KR20120108964A - 항엔도글린 항체 및 항ｖｅｇｆ 제제를 사용한 암 치료를 위한 병용 요법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 제제로 구성된 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면은 키메라 항엔도글린 항체 및 베바시주맙의 용도에 관한 것이다. 또 다른 측면은 VEGF 유도성 발아를 억제하기 위한 본 조성물의 용도에 관한 것이다. 또 다른 측면은 혈관신생을 억제하기 위한 본 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

항엔도글린 항체 및 항ＶＥＧＦ 제제를 사용한 암 치료를 위한 병용 요법{COMBINATION THERAPY OF CANCER WITH ANTI-ENDOGLIN ANTIBODIES AND ANTI-VEGF AGENTS}

상호 참조

본 출원은 2009년 8월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/234,574호의 이점을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

암은 관상 질환에 이은 인간의 2번째 주된 사망 원인이다. 전세계에서 매년 수백만 명의 사람들이 암으로 사망한다. 미국에서만도 암으로 인해 매년 50만 명 이상의 사람들이 사망하고 있으며, 연간 일부 140만 명이 새로운 사례로 진단을 받고 있다. 심장 질환으로 인한 사망은 현저하게 감소하고 있는 반면, 일반적으로 암으로 인한 사망은 증가 추세에 있다. 다음 세기 초반에는 암이 사망의 가장 큰 원인이 될 것으로 예측된다.

또한, 처음에 그의 원발성 암으로부터 살아남은 암 환자인 경우라도, 공통적으로는 그의 생명이 급격히 변동하는 것을 경험한다. 많은 암 환자들은 재발 가능성 또는 치료 실패라는 의식으로 인해 강한 우울증을 경험한다. 많은 암 환자들은 치료 이후 신체적으로 현저하게 쇠약해져 있음을 경험한다.

일반적으로 말하면, 가장 치명적인 암을 관리함에 있어 근본적인 문제는 효과적이며 비독성인 전신 요법이 없다는 데 있다. 암은 유전적 돌연변이로 인해 세포 성장이 조절되지 못하는 것을 특징으로 하는 복합 질환이다. 암성 세포는 모든 기관에 존재하며, 그의 과도한 성장은 정상적인 환경하에서 각종의 생리학적 인자에 의해 엄격하게 조절된다.

혈관신생은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관을 발생시키는 생리학적 과정이다. 혈관신생은 정상적인 과정 및 병적 과정, 둘 다에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안된 바 있다. 예를 들어, 혈관신생 과정은 동물의 기관 및 조직의 혈관계 발생에 관여한다.

특정 병적 병증에서, 혈관신생은 이환 조직 내의 세포에 적절한 혈액 및 영양을 공급하기 위한 수단으로서 자극을 받는다. 이러한 병적 병증들 다수에는 비정상적인 세포 증식 및/또는 조절이 관여한다. 고형암 및 삼출성 황반 변성은 계속적인 성장과 전이를 위한 새로운 혈액 공급 동원에 의존한다.

본원에서는 엔도글린에 결합하는 키메라 항체를 제공한다. 상기 항체는 시험관내 및 생체내 정제, 검출, 진단 및 치료학적 용도를 가지고 있다. 본원에서는 또한 하나 이상의 엔도글린 종 또는 그의 변이체에 결합하여 혈관신생을 억제하는 키메라 항체도 제공한다. 추가로 본원에서는 엔도글린에 결합하는 키메라 항체를 사용하여 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

키메라 항엔도글린 항체는 다양한 형태의 암, 고형 종양, 및 전이 등을 치료 또는 예방하는 항VEGF 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 조성물을 투여함으로써 다양한 형태의 암, 고형 종양, 및 전이 등을 치료하는 방법을 기술한다. 본원에 기술된 조성물은 또한 혈관을 수축시키고/시키거나, 질환과 관련된 내피 세포 증식을 억제하고/하거나, 혈관 누출이 일어나지 못하도록 방해한다.

본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증, 또는 증식성 유리체망막병증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 항체 및 항원 결합 단편을 투여함으로써 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증, 또는 증식성 유리체망막병증을 치료 또는 예방하는 방법을 기술한다. 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 혈관을 수축시키고/시키거나, 안질환과 관련된 내피 세포 증식을 억제하고/하거나, 출혈 증상을 제거하고/하거나, 흐린 시력을 치료하고/하거나, 시력 상실을 정체시키고/시키거나, 혈관 누출을 예방하며, 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증 또는 증식성 유리체망막병증 치료용 의약에 사용될 수 있다.

본원에서는 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역(V_H: heavy chain variable region); 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 불변 영역(Fc); 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역(V_L: light chain variable region); 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역(C_L: light chain constant region)을 가진 키메라 항엔도글린 항체를 제공한다.

한 측면에서, 본원에 기술된 항체는 상기 화합물의 약동학적 특성, 예를 들어, 생체내 안정성, 가용성, 생체이용성 또는 반감기를 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 그러한 변형으로는 PEG화 및/또는 당화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 기술된 항체는 종래 수단을 사용함으로써 신속 또는 장기간 전달을 위해 제제화될 수 있다. 하나의 비제한적인 실시양태에서, 신속 전달은 예를 들어, 정맥 주사에 의한 것이다. 또 다른 비제한적인 실시양태에서, 장기간 전달은 예를 들어, 피하 침착에 의한 것이다.

본원에서는 본원에 기술된 항체 및 항원 결합 단편, 및 허용되는 담체 또는 부형제로 이루어진 조성물을 제공한다.

본원에 기술된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 혈관신생과 관련된 각종 질환 및 병증, 예를 들어, 다양한 형태의 암, 고형 종양, 및 전이를 치료하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 이러한 항체 및 그의 항원 결합 단편은 다양한 형태의 암, 고형 종양, 및 전이와 관련된 질환 및 병증의 예방, 치료 또는 진단용 의약의 제제화에 사용될 수 있다.

본원에 기술된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 혈관신생/신생혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안구 또는 비안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨 망막병증), 당뇨 신장병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염 및 골관절염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 이러한 항체 및 그의 항원 결합 단편은 혈관신생과 관련된 질환 및 병증, 예를 들어, 혈관신생/신생혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안구 또는 비안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨 망막병증), 당뇨 신장병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염 및 골관절염의 예방, 치료 또는 진단용 의약의 제제화에 사용될 수 있다.

본원에서는 환자에게 키메라 항엔도글린 항체를 함유하는 제1 조성물, 및 항 VEGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 함유하는 제2 조성물을 투여함으로써 효과적인 숙주 면역 반응이 유도되도록 하는, 환자에서 숙주 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

본원에서는 환자에게 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물을 투여함으로써 효과적인 숙주 면역 반응이 유도되도록 하는, 환자에서 숙주 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

숙주 면역 반응은 체액성 면역 반응 또는 세포 매개 면역 반응일 수 있다. 면역 반응은 혈관신생, 혈관신생 의존성 질환 또는 혈관신생 의존성 질병을 억제하는 반응일 수 있다. 면역 반응은 또한 세포 신호전달 경로(예를 들어, Smad 신호전달)의 유도 또는 차단을 포함한다. 한 실시양태에서, 반응은 혈관신생을 억제한다.

본원에서는 혈관신생과 관련된 세포 신호전달 경로에 영향을 미치는 방법을 제공한다. 하나 이상의 본원에 기술된 조성물을 세포 신호전달 경로를 변경시키는 데 충분한 양으로 혈관신생 세포와 접촉시킬 수 있다(시험관내, 생체내 또는 생체외). 한 실시양태에서, 항체는 키메라 항엔도글린 항체이다. 하나의 비제한적인 일례로, 항체 결합에 대한 반응에서 Smad 1, 5 및/또는 8 신호전달은 혈관신생 세포에서는 약 1.5배 이상 만큼 억제된다. 또 다른 비제한적인 일례로, Smad 3 수준은 약 1.5배 이상 만큼 증가하는데, 이는 세포가 휴지 상태로 복귀하였음을 시사하는 것이다. 항VEGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물은 또한 키메라 항엔도글린 항체를 함유하는 조성물과 함께 관련하여 투여된다.

본원에서는 환자에게 본원에서 제공하는 하나 이상의 조성물을 투여하여 피험체에서 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 질병을 억제하는 방법을 제공한다. 혈관신생 의존성 질환 또는 질병은 하기: 다양한 형태의 암, 고형 종양 및 전이 중 어느 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 질병을 억제하면 질환 또는 질병과 관련된 증상이 완화된다. 또 다른 실시양태에서, 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 질병을 억제하면 종양 크기는 축소되거나, 종양이 진행되지 못하거나, 세포 증식이 감소되거나, 아폽토시스가 증가하거나, 피험체의 생존 기간은 연장된다.

본원에서는 본원에서 제공하는 하나 이상의 조성물을 투여함으로써 피험체에서 암 또는 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 조성물을 투여하면 치료받는 피험체의 수명은 연장될 수 있다. 치료하고자 하는 암/종양으로는 고형암을 포함하고; 종양은 원발성 종양 또는 전이성 종양일 수 있다. 고형 종양의 일례로는 피부, 흑색종, 폐, 췌장, 유방, 난소(ovary), 결장, 직장, 위, 갑상선, 후두, 난소(ovarian), 전립선, 결장직장, 두부, 경부, 눈, 입, 인후, 식도, 흉부, 골, 고환, 림프계, 골수, 골, 육종, 신장, 땀샘, 간, 콩팥, 뇌(예를 들어, 다형성 아교모세포종) 등의 조직 중으로부터 선택되는 조직 또는 기관의 것이 있다. 하나의 비제한적인 일례로, 고형 종양은 결장 종양, 유방 종양, 콩팥 종양, 폐 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 또는 상기 종양들 중 어느 것의 전이이다.

본원에서는 하기: 혈관신생/신생혈관형성을 특징으로 하는 다양한 형태의 안구 또는 비안질환(예를 들어, 황반 변성, 당뇨 망막병증), 당뇨 신장병증, 만성 염증성 질환(예를 들어, IBD), 류마티스 관절염 및 골관절염 중 어느 것을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 질병을 억제하면 질환 또는 질병과 관련된 증상은 완화된다. 또 다른 실시양태에서, 혈관신생 또는 혈관신생 의존성 질환 또는 질병을 억제하면 환자에서의 작용이 잘 이루어진다. 치료하고자 하는 안구 조직은 예를 들어, 당뇨 망막병증, 황반 변성 또는 신생혈관형성 녹내장을 앓는 환자의 망막 조직이고, 억제하고자 하는 혈관신생은 망막 조직에서 신생혈관형성이 발생하는 것인 망막 조직 혈관신생이다.

본 방법은 추가로 수술을 통해 종양을 제거하고/하거나, 하나 이상의 항암제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 항암제는 본원에 기술된 조성물은 본원에 기술된 조성물의 투여 이전, 그와 동시에 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 추가의 항암제는 본 조성물 투여 이전 1주일 이내에, 투여 이후 1주일 이내에 투여될 수 있거나, 또는 추가의 항암제는 본 조성물과 같은 날 투여될 수 있다. 추가의 항암제가 본 조성물과 같은 날 투여되는 경우, 이러한 투여는 동시 투여라고 할 수 있다.

본원에서는 혈관신생을 억제하는 데 충분한 치료학상 유효량의 본원에 기술된 하나 이상의 조성물과 세포 또는 조직을 접촉시켜 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 본원에서는 종양 세포의 성장을 억제하는 데 충분한 치료학상 유효량의 본원에 기술된 하나 이상의 조성물과 세포 또는 조직을 접촉시키거나, 피험체에게 상기 조성물을 투여함으로써 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 하나 이상의 조성물과 조직을 접촉시킴으로써, 그러한 접촉을 통해 혈관신생, 세포 성장, 증식, 세포 분열 등을 억제하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 조직은 배양된 조직 생검 샘플일 수 있거나, 또는 피험체에 존재하는 것일 수 있다.

본원에서는 세포 증식성 질병을 앓고 있거나, 그러한 위험이 있는 피험체에게 세포 증식성 질병을 치료하는 데 유효한 유효량의 본원에 기술된 하나 이상의 조성물을 투여하여 세포 증식성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 세포 증식성 질병은 예를 들어, 양성 또는 악성 고형 또는 비고형 종양일 수 있고, 종양은 전이성 또는 비전이성일 수 있다. 치료를 통해 피험체의 상태는 개선될 수 있으며, 하기 인자들: 세포 증식 감소, 세포 개수 감소, 아폽토시스 증가, 또는 세포 증식성 질병을 포함하는 세포 중 적어도 일부의 생존 감소 중 하나 이상이 발생하였는지 여부를 측정함으로써 치료에 대해 평가할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 중 하나 이상이 발생하게 되면 종양 또는 전이가 부분적으로 또는 전체적으로 제거될 수 있고, 환자의 생존 기간은 연장될 수 있다.

본원에서는 환자에게 치료학상 유효량의 본원에서 제공하는 하나 이상의 조성물을 투여하여 환자에서 당뇨 망막병증, 황반 변성, 맥락막 신생혈관형성 또는 신생혈관형성 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다. 치료를 통해 피험체의 상태는 개선될 수 있으며, 하기 인자들: 황반 부종 감소, CNV 면역 감소, 또는 시력 증가 중 하나 이상이 발생하였는지 여부를 측정함으로써 치료에 대해 평가할 수 있다.

또 다른 측면은 하나 이상의 본원에 기술된 조성물에 의해 피험체에서 만성 염증성 질환을 치료하는 것이다. 만성 염증성 질환의 비제한적인 일례로는 IBD, 크론병, 및 궤양성 대장염을 포함한다.

또 다른 측면은 하나 이상의 본원에 기술된 조성물을 투여하여 피험체에서 류마티스 관절염을 치료하는 것이다.

또 다른 측면은 하나 이상의 본원에 기술된 조성물을 투여하여 피험체에서 골관절염을 치료하는 것이다.

류마티스 관절염 및/또는 골관절염을 앓는 피험체를 치료하는 치료에 대해서는 공개된 가이드라인에 따라 측정된 적절한 카테고리의 ACR 점수에서의 개선을 비롯한, 다양한 수단에 의해 평가할 수 있다.

본원에서 제공하는 방법에서, 치료하고자 하는 피험체는 인간 또는 비인간 피험체일 수 있다. 본원에서 제공하는 조성물 및 항암제 또는 치료법은 환자의 건강 상태, 질환 또는 병증의 진행 상태, 및 치료 효능에 따라 1회 또는 다회에 걸쳐 투여(수행)될 수 있다. 치료 전 과정을 통해 요법 및 치료법은 조절될 수 있다(예를 들어, 조성물 중 항체의 투여량).

조성물은 국소적으로, 국부적으로 또는 전신으로, 예를 들어, 피하, 피하, 유리체내, 진피내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 근육내 주사에 의한 투여에 의해 투여될 수 있다.

추가로, 키메라 항엔도글린 항체는 또한 VEGF 경로를 억제하는 공지된 다른 요법 및/또는 항VEGF 항체와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 예로는 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트(VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

추가로, 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 암 치료용의 공지된 다른 요법 및/또는 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 예로는 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트 (VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 요법의 예로는 방사선조사, 수술, 하나 이상의 치료제 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서는 본원에서 제공하는 방법들 중 어느 것 하나 이상에 대한 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 가용성 엔도글린의 수준 증가는 암 환자의 생존 기간 단축과 상관 관계가 있다. 따라서, 한 측면에서, 가용성 엔도글린의 수준을 요법 이전 및 요법을 수행하는 동안에 모니터링할 수 있다. 그러므로, 가용성 엔도글린의 수준의 감소는 치료학적 요법이 환자를 치료함에 있어 효과적인지 여부를 나타내는 지표가 될 수 있다.

본 출원의 한 실시양태는 본원에 기술된 질병 치료용 의약의 제제화에서의 본원에 기술된 조성물 중 어느 것의 용도를 고려한다. 의약은 치료를 필요로 하는 환자/피험체의 신체적인 특징에 기초하여 제제화될 수 있고, 이는 예를 들어, 암성 조직의 단계에 기초하여 단일 또는 다중 제제로 제제화될 수 있다. 의약은 병원 및 진료소에 배부하기 위한 것으로서, 라벨에는 피험체에서의 본원에 기술된 질병 치료에 대한 지시가 표기되어 있는 적절한 라벨과 함께 적합한 패키지로 패킹될 수 있다. 의약은 단일 또는 다중 단위로 패킹될 수 있다. 본원에 기술된 조성물의 투여량 및 투여에 대한 설명서는 패키지와 함께 포함되어 있을 수 있다.

참고 문헌 인용

본 명세서에서 언급되는 모든 공개 문헌 및 특허 출원은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 각 공개 문헌 또는 특허 출원 전문이 구체적 및 개별적으로 본원에 참고로 포함되어 있다고 명시되고 있는 바와 같은 정도로 본원에 포함된다.

도 1은 TGF-β/ALK5 신호전달 경로를 나타내는 다이어그램을 제공한다. TGF-β/ALK5 경로(A)는 세포 증식을 억제한다. TGF-β/ALK1 경로(B)는 내피 세포 증식을 유도하며, ALK1 신호전달을 위해 CD105(엔도글린)를 필요로 한다. 점선은 불활성 또는 차단 경로를 나타낸다. 굵은 화살표 표시는 신호전달 경로의 자극을 나타낸다.
도 2는 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체(TRC105)의 아미노산 서열을 제공한다. 도 2A는 키메라 항엔도글린 항체의 대표적인 가변 경쇄(서열 번호 1)이고; 도 2B는 키메라 항엔도글린 항체의 대표적인 불변 경쇄(서열 번호 2)이며; 도 2C는 키메라 항엔도글린 항체의 대표적인 가변 중쇄(서열 번호 3)이고; 도 2D는 키메라 항엔도글린 항체의 대표적인 불변 감마1 중쇄(서열 번호 4)이다.
도 3은 콜라겐에 시딩된 HUVEC 구상체를 사용하여 TRC105가 용량에 의존하는 방식으로 VEGF 유도성 발아(sprouting)를 억제한다는 것을 도시한 것이다(N=3).
도 4는 TRC105는 VEGF 유도성 발아는 차단시키는 반면(사선형 해칭), HUVEC 구상체의 bFGF 유도성 발아는 억제시키지 못한다는 것(다이아몬드형 해칭)을 도시한 것이다(N=2).
도 5는 TRC105가 VEGF 유도성 발아에 미치는 억제성 효과(사선형 해칭)는 VEGF 억제제 베바시주맙(Bevacizumab)과 함께 조합되었을 때(다이아몬드형 해칭), 증진되고, 이를 통해 HUVEC 발아가 완전하게 억제된다는 것을 도시한 것이다.
도 6은 TRC105가 VEGF 유도성 발아에 미치는 억제성 효과(사선형 해칭)는 VEGF 수용체 키나제의 억제제와 함께 조합되었을 때(다이아몬드형 해칭)에는 증진되지 않는다는 것을 도시한 것이다.

제제화 또는 공정 파라미터는 당연히 달라질 수 있는 바, 본 출원은 특정의 제제화 또는 공정 파라미터로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것이 아님을 또한 이해하여야 한다. 추가로, 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질 다수가 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.

본 출원에 따라, 당업계에서 전반적으로 설명되고 있는 바와 같이, 종래의 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기법들이 사용될 수 있다.

키메라 항엔도글린 항체는 다양한 형태의 암, 고형 종양, 및 전이 등을 치료 또는 예방하는 데 항VEGF 제제와 함께 조합되어 사용될 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 조성물을 투여함으로써 다양한 형태의 암, 고형 종양, 및 전이 등을 치료하는 방법을 기술한다. 본원에 기술된 조성물은 또한 혈관을 수축시키고/시키거나, 질환과 관련된 내피 세포 증식을 억제하고/시키거나, 혈관 누출이 일어나지 못하도록 방해할 수 있다.

항체 용어

본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 천연이든, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생산된 것이든 간에 면역글로불린(Ig)을 의미한다. 상기 용어는 또한 항원 결합 도메인이거나, 또는 항원 결합 도메인에 상동성인 결합 도메인을 가진 임의의 폴리펩티드 또는 단백질도 포함한다. 상기 용어는 추가로 "항원 결합 단편" 및 하기 기술되는 것과 같은 유사 결합 단편에 대하여 상호교환적으로 사용될 수 있는 다른 용어도 포함한다. 키메라 항체도 상기 용어에 의해 고려된다.

천연 항체 및 천연 면역글로불린은 보통 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 전형적으로 하나의 이황화 결합에 의한 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있으며, 이황화 결합의 개수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 달라질 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격화된 쇄내 이황화 브릿지를 가지고 있다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인("V_H" 또는 "VH")을 가지고 있고, 이에 이어서 다수의 불변 도메인("C_H" 또는 "CH")을 가지고 있다. 각 경쇄는 한쪽 끝에는 가변 도메인("V_L" 또는 "VL")을, 그의 나머지 다른 한쪽 끝에는 불변 도메인("C_L" 또는 "CL")을 가지고 있으며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 특정의 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 경계를 형성하는 것으로 여겨진다.

본원에서 사용되는 바, "합성 폴리뉴클레오티드," "합성 유전자" 또는 "합성 폴리펩티드"라는 용어는 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부, 또는 아미노산 서열 또는 그의 일부가 천연적으로 발생된 등가의 서열과 비교하여 새로 디자인되거나 합성된 것이거나, 또는 변형된 것인 서열로부터 유래된 것을 의미한다. 합성 폴리뉴클레오티드(항체 또는 항원 결합 단편) 또는 합성 유전자는 핵산 또는 아미노산 서열의 화학적 합성법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 합성 유전자는 전형적으로는 아미노산, 또는 폴리뉴클레오티드 수준(또는 그 둘 다)에 있어 천연적으로 발생된 유전자와는 상이하며, 전형적으로 이는 맥락상 합성 발현 제어 서열에 포함된다. 천연 유전자와 비교하였을 때, 합성 유전자 폴리뉴클레오티드 서열이 반드시 상이한 아미노산을 포함하는 단백질을 코딩하는 것은 아닐 수 있고; 예를 들어, 이는 또한 상이한 코돈을 포함하나, 동일한 아미노산을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다(즉, 뉴클레오티드 변화가 아미노산 수준에서 침묵 돌연변이를 나타내는 것이다).

항체와 관련하여, "가변 도메인"이라는 용어는 항원의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 항체의 가변 도메인을 의미한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전역에 걸쳐 고르게 분포하는 것은 아니다. 오히려 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에 있어 초가변 영역(이는 또한 CDR로도 공지됨)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인 중 보다 고도로 보존되는 부위는 "프레임워크 영역" 또는 "FR(framework region)"로 명명된다. 비변형된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함하며, 이들은 대개 루프 연결부를 형성하는 3개의 CDR이 그 사이에 배치되어 있는 β 쉬트 구조를 취하고, 일부 경우에는 β 쉬트 구조의 일부를 취한다. 각 쇄에서 CDR는 FR에 의해 아주 근접하게 결합되어 있으며, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합부 형성에 기여한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669] 참조).

본원에서 사용되는 바, "초가변 영역" 및 "CDR"이라는 용어는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. CDR은 상보적인 방식으로 항원에 결합하는 3개의 서열 영역으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 이는 V_H 및 V_L 쇄 각각에 대해 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 알려져 있다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따르면, 경쇄 가변 도메인에서, CDR은 전형적으로는 대략 잔기 24-34(CDRL1), 50-56(CDRL2) 및 89-97(CDRL3)에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서, CDR은 전형적으로는 대략 잔기 31-35(CDRH1), 50-65(CDRH2) 및 95-102(CDRH3)에 상응한다. 다른 항체의 CDR은 삽입을 포함할 수 있는 바, 아미노산 번호 매김은 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 카바트(Kabat) 번호 매김 체계는 상이한 항체들 간의 번호 매김에서 임의의 삽입을 반영하기 위해 특정 잔기에 부착된 문자를 사용하는 번호 매김 방식을 사용하여 상기와 같은 삽입을 설명한다(예를 들어, 경쇄에서 CDRL1의 27A, 27B, 27C, 27D, 27E, 및 27F). 별법으로, 문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)]에 따르면, 경쇄 가변 도메인에서, CDR은 전형적으로는 대략 잔기 26-32(CDRL1), 50-52(CDRL2) 및 91-96(CDRL3)에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서, CDR은 전형적으로는 대략 잔기 26-32(CDRH1), 53-55(CDRH2) 및 96-101(CDRH3)에 상응한다.

본원에서 사용되는 바, "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 항원 결합 포켓 또는 그루브의 일부를 형성하는 프레임워크 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 잔기는 항원 결합 포켓 또는 그루브의 일부인 루프를 형성하고, 루프 중의 아미노산 잔기를 항원과 접촉할 수 있거나, 또는 접촉하지 않을 수 있다. 프레임워크 영역은 일반적으로 CDR 사이의 영역을 포함한다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따르면, 경쇄 가변 도메인에서, FR은 전형적으로 대략 잔기 0-23(FRL1), 35-49(FRL2), 57-88(FRL3), 및 98-109에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서, FR은 전형적으로 대략 잔기 0-30(FRH1), 36-49(FRH2), 66-94(FRH3), 및 103-133에 상응한다. 경쇄에 대한 카바트 번호 매김과 관련하여 상기에서 논의된 바와 같이, 중쇄 역시 유사한 방식으로 삽입을 설명한다(예를 들어, 중쇄에서 CDRH1의 35A, 35B). 별법으로, 문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)]에 따르면, 경쇄 가변 도메인에서, FR은 전형적으로 대략 잔기 0-25(FRL1), 33-49(FRL2) 53-90(FRL3), 및 97-109(FRL4)에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서, FR은 전형적으로 대략 잔기 0-25(FRH1), 33-52(FRH2), 56-95(FRH3), 및 102-113(FRH4)에 상응한다.

항체의 불변 도메인(Fc)은 항체가 항원에 결합하는 데 직접 관여하지는 않지만, 예를 들어, Fc 수용체(FcR: Fc receptor)와의 상호작용을 통해 항체 의존성 세포 독성에 항체가 관여하는 것과 같이 다양한 효과기 기능을 나타낸다. Fc 도메인은 또한 환자에게로의 투여 이후 순환 중 항체의 생체이용성을 증가시킬 수 있다. 인간 Fc 도메인을 대신하여 뮤린 Fc 도메인으로 치환하면, HAMA 부작용도 또한 감소될 수 있다.

면역글로불린 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 5가지의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하며, 이들 중 수개는 추가로 서브부류(이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인(Fc)은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 명명된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 입체형태도 주지되어 있다.

임의의 척추 동물 종으로부터 유래된 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 또는 ("κ") 및 람다 또는 ("λ")로 명명되는, 뚜렷하게 다른 두 유형 중 하나로 지정될 수 있다.

"항체의 항원 결합부," "항원 결합 단편," "항원 결합 도메인," "항체 단편" 또는 "항체의 기능적 단편"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 상기 용어에 포함되는 항체 단편에 대한 비제한적인 일례로는 (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 단일 아암 항체의 V_L 및 V_H 도메인을 함유하는 Fv 단편, (v) V_H 도메인을 함유하는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544 546]); 및 (vi) 단리된 CDR을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 ½ 항체도 본 정의에 포함된다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예를 들어, 디아바디 또한 본원에 포함된다.

"F(ab')₂" 및 "Fab" 부분은 Ig를 프로테아제, 예를 들어, 펩신 및 파파인으로 처리함으로써 생산될 수 있고, 이는 2개의 중쇄 각각의 힌지 영역 사이에 존재하는 이황화 결합 주변의 면역글로불린 분해에 의해 생성되는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 파파인은 2개의 중쇄 각각의 힌지 영역 사이에 존재하는 이황화 결합 상류쪽에서 IgG를 절단함으로써, V_L 및 C_L(경쇄 불변 영역)로 구성된 경쇄, 및 V_H 및 중쇄 불변 영역 중 C_{H γ1}(γ1) 영역으로 구성된 중쇄 단편이 이황화 결합을 통해 그의 C 말단 영역에서 연결되어 있는 것인 2개의 상동성 항체 단편을 생성한다. 이들 2개의 상동성 항체 단편들 각각 Fab'로 명명된다. 펩신은 또한 2개의 중쇄 각각의 힌지 영역 사이에 존재하는 이황화 결합 하류쪽에서 IgG를 절단함으로써, 상기 언급된 2개의 Fab'가 힌지 영역에서 연결되어 있는 것인 단편보다 약간 더 큰 항체 단편을 생성한다. 이러한 항체 단편은 F(ab')₂로 명명된다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과, 중쇄의 제1 불변 도메인(C_H1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 C_H1 도메인의 카르복실 말단에 몇개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서 Fab 단편과는 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 포함하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래는 그들 사이에 힌지 시스테인을 가지고 있는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 알려져 있다.

"Fv"는 완전한 항원 인식부 및 항원 결합부를 포함하는 항체 단편을 의미한다. 이러한 영역은 비공유 또는 공유 결합으로 밀착 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된 것이다(이황화 연결된 Fv는 당업계에서 문헌 [Reiter et al,. (1996) Nature Biotechnology 14:1239-1245]에 기술되어 있다). 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체 표면 상의 항원 결합부를 정의할 수 있도록 하는 상기와 같은 입체형태로 존재한다. 종합하면, V_H 및 V_L 쇄 각각으로부터의 CDR들 중 하나 이상으로 이루어진 조합이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 예를 들어, CDRH3 및 CDRL3이 수령체 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 V_H 및 V_L 쇄로 전달되었을 때에 이들은 항체에 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이며, 이러한 CDR 조합은 본원에 기술된 기법들 중 어느 것을 사용하여 결합, 친화도 등에 대해 테스트될 수 있다. 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이성인 오직 3개의 CDR만을 포함하는 Fv 절반부)조차도, 비록 제2 가변 도메인과 조합되었을 때보다는 친화도가 더 낮을 수는 있지만, 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다. 추가로, 비록 Fv 단편의 두 도메인(V_L 및 V_H)이 별개의 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, 이들은 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(이는 단일 쇄 Fv(scFv: single chain Fv)로도 공지됨; 문헌 ([Bird et al,. (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al,. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 및 [Osbourn et al,. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778]))를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 통해 결합될 수 있다. 그러한 scFv 또한 항체의 "항원 결합부"라는 용어 포함시키고자 한다. 완전한 Ig(예를 들어, IgG) 분자 또는 다른 이소형을 코딩하는 발현 벡터를 생성하기 위해 특이적인 scFv의 임의의 V_H 및 V_L 서열을 Fc 영역 cDNA 또는 게놈 서열에 연결시킬 수 있다. V_H 및 V_L은 또한 단백질 화학법 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 Ig의 Fab, Fv 또는 다른 단편을 생성하는 데에도 사용될 수 있다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 것인, 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 추가로 sFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 V_H 및 V_L 도메인 사이에 포함하고 있다. sFv에 대한 리뷰를 위해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조한다.

"아비머(AVIMER)™"라는 용어는 항체 및 항체 단편과는 상관이 없으며, A 도메인(이는 또한 A 부류 모듈, 보체형 반복부, 또는 LDL 수용체 A 부류 도메인으로도 지칭됨)으로도 지칭되는 수개의 모듈식의 재사용이 가능한 결합 도메인으로 구성된 인간 기원의 치료학적 단백질 부류를 지칭하는 것이다. 이는 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인으로부터 개발되었다(문헌 ([Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-1494]; [Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220])). 생성된 단백질은, 단일 에피토프 결합 단백질과 비교하여 개선된 친화도(일부 경우, 나노몰 이하(sub-nanomolar)), 및 특이성을 나타낼 수 있는 다중의 비의존 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2005/0221384호, 제2005/0164301호, 제2005/0053973호, 및 제2005/0089932호, 제2005/0048512호, 및 제2004/0175756호(이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)를 참조한다.

공지된 217개의 A 도메인들은 각각 ~35개의 아미노산을 포함하고(~4 kDa); 이들 도메인은 평균적으로 5개의 아미노산 길이인 링커에 의해 분리되어져 있다. 천연 A 도메인은 효율적으로 신속하게 폴딩하여 주로 칼슘 결합 및 이황화 형성에 의해 매개되는 균일하고 안정적인 구조를 형성한다. 단지 12개의 아미노산만으로 구성된 보존되는 스캐폴드 모티프가 이러한 공통된 구조를 위해 필요하다. 최종 결과물은, 다중 도메인들 각각이 별개의 기능을 나타내는 것인 다중 도메인을 포함하는 단일 단백질 쇄이다. 상기 단백질의 각 도메인은 독립적으로 결합하며, 각 도메인의 에너지적 기여는 부가적인 것이다. 이러한 단백질은 결합성 다량체로부터 "아비머™"로 명명된다.

"디아바디"라는 용어는 같은 폴리펩티드 쇄에서 중쇄 가변 도메인(V_H)과 경쇄 가변 도메인(V_L)이 연결되어 있는 것(V_H-V_L)을 포함하는, 2개의 항원 결합부를 가진 소형 항체 단편을 의미한다. 같은 쇄 상에서 2개의 도메인끼리 쌍을 형성하도록 하는 데에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인이 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원 결합부를 형성하도록 한다. 디아바디는 예를 들어, 문헌 (EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993)])에 보다 상세하게 기술되어 있다.

예를 들어, 낙타류 및 상어류로부터의 항체와 같이, 항원 결합 폴리펩티드는 또한 중쇄 이량체를 포함한다. 낙타류 및 상어류 항체는 V 유사 및 C 유사 도메인으로된 2개의 쌍으로 이루어진 동종이량체 쌍을 포함한다(어느 것도 경쇄는 포함하지 않는다). 낙타류에서의 중쇄 이량체 IgG의 V_H 영역은 경쇄와 소수성 상호작용을 할 필요가 없기 때문에, 보통 경쇄와 접촉하는 중쇄 중의 영역은 낙타류에서는 소친수성 아미노산 잔기로 변경되어 있다. 중쇄 이량체 IgG의 V_H 도메인은 V_HH 도메인으로 명명된다. 상어류 Ig-NAR은 하나의 가변 도메인(V-NAR 도메인)과 5개의 C 유사 불변 도메인(C-NAR 도메인)으로 이루어진 동종이량체를 포함한다. 낙타류에서, 항체 레퍼토리의 다양성은 V_H 또는 V_HH 영역 중 CDR1, 2, 및 3에 의해 결정된다. 낙타 V_HH 영역 중 CDR3은 평균 16개의 아미노산으로 된, 상대적으로 장쇄인 그의 길이를 특징으로 한다(문헌 [Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129]). 이는 많은 다른 종들의 항체의 CDR3 영역과는 대조를 이룬다. 예를 들어, 마우스 V_H의 CDR3은 평균 9개의 아미노산으로 이루어져 있다. 낙타류의 가변 영역의 생체내 다양성을 유지하는, 낙타류로부터 유래된 항체 가변 영역의 라이브러리는 예를 들어, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제20050037421호에 개시된 방법에 의해 제작될 수 있다.

"키메라" 형태의 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체는 비인간 Ig로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 키메라 항체를 포함한다. 대개, 키메라 항체는 뮤린 Fc 대신 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부가 삽입되어 있는 뮤린 항체이다. 상세한 설명을 위해서는 문헌 ([Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)])을 참조한다.

본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉, 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적으로 지시된다. 추가로, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함할 수 있는 종래(폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. "모노클로날"이라는 수식어구는 상기 항체가 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되었다는 특징을 나타내는데, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법에 의해, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)])에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

항체는 유글로불린 침전 방법, 카프로산 방법, 카프릴산 방법, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52), 또는 항Ig 칼럼 또는 단백질 A, G 또는 L 칼럼, 예를 들어, 하기에 보다 상세하게 기술하는 것을 사용하는 친화 크로마토그래피에 의해 상기 언급된 배양물 상등액 또는 복수로부터 단리되고 정제될 수 있다.

면역글로불린 분자를 구성할 때, 가변 영역 또는 그의 일부를 하나 이상의 불변 영역 또는 그의 일부에 융합시키거나, 연결시키거나, 또는 다르게는 그에 결합시켜 본원에 기술된 항체 중 어느 것을 제조할 수 있다. 이는 분자 클로닝 기법 또는 분자를 코딩하는 핵산에 대한 직접 합성법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "면역반응제"란 아미노산 잔기의 서열("결합부" 또는 "에피토프")에 특이적인 결합제, 항체 또는 그의 단편을 지칭하는 것으로서, 그러나, 다른 펩티드/단백질과도 교차 반응성을 띠고, 인간에서의 사용을 위해 인간 투여용으로 제제화된 수준에서는 독성을 띠지 않는 것이다. "결합"이라는 용어는 생리학적 조건하에 예를 들어, 공유, 정전기, 수소성, 및 이온 및/또는 수소 결합 상호작용에 기인한, 두 분자 간의 직접적인 회합을 지칭하며, 예를 들어, 염 브릿지 및 물 브릿지 및 임의의 다른 종래 결합 수단과 같은 상호작용을 포함한다. "우선적으로 결합한다"라는 용어는 결합제가 관련없는 아미노산 서열에 결합할 때보다 더 큰 친화도로 결합부에 결합하는 것을 의미하는 것이다. 친화도는 관련없는 아미노산 서열에 대한 결합제의 친화도보다 1배 이상으로 더 크거나, 2배 이상으로 더 크거나, 3배 이상으로 더 크거나, 4배 이상으로 더 크거나, 5배 이상으로 더 크거나, 6배 이상으로 더 크거나, 7배 이상으로 더 크거나, 8배 이상으로 더 크거나, 9배 이상으로 더 크거나, 10배 이상으로 더 크거나, 20배 이상으로 더 크거나, 30배 이상으로 더 크거나, 40배 이상으로 더 크거나, 50배 이상으로 더 크거나, 60배 이상으로 더 크거나, 70배 이상으로 더 크거나, 80배 이상으로 더 크거나, 90배 이상으로 더 크거나, 100배 이상으로 더 크거나, 1,000배 이상으로 더 클 수 있다. "면역반응제," "우선적으로 결합한다"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바, "친화도"라는 용어는 두 제제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 의미하는 것으로, 이는 Kd로 표시된다. 결합 단백질의 리간드에의 결합에 대한 친화도, 예를 들어, 항체의 에피토프에의 결합에 대한 친화도는 예를 들어, 약 100 나노몰(nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM)일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "결합성"이라는 용어는 희석 후 해리에 대한 2개 이상의 물질로 구성된 복합체의 저항성을 의미하는 것이다. 겉보기 친화도는 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay) 또는 당업자에게 친숙한 임의의 기법에 의해 측정될 수 있다. 결합성은 예를 들어, 스캐차드(Scatchard) 분석법 또는 당업자에게 친숙한 임의의 기법에 의해 측정될 수 있다.

"에피토프"란 항체의 가변 영역 결합 포켓과 결합 상호작용을 형성할 수 있는 항원 또는 다른 고분자의 일부를 의미한다. 그러한 결합 상호작용은 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 자명해질 수 있다. 항원 결합은 예를 들어, CDR3 또는 CDR3 쌍을 포함할 수 있거나, 일부 경우에서는 최대 V_H 및 V_L 쇄를 이루는 6개 CDR 모두의 상호작용을 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 펩티드 서열(즉, "연속")일 수 있거나, 또는 비인접 아미노산 서열(즉, "입체형태적" 또는 "불연속")로 구성된 것일 수 있다. 항체는 하나 이상의 아미노산 서열을 인식할 수 있는 바; 이에 에피토프는 1 초과의 상이한 아미노산 서열로 한정할 수 있다. 항체에 의해 인식되는 에피토프는 당업자에게 주지되어 있는 펩티드 지도화 및 서열 분석 기법에 의해 측정될 수 있다. 결합 상호작용은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 자명해 진다. TRC105는 미국 특허 번호 제5,928,641호; 제6,200,566호; 제6,190,660호; 및 제7,097,836호에 Y4-2F1 또는 SN6j로서 기술된 뮤린 항체와 같은 아미노산 서열인 뮤린 항체이다. Y4-2F1 및 SN6j에 의해 인식되는, 및 따라서 TRC105에 의해 인식되는 에피토프는 이전에 확인된 바 있다.

"특이적"이라는 용어는 항체가 상기 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 항원 이외의 다른 분자에는 어떤 유의적인 결합도 하지 않는 상황을 의미하는 것이다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 항원 결합 도메인은 다수의 항원이 보유하고 있는 특정의 에피토프에 대해 특이적이며, 이러한 경우, 항체는 그러한 에피토프를 보유하는 각종 항원에 결합할 수 있는 그러한 상황에도 적용될 수 있다. "우선적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 항체가 관련없는 아미노산 서열에 결합할 때보다 더 큰 친화도로 에피토프에 결합하는 것을 의미하는 것이며, 에피토프를 포함하는 다른 폴리펩티드에의 교차 반응이 인간에서의 사용을 위해 인간 투여용으로 제제화된 수준에서는 독성을 띠지 않는 것이다. 한 측면에서, 그러한 친화도는 관련없는 아미노산 서열에 대한 항체의 친화도보다 1배 이상으로 더 크거나, 2배 이상으로 더 크거나, 3배 이상으로 더 크거나, 4배 이상으로 더 크거나, 5배 이상으로 더 크거나, 6배 이상으로 더 크거나, 7배 이상으로 더 크거나, 8배 이상으로 더 크거나, 9배 이상으로 더 크거나, 10배 이상으로 더 크거나, 20배 이상으로 더 크거나, 30배 이상으로 더 크거나, 40배 이상으로 더 크거나, 50배 이상으로 더 크거나, 60배 이상으로 더 크거나, 70배 이상으로 더 크거나, 80배 이상으로 더 크거나, 90배 이상으로 더 크거나, 100배 이상으로 더 크거나, 또는 1,000배 이상으로 더 크다. "면역반응제," "결합한다," "우선적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "결합"이라는 용어는 생리학적 조건하에 예를 들어, 공유, 정전기, 수소성, 및 이온 및/또는 수소 결합 상호작용에 기인한, 두 분자 간의 직접적인 회합을 지칭하며, 예를 들어, 염 브릿지 및 물 브릿지 및 임의의 다른 종래 결합 수단과 같은 상호작용을 포함한다.

폴리펩티드에 적용되는 경우, ("실질적으로 순수한"이라는 것과 상호교환적으로 사용되는) "단리된"이라는 것은 그의 기원 또는 조작에 의해 (i) 발현 벡터 일부의 발현 생성물로서 숙주 세포에 존재하거나; 또는 (ii) 자연 상태에서 그들과 연결되어 있는 것 이외의 다른 단백질 또는 다른 화학적 부분에 연결되어 있거나; 또는 (iii) 자연 상태에는 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 그의 일부를 의미하는 것으로, 그 예로는 단백질이 자연 상태에서는 발견되지 않는 형태로 존재하도록 1 이상의 수소성 부분을 단백질에 첨부하거나, 첨가함으로써 화학적으로 조작된 단백질이 있다. "단리된"이란, 추가로는 (i) 화학적으로 합성되거나; 또는 (ii) 숙주 세포에서 발현되어, 그와 회합된 오염 단백질로부터 정제된 단백질을 의미한다. 상기 용어는 일반적으로 천연적으로는 그와 함께 발생하는 다른 단백질 및 핵산으로부터 분리되어 있는 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 또한 그를 정제하는 데 사용되는 물질, 예를 들어 항체 또는 겔 매트릭스(폴리아크릴아미드)로부터 분리된다.

혈관신생 용어

본원에서 사용되는 바, "혈관신생 억제성," "혈관신생 억제" 또는 "항혈관신생"이라는 용어는 맥관형성을 억제하는 것을 포함하며, 신생혈관형성의 정도, 양 또는 속도 감소에 영향을 미치는 것도 의미하는 것으로 한다. 조직내 내피 세포 증식 또는 이동의 정도, 양 또는 속도 감소에 영향을 주는 것이 혈관신생을 억제하는 것에 관한 구체적인 일례가 된다.

"혈관신생 억제성 조성물"이라는 용어는 혈관신생 매개 과정, 예를 들어, 내피 세포 이동, 증식, 관 형성을 억제하고, 이어서, 현존 혈관으로부터 새로운 혈관이 발생되지 못하도록 억제시킴으로써 결과적으로는 혈관신생 의존성 상태에 영향을 미치는 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "혈관신생 의존성 상태"라는 용어는 혈관신생 또는 맥관형성 과정인 병적 상태를 지속 또는 증강시키거나, 또는 정상적인 생리학적 과정에 유익한 영향을 미치는 상태를 의미하는 것으로 한다. 따라서, 혈관신생이 병적 상태를 지속시키는 혈관신생 의존성 상태를 치료하면 질환은 완화될 수 있는 반면, 혈관신생이 정상적인 생리학적 과정에 유익한 영향을 미치는 혈관신생 의존성 상태를 치료하면, 예를 들어, 정상적인 과정은 증진될 수 있다.

혈관신생은 기존 모세관 또는 모세관이후 세정맥으로부터 새로운 혈관이 형성되는 것이다. 맥관형성은 내피 세포 전구체인 혈관아세포로부터 발생되는 새로운 혈관의 형성으로부터 이루어진다. 두 과정 모두를 통해 새로운 혈관이 형성되며, 이는 혈관신생 의존성 상태라는 용어의 의미에 포함된다. 본원에서 사용되는 바, "혈관신생"이라는 용어는 맥관형성으로부터 이루어지는 것뿐만 아니라, 현존 혈관, 모세관 및 세정맥의 분지화 및 발아로부터 이루어지는 것인, 혈관을 새로 형성하는 것을 포함하는 것으로 한다. 혈관신생은 또한 ALK1 신호전달 및 관련된 Smad 1/5/8 인산화 및/또는 신호전달의 유도를 포함할 수 있다. CD105 또한 ALK1 신호전달 경로에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 따라서, 이 또한 혈관신생이라는 의미에도 포함된다.

종양 개시 CD105⁺ 세포 집단은 인간 신세포 암종에서 발견되었다. CD105⁺ 세포는 다른 종양 유형에 존재하는 암 줄기 세포에 대해 앞서 기술된 바 있는 종양 줄기 세포의 특징을 나타내었다. 관찰된 CD105⁺ 세포는 클론원성이며, 줄기 세포 마커를 발현하고 분화성 마커는 포함하지 않으며, 시험관내에서 상피 및 내피 세포 유형으로 분화될 수 있고, 생체내에서 일련의 이식가능한 종양을 발생시킬 수 있다. 중간엽 마커를 발현할 수 있는 클론으로부터 유래되었음에도 불구하고 종양은 기원 종양으로서 상피 암종이며, 이는 CD105⁺ 종양발생 집단의 유지 및 비종양발생의 비분화된 CD105- 집단의 존재를 특징으로 한다.

"숙주 면역 반응을 유도한다"라는 것은 환자가 질병의 징후 또는 증상의 완화 또는 감소를 경험하는 것을 의미하며, 구체적으로는 제한 없이 생명을 연장한다는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "증식성 질병" 및 "증식성 병증"이라는 용어는 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 증식을 특징으로 하는 임의의 병적 또는 비병적 생리학적 병증을 의미한다. "세포 증식성 질병" 및 "세포 증식성 병증"이라는 용어는 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 세포 증식 특징으로 하는 임의의 병적 또는 비병적 생리학적 병증뿐만 아니라, (예를 들어,결함이 있는 아폽토시스에 기인한) 비바람직하거나 또는 원치않는 세포 증식 또는 세포 생존을 특징으로 하는 병증, 결함이 있거나, 또는 비정상적이거나 또는 결함이 있는 아폽토시스를 특징으로 하는 병증, 뿐만 아니라, 비정상적이거나 또는 비바람직하거나 또는 원치않는 세포 생존을 특징으로 하는 병증을 비롯한 병증을 의미한다. "분화성 질병"이라는 용어는 비정상적이거나 또는 결함이 있는 분화를 특징으로 하는 임의의 병적 또는 비병적 생리학적 병증을 의미한다.

쉽게 치료될 수 있는 증식성 또는 분화성 질병으로는 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 세포 개수, 세포 성장 또는 세포 생존을 특징으로 하는, 악성 및 신생물성 질환 병증을 포함한다. 따라서, 그러한 질병 또는 병증은 질환 상태를 구성할 수 있고, 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 암성으로 형질전환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함할 수 있다.

증식성 또는 분화성 질병을 포함하는 세포는 세포 종괴로 응집될 수 있거나, 또는 분산될 수 있다. "비고형 종양"은 조혈계의 신생물을 의미하는 것으로서, 그 예로 전형적으로는 고형 종괴를 형성하지 않는 바, 미만성인 림프종, 골수종 및 백혈병, 또는 신생물이 있다. 백혈병의 특정 예로는 예를 들어, 급성 및 만성 림프아구성, 골수아구성 및 다발성 골수종을 포함한다.

"고형 종양"이라는 용어는 전형적으로는 함께 응집되어 종괴를 형성하는 신생물 또는 전이를 의미한다. 그러한 질병으로는 신생물 또는 암을 포함하며, 이는 실제로 임의의 세포 또는 조직 유형을 이환시킬 수 있고, 그 예로는 암종, 육종, 흑색종, 전이성 질병 또는 조혈 신생물성 질병이 있다. 전이성 종양은 유방, 폐, 갑상선, 두경부, 뇌, 림프계, 위장관(입, 식도, 위, 소장, 결장, 직장), 비뇨생식관(자궁, 난소, 자궁경부, 방광, 고환, 음경, 전립선), 콩팥, 췌장, 간, 골, 근육, 피부 등의 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 원발성 종양 유형으로부터 발생될 수 있다.

암종은 상피 또는 내분비 조직의 암을 의미하는 것으로, 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식계 암종, 고환암종, 유방암종, 전립선암종, 내분비계 암종, 및 흑색종을 포함한다. 예시적인 암종으로는 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장, 간 및 난소로부터 형성되는 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 암육종을 포함하며, 이는 예를 들어, 암종성 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양을 포함한다. 선암종은 선 조직의 암종, 또는 종양이 선 유사 구조를 형성하는 것인 암종을 포함한다.

치료하고자 하는 암성 조직은 예를 들어, 엔도글린을 비정상적인 수준으로 발현하는 내피 조직이다. 본원에서 사용되는 바, "형질전환된 세포"라는 용어는 자발적으로 무제한적인 성장 상태로 전환된 세포를 의미하는 것으로서, 즉, 세포가 배양물 중에서 무한대의 분열을 통해 성장할 수 있는 능력을 획득한 것을 의미하는 것이다. 형질전환된 세포는 그들의 성장 제어가 상실되었다는 점에서 신생물성, 역형성 및/또는 과다형성과 같은 용어를 통해 특징화될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "악성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형" 및 "형질전환된 표현형"이라는 용어는 제한하는 것은 아니지만, 포유동물 세포의 세포 형질전환과 관련된 하기와 같은 표현형 소질들: 세포 배양물 중에서의 장기화된 성장, 반고형 배지에서의 성장, 또는 면역무능 또는 동계 동물에서의 종양발생 성장에 의해 검출되는 불멸화, 형태학적 또는 성장 형질전환, 및 종양발생 중 어느 것을 포함하는 것으로 한다.

본원에서 "종양 세포 항원"이라는 용어는 비관련 종양 세포, 정상 세포 또는 정상의 체액 중에서보다 종양 세포 상에서 또는 체액 중에서 더 많은 양으로 존재하는 항원으로 정의된다. 항원 존재 여부는 당업자에게 공지된 임의의 여러 분석법에 의해 테스트될 수 있고, 제한 없이, 항체를 사용하는 음성 및/또는 양성 선별, 예를 들어, ELISA 분석법, 방사선면역측정법, 웨스턴 블롯에 의한 것을 포함한다.

"아폽토시스" 또는 "프로그래밍된 세포 사멸"이라는 용어는 원치않거나 또는 쓸모없는 세포를 발생 및 다른 정상적인 생물학적 과정 동안 제거하는 생리학적 과정을 의미한다. 아폽토시스는 정상적인 생리학적 조건하에서 발생하는 세포 사멸의 한 방식이며, 세포는 그 스스로의 사멸("세포 자멸")에 적극적으로 관여한다. 이는 정상적인 세포 전환 및 조직 항상성, 배아발생, 면역 내성의 유도 및 유지, 신경계 발생, 및 내분비 의존성 조직 위축 동안에 가장 흔히 관찰된다. 아폽토시스를 경험한 세포는 특징적인 형태학적 및 생화학적 특성을 보인다. 이러한 특성으로는 크로마틴 응집, 핵 및 세포질 응축, 세포질 및 핵의 막 결합 소포체(아폽토시스체)(이는 리보솜, 형태학상 온전한 미토콘드리아 및 핵 물질을 함유)로의 분할을 포함한다. 생체내의 이러한 아폽토시스체는 대식세포, 수지 세포 또는 인접한 상피 세포에 의해 빠르게 인식되고 포식화된다. 이러한 생체내의 효율적인 아폽토시스 세포 제거 기전에 기인하여 어떤 염증 반응도 유도되지 않는다. 시험관내의 아폽토시스체뿐만 아니라, 남아 있는 세포 단편도 궁극적으로는 팽윤되어 최종적으로는 용해된다. 이러한 시험관내의 세포 사멸의 최종 단계를 "2차 괴사"라 명명하였다. 아폽토시스는 DNA 단편화, 아넥신 V(Annexin V) 노출, 카스파제의 활성화, 시토크롬 c의 방출 등과 같이, 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 본원에서 사멸하도록 유도된 세포를 "아폽토시스 세포"라 명명한다.

본원에서 "아폽토시스 유도제"란 아폽토시스/프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 것으로 정의되며, 그의 예로는, 세포, 예를 들어, 종양 세포 또는 내피 세포가 프로그래밍된 세포 사멸되도록 유도하는 항엔도글린 항체, 항VEGF 항체, 방사선조사, 화학치료제 또는 수용체 결찰 제제가 있다. 예시적인 아폽토시스 유도제는 하기에서 더욱 상세하게 기술한다.

아폽토시스는 표준 아넥신 V 아폽토시스 분석법을 사용하여 테스트될 수 있는데: 여기서, NIH:OVCAR-3 세포를 6 웰 플레이트(NUNC)에서 성장시키고, 4-48시간 동안 길항제로(또는 또 다른 항암 약물과 함께 조합하여) 방사선 조사하거나 테스트하고, 세척하고, 1시간 동안 아넥신 V-FITC(BD-Pharmingen)로 염색한다. 유식 세포 측정법(Becton-Dickinson, CellQuest)으로 세포를 분석하고, 프로피디움 요오드화물로 대조염색시키고, 유식 세포 측정법으로 다시 분석한다.

항체 제조 및 발현 방법

유전 공학 방법에 의해 키메라 면역글로불린을 구성하였다. 앞서 기술된 바 있는 대부분의 키메라 면역글로불린은 마우스 모노클로날 항체로부터의 V_H 및 V_L과 인간 항체로부터의 C_L 및 Fc를 포함하였다. Fc 영역은 본원에 기술된 이소형들 중 임의의 것으로부터 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 키메라는 또한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 중 제한된 개수의 아미노산을 변형시키는 것에 관한 기준을 포함할 수 있다.

키메라 항체는 일반적으로 인간 요법에 사용함에 있어 마우스 항체보다 우수한 수개의 잠재적인 이점을 가지고 있다. 항체의 효과기 부분은 인간의 것이기 때문에 인간 면역계의 다른 부분과 보다 잘 상호작용하는 것으로 여겨진다(예를 들어, 보체 의존 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity) 또는 항체 의존 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)에 의해 보다 효율적으로 표적 세포를 파괴시킬 수 있다). 추가로, 인간 면역계는 키메라 항체의 불변 영역을 외래 물질로서 인식하지 않아야 하며, 따라서, 그와 같이 주사된 항체에 대한 항체 반응은 전형적으로는 전체가 외래 물질인 마우스 항체에 대한 것보다 작아야 한다. 최종적으로, 마우스 항체는 인간 순환에서 인간 항체의 반감기보다 훨씬 더 짧은 반감기를 가지는 것으로 알려져 있다. 가정컨대, 키메라 항체는 천연적으로 발생된 인간 항체와 더 유사한 반감기를 가지며, 이를 통해 더 소량의 투여량으로 덜 빈번하게 투여될 수 있다.

키메라 항체의 친화도 증가를 원하는 경우, 항체의 CDR 내의 잔기를 추가적으로 다른 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있다. 전형적으로는, CDR내 4개 이하의 아미노산 잔기를 변경시킬 수 있고, 가장 전형적으로는 CDR내 2개 이하의 잔기를 변경시킬 수 있으며, 단, 중쇄 CDR2는 예외적으로 무려 10개 정도의 잔기가 변경될 수 있다. 친화도 변화는 종래 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 것(예를 들어, Biacore)에 의해 측정될 수 있다.

키메라 항체는 당업계에 공지된 종래 기법을 사용하여 구성되고 제조될 수 있다. 추가로, 재조합적으로 제조된 항체는 대개 대량으로 제조될 수 있으며, 특히 고수준의 발현 벡터를 사용하는 경우에 그러하다.

수의학적 용도를 위해서 항체는 비인간 Fc를 사용함으로써 비인간(예를 들어, 영장류, 소, 말, 돼지 등)에게 투여하기 위해 합성될 수 있다.

당업계에서 인증된 기법, 예를 들어, 본원에서 제공하고 포함되어 있는 기법을 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 재조합 기법을 사용함으로써 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다.

발현을 위한 발현 시스템은 선별 마커로서 글루타민 신타제 유전자를 사용하여 GS 시스템(Lonza)을 사용하는 것이다. 요약하면, 선별가능한 마커로서 글루타민 신타제 유전자를 사용하여 GS 시스템(Lonza)을 사용함으로써 전기영동(250V)에 의해 CHO 세포에서 형질감염을 수행한다. 2 mM 글루타민과 함께 10% 투석된 우태아 혈청(FCS: Fetal Calf Serum)을 함유하는 DMEM(Sigma) 중에서 야생형 CHO 세포를 성장시킨다. 전기영동에 의해 6 x 10⁷개의 CHO 세포를 300 ㎍의 선형화된 DNA로 형질감염시킨다. 전기영동 후, 글루타민을 함유하는 DMEM 중에 세포를 재현탁시키고, 36 x 96 웰 플레이트(50 ㎕/웰)로 플레이팅시키고, 5% CO₂ 37℃에서 인큐베이션시킨다. 그 다음날, 150 ㎕/웰의 선택 배지(글루타민 미함유 DMEM)를 첨가한다. 대략 3주 경과 후, 음성 대조군으로서 비관련 항체를 사용함으로써 ELISA에 의해 콜로니를 스크리닝한다(하기 참조). >20 ㎍/ml로 생산하는 콜로니 모두를 24 웰 플레이트에 확장시킨 후, 이중 T25 플라스크로 확장시킨다.

고수준으로 제조하기 위한 경우, 널리 사용되는 포유동물 발현 시스템은 데히드로폴레이트 리덕타제 결핍("dhfr- ") 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의해 제공된 유전자 증폭 방법을 사용하는 것이다. 상기 시스템은 데히드로폴레이트의 데트라히드로폴레이트로의 전환을 촉매화시키는 DHFR 효소를 코딩하는 데히드로폴레이트 리덕타제 "dhfr" 유전자에 기초한 것이다. 고수준으로 제조하기 위해, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 기능성 DHFR 유전자를 함유하는 발현 벡터로 dhfr- CHO 세포를 형질감염시킨다. 이러한 경우, 원하는 단백질은 재조합 항체 중쇄 및/또는 경쇄이다.

경쟁적 DHFR 억제제 메토트렉세이트(MTX)의 양을 증가시킴에 따라 재조합 세포는 dhfr 유전자를 증폭시켜 내성을 발생시킨다. 표준 경우에서는, 사용되는 증폭 단위는 dhfr 유전자의 크기보다 훨씬 더 크며, 그 결과, 항체 중쇄가 함께 증폭된다.

단백질, 예를 들어, 항체 쇄를 대량으로 제조하고자 하는 경우, 사용되는 세포의 발현 수준과 안정성, 둘 다를 고려하여야 한다. 장기간 배양할 경우, 재조합 CHO 세포 집단은 비록 그가 단일의 모체 클론으로부터 유래된 경우라도 증폭 동안 그의 특이적인 항체 생산성과 관련하여 동종성을 상실하게 된다.

본 출원은 본원에 기술된 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(핵산), 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 폴리펩티드로 전사 및 번역시키는 숙주 세포 및 발현 시스템을 제공한다.

본 출원은 또한 상기와 같은 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구성체를 제공한다.

본 출원은 또한 상기와 같은 하나 이상의 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본원에 기술된 임의의 항체를 코딩하는 핵산은 본 출원의 한 측면을 형성하며, 이와 함께 그로부터 코딩 핵산으로부터의 발현을 포함하는 상기 항체를 제조하는 방법 또한 본 출원의 한 측면을 형성한다. 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 편리하게 발현시킬 수 있다. 발현에 의해 제조한 후, 항체 또는 그의 일부를 임의의 적합한 기법을 통해 단리 및/또는 정제한 후, 적절하게 사용할 수 있다.

본원에 기술된 특이적인 항체(또는 그의 일부)를 코딩하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 벡터는 실질적으로 순수하거나, 동종성인 형태로 예를 들어, 그의 자연 환경으로부터 단리 및/또는 정제될 수 있다. 핵산인 경우, 유리 또는 실질적으로 유리된 핵산 또는 유전자는 필요한 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 서열과는 다른 기원을 가진다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있다. 정제 방법은 당업계에 주지되어 있다.

각종의 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝 및 발현시키는 시스템은 주지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 세균, 포유동물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 콩팥 세포, NSO 마우스 골수종 세포 및 기타 다수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

매우 다양한 단세포 숙주 세포 또한 DNA 서열을 발현시키는 데 유용하다. 이러한 숙주로는 주지된 진핵 및 원핵 숙주, 예를 들어, E. 콜라이(E. coli) 균주, 슈도모나스(Pseudomonas) 균주, 바실러스(Bacillus) 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주, 진균 균주, 예를 들어, 효모 균주, 및 조직 배양물 중 동물 세포, 예를 들어, CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 녹색 원숭이(African Green Monkey) 콩팥 세포(예를 들어, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, 및 BMT10), 곤충 세포(예를 들어, Sf9), 및 인간 세포 및 식물 세포를 포함한다.

원핵 세포, 예를 들어, E. 콜라이에서 항체 또는 그의 일부를 발현시키는 것은 당업계에 잘 확립되어 있다. 리뷰를 위해서, 예를 들어, 문헌 [Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]을 참조한다.

조직 배양물 중 진핵 세포의 발현 또한 본원에 기술된 항체 제조를 위한 옵션으로서 당업자는 이용가능하며, 이에 대한 최근의 리뷰를 위해서는 예를 들어, 문헌 ([Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576]; [Trill JJ. et al,. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560])(이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)를 참조한다.

프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절하게는 다른 서열을 비롯한, 적절한 조절 서열을 포함하는 적합한 벡터가 선택될 수 있거나, 구성될 수 있다. 벡터는 바이러스 플라스미드, 예를 들어, 적절하게 파지 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 설명을 위해서, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어, 핵산 구성체 제조, 돌연변이유발, 서열 분석, DNA의 세포 내로의 도입, 및 유전자 발현에서의 핵산 조작, 및 단백질 분석에 관한 다수의 공지 기법과 프로토콜은 문헌 [Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al,. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기술되어 있다. (Sambrook) 등 및 (Ausubel) 등의 방법에 관한 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함되어 있으며, 당업계에 주지되어 있다.

따라서, 추가 측면은 본원에 개시된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 추가의 다른 측면은 상기 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 임의의 이용가능한 기법을 사용하여 도입할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기법으로는 예를 들어, 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란, 전기영동, 리포좀 매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어, 백시니아를 사용한 형질도입을 포함하고, 곤충 세포의 경우에는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함한다. 세균 세포의 경우, 적합한 기법으로는 예를 들어, 염화칼슘 형질전환, 전기영동 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.

도입 후, 예를 들어, 유전자 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현시키거나, 발현될 수 있도록 할 수 있다.

한 실시양태에서, 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합된다. 통합은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포함함으로써 촉진될 수 있다. Ig 인핸스는 필요에 따라 발현을 최대화시키기 위해 초기화될 수 있다.

본 출원은 또한 상기와 같은 항체(또는 그의 일부)를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 상기 언급한 것과 같은 구성체를 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 출원은 또한 엔도글린에 결합하는 키메라 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 예를 들어, 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자, 또는 그의 축퇴성 변이체, 그의 돌연변이체, 유사체, 또는 단편에 관한 것이다.

추가의 실시양태에서, 본원에 기술된 항체 또는 그의 일부의 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자의 전장의 DNA 서열은 적절한 숙주 내로 도입될 수 있는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 따라서, 본 출원은 항체의 V_H, V_L, C_L 및/또는 Fc를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 클로닝된 유전자 또는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 단세포 숙주로까지 확장된다.

또 다른 특징은 본원에 개시된 DNA 서열의 발현이다. 당업계에 주지되어 있는 바와 같이, DNA 서열은 이를 적절한 발현 벡터 중에서 발현 제어 서열에 작동적으로 연결시키고, 상기 발현 벡터를 사용하여 적절한 단세포 숙주를 형질전환시킴으로써 발현시킬 수 있다.

물론, 이미 DNA 서열의 일부인 것이 아니라면, DNA 서열을 발현 제어 서열에 작동적으로 연결시키는 것은 개시 코돈인 ATG를 DNA 서열의 상류쪽의 정확한 리딩 프레임에 제공하는 것을 포함한다.

폴리뉴클레오티드 및 벡터는 단리 및/또는 정제된 형태로 제공될 수 있다(예를 들어, 유리 또는 실질적으로 유리된 폴리뉴클레오티드는 필요한 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와는 다른 기원을 가진다). 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한," 및 "실질적으로 유리된"이라는 것은 예를 들어, 이물질을 약 20% 이하로, 이물질을 약 10% 이하로, 이물질을 약 5% 이하로, 이물질을 약 4% 이하로, 이물질을 약 3% 이하로, 이물질을 약 2% 이하로, 또는 이물질을 약 1% 이하로 함유하는 용액 또는 현탁액을 지칭하는 것이다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키는 데 매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합을 사용할 수 있다. 예를 들어, 유용한 발현 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 세그먼트로 구성될 수 있다. 적합한 벡터는 SV40 및 공지된 세균 플라스미드의 유도체, 예를 들어, E. 콜라이 플라스미드 col E1, Per1, Pbr322, Pmb9 및 그의 유도체, 플라스미드, 예를 들어, RP4; 파지 DNA, 예를 들어, 파지 λ의 수많은 유도체, 예를 들어, NM989, 및 다른 파지 DNA, 예를 들어, M13 및 섬유상 단일 가닥 파지 DNA; 효모 플라스미드, 예를 들어, 2u 플라스미드 또는 그의 유도체; 진핵 세포에서 유용한 벡터, 예를 들어, 곤충 또는 포유동물 세포에서 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 예를 들어, 파지 DNA 또는 다른 발현 제어 서열을 사용하도록 변형된 플라스미드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서는 또한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포도 제공한다. 본원에서 제공하는 것과 같은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 출원의 한 측면을 형성하며, 이와 함께 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 포함하는 상기 항체를 제조하는 방법 또한 본 출원의 한 측면을 형성한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 발현시킬 수 있다. 이어서, 항체를 임의의 적합한 기법을 통해 단리 및/또는 정제한 후, 적절하게 사용할 수 있다.

그에 작동적으로 연결된 DNA 서열의 발현을 제어하는 서열인 매우 다양한 발현 제어 서열 중 임의의 것을 상기 벡터 중에서 DNA 서열을 발현시키는 데 사용할 수 있다. 상기 유용한 발현 제어 서열로는 예를 들어, SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 조기 및 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 λ의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 제거 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소의 프로모터, 산성 포스파타제(예를 들어, Pho5)의 프로모터, 효모 접합 인자의 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려져 있는 다른 서열, 및 그의 다양한 조합을 포함한다.

DNA 서열을 발현시킴에 있어 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주 모두가 잘 동등하게 작용하는 것은 아님을 이해할 것이다. 또한, 같은 발현 시스템을 사용하는 경우라도 모든 숙주가 잘 동등하게 작용하는 것은 아닐 것이다. 그러나, 당업자는 본 출원의 범주로부터 벗어남 없이 과도한 실험없이도 원하는 발현을 달성할 수 있는 적절한 벡터, 발현 제어 서열, 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 벡터 선택시, 벡터는 숙주 내에서 작용을 해야 하는 바, 숙주가 고려되어야 한다. 벡터의 카피수, 그러한 카피수를 제어할 수 있는 능력, 및 상기 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질, 예를 들어, 항생제 마커의 발현 또한 고려될 것이다. 당업계의 숙련가는 본 출원의 범주로부터 벗어남 없이 원하는 발현을 달성할 수 있는 적절한 벡터, 발현 제어 서열, 및 숙주를 선택할 수 있다. 예를 들어, 벡터 선택시, 벡터는 숙주 내에서 작용하는 바, 숙주가 고려된다. 벡터의 카피수, 그러한 카피수를 제어할 수 있는 능력, 및 상기 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질, 예를 들어, 항생제 마커의 발현 또한 고려될 수 있다.

본 출원은 또한 상기와 같은 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 본원 전역에 기술되어 있는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구성체를 제공한다. 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 선별가능한 마커 및 적절하게는 다른 서열을 비롯한, 적절한 조절 서열을 포함하는 적합한 벡터가 선택될 수 있거나, 구성될 수 있다. 벡터는 바이러스 플라스미드, 예를 들어, 적절하게 파지 또는 파지미드 등일 수 있다. 추가의 설명을 위해서, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어, 핵산 구성체 제조, 돌연변이유발, 서열 분석, DNA의 세포 내로의 도입, 및 유전자 발현에서의 핵산 조작, 및 단백질 분석에 관한 다수의 공지 기법과 프로토콜은 문헌 [Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al,. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기술되어 있다. (Sambrook) 등 및 (Ausubel) 등의 방법에 관한 개시내용은 본원에 참고로 포함되어 있다.

발현 제어 서열 선택시, 보통은 다양한 인자가 고려된다. 인자의 예로는 시스템의 상대적인 강도, 그의 제어성, 및 그와 발현되는 특정 DNA 서열 또는 유전자와의 화합성, 특히 잠재적인 2차 구조와 관련된 것을 포함한다. 적합한 단세포 숙주는 예를 들어, 그와 선택된 벡터와의 화합성, 그의 분비에 대한 특징, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 그의 능력, 및 그의 발효 요건뿐만 아니라, 발현시키고자 하는 DNA 서열에 의해 코딩된 생성물의 숙주에 대한 독성, 및 발현 생성물의 정제의 용이성을 고려하여 선택될 것이다.

추가 측면은 본원에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 추가의 다른 측면은 임의의 기법을 사용하여 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기법으로는 예를 들어, 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란, 전기영동, 리포좀 매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스(예를 들어, 백시니아)를 사용한 형질도입을 포함할 수 있고, 곤충 세포의 경우에는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기법으로는 예를 들어, 염화칼슘 형질전환, 전기영동 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.

도입 후, 예를 들어, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함으로써 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 발현시키거나, 발현될 수 있도록 할 수 있다. 유도성 시스템을 사용할 수 있고, 발현은 활성 인자의 첨가에 의해 유도될 수 있다.

한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포함함으로써 촉진될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 숙주 세포의 에피좀 벡터 상에 유지된다.

본원에서는 특정 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템 중에서 상기 언급된 구성체를 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

상기 및 다른 인자를 고려하면, 당업자는 발효시 또는 대량으로 동물 배양물 중에서 DNA 서열을 발현시키는 다양한 벡터/발현 제어 서열/숙주 조합물을 구성할 수 있을 것이다.

항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 클로닝에 대해 부가적인 방식으로, 또는 그 이외의 방식으로 재조합적으로/합성적으로 제조될 수 있다. 적절한 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. 일반적으로, 서열이 발현을 위해 사용되는 경우, 의도된 숙주에 대해 바람직한 코돈이 선택될 것이다. 완전한 폴리뉴클레오티드는 표준 방법에 의해 제조된 중복 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있고, 이는 완전한 코딩 서열로 조립될 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Edge, Nature, 292:756 (1981)]; [Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984)]; [Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)])을 참조한다.

예를 들어, 재조합 및 화학적 합성법을 비롯한, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 항체(또는 그의 일부) 코딩 핵산을 도입하고 선택된 아미노산 위치를 변경하는 것을 동시에 수행할 수 있다.

항엔도글린 항체

엔도글린(CD105)은 180 kDa의 동종이량체성의 막횡단 단백질로서 세포 표면 상에서 발현된다. 외부 도메인은 높은 친화도(50 nM)로 TGF-β1 및 -3 동형체에 결합하고, CD105의 막횡단 및 세포내 도메인은 베타글리칸과 71%의 서열 유사성을 공유한다. 계내 하이브리드화에서 형광을 사용하여 확인된 바, 인간 CD105 유전자는 염색체 9q34 상에 위치하고, 코딩 영역은 14개의 엑손을 포함하고, TGF-β에 결합할 수 있는 능력을 가진 CD105의 2개의 상이한 동형체(L 및 S)의 특징이 규명되었다. 600개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 그 중 14개의 아미노산이 세포질 테일에 존재하는 S-CD105와는 대조적으로, L-CD105는 633개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 그 중 47개의 아미노산 잔기가 세포질 테일에 존재한다. 그러나, L-CD105이 우세하게 존재하는 형태이다. CD105는 구성적으로 내피 세포 중 주로 세린 및 트레오닌 잔기 상에서 인산화되며, 그러한 인산화는 세포내의 구성적으로 활성인 TGF-β RII에 기인하는 것이다. 단백질 키나제 C 억제제의 경우에서 관찰되는 효과와 유사하게, TGF-β가 CD105에 결합하게 되면 인산화는 하향 조절된다. 인간 CD105 아미노산 서열은 세포외 도메인의 노출된 영역에 위치하는 트리펩티드 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)을 포함한다. RGD 펩티드는 ECM 단백질, 예를 들어, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자(vWF: von Willebrand factor), I형 콜라겐, 및 피브리노겐에서 발견되는 중요한 인식 구조이고, 이는 세포 표면 인테그린에 의해 인식된다. 인테그린 부착은 내피가 중요한 역할을 하는 과정인 지혈, 혈전증, 혈관신생 및 염증에 연루되어 있다(문헌 [Duff et al., FASEB J., 17:984-992 (2003)]).

CD105는 증식성 내피 세포에 의해 발현되는 TGF-β 수용체 패밀리의 구성원이다. 내피 세포 증식을 위해서는 정상 수준의 CD105가 필요하다. CD105 발현은 저산소증 유도 인자-1-α(HIF-1-α: hypoxia inducible factor-1-α)의 생산을 통해 세포 저산소증에 의해 증가되며, 아폽토시스로부터 저산소 세포를 보호한다. CD105가 가지는 수개의 기능은 TGF-β 신호전달과 관련이 있다. TGF-β는 세린 키나제, 수용체 I(RI), 및 수용체 II(RII)로 구성된 이종이량체 수용체를 통해 신호를 전달한다. TGF-β가 수용체의 외부 도메인에 결합하게 되면, TGF-β RI을 인산화시키는 세포질 RII 키나제 활성은 정체를 드러내고, 이어서, 하류의 신호전달자, 예를 들어, Smad 단백질과 상호작용할 수 있다. CD105는 TGF-β 수용체 복합체의 일부를 형성하지만, 이는 세포 표면 상에 독립적으로 존재할 수 있다. 다수의 세포에서, CD105는 시험관내에서 TGF-β 신호전달을 억제한다.

CD105는 또한 다른 성장 인자, 예를 들어, 액티빈 A 및 골 형성 단백질(BMP: bone morphogenic protein)-10, -9, -7 및 -2에도 결합한다. TGF-β 또는 다른 성장 인자 리간드가 CD105에 결합하기 위해서는 적어도 수용체 RII가 존재하여야 하며, 이들 스스로는 리간드에 결합하지 못한다. CD105의 수용체와의 회합이 그 스스로 리간드에 대한 그의 친화도를 변경시키는 것은 아니다. 회합시, CD105의 세포질 도메인은 TGF-β RI 및 TGF-β RII에 의해 인산화되고; 이어서, TGF-β RII가 아닌 TGF-β RI 키나제는 수용체 복합체로부터 해리된다.

CD105 발현은 TGF-β RII의 인산화 수준은 억제시키지만, TGF-β RI의 인산화 수준은 증가시키며, 이를 통해 Smad 3이 아닌 Smad 2의 인산화는 증가한다. Smad 2가 다양한 전사 인자, 공활성 인자, 및 억제제와 상호작용할 수 있기 때문에, 인산화된 Smad 2는 유전자 전사를 조정하는 다발성 신호 통합기로서 작용할 수 있다. 따라서, CD105는 TGF-β RI 및 TGF-β RII과의 상호작용을 통해 TGF-β 기능을 조정하고, 하류 Smad 단백질의 인산화를 변형시킨다.

CD105는 TGF-β 수용체(TGF-βR), 액티빈 수용체 유사 키나제(ALK: activin receptor-like kinase) 및 액티빈 수용체를 포함하는, TGF-β 슈퍼패밀리의 다중 키나제 수용체 복합체의 신호전달을 조정하는 역할을 한다. CD105의 부재하에서 TGF-β 수용체가 활성화되면, 내피 세포 성장을 억제하는 SMAD 단백질(SMAD 2 및 3)이 인산화된다. 그러나, TGF-β에 의한 CD105의 활성화는 SMAD 단백질 인산화(SMAD 1, 5 및 8 인산화 포함)를 조정한다. 최종 결과는 TGF-β 수용체 활성화가 내피 세포에 대하여 성장 억제성 효과를 발휘한다는 것이다(도 1 참조). 항CD105 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 CD105 활성화를 방해하는 것이 내피 세포 성장을 억제시킴에 있어 TGF-β와 함께 시너지적으로 작용한다는 것은 놀라운 것은 아니다.

CD105 프로모터는 그 길이가 2.6 kb이며, TATA 또는 CAAT 전사 개시 박스를 포함하지 않는다. 그러나, 이는 TGF-β 반응 요소뿐만 아니라, GC가 풍부한 2개의 영역, Sp1에 대한 컨센서스 모티프, ets, GATA, AP-2, NGF-β, 및 Mad도 포함한다. 그럼에도 불구하고, CD105의 세포 분포는 상대적으로 제한되어 있다. 전사의 기저 수준은 -68번 위치의 ets 부위 및 Sp1 부위를 필요로 하는 것처럼 보이지만, 상대적으로 발현이 예를 들어, 내피 세포로 제한되는 것은 다중 조절 영역을 특히 -1294 내지 -932번 위치에 하나, 및 전사 개시 부위에 매우 근접한 위치에 또 다른 하나를 포함하는 것처럼 보인다. CD105는 TGF-β에 의해 상향 조절되며, 이는 -37 내지 -29번 위치에 Sp1 부위를 필요로 하는 것으로 나타났고, 이는 또한 (TGF-β 신호전달에 의해 활성화되는 Smad 3 및/또는 4에 결합하는, 하나 이상의 병치된 상류쪽 SBE 부위도 포함한다. 저산소증은 허혈성 조직 및 종양에서 공통적으로 나타는 특징으로서, 이는 혈관 내피 세포(EC: endothelial cell)에서 CD105 유전자 발현을 위한 강력한 자극제가 된다. 그러한 효과는 TGF-β1과 함께 조합되었을 때 강화된다. 상향 조절된 CD105는 저산소 스트레스 하에 EC에서 자신을 보호할 수 있는 역할을 발휘할 수 있다.

혈관 EC는 CD105의 주요 공급원이다. 혈관 평활근 세포, 섬유아세포, 대식세포, 프리B 및 골수단핵구 기원의 백혈병 세포, 및 적혈구 전구체를 비롯한 다른 세포 유형은 혈관 EC보다는 작은 정도로 CD105를 발현한다.

CD105는 혈관신생에 관여한다. HUVEC에서의 CD105 발현 억제는 TGF-β1과 의 조합시 시험관내 혈관신생이 현저하게 억제되었다는 것이 안티센스 실험을 통해 입증되었으며, 이는 CD105가 내피 세포에서 혈관신생전 성분이라는 것을 시사한다. CD105 넉아웃 마우스로부터 CD105가 혈관신생에서 중요한 역할을 한다는 것이 추가로 입증되었다. CD105 무표지(null) 마우스는 다발성 혈관 및 심장 결함을 보이며, 이를 통해 조기 배양 단계에서 사멸에 이르게 된다. CD105 무표지 마우스에서 관찰되는 중증의 혈관 장애는, CD105가 배아외 혈관구조에서 성숙한 혈관 형성을 위해서 필요하다는 것을 나타내며, 이는 혈관신생에서 엔도글린이 직접적인 역할을 한다는 것을 추가로 확인시켜 준다.

특히, CD105 또는 edg-1로도 알려져 있는 엔도글린은 증식성 혈관 내피 세포에서 고수준으로 발현되는 I형 동종이량체 막 당단백질이다. 따라서, 엔도글린은 주로 활성 혈관신생이 진행 중인 내피 세포에 대한 증식 관련 마커이다. 그러나, 정상 조직의 혈관 내피에 의한 엔도글린 발현은 제한될 수 있다. 인간 엔도글린은 형질전환 성장 인자-β(TGF-β: transforming growth factor-β)에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있으며, 엔도글린의 추론된 아미노산 서열은 TGF-β 수용체의 한 유형인 β-글리칸과 강력한 상동성을 가진다.

엔도글린(EDG)이 내피 및 백혈병 세포 상의 증식 관련 항원이기 때문에, EDG가 종양 혈관구조를 감소시키는 항체 기반 방법에서 표적화되었다. 그의 발현은 종양 관련 혈관 내피에서 상향 조절되며, EDG는 혈관신생에 필수적이다. 혈관신생은 신생혈관형성을 유도하는 새로운 모세 혈관의 형성과 현존 혈관구조의 유지를 포함한다. 혈관 기저막 및 간질 기질의 내피 세포 매개성 분해, 내피 세포의 이동, 내피 세포의 증식, 및 내피 세포에 의한 모세 혈관 고리 형성을 포함하는 일련의 순차적인 단계를 포함하는 복합 과정이다.

본원에서는 엔도글린에 결합하는 키메라 항체를 제공한다. 엔도글린은 현존 혈관구조를 포함하고 그를 지지하는 세포뿐만 아니라, 새로운 혈관구조의 성장을 촉진시키고, 그의 일부가 되는 세포 상에서도 발견될 수 있다. 이러한 항체는 엔도글린에 결합하여 혈관신생을 억제하고/시키거나, 현존 혈관구조 또는 현존 혈관구조의 유지를 억제하고/시키거나, 소(small) 혈관 확장을 억제한다. 상기 항체는 엔도글린 정제를 위해 사용되는 것 이외에도, 정제, 검출 및 진단 목적뿐만 아니라, 치료 목적으로도 유용하다. 본원에서 제공하는 항체는 다양한 병증 및 질환 치료용 의약의 제제화를 위해, 상기 병증 및 질환을 치료하는 방법을 위해, 및 검출 또는 진단 방법을 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 혈관신생은 새로운 혈관의 성장 및/또는 발생(이는 신생혈관형성으로도 언급됨), 소 혈관 확장, 과도한 또는 장기간의 혈관 성장, 및 현존 혈관구조의 유지를 포함한다. 혈관신생 병증 및 질환은 혈관신생과 관련되거나, 그에 의해 유발되었거나, 또는 그와 관련이 있는 질환 및 병증을 지칭한다. 그러한 질환에 대한 비제한적일 예로는 예를 들어, 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이)을 포함한다.

뮤린 모노클로날 항체(mAb: monoclonal antibody)는 엔도글린에 대해 유발된 것으로서, 이는 엔도글린 활성을 조정하여 혈관신생을 억제하고/시키거나, 소 혈관의 혈관확장을 억제한다. 이러한 뮤린 항체는 미국 특허 제5,928,641호, 제6,200,566호, 제6,190,660호, 및 제7,097,836호(이들 각각의 특허는 그 전문이 포함된다)에 기술되어 있다. 추가로, 이들 항체 다수의 생체외 및 생체내 효율도 입증되었다: 엔도글린에 결합하는 모노클로날 항체가 엔도글린 조절 화합물로서 관심의 대상이 된다. 그러나, 뮤린 항체 투여에는 예를 들어, 인간 항마우스 항체(HAMA: human anti-mouse antibody)에서의 면역원성을 비롯한 많은 제한이 있기 때문에 뮤린 항체의 치료학적 용도는 실현가능한 것은 아니다.

수개의 항엔도글린 항체, 특히, 항엔도글린 모노클로날 항체("mAb")가 기술되어 있다. MAb SN6은 마우스를 인간 백혈병 세포의 세포막의 당단백질 혼합물로 면역화시킴으로써 생성된 항체이다(문헌 [Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902]). SN6은 인간 엔도글린을 인식하는 뮤린 mAb이다. MAb 44G4는 마우스를 인간 프리B 백혈병 세포의 전체 세포 현탁액으로 면역화시킴으로써 생성된 항체이다(문헌 [Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141:1925-1933; 1990, J. Biol. Chem. 265:8361-8364]). 44G4 또한 인간 엔도글린을 인식하는 뮤린 mAb이다. MAb MJ7/18은 래트를 마우스의 염증성 피부로 면역화시킴으로써 생성된 항체이다(문헌 [Ge and Butcher, 1994, 상기 문헌 동일]). MJ7/18 또한 뮤린 엔도글린을 인식하는 mAb이다. mAb Tec-11은 마우스를 인간 제정맥 내피 세포로 면역화시킴으로써 생성된 항체이다(문헌 [Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634]). Tec-11은 인간 엔도글린에 대해 제한된 반응성을 가진 뮤린 mAb이다. 감소된 면역원성을 나타내면서, 그의 특이성은 유지 및/또는 개선된 것인 엔도글린에 결합하는 키메라 항체를 본원에서 기술한다. 추가로, 뮤린 항체와 관련된 문제 해소를 위해, 감소된 면역원성을 나타내면서, 그의 특이성은 유지 및/또는 개선된 것인, 엔도글린에 결합하여 혈관신생을 감소 및/또는 억제하는 키메라 항체를 본원에서 기술한다. 이러한 키메라 항엔도글린 항체는 엔도글린의 정제 및 검출뿐만 아니라, 각종 병증 및 질환의 진단 및 치료에도 유용하다. 엔도글린에 대한 항체는 혈관신생을 포함하거나, 그에 영향을 받았거나, 그에 의해 이환된 다양한 질환 및 병증의 치료를 위한 요법 개발에 있어 중요 부분을 나타낸다.

본원에서는 엔도글린에 결합하는 그의 키메라 항체를 제공한다. 또한, 엔도글린에 결합하여 혈관신생/신생혈관형성, 소 혈관 확장(부분적으로 또는 전체적으로)으로 억제하거나, 또는 (부분적으로 또는 전체적으로) 관리/치료하거나, 세포 증식을 억제하거나, 또는 종양 성장을 억제하는 그의 키메라 항체도 제공한다. 유사하게, 엔도글린 기능(예를 들어, 신호전달, 결합, 활성화 등)을 억제하는 것은 또한 엔도글린을 억제하거나, 그에 결합한다는 의미에 포함된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 키메라 항체는 엔도글린에 결합함으로써 혈관신생을 억제한다. 본 출원은 또한 키메라 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 세포주, 상기 세포를 제조하는 방법, 항체를 발현시키고, 그를 정제하는 방법을 제공한다.

ELISA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 종래의 방법을 사용함으로써 본원에서 제공되거나, 당업계에 공지된 분석법을 통해 본원에 기술된 본 방법을 사용하여 생성된, 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체는 엔도글린에 결합할 수 있는 능력에 대해 테스트될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 본원에 기술된 항체의 친화도 또한 비아코어(Biacore) 또는 표면 플라스몬 공명을 포함하나, 이에 한정되지 않는 종래의 방법을 사용함으로써 측정될 수 있다.

본원에서는 엔도글린에 결합하는 키메라 항체를 제공한다. 본원에서는 또한 엔도글린에 결합하여 혈관신생을 억제하는 키메라 항체를 제공한다.

본원에서는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가진 감마 1(γ1) 불변 영역(Fc)을 포함하는 키메라 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 본 항체의 V_H 및 V_L 서열을 가진 항체 중 5% 이상이 ELISA 분석법에서 키메라 항엔도글린 항체와의 경쟁에 의해 엔도글린에의 결합으로부터 차단되는 것인 조건하에서 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체와 경쟁할 수 있는 키메라 항체를 제공한다.

본원에서는 엔도글린에 결합하여 엔도글린의 활성을 조정하는 중화 키메라 항체를 제공한다. 중화 항체는 예를 들어, 엔도글린에의 결합에 의해 혈관신생을 억제한다.

키메라 항엔도글린 항체에 의한 혈관신생, 세포 증식 및/또는 종양 성장 억제율(%)이 음성 대조군보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 또는 그 초과로 크다는 것은 항체가 혈관신생을 억제한다는 것을 시사하는 것이다. 키메라 항엔도글린 항체에 의한 혈관신생, 세포 증식 및/또는 종양 성장 억제율(%)이 음성 대조군보다 2배 미만으로 크다는 것은 항체가 혈관신생을 억제시키지 못한다는 것을 시사하는 것이다.

키메라 항체의 엔도글린에의 결합을 통해 혈관신생, 세포 증식 및/또는 종양 성장은 부분적으로(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 범위 내의 임의 비율), 또는 완전하게 억제될 수 있다. 키메라 항체의 중화 또는 억제 활성은 시험관내 분석법을 사용하고/하거나, 당업계에서 인증된 분석법, 예를 들어, 본원에 기술되어 있거나, 또는 다르게는 당업계에 공지되어 있는 분석법을 사용하여 생체내에서 측정할 수 있다.

본원에 기술된 항체는 하기에서 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 검출 또는 진단을 위해 적용하는 데 유용하다. 본원에 기술된 항체는 엔도글린에의 결합에 유용하며, 결국, 본원에 기술된 바와 같이, 혈관신생을 억제할 수 있다.

항 VEGF 제제

혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)는 시험관내에서의 내피 세포의 증식 및 이동, 및 생체내에서의 혈관 침투 및 혈관신생을 유도하는 단백질로서 확인되었다. 이는 혈관 증식 및 투과성, 둘 다를 조절한다. 이는 또한 혈관 투과성 인자(VPF: vascular permeability factor)로서 알려져 있는 것으로서, 혈관 내피에 대한 그의 특이성 및 효능으로 인해 혈관신생전 인자들 중에서도 유일의 것이다. 이는 또한 새로 형성된 혈관에서 내피 세포에 대한 항아폽토시스 인자로서의 기능을 한다. VEGF는 종양 세포, 대식세포, T 세포, 평활근 세포, 콩팥 세포, 혈관사이 세포, 각질세포, 성상세포, 및 골아세포에서 발현된다.

한 실시양태에서, "인간 VEGF"란 문헌 ([Leung et al., Science 246: 1306 (1989)]; 및 [Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991)])에 기술된 바와 같이, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자, 및 관련된 121-, 189-, 및 206-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자와, 그와 함께 천연적으로 발생된 대립형질 및 프로세싱된 형태의 상기 성장 인자를 의미한다. "VEGF"라는 용어는 또한 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 래트 또는 영장류로부터 유래된 VEGF도 의미한다. 일부 경우에서, 특정 종으로부터 유래된 VEGF는 예를 들어, 인간 VEGF의 경우, hVEGF, 뮤린 VEGF의 경우, mVEGF와 같은 용어로 명시된다. "VEGF"라는 용어는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 중 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 절단된 형태의 폴리펩티드를 지칭하는 데에도 사용된다. "절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에서 표시된 것과 같은 번화 매김된 것이다. 예를 들어, 절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17번(메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서도 17번(메티오닌)이다. 절단된 천연 VEGF는 KDR 및 FLt-1 수용체에 대해 천연 VEGF와 비슷한 결합 친화도를 가진다. 한 실시양태에 따라, VEGF는 인간 VEGF이다.

VEGF 패밀리는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, 및 태반 성장 인자(PIGF: placenta growth factor)를 비롯한, 7개의 구성원들을 포함한다. 그들 모두 VEGF 상동성 도메인 중 8개의 시스테인 잔기로 이루어진 공통된 구조를 가진다. 추가로, VEGF-A와 관련하여, 6개의 상이한 동형체가 존재하며, VEGF-A165가 주된 동형체이다. 이들 동형체 모두 혈관신생에서 뚜렷이 구별되고 중복되는 기능을 가진다. VEGF 유전자는 염색체 6p.21 상에 위치한다. VEGF 패밀리의 다른 구성원들은 상이한 물리적 및 생물학적 특성을 가지며, 이들은 특이적인 티로신 키나제 수용체(VEGFR-1, VEGFR-2, 및 VEGFR-3)를 통해 작용한다. VEGFR-3 수용체 및 그의 리간드, VEGF-C 및 VEGF-D는 신생림프관 형성과 관련이 있고, PIGF는 동맥 형성과 연관이 있다.

VEGF에 대해 친화도가 높은 수용체 둘, VEGFR-1/Flt1(fms 유사 티로신 키나제-1) 및 VEGFR-2/Kdr/Flk-1(수용체/태아 간 키나제-1)을 포함하는 키나제 삽입체 도메인에 대한 특징을 규명하였다. 세번째 수용체, VEGFR-3 또한 알려져 있다. 이러한 수용체는 PDGF-수용체 패밀리로 분류된다. 그러나, VEGF 수용체는 (PDGF 패밀리의 다른 구성원들 중에서는 5개인 것과 대조적으로) 그의 세포외 도메인 중 7개의 면역글로불린 유사 루프와, 보다 장쇄인 키나제 삽입체를 포함한다. VEGF 수용체 중 일부는 또한 단핵구 및 흑색종 세포주 상에서도 존재할 수 있지만, VEGF 수용체 발현은 주로 혈관 내피 세포 중에서 이루어진다. 단지 내피 세포는 VEGF에의 반응으로 증식되는 것으로 나타났으며, 상이한 공급원으로부터의 내피 세포는 상이한 반응을 나타낸다. 따라서, VEGFR-1, VEGFR-2 및 VEGFR-3을 통해 매개되는 신호는 세포 유형에 따라 특이적인 것으로 나타났다.

VEGFR-1 및 VEGFR-2는 고 친화도(Kd는 각각 약 20 pM 및 200 pM)로 VEGF 165에 결합한다. Flk-1 수용체는 또한 VEGF에의 반응으로 자가인산화된 것으로 나타났다. VEGFR-2는 형태학적 성질, 액틴의 재조직화 및 상기 수용체를 과다발현하는 돼지 대동맥 내피 세포의 막 파동 변형(ruffling)에 있어 놀라운 변화를 일으키는 신호를 매개하였다. 이러한 세포에서 VEGFR-2는 또한 리간드 유도 화학주성 및 분열 촉진성을 매개한 반면; VEGFR-1은 VEGF에 대한 분열촉진 반응이 부족한 세포를 형질감염시켰다. 대조적으로, VEGF는 VEGFR-1을 발현하는 래트의 굴모양 내피 세포에 강력한 성장 자극 효과를 발휘하였다. VEGFR-1 및 VEGFR-2와의 인단백질의 공침전은 뚜렷히 구별되는데, 이는 상이한 신호전달 분자가 세포내 서열에 특이적인 수용체와 상호작용한다는 것을 제안한다.

VEGF는 그의 발현이 다양한 고형 종양에서 상향 조절되어 있기 때문에, 항종양 요법에 대한 한 표적이 된다. VEGF는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 것인 혈관신생의 주요 조절인자이다. 이러한 과정은 새로운 혈관의 형성에 의존하는 고형 종양 성장에 기본이 된다. 특정의 소형 분자 치료제는 혈관 내피 성장 인자 수용체("VEGFR: vascular endothelial growth factor receptor")를 표적할 수 있고; 소형 분자 치료제에 의한 상기와 같은 표적화를 통해 항암 효과가 일어날 수 있다. VEGF 수용체를 표적하는 제제는 새로운 혈관 형성의 억제를 통해 간접적으로 종양 성장을 차단시킨다. VEGF 유도성 혈관신생을 억제하면, 대식세포, 파골세포 또는 연골파괴세포의 VEGF 자극을 유의적으로 억제할 필요없이 항종양 또는 개선된 항종양 효과를 발휘할 수 있다.

본원에서 제공하는 한 실시양태에서, VEGF 길항제는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화된 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체이다. 한 구체적인 실시양태에 따라, 항VEGF 항체는 베바시주맙(AVASTEST®)이다. 또 다른 실시양태에 따라, 항VEGF 항체는 Fab, Fab', F(ab)'₂, 단일 쇄 Fv (scFv), 항체 절반부, 단일 쇄 결합 폴리펩티드, Fv 단편, 디아바디 및 선형 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

"VEGF 길항제"는 VEGF의 VEGF 또는 하나 이상의 VEGF 수용체, 또는 그를 코딩하는 핵산에의 결합을 비롯한 VEGF의 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 간섭할 수 있는 분자를 의미한다. 일부 경우에서, VEGF 길항제는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합한다. 한 실시양태에서, VEGF 길항제는 VEGF에 결합하여 시험관내 VEGF 유도성 내피 세포 증식을 억제한다.

한 실시양태에 따라, VEGF 길항제는 비VEGF 또는 비VEGF 수용체보다 더 큰 친화도로 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합한다. 또 다른 실시양태에 따라, VEGF 길항제는 1 uM 내지 1 μM 사이의 Kd로 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합한다. 또 다른 실시양태에 따라, VEGF 길항제는 500 nM 내지 1 μM 사이로 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합한다.

"항VEGF 항체"는 충분한 친화도 및 특이성으로 VEGF에 결합하는 항체이다. 본 발명의 항VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 병증을 표적하고 간섭하는 데 있어 치료제로서 사용될 수 있다. 항VEGF 항체는 보통은 다른 VEGF 동족체, 예를 들어, VEGF-B 또는 VEGF-C에, 또는 다른 성장 인자, 예를 들어, P1GF, PDGF 또는 bFGF에는 결합하지 않을 것이다.

"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴(AVASTIN)®"으로도 알려져 있는 항VEGF 항체인 "베바시주맙"은 문헌 [Presta et al,. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 기술된 방법에 따라 생성된 재조합 인간화된 항VEGF 모노클로날 항체이다. 이는 돌연변이화된 인간 IgG1 프레임워크 영역과, 인간 VEGF의 그의 수용체에의 결합을 차단하는, 뮤린 항hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합 상보성 결정 영역을 포함한다. 대부분의 프레임워크 영역을 포함하는, 베바시주맙 아미노산 서열 중 대략 93%는 인간 IgG1로부터 유래된 것이고, 상기 서열 중 약 7%는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된 것이다. 베바시주맙의 분자 질량은 약 149,000 달톤이며, 베바시주맙은 당화된 것이다. 베바시주맙의 뮤린 모노클로날 버전 및 인간화와 관련된 아미노산 서열은 서열 번호 5-10으로서 제공된다.

특정 실시양태에서, 조합 조성물로 투여되는 VEGF 수용체 억제제는 VEGF의 소형 분자 억제제이다. 다른 실시양태에서, 조합 조성물로 투여되는 VEGF 수용체 억제제는 항VEGF 항체이다. 하나의 비제한적인 일례로, 조합 조성물로 투여되는 VEGF 수용체 억제제는 베바시주맙(AVASTIN®)이다. 베바시주맙에 대한 비제한적인 투여량에 대한 예는 하기 및 실시예에서 보다 상세하게 논의된다.

변형된 항체 또는 그의 일부

본원에 기술된 항체는 추가로 치료학적 적용에 사용하기 위한 치료학적 부분을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 항체는 또한 면역접합체로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 본 명세서 및 특허청구범위의 목적으로 면역접합체란 본 발명에 따른 키메라 항엔도글린 항체 또는 그의 단편, 및 1 이상의 치료학적 라벨로 구성된 접합체를 의미한다. 치료학적 라벨은 항종양제 및 혈관신생 억제제를 포함한다. 그러한 항종양제는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 독소, 약물, 효소, 시토카인, 방사성핵종, 광역학적 제제, 및 혈관신생 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 독소는 리신 A 쇄, 돌연변이체 슈도모나스 외독소, 디프테리아 톡소이드, 스트렙토니그린, 보아마이신, 사포린, 겔로닌, 및 포키위드(pokeweed) 항바이러스성 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약물로는 다우노루비신, 메토트렉세이트, 및 칼리키아미신을 포함한다. 방사성핵종으로는 라디오메탈을 포함한다. 시토카인으로는 형질전환 성장 인자(TGF)-β, 인터루킨, 인터페론, 및 종양 괴사 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 광역학적 제제로는 포르피린 및 그의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 치료학적 라벨은 당업계에 공지되어 있을 것이며, 이는 또한 본원에서 고려된다. 항엔도글린 mAb 또는 그의 단편을 1 이상의 항종양제와 함께 복합체로 형성하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다(즉, 항체 접합체의 경우 문헌 [Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63:209-34]에서 리뷰됨). 상기 방법은 분자를 커플링 또는 연결시키는 데 사용되는 수개의 이용가능한 이종이작용성 시약들 중 하나를 사용할 수 있다. 추가의 방사성핵종은 분자, 예를 들어, 치료학제 및 진단 라벨을 연결시키는 추가의 방법과 함께 본원에 추가로 기술되어 있다.

항체는 다양한 목적을 위해 당업계에 공지된 기법을 사용함으로써, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol) 첨가에 의해 변형될 수 있다. PEG 변형(PEG화)을 통해 순환 시간 개선, 가용성 개선, 단백질분해에 대한 내성 개성, 항원성 및 면역원성 감소, 생체이용성 개선, 독성 감소, 안정성 개선, 및 보다 용이한 제제화 중 하나 이상이 이루어질 수 있다(리뷰를 위해, 문헌 [Francis et al., International Journal of Hematology 68: 1-18, 1998]를 참조한다).

항체의 Fc 부위는 환자에게 투여되었을 때에 혈중 순환시 반감기를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,217,798호(상기 특허 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기술된 것과 같은 당업계의 종래 수단을 사용함으로써 결정될 수 있다.

예를 들어, 미국 특허 번호 제7,091,321호 및 제6,737,056호(상기 각각의 특허 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)기술되어 있는 것과 같이, 순환시 항체 기반 융합 단백질의 반감기를 개선시키는 다른 방법 또한 알려져 있다. 추가로, 항체는 그의 복합체 N-글리코시드에 연결된 당 쇄 상에 푸코스를 함유하지 않도록 제조되거나 발현될 수 있다. 복합체 N-글리코시드에 연결된 당 쇄로부터 푸코스를 제거하는 것이, 항체 의존 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존 세포독성(CDC)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체 및 항원 결합 단편의 효과기 기능을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 엔도글린에 결합할 수 있는 항체는 그의 C 말단 단부에서, 임의의 항체 이소형, 예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM 및 이소형 서브부류들 중 임의의 것, 특히, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 모두 또는 그 일부에 부착될 수 있다.

추가로, 본원에 기술된 항체는 또한 혈액뇌 장벽을 통과할 수 있도록 변형될 수 있다. 본원에 기술된 항체에 대한 상기와 같은 변형을 통해 뇌 질환, 예를 들어, 다형성 아교모세포종(GBM: glioblastoma multiforme)을 치료할 수 있다. 단백질, 예를 들어, 항체가 혈액뇌 장벽을 통과할 수 있도록 하는 변형의 예는 미국 특허 공개 20070082380(상기 특허 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

면역글로불린의 당화가 그의 효과기 기능, 구조적 안정성, 및 항체 생산 세포로부터의 분비 속도에 유의적인 효과를 발휘하는 것으로 나타났다(문헌 [Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)]). 이러한 특성의 원인이 되는 당질기는 일반적으로 항체의 불변(C) 영역에 부착된다. 예를 들어, C_H2 도메인 중 아스파라긴 297에서의 IgG의 당화는 보체 의존 세포 용해의 고전적 경로를 활성화시킬 수 있는 IgG의 전체적인 능력을 위해 필요하다(문헌 [Tao and Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)]). C_H3 도메인 중 아스파라긴 402에서의 IgM의 당화는 항체의 적절한 조립 및 세포 용해 활성을 위해 필요하다(문헌 [Muraoka and Shulman, J. Immunol. 142:695 (1989)]). IgA 항체의 C_H1 및 C_H3 도메인 중 162번 및 419번 위치의 당화 부위를 제거하면 세포내 분해가 일어나고, 분비 90%가 억제되었다(문헌 [Taylor and Wall, Mol. Cell. Biol. 8:4197 (1988)]). 추가로, 항체는 그의 복합체 N-글리코시드에 연결된 당 쇄 상에 푸코스를 함유하지 않도록 제조되거나 발현될 수 있다. 복합체 N-글리코시드에 연결된 당 쇄로부터 푸코스를 제거하는 것이, 항체 의존 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존 세포독성(CDC)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체 및 항원 결합 단편의 효과기 기능을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 복합체 N-글리코시드에 연결된 당 쇄 중 푸코스를 포함하는 데 필요한 효소 및 생화학적 경로를 더 이상 포함하지 않도록 유전 공학적으로 조작된 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물, 또는 세포주(이는 또한 푸코실트랜스퍼라제 넉아웃 동물, 식물, 또는 세포로도 공지됨)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 분자 클로닝 기법을 사용하는 다양한 시스템을 통해 상기와 같은 "탈푸코실화된" 항체를 제조할 수 있다. 푸코실트랜스퍼라제 넉아웃 세포로 조작될 수 있는 세포에 대한 비제한적인 일례로는 CHO 세포, SP2/0 세포, NSO 세포, 및 YB2/0 세포를 포함한다.

가변(V) 영역에서의 면역글로불린의 당화 또한 관찰되었다. (Sox) 및 (Hood)은 인간 항체 중 약 20%가 V 영역에서 당화된다고 보고하였다(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:975 (1970)]). V 도메인의 당화는 V 영역 서열 중 N에 연결된 당화 신호 Asn-Xaa-Ser/Thr의 우연적 발생이 원인이 되어 일어나는 것으로 여겨지고, 당업계에서는 면역글로불린 기능에 있어 중요한 역할을 한다고는 인정받지 못했다.

가변 도메인 프레임워크 잔기의 당화는 항체와 항원의 결합 상호작용을 변경시킬 수 있다. 본 발명은 항체의 친화도를 증가시키기 위해 키메라 면역글로불린 쇄의 프레임워크 또는 CDR 중 제한된 개수의 아미노산을 선택하여 (예를 들어, 잔기의 치환, 결실, 또는 부가에 의해) 돌연변이화시키는 것에 관한 기준을 포함한다.

항원에의 결합에 대한 친화도는 일반적으로 전형적으로는, 하나 이상의 CDR에 인접한 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 중 V 영역 프레임워크 내로 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 조정될 수 있다. 전형적으로, 그러한 돌연변이는, 당화 부위 서열은 파괴시키거나 형성하지만, 폴리펩티드의 소수성인 구조적 특성에는 실질적으로 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환의 도입을 포함한다. 전형적으로, 프롤린 잔기를 도입하는 돌연변이는 회피된다. 항체의 당화는 미국 특허 번호 제6,350,861호(상기 특허는 당화와 관련하여 본원에 참고로 포함된다)에 추가로 기술되어 있다.

항체는 단기간 전달 또는 연장(장기간) 전달용으로 제제화될 수 있다.

엔도글린에 결합하는 항체는 또한 하기에서 보다 상세하게 기술하는 바와 같이, 엔도글린의 정제를 위해 및/또는 엔도글린과 관련된 질환 또는 질병을 검출 또는 진단하기 위한 목적으로 샘플 또는 환자 중의 엔도글린 수준을 검출하는 데 사용될 수 있다.

상기 방법을 사용하여 생성된 엔도글린에 결합하는 키메라 항체는 그들의 결합 친화도, 결합성, 및 중화 능력들 중 하나 이상에 대해 테스트될 수 있다. 유용한 키메라 항체는 환자에게 투여하여 혈관신생과 관련된 병증, 질환 또는 질병을 예방, 억제, 관리 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.

항체는 결합 친화도, 회합 속도, 해리 속도, 및 결합성들 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다. 한 측면에서, 항체는 엔도글린 또는 VEGF의 활성을 중화시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가될 수 있다. 결합 친화도, 회합 속도, 해리 속도, 및 결합성 측정은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 스캐차드 분석법, 비아코어 분석법(표면 플라스몬 공명) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당업계에서 인증된 분석법뿐만 아니라, 통상적으로 사용되고, 당업계의 숙련가에게 공지된 다른 분석법을 사용하여 달성될 수 있다.

항체의 엔도글린에의 결합 및/또는 예를 들어, 혈관신생을 억제할 수 있는 항체의 능력에 관한 측정은 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 경쟁적 결합 분석법, ELISPOT 분석법, 또는 당업계에 공지되는 임의의 다른 유용한 분석법을 사용함으로써 측정될 수 있다. 이러한 분석법은 통상적으로 사용되며, 당업계의 숙련가에 주지되어 있는 것이다.

하나의 비제한적인 실시양태에서, ELISA 분석법을 사용하여 엔도글린에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 결합능을 측정할 수 있다.

분석법, 예를 들어, ELISA는 또한 그의 다른 항체와 비교하여 엔도글린에 대한 특이성이 증가된 것으로 보이는 그의 항체를 확인하는 데 사용될 수 있다. 분석법, 예를 들어, ELISA는 또한 하나 이상의 폴리펩티드 전역의, 및 하나 이상의 엔도글린 또는 VEGF 종 전역의 에피토프에 결합하는 그의 항체를 확인하는 데 사용될 수 있다. 특이성 분석법은 엔도글린에 결합하는 그의 항체를 확인하기 위해 엔도글린 에피토프를 함유하는 다른 폴리펩티드 종 상의 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 능력에 대해 테스트 항체를 별개의 분석 챔버에서 동시에 스크리닝하는 병행 ELISA를 실시함으로써 수행될 수 있다. 당업자에게 친숙한, 겉보기 결합 친화도를 측정하는 또 다른 기법은 (BIACORE 2000 시스템 상에서 분석된) 표면 플라스몬 공명 기법이다(문헌 [Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329]). 표준 측정법 및 전통의 결합 분석법은 문헌 [Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229]에 기술되어 있다.

엔도글린에 대한 키메라 항체는 또한 다양한 형태의 암(예를 들어, 원발성 종양, 재발성 종양, 및 전이)과 관련하여 혈관신생과 관련된 각종 질환 및 병증을 치료할 수 있는 그의 능력에 대해 분석될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 분석법을 사용하여 상기 효과에 대해 모니터링할 수 있다. 그러한 여러 기법이 본원에 기술되어 있다. 한 일례에서, 본원에 기술된 항체는 엔도글린에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 분석된다. 또 다른 일례에서, 본원에 기술된 항체에 대한 친화도 상수는 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)에 의해 측정된다. 추가의 또 다른 일례에서, 본원에 기술된 항체는 혈관신생 억제에 대해 그가 미치는 효과에 대해 분석된다.

II . 조성물

본원에 기술된 화합물들은 각각 허용되는 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 조합되었을 때 조성물로서 사용될 수 있다. 그러한 조성물은 시험관내 또는 생체내 분석을 위해, 또는 개시된 화합물을 사용하여 피험체를 치료하기 위해 생체내 또는 생체외에서 피험체에게 투여하는 데 유용하다.

본원에서는 엔도글린의 생물학적 활성들 중 하나 이상, 예를 들어, 혈관신생 활성을 억제할 수 있는 키메라 항엔도글린 항체를 함유하는 조성물(의약)을 제공한다.

본원에서는 VEGF의 생물학적 활성들 중 하나 이상, 예를 들어, 그의 분열촉진 활성, 한 실시양태에서, 또는 혈관신생 활성을 억제할 수 있는 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)를 함유하는 조성물(의약)을 제공한다.

본원에서는 또한 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)의 조합을 함유하는 조성물(의약)을 제공한다.

키메라 항엔도글린 항체를 함유하는 조성물은 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)를 함유하는 조성물과 함께 순차적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다. 그러한 투여는 서로 약 4주 이내에, 서로 약 3주 이내에, 서로 약 2주 이내에, 서로 약 1주 이내에, 서로 약 1일 이내에, 서로 약 12시간 이내에, 서로 약 6시간 이내에, 서로 약 3시간 이내에, 서로 약 1시간 이내에, 서로 약 30분 이내에, 같은 날, 동시에, 또는 그의 조합으로 투여하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 조성물 및/또는 조합된 치료학적 부분의 다중 투여가 고려될 경우, 각각의 투여량은 상업적으로 이용가능한 제품의 표준을 사용하여 피험체의 연령, 신장, 체중, 건강 상태 및 다른 신체적 특징에 기초하여 공지된 투여량 및 농도를 사용하여 각각의 투여량이 실험적으로 결정될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

조성물이 순차적으로 투여될 때, 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체를 포함하는 조성물은 예를 들어, 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편) 이전 및/또는 이후에 투여될 수 있다. 별법으로, 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체를 포함하는 조성물은 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편) 이후에 투여된다.

조성물이 동시에 투여될 때, 키메라 항엔도글린 항체를 포함하는 조성물은 항VEGF 항체를 함유하는 조성물과 같은 부위에, 또는 그와는 다른 부위에 투여될 수 있다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 본원에서는 각각 엔도글린 및 VEGF의 생물학적 활성들 중 하나 이상, 예를 들어, 예를 들어, 분열촉진 활성, 세포 증식, 종양 성장, 신생혈관형성, 또는 혈관신생 활성을 억제할 수 있는, 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)를 함유하는 조성물(의약)을 제공한다.

치료 요법은 본원에 기술된 조성물들 각각을 1회 이상 투여하는 것을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 조성물은 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 별개의 조성물은 같은 경로에 의해, 또는 다른 경로에 의해 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 조성물은 6 내지 12주기 동안, 또는 종양 진행시까지 매주 내지 3주마다 투여된다. 본 방법은 추가로 최대 2년 동안 매주 내지 12주마다 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 일례로, 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)의 동시 투여는 1주째 수행한 후, 1, 2, 3, 또는 4주째 조성물을 추가 투여할 수 있고, 여기서, 동시 투여는 6 내지 12주기 동안, 또는 종양 진행시까지 반복된 후, 최대 2년 동안 매주 내지 12주마다 조성물을 투여한다.

환자에서 암을 치료하는 방법에 대한 하나의 비제한적인 일례로, 본 방법은 암을 수술을 통해 제거하고, 12개월 동안 또는 종양 진행시까지 1 내지 3주째 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)를 투여한 후, 1 내지 12주째 1 용량으로 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)를 동시 투여하는 것을 포함한다. 추가로, 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)의 동시 투여는 최대 6주기 동안 매주 내지 3주마다 반복될 수 있다. 임의로, 본 방법은 추가로 최대 2년 동안 매주 내지 12주마다 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)를 투여하는 것을 포함한다. 추가 용량의 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편)가 투여될 필요가 있는지 여부, 및 투여 시점을 결정하기 위해 치료 요법은 본원에서 제공하는 모니터링 방법과 함께 조합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

병용 요법은 시너지 및/또는 유익한 효과를 제공할 수 있거나, 또는 보다 소량의 조합물을 통해 보다 큰 안전 마진을 제공할 수 있게 할 수 있다. 본 발명은 암 또는 다른 질환의 예방, 관리, 치료 또는 제거를 위한 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF(또는 그의 항원 결합 단편)의 예방학적 또는 치료학적 효과를 증진시키는 치료 프로토콜을 포함한다.

한 실시양태에서, 추가의 치료학적 치료법, 예를 들어, (본원에 기술된) 혈관신생 억제제를 피험체에게 투여한다. 그러한 추가의 치료학적 치료법을 포함하는 조성물은 본원에 기술된 다른 조성물과 함께 조합하여 (순차적으로 또는 동시에) 투여될 수 있다.

본원에서 제공하는 암 치료를 위한 하나의 비제한적인 방법에서, 추가의 치료학적 치료법으로는 수술에 의한 암 제거, 방사선조사, 하나 이상의 화학치료제, 또는 그의 조합, 및 본원에 기술된 하나 이상의 조성물의 동시 투여를 포함한다. 한 측면에서, 조성물 투여는 예를 들어, 20분간 정맥내 주입하는 것일 수 있다.

따라서, 조성물은 활성 성분 이외에도 제약상 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 주지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분(들)의 효능에 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 따라 달라질 것이다.

본원에 기술된 방법에 의해 확인된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제제는 저장하기 위해 원하는 정도의 순도를 가진 단백질을 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 제조할 수 있다(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]), 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 비독성인 것이고, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제(아스코르브산 및 메티오닌 포함); 방부제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토니움 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기로 이루어진) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 당질(글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로서, 만닛톨, 트레할롯, 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 트윈(TWEEN)^®, 플루오닉스(PLURONICS)^® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

허용되는 담체는 투여받는 환자에게 생리학상 허용되는 것이고, 그와 함께 투여되거나/그에 포함되어 투여되는 것인 화합물의 치료학적 특성을 유지시켜 준다. 허용되는 담체 및 그의 제제는 일반적으로 예를 들어, 문헌 [Remington' pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)]에 기술되어 있다. 한 예시적인 담체는 생리학적 염수이다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"라는 어구는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미하며, 그 예로는 대상 화합물을 신체 한 기관, 또는 일부분의 투여 부위로부터 신체 또 다른 기관 또는 일부분으로, 또는 시험관내 분석 시스템에서 운반 또는 수송하는 데 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질이 있다. 각 담체는 제제의 다른 성분들과 화합성이고, 이를 투여받는 피험체에게 유해하지 않다는 의미에서 허용되는 것이다. 허용되는 담체는 대상 화합물의 특이적인 활성도 변경시키지 않아야 한다.

한 측면에서, 본원에서는 투여시 화합성인 용매(수성 또는 비수성), 용액, 에멀젼, 분산 매질, 코팅제, 등장제 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함하는 제약상 허용되거나, 생리학상 허용되는 조성물을 제공한다. 따라서, 조성물 또는 제제는 피험체에서 치료학적 및/또는 진단학적으로 사용하는 데 적합한 조성물을 지칭한다. 조성물 및 제제는 일정량의 본원에 기술된 화합물과, 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체를 포함한다.

조성물은 특정 투여 경로(즉, 전신 또는 국소 투여)에 대해 화합성이 되도록 제제화될 수 있다. 따라서, 조성물은 다양한 투여 경로에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 필요할 경우, 조성물 중의 화합물의 안정성을 개선시키기 위해 및/또는 조성물의 방출 속도를 제어하기 위해 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 첨가제는 대상 화합물의 특이적인 활성을 변경시키지는 않다. 예시적인 허용되는 첨가제로는 당, 예를 들어, 만닛톨, 소르비톨, 글루코스, 크실리톨, 트레할로스, 소르보스, 수크로스, 갈락토스, 덱스트란, 덱스트로스, 프럭토스, 락토스 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 허용되는 첨가제는 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예를 들어, 덱스트로스와 함께 조합될 수 있다. 별법으로, 예시적인 허용되는 첨가제로는 펩티드의 안정성을 증가시키고, 용액의 겔화를 감소시키는 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 계면활성제는 용액 중 0.01% 내지 5%의 양으로 조성물에 첨가될 수 있다. 상기와 같은 허용되는 첨가제를 첨가하면 보관시 조성물의 안정성 및 반감기는 증가하게 된다.

조성물은 예를 들어, 피하, 유리체내, 진피내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 근육내 주사를 포함하나, 이에 한정되지 않는 주사에 의해 투여될 수 있다. 각 유형의 주사용 조성물을 제제화하는 데 사용되는 부형제 및 담체가 본원에서 고려된다. 하기 설명은 단지 일례이며, 본 조성물의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 주사용 조성물은 예를 들어, 수용액(수 가용성일 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해 적합한 담체로는 생리학적 염수, 정균성 수액, 크레모포르 EL(Cremophor EL)™(BASF: 뉴저지주 파시패니 소재) 또는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)를 포함한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액일 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 항균제 및 항진균제로는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만닛톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물 중에 포함될 수 있다. 생성된 용액은 그 자체로 사용될 수 있도록 패킹되거나, 동결건조될 수 있고; 동결건조된 제제는 추후에 투여 이전에 멸균액과 조합될 수 있다. 정맥내 주사 또는 이환 부위에의 주사를 위해, 활성 성분은 발열성 물질 무함유의, 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 수 있고, 적합한 pH, 등장성, 및 안정성을 가진다. 당업자는 예를 들어, 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트를 가한 링거 주사액을 잘 제조할 수 있다. 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 첨가될 수 있다. 멸균 주사액은 적절한 용매 중에서 활성 성분을 필요한 양으로 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 그의 조합과 통합한 후, 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질을 포함하고, 상기 열거된 것으로부터 다른 성분들을 필요로 하는 멸균 비히클 내로 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 그의 제조 방법은 그의 이전의 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 원하는 추가 성분과 함께 활성 성분 분말을 수득할 수 있는 진공 건조 및 냉동 건조이다.

조성물은 통상적으로 유리체내, 피하로, 또는 유리체내 임플란트를 통해 투여될 수 있다.

조성물은 통상적으로 예를 들어, 단위 용량의 주사에 의해 정맥내로 투여될 수 있다. 주사하는 경우, 활성 성분은 실질적으로 발열성 물질 무함유의, 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 수 있고, 적합한 pH, 등장성, 및 안정성을 가진다. 당업자는 예를 들어, 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트를 가한 링거 주사액을 제조할 수 있다. 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제를 필요에 따라 포함할 수 있다. 추가로, 조성물은 에어로졸화를 통해 투여될 수 있다(문헌 [Lahn et al., Aerosolized Anti -T- cell - Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity, Int. Arch. Allegery Immune, 134: 49-55 (2004)]).

한 실시양태에서, 조성물은 예를 들어, 보관시 저장 기간을 연장시키기 위해 동결건조된다. 조성물이 본원에서 제공하는 의약 또는 임의의 방법에 사용하는 것으로 고려되는 경우, 조성물은 인간 환자에게 투여되었을 때 염증 반응 또는 어떤 불안전한 알레르기 반응도 유발하지 못하도록 조성물은 실질적으로 발열성 물질 함유하지 않아야 한다는 것에 주시한다. 발열성 물질에 대해 조성물을 테스트하고, 실질적으로 발열성 물질 무함유인 조성물을 제조하는 것은 당업계의 숙련가에게 잘 이해되고 있으며, 이는 상업적으로 이용가능한 키트를 사용함으로써 달성될 수 있다.

허용되는 담체는 조성물을 안정화시키거나, 흡수를 증가 또는 지연시키거나, 또는 제거를 증가 또는 지연시키는 화합물을 함유할 수 있다. 그러한 화합물로는 예를 들어, 당질, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란; 저분자량 단백질; 펩티드의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물; 또는 부형제 또는 다른 안정제 및/또는 완충제를 포함한다. 흡수를 지연시키는 제제로는 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다. 조성물을 안정화시키거나, 조성물의 흡수를 증가 또는 감소시키는 데 계면활성제 또한 사용될 수 있으며, 그 예로는 리포좀 담체를 포함한다. 화합물이 분해되지 못하도록 보호하기 위해, 화합물을 조성물과 복합체를 형성하도록 하여 산성 및 효소 가수분해에 대해 내성을 띠도록 할 수 있거나, 화합물을 예를 들어, 리포좀과 같이, 적절하게 내성을 띠는 담체 중에서 복합체를 형성하도록 할 수 있다. 화합물이 분해되지 못하도록 보호하는 수단은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 치료제의 경구 전달을 위한 지질 조성물에 대해서는 문헌 ([Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764]; [Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119-135]; 및 미국 특허 번호 제5,391,377호 참조).

"제약상 허용되는"이라는 어구는 생리학상 용인가능하고, 전형적으로는 피험체에게 투여되었을 때, 예를 들어, 급성 위연동 이상항진, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 유사한 유해 반응을 유발하지 않는 분자 엔티티 및 조성물이라는 것을 의미하는 것이다

치료학적 조성물과 관련하여 사용될 때, "단위 용량"이라는 용어는 피험체에 대한 단일의 용량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 희석제; 특, 담체, 또는 비히클과 함께 원하는 치료학적 효과를 발휘할 수 있도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.

조성물은 투여 제형과 화합성인 방식으로, 및 치료학상 유효량으로 투여될 수 있다. 투여량은 치료하고자 하는 피험체, 활성 성분을 사용할 수 있는 피험체 면역계의 능력, 및 원하는 결합능 정도에 따라 달라진다. 투여되어야 하는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 달라질 것이며, 각 개체마다 특유의 양이 될 것이다. 초기 투여 및 추가 자극 주사에 적합한 요법 또한 달라질 수 있지만, 초기 투여 후, 1시간 이상의 간격을 두고 반복된 투여량으로 후속 주사를 수행하거나, 또는 다른 투여를 수행하는 것이 전형적이다. 별법으로, 혈중 농도를 유지시키는 데 충분한 연속 정맥내 주입도 고려된다.

한 실시양태는 본원에 기술된 병증, 질환 또는 질병 치료용 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 조성물의 용도도 고려한다. 의약은 치료를 필요로 하는 환자/피험체의 신체적인 특징에 기초하여 제제화될 수 있고, 병증, 질환 또는 질병의 단계에 기초하여 단일 또는 다중 제제로 제제화될 수 있다. 의약은 병원 및 진료소에 배부하기 위한 것으로서, 라벨에는 본원에 기술된 질환을 앓는 피험체 치료에 대한 지시가 표기되어 있는 적절한 라벨과 함께 적합한 패키지로 패킹될 수 있다. 의약은 단일 또는 다중 단위로 패킹될 수 있다. 하기 기술하는 바와 같이, 조성물의 투여량 및 투여에 대한 설명서는 패키지와 함께 포함되어 있을 수 있다. 본 출원은 본원 상기에 기술된 키메라 항엔도글린 항체 및 제약상 허용되는 담체로 구성된 의약에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 출원은 본원 상기에 기술된 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편) 및 제약상 허용되는 담체로 구성된 의약에 관한 것이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 출원은 본원 상기에 기술된 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(또는 그의 항원 결합 단편) 및 제약상 허용되는 담체로 구성된 의약에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 조성물을 인간 환자에게 투여될 수 있도록 허용되게 발열성 물질 무함유로 제제화된다. 발열성 물질에 대해 조성물을 테스트하고, 발열성 물질 무함유인 조성물을 제조하는 것은 당업계의 숙련가에게 잘 이해되고 있다.

본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 질병 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 임의의 조성물의 용도를 고려한다. 의약은 치료를 필요로 하는 환자/피험체의 신체적인 특징에 기초하여 제제화될 수 있고, 질병에 기초하여 단일 또는 다중 제제로 제제화될 수 있다. 의약은 병원 및 진료소에 배부하기 위한 것으로서, 라벨에는 피험체에서의 본원에 기술된 질병 치료에 대한 지시가 표기되어 있는 적절한 라벨과 함께 적합한 패키지로 패킹될 수 있다. 의약은 단일 또는 다중 단위로 패킹될 수 있다. 조성물의 투여량 및 투여에 대한 설명서는 패키지와 함께 포함되어 있을 수 있다.

III . 사용 방법

본원에서는 엔도글린에 우선적으로 결합하는 키메라 항체로 이루어진 조성물을 피험체에게 투여함으로써 피험체(인간 또는 비인간)를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 방법은 추가로 항VEGF 항체로 이루어진 조성물을 피험체에게 투여함으로써 피험체(인간 또는 비인간)를 치료하는 것을 포함한다. 특정 경우에서, 본 방법은 피험체에게 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체, 둘 다를 포함하는 단일 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 경우에서, 본 발명은 피험체에게 키메라 항엔도글린 항체 및 베바시주맙, 둘 다를 포함하는 단일 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 유효 반응은 피험체가 질병의 징후 또는 증상이 부분적으로 또는 완전하게 완화되었거나 감소된 것을 경험하였을 때에 달성되며, 구체적으로는 제한 없이, 생존 기간 연장을 포함한다. 예측되는 무진행 생존 기간은 병의 재발 횟수, 질환 단계, 및 다른 인자들을 비롯한 예후 인자에 따라, 수개월 내지 수년으로 측정될 수 있다. 생존 기간 연장은 제한 없이, 1개월(mo.) 이상, 약 2 mos. 이상, 약 3 mos. 이상, 약 4 mos. 이상, 약 6 mos. 이상, 약 1년 이상, 약 2년 이상, 약 3년 이상, 약 4년 이상, 약 5년 이상 등의 시간을 포함한다. 전반적인 또는 무진행 생존 기간은 또한 수개월 내지 수년으로 측정될 수 있다. 별법으로, 유효 반응은, 피험체의 증상 또는 암 존재량이 정적 상태 그대로 남아 있지만, 악화되지는 않는 것일 수 있다. 징후 치료를 위한 추가의 조치는 하기에서 보다 상세하게 기술한다.

본원에 기술된 항체로 이루어진 조성물은 비치료제(예를 들어, 친화 정제용 제제)로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기와 같은 한 실시양태에서, 당업계에 공지되어 있는 종래의 방법을 사용하여 관심의 대상이 되는 단백질을 세파덱스(Sephadex) 또는 여과지와 같은 고형 상에 고정화시킨다. 고정화된 단백질을, 정제하고자 하는 관심의 대상이 표적(또는 그의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 이어서, 지지체를 적합한 용매로 세척하여, 표적 단백질은 고정화된 단백질에 결합되어 있는 표적 단백직을 제외한, 실질적으로 샘플 중의 모든 물질을 제거한다. 최종적으로, 지지체를 또 다른 용매, 예를 들어, 글리신 완충액(pH 5.0)으로 세척하여 표적 단백질을 유리시킨다. 정제 이외에도, 조성물은 엔도글린, VEGF 및 혈관신생과 관련된 질환 및 질병을 검출, 진단, 및 치료하는 데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "접촉시킨다"라는 것은 유기체로부터 유래된 폴리펩티드, 세포, 조직 또는 기관을 세척시킨 액체 매질과 함께 화합물로 된 용액 또는 조성물 모두를 함께 첨가하는 것을 의미한다. 별법으로, "접촉시킨다"라는 것은 유기체로부터 유래된 혈액, 혈청, 또는 혈장과 같은 액체와 함께 화합물로 된 용액 또는 조성물 모두를 함께 혼합하는 것을 의미한다. 시험관내 적용을 위해, 조성물은 또한 예를 들어, 디메틸 술폭시드(DMSO)와 같은 또 다른 성분을 포함할 수 있다. DMSO는 화합물의 흡수 또는 화합물의 용해도를 촉진시킬 수 있다. 테스트 화합물을 포함하는 조성물을 세포, 조직, 또는 기관을 세척시킨 매질에 첨가할 수 있거나, 예를 들어, 피펫 기반 장치 또는 시린지 기반 장치와 같은 전달 기기를 사용함으로써 예를 들어, 혈액과 같은 또 다른 액체와 혼합할 수 있다. 생체내 적용을 위해서는, 예를 들어, 임의의 적합한 수단에 의해 조성물을 피험체에게 투여함으로써 접촉시킬 수 있고; 제약상 허용되는 부형제 및 담체를 포함하는 조성물은 상기에 보다 상세하게 기술된 바와 같다.

"피험체" 또는 "환자"(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 동물, 예를 들어, 영장류, 설치류, 소, 말, 돼지, 양, 낙타, 라마 등)는 본원에 기술된 질환 또는 질병의 임상적 소견 및/또는 증상을 하나 이상 보이는 포유동물일 수 있다. 특정 상황하에서, 피험체는 증상이 없을 수도 있지만, 여전히 질환 또는 질병의 임상적 소견은 가지고 있을 수 있다. 항체는 치료학적 부분에 접합될 수 있거나, 치료학적 부분을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 항체는 검출가능한 부분에 접합될 수 있거나, 검출가능한 부분을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 치료학적 부분 및 검출가능한 부분, 둘 다에 접합될 수 있다. 항체는 친화성 태그(예를 들어, 정제 태그)에 접합될 수 있거나, 그와 함께 재조합적으로 공학처리될 수 있다. 친화성 태그, 예를 들어, His6 태그, 아비딘 등은 당업계에서 통상적인 것이다.

본원에서는 제공하는 항체 또는 그의 것은 치료학적 부분 및/또는 영상 또는 검출가능한 부분 및/또는 친화성 태그에 접합되거나, 연결될 수 있다. 폴리펩티드를 접합 또는 연결시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 화합물과 라벨 사이의 회합(결합)은 공유 및 비공유 상호작용, 화학적 접합을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 수단뿐만 아니라, 재조합 기법을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "혈관신생"은 혈관 유지 및 발생에 관한 모든 측먼을 포함한다. 따라서, 혈관신생은 (새로 형성되든, 또는 기존 혈관으로부터 형성되든 상관없이) 새로운 모세 혈관을 형성함으로써 신생혈관형성뿐만 아니라, 현존 혈관구조 및 소 혈관을 유지 및 제어하는 것을 포함한다. 혈관신생은 혈관 기저막 및 간질 기질의 내피 세포 매개성 분해, 내피 세포의 이동, 내피 세포의 증식, 및 내피 세포에 의한 모세 혈관 고리 형성을 포함하는 일련의 순차적인 단계를 포함하는 복합 과정이다. 혈관신생은 새로운 혈관의 성장 및/또는 발생(이는 신생혈관형성으로도 언급됨), 소 혈관 확장, 과도한 또는 장기간의 혈관 성장, 및 현존 혈관구조의 유지를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 본 명세서 및 특허청구범위의 목적으로 "혈관신생과 관련된 질환"이라는 용어는 혈관신생이 비정상적으로 장기화된 특정의 병적 과정을 의미한다. 이는 추가로 혈관신생 병증 및 질환, 예를 들어, 혈관신생과 관련이 있거나, 그에 의해 유발되거나, 또는 그와 연관된 질환 및 병증을 포함한다. 그러한 질환의 비제한적인 일례로는 다양한 형태의 암 및 전이, 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증, 또는 증식성 유리체망막병증을 포함한다. 본원에 기술된 항체는 엔도글린에의 결합 및 혈관신생 억제에 의해 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "항혈관신생 요법"이라는 용어는 (휴지 혈관구조와 비교하여 증식 혈관구조 상에서 더 높은 수준으로 발현되는) 엔도글린을 발현하는 세포 및/또는 혈관구조를 표적으로 하는 요법을 의미한다; 이는 추가로 혈관신생(즉, 신생혈관형성을 유도하는 새로운 모세 혈관의 형성)에 대한 요법, 현존 혈관구조 및/또는 과도한 혈관화 또는 혈관 성장에 대한 요법, 소 혈관 확장에 대한 요법, 및 질환 또는 병증에 대한 요법(예를 들어, 혈관 표적 요법)을 포함한다. 본 발명에서 고려되는 예시적인 질환 또는 병증으로 다양한 형태의 암 및 전이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"재발," "병의 재발" 또는 "병의 재발성"이라는 용어는 임상적으로 질환이 소실된 것으로 평가된 후 암 또는 질환이 회복되는 것을 지칭한다. 원위 전이 또는 국소 재발 진단도 병의 재발로서 간주될 수 있다.

"유지 요법"이라는 용어는 이전 치료 효과를 유지하는 데 도움을 주기 위해 제공되는 예정된 재치료를 의미한다. 유지 요법은 종종 질환 진행 상태와는 상관없이 특정 요법에 대한 반응을 연장시키거나, 암이 차도가 있는 상태로 유지될 수 있도록 도움을 주기 위해 제공된다.

종양학에서 "무진행 생존"이라는 용어는 치료 동안 및 치료 후 암이 성장하지 않는 기간을 의미한다. 무진행 생존은 환자가 완전한 반응 또는 부분적인 반응을 경험하는 시간뿐만 아니라, 환자가 안정적인 질환을 경험하는 시간도 포함한다.

한 측면에서, 본원에서는 암 또는 전이를 앓는 환자에게 본원에서 제공되는 조성물 중 임의의 것을 투여함으로써 피험체에서 암 또는 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 환자는 증상을 보일 수 있거나, 증상이 없을 수도 있다.

일부 경우에서, 조성물을 투여하면, 치료받은 환자의 수명은 연장되거나, 종양 부피가 감소하거나, 종양이 제거되거나, 세포 증식이 감소되거나, 종양 세포의 아폽토시스가 증가하거나, 또는 그의 조합이 이루어질 수 있다.

필요할 경우, 본 방법 추가로 수술을 통해 암을 제거하고/하거나, 추가의 항암제를 투여하거나, 또는 항암 치료법을 수행할 수 있다. 항암제는 본원 전역 어디에서든 제공되어 있다.

한 측면에서, 암을 앓는 환자의 증상은 호전된다. 호전은 예를 들어, 통증 감소, 종양 크기 축소, 종양 제거, 종양 크기 증가 또는 질환의 진행 방해, 전이 형성 방해, 또는 전이성 성장의 억제, 또는 그의 조합으로서 나타날 수 있다.

한 측면에서, 조성물을 투여하면, 환자가 하나 이상의 추가의 항암제 또는 항암 치료법을 사용하는 수술 또는 치료법을 받아야 할 필요가 감소하거나 제거된다.

키메라 항엔도글린 항체 및 항 VEGF 제제를 사용한 치료법

본원에서는 키메라 항엔도글린 항체를 함유하는 조성물 및 항VEGF 항체를 함유하는 조성물을 동시에, 또는 다른 시점에 투여하여 질환 또는 그의 중증도를 예방, 치료, 호전, 또는 경감시키는 단계를 포함하는, 혈관신생/신생혈관형성, 과도한 혈관화, 종양 성장, 종양 세포 증식 또는 소 혈관 확장과 관련된 하나 이상의 질환 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본원에서는 조성물의 조합물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생/신생혈관형성과 관련된 하나 이상의 질환 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "예방"이란 혈관신생과 관련되거나, 엔도글린 활성과 연과된 질환 또는 질병을 방어, 그의 증상 발병을 예방, 그의 진행을 예방하는 것을 언급한다. 본원에서 사용되는 바, "억제," "치료법" 및 "치료하는"이라는 것은 상호교환적으로 사용되며, 이는 예를 들어, 증상을 정체시키고, 생존 기간을 연장시키고, 증상을 부분적으로 또는 완전하게 호전시키고, 종양 또는 전이를 부분적으로 또는 완전하게 근절시키는 것을 의미한다.

조성물은 임의의 의학적 치료법에 적용될 수 있는 적당한 유익/유해 비율로 질환 또는 질병을 억제시킴으로써 일부 원하는 치료학적 효과를 발휘하는 데 효과적인 치료학상 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 본 조성물을 인간 환자에게 투여하기 위해서, 본 조성물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제제화될 수 있다. 치료학상 유효량은 기관 또는 조직에서 적어도 부분적으로 원하는 치료학적 또는 예방학적 효과를 달성할 수 있는 양이다. 질환 또는 질병을 예방하고/하거나 치료학적으로 치료하는 데 필요한 키메라 항엔도글린 항체 또는 항VEGF의 양은 그 자체로 고정된 것은 아니다. 항체의 투여량은 질환 유형, 질환의 광대함, 및 질환 또는 질병을 앓는 포유동물의 크기에 따라 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 2가지 항체는 상기 기술된 바와 같이 조합되어 환자에게 투여된다. 조합되어 투여된다는 것은 단일 조성물로, 또는 별개의 조성물로 투여되는 것을 의미한다.

본원에서 "투여하는"이란 조성물이 환자의 체내에 존재하도록 하는 방식으로 환자에게 하나 이상의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 그러한 투여는 제한 없이, 피하, 유리체내, 진피내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 근육내 투여(예를 들어, 주사)에 의해 국소적으로, 국부적으로 또는 전신으로 투여하는 것을 비롯한, 임의의 경로에 의해 이루어질 수 있다.

환자에게는 독성을 일으키지 않으면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료학적 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분 양을 얻을 수 있도록 하기 위해서 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출률, 치료 지속 기간, 사용되는 특정 화합물과 함께 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 상태 및 이전 의학적 병력 및 의학 분야에 주지되어 있는 인자를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.

본원에 기술된 항체는 다양한 투여량으로 다양한 기간에 걸쳐 피험체에게 투여될 수 있다. 투여량에 대한 비제한적인 예로 약 0.01 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 또는 그 사이의 임의의 정수값을 포함한다. 추가로, 항체는 상기 투여량(들)으로 주 2회, 매주, 매 2주마다, 매 3주마다, 매 4주마다, 매 6주마다, 매 8주마다, 매 12주마다, 또는 상기 범위 내의 주의 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항체를 2, 3, 4, 5 또는 6주 동안 주 1회 또는 2회에 걸쳐 투여한 후, 요법없이 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6주 동안 시행하는 투약 주기 또한 고려된다. 별법으로, 요법에 대한 피험체의 반응에 따라, 치료법 사이의 주기 시간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 투여량과 매주 시행되는 주기의 상이한 조합을 비롯한 추가의 투약 주기 또한 본원에서 고려된다.

본원에서 "접촉시킨다"라는 것은 본원에서 제공하는 조성물이 본원에 기술된 세포, 기관, 조직 또는 체액과 물리적으로 근접한 위치에 있도록 하는 수단으로서 정의된다. 접촉시킨다라는 것은 본원에서 제공하는 조성물 중 임의의 것을 전신 또는 국소 투여하는 것을 포함하며, 이는 비제한적으로는 시험관내, 생체내 및/또는 생체외 절차 및 방법을 포함한다. "조합한다" 및 "접촉시킨다"라는 것은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 같은 방식으로 정의되는 것으로 한다.

의사 또는 수의사는 필요한 조성물의 유효량(ED50)에 대해 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 원하는 치료학적 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 보다 낮은 수준으로 조성물 중에 사용되는 화합물의 투약을 개시할 수 있고, 원하는 효과를 달성할 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 별법으로, 투여량은 일정하게 유지될 수 있다.

조성물은 예를 들어, 상기 기술된 것과 같은 임의의 통상의 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 선택된 투여 경로와는 상관없이, 적합한 수화된 형태, 및/또는 조성물로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 예를 들어, 하기 기술되는 것과 같이, 또는 당업자에게 공지된 다른 종래 방법에 의해 허용되는 투여 제형으로 제제화된다.

화합물의 독성 및 치료학적 효능은 LD50(집단의 50%에게 치명적인 치사량) 및 ED₅₀(집단의 50%에서의 치료학상 유효량)의 측정을 위해 세포 배양물 또는 실험용 동물에서 표준 방법으로 측정할 수 있다. 독성과 치료학적 효과 사이의 용량비가 치료학적 지수이며, 이는 LD50/ED50 비로서 표시될 수 있다. 독성인 부작용을 보이는 화합물이 사용될 수 있지만, 건강한 세포에게 미칠 잠재적인 손상을 최소화시켜 부작용을 감소시키기 위해서는 상기 화합물을 이환 조직 부위로 표적화시키는 전달 시스템을 디자인하는 데 주의하여야 한다.

세포 배양 분석 및/또는 동물 연구로부터 얻은 데이터를 사용하여 인간에서 사용하기 위한 범위의 투여량을 가진 제제를 제제화할 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성은 거의 없거나 전혀 없이, ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 포함된다. 상기 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 그 범위 내에서 달라질 수 있다. 임의의 화합물의 경우, 치료학상 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 확립될 수 있다. 세포 배양물에 측정된 바와 같이, IC50(즉, 최대치의 절반을 억제할 수 있는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 배열을 달성할 수 있도록 투여량으로 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 혈장 내 수준을 측정할 수 있다. 그러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 화합물의 조합을 포함하는 조성물 또한 상기 방법들 중 어느 것을 사용함으로써 평가할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 조직에서의 혈관신생을 억제하는 것을 고려한다. 조직에서의 혈관신생 정도, 및 따라서, 달성될 수 있는 억제 범위는 다양한 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 의해 평가될 수 있다.

엔도글린 또는 VEGF를 인식하고(예를 들어, 그에 우선적으로 결합하고), 혈관신생을 억제하는 항체의 독특한 특이성을 통해 혈관신생(신생혈관형성), 소 혈관 확장, 과도한 혈관화, 종양 세포 증식, 및/또는 종양 성장을 특징으로 하는 질환을 진단 및 치료하는 용도를 가진다. 항체는 다양한 형태의 암(원발성 종양 및 전이)을 앓는 피험체에게 투여될 수 있다.

본원에 기술된 조성물을 투여하는 것 이외에도, 피험체는 또한 하나 이상의 추가의 혈관신생 억제제로 치료받을 수 있다는 것이 고려되고 있음을 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 바, "혈관신생 억제제"라는 용어는 본 명세서 및 특허청구범위의 목적으로 혈관신생을 억제하는 작용을 하는 펩티드, 단백질, 효소, 다당류, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, 재조합 벡터, 및 약물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 화합물 또는 분자를 의미한다. 혈관신생 억제제는 당업계에 공지되어 있고, 본원에서는 모든 유형의 것이 고려된다. 그러한 화합물 및 분자에 대한 비제한적인 예로는 천연 및 합성 생체분자, 예를 들어, 파클리탁셀, O-(클로로아세틸-카르보밀) 푸마질롤("TNP-470" 또는 "AGM 1470"), 트롬보스폰딘-1 , 트롬보스폰딘-2, 안지오스타틴, 인간 연골세포 유래 혈관신생 억제제("hCHIAMP: human chondrocyte-derived inhibitor of angiogenesis"), 연골 유래 혈관신생 억제제, 혈소판인자-4, gro-베타, 인간 인터페론 유도성 단백질 10("IP10"), 인터루킨 12, Ro 318220, 트리시클로데칸-9-일 크산테이트("D609"), 이르소글라딘, 8,9-디히드록시-7-메틸-벤조] 퀴놀리지눔 브로마이드("GPA 1734"), 메드록시프로게스테론, 헤파린과 코르티손의 조합물, 글루코시다제 억제제, 제니스테인, 탈리도마이드, 디아미노-안트라퀴논, 허비마이신, 우르솔산, 및 올레놀산을 포함한다. 항체에 대한 비제한적인 일례로는 분자, 예를 들어, VEGF, VEGF 수용체, 또는 엔토글린의 상이한 에피토프에 대한 것을 포함한다. 추가로, VEGF 수용체에 대한 소형 분자 억제제는 공지되어 있고, 본원에서 고려된다. VEGF 수용체 억제제에 대한 비제한적인 일례로는 라니비주맙(Lucentis), 아프리버셉트(VEGF-Trap), 수니티닙(Sutent), 소라페닙(Nexavar), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다.

하나의 비제한적인 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 라니비주맙이다. 라니비주맙에 대한 예시적인 안구용 투여량은 매달 유리체내로 투여되는 약 0.5 mg을 포함한다. 하나의 비제한적인 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 VEGF-트랩(VEGF-Trap)이다. VEGF-트랩에 대한 예시적인 투여량은 매 2 또는 3주마다 투여되는 약 0.5-약 10 mg/kg을 포함한다. VEGF-트랩에 대한 예시적인 안구용 투여량은 매달 또는 분기별로 유리체내로 투여되는 약 0.5-약 2.0 mg을 포함한다.

또 다른 비제한적인 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 수니티닙이다. 수니티닙에 대한 예시적인 요법은 4주 동안 약 50 mg을 투여한 후, 어떤 약물도 투여하지 않고 2주간 진행시키는 것을 포함한다. 치료 요법은 순환적 또는 비순환적 방식을 기초로 반복될 수 있다.

또 다른 비제한적인 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 소라페닙이다. 소라페닙에 대한 예시적인 투여량은 매일 투여되는 약 400 mg을 포함한다.

또 다른 비제한적인 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 악시티닙이다. 악시티닙에 대한 예시적인 투여량은 1일 2회 투여되는 약 3, 약 5, 또는 약 10 mg을 포함한다.

또 다른 비제한적인 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 페갑타닙이다. 페갑타닙에 대한 예시적인 투여량은 매 6주마다 유리체내로 투여되는 약 0.3-약 3 mg을 포함한다.

추가의 또 다른 비제한적인 실시양태에서, VEGF 수용체 억제제는 파조파닙이다. 파조파닙에 대한 예시적인 투여량은 매일 투여되는 약 200-약 1,000 mg을 포함한다.

이들 VEGF 수용체 억제제의 다중 조합물은 본원에 기술된 조성물과 함께 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 조합을 통해 기술된 항체 또는 항원 결합부를 보다 소량의 투여량으로 사용할 수 있다. 상기와 같은 투여량 변경은 항체 조합에 의한 시너지 효과의 결과일 수 있다.

암

CD105는 종양 혈관신생과 관련이 있으며, 정상 조직과 비교하여 각종 종양 조직의 내피에서는 강력하게 상향 조절되어 있다. CD105는 매우 다양한 종양 내피에 상향 조절되어 있다. 추가로, CD105는 상응하는 정상 조직에서보다 종양 내피에서 더욱 강력하게 발현된다. 따라서, 키메라 항엔도글린 항체를 사용하여 혈관신생을 억제하는 것이 암성 종양에 대한 치료 옵션을 나타낸다. 본원에 기술된 조성물을 사용하여 암성 종양 및 전이를 치료할 수 있다. 또한 조성물은 암성 종양 및 전이 치료용 의약의 제제화에 사용될 수 있다.

VEGF는 그의 발현이 다양한 고형 종양에서 상향 조절되어 있기 때문에, 항종양 요법에 대한 한 표적이 된다. VEGF는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 것인 혈관신생의 주요 조절인자이다. 이러한 과정은 새로운 혈관의 형성에 의존하는 고형 종양 성장에 기본이 된다. 특정의 소형 분자 치료제는 혈관 내피 성장 인자 수용체("VEGFR")를 표적할 수 있고; 소형 분자 치료제에 의한 상기와 같은 표적화를 통해 항암 효과가 일어날 수 있다. VEGF 수용체를 표적하는 제제는 새로운 혈관 형성의 억제를 통해 간접적으로 종양 성장을 차단시킨다. VEGF 유도성 혈관신생을 억제하면, 대식세포, 파골세포 또는 연골파괴세포의 VEGF 자극을 유의적으로 억제할 필요없이 항종양 또는 개선된 항종양 효과를 발휘할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "종양"이라는 용어는 (같은 유형의 정상 조직에 의한발현과 비교하였을 때) 엔도글린 및/또는 VEGF를 발현하는 암성 조직을 의미한다. 종양은 고형 종양 및 반고형 종양을 포함할 수 있다. 종양에 대한 비제한적인 일례로는 인간 백혈병(비T-세포형 (비T) 급성 림프아구성 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukemia), 골수단핵구 백혈병 포함); 및 그의 주변 혈관구조가 (같은 유형의 정상 조직에 의한 발현과 비교하였을 때) 엔도글린을 중간 정도 내지 고수준으로 발현하는 하는 것인 인간 고형 및 반고형 종양(혈관육종, 유방암종, 위암, 결장암종, 호지킨 림프종, 림프종, 다형성 아교모세포종(GBM), 폐암종, 흑색종, 골수종, 림프종, 골육종, 난소암종, 이하선종양, 인두암종, 전립선암종, 간세암종, 선암종, 및 직장S상결장 암종 포함)을 포함한다.

치료하고자 하는 암성 조직은 예를 들어, 엔도글린 및/또는 VEGF를 비정상적인 수준으로 발현하는 내피 조직이다.

종양 조직의 신생혈관형성이 일어나지 않을 경우, 종양 조직은 필요한 영양분을 얻지 못하고, 성장은 느려지며, 추가 성장은 중단되고, 퇴행하여, 최종적으로는 괴상성이 되어 종양은 사멸하게 된다. 본원에서는 종양 혈관신생을 억제시켜 종양 신생혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본원에서는 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

전이성 암 세포가 원발성 종양으로부터 나가기 위해서는 전이 형성이 원발성 종양의 혈관화를 필요로 하고, 2차 부위에서의 그의 확립은 전이 성장을 지원하는 신생혈관형성을 필요로 하는 바, 상기 방법은 전이 형성에 대해 특히 효과적이다.

본 발명의 "암/전이를 앓는 피험체"는 아직까지는 질환에 대한 어떤 증상도 나타내지 않는 돌연변이체 단백질(종양 관련 항원) 또는 돌연변이체 유전자를 발현할 수 있다는 것을 이해할 것이다. (돌연변이체 K-ras 단백질과 관련이 있는) 결장암의 하나의 비제한적인 일례에서, 결장의 일부 세포에 돌연변이체 K-ras 단백질를 포함하는 피험체는 비록 아직까지는 결장암에 대한 어떤 증상도 나타내지 않을 수도 있지만, 상기 피험체가 치료하고자 하는 피험체이다. "질병의 징후 또는 증상"은 질환의 임상적으로 인식되는 소견 또는 징조를 나타낸다.

종양 또는 전이를 앓는 피험체를 "치료"한다는 것은 치료 후 피험체의 증상을 부분적으로 완화시키거나, 전체적으로 완화시키거나, 또는 정적 상태 그대로 유지시키는 것을 의미한다. 치료받은 환자는 종양 부하의 부분적 또는 전체적인 완화를 나타낼 수 있다. 이는 방어, 요법 및 치유를 포함하는 것으로 한다. 하나의 비제한적인 일례에서, 고도의 전이성 암(예를 들어, 유방암)을 앓는 피험체는 추가 전이가 일어나지 않도록 치료되거나, 상기 피험체에서는 치료를 받지 않은 피험체와 비교하여 상기 암의 개수가 감소된다. 또 다른 비제한적인 일례에서, 피험체는 치료를 받지 않은 피험체와 비교하여 피험체의 고형암의 크기가 축소되거나, 그 크기가 더 이상은 증가하지 않도록 치료된다. 추가의 또 다른 비제한적인 일례에서, 치료받은 피험체에서의 암 세포의 개수는 치료를 받지 않은 피험체와 비교하여 증가하지 않거나, 감소된다. 개선은 또한 예를 들어, 세포 증식 감소, 세포 개수 감소, 아폽토시스 증가, 및/또는 치료받은 피험체의 생존 기간 연장으로서 정의될 수 있다.

본원에서 추가로 사용되는 바와 같이, 암 치료는 암성 성장 또는 종양의 정체, 부분적 또는 전체적인 제거를 포함한다. 치료 또는 부분적인 제거는 예를 들어, 성장 또는 종양 크기 및/또는 부피가 예를 들어, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배의 배수만큼 감소된 것, 또는 상기 범위 사이의 임의 배수만큼 감소된 것을 포함한다. 유사하게, 치료법 또는 부분적인 제거는 성장 또는 종양 크기 및/또는 부피가 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 감소율 또는 상기 범위 사이의 임의의 감소율 만큼 감소된 것을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 방법으로 치료하고자 하는 종양 또는 암은 폐암, 부인과 악성종양, 흑색종, 유방암, 뇌암(예를 들어, 다형성 아교모세포종, "GBM" 또는 신경아교종), 췌장암, 난소암, 자궁암, 결장직장암, 전립선암, 콩팥암, 두부암(head cancer), 간암(간세포암), 경부암(neck cancer), 콩팥암(신세포암), 음경암, 위암, 갑상선암, 방광암, 육종, 암종, 골수종, 및 림프종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양은 고형 또는 반고형 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양은 원발성 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양은 전이성 종양이다. 한 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양 또는 암은 상피 기원의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 치료하고자 하는 암은 골수종이다. 또 다른 실시양태에서, 치료하고자 하는 암은 난소암. 또 다른 실시양태에서, 치료하고자 하는 암은 콩팥/신장암이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 치료하고자 하는 암은 간세포/간암이다.

폐암

한 측면에서, 본원에서는 폐암 치료 방법을 제공한다. 폐암의 가장 일반적인 유형은 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer)이며, 이는 폐암 중 대략 80-85%를 차지하고, 편평세포암종, 선암종, 및 미분화성 대세포암종으로 분류된다. 소세포 폐암은 폐암의 15-20%를 차지한다.

폐암 단계별 분류는 그의 기원으로부터의 암 확장 정도를 평가하는 것이다. 이는 폐암에 대한 예후 및 잠재적인 치료법에 영향을 주는 중요한 인자이다. 비소세포 폐암종은 IA("1A"; 최선의 예후)부터 IV("4"; 최악의 예후)까지로 단계별로 분류된다. 소세포 폐암종은 흉부의 절반으로 한정되어 있고, 단일 방사선요법 범위의 범주내 포함되는 경우, 제한형 단계로 분류되며; 그렇지 않다면, 확장형 단계이다.

비소세포 폐암은 EUS(내시경 초음파: endoscopic ultrasound) 또는 CT 또는 MRI 스캔을 사용하여 단계별로 분류될 수 있거나, 또는 수술시 TNM 체계에 따라 질환의 정도를 부류함으로써 단계별로 분류될 수 있다. 이러한 피험체는 예후 및 치료법을 논하는 과정의 일부로서 단계별로 분류된다. AJCC는 TNM 단계별 분류 후, 추가로 분류할 것을 권고한다.

원발성 종양(T): TX: 원발성 종양 평가가 불가능하거나, 객담 또는 기관지폐포 세척액 중에는 악성 세포가 존재하지만, 영상 또는 기관지경술에서는 관찰되지 않는 경우. Tis: 상피내 암종이 있는 경우. T0: 원발성 종양에 대한 증거가 없는 경우. T1: 종양의 최대 크기가 3 cm 미만이고, 종양이 내장측 흉막으로 둘러싸여 있으며, 기관지경술에 의한 바, 주기관지로의 침습은 없는 경우. T2: 종양의 최대 크기가 3 cm 초과; 주기관지로 확장(그러나, 기관분기부로부터 2 cm 초과로 떨어짐); 및 폐쇄 폐렴(그러나, 폐 전체를 포함하지는 않음)인 것 중 임의의 특징을 가진 종양인 경우. T3: 흉부벽, 횡격막, 종격 흉막 또는 벽쪽 심장막의 침습; 기관분기부를 포함하지 않으며, 기관분기부로부터 2 cm 범위내에서 주기관지로 확장; 및 폐 전체의 폐쇄 폐렴인 것 중 임의의 특징을 가진 종양인 경우. T4: 종격, 심장, 대혈관, 기관, 식도, 척추골 또는 기관분기부의 침습; 같은 엽내의 별개의 종양 절; 및 악성 흉막 삼출물인 것 중 임의의 특징을 가진 종양인 경우. 림프절(N): NX: 림프절 평가가 불가능한 경우; N0: 어떤 림프절도 포함되지 않은 경우; N1: 동측 기관지 주위 또는 동측 폐문 림프절로 전이된 경우; N2: 동측 종격 또는 기관분기부 아래 림프절로 전이된 경우; 및 N3: 동측 쇄골상 림프절; 동측 사각근 림프절; 및 맞은편 림프절 중 임의 부위로 전이된 경우. 점막 전이(M): MX: 점막 전이 평가가 불가능한 경우; M0: 점막 전이가 존재하지 않는 경우; 및 M1: 점막 전이가 존재하는 경우.

자궁암/부인과 악성종양

자궁암은 자궁에서 발생하는 수개의 상이한 유형의 암들: 자궁육종(예를 들어, 자궁근층, 또는 자궁의 근육층의 육종이 가장 일반적인 평활근육종이다); 자궁내막암; 및 자궁경부암 중 임의의 것을 지칭할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본원에서는 자궁내막암을 치료하는 방법을 제공한다. 자궁내막암은 자궁의 내부 내피인 자궁내막에서 시작되는 암이다. 자궁암 및 자궁내막암의 일례들 중 그 일부로는 선암종, 선극세포종, 선편평암종, 유두상 장액성 선암종, 투명 세포 선암종, 자궁육종, 간질육종, 악성 혼합 중배엽성 종양, 및 평활근육종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 방법은 자궁경부암, 바람직하게는, 자궁경부 상피내 선암종을 치료한다. 상기 암의 주된 유형 2가지는 편평세포암종 및 선암종으로 존재하다. 전자는 모든 자궁경부암 중 약 80-90%를 구성하고, 이는 외자궁경부(질에 가장 가까운 부분) 및 내자궁경부(자궁에 가장 가까운 부분) 연결 지점에서 발생한다. 후자는 내자궁경부의 점액 생산 선세포에서 발생한다. 일부 자궁경부암은 이들 2가지 모두의 특징을 가지며, 이는 선편평암종 또는 혼합 암종이라 명명된다.

난소암

또 다른 측면에서, 본원에서는 상피 난소 종양을 비롯한, 난소암을 치료하는 방법을 제공한다.

난소암은 병적 이상에 관한 보고에서 수득된, 종양의 조직학적 성질에 따라 분류된다. 난소 상피 암종으로도 알려져 있는, 표면 상피 기질 종양이 가장 전형적인 유형의 난소암이다. 이는 장액성 종양, 자궁내막모양 종양 및 점액낭선종을 포함한다. 에스트로겐 생산 과립층 세포 종양 및 남성화 세르톨리 라이디히(Sertoli-Leydig) 세포 종양 또는 남성배세포종을 비롯한, 성삭 기질 종양이 난소암의 8%를 차지한다. 생식 세포 종양은 난소 종양의 대략 30%를 차지하지만, 난소암에 대해서는 겨우 5%를 차지하는데, 이는 대부분의 생식 세포 종양이 기형종이고, 대부분의 기형종은 양성이기 때문이다. 생식 세포 종양은 젊은 여성 및 소녀들에게서 발생하는 경향이 있다. 예후는 생식 세포 종양의 특이적인 조직학적 성질에 따라 달라지지만, 전반적으로는 적절하다. 혼합 종양은 종양 조직학상 상기 부류들 중 1 초과의 요소들을 포함하는 것이다.

난소암은 또한 신체 전역 다른 곳에서 발생한 원발성 암으로부터의 전이 결과인 속발성 암일 수 있다. 보통 원발성 암은 유방암 및 위장관암(이 경우, 난소암은 크루켄버그(Krukenberg) 암이다). 표면 상피 기질 종양은 복막(복강 내피)에서 기원할 수 있는데, 이 경우, 난소암은 원발성 복막암에 대한 속발성 암이지만, 치료법은 기본적으로 복막을 포함하는 원발성 표면 상피 기질 종양에 대한 치료법과 같다.

난소암 단계별 분류는 FIGO 단계별 분류 체계에 의해 이루어지며, 이는 (복식 전체 자궁절제술을 포함할 수 있는) 수술 후에 얻은 정보, 난소 및 자궁관, 둘 다의 제거, 대망, 및 세포 검사를 위한 골반(복강내) 세척액을 사용한다.

I 단계는 1개의 난소 또는 2개의 난소 모두로 제한되는 난소암을 지칭하고; IA는 1개의 난소; 난소낭 무손상; 난소 표면 상의 종양 부재; 복수 또는 복강내 세척액 중 악성 세포 부재를 포함하고; IB는 2개의 난소 모두; 난소낭 무손상; 난소 표면 상의 종양 부재; 음성 세척액을 포함하고; IC는 하기: 난소낭 파열, 난소 표면 상의 종양 존재, 양성 세척액 중 임의의 것을 가진 난소로 한정되는 종양이다.

단계 II는 골반 확장 또는 임플란트를 지칭하고; IIA는 자궁 또는 자궁관 상의 확장 또는 임플란트; 음성 세척액을 포함하고; IIB는 다른 구조 상의 확장 또는 임플란트; 음성 세척액을 포함하고; IIC는 양성 복강내 세척액과 함께 골반 확장 또는 임플란트를 포함한다.

단계 III은 골반 바깥쪽의 현미경적 복강내 임플란트; 또는 소장 또는 대망으로 확장된 골반으로 제한되는 것을 지칭하고; IIIA는 골반 너머로의 현미경적 복강내 전이를 지칭하고; IIIB는 크기가 2 cm 미만인, 골반 너머로의 육안적 복강내 전이를 지칭하고; IIIC는 크기가 > 2 cm인, 골반 너머로의 복강내 전이 또는 림프절 전이를 지칭한다.

단계 IV는 간으로의, 또는 복강 바깥쪽으로의 점막 전이를 지칭한다.

대동맥방 림프절 전이는 국소 림프절(단계 IIIC)로 간주된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 하기: 난소내 선암종 및 난소로부터 복강으로 이동한 선암종으로부터 선택되는 난소암을 치료한다.

흑색종

흑색종은 피부뿐만 아니라, 장 및 눈(포도막 흑색종)에서도 우세하게 발견되는 멜라닌 세포의 악성 종양이다. 이는 피부암 중에서 좀 더 보기 드문 유형들 중 하나이지만, 이는 피부암 관련 사망 대다수의 원인이 된다. 악성 흑색종은 멜라닌 세포라 명명되는 세포 세포의 조절되지 않는 성장으로부터 유발된 중증 유형의 피부암이다. 흑색종은 또한 맥락막 흑색종, 악성 흑색종, 피부 흑색종 및 안구내 흑색종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

흑색종은 하기 유형으로 분류될 수 있다: 악성 흑색점, 악성 흑점자 흑색종, 표재 확산 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 점막 흑색종, 결절성 흑색종, 폴립모양 흑색종, 섬유조직형성 흑색종, 무색소성 흑색종, 연조직 흑색종, 및 포도막 흑색종. 흑색종 단계는 하기와 같다:

단계 0 - 상피내 흑색종(클라크(Clark) 수준 I).

단계 I/II - 침습성 흑색종: T1a: 1.00 mm 미만, 원발성, 궤양 비포함, 클라크 수준 II-III; T1b: 1.00 mm 미만, 원발성, 궤양 포함 또는 클라크 수준 IV-V; 및 T2a: 1.00-2.00 mm, 원발성, 궤양 비포함.

단계 II - 고위험 흑색종: T2b: 1.00-2.00 mm, 원발성, 궤양 포함; T3a: 2.00-4.00 mm, 원발성, 궤양 비포함; T3b: 2.00-4.00 mm, 원발성, 궤양 포함; T4a: 4.00 mm 이상, 원발성, 궤양 비포함; 및 T4b: 4.00 mm 이상, 원발성, 궤양 포함.

단계 III - 국소 전이: N1: 단일 양성 림프절; N2: 2-3개의 양성 림프절 또는 국소 피부/이행 전이; 및 N3: 4개의 양성 림프절 또는 1개의 림프절 및 국소 피부/이행 전이.

단계 IV - 점막 전이: M1a: 점막 피부 전이, 정상 LDH; M1b: 폐 전이, 정상 LDH; 및 M1c: 다른 점막으로의 전이 또는 LDH 상승을 동반한 임의 점막으로의 전이.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 흑색종을 치료한다.

결장암 및 결장직장암

결장직장암(이는 또한 결장암 또는 대장암으로도 명명됨)은 결장, 직장(항문) 및 충수 내의 암성 성장을 포함한다. 전세계적으로 연간 655,000명이 사망하는데, 이는 3번째로 가장 보편적 형태의 암이며, 서양 세계에서의 암 관련 사망에 대한 2번째 주요 원인이 된다. 많은 결장직장암음 결장내 선종성 폴립으로부터 발생하는 것으로 여겨진다. 이같은 버섯 유사 성장은 보통 양성이지만, 일부는 시간이 경과함에 따라 암으로 발전할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 듀크(Dukes) 분류를 사용하여 단계 A-D에 기초하여 결장직장암을 분류할 수 있다. 단계 A는 점막으로 한정된 (즉, 장벽을 지나는 침습은 일어나지 않은) 결장직장암을 지칭한다. 단계 B1은 고유 근육층으로 확장되었지만, 그를 뚫고 침투하지는 않은(즉, 림프절이 침습되지는 않은) 것을 지칭하는 반면; 단계 B2 암은 고유 근육층을 뚫고 침투하였지만, 그를 뚫고 침투하지는 않은(즉, 림프절이 침습되지는 않은) 것을 지칭한다. 단계 C1은 고유 근육층으로 확장되었지만, 그를 뚫고 침투하지는 않은(즉, 림프절이 침습되지는 않은) 암을 지칭하는 반면; 단계 C2는 고유 근육층으로 확장되고 그를 뚫고 침투가 일어난(즉, 림프절이 포함된) 암을 지칭한다. 단계 D는 원위 전이성 확장을 지칭한다. 또한 TNM 체계를 사용하여 당업계에 공지되어 있는 종래 수단에 따라 결장직장암을 단계별로 분류할 수 있다.

유방암

본원에 기술된 방법에 의해 치료될 수 있는 유방암에는 여러 가지 유형이 존재한다. 상피내 소엽성 암종 및 유관 상피내 암종은 각각 소엽 및 유관에서 발생하였지만, 유방 주변의 지방 조직 또는 신체 다른 부위로 확장되지 않은 유방암이다. 침윤성(또는 침습성) 소엽성 및 유관 암종은 각각 소엽 및 유관에서 발생하여, 유방 지방 조직 및/또는 신체 다른 부위로 확장된 암이다. 한 측면에서, 본원에서는 유방암, 예를 들어, Her2- 및/또는 ER- 및/또는 PR-인 유방방인 것인, 유선내 유관 조직에서의 유관 암종을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법에 의해 치료가 유익한 다른 유방암에는 수질성 암종, 콜로이드성 암종, 관암종, 및 염증성 유방암이 있다.

한 실시양태에서, 유방암은 TNM 체계에 따라 단계별로 분류된다. 예후는 단계별 분류 결과와 매우 밀접한 연과성이 있으며, 단계별 분류는 또한 임상 시험 및 임상 실습, 둘 다에서 환자를 치료법에 배정하는 데 사용된다.

요약하면, 단계별 분류 결과를 위한 정보는 하기와 같다: TX: 원발성 종양 평가가 불가능한 경우; T0: 종양에 대한 어떤 증거도 없는 경우; Tis: 계내 암종은 존재하나, 비침습성인 경우; T1: 종양 < 2 cm인 경우; T2: 2 cm < 종양 ≤ 5 cm인 경우; T3: 종양 > 5 cm인 경우; T4: 흉부벽 또는 비푸로 성장한 임의의 크기를 가진 종양, 또는 염증성 유방암인 경우. NX: 인접 림프절 평가가 불가능한 경우; N0: 암이 국소 림프절로 확장되지 않은 경우; N1: 암이 1 내지 3개의 상악 림프절 또는 하나의 내흉 림프절로 확장된 경우; N2: 암인 4 내지 9개의 상악 림프절 또는 다발성 내흉 림프절로 확장된 경우; N3: 하기 중 하나에 적용되는 경우: 암이 10개 이상의 상악 림프절로 확장된 경우, 또는 암이 쇄골(빗장뼈) 아래 림프절로 확장된 경우, 또는 암이 쇄골 위 림프절로 확장된 경우, 또는 암이 상악 림프절을 포함하고 내흉 림프절을 확대시킨 경우, 또는 암이 4개 이상의 상악 림프절을 포함하고, 소량의 암이 전초 림프절 생검 상의 내흉 림프절에서 발견되는 경우. MX: 원위 확장(전이) 존재에 대한 평가가 불가능한 경우; M0: 원위 확장이 없는 경우. M1: 원위 기관(쇄골상 림프절 포함하지 않음)으로의 확장이 일어난 경우.

췌장암

또 다른 측면에서, 본원에서는 하기: 췌장관 조직 중 상피양 암종 및 췌장관 중 선암종으로부터 선택되는 췌장암을 치료하는 방법을 제공한다. 가장 일반적인 유형의 췌장암은 선암종으로서, 이는 췌장관 내피에서 발생한다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 췌장암을 치료한다.

전립선암

한 다른 측면에서, 본원에서는 하기: 골로 이동한 선암종 또는 선암종으로부터 선택되는 췌장암을 치료하는 방법을 제공한다. 전립선암은 요도의 제1 부위를 둘러싸고 있는, 남성의 전립선 기관에서 발생한다. 전립선은 수개의 세포 유형을 가지는데, 종양 중 99%는 정액 생산을 담당하는 선 세포에서 발생하는 선암종이다.

전립선암을 단계별로 분류하는 데 보편적으로 사용되는 체계에는 2가지가 있다. 가장 보편적인 것은 TNM 체계로서, 이는 종양 크기, 포함된 림프절 정도, 및 임의 전이(원위 확장)를 평가한다. 많안 다른 암들과 같이, 이들은 대개 4단계(I-IV)로 분류된다. 그보다는 덜 보편적으로 사용되는 또 다른 체계는 휘트모어-주잇(Whitmore-Jewett) 단계이다.

요약하면, I 단계 질환은 예를 들어, 양성 전립선 비대와 같이 전립선 조직이 다른 이유에서 제거되었을 때, 샘플의 소부분에서 우연히 발견되고, 세포는 정상 세포와 매우 유사하고, 선은 검사 손가락에 정상으로 감지되는 것인 암이다. II 단계에서는 보다 많은 전립선이 관여하고 있으며, 종괴가 선에서 감지될 수 있다. III 단계에서, 종양은 전립선 피막을 통해 확장되어 있고, 종괴는 선 표면 상에서 감지될 수 있다. IV 단계 질환에서, 종양은 가까운 구조체를 침습하였거나, 림프절 또는 다른 기관으로 확장된 상태이다. 등급을 분류하는 것은 파괴 잠재능의 예측 및 질환의 최종 예후에 대한 예측을 제공하는, 생검으로부터 세포 함량 및 조직 구조에 기초한다(Gleason).

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 전립선암을 치료한다.

두경부 암

두경부암(예를 들어, 경구, 후두, 코인두, 식도 등)은 입술, 구강(입), 비강, 부비동, 인두, 및 후두를 비롯한, 상부 호흡소화관으로부터 기원한, 생물학상 유사한 암 군들을 지칭하는 것이다. 대부분의 두경부암은 상기 영역의 점막 내피로부터 기원한, 편평세포암종이다. 두경부암은 대개 경부의 림프절로 확장되고, 이는 대개 진단시 가장 먼저(및 때때로는 유일하게) 발견되는 상기 질환의 소견이다. 두경부암은 담배 흡연, 알콜 소비, 및 특정의 성 매개 인간 유두종바이러스 균주를 비롯한, 특정의 환경 및 생활 방식 위험 요소와 강력한 연관성이 있다. 두경부암을 앓는 환자를 관리하는 것은 엄청난 과제로 남아있다. 암, 예를 들어, 하인두암, 후두암, 코인두암, 구인두암은 본원에 기술된 화합물을 사용함으로써 치료될 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 두부 또는 경부암을 치료한다.

콩팥암

또 다른 측면에서, 본원에서는 콩팥암을 치료하는 방법을 제공한다. 콩팥암(이는 또한 신장 세포암, 신세포암종, 신장 선암종, 및 콩팥세포암종으로도 명명됨)은 악성 세포가 콩팥 요세관 내피에서 발견되는 질환이다. 신세포암종은 근위 신장 요세관으로부터 발생된, 가장 보편적인 형태의 콩팥암이다. 이는 성인에게서 나타나는 가장 보편적인 유형의 콩팥암으로서, 사례 중 대략 80%의 원인이 된다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 콩팥암을 치료한다.

간암

또 다른 측면에서, 본원에서는 원발성 간암(간에서 시작된 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 원발성 간암은 성인 및 아동, 둘 다에서 발생할 수 있다. 간암은 악성 간종양의 존재(간 상에서, 또는 간내에서 일어나는 종양 또는 성장)를 특징으로 한다. 의료 영상(암 그 자체가 아닌 다른 이유인 경우라도)에서 발견될 수 있거나, 또는 복부 종괴, 복통, 황달, 또는 일부 다른 간 기능장애로서 환자에서 존재가 드러날 수 있다. 여러 가지 유형의 간암이 존재한다.

혈관종: 이는 가장 보편적인 유형의 양성 간 종양이다. 이는 혈관에서 시작된다. 이러한 종양들 대부분은 증상을 일으키지 않고, 어떤 치료도 필요로 하지 않는다. 경미한 상태에서부터 중증 상태일 경우, 일부는 출혈을 일으킬 수 있고, 제거될 필요가 있을 수 있다.

간선종: 이러한 양성 상피 간 종양은 간에서 발생된다. 이는 대부분의 경우 우간엽에 위치하며, 빈번하게는 고립형으로 관찰된다. 선종의 크기는 1 내지 30 cm 범위이다. 간선종과 관련된 증상은 모두 격렬한 복통을 유발할 수 있는 큰 병변과 관련이 있다.

초점성 결절성 과증식: 초점성 결절성 과증식(FNH: Focal nodular hyperplasia)은 간 종양 중 2번째로 가장 보편적인 유형이다. 이러한 종양은 선천성 동정맥 기형 간세포 반응의 결과이다. 이러한 과정은 간의 정상적인 구성 요소들 모두 존재하지만, 이들이 제시되는 패턴이 비정상적인 것이다. 비록 상기와 같은 병증들이 존재하더라도, 간은 여전히 정상 범위로 기능을 수행하는 것처럼 보일 수 있다.

간세포암: 간세포암(HCC: hepatocellular cancer)은 간암 중 가장 보편적인 암이다. 이는 알콜 남용 및 B 간염 감염과 관련이 있으며, 특히 아시아에서 우세하게 널리 퍼져있다. HCC의 대부분은 외과적 절제술에 의해 치유도 불가능한 시점에 검출된다; 절제가 불가능한 HCC의 전신 치료는 생존 기간이 1년 미만인 것과 관련이 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 간암을 치료한다.

림프종

림프종은 면역계의 림프구에서 기원하는 암 유형이다. 이는 종종 림프절에서 기원하며, 림프절 비대(종양)으로서 제시된다. 림프종은 림프계 백혈병과 매우 밀접한 관련이 있는데, 이러한 림프계 백혈병 또한 림프구에서 기원하기는 하지만, 전형적으로는 오직 순환 혈액 및 골수(조혈 과정을 통해 혈액 세포가 생성되는 장소)를 포함하며, 보통 종양은 형성하지는 않는다. 많은 유형의 림프종이 존재하며, 결국 림프종은 혈액학적 신생물이라고 명명되는 광범위한 질환군들 중의 한 부분이다. 일부 림프종 형태는 무통성(예를 들어, 소림프구 림프종)이고, 심지어 치료없이 장수할 수 있는 양립가능성이 있는 반면, 다른 형태는 공격성(예를 들어, 버킷 림프종)이며, 빠른 악화와 사망을 일으킨다.

2001년도에 공개되고 2008년 업데이트된 WHO 분류(http://en.wikipedia.org/wiki/Lymphoma-cite_note-isbn92-832-2411-6-2#cite_note-isbn92-832-2411-6-2)가 림프종에 대한 최신 분류이며, 이는 "Revised European-American Lymphoma classification"(REAL)에서 제시된 바 있는 근거를 토대로 한 것이다. 상기 체계는 림프종을 세포 유형(즉, 종양과 가장 유사한 정상 세포 유형) 및 정의용 표현형, 분자 또는 세포유전학적 특징에 의해 분류한다. 3개의 큰 군으로 분류된다: B 세포, T 세포, 및 자연살세포 세포 종양. 이보다는 덜 보편적인 다른 군들 또한 인지된다. 호지킨 림프종은 비록 WHO(및 이전) 분류내에서는 별개의 것으로 간주되기는 하지만, (비록 현저하게 비정상적이기는 하지만) 성숙한 B 세포 계통의 림프구의 종양으로서 인지된다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 림프종을 치료한다.

육종

육종은 결합 조직(골, 연골, 지방)의 암으로서, 이는 중배엽 증식을 유발한다.

육종은 상피 기원(유방, 결장, 췌장 등)인 암종과는 대조를 이룬다. 그러나, 조직 기원에 대한 이해가 서서히 진행되어 가고 있는 바, "육종"이라는 용어는 때때로 현재 상피 조직으로부터 발생하는 것으로 공지된 종양에 적용된다. 연조직 육종이라는 용어는 결합 조직으로부터 발생된 것을 제외한, 결합 조직내 포함된 요소를 포함하는 연조직(예를 들어, 근육 및 혈관)의 종양을 기술하는 데 사용된다.

육종은 그가 발생되는 조직 유형에 기초하여 다수의 상이한 명칭을 가지고 있다. 예를 들어, 골육종은 골로부터 발생하는 것이고, 연골육종은 연골로부터 발생하는 것이고, 평활근육종은 평활근으로부터 발생하는 것이다. 육종은 모든 연령대 범위의 사람들에서 발생할 수 있지만, 이는 극히 드물며, 모든 암 사례의 단지 1%만을 차지한다. GIST는 가장 보편적인 형태의 육종인데, 이는 미국내에서는 연간 대략 3,000-3,500건의 사례를 포함한다. 이는 북미에서 연간 대략 200,000건의 사례를 포함하는 유방암과 비교되어야 한다.

골육종 중 대략 50% 및 연조직 육종 중 대략 20%는 35세 미만의 사람들에게 진단되었다. 일부 육종, 예를 들어, 평활근육종, 연골육종, 및 위장관 기질 종양(GIST: gastrointestinal stromal tumor)은 아동에서보다는 성인에서 더 보편적이다. 유잉 육종 및 골육종을 비롯한, 등급이 가장 높은 골육종은 아동 및 젊은층의 성인에서 보다 더 보편적으로 발생한다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 육종을 치료한다.

암종

암종은 상피 세포로부터 발생하는 임의의 악성 암이다. 암종은 주변 조직 및 기관을 침습하고, 림프절 및 다른 부위로 전이되거나, 확장될 수 있다.

모든 신생물과 같이 암종도 그의 병리조직학적 외양에 의해 분류된다. 종양에 대한 2개의 공통된 해설적 용어인 선암종 및 편평세포암종은 각각 이들 세포가 선 또는 편평 세포 외양을 가질 수 있다는 사실을 반영한다. 심한 역형성 종양은 미분화성인 바, 이에 뚜렷한 조직학적 외양은 가지지 않는다(미분화성 암종).

때때로, 종양은 가정되는 최초 기관에 의해(예를 들어 전립선 암종), 또는 추정의 기원 세포에 의해(간세포암종, 신세포암종) 지칭될 수 있다.

선암종은 선 조직의 상피 세포에서 기원하여, 선 구조를 형성하는 악성 종양이다. 이는 폐에서 일반적으로 나타난다(모든 폐암종의 30-40%를 형성). 이는 배상 세포 또는 II형 폐포세포로부터 발생하며, 말초적으로 발견된다.

편평세포암종은 편평 화생으로부터 발생하는 것이다. 이는 폐 종양 중 20-30%를 차지하며, 보통 폐문에서 기원된 것이다.

소세포암종은 거의 흡연에 기인하는 것이 확실하다. 이는 조기에 전이되고, (환자의 나트륨 농도를 강하시키는) ADH를 분비할 수 있다.

대세포 미분화성 암종은 폐 신생물 중 10-15%를 차지한다. 이들은 공격성이며, 미분화성인 성질로 인해 인식되기 어렵다. 이는 대개 보편적으로 폐 중심에 존재한다.

비부비동(sinonasal) 미분화성 암종.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 암종을 치료한다.

골수종

다발성 골수종(이는 또한 MM(multiple myeloma), 골수종, 혈장 세포 골수종, 또는 오토 칼러(Otto Kahler) 이후의 칼러병으로도 알려져 있음)은 혈장 세포암이다. 이들 면역 세포는 골수에서 형성되며, 림프관에 많이 존재하며, 항체를 생산한다. 골수종은 치유가 불가능한 것으로 간주되지만, 스테로이드, 화학요법, 탈리도마이드 및 줄기 세포 이식을 통해 관해 유도될 수 있다. 골수종은 혈액학적 암이라고 명명되는 광범위한 질환군들 중의 한 부분이다.

다발성 골수종은 후방배중심 B 림프구에서 발생한다. (14번째 염색체 상의 유전자좌 14q32) 면역글로불린 중쇄 유전자와 종양유전자(대개 11q13, 4p16.3, 6p21, 16q23 및 20q11) 사이의 염색체 전위는 다발성 골수종 환자에서 빈번하게 관찰된다. 상기 돌연변이를 통해 골수종의 발병기전에서 중요한 개시 이벤트인 것으로 판단되는 종양유전자의 조절곤란을 일으킨다. 그 결과 혈장 세포는 증식되고, 게놈은 불안정화되며, 이로써 추가의 돌연변이와 전위가 발생하게 된다. 14번 염색체 이상은 모든 사례의 골수종 중 약 50%에서 관찰된다. 13번 염색체(그 일부)의 결실 또한 사례 중 약 50%에서 관찰된다.

혈장 세포에 의해 시토카인(특히, IL-6)이 생산되면 예를 들어, 골다공증과 같은 그의 국소화된 손상은 더 많이 발생하게 되며, 악성 세포가 성장할 수 있는 미세환경이 형성된다. 혈관신생(새로운 혈관의 인력)은 증가하게 된다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 골수종을 치료한다.

위암

위암(stomach or gastric cancer)은 위의 어느 부위에서든 발생할 수 있으며, 이는 위 전역 및 다른 기관; 특히, 식도, 폐 및 간으로 확장될 수 있다. 위암은 전세계적으로 연간 800,000명을 사망에 이르게 한다.

전이는 위암을 앓는 개체 중 80-90%에서 발생하며, 조기에 진단받은 환자들 중 6개월 생존율은 65%이며, 말기에 진단받은 환자의 경우에는 15% 미만이다.

위암은 그의 조기 단계에서는 대개 증상이 없거나, 단지 비특이적인 증상만을 유발한다. 증상이 발생할 때까지, 일반적으로 암은 신체 다른 부위로 전이되는데, 이는 그의 예후가 충분하지 못한 주된 이유들 중 하나이다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 위암을 치료한다.

갑상선암

갑상선 신생물 또는 갑상선암은 보통 4가지 종류의 갑상선 악성 종양 중 어느 것을 지칭한다: 유두상, 소포성, 수질성 또는 역형성. 유두상 및 소포성 종양이 가장 보편적이다. 이는 서서히 성장하고, 재발할 수 있지만, 보통은 45세 미만의 환자에서는 치명적인 것은 아니다. 수질성 종양은 갑상선으로만 한정된 경우에는 예후가 우수하지만, 전이가 발생된 경우에는 그 예후는 보다 충분하지 못한다. 역형성 종양은 빠르게 성장하며, 요법에 대해 열악하게 반응한다.

갑상선암은 정상갑상선 환자에서 발견되지만, 갑상선기능항진증 또는 갑상선기능저하증의 증상은 큰 또는 전이성의 분화가 잘 이루어진 종양과 관련이 있을 수 있다. 결절이 20세 미만의 환자에서 발견될 경우, 이는 특히 우려 대상이 된다. 상기 연령대에서 양성 결정을 나타낼 가능성은 더 낮고, 악성일 가능성은 훨씬 더 크다.

갑상선암은 그의 병적 특징에 따라 분류될 수 있다. 하기 변종이 구별될 수 있다(각종 서브유형에 대한 분포는 지역적 변이를 나타낼 수 있다): 유두상 갑상선암(최대 75%); 소포성 갑상선암(최대 15%); 수질성 갑상선암(최대 8%); 및 역형성 갑상선암(5% 미만). 소포성 및 유두상 유형은 함께 "분화성 갑상선암"으로 분류될 수 있다. 이러한 유형은 수질성 및 미분화성 유형보다 더욱 바람직한 예후를 가진다. 갑상선종은 갑상선의 양성 신생물이다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 갑상선암을 치료한다.

방광암

방광암은 여러 유형의 방광 악성 성장들 중 어느 것을 지칭한다. 이는 방광에서 비정상적인 세포가 제어없이 증식되는 질환이다. 방광은 뇨를 저장하는 중공성의 근육성 기관이며; 골반에 위치한다. 가장 보편적인 유형의 방광암은 방광 내부의 세포 내피에서 시작되며, 이는 이행세포암종으로 명명된다(때때로 요로상피세포암종으로 명명됨).

방광암 중 90%는 이행세포암종이다. 그 나머지 10%는 편평세포암종, 선암종, 육종, 소세포암종 및 신체 전역의 암으로부터의 2차 침전물이다.

하기 단계를 사용하여 TNM(종양, 림프절, 및 전이: tumor, lymph node, and metastasis) 단계별 분류 체계에 따라 암 위치, 크기, 확장을 분류하였다: 0 단계: 암 세포가 오직 방광의 내부 내피에서만 발견되는 단계. I 단계: 암 세포가 방광의 내부 내피 너머의 층으로까지 증식하였지만, 방광 근육까지는 증식하지 않은 단계. II 단계: 암 세포가 방광벽 근육으로까지 증식하였지만, 방광 주변의 지방 조직까지는 증식하지 않은 단계. III 단계: 암 세포가 방광 주변의 지방 조직 및 전립선, 질, 또는 자궁으로까지 증식하였지만, 림프절 또는 다른 기관까지는 증식하지 않은 단계. IV 단계: 암 세포가 림프절, 골반 또는 복벽, 및/또는 다른 기관으로까지 증식한 것인 단계. 재발성: 암이 치료를 받은 후에도 방광, 또는 또 다른 인접 기관에서 재발하는 것이다.

방광 TCC를 1997 TNM 체계에 따라 단계별로 분류한다: Ta 비침습성 유두상 종양; T1 침습성이지만, 방광 근육층까지는 아닌 단계; T2 근육층까지 침습성인 단계; T3 근육 너머의 방광 바깥쪽 지방으로까지 침습성인 단계; 및 T4 전립선, 자궁 또는 골반벽 등 주변 구조로까지 침습성인 단계.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 방광암을 치료한다.

혈관신생을 포함하는 안구 병증

황반 변성 병증 및 당뇨 망막병증

한 측면에서, 본 발명은 환자에게 본원에서 제공하는 조성물 중 하나 이상을 치료학상 유효량으로 투여하여 환자에서 당뇨 망막병증, 황반 변성, 맥락막 신생혈관형성 또는 신생혈관형성 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다.

황반 변성(AMD: macular degeneration)은 높은 시력을 담당하는, 황반이라 명명되는 망막 중심부의 광수용체 손실이다. 황반 변성은 망막 색소 상피와 혈관 맥락막 사이의 세포외 기질 성분 및 다른 조직 파편의 비정상적인 축적과 관련이 있다. 이러한 조직 파편 유사 물질은 드루젠이라 명명된다. 드루젠은 안저(눈) 검사를 통해 관찰된다. 정상적인 눈은 드루젠이 없는 황반을 가질 수 있지만, 드루젠은 망막 주변부에 풍부하게 존재할 수 있다. 황반 시력의 어떤 상실도 없이, 황반 중에 연성 드루젠이 존재하는 것은 AMD의 조기 단계로 간주된다. 황반 변성은 망막의 망막 색소 상피(RPE: retinal pigment epithelium) 층 아래의 비정상적인 혈관 발생인 맥락막 신생혈관형성(CNV: choroidal neovascularization)을 특징으로 한다. 이러한 혈관은 망막 색소 상피를 파괴시키면서 브루크막(Bruch's membrane)을 뚫고 나와, 출혈하고, 결국에는 황반에 흉터를 형성하여 중심 시력의 심오한 손실을 일으킨다(원반형 흉터 형성).

다른 안구 질병 이외에도 맥락막 신생혈관형성(CNV)이 보편적으로 황반 변성에서 발생하며, 이는 맥락막 내피 세포 증식, 세포외 기질 과다생산, 및 섬유혈관 망막하 막 형성과 관련이 있다. 망막 색소 상피 세포 증식 및 혈관신생 인자 생산이 맥락막 신생혈관형성에 효과를 미치는 것으로 보인다.

당뇨 망막병증(DR: diabetic retinopathy)은 모세관 기저막의 비후, 및 모세관의 내피 세포와 혈관주위세포 사이의 접촉 부족에 기인하는, 당뇨병에서 발생하는 과도한 혈관신생을 특징으로 하는 안구 질병이다. 혈관주위세포 손실은 모세관 누출을 증가시키고, 혈액 망막 장벽을 분해시킨다. 당뇨 망막병증은 미세혈관 망막 변화의 결과이다. 고혈당증 유도성 혈관주위세포 사멸 및 기저막의 비후는 혈관벽의 부전을 일으킨다. 이러한 손상은 혈액 망막 장벽의 형성을 변화시키며, 망막 혈관의 투과성을 증가시킨다. 소 혈관-예를 들어, 눈에 있는 소 혈관은 특히 혈당(혈중 글루코스) 조절이 불충분한 것에는 특히 취약하다. 망막내에서는 글루코스 및/또는 프럭토스가 과다축적되면 작은 혈관이 손상된다. 또한 손상된 혈관에서 체액 및 지질이 황반 상에 노출되면 황반 부종이 발생할 수 있다. 이러한 체액으로 인해 황반은 팽윤되고, 시력은 흐려진다. 이러한 손상으로 인해 망막내 산소는 부족해진다.

질환이 진행됨에 따라 망막내 산소 부족은 망막을 따라 진행되는 혈관신생과, 투명한 겔 유사 유리체액에서의 혈관신생을 자극한다. 시기적절한 치료없다면, 상기의 새로운 혈관은 출혈할 수 있고, 시력을 흐리게 할 수 있고, 망막을 파괴시킬 수 있다. 섬유혈관 증식은 또한 견인 망막 박리를 유발할 수 있다. 새로운 혈관은 또한 눈 전방각으로 성장하여 신생혈관형성 녹내장을 유발할 수 있다.

증식성 유리체망막병증은 유리체 막내 및 망막 표면 상의 세포막 및 섬유증 막의 세포 증식과 관련이 있다. 망막 색소 상피 세포 증식 및 이동은 이러한 안구 질병에서 보편적인 것이다. 증식성 유리체망막병증과 관련된 상기 막은 세포외 기질 성분, 예를 들어, I, II, 및 IV형 콜라겐, 및 피브로넥틴을 포함하고, 계속해서 섬유증화된다.

노인성 황반 변성(AMD) 및 당뇨 망막병증은 선진국에서의 실명의 2가지 주된 원인이다. 최근 승인받은 고분자 루센티스(LUCENTIS)®, 아바스틴(AVASTIN)®, 및 마큐젠(MACUGEN)®은 AMD 환자가 이용할 수 있는 치료 옵션을 개선시켰다. 루센티스®는 Fab이고, 아바스틴®은 모노클로날 항체이다. 이 둘 다 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하고, 현재까지는 AMD 치료에 있어 가장 인상적인 결과를 입증한 것이나; 치료받은 환자 중 오직 소수에서만 시력이 유의적으로 개선되었다. VEGF 이외의 표적으로 중점화된 항혈관신생 요법을 통해 VEGF 경로를 표적하는 제제와 관련된 한계점 중 일부를 극복할 수 있다.

본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체를 사용하여 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증, 또는 증식성 유리체망막병증을 치료 또는 예방할 수 있다. 본원에서는 본원에 기술된 항체를 투여하는 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증, 또는 증식성 유리체망막병증을 치료 또는 예방하는 방법을 기술한다. 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 혈관을 수축시키고/시키거나, 안질환과 관련된 내피 세포 증식을 억제하고/시키거나, 출혈 증상을 제거하고/하거나, 흐린 시력을 치료하고/하거나, 시력 상실을 정체시키고/시키거나, 혈관 누출을 예방할 수 있다. 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증 또는 증식성 유리체망막병증 치료용 의약에 사용될 수 있다.

추가로, 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 황반 변성, CNV, 당뇨 망막병증 또는 증식성 유리체망막병증 치료용의 공지된 요법 및/또는 화합물과 함께 조합되어 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 예로는 베바시주맙(AVASTIN®), 라니비주맙(LUCENTIS®), VEGF-트랩(VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙, 파조파닙 또는 마큐젠®을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 투여 방식 이외에도, 키메라 항엔도글린 항체는 유리체내를 통해 투여될 수 있다. 투여 방식에 대한 비제한적인 일례로는 유리체내 주사, 및 유리체내 임플란트 사용을 포함한다.

환자는 치료에 대한 개선 및 반응성에 대해 평가될 수 있다. 치료는 황반 부종 감소, CNV 면적 감소, 및 시력 증가를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 증상에 대한 측정 방법을 당업계에 공지되어 있고, 이는 추가로 하기 실시예에 기술되어 있다.

만성 염증성 질환

혈관신생 자극시 혈관이 침습할 수 있는 피부, 근육, 창자, 결합 조직, 관절, 골 등의 조직을 비롯한, 구조화된 조직으로 구성된 임의의 다양한 조직 또는 기관은 질환 증상에서 혈관신생을 지지할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 치료하고자 하는 조직은 염증성 조직이고, 억제하고자 하는 혈관신생은 염증성 조직에 신생혈관형성이 이루어지는 염증성 조직 혈관신생이다.

염증성 장 질환

혈관신생은 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease)에서 중요한 역할을 한다. IBD는 크론병 및 궤양성 대장염을 비롯한 장 및 창자 질환 또는 병증 세트를 포괄하는 상위 용어이다. 크론병은 전형적으로는 소장 및 대장 염증을 특징으로 하는 반면, 궤양성 대장염은 일반적으로 결장에 위치한다. 비정상적이거나 또는 병적 혈관신생은 크론병 및 궤양성 대장염, 둘 다에 중요하다. 상기 두 질환 모두 미세혈관 밀도 증가 및 미세혈관 기능장애를 포함하며, 이러한 혈관신생은 일시적으로 두 질환 모두에서 발견되는 조직 병리학적 성질 및 염증 주기와 관련이 있다. 엔도글린은 이러한 조직들에서 발현되며, IBD 동안 혈관신생의 조절곤란에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(문헌 [Chidlow et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 293:5-18 (2007)]).

본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 IBD를 치료하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 키메라 항엔도글린 항체는 크론병 또는 궤양성 대장염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 키메라 항엔도글린 항체는 또한 IBD, 크론병 또는 궤양성 대장염에 대한 수술 및/또는 공지된 요법과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 그러한 공지된 요법의 예로는 아미노살리실레이트(예를 들어, 메살라민), 코르티코스테로이드(예를 들어, 부데소니드, 프레드니손 등), 항생제(예를 들어, 메트로니디졸 등), 면역억제 약물(예를 들어, 아자티오프린, 6-머캅토푸린, 메토트렉세이트, 타크로리무스, 및 시클로스포린 등), 및 생물학적 약물, 예를 들어, 단백질 및 항체(예를 들어, 인플릭시맙 등)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

IBD 치료는 염증성 조직의 혈관화 감소에 의해 평가될 수 있다. 치료는 또한 IBD를 특징으로 하는 궤양성 병변의 정체, 관해, 및/또는 치유에 의해 평가될 수 있다.

당뇨 신장병증 & 신장 이식 허혈

당뇨 신장병증은 1형 및 2형 당뇨병, 둘 다의 이환 및 그로 인한 사망에 대한 주요 원인이 된다. 이는 전세계적으로 말기 신장 질환의 주요 원인이다. 당뇨 신장병증은 혈관신생전 인자의 합성 증가에 기인한 사구체 미세혈관 손상을 특징으로 한다. 이러한 혈관신생전 인자는 내피 세포 증식, 및 차후 혈관신생을 유발하며, 엔도글린은 만성 신장 질환에서 상향 조절되는 것으로 알려져 있다. 이러한 혈관신생을 통해 사구체는 파괴되고, 최종적으로 신부전에 이르게 된다.

신장 이식에서도 유사한 효과가 관찰되며, 이를 통해 이식된 기관의 허혈 및 부전이 일어난다. 엔도글린이 상향 조절되면 혈관신생이 상향 조절되고, 콩팥에는 염증이 발생하게 된다. 역으로, 엔도글린 무표지 마우스를 사용한 연구에서는 이식/허혈 후의 신장 손상은 현저하게 감소되었고, 기관의 생존은 증가된 것으로 나타났다.

본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 당뇨 신장병증, 이식 후 신부전, 및/또는 이식 후 허혈성 신장 손상을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

본원에서는 본원에 기술된 항체를 투여함으로써 당뇨 신장병증, 이식 후 신부전, 및/또는 이식 후 허혈성 신장 손상을 치료 또는 예방하는 방법을 기술한다. 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 당뇨 신장병증, 이식 후 신부전, 및/또는 이식 후 허혈성 신장 손상 치료용 의약에 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 당뇨 신장병증, 이식 후 신부전, 및/또는 이식 후 허혈성 신장 손상 치료를 위한 공지된 요법 및/또는 화합물과 함께 조합되어 사용될 수 있다.

환자는 예를 들어, 신장 기능 개선에 의해 치료법의 효능과 관련하여 평가될 수 있다.

류마티스 관절염 & 골관절염

류마티스 관절염은 과도한 혈관신생을 특징으로 하며, 이와 관련해서는 잘 이해되고 있다. 윤활액에서 발견되는 염증 및 파괴는 주변 윤활 조직에서 발견되는 혈관신생 증가와 직접적으로 관련이 있다. 다수의 혈관신생전 인자가 류마티스 관절염 환자의 이환 조직에 존재한다.

골관절염은 윤활 관절을 이환시키는 만성 장애를 초래하는 병증군이다. 혈관신생 및 염증은 질환의 병태생리에 있어 필수불가결한 과정이며, 이는 MMP 생산 자극, 및 연골내 골화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 기전을 통한 관절 손상의 원인이 된다. 추가로, 골관절염에서의 혈관신생은 추가의 신경분포를 유도하는데, 이는 각각이 계속하여 또 다른 것을 자극하는 피드백 루프로 발전하게 된다.

본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체는 류마티스 관절염 및 골관절염을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본원에서는 하나 이상의 본원에 기술된 조성물의 투여를 통해 류마티스 관절염 및 골관절염을 치료 또는 예방하는 방법을 기술한다. 본원에 기술된 인간화된 키메라 항엔도글린 항체는 또한 류마티스 관절염 및 골관절염 치료용 의약에 사용될 수 있다.

시험에서 잘 인정되는 RA 개선에 대한 복합 척도 2가지는 파울루스 기준(Paulus Criteria) 및 미국 류마티스 학회 기준(ACR: American College of Rheumatology Criteria)이다. 파울루스 기준은 하기: 압통 및 종창성 관절의 계수, 조조 강직, 질환 활성에 대한 환자의 평가, 질환 활성에 대한 의사의 평가 및 적혈구 침강 속도(ESR: erythrocyte sedimentation rate) 범위 중 4가지에서의 개선으로 정의된다. 개선 수준은 이들 변수 각각의 개선율(%)로서 설명되며, 즉, 파울루스 20 분류는 6개의 파라미터 중 4에서 20%가 개선된 반응자를 나타낸다.

류마티스 관절염은 또한 류마티스 학회 기준(ACR) 점수화를 사용하여 평가될 수 있다. 요약하면, 류마티스 관절염의 임상적 관해를 측정하는 ACR 분류 기준은 하기 인자들 중 5가지 이상이 2개월 이상 연속하여 존재하는 것에 의해 평가된다:

a. 조조 강직 < 15분;

b. 피로감 없음;

c. 관절 통증 없음;

d. 관절 압통 또는 운동통 없음;

e. 관절 또는 건초에 종창성 연조직 없음; 및

f. 여성의 경우, ESR(웨스터그렌(Westergren) 방법) < 30 mm/시간, 또는 남성의 경우, ESR(Westergren 방법) < 20 mm/시간.

배재도 존재할 수 있고, 이는 혈관염, 심장막염, 흉막염 또는 근염이 활성인 임상 소견을 포함하고, 및 류마티스 관절염에 기인한 최근의 설명이 불가능한 체중 감소 또는 열이 존재할 경우, 완전한 임상적 완전 관해라고 명시하는 것은 금지된다(문헌 [Pinals RS, et. al.: Arthritis Rheum 24:1308, 1981]). 추가로, 류마티스 관절염에서 기능 상태에 대한 ACR 분류 기준은 하기와 같은 환자 능력에 기초한 분류를 포함한다:

I류: 일상의 보통 활동(자기 관리, 직업 활동, 취미 활동)을 완전하게 수행할 수 있음;

II류: 보통의 자기 관리 및 직업 활동은 수행할 수 있지만, 취미 활동에는 제한이 있음;

III류: 보통의 자기 관리는 수행할 수 있지만, 직업 활동 및 취미 활동에는 제한이 있음;

IV류: 보통의 자기 관리, 직업 활동 및 취미 활동을 수행할 수 있는 능력에 제한이 있음.

골관절염은 또한 ACR 점수화에 의해 평가될 수 있다. 고골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준은 환자의 병력, 신체 검사 및 실험실 소견을 사용하여 평가되며: 환자는 고관절 통증, 및 하기 중 하나에 대해 평가된다:

(1) 15° 미만의 고관절에서의 내회전 및 45°mm /시간 이하의 ESR, 또는 ESR 이용이 불가능한 경우, 115°이하의 고관절 굴곡력; 또는

(2) 15° 미만의 고관절에서의 내회전, 고관절 내부와 관련된 통증, 60분 이하의 고관절 조조 강직, 및 50세 초과의 환자.

병력, 신체 검사, 실험실 소견, 및 방사선 사진 상의 소견을 사용하면, 전통의 포맷은 고관절 통증 및 하기 징후들 중 2가지이다: 20 mm/시간 미만의 ESR, 방사선 사진 상의 대퇴부 및/또는 관골구 골증식체, 또는 방사선 사진 상의 관절강 협착(상부, 축방향, 및/또는 내측). 분류 계보는 하기와 같다: (1) 방사선 사진 상의 대퇴부 및/또는 관골구 골증식체 또는 (2) 20 mm/시간 미만의 ESR 및 방사선 사진 상의 축방향 관절강 협착과 고관절 통증(문헌 [Altman, R, et al.: Arthritis Rheum 34:505, 1991]).

무릎 골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준

무릎 골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준은 하기 기준: 무릎 통증과 함께, 하기 중 3가지(3)와 관련되는 것을 사용하여 병력 및 신체를 이용함으로써 평가된다:

(1) 50세 초과인 환자;

(2) 30분 미만의 조조 강직;

(3) 활발하게 활동할 때 마찰음;

(4) 골 압통;

(5) 골 비대; 및

(6) 촉지가능한 윤활막의 열감 부재.

환자 병력, 신체 검사, 및 방사선 사진 상의 소견을 사용하여, 환자가 보이는 하기 특징들 중 하나와 관련시켜 무릎 통증을 평가할 수 있다: (1) 50세 초과인 환자; (2) 30분 미만의 조조 강직; 및 (3) 활발하게 활동할 때 마찰음 및 골증식체. 병력, 신체 검사, 실험실 소견을 사용하여, 하기 특징들 중 5가지(5)와 관련시켜 무릎 통증을 평가할 수 있다:

(1) 50세 초과인 환자;

(2) 30분 미만의 조조 강직;

(3) 활발하게 활동할 때 마찰음;

(4) 골 압통;

(5) 골 비대;

(6) 촉지가능한 윤활막의 열감 부재;

(7) 40 mm/시간 미만의 ESF;

(8) 1:40 미만의 류마티스 인자(RF: rheumatoid factor); 및

(9) 골관절염의 윤활액(SF: Synovial Fluid) 징후.

예를 들어, 문헌 [Altman, R, et al.: Arthritis Rheum 29:1039, 1986]을 참조한다.

손의 골관절염에 대한 ACR 임상 분류 기준은 하기와 같이 평가할 수 있다: 손의 통증, 동통 또는 강직과 함께, 하기들 중 3가지(3)를 통해 평가할 수 있다: (1) 하기 관절: 양손의 2번째와 3번째 사이의 원위지 골간 관절, 2번째와 3번째 사이의 근위지 골간 관절, 1번째 수근중수 관절 중 2개의 이상의 경조직 비대; (2) 원위지 골간 관절 중 2개의 이상의 경조직 비대; (3) 3개 미만의 종창성 MCP 관절; 및 (4) (1)에 열거된 관절들 중 1 이상의 변형.

병용 요법

본원에 기술된 실시양태에 따라, 본원에 기술된 조성물은 단독으로, 또는 하나 이상의 추가의 활성 또는 불활성 제제와 함께 조합되어 투여될 수 있다. 조합이 사용될 때, 키메라 엔도글린 항체 및 항VEGF 항체(그의 항원 결합 단편)는 동시 투여될 수 있거나, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

필요에 따라 화합물은 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 페메트렉스트, 테모졸로마이드, 옥살리플라틴, 엘비툭스, 벡티빅스, 소라페닙, 수니티닙, 제피티닙, 엘로티닙, 5-플루오로우라실(5-FU) 이리노테칸, 토포테칸, 류코보린, VELC ADE®, 레날리도마이드, 탈리도마이드, 젤로다, 탁소텔 및 본원에 기술된 종래의 다른 암 요법들 다수를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법과 조합되어 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "방사선"이란 예를 들어, 마이크로파, 자외선(UV), 적외선(IR), 또는 알파-, 베타- 또는 감마-방사선을 지칭한다. 방사선은 전신에 방사선 조사하지 않고 하나 이상의 종양의 부위에 방사선을 표적하는 종래 기법을 사용함으로써 "초점적으로" 또는 국소적으로 전달할 수 있다. 하기 열거하는 목록의 치료학적 요법들이 종래 요법을 나타내기는 하지만, 본 발명은 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 다른 공지의 치료학적 요법도 포함한다는 것을 이해할 것이다.

한 실시양태에서, 암은 난소암이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 화학요법(예를 들어, 독소루비신, 독실, 젬시타빈, 루비테칸, 및 백금 기반 화학치료학제, 예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴), 멜파란, 토포이소머라제 I 억제제, 예를 들어, 토포테칸 및 이리노테칸, 탁산 기반 요법, 호르몬, 방사선 요법, 전신 체온 저하, 이소플로본 유도체, 예를 들어, 페녹소디알, 세포독성 마크로라이드, 예를 들어, 에포틸론, 혈관신생 억제제, 예를 들어, 베바시주맙, 신호 전달 억제제, 예를 들어, 트라스투주맙, 유전자 요법, RNAi 요법, 면역요법, 모노클로날 항체, 포스파티딜이노시톨 유사 키나제 억제제, 예를 들어, 라파마이신, 또는 그의 임의 조합이다. 본원에 기술된 항체를 난소암 요법과 함께 조합하여 사용하는 병용 요법들은 또한 상기 요법의 공투여로부터 얻게 되는 시너지 효과에 기인하여 어느 한 요법, 또는 그 둘 다의 요법의 용량을 감소시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 암은 신장/콩팥암이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 화학요법, 파조파닙, 인터페론-알파 또는 IL-2이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 추가의 제제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제에 대한 비제한적인 일례로는 상기 기술된 것, 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트 (VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXA VAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 본원에 기술된 항체를 콩팥암 요법과 함께 조합하여 사용하는 병용 요법들은 또한 상기 요법의 공투여로부터 얻게 되는 시너지 효과에 기인하여 어느 한 요법, 또는 그 둘 다의 요법의 용량을 감소시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 암은 골수종이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 방사선요법, 벨케이드(VELCADE)®, 레날리도마이드, 또는 탈리도마이드이다. 한 실시양태에서, 추가의 제제는 벨케이드®이다. 이들 요법에 대한 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 병용 요법에 따라 조절될 수 있다.

한 실시양태에서, 암은 전립선암이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 방사선요법(예를 들어, 외부 빔 또는 근접치료), 호르몬 방해(아비라테론 사용을 포함한 안드로겐 억제), 열 쇼크 단백질 90(HSP90: heat shock protein 90) 억제제, 화학요법(예를 들어, 도세탁셀, 백금 기반 화학요법 예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴, 사트라플라틴 및 옥살리플라틴, 탁산, 에스트라무스틴), 프레드니손 또는 프레드니솔론, 콜레스테롤 강하 약물, 예를 들어, 스타틴, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH: leutinizing hormone-releasing hormone) 효현제, RNAi 요법, 수지 세포 기반 요법, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage-colony stimulating factor)를 분비할 수 있도록 유전적으로 변형된 전체 종양 세포(GVAX로도 공지됨), 또는 그의 임의 조합이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 추가의 제제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제에 대한 비제한적인 일례로는 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트 (VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다.

한 실시양태에서, 암은 폐암이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 방사선요법(예를 들어, 흉부 방사선요법, 하전 입자를 사용하는 방사선 요법, 우라실-테가푸르 및 백금 기반 화학요법(예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴 등) 및 비노렐빈, 엘로티닙(TARCEVA®), 제피티닙 (IRESSA®), 항표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 세툭시맙), 티로신 키나제의 소형 분자 억제제, 폐암 세포 증식에 관여하는 단백질에 대한 직접적인 억제제, 오로라 키나제 억제제, 레이저로 유도된 열요법, RNAi 요법, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 분비할 수 있도록 유전적으로 변형된 전체 종양 세포, 또는 그의 임의 조합이다. 추가의 치료학적 치료법은 탁솔 또는 페메트렉스트를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 추가의 제제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제에 대한 비제한적인 일례로는 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트(VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 이들 요법에 대한 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 병용 요법에 따라 조절될 수 있다.

한 실시양태에서, 암은 유방암이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 모노클로날 항체(예를 들어, Her-2 항체, 허셉틴), 애주번트 화학요법, 예를 들어, 단일 제제 화학요법 또는 병용 화학요법(예를 들어, 안트라시클린- 및 탁산 기반 다중화학요법, 탁솔, 또는 PMRT를 포함하거나 포함하지 않고, 내분비 조작포함하거나 포함하지 않는 표적 특이 트라스투주맙, 비노렐빈), 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 젤로다, 탁소텔, 선택성 에스트로겐 수용체 조절제, 예를 들어, 타목시펜 및 랄록시펜, 알로스테릭 에스트로겐 수용체 조절제, 예를 들어, 트릴로스탄, 방사선(예를 들어, 조직내 근접치료, Mammosite 장치, 3차원 입체조형 외부 방사선 및 수술중 방사선요법), 전신 합성을 억제하는 아로마타제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 엑세메스탄 및 레트로졸), RNAi 요법, 정맥내 사용을 위한 면역억제성 및 항증식성인 라파마이신의 유사체, 예를 들어, 템시로리무스(CCI779), 또는 그의 임의 조합이다. 유방암의 3차원 시험관내 조직 배양물 모델을 수행하는 방법에 관한 리뷰는 문헌 [Kim et al., Breast Cancer Research Treatment 85(3): 281-91 (2004)]에 기술되어 있다. 암을 테스트하는 다른 생체내 및 시험관내 모델도 공지되어 있으며, 이를 사용하여 본원에 기술된 항체를 테스트할 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 추가의 제제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제에 대한 비제한적인 일례로는 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트(VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 이들 요법에 대한 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 병용 요법에 따라 조절될 수 있다.

한 실시양태에서, 암은 결장암이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 방사선 요법, 및 화학요법(예를 들어, 5-플루오로우라실 (5-FU), 레바미졸, 류코보린 또는 세무스틴(메틸 CCNU)), N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크리딘-4-카르복스아미드 및 관련된 다른 카르복스아미드 항암 약물; 비토포이소머라제 II 억제제, 이리노테칸, 리포좀 토포테칸, 탁산 부류의 항암제(예를 들어, 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 크산테논 아세트산 부류의 화합물(예를 들어, 5,6-디메틸안테논-4-아세트산 PMAA), 라미나린, 부위 선택성 시클릭 AMP 유사체(예를 들어, 8-클로로아데노신 3',5'-시클릭 포스페이트), Cox-2의 피라노인돌 억제제, Cox-2의 카르보졸 억제제2, Cox-2의 테트라히드로카르보졸 억제제, Cox-2의 인덴 억제제, NSAIDS의 국소화된 억제제(예를 들어, 안트라닐산, 아스피린(5-아세틸살리실산), 아조디살리실산 나트륨, 카르보헤테로시클릭산, 카르프로펜, 클로람부실, 디클로페낙, 펜부펜, 펜클로페낙, 페노프로펜, 플루페남산, 플루르비프로펜, 플루프로펜, 푸로세미드, 금 티오말산 나트륨, 이부프로펜, 인도메타신, 인도프로펜, 케토프로펜, 로나졸락, 록소프로펜, 메클로페남산, 멜파남산, 멜파란, 나프록센, 페니실라민, 페닐아세트산, 프로프리온산, 살리실산, 살라조술파피리딘, 술린닥, 톨메틴, 피라졸론 부타존 프로파존 NSAID, 멜록시캄, 옥시캄, 피록시캄, 펠덴, 피록시캄 베타 시클로덱스트란, 네톡시캄, 에토돌락, 및 옥사프로진), HER-2/neu의 억제제, RNAi 요법, GM-CSF, 모노클로날 항체(예를 들어, 항Her-2/neu 항체, 항CEA 항체, A33(HB 8779), 100-210(HB 11764) 및 100-310(HB 11028)), 엘비툭스, 벡티빅스, 호르몬 요법, 피리미딘아민, 캄토테신 유도체(예를 들어, CPT-11), 폴리산(FA: folinic acid), 젬시타빈, Ara-C, 백금 기반 화학치료학제, 예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴, cGMP 특이 포스포디에스터라제 억제제, 또는 그의 임의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 추가의 치료학적 치료법은 5-FU, 류코보린 및 옥살리플라틴(FOLFOX)의 병용법이다. 한 실시양태에서, 추가의 치료학적 치료법은 5-FU, 이리노테칸 및 류코보린(IFL)의 병용법이다. 한 실시양태에서, 추가의 제제는 엘비툭스이다. 한 실시양태에서, 추가의 제제는 벡티빅스이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 추가의 제제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제에 대한 비제한적인 일례로는 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트(VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다. 이들 요법에 대한 투여량은 당업계에 공지되어 있고, 병용 요법에 따라 조절될 수 있다.

한 실시양태에서, 암은 췌장암이고, 하나 이상의 추가의 치료학적 치료법은 수술, 방사선 요법(RT), 플루오로우라실(5-FU) 및 RT, 전신 요법, 스텐팅, 젬시타빈(GEMZAR®), 젬시타빈 및 RT, 세툭시맙, 엘로티닙(TARCEVA®), 화학방사선, 또는 그의 임의 조합의 치료학적 치료법의 병용법이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 추가의 제제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제에 대한 비제한적인 일례로는 라니비주맙(LUCENTIS®), 아프리버셉트(VEGF-Trap), 수니티닙(SUTENT®), 소라페닙(NEXAVAR®), 악시티닙, 페갑타닙 및 파조파닙을 포함한다.

환자는 치료 요법 이전, 그동안, 및 그 이후를 비롯한, 하나 이상의 다중 시점에서의 증상과 관련하여 평가될 수 있다. 치료를 통해 피험체의 증상은 개선될 수 있으며, 하기 인자: 종양 크기 감소, 세포 증식 감소, 세포수 감소, 신생혈관형성 감소, 아폽토시스 증가, 또는 세포 증식성 질병을 포함하는 세포 중 적어도 일부의 생존 감소 중 하나 이상이 발생하였는지 여부를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 중 하나 이상이 발생되었다면, 암은 부분적 또는 전체적으로 제거될 수 있고, 환자의 생존 기간은 연장될 수 있다. 별법으로, 말기 암의 경우, 치료를 위해 질환은 정체될 수 있고/있거나, 삶의 질은 개선될 수 있고/있거나, 생존 기간은 연장될 수 있다.

기능에 관한 분석

본원에 기술된 조성물은 다양한 시험관내, 생체내 및 생체외 분석법으로 평가될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 분석법을 사용하여 상기 효과들을 모니터링할 수 있다. 수개의 상기 기법들이 본원에 기술되어 있다.

CD105 신호전달 및 기능에 관한 분석

CD105(엔도글린)는 증식성 내피 세포에 의해 발현되는 TGF-β 수용체 패밀리의 구성원이다. 내피 세포 증식을 위해서는 정상 수준의 CD105가 필요하다. CD105는 고형 종양의 혈관신생 혈관구조에서 강하게 발현되며, 혈관신생/혈관 발생에 관여하고, 보조 형질전환 성장 인자 β(TGF-β) 수용체이다. CD105는 백혈병 세포 및 내피 세포 상에서 발현되는 동종이량체성 세포막 당단백질이다. 그의 세포질 테일의 아미노산 서열이 상이한 CD105의 2가지 이소형, L-엔도글린(170 kDa) 및 S-엔도글린(160 kDa)의 특징이 규명된 바 있다.

CD105 발현은 저산소증 유도 인자-1-α(HIF-1-α)의 생산을 통해 세포 저산소증에 의해 증가되며, 아폽토시스로부터 저산소 세포를 보호한다. CD105는 TGF-β 수용체(TGF-βR), 액티빈 수용체 유사 키나제(ALK) 및 액티빈 수용체를 포함하는, TGF-β 슈퍼패밀리의 다중 키나제 수용체 복합체의 신호전달을 조정하는 역할을 한다. CD105의 부재하에서 TGF-β 수용체가 활성화되면, 내피 세포 성장을 억제하는 SMAD 단백질이 인산화된다. 그러나, TGF-β에 의한 CD105의 활성화는 SMAD 단백질 인산화를 조정한다. 최종 결과는 TGF-β 수용체 활성화가 내피 세포에 대하여 성장 억제성 효과를 발휘한다는 것이다.

항CD105 항체에 의해 CD105 활성화를 방해하는 것이 내피 세포 성장을 억제시킴에 있어 TGF-β와 함께 시너지적으로 작용한다. TGF-β는 내피 세포에서 반대되는 효과를 발휘하며 2가지 다른 I형 수용체/SMAD 신호전달 경로를 자극할 수 있다. TGF-β/ALK5 신호전달 경로(A)는 세포 증식 및 이동을 억제하는 반면, TGF-β/ALK1 경로(B)는 내피 세포 증식 및 이동을 유도한다. 혈관신생 동안 고도로 발현되는, 보조 TGF-β 수용체인 CD105는 ALK5 신호전달에 필수적이다. CD105의 부재하에서는 TGF-β/ALK5 신호전달이 우세하게 일어나며, 휴지기 내피를 유지시킨다. 고도한 CD105 발현은 ALK1 경로를 자극하고, ALK5 신호전달을 간접적으로 억제시켜 혈관신생의 활성화 상태를 촉진시킨다.

하나의 비제한적인 실시양태에서, 키메라 항체는 혈관신생 및 내피 세포 증식을 억제하는 것과 관련하여 평가될 수 있다. 키메라 항엔도글린 항체의 HUVEC에의 결합은 TGF-β의 HUVEC에의 추후 결합을 방해하지 않는다. 따라서, 항엔도글린 항체에 의해 내피 세포 성장을 직접 억제하는 것이, 생체내에서 항혈관신생 및 종양 억제 효과가 관찰되어지는 기본 기전 중 하나를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 항체는 Smad 1/5/8 인산화 및/또는 신호전달을 방해함으로써 혈관신생을 차단하는 것과 관련하여 평가될 수 있다. CD105는 TGF-β/ALK1의 신호전달을 통해 혈관신생을 촉진시키는 데 참여하고, 결국에는 Smad 2/3 단백질의 인산화 감소 및/또는 차단을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 키메라 항체는 Smad 2/3 인산화 및/또는 신호전달을 증진시킴으로써 혈관신생을 차단하는 것과 관련하여 평가될 수 있다.

TGF-β/ALK1 신호전달 경로 및/또는 Smad 1/5의 인산화에 대해 미치는 본원에서 제공하는 키메라 항체의 차단 또는 억제성 효과를 분석하는 방법 및 기법으로는 공지된 분자 기법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에서 단백질 중 임의의 것에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 사용하여 TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 본원에 기술된 키메라 항엔도글린 항체의 억제성 및/또는 자극성 효과를 측정할 수 있다. 유사하게, TGF-β/ALK5 or TGF-β/ALK1 경로에 관여하는 단백질에 대한 mRNA의 검출 또는 mRNA의 조절을 사용하여 본원에 개시된 키메라 항체의 억제성 및/또는 자극성 효과를 분석할 수 있다. TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 세포 신호전달을 분석하는 추가의 분석 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 고려된다.

본원에 개시된 키메라 항엔도글린 항체의 활성은 당업계에서 인증된 분석법, 예를 들어, 예를 들어, 결합 분석법, 예를 들어, ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라스몬 공명에 의해 평가될 수 있고, 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 HUVEC 세포에 대한 효과도 평가될 수 있다.

VEGF 신호전달 및 기능에 관한 분석

VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2(KDR/Flk-1)에의 결합을 특이적으로 억제하는 항체는 경쟁 및/또는 기능적 분석법을 사용하여 평가할 수 있다. 그러한 분석법으로는 ELISA 기반의 경쟁 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 경쟁 분석법에서, VEGF를 다양한 양의 테스트 항체(예를 들어, 100배 내지 1,000배 몰 과량의 것)를 미리 혼합하거나 또는 혼합하고, 테스트 항체가 VEGF의 VEGFR2에의 결합을 감소시킬 수 있는 능력에 대해 평가한다. VEGF를 미리 표지하고 직접 검출할 수 있거나, (2차) 항VEGF 항체 또는 2차 및 3차 항체 검출 시스템을 사용하여 검출할 수 있다. 상기 경쟁 분석법의 ELISA 포맷이 그러한 포맷인데, 임의의 유형의 면역경쟁분석법도 수행될 수 있다.

상기 경쟁 분석법에서 완전하게 관련이 없는 항체(비차단 항VEGF 모노클로날 항체) 존재하에서의 VEGF의 VEGFR2에의 결합은 대조값이 높다(100%). 테스트 분석법에서, 테스트 항체 존재하에서의 VEGF의 VEGFR2에의 결합이 유의적으로 감소하였다면, 이는 항체가 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2(KDR/Flk-1)에의 결합을 유의적으로 억제시켰음을 나타내는 것이다.

항체가 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2(KDR/Flk-1)에의 결합을 억제한다는 것을 찾아내고/내거나 확인할 수 있는 또 다른 결합 분석법은 공침전 분석법이다. 공침전 분석법은 VEGF가 용액 중의 하나 이상의 수용체에 결합하는 것을 차단할 수 있는 항체의 능력에 대해 테스트한다. 상기 분석법에서, VEGF 또는 검출가능하게 표지된 VEGF를 적합한 형태의 수용체와 함께 인큐베이션시킨다.

면역침전 또는 공침전 분석법을 수행하는 데는 많은 포맷이 존재하다. 본 경우에서, "적합한 형태의 수용체"는 VEGFR2 수용체 또는 상기 수용체의 세포외 도메인일 수 있다. 이어 면역침전은 표준 시약뿐만 아니라, VEGFR2 수용체 또는 VEGF가 결합하는 부위로부터 떨어져 있는 상기 수용체의 세포외 도메인 상의 에피토프에 대한 항체의 존재를 필요로 한다.

적합한 수용체와 상관없이, 면역침전 또는 공침전 분석법은 대조군과 함께 수행된다. VEGF가 단독으로 선택된 수용체에 결합할 수 있는 능력은 항VEGF 항체의 부재하에서의 침전에 의해 확인할 수 있다. 대조군으로서 작용하는, 공지의 결합 특성을 가진 항체의 존재 또는 부재하에서 동시에 병행 인큐베이션을 수행할 수 있다. 차단 대조군 및 비차단 대조군 항체, 둘 다를 사용하는 분석법이 동시에 병행하여 수행될 수 있다.

이어서, 예를 들어, 효과적인 면역침전 조성물, 예를 들어, 단백질 A 조성물 또는 단백질 A 세파로스 비드와 함께 인큐베이션시켜 임의의 결합된 면역학적 종을 면역침전시킨다. 이어서, VEGF 존재에 대해 침전물을 테스트한다. 초기 인큐베이션시의 VEGF가 검출가능하게 표지된 VEGF, 예를 들어, 방사성표지된 VEGF인 경우, 면역침전물 중 임의의 VEGF는 직접적으로 검출될 수 있다. 면역침전물 중 임의의 비표지형 VEGF는 다른 적합한 수단, 예를 들어, 겔 분리 및 항VEGF 항체를 사용한 면역검출에 의해 검출될 수 있다.

상기 공침전 분석법에서 VEGF가 VEGF 수용체에 결합하는 것을 차단할 수 있는 항체의 능력은, 비록 정질적 결과 또한 가치가 있지만, 쉽게 정량화될 수 있다. 표지된 VEGF의 직접 측정에 의해, 또는 예를 들어, 면역검출된 VEGF의 밀도측정 분석에 의해 정량화될 수 있다. 따라서, VEGF의 VEGFR2에의 결합을 억제할 수 있는 능력을 재현가능하게 보여주는, 즉, 그러한 능력이 일관되게 관찰되는 항체를 검출할 수 있고, 유용한 항체를 상기 개요한 정량적 기준에 따라 선택할 수 있다.

상기 기술된 공침전 분석법을 수행하나, 단, VEGFR2 대신 VEGFR1을 사용함으로써 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR1(FIt-1)에의 결합을 유의적으로 억제시키지 못하는 항VEGF 항체 또한 쉽게 확인할 수 있다. 따라서, EGF의 VEGF 수용체 VEGFR1(FIt-1)에의 결합은 유의적으로 억제시키지 않으면서, VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2 (KDR/Flk-1)에의 결합은 억제하는 항VEGF 항체 또한 상기 방법을 사용함으로써 쉽게 확인할 수 있다.

항체가 VEGF의 VEGF 수용체 VEGFR2(KDR/Flk-1)에의 결합을 유의적으로 억제하는지를 찾아내고/내거나 확인할 수 있는 기능적 분석법 또한 사용될 수 있다. 이는 일반적으로는 특정의 정의된 생물학적 반응을 담당하는 수용체로서 VEGFR2를 확인하는 것과 관련이 있다. 무세포 시스템에서 수행되고, 재현가능성, 신뢰성, 노동 절약성 및 비용 효과면에서 가장 우수한 상기 경쟁형 분석법보다는 전형적으로 덜 사용되기는 하지만, 그럼에도 불구하고 하기 분석법이 유용하다.

예를 들어, VEGFR2 차단 항VEGF 항체는 (VEGF의 분열촉진 활성을 억제하는) VEGF 매개성 내피 세포 성장을 억제할 수 있는 능력에 대해 테스트함으로써 확인될할 수 있다. 테스트 항체를 포함하거나 포함하지 않은 채, VEGF의 존재하에서 다양한 내피 세포 중 임의의 것을 사용하는 임의의 적합한 분석법이 사용될 수 있다. 예를 들어, VEGF를 포함하지 않는 것, 및 정의된 특성을 가진 대조군 항체를 포함하는 것(차단 및 비차단 둘 다)인 이중 분석법을 동시에 병행하여 수행할 수 있다. 비색 분석을 비롯한, 세포 개수를 측정하는 임의의 허용되는 수단에 의해 내피 세포 성장을 측정하고, 정확하게 정량화할 수 있다.

VEGF 매개성 내피 세포 성장을 억제할 수 있는 능력을 가진 항체는 일반적으로 VEGF 매개성 내피 세포 성장을 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 등으로 일관되게 억제한다는 것을 관찰할 수 있을 것이다. 그러한 범위의 억제는 항체가 생체내에서 혈관신생을 억제하는 데 충분한 특성을 가기고 있음을 시사한다. 보다 유의적인 억제 활성을 가진 항체를 본 발명으로부터 배제시키지 않는다.

항체를 확인하는 추가의 기능적 분석법으로는 VEGF 유도성 인산화 차단에 대해 테스트하는 분석법을 포함한다. 임의의 적합한 분석법은 임의 형태의 천연 또는 재조합 인산화가 가능한 VEGFR2를 발현시키는 다양한 내피 세포 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 적절한 기간 동안 테스트하고자 하는 항체의 존재 또는 부재하에서 세포를 VEGF와 함께 인큐베이션시킨다. 예를 들어, VEGF를 포함하지 않는 것, 및 정의된 특성을 가진 대조군 항체를 포함하는 것(차단 및 비차단 둘 다)인 이중 분석법을 동시에 병행하여 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 VEGFR2 차단 항VEGF 항체를 확인하는 추가의 다른 기능적 분석법은 VEGF 유도성 혈관 투과성의 억제에 대해 테스트하는 분석법이다. 비록 임의의 분석법이 사용될 수도 있지만, 적합한 분석법은, 동물, 예를 들어, 기니아 피그에 염료, 예를 들어, 에반스 블루(Evan's blue) 염료로 염색하고, 테스트 항체의 존재 또는 부재하에 VEGF를 제공한 후, 동물 피부 중의 염료 출현을 측정하는 마일즈(Miles) 투과성 분석법이다. 예를 들어, VEGF를 포함하지 않는 것, 및 정의된 특성을 가진 대조군 항체를 포함하는 것(차단 및 비차단 둘 다)인 이중 연구를 동시에 병행하여 수행할 수 있다. 동물 피부 중의 염료 출현은 동물의 등쪽에 반점, 예를 들어, 청색 반점으로 보여지는 것이며, 이를 사진촬영하고 측정할 수 있다.

SCID /누드 마우스

종양 성장을 분석하는 한가지 방법은 하기와 같이 SCID 마우스를 이용하는 것이다: 서브융합된 인간 M21 흑색종 세포를 수거하고, 세척하고, 멸균 PBS 중에 재현탁시킨다(20 x 10⁶개의 세포/mL). SCID 마우스에 100 ㎕의 M21 인간 흑색종 세포(2 x 10⁶개) 현탁액을 피하로 주사한다. 종양 세포 주사 후 3일째, 마우스를 처리하지 않거나, 또는 하나 이상의 대조군 또는 테스트 조성물을 정맥내 또는 복강내로 투여하여(예를 들어, 100 ㎍/마우스) 처리한다. 마우스를 24일 동안 매일 처리한다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정하고, 부피는 하기 공식: V = (L x W²)/2(여기서, V=부피, L=길이, 및 W=너비)을 사용하여 예측한다.

종양 성장을 분석하는 한가지 방법은 하기와 같이 누드 마우스를 이용한다: 50 ㎕ PBS 중 MDA-MB-435 종양 세포(0.4 x 10⁶개의 세포/마우스)를 암컷 누드 마우스(5 내지 6주령)의 유방 지방 패드 동소에 삽입한다. 종양의 평균 부피가 대략 50-80 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 임의 추출하고(1군당 10마리 이상), 주 2회씩 1회 투약당 1 ㎍(0.05 mg/kg), 10 ㎍(0.5 mg/kg), 100 ㎍(5 mg/kg) 또는 200 ㎍(10 mg/kg)으로 하나 이상의 항체를, 또는 100 ㎕ PBS 중 100 ㎍의 대조군 항체를, 또는 100 ㎕의 비히클 PBS를 정맥내 또는 복강내로 투여하는 처리를 개시한다; 일부 연구에서는 비처리군 또한 평가할 수 있다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정하고, 부피는 하기 공식: V = (L x W²)/2(여기서, V=부피, L=길이, 및 W=너비)을 사용하여 예측한다.

BALB /c 동계 마우스 모델

별법으로, 예를 들어, 문헌 [Tsujie et al., Int. J. Oncology, 29: 1087-1094 (2006)]에 예시된 바와 같이, 본원에 기술된 항체에 의해 종양 성장 및 그의 억제를 평가하는 데 BALB/c 동계 마우스 모델 또한 사용될 수 있다.

키메라 마우스

또 다른 분석법은 키메라 마우스:인간 마우스 모델에서 혈관신생을 측정하며, 이는 키메라 마우스 분석법이라 지칭된다. 본 분석법은 다른 문헌에도 상세히 설명되어 있으며, 추가로 본원에서는 혈관신생, 신생혈관형성, 및 종양 조직 퇴행을 측정하는 것으로 기술된다. 문헌 [Yan, et al,. (1993) J. Clin. Invest. 91:986-996]을 참조한다.

이식된 피부 이식편이 정상적인 인간 피부가 조직학적으로 매우 유사하고, 실제 인간 혈관이 이식된 인간 피부로부터 이식된 인간 피부 표면 상의 인간 종양 조직으로 성장하는 전체 조직의 신생혈관형성이 발생하는 바, 키메라 마우스 분석법은 생체내 혈관신생에 대해 유용한 분석 모델이다. 인간 이식편으로의 신생혈관형성의 기원은 신생혈관형성구조를 인간 특이 내피 세포 마커로 면역조직화학적 방법에 의해 염색함으로써 입증할 수 있다.

키메라 마우스 분석법은 새로운 혈관 성장 퇴행의 양 및 정도, 둘 다에 기초하여 신생혈관형성 퇴행을 입증한다. 추가로, 이식된 피부 상에 이식된 임의의 조직, 예를 들어 종양 조직의 성장에 대해 미치는 효과를 쉽게 모니터링할 수 있다. 최종적으로, 본 분석법은 분석 시스템에 독성에 대한 내부 제어가 이루어지는 바, 유용하다. 키메라 마우스를 임의의 테스트 시약에 노출시키고, 따라서, 마우스의 건강 상태는 독성이 지표가 된다. 본원에 기술되고, 당업계에 공지된 다른 동물 모델들 또한 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다.

토끼 눈 분석법

혈관신생을 측정하는 또 다른 측정법은 토끼 눈 모델을 생체내에서 측정하는 것이며, 이는 토끼 눈 분석법이라 지칭된다. 토끼 눈 분석법은 다른 문헌에도 상세히 설명되어 있으며, 문헌 [D'Amato et al,. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(9): 4082-4085]에 예시되어 있는 바와 같이, 혈관신생 억제제의 존재하에서 혈관신생 및 신생혈관형성, 둘 다를 측정하는 데 사용되어 왔다.

각막 가장자리 둘레로부터 각막으로 성장하는 토끼 혈관에 의해 예시되는 신생혈관형성 과정을 천연적으로 투명한 눈의 각막을 통해 쉽게 시각화할 수 있는 바, 토끼 눈 분석법은 인정받은 생체내 혈관신생에 대한 분석 모델이다. 추가로, 신생혈관형성의 자극 또는 억제 또는 신생혈관형성의 퇴행의 정도 및 양, 둘 다를 시간 경과에 따라 쉽게 모니터링할 수 있다.

최종적으로, 토끼를 임의의 테스트 시약에 노출시키고, 따라서, 토끼의 건강 상태는 테스트 시약의 독성이 지표가 된다.

요약하면, 닭 융모요막(CAM: chorioallantoic membrane) 분석법을 수행하고, 하나 이상의 대조군 또는 테스트 화합물을 함유하는 0.5% 카르복시메틸셀룰로스 펠릿을 이식한 후 48시간째 혈관구조 발생에 미치는 효과를 기록한다. 수크랄페이트(수크로스 황산알루미늄; Bukh Meditec: 코펜하겐)에 결합된, 강력한 효능이 있는 혈관신생 단백질인 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF: basic fibroblast growth factor) 650 ng을 함유하는 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트)(히드론; Interferon Sciences: 미국 뉴저지주 뉴브런즈윅 소재)의 펠릿 삽입에 의해 각막 신생혈관형성이 유도된다. 수크랄페이트를 펠릿에 첨가하면 bFGF는 분해로부터 보호되며, 이는 서방성으로 방출되어, bFGF/히드론(Hydron) 단독으로 유도된 것보다 더욱 현저하게 일관된 공격적인 혈관신생을 일으킨다. 히드론만을 단독으로 포함하는 펠릿의 경우 단지 1일인 것에 반하여, 수크랄페이트/히드론을 함유하는 펠릿으로부터의 bFGF 방출은 펠릿이 형성된 후 최대 4일까지 시험관내에서 검출될 수 있다. 12 ㎍의 재조합 bFGF(Takeda: 오사카 소재)를 함유하는 110 ㎕의 염수를 40 mg의 수크랄페이트와 혼합하고; 상기 현탁액을 에탄올 중 80 ㎕의 12%(wt/vol) 히드론에 첨가하여 펠릿을 제조할 수 있다. 이어서, 분액(10 ㎕)의 상기 혼합물을 테프론(Teflon) 꽂이 상에서 피펫팅하고, 건조시켜 대략 17개의 펠릿을 제조하였다.

마취된 암컷 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 토끼의 각 눈의, 각막 가장자리 둘레로부터 2 mm 떨어진 지점인 각막내 미세낭(micropocket)에 펠릿을 삽입한 후, 각막 표면 상에 에리트로마이신 연고를 1회 국소 적용시켰다. 연일 조직학적 검사를 수행함으로써 펠릿을 향해 각막으로 혈관 성장이 진행되고 있음을 입증하였는데, 이는 오직 염증성 세포에서는 드물게 관찰된다. 이러한 혈관신생 반응은 전신 방사선조사를 사용한 가혹한 면역 억제에 의해서는 변경되지 않으며, 수크랄페이트만을 단독으로 포함하는 펠릿을 혈관신생을 유도하지 못한다. 새로운 혈관은 염증보다는 bFGF에 의해 주로 유도된다. 위 세척에 의해 삽입 후 2일째부터 매일 0.5% 카르복시메틸셀룰로스 중에 현탁된 하나 이상의 화합물, 또는 비히클을 단독으로 동물에게 제공한다. 펠릿 삽입 직전에 6분 동안 면역이 저하된 동물에게 6 Gy 방사선을 전신에 조사한다. 방사선 조사에 의해 백혈구감소증이 현저하게 감소되며, 2일째까지 백혈구 계수는 >80% 감소하였고, 3일째까지는 90% 감소하였는데, 이는 이전 보고와 일치하는 결과이다.

동일의 각막 전문가(M. S. L.)에 의해 차폐된 방식으로 이틀마다 세극등을 사용하여 동물을 검사한다. 레티큘을 사용하여 가장장리 둘레로부터의 혈관 길이(L) 및 포함된 가장장리 둘레의 60분 단위의 시간수(C)를 측정함으로써 각막 신생혈관형성 면적을 측정한다. 하기 공식을 사용하여 환형 대역 세그먼트의 면적을 측정한다: C/12 x 3.1416 [r² - (r - L)²](여기서, r = 6 mm (토끼 각막 반경 측정치)). 펠릿에 인접한 균일의 인접 대역을 측정하고, 이를 통해 신생혈관형성의 전체적인 억제를 평가할 수 있다.

마우스 마트리겔 플러그 혈관신생 분석법

조성물이 혈관신생에 미치는 효과를 확인하기 위해 마우스 마트리겔 플러그 혈관신생 분석법을 사용할 수 있다. (문헌 ([Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97:1648-1652]; [Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141]))에 앞서 기술된 바와 같이, 각종 성장 인자(예를 들어, IGF-1, bFGF 또는 VEGF)(250 ng) 및 헤파린(0.0025 유닛/mL)을 성장 인자가 감소된 마트리겔과 혼합한다. 상기 동물로 구성된 하나 이상의 투여군을 사용하여 본원에 기술된 조성물 또는 대조군 항체를 마트리겔 제제에 포함시킬 수 있다. 대조군 실험에서는 성장 인자의 부재하에서 마트리겔을 제조한다. 0.5 mL의 마트리겔 제제를 마우스에 피하로 주사하고, 1주일 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 기간이 경과한 후, 마우스를 희생시키고, 중합화된 마트리겔 플러그를 수술을 통해 제거한다. 면역조직화학적 분석법 및 헤모글로빈 함량법을 포함하는 2가지 확립된 방법에 의해 마트리겔 플러그내의 혈관신생을 정량화한다(문헌 ([Furstenberger, et al., Lancet. 2002, 3:298-302]; [Volpert, et al., Cancel Cell 2002, 2(6):473-83]; 및 [Su, et al., Cancel Res. 2003, 63:3585-3592])). 면역조직화학적 분석법의 경우, 마트리겔 플러그를 OCT에 포매시키고, 급속 냉동시키고, 4 ㎛ 절편으로 제조한다. 냉동 절편을 메탄올/아세톤(1:1)에서 고정시킨다. 냉동 절편을, CD31에 대한 폴리클로날 항체로 염색한다. 20개의 고성능(200X) 현미경적 시야 범위내의 미세혈관 밀도 계수에 의해 혈관신생을 정량화한다.

헤모글로빈 함량은 문헌 ([Schnaper, et al., J. Cell Physiol. 1993, 256:235-246]; [Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97: 1648-1652]; [Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141]; 및 [Gigli, et al., J. Immunol. 1986, 100: 1154-1164])에 기술된 바와 같이 정량화할 수 있다. 마트리겔 임플란트를 드라이아이스 상에서 급속 냉동시키고, 밤새도록 동결건조시킨다. 건조된 임플란트를 1시간 동안 0.4 mL의 1.0% 사포닌(Calbiochem) 중에 재현탁시키고, 왕성하게 피펫팅하여 파괴시킨다. 제제를 15분 동안 14,000 X g로 원심분리하여 임의의 미립자를 제거한다. 이어서, 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 상등액 중 헤모글로빈의 농도를 직접 측정하고 정제된 헤모글로빈의 표준 농도와 비교한다.

세포 이동 분석 방법

세포 이동 분석법은 문헌, 예를 들어, [Brooks, et al., J. Clin. Invest 1997, 99:1390-1398]에 기술되어 있고, 세포 이동을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 본원에 기술된 세포 이동을 측정하는 한 방법에서, 트랜스웰 이동 챔버로부터의 막을 기질(여기서는 엔도글린 및/또는 VEGF)로 코팅하고, 트랜스웰을 세척하고, 비특이 결합부는 BSA로 차단한다. 서브융합된 배양물로부터 종양 세포를 수거하고, 세척하고, 분석 항체의 존재 또는 부재하에서 이동 완충액 중에 재현탁시킨다. 종양 세포가 코팅된 트랜스웰 막의 아래쪽으로 이동할 수 있게 한 후, 막의 위쪽에 남아있는 세포를 제거하고, 아래쪽으로 이동한 세포는 크리스탈 바이올렛으로 염색한다. 이어서, 한 현미경적 시야당 직접 세포를 계수하여 세포 이동을 정량화한다.

세포 증식 분석 방법

세포 증식은 당업자에게 공지된 방법에 의해 분석할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 서브융합된 인간 내피 세포(HUVEC: human endothelial cell)를 ECV 또는 ECVL 세포로부터의 CM(25 ㎕)의 존재 또는 부재하에서 저용량(5.0%)의 혈청을 함유하는 증식 완충액 중에 재현탁시키고, 내피 세포가 24시간 동안 증식할 수 있도록 할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 WST-1 분석용 키트(Chemicon)를 사용하여 미토콘드리아 데히드로게나제 활성을 측정함으로써 증식을 정량화할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이, 표준 방법을 사용하여 ³H 혼입을 측정함으로써 증식을 정량화할 수 있다(문헌 [She et al., Int. J. Cancel, 108: 251-257 (2004)]).

세포 증식을 평가하는 다른 방법도 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 고려된다. 추가로, 비제한적인 일례는 실시예에서 보다 상세히 기술한다.

CDC , ADCC 및 옵소닌화 유도 방법

형질전환된 세포에 대한 신체의 자연적 면역 반응을 증가시키기 위해 각종 요법이 지시되어 왔다. 종래 효과기 방법은 보체 의존 세포 용해("CDC"), 항체 의존 세포 세포독성("ADCC") 및 포식작용(표적 세포의 면역글로불린로의 코팅 후, 망상내피계에 의한 제거)을 포함한다. 항체 존재하에서 특정 효과기 세포, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 대한 표면 결합 수용체를 가진 림프계 세포가 표적 세포에 대한 항체 의존 세포 세포독성("ADCC") 반응을 매개하는 것으로 알려져 있다. ADCC를 수단으로 하여, 이러한 효과기 세포는 상기 표적 세포에 대한 세포 용해 활성을 발휘한다.

시험관내에서 2가지 유형의 ADCC 반응이 입증되었다. 고전적 ADCC 반응에서는 효과기 세포가 항체로 코팅된 표적 세포에 부착된 후, 표적 세포의 세포 용해를 일으킨다(문헌 [A. H. Greenberg et al., "Characteristics Of The Effector Cells Mediating Cytotoxicity Against Antibody-Coated Target Cells," Immunology, 21, p. 719 (1975)]). 상기와 같은 효과기와 표적 세포 사이의 부착은 표적 세포를 코팅하는 항체의 Fc 영역과 효과기 세포의 Fc 수용체 사이의 상호작용으로부터 일어나는 것이다. 이러한 유형의 ADCC 반응이 가지는 한가지 단점은 효과기 세포의 Fc 수용체에 대한 항체로서 표적 세포에 결합된 것인 항체와 경쟁하는 순환 항원-항체 복합체에 의해 저해될 수 있으며, 이는 종종 각종 질환과 관련이 있다(문헌 [I. C. M. MacLennan, "Competition For Receptors For Immunoglobulin On Cytotoxic Lymphocytes," Clin. Exp. Immunol., 10, p. 275 (1972)]). 상기와 같은 고전적 ADCC의 단점에 기인하여, 2번째 유형의 ADCC 반응(항체 지시 ADCC)이 사용될 수 있다. 항체 지시 ADCC에서, 먼저 표적 특이 항체는 효과기 세포에 부착되고, 이어서, 생성된 복합체는 항체를 통해 표적 세포 표면 상의 그의 특이적인 항원으로 "지시"된다. 항체 지시 ADCC는 숙주계를 순환하는 항원-항체 복합체가 존재하여도 어떤 영향도 받지 않을 수 있다는 이점을 가진다. Fc 영역/Fc 수용체 부착을 통해 이루어지는 항체와 효과기 세포 사이의 상호작용은 보통 약하다. 그리고, 일부 경우에서는, 항체는 표적 세포가 용해될 수 있도록 하는 데 충분한 기간 동안 계속하여 효과기 세포와 회합된 상태로 존재하지는 않는다. 이러한 잠재적인 문제로 볼 때, 항체는 폴리에틸렌 글리콜 및 프탈레이트 오일 혼합물에 의한 전처리를 사용하여 효과기 세포에 부착되었다(문헌 [J. F. Jones and D. M. Segal, "Antibody-Dependent Cell Mediated Cytolysis (ADCC) With Antibody-Coated Effectors: New Methods For Enhancing Antibody Binding And Cytolysis," J. Immunol., 125, pp. 926-33 (1980)]). 그러나, 신체에서 임의의 폴리에틸렌 글리콜 및 프탈레이트 오일 잔기가 항체-효과기 세포 복합체에 미칠 수 있는 독성 효과로 인해 상기 방법의 생체내 치료에의 적용가능성은 감소될 수 있다.

별법으로, 세포독성 약물을 사용하는 애주번트 화학요법에 의해 항체 지시 ADCC를 증강시키는 방법이 제안된 바 있다(문헌 [I. R. Mackay et al., "Effect On Natural Killer And Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Of Adjuvant Cytotoxic Chemotherapy Including Melphalan In Breast Cancer," Cancer Immunol. Immunother., 16, pp. 98-100 (1983)]). ADCC를 테스트하는 분석법은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,756,097호에서와 같이, 당업계에 주지되어 있다.

따라서, 본 실시양태는 신생혈관형성 또는 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 세포에 결합할 수 있거나, 세포의 포식작용 및 사멸을 증강시켜 생체내 보호를 증강시킬 수 있는 항체를 제공한다. 또한, 상기 항체가 결합할 수 있고, 동일의 효과를 가지는 결합부 또는 에피토프와 면역반응하거나, 그에 특이적으로 결합하거나, 또는 그에 우선적으로 결합하는 다른 항체 및 그의 기능적 단편도 제공한다.

항체는 또한 신생혈관형성 또는 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 세포(예를 들어, 내피 세포)에 대해 옵소닌성이거나, 옵소닌 활성을 보일 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, "옵소닌 활성"이란, 항원 또는 세포 수용체에 결합하여 항원 또는 세포 수용체의 포식세포에의 부착을 촉진시킴으로써 포식작용을 증강시킬 수 있는 옵소닌(일반적으로 항체 또는 혈청 인자 C3b)의 능력을 지칭하는 것이다. 특정 세포가 옵소닌 항체로 코팅되면, 이는 포식세포, 예를 들어, 호중구 및 대식세포에 대해 극도의 관심의 대상이 되며, 혈류로부터의 제거 속도는 현저하게 증가하게 된다. 옵소닌 활성은 미국 특허 번호 제6,610,293호에 기술되어 있는 것과 같이, 임의의 종래 방식으로 측정될 수 있다.

또 다른 비제한적인 실시양태에서, 신생혈관형성 질병 또는 혈관신생 의존 질병을 앓는 환자는 혈관신생으로부터 항원/펩티드(예를 들어, 엔도글린)를 흘린다. 이러한 항원/펩티드가 "종양 관련 항원"일 수 있다. 상기 환자는 항원/펩티드(예를 들어, 엔도글린)에 대한 항체를 전신 투여받을 수 있고, CDC, ADCC, 옵소닌화, 또는 임의의 다른 형태의 세포 매개 사멸을 유도하는 본원에 기술된 경로 중 임의의 것을 개시할 수 있다.

추가의 분석법

당업계에 공지된 다른 분석법 또한 본원에 기술된 조성물, 예를 들어, 하기 실시예에 기술하는 것의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있다.

패키징 및 키트

추가의 다른 실시양태에서, 본 출원은 상기 기술된 화합물을 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 엔도글린에 우선적으로 결합하는 키메라 항체 및 VEGF에 우선적으로 결합하는 항체가 키트로 제공될 수 있다. 키트는 하나 이상의 적합한 용기 수단을 포함할 수 있다.

본 키트의 용기 수단은 일반적으로 1 이상의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 및/또는 다른 용기 수단을 포함하며, 그 안에는 1 이상의 폴리펩티드가 배치될 수 있고/있거나, 바람직하게는 적합하게 분취되어 있을 수 있다. 키트는 1 이상의 융합 단백질, 검출가능한 부분, 리포터 분자를 함유하는 수단, 및/또는 시판용으로 단단히 밀폐된 임의의 다른 시약 용기를 포함할 수 있다. 상기 용기는 원하는 바이알을 보유하는 주사 및/또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트내 포함되어 있는 물질 사용에 관한 인쇄물을 포함할 수 있다.

패키지 및 키트는 추가로 제제 중 완충제, 방부제, 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 키트의 각 구성 요소는 개별 용기내 밀봉될 수 있고, 각종 용기들 모두 단일 패키지내 포함될 수 있다. 키트는 냉동 보관용 또는 실온 보관용으로 디자인될 수 있다.

추가로, 제제는 키트의 저장 수명을 연장시키기 위해 안정화제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 우혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin)을 포함한다. 조성물을 동결건조시킨 경우, 키트는 추가로 동결건조된 제제를 재구성하기 위한 용액 제제를 포함할 수 있다. 허용되는 재구성 용액은 당업계에 주지되어 있고, 그 예로는 예를 들어, 제약상 허용되는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)를 포함한다.

추가로, 본원에서 제공하는 패키지 또는 키트는 추가로 본원에서 제공하는 다른 부위들 중 임의의 것, 예를 들어, 하나 이상의 리포터 분자 및/또는 하나 이상의 검출가능한 부분/제제를 포함할 수 있다.

패키지 및 키트는 추가로 분석법, 예를 들어, ELISA 분석법을 위한 하나 이상의 성분들을 포함할 수 있다. 본 출원에서 테스트하고자 하는 샘플로는 예를 들어, 혈액, 혈장, 조직/종양 절편 및 분비물, 뇨, 림프, 및 그의 생성물을 포함한다. 패키지 및 키트는 추가로 샘플 수집을 위한 하나 이상의 구성 요소(예를 들어, 시린지, 컵, 면봉 등)를 포함할 수 있다.

패키지 및 키트는 추가로 예를 들어, 제품 설명, 투여 방식, 및/또는 치료 지시를 명시하는 라벨을 포함할 수 있다. 본원에서 제공하는 패키지는 본원에 기술된 조성물 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 패키지는 추가로 다양한 형태의 암 및 그의 전이 치료에 대한 라벨을 포함할 수 있다.

"포장재"라는 용어는 키트의 구성 요소들을 담고 있는 물리적 구조물을 의미한다. 포장재는 구성 요소들을 멸균 상태로 유지시킬 수 있고, 이는 통상 상기 목적에 사용되는 재료(예를 들어, 종이, 골판지, 유기, 플라스틱, 호일, 앰플 등)로 제조될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 적절한 설명서를 포함할 수 있다. 따라서, 키트는 추가로 본원에 기술된 임의의 방법에서 키트의 구성 요소 사용에 관한 라벨 또는 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기술된 임의의 방법에서 화합물 투여에 관한 설명서와 함께 화합물을 팩, 또는 디스펜서 중에 포함할 수 있다.

본원에 기술된 진단 방법 및 분석법을 사용하는 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 환자로부터 유래된 암 세포의 샘플 중 그의 발현 수준이 혈관신생 억제제에 대한 감도 또는 내성과 상관관계에 있는 것인 유전자 또는 유전자들의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 또는 유전자들은 VEGF, VEGF 수용체, 및 CD105로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 키트는 VEGF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 VEGF 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 CD105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 VEGF, VEGF 수용체, 및 CD105 중 2개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 혈관신생 억제제에 대한 감도와 상관관계에 있는 유전자를 2개 이상 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 혈관신생 억제제에 대한 내성과 상관관계에 있는 유전자를 2개 이상 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 혈관신생 억제제에 대한 감도와 상관관계에 있는 유전자를 1개 이상 및 혈관신생 억제제에 대한 내성과 상관관계에 있는 유전자를 1개 이상 포함한다.

추가의 다른 실시양태에서, 키트는 다양한 투여 형태로, 예를 들어, 캡슐제, 캐플릿, 젤캡, 현탁제용 분제 등의 형태로 치료하고자 하는 환자로부터 유래된 암 세포의 샘플 중 VEGF, VEGF 수용체, 및 CD105 발현 수준 검출을 위한 시약; 및 1 용량으로 또는 다중 용량으로, 본원에 기술된 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 억제제를 포함한다. 치료하고자 하는 환자로부터 유래된 암 세포의 샘플 중 VEGF, VEGF 수용체, 및 CD105 발현 수준 검출을 위한 시약을 포함하는 키트는 추가로 1 이상의 추가의 혈관신생 억제제를 공투여하기 위해 키트에 대한 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것을 포함할 것이라는 것이 추가로 고려된다.

설명서는 치료 방법을 비롯한, 본원에 기술된 방법들 중 임의의 것을 실시하는 것에 관한 설명을 포함할 수 있다. 설명서는 추가로 만족스러운 임상적 종점 또는 발생할 수 있는 임의의 유해 증상, 또는 규제 기관, 예를 들어, 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)에 의해 요구되는, 인간 피험체에서의 사용을 위한 추가 정보에 대한 지시를 포함할 수 있다.

설명서는 "인쇄물" 상에, 예를 들어, 키트내 또는 그에 부착된 종이 또는 판지 상에, 또는 키트 또는 포장재에 부착된 라벨 상에, 또는 키트 성분을 포함하는 바이알 또는 튜브에 부착된 라벨 상에 있을 수 있다. 설명서는 추가로 컴퓨터 판독용 매체, 예를 들어, 디스크(플로피 디스켓 또는 하드 디스크), 광학 CD, 예를 들어, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, 자기 테이프, 전자 저장 매체, 예를 들어, RAM 및 ROM, IC 팁, 및 이들의 하이브리드, 예를 들어, 자기/광학 저장 매체 상에 포함될 수 있다.

본 출원의 화합물 및 방법의 실시양태는 설명하고자 하는 것이며, 제한하는 것은 아니다. 엔도글린 결합과 관련하여 기능상 본래의 성질에 가깝게 유지시키면서, 기술된 변형을 포함한, 엔도글린에 결합하는 키메라 항체에 대해 이루어진 변경에 관한 상기의 구체적인 교시를 고려하여 당업자에 의해 수정 및 변형이 이루어질 수 있다.

실시예

본 출원은 본 출원의 예시적인 실시양태로서 제공되는 하기의 비제한적 일례를 참고하여 보다 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 예시적인 실시양태를 보다 완전하게 설명하기 위해 제시된 것이지만, 본 출원의 광범위한 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 본 출원의 특정 실시양태가 본원에 제시되어 있고 기술되어 있지만, 상기 실시양태는 단지 일례로서 제공되었다는 것은 자명하다. 다수의 변경, 수정, 및 치환이 이루어질 수 있다; 본원에 기술된 실시양태에 대한 다양한 대안이 본원에 기술된 방법을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

실시예 1

BIA 코어(표면 플라스몬 공명: SPR ) 분석

키메라 항엔도글린 항체 결합

표준 프로토콜을 사용하여 예를 들어, BIA코어 분석법을 사용함으로써 항체의 친화도를 평가할 수 있다. 요약하면, His 태깅된 재조합 인간 엔도글린의 포획을 위해 항히스티딘 태그 항체를 BIA코어 칩에 커플링시켜, 키메라 항엔도글린 항체의 결합을 측정하는 데 사용하였다. SPR 분석을 전개하는 데 최소 2개의 칩 시료 배취와 8개의 분석 배취에서 수행하였다. 상기 분석 전개에서 하기 파라미터를 평가하였다:

(a) 항his 항체의 CM5에의 커플링

EDC/NHS를 사용하여 종래 아민 화학법에 의해 항his 태그 항체를 BIA코어 CM5 칩에 커플링시켰다. 반응 조건(농도 및 pH)을 최적화시킬 것이다.

(b) 인간 엔도글린 결합 및 바이오센서 칩의 재생

결합된 항체를 용리시키는 각종 완충액(이전 경험을 기초로 한 완충액)을 사용하여 인간 엔도글린 결합 및 칩의 재생을 위한 조건을 테스트하였다. 일단 후보 재생 방법을 개발하고 나면, 단일 칩 표면의 결합능 및 배경을 25회 주기 이상으로 측정하였다. 목적은 평균적으로 배경을 1회 주기당 < 10 RU으로 감소시키고, 능력을 1회 주기당 < 1%로 감소시키고자 하는 것이었다.

(c) 인간 엔도글린 결합

최대 결합에 도달하는 데 적합한 농도를 측정하기 위해 인간 엔도글린의 용량 반응을 측정하였다.

(d) 키메라 항엔도글린 항체 결합

동적 또는 평형 결합 실험에 대한 적합한 범위를 결정하기 위해 키메라 항엔도글린 항체의 용량 반응을 측정하였다(이는 상대적인 동적 상수, ka 및 kd를 비교하거나, 병행 방법에 의해 상대적인 효능을 비교하는 것을 포함할 수 있다).

(e) 사전 확인 실험

측정의 정밀함과 정확성에 대한 예비 정보를 얻기 위해 다른 칩, 다른 유식 세포 및 다른 경우를 사용하여 선택된 조건하에서 3회 이상 결합 실험을 반복하였다. 모든 BIA코어 실험은 25℃하에 HBS-EP 전개 완충액에서 수행하였다.

항 VEGF 항체 결합

표준 프로토콜을 사용하여 예를 들어, BIA코어 분석법을 이용함으로써 항체의 친화도를 평가할 수 있었다. 요약하면, His 태깅된 재조합 인간 VEGF의 포획을 위해 항히스티딘 태그 항체를 BIA코어 칩에 커플링시켜, 항VEGF 항체의 결합을 측정하는 데 사용하였다. SPR 분석을 전개하는 데 최소 2개의 칩 시료 배취와 8개의 분석 배취에서 수행하였다. 상기 분석 전개에서 하기 파라미터를 평가하였다:

(a) 항his 항체의 CM5에의 커플링

EDC/NHS를 사용하여 종래 아민 화학법에 의해 항his 태그 항체를 BIA코어 CM5 칩에 커플링시켰다. 반응 조건(농도 및 pH)을 최적화시킬 것이다.

(b) 인간 VEGF 결합 및 바이오센서 칩의 재생

결합된 항체를 용리시키는 각종 완충액(이전 경험을 기초로 한 완충액)을 사용하여 인간 VEGF 결합 및 칩의 재생을 위한 조건을 테스트하였다. 일반 후보 새쟁 방법을 개발하고 나면, 단일 칩 표면의 결합능 및 배경을 25회 주기 이상으로 측정하였다. 목적은 평균적으로 배경을 1회 주기당 < 10 RU으로 감소시키고, 능력을 1회 주기당 < 1%로 감소시키고자 하는 것이었다.

(c) 인간 VEGF 결합

최대 결합에 도달하는 데 적합한 농도를 측정하기 위해 인간 VEGF의 용량 반응을 측정하였다.

(d) 항VEGF 항체 결합

동적 또는 평형 결합 실험에 대한 적합한 범위를 결정하기 위해 키메라 항VEGF 항체의 용량 반응을 측정하였다(이는 상대적인 동적 상수, ka 및 kd를 비교하거나, 병행 방법에 의해 상대적인 효능을 비교하는 것을 포함할 수 있다).

(e) 사전 확인 실험

측정의 정밀함과 정확성에 대한 예비 정보를 얻기 위해 다른 칩, 다른 유식 세포 및 다른 경우를 사용하여 선택된 조건하에서 3회 이상 결합 실험을 반복하였다. 모든 BIA코어 실험은 25℃하에 HBS-EP 전개 완충액에서 수행하였다.

실시예 2

키메라 항엔도글린 항체 결합에 대한 ELISA

ELISA를 사용하여 키메라 항엔도글린 항체의 엔도글린에의 결합을 분석할 수 있었다. 요약하면, 하기 단계에 따라 ELISA를 수행하였다:

1. 눈크 맥시소르프(Nunc Maxisorp) 플레이트를 100 ㎕/웰 PBS 중 1,500 ng/ml로 MAB9811-01(폴리클로날 항엔도글린 항체)을 사용하여 코팅하였다. 플레이트를 실러로 커버하고, 4℃에서 밤새도록(16-24시간) 인큐베이션시켰다.

2. -200 ㎕의 PBS(Tween 무함유)로 플레이트를 세척(2X)하였다.

3. 200 ㎕/웰의 BSA 차단액(1% BSA)을 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다.

4. 바이오테크(BioTek) 플레이트 세척기를 사용하여 트윈(Tween)(PBS-T)을 함유하는 PBS로 플레이트를 세척하였다(3X).

5. 0.1% BSA을 함유하는 PBS-T 중에 100 ㎕/웰의 CD105(R&D Systems 카탈로그 1097-EN)를 100 ng/ml로 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다.

6. 바이오테크 플레이트 세척기를 사용하여 PBS-T로 플레이트를 세척하였다(3X).

7. 테스트 웰에 100 ㎕/웰의 키메라 항엔도글린 항체를 (0.1% BSA을 함유하는 PBS-T 중에 희석된) 20, 10, 4, 2, 1, 0.5 및 0.2 ng/ml로 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 음성 대조군 웰에는 100 ㎕/웰의 이소형 대응 대조군 항체를 첨가하였다.

8. 바이오테크 플레이트 세척기를 사용하여 PBS-T로 플레이트를 세척하였다(3X).

9. 모든 웰에 0.1% BSA을 함유하는 PBS-T 중에 1:10,000으로 희석된, HRP에 접합된 100 ㎕/웰의 염소 항인간 IgG(Jackson Immunore search)를 첨가하고; 실온에서 30-60분 동안 인큐베이션시켰다.

10. 바이오테크 플레이트 세척기를 사용하여 PBS-T로 플레이트를 세척하였다(5X).

11. 100 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하고, 암실에서 15분 동안 덮개로 덮지 않고 인큐베이션시켰다.

12. 100 ㎕/웰의 TMB 종결 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

샘플에 대해 3중으로 실시하고, 광학 밀도를 판독하여 표준 곡선을 작성한 후, 결합 상수를 측정하였다. 스튜던츠 t 검정 또는 또 다른 표준 검정을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.

유사한 프로토콜을 사용하여 항체의 VEGF에의 결합에 대해 테스트할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

실시예 3

엔도글린 발현 세포 상의 이용가능한 에피토프의 항체 결합성 및 그 개수

표준 프로토콜을 사용하여 스캐차드 플롯 분석을 이용함으로써 엔도글린 발현 세포 상의 이용가능한 에피토프의 항체 결합성 및 그 개수를 평가할 수 있었다.

요약하면, 방사성표지된 키메라 항엔도글린 항체의 엔도글린 발현 KM-3 백혈병 세포 및 서브융합된 증식성 HUVEC에의 직접 결합에 대한 스캐차드 플롯 분석을 수행하였다. 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 요오도-겐(Iodo-Gen)을 사용하여 ¹²⁵I로 정제된 항엔도글린 항체를 개별적으로 방사성표지시켰다. 방사성표지된 키메라 항엔도글린 항체를 각각 평균적으로 IgG 분자 1개당 요오드 원자의 개수에 대해 분석하였다. 항원 결합 활성을 측정하기 위해 고정량(0.1 ㎍)의 각 ¹²⁵I로 표지된 mAb 및 2배로 하는 일련의 증가 처리된 엔도글린 발현 KM-3 또는 HUVEC 세포를 사용하여 적정 실험을 수행하였다. 공지 방법을 사용하여 결합 데이터에 대한 스캐차드 플롯 분석을 수행하였다. 본 분석에 의해 평형 상수 및 세포 1개당 결합된 mAb의 평균 최대 개수를 예측하였다.

실시예 4

차단 활성에 대한 웨스턴 블롯 분석

CD105를 발현하는 세포의 CD105 유발 활성화를 차단시킬 수 있는 키메라 항엔도글린 항체의 능력을 웨스턴 블롯을 통해 분석함으로써 CD105 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 인산화에 대하여 검출할 수 있었다.

공지된 웨스턴 블롯 기법에 따라 웨스턴 블롯 분석법을 수행함으로써 인산화된 Smad 1/5/8 또는 Smad 2를 확인하였다. PSmad 1 및 PSmad 2 항체는 비형질감염된 내피 세포에서 인산화된 Smad 1/5 또는 인산화된 Smad 2를 특이적으로 인식하였다. Smad 1, Smad 2, Smad 5, Id1(Santa Cruz) 및 엔도글린에 대한 1차 항체를 사용하여 샘플 중의 분자를 검출하였다. 증강 화학발광법(ECL: enhanced chemoluminescence)에 의해 검출을 수행하였다.

실시예 5

HUVEC 성장 억제 및 ³ H- 티미딘 혼입 분석

세포 성장 억제를 평가하는 데 많은 분석법이 이용될 수 있다.

한 일례로, 서브융합된 조건하에 37℃ CO₂ 인큐베이터 중 75 ㎠ 플라스크(Falcon, Becton-Dickinson: 미국 뉴저지 주 프랭클린 레이크스 소재)에서 HUVEC를 배양하였다. 37℃에서 15 min 동안 25 mM HEPES 완충액(pH 7.3) 중에서 15 mM EDTA를 함유하는 행크스 평행 염액과 함께 인큐베이션시켜 세포를 분리시켰다. 빙냉 PBS로 2회에 걸쳐 세척한 후, 세포를 25,000개의 세포/ml 농도로 내피 세포 성장 배지 중에 재현탁시켰다. 추가의 실험, FBS 및 소 뇌 추출물 무함유의 내피 세포 성장 배지 중에 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)를 현탁시키고, 그 중에서 배양하였다. 200 ㎕ 분액의 세포 현탁액을 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 시딩하였다. 세포를 37℃ CO₂ 인큐베이터 중에서 밤새도록 배양한 후, 키메라 항엔도글린 항체, 항VEGF 항체, 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체의 조합물, 대조군 IgG 또는 TGF-β1을 3중으로 첨가하였다. 배양 플레이트를 인큐베이터 중에 72 hr 동안 유지시키고, 상기 시간 동안 매 24 hr마다 새 배지 및 항체 또는 대조군으로 교체하였다. ³H-티미딘(1 μCi)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 20 hr 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS로 세척한 후, 37℃에서 15 min 동안 100 ㎕/웰 트립신-EDTA(0.05% 트립신, 0.53 mM EDTA)로 처리하였다. 하비스터(Harvester) 96(TOMTEC: 미국 코네티컷주 햄든 소재)을 사용하여 유리 섬유 필터(Wallac Printed FiltermatA) 상에서 세포를 수거하고, 트리룩스 1540 마이크로베타 액체 섬광 및 발광 계수기(Trilux 1540 MicroBeta Liquid Scintillation and Luminescence Counter)(Wallac: 핀란드 투르크 소재)에서 ³H-방사능을 측정하였다.

실시예 6

MTS 분석에 의한 HUVEC 성장 억제

내피 세포 성장 억제를 평가하는 데 많은 분석법이 이용될 수 있다.

한 일례로, 서브융합된 조건하에 37℃ CO₂ 인큐베이터 중 96 웰 플레이트(Falcon, Becton-Dickinson: 미국 뉴저지 주 프랭클린 레이크스 소재)에서 0.5% 우태아 혈청 및 30 ng/mL의 VEGF를 함유하는 EGM-2 배지(Clonetics: 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에 웰당 5,000개의 세포로 HUVEC를 배양하였다. 세포가 24시간 이상 동안 배양 플라스크에 부착될 수 있도록 하고, 키메라 항엔도글린 항체와 함께 또는 그를 포함하지 않고, 항VEGF 항체와 인큐베이션시켰다. 배양 플레이트를 인큐베이터 중에 72 hr 동안 유지시키고, 상기 시간 동안 매 24 hr마다 새 배지 및 항체 또는 대조군으로 교체하였다. 항체 처리 후 3일이 경과하였을 때, 1시간 동안 MTS 테트라졸리움 화합물을 웰에 첨가하고, 제조사의 설명서에 따라 490 nm에서 흡광도를 정량화하였다(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). 샘플에 대해 3중으로 실시하였다.

실시예 7

세포 이동 억제에 대한 분석

보이덴(Boyden) 챔버를 사용하여 세포 증식 및 활성화에 대한 척도로서 이동(화학주성)을 측정하였다.

요약하면, 세포 이동을 하기와 같이 평가하였다: 코스터(Costar) 핵공필터(공극 8 mm)를 4℃에서 밤새도록 피브로넥틴으로 코팅하였다. 챔버를 4℃에서 밤새도록 피브로넥틴으로 코팅하였다. 챔버를 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)로 세척하고, 하단 챔버는 혈청을 포함하거나 포함하지 않고, TGF-β3을 포함하거나 포함하지 않는 DMEM으로 충전시켰다. 세포를 트립신으로 처리하고, 대조군 항체, 키메라 항엔도글린 항체, 항VEGF 항체 또는 그의 조합의 존재하에서 DMEM 중 50,000개의 세포/ml인 최종 농도로 현탁시켰다. 150 ㎕ 분액의 세포 현탁액 상단 챔버에 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 16 hr 경과 후, 세포를 세척하고, 상부 표면을 문질러 비이동 세포를 제거하였다. 막을 메탄올 중에 고정시키고, 물로 세척하고, 염색시켜, 하부 표면 상에 존재하는 세포를 계수하였다.

실시예 8

ADCC 분석

예를 들어, 하기 프로토콜을 사용하여 본원에 기술된 항체의 IL-2 활성화된 자연살(NK: natural killer) 세포를 생성할 수 있는 능력 및 ADCC를 유도할 수 있는 능력에 대해 상기 항체를 평가할 수 있었다.

NK 단리 및 IL -2 활성화된 NK 세포 생성

PBMC를 단리시키고, 10% FBS를 함유하는 RPMI 중 4℃에서 24 hr 동안 휴지기화시켰다. 이어서, 2% FBS를 함유하는 RPMI 중에 PBMC를 놓고(전체 부피 = 50 mL), 10 mL의 세포 현탁액을 페트리 디쉬에 플레이팅시켰다. PBMC를 37℃에서 2 hr 동안 인큐베이션시키고, 비흡착 세포를 수집하였다. 48 hr 동안 1,000 U/mL IL-2와 함께 NK 세포를 8 X 10⁶/mL로 배양한 후, 분석에 사용하기 전 5-6일 동안 통상적으로 배양하였다.

자연살 세포 매개 세포독성 및 ADCC 분석

배양물로부터 NK 세포를 스크랩핑하고, 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하였다. RPMI 완전 배지(RPMI Complete)로 세포를 1회 세척하고, 10분 동안 1,200 rpm으로 회전시켰다. 이어서, NK 세포를 5 mL RPMI 완전 배지 중에 재현탁시키고, 계수하였다. 분석을 수행하기 전에 NK 세포 계수를 효과기:표적의 비가 10:1이 되도록 정규화시켰다. 정규화된 NK 세포를 플레이팅하고, 10 ㎕의 키메라 항엔도글린 항체를 지정 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 대조군 샘플로는 비처리 또는 대조군 항체 처리 세포 집단을 포함한다.

관심의 대상이 되는 표적 세포(HUVEC 세포)를 수집하고, 세척하고, 10분 동안 1,200 rpm으로 회전시키고, 5 mL RPMI 완전 배지 중에 재현탁시켰다. 표적 세포를 다시 세척하고, 무혈청 RPMI 중에 1 x 10⁶개의 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 이어서, 표적 세포를 37℃에서 1 hr 동안 최종 농도 5 ㎍/mL의 칼세인(Calcein) AM으로 표지한 후, RPMI 완전 배지로 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 표적 세포를 재현탁시키고, NK 세포 웰에 첨가하였다. 표적 세포/NK 세포 조합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 5분 동안 1,200 rpm으로 회전시키고, 세포를 세척하고, DPBS 중에 재현탁시켰다. 450/530 nm의 여기/방출을 사용하여 형광을 판독하였고, 방출은 항체에 의해 매개되는 세포 사멸에 대한 측정치였다.

실시예 9

투여량

본원에 기술된 항체의 최적의 투여량은 당업계에서 인증된 방법을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 결정할 수 있었다.

하나의 비제한적인 실시양태에서, 본원에 기술된 항체를 다양한 투여량으로 다양한 기간에 걸쳐 피험체에게 투여할 수 있다. 비제한적인 용량으로 약 0.01 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 또는 그 사이의 임의의 정수값을 포함한다. 추가로, 항체의 상기 투여량(들)으로 주 2회, 매주, 매 2주마다, 매 3주마다, 매 4주마다, 매 6주마다, 매 8주마다, 매 12주마다, 또는 상기 범위 내의 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항체를 4주 동안 주 1회 또는 2회에 걸쳐 투여한 후, 요법없이 2주 동안 시행하는 투약 주기 또한 고려된다. 예를 들어, 본원에 기술된 투여량과 매주 시행되는 주기의 상이한 조합을 비롯한 추가의 투약 주기 또한 본원에서 고려된다.

또 다른 실시양태에서, 베바시주맙(AVASTIN®)은 하기 투여량 및 요법에 기초하여 투여될 수 있다:

실시예 10

고형 종양 유형 상에서의 엔도글린 ( CD105 ) 발현

면역조직화학법을 사용하여 고형 종양 상에서의 엔도글린 발현을 평가하였다. 냉동 및 아세톤으로 고정된 인간 암종 샘플을 10,000배 희석된 항엔도글린 항체 SN6j 복수 희석액 또는 이소형 대응 대조군 IgG 복수 희석액과 반응시키고, DAKO 염색 키트로 염색시켰다. 헤마토실린으로 대조염색을 실시하였다. SN6j는 종양내 존재하는 혈관에 결합한 반면, 이소형 대응 대조군 IgG는 어떤 염색도 보이지 않았다. 테스트된 모든 유형의 종양이 종양 혈관구조 내에서 엔도글린을 발현하는 것으로 입증되었다.

실시예 11

SCID 마우스 내로 이식된 인간 피부에서의 기형성 인간 유방암 종양에 대한 항혈관신생 요법

SCID 마우스 내로 이식된 인간 피부에서의 기형성 인간 유방암 종양에 대한 본원에 기술된 항체의 항혈관신생 효과와 관련하여 본 항체의 효과를 평가할 수 있었다.

요약하면, 이식이 염증, 수축, 또는 거부 반응의 신호가 없을 때, SCID 마우스 내로 전층이 이식된 인간 피부에 MCF-7 세포(0.1 ml PBS 중 8 x 10⁶개의 세포)를 진피내로 삽입하였다. 뚜렷한 촉지성 종양(대부분 직경 3 내지 6 mm)이 출현할 때까지 마우스를 처리하지 않고 그대로 두었다. 뚜렷한 종양을 가진 마우스를 치료학적 연구를 위한 군으로 나누었다. (1) 키메라 항엔도글린 항체를 함유하는 용액(조성물), (2) 베바시주맙(AVASTEST®)을 함유하는 용액(조성물), (3) 키메라 항엔도글린 항체 및 베바시주맙(AVASTEST®)의 조합물을 함유하는 용액(조성물), 또는 (4) 이소형 대응 대조군 IgG를 함유하는 용액(조성물)을 각각 마우스 혈청 알부민을 함유하는 멸균 PBS로 희석시켰다(최종 농도 0.05%). mAb 요법을 위해, 200 ㎍/0.2 mL 테스트 항체 또는 대조군 IgG를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 매 2 내지 3일마다 투여를 수행하였다.

치료하는 동안, 마우스의 종양 크기와 이환에 대해 매일 모니터링하였다. 전자 저울(OHAUS™ Model GT210)을 사용하여 매주 2회에 걸쳐 마우스의 체중을 측량하였다. 옵토데모(OptoDemo)™ 소프트웨어(Fowler Co.)를 사용하는 컴퓨터에 연결된 전자 캘리퍼(PRO-MAX 6 인치 캘리퍼; Fowler Co.: 미국 매사추세츠주 뉴턴 소재)를 사용하여 매주 3회에 걸쳐 종양 크기를 측정하였다. 예를 들어, 하기 공식: V = 길이 x 너비 x 높이 x pi/6을 사용하여 측정된 종양 직경을 종양 부피로 전환하였다. 상이한 마우스 군들간의 비교를 위한 데이터의 통계학적 분석은 스튜던츠 t 검정을 사용하여 수행하였다.

실시예 12

난소암에 대한 마우스 모델

난소암을 치료할 수 있는 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체의 능력을 측정하기 위해 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에서 난소암 세포주를 사용할 수 있었다.

요약하면, 난소암 세포를 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에 삽입하여 난소 종양을 발생시켰다. 키메라 항엔도글린 항체, 베바시주맙(AVASTEST®), 키메라 항엔도글린 모노클로날 항체(mAb) 및 베바시주맙(AVASTEST®)의 조합물, 또는 대조군 IgG는 그의 용량을 증가시켜 가면서(1.8 mg/kg(체중)에서 출발) i.v.로 투여함으로써 확립된 종양을 보유하는 마우스 군을 처리하였다. 주 2 또는 3회에 걸쳐 치료하였다. 모든 군에 화학요법을 사용할 수 있었다. 마우스를 모니터링하고, 종양 성장에 대해서는 주 2 또는 3회에 걸쳐 측정하였다.

실시예 13

콩팥암에 대한 마우스 모델

콩팥암을 치료할 수 있는 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체의 능력을 측정하기 위해 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에서 콩팥암 세포주를 사용하였다.

요약하면, 콩팥암 세포를 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에 삽입하여 콩팥 종양을 발생시켰다. 키메라 항엔도글린 항체, 베바시주맙(AVASTEST®), 키메라 항엔도글린 모노클로날 항체(mAb) 및 베바시주맙(AVASTEST®)의 조합물, 또는 대조군 IgG은 그의 용량을 증가시켜 가면서(1.8 mg/kg(체중)에서 출발) i.v.로 투여함으로써 확립된 종양을 보유하는 마우스 군을 처리하였다. 주 2 또는 3회에 걸쳐 치료하였다. 모든 군에 화학요법을 사용할 수 있었다. 마우스를 모니터링하고, 종양 성장에 대해서는 주 2 내지 3회에 걸쳐 측정하였다.

실시예 14

결장직장암에 대한 마우스 모델

결장직장암을 치료할 수 있는 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체의 능력을 측정하기 위해 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에서 유방암 세포주를 사용하였다.

요약하면, 유방암 세포를 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에 삽입하여 결장직장 종양을 발생시켰다. 키메라 항엔도글린 항체, 베바시주맙(AVASTEST®), 키메라 항엔도글린 모노클로날 항체(mAb) 및 베바시주맙(AVASTEST®)의 조합물, 또는 대조군 IgG은 그의 용량을 증가시켜 가면서(10 mg/kg(체중)에서 출발) i.v.로 투여함으로써 확립된 종양을 보유하는 마우스 군을 처리하였다. 주 2 또는 3회에 걸쳐 치료하였다. 모든 군에 화학요법을 사용할 수 있었다. 마우스를 모니터링하고, 종양 성장에 대해서는 주 2 내지 3회에 걸쳐 측정하였다.

실시예 15

뇌암에 대한 마우스 모델

뇌암을 치료할 수 있는 키메라 항엔도글린 항체 및 항VEGF 항체의 능력을 측정하기 위해 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에서 다형성 아교모세포종 세포주를 사용하였다.

요약하면, 다형성 아교모세포종 암 세포를 SCID, 트랜스제닉 또는 누드 마우스에 삽입하여 유방 종양을 발생시켰다. 키메라 항엔도글린 항체, 베바시주맙(AVASTEST®), 키메라 항엔도글린 모노클로날 항체(mAb) 및 베바시주맙(AVASTEST®)의 조합물, 또는 대조군 IgG은 그의 용량을 증가시켜 가면서(10 mg/kg(체중)에서 출발) i.v.로 투여함으로써 확립된 종양을 보유하는 마우스 군을 처리하였다. 대조군 동물에는 대조군 IgG를 투여하였다. 주 2 또는 3회에 걸쳐 치료하였다. 모든 군에 화학요법을 사용할 수 있었다. 마우스를 모니터링하고, 종양 성장에 대해서는 주 2 내지 3회에 걸쳐 측정하였다.

실시예 16

결장직장암을 위한 병용 요법에 관한 임상 시험

본 실시예는 결장직장암을 앓는 환자에서 키메라 항엔도글린 항체를 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하였을 때의 안전성 및 효능을 예비 평가할 수 있도록 디자인된, 무작위 맹검 플라세보-대조군 다중 센터 II상 또는 III상 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자가 등록하였는데, 이중 약 50-약 400명의 환자는 치료군으로 배정하고, 약 50-약 400명의 환자는 플라세보 군으로 배정하였다. 시험은 6-10주기 동안 매 2-3주마다 1일째 정맥내로 투여되는 약 5 mg/kg의 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하여 매주 내지 3주마다 약 0.1-약 10 mg/kg의 키메라 항엔도글린 항체 또는 플라세보를 정맥내로 반복 투여하는 것으로 구성되었다. 모든 군에 화학요법을 사용할 수 있었다. 연구 기간은 약 6개월-약 5년으로 예측되었고, 초기 연구 종결시 지시된 바와 같이, 반응자에 대한 요법을 계속 수행하였다. 추가의 결과 측정은 하기와 같았다:

1차 결과 척도: 전반적인 반응률. 본 연구의 한가지 목표는 베바시주맙(AVASTEST®)과 플라세보를 사용한 경우의 전반적인 반응률이 약 40%인 것에서부터 베바시주맙(AVASTEST®)과 키메라 항엔도글린 항체를 사용한 경우의 전반적인 반응률이 약 60%(또는 초과)인 것으로 전반적인 반응률이 증가하였음을 입증하는 것이었다.

평가할 수 있는 2차 결과 척도로는 반응 지속 기간, 종양 진행 시간, 전반적인 생존 기간, 중증 및 비중증 부작용을 포함하였다. 예를 들어, 치료는 질환의 진행을 방해할 수 있거나(즉, 정체시킬 수 있거나), 또는 개선시킬 수 있었다. 별법으로 또는 추가로, 다른 목표는 하기: 종양 부하 감소, 신생혈관형성 감소, 부작용 감소, 유해 반응 감소, 및/또는 환자 순응도 증가 중 하나 이상과 관련하여 측정될 수 있었다.

실시예 17

콩팥암을 위한 병용 요법에 관한 임상 시험

본 실시예는 신세포암(콩팥암)을 앓는 환자에서 키메라 항엔도글린 항체를 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하였을 때의 안전성 및 효능을 예비 평가할 수 있도록 디자인된, 무작위 맹검 플라세보-대조군 다중 센터 II상 또는 III상 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자가 등록하였는데, 이중 약 50-약 400명의 환자는 치료군으로 배정하고, 약 50-약 400명의 환자는 플라세보 군으로 배정하였다. 시험은 3-6주기 동안 또는 진행시까지 매 2주마다 투여되는 약 2.5-약 15 mg/kg의 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하여 매주 내지 3주마다 약 0.1-약 30 mg/kg의 키메라 항엔도글린 항체 또는 플라세보를 정맥내로 반복 투여하는 것으로 구성되었다. 인터페론이 또한 두 처리암 모두에 사용될 수 있었다. 연구 기간은 약 6개월-약 5년으로 예측되었고, 초기 연구 종결시 지시된 바와 같이, 반응자에 대한 요법을 계속 수행하였다. 추가의 결과 측정은 하기와 같았다:

1차 결과 척도: 무진행 생존 기간. 본 연구의 한가지 목표는 베바시주맙(AVASTEST®)과 플라세보 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 9-13개월인 것에서부터 베바시주맙(AVASTEST®)과 키메라 항엔도글린 항체 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 14-18개월(또는 초과)인 것으로 무진행 생존 기간이 증가하였음을 입증하는 것이었다.

평가할 수 있는 2차 결과 척도로는 반응 지속 기간, 종양 진행 시간, 전반적인 생존 기간, 중증 및 비중증 부작용을 포함하였다. 예를 들어, 치료는 질환의 진행을 방해할 수 있거나(즉, 정체시킬 수 있거나), 또는 개선시킬 수 있었다. 별법으로 또는 추가로, 다른 목표는 하기: 종양 부하 감소, 신생혈관형성 감소, 부작용 감소, 유해 반응 감소, 및/또는 환자 순응도 증가 중 하나 이상과 관련하여 측정될 수 있었다.

실시예 18

간세포암 을 위한 병용 요법에 관한 임상 시험

본 실시예는 간세포암(간암)을 앓는 환자에서 키메라 항엔도글린 항체를 베바시주맙(AVASTEST®) 또는 소라페닙과 조합하였을 때의 안전성 및 효능을 예비 평가할 수 있도록 디자인된, 무작위 맹검 플라세보-대조군 다중 센터 II상 또는 III상 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자가 등록하였는데, 이중 약 50-약 400명의 환자는 치료군으로 배정하고, 약 50-약 400명의 환자는 플라세보 군으로 배정하였다. 시험은 3-6주기 동안 또는 진행시까지 매 2-3주마다 투여되는 약 2.5-약 15 mg/kg의 베바시주맙(AVASTEST®), 또는 매일 투여되는 약 400 mg의 소라페닙과 조합하여 매주 내지 3주마다 약 0.1-약 30 mg/kg의 키메라 항엔도글린 항체 또는 플라세보를 정맥내로 반복 투여하는 것으로 구성되었다. 연구 기간은 약 6개월-약 5년으로 예측되었고, 초기 연구 종결시 지시된 바와 같이, 반응자에 대한 요법을 계속 수행하였다. 추가의 결과 측정은 하기와 같았다:

1차 결과 척도: 무진행 생존 기간. 본 연구의 한가지 목표는 베바시주맙(AVASTEST®)(또는 소라페닙)과 플라세보 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 3-9개월인 것에서부터 베바시주맙(AVASTEST®)(또는 소라페닙)과 키메라 항엔도글린 항체 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 6-12개월(또는 초과)인 것으로 무진행 생존 기간이 증가하였음을 입증하는 것이었다.

평가할 수 있는 2차 결과 척도로는 반응 지속 기간, 종양 진행 시간, 전반적인 생존 기간, 중증 및 비중증 부작용을 포함하였다. 예를 들어, 치료는 질환의 진행을 방해할 수 있거나(즉, 정체시킬 수 있거나), 또는 개선시킬 수 있었다. 별법으로 또는 추가로, 다른 목표는 하기: 종양 부하 감소, 신생혈관형성 감소, 부작용 감소, 유해 반응 감소, 및/또는 환자 순응도 증가 중 하나 이상과 관련하여 측정될 수 있었다.

실시예 19

난소암을 위한 병용 요법에 관한 임상 시험

본 실시예는 난소암을 앓는 환자에서 키메라 항엔도글린 항체를 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하였을 때의 안전성 및 효능을 예비 평가할 수 있도록 디자인된, 무작위 맹검 플라세보-대조군 다중 센터 II상 또는 III상 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자가 등록하였는데, 이중 약 50-약 400명의 환자는 치료군으로 배정하고, 약 50-약 400명의 환자는 플라세보 군으로 배정하였다. 시험은 5주기 동안 1일째 정맥내로 약 15 mg/kg의 베바시주맙(AVASTEST®)을 투여한 후, 매 21일마다 정맥내로 투여되는 약 15 mg/kg의 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하여 매주 내지 3주마다 약 0.1-약 30 mg/kg의 키메라 항엔도글린 항체 또는 플라세보를 정맥내로 반복 투여하는 것으로 구성되었다. 화학요법 또한 두 처리암 모두에 사용될 수 있었다. 연구 기간은 약 6개월-약 5년으로 예측되었고, 초기 연구 종결시 지시된 바와 같이, 반응자에 대한 요법을 계속 수행하였다. 추가의 결과 측정은 하기와 같았다:

1차 결과 척도: 무진행 생존 기간. 본 연구의 한가지 목표는 베바시주맙(AVASTEST®)과 플라세보 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 3-6개월인 것에서부터 베바시주맙(AVASTEST®)과 키메라 항엔도글린 항체 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 4-12개월(또는 초과)인 것으로 무진행 생존 기간이 증가하였음을 입증하는 것이었다. 본 연구의 한가지 목표는 베바시주맙(AVASTEST®)와 플라세보를 사용한 경우의 전반적인 반응률이 약 20%인 것에서부터 베바시주맙(AVASTEST®)와 키메라 항엔도글린 항체를 사용한 경우의 전반적인 반응률이 약 30%(또는 초과)인 것으로 전반적인 반응률이 증가하였음을 입증하는 것이었다.

평가할 수 있는 2차 결과 척도로는 반응 지속 기간, 종양 진행 시간, 전반적인 생존 기간, 중증 및 비중증 부작용을 포함하였다. 예를 들어, 치료는 질환의 진행을 방해할 수 있거나(즉, 정체시킬 수 있거나), 또는 개선시킬 수 있었다. 별법으로 또는 추가로, 다른 목표는 하기: 종양 부하 감소, 신생혈관형성 감소, 부작용 감소, 유해 반응 감소, 및/또는 환자 순응도 증가 중 하나 이상과 관련하여 측정될 수 있었다.

실시예 20

다형성 아교모세포종을 위한 병용 요법에 관한 임상 시험

본 실시예는 다형성 아교모세포종(뇌암)을 앓는 환자에서 키메라 항엔도글린 항체를 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하였을 때의 안전성 및 효능을 예비 평가할 수 있도록 디자인된, 무작위 맹검 플라세보-대조군 다중 센터 II상 또는 III상 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자가 등록하였는데, 이중 약 50-약 400명의 환자는 치료군으로 배정하고, 약 50-약 400명의 환자는 플라세보 군으로 배정하였다. 시험은 3-6주기 동안 또는 진행시까지 매 2-3주마다 투여되는 2.5-약 15 mg/kg의 베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하여 매주 내지 3주마다 약 0.1-약 30 mg/kg의 키메라 항엔도글린 항체 또는 플라세보를 정맥내로 반복 투여하는 것으로 구성되었다. 연구 기간은 약 6개월-약 5년으로 예측되었고, 초기 연구 종결시 지시된 바와 같이, 반응자에 대한 요법을 계속 수행하였다. 추가의 결과 측정은 하기와 같았다:

1차 결과 척도: 무진행 생존 기간. 본 연구의 한가지 목표는 베바시주맙(AVASTEST®)과 플라세보 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 3-9개월인 것에서부터 베바시주맙(AVASTEST®)과 키메라 항엔도글린 항체 암의 경우, 무진행 생존 기간이 약 4-12개월(또는 초과)인 것으로 무진행 생존 기간이 증가하였음을 입증하는 것이었다. 평가할 수 있는 2차 결과 척도로는 반응 지속 기간, 종양 진행 시간, 전반적인 생존 기간, 중증 및 비중증 부작용을 포함하였다. 예를 들어, 치료는 질환의 진행을 방해할 수 있거나(즉, 정체시킬 수 있거나), 또는 개선시킬 수 있었다. 별법으로 또는 추가로, 다른 목표는 하기: 종양 부하 감소, 신생혈관형성 감소, 부작용 감소, 유해 반응 감소, 및/또는 환자 순응도 증가 중 하나 이상과 관련하여 측정될 수 있었다.

실시예 21

사이노몰구스 원숭이(Cynomolgus Monkey)에서의 전신 독성 연구

베바시주맙(AVASTEST®)과 조합하였을 때의 키메라 항엔도글린 항체의 독성에 관한 연구에서 사이노몰구스 원숭이를 사용하였다.

요약하면, 10.0 mg/kg, 30.0 mg/kg 또는 100.0 mg/kg의 키메라 항엔도글린 항체, 및 2.5, 5, 7.5, 10 또는 15 mg/kg의 베바시주맙(AVASTEST®)을 3주 동안 매주 원숭이에게 투여하였다. 플라세보 동물에게는 항체를 함유하지 않는 적절한 용액을 같은 스케줄로 투여하였다. 30 내지 60분에 걸쳐 정맥내 볼루스로서 투여량을 투여하고, 6마리 이상의 동물에 각 투여량 수준으로 투여하였다. 하기 지표들: 체중 측정, 기본 생리학적 임상 측정, 일련의 혈청 화학법, 혈액학적 평가 및 병리조직학적 평가 중 하나 이상을 통해 독성을 평가하였다.

실시예 22

사이노몰구스 원숭이에서의 국부적 독성 연구

유리체내 주사한 경우, 라니비주맙(LUCENTIS®)과 조합하였을 때의 키메라 항엔도글린 항체의 독성에 관한 연구에서 사이노몰구스 원숭이를 사용하였다.

요약하면, 0.25, 1.25 및 2.5 mg의 키메라 항엔도글린 항체, 및 0.5 mg의 라니비주맙(LUCENTIS®)을 6주 동안 매주 유리체내 주사에 의해 원숭이에게 투여하였다. 플라세보 동물에게는 항체를 함유하지 않는 적절한 용액을 같은 스케줄로 투여하였다. 유리체내 주사로서 투여량을 투여하고, 6마리 이상의 동물에 각 투여량 수준으로 투여하였다. 하기 지표들: 체중 측정, 기본 생리학적 임상 측정, 일련의 혈청 화학법, 혈액학적 평가 및 병리조직학적 평가 중 하나 이상을 통해 독성을 평가하였다.

실시예 23

세관망 형성

혈관신생은 관 형성에 대한 2차원 시험관내 모델에서 테스트할 수 있었다.

한 일례로, 항VEGF 항체, 키메라 항엔도글린 항체의 존재 또는 항VEGF 및 키메라 항엔도글린 항체 둘 다의 존재하에 서브융합된 조건하에서 8시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터 중 플라스크(Falcon, Becton-Dickinson: 미국 뉴저지 주 프랭클린 레이크스 소재)에서 5% 우태아 혈청 및 성장 인자를 함유하는 EGM-2 배지(Clonetics: 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에 웰당 5,000개의 세포로 HUVEC를 배양하였다. 관련이 없는 IgG 항체를 별도의 대조군으로서 포함하였다. 이어서, HUVEC 세포를 트립신으로 가볍게 처리하고, 10,000개 내지 15,000개의 세포 중합화된 EC매트릭스(ECMatrix) 겔(시험관내 혈관신생 분석용 키트, Chemicon) 상에 접종하였다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 현미경으로 세포를 시각화하고, 폐 폴리곤의 개수를 계수하고, 연속 내피 세포의 길이를 측정하고, 사진 촬영하였다. 모든 실험 조건에 대해 3중으로 테스트하였다.

실시예 24

발아 분석

혈관신생은 발아에 대한 3차원 시험관내 모델에서 테스트할 수 있었다. 제대로부터 HUVEC를 단리시키고, 37℃ 및 5% CO₂ 하에 10% 우태아 혈청(FBS: fetal bovine serum)(GIBCO: 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 및 내피 세포 성장 보충제(ECGS: endothelial cell growth supplement)(BD Biosciences: 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)로 보충된 M199 중에서 성장시켰다. 모든 실험을 위해 2 내지 4 계대 HUVEC를 사용하였다(0 계대는 초대 배양물이다). 37℃ 및 5% CO₂ 하에 10% FBS로 보충된 DMEM(GIBCO: 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 중에서 폐 섬유아세포(LF: lung fibroblast)를 통상적으로 성장시키고, P10 내지 P15 사이의 것을 사용하였다. ATCC로부터 입수가능한 다른 섬유아세포주 또한 사용할 수 있다.

세포 제조

비딩 1 내지 2일 전 M199/10% FBS/펜-스트렙(Pen-Strep)(1:100) 중에서 HUVEC 및 섬유아세포를 확장시켰다. HUVEC의 경우, 비딩하기 바로 전날 배지를 EGM-2(Clonetics, 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)로 교체하였다. 섬유아세포의 경우, 포매시키기 바로 전날 배지를 EGM-2로 교체하였다. 비딩을 위해서는 비드 1개당 대략 400개의 HUVEC가 필요하였다. 섬유아세포는 24 웰 플레이트에 대해 웰당 20,000개의 세포가 사용되었다. 96 웰 플레이트 또한 상기에 따라 일정 비율로 규모가 조절된 양으로 사용될 수 있다.

시토덱스 ( Cytodex ) 3 비드 제조

예를 들어, 시토덱스 3 미립담체 비드를 본 분석에 사용할 수 있었다(Amersharn Pharmacia Biotech: 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재).

50 ml 튜브 중 실온(RT: room temperature)에서 3시간 이상 동안 50 ml PBS(pH = 7.4) 중에서 건식 비드(0.5 g)를 수화시키고, 팽윤시키고, 로커 위에 놓았다.

비드를 정치시켰다(약 15분). 상등액을 버리고, 새 PBS(50 ml) 중에서 수분에 걸쳐 비드를 세척하였다.

세척된 PBS를 분리하고 새로운 PBS로 대체하였다:

비드 현탁액을 (예를 들어, Windshield Wiper 또는 Sigrnacote로부터 입수한) 실리콘으로 처리된 유리병에 넣었다. 115℃에서 15 min 동안 오토클레이브시켜 비드를 멸균시키고, 4℃에서 보관하였다.

시약

피브리노겐 용액

37℃ 수조 중 DPBS에 2 mg/ml 피브리노겐을 용해시켜 피브리노겐 용액을 제조하였다. 이어서, 튜브를 와동시키기보다는 도립시켜 상기 용액을 혼합하였다. 응고가능한 단백질의 비율(%)을 측정하고, 그에 따라 조절할 수 있었다. 이어서, 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켜 멸균시켰다.

아프로티닌

동결건조된 아프로티닌을 DI수 중에서 4 U/ml로 재구성하고, 멸균여과시킬 수 있었다. 각 1 ml의 분취액을 제조하고, -20℃에서 보관하였다.

트롬빈

트롬빈을 멸균수 중에서 50 U/ml로 재구성하였다. 0.5 ml의 분취액을 제조하고, -20℃에서 보관하였다.

비드를 HUVEC 로 코팅(1일째)

HUVEC 세포를 트립신으로 처리하였다. 비드를 정치시키고(원심분리하지 않음), 상등액은 흡인시키고, 간단히 1 ml의 가온 EGM-2 배지 중에서 비드를 세척하였다. FACS 튜브 중 1.5 ml의 가온 EGM-2 배지 중에서 1 x 10⁶개의 HUVEC와 비드(2,500개)를 혼합하고, 인큐베이터에 수직으로 꽂아 놓았다. (이는 대략 10개의 웰에 충분할 것이며; 필요하다면 규모를 확장시킬 수 있다).

매 20분마다 튜브를 도립시켜 혼합시키면서, 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. (비딩 후 비드는 최소 골프공 크기 정도로 보여야 하는데, 이는 발아를 위해 충분한 코팅이 이루어졌음을 나타낸다).

4시간 후, 코팅된 비드를 T25 조직 배양 플라스크(Falcon: 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)로 옮기고, 37℃ 및 5% CO₂ 하에 5 ml의 EGM-2 배지 중에서 밤새도록 인큐베이션시켰다.

코팅된 비드를 피브린 겔 중에 포매 (0일째)

상기 기술된 바와 같이 2.0 mg/ml 피브리노겐 용액을 제조하고, 0.15 유닛/ml의 아프로티닌을 피브리노겐 용액에 첨가하였다.

코팅된 비드를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 비드를 정치시켰다.

비드를 1 ml의 EGM-2 배지 중에 재현탁시키고, 1.5 ml 원심분리 튜브로 옮겼다. 비드를 1 ml의 EGM-2 배지로 3회에 걸쳐 세척하고, P1000 피펫으로 천천히 상하로 피펫팅하여 혼합하였다. 커버슬립 상에서 비드를 계수하고, 500개의 비드/ml 농도로 피브리노겐 용액 중에 재현탁시켰다.

트롬빈(0.625 유닛/ml)을 24 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 각 웰에 대한 피펫 팁을 교체하면서 각 웰에 피브리노겐/비드 현탁액(0.5 ml)을 첨가하였다.

약 4 내지 5회에 걸쳐 완만하게 상하로 피펫팅하여 트롬빈 및 피브리노겐/비드를 혼합하고; 피브린 겔 중 기포가 형성되지 않도록 하였다. 대조군 샘플을 항체 또는 하나 이상의 대조군 항체의 부재하에서 처리하였다. 테스트 샘플을 항엔도글린 항체 단독으로, 항VEGF 항체 단독으로 처리하거나, 또는 그의 조합으로 처리하였다. 여러 개의 다중 농도로 제제를 테스트할 수 있었다. 피브리노겐/비드 용액을 실온에서 5분 동안 및 37℃/5% CO₂에서 15 min 동안 응고시켰다. 전단 피브린을 최소화하기 위해 처음 5 min 응고되는 동안 플레이트를 건드리지 않는 것이 중요하며, 이를 통해 발아는 감소될 수 있다.

EGM-2(1 mL)를 적가 방식으로 각 웰에 첨가하였다. 폐 섬유아세포를 20,000개의 세포/웰의 농도로 응괴 상부에 시딩하였다. 원하는 만큼 성장이 이루어질 때까지 격일로 배양 배지를 새 EGM-2 배지로 교체하였다.

피브린 겔이 형성된 경우, 소량의 기포가 겔 중에 존재할 수 있다; 이는 3 내지 4일 경과 후에는 소멸할 것이다. 2일째 내지 4일째 사이에 발아가 뚜렷히 관찰되어야 한다. 약 4일째 내지 5일째 루멘이 형성되기 시작하여 발아는 계속하여 신장되었다. 약 4일째 내지 6일째 새로 형성된 관이 분지화되기 시작하였다. 약 6일째 내지 7일째까지 미세혈관 유사 구조는 인접한 관과 문합하기 시작하였고; 웰당 비드 개수의 증가로 문합은 보다 조기에 이루어졌다.

도 3에 도시된 바와 같이, 콜라겐에 시딩된 HUVEC 구상체를 사용하여 키메라 TRC105는 용량에 의존하는 방식으로 VEGF 유도성 발아를 억제시켰다(N=3).

추가로, 도 4에서 입증된 바와 같이, 키메라 TRC105는 VEGF 유도성 발아를 차단시킨 반면(사선형 해칭), HUVEC 구상체의 bFGF 유도성 발아는 억제시키지 못했다(다이아몬드형 해칭)(N=2).

도 5에 도시된 바와 같이, 키메라 TRC105가 VEGF 유도성 발아에 미치는 억제 효과(사선형 해칭)는 VEGF 억제제 아바스틴®과 함께 조합되었을 때(다이아몬드형 해칭) 증진되었다.

도 6은 키메라 TRC105가 EGF 유도성 발아에 미치는 억제 효과(사선형 해칭)가 키나제 억제제 PTK787과 함께 조합되었을 때(다이아몬드형 해칭)에는 증진되지 않았음을 나타낸다.

실시예 25

시험관내에서의 혈관신생 발아에 대한 면역세포화학법

내피 세포(EC) 핵 염색을 위해, 피브린 겔을 1 X PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, 밤새도록 2% 파라포름아미드 중에서 고정시켰다. 1 X PBS를 사용하여 2회 초과로 세척한 후, 이어서 겔을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로 염색하였다.

면역 염색을 위해, 먼저 간단하게 10 X 트립신으로 겔을 처리하여 LF를 제거하였다. 섬유아세포 모두가 제거되면 바로 혈청을 사용하여 분해를 중단시켰다. 이어서, HBSS(Cellgro: 미국 버지니아주 헌던 소재)를 사용하여 겔을 광범위하게 세척하였다(1X). 이어서, 10% 포르말린 중에서 10분 동안 배양물을 고정시키고, 5분 동안 0.5% 트리톤(Triton) X-100으로 투과시켰다. 2시간 동안 비특이 결합을 PBS 중 5% BSA 용액으로 차단시켰다.

차단 완충액 중 1/100의 희석율로 1차 항체를 사용하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 광범위하게 세척한 후, 결합된 항체는 1/1,000로 희석된 종 특이 알렉스플루오르(AlexFluor) 488 접합형 또는 알렉스플루오르 568 접합형의 2차 항체 희석액(Molecular Probes: 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)에 의해 검출하였다. 이소형 특이 비결합 항체를 대조군으로서 사용하였다. 배경이 높을 경우, 1차 또는 2하 항체의 농도를 감소시키고, 필요할 경우, 인큐베이션 및/또는 세척 횟수를 증가시킬 수 있었다. F-액틴은 0.2 μM 농도의 TRITC-팔로이딘(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)으로 염색하였다.

디지털 카메라와 커플링된 1X70 올림푸스(Olympus) 현미경 상에서 위상차 및 형광 영상을 포착하였다. 2광자 칼 자이스 마이크로이미징 LSM 510 메타(Carl Zeiss Microimaging LSM 510 Meta) 현미경 상에서 형광 Z 시리즈 영상 스택을 포착하고, 메타모르프(Metamorph) 소프트웨어(Universal Imaging Corporation: 미국 펜실베이니아주 다우닝타운 소재)를 사용하여 3차원 표면 양식으로 편집하였다. 따라서, 각종 마커의 발현을 쉽게 검출할 수 있었다.

배양물의 z 축을 따라 진행된 형광 광학 영상 스택을 포착하여 혈관을 3D로 표현할 수 있었다. 핵은 DAPI(녹색)로 염색하고, 혈관벽은 비멘틴(오렌지색)으로 염색하였다. 단층의 내피 세포로 둘러싸인 넓은 중공성 루멘을 시각적으로 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 시험관내 분석법에서 제시된 루멘은 대개 마트리겔(마트리겔) 분석법으로 관찰되는 바와 같이 세포내가 아닌 세포 사이에 존재한다는 것을 상기 영상을 통해 확인하였다. 추가로, HUVEC가 루멘쪽으로 향해 있는 첨단막과, 콜라겐 IV가 기저막과 피브린 겔과 나란히 놓인 기저막을 가지고 있다는 점에서 HUVEC는 분극화되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 26

맥락막 신생혈관형성 억제

동물에서 노인성 황반 변성(AMD) 그 자체가 발생되는 것은 아니지만, AMD에서 관찰되는 것과 유사한 맥락막 신생혈관형성은 브루크막 및 위에 가로 놓인 망막 색소 상피(RPE)를 집중적으로 파괴시키는 레이저의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 이러한 손상은 내재성 맥락막 모세 혈관의 RPE 층 및 망막하 공간으로의 비정상적인 성장을 자극시킨다. 브루크막의 파괴는 습식 형태의 AMD을 특징으로 하는 것을 비롯한, 모든 형태의 맥락막 신생혈관형성(CNV)에 공통적이다.

레이저로 유도된 맥락막 신생혈관형성 모델에서, 레이저로 손상시키기 하루 전날, 및 레이저 처리 후 2, 4, 8, 및 11일째 9 또는 10마리의 마우스로 구성된 군에 (1) 키메라 항엔도글린 항체 단독, (2) 항VEG 항체 단독, (3) 같은 조성물 또는 다른 조성물의 형태로 항VEGF 항체와 함께 조합된 키메라 항엔도글린 항체, 또는 (4) 대조군 항체를 피하(sc) 주사하여 처리하였다. 레이저 처리 후 14일째, 플루오레세인으로 표지된 덱스트란(50 mg)을 마우스에 정맥내로 주사하고, 안락사시키고, 맥락막 편평 표본을 위해 눈을 신속하게 해부하거나, 화합물에 포매시켜 최적의 절단 온도로 냉동시키고 병변 평가를 위해 절편으로 만들었다.

실시예 27

사이노몰구스 원숭이 성체에서 본원에 기술된 조성물이 레이저로 유도된 맥락막 신생혈관형성에 미치는 효과 또한 평가하였다.

본 실험에서는 (1) 키메라 항엔도글린 항체 단독, (2) 항VEG 항체 단독, (3) 같은 조성물 또는 다른 조성물의 형태로 항VEGF 항체와 함께 조합된 키메라 항엔도글린 항체, 또는 (4) 대조군 항체를 정맥내 또는 유리체내 주사하여 투여하였다. 각 동물의 각 망막에 9 내지 10번의 레이저 화상을 가하고, 처리 개시 전에 한번, 및 레이저 처리 후 15, 20 및 29일째 플루오레세인 혈관조영술에 의해 활성 맥락막 신생혈관형성 병변 발생에 대해 평가하였다. 레이저로 손상시키기 1주일 전에 시작하여 주 1회씩 조성물을 정맥내로 투여하였다. 레이저로 손상시키기 1주일 전에 시작하여 매 2주마다 1회, 또는 이미 활성 CNV 병변이 형성된 시점인 레이저 처리 후 2주 경과하였을 때 한번 유리체내 주사하였다. 대조군 동물은 레이저로 손상시키기 1주일 전에 시작하여 매주 정맥내로, 2주마다 유리체내 주사에 의해 플라세보를 투여받았다.

플루오레세인 혈관조영술에 의해 CNV 병변을 시각화하고, 표준 방법에 따라 등급화하였다.

실시예 28

노인성 황반 변성 치료

1차 연구

노인성 황반 변성의 소견을 보이는 환자에 (1) 키메라 항엔도글린 항체 단독, (2) 라니비주맙 단독, (3) 같은 조성물 또는 다른 조성물의 형태로 라니비주맙과 함께 조합된 키메라 항엔도글린 항체, 또는 (4) 신생혈관형성, 황반 질환, 및 망막 손상의 발생을 감소시키거나, 예방하는 대조군 항체를 유리체내 주사하여 치료하였다.

치료 제1 단계로서, 환자에서 전반적인 외안부 검사를 실시하여 안구 건강에 대한 기준선을 확립하였다. 외안부 검사는 간접 검안경검사, 세극등 현미경 검사, 주변 망막 검사, 안압 측정, 시력(나안 시력(unaided) 및 최대 교정 시력) 증상학법, 안저촬영술, 플루오레세인 혈관조영술, 광간섭성 단층촬영술, 망막 전도 검사법 및 A 스캔 측정법을 포함한다.

예비 검사 후, AMD 소견을 보이는 환자의 이환부 눈 유리체내에 상기 기술된 바와 같이 주사하였다. 양쪽 눈 모두가 이환된 상태일 경우, 이들을 따로따로 치료할 수 있다. 치료하고자 하는 눈에 점안액을 주사하였다.

치료 후, 환자의 눈을 1일째(1), 2일째(2), 7일째(7), 15일째(15), 30일째(30), 및 60일째(60) 및 그 후 2년 동안 매달 검사하였다. 재발 가능성이 있기 때문에, 환자는 그 이후에 매월 정기 검진을 받도록 하였다. 매 검사일날, 환자의 유리체액화에 대해 모니터링하였다. 추가로, 공막 누르기를 해서 간접 검안경검사를 사용함으로써 환자의 후유리체 박리에 대해 모니터링하였다. 마지막으로, 정기 망막 검진, 광간섭성 단층촬영술, 및 플루오레세인 혈관조영술을 통해 환자가 제시하는 AMD 정도를 연속하여 모니터링함으로써 망막하액 존재, 혈액, 삼출물, RPE 분리, 낭포 망막 변화, 또는 회색 기미의 녹색 망막하 신생혈관형성 막 존재에 대해 모니터링하였다. 재발성 신생혈관형성의 징후가 관찰될 경우 추가 치료를 필요로 할 수 있다. 추가 치료는 매주 또는 매월 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 초기 치료 수행 후 1-6개월 사이의 기간이 경과한 후에 추후 치료를 수행한다.

2차 연구

목적: 신생혈관형성 노인성 황반 변성(AMD) 치료를 위한 유리체내 키메라 항엔도글린 항체 및 라니비주맙의 효능을 입증하기 위함이다.

방법: AMD로부터 유발된 황반하 맥락막 신생혈관형성(CNV)을 앓는 50 내지 500명의 환자(50 내지 500개의 눈)가 허가받은 장소에서의 본 연구에 참가하였다.

재주사에 대한 기준은 황반내 체액 존재, 망막 중심의 두께(CRT: central retinal thickness)가 100 ㎛ 이상 증가, 황반내 체액 존재와 관련된 5개 이상의 문자에 대한 시력 손실, 새로운 고전적 CNV, 또는 새로운 황반 출혈이었다. 주요 결과 측정값은 12개월 후 15개 미만의 문자에 대한 시력 손실을 가진 눈의 비율이다. 최대 교정 시력 측정 및 임상 안구 검사를 1주째, 1개월째 및 이어서 5-12개월 동안 매달 수행하였다.

기준선과의 비교로 평균 시력 및 평균 CRT를 측정하였다. 안구 및/또는 전신 부작용에 대해 기록하였다.

실시예 29

손상으로 인해 유도된 각막 신생혈관형성의 억제

3개의 나일론 봉합사를 간질내 배치시키거나, 또는 (NaOH를 사용하여) 화학적으로 손상시키고, 각막 상피의 죽은 조직은 기계적으로 제거함으로써 수컷 C57BL/6 마우스에서 각막 신생혈관형성을 유도하였다. (1) 키메라 항엔도글린 항체 단독, (2) 항VEGF 항체 단독, (3) 같은 조성물 또는 다른 조성물의 형태로 항VEGF 항체 단독인 것과 함께 조합된 키메라 항엔도글린 항체, 또는 (4) 대조군 항체를 손상 이전 또는 이후 즉시 1회 또는 다중 시점에 복강내로 투여하는 다중 실험을 수행하였다.

세극등 현미경 검사 및 조직학적 평가에 의해 각막의 신생혈관의 성장에 대해 평가하였다. 혈관구조를 내피 세포 특이 플루오레세인에 접한된 렉틴으로 표지하고, PECAM 면역조직화학법을 사용하여 각막 편평 표본뿐만 아니라, 단면에서도 신생혈관형성을 평가하였다. 세극등 현미경 검사를 사용하여 각막 부종의 존재에 대해 평가하고, 단면으로 각막의 두께를 측정하였는데; 각막 두께의 증가는 부종 양을 반영하는 것이다. 각각 HEMA-3 또는 래트 항마우스 F4/80 모노클로날 항체로 단면을 염색함으로써 다형핵 백혈구(PMN: polymorphonuclear leukocyte) 및 대식세포의 개수를 측정하였다.

본원에 기술된 실시양태의 측면들은 본 정신 또는 그의 본질적인 특징들로부터 벗어남 없이 다른 형태로 구현될 수 있거나, 다른 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 모든 측면에서 제한하고자 하는 것이 아닌, 예시적인 것으로서 간주되어야 하고, 의미 및 등가 범위내에 존재하는 모든 변형도 그 안에 포함시키고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> TRACON PHARMACEUTICALS, INC. <120> COMBINATION THERAPY OF CANCER WITH ANTI-ENDOGLIN ANTIBODIES AND ANTI-VEGF AGENTS <130> 35882-712.601 <140> PCT/US2010/045651 <141> 2010-08-16 <150> 61/234,574 <151> 2009-08-17 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 12 His His His His His His 1 5

Claims (28)

1. 세포를, 키메라 항엔도글린 항체를 포함하는 조성물 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 VEGF 유도성 발아(sprouting)를 억제하는 방법으로서,
   상기 키메라 항엔도글린 항체는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역(V_L); 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역(C_L); 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역(V_H); 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가진 불변 영역(Fc)을 포함하는 것인, VEGF 유도성 발아를 억제하는 방법.
2. 키메라 항엔도글린 항체를 포함하는 조성물 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
   상기 키메라 항엔도글린 항체는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역(V_L); 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역(C_L); 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역(V_H); 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가진 불변 영역(Fc)을 포함하는 것인, 피험체에서 암 성장을 억제하는 방법.
3. 키메라 항엔도글린 항체를 포함하는 조성물 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
   상기 키메라 항엔도글린 항체는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역(V_L); 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역(C_L); 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역(V_H); 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가진 불변 영역(Fc)을 포함하는 것인, 피험체에서 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항엔도글린 항체가 치료학적 라벨, 진단 라벨, 또는 그 둘 다로 추가로 표지된 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 길항제가 추가로 치료학적 라벨, 진단 라벨, 또는 그 둘 다로 추가로 표지된 것인 방법.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환이 암, 또는 전이인 방법.
8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 고형 종양인 방법.
9. 제7항에 있어서, 암이 상피계 종양인 방법.
10. 제7항에 있어서, 암이 폐암, 부인과 악성종양, 흑색종, 유방암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 결장직장암, 전립선암, 콩팥암, 두부암(head cancer), 췌장암, 간암(간세포암), 자궁암, 경부암(neck cancer), 콩팥암(신세포암), 육종, 골수종 및 림프종으로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환이 혈관신생/신생혈관형성을 특징으로 하는 안질환, 당뇨 신장병증, 염증성 장 질환(IBD), 류마티스 관절염, 골관절염, 암, 또는 전이인 방법.
12. 제11항에 있어서, 안질환이 황반 변성인 방법.
13. 제11항에 있어서, 안질환이 당뇨 망막병증인 방법.
14. 제11항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환이 염증성 장 질환(IBD)인 방법.
15. 제11항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환이 류마티스 관절염인 방법.
16. 제11항에 있어서, 혈관신생과 관련된 질환이 골관절염인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항엔도글린 항체가 약 0.01 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg의 양으로 조성물 중에 존재하는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 길항제가 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 7.5 mg/kg, 약 10 mg/kg 또는 약 15 mg/kg의 양으로 조성물 중에 존재하는 것인 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항엔도글린 항체 및 VEGF 길항제가 같은 조성물 중에 존재하는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항엔도글린 항체 및 VEGF 길항제가 다른 조성물 중에 존재하는 것인 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항엔도글린 항체 및 VEGF 길항제가 순차적으로 투여되는 것인 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항엔도글린 항체 및 VEGF 길항제가 동시에 투여되는 것인 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항엔도글린 항체 및 VEGF 길항제가 같은 부위에 투여되는 것인 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항엔도글린 항체 및 VEGF 길항제가 다른 부위에 투여되는 것인 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 길항제가 항VEGF 항체인 방법.
26. 제25항에 있어서, 항VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 혈관신생 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 혈관신생 억제제가 화학요법, VEGF 수용체 억제제 또는 그의 조합인 방법.

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