KR102257138B1 - 불완전 골형성증의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)에 결합하는, 치료적 유효량의 결합 작용제를 대상체에게 투여함에 의한 대상체에서의 불완전 골형성증(OI)의 징후의 치료 및 개선 방법을 제공한다.

Description

불완전 골형성증의 치료 방법{METHODS FOR TREATING OSTEOGENESIS IMPERFECTA}

관련 출원

본 출원은 2013년 3월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/803,647호, 2013년 9월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/875,399호 및 2013년 10월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/883,151호에 관한 것이며, 그들의 각각의 내용은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

정부 재정 지원

본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 P01 HD070394, P01 HD22657 및 R01 DE01771하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.

기술분야

본 발명은 불완전 골형성증(OI)의 치료 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 또는 그의 아이소폼(isoform)에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하는 OI의 치료 방법에 관한 것이다.

"취약성 골 질환(brittle bone disease)" 또는 로브슈타인(Lobstein) 증후군으로도 알려져 있는 불완전 골형성증(OI)은 15,000명의 사람들마다 약 1명에게 발생하는 쇠약성 및 희귀성 선천적 골 질환이다. 표현형이 OI 유형 간에 달라지긴 하지만, 흔한 징후(symptom)는 골 및 치아의 불완전한 골화, 감소된 골량, 취약성 골 및 병적 골절을 포함한다. 이들 OI의 흔한 징후는 골 기질 침착 또는 항상성에 연루되는 I형 콜라겐 또는 다른 단백질의 결함을 야기하는 유전자 돌연변이에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 이들 징후, 및 치명적인 골절 및 합병증에 대한 경향의 결과로서, OI 환자의 기대 수명은 일반 집단과 비교하여 감소된다. 따라서, 당업계에서 OI에 대한 효과적인 치료를 개발하는 것이 시급하게 필요한 것이 명백하다.

도 1A(웨스턴 블롯) 및 도 1B 내지 도 1F(그래프)는 TGFβ 신호전달이 야생형 대조군에 비하여 Crtap^-/- 마우스 유래의 골에서 증가된 것을 나타낸다.
도 2a(발광 사진) 및 2b 내지 도 2c(그래프)는 TGFβ 리포터 마우스와 교배된 Crtap ^-/- 마우스가 야생형 대조군에 비하여 더 높은 TGFβ 활성을 나타내는 것을 보여준다.
도 3은 마우스 범-특이적인 항-TGFβ 항체 1D11로 처치된 Crtap ^-/- 마우스 유래의 척추뼈의 μCT 영상이다.
도 4는 마우스 범-특이적인 항-TGFβ 항체 1D11로 처치된 Crtap ^-/- 마우스 유래의 척추뼈의 정량적인 측정을 포함하는 그래프이다.
도 5는 마우스 범-특이적인 항-TGFβ 항체 1D11로 처치된 Crtap ^-/- 마우스 유래의 척추뼈의 조직형태계측 분석이다.
도 6a 및 도 6b는 3점 굽힘 시험으로 결정시, 마우스 범-특이적인 항-TGFβ 항체 1D11로 처치된 Crtap ^-/- 마우스 유래의 대퇴골의 생체역학적 특성(도 6A - 최대 하중 및 도 6B - 강성)을 나타내는 그래프이다.
도 7a 및 도 7b(현미경 영상) 및 도 7c(그래프)는 마우스 범-특이적인 항-TGFβ 항체 1D11로 처치된 Crtap ^-/- 마우스의 폐 표현형을 보여준다.
도 8은 항-데코린 항체로 염색된 Crtap ^-/- 및 야생형 폐의 현미경 영상이다.
도 9는 데코린 결합 검정을 도시하는 그래프이다.
도 10은 Crtap ^-/- 마우스에서 증가된 TGFβ 신호전달을 보여주는 하나의 그룹의 그래프, 사진 및 영상이다. 도 10a는 TGFβ 표적 유전자 p21, PAI -1 및 Col1a1의 정량적 RT-PCR의 결과를 보여주는 일련의 3개의 그래프이다. 그래프는 P3 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스의 두개골에서의 증가된 TGFβ 신호전달을 나타낸다. 결과는 야생형 그룹의 배수 변화의 평균±SD로 나타나 있다; 그룹마다 n=5, *p<0.05. 도 10b는 야생형 마우스에 비하여 Crtap ^-/- 에서 총 Smad2 단백질에 비한 활성화된 Smad2(pSmad2)의 증가된 양을 보여주는 P3 두개관 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석의 사진이며, 이는 증가된 TGFβ-신호전달을 시사한다; 그룹마다 n=3. 도 10c는 도 10b에 나타낸 웨스턴 블롯의 정량화를 보여주는 그래프이다. 결과는 야생형 그룹의 배수 변화의 평균±SD로 나타나 있다; *p<0.05. 도 10d는 TGFβ-리포터 마우스(SBE-Luc 마우스)와 교배된 야생형 마우스와 비교하여 Crtap ^-/- 에서 골격 구조와 중첩되는 영역에서의 증가된 생물발광을 보여주는 영상이다. P10에서 3마리의 한배새끼의 대표적인 영상이 나타나 있다. 3마리의 한배새끼에서, Crtap ^-/- 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 두부/두개관에서 평균 2.86배(SD±0.34) 생물발광 신호를 보여준다(스케일 막대 = 1 ㎝). 도 10e는 TGFβ 리포터 세포주를 사용하여, TGFβ 활성을 3일 동안 골형성 조건하에 배양된 야생형 및 Crtap ^-/- 골수 기질 세포로부터의 조절된 배지에서 평가하여, 야생형 세포로부터의 배지와 비교하여 더 큰 TGFβ 활성이 나타남을 보여주는 그래프이다. 결과는 야생형 그룹의 배수 변화의 평균±SD로 나타나 있다; 그룹마다 n=5, *p<0.05. 도 10f는 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스에서 증가된 세포내 염색을 보여주는 pSmad2에 대한 폐의 면역염색(P10)을 보여주는 2개의 사진이다(40배 배율). 그룹마다 n=3 마우스의 대표적인 영상이 나타나 있다(스케일 막대 = 20 ㎛).
도 11은 TGFβ 중화 항체 1D11로의 처치 후에 Crtap ^-/- 마우스의 표현형 교정을 보여주는 하나의 그룹의 사진 및 그래프이다. 도 11a는 8주 동안의 처치 후의 16주령 야생형(WT), 대조군 항체-처치 Crtap ^-/- 및 1D11-처치 Crtap ^-/- 마우스의 L4 척추체의 일련의 3개의 MicroCT 영상이다. 도 11b는 야생형, 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11 처치된 Crtap ^-/- 마우스에서의 증가된 골 부피/총 부피(BV/TV), 골소주(trabecular) 개수(Tb.N) 및 두께(Tb.Th)를 나타내는 L4 척추체의 MicroCT의 결과를 보여주는 하나의 그룹의 3개의 그래프이다. 결과는 평균±SD로 나타나 있다, 그룹마다 n=8, Crtap ^-/- 대조군에 비하여 Crtap ^-/- 1D11에 대하여 *p<0.05, 야생형에 비하여 Crtap ^-/- 에 대하여 +p<0.05. 도 11c는 야생형과 비교하여 Crtap ^-/- 마우스에서 골 표면마다 증가된 파골세포(N.Oc/BS) 및 조골세포(N.Ob/BS) 개수를 보여주는 L4 척추뼈의 조직형태계측 분석의 결과를 보여주는 하나의 그룹의 3개의 그래프이다. 1D11로의 처치 후의 감소된 조골세포 및 파골세포 개수는 Crtap ^-/- 마우스에서의 가속화된 골 재형성(remodeling)의 효율적인 억제를 나타낸다. Crtap ^-/- 마우스에서 골면적당 증가된 골세포 개수는 1D11 처치 후에 야생형 수준으로 감소된다. 결과는 평균±SD로 나타나 있다, 그룹마다 n=6, Crtap ^-/- 대조군에 비하여 Crtap ^-/- 1D11에 대하여 *p<0.05, 야생형에 비하여 Crtap ^-/- 에 대하여 +p<0.05. 도 11d는 8주 동안의 처치 후에 16-주령 야생형(WT), 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11-처치 Crtap ^-/- 마우스의 팽창된 폐의 헤마톡실린/에오신 염색을 보여주는 일련의 3개의 사진이다. Crtap ^-/- 대조군 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 원위의 기도 공간의 증가를 보인다. 1D11로의 처치 후에, 대조군 Crtap ^-/- 마우스와 비교하여 원위의 기도 직경의 감소가 존재한다. 그룹당 n=8 마우스의 대표적인 영상이 나타나 있다(스케일 막대 = 100 ㎛). 도 11e는 대조군 항체-처치된 Crtap ^-/- 및 야생형 마우스와 비교하여, 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스에서 원위 기도 공간의 상당한 감소를 나타내는, 평균-선형-절편(MLI) 방법에 의한 폐포 구조 사이의 거리의 정량화를 보여주는 그래프이다. 결과는 평균±SD로 나타나 있다, 그룹마다 n=8 마우스, 마우스마다 10개의 영상 분석, Crtap ^-/- 대조군에 비하여 Crtap ^-/- 1D11에 대하여 *p<0.05, 야생형에 비하여 Crtap ^-/- 에 대하여 +p<0.05.
도 12는 I형 콜라겐으로의 데코린 결합이 P986 3Hyp 부위와 중첩되며, Crtap ^-/- 마우스의 I형 콜라겐에서 감소되는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 12a는 야생형에 비하여 Crtap ^-/- 마우스의 두개골에서의 작은 류신-풍부 프로테오글리칸 데코린(Dcn), 비글리칸(biglycan, Bgn) 및 아스포린(asporin, Aspn)의 RNA 발현의 차이를 보이지 않는 P3 마우스의 두개골의 정량적 RT-PCR의 결과를 보여주는 하나의 그룹의 3개의 그래프이다. 결과는 야생형 그룹의 배수 변화의 평균±SD로 제공되어 있다, 그룹마다 n=5. 도 12b는 Crtap ^-/- 마우스의 I형 콜라겐으로의 재조합 데코린 코어 단백질의 결합이 야생형 I형 콜라겐에 비하여 대략 45% 더 낮음을 나타내는 표면 플라스몬 공명 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 3, 5 및 12 μM의 데코린을 사용하여 3가지 독립적인 실험을 수행하였다. 칩상에 고정화된 I형 콜라겐에 대해 정규화된, 결합된 총 데코린 양의 반응 유닛(RU)가 나타나 있다. Crtap ^-/- I형 콜라겐으로의 데코린 결합의 평균 감소는 44.6 ± 7.9%이다.
도 13은 증가된 TGFβ 신호전달의 억제가 Col1a2 유전자의 G610C 돌연변이로부터 야기되는 우성 OI의 마우스 모델(Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} )에서 골 표현형을 향상시키는 것을 보여주는 일련의 그래프 및 사진이다. 도 13a는 TGFβ 표적 유전자 p21 및 PAI-1의 정량적 RT-PCR의 결과를 보여주는 2개의 그래프이며, 이는 P3 야생형 및 Col1α2 ^tm1.1Mcbr 마우스의 두개골에서의 증가된 TGFβ 신호전달을 나타낸다. 결과는 야생형 그룹의 배수 변화의 평균±SD로 나타나 있다; 그룹마다 n=3, *p<0.05. 도 13b는 웨스턴 블롯 분석의 결과의 사진이며, 이는 야생형, 및 야생형에 비하여 Col1α2 ^tm1.1Mcbr 마우스의 P3 두개관 내에서, Smad2 단백질의 총 수준에 비하여 증가된 수준의 활성화된 Smad2(pSmad2)를 보여주며, 이는 증가된 TGFβ-신호전달을 시사한다; 그룹마다 n=3. 도 13c는 도 13b에 나타낸 웨스턴 블롯의 정량화를 보여주는 그래프이다. 결과는 야생형 그룹의 배수 변화의 평균±SD로 나타나 있다; *p<0.05. 도 13d는 8주 동안의 처치 후에 16-주령 야생형(WT), 대조군 항체-처치 Col1α2 ^tm1.1Mcbr 및 1D11-처치 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스의 L4 척추체의 MicroCT 영상의 일련의 사진이다. 도 13e는 L4 척추체의 MicroCT로부터의 데이터의 일련의 그래프이며, 이는 1D11로의 처치 후에 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스에서의 증가된 골 부피/총 부피(BV/TV), 골소주 개수(Tb.N) 및 두께(Tb.Th)를 보여준다. 결과는 평균±SD로 나타나 있다, 그룹마다 n=6, Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 대조군에 비하여 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 1D11에 대하여 *p<0.05, 야생형에 비하여 Col1α2 ^tm1.1Mcbr 에 대하여 +p<0.05.
도 14는 연구 기간 동안 야생형과 비교하여 Crtap ^-/- 마우스의 감소된 중량을 보여주는 중량 곡선 그래프이다(모든 시점에 대하여 p<0.05, 평균±SE가 나타나 있음). 대조군 Crtap ^-/- 마우스에 비하여 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스에서 중량의 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.
도 15는 Crtap ^-/- 마우스에서 비정상 I형 콜라겐 번역후 변형에 대한 TGFβ 억제의 영향이 없음을 보여주는 일련의 그래프 및 표이다. 도 15a는 야생형, 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스(16주령 마우스, 8주 동안의 처치 후)의 경골로부터의 추출된 I형 콜라겐의 탠덤(tandem) 질량 스펙트럼을 보여주는 일련의 3개의 그래프이다. 상부 그래프의 서열은 SEQ ID NO: 19이고, 중간의 그래프의 서열은 SEQ ID NO: 20이며, 하부 그래프의 서열은 SEQ ID NO: 21이다. 도 15b는 탠덤 질량 스펙트럼 분석의 요약을 보여주는 표이다. 1D11 처치는 골 시료에서 콜라겐 잔기 Pro986 알파 1(I)의 3-하이드록실화 상태에 유의미하게 영향을 미치지 않았다. 3-하이드록실화 잔기의 백분율의 평균(±SD)이 나타나 있다, 그룹마다 n=5. 도 15c는 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스의 골 I형 콜라겐이 야생형 마우스에 비하여 하이드록시라이실 피리디놀린(HP) 및 라이실 피리디놀린 교차결합(LP) 수준의 변화 및 증가된 HP/LP 비를 나타내는 것을 보여주는 하나의 그룹의 3개의 그래프이다. Crtap ^-/- 마우스의 1D11 처치는 대조군 Crtap ^-/- 마우스에 비하여 이들 파라미터에 상당히 영향을 미치지 않았다. 결과는 평균±SD로 제공되어 있다, 그룹마다 n=4 마우스, 야생형에 비하여 Crtap ^-/- 에 대하여 +p<0.05.
도 16은 치료 기간의 시작(도 16A = 8주령) 및 마지막(도 16b = 16주령)에 혈청 골-턴오버(bone-turnover) 마커 오스테오칼신(OCN) 및 골 콜라겐의 C-말단 교차결합된 텔로펩티드(CTX)를 보여주는 일련의 그래프이다. 도 16a는 연구의 시작에 야생형 마우스에 비하여 8주령 Crtap ^-/- 에서의 증가된 OCN 및 CTX 혈청 수준이 Crtap ^-/- 마우스에서의 증가된 골 턴오버를 나타내는 것을 보여주는 2개의 그래프이다. 결과는 평균±SD로 제공되어 있다, 야생형에 대하여 n=8, Crtap ^-/- 마우스에 대하여 n=14, 야생형에 비하여 Crtap ^-/- 에 대하여 +p<0.05. 도 16b는 16주령의 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스가 대조군 Crtap ^-/- 마우스에 비하여 감소된 혈청 OCN 및 상당히 감소된 CTX 혈청 수준으로의 경향을 보이는 것을 보여주는 2개의 그래프이며, 이는 TGFβ의 억제에 의한 증가된 골 턴오버의 억제를 나타낸다. 결과는 평균±SD로 제공되어 있다, 야생형에 대하여 n=8, Crtap ^-/- 그룹마다 n=7; Crtap ^-/- 대조군에 비하여 Crtap ^-/- 1D11에 대하여 *p<0.05, 야생형에 비하여 Crtap ^-/- 에 대하여 +p<0.05.
도 17은 야생형, 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11 처치된 Crtap ^-/- 마우스(16주령 마우스, 8주 동안의 처치 후)의 척추체 L4의 MicroCT 분석의 결과를 보여주는 표이다. 평균±SD는 골 부피/조직 부피(BV/TV), 골소주 개수(Tb.N), 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 분리(Tb.Sp) 및 골 부피의 골 무기질 밀도(BMD BV)에 대하여 나타나 있다; 그룹마다 n=8, +는 등분산 검정이 실패한 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis)의 순위 일원 분산 분석을 나타낸다. n.s. = 통계적으로 유의미하지 않음.
도 18은 야생형, 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스(16주령 마우스, 8주 동안의 처치 후)에 대한 근위 대퇴골에서의 골소주 골의 MicroCT 분석의 결과를 보여주는 표이다. 평균±SD는 골 부피/조직 부피(BV/TV), 골소주 개수(Tb.N), 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 분리(Tb.Sp) 및 골 부피의 골 무기질 밀도(BMD BV)에 대하여 나타나 있다; 그룹마다 n=8, +는 등분산 검정이 실패한 크루스칼-왈리스의 순위 일원 분산 분석을 나타낸다. n.s. = 통계적으로 유의미하지 않음.
도 19는 야생형, 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스(16주령 마우스, 8주 동안의 처치 후)에 대한 대퇴골 골간에서의 피질 골의 MicroCT 분석의 결과를 보여주는 표이다. 평균±SD는 피질 두께, 골 부피의 골 무기질 밀도(BMD BV), 전방-후방(a.p.) 직경, 횡단면적(CSA), 및 중간-측방(m.l.) 및 전방-후방(a.p.) 축에 대한 횡단 관성 모멘트(CSMI)에 대하여 나타나 있다; 그룹마다 n=8, n.s. = 통계적으로 유의미하지 않음.
도 20은 3-점 굽힘에 의한 대퇴골의 생체역학적 시험의 결과를 보여주는 표이다(16주령 마우스, 8주 동안의 처치 후). 야생형 마우스와 비교하여, 대조군 Crtap ^-/- 마우스는 탄성 계수 및 탄성 변위를 제외하고, 유의미하게 감소된 생체역학적 파라미터를 나타낸다. 1D11을 사용한 항 TGFβ-처치는 Crtap ^-/- 대퇴골에서 최대 하중 및 궁극 강도의 유의미한 개선을 야기하여, 이는 증가된 전체 골 및 조직 강도를 나타낸다. 그러나, 항복후 변위의 유의미한 변화가 관찰되지 않았으며, 이는 1D11이 OI 골의 증가된 취약성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 야생형에 대하여 N=6, 대조군 Crtap ^-/- 에 대하여 n=4 및 1D11 처치된 Crtap ^-/- 마우스에 대하여 n=3. n.s. = 통계적으로 유의미하지 않음.
도 21은 야생형, 대조군 Crtap ^-/- 및 1D11-처치된 Crtap ^-/- 마우스(16주령 마우스, 8주 동안의 처치 후)의 L4 척추체의 조직형태계측 분석의 결과를 보여주는 표이다. 평균±SD는 골 부피/조직 부피(BV/TV), 골소주 개수(Tb.N), 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 분리(Tb.Sp), 파골세포의 개수/골 표면(N.Oc/BS), 파골세포 표면/골 표면(Oc.S/BS), 조골세포의 개수/골 표면(N.Ob/BS), 조골세포 표면/골 표면(Oc.S/BS) 및 골세포의 개수/골 면적(N.Ot/B.Ar)에 대하여 나타나 있다; 그룹마다 n=6, +는 등분산 검정이 실패한 크루스칼-왈리스의 순위 일원 분산 분석을 나타낸다. n.s. = 통계적으로 유의미하지 않음.
도 22는 야생형, 대조군 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 및 1D11-처치된 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스(16주령 마우스, 8주 동안의 처치 후)의 척추체 L4의 MicroCT 분석의 결과를 보여주는 표이다. 평균±SD는 골 부피/조직 부피(BV/TV), 골소주 개수(Tb.N), 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 분리(Tb.Sp) 및 골 부피의 골 무기질 밀도(BMD BV)에 대하여 나타나 있다; 그룹마다 n=6, n.s. = 통계적으로 유의미하지 않음.
도 23은 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스의 I형 콜라겐으로의 재조합 데코린 코어 단백질의 결합을 측정하는 표면 플라스몬 공명 분석을 보여주는 그래프이다. 각각의 지정된 농도의 데코린에서 3회의 기술적 반복검증을 2회의 독립적인 생물학적 반복검증(◆ 반복검증 1, ▲ 반복검증 2)으로부터 수행하였다. 결과는 야생형의 평균의 백분율로 나타나 있다(막대는 그룹마다 평균을 나타낸다).
도 24(현미경 영상)는 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스의 원위 대퇴골 골간단에서의 데코린에 대한 면역염색을 나타낸다, 20배, 유전형마다 n=3, 스케일 막대 = 100㎛(도 24A 내지 도 24C) 및 40배 배율, 유전형마다 n=3, 스케일 막대 = 50㎛(도 24D 내지 도 24F). 대조군 대퇴골을 오직 2차 항체에서만 인큐베이션시켰다.
도 25(현미경 영상)는 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스의 원위 대퇴골 골간단에서의 TGFβ1에 대한 면역염색을 나타낸다, 20배, 유전형마다 n=3, 스케일 막대 = 100㎛(도 25A 내지 도 25C) 및 40배 배율, 유전형마다 n=3, 스케일 막대 = 50㎛(도 25D 내지 도 25F). 대조군 대퇴골을 오직 2차 항체에서만 인큐베이션시켰다.
도 26(현미경 영상)은 야생형 및 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스의 원위 대퇴골 골간단에서의 TGFβ1에 대한 면역염색을 나타낸다, 20배, 유전형마다 n=3, 스케일 막대 = 100㎛(도 26A 내지 도 26C) 및 40배 배율, 유전형마다 n=3, 스케일 막대 = 50㎛(도 26D 내지 도 26F). 대조군 대퇴골을 오직 2차 항체에서만 인큐베이션시켰다.
요약
본 발명은 불완전 골형성증(OI)을 효율적으로 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 또는 그의 아이소폼에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하는 OI의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 결합 단백질은 "범-특이적"이며, 모든 3가지 인간 아이소폼의 TGFβ, 즉, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 결합 단백질은 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하고, 그를 중화시킨다. 일 양태에서, 본 발명은 TGFβ에 특이적으로 결합하는, 치료적 유효량의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 OI의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 OI의 치료 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 IgG4 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG4 불변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 κ 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서. 인간 κ 경쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 IgG4 불변 영역 및 인간 κ 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 인간 IgG4 불변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하며, 인간 κ 경쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3를 중화시킨다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 골 부피 밀도(BV/TV), 전체 골 표면(BS), 골 표면 밀도(BS/BV), 골소주 개수(Tb.N), 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 간격(Tb.Sp) 및 총 부피(Dens TV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 파라미터를 개선시킨다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 골흡수를 억제한다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 요중(urinary) 하이드록시프롤린, 요중 총 피리디놀린(PYD), 요중 유리 데옥시피리디놀린(DPD), 요중 I형 콜라겐 교차결합된 N-텔로펩티드(NTX), 요중 또는 혈청 I형 콜라겐 교차결합된 C-텔로펩티드(CTX), 골 시알로단백질(BSP), 오스테오폰틴(OPN) 및 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 흡수의 혈청 바이오마커를 감소시킨다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 총 알칼리성 포스파타제, 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신 및 I형 프로콜라겐(C-말단/N-말단)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 침착의 혈청 바이오마커를 증가시킨다.
다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 골 흡수를 억제한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 골 침착을 촉진시킨다. 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 청각 기능, 폐 기능 및 신장 기능으로 이루어진 군으로부터 선택되는 OI에 의해 영향을 받는 비골격 기관의 기능을 개선시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 TGFβ에 결합하는, 치료적 유효량의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 OI의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 OI의 치료 방법을 제공하며, 여기서, 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 치료제와 병용하여, TGFβ에 결합하는, 치료적 유효량의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 OI의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 OI의 치료 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 상기 치료제는 비스포스포네이트이다.
상세한 설명
A. 정의
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 또한, 문맥에서 명백하게 다르게 설명되지 않는 한, 복수의 참조대상도 포함하는 것을 주목한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내(또는 1% 이하)를 의미한다.
용어 "투여하다" 또는 "투여"는 체외에 존재하는 바와 같은 물질(예를 들어, 항체)을 환자에게 예를 들어, 점막, 피부내, 정맥내, 피하, 근육내 전달 및/또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 신체 전달 방법에 의해 주사하거나 달리 물리적으로 전달하는 행동을 말한다. 질환 또는 그의 징후가 치료되는 경우에, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 그의 징후의 발병 후에 일어난다. 질환 또는 그의 징후가 예방되는 경우에, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 그의 징후의 발병 전에 일어난다.
TGFβ의 "길항제" 또는 "억제제"는 예를 들어 TGFβ를 발현하는 세포에서 또는 TGFβ 리간드를 발현하거나 TGFβ 수용체를 발현하는 세포에서 TGFβ의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나 다르게는 감소시킬 수 있는 분자를 말한다. 예시적인 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체를 세포 표면-발현된 TGFβ 수용체(예를 들어, TGFβ 수용체 1, 2 또는 3)를 갖는 세포와 접촉시키는 경우 상기 세포에서 TGFβ의 활성을 억제하거나 또는 다르게는 감소시키는 길항제 항체이다. 일부 구현예에서, TGFβ의 길항제(예를 들어, 본 발명의 항체)는 예를 들어, TGFβ 수용체를 발현하는 세포의 활성화 및/또는 세포 신호전달 경로를 억제하거나 다르게는 감소시켜, 이에 의해, 길항제의 부재하의 TGFβ-매개의 생물학적 활성에 비해 세포의 TGFβ-매개의 생물학적 활성을 억제함으로써 작용할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 길항성 항-TGFβ 항체, 바람직하게는 완전 인간, 모노클로널, 길항성 항-TGFβ 항체이다.
용어 "항체", "면역글로불린" 또는 "Ig"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 항체는 합성 항체, 모노클로널 항체, 재조합에 의해 생성되는 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디, 단쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 등을 포함), 낙타화 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-결합 Fv(sdFv), 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 상기의 것 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, TGFβ 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위(예를 들어, 항-TGFβ 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR))를 함유하는 항원 결합 도메인 또는 분자를 포함한다. 항-TGFβ 항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 분류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 임의의 하위분류(IgG2a 및 IgG2b)의 면역글로불린 분자의 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 인간화, 예를 들어, 인간화 모노클로널 항-TGFβ 항체이다. 다른 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 완전 인간, 예를 들어, 완전 인간 모노클로널 항-TGFβ 항체이다. 바람직한 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 IgG 항체, 예를 들어, IgG4 항체이다.
용어 "조성물" 및 "제형"은 특정 성분(예를 들어, 항-TGFβ 항체)을 선택적으로 명시된 양으로 함유하는 제품, 및 선택적으로 명시된 양으로 명시된 성분들의 조합으로부터 직접 또는 간접적으로 야기되는 임의의 제품을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 항원으로의 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능, 예를 들어 Fc 수용체와의 상호작용을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카복시 말단 부분을 나타낸다. 상기 용어는 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린의 다른 부분, 가변 도메인에 비해 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 나타낸다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인, 및 경쇄의 CHL 도메인을 함유한다.
용어 "에피토프"는 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역에 결합할 수 있고, 동물, 바람직하게는 포유동물에서, 가장 바람직하게는 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있는, 항원 활성 또는 면역원성 활성을 갖는 항원, 예를 들어 TGFβ 폴리펩티드 또는 TGFβ 폴리펩티드 단편의 표면상의 국소화된 영역을 의미한다. 면역원성 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 유도하는 폴리펩티드의 부분이다. 항원 활성을 갖는 에피토프는 당업계에 널리 알려져 있는 임의의 방법, 예를 들어, 면역검정에 의해 결정시 항체가 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 부분이다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면기로 이루어지고, 특정 3차원 구조 특징 및 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프에 기여하는 폴리펩티드의 영역은 폴리펩티드의 인접 아미노산일 수 있거나, 에피토프는 폴리펩티드의 2개 이상의 비인접 영역으로부터 함께 비롯될 수 있다. 에피토프는 항원의 3차원 표면 특징부일 수 있거나 아닐 수 있다. 특정 구현예에서, TGFβ 에피토프는 TGFβ 폴리펩티드(예를 들어, TGFβ 폴리펩티드의 삼량체 형태에서)의 3차원 표면 특징부이다. 다른 구현예에서, TGFβ 에피토프는 TGFβ 폴리펩티드(예를 들어, TGFβ 폴리펩티드의 이량체 형태 또는 단량체 형태에서)의 선형 특징부이다. 항-TGFβ 항체는 단량체 형태의 TGFβ의 에피토프, 이량체 형태의 TGFβ의 에피토프 또는 단량체 형태 및 이량체 형태 둘 모두의 TGFβ에 특이적으로 결합할 수 있다.
용어 "부형제"는 약물에 대한 희석제, 비히클, 보존제, 결합제, 안정화제 등으로 통상 사용되는 불활성 물질을 말하고, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민 등), 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 등), 지방산 및 인지질(예를 들어, 알킬 설포네이트, 카프릴레이트 등), 계면활성제(예를 들어, SDS, 폴리소르베이트, 비이온성 계면활성제 등), 당류(예를 들어, 수크로스, 말토스, 트레할로스 등) 및 폴리올(예를 들어, 만니톨, 소르비톨 등)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 또한 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA]을 참조한다.
펩티드 또는 폴리펩티드의 맥락에서, 용어 "단편"은 전장 아미노산 서열보다 작은 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 단편은 예를 들어 아미노산 서열로부터 아미노 말단에서의 절단, 카복시 말단에서의 절단, 및/또는 잔기(들)의 내부 결실로부터 야기될 수 있다. 단편은 예를 들어 선택적 RNA 스플라이싱 또는 생체내 프로테아제 활성으로부터 야기될 수 있다. 특정 구현예에서, TGFβ 단편은 TGFβ 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 50개, 100개 아미노산 잔기, 적어도 125개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 150개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 175개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 200개의 인접 아미노산 잔기 또는 적어도 250개의 인접 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, TGFβ 폴리펩티드, 또는 TGFβ 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 전장 폴리펩티드 또는 항체의 적어도 1, 적어도 2, 또는 적어도 3개의 기능을 유지한다.
용어 "완전 인간 항체" 또는 "인간 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 인간 가변 영역, 가장 바람직하게는 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 용어는 인간 기원의 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 특정 구현예에서, "완전 인간" 항-TGFβ 항체는 TGFβ 폴리펩티드에 결합하고 인간 생식계열 면역글로불린 핵산 서열의 천연 발생 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 인코딩되는 항체도 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 완전 인간 항체이다. 용어 "완전 인간 항체"는 카바트(Kabat) 등에 의해 설명된 바와 같이 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다(문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 완전 인간 항체를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
어구 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 분리된 인간 항체, 예를 들어 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현되는 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리되는 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 및/또는 트랜스크로모좀(transchromosomal)인 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)로부터 분리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295] 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 분리되는 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가질 수 있다(문헌[Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 그러나, 특정 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)로 처리되고, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 천연적으로 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리(repertoire)에 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
항체를 참조하여 사용되는 경우 용어 "중쇄"는 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 5개의 별개의 유형, 즉 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)를 의미한다. 이들 별개의 유형의 중쇄는 당업계에 널리 알려져 있고, IgG의 4개의 하위분류, 즉 IgG1, IgG1, IgG3 및 IgG4를 포함하여 각각 항체의 5개의 분류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 야기한다. 바람직하게는, 중쇄는 인간 중쇄이다.
"분리된" 또는 "정제된" 항체에는 항체가 유래되는 세포 또는 조직 공급원 유래의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 존재하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 용어 "세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는"은 항체가, 그것이 분리되는 세포의 세포 성분으로부터 분리되거나 재조합에 의해 생성된 항체의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만(건조 중량 기준)의 이종성 단백질(본원에서 "오염 단백질"로도 언급됨)을 갖는 항체의 제제를 포함한다. 항체가 재조합에 의해 생성되는 경우, 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않는 것도 또한 바람직하며, 다시 말하면, 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만을 나타낸다. 항체가 화학적 합성에 의해 생성되는 경우, 항체에 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는 것이 바람직하며, 다시 말하면, 항체는 단백질 합성에 관련되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 이러한 항체 제제는 대상 항체 이외의 화학적 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 5% 미만(건조 중량 기준)으로 갖는다. 바람직한 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 분리되거나 정제된 것이다.
용어 "카바트 넘버링" 및 유사 용어는 당업계에서 인지되어 있고, 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 다른 아미노산 잔기보다 더 가변성 (즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 의미한다(문헌[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391] 및 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]). 중쇄 가변 영역에서, 초가변 영역은 전형적으로 CDR1에 대하여 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2에 대하여 아미노산 위치 50 내지 65, 및 CDR3에 대하여 아미노산 위치 95 내지 102 범위이다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 전형적으로 CDR1에 대하여 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2에 대하여 아미노산 위치 50 내지 56, 및 CDR3에 대하여 아미노산 위치 89 내지 97 범위이다.
항체를 참조하여 사용되는 경우, 용어 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 또는 람다(λ)로 언급되는 2개의 별개의 유형을 의미한다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 알려져 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
용어 "관리하다", "관리하는", 및 "관리"는 대상체가 치료법(예를 들어, 예방 또는 치료제)로부터 얻는, 질환 또는 장애의 치유를 야기하지는 않는 유익한 효과를 의미한다. 특정 구현예에서, 질환의 진행 또는 악화를 방지하도록 TGFβ-매개의 질환(예를 들어, OI), 또는 그의 하나 이상의 징후를 "관리"하기 위해 대상체에게 하나 이상의 치료법(예를 들어, 예방 또는 치료제)을 시행한다.
용어 "모노클로널 항체"는 균질한 또는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 의미하고, 각각의 모노클로널 항체는 전형적으로 항원상의 단일의 에피토프를 인식할 것이다. 바람직한 구현예에서, "모노클로널 항체"는 단일의 하이브리도마 또는 다른 세포에 의해 생성된 항체이다. 용어 "모노클로널"은 항체를 제조하기 위한 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노클로널 항체는 문헌[Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나 또는 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 클로널 세포주 및 그에 의해 발현된 모노클로널 항체의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 널리 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed.; Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York] 참조).
용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 더욱 특별히 인간에서 사용하기 위해 연방 정부 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 인지되어 있는 약전에 열거된 것을 의미한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 알맞은 또는 편리한 투여형을 제조하기 위해 활성 분자, 예를 들어, 모노클로널 항체와 조합되는 임의의 불활성 물질을 의미한다. "약제학적으로 허용되는 부형제"는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이며, 모노클로널 항체를 포함하는 제형의 다른 성분과 혼화성인 부형제이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 본원에 제공된 치료법 또는 치료법의 병용(예를 들어, 예방 또는 치료제의 병용)의 시행으로부터 야기되는, TGFβ-매개의 질환 및/또는 그와 관련된 징후의 발생, 재발, 발병 또는 확산의 완전한 또는 부분적인 억제를 말한다.
용어 "TGFβ 항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 TGFβ 폴리펩티드의 부분을 말한다. 또한, TGFβ 항원은 항체가 특이적으로 결합하는 TGFβ 폴리펩티드 또는 그의 단편의 유사체 또는 유도체를 말한다. 일부 구현예에서, TGFβ 항원은 단량체 TGFβ 항원 또는 이량체 TGFβ 항원이다. 에피토프에 기여하는 TGFβ 폴리펩티드의 영역은 폴리펩티드의 인접 아미노산일 수 있거나 또는 에피토프는 폴리펩티드의 2개 이상의 비-인접 영역에서 함께 비롯될 수 있다. 에피토프는 항원의 3차원 표면 특징부일 수 있거나 아닐 수 있다. 면역 반응을 유도할 수 있는 TGFβ 항원의 표면상의 국소화된 영역이 TGFβ 에피토프이다. 에피토프는 항원의 3차원 표면 특징부일 수 있거나 아닐 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, TGFβ 항원의 "유사체"는 본원에 기술된 TGFβ 폴리펩티드, TGFβ 폴리펩티드의 단편 또는 TGFβ 에피토프와 유사하거나 동일한 기능을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어, 유사체는 본원에 기술된 TGFβ 폴리펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3), TGFβ 폴리펩티드의 단편, TGFβ 에피토프 또는 항-TGFβ 항체의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 폴리펩티드는 엄격한 조건하에 본원에 기술된 TGFβ 폴리펩티드, TGFβ 폴리펩티드의 단편 또는 TGFβ 에피토프를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
용어 "인간 TGFβ", "hTGFβ" 또는 "hTGFβ 폴리펩티드" 및 유사 용어는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드("폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에 상호교환가능하게 사용됨) 및 그의 SNP 변이체를 포함하는 관련 폴리펩티드를 말한다. 관련된 폴리펩티드는 바람직하게는 TGFβ 활성을 보유하고/하거나 항-TGFβ 면역 반응을 생성시키기에 충분한 대립형질 변이체(예를 들어, SNP 변이체); 스플라이스 변이체; 단편; 유도체; 치환, 결실 및 삽입 변이체; 융합 폴리펩티드; 및 종간 상동체를 포함한다. 또한, 항-TGFβ 면역학적 반응을 생성시키기에 충분한 가용성 형태의 TGFβ도 포함된다. 당업자가 이해할 바와 같이, 항-TGFβ 항체는 TGFβ 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 항원, 및/또는 에피토프에 결합할 수 있고, 이것은 에피토프가 보다 큰 항원의 일부이고, 이 항원은 보다 큰 폴리펩티드 단편의 일부이고, 이 단편은 다시 보다 큰 폴리펩티드의 일부이기 때문이다. hTGFβ는 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.
용어 "TGFβ-매개의 질환" 및 "TGFβ-매개의 장애"는 상호교환가능하게 사용되며, 전적으로 또는 부분적으로 TGFβ, 예를 들어, hTGFβ에 의해 야기되거나, 또는 그의 결과인 임의의 질환 또는 장애를 말한다. 특정 구현예에서, TGFβ는 비정상적으로 발현된다. 일부 구현예에서, TGFβ는 특정 세포 유형에서 비정상적으로 상향조절될 수 있다. 다른 구현예에서, 정상, 비정상 또는 과도한 세포 신호전달은 TGFβ 수용체로의 TGFβ 결합에 의해 야기된다. 특정 구현예에서, TGFβ 수용체(예를 들어, TGFβ 수용체 1, 2 또는 3)는 세포, 예를 들어, 조골세포, 파골세포 또는 골수 기질 세포의 표면상에 발현된다. 특정 구현예에서, TGFβ-매개의 질환은 퇴행성 골 질환, 예를 들어, 불완전 골형성증이다.
용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항원 또는 그의 단편(예를 들어, TGFβ)에 특이적으로 결합하고, 다른 항원에 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어, 방사성면역검정(RIA), 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 비아코어(BIACORE) 또는 당업계에 알려져 있는 다른 검정에 의해 결정시, 더 낮은 친화성으로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-TGFβ 항체는 상이한 비-TGFβ 항원보다 2배 넘게 더 큰 친화성으로 TGFβ(예를 들어, hTGFβ)에 특이적으로 결합할 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 변이체 또는 단편은 관련 항원과 교차-반응성일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 hTGFβ 및 다른 TGFβ 항원(예를 들어, 설치류 또는 비인간 영장류 TGFβ 항체)과 교차-반응성일 수 있다. 바람직하게는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 변이체 또는 단편은 다른 비-TGFβ 항원과 교차-반응하지 않는다. TGFβ 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 변이체 또는 단편을 예를 들어, 면역검정, 비아코어 또는 당업자에게 알려져 있는 다른 기술에 의해 확인할 수 있다. 전형적으로, 특이적인 또는 선택적인 반응은 백그라운드 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 더욱 전형적으로는 백그라운드의 10배 초과일 것이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질 또는 항체는 1×10^-6M 내지 1×10^-7의 해리 상수로 그의 항원, 예를 들어, TGFβ에 결합할 것이다. 다른 구현예에서, 해리 상수는 1×10^-6M 내지 1×10^-8이다. 예를 들어, 항체 특이성에 관한 논의에 대해서는 문헌[Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336]을 참조한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 대상체는 바람직하게는 포유류, 예를 들어 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간), 가장 바람직하게는 인간이다. 일 구현예에서, 대상체는 TGFβ-매개 질환을 갖는 포유류, 바람직하게는 인간이다. 다른 구현예에서, 대상체는 TGFβ-매개의 질환이 발생할 위험이 있는 포유류, 바람직하게는 인간이다.
용어 "치료제"는 TGFβ-매개의 질환 및/또는 그와 관련된 징후의 치료, 관리 또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 작용제를 말한다. 특정 구현예에서, 용어 "치료제"는 TGFβ 항체를 말한다. 다른 특정 구현예에서, 용어 "치료제"는 TGFβ 항체 이외의 작용제를 말한다. 바람직하게는, 치료제는 TGFβ-매개의 질환 또는 그와 관련된 하나 이상의 징후의 치료, 관리 또는 개선을 위해 유용한 것으로 알려져 있거나, 그를 위해 사용되었거나, 현재 사용되고 있는 작용제이다.
용어 "치료법"은 TGFβ-매개의 질환(예를 들어, OI)의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 작용제를 말한다. 특정 구현예에서, 용어 "치료법(들)"은 생물학적 치료법, 지지 요법, 및/또는 당업자, 예를 들어 의료인에게 알려져 있는, TGFβ-매개의 질환의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 유용한 다른 치료법을 말한다.
용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 치료법의 시행(하나 이상의 예방 또는 치료제의 투여를 포함하나 이에 제한되지 않음)으로부터 야기되는 TGFβ-매개의 질환(예를 들어, OI)의 진행, 중증도, 및/또는 기간의 감소 또는 개선을 말한다. 특정 구현예에서, 이러한 용어는 TGFβ 수용체로의 TGFβ의 결합의 감소 또는 억제, 대상체의 TGFβ 수용체를 발현하는 세포로부터 TGFβ의 생성 또는 분비의 감소 또는 억제, 대상체의 TGFβ 수용체를 발현하지 않는 세포로부터 TGFβ의 생성 또는 분비의 감소 또는 억제, 및/또는 TGFβ-매개의 질환, 예를 들어 OI와 관련된 하나 이상의 징후의 억제 또는 감소를 말한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 경쇄 및 중쇄의 부분, 전형적으로 중쇄의 대략 아미노-말단의 120 내지 130개 아미노산 및 경쇄의 약 100 내지 110개 아미노산을 말하고, 이것은 항체 간에 서열이 크게 상이하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 영역에 집중되는 한편, 가변 도메인 내의 보다 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 경쇄 및 중쇄의 CDR은 주로 항체와 항원의 상호작용을 담당한다. 아미노산 위치의 넘버링은 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D. C.) 5^th ed. ("카바트 등")]에 기재된 바와 같은 EU 인덱스(Index)에 따른다. 바람직한 구현예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
B. 불완전 골형성증 ( OI )
OI는 골 기질 침착 또는 항상성에 수반되는 하나 이상의 단백질의 결함을 특징으로 하는 하나의 그룹의 선천성 골 장애를 포함한다. OI의 특정 유전자 돌연변이 및 생성된 단백질 결함 및 발병된 개체의 표현형에 의해 정의되는 8가지 유형의 OI가 존재한다. 표현형이 OI 유형 간에 달라지긴 하지만, 공통의 징후는 골 및 치아의 불완전한 뼈형성, 감소된 골량, 취약성 골 및 병적 골절을 포함한다.
I형 콜라겐은 석회화 및 비석회화 조직 둘 모두에서 가장 풍부한 결합 조직 단백질 중 하나이다. I형 콜라겐의 정확한 합성, 번역후 변형 및 분비는 적절한 조직 발생, 유지 및 회복에 필요하다. OI가 있는 개체에서 확인된 대부분의 돌연변이는 I형 콜라겐의 합성의 감소, 또는 I형 콜라겐의 부정확한 합성 및/또는 프로세싱을 야기한다.
I형 콜라겐 유전자에 대한 돌연변이에 더하여, 콜라겐의 세포내 수송 및 프로세싱에 관여하는 유전자의 다른 돌연변이가 OI에 걸린 개체에서 확인되었다. 이들 유전자는 분자 샤프론, 예를 들어, FK506 결합 단백질 10(FKBP10) 및 열 충격 단백질 47(HSP47)(문헌[Alanay et al., 2010]; 문헌[Christiansen et al., 2010]; 문헌[Kelley et al., 2011])을 포함한다. 분자내 콜라겐 교차-결합 유전자, 예를 들어, 프로콜라겐-라이신, 2-옥소글루타레이트 5-디옥시게나제 2(PLOD2)에서, 그리고 류신 프롤린-풍부 프로테오글리칸(레프레칸(leprecan))(LEPRE1), 펩티딜프롤릴 아이소머라제 B(사이클로필린 B)(CYPB) 및 연골 관련 단백질(CRTAP)을 포함하는 콜라겐 프롤릴 하이드록실라제 과의 유전자의 구성원에서, 추가의 돌연변이가 확인되었다(문헌[Morello et al., 2006]; 문헌[Cabral et al., 2007]; 문헌[Baldridge et al., 2008]; 문헌[van Dijk et al., 2009]; 문헌[Choi et al., 2009]; 문헌[Barnes et al., 2010]; 문헌[Pyott et al., 2011]). 돌연변이는 별개로 하고, 단백질, 예를 들어, 골 형태형성 단백질(BMP) 및 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 및 그들의 각각의 수용체는 다양한 OI 표현형에 참여하는 것으로 여겨지지만, 그들의 정확한 작용 메커니즘은 알려져 있지 않다(문헌[Gebken et al., 2000]).
일 구현예에서, TGFβ 발현은 I형 및 II형 콜라겐에 결합하는 분자에 의해 조절된다. 특정 구현예에서, 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP)은 TGFβ 발현을 조절한다. 특정 구현예에서, 데코린은 TGFβ 합성을 조절한다. 특정 구현예에서, 데코린은 I형 또는 II형 콜라겐에 결합하지 않으며, 여기서, 3-하이드록시프롤린 부위는 I형 및/또는 II형 콜라겐 분자의 위치 986에서 부재이다.
C. 골 생물학
척추동물 골격은 구조, 지지, 보호 및 이온 수송을 조절하기 위한 미네랄의 공급원을 제공하는 살아 있는 석회화된 조직인 골로 이루어진다. 골은 세포 및 무세포 성분 둘 모두로 이루어진 특수 결합 조직이다. 무세포 세포외 기질(ECM)은 콜라겐성 및 비-콜라겐성 단백질 둘 모두를 함유하며, 그들 둘 모두는 석회화 프로세스에 참여한다. 정확하게 분비되고 정렬된 ECM은 적절한 골 형성에 중요하다. 불완전 골형성증에서 입증된 바와 같이, ECM 단백질 중 임의의 것이 부재이거나, 기형이거나 오정렬되는 경우 병적이상이 발생한다.
용어 "피질 골" 또는 "치밀 골"은 치밀하고, 강성이며, 강인한 골의 외층을 말한다. 용어 "골소주 골" 또는 "해면골"은 피질 골보다 더 가볍고, 덜 치밀한 골의 해면 내층이다. 용어 "골소주"는 해면골의 미세한 구조 유닛을 말하며, 이는 막대-유사 형상이며, 콜라겐성 조성의 것이다.
골은 끊임없는 재형성을 겪는 역동적인 조직이다. 용어 "조골세포"는 유골(osteoid)을 침착시키는 최종-분화된 골 형성 세포를 말한다. 용어 "유골"은 주로 I형 콜라겐으로 이루어진 미성숙, 탈미네랄화된 골을 말한다. 용어 "전구-조골세포"는 완전히 분화되지 않은 증식성 미성숙 조골세포를 말한다. 용어 "골 조상 세포(osteoprogenitor)"는 조골세포를 포함하는 몇몇 기질 세포 유형이 생기게 하는 만능 세포를 말한다. 흔히 "중간엽 줄기 세포"로 지칭되는 골 조상 세포는 골수에서 발생하며, 소수는 순환하는 혈액으로부터 분리될 수 있다. 용어 "파골세포"는 골수 단핵구의 자손인 최종-분화된 골 흡수 세포를 말한다. 파골세포는 그들의 타르트레이트 저항성 산 포스파타제(TRAP)의 발현에 의해 확인될 수 있다.
조골세포 및 파골세포는 정상의 항상성 조건하에서, 함께 골 무결성을 유지하기 위하여 작용한다. 골 침착 및 골 흡수가 분리되면, 병적이상이 발생한다. 예를 들어, 골화석증은 비흡수성 파골세포의 결과인 지나치게 치밀하고 단단한 골을 특징으로 하는 골 질환인데 반하여, 골다공증은 증가된 파골세포 활성으로부터 야기될 수 있는 취약성, 다공성 골을 특징으로 하는 골 장애이다. 증거에 의해, 파골세포 활성이 불완전 골형성증에서 증가될 수 있음이 뒷받침되며, 이는 치료적 개입에 잠재적인 표적으로서 이들 세포 유형을 관련시킨다. 본 개시내용은 TGFβ 항체를 사용한 파골세포의 억제 방법을 포함한다.
조직학 및 조직형태계측, 원자력 현미경, 공초점 라만(Raman) 현미경, 나노압입(nanoindentation), 3-점 굽힘 시험, X-선 영상화 및 마이크로 전산화 단층촬영(μ-CT)을 포함하는 몇몇의 방법을 사용하여, 골의 구조, 밀도 및 질을 측정하고 특성화시킬 수 있다. 예시된 구현예에서, 이들 방법 중 적어도 하나에 의해 골을 측정하고 특성화한다.
용어 "골 부피 밀도"는 석회화된 물질(골 부피 또는 BV)로 이루어진 주어진 골의 부피(총 부피 또는 TV)의 분율을 말한다. 따라서, 골 부피 밀도는 BV/TV로 계산하고, 백분율로 기록한다. 용어 "특정 골 표면"은 총 골 표면(BS)/주어진 골의 부피를 말한다. 따라서, 특정 골 표면은 BS/TV로 계산한다. 다른 통상의 골 척도는 골 면적(B.Ar), 골소주 개수(Tb.N); 골소주 간격(Tb.Sp); N.Oc(파골세포 개수); Oc.S(파골세포 표면적); Oc.S/BS; 조골세포 개수(N.Ob), 조골세포 표면적(Ob.S), 조골세포 둘레(Ob.Pm) 및 상기 척도 중 임의의 것의 파생물을 포함한다. 보다 큰 Oc.S/BS는 파골세포에 의한 증가된 골 흡수의 지표이다.
D. 형질전환 성장 인자 베타( TGFβ )
TGFβ는 세포 증식 및 분화, 배아 발생, 세포외 기질 형성, 골 발생, 상처 치유, 조혈작용, 및 면역 및 염증성 반응에 수반되는 다작용성 사이토카인이다(문헌[Roberts et al., 1981]; 문헌[Border et al., 1995a]). 분비된 TGFβ 단백질은 잠재성-관련 펩티드(LAP) 및 성숙 TGFβ 펩티드로 절단되며, 잠재성 및 활성 형태로 관찰된다. 성숙 TGFβ 펩티드는 동종이량체, 및 다른 TGFβ 과 구성원과 이종이량체 둘 모두를 형성한다. TGFβ는 임의의 천연의 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 합성에 의해(예를 들어, 재조합 DNA 기술의 사용에 의해) 생성될 수 있다. 바람직하게는 TGFβ 분자는 본원에 "hTGF"로 알려져 있는 인간 유래의 것이다.
3개의 인간 TGFβ 아이소폼, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3(각각 스위스 프로트(Swiss Prot) 수탁 번호 P01137, P08112 및 P10600)가 존재하며, 그들은 그들의 생물학적 활성 상태에서, 쇄-간 이황화 교차결합에 의해 연결된 2개의 112개 아미노산 단량체를 포함하는 25 kDa 동종이량체이다. TGF-β1은 TGF-β2와는 27개, TGF-β3와는 22개의, 주로 보존적인 아미노산 변화에 의해 상이하다. 이들 차이는 X선 결정학에 의해 결정되는 TGFβ의 3차원 구조에 대하여 맵핑되었고(문헌[Schlunegger et al., 1992]; 문헌[Peer et al., 1996]), 수용체 결합 영역이 정의되었다(문헌[Griffith et al., 1996]; 문헌[Qian et al., 1996]).

인간에는 3개의 TGFβ 수용체, TGFβ 수용체 1, 2 및 3이 존재하며, 이는 TGFβ 단백질 과 구성원에 대한 친화성을 포함하는 그들의 구조 및 기능 특성에 의해 구별될 수 있다. 동종이량체 또는 이종이량체 TGFβ 막횡단 수용체 복합체로의 TGFβ 단백질의 결합은 세포내 SMAD 단백질에 의해 매개되는 원형 TGFβ 신호전달 경로를 활성화시킨다.
TGFβ의 탈조절은 인간에서 선천적 결함, 암, 만성 염증성, 자가면역 질환 및 섬유증 질환과 같은 수많은 증상에 연루되는 병적 과정을 야기한다(문헌[Border et al., 1994]; 문헌[Border et al., 1995b]).
인간 TGFβ는 마우스 TGFβ와 매우 유사하다: 인간 TGFβ1은 마우스 TGFβ1과 오직 하나의 아미노산 차이만을 가지며; 인간 TGFβ2는 마우스 TGFβ2와 오직 3개의 아미노산 차이만을 갖고; 인간 TGFβ3는 마우스 TGFβ3와 동일하다.
E. 형질전환 성장 인자 베타( TGFβ )에 결합하는 분자
본 발명은 TGFβ에 결합하는 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. TGFβ 결합제는 임의의 결합 분자, 예를 들어, 항체, 융합 단백질(예를 들어, 이뮤노아드헤신(immunoadhesin)), siRNA, 핵산, 압타머, 단백질 또는 소분자 유기 화합물일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 TGFβ에 결합하는 항체(항-TGFβ 항체) 또는 그의 변이체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 항-TGFβ 항체는 TGFβ 단백질, 폴리펩티드 단편 또는 에피토프에 특이적으로 결합한다. TGFβ에 결합하는 분자는 임의의 종 유래의 것일 수 있다.
예시적인 특정 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 인간화 항체, 완전 인간 항체 또는 그의 변이체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 바람직한 항-TGFβ 항체는 TGFβ와 그의 수용체의 결합을 방지하고, TGFβ 생물학적 활성(예를 들어, TGFβ 수용체-매개의 세포내 SMAD 신호전달 및 생성되는 세포 활성)을 억제한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 레르델리무맙(Lerdelimumab)(CAT-152), 메텔리무맙(Metelimumab)(CAT-192), 프레솔리무맙(Fresolimumab)(GC-1008), LY2382770, STX-100 또는 IMC-TR1이다.
구체적인 특정 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 하기의 상보성 결정 영역(CDR) 중 임의의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다:

구체적인 다른 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 하기의 상보성 결정 영역(CDR) 중 임의의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다:

구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
다른 구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
더욱 구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:

다른 구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:

더욱 구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 불변 영역, 예를 들어, 인간 IgG 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG4 불변 영역이다. 추가의 구현예에서, 불변 영역은 변형된 인간 IgG4 불변 영역이다. 바람직하게는, IgG4 불변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다:

다른 구현예에서, 불변 영역은 인간 Cκ 불변 영역이다. 바람직하게는, Cκ 불변 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다:

구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다:

위치 1 내지 120: 중쇄의 가변 영역(VH). CDR(상보성 결정 영역, 카바트 정의에 따름)은 밑줄 표시됨.
위치 121 내지 447: 인간 IgG4의 불변 영역(스위스프로트 IGHG4_HUMAN).
다른 구체적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다:

위치 1 내지 108: 경쇄의 가변 영역(VL). CDR(상보성 결정 영역, 카바트 정의에 따름)은 밑줄 표시됨.
위치 109 내지 215: 인간 Cκ의 불변 영역.
추가의 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 리더 서열을 포함하는 것으로서, 숙주 세포에 의해 발현된다. 리더 서열은 바람직하게는 1 내지 30개 아미노산 길이의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 25 내지 25개 아미노산, 가장 바람직하게는 19개 아미노산을 포함한다. 중쇄, 경쇄 또는 중쇄 및 경쇄 둘 모두는 리더 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 리더 서열은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

따라서, 미가공 중쇄를 발현할 수 있는 숙주 세포는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

여기서,
위치 1 내지 19: 리더 서열
위치 20 내지 139: 중쇄의 가변 영역(VH). CDR(상보성 결정 영역, 카바트 정의에 따름)은 밑줄 표시됨.
위치 140 내지 466: 인간 IgG4의 불변 영역(스위스프로트 IGHG4_HUMAN).
다른 예시적인 구현예에서, 미가공 경쇄를 발현하는 숙주 세포는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

여기서,
위치 1 내지 19: 리더 서열
위치 20 내지 127: 경쇄 가변 영역(VL). CDR(상보성 결정 영역, 카바트 정의에 따름)은 밑줄 표시됨.
위치 128 내지 234: 인간 Cκ의 불변 영역.
본 발명의 예시적인 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 인간화 또는 완전 인간 항체이다. 인간화 및 완전 인간 항체 아이소타입의 예에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 포함된다. 바람직하게는, 항-TGFβ 항체는 IgG 항체이다. 4가지 형태의 IgG가 존재한다. 바람직하게는, 항-TGFβ 항체는 IgG4 항체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 인간화 IgG4 항체이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 완전 인간 IgG4 항체이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IgG4 항-TGFβ 항체이다. 본 발명의 대안적인 가장 바람직한 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 IgG4 항-TGFβ 항체이며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 3개의 CDR을 포함한다. SEQ ID NO: 14를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 15를 포함하는 경쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO: 9와 상응하는 CDR 서열을 포함하는 항-TGFβ 항체를 포함하는 항-TGFβ 항체의 확인, 분리, 제조 및 특성화는 전문이 각각 본원에 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제7,723,486호 및 미국 특허 제8,383,780호에 상세히 기술되어 있다.
바람직하게는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 "범-특이적"이며, 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합하며, 길항제로서 작용한다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합하며, 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3를 중화시킨다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 예시적인 범-특이적 항-TGFβ 모노클로널 항체(mAb)는 전문이 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,723,476호 및 제8,383,780호에 기술되어 있다.
1D11.16은 매우 다양한 시험관내 검정에서 인간 및 마우스 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3를 중화시키는 예시적인 뮤린 범-특이적 항-TGFβ 항체이며(전문이 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌[Dasch et al., 1989]; 문헌[Dasch et al., 1996]; MAB1835에 대한 알앤디 시스템(R&D System) 제품 설명서), 섬유증의 동물 모델에서의 원리 증명 연구에 효과적이다(문헌[Ling et al., 2003]; 문헌[Miyajima et al., 2000]; 문헌[Schneider et al., 1999]; 문헌[Khanna et al., 1999]; 문헌[Shenkar et al., 1994]). 그러나, 1D11.16이 뮤린 모노클로널 항체이기 때문에(문헌[Dasch et al., 1989]; 문헌[Dasch et al., 1996]), 그것은 인간에서의 치료적 이용을 위해 바람직하지 않다. 따라서, 특정 구현예에서, 1D11.16 항체의 변이체 또는 유도체를 본 발명에 사용한다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 특정 구현예는 또한 항-TGFβ 항체의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IgG4 항-TGFβ 항체인 항-TGFβ 항체의 변이체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 1D11.16 항체의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 항-TGFβ 항체의 변이체는 그들의 높은 유사성에 기초하여 유사한 물리화학적 특성을 가질 수 있으며, 이에 따라, 또한 본 발명에 범주에 포함된다. 변이체는 본원에 기재된 항-TGFβ 항체와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%, 예를 들어, 적어도 98% 또는 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지며, TGFβ 폴리펩티드, TGFβ 폴리펩티드 단편 또는 TGFβ 에피토프로의 결합을 위해 경쟁할 수 있는 항체로 정의된다. 바람직하게는, 변이체는 TGFβ와 그의 수용체의 결합, 및 TGFβ 생물학적 활성(예를 들어, TGFβ 수용체-매개의 세포내 SMAD 신호전달 및 생성되는 세포 활성)을 개선시키거나, 중화시키거나, 다르게는 억제할 것이다. 표적으로의 결합에 대한 경쟁을 결정하는 것은 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 행해질 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 인간 항체이며, 바람직하게는 IgG4 분자이다. 바람직한 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IgG4 항-TGFβ 항체와 아미노산 서열이 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 용어 "변이체"는 항-TGFβ 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 서열이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 말한다. 변이체는 아미노산 치환, 변형, 부가 및 결실을 포함하는 보존적 서열 변형을 가질 수 있다.
변형의 예에는 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/블로킹 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 절단 및 세포 리간드 또는 다른 단백질로의 결합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 아미노산 변형은 당업계에 알려져 있는 표준 기술, 예를 들어, 위치-지정 돌연변이유발, 분자 클로닝, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발 및 무작위 PCR-매개의 돌연변이유발에 의해 항체를 인코딩하는 핵산에 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 구조 또는 화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 과는 당업계에 정의되어 있다. 이들 과에는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)를 갖는 아미노산이 포함된다. 상기 사용되는 것 이외의 아미노산 잔기 과의 분류도 또한 사용할 수 있는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 추가로, 변이체는 비보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 상이한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기로의 아미노산의 대체를 가질 수 있다. 또한, 유사한 미소한 변이는 아미노산 결실 또는 삽입 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 면역학적 활성을 없애지 않고, 치환, 변형, 삽입 또는 결실될 수 있는지의 결정의 지침은 당업계에 잘 알려져 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾을 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어, 특히 갭(Gap) 또는 베스트핏(Bestfit)을 사용하여, 비교할 아미노산 서열을 최적으로 정렬하고, 유사하거나 동일한 아미노산 잔기를 정할 수 있다. 변이체는 항-TGFβ 항체와 비교하여 동일하거나 상이한, 더 높거나 더 낮은 결합 친화성을 가질 수 있으나, 여전히 TGFβ에 특이적으로 결합하고, 항-TGFβ 항체와 동일하거나, 더 높거나 더 낮은 생물학적 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 구현예는 항-TGFβ 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 용어 "항원 결합 도메인", "항원 결합 영역", "항원 결합 단편" 및 유사 용어는 항원과 상호작용하고, 항원에 대한 그의 특이성 및 친화성을 결합 작용제에 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 부분을 말한다(예를 들어, 상보성 결정 영역(CDR)). 항원 결합 영역은 임의의 동물 종, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 토끼, 랫트 또는 햄스터) 및 인간으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 영역은 인간 기원의 것일 것이다. 항원 결합 단편의 비제한적인 예에는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv(scFv) 분자, dAb 단편 및 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위가 포함된다.
F. 치료적 투여
본원에 기술된 방법은 TGFβ에 결합하는 치료적 유효량의 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은, 어구 "치료적 유효량"은 OI와 관련된 하나 이상의 징후의 검출가능한 개선을 야기하거나, 불완전 골형성증의 증상 또는 징후(들)를 야기하는 기초가 되는 발병 메커니즘(들)과 상호관련된 생물학적 효과(예를 들어, 특정 바이오마커의 수준의 감소)를 야기하는, TGFβ에 결합하는 항체의 용량을 의미한다. 예를 들어, 골 무기질 밀도를 증가시키고/거나 골량 및/또는 골 강도를 증가시키고/거나 골 및/또는 치아 골절을 감소시키고/거나 OI의 임의의 진단 척도를 개선시키는, TGFβ에 결합하는 항체의 용량은 치료적 유효량으로 간주된다.
일 구현예에서, 골 무기질 밀도, 골량 및/또는 골 강도는 TGFβ에 결합하는 항체로의 처치 후에 약 5% 내지 약 200% 증가한다. 특정 구현예에서, 골 무기질 밀도, 골량 및/또는 골 강도는 TGFβ에 결합하는 항체로의 처치 후에 약 5% 내지 약 10%, 10% 내지 약 15%, 15% 내지 약 20%, 20% 내지 약 25%, 25% 내지 약 30%, 30% 내지 약 35%, 35% 내지 약 40%, 40% 내지 약 45%, 45% 내지 약 50%, 50% 내지 약 55%, 55% 내지 약 60%, 60% 내지 약 65%, 65% 내지 약 70%, 70% 내지 약 75%, 75% 내지 약 80%, 80% 내지 약 85%, 85% 내지 약 90%, 90% 내지 약 95%, 95% 내지 약 100%, 100% 내지 약 105%, 105% 내지 약 110%, 110% 내지 약 115%, 115% 내지 약 120%, 120% 내지 약 125%, 125% 내지 약 130%, 130% 내지 약 135%, 135% 내지 약 140%, 140% 내지 약 145%, 145% 내지 약 150%, 150% 내지 약 155%, 155% 내지 약 160%, 160% 내지 약 165%, 165% 내지 약 170%, 170% 내지 약 175%, 175% 내지 약 180%, 180% 내지 약 185%, 185% 내지 약 190%, 190% 내지 약 195% 또는 195% 내지 약 200% 증가된다.
특정 구현예에서, 골 흡수의 혈청 바이오마커, 예를 들어, 요중 하이드록시프롤린, 요중 총 피리디놀린(PYD), 요중 유리 데옥시피리디놀린(DPD), 요중 I형 콜라겐 교차결합된 N-텔로펩티드(NTX), 요중 또는 혈청 I형 콜라겐 교차결합된 C-텔로펩티드(CTX), 골 시알로단백질(BSP), 오스테오폰틴(OPN) 및 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP)를 감소시키는 항체의 용량은 치료적 유효량으로 간주된다. 일 구현예에서, 골 흡수의 혈청 바이오마커는 TGFβ에 결합하는 항체로의 처치 후에 약 5% 내지 약 200% 감소된다.
일 구현예에서, 골 흡수의 혈청 바이오마커, 예를 들어, 요중 하이드록시프롤린, 요중 총 피리디놀린(PYD), 요중 유리 데옥시피리디놀린(DPD), 요중 I형 콜라겐 교차결합된 N-텔로펩티드(NTx), 요중 또는 혈청 I형 콜라겐 교차결합된 C-텔로펩티드(CTX), 골 시알로단백질(BSP), 오스테오폰틴(OPN) 및 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP)는 TGFβ에 결합하는 항체로의 처치 후에 약 5% 내지 약 10%, 10% 내지 약 15%, 15% 내지 약 20%, 20% 내지 약 25%, 25% 내지 약 30%, 30% 내지 약 35%, 35% 내지 약 40%, 40% 내지 약 45%, 45% 내지 약 50%, 50% 내지 약 55%, 55% 내지 약 60%, 60% 내지 약 65%, 65% 내지 약 70%, 70% 내지 약 75%, 75% 내지 약 80%, 80% 내지 약 85%, 85% 내지 약 90%, 90% 내지 약 95%, 95% 내지 약 100%, 100% 내지 약 105%, 105% 내지 약 110%, 110% 내지 약 115%, 115% 내지 약 120%, 120% 내지 약 125%, 125% 내지 약 130%, 130% 내지 약 135%, 135% 내지 약 140%, 140% 내지 약 145%, 145% 내지 약 150%, 150% 내지 약 155%, 155% 내지 약 160%, 160% 내지 약 165%, 165% 내지 약 170%, 170% 내지 약 175%, 175% 내지 약 180%, 180% 내지 약 185%, 185% 내지 약 190%, 190% 내지 약 195% 또는 195% 내지 약 200% 감소된다.
특정 구현예에서, 골 침착의 혈청 바이오마커, 예를 들어, 총 알칼리성 포스파타제, 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신 및 I형 프로콜라겐(C-말단/N-말단)을 증가시키는 항체의 용량은 치료적 유효량으로 간주된다. 일 구현예에서, 골 침착의 혈청 바이오마커는 TGFβ에 결합하는 항체로의 처치 후에 약 5% 내지 약 200% 증가된다.
일 구현예에서, 골 침착의 혈청 바이오마커, 예를 들어, 총 알칼리성 포스파타제, 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신 및 I형 프로콜라겐(C-말단/N-말단)은 TGFβ에 결합하는 항체로의 처치 후에 약 5% 내지 약 10%, 10% 내지 약 15%, 15% 내지 약 20%, 20% 내지 약 25%, 25% 내지 약 30%, 30% 내지 약 35%, 35% 내지 약 40%, 40% 내지 약 45%, 45% 내지 약 50%, 50% 내지 약 55%, 55% 내지 약 60%, 60% 내지 약 65%, 65% 내지 약 70%, 70% 내지 약 75%, 75% 내지 약 80%, 80% 내지 약 85%, 85% 내지 약 90%, 90% 내지 약 95%, 95% 내지 약 100%, 100% 내지 약 105%, 105% 내지 약 110%, 110% 내지 약 115%, 115% 내지 약 120%, 120% 내지 약 125%, 125% 내지 약 130%, 130% 내지 약 135%, 135% 내지 약 140%, 140% 내지 약 145%, 145% 내지 약 150%, 150% 내지 약 155%, 155% 내지 약 160%, 160% 내지 약 165%, 165% 내지 약 170%, 170% 내지 약 175%, 175% 내지 약 180%, 180% 내지 약 185%, 185% 내지 약 190%, 190% 내지 약 195% 또는 195% 내지 약 200% 증가된다.
다른 구현예는 OI에 의해 영향을 받은 비골격 기관의 기능을 개선시키는 치료적 유효 용량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 청각, 폐 및/또는 신장 기능을 개선시키는 TGFβ에 결합하는 항체의 용량은 치료적 유효량으로 간주된다.
본 발명의 방법에 따르면, 대상체에게 투여되는 TGFβ에 결합하는 항체의 치료적 유효량은 대상체의 연령 및 크기(예를 들어, 체중 또는 체표면적), 및 투여 경로 및 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 인자에 따라 달라질 것이다.
예시적인 특정 구현예에서, 항-TGFβ 항체는 대상체에게 피하 용량으로 투여된다. 다른 예시적인 투여 방식은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼러스(bolus) 주사에 의해, 상피 내층 또는 점막피부 내층(예컨대, 구강점막, 직장 및 장관점막 등)을 통한 흡수에 의해, 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 작용제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소로 이루어질 수 있다. TGFβ 항체는 비경구 또는 피하 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐에서의 캡슐화, 수용체 매개의 엔도시토시스가 알려져 있고, 약제학적 조성물을 투여하는 데 이용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 치료적 조성물은 적절한 담체, 부형제 및 개선된 수송, 전달, 용인성 등을 제공하기 위하여 제형 내에 혼입되는 다른 작용제와 함께 투여될 것이다. 다수의 적절한 제형들은 모든 약사에게 알려져 있는 처방집에서 찾아볼 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA). 이들 제형은 예를 들어, 산제, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소낭(예를 들어, 리포펙틴(LIPOFECTIN)™), DNA 컨쥬게이트, 무수의 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 또한, 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다.
약제학적 조성물은 활성 성분의 용량을 맞추는 데 적합한 단위 용량의 투여형으로 제조될 수 있다. 이러한 단위 용량의 투여형은, 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다.
약제학적 조성물은 또한, 임의의 허용되는 장치 또는 메커니즘을 이용하여 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 주사기 및 주사바늘을 사용하여, 또는 재사용가능한 펜 및/또는 자동주사기 전달 장치로 달성될 수 있다. 본 발명의 방법은 TGFβ 결합제(또는 결합제를 포함하는 약제학적 제형)를 투여하기 위하여 수많은 재사용가능한 펜 및/또는 자동주사기 전달 장치를 이용하는 것을 포함한다. 이러한 장치의 예로 몇 가지만을 언급하자면, 오토펜(AUTOPEN)™(영국 우드스탁 소재의 우웬 멈포드, 인코포레이티드(Owen Mumford, Inc.)), 디세트로닉(DISETRONIC)™ 펜(스위스 버그도프 소재의 디세트로닉 메디컬 시스템즈(Disetronic Medical Systems)), 휴마로그 믹스(HUMALOG MIX) 75/25™ 펜, 휴마로그(HUMALOG)™ 펜, 휴말린(HUMALIN) 70/30™ 펜(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 일리 릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Co.)), 노보펜(NOVOPEN)™ I, II 및 III(덴마크 코펜하겐 소재의 노보 노르디스크(Novo Nordisk)), 노보펜 주니어(NOVOPEN JUNIOR)™(덴마크 코펜하겐 소재의 노보 노르디스크), BD™ 펜(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)), 옵티펜(OPTIPEN)™, 옵티펜 프로(OPTIPEN PRO)™, 옵티펜 스탈렛(OPTIPEN STARLET)™, 및 옵티클릭(OPTICLIK)™(독일 프랑크푸르트 소재의 사노피-아벤티스(sanofi-aventis))이 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. 약제학적 조성물의 피하 전달에 응용을 갖는 일회용 펜 및/또는 자동주사기 전달 장치의 예로 몇 가지만을 언급하자면, 솔로스타(SOLOSTAR)™ 펜(사노피-아벤티스), 플렉스펜(FLEXPEN)™(노보 노르디스크) 및 퀵크펜(KWIKPEN)™(일리 릴리), 슈어클릭(SURECLICK)™ 자동주사기(미국 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재의 암젠(Amgen)), 펜렛(PENLET)™(독일 슈투트가르트 소재의 하셀마이어(Haselmeier)), 에피펜(EPIPEN)(Dey, L.P.) 및 휴미라(HUMIRA)™ 펜(미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 랩스(Abbott Labs))이 포함되나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 대상체에게 TGFβ 결합제(또는 결합제를 포함하는 약제학적 제형)를 전달하기 위하여 마이크로주입기(microinfusor)를 이용하는 것도 본원에서 고려된다. 본원에 사용된 용어 "마이크로주입기"는 장시간(예컨대, 약 10, 15, 20, 25, 30분 이상)에 걸쳐 많은 부피(예를 들어, 최대 약 2.5 ㎖ 이상)의 치료적 제형을 서서히 투여하도록 설계된 피하 전달 장치를 의미한다. 예컨대, 미국 특허 제6,629,949호; 미국 특허 제6,659,982호; 및 문헌[Meehan et al., J. Controlled Release 46:107-116 (1996)]을 참조한다. 마이크로주입기는 고농도(예컨대, 약 100, 125, 150, 175, 200 ㎎/㎖ 이상) 및/또는 점성의 용액 내에 함유된 대용량의 치료적 단백질의 전달에 특히 유용하다.
G. 병용 요법
특정 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 추가의 치료제와 병용하여, TGFβ에 결합하는 항체를 OI의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 OI의 치료 방법을 포함한다. 본 발명의 방법의 실시에서 항-TGFβ 항체와 병용하여 투여될 수 있는 추가의 치료제의 예에는 비스포스포네이트, 칼시토닌, 테리파라티드(teriparatide) 및 대상체에서 불완전 골형성증을 치료하거나 예방하거나 개선하는 것으로 알려져 있는 임의의 다른 화합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에서, 추가의 치료제(들)는 TGFβ에 결합하는 항체와 동시에 또는 그와 연속하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 동시의 투여를 위하여, TGFβ에 결합하는 항체 및 적어도 하나의 추가의 치료제 둘 모두를 포함하는 약제학적 제형이 제조될 수 있다. 일 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 약제학적 비스포스포네이트(예를 들어, 에티드로네이트(Etidronate), 클로드로네이트(Clodronate), 틸루드로네이트(Tiludronate), 파미드로네이트(Pamidronate), 네리드로네이트(Neridronate), 올파드로네이트(Olpadronate), 알렌드로네이트(Alendronate), 이반드로네이트(Ibandronate), 졸레드로네이트(Zoledronate) 및 리세드로네이트(Risedronate)와 병용하여 투여된다. 다른 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 골 형성을 자극하는 약물, 예를 들어, 부갑상선 호르몬 유사체 및 칼시토닌과 병용하여 투여된다. 또 다른 구현예에서, TGFβ에 결합하는 항체는 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)와 병용하여 투여된다. 본 발명의 방법의 실시에서 TGFβ에 결합하는 항체와 병용하여 투여되는 추가의 치료제의 양은 당업계에 알려져 있고 용이하게 이용가능한 통상의 방법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
실시예
OI는 병에 걸린 개체가 I형 콜라겐의 알파 1 또는 알파 2 쇄의 일차 서열의 돌연변이 및 I형 콜라겐, 및 I형 콜라겐 피브릴에 결합하는 단백질의 번역후 변형의 이상으로 인하여, I형 콜라겐 피브릴 형성의 이상을 나타내는 전신 결합 조직 질환이다. CRTAP는 연골 관련 단백질로 지칭되는 단백질, I형 콜라겐의 적절한 폴딩, 번역후 변형 및 분비를 보조하는 기능을 하는 프롤릴-3-하이드록실화 복합체의 구성원을 인코딩한다. CRTAP에 대한 돌연변이는 VII형 불완전 골형성증의 원인이 된다. Crtap 유전자가 결여된 마우스(Crtap^-/-)는 불완전 골형성증을 모방하는 표현형을 나타내며, 이러한 질환의 모델로 사용된다(문헌[Morello et al., 2006]). Crtap ^-/- 마우스 및 연령-매치된 야생형(WT) 한배새끼 대조군을 하기의 실시예에 사용하였다.
재료 및 방법
동물, 항- TGFβ 처치 및 조직 수집
Crtap ^-/- 마우스를 생성하고, 혼합된 C57Black/6J/129Sv 유전자 백그라운드에서 유지하였다. Col1a2 유전자에 G610C 돌연변이를 지니는 마우스(Col1α 2 ^tm1.1Mcbr )를 수득하고, 야생형 C57Bl/6J 마우스와 교배하였다. Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 대립형질에 대해 이형접합성이었던 마우스를 실험을 위해 사용하였다. Smad2/3 의존성 TGFβ 신호전달 경로에 반응하여 루시퍼라제를 발현하는 TGFβ-리포터 마우스(SBE-Luc 마우스)를 수득하고, 2 세대 동안 Crtap ^+/- 마우스와 교배하여, 리포터 트랜스진(transgene)을 발현하는 Crtap ^-/- 마우스 및 야생형 한배새끼를 생성하였다. 모든 마우스를 사육장에 가두고, 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인된 프로토콜에 따라 동물 실험을 수행하였다.
단백질 및 RNA 분석을 위하여, P3 마우스의 두개관을 분리하고, 골외 조직을 없애고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. Crtap ^-/- P10 마우스 폐의 면역염색을 위하여, 각 마우스의 폐를 희생 직후에 25 ㎝ H₂O의 고정 압력에서 4% 파라포름알데히드를 사용하여 중력에 의해 똑같이 부풀게 한 다음, 기도에서 봉합을 폐쇄하였다. 그 다음, 폐를 흉부로부터 조심히 절개하고, 4% 파라포름알데히드에서 하룻밤 고정시켰다.
8주령 암컷 Crtap ^-/- 및 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스를 범-TGFβ 중화 항체 1D11으로 8주 동안 처치하였다(10 ㎎/㎏(체중), 매주 3회 복강내 주사). 대조군 Crtap ^-/- , Col1α2 ^tm1.1Mcbr 및 야생형 마우스에 동일한 IgG1 아이소타입의 대조군 항체(13C4)를 제공하였다. 처치 후에, 마우스를 희생시키고, microCT 및 골 조직형태계측을 위해 요추 및 대퇴골을 수집하고, 10% 포르말린에서 고정하였다. 생체역학적 시험을 수행할 때까지, Crtap ^-/- 마우스의 반대쪽 대퇴골을 염수에 적신 거즈로 싸서 -20℃에서 보관하였다. 이들 Crtap ^-/- 마우스의 폐를 P10 마우스에 대해 기재된 바와 동일하게 부풀게 하고 수집하고 고정하였다. 1D11 또는 대조군 항체를 그룹 배정에 따라 주사하였기 때문에, 처치 동안 결합이 가능하지 않았다. 모든 이후의 분석에서, 조사관은 유전형 및 처치군에 대하여 맹검시험하였다.
면역블롯팅
단백질을 급속 동결된 P3 두개관 시료로부터 추출하고, 300 ㎕ 용해 완충제(0.0625 M Tris-HCl pH 7.5, 2% SDS, 5 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄ 및 로슈컴플리트(RocheComplete) 프로티나제 억제제)로 옮기고, 1분 동안 균질화시킨 다음, 95℃에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 원심분리 필터 유닛(Centrifugal Filter Unit)/아미콘 울트라(Amicon Ultra) 3K(밀리포어(Millipore))로 옮기고, 원심분리하여 단백질을 농축시켰다. 용해물의 총 단백질 농도를 제조처의 지침에 따라 Micro BCA 시약(피어스(Pierce))을 사용하여 측정하였다. 40 ㎍의 두개관 단백질 추출물을 5% β-머캅토에탄올을 함유하는 라엠멜리(laemmeli) 완충제에 현탁화시키고, 미니 프로테안(Mini Protean) TGX SDS-PAGE 겔(기울기 4-20%; 바이오-라드(Bio-Rad))에서 분리하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. PVDF 멤브레인을 pSmad2 모노클로널 항체(셀 시그널링(Cell Signaling) #3108, 5% BSA를 함유하는 TBST 중에 1:750, 하룻밤) 후에 이차 HRP-연결 항-토끼 항체(GE, 5% BSA를 함유하는 TBST 중에 1:5000, 2시간 동안)와 함께 인큐베이션시킨 다음, ECL 플러스(Plus) 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(GE)으로 처리하고, X-선 필름에 노출시켰다. 이후에, 항체를 리블롯 플러스(ReBlot Plus) 시약(밀리포어)을 사용하여 멤브레인으로부터 떼어내고, Smad2 모노클로널 항체(셀 시그널링 #5339, 5% BSA를 함유하는 TBST 중 1:2000, 하룻밤)와 함께 인큐베이션시킨 다음, 유사한 2차 항체 인큐베이션 및 ECL 매개의 가시화를 행하였다. X-선 필름을 스캐닝하고, 각 밴드의 농도를 ImageJ 소프트웨어(미국 국립보건원)를 사용하여 정량화하였다.
정량적 리얼타임 PCR
총 RNA를 트리졸(Trizol) 시약(인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 급속 동결된 P3 마우스 두개관으로부터 추출하였다. 슈퍼스크립트(Superscript) III RT 시스템(인비트로겐)을 사용하여 제조처의 프로토콜에 따라 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 정량적 RT-PCR을 유전자-특이적 프라이머 및 SYBR 그린(Green) I 시약(로슈)을 사용하여 LightCycler.v 1.5(로슈)에서 수행하였다. cDNA 농도를 정규화시키기 위한 참조 유전자로서 β2-마이크로글로불린을 사용하였다.
생체내 생물발광 영상화
TGFβ-리포터 트랜스진을 발현하는 P10 Ctrap ^-/- 마우스 및 야생형 한배새끼(SBE-Luc 마우스)에 D-루시페린(골드바이오(Goldbio), 150 ㎎/㎏, 복강내)을 주사하고, 이소플루란으로 마취시키고, 생물발광 영상화 시스템(제노겐(Xenogen))을 사용하여 주사 10분 후에 영상화시켰다.
일차 조골세포 배양, TGFβ -리포터 세포
골수 세포를 대략 2개월령 Crtap ^-/- 및 야생형 마우스의 경골 및 대퇴골로부터 분리하고, 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 α-MEM에서 배양하였다. 배지를 2일마다 교체하고, 미부착된 세포를 폐기하였다. 7일 후에, 골수 기질 세포(BMSC)로 정의되는 부착된 세포를 ㎠당 2.5×10⁴개의 세포로 24-웰 플레이트에 다시 씨딩하고, 골원성 배지(α-MEM, 10% FBS, 500 μM 아스코르브산 및 10 mM β-글리세로포스페이트)에서 3일 동안 배양하였다. 조절된 배지를 수집하고, PAI-루시퍼라제 리포터 밍크 폐 상피 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, 세포 용해물을 루시퍼라제 활성 검정을 위해 수집하고, 듀얼-루시퍼라제(Dual-Luciferase) 리포터 시스템(프로메가(Promega))을 사용하여 측정하였다. 결과를 마이크로(Micro) BCA 시약(피어스)을 사용하여 정량화된 총 단백질 양으로 정규화시켰다.
MicroCT , 뼈 조직형태계측
요추 및 대퇴골을 골소주 및 피질 골 파라미터의 정량화를 위해 스칸코(Scanco) μCT-40 microCT를 사용하여 스캐닝하였다. 척추체 L4의 골소주 골 및 대퇴골의 원위 뼈몸통끝 섹션을 수동으로 윤곽대비시킴으로써 척추 및 대퇴 골소주 골 파라미터를 스칸코 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 대퇴골 골간의 중심에서의 피질 골 파라미터를 소프트웨어에 포함된 자동화된 이진화(thresholding) 알고리즘을 사용하여 정량화시켰다.
그 다음, 스캐닝된 탈회되지 않은 Crtap ^-/- 마우스 척추 시료를 절편을 위해 플라스틱에 포매시켰다. 톨루이딘 블루 염색 및 TRAP 염색을 바이오퀀트 오스테오(Bioquant Osteo) 영상 분석 시스템을 사용하여 각각 Ob 및 Oc의 가시화 및 정량화를 위한 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
면역염색 및 조직학
면역조직화학을 위하여, P5 마우스의 뒷다리를 수집하고, 4% 파라포름알데히드에서 하룻밤 고정하고, 파라핀에 포매시켰다. 파라핀제거 및 재수화 후에, 열-유도된 항원 회수를 수행한 다음(다코(Dako), S1700), 30분 동안 히알루로니다제로 처리하였다(2 ㎎/㎖; 시그마(Sigma)). 내인성 퍼옥시다제를 10분 동안 3% 과산화수소를 사용하여 블로킹시켰다. 블로킹 용액(PBS 중 3% 정상 염소 혈청, 0.1% BSA, 0.1% Triton X-100)와의 인큐베이션 후에, 절편을 37℃에서, 60분 동안(각각 PBS 중 1:25 희석, 대조군 시료는 오직 PBS 중에서 인큐베이션시킴) TGFβ1(G1221, 프로메가) 및 데코린(LF-113, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 래리 피셔, 미국 국립 치과 두개안면 연구(Larry Fisher, National Institute of Dental and Craniofacial Research)에서 친절히 제공)에 대한 항체에서 인큐베이션시킨 다음, 2차 항체(슈퍼픽쳐 플로이머(SuperPicTure Ploymer) 검출 키트, 인비트로겐)와 함께 인큐베이션시켰다. 기질 DAB를 제조처의 권고에 따라 첨가하고, 시료를 탈수화시키고, 사이토실(Cytoseal) XYL 자일렌계 봉입 매질(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 봉입하였다. 야생형 및 돌연변이체 한배새끼의 절편을 동시에 처리하였다. 골소주 골의 영상을 야생형 및 돌연변이체 한배새끼에 대하여 동일한 노출 시간을 사용하여 광학 현미경(악시오플란(Axioplan) 2, 제이스(Zeiss))으로 취하였다.
P10 및 16주령 Crtap ^-/- 마우스의 폐를 조직 수집 동안 동일하게 부풀게 하고, 4% 파라포름알데히드에서 고정하고, 파라핀 포매시켰다. P10 Crtap ^-/- 및 야생형 마우스의 폐를 pSmad2에 대한 면역염색을 위해 사용하였다. 약술하면, 파라핀 절편을 자일렌으로 처리하고, 재수화시키고, 항원 회수를 위해 20분 동안 가열하였다(pH 6; 다코). 그 다음, 절편을 블로킹 용액(PBS 중 3% 정상 당나귀 혈청, 0.1% BSA, 0.1% 트리톤 X-100)에서 인큐베이션시킨 다음, 토끼 항-pSmad2 항체(1:500)(셀 시그널링, #3108), 알렉사 플루어(Alexa flour) 594에 컨쥬게이트된 당나귀 항-토끼 2차 항체(1:600)(인비트로겐)와 인큐베이션시키고, DAPI가 존재하는 프롤롱 골드(Prolong Gold) 광퇴색 방지(anti-fade) 시약(인비트로겐)과 함께 봉입하였다. 이들 절편으로부터의 형광 영상을 동일한 노출 시간을 사용하여 제이스 현미경(악시오비젼(Axiovision) 소프트웨어)을 사용해 취하였다.
16주령 마우스의 폐 조직학 및 형태계측을 위하여, 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위한 표준 프로토콜을 사용하여 시상주위 절편을 염색하였다. 평균 선형 절편(MLI) 방법을 사용하여 폐포 구조 간의 거리를 정량화하였다. 약술하면, 광학 현미경(악시오플란(Axioplan) 2, 제이스)을 사용하여 마우스마다 10개의 조직학 필드를 양쪽의 폐엽 모두로부터 20배 배율로 캡쳐하였다. 수정된 ImageJ 소프트웨어(미국국립보건원, 폴 톰슨(Paul Thompson)에 의해 수정)를 사용하여 MLI를 측정하였다. 혈관, 큰 기도 및 다른 비폐포 구조의 수동의 제거 후에, 소프트웨어는 자동으로 각 영상에서 폐포 조직을 이진화시키고, 1,353개 라인으로 이루어진 라인 그리드(line grid)를 더하는데, 각 라인은 이미지에 걸쳐 21 픽셀이다. 폐포 구조를 가로막는 라인의 수를 사용하여, MLI를 계산하였다.
3-점 굽힘에 의한 생물역학적 시험
Crtap ^-/- 및 야생형 대퇴골을 인스트론(Instron) 5848 장치(미국 매사추세츠주 노르우드 소재의 인스트론 인코포레이티드(Instron Inc.))와 함께 6 ㎜의 스팬을 사용하여, 3-점 굽힘에 의해 시험하였다. 모든 대퇴골을 실온에서 습윤 상태로 시험하였다. 그들에 5초 동안 0.05 N/초의 속도로 1N로 예비 부하시켰다. 예비-부하 후에, 대퇴골을 0.1 ㎜/초의 속도로 파괴까지 부하시켰다. 하중 및 변위 데이터를 블루힐(BLUEHILL) 소프트웨어(인스트론 5848)를 사용하여 40 ㎐의 속도로 캡쳐하였다.
항복점을 결정하기 위하여, 하중-변위 곡선에서 예비 부하 후에 그리고 최대 부하 전에 소정의 영역을 확인하였다. 이러한 영역을 5개의 선분으로 분리하고, 이로부터 기울기가 가장 큰 선분의 핏팅된 라인을 취하였다. 다음으로, 0.012 ㎜ 오프셋(offset)을 라인에서 시행하였다. 오프셋 라인과 하중-변위 곡선 간의 교차점은 0.012 오프셋 항복점이었다. 이러한 항복점은 문헌에서 통상적으로 선택되는 0.2% 오프셋 변형에 더욱 근접하게 상응한다. 탄성 영역을 예비 부하의 완료로부터 항복점까지의 영역으로 확인하였다. 항복후 영역을 항복점으로부터 하중의 변화가 파괴를 나타내는 -1N을 넘는 점까지의 영역으로 확인하였다. 탄성 변위는 시편이 탄성 영역에 유지되는 동안의 변위였다. 항복후 변위는 시편이 항복후 영역에 유지되는 동안의 변위였다. 총 변위를 탄성 변위 및 항복후 변위의 합으로 계산하였다. 사다리꼴 수치 적분 방법을 사용하여, 파괴에 대한 에너지를 하중-변위 곡선 아래 면적으로 계산하였다. 시편이 파괴되기 전에, 블루힐에 의해 기록되는 가장 큰 하중 값을 찾음으로써 최대 하중을 결정하였다. 강성을 계산하기 위하여, 최소 제곱 핏 방법을 하중-변위 곡선의 탄성 영역의 급격한 선분에 적용하였다. 강성은 최소 제곱 핏 라인의 기울기였다. 대퇴 골간의 microCT 분석으로부터 수득된 기하학적 데이터(직경 및 관성 모멘트)를 사용하여 고유 물질 특성, 극한강도, 파괴 인성 및 탄성 계수를 계산하였다.
혈청 골 턴오버 마커
혈청 오스테오칼신(OCN)을 바이오메디칼 테크놀로지즈 인코포레이티드(Biomedical Technologies Inc)로부터의 마우스 오스테오칼신 EIA 키트를 사용하여 정량화하였다. 골 콜라겐(CTX)의 C-말단 교차결합된 텔로펩티드를 이뮤노디아그노스틱 시스템즈 리미티드(Immunodiagnostic Systems Ltd)로부터의 RatLaps^TM EIA 키트를 사용하여 정량화하였다. 둘 모두의 분석을 제조처의 프로토콜에 따라 수행하였다.
콜라겐 SDS-PAGE, 질량 분석법 및 교차결합 분석
질량 분석법을 위하여, I형 콜라겐을 Crtap ^-/- 및 야생형 경골로부터 제조하였다. 골을 클로로포름/메탄올(3:1 v/v)을 사용하여 지방을 제거하고, 0.5 M EDTA, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.5에서 탈무기질화하였으며, 모든 단계는 4℃였다. 뼈를 미세하게 갈고, 콜라겐을 SDS-PAGE 시료 완충제 중에서 열 변성(90℃)에 의해 가용화시켰다. SDS-PAGE 겔로부터 콜라겐 α-쇄를 절단하고, 겔-내 트립신 분해로 처리하였다. 전기분무 MS를 4.5 ㎕ 분으로 용리되는 C8 모세관 컬럼(300 ㎛ ×150 ㎜; 그레이스 바이다크(Grace Vydac) 208 MS5.315)을 사용하는 인-라인 액체 크로마토그래피(LC)(써모피니간(ThermoFinnigan))이 장착된 LCQ Deca XP 이온-트랩 질량 분석기를 사용하여 트립신에 의해 생긴 펩티드에서 수행하였다. 시퀘스트(Sequest) 검색 소프트웨어(써모피니간)를 NCBI 단백질 데이터베이스를 사용하여 펩티드 확인을 위해 사용하였다.
6N HCl 중에서 탈무기질화 골을 가수분해시킨 후에, 피리디놀린 교차결합(HP 및 LP)을 HPLC에 의해 정량화하였다.
표면 플라스몬 공명 분석
표면 플라스몬 공명 분석을 비아코어 X 기기(지이 헬쓰케어 바이오-사이언스 코포레이션(GE Healthcare Bio-Science Corp.))를 사용하여 수행하였다. 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스로부터의 정제된 고유 마우스 힘줄 I형 콜라겐을 각각 0.05 ng/㎟(500 RU) 및 0.08 ng/㎟(800 RU)의 농도에서 아미드 커플링에 의해 CM5 센서 칩에 고정화시켰다. 실험을 HBS-P 완충제(150 mM NaCl 및 0.005% 계면활성제 P20을 함유하는 10 mM Hepes 완충제, pH 7.4) 중에 10 ㎕/분의 유속 및 20℃에서 행하였다. 재조합 인간 데코린 코어 단백질(알앤디 시스템즈)을 I형 CM5 칩 둘 모두에 주입하였다. 인간 데코린의 원액의 농도를 아미노산 분석에 의해 결정하였다. 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스 I형 콜라겐으로의 데코린의 결합 반응을 CM5 센서 칩 상의 고정화된 I형 콜라겐의 양에 의해 정규화시켰다. 3가지 농도의 데코린(3, 5 및 12 μM)을 사용하였으며, 각 농도에 대하여, 분석을 3회 반복하였다. 이러한 실험을 매번 상이한 마우스로부터 분리된 콜라겐으로 2회 수행하였다.
통계 방법
2개의 그룹 간의 비교를 비대응(unpaired), 양방 스튜던츠(Student's) t-검정을 사용하여 수행하였다. 3개의 그룹 간의 비교를 위하여, 그룹의 등분산이 확인되면, 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행한 다음, 홀름-시닥(Holm-Sidak) 방법을 사용하여 모든 다수의 쌍별 비교를 행하였다. 등분산 시험이 실패하면, 크루스칼-왈리스 순위 일원 분산 분석을 수행한 다음, 터키 검정(Tukey Test)을 사용하여 다수의 모든 쌍별 비교를 행하였다. 0.05 미만의 P 값은 스튜던츠 t- 검정, ANOVA 및 크루스칼-왈리스의 순위 일원 분산 분석에 대하여 통계적으로 유의미한 것으로 여겨진다. 다수의 사후 쌍별 비교를 위하여, 각 P 값을 P 값의 순위 및 그룹 간의 차이가 유의미한지를 결정하기 위하여 이루어지는 총 비교의 수에 좌우되는 한계 수준과 비교하였다. 시그마 플롯(Sigma Plot) V11.0(시스타트 소프트웨어 인코포레이티드(Systat Software Inc.))을 통계적 분석을 위해 사용하였다.
OI 마우스의 골 및 폐에 대한 1D11의 영향은 연구의 시작시에 알려져 있지 않다. 마우스의 그룹마다 초기 시료 크기를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 90% 파워(power)로, MicroCT에 의해 1D11 및 대조군 처치된 OI 마우스 간에, 최소 20%의 골량(BV/TV)의 차이를 검출하기 위하여, 8마리 마우스의 그룹 크기가 필요한 것을 계산하였다.
실시예 1: Crtap ^-/- 두개관에서의 변경된 TGFβ 신호전달
Crtap ^-/- 마우스 및 연령-매치된 야생형(WT) 한배새끼 대조군을 활성화된 pSmad 2, TGFβ 신호전달 경로의 구성원 및 TGFβ의 다른 다운스트림 표적의 발현을 위해 분석하였다. 두개골을 잘라내고, RNA 및 단백질을 추출하고, 각각 리얼타임-PCR 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 도 1A 및 도 1B에서 관찰할 수 있는 바와 같이, Crtap ^-/- 마우스는 웨스턴 블롯에 의해 측정되고, 농도계에 의해 정량화되는 경우, 야생형 마우스에 비하여, 100% 더 높은 비의 활성화된 pSmad2 대 총 Smad2를 가졌으며, 이는 TGFβ 신호전달이 Crtap^-/- 마우스에서 상승되는 것을 나타낸다. TGFβ의 전사 표적, 예를 들어, Col1a1 및 p21은 RT-PCR에 의해 측정시 야생형 대조군에 비하여 상승되었으며, 각각 도 1C 및 도 1D에 나타나 있다. 섬유증-촉진(pro-fibrotic) ECM 단백질 결합 조직 성장 인자(CTGF)를 측정하였으며, RT-PCR에 의해 결정시 야생형 대조군과 비교하여 Crtap ^-/- 마우스에서 대략 50% 더 높은 것이 관찰되었으며, 도 1E에 나타내었다. 도 1F에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 분석에 의해, 사이클린-의존성 키나제 억제제 p27의 발현이 Crtap^-/- 또는 야생형 마우스 중 어느 하나에서 변경되지 않았음이 드러났다.
실시예 2: Crtap ^-/- 마우스 생체내에서 그리고 crtap ^-/ - 조골세포에서의 증 가된 TGFb 활성
Crtap ^-/- 마우스를 TGFβ 신호전달의 활성화에 반응하여 루시퍼라제를 발현하는 TGFβ 리포터 마우스(잭슨 래보러터리(Jackson Laboratory); B6.Cg-Tg(SBE/TK-luc)7Twc/J)와 교배시켰다. P9 마우스에 기질 D-루시페린(150 ㎎/㎏)을 영상화(제노겐(Xenogen); IVIS 카메라 시스템) 10분 전에 주사하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, Crtap ^-/- 마우스는 그들의 꼬리, 장골 및 두개관에서 야생형 대조군에 비하여 상당히 더 높은 발광을 가졌으며, 이는 crtap^-/- 마우스에서의 증가된 TGFb 활성을 나타낸다. 도 2b, 두개관에서의 루시퍼라제 활성의 정량화.
골수 기질 세포(BMSC)를 Crtap ^-/- 및 야생형 마우스로부터 분리하고, 생체외에서 골원성 조건하에 배양하고, 조절된 배양 배지를 TGFβ 신호전달의 활성화에 반응하여 루시퍼라제를 발현하는 세포주를 사용하여 TGFβ 활성에 대하여 분석하였다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, Crtap ^-/- BMSC로부터의 조절된 배지는 야생형 마우스로부터의 BMSC에 비하여 거의 2배 더 큰 루시퍼라제 활성의 리포터 세포주를 야기하였다. 이들 데이터는 함께, TGFβ 분비 및 활성이 Crtap^-/- 마우스의 골 및 조골세포에서 상승된 것을 나타낸다.
실시예 3: Crtap ^-/- 척추뼈의 μCT 분석
성체 8주령 Crtap ^-/- 마우스(그룹마다 N=6)에 1D11(10 ㎎/㎏, 복강내, 3회/주, 총 8주), SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 TGFβ에 결합하는 범-특이적 항체의 뮤린 대용물을 투여하였다. 관련없는 13C4 항체를 대조군으로서 Crtap ^-/- 마우스 및 야생형 마우스의 개별 그룹에 투여하였다(N=6). 16주령 마우스의 L4 척추체(8주 내지 16주에 처치)를 μ-CT에 의해 영상화하였다. 8주 동안 TGFβ 중화 항체 1D11(젠자임(Genzyme); 10 ㎎/㎏, 복강내, 3회/주)로 처치된 8주령 Crtap ^-/- 마우스(그룹마다 n=6), 및 대조군 항체(13C4-위약)로 처치된 야생형(WT) 및 대조군 Crtap ^-/- 마우스로부터의 척추체 L4의 microCT 데이터는 도 3에 나타나 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Crtap^-/- 척추뼈는 야생형 대조군 척추뼈와 비교하여, 해면상이었다. 그러나, 1D11 처치는 야생형 상태와 유사한 골격 표현형을 야기한다.
도 3으로부터의 데이터를 도 4에서 정량화하였으며, 범-특이적 항-TGFβ 항체로의 처치는 Crtap^-/- 마우스의 골격 표현형을 구제하였다. 처치된 Crtap ^-/- 마우스로부터의 척추뼈는 골 부피 밀도(BV/TV), 총 골 표면(BS), 골 표면 밀도(BS/BV), 골소주 개수(Tb.N), 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 간격(Tb.Sp) 및 총 부피(Dens TV)를 포함하는 측정된 파라미터에서 야생형 대조군 마우스와 통계적으로 유사하였다.
실시예 4: 항- TGFβ 처치된 Crtap ^-/- 척추뼈의 조직형태계측
μ-CT에 더하여, 항체-처치, 위약-처치 및 야생형 마우스의 척추뼈를 조직형태계측에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, μ-CT 결과를 조직형태계측 분석에 의해 확인하였다. 또한, 조직 절편을 파골세포 마커 TRAP의 발현에 대하여 염색하였다. 분석에 의해, 야생형 대조군에 비하여 Crtap ^-/- 마우스에서 더 많은 골 표면을 커버하는 더 많은 파골세포가 존재하였음이 드러났으며(N.Oc/BS 및 Oc.S/BS), 이는 증가된 파골세포 활성을 나타낸다. 1D11 항-TGFβ로의 처치는 모든 파골세포-특이적 파라미터를 야생형 수치 미만으로 감소시켰다. 따라서, 파골세포는 TGFβ 항체, 더욱 구체적으로는 범-특이적 항-TGFβ 항체에 대한 유력한 표적으로 확인되었다.
실시예 5: 항- TGFβ 처치된 Crtap ^-/- 대퇴골의 3점 굽힘 시험
생물역학적 시험을 5초 동안 1 N/초의 속도로 1N로 예비 부하된, 6 ㎜ 스팬이 있는 인스트론 5848 장치(미국 매사추세츠주 노르우드 소재의 인스트론 인코포레이티드)를 사용하는 표준 3-점 굽힘 시험을 이용하여 16주령 마우스(8 내지 16주의 처치 후)의 절개된 대퇴골에서 수행하였다. 예비-부하 후에, 대퇴골을 파괴될 때까지 0.1 ㎜/초의 속도로 압축시켰다. 하중 및 변위 데이터를 블루힐 소프트웨어(인스트론 5848)를 사용함으로써 40 ㎐의 속도로 캡쳐하였다.
도 6에 입증된 바와 같이, Crtap ^-/- 마우스 대퇴골은 야생형 대조군 마우스에 비하여 강성이 더 적었으며, 상당히 더 적은 최대 하중을 견딜 수 있었다. 1D11 처치된 Crtap ^-/- 마우스의 대퇴골은 대조군 crtap^-/- 마우스에 비하여 최대 하중의 상당한 개선 및 강성 증가의 경향을 보였다.
따라서, 1D11 범-특이적 항-TGFβ 항체로의 처치는 Crtap^-/- 마우스의 골격 표현형을 정량적으로, 정성적으로, 그리고 생물역학적으로 복구시켰다.
실시예 6: 1D11을 사용한 TGFβ 신호전달의 억제는 폐 표현형을 개선시킨 다
Crtap ^-/- 마우스는 낮은 골량에 의해 나타나는 전신 결합 조직 질환, 사구체경화증 및 폐이형성증을 갖는다(문헌[Baldridge et al.; PLoSone, 5(5):e10560 (2010)]). 증가된 TGFβ 발현은 pSmad2에 대한 양성 면역염색에 의해 입증되고, 도 7a에 나타낸 바와 같이, Crtap^-/- 마우스의 폐에서 관찰되었다. Crtap ^-/- 마우스는 조직학적으로, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스에 비하여 증가된 원위 기도 공간을 나타내었다. 도 7a 및 도 7b에 나타내고, 도 7c에 정량화된 바와 같이(대조군 Crtap^-/-에 대하여 *P<0.05; 마우스마다 10개 영상 분석, 그룹마다 n=8 마우스), 1D11 처치(10 ㎎/㎏, 복강내, 8주 동안 3회/주)는 Crtap ^-/- 마우스에서 pSmad2 발현을 감소시키고, 원위 기도 공간을 감소시키며, 폐 표현형을 개선시켰다.
실시예 7: Crtap ^-/- 폐에서의 데코린 발현
Crtap^-/- 마우스의 골 및 폐에서 이상조절된 TGFβ 신호전달의 기초를 이해하기 위하여, TGFβ 발현의 전사 조절제를 조사하였다. ECM에서 TGFβ를 조절할 수 있는 세포외 단백질의 주요 분류는 작은 류신 풍부 프로테오글리칸(SLRP), 예를 들어, 데코린을 포함한다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 면역염색에 의해, 야생형 대조군 폐에 비하여 Crtap^-/- 폐에서 증가된 데코린의 발현이 나타났다.
데코린이 성숙 TGFβ의 조절제이기 때문에, 이러한 관찰은 OI에서 발생하는 바와 같은, 콜라겐의 변경된 번역후 변형이 SLRP를 포함하는 ECM 단백질의 상호작용을 변경시킴을 시사한다. 데코린은 하이드록시프롤린 부위, 예를 들어, I형 및 II형 콜라겐의 아미노산 잔기 396에 위치한 부위에 결합하며, 이는 Crtap^-/- 마우스에서 부재이다. 데코린 결합 검정을 수행하여, 데코린 결합이 OI에서 변경될 수 있는지, 그리고 이것이 적어도 부분적으로 Crtap^-/- 골 및 마우스에서 관찰되는 표현형의 원인이 될 수 있는 지를 결정하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 3-하이드록실화된 콜라겐 펩티드(I형 및 II형 콜라겐에서와 같음)로의 데코린 결합은 3-하이드록실화가 없는 콜라겐 펩티드(III형 콜라겐에서와 같음)보다 더 컸다.
실시예 8: 증가된 TGFβ 신호전달은 불완전 골형성증의 공통의 메커니즘 이다
OI는 취약성 골, 낮은 골량, 골 기형 및 골절을 특징으로 한다. 또한, 폐 이상을 포함하는 골격외 소견은 실질적으로 이환율 및 사망률에 기여한다. 대부분의 OI의 사례는 I형 콜라겐을 인코딩하는 유전자(COL1A1 및 COL1A2)에서의 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기된다. 최근에, 콜라겐의 번역후 번형에 수반되는 단백질을 인코딩하는 추가의 유전자의 돌연변이가 열성형의 OI를 야기하는 것으로 확인되었다. 연골 관련 단백질(CRTAP), I형 콜라겐의 프롤린 잔기 986α1(I)의 3-하이드록실화를 담당하는 프롤릴-3-하이드록실라제 복합체의 구성원에서 먼저 설명되었다. 정상 하위 대립 인자(hypomorphic) CRTAP 돌연변이는 피브릴 콜라겐에서 3-하이드록시프롤린(3Hyp)의 부분적인 소실뿐 아니라 다른 잔기의 과변형을 야기하고, 열성 VII형 OI를 야기하며, 이는 임상적으로 중증의 우성형의 OI와 중첩된다. 3Hyp의 생리적 기능은 완전히 이해되지 않았지만, 생화학적 연구에 의해, 그것이 콜라겐 안정성에 부정적으로 영향을 미치기보다는 콜라겐-단백질 상호작용에 연루될 수 있음이 시사된다.
ECM은 신호전달 분자 및 그들의 조절제에 대한 중요한 저장소이다. 골에서, TGFβ는 국소화된 골 흡수 파골세포 및 골 형성 조골세포의 활성을 결합시킴으로써 골 재형성의 주요 조정자로 작용한다. TGFβ는 조골세포에 의해 풍부하게 생성되며, 주로 불활성 잠재성 형태로 분비되고, 골 매트릭스에 침착된다. 여기서, 파골세포에 의한 골 흡수 동안 TGFβ가 방출되고, 활성화될 수 있다. 추가의 조절 수준으로서, 활성 TGFβ는 프로테오글리칸에 의해 결합될 수 있으며, 프로테오글리칸은 콜라겐 피브릴과 회합되어 그의 생물활성을 조절한다. I형 콜라겐이 골 내의 ECM의 가장 풍부한 성분이기 때문에, OI에서 관찰되는 콜라겐 구조의 변경이 골 취약성을 증가시킬 뿐 아니라, 골 매트릭스의 신호전달 저장소 기능에 영향을 미친다는 흥미로운 가설이 제기된다. 흥미롭게도, Crtap ^-/- 마우스는 증가된 TGFβ 신호전달의 동물 모델과 표현형 중첩을 보인다. 예를 들어, TGFβ 과발현은 낮은 골량을 야기한다. 또한, Crtap ^-/- 마우스는 마르판(Marfan) 증후군의 마우스 모델에서 관찰되는 것과 유사한 폐 내의 폐포 기도 공간의 확장을 나타내며, 마르판 증후군에서, 증가된 TGFβ 신호전달이 폐 병적이상의 주요 공여자인 것으로 보인다. 따라서, 열성 OI라면, TGFβ 신호전달의 상태를 Crtap ^-/- 마우스 모델에서 연구하였다.
골에서의 TGFβ 신호전달의 상태를 평가하기 위하여, Crtap ^-/- 마우스의 두개골에서의 TGFβ 표적 유전자의 발현 수준을 평가하였다. 야생형(WT) 시료와 비교하여, Crtap ^-/- 골은 상승된 TGFβ 활성과 일치하게, TGFβ 다운스트림 표적 p21(사이클린-의존성 키나제 억제제 1), PAI -1(플라스미노겐 활성화제 억제제-1) 및 Col1a1의 증가된 발현을 보였다(도 10a). 세포내 TGFβ 신호전달 경로의 증가된 활성화를 확인하기 위하여, Smad2, TGFβ 수용체의 활성화 후에 인산화되는 세포내 2차 메신저 단백질의 상태를 평가하였다. 표적 유전자 발현과 일치하게, 면역블롯 분석은 Crtap ^-/- 마우스의 골 시료에서 더 높은 비의 인산화된 Smad2(pSmad2) 대 총 Smad2를 보여주었으며, 이는 증가된 TGFβ 신호전달을 나타낸다(도 10b 및 도 10c).
이들 고정된 척도가 생체내에서 증가된 TGFβ 활성을 반영하는지를 결정하기 위하여, Crtap ^-/- 마우스를 TGFβ-반응성 Smad 결합 요소의 제어 하에 루시퍼라제를 발현하는 TGFβ-리포터 마우스(SBE-Luc 마우스)와 교배하였다. WT/SBE-Luc 한배새끼와 비교하여, Crtap ^-/- /SBE-Luc 마우스는 골격 구조에 걸친 영역의 생물발광의 증가를 보였으며, 이는 생체내에서 증가된 TGFβ 활성을 나타낸다(도 10d). 3마리의 한배새끼에서, Crtap ^-/- 마우스는 야생형 마우스에 비하여 두부/두개관에서 평균 2.86배(SD±0.34) 생물발광 신호를 보인다. 더욱이, Crtap의 소실과 관련된 증가된 TGFβ/Smad 신호전달이 골에 고유한 것인지 시험하기 위하여, 즉, 조직 자율적인지를 시험하기 위하여, 골수 기질 세포(BMSC)를 시험관내에서 조골세포로 분화시켰다. TGFβ 리포터 세포주를 사용함으로써, Crtap ^-/- BMSC로부터의 조절된 배지가 야생형 BMSC로부터의 배지와 비교하여 더 높은 TGFβ 활성을 나타내는 것이 관찰되었다(도 10e). 이들 관찰은 함께, Crtap의 소실이 조직 자율적 방식으로 골에서 TGFβ 신호전달을 향상시키는 것을 나타낸다.
또한, 중증의 OI가 있는 환자는 고유한 폐 이상을 나타낼 수 있으며, 호흡 부전은 이들 개체에서 사망을 이끄는 원인 중 하나이다. 흥미롭게도, Crtap ^-/- 마우스는 다른 발생 모델에서의 증가된 TGFβ 신호전달과 관련된 특성인, 폐포 기도 공간의 광범위 증가를 보인다. 따라서, Crtap ^-/- 마우스의 폐는 폐포 세포에서 pSmad2에 대한 증가된 세포내 염색을 보였으며, 이는 증가된 TGFβ 활성이 골격외 조직에도 존재하는 것을 나타낸다(도 10f).
증가된 TGFβ 신호전달이 Crtap ^-/- 마우스에서 골 및 폐 표현형에 기여하는 원인이 되는 메커니즘을 나타내는지를 이해하기 위하여, 범-TGFβ 중화 항체(1D11)를 사용하여 구제 실험을 수행하였다. 8주령 Crtap ^-/- 마우스를 8주 동안 1D11로 처치하고; 대조군 Crtap ^-/- 및 야생형 마우스에 비-특이적 대조군 항체(13C4)를 제공하였다. 1D11은 처치된 Crtap ^-/- 마우스의 체중을 유의미하게 변경시키지 않았으며, 이는 TGFβ 억제가 일반적 영양 상태에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다(도 14). 또한, 질량 분석 및 교차결합 분석은 1D11이 Crtap ^-/- 마우스에서 I형 콜라겐 P986 3-하이드록실화 또는 콜라겐 교차결합의 상태를 유의미하게 변경시키지 않았음을 보여주었으며, 이는 이상조절된 TGFβ 신호전달이 변경된 분자 콜라겐 구조의 결과이며, 세포내 콜라겐 프로세싱 또는 세포외 피브릴 어셈블리에 직접 연루되지 않음을 뒷받침한다(도 15). Crtap ^-/- 마우스는 감소된 골량 및 비정상 골소주 골 파라미터를 나타낸다(도 11a 및 도 11b). 척추뼈의 microCT 영상화 분석에 의해, 대조군 Crtap ^-/- 마우스와 비교하여, TGFβ 억제가 골 부피/총 부피, 골소주 개수 및 골소주 두께를 포함하는 골소주 골 파라미터를 야생형 수준에 근접하게, 유의미하게 개선시키는 것이 나타났다(도 11a 및 도 11b 및 도 17). 유사한 유리한 효과가 Crtap ^-/- 마우스의 대퇴 골소주 골에서 관찰되었으며, 여기서, TGFβ 억제는 골소주 골 파라미터를 유의미하게 개선시켰다(도 18). 1D11을 사용한 골격상의 TGFβ 억제의 효과가 야생형 마우스 및 Esl-1^-/- 마우스11, 정상 TGFβ 성숙의 결함으로 인하여 증가된 TGFβ 활성을 갖는 모델에서 이전에 보고되었다. 1D11이 야생형 마우스의 척추에서 골소주 BV/TV를 중등으로 33%까지 증가시켰지만, Esl-1^-/- 마우스는 BV/TV의 106% 증가를 나타내었다. 이는 TGFβ가 골격에서 증가되는 병리생리학적 상황에서의 TGFβ의 표적화가 상대적으로 더 확연한 긍정적인 영향을 야기할 수 있었음을 시사한다. 현재의 연구에서, 1D11은 Crtap^-/- 마우스에서 척추의 골소주 BV/TV를 235%까지 증가시켰으며, 이는 이상조절된 TGFβ 신호전달이 Crtap^-/- 마우스에서의 낮은 골량의 중요한 공여자임을 뒷받침한다. 대퇴골 골간에서, Ctrap ^-/- 마우스의 피질 두께, 직경, 단면적 및 횡단 관성 모멘트를 포함하는 피질 구조의 파라미터는 야생형 마우스에 비하여 유의미하게 감소되었다. 1D11 처치 후에, 이들 파라미터는 더 이상 야생형 마우스와 유의미하게 상이하지 않았다(도 19). 피질 및 골소주 골의 이들 변화가 개선된 골 강도를 중개하는지를 시험하기 위하여, 3-점 굽힘에 의해 대퇴골의 생체역학적 시험을 수행하였다. TGFβ 억제가 처치된 Crtap ^-/- 마우스에서 최대 하중 및 극한 강도를 증가시킬 수 있는 것이 관찰되었으며, 이는 개선된 전체 골 및 조직 강도 및 개선된 내골절성을 나타낸다. 그러나, 1D11 처치는 대조군 및 1D11 처치된 Crtap ^-/- 마우스 둘 모두에서 감소된 항복-후 변위로 나타난 바와 같이, OI 골의 증가된 취약성에 영향을 갖지 않았다(도 20). 이는 아마도 변경된 콜라겐 구조와 관련된 고유의 비정상 무기질화를 반영할 것이다. 이들 관찰은 함께, 증가된 TGFβ 신호전달이 Crtap 결함으로부터 야기되는 열성 OI의 골 표현형에 대한 주요 공여자이며, 이상조절된 TGFβ 신호전달의 억제가 골량, 미세구조 파라미터를 복구시키고, 전체 골 강도를 개선시키는 것을 나타낸다.
Crtap ^-/- 마우스에서의 TGFβ의 억제의 영향을 세포 수준에서 이해하기 위하여, 처치된 마우스에서 조직형태계측 분석을 수행하였다. 이러한 연구에서 척추체의 절편에서, 야생형 마우스에 비해 대조군 Crtap ^-/- 에서 골 표면당 증가된 파골세포(Oc) 및 조골세포(Ob) 개수가 관찰되었으며, 이는 척추에서의 증가된 골 재형성을 나타낸다(도 11c 및 도 21). 일관되게, 혈청 골 턴오버 마커 오스테오칼신(OCN) 및 골 콜라겐의 C-말단 교차결합된 텔로펩티드(CTX)가 8주령(OCN 및 CTX) 및 16주령(오직 CTX만) 대조군 Crtap ^-/- 마우스에서 상승되었다(도 19). 골의 세포 조성의 유사한 변화가 우성 및 열성 OI가 있는 환자에서 설명되었으며, 이는 증가된 골 턴오버와 일치하는 증가된 Oc 및 Ob 개수를 보여준다. 흥미롭게도, TGFβ 신호전달이 증가된 마우스 모델은 또한, 증가된 파골세포 골 흡수 및 비정상 골 재형성과 함께 낮은 골량을 보인다. 골 세포에 대한 TGFβ의 영향의 대부분의 보고는 TGFβ가 골 회복의 부위에서 Oc 및 Ob 전구체의 동원 및 초기 분화에 이어서, 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1) 매개의 Ob 분화를 자극할 수 있는 모델과 일치한다. 그러나, TGFβ는 지속적으로 높은 용량에서, 분화 인자 RUNX2를 억제함으로써 Ob 분화를 억제할 수 있다. Oc/Ob 상호작용에 대한 중요한 영향을 고려해볼 때, TGFβ 이용가능성의 미세한 조정은 골 재형성 동안 골 흡수와 형성의 국소의 결합을 위한 중요한 인자이며, 그의 불균형은 상당한 골 병적이상을 야기할 수 있다.
대조군 Crtap ^-/- 마우스에서의 관찰과 대조적으로, 1D11로 처치된 Crtap ^-/- 마우스의 골 절편에 의해, 감소된 Oc 및 Ob 개수가 드러났으며, 이는 야생형 마우스에서 관찰되는 값보다 훨씬 더 낮았고, 이는 이러한 실험에 사용된 1D11의 용량에서 TGFβ 억제의 결과로서 이상조절된 골 재형성의 초생리학적(supraphysiologic) 억제를 나타낸다(도 11c). 또한, 야생형 수준 미만의 Oc 및 Ob의 감소의 관찰은 이전의 보고와 일치하게, 골 재형성 과정 동안 Oc 및 Ob를 정상적으로 조정하기 위한 국소의 TGFβ의 양의 생리학적 요건을 강조한다. 본 발명자들은 관찰은 1D11 처리가 Oc 개수를 감소시키지만, Ob 개수를 증가시키는 야생형 마우스에서의 이전의 연구와 상이하다. 이는 야생형 마우스에서의 정상의 골에 비하여 증가된 TGFβ 신호전달 및 증가된 골 재형성이 있는 병리생리학적 상황에서, TGFβ 억제의 별개의 세포 영향을 반영할 수 있다. TGFβ는 조골세포 전구체 세포의 분화를 억제하는 것으로 보이며, 이에 의해, 증가된 TGFβ 신호전달은 보다 높은 비율의 미성숙 조골세포 계통 세포를 야기할 수 있었다. 다른 한편으로, 골 표면에서의 증가된 개수 또는 보다 높은 비율의 미성숙 Ob는 이들 세포에 의해 분비되는 TGFβ의 양의 증가를 야기할 수 있었다. 1D11을 사용한 TGFβ 억제가 Crtap ^-/- 마우스에서 증가된 Ob 개수를 상당히 감소시키는 것의 관찰은 증가된 TGFβ 신호전달이 조골세포 계통 세포의 증가의 원인이 되어 그에 기여함을 뒷받침한다.
Oc 및 Ob 개수에 관한 관찰에 더하여, 대조군 Crtap ^-/- 마우스에서 골 면적당 더 큰 골세포(Ot) 개수가 관찰되었으며, 이는 1D11 처치된 Crtap ^-/- 마우스에서, 야생형 마우스와 유사한 수준으로 감소되었다(도 11c 및 도 21). OI 환자에서, 증가된 Ot 밀도가 더욱 중증의 형태의 질환이 있는 개체에서 관찰되었으며, 이는 아마도 OI 골에서의 생리학적 성숙의 결함으로 인한 미성숙 원발성 골의 존재를 반영할 것이다. 증가된 TGFβ 신호전달이 OI에서 골 병적이상에 기여한다는 본 발명자들의 가설과 일치하게, 야생형 마우스에서 TGFβ의 과발현은 유사하게 증가된 Ot 밀도를 야기한다. 가능한 설명으로서, TGFβ는 Ob에서 Ot로의 전이 동안 Ob 아폽토시스를 억제할 수 있으며, 이에 의해, 증가된 Ot 밀도를 야기한다. 종합하여, 이들 관찰은 증가된 TGFβ 신호전달이 Crtap ^-/- 마우스에서 높은 골 턴오버 상태 및 손상된 골 성숙에 기여하며, 이상조절된 TGFβ 신호전달의 억제가 이들 세포 변경을 역전시키는 것을 나타낸다.
Oc/Ob 상호작용에 대한 이들 중요한 영향을 고려해 볼 때, TGFβ 이용가능성의 미세한 조정은 골 재형성 동안 골 흡수와 골 형성의 국소의 결합을 위한 중요한 인자이며, 그의 불균형은 상당한 골 병적이상을 야기할 수 있다. 본 발명자들의 관찰은 Crtap ^-/- 마우스에서의 이상조절된 TGFβ 신호전달의 억제가 골량 및 미세구조 파라미터를 복구시키고, 전체 골 강도를 향상시키고, Crtap ^-/- 마우스에서 관찰되는 세포 변경을 역행시키는 것을 나타낸다. 따라서, TGFβ 신호전달의 이상조절은 이러한 열성 OI의 마우스 모델에서 골 표현형의 중요한 공여자이다.
또한, 본 발명자들은 TGFβ 억제가 Crtap ^-/- 마우스의 폐 표현형에 영향을 미치는 지에 관심을 두었다. 대조군 Crtap ^-/- 마우스의 폐는 야생형 마우스에 비하여 원위 기도 공간의 증가를 보였다(도 11d). 흥미롭게도, TGFβ 중화 항체로 처치된 Crtap ^-/- 마우스의 폐는 폐포 구조 사이의 거리의 60% 개선을 보였다(도 11d 및 도 11e). 이러한 관찰은 과잉의 TGFβ 신호전달이 Crtap^-/- 마우스에 존재하는 폐 이상에 대한 중요한 발병 공여자인 것을 나타낸다. 증가된 TGFβ 신호전달은 발생 중인 폐 이상 및 성숙 폐의 질환과 관련이 있다. 예를 들어, 폐에서의 TGFβ 과발현은 확대된 기도 공간의 면적과 함께 손상된 폐 발생을 야기하며, 증가된 TGFβ 신호전달은 마르판 증후군에서의 폐 이상에서, 그리고 폐기종 및 기관지 천식의 발생에서, 원인이 되는 병리 메커니즘이다. 본 발명자들의 결과는 과잉의 TGFβ 신호전달이 Crtap ^-/- 마우스에 존재하는 폐 이상의 중요한 발병 공여자임을 나타낸다. Crtap ^-/- 마우스에서 1D11을 사용한 폐 표현형의 부분적 구제를 고려해 볼 때, TGFβ 억제가 표현형을 개선시킬 수 있는 경우에 이후의 단계에서 폐 조직을 유지하는 것에 더하여, 이상조절된 TGFβ 신호전달은, 해부 구조가 확립되는 경우, 폐 조직 발생에 영향을 미칠 수 있다.
Crtap의 소실로 인한 콜라겐의 변경(P986에서의 3Hyp의 소실 및 콜라겐의 번역후 과변형을 야기)이 이상조절된 TGFβ 신호전달을 야기하는 방법에 대하여 다음의 의문이 제기되었다. 생화학적 분석에 의해, 콜라겐 프롤릴-3-하이드록실화가 콜라겐 분자의 안정성에 근본적으로 영향을 미치지 않고, 대신에 그것이 콜라겐-단백질 상호작용에 영향을 미칠 수 있는 것이 나타났다. 매력적인 가설은 3Hyp의 소실이 작은 류신-풍부 프로테오글리칸(SLRP)과의 콜라겐 상호작용에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. SLRP는 I형 콜라겐 및 TGFβ 둘 모두에 결합하여, 이에 의해 TGFβ 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, SLRP 데코린은 골육종 세포에서 TGFβ의 별개의 영향을 억제할 수 있는 한편, 그것은 전조골세포에서 TGFβ 활성을 증진시킨다. I형 콜라겐상의 데코린의 결합 영역은 Crtap 결함으로 인하여 OI에서 비하이드록실화된 P986 잔기에 근접하여 위치한 3중 나선 도메인의 잔기 961/962에 집중되는 것으로 제안된다. 따라서, P986 3Hyp 위치가 I형 콜라겐으로의 데코린의 결합을 위한 상호작용 부위를 방어하여, 이에 의해, 콜라겐으로의 성숙 TGFβ의 격리를 매개할 수 있다.
그러므로, 콜라겐으로의 데코린 결합이 TGFβ 조절에 중요하며, 이러한 결합이, 예를 들어, 열성의 OI의 사례에서 I형 콜라겐의 α1 쇄 내의 P986의 번역후 3-프롤릴-하이드록실화 변형의 소실에 의한 변경된 콜라겐 구조로 파괴된다는 가설을 세웠다. Crtap의 소실이 두개골 내의 데코린 및 기타 SLRP의 RNA 발현(도 12a) 또는 골소주 골에서 데코린의 정성적 존재비(도 24)를 변경시키지 않지만, 야생형 마우스에 비하여 Crtap ^-/- 마우스로부터 분리된 I형 콜라겐으로의 재조합 데코린 코어 단백질의 결합을 감소시키는 것이 확인되었다(도 12b). 야생형 및 Crtap ^-/- 마우스의 I형 콜라겐으로의 재조합 데코린 코어 단백질의 결합의 표면 플라스몬 공명 분석 측정에 의해, 시험한 3가지 농도에서 Crtap ^-/- 마우스에서의 감소된 결합이 입증되었다(도 23). 데코린의 각각의 표기된 농도에서, 3회의 기술적 반복검증을 2회의 독립적인 생물학적 반복검증(◆ 반복검증 1, ▲ 반복검증 2)으로부터 수행하였다. 결과는 야생형의 평균의 백분율로 나타나 있다(막대는 그룹마다의 평균을 나타낸다). 3, 5 및 12 μM의 데코린에서 Crtap^-/- I형 콜라겐에 결합하는 데코린의 평균 감소는 각각 28.5%, 33.5% 및 38.1%였다.
이러한 관찰은 콜라겐-프로테오글리칸 상호작용의 변경이 OI에서의 골 및 다른 콜라겐 풍부 조직의 이상조절된 TGFβ 신호전달에 기여할 수 있음을 시사한다. 데코린이 TGFβ 생물활성을 효율적으로 감소시키기 위한 보고된 데코린-콜라겐 결합의 요건에 기초하여, OI 콜라겐의 결함은 데코린의 변경된 결합을 야기하고, 이에 따라, 매트릭스 중의 TGFβ를 격리하고, TGFβ 기능을 조절하는 그의 능력을 야기할 수 있다. 이런 이유로, TGFβ의 절대 수준의 주요 변화가 존재하지 않더라도, 변경된 프로테오글리칸-콜라겐 상호작용이 OI의 골 및 다른 콜라겐 풍부 조직에서 이상조절된 TGFβ 신호전달에 기여할 수 있다(도 24 및 도 25). 이러한 개념은 더욱 중증의 형태의 우성 OI에서 COL1A1 및 COL1A2 돌연변이가 프로테오글리칸에 결합하는 것으로 알려져 있는 특정 영역에서 클러스터링된다는 관찰에 의해 뒷받침되며, 이는 추가로 정상의 골 항상성에 대한 프로테오글리칸-콜라겐 상호작용의 생리학적 관련성을 뒷받침한다. 또한, 이것은 콜라겐 결합 부위에 대하여 데코린과 경쟁하는 다른 프로테오글리칸이 이상조절된 TGFβ 활성에 기여할 수 있으며, 추가의 신호전달 경로가 변경될 수 있음을 암시할 것이다.
콜라겐 섬유의 결함이 있는 구조가 취약성 골 및 골격외 소견을 야기하는 일부 열성형 및 우성형의 OI의 임상적 중첩 때문에, TGFβ 신호전달의 이상조절이 공통의 병리생리학적 질환 메커니즘일 수 있다. 이러한 가설을 다루기 위하여, 우성 OI의 마우스 모델에서의 TGFβ 신호전달의 상태를 조사하였다. Col1a2 유전자 내에 G610C 돌연변이를 지니는 낙-인(knock-in) 마우스(Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} )는 아미시 집단에서 원래 확인되었던 우성으로 유전되는 중등형의 OI와 표현형을 모사한다. Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스의 골 시료에서, TGFβ 표적 유전자 p21 및 PAI -1의 증가된 발현이 관찰되었으며, 이는 TGFβ 신호전달의 상향조절을 나타낸다(도 13a). 일관되게, Col1α2 ^tm1.1Mcbr 마우스로부터의 골 추출물의 면역블롯 분석은 또한, Crtap ^-/- 마우스에서의 본 발명자들의 관찰과 유사한, 증가된 비의 활성화 pSmad2/총 Smad2를 보였다(도 13b 및 도 13c).
또한, 이들 우성 OI의 모델에서 증가된 TGFβ 신호전달이 원인 메커니즘을 나타내는지를 시험하기 위하여, 8주령 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스를 8주 동안 TGFβ-중화 항체 1D11로 처치하였으며; 대조군 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 및 야생형 마우스를 대조군 항체 13C4로 처치하였다. Crtap ^-/- 마우스에서의 관찰과 유사하게, 1D11-처치에 의해, 척추에서의 골소주 골 파라미터가 야생형 수준으로 복구되었다(도 13d, 도 13e 및 도 22). 이들 관찰은 함께, 이상조절된 TGFβ 신호전달이 우성형의 OI의 발병에도 중요한 공여자이며, 항-TGFβ 요법이 우성 OI에서 골 표현형을 교정하는 것을 나타낸다.
임상-중개(clinical-translational) 관점에서, OI 환자에서 전신 TGFβ 억제의 잠재적인 부정적 영향이 고려되어야 한다. TGF - β1 ^-/- 마우스는 생의 첫 주 내에 중증의 다발성 염증 질환 및 면역계의 조절이상이 발생되지만, 1D11으로 처치된 Crtap ^-/- 및 Col1α2 ^{tm1 . 1Mcbr} 마우스 둘 모두에서, 본 발명자들은 일반 건강, 거동 또는 성장에 대한 명백한 부정적인 영향을 관찰하지 않았으며, 이는 성체 마우스에서의 TGFβ 리간드의 부분적인 약리학적 억제의 영향이 발생 동안의 TGFβ1의 완전한 소실과는 상이한 것을 시사한다. 인간에서, 3가지 아이소폼의 TGFβ에 대한 그의 친화성 및 특이성이 1D11과 유사한 프레솔리무맙(GC1008, 젠자임)을 치료-내성 원발성 국소 분절성 사구체경화증, 특발성 폐섬유증 및 악성 흑색종 또는 신장 세포 암종이 있는 환자에서 제I상 연구에서 사용하였다. 이들 연구에서, 프레솔리무맙은 일반적으로 잘 용인되었으며, 가능한 용량-관련 유해 사례에는 피부 발진 또는 병변, 코피, 치은 출혈 및 피로가 포함된다.
OI의 분자적 메커니즘은 불완전하게 이해되어 있다. 결과적으로, OI가 있는 환자에 대한 현재의 치료 옵션은 주로 골다공증의 치료에 사용되는 바와 같은 흡수 방지 치료법에 제한된다. 흥미롭게도, OI가 있는 성인에서의 최근의 동화제(anabolic agent) 테리파라티드(teriparatide)의 무작위, 위약 대조 시험에 의해, 중증의 III/IV형의 OI는 경증의 I형 OI가 반응하는 것과 다르게 반응하는 것으로 나타났다(문헌[Orwoll et al., 2014]). 이는 세포 신호전달의 변형을 표적으로 하는 치료법에 반응하는 유전자형의 차이를 시사하며, TGFβ-표적화된 치료가 콜라겐 및 콜라겐 번역후 변형 유전자 돌연변이에 기인한 중증의 OI에서의 추가의 연구를 위한 유망한 옵션일 수 있음을 시사한다. 종합하여, 본 발명자들의 데이터는 상이한 유전적으로 유전된 취약성 골 질환의 형태의 발병 메커니즘으로서 이상조절된 매트릭스-세포 신호전달의 개념을 뒷받침하고, 골격 및 골격외 조직에서의 과활성 TGFβ 활성을 중화시킴에 의한, OI의 치료를 위한 질환-특이적 메커니즘-기반의 전략을 설명한다.

SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORP. BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE <120> METHODS FOR TREATING OSTEOGENESIS IMPERFECTA <130> 554897 SA9-108WO <140> <141> <150> 61/883,151 <151> 2013-10-26 <150> 61/875,399 <151> 2013-09-09 <150> 61/803,647 <151> 2013-03-20 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu 85 90 95 Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu 100 105 110 Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr 115 120 125 His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Pro Val Leu Leu 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 18 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala 100 105 110 Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> hydroxylated Pro <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> 3-hydroxylated Pro <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> hydroxylated Pro <400> 19 Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> hydroxylated Pro <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> hydroxylated Pro <400> 20 Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> hydroxylated Pro <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> hydroxylated Pro <400> 21 Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg 1 5 10 15

Claims (30)

1. 인간 형질전환 성장 인자 베타1(TGFβ1), TGFβ2 및 TGFβ3에 결합하고 이를 중화시키는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서의 불완전 골형성증(OI)의 치료를 위한 약제학적 조성물이며,
   상기 항체 또는 항원 결합 단편은
   각각 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
   각각 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역
   을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이
   SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
   SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
   을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 인간 IgG₄ 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
4. 제3항에 있어서, 인간 IgG₄ 불변 영역이 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 κ 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 인간 κ 경쇄 불변 영역이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
7. 제1항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 IgG₄ 불변 영역 및 인간 κ 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   인간 IgG₄ 불변 영역이 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고,
   인간 κ 경쇄 불변 영역이 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인
   약제학적 조성물.
9. 제1항에 있어서, 항체가
   SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
   SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
   를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
10. 제1항, 제2항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 골 부피 밀도(BV/TV), 총 골 표면(BS), 골 표면 밀도(BS/BV), 골소주 개수(Tb.N), 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 간격(Tb.Sp) 및 총 부피(Dens TV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 파라미터를 개선시키는 것인 약제학적 조성물.
11. 제1항, 제2항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 요중(urinary) 하이드록시프롤린, 요중 총 피리디놀린(PYD), 요중 유리 데옥시피리디놀린(DPD), 요중 I형 콜라겐 교차결합된 N-텔로펩티드(NTX), 요중 또는 혈청 I형 콜라겐 교차결합된 C-텔로펩티드(CTX), 골 시알로단백질(BSP), 오스테오폰틴(OPN) 및 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 흡수의 혈청 바이오마커를 감소시키는 것인 약제학적 조성물.
12. 제1항, 제2항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 총 알칼리성 포스파타제, 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신 및 I형 프로콜라겐(C-말단/N-말단)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 침착의 혈청 바이오마커를 증가시키는 것인 약제학적 조성물.
13. 제1항, 제2항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 골 흡수를 억제하는 것인 약제학적 조성물.
14. 제1항, 제2항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 골 침착을 촉진시키는 것인 약제학적 조성물.
15. 제1항, 제2항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 OI에 의해 영향을 받는 폐 기능을 개선시키는 것인 약제학적 조성물.
16. 제1항, 제2항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제와 병용되는 약제학적 조성물.
17. 제16항에 있어서, 치료제가 비스포스포네이트인 약제학적 조성물.
18. 제16항에 있어서, 치료제가 부갑상선 호르몬인 약제학적 조성물.
19. 제16항에 있어서, 치료제가 칼시토닌인 약제학적 조성물.
20. 제16항에 있어서, 치료제가 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)인 약제학적 조성물.
21. 제16항에 있어서, 치료제가 테리파라티드(teriparatide)인 약제학적 조성물.
22. 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서의 불완전 골형성증(OI)의 치료를 위한 약제학적 조성물이며,
    상기 항체는
    SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하고,
    상기 약제학적 조성물은 비스포스포네이트와 병용되는 것인
    약제학적 조성물.
23. 제22항에 있어서, 비스포스포네이트가 알렌드로네이트(alendronate)인 약제학적 조성물.
24. 제22항에 있어서, 비스포스포네이트가 파미드로네이트(pamidronate)인 약제학적 조성물.
25. 제22항에 있어서, 비스포스포네이트가 졸레드로네이트(zoledronate)인 약제학적 조성물.
26. 제22항에 있어서, 비스포스포네이트가 리세드로네이트(risedronate)인 약제학적 조성물.
27. 제1항, 제2항, 제9항 및 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 I형 OI를 갖는 것인 약제학적 조성물.
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