EA025367B1 - Комбинированная терапия рака с помощью антител против эндоглина и агентов против vegf - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к композициям химерных антител против эндоглина и агентов против VEGF. Другой аспект относится к применению химерных антител против эндоглина и бевацизумаба. Другой аспект относится к применению композиций для ингибирования VEGF-индуцированного прорастания. Другой аспект относится к применению композиций для ингибирования ангиогенеза.

Description

Согласно данному изобретению предложены химерные антитела, которые связываются с эндоглином. Такие антитела находят применения ίη νίΐτο и ίη νίνο для очистки, детекции, диагностики и терапии. Кроме того, согласно данному изобретению предложены химерные антитела, которые связываются с одним или более видами или вариантами эндоглина и ингибируют ангиогенез. Кроме того, согласно данному изобретению предложены способы лечения ангиогенез-ассоциированных заболеваний химерными антителами, которые связываются с эндоглином.

Химерные антитела против эндоглина могут быть использованы в комбинации с агентами против УЕОР для лечения или предупреждения различных форм рака, солидных опухолей и метастазов и тому подобного. В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения различных форм рака, солидных опухолей и метастазов и тому подобного посредством введения композиций, описанных в данной заявке. Композиции, описанные в данной заявке, также могут вызывать сокращение объема кровеносных сосудов, ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток, ассоциированную с заболеванием, и/или предупреждать пропотевание (1еакаде) кровеносных сосудов.

Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна, СИУ (хориоидальная неоваскуляризация), диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии. В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна, СИУ, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии посредством введения антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке. Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут вызывать сокращение объема кровеносных сосудов, ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток, ассоциированную с глазным заболеванием, устранять симптомы кровотечения, лечить затуманенное зрение (с1оибу νίδίοη), останавливать процесс потери зрения и/или предупреждать пропотевание кровеносных сосудов. Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в лекарственных средствах для лечения дегенерации желтого пятна, СИУ, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии.

Согласно данному изобретению предложено химерное антитело против эндоглина, имеющее вариабельную область тяжелой цепи (Ун), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕЦ ГО N0: 3; константную область тяжелой цепи (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕЦ ГО N0: 4; вариабельную область легкой цепи (Уь), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕЦ ГО N0: 1; и константную область легкой цепи (С_ъ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в БЕЦ ГО N0: 2.

В одном аспекте антитела, описанные в данной заявке, могут быть модифицированы с целью изме- 1 025367 нения фармакокинетического свойства соединения, такого как, например, стабильность, растворимость, биодоступность или период полувыведения ίη νίνο. Такие модификации включают, но не ограничиваются этим, пэгилирование и/или гликозилирование.

Антитела, описанные в данной заявке, могут быть приготовлены в виде препаратов для быстрой или пролонгированной доставки с использованием традиционных способов. В одном неограничивающем воплощении быструю доставку осуществляют, например, посредством внутривенной инъекции. В другом неограничивающем воплощении пролонгированную доставку осуществляют, например, посредством подкожного депонирования.

Согласно данному изобретению предложены композиции антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данной заявке, и приемлемого носителя или эксципиента.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения различных заболеваний и состояний, ассоциированных с ангиогенезом, например, различных форм рака, солидных опухолей и метастазов. В дополнение к этому, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут быть использованы для изготовления лекарственного средства для профилактики, лечения или диагностики заболеваний и состояний, ассоциированных с различными формами рака, солидными опухолями и метастазами.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения различных форм глазных или неглазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии), диабетической нефропатии, хронических воспалительных заболеваний (например, ΙΒΌ (воспалительное заболевание кишечника)), ревматоидного артрита и остеоартрита. Кроме того, данные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, могут быть использованы в изготовлении лекарственного средства для профилактики, лечения или диагностики заболеваний и состояний, ассоциированных с ангиогенезом, например различных форм глазных или неглазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией (например, дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии), диабетической нефропатии, хронических воспалительных заболеваний (например, ΙΒΌ), ревматоидного артрита и остеоартрита.

Согласно данному изобретению предложен способ индукции иммунного ответа у хозяина-пациента путем введения указанному пациенту первой композиции, содержащей химерное антитело против эндоглина, и второй композиции, содержащей антитело против УЕСР или его антигенсвязывающий фрагмент, посредством чего индуцируется эффективный иммунный ответ хозяина.

Согласно данному изобретению предложен способ индукции иммунного ответа у хозяина-пациента путем введения указанному пациенту композиции, содержащей химерное антитело против эндоглина и антитело против УЕСР или его антигенсвязывающий фрагмент, посредством чего индуцируется эффективный иммунный ответ хозяина.

Иммунный ответ хозяина может представлять собой гуморальный иммунный ответ или клеточный иммунный ответ. Иммунный ответ может представлять собой ответ, который ингибирует ангиогенез, ангиогенез-зависимое заболевание или ангиогенез-зависимое расстройство. Иммунные ответы также включают индукцию или блокаду клеточных сигнальных путей (например, 8тай-сигнального пути). В одном из воплощений ответ ингибирует ангиогенез.

Согласно данному изобретению предложен способ воздействия на клеточные сигнальные пути, ассоциированные с ангиогенезом. Ангиогенные клетки могут быть приведены в контакт (ίη νίΐτο, ίη νίνο или ех νίνο) с одной или более композициями, описанными в данной заявке, в количестве, достаточном для изменения клеточных сигнальных путей. В одном из воплощений антитело представляет собой химерное антитело против эндоглина. В одном неограничивающем примере в ответ на связывание с антителом передача сигнала через 8шай 1, 5 и/или 8 в ангиогенных клетках ингибируется примерно в 1,5 раза или более. В другом неограничивающем примере уровни 8шай 3 увеличиваются примерно в 1,5 раза или более, что указывает на то, что клетки возвращаются в состояние покоя. Композицию, содержащую антитело против УЕСР или его антигенсвязывающий фрагмент, также вводят вместе с композицией, содержащей химерное антитело против эндоглина.

Согласно данному изобретению предложен способ ингибирования ангиогенеза или ангиогенеззависимого заболевания или расстройства у субъекта путем введения пациенту одной или более композиций, предложенных в данной заявке. Ангиогенез-зависимое заболевание или расстройство может представлять собой любое из следующего: различные формы рака, солидные опухоли и метастазы. В одном из воплощений ингибирование ангиогенеза или ангиогенез-зависимого заболевания или расстройства облегчает симптомы, ассоциированные с данным заболеванием или расстройством. В другом воплощении ингибирование ангиогенеза или ангиогенез-зависимого заболевания или расстройства приводит к уменьшению размера опухоли, предупреждению развития опухоли, уменьшению клеточной пролиферации, увеличению апоптоза или повышению выживаемости субъекта.

Согласно данному изобретению предложен способ предупреждения или лечения рака или метастазов у субъекта путем введения одной или более композиций, предложенных в данной заявке. Введение композиций может продлить жизнь субъекта, которого лечат. Рак/опухоль, подлежащие лечению, вклю- 2 025367 чают солидную опухоль; опухоль может представлять собой первичную опухоль или метастатическую опухоль. Типичными солидными опухолями являются опухоли ткани или органа, выбранных из кожи, меланомы, легкого, поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки, прямой кишки, желудка, щитовидной железы, гортани, яичников, предстательной железы, колоректальной области, головы, шеи, глаза, ротовой полости, горла, пищевода, грудной клетки, кости, яичка, лимфоидной ткани, костного мозга, кости, саркомы, почечной ткани, потовых желез, печени, почки, головного мозга, например мультиформной глиобластомы, и тому подобных тканей. В одном неограничивающем примере солидная опухоль представляет собой опухоль толстой кишки, опухоль молочной железы, опухоль почки, опухоль легкого, опухоль предстательной железы, опухоль яичников или метастаз любой из таких опухолей.

Согласно данному изобретению предложен способ предупреждения или лечения любого из следующего: различные формы глазных или неглазных заболеваний, характеризующихся ангиогенезом/неоваскуляризацией, (например, дегенерация желтого пятна, диабетическая ретинопатия), диабетическая нефропатия, хронические воспалительные заболевания (например, ΙΒΌ), ревматоидный артрит и остеоартрит. В одном из воплощений ингибирование ангиогенеза или ангиогенез-зависимого заболевания или расстройства ослабляет симптомы, ассоциированные с данным заболеванием или расстройством. В другом воплощении ингибирование ангиогенеза или ангиогенез-зависимого заболевания или расстройства приводит к восстановлению работоспособности пациента. Глазная ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, ткань сетчатки глаза пациента с диабетической ретинопатией, дегенерацией желтого пятна или неоваскулярной глаукомой, а ангиогенез, подлежащий ингибированию, представляет собой ангиогенез в ретинальной ткани, когда наблюдается неоваскуляризация ретинальной ткани.

Кроме того, данный способ может включать хирургическое удаление опухоли и/или введение одного или более противораковых средств. Дополнительный противораковый агент можно вводить до, одновременно или после введения композиций, описанных в данной заявке. Дополнительное противораковое средство можно вводить за неделю до введения композиций, через неделю после введения композиций, или дополнительное противораковое средство можно вводить в тот же день, что и композиции. Если дополнительный противораковый агент вводят в тот же день, что и композиции, то введение может быть одновременным.

Согласно данному изобретению предложен способ ингибирования ангиогенеза путем приведения клетки или ткани в контакт с терапевтически эффективным количеством одной или более композиций, описанных в данной заявке, достаточным для ингибирования ангиогенеза. Согласно данному изобретению предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток путем приведения опухолевых клеток в контакт с терапевтически эффективным количеством одной или более композиций, описанных в данной заявке, достаточным для ингибирования роста опухолевых клеток, или путем введения субъекту терапевтически эффективного количества одной или более композиций, описанных в данной заявке, достаточного для ингибирования роста опухолевых клеток.

Согласно данному изобретению предложен способ, включающий приведение ткани в контакт с одной или более композициями, описанными в данной заявке, где приведение в контакт ингибирует ангиогенез, клеточный рост, пролиферацию, клеточное деление и т.д. Ткань может представлять собой биопсийный образец культивируемой ткани или может присутствовать в субъекте.

Согласно данному изобретению предложен способ предупреждения или лечения клеточного пролиферативного расстройства путем введения субъекту с клеточным пролиферативным расстройством или с риском развития клеточного пролиферативного расстройства эффективного количества одной или более композиций, предложенных в данной заявке, эффективных для лечения клеточного пролиферативного расстройства. Клеточное пролиферативное расстройство может представлять собой, например, доброкачественную или злокачественную солидную или несолидную опухоль, и опухоль может быть метастатической или неметастатической. Такое лечение может приводить к улучшению состояния субъекта и может быть оценено путем определения наличия одного или более из следующих факторов: уменьшение клеточной пролиферации, уменьшение количеств клеток, увеличение апоптоза или уменьшение выживания по меньшей мере части клеток, включающих клеточное пролиферативное расстройство. Одно или более из этих событий в некоторых случаях могут приводить к частичной или полной элиминации опухоли или метастазов и продлению выживаемости пациента.

Согласно данному изобретению предложен способ лечения диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, хориоидальной неоваскуляризации или неоваскулярной глаукомы у пациента путем введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества одной или более композиций, предложенных в данной заявке. Такое лечение может приводить к улучшению состояния субъекта и может быть оценено путем определения наличия одного или более из следующих факторов: уменьшение макулярного отека, уменьшение площади СЫУ или увеличение остроты зрения.

Другой аспект относится к лечению хронического воспалительного заболевания у субъекта одной или более композициями, описанными в данной заявке. Неограничивающие примеры хронических воспалительных заболеваний включают ΙΒΌ, болезнь Крона и язвенный колит.

Другой аспект относится к лечению ревматоидного артрита у субъекта путем введения одной или

- 3 025367 более композиций, описанных в данной заявке.

Другой аспект относится к лечению остеоартрита у субъекта путем введения одной или более композиций, описанных в данной заявке.

Лечение субъекта с ревматоидным артритом и/или остеоартритом может быть оценено различными способами, включая улучшение соответствующих категорий критериев АСК (Американской коллегии ревматологов), измеренных в соответствии с опубликованными руководствами.

В способах, предложенных в данной заявке, субъект, подлежащий лечению, может представлять собой человека или субъекта, не являющегося человеком. Композиции и противораковый агент или способы лечения, предложенные в данной заявке, могут применяться однократно или многократно в зависимости от состояния здоровья пациента, развития заболевания или состояния и эффективности данного лечения. На всем протяжении курса лечения могут быть внесены корректировки в терапию и способы лечения (например, в отношении дозировки антитела в композиции).

Композиции можно вводить локально, местно или системно, например, введение посредством подкожной, интравитреальной, интрадермальной, внутривенной, внутриартериальной, внутрибрюшинной или внутримышечной инъекции.

Кроме того, химерные антитела против эндоглина также могут быть использованы в комбинации с другими известными терапиями и/или антителами против УЕОР, которые ингибируют УЕСР-путь. Примеры таких соединений включают, но не ограничиваются этим, ранибизумаб (ЬиСЕМТ1§®), афлиберцепт (УЕСР-Тгар), сунитиниб (δυΤΕΝΤ®), сорафениб (ИЕХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.

Кроме того, химерные антитела против эндоглина и антитела против УЕСР или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в комбинации с другими известными терапиями и/или соединениями для лечения рака. Примеры таких соединений включают, но не ограничиваются этим, ранибизумаб (ЬиСЕИТ18®), афлиберцепт (УЕСР-Тгар), сунитиниб (δυΤΈΝΤ®). сорафениб (ИЕХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Примеры других терапий включают, но не ограничиваются этим, облучение, хирургическую операцию или введение одного или более химиотерапевтических агентов.

Согласно данному изобретению предложен способ мониторинга эффективности одного или более способов, предложенных в данной заявке. Повышенные уровни растворимого эндоглина коррелировали с уменьшением выживаемости раковых пациентов. Так, в одном аспекте мониторинг уровней растворимого эндоглина можно проводить до и во время терапии. Поэтому снижение уровней растворимого эндоглина может служить одним из показателей того, что терапевтическая схема является эффективной в лечении пациента.

Одно из воплощений настоящей заявки подразумевает применение любой из композиций, описанных в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения расстройства, описанного в данной заявке. Лекарственные средства могут быть приготовлены в соответствии с физическими характеристиками пациента/субъекта, нуждающегося в таком лечении, и могут быть приготовлены в виде одно- или многодозовых препаратов с учетом стадии, например, раковой ткани. Лекарственные средства могут быть упакованы в подходящую упаковку с соответствующими этикетками для распределения в больницах и клиниках, при этом этикетка предназначена для указания лечения расстройства, как описано в данной заявке, у субъекта. Лекарственные средства могут быть упакованы в виде однократных или многократных единиц. В упаковки могут быть включены инструкции относительно дозировки и введения композиций, описанных в данной заявке.

Включение посредством ссылки

Все публикации и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в данное изобретение посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана как включенная посредством ссылки во всей своей полноте, если конкретно не указано иное.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлена диаграмма сигнального пути ТСР-в/АЬК5. ТСР-в/АЬК5-путь (А) приводит к ингибированию клеточной пролиферации. ТСР-в/АЬК1-путь (В) индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток и требует СЭ105 (эндоглин) для передачи сигнала через АТК1. Пунктирные линии обозначают неактивные или заблокированные пути. Стрелка, выделенная жирным шрифтом, обозначает стимуляцию сигнального пути.

На фиг. 2 представлены аминокислотные последовательности химерного антитела против эндоглина (ТКС105), описанного в данной заявке. На фиг. 2А представлена репрезентативная вариабельная область легкой цепи химерного антитела против эндоглина (8ЕС ГО N0: 1); на фиг. 2В представлена репрезентативная константная область легкой цепи химерного антитела против эндоглина (8ЕС ГО N0: 2); на фиг. 2С представлена репрезентативная вариабельная область тяжелой цепи химерного антитела против эндоглина (8ЕС ГО N0: 3); и на фиг. 2Ό представлена репрезентативная константная область гамма-1 тяжелой цепи химерного антитела против эндоглина (8ЕС ГО N0: 4).

- 4 025367

Фиг. 3 иллюстрирует, что при использовании НИУЕС-сфероидов, посеянных в коллагене, ТК.С105 ингибирует УЕОР-индуцированное прорастание дозозависимым образом (Ν = 3).

Фиг. 4 иллюстрирует, что хотя ТК.С105 блокирует УЕОР-индуцированное прорастание (диагональная штриховка), оно не ингибирует ЬРОР-индуцированное прорастание (ромбовидная штриховка) ННУЕС-сфероидов (Ν = 2).

Фиг. 5 иллюстрирует, что ингибиторный эффект ТК.С105 на УЕОР-индуцированное прорастание (диагональная штриховка) усиливается при объединении с ингибитором УЕОР бевацизумабом (ромбовидная штриховка), так что прорастание НИУЕС полностью ингибируется.

Фиг. 6 иллюстрирует, что ингибиторный эффект ТК.С105 на УЕОР-индуцированное прорастание (диагональная штриховка) не усиливается при объединении с ингибитором УЕОР-рецепторной киназы (ромбовидная штриховка).

Подробное описание изобретения

Следует понимать, что данная заявка не ограничивается конкретными композициями или параметрами способов, поскольку они, разумеется, могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данной заявке терминология применяется только для описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения. Кроме того, очевидно, что ряд способов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным в данной заявке, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящих изобретений.

Согласно настоящей заявке могут быть использованы традиционные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантных ДНК, как подробно разъяснено в данной области техники.

Химерные антитела против эндоглина могут быть использованы в комбинации с агентами против УЕОР для лечения или предупреждения различных форм рака, солидных опухолей и метастазов и тому подобного. В данной заявке описаны способы лечения различных форм рака, солидных опухолей и метастазов и тому подобного посредством введения композиций, описанных в данной заявке. Композиции, описанные в данной заявке, также могут вызывать сокращение объема кровеносных сосудов, ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток, ассоциированную с заболеванием, и/или предупреждать пропотевание кровеносных сосудов.

Терминология по антителам

Как использовано в данной заявке, термин антитело относится к иммуноглобулину (1д), независимо от того, является ли он природным или получен частично или полностью синтетическим путем. Термин также охватывает любой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, который представляет собой антигенсвязывающий домен или гомологичен ему. Кроме того, данный термин включает в себя антигенсвязывающие фрагменты и другие взаимозаменяемые термины для сходных связывающих фрагментов, таких как описано ниже. Химерные антитела также охватываются этим термином.

Нативные антитела и нативные иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (Ъ) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. В типичном случае каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей варьирует среди тяжелых цепей иммуноглобулинов различных изотипов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (У_Н или УН), за которым следует ряд константных доменов (С_Н или СН). Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (Уь или УЬ) и константный домен (Сь или СЬ) на своем другом конце; константный домен легкой цепи соответствует первому константному домену тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи соответствует вариабельному домену тяжелой цепи. Полагают, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

Термины синтетический полинуклеотид, синтетический ген или синтетический полипептид, как использовано в данной заявке, означают, что соответствующая полинуклеотидная последовательность или ее часть, либо аминокислотная последовательность или ее часть, происходит из последовательности, которая была сконструирована или синтезирована бе ηονο, либо модифицирована по сравнению с эквивалентной природной последовательностью. Синтетические полинуклеотиды (антитела или антигенсвязывающие фрагменты) или синтетические гены могут быть получены способами, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, химический синтез нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей. Синтетические гены обычно отличаются от природных генов либо на аминокислотном, либо на полинуклеотидном уровне (или на обоих уровнях) и обычно расположены в контексте синтетических последовательностей, контролирующих экспрессию. По сравнению с природными генами синтетические генные полинуклеотидные последовательности не обязательно могут кодировать белки с различными аминокислотами; например, они также могут охватывать синтетические полинуклеотидные последовательности, которые включают разные кодоны, но которые кодируют одну и ту же аминокислоту (т.е. нуклеотидные изменения представляют собой молчащие мутации на аминокислотном уровне).

Что касается антител, то термин вариабельный домен относится к вариабельным доменам анти- 5 025367 тел, которые используются в связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена в пределах вариабельных доменов антител. Точнее, она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками (также известными как СИК (участки, определяющие комплементарность; от англ. сотр1стсп1агу беЮгттшд гедюп5)), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Наиболее высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными участками или РК. Каждый из вариабельных доменов немодифицированных тяжелой и легкой цепей содержит четыре РК (РК1, РК2, РК3 и РК4), в основном имеющие β-складчатую конфигурацию, разделенные тремя СИК, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть β-складчатой структуры. СИК в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга благодаря РКучасткам и вместе с СИК другой цепи участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител (см. КаЬа! е! а1., Зедиепсез о£ РгоЮиъ о£ 1ттиио1одюа1 1п1еге51. 51Н Еб. РиЬйс НеаЬЬ Зегуюе, Ναΐίοηαΐ Ιηδίί1иЮ5 о£ НеаЬЬ, Ве1Ье5ба. Мб. (1991), страницы 647-669).

Термины гипервариабельный участок и СИК, когда они используются в данной заявке, относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. СИК содержат аминокислотные остатки из трех участков последовательности, которые связываются комплементарным образом с антигеном и известны как СИК1, СИК2 и СИК3 для каждой из У_Н- и УЪ-цепей. В вариабельном домене легкой цепи СИК обычно соответствуют приблизительно остаткам 24-34 (СИКГ1), 50-56 (СИКЬ2) и 89-97 (СИКЬЗ), а в вариабельном домене тяжелой цепи СИК обычно соответствуют приблизительно остаткам 31-35 (СИКН1), 50-65 (СИКН2) и 95-102 (СИКНЗ) в соответствии с КаЬа! е! а1., 8едиепсе5 о£ РгоЮиъ о£ 1ттипо1одюа1 1йеге51, 51Ь Еб. РиЬЬс НеаЬЬ Зегуюе, Ν;·ιΙίοπ;·ι1 1п5Йи1е5 о£ НеаЬЬ, Ве1Ье5ба, Мб. (1991). Следует понимать, что СИК различных антител могут содержать вставки, поэтому нумерация аминокислот может отличаться. Система нумерации по КаЬа1 учитывает такие вставки, используя схему нумерации, согласно которой к конкретным остаткам добавляют буквы (например, 27А, 27В, 27С, 27И, 27Е и 27Р из СИКЕ1 в легкой цепи), чтобы показать любые вставки в нумерациях среди разных антител. Альтернативно, в соответствии с СЬобиа апб Ье5к, I. Мо1. Βίο1., 196: 901-917 (1987), в вариабельном домене легкой цепи СИК обычно соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (СИКЕ1), 50-52 (СИКЬ2) и 91-96 (СИКЬ3), а в вариабельном домене тяжелой цепи СИК обычно соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (СИКН1), 53-55 (СИКН2) и 96-101 (СИКН3).

Как использовано в данной заявке, каркасный участок или РК относится к аминокислотным остаткам каркаса, которые образуют часть антигенсвязывающего кармана или углубления. В некоторых воплощениях каркасные остатки образуют петлю, которая является частью антигенсвязывающего кармана или углубления, и аминокислотные остатки в этой петле могут контактировать или не контактировать с антигеном. Каркасные участки обычно представляют собой участки, расположенные между СИК. В вариабельном домене легкой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-23 (РКЬ1), 3549 (РКЬ2), 57-88 (РКЬ3) и 98-109, а в вариабельном домене тяжелой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-30 (РКН1), 36-49 (РКН2), 66-94 (РКН3) и 103-133 в соответствии с КаЬа! е! а1., 8едиепсе5 о£ РгоЮиъ о£ 1ттипо1одюа1 1п1еге51, 5Ηι Еб. РиЬЬс НеаЬЬ Зегуюе, №Шопа1 1п5Й1и1е5 о£ НеаЬЬ, Ве!Ье5ба, Мб. (1991). Как обсуждалось выше в отношении нумерации по КаЬа! для легкой цепи, в тяжелой цепи также аналогичным образом учитываются вставки (например, 35А, 35В из СИКН1 в тяжелой цепи). Альтернативно, в соответствии с СЬобиа апб Ье5к, I. Мо1. Βίο1., 196: 901-917 (1987), в вариабельном домене легкой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (РКЕ1), 33-49 (РКЕ2) 53-90 (РКЬ3) и 97-109 (РКЬ4), а в вариабельном домене тяжелой цепи РК обычно соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (РКН1), 33-52 (РКН2), 56-95 (РКН3) и 102-113 (РКН4).

Константные домены (Рс) антител не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности посредством взаимодействий, например, с Рс-рецепторами (РсК). Рс-домены также могут увеличивать биодоступность антитела в кровотоке после введения указанному пациенту. Замена мышиного Рс-домена на человеческий Рс-домен также может уменьшать побочные НАМАреакции.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: 1§А, 1§И, 1дЕ, 1§О и 1дМ, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например Ι§Ο1, 1дО2, Ι§Ο3, Ι§Ο4, 1дА1 и 1дА2. Константные домены тяжелой цепи (Рс), которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются соответственно α, δ, ε, γ и μ. Хорошо известны субъединичные структуры и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов.

Легкие цепи антител любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа или (к) и лямбда или (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.

Термины антигенсвязывающий участок антитела, антигенсвязывающий фрагмент, антигенсвя- 6 025367 зывающий домен, фрагмент антитела или функциональный фрагмент антитела используются в данной заявке взаимозаменяемо для обозначения одного или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры фрагментов антитела, охватываемых такими терминами, включают, но не ограничиваются этим, (1) РаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из У_ъ-, У_н-, С_ъ- и С_Н1-доменов; (2) Р(аЬ')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (3) Рй-фрагмент, состоящий из У_н- и С_Н1-доменов; (4) Ρν-фрагмент, содержащий У_ъ- и У_н-домены одного плеча антитела; (5) йАЬ (однодоменное антитело) фрагмент (ЛУагй е! а1. (1989) №1иге, 341: 544-546), который содержит У_н-домен; и (6) выделенный СОК. Кроме того, в это определение включены половинки антител, содержащие одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также охвачены данным описанием.

Группировки Р(аЬ')₂ и РаЬ' могут быть получены путем обработки 1д протеазой, такой как пепсин и папаин, и включают фрагменты антитела, полученные в результате переваривания иммуноглобулина вблизи дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей. Например, папаин расщепляет 1дС выше дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей, с образованием двух гомологичных фрагментов антитела, в которых легкая цепь, состоящая из У_ъ и С_ъ (константная область легкой цепи), и фрагмент тяжелой цепи, состоящий из У_н И С_ну₁ (γ1 область в константной области тяжелой цепи), соединены по их С-концевым областям посредством дисульфидной связи. Каждый из этих двух гомологичных фрагментов антитела называется РаЬ'. Пепсин также расщепляет 1дС ниже дисульфидных связей, находящихся между шарнирными областями в каждой из этих двух тяжелых цепей, с образованием фрагмента антитела несколько большего размера по сравнению с фрагментом, в котором два вышеупомянутых РаЬ' соединены в шарнирной области. Этот фрагмент антитела называется Р(аЬ')₂.

РаЬ-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (Сн1) тяжелой цепи. РаЬ'-фрагменты отличаются от РаЬ-фрагментов тем, что на карбоксильном конце Сн1домена тяжелой цепи добавлено несколько остатков, включающих один или более цистеинов из шарнирной области антитела. В данной заявке РаЬ'-Зн представляет собой обозначение для РаЬ', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. Р(аЬ')₂-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пар РаЬ'-фрагментов, которые содержат между собой шарнирные цистеины. Также известны и другие химические сочетания фрагментов антитела.

Βν относится к фрагменту антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые находятся в тесной нековалентной или ковалентной ассоциации (соединенные дисульфидными связями Рν были описаны в данной области, Ке11ег е! а1. (1996) №Циге В1о1еейпо1оду. 14: 1239-1245). Его конфигурация такова, что три СЭР каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности димера УнУ_ь. В совокупности, комбинация одного или более СГОК из каждой из У_н- и У_ъ-цепей придает антигенсвязывающую специфичность антителу. Например, будет очевидно, что, например, СЭКИ3 и СОКЬЗ могут быть достаточными для придания антигенсвязывающей специфичности антителу, когда они перенесены на У_н- и У_ъ-цепи реципиентного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и эта комбинация СГОК может быть протестирована в отношении связывания, аффинности и т.д. с использованием любого из методов, описанных в данной заявке. Даже единичный вариабельный домен (или половина Τν, содержащая только три СОК, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя вероятно с меньшей аффинностью, чем когда он объединен со вторым вариабельным доменом. Кроме того, несмотря на то, что два домена Рν-фрагмента (Уь и У_н) кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных методов посредством синтетического линкера, который позволяет получить их в виде единой белковой цепи, в которой У_ь- и У_н-области объединяются в пару с образованием одновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Рν (8сРν); Вий е! а1. (1988) Заеисе, 242: 423-426; ИизЮп е! а1. (1988) Ргос. ЫаЙ. Асай. Зег ИЗА, 85: 58795883; и ОзЬоиги е! а1. (1998) Ν;·ιΓ Вю1есЬиок, 16: 778). Также подразумевается, что такие 8сРν охватываются термином антигенсвязывающий участок антитела. Любые последовательности У_н И У_ъ конкретного 8сРУ могут быть связаны с кДНК или геномными последовательностями Рс-области с целью создания экспрессирующих векторов, кодирующих полные молекулы 1д (например, 1дС) или другие изотипы. У_н И У_ъ также могут быть использованы в создании РаЬ, Рν или других фрагментов 1д с использованием либо методов белковой химии, либо технологии рекомбинантных ДНК.

Одноцепочечные антительные фрагменты Рν или 8Рν содержат У_н- и У[-домены антитела, где эти домены находятся в одной полипептидной цепи. В некоторых воплощениях полипептид Рν дополнительно содержит полипептидный линкер между У_н- и У_ъ-доменами, который позволяет 8Рν образовывать желаемую структуру для связывания с антигеном. Обзор 8Рν см., например, у РЬюкЙшп в ТЬе РЬагтасо1оду о£ Мопос1опа1 АиНЬоФез, Уо1. 113, КозеиЬигд апй Мооге ейз., Зргшдег-Уег1ад, Νον Уогк, рр. 269-315 (1994).

- 7 025367

Термин АВИМЕР™ относится к классу терапевтических белков человеческого происхождения, которые не относятся к антителам и фрагментам антител и состоят из нескольких модульных и многократно используемых связывающих доменов, обозначенных как А-домены (также известных как модуль класса А, повтор комплементарного типа или домен класса А рецептора ЬОЬ (липопротеины низкой плотности)). Они были разработаны на основе человеческих внеклеточных рецепторных доменов с помощью перетасовки экзонов ίη νίίτο и фагового дисплея (8Пуегтап с1 а1., 2005, ΝαΙ. Вю1есЬпо1. 23: 14931494; 8Пуегтап еί а1., 2006, Ναί Вю1ес1то1. 24: 220). Полученные белки могут содержать многочисленные независимые связывающие домены, которые могут демонстрировать улучшенную аффинность (в некоторых случаях, на субнаномолярном уровне) и специфичность по сравнению с белками, связывающими один эпитоп. См., например, публикации заявок на патент США № 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 и 2005/0089932, 2005/0048512 и 2004/0175756, каждая из которых таким образом включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Каждый из известных 217 А-доменов человека содержит примерно 35 аминокислот (примерно 4 кДа); и эти домены отделены друг от друга линкерами, длина которых в среднем составляет пять аминокислот. Нативные А-домены быстро и эффективно сворачиваются в однородную стабильную структуру, опосредстванную главным образом путем связывания с кальцием и образования дисульфидных связей. Для такой общей структуры необходим консервативный каркасный мотив лишь из 12 аминокислот. Конечным результатом является одиночная белковая цепь, содержащая многочисленные домены, каждый из которых осуществляет отдельную функцию. Каждый домен этих белков связывает независимо, и энергетические вклады каждого домена суммируются. Эти белки были названы АВИМЕРами™, исходя из авидности и мультимеров.

Термин диатела относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (УН), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (УЬ) в одной и той же полипептидной цепи (УН-УЪ). В результате использования линкера, который является слишком коротким для образования пары между двумя доменами в одной и той же цепи, эти домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Более полно диатела описаны, например, в ЕР 404097; АО 93/11161 и НоШпдег еί а1., Ргос. Ναί1. Асай. 8с1. И8А, 90: 6444-6448 (1993).

Антигенсвязывающие полипептиды также включают димеры тяжелых цепей, такие как, например, антитела верблюдов и акул. Верблюжьи и акульи антитела содержат гомодимерную пару двух цепей из У-подобного и С-подобного доменов (ни одна из которых не имеет легкой цепи). Поскольку У_Н-область 1§О у верблюдов, представляющего собой димер тяжелых цепей, не должна вступать в гидрофобные взаимодействия с легкой цепью, эта область в тяжелой цепи, которая обычно контактирует с легкой цепью, у верблюда подвергается замене на гидрофильные аминокислотные остатки. У_Н-домены 1§О в виде димера тяжелых цепей называются У_НН-доменами. Акульи Ι§-ΝΑΚ (новые антигенные рецепторы усатой акулы-няньки; от англ. пигке кЪагк (пек) апйдеп гесерЮгк) содержат гомодимер одного вариабельного домена (названного доменом У-ЫАК) и пяти С-подобных константных доменов (доменов С-ΝΑΚ). Разнообразие репертуара антител у верблюдов определяется СОК 1, 2 и 3 в У_Н- или У_НН-областях. СОК3 в УНН-области верблюда характеризуется своей относительно большой длиной, в среднем составляющей 16 аминокислот (Миу1йегтапк еί а1., 1994, Рго1ет Епдшеегшд 7(9): 1129). Это отличает его от СОК3участков антител многих других видов. Например, СОК3 из У_Н мыши имеет в среднем 9 аминокислот. Библиотеки вариабельных областей верблюжьих антител, которые поддерживают разнообразие ш νίνο вариабельных областей верблюда, могут быть созданы, например, методами, описанными в заявке на патент США с серийным № 20050037421.

Химерные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител включают химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого 1д. В основном, химерные антитела представляют собой мышиные антитела, в которые вставлена по меньшей мере часть константной области (Рс) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина, вместо мышиной Рс-области. Для подробной информации см. 1опек еί а1., ЫаШге 321: 522-525 (1986); КеюЪтапп еί а1., ΝαШе 332: 323-329 (1988); и Ртезй, Сигг. Ор. 8Кис! Вю1., 2: 593-596 (1992).

Термин моноклональное антитело, как использовано в данной заявке, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам традиционных (поликлональных) антител, которые могут включать различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение моноклональное указывает на характер антитела, полученного по существу из гомогенной популяции антител, и не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным в КоЫег еί а1., №Циге. 256: 495 (1975), или могут быть полу- 8 025367 чены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). В некоторых воплощениях моноклональные антитела можно выделить из фаговых библиотек антител с использованием методик, описанных, например, в С1асккоп е! а1., Ма1иге, 352: 624-628 (1991) и Магкк е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 222: 581-597 (1991).

Антитела могут быть выделены и очищены из культурального супернатанта или асцитов, как упомянуто выше, путем осаждения насыщенным сульфатом аммония, методом эуглобулинового высаливания, методом с использованием капроновой кислоты, методом с использованием каприловой кислоты, с помощью ионообменной хроматографии (ΌΕΑΕ или ΌΕ52) или аффинной хроматографии с использованием анти-1д-колонки или колонки с белком Α, С или Ь, таких как описано более подробно ниже.

При конструировании иммуноглобулиновой молекулы вариабельные области или их участки могут быть слиты, соединены или иным образом присоединены к одной или более константным областям или их участкам с получением любого из антител, описанных в данной заявке. Это может быть осуществлено различными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, методы молекулярного клонирования или прямой синтез нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы.

Как использовано в данной заявке, иммунореактивный относится к связывающим агентам, антителам или их фрагментам, которые специфичны к последовательности аминокислотных остатков (сайт связывания или эпитоп), и даже если обладают перекрестной реактивностью в отношении других пептидов/белков, являются нетоксичными в концентрациях, приготовленных для введения людям. Термин связывание относится к непосредственной ассоциации двух молекул вследствие, например, ковалентных, электростатических, гидрофобных и ионных взаимодействий и/или взаимодействий на основе водородных связей в физиологических условиях и включающих такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики и любые другие традиционные способы связывания. Термин предпочтительно связывается означает, что связывающий агент связывается с сайтом связывания с более высокой аффинностью, чем он связывается с неродственными аминокислотными последовательностями. Аффинность может быть по меньшей мере в 1 раз выше, по меньшей мере в 2 раза выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей мере в 9 раз выше, 10 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем аффинность связывающего агента в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины иммунореактивный и предпочтительно связывается используются в данной заявке взаимозаменяемо.

Как использовано в данной заявке, термин аффинность относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов и выражается в виде Кб. Аффинность связывания белка с лигандом, такая как аффинность антитела в отношении эпитопа, может составлять, например, от примерно 100 наномоль (нМ) до примерно 0,1 нМ, от примерно 100 нМ до примерно 1 пикомоль (пМ) или от примерно 100 нМ до примерно 1 фемтомоль (фМ). Как использовано в данной заявке, термин авидность относится к устойчивости комплекса двух или более агентов к диссоциации после разведения. Кажущиеся аффинности могут быть определены такими способами, как иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЬ18А), или любым другим методом, известным специалисту в данной области. Авидности могут быть определены такими методами, как анализ Скэтчарда, или любым другим методом, известным специалисту в данной области.

Термин эпитоп относится к той части антигена или другой макромолекулы, которая способна создавать связывающее взаимодействие со связывающим карманом вариабельной области антитела. Такие связывающие взаимодействия могут проявляться в виде межмолекулярного контакта с одним или более аминокислотными остатками одного или более СЭВ. В связывание с антигеном могут быть вовлечены, например СЭК.3, или пара СЭВ3, или в некоторых случаях взаимодействия вплоть до всех шести СЭВ ν_Η- и У[-цепей. Эпитоп может представлять собой линейную пептидную последовательность (т.е. непрерывную) или может состоять из прерывистых аминокислотных последовательностей (т.е. быть конформационным или дискретным). Антитело может распознавать одну или более аминокислотных последовательностей; поэтому эпитоп может определять более чем одну дискретную аминокислотную последовательность. Эпитопы, распознаваемые антителами, могут быть определены методами пептидного картирования и анализа последовательности, хорошо известными специалисту в данной области. Связывающие взаимодействия проявляются в виде межмолекулярных контактов с одним или более аминокислотными остатками СЭВ. ТВС105 представляет собой мышиное антитело, которое имеет ту же аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело, описанное как Υ4-2Ρ1 или 8Ν6_) в патентах США с номерами 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836. Эпитопы, распознаваемые Υ4-2Ρ1 и 8Ν6_) и, следовательно, ТВС105, были идентифицированы ранее.

Термин специфический относится к ситуации, при которой антитело не будет демонстрировать какого-либо значительного связывания с молекулами, отличными от антигена, содержащего эпитоп, рас- 9 025367 познаваемый антителом. Термин также применим, когда, например, антиген-связывающий домен специфичен к конкретному эпитопу, который имеется у ряда антигенов, в этом случае антитело будет способно связываться с различными антигенами, несущими этот эпитоп. Термины предпочтительно связывается или специфически связывается означают, что антитела связываются с эпитопом с более высокой аффинностью, чем с неродственными аминокислотными последовательностями, и если обладают перекрестной реактивностью в отношении других полипептидов, содержащих данный эпитоп, то являются нетоксичными при уровнях, при которых их готовят в форме препаратов для введения людям. В одном из аспектов такая аффинность по меньшей мере в 1 раз выше, по меньшей мере в 2 раза выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей мере в 9 раз выше, в 10 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем аффинность антитела в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины иммунореактивный, связывается, предпочтительно связывается и специфически связывается используются в данной заявке взаимозаменяемо. Термин связывание относится к непосредственной ассоциации двух молекул вследствие, например ковалентных, электростатических, гидрофобных и ионных взаимодействий и/или взаимодействий на основе водородных связей в физиологических условиях и включает такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики и любые другие традиционные способы связывания.

Термин выделенный (используемый взаимозаменяемо с термином по существу чистый) при применении к полипептидам означает полипептид или его участок, который в соответствии с его происхождением или процедурой: (1) присутствует в клетке-хозяине в виде продукта экспрессии участка экспрессирующего вектора; или (2) связан с белком или другой химической группировкой, отличными от тех, с которыми они связаны в природе; или (3) не встречается в природе, например, белок, который подвергается химической обработке путем присоединения или добавления по меньшей мере одной гидрофобной группировки к данному белку, с тем чтобы данный белок находился в форме, не обнаруживаемой в природе. Под выделенным также подразумевают белок, который: (1) синтезирован химическим путем; или (2) экспрессирован в клетке-хозяине и очищен от сопутствующих и загрязняющих белков. Как правило, этот термин означает полипептид, который отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он существует в природе. Обычно полипептид также отделен от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используются для очистки.

Терминология по ангиогенезу

Как использовано в данной заявке, термины ингибирующий ангиогенез, ангиогенез-ингибирующий или антиангиогенный включают ингибирование васкулогенеза (образование и развитие сосудов) и предназначены для обозначения влияния на уменьшение степени, величины или скорости неоваскуляризации. Влияние на уменьшение степени, величины или скорости пролиферации эндотелиальных клеток или миграции в ткани представляет собой конкретный пример ингибирования ангиогенеза.

Термин ангиогенез-ингибирующая композиция относится к композиции, которая ингибирует ангиогенез-опосредованные процессы, такие как миграция эндотелиальных клеток, пролиферация, образование трубочек, и впоследствии приводит к ингибированию образования новых кровеносных сосудов из уже существующих сосудов и, таким образом, влияет на ангиогенез-зависимые состояния.

Как использовано в данной заявке, термин ангиогенез-зависимое состояние предназначен для обозначения состояния, при котором процесс ангиогенеза или васкулогенеза поддерживает или усиливает патологическое состояние или оказывает благоприятное воздействие на нормальные физиологические процессы. Поэтому лечение ангиогенез-зависимого состояния, при котором ангиогенез поддерживает патологическое состояние, могло бы приводить к подавлению заболевания, в то время как лечение ангиогенез-зависимого состояния, при котором ангиогенез оказывает благоприятное воздействие на нормальные физиологические процессы, могло бы приводить, например, к усилению нормального процесса.

Ангиогенез представляет собой образование новых кровеносных сосудов из уже существующих капилляров или посткапиллярных венул. Васкулогенез является результатом образования новых кровеносных сосудов, возникающих из ангиобластов, которые являются предшественниками эндотелиальных клеток. Оба процесса приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включены в значение термина ангиогенез-зависимые состояния. Подразумевается, что термин ангиогенез, как использовано в данной заявке, включает в себя образование сосудов бе ηονο, например, которые возникают в результате васкулогенеза, а также тех, которые возникают в результате разветвления и прорастания существующих сосудов, капилляров и венул. Ангиогенез также может быть вовлечен в индукцию АЬК1-сигнального пути и фосфорилирования и/или сигнального пути родственного 8таб 1/5/8. Кроме того, известно, что СО105 вовлечен в АЬК1-сигнальный путь и, таким образом, также включен в понятие ангиогенеза.

Популяции опухолеинициирующих клеток СО105+ были обнаружены в карциномах почек человека. Клетки СЭ105'. являющиеся характерным признаком опухолевых стволовых клеток, описанным ранее для раковых стволовых клеток, присутствуют в других типах опухолей. Обнаруженные клетки СЭ105+

- 10 025367 были клоногенными, экспрессировали маркеры стволовых клеток и не имели маркеров дифференцировки, могли дифференцироваться ίη νίΐτο в эпителиальные и эндотелиальные типы клеток и могли генерировать ίη νίνο периодически трансплантируемые опухоли. Опухоли, несмотря на то, что они происходят из клонов, экспрессирующих мезенхимальные маркеры, представляют собой эпителиальные карциномы по происхождению опухоли и характеризуются сохранением онкогенной популяции СИ105+ и присутствием неонкогенной дифференцированной популяции СИ105^-.

Индукция иммунного ответа хозяина означает, что пациент испытывает облегчение или ослабление признаков или симптомов болезни, и конкретно включает в себя, без ограничения, продление выживаемости.

Как использовано в данной заявке, термины пролиферативное расстройство и пролиферативное состояние означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной пролиферацией. Термины клеточное пролиферативное расстройство и клеточное пролиферативное состояние означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной клеточной пролиферацией, а также включающее состояния, характеризующиеся нежелательной или неблагоприятной клеточной пролиферацией или клеточным выживанием (например, вследствие недостаточного апоптоза), состояния, характеризующиеся аберрантным или недостаточным апоптозом, а также состояния, характеризующиеся аберрантным или нежелательным либо неблагоприятным клеточным выживанием. Термин расстройство дифференцировки означает любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или недостаточной дифференцировкой.

Пролиферативные расстройства или расстройства дифференцировки, подлежащие лечению, включают болезненные состояния, доброкачественные и неопластические, характеризующиеся аномальным или нежелательным числом клеток, клеточным ростом или клеточным выживанием. Поэтому такие расстройства или состояния могут представлять собой болезненное состояние и включать все типы раковых опухолей или онкогенных процессов, метастатических тканей или трансформированных в злокачественные клеток, тканей или органов.

Клетки, характеризующие пролиферативное расстройство или расстройство дифференцировки, могут быть агрегированы в клеточную массу или рассеяны. Термин несолидная опухоль относится к новообразованиям гематопоэтической системы, таким как лимфомы, миеломы и лейкозы, или новообразованиям, которые являются диффузными по своей природе, поскольку обычно они не образуют твердой массы. Конкретные примеры лейкозов включают, например, острую и хроническую лимфобластную, миелобластную и множественную миелому.

Термин солидная опухоль относится к новообразованиям или метастазам, которые обычно агрегируют вместе и образуют массу. Такие расстройства включают новообразования или виды рака, которые могут поражать фактически любой тип клеток или тканей, например, карциному, саркому, меланому, метастатические расстройства или гематопоэтические неопластические расстройства. Метастатическая опухоль может возникать из множества типов первичных опухолей, включая, но не ограничиваясь этим, опухоль молочной железы, легкого, щитовидной железы, головы и шеи, головного мозга, лимфоидной ткани, желудочно-кишечного тракта (ротовой полости, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстой кишки, прямой кишки), мочеполового пути (матки, яичника, шейки матки, мочевого пузыря, яичка, полового члена, предстательной железы), почки, поджелудочной железы, печени, кости, мышцы, кожи и т.д.

Карциномы относятся к злокачественным новообразованиям эпителиальной или эндокринной ткани и включают карциномы дыхательной системы, карциномы желудочно-кишечной системы, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, карциномы эндокринной системы и меланомы. Типичные карциномы включают карциномы, происходящие из шейки матки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, толстой кишки, печени и яичника. Термин также включает карциносаркомы, например, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Аденокарцинома включает карциному железистой ткани или в которой опухоль образует железистоподобную структуру.

Подлежащей лечению раковой тканью является, например, эндотелиальная ткань, экспрессирующая аномальный уровень эндоглина. Как использовано в данной заявке, термин трансформированные клетки относится к клеткам, которые спонтанно превратились в состояние неограниченного роста, т.е. они приобрели способность расти вследствие неопределенного числа делений в культуре. Трансформированные клетки можно охарактеризовать такими терминами, как неопластический, анапластический и/или гиперпластический в отношении утраты ими контроля роста. Для целей данного изобретения подразумевается, что термины трансформированный фенотип злокачественных клеток млекопитающих и трансформированный фенотип охватывают, но не ограничиваются этим, любой из следующих далее фенотипических признаков, ассоциированных с клеточной трансформацией клеток млекопитающих: иммортализацию, морфологическую трансформацию или трансформацию роста и онкогенность, выявляемые по продолжительному росту в клеточной культуре, росту на полутвердых средах или онкогенному росту в иммунонекомпетентных или сингенных животных.

- 11 025367

Термин антиген опухолевых клеток определен в данной заявке как антиген, который присутствует в более высоких количествах на опухолевой клетке или в жидкостях организма, чем на не имеющих к нему отношения опухолевых клетках, нормальных клетках или в нормальной жидкости организма. Присутствие антигена можно определить любым из множества анализов, известных специалистам в данной области, и они включают без ограничения, отрицательную и/или положительную селекцию с помощью антител, например, ЕЬТЗА-анализ, радиоиммуноанализ или вестерн-блоттинг.

Термин апоптоз или программируемая гибель клеток относится к физиологическому процессу, посредством которого нежелательные или непригодные клетки удаляются в процессе развития и других нормальных биологических процессов. Апоптоз представляет собой тип клеточной смерти, который происходит в нормальных физиологических условиях, и клетка является активным участником своей собственной гибели (клеточный суицид). Это очень часто происходит в процессе нормального обновления клеточной популяции и тканевого гомеостаза, эмбриогенеза, индукции и поддержания иммунологической толерантности, развития нервной системы и зависимой от эндокринной системы атрофии ткани. Клетки, подвергающиеся апоптозу, демонстрируют характерные морфологические и биохимические признаки. Эти признаки включают агрегацию хроматина, ядерную и цитоплазматическую конденсацию, разделение цитоплазмы и ядра на ограниченные мембранами везикулы (апоптотические тельца), которые содержат рибосомы, морфологически интактные митохондрии и ядерный материал. Ιη νίνο, эти апоптотические тельца быстро распознаются и фагоцитируются макрофагами, дендритными клетками или прилегающими эпителиальными клетками. Благодаря этому эффективному механизму удаления апоптотических клеток ίη νίνο не индуцируется воспалительный ответ. Ιη νίίτο, апоптотические тельца, а также оставшиеся клеточные фрагменты в конце концов набухают и в итоге лизируются. Эта конечная фаза гибели клеток ίη νίίτο была названа вторичным некрозом. Апоптоз можно определять методами, известными специалистам в данной области, такими как фрагментация ДНК, воздействие аннексина V, активация каспаз, высвобождение цитохрома С и т.д. Клетка, гибель которой была индуцирована, называется в данной заявке апоптотической клеткой.

Апоптоз-индуцирующий агент определяют в данной заявке как индуцирующий апоптоз/программируемую гибель клеток и включающий, например, антитела против эндоглина, антитела против УЕОР, облучение, химиотерапевтические агенты или рецептор-связывающие агенты, где клетки, например, опухолевые клетки или эндотелиальные клетки индуцируют к программируемой клеточной смерти. Типичные апоптоз-индуцирующие агенты описаны более подробно ниже.

Апоптоз можно определять, используя стандартный анализ апоптоза с помощью аннексина V: ΝΙΗ (Национальный институт здравоохранения (США)): клетки ΘνθΑΚ-3 (рак яичников; от англ. οναπαη сапсег) выращивают в 6-луночных планшетах (ΝυΝΟ) и облучают или обрабатывают антагонистом (или в комбинации с другим противораковым лекарственным средством) в течение 4-48 ч, промывают и окрашивают с помощью аннексин ν-РГТС (флуоресцеинизотиоцианат) (ВП-РЬатттдеи) в течение 1 ч. Клетки анализируют с помощью проточной цитометрии (Весίοη-^^ск^η8οη, СеПОиеЧу подвергают контрастному окрашиванию йодидом пропидия и снова анализируют на проточном цитометре.

Способы получения и экспрессии антител

Химерные иммуноглобулины были сконструированы посредством генетической инженерии. Большинство химерных иммуноглобулинов, которые были описаны ранее, содержат ν_Η и ν₂ от мышиного моноклонального антитела и С_ъ и Рс от человеческого антитела. Можно использовать Рс-области от любого из изотипов, описанных в данной заявке. Как описано в данной заявке, признаком химерной конструкции также может быть ограниченное число модифицированных аминокислот в каркасе вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи для увеличения аффинности антитела.

Химерные антитела обычно имеют несколько потенциальных преимуществ по сравнению с мышиными антителами для применения в терапии человека. Поскольку эффекторная область антитела является человеческой, считают, что она лучше взаимодействует с другими частями иммунной системы человека (например, разрушает клетки-мишени более эффективно посредством комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС)). Кроме того, иммунная система человека не должна распознавать константную область химерного антитела как чужеродную, и поэтому антительный ответ против такого инъецируемого антитела обычно должен быть более слабым, чем против полностью чужеродного мышиного антитела. И наконец, известно, что мышиные антитела имеют период полувыведения из кровотока человека намного более короткий, чем период полувыведения человеческих антител. Химерные антитела предположительно могут иметь период полувыведения более приближенный к природным человеческим антителам, что позволяет вводить меньшие дозы и с меньшей частотой.

Если желательно иметь химерное антитело с повышенной аффинностью, то остатки в пределах СЭК антитела могут быть дополнительно заменены на другие аминокислоты. Обычно изменяют не более четырех аминокислотных остатков в СЭК и в наиболее общем случае будут изменены не более двух остатков в СЭК, за исключением С.ПР2 тяжелой цепи, где могут быть изменены вплоть до 10 остатков. Изменения аффинности могут быть измерены традиционными способами, такими как способы, описанные в данной заявке (например, Βί;κοΐΌ).

- 12 025367

Химерные антитела могут быть сконструированы и получены с использованием традиционных методов, известных в данной области. Кроме того, полученные рекомбинантным способом антитела часто могут быть произведены в больших количествах, в частности, при использовании векторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии.

Что касается применений в ветеринарии, то антитело может быть синтезировано для введения субъекту, не являющемуся человеком (например, примату, корове, лошади, свинье и т.д.), с использованием не-человеческой Ре-области.

Признанные в данной области техники методы, такие как методы, предложенные и включенные в данное описание, можно использовать для модификации нуклеотидов, кодирующих аминокислотные последовательности, используя рекомбинантные методы в сайтах рестрикции эндонуклеазами.

Что касается экспрессии, то экспрессирующая система представляет собой систему, в которой применяется Οδ-система (Εοη/а). использующая ген глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Кратко, трансфекцию осуществляют в клетках СНО путем электропорации (250 В) с помощью Οδсистемы (Еоп/а), в которой используют ген глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Клетки СНО дикого типа выращивали в ΌΜΕΜ (81дта), содержащей 10% диализованной фетальной телячьей сыворотки (РС8), с 2 мМ глутамина. 6 χ 10⁷ клеток СНО подвергают трансфекции, используя 300 мкг линеаризованной ДНК, путем электропорации. После электропорации клетки ресуспендируют в ΌΜΕΜ с глутамином и высевают в 36 χ 96-луночные планшеты (50 мкл/лунка) и инкубируют при 37°С в 5% СО₂. На следующие сутки добавляют по 150 мкл/лунку селективной среды (ΌΜΕΜ без глутамина). Приблизительно через 3 недели проводят скрининг колоний посредством ЕЫ8Л (см. ниже), используя нерелевантное антитело в качестве отрицательного контроля. Все колонии, продуцирующие более 20 мкг/мл, переносят в 24-луночные планшеты и затем в двух повторностях во флаконы Т25.

Что касается продукции на высоком уровне, то широко используемая экспрессирующая система млекопитающих представляет собой систему, в которой используют процедуру амплификации генов, обеспечиваемую дефектными по дегидрофолатредуктазе (йНГг-) клетками яичника китайского хомячка. Система основана на гене дегидрофолатредуктазы йНГг, который кодирует фермент ΌΗΡΚ, катализирующий превращение дегидрофолата в тетрагидрофолат. Для достижения высокого уровня продукции, йНГг-клетки СНО подвергают трансфекции экспрессирующим вектором, содержащим функциональный ген ΌΗΡΚ вместе с геном, который кодирует целевой белок. В этом случае целевой белок представляет собой тяжелую цепь и/или легкую цепь рекомбинантного антитела.

При увеличении количества конкурентного ингибитора ΌΗΡΚ метотрексата (МТХ) рекомбинантные клетки развивают устойчивость путем амплификации гена йЬГг. В стандартных случаях размер используемой единицы амплификации больше размера гена йЬГг и в результате тяжелая цепь антитела амплифицируется совместно.

При крупномасштабном получении белка, такого как цепь антитела, желательно, чтобы в расчет принимался как уровень экспрессии, так и стабильность используемых клеток. В долгоживущей культуре популяции рекомбинантных клеток СНО утрачивают гомогенность в отношении продуцирования ими конкретного антитела в процессе амплификации, даже если они происходят из одного родительского клона.

Согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид (нуклеиновая кислота), кодирующий антитело или его участок, как описано в данной заявке, векторы, содержащие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева и экспрессирующие системы для транскрипции и трансляции таких полинуклеотидов в полипептиды.

Согласно настоящему изобретению также предложены конструкции в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессирующих кассет, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, упомянутый выше.

Согласно настоящему изобретению также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более конструкций, упомянутых выше. Нуклеиновая кислота, кодирующая любое антитело, описанное в данной заявке, образует аспект настоящей заявки, согласно которому предложен способ получения антитела, который включает экспрессию посредством этого кодирующей нуклеиновой кислоты. Экспрессия удобно достигается путем культивирования в соответствующих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих данную нуклеиновую кислоту. После получения путем экспрессии антитело или его участок можно выделить и/или очистить с помощью любого подходящего метода, затем использовать соответствующим образом.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие конкретные антитела (или их участки), и содержащие их векторы, описанные в данной заявке, могут быть предложены выделенными и/или очищенными, например, из их естественного окружения, по существу в чистой или гомогенной форме. В данном случае нуклеиновая кислота не содержит или по существу не содержит нуклеиновую кислоту или гены, имеющие происхождение, отличное от последовательности, кодирующей полипептид с необходимой функцией. Последовательности нуклеиновой кислоты могут содержать ДНК или РНК и могут быть полностью или частично синтетическими. Методы очистки хорошо известны в данной области.

- 13 025367

Системы клонирования и экспрессии полипептида во многих различных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают клетки бактерий, млекопитающих, дрожжей и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают, но не ограничиваются этим, клетки яичника китайского хомячка, клетки НеЬа, клетки почки новорожденного сирийского хомячка, клетки мышиной миеломы №0 и многие другие.

Широкий спектр одноклеточных клеток-хозяев также полезен для экспрессии последовательностей ДНК. Эти хозяева включают хорошо известных эукариотических и прокариотических хозяев, таких как штаммы Е. сой, Рзеиботопаз, ВасШиз, БЦерЮтусез, грибы, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как клетки СНО, ΥΒ/20, №0, БР2/0, ΚΙ.Ι, В-\У и Ь-М, клетки почки африканской зеленой мартышки (например, С0Б 1, С0Б 7, ВБС1, ВБС40 и ВМТ10), клетки насекомых (например, БГ9), человеческие клетки и растительные клетки в тканевой культуре.

Экспрессия антител или их участков в прокариотических клетках, таких как Е. сой, является общепринятой в данной области. В качестве обзора см., например, РШскТОип, А. Вю/Тесйпо1оду, 9: 545-551 (1991).

Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области в качестве варианта получения антител, описанных в данной заявке, см. недавние обзоры, например, КаГГ, М.Е. (1993) Сигг. 0ршюп Вю1есй., 4: 573-576; Ттй1 Ы. е1 а1. (1995) Сигг. 0ршюп Вю1есй., 6: 553-560, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности, в зависимости от ситуации. Векторы могут быть плазмидами, вирусными, например фагом, или фагмидными, в зависимости от ситуации. Подробнее см., например, Мо1еси1аг С1ошпд: а йаЬогаЮгу Мапиа1: 2пб ебШоп, Батйтоок е1 а1., 1989, Со1б Брппд Натйот йаЬогаЮгу Ргезз. Многие известные методы и протоколы для работы с нуклеиновой кислотой, например для получения конструкций нуклеиновых кислот, для мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и генной экспрессии и анализа белков, описаны подробно в Бйой Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, Бесопб ЕШйоп, АизиЪе1 е1 а1. ебз., Шйп ^йеу & Бопз, 1992. Методы, описанные БатЪгоок и др. и АизиЪе1 и др., включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте и хорошо известны в данной области.

Таким образом, в другом аспекте предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, которая описана в данной заявке. В еще одном аспекте предложен способ, включающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Для введения можно использовать любой подходящий метод. Что касается эукариотических клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансфекцию с использованием фосфата кальция, ИЕАЕ-декстрана, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например, вируса осповакцины, или, для клеток насекомых, бакуловируса. Что касается бактериальных клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага.

После введения можно инициировать или сделать возможной экспрессию нуклеиновой кислоты, например, путем культивирования клетки-хозяева в условиях, подходящих для экспрессии данного гена.

В одном из воплощений нуклеиновая кислота интегрирована в геном (например, хромосому) клетки-хозяева. Интеграцию можно стимулировать путем включения последовательностей, которые способствуют рекомбинации с геномом, в соответствии со стандартными способами. Для максимизации экспрессии можно использовать необходимые 1д-энхансер.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ, включающий применение конструкции, как указано выше, в экспрессирующей системе для экспрессии антител (или их участков), упомянутых выше.

Настоящее изобретение также относится к выделенным нуклеиновым кислотам, таким как рекомбинантные молекулы ДНК или клонированные гены либо их вырожденные варианты, мутанты, аналоги или их фрагменты, которые кодируют химерное антитело, которое связывает эндоглин.

В другом воплощении полная ДНК-последовательность рекомбинантной молекулы ДНК или клонированного гена антитела или его участка, описанных в данной заявке, может быть функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью, которая может быть введена в подходящего хозяина. Данная заявка соответственно распространяется на одноклеточных хозяев, трансформированных клонированным геном или рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую У_н, У_ъ, Сь и/или Рс антитела.

Другим признаком является экспрессия последовательностей ДНК, описанных в данной заявке. Как хорошо известно в данной области, последовательности ДНК могут экспрессироваться в результате функционального связывания их с контролирующей экспрессию последовательностью в соответствующем экспрессирующем векторе и применения такого экспрессирующего вектора для трансформации соответствующего одноклеточного хозяина.

- 14 025367

Такое функциональное связывание последовательности ДНК с контролирующей экспрессию последовательностью несомненно включает, если не часть последовательности ДНК, то обеспечение инициирующего кодона АТС в корректной рамке считывания выше последовательности ДНК.

Полинуклеотиды и векторы могут быть представлены в выделенной и/или очищенной форме (например, не содержащей или по существу не содержащей полинуклеотидов, имеющих происхождение, отличное от полинуклеотида, кодирующего полипептид с необходимой функцией). Как использовано в данной заявке, термин по существу чистый и по существу свободный относится к раствору или суспензии, содержащему(ей) менее чем, например, примерно 20% или меньше примеси, примерно 10% или меньше примеси, примерно 5% или меньше примеси, примерно 4% или меньше примеси, примерно 3% или меньше примеси, примерно 2% или меньше примеси или примерно 1% или меньше примеси.

Для экспрессии последовательностей ДНК по данному изобретению можно использовать целый ряд комбинаций хозяин/экспрессирующий вектор. Полезные экспрессирующие векторы, например, могут состоять из сегментов хромосомных, нехромосомных и синтетических последовательностей ДНК. Подходящие векторы включают, но не ограничиваются этим, производные 8У40 (обезьяний вирус 40) и известные бактериальные плазмиды, например, плазмиды Е. οοΐί οοΐ Е1, Рег1, РЬг322, РтЬ9 и их производные, плазмиды, такие как КР4; фаговые ДНК, например, многочисленные производные фага λ, например ΝΜ989, и ДНК другого фага, например М13, и однонитевую ДНК нитчатого фага; дрожжевые плазмиды, такие как плазмида 2и или ее производные; векторы, полезные в эукариотических клетках, такие как векторы, полезные в клетках насекомых или млекопитающих; векторы, происходящие из комбинаций плазмид и фаговых ДНК, такие как плазмиды, которые были модифицированы для использования фаговой ДНК, или другие контролирующие экспрессию последовательности; и тому подобное.

Кроме того, согласно данному изобретению предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более полинуклеотидных конструкций. Полинуклеотид, кодирующий антитело, предложенное в данной заявке, образует аспект настоящей заявки, согласно которому предложен способ получения антитела, который включает экспрессию с одного или более полинуклеотидов. Экспрессия может достигаться, например, путем культивирования в подходящих условиях рекомбинантных клетокхозяев, содержащих данный полинуклеотид. Затем антитело можно выделить и/или очистить с помощью любого подходящего метода и использовать соответствующим образом.

Любая из широкого спектра контролирующих экспрессию последовательностей - последовательностей, которые контролируют экспрессию последовательности ДНК, функционально связанной с ней могут быть использованы в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК. Такие полезные контролирующие экспрессию последовательности включают, например, ранние или поздние промоторы 8У40, СМУ (цитомегаловирус), вируса осповакцины, полиомы или аденовируса, 1ас-систему, ΐτρсистему, ТАС-систему, ТКС-систему, ЬТК-систему, главные операторные и промоторные участки фага А, регуляторные участки белка оболочки фага ГЙ, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, Р1ю5), промоторы факторов спаривания дрожжей и другие последовательности, известные для регуляции экспрессии генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации.

Следует понимать, что не все векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяева будут одинаково хорошо функционировать для экспрессии последовательностей ДНК. Также не все хозяева будут одинаково хорошо функционировать с одной и той же экспрессирующей системой. Однако специалист в данной области будет способен выбрать надлежащие векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяев без чрезмерного экспериментирования, чтобы осуществить желаемую экспрессию без отклонения от объема данной заявки. Например, при выборе вектора необходимо учитывать хозяина, поскольку вектор должен в нем функционировать. Также следует принимать во внимание число копий вектора, способность контролировать такое число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых данным вектором, таких как маркеры антибиотиков. Средний специалист в данной области может выбрать надлежащие векторы, последовательности, контролирующие экспрессию, и хозяев, чтобы осуществить желаемую экспрессию без отклонения от объема данной заявки. Например, при выборе вектора учитывают хозяина, поскольку вектор в нем функционирует. Также следует принимать во внимание число копий вектора, способность контролировать такое число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых данным вектором, таких как маркеры антибиотиков.

Согласно настоящему изобретению также предложены конструкции в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессирующих кассет, как описано в другом месте в данной заявке, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, упомянутый выше. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, селектируемые маркеры и другие последовательности, в зависимости от ситуации. Векторы могут быть плазмидами, вирусными, например фагом, или фагмидными, в зависимости от ситуации. Подробнее см., например, Μο№ιι1;π Οοηίη§: а ^аЬο^аΐο^у Мапиа1: 2пй еййюц 8;πιΦγοο1< еΐ а1., 1989, С.01Й 8ргшд Η;πΤογ ^аЬο^аΐο^у Ргезз. Многие известные методы и протоколы для работы с нуклеиновой кислотой, например, для получения конструкций нуклеиновых

- 15 025367 кислот, для мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и генной экспрессии и анализа белков, описаны подробно в 8Ьог1 РгоЮсо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 8есопб Εάίΐίοη, АикиЬе1 с! а1. ебк., ίοΐιη \УПеу & δοηκ, 1992. Методы, описанные 8атЬтоок и др. и АикиЬе1 и др., включены в данное описание посредством ссылки.

При выборе последовательности, контролирующей экспрессию, обычно учитывают множество факторов. Они включают, например, относительную эффективность системы, ее регулируемость и ее совместимость с конкретной последовательностью ДНК или геном, подлежащими экспрессии, в частности, что касается возможных вторичных структур. Подходящие одноклеточные хозяева будут выбраны с учетом, например, их совместимости с выбранным вектором, особенностей их секреции, их способности к корректному сворачиванию белков и необходимых условий их ферментации, а также токсичности для хозяина продукта, кодируемого последовательностями ДНК, подлежащими экспрессии, и легкости очистки продуктов экспрессии.

В другом аспекте предложена клетка-хозяин, содержащая один или более полинуклеотидов, описанных в данной заявке. В еще одном аспекте предложен способ введения таких одного или более полинуклеотидов в клетку-хозяина любым подходящим методом. Что касается эукариотических клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансфекцию с использованием фосфата кальция, БЕАЕ-декстрана, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса (например, вируса осповакцины), или, для клеток насекомых, бакуловируса. Что касается бактериальных клеток, то подходящие методы могут включать, например, трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофагов.

После введения можно инициировать или сделать возможной экспрессию одного или более полинуклеотидов, например путем культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии одного или более полипептидов с одного или более полинуклеотидов. Можно использовать индуцибельные системы и индуцировать экспрессию путем добавления активатора.

В одном из воплощений полинуклеотиды могут быть интегрированы в геном (например, хромосому) клетки-хозяева. Интеграцию можно стимулировать путем включения последовательностей, которые стимулируют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными способами. В другом воплощении нуклеиновая кислота сохраняется на эписомном векторе в клетке-хозяине.

В данной заявке предложены способы, включающие применение конструкции, которая указана выше, в экспрессирующей системе с целью экспрессии конкретного полипептида.

Учитывая эти и другие факторы, специалист в данной области сможет сконструировать ряд комбинаций вектор/последовательность, контролирующая экспрессию/хозяин, которые будут экспрессировать последовательности ДНК при ферментации или крупномасштабном культивировании клеток животных.

Полинуклеотид, кодирующий антитело или его участок, может быть получен рекомбинантным методом/методом синтеза в дополнение к клонированию, или скорее, клонирован. Полинуклеотид может быть сконструирован с использованием подходящих кодонов. В общем случае для предполагаемого хозяина будут выбраны предпочтительные кодоны, если данная последовательность будет использована для экспрессии. Весь полинуклеотид можно собрать из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными методами и собранных в полную кодирующую последовательность. См., например, Ебде, Ыа1иге, 292: 756 (1981); ЫатЬап е! а1., 8с1епсе, 223: 1299(1984); ,1а\ е! а1., ί. Βίο1. СЬет., 259: 6311 (1984).

Одновременное введение нуклеиновых кислот, кодирующих антитело (или его участок), и замены аминокислот по выбранным положениям могут быть осуществлены различными способами, известными специалистам в данной области, включая, например рекомбинантный и химический синтез.

Антитела против эндоглина

Эндоглин (СБ105) экспрессируется на клеточной поверхности в виде гомодимерного трансмембранного белка с массой 180 кДа. Наружный домен связывается с изоформами Τ0Ρ-β1 и -3 с высокой аффинностью (50 нМ), и трансмембранный и внутриклеточный домены СБ105 имеют 71%-ное сходство последовательности с бетагликаном. Ген СБ105 человека расположен на хромосоме 9д34, как идентифицировано с использованием флуоресцентной гибридизации ίη кЬи, и кодирующая область содержит 14 экзонов, и были охарактеризованы две разные изоформы (Ь и δ) СБ105 со способностью связывать ΤΟΡβ. Ь-СБ105 состоит из 633 аминокислотных остатков с 47 аминокислотными остатками в цитоплазматическом хвосте, в противоположность 8-СБ105, который состоит из 600 аминокислотных остатков и с цитоплазматическим хвостом длиной 14 аминокислот. Однако преобладающей формой является ЬСБ105. СБ105 конститутивно фосфорилируется в эндотелиальных клетках, главным образом по остаткам серина и треонина, и это фосфорилирование обусловлено конститутивно активным ΤΟΡ-β КИ в клетке. Связывание ΤΟΡ-β с СБ105 приводит к подавлению фосфорилирования, аналогичному эффектам, наблюдаемым для ингибиторов протеинкиназы С. Аминокислотная последовательность человеческого СБ105 содержит трипептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (КОБ), локализованный в экспонированном участке внеклеточного домена. Пептид КОБ представляет собой ключевую распознавае- 16 025367 мую структуру, обнаруженную на белках ЕСМ (внеклеточный матрикс), таких как фибронектин, витронектин, фактор фон Виллебрандта (ν^Ε), коллаген I типа и фибриноген, и распознается интегринами клеточной поверхности. Адгезия с участием интегринов вовлечена в гемостаз, тромбоз, ангиогенез и воспаление, процессы, в которых эндотелий играет критическую роль. (ЭиГГ с1 а1., РА8ЕВ 1.. 17: 984-992 (2003)).

С'Э105 является членом семейства рецепторов ТСР-β, который экспрессируется пролиферирующими эндотелиальными клетками. Для пролиферации эндотелиальных клеток необходимы нормальные уровни СЭ105. Экспрессия СЭ105 увеличивается в результате клеточной гипоксии благодаря продуцированию гипоксия-индуцибельного фактора-1-α (ΗΙΕ-1-α) и защищает гипоксические клетки от апоптоза. Некоторые функции СЭ105 ассоциированы с ТСР-всигнальным путем. ТСР-β передает сигнал через гетеродимерные рецепторы, состоящие из серинкиназ, рецептора I (ΚΙ) и рецептора II (КН). Связывание ТСР-β с наружными доменами рецептора демаскирует активность цитоплазматической киназы КН, фосфорилирущей ТСР-β ΚΣ, который затем может взаимодействовать с нижележащими сигнальными молекулами, такими как белки §таб. СЭ105 образует часть ТСР-в-рецепторного комплекса, но может существовать независимо на клеточной поверхности. Во многих клетках ίη νίΐΓΟ СЭ105 подавляет ТСР-βсигнальный путь.

СЭ105 также связывает другие ростовые факторы, такие как активин А и костные морфогенетические белки (ВМР) -10, -9, -7 и -2. Связывание ТСР-β или других лигандов ростовых факторов с СЭ105 требует присутствия по меньшей мере рецептора КН, а сам он не может связывать лиганды. Ассоциация СЭ105 с рецепторами не изменяет их аффинности к самому лиганду. После ассоциации цитоплазматический домен СЭ105 фосфорилируется под действием ТСР-β Ы и ТСР-β КН; затем киназа ТСР-β КТ, но не ТСР-β КН, диссоциирует из рецепторного комплекса.

Экспрессия СЭ105 ингибирует уровни фосфорилирования ТСР-β КН, но увеличивает уровни фосфорилирования ТСР-β Ы, что приводит к повышенному фосфорилированию §таб 2, но не §таб 3. Поскольку §таб 2 может взаимодействовать с рядом транскрипционных факторов, коактиваторов и супрессоров, фосфорилированный §таб 2 может действовать в качестве интегратора многочисленных сигналов для модулирования транскрипции генов. Таким образом, СЭ105 модулирует функции ТСР-β путем взаимодействия с ТСР-β К! и ТСР-β КН и модифицирует фосфорилирование нижележащих §таб-белков.

Действие СЭ105 заключается в модулировании передачи сигнала в многокомпонентных киназных рецепторных комплексах суперсемейства ТСР-β, включающего рецепторы ТСР-β (ΤСР-βΚ), активинрецептор-подобные киназы (АЬК) и активиновые рецепторы. В отсутствие СЭ105 активация рецепторов ТСР-β приводит к фосфорилированию белков §МАЭ (§МАЭ 2 и 3), которые ингибируют рост эндотелиальных клеток. Однако активация СЭ105 под действием ТСР-β модулирует фосфорилирование белков §МАЭ (включая фосфорилирование §МАЭ 1, 5 и 8). Конечным результатом является высвобождение ингибирующих рост эффектов активации рецептора ТСР-β на эндотелиальных клетках (см. фиг. 1). Неудивительно, что предупреждение активации СЭ105 с помощью антитела против СЭ105 или антисмыслового олигонуклеотида действует синергически с ТСР-β в отношении подавления роста эндотелиальных клеток.

Промотор СЭ105 имеет длину 2,6 т.п.н., но не содержит ТАТА- или СААТ-боксы для инициации транскрипции. Однако он имеет две СС-богатые области, консенсусные мотивы для δρ1, ей, САТА, АР2, NСР-β (фактор-β роста нервов) и Маб, а также ТСР-β отвечающие элементы. Тем не менее, СЭ105 имеет относительно ограниченное клеточное распределение. По-видимому, для достижения базального уровня транскрипции необходим ей-сайт в положении -68 и §р1-сайты, однако в относительное ограничение экспрессии, например, в эндотелиальных клетках, по-видимому, вовлечены многочисленные регуляторные участки, в частности, один в положении от -1294 до -932, а другой очень близко к сайту инициации транскрипции. СЭ105 активируется под действием ТСР-β, и это, как показано, требует §р1-сайта в положении от -37 до -29, также вовлекая один или более смежных вышележащих §ВЕ (§таб-связывающих элементов) сайтов, связывающих §таб 3 и/или 4 (которые активируются ТСР^-сигнальным путем). Гипоксия является общим признаком ишемических тканей и опухолей и является мощным стимулятором экспрессии гена СЭ105 в эндотелиальных клетках (ЕС) сосудов. Такой эффект потенцируется в комбинации с ТСР-β 1. Активированный СЭ105 может влиять на функцию самозащиты в ЕС в условиях гипоксического стресса.

ЕС сосудов представляют собой главный источник СЭ105. Клетки других типов, включая гладкомышечные клетки сосудов, фибробласты, макрофаги, лейкозные клетки пре-В- и миеломоноцитарного происхождения и эритроидные предшественники, экспрессируют СЭ105 в меньшей степени.

СЭ105 вовлечен в ангиогенез. Эксперименты с использованием антисмысловых последовательностей продемонстрировали, что подавление экспрессии СЭ105 в НиУЕС приводило к заметному ингибированию ангиогенеза ίη νίΐΓΟ в комбинации с ТСР-βί, что указывает на то, что СЭ105 является проангиогенным компонентом в эндотелиальных клетках. Дополнительным доказательством важной роли СЭ105 в ангиогенезе является использование СЭ105-нокаутных мышей. СЭ105-нулевые мыши демонстриру- 17 025367 ют многочисленные сердечно-сосудистые дефекты, приводящие к смерти на ранней стадии эмбрионального развития. Тяжелые сосудистые поражения, обнаруженные у СИ105-нулевых мышей, указывают на то, что СИ105 необходим для образования зрелых кровеносных сосудов во внеэмбриональной сосудистой сети, что также подтверждает непосредственную роль эндоглина в ангиогенезе.

Эндоглин, среди прочего также известный как СИ105 или ебд-1, представляет собой гомодимерный мембранный гликопротеин I типа, который экспрессируется на высоких уровнях в пролиферирующих эндотелиальных клетках сосудов. Таким образом, эндоглин главным образом представляет собой ассоциированный с пролиферацией маркер эндотелиальных клеток, подвергающихся активному ангиогенезу. Однако экспрессия эндоглина может быть ограничена сосудистым эндотелием нормальных тканей. Известно, что человеческий эндоглин специфически связывается с трансформирующим фактором роста-β (ТОР-β), и выведенная аминокислотная последовательность эндоглина имеет строгую гомологию с βгликаном, типом рецептора ТОР-β.

Эндоглин (ЕИО) был мишенью в основанных на антителах способах сокращения сосудистой сети опухоли, поскольку ЕИО представляет собой ассоциированный с пролиферацией антиген эндотелиальных и лейкозных клеток. Его экспрессия активируется в опухолеассоциированном сосудистом эндотелии, и ЕИО является существенным фактором ангиогенеза. Ангиогенез включает образование новых капиллярных кровеносных сосудов, приводящее к неоваскуляризации, а также поддержанию существующей сосудистой сети. Он представляет собой сложный процесс, который включает серию последовательных стадий, в том числе опосредованную эндотелиальными клетками деградацию базальной мембраны сосудов и интерстициальных матриксов, миграцию эндотелиальных клеток, пролиферацию эндотелиальных клеток и образование капиллярных петель эндотелиальными клетками.

Согласно данному изобретению предложены химерные антитела, которые связывают эндоглин. Эндоглин можно обнаружить на клетках, которые содержат и поддерживают существующую сосудистую сеть, а также в клетках, которые стимулируют рост новой сосудистой сети и становятся ее частью. Эти антитела могут связывать эндоглин и тем самым ингибировать ангиогенез, ингибировать существующую сосудистую сеть или поддержание существующей сосудистой сети и/или ингибировать дилатацию малых сосудов. В дополнение к их применению для очистки эндоглина, эти антитела полезны для очистки, детекции и диагностических целей, а также терапевтических целей. Антитела, предложенные в данной заявке, могут быть использованы для изготовления лекарственных средств для лечения ряда состояний и заболеваний, в способах лечения указанных состояний и заболеваний и способах детекции или диагностики. Как использовано в данной заявке, ангиогенез вовлечен в рост и/или развитие новых кровеносных сосудов (что также обозначается как неоваскуляризация), дилатацию малых сосудов, чрезмерный или продолжительный рост сосудов и поддержание существующей сосудистой сети. Ангиогенные состояния и заболевания относятся к таким заболеваниям и состояниям, которые связаны с ангиогенезом, вызваны ангиогенезом или ассоциированы с ангиогенезом. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают, например, различные формы рака (первичные опухоли и метастазы).

Были получены мышиные моноклональные антитела (тАЬ) против эндоглина, которые модулируют активность эндоглина и посредством этого ингибируют ангиогенез и/или ингибируют вазодилатацию малых кровеносных сосудов. Эти мышиные антитела описаны в патентах США 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836, каждый из которых таким образом включен во всей своей полноте. Кроме того, была продемонстрирована эффективность ех νίνο и ίη νίνο ряда таких антител; моноклональные антитела, которые связывают эндоглин, представляют интерес в качестве эндоглин-модулирующих соединений. Однако терапевтическое применение мышиных антител является недопустимым, поскольку введение мышиных антител имеет ряд ограничений, включая иммуногенность, например, в форме человеческих антимышиных антител (НАМА).

Описано несколько антител против эндоглина, в частности моноклональные антитела (тАЬ) против эндоглина. МАЬ §N6 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей смесями гликопротеинов клеточных мембран лейкозных клеток человека (Наги1а апб §еοη, 1986, Ргос. №й1. Асаб. 8с1. 83: 7898-7902). §N6 представляет собой мышиное тАЬ, которое распознает человеческий эндоглин. МАЬ 44О4 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей цельноклеточными суспензиями пре-В лейкозных клеток человека (Όοιι^οκ апб Бе1аг1е. 1988, ί. Iттиηο1. 141: 1925-1933; 1990, 1. ΒίοΙ. СЬет. 265: 8361-8364). 44О4 также представляет собой мышиное тАЬ, которое распознает человеческий эндоглин. МАЬ М17/18 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации крыс кусочками воспаленной кожи мышей (Ое апб ВШсЬег, 1994, выше). Кроме того, М17/18 представляет собой тАЬ, которое распознает мышиный эндоглин. тАЬ Тес-11 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей эндотелиальными клетками пупочной вены человека (Вштоук е1 а1., 1995, СЬп. Сапсег Кек. 1: 1623-1634). Тес-11 представляет собой мышиное тАЬ с реактивностью, ограниченной человеческим эндоглином. В данной заявке описаны химерные антитела, связывающие эндоглин, которые демонстрируют сниженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Кроме того, для устранения проблем, ассоциированных с мышиными антителами, в данной заявке описаны химерные антитела, связывающие эндоглин и уменьшающие и/или

- 18 025367 ингибирующие ангиогенез, которые демонстрируют сниженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Эти химерные антитела против эндоглина полезны для диагностики или лечения различных состояний и заболеваний, а также для очистки и детекции эндоглина. Антитела против эндоглина представляют важную область для разработки терапий для лечения ряда заболеваний и состояний, которые вовлеают ангиогенез, подвержены влиянию или воздействию ангиогенеза.

Согласно данному изобретению предложены химерные антитела, которые связываются с эндоглином. Также предложены химерные антитела, которые связывают эндоглин и ингибируют (частично или полностью) или контролируют/лечат (частично или полностью) ангиогенез/неоваскуляризацию, дилатацию малых сосудов, ингибирование клеточной пролиферации или ингибирование опухолевого роста. Аналогично, в понятие ингибирования или связывания эндоглина также включено ингибирование функции эндоглина (например, передачи сигнала, связывания, активации и тому подобного). В еще одном другом воплощении химерное антитело ингибирует ангиогенез посредством связывания с эндоглином. Согласно данному изобретению также предложены клеточные линии, которые могут быть использованы для продукции химерных антител, способы получения клеточных линий, способы экспресии антител и их очистки.

Очевидно, что антитела, которые специфически связывают эндоглин, полученный с использованием способов, описанных в данной заявке, можно протестировать с использованием анализов, предложенных в данной заявке или известных в данной области, в отношении способности связываться с эндоглином, используя традиционные методы, включая, но не ограничиваясь этим, ЕЫЗЛ Аффинность антител, описанных в данной заявке, также можно определить, используя традиционные методы, включая, но не ограничиваясь этим, Вьасоге или поверхностный плазмонный резонанс.

Согласно данному изобретению предложены химерные антитела, которые связывают эндоглин. Кроме того, согласно данному изобретению предложены химерные антитела, которые связывают эндоглин и ингибируют ангиогенез.

Согласно данному изобретению предложено химерное антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 1, константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ГО N0: 2, вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 3, гамма 1 (γ1) константную область (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 4.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено химерное антитело, способное конкурировать с химерным антителом против эндоглина, описанным в данной заявке, в условиях, при которых по меньшей мере 5% антитела, имеющего ν_Η- и У_ъ-последовательности данного антитела, блокируется от связывания с эндоглином вследствие конкуренции с таким антителом в ЕЫЗЛ-анализе.

Согласно данному изобретению предложены нейтрализующие химерные антитела, которые связываются с эндоглином и модулируют активность эндоглина. Нейтрализующее антитело, например, может ингибировать ангиогенез посредством связывания с эндоглином.

Процент (%) ингибирования ангиогенеза, клеточной пролиферации и/или опухолевого роста химерным антителом против эндоглина, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или более превышающий величину для отрицательных контролей, является показателем того, что антитело ингибирует ангиогенез. Процент (%) ингибирования ангиогенеза, клеточной пролиферации и/или опухолевого роста химерным антителом против эндоглина, менее чем в 2 раза превышающий величину для отрицательных контролей, является показателем того, что антитело не ингибирует ангиогенез.

Связывание химерного антитела с эндоглином может частично (например, на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или на любое число в данной заявке) или полностью ингибировать ангиогенез, клеточную пролиферацию и/или опухолевый рост. Нейтрализующая или ингибирующая активность химерного антитела может быть определена с использованием анализа ίη νίΐτο и/или ίη νίνο с использованием признанных в данной области техники анализов, такие как анализы, описанные в данной заявке или иным образом известные в данной области.

Антитела, описанные в данной заявке, полезны для применений в детекции или диагностике, как более подробно описано ниже. Антитела, описанные в данной заявке, полезны для связывания с эндоглином, что, в свою очередь, может ингибировать ангиогенез, как описано в данной заявке.

Агенты против νΈΟΡ

Фактор роста сосудистого эндотелия (νΕΟΡ) был идентифицирован как белок, который индуцирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток ίη νίΐτο и проницаемость кровеносных сосудов и ангиогенез ίη νίνο. Он регулирует как сосудистую пролиферацию, так и проницаемость. Также известный как фактор сосудистой проницаемости (νΡΡ), он является уникальным фактором среди проангиогенных факторов благодаря своей специфичности в отношении сосудистого эндотелия и эффективности. Он также функционирует в качестве антиапоптотического фактора эндотелиальных клеток во вновь обра- 19 025367 зующихся сосудах. УЕОР экспрессируется в опухолевых клетках, макрофагах, Т-клетках, гладкомышечных клетках, клетках почки, мезангиальных клетках, кератиноцитах, астроцитах и остеобластах.

Термин УЕОР человека относится в одном из воплощений к 165-аминокислотному фактору роста сосудистых эндотелиальных клеток человека и родственным 121-, 189- и 206-аминокислотным факторам роста сосудистых эндотелиальных клеток, которые описаны в Ьеипд е1 а1., 8с1епсе, 246: 1306 (1989); и Ноиск е1 а1., Мо1. Епбоспп., 5: 1806 (1991) вместе с природными аллельными и процессированными формами этих ростовых факторов. Термин УЕОР также относится к УЕОР из видов, не являющихся человеком, таких как мышь, крыса или примат. В некоторых случаях УЕОР из конкретного вида указывается такими терминами, как ЬУЕОР для УЕОР человека, тУЕОР для УЕОР мыши и т.д. Термин УЕОР также используется для обозначения укороченных форм полипептида, содержащих аминокислоты 8-109 или 1-109 из 165-аминокислотного фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток человека. Аминокислотные положения для укороченного нативного УЕОР пронумерованы, как указано в последовательности нативного УЕОР. Например, аминокислотное положение 17 (метионин) в укороченном нативном УЕОР также представляет собой положение 17 (метионин) в нативном УЕОР. Укороченный нативный УЕОР имеет аффинность связывания с рецепторами КОК и РЬ-1, сравнимую с нативным УЕОР. Согласно одному из воплощений УЕОР представляет собой УЕОР человека.

Семейство УЕОР включает в себя семь членов, в том числе УЕОР-А, УЕОР-В, УЕОР-С, УЕОР-О, УЕОР-Е, УЕОР-Р и плацентарный фактор роста (Р1ОР). Все они имеют общую структуру из восьми цистеиновых остатков в УЕОР-гомологичном домене. Кроме того, что касается УЕОР-А, то существуют шесть разных изоформ, и УЕОР-А165 является основной изоформой. Все эти изоформы имеют различные и перекрывающиеся функции в ангиогенезе. Ген УЕОР расположен на хромосоме 6р.21. Различные члены семейства УЕОР имеют разные физические и биологические свойства, и они действуют через специфические тирозинкиназные рецепторы (УЕОРК-1, УЕОРК-2 и УЕОРК-3). УЕОРК-3 рецептор и его лиганды УЕОР-С и УЕОР-О ассоциированы с лимфангиогенезом, тогда как Р1ОР связан с артериогенезом.

Были охарактеризованы два высокоаффинных рецептора к УЕОР, УЕОРК-1/РЫ (£т8-подобная тирозинкиназа-1) и УЕОРК-2/Кбг/Р1к-1 (рецептор, содержащий домен с киназной вставкой/киназа-1 эмбриональной печени). Также известен третий рецептор - УЕОРК-3. Эти рецепторы относят к семейству рецепторов РООР (тромбоцитарный фактор роста). Однако рецепторы УЕОР имеют семь иммуноглобулиноподобных петель в своих внеклеточных доменах (в отличие от пяти у других членов семейства РООР) и более длинный киназную вставку. Экспрессия рецепторов УЕОР происходит главным образом в сосудистых эндотелиальных клетках, хотя некоторое количество может присутствовать на моноцитах и на клеточных линиях меланомы. Было показано, что только эндотелиальные клетки пролиферируют в ответ на УЕОР, и эндотелиальные клетки из разных источников демонстрируют разные ответы. Таким образом, сигналы, опосредованные через УЕОРК-1, УЕОРК-2 и УЕОРК-3, по-видимому, являются специфичными к типу клеток.

УЕОРК-1 и УЕОРК-2 связывают УЕОР 165 с высокой аффинностью (Кб примерно 20 и 200 пМ, соответственно). Также было показано, что рецептор Р1к-1 подвергается аутофосфорилированию в ответ на УЕОР. УЕОРК-2 опосредовал сигналы, вызывающие поразительные изменения в морфологии, реорганизацию актина и активные перемещения в мембране эндотелиальных клеток аорты свиньи, сверхэкспрессирующих этот рецептор. В этих клетках УЕОРК-2 также опосредовал лиганд-индуцированный хемотаксис и митогенность; тогда как у УЕОРК-1-трансфицированных клеток отсутствовали митогенные ответы на УЕОР. В противоположность этому, УЕОР оказывал сильный рост-стимулирующий эффект на синусоидальные эндотелиальные клетки крысы, экспрессирующие УЕОРК-1. Фосфопротеины, осаждающиеся совместно с УЕОРК-1 и УЕОРК-2, различаются, и это позволяет предположить, что с рецепторспецифическими внутриклеточными последовательностями взаимодействуют разные сигнальные молекулы.

УЕОР представляет собой одну из мишеней для противоопухолевых терапий, поскольку его экспрессия активируется в ряде солидных опухолей. УЕОР представляет собой главный регулятор ангиогенеза, роста новых сосудов из уже существующих сосудов. Этот процесс является фундаментальным для роста солидных опухолей, который зависит от образования новых кровеносных сосудов. Некоторые низкомолекулярные терапевтические агенты способны направленно воздействовать на рецептор фактора роста сосудистого эндотелия (УЕОРК); такое направленное воздействие низкомолекулярными терапевтическими средствами может приводить к противораковым эффектам. Агенты, направленные на рецептор УЕОР, непосредственно блокируют опухолевый рост путем ингибирования образования новых сосудов. Ингибирование УЕОР-индуцированного ангиогенеза может оказывать противоопухолевый или улучшенный противоопухолевый эффект без значительного ингибирования УЕОР-стимуляции макрофагов, остеокластов или хондрокластов.

В одном из воплощений, предложенном в данной заявке, антагонист УЕОР представляет собой антитело, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональное антитело, химерное антитело, человеческое и гуманизированное антитело. Согласно одному из конкретных воплощений антитело против УЕОР представляет собой бевацизумаб (АУА8Т1Ы®). Согласно другому воплощению антитело против УЕОР

- 20 025367 выбрано из группы, состоящей из РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)'₂, одноцепочечного Ρν (ксРу), половинок антитела, одноцепочечного связывающего полипептида, Ρν-фрагмента, диатела и линейного антитела.

Антагонист VΕСΡ относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, ингибировать, отменять, уменьшать или интерферировать активности VΕСΡ, включая его связывание с VΕСΡ или одним или более рецепторами VΕСΡ, или с кодирующей их нуклеиновой кислотой. В некоторых случаях антагонист VΕСΡ связывается VΕСΡ или рецептор VΕСΡ. Согласно одному из конкретных воплощений антагонист VΕСΡ связывается с VΕСΡ и ингибирует VΕСΡ-индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток ίη νίίτο.

Согласно одному из воплощений антагонист VΕСΡ связывается с VΕСΡ или рецептором VΕСΡ с более высокой аффинностью, чем с не-VΕСΡ или рецептором не-VΕСΡ. Согласно другому воплощению антагонист VΕСΡ связывается с VΕСΡ или рецептором VΕСΡ с Кб в диапазоне от 1 нМ до 1 мкМ. Согласно другому воплощению антагонист VΕСΡ связывается с VΕСΡ или рецептором VΕСΡ в диапазоне от 500 нМ и до 1 мкМ.

Антитело против VΕСΡ представляет собой антитело, которое связывается с VΕСΡ с достаточной аффинностью и специфичностью. Антитело против VΕСΡ по изобретению может быть использовано в качестве терапевтического агента при направленном воздействии на заболевания или состояния и препятствовании заболеваниям или состояниям, в которые вовлечена активность VΕСΡ. Антитело против VΕСΡ обычно не будет связываться с другими гомологами VΕСΡ, такими как VΕСΡ-Β или VΕСΡ-С, или с другими ростовыми факторами, такими как Р1СР, РЭСР или ЬРСР (основный фактор роста фибробластов).

Антитело против VΕСΡ бевацизумаб, также известное как гЬиМАЬ VΕСΡ или ΑνΑδΤΙΝ®, представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VΕСΡ, полученное в соответствии со способами, описанными в Ргек!а е! а1. (1997) Сапсег Век. 57: 4593-4599. Оно содержит мутированные каркасные участки 1дС1 человека и антигенсвязывающие, определяющие комплементарность участки из мышиного моноклонального антитела против ЬVΕСΡ Α.4.6.1, которое блокирует связывание VΕСΡ человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большинство каркасных участков, происходит из 1дС1 человека и примерно 7% последовательности происходит из мышиного антитела А4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу примерно 149000 дальтон и является гликозилированным. Аминокислотные последовательности, ассоциированные с мышиным моноклональным вариантом, и гуманизированные варианты бевацизумаба представлены в виде 8ЕЦ ГО N0: 5-11.

В некоторых воплощениях ингибитор рецептора VΕСΡ, подлежащий введению в комбинированной композиции, представляет собой низкомолекулярный ингибитор VΕСΡ. В других воплощениях ингибитор рецептора VΕСΡ, подлежащий введению в комбинированной композиции, представляет собой антитело против VΕСΡ. В одном неограничивающем примере ингибитор рецептора VΕСΡ, подлежащий введению в комбинированной композиции, представляет собой бевацизумаб (ΑνΑδΤΙΝ®). Типичные неограничивающие дозировки для бевацизумаба рассмотрены более подробно ниже и в примерах.

Модифицированные антитела или их части

Антитела, описанные в данной заявке, могут дополнительно содержать терапевтическую группировку для использования в терапевтических применениях.

Антитела, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в виде иммуноконъюгатов. Как использовано в данной заявке, для целей описания и формулы изобретения, иммуноконъюгаты относятся к конъюгатам, состоящим из химерных антител против эндоглина или их фрагментов по настоящему изобретению и по меньшей мере одной терапевтической метки. Терапевтические метки включают противоопухолевые агенты и ингибиторы ангиогенеза. Такие противоопухолевые агенты известны в данной области и включают, но не ограничиваются этим, токсины, лекарственные средства, ферменты, цитокины, радионуклиды, фотодинамические агенты и ингибиторы ангиогенеза. Токсины включают, но не ограничиваются этим, цепь рицина А, мутантные экзотоксины из Ркеиботопак, дифтерийный токсоид, стрептонигрин, боамицин (Ьоатусш), сапорин, гелонин и антивирусный белок лаконоса. Лекарственные средства включают даунорубицин, метотрексат и калихеамицины. Радионуклиды включают радиоактивные металлы. Цитокины включают, но не ограничиваются этим, трансформирующий фактор роста (ТСР)-в, интерлейкины, интерфероны и факторы некроза опухолей. Фотодинамические агенты включают, но не ограничиваются этим, порфирины и их производные. Дополнительные терапевтические метки будут известны в данной области и также рассматриваются в данной заявке. Способы образования комплексов тΑЬ против эндоглина или его фрагмента по меньшей мере с одним противоопухолевым агентом хорошо известны специалистам в данной области (т.е. обзор конъюгатов антител приведен в СЬеЕе е! а1., 1994, РЬагтасо1. ТЬеп, 63: 209-34). В таких способах можно применять один из нескольких доступных гетеробифункциональных реагентов, используемых для сочетания или связывания молекул. Дополнительные радионуклиды описаны в данной заявке далее вместе с дополнительными способами связывания молекул, таких как терапевтические и диагностические метки.

Антитела могут быть модифицированы с использованием методов, известных в данной области для

- 21 025367 различных целей, например, посредством добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ). Модификация посредством ПЭГ (ПЭГилирование) может приводить к одному или более чем одному из следующего: улучшенному времени циркуляции, улучшенной растворимости, повышенной устойчивости к протеолизу, пониженной антигенности и иммуногенности, улучшенной биодоступности, пониженной токсичности, улучшенной стабильности и упрощению технологии изготовления лекарственного средства (см. обзор в Ριαηΰδ еί а1., Iηίе^ηаί^οηа1 ίοιίΓηαΙ οί НетаГО^ду, 68: 1-18, 1998).

Рс-области антител могут быть модифицированы с целью увеличения периода полувыведения из кровотока после введения указанному пациенту. Модификации могут быть определены с использованием традиционных в данной области способов, таких как, например, описанные в патенте США № 7217798, который таким образом включен посредством ссылки во всей своей полноте.

Также известны другие способы увеличения периода полувыведения слитых белков на основе антител из кровотока, такие как, например, описанные в патентах США № 7091321 и 6737056, каждый из которых таким образом включен посредством ссылки. Кроме того, могут быть получены или экспрессированы такие антитела, которые не содержат фукозу на своих комплексных Ν-гликозид-связанных сахарных цепях. Известно, что удаление фукозы из комплексных Ν-гликозид-связанных сахарных цепей увеличивает эффекторные функции антител и антигенсвязывающих фрагментов, включая, но не ограничиваясь этим, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС) и комплементзависимую цитотоксичность (СЭС).

Аналогично, антитела, которые могут связывать эндоглин, могут быть присоединены по их С-концу ко всей или к части тяжелой цепи иммуноглобулина, происходящей из любого изотипа антител, например, ЦО, ЦА, ЦЕ, Ι§Ό и ЦМ, и любого из подклассов изотипов, в частности, ЦО1, 1дС2Ь, ЦО2а, ЦО3 и ЦО4.

Кроме того, антитела, описанные в данной заявке, могут быть модифицированы, с тем чтобы они могли проходить через гематоэнцефалический барьер. Такая модификация антител, описанных в данной заявке, делает возможным лечение заболеваний головного мозга, таких как мультиформная глиобластома (ОВМ). Типичные модификации, позволяющие белкам, таким как антитела, проходить через гематоэнцефалический барьер, описаны в патентной публикации США 20070082380, которая таким образом включена посредством ссылки во всей своей полноте.

Было показано, что гликозилирование иммуноглобулинов оказывает значительное влияние на их эффекторные функции, структурную стабильность и скорость секреции из антитело-продуцирующих клеток (ЬеабюгЪаггозу еί а1., Μο1. Iттиηο1. 22: 407 (1985)). Углеводные группы, отвечающие за эти свойства, обычно присоединены к константным (С) областям антител. Например, гликозилирование ЦО по аспарагину 297 в домене Сн2 требуется для полной способности ЦО активировать классический (путь) комплемент-зависимого цитолиза (Таο аЫ Μοττίδοη, ί. ^тию! 143: 2595 (1989)). Гликозилирование ЦМ по аспарагину 402 в домене Сн3 необходимо для достижения правильной сборки и цитолитической активности антитела (Минюка апб ЕШтащ ί. Iттиηο1. 142: 695 (1989)). Удаление сайтов гликозилирования в положениях 162 и 419 в доменах Сн1 и Сн3 ЦА антитела приводит к внутриклеточной деградации и по меньшей мере к 90%-ному ингибированию секреции (ТауКг аЫ ^а11, Μο1. Се11. ΒίοΙ. 8: 4197 (1988)). Кроме того, могут быть получены или экспрессированы такие антитела, которые не содержат фукозу на своих комплексных Ν-гликозид-связанных сахарных цепях. Известно, что удаление фукозы из комплексных Ν-гликозид-связанных сахарных цепей увеличивает эффекторные функции антител и антигенсвязывающих фрагментов, включая, но не ограничиваясь этим, антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС) и комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС). Эти дефукозилированные антитела могут быть получены с помощью различных систем, в которых используются методы молекулярного клонирования, известные в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, трансгенных животных, трансгенные растения или клеточные линии, которые были созданы с помощью генной инженерии, так что они больше не содержат ферменты и биохимические пути, необходимые для включения фукозы в комплексные Ν-гликозид-связанные сахарные цепи (также известные как фукозилтрансфераза-нокаутные животные, растения или клетки). Неограничивающие примеры клеток, которые могут быть модифицированы с тем, чтобы получить фукозилтрансфераза-нокаутные клетки, включают клетки СНО, клетки ЕР2/0, клетки Νδ0 и клетки ΥΒ2/0.

Также было рассмотрено гликозилирование иммуноглобулинов в вариабельной (V) области. δοχ и Ηοο6 сообщили, что примерно 20% человеческих антител гликозилированы в ν-области (Ргос. Νη11. Асаб. δα. υδΑ, 66: 975 (1970)). Предполагают, что гликозилирование ν-домена происходит в результате случайной встречаемости Ν-связанного сигнала гликозилирования Αδη-Xаа-δе^/ТЬ^ в последовательности ν-области и, как считается в данной области, не играет существенной роли в функционировании иммуноглобулинов.

Гликозилирование по каркасному остатку в вариабельном домене может изменять связывающее взаимодействие антитела с антигеном. Настоящее изобретение включает критерии, согласно которым выбирают ограниченное количество аминокислот в каркасном участке или СОК химерной иммуноглобулиновой цепи, которые подлежат мутации (например, путем замены, делеции или добавления остатков) с целью увеличения аффинности антитела.

- 22 025367

Аффинность связывания с антигеном обычно можно модулировать путем введения одной или более мутаций в каркас У-области, обычно в участки, прилегающие к одному или более СОК, и/или в один или более каркасных участков. Обычно такие мутации подразумевают введение консервативных аминокислотных замен, которые либо разрушают, либо создают последовательности сайтов гликозилирования, но по существу не влияют на гидропатические структурные свойства полипептида. Обычно избегают мутаций, которые вводят остаток пролина. Гликозилирование антител также описано в патенте США № 6350861, который включен в данное описание посредством ссылки в отношении гликозилирования.

Антитела могут быть приготовлены для кратковременной доставки или пролонгированной (долговременной) доставки.

Антитела, которые связываются с эндоглином, также могут быть использованы для очистки эндоглина и/или для детекции уровней эндоглина в образце или у пациента, чтобы детектировать или диагностировать заболевание или расстройство, ассоциированное с эндоглином, как описано более подробно ниже.

Химерные антитела, которые связывают эндоглин, полученные с использованием таких способов, можно протестировать в отношении одного или более чем одного из следующего: аффинности связывания, авидности и нейтрализующих свойств. Полезные химерные антитела могут быть использованы для введения указанному пациенту с целью предупреждения, ингибирования, регуляции или лечения состояния, заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом.

Антитела могут быть оценены в отношении одного или более чем одного из следующего: аффинности связывания, скоростей ассоциации, скоростей диссоциации и авидности. В одном из аспектов антитела могут быть оценены в отношении их способности нейтрализовать активность эндоглина или УЕОР. Измерение аффинности связывания, скоростей ассоциации, скоростей диссоциации и авидности может быть осуществлено с использованием признанных в данной области техники анализов, включающих, но не ограничивающихся этим, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8А), анализ Скэтчарда, В1АСОКЕ-анализ (поверхностный плазмонный резонанс) и т.д., а также другие анализы, обычно используемые и известные среднему специалисту в данной области.

Измерение связывания антител с эндоглином и/или способности антител, например, ингибировать ангиогенез, можно осуществить, используя, например, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ§А), анализ конкурентного связывания, ЕЫ8РОТ-анализ (иммуноферментный спот-анализ) или любой другой полезный анализ, известный в данной области. Эти анализы являются обычно используемыми анализами, и они хорошо известны среднему специалисту в данной области.

В одном неограничивающем воплощении ЕЫ§А-анализ может быть использован для измерения связывающей способности специфических антител, которые связываются с эндоглином.

Анализы, такие как ЕЫ§А, также могут быть использованы для идентификации антител, которые демонстрируют повышенную специфичность к эндоглину в сравнении с другими антителами. Анализы, такие как ЕЫ§А, также могут быть использованы для идентификации антител, которые связываются с эпитопами на одном или более полипептидах и на одном или более видах эндоглина или УЕОР. Анализ специфичности можно выполнить, осуществляя параллельные ЕЫ§А-анализы, в которых в отдельных камерах для анализа одновременно проводят скрининг тестируемых антител в отношении способности связываться с одним или более эпитопами на различных вариантах полипептида, содержащего эпитопы эндоглина, для идентификации антител, которые связываются с эндоглином. Другим методом измерения кажущейся аффинности связывания, известным специалистам в данной области, является метод поверхностного плазмонного резонанса (анализ осуществляют на системе В1АСОКЕ 2000) (Ы1)еЫай, с1 а1., О1усо. 1.· 2000, 17: 323-329). Стандартные измерения и традиционные анализы связывания описаны в Нее1еу, К. Р., Епйосг. Кез., 2002, 28: 217-229.

Химерные антитела к эндоглину также могут быть проанализированы в отношении их способности лечить различные заболевания и состояния, ассоциированные с ангиогенезом применительно к различным формам рака (например, первичным опухолям, рецидивирующим опухолям и метастазам). Для мониторинга таких эффектов можно использовать любой подходящий анализ, известный специалисту в данной области. Некоторые такие методы описаны в данной заявке. В одном из примеров антитела, описанные в данной заявке, анализируют в отношении их способности связывать эндоглин. В другом примере константы аффинности для антител, описанных в данной заявке, определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (δΡΚ). В еще одном другом примере антитела, описанные в данной заявке, анализируют в отношении их эффекта на ингибирование ангиогенеза.

II. Композиции

Каждое из соединений, описанных в данной заявке, может быть использовано в виде композиции при объединении с приемлемым носителем или эксципиентом. Такие композиции полезны для анализа ίη νίίτο или ίη νίνο либо для введения субъекту ίη νίνο или ех νίνο для лечения субъекта описанными соединениями.

Согласно данному изобретению предложены композиции (лекарственные средства), содержащие химерное антитело против эндоглина, способное ингибировать одну или более биологических активностей эндоглина, таких как ангиогенная активность.

- 23 025367

Согласно данному изобретению предложены композиции (лекарственные средства), содержащие антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) против УЕОР, способное ингибировать одну или более биологических активностей УЕОР, таких как его митогенная активность в одном из воплощений или ангиогенная активность.

Кроме того, согласно данному изобретению предложены композиции (лекарственные средства), содержащие комбинацию химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР.

Композиции, содержащие химерное антитело против эндоглина, можно вводить последовательно или одновременно с композицией, содержащей антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) против УЕОР. Такие введения включают, но не ограничиваются этим, введение с интервалом примерно в четыре недели, с интервалом примерно в три недели, с интервалом примерно в две недели, с интервалом примерно в одну неделю, с интервалом в одни сутки, с интервалом примерно в 12 ч, с интервалом примерно в 6 ч, с интервалом примерно в 3 ч, с интервалом примерно в 1 ч, с интервалом примерно в 30 мин, в один и тот же день, в одно и то же время или в их комбинации. Когда рассматриваются многократные дозы композиции по настоящему изобретению и/или комбинированной терапевтической группировки, понятно, что дозы каждого могут быть определены эмпирически с использованием известных доз и концентраций с учетом возраста, роста, массы, состояния здоровья и других физических характеристик субъекта, применяя стандарты имеющихся в продаже продуктов.

Когда композиции вводят последовательно, тогда композицию, содержащую химерное антитело против эндоглина, как описано в данной заявке, можно вводить, например, до и/или после антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР. Альтернативно, композицию, содержащую химерное антитело против эндоглина, как описано в данной заявке, вводят после антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР.

Когда композиции вводят одновременно, тогда композицию, содержащую химерное антитело против эндоглина, можно вводить в то же место или в другое место по сравнению с композицией, содержащей антитело против УЕОР.

В еще одном другом воплощении согласно данному изобретению предложены композиции (лекарственные средства), содержащие химерное антитело против эндоглина и антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) против УЕОР, способные ингибировать одну или более биологических активностей эндоглина и УЕОР, соответственно, таких как митогенная активность, клеточная пролиферация, опухолевый рост, неоваскуляризация или ангиогенная активность.

Следует понимать, что схемы лечения могут включать одно или более чем одно введение каждой из композиций, описанных в данной заявке. Композицию можно вводить в однократной дозе или многократных дозах. Введение раздельных композиций можно выполнять одним и тем же путем или разными путями.

В одном из воплощений композицию вводят каждые одну-три недели в течение от шести до 12 циклов или пока опухоль прогрессирует. Данный способ может дополнительно включать стадию введения композиции каждые одну-двенадцать недель до двух лет включительно. В другом неограничивающем примере одновременное введение химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР происходит в 1-ю неделю, с последующим дополнительным введением композиций в первую, вторую, третью или четвертую неделю, причем одновременное введение повторяют в течение от шести до двенадцати циклов или пока опухоль прогрессирует, и с последующим введением композиций каждые одну-двенадцать недель до двух лет включительно.

В одном неограничивающем примере способа лечения рака у пациента указанный способ включает хирургическое удаление раковой опухоли и введение химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР в одну-три недели в течение 12 месяцев или пока опухоль прогрессирует, с последующим одновременным введением антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР в дозе в одну-12 недель. Кроме того, одновременное введение химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР можно повторять каждые одну-три недели вплоть до 6 циклов включительно. Возможно, что способ также включает введение химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР каждые одну-двенадцать недель до двух лет включительно. Понятно, что схемы лечения можно комбинировать с методами мониторинга, предложенными в данной заявке, с целью определения того, необходимо ли и когда необходимо введение дополнительных доз химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР.

Комбинированная терапия может обеспечивать синергический и/или благоприятный эффект или может позволить использовать более низкие дозы комбинации для обеспечения большей безопасности. Изобретение охватывает протоколы лечения, которые усиливают профилактический или терапевтический эффект химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕОР в отношении предупреждения, регуляции, лечения или удаления рака или других заболеваний.

- 24 025367

В одном из воплощений субъекту назначают дополнительное терапевтическое лечение, такое как, например, ингибитор ангиогенеза (как описано в данной заявке). Композицию, содержащую такое дополнительное терапевтическое лечение, можно вводить в комбинации (или последовательно, или одновременно) с другими композициями, описанными в данной заявке.

В одном неограничивающем способе лечения рака, предложенном в данной заявке, дополнительное терапевтическое лечение включает хирургическое удаление раковой опухоли, облучение, один или более химиотерапевтических агентов или их комбинацию и одновременное введение одной или более композиций, описанных в данной заявке. В одном из аспектов введение композиции может представлять собой, например, 20-минутную внутривенную инфузию.

Такие композиции могут включать, в дополнение к активному ингредиенту, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие вещества, хорошо известные специалистам в данной области. Такие вещества должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного(ых) ингредиента(ов). Точная природа носителя или другого вещества будет зависеть от пути введения.

Препараты, содержащие антитело или антигенсвязывающий фрагмент, идентифицированные способами, описанными в данной заявке, могут быть приготовлены для хранения путем смешивания белка, имеющего желательную степень очистки, с возможными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (КетшдЮи'к РЬагтасейса1 Заеисек, 16!Ь ейШои, О§о1, А. Ей. (1980)) в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами являются такие, которые не токсичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЕЭТА (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлокомплексы (например, Ζη-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Τ\νΕΕΝ®, РШКОМСЗ® или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Приемлемые носители являются физиологически приемлемыми для введения пациенту и сохраняют терапевтические свойства соединений, с которыми/в которых их вводят. Приемлемые носители и их препараты в целом описаны, например, в КетшдЮи'к РЬагтасейса1 Заеисек (18!Ь ЕйШои, ей. А. Оепиаго, Маск РиЬНкЫид Со., ЕаЧои, РА 1990). Одним из типичных носителей является физиологический раствор. Фраза фармацевтически приемлемый носитель, которая использована в данной заявке, означает фармацевтически приемлемое вещество, композицию или разбавитель, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, вовлекаемые в перенос или транспортировку соединений по настоящему изобретению из места введения, расположенного в одном органе или участке тела, в другой орган или участок тела или в систему для анализа ш νίΙΐΌ. Каждый носитель является приемлемым в смысле его совместимости с другими ингредиентами препарата и не наносит вреда субъекту, которому его вводят. Никакой приемлемый носитель не должен изменять специфической активности соединений по настоящему изобретению.

В одном из аспектов согласно данному изобретению предложены фармацевтически приемлемые или физиологически приемлемые композиции, включающие растворители (водные или неводные), растворы, эмульсии, дисперсионные среды, покрытия, изотонические и стимулирующие или замедляющие всасывание агенты, совместимые с введением. Таким образом, композиции или препараты относятся к композиции, подходящей для терапевтического и/или диагностического применения у субъекта. Композиции и препараты включают количество соединения, описанного в данной заявке, и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель.

Композиции могут быть приготовлены совместимыми с конкретным путем введения (т.е. системным или локальным). Таким образом, композиции включают носители, разбавители или эксципиенты, подходящие для введения различными путями.

В другом воплощении композиции могут дополнительно содержать, при необходимости, приемлемое вспомогательное вещество с целью улучшения стабильности соединений в композиции и/или для контроля скорости высвобождения композиции. Приемлемые вспомогательные вещества не изменяют специфической активности соединений по настоящему изобретению. Типичные приемлемые вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются этим, сахар, такой как маннит, сорбит, глюкоза, ксилит, трегалоза, сорбоза, сахароза, галактоза, декстран, декстроза, фруктоза, лактоза и их смеси. Приемлемые вспомогательные вещества могут быть объединены с приемлемыми носителями и/или эксципиентами, такими как декстроза. Альтернативно, типичные приемлемые вспомогательные вещества включа- 25 025367 ют, но не ограничиваются этим, поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 20 или полисорбат 80 для увеличения стабильности пептида и уменьшения желирования раствора. Поверхностноактивное вещество можно добавлять к композиции в количестве от 0,01% до 5% раствора. Добавление таких приемлемых вспомогательных веществ увеличивает стабильность и период полувыведения композиции при хранении.

Композиции можно вводить, например, посредством инъекции, включая, но не ограничиваясь этим, подкожную, интравитреальную, интрадермальную, внутривенную, внутриартериальную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию. Эксципиенты и носители для применения в изготовлении композиций для каждого типа инъекции рассматриваются в данной заявке. Следующие далее описания приведены только в качестве примера и не предполагают ограничения объема композиций. Композиции для инъекций включают, например, водные растворы (когда вещества растворимы в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Носители, подходящие для внутривенного введения, включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, СтеторЬот ЕЬ™ (ВА8Р, Рагаррапу, N.1.) или забуференный фосфатами физиологический раствор (РВ8). Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Антибактериальные и противогрибковые агенты включают, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тимеросал. В композиции могут быть включены изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит и хлорид натрия. Полученные растворы могут быть упакованы для применения в том виде, как они есть, или могут быть лиофилизированы; лиофилизированный препарат позже можно объединить со стерильным раствором перед введением. В случае внутривенной инъекции или инъекции в место поражения активный ингредиент может находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, который является апирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области способны правильно приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонические разбавители, такие как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости, могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие вспомогательные вещества. Стерильные инъекционные растворы можно приготовить путем включения активного ингредиента в необходимом количестве в соответствующий растворитель вместе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем включения активного ингредиента в стерильный разбавитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, способы приготовления представляют собой вакуумную сушку и сублимационную сушку, посредством которых получают порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрацией.

Традиционно композиции можно вводить интравитреально, подкожно или посредством интравитреального имплантата.

Традиционно композиции можно вводить внутривенно, например, посредством инъекции однократной дозы. В случае инъекции активный ингредиент может находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, который является по существу апирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Подходящие растворы можно приготовить, используя, например, изотонические разбавители, такие как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости, могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие вспомогательные вещества. Кроме того, композиции можно вводить посредством распыления в виде аэрозоля. (ЬаЬи е1 а1., АегокоП/ей АпЬ-Т-сеПКесер1от АпйЪоФек Аге ЕПссОуе адашк! Аитау ШПаттаОоп апй Нуреттеасйуйу, Ιηΐ. АтсЬ. А11едегу 1ттипе, 134: 49-55 (2004)).

В одном из воплощений композиция лиофилизирована, например, для увеличения срока годности при хранении. Если композиции рассматриваются для применения в лекарственных средствах или в любом из способов, предложенных в данной заявке, предполагается, что данная композиция может быть по существу свободна от пирогенов, таким образом, композиция не будет вызывать воспалительную реакцию или опасную аллергическую реакцию при введении пациенту-человеку. Тестирование композиций на пирогены и приготовление композиций, по существу свободных от пирогенов, хорошо известно среднему специалисту в данной области и может быть выполнено с использованием имеющихся в продаже наборов.

Приемлемые носители могут содержать соединение, которое стабилизирует композицию, увеличивает или замедляет всасывание, либо увеличивает или замедляет клиренс. Такие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны; низкомолекулярные белки; компози- 26 025367 ции, которые уменьшают клиренс или гидролиз пептидов; или эксципиенты или другие стабилизаторы и/или буферы. Агенты, которые замедляют всасывание, включают, например, моностеарат алюминия и желатин. Для стабилизации или для увеличения или уменьшения всасывания композиций также можно использовать детергенты, включая липосомные носители. Для защиты от переваривания, соединение можно подвергнуть образованию комплекса с композицией для придания ему устойчивости к кислотному и ферментативному гидролизу, или соединение можно подвергнуть образованию комплекса в соответственно устойчивом носителе, таком как липосома. Способы защиты соединений от переваривания известны в данной области (см., например, Ρίχ (1996) РЬагт. Кез. 13: 1760-1764; 8атаηеη (1996) ί. РЬагт. РЬагтасс1., 48: 119-135; и патент США № 5391377, описывающие липидные композиции для пероральной доставки терапевтических агентов).

Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые являются физиологически переносимыми и обычно не дают аллергической или подобной неблагоприятной реакции, такой как растройство желудка, головокружение и тому подобное, при введении субъекту.

Термин однократная доза, когда он используется со ссылкой на терапевтическую композицию, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве унитарной дозировки для субъектов, где каждая единица содержит заданное количество активного вещества, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым разбавителем; т.е. носителем или наполнителем.

Композиции можно вводить способом, совместимым с дозированной лекарственной формой и в терапевтически эффективном количестве. Количество, подлежащее введению, зависит от субъекта, которого лечат, способности иммунной системы субъекта утилизировать активный ингредиент и степени желаемой связывающей способности. Точные количества активного ингредиента, необходимые для введения, зависят от заключения практикующего врача, и являются индивидуальными для каждого индивидуума. Подходящие режимы для первоначального введения и бустер-инъекций также меняются, но являются типичными примерами первоначального введения с последующими повторными дозами с интервалами в один или более часов с последующей инъекцией или другим введением. Альтернативно, рассматриваются непрерывные внутривенные инфузии, достаточные для поддержания концентраций в крови.

Одно из воплощений охватывает применение композиций, описанных в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения состояния, заболевания или расстройства, описанного в данной заявке. Лекарственные средства могут быть приготовлены на основании физических характеристик пациента/субъекта, нуждающегося в таком лечении, и могут быть приготовлены в виде разовых или множественных препаратов с учетом стадии состояния, заболевания или расстройства. Лекарственные средства могут быть упакованы в подходящую упаковку с соответствующими этикетками для распределения по больницам и клиникам, где этикетка предназначена для указания лечения субъекта, имеющего заболевание, описанное в данной заявке. Лекарственные средства могут быть упакованы в виде одной или множества единиц. Инструкции относительно дозировки и введения композиций могут быть включены в упаковки, как описано ниже. Настоящая заявка направлена на лекарственные средства из химерного антитела против эндоглина, описанного в данной заявке выше, и фармацевтически приемлемого носителя. В другом воплощении настоящая заявка относится к лекарственным средствам из антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕСР, описанного в данной заявке выше, и фармацевтически приемлемого носителя. В еще одном другом воплощении настоящая заявка направлена на лекарственные средства из химерного антитела против эндоглина и антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) против УЕСР, описанных в данной заявке выше, и фармацевтически приемлемого носителя.

В одном из воплощений настоящего изобретения приготовлены композиции, свободные от пирогенов, так что они являются приемлемыми для введения пациентам-людям. Тестирование композиций на пирогены и получение композиций, свободных от пирогенов, хорошо известно среднему специалисту в данной области.

В одном из воплощений настоящего изобретения рассматривается применение любой из композиций по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения расстройства по настоящему изобретению. Лекарственные средства могут быть приготовлены, основываясь на физических характеристиках пациента/субъекта, нуждающегося в таком лечении, и могут быть приготовлены в виде одно- или многокомпонентных композиций с учетом расстройства. Лекарственные средства могут быть упакованы в подходящую упаковку с соответствующими этикетками для распределения по больницам и клиникам, при этом этикетка предназначена для указания лечения расстройства, как описано в данной заявке, у субъекта. Лекарственные средства могут быть упакованы в виде одной или множества единиц. В упаковки могут быть включены инструкции относительно дозировки и введения композиций.

ΙΙΙ. Способы применения

Согласно данному изобретению предложен способ лечения субъекта (человека или субъекта, не являющегося человеком) путем введения указанному субъекту композиции химерного антитела, которое

- 27 025367 предпочтительно связывается с эндоглином. Способы, описанные в данной заявке, также включают лечение субъекта (человека субъекта, не являющегося человеком) путем введения указанному субъекту композиции антитела против УЕОР. В некоторых случаях данные способы включают введение субъекту единой композиции, содержащей и химерное антитело против эндоглина, и антитело против УЕОР. В других случаях способы включают введение субъекту единой композиции, содержащей и химерное антитело против эндоглина, и бевацизумаб.

Эффективный ответ по настоящему изобретению достигается, если субъект испытывает частичное или полное облегчение или ослабление признаков или симптомов болезни, и конкретно включает, без ограничения, продление выживаемости. Ожидаемые периоды времени выживания без развития заболевания могут составлять от нескольких месяцев до нескольких лет в зависимости от прогностических факторов, включающих число рецидивов, стадию заболевания и другие факторы. Увеличение выживаемости включает, без ограничения, периоды времени, составляющие по меньшей мере 1 месяц (мес), примерно по меньшей мере 2 мес, примерно по меньшей мере 3 мес, примерно по меньшей мере 4 мес, примерно по меньшей мере 6 мес, примерно по меньшей мере 1 год, примерно по меньшей мере 2 года, примерно по меньшей мере 3 года, примерно по меньшей мере 4 года, примерно по меньшей мере 5 лет и т.д. Общая или выживаемость без развития заболевания также может составлять от нескольких месяцев до нескольких лет. Альтернативно, эффективный ответ может состоять в том, что симптомы у субъекта или опухолевая масса остаются неизменными и не усугубляются. Следующие указания к лечению показаний описаны более подробно ниже.

Композиции антител, описанных в данной заявке, могут быть использованы в качестве нетерапевтических агентов (например, в качестве агентов для аффинной очистки). Обычно в одном из таких воплощений представляющий интерес белок иммобилизован на твердой фазе, такой как смола ЗерЬабех или фильтровальная бумага, с использованием традиционных методов, известных в данной области. Иммобилизованный белок приводят в контакт с образцом, содержащим представляющую интерес мишень (или ее фрагмент), подлежащую очистке, и после этого носитель промывают подходящим растворителем, который будет удалять по существу весь материал в образце, за исключением белка-мишени, который связан с иммобилизованным антителом. В конце носитель промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который будет высвобождать белок-мишень. Помимо очистки, композиции могут быть использованы для детекции, диагностики и терапии заболеваний и расстройств, ассоциированных с эндоглином, УЕОР и ангиогенезом.

Термин приведение в контакт, как использовано в данной заявке, относится к добавлению раствора или композиции соединения вместе с жидкой средой, омывающей полипептиды, клетки, ткань или орган из организма. Альтернативно, приведение в контакт относится к смешиванию раствора или композиции соединения вместе с жидкостью, такой как кровь, сыворотка или плазма крови, происходящей из организма. В случае применений ш νίΐτο, композиция также может содержать другой компонент, такой как диметилсульфоксид (ИМ8О). ИМ8О облегчает поглощение соединений или растворимость соединений. Раствор, содержащий тестируемое соединение, можно добавить в среду, омывающую клетки, ткани или органы, или смешать с другой жидкостью, такой как кровь, используя аппарат для доставки, такой как устройство на основе пипетки или устройство на основе шприца. Для применений ш νίνο приведение в контакт может быть осуществлено, например, посредством введения композиции пациенту любым подходящим способом; композиции вместе с фармацевтически приемлемыми эксципиентами и носителями описаны более подробно выше.

Субъект или пациент (например, млекопитающее, такое как человек или животное, не являющееся человеком, такое как примат, грызун, корова, лошадь, свинья, овца, верблюд, лама и т.д.) может представлять собой млекопитающее, которое демонстрирует одно или более клинических признаков и/или симптомов заболевания или расстройства, описанного в данной заявке. В некоторых ситуациях субъект может не обнаруживать симптомы и все же иметь клинические проявления заболевания или расстройства. Антитело может быть конъюгировано с терапевтической группировкой или представлять собой слитый белок, содержащий терапевтическую группировку. Антитело может быть конъюгировано с детектируемой группировкой или представлять собой слитый белок, содержащий детектируемую группировку. В одном из воплощений антитело может быть конъюгировано как с терапевтической группировкой, так и с детектируемой группировкой. Антитело может быть конъюгировано или рекомбинантно сконструировано с аффинной меткой (например, меткой для очистки). Аффинные метки, такие как, например, Н156-метки, авидин и т.д., традиционно используются в данной области.

В данном изобретении предложены такие антитела или их фрагменты, которые могут быть конъюгированы или связаны с терапевтической группировкой, и/или визуализирующей или детектируемой группировкой, и/или аффинной меткой. Способы конъюгирования или связывания полипептидов хорошо известны в данной области. Ассоциации (связывание) между соединениями и метками включают любые способы, известные в данной области, включающие, но не ограничивающиеся этим, ковалентные и нековалентные взаимодействия, химическое конъюгирование, а также рекомбинантные методы.

Ангиогенез, используемый в данной заявке, включает все аспекты поддержания и развития кровеносных сосудов. Таким образом, ангиогенез включает образование новых капиллярных кровеносных

- 28 025367 сосудов (независимо от того, образуются ли они бе ηονο или из уже существующих сосудов), приводящее к неоваскуляризации, а также поддержание и контроль существующей сосудистой сети и малых кровеносных сосудов. Ангиогенез представляет собой сложный процесс, который включает серию последовательных стадий, включающих опосредованную эндотелиальными клетками деградацию сосудистой базальной мембраны и интерстициальных матриксов, миграцию эндотелиальных клеток, пролиферацию эндотелиальных клеток и образование капиллярных петель эндотелиальными клетками. Ангиогенез вовлечен в рост и/или развитие новых кровеносных сосудов (что также обозначается как неоваскуляризация), дилатацию малых сосудов, чрезмерный или пролонгированный рост сосудов и поддержание существующей сосудистой сети.

Термин ангиогенез-ассоциированное заболевание используется в данной заявке для целей описания и формулы изобретения для обозначения некоторых патологических процессов у людей, при которых ангиогенез является аномально продолжительным. Он также включает ангиогенные состояния и заболевания, такие как заболевания и состояния, которые связаны с ангиогенезом, вызваны или ассоциированы с ангиогенезом. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают различные формы рака и метастазы, дегенерацию желтого пятна, СNУ, диабетическую ретинопатию или пролиферативную витреоретинопатию. Антитела, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения ангиогенез-ассоциированного заболевания посредством связывания эндоглина и ингибирования ангиогенеза.

Термин антиангиогенная терапия используется в данной заявке для обозначения терапии, направленной на клетки и/или сосудистую сеть, экспрессирующие эндоглин (экспрессируемый на более высоких уровнях в пролиферирующей сосудистой сети по сравнению с сосудистой сетью, находящейся в состоянии покоя); он также включает в себя терапию, направленную против ангиогенеза (т.е. образования новых капиллярных кровеносных сосудов, приводящего к неоваскуляризации); терапию, направленную против ангиогенеза существующей сосудистой сети и/или чрезмерной васкуляризации или роста кровеносных сосудов; терапию, направленную против дилатации малых сосудов; и терапию, направленную на заболевание или состояние (например, сосудистую направленную терапию). Типичные заболевания или состояния, рассматриваемые в данном изобретении, включают, но не ограничиваются этим, различные формы рака и метастазы.

Термины рецидив, обострение или рецидивирующий относятся к возврату рака или заболевания после клинической оценки изчезновения заболевания. Обнаружение отдаленного метастаза или локального рецидива можно считать обострением.

Термин поддерживающая терапия относится к плановому повторному лечению, которое назначают для поддержания эффектов предшествующего лечения. Поддерживающую терапию часто назначают для того, чтобы способствовать обеспечению ремиссии рака или пролонгировать ответ на специфическую терапию вне зависимости от развития заболевания.

Термин выживаемость без развития заболевания в онкологии относится к периоду времени в процессе и после лечения, когда раковая опухоль не растет. Выживаемость без развития заболевания включает период времени, когда пациенты продемонстрировали полный ответ или частичный ответ, а также период времени, когда пациенты продемонстрировали стабильное заболевание.

В одном из аспектов согласно данному изобретению предложен способ предупреждения или лечения рака или метастаза у субъекта путем введения любой из композиций, предложенных в данной заявке, пациенту, страдающему от рака или метастаза. Такой пациент может демонстрировать или не демонстрировать симптомы заболевания.

В некоторых случаях введение композиции приводит к увеличению продолжительности жизни пациента, которого лечат, уменьшению объема опухоли, изчезновению опухоли, уменьшению клеточной пролиферации, увеличению апоптоза опухолевых клеток или их комбинации.

При необходимости, способы могут дополнительно включать хирургическое удаление рака и/или введение дополнительного противоракового агента или лечения. Противораковые агенты были предложены в данной заявке в другом месте.

В одном из аспектов симптомы у пациента, страдающего от рака, облегчаются. Облегчение может проявляться, например, в виде уменьшения боли, уменьшения размера опухоли, элиминации опухолей, предупреждения увеличения размера опухолей или развития заболевания, предупреждения образования метастаза или ингибирования метастатического роста или их комбинации.

В одном из аспектов введение композиций снижает или устраняет необходимость подвергать пациента хирургической операции или лечению с использованием одного или более чем одного дополнительного противоракового агента или лечения.

Лечение с помощью химерных антител против эндоглина и агентов против УЕОР

Согласно данному изобретению предложены способы предупреждения или лечения одного или более заболеваний или расстройств, ассоциированных с ангиогенезом/неоваскуляризацией, чрезмерной васкуляризацией, опухолевым ростом, пролиферацией опухолевых клеток или дилатацией малых сосудов, включающие введение композиции, содержащей химерное антитело против эндоглина, и композиции, содержащей антитело против УЕОР, в одно и то же время или в разные моменты времени, и посредством этого предупреждение, лечение, облегчение или ослабление заболевания или его тяжести.

- 29 025367

Согласно данному изобретению предложены способы предупреждения или лечения одного или более заболеваний или расстройств, ассоциированных с ангиогенезом/неоваскуляризацией, включающие введение комбинации композиций.

Как использовано в данной заявке, предупреждение относится к профилактике, предупреждению начала возникновения симптомов, предупреждению развития заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом или коррелирующего с активностью эндоглина. Как использовано в данной заявке, термины ингибирование, лечение и осуществление лечения используются взаимозаменяемо и относятся, например, к остановке развития симптомов, продлению выживаемости, частичному или полному облегчению симптомов и частичному или полному уничтожению опухоли или метастазов.

Композиции можно вводить пациенту в терапевтически эффективном количестве, которое эффективно для получения некоторого желаемого терапевтического эффекта путем ингибирования заболевания или расстройства при целесообразном соотношении польза/риск, подходящем для любого терапевтического лечения. Для введения композиций по настоящему изобретению пациентам-людям эти композиции могут быть приготовлены согласно методологии, известной специалисту в данной области. Терапевтически эффективное количество представляет собой количество, с помощью которого достигается, по меньшей мере частично, желаемый терапевтический или профилактический эффект в органе или ткани. Количество химерного антитела против эндоглина или антитела против УЕОР, необходимое для обеспечения предупреждения и/или терапевтического лечения заболевания или расстройства, не является фиксированным рег ке. Количество вводимого антитела может варьировать в зависимости от типа заболевания, распространения заболевания и размера млекопитающего, страдающего от данного заболевания или расстройства. В одном из воплощений два антитела, описанные в данной заявке, вводят пациенту в комбинации, как описано выше. Введение в комбинации может относиться к введению в единой композиции или в раздельных композициях.

Введение относится в данной заявке к предоставлению одной или более композиций пациенту способом, который приводит к поступлению композиции внутрь организма пациента. Такое введение может быть осуществлено любым путем, включающим, без ограничения, локальный, местный или системный посредством подкожного, интравитреального, интрадермального, внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного или внутримышечного введения (например, посредством инъекции).

Действительные уровни дозировок активных ингредиентов в композициях можно варьировать для того, чтобы получить то количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировок будет зависеть от множества факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретной применяемой композицией, возраст, пол, массу, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни пациента, которого лечат, и тому подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

Антитела, описанные в данной заявке, можно вводить субъекту в различных дозовых количествах и в течение различных временных интервалов. Неограничивающие дозы включают примерно 0,01 мг/кг, примерно 0,05 мг/кг, примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 30 мг/кг или любое целое число между ними. Кроме того, дозу(ы) антитела можно вводить два раза в неделю, один раз в неделю, каждые две недели, каждые три недели, каждые 4 недели, каждые 6 недель, каждые 8 недель, каждые 12 недель или любую комбинацию недель среди них. Также рассматриваются такие циклы ведения, как, например, введение антител один или два раза в неделю в течение 2, 3, 4, 5 или 6 недель, с последующими 1, 2, 3, 4, 5 или 6 неделями без терапии. Альтернативно, в зависимости от ответа субъекта на терапию, период повторения цикла между лечениями может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. Дополнительные циклы введения, включающие, например, различные комбинации доз и еженедельных циклов, описанных в данной заявке, также рассматриваются в пределах данного изобретения.

Приведение в контакт определяют в данной заявке как способ приведения композиции, предложенной в данной заявке, в состояние физической близости с клеткой, органом, тканью или жидкостью, как описано в данной заявке. Приведение в контакт охватывает системное или локальное введение любой из композиций, предложенных в данной заявке, и включает, без ограничения, процедуры и способы ίη νίΐΓο, ίη νίνο и/или ех νίνο. Термины объединение и приведение в контакт используются в данной заявке взаимозаменяемо и подразумевают их определение аналогичным образом.

Врач или ветеринар может легко определить и назначить эффективное количество (ЕБ₅₀) необходимой композиции. Например, врач или ветеринар мог бы начать с доз соединений, используемых в композиции, на более низких уровнях, чем те, которые требуются для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эффект. Альтернативно, дозу можно оставить неизменной.

Композиции можно вводить пациенту любым удобным путем, как описано выше. Независимо от выбранного пути введения, соединения по настоящему изобретению, которые могут быть использованы

- 30 025367 в подходящей гидратированной форме, и/или композиции готовят в приемлемых лекарственных формах, таких как описано ниже, или другими традиционными способами, известными специалистам в данной области.

Токсичность и терапевтическая эффективность соединений могут быть определены стандартными процедурами в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, для определения ЬИ₅₀ (доза, летальная для 50% популяции) и ЕИ₅₀ (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами называется терапевтическим индексом, и его можно выразить в виде соотношения РИ₅₀/ЕИ₅₀. Поскольку могут быть использованы соединения, которые демонстрируют токсичные побочные эффекты, при конструировании системы доставки, которая нацеливает такие соединения на участок пораженной ткани, следует позаботиться о том, чтобы минимизировать возможное повреждение здоровых клеток и, таким образом, уменьшить побочные эффекты.

Данные, полученные из анализов клеточных культур и/или исследований на животных, могут быть использованы в определении диапазона дозировки для применения у людей. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ЕИ₅₀ с незначительной токсичностью или с отсутствием токсичности. Дозировка может варьироваться в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения терапевтически эффективную дозу можно определить первоначально на основании анализов клеточных культур. В животных моделях может быть определена доза для достижения диапазона концентраций, циркулирующих в плазме крови, который включает 1С₅₀ (т.е. концентрацию тестируемого соединения, которая вызывает полумаксимальное ингибирование), как определено в клеточной культуре. Уровни в плазме крови могут быть измерены, например, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии. Такая информация может быть использована для более точного определения доз, полезных для людей. Композиции, содержащие комбинации соединений, также можно оценить, используя эти способы.

В одном из воплощений изобретение охватывает ингибирование ангиогенеза в ткани. Степень ангиогенеза в ткани и, следовательно, степень достигаемого ингибирования можно оценить различными способами, такими как способы, описанные в данной заявке.

Уникальная специфичность антител, которые распознают (например, предпочтительно связывают) эндоглин или УЕОР и ингибируют ангиогенез, обеспечивает диагностические и терапевтические применения в отношении заболеваний, характеризующихся ангиогенезом (неоваскуляризацией), дилатацией малых сосудов, чрезмерной васкуляризацией, пролиферацией опухолевых клеток и/или опухолевым ростом. Антитела можно вводить субъекту, страдающему от различных форм рака (первичных опухолей и метастазов).

Следует понимать, что помимо введения описанных в данной заявке композиций, в данной заявке предполагается, что субъекта также можно лечить одним или более чем одним дополнительным ингибитором ангиогенеза.

Термин ингибитор ангиогенеза используют в данной заявке, для целей описания и формулы изобретения, для обозначения соединения или молекулы, включающих, но не ограничивающихся этим, пептиды, белки, ферменты, полисахариды, олигонуклеотиды, ДНК, РНК, рекомбинантные векторы и лекарственные средства, функция которых заключается в ингибировании ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза известны в данной области, и все типы рассматриваются в данной заявке. Неограничивающие примеры соединений и молекул включают природные и синтетические биомолекулы, такие как паклитаксел, О-(хлорацетил-карбамоил)-фумагиллол (ΊΝΡ-470 или АОМ 1470), тромбоспондин-1, тромбоспондин-2, ангиостатин, ингибитор ангиогенеза из хондроцитов человека (ЬСН1АМР), ангиогенный ингибитор из хряща, фактор-4 тромбоцитов, дго-бета, интерферон-индуцибельный белок 10 (ΙΡ10) человека, интерлейкин-12, Κο318220, трициклодекан-9-ил-ксантат (Ό609), ирсогладин, 8,9-дигидрокси-7-метилбензо[Ь]-хинолизиния бромид (ОРА 1734), медрокси-прогестерон, комбинацию гепарина и кортизона, ингибиторы глюкозидазы, генистеин, талидомид, диамино-антрахинон, гербимицин, урсоловую кислоту и олеанолевую кислоту. Неограничивающие примеры антител включают антитела, направленные против таких молекул, как УЕОР, рецептор УЕОР или различные эпитопы эндоглина. Кроме того, известны и рассматриваются в данной заявке низкомолекулярные ингибиторы рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают ранибизумаб (ЬисепИк), афлиберцепт (УЕОР-Тгар), сунитиниб (§и1еп1)„ сорафениб (№хауаг), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.

В одном неограничивающем воплощении ингибитором рецептора УЕОР является ранибизумаб. Типичные дозировки для глаз для ранибизумаба включают примерно 0,5 мг, вводимых интравитреально ежемесячно. В одном неограничивающем воплощении ингибитором рецептора УЕОР является УЕОРТгар. Типичные дозировки для УЕОР-Тгар включают от примерно 0,5 до примерно 10 мг/кг, вводимых каждые 2 или 3 недели. Типичные дозировки для глаз для УЕОР-Тгар включают от примерно 0,5 до примерно 2,0 мг, вводимых интравитреально ежемесячно или ежеквартально.

В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора УЕОР является сунитиниб. Типичные режимы для сунитиниба включают примерно 50 мг, вводимых в течение 4 недель, затем в тече- 31 025367 ние 2 недель без лекарственного средства. Схемы лечения можно повторять, основываясь на циклической или ациклической схеме.

В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора νΕΟΡ является сорафениб. Типичные дозировки для сорафениба включают примерно 400 мг, вводимых один раз в сутки.

В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора νΕΟΡ является акситиниб. Типичные дозировки для акситиниба включают примерно 3, примерно 5 или примерно 10 мг, вводимых два раза в сутки.

В другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора νΕΟΡ является пегаптаниб. Типичные дозировки для пегаптаниба включают от примерно 0,3 до примерно 3 мг, вводимых интравитреально каждые 6 недель.

В еще одном другом неограничивающем воплощении ингибитором рецептора νΕΟΡ является пазопаниб. Типичные дозировки для пазопаниба включают от примерно 200 до примерно 1000 мг, вводимых один раз в сутки.

Многочисленные комбинации этих ингибиторов рецептора νΕΟΡ можно вводить вместе с композициями, описанными в данной заявке. В одном из воплощений комбинации могут приводить к применению более низких доз для описанных антител или связывания антигена. Такие изменения в дозировке могут быть результатом синергических эффектов комбинаций антител.

Рак ί'.Ό105 ассоциирован с опухолевым ангиогенезом и сильно активируется в эндотелии различных опухолевых тканей по сравнению с эндотелием в нормальных тканях. ί'.Ό105 активируется в широком диапазоне опухолевых эндотелиальных клеток. Кроме того, наблюдается более сильная экспрессия ί'.Ό105 в эндотелии опухоли, чем соответствующих нормальных тканях. Таким образом, ингибирование ангиогенеза химерными антителами против эндоглина представляет собой способ лечения раковых опухолей. Композиции, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения раковых опухолей и метастазов. Данные композиции также могут быть использованы в изготовлении лекарственных средств для лечения раковых опухолей и метастазов.

νΕΟΡ представляет собой одну из мишеней для противоопухолевых терапий, поскольку его экспрессия активируется в ряде солидных опухолей. νΕΟΡ представляет собой главный регулятор ангиогенеза, роста новых сосудов из уже существующих сосудов. Этот процесс является фундаментальным для роста солидных опухолей, который зависит от образования новых кровеносных сосудов. Некоторые низкомолекулярные терапевтические агенты способны направленно воздействовать на рецептор фактора роста сосудистого эндотелия (νΕΟΡΚ); такое направленное воздействие низкомолекулярными терапевтическими средствами может оказывать противораковые эффекты. Агенты, нацеленные на рецептор νΕΟΡ, непосредственно блокируют опухолевый рост путем ингибирования образования новых сосудов. Ингибирование νΕΟΡ-индуцированного ангиогенеза может демонстрировать противоопухолевый или улучшенный противоопухолевый эффект без значительного ингибирования νΕΟΡ-стимуляции макрофагов, остеокластов или хондрокластов.

Термин опухоль используется в данной заявке для обозначения раковой ткани, экспрессирующей эндоглин и/или νΕΟΡ (по сравнению с экспрессией нормальной тканью того же типа). Опухоли могут включать солидные опухоли и полусолидные опухоли. Неограничивающие примеры опухолей включают лейкозы человека, в том числе не-Т-клеточный (не-Т) острый лимфобластный лейкоз (ЛЬЬ), миеломоноцитарный лейкоз; и солидные и полусолидные опухоли человека, вместе с окружающей их сосудистой сетью, экспрессирующей эндоглин на уровнях от средних до высоких (по сравнению с экспрессией нормальной тканью того же типа), включая ангиосаркому, рак молочной железы, рак желудка, рак толстой кишки, лимфому Ходжкина, лимфому, мультиформную глиобластому (ΟΒΜ), рак легких, меланому, миелому, лимфому, остеосаркому, рак яичников, опухоль околоушной железы, фарингеальную карциному, рак предстательной железы, гепатоцеллюлярную карциному, карциному почки и карциному ректосигмоидного отдела.

Раковая ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, эндотелиальную ткань, экспрессирующую аномальный уровень эндоглина и/или νΕΟΡ.

В отсутствие неоваскуляризации опухолевой ткани, эта опухолевая ткань не получает необходимых питательных веществ, рост ее замедляется, прекращается дополнительное рост, происходит регрессия, и она в конце становится некротической, что приводит к уничтожению опухоли. Согласно данному изобретению предложены способы ингибирования неоваскуляризации опухоли путем ингибирования опухолевого ангиогенеза. Аналогично, согласно данному изобретению предложены способы ингибирования опухолевого роста.

Данные способы также особенно эффективны против образования метастазов, поскольку их образование требует васкуляризации первичной опухоли, чтобы метастазирующие раковые клетки могли покинуть первичную опухоль, и их закрепление во вторичном месте требует васкуляризации для поддержания роста метастазов.

Следует понимать, что субъект, страдающий от рака/метастаза по изобретению может экспрессировать мутантный белок (опухолеассоциированный антиген) или мутантный ген и все еще не демонстри- 32 025367 ровать симптомы данного заболевания. В одном неограничивающем примере рака толстой кишки (который ассоциируется с мутантным белком К-гак) субъект с мутантным белком К-гак в некоторых клетках толстой кишки представляет собой субъекта, подлежащего лечению, даже если этот субъект может все еще не иметь симптомов рака толстой кишки. Признаки или симптомы болезни представляют собой клинически идентифицированные проявления или признаки заболевания.

Под лечением субъекта, страдающего от опухоли или метастаза, подразумевают, что симптомы у субъекта частично снимаются, полностью снимаются или остаются неизменными после лечения. Пациент, который был подвергнут лечению, может демонстрировать частичное или полное уменьшение опухолевой нагрузки. Подразумевают, что это охватывает профилактику, лечение и излечение. В одном неограничивающем примере лечат субъекта, страдающего от высокометастатического рака (например, рака молочной железы), при этом дополнительные метастазы либо не возникают, либо количество их уменьшено по сравнению с субъектом, который не получает лечения. В другом неограничивающем примере лечат субъекта, у которого солидная раковая опухоль либо уменьшается в размере, либо не увеличивается в размере по сравнению с субъектом, который не получает лечения. В еще одном другом неограничивающем примере количество раковых клеток у субъекта, которого лечат, либо не увеличивается, либо уменьшается по сравнению с количеством раковых клеток у субъекта, который не получает лечения. Улучшение также может быть определено, например, как пониженная клеточная пролиферация, сниженные количества клеток, повышенный апоптоз и/или увеличенная выживаемость субъекта, которого лечат.

Кроме того, как использовано в данной заявке, лечение рака включает остановку развития, частичную или полную элиминацию злокачественного роста или опухоли. Лечение или частичная элиминация включает, например, кратное уменьшение роста или размера и/или объема опухоли, например, примерно в 2 раза, примерно в 3 раза, примерно в 4 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 20 раз, примерно в 50 раз или любое промежуточное кратное уменьшение. Аналогично, лечение или частичная элиминация может включать процентное уменьшение роста или размера и/или объема опухоли, составляющее примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или любое промежуточное процентное уменьшение.

Опухоль или рак, которые лечат в способах, описанных в данной заявке, включают, но не ограничиваются этим, рак легкого, гинекологические злокачественные опухоли, меланому, рак молочной железы, рак головного мозга (например, мультиформную глиобластому, ОВМ или глиому), рак поджелудочной железы, рак яичников, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак головы, рак печени (гепатоцеллюлярный рак), рак шеи, рак почки (почечноклеточный рак), рак полового члена, рак желудка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, саркому, карциному, миелому и лимфому. В одном из воплощений опухоль, подлежащая лечению, представляет собой солидную или полусолидную опухоль. В другом воплощении опухоль, подлежащая лечению, представляет собой первичную опухоль. В другом воплощении опухоль, подлежащая лечению, представляет собой метастатическую опухоль. В одном из воплощений опухоль или рак, которые лечат, имеют эпителиальное происхождение. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой миелому. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой рак яичников. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой рак почки/почечноклеточный рак. В еще одном другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой гепатоцеллюлярный рак/рак печени.

Рак легкого

В одном из аспектов согласно данному изобретению предложен способ лечения рака легкого. Наиболее распространенным типом рака легкого является немелкоклеточный рак легкого (Ы§СЬС), который составляет приблизительно 80-85% случаев рака легкого и подразделяется на плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы и крупноклеточные недифференцированные карциномы. Мелкоклеточный рак легкого составляет 15-20% случаев рака легкого.

Стадирование рака легкого представляет собой оценку степени распространения рака из его первоначального источника. Это является важным фактором, влияющим на прогноз и возможное лечение рака легкого. Немелкоклеточную карциному легкого классифицируют на стадии от ΙΑ (первая А; наиболее благоприятный прогноз) до IV (четвертая; наиболее неблагоприятный прогноз). Мелкоклеточную карциному легкого классифицируют как локализованную стадию, если она ограничивается одной половиной грудной клетки и находится в области одного радиотерапевтического поля; в противном случае, ее относят к распространенной стадии.

Стадии немелкоклеточного рака легкого можно определить, используя ЕИ8 (эндоскопическое ультразвуковое исследование) или сканирование посредством СТ (компьютерная томография) либо МЫ (магнитно-резонансная визуализация), или при хирургической операции для классификации степени заболевания согласно системе ΤΝΜ. Эти субъекты подвергаются процедуре стадирования, являющейся частью процесса анализа прогноза и лечения. А1СС (Американский объединенный комитет по изучению рака) рекомендует ΤΝΜ-стадирование с последующей классификацией по группам.

Первичная опухоль (Т): ТХ: первичную опухоль невозможно определить, или имеются злокачественные клетки в мокроте или бронхоальвеолярном лаваже, но это не видно при визуализации или брон- 33 025367 хоскопии; Τίκ: карцинома ш κίΐιι. Т0: нет признаков первичной опухоли. Т1: опухоль имеет размер менее 3 см в наибольшем измерении, окружена легким или висцеральной плеврой и без бронхоскопической инвазии в главный бронх. Т2: опухоль характеризуется любым из следующего: размер более 3 см в наибольшем измерении; распространение в главный бронх (но не ближе 2 см от киля (трахеи)) и обструктивный пневмонит (но не затрагивающий все легкое). Т3: опухоль характеризуется любым из следующего: инвазия на грудную стенку, диафрагму, средостенную плевру или париетальный перикард; распространение в главный бронх не доходя 2 см до киля, но не затрагивая киль; и обструктивный пневмонит всего легкого. Т4: опухоль характеризуется любым из следующего: инвазия в средостение, сердце, крупные сосуды, трахею, пищевод, позвоночник или киль; отдельные опухолевые узлы в той же доле; и злокачественный плевральный выпот. Лимфоузлы (Ν): ΝΧ: лимфоузлы определить невозможно; ΝΟ: лимфоузлы не задеты; Ν1: метастаз в ипсилатеральные перибронхиальные или ипсилатералыные лимфоузлы корня (легкого); Ν2: метастаз в ипсилатералыные средостенные или трахеобронхиалыные лимфоузлы; и Ν3: метастаз в любые из: ипсилатералыные надключичные лимфоузлы; ипсилатеральные лестничные лимфоузлы; и контралатеральные лимфоузлы. Отдаленный метастаз (М): МХ: отдаленный метастаз определить невозможно; МО: отдаленного метастаза не выявлено; и М1: отдаленный метастаз присутствует.

Рак матки/гинекологические злокачественные опухоли

Рак матки может относиться к любому из нескольких различных типов рака, которые встречаются в матке, а именно: саркомы матки (например, саркомы миометрия или мышечной оболочки матки представляют собой наиболее распространенные лейомиосаркомы), эндометриальный рак и рак шейки матки.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака эндометрия. Эндометриальный рак представляет собой рак, который начинается в эндометрии, внутренней выстилке матки. Некоторые из примеров рака матки и эндометрия включают, но не ограничиваются этим, аденокарциномы, аденоакантомы, плоскоклеточные аденокарциномы, папиллярные серозные аденокарциномы, светлоклеточные аденокарциномы, саркомы матки, стромальные саркомы, злокачественные смешанные мезодермальные опухоли и лейомиосаркомы.

В другом аспекте, используя данный способ, лечат рак шейки матки, предпочтительно аденокарциному эпителия шейки матки. Существуют два основных типа этого рака: плоскоклеточная карцинома и аденокарциномы. Первая составляет примерно 80-90% всех случаев рака шейки матки и развивается там, где соединяются есЮсетх (область, примыкающая к влагалищу) и епйосегззх (слизистая оболочка канала шейки матки) (область, примыкающая к матке). Последние развиваются в продуцирующих слизь железистых клетках епйосегззх. Некоторые случаи рака шейки матки имеют характеристики обоих из них и называются плоскоклеточными аденокарциномами или смешанными карциномами.

Рак яичников

В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака яичников, включая эпителиальные опухоли яичников.

Рак яичников классифицируют в соответствии с гистологией опухоли, полученной в отчете о результатах гистологического исследования. Поверхностная эпителиально-стромальная опухоль, также известная как эпителиальная карцинома яичников, представляет собой наиболее типичный вид рака яичников. Она включает серозную опухоль, эндометриоидную опухоль и муцинозную цистаденокарциному. Опухоль стромы полового тяжа, включая эстроген-продуцирующую зернистоклеточную опухоль и вирилизирующую опухоль из клеток Сертоли-Лейдига или арренобластому, составляет 8% случаев рака яичников. Опухоль из зародышевых клеток составляет приблизительно 30% случаев опухолей яичников, но только 5% случаев рака яичников, поскольку большинство опухолей из зародышевых клеток представляют собой тератомы, а большинство тератом являются доброкачественными. Склонность к возникновению опухоли из зародышевых клеток наблюдается у молодых женщин и девочек. Прогноз зависит от конкретных результатов гистологии опухоли из зародышевых клеток, но в общем является благоприятным. Смешанные опухоли содержат элементы более чем одного из приведенных выше классов гистологии опухолей.

Рак яичников также может представлять собой вторичный рак, результат метастаза из первичного рака, находящегося в другом месте в организме. Распространенными видами первичного рака являются рак молочной железы и рак желудочно-кишечного тракта (в этом случае рак яичников представляет собой рак Крукенберга). Поверхностная эпителиально-стромальная опухоль может возникать в брюшине (выстилке брюшной полости), в этом случае рак яичников является вторичным по отношению к первичному перитонеальному раку, но лечение в основном является таким же, как и для первичной поверхностной эпителиально-стромальной опухоли, вовлекающей брюшину.

Стадирование рака яичников осуществляют с использованием системы классификации стадий заболевания Р1ОО (Международная федерация акушеров и гинекологов) и используют информацию, полученную после хирургической операции, которая может включать полную абдоминальную гистерэктомию, удаление обоих яичников и обеих маточных труб, промывания сальника и таза (брюшины) для цитологического исследования. Стадия согласно А1СС представляет собой ту же стадию, что и стадия согласно Р1ОО.

- 34 025367

Стадия I относится к раку яичников, ограниченному одним или двумя яичниками: 1А - поражен один яичник; капсула интактна; опухоли на поверхности яичника нет; злокачественных клеток в асцитах или водах после промывания брюшины нет; 1В - поражены оба яичника; капсула интактна; опухоли на поверхности яичников нет; отрицательный ответ в промывных водах; и 1С - опухоль ограничена яичниками, плюс любое из следующего: капсула перфорирована, опухоль на поверхности яичников, положительный ответ в промывных водах.

Стадия II относится к распространению или внедрению в область таза: НА - распространение или внедрение в матку или маточную трубу; отрицательный ответ в промывных водах; 11В - распространение или внедрение в другие структуры таза; отрицательный ответ в промывных водах; и 11С распространение или внедрение в отделы таза с положительным ответом в водах после промывания брюшины.

Стадия III относится к микроскопическим внедрениям в брюшину за пределами таза; или ограничивается тазом с распространением в тонкий кишечник или сальник: ША - микроскопические перитонеальные метастазы за пределами таза; ШВ - макроскопические перитонеальные метастазы за пределами таза размером менее 2 см; и ШС - перитонеальные метастазы за пределами таза размером более 2 см или метастазы в лимфоузлы.

Стадия ТУ относится к отдаленным метастазам в печень или за пределами брюшной полости.

Метастазы парааортального лимфоузла считаются регионарными лимфоузлами (Стадия ШС).

В некоторых воплощениях способами, описанными в данной заявке, лечат рак яичников, выбранный из следующего: аденокарцинома яичника и аденокарцинома, которая мигрировала из яичника в брюшную полость.

Меланома

Меланома представляет собой злокачественную опухоль меланоцитов, которая преимущественно обнаруживается в коже, а также в кишечнике и в глазу (увеальная меланома). Это один из редко встречающихся типов рака кожи, однако вызывает большинство смертей, связанных с раком кожи. Злокачественная меланома является тяжелой формой рака кожи, вызываемой неконтролируемым ростом пигментных клеток, называемых меланоцитами. Меланомы также включают, но не ограничиваются этим, хориоидальную меланому, злокачественные меланомы, меланомы кожи и внутриглазные меланомы.

Меланому можно разделить на следующие типы: злокачественное лентиго, меланома типа злокачественного лентиго, поверхностно распространяющаяся меланома, акральная лентигинозная меланома, меланома слизистых оболочек, узловая меланома, полипоидная меланома, десмопластическая меланома, амеланотическая меланома, меланома мягких тканей и увеальная меланома. Стадии меланомы приведены ниже.

Стадия 0 - меланома ίη κίΐιι (уровень по Кларку I).

Стадия 1/11 - инвазивная меланома: Т1а: первичная менее 1,00 мм, без изъязвления, уровень по Кларку П-Ш; Т1Ь: первичная менее 1,00 мм, с изъязвлением, или уровень по Кларку ГУ-У; и Т2а: первичная 1,00-2,00 мм, без изъязвления.

Стадия II - высокий риск развития меланомы: Т2Ь: первичная 1,00-2,00 мм, с изъязвлением; Т3а: первичная 2,00-4,00 мм, без изъязвления; Т3Ь: первичная 2,00-4,00 мм, с изъязвлением; Т4а: первичная 4,00 мм или более, без изъязвления; и Т4Ь: первичная 4,00 мм или более, с изъязвлением.

Стадия III - регионарный метастаз: N1: один положительный лимфоузел; N2: 2-3 положительных лимфоузла или регионарный метастаз в кожу/транзитный метастаз; и N3: 4 положительных лимфоузла или лимфоузел и регионарные метастазы в кожу/транзитные метастазы.

Стадия Ш - отдаленный метастаз: М1а: отдаленный метастаз в кожу, нормальный уровень БОН (лактатдегидрогеназы); М1Ь: метастаз в легкие, нормальный уровень БОН; и М1с: другой отдаленный метастаз или любой отдаленный метастаз с повышенным уровнем БОН.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат меланому.

Рак толстой кишки и колоректальный рак

Колоректальный рак (также называемый раком толстой кишки или раком толстого кишечника) включает раковые опухоли в толстой кишке, прямой кишке (анусе) и аппендиксе. С учетом 655000 случаев смерти во всем мире за год, он является третьей наиболее распространенной формой рака и второй основной причиной смерти, связанной с раком, в западном мире. Полагают, что многие случаи колоректального рака возникают из аденоматозных полипов в толстой кишке. Эти грибоподобные опухоли обычно бывают доброкачественными, но некоторые из них со временем могут развиваться в раковые.

В другом воплощении для классификации колоректального рака можно использовать классификацию Дьюкса, основанную на стадиях А-Ό. Стадия А относится к колоректальному раку, который ограничивается слизистой оболочкой (т.е. не проникает через стенку кишечника). Стадия В1 относится к прорастанию в мышечную оболочку, но не к прохождению сквозь нее (т.е. лимфоузлы не поражены); в то время как рак на стадии В2 уже проник через мышечную оболочку, но не прошел сквозь нее (т.е. лимфоузлы не поражены). Стадия С1 относится к раку, который прорастает в мышечную оболочку, но не проходит сквозь нее (т.е. лимфоузлы поражены); в то время как стадия С2 относится к раку, который прорастает в мышечную оболочку и проходит сквозь нее (т.е. лимфоузлы поражены). Стадия Ό относится к

- 35 025367 отдаленному метастатическому распространению. Кроме того, для стадирования колоректального рака можно использовать систему ΤΝΜ согласно традиционным способам, известным в данной области.

Рак молочной железы

Существует несколько типов рака молочной железы, которые можно лечить способами, описанными в данной заявке. Дольковая карцинома ίη κίίυ и протоковая карцинома ίη κίΐυ представляют собой рак молочной железы, который развивается в дольках и протоках, соответственно, но не распространяется в жировую ткань, окружающую молочную железу, или в другие части организма. Инфильтрирующие (или инвазивные) дольковая и протоковая карцинома представляют собой рак, который развивается в дольках и протоках, соответственно, и распространяется или в жировую ткань молочной железы и/или в другие части организма. В одном из аспектов согласно данному изобретению предложен способ лечения рака молочной железы, такого как протоковая карцинома в ткани протоков молочной железы, рак молочной железы, который представляет собой Нег2- и/или ЕВ(рецептор эстрогена)-, и/или РВ(рецептор прогестерона)-. Другие виды рака молочной железы, для которых лечение с помощью данных способов будет полезным, представляют собой медуллярные карциномы, коллоидные карциномы, тубулярные карциномы и воспалительный рак молочной железы.

В одном из воплощений стадирование рака молочной железы осуществляют согласно системе ΤΝΜ. Прогноз тесно связан с результатами стадирования, и стадирование также используется для распределения пациентов для лечений как в клинических испытаниях, так и в клинической практике.

Кратко, информация по стадированию приведена ниже. ТХ: первичная опухоль не может быть измерена. Т0: опухоли не определяется. Τίκ: карцинома ίη κίΐυ, без инвазии; Т1: опухоль не более 2 см; Т2: опухоль более 2 см, но не более 5 см; Т3: опухоль более 5 см; Т4: опухоль любого размера, прорастающая в грудную стенку или кожу, либо воспалительный рак молочной железы. ΝΧ: состояние ближних лимфоузлов невозможно оценить. Ν0: рак не распространен на регионарные лимфоузлы. Ν1: рак распространился на 1-3 подмышечных или один внутренний лимфоузел молочной железы. Ν2: рак распространился на 4-9 подмышечных лимфоузлов или многочисленные внутренние лимфоузлы молочной железы. Ν3: относится к одному из следующего: рак распространился на 10 или более подмышечных лимфоузлов, или рак распространился на подключичные лимфоузлы (ключица), или рак распространился на надключичные лимфоузлы, или рак вовлекает подмышечные лимфоузлы и распространился на внутренние лимфоузлы молочной железы, или рак вовлекает 4 или более подмышечных лимфоузлов, и обнаруживается маленький метастаз во внутренних лимфоузлах молочной железы по данным биопсии сторожевого лимфоузла. ΜΧ: наличие отдаленного поражения (метастаза) невозможно определить. М0: отдаленное поражение отсутствует. М1: обнаружено поражение в отдаленных органах (не включая надключичного лимфоузла).

Рак поджелудочной железы

В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака поджелудочной железы, выбранного из следующего: эпителиоидной карциномы в ткани протока поджелудочной железы и аденокарциномы в протоке поджелудочной железы. Самым распространенным типом рака поджелудочной железы является аденокарцинома, встречающаяся в выстилке протока поджелудочной железы.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак поджелудочной железы.

Рак предстательной железы

В одном из других аспектов согласно данному изобретению предложен способ лечения рака предстательной железы, выбранного из следующего: аденокарциномы или аденокарциномы, которая мигрировала в кость. Рак предстательной железы развивается в предстательной железе у мужчин, которая окружает первую часть уретры. В предстательной железе имеется несколько типов клеток, однако 99% опухолей составляют аденокарциномы, которые развиваются в железистых клетках, отвечающих за образование семенной жидкости.

Существуют две схемы, обычно используемые для стадирования рака предстательной железы. Самой распространенной является система ΤΝΜ, с помощью которой оценивают размер опухоли, степень вовлечения лимфоузлов и любой метастаз (отдаленное поражение). Так же как и многие другие виды рака, их часто классифицируют согласно четырем стадиям (Ι-Ιν). Другой схемой, используемой не так часто, является стадирование по Уитмору-Джуитту (\У1й1тоге-.1е\уеи).

Кратко, стадия Ι заболевания представляет собой рак, который обнаруживается случайно в небольшом участке образца, когда ткань предстательной железы была удалена по другим причинам, таким как доброкачественная гипертрофия предстательной железы, и клетки очень напоминают нормальные клетки, и железа пальпируется как нормальная при обследовании с помощью пальца руки. На стадии ΙΙ уже вовлечена более значительная часть предстательной железы, и может пальпироваться уплотнение внутри железы. На стадии ΙΙΙ опухоль распространена по всей капсуле предстательной железы, и уплотнение может пальпироваться на поверхности железы. На стадии Ιν заболевания опухоль инвазирует ближние структуры или распространяется в лимфоузлы или другие органы. Определение стадии основано на клеточном содержимом и архитектуре ткани после биопсии (Глисон), что обеспечивает оценку деструктивного потенциала и окончательный прогноз заболевания.

- 36 025367

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак предстательной железы.

Рак головы и шеи

Виды рака головы и шеи (например, рака полости рта, рака гортани, рака носоглотки, рака пищевода и т.д.) относятся к группе биологически сходных видов рака, происходящих из верхних отделов дыхательного и пищеварительного тракта, включая губу, ротовую полость (рот), носовую полость, околоносовые пазухи, глотку и гортань. Большинство видов рака головы и шеи представляют собой плоскоклеточные карциномы, происходящие из слизистой выстилки (эпителия) этих областей тела. Рак головы и шеи часто поражает лимфоузлы шеи, и зачастую это является первым (а иногда единственным) проявлением заболевания в момент диагностики. Рак головы и шеи строго ассоциирован с некоторыми факторами внешней среды и факторами риска, обусловленными образом жизни, включая табакокурение, употребление спиртных напитков и некоторые штаммы передаваемого половым путем папилломавируса человека. Тактика лечения пациентов с диагнозом рака головы и шеи остается задачей высокой сложности. Используя соединения, описанные в данной заявке, можно лечить такие виды рака, как рак гортаноглотки, рак гортани, рак носоглотки, рак ротоглотки.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак головы или шеи.

Рак почек

В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения рака почек. Рак почек (также называемый почечноклеточным раком, почечноклеточной карциномой, почечной аденокарциномой и гипернефромой) представляет собой заболевание, при котором злокачественные клетки обнаруживаются в выстилке канальцев в почке. Почечноклеточная карцинома представляет собой наиболее распространенную форму рака почек, возникающего из проксимального почечного канальца. Она является самым распространенным типом рака почек у взрослых, отвечая приблизительно за 80% случаев.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак почек.

Рак печени

В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ лечения первичного рака печени (рака, который начинается в печени). Первичный рак печени может встречаться как у взрослых, так и у детей. Рак печени характеризуется наличием злокачественных опухолей печени - опухолей или новообразований на поверхности или внутри печени. Они могут быть обнаружены при медицинской визуализации (даже по другой причине, чем сам рак) или могут присутствовать у пациентов в виде абдоминальной опухоли, абдоминальной боли, желтухи или некоторой другой дисфункции печени. Существует несколько типов рака печени.

Гемангиомы: они представляют собой самый распространенный тип доброкачественной опухоли печени. Они возникают в кровеносных сосудах. Большинство этих опухолей не вызывают симптомов, необходимости в их лечении нет. Некоторые могут кровоточить и нуждаться в удалении, если их состояние характеризуется от умеренного до тяжелого.

Гепатоаденомы: эти доброкачественные эпителиальные опухоли печени развиваются в печени. В большинстве случаев они локализованы в правой доле печени и часто являются одиночными. Размер аденом варьируется в диапазоне от 1 до 30 см. Все симптомы, ассоциированные с гепатоаденомами, связаны с обширными поражениями, которые могут вызывать сильную абдоминальную боль.

Фокальная нодулярная гиперплазия: фокальная нодулярная гиперплазия (ΡΝΗ) представляет собой вторую наиболее распространенную опухоль печени. Эта опухоль является результатом реакции гепатоцитов на артериовенозный врожденный порок. Этот процесс представляет собой процесс, при котором присутствуют все нормальные составные части печени, но конфигурация, в которой они представлены, является аномальной. Даже если эти состояния имеют место, печень все же считается функционирующей в пределах нормы.

Гепатоцеллюлярный рак: гепатоцеллюлярный рак (НСС) представляет собой наиболее распространенный рак печени. Он ассоциирован со злоупотреблением алкоголя и инфекцией гепатита В и особенно преобладает в Азии. Большинство случаев НСС детектируется в тот момент времени, когда лечение путем хирургического удаления является невозможным; системное лечение неоперабельного НСС связано с выживаемостью в течение менее одного года.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак печени.

Лимфома

Лимфома представляет собой тип рака, который возникает в лимфоцитах иммунной системы. Они часто происходят из лимфоузлов, присутствуя в виде разрастания узла (опухоли). Лимфомы находятся в близком родстве с лимфоидными лейкозами, которые также происходят из лимфоцитов, но обычно вовлекают только циркулирующую кровь и костный мозг (где клетки крови образуются в процессе, названном гематопоэзом) и, как правило, не образуют опухоли. Существует много типов лимфом, и, в свою очередь, лимфомы представляют собой часть обширной группы заболеваний, называемых гематологическими новообразованиями. Некоторые формы лимфомы являются безболезненными (например, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома), совместимыми с долгой жизнью даже без лечения, тогда как другие формы являются агрессивными (например, лимфома Беркитта), вызывая быстрое истощение и смерть.

- 37 025367

Классификация ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения), опубликованная в 2001 г. и дополненная в 2008 г. (ЬйрУ/еп.'ЮкзребТа.огд/дакз/ЬутрЬота - сйе_по1е-кЬп92-832-2411-6-2#сПе_по1е-кЬп92832-2411-6-2) представляет собой самую позднюю классификацию лимфом и основывается на основных положениях, заложенных в Пересмотренной Европейско-Американской классификации лимфом (КЕАЬ). Согласно этой системе лимфомы группируют по клеточному типу (т.е. нормальный клеточный тип, который имеет наибольшее сходство с опухолью) и определенным фенотипическим, молекулярным или цитогенетическим характеристикам. Существуют три большие группы: В-клеточные, Т-клеточные опухоли и опухоли природных клеток-киллеров. Также известны другие менее распространенные группы. Лимфома Ходжкина, хотя и рассматривается отдельно в рамках классификации ВОЗ (и предыдущих классификаций), в настоящее время признана как опухоль, хотя и заметно аномальная, лимфоцитов линии зрелых В-клеток.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат лимфому.

Саркома

Саркома представляет собой рак соединительной ткани (костной, хрящевой, жировой), приводящий к пролиферации мезодермы.

Это отличает ее от карцином, которые имеют эпителиальное происхождение (карциномы молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы и другие). Однако с развитием понимания тканевого происхождения, термин саркома иногда применяется к опухолям, которые, как теперь известно, возникают из эпителиальной ткани. Термин саркома мягких тканей используется для описания опухолей мягкой ткани, которая включает элементы, присутствующие в соединительной ткани, но не происходящие из нее (такие как мышцы и кровеносные сосуды).

Саркомы имеют несколько различных названий на основе типа ткани, из которой они возникают. Например, остеосаркома возникает из кости, хондросаркома возникает из хряща, а лейомиосаркома возникает из гладкой мышцы. Саркомы поражают людей всех возрастных групп, но являются очень редкими, составляя только 1% от всех случаев рака. СГОТ представляет собой наиболее распространенную форму саркомы, составляя приблизительно 3000-3500 случаев в год в Соединенных Штатах Америки. Это можно сравнить с раком молочной железы, число случаев которого в Северной Америке составляет приблизительно 200000 в год.

У людей в возрасте до 35 лет диагностируют приблизительно 50% случаев саркомы костей и 20% случаев саркомы мягких тканей. Некоторые саркомы, такие как лейомиосаркома, хондросаркома и стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (С^Т), чаще встречаются у взрослых, чем у детей. У детей и молодежи намного чаще встречаются саркомы костей в самой высокой степенью злокачественности, включая саркому Юинга и остеосаркому.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат саркому.

Карцинома

Карцинома представляет собой любой злокачественный рак, который возникает из эпителиальных клеток. Карциномы инвазируют окружающие ткани и органы и могут метастазировать или распространяться в лимфоузлы и другие места.

Карцинома, как и любое новообразование, классифицируется согласно своим гистопатологическим признакам. Аденокарцинома и плоскоклеточная карцинома, два общих описательных термина для опухолей, отражают тот факт, что эти клетки могут иметь признаки железистых или сквамозных клеток, соответственно. Строго анапластические опухоли могут быть недифференцированными в той степени, что они не будут иметь различимых гистологических признаков (недифференцированная карцинома).

Иногда опухоль обозначают в соответствии с предполагаемым органом первичной (например, карцинома предстательной железы) или предполагаемой клеткой происхождения (гепатоцеллюлярная карцинома, почечноклеточная карцинома).

Аденокарцинома представляет собой злокачественную опухоль, возникающую из эпителиальных клеток железистой ткани и образующую железистые структуры. Она часто встречается в легком (составляя 30-40% всех случаев рака легких). Она обнаруживается по периферии, возникая из бокаловидных клеток или пневмоцитов II типа.

Плоскоклеточная карцинома возникает из плоскоклеточной метаплазии. На нее приходится 20-30 процентов опухолей легкого, и обычно она происходит из корня легкого.

Мелкоклеточная карцинома почти наверняка является следствием курения. Она метастазирует рано и может секретировать АИН (алкогольдегидрогеназу) (понижая концентрацию натрия у пациентов).

Крупноклеточные недифференцированные карциномы составляют 10-15 процентов новообразований легкого. Они являются агрессивными и плохо распознаются вследствие недифференцированной природы. Наиболее часто они располагаются в центральной части легкого.

Синоназальная недифференцированная карцинома.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат карциному.

- 38 025367

Миелома

Множественная миелома (также известная как ММ, миелома, миелома плазматических клеток или как болезнь Калера (Οίίο КаЫег)) представляет собой рак плазматических клеток. Эти иммунные клетки образуются в костном мозге, их много в лимфатической системе, и они продуцируют антитела. Миелома считается неизлечимой, однако используя стероиды, химиотерапию, талидомид и трансплантацию стволовых клеток, можно вызвать ремиссии. Миелома является частью большой группы заболеваний, называемых гематологическими злокачественными новообразованиями.

Множественная миелома развивается в В-лимфоцитах пост-герминального центра. У пациентов с множественной миеломой часто наблюдается хромосомная транслокация между геном тяжелой цепи иммуноглобулина (на четырнадцатой хромосоме, локус 14ц32) и онкогеном (часто 11ц13, 4р16.3, 6р21, 16с|23 и 20ц11). Эта мутация приводит к разрегуляции данного онкогена, что, как полагают, является важным инициирующим событием в патогенезе миеломы. Результатом является пролиферация клона плазматических клеток и геномная нестабильность, что приводит к последующим мутациям и транслокациям. Нарушение в хромосоме 14 наблюдается примерно в 50% всех случаев миеломы. Делеция (частей) тринадцатой хромосомы также наблюдается примерно в 50% случаев.

Продукция цитокинов (особенно 1Ь-6) плазматическими клетками вызывает значительные их локализованные повреждения, такие как остеопороз, и создает микроокружение, в котором разрастаются злокачественные клетки. Ангиогенез (привлечение новых кровеносных сосудов) увеличивается.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат миелому.

Рак желудка

Рак желудка или желудочный рак может развиваться в любой части желудка и может распространяться по всему желудку и другим органам; в частности, пищеводу, легким и печени. Рак желудка является причиной примерно 800000 случаев смерти во всем мире за год.

Метастазы встречаются у 80-90% индивидуумов с раком желудка, с показателем шестимесячной выживаемости 65% у тех, у кого он диагностирован на ранних стадиях, и менее 15% у тех, у кого он диагностирован на поздних стадиях.

Рак желудка часто является бессимптомным или вызывает лишь неспецифические симптомы на ранних стадиях своего развития. Со временем эти симптомы проявляются, рак обычно метастазирует в другие части организма, и это является одной из главных причин для его неблагоприятного прогноза.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак желудка.

Рак щитовидной железы

Новообразование щитовидной железы или рак щитовидной железы обычно относится к любому из четырех видов злокачественных опухолей щитовидной железы: папиллярному, фолликулярному, медуллярному или анапластическому. Папиллярные и фолликулярные опухоли являются наиболее распространенными. Они растут медленно и могут давать рецидивы, но обычно не являются фатальными для пациентов в возрасте до 45 лет. Медуллярные опухоли имеют хороший прогноз, если они ограничены щитовидной железой, и более неблагоприятный прогноз, если имеет место метастаз. Анапластические опухоли являются быстро растущими и плохо отвечают на терапию.

Рак щитовидной железы обычно обнаруживают у пациента с эутириозом, но симптомы гипертиреоза или гипотиреоза могут быть ассоциированы с большой или метастатической хорошо дифференцированной опухолью. Особенно это касается узлов, когда они обнаруживаются у пациентов в возрасте до 20 лет. Появление доброкачественных узлов в этом возрасте менее вероятно, а значит потенциал злокачественности намного выше.

Типы рака щитовидной железы можно классифицировать в соответствии с их патологическими характеристиками. Можно выделить следующие варианты (распределение по различным подтипам может демонстрировать регионарную вариацию): папиллярный рак щитовидной железы (до 75% включительно); фолликулярный рак щитовидной железы (до 15% включительно); медуллярный рак щитовидной железы (до 8% включительно); и анапластический рак щитовидной железы (меньше 5%). Фолликулярный и папиллярный типы вместе можно классифицировать как дифференцированный рак щитовидной железы. Эти типы имеют более благоприятный прогноз, чем медуллярные и недифференцированные типы. Аденома щитовидной железы представляет собой доброкачественное новообразование щитовидной железы.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак щитовидной железы.

Рак мочевого пузыря

Рак мочевого пузыря относится к любому из нескольких типов злокачественных опухолей мочевого пузыря. Это заболевание, при котором в мочевом пузыре бесконтрольно размножаются аномальные клетки. Мочевой пузырь представляет собой полый мышечный орган, в котором накапливается моча; он локализован в области малого таза. Самый распространенный тип рака мочевого пузыря начинается в клетках, выстилающих внутреннюю поверхность мочевого пузыря, и называется переходноклеточной карциномой (иногда уротелиальной карциномой).

В 90% случаев рак мочевого пузыря представляет собой переходно-клеточную карциному (ТСС). Другие 10% относятся к плоскоклеточной карциноме, аденокарциноме, саркоме, мелкоклеточной карци- 39 025367 номе и вторичным метастазам из видов рака, находящихся в других местах в организме.

Для классификации локализации, размера и распространенности рака в соответствии с системой стадирования ТНМ (опухоль, лимфоузел и метастаз) используют следующие стадии. Стадия 0: раковые клетки обнаружены только на внутренней выстилке мочевого пузыря. Стадия Ι: раковые клетки проникли в слой, лежащий за пределами внутренней выстилки мочевого пузыря, но не в мышцы мочевого пузыря. Стадия ΙΙ: раковые клетки проникли в мышцы стенки мочевого пузыря, но не в жировую ткань, которая окружает мочевой пузырь. Стадия ΙΙΙ: раковые клетки проникли в жировую ткань, окружающую мочевой пузырь, и в предстательную железу, влагалище или матку, но не в лимфоузлы или другие органы. Стадия 1У: раковые клетки проникли в лимфоузлы, таз или стенку брюшной полости и/или другие органы. Рецидив: после лечения рак рецидивирует в мочевой пузырь или в другой близлежащий орган.

Стадирование ТСС мочевого пузыря осуществляют согласно системе ТНМ 1997 г.: Та - неинвазивная папиллярная опухоль; Т1 - инвазивная, но не дальше мышечного слоя мочевого пузыря; Т2 - инвазивная в мышечную оболочку; Т3 - инвазивная за пределы мышцы в жировую ткань снаружи от мочевого пузыря; и Т4 - инвазивная в окружающие структуры, такие как предстательная железа, матка или стенка малого таза.

В одном из воплощений способами, описанными в данной заявке, лечат рак мочевого пузыря.

Глазные состояния, вовлекающие ангиогенез

Состояния дегенерации желтого пятна и диабетическая ретинопатия

В одном из аспектов согласно настоящему изобретению предложен способ лечения диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, хориоидальной неоваскуляризации или неоваскулярной глаукомы у пациента путем введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества одной или более композиций, предложенных в данной заявке.

Дегенерация желтого пятна (АМИ) представляет собой утрату фоторецепторов в центральной области сетчатки, называемой макулой, которые отвечают за высокую остроту зрения. Дегенерация макулы ассоциирована с аномальным отложением компонентов внеклеточного матрикса и другого дебриса в мембране между ретинальным пигментным эпителием и сосудистой оболочкой глаза. Такой дебрисоподобный материал называется друзами. Друзы наблюдаются при офтальмоскопическом исследовании глаза. Нормальные глаза могут не иметь друз, однако на периферии сетчатки друзы могут присутствовать в изобилии. Наличие мягких друз в макуле, при отсутствии утраты макулярного зрения, считается ранней стадией АМЭ. Дегенерация желтого пятна характеризуется хориоидальной неоваскуляризацией (СХУ), развитием аномальных кровеносных сосудов под слоем ретинального пигментного эпителия (КРЕ) сетчатки. Эти сосуды прорываются через мембрану Бруха, нарушая ретинальный пигментный эпителий, кровоточат и в конечном итоге вызывают рубцевание макулярной зоны, что приводит к полной потере центрального зрения (образованию дисковидного рубца).

Хориоидальная неоваскуляризация ^N7) обычно наблюдается при дегенерации желтого пятна, в дополнение к другим глазным расстройствам, и ассоциирована с пролиферацией хориоидальных эндотелиальных клеток, сверхпродуцированием внеклеточного матрикса и образованием сосудистоволокнистой субретинальной мембраны. Пролиферация клеток ретинального пигментного эпителия и продуцирование ангиогенных факторов, по-видимому, оказывают эффект на хориоидальную неоваскуляризацию.

Диабетическая ретинопатия (ИК) представляет собой глазное расстройство, характеризующееся чрезмерным ангиогенезом, который развивается при диабете вследствие утолщения капиллярных базальных мембран и отсутствия контакта между перицитами и эндотелиальными клетками капилляров. Утрата перицитов усиливает пропотевание капилляров и приводит к нарушению гематоретинального барьера. Диабетическая ретинопатия является результатом микрососудистых изменений сетчатки. Индуцированная гипергликемией гибель перицитов и утолщение базальной мембраны приводят к функциональной недостаточности стенок сосудов. Эти нарушения вызывают изменения в образовании гематоретинального барьера и также делают кровеносные сосуды сетчатки более проницаемыми. Малые кровеносные сосуды, такие как сосуды в глазу, особенно чувствительны к недостаточной регуляции содержания сахара в крови (содержания глюкозы в крови). Избыточное накопление глюкозы и/или фруктозы повреждает очень мелкие кровеносные сосуды в сетчатке. Макулярный отек также может развиться, когда жидкость и липиды вытекают из кровеносных сосудов на макулу. Под воздействием этих жидкостей макула набухает, в результате чего теряется четкость зрения. Это повреждение также приводит к недостатку кислорода в сетчатке.

По мере развития заболевания недостаток кислорода в сетчатке стимулирует ангиогенез во всей сетчатке и в прозрачном гелеобразном стекловидном теле глаза, которым заполнена внутренняя часть глаза. Без своевременного лечения эти новые кровеносные сосуды могут кровоточить, затуманивать зрение и разрушать сетчатку. Сосудисто-волокнистая пролиферация также может вызывать тракционную отслойку сетчатки. Новые кровеносные сосуды также могут прорастать в угол передней камеры глаза и вызывать неоваскулярную глаукому.

Пролиферативная витреоретинопатия ассоциирована с клеточной пролиферацией клеточных и фиброзных оболочек внутри стекловидных мембран и на поверхностях сетчатки. При этом глазном рас- 40 025367 стройстве часто встречается пролиферация и миграция клеток ретинального пигментного эпителия. Мембраны, ассоциированные с пролиферативной витреоретинопатией, содержат такие компоненты внеклеточного матрикса, как коллаген I, II и 1У типов и фибронектин, и постепенно становятся фиброзными.

Возрастная дегенерация желтого пятна (АМЭ) и диабетическая ретинопатия представляют собой две основные причины слепоты в развитом мире. Благодаря недавнему разрешению на применение макромолекул ЬиСЕКПЗ®, АУАЗТШ® и МАСυΟЕN® улучшены возможности лечения, имеющиеся для пациентов с АМЭ. ЬИСЕКПЗ® представляет собой РаЬ, а АУАЗТШ® представляет собой моноклональное антитело. Оба они связывают фактор роста сосудистого эндотелия (УЕОР) и продемонстрировали наиболее впечатляющие на сегодняшний день результаты в отношении лечения АМЭ; тем не менее, только меньшая часть подвергнутых лечению пациентов испытывает значительное улучшение остроты зрения. Антиангиогенная терапия, сфокусированная на мишени, отличной от УЕОР, может преодолеть некоторые из ограничений, ассоциированных с агентами, которые направленно действуют на УЕОРпуть.

Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна, СNУ, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии. В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна, СNУ, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии посредством введения антител, описанных в данной заявке. Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут вызывать сокращение объема кровеносных сосудов, ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток, ассоциированную с глазным заболеванием, устранять симптомы кровотечения, лечить замутненное зрение, останавливать процесс потери зрения и/или предупреждать пропотевание кровеносных сосудов. Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в лекарственных средствах для лечения дегенерации желтого пятна, СNУ, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии.

Кроме того, химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в комбинации с известными терапиями и/или соединениями для лечения дегенерации желтого пятна, СNУ, диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии. Примеры таких соединений включают, но не ограничиваются этим, бевацизумаб (АУАЗТШ®), ранибизумаб (ЬИСЕЭТ1З®), УЕОР-Тгар, сунитиниб (ЗИТЕКТ®), сорафениб (МЕХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб, пазопаниб или МАСиОЕЖ®. Помимо способов введения, описанных в данной заявке, химерные антитела против эндоглина можно вводить через интравитреальные пути (в стекловидное тело). Неограничивающие примеры интравитреальных способов введения включают интравитреальную инъекцию и применение интравитреальных имплантатов.

Пациентов можно оценивать в отношении улучшения и восприимчивости к лечению. Лечение включает, но не ограничивается этим, уменьшение макулярного отека, уменьшение областей СМУ и увеличение остроты зрения. Показатели симптомов известны в данной области и дополнительно описаны ниже в Примерах.

Хронические воспалительные заболевания

Любые из широкого спектра тканей или органов, состоящих из организованных тканей, могут поддерживать ангиогенез при болезненных состояниях, включая кожу, мышцу, кишечник, соединительную ткань, суставы, кости и тому подобную ткань, в которой кровеносные сосуды могут распространяться при ангиогенных стимулах. Так, в одном из воплощений ткань, подлежащая лечению, представляет собой воспаленную ткань, а ангиогенез, подлежащий ингибированию, представляет собой ангиогенез в воспаленной ткани, при этом в воспаленной ткани происходит неоваскуляризация.

Воспалительные заболевания кишечника

Ангиогенез играет важную роль в воспалительном заболевании кишечника (ΙΒΌ). ΙΒΌ представляет собой обобщающий термин для ряда кишечных и интестинальных заболеваний или состояний, включающих болезнь Крона и язвенный колит. Болезнь Крона обычно характеризуется воспалением тонкого и толстого кишечника, в то время как язвенный колит обычно локализуется в толстой кишке. Аномальный или патологический ангиогенез играет центральную роль как при болезни Крона, так и при язвенном колите. Оба заболевания вызывают увеличение плотности капилляров и дисфункцию мелких сосудов, и такой ангиогенез связан во времени с тканевой патологией и воспалительными циклами, обнаруженными при обоих заболеваниях. Известно, что эндоглин экспрессируется в этих тканях и играет роль в разрегуляции ангиогенеза при ΙΒΌ. (СЫй1о» е! а1., Ат. I. РЬу8ю1. Оа8!гош!е8!. ЬАег РЬу8ю1., 293: 518(2007)).

Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения ΙΒΌ. Кроме этого, химерные антитела против эндоглина могут быть использованы для лечения болезни Крона или язвенного колита. Химерные антитела против эндоглина также могут быть использованы в комбинации с хирургической операцией и/или терапиями, известными для ΙΒΌ, болезни Крона или язвенного колита. Примеры таких известных терапий включают, но не ограничиваются этим, аминосалицилаты (например, месаламин), кортикостероиды (например, будесонид, преднизон и т.д.), антибио- 41 025367 тики (например, метронидазол и т.д.), иммуносупрессивные лекарственные средства (например, азатиоприн, 6-меркаптопурин, метотрексат, такролимус и циклоспорин и т.д.) и биологические лекарственные средства, такие как белки и антитела (например, инфликсимаб и т.д.).

Лечение ΙΒΌ можно оценить по уменьшению васкуляризации воспалительной ткани. Лечение также можно оценить по остановке развития, прекращению воспалительного процесса и/или заживлению язвенных поражений, которые характеризуют ΙΒΌ.

Диабетическая нефропатия и ишемия после трансплантации почки

Диабетическая нефропатия представляет собой главную причину осложнений и смертности при диабете как 1 типа, так и 2 типа. Она является основной причиной терминальной стадии почечной недостаточности во всем мире. Диабетическая нефропатия характеризуется повреждением гломерулярных капилляров вследствие повышенного синтеза проангиогенных факторов. Эти проангиогенные факторы вызывают повышенную пролиферацию эндотелиальных клеток и последующий ангиогенез, и эндоглин, как известно, активируется при хроническом почечном заболевании. Этот ангиогенез приводит к разрушению клубочков и в конечном счете к почечной недостаточности.

Аналогичные эффекты наблюдаются при трансплантации почки, что приводит к ишемии и нарушению работы трансплантированного органа. Активация эндоглина приводит к активации ангиогенеза и воспалению в почке. И наоборот, исследования с использованием эндоглин-нулевых мышей демонстрируют значительное уменьшение почечного повреждения после трансплантации/ишемии и повышенную выживаемость органа.

Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения или предупреждения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации.

В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации посредством введения антител, описанных в данной заявке. Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в лекарственных средствах для лечения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации. Кроме этого, химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в комбинации с известные терапиями и/или соединениями для лечения диабетической нефропатии, почечной недостаточности после трансплантации и/или ишемического повреждения почек после трансплантации.

Пациентов можно оценивать в отношении эффективности лечения, например, по улучшению функционирования почек.

Ревматоидный артрит и остеоартрит

Ревматоидный артрит характеризуется чрезмерным ангиогенезом и в этом смысле хорошо понятен. Воспаление и разрушение, обнаруживаемые в синовиальных жидкостях, относятся непосредственно к повышенному ангиогенезу, обнаруживаемому в его окружении и в синовиальных тканях. В пораженных тканях пациентов с ревматоидным артритом присутствуют многочисленные проангиогенные факторы.

Остеоартрит относится к группе хронических инвалидизирующих состояний, которые поражают синовиальные суставы. Ангиогенез и воспаление представляют собой важные процессы в патофизиологии данного заболевания, и они вносят вклад в поражение суставов с помощью различных механизмов, включая, но не ограничиваясь этим, стимуляцию продукции ММР (матриксные металлопротеазы) и эндохондральное окостенение. Кроме этого, ангиогенез при остеоартрите индуцирует последующую иннервацию, в результате чего развивается петля обратной связи, где одно из них продолжает стимулировать другое.

Химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения или предупреждения ревматоидного артрита и остеоартрита. В данной заявке описаны способы лечения или предупреждения ревматоидного артрита и остеоартрита посредством введения одной или более композиций, описанных в данной заявке. Гуманизированные химерные антитела против эндоглина, описанные в данной заявке, также могут быть использованы в лекарственных средствах для лечения ревматоидного артрита и остеоартрита.

Двумя общепринятыми суммарными показателями улучшения КА в испытаниях являются: критерии Паулюса (Раи1и5) и критерии Американской коллегии ревматологии (АСК). Критерии Паулюса определяются как улучшение по 4-м из следующих показателей: число болезненных и припухших суставов, утренняя скованность, оценка пациентом активности заболевания, оценка врачом активности заболевания и показатель скорости оседания эритроцитов (Е8К). Уровень улучшения выражают в виде процентного улучшения каждой из этих переменных, т.е. классификация по Паулюсу 20 указывает на пациента, отвечающего на лечение, который показал 20%-ное улучшение по 4 из 6 параметров.

Ревматоидный артрит также можно оценить, используя оценку по шкале Американской коллегии ревматологии (АСК). Кратко, критерии классификации согласно АСК для определения клинической ремиссии при ревматоидном артрите оценивают по наличию 5 или более из следующих факторов, присутствующих по меньшей мере в течение двух месяцев подряд:

- 42 025367

а) утренняя скованность менее 15 мин;

б) отсутствие усталости;

в) отсутствие боли в суставах;

г) отсутствие болезненности суставов или боли при движении;

д) отсутствие припухлости мягких тканей в суставах или влагалищах сухожилий; и

е) ΕδΚ (метод Вестергрена (^е8ίе^§^еη)) менее 30 мм/ч для женщин или 20 мм/ч для мужчин.

Могут быть исключения, и они включают: клинические проявления активного васкулита, перикардита, плеврита или миозита и необъяснимое недавнее уменьшение массы или лихорадку, обусловленную ревматоидным артритом, что будет препятствовать установлению полной клинической ремиссии (Рта18 Κδ, ей а1., Аг1ЬгЙ18 КЬеит. 24: 1308, 1981). Кроме того, критерии классификации согласно АСК функционального статуса при ревматоидном артрите включают классификацию, основанную на следующих способностях пациента:

Класс Ι: способен полностью осуществлять привычную деятельность в повседневной жизни (уход за собой, профессиональную и относящуюся к хобби);

Класс ΙΙ: способен осуществлять обычный уход за собой и профессиональную деятельность, но ограничен в деятельности, относящейся к хобби;

Класс ΙΙΙ: способен осуществлять обычный уход за собой, но ограничен в профессиональной и относящейся к хобби деятельности; и

Класс Ιν: ограниченная способность осуществлять обычный уход за собой, профессиональную и относящуюся к хобби деятельность.

Остеоартрит также можно оценить, используя количественную оценку по шкале АСК. Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита тазобедренного сустава оценивают, используя историю болезни, данные медицинского осмотра и лабораторных исследований: проводят оценку состояния пациента в отношении боли в тазобедренном суставе и одного из следующего:

(1) внутренняя ротация в тазобедренном суставе составляет менее 15 градусов, а ЕЕК не более 45 мм/час, или сгибание тазобедренного сустава не более 115 градусов, если данных ЕЕК нет в наличии; или (2) внутренняя ротация в тазобедренном суставе составляет менее 15 градусов, боль ассоциирована с внутренним тазобедренным суставом, утренняя скованность тазобедренного сустава в течение не более 60 мин и возраст пациента более 50 лет.

Используя историю болезни, данные медицинского осмотра, лабораторных и рентгенографических исследований традиционным форматом рассматривают боль в тазобедренном суставе и два из следующих показаний: ЕЕК менее 20 мм/час, рентгенографически выявляемые остеофиты бедренной кости и/или вертлужной впадины либо рентгенографически выявляемое сужение суставной щели (в верхнем, аксиальном и/или медиальном отделе). Дерево классификации приведено ниже: боль в тазобедренном суставе в сочетании с (1) рентгенографически выявляемыми остеофитами бедренной кости и/или вертлужной впадины, или (2) ЕЕК не более 20 мм/час и рентгенографически выявляемое сужение суставной щели в аксиальном отделе (АНта^ К, еί а1., АгИтИх КЬеит., 34: 505, 1991).

Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита колена

Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита колена оценивают с использованием истории болезни и данных медицинского осмотра, используя следующие критерии: боль в колене в сочетании с тремя (3) из следующих признаков:

(1) возраст пациента составляет более 50 лет;

(2) длительность утренней скованности менее 30 мин;

(3) крепитация при активном движении;

(4) болезненность костей;

(5) костное разрастание; и (6) непальпируемое тепло от синовиальной оболочки.

Используя историю болезни, данные медицинского осмотра, лабораторных и рентгенографических исследований, можно оценить боль в колене в сочетании с одной из следующих характеристик пациента:

(1) возраст пациента составляет больше 50 лет; (2) длительность утренней скованности менее 30 мин; и (3) крепитация при активном движении и остеофиты. Используя историю болезни, данные медицинского осмотра и лабораторных исследований: боль в колене можно оценить в сочетании с пятью (5) из следующих признаков:

(1) возраст пациента составляет больше 50 лет;

(2) длительность утренней скованности менее 30 мин;

(3) крепитация при активном движении;

(4) болезненность костей;

(5) костное разрастание;

(6) непальпируемое тепло от синовиальной оболочки;

(7) ЕЕР составляет менее 40 мм/час;

(8) ревматоидный фактор (КР) менее 1:40; и

- 43 025367 (9) признаки остеоартрита в синовиальной жидкости (§Р).

См., например, АНтащ К., е! а1., АгТОгШк КЬеит., 29: 1039, 1986. Клинические критерии согласно классификации АСК для остеоартрита кисти рук можно оценить, как приведено ниже: боль, тупая боль или тугоподвижность в кисти в сочетании с тремя (3) из следующих признаков: (1) разрастание твердых тканей двух или более из следующих суставов (вторых и третьих дистальных межфаланговых, вторых и третьих проксимальных межфаланговых и первых пястно-запястных суставов обеих кистей); (2) разрастание твердых тканей двух или более дистальных межфаланговых суставов; (3) наличие меньше трех припухших МСР (пястно-фаланговых) суставов и (4) деформация по меньшей мере одного из суставов, перечисленных выше в (1).

Комбинированная терапия

В соответствии с воплощениями, изложенными в данном описании, композиции, описанные в данной заявке, можно вводить отдельно или в комбинации с одним или более дополнительными активными или неактивными агентами. В том случае, когда применяются комбинации, можно использовать одновременное или последовательное введение химерных антител против эндоглина и антител (их антигенсвязывающих фрагментов) против УЕОР.

Соединения можно, при необходимости, вводить в комбинации с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим лечением, включая, но не ограничиваясь этим, адриамицин, циклофосфамид, паклитаксел, пеметрексед, темозоломид, оксалиплатин, эрбитукс, вектибикс, сорафениб, сунитиниб, гефитиниб, эрлотиниб, 5-фторурацил (5-РИ) иринотекан, топотекан, лейковорин, УЕБСАБЕ®, леналидомид, талидомид, кселода, таксотер и многие другие традиционные противораковые терапии, описанные в данной заявке. Как использовано в данном описании, облучение относится, например, к облучению микроволнами, ультрафиолетовому (УФ), инфракрасному (ИК) или альфа-, бета- или гаммаизлучению. Облучение может быть сфокусированным или доставленным локально с использованием традиционных методов для нацеливания облучения на участок с одной или более опухолями без облучения всего организма. Следует понимать, что перечень схем лечения, приведенных ниже, представляет традиционные терапии, однако настоящее изобретение охватывает и другие известные схемы лечения, которые конкретно не описаны в данной заявке.

В одном из воплощений рак представляет собой рак яичников, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, химиотерапию (например, доксорубицин, доксил, гемцитабин, рубитекан и химиотерапевтические средства на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин), мелфалан, ингибиторы топоизомеразы Ι, такие как топотекан и иринотекан, терапию на основе таксана, гормоны, лучевую терапию, гипотермию всего организма, производные изофлавонов, такие как феноксодиал, цитотоксичные макролиды, такие как эпотилоны, ингибиторы ангиогенеза, такие как бевацизумаб, ингибиторы сигнальной трансдукции, такие как трастузумаб, генную терапию, терапию с использованием ΡΝΛί (РНК-интерференция), иммунотерапию, моноклональные антитела, ингибиторы фосфатидилинозитол-подобной киназы, такие как рапамицин, или любую их комбинацию. Комбинированная терапия антителами, описанными в данной заявке, вместе с терапиями рака яичников также может предусматривать более низкие дозы либо одной из них, либо обеих терапий, благодаря синергическому эффекту от совместного применения этих терапий.

В одном из воплощений рак представляет собой почечный рак/рак почки, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, химиотерапию, пазопаниб, интерферон-альфа или 1Б-2. В еще одном другом воплощении дополнительным агентом является ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают ингибиторы, описанные выше, ранибизумаб (Ρυί',ΈΝΤΙδ®), афлиберцепт (УБОР-ГОар), сунитиниб ^ОТЕОТ®), сорафениб (МЕХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Комбинированная терапия антителами, описанными в данной заявке, вместе с терапиями рака почек, также может предусматривать более низкие дозы либо одной из них, либо обеих терапий, благодаря синергическому эффекту от совместного применения этих терапий.

В одном из воплощений рак представляет собой миелому, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию, УЕБСАБЕ®, леналидомид или талидомид. В одном из воплощений дополнительным агентом является УЕБСАБЕ®. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.

В одном из воплощений рак представляет собой рак предстательной железы, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию (например, терапию внешним пучком или брахитерапию), антигормональную терапию (подавление андрогенов, в том числе абиротероном), ингибиторы белка теплового шока 90 (Н8Р90), химиотерапию (например, доцетаксел, химиотерапию на основе платины, такую как цисплатин, карбоплатин, сатраплатин и оксалиплатин, таксан, эстрамустин), преднизон или преднизолон, понижающие уровень холестерина лекарственные средства, такие как статины, агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (ЬНКН), терапию с использованием КМАц терапии на основе дендритных клеток, цельные опу- 44 025367 холевые клетки, генетически модифицированные с целью секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ΟΜ-Ο8Ρ) (также известного как ΟνΑΧ) или любую их комбинацию. В еще одном другом воплощении дополнительным агентом является ингибитор рецептора νΕΟΡ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора νΕΟΡ включают ранибизумаб (ΕυΟΕ^Γ^®), афлиберцепт (νΕΟΡ-Тгар), сунитиниб (δυΤΕ^Σ®), сорафениб (^ХАУАИ®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.

В одном из воплощений рак представляет собой рак легкого, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию (например, торакальную лучевую терапию, лучевую терапию с использованием заряженных частиц), урацил-тегафур и химиотерапию на основе платины (например, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин и т.д.) и винорелбин, эрлотиниб (ТАКСЕУА®). гефитиниб (ΙΚΕδδΑ®), антитела к рецептору эпидермального фактора роста (например, цетуксимаб), низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ, прямые ингибиторы белков, вовлеченных в пролиферацию клеток рака легкого, ингибиторы Ашота-киназы, лазериндуцированную термотерапию, терапию с использованием ΚΧΑί, цельные опухолевые клетки, генетически модифицированные с целью секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ΟΜ-ΟδΡ) (также известного как ΟνΑΧ) или любую их комбинацию. Дополнительные терапевтические лечения включают таксол или пеметрексед. В еще одном другом воплощении дополнительным агентом является ингибитор рецептора νΕΟΡ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора νΕΟΡ включают ранибизумаб (ΕυΟΕ^^®), афлиберцепт (νΕΟΡ-Тгар), сунитиниб (δυΤΕΚΤ®), сорафениб ^ΕΧΑνΑ®^, акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.

В одном из воплощений рак представляет собой рак молочной железы, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, моноклональные антитела (например, антитела к Нег-2, герцептин), адъювантную химиотерапию, такую как химиотерапия с использованием одного средства или комбинированная химиотерапия (например, полихимиотерапии на основе антрациклина и таксана, таксол или мишень-специфичный трастузумаб с эндокринной регуляцией или без нее с применением или без применения ΡΜΚΤ (радиационная терапия после мастэктомии), винорелбин), адриамицин, циклофосфамид, кселода, таксотер, селективные модуляторы рецепторов эстрогена, такие как тамоксифен и ралоксифен, аллостерические модуляторы рецепторов эстрогена, такие как трилостан, облучение (например, интерстициальную брахитерапию, устройство Μаттο5^ΐе, 3-мерную конформную наружную лучевую терапию и интраоперационную лучевую терапию), ингибиторы ароматазы, которые подавляют общий синтез организмом (например, анастрозол, экземестан и летрозол), терапию с использованием ΚΗΑί, внутривенные аналоги рапамицина, которые являются иммуносупрессивными и антипролиферативными, такие как темсиролимус (СС1779), или любую их комбинацию. Обзор способов получения трехмерных моделей культивирования ίη νίΐτο тканей рака молочной железы описан в Ктш еΐ а1., ВгеаЧ Сансег Кекеатсй ТгеаЦнеШ, 85(3): 281-91 (2004). Другие модели тестирования рака ίη νίνο и ίη νίΐτο известны и могут быть использованы для тестирования антител, описанных в данной заявке. В еще одном другом воплощении дополнительным агентом является ингибитор рецептора νΕΟΡ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора νΕΟΡ включают ранибизумаб (ΕυСΕNΤIδ®), афлиберцепт (νΕΟΡ-Тгар), сунитиниб (δ^Ε^ί®), сорафениб ^ΕΧΑνΑΕ^®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.

В одном из воплощений рак представляет собой рак толстой кишки, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию и химиотерапию (например, 5-фторурацил (5-Ρυ), левамизол, лейковорин или семустин (метил-ССИЕ [метил-1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина])), №[2-(диметиламино)этил]акридин-4-карбоксамид и другие родственные карбоксамидные противораковые лекарственные средства; ингибиторы топоизомеразы, не являющиеся ингибиторами топоизомеразы ΙΙ, иринотекан, липосомный топотекан, противораковые средства таксанового класса (например, паклитаксел или доцетаксел), соединение класса ксантенон-уксусной кислоты (например, 5,6-диметилксантенон-4-уксусная кислота РМАА), ламинарин, сайт-селективные аналоги циклического ΑΜΡ (аденозинмонофосфат) (например, 8-хлораденозин3',5'-циклический фосфат), пираноиндольные ингибиторы Сох-2 (циклооксигеназа-2), карбазольные ингибиторы Сох-2, тетрагидрокарбазольные ингибиторы Сох-2, инденовые ингибиторы Сох-2, ограниченные ингибиторы ΧδΑΙΩ (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства) (такие как антраниловые кислоты, аспирин (5-ацетилсалициловая кислота), азодизал-натрий, карбогетероциклические кислоты, карпрофен, хлорамбуцил, диклофенак, фенбуфен, фенклофенак, фенопрофен, флуфенамовая кислота, флурбипрофен, флупрофен, фуросемид, ауротиомалат натрия, ибупрофен, индометацин, индопрофен, кетопрофен, лоназолак, локсопрофен, меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота, мелфалан, напроксен, пеницилламин, фенилуксусные кислоты, пропионовые кислоты, салициловые кислоты, салазосульфапиридин, сулиндак, толметин, ΧδΑΙΩ пиразолон бутазон пропазон, мелоксикам, оксикамы, пироксикам, фелден, пироксикам бета-циклодекстран, теноксикам, этодолак и оксапрозин), ингибитор

- 45 025367

НЕК-2/пеи, терапию с использованием ΚΝΛί. ОМ-С8Р, моноклональные антитела (например, антитела против Нег-2/пеи, антитела против СЕА (карциноэмбриональный антиген), А33 (НВ 8779), 100-210 (НВ 11764) и 100-310 (НВ 11028)), эрбитукс, вектибикс, гормональную терапию, пиримидинамины, производные камптотецина (например, СРТ-11), фолиновую кислоту (РА), гемцитабин, Ага-С, химиотерапевтические средства на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин, ингибитор сОМР-специфической фосфодиэстеразы или любую их комбинацию. В одном из воплощений дополнительным терапевтическим лечением является комбинация 5-РИ, лейковорина и оксалиплатина (РОЬРОХ). В одном из воплощений дополнительным терапевтическим лечением является комбинация 5Ри, иринотекана и лейковорина (1РЬ). В одном из воплощений дополнительным агентом является эрбитукс. В одном из воплощений дополнительным агентом является вектибикс. В еще одном другом воплощении дополнительным агентом является ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают ранибизумаб (ЬиСЕКПЗ®), афлиберцепт (УЕОР-Тгар), сунитиниб (8ИТЕЭТ®), сорафениб (ЖХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и соответственно могут быть адаптированы с учетом комбинированной терапии.

В одном из воплощений рак представляет собой рак поджелудочной железы, а одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение, являющееся комбинацией терапевтических лечений, представляет собой хирургическую операцию, лучевую терапию (КТ), фторурацил (5-РИ) и КТ, системную терапию, стентирование, гемцитабин (ОЕМ2АК®), гемцитабин и КТ, цетуксимаб, эрлотиниб (ТАКСЕУА®), химиолучевую терапию или любую их комбинацию. В еще одном другом воплощении дополнительным агентом является ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают ранибизумаб (ЕиСЕЭТ18®), афлиберцепт (УЕОР-Тгар), сунитиниб (8ИТЕЭТ®), сорафениб (ЖХАУАК®), акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.

Пациентов оценивают в отношении симптомов для одной или более многочисленных временных точек, включая до, в течение и после применения схем лечения. Лечение может приводить к улучшению состояния субъекта и может быть оценено путем определения наличия одного или более из перечисленных ниже факторов: уменьшение размера опухоли, уменьшение клеточной пролиферации, уменьшение количества клеток, ослабление неоваскуляризации, увеличение уровня апоптоза или уменьшение выживаемости по меньшей мере части клеток, характеризующихся клеточным пролиферативным расстройством. Одно или более из этих событий в некоторых случаях может приводить к частичной или полной элиминации рака и продлению выживаемости пациента. Альтернативно, для видов рака в терминальной стадии лечение может приводить к остановке развития заболевания, улучшенному качеству жизни и/или продлению выживаемости.

Функциональные анализы

Композиции, описанные в данной заявке, могут быть оценены в различных анализах ш уйго, ш νί\Ό и ех У1уо. Любой подходящий анализ, известный специалисту в данной области, может быть использован для мониторинга таких эффектов. Некоторые из таких методов описаны в данной заявке.

Анализ СО105-сигнального пути и его функции ί'.Ό105 (эндоглин) является членом семейства рецепторов ТОР-β, который экспрессируется пролиферирующими эндотелиальными клетками, и для пролиферации эндотелиальных клеток необходимы нормальные уровни СЭ105. СЭ105 экспрессируется в высокой степени в ангиогенной сосудистой сети солидных опухолей, вовлечен в ангиогенез/развитие сосудов и представляет собой вспомогательный рецептор трансформирующего фактора роста β (ТОР-β). ί'.Ό105 является гомодимерным гликопротеином клеточной мембраны, который экспрессируется на лейкозных клетках и эндотелиальных клетках. Были охарактеризованы две изоформы ί'.Ό105, Ь-эндоглин (170 кДа) и 8-эндоглин (160 кДа), отличающиеся по аминокислотной последовательности их цитоплазматических хвостов.

Экспрессия ί'.Ό105 увеличивается при клеточной гипоксии благодаря продукции индуцируемого гипоксией фактора-1-α (Н1Р-1-а) и защищает гипоксические клетки от апоптоза. СЭ105 действует на модулирование передачи сигнала в многокомпонентных комплексах рецепторных киназ суперсемейства ТОР-β, включающего рецепторы ТОР-β (ТОР-вК), активин-рецептор-подобные киназы (АЬК) и активиновые рецепторы. В отсутствие СЭ105 активация рецепторов ТОР-β приводит к фосфорилированию белков 8МАО, которые ингибируют рост эндотелиальных клеток. Однако активация СЭ105 под действием ТОР-β модулирует фосфорилирование белков 8МАО. Конечным результатом является высвобождение ингибирующих рост эффектов активации рецептора ТОР-β на эндотелиальных клетках.

Предотвращение активации ί'.Ό105 с помощью антитела против СЭ105 осуществляется синергически с ТОР-β для подавления роста эндотелиальных клеток. ТОР-β может стимулировать два различных опосредованных рецептором I типа/8тай сигнальных пути, вызывающих противоположные эффекты в эндотелиальных клетках. ТОРф/АЬ^-сигнальный путь (А) приводит к ингибированию клеточной пролиферации и миграции, тогда как ТОРф/АЬ^-путь (В) индуцирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. ί'.Ό105, вспомогательный рецептор ТОР-β, экспрессируемый в высокой степени в процессе ангиогенеза, является существенным для АЬК1-сигнального пути. В отсутствие СЭ105 ТОР- 46 025367 в/АЬК5-сигнальный путь становится преобладающим и поддерживает эндотелий в состоянии покоя. Высокая экспрессия СИ105 стимулирует АЬК1-путь и опосредованно ингибирует АЬК5-сигнальный путь, обеспечивая таким образом активированное состояние ангиогенеза.

В одном неограничивающем воплощении химерные антитела могут быть оценены в отношении ингибирования ангиогенеза и пролиферации эндотелиальных клеток. Связывание химерных антител против эндоглина с НИУЕС не предотвращает последующего связывания ТОР-β с НИУЕС. Таким образом, непосредственное подавление роста эндотелиальных клеток антителами против эндоглина представляет собой один из основополагающих механизмов, с помощью которых антиангиогенные эффекты и эффекты подавления опухолей проявляются ш νίνο. В другом воплощении химерные антитела могут быть оценены в отношении блокирования ангиогенеза посредством предотвращения фосфорилирования и/или сигнального пути через §таб1/5/8. СИ105 участвует в стимуляции ангиогенеза путем передачи сигнала через ТОР-β/А^К1, что, в свою очередь, включает снижение и/или блокирование фосфорилирования белков §таб2/3. В еще одном другом воплощении химерные антитела могут быть оценены в отношении блокирования ангиогенеза посредством усиления фосфорилирования и/или сигнального пути через §таб2/3.

Способы и методы анализа блокирующего или ингибирующего действия химерных антител, предложенных в данном изобретении, на ТОР-β/А^К1-сигнальный путь и/или фосфорилирование §таб1/5 включают, но не ограничиваются этим, известные молекулярные методы. В качестве примера, для определения ингибирующего и/или стимулирующего эффекта химерных антител против эндоглина, описанных в данной заявке, на 760()^00- или ТОР-β/А^К1-пути можно использовать вестерн-блоттинг с использованием антител, специфичных к любому из этих белков в ТОР-β/А^К5- или ТОР-)/АЕК1путях. Аналогично, для анализа ингибирующего и/или стимулирующего эффекта химерных антител, описанных в данной заявке, можно использовать детекцию мРНК или регуляцию мРНК для белков, вовлеченных в ТОР-)/АЕК5-или ТОР-)/АЕК1-пути. Дополнительные методы анализа передачи клеткой сигнала по ТОР-β/А^К5- или ТОР-β/А^К1-путям известны в данной области и рассматриваются в данном описании.

Активность химерных антител против эндоглина, описанных в данной заявке, можно оценить, используя принятые в данной области анализы, например, с использованием анализов связывания, таких как ЕЬ1§А, конкурентные ЕЬ1§А, поверхностный плазмонный резонанс, и влияния на клетки НИУЕС, как описано более подробно ниже.

Анализ УЕОР-сигнального пути и его функции

Антитела, которые специфически ингибируют связывание УЕОР с УЕОР-рецептором УЕОРК2 (КИК/Р1к-1), можно оценить, используя анализы конкурентные и/или функциональные анализы. Анализы включают, но не ограничиваются этим, конкурентные анализы на основе ЕЬ1§А. В конкурентных анализах заранее готовят смеси или смешивают УЕОР с различными количествами тестируемых антител (например, в 100-1000-кратном молярном избытке) и определяют способность тестируемых антител уменьшать связывание УЕОР с УЕОРК2. УЕОР можно предварительно метить и определять напрямую, либо можно определять, используя (вторичное) антитело против УЕОР или систему детекции с использованием вторичного и третичного антитела. ЕШЗА-формат для такого анализа конкурентного связывания представляет собой один из таких форматов, однако может быть выполнен любой тип конкурентного иммуноанализа.

Связывание УЕОР с УЕОРК2 в присутствии полностью нерелевантного антитела (включая неблокирующие моноклональные антитела против УЕОР) представляет собой контрольное высокое значение (100%) в таком конкурентном анализе. Наблюдаемое в тест-анализе значительное уменьшение связывания УЕОР с УЕОРК2 в присутствии тестируемого антитела указывает на присутствие антитела, которое значительно ингибирует связывание УЕОР с УЕОР-рецептором УЕОРК2 (КИК/Р1к-1).

Другим анализом связывания для идентификации и/или подтверждения того, что антитело ингибирует связывание УЕОР с УЕОР-рецептором УЕОРК2 (КИК/Р1к-1), является анализ копреципитации. В анализе копреципитации тестируют способность антитела блокировать связывание УЕОР с одним или более рецепторами в растворе. В таком анализе УЕОР или меченный детектируемой меткой УЕОР инкубируют с подходящей формой рецептора.

Существует много форматов для проведения анализов иммунопреципитации или копреципитации. В данном случае термин подходящая форма рецептора может относиться к рецептору УЕОРК2 или внеклеточному домену данного рецептора. Для иммунопреципитации в этом случае требуется, наряду со стандартными реагентами, присутствие антитела против рецептора УЕОРК2 или эпитопа на внеклеточном домене данного рецептора, отличного от сайта, с которым связывается УЕОР.

Вне зависимости от подходящего рецептора, анализы иммунопреципитации или копреципитации проводят вместе с контролями. Способность самого УЕОР связываться с выбранным рецептором может быть подтверждена преципитацией в отсутствие антитела против УЕОР. Могут быть проведены параллельные инкубации в присутствии или в отсутствие антитела с известными связывающими свойствами, действующего в качестве контроля. Анализы с использованием как блокирующего контрольного, так и

- 47 025367 неблокирующего контрольного антитела можно проводить параллельно.

Любые связавшиеся иммунологические структуры далее подвергают иммунопреципитации, например, путем инкубации с эффективной иммунопреципитирующей композицией, такой как композиция на основе белка А или гранулы сефарозы с белком А. Затем преципитат тестируют на присутствие УЕОР. В тех случаях, когда УЕОР при начальной инкубации представлял собой меченный детектируемой меткой УЕОР, такой как меченный радиоактивной меткой УЕОР, УЕОР можно определять непосредственно в иммунопреципитатах. Немеченый УЕОР в иммунопреципитатах можно определять с помощью других подходящих средств, например, путем разделения в геле и иммунодетекции с использованием антитела против УЕОР.

Способность антитела блокировать связывание УЕОР с рецептором УЕОР, таким как УЕОРК2, в таком анализе копреципитации можно легко определить количественно, хотя качественные результаты также чрезвычайно важны. Количественного определения можно достичь прямым измерением меченого УЕОР или, например, с использованием денситометрических анализов иммунодетектируемого УЕОР. Таким образом, можно детектировать антитела, которые демонстрируют воспроизводимую, т.е. постоянно наблюдаемую, способность ингибировать связывание УЕОР с УЕОРК2, и в соответствии с количественными критериями, представленными выше, могут быть выбраны полезные антитела.

Антитела против УЕОР, которые, по существу, не ингибируют связывание УЕОР с УЕОРрецептором УЕОРК1 (ΓΊί-1), также можно легко идентифицировать, проводя анализы копреципитации, как описано выше, но используя УЕОРК1, а не УЕОРК2. Поэтому антитела против УЕОР, которые ингибируют связывание УЕОР с УЕОР-рецептором УЕОРК2 (КЭК/Р1к-1) без значительного ингибирования связывания УЕОР с УЕОР-рецептором УЕОРК1 (Р11-1), также можно легко идентифицировать, используя такие методы.

Также можно использовать функциональные анализы для идентификации и/или подтверждения того, что антитело ингибирует в значительной степени связывание УЕОР с УЕОР-рецептором УЕОРК2 (КЭК/Р1к-1). Обычно они связаны с идентификацией УЕОРК2 как рецептора, ответственного за некоторые определенные биологические ответы. Несмотря на то, что обычно они используются реже, чем вышеописанные конкурентные анализы, которые проводят в бесклеточных системах и которые являются наиболее воспроизводимыми, надежными, менее трудоемкими и менее затратными, приведенные далее анализы тем не менее являются полезными.

Например, УЕОРК2-блокирующее антитело против УЕОР можно идентифицировать путем тестирования способности ингибировать УЕОР-опосредованный рост эндотелиальных клеток (ингибирование митогенной активности УЕОР). Можно применять любой подходящий анализ с использованием любых различных эндотелиальных клеток в присутствии УЕОР и в присутствии или в отсутствие тестируемых антител. Параллельно можно проводить повторные анализы, такие как анализы без УЕОР и анализы в присутствии контрольных антител с определенными свойствами (как блокирующих, так и неблокирующих). Можно определять и точно количественно измерять рост эндотелиальных клеток с помощью любых приемлемых средств определения числа клеток, включая колориметрические анализы.

Антитело со способностью ингибировать УЕОР-опосредованный рост эндотелиальных клеток обычно будет демонстрировать постоянно наблюдаемое ингибирование УЕОР-опосредованного роста эндотелиальных клеток, составляющее примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или около того. Ингибирование в таких диапазонах будет указывать на присутствие антитела со свойствами, достаточными для ингибирования ангиогенеза ш νί\Ό. Антитела, обладающие более значительной ингибирующей активностью, не исключаются из изобретения.

Другие функциональные анализы для идентификации антител включают анализы тестирования блокирования УЕОР-индуцированного фосфорилирования. Можно применить любой подходящий анализ с использованием любых различных эндотелиальных клеток, которые экспрессируют любую форму нативного или рекомбинантного фосфорилируемого УЕОРК2. Клетки инкубируют с УЕОР в присутствии или в отсутствие тестируемого антитела в течение подходящего периода времени. Параллельно можно проводить повторные анализы, такие как анализы без УЕОР и анализы в присутствии контрольных антител с определенными свойствами (как блокирующих, так и неблокирующих).

Другими функциональными анализами для идентификации УЕОРК2-блокирующих антител против УЕОР по настоящему изобретению являются анализы тестирования ингибирования УЕОР-индуцированной сосудистой проницаемости. Несмотря на то, что можно использовать любой такой анализ, одним из подходящих анализов является анализ проницаемости по Майлсу (МПек), когда животным, таким как морские свинки, инъецируют краситель, такой как синий краситель Эванса, и появление красителя в коже животного определяют после введения УЕОР в присутствии или в отсутствие тестируемых антител. Параллельно можно проводить повторные анализы, такие как анализы без УЕОР и анализы в присутствии контрольных антител с определенными свойствами (как блокирующих, так и неблокирующих). Присутствие красителя в коже животного обычно проявляется в виде пятен, например, синих пятен, на спине животного, которые могут быть сфотографированы и измерены.

- 48 025367

8СГО/бестимусные мыши

В одном из методов анализа опухолевого роста используют 8СГО-мышей (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, от англ. зеуеге тотЬтей ^ттиηοйеΠс^еηсу). как приведено ниже: субконфлюэнтные клетки меланомы человека М21 собирают, промывают и ресуспендируют в стерильном РВ8 (20 χ 10⁶ на один мл). 8СГО-мышам инъецируют подкожно по 100 мкл суспензии клеток меланомы человека М21 (2 χ 10⁶). Через трое суток после инъекции опухолевых клеток мышей либо не обрабатывают, либо обрабатывают внутривенно или внутрибрюшинно (например, 100 мкг/мышь) одной или более чем одной контрольной или тестируемой композицией. Мышей обрабатывают один раз в сутки в течение 24 суток. Размер опухоли измеряют циркулем и объем оценивают, используя формулу У = (Ь χ \ν²)/2, где У представляет собой объем, Ь представляет собой длину, и представляет собой ширину.

В одном из способов анализа опухолевого роста используют бестимусных мышей, как приведено ниже: опухолевые клетки МОА-МВ-435 (0,4 χ 10⁶ клеток/мышь) в 50 мкл РВ8 ортотопически имплантируют в жировую ткань молочной железы самкам бестимусных мышей (в возрасте пяти-шести недель). Когда опухоли достигают среднего объема приблизительно 50-80 мм³, мышей рандомизируют (по меньшей мере 10/группу) и начинают внутривенную или внутрибрюшинную обработку два раза в неделю одним или более чем одним антителом в концентрации 1 мкг (0,05 мг/кг) на одну дозу, 10 мкг (0,5 мг/кг), 100 мкг (5 мг/кг) или 200 мкг (10 мг/кг), либо 100 мкг контрольного антитела в 100 мкл РВ8, либо 100 мкл разбавителя РВ8; в некоторых исследованиях также можно оценивать необработанную группу. Размер опухоли измеряют циркулем и объем оценивают, используя формулу У = (Ь χ \ν²)/2, где У представляет собой объем, Ь представляет собой длину, и представляет собой ширину.

Модели сингенных мышей ВАЬВ/с

Альтернативно, для оценки опухолевого роста и его ингибирования антителами, описанными в данной заявке, также могут быть использованы модели сингенных мышей ВАЬВ/с, как проиллюстрировано, например, в Тзире еΐ а1., Ιηΐ. ί. Ο^οίο^, 29: 1087-1094 (2006).

Химерные мыши

В другом анализе измеряют ангиогенез с использованием мышиной модели химерная мышь:человек, и его обозначают как анализ с использованием химерных мышей. Данный анализ описан подробно другими авторами и дополнительно был описан в данной заявке для оценки ангиогенеза, неоваскуляризации и регрессии опухолевых тканей. См. Уап еΐ а1. (1993) ί. СЬп. 1пуе8Ь, 91: 986-996.

Анализ с использованием химерных мышей является полезной моделью для анализа ангиогенеза ίη νίνο, поскольку трансплантируемые кожные лоскуты гистологически очень напоминают нормальную человеческую кожу, и неоваскуляризация целой ткани происходит, когда настоящие человеческие кровеносные сосуды прорастают из пересаженной человеческой кожи в человеческую опухолевую ткань, расположенную на поверхности пересаженной человеческой кожи. Начало неоваскуляризации в человеческом трансплантате может быть продемонстрировано с использованием иммуногистохимического окрашивания новообразованной сосудистой сети на специфические маркеры эндотелиальных клеток человека.

Анализ с использованием химерных мышей демонстрирует регрессию неоваскуляризации на основе как количества новых сосудов, так и степени регрессии роста новых сосудов. Кроме того, он прост для мониторинга влияния на рост любой ткани, трансплантированной на пересаженную кожу, такой как опухолевая ткань. И наконец, данный анализ является полезным, поскольку существует внутренний контроль токсичности в данной аналитической системе. Химерную мышь подвергают воздействию какоголибо тестируемого реагента, и, следовательно, состояние здоровья мыши является показателем токсичности. Другие животные модели, описанные в данной заявке и известные в данной области, также могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке.

Анализ с использованием глаза кролика

Другим способом оценки ангиогенеза является модель глаза кролика ίη νίνο, и его обозначают как анализ с использованием глаза кролика. Анализ с использованием глаза кролика описан подробно другими авторами и был использован для оценки как ангиогенеза, так и неоваскуляризации в присутствии ингибиторов ангиогенеза, как проиллюстрировано в О’АтаЮ еΐ а1. (1994) Ртос. Νηΐ1. Асай. 8ск И8А, 91(9): 4082-4085.

Анализ с использованием глаза кролика является признанной моделью анализа ангиогенеза ίη νίνο, поскольку за процессом неоваскуляризации, проиллюстрированным прорастанием кровеносных сосудов кролика от края роговицы внутрь роговицы, легко наблюдать через прозрачную по своей природе роговицу глаза. Кроме этого, и степень и уровень стимуляции или ингибирования неоваскуляризации или регрессии неоваскуляризации можно легко регистрировать во времени.

И наконец, кролика подвергают воздействию какого-либо тестируемого реагента, и, следовательно, состояние здоровья кролика является показателем токсичности тестируемого реагента.

Кратко, проводят анализы с использованием хорионаллантоисной мембраны (САМ) цыпленка и влияние на развитие сосудистой сети регистрируют через 48 ч после имплантации гранулы из 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозы, содержащей одно или более чем одно контрольное или тестируемое соедине- 49 025367 ние. Неоваскуляризацию роговицы индуцируют имплантацией гранулы из поли(гидроксиэтилметакрилата) (гидрон; 1п1сгГсгоп 8аепсек, Νον Втцпктеюк, N1). содержащей 650 нг сильнодействующего ангиогенного белка основного фактора роста фибробластов (ЬРОР), связанного с сукральфатом (сахароза, алюминий, сульфат; ВикЬ МейЬес, СорепЬадеп). Добавление сукральфата к грануле защищает ЬРОР от деградации и обеспечивает его медленное высвобождение, вызывая таким образом устойчивый агрессивный ангиогенез, который более выражен, чем индуцированный только ЬРОР/гидроном. Высвобождение ЬРОР из гранул, содержащих сукральфат/гидрон, можно определять ίη νίίτο в течение до 4 суток включительно после образования таких гранул, по сравнению только с 1 сутками для гранул, содержащих лишь гидрон. Гранулы делают путем смешивания 110 мкл физиологического раствора, содержащего 12мкг рекомбинантного ЬРОР (Такейа, Окака), с 40 мг сукральфата; эту суспензию добавляют к 80 мкл 12%-ного (мас/об.) гидрона в этаноле. Затем, используя пипетку, аликвоты (10 мкл) этой смеси наносят на тефлоновые штифты и оставляют высыхать, получая приблизительно 17 гранул.

Гранулу имплантируют в роговичные карманы каждого глаза подвергнутой анестезии самки новозеландского белого кролика в 2 мм от края с последующим однократным местным нанесением на поверхность роговицы эритромициновой мази. Гистологическое исследование в последующие дни демонстрирует прогрессирующее прорастание кровеносных сосудов в роговицу в направлении гранулы с наблюдаемыми очень редкими воспалительными клетками. Этот ангиогенный ответ не изменяется в результате серьезного подавления иммунитета при облучении всего организма, и гранулы с одним только сукральфатом не индуцируют ангиогенез. Новые сосуды главным образом индуцируются ЬРОР, а не воспалением. Животным один раз в сутки, начиная с 2-х суток после имплантации, вводят посредством желудочного зонда одно или более соединений, суспендированных в 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозе, или только разбавитель. Подвергаемые иммуносупрессивной терапии животные получают облучение всего организма (6 Гр) в течение 6 мин непосредственно перед имплантацией гранул. Эта доза облучения приводит к развитию заметной лейкоцитопении с более чем 80%-ным уменьшением числа лейкоцитов на 2-е сутки и более чем 90%-ным уменьшением на 3-и сутки, результаты, которые согласуются с предварительными сообщениями.

Животных обследует один раз в двое суток, используя щелевую лампу с экраном, один и тот же специалист по роговице (М.8.Ь.). Зону неоваскуляризации роговицы определяют путем измерения с использованием окулярной сетки длины сосудов (Ь) от края и количества сегментов циферблата (С) от края. Для определения площади сегмента круговой зоны используют формулу: С/12 х 3,1416 [г² - (г - Ь)²], где г = 6 мм, измеренный радиус роговицы глаза кролика. Измеряют равномерно распределенную сплошную зону неоваскуляризации, прилегающую к грануле, таким образом можно оценить общее ингибирование неоваскуляризации.

Анализы ангиогенеза на мышах с использованием вставки из матригеля

Для подтверждения эффектов композиции на ангиогенез может быть применен анализ ангиогенеза на мышах с использованием вставки из матригеля. Различные ростовые факторы (например, 1ОР-1, ЬРОР или VЕОР) (250 нг) и гепарин (0,0025 единиц на мл) смешивают с матригелем, характеризующимся пониженным содержанием ростовых факторов, как описывалось ранее (Мойекапо, е1 а1., ί. Се11 Βίοι., 1983, 97: 1648-1652; 8(еГапккоп, е1 а1., ί. Вю1. Скет., 2000, 276: 8135-8141). Композиции, описанные в данной заявке, или контрольные антитела могут быть включены в препараты матригеля для использования в одной или более группах дозировок у животных. В контрольных экспериментах матригель готовят в отсутствие ростовых факторов. Мышам подкожно инъецируют 0,5 мл препарата матригеля и оставляют инкубироваться в течение одной недели. После периода инкубации мышей умерщвляют и полимеризованные вставки из матригеля извлекают хирургическим путем. Ангиогенез внутри вставок из матригеля количественно определяют, используя два общепризнанных метода, включая иммуногистохимический анализ и определение содержания гемоглобина (РитйепЬегдет, е1 а1., Ьапсе1, 2002, 3: 298-302; ^1рей, е1 а1., Сапсег Се11, 2002, 2(6): 473-83; и 8и, е1 а1., Сапсег Кек., 2003, 63: 3585-3592). Для иммуногистохимического анализа вставки из матригеля погружают в ОСТ, быстро замораживают и готовят срезы толщиной 4 мкм. Замороженные срезы фиксируют в смеси метанол/ацетон (1:1). Замороженные срезы окрашивают поликлональным антителом против СЭ31. Ангиогенез количественно определяют по плотности капилляров, подсчитанной в 20 полях высокомощного (200х) микроскопа.

Содержание гемоглобина можно определить количественно, как описано ранее (8сЬпарег, е1 а1., ί. Се11 РЬуяоЦ 1993, 256: 235-246; Мойекапо, е1 а1., ί. Се11 Вю1. ,1983, 97: 1648-1652; 81еГапккоп, е1 а1., ί. Вю1. СЬет., 2000, 276: 8135-8141; и О1дЬ, е1 а1., ί. 1ттипо1. 1986, 100: 1154-1164). Имплантаты матригеля быстро замораживают на сухом льду и лиофилизируют в течение ночи. Высушенные имплантаты ресуспендируют в 0,4 мл 1,0%-ного сапонина (Са1ЬюсЬет) в течение 1 ч и разрушают энергичным пипетированием. Препараты центрифугируют при 14000 х д в течение 15 мин для удаления всех твердых частиц. Концентрацию гемоглобина в супернатанте затем определяют непосредственно путем измерения поглощения при 405 нм и сравнивают со стандартной концентрацией очищенного гемоглобина.

Методы анализа клеточной миграции

Анализы клеточной миграции были описаны в литературе, например, в Вгоокк, е1 а1., ί. СЬп. 1^екк,

- 50 025367

1997, 99: 1390-1398, и методы измерения клеточной миграции известны специалистам в данной области. В одном из методов измерения клеточной миграции, описанных в данной заявке, на мембраны из камер Тгап5\уе11 для изучения миграции наносят субстрат (здесь эндоглин и/или УЕСР), камеры Тгап5\уе11 промывают и участки неспецифического связывания блокируют с помощью ВЗА Опухолевые клетки из субконфлюэнтных культур собирают, промывают и ресуспендируют в буфере для анализа миграции в присутствии или в отсутствие антител для анализа. После того, как опухолевым клеткам позволяют мигрировать под мембраны Тгаик^еН с покрытием, клетки, оставшиеся над мембраной, удаляют, а клетки, которые мигрировали через нее, окрашивают кристаллическим фиолетовым. Затем клеточную миграцию определяют количественно путем прямого подсчета числа клеток в поле микроскопа.

Методы анализа клеточной пролиферации

Клеточную пролиферацию можно анализировать методами, известными специалистам в данной области. Как описано в данной заявке, субконфлюэнтные эндотелиальные клетки человека (НиУЕС) могут быть ресуспендированы в буфере для пролиферации, содержащем низкое количество (5,0%) сыворотки в присутствии или в отсутствие СМ (25 мкл) из клеток ЕСУ или ЕСУЬ, и эндотелиальные клетки оставляют пролиферировать в течение 24 ч. Пролиферацию можно определить количественно путем измерения активности митохондриальной дегидрогеназы с использованием имеющегося в продаже набора для анализа ^8Т-1 (СЬетюоп). Кроме того, как описано в данной заявке, пролиферацию можно определить количественно путем измерения включения ³Н с использованием стандартных методов (8Пе е! а1., ГОБ ί. Сапсег, 108: 251-257 (2004)).

Другие способы оценки клеточной пролиферации известны в данной области и рассматриваются в данном описании. Другие неограничивающие примеры более подробно описаны в примерах.

Способы индукции СЭС, АЭСС и опсонизации

На усиление природного иммунного ответа организма на трансформированные клетки были направлены различные терапии. Традиционные эффекторные способы включают комплемент-зависимый цитолизис (СЭС), антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) и фагоцитоз (клиренс посредством ретикулоэндотелиальной системы после того, как клетка-мишень покрывается иммуноглобулином). Известно, что в присутствии антител некоторые эффекторные клетки, такие как лимфоидные клетки, имеющие связанные с поверхностью рецепторы для Рс-областей антител, опосредуют реакцию антителозависимой клеточной цитотоксичности (АИСС) против клеток-мишеней. Посредством АИСС эти эффекторные клетки демонстрируют цитолитическую активность против таких клеток-мишеней.

Были продемонстрированы два типа реакций АИСС ш уйго. В классических реакциях АИСС эффекторные клетки прикрепляются к покрытым антителами клеткам-мишеням и после этого вызывают цитолизис клеток-мишеней (А. Н. СгеепЬегд е! а1., СПагасйгкПск 0П ТПе ЕППесГОг Се1к Меб1айпд Су1о1ох1сйу АдапГО АпйЬобу-Соа1еб Тагде! Се1к, ГОипипокду, 21, р. 719 (1975)). Такое прикрепление эффекторной клетки к клетке-мишени является результатом взаимодействия Рс-области антитела, покрывающего клетку-мишень, и Рс-рецептора эффекторной клетки. Одним из недостатков этого типа реакции АИСС является то, что ее протекание может быть затруднено циркулирующими в крови комплексами антиген-антитело, часто ассоциированными с различными заболеваниями, которые конкурируют со связанным с клеткой-мишенью антителом за Рс-рецепторы на эффекторных клетках (I. С. М. МасЬеипап, СотреППоп Рог Кесер1ог8 Рог ГО1типод1оЬиПп 0п СуГОГОхю БутрНосу1е5, СПп. Ехр. Iттипо1., 10, р. 275 (1972)). В связи с таким недостатком классической АИСС можно использовать второй тип реакции АИСС - антитело-направленную АИСС. При антитело-направленной АИСС специфичное к мишени антитело первоначально прикрепляется к эффекторной клетке, и полученный комплекс затем направляется, при посредничестве антитела, к его специфичному антигену на поверхности клетки-мишени. Предпочтительно, когда на антитело-направленную АИСС может не влиять присутствие комплексов антигенантитело, циркулирующих в системе хозяина. Взаимодействие между антителами и эффекторными клетками путем присоединения Рс-области к Рс-рецептору в норме является слабым. И в некоторых случаях антитела не остаются ассоциированными с эффекторными клетками в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить лизис клеток-мишеней. В свете этой возможной проблемы, антитела были присоединены к эффекторным клеткам с использованием предварительной обработки полиэтиленгликолем и смесью фталатных масел (ί. Р. 1опе8 апб И. М. 8еда1, АпНЬобу-Иерепбей Се11 Меб1а1еб Су1о1у818 (АИСС) ^ίΐΠ АпПЬобу-Соайб ЕПссЮп,: №\у МеГОобк Рог ЕпПапсшд АпНЬобу Вшбшд Апб Су1о1у818, ί. Iттипо1., 125, рр. 926-33 (1980)). Однако применимость этого способа для обработок ш угуо может быть снижена из-за токсичных эффектов, которые могут оказывать на организм любые остатки полиэтиленгликоля и фталатного масла на комплексе антитело-эффекторная клетка.

Альтернативно, был предложен способ усиления антитело-направленной АИСС посредством адъювантной химиотерапии цитотоксичными лекарственными средствами (I. К. Маскау е! а1., ЕПсс! 0п №йига1 КШег Апб АпНЬобу-Оерепбеп1 Се11и1аг СуЮохюйу 0П Абщуап! СуЮЮхю СПетоГОегару !пс1иб1пд Ме1рПа1ап ГО ВгеаЧ Сапсег, Сапсег Iттипо1. ГОппипоПюг., 16, рр. 98-100 (1983)). Анализы тестирования АЭСС хорошо известны в данной области, такие как, например, описанные в патенте США № 5756097.

Соответственно, согласно воплощениям настоящего изобретения предложены антитела, которые могут связываться с клетками, играющими роль в неоваскуляризации или ангиогенезе, или которые мо- 51 025367 гут усиливать фагоцитоз и киллинг клеток и поэтому улучшать защиту ίη νί\Ό. Также предложены другие антитела и их функциональные фрагменты, которые являются иммунореактивными, специфически связываются или предпочтительно связываются с сайтом связывания или эпитопом, с которым такие антитела могут связываться, и которые оказывают такой же эффект.

Антитела также могут быть опсоническими или демонстрировать опсоническую активность в отношении клеток, играющих роль в неоваскуляризации или ангиогенезе (например, эндотелиальных клеток). Как понятно специалистам в данной области, опсоническая активность относится к способности опсонина (обычно либо антитела, либо сывороточного фактора С3Ь) связываться с антигеном или клеточным рецептором для стимуляции прикрепления антигена или клеточного рецептора к фагоциту и посредством этого усиления фагоцитоза. Некоторые клетки становятся чрезвычайно привлекательными для фагоцитов, таких как нейтрофилы и макрофаги, когда они покрыты опсоническим антителом, и скорость их клиренса из кровотока поразительным образом увеличивается. Опсоническую активность можно измерить любым традиционным методом, описанным, например, в патенте США № 6610293.

В другом неограничивающем воплощении пациент, имеющий неоваскулярное расстройство или ангиогенез-зависимое расстройство, выделяет (к1ебк) антигены/пептиды (например, эндоглин), имеющие отношение к ангиогенезу. Эти антигены/пептиды могут представлять собой опухолеассоциированные антигены. Таким пациентам можно системно вводить антитело к антигену/пептиду (например, эндоглину) и инициировать у них любой из путей, описанных в данной заявке, чтобы индуцировать СОС, ΑΩΡΌ опсонизацию или любую другую форму клеточно-опосредованного киллинга.

Дополнительные анализы

Для тестирования эффекта композиций, описанных в данной заявке, также можно использовать другие анализы, известные в данной области, такие как, например, анализы, описанные ниже в Примерах.

Упаковки и наборы

В других воплощениях настоящее изобретение относится к наборам для применения вместе с соединениями, описанными выше. В наборе могут быть предложены химерные антитела, которые предпочтительно связываются с эндоглином, и антитела, которые предпочтительно связываются с УЕСР. Наборы могут включать одно или более подходящих контейнерных средств.

Контейнерные средства в наборах обычно будут включать по меньшей мере один флакон, тестпробирку, колбу, бутылку, шприц и/или другие контейнерные средства, в которые может быть помещен и/или предпочтительно соответственно расфасован по аликвотам по меньшей мере один полипептид. Наборы могут включать средство для содержания в нем по меньшей мере одного слитого белка, детектируемой группировки, репортерной молекулы, и/или любые другие контейнеры для реагентов в закрытом состоянии для продажи на рынке. Такие контейнеры могут включать пластиковые контейнеры, полученные литьем под давлением и/или литьем с раздувом, в которых хранят целевые флаконы. Наборы также могут включать отпечатанную инструкцию по применению таких материалов в наборе.

Упаковки и наборы дополнительно могут включать буферный агент, консервант и/или стабилизирующий агент в препарате. Каждый компонент набора может быть заключен в индивидуальный контейнер, и все различные контейнеры могут находиться в одной упаковке. Наборы могут быть сконструированы для хранения в холодильнике или для хранения при комнатной температуре.

Кроме того, данные препараты могут содержать стабилизаторы для увеличения срока годности наборов и включают, например, бычий сывороточный альбумин (ΒδΑ). Если композиции являются лиофилизированными, то набор может содержать дополнительные препараты растворов для разведения лиофилизированных препаратов. Приемлемые растворы для разведения хорошо известны в данной области и включают, например, фармацевтически приемлемый, забуференный фосфатами физиологический раствор ^Βδ).

Кроме того, упаковки или наборы, предложенные в данном изобретении, могут дополнительно включать любую из других группировок, предложенных в данном изобретении, таких как, например, одна или более репортерных молекул и/или одна/один или более детектируемых группировок/агентов.

Упаковки и наборы могут дополнительно включать один или более компонентов для анализа, такого как, например, ΕΠδΑ-анализ. Образцы, подлежащие тестированию в данной заявке, включают, например кровь, плазму, срезы ткани/опухоли и выделения, мочу, лимфу и их продукты. Упаковки и наборы могут дополнительно включать один или более компонентов для сбора образца (например, шприц, колпачок, тампон и т.д.).

Упаковки и наборы могут дополнительно включать этикетку, уточняющую, например, описание продукта, способ введения и/или показание для лечения. Упаковки, предложенные в данном изобретении, могут содержать любую из композиций, описанных в данной заявке. Упаковка может дополнительно включать маркировку для лечения различных форм рака и их метастазов.

Термин упаковочный материал относится к физической структуре, в которой размещены компоненты набора. Упаковочный материал помогает сохранить компоненты стерильными и может быть сделан из материала, обычно используемого для таких целей (например, из бумаги, гофрированного карто- 52 025367 на, стекла, пластика, фольги, ампул и т.д.). Этикетка или вкладыш в упаковку могут включать соответствующие письменные инструкции. Поэтому наборы могут дополнительно включать в себя этикетки или инструкции по применению компонентов набора в любом способе, описанном в данной заявке. Набор может содержать соединение в упаковке или диспенсере вместе с инструкциями по введению соединения в способе, описанном в данной заявке.

Также предложены наборы, которые используются в диагностических методах и анализах, описанных в данной заявке. В некоторых воплощениях набор содержит реагенты для детекции гена или генов, уровни экспрессии которых коррелировали с чувствительностью или устойчивостью к ингибитору ангиогенеза в образце раковых клеток от пациента. В некоторых воплощениях этот ген или эти гены выбраны УЕОР, рецептора УЕОР и СЭ105. В некоторых воплощениях набор содержит УЕОР. В некоторых воплощениях набор содержит рецептор УЕОР. В некоторых воплощениях набор содержит ί'Ό105. В некоторых воплощениях набор содержит по меньшей мере два из УЕОР, рецептора УЕОР и ί'Ό105. В некоторых воплощениях набор содержит по меньшей мере два гена, которые коррелировали с чувствительностью к ингибитору ангиогенеза. В некоторых воплощениях набор содержит по меньшей мере два гена, которые коррелировали с устойчивостью к ингибитору ангиогенеза. В некоторых воплощениях набор содержит по меньшей мере один ген, который коррелировал с чувствительностью к ингибитору ангиогенеза, и один ген, который коррелировал с устойчивостью к ингибитору ангиогенеза.

В других воплощениях набор содержит реагенты для детекции уровней экспрессии УЕОР, рецептора УЕОР и ί'Ό105 в образце опухолевых клеток от пациента, подлежащего лечению; и дозу или дозы ингибитора, включая, но не ограничиваясь этим, антитела, описанные в данной заявке, в различных лекарственных формах, таких как капсулы, каплеты, желатиновые капсулы, порошки для суспензий и т.д. Также предполагается, что наборы, содержащие реагенты для детекции уровней экспрессии УЕОР, рецептора УЕОР и ί'Ό105 в образце опухолевых клеток от пациента, подлежащего лечению, будут дополнительно содержать любое из вышеупомянутых воплощений наборов для совместного введения по меньшей мере одного дополнительного ингибитора ангиогенеза.

Инструкции могут включать инструкции по практическому применению любого из способов, описанных в данной заявке, включающих способы лечения. Инструкции могут дополнительно включать указания относительно удовлетворительного клинического результата или любых неблагоприятных симптомов, которые могут иметь место, или дополнительную информацию, требуемую регулирующими органами, такими как Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, для применения на субъекте-человеке.

Инструкции могут быть представлены в виде печатной продукции, например, на бумаге или картоне, помещенных внутрь набора или прикрепленных к нему, или на этикетке, прикрепленной к набору или упаковочному материалу, либо присоединенной к флакону или пробирке, содержащим компонент набора. Инструкции могут дополнительно содержаться на носителе, считываемом компьютером, таком как диск (гибкая дискета или жесткий диск), оптический СО, такой как СО- или ОУЭ-КОМ/КАМ, магнитная лента, электрические накопители, такие как КАМ и КОМ, носитель на интегральных схемах 0С ίίρ) и их гибриды, такие как магнитные/оптические накопители.

Подразумевается, что воплощения соединений и способов по настоящему изобретению являются иллюстративными и неограничивающими. Специалистом в данной области могут быть сделаны модификации и вариации в свете приведенных выше разъяснений, в особенности тех, которые могут относиться к изменениям в химерных антителах, которые связываются с эндоглином, близким к описанным модификациям с сохранением приближенной к нативной функциональности в отношении связывания эндоглина. Поэтому следует понимать, что изменения могут быть сделаны в конкретных описанных воплощениях, которые находятся в пределах объема того, что описано.

Примеры

Данное изобретение может быть лучше понято со ссылкой на следующие далее неограничивающие примеры, которые приведены в качестве типичных воплощений применения. Следующие далее примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать типичные воплощения, и, однако, их не следует рассматривать как ограничивающие широкий объем изобретения. Хотя некоторые воплощения настоящего изобретения показаны и описаны в данном описании, очевидно, что такие воплощения приведены только в качестве примера. Могут иметь место многочисленные вариации, изменения и замены; следует понимать, что при практическом воплощении способов, описанных в данной заявке, можно использовать различные альтернативы воплощений, описанных в данном описании изобретения.

Пример 1

ВШсою-анализ (поверхностный плазмонный резонанс: 8РК)

Связывание химерных антител против эндоглина

Аффинность антител можно оценить, используя, например, ВШсою-анализ с использованием стандартных протоколов. Кратко, антитело против гистидиновой метки связывают с ВШсоге-чипом для захвата Н18-меченного рекомбинантного эндоглина человека, который, в свою очередь, используют для измерения связывания химерного антитела против эндоглина. Разработку 8РК-анализа проводят как минимум для 2 партий приготовленных чипов плюс 8 аналитических партий. При разработке анализа оце- 53 025367 нивают следующие параметры:

(а) Связывание антитела против гистидина с чипами СМ5 Антитела против гистидиновой метки связывают с чипом СМ5 В^готе при помощи обычного химического взаимодействия аминов с использованием ЕБС/ΝΗδ (М(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид/Мгидроксисукцинимид). Условия реакции (концентрация и рН) следует оптимизировать.

(б) Связывание эндоглина человека и регенерация биосенсорного чипа

Условия тестируют в отношении связывания эндоглина человека и регенерации чипа с использованием различных буферов (с учетом предыдущего опыта) для элюирования связанного антитела. После разработки способа-кандидата для регенерации измеряют связывающую способность и фоновый сигнал для поверхности одного чипа в течение по меньшей мере 25 циклов. Целью является получение среднего превышения над фоновым сигналом менее 10 КИ (резонансных единиц) за цикл и уменьшения емкости менее 1% за цикл.

(в) Связывание эндоглина человека

Измеряют зависимость ответа от дозы эндоглина человека с целью определения подходящей концентрации для достижения максимального связывания.

(г) Связывание химерного антитела против эндоглина

Измеряют зависимость ответа от дозы химерного антитела против эндоглина с целью определения подходящего диапазона для кинетических или равновесных экспериментов по связыванию (которые могут включать в себя сравнение относительных кинетических констант к_а и к,| или сравнение относительной активности методом параллельных профилей).

(д) Предварительные эксперименты для подтверждения достоверности

Эксперименты по связыванию повторяют по меньшей мере три раза в выбранных условиях, используя разные чипы, разные проточные ячейки и в разных обстоятельствах для получения предварительной информации о точности и достоверности измерений. Все эксперименты с использованием В^готе проводят при 25°С в рабочем буфере ΗΒδ-ЕР.

Связывание антитела против УЕОР

Аффинность антител можно оценить, используя, например, В^тою-анализ с использованием стандартных протоколов. Кратко, антитело против гистидиновой метки связывают с чипом ВМ^ге для захвата Ηίδ-меченного рекомбинантного УЕОР человека, который в свою очередь будет использован для измерения связывания антитела против УЕОР. Разработку δΡΚ-анализа проводят как минимум для 2 партий приготовленных чипов плюс 8 аналитических партий. При разработке анализа оценивают следующие параметры:

(а) Связывание антитела против гистидиновой метки с чипами СМ5 Антитело против гистидиновой метки связывают с чипом СМ5 В^готе при помощи обычного химического взаимодействия аминов с использованием ЕБС/ΝΗδ. Условия реакции (концентрация и рН) следует оптимизировать.

(б) Связывание УЕОР человека и регенерация биосенсорного чипа Условия тестируют в отношении связывания УЕОР человека и регенерации чипа с использованием различных буферов (с учетом предыдущего опыта) для элюирования связанного антитела. После разработки способа-кандидата для регенерации измеряют связывающую способность и фоновый сигнал для поверхности одного чипа в течение по меньшей мере 25 циклов. Целью является получение среднего превышения над фоновым сигналом менее 10 КИ за цикл и уменьшения емкости менее 1% за цикл.

(в) Связывание УЕОР человека

Измеряют зависимость ответа от дозы УЕОР человека с целью определения подходящей концентрации для достижения максимального связывания.

(г) Связывание антитела против УЕОР

Измеряют зависимость ответа от дозы химерного антитела против УЕОР с целью определения подходящего диапазона для кинетических или равновесных экспериментов по связыванию (которые могут включать в себя сравнение относительных кинетических констант к_а и к,| или сравнение относительной активности методом параллельных профилей).

(д) Предварительные эксперименты для подтверждения достоверности

Эксперименты по связыванию повторяют по меньшей мере три раза в выбранных условиях, используя разные чипы, разные проточные ячейки и в разных обстоятельствах для получения предварительной информации о точности и достоверности измерений. Все эксперименты с использованием В^готе проводят при 25°С в рабочем буфере Μδ-ЕР.

Пример 2

ЕЬГОА для связывания химерного антитела против эндоглина

ЕЬГОА можно использовать для анализа связывания химерных антител против эндоглина с эндоглином. Кратко, ЕЬГОА проводят согласно приведенным ниже стадиям.

1. Наносят на планшет Мтс Μη.χίδοΓρ ΜАΒ9811-01 (поликлональное антитело против эндоглина) в концентрации 1500 нг/мл в ΡΒδ, 100 мкл/лунка. Герметично закрывают планшет и инкубируют в течение ночи (16-24 ч) при 4°С.

2. Промывают планшет 2 раза 200 мкл ΡΒδ (не содержащего твина).

- 54 025367

3. Добавляют ВЗА-содержащий блокирующий раствор (1% ВЗА) в количестве 200 мкл/лунка и инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре.

4. Промывают планшет 3 раза РВЗ, содержащим твин (РВЗ-Т), используя устройство для промывки планшетов ВюТек.

5. Добавляют СИ105 (№ по каталогу К&И Зу51ет5 1097ΈΝ) в количестве 100 мкл/лунка в концентрации 100 нг/мл в РВЗ-Т с 0,1% ВЗА и инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре.

6. Промывают планшет 3 раза РВЗ-Т, используя устройство для промывки планшетов ВюТек.

7. В тестовые лунки: добавляют химерные антитела против эндоглина в концентрации 20, 10, 4, 2, 1, 0,5 и 0,2 нг/мл (разбавленные РВЗ-Т с 0,1% ВЗА) в количестве 100 мкл/лунка и инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре. В лунки с отрицательными контролями: добавляют подходящее по изотипу контрольное антитело в количестве 100 мкл/лунка.

8. Промывают планшет 3 раза РВЗ-Т, используя устройство для промывки планшетов ВюТек.

9. Во все лунки добавляют антитела козы против 1дО человека, конъюгированные с НКР (пероксидазой хрена) (1аск5оп 1ттипоге5еагсЬ), разбавленные 1:10000 в РВЗ-Т с 0,1% ВЗА, в количестве 100 мкл/лунка; инкубируют в течение 30-60 мин при комнатной температуре.

10. Промывают планшет 5 раз РВЗ-Т, используя устройство для промывки планшетов ВюТек.

11. Добавляют раствор субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) в количестве 100 мкл/лунка и инкубируют незакрытым в темноте в течение 15 мин.

12. Останавливают реакцию добавлением стоп-раствора ТМВ в количестве 100 мкл/лунка.

Образцы анализируют в трех параллелях и для построения стандартной кривой и определения константы связывания считывают оптическую плотность. Проводят статистический анализ, используя критерий Стьюдента или другой стандартный критерий.

Следует понимать, что аналогичный протокол можно использовать для тестирования связывания антител с УЕОР.

Пример 3

Авидность антител и количество доступных эпитопов на эндоглин-экспрессирующих клетках

Авидность антител и количество доступных эпитопов на эндоглин-экспрессирующих клетках можно оценить, применяя анализы графика Скэтчарда с использованием стандартных протоколов.

Кратко, проводят анализы графика Скэтчарда для прямого связывания меченных радиоактивной меткой химерных антител против эндоглина с эндоглин-экспрессирующими лейкозными клетками КМ-3 и субконфлюентными пролиферирующими НИУЕС проводят. Очищенные антитела против эндоглина индивидуально метят радиоактивным ¹²⁵Ι, используя 1обо-Оеп и в соответствии со стандартными методами, известными специалистам в данной области. Меченные радиоактивной меткой химерные антитела против эндоглина анализируют в отношении среднего содержания атомов йода на молекулу ΙβΟ, соответственно. Для определения антиген-связывающей активности проводят эксперименты по титрованию, используя фиксированное количество (0,1 мкг) каждого '^-меченного тАЬ и эндоглин-экспрессирующие клетки КМ-3 или НИУЕС в серийных 2-кратно возрастающих концентрациях. Анализ данных по связыванию с использованием графика Скэтчарда осуществляют известными методами. В результате проведения этого анализа определяют константу равновесия и среднее максимальное количество связавшегося тАЬ на клетку.

Пример 4

Анализ блокирующей активности с использованием вестерн-блоттинга

Способность химерных антител против эндоглина блокировать СИ105-стимулированную активацию клеток, экспрессирующих СИ105, можно проанализировать с использованием вестерн-блоттинга с детекцией фосфорилирования белков, вовлеченных в сигнальный путь с участием СИ105.

Анализы с использованием вестерн-блоттинга проводили с целью идентификации фосфорилированных Зтаб1/5/8 или Зтаб2 в соответствии с известными методами вестерн-блоттинга. РЗтаб1- и РЗтаб2-Антитела специфически распознают фосфорилированный Зтаб1/5 или фосфорилированный Зтаб2 в нетрансфицированных эндотелиальных клетках. Для детекции молекул в образцах используют первичные антитела против Зтаб1, Зтаб2, Зтаб5, Ι61 (Зайа Сги/) и эндоглина. Детекцию осуществляют с использованием усиленной хемолюминесценции (ЕСЬ).

Пример 5

Ингибирование роста НИУЕС и анализ включения ³Н-тимидина

Для оценки ингибирования клеточного роста пригоден ряд анализов.

В одном из примеров НИУЕС культивируют во флаконах 75 см² (Ра1соп, ВесЮп-Июкпъоп, РгапкПп Ьаке5, Νΐ) в СО₂-инкубаторе при 37°С в субконфлюентных условиях. Клетки отделяют посредством инкубации со сбалансированным солевым раствором Хенкса вместе с 15 мМ ЕИТА в 25 мМ буфере НЕРЕЗ (№2-гидроксиэтил-пиперазин-№2-этансульфоновая кислота), рН 7,3, при 37°С в течение 15 мин. После двукратной промывки охлажденным во льду РВЗ клетки ресуспендируют в среде для роста эндотелиальных клеток в концентрации 25000 клеток/мл. В дополнительных экспериментах эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НИУЕС) суспендируют и культивируют в среде для роста эндотелиальных клеток, не содержащей РВЗ (фетальной телячьей сыворотки) и экстрактов головного мозга быка. 200 мкл

- 55 025367 аликвоту клеточной суспензии вносят в каждую лунку 96-луночных культуральных планшетов для. Клетки культивируют при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение ночи, затем добавляют в трех параллелях химерные антитела против эндоглина, антитела против УТОР, комбинацию химерных антител против эндоглина и антител против УЕОР, контрольные ЦО или ТОР-31. Культуральные планшеты выдерживают в инкубаторе в течение 72 ч, осуществляя замену в течение этого периода времени на свежие среды и антитела или контроли каждые 24 ч. В каждую лунку добавляют ³Н-тимидин (1 мкКи) и планшеты инкубируют в течение 20 ч. Клетки промывают РВЕ, затем обрабатывают смесью трипсин-ЕЭТА (0,05% трипсина; 0,53 мМ ЕЭТА) в количестве 100 мкл/лунка при 37°С в течение 15 мин. Клетки собирают на стекловолокнистых фильтрах (^а11ас РпШеб Р111егта1А), используя НагуеЧег 96 (ТОМТЕС, Натбеи, СТ), и определяют ³Н-радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном и люминесцентном счетчике Тгйих 1540 МюгоВеШ (^а11ас, Тигки, Рткшб).

Пример 6

Ингибирование роста ΗυVΕС в МТЕ-анализе(метантиосульфонатный анализ)

Для оценки ингибирования роста эндотелиальных клеток пригоден ряд анализов.

В одном из примеров ΗυVΕС культивируют в 96-луночных планшетах (Ра^ш Βесίοη-^^ск^η8οη, РюмИю Ьакек, Νί) в СО₂-инкубаторе при 37°С в субконфлюентных условиях в количестве 5000 клеток на лунку в среде ЕОМ-2 (среда-2 для выращивания эндотелиальных клеток) (ΟοικίΚδ, ^аНе^Ше, МО), содержащей 0,5% фетальной телячьей сыворотки и 30 нг/мл УЕОР. Клетки оставляют прикрепляться к культуральному флакону по меньшей мере на 24 ч и затем инкубируют с антителом против УЕОР в присутствии или в отсутствие химерного антитела против эндоглина. Культуральные планшеты выдерживают в инкубаторе в течение 72 ч, осуществляя замену в течение этого периода времени на свежие среды и антитела или контроли каждые 24 ч. Через трое суток обработки антителом в лунки добавляют МТЕтетразолиевое соединение на один час и количественно определяют абсорбцию при 490 нм в соответствии с инструкциями производителя (Се11 ТНег 96 Α^иеοи5 Оне δοϊιιΐίοη Се11 Рю^ю^м Аккау, Рготеда). Все образцы измеряют в трех параллелях.

Пример 7

Анализ ингибирования миграции клеток

Миграцию (хемокинез) как меру клеточной пролиферации и активации измеряют, используя камеру Бойдена.

Кратко, миграцию клеток оценивают следующим образом: нуклеопоровый фильтр Сο8ίа^ (поры 8 мм) покрывают фибронектином в течение ночи при 4°С. Камеру промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВЕ) и нижнюю камеру заполняют ЭМЕМ (среда Игла, модифицированная Дульбекко), содержащей или не содержащей сыворотку, и содержащей или не содержащей ТОР-33. Клетки трипсинизируют и суспендируют в конечной концентрации 50000 клеток/мл в ЭМЕМ в присутствии контрольного антитела, химерного антитела против эндоглина, антитела против УЕОР или их комбинации. В верхнюю камеру добавляют 150 мкл аликвоту клеточной суспензии и инкубируют при 37°С. Через 16 ч клетки промывают и верхнюю поверхность вытирают для удаления немигрировавших клеток. Мембраны фиксируют в метаноле, промывают водой, окрашивают и подсчитывают количество клеток, находящихся на нижней поверхности.

Пример 8

Анализ АЭСС

Антитела, описанные в данном описании изобретения, можно оценить по их способности генерировать ΙΕ-2-активированные природные киллерные (ΝΚ) клетки и индуцировать АЭСС, используя, например, следующие протоколы.

Выделение ΝΚ и генерация ΙΕ-2-активированных ΝΚ-клеток

РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяют и оставляют на 24 ч при 4°С в ΚРΜI с 10% РВЕ. РВМС затем помещают в ΚРΜI с 2% РВЕ (общий объем = 50 мл) и 10 мл клеточной суспензии помещают на чашку Петри. РВМС инкубируют в течение 2 ч при 37°С и неприкрепившиеся клетки собирают. ΝΚ-клетки культивируют в количестве 8 х 10⁶/мл вместе с 1000 ед./мл ΙΕ-2 в течение 48 ч, затем в условиях обычного культивирования в течение 5-8 суток, после чего используют в анализе.

Анализы природной цитотоксичности и АЭСС

ΝΚ-клетки собирают из культуры и собирают в коническую пробирку емкостью 50 мл. Клетки промывают один раз полной средой ΚРΜI и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин. Затем ΝΚ-клетки ресуспендируют в 5 мл полной среды ΚРΜI и подсчитывают их количество. Перед проведением анализа число ΝΚ-клеток нормируют к соотношению эффектор:мишень 10:1. Нормированные ΝΚ клетки высевают и в предназначенные для этого лунки добавляют 10 мкл химерных антител против эндоглина и инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Контрольные образцы включают необработанные или обработанные контрольным антителом клеточные популяции.

Интересующие клетки-мишени собирают (клетки ΗυVΕС), промывают, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин и ресуспендируют в 5 мл полной среды КРМР Клетки-мишени еще раз промывают и ресуспендируют в бессывороточной ΚРΜI до конечной концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл. Клетки- 56 025367 мишени затем метят, используя кальцеин АМ в конечной концентрации 5 мкг/мл, в течение 1 ч при 37°С, затем дважды промывают полной средой КРМ1. Клетки-мишени затем ресуспендируют и добавляют в лунки с NΚ-клетками. Комбинацию клетки-мишени/NΚ-клетки инкубируют при 37°С в течение 4 ч. После инкубации планшеты центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин, клетки промывают и ресуспендируют в ЭРВБ (фосфатно-солевой буфер Дульбекко). Флуоресценцию считывают, используя возбуждение/эмиссию 450/530 нм, и эмиссия является количественным показателем киллинга клеток, опосредованного антителами.

Пример 9

Дозировки для введения

Оптимальные дозировки антител, описанных в данном описании изобретения, можно определить, используя признанные в данной области методы и как описано выше.

В одном неограничивающем воплощении антитела, описанные в данном описании изобретения, можно вводить субъекту в различных дозировках и в течение различных интервалов времени. Неограничивающие дозы включают примерно 0,01 мг/кг, примерно 0,05 мг/кг, примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 30 мг/кг или любое целое число между ними. Кроме того, доза(ы) антитела может(могут) быть введена(ы) два раза в неделю, еженедельно, каждые две недели, каждые три недели, каждые 4 недели, каждые 6 недель, каждые 8 недель, каждые 12 недель или в любой комбинации недель среди них. Также рассматриваются циклы дозирования, такие как, например, введение антител один раз или два раза в неделю в течение 4 недель, затем следуют 2 недели без терапии. Дополнительные циклы дозирования, включая, например, разные комбинации доз и еженедельные циклы, описанные в данном описании, также рассматриваются в данном изобретении.

В другом воплощении можно вводить бевацизумаб (АУАБТШ®) на основании следующих дозировок и режимов:

Тип опухоли	Режим дозирования
Резистентные солидные опухоли	Введение 2,5; 5; 7,5; 10 или 15 мг/кг внутривенно еженедельно или каждые 3 недели, затем 7,5 или 15 мг/кг внутривенно еженедельно или каждые 3 недели.
Запущенные солидные опухоли	Введение 5 или 10 мг/кг внутривенно каждые 7 или 14 суток.
Колоректальный рак	Введение 5 мг/кг внутривенно на 1-е сутки, вводя каждые 1 или 2 недели + 2 суток суммарно для трех доз.
Введение 5 мг/кг внутривенно на 1-е сутки каждые 1 или 2 недели в течение 10 циклов.
Введение 7,5 мг/кг внутривенно на 1-е сутки каждые 1 или 3 недели в течение 6 циклов.
Рак легких Рак головного мозга (глиосаркомы и глиомы) Рак яичников Нейроэндокринная карцинома Рак шейки матки Рак молочной железы Тип опухоли	Введение 15 мг/кг внутривенно на 1-е сутки каждые 1 или 3 недели в течение 3 или 6 циклов. Введение 10 мг/кг еженедельно или раз в две недели в течение 6 циклов. Четыре (4) цикла введения по 10 мг/кг каждые 7 или 14 суток. Введение 15 мг/кг каждую неделю или каждые 3 недели. Введение 15 мг/кг внутривенно на 1-е сутки, затем введение 15 мг/кг внутривенно каждые 7 суток или 21 сутки в течение 5 циклов. Введение 15 мг/кг внутривенно в течение 90 минут каждые 7 суток или 21 сутки. Введение 10 мг/кг внутривенно на 1-е, 7-е и 15-е сутки Введение 10 мг/кг внутривенно каждые 1 или 2 недели в течение 2 или 4 циклов. Режим дозирования
Рак предстательной железы	Внутривенное введение каждую неделю или каждые 3 недели в сумме в течение 17 циклов в течение суммарно 1 года.
Рак печени	Введение 10 мг/кг внутривенно каждые 7 или 14 суток, повторение цикла каждые 28 суток.
Рак поджелудочной железы	Введение от 10 до 15 мг/кг внутривенно в течение 90 минут каждые 1 или 2 недели.
Метастатический рак головы и шеи	Введение 15 мг/кг внутривенно каждую 1 неделю или каждые 3 недели.

- 57 025367

Пример 10

Экспрессия эндоглина (СЛ105) в различных типах солидных опухолей

Экспрессию эндоглина в солидных опухолях оценивали, используя иммуногистохимию. Замороженные и фиксированные в ацетоне образцы карциномы человека оставляли взаимодействовать с асцитами антитела ЗЖ>) против эндоглина, или с асцитами подходящих по изотипу контрольных !дО, в 10000-кратном разведении и окрашивали, используя наборы ΌΛΚΟ для окрашивания. Контрастное окрашивание осуществляли с помощью гематоксилина. ЗЖ) связывался с кровеносными сосудами в опухоли, в то время как подходящий по изотипу контрольный !дО не демонстрировал никакого окрашивания. Все протестированные типы опухолей продемонстрировали экспрессию эндоглина в сосудистой сети опухоли.

Опухоль	Число образцов	Реактивность (0, +, ++, +++>
Мочевой пузырь	2	+++
Кость	1	+++
Молочная железа	21	+++
Толстая кишка	4	+++
Пищевод	1	+++
Печень	1	+++
Легкое	3	+++
Лимфома	7	+++
Яичник	2	+++/++
Поджелудочная железа	1	+++
Половой член	1	+++
Прямая кишка	2	+++
Желудок	2	+++/++
Щитовидная железа	3	+++/++

Пример 11

Антиангиогенная терапия ранее сформировавшихся раковых опухолей молочной железы человека в коже человека, пересаженной ЗСГО-мышам

Эффект антител, описанных в данном описании изобретения, можно оценить по их антиангиогенному эффекту на ранее сформировавшиеся раковые опухоли молочной железы человека в коже человека, пересаженной ЗСГО-мышам.

Кратко, клетки МСР-7 (8 х 10⁶ клеток в 0,1 мл РΒЗ) трансплантируют интрадермально в полнослойную кожу человека, пересаженную ЗСГО-мышам, когда эти трансплантаты демонстрировали отсутствие признаков воспаления, сокращения или отторжения. Мышей не обрабатывают до появления отчетливых пальпируемых опухолей (в большинстве случаев 3-6 мм в диаметре). Для терапевтических исследований мышей с отчетливыми опухолями делят на группы. Каждый из растворов (композиций), содержащих (1) химерное антитело против эндоглина, (2) бевацизумаб (АУАЗТГО®), (3) комбинацию химерного антитела против эндоглина и бевацизумаба (АУАЗТГО®) или (4) подходящий по изотипу контрольный !дО, разбавляют стерильным РΒЗ, содержащим сывороточный альбумин мыши (конечная концентрация 0,05%). Для тАЬ-терапии внутривенно (в/в) через хвостовую вену мышей вводят тестируемое антитело или контрольный !дО в количестве 200 мкг/0,2 мл. Введение осуществляют каждые двое-трое суток.

Во время обработки ежедневно проводят мониторинг размера опухоли и заболеваемости мышей. Мышей взвешивают два раза в неделю, используя электронные весы (ОнАИЗ™ модель ОТ210). Размер опухоли измеряют три раза в неделю, используя электронный кронциркуль (6-дюймовый кронциркуль РКО-МАХ; Ро»1ег Со., Ж\\1он, Ма88.), подключенный к компьютеру, с использованием программного обеспечения ОрЮЭето™ (Ро»1ег Со.). Измеренные диаметры опухолей переводят в объемы опухолей, используя, например, следующую формулу: У=длинахширинахвысотахтт/6.

Статистический анализ данных для сравнения разных групп мышей проводят, используя критерий Стьюдента.

Пример 12

Мышиная модель рака яичников

Для определения способности химерного антитела против эндоглина и антитела против УЕОР лечить рак яичников можно использовать клеточную линию рака яичников в ЗСГО-, трансгенных или бестимусных мышах.

Кратко, клетки рака яичников имплантируют ЗСГО-, трансгенным или бестимусным мышам для образования опухолей яичников. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) химерного антитела против эндоглина, бевацизумаба (АУАЗТГО®), комбинации химерного моноклонального антитела (тАЬ) против эндоглина

- 58 025367 и бевацизумаба (АУАЭТШ®) или контрольного 1дО. Обработку проводят 2 или 3 раза в неделю. Во всех группах может быть применена химиотерапия. Проводят мониторинг у мышей и рост опухоли измеряют 2 или 3 раза в неделю.

Пример 13

Мышиная модель рака почки

Для определения способности химерного антитела против эндоглина и антитела против УЕОР лечить рак почки используют клеточную линию рака почки в 8СГО-, трансгенных или бестимусных мышах.

Кратко, клетки рака почки имплантируют 8СГО-, трансгенным или бестимусным мышам для образования опухолей почки. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 1,8 мг/кг массы тела) химерного антитела против эндоглина, бевацизумаба (АУАетШ®), комбинации химерного моноклонального антитела (тАЬ) против эндоглина и бевацизумаба (АУАетШ®) или контрольного 1дО. Обработку проводят 2-3 раза в неделю. Во всех группах может быть применена химиотерапия. Проводят мониторинг у мышей и рост опухоли измеряют 2-3 раза в неделю.

Пример 14

Мышиная модель колоректального рака

Для определения способности химерного антитела против эндоглина и антитела против УЕОР лечить колоректальный рак используют клеточную линию колоректального рака в 8СГО-, трансгенных или бестимусных мышах.

Кратко, клетки колоректального рака имплантируют 8СГО-, трансгенным или бестимусным мышам для образования опухолей прямой кишки. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 10 мг/кг массы тела) химерного антитела против эндоглина, бевацизумаба (АУАетШ®), или комбинации химерного моноклонального антитела (тАЬ) против эндоглина и бевацизумаба (АУАетШ®). Контрольным животным вводят контрольный 1§О. Обработку проводят 2 или 3 раза в неделю. Во всех группах может быть применена химиотерапия. Проводят мониторинг у мышей и рост опухоли измеряют 2-3 раза в неделю.

Пример 15

Мышиная модель рака головного мозга

Для определения способности химерного антитела против эндоглина и антитела против УЕОР лечить рак головного мозга используют клеточную линию мультиформной глиобластомы в 8СГО-, трансгенных или бестимусных мышах.

Кратко, клетки рака мультиформной глиобластомы имплантируют 8СГО-, трансгенным или бестимусным мышам для образования опухолей молочной железы. Группы мышей, несущих развившиеся опухоли, обрабатывают путем в/в введения возрастающих доз (начиная с 10 мг/кг массы тела) химерного антитела против эндоглина, бевацизумаба (АУА§ΤIN®), комбинации химерного моноклонального антитела (тАЬ) против эндоглина и бевацизумаба (АУАетШ®). Контрольным животным вводят контрольный 1§О. Обработку проводят 2 или 3 раза в неделю. Во всех группах может быть применена химиотерапия. Проводят мониторинг у мышей и рост опухоли измеряют 2-3 раза в неделю.

Пример 16

Клиническое испытание комбинированной терапии колоректального рака

В данном примере описано рандомизированное, слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование, фаза ΙΙ или фаза ΙΙΙ, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования химерного антитела против эндоглина с бевацизумабом (АУА§ΤΙΝ®) у пациентов с колоректальным раком. Включены от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание будет заключаться во введении внутривенных повторяющихся доз химерного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели в комбинации с бевацизумабом (АУАЭТШ®) в дозе примерно 5 мг/кг внутривенно в 1-е сутки каждые 2-3 недели в течение 6-10 циклов. Во всех группах можно применять химиотерапию. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как показано в конце первоначального исследования. Дополнительными показателями результата являются следующие.

Основной показатель результата: суммарный показатель ответа. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение суммарного показателя ответа от примерно 40% при применении бевацизумаба (АУАЗГОМ®) плюс плацебо до примерно 60% (или более) при применении бевацизумаба (АУАСТШ®) плюс химерное антитело против эндоглина.

Вторичные показатели результата, которые можно оценить, включают продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, среднюю выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие)

- 59 025367 или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующих: уменьшение опухолевой массы, уменьшение неоваскуляризации, ослабление побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.

Пример 17

Клиническое испытание комбинированной терапии рака почек

В данном примере описано рандомизированное, слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование, фаза ΙΙ или фаза ΙΙΙ, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования химерного антитела против эндоглина с бевацизумабом (АУА8ΤΙΝ®) у пациентов с почечноклеточным раком (раком почек). Включены от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное клиническое испытание будет состоять из введения внутривенных повторяющихся доз химерного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели, в комбинации с бевацизумабом (ΑΥΑ8ΤΙΝ®) в дозе от примерно 2,5 до примерно 15 мг/кг, каждые две недели в течение 3-6 циклов или пока продолжается развитие. В обеих группах лечения также можно использовать интерферон. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными показателями результата являются критерии, приведенные ниже.

Основной показатель результата: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 9-13 месяцев в группе, принимающей бевацизумаб (АУА8ΤΙΝ®) плюс плацебо, до примерно 14-18 месяцев (или более) в группе, принимающей бевацизумаб (ΑΥΑ8ΤΙΝ®) плюс химерное антитело против эндоглина.

Вторичные показатели результата, которые можно оценивать, включают продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, среднюю выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующего: уменьшение опухолевой массы, уменьшение неоваскуляризации, ослабление побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.

Пример 18

Клиническое испытание комбинированной терапии гепатоклеточного рака

В этом примере описано рандомизированное, слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование, фаза ΙΙ или фаза ΙΙΙ, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования химерного антитела против эндоглина с бевацизумабом (ΑΥΑ8ΤΙΝ®) или сорафенибом у пациентов с гепатоклеточным раком (раком печени). Включено от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание состоит во введении внутривенных повторяющихся доз химерного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели в комбинации с бевацизумабом (ΑΥΑ8ΤΙΝ®) в количестве от примерно 2,5 до примерно 15 мг/кг, каждые две-три недели или с сорафенибом в дозе от примерно 400 мг ежедневно в течение 3-6 циклов или пока продолжается развитие. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными показателями результата являются следующие.

Основные показатели результата: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 3-9 месяцев в группе, принимающей бевацизумаб (ΑΥΑ8ΤΙΝ®) (или сорафениб) плюс плацебо, до примерно 6-12 месяцев (или более) в группе, принимающей бевацизумаб (ΑΥΑ8ΤΙΝ®) (или сорафениб) плюс химерное антитело против эндоглина.

Вторичные показатели результата, которые могут быть оценены, включают продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, общую выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующего: уменьшение опухолевой массы, уменьшение неоваскуляризации, ослабление побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.

- 60 025367

Пример 19

Клиническое испытание комбинированной терапии рака яичников

В этом примере описано рандомизированное, слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование, фаза ΙΙ или фаза ΙΙΙ, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования химерного антитела против эндоглина с бевацизумабом (АУАБТГЫ®) у пациентов с раком яичников. Включено от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное испытание состоит во введении внутривенных повторяющихся доз химерного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели в комбинации с бевацизумабом (АУАБТГЫ®) в дозе примерно 15 мг/кг внутривенно на 1-е сутки, с последующим введением в дозе 15 мг/кг внутривенно каждые 21 сутки в течение 5 циклов. В обеих группах пациентов также может быть применена химиотерапия. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными показателями результата являются следующие.

Основной показатель результата: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 3-6 месяцев в группе, принимающей бевацизумаб (АУАБТ1Ы®) плюс плацебо, до примерно 4-12 месяцев (или более) в группе, принимающей бевацизумаб (АУАБТГЫ®) плюс химерное антитело против эндоглина. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение суммарного показателя ответа от примерно 20% при применении бевацизумаба (АУАБТГЫ®) плюс плацебо до примерно 30% (или более) при применении бевацизумаба (АУАБТГЫ®) плюс химерное антитело против эндоглина.

Вторичные показатели результата, которые могут быть оценены, включают продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, среднюю выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующих: уменьшение опухолевой массы, уменьшение неоваскуляризации, ослабление побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.

Пример 20

Клиническое испытание комбинированной терапии мультиформной глиобластомы

В данном примере описано рандомизированное, слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование, фаза ΙΙ или фаза ΙΙΙ, предназначенное для получения предварительной оценки безопасности и эффективности комбинирования химерного антитела против эндоглина с бевацизумабом (АУАБТ1Ы®) у пациентов с мультиформной глиобластомой (раком головного мозга). Включено от примерно 100 до примерно 800 пациентов, при этом от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе лечения и от примерно 50 до примерно 400 пациентов отнесены к группе плацебо. Данное состоит во введении внутривенных повторяющихся доз химерного антитела против эндоглина в количестве от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели в комбинации с бевацизумабом (АУАБТГЫ®) в дозе от примерно 2,5 до примерно 15 мг/кг, каждые две-три недели в течение 3-6 циклов или пока продолжается развитие. Интервал времени для данного исследования оценивают от примерно 6 месяцев до примерно 5 лет с продолжением терапии для пациентов, отвечающих на лечение, как будет показано в конце первоначального исследования. Дополнительными показателями результата являются следующие.

Основные показатели результата: выживаемость без развития заболевания. Одна из задач данного исследования заключается в том, чтобы продемонстрировать увеличение продолжительности выживаемости без развития заболевания от примерно 3-9 месяцев в группе, принимающей бевацизумаб (АУАБТ1Ы®) плюс плацебо, до примерно 4-12 месяцев (или более) в группе, принимающей бевацизумаб (АУАБТГЫ®) плюс химерное антитело против эндоглина.

Вторичные показатели результата, которые могут быть оценены, включают продолжительность ответа, время до начала развития опухоли, среднюю выживаемость, тяжелые или нетяжелые побочные явления. Например, лечение может предотвращать развитие данного заболевания (т.е. останавливать развитие) или может приводить к улучшению. Альтернативно или в дополнение к этому можно измерить другие показатели, относящиеся к одному или более чем одному из следующего: уменьшение опухолевой массы, уменьшение неоваскуляризации, ослабление побочных эффектов, уменьшение неблагоприятных реакций и/или улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения.

Пример 21

Системное токсикологическое исследование на яванских макаках

В токсикологическом исследовании химерных антител против эндоглина в комбинации с бевацизумабом (АУАБТГЫ®) используют яванских макак.

- 61 025367

Кратко, макакам один раз в неделю в течение трех недель вводят химерное антитело против эндоглина в количестве 10,0, 30,0 или 100,0 мг/кг и бевацизумаб (ΑУΑδΤIN®) в количестве 2,5; 5; 7,5; 10 или 15 мг/кг. Животным, получающим плацебо, в том же режиме вводят соответствующий раствор, не содержащий антитела. Дозы вводят в виде внутривенного болюса в течение 30-60 мин и для каждого уровня доз используют по меньшей мере шесть животных. Токсикологическое действие оценивают по одному или более чем одному из следующих показателей: измерения массы тела, измерения основных физиологических и клинических показателей, периодический биохимический анализ сыворотки, гематологические оценки и гистопатологические оценки.

Пример 22

Местное токсикологическое исследование на яванских макаках

В токсикологическом исследовании химерных антител против эндоглина в комбинации с ранибизумабом (ΙΛΧΤΧΠδ®). вводимых посредством инъекции в стекловидное тело, используют яванских макак.

Кратко, макакам один раз в неделю в течение шести недель посредством инъекции в стекловидное тело вводят химерное антитело против эндоглина в количестве 0,25; 1,25 и 2,5 мг, и 0,5 мг ранибизумаба (ΙΛΧΕΥΠδ®). Животным, получающим плацебо, вводят в том же режиме соответствующий раствор, не содержащий антитела. Дозы вводят в виде инъекций в стекловидное тело и для каждого уровня доз используют по меньшей мере шесть животных. Токсикологическое действие оценивают по одному или более чем одному из следующих показателей: измерения массы тела, измерения основных физиологических клинических показателей, периодический биохимический анализ сыворотки, гематологические оценки и гистопатологические оценки.

Пример 23

Формирование трубчатой сети

Ангиогенез можно тестировать ίη νίΐτο в двумерной модели формирования трубочек.

В одном из примеров ΗυVΕС культивируют в среде ΕΟΜ-2 (С^ейск, \Уа1кег5уП1е, ΜΌ), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки и ростовые факторы, во флаконах (Ρ^οη, Βесΐοη-^^ск^η5οη, Ρπ·ιη1<1ίη Ьакек, N1) в СО₂-инкубаторе при 37°С в субконфлюентных условиях в присутствии антитела против νΕΟΡ, химерного антитела против эндоглина или как антитела против νΕΟΡ, так и химерного антитела против эндоглина, в течение 8 ч. В качестве отдельного контроля включено нерелевантное антитело 1дС. Затем клетки ΗυνΕί'.' слегка трипсинизируют и 10000-15000 клеток инокулируют на полимеризованный гель ΕСΜаΐ^^x (набор для анализа ангиогенеза ίη νίΐτο, Ο^ιηΚοη). После инкубации в течение ночи клетки визуализируют под микроскопом и подсчитывают число замкнутых многоугольников, измеряют длину непрерывной массы эндотелиальных клеток и делают снимки. Все экспериментальные условия тестируют в трех параллелях.

Пример 24

Анализы прорастания

Ангиогенез можно тестировать ίη νίΐτο в трехмерной модели прорастания.

ΗυVΕС выделяют из пуповин и растят в М199 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ΡΒδ) (С1ВС0. СайкЪаб, СΑ) и ростовой добавкой для эндотелиальных клеток (ΕΟΌδ) (ΒΌ В^аемек, Вебйтб, ΜΑ), при 3°С и 5% СО₂. Во всех экспериментах используют 2-4-й пассажи НЕУЕС (пассаж О (РО) является первичной культурой). Легочные фибробласты (БЕ) растят традиционным способом в ΌΜΕΜ (С1ВС0. Сат1кЪаб, СΑ) с добавлением 10% ΡΒδ при 37°С и 5% СО₂, и используют пассажи между Р10 и Р15. Также можно использовать другие линии фибробластов, которые можно получить из АТСС (Американской коллекции типовых культур).

Получение клеток

НЕУЕС и фибробласты растят в М199/10% ΕΒδ^η-δΙιτρ (пенициллин + стрептомицин) (1:100) в течение 1-2 суток, затем гранулируют. В случае ΗυVΕС среду заменяют на ΕΟΜ-2 (ΟοικΙχκ, \Уа1кегкуШе, ΜΌ) за сутки до гранулирования. В случае фибробластов среду заменяют на ΕΟΜ-2 за сутки до включения. Для гранулирования требуется приблизительно 400 НЕУЕС на гранулу. Фибробласты используют в количестве 20000 клеток на лунку для 24-луночного планшета. Также можно использовать девяносто шестилуночные планшеты с соответственно пересчитанными количествами.

Подготовка гранул цитодекса 3

В данном анализе можно использовать, например, гранулы микроносителя цитодекса 3 (ЛтегкНат РЬагтааа Β^οΐесЬ, Р|кса1агеау. N1).

Сухие гранулы (0,5 г) гидратируют и оставляют набухать в 50 мл ΡΒδ (рН 7,4) в течение по меньшей мере 3 ч при комнатной температуре (КТ) в пробирке емкостью 50 мл и помещают ее на шейкер.

Гранулам дают возможность осесть (примерно 15 мин). Супернатант отбрасывают и гранулы промывают в течение нескольких минут в свежем ΡΒδ (50 мл).

Промывки ΡΒδ отбрасывают и заменяют свежим ΡΒδ.

Суспензию гранул помещают в силиконизированную стеклянную бутылку (например, от \νίηάкЫе1б \У1рег или δ^д^ηасοΐе). Гранулы стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при 115°С и за- 62 025367 тем хранят при 4°С.

Реагенты

Раствор фибриногена

Раствор фибриногена готовят путем растворения 2 мг/мл фибриногена в ИРВ§ в водяной бане при 37°С. Затем раствор перемешивают путем переворачивания пробирки, а не встряхивания. Процентное содержание коагулируемого белка может быть определено и соответственно скорректировано. Затем раствор пропускают через 0,22-мкм фильтр для стерилизации.

Апротинин

Лиофилизированный апротинин можно восстановить в ΌΙ (деионизованной) воде в концентрации 4 Ед/мл и подвергнуть стерилизующей фильтрации. Отбирают аликвоты объемом 1 мл каждая и хранят их при -20°С.

Тромбин

Тромбин восстанавливают в стерильной воде в концентрации 50 Ед/мл. Отбирают аликвоты по 0,5 мл и хранят их при -20°С.

Нанесение на гранулы НИУЕС (сутки 1)

Клетки НИУЕС трипсинизируют. Гранулам дают отстояться (не центрифугируют), супернатант удаляют посредством аспирации и гранулы быстро промывают 1 мл теплой среды ЕОМ-2. Гранулы (2500) смешивают с 1 х 10⁶ НИУЕС в 1,5 мл теплой среды ЕОМ-2 в пробирке для РАС§ (сортировки флуоресцентно-активированных клеток) и вертикально размещают в инкубаторе. (Этого количества будет достаточно для приблизительно 10 лунок; при необходимости можно провести масштабирование).

Смесь инкубируют в течение 4 ч при 37°С, переворачивая пробирку и перемешивая ее содержимое каждые 20 мин (гранулы после нанесения на них покрытия должны выглядеть как мини-мячи для гольфа, что указывает на образование покрытия, достаточного для прорастания).

Через 4 ч гранулы с нанесенным покрытием переносят во флакон для культивирования тканей Т25 (Ра^п, Веб1огб, МА) и инкубируют в течение ночи в 5 мл среды ЕОМ-2 при 37°С и 5% СО₂.

Встраивание гранул с нанесенным покрытием в фибриновый гель (сутки 0)

Готовят раствор фибриногена (2,0 мг/мл), как описано выше, и к раствору фибриногена добавляют 0,15 единиц/мл апротинина.

Гранулы с нанесенным покрытием переносят в коническую пробирку объемом 15 мл и гранулам дают отстояться.

Гранулы ресуспендируют в 1 мл среды ЕОМ-2 и переносят в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Гранулы три раза промывают 1 мл среды ЕОМ-2, перемешивают посредством медленного пипетирования вверх/вниз с помощью пипетки Р1000. Гранулы подсчитывают на покровном стекле и ресуспендируют в растворе фибриногена в концентрации 500 гранул/мл.

В каждую лунку 24-луночного планшета добавляют тромбин (0,625 ед./мл). В каждую лунку добавляют суспензию фибриноген/гранул (0,5 мл), меняя наконечник пипетки для каждой лунки.

Тромбин и фибриноген/гранулы перемешивают посредством аккуратного пипетирования вверх/вниз примерно четыре-пять раз; следует избегать образования пузырьков в фибриновом геле. Контрольные образцы либо обрабатывают в отсутствие антител, либо одного или более контрольных антител. Тестируемые образцы обрабатывают только антителами против эндоглина, только антителами против УЕОР или их комбинацией. Могут быть протестированы многочисленные концентрации агентов. Раствор фибриногена/гранул отставляют для образования сгустка на 5 мин при комнатной температуре и затем на 15 мин при 37°С/5% СО₂. Важно не двигать планшет в течение первых 5 мин образования сгустка, чтобы свести к минимуму деформацию фибрина, в результате которой может ухудшиться прорастание.

В каждую лунку по каплям добавляют ЕОМ-2 (1 мл). Легочные фибробласты высевают поверх сгустка в концентрации 20000 клеток/лунка. Следует заменять культуральную среду на свежую среду ЕОМ2 один раз в двое суток до тех пор, пока не будет достигнут желаемый рост.

Когда фибриновый гель сформируется, в геле могут присутствовать крошечные пузырьки; они исчезнут в течение 3-4 суток. Прорастание должно быть заметно между 2-ми и 4-ми сутками. Образование просвета начинается примерно на 4-5-е сутки, и отростки продолжают удлиняться. Вновь образованные трубки начинают разветвляться примерно на 4-6-е сутки. На 6-7-е сутки эти подобные микрососудам структуры начинают соединяться (анастомоз) с прилегающими трубочками; увеличение числа гранул на одну лунку будет приводить к более раннему началу анастомоза.

Как показано на фиг. 3, химерное ТКС105 ингибировало УЕОР-индуцированное прорастание дозозависимым образом (N=3) при использовании НИУЕС-сфероида, посеянного в коллаген.

Кроме того, в то время как химерное ТКС105 блокировало УЕОР-индуцированное прорастание (диагональная штриховка), оно не ингибирует ЬРОР-индуцированное прорастание (ромбовидная штриховка) НИУЕС-сфероидов (Ν = 2), как показано на фиг. 4.

Ингибиторный эффект химерного ТКС105 на УЕОР-индуцированное прорастание (диагональная штриховка) усиливался в комбинации с ингибитором УЕОР АУА§ТГИ® (ромбовидная штриховка), как

- 63 025367 показано на фиг. 5.

На фиг. 6 показано, что ингибиторный эффект химерного ТВС105 на УЕСР-индуцированное прорастание (диагональная штриховка) не усиливался в комбинации с ингибитором киназы РТК787 (ромбовидная штриховка).

Пример 25

Иммуноцитохимический анализ ангиогенных отростков ίη νίΙΐΌ

Для окрашивания ядер эндотелиальных клеток (ЕС) фибриновые гели дважды промывают 1 х РΒδ и затем фиксируют в течение ночи в 2%-ном параформальдегиде. После двух дополнительных промывок с использованием 1 х РΒδ гели далее окрашивают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ΌΑΓΙ) (δί^ι™, δί. Ьошк, МО).

Для иммуноокрашивания ЬР сначала удаляют посредством непродолжительной обработки гелей 10х трипсином. Переваривание останавливают сывороткой, как только все фибробласты удалены. Затем гели энергично промывают ΗΒδδ (сбалансированным солевым раствором Хенкса) (1х, Се11дго, Нетбон, νΑ). Затем культуры фиксируют в течение 10 мин в 10%-ном формалине и пермеабилизируют 0,5%-ным тритоном Х-100 в течение 5 мин. Неспецифическое связывание блокируют раствором 5%-ного ΒδΑ в РΒδ в течение 2 ч.

Первичные антитела используют в разведении 1/100 в блокирующем буфере и инкубируют в течение ночи при 4°С. После энергичной промывки связавшееся антитело детектируют, используя видоспецифичные конъюгированные с Α1еxа Р1иог 488 или Α1еxа Р1иог 568 вторичные антитела в разведении 1/1000 (Мо1еси1аг РгоЬек, Саг1кЬаб, СΑ). В качестве контроля используют изотип-специфичные несвязывающие антитела. Если имеется сильный фоновый сигнал, концентрацию первичного и вторичного антитела можно уменьшить и, если необходимо, можно увеличить продолжительность инкубации и/или промывки. Р-актин окрашивают с помощью ТК1ТС(тетраметилродамин-изотиоцианат)-фаллоидина (δίβΗΚ-ι, δί. Ьошк, МО) в концентрации 0,2 мкМ.

Фазово-контрастные и флуоресцентные изображения получают на микроскопе ΙΧ70 01утрик, соединенном с цифровой камерой. Набор Ζ-серии флуоресцентных изображений получают на двухфотонном микроскопе Саг1 Ζе^κκ Мкгоьтадшд ΕδΜ 510 Ме!а и компилируют в трех-мерные изображения с использованием программного обеспечения Ме!атогрЬ (итуегка1 1тадш§ СогрогаЕоп, ОозушпЦозуп РΑ). Таким образом, можно легко обнаружить экспрессию различных маркеров.

Для создания 30-изображений сосудов могут быть получены наборы флуоресцентных оптических изображений вдоль ζ-оси культурах. Ядра окрашивают ΌΑΓΙ (зеленым), а стенки сосудов окрашивают на виментин (оранжевым). Ясно видны широкие полые просветы, окруженные одним слоем эндотелиальных клеток. Эти изображения подтверждают, что просветы, присутствующие в анализе ίη νίίΐΌ, являются межклеточными, а не внутриклеточными щелями, как это часто наблюдается в анализах с использованием матригеля. Кроме того, можно подтвердить, что НИУЕС являются поляризованными, так как они содержат апикальную мембрану, обращенную в сторону просвета, и базальную мембрану, смыкающуюся с богатой коллагеном Ιν основной мембраной и фибриновым гелем.

Пример 26

Подавление хориоидальной неоваскуляризации

Хотя у животных не развивается возрастная дегенерация желтого пятна (ΑΗΡ) как таковая, можно вызвать хориоидальную неоваскуляризацию, похожую на наблюдаемую при ΑΜ^, используя лазер для получения очаговых повреждений в мембране Бруха и лежащем сверху ретинальном пигментном эпителии (ВРЕ). Это повреждение стимулирует аномальный рост нижележащих хориоидальных капилляров в слой ВРЕ и субретинальное пространство. Нарушение мембраны Бруха является общим для всех форм хориоидальной неоваскуляризации (ΟΝν), включая те, которые характерны для влажной формы ΑΜ^.

В модели индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации группы из 9 или 10 мышей обрабатывают при помощи подкожных (п/к) инъекций (1) только химерного антитела против эндоглина, (2) только антитела против УЕС, (3) химерного антитела против эндоглина в комбинации с антителом против УЕСР в составе одной и той же композиции или разных композиций, либо (4) контрольного антитела за одни сутки до повреждения лазерным излучением и на 2-е, 5-е, 8-е и 11-е сутки после применения лазера. Через 14 суток после лазерного повреждения мышам внутривенно инъецируют меченный флуоресцеином декстран (50 мг), мышей подвергают эвтаназии и глаза быстро рассекают на хороидальные плоские срезы или замораживают в соединении для включения с оптимальной температурой для приготовления срезов, и делают срезы для оценки этих повреждений.

Пример 27

Влияние композиций, описанных в данном описании изобретения, на индуцированную лазером хориоидальную неоваскуляризацию также оценивают на взрослых яванских макаках.

В данном эксперименте вводят (1) только химерное антитело против эндоглина, (2) только антитело против УЕСР, (3) химерное антитело против эндоглина в комбинации с антителом против УЕСР в составе одной и той же композиции или разных композиций, либо (4) контрольное антитело вводят посредством внутривенной инъекции или инъекции в стекловидное тело. Каждое животное получает девять или

- 64 025367 десять лазерных ожогов в сетчатке каждого глаза, и развитие активных повреждений, связанных с хориоидальной неоваскуляризацией, оценивают посредством флуоресцентной ангиографии один раз перед началом обработки и через 15, 20 и 29 суток после обработки лазером. Композиции вводят внутривенно один раз в неделю, начиная за одну неделю до повреждения лазером. Инъекции в стекловидное тело выполняют один раз каждые две недели, начиная за одну неделю до обработки лазером, или один раз через две недели после обработки лазером, когда активные СNУ-повреждения, уже сформированы. Контрольным животным делают один раз в неделю внутривенные инъекции или один раз в две недели инъекции в стекловидное тело плацебо, начиная за одну неделю до обработки лазером.

СNУ-повреждения визуализируют с использованием флуоресцентной ангиографии и классифицируют согласно стандартным процедурам.

Пример 28

Лечение возрастной дегенерации желтого пятна

Первое исследование

Пациентов с проявлениями возрастной дегенерации желтого пятна лечат инъекцией в стекловидное тело (1) только химерного антитела против эндоглина, (2) только ранибизумаба, (3) химерного антитела против эндоглина в комбинации с ранибизумабом в составе одной и той же композиции или разных композиций, либо (4) контрольного антитела для ослабления или предупреждения развития неоваскуляризации, макулярного заболевания и повреждения сетчатки.

В качестве первого этапа лечения пациентам следует пройти полное обследование глаз для установления исходного уровня здоровья глаз. Обследование глаз включает обратную офтальмоскопию, биомикроскопию глаза при помощи щелевой лампы, периферическое обследование сетчатки, измерения внутриглазного давления, симптоматику остроты зрения (без коррекции и с наилучшей коррекцией), фотографирование глазного дна, флуоресцеиновую ангиографию, оптическую когерентную томографию, электроретинографию и измерения в А-режиме.

После проведения предварительного обследования осуществляют описанную выше инъекцию в стекловидное тело в поврежденный глаз пациента с проявлением ΛΜΌ. Если повреждены оба глаза, их можно лечить по отдельности. В глаз, подлежащий лечению, инъецируют глазной раствор.

После лечения необходимо провести обследование глаз пациентов в первые (1), вторые (2), седьмые (7), пятнадцатые (15), тридцатые (30) и шестидесятые (60) сутки и затем ежемесячно в течение 2 лет. В связи с возможностью рецидива в дальнейшем пациенты должны проходить ежемесячные периодические обследования. В каждый день обследования у пациента проводят мониторинг разжижения стекловидного тела. Кроме того у пациентов проводят мониторинг более поздних отслоений стекловидного тела, используя обратную офтальмоскопию с придавливанием склеры. Наконец, проводят непрерывный мониторинг степени АМО у пациентов путем периодических обследований сетчатки, оптической когерентной томографии и получения ангиограмм с использованием флуоресцеина для мониторинга присутствия субретинальной жидкости, крови, экссудатов, отслоения КРЕ, кистозных изменений сетчатки или наличия серовато-зеленой субретинальной неоваскулярной мембраны. Может потребоваться дополнительное лечение, если наблюдаются признаки повторной неоваскуляризации. Дополнительные виды лечения можно осуществлять еженедельно или ежемесячно. В предпочтительном воплощении последующие виды лечения выполняют после начального лечения через 1-6 месяцев.

Второе исследование

Цель: продемонстрировать эффективность вводимых в стекловидное тело химерных антител против эндоглина и ранибизумаба для лечения неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна (АМО).

Методы: от пятидесяти до 500 пациентов (50-500 глаз) с субфовеальной хориоидальной неоваскуляризацией ^ΝΫ) в результате АМЭ принимают участие в данном исследовании в утвержденном центре.

Критериями повторного инъецирования являются присутствие жидкости в желтом пятне, повышенная толщина центральной зоны сетчатки (СКТ), составляющая по меньшей мере 100 микрон, снижение остроты зрения по меньшей мере на 5 букв, ассоциированное с увеличением количества жидкости в желтом пятне, новая классическая СNУ или новое кровоизлияние в желтом пятне. Основным показателем результата является доля глаз со снижением остроты зрения меньше чем 15 букв через 12 месяцев. Измерение остроты зрения с максимальной коррекцией и клиническое обследование глаз проводят в 1ую неделю, 1-й месяц и затем ежемесячно в течение 5-12 месяцев.

Среднюю остроту зрения и среднюю СКТ измеряют относительно исходного состояния. Отмечают офтальмологические и/или системные побочные эффекты.

Пример 29

Ингибирование индуцированной повреждением роговичной неоваскуляризации

Роговичную неоваскуляризацию индуцируют у самцов мышей С57ВЬ/6 посредством интрастромального наложения 3 швов из нейлоновых нитей или посредством химического повреждения (Ν;·ιΟΗ) и механической обработки эпителия роговицы. Проводят многочисленные эксперименты, в которых вводят внутрибрюшинно один раз или в различные моменты времени непосредственно до или после повре- 65 025367 ждения (1) только химерное антитело против эндоглина, (2) только антитело против УЕОР, (3) химерное антитело против эндоглина в комбинации только с антителом против УЕОР в составе одной и той же композиции или разных композиций, либо (4) контрольное антитело.

Рост новых сосудов в роговице оценивают с использованием микроскопии при помощи щелевой лампы и гистологического анализа. Сосудистую сеть метят специфичным к эндотелиальным клеткам лектином, конъюгированным с флуоресцеином, и неоваскуляризацию оценивают по плоским гистологическим срезам, а также по поперечным срезам роговицы, используя иммуногистохимический анализ с использованием РЕСАМ (молекулы адгезии эндотелиальных клеток и тромбоцитов). Наличие отека роговицы оценивают, используя микроскопию при помощи щелевой лампы, а толщину роговицы измеряют на поперечных срезах; увеличение толщины роговицы является отражением величины отека. Количество полиморфоядерных лейкоцитов (РМЩ и макрофагов определяют путем окрашивания поперечных срезов при помощи НЕМА-3 или моноклонального антитела Р4/80 крысы против мыши соответственно.

Аспекты воплощений, изложенных в данном описании изобретения, могут быть реализованы в других формах или выполнены иным образом, не отклоняясь от их сущности или существенных признаков. Следовательно, настоящее описание следует рассматривать во всех проиллюстрированных и неорганичивающих аспектах, и подразумевается, что все изменения, которые подпадают под значение и диапазон эквивалентности, включены в данное описание.

Перечень последовательностей <110> ТРАКОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.

<120> КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ РАКА С ПОМОЩЬЮ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЭНДОГЛИНА И АГЕНТОВ ПРОТИВ УЕОР <130> 35882-712.601 <140> РСТ/и82010/045651 <141> 2010-08-16 <150> 61/234,574 <151> 2009-08-17 <160> 12 <170> Ра1епПп \'егкюп 3.5 <210> 1 <211>106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 1

О1п Не Уа1 Ьеи 8ег О1п 8ег Рго А1а Не Ьеи 8ег А1а 8ег Рго О1у

5 10 15

О1и Ьук Уа1 ТЬг Ме1 ТЬг Сук Агд А1а 8ег 8ег 8ег Уа1 8ег Туг Ме1 20 25 30

Н18 Тгр Туг О1п О1п Ьук Рго О1у 8ег 8ег Рго Ьук Рго Тгр Не Туг

40 45

А1а ТЬг 8ег Акп Ьеи А1а 8ег О1у Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе 8ег О1у 8ег 50 55 60

О1у 8ег О1у ТЬг 8ег Туг 8ег Ьеи ТЬг Не 8ег Агд Уа1 О1и А1а О1и

70 75 80

Акр А1а А1а ТЬг Туг Туг Сук О1п О1п Тгр 8ег 8ег Акп Рго Ьеи ТЬг

- 66 025367

90 95

РНе О1у А1а О1у ТНг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз 100 105 <210>2 <211>106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 2

ТНг Уа1 А1а А1а Рго δе^ Уа1 РНе 11е РНе Рго Рго δе^ Азр О1и О1п 1 5 10 15

Ьеи Ьуз δе^ О1у ТНг А1а δе^ Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе Туг 20 25 30

Рго Агд О1и А1а Ьуз Уа1 О1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи О1п δе^

40 45

О1у Азп δе^ О1п О1и δе^ Уа1 ТНг О1и О1п Азр δе^ Ьуз Азр δе^ ТНг 50 55 60

Туг δе^ Ьеи δе^ δе^ ТНг Ьеи ТНг Ьеи δе^ Ьуз А1а Азр Туг О1и Ьуз 65 70 75 80

Ηίδ Ьуз Уа1 Туг А1а Суз О1и Уа1 ТНг Ηίδ О1п О1у Ьеи δе^ δе^ Рго 85 90 95

Уа1 ТНг Ьуз δе^ РНе Азп Агд О1у О1и Суз 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 3

О1и Уа1 Ьуз Ьеи О1и О1и δе^ О1у О1у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго О1у О1у 1 5 10 15 δе^ Μеί Ьуз Ьеи δе^ Суз А1а А1а δе^ О1у РНе ТНг РНе δе^ Азр А1а 20 25 30

Тгр Μеί Азр Тгр Уа1 Агд О1п δе^ Рго О1и Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а О1и 11е Агд δе^ Ьуз А1а δе^ Азп Ηίδ А1а ТНг Туг Туг А1а О1и 50 55 60 δе^ Уа1 Ьуз О1у Агд РНе ТНг 11е δе^ Агд Азр Азр δе^ Ьуз δе^ δе^

70 75 80

- 67 025367

Уа1 Туг Ьеи О1п Ме! Акп 8ег Ьеи Агд А1а О1и Акр ТЬг О1у 11е Туг 85 90 95

Туг Сук ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Акр 8ег Тгр О1у О1п О1у ТЬг 100 105 110

ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 8ег 8ег 115 <210>4 <211> 330 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 4

А1а 8ег ТЬг Ьук О1у Рго 8ег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго 8ег 8ег Ьук 1 5 10 15

8ег ТЬг 8ег О1у О1у ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Сук Ьеи Уа1 Ьук Акр Туг 20 25 30

РЬе Рго О1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 8ег Тгр Акп 8ег О1у А1а Ьеи ТЬг 8ег 35 40 45

О1у Уа1 Н1к ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи О1п 8ег 8ег О1у Ьеи Туг 8ег 50 55 60

Ьеи 8ег 8ег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго 8ег 8ег 8ег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг 65 70 75 80

Туг 11е Сук Акп Уа1 Акп Шк Ьук Рго 8ег Акп ТЬг Ьук Уа1 Акр Ьук 85 90 95

Ьук Уа1 О1и Рго Ьук 8ег Сук Акр Ьук ТЬг Шк ТЬг Сук Рго Рго Сук 100 105 110

Рго А 1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго 8ег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго 115 120 125

Ьук Рго Ьук Акр ТЬг Ьеи Ме! 11е 8ег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Сук 130 135 140

Уа1 Уа1 Уа1 Акр Уа1 8ег Шк О1и Акр Рго О1и Уа1 Ьук РЬе Акп Тгр 145 150 155 160

Туг Уа1 Акр О1у Уа1 О1и Уа1 Шк Акп А1а Ьук ТЬг Ьук Рго Агд О1и 165 170 175

О1и О1п Туг Акп 8ег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 8ег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 180 185 190

Шк О1п Акр Тгр Ьеи Акп О1у Ьук О1и Туг Ьук Сук Ьук Уа1 8ег Акп 195 200 205

Ьук А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьук ТЬг 11е 8ег Ьук А1а Ьук О1у 210 215 220

- 68 025367

О1и Рго Агд О1и Рго О1и Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Акр О1и 225 230 235 240

Ьеи ТЬг Ьук Аки О1и Уа1 Зег Ьеи ТЬг Сук Ьеи Уа1 Ьук О1у РЬе Туг 245 250 255

Рго Зег Акр Не А1а Уа1 О1и Тгр О1и Зег Аки О1у О1и Рго О1и Аки 260 265 270

Аки Туг Ьук ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Акр Зег Акр О1у Зег РЬе РЬе 275 280 285

Ьеи Туг Зег Ьук Ьеи ТЬг Уа1 Акр Ьук Зег Агд Тгр О1и О1и О1у Аки 290 295 300

Уа1 РЬе Зег Сук Зег Уа1 Ме! Шк О1и А1а Ьеи Шк Аки Шк Туг ТЬг 305 310 315 320

О1и Ьук Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у Ьук 325 330 <210>5 <211>123 <212> ПРТ <213> Мик тикси1ик <400> 5

О1и Не О1и Ьеи Уа1 О1и Зег О1у Рго О1и Ьеи Ьук О1и Рго О1у О1и 1 5 10 15

ТЬг Уа1 Агд Ие Зег Сук Ьук А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Аки Туг 20 25 30

О1у Ме! Аки Тгр Уа1 Ьук О1и А1а Рго О1у Ьук О1у Ьеи Ьук Тгр Ме! 35 40 45

О1у Тгр Ие Аки ТЬг Туг ТЬг О1у О1и Рго ТЬг Туг А1а А1а Акр РЬе 50 55 60

Ьук Агд Агд РЬе ТЬг РЬе Зег Ьеи О1и ТЬг Зег А1а Зег ТЬг А1а Туг 65 70 75 80

Ьеи О1и Не Зег Аки Ьеи Ьук Аки Акр Акр ТЬг А1а ТЬг Туг РЬе Сук 85 90 95

А1а Ьук Туг Рго Шк Туг Туг О1у Зег Зег Шк Тгр Туг РЬе Акр Уа1 100 105 110

Тгр О1у А1а О1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120 <210> 6 <211> 123 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

- 69 025367 <400> 6

О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго О1у О1у 1 5 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Су5 А1а А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг А5п Туг 20 25 30

О1у Ме! А5п Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьу5 О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 35 40 45

О1у Тгр Не А5п ТЬг Туг ТЬг О1у О1и Рго ТЬг Туг А1а А1а А5р РЬе 50 55 60

Ьу5 Агд Агд РЬе ТЬг РЬе Зег Ьеи А5р ТЬг Зег Ьу5 Зег ТЬг А1а Туг 65 70 75 80

Ьеи О1п Ме! А5п Зег Ьеи Агд А1а О1и А5р ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Су5 85 90 95

А1а Ьу5 Туг Рго Н15 Туг Туг О1у Зег Зег Н15 Тгр Туг РЬе А5р Уа1 100 105 110

Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120 <210> 7 <211> 113 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 7

О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго О1у О1у 1 5 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Су5 А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30

А1а Ме! Зег Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьу5 О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 35 40 45

Зег Уа1 Не Зег О1у А5р О1у О1у Зег ТЬг Туг Туг А1а А5р Зег Уа1 50 55 60

Ьу5 О1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд А5р А5п Зег Ьу5 А5п ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи О1п Ме! А5п Зег Ьеи Агд А1а О1и А5р ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Су5 85 90 95

А1а Агд О1у РЬе А5р Туг Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег 100 105 110

Зег <210> 8 <211> 108

- 70 025367 <212>ПРТ <213> Мик тикси1ик <400> 8

Акр 11е О1п Ме1 ТЬг О1п ТЬг ТЬг 8ег 8ег Ьеи 8ег А1а 8ег Ьеи О1у 1 5 10 15

Акр Агд νΗ1 11е 11е 8ег Сук 8ег А1а 8ег О1п Акр 11е 8ег Акп Туг 20 25 30

Ьеи Акп Тгр Туг О1п О1п Ьук Рго Акр О1у ТЬг Vа1 Ьук ν;·ι1 Ьеи 11е 35 40 45

Туг РЬе ТЬг 8ег 8ег Ьеи Шк 8ег О1у ν;·ι1 Рго 8ег Агд РЬе 8ег О1у 50 55 60

8ег О1у 8ег О1у ТЬг Акр Туг 8ег Ьеи ТЬг 11е 8ег Акп Ьеи О1и Рго 65 70 75 80

О1и Акр 11е А1а ТЬг Туг Туг Сук О1п О1п Туг 8ег ТЬг ν;·ι1 Рго Тгр 85 90 95

ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьук Ьеи О1и 11е Ьук Агд 100 105 <210> 9 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 9

Акр 11е О1п Ме1 ТЬг О1п 8ег Рго 8ег 8ег Ьеи 8ег А1а 8ег Vа1 О1у 1 5 10 15

Акр Агд νΗ1 ТЬг 11е ТЬг Сук 8ег А1а 8ег О1п Акр 11е 8ег Акп Туг 20 25 30

Ьеи Акп Тгр Туг О1п О1п Ьук Рго О1у Ьук А1а Рго Ьук ν;·ι1 Ьеи 11е 35 40 45

Туг РЬе ТЬг 8ег 8ег Ьеи Шк 8ег О1у ν;·ι1 Рго 8ег Агд РЬе 8ег О1у 50 55 60

8ег О1у 8ег О1у ТЬг Акр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е 8ег 8ег Ьеи О1п Рго 65 70 75 80

О1и Акр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Сук О1п О1п Туг 8ег ТЬг Vа1 Рго Тгр 85 90 95

ТЬг РЬе О1у О1п О1у ТЬг Ьук ν;·ι1 О1и 11е Ьук Агд 100 105 <210> 10 <211>108 <212> ПРТ

- 71 025367 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 10

Азр 11е О1п Μеί ТНг О1п δе^ Рго δе^ δе^ Ьеи δе^ А1а δе^ Уа1 О1у 1 5 10 15

Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а δе^ О1п δе^ 11е δе^ Азп Туг 20 25 30

Ьеи А1а Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45

Туг А1а А1а δе^ δе^ Ьеи О1и δе^ О1у Уа1 Рго δе^ Агд РНе δе^ О1у 50 55 60 δе^ О1у δе^ О1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е δе^ δе^ Ьеи О1п Рго 65 70 75 80

О1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз О1п О1п Туг Азп δе^ Ьеи Рго Тгр 85 90 95

ТНг РНе О1у О1п О1у ТНг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210> 11 <211> 330 <212> ПРТ <213> Ηοтο зар1епз <400> 11

А1а δе^ ТНг Ьуз О1у Рго δе^ Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго δе^ δе^ Ьуз 1 5 10 15 δе^ ТНг δе^ О1у О1у ТНг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг 20 25 30

РНе Рго О1и Рго Уа1 ТНг Уа1 δе^ Тгр Азп δе^ О1у А1а Ьеи ТНг δе^ 35 40 45

О1у Уа1 Ηίδ ТНг РНе Рго А1а Уа1 Ьеи О1п δе^ δе^ О1у Ьеи Туг δе^ 50 55 60

Ьеи δе^ δе^ Уа1 Уа1 ТНг Уа1 Рго δе^ δе^ δе^ Ьеи О1у ТНг О1п ТНг 65 70 75 80

Туг 11е Суз Азп Уа1 Азп Ηίδ Ьуз Рго δе^ Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз 85 90 95

Ьуз Уа1 О1и Рго Ьуз δе^ Суз Азр Ьуз ТНг Ηίδ ТНг Суз Рго Рго Суз 100 105 110

Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго δе^ Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго 115 120 125

Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи Μеί 11е δе^ Агд ТНг Рго О1и Уа1 ТНг Суз 130 135 140

- 72 025367

Уа1 Уа1 Уа1 Акр Уа1 8ег Шк О1и Акр Рго О1и Уа1 Ьук РЬе Акп Тгр 145 150 155 160

Туг Уа1 Акр О1у Уа1 О1и Уа1 Шк Акп А1а Ьук ТЬг Ьук Рго Агд О1и 165 170 175

О1и О1п Туг Акп 8ег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 8ег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 180 185 190

Шк О1п Акр Тгр Ьеи Акп О1у Ьук О1и Туг Ьук Сук Ьук Уа1 8ег Акп 195 200 205

Ьук А1а Ьеи Рго А1а Рго Не О1и Ьук ТЬг Не 8ег Ьук А1а Ьук О1у 210 215 220

О1п Рго Агд О1и Рго О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго 8ег Агд Акр О1и 225 230 235 240

Ьеи ТЬг Ьук Акп О1п Уа1 8ег Ьеи ТЬг Сук Ьеи Уа1 Ьук О1у РЬе Туг 245 250 255

Рго 8ег Акр Не А1а Уа1 О1и Тгр О1и 8ег Акп О1у О1п Рго О1и Акп 260 265 270

Акп Туг Ьук ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Акр 8ег Акр О1у 8ег РЬе РЬе 275 280 285

Ьеи Туг 8ег Ьук Ьеи ТЬг Уа1 Акр Ьук 8ег Агд Тгр О1п О1п О1у Акп 290 295 300

Уа1 РЬе 8ег Сук 8ег Уа1 Ме1 Шк О1и А1а Ьеи Шк Акп Шк Туг ТЬг 305 310 315 320

О1п Ьук 8ег Ьеи 8ег Ьеи 8ег Рго О1у Ьук 325 330 <210> 12 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая 6хШк метка <400> 12

Шк Шк Шк Шк Шк Шк

5

Claims (28)

1. Способ ингибирования прорастания сосудов, индуцированного УЕОР (фактором роста сосудистого эндотелия), путем приведения эндотелиальных клеток в контакт с первой композицией, содержащей химерное антитело против эндоглина и приемлемый носитель или эксципиент, и второй композицией, содержащей антагонист УЕОР и приемлемый носитель или эксципиент;

где указанное химерное антитело против эндоглина содержит вариабельную область легкой цепи (У_ъ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 1; константную область легкой цепи (С_ъ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО

- 73 025367

ΝΟ: 2; вариабельную область тяжелой цепи (Ун), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 3; и константную область (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4.

2. Способ ингибирования роста раковой опухоли у субъекта, включающий введение первой композиции, содержащей химерное антитело против эндоглина и приемлемый носитель или эксципиент, и второй композиции, содержащей антагонист УЕОР и приемлемый носитель или эксципиент;

где указанное химерное антитело против эндоглина содержит вариабельную область легкой цепи (Уь), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1; константную область легкой цепи (Сь), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2; вариабельную область тяжелой цепи (У_Н), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ΝΟ: 3; и константную область (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4.

3. Способ лечения связанного с ангиогенезом заболевания у субъекта, включающий введение первой композиции, содержащей химерное антитело против эндоглина и приемлемый носитель или эксципиент, и второй композиции, содержащей антагонист УЕОР и приемлемый носитель или эксципиент;

где указанное химерное антитело против эндоглина содержит вариабельную область легкой цепи (Уь), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1; константную область легкой цепи (С_ъ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2; вариабельную область тяжелой цепи (У_Н), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ΝΟ: 3; и константную область (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4, где лечение указанного связанного с ангиогенезом заболевания характеризуется ингибированием УЕОР-индуцированного ангиогенеза.

4. Способ по любому из пп.1-3, где указанное антитело против эндоглина дополнительно включает терапевтическую метку, выбранную из противоопухолевых агентов и ингибиторов ангиогенеза.

5. Способ по любому из пп.1-4, где указанный антагонист УЕОР дополнительно включает терапевтическую метку, выбранную из противоопухолевых агентов и ингибиторов ангиогенеза.

6. Способ по любому из пп.3-5, где связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой рак или метастаз.

7. Способ по любому из пп.2-6, где рак представляет собой солидную опухоль.

8. Способ по п.6, где рак представляет собой опухоль эпителиального происхождения.

9. Способ по п.6, где рак выбран из рака легкого, гинекологической злокачественной опухоли, меланомы, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака матки, колоректального рака, рака предстательной железы, рака почки, рака головы, рака печени, рака шеи, саркомы, миеломы и лимфомы.

10. Способ по любому из пп.3-5, где связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой глазное заболевание, характеризующееся ангиогенезом/неоваскуляризацией, диабетическую нефропатию, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), ревматоидный артрит или остеоартрит.

11. Способ по п. 10, где глазное заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна.

12. Способ по п.10, где глазное заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.

13. Способ по п.10, где связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ).

14. Способ по п.10, где связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой ревматоидный артрит.

15. Способ по п.10, где связанное с ангиогенезом заболевание представляет собой остеоартрит.

16. Способ по любому из пп.1-15, где химерное антитело против эндоглина присутствует в композиции в количестве примерно 0,01 мг/кг, примерно 0,05 мг/кг, примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 30 мг/кг.

17. Способ по любому из пп.1-16, где антагонист УЕОР присутствует в композиции в количестве примерно 2,5 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 7,5 мг/кг, примерно 10 мг/кг или примерно 15 мг/кг.

18. Способ по любому из пп.1-17, где композицию, содержащую химерное антитело против эндоглина, и композицию, содержащую антагонист УЕОР, вводят последовательно.

19. Способ по любому из пп.1-17, где композицию, содержащую химерное антитело против эндоглина, и композицию, содержащую антагонист УЕОР, вводят одновременно.

20. Способ по любому из пп.1-17, где композицию, содержащую химерное антитело против эндоглина, и композицию, содержащую антагонист УЕОР, вводят в один и тот же участок.

21. Способ по любому из пп.1-17, где композицию, содержащую химерное антитело против эндоглина, и композицию, содержащую антагонист УЕОР, вводят в разные участки.

22. Способ по любому из пп.1-21, где антагонист УЕОР представляет собой антитело против УЕОР.

23. Способ по п.22, где антитело против УЕОР представляет собой бевацизумаб.

24. Способ по любому из пп.2-23, дополнительно включающий введение одного или более ингибиторов ангиогенеза.

25. Способ по п.24, где ингибитор ангиогенеза представляет собой ингибитор рецептора УЕОР.

- 74 025367

26. Способ по любому из пп.2-23, дополнительно включающий проведение химиотерапии.

27. Способ по любому из пп.1-21, где антагонист УЕОР представляет собой ингибитор рецептора УЕОР.

28. Способ по п.27, где ингибитор рецептора УЕОР выбран из группы, состоящей из ранибизумаба, афлиберцепта, сунитиниба, сорафениба, акситиниба, пегаптаниба и пазопаниба.

Модель регуляции ангиогенеза посредством СЦ105 (эндоглина)

Фиг. 1

A. \/с ТИС105: СОИ подчеркнуты

ГОАС’ТКГЕЪК !3ΒΏ ГЕ КО: 1)

B. ТКС105С1-:

УТКЗГНЯСЕС ЕЕ ЪЮ: 2)

C. Ун ТИС 105: СОИ подчеркнуты

7Ста’«йЕЕ?Г15КС0СТТ1,Т755 (3£0 ΙΡ КО: 3) ίλ ГКС105Су1

Α5ΤΚ<3Ρ5νΡ?1Α1⁵33Κ3Τ33θτΑΑΠ©ΟΠνίωΥΓ?ΕΡντν5ίΊΝδ<3?,Ι.ΤδθνΗΤΡΡΑνϊ455ί2-ϊ·Υ3153νν^!?7Ρ55ίΠ·β'ΤΟΤνΤΓΤΝνΝΗΚΡ5ΝΤΣ€σΏΚ :<УЕЗРК£!СО1С?НГСРРСРЛРЕЬЬтеР5УРЬРТРК?ЕПТ1Ш5Р.ТР^П’Г:УУ¥П7ЯНВОР£?7КЖ^,?¥*^гьИЗУЕ71^АлТКРЕ£Е0УЬ’'3?7К'Л^гд7ЬТУЬ Ч0ЁЖЦ'УГ’ЖЕ¥КСКУЯЦКАСР?гРГЕКТ15КАКа0Р13^РС1¹/1|^г7ЬРРЗйСЕЬТ1ЭТ0\-^гЙ1ТС1Л’КСР'£Р301АХтаЕ51чО2Рй:ККУК77?Г’'.^гЬОЗБС5Рг· ЕУЗКГТтекЗа^^^ОСКУРЗСЗУМКЕАкНННУ'ГОКЗ^ЙЬЗРОК {3Εζ> ХЕ НО: 4)

Фиг. 2

УЕег (25 нг/мл) + + * + + + АЬ от Тгасоп (мкг/мл) 1 1 10 10 100 100 Рс (мкг/мл) 1 1 10 10 100 100

Фиг. 3

- 75 025367

4.5

УЕСР (25 нг/мл) + + + АЬ от Тгасоп (мкг/мл) 10 10 10 Рс (мкг/мл) 10 10 ЬРбР (100 нг/мл)

Фиг. 4

Фиг. 5

Фиг. 6