ES2616985T3

ES2616985T3 - Anticuerpos de unión a esclerostina

Info

Publication number: ES2616985T3
Application number: ES10014361.9T
Authority: ES
Inventors: Hsieng Sen Lu; Christopher Paszty; Martyn Kim Robinson; Alistair James Henry; Kelly Sue Hoffmann; John Latham; Alastair Lawson; David Winkler; Aaron George Winters
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2005-05-03
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2026-04-28
Also published as: JP2014177470A; HUE033718T2; EP2298800B2; ES2619709T3; ES2620684T5; PL2301961T5; WO2006119062A3; WO2006119062A2; SI2301961T1; FI2301961T4; HUE032092T2; ES2616985T5; ES2624643T5; CA2607276A1; HRP20170514T1; EP2251351B2; SI2301961T2; JP2022024162A; HRP20170679T4; PL2251351T3

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une con esclerostina humana de SEQ ID NO: 1 con una constante de disociación de menos de o igual a 1 x 10-9 M como se determinó por resonancia de plasmón superficial y aumenta al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero; y a) comprende CDR-L1 de SEQ ID NO: 48, CDR-L2 de SEQ ID NO: 49, CDR-L3 de SEQ ID NO: 50, CDR-H1 de SEQ ID NO: 45, CDR-H2 de SEQ ID NO: 46 y CDR-H3 de SEQ ID NO: 47; b) comprende CDR-L1 de SEQ ID NO: 42, CDR-L2 de SEQ ID NO: 43, CDR-L3 de SEQ ID NO: 44, CDR-H1 de SEQ ID NO: 39, CDR-H2 de SEQ ID NO: 40 y CDR-H3 de SEQ ID NO: 41; o c) bloquea de forma cruzada la unión de dicho anticuerpo de (a) o (b) con esclerostina humana de SEQ ID NO: 1 o se bloquea de forma cruzada la unión con esclerostina humana de SEQ ID NO: 1 por dicho anticuerpo de (a) o (b), en el que el bloqueo cruzado se determina por resonancia de plasmón superficial o ELISA.

Description

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generados por digestión con AspN. El péptido AspN22,7-23,5 contiene los 4 enlaces disulfuro. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó mediante análisis de ESI-LC-MS. La Figura 13 representa un esquema lineal de cuatro péptidos de esclerostina humana (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) generados por digestión con tripsina.

5 La Figura 14 muestra un esquema lineal de cinco péptidos de esclerostina humana (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5) generados por digestión con AspN. El pico de HPLC de AspN14,6 está compuesto de tres péptidos no unidos por ningún enlace disulfuro. La Figura 15 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a la unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-A. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5. La Figura 16 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos

15 péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-B. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5. La Figura 17 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-C. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5. La Figura 18 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos

25 péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-D. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5. La Figura 19 muestra dos epítopos de unión a Mab de esclerostina humana. La Figura 19A muestra la secuencia del epítopo del Bucle 2 para unión de Ab-A y Ab-B con esclerostina humana (SEQ ID NO: 6). La Figura 19B muestra la secuencia, enlaces disulfuro y esquema del epítopo T20,6 para unión de Ab-C y Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 2-5). La Figura 20 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina. La Figura 20A muestra la digestión del complejo de Ab-D de esclerostina humana. La Figura 20B muestra la digestión de la esclerostina humana sola. Se indican los picos de los péptidos T19,2, T20, T20,6 y

35 T21-22. La Figura 21 muestra la secuencia, enlace disulfuro y esquema del epítopo “derivado de T20,6 1 (nudo de cistina + 4 ramas)” para unión de Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 70-73). La Figura 22 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) de ratón se usó a 1 g/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 y 5 g/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio. La Figura 23 representa resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina humana (Scl) se usó a 1 g/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 8 y 4 g/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos

45 de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio. La Figura 24 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) humana se usó a 1 g/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 g/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio. La Figura 25 representa resultados de un modelo de ratón SCID de pérdida de hueso inducida por inflamación. El tratamiento con Ab-A protegió a los ratones de pérdida de hueso relacionada con inflamación asociada con colitis cuando se midió como densidad mineral ósea total (Figura 25A), densidad de hueso vertebral (Figura 25B) y densidad de hueso fémur (Figura 25C).

55 Descripción detallada

La presente invención se refiere a regiones de la proteína esclerostina humana que contienen epítopos reconocidos por anticuerpos que también se unen a esclerostina de longitud completa, y métodos para preparar y usar estos epítopos. La divulgación también proporciona agentes de unión (tales como anticuerpos) que se unen específicamente a esclerostina o parte de esclerostina, y métodos para usar dichos agentes de unión. Los agentes de unión son útiles para bloquear o afectar a la unión de esclerostina humana con uno o más ligandos.

La esclerostina humana recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. nº 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está 65 disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. nº 1589-ST-025).

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Anticuerpos monoclonales de unión a esclerostina de uso en investigación están disponibles en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; monoclonal de ratón 2006 cat. nº MAB1406; monoclonal de rata: 2006 cat. nº MAB1589). Las Patentes de Estados Unidos Nº 6.395.511 y 6.803.453 y Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20040009535 y 20050106683 se refieren a anticuerpos anti-esclerostina en general.

5 Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión esclerostina humana incluya la proteína de SEQ ID NO: 1 y variantes alélicas de la misma. La esclerostina puede purificarse a partir de células hospedadoras 293T que se hayan transfectado por un gen codificante de esclerostina mediante elución de sobrenadante filtrado de fluido de cultivo de células hospedadoras usando una columna de Heparina HP, usando un gradiente salino. La preparación y purificación adicional usando cromatografía de intercambio catiónico se describen en los Ejemplos 1 y

2.

Los agentes de unión son preferentemente anticuerpos, como se define en el presente documento. El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo. Un anticuerpo puede comprender

15 una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonal, monoclonal, quimérica, humanizada o humana que tienen cadenas de longitud completa pesadas y/o ligeras) o comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab’)2, Fab, Fab’, Fv, Fc y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos de cadena sencilla, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (Véase por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechonology, 23, 9, 1126-1136). También se desvelan polipéptidos de anticuerpo en la Patente de Estados Unidos Nº 6.703.199, incluyendo monocuerpos de polipéptidos de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpos se desvelan en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2005/0238646, que son polipéptidos de cadena sencilla.

25 Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo con métodos convencionales. Como ejemplo, los fragmentos de anticuerpo puede producirse por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab’)2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab’ 3,5S. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, Patente de Estados Unidos Nº 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959 Edelman et al., en Methods in Enzymology 1: 422 (Academic Press 1967); y en

35 Andrews, S.M. y Titus, J.A. en Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley & Sons, Nueva York (2003), páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10A. 1-2.10A.5. También pueden usarse otros métodos para escindir anticuerpos, tales como separar cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes (Fd), escindir además fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que reconoce el anticuerpo intacto.

Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína modificada por ingeniería genética o sintética. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de cadena ligera, los fragmentos “Fv” que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligera y pesada están conectadas

45 por un enlazador peptídico (proteínas scFv).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Pueden obtenerse CDR (también denominadas “unidades de reconocimiento mínimas” o “región hipervariable”) construyendo polinucleótidos que codifiquen la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como un molde (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991; Courtenay-Luck “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of

55 Antibodies,” en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Por lo tanto, el agente de unión puede comprender al menos una CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender además al menos un dominio de región variable de un anticuerpo descrito en el presente documento. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprenderá en general al menos una secuencia de CDR responsable de la unión a esclerostina humana, por ejemplo CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y/o las CDR de cadena ligera descritas específicamente en el presente documento y que está adyacente a o en fase con uno o más secuencias marco conservadas. En términos 65 generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) de inmunoglobulina. Por lo tanto, por ejemplo, el dominio de región V puede ser

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Las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (por ejemplo, sustituciones de

5 aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (por ejemplo, en la parte del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución de aminoácidos conservativa puede típicamente no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparezca en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).

Los agentes de unión pueden enlazarse químicamente con polímeros, lípidos u otros restos.

15 Los agentes de unión pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura marco biocompatible comprende un polipéptido o parte del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable,

o marco, o armazón, que es capaz de presentar una o más secuencias de aminoácidos que se unen con un antígeno (por ejemplo, CDR, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o “pliegue” polipeptídico (un motivo estructural) o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en relación con un polipéptido o pliegue de origen natural. Estos armazones pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como un ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o

25 virus.

Típicamente las estructuras marco biocompatibles basadas en armazones proteicos o esqueletos distintos de dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden usarse las basadas en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de cinc CP1, PST1, superenrollamiento, LACI-D1, dominio Z y dominios tendramisat (Véase por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).

Los agentes de unión incluyen los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento. Pueden producirse anticuerpos humanizados tales como los descritos en el presente documento usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang W. et al.,

35 Methods. 36(1): 35-42, 2005; Dall’Acqua WF, et al., Methods 36(1): 43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21 (8): 397-402, 2000).

Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que los agentes de unión adecuados incluyen partes de estos anticuerpos, tales como uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se desvela específicamente en el presente documento. Al menos una de las regiones de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el agente de unión conserve la especificidad de unión dela CDR no sustituida. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica, en la que el agente de unión bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede ser una 45 molécula no proteica en la que el agente de unión muestra un patrón de unión a péptidos de esclerostina humana similar en un “ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana” al mostrado en al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, en el que el agente de unión es una proteína de unión recombinante o un péptido sintético, y la proteína de unión recombinante bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, en el que el agente de unión es una proteína de unión recombinante, y la proteína de unión recombinante muestra un patrón de unión a péptidos de esclerostina humana similar en el ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de

55 esclerostina humana (descrito posteriormente en el presente documento) al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y/o neutraliza esclerostina.

Cuando un anticuerpo comprende uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se ha descrito anteriormente, puede obtenerse por expresión de una célula hospedadora que contiene ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica cada secuencia de CDR puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos de la CDR y sintetizarse junto con cualquier secuencia de ADN de región constante y marco de región variable de anticuerpo deseada usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos, mutagénesis dirigida y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado. Está ampliamente 65 disponible para los expertos en la materia ADN que codifica las regiones constantes y marcos de región variable a partir de bases de datos de secuencias genéticas tales como GenBank. Cada una de las CDR anteriormente

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mencionadas se localizará típicamente en un marco de región variable en las posiciones 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) y 95-102 (CDR-H3) de la cadena pesada y las posiciones 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) y 89-97 (CDR-L3) de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).

5 Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo puede propagarse y expresarse de acuerdo con cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos para escisión, ligación, transformación y transfección de ácido nucleico usando cualquier variedad de vectores de expresión conocidos. Por lo tanto, puede preferirse la expresión de un fragmento de anticuerpo en un hospedador procariota, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178: 497-515). Puede preferirse la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo en una célula hospedadora eucariota, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero) o células vegetales. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero sin limitación, mieloma (tal como una línea NSO de ratón), COS, CHO o células de hibridoma. Los ejemplos de células vegetales incluyen

15 tabaco, maíz, soja y células de arroz.

Pueden prepararse uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o una bacteria, tal como E. coli, en la que se producirá producción del anticuerpo. Para obtener transcripción y traducción eficaz, la secuencia de ADN en cada vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y secuencia líder unidos operativamente con la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos de este modo se conocen generalmente bien y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo, se describen procedimientos de biología molecular básica en Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor

25 Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Maniatis et al, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). Puede realizarse secuenciación de ADN como se describe en Sanger et al. (PNAS 74: 5463, (1977)) y el manual de secuenciación de plc de Amersham International, y puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154: 367-82 (1987); el manual de Anglian Biotechnology Ltd). Adicionalmente, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación y cultivo de células apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).

35 Cuando se desee mejorar la afinidad de anticuerpos de acuerdo con la invención que contienen una o más de las CDR anteriormente mencionadas, puede obtenerse por varios protocolos de maduración de afinidad, incluyendo mantener las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), combinación de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), presentación de fagos (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos métodos de maduración de afinidad se analizan en Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

Pueden obtenerse otros anticuerpos mediante inmunización convencional y procedimientos de fusión de células

45 como se describen en el presente documento y se conocen en la técnica. Pueden generarse anticuerpos monoclonales usando una diversidad de técnicas conocidas. En general, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256: 495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:

2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes de Estados Unidos Nº RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Pueden derivarse fragmentos de anticuerpo de los mismos usando cualquier técnica convencional adecuada tal como

55 digestión proteolítica u, opcionalmente, mediante digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Como alternativa, dichos fragmentos también pueden generarse mediante técnicas de ingeniería genética recombinante como se describe en el presente documento.

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando a un animal, por ejemplo, una rata, hámster, un conejo o preferentemente un ratón, incluyendo por ejemplo un transgénico o un knock-out, como se conoce en la técnica, con un inmunógeno que comprende esclerostina humana de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. La presencia de producción de anticuerpos específica puede supervisarse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo obteniendo una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que se une a esclerostina humana o

65 péptido usando uno cualquiera de varios métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. De animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran células linfoides, más

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regiones variables de cadena ligera y cadena pesada a partir del linfocito B de acuerdo con técnicas de biología molecular conocidas en este campo (documento WO 92/02551; Patente de Estados Unidos 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)) y descritas en el presente documento. Pueden aislarse linfocitos B de un animal inmunizado del bazo, ganglio linfático o muestra de sangre periférica seleccionando una célula que 5 produce un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina. Los linfocitos B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Se conocen bien en la técnica métodos para detectar linfocitos B individuales que producen un anticuerpo con la especificidad deseada, por ejemplo, mediante formación de placas, separación de células activadas por fluorescencia, estimulación in vitro seguida de detección de anticuerpo específico y similares. Los métodos para selección de linfocitos B productores de anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una única suspensión celular de linfocitos B en agar blando que contiene esclerostina humana. La unión del anticuerpo específico producido por el linfocito B con el antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que se seleccionen los linfocitos B que producen el anticuerpo deseado, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el

15 presente documento.

Un método adicional para obtener anticuerpos es por presentación de fagos. Véase, por ejemplo, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Pueden crearse bibliotecas combinatorias de región variable de inmunoglobulina humanas o murinas en vectores de fagos que pueden explorarse para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Huse et al., 1989 Science 246: 1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA

88: 4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47-52 y

25 referencias citadas en las mismas. Por ejemplo, puede insertarse una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de región variable de Ig en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en fase con la secuencia que codifica una proteína de cubierta de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de cubierta con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. También pueden presentarse fragmentos Fab de inmunoglobulina en una partícula de fago (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº: 5.698.426).

También pueden prepararse bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en fago lambda, por ejemplo, usando vectores ImmunoZap™ (H) y ImmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, se aísla ARNm de una población de linfocitos B y se usa para crear bibliotecas de

35 expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores ImmunoZap(H) y ImmunoZap (L). Estos vectores pueden explorarse individualmente o pueden expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse et al., mencionado anteriormente; véase también Sastry et al., mencionado anteriormente). Pueden convertirse posteriormente placas positivas en un plásmido no lítico que permita expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonales de E. coli.

En un hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal pueden amplificarse usando cebadores nucleotídicos. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden obtenerse de fuentes disponibles en el mercado. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón, incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa,

45 VHb, VHc, VHd, CH1, VL y CL). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que pueden después insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse después en sistemas de expresión basados en E. coli, levadura o mamífero. Pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla que contiene una fusión de los dominios VH y VL usando estos métodos (véase Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).

Una vez que se han obtenido células que producen anticuerpos usando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm del mismo de acuerdo con procedimientos convencionales como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos de los mismos pueden secuenciarse y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR

55 pueden manipularse como se ha descrito previamente para generar otros anticuerpos.

Preferentemente los agentes de unión se unen específicamente a esclerostina. Como con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la materia reconoce que los diversos restos con los que un agente de unión no debería unirse de forma detectable para ser terapéuticamente eficaz y adecuado serían extensos y difíciles de enumerar. Por lo tanto, para un agente de unión divulgado en el presente documento, la expresión “se une específicamente” se refiere a la capacidad de un agente de unión para unirse a esclerostina, preferentemente esclerostina humana, con mayor afinidad que se une a una proteína de control no relacionada. Preferentemente la proteína de control es lisozima de clara de huevo de gallina. Preferentemente el agente de unión se une a esclerostina con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por 65 una proteína de control. Un agente de unión puede tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10-7 M, menor de o igual a 1 x 10-8 M, menor de o igual a 1 x 10-9 M, menor de o igual a 1 x 10-10 M,

14

menor de o igual a 1 x 10-11 M o menor de o igual a 1 x 10-12 M.

La afinidad puede determinarse por un ensayo de ELISA de afinidad. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un ensayo de BIAcore. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método 5 cinético. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método de equilibrio/solución. Dichos métodos se describen en más detalle en el presente documento o se conocen en la técnica.

Los agentes de unión de esclerostina preferentemente modulan la función de esclerostina en el ensayo basado en células descrito en el presente documento y/o el ensayo in vivo descrito en el presente documento y/o se unen a uno

10 o más de los epítopos descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada la unión de uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. En consecuencia, dichos agentes de unión pueden identificarse usando los ensayos descritos en el presente documento.

15 Pueden generarse agentes de unión identificando en primer lugar anticuerpos que se unan a uno o más de los epítopos proporcionados en el presente documento y/o se neutralizan en los ensayos basados en células y/o in vivo descritos en la presente solicitud y/o bloquean de forma cruzada los anticuerpos descritos en la presente solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpos se usan después para insertar en marcos biocompatibles

20 apropiados para generar agentes de unión a esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, o puede ser una molécula no proteica. Los ensayos descritos en el presente documento permiten la caracterización de agentes de unión. Preferentemente los agentes de unión son anticuerpos como se definen en el presente documento.

25 Se entenderá por un experto en la materia que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden experimentar una diversidad de modificaciones postraduccionales. El tipo y alcance de estas modificaciones depende con frecuencia de la línea celular hospedadora usada para expresar la proteína así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto

30 básico carboxilo-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).

Se describen posteriormente anticuerpos denominados Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1. “HC” se refiere a la cadena pesada y “LC” se refiere a la cadena ligera. Para algunos anticuerpos posteriores, las CDR están sombreadas en

35 cajas y las regiones constantes (C) se muestran en negrita y cursiva.

Ab-D

El anticuerpo D (también denominado en el presente documento Ab-D y Mab-D) es un anticuerpo de ratón que 40 muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-D se muestra en la Figura 18.

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena ligera de Ab-D:

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La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-D es la siguiente:

15

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La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-D incluyendo el péptido señal es la siguiente:

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Secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-D incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal:

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La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena pesada HC de Ab-D es la siguiente:

16

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La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-D es:

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La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-D incluyendo el péptido señal es:

17

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Cadena pesada de Ab-C La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es:

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La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es la siguiente:

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20

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La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:

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La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:

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La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

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La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A es:

23

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Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-B son las siguientes:

5 CDR-H1: TSGMGVG (SEQ ID NO: 57) CDR-H2: HIWWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID NO: 58) CDR-H3: EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID NO: 59)

10 Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-B son:

CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID NO: 60) CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID NO: 61) CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID NO: 62)

15 Los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen a regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína. La unión de un anticuerpo con esclerostina puede correlacionarse con aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea conseguida mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y en el Ejemplo 12 (mono). Los aumentos de al menos

20 uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea pueden también conseguirse mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y Ejemplo 12 (mono). Puesto que la unión de un anticuerpo con esclerostina se determina principalmente por sus secuencias de CDR, puede generarse un anticuerpo con todas o algunas de las secuencias de CDR divulgadas en un marco apropiado, donde el anticuerpo conserva la capacidad para unirse específicamente con esclerostina, y puede

25 esperarse conseguir aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea. Dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento de afecciones humanas o animales que están provocadas por, asociadas con, o dan como resultado al

30

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Ab-3

5 Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 3 (también denominado en el presente documento Ab-3) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-3 10 Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:

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15 Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:

35

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Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-3 incluyendo el péptido señal:

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Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

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Cadena pesada de Ab-3 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-3:

36

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Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:

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10 Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:

40

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Dominios variables de Ab-5: Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):

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10 Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):

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Secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):

45

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Cadena Pesada de Ab-7 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:

51

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imagen62

Ab-8 Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 8 (también denominado en el presente documento Ab-8) son las

5 siguientes: Cadena Ligera de Alb-8 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:

10

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:

53

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-8:

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Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-8 incluyendo el péptido señal:

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55

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:

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Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:

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Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

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57

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Cadena Pesada de Ab-10 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:

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61 Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-10 incluyendo el péptido señal:

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Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

62

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imagen83

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:

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Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:

65

imagen85

Cadena Ligera de Ab-12 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-12:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-12:

imagen87

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-12 incluyendo el péptido señal:

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15 Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

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67

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Cadena Pesada de Ab-12 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:

68

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:

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Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:

72 Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

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Ab-13 se humanizó para generar Ab-14. Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 14 (también denominado en el presente documento Ab-14) son las

10 siguientes:

Cadena Ligera de Ab-14

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-14:

15

73

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Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):

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Secuencia de ADN del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):

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Ab-3 se humanizó para generar Ab-15.

Ab-15

15 Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 15 (también denominado en el presente documento Ab-15) son las siguientes: Cadena Ligera de Ab-15:

20 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:

78

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Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15 sin lisina carboxiloterminal:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15:

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80

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Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-15 son: CDR-H1: DFYLH (SEQ ID NO: 290) CDR-H2: RIDPENGDTLYDPKFQD (SEQ ID NO: 291) CDR-H3: EADYFHDGTSYWYFDV (SEQ ID NO: 292)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-15 son: CDR-L1: SVSSTISSNHLH (SEQ ID NO: 278) CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID NO: 279) CDR-L3: QQWSSYPLT (SEQ ID NO: 280)

Dominios variables de Ab-15 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal): 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSVSSTIS SNHLHWFQQK PGKAPKSLIY 51 GTSNLASGVP SRFSGSGSGT

DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QWSSYPLTFG 101 GGTKVEIK (SEQ ID NO:384) Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):

82

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Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):

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Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):

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Ab-11 se humanizó para generar Ab-16. 15 Ab-16 Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 16 (también denominado en el presente documento Ab-16) son las siguientes: 20 Cadena Ligera de Ab-16 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:

83

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Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16 sin lisina carboxiloterminal:

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Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16:

85

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Tabla 1

SEQ ID NO: DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS

52: CDR-H2 de Ab-A y Ab-1 TIDSGGRTDYASWAKG

53: CDR-H3 de Ab-A y Ab-1 NWNL

60: CDR-L1 de Ab-B SASSSVSFVD

61: CDR-L2 de Ab-B RTSNLGF

62: CDR-L3 de Ab-B QQRSTYPPT

57: CDR-H1 de Ab-B TSGMGVG

58: CDR-H2 de Ab-B HIWWDDVKRYNPVLKS

59: CDR-H3 de Ab-B EDFDYDEEYYAMDY

48: CDR-L1 de Ab-C KASQSVDYDGDSYMN

49: CDR-L2 de Ab-C AASNLES

50: CDR-L3 de Ab-C QQSNEDPWT

45: CDR-H1 de Ab-C DCYMN

46: CDR-H2 de Ab-C DMPFNGGTTYNQKFKG

47: CDR-H3 de Ab-C SHYVFDGRVPWDAMDY

42: CDR-L1 de Ab-D QASQGTSINLN

43: CDR-L2 de Ab-D GSSNLED

44: CDR-L3 de Ab-D LQHSYLPYT

39: CDR-H1 de Ab-D DHYMS

40: CDR-H2 de Ab-D DINPYSGETTYNQKFKG

41: CDR-H3 de Ab-D DDYDASPFAY

275: CDR-L1 de Ab-2 RASSSVYYYMH

276: CDR-L2 de Ab-2 ATSNLAS

277: CDR-L3 de Ab-2 QQWSSDPLT

287: CDR-H1 de Ab-2 DYFIH

288: CDR-H2 de Ab-2 RLDPEDGESDYAPKFQP

289: CDR-H3 de Ab-2 EDYPGTYTFFPY

278: CDR-L1 de Ab-3 y Ab-15 SVSSTISSNHLH

279: CDR-L2 de Ab-3 y Ab-15 GTSNLAS

280: CDR-L3 de Ab-3 y Ab-15 QQWSSYPLT

290: CDR-H1 de Ab-3 y Ab-15 DFYLH

291: CDR-H2 de Ab-3 y Ab-15 RIDPENGDTLYDPKFQD

292: CDR-H3 de Ab-3 y Ab-15 EADYFHDGTSYWYFDV

78: CDR-L1 de Ab-4 y Ab-5 RASQDISNYLN

79: CDR-L2 de Ab-4 y Ab-5 YTSRLLS

80: CDR-L3 de Ab-4 y Ab-5 QQGDTLPYT

245: CDR-H1 de Ab-4 y Ab-5 DYNMH

246: CDR-H2 de Ab-4 y Ab-5 EINPNSGGAQYNQKFKG

247: CDR-H3 de Ab-4 y Ab-5 LGYDDIYDDWYFDV

81: CDR-L1 de Ab-6 RASQDISNYLN

99: CDR-L2 de Ab-6 YTSRLHS

100: CDR-L3 de Ab-6 QQGDTLPYT

248: CDR-H1 de Ab-6 DYNMH

249: CDR-H2 de Ab-6 EINPNSGGSGYNQKFKG

250: CDR-H3 de Ab-6 LVYDGSYEDWYFDV

101: CDR-L1 de Ab-7 RASQVITNYLY

102: CDR-L2 de Ab-7 YTSRLHS

103: CDR-L3 de Ab-7 QQGDTLPYT

251: CDR-H1 de Ab-7 DYNMH

252: CDR-H2 de Ab-7 EINPNSGGAGYNQQFKG

253: CDR-H3 de Ab-7 LGYVGNYEDWYFDV

104: CDR-L1 de Ab-8 RASQDISNYLN

105: CDR-L2 de Ab-8 YTSRLLS

103 104

Tabla 1

SEQ ID NO: DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS

106: CDR-L3 de Ab-8 QQGDTLPYT

254: CDR-H1 de Ab-8 DYNMH

255: CDR-H2 de Ab-8 EINPNSGGAGYNQKFKG

256: CDR-H3 de Ab-8 LGYDDIYDDWYFDV

107: CDR-L1 de Ab-9 RASQDISNYLN

108: CDR-L2 de Ab-9 YTSRLFS

109: CDR-L3 de Ab-9 QQGDTLPYT

257: CDR-H1 de Ab-9 DYNMH

258: CDR-H2 de Ab-9 EINPNSGGAGYNQKFKG

259: CDR-H3 de Ab-9 LGYDDIYDDWYFDV

110: CDR-L1 de Ab-10 RASQDISNYLN

111: CDR-L2 de Ab-10 YTSRLLS

112: CDR-L3 de Ab-10 QQGDTLPYT

260: CDR-H1 de Ab-10 DYNMH

261: CDR-H2 de Ab-10 EINPNSGGAGYNQKFKG

262: CDR-H3 de Ab-10 LGYDDIYDDWYFDV

281: CDR-L1 de Ab-11 y Ab-16 RASSSISYIH

282: CDR-L2 de Ab-11 y Ab-16 ATSNLAS

283: CDR-L3 de Ab-11 y Ab-16 QQWSSDPLT

293: CDR-H1 de Ab-11 y Ab-16 DYYIH

294: CDR-H2 de Ab-11 y Ab-16 RVDPPNQETEFAPKFPG

295: CDR-H3 de Ab-11 y Ab-16 EDYDGTYTWFPY

113: CDR-L1 de Ab-12 RASQDISNYLN

114: CDR-L2 de Ab-12 YTSTLQS

115: CDR-L3 de Ab-12 QQGDTLPYT

263: CDR-H1 de Ab-12 DYNMH

264: CDR-H2 de Ab-12 EINPNSGGSGYNQKFKG

265: CDR-H3 de Ab-12 LGYYGNYETDWYFDV

284: CDR-L1 de Ab-13 y Ab-14 RASSSVTSSYLN

285: CDR-L2 de Ab-13 y Ab-14 QQYDFFPST

286: CDR-L3 de Ab-13 y Ab-14 DYYMN

296: CDR-H1 de Ab-13 y Ab-14 DYYMN

297: CDR-H2 de Ab-13 y Ab-14 DINPYNDDTTYNHKFKG

298: CDR-H3 de Ab-13 y Ab-14 ETAVITTNAMD

116: CDR-L1 de Ab-17 y Ab-18 SVSSSISSSNLH

237: CDR-L2 de Ab-17 y Ab-18 GTSNLAS

238: CDR-L3 de Ab-17 y Ab-18 QQWTTTYT

266: CDR-H1de Ab-17 y Ab-18 CDR-H1 DYYIH

267: CDR-H2 de Ab-17 y Ab-18 RIDPDNGESTYVPKFQG

268: CDR-H3 de Ab-17 y Ab-18 EGLDYGDYYAVDY

239: CDR-L1 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 RASQDISSYLN

240: CDR-L2 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 STSRLNS

241: CDR-L3 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 QQDIKHPT

269: CDR-H1 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 DYIMH

270: CDR-H2 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 YINPYNDDTEYNEKFKG

271: CDR-H3 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 SIYYYDAPFAY

242: CDR-L1 de Ab-21 y Ab-22 KASQDVFTAVA

243: CDR-L2 de Ab-21 y Ab-22 WASTRHT

244: CDR-L3 de Ab-21 y Ab-22 QQYSSYPLT

272: CDR-H1 de Ab-21 y Ab-22 DYYMH

273: CDR-H2 de Ab-21 y Ab-22 RIDPENGDIIYDPKFQG

274: CDR-H3 de Ab-21 y Ab-22 DAGDPAWFTY

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procedimientos conocidos en la técnica. La solución de bloqueo se retira después de la placa de ELISA y se añade un segundo anticuerpo anti-esclerostina (Ab-Y) que se ensaya con respecto a su capacidad para bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento, en exceso (por ejemplo 50 l de 10 g/ml) en solución de bloqueo a los pocillos apropiados de la placa de ELISA. A continuación, se añade después una cantidad limitada (por ejemplo 50 l de 10 ng/m) de esclerostina en solución de bloqueo a los pocillos apropiados y la placa se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente en agitación. La placa se lava después 2-4 veces con solución de lavado. Se añade una cantidad apropiada de un reactivo de detección de esclerostina [por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-esclerostina biotinilado que se ha unido en complejo previamente con una cantidad apropiada de un conjugado de peroxidasa de rábano rusticano-esclerostina (HPR)] en solución de bloqueo a la placa de ELISA y se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente. La placa se lava después al menos cuatro veces con solución de lavado y se desarrolla con un reactivo apropiado [por ejemplo, sustratos de HRP tales como TMB (colorimétrico)

o diversos sustratos luminiscentes de HRP]. La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario que el ensayo de ELISA se procese de tal modo que la señal de control de positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.

Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultantes de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:

1) el formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución y 2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.

Ab-X y Ab-Y se definen como de bloqueo cruzado si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo antiesclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60% y el 100%, específicamente entre el 70% y el 100%, y más específicamente entre el 80% y 100%, de la señal de detección de esclerostina (es decir la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir los pocillos de control positivos).

En el caso de que se use una versión marcada de esclerostina en el ELISA, tal como una Esclerostina marcada con His N terminal (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat nº 1406-ST-025) entonces un tipo apropiado de reactivo de detección de esclerostina incluiría un anticuerpo anti-His marcado con HROP. Además de usar Esclerostina marcada con His N terminal, también podría usarse Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador conocidos en la técnica en este ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA (por ejemplo, marcador HA con anticuerpos anti-HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG, marcador de biotina con estreptavidina).

EJEMPLO 8

ENSAYO DE MINERALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS PARA IDENTIFICAR AGENTES CAPACES DE ANTAGONIZAR LA ACTIVIDAD DE ESCLEROSTINA

Introducción

Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modelo in vitro de formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de la diferenciación de células de linaje de osteoblastos mediante uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de matriz y finalmente deposición de minerales, que se refiere a la cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición de mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.

La deposición de mineral tiene una fuerte característica biofísica, porque una vez que las “semillas” minerales comienzan a formarse, la cantidad total de mineral que se depositará en el cultivo completo puede en ocasiones depositarse con bastante rapidez, tal como en un periodo de unos pocos días después. El momento y alcance de la deposición mineral en cultivo están influidos, en parte, por las células/línea celular de linaje de osteoblastos particular que se use, las condiciones de crecimiento, la elección de agentes de diferenciación y el número de lote

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Claims

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