CN111000997A - 用于治疗成骨不全的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗成骨不全的方法，具体地，提供用于在受试者中治疗和改善成骨不全(OI)的症状的方法，所述方法通过给所述受试者施用治疗有效量的结合转化生长因子β(TGFβ)的结合剂进行。

Description

用于治疗成骨不全的方法

本发明申请是基于申请日为2014年03月20日、申请号为201480028990.8 (国际申请号为PCT/US2014/031279)、名称为“用于治疗成骨不全的方法”的 发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请涉及2013年3月20日提交的美国临时专利申请No.61/803,647， 2013年9月9日提交的美国临时专利申请No.61/875,399，和2013年10月 26日提交的美国临时专利申请No.61/883,151，其各自内容整体通过引用并 入本文。

技术领域

本发明涉及用于治疗成骨不全(OI)的方法。更具体地，本发明涉及使用 特异性结合人转化生长因子β(TGFβ)或其同种型(isoform)的结合蛋白(如抗体 或其抗原结合片段)治疗OI的方法。

背景技术

成骨不全(OI)，也已知为“脆骨病”或“洛布斯坦综合征”，是使人虚弱的和 罕见的先天性骨病，其大约每15000人中影响一人。尽管OI类型之间的表型 不同，共同的症状包括骨和牙的不完全骨化、减少的骨量、脆骨和病理性骨 折。OI的这些共同的症状被认为是由于基因突变引起，所述基因突变导致I 型胶原或参与骨基质沉积或稳态平衡的其它蛋白的缺乏。由于这些症状以及 致死骨折和并发症的倾向，OI患者的预期寿命与一般人群相比是降低的。因 此，本领域中显然存在开发对OI的有效治疗的迫切需要。

附图简述

图1A(蛋白印迹)和1B-1F(图表)阐明与野生型对照相比，在来自Crtap^-/-小鼠的骨中的TGFβ信号传导升高。

图2A(荧光图)和2B-C(图表)显示和TGFβ报道子(reporter)小鼠杂交的 Crtap^-/-小鼠与野生型对照相比展现更高的TGFβ活性。

图3是来自用小鼠泛特异性(pan-specific)抗-TGFβ抗体1D11处理的 Crtap^-/-小鼠的椎骨的μCT图像。

图4是含有来自用小鼠泛特异性抗-TGFβ抗体1D11处理的Crtap^-/-小鼠 的椎骨的定量测量的图表。

图5是来自用小鼠泛特异性抗-TGFβ抗体1D11处理的Crtap^-/-小鼠的椎 骨的组织形态测定分析。

图6A和6B是阐明来自用小鼠泛特异性抗-TGFβ抗体1D11处理的 Crtap^-/-小鼠的股骨的生物力学特性的图表(图6A-最大负荷，和图6B-刚度)， 其由三点弯曲测试确定。

图7A和7B(显微图像)和7C(图表)阐明用小鼠泛特异性抗-TGFβ抗体 1D11处理的Crtap^-/-小鼠的肺表型。

图8是用抗-核心蛋白多糖(decorin)抗体染色的Crtap^-/-和WT肺的显微 图像。

图9是描述核心蛋白多糖结合测定的图表。

图10是显示Crtap^-/-小鼠中增加的TGFβ信号传导的一组图表、照片和 图像。图10A是显示TGFβ靶基因p21、PAI-1、和Col1a1的定量RT-PCR结 果的一系列三个图表。所述图表表明P3 WT和Crtap^-/-小鼠的颅盖骨中增加 的TGFβ信号传导。结果显示为WT组平均值±SD的倍数变化；每组n＝5， *p<0.05。图10B是P3颅盖蛋白提取物的蛋白印迹分析的照片，其显示Crtap^-/-相比于WT小鼠，其中活化的Smad2相对于总Smad2蛋白的增加的量，提示 增加的TGFβ-信号传导；每组n＝3。图10C是显示图10B所示蛋白印迹的定 量的图表。结果显示为WT组平均值±SD的倍数变化，*p<0.05。图10D是 显示与和TGFβ-报道子小鼠(SBE-Luc小鼠)杂交的WT小鼠相比，Crtap^-/-中 与骨骼结构重叠的区域中增加的生物荧光。显示了在P10的3窝的代表性图 像。在3窝中，Crtap^-/-小鼠显示与WT小鼠相比在头/颅盖处平均2.86倍(SD±0.34)的生物荧光信号(比例尺条＝1cm)。图10E的图表显示使用TGFβ报 道子细胞系，在条件培养基中评估来自在成骨条件下培养3天的WT和Crtap^-/-骨髓基质细胞的TGFβ活性，阐明与来自WT细胞的培养基相比更高的TGFβ 活性。结果显示为WT组平均值±SD的倍数变化；每组n＝5，*p<0.05。图10F 是显示肺(P10)对pSmad2的免疫染色的两幅图片，其显示在WT和Crtap^-/-小 鼠中增加的细胞内染色(40X放大率)。显示每组n＝3小鼠的代表性图像(比例尺条＝20μm)。

图11是显示Crtap^-/-小鼠在用TGFβ中和抗体1D11处理后的表型校正 的一组照片和图表。图11A是16周龄野生型(WT)、对照抗体-处理的Crtap^-/-和1D11-处理的Crtap^-/-小鼠在处理8周后的L4椎体的一系列三张微型CT图 像。图11B是显示L4椎体的微型CT结果的一组三张图表，其阐明WT、对 照Crtap^-/-和1D11处理的Crtap^-/-小鼠中增加的骨体积/总体积(BV/TV)、小 梁数目(Tb.N)和厚度(Tb.Th)。结果显示为平均±SD，n＝8每组，对Crtap^-/-1D11 vs.Crtap^-/-对照为*p<0.05，对Crtap^-/-vs.WT为+p<0.05。图11C是显示L4 椎骨的组织形态测定分析结果的一组三张图表，其显示Crtap^-/-小鼠中与WT 相比增加的每骨表面积破骨细胞(N.Oc/BS)和成骨细胞(N.Ob/BS)数目。在用 1D11处理后减少的成骨细胞和破骨细胞数目表明在Crtap^-/-小鼠中对加速的 骨重建的有效抑制。Crtap^-/-小鼠中增加的每骨表面积的骨细胞数目(N.Ot/B.Ar) 在1D11处理后被减少至WT水平。结果显示为平均±SD，每组n＝6，对Crtap^-/- 1D11 vs.Crtap^-/-对照为*p<0.05，对Crtap^-/-vs.WT为+p<0.05。图11D是显 示16周龄野生型(WT)、对照Crtap^-/-和1D11-处理的Crtap^-/-小鼠在处理8周 后膨胀的肺的苏木精/伊红染色的一系列三张图像。与WT小鼠相比，Crtap^-/-对照小鼠显示远端气道空间的增加。在用1D11处理后，与对照Crtap^-/-小鼠 相比，远端气道直径存在减少。显示每组n＝8小鼠的代表性图像(比例尺条 ＝100μm)。图11E是显示通过平均线性截距法(MLI)定量的肺泡结构(alveolar structure)之间距离的图表，其阐明与对照抗体处理的Crtap^-/-和WT小鼠相比， 1D11-处理的Crtap^-/-小鼠中远端气道空间的显著减少。结果显示为平均±SD， 每组n＝8只小鼠，每只小鼠分析10张图像，对Crtap^-/-1D11 vs.Crtap^-/-对照 为*p<0.05，对Crtap^-/-vs.WT为+p<0.05。

图12是显示与I型胶原结合的核心蛋白多糖和P986 3Hyp位点重叠并 且在Crtap^-/-小鼠的I型胶原中减少的一系列图表。图12A是显示P3小鼠颅 盖骨的定量RT-PCR结果的一组三张图表，其显示与WT相比，Crtap^-/-小鼠 颅盖骨中富含亮氨酸的小蛋白多糖类核心蛋白多糖(Dcn)、双糖链蛋白多糖 (biglycan；Bgn)和asporin(Aspn)的RNA表达没有不同。结果给出为WT组平 均值±SD的倍数变化，每组n＝5。图12B是显示表面等离子体共振分析结果 的图表，其表明重组核心蛋白多糖核心蛋白与Crtap^-/-小鼠的I型胶原的结合 与野生型I型胶原相比少大约45％。使用3、5和12μM的核心蛋白多糖进行 了三个独立实验。显示了结合的核心蛋白多糖总量的响应单位，其标准化至 固定于芯片上的I型胶原。结合Crtap^-/-I型胶原的核心蛋白多糖的平均减少 为44.6±7.9％。

图13是显示对增加的TGFβ信号传导的抑制改善显性OI的小鼠模型中 的骨表型的一系列图表和照片，所述OI是由于Col1a2基因中的G610C突变 (Col1α2^tm1.1Mcbr)。图13A是显示TGFβ靶基因p21和PAI-1的定量RT-PCR结 果的两个图表，其表明P3 WT和Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠颅盖骨中增加的TGFβ信 号传导。结果显示为WT组平均值±SD的倍数变化；每组n＝3，*p<0.05。图 13B是蛋白印迹分析结果的照片，其显示与WT相比，在WT和Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠的P3颅盖中相对于总Smad2蛋白水平，活化Smad2(pSmad2)水平增加， 提示增加的TGFβ-信号传导；每组n＝3。图13C是显示图13B所示蛋白印迹 的定量的图表。结果显示为WT组平均值±SD的倍数变化；*p<0.05。图13D 是16周龄野生型(WT)、对照抗体-处理的Col1α2^tm1.1Mcbr和1D11-处理的 Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠在处理8周后的L4椎体的一系列微型CT图像的照片。图13E是来自L4椎体微型CT的数据的一系列图表，其显示用1D11处理后 Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠中增加的骨体积/总体积(BV/TV)、小梁数目(Tb.N)和厚度 (Tb.Th)。结果显示为平均±SD，每组n＝6，对Col1α2^tm1.1Mcbr 1D11 vs. Col1α2^tm1.1Mcbr对照为*p<0.05，对Col1α2^tm1.1Mcbr vs.WT为+p<0.05。

图14是重量曲线图表，其显示在研究期间与WT相比Crtap^-/-小鼠降低 的体重(对全部时间点p<0.05，显示平均±SE)。1D11-处理的Crtap^-/-小鼠相比 于对照Crtap^-/-小鼠没有观察到重量的统计学显著差异。

图15是显示TGFβ抑制对Crtap^-/-小鼠中异常I型胶原翻译后修饰没有 作用的一系列图和表。图15A是显示提取自WT、对照Crtap^-/-和1D11-处理 的Crtap^-/-小鼠胫骨(16周龄小鼠，在处理8周后)的I型胶原的串联质谱的一 系列三张图表。上图的序列为SEQ ID NO:19，中图的序列为SEQ ID NO:20， 而下图的序列为SEQ ID NO:21。图15B是显示对串联质谱分析的总结的表。 1D11处理并没有显著影响骨样品中胶原残基Pro986α1(I)的3-羟基化状态。 显示3-羟基化残基百分比的均值(±SD)，每组n＝5。图15C是一组三张图表， 其显示对照Crtap^-/-和1D11-处理的Crtap^-/-小鼠的骨I型胶原，与WT小鼠 相比展现羟基赖氨酰吡啶诺林(HP)以及赖氨酰吡啶诺林交联物(LP)水平的变 化和HP/LP比率的增加。与对照Crtap^-/-小鼠相比，Crtap^-/-小鼠的1D11处 理并不显著影响这些参数。结果以平均±SD给出，每组n＝4只小鼠，Crtap^-/-vs. WT为+p<0.05。

图16是显示处理研究开始(图16A＝8周龄)和末尾(图16B＝16周龄)时血 清骨更新标志物骨钙蛋白(OCN)和骨胶原C-端交联端肽(CTX)的一系列图表。 图16A是显示与WT小鼠相比，在研究开始8周龄Crtap^-/-中增加的OCN和 CTX血清水平的两张图表，表明Crtap^-/-小鼠中增加的骨更新。结果以平均 ±SD给出，对WT n＝8，对Crtap^-/-小鼠n＝14，对Crtap^-/-vs.WT为+p<0.05。 图16B是两张图表，其显示与对照Crtap^-/-小鼠相比，16周龄的1D11-处理的 Crtap^-/-小鼠显示降低的血清OCN的趋势和显著降低的CTX血清水平，表明 TGFβ抑制对增加的骨更新的抑制。结果以平均±SD给出，对WT n＝8，每 Crtap^-/-组n＝7，对Crtap^-/-1D11 vs.Crtap^-/-对照为*p<0.05，对Crtap-/-vs.WT 为+p<0.05。

图17是显示WT、对照Crtap^-/-和1D11-处理的Crtap^-/-小鼠椎体L4(16 周龄小鼠，在处理8周后)的微型CT分析结果的表。对骨体积/组织体积 (BV/TV)、小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁间隙(Tb.Sp)和骨体积的骨 矿物质密度(BMD BV)显示平均±SD；每组n＝8，+表示如果等方差检验失败 的秩和Kruskal-Wallis单因素ANOVA，n.s.＝统计学不显著。

图18是显示WT、对照Crtap^-/-和1D11-处理的Crtap^-/-小鼠近端股骨小 梁骨(16周龄小鼠，在处理8周后)的微型CT分析结果的表。对骨体积/组织 体积(BV/TV)、小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁间隙(Tb.Sp)和骨体积 的骨矿物质密度(BMD BV)显示平均±SD；n＝8每组。+表示如果等方差检验 失败的秩和Kruskal-Wallis单因素ANOVA，n.s.＝统计学不显著。

图19是显示WT、对照Crtap^-/-和1D11-处理的Crtap^-/-小鼠股骨骨干骨 皮质(cortical bone at the femur midshaft)(16周龄小鼠，处理8周后)的微型CT 分析结果的表。对皮质厚度、骨体积的骨矿物质密度(BMD BV)、前后(a.p.) 直径、横截面面积(CSA)和对内外(medio-lateral；m.l.)和前后(a.p.)轴的横截面 转动惯量(CSMI)；n＝8每组。n.s.＝统计学不显著。

图20是显示通过3点弯曲对股骨生物力学测试的结果的表(16周龄小鼠， 处理8周后)。与WT小鼠相比，对照Crtap^-/-小鼠展现显著降低的生物力学 参数，除了弹性模量和弹性位移之外。用1D11抗TGFβ处理导致Crtap^-/-股 骨中最大负荷和极限强度的显著改善，表明增加的全骨和组织强度。然而， 没有观察到屈服后位移的显著变化，表明1D11并不影响OI骨中增加的脆性。 对WT，N＝6；对对照Crtap^-/-，n＝4；而对1D11处理的Crtap^-/-小鼠，n＝3。 n.s.＝统计学不显著。

图21是显示WT、对照Crtap^-/-和1D11-处理的Crtap^-/-小鼠L4椎体(16 周龄小鼠，处理8周后)的组织形态测定分析结果的表。对骨体积/组织体积 (BV/TV)、小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁间隔(Tb.Sp)、破骨细胞数 目/骨表面积(N.Oc/BS)、破骨细胞表面积/骨表面积(Oc.S/BS)、成骨细胞数目/ 骨表面积(N.Ob/BS)、成骨细胞表面积/骨表面积(Oc.S/BS)和骨细胞数目/骨面 积(N.Ot/B.Ar)显示平均±SD；每组n＝6。+表示如果等方差检验失败的秩和 Kruskal-Wallis单因素ANOVA，n.s.＝统计学不显著。

图22是显示WT、对照Col1α2^tm1.1Mcbr和1D11处理的Col1α2^tm1.1Mcbr小 鼠椎体L4(16周龄小鼠，处理8周后)的微型CT分析结果的表。对骨体积/组 织体积(BV/TV)、小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁间隔(Tb.Sp)和骨体 积的骨矿物质密度(BMD BV)显示平均±SD；n＝6每组，n.s.＝统计学不显著。

图23是显示测量重组核心蛋白多糖核心蛋白与WT和Crtap^-/-小鼠的I 型胶原结合的表面等离子体共振分析的图表。来自两个独立生物学重复(◆重 复1、▲重复2)的核心蛋白多糖进行各个所指明浓度的三个技术重复。结果 显示为WT平均值的百分比(短线表示每组平均值)。

图24(显微图像)显示对WT和Crtap^-/-小鼠远端股骨干骺端中的核心蛋 白多糖免疫染色，在20X，每基因型n＝3，比例尺条＝100μm(图24A-24C)， 以及40X放大率，每基因型n＝3，比例尺条＝50μm(图24D-24F)。对照股骨仅 仅在二抗中孵育。

图25(显微图像)显示对WT和Crtap-/-小鼠远端股骨干骺端中的TGFβ1 免疫染色，在20X，每基因型n＝3，比例尺条＝100μm(图25A-25C)，以及40X 放大率，每基因型n＝3，比例尺条＝50μm(图25D-25F)。对照股骨仅仅在二抗 中孵育。

图26(显微图像)显示对WT和Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠远端股骨干骺端中的 TGFβ1免疫染色，在20X，每基因型n＝3，比例尺条＝100μm(图26A-26C)， 以及40X放大率，每基因型n＝3，比例尺条＝50μm(图26D-26F)。对照股骨仅 仅在二抗中孵育。

发明内容

本发明涉及用于有效地治疗成骨不全(OI)的方法。更具体地，本发明涉及 使用特异性结合转化生长因子β(TGFβ)或其同种型的结合蛋白如抗体或其抗原 结合片段治疗OI的方法。优选地，所述结合蛋白是“泛特异性的(pan-specific)” 且结合TGFβ的全部三种人同种型，即TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。更优选地， 所述结合蛋白特异性结合并中和人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。在一方面，本发 明提供了用于在有需要的受试者中治疗OI的方法，包括给所述受试者施用治疗 有效量的特异性结合TGFβ的抗体或其抗原结合片段。

在一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重 链可变区包含具有选自SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的三个互补决定区 (CDR)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含具有选自SEQ ID NO:7、8和 9的氨基酸序列的三个CDR。

在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述 重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可 变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含人IgG4恒定区。在 一实施方式中，所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在另 一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含人κ轻链恒定区。在另一 实施方式中，所述人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在另一 实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含人IgG4恒定区，和人κ轻链 恒定区。

在另一实施方式中，所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序 列，以及所述人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在另一实施 方式中，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在 另一实施方式中，所述抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸 序列。在另一实施方式中，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:14 的氨基酸序列；以及轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段结合人TGFβ1、TGFβ2 和TGFβ3。在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段中和人TGFβ1、 TGFβ2和TGFβ3。

在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段改善骨参数，所述骨参 数选自骨体积密度(BV/TV)、总骨表面积(BS)、骨表面积密度(BS/BV)、小梁 数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁间隙(Tb.Sp)和总体积(Dens TV)。

在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段抑制骨吸收。

在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段减少骨吸收的血清标志 物，所述骨吸收的血清标志物选自尿羟基脯氨酸、尿总吡啶诺林(PYD)、尿游 离脱氧吡啶诺林(DPD)、尿I型胶原交联的N-端肽(NTX)、尿或血清I型胶原 交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)和酒石酸盐抗性酸性 磷酸酶5b(TRAP)。

在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段增加骨沉积血清标志物， 所述骨沉积血清标志物选自总碱性磷酸酶、骨特异性碱性磷酸酶、骨钙蛋白 和I型前胶原(C-端/N-端)。

在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段抑制骨吸收。在另一实 施方式中，所述抗体或其抗原结合片段促进骨沉积。在另一实施方式中，所 述抗体或其抗原结合片段改善受OI影响的非骨骼器官的功能，所述功能选自 听觉功能、肺功能和肾功能。

在另一方面，本发明提供在有需要的受试者中治疗OI的方法，包括给所 述受试者施用治疗有效量的结合TGFβ的抗体或其抗原结合片段，其中所述 抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述轻 链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗OI的方法，包 括给所述受试者施用治疗有效量的与至少一种治疗剂组合的结合TGFβ的抗 体或其抗原结合片段。在另一实施方式中，所述治疗剂是双膦酸盐。

具体地，本发明涉及如下各项：

1.一种用于在有需要的受试者中治疗成骨不全(OI)的方法，包括给所述 受试者施用治疗有效量的特异性结合转化生长因子β(TGFβ)的抗体或其抗原 结合片段。

2.项1的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述 重链可变区包含具有选自SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的三个互补决定 区(CDR)；以及包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有选自SEQ ID NO:7、 8和9的氨基酸序列的三个CDR。

3.项1或2的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区， 所述重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及包含轻链可变区，所 述轻链可变区包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列。

4.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含人 IgG4恒定区。

5.项4的方法，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序 列。

6.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含人κ 轻链恒定区。

7.项6的方法，其中所述人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:13的氨基酸 序列。

8.项1-3中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含人 IgG4恒定区，和人κ轻链恒定区。

9.项8的方法，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序 列，且所述人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

10.前述项中任一项的方法，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

11.前述项中任一项的方法，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

12.前述项中任一项的方法，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；以及包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨 基酸序列。

13.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人 TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。

14.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段中和人 TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。

15.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段改善骨参数， 所述骨参数选自骨体积密度(BV/TV)、总骨表面积(BS)、骨表面积密度(BS/BV)、 小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁间隙(Tb.Sp)和总体积(Dens TV)。

16.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制骨吸收。

17.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段减少骨吸 收的血清标志物，所述骨吸收的血清标志物选自尿羟基脯氨酸、尿总吡啶诺 林(PYD)、尿游离脱氧吡啶诺林(DPD)、尿I型胶原交联的N-端肽(NTX)、尿 或血清I型胶原交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)和酒 石酸盐抗性酸性磷酸酶5b(TRAP)。

18.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段增加骨沉 积血清标志物，所述骨沉积血清标志物选自总碱性磷酸酶、骨特异性碱性磷 酸酶、骨钙蛋白和I型前胶原(C-端/N-端)。

19.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制骨吸收。

20.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段促进骨沉积。

21.前述项中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段改善受OI 影响的非骨骼器官的功能，所述功能选自听觉功能、肺功能和肾功能。

22.一种在有需要的受试者中治疗成骨不全(OI)的方法，包括给所述受试 者施用治疗有效量的结合转化生长因子β(TGFβ)的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列， 所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

23.一种用于在有需要的受试者中治疗成骨不全(OI)的方法，包括给所述 受试者施用治疗有效量的结合转化生长因子β(TGFβ)的抗体或其抗原结合片 段，其与至少一种治疗剂组合。

24.项23的方法，其中所述治疗剂是双膦酸盐。

发明详述

A.定义

除非另外定义，本文所用全部技术和科学术语具有与本领域的普通技术 人员通常所理解的含义相同的含义。

应当指出如本文所用以及在所附权利要求中，单数形式的“一(a)”、“一 (an)”、“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚指明。

术语“约”或“大约”指的是在给定的值或范围的10％，更优选5％(或1％或 更少)以内。

术语“施用(asminister)”或“施用(administration)”指的是将在体外存在的物质(如抗体)注射或以其他方式物理递送进患者的动作，例如，通过粘膜、真皮 内、静脉内、皮下、肌肉内递送，和/或本文描述的或本领域已知的任何其它 物理递送方法。当治疗疾病或其症状时，所述物质的施用一般在所述疾病或 其症状出现之后进行。当预防疾病或其症状时，所述物质的施用一般在所述 疾病或其症状出现前进行。

TGFβ的“拮抗剂”或“抑制剂”指的是例如在表达TGFβ的细胞中或在表达 TGFβ配体或表达TGFβ受体的细胞中，能够抑制或以其他方式降低TGFβ的 一或多种生物学活性的分子。在某些示例性实施方式中，本发明的抗体是拮 抗剂抗体，其与细胞接触时抑制或以其他方式降低所述细胞中的TGFβ活性， 所述细胞具有细胞表面表达的TGFβ受体(如，TGFβ受体1、2或3)。在一些 实施方式中，TGFβ的拮抗剂(如本发明的抗体)可以例如通过抑制或以其他方 式降低表达TGFβ受体的细胞的活化和/或细胞信号传导途径而起作用，由此 相对于不存在所述拮抗剂的TGFβ介导的生物学活性，抑制所述细胞的TGFβ 介导的生物学活性。在本发明的某些实施方式中，所述抗体TGFβ抗体是拮 抗性抗TGFβ抗体，优选全人、单克隆拮抗性抗TGFβ抗体。

术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文可互换使用。术语抗体包括但不 限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性 抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、细胞内抗体、单链Fv(scFv)(如， 包括单特异性、双特异性等)、骆驼化抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连 接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗-Id)抗体和上述任一的表位结合片段。具体而言， 抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即抗原结合 结构域或含有特异性结合TGFβ抗原的抗原结合位点的分子(如抗TGFβ抗体 的一或多个互补决定区(CDR))。所述抗TGFβ抗体可以是任何型(如，IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类(如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2) 或任何亚类(如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方式中，所 述抗TGFβ抗体是人源化的，例如人源化的单克隆抗TGFβ抗体。在其它实 施方式中，所述抗TGFβ抗体是全人抗体，例如全人单克隆抗TGFβ抗体。 在优选实施方式中，所述抗TGFβ抗体是IgG抗体，例如IgG4抗体。

术语“组合物”和“制剂”旨在涵盖含有(任选地)特定量的特定成分(如抗 TGFβ抗体)的产品，以及直接或间接获得自所述(任选地)特定量的特定成分的 组合的任意产品。

术语“恒定区”或“恒定结构域”指的是轻链和重链羧基端部分，其不直接 参与抗体与抗原的结合，但展现多种效应子功能，例如和Fc受体相互作用。 所述术语指的是免疫球蛋白分子的一部分，其相对于免疫球蛋白的其它部分 (含有抗原结合位点的可变结构域),具有更保守的氨基酸序列。所述恒定结构 域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域，以及轻链的CHL结构域。

术语“表位”指的是抗原(例如TGFβ多肽或TGFβ多肽片段)表面上的局 部区域，其能够结合抗体的一或多个抗原结合区，且在动物、优选哺乳动物 及最优选人中具有能够引起免疫应答的抗原性或免疫原性活性。具有免疫原 性活性的表位是多肽在动物中引起抗体应答的部分。具有抗原性活性的表位 是多肽中抗体特异性结合的部分，其通过本领域公知的任何方法确定，例如 免疫测定法。抗原性表位并一定需要是免疫原性的。表位通常由一组化学活 性表面分子例如氨基酸或糖侧链组成并具有特定三维结构特性以及特定电荷特性。多肽构成表位的区域可以是所述多肽中的邻接的氨基酸或表位可以来 自所述多肽两个或更多个非邻接区域。表位可以是或可以不是抗原的三维表 面特征。在某些实施方式中，TGFβ表位是TGFβ多肽的三维表面特征(如， 在TGFβ多肽的三聚体形式)。在其它实施方式中，TGFβ表位是TGFβ多肽 的线性特征(如，以TGFβ多肽的二聚体或单体形式)。抗TGFβ抗体可以特异 性结合TGFβ的单体形式的表位，TGFβ二聚体形式的表位，或TGFβ的单体 形式或二聚体形式两者。

术语“赋形剂”指的是通常用于药物作为稀释剂、媒介物、防腐剂、结合 剂、稳定剂等的惰性物质，且包括但不限于，蛋白质(如血清白蛋白等)、氨基 酸(如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷 脂类(如烷基磺酸盐类、辛酸盐等)、表面活性剂(如SDS、聚山梨酯、非离子 型表面活性剂等)、糖类(如蔗糖、甘露糖、海藻糖等)和多元醇(如甘露醇、山 梨醇等)。也见Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co., Easton,Pa.，其通过引用整体并入本文。

在肽和多肽的上下文中，术语“片段”指的是包含少于全长氨基酸序列的 肽或多肽。此类片段可以获得自例如所述氨基酸序列氨基端处的截短、羧基 端处的截短和/或内部残基缺失。片段可以例如获得自选择性RNA剪接或获 得自体内蛋白酶活性。在某些实施方式中，TGFβ片段包括这样的多肽，所述 多肽包含TGFβ多肽氨基酸序列的至少50个，至少100个氨基酸残基，至少 125个邻接的氨基酸残基，至少150个邻接的氨基酸残基，至少175个邻接 的氨基酸残基，至少200个邻接的氨基酸残基或至少250个邻接的氨基酸残 基的氨基酸序列。在一具体实施方式中，TGFβ多肽或特异性结合TGFβ抗原 的抗体的片段保留全长多肽或抗体的至少1种，至少2种或至少3种功能。

术语“全人抗体”或“人抗体”在本文可互换使用且指的是包含人可变区和 最优选地人恒定区的抗体。在具体实施方式中，所述术语指的是包含人来源 的可变区和恒定区的抗体。“全人”抗TGFβ抗体，在某些实施方式中，也可 以涵盖结合TGFβ多肽且由人种系免疫球蛋白核酸序列的天然出现的体细胞 变体的核酸序列编码的抗体。在具体实施方式中，抗TGFβ抗体是全人抗体。 术语“全人抗体”包括具有对应于Kabat等(See Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)所描述的人种系免疫球蛋白序 列的可变区和恒定区的抗体。产生全人抗体的方法是本领域已知的。

短句“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体， 例如使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，分离自重组的组合人 抗体文库的抗体，分离自对人免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的动物 (如小鼠或牛)的抗体(见例如,Taylor,L.D.等(1992)Nucl.Acids Res. 20:6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的 任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可以具有衍 生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(见Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。然而，在某些实 施方式中，此类重组人抗体被进行体外诱变(或当使用人Ig序列的转基因动物 时，体内体细胞诱变)，且因此所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列当 衍生自或与人种系VH和VL序列相关时，可以并不天然体内存在于人抗体 种系库。

术语“重链”在提及抗体使用时，指的是基于重链恒定结构域氨基酸序列 的5种不同型，称作阿尔法(α)、德尔塔(Δ)、伊普西隆(ε)、伽马(γ)和缪(μ)。 重链的这些不同型是本领域公知的且给出5种不同类的抗体，分别是IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的4个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。 优选地所述重链是人重链。

“分离的”或“纯化的”抗体基本上没有细胞物质或其它来自所述抗体所获 得自的细胞或组织来源的污染蛋白，或当化学合成时基本上没有化学前体或其 它化合物。语句“基本上没有细胞物质”包括抗体制备物，其中所述抗体与细胞 的细胞组分分开，所述抗体从所述细胞分离或重组产生。因此，基本上没有细 胞物质的抗体包括抗体制备物，其具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重 计)的异源蛋白(在本文也称作“污染蛋白”)。当所述抗体重组产生时，其也优选 地基本上没有培养基，即培养基占蛋白制备物的体积少于约20％、10％或5％。 当所述抗体通过化学合成产生时，其优选基本上没有化学前体或其它化合物， 即，其与参与蛋白合成的化学前体或其它化合物分开。因此，抗体的此类制备 物具有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的除感兴趣抗体外的化学前体 或化合物。在优选实施方式中，抗TGFβ抗体是分离的或纯化的。

术语“Kabat编号”及类似术语是本领域承认的且指的是对抗体或其抗原 结合片段的重链和轻链可变区中比其它氨基酸残基更可变(即超变)的氨基酸 进行编号的系统(Kabat等(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391and,Kabat 等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S. Department of Healthand Human Services,NIH Publication No.91-3242)。对于 重链可变区，超变区一般从氨基酸位置31至35的范围为CDR1，氨基酸位 置50至65为CDR2，而氨基酸位置95至102为CDR3。对于轻链可变区， 超变区一般从氨基酸位置24至34的范围为CDR1，氨基酸位置50至56为CDR2，而氨基酸位置89至97为CDR3。

术语“轻链”在提及抗体使用时，指的是基于恒定结构域氨基酸序列的2 种不同型，称作卡帕(κ)或拉姆达(λ)。轻链氨基酸序列是本领域公知的。在优 选实施方式中，轻链是人轻链。

术语“控制(manage)”、“控制(managing)”和“控制(management)”指的是受 试者得自疗法(如，预防或治疗剂)的有益效果，其并不导致疾病或病症的治愈。 在某些实施方式中，给受试者施用一或多种疗法(如预防或治疗剂)以“控 制”TGFβ介导的疾病(如OI)或其一或多种症状，从而预防所述疾病的进展或 恶化。

术语“单克隆抗体”指的是获得自同质的或基本上同质的抗体群体的抗 体，且各单克隆抗体将通常识别抗原上的单一表位。在优选实施方式中，“单 克隆抗体”是由单一杂交瘤或其它细胞产生的抗体。术语“单克隆”并不限于用 于制备所述抗体的任何具体方法。例如，单克隆抗体可以通过Kohler等； Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备或可以从噬菌体文库分离。其它 用于制备克隆细胞系及由此制备表达的单克隆抗体的方法是本领域公知的 (见例如，Chapter 11in:Short Protocols in Molecular Biology,(2002)5th Ed.； Ausubel等,eds.,John Wiley and Sons,New York)。

术语“药物学可接受的”指的是被联邦或州政府的管理机构批准，或在美 国药典、欧洲药典或其它广泛承认的药典中列出，用于在动物中及更具体地 在人中的使用。

术语“药物学可接受的赋形剂”指的是和活性分子如单克隆抗体组合以制 备合适的或便利的剂型的任何惰性物质。“药物学可接受的赋形剂”是在所采 用的剂量和浓度对受体非毒性的赋形剂，且与包含所述单克隆抗体的制剂的 其它成分相容。

术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”指的是 TGFβ介导的疾病和/或其涉及症状的发展、复发、出现或扩散的总的或部分 抑制，其获得自本文提供的疗法或疗法组合(如预防或治疗剂的组合)的施用。

术语“TGFβ抗原”指的是TGFβ多肽被抗体特异性结合的部分。TGFβ抗 原还指的是TGFβ或其片段被抗体特异性结合的类似物或衍生物。在一些实 施方式中，TGFβ抗原是单体TGFβ抗原或二聚体TGFβ抗原。TGFβ多肽构 成表位的区域可以是所述多肽中的邻接的氨基酸或表位可以来自所述多肽两 个或更多个非邻接区域。表位可以是或可以不是抗原的三维表面特征。TGFβ 抗原表面上能够引起免疫应答的局部区域是TGFβ表位。表位可以是或可以 不是抗原的三维表面特征。如本文所用，TGFβ抗原的“类似物”指的是和本文 所述的TGFβ多肽、TGFβ多肽片段或TGFβ表位具有类似或相同功能的多肽。 例如，所述类似物可以包含与本文所述TGFβ多肽(如SEQ ID NO:1、2或3)、 TGFβ多肽片段、TGFβ表位或抗TGFβ抗体的氨基酸序列至少80％、至少85％、 至少90％、至少95％或至少99％相同的序列。额外地或可选地，所述多肽由 在严格条件下与编码本文所述的TGFβ多肽、TGFβ多肽片段或TGFβ表位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。

术语“人TGFβ”、“hTGFβ”或“hTGFβ多肽”和类似术语指的是包含氨基酸 序列SEQID NO:1、2或3的多肽和相关多肽(本文“多肽”、“肽”和“蛋白”可 互换使用)，包括其SNP变体。相关多肽包括等位基因变体(如“SNP”变体)； 剪接变体；片段；衍生物；取代、缺失和插入变体；融合多肽；和种间同源 物，优选地，其保留TGFβ活性和/或足以产生抗TGFβ免疫应答。还涵盖的 是TGFβ的可溶形式，其足以产生抗TGFβ免疫学应答。如本领域技术人员 将理解，抗TGFβ抗体能够结合TGFβ多肽、多肽片段、抗原和/或表位，由 于表位是更大的抗原的一部分，所述抗原是更大的多肽片段的一部分，所述 多肽片段进而是更大的多肽的一部分。hTGFβ可以以二聚体或单体形式存在。

术语“TGFβ介导的疾病”和“TGFβ介导的病症”可互换使用且指的是完全 或部分由TGFβ如hTGFβ引起或是TGFβ如hTGFβ的结果的任何疾病或病症。 在某些实施方式中，TGFβ异常表达。在一些实施方式中，TGFβ在特定细胞 类型中可以异常地被上调。在其它实施方式中，TGFβ和TGFβ受体的结合引 起正常、异常或过度的细胞信号传导。在某些实施方式中，TGFβ受体(如TGFβ 受体1、2或3)表达于细胞表面上，所述细胞例如成骨细胞、破骨细胞或骨髓 基质细胞。在某些实施方式中，所述TGFβ介导的疾病是退行性骨病，例如 成骨不全。

术语“特异性结合(binds)”或“特异性结合(binding)”意指特异性结合抗原 或其片段(如TGFβ)而不特异性结合其它抗原。特异性结合抗原的抗体可以以 较低亲和力结合其他肽或多肽，所述亲和力通过例如放射性免疫测定(RIA)、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIACORE或本领域已知的其它测定来确定。在 某些实施方式中，本发明的抗TGFβ抗体可以以比不同的、非TGFβ抗原高 多于两倍的亲和力特异性结合TGFβ(如hTGFβ)。特异性结合抗原的抗体或其 变体或片段可以与相关抗原具有交叉反应性。例如，在某些实施方式中，抗TGFβ抗体可以与hTGFβ及另一TGFβ抗原(如啮齿类或非人灵长类TGFβ抗 体)交叉反应。优选地，特异性结合抗原的抗体或其变体或片段不和其它非 TGFβ抗原交叉反应。特异性结合TGFβ抗原的抗体或其变体或片段可以通过 例如免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其它技术鉴别。典型地，特 异性或选择性反应将是背景信号或噪音的至少两倍，且更典型地，超过背景 10倍。在一些实施方式中，结合蛋白或抗体将以1x10^-6 M至1x10^-7的解离常数结合其抗原，如TGFβ。在其它实施方式中，所述解离常数为1x10^-6 M至1x10^-8。关于抗体特异性的讨论见例如Paul,ed.,1989,Fundamental Immunology Second Edition,RavenPress,New York，第332-336页。

术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，受试者优选是哺乳动 物，例如非灵长类(如牛、猪、马、猫、犬、大鼠等)和灵长类(如猴和人)，最 优选人。在一实施方式中，所述受试者是患有TGFβ介导的疾病的哺乳动物， 优选人。在另一实施方式中，所述受试者是具有发展出TGFβ介导的疾病的 风险的哺乳动物，优选人。

术语“治疗剂”指的是能够用于治疗、控制或缓解TGFβ介导的疾病和/或 其相关症状的任何药剂。在某些实施方式中，术语“治疗剂”指的是TGFβ抗 体。在某些其它实施方式中，术语“治疗剂”指的是除TGFβ抗体外的药剂。 优选地，治疗剂是已知可用于或已经用于或当前正用于治疗、控制或缓解 TGFβ介导的疾病或一或多种其相关症状的药剂。

术语“疗法”指的是能够用于预防、控制、治疗和/或缓解TGFβ介导的疾 病(如OI)的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方式中，术语“疗法 (therapies)”和“疗法(therapy)”指的是本领域技术人员(如医务人员)已知的可用 于预防、控制、治疗和/或缓解TGFβ介导的疾病的生物疗法、支持疗法和/ 或其它疗法。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是TGFβ介导的疾病(如OI)的进展、严重性和/或持续时间的减少或缓解，其获得自一或多 种疗法的施用(包括但不限于一或多种预防或治疗剂的施用)。在具体实施方式 中，此类术语指的是TGFβ与TGFβ受体结合的减少或抑制，受试者中表达 TGFβ受体的细胞中TGFβ的产生或分泌的减少或抑制，受试者中不表达TGFβ 受体的细胞中TGFβ的产生和分泌的减少或抑制，和/或与TGFβ介导的疾病 例如OI相关的一或多种症状的抑制或减少。

术语“可变区”或“可变结构域”指的是轻链和重链的一部分，一般在重链 中大约氨基端120-130个氨基酸和在轻链中大约100-110个氨基酸，其在抗体 之间在序列上广泛地不同并且用于各具体抗体对其具体抗原的结合和特异 性。序列中的可变性集中于称作互补决定区(CDR)的那些区域，而在可变结 构域中较高度保守的区域称作框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体 和抗原的相互作用。氨基酸位置编号根据EU Index，如Kabat等(1991) Sequences of proteins of immunological interest.(U.S.Department ofHealth and Human Services,Washington D.C.)5^th ed.("Kabat等")。在优选实施方式中，所 述可变区是人可变区。

B.成骨不全(OI)

OI涵盖一组先天性骨疾病，特征为一或多种参与骨基质沉积或稳态平衡 的蛋白的缺陷。有8种类型的OI，其通过它们的特定基因突变，和所造成的 蛋白缺陷以及受影响个体的表型来定义。尽管OI类型之间的表型不同，共同 的症状包括骨和牙的不完全骨化、减少的骨量、脆骨和病理性骨折。

I型胶原是钙化和非钙化组织中最丰富的结缔组织蛋白之一。I型胶原的 精确合成、翻译后修饰和分泌对于正确的组织发育、维持和修复是必需的。 患有OI的个体中鉴别的大多数突变导致减少的I型胶原合成，或I型胶原不 正确的合成和/或加工。

除了I型胶原基因的突变外，在受OI影响的个体中已经鉴别到参与胶原 细胞内运输和加工的基因中的其它突变。这些基因包括分子伴侣，例如FK506 结合蛋白10(FKBP10)和热休克蛋白47(HSP47)(Alanay等,2010； Christiansen等,2010；Kelley等,2011)。在分子间胶原交联基因如前胶原-赖 氨酸、2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2)中，以及在胶原脯氨酰羟化酶家族 基因成员包括富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(leprecan)(LEPRE1)、肽基脯氨酰 异构酶B(亲环素B)(CYPB)和软骨相关蛋白(CRTAP)(Morello等,2006； Cabral等,2007；Baldridge等,2008；van Dijk等,2009；Choi等,2009；Barnes 等,2010；Pyott等,2011)中鉴别到额外的突变。除了突变外，蛋白例如骨形态 生成蛋白(BMP)和转化生长因子β(TGFβ)和它们各自的受体被认为参与多种 OI表型，不过它们作用的确切机理未知(Gebken等,2000)。

在一实施方式中，TGFβ表达受结合I型和II型胶原的分子调控。在某些 实施方式中，富含亮氨酸的小蛋白多糖(small leucine rich proteoglycan；SLRP) 调控TGFβ表达。在具体实施方式中，核心蛋白多糖调控TGFβ合成。在某 些实施方式中，核心蛋白多糖并不结合I型或II型胶原，其中所述I型和/或 II型胶原分子在位置986处不存在3-羟脯氨酸位点。

C.骨生物学

脊椎动物骨骼由骨组成，其是活的、钙化的组织，其提供结构、支持、 保护和用于调节离子运输的矿物来源。骨是特化的结缔组织，其包含细胞组 分和无细胞组分两者。无细胞细胞外基质(ECM)含有胶原性蛋白和非胶原性 蛋白两者，其均参与钙化过程。正确分泌和排列的ECM对于正确骨形成是关 键的。当ECM蛋白的任一不存在、畸形或错误排列时，导致病变，如在成骨 不全中所证明的。

术语“骨皮质”或“骨密质”指的是骨的外层，其致密、刚性且坚硬。术语“小 梁骨”或“骨松质”是骨的海绵状内层，其比骨皮质轻且较不致密。术语“小梁” 指的是海绵状骨的显微结构单元，其具有杆样形状和胶原性组成。

骨是动态组织，其经受持续的重建。术语“成骨细胞”指的是沉积类骨质 的终末分化的骨形成细胞。术语“类骨质”指的是未成熟的、未矿化的骨，其 主要包含I型胶原。术语“前成骨细胞”指的是增殖中的未成熟成骨细胞，其 没有完全分化。术语“骨祖细胞(osteoprogenitor)”指的是多能细胞，其产生包 括成骨细胞在内的若干基质细胞类型。骨祖细胞，通常称作“间充质干细胞”， 在骨髓中产生并且能够在循环血液中分离到少量。术语“破骨细胞”指的是终 末分化的骨吸收细胞，其传自骨髓单核细胞。通过其酒石酸盐抗性酸性磷酸 酶(TRAP)的表达可以鉴别破骨细胞。

在正常稳态平衡条件下，成骨细胞和破骨细胞协调工作以维持骨完整性。 当骨沉积和骨吸收不配合时导致病变。例如，骨硬化症是特征为过度致密、 坚硬的骨的骨疾病，其是破骨细胞不吸收的结果，而骨质疏松症是特征为脆 的、多孔骨的骨疾病，其可由增加的破骨细胞活性造成。证据表明破骨细胞 活性在成骨不全中可被增加，提示这些细胞类型为潜在的治疗介入的靶。本 公开包括用TGFβ抗体抑制破骨细胞的方法。

可使用若干方法测量和表征骨的结构、密度和质量，包括组织学和组织 形态测定、原子力显微检查、共聚焦拉曼显微检查、纳米压痕(nanoindentation)、 三点弯曲测试、X射线成像和微计算机断层扫描(μ-CT)。在示例性实施方式 中，骨通过这些方法中的至少一种测量和表征。

术语“骨体积密度”指的是骨给定体积(总体积或TV)中包含钙化物质(骨 体积或BV)的分数。因此，骨体积密度计算为BV/TV并以百分比报告。术语 “比骨表面积”指的是每给定骨体积的总骨表面积(BS)。因此，比骨表面积计 算为BS/TV。其它常见骨量度包括：骨面积(B.Ar)，小梁数目(Tb.N)；小梁间 隙(Tb.Sp)；N.Oc(破骨细胞数目)；Oc.S(破骨细胞表面积)；Oc.S/BS；成骨细 胞数目(N.Ob)，成骨细胞表面积(Ob.S)，成骨细胞周长(Ob.Pm)，和任意所述 量度的衍生物。较大的Oc.S/BS是破骨细胞增加的骨吸收的指示。

D.转化生长因子β(TGFβ)

TGFβ是多功能细胞因子，其参与细胞增殖和分化、胚胎发育、细胞基质形 成、骨发育、伤口愈合、血细胞生成和免疫及炎症应答(Roberts等,1981；Border 等,1995a)。分泌的TGFβ蛋白被切割成潜伏相关肽(LAP)和成熟TGFβ肽，且以 潜伏和活性形式被发现。成熟TGFβ肽形成同二聚体以及和其它TGFβ家族成 员的异二聚体。TGFβ可以从任何天然来源纯化，或可以合成产生(如通过使用 重组DNA技术)。优选地，所述TGFβ分子来自人，在本文称作“hTGFβ”。

有三种人TGFβ同种型：TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(Swiss Prot登录号分 别是P01137、P08112和P10600)，在它们的生物学活性状态是25kDa的同二 聚体，包含由链间二硫桥连接的两个112个氨基酸的单体。TGFβ1与TGFβ2 的不同在于27个主要为保守的氨基酸变化，与TGFβ3的主要在于22个主要 为保守的氨基酸变化。这些差异已经定位于通过X-射线晶体学确定的TGFβ 的3D结构上(Schlunegger等,1992；Peer等,1996)并且已经确定受体结合 区域(Griffith等,1996；Qian等,1996)。

hTGFβ1(SEQ ID NO:1)

hTGFβ2(SEQ ID NO:2)

hTGFβ3(SEQ ID NO:3)

在人中有三种TGFβ受体，TGFβ受体1、2和3，其能够通过它们的结 构和功能特性，包括对TGFβ蛋白家族成员的亲和力来区分。TGFβ蛋白与同 二聚体或异二聚体TGFβ跨膜受体复合物的结合活化由胞内SMAD蛋白介导 的常规TGFβ信号传导途径。

TGFβ的去调节导致病理学过程，其在人中已经牵涉多种病症，例如出生 缺陷、癌症、慢性炎症、自身免疫疾病和纤维变性疾病(Border等,1994；Border 等,1995b)。

人TGFβ非常类似于小鼠TGFβ：人TGFβ1与小鼠TGFβ1仅具有1个氨 基酸差异；人TGFβ2与小鼠TGFβ2仅具有3个氨基酸差异；而人TGFβ3与 小鼠TGFβ3相同。

E.结合转化生长因子β(TGFβ)的分子

本发明包括这样的方法，所述方法包括给受试者施用结合TGFβ的分子。 TGFβ结合物可以是任意结合分子，例如抗体、融合蛋白(如免疫粘附素)、 siRNA、核酸、适体、蛋白或小分子有机化合物。

在某些实施方式中，本发明包括结合TGFβ的抗体(抗TGFβ抗体)，或其 变体，或其抗原结合片段。抗TGFβ抗体特异性结合TGFβ蛋白、多肽或表 位。结合TGFβ的分子可以来自任何物种。

在某些示例性实施方式中，所述结合TGFβ的抗体是人源化抗体、全人 抗体或其变体，或其抗原结合片段。优选的抗TGFβ抗体阻止TGFβ和其受 体的结合并抑制TGFβ生物学活性(例如TGFβ受体介导的胞内SMAD信号转 导和由此产生的细胞活性)。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是乐德木单抗(Lerdelimumab)(CAT-152)、美替木单抗(Metelimumab)(CAT-192)、夫苏木单抗 (Fresolimumab)(GC-1008)、LY2382770、STX-100或IMC-TR1。

在某些具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含重链可变区(VH)， 所述重链可变区包含以下互补决定区(CDR)任意一或多个的氨基酸序列：

HCDR1–SNVIS(SEQ ID NO:4)；

HCDR2–GVIPIVDIANYAQRFKG(SEQ ID NO:5)；或

HCDR3–TLGLVLDAMDY(SEQ ID NO:6)。

在其它具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含轻链可变区(VL)， 所述轻链可变区包含以下互补决定区(CDR)任意一或多个的氨基酸序列：

LCDR1–RASQSLGSSYLA(SEQ ID NO:7)；

LCDR2–GASSRAP(SEQ ID NO:8)；或

LCDR3–QQYADSPIT(SEQ ID NO:9)。

在一具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含重链可变区(VH)，所 述重链可变区包含SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列。

在另一具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含轻链可变区(VL)， 所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列。

在更具体的实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含重链可变区，所述 重链可变区包含SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述 轻链可变区包含SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列。

在一具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含重链可变区,所述重链 可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列：

在另一具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含轻链可变区,所述轻 链可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列：

在更具体的实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含重链可变区，所述 重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可 变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述结合TGFβ的抗体还包含恒定区，如人IgG恒 定区。在一些实施方式中，所述恒定区是人IgG4恒定区。在另外的实施方式 中，所述恒定区是修饰的人IgG4恒定区。优选地，所述IgG4恒定区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列：

在其它实施方式中，所述恒定区是人Cκ恒定区。优选地，所述Cκ恒定 区包含SEQID NO:13的氨基酸序列：

在一具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含重链，所述重链包含 SEQ ID NO:14的氨基酸序列：

位置1-120：所述重链的可变区(VH)。下划线的是CDR(互补决定区，根 据Kabat定义)。

位置121-447：人IgG4恒定区(SwissProt IGHG4_HUMAN)。

在其它具体实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含轻链，所述轻链包 含SEQ IDNO:15的氨基酸序列：

位置1-108：所述轻链的可变区(VL)。下划线的是CDR(互补决定区，根 据Kabat定义)。

位置109-215：人Cκ恒定区。

在另外的实施方式中，所述结合TGFβ的抗体包含重链，所述重链包含 SEQ ID NO:14的氨基酸序列；以及轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨 基酸序列。

在一些实施方式中，所述结合TGFβ的抗体由宿主细胞表达为包含前导 序列。所述前导序列优选包含长1-30个氨基酸，更优选25-25个氨基酸，以 及最优选19个氨基酸的氨基酸序列。所述重链、轻链或重链和轻链两者可以 包含前导序列。

例如，所述轻链或重链前导序列可以包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列：MGWSCIILFL VATATGVHS(SEQ ID NO:16)。因此，宿主细胞可以表达未加 工的重链，所述未加工的重链可包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列：

其中

位置1-19：前导序列

位置20-139：所述重链的可变区(VH)。下划线的是CDR(互补决定区， 根据Kabat定义)。

位置140-466：人IgG4恒定区(SwissProt IGHG4_HUMAN)。

在其它示例性实施方式中，表达未加工轻链的宿主细胞可包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列：

其中

位置1-19：前导序列

位置20-127：所述轻链的可变区(VL)。下划线的是CDR(互补决定区， 根据Kabat定义)。

位置128-234：人Cκ的恒定区。

在本发明的示例性实施方式中，所述结合TGFβ的抗体是人源化抗体或 全人抗体。人源化抗体和全人抗体同种型的实例包括IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM。优选地，所述抗TGFβ抗体是IgG抗体。有四种形式的IgG。优选地， 所述抗TGFβ抗体是IgG4抗体。在本发明的一个实施方式中，所述抗TGFβ 抗体是人源化的IgG4抗体。在本发明的另一实施方式中，所述抗TGFβ抗体 是全人IgG4抗体。

在本发明最优选的实施方式中，所述抗TGFβ抗体是IgG4抗TGFβ抗体， 其包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；以及轻链，所述轻 链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在本发明可选的最优选的实施方式中， 所述抗TGFβ抗体是IgG4抗TGFβ抗体，其包含重链可变区和轻链可变区， 所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4、5和6的3个互补决定 区，且所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7、8和9的3个CDR。美国专利No.7,723,486和美国专利No.8,383,780中详细描述了抗TGFβ抗体 的鉴别、分离、制备和表征，包括这样的抗TGFβ抗体，其包含含有SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列，和含有SEQ ID NO:15的轻链氨基酸序列，且CDR 序列对应于SEQ ID NO:4-9，所述专利通过引用整体并入本文。

优选地，所述抗体或其抗原结合片段是“泛特异性的”并且结合人TGFβ1、 TGFβ2和TGFβ3。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合人TGFβ1、 TGFβ2和TGFβ3，并作为拮抗剂起作用。更优选地，所述抗体或其抗原结合 片段结合人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，并中和人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。 适于本发明的方法中使用的示例性泛特异性抗TGFβ单克隆抗体(mAb)描述 于美国专利Nos.7,723,476和8,383,780，其各自通过引用整体并入本文。

1D11.16是示例性鼠泛特异性抗TGFβ抗体，其在大量体外测定中中和人 和小鼠TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(Dasch等,1989；Dasch等,1996；R&D System 对MAB1835的产品说明,其各自通过引用整体并入本文)，并且在纤维化动物 模型中的概念验证研究中是有效的(Ling等,2003；Miyajima等,2000； Schneider等,1999；Khanna等,1999；Shenkar等,1994)。然而，由于1D11.16 是鼠单克隆抗体(Dasch等,1989；Dasch等,1996)，其对于在人中的治疗用途 不是优选的。因此，在某些实施方式中，在本发明的方法中采用1D11.16抗 体的变体或衍生物。

如上所述，本发明的某些实施方式还包括抗TGFβ抗体的变体或衍生物。 具体而言，本发明可包括抗TGFβ抗体的变体，所述抗TGFβ抗体是IgG4抗 TGFβ抗体，其包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；以及 轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在其它实施方式中，本发 明包括1D11.16抗体的变体或衍生物。抗TGFβ抗体的变体基于它们的高相 似性，可以具有类似的物理化学性质，并因此也包括在本发明的范围内。变体定义为具有与本文描述的抗TGFβ抗体至少80％、至少90％、至少95％或 至少97％如至少98％或99％同源的氨基酸序列，并能够竞争与TGFβ多肽、 TGFβ多肽片段或TGFβ表位的结合的抗体。优选地，所述变体将改善、中和 /或以其他方式抑制TGFβ和其受体的结合以及TGFβ生物学活性(例如TGFβ 受体介导的胞内SMAD信号转导和由此产生的细胞活性)。与靶结合的竞争 的测定可以通过本领域技术人员已知的常规方法实现。优选地所述变体是人 抗体，优选是IgG4分子。在优选的实施方式中，所述变体在氨基酸序列上与 IgG4抗TGFβ抗体具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性， 所述IgG4抗TGFβ抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序 列；以及轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。术语“变体”指的 是包含这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列相比于所述抗TGFβ抗体 的氨基酸序列有一或多个氨基酸改变。所述变体可以具有保守性序列修饰， 包括氨基酸取代、修饰、添加和缺失。

修饰的实例包括但不限于，糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺 化、由已知保护基/封闭剂的衍生化、蛋白水解切割，以及连接至细胞配体或 其它蛋白。可以通过本领域已知的标准技术导入氨基酸修饰，例如在编码所述 抗体的核酸中的定点诱变、分子克隆、寡核苷酸定向诱变和随机PCR介导的 诱变。保守性氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似结构或化学特性的氨 基酸残基替换的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。 这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性 侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性 侧链的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)， 以及具有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人 员也将清楚也可以采用除上述所用的之外的氨基酸残基家族分类。此外，变体 可以具有非保守性氨基酸取代，例如用具有不同结构或化学特性的氨基酸残基 置换氨基酸。类似的次要变化还可以包括氨基酸缺失或插入或两者。确定哪些氨基酸残基可以被取代、修饰、插入或缺失而不破坏免疫学活性的指导可以使 用本领域公知的计算机程序找到。本领域技术人员已知的计算机算法，例如尤 其是Gap或Bestfit，可以用于最优地比对待比较的氨基酸序列并定义相似的或 相同的氨基酸残基。与抗TGFβ抗体相比，变体可以具有相同的或不同的，更 高的或较低的结合亲和力，但仍然能够特异性结合TGFβ，且可以和所述抗 TGFβ抗体具有相同的、更高的或更低的生物学活性。

本发明的实施方式还包括所述抗TGFβ抗体的抗原结合片段。术语“抗原 结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合片段”和类似术语指的是抗体的一部 分，其包含与抗原相互作用并赋予所述结合剂对抗原的特异性和亲和力的氨 基酸残基(如互补决定区(CDR))。所述抗原结合片段可以衍生自任何动物物 种，例如啮齿类(如兔、大鼠或仓鼠)和人。优选地，所述抗原结合片段将具有 人来源。抗原结合片段的非限制性实例包括：Fab片段、F(ab')2片段、Fd片 段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、dAb片段和由模拟所述抗体超变区的氨基 酸残基组成的最小识别单元。

F.治疗性施用

本文描述的方法包括给受试者施用治疗有效量的结合TGFβ的抗体。如 本文所用，短句“治疗有效量”指的是结合TGFβ的抗体的剂量，其导致与OI 相关的一或多种症状的可检测的改善，或其引起与导致成骨不全的病症或症 状的病理学机制相关的生物学效应(如降低特定生物标志物的水平)。例如，结 合TGFβ的抗体增加骨矿物质密度、增加骨量和/或骨强度、减少骨折和/或牙 折断和/或改善OI的任何诊断性量度的剂量被认为是治疗有效量。

在一实施方式中，在用结合TGFβ的抗体治疗后，骨矿物质密度、骨量 和/或骨强度增加大约5％至大约200％。在某些实施方案中，在用结合TGFβ 的抗体治疗后，骨矿物质密度、骨量和/或骨强度增加大约5％至大约10％、 10％至大约15％、15％至大约20％、20％至大约25％、25％至大约30％、30％ 至大约35％、35％至大约40％、40％至大约45％、45％至大约50％、50％至大 约55％、55％至大约60％、60％至大约65％、65％至大约70％、70％至大约 75％、75％至大约80％、80％至大约85％、85％至大约90％、90％至大约95％、 95％至大约100％、100％至大约105％、105％至大约110％、110％至大约115％、 115％至大约120％、120％至大约125％、125％至大约130％、130％至大约135％、 135％至大约140％、140％至大约145％、145％至大约150％、150％至大约155％、 155％至大约160％、160％至大约165％、165％至大约170％、170％至大约175％、 175％至大约180％、180％至大约185％、185％至大约190％、190％至大约195％ 或195％至大约200％。

在某些实施方式中，减少骨吸收的血清标志物例如尿羟基脯氨酸、尿总 吡啶诺林(PYD)、尿游离脱氧吡啶诺林(DPD)、尿I型胶原交联的N-端肽 (NTX)、尿或血清I型胶原交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白 (OPN)和酒石酸盐抗性酸性磷酸酶5b(TRAP)的抗体剂量被认为是治疗有效 量。在一实施方式中，在用结合TGFβ的抗体治疗后，骨吸收的血清标志物 被减少大约5％至大约200％。

在一实施方式中，在用结合TGFβ的抗体治疗后，骨吸收的血清标志物 例如尿羟基脯氨酸、尿总吡啶诺林(PYD)、尿游离脱氧吡啶诺林(DPD)、尿I 型胶原交联的N-端肽(NTX)、尿或血清I型胶原交联的C-端肽(CTX)、骨涎 蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)和酒石酸盐抗性酸性磷酸酶5b(TRAP)被减少大 约5％至大约10％、10％至大约15％、15％至大约20％、20％至大约25％、25％ 至大约30％、30％至大约35％、35％至大约40％、40％至大约45％、45％至大 约50％、50％至大约55％、55％至大约60％、60％至大约65％、65％至大约 70％、70％至大约75％、75％至大约80％、80％至大约85％、85％至大约90％、 90％至大约95％、95％至大约100％、100％至大约105％、105％至大约110％、 110％至大约115％、115％至大约120％、120％至大约125％、125％至大约130％、 130％至大约135％、135％至大约140％、140％至大约145％、145％至大约150％、 150％至大约155％、155％至大约160％、160％至大约165％、165％至大约170％、 170％至大约175％、175％至大约180％、180％至大约185％、185％至大约190％、 190％至大约195％或195％至大约200％。

在某些实施方式中，增加骨沉积的血清生物标志物例如总碱性磷酸酶、 骨特异性碱性磷酸酶、骨钙蛋白和I型前胶原(C-端/N-端)的抗体剂量被认为 是治疗有效量。在一实施方式中，在用结合TGFβ的抗体治疗后，骨沉积的 血清标志物被增加大约5％至大约200％。

在某些实施方案中，在用结合TGFβ的抗体治疗后，骨沉积的血清生物 标志物例如总碱性磷酸酶、骨特异性碱性磷酸酶、骨钙蛋白和I型前胶原(C- 端/N-端)增加大约5％至大约10％、10％至大约15％、15％至大约20％、20％ 至大约25％、25％至大约30％、30％至大约35％、35％至大约40％、40％至大 约45％、45％至大约50％、50％至大约55％、55％至大约60％、60％至大约 65％、65％至大约70％、70％至大约75％、75％至大约80％、80％至大约85％、 85％至大约90％、90％至大约95％、95％至大约100％、100％至大约105％、105％至大约110％、110％至大约115％、115％至大约120％、120％至大约125％、 125％至大约130％、130％至大约135％、135％至大约140％、140％至大约145％、 145％至大约150％、150％至大约155％、155％至大约160％、160％至大约165％、 165％至大约170％、170％至大约175％、175％至大约180％、180％至大约185％、 185％至大约190％、190％至大约195％或195％至大约200％。

其它实施方式包括施用治疗有效剂量的抗体，其改善受OI影响的非骨骼 器官的功能。例如，改善听觉、肺和/或肾功能的结合TGFβ的抗体的剂量被 认为是治疗有效量。

根据本发明的方法，给受试者施用的结合TGFβ的抗体的治疗有效量将 取决于所述受试者的年龄和大小(如体重或体表面积)，以及施用途径，和本领 域普通技术人员公知的其它因素而有所不同。

在某些示例性实施方式中，所述抗TGFβ抗体作为皮下剂量给受试者施 用。施用的其它示例性方式包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、 鼻内、硬膜外和经口途径。组合物可以通过任何便利的途径施用，例如通过 输注和推注，通过经由上皮或粘膜层(如口腔黏膜、直肠和小肠粘膜等)的吸收， 且可和其它生物学活性剂一起施用。施用可以是全身性施用或局部施用。所 述TGFβ抗体可以肠胃外或皮下施用。

多种递送系统是已知的并可以用于施用所述药物组合物，如，包囊化于 脂质体中、微粒、微胶囊、受体介导的内吞(见例如Wu等(1987)J.Biol.Chem. 262:4429-4432)。所述治疗组合物将和合适的载体、赋形剂和其它被并入制剂 中以提供改善的转移、递送、耐受等药剂一起施用。大量合适的制剂可以在 全体药物化学家已知的处方集中找到：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、 软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阴离子型或阳离子型)的小囊泡(如 LIPOFECTIN^TM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂 碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。也见 Powell等"Compendiumof excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。

药物组合物可以制备成单位剂量的剂型以适于配合活性成分的剂量。此 类单位剂量的剂型包括例如，片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿瓶)、栓剂等。

药物组合物也可以使用任何可接受的装置或机构给受试者施用。例如， 可以使用注射器和针或使用可重复使用的笔和/或自动注射器递送装置实现 所述施用。本发明的方法包括使用多种可重复使用的笔和/或自动注射器递送 装置来施用TGFβ结合物(或包含所述结合物的药物制剂)。此类装置的实例包 括但不限于AUTOPEN^TM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、 DISETRONIC^TM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、 HUMALOG MIX 75/25^TM笔、HUMALOG^TM笔、HUMALIN 70/30^TM笔(Eli Lilly andCo.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN^TMI、II和III(Novo Nordisk, Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk,Copenhagen, Denmark)、BD^TM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN^TM、 OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis, Frankfurt,Germany)，仅列出少量。应用于皮下递送药物组合物的一次性笔和 /或自动注射器递送装置的实例包括但不限于，SOLOSTAR^TM笔 (sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)和KWIKPEN^TM(Eli Lilly)、 SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM (Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM Pen (Abbott Labs,Abbott Park,IL)，仅列出少量。

本文也考虑使用微输注器(microinfusor)来递送TGFβ结合物(或包含所述 结合物的药物制剂)至受试者。如本文所用，术语“微输注器”指的是皮下递送 装置，其设计为在延长的时间段内(如大约10、15、20、25、30或更多分钟) 缓慢地施用大体积(如多达2.5mL或更多)的治疗制剂。见例如，U.S.6,629,949； US 6,659,982；和Meehan等,J.ControlledRelease 46:107-116(1996)。微输注 器特别可用于递送大剂量的以高浓度(如大约100、125、150、175、200mg/mL 或更高)包含在内的和/或粘稠溶液中的治疗性蛋白质。

G.组合疗法

在某些方面，本发明包括治疗OI的方法，所述方法包括给有需要的受试 者施用结合TGFβ的抗体与至少一种额外的治疗剂组合的治疗。在本发明的 方法的实践中可以与抗TGFβ抗体组合施用的额外的治疗剂的实例包括但不 限于，双膦酸盐类、降钙素、特立帕肽和已知治疗、预防或改善受试者中成 骨不全的任何其它化合物。在本方法中，所述额外的治疗剂可以与结合TGFβ 的抗体同时地或顺序地施用。例如，对于同时施用，可以制备含有结合TGFβ 的抗体以及至少一种额外的治疗剂两者的药物制剂。在一实施方式中，所述 结合TGFβ的抗体和药物双膦酸盐类(如羟乙膦酸盐(Etidronate)、氯屈膦酸盐(Clodronate)、替鲁膦酸盐(Tiludronate)、帕米膦酸盐(Pamidronate)、奈立膦酸 盐(Neridronate)、奥帕膦酸盐(Olpadronate)、阿屈膦酸盐(Alendronate)、伊班膦 酸盐(Ibandronate)、唑来膦酸盐(Zoledronate)和利塞膦酸盐(Risedronate))组合 施用。在另一实施方式中，所述结合TGFβ的抗体和刺激骨形成的药物组合 施用，例如甲状旁腺激素类似物和降钙素。在仍另一实施方式中，所述结合 TGFβ的抗体和选择性雌激素受体调节剂(SERM)组合施用。在本发明的方法 的实践中与所述结合TGFβ的抗体组合使用的额外的治疗剂的量可以通过本 领域已知的和容易获得的常规方法容易地测定。

实施例

OI是全身性结缔组织疾病，其中受影响个体展现I型胶原纤维形成的不 正常(其由于I型胶原的α1或α2链一级序列中的突变)，以及I型胶原翻译 后修饰和结合I型胶原纤维的蛋白的不正常。CRTAP编码称作软骨相关蛋白 的蛋白，其是脯氨酰-3-羟化复合物的成员，作用是帮助I型胶原的正确折叠、 翻译后修饰和分泌。CRTAP的突变负责VII型成骨不全。缺乏Crtap基因的 小鼠(Crtap^-/-)展现模拟成骨不全的表型，并且用作该疾病的模型(Morello等, 2006)。Crtap^-/-小鼠和年龄匹配的野生型(WT)同窝对照用于如下实施例。

材料和方法

动物、抗TGFβ治疗和组织收集

在混合的C57Black/6J/129Sv遗传背景上产生和维持Crtap^-/-小鼠。获得 在Col1a2基因中携带G610C突变的小鼠(Col1α2^tm1.1Mcbr)并与野生型C57Bl/6J 小鼠繁育。对Col1α2^tm1.1Mcbr等位基因为杂合的小鼠用于实验。获得应答于 Smad2/3依赖型TGFβ信号传导途径而表达萤光素酶的TGFβ报道子小鼠 (SBE-Luc小鼠)并与Crtap^+/-小鼠繁育2代以生成Crtap^-/-小鼠和表达所述 报道子基因的同窝野生型。全部小鼠圈养于动物饲养所，且遵循Animal Care and Use Committee(IACUC)批准的方案进行动物实验。

对于蛋白和RNA分析，分离P3小鼠的颅盖，清除骨外组织，并在液氮 中速冻。对于Crtap^-/-P10小鼠肺的免疫染色，在处死后各小鼠的肺立即同 等地用4％多聚甲醛以恒定的25cm H₂O的压力通过重力膨胀，然后在气管处 缝合。然后轻柔地从胸腔摘除肺并固定于4％多聚甲醛中过夜。

八周龄的雌性Crtap^-/-和Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠用泛-TGFβ中和抗体1D11 处理8周(10mg/kg体重，I.P.，每周注射3次)。对照Crtap^-/-、Col1α2^tm1.1Mcbr和WT小鼠接受相同IgG1同种型的对照抗体(13C4)。在处理后，处死小鼠， 收集腰椎和股骨并固定于10％福尔马林中用于微型CT和骨组织形态测定。 Crtap^-/-小鼠的对侧股骨储存于-20℃，包裹于盐水浸湿的纱布，直到进行生物 力学测试。这些Crtap^-/-小鼠的肺如P10小鼠一样相等地膨胀，收集并固定。 在处理期间不可能盲试，因为1D11和对照抗体根据分组注射。在全部随后分 析中，研究者不知道基因型和处理组。

免疫印迹

蛋白提取自速冻P3颅盖样品，转移至300μl裂解缓冲液(0.0625M Tris-HCl pH7.5、2％SDS、5mM NaF、2mM Na₃VO₄和RocheComplete蛋 白酶抑制剂)并均质化1分钟，随后在95℃孵育40分钟。将上清液转移至 Centrifugal Filter Units/Amicon Ultra 3K(Millipore)并离心以浓缩蛋白。使用 Micro BCA试剂(Pierce)遵循制造商说明测量裂解物中总蛋白浓度。将40μg 的颅盖蛋白提取物悬浮于含有5％巯基乙醇的laemmeli缓冲液并在Mini Protean TGX SDS-PAGE凝胶(梯度4-20％；Bio-Rad)上分离并转移至PVDF 膜上用于蛋白印迹分析。PVDF膜用pSmad2单克隆抗体孵育(Cell Signaling #3108,1:750于含5％BSA的TBST过夜)，之后是二抗HRP-连接的抗-兔抗体 (GE,1:5000于含5％BSA的TBST中2小时)，用ECL Plus Western Blotting Detection System(GE)处理并曝光于X射线胶片。随后，使用ReBlot Plus试 剂(Millipore)从膜剥离抗体，并和Smad2单克隆抗体一起孵育(Cell Signaling #5539，1:2000于含5％BSA的TBST中过夜)，之后是类似的二抗孵育及ECL介导的显影。扫描X射线胶片并使用ImageJ软件(National Institutes of Health) 定量各带的密度。

定量实时PCR

使用Trizol试剂(Invitrogen)从速冻P3小鼠提取总RNA。使用Superscript IIIRT系统(Invitrogen)根据生产商说明从总RNA合成cDNA。在LightCycler.v 1.5(Roche)使用基因特异性引物和SYBR Green I试剂(Roche)进行定量 RT-PCR。β2-微球蛋白用作标准化cDNA浓度的参考基因。

体内生物荧光成像

向表达TGFβ-报道子转基因(SBE-Luc小鼠)的P10 Ctrap^-/-小鼠和同窝野 生型注射D-萤光素(Goldbio,150mg/kg,IP)，用异氟醚麻醉，在注射后10分 钟用生物萤光成像系统(Xenogen)成像。

原代成骨细胞培养、TGFβ-报道子细胞

从大约2月龄的Crtap^-/-和野生型小鼠的胫骨和股骨分离骨髓细胞并在 含有10％FBS、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的α-MEM中培养。每 两天更换培养基并弃去未贴壁细胞。7天后，贴壁细胞，定义为骨髓基质细 胞(BMSC)，以2.5x10⁴个细胞每cm²重新接种至24孔板并在成骨性培养基 (α-MEM，10％FBS、500μM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸酯)中培养3天。 收集条件处理的培养基并和PAI-萤光素酶报道子貂(mink)肺上皮细胞一起孵 育。在24小时后,收集细胞裂解物用于萤光素酶活性测定,其通过使用 Dual-LuciferaseReporter System(Promega)测量。结果标准化至使用Micro BCA试剂(Pierce)定量的总蛋白量。

微型CT、骨组织形态测定

使用ScancoμCT-40微型CT扫描腰椎骨和股骨用于定量小梁和骨皮质参 数。通过手工外形修复椎体L4的小梁骨以及股骨的远端干骺端截面，使用 Scanco分析软件分析椎骨和股骨小梁骨参数。在股骨骨干中央处的骨皮质参 数使用所述软件中包含的自动阈值算法进行定量。

扫描的未脱钙Crtap^-/-小鼠脊柱样品然后包埋与塑料中用于切片。使用标 准方案进行甲苯胺蓝染色和TRAP染色用于使用Bioquant Osteo Image Analysis System分别可视化和定量Ob's和Oc's。

免疫染色和组织学

对于免疫组织化学，收集P5小鼠的后肢，在4％多聚甲醛中固定过夜并 包埋于石蜡中。在脱蜡和再水合后，进行热诱导的抗原恢复(Dako,S1700)， 随后用透明质酸酶(2mg/ml；Sigma)处理30分钟。内源过氧化物酶用3％过氧 化氢封闭10分钟。在和封闭溶液孵育后(3％正常山羊血清，0.1％BSA，0.1％ Triton X-100于PBS中)，切片在针对TGFβ1(G1221,Promega)和核心蛋白多 糖(LF-113,由Larry Fisher,National Institute of Dentaland Craniofacial Research,Bethesda,MD,USA馈赠)的抗体中在37C孵育60min(各自1:25稀 释于PBS，对照样品仅在PBS中孵育)，随后和二抗孵育(SuperPicTure PloymerDetection试剂盒,Invitrogen)。根据生产商推荐加入底物DAB，样品脱水并使 用CytosealXYL基于二甲苯的封装介质(Thermo Scientific)封装。WT和同窝 突变体的切片在相同时间处理。对WT和同窝突变体使用相同曝光时间用光 学显微镜(Axioplan 2,Zeiss)拍摄小梁骨图像。

P10和16周龄Crtap^-/-小鼠的肺在组织收集期间相等地膨胀，固定于4％ 多聚甲醛中，并石蜡包埋。P10 Crtap^-/-和野生型小鼠的肺用于针对pSmad2 免疫染色。简言之，石蜡切片用二甲苯处理，再水合，并加热20分钟用于抗 原恢复(pH 6；Dako)。切片然后在封闭溶液(3％正常驴血清，0.1％BSA,0.1％ Triton X-100于PBS中)中孵育，随后和兔抗-pSmad2抗体(1:500)(Cell signaling, #3108)孵育，缀合Alexa flour 594的驴抗-兔二抗(1:600)(Invitrogen)孵育，并 用具有DAPI的Prolong Gold抗褪色试剂(Invitrogen)封装。使用Zeiss显微镜 (Axiovision Software)使用相同曝光时间拍摄这些切片的荧光图像。

对于16周龄小鼠的肺组织学和形态测量，旁矢状面切片使用苏木精和伊 红染色的标准方案染色。使用平均线性截距(MLI)方法定量肺泡结构之间的距 离。简言之，使用光学显微镜(Axioplan 2,Zeiss)，每小鼠在20X放大率下捕 获来自两个肺的全部肺叶的10个组织学视野。使用修改的ImageJ软件 (National Institutes of Health,由PaulThompson修改)测量MLI。在人工去除血 管、大的气道和其它非肺泡结构后，所述软件自动设定各图像的肺泡组织阈 值，并将由1353行(每行测量21像素)组成的线网覆盖于所述图像。截断肺泡 组织的行数用于计算MLI。

通过3点弯曲测试生物力学

通过三点弯曲使用6mm弦长用Instron 5848装置(Instron Inc.,Norwood MA) 测试Crtap^-/-和WT股骨。全部股骨在室温润湿测试。它们以0.05N/s的速率进 行5秒预负荷至1N。在预负荷后，股骨以0.1mm/秒的速率负荷至被破坏。负 荷和位移数据使用BLUEHILL软件(Instron 5848)在40Hz速率捕获。

为了测定屈服点，鉴定负荷-位移曲线上在预负荷之后和最大负荷之前的 区域。该区域被分成5段，取该段具有最大斜率的拟合线。然后，在所述线 上应用0.012的偏移量(offset)。偏移线和负荷-位移曲线交点为0.012偏移屈 服点。该屈服点更接近地对应于0.2％偏移应变(在文献中经常选择)。弹性区 域鉴定为预负荷完成至屈服点的区域。屈服后区域鉴定为从屈服点至负荷变 化超出-1N的点的区域，表示破坏。弹性位移是样本保持在弹性区期间的位 移。屈服后位移是样本保持在屈服后区域期间的位移。总位移计算为弹性位 移和屈服后位移的和。使用梯形数值积分方法，到达破坏的能量计算为负荷- 位移曲线下的面积。通过发现在样本破坏前，由BLUEHILL记录的最高负荷 值确定最大负荷。为了计算刚度，对负荷-位移曲线的弹性区的最陡段应用最 小二乘拟合法。刚度是最小二乘拟合线的斜率。获得自股骨骨干的微型CT 分析的几何数据(直径和转动惯量)用于计算固有材料特性：极限强度、对破坏 的韧性和弹性模量。

血清骨更新(turnover)标记物

使用来自Biomedical Technologies Inc.的Mouse Osteocalcin EIA Kit定量血清骨钙蛋白(OCN)。骨胶原的C-端交联端肽(CTX)使用来自Immunodiagnostic SystemsLtd的RatLaps^TM EIA Kit进行定量。两种分析均根 据生产商说明进行。

胶原SDS-PAGE、质谱和交联分析

从Crtap^-/-和野生型胫骨制备I型胶原用于质谱。骨用氯仿/甲醇(3:1v/v) 脱脂并在0.5M EDTA,0.05M Tris-HCl,pH 7.5中去矿物质化，全部步骤在4℃ 进行。将骨精细地粉碎并通过在SDS-PAGE样品缓冲液中热变性(90℃)将胶 原溶解。从SDS-PAGE凝胶切下胶原α-链并进行胶内胰蛋白酶消化。使用装 配有在线液相色谱(LC)(ThermoFinnigan)的LCQDeca XP离子阱质谱仪对胰 蛋白酶肽进行电喷射MS，使用C8毛细管柱(300μm x 150mm；Grace Vydac 208MS5.315)以4.5μl min洗脱。使用Sequest搜索软件(ThermoFinnigan)使用 NCBI蛋白数据库用于肽鉴别。

在6N HCl中水解去矿物质化的骨后，通过HPLC定量吡啶诺林交联物 (HP和LP)。

表面等离子体共振分析

使用BIACore X仪器(GE Healthcare Bio-Science Corp.)进行表面等离子体 共振实验。来自野生型和Crtap^-/-小鼠的经纯化的天然小鼠腱I型胶原通过酰 胺偶联分别以大约0.05ng/mm²(500RU)和0.08ng/mm²(800RU)的浓度固 定化于CM5传感器芯片上。以10μl/min的流速和20℃在HBS-P缓冲液(10 mM Hepes缓冲液,pH 7.4,含有150mM NaCl和0.005％表面活性剂P20) 进行所述实验。将重组人核心蛋白多糖核心蛋白(R&D systems)注射至两种I 型CM5芯片上。人核心蛋白多糖的储液浓度通过氨基酸分析确定。核心蛋白 多糖对野生型和Crtap^-/-小鼠I型胶原的结合应答通过CM5传感器芯片上固 定化的I型胶原的量进行标准化。使用三种浓度的核心蛋白多糖(3、5和 12μM)，各浓度的分析重复三次。该实验用每次分离自不同小鼠的胶原进行 两次。

统计学方法

两组之间的比较使用非配对、双尾学生T检验进行。对于3组之间的比 较，如果确认组间等方差，进行单因素方差分析(ANOVA)，之后使用 Holm-Sidak方法进行全部配对多重比较。如果等方差检验失败，进行秩和 Kruskal-Wallis单因素ANOVA，之后是使用Tukey检验的全部配对多重比较。 对于学生T检验、ANOVA和秩和Kruskal-Wallis单因素ANOVA，小于0.05 的P值被认为是统计学显著的。对于事后配对多重比较，各P值与取决于P 值的秩和总比较数目(以确定是否组间差异是显著的)的临界水平进行比较。 Sigma Plot V11.0(Systat Software Inc.)用于统计学分析。

1D11对OI小鼠的骨和肺的作用在研究开始时是未知的。为了确定每组 小鼠初始样本大小，我们计算出为了以90％功效检测出1D11和对照处理的 OI小鼠之间由微型CT确定的骨量(BV/TV)的20％的最小差异，需要8只小 鼠的组大小。

实施例1：Crtap^-/-颅盖中改变的TGFβ信号传导

分析Crtap^-/-小鼠和年龄匹配的同窝野生型(WT)对照的活化 pSmad2(TGFβ信号传导途径的成员)，以及TGFβ的其它下游靶的表达。切下 颅盖骨并提取RNA和蛋白质，分别通过实时-PCR和蛋白印迹分析。如可见 于图1A和1B，与野生型小鼠相比，Crtap^-/-小鼠具有高100％的pSmad2与 总Smad2的比率，其通过蛋白印迹测定并通过密度计量定量，表明TGFβ信号传导在Crtap^-/-小鼠中被升高。TGFβ的转录靶，例如Col1a1和p21，相比 于WT对照被升高，如通过RT-PCR所测量的并分别阐述于图1C和图1D。 测量原纤维变性ECM蛋白结缔组织生长因子(CTGF)并发现相比于WT对照， 在Crtap^-/-小鼠中高大约50％，其通过RT-PCR测定并阐述于图1E。如图1F 所示，RT-PCR分析揭示细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27的表达在Crtap^-/-或WT小鼠中均没有被改变。

实施例2：在Crtap^-/-小鼠体内和在crtap^-/-成骨细胞中增加的TGFb 活性

将Crtap^-/-小鼠与应答于TGFβ信号传导活化而表达萤光素酶的TGFβ报 道子小鼠(Jackson Laboratory；B6.Cg-Tg(SBE/TK-luc)7Twc/J)杂交。用底物D- 荧光素(150mg/kg)在成像前10分钟注射至P9小鼠。如图2A所示，与WT 对照相比，Crtap^-/-小鼠在其尾部、长骨和颅盖具有高得多的荧光，表明crtap^-/-小鼠中增加的TGFb活性。图2B，颅盖处萤光素酶的活性的定量。

骨髓基质细胞(BMSC)分离自Crtap^-/-小鼠和WT小鼠，在成骨性条件下 离体培养，而条件处理的培养基针对TGFβ活性使用应答TGFβ信号传导的 活化而表达萤光素酶的细胞系进行分析。如图2C所示，与来自WT小鼠的BMSC相比，来自Crtap^-/-BMSC的条件处理的培养基导致所述报道子细胞系 高接近两倍的萤光素酶活性。总言之，这些数据表明TGFβ分泌和活性在 Crtap^-/-小鼠的骨和成骨细胞中升高。

实施例3:Crtap^-/-椎骨的μCT分析

成年8周龄Crtap^-/-小鼠(N＝6每组)施用1D11(10mg/kg，I.P.，3次/周， 共8周)，结合TGFβ的泛特异性抗体的鼠替代物，其包含重链和轻链，所述 重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基 酸序列。不相关的13C4抗体施用至单独组的Crtap^-/-小鼠和WT小鼠作为对 照(n＝6)。16周龄小鼠的L4椎体(从8-16周处理)通过μ-CT成像。来自用TGFβ 中和抗体1D11(Genzyme；10mg/kg,I.P.；3次/周)处理8周的8周龄Crtap^-/-小鼠(n＝6每组)以及用对照抗体(13C4安慰剂)处理的野生型(WT)和对照 Crtap^-/-小鼠的椎体L4的微型CT数据示于图3。如图3所示，相比于WT对 照椎骨，Crtap^-/-椎骨是多孔的。然而，1D11处理导致与WT条件可比的骨 骼表型。

来自图3的数据定量于图4，用泛特异性抗TGFβ抗体处理拯救Crtap^-/-小 鼠的骨骼表型。在测量的参数中，来自经处理的Crtap^-/-小鼠的椎骨统计学上 类似于WT对照小鼠，所述参数包括骨体积密度(BV/TV)、总骨表面积(BS)、 骨表面积密度(BS/BV)、小梁数目(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁间隙(TB.Sp) 和总体积(Dens TV)。

实施例4：抗-TGFβ处理的Crtap^-/-椎骨的组织形态测定

除了μ-CT外，抗体处理的、安慰剂处理的和WT小鼠的椎骨通过组织 形态测定进行分析。如图5A和5B所示，μ-CT结果通过组织形态测定分析 确认。此外，组织切片针对破骨细胞标志物TRAP的表达进行染色。分析揭 示与WT对照相比，Crtap^-/-小鼠中有更多破骨细胞覆盖更多的骨表面积 (N.Oc/BS和Oc.S/BS)，表明增加的破骨细胞活性。用1D11抗TGFβ处理将 全部破骨细胞特异性参数降低至低于WT数目。因此，鉴定破骨细胞为TGFβ 抗体的潜在靶，更具体而言，泛特异性抗TGFβ抗体的潜在靶。

实施例5：抗TGFβ处理的Crtap^-/-股骨的三点弯曲测试

在16周龄小鼠切除的股骨上进行生物力学测试(在从8-16周的处理后)， 使用标准三点弯曲测试，使用Instron 5848装置(Instron Inc.,Norwood MA)， 弦长6mm，以1N/s速率预负荷5秒至1N。在预负荷后，股骨以0.1mm/秒的 速率压迫至破坏。负荷和位移数据使用BLUEHILL软件(Instron 5848)在40Hz 速率捕获。

如图6所示，相比于WT对照小鼠，Crtap^-/-小鼠股骨较不坚硬且能够经 受显著较小的最大负荷。1D11处理的Crtap^-/-小鼠的股骨显示显著改善的最 大负荷，以及与对照crtap^-/-小鼠相比增加的刚度的趋势。

因此，用1D11泛特异性抗TGFβ抗体处理定量地、定性地和生物力学地 恢复Crtap^-/-小鼠的骨骼表型。

实施例6：用1D11抑制TGFβ信号传导改善肺表型

Crtap^-/-小鼠具有全身性结缔组织疾病，表现为低骨量、肾小球硬化和肺 发育异常(Baldridge等；PLoSone,5(5):e10560(2010))。在Crtap^-/-小鼠的肺中看 见增加的TGFβ表达，如针对pSmad2的免疫染色阳性所证明的以及如图7A 所示。组织学上，相比于WT小鼠，Crtap^-/-小鼠展现增加的远端气道空间， 如图7B中所示。1D11处理(10mg/kg，IP，3x/周，处理8周)降低Crtap^-/-小 鼠中pSmad2表达并减小远端气道空间并改善肺表型，如图7A和图7B所示 并定量于图7C(*P<0.05vs.对照Crtap^-/-；每只小鼠分析10张图像，每组n＝8 只小鼠)。

实施例7：Crtap^-/-肺中的核心蛋白多糖表达

研究TGFβ表达的转录调控物以了解Crtap^-/-小鼠的骨和肺中TGFβ信号 传导失调的基础。可以在ECM中调控TGFβ的主要类别的细胞外蛋白包括富 含亮氨酸的小蛋白多糖(SLRP)，例如核心蛋白多糖。免疫染色揭示与WT对 照肺相比，核心蛋白多糖在Crtap^-/-肺中增加的表达，如图8所示。

由于核心蛋白多糖是成熟TGFβ的调控物，该发现提示改变的胶原翻译 后修饰，如在OI中出现的，改变ECM蛋白包括SLRP的相互作用。核心蛋 白多糖结合羟脯氨酸位点，例如位于I型和II型胶原氨基酸残基396处的位 点，其不存在于Crtap^-/-小鼠中。进行核心蛋白多糖结合测定来确定核心蛋白 多糖结合是否在OI中被改变，以及这是否部分负责在Crtap^-/-骨和小鼠中观 察到的表型。如图9所示，结合3-羟基化胶原肽(如在I型和II型胶原中)的 核心蛋白多糖多于没有3-羟基化的胶原多肽(如在III型胶原中)。

实施例8：增加的TGFβ信号传导是成骨不全中的共同机制

OI表征为脆骨、低骨量、骨畸形和骨折。此外，骨外表现包括肺异常本 质上对发病率和死亡率有作用。OI的大部分例子由编码I型胶原的基因 (COL1A1和COL1A2)中的常染色体显性突变引起。最近几年，已经鉴别 在编码参与胶原翻译后修饰的蛋白的额外基因中的突变是隐性形式OI的原 因。最早描述的位于软骨相关蛋白(CRTAP)中，其是负责I型胶原脯氨酸残基 986α1(I)的3-羟基化的脯氨酰-3-羟化酶复合物的成员。次形态CRTAP突变 导致纤维胶原中3-羟基脯氨酸(3Hyp)的部分损失以及其它残基的过度修饰， 并导致隐性VII型OI，其临床上与显性形式的严重OI重叠。3Hyp的生理学 功能并不完全了解，但生物化学研究提示其可能参与胶原-蛋白相互作用，而 不是负面影响胶原稳定性。

ECM是信号传导分子和它们的调控物的重要储库。在骨中，通过偶联骨 吸收性破骨细胞和骨形成性成骨细胞的局部活性，TGFβ充当骨重建的中央协 调物。TGFβ由成骨细胞大量产生，主要以非活性潜伏形式分泌，并被沉积至 骨基质中。在此处，在破骨细胞的骨吸收期间，它可以被释放并活化。作为 额外水平的调控，活性TGFβ可以被蛋白多糖结合，所述蛋白多糖调节其与 胶原原纤维相关的生物活性。因为I型胶原是骨中ECM最丰富的组分，这给 出有趣的假设，即在OI中观察到的胶原结构的改变不仅仅增加骨脆性，而且 还影响骨基质的信号传导储库功能。有趣的是，Crtap^-/-小鼠显示和具有增加 TGFβ信号传导的动物模型的表型重叠。例如，TGFβ过表达导致低骨量。此 外，Crtap^-/-小鼠在肺中显示肺泡气道空间的扩大，类似于在马方综合征 (Marfan syndrome)的小鼠模型中观察到的，其中增加的TGFβ信号传导已经显 示为肺病理学的主要促成者。因此，如果隐性OI，在Crtap^-/-小鼠中研究TGFβ 信号传导的状态。

为了评估骨中的TGFβ信号传导状态，评估Crtap^-/-小鼠的颅盖骨中TGFβ 靶基因的表达水平。与野生型(WT)样品相比，Crtap^-/-骨显示TGFβ下游靶p21 (细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1)、PAI-1(纤维蛋白溶酶原活化物抑制剂-1) 和Col1a1增加的表达，与升高的TGFβ活性一致(图10A)。为确认胞内TGFβ 信号传导途径的增加的活化，评估了Smad2的状态，Smad2是胞内第二信使 蛋白，其在TGFβ受体活化后被磷酸化。与靶基因表达一致，免疫印迹分析 显示在Crtap^-/-小鼠的骨样品中磷酸化Smad2(pSmad2)与总Smad2的更高的 比率，表明增加的TGFβ信号传导(图10B和10C)。

为了确定是否这些静态测量反映增加的体内TGFβ活性，Crtap^-/-小鼠和 在TGFβ-应答Smad结合元件控制下表达萤光素酶的TGFβ-报道子小鼠 (SBE-Luc小鼠)杂交。与同窝WT/SBE-Luc相比，Crtap^-/-/SBE-Luc小鼠显示 在骨骼结构上增加的生物荧光面积，表明增加的体内TGFβ活性(图10D)。在 3窝中，Crtap^-/-小鼠显示与WT小鼠相比在头/颅盖处平均2.86倍(SD±0.34) 的生物荧光信号。此外，为了测试与Crtap损失相关的增加的TGFβ/Smad信 号传导是骨固有的，即组织自发的，体外将骨髓基质细胞(BMSC)分化成成骨 细胞。通过使用TGFβ报道子细胞系，发现与来自WT BMSC的培养基相比， 来自Crtap^-/-BMSC的条件处理的培养基展现更高的TGFβ活性(图10E)。总 言之，这些发现表明Crtap的损失以组织自发方式增强骨中TGFβ信号传导。

具有严重OI的患者也能展现固有肺异常，且呼吸衰竭是这些个体的主要 死亡原因之一。有趣的是，Crtap^-/-小鼠显示肺泡气道空间的弥散增加，其是 与其他发育模型中增加的TGFβ信号传导相关的特征。因此，Crtap^-/-小鼠的 肺在肺泡细胞中显示增加的对pSmad2的胞内染色，表明增加的TGFβ活性也 存在于骨外组织中(图10F)。

为了理解增加的TGFβ信号传导是否代表促成Crtap^-/-小鼠中骨和肺表型 的原因机制，用泛-TGFβ中和抗体(1D11)进行拯救实验。八周龄的Crtap^-/-小 鼠用1D11处理8周；对照Crtap^-/-和WT小鼠接受非特异性对照抗体(13C4)。 1D11并不显著改变处理的Crtap^-/-小鼠的体重，表明TGFβ抑制并不影响一般 营养状态(图14)。此外，质谱和交联分析显示1D11并不显著改变Crtap^-/-小 鼠中I型胶原P986 3-羟基化的状态或胶原交联，提示失调的TGFβ信号传导 是改变的分子胶原结构的结果，且不直接参与胞内胶原加工和胞外原纤维组 装(图15)。Crtap^-/-小鼠展现降低的骨量和不正常的小梁骨参数(图11A和 11B)。椎骨的微型CT成像分析阐明与对照Crtap^-/-小鼠相比，TGFβ抑制显 著将小梁骨参数，包括骨体积/总体积、小梁数目和小梁厚度改善至接近WT 水平(图11A和11B，以及图17)。在Crtap^-/-小鼠中的股骨小梁骨中观察到类 似有益效果，其中TGFβ抑制显著地改善小梁骨参数(图18)。在WT小鼠和Esl-1^-/-小鼠11(由于正常TGFβ成熟中的缺陷而增加TGFβ活性的模型)中，之 前已经报道用1D11抑制TGFβ对骨骼的作用。尽管在WT小鼠的脊柱中1D11 中度增加小梁BV/TV 30％，而Esl-1^-/-小鼠显示BV/TV的106％的增加。这 提示在TGFβ在骨骼中被增加的病理生理情况中靶向TGFβ能够导致相对地 更显著的正面作用。在本研究中，1D11使Crtap^-/-小鼠脊柱处的小梁BV/TV 增加235％，支持了失调的TGFβ信号传导是Crtap^-/-小鼠中低骨量的重要促成者。在股骨骨干处，与WT小鼠相比，Crtap^-/-小鼠中皮质体系结构的参数 包括皮质厚度、直径、横切面积和横切转动惯量被显著降低。在1D11处理之 后，这些参数与WT小鼠的区别不再显著(图19)。为了测试皮质和小梁骨中 的这些改变是否翻译成改善的骨强度，通过3-点弯曲进行股骨的生物力学测 试。发现TGFβ抑制能够增加处理的Crtap^-/-小鼠中的最大负荷和极限强度， 表明改善的全骨和组织强度和改善的对骨折的抗性。然而，1D11处理对于OI骨的增加的脆性没有作用，如对照和1D11处理的Crtap^-/-小鼠中降低的屈 服后位移所表明的(图20)。这可能反映了与改变的胶原结构相关的先天异常 矿化。总的而言，这些发现表明增加的TGFβ信号转导是由Crtap缺陷造成 的隐性OI中的骨表型的主要促成因素，且抑制失调的TGFβ信号传导，恢复 骨量、微结构参数并改善全骨强度。

为了理解Crtap^-/-小鼠中TGFβ抑制在细胞水平的作用，在处理的小鼠上 进行组织形态测定。在该研究中的椎体切片中，发现与WT小鼠相比，对照 Crtap^-/-中每骨表面积增加的破骨细胞(Oc)和成骨细胞(Ob)数目，表明在脊柱 中增加的骨重建(图11C和图21)。一致地，血清骨更新标志物骨钙蛋白(OCN) 和骨胶原的C-端交联端肽(CTX)在8周龄(OCN和CTX)和16周龄(仅CTX) 对照Crtap^-/-小鼠中升高(图19)。在具有显性和隐性OI的患者中已经描述骨 细胞组分中的类似变化，显示增加的Oc和Ob数目与增加的骨更新一致。有 趣的是，具有增加的TGFβ信号传导的小鼠模型也显示低骨量，伴随增加的 破骨细胞骨吸收和不正常的骨重建。TGFβ对骨细胞的作用的大多数报道与这 样的模型一致，其中TGFβ能够刺激在骨修复位点处的Oc和Ob前体的招募 和初始分化，随后是胰岛素样生长因子(IGF-1)介导的Ob分化。然而，在持 续的高剂量，通过抑制分化因子RUNX2，TGFβ能够抑制Ob分化。考虑到 对Oc/Ob相互作用的决定性作用，TGFβ可用性的微调是在骨重建期间局部 偶联骨吸收和骨形成的关键因素，且其不平衡可导致显著的骨病变。

与在对照Crtap^-/-小鼠中的发现相反，用1D11处理的Crtap^-/-小鼠的切 片显示减少的Oc和Ob数目，其甚至低于在WT小鼠中测量到的值，表明在 该实验中使用的1D11的剂量下TGFβ抑制造成的失调骨重建的超生理学抑制 (supraphysiologic suppression)(图11C)。与较早的报道一致，Oc's和Ob's降低 至低于WT水平的观察结果也印证了在骨重建过程期间生理学需要局部量的 TGFβ以正常协调Oc's和Ob's。我们的发现不同于之前在WT小鼠中的研究， 其中1D11处理减少Oc数目但增加Ob数目。这可能反映了TGFβ抑制在病 理生理学情况中不同的细胞作用，所述病理生理学情况具有增加TGFβ信号 传导以及相比于WT小鼠中正常骨增加的骨重建。已经显示TGFβ抑制成骨 细胞前体细胞的分化，且增加的TGFβ信号传导能够由此导致更高比例的未 成熟成骨细胞谱系细胞。在另一方面，在骨表面上未成熟Ob's增加的数目或 更高的比例能够导致增加的由这些细胞分泌的TGFβ的量。用1D11抑制TGFβ 显著降低Crtap^-/-小鼠中增加的Ob数目的发现提示增加的TGFβ信号传导是 促成成骨细胞谱系细胞增加的原因。

除了关于Oc和Ob数目的发现，观察到对照Crtap^-/-小鼠中更高的每骨 面积骨细胞(Ot)数目，其在1D11处理的Crtap^-/-小鼠中被降低至与WT小鼠 中的那些可比较的水平(图11C和图21)。在OI患者中，在具有所述疾病更严 重形式的个体中已经观察到增加的Ot密度，很可能反映由于OI骨中生理学 成熟的缺陷而存在未成熟原骨(primary bone)。与我们增加的TGFβ信号传导 促成OI中的骨病理学的假设一致，在WT小鼠中过表达TGFβ类似地导致增 加的Ot密度。作为可能的解释，在Ob's向Ot's转换期间，TGFβ能够抑制 Ob凋亡，并由此导致增加的Ot密度。总而言之，这些发现表明增加的TGFβ 信号传导促成Crtap^-/-小鼠中高骨更新状态和受损的骨成熟，以及表明失调的 TGFβ信号传导的抑制逆转这些细胞变化。

考虑到对Oc/Ob相互作用的这些决定性作用，TGFβ可用性的微调是在 骨重建期间局部偶联骨吸收和骨形成的关键因素，且其不平衡可导致显著的 骨病变。我们的发现表明在Crtap^-/-小鼠中抑制失调的TGFβ信号传导恢复骨 量以及微结构参数，改善全骨强度，并逆转在Crtap^-/-小鼠中观察到的细胞变 化。因此，TGFβ信号传导失调是隐性OI的该小鼠模型中骨表型的重要促成 因素。

我们还对TGFβ抑制是否影响Crtap^-/-小鼠的肺表型感兴趣。对照Crtap^-/-小鼠的肺显示相比于WT小鼠远端气道空间的增加(图11D)。有趣的是，用 TGFβ中和抗体处理的Crtap^-/-小鼠的肺显示肺泡结构之间距离的60％的改善 (图11D和11E)。该发现表明过度TGFβ信号传导也是Crtap^-/-小鼠中肺异常 的重要致病促成因素。已经将增加的TGFβ信号传导与肺发育异常以及成熟 肺中的疾病相联系。例如，肺中TGFβ过表达导致具有扩大的气道空间面积 的受损的肺发育，且增加的TGFβ信号传导是马方综合征以及肺气肿和支气 管哮喘发展中肺异常的起作用的致病机制。我们的结果表明过度TGFβ信号 传导也是Crtap^-/-小鼠中肺异常的重要致病促成因素。考虑到Crtap^-/-小鼠中 用1D11部分拯救肺表型，有可能除了在TGFβ抑制能够改善所述表型的较晚 时期维持肺组织之外，当解剖结构建立的时候，失调的TGFβ信号传导影响 肺组织发育。

所问的下一个问题是由于Crtap缺失(导致丧失在P986处的3Hyp以及胶 原翻译后过度修饰)导致的胶原中的变化如何导致失调的TGFβ信号传导。生 物化学分析表明胶原脯氨酰-3-羟基化并不根本地影响胶原分子的稳定性，但 相反地其可能影响胶原-蛋白相互作用。一种有吸引力的假设是3Hyp的缺失 能够影响胶原和富含亮氨酸的小蛋白多糖(SLRP)的相互作用。SLRP已知结合 I型胶原和TGFβ两者，且由此调节TGFβ活性。例如，SLRP核心蛋白多糖 能够在骨肉瘤细胞中抑制TGFβ的不同作用，而其在成骨细胞前体细胞中增强TGFβ活性。提示核心蛋白多糖在I型胶原上的结合区域集中于三螺旋结 构域的残基961/962处，其位置紧密邻近P986残基(在OI中由于Crtap缺陷 而未羟基化)。因此，有可能P9863Hyp位置标记核心蛋白多糖和I型胶原结 合的相互作用位点，由此介导成熟TGFβ至胶原的隔离(sequestration)。

因此，假设结合胶原的核心蛋白多糖对于TGFβ调控是关键的，并且该 结合被改变的胶原结构打断，例如被在隐性OI的情况中I型胶原α1链中P986 翻译后3-脯氨酰-羟基化修饰的丧失打断。鉴定到尽管Crtap缺失并不改变颅 盖骨中核心蛋白多糖和其它SLRP的RNA表达(图12A)，也不改变核心蛋白 多糖在小梁骨中的定性丰度(图24)，其的确降低重组核心蛋白多糖核心蛋白 与分离自Crtap^-/-小鼠的I型胶原的结合(相对于WT小鼠)(图12B)。WT和 Crtap^-/-小鼠的I型胶原与重组核心蛋白多糖核心蛋白的结合的表面等离子体 共振分析测量证明在所测试的三种浓度在Crtap^-/-小鼠中降低的结合(图23)。 来自两个独立生物学重复(◆重复1、▲重复2)的核心蛋白多糖进行各个所指 明浓度的三个技术重复。结果显示为WT平均值的百分比(条表示每组平均 值)。在3、5和12μM核心蛋白多糖下与Crtap^-/-I型胶原结合的核心蛋白多 糖的平均降低分别为28.5％、33.5％和38.1％。

该发现提示胶原-蛋白多糖的相互作用的改变可能促成OI中骨和其它富 含胶原组织中失调的TGFβ信号传导。基于报道的核心蛋白多糖有效降低 TGFβ生物活性对核心蛋白多糖-胶原结合的要求，有可能OI胶原的缺陷导致 改变的核心蛋白多糖结合，并因此，导致其将TGFβ隔离在基质中并调节TGFβ 功能的能力。因此，改变的蛋白多糖-胶原相互作用可能促成OI中骨和其它 富含胶原组织中失调的TGFβ信号传导，即使不存在绝对TGFβ水平的主要 变化(图24和图25)。在更严重形式的显性OI中的COL1A1和COL1A2突变 聚簇于已知结合蛋白多糖的特定区域的发现支持这一观点，进一步支持蛋白 多糖-胶原相互作用与正常骨稳态平衡的生理学相关性。这也将暗示，和核心 蛋白多糖竞争胶原结合位点的其它蛋白多糖也可能促成失调的TGFβ活性， 且额外的信号传导途径能被改变。

由于OI一些隐性和显性形式的临床重叠(其中胶原纤维的缺陷结构导致 脆骨症和骨外征象)，有可能TGFβ信号传导的失调是共同的病理生理学疾病 机制。为了证明该假设，研究了显性OI的小鼠模型中的TGFβ信号传导状态。 在Col1a2基因中携带G610C突变的敲入小鼠(Col1α2^tm1.1Mcbr)表型模拟显性遗 传的中等形式的OI，所述OI原始在Amish人群中鉴别。在Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠的骨样品中，发现TGFβ靶基因p21和PAI-1增加的表达，表明TGFβ信号传导被上调(图13A)。一致地，来自Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠的骨提取物的免 疫印迹分析也显示活化的pSmad/总Smad2的增加的比率，类似于我们在 Crtap^-/-小鼠中的观察(图13B和13C)。

为了测试在该显性OI模型中增加的TGFβ信号传导也代表致病机制，8 周龄的Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠用TGFβ-中和抗体1D11处理8周；对照 Col1α2^tm1.1Mcbr和WT小鼠用对照抗体13C4处理。类似于在Crtap^-/-小鼠中 的发现，1D11-处理将脊柱处的小梁骨参数恢复至WT水平(图13D、13E和 22)。一并考虑，这些发现表明失调的TGFβ信号传导对于显性形式的OI的发病机制也是重要的促成因素，以及表明抗TGFβ疗法校正了显性OI中的骨 表型。

从临床-翻译角度，必须考虑OI患者中全身TGFβ抑制的潜在负面作用。 尽管TGF-β1^-/-小鼠在生命的最初几周发展出严重的多病灶炎症疾病和免疫 系统失调，在用1D11处理的Crtap^-/-和Col1α2^tm1.1Mcbr小鼠中，我们没有观 察到对一般健康、行为或生长的明显负面作用，提示在成年小鼠中对TGFβ 配体的部分药物学抑制不同于在发育期间TGFβ1的完全缺失。在人中，夫苏 木单抗(GC1008,Genzyme)，其对TGFβ三种同种型的亲和力和特异性类似于 1D11，被用于患者中的I期研究，所述患者具有治疗抗性原发灶节段性肾小 球硬化、特发性肺纤维化和恶性黑色素瘤或肾细胞癌。在这些研究中，夫苏 木单抗大体上是良好耐受的，可能具有剂量相关副作用包括皮疹或斑、鼻出 血、牙龈出血和疲劳。

OI的分子机制并没有完全了解。因此，当前对患有OI的患者的治疗选 择主要限于抗吸收疗法，如用于治疗骨质疏松症。有趣的是，最近的合成代 谢剂特立帕肽在OI成人中的随机化、安慰剂对照试验显示III/IV型严重OI 与具有I型温和OI的那些反应不同(Orwoll等,2014)。这提示对靶向修饰细 胞信号传导的疗法应答的基因型差异，以及TGFβ-靶向治疗可能是在由于胶 原和胶原翻译后修饰基因突变造成的严重OI中进一步研究的有希望的选择。 总体上，我们的数据支持失调的基质细胞信号传导为脆骨病不同遗传学遗传形式的发病机制的概念，并指出基于疾病特异性机制，通过中和骨骼和骨外 组织的过度活性的TGFβ来治疗OI的策略。

序列表

<110> 建新公司(GENZYME CORPORATION)

贝勒医学院(BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE)

<120>用于治疗成骨不全的方法

<130> 554897 SA9-108WO

<140>

<141>

<150> 61/883,151

<151> 2013-10-26

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<151> 2013-09-09

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<221> 来源

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355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 15

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="对人工序列的描述：合成多肽"

<400> 15

Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 16

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="对人工序列的描述：合成肽"

<400> 16

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 17

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="对人工序列的描述：合成多肽"

<400> 17

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Asn Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala

65 70 75 80

Gln Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Thr Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

210 215 220

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225 230 235 240

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 18

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="对人工序列的描述：合成多肽"

<400> 18

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala

100 105 110

Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 鼠(Mus sp.)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 羟基化的Pro

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 3-羟基化的Pro

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 羟基化的Pro

<400> 19

Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg

1 5 10 15

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 鼠(Mus sp.)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 羟基化的Pro

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 羟基化的Pro

<400> 20

Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg

1 5 10 15

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 鼠(Mus sp.)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 羟基化的Pro

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> 羟基化的Pro

<400> 21

Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg

1 5 10 15

Claims (18)

1.一种用于在有需要的人受试者中治疗成骨不全(OI)的药物组合，其包含：

(i)双膦酸盐或特立帕肽；和

(ii)结合转化生长因子β(TGFβ)的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

2.权利要求1的药物组合，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的药物组合，其包含阿屈膦酸盐和所述抗体。

4.权利要求1或2的药物组合，其包含帕米膦酸盐和所述抗体。

5.权利要求1或2的药物组合，其包含唑来膦酸盐和所述抗体。

6.权利要求1或2的药物组合，其包含利塞膦酸盐和所述抗体。

7.抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗人受试者的药物中的用途，所述人受试者已被诊断为患有成骨不全(OI)而且已经被确定对于I型或II型胶原、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(leprecan)或软骨相关蛋白(CRTAP)具有突变的基因，其中所述抗体或其抗原结合片段结合转化生长因子β(TGFβ)且包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)1-3和分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的轻链CDR1-3。

8.权利要求7的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别包含SEQ ID NO:10和11的氨基酸序列。

9.权利要求7的用途，其中所述抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链恒定区。

10.权利要求9的用途，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，且所述人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

11.权利要求10的用途，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含SEQID NO:14和15的氨基酸序列。

12.权利要求7-11中任一项的用途，其中所述抗体与至少一种治疗剂组合施用。

13.权利要求12的用途，其中所述治疗剂选自下组：双膦酸盐、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素类似物、降钙素和选择性雌激素受体调节剂。

14.抗体或其抗原结合片段在制造用于在有需要的人受试者中治疗成骨不全(OI)的方法中的药物中的用途，其中

所述抗体或其抗原结合片段结合转化生长因子β(TGFβ)且包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)1-3和分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的轻链CDR1-3；和

所述方法包括测量如下的水平：(1)一种或多种选自下组的骨沉积生物标志物：1型前胶原(C端/N端)、骨钙蛋白、总碱性磷酸酶和骨特异性碱性磷酸酶，或(2)一种或多种选自下组的骨吸收生物标志物：尿羟基脯氨酸、尿总吡啶诺林、尿游离脱氧吡啶诺林，尿I型胶原交联的N-端肽、尿或血清I型胶原交联的C-端肽、骨涎蛋白、骨桥蛋白和酒石酸盐抗性酸性磷酸酶5b。

15.权利要求14的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别包含SEQ ID NO:10和11的氨基酸序列。

16.权利要求14的用途，其中所述抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链恒定区。

17.权利要求16的用途，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含SEQID NO:14和15的氨基酸序列。

18.权利要求1-6中任一项的药物组合或权利要求7-17中任一项的用途，其中所述受试者患有I型OI。

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