CN116554323A - 人源化抗il21抗体的开发和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗IL21抗体或其抗原结合片段；还提供了抗IL21抗体或其抗原结合片段作为IL21抑制剂的用途，以及在制备组合物、偶联物和试剂盒中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，具体涉及抗白细胞介素21(Interleukin-21，IL21)抗体及其应用，还涉及包含所述抗体的组合物、偶联物和试剂盒。
背景技术
白细胞介素21(IL21)是一种主要由卵泡辅助性T(Tfh)和T辅助17(Th17)细胞产生的自分泌细胞因子，在免疫应答中具有重要作用。通过与IL21受体(IL21R)结合，IL21可以促进Tfh和Th17细胞的增殖和发育、平衡辅助T细胞亚群、诱导B细胞增殖分化为浆细胞以及促进免疫球蛋白的产生。IL21的这些生理功能主要是通过JAK/STAT、MAPK和PI3K信号通路介导的。而IL21的靶基因，例如B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(Blimp-1)、细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)、CXCR5和Bcl6，在体液免疫反应中起重要作用。IL21对B细胞的增殖、分化、成熟和凋亡具有正反两方面的作用，这取决于信号激活途径和B细胞的共同刺激信号。
在系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、1型糖尿病(T1D)、免疫性血小板减少症(ITP)、原发性干燥综合征(pSS)、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)及银屑病患者中，外周血或组织内IL21水平明显高于健康人。这种升高的IL21水平与SLE和RA患者的Tfh细胞、浆细胞、自身抗体及疾病活性呈正相关。这些证据表明，IL21在自身免疫性疾病、过敏、炎症性疾病和癌症中起着多种作用。
IL21被认为是系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎(RA)，1型糖尿病(TID)和癌症治疗中特别有吸引力的靶标。近些年，阻断IL21信号通路已被用于SLE，RA，T1D和银屑病小鼠模型的治疗方案研究。在SLE的小鼠模型中封闭IL21R治疗可显著降低狼疮症状，减轻器官组织损害，提高生存率；中和IL21治疗可减少自身抗体水平，提高生存率。在RA的小鼠模型中封闭IL21R治疗可减少关节组织的炎性细胞浸润，减轻疾病严重程度。在T1D的小鼠模型中封闭IL21R治疗可降低疾病发生率，减少自身反应性免疫细胞。在银屑病的小鼠模型中，中和IL21治疗可抑制角质形成细胞增殖并下调炎症因子。在小鼠的疾病模型中，阻断IL21信号通路的治疗方案具有症状改善和发病率降低的显著疗效。
在体外实验中，中和IL21或封闭IL21R均可抑制自身抗体产生并减少炎症因子释放。一项临床研究发现，抗IL21抗体可以线性药代动力学改善RA疾病活动性，而高水平的抗IL21抗体可导致感染风险和皮肤过敏反应的增加。另一项临床研究发现，在健康人中由于抗药物抗体的作用，抗IL21抗体展现出高免疫原性、低生物利用度和快速清除率。
综上所述，以IL21作为靶点是自身免疫性疾病治疗的新方向，特别是以B细胞、自身抗体异常为主要发病机制的自身免疫病。但现有的抗IL21抗体和IL21R封闭蛋白存在免疫原性高、亲和力有限、生物利用度低以及治疗效果未达到预期的问题。针对同一靶点不同抗体的氨基酸序列存在差异，使抗体可能具有不同的亲和力、功能活性以及成药的可开发性。有鉴于此，本发明目的在于提供免疫原性低、特异性高、亲和力强、中和活性更佳的人源化抗IL21单克隆抗体，其氨基酸序列不同于现有抗IL21抗体。本发明有助于针对IL21靶点治疗策略的进一步发展，并提供更多临床治疗和科研检测的选择。
发明内容
为解决前述问题，本发明提供了以下多个方面的内容，包括免疫原性低、特异性高、亲和力强、中和活性更佳的抗IL21抗体等。
第一个方面，本发明提供了抗IL21抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区包含：
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:6、16、26、36、41、51、56或其变体所示的重链CDR1，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:7、17、27、42、52、63、72或其变体所示的重链CDR2，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:8、18、28、43、53、57或其变体所示的重链CDR3；
所述轻链可变区包含：
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:11、21、31、46、85、88、97、100、103、106、109或其变体所示的轻链CDR1，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:12、22、32、47、60或其变体所示的轻链CDR2，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:13、23、33、48或其变体所示的轻链CDR3。
进一步地，本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段中，所述重链可变区包含：选自如氨基酸序列SEQ ID NO:4、14、24、34、39、49、54、61、64、66、68、70、73、75、77、79或81所示的序列，
所述轻链可变区包含：选自如氨基酸序列SEQ ID NO:9、19、29、37、44、58、83、86、89、91、93、95、98、101、104或107所示的序列。
优选地，本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段，包含选自以下任一重链可变区和轻链可变区对：
(a)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:6-8的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:11-12的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:16-18的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:21-23的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:26-28的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:31-33的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:36、17、18的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:21-23的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:41-43的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:46-48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:51-53的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:21-23的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、42、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:46、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:26、63、28的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:85、32、33的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:26、63、28的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:88、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:46、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列
(k)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:97、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:100、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(m)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:103、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列
(n)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、42、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:106、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(o)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、42、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:109、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
最优选地，本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段，包含选自以下任一重链可变区和轻链可变区的组合：
(a)分别由SEQ ID NO:4与9所示的重链可变区和轻链可变区，
(b)分别由SEQ ID NO:14与19所示的重链可变区和轻链可变区，
(c)分别由SEQ ID NO:24与29所示的重链可变区和轻链可变区，
(d)分别由SEQ ID NO:34与37所示的重链可变区和轻链可变区，
(e)分别由SEQ ID NO:39与44所示的重链可变区和轻链可变区，
(f)分别由SEQ ID NO:49与37所示的重链可变区和轻链可变区，
(g)分别由SEQ ID NO:54与58所示的重链可变区和轻链可变区，
(h)分别由SEQ ID NO:61与83所示的重链可变区和轻链可变区，
(i)分别由SEQ ID NO:64与86所示的重链可变区和轻链可变区，
(j)分别由SEQ ID NO:66与89所示的重链可变区和轻链可变区，
(k)分别由SEQ ID NO:68与91所示的重链可变区和轻链可变区，
(l)分别由SEQ ID NO:70与93所示的重链可变区和轻链可变区，
(m)分别由SEQ ID NO:73与95所示的重链可变区和轻链可变区，
(n)分别由SEQ ID NO:75与98所示的重链可变区和轻链可变区，
(o)分别由SEQ ID NO:77与101所示的重链可变区和轻链可变区，
(p)分别由SEQ ID NO:79与104所示的重链可变区和轻链可变区，
(q)分别由SEQ ID NO:81与107所示的重链可变区和轻链可变区。
本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段，轻链可变区的骨架区来源于人胚系轻链基因IMGT_hVK1-33或IGKJ2*01，重链可变区的骨架区来源于人胚系重链基因IMGT_hVH1-69或IGHJ4*01。
本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段可以阻断IL21与IL21R结合。
进一步地，本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段优选为抗人和食蟹猴IL21的抗体或其抗原结合片段。
第二个方面，本发明提供了抗IL21抗体或其抗原结合片段作为白细胞介素21抑制剂的用途。
第三个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段；进一步地，该试剂盒为以下任一：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)、荧光免疫试剂盒和微流体芯片。
第四个方面，本发明提供了结合物，其通过本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段经化学标记或生物标记制备；进一步地，所述化学标记为荧光素、同位素、免疫毒素和/或化学药物，所述生物标记为特异性抗体、生物素、亲和素或酶标记。
第五个方面，本发明提供了偶联物，其通过将本发明的抗IL21抗体或其抗原结合片段与固体介质或半固体介质偶联制得；进一步地，还提供了偶联物在制备用于中和IL21的免疫吸附柱中的用途，以及制备用于免疫亲和纯化天然IL21的微珠中的用途。
第六个方面，本发明提供了第一个方面描述的抗IL21抗体或其抗原结合片段，或第四个方面描述的结合物在制备用于降低IL21水平的试剂和/或药物中的用途。
第七个方面，本发明提供了第一个方面描述的抗IL21抗体或其抗原结合片段在制备诊断和/或治疗自身免疫性疾病的试剂和/或药物中的用途。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：人IL21及食蟹猴IL21蛋白SDS-PAGE结果图；
图2：人IL21R蛋白非还原SDS-PAGE结果图；
图3：IFNγ释放实验评价IL21蛋白功能活性结果图；
图4：人鼠嵌合抗人IL21单克隆抗体报告基因检测结果图；
图5：人鼠嵌合抗人IL21单克隆抗体PBMCs STAT3磷酸化检测结果图；
图6：人源化抗IL21抗体报告基因检测结果图；
图7：人源化抗IL21抗体细胞增殖检测结果图；
图8：人源化抗IL21抗体PBMCs STAT3磷酸化检测结果图；
图9：人源化抗IL21抗体抑制活化的CD4+T细胞诱导浆细胞分化的流式细胞学检测结果图；
图10：人源化抗IL21抗体抑制活化的CD4+T细胞诱导CD19+B细胞分泌IgG2的ELISA检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在一个方面，本文提供的是特异性结合IL21(例如，人和食蟹猴IL21)的抗体(例如，单克隆抗体)及其抗原结合片段。在具体的方面，本文提供的是特异性结合人IL21的单克隆抗IL21抗体，其中所述抗IL21抗体包括亲本抗体的变体。在具体的方面，本文提供的是特异性结合IL21(例如，人和食蟹猴IL21)的抗体。在特定的方面，本文提供的是包含一个或更多个氨基酸残基修饰(包括替换、缺失等)的抗IL21抗体(例如，重链可变区的骨架区中1-13个氨基酸取代)，与没有所述修饰的亲本抗体相比，其保持与抗原的亲和力。在某些方面，在体内或在体外、或在体内与在体外两者，这样的抗IL21抗体阻断IL21与IL21R的结合。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或抗原结合片段可以包含不是天然存在于动物或哺乳动物(例如，人类)体内的抗体种系全集之内的序列。
如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
在本文的上下文中，“阻断IL21与IL21R结合”是指阻断或部分阻断IL21与IL21R的结合，部分阻断例如可以将IL21与IL21R结合产生的效应降低至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
就抗体链多肽序列而言，短语“基本相同”可理解为表现出与参照多肽序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的抗体链。就核酸序列而言，该术语可理解为表现出与参照核酸序列至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列。
序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。
抗体或抗原的“功能片段、变体、衍生物或类似物”等以及它们的多种形式等短语和术语是指具有与全长目的抗体或抗原在性质上相同的生物活性的化合物或分子。
如本文所用，术语“抗体”被用于最宽泛的含义，具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、携带一个或多个CDR或源自CDR序列的抗体片段或合成多肽，只要这些多肽表现出所需的生物活性。“抗体”也可指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区，保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段，例如抗肿瘤干细胞抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员(“类型”和“种类”、以及“亚型”和“亚类”在本文中可互换使用)。天然或野生型(即得自未人工操纵的群体成员)抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条重链的一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链的一端具有可变结构域(VL)，另一端具有恒定结构域。所谓“未人工操纵”意指未经旨在使其含有或表达外来抗原结合分子的处理。野生型可指一个群体中发现的最普遍的等位基因或种类或指得自未人工操纵动物的抗体，相比较于等位基因或多态型，或得自以某种形式的操纵例如诱变、使用重组方法等改变该抗原结合分子的氨基酸的变体或衍生物。
正如本文所使用，“抗IL21抗体”意指可特异性结合IL21的抗体或源自这些抗体的多肽(衍生物)，其包括但不限于抑制或实质降低IL21与其受体结合的分子。
就抗体的可变结构域而言，术语“可变”系指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些部分，且被用于针对其特异靶点的特定抗体的特异识别和结合。但是，可变性在抗体的整个可变结构域内不是均匀分布的。可变性集中在被称为互补决定区域(CDRs；即CDR1、CDR2和CDR3)或高变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变结构域内。可变结构域内保守程度更高的部分被称为骨架(FR)区或构架序列。天然重链和轻链的每个可变结构域均包括四个FR区，其主要采用β-折叠构型，它们籍三个CDRs连接起来，CDRs形成环，所述环连接β-折叠结构并在某些情形下形成部分的β-折叠结构。每条链的CDRs通常被FR区连接起来，并且借助于来自其它链的CDR，有助于抗体靶结合位点(表位或决定簇)的形成(参看Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，NationalInstitute ofHealth，Bethesda，MD(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统而进行的，除非另有说明。一个CDR可具有特异结合关联表位的能力。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合片段的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant AntibodiesforCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型地包含至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体骨架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合抗原的抗体。“功能片段”或“抗IL21抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段”含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab’)2等等。“Fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用，以确定VH-VL二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个CDRs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的CDRs的Fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。
“单链Fv”、“dsFv”或“scFab”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域位于单条多肽链上。一般而言，所述Fv多肽还包括一段位于VH和VL区域之间的多肽连接体，其通常为柔性分子，可使dsFv形成适合于靶结合的所需结构。
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)而产生的细胞或细胞系。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，Harlow&Lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)、两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和生物活性的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。引入的突变通常为保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1个或2个氨基酸突变的抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域，其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和骨架区(FR)，CDR是抗原结合位点/抗原结合结构域的组成部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”和“抗原结合位点(antigen-binding site)”同义地用来指识别并与同种(cognate)抗原相互作用的抗体结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点，每个抗原结合位点包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补决定区(CDR)。
如本文所用，VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分，从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分，从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过和抗原之间的非共价相互作用与抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是游离的抗原或存在于细胞表面的抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的。例如BIAcore系统(仪器及软件)基于光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)原理，实时记录分子结合和解离过程中传感芯片表面分子质量发生的变化，从而实时监测分子间相互作用。通过数据分析软件获得抗体与配体之间的结合速率常数(association rate constant，ka)、解离速率常数(dissociationrate constant，kd)和平衡解离常数(dissociation equilibrium constant，KD)。
如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位，由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者，在第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低，可以但不必需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体结合的情况中，无论是相同、更高或更低程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其片段)，本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。
如本文所用，“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用。
“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”指所述蛋白质、多肽或抗体(1)不与在其天然状态下伴随的天然相关成分进行关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在天然条件下出现。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分"分离"。还可通过分离使蛋白质实质上不含天然相关成分，即通过本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
在肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行氨基酸取代而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,MolecularBiology ofthe Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以通过分子克隆技术制备获得，分离的核酸分子不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。
本文所述序列表中所述序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。这些保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。例如，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及PCR介导的诱变)将修饰引入本文所述的序列中。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基家族是本领域已有定义的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗IL21抗体中非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知(例如，参见Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:412-417(1997))。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，例如测定宿主细胞产生多肽质量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物或细胞培养基上清中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)细胞、各种非洲绿猴肾细胞(COS细胞)、HeLa细胞、人胚胎肾细胞(HEK细胞)例如HEK293细胞、大肠杆菌DH5α。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通过限制酶切和连接或通过同源重组可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括调控序列、启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。
实施例1：抗人IL21单克隆抗体的制备
分别合成人IL21(Gene ID:59067,Protein ID:NP_068575.1)和食蟹猴(Macacafascicularis/crab-eating macaque)IL21(Gene ID:102130762,Protein ID:XP005555921.1)cDNA序列(pUC57-hIL21、pUC57-cyIL21，Genewiz)并作为模板，PCR扩增人IL21(His25-Ser162)或食蟹猴IL21(His25-Ser162)，C端与6×His融合构建重组表达载体。瞬转入HEK293F细胞进行表达，收集细胞培养上清按说明书进行镍柱亲和纯化(GE Life，17371202)。表达得到人及食蟹猴IL21(His)重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，SDS-PAGE结果如图1所示。
类似地，合成人IL21R基因pUC57-hIL21R(GENEWIZ)并作为模板，PCR扩增人IL21R(Cys20-Pro236)，C端与小鼠IgG2a Fc融合，构建重组表达载体。瞬转入HEK293F细胞进行表达，收集细胞培养上清按说明书进行Protein G纯化(碧云天，P2053)。表达得到人IL21R(mFc)双价重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SDS-PAGE结果如图2所示。
人IL21蛋白：
人IL21(Protein ID:NP_068575.1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
hksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
食蟹猴IL21蛋白：
食蟹猴IL21(Protein ID:XP 005555921.1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
hksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndldpeflpapedvetncewsaiscfqkaqlksantgnneriinlsikklkrkspstgaerrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
人IL21R蛋白：
人IL21R(Protein ID:AAG29346.1)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
cpdlvcytdylqtvicilemwnlhpstltltwqdqyeelkdeatscslhrsahnathatytchmdvfhfmaddifsvnitdqsgnysqecgsfllaesikpappfnvtvtfsgqyniswrsdyedpafymlkgklqyelqyrnrgdpwavsprrklisvdsrsvsllplefrkdssyelqvragpmpgssyqgtwsewsdpvifqtqseelkegwnp
此外，纯化得到人IL21蛋白与商业化人IL21蛋白(Novoprotein，CC45)通过诱导NK-92细胞(Pricella，CL-0530)释放IFNγ实验评价功能活性。NK-92是人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞衍生来的一株IL2依赖型NK细胞株，其生长及功能依赖人IL2细胞因子。处于对数生长期的NK-92细胞通过饥饿处理消除人IL2作用后加入人IL21刺激48小时，收取培养基上清，使用Human IFNγELISA Set(BD，555142)检测细胞培养上清中IFNγ分泌水平。结果如图3所示，表达的人IL21蛋白可有效刺激IFNγ释放，且高浓度刺激水平与商业化人IL21蛋白相当。纯化得到的人IL21蛋白具有功能活性可用于免疫小鼠。
1.2小鼠免疫及细胞融合
使用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，多次进行人IL21蛋白注射及血清抗体效价检测(具体方法见1.3)。首次免疫使用50μg人IL21蛋白与50μL弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化液，多点皮下注射。首次免疫后每两周进行一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂(Sigma公司，F5506)替代弗氏完全佐剂。第三次加强免疫开始，进行血清抗体效价检测，细胞融合前3天，选择对人IL21蛋白具有阻断活性且亲和力高的小鼠腹腔注射50μg人IL21蛋白进行冲击免疫。
颈椎脱臼法处死小鼠，取淋巴结及脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞混合，采用ECM 2001电融合仪(BTX)进行细胞融合。融合后细胞用含HAT(Sigma，H0262-10VL)的RPMI 1640完全培养基(以下简称HAT完全培养基)进行连续筛选培养，第3天用新鲜HAT完全培养基进行半量换液，第5天用含HT(Sigma，H0137-10VL)的RPMI 1640完全培养基(以下简称HT完全培养基)进行全换液。融合后第7天，取培养基上清进行亲和力检测及阻断性检测(具体方法见1.3及1.4)，选择同时具有亲和力及阻断活性的杂交瘤细胞母克隆以HT完全培养基进行有限稀释，获得单克隆杂交瘤细胞。待单细胞克隆生长形成，扩大培养并再次进行亲和力及阻断性检测。进一步地，对培养基上清中抗体进行Protein G纯化，通过Ba/f3-hIL21R-STAT3报告基因实验，以及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中STAT3磷酸化实验检测杂交瘤细胞产生抗体的中和活性(具体方法见实施例4.1及4.3)。选择抗体具有中和活性的单克隆杂交瘤细胞提取mRNA并冻存保种。
1.3 ELISA检测抗体亲和力
用0.05M pH9.0碳酸氢盐缓冲液配置2μg/mL人IL21抗原蛋白、2μg/mL食蟹猴IL21蛋白于酶标板(Costar，9018)中4℃包被过夜。用PBS配置2％脱脂牛奶室温封闭1小时，小鼠血清用PBS配置1％BSA进行梯度稀释，细胞培养上清不进行稀释，阳性对照为avizakimab类似物(参考专利US10588969B2)，阴性对照为样本稀释液，待测样本室温孵育1小时。样本检测抗体为Goat anti-mouse IgG Fc HRP(Jackson ImmunoResearch，115-035-071)，阳性对照检测抗体为Goat anti-human IgG Fc HRP(Jackson ImmunoResearch，109-035-098)。TMB显色液(Sigma，T2885)室温避光显色10-15分钟，加入2M硫酸终止反应，放入酶标仪中读取OD450nm吸光度。
1.4 ELISA检测抗体阻断性
用0.05M pH9.0碳酸氢盐缓冲液稀释2μg/mL人IL21R蛋白于酶标板中4℃包被过夜。用PBS配置2％脱脂牛奶室温封闭1小时。使用EZ-Lin Sulfo NHS-LC-LC-生物素(ThermoScientific，A35358)按说明书对人IL21蛋白(Novoprotein，CC45)进行偶联。1％BSA配置终浓度0.01μg/mL生物素标记的人IL21蛋白，分别与1％BSA梯度稀释的小鼠血清或等体积的细胞培养上清原液37℃预孵育1小时，阳性对照为3μg/mL avizakimab类似物，阴性对照为样本稀释液。待测样本与IL21的混合物加入ELISA板室温孵育2小时，检测抗体为Streptavidin-HRP(Jackson ImmunoResearch，016-130-084)，用PBS配置0.5％脱脂牛奶按说明书稀释后室温孵育1小时。TMB显色液(Sigma，T2885)室温避光显色10-15分钟，加入2M硫酸终止反应，放入酶标仪中读取OD450nm吸光度。
实施例2：抗人IL21单克隆抗体的分子克隆及人源化改造
2.1抗人IL21单克隆抗体的分子克隆
根据筛选结果，取生长良好的阳性单克隆杂交瘤细胞使用Trizol(生工，B610409)常规方法获得总mRNA，通过逆转录试剂盒(Invitrogen，18080051)获得总cDNA。以此为模板扩增抗体的可变区序列，得到候选阳性单克隆抗体的重链和轻链可变区序列见下表。
表1、抗IL21鼠源抗体的可变区序列
克隆：14G7
14G7重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码核酸如SEQ ID NO.5所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.6、7、8所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYTINWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTAYNQKF
KGKATLTV
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCARRGANYYDYEDWFAYWGQGTLVTVSA
核酸序列
CAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCT
GCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACACCATAAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAA
GAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATGGTGGTACTGCCTACAACCAGAAGTTC
AAGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTC
TGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTTTGTGCAAGAAGAGGGGCCAACTACTATGATTACGA
AGACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
14G7轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其编码核酸如SEQ ID NO.10所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.11、12、13所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
QIVLSQSPAIMSASPGERVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTVNLASGVPARFSGS
GSGTSYSL
--FR3--------->CDR3<---FR4--->
TISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLEIK
核酸序列
CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAGGGTCACCATATCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCGCACAGTCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACGATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTATCACAGTTATCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
15D11克隆：
15D11重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，其编码核酸如SEQ ID NO.15所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.16、17、18所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<------
EVQLVESGGGLVNPGGSLKLSCAASGITFSNNAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGNTYYPDSVK
GRFAISRD
---------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DARNILYLQMTSLRSEDTAMYYCARVPVVADWNFDVWGAGTTVTVSS
核酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAATCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCACTTTCAGTAACAATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAATACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGATGATGCCAGGAACATCCTATACTTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGTCCCAGTAGTAGCTGACTGGAACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
15D11轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，其编码核酸如SEQ ID NO.20所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.21、22、23所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<-----------
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPA
RFSGSGSG
--FR3-------------->CDR3<---FR4--->
TDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLELK
核酸序列
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGCTGAAA
18B10克隆：
18B10重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，其编码核酸如SEQ ID NO.25所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.26、27、28所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
EIQLVQSGAELVRPGASVMLSCKASGYSFTTYYIVWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETELHQKF
KDKATLTV
---------FR3------------->CDR3<---FR4--->
DASSTTAYIQLSSPTSEDSAVYYCARGDGYYLFALDYWGQGTSVTVSS
核酸序列
GAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGATGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACTCCTTCACCACCTACTATATAGTCTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGCATGATTCATCCTTCCGATAGTGAAACTGAGTTACATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACGCATCCTCCACCACAGCCTACATACAACTCAGTAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGATGGTTACTACCTCTTTGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
18B10轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，其编码核酸如SEQ ID NO.30所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.31、32、33所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<----------
DVVMTQTPLSLPVNIGDQASISCKSTKSLLNSDGFTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLVSNRFSGVP
DRFSGSGS
---FR3-------------->CDR3<---FR4--->
GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQSNYLPLTFGAGTKLEIK
核酸序列
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGCCTGTCAATATTGGAGATCAAGCCTCTATCTCTTGCAAGTCTACTAAGAGTCTTCTGAATAGTGATGGATTCACTTATTTGGACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTAATATATTTGGTTTCTAATCGATTTTCTGGAGTTCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTTCCAGAGTAACTATCTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
18C2克隆：
18C2重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，其编码核酸如SEQ ID NO.35所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.36、17、18所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<------
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGITFSDYAMSWVRQTPERRLEWVASISSGGNTYYPDSVK
GRFAISRD
--------FR3------------->CDR3<---FR4--->
DDRNILYLQLTSLRSEDTAMYYCARVPVVADWNFDVWGAGTTVTVSS
核酸序列
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCACTTTCAGTGACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAGGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGATGATGACAGGAACATCTTATACCTGCAATTGACCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATGTACTACTGTGCAAGAGTCCCAGTAGTAGCTGACTGGAACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
18C2轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，其编码核酸如SEQ ID NO.38所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.21、22、23所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<-----------
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPA
RFSGSGSG
---FR3------------->CDR3<---FR4--->
TDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK
核酸序列
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
18F9克隆：
18F9重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，其编码核酸如SEQ ID NO.40所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.41、42、43所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<------
QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGFSFTGSSMNWVRQSSEKSLEWIGNIDPYYGGTNYNQKF
KGKATLTV
--------FR3-------------->CDR3<---FR4--->
DKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARYDGYFVMDYWGQGTSVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTTCTCATTCACTGGCTCCAGCATGAACTGGGTGAGGCAGAGCAGTGAAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTGATCCTTACTATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATGATGGTTACTTCGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
18F9轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，其编码核酸如SEQ ID NO.45所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.46、47、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVIITCKASQDVMTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPDRFTG
SGSGTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSVQAEDLAVYYCQQHYSAPPTFGGGTKLEIK
核酸序列
GACATTGTGATGACACAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCATCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTCATGACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTGCTGATTTATTCGGCATCCTCCCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTGCTCCTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
20G6克隆：
20G6重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示，其编码核酸如SEQ ID NO.50所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.51、52、53所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<------
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNEAMSWVRQTPEKRLEWIASISSGGNTYYPDSVM
GRFAISRD
--------FR3------------->CDR3<---FR4--->
NARNILYLQMSSLRSEDTAIYFCARAPVVADWYFDVWGAGTTVTVSS
核酸序列
GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACGAGGCCATGTCTTGGGTTCGGCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGATCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAACACCTACTATCCAGACAGTGTGATGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATTTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATATATTTCTGTGCAAGAGCCCCAGTAGTAGCTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
20G6轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，其编码核酸如SEQ ID NO.38所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.21、22、23所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<----------
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPA
RFSGSGSG
---FR3------------->CDR3<---FR4--->
TDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK
核酸序列
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
46D23克隆：
46D23重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示，其编码核酸如SEQ ID NO.55所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.56、42、57所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
EVQLQQSGPELEKPGDSVKISCKASGFSFTGYSMNWVRQSNEKSLEWIGNIDPYYGGTNYNQKF
KGKATLTV
--------FR3-------------->CDR3<---FR4--->
DKSSSTVYMQLKSLTSEDSAVYYCARYDGYFVLDYWGQGTSVTVSS
核酸序列
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGATTCAGTGAAGATATCATGCAAGGCTTCTGGTTTCTCATTCACGGGCTACAGCATGAACTGGGTGAGGCAGAGCAATGAAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTGATCCTTACTATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCTTCCAGCACAGTCTACATGCAGCTCAAGAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATGATGGTTACTTCGTCTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
46D23轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示，其编码核酸如SEQ ID NO.59所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.46、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DVVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVMTAVAWYQQKPGHSPKLLIYAASSRYTGVPDRFTA
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSVQAEDLAVYYCQQHYSAPPTFGGGTKLEIK
核酸序列
GACGTTGTGATGACTCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTCATGACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACATTCTCCTAAATTACTGATTTATGCGGCATCCTCCCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGCCAGTGGATCTGTGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTGCTCCTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
将阳性单克隆抗体的重链可变区克隆入含有人重链固定区和调节元件的载体，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG重链。类似地，将轻链可变区克隆入含有人轻链固定区和调节元件的载体，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG轻链。经测序核对后，将重链及轻链表达载体瞬转入CHO细胞培养，收集上清并过滤，采用ProteinA纯化IgG，加入30kDa超滤离心管(Millipore，UFC803008)将蛋白超滤浓缩。纯化得到抗人IL21嵌合体单克隆抗体，分别命名为14G7、15D11、18B10、18C2、18F9、20G6、46D23。
2.2抗人IL21嵌合单克隆抗体亲和力及中和活性检测
如2.1所述得到7株抗人IL21嵌合体单克隆抗体，通过分子筛色谱(Sizeexclusion chromatography，SEC)检测ProteinA纯化后单体、聚体及片段比例如下表所示。
表2、抗人IL21嵌合单克隆抗体SEC检测结果
通过等离子表面共振在Biacore T200上检测7株抗人IL21嵌合单克隆抗体与人IL21、食蟹猴IL21的亲和力如下表所示。
表3、抗人IL21嵌合单克隆抗体亲和力检测结果
如实施例4.1所述，通过Ba/f3-hIL21R-STAT3报告基因检测7株抗人IL21嵌合单克隆抗体的中和活性结果见图4。即5ng/mL人IL21商业化蛋白可与Ba/f3-hIL21R-STAT3细胞系IL21R结合引起STAT3关联的荧光素酶表达，而抗人IL21抗体可中和该作用。
表4、抗人IL21嵌合单克隆抗体报告基因结果
如实施例4.3所述，通过PBMCs STAT3磷酸化实验检测7株抗人IL21嵌合单克隆抗体的中和活性结果见图5。结果表明，3600pM人IL21商业化蛋白可与健康人PBMCs的IL21R结合引起STAT3发生磷酸化，而本发明的抗人IL21抗体可中和该作用。
2.3抗人IL21单克隆抗体的人源化改造
选择亲和力及阻断活性均优的鼠抗体18B10和46D23进行可变区人源化。将鼠抗体18B10轻链可变区CDR移植到同源性较高的人抗体胚系轻链基因IMGT_hVK2-28，JK基因采用同源性最高的人IGKJ2*01，将鼠抗体18B10重链可变区CDR移植到人胚系重链基因IMGT_hVH1-69，JH基因采用同源性最高的人IGHJ4*01。类似地，将鼠抗体46D23序列可变区CDR移植到同源性较高人胚系轻链基因IMGT_hVK1-33、IGKJ2*01和人胚系重链基因IMGT_hVH1-69、IGHJ4*01。
设计共得到10个重链变体h18B10-VHv1-v4、h46D23-VHv1-v6和10个轻链变体h18B10-VKv1、h46D23-VKv1-v9，合成序列并分别克隆到含有抗体kappa链固定区(Ckappa)或人IgG1固定区CH1-CH3的真核表达载体。将轻、重链表达载体进行组合配对后，瞬转CHO细胞进行表达，收取培养上清通过ProteinA进行纯化。
人源化抗人IL21抗体的重链及轻链可变区序列见下表。
表5、人源化抗人IL21抗体的重链可变区序列
表6、人源化抗人IL21抗体的轻链可变区序列
h18B10 VHv1
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示，其编码核酸如SEQ ID NO.62所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.26、63、28所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIVWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETELHQKF
QGRVTLTV
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DASSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDGYYLFALDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGATTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACAGCTTCACCACCTACTACATCGTGTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGCATGATCCATCCTAGCGACAGCGAGACTGAGCTGCACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACAGTGGACGCCTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCAAGAGGCGACGGCTACTACCTGTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
h18B10 VHv2
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示，其编码核酸如SEQ ID NO.65所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.26、63、28所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIVWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETELHQKF
QGRVTITV
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DASSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDGYYLFALDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACAGCTTCACCACCTACTACATCGTGTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGCATGATCCATCCTAGCGACAGCGAGACTGAGCTGCACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATTACAGTGGACGCCTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCAAGAGGCGACGGCTACTACCTGTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
h18B10 VHv3
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.66所示，其编码核酸如SEQ ID NO.67所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.26、63、28所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYIVWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETELHQKF
QGRVTITV
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DASTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDGYYLFALDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTACATCGTGTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGCATGATCCATCCTAGCGACAGCGAGACTGAGCTGCACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACAGTGGACGCCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCAAGAGGCGACGGCTACTACCTGTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
h18B10 VHv4
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.68所示，其编码核酸如SEQ ID NO.69所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.26、63、28所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYYIVWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETELHQKF
QGRVTITA
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DASTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDGYYLFALDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTACATCGTGTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGCATGATCCATCCTAGCGACAGCGAGACTGAGCTGCACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACAGCCGACGCCTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCAAGAGGCGACGGCTACTACCTGTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
h46D23 VHv1
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.70所示，其编码核酸如SEQ ID NO.71所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.56、72、57所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSFTGYSMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTNYNQKF
QGRVTLTV
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DKSSSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYDGYFVLDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCAGCTTCACCGGCTACAGCATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGCAACATCGACCCTTACTACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACGACGGCTACTTCGTGCTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT
h46D23 VHv2
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示，其编码核酸如SEQ ID NO.74所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.56、72、57所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSFTGYSMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTNYNQKF
QGRVTITV
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DKSSSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYDGYFVLDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCAGCTTCACCGGCTACAGCATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGCAACATCGACCCTTACTACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCatcACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGTGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACGACGGCTACTTCGTGCTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT
h46D23 VHv3
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.75所示，其编码核酸如SEQ ID NO.76所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.56、72、57所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTGYSMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTNYNQKF
QGRVTITV
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDGYFVLDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCACCTTCACCGGCTACAGCATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGCAACATCGACCCTTACTACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGTGGACAAGAGCACCAGCACCGCGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACGACGGCTACTTCGTGCTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT
h46D23 VHv4
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.77所示，其编码核酸如SEQ ID NO.78所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.56、72、57所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTGYSMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTNYNQKF
QGRVTITA
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDGYFVLDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCACCTTCACCGGCTACAGCATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGCAACATCGACCCTTACTACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCGGACAAGAGCACCAGCACCGCGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACGACGGCTACTTCGTGCTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT
h46D23 VHv5
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示，其编码核酸如SEQ ID NO.80所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.56、42、57所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTGYSMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTNYNQKF
KGRVTITA
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDGYFVLDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCACCTTCACCGGCTACAGCATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGCAACATCGACCCTTACTACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAATTCaAGGGCAGAGTGACCATCACCGCGGACAAGAGCACCAGCACCGCGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACGACGGCTACTTCGTGCTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT
h46D23 VHv6
重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示，其编码核酸如SEQ ID NO.82所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.56、42、57所示。
<------------FR1------------>CDR1<----FR2----->CDR2
<-----
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSFTGYSMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTNYNQKF
KGRVTITA
----------FR3------------>CDR3<---FR4--->
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDGYFVLDYWGQGTLVTVSS
核酸序列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCAgCTTCACCGGCTACAGCATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGCAACATCGACCCTTACTACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAATTCaAGGGCAGAGTGACCATCACCGCGGACAAGAGCACCAGCACCGCGTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACGACGGCTACTTCGTGCTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTGTCATCT
h18B10 VKv1
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示，其编码核酸如SEQ ID NO.84所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.85、32、33所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<----------
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTKSLLNSDGFTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLVSNRFSGVP
DRFSGSGS
---------FR3-------->CDR3<---FR4--->
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQSNYLPLTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCACAAAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCTTCACCTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAACCCGGCCAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACCTGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGAGCAACTACCTGCCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv1
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.86所示，其编码核酸如SEQ ID NO.87所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.88、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVMTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSG
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACGTGCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCCAGCCAGGACGTGATGACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv2
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.89所示，其编码核酸如SEQ ID NO.90所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.88、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVMTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSG
SGSGTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCCAGCCAGGACGTGATGACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv3
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.91所示，其编码核酸如SEQ ID NO.92所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.88、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVMTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSA
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCCAGCCAGGACGTGATGACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGCCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv4
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.93所示，其编码核酸如SEQ ID NO.94所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.46、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVMTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSG
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTAAGGCCAGCCAGGACGTGATGACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv5
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.95所示，其编码核酸如SEQ ID NO.96所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.97、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSG
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTAAGGCCAGCCAGGACGTGAGCACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv6
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.98所示，其编码核酸如SEQ ID NO.99所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.100、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVATAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSA
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCCAGCCAGGACGTGgcGACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGCCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv7
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.101所示，其编码核酸如SEQ ID NO.102所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.103、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVLTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSA
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCCAGCCAGGACGTGcTGACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGCCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv8
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.104所示，其编码核酸如SEQ ID NO.105所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.106、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVVTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSA
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCCAGCCAGGACGTGgtGACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGCCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h46D23 VKv9
轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.107所示，其编码核酸如SEQ ID NO.108所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.109、60、48所示。
<----------FR1-------->CDR1<-----FR2----->CDR2
<---------------
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVYTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSRYTGVPSRFSA
SGSVTDFT
---FR3--------->CDR3<---FR4--->
FTISSLQPEDIATYYCQQHYSAPPTFGQGTKLEIK
核酸序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCCAGCCAGGACGTGtacACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCTCTAGATACACAGGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGCCAGCGGCTCTGTGACCGACTTCACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCGCCCCTCCAACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
如实施例4.1所述，通过Ba/f3-hIL21R-STAT3报告基因实验，检测并筛选人源化抗人IL21抗体对人IL21蛋白的中和活性，同时与抗人IL21嵌合抗体进行比较。人源化抗体相对于母本嵌合抗体的中和活性结果如下表所示。
表7、人源化抗人IL21抗体报告基因结果
如实施例4.2所述，通过Ba/f3-hIL21R-STAT3细胞增殖实验，检测并筛选人源化抗人IL21抗体对人IL21蛋白的中和活性，同时与avizakimab类似物(参考专利US10588969B2)进行比较。人源化抗体相对于avizakimab类似物的中和活性结果如下表所示。
表8、人源化抗人IL21抗体细胞增殖结果
实施例3：人源化抗人IL21单克隆抗体对不同种属IL21的亲和力
通过等离子表面共振在Biacore T200上分别检测人源化抗人IL21抗体对人、食蟹猴IL21的亲和力。将人IL21商业化蛋白配置为终浓度10nM，依次2倍稀释5个梯度；将食蟹猴IL21重组蛋白配置为终浓度15nM，依次2倍稀释5个梯度。使用ProteinA将待测抗体以1μg/mL偶联于固相载体，加入梯度浓度的人IL21或食蟹猴IL21进行检测。通过数据分析软件获得抗体与配体之间的结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)，结果如下表所示。
表9、人源化抗人IL21抗体亲和力检测结果
实施例4：人源化抗人IL21抗体的中和活性
4.1报告基因实验
采用常规方法(Maurer et al.,2012)构建单克隆稳转细胞株Ba/f3-hIL21R-STAT3。生长培养基为IMDM含有10％FBS及10ng/mL小鼠IL3(SinoBiological，51066-MNAH)。该细胞表达人IL21R，与人IL21结合可引起STAT3关联的荧光素酶表达。终浓度5ng/mL人IL21蛋白(Novoprotein，CC45)与人源化抗人IL21抗体h18B10、h46D23及对标抗体aviazkimab混合，37℃孵育30分钟。取对数生长的Ba/f3-hIL21R-STAT3细胞饥饿过夜。次日用含2％FBS的IMDM培养基重悬，5×104细胞/孔加入96孔U型板，再加入已孵育的抗原抗体混合物，继续培养6小时。采用Bio-Lite LuciferaseAssay System(Vazyme，DD1201)按照说明书进行荧光素酶检测，在多功能酶标仪上读取化学发光。人源化抗人IL21抗体h18B10、h46D23对人IL21的中和活性优于对标抗体Aviazkimab，结果如图6所示。空白对照组仅含细胞，不含抗原抗体混合物。同型对照组抗体为抗KLH人IgG1，其余与样本组相同。计量资料以均数±标准差(Mean±SD)的方式表示。IC50计算采用Inhibitorvs.Response-Variableslope(fourparameters)。相对中和活性＝对照IC50/样本IC50×100％。
4.2细胞增殖实验
单克隆稳转细胞株Ba/f3-hIL21R-STAT3的生长高度依赖人IL21或小鼠IL3，在一定浓度范围内具有量效关系。抗原抗体混合物预处理同4.1所述。取对数生长的Ba/f3-hIL21R-STAT3细胞，用10％FBS IMDM培养基重悬，5×103细胞/孔加入96孔平板饥饿过夜。次日加入已经过孵育的抗原抗体混合物，继续培养3-4天。采用CellTiter-3D CellViabilityAssay(Promega，G9682)按照说明书进行细胞增殖检测，在多功能酶标仪上读取化学发光。人源化抗人IL21抗体h18B10、h46D23对人IL21的中和活性优于对标抗体Aviazkimab，结果如图7所示。空白对照组仅含细胞，不含抗原抗体混合物。同型对照组抗体为抗KLH人IgG1，其余与样本组相同。计量资料以均数±标准差(Mean±SD)的方式表示。IC50计算采用Inhibitor vs.Response-Variable slope(fourparameters)。相对中和活性＝对照IC50/样本IC50×100％。
4.3PBMCs STAT3磷酸化实验
经知情同意后，无菌抽取健康志愿者静脉血。采取密度梯度离心法，使用淋巴细胞分离液(GE，17-1440-03)得到PBMCs，用台盼蓝法细胞计数。终浓度3.5nM(53.9ng/mL)人IL21蛋白(Novoprotein，CC45)与人源化抗人IL21抗体h18B10、h46D23及对标抗体Aviazkimab混合，37℃孵育30分钟。向96孔U型板中加入抗原抗体混合物，用1640培养基洗涤PBMCs并重悬，5×105PBMCs/孔加入孔板培养30分钟。通过流式细胞学检测磷酸化水平。使用磷酸化固定液Fix Buffer I(BD BioSciences，557870)终止细胞磷酸化，使用磷酸化破膜液Perm Buffer III(BD BioSciences，558050)按说明书操作。随后加入流式抗体Alexa Fluor 647anti-STAT3 Phospho(Biolegend，651008)及PE anti-human CD3(Biolegend，300408)4℃避光孵育45分钟。用PBS洗涤并重悬PBMCs，通过流式细胞仪进行检测。用FlowJo软件进行分析，在淋巴细胞亚群中圈取CD3阳性细胞群，在CD3阳性细胞群中分析磷酸化STAT3(pSTAT3)的平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)。人源化抗人IL21抗体h18B10、h46D23对人IL21的中和活性优于对标抗体Aviazkimab，结果如图8所示。空白对照组仅含细胞，不含抗原抗体混合物。同型对照组抗体为抗KLH人IgG1，其余与样本组相同。计量资料以均数±标准差(Mean±SD)的方式表示。IC50计算采用Inhibitorvs.Response-Variable slope(fourparameters)。相对中和活性＝对照IC50/样本IC50×100％。
4.4活化的CD4+T细胞与CD19+B细胞共培养实验
活化的CD4+T细胞与CD19+B细胞共培养可诱导浆细胞分化。抗IL21抗体可抑制由活化CD4+T细胞诱导的浆细胞分化。分离PBMCs方法如4.3所述。使用CD4 MicroBeads,human细胞分选试剂(Miltenyi，130-097-048)从PBMCs中分离CD4+T细胞；CD19 MicroBeads,human细胞分选试剂(Miltenyi，130-050-301)从PBMCs中分离CD19+B细胞，分别计数。分离得到的CD4+T细胞及CD19+B细胞经流式检测纯度均>98％。细胞培养基为1640含10％FBS，50μM 2-巯基乙醇，青霉素-链霉素。2μg/mL Purified anti-human CD3(Biolegend，300438，MouseIgG1)加入96孔U型板4℃孵育过夜。次日U型板中加入人源化抗人IL21抗体h18B10、h46D23及对标抗体Aviazkimab。来自同一健康志愿者的CD4+T细胞与CD19+B细胞1:1混合，含终浓度1μg/mLPurified anti-human CD28(Biolegend，302914，Mouse IgG1)的细胞培养基重悬1×105细胞/孔加入U型板培养5天。空白对照组为未活化的CD4+T细胞与CD19+B细胞共培养，不含抗体及刺激。同型对照组抗体为抗KLH人IgG1，其余与样本组相同。
共培养第5天收集细胞，通过流式细胞学检测浆细胞分化情况。使用Fc ReceptorBlocking Solution(Biolegend，422302)室温封闭15分钟，加入流式抗体FITC-CD4(Biolegend，317408)，PE-CD19(Beckman Coulter，A07769)，BV605-CD38(BD，562665)，APC-CD20(Biolegend，302310)4℃避光孵育45分钟。加入死细胞染料碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)终浓度1μg/mL(Sigma，P4170)4℃避光孵育5分钟。用PBS洗涤并重悬细胞，通过流式细胞仪进行检测。用FlowJo软件进行分析，在活细胞亚群中圈取CD19+CD4-细胞群，在CD19+CD4-细胞群中圈取CD38+CD20-浆细胞群，分析细胞比例，结果如图9所示。
共培养第5天收集细胞培养上清，通过ELISA检测人IgG2分泌。该共培养体系中添加的抗体亚型为人IgG1，添加的刺激抗体亚型为小鼠IgG1，在人IgG2 ELISA检测中无交叉反应。用PBS配置5μg/mL MouseAnti-Human IgG2 Fc(Southernbiotech，9070-01)于酶标板中4℃包被过夜。1％BSA室温封闭1小时。用细胞培养基配置10μg/mL anti-KLH hIgG1对人IgG2标准品蛋白进行稀释，未稀释的细胞培养上清100μL/孔室温孵育1小时。检测抗体GoatAnti-Human IgG HRP(Jackson ImmunoResearch，109-035-098)室温孵育1小时。TMB显色液(Sigma，T2885)室温避光显色10-15分钟，加入2M硫酸终止反应，放入酶标仪中读取OD450nm吸光度，结果如图10所示。计量资料以均数±标准差(Mean±SD)的方式表示。
4.5人源化抗人IL21抗体亲和力与相关专利竞品比较结果
由于评价中和活性的实验体系存在差异，且相同实验体系不同实验批次之间可比性较差，故无法将中和活性指标IC50与相关竞品IC50直接进行比较。为比较中和活性，选择专利US 10588969B2提供的人源化抗人IL21抗体序列表达avizakimab类似物，并以此作为阳性对照进行中和活性实验评价。实验结果参见表101-3行，相关专利提供亲和力数据参见表104-8行，表明本发明的人源化抗体h18B10和h46D23，与现有的抗体对比，对人IL21以及食蟹猴IL21都具有更好的亲和力。
表10、人源化抗人IL21抗体亲和力与相关专利竞品比较结果
ND：未提供。
根据上述，本发明所属领域的技术人员能够理解，在不改变本发明的技术思路或必要特征的情况下，本发明可以其他具体形式实施。在这点上，本文公开的示例性实施方式仅以示例为目的，不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明意图不仅包括示例性实施方式，而且涵盖所附权利要求限定的本发明的精神和范围可包括的各种替代方式、改动、等同范围和其他实施方式。
Claims (17)
1.抗IL21抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，
所述重链可变区包含：
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:6、16、26、36、41、51、56或其变体所示的重链CDR1，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:7、17、27、42、52、63、72或其变体所示的重链CDR2，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:8、18、28、43、53、57或其变体所示的重链CDR3；
所述轻链可变区包含：
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:11、21、31、46、85、88、97、100、103、106、109或其变体所示的轻链CDR1，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:12、22、32、47、60或其变体所示的轻链CDR2，
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:13、23、33、48或其变体所示的轻链CDR3。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，可以阻断IL21与IL21R结合。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含：
选自如氨基酸序列SEQ ID NO:4、14、24、34、39、49、54、61、64、
66、68、70、73、75、77、79或81所示的序列，
所述轻链可变区包含：选自如氨基酸序列SEQ ID NO:9、19、29、37、
44、58、83、86、89、91、93、95、98、101、104或107所示的序列。
4.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含选自以下任一重链可变区和轻链可变区的组合：
(a)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:6-8的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:11-12的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:16-18的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:21-23的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:26-28的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:31-33的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:36、17、18的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:21-23的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:41-43的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:46-48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:51-53的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:21-23的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、42、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:46、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:26、63、28的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:85、32、33的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:26、63、28的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:88、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:46、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列
(k)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:97、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:100、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(m)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、72、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:103、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列
(n)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、42、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:106、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(o)重链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:56、42、57的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，轻链可变区包含分别对应于SEQ ID NO:109、60、48的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
5.权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含选自以下任一重链可变区和轻链可变区对：
(a)分别由SEQ ID NO:4与9所示的重链可变区和轻链可变区，
(b)分别由SEQ ID NO:14与19所示的重链可变区和轻链可变区，
(c)分别由SEQ ID NO:24与29所示的重链可变区和轻链可变区，
(d)分别由SEQ ID NO:34与37所示的重链可变区和轻链可变区，
(e)分别由SEQ ID NO:39与44所示的重链可变区和轻链可变区，
(f)分别由SEQ ID NO:49与37所示的重链可变区和轻链可变区，
(g)分别由SEQ ID NO:54与58所示的重链可变区和轻链可变区，
(h)分别由SEQ ID NO:61与83所示的重链可变区和轻链可变区，
(i)分别由SEQ ID NO:64与86所示的重链可变区和轻链可变区，
(j)分别由SEQ ID NO:66与89所示的重链可变区和轻链可变区，
(k)分别由SEQ ID NO:68与91所示的重链可变区和轻链可变区，
(l)分别由SEQ ID NO:70与93所示的重链可变区和轻链可变区，
(m)分别由SEQ ID NO:73与95所示的重链可变区和轻链可变区，
(n)分别由SEQ ID NO:75与98所示的重链可变区和轻链可变区，
(o)分别由SEQ ID NO:77与101所示的重链可变区和轻链可变区，
(p)分别由SEQ ID NO:79与104所示的重链可变区和轻链可变区，
(q)分别由SEQ ID NO:81与107所示的重链可变区和轻链可变区。
6.权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区的骨架区来源于人胚系轻链基因IMGT_hVK1-33或IGKJ2*01，所述重链可变区的骨架区来源于人胚系重链基因IMGT_hVH1-69或IGHJ4*01。
7.权利要求1至6中任一项所述抗体或其抗原结合片段作为IL21抑制剂的用途。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至6中任一项所述的抗IL21抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为以下任一：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)、荧光免疫试剂盒和微流体芯片。
10.结合物，其特征在于，通过将权利要求1至6中任一项所述的抗IL21抗体或其抗原结合片段经化学标记或生物标记制备。
11.根据权利要求10所述的结合物，其特征在于，所述化学标记为荧光素、同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为特异性抗体、生物素、亲和素或酶标记。
12.偶联物，其特征在于，通过将权利要求1至6中任一项所述的抗IL21抗体或其抗原结合片段与固体介质或半固体介质偶联制得。
13.根据权利要求12所述的偶联物在制备用于中和IL21的免疫吸附柱中的用途，以及制备用于免疫亲和纯化天然IL21的微珠中的用途。
14.权利要求1至6中任一项所述的抗IL21抗体或其抗原结合片段或权利11所述的结合物在制备用于特异性结合和/或降低IL21水平的诊断试剂和/或药物中的用途。
15.权利要求1至6中任一项所述的抗IL21抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断和/或治疗自身免疫性疾病的试剂和/或药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病选自以下任一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、原发性干燥综合征、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病。
17.用于表达权利要求1至6中任一项所述的抗IL21抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
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