ES2619709T5 - Agentes de unión a esclerostina - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Agentes de unión a esclerostina
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a anticuerpos capaces de unirse a esclerostina o fragmentos de la misma.
Antecedentes de la invención
Durante la vida de un individuo suceden dos o tres fases de cambios distintas en la masa ósea (véase Riggs, West J. Med. 154: 63-77 (1991)). La primera fase se produce tanto en hombres como en mujeres y continúa hasta la consecución de una masa de hueso máxima. Esta primera fase se consigue mediante crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondriales y crecimiento radial debido a una tasa de aposición perióstea. La segunda fase comienza aproximadamente a los 30 años para el hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y la pelvis) y aproximadamente a los 40 años para hueso cortical (por ejemplo, huesos largos hallados en las extremidades) y continúa hasta la vejez. Esta fase se caracteriza por pérdida de hueso lenta y se produce tanto en hombres como en mujeres. En mujeres, también se produce una tercera fase de pérdida de hueso, más probablemente debido a deficiencias de estrógenos posmenopáusicas. Durante esta fase solamente, las mujeres pueden perder una masa de hueso adicional del hueso cortical y del compartimento trabecular (véase, Riggs, mencionado anteriormente).
La pérdida de contenido mineral óseo puede estar provocada por una amplia diversidad de afecciones y puede dar como resultado problemas médicos significativos. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en seres humanos y está caracterizada por reducciones notables de la masa ósea esquelética y densidad mineral, deterioro estructural del hueso, incluyendo degradación de la microarquitectura del hueso y aumentos correspondientes de la fragilidad ósea (es decir, reducciones de la fuerza ósea), y susceptibilidad a fractura en individuos aquejados. La osteoporosis en seres humanos está generalmente precedida de osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor de una desviación típica pero menor de 2,5 desviaciones típicas por debajo del valor medio para hueso adulto joven), una afección hallada en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Se ha diagnosticado a otros 7-8 millones de pacientes en Estados Unidos con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral óseo mayor de 2,5 desviaciones típicas por debajo de la del hueso de adulto joven maduro). La frecuencia de osteoporosis en la población humana aumenta con la edad. Entre los caucásicos, la osteoporosis es predominante en mujeres quienes, en los Estados Unidos, comprenden el 80% del grupo de pacientes con osteoporosis. La fragilidad aumentada y susceptibilidad a fractura del hueso esquelético en los ancianos está agravada por el mayor riesgo de caídas accidentales en esta población. Las fracturas de caderas, muñecas y vértebras están entre las lesiones más habituales asociadas con la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente incómodas y caras para el paciente, y para las mujeres se correlacionan con altas tasas de mortalidad y morbilidad.
Aunque la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a la reducción de la masa ósea, pocos de los tratamientos actualmente disponibles para trastornos esqueléticos pueden aumentar la densidad ósea de los adultos, y la mayoría de los tratamientos disponibles en la actualidad actúa principalmente inhibiendo adicionalmente la resorción del hueso en lugar de estimular nueva formación de hueso. El estrógeno se está prescribiendo ahora para retardar la pérdida de hueso. Sin embargo, existe cierta controversia sobre si los pacientes obtienen algún beneficio a largo plazo y si el estrógeno tiene algún efecto en pacientes de más 75 años de edad. Además, se cree que el uso de estrógenos aumenta el riesgo de cáncer de mama y endometrio. También se ha sugerido calcitonina, osteocalcina con vitamina K o altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, para mujeres posmenopáusicas. Las altas dosis de calcio, sin embargo, tienen con frecuencia efectos secundarios gastrointestinales no deseados, y los niveles de calcio en suero y orina deben supervisarse continuamente (por ejemplo, Khosla y Riggs, Mayo Clin. Proc. 70: 978982, 1995).
Otros enfoques terapéuticos actuales para la osteoporosis incluyen bifosfonatos (por ejemplo, Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronato, neridronato, skelid, bonefos), hormona paratiroidea, calcilíticos, calcimiméticos (por ejemplo, cinacalcet), estatinas, esteroides anabólicos, sales de lantano y estroncio y fluoruro sódico. Dichos compuestos terapéuticos, sin embargo, se asocian con frecuencia con efectos secundarios indeseables (véase Khosla y Riggs, mencionado anteriormente).
La esclerostina, el producto del gen SOST, está ausente en esclerosteosis, una enfermedad esquelética caracterizada por sobrecrecimiento del hueso y huesos densos fuertes (Brunkowet al.,Am. J. Hum. Genet., 68: 577 589, 2001; Balemanset al.,Hum. Mol. Genet., 10: 537-543, 2001). La secuencia de aminoácidos de la esclerostina humana se ha presentado en Brunkowet al.en la referencia anterior y se divulga en el presente documento como SEQ ID NO: 1.
Los documentos WO 2005/014650 y WO 2005/003158 describen anticuerpos para esclerostina. Avsian-Kretchmer y Hsueh (2004) Molecular Endocrinology 18(1), 1-12 describe análisis genómico comparativo de antagonistas de la proteína morfogenética del hueso que contiene nudo de cisteína anular de ocho miembros.
Breve sumario de la invención
Se divulgan en el presente documento composiciones que pueden usarse para aumentar al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea, y que puede por lo tanto usarse para tratar una amplia diversidad de afecciones en las que sea deseable un aumento de al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. La presente invención también ofrece otras ventajas relacionadas descritas en el presente documento.
La divulgación se refiere a regiones (epítopos) de esclerostina humana reconocidas por los anticuerpos desvelados en el presente documento, métodos de uso de estos epítopos y métodos para preparar dichos epítopos.
La divulgación también se refiere a epítopos específicos de la región de nudo de cistina de esclerostina y anticuerpos que se unen específicamente con esa región.
Los anticuerpos pueden unirse específicamente a esclerostina. Los anticuerpos pueden bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina y/o bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento. Los anticuerpos también pueden caracterizarse por su patrón de unión con péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídico de esclerostina humana” como se divulga en el presente documento.
Los anticuerpos pueden aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.
Los anticuerpos pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
La divulgación se refiere a métodos para obtener epítopos adecuados para su uso como inmunógenos para generar, en mamíferos, anticuerpos tales como anticuerpos capaces de unirse específicamente a esclerostina; en ciertas realizaciones los anticuerpos generados son capaces de neutralizar la actividad de esclerostinain vivo.
La divulgación se refiere además a una composición para inducir un anticuerpo específico de esclerostina cuando la composición se administra a un animal, comprendiendo la composición un polipéptido que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, en las que SEQ ID NO: 2 y 4 se unen por un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 57 y 111 en referencia a SEQ ID NO: 1, y SEQ ID NO: 3 y 5 se unen por (a) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 82 y 142 en referencia a SEQ ID NO: 1 y (b) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 86 y 144 en referencia a SEQ ID NO: 1.
La divulgación también se refiere al polipéptido T20,6 que consiste en una proteína esclerostina humana truncada en múltiples puntos de SEQ ID NO: 1, en el que los aminoácidos 1-50, 65-72, 91-100, 118-137 y 150-190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes del polipéptido; este polipéptido puede obtenerse por digestión tríptica de esclerostina humana y la proteína puede aislarse por fraccionamiento de HPLC.
La divulgación también se refiere a la parte inmunogénica T20,6 de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 y 138-149 de SEQ ID NO: 1; en la que la parte inmunogénica comprende:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144.
La divulgación también se refiere a un derivado de parte inmunogénica T20,6 de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 57-64, 73-86, 111-117 y 138-144 de SEQ ID NO: 1; en la que la parte inmunogénica comprende:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144.
La divulgación también se refiere además a un polipéptido que consiste esencialmente en una proteína esclerostina humana de SEQ ID NO: 1 truncada en los extremos C terminal y N terminal, en el que los aminoácidos 1-85 y 112 190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes del polipéptido.
La divulgación también se refiere a una parte inmunogénica de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 6).
La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 92-109 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96).
La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 99-120 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
La divulgación se refiere a un método para producir una parte inmunogénica de esclerostina humana, que comprende las etapas de:
(a) tratar la esclerostina humana para conseguir digestión tríptica completa:
(b) recoger la muestra de digestión tríptica completa que tiene peso molecular promedio de 7122,0 Dalton (masa teórica 7121,5 Dalton) o tiempo de retención de aproximadamente 20,6 minutos como se determina por elución de una columna de HPLC de fase inversa con gradiente lineal de ácido trifluoroacético 0,05 % a acetonitrilo 90 % en TFA 0,05 % a un caudal de 0,2 ml/min; y
(c) purificar la parte inmunogénica.
La divulgación también se refiere a un método para generar un anticuerpo capaz de unirse específicamente a esclerostina, comprendiendo el método:
(a) inmunizar un animal con una composición que comprende polipéptido T20,6 o un derivado de T20,6;
(b) recoger suero del animal; y
(c) aislar del suero un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina.
La divulgación también se refiere a un método para detectar un anticuerpo antiesclerostina en una muestra biológica, que comprende las etapas de
(a) poner en contacto la muestra biológica con el polipéptido T20,6 o un derivado de T20,6 en condiciones que permitan que se forme un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido; y
(b) detectar la presencia o ausencia del complejo,
en el que la presencia del complejo indica que la muestra biológica contiene un anticuerpo antiesclerostina.
La divulgación se refiere además a un anticuerpo de esclerostina que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D con una proteína esclerostina. La unión del anticuerpo con esclerostina también puede bloquearse de forma cruzada por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o similares. La divulgación se refiere además a un anticuerpo de esclerostina cuya unión con esclerostina está bloqueada de forma cruzada por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o similares.
La divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24) con una proteína de esclerostina. El anticuerpo también puede bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24). El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo aislado que está bloqueado de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24); el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.
La divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado que muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” al que se muestra por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D; el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, o un anticuerpo quimérico.
La divulgación se refiere además adicionalmente al tratamiento de un trastorno óseo asociado con al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, baja calidad ósea y baja fuerza ósea en un sujeto mamífero. Se proporciona a un sujeto que necesite dicho tratamiento una cantidad de un anticuerpo antiesclerostina o fragmento de unión a esclerostina del mismo suficiente para aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea.
La divulgación también se refiere a un polipéptido de esclerostina aislado o fragmentos del mismo, en el que el polipéptido contiene 6 restos de cisteína conservados y los fragmentos del mismo comprenden de 7 a 14 aminoácidos de SEQ ID NO: 2; de 8 a 17 aminoácidos de SEQ ID NO: 3; de 8 a 18 restos de<s E q>ID NO: 4, y de 6 a 12 restos de SEQ ID NO: 5, y el polipéptido o fragmentos del mismo se estabilizan por enlaces disulfuro entre SEQ ID NO: 2 y 4, y entre SEQ ID NO: 3 y 5; el polipéptido o fragmentos pueden comprender 10-14 aminoácidos de SEQ ID NO: 2; de 14 a 17 aminoácidos de SEQ ID<n O :>3; de 13 a 18 aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y de 8 a 12 restos de SEQ ID NO: 5; y el polipéptido o fragmentos pueden comprender SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina humana. Los anticuerpos pueden bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina humana y/o bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina humana por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento.
También se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que puede aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido de mineral del hueso, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.
También se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
También se desvela un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360, y variantes de las mismas, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la esclerostina.
También se desvela un anticuerpo, que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360 y variantes de las mismas.
También se desvelan regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividadin vivode la proteína. Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 1A) (SEQ ID NO: 23) y cadena pesada (Figura 1B) (SEQ ID NO: 27) para el anticuerpo Ab A antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 2 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 2A) (SEQ ID NO: 31) y cadena pesada (Figura 2B) (SEQ ID NO: 35) para el anticuerpo Ab-B antiesclerostina.
La Figura 3 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 3A) (SEQ ID NO: 15) y la cadena pesada (Figura 3B)<( s E q>ID NO: 19) para el anticuerpo Ab-C antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 4 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 4A) (SEQ ID NO: 7) y la cadena pesada (Figura 4B)<( s E q>ID NO: 11) para el anticuerpo Ab-D antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 5 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34), Ab-A o Ab-B.
La Figura 6 muestra la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 2 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34) o Ab-C.
La Figura 7 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo o Ab-D.
La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal escindido) de esclerostina humana (SEQ ID NO: 1). También se representa la secuencia de nucleótidos de la región codificante de esclerostina humana que codifica la forma madura de esclerostina humana. Las ocho cistinas están numeradas C1 a C8. El nudo de cistina está formado por tres enlaces disulfuro (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 y C6 también forman un enlace disulfuro, sin embargo este disulfuro no es parte del nudo de cistina.
La Figura 9 representa un esquema de la estructura básica de la esclerostina humana. Hay una rama N-terminal (del primer Q a C1) y una rama C-terminal (de C8 al Y terminal). Entre estas ramas está la estructura de nudo de cistina (formada por tres disulfuros: C1-C5; C3-C7; C4-C8) y tres bucles que están designados Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Las regiones distales del Bucle 1 y Bucle 3 están unidas por el disulfuro C2-C6. Se indican sitios de escisión de tripsina potenciales (arginina=R y lisina=K). Algunos de los sitios de escisión de AspN potenciales están indicados (solamente se muestran restos de ácido aspártico (D)).
La Figura 10 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina o AspN. Los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con tripsina están indicados (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) como lo están los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con AspN (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5).
La Figura 11 representa información de secuencia y masa para los péptidos con enlaces disulfuro de esclerostina humana aislados generados por digestión con tripsina. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó por análisis de ESI-LC-MS.
La Figura 12 representa la información de secuencia y masa para los péptidos de esclerostina humana aislados generados por digestión con AspN. El péptido AspN22,7-23,5 contiene los 4 enlaces disulfuro. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó mediante análisis de ESI-LC-MS. La Figura 13 representa un esquema lineal de cuatro péptidos de esclerostina humana (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) generados por digestión con tripsina.
La Figura 14 muestra un esquema lineal de cinco péptidos de esclerostina humana (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5) generados por digestión con AspN. El pico de HPLC de AspN14,6 está compuesto de tres péptidos no unidos por ningún enlace disulfuro.
La Figura 15 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a la unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-A. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 16 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-B. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 17 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-C. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 18 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-D. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 19 muestra dos epítopos de unión a Mab de esclerostina humana. La Figura 19A muestra la secuencia del epítopo del Bucle 2 para unión de Ab-A y Ab-B con esclerostina humana (SEQ ID NO: 6). La Figura 19B muestra la secuencia, enlaces disulfuro y esquema del epítopo T20,6 para unión de Ab-C y Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 2-5).
La Figura 20 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina. La Figura 20A muestra la digestión del complejo de Ab-D de esclerostina humana. La Figura 20B muestra la digestión de la esclerostina humana sola. Se indican los picos de los péptidos T19,2, T20, T20,6 y T21-22.
La Figura 21 muestra la secuencia, enlace disulfuro y esquema del epítopo “derivado de T20,61 (nudo de cistina 4 ramas)” para unión de Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 70-73).
La Figura 22 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) de ratón se usó a 1 μg/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 y 5 μg/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 23 representa resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina humana (Scl) se usó a 1 μg/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 8 y 4 μg/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 24 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) humana se usó a 1 μg/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 μg/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 25 representa resultados de un modelo de ratón SCID de pérdida de hueso inducida por inflamación. El tratamiento con Ab-A protegió a los ratones de pérdida de hueso relacionada con inflamación asociada con colitis cuando se midió como densidad mineral ósea total (Figura 25A), densidad de hueso vertebral (Figura 25B) y densidad de hueso fémur (Figura 25C).
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere a regiones de la proteína esclerostina humana que contienen epítopos reconocidos por anticuerpos que también se unen a esclerostina de longitud completa, y métodos para preparar y usar estos epítopos. La invención también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina o parte de esclerostina. Los anticuerpos son útiles para bloquear o afectar a la unión de esclerostina humana con uno o más ligandos.
La esclerostina humana recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1589-ST-025). Anticuerpos monoclonales de unión a esclerostina de uso en investigación están disponibles en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; monoclonal de ratón 2006 cat. n° MAB1406; monoclonal de rata: 2006 cat. n° MAB1589). Las Patentes de Estados Unidos N° 6.395.511 y 6.803.453 y Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20040009535 y 20050106683 se refieren a anticuerpos anti-esclerostina en general.
Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión esclerostina humana incluya la proteína de SEQ ID NO: 1 y variantes alélicas de la misma. La esclerostina puede purificarse a partir de células hospedadoras 293T que se hayan transfectado por un gen codificante de esclerostina mediante elución de sobrenadante filtrado de fluido de cultivo de células hospedadoras usando una columna de Heparina HP, usando un gradiente salino. La preparación y purificación adicional usando cromatografía de intercambio catiónico se describen en los Ejemplos 1 y 2.
Los “agentes de unión” de la invención como se describe en lo sucesivo en el presente documento son anticuerpos, como se define en el presente documento. El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo. Un anticuerpo puede comprender una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonal, monoclonal, quimérica, humanizada o humana que tienen cadenas de longitud completa pesadas y/o ligeras) o comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos de cadena sencilla, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (Véase por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechonology, 23, 9, 1126-1136). También se desvelan polipéptidos de anticuerpo en la Patente de Estados Unidos N° 6.703.199, incluyendo monocuerpos de polipéptidos de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpos se desvelan en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2005/0238646, que son polipéptidos de cadena sencilla.
Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo con métodos convencionales. Como ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3,5S. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, Patente de Estados Unidos N° 4.331.647, Nisonoffet al.,Arch. Biochem. Biophys. 89; 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73; 119, 1959 Edelmanet al.,en Methods in Enzymology 1; 422 (Academic Press 1967); y en Andrews, S.M. y Titus, J.A. en Current Protocols in Immunology (Coligan J.E.,et al.,eds), John Wiley & Sons, Nueva York (2003), páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10A. 1-2.10A.5. También pueden usarse otros métodos para escindir anticuerpos, tales como separar cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes (Fd), escindir además fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que reconoce el anticuerpo intacto.
Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína modificada por ingeniería genética o sintética. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de cadena ligera, los fragmentos “Fv” que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligera y pesada están conectadas por un enlazador peptídico (proteínas scFv).
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Pueden obtenerse CDR (también denominadas “unidades de reconocimiento mínimas” o “región hipervariable”) construyendo polinucleótidos que codifiquen la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como un molde (véase, por ejemplo, Larricket al.,Methods; A Companion to Methods in Enzymology2:106, 1991; Courtenay-Luck “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” en Monoclonal Antibodies; Production, Engineering and Clinical Application, Ritteret al.(eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Wardet al.,“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birchet al.,(eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc.
1995)).
Por lo tanto, en una realización, el agente de unión comprende al menos una CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender además al menos un dominio de región variable de un anticuerpo descrito en el presente documento. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una secuencia de CDR responsable de la unión con esclerostina humana, por ejemplo CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y/o las CDR de cadena ligera descritas específicamente en el presente documento y que están adyacentes o en fase con una o más secuencias marco conservadas. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de cadena pesada (V<h>) y/o ligera (V<l>) de inmunoglobulina. Por lo tanto, por ejemplo, el domino de región V puede ser monomérico y ser un dominio V<h>o V<l>, que es capaz de unirse de forma independiente con esclerostina humana con una afinidad al menos igual a 1 x 10-7 M o menos como se describe posteriormente. Como alternativa, el dominio de región V puede ser dimérico y contener dímeros V<h>-V<h>, V<h>-V<l>o V<l>-V<l>. El dímero de región V comprende al menos una cadena V<h>y al menos una V<l>que pueden no estar asociadas covalentemente (denominado en lo sucesivo en el presente documento F<v>). Si se desea, las cadenas pueden estar acopladas covalentemente bien directamente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador para formar un Fv de cadena sencilla (scFv).
El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una versión modificada por ingeniería genética del mismo. Por versión modificada por ingeniería genética se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones modificadas por ingeniería genética incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, deleciones o cambios en o a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable modificados por ingeniería genética que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos marco de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de región variable puede estar unido covalentemente en un aminoácido C-terminal con al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Por lo tanto, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede estar unido a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De forma similar un dominio V<l>puede estar unido a un dominio C<k>o un fragmento del mismo. De este modo, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab donde el dominio de unión a antígeno contiene dominios V<h>y V<l>asociados unidos covalentemente en sus extremos C con un dominio CH1 y C<k>, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo para proporcionar una región bisagra o una parte de un dominio de región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios CH2y CH3 de anticuerpo.
Como se describe en el presente documento, los agentes de unión comprenden al menos una de estas CDR. Por ejemplo, una o más CDR pueden incorporarse en regiones marco conservadas de anticuerpos conocidas (IgG1, IgG2, etc.) o conjugarse con un vehículo adecuado para potenciar la semivida del mismo. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, Fc, polietilenglicol (PEG), albúmina, transferrina y similares. Estos y otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. Dichos péptidos de CDR conjugados pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica u otra. En una realización, uno o más polímeros solubles en agua están enlazados en una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino, de un agente de unión.
En ciertas realizaciones preferidas, un agente de unión comprende una o más uniones de polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitación, polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. En ciertas realizaciones, un agente de unión derivado comprende uno o más de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros. En ciertas realizaciones, uno o más polímeros solubles en agua están unidos aleatoriamente a una o más cadenas laterales. En ciertas realizaciones, PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica para un agente de unión, tal como un anticuerpo. Algunos de dichos procedimientos se analizan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 6.133.426.
Se apreciará que un agente de unión de la presente invención puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el agente de unión conserve especificidad de unión. Por lo tanto, están abarcadas dentro del alcance de la invención modificaciones de las estructuras de agentes de unión. Estas pueden incluir sustituciones de aminoácidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyen la capacidad de unión esclerostina de un agente de unión. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar restos de aminoácidos de origen no natural, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o revertidas de restos de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativa también puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto normativo de modo que haya poco o ningún efecto en la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición.
Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácidos o miméticos de aminoácidos por un miembro de otra clase con diferentes propiedades físicas (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homólogas de anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.
Además, un experto en la materia puede generar variantes de ensayo que contengan una sustitución de aminoácidos sencilla en cada resto de aminoácido deseado. Las variantes pueden después explorarse usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes podrían usarse para recopilar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubriera que un cambio en un resto de aminoácido particular diera como resultado actividad destruida, reducida de forma indeseable o inadecuada, podrían evitarse variantes con dicho cambio. En otras palabras, basándose en información recopilada de dichos experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos donde deberían evitarse sustituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones.
Un experto en la materia será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas. En ciertas realizaciones, un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En ciertas realizaciones, se pueden identificar restos y partes de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. En ciertas realizaciones, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura polipeptídica.
Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de función estructural que identifican restos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de los restos de aminoácidos en una proteína que corresponden a restos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos restos de aminoácidos importantes predichos. Un experto en la materia puede analizar también la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la materia puede predecir el alineamiento de restos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas realizaciones, un experto en la materia puede elegir no hacer cambios radicales a los aminoácidos que se ha predicho que están en la superficie de la proteína, puesto que dichos restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas.
Se han dedicado varias publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4); 422-427 (1996), Chouet al.,Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chouet al.,Biochemistry 113(2): 211-222 (1974); Chouet al.,Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47; 45-148 (1978); Chouet al.,Ann. Rev. Biochem., 47; 251-276 y Chouet al.,Biophys. J., 26; 367-384 (1979). Además, están disponibles en la actualidad programas informáticos para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en la realización de modelos de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tengan una identidad de secuencia mayor del 30% o similitud mayor del 40% tienen con frecuencia topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural proteica (PDB) ha proporcionado predictabilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holmet al.,Nucl. Acid. Res., 27(1); 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenneret al.,Curr. Op. Struct. Biol., 7(3); 369-376 (1997)) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que se ha resuelto un número de estructuras crítico, la predicción estructural se hará drásticamente más precisa.
Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen “reconocimiento de pliegues” (Jones, D., Curr., Opin. Struct. Biol., 7(3); 377-87 (1997); Sipplet al.,Structure, 4(1); 15-19 (1996)), “análisis de perfil” (Bowieet al.,Science, 253; 164-170 (1991); Gribskovet al.,Meth. Enzym., 183; 146-159 (1990); Gribskovet al.,Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13); 4355-4358 (1987)) y “enlace evolutivo” (Véase Holm, mencionado anteriormente (1999) y Brenner, mencionado anteriormente (1997)).
En ciertas realizaciones, las variantes de agentes de unión incluyen variantes de glicosilación donde el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. En ciertas realizaciones, las variantes comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación ligados a N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación ligado a N está caracterizado por la secuencia; Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde el resto de aminoácido designado como X puede ser cualquier resto de aminoácido excepto prolina. La sustitución de restos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidratos ligada a N. Como alternativa, las sustituciones que eliminen esta secuencia retirarán una cadena de carbohidratos ligada a N existente. También se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidratos ligadas a N donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación ligados a N (típicamente los que son de origen natural) y se crean uno o más nuevos sitios ligados a N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína donde uno o más restos de cisteína se suprimen de o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos restos de cisteína que la proteína nativa, y típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la materia en el momento en que se deseen dichas sustituciones. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar restos importantes de anticuerpos para esclerostina, o por aumentar o reducir la afinidad de los anticuerpos para esclerostina descritos en el presente documento.
De acuerdo con ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que; (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. De acuerdo con ciertas realizaciones, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (en ciertas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (en ciertas realizaciones, en la parte del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). En ciertas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa puede típicamente no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparezca en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)) y Thorntonet al.Nature 354; 105 (1991).
En ciertas realizaciones, los agentes de unión de la invención pueden enlazarse químicamente con polímeros, lípidos u otros restos.
Los agentes de unión pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura marco biocompatible comprende un polipéptido o parte del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable, o marco, o armazón, que es capaz de presentar una o más secuencias de aminoácidos que se unen con un antígeno (por ejemplo, CDR, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o “pliegue” polipeptídico (un motivo estructural) o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en relación con un polipéptido o pliegue de origen natural. Estos armazones pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como un ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.
Típicamente, las estructuras marco biocompatibles basadas en armazones proteicos o esqueletos distintos de dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden usarse las basadas en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de cinc CP1, PST1, superenrollamiento, LACI-D1, dominio Z y dominios tendramisat (Véase por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
En realizaciones preferidas, se apreciará que los agentes de unión de la invención incluyen los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento. Pueden producirse anticuerpos humanizados tales como los descritos en el presente documento usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (Zhang, W.,et al.,Molecular Immunology. 42(12); 1445-1451, 2005; Hwang W.et al.,Methods. 36(1); 35-42, 2005; Dall'Acqua WF,et al.,Methods 36(1); 43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21 (8); 397-402, 2000).
Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que los agentes de unión adecuados incluyen partes de estos anticuerpos, tales como uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se desvela específicamente en el presente documento. Al menos una de las regiones de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 pueden tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el agente de unión conserve la especificidad de unión de la CDR no sustituida. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica, en la que el agente de unión bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza la esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica en la que el agente de unión muestra un patrón de unión similar a los péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana” al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-C, Ab-D, Ab-2, Ab-3, Ab-11, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-21 y Ab-22, y/o neutralice esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesto de aminoácidos, en los que el agente de unión es una proteína de unión recombinante o un péptido sintético y la proteína de unión recombinante bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, en el que el agente de unión es una proteína de unión recombinante, y la proteína de unión recombinante muestra un patrón de unión similar a péptidos de esclerostina humana en el ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana (descritos posteriormente en el presente documento) al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-C, Ab-D, Ab-2, Ab-3, Ab-11, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-21 y Ab-22, y/o neutraliza esclerostina. Cuando un anticuerpo comprende uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se ha descrito anteriormente, puede obtener por expresión a partir de una célula hospedadora que contiene ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica cada secuencia de CDR puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos de la CDR y sintetizarse junto con cualquier secuencia de ADN de región constante y marco de región variable de anticuerpo deseada usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos, mutagénesis dirigida y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado. Está ampliamente disponible para los expertos en la materia ADN que codifica las regiones constantes y marcos de región variable a partir de bases de datos de secuencias genéticas tales como GenBank®. Cada una de las CDR anteriormente mencionadas se localizará típicamente en un marco de región variable en las posiciones 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) y 95-102 (CDR-H3) de la cadena pesada y las posiciones 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) y 89-97 (CDR-L3) de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabatet al.,1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).
Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo puede propagarse y expresarse de acuerdo con cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos para escisión, ligación, transformación y transfección de ácido nucleico usando cualquier variedad de vectores de expresión conocidos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones puede preferirse la expresión de un fragmento de anticuerpo en un hospedador procariota, tal comoEscherichia coli(véase, por ejemplo, Pluckthunet al.,1989 Methods Enzymol. 178; 497-515). En ciertas otras realizaciones, puede preferirse la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo en una célula hospedadora eucariota, incluyendo levadura (por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombeyPichia pastoris),células animales (incluyendo células de mamífero) o células vegetales. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero sin limitación, mieloma (tal como una línea NSO de ratón), COS, CHO o células de hibridoma. Los ejemplos de células vegetales incluyen tabaco, maíz, soja y células de arroz.
Pueden prepararse uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o una bacteria, tal comoE. coli,en la que se producirá producción del anticuerpo. Para obtener transcripción y traducción eficaz, la secuencia de ADN en cada vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y secuencia líder unidos operativamente con la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos de este modo se conocen generalmente bien y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo, se describen procedimientos de biología molecular básica en Maniatiset al.(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Maniatiset al,3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). Puede realizarse secuenciación de ADN como se describe en Sangeret al.(PNAS 74; 5463, (1977)) y el manual de secuenciación de μlc de Amersham International, y puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Krameret al.,Nucleic Acids Res. 12; 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 488-92 (1985); Kunkelet al.,Methods in Enzymol. 154; 367-82 (1987); el manual de Anglian Biotechnology Ltd). Adicionalmente, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación y cultivo de células apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).
Cuando se desee mejorar la afinidad de anticuerpos de acuerdo con la invención que contienen una o más de las CDR anteriormente mencionadas, puede obtenerse por varios protocolos de maduración de afinidad, incluyendo mantener las CDR (Yanget al.,J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), combinación de cadenas (Markset al.,Biotechnology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación deE. coli(Lowet al.,J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), barajado de ADN (Pattenet al.,Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), presentación de fagos (Thompsonet al,J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri,et al.,Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos métodos de maduración de afinidad se analizan en Vaughanet al.,(Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Pueden obtenerse otros anticuerpos de acuerdo con la invención mediante inmunización convencional y procedimientos de fusión de células como se describen en el presente documento y se conocen en la técnica. Pueden generarse anticuerpos monoclonales de la invención usando una diversidad de técnicas conocidas. En general, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohleret al.,Nature 256; 495, 1975; Coliganet al.(eds.), Current Protocols in Immunology, 1; 2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes de Estados Unidos N° RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksleyet al.,“Production of monoclonal antibodies against proteins expressed inE. coli,"en DNA Cloning 2; Expression Systems, 2a Edición, Gloveret al.(eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Pueden derivarse fragmentos de anticuerpo de los mismos usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica u, opcionalmente, mediante digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Como alternativa, dichos fragmentos también pueden generarse mediante técnicas de ingeniería genética recombinante como se describe en el presente documento.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando a un animal, por ejemplo, una rata, hámster, un conejo o preferentemente un ratón, incluyendo por ejemplo un transgénico o un knock-out, como se conoce en la técnica, con un inmunógeno que comprende esclerostina humana de SEQ ID NO; 1, o un fragmento de la misma, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. La presencia de producción de anticuerpos específica puede supervisarse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo obteniendo una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que se une a esclerostina humana o péptido usando uno cualquiera de varios métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. De animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran células linfoides, más habitualmente células del bazo o ganglio linfático, para obtener linfocitos B. Los linfocitos B se fusionan después con un compañero de fusión de célula de mieloma sensibilizado a fármaco, preferentemente uno que sea singénico con el animal inmunizado y que tenga opcionalmente otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad para expresar productos génicos de Ig endógenos, por ejemplo, P3X63 - Ag 8.653 (A<t>C<c>N° CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, que son líneas celulares eucariotas inmortales. Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante varios minutos con un agente promotor de fusión de membrana, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y después sembrarse a baja densidad en un medio selectivo que apoye el crecimiento de células de hibridoma pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente una a dos semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias individuales, y pueden ensayarse anticuerpos producidos por las células con respecto a actividad de unión con esclerostina humana, usando una cualquiera de una diversidad de inmunensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, mediante clonación de dilución limitada o mediante aislamiento en placa de agar suave) y se seleccionan y cultivan clones positivos que producen un anticuerpo específico para esclerostina. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de cultivos de hibridoma. Un método alternativo para producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, sensibilizado con pristano) para prolongar la formación de líquido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una diversidad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaños y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baineset al.,“Purification of Immunoglobulin G (IgG)," en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Pueden purificarse anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo y una proteína de unión a TGF-beta, o fragmento o variante de los mismos.
Un anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por cualquier variedad de técnicas que resultarán familiares para los expertos habituales en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, transformación por Virus de Epstein Barr (VEB) de células de sangre periférica humana (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunizaciónin vitrode linfocitos B humanos, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fago de región V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la técnica y basados en la divulgación del presente documento. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos de ratones transgénicos que se han modificado por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a presentación antigénica. Se describen métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos, por ejemplo, por Greenet al.,Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberget al.,Nature 368: 856, 1994; Tayloret al.,Int. Immun. 6: 579, 1994; Patente de Estados Unidos N° 5.877.397; Bruggemannet al.,1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovitset al.,1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones dirigidas de los loci de cadena pesada y cadena ligera endógenos (véase también Bruggemannet al.,Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de minigenes, o transloci en cromosomas artificiales de levadura, que experimentan reordenación del ADN específica de linfocitos B e hipermutación en el tejido linfoide de ratón. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos inmunizando los ratones transgénicos, que pueden después producir anticuerpos humanos específicos para esclerostina. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden usarse para producir hibridomas que secreten anticuerpos humanos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. También pueden obtenerse sueros policlonales que contienen anticuerpos humanos de la sangre de los animales inmunizados.
Otro método para generar anticuerpos humanos de la invención incluye inmortalizar células de sangre periférica humana por transformación con VEB. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.646.456. Dicha línea de linfocitos B inmortalizada (o línea celular linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a esclerostina puede identificarse por métodos de inmunodetección como se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, un ELISA, y después aislarse por técnicas de clonación convencionales. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo antiesclerostina puede mejorarse fusionando la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ratón-humano de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Glaskyet al.,Hybridoma 8: 377-89 (1989)). Otro método más para generar anticuerpos monoclonales humanos es la inmunizaciónin vitro,que incluye sensibilizar linfocitos B esplénicos humanos con esclerostina humana, seguido de fusión de los linfocitos B sensibilizados con un compañero de fusión heterohíbrido. Véase, por ejemplo, Boerneret al.,1991 J. Immunol. 147: 86-95.
En ciertas realizaciones, se selecciona un linfocito B que produce un anticuerpo antiesclerostina humana y se clonan las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada a partir del linfocito B de acuerdo con técnicas de biología molecular conocidas en este campo (documento WO 92/02551; Patente de Estados Unidos 5.627.052; Babcooket al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)) y descritas en el presente documento. Pueden aislarse linfocitos B de un animal inmunizado del bazo, ganglio linfático o muestra de sangre periférica seleccionando una célula que produce un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina. Los linfocitos B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Se conocen bien en la técnica métodos para detectar linfocitos B individuales que producen un anticuerpo con la especificidad deseada, por ejemplo, mediante formación de placas, separación de células activadas por fluorescencia, estimulaciónin vitroseguida de detección de anticuerpo específico y similares. Los métodos para selección de linfocitos B productores de anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una única suspensión celular de linfocitos B en agar blando que contiene esclerostina humana. La unión del anticuerpo específico producido por el linfocito B con el antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que se seleccionen los linfocitos B que producen el anticuerpo deseado, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.
Un método adicional para obtener anticuerpos de la invención es por presentación de fagos. Véase, por ejemplo, Winteret al.,1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burtonet al.,1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Pueden crearse bibliotecas combinatorias de región variable de inmunoglobulina humanas o murinas en vectores de fagos que pueden explorarse para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Huseet al.,1989 Science 246: 1275-81; Sastryet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-32 (1989); Alting-Meeset al.,Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kanget al.,1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-66; Hoogenboomet al.,1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebuschet al.,1997 Hybridoma 16: 47-52 y referencias citadas en las mismas. Por ejemplo, puede insertarse una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de región variable de Ig en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en fase con la secuencia que codifica una proteína de cubierta de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de cubierta con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. De acuerdo con ciertas realizaciones, también pueden presentarse fragmentos Fab de inmunoglobulina en una partícula de fago (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N°: 5.698.426).
También pueden prepararse bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en fago lambda, por ejemplo, usando vectores MmmunoZap™ (H) y XImmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, se aísla ARNm de una población de linfocitos B y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores XImmunoZap(H) y MmmunoZap (L). Estos vectores pueden explorarse individualmente o pueden expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huseet al.,mencionado anteriormente; véase también Sastryet al.,mencionado anteriormente). Pueden convertirse posteriormente placas positivas en un plásmido no lítico que permita expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonales deE. coli.
En una realización, en un hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal se amplifican usando cebadores nucleotídicos. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden obtenerse de fuentes disponibles en el mercado. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón, incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, V<hc>, VHd, C<h>1, V<l>y C<l>). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que pueden después insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse después en sistemas de expresión basados enE. coli,levadura o mamífero. Pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla que contiene una fusión de los dominios V<h>y V<l>usando estos métodos (véase Birdet al.,Science 242: 423-426, 1988). Una vez que se han obtenido células que producen anticuerpos de acuerdo con la invención usando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm del mismo de acuerdo con procedimientos convencionales como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos de los mismos pueden secuenciarse y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR pueden manipularse como se ha descrito previamente para generar otros anticuerpos de acuerdo con la invención.
Preferentemente los agentes de unión se unen específicamente a esclerostina. Como con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la materia reconoce que los diversos restos con los que un agente de unión no debería unirse de forma detectable para ser terapéuticamente eficaz y adecuado serían extensos y difíciles de numerar. Por lo tanto, para un agente de unión divulgado en el presente documento, la expresión “se une específicamente” se refiere a la capacidad de un agente de unión para unirse a esclerostina, preferentemente esclerostina humana, con mayor afinidad que se une a una proteína de control no relacionada. Preferentemente la proteína de control es lisozima de clara de huevo de gallina. Preferentemente los agentes de unión se unen a esclerostina con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por una proteína de control. Un agente de unión puede tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10<- 10>M, menor de o igual a 1 x 10<-11>M o menor de o igual a 1 x 10<- 12>M.
La afinidad puede determinarse por un ensayo de ELIA de afinidad. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un ensayo de BIAcore. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método cinético. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método de equilibrio/solución. Dichos métodos se describen en más detalle en el presente documento o se conocen en la técnica.
Los agentes de unión a esclerostina de la presente invención preferentemente modulan la función de esclerostina en el ensayo basado en células descrito en el presente documento y/o el ensayoin vivodescrito en el presente documento y/o se unen a uno o más de los epítopos descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada la unión de uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. En consecuencia, dichos agentes de unión pueden identificarse usando los ensayos descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, se generan agentes de unión identificando en primer lugar anticuerpos que se unan a uno o más de los epítopos proporcionados en el presente documento y/o se neutralizan en los ensayos basados en células y/oin vivodescritos en esta solicitud y/o bloquean de forma cruzada los anticuerpos descritos en el presente documento y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpos se usan después para insertar en marcos biocompatibles apropiados para generar agentes de unión a esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, o puede ser una molécula no proteica. Los ensayos descritos en el presente documento permiten la caracterización de agentes de unión. Preferentemente, los agentes de unión de la presente invención son anticuerpos como se definen en el presente documento.
Se entenderá por un experto en la materia que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden experimentar una diversidad de modificaciones postraduccionales. El tipo y alcance de estas modificaciones depende con frecuencia de la línea celular hospedadora usada para expresar la proteína así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto básico carboxilo-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).
Se describen posteriormente anticuerpos denominados Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1. “HC” se refiere a la cadena pesada y “LC” se refiere a la cadena ligera. Para algunos anticuerpos posteriores, las CDR están sombreadas en cajas y las regiones constantes (C) se muestran en negrita y cursiva.
Ab-D
El anticuerpo D (también denominado en el presente documento Ab-D y Mab-D) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-D se muestra en la Figura l8.
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena ligera de Ab-D:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-D es la siguiente:
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-D incluyendo el péptido señal es la siguiente:
Secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-D incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal:
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena pesada HC de Ab-D es la siguiente:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-D es:
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-D incluyendo el péptido señal es:
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-D incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
i
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-D son las siguientes:
Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-D son:
Ab-C
El anticuerpo C (también denominado en el presente documento Ab-C y Mab-C) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-C se muestra en la Figura 17. La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la Cadena Ligera de Ab-C es la siguiente:
A
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-C es:
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
Cadena pesada de Ab-C
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es la siguiente:
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-C son como sigue:
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-C son:
Ab-A
El anticuerpo A (también denominado en el presente documento Ab-A y Mab-A) es un anticuerpo quimérico de ratón-conejo que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-A se muestra en la Figura 15.
Cadena Ligera de Ab-A
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A es:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A:
La secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:
( Q )La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-A son las siguientes:
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-A son:
Ab-A se humanizó y se denomina Anticuerpo 1 (también denominado en el presente documento Ab-1), que tiene las siguientes secuencias:
La secuencia de ácido nucleico de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
La secuencia de aminoácidos de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:
La secuencia de ácido nucleico de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
La secuencia de aminoácidos de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-1 son las siguientes:
Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-1 son:
Ab-B
El anticuerpo B (también denominado en el presente documento Ab-B y Mab-B) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-B se muestra en la Figura 16. Cadena Ligera de Ab-B
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-B es:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-B es:
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-B incluyendo el péptido señal es:
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-B incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
Cadena Pesada de Ab-B
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-B incluyendo el péptido señal:
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-B incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-B son las siguientes:
CDR-H1: TSGMGVG (SEQ ID NO: 57)
CDR-H2: HIWWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID NO: 58)
CDR-H3: EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID NO: 59)
Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-B son:
CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID NO: 60)
CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID NO: 61)
CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID NO: 62)
Los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen a regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividadin vivode la proteína. La unión de un anticuerpo con esclerostina puede correlacionarse con aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea conseguida mediante el uso del anticuerpoin vivotal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y en el Ejemplo 12 (mono). Los aumentos de al menos uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea pueden también conseguirse mediante el uso del anticuerpoin vivotal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y Ejemplo 12 (mono). Puesto que la unión de un anticuerpo con esclerostina se determina principalmente por sus secuencias de CDR, puede generarse un anticuerpo para practicar la invención con todas o algunas de las secuencias de CDR divulgadas en un marco apropiado, donde el anticuerpo conserva la capacidad para unirse específicamente con esclerostina, y puede esperarse conseguir aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea. Dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento de afecciones humanas o animales que están provocadas por, asociadas con, o dan como resultado al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, baja calidad ósea y baja fuerza ósea. Se conocen por los expertos en la materia métodos para construir y expresar anticuerpos y fragmentos de los mismos que comprenden CDR de la presente invención.
La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-A, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:51 para CDR-H1, SEQ ID NO:52 para CDR-H2y SEQ ID NO:53 para CDRH3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:51 para CDR-H1, SEQ ID NO:52 para CDR-H2y SEQ ID NO:53 para CDRH3.
Cuando en anticuerpos de la divulgación está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDr que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:54 para CDR-L1, SEQ ID NO:55 para CDR-L2 y SEQ ID NO:56 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:54 para CDR-L1, SEQ ID NO:55 para CDR-L2 y SEQ ID NO:56 para CDR-L3.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-B, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una c Dr que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:57 para CDR-H1, SEQ ID NO:58 para CDR-H2y SEQ ID NO:59 para CDRH3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:57 para CDR-H1, SEQ ID NO:58 para CDR-H2y SEQ ID NO:59 para CDRH3.
Cuando en anticuerpos de la divulgación está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:60 para CDR-L1, SEQ ID NO:61 para CDR-L2 y SEQ ID NO:62 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:60 para CDR-L1, SEQ ID NO:61 para CDR-L2 y SEQ ID NO:62 para CDR-L3.
La presente divulgación también se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-C, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:45 para CDR-H1, SEQ ID NO:46 para CDR-H2y SEQ ID NO:47 para CDRH3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:45 para CDR-H1, SEQ ID NO:46 para CDR-H2y SEQ ID NO:47 para CDRH3.
Cuando en anticuerpos de la divulgación está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:48 para CDR-L1, SEQ ID NO:49 para CDR-L2 y SEQ ID NO:50 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:48 para CDR-L1, SEQ ID NO:49 para CDR-L2 y SEQ ID NO:50 para CDR-L3.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-D, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:39 para CDR-H1, SEQ ID NO:40 para CDR-H2y SEQ ID NO:41 para CDRH3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:39 para CDR-H1, SEQ ID NO:40 para CDR-H2y SEQ ID NO:41 para CDRH3.
Cuando en anticuerpos de la divulgación está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:42 para CDR-L1, SEQ ID NO:43 para CDR-L2 y SEQ ID NO:44 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO:42 para CDR-L1, SEQ ID NO:43 para CDR-L2 y SEQ ID NO:44 para CDR-L3.
Se describen posteriormente anticuerpos anti-esclerostina adicionales. Para algunas de las secuencias de aminoácidos las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están sombreadas en cajas y las regiones constantes están en negrita y cursiva.
Ab-2
Las secuencias de la LC y HC del Anticuerpo 2 (también denominado Ab-2) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-2:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-2 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-2
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -2 in c lu y e n d o la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l p é p tid o s e ñ a l:
Ab-3
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 3 (también denominado en el presente documento Ab-3) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-3
Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-3 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena pesada de Ab-3
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -3 :
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-3:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -3 in c lu y e n d o e l p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Ab-4
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 4 (también denominado en el presente documento Ab-4) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-4
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-4 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-4
Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -4 in c lu y e n d o la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l p é p tid o s e ñ a l:
Ab-4 se humanizó para generar Ab-5.
Ab-5
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 5 (también denominado en el presente documento Ab-5) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-5
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-5
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -5 :
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5 sin lisina carboxi-terminal:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Dominios variables de Ab-5:
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):
( Q )
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):
La secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):
G
A
G
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-5 son las siguientes:
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-5 son:
Ab-6
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 6 (también denominado en el presente documento Ab-6) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-6
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-6 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-6
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -6 :
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-6:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -6 in c lu y e n d o e l p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Ab-7
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 7 (también denominado en el presente documento Ab-7) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-7
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-7 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-7
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -7 in c lu y e n d o la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l p é p tid o s e ñ a l:
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 8 (también denominado en el presente documento Ab-8) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-8
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la L C d e A b -8 :
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-8 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-8
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -8 :
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-8:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -8 in c lu y e n d o e l p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Ab-9
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 9 (también denominado en el presente documento Ab-9) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-9
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-9
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 10 (también denominado en el presente documento Ab-10) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-10
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-10:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la L C d e A b -10 :
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-10 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-10
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -10 :
)Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -10 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 11 (también denominado en el presente documento Ab-11) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-11
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-11:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-11:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-11 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-11 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:
G
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-11 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
)Ab-12
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 12 (también denominado en el presente documento Ab-12) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-12
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-12:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la L C d e A b -12 :
)Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-12 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-12
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -12 :
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -12 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Ab-13
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 13 (también denominado en el presente documento Ab-13) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-13
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-13:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-13:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-13
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -13 in c lu y e n d o la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l p é p tid o s e ñ a l:
Ab-13 se humanizó para generar Ab-14.
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 14 (también denominado en el presente documento Ab-14) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-14
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-14:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la L C d e A b -14 :
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-14 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-14
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -14 :
)Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14 sin lisina carboxiloterminal:
Secuencia de ácido de nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -14 in c lu y e n d o la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l p é p tid o s e ñ a l:
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-14 son:
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-14 son:
Dominios variables de Ab-14
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):
5
Secuencia de ADN del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):
m
Ab-3 se humanizó para generar Ab-15.
Ab-15
5
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 15 (también denominado en el presente documento Ab-15) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-15:
0 Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:
5
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-15 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de A-15
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -15 :
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15 sin lisina carboxiloterminal:
5
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15:
,0
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-15 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-15 son:
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-15 son:
Dominios variables de Ab-15
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):
Ab-11 se humanizó para generar Ab-16.
Ab-16
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 16 (también denominado en el presente documento Ab-16) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-16
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-16 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-16
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -16 :
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16 sin lisina carboxiloterminal:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -16 in c lu y e n d o la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l p é p tid o s e ñ a l:
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-16 son:
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-16 son:
Dominios variables de Ab-16
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-16 (sin secuencia señal):
S e c u e n c ia d e A D N d e d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra d e A b -16 (s in s e c u e n c ia s e ñ a l) :
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):
Los anticuerpos adicionales se denominan en el presente documento Anticuerpos 17-22 (también denominados en el presente documento Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21 y Ab-22). La región constante Kappa para todas las regiones VK de Ab-17, Ab-19 y Ab-21 es la siguiente:
La Región Constante Pesada para todas las regiones VH de los anticuerpos, 17, 19 y 21 es la siguiente:
En las siguientes secuencias de aminoácidos de anticuerpos, los aminoácidos sombreados en cajas representan regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los aminoácidos subrayados representan péptidos señal. Ab-17
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
Ab-17 se humanizó para generar Ab-18.
Ab-18
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -18 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal):
Ab-19
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
( Q )Ab-19 se humanizó para generar el Anticuerpo 20 (también denominado en el presente documento Ab-20) y el Anticuerpo 23 (también denominado en el presente documento Ab-23).
Ab-20
Versión de IgG4
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -20 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
Ab-23
Versión de IgG2
Cadena Ligera:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:
Secuencia de aminoácidos de forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23 sin lisina carboxilo-terminal:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-23 son las siguientes:
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-23 son:
Dominios variables de Ab-23:
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-23 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-23 (sin secuencia señal):
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):
S
C S D GQ S (SEQ O:36 )
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):
Ab-21
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la L C d e A b -21 in c lu y e n d o e l p é p tid o s e ñ a l:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
Ab-21 se humanizó para producir Ab-22.
Ab-22
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-22 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-22 (sin secuencia señal):
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):
Para Ab-18, Ab-20 y Ab-22, la región constante kappa humana de cadena ligera es la siguiente:
y la región constante gamma-4 humana de cadena pesada es la siguiente:
La región bisagra contiene la mutación Ser-241-Pro para mejorar la estabilidad de la bisagra (Angal Set al.,(1993), Mol Immunol, 30 (1), 105-108).
Ab-24
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 24 (también denominado en el presente documento Ab-24) son las siguientes:
Cadena Ligera:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-24:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-24:
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
Cadena Pesada de Ab-24:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
G G ( Q )
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena ligera de Ab-24 son las siguientes:
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-24 son las siguientes:
La Tabla 1 a continuación proporciona la SEQ ID NO y secuencias de aminoácidos de las CDR de Ab-A, Ab-B, Ab C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24. L1, L2 y L3 se refieren a las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 y H1, H2y H3 se refieren a las CDR de cadena pesada 1, 2 y 3 de acuerdo con el sistema de numeración Kabat (Kabatet al.,1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).
Un oligopéptido o polipéptido está dentro del alcance de la divulgación si tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a al menos una de las CDR de la Tabla 1 anterior; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o está bloqueada de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24; y/o con una CDR de un agente de unión a esclerostina donde el agente de unión puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo de Bucle 2; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo T20,6; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)”.
Los anticuerpos de unión a esclerostina están dentro del alcance de la divulgación si tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o unirse a un epítopo de bucle 2; y/o unirse a un epítopo T20,6; y/o unirse a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)”.
Los polinucleótidos que codifican agentes de unión a esclerostina están dentro del alcance de la divulgación si tienen secuencias polinucleotídicas que son al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a un polinucleótido que codifica una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21; Ab-22, Ab-23 y Ab-24 y donde los agentes de unión a esclerostina codificados bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o se unen a un epítopo de bucle 2; y/o se unen a un epítopo T20,6; y/o se unen a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)”.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10'10 M, menor de o igual a 1 x 10'11 M o menor de o igual a 1 x 10'12 M.
La afinidad de un anticuerpo, así como el grado en el que inhibe la unión, puede determinarse por un experto habitual en la materia usando técnicas convencionales, por ejemplo las descritas en Scatchardet al.(Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660-672 (1949)) o por resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para resonancia de plasmón superficial, las moléculas diana se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que se desplaza a lo largo de una celda de flujo. Si se produce unión de ligando con la diana inmovilizada, el índice refractario local cambia, lo que conduce a un cambio en el ángulo de SPR, que puede supervisarse en tiempo real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las tasas de cambio de la señal de SPR pueden analizarse para producir constantes de velocidad aparente para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores proporciona la constante en equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolffet al.,Cancer Res. 53: 2560-65 (1993)).
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA. Puede obtenerse o derivar de un animal, por ejemplo, ave de corral (por ejemplo, pollo) y mamíferos, que incluye pero sin limitación un ratón, rata, hámster, conejo u otro roedor, vaca, caballo, oveja, cabra, camello, ser humano u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de internalización. La producción de anticuerpos se divulga en general en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2004/0146888 A l.
Ensayos de caracterización
En los métodos descritos anteriormente para generar anticuerpos, incluyendo la manipulación de las CDR de Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Anticuerpo 1-24 (Ab-1 a Ab-24) específicas en nuevas regiones marco conservadas y/o constantes, están disponibles ensayos apropiados para seleccionar los anticuerpos deseados (es decir, ensayos para determinar la afinidad de unión con esclerostina; ensayos de bloqueo cruzado; “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore; ensayo basado en células MC3T3-E1; ensayosin vivo).
Ensayos de unión de epítopos
La esclerostina humana de forma madura es una glicoproteína de 190 aminoácidos con una estructura de nudo de cistina (Figuras 8 y 9). Además de la estructura en nudo de cistina, la proteína se caracteriza porque tiene tres bucles designados como Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. La esclerostina humana se sometió a digestión proteolítica para producir fragmentos. Brevemente, usando diferentes proteasas, incluyendo tripsina, aspN y lysC, se generaron fragmentos con diversos sitios de escisión y tamaños. Se determinaron las secuencias y la masa para diversos péptidos de esclerostina humana. Se evaluó la protección de anticuerpos para determinar el efecto sobre la accesibilidad para proteólisis, incluyendo el enmascaramiento de sitio cortado y desplazamiento peptídico. Finalmente, se realizó un “ensayo de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en BIAcore.
La exposición de esclerostina a escisión por tripsina dio como resultado un patrón de fragmentos peptídicos como se resumen en la Figura 13. Los fragmentos se denominan T19,2, T20, T20,6 y T21-22. Como se muestra de forma esquemática en la Figura 19B, el epítopo T20,6 es un complejo de cuatro secuencias peptídicas separadas que se unen por los tres enlaces disulfuro de la región del nudo de cistina. Dos de los péptidos están unidos por dos enlaces disulfuro. Los otros dos péptidos están unidos por un enlace disulfuro que, esquemáticamente, divide en dos los primeros dos polipéptidos.
El epítopo T20,6 que se generó por digestión con tripsina conserva la estructura de nudo de cistina del polipéptido nativo y está reconocido por los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Un derivado del epítopo T20,6 consiste en la región del nudo de cistina y los aminoácidos 58-64, 73-81, 112-117 y 138-141 en posición de secuencia con referencia a SEQ ID NO: 1. Este epítopo derivado se muestra en la Figura 21. Un epítopo que comprende la región de nudo de cistina puede tener uno o más aminoácidos que están presentes en el epítopo T20,6 (Figura 19B) pero no presentes en el epítopo derivado de T20,6 (Figura 21).
Otra región que contiene epítopos se identificó en la región de Bucle 2 de esclerostina humana (Figura 19A) y se reconoce por los anticuerpos Ab-A y Ab-B. Un epítopo de Bucle 2 comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, SEQ ID NO: 6). De forma estérica, con referencia a esclerostina de longitud completa de SEQ ID NO: 1, la estructura que contiene el Bucle 2 se define en un extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 86 (C4) y cisteína en la posición 144 (C8) y en el otro extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 111 (C5) y cisteína en la posición 57 (C1).
Los péptidos generados por escisión de aspN de esclerostina humana se muestran en la Figura 12. En la Figura, estos péptidos se designan AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5 y también se denominan en el presente documento N14,6, N18,6 y N22,7-23,5, respectivamente.
Un grupo de anticuerpos muestra un patrón específico de unión con ciertos epítopos como se demuestra por un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Brevemente, el anticuerpo se preincuba con el epítopo para ensayar, a concentraciones que saturarán los sitios de unión a epítopo en el anticuerpo. El anticuerpo se expone después a esclerostina unida a una superficie de microplaca. Después de los procedimientos de incubación y lavado apropiados, se establece un patrón de unión competitiva. Como se muestra en la Figura 18, el anticuerpo ejemplar Ab-D se unió a moléculas de esclerostina unidas a la superficie de la microplaca. La preincubación del anticuerpo Ab-D con esclerostina redujo la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca hasta casi cero. La preincubación con un péptido que consistía en el epítopo T19,2 mostró que T19,2 no competía con la esclerostina por la unión con el anticuerpo. Sin embargo, la preincubación con uno cualquiera de los epítopos designados<t>20, T20,6, T21-22 o N22,7-23,5 suprimió una gran proporción de la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca. Por el contrario, la preincubación del anticuerpo con uno cualquiera de los epítopos designados T19,2, N14,6 o N18,6 no suprimió la capacidad del anticuerpo para unirse a esclerostina. Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 17) es Ab-C.
El anticuerpo Ab-D es por lo tanto ejemplar y representativo de un grupo de anticuerpos que se unen a los epítopos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, N14,6 y N18,6, como se mide por la capacidad para bloquear la unión del anticuerpo con esclerostina. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencia de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud del anticuerpo se determina funcionalmente tal como mediante la capacidad para unirse con esclerostina después de la preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Se incluyen en la invención anticuerpos que muestran un patrón de unión similar o idéntico al del anticuerpo Ab-D. Por “similar a” se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con cada uno de los polipéptidos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 por lo que esta unión superará en competición al menos el 50% de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2, N14,6 y N18,6, dando como resultado una reducción del 30% o menos de la unión que se produciría en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.
Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión del anticuerpo de la Figura 18 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-D y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión a epítopos de Ab-D se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de nudo de cistina de esclerostina.
Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19B, un epítopo T20,6 ejemplar comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3SCQC4GPAR (SEQ ID NO: 3) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8KRLTR (SEQ ID NO: 5) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica DVSEYSC1RELHFTR (SEQ ID NO: 2) está unida a la cadena peptídica WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SEQ I<d>NO: 4) por un enlace disulfuro de C1 a<c>5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 3 y 5 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 a 4 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 19B.
Como se desvela en el presente documento y con referencia a la Figura 21, un epítopo derivado ejemplar de T20,6 comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3 SGQC4 (SEQ ID NO: 70) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8 (SEQ ID NO: 71) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica C1RELHFTR (SEQ ID nO: 72) está unida a la cadena peptídica C5IPDRYR (SEQ ID NO: 73) por un enlace disulfuro de C1 a C5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 70 y 71 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 72 y 73 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 21.
El anticuerpo Ab-A es ejemplar y representativo de un segundo grupo de anticuerpos que tienen un patrón de unión característico con péptidos de esclerostina humana que es distinto del obtenido para los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Ab-A y el grupo de anticuerpos que representa se unen al epítopo N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, T20, T20,6, T21-22, N14,6 o N18,6, como se mide mediante la capacidad para bloquear la unión de anticuerpo con esclerostina (Fig. 15). Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 16) es Ab-B. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencias de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud de anticuerpo se determina funcionalmente tal como por la capacidad de unirse con esclerostina después de preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Se incluyen en la divulgación anticuerpos que muestran un patrón de unión similar o idéntico al del anticuerpo Ab-A. Por “similar a” se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con el polipéptido N22,7-23,5 por la que esta unión superará por competición al menos el 50% de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2,<t>20, T20,6, T21-22, N14,6 y N18,6 dando como resultado una reducción del 30% o menos de la unión que se produciría en la ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.
Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión de anticuerpo de la Figura 15 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-A y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión de epítopo de Ab-A se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de Bucle 2 de la esclerostina. Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19A, la región de Bucle 2 puede describirse como un péptido lineal, pero adquiere una estructura terciaria cuando está presente en una esclerostina nativa o una parte que contiene nudo de cistina de esclerostina en la que la estructura de enlace disulfuro nativo se mantiene. La estructura lineal o terciaria del epítopo de Bucle 2 puede afectar a la unión del anticuerpo con el mismo, como se analiza en los Ejemplos. Una región de Bucle 2 puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos: C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID No : 6). “C4” se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 86 con referencia a SEQ ID NO: 1. “C5” se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 111 con referencia a SEQ ID NO: 1. En la proteína de esclerostina nativa, C4 está unido a una cisteína en la posición 144 (C8) por un enlace disulfuro y C5 está ligado a una cisteína en la posición 57 (C1) por un enlace disulfuro. Los epítopos derivados de la región de Bucle 2 incluyen CGP<a>R<l>LPNAIG<r>G<k>WW<r>PS (SEQ ID NO: 63); GPARLLPNAIGRG KWWRPSG (SEQ ID NO: 64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID NO: 65); ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID NO: 66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (SEQ ID NO: 67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID NO: 68); y LP NAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 69).
ENSAYOS DE BLOQUEO CRUZADO
Las expresiones “bloqueo cruzado”, “bloqueado de forma cruzada” y “bloquear de forma cruzada” se usan de forma intercambiable en el presente documento para indicar la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión para interferir con la unión de otros anticuerpos o agentes de unión con esclerostina.
El alcance en el que un anticuerpo u otro agente de unión es capaz de interferir con la unión de otro con esclerostina y por lo tanto si puede decirse que bloquea de forma cruzada de acuerdo con la invención, puede determinarse usando ensayos de unión competitiva. Un ensayo cuantitativo particularmente adecuado usa una máquina de Biacore que puede medir el alcance de las interacciones usando tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado usa un enfoque basado en ELISA para medir la competición entre anticuerpos u otros agentes de unión con respecto a su unión con esclerostina.
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO DE BIACORE
A continuación se describe en general un ensayo de Biacore adecuado para determinar si un anticuerpo u otro agente de unión bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de forma cruzada de acuerdo con la invención. Por conveniencia se hace referencia a dos anticuerpos, pero se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los agentes de unión a esclerostina descritos en el presente documento. La máquina de Biacore (por ejemplo el Biacore 3000) se maneja en línea con las recomendaciones del fabricante.
Por lo tanto en un ensayo de bloqueo cruzado, la esclerostina se acopla a una microplaca CM5 Biacore usando química de acoplamiento de aminas convencional para generar una superficie recubierta con esclerostina. Típicamente se acoplarían 200-800 unidades de resonancia de esclerostina a la microplaca (una cantidad que proporciona niveles fácilmente medibles de unión pero que puede saturarse fácilmente por las concentraciones de reactivo de ensayo usadas).
Los anticuerpos (denominados A* y B*) para ensayar con respecto a su capacidad para bloquearse de forma cruzada entre sí se mezclan a una relación molar de uno a uno de sitios de unión en un tampón adecuado para crear la mezcla de ensayo. Cuando se calculan las concentraciones basándose en el sitio de unión, se asume que el peso molecular de un anticuerpo es el peso molecular total del anticuerpo dividido por el número de sitios de unión de esclerostina en ese anticuerpo.
La concentración de cada anticuerpo en la mezcla de ensayo debería ser suficientemente alta para saturar fácilmente los sitios de unión para ese anticuerpo en las moléculas de esclerostina capturadas en la microplaca de Biacore. Los anticuerpos en la mezcla están a la misma concentración molar (basándose en la unión) y esa concentración típicamente sería entre 1,00 y 1,5 micromolar (basándose en un sitio de unión).
También se preparan soluciones separadas que contienen anticuerpo A* solamente y anticuerpo B* solamente. El anticuerpo A* y anticuerpo B* en estas soluciones deberían estar en el mismo tampón y a la misma concentración que en la mezcla de ensayo.
La mezcla de ensayo se pasa sobre la microplaca de Biacore recubierta de esclerostina y se registra la cantidad total de unión. La microplaca se trata después de tal modo que se retiren los anticuerpos unidos sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca. Típicamente esto se realiza tratando a la microplaca con HCl 30 mM durante 60 segundos.
La solución de anticuerpo A* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión. La microplaca se trata de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca.
La solución de anticuerpo B* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión.
A continuación se calcula la unión teórica máxima de la mezcla de anticuerpo A* y anticuerpo B*, y es la suma de la unión de cada anticuerpo sobre la superficie de esclerostina solo. Si la unión registrada real de la mezcla es menor que este máximo teórico entonces los dos anticuerpos están bloqueándose de forma cruzada entre sí.
Por lo tanto, en general, un anticuerpo de bloqueo cruzado u otro agente de unión de acuerdo con la invención es uno que se unirá a esclerostina en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore anterior de modo que durante el ensayo y en presencia de un segundo anticuerpo u otro agente de unión de la invención la unión registrada sea entre 80% y 0,1% (por ejemplo, 80% a 4%) de la unión teórica máxima, específicamente entre 75% y 0,1% (por ejemplo, 75% a 4%) de la unión teórica máxima y más específicamente entre el 70% y 0,1% (por ejemplo 70% a 4%) de la unión teórica máxima (como se acaba de definir anteriormente) de los dos anticuerpos o agentes de unión en combinación.
El ensayo de Biacore descrito anteriormente es un ensayo primario usado para determinar si los anticuerpos u otros agentes de unión se bloquean de forma cruzada entre sí de acuerdo con la invención. En pocas ocasiones los anticuerpos particulares u otros agentes de unión pueden no unirse con esclerostina acoplada mediante química de amina a una microplaca de Biacore CM5 (esto sucede habitualmente cuando el sitio de unión relevante en la esclerostina se enmascara o se destruye por el acoplamiento a la microplaca). En dichos casos el bloqueo cruzado puede determinarse usando una versión marcada de Esclerostina, por ejemplo Esclerostina marcada con His N terminal (R & D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat. n° 1406-ST-025). En este formato particular, un anticuerpo anti-His se acoplaría a la microplaca de Biacore y después la Esclerostina marcada con His se pasaría sobre la superficie de la microplaca y se capturaría por el anticuerpo anti-His. El análisis de bloqueo cruzado se llevaría a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración de microplaca, se cargaría nueva esclerostina marcada con His de nuevo en la superficie recubierta con anticuerpo anti-His. Además del ejemplo proporcionado usando Esclerostina marcada con His N terminal, podría usarse como alternativa Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador que se conocen en la técnica para dicho análisis de bloqueo cruzado (por ejemplo marcador HA con anticuerpos anti-HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG; marcador de biotina con estreptavidina).
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA
Lo siguiente describe en general un ensayo de ELISA para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina u otro agente de unión a esclerostina bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de formar cruzada de acuerdo con la invención. Por conveniencia, se hace referencia a dos anticuerpos (Ab-X y Ab-Y), pero se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los agentes de unión a esclerostina descritos en el presente documento.
El principio general de del ensayo es tener un anticuerpo anti-esclerostina recubriendo los pocillos de una placa de ELISA. Se añade una cantidad en exceso de un segundo anticuerpo anti-esclerostina que potencialmente bloquea de forma cruzada en la solución (es decir, no unido a la placa de ELISA). Se añade después una cantidad limitada de esclerostina a los pocillos. El anticuerpo recubierto y el anticuerpo en solución compiten por la unión del número limitado de moléculas de esclerostina. La placa se lava para retirar esclerostina que no se haya unido al anticuerpo de recubrimiento y también para retirar el segundo anticuerpo en fase de solución así como cualquier complejo formado entre el segundo anticuerpo en fase de solución y la esclerostina. La cantidad de esclerostina unida se mide después usando un reactivo de detección de esclerostina apropiado. Un anticuerpo en solución que sea capaz de bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento será capaz de provocar una reducción del número de moléculas de esclerostina a las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en relación con el número de moléculas de esclerostina con las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en ausencia del segundo anticuerpo en fase de solución.
Este ensayo se describe en más detalle adicionalmente posteriormente con respecto a Ab-X y Ab-Y. En el caso en el que Ab-X se selecciona para ser el anticuerpo inmovilizado, este se usa para recubrir los pocillos de la placa de ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una solución de bloqueo adecuada para minimizar la unión no específica de reactivos que es añaden posteriormente. Se añade después una cantidad en exceso de Ab-Y a la placa de ELISA de modo que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-Y por pocillo sean al menos 10 veces mayores que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-X que se usaron, por pocillo, durante el recubrimiento de la placa de ELISA. Después se añade esclerostina de modo que los moles de esclerostina añadidos por pocillo sean al menos 25 veces menores que los moles de sitios de unión de esclerostina de Ab-X que se usaron para recubrir cada pocillo. Después de un periodo de incubación adecuado la placa de ELISA se lava y se añade un reactivo de detección de esclerostina para medir la cantidad de esclerostina unida específicamente por el anticuerpo anti-esclerostina de recubrimiento (en este caso Ab-X). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir, sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. El ensayo de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario procesar el ensayo de ELISA de tal manera que la señal de control positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.
Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultante de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos: 1) formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución
Y
2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.
Ab-X y Ab-Y se definen como bloqueadores cruzados si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo antiesclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60% y el 100%, específicamente entre el 70% y el 100% y más específicamente entre el 80% y el 100%, de la señal de detección de esclerostina (es decir, la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir, los pocillos de control de positivo).
Un ejemplo de dicho ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA puede hallarse en el Ejemplo 7 (“ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA”).
ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS
Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modeloin vitrode formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de diferenciación de células de linaje de osteoblastos por uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de la matriz y finalmente deposición de mineral, que se refiere a cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.
Las células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983.In vitrodifferentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) y subclones de la línea celular original pueden formar mineral en cultivo tras el crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275: 19992-20001). Tanto para el subclón MC3T3-E1-BF así como para las células originales MC3T3-E1, la esclerostina puede inhibir uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que son capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitan la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hay un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo). Los anticuerpos usados en los experimentos de ensayo de mineralización basado en células mostrados en las Figuras 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 Kd y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.
Cuando se ejecuta el ensayo con el objetivo de determinar si un anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión a esclerostina particular puede neutralizar la esclerostina (es decir, es un anticuerpo neutralizante de esclerostina o derivado del mismo, o es un agente de unión neutralizante de esclerostina), es necesario que la cantidad de esclerostina usada en el ensayo sea la cantidad mínima de esclerostina que provoca al menos una reducción del 70%, estadísticamente significativa, en la deposición de fosfato cálcico (medida como calcio) en el grupo de solamente esclerostina, en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo sin esclerostina. Un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o un agente de unión neutralizante antiesclerostina se define como uno que provoca un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo, sin agente de unión). Para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina o un agente de unión antiesclerostina es neutralizante o no, la cantidad de anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión antiesclerostina usado en el ensayo debe ser tal que haya un exceso de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Dependiendo de la potencia del anticuerpo, el exceso en veces que puede requerirse puede ser de 24, 18, 12, 6, 3 o 1,5, y un experto en la materia está familiarizado con la práctica rutinaria de ensayos de más de una concentración de agente de unión. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o agente de unión neutralizante antiesclerostina muy potente será capaz de neutralizar la esclerostina incluso cuando haya un exceso menor de 6 veces de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Un anticuerpo neutralizante anti esclerostina o agente de unión neutralizante antiesclerostina menos potente será capaz de neutralizar la esclerostina solamente en un exceso de 12, 18 o 24 veces. Los agentes de unión a esclerostina con este intervalo completo de potencias son adecuados como agentes de unión a esclerostina neutralizantes. Se describen en detalle en el Ejemplo 8 ensayos de mineralización basados en células ejemplares.
Los anticuerpos anti-esclerostina y derivados de los mismos que pueden neutralizar la esclerostina humana y agentes de unión a esclerostina que pueden neutralizar esclerostina humana pueden ser útiles en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea bajo y fuerza ósea baja.
ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓNIN VIVO
Pueden medirse los aumentos de diversos parámetros asociados con, o que resultan de, la estimulación de nueva formación de hueso como un resultado de ensayosin vivode agentes de unión a esclerostina para identificar los agentes de unión que son capaces de neutralizar esclerostina y por lo tanto son capaces de provocar estimulación de nueva formación de hueso. Dichos parámetros incluyen diversos marcadores anabólicos del suero [por ejemplo osteocalcina, P1NP (propéptido n-terminal de procolágeno de tipo 1)], marcadores histomorfométricos de formación del hueso (por ejemplo, superficie de osteoblasto/superficie de hueso; tasa de formación de hueso/superficie de hueso; grosor trabecular), densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. Un agente de unión neutralizante de esclerostina se define como uno capaz de provocar un aumento estadísticamente significativo en comparación con animales tratados con vehículo, en cualquier parámetro asociado con, o que resulta de, la estimulación de nueva formación de hueso. Dicho ensayoin vivopuede realizarse en cualquier mamífero adecuado (por ejemplo ratón, rata, mono). Un ejemplo de dichos ensayosin vivopuede encontrarse en el Ejemplo 5 (“ensayosin vivode anticuerpos monoclonales anti-esclerostina”).
Aunque la secuencia de aminoácidos de esclerostina no es 100% idéntica en todas las especies de mamífero (por ejemplo la esclerostina de ratón no es 100% idéntica a esclerostina humana), se apreciará por un experto en la materia que un agente de unión de esclerostina que puede neutralizar,in vivo,la esclerostina de una cierta especie (por ejemplo, ratón) y que también puede unirse a esclerostina humanain vitroes muy probable que sea capaz de neutralizar la esclerostina humanain vivo.Por lo tanto, dicho agente de unión a esclerostina humana (por ejemplo, anticuerpo anti-esclerostina humana) puede ser útil en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea baja y fuerza ósea baja. Los ratones en los que se ha usado recombinación homóloga para suprimir el gen de esclerostina de ratón e insertar el gen de esclerostina humana en su lugar (es decir, ratones knock-in para el gen de esclerostina humana o ratones knock-in para SOST humana) serían un ejemplo de un sistemain vivoadicional.
Se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden uno de los agentes de unión anteriormente descritos tales como al menos uno del anticuerpo Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1 a Ab-24 para esclerostina humana, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutica o fisiológicamente aceptable. Se divulgan composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento en la Solicitud relacionada N° Serie N° 10/868.497, presentada el 16 de junio de 2004, que reivindica el beneficio de prioridad de N° de Serie 60/478.977.
Se conoce bien en la técnica, el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración subcutánea, oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular y formulación, algunos de los cuales se analizan brevemente posteriormente para fines generales de ilustración. En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden suministrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento por vía subcutánea, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intramuscular o incluso por vía intraperitoneal. Dichos enfoques se conocen bien por los expertos en la materia, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.543.158; Patente de Estados Unidos N° 5.641.515 y Patente de Estados Unidos N° 5.399.363. En ciertas realizaciones, pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como sales farmacológicamente aceptables o de base libre en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase Patente de Estados Unidos N° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
En una realización, para administración parenteral en una solución acuosa, la solución debe tamponarse de forma adecuada si es necesario y el diluyente líquido en primer lugar se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la materia conocerán un medio acuoso estéril que puede emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., págs. 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá cierta variación en la dosificación necesariamente dependiendo de la afección del sujeto que se trate. Además, para administración humana, las preparaciones por supuesto preferentemente cumplirán los patrones de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales como se requiere por la Oficina de Patrones Biológicos de la FDA.
En otra realización de la invención, las composiciones divulgadas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También pueden derivarse sales formadas por los grupos carboxilo libres de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en la cantidad que sea terapéuticamente eficaz.
Los vehículos pueden comprender además todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, tampones, soluciones transportadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conocen bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse principios activos complementarios en las composiciones. La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o desafortunada similar cuando se administra a un ser humano.
En ciertas realizaciones, se usan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en células/organismos hospedadores adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para el suministro encapsulado en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similar. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden unirse, covalente o no covalentemente, con la superficie de dichos vehículos transportadores.
La formación y uso de liposoma y preparaciones de tipo liposomal como vehículos farmacéuticos potenciales generalmente se conoce por los expertos en la materia (véase por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7): 307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56 (3):691-95, 1998; Chandranet al.,Indian J. Exp. Biol. 35(8): 801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3): 233-61, 1995; Patente de Estados Unidos N° 5.567.434; Patente de Estados Unidos N° 5.552.157; Patente de Estados Unidos N° 5.565.213; Patente de Estados Unidos N° 5.738.868 y Patente de Estados Unidos N° 5.795.587). El uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después del suministro sistémico. En ciertas realizaciones, se forman liposomas a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)).
Como alternativa, en otras realizaciones, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos de un modo estable y reproducible (véase por ejemplo, Quintanar-Guerreroet al.,Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998). Para evitar efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de tamaños de aproximadamente 0,1 μm) pueden diseñarse usando polímeros capaces de degradarsein vivo.Dichas partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, por Couvreuret al.,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1): 1-20, 1988; zur Muhlenet al.,Eur. J. Pharm. Biopharm.
45(2): 149-55, 1998; Zambauxet al.,J. Controlled Release 50(1-3): 31-40, 1998; y Patente de Estados Unidos N° 5.145.684.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden situarse dentro de recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones con respecto al uso de dichas composiciones farmacéuticas. Generalmente, dichas instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como dentro de ciertas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, solución salina o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.
La dosis administrada puede variar de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. Como resultará evidente para un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que se trate, la respuesta deseada, la afección del paciente y así sucesivamente. Típicamente, las composiciones pueden administrarse por una diversidad de técnicas, como se ha observado anteriormente.
Los aumentos del contenido mineral óseo y/o densidad mineral ósea pueden determinarse directamente mediante el uso de rayos X (por ejemplo, Absorciometría de rayos X de Energía Dual o “DEXA”) o por interferencia mediante la medición de 1) marcadores de formación de hueso y/o actividad de osteoblastos, tales como, pero sin limitación, fosfatasa alcalina específica de osteoblastos, osteocalcina, propéptido C' de procolágeno de tipo 1 (PICP), fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7: 243(1995)) y propéptido N terminal de procolágeno 1 de suero (P1NP) y/o 2) marcadores de reabsorción de hueso y/o actividad de osteoclastos incluyendo, pero sin limitación, piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas resistentes a tartrato de plasma y galactosil hidroxilisina; (véase Comier, misma referencia), TRAP 5b de suero (fosfatasa ácida resistente a tartrato isoforma 5b) y telopéptido C reticulado en suero (sCTXI). La cantidad de masa ósea también puede calcularse a partir de los pesos corporales o mediante el uso de otros métodos (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5: 177-181, 1984). Se usan animales y modelos animales particulares en la técnica para ensayar el efecto de las composiciones y métodos de la invención en, por ejemplo, parámetros de pérdida de hueso, reabsorción del hueso, formación de hueso, fuerza ósea o mineralización del hueso que imitan las condiciones de enfermedad humana tales como osteoporosis y osteopenias. Los ejemplos de dichos modelos incluyen el modelo de rata ovariectomizada (Kalu, D.N., The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone and Mineral 15: 175-192 (1991); Frost, H.M. y Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoporosis. Bone and Mineral 18: 227-236 (1992); y Jee, W.S.S. y Yao, W., Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1: 193-207 (2001)).
Las afecciones particulares que pueden tratarse por las composiciones de la presente invención incluyen displasias, donde el crecimiento o desarrollo de hueso es anómalo y una amplia diversidad de causas de osteopenia, osteoporosis y pérdida de hueso. Los ejemplos representativos de dichas afecciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exostosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis y osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de huesa inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de peso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrantes del hueso, pérdida ósea oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades ósea metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juvenil, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémico (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides, pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteopenia u osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, displasia fibrosa, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial. Más afecciones se relacionan con pérdida de hueso asociada con el envejecimiento, incluyendo pérdida de hueso facial asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con el envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con el envejecimiento.
Las composiciones de la presente invención también pueden ser útiles para mejorar resultados en procedimientos ortopédicos, procedimientos dentales, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto óseo, cirugía cosmética ósea y reparación del hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial. Puede administrarse una o más composiciones antes, durante y/o después del procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación.
La divulgación también proporciona un kit de diagnóstico que comprende al menos un agente de unión antiesclerostina de acuerdo con la presente invención. Además, dicho kit puede comprender opcionalmente uno o más de los siguientes:
(1) instrucciones para usar el o los agentes de unión para exploración, diagnóstico, pronóstico, supervisión terapéutica o cualquier combinación de estas aplicaciones;
(2) un compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión anti-esclerostina;
(3) una fase sólida (tal como una tira de reactivo) sobre la que se inmovilizan el agente o agentes de unión antiesclerostina; y
(4) un marcador o inserto que indica la aprobación reguladora para uso de exploración, diagnóstico, pronóstico o terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
Si no se proporciona compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión, el agente o los agentes de unión en sí mismos pueden marcarse con uno o más de un marcador o marcadores detectables, por ejemplo un resto quimioluminiscente, enzimático, fluorescente o radiactivo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación.
Ejemplos
EJEMPLO 1
Expresión recombinante de esclerostina
La esclerostina recombinante humana/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n° 1589-ST-025).
Como alternativa, las diferentes especies de esclerostina pueden expresarse de forma transitoria en células 293T o 293EBNA adaptadas para suspensión sin suero. Pueden realizarse transfecciones como cultivos de 500 ml o 1 l. Los siguientes reactivos y materiales están disponibles de Gibco BRL (ahora Invitrogen, Carlsbad, CA). Los números de catálogo se enumeran entre paréntesis: DMEM sin suero (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); Complemento de Selenio-Transferrina-Insulina 1X (51500-056); Pen Strep Glut 1X (10378-016); 1-Glutamina 2 mM (25030-081); HEPES 20 mM (15630-080); Pluronic F68 al 0,01% (24040-032). Brevemente, el inóculo celular (5,0 10,0 X 105 células/ml por volumen de cultivo) se centrifuga a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C para retirar el medio acondicionado.
Las células se resuspenden en DMEM sin suero y se centrifugan de nuevo a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C. Después de aspirar la solución de lavado, las células se resuspenden en medio de crecimiento [DMEM/F12 (3:1) Complemento de Insulina-Transferrina-Selenio 1X Pen Strep Glut 1X L-Glutamina 2 mM HEPES 20 mM Pluronic F68 al 0,01%] en un cultivo de matraz en agitación de 1 l o 3 l. El cultivo del matraz en agitación se mantiene en una placa de agitación magnética a 125 RPM que se sitúa en un incubador humidificado mantenido a 37 °C y CO2al 5%. El ADN plasmídico de expresión de mamífero (por ejemplo, pcDNA3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), que contiene la región codificante completa (y codón de parada) de esclerostina con una secuencia consenso de Kozak (por ejemplo, CCACC) directamente 5' del sitio de inicio ATG, está en complejo con el reactivo de transfección en un tubo cónico de 50 ml.
El complejo de reactivo de transfección de ADN puede prepararse en 5-10% del volumen de cultivo final en DMEM u OPTI-MEM sin suero. Los reactivos de transfección que pueden usarse para este fin incluyen X-tremeGene RO-1539 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), FuGene6 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 293fectin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se añade en primer lugar 1,5 μg de ADN plasmídico/ml de cultivo a DMEM sin suero, seguido de 1-5 μl de reactivo de transfección/ml de cultivo. Los complejos pueden incubarse a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-30 minutos y después añadirse a las células en el matraz de agitación. La transfección/expresión puede realizarse durante 4-7 días, después de lo cual el medio acondicionado (CM) se recoge por centrifugación a 4.000 RPM durante 60 minutos a 44 °C.
EJEMPLO 2
PURIFICACIÓN DE ESCLEROSTINA RECOMBINANTE
La esclerostina recombinante se purificó de células hospedadoras de mamífero como sigue. Todos los procesos de purificación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se usó un esquema de purificación para purificar diversas especies de esclerostina, incluyendo esclerostina murina y humana. El esquema de purificación usó cromatografía de afinidad seguido de cromatografía de intercambio catiónico.
Cromatografía de heparina
El medio acondicionado de célula hospedadora de mamífero (CM) se centrifugó en una centrífuga Beckman J6-M1 a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C para retirar residuos celulares. El sobrenadante de CM se filtró después a través de un filtro de 0,2 μm estéril. (En este punto el CM filtrado estéril puede almacenarse opcionalmente congelado hasta su purificación). Si el CM se congeló, este se descongeló a las siguientes temperaturas, o combinación de las mismas: 4 °C, temperatura ambiente o agua templada. Después de la congelación el CM se filtró a través de un filtro de 0,2 μm estéril y se concentró opcionalmente por ultrafiltración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de punto de corte de 10 kD de peso molecular. El concentrado de CM se filtró a través de un filtro de 0,2 μm estéril y después se cargó en una columna de Alto Rendimiento de Heparina (Heparina HP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences) equilibrada en PBS. Como alternativa, el sobrenadante de CM filtrado puede cargarse directamente en la columna de Heparina HP equilibrada en PBS.
Después de cargar, la columna de Heparina HP se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal (es decir, absorbancia medida antes de cargar el sobrenadante de CM). La esclerostina se eluyó después de la columna usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 2 M en PBS. La absorbancia a 280 nm del eluato se supervisó y se recogieron las fracciones que contenían proteína. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de Heparina HP.
Cromatografía de Intercambio Catiónico
La esclerostina eluida de la columna de Heparina HP se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio catiónico usando medio de cromatografía de Alto Rendimiento SP (SPHP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences). Se cambió el tampón del grupo de heparina HP a PBS por diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). El grupo de Heparina HP dializado se cargó después en una columna de SPHP equilibrada en PBS. Después de cargar, la columna se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal. La esclerostina se eluyó después de la columna SPHP usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 1 M en PBS. La absorbancia a 280 nm de eluato se supervisó y se recogió la esclerostina eluida en fracciones. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de SPHP.
Formulación
Después de la purificación, el grupo de SPHP se formuló en PBS mediante diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). Si fue necesaria la concentración de esclerostina, se usó un dispositivo de centrífuga (Amicon Centricon o Centriprep) con una membrana de 10.000 de PCPM. Después de la formulación la esclerostina se filtró a través de un filtro de 0,2 μm estéril y se almacenó a 4 °C o se congeló.
EJEMPLO 3
ELISA DE UNIÓN DE PÉPTIDOS
Se sintetizó una serie de péptidos solapantes (siendo cada péptido de aproximadamente 20-25 aminoácidos de longitud) basándose en la secuencia de aminoácidos conocida de la esclerostina de rata (SEQ ID NO: 98). Los péptidos se diseñaron de modo que todos contuvieran un resto de cisteína reducido; se incluyó una cisteína adicional en el extremo C terminal de cada péptido que no contenía ya una en su secuencia. Esto permitió a los péptidos unirse a las placas de ensayo mediante acoplamiento covalente, usando placas de unión de sulfhidrilo disponibles en el mercado (Costar), a una concentración de 1 μg/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS: pH 6,5) que contenían EDTA 1 mM. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 200,5%. Las placas se bloquearon mediante incubación con una solución de PBS que contenía gelatina de piel de pescado 0,5% (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en PBS que contenía Tween 200,5%.
Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a 1 μg/ml en PBS que contenía gelatina de piel de pescado al 0,5% y se incubaron con las placas recubiertas de péptido durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiró el anticuerpo en exceso mediante tres lavados con PBS, Tween 20 0,5%. Las placas se incubaron después con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (diluido de forma apropiada en PBS que contenía Tween 200,5%) y capaz de unirse al anticuerpo de interés. Las placas se lavaron después tres veces: una vez con PBS que contenía Tween 20 0,5% y dos veces con PBS. Finalmente las placas se incubaron con un sustrato cromogénico de peroxidasa de rábano rusticano (TMB-Stable Stop, RDI) durante 5 minutos a temperatura ambiente, el desarrollo del color se detuvo con ácido y se midió la densidad óptica de las placas a 450 nm.
Materiales
Placas de Unión de Sulfhidrilo de Costar (VWR n° 29442-278)
Tampón de recubrimiento: PBS 1X pH 6,5 EDTA 1 mM
Tampón de bloqueo: PBS 1X Gelatina de Piel de Pescado 0,5% (PBS de CS; FSG de Sigma n° G 7765) Tampón de lavado: PBS 1X Tween 200,5%
Péptidos de Esclerostina de Rata
Muestras de anticuerpo: Ab transitorio, Ab recombinante Purificado, Suero de conejo, etc.
Ab secundario apropiado: de Cabra-anti-HRP de Ratón/Conejo (Jackson Immuno Research, 115-036-072) TMB-Stable Stop (RDI n° RDI-TMBSX-1L)
HCl 0,5 M
Los métodos fueron los siguientes:
1. Recubrir placas con 100 μl/pocillo de péptido de esclerostina de rata diluido en PBS 1x pH 6,5 EDTA 1 mM a 1 μg/ml. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. (Las placas deberían usarse en un periodo de 30 minutos desde la apertura).
2. Lavar placas 3X con tampón de lavado.
3. Bloquear las placas con 200 μl/pocillo de tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Repetir el lavado como se ha descrito en (2).
5. Incubar las placas con 50 μl/pocillo de muestras diluidas en tampón de bloqueo - los títulos de suero comienzan a 1:100; uso de Ab Recombinante Transitorio puro; uso de Ab recombinante Purificado a 1 μg/ml (todas las muestras se procesan por duplicado). Incubar las placas durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Lavar las placas como se ha descrito en (2).
7. Incubar las placas con 50 μl/pocillo de Anticuerpo Secundario apropiado (marcado con HPR) diluido 1:1600 en Tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
8. Lavar las placas con tampón de lavado 1X, PBS 2X.
9. Incubar las placas con 50 μl/pocillo de TMB, 5 minutos a temperatura ambiente.
10. Detener la reacción con 50 ^l/pocillo de HCl 0,5 M.
11. Leer placas a 450 nm de longitud de onda.
Las siguientes secuencias peptídicas se exploraron como se ha descrito anteriormente:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID NO: 82)
TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO: 83)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO: 84)
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO: 85)
CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID NO: 86)
CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (SEQ ID NO: 87)
CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID NO: 88)
CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 89)
RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID NO: 90)
PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO: 91)
KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO: 92)
IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID NO: 93)
SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO: 94)
KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO: 95)
PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96)
KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
Un anticuerpo neutralizante de alta afinidad (Ab-19) se unió a dos secuencias peptídicas solapantes: PNAIGRVKW WRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96) y KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
Este procedimiento permite el reconocimiento de epítopos por anticuerpos que reaccionan con epítopos aparentemente lineales. Los péptidos que contienen todo o parte del sitio de unión a anticuerpo se unirán al anticuerpo y de este modo se detectarán.
EJEMPLO 4
IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS DE ESCLEROSTINA HUMANA
Estructura de esclerostina
La esclerostina humana de forma madura (péptido señal retirado) es una proteína de 190 aminoácidos (Figura 8). La Figura 9 muestra un esquema de la estructura general de la esclerostina con una rama N terminal (de la Q N terminal a Cisteína 1) y una rama C terminal (de Cisteína 8 a la Y terminal). Intercalada entre estas dos ramas hay una estructura de nudo de cistina y tres bucles que se designan Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Los cuatro enlaces disulfuro en esclerostina son Cys1 en la posición de secuencia 57 unida a Cys5 en la posición de secuencia 111 (denominado C1-C5), Cys2 en la posición de secuencia 71 unida a Cys6 en la posición de secuencia 126 (denominado C2-C6), Cys3 en la posición de secuencia 82 unida a Cys7 en la posición de secuencia 142 (denominado C3-C7), Cys4 en la posición de secuencia 86 unida a Cys8 en la posición de secuencia 144 (denominado C4-C8). La estructura en anillo de ocho miembros se forma mediante enlaces disulfuro C3-C7 y C4-C8. Esa estructura en anillo, junto con el enlace disulfuro C1-C5 que penetra a través del anillo, forma un nudo de cistina típico. C2-C6, que no es parte del nudo de cistina, pone dos estructuras en bucle grandes, bucle 1 (restos 57 a 82) y bucle 3 (restos 111 a 142) juntos entre sí. El bucle 2 va de C4 (resto 86) a C5 (resto 111).
Experimental
El enfoque general para caracterizar los epítopos unidos por anticuerpos monoclonales anti-esclerostina implicó fragmentar la Esclerostina humana en péptidos con diferentes proteasas, determinar la secuencia de los diversos péptidos de esclerostina humana, aislar estos péptidos y ensayar cada uno de ellos con respecto a su capacidad para unirse a un anticuerpo monoclonal particular usando un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Los datos resultantes permitieron que se determinara la localización del epítopo de unión.
Las digestiones peptídicas se sometieron a mapeo de péptidos por HPLC; los picos individuales se recogieron y los péptidos se identificaron y se mapearon mediante espectrometría de masas por desorción de láser asistida por matriz (MALDI-MS) y análisis de LC-MS de ionización por electronebulización (ESI-LC-MS) y/o mediante secuenciación N terminal. Todos los análisis de HPLC para estos estudios se realizaron usando una columna C8 de fase inversa (2,1 mm i.d. x 15 cm de longitud). El mapeo de péptidos por HPLC se realizó con un gradiente lineal de ácido tricloroacético 0,05% (fase móvil A) a acetonitrilo al 90% en ácido trifluoroacético al 0,05%. Las columnas se desarrollaron durante 50 minutos a un caudal de 0,2 ml/min.
Digestiones con tripsina y AspN Endoproteinasa
La esclerostina humana en forma madura se digirió con tripsina, que escinde después de arginina y lisina, o con AspN. Se incubaron aproximadamente 200 μg de esclerostina a 0,5-10 mg/ml en PBS (pH 7,2) durante 20 h a 37 °C con 8 μg de tripsina o AspN.
Digestión de tripsina
La cromatografía de HPLC de las digestiones de tripsina produjo varios picos importantes (Fig. 10A). Se realizó análisis de secuencia en los picos peptídicos recuperados de HPL<c>después de digestión con tripsina. El análisis de ESI LC-MS en línea del producto de digestión peptídica también se realizó para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. Se determinó de este modo la identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos (Fig. 11). La Figura 13 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (T19,2, T20, T20,6, T21-22) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada T (por ejemplo, T19,2) refleja el tiempo de retención. T19,2 contiene dos péptidos (uno del bucle 1 y uno del bucle 3) unidos por el enlace disulfuro C2-C6. T20 contiene dos péptidos mantenidos juntos por la estructura de nudo de cistina, con los bucles intactos 1 y 3 mantenidos juntos por el disulfuro C2-C6 y con la mayor parte del bucle 2 ausente. T20,6 contiene cuatro secuencias mantenidas juntas por la estructura de nudo de cistina, pero carece de parte del bucle 1 y bucle 3 (la parte T19,2) y carece de la mayoría del bucle 2. T21-22 es casi idéntico a T20 pero tiene 3 aminoácidos adicionales en la región del bucle 2.
Digestión con AspN
La cromatografía de HPLC de los productos de digestión de AspN produjo varios picos principales (Fig. 10B). Se realizó análisis de secuencia de los picos peptídicos recuperados de HPLC. También se realizó análisis de ESI LC-MS en línea del producto de digestión peptídico para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. La identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos del producto de digestión de AspN se determinó de este modo (Fig. 12). La Figura 14 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (AspN14,6, AspN18,6, AspN22,7-23,5) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada AspN (por ejemplo AspN 18,6) refleja el tiempo de retención. AspN14,6 contiene tres péptidos cortos de las ramas tanto N como C terminales de esclerostina, mientras que AspN 18,6 es un péptido mayor de la rama N terminal de esclerostina. AspN22,7-23,5 contiene un único fragmento peptídico de 104 aminoácidos que abarca las ocho cisteínas (los cuatro enlaces disulfuro), el nudo de cistina y todos los bucles 1, 2 y 3.
La estrategia para caracterizar los epítopos fue usar estos diversos péptidos de esclerostina humana generados por tripsina y AspN y determinar qué péptidos podían aún unirse a los diversos anticuerpos (Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D). Específicamente esto se ensayó en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore donde la unión de un anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana inmovilizada en la microplaca de Biacore se determinó en presencia o ausencia de cada una de las diversas fracciones peptídicas de HPLC de tripsina y AspN aisladas. En ausencia de cualquier péptido competidor, el anticuerpo monoclonal particular fue capaz de unirse a la esclerostina humana en la microplaca y producir una respuesta en unidades de resonancia, UR. La preincubación del anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana intacta en solución, seguida de ensayo de la unión con la microplaca, demostró que la unión del Mab con esclerostina humana en solución evitó la unión del Mab con la esclerostina humana en la microplaca, validando de este modo el principio general de este ensayo de competición.
Este procedimiento general se repitió individualmente para cada péptido. Se interpretó que una respuesta de UR robusta indicaba que el péptido particular ensayado no podía unirse al Mab en solución (por lo tanto el Mab era libre para unirse a la esclerostina humana que se había inmovilizado en la microplaca). Por el contrario, la ausencia de una respuesta de UR robusta indicó que el Mab era capaz de unirse al péptido de esclerostina en solución. Estos patrones de unión, acoplados con la identidad conocida de los diversos péptidos de esclerostina, se usaron para determinar los epítopos de esclerostina que se unían a anticuerpos anti-esclerostina Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D. ENSAYO DE UNIÓN COMPETITIVA DE EPÍTOPOS PEPTÍDICOS DE ESCLEROSTINA HUMANA BASADO EN BIACORE
Preparación de superficie de esclerostina humana:
Se realizó inmovilización de esclerostina humana en forma madura en una superficie de microplaca sensora BIAcore (CM5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se activaron grupos carboxilo en las superficies de la microplaca sensora inyectando 60 μl de una mezcla de contenía N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0,2 M y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M. La esclerostina humana se diluyó en acetato sódico 10 mM, pH 4,0 a una concentración de 20 μg/ml seguido de inyección sobre la superficie de CM5 activada. Los grupos reactivos en exceso en la superficie se desactivaron inyectando 60 μl de etanolamina 1 M. Los niveles inmovilizados finales fueron de ~ 5000 unidades de resonancia (UR) para la superficie de esclerostina humana. También se preparó una superficie de referencia acoplada a simulación blanca en las microplacas sensoras.
Análisis de especificidad de unión:
La solución salina tamponada con fosfato 1X sin cloruro cálcico o cloruro de magnesio fue de Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA. La albúmina de suero bovino, fracción V, sin IgG fue de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Cada Mab (2 nM) se incubó por separado con esclerostina humana 20 nM o un péptido de esclerostina humana particular (nota: hay 3 péptidos no unidos en AspN14,6) en el tampón de muestra (PBS 1X P-200,005% BSA 0,1 mg/ml) antes de inyección sobre la superficie de esclerostina humana inmovilizada. El caudal para la inyección de muestra fue de 5 μl/min seguido de regeneración de superficie usando NaCl 1 M en Glicina 8 mM, pH 2,0 a 30 μl/min durante 30 segundos. Los datos se analizaron usando BIAevaluación 3.2 y se presentan en la Figura 15 (Ab-A), Figura 16 (Ab-B), Figura 17 (Ab-C) y Figura 18 (Ab-D).
Epítopos T20,6 y Bucle 2:
Los patrones de unión del péptido de esclerostina para dos anticuerpos representativos (Ab-A y Ab-B) fueron prácticamente idénticos (Fig. 15 y Fig. 16) y mostraron que ambos de estos Anticuerpos podían unirse solamente al péptido AspN22,7-23,5. La única diferencia entre AspN22,7-23,5 y todos los demás péptidos de esclerostina es que AspN22,7-23,5 contiene un bucle 2 intacto. Esto muestra que Ab-A y Ab-B se unen a la región de bucle 2 de esclerostina definiendo de este modo el epítopo de bucle 2 (Fig. 19A). Los patrones de unión del péptido de esclerostina para Ab-C y Ab-D fueron prácticamente idénticos entre sí (Fig. 17 y Fig. 18) pero completamente distintos del hallado para Ab-A y Ab-B. De los péptidos ensayados en este Ejemplo, el péptido más pequeño al que pudieron unirse Ab-C y Ab-D fue el péptido T20,6. Este resultado define el epítopo T20,6 (Fig. 19B).
Ensayo de protección de proteasa:
El principio general de este ensayo es que la unión de un Mab con esclerostina puede dar como resultado la protección de ciertos sitios de escisión de proteasa específicos y esta información puede usarse para determinar la región de esclerostina con la que se une el Mab.
Epítopo “derivado de T20,61 (nudo de cistina 4 ramas)”:
La Figura 20 muestra los mapas peptídicos de HPLC para un complejo de Ab-D de esclerostina humana (Fig. 20A: la esclerostina humana se preincubó a una relación molar de 1:1 con Ab-D antes de digestión con tripsina como se ha descrito anteriormente) y esclerostina humana solamente (Fig. 20B: la esclerostina humana se digirió con tripsina como se ha descrito anteriormente). Los picos peptídicos de T19,2 y T20,6 en la Figura 20A mostraron una clara reducción de su altura de pico respectiva, en comparación con la Figura 20B. Esta reducción en las alturas de los picos se vio acompañada de un aumento de la altura de los picos para los péptidos T20 y T21-22. Esto datos indican que los restos de aminoácidos básicos en el bucle 1 y bucle 3, que en ausencia de Ab-D se escindieron mediante tripsina para generar los péptidos T19,2 y T20,6, fueron resistentes a escisión por tripsina cuando Ab-D se preunió a esclerostina. La presencia de T20, T20,6 y T21-22 indica que el bucle 2 aún se escindía eficazmente cuando Ab-D estaba preunido a esclerostina. Estos datos indican que Ab-D se unió al lado del bucle 1 y bucle 3 del epítopo T20,6 definiendo de este modo el epítopo más pequeño “derivado 1 de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)” mostrado en la Figura 21.
EJEMPLO 5
ENSAYOSIN VIVODE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN RATONES
Se obtuvieron ratones macho BDF1 de cuatro semanas de edad de Charles River Laboratories (Raleigh, NC) y se alojaron en jaulas limpias, con cinco animales por jaula. La temperatura ambiente se mantuvo entre 20 y 22,22 °C, y la humedad relativa se mantuvo entre 34 y 73%. El laboratorio que alojaba las jaulas tuvo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y cumplía todas las especificaciones de AAALAC. Se realizaron observaciones clínicas en todos los ratones en el estudio una vez al día.
Los anticuerpos monoclonales anti-esclerostina purificados (Ab-A Fig.1; Ab-B Fig.2; Ab-C Fig.3; Ab-D Fig.4) se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco estéril. Se inyectaron anticuerpos anti-esclerostina o vehículo PBS a los ratones por vía subcutánea a 21 μl por gramo de peso corporal, dos veces por semana (lunes y martes) a 25 mg/kg. Se diluyó PTH humano (1-34) en tampón de PTH (HCl 0,001, NaCl 0,15, bSa 2%) y se dosificó por vía subcutánea a 21 μl por gramo de peso corporal cinco veces a la semana (lunes, martes, miércoles, jueves, viernes) a 100 μg/kg como un control positivo (Figuras 5 y 6). El número de ratones por grupo fue de N=5 en las Figs. 5 y 6, y N=6 en la Figura 7.
Densitometría de huesoin vivoPIXImus
La densidad mineral ósea (DMO) se determinó semanalmente en la metáfisis tibial proximal y vértebras lumbares mediante Absorciometría de rayos X de Energía Dual periférica (pDEXA) con el sistema PIXImus2 de GE/Lunar Medical Systems, Madison, WI. Se situó una región de interés (ROI) de 25 mm2 para incluir la superficie articular proximal, la epífisis y el extremo proximal en la metáfisis de la tibia. Se situó una región de interés (ROI) para incluir las vértebras lumbares (L1-L5). Las regiones lumbar y tibial proximales se analizaron para determinar la densidad mineral ósea total. Se presentaron las medidas de los grupos Desviación Típica y se compararon con el grupo de tratamiento con vehículo para análisis estadístico.
Análisis estadístico
Se realizó análisis estadístico con un Dunnett y Tukey-Kramer (usando MS Excel y JMP v. 5.0 para los datos de DMO). Las medidas de los grupos para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05).
Actividad neutralizante de esclerostina de anticuerpos
Los aumentos estadísticamente significativos de DMO en comparación con el vehículo vistos para cada uno de Ab-A (Figura 5), Ab-B (Figura 5), Ab-C (Figura 6) y Ab-D (Figura 7) demuestran que estos cuatro anticuerpos son anticuerpos neutralizantes de esclerostina. Además estos datos muestran que, para anticuerpos anti-esclerostina que se unen a esclerostina de ratón, puede usarse tratamiento y análisis de ratones como se ha descrito anteriormente para identificar anticuerpos neutralizantes de esclerostina.
EJEMPLO 6
EXPLORACIÓN PARA ANTICUERPOS QUE BLOQUEAN LA UNIÓN DE UN ANTICUERPO CON ESCLEROSTINA HUMANA
La esclerostina humana se acopló a una microplaca de Biacore CM5 usando química de acoplamiento de amina convencional para generar una superficie recubierta de esclerostina. Se acoplaron 300 unidades de resonancia de esclerostina a la superficie.
Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a una concentración de 200 μg/ml en tampón HBS-EP (que es HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensioactivo P200,005% (v/v)) y después se mezcló en una relación molar de uno a uno (basándose en el sitio de unión) para generar la mezcla de ensayo. Esta mezcla de ensayo contenía por lo tanto cada anticuerpo a una concentración de 100 μg/ml (1,3 μm basándose en un sitio de unión). También se prepararon soluciones separadas que contenían cada uno de los anticuerpos en la mezcla de ensayo solamente. Estas soluciones contenían los anticuerpos individuales en tampón HBS-EP a una concentración de 100 μg/ml (1,3 μm basándose en un sitio de unión).
Se pasaron 20 μl de la mezcla de ensayo sobre la microplaca recubierta con esclerostina a un caudal de 10 μl/min y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató después con dos pulsos de 60 segundos de HCl 30 mM para retirar todo el anticuerpo unido. Después se pasó una solución que contenía solamente uno de los anticuerpos de la mezcla de ensayo (a 1,3 μM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca del mismo modo que la mezcla de ensayo y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido y finalmente se pasó una solución que contenía el otro anticuerpo de la mezcla de ensayo solamente (a 1,3 μM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca y se registró la cantidad de unión.
La tabla posterior muestra los resultados de ensayos de bloqueo cruzado en una serie de anticuerpos diferentes. Los valores en cada celda de la tabla representan la cantidad de unión (en UR) vista cuando los anticuerpos (a 1,3 μM basándose en un sitio de unión) o tampón indicados en la fila superior de la tabla se mezclaron con los anticuerpos (a 1,3 μM basándose en un sitio de unión) o tampón indicados en la primera columna de la tabla.
Usando el valor de unión medio (en UR) para cada combinación de anticuerpos de la tabla anterior (puesto que cada combinación aparece dos veces) es posible calcular el porcentaje de la unión teórica mostrado por cada combinación de anticuerpos. La unión teórica se calcula como la suma de los valores medios para los componentes de cada mezcla de ensayo cuando se ensayan solos (es decir, anticuerpo y tampón).
A partir de los datos anteriores resulta evidente que Ab-4, Ab-A y Ab-19 se bloquean de forma cruzada entre sí. De forma similar Ab-13 y Ab-3 se bloquean de forma cruzada entre sí.
EJEMPLO 7
BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA
Los volúmenes líquidos usados en este ejemplo serían los usados típicamente en ELISA de placa de 96 pocillos (por ejemplo 50-200 μl/pocillo). En este ejemplo se supone que Ab-X y Ab-Y tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión de esclerostina por molécula de anticuerpo. Un anticuerpo antiesclerostina (Ab-X) se usa para recubrir (por ejemplo 50 μ de 1 μg/ml) una placa de ELISA de 96 pocillos [por ejemplo, Microplaca de Fondo Plano EIA/RIA de 96 Pocillos de Corning (Producto n° 3590), Corning Inc., Acton, Ma ] durante al menos una hora. Después de esta etapa de recubrimiento se retira la solución de anticuerpo, la placa se lava una vez o dos veces con solución de lavado (por ejemplo, PBS y Tween 20 0,05%) y después se bloquea usando una solución de bloqueo apropiada (por ejemplo, PBS, BSA 1%, suero de cabra 1% y Tween 20 0,5%) y procedimientos conocidos en la técnica. La solución de bloqueo se retira después de la placa de ELISA y se añade un segundo anticuerpo anti-esclerostina (Ab-Y) que se ensaya con respecto a su capacidad para bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento, en exceso (por ejemplo 50 μl de 10 μg/ml) en solución de bloqueo a los pocilios apropiados de la placa de ELISA. A continuación, se añade después una cantidad limitada (por ejemplo 50 μl de 10 ng/m) de esclerostina en solución de bloqueo a los pocillos apropiados y la placa se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente en agitación. La placa se lava después 2-4 veces con solución de lavado. Se añade una cantidad apropiada de un reactivo de detección de esclerostina [por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-esclerostina biotinilado que se ha unido en complejo previamente con una cantidad apropiada de un conjugado de peroxidasa de rábano rusticano-esclerostina (h Pr )] en solución de bloqueo a la placa de ELISA y se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente. La placa se lava después al menos cuatro veces con solución de lavado y se desarrolla con un reactivo apropiado [por ejemplo, sustratos de HRP tales como TMB (colorimétrico) o diversos sustratos luminiscentes de HRP]. La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario que el ensayo de ELISA se procese de tal modo que la señal de control de positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo. Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultantes de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:
1) el formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución
y
2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.
Ab-X y Ab-Y se definen como de bloqueo cruzado si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo antiesclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60% y el 100%, específicamente entre el 70% y el 100%, y más específicamente entre el 80% y 100%, de la señal de detección de esclerostina (es decir la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir los pocillos de control positivos).
En el caso de que se use una versión marcada de esclerostina en el ELISA, tal como una Esclerostina marcada con His N terminal (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat n° 1406-ST-025) entonces un tipo apropiado de reactivo de detección de esclerostina incluiría un anticuerpo anti-His marcado con HROP. Además de usar Esclerostina marcada con His N terminal, también podría usarse Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador conocidos en la técnica en este ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA (por ejemplo, marcador HA con anticuerpos anti HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG, marcador de biotina con estreptavidina).
EJEMPLO 8
MINERALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS PARA IDENTIFICAR AGENTES CAPACES DE ANTAGONIZAR LA ACTIVIDAD DE ESCLEROSTINA
Introducción
Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modeloin vitrode formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de la diferenciación de células de linaje de osteoblastos mediante uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de matriz y finalmente deposición de minerales, que se refiere a la cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición de mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.
La deposición de mineral tiene una fuerte característica biofísica, porque una vez que las “semillas” minerales comienzan a formarse, la cantidad total de mineral que se depositará en el cultivo completo puede en ocasiones depositarse con bastante rapidez, tal como en un periodo de unos pocos días después. El momento y alcance de la deposición mineral en cultivo están influidos, en parte, por las células/línea celular de linaje de osteoblastos particular que se use, las condiciones de crecimiento, la elección de agentes de diferenciación y el número de lote particular del suero usado en el medio de cultivo celular. Para cultivos de mineralización de línea celular/célula de linaje de osteoblastos, deberían ensayarse al menos de ocho a quince lotes de suero de más de un proveedor para identificar un lote de suero particular que permita que se produzca la mineralización.
Las células MC3T3-E1 (Sudo Het al., In vitrodifferentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaría. J. Cell Biol. 96: 191-198) y subclones de la línea celular original pueden formar mineral en cultivo tras su crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Rediman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J Biol Chem 275: 19992-20001).
Identificación de Anticuerpos Neutralizantes de Esclerostina
Se usaron células MC3T3-E1-BF para el ensayo de mineralización. Se usaron ácido ascórbico y B-glicerofosfato para inducir diferenciación de células MC3T3-E1-BF que conduzca a deposición mineral. El protocolo de exploración específico, en formato de 96 pocillos, implicó sembrar células en placas un miércoles, seguido de siete cambios de medio (como se describe adicionalmente posteriormente) durante un periodo de 12 días, teniendo lugar la mayor parte de la deposición mineral aproximadamente en las dieciocho horas finales (por ejemplo, del domingo por la noche al lunes). Para cualquier tratamiento dado, se usaron 3 pocillos (N=3). El momento y alcance específicos de la deposición mineral pueden variar dependiendo, en parte, del número de lote de suero particular que se use. Los experimentos de control permitirán explicar dichas variables, como se conoce bien en la técnica de la experimentación de cultivo celular en general.
En este sistema de ensayo la esclerostina inhibió uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducían a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibió la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que fueron capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitaron la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hubo un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medida en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir, sin anticuerpo). Para análisis estadístico (usando MS Excel y JMP) se usó un ANOVA de 1 vía seguido de comparación de Dunnett para determinar diferencias entre grupos. Las medias de grupo para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05). Se muestra un resultado representativo del procesamiento de este ensayo en la Figura 22. En ausencia de esclerostina de ratón recombinante, la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral sucedieron con normalidad. Se muestran los niveles de calcio en cada grupo de tratamiento como medias Error Típico de la Media (ETM). En este experimento ejemplar los niveles de calcio del ensayo de calcio fueron ~31 μg/ml. Sin embargo, la adición de esclerostina de ratón recombinante provocó inhibición de la mineralización y el calcio se redujo en ~85%. La adición de anticuerpo monoclonal anti-esclerostina Ab-19 o Ab-4 junto con la esclerostina recombinante dio como resultado un aumento estadísticamente significativo en la deposición mineral, en comparación con el grupo solamente de esclerostina, debido a que la actividad inhibidora de esclerostina se neutralizó por uno de los anticuerpos. Los resultados de este experimento indican que Ab-19 y Ab-4 son anticuerpos monoclonales neutralizantes de esclerostina (Mab).
La Figura 23 muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y dos Mab antiesclerostina humanizados. La Figura 24 también muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y Mab anti-esclerostina de ratón y humanizados según se indica.
Los anticuerpos usados para los experimentos mostrados en la Fig. 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.
Se describe a continuación un protocolo de cultivo de células MC3T3-E1-BF.
Reactivos y Medios
Alfa-MEM se fabrica habitualmente con una fecha de caducidad de 1 año. Para el cultivo celular se usó Alfa-MEM que no tenía más de 6 meses después de la fecha de fabricación.
Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu) se preparó como sigue: se descongeló un frasco de 500 ml de FBS y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Se añadieron 100 ml de este FBS a 1 litro de Alfa-MEM seguido de la adición de 10 ml de PenStrepGlutamina 100x. El FBS no usado se separó en alícuotas y se volvió a congelar para uso posterior.
El Medio de Diferenciación (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu ácido ascórbico 50 μg/ml beta-glicerofosfato 10 mM) se preparó como sigue:
Se prepararon 100 ml de Medio de Diferenciación complementando 100 ml de Medio de Expansión con ácido ascórbico y beta-glicerofosfato como sigue:
Conc. de reserva (véase posteriormente) Volumen Conc. Final
Ácido ascórbico 10 mg/ml 0,5 ml 100 μg/ml (50 μg/ml 50 μg/ml) P-glicerofosfato 1 M 1,0 ml 10 nM
Se preparó Medio de Diferenciación complementando Medio de Expansión solamente el día en que el Medio de Diferenciación iba a usarse para cultivo celular. La concentración final de ácido ascórbico en el Medio de Diferenciación es de 100 μg/ml debido a que Alfa-MEM ya contiene ácido ascórbico 50 μg/ml. Se preparó solución madre de ácido ascórbico (10 mg/ml) y se separó en alícuotas para congelar a -80 °C. Cada alícuota se usó solamente una vez (es decir no se volvió a congelar). Se preparó solución madre de beta-glicerofosfato (1 M) y se separó en alícuotas para congelar a -20 °C. Cada alícuota se congeló y se descongeló un máximo de 5 veces antes de descartarse.
Cultivo Celular para expansión de células MC3T3-E1-BF.
Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO25%. Se generó un banco de células para los fines de explorar con respecto a anticuerpos neutralizantes de esclerostina. El banco de células se creó como sigue:
Se descongeló un recipiente de células MC3T3-E1-BF congeladas mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, se sembraron 1 x 106 células en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu en un matraz T175.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente a los 7 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 células en placas con 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces de T175 usados para sembrar en este punto dependió del número de células totales disponible y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90%/DMSO 10%. Este “pase final” de células congeladas fue el pase que se usó para el ensayo de exploración.
Cultivo celular para mineralizar células MC3T3-E1-BF.
Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO25%. Es deseable minimizar las fluctuaciones de temperatura y % de CO2 durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. Esto puede conseguirse minimizando el tiempo que las placas pasan fuera del incubador durante la alimentación y también minimizando el número de veces que se abre y se cierra la puerta del incubador durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. A este respecto puede ser útil tener un incubador de cultivo tisular que esté dedicado exclusivamente al cultivo celular de mineralización (y por lo tanto no se abra o cierre más de lo que es necesario).
Se descongeló un número apropiado de recientes de “pase final” preparados como se ha descrito anteriormente mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10%/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células por azul de tripano y hemacitómetro, se sembraron 2500 células en placas en 200 microlitros de medio de Expansión por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I (Becton Dickinson Labware, cat. n° 354407).
Para evitar un efecto de mineralización de borde de placa, las células no se sembraron en las placas en la columna/fila más externa en todo el borde de la placa. En su lugar se añadieron 200 microlitros de PBS a estos pocillos.
Procedimiento de cultivo celular ejemplar
En el siguiente procedimiento, se indica que el día de partida para la siembra de las células en placas es un miércoles. Si se usa un día de la semana diferente como el día de partida para la siembra de las células en placas, ese día dará inicio al programa diario de retirada y adición de medio durante el proceso completo como se indica posteriormente. Por ejemplo, si las células se siembran un martes, el medio no debería retirarse y añadirse el primer viernes y sábado, ni el segundo viernes y sábado. Con un comienzo en martes, las placas se prepararían para el ensayo de calcio el domingo final.
Las células se sembraron un miércoles a 2500 células en 200 μl de medio de Expansión.
El jueves se retiró todo el medio de Expansión y se añadieron 200 μl de Medio de Diferenciación.
El viernes se retiraron 100 μl de medio y se añadieron 100 μl de Medio de Diferenciación nuevo.
El lunes se retiraron 100 μl de medio y se añadieron 100 μl de Medio de Diferenciación nuevo.
El martes se retiraron 100 μl de medio y se añadieron 100 μl de Medio de Diferenciación nuevo.
El miércoles se retiraron 100 μl de medio y se añadieron 100 μl de Medio de Diferenciación nuevo.
El jueves se retiraron 100 μl de medio y se añadieron 100 μl de Medio de Diferenciación nuevo.
El viernes se retiraron 100 μl de medio y se añadieron 100 μl de Medio de Diferenciación nuevo.
El lunes siguiente se prepararon placas para el ensayo de calcio como sigue:
Las placas se lavaron una vez con Tris 10 mM, HCl pH 7-8.
Trabajando bajo una campana de humos, se añadieron 200 μl de NHC 0,5 N por pocillo. Las placas se congelaron después a -80 °C.
Justo antes de medir el calcio, las placas se congelaron-descongelaron dos veces y después se usó trituración con una pipeta multicanal para dispersar los contenidos de la placa. Después se permitió que los contenidos de la placa reposaran a 4 °C durante 30 minutos momento en el cual se retiró una cantidad apropiada de sobrenadante para medir el calcio usando un kit de calcio disponible en el mercado. Un kit ejemplar y no limitante es Calcium (CPC) Liquicolor, Cat. N° 0150-250, Stanbio Laboratory, Boerne, TX.
En este ensayo basado en células, la esclerostina inhibe uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Por lo tanto, en experimentos en los que se indujo esclerostina en el experimento de cultivo celular particular, se añadió la esclerostina recombinante al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. En los casos en los que se ensaya un anticuerpo monoclonal anti-esclerostina (Mab) con respecto a la capacidad para neutralizar esclerostina, es decir, permitir la mineralización neutralizando la capacidad de la esclerostina para inhibir la mineralización, el Mab se añadió al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. De acuerdo con el protocolo, eso se consiguió como sigue: el Mab se preincubó con la esclerostina recombinante en medio de Diferenciación durante 45-60 minutos a 37 °C y después este medio se usó para alimentar a las células.
Se ha descrito anteriormente un protocolo de mineralización de 12 días para las células MC3T3-E1-BF. Usando los mismos reactivos y protocolo de alimentación, las células originales MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983.In vitrodifferentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96: 191-198) que los inventores obtuvieron del Banco de Células RIKEN (RGB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsukubashi, Ibaraki 305-0074, Japón) tardaron más en mineralizarse (20 días totales para la mineralización) que las células MC3T3-E1-BF. La mineralización de las células MC3T3-E1 originales se inhibió mediante esclerostina recombinante y esta inhibición se bloqueó usando un anticuerpo neutralizante de esclerostina.
EJEMPLO 9
EL ANTICUERPO ANTI-ESCLEROSTINA PROTEGE DE LA PÉRDIDA DE HUESO INDUCIDA POR INFLAMACIÓN EN EL MODELO DE TRANSFERENCIA DE CD4 CD45RBHI DE COLITIS EN RATONES SCID
Sumario del modelo
La inyección del subconjunto CD45RBalto de linfocitos T CD4+ en ratonesscidC.B-17 da como resultado la inflamación intestinal crónica con características similares a las de enfermedad inflamatoria del intestino humana (IBD). Se observa diarrea y enfermedad de debilitamiento 3-5 semanas después de la transferencia celular con infiltración de leucocitos grave en el colon acompañado de hiperplasia de células epiteliales y formación de granuloma. Los ratonesscidC.B-17 que reciben el subconjunto recíproco de células CD4+, las que expresan CD45RBbajo, no muestran colitis y tienen un aumento de peso indistinguible de ratonesscidno inyectados. Además de los síntomas de colitis, el modelo de transferencia de linfocitos T CD4+ CD45RBalto de colitis está acompañado de una reducción de la densidad mineral ósea (DMO), que se cree que es principalmente mediante mecanismos inflamatorios en lugar de malabsorción dietética (Byrne, F. R.et al,Gut 54: 78-86, 2005).
Inducción de colitis y pérdida de hueso inducida por inflamación
Se tomaron bazos de ratones balb/c hembra y se rompieron mediante un tamiz celular de 70 μm. La población de CD4+ se enriqueció después mediante selección negativa con Dynabeads usando anticuerpos contra B220, MAC-1, CD8 e I-Ad. La población enriquecida se tiñó después con anti-CD4 conjugado con FITC y anti-CD45RB conjugado con PE y se fraccionó en poblaciones CD4+CD45RBalto y CD4+CD45RBbajo por separación de dos colores en un Moflo (Dakocytomation). Las poblaciones de CD45RBalto y CD45RBbajo se definieron como el 40% de tinción más brillante y el 20% de tinción más pálida de células CD4+ respectivamente. Se inyectaron después 5 x 105 células i.p. en ratonesscidC.B-17 el día 0 y se supervisó el desarrollo de colitis mediante la aparición de heces blandas o diarrea y pérdida de peso. Se tomaron mediciones de densidad mineral ósea al final del estudio (día 88).
Efecto del tratamiento anti-Esclerostina en síntomas de colitis y DMO
Se dosificó IgG Ab-A a 10 mg/kg s.c. desde el día antes de la transferencia de células CD4+CD45RBalto y se comparó con ratones que recibieron el anticuerpo de control negativo 101.4 también dosificado a 10 mg/kg s.c. Los anticuerpos se dosificaron semanalmente a continuación. Un grupo de ratones que recibió células CD4+CD45RBbajo no patógenas y se dosificaron con 10 mg/kg de 101.4 se estudió como un control. Al final del estudio (día 88) se midió la densidad mineral ósea y se tomaron secciones del colon para análisis de infiltración celular y evaluación de daño histológico.
a) Sin efecto en síntomas de colitis
Los síntomas de colitis típicos tales como pérdida de peso e infiltración de células inflamatorias en el colon no se vieron afectados por el tratamiento con Ab-A. De forma similar no hubo mejora de daño histológico al colon después del tratamiento con Ab-A.
b) Inhibición de pérdida inducida por inflamación de densidad mineral ósea.
El día 88 después de la transferencia de células en ratonesscidC.B-17, se midió la densidad mineral ósea (DMO total, DMO de vértebras y DMO del fémur). En comparación con ratones de control que recibieron células no patógenas CD4+CD45RBbajo, los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y el anticuerpo de control negativo 101.4 tuvieron densidad mineral ósea reducida, como se muestra en la Figura 25. Por el contrario, no se observó reducción de DMO después de tratamiento con Ab-A. Las mediciones totales, de vértebras y de fémur de DMO fueron significativamente mayores en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con Ab-A que los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con 101.4 (P<0,001 por ensayo de comparación múltiple de Bonferroni).
EJEMPLO 10
DETERMINACIÓN BASADA EN KINEXA DE AFINIDAD (K<d>) DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA POR ESCLEROSTINA HUMANA
La afinidad de varios anticuerpos anti-esclerostina por esclerostina humana se evaluó mediante un análisis de unión en equilibrio en solución usando KinExA® 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Para estas mediciones, se pre-recubrieron perlas Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) con esclerostina humana 40 μg/ml en Na2CO3 50 mM, pH 9,6 a 4 °C durante una noche. Las perlas se bloquearon después con BSA 1 mg/ml en Tris-HCl 1 M, pH 7,5 a 4 °C durante dos horas. Se mezclaron 10 μM, 30 μM o 100 μM del anticuerpo con diversas concentraciones de esclerostina humana, que varió en concentración de 0,1 μM a 1 nM, y se equilibró a temperatura ambiente durante más de 8 horas en<p>B<s>con BSA 0,1 mg/ml y P20 0,005%. Las mezclas se pasaron después sobre las perlas recubiertas con esclerostina humana. La cantidad de anticuerpo anti esclerostina unido a perlas se cuantificó usando anticuerpos anti-IgG de ratón de cabra marcados con Cy5 fluorescente o anti-IgG humana de cabra marcados con Cy5 fluorescente (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) para las muestras de anticuerpo de ratón o humano, respectivamente. La cantidad de señal fluorescente medida fue proporcional a la concentración de anticuerpo antiesclerostina libre en cada mezcla de reacción en equilibrio. La constante de disociación en equilibrio (K<d>) se obtuvo a partir de regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogénea de un sitio de curva n proporcionado en el software KinExA Pro. Los resultados de los ensayos de KinExA para los anticuerpos seleccionados se resumen en la siguiente tabla.
Anticuerpos Antígeno Ko (μM) intervalo de confianza al 95%Ab-13 Esclerostina Humana 0,6 0,4 ~ 0,8 μM
Ab-4 Esclerostina Humana 3 1,8 ~ 4 μM
Ab-19 Esclerostina Humana 3 1,7 ~ 4 μM
Ab-14 Esclerostina Humana 1 0,5 ~ 2 μM
Ab-5 Esclerostina Humana 6 4,3 ~ 8 μM
Ab-23 Esclerostina Humana 4 2,1 ~ 8 μM
EJEMPLO 11
MÉTODO DE BIACORE PARA DETERMINAR LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA HUMANIZADOS POR ESCLEROSTINA HUMANA.
La tecnología BIAcore supervisa la unión entre biomoléculas en tiempo real y sin la necesidad de marcaje. Uno de los que interaccionan, denominado el ligando, se inmoviliza directamente o se captura en la superficie inmovilizada mientras que el otro, denominado el analito, fluye en solución sobre la superficie capturada. El sensor detecta el cambio de masa en la superficie sensora a medida que el analito se une al ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al proceso de asociación. El proceso de disociación se supervisa cuando el analito se reemplaza por tampón. En el ensayo de BIAcore de afinidad, el ligando es el anticuerpo anti-esclerostina y el analito es esclerostina.
Instrumento
Biacore® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suecia
Microplaca sensora
CM5 (uso de investigación) Número de Catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Las microplacas se almacenaron a 4 °C.
Solución de BIAnormalización
Glicerol al 70% (p/p). Parte del Kit de BIAmantenimiento Número de Catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. El kit de BIAmantenimiento se almacenó a 4 °C.
Kit de Acoplamiento de Amina
Número de Catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia.
Clorhidrato de etil-3-(e-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Compuesto hasta 75 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 μl a -70 °C.
N-hidroxisuccinimida (NHS). Compuesto hasta 11,5 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 μl a -74 °C.
Clorhidrato de etanolamina 1 M - NaOH pH 8,5. Almacenado en alícuotas de 200 μl a -70 °C.
Tampones
Tampón de ejecución para inmovilizar el anticuerpo de captura: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005%). Número de Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C.
Tampón de inmovilización: Acetato 5.0 (que es acetato sódico 10 mM pH 5,0). Número de Catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C.
Tampón de ejecución para ensayo de unión: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005%, Número de Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia) con CM-Dextrano añadido a 1 mg/ml (Número de Catálogo 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Suiza). Tampón almacenado a 4 °C. Captura de ligando
IgG anti-humano de cabra fragmento F(ab')2Affinipure, específico de fragmento Fc. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, Estados Unidos) número de Catálogo: 109-006-098. Reactivo almacenado a 4 °C.
Ligando
Anticuerpos anti-esclerostina humana humanizados Ab5, Ab14 y Ab20.
Analito
Esclerostina humana recombinante. Alícuotas almacenadas a -70 °C y descongeladas una vez para cada ensayo. Solución de regeneración
HCl 40 mM preparado por dilución con agua destilada a partir de una solución madre 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Número de catálogo: 101254H).
NaOH 5 mM preparado mediante dilución con agua destilada a partir de una solución madre 50 mM. Número de catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suecia.
Métodos de Ensayo
El formato de ensayo fue captura del anticuerpo anti-esclerostina mediante Fc anti-IgG humano inmovilizado, después valoración de la esclerostina sobre la superficie capturada.
Se proporciona a continuación un ejemplo del procedimiento:
Se realizó BIA (Análisis de Interacción Biamolecular) usando un BIAcore 3000 (BIAcore AB). Se inmovilizó IgG anti-humano de cabra Fragmento F(ab')2Affinipure, específico de fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) en una microplaca sensora CM5 mediante química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ~4000 unidades de respuesta (UR). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P200,005%, BIAcore AB) que contenía CM-Dextrano 1 mg/ml como el tampón de ejecución con un caudal de 10 μl/min. Se usó una inyección de 10 μl del anticuerpo anti-esclerostina a ~5 μg/ml para captura por el Fc anti-IgG humano inmovilizado. Los niveles de captura de anticuerpo fueron típicamente 100-200 UR. La esclerostina se valoró sobre el anticuerpo anti-esclerostina capturado a diversas concentraciones a un caudal de 30 μl/min. La superficie se regeneró por dos inyecciones de 10 μl de HCl 40 mM, seguido de una inyección de 5 μl de NaOH 5 mM a un caudal de 10 μl/min.
Se analizaron curvas de unión con resta de fondo usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo procedimientos convencionales. Se determinaron los parámetros cinéticos a partir del algoritmo de ajuste.
Los datos cinéticos y las constantes de disociación calculadas se proporcionan en la Tabla 2.
TABLA 2: - clerostina
EJEMPLO 12
ENSAYOSIN VIVODE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN MONOS CYNOMOLGUS Se usaron treinta y tres monos cynomolgus hembra de aproximadamente 3-5 años de edad (Macaca fascicularis)en este estudio de 2 meses. El estudio contenía 11 grupos:
Grupo 1: vehículo (N=4)
Grupo 2: Ab-23 (N=2, dosis 3 mg/kg)
Grupo 3: Ab-23 (n=3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 4: Ab-23 (n=3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 5: Ab-5 (N=3, dosis 3 mg/kg)
Grupo 6: Ab-5 (n =3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 7: Ab-5 (n =3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 8: Ab-14 (N=3, dosis 3 mg/kg)
Grupo 9: Ab-14 (n=3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 10: Ab-14 (N=3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 11: Hormona paratiroidea (1-34) [PTH (1-34)] (N=3, dosis 10 μg/kg)
Toda la dosificación fue subcutánea. Se dosificó PTH (1-34) cada día, los anticuerpos monoclonales (Mab) se dosificaron dos veces (primera dosis al comienzo del estudio y segunda dosis en el punto temporal de un mes). Para evaluación de parámetros de hueso (por ejemplo densidad mineral ósea) se realizaron exploraciones pQCT (tomografía computarizada cuantitativa periférica) y DXA (absorciometría de rayos X de energía dual) antes del comienzo del estudio (para obtener los valores de línea basal) y después de un mes (antes de la segunda dosis de Mab) y finalmente al final del estudio (punto temporal de 2 meses) momento en el cual se realizaron necropsias de los monos para análisis adicional (por ejemplo análisis histomorfométrico).
Los animales se marcaron con fluorocromo (días 14, 24, 47 y 57) para histomorfometría dinámica. Se recogió suero en diversos puntos temporales durante el estudio [día 1 antes de la dosis (el día de la primera dosis de Mab), día 1 doce horas después de la dosis, día 2, día 3, día 5, día 7, día 14, día 21, día 28, día 29 doce horas después de la dosis (el día 29 fue el día de la segunda y última dosis de Mab), día 30, día 31, día 33, día 35, día 42, día 49 y día 56].
Se midieron tres biomarcadores de suero relacionados con hueso usando kits disponibles en el mercado:
Osteocalcina (OC) (Kit de Radioinmunoensayo de Osteocalcina DSL; Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX, Estados Unidos).
Propéptido N-terminal de Procolágeno de Tipo I (P1NP) (Kit de Radioinmunoensayo de P1NP; Orion Diagnostica, Espoo, Finlandia).
Fragmentos de C-telopéptido de cadenas a1 de colágeno de tipo I (sCTXI) (Serum CrossLaps® ELISA; Nordic Bioscience DiagnosticsA/S, Herlev, Dinamarca).
Las exploraciones de pQCT y DXA produjeron datos sobre diversos parámetros del hueso (incluyendo densidad mineral ósea (DMO) y contenido mineral óseo) a lo largo de numerosos sitios esqueléticos (incluyendo metáfisis y diáfisis tibial, metáfisis y diáfisis radial, cuello femoral, vértebras lumbares). El análisis de estos datos de hueso (porcentaje de cambio de línea basal para cada animal) y los datos de biomarcadores de suero anabólicos (OC, P1NP) (porcentaje de cambio desde la línea basal para cada animal) revelaron aumentos estadísticamente significativos, frente al grupo de vehículo, en algunos parámetros en algunos de los puntos temporales y dosis para cada Mab. Estos datos de parámetros de hueso, datos de biomarcadores de suero, así como los datos histomorfométricos, indicaron que cada uno de los 3 Mab (Ab-23, Ab-5 y Ab-14) fue capaz de neutralizar la esclerostina en monos cynomolgus. Esta actividad fue más robusta para Ab-23 y Ab-5, particularmente a la dosis más alta (30 mg/kg), con un claro aumento en la formación del hueso (efecto anabólico) así como aumentos netos de hueso (por ejemplo, DMO). También se encontraron aumentos estadísticamente significativos en parámetros del hueso y parámetros histomorfométricos anabólicos para el grupo de control positivo (PTH (1-34)).
Se aumentaron los marcadores de formación de hueso en suero (P1NP, osteocalcina) (p<0,05 frente a vehículo (VEH)) en diversos puntos temporales y dosis, pero particularmente en los grupos de 30 mg/kg para Ab-23 y Ab-5. Los análisis histomorfométricos revelaron aumentos drásticos (p<0,05 frente a VEH) en las tasas de formación de hueso en hueso esponjoso en vértebras lumbares y tibia proximal (aumento de hasta 5 veces), así como en la superficie endocortical de la mitad del fémur (aumento de hasta 10 veces) a las dosis más altas de Ab-23 y Ab-5. El grosor trabecular se aumentó con dosis alta de Ab-23 y Ab-5 en vértebras lumbares (>60%, p<0,05 frente a VEH). Al final del estudio (2 meses), la DMO de área, como porcentaje de cambio desde la línea basal, aumentó (p<0,05 frente a VEH) en el cuello femoral, radio ultra-distal (Ab-23, 30 mg/kg) y vértebras lumbares (Ab-5, 30 mg/kg). Los aumentos de DMO de área en las vértebras lumbares estuvieron acompañados de aumentos en la fuerza vertebral (97% de aumento en la carga máxima vertebral para Ab-23, 30 mg/kg; p<0,05 frente VEH); los valores de línea basal para DMO de área lumbar antes de la dosificación de Mab fueron estadísticamente similares entre todos los grupos. En resumen, la administración a corto plazo de Mab neutralizantes de esclerostina en monos cynomolgus dio como resultado, en parte, aumentos de la formación de hueso, DMO y fuerza ósea vertebral.
A partir de lo anterior, aunque se han descrito realizaciones específicas de la invención en el presente documento para fines de ilustración, pueden realizarse diversas modificaciones sin desviarse del alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto según las reivindicaciones adjuntas.
Aspectos de la divulgación
Los siguientes son aspectos de la divulgación:
1. Una composición que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. 2. Una composición que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, 64, 65, 66, 67, 68 o 69.
3. Una composición que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o los cuatro polipéptidos de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
4. Una composición que comprende un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, en el que SEQ ID NO: 2 y 4 se unen por un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 57 y 11 en referencia a SEQ ID NO: 1, y SEQ ID NO: 3 y 5 se unen por al menos uno de (a) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 82 y 142 en referencia a SEQ ID NO: 1, y (b) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 86 y 144 en referencia a SEQ ID NO: 1.
5. Un polipéptido que consiste esencialmente en una proteína esclerostina humana truncada en múltiples puntos de SEQ ID NO: 1, en el que los aminoácidos 1-50, 65-72, 91-100, 118-137 y 150-190 de SEQ ID No : 1 están ausentes de dicho polipéptido.
6. Una composición que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o los cuatro polipéptidos de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73.
7. Una composición que comprende un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73, en el que SEQ ID NO: 72 y 73 se unen por un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 57 y 111 en referencia a SEQ ID NO: 1, y SEQ ID NO: 70 y 71 se unen por al menos uno de (a) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 82 y 142 en referencia a SEQ ID NO: 1, y (b) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 86 y 144 en referencia a SEQ ID NO: 1.
8. La composición de uno cualquiera de los aspectos 1-3, 6 y 7 en la que cada uno de dichos polipéptidos conserva la estructura terciaria de la región polipeptídica correspondiente de esclerostina humana de SEQ ID NO: 1.
9. Un polipéptido que consiste esencialmente en una proteína esclerostina humana truncada en múltiples puntos de SEQ ID NO: 1, en el que los aminoácidos 1-56, 65-72, 87-110, 118-137 y 145-190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes de dicho polipéptido.
10. El polipéptido del aspecto 9, en el que dicho polipéptido se obtiene por digestión tríptica de esclerostina humana.
11. El polipéptido del aspecto 10, en el que dicha esclerostina humana se trata con tripsina para conseguir digestión con tripsina completa y dicho polipéptido se aísla por HPLC.
12. Una parte de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 y 138-149 de SEQ ID NO: 1, en la que dicha parte tiene al menos uno, al menos dos o los tres de:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144.
13. Una parte de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 57-64, 73-86, 111-117 y 138-144 de SEQ ID NO: 1, en la que dicha parte tiene al menos uno, al menos dos o los tres de:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144.
14. Un polipéptido que consiste esencialmente en una proteína esclerostina humana de SEQ ID NO: 1 truncada en los extremos C terminal y N terminal, en el que los aminoácidos 1-85 y 112-190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes de dicho polipéptido.
15. Una parte de esclerostina humana, que comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1.
16. Una parte de esclerostina humana, que comprende SEQ ID NO: 6.
17. Una parte de esclerostina humana, que comprende SEQ ID NO: 63, 64, 65, 66, 67, 68 o 69.
18. Una parte de esclerostina de rata, que comprende SEQ ID NO: 96 o 97.
19. Un método para producir una parte de esclerostina humana, que comprende las etapas de:
(a) tratar la esclerostina humana con tripsina para conseguir digestión tríptica completa;
(b) recoger la muestra de digestión tríptica que tiene masa molecular promedio de 7122,0 D (masa teórica 7121,5 D) o tiempo de retención de aproximadamente 20,6 minutos como se determina por elución de una columna de HPLC de fase inversa con gradiente lineal de ácido trifluoroacético 0,05 % a acetonitrilo 90 % en TFA 0,05 % a un caudal de 0,2 ml/min; y
(c) purificar dicha parte.
20. Un polipépt
SEQ ID NO: 6;
SEQ ID NO: 2;
SEQ ID NO: 3;
SEQ ID NO: 4;
SEQ ID NO: 5;
SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO 96
SEQ ID NO 97
SEQ ID NO: 63
SEQ ID NO: 64
SEQ ID NO: 65
SEQ ID NO: 66
SEQ ID NO: 67
SEQ ID NO: 68
SEQ ID NO: 69
SEQ ID NO 70
SEQ ID NO 71
SEQ ID NO 72
SEQ ID NO 73 o
SEQ ID NO 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73.
21. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1-18 y 20, para uso en un método para generar un anticuerpo que comprende administrar el polipéptido a un animal.
22. El polipéptido de acuerdo con el aspecto 21, para uso en dicho método en el que el animal es un mamífero.
23. Una vacuna que comprende al menos un polipéptido que comprende uno o más de los epítopos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 70, 71, 72 y 73.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal que se une con una parte de esclerostina humana y tiene una afinidad de unión por la esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10-10 M, en la que dicha parte consiste en los aminoácidos 57-64, 73 86, 111-117 y 138-144 de SEQ ID NO: 1 y tiene las tres de:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144.
2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 que es un fragmento F(ab')2, Fab, Fab' o Fv.
3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
4. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se une con esclerostina humana con una afinidad de unión menor de o igual a 1 x 10-11 M o menor de o igual a 1 x 10-12 M.
5. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se une con esclerostina humana con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por lisozima de clara de huevo de gallina.
6. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 que comprende el siguiente conjunto de secuencias de CDR: CDR-L1 de SEQ ID NO: 284
CDR-L2 de SEQ ID NO: 285
CDR-L3 de SEQ ID NO: 286
CDR-H1 de SEQ ID NO: 296
CDR-H2 de SEQ ID NO: 297
CDR-H3 de SEQ ID NO: 298.
7. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que aumenta al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero, o que bloquea el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
8. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en el tratamiento de osteoporosis u osteopenia.
9. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en un método para mejorar los resultados en procedimientos ortopédicos, procedimientos dentales, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto de hueso, cirugía cosmética de hueso o reparación del hueso tales como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada o reconstrucción facial.
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