DK164510B - Humant hybridom, humant monoklonalt antistof opnaaet derfra, anvendelse af et saadant antistof og fremgangsmaade til fremstilling af et saadant antistof - Google Patents

Description

i

DK 164510 B

Den foreliggende opfindelse angår et humant hybridom, et humant antistof opnået derfra, anvendelse af et sådant antistof og fremgangsmåde til fremstilling af et sådant antistof.

5 Pattedyrsimmunsystemet har en mageløs evne til at produ cere molekyler med specificitet og tiltrækning over for en særlig rumstruktur og polær struktur, hvilket kan findes med aminosyresekvenser og sukkerarter. I lang tid var man afhængig af fremstilling af antistoffer 10 under anvendelse af immunsystemet in vivo. De resulterende polyklonale antistoffer viste høj specificitet for et specifikt antigen, men kunne ikke skelne mellem forskellige steder på antigenet og var derfor en blanding af antistoffer med varierende specificitet og tiltrækning.

15 Man observerede således gennemsnittet for hele præparatet og ikke egenskaberne for et specifikt antistof.

Siden Milstein og Kohiers epokegørende arbejde kan man nu fremstille homogene præparater af antistoffer ved at sammensmelte en B-lymfocyt med en myelomacelle til 20 fremstilling af en celle, der kaldes en hybridoma. For størstepartens vedkommende har anvendelsen af denne teknologi været begrænset til museceller, hvor stabile myelomalinier har tjent som fusionspartnere til tilvejebringelse af stabile hybridomer, som kan produceres 25 med høj effektivitet, og som er i stand til at blive holdt som produktive enheder i lang tid. Højere organismer, især mennesker, har vist sig at være meget mere utilregnelige ved udvikling af fusionspartnere og hybridomer. I 1980 blev den første humane fusionspartner 30 imidlertid rapporteret af doktor Olsson og doktor Kaplan, og siden den tid er yderligere nogle få humane fusionspartnere rapporteret. Ikke desto mindre er fremstillingen af hybridomer ved human x human krydsninger forblevet vanskelig på grund af problemer med effektiv fusion, 35 dyrkning af cellerne og bevarelse af deres produktive

DK 164510 B

2 egenskaber. På grund af de mange fordele ved at have humane hybridomer, som producerer antistoffer, der er allogene over for en human vært, specielt til anvendelse in vivo, forbliver humane hybridomer imidlertid af stor 5 interesse. I andre tilfælde, selv med de vanskeligheder, der mødes med human x human krydsninger, kan det humane hybridom være foretrukkent frem for en heterogen krydsning, hvor det resulterende hybridom kan tabe den genetiske information for de monoklonale antistoffer efter 10 et antal passager.

Et af interesseområderne for anvendelse af monoklonale antistoffer er ved diagnose og behandling af cancer.

Det er ønskeligt, at monoklonale antistoffer til disse formål er specifikke for en særlig type cancer eller 15 delmængde af cancere frem for at være specifikke over for en særlig værtscancercelle. Det er derfor ønskeligt at udvikle monoklonale antistoffer, der kan anvendes ved diagnose og behandling af humane cancere.

Nowinski et al., Science (1980) 210:557-539 beskriver 20 humane monoklonale antistoffer mod Forssman-antigen.

Corce et al., Nature (1980) 288:488-489 beskriver humane hybridomer, der udskiller antistoffer mod mæslingevirus. Olsson og Kaplan, PNAS USA (1980) ]]_: 5429-5431 beskriver human x human hybridomer, der producerer monoklonale 25 antistoffer med foruddefineret antigen specificitet, såvel som den fusionspartner, der anvendes til produktion af antistofferne. Se også US patent nr. 4 451 570

Schlom et al., PNAS USA (1980) (77:6841-6845 beskriver monoklonale antistoffer mod brystcancer, herunder et 30 monoklonalt antistof mod brystcancer, der kan skelne mellem kræftceller og normale epithelceller hos pattedyr i samme bryst. Sikora beskriver i Brit. J. of Cancer (1981) 43:696 adskillelse in situ af lymfocytter fra

DK 164510 B

3 en cancer, hvorved opnås antistoffer, der er specifikke over for canceren. I Proceedings of the 15th Leukocyte Culture Conference, Parker and O'Brien, red., Wiley Interscience, N.Y. 3. - 10. december 1982 beskrives 3 det omhandlede hybridom. Der henvises til denne redegørelse .

GB offentliggørelsesskrift nr. 2 086 937 omtaler humanhuman hybridomaceller, og EP offentliggørelseskrift nr. 44 722 omtaler humane hybridomaceller, der har gener 10 fra de samme humane neoplastiske værtslymfocytter.

I modsætning hertil omhandler opfindelsen fusion af B-lymfocytter fra drænende lymfeknuder hos en human vært med cervixcarcinoma med humane immortaliserede B-celler.

15 Opfindelsen angår således humane hybridomer, der er i stand til at producere monoklonale antistoffer, som kan skelne humane neoplastiske celler fra normale humane fibroblaster, T-lymfocytter eller perifere blod-lymfocytter, hvor det humane hybridom kan opnås ved 20 fusion af en human B-lymfocyt fra en lymfeknude drænende en fast tumor med en human immortaliseret B-celle, som ikke selv udskiller immunoglobulin, eller human hybridom afledt deraf. Den faste tumor er specielt en cervixcarcinoma, især hybridomaceller CLNH5 eller CLNH11.

25 Opfindelsen angår endvidere monoklonale antistoffer opnået ud fra sådanne hybridomaceller eller fragmenter deraf eller sådanne mærkede celler eller fragmenter.

Derudover angår opfindelsen anvendelse af sådanne monoklonale antistoffer til bestemmelse af tilstedeværelse 30 af en neoplasme og en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne monoklonale antistoffer. Anvendelsen er ejen-

DK 164510 B

4 do'mmelig ved det i krav 9's kendetegnende del anførte, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav ll's kendetegnende del anførte.

Lymfocytter afledt fra en neoplastisk human vært immor-taliseres som nævnt ved sammensmeltning eller fusion med humane fusionspartnere til tilvejebringelse af human x human hybridomer, der udskiller monoklonale antistoffer, der er specifikke for en neoplastisk celle.

Specielt tilvejebringes monoklonale antistoffer specifikke over for faste tumorceller, såsom cervixcancer-celler, til anvendelse ved diagnose og terapi.

Humane monoklonale antistoffer specifikke over for neo-plastiske celler fra faste tumorer opnås fra human x human fusioner under anvendelse af B-lymfocytter, f.eks. fra lymfeknudedræning af en fast tumor. Specielt vælges lymfeknuder, som synes at være aktive, baseret på necrose af tumorceller i nærheden af lymfeknuden i en immu-nokompetent vært.

Den eller de drænede lymfeknuder kan isoleres i forbindelse med en række forskellige typer humant væv, f.eks. fra cervix, brystet, colon, lungerne, prostata, huden etc. Af særlig interesse er lymfeknuder fra rygradsområdet .

Fusionspartneren kan være en vilkårlig passende human immortaliseret B-celle, som ikke udskiller immunoglo-buliner, individuelle kæder eller fragmenter deraf, som man kan selektere for, f.eks. med HAT-medium, og som ønskeligt har en høj fusionseffektivitet. Illustrative fusionspartnere er UC729-6, J-4 (SK0-007) og GM1500 6TG-A12.

DK 164510 B

5

Fusionerne kan udføres som beskrevet i litteraturen under anvendelse af PEG1500 som fusogen, udpladning af cellerne i et HAT-medium i flere fordybninger og derpå undersøgelse af de overliggende væsker i fordyb-^ ninger med en levedygtig celle for antistoffer af interesse. Fordybninger, der er positive for reaktivitet, klones derpå ved begrænset fortynding og ekspanderes.

Af særlig interesse er de hidtil ukendte hybridomer CLNH5 og CLNH11, hybridomer opnået ud fra CLNH5 og CLNH11, ^ antistoffer afledt fra sådanne hybridomer, derivater af sådanne antistoffer og anvendelsen af antistofferne og deres derivater til diagnose og terapi. CLNH5 og CLNH11 opnås ved fusion mellem fusionspartneren UC729-6 og lymfocytter fra lymfeknudeceller fra en patient med cervixcancer. UC729-6 er deponeret hos A.T.C.C. under 15 betegnelsen nr. CRL 8061. UC729-6 blev deponeret til patentformål i forbindelse med indleveringen af ansøgning nr. 247 652, der har ført til US patent nr. 4 451 570.

De til fusion anvendte lymfocytter var fra en dræning af en lymfeknude fra rygradsområdet og perifere blodlym- 20 focytter fra en patient med cervixcarcinoma. Fusionen udføres ved at kombinere patientens lymfocytter fra lymfeknuden med fusionspartneren UC729-6 i et forhold på ca. 2:1 i en opløsning af ca. 35% polyethylenglycol i HEPES puffret RPMI 1640. Blandingen af celler sus-25 penderes derpå i et passende selektivt medium, specielt HAT-medium indeholdende ca. 10% føtal bovin serum, an- 5 bringes i fordybninger med ca. 10 celler pr. fordybning og får tilstrækkelig tid for cellerne til at gro. Det selektive medium erstattes fra tid til anden.

Fordybninger fra ovennævnte fusion gav kloner specifikt reaktive over for cervixcancerceller fra værtspatienten, som blev betegnet CLNH5 og CLNH11. Disse fordybninger 30

DK 164510 B

6 gav henholdsvis humane IgM og IgG monoklonale antistoffer, som reagerer med antigen fundet på en række cervixcarcino-mer og andre tumorcellelinier, f. eks. små cellecarcino-mer i lungen, men ikke med normalt væv og normale celle-linier, som blev afprøvet.

Hybridomerne og de monoklonale antistoffer kan finde anvendelse på en række forskellige måder, specielt som kilder for genetisk materiale, som reagenser, og som forstadier for produkter, som finder anvendelse som reagenser.

De omhandlede hybridomer kan anvendes som kilde for genetisk materiale. De omhandlede hybridomer kan f. eks. sammensmeltes med andre fusionspartnere til opnåelse af hidtil ukendte hybridomer med samme udskillelses-egenskaber som CLNH5 og CLNH11 til tilvejebringelse af antistoffer med den samme specificitet. Sådanne fusioner kan resultere i produktionen af antistoffer med forskellige tunge kæder, hvorved man opnår andre klasser eller underklasser af antistoffer, f. eks. G, A eller 20 M*

Hybridomet kan også anvendes som kilde for DNA, som ved hybrid DNA-teknologi, generne kan udskæres, indføres i en lymfoma til produktion af de modne antistoffer.

De monoklonale antistoffer kan anvendes på en række forskellige måder, både ved in vivo og in vitro diagnose, såvel som i terapi. Til mange anvendelser vil antistofferne være mærket med en forbindelse, som giver antistofferne en ønsket egenskab, såsom tilvejebringelse af jg et detekterbart signal, tilvejebringelse af cytotoxicitet, tilvejebringelse af lokaliseret elektromagnetisk bestråling eller lignende. Mærker kan omfatte radionuclider. enzymer, fluoroscensgivende stoffer, taxiner eller det cytotoxiske fragment af toxiner, partikler, metaller,

DK 164510B

7 metalloider, etc. Antistofferne kan inkorporeres i lipo- ' sommembraner eller modificeres med lipider, så de inkorporeres i sådanne membraner. Antistofferne kan som sådanne eller mærkede anvendes ved in vitro diagnose 5 til måling af tilstedeværelsen af antigener forbundet med en neoplasme, såsom cervixcancer, til in vivo diagnose for indføring i en vært, f. eks. intravenøst, i en fysiologisk acceptabel bærer, f. eks. PBS, eller kan indføres til terapeutiske formål på samme måde.

10 Antistofferne kan som sådanne eller mærkede også anvendes til behandling af en neoplasme i en human vært, såsom cervixcarcinoma, prostatatumor, coloncarcinoma, lungecancer, brystcancer og melanoma. Antistofferne ifølge opfindelsen er letopløselige i fysiologisk saltvand 15 og kan derfor injiceres intravenøst eller intramusku- lært som en saltvandsopløsning eller et drop. Endvidere kan antistofferne ifølge opfindelsen anvendes i form af en salve eller et suppostorium.

Den anvendte mængde antistof vil variere i afhængighed 20 af den særlige anvendelse. Indføring af antistoffer til diagnose og terapeutiske formål er beskrevet omhyggeligt i litteraturen.

Hele antistoffet behøver ikke anvendes; for mange anvendelser er blot et fragment med intakte variable områder 25 tilstrækkeligt. F. eks. kan Fab-fragmenter, F(ab')rag- menter eller Fv-fragmenter være tilstrækkelige.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

DK 164510 B

8 EKSPERIMENTELT Materialer og metoder Fusion og valg af hybridomer

Lymfeknuder blev enerveret med en tang i RPMI 1640 medium, 5 og isolerede lymfocytter blev dyrket natten over ved 37 °C og 5% CO2 i RPMI 1640 med 10% føtal kalveserum (FCS) og 2 mM L-glutamin, Lymfocytterne blev talt og blandet i et forhold på 2:1 med den humane lymfoblastoide B-cellelinie UC729-6 (Handley og Royston. 1982, i Hybri-10 domas in Cancer Diagnosis and Treatment, udg. Mitchell og Oettgen, pp. 125 - 132, Raven Press, N.Y.), derpå sammensmeltet med polyethylenglycol 1500 ved en modifikation af teknikken af Gefter et al., Somatic Cell Genetics (1977) 3^321-336. Sammensmeltede celler blev 15 udpladet med 10"" celler/brønd i en Costar 96 mikroti- terplade med Hypoxanthine-Amethopterin- Thymidine (HAT, Littlefield, Science (1964) 145:709-710) suppleret RPMI 1640 med 10?ί FCS og L-glutamin. I løbet af 10 - 20 dage blev brønde, der var positive for hybridomavækst, prøvet 20 for human antistofproduktion, og deres reaktivitet over for et begrænset humant cellepanel ved en enzymimmunoprøve (EIA). Brønde, der var positive for reaktivitet blev klonet ved begrænset fortynding uden anvendelse af fødelag og ekspanderet til yderligere studium.

25

Enzym-immunoprøve

Humane MoAb'er og deres reaktivitet over for celler blev detekteret ved en modifikation af en EIA tidligere beskrevet (Handley et al., J. of Immunologic Methods (1982) 5_4:291-296, som modificeret af Glassy et al., 30 3. Immunologic Methods (1983) under trykning). Kort

DK 164510 B

9 sagt blev 50 ,ul af enten en affinitetsrenset gede-antihuman Ig eller en 4 x 10 celle/ml suspension im-mobiliseret i triplikatfordybninger i en immunofi 11re-ringsmanifold. (Den specielt udformede mikrotiterplade, 5 som tjener som både inkuberingskammer og fi1 treringsma- nifold ( V P nr. 107; \l og P Scientific, San Diego, CA)). Bunden af hver brønd indeholder et 0,6 mm hul, over hvilket er anbragt et glasfiberfilter med en diameter på 6 mm. Overfladespænding forhindrer væskevolumener 10 under 100 ^ul i at dræne gennem hullet, indtil vakuum er påført. Når vakuum er påført, trækkes væsken gennem filtret og ud af drænhullet, idet der efterlades par-tikelformigt materiale fældet på filtret. Efter vask 3 gange med 0,3?ί gelatine i phosphatpufret saltvand blev 50 yul af den overliggende hybridoma-væske inkuberet 15 30 minutter ved stuetemperatur. Filtre blev derpå vasket og inkuberet med 50 yUl peberrod-peroxidasekonjugeret gede-antihuman Ig i yderligere 30 minutter. Filtre blev vasket igen og inkuberet med 150 ^ul af en 400 ^ug/ml opløsning af orthophenylendiamin i citratpuffer. 100 20 ^ul fra hver brønd blev derpå overført til en ny plade indeholdende 50 ^ul 2,5 M t^SO^ og aflæst på en Dynatek (Alexandria, VA) MR 580 micro-ELISA læser ved 492 nm.

Hybr i doma ku Itu r væsker blev udfældet med 50?ό ammoniumsulfat, og rå Ig-fraktioner blev opsamlet. Bundfaldene 25 blev opløst i fysiologisk saltvand og renset ved affini- tetschromatografi under anvendelse af S. aureus Protein A-bundet Sepharose med IgC og Sepharose-(fåreanti(human IgM)antistof) med IgM. Fra 1 liter af dyrkningsmediet af CLNH5 opnåedes 2,2 mg IgM, mens der fra 1 liter af 30 dyrkningsvæsken fra CLNH11 blev opnået 3,0 mg IgG.

10

DK 164510 B

RESULTATER

Tabel 1 angiver resultaterne for fusionsforsøg på fremstilling af anti-SCCC (squamous celle carcinoma of cervix) human MoAb'er. Fusionsproducering af CLNH5 og CLNH11, human-human hybridomer udskillende en MoIgMk og en MoIgG 5 reaktiv med SCCC-cellelinier, dannede 6 vækstpositive brønde af 80 udpladede brønde. Hybridomer CLNH5 og CLNH11 blev klonet og ekspanderet, når de viste sig at reagere med cervixcarcinoma cellelinierne CaSki og HeLa.

10 TABEL 1

Dannelse og identifikation af humane MoAb'er

Lymfe- Antal Antal kirtel- lymfocyt- Hybridomer Antal se- Antal humandræning ter sam- dannet kretioner reaktive

mensmeltet M G A

Cervix- 7,0 x 106 6 210 2 (CLHN5 og 11) carcinoma (SCCC)

De relative mængder af human MoAb bundet til hver af cellelinierne som anført blev målt ved EIA.

Antistof (IgM) udskilt af CLNH5 viser positiv reaktivitet med carcinomer fra cervix (CaSki, HeLa), lunge (T923, Calu-1 og SK-MES-1), melanoma (SK-MEL-28) og 15 prostata (LnCap) og var negativt over for normale fibro-blastre, T-lymfocytter og perifere blodlymfocytter.

Antistof (IgG) udskilt af CLNH11 viser positiv reaktivitet med carcinomer fra cervix (CaSki, HeLa), prostata (PC-3), bryst (ZR-76-1), colon (C0L0-205) og melanoma 20

DK 164510 B

11 (G — 361) og var negativt over for normale fibroblastre (WI 38 og MRC-9), T-lymfocytter og perifere blodlymfocytter.

De cytokemiske egenskaber for hybridomerne ifølge opfin-5 delsen er som vist i det følgende.

Hybridoma CLNH5: (1) Antal kromosomer: 60 - 90 (maksimal hyppighed 80).

(2) Den udskiller humant immunoglobulin M (IgM).

(3) Fordoblingstid: 30 - 40 timer.

10 (4) Lymfocytisk enkeltcelle.

(3) Dens DNA-indhold er mindst 2 gange, f. eks. 2 - 2,5 gange af, hvad der er normalt for humane lymfocytter .

(6) IgM binder til humane cervixcarcinomaceller og andre 13 carcinomaceller som nævnt i det foregående.

Desuden kan ovennævnte hybridoma CLNH5 formeres i HAT-me-dium (medium indeholdende hypoxanthin, amethopterin og thymidin).

Hybridoma CLNH11: 20 (1) Antal kromosomer: 60 - 90 (maksimalhyppighed 80).

(2) Den udskiller humane immunoglobuliner G (IgG).

(3) Fordoblingstid: 30 - 40 timer.

DK 164510B

12 (4) Lymfocytisk enkeltcelle.

(5) Dens DNA-indhold er mindst 2 gange, f. eks. 2 -2,5 gange af, hvad der er normalt for humane lymfocytter.

5 (6) IgG binder til humane cervixcarcinomaceller og andre carcinomaceller som nævnt i det foregående.

Desuden kan ovennævnte hybridoma CLNH11 formeres i HAT-me-dium.

Det relative DNA-indhold (forholdet til DNA-indholdet 10 af normale humane lymfocytter) blev bestemt ved en meto de, som omfatter tørring af hybridoma'en og derpå adskillelse og analyse af den med et cytofluorometer.

Egenskaberne for de monoklonale humane immunoglobuliner ifølge opfindelsen er vist i det følgende.

15 Monoklonal human immunoglobulin fremstillet med hybri doma CLNH5 (a) Det er human immunoglobulin M (IgM).

(b) Det har en stærkere bindingsaffinitet til cellelinier, HeLa og CaSki, end til normale fibroblaster 20 (WI-38).

(c) Det reagerer ikke med humane røde blodlegemer eller udviser agglutineringsreaktion på humane røde blodlegemer .

25 (d) Det er sammensat af tunge kæder (H-kæder) og lette kæder (L-kæder), har en molvægt på ca. 180 000 (mono-

DK 164510 B

13 mer) og eksisterer som en pentamer i dyrkningsvæsken.

Monoklonal human immunoq]obul in fremstillet med hybri-doma CLNH11 3 (a) Det er human immunoglobulin G (IgG).

(b) Det har en stærkere bindingsaffinitet til cellelinier, HeLa og CaSki, end til normale fibroblaster (WI — 38).

(c) Det reagerer ikke med humane røde blodlegemer eller 10 udviser agglutineringsreaktion på humane røde blod legemer.

(d) Det er sammensat af H-kæder og L-kæder og har en molekylvægt på ca. 150 000.

Bindingsaktiviteten for humane monoklonale antistoffer, 15 der skelner neoplastiske celler fra normale celler, blev målt som følger:

En oprindelig human vævssektion omfattende carcinomacel-ler og normale celler blev fikseret på en glasplade med glutaraldehyd og derpå farvet ved enzymimmunoprøve 20 efter metoden af Sternberger et al., J. Hist. Cyto.

18 315 (1970).

De omhandlede monoklonale antistoffer er nyttige til diagnose, til afbildning og potentiel kraftige til behandling af cervixcarcinoma såvel som andre reaktive 25 tumorer. På grund af specificiteten for de monoklonale antistoffer i forhold til en række cervixcarcinomer fra forskellage værter kan de omhandlede antistoffer anvendes i forskellige værter og ikke blot i den vært,

DK 164510 B

14 der er kilde for antigenet. Fordi de omhandlede antistoffer er humane, er det mindre sandsynligt, at de danner et væsentligt immunrespons, når de anvendes in vivo i diagnose eller terapi.

Claims (11)

1. Humant hybridom, der er i stand til at producere monoklonale antistoffer, som kan skelne humane neoplas-tiske celler fra normale humane fibroblaster, T-lymfo-cytter eller perifere blodlymfocytter, hvori det humane 5 hybridom kan opnås ved fusion af en human B-lymfocyt fra en lymfeknude drænende en fast tumor med en human immortaliseret B-celle, som ikke selv udskiller immunoglobulin, eller humant hybridom afledt deraf.

2. Humant hybridom eller humant hybridom afledt derfra 10 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den faste tumor er et cervixcarcinom.

3. Humant hybridom CLNH5 eller CLNH11 eller humant hybridom afledt derfra ifølge krav 2.

4. Humant monoklonalt antistof opnået ud fra humane 15 hybridomer ifølge et vilkårligt af kravene 1, 2 eller 3.

5. Humant monoklonalt antistof ifølge krav 4 eller fragmenter deraf, mærket med et mærke, der er i stand til at give et detekterbart signal.

6. Humant monoklonalt antistof ifølge krav 5, k e n - 20 detegnet ved, at mærket er et radionuclid.

7. Humant monoklonalt antistof ifølge krav 4 eller fragmenter deraf mærket med et toxin.

8. Humant monoklonalt antistof opnået fra humane hybridomer ifølge krav 4, kendetegnet ved, at 25 antistoffet er humant immunoglobulin M eller G. DK 164510 B

9. Anvendelse af et monoklonalt antistof ifølge et vil- · kårligt af kravene 6-8 til bestemmelse af tilstedeværelsen af en neoplasme, kendetegnet ved, at man 5 kombinerer en prøve fra en vært mistænkt for at have en neoplasme med et monoklonalt antistof eller et fragment deraf, detekterer tilstedeværelsen af bindingen af det monoklo-nale antistof eller et fragment deraf.

10 .10. Anvendelse ifølge krav 9, hvori prøven er værtsvæv.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af humane monoklonale antistoffer ifølge et vilkårligt af kravene 5-8, kendetegnet ved, at man sammensmelter B-lymfocytter fra humane lymfeknuder, 15 associeret med en neoplasme i en human vært, med en human fusionspartner til fremstilling af hybridomer, kloner disse hybridomer til fremstilling af individuelle kloner, screener disse kloner for monoklonale antistoffer spe-20 cifikke over for tumorcellerne og tumorceller fra samme væv fra andre værter og dyrker disse specifikke kloner, hvorved de monoklonale antistoffer fremstilles.