JP7016113B2 - 骨形成不全症の処置方法 - Google Patents
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Description
この出願は、2013年3月20日に出願された米国仮特許出願第61/803,647号、2013年9月9日に出願された米国仮特許出願第61/875,399号、および2013年10月26日に出願された米国仮特許出願第61/883,151号と関連し、これらの仮特許出願の内容は参照によって全体としてそれぞれ本明細書に組み入れる。
本発明は、米国国立衛生研究所より付与された第P01 HD070394号、第P01 HD22657号および第R01 DE01771号の下で政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は骨形成不全症(osteogenesis imperfecta、OI)を処置する方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒトトランスフォーミング成長因子ベータ(transforming growth factor beta、TGFβ)またはそのアイソフォームに特異的に結合する結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を使用して、OIを処置する方法に関する。
本発明は骨形成不全症(OI)を効果的に処置する方法に関する。より詳細には、本発明は、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)またはそのアイソフォームに特異的に結合する結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を使用して、OIを処置する方法に関する。好ましくは、結合タンパク質は「汎特異的」であり、ヒトTG
Fβの3つのアイソフォーム、つまりTGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3の全てに結合する。より好ましくは、結合タンパク質は、ヒトTGFβ1、TGFβ2およびTGFβ3に特異的に結合し、中和する。一態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるOIを処置する方法であって、該対象に、TGFβに特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含む前記方法を提供する。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。
ト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、単鎖Fvs(scFv)(例えば、単一特異性、二重特異性など)、ラクダ化抗体、Fab断片、F(ab’)断片、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体およびこれらの任意のエピトープ結合断片を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり抗原結合ドメイン、またはTGFβ抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子(例えば、抗TGFβ抗体の1つまたはそれ以上の相補性決定領域(CDR))を含む。抗TGFβ抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、任意のクラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)または任意の下位クラス(例えばIgG2aとIgG2b)の抗体であってもよい。特定の実施形態において、抗TGFβ抗体は、ヒト化抗体、例えばヒト化モノクローナル抗TGFβ抗体である。別の実施形態において、抗TGFβ抗体は、完全ヒト抗体、例えば完全ヒトモノクローナル抗TGFβ抗体である。好ましい実施形態において、抗TGFβ抗体は、IgG抗体、例えばIgG4抗体である。
界面活性剤など)、ショ糖エステル(例えばショ糖、マルトース、トレハロースなど)および多価アルコール(例えばマンニトール、ソルビトールなど)が挙げられる。参照によって全体として本明細書に組み入れるRemington’s Pharmaceutical Sciences(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.も参照のこと。
of Health and Human Services、NIH Publication No.91~3242参照)。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組み換えヒト抗体はインビトロ変異生成(またはヒトのIg配列に動物の遺伝子組み換え体が使用されるときはインビボでの体性変異)にかけられ、したがってその組み換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系VHおよびVL配列に由来
および関連する一方、インビボのヒト抗体生殖細胞系レパートリーには天然に存在しない可能性もある配列である。
に十分な、対立形質変異体(例えば、SNP変異体)、スプライス変異体、断片;誘導体;置換、欠失、および挿入変異体;融合ポリペプチド;ならびに異種間ホモログが挙げられる。さらに、抗TGFβ免疫反応を生成するために十分なTGFβの可溶形態も包含される。当業者であれば認識するように、抗TGFβ抗体は、TGFβポリペプチド、ポリペプチド断片、抗原および/または、エピトープがより大きなポリペプチド断片の一部、さらにはより大きなポリペプチドの一部である大きな抗原の一部であるとき、エピトープに結合することができる。hTGFβは二量体形態または単量体形態で存在することもできる。
「治療薬剤」は、TGFβ抗体を指す。ある別の実施形態において、用語「治療薬剤」は、TGFβ抗体以外の薬剤を指す。好ましくは、治療薬剤は、TGFβ媒介疾患またはその1つもしくはそれ以上の症状の処置、制御または緩和に有用であることが公知であるか、またはこれまで使用されたもしくは現在使用されている薬剤である。
Services、Washington D.C.)第5版(「Kabatら」)に記載されているようなEUインデックスに従う。好ましい実施形態において、可変領域はヒト可変領域である。
OIは、骨マトリックス沈着またはホメオスタシスに関与する1つまたはそれ以上のタンパク質の欠損によって特徴付けられる一群の先天性骨障害を包含する。特定の遺伝子変異、生じるタンパク質の欠損、または罹患個体の表現型によって定義される8つの種類のOIがある。OIの種類によって表現型は様々であるが、共通の症状として、骨格と歯の不完全骨化、骨量減少、脆弱骨、および病的骨折が挙げられる。
istiansenら、2010;Kelleyら、2011)が挙げられる。さらなる変異が、分子間コラーゲン架橋遺伝子、例えば、プロコラーゲン-リジン、2-オキソグルタレート5-ジオキシゲナーゼ2(PLOD2)において、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ遺伝子ファミリーのメンバー、例えばロイシンプロリン-高プロテオグリカン(レプレカン(leprecan))(LEPRE1)、ペプチジルプロリルイソメラーゼB(シクロフィリンB)(CYPB)において、および軟骨関連タンパク質(CRTAP)において特定されている(Morelloら、2006;Cabralら、2007;Baldridgeら、2008;van Dijkら、2009;Choiら、2009;Barnesら、2010;Pyottら、2011)。変異に加えて、骨形成タンパク質(BMP)およびトランスフォーミング成長因子β(TGFβ)ならびにそれぞれの受容体などのタンパク質が様々なOI表現型に関与していると考えられるが、それらの作用の正確なメカニズムはわかっていない(Gebkenら、2000)。
脊椎動物の骨格は、骨で構成されており、骨は、構造、土台、保護、およびイオン輸送を制御する無機物質源である生きた石灰化組織である。骨は細胞および非細胞成分で構成される特別な結合組織である。非細胞性細胞外マトリックス(ECM)は、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質を含んでおり、それらの両方が石灰化プロセスに関与している。正確に分泌され整列したECMが、適切な骨形成にとって重要である。骨形成不全症で証拠づけられるように、いずれかのECMタンパク質の欠失、奇形または誤配列により、病理が発生する。
TGFβは、細胞の増殖および分化、胚発生、細胞外マトリックス形成、骨発達、創傷治癒、造血、ならびに免疫および炎症反応に関与する多機能サイトカインである(Robertsら、1981;Borderら、1995a)。分泌TGFβタンパク質は、潜在関連ペプチド(latency-associated peptide、LAP)および成熟TGFβペプチドへと切断され、潜在型および活性型で見出される。成熟したTGFβペプチドは、ホモ二量体、および他のTGFβファミリーとのヘテロ二量体の両方を形成する。TGFβは、任意の天然源から精製することができ、または合成的に(例えば組み換えDNA技術の使用によって)製造することもできる。TGFβ分子は、「hTGF」として知られるヒト由来の分子であることが好ましい。
MPPSGLRLLL LLLPLLWLLV LTPGRPAAGL STCKTIDMEL VKRKRIEAIR GQILSKLRLA 60
SPPSQGEVPP GPLPEAVLAL YNSTRDRVAG ESAEPEPEPE ADYYAKEVTR VLMVETHNEI 120
YDKFKQSTHS IYMFFNTSEL REAVPEPVLL SRAELRLLRL KLKVEQHVEL YQKYSNNSWR 180
YLSNRLLAPS DSPEWLSFDV TGVVRQWLSR GGEIEGFRLS AHCSCDSRDN TLQVDINGFT 240
TGRRGDLATI HGMNRPFLLL MATPLERAQH LQSSRHRRAL DTNYCFSSTE KNCCVRQLYI 300
DFRKDLGWKW IHEPKGYHAN FCLGPCPYIW SLDTQYSKVL ALYNQHNPGA SAAPCCVPQA 360
LEPLPIVYYV GRKPKVEQLS NMIVRSCKCS 390(配列番号1)
MHYCVLSAFL ILHLVTVALS LSTCSTLDMD QFMRKRIEAI RGQILSKLKL TSPPEDYPEP 60
EEVPPEVISI YNSTRDLLQE KASRRAAACE RERSDEEYYA KEVYKIDMPP FFPSENAIPP 120
TFYRPYFRIV RFDVSAMEKN ASNLVKAEFR VFRLQNPKAR VPEQRIELYQ ILKSKDLTSP 180
TQRYIDSKVV KTRAEGEWLS FDVTDAVHEW LHHKDRNLGF KISLHCPCCT FVPSNNYIIP 240
NKSEELEARF AGIDGTSTYT SGDQKTIKST RKKNSGKTPH LLLMLLPSYR LESQQTNRRK 300
KRALDAAYCF RNVQDNCCLR PLYIDFKRDL GWKWIHEPKG YNANFCAGAC PYLWSSDTQH 360
SRVLSLYNTI NPEASASPCC VSQDLEPLTI LYYIGKTPKI EQLSNMIVKS CKCS 414(配列番号2)
MKMHLQRALV VLALLNFATV SLSLSTCTTL DFGHIKKKRV EAIRGQILSK LRLTSPPEPT 60
VMTHVPYQVL ALYNSTRELL EEMHGEREEG CTQENTESEY YAKEIHKFDM IQGLAEHNEL 120
AVCPKGITSK VFRFNVSSVE KNRTNLFRAE FRVLRVPNPS SKRNEQRIEL FQILRPDEHI 180
AKQRYIGGKN LPTRGTAEWL SFDVTDTVRE WLLRRESNLG LEISIHCPCH TFQPNGDILE 240
NIHEVMEIKF KGVDNEDDHG RGDLGRLKKQ KDHHNPHLIL MMIPPHRLDN PGQGGQRKKR 300
ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST 360
VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS 412(配列番号3)
本発明は、TGFβと結合する分子を対象に投与することを含む方法を含む。TGFβ結合剤は、任意の結合性の分子、例えば抗体、融合タンパク質(例えば免疫アドヘシン)、siRNA、核酸、アプタマー、タンパク質または小分子有機化合物であり得る。
HCDR2-GVIPIVDIANYAQRFKG(配列番号5)、または
HCDR3-TLGLVLDAMDY(配列番号6)。
LCDR2-GASSRAP(配列番号8)、または
LCDR3-QQYADSPIT(配列番号9)。
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFS SNVISWVRQA PGQGLEWMGG VIPIVDIANY AQRFKGRVTI TADESTSTTY MELSSLRSED TAVYYCASTL GLVLDAMDYW
GQGTLVTVSS(配列番号10)。
ETVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSLG SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRAPGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYADSPITFG QGTRLEIK(配列番号11)。
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK(配列番号12)。
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC(配列番号13)。
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFS SNVISWVRQA PGQGLEWMGG VIPIVDIANY AQRFKGRVTI TADESTSTTY MELSSLRSED TAVYYCASTL GLVLDAMDYW
GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK(配列番号14)。
位置1-120:重鎖(VH)の可変領域。CDR(相補性決定領域、Kabatの定義による)に下線を付している。
位置121-447:ヒトIgG4の定常領域(SwissProt IGHG4_HUMAN)。
ETVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSLG SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRAPGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYADSPITFG QGTRLEIKRT
VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC(配列番号15)。
位置1-108:軽鎖(VL)の可変領域。CDR(相補性決定領域、Kabatの定義による)に下線を付している。
位置109-215:ヒトCκの定常領域。
NVISWVRQAP GQGLEWMGGV IPIVDIANYA QRFKGRVTIT ADESTSTTYM 100
ELSSLRSEDT AVYYCASTLG LVLDAMDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL 150
APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG 200
LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPSCPA 250
PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG 300
VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS 350
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 400
ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA 450
LHNHYTQKSL SLSLGK 466(配列番号17)。
ここで、
位置1~19:リーダー配列
位置20~139:重鎖(VH)の可変領域。CDR(相補性決定領域、Kabatの定義による)に下線を付している。
位置140~466:ヒトIgG4の定常領域(SwissProt IGHG4_HUMAN)。
MGWSCIILFL VATATGVHSE TVLTQSPGTL SLSPGERATL SCRASQSLGS 50
SYLAWYQQKP GQAPRLLIYG ASSRAPGIPD RFSGSGSGTD FTLTISRLEP 100
EDFAVYYCQQ YADSPITFGQ GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA 150
SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 200
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 234(配列番号18)。
ここで、
位置1~19:リーダー配列
位置20~127:軽鎖(VL)の可変領域。CDR(相補性決定領域、Kabatの定義による)に下線を付している。
位置128~234:ヒトCκの定常領域。
ct sheet for MAB1835、これらは参照によって全体としてそれぞれ本明細書に組み入れる)、線維症モデル動物における原理究明研究においても有用である(Lingら、2003;Miyajimaら、2000;Schneiderら、1999;Khannaら、1999;Shenkarら、1994)。しかしながら、1D11.16は、マウスモノクローナル抗体であるので(Daschら、1989;Daschら、1996)、ヒトでの治療的使用には好ましくない。したがって、特定の実施形態では、1D11.16抗体の変異体または誘導体が本発明の方法で用いられる。
アルゴリズム、例えば、特にGapまたはBestfitは、当業者に良く知られており、比較されるアミノ酸配列を最適に整列させて、アミノ酸残基の類似性または同一性を定義するために使用することができる。変異体は、抗TGFβ抗体と比較して、同じまたは異なる、より高いまたはより低い結合親和力を有し、なおTGFβに結合することができ、より高いまたはより低いが抗TGFβ抗体と同じ生物学的活性を有する。
本明細書に記載の方法は、TGFβに結合する治療有効量の抗体を対象に投与することを含む。本明細書で使用するとき、語句「治療有効量」は、OIに関連する1つまたはそれ以上の症状の検知可能な改善をもたらす、または骨形成不全症の病態もしくは症状を生じさせる根本的な病理学的メカニズムに相関する生物学的効果(例えば特別のバイオマーカーのレベルの低下)を生じさせる、TGFβに結合する抗体の用量を意味する。例えば、骨塩量を増加させ、骨量および/もしくは骨強度を増加させ、骨折および/もしくは歯損を低下させ、ならびに/またはOIの任意の診断測定値を改善するTGFβに結合する抗体の用量は、治療有効量と考えられる。
ペプチド(CTX)、骨シアロタンパク質(BSP)、オステオポンチン(OPN)および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ5b(TRAP)は、TGFβに結合する抗体を用いた処置後に、約5%~約10%、10%~約15%、15%~約20%、20%~約25%、25%~約30%、30%~約35%、35%~約40%、40%~約45%、45%~約50%、50%~約55%、55%~約60%、60%~約65%、65%~約70%、70%~約75%、75%~約80%、80%~約85%、85%~約90%、90%~約95%、95%~約100%、100%~約105%、105%~約110%、110%~約115%、115%~約120%、120%~約125%、125%~約130%、130%~約135%、135%~約140%、140%~約145%、145%~約150%、150%~約155%、155%~約160%、160%~約165%、165%~約170%、170%~約175%、175%~約180%、180%~約185%、185%~約190%、190%~約195%、または195%~約200%低下する。
of excipients for parenteral formulations」、PDA(1998)、J Pharm Sci Technol、第52巻、238~311頁も参照のこと。
量(例えば約2.5mLまたはそれ以上まで)の治療用製剤をゆっくり投与するように設計された皮下送達装置を意味する。例えば、米国特許第6,629,949号;米国特許第6,659,982号;およびMeehanら、J. Controlled Release、第46巻、107~116頁(1996)参照。マイクロインフューザは、高濃度(例えば、約100、125、150、175、200mg/mLもしくはそれ以上)および/または粘性の溶液内に含まれた大量の治療用タンパク質を送達させるために特に有用である。
ある態様において、本発明は、そのような処置を必要とする対象に、TGFβに結合する抗体を、少なくとも1つのさらなる治療薬剤と組み合わせて投与することを含むOIを処置する方法を包含する。本発明の方法の実施においてTGFβに結合する抗体と組み合わせて投与され得るさらなる治療薬剤の例としては、これらに限定されないが、ビスホスホネート、カルシトニン、テリパラチド、および対象の骨形成不全症を処置、予防または緩和することが知られている任意の他の化合物が挙げられる。本発明の方法において、さらなる治療薬剤は、TGFβに結合する抗体と同時にまたは連続的に投与することができる。例えば、同時投与に関して、TGFβに結合する抗体と少なくとも1つのさらなる治療薬剤との両方を含む医薬製剤を作製することができる。一実施形態において、TGFβに結合する抗体は、ビスホスホネート製剤(例えばエチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネドリネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、ゾレンドロネート、およびリセドロネート)と組み合わせて投与される。別の実施形態において、TGFβに結合する抗体は、骨形成を刺激する薬物、例えば副甲状腺ホルモンアナログおよびカルシトニンと組み合わせて投与される。さらに別の実施形態において、TGFβに結合する抗体は、選択的エストロゲン受容体調節因子(SERM)と組み合わせて投与される。本発明の方法の実施において、TGFβに結合する抗体と組み合わせて投与されるさらなる治療薬剤の量は、既知の方法および当該分野で容易に利用可能な常法にしたがって簡便に決定することができる。
動物、抗TGFβ処置および組織回収
Crtap-/-マウスを生成し、混合C57Black/6J/129Sv遺伝的バックグラウンドを維持した。Col1α2遺伝子(Col1α2tm1.1Mcbr)におけるG610C変異を保有するマウスを得て、野生型C57Bl/6Jマウスに交配させた。Col1α2tm1.1Mcbr対立遺伝子に対してヘテロ接合性のマウスも実験に使用した。Smad2/3依存のTGFβシグナル伝達経路に応答してルシフェラーゼを発現するTGFβ-リポーターマウス(SBE-Lucマウス)を取得し、Crtap+/-マウスと2世代交配してリポーター導入遺伝子を発現するCrtap-/-マウスおよび野生型同腹子を生成した。マウスは全て小動物施設に収容し、実験は動物実験委員
会(IACUC)の承認プロトコルにしたがって実施した。
急速凍結したP3頭蓋冠試料からタンパク質を抽出し、300μlの溶解バッファー(0.0625M Tris-HCl pH7.5、2%SDS、5mM NaF、2mM
Na3VO4およびロシュコンプリートプロテイナーゼ阻害剤)に移して、1分間ホモジナイズし、95℃で40分間インキュベートした。上清を遠心濾過ユニット/Amicon Ultra 3K(Millipore)に移し、遠心分離してタンパク質を濃縮した。溶解物の全タンパク濃度を、製造業者の指示にしたがってMicro BCA試薬(Pierce)を使用して測定した。40μgの頭蓋冠タンパク質抽出物を、5%のβ-メルカプトエタノールを含有するレムリ(laemmeli)緩衝剤に懸濁し、Mini Protean TGX SDS-PAGEゲル(勾配4~20%;Bio-Rad)上で分離し、ウェスタンブロット分析用のPVDF膜上に移した。PVDF膜を、pSmad2モノクローナル抗体とインキュベートし(Cell Signaling #3108、5%BSA含有TBST中1:750、一晩)、次いで二次HRP結合抗ウサギ抗体とインキュベートし(GE、5%BSA含有TBST中1:5000、2時間)、ECL Plus Western Blotting Detection System(GE)を用いて処置して、X線フィルムに曝露させた。続いて、抗体を、ReBlot Plus試薬(Millipore)を使用して膜から剥がし、Smad2モノクローナル抗体とインキュベートし(Cell Signaling#5339、5%BSA含有TBST中1:2000、一晩)、その後、同様に二次抗体とインキュベートし、ECLを媒介させて可視化した。X線フィルムをスキャンし、各バンドの密度をImageJソフトウェア(National Institutes of Health)を使用して定量した。
全RNAを、Trizol試薬(Invitrogen)を使用して急速凍結P3マウス頭蓋冠から抽出した。Superscript III RT system(Invitrogen)を使用して、製造業者のプロトコルに従い、全RNAからcDNAを合成した。定量RT-PCRを、遺伝子特異的プライマーおよびSYBRグリーンI試薬(Roche)を使用して、LightCycler.v1.5(Roche)で実施した。β2-マイクログロブリンをs遺伝子として使用してcDNA濃度を標準化した。
TGFβリポーター導入遺伝子を発現するP10Ctrap-/-マウスおよび野生型同腹子(SBE-Lucマウス)に、D-ルシフェリン(Goldbio、150mg/kg、IP)を注入し、イソフルランで麻酔をかけ、生物発光画像システム(Xenogen)を使用して、注入後10分間画像処理した。
骨髄細胞をおよそ2か月齢のCrtap-/-および野生型マウスの脛骨および大腿骨から分離し、10%FBS、100U/mLペニシリンおよび100ug/mLストレプトマイシンを補足したα-MEMで培養した。培地は2日に1回ごとに代え、非接着細胞は廃棄した。7日後に、骨髄間質細胞(BMSC)と定義される接着細胞を、24ウェルプレートに、1cm2あたり2.5×104細胞で再播種し、骨形成培地(α-MEM、10%FBS、500μMアスコルビン酸および10mM β-グリセロホスフェート)中で3日間培養した。調整培地を回収し、PAIルシフェラーゼ・リポーター・ミンク肺上皮細胞と共にインキュベートした。24時間後、細胞溶解物をルシフェラーゼ活性アッセイのために回収し、Dual-Luciferase Reporter System(Promega)を使用して測定した。結果は、Micro BCA試薬(Pierce)を使用して定量した全タンパク質に対して標準化した。
腰部脊椎と大腿骨は、Scanco μCT-40マイクロCTを使用してスキャンし、骨梁および皮質骨パラメータを定量した。脊椎および大腿部の骨梁骨パラメータを、手動で椎体L4の骨梁ならびに大腿骨の遠位骨端セクションの輪郭をとることにより、Scanco分析ソフトウェアを使用して分析した。大腿部の中軸中心にある皮質骨パラメータは、ソフトウェアに含まれた自動閾値アルゴリズムを使用して定量した。
免疫組織化学については、P5マウスの後足を回収し、4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィンに包埋した。脱パラフィンおよび再水和後、熱誘導抗原回収(Dako、S1700)を実施し、次いでヒアルロニダーゼを用いて30分間処置した(2mg/ml;Sigma)。内因性ペルオキシダーゼを、3%過酸化水素を使用して10分間ブロックした。ブロッキング溶液(3%標準ヤギ血清、0.1%BSA、0.1%TritonX-100、PBS中)でインキュベートした後、切片を、TGFβ1に対する抗体(G1221、Promega)、およびデコリン(LF-113、Larry Fisher、National Institute of Dental and Craniofacial Research、Bethesda、MD、USAより好意で提供)で、60分間37℃でインキュベート(それぞれPBSで1:25希釈、対照試料はPBSのみでインキュベート)し、次いで二次抗体と共にインキュベートした(SuperPicTure Ploymer Detection kit、Invitrogen)。DAB基質を製造業者の推奨にしたがって添加し、試料を脱水して、Cytoseal XYLキシレンをベースとするマウント培地(Thermo Scientific)を使用してマウントした。WTと変異同腹子の切片は、同時に処置した。WTと変異体同腹子について、骨梁骨の画像を、同一の露光時間を使用して、光学顕微鏡(Axioplan2、ツァイス)を用いて得た。
Crtap-/-およびWTの大腿骨を、3点曲げ試験によって、Instron5848装置(Instron Inc.,Norwood MA)で6mmのスパンを用いて試験した。大腿骨は全て室温で、湿らせて試験した。これらを0.05N/秒の速度で5秒間、1Nで予荷重した。予荷重に続き、大腿骨を破壊されるまで0.1mm/秒の速度で荷重した。荷重と変位のデータはBLUEHILLソフトウェア(Instron5848)を使用して40Hzの速度で得た。
血清オステオカルシン(OCN)は、Biomedical Technologies Inc.からのマウス・オステオカルシンEIAキットを使用して定量した。骨コラ
ーゲン(CTX)のC末端架橋テロペプチドは、Immunodiagnostic Systems Ltd.からのRatLaps(商標)EIAキットを使用して定量した。両方の分析は、製造業者のプロトコルにしたがって実施した。
質量分析については、I型コラーゲンを、Crtap-/-および野生型脛骨から製造した。骨を、クロロホルム/メタノール(3:1 v/v)で脱脂し、0.5MのEDTA、0.05MのTris-HCl、pH7.5で脱塩し、これらの脱塩工程は全て4℃で実施した。骨を細かく刻み、コラーゲンをSDS-PAGE試料バッファー中での熱変性(90℃)によって可溶化した。コラーゲンα鎖をSDS-PAGEゲルから切断し、インゲル・トリプシン消化にかけた。Electrospray MSを、トリプシンペプチドについて、C8キャピラリーカラム(300μm×150mm;Grace Vydac208 MS5.315)を使用したインライン液体クロマトグラフィー(LC)(ThermoFinnigan)を装備したLCQ Deca XPイオントラップ質量分析計を使用して、4.5μl分で溶出して実施した。Sequest検索ソフトウェア(ThermoFinnigan)を使用して、NCBIタンパク質データベースを使用してペプチド同定を行った。
表面プラズモン共鳴実験はBIACore X機器(GE Healthcare Bio-Science Corp.)を使用して実施した。野生型およびCrtap-/-マウス由来の精製された天然マウス腱I型コラーゲンを、CM5センサー・チップ上で、それぞれ約0.05ナノグラム/mm2(500RU)および0.08ナノグラム/mm2(800RU)の濃度でのアミドカップリングによって固定化した。実験は、10μl/分の流速にて20℃でHBSPバッファー(10mM Hepesバッファー、pH7.4、150mM NaClおよび0.005%界面活性剤P20を含有)中で実施した。組み換えヒトデコリンコアタンパク質(R&D systems)を両方のI型CM5チップ上に注射した。ヒトデコリン原液の濃度はアミノ酸分析によって決定した。デコリンの野生型およびCrtap-/-マウスI型コラーゲンに対する結合応答は、CM5センサー・チップ上の固定化I型コラーゲンの量によって標準化した。3つのデコリン濃度(3、5および12μM)を使用して、各濃度について分析を3回繰り返した。この実験は、各時間の異なるマウスから単離したコラーゲンで2回実施した。
2群間の比較は、不対両側スチューデントt検定を使用して行った。3群間の比較については、群の等分散が確認された場合には一元配置分散分析(ANOVA)を実施し、次いでHolm-Sidak法を使用して全ペアワイズ多重比較を行った。等分散試験が不合格となった場合は、クラスカル=ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析を実施し、次いでTukeyテストを使用して、全ペアワイズ多重比較を行った。0.05未満のP値を、スチューデントt検定、ANOVA、およびクラスカル=ウォリスの順位に基づく一元配置ANOVAで統計的に有意であるとみなした。事後ペアワイズ多重比較については、各P値について、P値の順位および比較総数に依存する臨界レベルと比較し、群間の差異が有意であるかを測定した。Sigma Plot V11.0(Systat Software Inc.)を統計分析に使用した。
1と対照処置OIマウスとの間の90%出力でのマイクロCTによる骨量(BV/TV)の最小差異20%を検出した。1群のサイズは8匹のマウスを必要とした。
Crtap-/-マウスおよび年齢一致野生型(WT)同腹子対照を、活性化pSmad2、TGFβシグナル伝達経路のメンバー、およびTGFβの下流の他の標的の発現について分析した。頭蓋骨を切除し、RNAおよびタンパク質を、リアルタイム-PCRおよびウェスタンブロットによってそれぞれ抽出し、分析した。図1Aおよび1Bにおいて見出し得るように、Crtap-/-マウスは、ウェスタンブロットで測定し、デンシトメトリで定量化するとき、WTマウスと比較して全Smad2に対する活性化pSmad2の比率が100%高く、TGFβシグナル伝達がCrtap-/-マウス中で上昇していることが示された。TGFβの転写標的、例えばCol1α1およびp21は、RT-PCRによって測定するとき、図1Cおよび図1Dで実証されるように、WT対照と比較して、それぞれ上昇していた。線維化促進性ECMタンパク質結合組織成長因子(CTGF)を測定すると、RT-PCRによって測定するように、および図1Eで実証されるように、WT対照と比較してCrtap-/-マウスでは約50%高いことがわかった。図1Fにおいて示されるように、RT-PCR分析は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤p27の発現が、Crtap-/-マウスまたはWTマウスにおいて変わらないことが明らかになった。
Crtap-/-マウスを、TGFβシグナル伝達の活性化に応じてルシフェラーゼを発現するTGFβリポーターマウスと交配させた(Jackson Laboratory;B6.Cg-Tg(SBE/TK-luc)7Twc/J)。P9マウスに、基質D-ルシフェリン(150mg/kg)を注入し、10分後にイメージングした(Xenogen;IVISカメラシステム)。図2Aで実証されるように、Crtap-/-マウスは、WT対照と比較して、尾骨、長骨および頭蓋冠において発光がかなり高く、crtap-/-マウスにおいてTGFb活性が増加していることを示していた。図2Bは、頭蓋冠でのルシフェラーゼ活性を定量したものである。
8週齢成体Crtap-/-マウス(1群あたりN=6)に、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、TGFβに結合する汎特異的抗体のマウス代替物である1D11(10mg/kg、I.P.,3回/週、全8週)を投与した。無関係の13C4抗体を、Crtap-/-マウスと対照としてのWTマウス(N=6)の個別群に投与した。16週齢マウス(週8~16から処置)のL4椎体を、μ-CTで画像化した。TGFβ中和抗体1D11(Genzyme;10mg/kg、I.P.,3回/週)で8週間処置した8週齢Crtap-/-マウス(1群
あたりn=6)ならびに対照抗体(13C4プラセボ)で処置した野生型(WT)および対照Crtap-/-マウスからの椎体L4のマイクロCTデータを図3に示した。図3に示されるように、Crtap-/-脊椎は、WT対照脊椎と比較して海綿状であった。しかしながら、1D11処置により、WT状態と同様の骨格表現型に帰着した。
μ-CTに加えて、抗体処置マウス、プラセボ処置マウスおよびWTマウスの脊椎骨を、組織形態計測によって分析した。図5Aおよび5Bに示されるように、μ-CTの結果を組織形態計測により確認した。さらに、組織切片を、破骨細胞マーカーTRAPの発現について染色した。分析で明らかにされるように、Crtap-/-マウスの骨表面では、WT対照と比較して、より多くの破骨細胞が被覆され(N.Oc/BSおよびOc.S/BS)、破骨細胞活性が増加していることが示された。1D11抗TGFβを用いた処置により、全ての破骨細胞特異的パラメータがWT数未満に減少した。したがって、破骨細胞は、TGFβ抗体、より詳細には、汎特異的抗TGFβ抗体に対する有望な標的として同定された。
生体力学試験は、インストロン5848装置(Instron Inc.,Norwood MA)を用いた標準3点曲げ試験を使用して、6mmのスパンで、1N/秒の速度で5秒間1Nを予荷重して、16週齢マウス(処置後8~16週目)の切除した大腿骨に実施した。予荷重に続き、大腿骨を破壊されるまで0.1mm/秒の速度で圧縮した。荷重と変位のデータはBLUEHILLソフトウェア(Instron5848)を使用して40Hzの速度で得た。
Crtap-/-マウスは、低い骨量、糸球体硬化症および肺形成障害によって現れる全身性結合組織疾患を有した(Baldridgeら; PLoSone 5(5):e10560(2010))。TGFβ発現の増加が、pSmad2の免疫染色陽性により証拠づけられ、図7Aで実証されるように、Crtap-/-マウスの肺で見られた。組織学的に、Crtap-/-マウスは、図7Bに示されるように、WTマウスと比較して、遠位気道空間が増加していることが示された。図7Aおよび図7Bで実証され、図7Cで定量化されるように(*P<0.05対対照Crtap-/-;1マウスあたり10画
像解析、1群あたりn=8マウス)、1D11処置(10mg/kg、IP、3x/週を8週間)により、Crtap-/-マウスにおけるpSmad2発現が減少し、遠位気道空間が減少し、肺表現型が改善した。
Crtap-/-マウスの骨および肺における調節不全TGFβシグナル伝達の基礎を理解するためにTGFβ発現の転写制御因子を調べた。ECMにおいてTGFβを制御可能な細胞外タンパク質の主なクラスとしては、小ロイシンリッチプロテオグリカン(SLRP)、例えばデコリンが挙げられる。図8に示されるように、免疫染色により、WT対照肺と比較して、Crtap-/-肺におけるデコリンの発現が増加していることが明らかになった。
OIは、脆弱骨、低骨量、骨変形および骨折を特徴とする。さらに、肺異常を含む骨外性の症状発現は実質的に病的状態および死を導く。OIの症例の多くは、I型コラーゲンをコードする遺伝子の常染色体優性突然変異(COL1A1とCOL1A2)によって引き起こされる。近年、コラーゲンの翻訳後修飾に関与するタンパク質をコードするさらなる遺伝子の突然変異がOIの退行形態を引き起こすものとして同定された。記述された第1番目の変異は、I型コラーゲンのプロリン残基986α1(I)の3-ヒドロキシル化に関わるプロリル-3-ヒドロキシラーゼ複合体の一員である軟骨関連タンパク質(CRTAP)にあった。低形質CRTAP変異は、原線維性コラーゲンにおける3-ヒドロキシプロリン(3Hyp)の部分的損失および他の残基の過剰修飾を導き、優性形態の重度OIと臨床的に重複する退行性OI VII型に帰着した。3Hypの生理学的作用は、完全には理解されていないが、生化学的研究によって、コラーゲンの安定性に否定的に影響するよりもむしろコラーゲン-タンパク質相互作用に関係していることが示唆された。
れた。さらに、Crtap-/-マウスは肺において肺胞気道空間の拡大を示すが、これはマルファン症候群モデルマウスで観察される状態と類似しており、TGFβシグナル伝達の増加が、肺病理の主な要因であることが示された。したがって、OI退行の場合のTGFβシグナル伝達の状態をCrtap-/-モデルマウスにおいて調べた。
対照Crtap-/-マウスと比較して、TGFβ阻害が、骨体積/全体積、骨梁数、骨梁幅を含む骨梁骨パラメータを、WTレベルの近くまで顕著に改善したことを示した(図11Aおよび11B、および図17)。同様の有益な効果が、Crtap-/-マウスの大腿部の骨梁骨で観察され、TGFβ阻害により骨梁骨パラメータが顕著に改善された(図18)。1D11を用いた骨格におけるTGFβ阻害の効果は、WTマウスと、正常TGFβ成熟の機能不全によりTGFβ活性が増加したモデルであるEsl-1-/-マウスとにおいて、以前に報告されている。1D11はWTマウスの背骨で骨梁BV/TVを33%、穏やかに増加させたが、Esl-1-/-マウスでは、BV/TVの106%増加が示された。このことは、骨格中で増加している病態生理学状況でTGFβを標的とすることで、相対的により明白な肯定的な結果に結びつきうることを示唆した。本研究において、1D11は、Crtap-/-マウスの背骨で骨梁BV/TVを235%増加させ、TGFβシグナル伝達の調節異常がCrtap-/-マウスにおける低い骨量の重要な要因であることを支持した。大腿骨中軸では、Ctrap-/-マウスにおいて、皮質の幅、直径、横断面積および横断面の慣性モーメントを含む皮質のアーキテクチャーのパラメータが、WTマウスと比較して顕著に低下していた。1D11処置後、これらのパラメータは、もはやWTマウスと有意な差異はなかった(図19)。皮質および骨梁骨におけるこれらの変化が、骨強度の改善に転換されるどうかを試験するために、3点曲げ試験による大腿骨の生体力学試験を実施した。TGFβ阻害により、処置されたCrtap-/-マウスにおいて最大荷重と極限強度が増加されたことがわかり、全体の骨および組織強度の向上と骨折に対する耐性の改善が示された。しかしながら、1D11処置は、対照および1D11処置Crtap-/-マウスの両方で降伏後変位の低下が示されるように(図20)、OI骨の脆性増加には影響を与えなかった。これはおそらく、変化したコラーゲン構造に関連した固有の異常なミネラル化を反映していると考えられた。まとめると、これらの知見から、TGFβシグナル伝達の増加が、Crtap欠損に起因する退行性OIの骨表現型の主要な要因であり、TGFβシグナル伝達調節異常の阻害により、骨量、微細構造パラメータが回復し、全骨強度が改善することが示された。
期の報告と一致して、WTレベルより低いOc数およびOb数が観察されたことでも、骨再構築プロセスの間の通常のOc数およびOb数を調整するためにTGFβの局所的量の生理学的必要性が強調された。我々の知見は、WTマウスについての1D11処置によりOc数が低下し、Ob数が増加したという従来の研究とは異なった。これは、WTマウスの正常骨と比較して、増加したTGFβシグナル伝達および増加した骨再構築を伴う病態生理学的状況におけるTGFβ阻害の明白な細胞効果を反映している可能性がある。TGFβは骨芽細胞前駆細胞の分化を阻害することが示されており、TGFβシグナル伝達の増加により、未熟な骨芽細胞系細胞の割合が高くなる可能性がある。他方、骨表面における未熟Obの増加または高比率により、これらの細胞による分泌TGFβの量の増加が引き起こされ得る。1D11を用いたTGFβ阻害により、Crtap-/-マウスにおいて増加したOb数が著しく低下するという知見は、TGFβシグナル伝達の増加が、骨芽細胞系細胞の増加に必然的に関与することを示唆している。
のG610C変異(Col1α2tm1.1Mcbr)を保有するノックイン・マウスは、アーミッシュ系集団で最初に同定された優性遺伝される軽度OI型の表現型模写体である。Col1α2tm1.1Mcbrマウスの骨試料において、TGFβ目標遺伝子p21およびPAI-1の発現増加が確認され、TGFβシグナル伝達が上方調節されていることが示唆された(図13A)。一貫して、Col1α2tm1.1Mcbrマウス由来の骨抽出物の免疫ブロット分析においても、活性化pSmad2/全Smad2の比率増加が示され、Crtap-/-マウスにおける我々の観察と類似していた(図13Bおよび13C)。
Claims (13)
- トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)に結合する抗体または抗原結合断片を含む、ヒト対象の骨形成不全症(OI)の治療用の医薬組成物であって、
ヒト対象は、I型またはII型コラーゲン、ロイシンプロリン-高プロテオグリカン(レプレカン)、または軟骨関連タンパク質(CRTAP)の変異遺伝子を持っていると特定され、
前記抗体または抗原結合断片は、配列番号4、5および6のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域(CDR)1-3、および配列番号7、8および9のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖CDR1-3を含む、
前記医薬組成物。 - 前記抗体が、それぞれ配列番号10および11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、ヒトIgG4定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- ヒトIgG4定常領域が配列番号12のアミノ酸配列を含み、ヒトκ軽鎖定常領域が配列番号13のアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号14および15のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記対象がI型OIである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が少なくとも1つの治療薬と組み合わせて使用される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記薬剤が、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンアナログ、カルシトニン、および選択的エストロゲン受容体調節因子からなる群から選択される、請求項7に記載の医薬組成物。
- ヒト対象における骨形成不全症(OI)を治療する方法において使用するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、
前記抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号4、5、および6のアミノ酸配列をそれぞれ有する相補性決定領域を有する重鎖相補性決定領域(CDR)1-3および配列番号7、8、および9のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖CDR1-3を含み、そして
前記方法は、
a)抗体またはその抗原結合断片を投与すること、
b)(1)1型プロコラーゲン(C末端/N末端)、オステオカルシン、総アルカリホス
ファ
ターゼ、および骨特異的アルカリホスファターゼから選択される骨沈着の1つ以上のバイオマーカー、または
(2)尿中ヒドロキシプロリン、尿中総ピリジノリン、尿中遊離デオキシピリジノリン、
尿中コラーゲンI型架橋N-テロペプチド、尿中または血清コレーゲンI型架橋C-テロペプチド、骨シアロタンパク質、オステオポンチンおよび酒石酸耐性酸性ホスファターゼ5bから選択される骨吸収の1つ以上のバイオマーカー
のレベルを測定することを含む、
前記医薬組成物。 - 前記抗体が、それぞれ配列番号10および11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、ヒトIgG4定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域を含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号14および15のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記対象がI型OIである、請求項9に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (6)
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