ES2619709T3 - Agentes de unión a esclerostina - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, en el que SEQ ID NO: 2 y 4 están unidas por un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 57 y 111 en referencia a SEQ ID NO: 1, y SEQ ID NO: 3 y 5 están unidas por (a) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 82 y 142 en referencia a SEQ ID NO: 1, y (b) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 86 y 144 en referencia a SEQ ID NO: 1.
Description
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Pueden obtenerse CDR (también denominadas “unidades de reconocimiento mínimas” o “región hipervariable”) construyendo polinucleótidos que codifiquen la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la
5 región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como un molde (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991; Courtenay-Luck “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Por lo tanto, en una realización, el agente de unión comprende al menos una CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender además al menos un dominio de región variable 15 de un anticuerpo descrito en el presente documento. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una secuencia de CDR responsable de la unión con esclerostina humana, por ejemplo CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y/o las CDR de cadena ligera descritas específicamente en el presente documento y que están adyacentes o en fase con una o más secuencias marco conservadas. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) de inmunoglobulina. Por lo tanto, por ejemplo, el domino de región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL, que es capaz de unirse de forma independiente con esclerostina humana con una afinidad al menos igual a 1 x 10-7 M o menos como se describe posteriormente. Como alternativa, el dominio de región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. El dímero de región V comprende al menos una cadena VH y al menos una VL que pueden no estar asociadas covalentemente
25 (denominado en lo sucesivo en el presente documento FV). Si se desea, las cadenas pueden estar acopladas covalentemente bien directamente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador para formar un Fv de cadena sencilla (scFV).
El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una versión modificada por ingeniería genética del mismo. Por versión modificada por ingeniería genética se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones modificadas por ingeniería genética incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, deleciones o cambios en o a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable modificados por ingeniería genética que contienen al menos una
35 CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos marco de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de región variable puede estar unido covalentemente en un aminoácido C-terminal con al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Por lo tanto, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede estar unido a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De forma similar un dominio VL puede estar unido a un dominio CK o un fragmento del mismo. De este modo, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab donde el dominio de unión a antígeno contiene dominios VH y VL asociados unidos covalentemente en sus extremos C con un dominio CH1 y CK, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo para proporcionar una región bisagra o una parte de un
45 dominio de región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab’, o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios CH2 y CH3 de anticuerpo.
Como se describe en el presente documento, los agentes de unión comprenden al menos una de estas CDR. Por ejemplo, una o más CDR pueden incorporarse en regiones marco conservadas de anticuerpos conocidas (IgG1, IgG2, etc.) o conjugarse con un vehículo adecuado para potenciar la semivida del mismo. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, Fc, polietilenglicol (PEG), albúmina, transferrina y similares. Estos y otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. Dichos péptidos de CDR conjugados pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica u otra. En una realización, uno o más polímeros solubles en agua están enlazados en una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino, de un agente de unión.
55 En ciertas realizaciones preferidas, un agente de unión comprende una o más uniones de polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitación, polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. En ciertas realizaciones, un agente de unión derivado comprende uno o más de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros. En ciertas realizaciones, uno o más polímeros solubles en agua están unidos aleatoriamente a una o más cadenas laterales. En ciertas realizaciones, PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica para un agente de unión, tal como un anticuerpo. Algunos de dichos procedimientos se
65 analizan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.133.426.
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Se apreciará que un agente de unión de la presente invención puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el agente de unión conserve especificidad de unión. Por lo tanto, están abarcadas dentro del alcance de la invención modificaciones de las estructuras de agentes de unión. Estas pueden incluir sustituciones de aminoácidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyen la capacidad de
5 unión esclerostina de un agente de unión. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar restos de aminoácidos de origen no natural, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o revertidas de restos de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativa también puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto normativo de modo que haya poco o ningún efecto en la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición.
Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácidos o miméticos de aminoácidos por un miembro de otra clase con diferentes propiedades físicas (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano
15 que son homólogas de anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.
Además, un experto en la materia puede generar variantes de ensayo que contengan una sustitución de aminoácidos sencilla en cada resto de aminoácido deseado. Las variantes pueden después explorarse usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes podrían usarse para recopilar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubriera que un cambio en un resto de aminoácido particular diera como resultado actividad destruida, reducida de forma indeseable o inadecuada, podrían evitarse variantes con dicho cambio. En otras palabras, basándose en información recopilada de dichos experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos donde deberían evitarse sustituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones.
25 Un experto en la materia será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas. En ciertas realizaciones, un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En ciertas realizaciones, se pueden identificar restos y partes de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. En ciertas realizaciones, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura polipeptídica.
35 Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de función estructural que identifican restos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de los restos de aminoácidos en una proteína que corresponden a restos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos restos de aminoácidos importantes predichos.
Un experto en la materia puede analizar también la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la materia puede predecir el alineamiento de restos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas realizaciones, un experto en la materia puede elegir no hacer cambios radicales a los aminoácidos que se ha
45 predicho que están en la superficie de la proteína, puesto que dichos restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas.
Se han dedicado varias publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Además, están disponibles en la actualidad programas informáticos para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en la realización de modelos de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tengan una identidad de secuencia mayor del 30% o similitud mayor del 40% tienen con frecuencia topologías
55 estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural proteica (PDB) ha proporcionado predictabilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que se ha resuelto un número de estructuras crítico, la predicción estructural se hará drásticamente más precisa.
Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen “reconocimiento de pliegues” (Jones, D., Curr., Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-19 (1996)), “análisis de perfil” (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat.
65 Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)) y “enlace evolutivo” (Véase Holm, mencionado anteriormente (1999) y Brenner, mencionado anteriormente (1997)).
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En ciertas realizaciones, las variantes de agentes de unión incluyen variantes de glicosilación donde el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. En ciertas realizaciones, las variantes comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación ligados a N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación ligado a N está caracterizado por la secuencia: Asn-X-Ser 5 o Asn-X-Thr, donde el resto de aminoácido designado como X puede ser cualquier resto de aminoácido excepto prolina. La sustitución de restos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidratos ligada a N. Como alternativa, las sustituciones que eliminen esta secuencia retirarán una cadena de carbohidratos ligada a N existente. También se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidratos ligadas a N donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación ligados a N (típicamente los que son de origen natural) y se crean uno o más nuevos sitios ligados a N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína donde uno o más restos de cisteína se suprimen de
o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína
15 generalmente tienen menos restos de cisteína que la proteína nativa, y típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la materia en el momento en que se deseen dichas sustituciones. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar restos importantes de anticuerpos para esclerostina, o por aumentar o reducir la afinidad de los anticuerpos para esclerostina descritos en el presente documento.
De acuerdo con ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar 25 complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. De acuerdo con ciertas realizaciones, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (en ciertas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (en ciertas realizaciones, en la parte del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). En ciertas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa puede típicamente no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparezca en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)), Introduction to
35 Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)) y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).
En ciertas realizaciones, los agentes de unión de la invención pueden enlazarse químicamente con polímeros, lípidos u otros restos.
Los agentes de unión pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura marco biocompatible comprende un polipéptido o parte del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable,
o marco, o armazón, que es capaz de presentar una o más secuencias de aminoácidos que se unen con un
45 antígeno (por ejemplo, CDR, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o “pliegue” polipeptídico (un motivo estructural) o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en relación con un polipéptido o pliegue de origen natural. Estos armazones pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como un ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.
Típicamente, las estructuras marco biocompatibles basadas en armazones proteicos o esqueletos distintos de dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden usarse las basadas en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de cinc CP1, PST1, superenrollamiento, LACI-D1, dominio Z y dominios
55 tendramisat (Véase por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
En realizaciones preferidas, se apreciará que los agentes de unión de la invención incluyen los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento. Pueden producirse anticuerpos humanizados tales como los descritos en el presente documento usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36(1): 35-42, 2005; Dall’Acqua WF, et al., Methods 36(1): 43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21 (8): 397-402, 2000).
Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que los agentes de unión adecuados incluyen partes de estos anticuerpos, tales como uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se desvela 65 específicamente en el presente documento. Al menos una de las regiones de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 pueden tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el agente de unión conserve
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la especificidad de unión de la CDR no sustituida. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica, en la que el agente de unión bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza la esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica en la que el agente de unión muestra un patrón de unión similar a los péptidos de esclerostina 5 humana en un “ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana” al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-C, Ab-D, Ab-2, Ab-3, Ab-11, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-21 y Ab-22, y/o neutralice esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesto de aminoácidos, en los que el agente de unión es una proteína de unión recombinante o un péptido sintético y la proteína de unión recombinante bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, en el que el agente de unión es una proteína de unión recombinante, y la proteína de unión recombinante muestra un patrón de unión similar a péptidos de esclerostina humana en el ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana (descritos posteriormente en el presente documento) al mostrado por al menos uno de los antcuerpos Ab-C, Ab-D, Ab-2, Ab-3, Ab-11, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, 15 Ab-18, Ab-21 y Ab-22, y/o neutraliza esclerostina. Cuando un anticuerpo comprende uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se ha descrito anteriormente, puede obtener por expresión a partir de una célula hospedadora que contiene ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica cada secuencia de CDR puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos de la CDR y sintetizarse junto con cualquier secuencia de ADN de región constante y marco de región variable de anticuerpo deseada usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos, mutagénesis dirigida y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado. Está ampliamente disponible para los expertos en la materia ADN que codifica las regiones constantes y marcos de región variable a partir de bases de datos de secuencias genéticas tales como GenBank. Cada una de las CDR anteriormente mencionadas se localizará típicamente en un marco de región variable en las posiciones 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) y 95-102 (CDR-H3) de la cadena pesada y las posiciones 24-34 (CDR
25 L1), 50-56 (CDR-L2) y 89-97 (CDR-L3) de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).
Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo puede propagarse y expresarse de acuerdo con cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos para escisión, ligación, transformación y transfección de ácido nucleico usando cualquier variedad de vectores de expresión conocidos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones puede preferirse la expresión de un fragmento de anticuerpo en un hospedador procariota, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178: 497-515). En ciertas otras realizaciones, puede preferirse la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo en una célula
35 hospedadora eucariota, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero) o células vegetales. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero sin limitación, mieloma (tal como una línea NSO de ratón), COS, CHO o células de hibridoma. Los ejemplos de células vegetales incluyen tabaco, maíz, soja y células de arroz.
Pueden prepararse uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o una bacteria, tal como E. coli, en la que se producirá producción del anticuerpo. Para obtener transcripción y traducción eficaz, la secuencia de ADN en cada vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y secuencia líder unidos 45 operativamente con la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos de este modo se conocen generalmente bien y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo, se describen procedimientos de biología molecular básica en Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Maniatis et al, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). Puede realizarse secuenciación de ADN como se describe en Sanger et al. (PNAS 74: 5463, (1977)) y el manual de secuenciación de plc de Amersham International, y puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154: 367-82 (1987); el manual de Anglian Biotechnology Ltd). Adicionalmente, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación y cultivo de células
55 apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).
Cuando se desee mejorar la afinidad de anticuerpos de acuerdo con la invención que contienen una o más de las CDR anteriormente mencionadas, puede obtenerse por varios protocolos de maduración de afinidad, incluyendo mantener las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), combinación de cadenas (Marks et al., Biotechnology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), presentación de fagos (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos
65 métodos de maduración de afinidad se analizan en Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
11
Pueden obtenerse otros anticuerpos de acuerdo con la invención mediante inmunización convencional y procedimientos de fusión de células como se describen en el presente documento y se conocen en la técnica. Pueden generarse anticuerpos monoclonales de la invención usando una diversidad de técnicas conocidas. En general, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos mediante métodos 5 conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256: 495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1: 2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes de Estados Unidos Nº RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Pueden derivarse fragmentos de anticuerpo de los mismos usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica u, opcionalmente, mediante digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Como alternativa, dichos fragmentos también pueden generarse mediante técnicas de ingeniería genética recombinante
15 como se describe en el presente documento.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando a un animal, por ejemplo, una rata, hámster, un conejo o preferentemente un ratón, incluyendo por ejemplo un transgénico o un knock-out, como se conoce en la técnica, con un inmunógeno que comprende esclerostina humana de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. La presencia de producción de anticuerpos específica puede supervisarse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo obteniendo una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que se une a esclerostina humana o péptido usando uno cualquiera de varios métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. De animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran células linfoides, más 25 habitualmente células del bazo o ganglio linfático, para obtener linfocitos B. Los linfocitos B se fusionan después con un compañero de fusión de célula de mieloma sensibilizado a fármaco, preferentemente uno que sea singénico con el animal inmunizado y que tenga opcionalmente otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad para expresar productos génicos de Ig endógenos, por ejemplo, P3X63 -Ag 8.653 (ATCC Nº CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, que son líneas celulares eucariotas inmortales. Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante varios minutos con un agente promotor de fusión de membrana, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y después sembrarse a baja densidad en un medio selectivo que apoye el crecimiento de células de hibridoma pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente una a dos semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias individuales, y pueden 35 ensayarse anticuerpos producidos por las células con respecto a actividad de unión con esclerostina humana, usando una cualquiera de una diversidad de inmunensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, mediante clonación de dilución limitada o mediante aislamiento en placa de agar suave) y se seleccionan y cultivan clones positivos que producen un anticuerpo específico para esclerostina. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de cultivos de hibridoma. Un método alternativo para producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, sensibilizado con pristano) para prolongar la formación de líquido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una diversidad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sepharose,
45 cromatografía de exclusión por tamaños y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Pueden purificarse anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, una anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo y una proteína de unión a TGF-beta, o fragmento o variante de los mismos.
Un anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos
55 monoclonales humanos pueden generarse por cualquier variedad de técnicas que resultarán familiares para los expertos habituales en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, transformación por Virus de Epstein Barr (VEB) de células de sangre periférica humana (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de linfocitos B humanos, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fago de región V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la técnica y basados en la divulgación del presente documento. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos de ratones transgénicos que se han modificado por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a presentación antigénica. Se describen métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos, por ejemplo, por Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994; Patente de
65 Estados Unidos Nº 5.877.397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera
12
amplifican usando cebadores nucleotídicos. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden obtenerse de fuentes disponibles en el mercado. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón, incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL y CL). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena 5 pesada o ligera, que pueden después insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse después en sistemas de expresión basados en
E. coli, levadura o mamífero. Pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla que contiene una fusión de los dominios VH y VL usando estos métodos (véase Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).
Una vez que se han obtenido células que producen anticuerpos de acuerdo con la invención usando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm del mismo de acuerdo con procedimientos convencionales como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos de los mismos pueden secuenciarse y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR pueden manipularse como se ha descrito previamente para generar otros anticuerpos
15 de acuerdo con la invención.
Preferentemente los agentes de unión se unen específicamente a esclerostina. Como con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la materia reconoce que los diversos restos con los que un agente de unión no debería unirse de forma detectable para ser terapéuticamente eficaz y adecuado serían extensos y difíciles de numerar. Por lo tanto, para un agente de unión divulgado en el presente documento, la expresión “se une específicamente” se refiere a la capacidad de un agente de unión para unirse a esclerostina, preferentemente esclerostina humana, con mayor afinidad que se une a una proteína de control no relacionada. Preferentemente la proteína de control es lisozima de clara de huevo de gallina. Preferentemente los agentes de unión se unen a esclerostina con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por
25 una proteína de control. Un agente de unión puede tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10-10 M, menor de o igual a 1 x 10-11 M o menor de o igual a 1 x 10-12 M.
La afinidad puede determinarse por un ensayo de ELIA de afinidad. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un ensayo de BIAcore. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método cinético. En ciertas realizaciones, la afinidad puede determinarse por un método de equilibrio/solución. Dichos métodos se describen en más detalle en el presente documento o se conocen en la técnica.
Los agentes de unión a esclerostina de la presente invención preferentemente modulan la función de esclerostina en el ensayo basado en células descrito en el presente documento y/o el ensayo in vivo descrito en el presente
35 documento y/o se unen a uno o más de los epítopos descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada la unión de uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. En consecuencia, dichos agentes de unión pueden identificarse usando los ensayos descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, se generan agentes de unión identificando en primer lugar anticuerpos que se unan a uno o más de los epítopos proporcionados en el presente documento y/o se neutralizan en los ensayos basados en células y/o in vivo descritos en esta solicitud y/o bloquean de forma cruzada los anticuerpos descritos en el presente documento y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpos se usan después para insertar en marcos biocompatibles
45 apropiados para generar agentes de unión a esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, o puede ser una molécula no proteica. Los ensayos descritos en el presente documento permiten la caracterización de agentes de unión. Preferentemente, los agentes de unión de la presente invención son anticuerpos como se definen en el presente documento.
Se entenderá por un experto en la materia que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden experimentar una diversidad de modificaciones postraduccionales. El tipo y alcance de estas modificaciones depende con frecuencia de la línea celular hospedadora usada para expresar la proteína así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto
55 básico carboxilo-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).
Se describen posteriormente anticuerpos denominados Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1. “HC” se refiere a la cadena pesada y “LC” se refiere a la cadena ligera. Para algunos anticuerpos posteriores, las CDR están sombreadas en cajas y las regiones constantes (C) se muestran en negrita y cursiva.
Ab-D
El anticuerpo D (también denominado en el presente documento Ab-D y Mab-D) es un anticuerpo de ratón que 65 muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-D se muestra en la Figura 18.
14
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena ligera de Ab-D:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-D es la siguiente:
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-D incluyendo el péptido señal es la siguiente:
Secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-D incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal:
15
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena pesada HC de Ab-D es la siguiente:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-D es:
16
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-D incluyendo el péptido señal es:
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-D incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
17
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-D son las siguientes:
5 CRD-H1: DHYMS (SEQ ID NO: 39) CDR-H2: DINPYSGETTYNQKFKG (SEQ ID NO: 40) CDR-H3: DDYDASPFAY (SEQ ID NO: 41)
10 Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-D son:
CDR-L1: QASQGTSINLN (SEQ ID NO: 42) CDR-L2: GSSNLED (SEQ ID NO: 43) CDR-L3: LQHSYLPYT (SEQ ID NO: 44)
15 Ab-C
El anticuerpo C (también denominado en el presente documento Ab-C y Mab-C) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-C se muestra en la Figura 17.
20 La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la Cadena Ligera de Ab-C es la siguiente:
18
Cadena pesada de Ab-C La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es:
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es la siguiente:
20
- Tabla 1
- SEQ ID NO
- DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
- 56
- CDR-L3 de Ab-A y Ab-1 QGAYNDVIYA
- 51
- CDR-H1 de Ab-A y Ab-1 SYWMN
- 52
- CDR-H2 de Ab-A y Ab-1 TIDSGGRTDYASWAKG
- 53
- CDR-H3 de Ab-A y Ab-1 NWNL
- 60
- CDR-L1 de Ab-B SASSSVSFVD
- 61
- CDR-L2 de Ab-B RTSNLGF
- 62
- CDR-L3 de Ab-B QQRSTYPPT
- 57
- CDR-H1 de Ab-B TSGMGVG
- 58
- CDR-H2 de Ab-B HIWWDDVKRYNPVLKS
- 59
- CDR-H3 de Ab-B EDFDYDEEYYAMDY
- 48
- CDR-L1 de Ab-C KASQSVDYDCDSYMN
- 49
- CDR-L2 de Ab-C AASNLES
- 50
- CDR-L3 de Ab-C QQSNEDPWT
- 45
- CDR-H1 de Ab-C DCYMN
- 46
- CDR-H2 de Ab-C DINPFNGGTTYNQKFKG
- 47
- CDR-H3 de Ab-C SHYYFDGRVPWDAMDY
- 42
- CDR-L1 de Ab-D QASQGTSINLN
- 43
- CDR-L2 de Ab-D GSSNLED
- 44
- CDR-L3 de Ab-D LQHSYLPYT
- 39
- CDR-H1 de Ab-D DHYMS
- 40
- CDR-H2 de Ab-D DINPYSGETTYNQKFKG
- 41
- CDR-H3 de Ab-D DDYDASPFAY
- 275
- CDR-L1 de Ab-2 RASSSVYYYMH
- 276
- CDR-L2 de Ab-2 ATSNLAS
- 277
- CDR-L3 de Ab-2 QQWSSDPLT
- 287
- CDR-H1 de Ab-2 DYFIH
- 288
- CDR-H2 de Ab-2 RLDPEDGESDYAPKFQD
- 289
- CDR-H3 de Ab-2 EDYPGTYTFFPY
- 278
- CDR-L1 de Ab-3 y Ab-15 SVSSTISSNHLH
- 279
- CDR-L2 de Ab-3 y Ab-15 GTSNLAS
- 280
- CDR-L3 de Ab-3 y Ab-15 QQWSSYPLT
- 290
- CDR-H1 de Ab-3 y Ab-15 DFYLH
- 291
- CDR-H2 de Ab-3 y Ab-15 RIDPENGDTLYPPKFQD
- 292
- CDR-H3 de Ab-3 y Ab-15 EADYFHDGTSYWYFDV
- 78
- CDR-L1 de Ab-4 y Ab-5 RASQDISNYLN
- 79
- CDR-L2 de Ab-4 y Ab-5 YTSRLLS
- 80
- CDR-L3 de Ab-4 y Ab-5 QQGDTLPYT
- 245
- CDR-H1 de Ab-4 y Ab-5 DYIMH
- 246
- CDR-H2 de Ab-4 y Ab-5 EINPIVSGGAQYNQKFKG
- 247
- CDR-H3 de Ab-4 y Ab-5 LGYDDIYDI7WYFDV
- 81
- CDR-L1 de Ab-6 RASQDISNYLN
- 99
- CDR-L2 de Ab-6 YTSRLHS
- 100
- CDR-L3 de Ab-6 QQGDTLPYT
- 248
- CDR-H1 de Ab-6 DYNMH
- 249
- CDR-H2 de Ab-6 EINPNSGGSGYNQKFKG
- 250
- CDR-H3 de Ab-6 LVYDGSYEDWYFDV
- 101
- CDR-L1 de Ab-7 RASQVITNYLY
- 102
- CDR-L2 de Ab-7 YTSRLHS
- 103
- CDR-L3 de Ab-7 QQGDTLPYT
- 251
- CDR-H1 de Ab-7 DYNMH
- 252
- CDR-H2 de Ab-7 CDR-H2 de Ab-7 EINPNSGGAGYNQQFKG
- 253
- CDR-H3 de Ab-7 LGYVGNYEDWYFDV
105 106
- Tabla 1
- SEQ ID NO
- DESCRICIPCIÓN SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
- 104
- CDR-L1 de Ab-8 RASQDISNYLN
- 105
- CDR-L2 de Ab-8 YTSRLLS
- 106
- CDR-L3 de Ab-8 QQGDTLPYT
- 254
- CDR-H1 de Ab-8 DYIMH
- 255
- CDR-H2 de Ab-8 EINPNSGGAGYNQKFKG
- 256
- CDR-H3 de Ab-8 LGYDDIYDDWYFDV
- 107
- CDR-L1 de Ab-9 RASQDISNYLN
- 108
- CDR-L2 de Ab-9 YTSRLFS
- 109
- CDR-L3 de Ab-9 QQGDTLPYT
- 257
- CDR-H1 de Ab-9 DYNMH
- 258
- CDR-H2 de Ab-9 EINPNSGGAGYNQKFKG
- 259
- CDR-H3 de Ab-9 LOYDDIYPDWYTDV
- 110
- CDR-L1 de Ab-10 RASQDISNYLN
- 111
- CDR-L2 de Ab-10 YTSRLLS
- 112
- CDR-L3 de Ab-10 QQGDTLPYT
- 260
- CDR-H1 de Ab-10 DYIMH
- 261
- CDR-H2 de Ab-10 EINPNSGGAGYNQKFKG
- 262
- CDR-H3 de Ab-10 LGYDDIYDDWYFDV
- 281
- CDR-L1 de Ab-11 y Ab-16 RASSSISYIH
- 282
- CDR-L2 de Ab-11 y Ab-16 ATSNLAS
- 283
- CDR-L3 de Ab-11 y Ab-16 QQWSSDPLT
- 293
- CDR-H1 de Ab-11 y Ab-16 DYYIH
- 294
- CDR-H2 de Ab-11 y Ab-16 RVDPDNGETEFAPKFPG
- 295
- CDR-H3 de Ab-11 y Ab-16 EDYDGTYTWFPY
- 113
- CDR-L1 de Ab-12 RASQDISNYLN
- 114
- CDR-L2 de Ab-12 YTSTLQS
- 115
- CDR-L3 de Ab-12 QQGDTLPYT
- 263
- CDR-H1 de Ab-12 DYNMH
- 264
- CDR-H2 de Ab-12 EDNPNSGGSGYNQKFKG
- 265
- CDR-H3 de Ab-12 LGYYGNYEDWYFDV
- 284
- CDR-L1 de Ab-13 y Ab-14 RASSSVTSSYLN
- 285
- CDR-L2 de Ab-13 y Ab-14 QQYDFFPST
- 286
- CDR-L3 de Ab-13 y Ab-14 DYYMN
- 296
- CDR-H1 de Ab-13 y Ab-14 DYYMN
- 297
- CDR-H2 de Ab-13 y Ab-14 DINPYNDDTTYNHKFKG
- 298
- CDR-H3 de Ab-13 y Ab-14 ETAVITTNAMD
- 116
- CDR-L1 de Ab-17 y Ab-18 SVSSSISSSNLH
- 237
- CDR-L2 de Ab-17 y Ab-18 GTSNLAS
- 238
- CDR-L3 de Ab-17 y Ab-18 QQWTTTYT
- 266
- CDR-H1de Ab-17 y Ab-18 CDR-H1 DYYIH
- 267
- CDR-H2 de Ab-17 y Ab-18 RIDPDNGESTYVPKFQG
- 268
- CDR-H3 de Ab-17 y Ab-18 EGLDYGDYYAVDY
- 239
- CDR-L1 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 RASQDISSYLN
- 240
- CDR-L2 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 STSRLNS
- 241
- CDR-L3 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 QQDIKHPT
- 269
- CDR-H1 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 DYIMH
- 270
- CDR-H2 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 YINPYNDDTEYNEKFKG
- 271
- CDR-H3 de Ab-19, Ab-20 y Ab-23 SIYYYDAPFAY
- 242
- CDR-L1 de Ab-21 y Ab-22 KASQDVFTAVA
- 243
- CDR-L2 de Ab-21 y Ab-22 WASTRHT
- 244
- CDR-L3 de Ab-21 y Ab-22 QQYSSYPLT
- 272
- CDR-H1 de Ab-21 y Ab-22 DYYMH
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-
imagen1 imagen2
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