ES2901698T3 - Epítopos de esclerostina - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que bloquea de forma cruzada la unión del anticuerpo Ab-C o Ab-D con esclerostina o se bloquea de forma cruzada su unión con esclerostina por el anticuerpo Ab-C o Ab-D, donde el anticuerpo Ab-C tiene cadenas ligeras de SEQ ID NO: 15 y cadenas pesadas de SEQ ID NO: 19 y Ab-D tiene cadenas ligeras de SEQ ID NO: 7 y cadenas pesadas de SEQ ID NO: 11, donde el bloqueo cruzado se determina por el ensayo de Biacore, donde el anticuerpo de bloqueo cruzado se une a esclerostina en el ensayo de Biacore de forma que durante el ensayo y en presencia de un segundo anticuerpo la unión registrada es de entre el 80 % y el 0,1 % de la unión teórica máxima de los dos anticuerpos en combinación, o donde el bloqueo cruzado se determina por ELISA, donde el anticuerpo en fase de solución provoca una reducción de entre el 60 % y el 100 % de la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo que recubre la placa de ELISA en comparación con la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo de recubrimiento en ausencia del anticuerpo en fase de solución, y donde el anticuerpo aumenta al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.

Description

DESCRIPCIÓN

Epítopos de esclerostina

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a epítopos de la proteína esclerostina humana, y a agentes de unión (tales como anticuerpos) capaces de unirse a esclerostina o fragmentos de los mismos.

Antecedentes de la invención

Durante la vida de un individuo suceden dos o tres fases de cambios distintas en la masa ósea (véase Riggs, West J. Med. 154: 63-77 (1991)). La primera fase se produce tanto en hombres como en mujeres y continúa hasta la consecución de una masa de hueso máxima. Esta primera fase se consigue mediante crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondriales y crecimiento radial debido a una tasa de aposición perióstea. La segunda fase comienza aproximadamente a los 30 años para el hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y la pelvis) y aproximadamente a los 40 años para hueso cortical (por ejemplo, huesos largos hallados en las extremidades) y continúa hasta la vejez. Esta fase se caracteriza por pérdida de hueso lenta y se produce tanto en hombres como en mujeres. En mujeres, también se produce una tercera fase de pérdida de hueso, más probablemente debido a deficiencias de estrógenos posmenopáusicas. Durante esta fase solamente, las mujeres pueden perder una masa de hueso adicional del hueso cortical y del compartimento trabecular (véase, Riggs, mencionado anteriormente).

La pérdida de contenido mineral óseo puede estar provocada por una amplia diversidad de afecciones y puede dar como resultado problemas médicos significativos. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en seres humanos y está caracterizada por reducciones notables de la masa ósea esquelética y densidad mineral, deterioro estructural del hueso, incluyendo degradación de la microarquitectura del hueso y aumentos correspondientes de la fragilidad ósea (es decir, reducciones de la fuerza ósea), y susceptibilidad a fractura en individuos aquejados. La osteoporosis en seres humanos está generalmente precedida de osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor de una desviación típica pero menor de 2,5 desviaciones típicas por debajo del valor medio para hueso adulto joven), una afección hallada en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Se ha diagnosticado a otros 7-8 millones de pacientes en Estados Unidos con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral óseo mayor de 2,5 desviaciones típicas por debajo de la del hueso de adulto joven maduro). La frecuencia de osteoporosis en la población humana aumenta con la edad. Entre los caucásicos, la osteoporosis es predominante en mujeres quienes, en los Estados Unidos, comprenden el 80 % del grupo de pacientes con osteoporosis. La fragilidad aumentada y susceptibilidad a fractura del hueso esquelético en los ancianos está agravada por el mayor riesgo de caídas accidentales en esta población. Las fracturas de caderas, muñecas y vértebras están entre las lesiones más habituales asociadas con la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente incómodas y caras para el paciente, y para las mujeres se correlacionan con altas tasas de mortalidad y morbilidad.

Aunque la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a la reducción de la masa ósea, pocos de los tratamientos actualmente disponibles para trastornos esqueléticos pueden aumentar la densidad ósea de los adultos, y la mayoría de los tratamientos disponibles en la actualidad actúa principalmente inhibiendo adicionalmente la resorción del hueso en lugar de estimular nueva formación de hueso. El estrógeno se está prescribiendo ahora para retardar la pérdida de hueso. Sin embargo, existe cierta controversia sobre si los pacientes obtienen algún beneficio a largo plazo y si el estrógeno tiene algún efecto en pacientes de más 75 años de edad. Además, se cree que el uso de estrógenos aumenta el riesgo de cáncer de mama y endometrio. También se ha sugerido calcitonina, osteocalcina con vitamina K o altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, para mujeres posmenopáusicas. Las altas dosis de calcio, sin embargo, tienen con frecuencia efectos secundarios gastrointestinales no deseados, y los niveles de calcio en suero y orina deben supervisarse continuamente (por ejemplo, Khosla y Riggs, Mayo Clin. Proc. 70: 978982, 1995).

Otros enfoques terapéuticos actuales para la osteoporosis incluyen bifosfonatos (por ejemplo, Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronato, neridronato, skelid, bonefos), hormona paratiroidea, calcilíticos, calcimiméticos (por ejemplo, cinacalcet), estatinas, esteroides anabólicos, sales de lantano y estroncio y fluoruro sódico. Dichos compuestos terapéuticos, sin embargo, se asocian con frecuencia con efectos secundarios indeseables (véase Khosla y Riggs, mencionado anteriormente).

La esclerostina, el producto del gen SOST, está ausente en esclerosteosis, una enfermedad esquelética caracterizada por sobrecrecimiento del hueso y huesos densos fuertes (Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet., 68: 577-589, 2001; Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10: 537-543, 2001). La secuencia de aminoácidos de la esclerostina humana se ha presentado en Brunkow et al. en la referencia anterior y se divulga en el presente documento como SEQ ID NO: 1.

El documento WO 2005/014650 describe anticuerpos específicos para esclerostina y métodos para aumentar la mineralización del hueso, y el documento WO 2005/003158 describe composiciones y métodos para aumentar la mineralización ósea.

Breve sumario de la invención

Se divulgan en el presente documento composiciones y métodos que pueden usarse para aumentar al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea, y que puede por lo tanto usarse para tratar una amplia diversidad de afecciones en las que sea deseable un aumento de al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. La presente invención también ofrece otras ventajas relacionadas descritas en el presente documento.

La divulgación se refiere a regiones (epítopos) de esclerostina humana reconocidas por los agentes de unión divulgados en el presente documento, métodos de uso de estos epítopos y métodos de preparación de dichos epítopos.

La divulgación también se refiere a epítopos específicos de la región de esclerostina identificada como Bucle 2, y agentes de unión que se unen específicamente a esa región.

La invención se refiere a epítopos específicos de la región de nudo de cisteína de esclerostina, y a anticuerpos que se unen específicamente con esa región.

La divulgación se refiere a agentes de unión, tales como anticuerpos, que se unen específicamente a esclerostina. Los agentes de unión pueden caracterizarse por su capacidad para bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina y/o para bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento. Los anticuerpos y otros agentes de unión también pueden caracterizarse por su patrón de unión con péptidos de esclerostina humana en un "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídico de esclerostina humana" como se divulga en el presente documento.

La divulgación se refiere a agentes de unión, tales como anticuerpos, que pueden aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.

La divulgación se refiere a agentes de unión, tales como anticuerpos que pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.

La divulgación se refiere además a construcciones polipeptídicas que comprenden dos, tres o cuatro fragmentos polipeptídicos unidos por al menos un enlace disulfuro, que representa una región central del nudo de cisteína de esclerostina, y anticuerpos capaces de unirse específicamente con los mismos.

La divulgación se refiere a métodos para obtener epítopos adecuados para su uso como inmunógenos para generar, en mamíferos, agentes de unión, tales como anticuerpos capaces de unirse específicamente a esclerostina; en ciertos aspectos los agentes de unión generados son capaces de neutralizar la actividad de esclerostina in vivo.

La divulgación se refiere a una composición para inducir un anticuerpo específico para esclerostina cuando la composición se administra a un animal, comprendiendo la composición un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 69.

La divulgación también se refiere a una composición para inducir un anticuerpo específico para esclerostina cuando la composición se administra a un animal, comprendiendo la composición al menos un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; la composición puede comprender al menos dos o al menos tres de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, y la composición puede comprender las cuatro secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

La divulgación también se refiere a una composición para inducir un anticuerpo específico para esclerostina cuando la composición se administra a un animal, comprendiendo la composición un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; donde SEQ ID NO: 2 y 4 se unen por un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 57 y 111 con referencia a SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 y 5 se unen por al menos uno de (a) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 82 y 142 con referencia a SEQ ID NO: 1, y (b) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 86 y 144 con referencia a SEQ ID NO: 1; el polipéptido puede conservar la estructura terciaria de la región polipeptídica correspondiente de esclerostina humana de SEQ ID NO: 1.

La divulgación también se refiere al polipéptido T20.6 que consiste esencialmente en una proteína de esclerostina humana múltiplemente truncada de SEQ ID NO: 1, donde los aminoácidos 1-50, 65-72, 91-100, 118-137 y 150-190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes del polipéptido: este polipéptido puede obtenerse por digestión tríptica de esclerostina humana y la proteína puede aislarse por fraccionamiento de HPLC.

La divulgación se refiere además a la parte inmunogénica T20.6 de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 y 138-149 de SEQ ID NO: 1, donde la parte inmunogénica comprende al menos uno de:

(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;

(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y

(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144;

la parte inmunogénica puede tener al menos dos de estos enlaces disulfuros; y la parte inmunogénica puede tener los tres enlaces disulfuros.

La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica T20.6 de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 57-64, 73-86, 111-117 y 138-144 de SEQ ID NO: 1, donde la parte inmunogénica comprende al menos uno de:

(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;

(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y

(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144;

la parte inmunogénica puede tener al menos dos de estos enlaces disulfuros; y la parte inmunogénica puede tener los tres enlaces disulfuros.

La divulgación se refiere además a un polipéptido que consiste esencialmente en una proteína de esclerostina humana de SEQ ID NO: 1 truncada en los extremos C terminal y N terminal, donde los aminoácidos 1-85 y 112-190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes del polipéptido.

La divulgación también se refiere a una parte inmunogénica de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 6).

La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 92-109 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96).

La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 99-120 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).

La divulgación se refiere a un método para producir una parte inmunogénica de esclerostina humana, que comprende las etapas de:

(a) tratar la esclerostina humana para conseguir digestión tríptica completa:

(b) recoger la muestra de digestión tríptica que tiene un peso molecular promedio de 7122,0 Dalton (masa teórica 7121,5 Dalton) o tiempo de retención de aproximadamente 20,6 minutos como se determinó por elución de una columna de HPLC de fase inversa con gradiente lineal de ácido trifluoroacético 0,05 % a acetonitrilo 90 % en TFA 0,05 % a un caudal de 0,2 ml/min; y

(c) purificar la parte inmunogénica.

La divulgación se refiere a un método para generar un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina, que comprende:

(a) inmunizar a un animal con una composición que comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 97;

(b) recoger sueros del animal; y

(c) aislar de los sueros un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina.

La divulgación también se refiere a un método para generar un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina, que comprende:

(a) inmunizar a un animal con una composición que comprende el polipéptido T20.6 o un derivado de T20.6; (b) recoger sueros del animal; y

(c) aislar de los sueros un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina.

La divulgación se refiere además a un método para detectar un anticuerpo anti esclerostina en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra biológica con un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 97 en condiciones que permiten que se forme un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido; y

(b) detectar la presencia o ausencia del complejo,

donde la presencia del complejo indica que la muestra biológica contiene un anticuerpo anti esclerostina.

La divulgación también se refiere a un método para detectar un anticuerpo anti esclerostina en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra biológica con el polipéptido T20.6 o un derivado de T20.6 en condiciones que permiten que se forme un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido; y

(b) detectar la presencia o ausencia del complejo,

donde la presencia del complejo indica que la muestra biológica contiene un anticuerpo anti esclerostina.

La divulgación se refiere además a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo, que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D a una proteína de esclerostina. También puede bloquearse de forma cruzada la unión con esclerostina del agente de unión a esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o similares.

La divulgación se refiere además a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo, cuya unión con esclerostina se bloquea de forma cruzada por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o similares.

La divulgación se refiere además a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo aislado que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24) con una proteína de esclerostina. El agente de unión a esclerostina también puede bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24). El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.

La divulgación también se refiere a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo aislado que está bloqueado de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1 -24 (Ab-1 a Ab-24); el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.

La divulgación se refiere además a un agente de unión, tal como un anticuerpo aislado que muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en un "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" al que se muestra por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D; el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, o un anticuerpo quimérico.

La invención se refiere además adicionalmente a un anticuerpo monoclonal de la invención para su uso en un método para el tratamiento de un trastorno óseo asociado con al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, baja calidad ósea y baja fuerza ósea en un sujeto mamífero, método que comprende proporcionar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una cantidad de dicho anticuerpo suficiente para aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea.

La divulgación también se refiere a un polipéptido de esclerostina aislado o fragmentos del mismo, donde el polipéptido contiene 6 restos de cisteína conservados y los fragmentos del mismo comprenden de 7 a 14 aminoácidos de SEQ ID NO: 2; 8 a 17 aminoácidos de SEQ ID NO: 3; 8 a 18 restos de SEQ ID n O: 4; y 6 a 12 restos de SEQ ID NO: 5, y el polipéptido o fragmentos del mismo se estabilizan por enlaces disulfuro entre SEQ ID NO: 2 y 4, y entre SEQ ID NO: 3 y 5; el polipéptido o fragmentos pueden comprender 10-14 aminoácidos de SEQ ID NO: 2: 14 a 17 aminoácidos de s Eq ID No : 3; 13 a 18 aminoácidos de SEQ iD NO: 4: y 8 a 12 restos de SEQ ID NO: 5; y el polipéptido o fragmentos pueden comprender SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina humana. Los anticuerpos se caracterizan por su capacidad de bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina humana y/o de bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina humana por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento.

También se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que puede aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido de mineral del hueso, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.

También se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.

También se proporciona un agente de unión, tal como un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ iD NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360, y variantes de las mismas, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la esclerostina.

También se proporciona un agente de unión, tal como un anticuerpo, que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de s Eq iD NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360 y variantes de las mismas.

También se proporcionan regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 1A) (SEQ ID NO: 23) y cadena pesada (Figura 1B) (SEQ ID NO: 27) para el anticuerpo Ab­ A antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.

La Figura 2 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 2A) (SEQ ID NO: 31) y cadena pesada (Figura 2B) (SEQ ID NO: 35) para el anticuerpo Ab-B antiesclerostina.

La Figura 3 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 3A) (SEQ ID NO: 15) y la cadena pesada (Figura 3B) (s Eq ID NO: 19) para el anticuerpo Ab-C antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.

La Figura 4 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 4A) (SEQ ID NO: 7) y la cadena pesada (Figura 4B) (s Eq ID NO: 11) para el anticuerpo Ab-D antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.

La Figura 5 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34), Ab-A o Ab-B.

La Figura 6 muestra la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 2 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34) o Ab-C.

La Figura 7 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo o Ab-D.

La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal escindido) de esclerostina humana (SEQ ID NO: 1). También se representa la secuencia de nucleótidos de la región codificante de esclerostina humana que codifica la forma madura de esclerostina humana. Las ocho cistinas están numeradas C1 a C8. El nudo de cistina está formado por tres enlaces disulfuro (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 y C6 también forman un enlace disulfuro, sin embargo, este disulfuro no es parte del nudo de cistina.

La Figura 9 representa un esquema de la estructura básica de la esclerostina humana. Hay una rama N-terminal (del primer Q a C1) y una rama C-terminal (de C8 al Y terminal). Entre estas ramas está la estructura de nudo de cistina (formada por tres disulfuros: C1-C5; C3-C7; C4-C8) y tres bucles que están designados Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Las regiones distales del Bucle 1 y Bucle 3 están unidas por el disulfuro C2-C6. Se indican sitios de escisión de tripsina potenciales (arginina=R y lisina=K). Algunos de los sitios de escisión de AspN potenciales están indicados (solamente se muestran restos de ácido aspártico (D)).

La Figura 10 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina o AspN. Los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con tripsina están indicados (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) como lo están los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con AspN (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5).

La Figura 11 representa información de secuencia y masa para los péptidos con enlaces disulfuro de esclerostina humana aislados generados por digestión con tripsina. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó por análisis de ESI-LC-MS.

La Figura 12 representa la información de secuencia y masa para los péptidos de esclerostina humana aislados generados por digestión con AspN. El péptido AspN22,7-23,5 contiene los 4 enlaces disulfuro. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó mediante análisis de ESI-LC-MS.

La Figura 13 representa un esquema lineal de cuatro péptidos de esclerostina humana (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) generados por digestión con tripsina.

La Figura 14 muestra un esquema lineal de cinco péptidos de esclerostina humana (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5) generados por digestión con AspN. El pico de HPLC de AspN14,6 está compuesto de tres péptidos no unidos por ningún enlace disulfuro.

La Figura 15 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a la unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-A. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.

La Figura 16 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-B. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.

La Figura 17 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-C. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.

La Figura 18 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-D. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.

La Figura 19 muestra dos epítopos de unión a Mab de esclerostina humana. La Figura 19A muestra la secuencia del epítopo del Bucle 2 para unión de Ab-A y Ab-B con esclerostina humana (SEQ ID NO: 6). La Figura 19B muestra la secuencia, enlaces disulfuro y esquema del epítopo T20,6 para unión de Ab-C y Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 2-5).

La Figura 20 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina. La Figura 20A muestra la digestión del complejo de Ab-D de esclerostina humana. La Figura 20B muestra la digestión de la esclerostina humana sola. Se indican los picos de los péptidos T19,2, T20, T20,6 y T21-22. La Figura 21 muestra la secuencia, enlace disulfuro y esquema del epítopo "derivado de T20,6 1 (nudo de cistina 4 ramas)" para unión de Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 70-73).

La Figura 22 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) de ratón se usó a 1 pg/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 y 5 pg/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.

La Figura 23 representa resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina humana (Scl) se usó a 1 pg/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 8 y 4 pg/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.

La Figura 24 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) humana se usó a 1 pg/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 pg/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.

La Figura 25 representa resultados de un modelo de ratón SCID de pérdida de hueso inducida por inflamación. El tratamiento con Ab-A protegió a los ratones de pérdida de hueso relacionada con inflamación asociada con colitis cuando se midió como densidad mineral ósea total (Figura 25A), densidad de hueso vertebral (Figura 25B) y densidad de hueso fémur (Figura 25C).

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere a regiones de la proteína esclerostina humana que contienen epítopos reconocidos por anticuerpos que también se unen a esclerostina de longitud completa, y métodos para preparar y usar estos epítopos. La divulgación también proporciona agentes de unión (tales como anticuerpos) que se unen específicamente a esclerostina o parte de esclerostina, y a métodos de uso de tales agentes de unión. Los agentes de unión son útiles para bloquear o afectar a la unión de esclerostina humana con uno o más ligandos.

La esclerostina humana recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. N.° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. N.° 1589-ST-025). Anticuerpos monoclonales de unión a esclerostina de uso en investigación están disponibles en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; monoclonal de ratón 2006 cat. N.° MAB1406; monoclonal de rata: 2006 cat. N.° MAB1589). Las Patentes de Estados Unidos N.° 6.395.511 y 6.803.453 y Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20040009535 y 20050106683 se refieren a anticuerpos anti-esclerostina en general.

Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión esclerostina humana incluya la proteína de SEQ ID NO: 1 y variantes alélicas de la misma. La esclerostina puede purificarse a partir de células hospedadoras 293T que se hayan transfectado por un gen codificante de esclerostina mediante elución de sobrenadante filtrado de fluido de cultivo de células hospedadoras usando una columna de Heparina HP, usando un gradiente salino. La preparación y purificación adicional usando cromatografía de intercambio catiónico se describen en los Ejemplos 1 y 2.

Los agentes de unión son preferentemente anticuerpos, como se define en el presente documento. El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo. Un anticuerpo puede comprender una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonal, monoclonal, quimérica, humanizada o humana que tienen cadenas de longitud completa pesadas y/o ligeras) o comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos de cadena sencilla, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (Véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechonology, 23, 9, 1126-1136). También se desvelan polipéptidos de anticuerpo en la Patente de Estados Unidos N.° 6.703.199, incluyendo monocuerpos de polipéptidos de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpos se desvelan en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2005/0238646, que son polipéptidos de cadena sencilla.

Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo con métodos convencionales. Como ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3,5S. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, Patente de Estados Unidos N.° 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89; 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959 Edelman et al., en Methods in Enzymology 1; 422 (Academic Press 1967); y en Andrews, S.M. y Titus, J.A. en Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley & Sons, Nueva York (2003), páginas 2.8.1­ 2.8.10 y 2.10A. 1-2.10A.5. También pueden usarse otros métodos para escindir anticuerpos, tales como separar cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes (Fd), escindir además fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que reconoce el anticuerpo intacto.

Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína modificada por ingeniería genética o sintética. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de cadena ligera, los fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligera y pesada están conectadas por un enlazador peptídico (proteínas scFv).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Pueden obtenerse CDR (también denominadas "unidades de reconocimiento mínimas" o "región hipervariable") construyendo polinucleótidos que codifiquen la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como un molde (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology 2; 106, 1991; Courtenay-Luck "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," en Monoclonal Antibodies; Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," en Monoclonal Antibodies; Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Por lo tanto, el agente de unión puede comprender al menos una CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender además al menos un dominio de región variable de un anticuerpo descrito en el presente documento. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprenderá en general al menos una secuencia de CDR responsable de la unión con esclerostina humana, por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y/o las CDR de cadena ligera específicamente descritas en el presente documento y que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco conservadas. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de cadena pesada (VH) y/o cadena ligera (VL). Por lo tanto, por ejemplo, el dominio de región V puede ser monomérico y ser un dominio VH y VL, que es capaz de unirse independientemente con esclerostina humana con una afinidad al menos igual a 1 x 10^{' 7} M o menos como se describe posteriormente. Como alternativa, el dominio de región V puede ser dimérico y contiene dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl, dímeros. El dímero de región V comprende al menos una cadena Vh y al menos una Vl que pueden no estar asociadas covalentemente (denominado en lo sucesivo en el presente documento Fv ). Si se desea, las cadenas pueden estar acopladas covalentemente bien directamente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador para formar un Fv de cadena sencilla (scFv).

El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una versión modificada por ingeniería genética del mismo. Por versión modificada por ingeniería genética se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones modificadas por ingeniería genética incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, deleciones o cambios en o a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable modificados por ingeniería genética que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos marco de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo.

El dominio de región variable puede estar unido covalentemente en un aminoácido C-terminal con al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Por lo tanto, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede estar unido a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De forma similar un dominio Vl puede estar unido a un dominio Ck o un fragmento del mismo. De este modo, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab donde el dominio de unión a antígeno contiene dominios V h y Vl asociados unidos covalentemente en sus extremos C con un dominio CH1 y Ck, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región bisagra o una parte de un dominio de región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios CH2 y CH3 de anticuerpo.

Como se describe en el presente documento, los agentes de unión comprenden al menos una de estas CDR. Por ejemplo, una o más CDR pueden incorporarse en regiones marco conservadas de anticuerpos conocidas (IgG1, IgG2, etc.) o conjugarse con un vehículo adecuado para potenciar la semivida del mismo. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, Fc, polietilenglicol (PEG), albúmina, transferrina y similares. Estos y otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. Dichos péptidos de CDR conjugados pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica u otra. Uno o más polímeros solubles en agua están enlazados en una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino, de un agente de unión.

Un agente de unión puede comprender una o más uniones de polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitación, polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. Un agente de unión derivado puede comprender uno o más de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros. Uno o más polímeros solubles en agua pueden estar unidos aleatoriamente a una o más cadenas laterales. El PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica para un agente de unión, tal como un anticuerpo. Algunos de dichos procedimientos se analizan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6.133.426.

Se apreciará que un agente de unión puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el agente de unión conserve especificidad de unión. Por lo tanto, están abarcadas dentro del alcance de la divulgación modificaciones de las estructuras de agentes de unión. Estas pueden incluir sustituciones de aminoácidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyen la capacidad de unión esclerostina de un agente de unión. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar restos de aminoácidos de origen no natural, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o revertidas de restos de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativa también puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto normativo de modo que haya poco o ningún efecto en la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácidos o miméticos de aminoácidos por un miembro de otra clase con diferentes propiedades físicas (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homólogas de anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.

Además, un experto en la materia puede generar variantes de ensayo que contengan una sustitución de aminoácidos sencilla en cada resto de aminoácido deseado. Las variantes pueden después explorarse usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes podrían usarse para recopilar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubriera que un cambio en un resto de aminoácido particular diera como resultado actividad destruida, reducida de forma indeseable o inadecuada, podrían evitarse variantes con dicho cambio. En otras palabras, basándose en información recopilada de dichos experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos donde deberían evitarse sustituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones.

Un experto en la materia será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas. Un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. Se pueden identificar restos y partes de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. Incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura polipeptídica.

Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de función estructural que identifican restos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de los restos de aminoácidos en una proteína que corresponden a restos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos restos de aminoácidos importantes predichos.

Un experto en la materia puede analizar también la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la materia puede predecir el alineamiento de restos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la materia puede elegir no hacer cambios radicales a los aminoácidos que se ha predicho que están en la superficie de la proteína, puesto que dichos restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas.

Se han dedicado varias publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4); 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2); 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry 113(2); 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47; 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47; 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26; 367-384 (1979). Además, están disponibles en la actualidad programas informáticos para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en la realización de modelos de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tengan una identidad de secuencia mayor del 30 % o similitud mayor del 40 % tienen con frecuencia topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural proteica (PDB) ha proporcionado predictibilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1); 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3); 369-376 (1997)) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que se ha resuelto un número de estructuras crítico, la predicción estructural se hará drásticamente más precisa.

Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "reconocimiento de pliegues" (Jones, D., Curr., Opin. Struct. Biol., 7(3); 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1); 15-19 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie et al., Science, 253; 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183; 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13); 4355-4358 (1987)) y "enlace evolutivo" (Véase Holm, mencionado anteriormente (1999) y Brenner, mencionado anteriormente (1997)).

Las variantes de agentes de unión incluyen variantes de glicosilación donde el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. Las variantes pueden comprender un número mayor o menor de sitios de glicosilación ligados a N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación ligado a N está caracterizado por la secuencia; Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde el resto de aminoácido designado como X puede ser cualquier resto de aminoácido excepto prolina. La sustitución de restos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidratos ligada a N. Como alternativa, las sustituciones que eliminen esta secuencia retirarán una cadena de carbohidratos ligada a N existente. También se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidratos ligadas a N donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación ligados a N (típicamente los que son de origen natural) y se crean uno o más nuevos sitios ligados a N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína donde uno o más restos de cisteína se suprimen de o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos restos de cisteína que la proteína nativa, y típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.

Las sustituciones de aminoácidos deseadas (conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la materia en el momento en que se deseen dichas sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar restos importantes de anticuerpos para esclerostina, o por aumentar o reducir la afinidad de los anticuerpos para esclerostina descritos en el presente documento.

Las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que; (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (por ejemplo, en la parte del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución de aminoácidos conservativa puede típicamente no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparezca en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354; 105 (1991).

Los agentes de unión pueden enlazarse químicamente con polímeros, lípidos u otros restos.

Los agentes de unión pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura marco biocompatible comprende un polipéptido o parte del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable, o marco, o armazón, que es capaz de presentar una o más secuencias de aminoácidos que se unen con un antígeno (por ejemplo, CDR, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o "pliegue" polipeptídico (un motivo estructural) o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en relación con un polipéptido o pliegue de origen natural. Estos armazones pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como un ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.

Típicamente las estructuras marco biocompatibles se basan en armazones proteicos o esqueletos distintos de dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden usarse las basadas en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de cinc CP1, PST1, superenrollamiento, LACI-D1, dominio Z y dominios tendramisat (Véase, por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).

Los agentes de unión incluyen los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento. Pueden producirse anticuerpos humanizados tales como los descritos en el presente documento usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12); 1445-1451,2005; Hwang W. et al., Methods.

36(1); 35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1); 43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21 (8); 397­ 402, 2000).

Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que los agentes de unión adecuados incluyen partes de estos anticuerpos, tales como uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se desvela específicamente en el presente documento. Al menos una de las regiones de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 pueden tener al menos una sustitución de aminoácido, siempre que el agente de unión conserve la especificidad de unión de la CDR no sustituida. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica, donde el agente de unión bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza la esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica en la que el agente de unión muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en un "ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana" al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, donde el agente de unión es una proteína de unión recombinante o un péptido sintético, y la proteína de unión recombinante bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, donde el agente de unión es una proteína de unión recombinante, y la proteína de unión recombinante muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en el ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana (descrito en el presente documento posteriormente) al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y/o neutraliza esclerostina.

Cuando un anticuerpo comprende CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se ha descrito anteriormente, puede obtenerse por expresión de una célula hospedadora que contiene ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica cada secuencia de CDR puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos de la CDR y sintetizarse junto con cualquier secuencia de ADN de región constante y marco de región variable de anticuerpo deseada usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos, mutagénesis dirigida y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado. Está ampliamente disponible para los expertos en la materia ADN que codifica las regiones constantes y marcos de región variable a partir de bases de datos de secuencias genéticas tales como GenBank®. Cada una de las CDR anteriormente mencionadas se localizará típicamente en un marco de región variable en las posiciones 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) y 95-102 (CDR-H3) de la cadena pesada y las posiciones 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) y 89-97 (CDR-L3) de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).

Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo puede propagarse y expresarse de acuerdo con cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos para escisión, ligación, transformación y transfección de ácido nucleico usando cualquier variedad de vectores de expresión conocidos. Por lo tanto, puede preferirse la expresión de un fragmento de anticuerpo en un hospedador procariota, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178; 497-515). Puede preferirse la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo en una célula hospedadora eucariota, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero) o células vegetales. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero sin limitación, mieloma (tal como una línea NSO de ratón), c Os , CHO o células de hibridoma. Los ejemplos de células vegetales incluyen tabaco, maíz, soja y células de arroz.

Pueden prepararse uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o una bacteria, tal como E. coli, en la que se producirá producción del anticuerpo. Para obtener transcripción y traducción eficaz, la secuencia de ADN en cada vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y secuencia líder unidos operativamente con la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos de este modo se conocen generalmente bien y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo, se describen procedimientos de biología molecular básica en Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Maniatis et al, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). Puede realizarse secuenciación de ADN como se describe en Sanger et al. (PNAS 74; 5463, (1977)) y el manual de secuenciación de plc de Amersham International, y puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12; 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154; 367-82 (1987); el manual de Anglian Biotechnology Ltd). Adicionalmente, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación y cultivo de células apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, MP, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).

Cuando se desee mejorar la afinidad de anticuerpos que contienen una o más de las CDR anteriormente mencionadas puede obtenerse por varios protocolos de maduración de afinidad, incluyendo mantener las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), combinación de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), presentación de fagos (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri, et al., Nature, 391,288-291, 1998). Todos estos métodos de maduración de afinidad se analizan en Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

Pueden obtenerse otros anticuerpos mediante inmunización convencional y procedimientos de fusión de células como se describen en el presente documento y se conocen en la técnica. Pueden generarse anticuerpos monoclonales usando una diversidad de técnicas conocidas. En general, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256; 495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1; 2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes de Estados Unidos N.° RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," en DNA Cloning 2; Expression Systems, 2a Edición, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Pueden derivarse fragmentos de anticuerpo de los mismos usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica u, opcionalmente, mediante digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Como alternativa, dichos fragmentos también pueden generarse mediante técnicas de ingeniería genética recombinante como se describe en el presente documento.

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando a un animal, por ejemplo, una rata, hámster, un conejo o preferentemente un ratón, incluyendo por ejemplo un transgénico o un knock-out, como se conoce en la técnica, con un inmunógeno que comprende esclerostina humana de SEQ ID NO; 1, o un fragmento de la misma, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. La presencia de producción de anticuerpos específica puede supervisarse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo obteniendo una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que se une a esclerostina humana o péptido usando uno cualquiera de varios métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. De animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran células linfoides, más habitualmente células del bazo o ganglio linfático, para obtener linfocitos B. Los linfocitos B se fusionan después con un compañero de fusión de célula de mieloma sensibilizado a fármaco, preferentemente uno que sea singénico con el animal inmunizado y que tenga opcionalmente otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad para expresar productos génicos de Ig endógenos, por ejemplo, P3X63 - Ag 8.653 (ATCC N.° CRL 1580); Ns O, SP20) para producir hibridomas, que son líneas celulares eucariotas inmortales. Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante varios minutos con un agente promotor de fusión de membrana, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y después sembrarse a baja densidad en un medio selectivo que apoye el crecimiento de células de hibridoma, pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente una a dos semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias individuales, y pueden ensayarse anticuerpos producidos por las células con respecto a actividad de unión con esclerostina humana, usando una cualquiera de una diversidad de inmunoensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, mediante clonación de dilución limitada o mediante aislamiento en placa de agar suave) y se seleccionan y cultivan clones positivos que producen un anticuerpo específico para esclerostina. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de cultivos de hibridoma. Un método alternativo para producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, sensibilizado con pristano) para prolongar la formación de líquido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una diversidad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaños y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Pueden purificarse anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo antiidiotipo y una proteína de unión a TGF-beta, o fragmento o variante de los mismos.

Un anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por cualquier variedad de técnicas que resultarán familiares para los expertos habituales en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, transformación por Virus de Epstein Barr (VEB) de células de sangre periférica humana (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de linfocitos B humanos, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fago de región V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la técnica y basados en la divulgación del presente documento. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos de ratones transgénicos que se han modificado por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a presentación antigénica. Se describen métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos, por ejemplo, por Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994; Patente de Estados Unidos N.° 5.877.397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci.

764: 525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones dirigidas de los loci de cadena pesada y cadena ligera endógenos (véase también Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de minigenes, o transloci en cromosomas artificiales de levadura, que experimentan reordenación del ADN específica de linfocitos B e hipermutación en el tejido linfoide de ratón. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos inmunizando los ratones transgénicos, que pueden después producir anticuerpos humanos específicos para esclerostina. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden usarse para producir hibridomas que secreten anticuerpos humanos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. También pueden obtenerse sueros policlonales que contienen anticuerpos humanos de la sangre de los animales inmunizados.

Otro método para generar anticuerpos humanos incluye inmortalizar células de sangre periférica humana por transformación con VEB. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 4.646.456. Dicha línea de linfocitos B inmortalizada (o línea celular linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a esclerostina puede identificarse por métodos de inmunodetección como se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, un ELISA, y después aislarse por técnicas de clonación convencionales. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo antiesclerostina puede mejorarse fusionando la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ratón-humano de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Glasky et al., Hybridoma 8: 377-89 (1989)). Otro método más para generar anticuerpos monoclonales humanos es la inmunización in vitro, que incluye sensibilizar linfocitos B esplénicos humanos con esclerostina humana, seguido de fusión de los linfocitos B sensibilizados con un compañero de fusión heterohíbrido. Véase, por ejemplo, Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147: 86-95.

Se puede seleccionar un linfocito B que produce un anticuerpo antiesclerostina humana y se pueden clonar las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada a partir del linfocito B de acuerdo con técnicas de biología molecular conocidas en este campo (documento WO 92/02551; Patente de Estados Unidos 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)) y descritas en el presente documento. Pueden aislarse linfocitos B de un animal inmunizado del bazo, ganglio linfático o muestra de sangre periférica seleccionando una célula que produce un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina. Los linfocitos B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Se conocen bien en la técnica métodos para detectar linfocitos B individuales que producen un anticuerpo con la especificidad deseada, por ejemplo, mediante formación de placas, separación de células activadas por fluorescencia, estimulación in vitro seguida de detección de anticuerpo específico y similares. Los métodos para selección de linfocitos B productores de anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una única suspensión celular de linfocitos B en agar blando que contiene esclerostina humana.

La unión del anticuerpo específico producido por el linfocito B con el antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que se seleccionen los linfocitos B que producen el anticuerpo deseado, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando a Dn o ARNm de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.

Un método adicional para obtener anticuerpos es por presentación de fagos. Véase, por ejemplo, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Pueden crearse bibliotecas combinatorias de región variable de inmunoglobulina humanas o murinas en vectores de fagos que pueden explorarse para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.223.409; Huse et al., 1989 Science 246: 1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47-52 y referencias citadas en las mismas. Por ejemplo, puede insertarse una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de región variable de Ig en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en fase con la secuencia que codifica una proteína de cubierta de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de cubierta con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. También pueden presentarse fragmentos Fab de inmunoglobulina en una partícula de fago (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.°: 5.698.426).

También pueden prepararse bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en fago lambda, por ejemplo, usando vectores ZlmmunooZap™(H) y ZImmunoZap™(L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, se aísla ARNm de una población de linfocitos B y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores ZImmunoZap(H) y ZImmunoZap (L). Estos vectores pueden explorarse individualmente o pueden expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse et al., mencionado anteriormente; véase también Sastry et al., mencionado anteriormente). Pueden convertirse posteriormente placas positivas en un plásmido no lítico que permita expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonales de E. coli.

En un hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal pueden amplificarse usando cebadores nucleotídicos. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden obtenerse de fuentes disponibles en el mercado. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón, incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, Vhc, VHd, Ch1 , Vl y Cl). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que pueden después insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse después en sistemas de expresión basados en E. coli, levadura o mamífero. Pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla que contiene una fusión de los dominios V h y Vl usando estos métodos (véase Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).

Una vez que se han obtenido células que producen anticuerpos usando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm del mismo de acuerdo con procedimientos convencionales como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos de los mismos pueden secuenciarse y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR pueden manipularse como se ha descrito previamente para generar otros anticuerpos.

Preferentemente los agentes de unión se unen específicamente a esclerostina. Como con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la materia reconoce que los diversos restos con los que un agente de unión no debería unirse de forma detectable para ser terapéuticamente eficaz y adecuado serían extensos y difíciles de numerar. Por lo tanto, para un agente de unión divulgado en el presente documento, la expresión "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un agente de unión para unirse a esclerostina, preferentemente esclerostina humana, con mayor afinidad que se une a una proteína de control no relacionada. Preferentemente la proteína de control es lisozima de clara de huevo de gallina. Preferentemente los agentes de unión se unen a esclerostina con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por una proteína de control. Un agente de unión puede tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10^{' 7} M, menos de o igual a 1 x 10^{' 8} M, menos de o igual a 1 x 10^{' 9} M, menos de o igual a 1 x 10^{' 10} M, menos de o igual a 1 x 10^{' 11} M o menos de o igual a 1 x 10^{' 12} M.

La afinidad puede determinarse por un ensayo de ELIA de afinidad. La afinidad puede determinarse por un ensayo de BIAcore. La afinidad puede determinarse por un método cinético. La afinidad puede determinarse por un método de equilibrio/solución. Dichos métodos se describen en más detalle en el presente documento o se conocen en la técnica.

Los agentes de unión de esclerostina preferentemente modulan la función de esclerostina en el ensayo basado en células descrito en el presente documento y/o el ensayo in vivo descrito en el presente documento y/o se unen a uno o más de los epítopos descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada la unión de uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. En consecuencia, dichos agentes de unión pueden identificarse usando los ensayos descritos en el presente documento.

Pueden generarse agentes de unión identificando en primer lugar anticuerpos que se unan a uno o más de los epítopos proporcionados en el presente documento y/o se neutralizan en los ensayos basados en células y/o in vivo descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada los anticuerpos descritos en la presente solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpos se usan después para insertar en marcos biocompatibles apropiados para generar agentes de unión a esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, o puede ser una molécula no proteica. Los ensayos descritos en el presente documento permiten la caracterización de agentes de unión. Preferentemente, los agentes de unión son anticuerpos como se definen en el presente documento.

Se entenderá por un experto en la materia que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden experimentar una diversidad de modificaciones postraduccionales. El tipo y alcance de estas modificaciones depende con frecuencia de la línea celular hospedadora usada para expresar la proteína, así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto básico carboxilo-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).

Se describen posteriormente anticuerpos denominados Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1. "HC" se refiere a la cadena pesada y "LC" se refiere a la cadena ligera. Para algunos anticuerpos posteriores, las CDR están sombreadas en cajas y las regiones constantes (C) se muestran en negrita y cursiva.

Ab-D

El anticuerpo D (también denominado en el presente documento Ab-D y Mab-D) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-D se muestra en la Figura 18.

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena ligera de Ab-D:

1 DVQMIQSPSS LSASLGDIVT M T í^ ^ G T S IN liíW F Q Q K P GKAPKLUYg

51 SSNÍJBD.GVPS RFSGSRYGTD FTLTISSLED ED LA tYFCI^H SV ^YTFG G

101 GTKLEIKA4Í) AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SW CFLNNFYPKDJNVKfm

151DGSERONGVL NSWTDODSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEA THKT

201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:7)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-D es la siguiente:

1 GATGTCCAGA TGATTCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTTTGGGAGA

51 CATAGTCACC ATGACTTGCC AGGCAAGTCA GGGCACTAGC ATTAATTTAA

101 ACTGGTTTCA GCAAAAACCA GGGAAGGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGGT

151 TCAAGCAACT TGGAAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTAGATA

201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT GAAGATCTGG

251 CAACTTATTT CTGTCTACAA CATAGTTATC TCCCGTACAC GTTCGGAGGG

301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID

NO:8)

La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-D incluyendo el péptido señal es la siguiente:

1 MNTRAPAEFL GFLLLWFLGA RCDVQMIQSP SSLSASLGDIVTMTCQASQG 51 TSINLNWFQQ KPGKAPKLLI YGSSNLEDGV PSRFSGSRYG TDFTLTISSL

101 EDEDLATYFC LQHSYLPYTF GGGTKLEIKR ADAAPTVSLF PPSSEQLTSG

151 GASVYCFLNN FYPKDINVKW KIDGSERQNG VLNSWTDQDS KDSTYSMSST

201 LTLTKDEYER HNSYTCEATH KTSTSPIVKS FNRNEC (SEQ ID NO:9)

Secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-D incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal:

1 ATGAACACGA GGGCCCCTGC TGAGTTCCTT GGGTTCCTGT TGCTCTGGTT

51 TTTAGGTGCC AGATGTGATG TCCAGATGAT TCAGTCTCCA TCCTCCCTGT

101 CTGCATCTTT GGGAGACATA GTCACCATGA CITGCCAGGC AAGTCAGGGC

151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AGGCTCCTAA

201 GCTCCTGATC TATGGTTCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT

251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG

301 GAGGATGAAG ATCTGGCAAC TTATTTCTGT CTACAACATA GTTATCTCCC

351 GTACACGTTC GGAGGGGGGA CCAAGCTGGA AATAAAACGG GCTGATGCTG

401 CACCAACTGT ATCCATCTTC CCACCATCCA GTGAGCAGTT AACATCTGGA

451 GGTGCCTCAG TCGTGTGCTT CTTGAACAAC TTCTACCCCA AAGACATCAA

501 TGTCAAGTGG AAGATTGATG GCAGTGAACG ACAAAATGGC GTCCTGAACA

551 GTTGGACTGA TCAGGACAGC AAAGACAGCA CCTACAGCAT GAGCAGCACC 601 CTCACGTTGA CCAAGGACGA GTATGAACGA CATAACAGCT ATACCTGTGA

651 GGCCACTCAC AAGACATCAA CTTCACCCAT TGTCAAGAGC TTCAACAGGA

701 ATGAGTGTTA G (SEQ ID NO: 10)

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena pesada HC de Ab-D es la siguiente:

1 ^Q ^Q SG PELV TPG A SV K I SCKASGYTFT¡DH^gWVKQS HGKSLEW1GD,

51 ^ Y S Q E ljY ,N Q K F K (írA T L TVDKSSSIAY MEERGLTSED SAVYYCARDD

101 iYDAS^AYWG QGTLVTVSA/4 KTTPPSVYPLAPGSAAOTNSMVTLGCLVKG

151 YFPEPVTVTWNSGSLSSGVI1TFPA VLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT

201 CNVÁHPASSTKVPKK1VPRD CGCKPC1CTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT

251 LTPKVTCWVDISKDDPEVQ FSWFVDDVEVI1TAQTQPREE QFNSTFRSVS

301 ELP1MHQDWL NGKEFKCRVNSPAFPAPIEK TISKTKGRPKAPQVYT1PPP

351 KEQMAKDKVSLTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMDTDGSY

401 FIYSKI.NVQK SNWEA GNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ ID NO: 11)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-D es:

1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTGGTGACGC CTGGGGCTTC

51 AGTGAAGATA TCTTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACCACTACA

101 TGAGCTGGGT GAAGCAGAGT CATGGAAAAA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT

151 ATTAATCCCT ATTCTGGTGA AACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAC

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG TATAGCCTAC ATGGAGATCC 251 GCGGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGATGAT 301 TACGACGCCT CTCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC TGGTCACTGT 351 CTCTGCAGCC AAAACGACAC CCCCATCTGT CTATCCACTG GCCCCTGGAT 401 CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC TGGGATGCCT GGTCAAGGGC 451 TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG AACTCTGGAT CCCTGTCCAG 501 CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA GTCTGACCTC TACACTCTGA 551 GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT GGCCCAGCGA GACCGTCACC 601 TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC AAGGTGGACA AGAAAATTGT 651 GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT ATGTACAGTC CCAGAAGTAT 701 CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA AGGATGTGCT CACCATTACT 751 CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA GACATCAGCA AGGATGATCC 801 CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA TGTGGAGGTG CACACAGCTC 851 AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACTITCCG CTCAGTCAGT 901 GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC AATGGCAAGG AGTTCAAATG 951 CAGGGTCAAC AGTCCAGCTT TCCCTGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA 1001 AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG TGTACACCAT TCCACCTCCC 1051 AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT CTGACCTGCA TGATAACAGA

1101 CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG GCAGTGGAAT GGGCAGCC AG

1151 CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA TGGACACAGA TGGCTCTTAC

1201 TTCATCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG AGCAACTGGG AGGCAGGAAA

1251 TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG CCTGCACAAC CACCATACTG

1301 AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT GA (SEQ ID NO: 12)

La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-D incluyendo el péptido señal es:

1 MRCRWIFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL VTTGASVKIS CKASGYTFTD 51 HYMSWVKQSH GKSLEWIGDINPYSGETTYN QKFKGTATLT VDKSSSIAYM 101 EIRGLTSEDS AVYYCARDDY DASPFAYWGQ GTLVTVSAAK TTPPSVYPLA 151 PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY 201 TLSSSVTVPS STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKKTVPRDC GCKPCICTVP 251 EVSSVFIFPP KPKDVLTITL TPKVTCVWDISKDDPEVQF SWFVDDVEVH 301 TAQTQPREEQ FNSTFRSVSK LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS PAFPAPIEKT 351 ISKTKGRPKA PQVYT1PPPK EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG 401 QPAENYKNTQ PIMDTDGSYFIYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH 451 HTEKSLSHSP GK (SEQ ID NO: 13)

La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-D incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

1 ATGAGATGCA GGTGGATCTT TCTCTTTCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTG GTGACGCCTG

101 GGGCTTCAGT GAAGATATCT TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC

151 CACTACATGA GCTGGGTGAA GCAGAGTCAT GGAAAAAGCC TTGAGTGGAT

201 TGGAGATATT AATCCCTATT CTGGTGAAAC TACCTACAAC CAGAAGTTCA

251 AGGGCACGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CTTCCAGTAT AGCCTACATG

301 GAGATCCGCG GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 AGATGATTAC GACGCCTCTC CGTTTGCTTA CTGGGGCCAA GGGACTCTGG

401 TCACTGTCTC TGCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC

451 CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT

501 CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC

551 TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC

601 ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC

651 CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA

701 AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA

751 GAAGTATCAT CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC

801 CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG

851 ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC

901 ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CTITCCGCTC

951 AGTCAGTGAA CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT

1001 TCAAATGCAG GGTCAACAGT CCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC 1051 ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC 1101 ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA 1151 TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATOGG 1201 CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG 1251 CTCTTACTTC ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG 1301 CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC

1351 CATACTGAGA AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID NO:14)

i

Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-D son las siguientes:

CRD-H1: DHYMS (SEQ ID NO: 39)

CDR-H2: DINPYSGETTYNQKFKG (SEQ ID NO: 40)

CDR-H3: DDYDASPFAY (SEQ ID NO: 41)

Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-D son:

CDR-L1: QASQGTSINLN (SEQ ID NO: 42)

CDR-L2: GSSNLED (SEQ ID NO: 43)

CDR-L3: LQHSYLPYT (SEQ ID NO: 44)

Ab-C

El anticuerpo C (también denominado en el presente documento Ab-C y Mab-C) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-C se muestra en la Figura 17. La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la Cadena Ligera de Ab-C es la siguiente:

1 DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISC^^SVD^GDSYÑmW Y QQKPGQPPKL

51 ^u Y^{á í} :^{sñlés giparfsgng sgtdftlñih pveéédavty yc}§ ^qsnedp$

101 TjFGGGTKLEI KRADAAPTVSIFPPSSEQL T SGGASWCFL NÑFYPKDIÑV

151 KWKWGSERQNGVLNSWTDQ DSKDSTTSMS STLTLTKDEYERHNSYTCEA

201 THKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 15)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-C es:

1 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT CTCTAGGCCT

51 GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTG

101 ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC

151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG CCAGGTTTAG

201 TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG

251 AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA GGATCCGTGG

301 ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG ATGCTGCACC

351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG

401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC

451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG

501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA

551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC

601 ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA

651 GTGTTAG (SEQ ID NO: 16)

La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:

1 METDTTLLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LTVSLGLRATISCKASQSVD

51 YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLMH 101 PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW TFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLT

151 SGGASW CFL NNFYPKD1NV KWKEDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ EDNO:17)

La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG

51 CTCCACTGGT GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT 101 CTCTAGGCCT GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT 151 TATGATGGTG ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG 251 CCAGGTTTAG TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA 351 GGATCCGTGG ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG 401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA 501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC 551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC 601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC 651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA 701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID NO: 18)

Cadena pesada de Ab-C

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es:

1 EVQLQQSGPE LVKPGTSVKM SCKASGYTFT bCYMNWVKQS HGKSLEWIGÉI 5 1 INPFNGGTW M íO ^G K A TL TVDKSSSTAY MQLNSLTSDD SAVYYCARSíf 10EYYFDGRVPWD ¿UvffiYWGQGTS VTVSSAKTTP PS VYPLAPGS AA O TNSMVTL

151 GCL VKGYFPE PVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW

201PSETVTCNVA HPASSTKVDKKTVPRDCGCKPCICTVPEVS SW FPPKPK

251DVLTITLTPK VTCWVDISKDDPEVOFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS

301 TFRSVSELPIMHQDWUÍGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV

351 YTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENTKNTQPIM

401DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE A GNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ

ID NO: 19)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es la siguiente:

1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGACTTC

51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTGCTACA

101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGGAAGA GCCTTGAATG GATTGGAGAT

151 ATTAATCCTT TCAACGGTGG TACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC ATGCAGCTCA

251 ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATCCCAT

301 TATTACTTCG ATGGTAGAGT CCCTTGGGAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA

351 AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT

401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG

451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA

501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT

551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG

601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA

651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT

701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG

751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA

801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG

851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC

901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA

951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA

1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG

1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT

1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC

1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGMCTACA AGAACACTCA GCCCATCATG

1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG

1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC

1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA

(SEQ ID NO:20)

La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:

1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGTSVKMS CKASGYTFTD

51 CYMNWVKQSH GKSLEW1GDINPFNGGTTYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM

101 QLNSLTSDDS AVYYCARSHY YFDGRVPWDA MDYWGQGTSV TVSSAKTTPP

151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHT7PAV

201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDCGCKP

251 QCTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTTTLTPKV TCYWDISKD DPEVQFSWFV

301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPEM HQDWLNGKEF KCRW SAAFP

351 APIEKUSKT KGRPKAPQVY HPPPKEQMA KDKVSLTCMITDFFPEDITV

401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH

451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID NO:21)

La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG

101 GGACTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC

151 TGCTACATGA ACrGGGTGAA GCAGAGCCAT GGGAAGAGCC TTGAATGGAT

201 TGGAGATATT AATCCTTTCA ACGGTGGTAC TACCTACAAC CAGAAGTTCA

251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG

301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGACGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATCCCATTAT TACTTCGATG GTAGAGTCCC TTGGGATGCT ATGGACTACT

401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA

451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT

501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA

551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC

601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG

651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA

701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT

751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA

801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG

851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA

901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT

951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT

1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCITTCCCT

1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC

1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG

1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG

1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC

1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC

1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT

1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG

1401 TAAATGA (SEQ ID NO:22) *

Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-C son como sigue:

CDR-H1: DCYMN (SEQ ID NO: 45)

CDR-H2: DINPFNGGTIYNQKFKG (SEQ ID NO: 46)

CDR-H3: SHYYFDGRVPWDAMDY (SEQ ID NO: 47)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-C son:

CDR-L1: KASQSVDYDGDSYN (SEQ ID NO: 48)

CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO: 49)

CDR-L3: QQSNEDPWT (SEQ ID NO: 50)

Ab-A

El anticuerpo A (también denominado en el presente documento Ab-A y Mab-A) es un anticuerpo quimérico de ratónconejo que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-A se muestra en la Figura 15.

Cadena Ligera de Ab-A

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:

1 AQVLTQTPAS VSAAVGGTVT IN C ^ jS ^ V Y 'D N ® L S W F Q Q KPGQPPKLLI 51 YDÁ'SDlASGV PSRFSGSGSG TQFTLTISGV QCADAATYYC QGÁWDVIY4'

101 FGGGTEVVVK R TDAAPTVS1FPPSSEQL TS GGASWCFLN NFYPKDÜWK

151 WK1DGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEA T

201HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NO:23)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:

1 GCGCAAGTGC TGACCCAGAC TCCAGCCTCC GTGTCTGCAG CTGTGGGAGG

51 CACAGTCACC ATCAATTGCC AGTCCAGTCA GAGTGTTTAT GATAACAACT

101 GGTTAGCCTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGC AGCCTCCCAA GCTCCTGATT

151 TATGATGCAT CCGATCTGGC ATCTGGGGTC CCATCGCGGT TCAGTGGCAG

201 TGGATCTGGG ACACAGTTCA CTCTCACCAT CAGCGGCGTG CAGTGTGCCG

251 ATGCTGCCAC TTACTACTGT CAAGGCGCTT ATAATGATGT TATTTATGCT

301 TTCGGCGGAG GGACCGAGGT GGTGGTCAAA CGTACGGATG CTGCACCAAC

351 TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT GGAGGTGCCT

401 CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT CAATGTCAAG

451 TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA ACAGTTGGAC

501 TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC ACCCTCACGT

551 TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG TGAGGCCACT

601 CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA GGAATGAGTG

651 TTAG (SEQ ED NO:24)

La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:

1 MDTRAPTQLL GLLLLWLPGA TFAQVLTQTP ASVSAAVGGT VTINCQSSQS

51 VYDNNWLAWF QQKPGQPPKL LIYDASDLAS GVPSRFSGSG SGTQFTLTIS

101 GVQCADAATY YCQGAYNDV1YAFGGGTEW VKRTDAAPTV SIFPPSSEQL

151 TSGGASWCF LNNFYPKDIN VKWK3DGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM

201 SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:25)

La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

1 ATGGACACGA GGGCCCCCAC TCAGCTGCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT

51 CCCAGGTGCC ACATTTGCGC AAGTGCTGAC CCAGACTCCA GCCTCCGTGT

101 CTGCAGCTGT GGGAGGCACA GTCACCATCA ATTGCCAGTC CAGTCAGAGT

151 GTTTATGATA ACAACTGGTT AGCCTGGTTT CAGCAGAAAC CAGGGC AGCC

201 TCCCAAGCTC CTGATTTATG ATGCATCCGA TCTGGCATCT GGGGTCCCAT

251 CGCGGTTCAG TGGCAGTGGA TCTGGGACAC AGTTCACTCT CACCATCAGC

301 GGCGTGCAGT GTGCCGATGC TGCCACITAC TACTGTCAAG GCGCTTATAA

351 TGATGTTATT TATGCTTTCG GCGGAGGGAC CGAGGTGGTG GTCAAACGTA

401 CGGATGCTGC ACCAACTGTA TCCATCTTCC CACCATCCAG TGAGCAGTTA

451 ACATCTGGAG GTGCCTCAGT CGTGTGCTTC TTGAACAACT TCTACCCCAA

501 AGACATCAAT GTCAAGTGGA AGATTGATGG CAGTGAACGA CAAAATGGCG

551 TCCTGAACAG TTGGACTGAT CAGGACAGCA AAGACAGCAC CTACAGCATG

601 AGCAGCACCC TCACGTTGAC CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAAC AGOTA

651 TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAACTTCACCCATT GTCAAGAGCT

701 TCAACAGGAA TGAGTGTTAG (SEQ ID NO:26)

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A es:

1 Q S^ESG G ^V TPG TPLTLT CTA SG FSI^SY% ^W V R Q A P GEGLEWIGÜÍ

51 DSGGRTDYAS.WAKGRFIISR TSTTMDLKMT SLTTGDTARY FC A R ^ Ñ liW G 101 QGTLVTVSSA STKGPSl'TPL APGSAAQTNS MVTLGCL VKG YFPEPVTVTW

151NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASST

201KVDKKIVPRD CGCKPC1CTV PEVSSVFIFP PKPKDVLT1TLTPKVTCWV

251DISKDDPEVQ FSWFJ'DDVEVHTAQTQPREE QFHSTFRSVS ELPIMHQDWL

301NGKEFKCR VN SAAFPAPÍEK TISKTKGRPK APQVYTTPPP KEQMAKDKVS

351LTCM IW FFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMNTNGSY FVYSKLNVOK

401SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ ID NO:27)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A:

1 CAGTCGCTGG AGGAGTCCGG GGGTCGCCTG GTCACGCCTG GGACACCCCT

51 GACACTCACC TGCACAGCCT CTGGATTCTC CCTCAGTAGT TATTGGATGA

101ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGGAGGGGC TGGAATGGAT CGGAACCATT

151 GATTCTGGTG GTAGGACGGA CTACGCGAGC TGGGCAAAAG GCCGATTCAC

201 CATCTCCAGA ACCTCGACTA CGATGGATCT GAAAATGACC AGTCTGACGA

251 CCGGGGACAC GGCCCGTTAT TTCTGTGCCA GAAATTGGAA CTTGTGGGGC

301 CAAGGCACCC TCGTCACCGT CTCGAGCGCT TCTACAAAGG GCCCATCTGT

351 CTATCCACTG GCCCCTGGAT CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC

401 TGGGATGCCT GGTCAAGGGC TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG

451 AACTCTGGAT CCCTGTCCAG CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA

501 GTCTGACCTC TACACTCTGA GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT

551 GGCCCAGCGA GACCGTCACC TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC

601 AAGGTGGACA AGAAAATTGT GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT

651 ATGTACAGTC CCAGAAGTAT CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA

701 AGGATGTGCT CACCATTACT CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA

751 GACATCAGCA AGGATGATCC CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA

801 TGTGGAGGTG CACACAGCTC AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA

851 GCACTTTCCG CTCAGTCAGT GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC

901 AATGGCAAGG AGTTCAAATG CAGGGTCAAC AGTGCAGCTT TCCCTGCCCC

951 CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG

1001 TGTACACCAT TCCACCTCCC AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT

1051 CTGACCTGCA TGATAACAGA CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG

1101 GCAGTGGAAT GGGCAGCCAG CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA

1151 TGGACACAGA TGGCTCTTAC TTCG TCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG

1201 AGCAACTGGG AGGCAGGAAA TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG

1251 CCTGCACAAC CACCATACTG AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT

1301 GA (SEQ ID NO:28)

La secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:

1 METGLRWLLL VAVLKGVHCQ SLEESGGRLV TPGTTLTLTC TASGFSLSSY

51 WMNWVRQAPG EGLEWIGTDD SGGRTDYASW AKGRFTISRT STTMDLKMTS

101 LTTGDTARYF CARNWNLWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVYPLA PGSAAQTNSM

151 VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY TLSSSVTVPS

20 i STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKKTVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPP

251 KPKDVLTITL TPKVTCVWDISKDDPEVQF SWFVDDVEVH TAQTQPREEQ

301 FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS AAFPAPEEKT1SKTKGRPKA

351 PQVYTIPPPK EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ

401 PIMNTNGSYF VYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH HTEKSLSHSP

451 GK (SEQ ID NO:29)

La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGAGACTG GGCTGCGCTG GCTTCTCCTG GTCGCTGTGC TCAAAGGTGT

51 CCACTGTCAG TCGCTGGAGG AGTCCGGGGG TCGCCTGGTC ACGCCTGGGA

101 CACCCCTGAC ACTCACCTGC ACAGCCTCTG GATTCTCCCT CAGTAGTTAT

151 TGGATGAACT GGGTCCGCCA GGCTCCAGGG GAGGGGCTGG AATGGATCGG

201 AACCATTGAT TCTGGTGGTA GGACGGACTA CGCGAGCTGG GCAAAAGGCC

251 GATTCACCAT CTCCAGAACC TCGACTACGA TGGATCTGAA AATGACCAGT

301 CTGACGACCG GGGACACGGC CCGTTATTTC TGTGCCAGAA ATTGGAACTT

351 GTGGGGCCAA GGCACCCTCG TCACCGTCTC GAGCGCTTCT ACAAAGGGCC

401 CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG

451 GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT

501 GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG

551 TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC

601 AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG

651 CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC

701 CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT CTGTC1TCAT CTTCCCCCCA

751 AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT

801 TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG

851 TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG

901 TTCAACAGCA CTITCCGCTC AGTCAGTGAA CTTCCCATCA TGCACCAGGA

951 CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG GGTCAACAGT GCAGCTTTCC

1001 CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT

1051 CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA

1101 AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG

1151 TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG

1201 CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC GTCTACAGCA AGCTCAATGT

1251 GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC

1301 ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA AGAGCCTCTC CCACTCTCCT

1351 GGTAAATGA (SEQ ID NO:30)

Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-A son las siguientes:

CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO: 51)

CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO: 52)

CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO: 53)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-A son:

CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO: 54)

CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO: 55)

CDR-L3: QGAYNDVIYA (SEQ ID NO: 56)

Ab-A se humanizó y se denomina Anticuerpo 1 (también denominado en el presente documento Ab-1), que tiene las siguientes secuencias:

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGT

GCCACATTTGCTCAAGTTCTGACCCAGAGTCCAAGCAGTCTCTCCGCCAGCGTAGGC

GATCGTGTGACTATTACCTGTCAATCTAGTCAGAGCGTGTATGATAACAATTGGCTG

GCGTGGTACCAGCAAAAACCGGGCAAAGCCCCGAAGCTGCTCATCTATGACGCGTC

CGATCTGGCTAGCGGTGTGCCAAGCCGTTTCAGTGGCAGTGGCAGCGGTACTGACT

rrACCCTCACAATTTCGTCTCTCCAGCCGGAAGATTTCGCCACTTACTATTGTCAAG

GTGCTTACAACGATGTGATTTATGCCTTCGGTCAGGGCACTAAAGTAGAAATCAAA

CGT (SEQ ID NO:74)

La secuencia de aminoácidos de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCACTGT

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGAGGCGGGCTTGTCCAGCCTGGAGGGAGCCTGCG

TCTCTC1TGTGCAGCAAGCGGCTTCAGCTTATCCTCTTACTGGATGAATTGGGTGCG

GCAGGCACCTGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCACCATTGATTCCGGAGGCCGTA

CAGACTACGCGTCTTGGGCAAAGGGCCGTTTCACCATTTCCCGCGACAACTCCAAA

AATACCATGTACCTCCAGATGAACTCTCTCCGCGCAGAGGACACAGCACGTTATTA

CTGTGCACGCAACTGGAATCTGTGGGGTCAAGGTACTCTTGTAACAGTCTCGAGC

(SEQ ID NO:76 )

La secuencia de aminoácidos de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:

Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-1 son las siguientes:

CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO: 51)

CDR-H2: TTDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO: 52)

CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO: 53)

Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-1 son:

CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO: 54)

CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO: 55)

CDR-L3: QGAYNDVIYA (SEQ ID NO: 56)

Ab-B

El anticuerpo B (también denominado en el presente documento Ab-B y Mab-B) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-B se muestra en la Figura 16.

Cadena Ligera de Ab-B

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-B es:

1 QIVLTQSPTI VSASPGEKVT LIC^ÁSSSVpFVDWFQQKPG TSPKRWIYR? 51 SNLG^GVPAR FSGGGSGTSH SLTISRMEAE DAATYYCQQf^TTPPTFGAG

101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS WCFLNNFYP KDINVKWK1D

151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS

201 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ID NO:31)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-B es:

1 CAAATTGTTC TCACCCAGTC TCCAACAATC GTGTCTGCAT CTCCAGGGGA

51 ^{GAAGGTCACC CTAATCTGCA GTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TTCGTGGACT}

101 ^{GGTTCCAGCA GAAGCCAGGC ACTTCTCCCA AACGCTGGAT TTACAGAACA}

151 ^{TCCAACCTGG GTTTTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCG GTGGATCTGG}

201 ^{GACCTCTCAC TCTCTCACAA TCAGCCGAAT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA}

251 ^{CTTATTACTG CCAGCAAAGG AGTACTTACC CACCCACGTT CGGTGCTGGG}

301 ^{ACCAAGCTGG AACTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT}

351 ^{CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT}

401 ^{TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT}

451 ^{GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG}

501 ^{CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG}

551 ^{AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA}

601 ^{ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG} (SEQ ^ID NO:32)

La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-B incluyendo el péptido señal es:

1 M HFQVQIFSF L L IS A S V IV S RGQIVLTQSP TIV SA SPG EK V T L IC S A S S S

5 1 VSFVDWFQQK PGTSPKRWIY RTSNLGFGVP ARFSGGGSGT SH SLTISRM E

1 0 1 AEDAATYYCQ QRSTYPPTFG AGTKLELKRA D A A PTV SIFP PSSEQLTSGG

1 51 A S W C FL N N F YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSM SSTL

2 01 TLTKDEYERH NSYTCEATHK T S T S P IV K S F NRNEC (SE Q ID N O :33 )

La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-B incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:

1 ATGCATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT

51 CATAGTGTCC AGAGGGCAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA ACAATCGTGT

1 01 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCCTAA TCTGCAGTGC CAGTTCAAGT

1 51 GTAAGTTTCG TGGACTGGTT CCAGCAGAAG CCAGGCACTT CTCCCAAACG

2 01 CTGGATTTAC AGAACATCCA ACCTGGGTTT TGGAGTCCCT GCTCGCTTCA

25 1 GTGGCGGTGG ATCTGGGACC TCTCACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG

30 1 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCACC

3 51 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAACT GAAACGGGCT GATGCTGCAC

4 01 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT

4 51 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT

50 1 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT

55 1 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC

60 1 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC

65 1 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG

70 1 AGTGTTAG (S E Q ED N O :34)

Cadena Pesada de Ab-B

La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:

1 QVTLKESGPG ILQ PSQ T LSL T C SFSG FSLS TSjSMGVGWIR HPSGKNLEWL 51 T^ix^wwéDVK? y n p Vl ^ s r l t ISKDTSNSQV FLKIANVDTA DTATYYCARI ^{1 01 ÍÉDFpY5EEYY'_ AÍíD^WGQGTS V IV SSA K TTP} PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKWK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251 DVLTITLTPK VTCVWDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM

401 DTDGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNKHTE KSLSHSPGK (SEQ

IDNO:35)

La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:

1 CAGGTTACTC TGAAAGAGTC TGGCCCTGGG ATATTGCAGC CCTCCCAGAC

51 CCTCAGTCTG ACTTGTTCTT TCTCTGGGTT TTCACTGAGC ACTTCTGGTA

1 01 TGGGTGTAGG CTGGATTCGT CACCCATCAG GGAAGAATCT GGAGTGGCTG 1 51 GCACACATTT GGTGGGATGA TGTCAAGCGC TATAACCCAG TCCTGAAGAG 2 01 CCGACTGACT ATCTCCAAGG ATACCTCCAA CAGCCAGGTA TTCCTCAAGA 2 51 TGGCCAATGT GGACACTGCA GATACTGCCA CATACTACTG TGCTCGAATA 3 01 GAGGACTTTG ATTACGACGA GGAGTATTAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA 3 51 AGGAACCTCA GTCATCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 4 01 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 4 51 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA 50 1 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT 5 51 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG 60 1 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA 65 1 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT 70 1 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG 75 1 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA 80 1 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG 85 1 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC 90 1 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA 95 1 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA 10 0 1 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG 10 5 1 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT 11 0 1 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 11 51 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG

12 01 GACACAGATG GCTCTTACTT CGTCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG

12 51 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC

13 01 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA

(SEQ EDNO:36)

La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-B incluyendo el péptido señal:

1 M GRLTSSFLL LIV PA YV LSQ VTLK ESG PG I LQPSQTLSLT C S F S G F S L S T

51 SGMGVGWIRH PSGKNLEWLA HIWWDDVKRY NPVLKSRLTI SKDTSNSQVF

101 LKIANVDTAD TA TYYCA RIE DFDYDEEYYA MDYWGQGTSV IV SSA K T T PP

151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKG YFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV

201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP

251 CICTV PEV SS V FIFP P K P K D V LT IT LT PK V TCVWDISKD DPEVQFSWFV

301 DDVEVHTAQT Q PREEQFNST FR SV SELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP

351 A P IE K T IS K T KGRPKAPQVY TIPPPKEQM A KDKVSLTCMI T D F FP E D IT V

401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH

451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SI Q ID N O :37)

La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-B incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGCAGGC TTACTTCTTC ATTCCTGCTA CTGATTGTCC CTGCATATGT

51 CCTGTCCCAG GTTACTCTGA AAGAGTCTGG CCCTGGGATA TTGCAGCCCT

1 01 CCCAGACCCT CAGTCTGACT TGTTCTTTCT CTGGGTTTTC ACTGAGCACT

1 51 TCTGGTATGG GTGTAGGCTG GATTCGTCAC CCATCAGGGA AGAATCTGGA

20 1 GTGGCTGGCA CACATTTGGT GGGATGATGT CAAGCGCTAT AACCCAGTCC

25 1 TGAAGAGCCG ACTGACTATC TCCAAGGATA CCTCCAACAG CCAGGTATTC

30 1 CTCAAGATCG CCAATGTGGA CACTGCAGAT ACTGCCACAT ACTACTGTGC

35 1 TCGAATAGAG GACTTTGATT ACGACGAGGA GTATTATGCT ATGGACTACT

40 1 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ATCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA

45 1 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT

50 1 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA

55 1 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC

60 1 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG

65 1 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA

70 1 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT

75 1 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA

80 1 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG

85 1 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA

90 1 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT

95 1 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT

10 01 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT

1 05 1 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC

11 0 1 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG

1 15 1 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG

12 0 1 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC

12 51 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCGT CTACAGCAAG CTCAATGTGC

13 01 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT

13 5 1 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG

14 01 TAAATGA (SEQ ID N O :38 )

Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-B son las siguientes:

CDR-H1: TSGMGVG (SEQ ID NO: 57)

CDR-H2: HIWWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID NO: 58)

CDR-H3: EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID NO: 59)

Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-B son:

CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID NO: 60)

CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID NO: 61)

CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID NO: 62)

Los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen a regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína. La unión de un anticuerpo con esclerostina puede correlacionarse con aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea conseguida mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y en el Ejemplo 12 (mono). Los aumentos de al menos uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea pueden también conseguirse mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y Ejemplo 12 (mono). Puesto que la unión de un anticuerpo con esclerostina se determina principalmente por sus secuencias de CDR, puede generarse un anticuerpo con todas o algunas de las secuencias de CDR divulgadas en un marco apropiado, donde el anticuerpo conserva la capacidad para unirse específicamente con esclerostina, y puede esperarse conseguir aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea. Dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento de afecciones humanas o animales que están provocadas por, asociadas con, o dan como resultado al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, baja calidad ósea y baja fuerza ósea. Se conocen por los expertos en la materia métodos para construir y expresar anticuerpos y fragmentos de los mismos que comprenden CDR de la presente divulgación.

La presente divulgación se refiere por lo tanto en un aspecto a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-A, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 51 para CDR-H1, SEQ ID NO: 52 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 53 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 51 para CDR-H1, SEQ ID NO: 52 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 53 para CDR-H3.

Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 54 para CDR-L1, SEQ ID NO: 55 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 56 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 54 para CDR-L1, SEQ ID NO: 55 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 56 para CDR-L3.

La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-B, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 57 para CDR-H1, SEQ ID NO: 58 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 59 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 57 para CDR-H1, SEQ ID NO: 58 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 59 para CDR-H3.

Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 60 para CDR-L1, SEQ ID NO: 61 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 62 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 60 para CDR-L1, SEQ ID NO: 61 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 62 para CDR-L3.

La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-C, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 45 para CDR-H1, SEQ ID NO: 46 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 47 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 45 para CDR-H1, SEQ ID NO: 46 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 47 para CDR-H3.

Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 48 para CDR-L1, SEQ ID NO: 49 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 50 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 48 para CDR-L1, SEQ ID NO: 49 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 50 para CDR-L3.

La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-D, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 39 para CDR-H1, SEQ ID NO: 40 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 41 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 39 para CDR-H1, SEQ ID NO: 40 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 41 para CDR-H3.

Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 42 para CDR-L1, SEQ ID NO: 43 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 44 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 42 para CDR-L1, SEQ ID NO: 43 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 44 para CDR-L3.

Se describen posteriormente anticuerpos anti-esclerostina adicionales. Para algunas de las secuencias de aminoácidos las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están sombreadas en cajas y las regiones constantes están en negrita y cursiva.

Ab-2

Las secuencias de la LC y HC del Anticuerpo 2 (también denominado Ab-2) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-2:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:

I QIVLSQSPAI LSTSPGEKVT MTC'R ASSSVY YMHWYQQKPG SSPKPW1YA7

51 SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTITRVEAE DAATYYC'QQW SSDPLTFGAG

101 TKLBl.K RADA APTVSUPPSSEQLTSGGAS VVCELNNEYP KDINVKWKIl) 151 (iSERQNGVLNSWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKPEYLRUNS YTCEATHKTS 201 TSP1VKSFNR NEC(SEQ ID NO 117)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:

1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTACAT CTCCAGGGGA

51 GAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTATAT TACATGCACT

101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA

151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGTTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTC'TGG

201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAC'CAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCC’A

251 CTTATTACTG CCAGC'AGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG

301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT

351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT

401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT

451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG

501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG

551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA

601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID

NO: 118) ’•

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:

l MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AILSTSPGEK VTMTCRASSS

51 VYYMHWYQQK PGSSPKPWIY ATSNLASGVP VRFSGSGSGT SYSLT1TRVE

101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG

151 ASWCFLNNF YPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL

201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO: 119)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-2 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT

51 CATTATGTCC AGGGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCAATCCTGT

101 CTACATCTCC AGGGGAGAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT

151 GTATATTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACC

201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA

251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAC CAGAGTGGAG

301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT

351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC

401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT

451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT

501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGIT

551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC

601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC

651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG

701 AGTGTTAG (SEQ ED NO: 120)

Cadena Pesada de Ab-2

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:

1 EVQVQQSGPE LVKPGASVKL SCTASGFNK g ^ p W V K Q R PEQGLEWIGg 51 p D fp (3 É S p Y ÁPKJFggKAIM TADTSSNTAY*LQLRSLTSED TAIYYCERED

101 YJDGTYTTBPY WGQGTLVTVS A.4KTTPPSVY PLAPGSAA OT NSMVTLGCÍ V

151KGYFPÉPVTVTWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSJ1VPSET

201 VTCNVAHPAS STKVDKMVP RBCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKDVLT

251ITLTPEVTCV WDISKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRS

301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKTTSKTKGR PKAPQVYTIP

351PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYKNTQPMDTDG

401SYF1YSKLNV QKSNWEA GNT FTCSVLBEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID

NO: 121)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:

1 GAGGTTCAGG TGCAGCAGTC TGGGCCAGAA CTTGTGAAGC CAGGGGCCTC

51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CAACATTAAA GACTACTTTA

101 TACACTGGGT GAAGCAGAGG CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG

151 CTTGATCCTG AGGATGGTGA AAGTGATTAT GGCCCGAAGT TCCAGGACAA

201 GGCCATTATG ACAGCAGACA CATCATCCAA CACAGCCTAT CTTCAGCTCA

251 GAAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTATTGTGA GAGAGAGGAC

301 TACGATGGTA CCTACACCTT TTTTCCTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT

351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC

401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC

451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT

501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA

551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC

601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA

651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG

701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC

7 51 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA

801TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA

851CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA

901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT

951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA

1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA

1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT

1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC

1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC

1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC

1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC

1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ ID NO: 122)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:

1 MKCSWVEFFL MAWTGVNSE VQVQQSGPEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD

51 YFMWVKQRP EQGLEWIGRL DPEDGESDYA PKFQDKAIMT ADTSSNTAYL

101 QLRSLTSEDT AIYYCEREDY DGTYTFFPYW GQG1LVTVSA AKTTPPSVYP

151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD

201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKTVPR DCGCKPCICT

251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCW VDISKDDPEV QFSWFVDDVE

301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPEE

351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW

401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH

451 NHHTEKSLSH SPGK. (SEQ ID NO: 123)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-2 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT

51 CAATTCAGAG GTTCAGGTGC AGCAGTCTGG GCCAGAACTT GTGAAGCCAG

101 GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC

151 TACTTTATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT

201 TGGAAGGCTT GATCCTGAGG ATGGTGAAAG TGATTATGCC CCGAAGTTCC

251 AGGACAAGGC CATTATGACA GCAGACACAT CATCCAACAC AGCCTATCTT

301 CAGCTCAGAA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ATTGTGAGAG

351 AGAGGACTAC GATGGTACCT ACACCTTTTT TCCTTACTGG GGCCAAGGGA

401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA

451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG

501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG

551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC

601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG

651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG

701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA

751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT

801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA

851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG

901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT

951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA

1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CnTCCCTGC CCCCATCGAG

1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC

1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT

1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG

1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC

1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT

1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC

1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID

NO: 124)

Ab-3

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 3 (también denominado en el presente documento Ab-3) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-3

Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:

1 EIVLTQSPAL MAASPGEKVT ÍTCSVSS^S^NHEHWFQQK SDTSPKPWIY

51 GTSÑfcASGVP VRFSGSGSGT SYSLTISSME AED AATYY CQrQ^SSYPLTFG

101AGTKLELRA4 DAAPTVS1FP PSSEQL TSGG ASWCFLNNF YPKDINVKWK

151WGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTL TLTKDEYERB NSYTCEA THE

201 TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO: 125)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:

1 GAAATTGTGC TCACCCAGTC TCCAGCACTC ATGGCTGCAT CTCCGGGGGA

51 GAAGGTCACC ATCACCTGCA GTGTCAGTTC AACTATAAGT TCCAACCACT

101 TGCACTGGTT CCAGCAGAAG TCAGACACCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT

151 GGCACATCCA ACCTGGCITC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG

201 ATCTGGGACC TCTTATTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG GCTGAGGATG

251 CTGCCACTTA TTACTGTCAA CAGTGGAGTA GTTACCCACT CACGTTCGGC

301 GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAGACGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC

351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG

401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG

451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA

501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA

551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG

601 ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGTTAG (SEQ

IDNO:126)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-3 incluyendo el péptido señal:

1 MDFHVQIFSF ML1SVTVILS SGEIVLTQSP ALMAASPGEK VTTTCSVSST

51 ISSNHLHWFQ QKSDTSPKPWIYGTSNLASG VPVRFSGSGS GTSYSLUSS

101 MEAEDAATYY CQQWSSYPLT FGAGTKLELR RADAAPTVSIFPPSSEQLTS

151 GGASWCFLN NFYPKDINVK WKEDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS

201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NO:127)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGATTTTC ATGTGCAGAT TTTCAGCTTC ATGCTAATCA GTGTCACAGT

51 CATTTTGTCC AGTGGAGAAA TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA GCACTCATGG

101 CTGCATCTCC GGGGGAGAAG GTCACCATCA CCTGCAGTGT CAGTTCAACT

151 ATAAGTTCCA ACCACTTGCA CTGGTTCCAG CAGAAGTCAG ACACCTCCCC

201 CAAACCCTGG ATTTATGGCA CATCCAACCT GGCTTCTGGA GTCCCTGTTC

251 GCTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACCTCTT ATTCTCTCAC AATCAGCAGC

301 ATGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGTCAACAGT GGAGTAGTTA

351 CCCACTCACG TTCGGCGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAGA CGGGCTGATG

401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT

451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT

501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA

551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC

601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG

651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA

701 GGAATGAGTG TTAG (SEQ ID NO: 128)

Cadena pesada de Ab-3

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-3:

1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCTASDFNK ^FYI^WMRQR PEQGLDWIGR

51 'IDPEÍ^DTEY-DPKPQDKA'rL TTDTSSNTAY LQLSGLTSET TAVYYCSREAj 101 )0Y^fl),G^SyíSñ^>§W GAGTT YTVSSAKTTP PSVTPLAPGS AAOTNSATVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLOSDLYTLS SSVTVPSSlJf'

201PSETVTCNVA HPASSTKVDK KTVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFIFPPKPK

251DVLTTTLTPK VTCVWDISKDDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS

• 301 TFRSVSELPIMHODWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPOV

351 YTLPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDÍT VEWOWNGOPA ENYKNTOPIM

401DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE A GNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ

ID NO: 129)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-3:

1 GAGGTTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAA CTTGTGAGGC CAGGGGCCTT

51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC

101 TACACTGGAT GAGGCAGCGG CCTGAACAGG GCCTGGACTG GATTGGAAGG

151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA

201 GGCCACTCTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTGCAGCTCA

251 GCGGCCTGAC ATCTGAGACC ACTGCCGTCT ATTACTGTTC TAGAGAGGCG

301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCGC

3 51 AGGGACCACA ATCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT

401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG

451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA

501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT

551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG

601 CCCAGCGAUA GUG1LACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA

651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT

701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG

751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA

801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG

851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC

901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA

951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA

1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG

1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT

1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC

1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG

1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG

1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC

1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 130)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-3 incluyendo el péptido señal:

1 MKCSWVIFFL MAWTGVNSE VQLQQSGAEL VRPGALVKLS CTASDFNIKD

51 FVLHWMRQRP EQGLDWIGRJ DPENGDTLYD PKFQDKATLT TDTSSNTAYL

101 QLSGLTSETT AVYYCSREAD YFHDGTSYWY FDVWGAGTTITVSSAKTTPP

151 SYYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV

201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDCGCKP

251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLT1TLTPKV TCVWDISKD DPEVQFSWFV

301 DDVEVHTAQT QPRJEEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP

351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TDPPPKEQMA KDKVSLTCMITDFFPEDITV

401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIY SK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH

451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID NO: 131)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT

51 CAATTCAGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTT GTGAGGCCAG

101 GGGCCTTAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC

151 TTCTATCTAC ACTGGATGAG GCAGCGGCCT GAACAGGGCC TGGACTGGAT

201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCC

251 AGGACAAGGC CACTCTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG

301 CAGCTCAGCG GCCTGACATC TGAGACCACT GCCGTCTATT ACTGTTCTAG

351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT

401 GGGGCGCAGG GACCACAATC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA

451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT

501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA

551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC

601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG

651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA

701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT

751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA

801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG

851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA

901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT

951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT

1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC A G C m C C C T

1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC

1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG

1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG

1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC

1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC

1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT

1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG

1401 TAAATGA (SEQ ID NO: 132)

Ab-4

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 4 (también denominado en el presente documento Ab-4) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-4

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:

1 DIQMTQITSS LSASLGDRVS S^JYX^WYQQKP DGTFKLLEF^’

51 TSRIXSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFC&Q GDTTPYTFGG

101 GTKLEIKA4Z) AAPTl'SIFPP SSEQL TSGGA S WCFLNNFY PKDINl'KWKI 151 DGSERQNGVL NSJtTDQDSKD STYSMSSTLT L TKDE YERHN SYTCEA TIÍKT 201 STSPn'XSFN RNEC (SEQ ID NO: 133)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:

1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA

51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA

101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC

151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC

201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG

251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG

301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID

NO: 134)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:

1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS

51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ

101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSEFPP SSEQLTSGGA

151 SW CFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD S'rYSMSSTLT

201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:135)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-4 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG

51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT T01 CTCTÜGGAüA LAUVAirCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC

151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT

201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG

251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA

301 GAAGATTTTG CCACTTACIT TTGCCAACAG GGAGATACGCITCCGTACAC

351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA

401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC

451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA

501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA

551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG

601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC

651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT

701 GTTAG (SEQ ID NO: 136)

Cadena Pesada de Ab-4

Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:

1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNNffiWVKQN QGKTLEWIGÉ

51 ^NSQG^GY NQEJ^GICATL TVDKSSTTAY MÉLRSLTSED SAVYYCARLG "

101 VD D ^D Y?Yf DyWGAGTTVT VSSAJ5JTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC

151 L VKGYFPEPVTVTWNSGSLS SGVUTFPA VL QSDL YTLSSS VTVPSSTWPS

201 ETVTCNVAJfP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFTFPPKPKDV

251L TITL TPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD D VE VHTA QTO PREEOFNSTF

301RSVSELPMH ODWLNGKEFK CR VNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT

351IPPPKEQMAK DKVSLTCMTTDFFPEDUVE WOWNGOPAEN YKNTOPIMDT

401DGSYFJYSKL NVQKSNWEA G NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ED

NO:137)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:

1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC

51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA

101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA

151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC

251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC

301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC

351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC

401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC

451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG

501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCITCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC

551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC

601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA

651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG

701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG

751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG

801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG

851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTITC

901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA

951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC m C C C T G C C CCCATCGAGA

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC

T&5Í XtTdCX'CCTt'CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG

1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA

1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA

1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG

1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA

1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID

NO: 138)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQ.QSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD

51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM

101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV

151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ

201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPC1

251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD

301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP

351 EEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMTID FFPEDITVEW

401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG

451 LIINHHTEKSL SHSPGK(SEQIDNO:139)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-4 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG

101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCCIGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC

151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGAT

201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA

251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG

301 GAGCTCCGCA GGCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG

401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC

451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT

501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA

551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG

601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG

651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA

701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA

751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA

801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG

851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT

901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG

951 CACnTCCGC TCAGTCAGTG ^{a a c t t c c c a t c a t g c a c c a g} GACTGGCTCA

1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC

1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG

1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA

1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTQTT ACATGAGGGC

1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG

1401 A(SÉQ^)NC>:140)

Ab-4 se humanizó para generar Ab-5.

Ab-5

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 5 (también denominado en el presente documento Ab-5) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-5

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:

1 DigMTQSPSS LSASVGDRVT IT(^SQDISKYy{W YQQp GjCAPKLLTYY.

51 TSRLLSGVPS Rf SGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYOQQ^GDTLPYTTGG

101 GTKVEIKR TVAAPSVFTFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV

151DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHE VYACEVTHQG

201 LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO: 141)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:

1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA

51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA

101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT

151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC

201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATITCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG

251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC

301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT

351 CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT

401 GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG

451 GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA

501 CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG

551 CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC

601 CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT (SEQ ID

NO: 142)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:

1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD

51 ISNYLNWYQQ KPGKAPKLLIYYTSRLLSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL

101 QPEDFATYYC QQGDTLPYTF GGGTKVEIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG

151 TASWCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST

201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 143)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT

51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT

101 CCGCATCCGT AGGCGACCGC GTAACCATAA CATGTAGAGC ATCTCAAGAT

151 ATTTCCAACT ATTTGAATTG GTACCAACAA AAACCCGGCA AAGCACCTAA

201 ACTCCTCATT TACTATACAT CAAGACTCCT CTCCGGCGTT CCATCACGAT

251 TCTCAGGCTC CGGCTCCGGC ACAGATTTCA CACTCACTAT TTCCTCCCTC

301 CAACCAGAAG ATTTTGCAAC CTATTACTGT CAACAAGGCG ATACACTCCC

351 ATACACATTC GGCGGCGGCA CAAAAGTTGA AATTAAACGT ACGGTGGCTG

401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA

451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA

50 rAGTACÁGfGG 7CAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC

601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA

651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG

701 GAGAGTGT (SEQ ID NO: 144)

Cadena Pesada de Ab-5

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5:

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE

51 INPNSGGÁGY ÑQKFKGRVTM TTDTSTSTAY MEIJRSLRSDD TAVYYCARL^

lOÍ YDDrYDDWYFDV^VGQGTTVT VS&ASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 151LVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVUTFPA VL QSSGLYSLSS WTVPSSNFG

201 TQJYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP PCP.4PPVA CP SVFLFPrKPK 251DTLM1SRTPE VTCWVDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS

301 TFR WSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPEEKT1SK TKGQPREPQV

351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML

401DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ

ID NO: 145)

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5 sin lisina carboxi-terminal:

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYÑ&HWVRQA PGQGLEWMGE

51 IÑPNSGGAGY.HQKFMRV™ TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG

101 M t ó D ^ ^ ;DVWGQGTTVT VSSASTEGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 151 LVmYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL OSSGLYSLSS WTVPSSNFG

201 TQTYTCNVDHKPSNTKVDKT VERKCCVECPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPK

251 DTLM1SRTPE VTCWVDVSHEDPEVOFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS

301 TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPTEKTISK TKGQPREPQV

351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPpUíL 401DSDGSFFLYS KLTVDKSR WQ QGNVFSCSmHEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ EDNO-.392)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5:

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG

51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA

101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA

151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG

201 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC

251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG

301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC

351 AACAGTTACC GTCTCTAGTG CCTCCACCAA GGGCCCATCG GTCTTCCCCC

401 TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC CCTGGGCTGC

451 CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG

501 CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA CAGTCCTCAG

551 GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAACTTCGGC

601 ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT

651 GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA CCGTGCCCAG

701 CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG

751 GACACCCTCA" TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG TGGTGGTGGA

801 CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG

851 TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC

901 ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG ACTGGCTGAA

951 CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC CCAGCCCCCA

1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG

1051 TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC AGGTCAGCCT

1101 GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG

1151 AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC TCCCATGCTG

1201 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG

1251 CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC

1301 TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAA (SEQ

ID NO: 146)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:

1 MDWTWRTLFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD

51 YNMHWVROAP GQGLEWMGEINPNSGGAGYN QKFKGRVTMT TDTSTSTAYM

101 ELRSLRSDDT AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV

151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ

201 SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP

251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVQFNWYV

301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST F R W S V L T W HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP

351 APEEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

451 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 147)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC

51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTA AAAAAACCAG

101 GAGCAAGCGT TAAAGTTTCT TGTAAAGCAA GCGGATATAC ATTTACAGAT

151 TACAACATGC ATTGGGTAAG ACAAGCGCCA GGACAAGGAT TGGAATGGAT

201 GGGCGAAATT AACCCTAATA GTGGAGGAGC AGGCTACAAT CAAAAATTCA

25 1 AAGGGAGAGT TACAATGACA ACAGACACAA GCACTTCAAC AGCATATATG

301 GAACTGCGAT CACTTAGAAG CGACG ATACA GCTGTATACT ATTGCGCACG

351 ACTTGGGTAT GATGATATAT ATGATGACTG GTATTTCGAT GTTTGGGGCC

401 AGGGAACAAC AGTTACCGTC TCTAGTGCCT CCACCAAGGG CCCATCGGTC

451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT

501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA

551 ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG

601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA

651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA

701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG

751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCITCCTCTTCCCCCCAAA

801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG

851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG

901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT

951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT

1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA

1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC

1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG

1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG

1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC

1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCITCITCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG

1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT

1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG

1401 TAAA (SEQ ID NO: 148)

Dominios variables de Ab-5:

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT I T C R ^ ^ ^ Ñ Y L íf ^ Q Q K P GKAPKLLTYX 51 TSRJtLSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFÁTYY Cj^QGJMTj YTFGG 101 GTKVEIK (SEQ IDNO:376)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):

1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA

51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA

101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT

151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC

201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG

251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC

301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA A (SEQ ID NO:377)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT Í£YÑMÍ$WVRQA PGQGLEWMGE

51 ÍNPѧ$3AGY bLQlJPKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARl^ 101YÍJD rY BP^flP DYWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:378)

La secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG

51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA

101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA

151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG

201 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC

251 GATCACTTAG ÁAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG

301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC

351 AACAGTTACC GTCTCTAGT (SEQ ID NO:379)

Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-5 son las siguientes:

CDR-H1: DYNMH (SEQ ID NO: 245)

CDR-H2: EINPNSGGAGYNQKFKG (SEQ ID NO: 246)

CDR-H3: LGYDDIYDDWYFDV (SEQ ID NO: 247)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-5 son:

CDR-L1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 78)

CDR-L2: YTSRLLS (SEQ ID NO: 79)

CDR-L3: QQGDTLPYT (SEQ ID NO: 80)

Ab-6

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 6 (también denominado en el presente documento Ab-6) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-6

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:

1 DIQMJQTTSS LSASLGDRVT ISCR^QDIS^YQlW FQQKP DGTLKLLIFjY;

51 ¡TSREH&jVPS RFSGSGSGTD YSL7ÍSNLEQ EDJATYFCQQ^DTLPYTFGG

101 GTKLÉmjMZ) AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SWCFLNNFYPKDINVKWK1

151DGSERQNGVL NSWTDODSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEA THKT

201 STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 149)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:

1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA

51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA

101 ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT GATCTTCTAC

151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC

201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA GAAGATATTG

251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC1TCCGTACAC GTTCGGGGGG

301 GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SBQ ID

NO: 150)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-6 incluyendo el péptido señal:

1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVTISCRASQDIS

51 NYLNWFQQKP DGTLKLUFY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLT1SNLEQ

101 ED1ATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIRRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA

151 SWCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT

201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:151)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT

101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC

151 AATTATTTAA ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT 201 GATCTTCTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC 351 GTTCGGGGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO: 152)

Cadena Pesada de Ab-6

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-6:

1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT gYNM^WVKQN QGKSLEWIGÜ 51 fH P F ?G G S G Y ,l^ Q í^ j^ T L TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARÍV

101 ^© SY ^JV Y ^D ^W G A G T T V T VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC

151LVKGYFPEPV TVTWNSGSLSSGVHTFPA VL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS

201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPE VSS V FTFPPKPKD V 251LTULTPKVT CWVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351IPPPKEOMAKDKVSLTCM1T DFFPEDITVE WQWNGOPAEN YKNTQPMDT

401 DGSYFÍYSKL NVQKSNWEA G NTFTCSVLHE GLHNHHTEES LSHSPGK (SEQ ED

NO:153)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-6:

1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC

51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA

101TGCACTGGGT GAAACAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAA

151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TAGTGGCTAC AACCAAAAGT TCAAAGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC

251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGTC

301 TACGATGGCA GCTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC

351 CACGGTCACC GTGTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC

401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAAGTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC

451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG

501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC

551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC

601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA

651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG

701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG

751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG

801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG

851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC

C Í(j W a GTGAACTTCC c a t c a t g c a c c a g g a c t g g c t c a a t g g c a a 951 g g a g t t c a a a t g c a g g g t c a a c a g t g c a g c t t t c c c t g c c c c c a t c g a g a

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC

1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG

1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA

1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA

1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG

1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA

1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID

NO: 154)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-6 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD

51 YNMHWVKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM

101 ELRSLTSEDS AVYYCARLVY DGSYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV

151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ

201 SDLYTLSSSV TYPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI

251 CTVPEVSSVF EFPPKPKDVL TTTLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD

301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP

351 EKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW

401 QWNGQPAENY KNTQPMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG

451 LHNHHTEKSL SHSPGK(SEQ ID NO: 155)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG

101 GGGCTTCAGT GAAG ATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTG AC

151 TACAACATGC ACTGGGTGAA ACAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT

201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTAG TGGCTACAAC CAAAAGTTCA

251 A AGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CTTCCAGCAC AGCCTACATG

301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATTGGTCTAC GATGGCAGCT ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG

401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC

451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT

501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA

551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG

601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG

651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA

701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA

751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA

801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG

851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT

901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG

951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA

1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC

1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT

1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC

1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG

1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT

1251 GGACXtXCjÁl' Gg c t c t t a c t TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA

1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC

1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG

1401 A (SEQ ID NO: 156)

Ab-7

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 7 (también denominado en el presente documento Ab-7) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-7

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:

101 GTKLEIKJMD AAPTVSIFPP SSEQL TSGGA SWCFLNNFY PKDINVKWKI

151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT

201 STSPB'KSFN RNEC (SEQ ID NO: 157)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:

1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA

51 CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC AATTATTTAT

101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT GATCTACTAC

151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC

201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG GAAGATATTG

251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG

301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID

NO: 158)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:

1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVTICCRASQVTT

51 NYLYWYQQKP DGTFKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ

101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSEFPP SSEQLTSGGA

151 SW CFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT

201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 159)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-7 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG

51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT

101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC

151 AATTATTTAT ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT

201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG

251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG

301 GAAGATA’ITG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC

351 GTTCGGÁGGG'GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA

401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC

451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAAC1TCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA

501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA

551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG

601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC

651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT

701 GT (SEQ ID NO: 160)

Cadena Pesada de Ab-7

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:

1 EVQI^SGPELM KPG ASVKM SCKASGYTFT.DYNNffi(WMKQN QGKSLEWIGÉ

51 ÍÑPNSGGAGY NQQFKGKATL TVDKSSRTAY MELRSLTSED SAVYYCAR1Q "*

10 rYVGNYED.WYT pVWGAGTTVT VSSAK1TPPS VYPLAPGSAA OTNSMVTLGC

151L VKGYFPÉPV TVTWNSGSLS SGVUTFPA VL QSDL YTLSSS VTVPSSTWPS

201 ETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSV F1FPPKPKDV

251LTTTLTPKVT CWVDISKJDD PEVQFSWFVD D VEVHTAQTQ PREEOFNSTF

301 RSVSELPIM1IQDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKT1SKTK GRPKAPQVYT

351IPPPKEQMAK DKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT

401DGSYFIYSKL NVQKSNWE/i G NTFTCSVLHE GLHNÍÍHTEKS1SHSPGK (SEQ ID NO:161)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:

1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC

51 AGTG AAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA

101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAATG GATAGGAGAA

151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGCAGT TCAAAGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG GACAGCCTAC ATGGAGCTCC

251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC

301 TACGTTGGTA ATTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGQ GCGCAGGGAC

351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC

401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC

451 CTGGTCAAGG GCTATITCCC TQAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG

501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC

551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC

601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA

651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG

701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG

751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG

801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG

851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC

901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA

951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC

1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG

1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA

1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA

1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG

1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA

' ' BOrACCACCÁTAC TCÍAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA A (SEQ ID NO: 162)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD

51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGAGYN QQFKGKATLT VDKSSRTAYM

101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY VGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV

151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ

201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTTCVDKKTV PRDCGCKPCI

251 CTVPEVSSVF EFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWD1SKDDP EVQFSWFVDD

301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP

351 DEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW

401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG

451 LHNHHTEKSL SHSPGK(SEQ ID NO: 163)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-7 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGGCTG

101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC

151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAATGGAT

201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGCAGTTCA

251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGGAC AGCCTACATG

301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATTGGGCTAC GTTGGTAATT ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG

401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC

451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT

501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATITCCCIGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA

551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG

601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG AGTGTCCCCT CCAGCACCTG

651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA

701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCC1TGCATA

751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA

801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG

851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT

901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AQTTCAACAG

951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA

1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC

1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT

1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC

1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG

1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT

1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA

1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC

1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAA

(SEQIDNO:164) ’

Ab-8

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 8 (también denominado en el presente documento Ab-8) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-8

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:

1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA

51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA

101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC

151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC

201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG

251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG

301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTrAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID

NO: 166)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-8 incluyendo el péptido señal:

1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVSISCRASQDIS

51 NYLNWYQQKP DGTFKLLDFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTTYNLEQ

101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSrFPP SSEQLTSGGA

151 SW CFLNNFY PKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT

201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 167)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG

51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT

101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC

151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT

201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG

251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA

301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC

351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA

401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC

451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA

501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA

551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG

601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC

651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT

701 GTTAG (SEQ ID NO: 168)

Cadena Pesada de Ab-8

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-8:

1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYÑMHWVKQN QGKTLDWIGE

51 INPNSGGÁGYNQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLtí " 101 ¡YDDrYDpWYF ^YWGAGTTVT VSSAETTPPS VYPLAPGSAA OTNSMVTLGC

151LVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS

201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKK1VPRDCGCKPCICTVPE VSS V FIFPPKPKD V

251LTTTLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF

301 RSVSELPIMH QDK'LNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT

351IPPPKEQMAKDKl'SLTCMTT DFFPEDITVE WQWNGOPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYFIYSKL NVOKSNWEA G NTFTCSVLHE GLlPNIíTÍTEUS LSHSPGK (SEQ ID NO: 169)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-8:

1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC

51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA

101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGACTG GATAGGAGAA

151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC

251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC

301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC

351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC

401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC

451 CTGGTCAAGG GCTATITCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG

501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC

551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC

601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA

651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG

701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG

751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG

801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG

851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC

901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA

951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC

1051ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG

1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA

1151ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA

1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG

1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA

1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID

NO: 170)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-8 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD

51 YNMHWVKQNQ GKTLDWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM

101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV

151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ

20i sdT í ’TLs s s v ’ TVP’SSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI

251 CTVPEVSSVF EFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD

301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP

351 EEKT1SKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW

401 QWNGQPAENY KNTQPEMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG

451 LHNHHTEKSL SHSPGK(SEQ ID NO: 171)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG

101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC

151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGACTGGAT

201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA

251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG

301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG

401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC

451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT

501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA

551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG

601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG

651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA

701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA

751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA

801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG

851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT

901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG

951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA

1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC

1051ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT

1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC

1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG

1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT

1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA

1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC

1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG

1401 A (SEQ ID NO: 172)

Ab-9

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 9 (también denominado en el presente documento Ab-9) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-9

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:

1 DIQMTQUSS LS ASLGDRVS ISCRA5^DlJ>Tm^WYQQKP DGTFKLUF^ 51 iTSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSDITYNLEQ EDFATYFCX^GDTLPYTFGG 101 GTKVELKJL4Z) AAPTVSIFPP SSEOLTSGGA SWCFLNNFY PEJDINVKWKl 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD S TYSMSSTL T L TKDE YERfíN SYTCEA THKT 201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 173)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:

1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA

51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA

101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC

151 ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC

201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG

251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG

301 GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CITCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID

NO: 174)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:

1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVSISCRASQDIS

51 NVLNWYQQKP DGTFKLLEFY TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTTYNLEQ

101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA

151 SWCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT

201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:175)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG

51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT

101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC

151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT

201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG

251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATITACAA CCTGGAGCAA

301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC1TCCGTACAC

351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA

401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC

451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA

501 GTGGAAQATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA

551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG

601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC

651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT

701 GT (SEQ ID NO: 176)

Cadena Pesada de Ab-9

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:

1 EVQLQQSGPE LMKPGTSVKM SCKASGYTFT DYNMgWVKQT QGKTLEWIGE 51 INPNséGAW NQKPKGM TL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAKL^

101IYDDIYDD5YYP DVWGAGTTVT VSSAKTTAPS VYPLAPVCGD TTGSSVTLGC

151LVKGYFPEPV TLTWNSGSLSSDVHTFPALL QSGLYTLSSS VTVTTWPSQT

201 ITCNVáHPAS STKVDKKIEP RGSPTHKPCP PCPAPNLLGG PSVFIFPPK1

251KDVLMISLSPMVTCVWDVSEDDPDVHVSWFVNNVEVHTA QTQTHREDYN

^{J fL -fi S} .s. |^l_^b- SOI STIR WSÁLP IQffQD WMSGK EFKCKVNNKA IPAPIER TIS KPKGP VRAPQ

351 VYVLPPPEEE MTKKQVTLTC MITDFMPEDIYVEWTNNGQT ELNYKNTEPV

401LDSDGSYFMYSKLR VEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHT TKSFSRTPGK

(SEQ ID NO: 177)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:

1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGACTTC

51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATC^ACT GACTACAACA

101 TGCACTGGGT GAAGCAGACC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA

151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC

251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAAATTGGGC

301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC

351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACAAC AGCCCCATCG GTCTATCCAC

401 TGGCCCCTGT GTGTGGAGAT ACAACTGGCT CCTCGGTGAC TCTAGGATGC

451 CTGGTCAAGG GTTATTTCCC TGAGCCAGTG ACCTTGACCT GGAACTCTGG

501 ATCCCTGTCC AGTGATGTGC ACACCTTCCC AGCTCTCCTG CAGTCTGGCC

551 TCTACACCCT CAGCAGCTCA GTGACTGTAA CCACCTGGCC CAGCCAGACC

601 ATCACCTGCA ATGTGGCCCA CCCGGCAAGC AGCACCAAAG TGGACAAGAA

651 AATTGAGCCC AGAGGGTCCC CAACACATAA ACCCTGTCCT CCATGCCCAG

701 CTCCTAACCT CTTGGGTGGA CCATCCGTCT TCATCTTCCC TCCAAAGATC

751 AAGGATGTAC TCATGATCTC CCTGAGCCCC ATGGTCACGT GTGTGGTGGT

801 GGATGTGAGC GAGGATGACC CAGATGTCCA TGTCAGCTGG TTCGTGAACA

851 ACGTGGAAGT ACACACAGCT CAGACACAAA CCCATAGAGA GGATTACAAC

901 AGTACTATCC GGGTGGTCAG TGCCCTCCCC ATCCAGCACC AGGACTGGAT

951 GAGTGGCAAG GAGTTCAAAT GCAAGGTCAA CAACAAAGCC CTCCCAGCGC

1001 CCATCGAGAG AACCATCTCA AAACCCAAAG GGCCAGTAAG AGCTCCACAG

1051 GTATATGTCT TGCCTCCACC AGAAGAAGAG ATGACTAAGA AACAGGTCAC

1101 TCTGACCTGC ATGATCACAG ACTTCATGCC TGAAGACATT TACGTGGAGT 1

1151 GGACCAACAA CGGGCAAACA GAGCTAAACT ACAAGAACAC TGAACCAGTC

1201 CTGGACTCTG ATGGTTCTTA CTTCATGTAC AGCAAGCTGA GAGTGGAAAA

1251 GAAGAACTGG GTGGAAAGAA ATAGCTACTC CTGTTCAGTG GTCCACGAGG

1301 GTCTGCACAA TCACCACACG ACTAAG AGCT TCTCCCGGAC TCCGGGTAAA

(SEQ ÍDNO:178)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGTSVKMS CKASGYTFTD

51 YNMHWVKQTQ GKTLEWIGE1NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM

101 ELRSLTSEDS AVYYCAKLGY DDTYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTAPSV

151 YPLAPVCGDT TGSSVTLGCL VKGYFPEPVT LTWNSGSLSS DVHTFPALLQ

201 SGLYTLSSSV TVTTWPSQT1TCNVAHPASS TKVDKKIEPR GSPTHKPCPP

251 CPAFNLLGGP SVFTFPPKIK DVLMISLSPM VTCVWDVSE DDPPVHVSWF

301 VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS T1RWSALPIQHQDWMSGKE FKCKVNNKAL

351 PAPffiRTISK PKGPVRAPQV YVLPPPEEEM TKKQVTLTCMITDFMPEDIY

401 VEWTNNGQTE LNYKNTEPVL DSDGSYFMYS KLRVEKKNWV ERNSYSCSW

451 HEGLHNHHTT KSFSRTPGK (SEO ID NO: 179)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG

101 GGACTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC

151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGAT

201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA

251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG

301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAA

351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG

401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACAACAGC CCCATCGGTC

451 TATCCACTGG CCCCTGTGTG TGGAGATACA ACTGGCTCCT CGGTGACTCT

501 AGGATGCCTG GTCAAGGGTT ATTTCCCTGA GCCAGTGACC TTGACCTGGA

551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGT GATGTGCACA CCTTCCCAGC TCTCCIGCAG

601 TCTGGCCTCT ACACCCTCAG CAGCTCAGTG ACTGTAACCA CCTGGCCCAG

651 CCAGACCATC ACCTGCAATG TGGCCCACCC GGCAAGCAGC ACCAAAGTGG

701 ACAAGAAAAT TGAGCCCAGA GGGTCCCCAA CACATAAACC CTGTCCTCCA

751 TGCCCAGCTC CTAACCTCTT GGGTGGACCA TCCGTCTTCA TCTTCCCTCC

SOI AAAGATCAAG GATGTACTCA TGATCTCCCT GAGCCCCATG GTCACGTGTG

851 TGGTGGTGGA TGTGAGCGAG GATGACCCAG ATGTCCATGT CAGCTGGTTC

901 GTGAACAACG TGGAAGTACA CACAGCTCAG ACACAAACCC ATAGAGAGGA

951 TTACAACAGT ACTATCCGGG TGGTCAGTGC CCTCCCCATC CAGCACCAGG

1001ACTGGATGAG TGGCAAGGAG TTCAAATGCA AGGTCAACAA CAAAGCCCTC

1051 CCAGCGCCCA TCGAGAGAAC CATCTCAAAA CCCAAAGGGC CAGTAAGAGC

1101 TCCACAGGTA TATGTCTTGC CTCCACCAGA AGAAGAGATG ACTAAGAAAC

1151 AGGTCACTCT GACCTGCATG ATCACAGACT TCATGCCTGA AGACAnTAC

1201 GTGGAGTGGA CCAACAACGG GCAAACAGAG CTAAACTACA AGAACACTGA

1251 ACCAGTCCTG GACTCTGATG GTTCTTACTT CATGTACAGC AAGCTGAGAG

1301 TGGAAAAGAA GAACTGGGTG GAAAGAAATA GCTACTCCTG TTCAGTGGTC

1351 CACGAGGGTC TGCACAATCA CCACACGACT AAGAGCTTCT CCCGGACTCC

1401 GGGTAAA (SEQ ID NO:1SO)

Ab-10

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 10 (también denominado en el presente documento Ab-10) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-10

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-10:

1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRAS^ DIS jWÍttWYQQKP DGTFKLLLFf/

51 >Í|£U|GVPS RFSGSGSGTD YSLTÍYNLEQ EDFÁTYFC^GDILKr^FGG

101 GTKLEIKKAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA SWCFLNNFYPKDÍNVKWKI

151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA THKT

201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 181)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-10:

1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA

51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA

101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC

151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC

201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATnTG

251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG

301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID

NO: 182)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-10 incluyendo el péptido señal:

1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVSISCRASQDIS

5 1 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTTYNLEQ

101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEEKRAD AAPP/SIFPL SSEQLTSGGA

151 SWCFLNNFY PKDINVKWK1DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT

201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPTVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 183)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GmTCAAGG

51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT

101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC

151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT

201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG

251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA

301 GAAGATnTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC nCCGTACAC

351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA

401 CTGTATCCAT CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGnAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCnGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA

501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA

551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG

601 nGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC

651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATOTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT

701 GnAG (SEQ ID NO: 184)

Cadena Pesada de Ab-10

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:

1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYN&1PÍWVK.QN QGKTLEWIGÉ

51 íÍNPMGG^AGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLq 101 YpplYDÍJW^pVfWGAGTTVT VS&AKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC

151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLSSGVHTFPA VL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS

201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKK1VPRDCGCKPCICTVPEVSSV FIFPPKPKDV

251 LT1TLTPKVTCWVD1SKDD PEVQFSWFVD DVEVJÍTAOTQ PREEQFNSTF

301 RSVSELPIM1IQDWLNGKEFR CRVNSAAFPA PIEKT1SKTKGRPKAPQVYT

351 1PPPKEQMAKDKVSLTCM1TDFFPED1TVE WQWNGQPAEN YKNl'QPIMDT

401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID

NO: 185)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:

1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC

51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA

101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAATG GATAGGAGAA

151 ATfAÁTCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC

251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC

301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC

351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC

401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATQGTGAC CCTGGGATGC

451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG

501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC

551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC

601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA

651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG

701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG

751 CI'CACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG

801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG

851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTITC

901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA

951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC

1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG

1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA

1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA

1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG

1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA

1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID

NO: 186)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-10 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD

51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM

101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV

151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ

201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI

251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD

301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAPPAP

351 IEKTISKTKG RPKAPQVYT1PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW

401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYHYSKJLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG

451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 187)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG

101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC

151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAATGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG

301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG

401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGÁCACC CCCATCTGTC

451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT

501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA

551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG

601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG

651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA

701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA

751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA

801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG

851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT

901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG

951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA

1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC

1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT

1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC

1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG

1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT

1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA

1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC

1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG

1401 A (SEQ IDNO:l88)

Ab-11

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 11 (también denominado en el presente documento Ab-11) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-11

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-11:

1 QIVLSQSPAF LSVSPGDKVT MTCRpSSISY1HWFQQKPG SSPRSWlTÁ'íl

51 SNÉA^GVPGR FSGSGSGTSY SLTÍSRVEAE DAATYYC^W 'SSDPLIPGAG

101 T K L E L K U !)^ APTVSIFPPS SEQL TSGGAS WCFLNNFYP KDim'KWKLD

151 GSERQNGVLNSWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS

201 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ID NO: 189)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-11:

1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCATTC CTGTCTGTAT CTCCAGGGGA

51 TAAGGTCÁCA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT

101 GGTTTCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA GATCCTGGAT TTATGCCACA

151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGGTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG

201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAG GATGCTGCCA

251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG

301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT

351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT

401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT

451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG

501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG

551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA

601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID

NO: 190)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:

1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AFLSVSPGDK VTMTCRASSS

sTlISYníWFQQiTPGSSPRSWIY ATSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTISRVE

101 AEDAATYYCQ QWSSDPLT7G AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG

151 ASWCFLNNF YPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL

201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO: 191)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-11 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT

51 CATAATGTCC AGAGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCATTCCTGT

101 CTGTATCTCC AGGGGATAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT

151 ATAAGTTACA TACACTGGTT TCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAGATC

201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCITC TGGAGTCCCT GGTCGCTTCA

251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG

301 GCTGAGGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT

351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC

401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT

451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT

501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT

551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC

601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGG

651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG

701 AGTGTTAG (SEQ ID NO: 192)

Cadena Pesada de Ab-11

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:

1 EVQLQQSGAD LVQPGASVKV SCTASGFDIK Dr&HWMKQR PDQGLEWIGR

51 VDPDÑ6ETÉF APKFPGKATF TTDTSSNTAY LQLRGLTSED TAIYYCGRED '

101 YIXjT^TWEBY WGQGTLVTVS AAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV

151KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPA VLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET

201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKDVLT

251ITLTPKVTCV WDISKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTOPR EEQFNSTFRS

301 VSELPIMHOD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKTISKTKGR PKAPQVYTIP

351PPKEOMAKDK VSLTCM1TDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYKNTQPIMDTDG

401SYFIYSKLNV QKSNWEAGNTFTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID

NO: 193)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:

1 GAAGTTCAGC TGCAACAGTC TGGGGCAGAC CTTGTGCAGC CAGGGGCCTC

51 AGTCAAGGTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CGACATTAAG GACTACTATA

101 TACACTGGAT GAAACAGAGG CCTGACCAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG

151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA

201 GGCCACTTTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACÁGCCTAC CTACAACTCA

251 GAGGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTACTGTGG GAGAGAAGAC

301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT

351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC

401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC

451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT

501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA

551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC

601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA

651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG

701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC

751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA

801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA

851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA

901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT

951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCnTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA

1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA

1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT

1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC

1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC

1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC

1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC

1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ ID NO: 194)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:

1 MKCSWVffFL MAWTGVNSE VQLQQSGADL VQPGASVKVS CTASGFDKD

51 YY1HWMKQRP DQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKATFT TDTSSNTAYL

101 QLRGLTSEDT AIYYCGREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP

151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD

201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT

251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCW VDISKDDPEV QFSWFVDDVE

301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPEE

351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMTTDFF PEDITVEWQW

401 NGQPAENYKN TQPMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH

451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO: 195)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-11 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT

51 CAATTCAGAA GTTCAGCTGC AACAGTCTGG GGCAGACCTT GTGCAGCCAG

101 GGGCCTCAGT CAAGGTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCGA CATTAAGGAC

151 TACTATATAC ACTGGATGAA ACAGAGGCCT GACCAGGGCC TGGAGTGGAT

201 TGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC

251 CGGGCAAGGC CACTTTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA

301 CAACTCAGAG GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ACTGTGGGAG

351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA

401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA

451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG

501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG

551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC

601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG

651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG

701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA

751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT

801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA

851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG

901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT

951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA

1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG

105 Í^AAÁACCÁTCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC

1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT

1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG

1201AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC

1251AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT

1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC

1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID

NO:196)

Ab-12

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 12 (también denominado en el presente documento Ab-12) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-12:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-12:

1 DLqMTQTTSS LSASLGDRVT ISCÍ^ SQPÍS ÑY Í^WYQQKP DGTVKLLIF^

51 f^STDC^GVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLÉQ D D A A TYFC ^O T’lÉPYTFGG

101 GTKLEIK&4Í) AAPTVSIFPP SSEOLTSGGA SWCFLNNFYPKDUSVKWK1

151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT

201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 197)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-12:

1 GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA

51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA

101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT GATCTTCTAC

151 ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGjGTTCAGTG GCAGTGGGTC

201 TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA GATGATQCTG

251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG

301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT

351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTrAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT

401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT

451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA

501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG

551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA

601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID

NO: 198)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-12 incluyendo el péptido señal:

1 MMSSAQFLGL LLLCFQGSRC DLQMTQTTSS LSASLGDRVTISCRASQDIS

51 NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN YSLTTTNLEQ

101 DDAATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA

151 SWCFLNNFY PKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT

201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 199)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG

51 TTCCAGATGT GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT

101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC

~151 AATTATTTÁÁ ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT

201 GATCTTCTAC ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG

251 GCAGTGGGTC TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA

301 GATGATGCTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC

351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA

401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC

451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA

501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA

551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG

601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC

651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT

701 GTTAG (SEQ ID NO:200) .

Cadena Pesada de Ab-12

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:

1 EVQLQQSGPE l m k p g a s v k m s c k a s g y t f t d y n m h w m k q n q g k s l e w ig e

51 JÑPNS^GSGY'^QKFK.G'KATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARLC?

íoi Yi¿G $Ym w Y¥ ^dV ^{w g a g t t v t} vssakttpps vyplapgsaa qtnsm vtlgc 151L VKGYFPEPVTVfWNSGSLS SGVHTFPA VL OSDL YTLSSS VTVPSSTWPS

201ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC1CTVPEVSSVFIFPPKPKDV

251 LTITLTPKVTCVWDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTO PREEOFNSTF

301 RSVSELPIME ODWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPOVYT

351IPPPKEOMAE DKVSLTCMTTDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTOPIMDT

401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEA G NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID

NO:201)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:

i g a g g t c c a g t t g c a a c a g t c t g g a c c t g a a c t a a t g a a g c c t g g g g c t t c 51 a g t g a a g a t g t c c t g c a a g g c t t c t g g a t a c a c a t t c a c t g a c t a c a a c a

101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAG

151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TTCTGGTTAC AACCAGAAGT TCAAAGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC

251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC

301 TACTATGGTA ACTACGAGGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC

351 CACGGTCACC GTCTCCTCTG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC

401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC

451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG

501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC

551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC

601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA

651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG

701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG

751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG

801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG

851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC

901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA

951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC

1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG

1101 CATGATAACÁ GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA

1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA

1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG

1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACArGAG GGCCTGCACA

1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID

NO:202)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-12 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSWTFLFL LSGTSGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD

51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM

101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY YGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAK1TPPSV

151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ

201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI

251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL HTLTPKVTC VWDISKDDP EVQFSWFVDD

301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP

351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMTID FFPEDITVEW

401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG

451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ED NO.203)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTTCGGGTGT

51 CCTCTCTGAG GTCCAGTTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG

101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC

151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT

201 AGGAGAGATT AATCCTAACA GTGGTGGTTC TGGTTACAAC CAGAAGITCA

251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGCAC AGCCTACATG

301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATTGGGCTAC TATGGTAACT ACGAGGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG

401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCTGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC

451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT

501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA

551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG

601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG

651 GCCCAGCGAG ACCQTCACCT GCAACGTTGC CCA CCCGGCC AGCAGCACCA

701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA

751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA

801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG

851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT

901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG

951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA

1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC

1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT

1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC

1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG

1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT

1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA

1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC

1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG

1401 A (SEQ ID NO:204)

Ab-13

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 13 (también denominado en el presente documento Ab-13) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-13

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-13:

1 Q1VLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVT SSYLNWYQQK PGSSPKLWIY

511STSNLASGVP ARFSGSGSGT SYSLÍISSVE ÁEDÁATYYCQ QYDFFPSTFG

101 GGIÍKLEIIÜL4 DAAPTVSIFP PSSEOLTSGGASWCFLNNF YPKDIÑVEWK

151WGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTL TLTKDEYERH NSYTCEATHK

201 TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ED NO:205)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-13:

1 CAGATTGTTC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA

51 GAAGGTCACC ATGACCTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAACT TCCAGTTACT

101 TGAACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCTT CCCCCAAACT CTGGATTTAT

151 AGCACATCCA ACCTGGCITC AGGAGTCCCA GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG

201 GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGTGTGGAG GCTGAGGATG

251 CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTATGATT TTTTCCCATC GACGTTCGGT

301 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC

351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG

401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG

451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA

501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA

551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG

601 ACATCAACTT CACCCATCGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGT (SEQ ID

NO:206)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:

1 MDSQVQIFSF LUSALVKMS RGQIYLTQSP AIMSASPGEK VTMTCRASSS

51 VTSSYLNWYQ QKPGSSPKLWIYSTSNLASG VPARFSGSGS GTSYSLTISS

101 VEAEDAATYY CQQYDFFPST FGGGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTS

151 GGASWCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS

201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NO:207)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGATTCTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTTCTAATCA GTGCCTTAGT

51 CAAAATGTCC AGAGGACAGA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT

101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCAAGT

151 GTAACTTCCA GTTACTTGAA CTGGTACCAG CAGAAGCCAG GATCTTCCCC

201 CAAACTCTGG ATTTATAGCA CATCCAACCT GGCTTCAGGA GTCCCAGCTC

251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGT

301 GTGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGCCAGCAGT ATGATTTTTT

351 CCCATCGACG TTCGGTGGAG GCACCAAGCT GGAAATCAAG CGGGCTGATG

401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT

451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT

501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA

' 551 A ¿A (jfT(j £ t AC"TÓÁTCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC

601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG

651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATCGTCAAG AGCTTCAACA

701 GGAATGAOTG T (SEQ ID NO:208)

Cadena Pesada de Ab-13

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:

1 EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT DYYMÑWVKQS HGESLEWIGp¡ 51 INPYNDDTTY tíHfcPKGJCATL TVDKSSNTAY MQLNSLTSED SAVYYCARET

101 AW TO ÁM D Y WGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQT NSMVTLGCL V

151KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VBTFPA VLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKKTVPRDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKDVLT 251ITLTPKVTCV WD1SKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKT1SKTKGR PKAPQVYT1P

351PPKEQMAKDK VSLTCMTTDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG

401SYFIYSKLNV QKSNWEA GNT FTCSVLHEGL HNHI1TEKSLS HSPGK (SEQ ID

NO:209)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:

1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCTTC

51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACTACA

101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGAGAGA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT

151 ATTAATCCTT ACAACGATGA TACTACCTAC AACCACAAGT TCAAGGGCAA

201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAA CACAGCCTAC ATGCAGCTCA

251 ACAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGAGACG

301 GCCGTTATTA CTACGAATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT

351 CACCGTCTCC TCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC

401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC

451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT

501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA

551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC

601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA

651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG

701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC

751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA

801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA

851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA

901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT

951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCnTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA

1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA

1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT

1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC

1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC

1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC

1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC

1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAA (SEQ ID NO:210)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:

1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTD

51 YYMNWVKQSH GESLEWIGDINPYNDDTTYN HKFKGKATLT VDKSSNTAYM

101 QLNSLTSEDS AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTSVTVSS AK1TPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKTVPR DCGCKPCICT

251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCW VDISKDDPEV QFSWFVDDVE

301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPLMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KT1SKTKGRP KAPQVYTEPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO:211)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT

51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG

101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC

151 TACTACATGA ACTGGGTGAA GC AGAGCCAT GGAGAGAGCC TTGAGTGGAT

201 TGGAGATATT AATCCTTACA ACGATGATAC TACCTACAAC CACAAGTTCA

251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG

301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG

351 AGAGACGGCC GTTATTACTA CGAATGCTAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA

401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA

451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG

501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG

551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC

601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG

651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG

701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA

751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CITCATCTrC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT

801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA

851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG

901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT’

951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA

1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CnTCCCTGC CCCCATCGAG

1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC

1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT

1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG

1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC

1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT

1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC

1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AA (SEQ ID

NO:212)

Ab-13 se humanizó para generar Ab-14.

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 14 (también denominado en el presente documento Ab-14) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-14

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-14:

1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT rrCRASSSVT SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY

51 SÍSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYDFFPSTFG

101 GGTKVEIKffJ VAAPSVF1FP PSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQ RK

1SI VDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQ

201 GLSSPVTKSF NFGEC (SEQ ID NO:213)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-14:

1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA

51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC

101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC

151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG

201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT

251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA

301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAGCGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT

351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG

401 TGTGCCTGCT GAATAACITC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG

451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA

501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA

551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG

601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID

NO:214)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:

1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VOTCRASSS

51 VTSSYLNWYQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASG VPSRFSGSGS GTEFTLTISS

101 LQPEDFATYY CQQYDFFPST FGGGTKVEDC RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS

151 GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS

201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:215)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-14 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGCTGAC CCAGAGCCCC AGCTTCCTTT 101 CCGCATCCGT TGGTGACCGA GTAACAATCA CATGCCGCGC CTCATCTTCA 151 GTTACATCTT CTTATCTTAA TTGGTATCAA CAAAAACCAG GAAAAGCACC 201 TAAACTTCTT ATATACTCTA CATCTAATCT CGCATCAGGA GTTCCCTCTC 251 GATTTTCAGG ATCTGGATCA GGCACAGAATITACACTTAC TATATCATCA 301 CTCCAACCAG AAGACTTCGC CACTTATTAC TGCCAACAAT ACGATTTTTT 351 TCCAAGCACA TTCGGAGGAG GTACAAAAGT AGAAATCAAG CGTACGGTGG 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAA G TCTACGCCTG 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 701 GGGGAGAGTQ T (SEQ ID NO:216)

Cadena Pesada de Ab-14

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14 sin lisina carboxilo-terminal:

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT pYYMÑWVRQA PGQRLEWMGDj

51 TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET

101 ÁW lttAM Q Yw G Q G rrVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCÍV

151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQ

201 TYrCNVDHKP SN1KVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT

251 LMSRTPEVT CVWDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTF

301 RW SVLTW H QDWLNGKEYE CKVSNKGLPA PIEKT1SKTK GQPREPOVYT

351 LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSD1A VE WESNGOPENN YKTTPPMLDS

401 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE.4LHNHYTQESLSLSPG (SEQ ID

NO:393)

Secuencia de ácido de nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14:

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG

51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTAC A

101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC

151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG

201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT

251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT

301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT

351 TACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC CCCCTGGCGC

401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC

451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT

501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT

551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG

601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA

651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC

701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGAC ACC

751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG

801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG

851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC

901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA

951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC G AGAACC AC A GGTGTACACC

1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG

1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA

1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC

1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG

1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA

1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ID

NO:218)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:

1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD

51 YYMNWVRQAP GQRLEWMGDINPYNDDTTYK HKFKGRVTIT RDTSASTAYM

101 ELSSLRSEDT AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP

151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS

201 G LYSLSSW T VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP

251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVQFNWYVDG

301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR W SV LTW H Q DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP

3 51 IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW

401 ESNGQPENNY KTTTPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA

451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID N 0:219)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-14 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC

51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTC AAG AAACCTG

101 GAGCAAGCGT AAAGGTTAGT TGCAAAGCAT CTGGATACAC ATTTACCGAC

151 TACTACATGA ATTGGGTACG ACAAGCCCCT GGACAAAGAC TTGAATGGAT

201 GGGAGACATT AACCCTTATA ACGACGACAC TACATACAAT CATAAATTTA

251 AAGGAAGAGT TACAATTACA AGAGATACAT CCGCATCAAC CGCCTATATG

301 GAACTTTCCT CATTGAGATC TGAAGACACT GCTGTTTATT ACTGTGCAAG

351 AGAAACTGCC GTTATTACTA CTAACGCTAT GGATTACTGG GGTCAAGGAA

401 CCACTGTTAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCg

451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG

501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG

551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA

601 GGACTCTACT CCCTCAGGAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG

651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG

701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA

751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA

801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG

851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC

901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG

951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA

1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC

1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCQAG AACCACAGGT

1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC

1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGAC ATCGC CGTGGAGTGG

1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT

1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA

1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT

1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA

(SEQ IDNO.-220)

Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-14 son:

CDR-H1: DYYMN (SEQ ID NO: 296)

CDR-H2: DINPYNDDITYNHKFKG (SEQ ID NO: 297)

CDR-H3: ETAVITTNAMD (SEQ ID NO: 298)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-14 son:

CDR-L1: RASSSVTSSYLN (SEQ ID NO: 284)

CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID NO: 285)

CDR-L3: QQYDFFPST (SEQ ID NO: 286)

Dominios variables de Ab-14

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):

101 GGTKVEIK (SEQ ID NO:380)

Secuencia de ADN del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):

1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA

51 ccgagtaaca ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA tcttcttatc

101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC

151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG

201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT

251 TCGCCACrrA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA 301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAG (SEQ ID NO:381)

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):

Secuencia de ADN del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG

51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GAQTACTACA

101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC

151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG

201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT

251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT

301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT

351 TACCGTCTCT AGT (SEQ ID NO:383)

Ab-3 se humanizó para generar Ab-15.

Ab-15

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 15 (también denominado en el presente documento Ab-15) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-15:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT rTCSVSSITS SÑHLHWFQQK PGKAPKSUY

51 jGTSNEÁSGVP SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFÁTYYC ^{j^}Q^SSYPLTTG

101 GGTKVEIOJ VAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKÍ/QWK

151 VDNALOSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEl'THO 201 GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:221)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:

1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA

51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC

101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC

151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG

201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT

251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC

301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAACGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT

351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG

401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG

451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTQ TCACAGAGCA

501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA

551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATQAG

601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID

NO:222)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:

1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSVSST

51ISSNHLHWFQ QKPGKAPKSLIYGTSNLASG VPSRFSGSGS GTDFTLT1SS

101 LQPEDFATYY CQQWSSYPLT FGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS

151 GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNAEQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS

201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:223)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-15 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT

51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT

ToT ^{CAGCATCCGT AGGCGATAGA GTTACAATAA CATGCAGCGT ATCATCAACT}

151 ATATCATCAA ATCATCTTCA TTGGTTCCAA CAGAAACCCG GCAAAGCACC

201 TAAATCACTT ATATACGGCA CATCAAATCT CGCATCAGGC GTTCCTTCAA

251 GATTTTCAGG CTCTGGCTCA GGCACCGACT TTACTCTTAC AATATCCTCC

301 CTCCAACCCG AAGACTTCGC AACCTATTAC TGTCAACAAT GGTCCTCATA

351 TCCACTCACA TTTGGCGGCG GCACAAAAGT AGAAATTAAA CGTACGGTGG

401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT

451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC

501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG

551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC

601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAQ AAACACAAAG TCTACGCCTG

651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA

701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID NO:224)

Cadena Pesada de Ab-15

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15:

l EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK pT^O^WVRQA PGQGLEWIGR

51 fePEÑ ^T L/D PK FQ D K V T M TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAJRkS 101 DYEHDGTSYW ^{y f d v w g r g t l} v rv s s ¿ S 7 ff(7 PSWPLAPCS r st se st a a l

151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSWTVPSSN

201 FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK

251 PKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVBNAKTKPREEQF

301NSTFRWSVL TVVFÍQDWLNGKEYKCKVSNK GLPAP1EKT1SKTKGQPREP

351 QVYTLPPSRE EMTKNO VSL T CL VEGFYPSD1A VEWESNGQ PENNYKTTPP

401MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG

451K (SEQ ID NO:225)

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15 sin lisina carboxilo-terminal:

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLgWVRQA PGQGLEWIGR^ 51 ^PENGDTLY DPKF^E^KVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREÁi

101 D ^ ^ D G T S W 'Y F D W G R G T L VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL

151 GCLVKDYFPEPVi'VSWNSGA LTSGVFITFPA VLQSSGLYSL SSWTVPSSN

201 FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK

251 PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVQFN WYl'DGVEl'HN AKTKPREEQF

301 NSTFRWSVL TWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP1EKTISKTKGQPREP

351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD1AVEWESNGQ PENNYKTTPP

401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG

451 (SEQ ED NQ:394)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15:

51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC

101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG

151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA

201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA

251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG

301 GATTAnTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG

351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGTGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT

401 TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG

451 GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA

501 CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTACAGT

551 CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC

601 TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC

651 CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATQ TTGTGTCGAG TGCCCACCGT

701 GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA

751 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CGTGCGTGGT

801 GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC TGGTACGTGG

851 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC

901 AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG

951 GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG

1001 CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA

1051 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT

1101 CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC ATCGCCGTGG

1151 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC

1201 ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA

1251 CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG

1301 AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT

1351 AAA(SEQÍDNO:226)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:

1 MPWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASDFNIKD

51 FYLHWVRQA? GQGLEWIGRIDPENGDTLYD PKFQDKVTMT TDTSTSTAYM

101 ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFHDGTSYWY FDVWGRGTLV TVSSASTKGP

151 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAE TSGVHTFPAV

201 LQSSGLYSLS SWTVPSSNF GTQTYTCNVP HKPSNTKVDK TVERKCCVEC

251 PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KJDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVQFNW

301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRWSVLT WHQDWLNGK EYKCKVSNKG

351 LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSRJEE MTKNQVSETC LVKGFYPSDI

401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV

451 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NQ:227)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-15 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC

51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG .AAGAAGCCTG

101 GGGCCTCAGTGAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC

151 TTCTATCTAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT

201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCC

251 AGGACAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT CCACCAGCAC AGCCTACATG

301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG

351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT

401 GGGGCCGTGG CACCCTGGTC ACCGTCTCTA GTGCCTCCAC CAAGGGCCCA

451 TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAGCACAGC

501 GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT

551 CGTGGAACTC AGGCGCTCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCAGCTGTC

601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC

651 CAGCAACTTC GGCACCCAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA

701 GCAACACCAA GGTGGACAAG ACAGTTGAGC GCAAATGTTG TGTCGAGTGC

751 CCACCGTGCC CAGCACCACC TGTGGCAGGA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC

801 CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT

851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG

901 TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CACGGGAGGA

951 GCAGTTCAAC AGCACGTTCC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTTGTGCACC

1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC

1051 CTCCCAGCCC CCAT£GAGAA AACCATCTCC AAAACCAAAG GGCAGCCCCG

1101 AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGGAGGAG ATGACCAAGA

1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC

1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAQAACAACT ACAAGACCAC

1251 ACCTCCCATG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAAGCTCA

1301 CCQTGGACAA GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG

1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC

1401 TCCGGGTAAA (SEQ ED NO:228)

Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-15 son:

CDR-H1: DFYLH (SEQ ID NO: 290)

CDR-H2: REDPENGDTLYDPKFQD (SEQ ID NO: 291)

CDR-H3: EADYFHDGTSYWYFDV (SEQ ID NO: 292)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-15 son:

CDR-L1: SVSSHSSNHLH (SEQ ID NO: 278)

CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID NO: 279)

CDR-L3: QQWSSYPLT (SEQ ID NO: 280)

Dominios variables de Ab-15

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):

1 QACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA 51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC

101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC

151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG

201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT

251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC

301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAA (SEQ ED NO:385)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC

51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC

101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG

151ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTITATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA

201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA

251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG

301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG

351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGT (SEQ ED NO:387)

Ab-11 se humanizó para generar Ab-16.

Ab-16

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 16 (también denominado en el presente documento Ab-16) son las siguientes:

Cadena Ligera de Ab-16:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:

1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCpSSSÍÍ-Y1HWYQQKPGKAPKLLIYkT

51 SNLA^GVPSR FSGSGSGTEF TITÍS SLQPífDFATYY GGG

lOl fíCVEnCRTO APSVFIFPPSDEQLKSGTAS VVCLLNNFYPREAKVOWKl'D

151NALQSGNSQE SVTEODSKDS TYSLSSTLJL SKADYEKHKV YACEVTHOGL

201SSPVTKSFNR GEC (SEQ ED NO:229)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:

1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA

51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT

101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA

151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG

201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA

251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AQTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG

301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTQ TCTTCATCTT

351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC

401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT

451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG

501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG

551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG

601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID NO:230)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:

1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS

51 ISY1HWYQQK PGKAPKLUY ATSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ

101 PEDFATYYCQ QWSSDPLTFG GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT

151 ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL

201 TLSRADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:231)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-16 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT

51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTTCCTGT

101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT

151 ATAAGTTACA TACACTGGTA TCAGCAAAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT

201 CCTGATCTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGGGTCCCA TCAAGGTTCA

251 GCGGCAGTGG ATCTGGGACA GAATTCACTC TCACAATCAG CAGCCTGCAG

301 CCTGAAGATT TTGCAACTTA TTACTGTCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT

351 CACGTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC

401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT

451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT

501 ACAQTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG

551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG

601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT

651 GACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AA.CAGGGGAG

701 AGTGT (SEQ ID NO:232)

Cadena Pesada de Ab-16

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16:

1 EVQLVQSGAE VKKPOASVKV SCKASGFDKpYY1HWVRQA PGQGLEWIGR:

51 yDPDÑGETEF ÁPKPP<j KVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAEJED,

101 ¡YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV

151KDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQS SGLYSLSSW TVPSSNFGTQ

201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT

251LMJSRTPEVTCWVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF

301 RWSVLTWH QDWLNGKETK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT

351 LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIA VE WESNGQPENN YKTTPPMLDS

401DGSFFLYSKL TVDKSRWQOG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID

NO:233)

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16 sin Usina carboxilo-terminal:

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIKDYYÍHWVRQA PGQGLEWIGR

51 VDPDNGÉTEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARÉD

101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV

151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG IFfTFPA VLQS SGLYSLSSW TVPSSNFGTQ

201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT

251 LMJSRTPEVT CWVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF

301 RWSVLTWH QDWLNGKETK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPOVYT

351 LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIA\E WESNGQPENN YKTTPPMLDS

401 DGSFFLYSKL TVDKSR WQOG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID

NO:395) •

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16:

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC

51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA

101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG

151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA

201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA

251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC

301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT

351 CACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC CCCCTGGCGC

401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC

451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT

501 GACCAGCGGC GTGGACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT

551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG

601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA

651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC

701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC

751 CTCATGATCTCCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG

801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG

851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGQAGQ AGCAGTTCAA CAGCACGTTC

901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CQTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA

951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCC ATCGAGA

1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACQACA GGTGTACACC

1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG

1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA

1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC

1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG

1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA

1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ED

NO:234)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:

1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGFDEKD

51 YY1HWVRQAP GQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKVTMT TDTSISTAYM

101 ELSRLRSDDT AVYYCAREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSS ASTICGPSVFP

151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS

201 GLYSLSSW T VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS MTKVDKTVER KCCVECPPCP

251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVQFNWYVDG

301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR W SVLTW HQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP

351 EEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW

401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA

451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ED NO:235)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-16 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC

51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG

101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATTCGA CATTAAGGAC

151 TACTATATAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT

201 CGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC

251 CGGGCAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG

301 GAGCTGAGCA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG

351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA

401 CTCTGGTCAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCGATC GGTCITCCCC

451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG

501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCQ TGGAACTCAG

551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA

601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG

651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAQC AACACCAAGG

701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA

751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA

801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG

851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC

901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG

951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA

1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC

1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT

1101 GTACACCCTG CCCCQATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC

1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG

1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT

1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA

1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT

1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ

ID NO:236)

Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-16 son:

CDR-H1 DYYIH (SEQ ID NO: 293)

CDR-H2 RVDPDNGETEFAPKFPG (SEQ ID NO: 294)

CDR-H3 EDYDGTYTWFPY (SEQ ID NO: 295)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-16 son:

CDR-L1 RASSSISYIH (SEQ ID NO: 281)

CDR-L2 ATSNLAS (SEQ ID NO: 282)

CDR-L3 QQWSSDPLT (SEQ ID NO: 283)

Dominios variables de Ab-16

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-16 (sin secuencia señal):

1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVTITCRASSSIS YIHjWYQQKPG KAPKLLIYAT

51 'SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTÍSSIQPE DFATYYCQQW SSDPLTFGGG

101IXVÉÍK (SEQ ID NQ:388)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-16 (sin secuencia señal):

1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA

51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACAGT

101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA

151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG

201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA

251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG

301 ACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID NO:389)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SC^SGFDIKDYVjHWVRQA PGQGLEWIGR

51 \®EDNQEXEF APKFPGKVTN1TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR3ED

101 YDGTYT^V^: WGQGTLVTVS S (SEQ ID NO:390)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC

51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA

101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG

151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA

201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA

251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT A TTACTGTGC GAGAGAAGAC

301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT

351 CACCGTCTCT AGT (SEQ ID NO:391)

Los anticuerpos adicionales se denominan en el presente documento Anticuerpos 17-22 (también denominados en el presente documento Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21 y Ab-22). La región constante Kappa para todas las regiones VK de Ab-17, Ab-19 y Ab-21 es la siguiente:

TDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQP

SBCDSTYSMSSTLrLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:323)

La Región Constante Pesada para todas las regiones VH de los anticuerpos, 17, 19 y 21 es la siguiente:

AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLYKGVTPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS

DLYT1^SS\TWSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIF

PPKPKDVLTrrLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRS

VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKD

KVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA

GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:324)

En las siguientes secuencias de aminoácidos de anticuerpos, los aminoácidos sombreados en cajas representan regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los aminoácidos subrayados representan péptidos señal.

Ab-17

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:

m d fo v q ifs f^ isv t v ilssg eiv l t q sp a lm a a sp g ek v t it c Sv ss i^sssn Lh w so o k SGTSPKLWIYlGT^CLXSG VP VRFSGSGSGTS Y SLTT S SMEAED AÁTYY C(^.W TFfYTFG SGTKLELKR (SEQ ID NO:299)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCATGCTAATCAGTGTCACAGTCATATTO

TCCAGTGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCAGGG

GAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAGCTCGAGTATAAGTTCCAGCAACTTACA

CTGGTCCCAGCAGAAGTCAGGAACCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGGCACATCCA

a c c ttg c t t c t g g a g t c c c t g t t c g c t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c c t c t t a t t c t c t c a c a a t c a g c a g c a t g g a g g c t g a a g a t g c t g c c a c it a t t a c t g t c a a c a g t g g a c t a c t a c g t a t a c g t t c g g a t c g g g g a c c a a g c t g g a g c t g a a a c g t (SEQ ED NO:300)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:

a t g g g a t g g a a c tg g a t c a tc ttc ttc c tg a tg g c a g tg g tta c a g g g g tc a a ttc a g a g g tg c a g ttg c g g c a g tc tg g g g c a g a c c ttg tg a a g c c a g g g g c c tc a g tc a a g t t g t c c t g c a c a g c t t c t g g c t t c a a c a t t a a a g a c t a c t a t a t a c a c t g g g t g a a g c a g a g g c c tg a a c a g g g c c tg g a g tg g a ttq g a a g g a ttg a tc c t g a ta a tg g tg a a a g t a c a t a t g t c c c g a a g t t c c a g g g c a a g g c c a c t a t a a c a g c a g a c a c a t c a t c c a a c a c a g c c t a c c t a c a a c t c a g a a g c c t g a c a t c t g a g g a c a c t g c c a t c t a

tta ttg tg g g a g a g a g g g g c tc g a c ta tg g tg a c ta c ta tg c tg tg g a c ta c tg g g GTCAAGGAACCTCGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ IDNO:302)

Ab-17 se humanizó para generar Ab-18.

Ab-18

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:

MDMRVP AQ LLG LLLLWLPG ARCDIOLTO SPSFLS AS V GDR VTITCS VS S SISS SNLHWY O

QKPGW KIiJYGTmASGW SRFSGSGSGTEFaTISSLQPEDFATYYCQQW ITiYI^ GQGTKLEIKR (SEQ ID NO:3Q3)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:

ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCGGG

CGCGCGCTGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGG

GCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAACCTG

CATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAG

CAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAAT

TTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGC

AGTGGACCACCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT(SEQ

ID NO:304)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:

a tg g a ttg g a c c tg g a g c a ttc tg tttc tg g tg g c g g c g c c g a c c g g c g c g c a ta g cg a a g tg ca g ctg g tg ca g a g c g g cg cg g a a g tg a a a a a a c cg g g cg cg a g cg tg a a a g tg a g c tg c a a a g c g a g c g g c ttta a c a tta a a g a tta tta t a ttc a ttg g g t g c g c c a g g c g c c g g g c c a g g g c c tg g a a tg g a tg g g c c g c a ttg a tc c g g a ta a c g GCGAAAGCACCTATGTGCCGAAATrTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACC

AGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGT

GTATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTATTG

GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:306)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):

GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGT

g a c c a t t a c c t g c a g c g tg a g c a g c a g c a tta g c a g c a g c a a c c tg c a ttg q ta tc

AGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAGCAACCTGGCG

AGCGGCGTGCCGAGCCGCTTrAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAATTTACCCTGAC CATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGAmTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGACCA

CCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ ED NO:369)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal):

QG'ILVTVSS (SEQ ID NO:370)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal):

GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA

AAGTG AGCTGC AAAGC G AGCGGCTTTAAC ATTAAAG ATTATTATATTC ATT GGGTG

CGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGATAACGG

CGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCA

GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTG

ta tta ttg c g c g c g c g a a g g c c tg g a tta tg g c g a tta tta tg c g g tg g a tta ttg g GGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ IDNO:371)

Ab-19

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:

ATCGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCT

g a g g tc c a g c tg c a g c a g tc tg g a c c tg a g c tg g ta a a g c c tg g g g c ttc a g tg a a g a tg tc c tg c a a g g c ttc tg g g ttc a c a ttc a c tg a c ta c a tta tg c a c tg g g tg a a g c a g a a g c c tg g g c a g g g c c ttg a g tg g a ttg g a ta ta tta a tc c tta c a a tg a tg a ta c tg a a t a c a a t g a g a a g t t c a a a g g c a a g g c c a c a c t g a c t t c a g a c a a a t c c tc c a g c a c a g c c ta c a tg g a tc tc a g c a g tc tg a c c tc tg a g g g c tc tg c g g tc t a t t a c t g t g c a a g a tc g a ttt a tta c ta c g a tg c c c c g tttg c tta c tg g g g c c a a g g g ACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO:310)

Ab-19 se humanizó para generar el Anticuerpo 20 (también denominado en el presente documento Ab-20) y el Anticuerpo 23 (también denominado en el presente documento Ab-23).

Ab-20

Versión de IgG4

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:

ATOATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGAT

GTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGTG

TCACCATCACTTGCCGCGCAAGTCAGGATATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGC

AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTACTTCCCGTTTGAATAGTG

GGGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA

GCA GTCTGC AACCTG AAGATTTTGC AACTTACTACTGTC AAC AGGATATTAAA CA CC

CTACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGT (SEQ ID NO:312)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:

NffiWIWnTJlJLSGTAGVHSEy(^VOSG^VKKPGSSVKVSCKASGFITTDYIMHWVRO APGQGLE V^^YIÑFVT^DIEYNEKFKGRVTITADKST^ A YMELS SUtSÉDTAVYY C A RÍ5IYYl(T?AffAYWGQGTL VTYS S (SEQ ID NO:313)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAA

GGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTTTACCTTCACCGACTATATTATGCACTGGGTGCG

TCAGGCCCCTGGTCAAGGGCTTGAGTGGATGGGCTATATCAACCCTTATAATGATG

ACACCGAATACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGTGTCACGATTACCGCGGACAAATCC

ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGTGTA

t t a c tg tg c g c q ttc g a ttta tta c ta c g a tg c c c c g tttg c tta c tq g g g c c a a g g GACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO:349)

Ab-23

Versión de IgG2

Cadena Ligera:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT UCÍÍASQDIS Sg3£WYQQKP GKAPKLUY5 51 íTSBÍLlSÍSGVPS RFSGSGSGTD FTXTISSLQP EDFATYYC^Q SÍKHPTFGQG 101 TKVEIKjRTyA A^jPSVFIFPPS DEQ LKSG TAS W C LLN N FYP REAKVOW KVD

151 NALQSGNSQE SVTEQ DSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

20 1 SSPVTK SFN R GEC (SEQ ID NO:341)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:

1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGTGA

51 CCGTGTCACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAA

101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT

151 ACTTCCCGTT TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTC

201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG

251 CAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGC

301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT

351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC

401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT

451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG

501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAQ

551ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG

601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID NO:342)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:

1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD

51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYSTSRLNSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL

101 QPEDFATYYC QQDIKHPTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFEFP PSDEQLKSGT

151 ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL

201ILSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NQ:343)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACATGA GGGTGCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTGTGGCT

51 GAGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT

101 CTGCATCTGT AGGTGACCGT GTCACCATCA CTTGCCGCGC AAGTCAGGAT

151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA

201 GCTCCTGATC TATTCTACTT CCCGTTTGAA TAGTGGGGTC CCATCACGGT

251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG

301 CAACCTQAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGGATA TTAAACACCC

351 TACGTTCGGT CAAGGCACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC

401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT

451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT

501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGG TAACTCC CAGGAGAGTG

551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG

601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT

651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG

701 AGTGT (SEQ ID NO',344)

Cadena Pesada:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:

1 EVQLVQSGAE VKXPGSSVKV SCKASGFTTT DOTHWVRQA PGQGLEWMGY

51 ^ l^ IK E Y 'ív ffiK F K G R V T I TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAtóí

101' YYYDAJPFAYW GQGILVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCL VK

151 b'YFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPA VLOSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT

201 YTCNVDHEPS NTEVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVFLFPPKPKDTL

251MISRTPEVTC VWDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEOFNSTFR

301 ^{W SV L T W H O DW LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT1SKTKG QPREPQVYTL}

351^{PPSREEM TKN Q VSL TCL VKG FYPSDIA VEW ESNG Q PENN Y KTTPPMLDSD}

401 G SFFLYSK LT VDKSRWOOGN VFSCSVM HEA LHNHYTQ KSL SLSPG K (SEQ ID

NO:345)

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23 sin lisina carboxilo-terminal:

1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYEvpJWVRQA PGQGLEWMG^ 51 ^ Y ^ D T ^ Y ^ Í^ K G ÍR V T l TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSl

101 YYYp’APFA YW GQGTLVTVSS ASTKG PSVFP LA PC SR STSE STAALGCL VK

151 D YFP EP V TV S WNSGAL TSGV HTFPA VLQSS G L Y SL SSW T VPSSNFGTQT

201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVA G P SV F LFPPKPKDTL

251 M ISR TPEVTC V W D VSHEDP EVQFNW YVDG VEVHNAKTKP REEQ FNSTFR

301 W SVLTW H Q D W LN G K EYK CK VSN K G LPA P IEK TISK TK G QPREPQVYTL

351 PPSREEM TKN Q VSLTCLVKG FYPSDIA VEW ESNG Q PENN Y KTTPPMLDSD

401 G SFFL Y SK L T VDKSRWQQGN VFSCSVM HEA LH NHYTO KSL SLSPG (SEQ ED

NO:396)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:

1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC

51 GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTA

101 TGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGOCTAT

151 ATCAACCCTT ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCG

201 TGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA

251 GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATT

301 TATTACTACG ATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGA CTCTGGTCAC

351 CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCITCCCC CTGGCGCCCT

401 GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG

451 GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCTCTGAC

501 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT

551 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC

601 TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC

651 AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCQAGTGCCC ACCGTGCCCA GCACCACCTG

701 TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC

751 ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA

801 CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC

851 ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG CACGTTCCGT

901 GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTQCACCAG GACTGGCTGA ACGGCAAGGA

951 GTACAAGTOC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA

1001 CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGQT GTACACCCTG

1051 CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT

1101 ^{g g tca a a g g c t t c t a c c c c a} GCGACATCGC ^{cg tg g ag tg g g a g a g c a a tg} 1151 g g ca g ccg g a g a a c a a c t a c a a g a c c a c a c c tc c c a t g c t g g a c t c c g a c 1201 g g c tc c ttc t tc c t c t a c a g c a a g c t c a c c g tg g a ca a g a g c a g g tg g c a

1251 GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC

1301 ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO:346)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:

1 MDWTWRTLFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKASGFTFTD

51 YTMHWVRQAP GQGLEWMGYINPYNDDTEYN EKFKGRVTIT ADKSTSTAYM

101 ELSSLRSEDT AVYYCARSIY YYDAPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL

151 APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG

201 LYSLSSWTV PSSNFGTQTY TCNVDHKPSN TKVDKTVERK CCVECPPCPA

251 PPVÁGPSVFE FPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSHEDPE VQFNWYVDGV

301 EVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTWHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPAPI

351 EKT1SKTKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE

401 SNGQPENNYK TTPPMiDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQQQNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO:347)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC

51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG

101 GGTCCTCGGT GMGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTTTAC CTTCACCGAC

151 TATATTATGC ACTGGGTGCG TCAGGCCCCT GGTCAAGGGC TTGAGTGGAT

201 GGGCTATATC AACCCTTATA ATGATGACAC CGAATACAAC GAGAAGTTCA

251 AGGGCCGTGT CACGATTACC GCGGACAAAT CCACGAGCAC AGCCTACATG

301 GAGCTGAGCA GCCTGCGCTC TGAGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGCG

351 TTCGATTTAT TACTACGATG CCCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC

401 TGGTCACCGT CTCTAGTGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT CITCCCCCTG

451 GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT

501 GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG

551 CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA

601 CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC

651 CCAGACCTAC ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG

701 ACAAGACAGT TGAGCGCAAA TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCAGCA

751 CCACCTGTGG CAGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA

801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG

851 TGAGCCACGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG

901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCACGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC

951 GTTCCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTTGT GCACCAGGAC TGGCTGAACG

1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC AGCCCCCATC

1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAAC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA

1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA

1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG

1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACACCTC CCATGCTGGA

1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA

1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG

1351 CACAACCACT ACACGCAQAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAA (SEQ ID

NO:348)

Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-23 son las siguientes:

CDR-H1: DYIMH (SEQ ID NO: 269)

CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID NO: 270)

CDR-H3: SIYYYVAPFAY (SEQ ID NO: 271)

Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-23 son:

CDR-L1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 239)

CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID NO: 240)

CDR-L3: QQDIKHPT (SEQ ID NO: 241)

Dominios variables de Ab-23:

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-23 (sin secuencia señal):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCRASQDIS SYLNWYQQKP GKAPKEUYS

TSRENSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ DIKHPTFGQG

nCVEIK (SEQIPNO.-364)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-23 (sin secuencia señal):

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGTGTC

ACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAAATTGGTATCA

GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCTACTTCCCGTT

TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTCTGGGACAGAT '

TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTGCAACTTACTA

CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT GGGTCAAGGCACCAAGGTGG

AGATCAAA (SEQ ID NO.365)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):

EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA

PGQGLEWMGYINPYNDDTEY NEKFKGRVTITADKSTSTAY MELSSLRSED

TAVYYCARSIYYYDAPFAYW GQGTLVTVSS (SEQ ED NQ:366)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAA

GGTC TCCTGCAA GG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTATGCACTGGGT

GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTATATCAACCCTT

ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCGTGTCACGATT

ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGCG

CTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATTTATTACTACG

ATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGT (SEQ ID

NO:367)

Ab-21

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:

M K^OTOVFVYM LL^GVEGDIVMTOSHKFMSTSVGDRVmC^pDWfÁVAWYO QKPGQSPKLlIWASTRITÍClVPDRrrGSGSGTDFILTIS^QSEDLADYlX^Q^SYiPCf FGAGTKLELKR (SEQ fe NO:315)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:

ATGAAGTCACAGACCCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAA

GGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACGTCAGTAGGAGACAG

GGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTCTTTACTGCTGTAGCCTGGTATCA

ACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGAnTACTGGGCATCCACCCGGCACA

CTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA

TTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAACAATATAGCAGCT

ATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID NO:316)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:

ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCA

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAA

GTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAATATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAA

GCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGAATGGTG

ATATTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTATAACAACAGACACATCC

t c c a a c a c a g c c t a c c t g c a g c t c a g c 'a g c c tg a c g t c t g a g g a c a c t g c c g t c t a t

TACTGTGCTTACGATGCTGGTGACCCCGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACT

CTQGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NQ:318)

Ab-21 se humanizó para producir Ab-22.

Ab-22

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:

MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCDIQMTOSPSSLSASVGDRVnTCKASODVFTXVAW YQQKPGKAPKLLIWÁSTRHfiGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSlQPEDFATYYCQQYSSY^ ¡LTFGGGTKVEIKR (SÉQIPNÓ:319)

Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:

ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCGCGG

CGCGCGCTGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGG

GCGATCGCGTGACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTGGCG

TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCAC

CCGCCATACCGGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTA

CCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGT

ATAGCAGCTATCCGCTGACCTrTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ ID NO:320)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:

a tg g a ttg g a c c tg g a g c a ttc tg tttc tg g tg g c g g c g c c g a c c g g c g c g c a ta g c g a a g tg ca g ctg g tg ca g a g c g g cg cg g a a g tg a a a a a a c cg g g cg cg a g cg tg a a a g tg a g c tg c a a a g c g a g c g g c ttta a c a tta a a g a tta tta t a tg c a ttg g g t g c g c c a g g c g c c g g g c c a g g g c c tg g a a tg g a tc g g c c g c a ttg a tc c g g a a a a c g g c g a ta tta ttt a tg a tc c g a a a tttc a g g g c c g c g tg a c c a tg a c c a c c g a ta c c a g c a c c a g c a c c g c g ta t a tg g a a c tg c g c a g c c tg c g c a g c g a tg a ta c c g c g g t g ta tta t tg c g c g ta tg a tg c g g g c g a tc c g g c g tg g ttta c c ta ttg g g g c c a g g g CACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ H) NO:322)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-22 (sin secuencia señal):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCKASQDVF TAVAWYQQKP GKAPKLLTYW

ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLHSSLQP EDFATYYCQQ YSSYPLTFGG

GTKVEDCR (SEQ ID NO:336)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-22 (sin secuencia señal):

GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGT

g a cca tta c c tg c a a a g c g a q c c a g g a tg tg ttta c c g c g g tg g c g tg g ta tc a g c

AGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCACCCGCCATACC

GGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCAT

t a g c a g c c tg c a g c c g g a a g a ttttg g g a c c ta tta ttg c c a g c a g ta ta g c a g c t

ATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ ID NO:337)

Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):

EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNDC DYYMHWVRQA PGQGLEWIGRIDPENGDIIY ^{d pk fq g r v t m t t d t s t st a y m e l r s l r s d d} TAVYY CAYDAGDPAWFTYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO:338)

Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):

GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA

AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCnTAACATTAAAGATTATTATATGCATTGGGTG

CGCCAGGQGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAAAACG

GCGATATTATTTATGATCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCA

GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTG

TATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCQTGGTTTACCTATTGGGGCCAGGGC

ACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:339).

Para Ab-18, Ab-20 y Ab-22, la región constante kappa humana de cadena ligera es la siguiente:

TVAAPSWIFPPSDEQLKSGTASWCIXNNFYPREAKVQWKVDNAIJQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID NO:325)

y la región constante gamma-4 humana de cadena pesada es la siguiente:

ASTKG PS VFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVS WNSG ALTSG VHTFP A VLQS S

GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS

TYRWSVLTVLHQPWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE

MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR

WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (SEQ ID NO:326)

La región bisagra contiene la mutación Ser-241-Pro para mejorar la estabilidad de la bisagra (Angal S et al., (1993), Mol Immunol, 30 (1), 105-108).

Ab-24

Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 24 (también denominado en el presente documento Ab-24) son las siguientes:

Cadena Ligera:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-24:

101 [TFGGGTKLEIKRADAAPTVS1FPPSSEQL T SGGASWCFL NNFYPKDLNV

151 KW'KWGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STL TL TKDEY ERHNSYTCEA

201 THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ IP NO:350)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-24:

1 GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA

51 GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTA

101 CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC

151 CTCATCTATG CIGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG CCAGGTTTAG

201 TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG

251 AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTTC

301 ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG ATGCTGCACC

351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG

401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC

451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG

501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA

551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC

601 ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA

651 GTGTTAG (SEQ ID NO:354)

Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:

1 METDTTLLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LAVSLGQRATIACKASQSVD

51 YDGTSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES EEPARFSGTG SGTDFTLNIH

101 PVEEEDITTY YCQQSNEDPF TFGGGTKLEIKRADAAPTVS EFPPSSEQLT •

151 SGGASWCFL NNFYPKDINV KWKEDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS

201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA 1HKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID NO:355) Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGAGAGAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTrCCAGG

51 CTCCACTGGT GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT

101 CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT

151 TATGATGGTA CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAQCC

201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG

251 CCAGGTTTAG TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT

301 CCTGTGGAGG AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA

351 GGATCCGTTC ACGTTCGGAQ GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG

401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA

451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA

501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC

551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC

601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAAQGACATA ACAGCTATAC

651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA

701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID NO:3S6)

Cadena Pesada de Ab-24:

Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:

1 QVQLQQPGTE LVRPGTSVKL SCKASGYTFT TYWMHWVKQR PGQGLEWIGM

51 ÍHPSASEIRL D Q próX A T L TLDKSSSTAY MHLSGFTSVD SAVYYCARSG“" 101 EWGSMDYWGQ GTSVTVSSAiT TTPPSVYPLA PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY 151 FP EPITVfm SGSISSGVHT FPA VLOSDL Y TLSSSVTVPS STWPSETVTC 201 NVAHPASSTK VDKK1VPRDC GCKPcJdVP EVSSVFIFPP KPKDVLTITL

251 TPKVTCVWD1SKDDPEVQF SWFVDDVEVE TAQTOPREEQ FNSTFRSVSE

301 LPTMHODWLN GEEFKCRVNS AAFPAPIEKTISKTEGRPKA PQVYTIPPPK

351 EOMAKDKVSL TCMITDFFPE D1TVEWQWNG QPAENYKNTQ P1MDTDGSYF

401 IYSKLNVQKS NWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSP GK (SEQ ID NO:357)

Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:

1 CAGGTCCAAC TACAGCAGCC TGGGACTGAG CTGGTGAGGC CTGGAACTTC

51 AGTGAAGTTG TCCTGTAAGG CTTCTGGCTA C ATCTTCACC ACCTACTGGA

101 TGAACTGGGT GAAACAGAGG CCTGGACAAG GCCTTGAGTG GATTGGCATG

151 ATTC ATCCTT CCGCAAGTGA AATTAGGTTG GATCAGAAAT TCAAGGAC AA

201 GGCCACATTG ACTCTTGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAT ATGCACCTCA

251 GCGGCCCGAC ATCTGTGGAT TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGATCAGGG

301 GAATGGGGGT CTATGGACTA CTGGGGTCAA GGAACCTCAG TCACCGTCTC

351 CTCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG

401 CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGCT CAAGGGCTAT

451 TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG

501 TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA

551 GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC

601 AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG QTGGACAAGA AAATTGTGCC

651 CAGGGATTGT GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT

701 CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG

751 ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA

801 GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAQA

851 CQCAACCCCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA

901 CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG

951 GGTCAACAGT GCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA

1001 CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACAQC ATTCC ACCTCCCAAG

1051 GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT

1101 CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG

1151 AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC

1201 ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC

1251 TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA

1301 AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID NO:361)

Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:

1 MGWSSI1LFL VATATGVHSQ VQLQQPGTEL VRPGTSVKLS CKASGYIFTT

51 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMIHPSASEIRLD QKFRDKATLT LDKSSSTAYM

101 HLSGPTSVDS AVYYCARSGE WGSMDYWGQG TSVTVSSAKT TPPSVYPLAP

151 GSAAQTNSMV TLGCLVKGYF PEPVTVTWNS GSLSSGVHTF PAVLQSDLYT

201 LSSSVTVPSS TWPSETVTCN VAHPASSTXV DKKIVPRDCG CKPCICTVPE

251 VSSVFIFPPK PKDVLTITET PKVTCVWDISKDDPEVQFS WFVDDVEVHT

301 AQTQPREEQF NSTFRSVSEL PIMHQDWENG KEFKCRVNSA AFPAPIEKTI

351 SKTKGRPKAP QVYTTPPPKE QM/VKDKVSLT CMITDFFPEDITVEWQWNGQ

401 PAENYKNTQPIMDTDGSYFIYSKLNVQKSN WEAGNTFTCS VLHEGLHNHH

451 TEKSLSHSPG K (SEQ ID NO:362)

Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:

1 ATGGGATGGA GCTCTATCAT CCTCTTCTTG GTAGCAACAG CTACAGGTGT

51 CCACTCCCAG GTCCAACTAC AGCAGCCTGG GACTGAGCTG GTGAGGCCTG

101 GAACTTCAGT GAAQTTGTCC TQTAAGGCTT CTGGCTACAT CTTCACCACC

151 TACTGGATGA ACTGGGTGAA ACAGAGGCCT GGACAAGGCC TTGAGTGGAT

201 TGGCATGATT CATCCTTCCG CAAGTGAAAT TAGGTTGGAT CAGAAATTCA

251 AGGACAAGGC CACATTGACT CTTGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTATATG

301 CACCTCAGCG GCCCGACATC TGTGGATTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG

351 ATCAGGGGAA TGGGGGTCTA TGGACTACTG GGGTCAAGGA ACCTCAGTCA

401 CCGTCTCCTC AGCCAAAACG ACACCCCCAT CTGTCTATCC ACTGGCCCCT

451 GQATCTGCTG CCCAAACTAA CTCCATGGTG ACCCTGGGAT GCCTGGTCAA

501 GGGCTATTTC CCTGAGCCAG TGACAGTGAC CTGGAACTCT GGATCCCTGT

551 CCAGCGGTGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TGCAGTCTGA CCTCTACACT

601 CTGAGCAGCT CAGTGACTGT CCCCTCCAGC ACCTGGCCCA GCGAGACCGT

651 CACCTGCAAC GTTGCCCACC CGGCCAGCAG CACCAAGGTG GACAAGAAAA

701 TTGTGCCCAG GGATTGTGGT TGTAAGCCTT GCATATGTAC AGTCCCAGAA

751 GTATCATCTG TCTTCATCTT CCCCCCAAAG CCCAAGGATG TGCTCACCAT

801 TACTCTGACT CCTAAGGTCA CGTGTGTTGT GGTAG ACATC AGCAAGGATG

851 ATCCCGAGGT CCAGTTCAGC TGGTTTGTAG ATGATGTGGA GGTGCACACA

901 GCTCAGACGC AACCCCGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACTT TCCGCTCAGT

951 CAGTGAACTT CCCATCATGC ACCAGGACTG GCTCAATGGC AAGGAGTTCA

1001 AATGCAGGGT CAACAGTGCA GCTTTCCCTG CCCCCATCGA GAAAACCATC

1051 TCCAAAACCA AAGGCAGAQC GAAGGCTCCA CAGGTGTACA CCATTCCACC

1101 TCCCAAGGAG CAGATGGCCA AGGATAAAGT CAGTCTGACC TGCATGATAA

1151 CAGACTTCTT CCCTGAAGAC ATTACTGTGG AQTGGCAGTG GAATGGGCAG

1201 CCAGCGGAGA ACTACAAGAA CACTCAGCCC ATCATGGACA CAGATGGCTC

1251 TTACTTCATC TACAGCAAGC TCAATGTGCA GAAGAGCAAC TGGGAGGCAG

1301 GAAATACTTT CACCTGCTCT GTGTTACATG AGGGCCTGCA CAACCACCAT

1351 ACTGAGAAGA GCCTCTCCCA CTCTCCTGGT AAATGA (SEQ ID NO:363)

Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena ligera de Ab-24 son las siguientes:

CDR-L1: KASQSVDYDGTSYMN (SEQ ID NO: 351)

CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO: 352)

CDR-L3: QQSNEDPFT (SEQ ID NO: 353)

Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-24 son las siguientes:

CDR-H1: TYWMN (SEQ ID NO: 358)

CDR-H2: MIHPSASEIRLDQKFKD (SEQ ID NO: 359)

CDR-H3: SGEWGSMDY (SEQ ID NO: 360)

La Tabla 1 a continuación proporciona la SEQ ID NO y secuencias de aminoácidos de las CDR de Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24. L1, L2 y L3 se refieren a las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 y H1, H2 y H3 se refieren a las CDR de cadena pesada 1, 2 y 3 de acuerdo con el sistema de numeración Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).

continuación

continuación

Un oligopéptido o polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a al menos una de las CDR de la Tabla 1 anterior; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o está bloqueada de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab 23, y Ab-24; y/o con una CDR de un agente de unión a esclerostina donde el agente de unión puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo de Bucle 2; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo t 20,6; y/o a una c Dr de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo "derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)".

Los polipéptidos y anticuerpos del agente de unión a esclerostina pueden tener secuencias de aminoácidos que son al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o se unen a un epítopo de bucle 2; y/o se unen a un epítopo T20,6; y/o se unen a un epítopo "derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)".

Los polinucleótidos que codifican agentes de unión a esclerostina pueden tener secuencias polinucleotídicas que son al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a un polinucleótido que codifica una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab- 24, y donde los agentes de unión a esclerostina codificados bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o se unen a un epítopo de bucle 2; y/o se unen a un epítopo T20,6; y/o se unen a un epítopo "derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)".

Los anticuerpos pueden tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10'7 M, menos de o igual a 1 x 10'8 M, menos de o igual a 1 x 10'9 M, menos de o igual a 1 x 10'10 M, menos de o igual a 1 x 10'11 M o menos de o igual a 1 x 10 ’12 M.

La afinidad de un agente de unión tal como un anticuerpo o compañero de unión, así como el grado en el que un agente de unión (tal como un anticuerpo) inhibe la unión, puede determinarse por un experto habitual en la materia usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas en Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660-672 (1949)) o por resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para resonancia de plasmón superficial, las moléculas diana se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que se desplaza a lo largo de una celda de flujo. Si se produce unión de ligando con la diana inmovilizada, el índice refractario local cambia, lo que conduce a un cambio en el ángulo de SPR, que puede supervisarse en tiempo real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las tasas de cambio de la señal de SPR pueden analizarse para producir constantes de velocidad aparente para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores proporciona la constante en equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-65 (1993)).

Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA. Puede obtenerse o derivar de un animal, por ejemplo, ave de corral (por ejemplo, pollo) y mamíferos, que incluye, pero sin limitación un ratón, rata, hámster, conejo u otro roedor, vaca, caballo, oveja, cabra, camello, ser humano u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de internalización. La producción de anticuerpos se divulga en general en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2004/0146888 A1.

Ensayos de caracterización

En los métodos descritos anteriormente para generar anticuerpos, incluyendo la manipulación de las CDR de Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Anticuerpo 1-24 (Ab-1 a Ab-24) específicas en nuevas regiones marco conservadas y/o constantes, están disponibles ensayos apropiados para seleccionar los anticuerpos o agentes de unión deseados (es decir, ensayos para determinar la afinidad de unión con esclerostina; ensayos de bloqueo cruzado; "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore; ensayo basado en células MC3T3-E1; ensayos in vivo).

Ensayos de unión de epítopos

La esclerostina humana de forma madura es una glicoproteína de 190 aminoácidos con una estructura de nudo de cistina (Figuras 8 y 9). Además de la estructura en nudo de cistina, la proteína se caracteriza porque tiene tres bucles designados como Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. La esclerostina humana se sometió a digestión proteolítica para producir fragmentos. Brevemente, usando diferentes proteasas, incluyendo tripsina, aspN y lysC, se generaron fragmentos con diversos sitios de escisión y tamaños. Se determinaron las secuencias y la masa para diversos péptidos de esclerostina humana. Se evaluó la protección de anticuerpos para determinar el efecto sobre la accesibilidad para proteólisis, incluyendo el enmascaramiento de sitio cortado y desplazamiento peptídico. Finalmente, se realizó un "ensayo de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en BIAcore.

La exposición de esclerostina a escisión por tripsina dio como resultado un patrón de fragmentos peptídicos como se resumen en la Figura 13. Los fragmentos se denominan T19,2, T20, T20,6 y T21-22. Como se muestra de forma esquemática en la Figura 19B, el epítopo T20,6 es un complejo de cuatro secuencias peptídicas separadas que se unen por los tres enlaces disulfuro de la región del nudo de cistina. Dos de los péptidos están unidos por dos enlaces disulfuro. Los otros dos péptidos están unidos por un enlace disulfuro que, esquemáticamente, divide en dos los primeros dos polipéptidos.

El epítopo T20,6 que se generó por digestión con tripsina conserva la estructura de nudo de cistina del polipéptido nativo y está reconocido por los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Un derivado del epítopo T20,6 consiste en la región del nudo de cistina y los aminoácidos 58-64, 73-81, 112-117 y 138-141 en posición de secuencia con referencia a SEQ ID NO: 1. Este epítopo derivado se muestra en la Figura 21. Un epítopo que comprende la región de nudo de cistina puede tener uno o más aminoácidos que están presentes en el epítopo T20,6 (Figura 19B) pero no presentes en el epítopo derivado de T20,6 (Figura 21).

Otra región que contiene epítopos se identificó en la región de Bucle 2 de esclerostina humana (Figura 19A) y se reconoce por los anticuerpos Ab-A y Ab-B. Un epítopo de Bucle 2 comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, Se Q ID NO: 6). De forma estérica, con referencia a esclerostina de longitud completa de SEQ ID NO: 1, la estructura que contiene el Bucle 2 se define en un extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 86 (C4) y cisteína en la posición 144 (C8) y en el otro extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 111 (C5) y cisteína en la posición 57 (C1).

Los péptidos generados por escisión de aspN de esclerostina humana se muestran en la Figura 12. En la Figura, estos péptidos se designan AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5 y también se denominan en el presente documento N14,6, N18,6 y N22,7-23,5, respectivamente.

Un grupo de anticuerpos muestra un patrón específico de unión con ciertos epítopos como se demuestra por un "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore. Brevemente, el anticuerpo se preincuba con el epítopo para ensayar, a concentraciones que saturarán los sitios de unión a epítopo en el anticuerpo. El anticuerpo se expone después a esclerostina unida a una superficie de microplaca. Después de los procedimientos de incubación y lavado apropiados, se establece un patrón de unión competitiva. Como se muestra en la Figura 18, el anticuerpo ejemplar Ab-D se unió a moléculas de esclerostina unidas a la superficie de la microplaca. La preincubación del anticuerpo Ab-D con esclerostina redujo la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca hasta casi cero. La preincubación con un péptido que consistía en el epítopo T19,2 mostró que T19,2 no competía con la esclerostina por la unión con el anticuerpo. Sin embargo, la preincubación con uno cualquiera de los epítopos designados T20, T20,6, T21-22 o N22,7-23,5 suprimió una gran proporción de la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca. Por el contrario, la preincubación del anticuerpo con uno cualquiera de los epítopos designados T19,2, N14,6 o N18,6 no suprimió la capacidad del anticuerpo para unirse a esclerostina. Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 17) es Ab-C.

El anticuerpo Ab-D es por lo tanto ejemplar y representativo de un grupo de anticuerpos que se unen a los epítopos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, N14,6 y N18,6, como se mide por la capacidad para bloquear la unión del anticuerpo con esclerostina. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencia de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud del anticuerpo se determina funcionalmente tal como mediante la capacidad para unirse con esclerostina después de la preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Se incluyen en la invención anticuerpos que muestran un patrón de unión similar o idéntico al del anticuerpo Ab-D. Por "similar a" se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con cada uno de los polipéptidos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 por lo que esta unión superará en competición al menos el 50 % de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2, N14,6 y N18,6, dando como resultado una reducción del 30 % o menos de la unión que se produciría en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.

Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión del anticuerpo de la Figura 18 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-D y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión a epítopos de Ab-D se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de nudo de cistina de esclerostina.

Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19B, un epítopo T20,6 ejemplar comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (SEQ ID NO: 3) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8KRLTR (SEQ ID NO: 5) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica DVs Ey SC1RELHFTR (SEQ ID NO: 2) está unida a la cadena peptídica WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SEQ ID NO: 4) por un enlace disulfuro de C1 a C5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 3 y 5 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 a 4 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 19B.

Como se desvela en el presente documento y con referencia a la Figura 21, un epítopo derivado ejemplar de T20,6 comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3 SGQC4 (SEQ ID NO: 70) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8 (SEQ ID NO: 71) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica C1RELHfTr (SEQ ID NO: 72) está unida a la cadena peptídica C5IPDRYR (SEQ ID NO: 73) por un enlace disulfuro de C1 a C5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 70 y 71 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 72 y 73 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 21.

El anticuerpo Ab-A es ejemplar y representativo de un segundo grupo de anticuerpos que tienen un patrón de unión característico con péptidos de esclerostina humana que es distinto del obtenido para los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Ab­ A y el grupo de anticuerpos que representa se unen al epítopo N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, T20, T20,6, T21-22, N14,6 o N18,6, como se mide mediante la capacidad para bloquear la unión de anticuerpo con esclerostina (Fig. 15). Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 16) es Ab-B. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencias de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud de anticuerpo se determina funcionalmente tal como por la capacidad de unirse con esclerostina después de preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Los anticuerpos pueden mostrar un patrón de unión similar o idéntico al del anticuerpo Ab-A. Por "similar a" se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con el polipéptido N22,7-23,5 por la que esta unión superará por competición al menos el 50 % de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2, T20, T20,6, T21-22, N14,6 y N18,6 dando como resultado una reducción del 30 % o menos de la unión que se produciría en la ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.

Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión de anticuerpo de la Figura 15 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-A y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión de epítopo de Ab-A se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de Bucle 2 de la esclerostina. Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19A, la región de Bucle 2 puede describirse como un péptido lineal, pero adquiere una estructura terciaria cuando está presente en una esclerostina nativa o una parte que contiene nudo de cistina de esclerostina en la que la estructura de enlace disulfuro nativo se mantiene. La estructura lineal o terciaria del epítopo de Bucle 2 puede afectar a la unión del anticuerpo con el mismo, como se analiza en los Ejemplos. Una región de Bucle 2 puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos: C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID No : 6). "C4" se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 86 con referencia a SEQ ID NO: 1. "C5" se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 111 con referencia a SEQ ID NO: 1. En la proteína de esclerostina nativa, C4 está unido a una cisteína en la posición 144 (C8) por un enlace disulfuro y C5 está ligado a una cisteína en la posición 57 (C1) por un enlace disulfuro. Los epítopos derivados de la región de Bucle 2 incluyen CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID NO: 63); GPARLLPNAIGRG KWWRPSG (SEQ ID NO: 64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID NO: 65); ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID NO: 66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (SEQ ID NO: 67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID NO: 68); y LP NAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 69).

ENSAYOS DE BLOQUEO CRUZADO

Las expresiones "bloqueo cruzado", "bloqueado de forma cruzada" y "bloquear de forma cruzada" se usan de forma intercambiable en el presente documento para indicar la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión para interferir con la unión de otros anticuerpos o agentes de unión con esclerostina.

El alcance en el que un anticuerpo u otro agente de unión es capaz de interferir con la unión de otro con esclerostina y por lo tanto si puede decirse que bloquea de forma cruzada, puede determinarse usando ensayos de unión competitiva. Un ensayo cuantitativo particularmente adecuado usa una máquina de Biacore que puede medir el alcance de las interacciones usando tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado usa un enfoque basado en ELISA para medir la competición entre anticuerpos u otros agentes de unión con respecto a su unión con esclerostina.

ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO DE BIACORE

A continuación, se describe en general un ensayo de Biacore adecuado para determinar si un anticuerpo u otro agente de unión bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de forma cruzada de acuerdo con la invención. Por conveniencia se hace referencia a dos anticuerpos, pero se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los agentes de unión a esclerostina descritos en el presente documento. La máquina de Biacore (por ejemplo, el Biacore 3000) se maneja en línea con las recomendaciones del fabricante.

Por lo tanto, en un ensayo de bloqueo cruzado, la esclerostina se acopla a una microplaca CM5 Biacore usando química de acoplamiento de aminas convencional para generar una superficie recubierta con esclerostina. Típicamente se acoplarían 200-800 unidades de resonancia de esclerostina a la microplaca (una cantidad que proporciona niveles fácilmente medibles de unión pero que puede saturarse fácilmente por las concentraciones de reactivo de ensayo usadas).

Los anticuerpos (denominados A* y B*) para ensayar con respecto a su capacidad para bloquearse de forma cruzada entre sí se mezclan a una relación molar de uno a uno de sitios de unión en un tampón adecuado para crear la mezcla de ensayo. Cuando se calculan las concentraciones basándose en el sitio de unión, se asume que el peso molecular de un anticuerpo es el peso molecular total del anticuerpo dividido por el número de sitios de unión de esclerostina en ese anticuerpo.

La concentración de cada anticuerpo en la mezcla de ensayo debería ser suficientemente alta para saturar fácilmente los sitios de unión para ese anticuerpo en las moléculas de esclerostina capturadas en la microplaca de Biacore. Los anticuerpos en la mezcla están a la misma concentración molar (basándose en la unión) y esa concentración típicamente sería entre 1,00 y 1,5 micromolar (basándose en un sitio de unión).

También se preparan soluciones separadas que contienen anticuerpo A* solamente y anticuerpo B* solamente. El anticuerpo A* y anticuerpo B* en estas soluciones deberían estar en el mismo tampón y a la misma concentración que en la mezcla de ensayo.

La mezcla de ensayo se pasa sobre la microplaca de Biacore recubierta de esclerostina y se registra la cantidad total de unión. La microplaca se trata después de tal modo que se retiren los anticuerpos unidos sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca. Típicamente esto se realiza tratando a la microplaca con HCl 30 mM durante 60 segundos.

La solución de anticuerpo A* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión. La microplaca se trata de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca.

La solución de anticuerpo B* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión.

A continuación, se calcula la unión teórica máxima de la mezcla de anticuerpo A* y anticuerpo B*, y es la suma de la unión de cada anticuerpo sobre la superficie de esclerostina solo. Si la unión registrada real de la mezcla es menor que este máximo teórico entonces los dos anticuerpos están bloqueándose de forma cruzada entre sí.

Por lo tanto, en general, un anticuerpo u otro agente de unión de bloqueo cruzado de acuerdo con la invención es uno que se unirá a esclerostina en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore anterior de modo que durante el ensayo y en presencia de un segundo anticuerpo u otro agente de unión de la invención la unión registrada sea entre 80 % y 0,1 % (por ejemplo, 80 % a 4 %) de la unión teórica máxima, específicamente entre 75 % y 0,1 % (por ejemplo, 75 % a 4 %) de la unión teórica máxima y más específicamente entre el 70 % y 0,1 % (por ejemplo 70 % a 4 %) de la unión teórica máxima (como se acaba de definir anteriormente) de los dos anticuerpos o agentes de unión en combinación.

El ensayo de Biacore descrito anteriormente es un ensayo primario usado para determinar si los anticuerpos u otros agentes de unión se bloquean de forma cruzada entre sí de acuerdo con la invención. En pocas ocasiones los anticuerpos u otros agentes de unión particulares pueden no unirse con esclerostina acoplada mediante química de amina a una microplaca de Biacore CM5 (esto sucede habitualmente cuando el sitio de unión relevante en la esclerostina se enmascara o se destruye por el acoplamiento a la microplaca). En dichos casos el bloqueo cruzado puede determinarse usando una versión marcada de Esclerostina, por ejemplo, Esclerostina marcada con His N terminal (R & D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat. N.° 1406-ST-025). En este formato particular, un anticuerpo anti-His se acoplaría a la microplaca de Biacore y después la Esclerostina marcada con His se pasaría sobre la superficie de la microplaca y se capturaría por el anticuerpo anti-His. El análisis de bloqueo cruzado se llevaría a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración de microplaca, se cargaría nueva esclerostina marcada con His de nuevo en la superficie recubierta con anticuerpo anti-His. Además del ejemplo proporcionado usando Esclerostina marcada con His N terminal, podría usarse como alternativa Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador que se conocen en la técnica para dicho análisis de bloqueo cruzado (por ejemplo, marcador HA con anticuerpos anti-HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG; marcador de biotina con estreptavidina).

ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA

Lo siguiente describe en general un ensayo de ELISA para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina u otro agente de unión a esclerostina bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de formar cruzada. Por conveniencia, se hace referencia a dos anticuerpos (Ab-X y Ab-Y), pero se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los agentes de unión a esclerostina descritos en el presente documento.

El principio general de del ensayo es tener un anticuerpo anti-esclerostina recubriendo los pocillos de una placa de ELISA. Se añade una cantidad en exceso de un segundo anticuerpo anti-esclerostina que potencialmente bloquea de forma cruzada en la solución (es decir, no unido a la placa de ELISA). Se añade después una cantidad limitada de esclerostina a los pocillos. El anticuerpo recubierto y el anticuerpo en solución compiten por la unión del número limitado de moléculas de esclerostina. La placa se lava para retirar esclerostina que no se haya unido al anticuerpo de recubrimiento y también para retirar el segundo anticuerpo en fase de solución, así como cualquier complejo formado entre el segundo anticuerpo en fase de solución y la esclerostina. La cantidad de esclerostina unida se mide después usando un reactivo de detección de esclerostina apropiado. Un anticuerpo en solución que sea capaz de bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento será capaz de provocar una reducción del número de moléculas de esclerostina a las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en relación con el número de moléculas de esclerostina con las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en ausencia del segundo anticuerpo en fase de solución.

Este ensayo se describe en más detalle adicionalmente posteriormente con respecto a Ab-X y Ab-Y. En el caso en el que Ab-X se selecciona para ser el anticuerpo inmovilizado, este se usa para recubrir los pocillos de la placa de ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una solución de bloqueo adecuada para minimizar la unión no específica de reactivos que es añaden posteriormente. Se añade después una cantidad en exceso de Ab-Y a la placa de ELISA de modo que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-Y por pocillo sean al menos 10 veces mayores que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-X que se usaron, por pocillo, durante el recubrimiento de la placa de ELISA. Después se añade esclerostina de modo que los moles de esclerostina añadidos por pocillo sean al menos 25 veces menores que los moles de sitios de unión de esclerostina de Ab-X que se usaron para recubrir cada pocillo. Después de un periodo de incubación adecuado la placa de ELISA se lava y se añade un reactivo de detección de esclerostina para medir la cantidad de esclerostina unida específicamente por el anticuerpo anti-esclerostina de recubrimiento (en este caso Ab-X). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir, sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. El ensayo de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario procesar el ensayo de ELISA de tal manera que la señal de control positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.

Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultante de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:

1) formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución

y

2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.

Ab-X y Ab-Y se definen como bloqueadores cruzados si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo antiesclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60 % y el 100 %, específicamente entre el 70 % y el 100 % y más específicamente entre el 80 % y el 100 %, de la señal de detección de esclerostina (es decir, la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir, los pocillos de control de positivo).

Un ejemplo de dicho ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA puede hallarse en el Ejemplo 7 ("ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA").

ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS

Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modelo in vitro de formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de diferenciación de células de linaje de osteoblastos por uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de la matriz y finalmente deposición de mineral, que se refiere a cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.

Las células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) y subclones de la línea celular original pueden formar mineral en cultivo tras el crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Rediman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275: 19992­ 20001). Tanto para el subclón MC3T3-E1-BF, así como para las células originales MC3T3-E1, la esclerostina puede inhibir uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que son capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitan la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hay un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo). Los anticuerpos usados en los experimentos de ensayo de mineralización basado en células mostrados en las Figuras 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 Kd y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.

Cuando se ejecuta el ensayo con el objetivo de determinar si un anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión antiesclerostina particular puede neutralizar la esclerostina (es decir, es un anticuerpo neutralizante de esclerostina o derivado del mismo, o es un agente de unión a esclerostina neutralizante), es necesario que la cantidad de esclerostina usada en el ensayo sea la cantidad mínima de esclerostina que provoca al menos una reducción del 70 %, estadísticamente significativa, en la deposición de fosfato cálcico (medida como calcio) en el grupo de solamente esclerostina, en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo sin esclerostina. Un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o un agente de unión neutralizante anti-esclerostina se define como uno que provoca un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo, sin agente de unión). Para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión anti-esclerostina es neutralizante o no, la cantidad de anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión anti-esclerostina usado en el ensayo debe ser tal que haya un exceso de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Dependiendo de la potencia del anticuerpo, el exceso en veces que puede requerirse puede ser de 24, 18, 12, 6, 3 o 1,5, y un experto en la materia está familiarizado con la práctica rutinaria de ensayos de más de una concentración de agente de unión. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o agente de unión neutralizante anti-esclerostina muy potente será capaz de neutralizar la esclerostina incluso cuando haya un exceso menor de 6 veces de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o agente de unión neutralizante anti-esclerostina menos potente será capaz de neutralizar la esclerostina solamente en un exceso de 12, 18 o 24 veces. Los agentes de unión a esclerostina con este intervalo completo de potencias son adecuados como agentes de unión a esclerostina neutralizantes. Se describen en detalle en el Ejemplo 8 ensayos de mineralización basados en células ejemplares.

Los anticuerpos anti-esclerostina y derivados de los mismos que pueden neutralizar esclerostina humana, y agentes de unión a esclerostina que pueden neutralizar esclerostina humana pueden ser útiles en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea baja y fuerza ósea baja.

ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN IN VIVO

Pueden medirse los aumentos de diversos parámetros asociados con, o que resultan de, la estimulación de nueva formación de hueso como un resultado de ensayos in vivo de agentes de unión a esclerostina para identificar los agentes de unión que son capaces de neutralizar esclerostina y por lo tanto son capaces de provocar estimulación de nueva formación de hueso. Dichos parámetros incluyen diversos marcadores anabólicos del suero [por ejemplo osteocalcina, P1NP (propéptido n-terminal de procolágeno de tipo 1)], marcadores histomorfométricos de formación del hueso (por ejemplo, superficie de osteoblasto/superficie de hueso; tasa de formación de hueso/superficie de hueso; grosor trabecular), densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. Un anticuerpo neutralizante de esclerostina se define como uno capaz de provocar un aumento estadísticamente significativo en comparación con animales tratados con vehículo, en cualquier parámetro asociado con, o que resulta de, la estimulación de nueva formación de hueso. Dicho ensayo in vivo puede realizarse en cualquier mamífero adecuado (por ejemplo, ratón, rata, mono). Un ejemplo de dichos ensayos in vivo puede encontrarse en el Ejemplo 5 ("ensayos in vivo de anticuerpos monoclonales anti-esclerostina").

Aunque la secuencia de aminoácidos de esclerostina no es 100 % idéntica en todas las especies de mamífero (por ejemplo, la esclerostina de ratón no es 100 % idéntica a esclerostina humana), se apreciará por un experto en la materia que un agente de unión a esclerostina que puede neutralizar, in vivo, la esclerostina de una cierta especie (por ejemplo, ratón) y que también puede unirse a esclerostina humana in vitro es muy probable que sea capaz de neutralizar la esclerostina humana in vivo. Por lo tanto, dicho agente de unión a esclerostina humana (por ejemplo, anticuerpo anti-esclerostina humana) puede ser útil en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea baja y fuerza ósea baja. Los ratones en los que se ha usado recombinación homóloga para suprimir el gen de esclerostina de ratón e insertar el gen de esclerostina humana en su lugar (es decir, ratones knock-in para el gen de esclerostina humana o ratones knock-in para SOST humana) serían un ejemplo de un sistema in vivo adicional.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden uno de los agentes de unión descritos anteriormente, tal como al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1 a Ab-24 para esclerostina humana, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutica o fisiológicamente aceptable. Se divulgan composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento en la Solicitud relacionada N.° Serie N.° 10/868.497, presentada el 16 de junio de 2004, que reivindica el beneficio de prioridad de N.° de Serie 60/478.977.

Se conoce bien en la técnica, el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración subcutánea, oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular y formulación, algunos de los cuales se analizan brevemente posteriormente para fines generales de ilustración.

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden suministrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.

En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento por vía subcutánea, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intramuscular o incluso por vía intraperitoneal. Dichos enfoques se conocen bien por los expertos en la materia, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5.543.158; Patente de Estados Unidos N.° 5.641.515 y Patente de Estados Unidos N.° 5.399.363. Las soluciones de los compuestos activos como sales farmacológicamente aceptables o de base libre en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase Patente de Estados Unidos N.° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administración parenteral en una solución acuosa, la solución debe tamponarse de forma adecuada si es necesario y el diluyente líquido en primer lugar se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la materia conocerán un medio acuoso estéril que puede emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., págs. 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá cierta variación en la dosificación necesariamente dependiendo de la afección del sujeto que se trate. Además, para administración humana, las preparaciones por supuesto preferentemente cumplirán los patrones de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales como se requiere por la Oficina de Patrones Biológicos de la FDA.

Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También pueden derivarse sales formadas por los grupos carboxilo libres de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en la cantidad que sea terapéuticamente eficaz.

Los vehículos pueden comprender además todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, tampones, soluciones transportadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conocen bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse principios activos complementarios en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o desafortunada similar cuando se administra a un ser humano.

Se pueden usar liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones divulgadas en el presente documento en células/organismos hospedadores adecuados. En particular, las composiciones pueden formularse para el suministro encapsulado en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similar. Como alternativa, las composiciones pueden unirse, covalente o no covalentemente, con la superficie de dichos vehículos transportadores.

La formación y uso de liposoma y preparaciones de tipo liposomal como vehículos farmacéuticos potenciales generalmente se conoce por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7): 307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56 (3):691-95, 1998; Chandran etal., Indian J. Exp. Biol. 35(8): 801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3): 233-61, 1995; Patente de Estados Unidos N.° 5.567.434; Patente de Estados Unidos N.° 5.552.157; Patente de Estados Unidos N.° 5.565.213; Patente de Estados Unidos N.° 5.738.868 y Patente de Estados Unidos N.° 5.795.587). El uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después del suministro sistémico. Los liposomas se pueden formar a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)).

Alternativamente, se divulgan formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones divulgadas en el presente documento. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos de un modo estable y reproducible (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998). Para evitar efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de tamaños de aproximadamente 0,1 pm) pueden diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1): 1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3): 31-40, 1998; y Patente de Estados Unidos N.° 5.145.684.

Además, las composiciones farmacéuticas pueden situarse dentro de recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones con respecto al uso de dichas composiciones farmacéuticas. Generalmente, dichas instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como dentro de ciertos aspectos, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, solución salina o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.

La dosis administrada puede variar de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. Como resultará evidente para un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que se trate, la respuesta deseada, la afección del paciente y así sucesivamente. Típicamente, las composiciones pueden administrarse por una diversidad de técnicas, como se ha observado anteriormente.

Los aumentos del contenido mineral óseo y/o densidad mineral ósea pueden determinarse directamente mediante el uso de rayos X (por ejemplo, Absorciometría de rayos X de Energía Dual o "DEXA") o por interferencia mediante la medición de 1) marcadores de formación de hueso y/o actividad de osteoblastos, tales como, pero sin limitación, fosfatasa alcalina específica de osteoblastos, osteocalcina, propéptido C' de procolágeno de tipo 1 (PICP), fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7: 243(1995)) y propéptido N terminal de procolágeno 1 de suero (P1NP) y/o 2) marcadores de reabsorción de hueso y/o actividad de osteoclastos incluyendo, pero sin limitación, piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas resistentes a tartrato de plasma y galactosil hidroxilisina; (véase Comier, misma referencia), TRAP 5b de suero (fosfatasa ácida resistente a tartrato isoforma 5b) y telopéptido C reticulado en suero (sCTXI). La cantidad de masa ósea también puede calcularse a partir de los pesos corporales o mediante el uso de otros métodos (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5: 177-181, 1984). Se usan animales y modelos animales particulares en la técnica para ensayar el efecto de las composiciones y métodos divulgados en el presente documento en, por ejemplo, parámetros de pérdida de hueso, reabsorción del hueso, formación de hueso, fuerza ósea o mineralización del hueso que imitan las condiciones de enfermedad humana tales como osteoporosis y osteopenias. Los ejemplos de dichos modelos incluyen el modelo de rata ovariectomizada (Kalu, D.N., The ovariectomized rat 114os114lo f postmenopausal bone 114os. Bone and Mineral 15: 175-192 (1991); Frost, H.M. y Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoponosis. Bone and Mineral 18: 227-236 (1992); y Jee, W.S.S. y Yao, W., Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1: 193-207 (2001)).

Las afecciones particulares que pueden tratarse por las composiciones divulgadas en el presente documento incluyen displasias, en donde el crecimiento o desarrollo del hueso es anómalo, y una amplia diversidad de causas de osteopenia, osteoporosis y pérdida de hueso. Los ejemplos representativos de dichas afecciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exostosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis y osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de huesa inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de peso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrantes del hueso, pérdida ósea oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades ósea metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juvenil, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémico (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides, pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteopenia u osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, displasia fibrosa, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial. Más afecciones se relacionan con pérdida de hueso asociada con el envejecimiento, incluyendo pérdida de hueso facial asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con el envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con el envejecimiento.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser útiles para mejorar resultados en procedimientos ortopédicos, procedimientos dentales, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto de hueso, cirugía cosmética de hueso y reparación del hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial. Puede administrarse uno o más anticuerpos antes, durante y/o después del procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación.

También se divulga un kit de diagnóstico que comprende al menos un agente de unión anti-esclerostina. El agente de unión puede ser un anticuerpo. Además, dicho kit puede comprender opcionalmente uno o más de los siguientes:

(1) instrucciones para usar el o los agentes de unión para exploración, diagnóstico, pronóstico, supervisión terapéutica o cualquier combinación de estas aplicaciones;

(2) un compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión anti-esclerostina;

(3) una fase sólida (tal como una tira de reactivo) sobre la que se inmovilizan el agente o agentes de unión antiesclerostina; y

(4) un marcador o inserto que indica la aprobación reguladora para uso de exploración, diagnóstico, pronóstico o terapéutico o cualquier combinación de los mismos.

Si no se proporciona compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión, el agente o los agentes de unión en sí mismos pueden marcarse con uno o más de un marcador o marcadores detectables, por ejemplo, un resto quimioluminiscente, enzimático, fluorescente o radiactivo.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Expresión recombinante de esclerostina

La esclerostina recombinante humana/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. N.° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. N.° 1589-ST-025).

Como alternativa, las diferentes especies de esclerostina pueden expresarse de forma transitoria en células 293T o 293EBNA adaptadas para suspensión sin suero. Pueden realizarse transfecciones como cultivos de 500 ml o 1 l. Los siguientes reactivos y materiales están disponibles de Gibco BRL (ahora Invitrogen, Carlsbad, CA). Los números de catálogo se enumeran entre paréntesis: DMEM sin suero (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); Complemento de Selenio-Transferrina-Insulina 1X (51500-056); Pen Strep Glut 1X (10378-016); I-Glutamina 2 mM (25030-081); HEPES 20 mM (15630-080); Pluronic F68 al 0,01 % (24040-032). Brevemente, el inóculo celular (5,0-10,0 X 105 células/ml por volumen de cultivo) se centrifuga a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C para retirar el medio acondicionado.

Las células se resuspenden en DMEM sin suero y se centrifugan de nuevo a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C. Después de aspirar la solución de lavado, las células se resuspenden en medio de crecimiento [DMEM/F12 (3:1) Complemento de Insulina-Transferrina-Selenio 1X Pen Strep Glut 1X L-Glutamina 2 mM HEPES 20 mM Pluronic F68 al 0,01 %] en un cultivo de matraz en agitación de 1 l o 3 l. El cultivo del matraz en agitación se mantiene en una placa de agitación magnética a 125 RPM que se sitúa en un incubador humidificado mantenido a 37 °C y CO2 al 5 %. El ADN plasmídico de expresión de mamífero (por ejemplo, pcDNA3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), que contiene la región codificante completa (y codón de parada) de esclerostina con una secuencia consenso de Kozak (por ejemplo, CCACC) directamente 5' del sitio de inicio ATG, está en complejo con el reactivo de transfección en un tubo cónico de 50 ml.

El complejo de reactivo de transfección de ADN puede prepararse en 5-10 % del volumen de cultivo final en DMEM u OPTI-MEM sin suero. Los reactivos de transfección que pueden usarse para este fin incluyen X-tremeGene RO-1539 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), FuGene6 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 293fectin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se añade en primer lugar 1,5 pg de ADN plasmídico/ml de cultivo a DMEM sin suero, seguido de 1-5 pl de reactivo de transfección/ml de cultivo. Los complejos pueden incubarse a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-30 minutos y después añadirse a las células en el matraz de agitación. La transfección/expresión puede realizarse durante 4-7 días, después de lo cual el medio acondicionado (CM) se recoge por centrifugación a 4.000 RPM durante 60 minutos a 4 °C.

EJEMPLO 2

PURIFICACIÓN DE ESCLEROSTINA RECOMBINANTE

La esclerostina recombinante se purificó de células hospedadoras de mamífero como sigue. Todos los procesos de purificación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se usó un esquema de purificación para purificar diversas especies de esclerostina, incluyendo esclerostina murina y humana. El esquema de purificación usó cromatografía de afinidad seguido de cromatografía de intercambio catiónico.

Cromatografía de heparina

El medio acondicionado de célula hospedadora de mamífero (CM) se centrifugó en una centrífuga Beckman J6-M1 a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C para retirar residuos celulares. El sobrenadante de CM se filtró después a través de un filtro de 0,2 pm estéril. (En este punto el CM filtrado estéril puede almacenarse opcionalmente congelado hasta su purificación). Si el CM se congeló, este se descongeló a las siguientes temperaturas, o combinación de las mismas: 4 °C, temperatura ambiente o agua templada. Después de la congelación el CM se filtró a través de un filtro de 0,2 pm estéril y se concentró opcionalmente por ultrafiltración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de punto de corte de 10 kD de peso molecular. El concentrado de CM se filtró a través de un filtro de 0,2 pm estéril y después se cargó en una columna de Alto Rendimiento de Heparina (Heparina HP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences) equilibrada en PBS. Como alternativa, el sobrenadante de CM filtrado puede cargarse directamente en la columna de Heparina HP equilibrada en PBS.

Después de cargar, la columna de Heparina HP se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal (es decir, absorbancia medida antes de cargar el sobrenadante de CM). La esclerostina se eluyó después de la columna usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 2 M en PBS. La absorbancia a 280 nm del eluato se supervisó y se recogieron las fracciones que contenían proteína. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de Heparina HP.

Cromatografía de Intercambio Catiónico

La esclerostina eluida de la columna de Heparina HP se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio catiónico usando medio de cromatografía de Alto Rendimiento SP (SPHP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences). Se cambió el tampón del grupo de heparina HP a PBS por diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). El grupo de Heparina HP dializado se cargó después en una columna de SPHP equilibrada en PBS. Después de cargar, la columna se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal. La esclerostina se eluyó después de la columna SPHP usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 1 M en PBS. La absorbancia a 280 nm de eluato se supervisó y se recogió la esclerostina eluida en fracciones. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de SPHP.

Formulación

Después de la purificación, el grupo de SPHP se formuló en PBS mediante diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). Si fue necesaria la concentración de esclerostina, se usó un dispositivo de centrífuga (Amicon Centricon o Centriprep) con una membrana de 10.000 de PCPM. Después de la formulación la esclerostina se filtró a través de un filtro de 0,2 pm estéril y se almacenó a 4 °C o se congeló.

EJEMPLO 3

ELISA DE UNIÓN DE PÉPTIDOS

Se sintetizó una serie de péptidos solapantes (siendo cada péptido de aproximadamente 20-25 aminoácidos de longitud) basándose en la secuencia de aminoácidos conocida de la esclerostina de rata (SEQ ID NO: 98). Los péptidos se diseñaron de modo que todos contuvieran un resto de cisteína reducido; se incluyó una cisteína adicional en el extremo C terminal de cada péptido que no contenía ya una en su secuencia. Esto permitió a los péptidos unirse a las placas de ensayo mediante acoplamiento covalente, usando placas de unión de sulfhidrilo disponibles en el mercado (Costar), a una concentración de 1 pg/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS: pH 6,5) que contenían EDTA 1 mM. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 0,5 %. Las placas se bloquearon mediante incubación con una solución de PBS que contenía gelatina de piel de pescado 0,5 % (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en PBS que contenía Tween 200,5 %.

Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a 1 pg/ml en PBS que contenía gelatina de piel de pescado al 0,5 % y se incubaron con las placas recubiertas de péptido durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiró el anticuerpo en exceso mediante tres lavados con PBS, Tween 20 0,5 %. Las placas se incubaron después con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (diluido de forma apropiada en PBS que contenía Tween 20 0,5 %) y capaz de unirse al anticuerpo de interés. Las placas se lavaron después tres veces: una vez con PBS que contenía Tween 20 0,5 % y dos veces con PBS. Finalmente, las placas se incubaron con un sustrato cromogénico de peroxidasa de rábano rusticano (TMB-Stable Stop, RDI) durante 5 minutos a temperatura ambiente, el desarrollo del color se detuvo con ácido y se midió la densidad óptica de las placas a 450 nm.

Materiales

Placas de Unión de Sulfhidrilo de Costar (VWR N.° 29442-278)

Tampón de recubrimiento: PBS 1X pH 6,5 EDTA 1 mM

Tampón de bloqueo: PBS 1X Gelatina de Piel de Pescado 0,5 % (PBS de CS; FSG de Sigma N.° G 7765)

Tampón de lavado: PBS 1X Tween 200,5 %

Péptidos de Esclerostina de Rata

Muestras de anticuerpo: Ab transitorio, Ab recombinante Purificado, Suero de conejo, etc.

Ab secundario apropiado: de Cabra-anti-HRP de Ratón/Conejo (Jackson Immuno Research, 115-036-072)

TMB-Stable Stop (RDI N.° RDI-TMBSX-1L) HCl 0,5 M

Los métodos fueron los siguientes:

1. Recubrir placas con 100 pl/pocillo de péptido de esclerostina de rata diluido en PBS 1x pH 6,5 EDTA 1 mM a 1 pg/ml. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. (Las placas deberían usarse en un periodo de 30 minutos desde la apertura).

2. Lavar placas 3X con tampón de lavado.

3. Bloquear las placas con 200 pl/pocillo de tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.

4. Repetir el lavado como se ha descrito en (2).

5. Incubar las placas con 50 pl/pocillo de muestras diluidas en tampón de bloqueo - los títulos de suero comienzan a 1:100; uso de Ab Recombinante Transitorio puro; uso de Ab recombinante Purificado a 1 pg/ml (todas las muestras se procesan por duplicado). Incubar las placas durante 1 h a temperatura ambiente.

6. Lavar las placas como se ha descrito en (2).

7. Incubar las placas con 50 pl/pocillo de Anticuerpo Secundario apropiado (marcado con HPR) diluido 1:1600 en Tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.

8. Lavar las placas con tampón de lavado 1X, PBS 2X.

9. Incubar las placas con 50 pl/pocillo de TMB, 5 minutos a temperatura ambiente.

10. Detener la reacción con 50 pl/pocillo de HCl 0,5 M.

11. Leer placas a 450 nm de longitud de onda.

Las siguientes secuencias peptídicas se exploraron como se ha descrito anteriormente:

QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID NO: 82)

TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO: 83)

PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO: 84)

ENGGRPPHHPYDTKPVSEYS (SEQ ID NO: 85)

CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID NO: 86)

CRELHYTRFVTDQPSRSAKPVTELV (SEQ ID NO: 87)

CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID NO: 88)

CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 89)

RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID NO: 90)

PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO: 91)

KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO: 92)

IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID NO: 93)

SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO: 94)

KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO: 95)

PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96)

KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).

Un anticuerpo neutralizante de alta afinidad (Ab-19) se unió a dos secuencias peptídicas solapantes: PNAIGRVKW­ WRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96) y KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).

Este procedimiento permite el reconocimiento de epítopos por anticuerpos que reaccionan con epítopos aparentemente lineales. Los péptidos que contienen todo o parte del sitio de unión a anticuerpo se unirán al anticuerpo y de este modo se detectarán.

EJEMPLO 4

IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS DE ESCLEROSTINA HUMANA

Estructura de esclerostina

La esclerostina humana de forma madura (péptido señal retirado) es una proteína de 190 aminoácidos (Figura 8). La Figura 9 muestra un esquema de la estructura general de la esclerostina con una rama N terminal (de la Q N terminal a Cisteína 1) y una rama C terminal (de Cisteína 8 a la Y terminal). Intercalada entre estas dos ramas hay una estructura de nudo de cistina y tres bucles que se designan Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Los cuatro enlaces disulfuro en esclerostina son Cys1 en la posición de secuencia 57 unida a Cys5 en la posición de secuencia 111 (denominado C1-C5), Cys2 en la posición de secuencia 71 unida a Cys6 en la posición de secuencia 126 (denominado C2-C6), Cys3 en la posición de secuencia 82 unida a Cys7 en la posición de secuencia 142 (denominado C3-C7), Cys4 en la posición de secuencia 86 unida a Cys8 en la posición de secuencia 144 (denominado C4-C8). La estructura en anillo de ocho miembros se forma mediante enlaces disulfuro C3-C7 y C4-C8. Esa estructura en anillo, junto con el enlace disulfuro C1-C5 que penetra a través del anillo, forma un nudo de cistina típico C2-C6, que no es parte del nudo de cistina, pone dos estructuras en bucle grandes, bucle 1 (restos 57 a 82) y bucle 3 (restos 111 a 142) juntos entre sí. El bucle 2 va de C4 (resto 86) a C5 (resto 111).

Experimental

El enfoque general para caracterizar los epítopos unidos por anticuerpos monoclonales anti-esclerostina implicó fragmentar la Esclerostina humana en péptidos con diferentes proteasas, determinar la secuencia de los diversos péptidos de esclerostina humana, aislar estos péptidos y ensayar cada uno de ellos con respecto a su capacidad para unirse a un anticuerpo monoclonal particular usando un "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore. Los datos resultantes permitieron que se determinara la localización del epítopo de unión.

Las digestiones peptídicas se sometieron a mapeo de péptidos por HPLC; los picos individuales se recogieron y los péptidos se identificaron y se mapearon mediante espectrometría de masas por desorción de láser asistida por matriz (MALDI-MS) y análisis de LC-MS de ionización por electronebulización (ESI-LC-MS) y/o mediante secuenciación N terminal. Todos los análisis de HPLC para estos estudios se realizaron usando una columna C8 de fase inversa (2,1 mm i.d. x 15 cm de longitud). El mapeo de péptidos por HPLC se realizó con un gradiente lineal de ácido tricloroacético 0,05 % (fase móvil A) a acetonitrilo al 90 % en ácido trifluoroacético al 0,05 %. Las columnas se desarrollaron durante 50 minutos a un caudal de 0,2 ml/min.

Digestiones con tripsina y AspN Endoproteinasa

La esclerostina humana en forma madura se digirió con tripsina, que escinde después de arginina y lisina, o con AspN. Se incubaron aproximadamente 200 pg de esclerostina a 0,5-1,0 mg/ml en PBS (pH 7,2) durante 20 h a 37 °C con 8 pg de tripsina o AspN.

Digestión de tripsina

La cromatografía de HPLC de las digestiones de tripsina produjo varios picos importantes (Fig. 10A). Se realizó análisis de secuencia en los picos peptídicos recuperados de HPLC después de digestión con tripsina. El análisis de ESI LC-MS en línea del producto de digestión peptídica también se realizó para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. Se determinó de este modo la identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos (Fig. 11). La Figura 13 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (T19,2, T20, T20,6, T21-22) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada T (por ejemplo, T19,2) refleja el tiempo de retención. T19,2 contiene dos péptidos (uno del bucle 1 y uno del bucle 3) unidos por el enlace disulfuro C2-C6. T20 contiene dos péptidos mantenidos juntos por la estructura de nudo de cistina, con los bucles intactos 1 y 3 mantenidos juntos por el disulfuro C2-C6 y con la mayor parte del bucle 2 ausente. T20,6 contiene cuatro secuencias mantenidas juntas por la estructura de nudo de cistina, pero carece de parte del bucle 1 y bucle 3 (la parte T19,2) y carece de la mayoría del bucle 2. T21-22 es casi idéntico a T20, pero tiene 3 aminoácidos adicionales en la región del bucle 2.

Digestión con AspN

La cromatografía de HPLC de los productos de digestión de AspN produjo varios picos principales (Fig. 10B). Se realizó análisis de secuencia de los picos peptídicos recuperados de HPLC. También se realizó análisis de ESI LC-MS en línea del producto de digestión peptídico para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. La identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos del producto de digestión de AspN se determinó de este modo (Fig. 12). La Figura 14 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (AspN14,6, AspN18,6, AspN22,7-23,5) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada AspN (por ejemplo, AspN 18,6) refleja el tiempo de retención. AspN14,6 contiene tres péptidos cortos de las ramas tanto N como C terminales de esclerostina, mientras que AspN 18,6 es un péptido mayor de la rama N terminal de esclerostina. AspN22,7-23,5 contiene un único fragmento peptídico de 104 aminoácidos que abarca las ocho cisteínas (los cuatro enlaces disulfuro), el nudo de cistina y todos los bucles 1, 2 y 3.

La estrategia para caracterizar los epítopos fue usar estos diversos péptidos de esclerostina humana generados por tripsina y AspN y determinar qué péptidos podían aún unirse a los diversos anticuerpos (Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D). Específicamente esto se ensayó en un "ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana" basado en Biacore donde la unión de un anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana inmovilizada en la microplaca de Biacore se determinó en presencia o ausencia de cada una de las diversas fracciones peptídicas de HPLC de tripsina y AspN aisladas. En ausencia de cualquier péptido competidor, el anticuerpo monoclonal particular fue capaz de unirse a la esclerostina humana en la microplaca y producir una respuesta en unidades de resonancia, UR. La preincubación del anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana intacta en solución, seguida de ensayo de la unión con la microplaca, demostró que la unión del Mab con esclerostina humana en solución evitó la unión del Mab con la esclerostina humana en la microplaca, validando de este modo el principio general de este ensayo de competición.

Este procedimiento general se repitió individualmente para cada péptido. Se interpretó que una respuesta de UR robusta indicaba que el péptido particular ensayado no podía unirse al Mab en solución (por lo tanto, el Mab era libre para unirse a la esclerostina humana que se había inmovilizado en la microplaca). Por el contrario, la ausencia de una respuesta de UR robusta indicó que el Mab era capaz de unirse al péptido de esclerostina en solución. Estos patrones de unión, acoplados con la identidad conocida de los diversos péptidos de esclerostina, se usaron para determinar los epítopos de esclerostina que se unían a anticuerpos anti-esclerostina Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D.

ENSAYO DE UNIÓN COMPETITIVA DE EPÍTOPOS PEPTÍDICOS DE ESCLEROSTINA HUMANA BASADO EN BIAQORE

Preparación de superficie de esclerostina humana:

Se realizó inmovilización de esclerostina humana en forma madura en una superficie de microplaca sensora BIAcore (CM5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se activaron grupos carboxilo en las superficies de la microplaca sensora inyectando 60 pl de una mezcla de contenía N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0,2 M y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M. La esclerostina humana se diluyó en acetato sódico 10 mM, pH 4,0 a una concentración de 20 pg/ml seguido de inyección sobre la superficie de CM5 activada. Los grupos reactivos en exceso en la superficie se desactivaron inyectando 60 pl de etanolamina 1 M. Los niveles inmovilizados finales fueron de ~ 5000 unidades de resonancia (UR) para la superficie de esclerostina humana. También se preparó una superficie de referencia acoplada a simulación blanca en las microplacas sensoras.

Análisis de especificidad de unión:

La solución salina tamponada con fosfato 1X sin cloruro cálcico o cloruro de magnesio fue de Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA. La albúmina de suero bovino, fracción V, sin IgG fue de Sigma-Aldrich, St Louis, MO. Cada Mab (2 nM) se incubó por separado con esclerostina humana 20 nM o un péptido de esclerostina humana particular (nota: hay 3 péptidos no unidos en AspN14,6) en el tampón de muestra (p Bs 1X P-20 0,005 % BsA 0,1 mg/ml) antes de inyección sobre la superficie de esclerostina humana inmovilizada. El caudal para la inyección de muestra fue de 5 pl/min seguido de regeneración de superficie usando NaCl 1 M en Glicina 8 mM, pH 2,0 a 30 pl/min durante 30 segundos. Los datos se analizaron usando BIAevaluación 3.2 y se presentan en la Figura 15 (Ab-A), Figura 16 (Ab-B), Figura 17 (Ab-C) y Figura 18 (Ab-D).

Epítopos T20,6 y Bucle 2:

Los patrones de unión del péptido de esclerostina para dos anticuerpos representativos (Ab-A y Ab-B) fueron prácticamente idénticos (Fig. 15 y Fig. 16) y mostraron que ambos de estos Anticuerpos podían unirse solamente al péptido AspN22,7-23,5. La única diferencia entre AspN22,7-23,5 y todos los demás péptidos de esclerostina es que AspN22,7-23,5 contiene un bucle 2 intacto. Esto muestra que Ab-A y Ab-B se unen a la región de bucle 2 de esclerostina definiendo de este modo el epítopo de bucle 2 (Fig. 19A). Los patrones de unión del péptido de esclerostina para Ab-C y Ab-D fueron prácticamente idénticos entre sí (Fig. 17 y Fig. 18) pero completamente distintos del hallado para Ab-A y Ab-B. De los péptidos ensayados en este Ejemplo, el péptido más pequeño al que pudieron unirse Ab-C y Ab-D fue el péptido T20,6. Este resultado define el epítopo T20,6 (Fig. 19B).

Ensayo de protección de proteasa:

El principio general de este ensayo es que la unión de un Mab con esclerostina puede dar como resultado la protección de ciertos sitios de escisión de proteasa específicos y esta información puede usarse para determinar la región de esclerostina con la que se une el Mab.

Epítopo "derivado de T20,6 1 (nudo de cistina 4 ramas)":

La Figura 20 muestra los mapas peptídicos de HPLC para un complejo de Ab-D de esclerostina humana (Fig. 20A: la esclerostina humana se preincubó a una relación molar de 1:1 con Ab-D antes de digestión con tripsina como se ha descrito anteriormente) y esclerostina humana solamente (Fig. 20B: la esclerostina humana se digirió con tripsina como se ha descrito anteriormente). Los picos peptídicos de T19,2 y T20,6 en la Figura 20A mostraron una clara reducción de su altura de pico respectiva, en comparación con la Figura 20B. Esta reducción en las alturas de los picos se vio acompañada de un aumento de la altura de los picos para los péptidos T20 y T21-22. Esto datos indican que los restos de aminoácidos básicos en el bucle 1 y bucle 3, que en ausencia de Ab-D se escindieron mediante tripsina para generar los péptidos T19,2 y T20,6, fueron resistentes a escisión por tripsina cuando Ab-D se preunió a esclerostina. La presencia de T20, T20,6 y T21-22 indica que el bucle 2 aún se escindía eficazmente cuando Ab-D estaba preunido a esclerostina. Estos datos indican que Ab-D se unió al lado del bucle 1 y bucle 3 del epítopo T20,6 definiendo de este modo el epítopo más pequeño "derivado 1 de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)" mostrado en la Figura 21.

EJEMPLO 5

ENSAYOS IN VIVO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN RATONES

Se obtuvieron ratones macho BDF1 de cuatro semanas de edad de Charles River Laboratories (Raleigh, NC) y se alojaron en jaulas limpias, con cinco animales por jaula. La temperatura ambiente se mantuvo entre 20 y 22,22 °C, y la humedad relativa se mantuvo entre 34 y 73 %. El laboratorio que alojaba las jaulas tuvo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y cumplía todas las especificaciones de AAALAC. Se realizaron observaciones clínicas en todos los ratones en el estudio una vez al día.

Los anticuerpos monoclonales anti-esclerostina purificados (Ab-A Fig.1; Ab-B Fig.2; Ab-C Fig.3; Ab-D Fig.4) se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco estéril. Se inyectaron anticuerpos anti-esclerostina o vehículo PBS a los ratones por vía subcutánea a 21 pl por gramo de peso corporal, dos veces por semana (lunes y martes) a 25 mg/kg. Se diluyó PTH humano (1-34) en tampón de PTH (HCl 0,001, NaCl 0,15, b Sa 2 %) y se dosificó por vía subcutánea a 21 pl por gramo de peso corporal cinco veces a la semana (lunes, martes, miércoles, jueves, viernes) a 100 pg/kg como un control positivo (Figuras 5 y 6). El número de ratones por grupo fue de N=5 en las Figs.

5 y 6, y N=6 en la Figura 7.

Densitometría de hueso in vivo PIXImus

La densidad mineral ósea (DMO) se determinó semanalmente en la metáfisis tibial proximal y vértebras lumbares mediante Absorciometría de rayos X de Energía Dual periférica (pDEXA) con el sistema PIXImus2 de GE/Lunar Medical Systems, Madison, WI. Se situó una región de interés (ROI) de 25 mm2 para incluir la superficie articular proximal, la epífisis y el extremo proximal en la metáfisis de la tibia. Se situó una región de interés (ROI) para incluir las vértebras lumbares (L1-L5). Las regiones lumbar y tibial proximales se analizaron para determinar la densidad mineral ósea total. Se presentaron las medidas de los grupos Desviación Típica y se compararon con el grupo de tratamiento con vehículo para análisis estadístico.

Análisis estadístico

Se realizó análisis estadístico con un Dunnett y Tukey-Kramer (usando MS Excel y JMP v. 5.0 para los datos de DMO). Las medidas de los grupos para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05).

Actividad neutralizante de esclerostina de anticuerpos

Los aumentos estadísticamente significativos de DMO en comparación con el vehículo vistos para cada uno de Ab-A (Figura 5), Ab-B (Figura 5), Ab-C (Figura 6) y Ab-D (Figura 7) demuestran que estos cuatro anticuerpos son anticuerpos neutralizantes de esclerostina. Además, estos datos muestran que, para anticuerpos anti-esclerostina que se unen a esclerostina de ratón, puede usarse tratamiento y análisis de ratones como se ha descrito anteriormente para identificar anticuerpos neutralizantes de esclerostina.

EJEMPLO 6

ENSAYO DE EXPLORACIÓN PARA ANTICUERPOS QUE BLOQUEAN LA UNIÓN DE UN ANTICUERPO CON ESCLEROSTINA HUMANA

La esclerostina humana se acopló a una microplaca de Biacore CM5 usando química de acoplamiento de amina convencional para generar una superficie recubierta de esclerostina. Se acoplaron 300 unidades de resonancia de esclerostina a la superficie.

Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a una concentración de 200 pg/ml en tampón HBS-EP (que es HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005 % (v/v)) y después se mezcló en una relación molar de uno a uno (basándose en el sitio de unión) para generar la mezcla de ensayo. Esta mezcla de ensayo contenía por lo tanto cada anticuerpo a una concentración de 100 pg/ml (1,3 pm basándose en un sitio de unión). También se prepararon soluciones separadas que contenían cada uno de los anticuerpos en la mezcla de ensayo solamente. Estas soluciones contenían los anticuerpos individuales en tampón HBS-EP a una concentración de 100 pg/ml (1,3 pm basándose en un sitio de unión).

Se pasaron 20 pl de la mezcla de ensayo sobre la microplaca recubierta con esclerostina a un caudal de 10 pl/min y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató después con dos pulsos de 60 segundos de HCl 30 mM para retirar todo el anticuerpo unido. Después se pasó una solución que contenía solamente uno de los anticuerpos de la mezcla de ensayo (a 1,3 pM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca del mismo modo que la mezcla de ensayo y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido y finalmente se pasó una solución que contenía el otro anticuerpo de la mezcla de ensayo solamente (a 1,3 pM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca y se registró la cantidad de unión.

La tabla posterior muestra los resultados de ensayos de bloqueo cruzado en una serie de anticuerpos diferentes. Los valores en cada celda de la tabla representan la cantidad de unión (en UR) vista cuando los anticuerpos (a 1,3 pM basándose en un sitio de unión) o tampón indicados en la fila superior de la tabla se mezclaron con los anticuerpos (a 1,3 pM basándose en un sitio de unión) o tampón indicados en la primera columna de la tabla.

Usando el valor de unión medio (en UR) para cada combinación de anticuerpos de la tabla anterior (puesto que cada combinación aparece dos veces) es posible calcular el porcentaje de la unión teórica mostrado por cada combinación de anticuerpos. La unión teórica se calcula como la suma de los valores medios para los componentes de cada mezcla de ensayo cuando se ensayan solos (es decir, anticuerpo y tampón).

A partir de los datos anteriores resulta evidente que Ab-4, Ab-A y Ab-19 se bloquean de forma cruzada entre sí. De forma similar Ab-13 y Ab-3 se bloquean de forma cruzada entre sí.

EJEMPLO 7

ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA

Los volúmenes líquidos usados en este ejemplo serían los usados típicamente en ELISA de placa de 96 pocillos (por ejemplo 50-200 pl/pocillo). En este ejemplo se supone que Ab-X y Ab-Y tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión de esclerostina por molécula de anticuerpo. Un anticuerpo antiesclerostina (Ab-X) se usa para recubrir (por ejemplo 50 p de 1 pg/ml) una placa de ELISA de 96 pocillos [por ejemplo, Microplaca de Fondo Plano EIA/RIA de 96 Pocillos de Corning (Producto N.° 3590), Corning Inc., Acton, MA] durante al menos una hora. Después de esta etapa de recubrimiento se retira la solución de anticuerpo, la placa se lava una vez o dos veces con solución de lavado (por ejemplo, PBS y Tween 20 0,05 %) y después se bloquea usando una solución de bloqueo apropiada (por ejemplo, PBS, BSA 1 %, suero de cabra 1 % y Tween 200,5 %) y procedimientos conocidos en la técnica. La solución de bloqueo se retira después de la placa de ELISA y se añade un segundo anticuerpo anti-esclerostina (Ab-Y) que se ensaya con respecto a su capacidad para bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento, en exceso (por ejemplo 50 pl de 10 pg/ml) en solución de bloqueo a los pocillos apropiados de la placa de ELISA. A continuación, se añade después una cantidad limitada (por ejemplo 50 pl de 10 ng/m) de esclerostina en solución de bloqueo a los pocillos apropiados y la placa se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente en agitación. La placa se lava después 2-4 veces con solución de lavado. Se añade una cantidad apropiada de un reactivo de detección de esclerostina [por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-esclerostina biotinilado que se ha unido en complejo previamente con una cantidad apropiada de un conjugado de peroxidasa de rábano rusticano-esclerostina (HPR)] en solución de bloqueo a la placa de ELISA y se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente. La placa se lava después al menos cuatro veces con solución de lavado y se desarrolla con un reactivo apropiado [por ejemplo, sustratos de HRP tales como TMB (colorimétrico) o diversos sustratos luminiscentes de HRP]. La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario que el ensayo de ELISA se procese de tal modo que la señal de control de positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.

Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultantes de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:

1) el formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución

y

2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.

Ab-X y Ab-Y se definen como de bloqueo cruzado si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60 % y el 100 %, específicamente entre el 70 % y el 100 %, y más específicamente entre el 80 % y 100 %, de la señal de detección de esclerostina (es decir la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir los pocillos de control positivos).

En el caso de que se use una versión marcada de esclerostina en el ELISA, tal como una Esclerostina marcada con His N terminal (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat N.° 1406-ST-025) entonces un tipo apropiado de reactivo de detección de esclerostina incluiría un anticuerpo anti-His marcado con HROP. Además de usar Esclerostina marcada con His N terminal, también podría usarse Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador conocidos en la técnica en este ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA (por ejemplo, marcador HA con anticuerpos anti-HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG, marcador de biotina con estreptavidina).

EJEMPLO 8

ENSAYO DE MINERALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS PARA IDENTIFICAR AGENTES CAPACES DE ANTAGONIZAR LA ACTIVIDAD DE ESCLEROSTINA

Introducción

Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modelo in vitro de formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de la diferenciación de células de linaje de osteoblastos mediante uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de matriz y finalmente deposición de minerales, que se refiere a la cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición de mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.

La deposición de mineral tiene una fuerte característica biofísica, porque una vez que las "semillas" minerales comienzan a formarse, la cantidad total de mineral que se depositará en el cultivo completo puede en ocasiones depositarse con bastante rapidez, tal como en un periodo de unos pocos días después. El momento y alcance de la deposición mineral en cultivo están influidos, en parte, por las células/línea celular de linaje de osteoblastos particular que se use, las condiciones de crecimiento, la elección de agentes de diferenciación y el número de lote particular del suero usado en el medio de cultivo celular. Para cultivos de mineralización de línea celular/célula de linaje de osteoblastos, deberían ensayarse al menos de ocho a quince lotes de suero de más de un proveedor para identificar un lote de suero particular que permita que se produzca la mineralización.

Las células MC3T3-E1 (Sudo H et al., In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96: 191-198) y subclones de la línea cellular original pueden formar mineral en cultivo tras su crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stagespecific osteoblast cell cycle. J Biol Chem 275: 19992-20001).

Identificación de Anticuerpos Neutralizantes de Esclerostina

Se usaron células MC3T3-E1-BF para el ensayo de mineralización. Se usaron ácido ascórbico y B-glicerofosfato para inducir diferenciación de células MC3T3-E1-BF que conduzca a deposición mineral. El protocolo de exploración específico, en formato de 96 pocillos, implicó sembrar células en placas un miércoles, seguido de siete cambios de medio (como se describe adicionalmente posteriormente) durante un periodo de 12 días, teniendo lugar la mayor parte de la deposición mineral aproximadamente en las dieciocho horas finales (por ejemplo, del domingo por la noche al lunes). Para cualquier tratamiento dado, se usaron 3 pocillos (N=3). El momento y alcance específicos de la deposición mineral pueden variar dependiendo, en parte, del número de lote de suero particular que se use. Los experimentos de control permitirán explicar dichas variables, como se conoce bien en la técnica de la experimentación de cultivo celular en general.

En este sistema de ensayo la esclerostina inhibió uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducían a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibió la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que fueron capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitaron la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hubo un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medida en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir, sin anticuerpo). Para análisis estadístico (usando MS Excel y JMP) se usó un ANOVA de 1 vía seguido de comparación de Dunnett para determinar diferencias entre grupos. Las medias de grupo para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05). Se muestra un resultado representativo del procesamiento de este ensayo en la Figura 22. En ausencia de esclerostina de ratón recombinante, la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral sucedieron con normalidad. Se muestran los niveles de calcio en cada grupo de tratamiento como medias Error Típico de la Media (ETM). En este experimento ejemplar los niveles de calcio del ensayo de calcio fueron ~31 pg/ml. Sin embargo, la adición de esclerostina de ratón recombinante provocó inhibición de la mineralización y el calcio se redujo en ~85 %. La adición de anticuerpo monoclonal anti-esclerostina Ab-19 o Ab-4 junto con la esclerostina recombinante dio como resultado un aumento estadísticamente significativo en la deposición mineral, en comparación con el grupo solamente de esclerostina, debido a que la actividad inhibidora de esclerostina se neutralizó por uno de los anticuerpos. Los resultados de este experimento indican que Ab-19 y Ab-4 son anticuerpos monoclonales neutralizantes de esclerostina (Mab).

La Figura 23 muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y dos Mab anti-esclerostina humanizados. La Figura 24 también muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y Mab anti-esclerostina de ratón y humanizados según se indica.

Los anticuerpos usados para los experimentos mostrados en la Fig. 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.

Se describe a continuación un protocolo de cultivo de células MC3T3-E1-BF.

Reactivos y Medios

Reactivos Compañía N.° de catálogo

Alfa-MEM Gibco-Invitrogen 12571-048

Ácido ascórbico Sigma A4544

Beta-glicerofosfato Sigma G6376

PenStrepGlutamina 100X Gibco-Invitrogen 10378-016

Dimetilsulfóxido (DMSO) Sigma D5879 o D2650

Suero fetal bovino (FBS) Cansera CS-C08-500 (N.° de lote SF50310)

o suero fetal bovino (FBS) TerraCell Int. CS-C08-1000A (N.° de lote SF-20308)

Alfa-MEM se fabrica habitualmente con una fecha de caducidad de 1 año. Para el cultivo celular se usó Alfa-MEM que no tenía más de 6 meses después de la fecha de fabricación.

Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu) se preparó como sigue:

Se descongeló un frasco de 500 ml de FBS y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Se añadieron 100 ml de este FBS a 1 litro de Alfa-MEM seguido de la adición de 10 ml de PenStrepGlutamina 100x. El FBS no usado se separó en alícuotas y se volvió a congelar para uso posterior.

El Medio de Diferenciación (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu ácido ascórbico 50 pg/ml beta-glicerofosfato 10 mM) se preparó como sigue:

Se prepararon 100 ml de Medio de Diferenciación complementando 100 ml de Medio de Expansión con ácido ascórbico y beta-glicerofosfato como sigue:

Conc. de reserva (véase posteriormente) Volumen Conc. Final

Ácido ascórbico 10 mg/ml 0,5 ml 100 pg/ml (50 pg/ml 50 pg/ml) P-glicerofosfato 1 M 1,0 ml 10 nM

Se preparó Medio de Diferenciación complementando Medio de Expansión solamente el día en que el Medio de Diferenciación iba a usarse para cultivo celular. La concentración final de ácido ascórbico en el Medio de Diferenciación es de 100 pg/ml debido a que Alfa-MEM ya contiene ácido ascórbico 50 pg/ml. Se preparó solución madre de ácido ascórbico (10 mg/ml) y se separó en alícuotas para congelar a -80 °C. Cada alícuota se usó solamente una vez (es decir no se volvió a congelar). Se preparó solución madre de betaglicerofosfato (1 M) y se separó en alícuotas para congelar a -20 °C. Cada alícuota se congeló y se descongeló un máximo de 5 veces antes de descartarse.

Cultivo Celular para expansión de células MC3T3-E1-BF.

Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO25 %. Se generó un banco de células para los fines de explorar con respecto a anticuerpos neutralizantes de esclerostina. El banco de células se creó como sigue:

Se descongeló un recipiente de células MC3T3-E1-BF congeladas mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, se sembraron 1 x 106 células en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu en un matraz T175.

Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente a los 7 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05 %; EDTA 0,532 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 células en placas con 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces de T175 usados para sembrar en este punto dependió del número de células totales disponible y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %.

Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (T ripsina 0,05 %; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %.

Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (T ripsina

0,05 %; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Tras determinar el número de células utilizando azul tripano y un hemacitómetro, se sembraron en placas las células a 1 x 106 células en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS

10 %/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %.

Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (T ripsina

0,05 %; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %.

Este "pase final" de células congeladas fue el pase que se usó para el ensayo de exploración.

Cultivo celular para mineralizar células MC3T3-E1-BF.

Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO2 5 %. Es deseable minimizar las fluctuaciones de temperatura y % de CO2 durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. Esto puede conseguirse minimizando el tiempo que las placas pasan fuera del incubador durante la alimentación y también minimizando el número de veces que se abre y se cierra la puerta del incubador durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. A este respecto puede ser útil tener un incubador de cultivo tisular que esté dedicado exclusivamente al cultivo celular de mineralización (y por lo tanto no se abra o cierre más de lo que es necesario).

Se descongeló un número apropiado de recientes de "pase final" preparados como se ha descrito anteriormente mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células por azul de tripano y hemacitómetro, se sembraron 2500 células en placas en 200 microlitros de medio de Expansión por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I (Becton Dickinson Labware, cat. N.° 354407).

Para evitar un efecto de mineralización de borde de placa, las células no se sembraron en las placas en la columna/fila más externa en todo el borde de la placa. En su lugar se añadieron 200 microlitros de PBS a estos pocillos.

Procedimiento de cultivo celular ejemplar

En el siguiente procedimiento, se indica que el día de partida para la siembra de las células en placas es un miércoles.

Si se usa un día de la semana diferente como el día de partida para la siembra de las células en placas, ese día dará inicio al programa diario de retirada y adición de medio durante el proceso completo como se indica posteriormente.

Por ejemplo, si las células se siembran un martes, el medio no debería retirarse y añadirse el primer viernes y sábado, ni el segundo viernes y sábado. Con un comienzo en martes, las placas se prepararían para el ensayo de calcio el domingo final.

Las células se sembraron un miércoles a 2500 células en 200 pl de medio de Expansión.

El jueves se retiró todo el medio de Expansión y se añadieron 200 pl de Medio de Diferenciación.

El viernes se retiraron 100 pl de medio y se añadieron 100 pl de Medio de Diferenciación nuevo.

El lunes se retiraron 100 pl de medio y se añadieron 100 pl de Medio de Diferenciación nuevo.

El martes se retiraron 100 pl de medio y se añadieron 100 pl de Medio de Diferenciación nuevo.

El miércoles se retiraron 100 pl de medio y se añadieron 100 pl de Medio de Diferenciación nuevo.

El jueves se retiraron 100 pl de medio y se añadieron 100 pl de Medio de Diferenciación nuevo.

El viernes se retiraron 100 pl de medio y se añadieron 100 pl de Medio de Diferenciación nuevo.

El lunes siguiente se prepararon placas para el ensayo de calcio como sigue:

Las placas se lavaron una vez con Tris 10 mM, HCl pH 7-8.

Trabajando bajo una campana de humos, se añadieron 200 pl de NHC 0,5 N por pocillo. Las placas se congelaron después a -80 °C.

Justo antes de medir el calcio, las placas se congelaron-descongelaron dos veces y después se usó trituración con una pipeta multicanal para dispersar los contenidos de la placa. Después se permitió que los contenidos de la placa reposaran a 4 °C durante 30 minutos momento en el cual se retiró una cantidad apropiada de sobrenadante para medir el calcio usando un kit de calcio disponible en el mercado. Un kit ejemplar y no limitante es Calcium (CPC) Liquicolor,

Cat. N.° 0150-250, Stanbio Laboratory, Boeme, TX.

En este ensayo basado en células, la esclerostina inhibe uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Por lo tanto, en experimentos en los que se indujo esclerostina en el experimento de cultivo celular particular, se añadió la esclerostina recombinante al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. En los casos en los que se ensaya un anticuerpo monoclonal anti-esclerostina (Mab) con respecto a la capacidad para neutralizar esclerostina, es decir, permitir la mineralización neutralizando la capacidad de la esclerostina para inhibir la mineralización, el Mab se añadió al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. De acuerdo con el protocolo, eso se consiguió como sigue: el Mab se preincubó con la esclerostina recombinante en medio de Diferenciación durante 45-60 minutos a 37 °C y después este medio se usó para alimentar a las células.

Se ha descrito anteriormente un protocolo de mineralización de 12 días para las células MC3T3-E1-BF. Usando los mismos reactivos y protocolo de alimentación, las células originales MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96: 191-198) que los inventores obtuvieron del Banco de Células RIKEN (RCB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsukubashi, Ibaraki 305-0074, Japón) tardaron más en mineralizarse (20 días totales para la mineralización) que las células MC3T3-E1-BF. La mineralización de las células MC3T3-E1 originales se inhibió mediante esclerostina recombinante y esta inhibición se bloqueó usando un anticuerpo neutralizante de esclerostina.

EJEMPLO 9

EL ANTICUERPO ANTI-ESCLEROSTINA PROTEGE DE LA PÉRDIDA DE HUESO INDUCIDA POR INFLAMACIÓN EN EL MODELO DE TRANSFERENCIA DE CD4 CD45RBHI DE COLITIS EN RATONES SCID

Sumario del modelo

La inyección del subconjunto CD45RBalto de linfocitos T CD4+ en ratones scid C.B-17 da como resultado la inflamación intestinal crónica con características similares a las de enfermedad inflamatoria del intestino humana (IBD). Se observa diarrea y enfermedad de debilitamiento 3-5 semanas después de la transferencia celular con infiltración de leucocitos grave en el colon acompañado de hiperplasia de células epiteliales y formación de granuloma. Los ratones scid C.B-17 que reciben el subconjunto recíproco de células CD4+, las que expresan CD45RBbajo, no muestran colitis y tienen un aumento de peso indistinguible de ratones scid no inyectados. Además de los síntomas de colitis, el modelo de transferencia de linfocitos T CD4+ CD45RBalto de colitis está acompañado de una reducción de la densidad mineral ósea (DMO), que se cree que es principalmente mediante mecanismos inflamatorios en lugar de malabsorción dietética (Byrne, F. R. et al, Gut 54: 78-86, 2005).

Inducción de colitis y pérdida de hueso inducida por inflamación

Se tomaron bazos de ratones balb/c hembra y se rompieron mediante un tamiz celular de 70 pm. La población de CD4+ se enriqueció después mediante selección negativa con Dynabeads usando anticuerpos contra B220, MAC-1, CD8 e I-Ad. La población enriquecida se tiñó después con anti-CD4 conjugado con FITC y anti-CD45RB conjugado con PE y se fraccionó en poblaciones CD4+CD45RBalto y ClD4+CD45RBbajo por separación de dos colores en un Moflo (Dakocytomation). Las poblaciones de CD45RBalto y CD45RBbajo se definieron como el 40 % de tinción más brillante y el 20 % de tinción más pálida de células CD4+ respectivamente. Se inyectaron después 5x105 células i.p. en ratones scid C.B-17 el día 0 y se supervisó el desarrollo de colitis mediante la aparición de heces blandas o diarrea y pérdida de peso. Se tomaron mediciones de densidad mineral ósea al final del estudio (día 88).

Efecto del tratamiento anti-Esclerostina en síntomas de colitis y DMO

Se dosificó IgG Ab-A a 10 mg/kg s.c. desde el día antes de la transferencia de células CD4+CD45RBalto y se comparó con ratones que recibieron el anticuerpo de control negativo 101.4 también dosificado a 10 mg/kg s.c. Los anticuerpos se dosificaron semanalmente a continuación. Un grupo de ratones que recibió células CD4+CD45RBbajo no patógenas y se dosificaron con 10 mg/kg de 101.4 se estudió como un control. Al final del estudio (día 88) se midió la densidad mineral ósea y se tomaron secciones del colon para análisis de infiltración celular y evaluación de daño histológico.

a) Sin efecto en síntomas de colitis

Los síntomas de colitis típicos tales como pérdida de peso e infiltración de células inflamatorias en el colon no se vieron afectados por el tratamiento con Ab-A. De forma similar no hubo mejora de daño histológico al colon después del tratamiento con Ab-A.

b) Inhibición de pérdida inducida por inflamación de densidad mineral ósea.

El día 88 después de la transferencia de células en ratones scid C.B-17, se midió la densidad mineral ósea (DMO total, DMO de vértebras y DMO del fémur). En comparación con ratones de control que recibieron células no patógenas CD4+CD45RBbajo, los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y el anticuerpo de control negativo 101.4 tuvieron densidad mineral ósea reducida, como se muestra en la Figura 25. Por el contrario, no se observó reducción de DMO después de tratamiento con Ab-A. Las mediciones totales, de vértebras y de fémur de DMO fueron significativamente mayores en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con Ab-A que los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con 101.4 (P<0,001 por ensayo de comparación múltiple de Bonferroni).

EJEMPLO 10

DETERMINACIÓN BASADA EN KINEXA DE AFINIDAD (Kd) DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA POR ESCLEROSTINA HUMANA

La afinidad de varios anticuerpos anti-esclerostina por esclerostina humana se evaluó mediante un análisis de unión en equilibrio en solución usando KinExA® 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Para estas mediciones, se pre­ recubrieron perlas Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) con esclerostina humana 40 pg/ml en Na2C0350 mM, pH 9,6 a 4 °C durante una noche. Las perlas se bloquearon después con BSA 1 mg/ml en Tris-HCl 1 M, pH 7,5 a 4 °C durante dos horas. Se mezclaron 10 pM, 30 pM o 100 pM del anticuerpo con diversas concentraciones de esclerostina humana, que varió en concentración de 0,1 pM a 1 nM, y se equilibró a temperatura ambiente durante más de 8 horas en PBS con BSA 0,1 mg/ml y P20 0,005 %. Las mezclas se pasaron después sobre las perlas recubiertas con esclerostina humana. La cantidad de anticuerpo anti esclerostina unido a perlas se cuantificó usando anticuerpos anti-IgG de ratón de cabra marcados con Cy5 fluorescente o anti-IgG humana de cabra marcados con Cy5 fluorescente (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) para las muestras de anticuerpo de ratón o humano, respectivamente. La cantidad de señal fluorescente medida fue proporcional a la concentración de anticuerpo anti-esclerostina libre en cada mezcla de reacción en equilibrio. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se obtuvo a partir de regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogénea de un sitio de curva n proporcionado en el software KinExA Pro. Los resultados de los ensayos de KinExA para los anticuerpos seleccionados se resumen en la siguiente tabla.

Anticuerpos Antígeno Kd (pM) intervalo de confianza al 95 % Ab-13 Esclerostina Humana 0,6 0,4 ~ 0,8 pM

Ab-4 Esclerostina Humana 3 1,8 ~ 4 pM

Ab-19 Esclerostina Humana 3 1,7 ~ 4 pM

Ab-14 Esclerostina Humana 1 0,5 ~ 2 pM

Ab-5 Esclerostina Humana 6 4,3 ~ 8 pM

Ab-23 Esclerostina Humana 4 2,1 ~ 8 pM

EJEMPLO 11

MÉTODO DE BIACORE PARA DETERMINAR LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA HUMANIZADOS POR ESCLEROSTINA HUMANA.

La tecnología BIAcore supervisa la unión entre biomoléculas en tiempo real y sin la necesidad de marcaje. Uno de los que interaccionan, denominado el ligando, se inmoviliza directamente o se captura en la superficie inmovilizada mientras que el otro, denominado el analito, fluye en solución sobre la superficie capturada. El sensor detecta el cambio de masa en la superficie sensora a medida que el analito se une al ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al proceso de asociación. El proceso de disociación se supervisa cuando el analito se reemplaza por tampón. En el ensayo de BIAcore de afinidad, el ligando es el anticuerpo anti-esclerostina y el analito es esclerostina.

Instrumento

Biacore® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suecia

Microplaca sensora

CM5 (uso de investigación) Número de Catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Las microplacas se almacenaron a 4 °C.

Solución de BIAnormalización

Glicerol al 70 % (p/p). Parte del Kit de BIAmantenimiento Número de Catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. El kit de BIAmantenimiento se almacenó a 4 °C.

Kit de Acoplamiento de Amina

Número de Catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia.

Clorhidrato de etil-3-(e-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Compuesto hasta 75 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 pl a -70 °C.

N-hidroxisuccinimida (NHS). Compuesto hasta 11,5 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 pl a -70 °C.

Clorhidrato de etanolamina 1 M - NaOH pH 8,5. Almacenado en alícuotas de 200 pl a -70 °C.

Tampones

Tampón de ejecución para inmovilizar el anticuerpo de captura: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005 %). Número de Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C.

Tampón de inmovilización: Acetato 5.0 (que es acetato sódico 10 mM pH 5,0). Número de Catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C.

Tampón de ejecución para ensayo de unión: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P200,005 %, Número de Catálogo BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia) con CM-Dextrano añadido a 1 mg/ml (Número de Catálogo 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Suiza). Tampón almacenado a 4 °C.

Captura de ligando

IgG anti-humano de cabra fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fc. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, Estados Unidos) número de Catálogo: 109-006-098. Reactivo almacenado a 4 °C.

Ligando

Anticuerpos anti-esclerostina humana humanizados Ab5, Ab14 y Ab20.

Analito

Esclerostina humana recombinante. Alícuotas almacenadas a -70 °C y descongeladas una vez para cada ensayo. Solución de regeneración

HCl 40 mM preparado por dilución con agua destilada a partir de una solución madre 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Número de catálogo: 101254H).

NaOH 5 mM preparado mediante dilución con agua destilada a partir de una solución madre 50 mM. Número de catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suecia.

Método de Ensayo

El formato de ensayo fue captura del anticuerpo anti-esclerostina mediante Fc anti-IgG humano inmovilizado, después valoración de la esclerostina sobre la superficie capturada.

Se proporciona a continuación un ejemplo del procedimiento:

Se realizó BIA (Análisis de Interacción Biamolecular) usando un BIAcore 3000 (BIAcore AB). Se inmovilizó IgG anti­ humano de cabra Fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) en una microplaca sensora CM5 mediante química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ~4000 unidades de respuesta (UR). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005 %, BIAcore AB) que contenía CM-Dextrano 1 mg/ml como el tampón de ejecución con un caudal de 10 pl/min. Se usó una inyección de 10 pl del anticuerpo anti-esclerostina a ~5 pg/ml para captura por el Fc anti-IgG humano inmovilizado. Los niveles de captura de anticuerpo fueron típicamente 100-200 UR. La esclerostina se valoró sobre el anticuerpo anti-esclerostina capturado a diversas concentraciones a un caudal de 30 pl/min. La superficie se regeneró por dos inyecciones de 10 pl de HCl 40 mM, seguido de una inyección de 5 pl de NaOH 5 mM a un caudal de 10 pl/min. Se analizaron curvas de unión con resta de fondo usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo procedimientos convencionales. Se determinaron los parámetros cinéticos a partir del algoritmo de ajuste.

Los datos cinéticos y las constantes de disociación calculadas se proporcionan en la Tabla 2.

TABLA 2: Afini ni r n i- l r in r clerostina

EJEMPLO 12

ENSAYOS IN VIVO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN MONOS CYNOMOLGUS

Se usaron treinta y tres monos cynomolgus hembra de aproximadamente 3-5 años de edad (Macaca fascicularis) en este estudio de 2 meses. El estudio contenía 11 grupos:

Grupo 1: vehículo (N=4)

Grupo 2: Ab-23 (N=2, dosis 3 mg/kg)

Grupo 3: Ab-23 (n =3, dosis 10 mg/kg)

Grupo 4: Ab-23 (n =3, dosis 30 mg/kg)

Grupo 5: Ab-5 (N=3, dosis 3 mg/kg)

Grupo 6: Ab-5 (n =3, dosis 10 mg/kg)

Grupo 7: Ab-5 (n =3, dosis 30 mg/kg)

Grupo 8: Ab-14 (N=3, dosis 3 mg/kg)

Grupo 9: Ab-14 (n =3, dosis 10 mg/kg)

Grupo 10: Ab-14 (N=3, dosis 30 mg/kg)

Grupo 11: Hormona paratiroidea (1-34) [PTH (1-34)] (N=3, dosis 10 pg/kg)

Toda la dosificación fue subcutánea. Se dosificó PTH (1-34) cada día, los anticuerpos monoclonales (Mab) se dosificaron dos veces (primera dosis al comienzo del estudio y segunda dosis en el punto temporal de un mes). Para evaluación de parámetros de hueso (por ejemplo densidad mineral ósea) se realizaron exploraciones pQCT (tomografía computarizada cuantitativa periférica) y DXA (absorciometría de rayos X de energía dual) antes del comienzo del estudio (para obtener los valores de línea basal) y después de un mes (antes de la segunda dosis de Mab) y finalmente al final del estudio (punto temporal de 2 meses) momento en el cual se realizaron necropsias de los monos para análisis adicional (por ejemplo análisis histomorfométrico). Los animales se marcaron con fluorocromo (días 14, 24, 47 y 57) para histomorfometría dinámica. Se recogió suero en diversos puntos temporales durante el estudio [día 1 antes de la dosis (el día de la primera dosis de Mab), día 1 doce horas después de la dosis, día 2, día 3, día 5, día 7, día 14, día 21, día 28, día 29 doce horas después de la dosis (el día 29 fue el día de la segunda y última dosis de Mab), día 30, día 31, día 33, día 35, día 42, día 49 y día 56].

Se midieron tres biomarcadores de suero relacionados con hueso usando kits disponibles en el mercado:

Osteocalcina (OC) (Kit de Radioinmunoensayo de Osteocalcina DSL; Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX, Estados Unidos).

Propéptido N-terminal de Procolágeno de Tipo I (P1NP) (Kit de Radioinmunoensayo de P1NP; Orion Diagnostica, Espoo, Finlandia).

Fragmentos de C-telopéptido de cadenas al de colágeno de tipo I (sCTXI) (Serum CrossLaps® ELISA; Nordic Bioscience Diagnostics A/S, Herlev, Dinamarca).

Las exploraciones de pQCT y DXA produjeron datos sobre diversos parámetros del hueso (incluyendo densidad mineral ósea (DMO) y contenido mineral óseo) a lo largo de numerosos sitios esqueléticos (incluyendo metáfisis y diáfisis tibial, metáfisis y diáfisis radial, cuello femoral, vértebras lumbares). El análisis de estos datos de hueso (porcentaje de cambio de línea basal para cada animal) y los datos de biomarcadores de suero anabólicos (OC, P1 NP) (porcentaje de cambio desde la línea basal para cada animal) revelaron aumentos estadísticamente significativos, frente al grupo de vehículo, en algunos parámetros en algunos de los puntos temporales y dosis para cada Mab. Estos datos de parámetros de hueso, datos de biomarcadores de suero, así como los datos histomorfométricos, indicaron que cada uno de los 3 Mab (Ab-23, Ab-5 y Ab-14) fue capaz de neutralizar la esclerostina en monos cynomolgus. Esta actividad fue más robusta para Ab-23 y Ab-5, particularmente a la dosis más alta (30 mg/kg), con un claro aumento en la formación del hueso (efecto anabólico) así como aumentos netos de hueso (por ejemplo, DMO). También se encontraron aumentos estadísticamente significativos en parámetros del hueso y parámetros histomorfométricos anabólicos para el grupo de control positivo (PTH (1-34)).

Se aumentaron los marcadores de formación de hueso en suero (P1 NP, osteocalcina) (p<0,05 frente a vehículo (VEH)) en diversos puntos temporales y dosis, pero particularmente en los grupos de 30 mg/kg para Ab-23 y Ab-5. Los análisis histomorfométricos revelaron aumentos drásticos (p<0,05 frente a VEH) en las tasas de formación de hueso en hueso esponjoso en vértebras lumbares y tibia proximal (aumento de hasta 5 veces), así como en la superficie endocortical de la mitad del fémur (aumento de hasta 10 veces) a las dosis más altas de Ab-23 y Ab-5. El grosor trabecular se

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que bloquea de forma cruzada la unión del anticuerpo Ab-C o Ab-D con esclerostina o

se bloquea de forma cruzada su unión con esclerostina por el anticuerpo Ab-C o Ab-D, donde el anticuerpo Ab-C tiene

cadenas ligeras de SEQ ID NO: 15 y cadenas pesadas de SEQ ID NO: 19 y Ab-D tiene cadenas ligeras de SEQ ID

NO: 7 y cadenas pesadas de SEQ iD NO: 11,

donde el bloqueo cruzado se determina por el ensayo de Biacore, donde el anticuerpo de bloqueo cruzado se une

a esclerostina en el ensayo de Biacore de forma que durante el ensayo y en presencia de un segundo anticuerpo

la unión registrada es de entre el 80 % y el 0,1 % de la unión teórica máxima de los dos anticuerpos en

combinación, o donde el bloqueo cruzado se determina por ELISA, donde el anticuerpo en fase de solución provoca

una reducción de entre el 60 % y el 100 % de la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo que

recubre la placa de ELISA en comparación con la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo de

recubrimiento en ausencia del anticuerpo en fase de solución,

y donde el anticuerpo aumenta al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral

óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que se une a esclerostina humana con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por la lisozima de clara de huevo de gallina determinada por

resonancia de plasmón superficial.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, que es una IgG.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, que es un F(ab')2, Fab, Fab' o Fv.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo

humano.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo de bloqueo cruzado se une

a esclerostina en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore de forma que durante el ensayo y en presencia del segundo

anticuerpo la unión registrada es de entre el 75 % y el 4 % de la unión teórica máxima de los dos anticuerpos en

combinación.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo de bloqueo cruzado se une a

esclerostina en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore de forma que durante el ensayo y en presencia del segundo

anticuerpo la unión registrada es de entre el 70 % y el 4% de la unión teórica máxima de los dos anticuerpos en

combinación.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo de bloqueo cruzado se une a

esclerostina en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore de forma que durante el ensayo y en presencia del segundo

anticuerpo la unión registrada es de entre el 80 % y el 4 % de la unión teórica máxima de los dos anticuerpos en

combinación.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde en el ELISA el anticuerpo en fase de solución

provoca una reducción de entre el 70 % y el 100 % de la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo que

recubre la placa de ELISA en comparación con la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo de

recubrimiento en ausencia del anticuerpo en fase de solución.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde en el ELISA el anticuerpo en fase de solución

provoca una reducción de entre el 80 % y el 100 % de la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo que

recubre la placa de ELISA en comparación con la cantidad de esclerostina con la que se une el anticuerpo de

recubrimiento en ausencia del anticuerpo en fase de solución.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que bloquea el efecto inhibidor de esclerostina

en un ensayo de mineralización basado en células.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para el tratamiento

de un trastorno óseo asociado con al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido

mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea baja y fuerza ósea baja en un sujeto mamífero, método que

comprende proporcionar a un sujeto que necesita tal tratamiento una cantidad de dicho anticuerpo suficiente para

aumentar al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad

ósea y fuerza ósea.

13. El anticuerpo de la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de la osteoporosis o la osteopenia.

14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la mejora de los resultados en procedimientos ortopédicos, procedimientos dentales, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto de hueso, cirugía cosmética de hueso o reparación de hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada o reconstrucción facial.

15. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente y vehículo farmacéuticamente aceptables.