3, dose 30 mg/kg)
Gruppe 5: Ab-5 (N=3, dose 3 mg/kg)
Gruppe 6: Ab-5 (N=3, dose 10 mg/kg)
Gruppe 7: Ab-5 (N=3, dose 30 mg/kg)
Gruppe 8: Ab- 14 (N=3, dose 3 mg/kg)
Gruppe 9: Ab-14 (N=3, dose 10 mg/kg)
Gruppe 10: Ab-14 (N=3, dose 30 mg/kg)
Gruppe 11: Paratyroidhormon (1-34) [PTH (1-34)] (N=3, dose 10 ug/kg)
Alle dosering var subkutan. PTH (1-34) ble dosert hver dag, monoklonale antistoffer (Mab'er) ble dosert to ganger (første dose ved begynnelsen av studien og andre dose ved en måneds tidspunktet). For bedømmelse av beinparametre (for eksempel beinmineraltetthet) ble pQCT (perifer kvantitativ beregnet tomografi) og DXA (dobbelt energi røntgenstråleabsorbtiometri) scan gjennomført før begynnelsen av studien (for å oppnå grunnlinjeverdier) og etter en måned (før den andre dosen av Mab) og endelig ved slutten av studien (2 måneders tidspunkt) ved hvilket punkt apene ble obdusert for videre analyse (for eksempel histomorfometrisk analyse). Dyr ble fluorkrommerket (dagene 14, 24, 47 og 57) for dynamisk histomorfometri. Serum ble samlet ved ulike tidspunkter i løpet av studien [dag 1 pre-dose (dagen før den første Mab dosen), dag 1 tolv timer etter-dose, dag 2, dag 3, dag 5, dag 7, dag 14, dag 21, dag 28, dag 29 tolv timer post-dose (dag 29 var dagen for den andre og endelige Mab dosen), dag 30, dag 31, dag 33, dag 35, dag 42, dag 49 og dag 56].
Tre beinrelaterte serumbiomarkører ble målt ved å benytte kommersielt tilgjengelige sett:
Osteokalsin (OC) (DSL osteokalsinradioimmunoanalysesett; Diagnostic Systems Laboratories, Inc.,Webster, TX, USA)
N-terminalt propeptid av type I prokollagen (P1NP) (P1NP radioimmunoanalysesett; Orion Diagnostica, Espoo, Finland).
C-telopeptidfragmenter av kollagen type I a1 kjeder (sCTXD (Serum CrossLaps<® >ELISA; Nordic Bioscience Diagnostics A/S, Herlev, Danmark).
pQCT og DXA scan resulterte i data på ulike beinparametre (inkludert beinmineraltetthet (BMD) og beinmineralinnhold) over tallrike skjelettområder (inkludert tibial metafyse og diafyse, radial metafyse og diafyse, lårhalsbein, lumbal ryggvirvel).
Analyse av disse beindata (prosent forandring fra grunnlinje for hvert dyr) og de anabole (OC, P1NP) serumbiomarkørdata (prosent forandring fra grunnlinje for hvert dyr) avslørte statistisk signifikante økninger, versus vehikkelgruppen, i noen parametere ved noen av tidspunktene og dosene for hver Mab. Disse beinparameterdata, serumbiomarkørdata, likeså som histomorfometriske data, indikerte at hver av de 3 Mab'er (Ab-23, Ab-5 og Ab-14) var i stand til å nøytralisere sklerostin i cynomolge aper. Denne aktivitet var mer robust for Ab-23 og Ab-5, spesielt ved den høyeste dose (30 mg/kg), med en klar økning i beindannelse (anabol effekt) likeså som nettogevinst i bein (for eksempel BMD). Statistisk signifikante økninger i beinparametre og anabole histomorfometriske parametre ble også funnet for den positive kontrollgruppen (PTH (1-34)).
Serumbeindannelsesmarkører (P1NP, osteokalsin) ble økt (p<0,05) versus vehikkel (VEH) ved forskjellige tidspunkter og doser, men spesielt i 30 mg/kg gruppene for Ab-23 og Ab-5. Histomorfometrisk analyse avdekker dramatiske økninger (p<0,05 versus VEH) i beindannelseshastigheter i porøse bein ved lumbal ryggvirvel og proksimal tibia (opp til 5 gangers økning), likeså som ved endokortikaloverflaten av lårbeinmidtskaftet (opp til 10 gangers økning) ved de høyeste dosene av Ab-23 og Ab-5. Trabekulær tykkelse var økt med høy dose Ab-23 og Ab-5 i lumbal ryggvirvel (> 60 %, p<0,05 versus VEH). Ved studiets slutt (2 måneder) var areal BMD, som prosent forandring fra grunnlinje økt (p<0,05 versus VEH) ved lårbeinshalsen, ultradistal radius (Ab-23, 30 mg/kg) og lumbal ryggvirvel (Ab-5, 30 mg/kg). Økningene i areal BMD ved lumbal ryggvirvel var forbundet med økninger i vertebral styrke (97 % økning i vertebral maksimal last for Ab-23, 30 mg/kg; p<0,05 versus VEH); grunnlinjeverdier for lumbal areal BMD før Mab dosering var statistisk lik over alle gruppene. I sammendrag, resulterte kortidsadministrasjon av sklerostinnøytraliserende Mab'er i cynomolge aper delvis i økning i beindannelse, BMD og vertebral beinstyrke.

Claims (14)

Patentkrav
1.
Monoklonalt antistoff som binder seg til human sklerostin i SEQ ID NO: 1 med en dissosiasjonskonstant på mindre enn eller lik 1 x 10<-9 >M, bestemt av overflateplasmonresonans og øker minst én av bendannelse, benmineraltetthet, benmineralinnhold, benmasse, benkvalitet og benstyrke hos et pattedyr; og
a) omfatter CDR-L1 av SEQ ID NO: 48, CDR-L2 av SEQ ID NO: 49, CDR-L3 av SEQ ID NO: 50, CDR-H1 av SEQ ID NO: 45, CDR-H2 av SEQ ID NO: 46 og CDR-H3 av SEQ ID NR: 47;
b) omfatter CDR-L1 av SEQ ID NO: 42, CDR-L2 av SEQ ID NO: 43, CDR-L3 av SEQ ID NO: 44, CDR-H1 av SEQ ID NO: 39, CDR-H2 av SEQ ID NO: 40, og CDR-H3 av SEQ ID NO: 41; eller
c) kryssblokkerer bindingen av nevnte antistoff til (a) eller (b) til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 eller er kryss-blokkert fra binding til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 av nevnte antistoff (a) eller (b), hvor kryssblokkering bestemmes av overflateplasmonresonans eller ELISA.
2.
Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, som binder seg til polypeptidene T20, T20.6, T21-22 og N22.7-23.5 og har minimal påviselig binding til polypeptidene T19.2, N14.6 og N18.6,
hvor polypeptid T20 har sekvenser DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR og PSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLT R;
hvor polypeptid T20.6 har sekvenser DVSEYSCREL HFTR, WWRPSGPPFR CIPDRYR, SAKPVTELVC SGQCGPAR og LVASCKCKRL TR;
hvor polypeptid T21-22 har sekvenser DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR og WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTR;
hvor polypeptid N22.7-23.5 har sekvensen DVSEYSCREL HFTRYVTDGP CRSAKPVTEL VCSGQCGPAR LLPNAIGRGK WWRPSGPDFR CIPDRYRAQR VQLLCPGGEA PRARKVRLVA SCKCKRLTRF HNQS;
hvor polypeptid T19.2 har sekvenser YVTDGP CR og VQLLCPGGEA PR;
hvor polypeptid N14.6 har sekvenser ENGGRPPHHPF, EIIPELGFYP EPPP og DFGTEAARPQ KGRKPRPRAR SAKANQA; og
hvor polypeptid N18.6 har sekvensen DATEIIPELG EYPEPPPELE NNKTMNRAEN GGRPPHHPFE TK.
3.
Monoklonalt antistoff ifølge krav 1 eller 2, som er et F(ab')2, Fab, Fab' eller Fv fragment.
4.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, som er et humanisert antistoff eller et humant antistoff.
5.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, som binder seg til human sklerostin i SEQ ID NO: 1 med dissosiasjonskonstant på mindre enn eller lik 1 x 10<-9 >M, bestemt av overflate-plasmonresonans
6.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, som binder seg til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 med en dissosiasjonskonstant på mindre enn eller lik 1 x 10<-10 >M, mindre enn eller lik 1 x 10<-11 >M, eller mindre enn eller lik 1 x 10<-12 >M.
7.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, som binder seg til humant sklerostin i SEQ ID NO: 1 med en affinitet som er minst 50, 100, 250, 500, 1000 eller 10000 ganger større enn affiniteten for hønseeggehvite lysozym.
8.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, hvori det kryssblokkerende antistoff binder seg til sklerostin i en Biacore-analyse slik at i nærvær av det kryssblokkerte antistoff er den registrerte bindingen fra 75% til 4% av den maksimale teoretiske binding av de to antistoffene i kombinasjon.
9.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, hvori det kryssblokkerende antistoffet i oppløsningsfasen i ELISA forårsaker en reduksjon på mellom 60% og 100% i mengden sklerostin bundet av antistoff belagt på ELISA-platen sammenlignet med mengden sklerostin bundet av det belagte antistoff i fravær av oppløsningsfaseantistoffet.
10.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, hvori antistoffet til (a) har lette kjeder med SEQ ID NO: 15 og tunge kjeder med SEQ ID NO: 19.
11.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10, hvori antistoffet til (b) har lette kjeder med SEQ ID NO: 7 og tunge kjeder med SEQ ID NO: 11.
12.
Monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11 for anvendelse ved behandling av osteoporose eller osteopeni.
13.
Monoklonalt antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 for anvendelse for å forbedre utfallet i ortopediske prosedyrer, tannbehandlinger, implantatkirurgi, leddbytte, bentransplantasjon, benkosmetisk kirurgi eller benreparasjon som bruddheling, ikke-organisert helbredelse, forsinket organisert helbredelse eller ansiktsrekonstruksjon.
14.
Farmasøytisk sammensetning omfattende et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, og en farmasøytisk eller fysiologisk akseptabel bærer, hjelpestoff eller fortynningsmiddel.
NO20201120A 2005-05-03 2006-04-28 Monoklonalt antistoff og farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff. NO346914B1 (no)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67758305P 2005-05-03 2005-05-03
US77684706P 2006-02-24 2006-02-24
US78224406P 2006-03-13 2006-03-13
US79264506P 2006-04-17 2006-04-17
US11/411,003 US7592429B2 (en) 2005-05-03 2006-04-25 Sclerostin-binding antibody
PCT/US2006/016441 WO2006119107A2 (en) 2005-05-03 2006-04-28 Sclerostin binding agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20201120A1 NO20201120A1 (no) 2008-01-30
NO346914B1 true NO346914B1 (no) 2023-02-27

Family

ID=36992590

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20201120A NO346914B1 (no) 2005-05-03 2006-04-28 Monoklonalt antistoff og farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff.
NO20076046A NO345294B1 (no) 2005-05-03 2007-11-23 Sklerostinbindingsantistoff, fremgangsmåte for fremstilling derav, farmasøytisk sammensetning og anvendelse derav
NO2021014C NO2021014I1 (no) 2005-05-03 2021-03-24 romosozumab
NO20230084A NO20230084A1 (no) 2005-05-03 2023-01-31 Bindingsvirkninger

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20076046A NO345294B1 (no) 2005-05-03 2007-11-23 Sklerostinbindingsantistoff, fremgangsmåte for fremstilling derav, farmasøytisk sammensetning og anvendelse derav
NO2021014C NO2021014I1 (no) 2005-05-03 2021-03-24 romosozumab
NO20230084A NO20230084A1 (no) 2005-05-03 2023-01-31 Bindingsvirkninger

Country Status (42)

Country Link
US (7) US7592429B2 (no)
EP (7) EP2325199B1 (no)
JP (4) JP5462484B2 (no)
KR (4) KR20130126752A (no)
CN (4) CN107446043A (no)
AR (1) AR053266A1 (no)
AU (2) AU2006242476B2 (no)
BR (2) BR122020023315B1 (no)
CA (2) CA2947080A1 (no)
CR (1) CR9524A (no)
CY (4) CY1114350T1 (no)
DK (3) DK3670528T3 (no)
EA (2) EA021539B1 (no)
ES (4) ES2902548T3 (no)
GE (2) GEP20125594B (no)
GT (1) GT200600186A (no)
HK (3) HK1151803A1 (no)
HR (3) HRP20211904T1 (no)
HU (3) HUE057097T2 (no)
IL (3) IL187106A (no)
LT (2) LT3670528T (no)
LU (1) LUC00151I2 (no)
MA (1) MA29528B1 (no)
ME (2) ME02247B (no)
MX (3) MX358705B (no)
MY (1) MY163480A (no)
NL (1) NL301034I2 (no)
NO (4) NO346914B1 (no)
NZ (2) NZ563539A (no)
PE (1) PE20070317A1 (no)
PH (1) PH12015501848A1 (no)
PL (3) PL2325199T3 (no)
PT (3) PT2325199E (no)
RS (3) RS62685B1 (no)
SG (1) SG10201403400UA (no)
SI (3) SI3670528T1 (no)
TN (1) TNSN07406A1 (no)
TW (5) TWI494320B (no)
UA (1) UA123695C2 (no)
UY (2) UY29514A1 (no)
WO (1) WO2006119107A2 (no)
ZA (1) ZA200709480B (no)

Families Citing this family (207)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69942782D1 (de) 1998-11-27 2010-10-28 Ucb Sa Zusammensetzungen und Verfahren zur Erhöhung der Knochenmineralisierung
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
AU2003221841A1 (en) 2002-04-03 2003-10-27 Celltech R And D, Inc. Association of polymorphisms in the sost gene region with bone mineral density
US7585501B2 (en) 2002-06-14 2009-09-08 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods for treating kidney disease
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
AU2003276430A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
NZ544618A (en) 2003-06-16 2009-02-28 Celltech R & D Inc Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
ITMI20050739A1 (it) * 2005-04-22 2006-10-23 Effebi Spa Piastrina di connsessione valvola-attuatore
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
ITTO20050905A1 (it) * 2005-12-23 2007-06-24 Univ Degli Studi Torino Leganti sintetici capaci di legare l'ocratossina e relativi usi
WO2008061013A2 (en) * 2006-11-10 2008-05-22 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
WO2008133722A2 (en) * 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
ES2666650T3 (es) 2006-12-29 2018-05-07 OstéoQC Inc. Métodos para alterar el crecimiento óseo mediante la administración de antagonista o agonista de sost o wise
MX2009010051A (es) 2007-03-20 2009-10-12 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-esclereostina.
EP2599791A1 (en) * 2007-04-27 2013-06-05 Genentech, Inc. Potent, stable and non-immunosuppressive anti-CD4 antibodies
US7977313B2 (en) * 2007-04-27 2011-07-12 Affinergy, Inc. Methods and compositions for promoting localization of pharmaceutically active agents to bone
CA2698103A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
US7981415B2 (en) * 2007-09-07 2011-07-19 Cisthera, Inc. Humanized PAI-1 antibodies
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
ES2750254T3 (es) * 2007-09-27 2020-03-25 Amgen Inc Formulaciones farmacéuticas
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
JP2011506483A (ja) * 2007-12-14 2011-03-03 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体を用いた骨折の治療方法
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
US9029508B2 (en) * 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20110016959A (ko) * 2008-06-03 2011-02-18 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
BRPI0913406A2 (pt) * 2008-06-03 2018-01-09 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
MX2010014574A (es) * 2008-07-08 2011-04-27 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable dual para prostaglandina e2 y usos de las mismas.
BRPI1008692B8 (pt) 2009-02-17 2021-05-25 Ucb Biopharma Sprl anticorpo antagonista tendo especificidade para ox40 humano, sequência de dna isolado, vetor de clonagem ou de expressão, célula hospedeira, processo para a produção do referido anticorpo, composição farmacêutica, uso do 5 referido anticorpo e proteína de fusão
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
US20110008766A1 (en) * 2009-05-01 2011-01-13 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US9775819B2 (en) * 2009-09-16 2017-10-03 R.P. Scherer Technologies, Llc Oral solid dosage form containing nanoparticles and process of formulating the same using fish gelatin
BR112012008833A2 (pt) * 2009-10-15 2015-09-08 Abbott Lab imunoglobulinas de dominio variavel duplo e usos das mesmas
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011127141A1 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Abbott Laboratories TNF-α BINDING PROTEINS
WO2011128424A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Novartis Ag Methods and compositions for improving implant osseointegration
AU2011250920B2 (en) * 2010-05-14 2015-05-21 Amgen Inc. High concentration antibody formulations
BR112012031121B1 (pt) 2010-06-07 2022-09-27 Amgen Inc Dispositivo de distribuição de drogas, kit e método de operar um dispositivo de distribuição de droga utilizável
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US9403882B2 (en) * 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
JP2013539364A (ja) 2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
EP2632951B1 (en) 2010-10-27 2017-08-02 Amgen Inc. Dkk1 antibodies and methods of use
WO2012061374A2 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
DE20187001T1 (de) 2010-11-05 2021-04-01 Novartis Ag Verfahren zur behandlung von psoriasus-arthritis mit il-17 antagonisten
CA2819356C (en) 2010-11-30 2023-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
ES2720136T3 (es) * 2010-12-22 2019-07-18 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anticuerpo modificado con semivida mejorada
EP2681242B1 (en) 2011-03-01 2018-01-24 Amgen Inc. Sclerostin and dkk-1 bispecific binding agents
PE20140437A1 (es) * 2011-03-25 2014-04-17 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos
WO2012135315A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Amgen Inc. Vial adapter and system
AU2012245495A1 (en) 2011-04-19 2013-11-07 Amgen Inc. Method for treating osteoporosis
AU2012245231B2 (en) 2011-04-20 2016-10-13 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
RS57279B1 (sr) 2011-04-25 2018-08-31 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-b7-h3 antitelo
US20140056912A1 (en) 2011-04-29 2014-02-27 Novartis Ag Methods of treating squamous cell carcinoma
HUE039786T2 (hu) 2011-08-04 2019-02-28 Amgen Inc Csonthiány-defektusok kezelési módszere
SI3045189T1 (en) 2011-10-14 2018-07-31 Amgen Inc. Injector and mode of composition
RU2014120981A (ru) * 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Иммунные связывающие агенты против склеростина
RU2014120755A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Иммуносвязующие агенты, направленные против tnf
MX2014004980A (es) 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes biespecificos dirigidos contra tnf e il-17.
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
EP2797953B1 (en) * 2011-12-28 2020-06-03 Amgen Inc. Method of treating alveolar bone loss through the use of anti-sclerostin antibodies
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
NZ631565A (en) 2012-03-14 2016-07-29 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
JP6770312B2 (ja) * 2012-07-05 2020-10-14 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 骨疾患の治療
JP6109952B2 (ja) 2012-11-01 2017-04-05 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ／ｄｌｌ４二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびこれらの使用
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US20150290390A1 (en) 2012-11-21 2015-10-15 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
TWI639453B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
SG10201708048XA (en) * 2013-03-18 2017-10-30 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
ES2700238T5 (es) * 2013-03-20 2022-05-20 Genzyme Corp Métodos para tratar la osteogénesis imperfecta
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
EP3041863A4 (en) 2013-09-05 2017-08-16 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
WO2015061386A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN104892753B (zh) * 2014-03-07 2019-11-29 神州细胞工程有限公司 一种中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗体及其用途
WO2015154052A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Isotyping immunoglobulins using accurate molecular mass
WO2015171777A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
EP3467501B1 (en) 2014-05-16 2020-11-04 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
CA2948005C (en) 2014-06-03 2023-07-18 Amgen Inc. Systems and methods for remotely processing data collected by a drug delivery device
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
KR102534017B1 (ko) 2014-10-23 2023-05-19 암젠 인크 약제학적 제형의 점도 감소
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3233163B1 (en) 2014-12-19 2021-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
DK3269735T3 (da) * 2015-03-13 2020-12-14 Jiangsu Hengrui Medicine Co Antistof mod sclerostin, antigenbindende fragment og medicinsk anvendelse deraf
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
KR20180025865A (ko) 2015-07-06 2018-03-09 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 다중특이적 항원 결합 분자 및 이의 용도
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
KR20180133399A (ko) 2016-03-01 2018-12-14 이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. 인간 폴리오바이러스 수용체(ｐｖｒ)에 특이적인 항체
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
RS61412B1 (sr) * 2016-03-17 2021-03-31 Tillotts Pharma Ag Anti-tnf alfa-antitela i njihovi funkcionalni fragmenti
US11352446B2 (en) 2016-04-28 2022-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
EP3455142B1 (en) 2016-05-13 2023-08-09 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
JP2019527710A (ja) 2016-08-08 2019-10-03 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体を用いた結合組織付着の改善方法
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
JP6918808B2 (ja) * 2016-08-31 2021-08-11 栄研化学株式会社 異なる方式で抗原を固定化した抗原担持不溶性担体粒子を用いる抗体測定法、抗体測定用試薬
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
CN110520439B (zh) 2016-11-08 2024-03-08 迈阿密大学 抗分泌粒蛋白iii(scg3)抗体及其用途
WO2018115879A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
ES2862922T3 (es) * 2016-12-21 2021-10-08 Mereo Biopharma 3 Ltd Uso de anticuerpos antiesclerostina en el tratamiento de la osteogénesis imperfecta
WO2018136398A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
EP3574010A4 (en) * 2017-01-30 2020-12-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-SCLEROSTIN ANTIBODIES AND METHOD OF USE
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
MX2019010543A (es) 2017-03-07 2019-10-21 Amgen Inc Insercion de agujas por sobrepresion.
KR20240005194A (ko) 2017-03-09 2024-01-11 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
EP3596225A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
KR20240042212A (ko) 2017-03-28 2024-04-01 암겐 인코포레이티드 플런저 로드 및 주사기 조립 시스템 및 방법
CA3059468A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Tesaro, Inc. Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
EP3615069A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Amgen Inc. N-acetylated and non-acetylated dipeptides containing arginine to reduce the viscosity of viscous compositions of therapeutic polypeptides
CA3061982A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
WO2018226565A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
MX2019015479A (es) 2017-06-23 2020-02-20 Amgen Inc Dispositivo electronico de administracion de farmacos con tapa accionada por un conjunto de conmutador.
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
IL271173B2 (en) 2017-07-21 2024-04-01 Amgen Inc Gas permeable sealing element for drug container and methods of assembly
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
AU2018305613A1 (en) * 2017-07-27 2020-01-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. SOST antibody pharmaceutical composition and uses thereof
KR102560646B1 (ko) 2017-08-01 2023-07-27 암젠 인크 질량 분광분석법으로의 분석을 위한 폴리펩티드 샘플의 실시간 제조를 위한 시스템 및 방법
AU2018312564A1 (en) 2017-08-01 2020-01-30 Amgen Inc. Systems and methods for performing a real-time glycan assay of a sample
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US11788093B2 (en) 2017-09-07 2023-10-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric antigen receptor t-cells expressing interleukin-8 receptor
US11946937B2 (en) 2017-09-13 2024-04-02 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identification and monitoring of apoptosis inhibitor of macrophage
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
AU2018358749B2 (en) 2017-11-06 2024-02-29 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
CA3084486A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
US20210041453A1 (en) 2018-03-13 2021-02-11 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
KR20200131266A (ko) 2018-03-13 2020-11-23 암젠 인크 질량 분광 분석을 위한 폴리펩티드의 순차적 소화
JP2021519068A (ja) 2018-03-26 2021-08-10 アムジェン インコーポレイテッド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォーム
WO2019191534A1 (en) * 2018-03-30 2019-10-03 Amgen Inc. C-terminal antibody variants
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
CN112584859A (zh) 2018-07-02 2021-03-30 美国安进公司 抗steap1抗原结合蛋白
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US20210369982A1 (en) 2018-07-24 2021-12-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CN112351804A (zh) 2018-07-24 2021-02-09 安进公司 用于施用药物的输送装置
US20210228797A1 (en) 2018-07-31 2021-07-29 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
WO2020033788A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Amgen Inc. Method of preparing an antibody pharmaceutical formulation
CA3106452A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CA3110529A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US20210338936A1 (en) 2018-10-05 2021-11-04 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
EA202191037A1 (ru) 2018-10-15 2021-08-05 Эмджен Инк. Устройство доставки лекарственного средства, имеющее демпферный механизм
AU2019359801A1 (en) 2018-10-15 2021-03-18 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MA54066A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction d'aiguille partielle
EP3873566A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
EP3894839A1 (en) 2018-12-14 2021-10-20 Amgen Inc. System suitability method for use with protein concentration determination by slope
US20220137061A1 (en) 2019-02-14 2022-05-05 Amgen Inc. Systems And Methods For Preparing A Sample and Performing A Real-Time Assay Of The Sample
US20220137010A1 (en) 2019-02-20 2022-05-05 Amgen Inc. Methods of determining protein stability
JP2022522816A (ja) 2019-03-04 2022-04-20 アムジエン・インコーポレーテツド 高分子量種のインビボでの可逆性
CN109897105B (zh) * 2019-03-22 2022-05-20 天承南运(天津)科技有限公司 Ev71病毒的单克隆抗体、其制备方法及其检测试纸条
EP3948242A1 (en) 2019-03-27 2022-02-09 Amgen Inc. Methods of fingerprinting therapeutic proteins via a two-dimensional (2d) nuclear magnetic resonance technique at natural abundance for formulated biopharmaceutical products
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
AU2020288652A1 (en) 2019-06-05 2021-11-18 Amgen Inc. Methods of identifying attributes of therapeutic proteins
US20220275073A1 (en) 2019-08-12 2022-09-01 Amgen Inc. Anti-Sclerostin Antibody Formulations
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
CN110499287B (zh) * 2019-08-30 2021-07-23 博雅干细胞科技有限公司 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法
MX2022003461A (es) 2019-09-26 2022-04-19 Amgen Inc Metodos de produccion de composiciones de anticuerpos.
EP4142778A1 (en) * 2020-04-30 2023-03-08 Board of Regents, The University of Texas System Anti-cd79b antibodies and chimeric antigen receptors and methods of use thereof
CN111537737B (zh) * 2020-05-18 2023-05-12 巴迪泰（广西）生物科技有限公司 降钙素原与c-反应蛋白联合检测试剂盒
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
JP2023543167A (ja) 2020-09-18 2023-10-13 アムジエン・インコーポレーテツド ペプチドマッピング分析のための試料を処理する方法
US20240043501A1 (en) 2020-10-15 2024-02-08 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
CA3200262A1 (en) 2020-11-05 2022-05-12 Amgen Inc. Materials and methods for protein processing
KR102255372B1 (ko) 2020-11-24 2021-05-25 (주)발맥스기술 간편 제작 설치 가능 bog 열교환장치
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
TW202317614A (zh) 2021-06-07 2023-05-01 美商安進公司 使用岩藻糖苷酶控制糖基化蛋白的去岩藻糖基化水平
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen, Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
TW202325853A (zh) 2021-11-09 2023-07-01 美商安進公司 治療性蛋白之生產
WO2023179791A1 (en) * 2022-03-24 2023-09-28 Angitia Biomedicines Limited Treatment of musculoskeletal disorders
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003158A2 (en) * 2003-06-16 2005-01-13 Celltech R & D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2005014650A2 (en) * 2003-06-16 2005-02-17 Celltech R & D, Inc. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US32011A (en) 1861-04-09 Coffee-pot
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4331647A (en) * 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) * 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4427115A (en) * 1981-10-19 1984-01-24 Laipply Thomas C One piece alcohol preparation device
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
USRE32011E (en) * 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
JPS58117537A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Toray Ind Inc 感光性樹脂組成物
JPS5955608A (ja) * 1982-09-24 1984-03-30 Hitachi Ltd 増幅器
US4543439A (en) * 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US6054561A (en) * 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3417525C1 (de) * 1984-05-11 1986-01-09 Matter + Siegmann Ag, Wohlen Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen Erfassung von kohlenwasserstoffhaltigen Schwebeteilchen in Gasen
US4902614A (en) * 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5571714A (en) 1988-12-22 1996-11-05 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies which bind both transforming growth factors β1 and β2 and methods of use
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5549910A (en) * 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5177197A (en) 1990-02-27 1993-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleotide sequence expressing human transforming growth factor-β1-binding protein
US5466468A (en) * 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP3218637B2 (ja) * 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
WO1992002551A1 (en) * 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
JP2958076B2 (ja) * 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5877397A (en) * 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) * 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JPH04141095A (ja) 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
US5070108A (en) * 1990-10-12 1991-12-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating osteoporosis, increasing bone mineral content and preventing the occurrence of compression fractures in a mammal
CA2094608A1 (en) 1990-10-22 1992-04-23 John D. Taylor Dna construct for providing rna therapy
US5145684A (en) * 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
US5399363A (en) * 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
AU668349B2 (en) * 1991-04-25 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
US5864027A (en) * 1993-06-07 1999-01-26 Genentech, Inc. HIV envelope polypeptides
US5543158A (en) * 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5453492A (en) * 1993-07-28 1995-09-26 La Jolla Cancer Research Foundation 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β
US5837458A (en) * 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
ATE378407T1 (de) 1994-04-29 2007-11-15 Curis Inc Morphogene protein-spezifische zelloberflächenrezeptoren und ihre verwendungen
DE4427221A1 (de) 1994-08-01 1996-02-08 Gsf Forschungszentrum Umwelt Retrovirus-induzierte Osteoklasten-Modulation für die Osteoporose-Therapie
US5846770A (en) 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US6057421A (en) * 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
IE80468B1 (en) * 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
WO1996039486A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. Human ccn-like growth factor
US5738868A (en) * 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
ES2312177T3 (es) * 1996-05-22 2009-02-16 Viventia Biotech Inc. Fragmentos de union a antigenos que detectan especificamente celulas cancerosas, nucleotidos que codifican los fragmentos y el uso de los mismos para la profilaxis y deteccion de canceres.
US6133426A (en) * 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US5989909A (en) 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof
AU6959898A (en) * 1997-04-11 1998-11-11 David J. Grainger Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathol ogies
EP1958962A3 (en) * 1997-06-12 2013-05-01 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US6075007A (en) 1997-07-17 2000-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified noggin polypeptide and compositions
JP2001512016A (ja) 1997-08-01 2001-08-21 ジェンセット 筋肉およびその他中胚葉組織中で発現される分泌タンパク質の５’ｅｓｔ
US6815201B2 (en) * 1997-09-08 2004-11-09 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. HIV-1 gp120 V1/V2 domain epitopes capable of generating neutralizing antibodies
GB9818881D0 (en) * 1998-08-28 1998-10-21 Glaxo Group Ltd Compounds
US6544485B1 (en) * 2001-01-29 2003-04-08 Sharper Image Corporation Electro-kinetic device with enhanced anti-microorganism capability
DE69942782D1 (de) * 1998-11-27 2010-10-28 Ucb Sa Zusammensetzungen und Verfahren zur Erhöhung der Knochenmineralisierung
CA2361553A1 (en) * 1999-01-29 2000-08-03 Zhenping Zhu Antibodies specific to kdr and uses thereof
US20090087878A9 (en) * 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
JP2003501087A (ja) 1999-06-09 2003-01-14 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の治療のための組成物と方法
JP4141095B2 (ja) 1999-10-29 2008-08-27 三洋電機株式会社 半導体装置とその製造方法
WO2001064885A1 (en) 2000-03-02 2001-09-07 Amgen, Inc. Chordin-like-2 molecules and uses thereof
JP2003534813A (ja) 2000-06-01 2003-11-25 アムジェン インコーポレーテッド シスチンノットポリペプチド：ｃｌｏａｋｅｄ−２分子およびその使用
EP1366156A2 (en) 2000-06-19 2003-12-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Osteolevin gene polymorphisms
EP1341814A2 (en) 2000-09-01 2003-09-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
PT1324776E (pt) 2000-10-12 2009-12-23 Genentech Inc Formulações de proteína concentradas de viscosidade reduzida
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2374027A1 (en) * 2001-03-13 2002-09-13 The Minister Of National Defence Cloning, expression, sequencing, and functional enhancement of monoclonal scfv antibody against venezuelan equine encephalitis virus(vee)
DE10145772A1 (de) * 2001-09-17 2003-04-10 Bayer Cropscience Ag DELTA·1·-Pyrroline
JP2005512962A (ja) * 2001-09-20 2005-05-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 抗ｐｄｇｆ抗体および設計抗体の産生方法
AUPR837201A0 (en) 2001-10-19 2001-11-15 BUKILIC, Aleksandar Method and apparatus for cleaning and disinfecting a toothbrush
BR0214680A (pt) 2001-12-06 2006-05-30 Biocontrol Systems Inc coleta de amostra e sistema de teste
US20030186915A1 (en) * 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
CA2476410C (en) * 2002-03-01 2013-09-24 Celltech R & D, Inc. Methods to increase or decrease bone density
AU2003221841A1 (en) 2002-04-03 2003-10-27 Celltech R And D, Inc. Association of polymorphisms in the sost gene region with bone mineral density
FR2838379B1 (fr) 2002-04-12 2005-06-24 Valeo Climatisation Dispositif de purification de l'air de l'habitacle d'un vehicule automobile
AU2003276430A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
US7893218B2 (en) * 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
WO2004098491A2 (en) 2002-11-01 2004-11-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services METHOD OF PREVENTING INFECTIONS FROM BIOTERRORISM AGENTS WITH IMMUNOSTIMULATORY CpG OLIGONUCLEOTIDES
DE10255152A1 (de) 2002-11-26 2004-06-03 Von Langen Ursula Lang Schadstoffsauger
US7642238B2 (en) 2002-12-05 2010-01-05 Shaughnessy John D Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
US20040141875A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-22 Rajiv Doshi System and method for treating microorganisms within motor vehicle heating, ventilation, and air conditioning units
ES2379689T3 (es) 2003-03-14 2012-04-30 Ucb Manufacturing, Inc. A Company Incorporated Under The Laws Of The State Of Delaware Complejo de esclerostina y nogina o cordina, y agentes que modulan la formación de dicho complejo
US20050158303A1 (en) 2003-04-04 2005-07-21 Genentech, Inc. Methods of treating IgE-mediated disorders comprising the administration of high concentration anti-IgE antibody formulations
CU23403A1 (es) * 2003-04-23 2009-08-04 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido n-glicolil gm3 y su uso para diagnóstico y tratamiento de tumores
WO2005018912A1 (de) * 2003-07-21 2005-03-03 Alpla-Werke Alwin Lehner Gmbh & Co. Kg Verfahren zur herstellung eines preformlings für kunststoffflaschen
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US20050267233A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Joshi Ashok V Anti-microbial handle system
AU2005267722B2 (en) 2004-08-04 2009-10-08 Amgen Inc. Antibodies to Dkk-1
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
EP1981910B1 (en) 2006-01-13 2013-06-26 A Chan Holding B.V. Method for identifying inhibitor of the glypican-sclerostin interaction
WO2008133722A2 (en) 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
WO2008061013A2 (en) 2006-11-10 2008-05-22 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
ES2666650T3 (es) 2006-12-29 2018-05-07 OstéoQC Inc. Métodos para alterar el crecimiento óseo mediante la administración de antagonista o agonista de sost o wise
JP2010526766A (ja) 2007-02-02 2010-08-05 ノバルティス アーゲー 骨関連障害を処置するためのスクレロスチン結合パートナーのモジュレーター
MX2009010051A (es) 2007-03-20 2009-10-12 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-esclereostina.
CL2008002775A1 (es) * 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
US20100254980A1 (en) 2007-11-02 2010-10-07 Novartis Ag Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (lrp6)
JP2011506483A (ja) 2007-12-14 2011-03-03 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体を用いた骨折の治療方法
BRPI0913406A2 (pt) 2008-06-03 2018-01-09 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
WO2010100200A2 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Novartis Ag Lyophilised antibody formulation
WO2010100179A2 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Novartis Ag Self-forming gel system for sustained drug delivery
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2010130830A2 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
AU2011250920B2 (en) * 2010-05-14 2015-05-21 Amgen Inc. High concentration antibody formulations
WO2012028683A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Novartis Ag Antibody gel system for sustained drug delivery
EP2632951B1 (en) * 2010-10-27 2017-08-02 Amgen Inc. Dkk1 antibodies and methods of use
EP2681242B1 (en) * 2011-03-01 2018-01-24 Amgen Inc. Sclerostin and dkk-1 bispecific binding agents
PE20140437A1 (es) * 2011-03-25 2014-04-17 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos
HUE039786T2 (hu) * 2011-08-04 2019-02-28 Amgen Inc Csonthiány-defektusok kezelési módszere
EP2797953B1 (en) * 2011-12-28 2020-06-03 Amgen Inc. Method of treating alveolar bone loss through the use of anti-sclerostin antibodies
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2019191534A1 (en) * 2018-03-30 2019-10-03 Amgen Inc. C-terminal antibody variants

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003158A2 (en) * 2003-06-16 2005-01-13 Celltech R & D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2005014650A2 (en) * 2003-06-16 2005-02-17 Celltech R & D, Inc. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization

Also Published As

Publication number Publication date
NO2021014I1 (no) 2021-03-24
UA123695C2 (uk) 2021-05-19
EP2325200A1 (en) 2011-05-25
TW201323438A (zh) 2013-06-16
ES2537278T3 (es) 2015-06-05
AU2006242476B2 (en) 2012-05-31
KR20140037293A (ko) 2014-03-26
JP2014012001A (ja) 2014-01-23
EP3670528B1 (en) 2021-09-08
GEP20166454B (en) 2016-04-11
NO345294B1 (no) 2020-11-30
EP3985015A1 (en) 2022-04-20
SI2325199T1 (sl) 2015-07-31
EP1891101B1 (en) 2013-05-22
PL1891101T3 (pl) 2013-11-29
HRP20130803T1 (hr) 2013-11-08
DK3670528T3 (da) 2021-12-06
BRPI0610197A2 (pt) 2010-06-01
CN103435698B (zh) 2018-08-31
US20070110747A1 (en) 2007-05-17
CY1114350T1 (el) 2016-08-31
TW201741332A (zh) 2017-12-01
CR9524A (es) 2008-05-21
JP2008539726A (ja) 2008-11-20
GT200600186A (es) 2007-02-09
AU2006242431A1 (en) 2006-11-09
CN107446043A (zh) 2017-12-08
LTPA2020506I1 (lt) 2020-04-27
NL301034I2 (nl) 2020-05-13
ZA200709480B (en) 2010-07-28
WO2006119107A3 (en) 2006-12-28
EP2325199A1 (en) 2011-05-25
US7872106B2 (en) 2011-01-18
EP2336163A1 (en) 2011-06-22
EP2264063A1 (en) 2010-12-22
KR20150117302A (ko) 2015-10-19
TWI778444B (zh) 2022-09-21
TW202323271A (zh) 2023-06-16
EP2325199B1 (en) 2015-03-04
US7592429B2 (en) 2009-09-22
IL224968B (en) 2018-03-29
HUS2000007I1 (hu) 2020-03-30
JP5391360B2 (ja) 2014-01-15
DK2325199T3 (da) 2015-05-26
NZ591636A (en) 2012-10-26
US20130203965A1 (en) 2013-08-08
GEP20125594B (en) 2012-08-10
ES2902548T3 (es) 2022-03-28
UY38207A (es) 2020-11-30
US20090304713A1 (en) 2009-12-10
CN103819558A (zh) 2014-05-28
HK1198444A1 (en) 2015-04-24
MX2007013759A (es) 2008-04-29
LT3670528T (lt) 2021-12-27
ME02247B (me) 2015-10-30
NZ563539A (en) 2011-04-29
PL2325199T3 (pl) 2015-08-31
US8637643B2 (en) 2014-01-28
BR122020023315B1 (pt) 2021-06-08
ES2689143T3 (es) 2018-11-08
NO20230084A1 (no) 2008-01-30
EA201400933A1 (ru) 2015-04-30
LUC00151I2 (no) 2021-02-15
MA29528B1 (fr) 2008-06-02
MX2018005512A (es) 2021-11-16
PH12015501848A1 (en) 2020-07-06
ME02085B (me) 2014-02-28
IL224967B (en) 2019-03-31
EA200702402A1 (ru) 2008-04-28
IL187106A (en) 2015-10-29
EP1891101A2 (en) 2008-02-27
HUE057097T2 (hu) 2022-04-28
CN101287756A (zh) 2008-10-15
CY1124802T1 (el) 2022-11-25
AR053266A1 (es) 2007-04-25
AU2006242476A1 (en) 2006-11-09
KR20080011420A (ko) 2008-02-04
PT1891101E (pt) 2013-08-23
WO2006119107A2 (en) 2006-11-09
KR101624809B1 (ko) 2016-05-26
TWI712613B (zh) 2020-12-11
JP5462484B2 (ja) 2014-04-02
CN101287756B (zh) 2014-06-25
US11939372B2 (en) 2024-03-26
EP2264063B1 (en) 2018-06-27
LTC1891101I2 (lt) 2020-09-25
EA021539B1 (ru) 2015-07-30
CN103819558B (zh) 2016-08-24
JP5789652B2 (ja) 2015-10-07
PE20070317A1 (es) 2007-04-27
BRPI0610197B1 (pt) 2021-05-11
US9296812B2 (en) 2016-03-29
HUE025530T2 (en) 2016-04-28
KR20130126752A (ko) 2013-11-20
CN103435698A (zh) 2013-12-11
PT3670528T (pt) 2021-12-09
HK1151803A1 (en) 2012-02-10
TNSN07406A1 (en) 2009-03-17
JP2013249303A (ja) 2013-12-12
SI1891101T1 (sl) 2013-10-30
NO20076046L (no) 2008-01-30
US20110097342A1 (en) 2011-04-28
SG10201403400UA (en) 2014-10-30
MY163480A (en) 2017-09-15
US20130121997A1 (en) 2013-05-16
CY2020009I1 (el) 2020-11-25
HRP20211904T1 (hr) 2022-03-04
HK1108705A1 (en) 2008-05-16
RS54049B1 (en) 2015-10-30
UY29514A1 (es) 2006-11-30
US20160168241A1 (en) 2016-06-16
CY2020009I2 (el) 2020-11-25
RS52919B (en) 2014-02-28
KR101653122B1 (ko) 2016-08-31
LUC00151I1 (no) 2020-03-16
KR101450888B1 (ko) 2014-10-16
RS62685B1 (sr) 2021-12-31
WO2006119107A9 (en) 2007-09-20
CA2947080A1 (en) 2006-11-09
US8383801B2 (en) 2013-02-26
DK1891101T3 (da) 2013-08-26
AU2006242431B2 (en) 2012-11-08
ES2412857T3 (es) 2013-07-12
HRP20150597T1 (hr) 2015-09-11
EP1891101B8 (en) 2013-06-26
CA2607197A1 (en) 2006-11-09
NO20201120A1 (no) 2008-01-30
PL3670528T3 (pl) 2022-01-31
IL187106A0 (en) 2008-02-09
MX358705B (es) 2018-08-31
SI3670528T1 (sl) 2022-01-31
EP3670528A1 (en) 2020-06-24
JP5409952B2 (ja) 2014-02-05
CA2607197C (en) 2016-12-13
TW200716667A (en) 2007-05-01
CY1116525T1 (el) 2017-03-15
PT2325199E (pt) 2015-07-10
EA037044B1 (ru) 2021-01-29
TWI494320B (zh) 2015-08-01
US10562964B2 (en) 2020-02-18
JP2014061000A (ja) 2014-04-10
BRPI0610197B8 (pt) 2021-05-25
TW202108605A (zh) 2021-03-01
US20200048338A1 (en) 2020-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7361086B2 (ja) スクレロスチンエピトープ
NO20230084A1 (no) Bindingsvirkninger