JPH0767388B2 - 抗体産生細胞株の樹立方法 - Google Patents
抗体産生細胞株の樹立方法Info
- Publication number
- JPH0767388B2 JPH0767388B2 JP61004678A JP467886A JPH0767388B2 JP H0767388 B2 JPH0767388 B2 JP H0767388B2 JP 61004678 A JP61004678 A JP 61004678A JP 467886 A JP467886 A JP 467886A JP H0767388 B2 JPH0767388 B2 JP H0767388B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- antigen
- cell
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗体産生細胞株の樹立方法に関する。
（従来の技術） マウスＢ細胞ハイブリドーマ法の確立により、各種の抗
原に対するモノクローナル抗体が数多く取得されてい
る。
原に対するモノクローナル抗体が数多く取得されてい
る。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、ヒトモノクローナル抗体の産生について
はその源となる特異的産生細胞を大量に得ることが困難
なため多数のクローンを取得し、スクリーニングするこ
とが行なわれている。
はその源となる特異的産生細胞を大量に得ることが困難
なため多数のクローンを取得し、スクリーニングするこ
とが行なわれている。
このハイブリドーマ法では最も効率の良いモノクローナ
ル抗体産生細胞の樹立方法でも104個分の１以上での効
率を達成することは困難であり、しかも105個での抗体
産生細胞株の樹立は実際上不可能であると考えられてい
る。
ル抗体産生細胞の樹立方法でも104個分の１以上での効
率を達成することは困難であり、しかも105個での抗体
産生細胞株の樹立は実際上不可能であると考えられてい
る。
その樹立のためには、少なくとも105個の抗原特異的な
Ｂ細胞の存在が必要とされる。
Ｂ細胞の存在が必要とされる。
このためには、たとえばワクチンにより抗原を感作した
後に、そのリンパ球を集める等の方法が行なわれている
が、腫瘍等の場合には実際上不可能である。
後に、そのリンパ球を集める等の方法が行なわれている
が、腫瘍等の場合には実際上不可能である。
また、in vitro（イン ビトロ）での免疫も試みられは
じめ、抗原添加やPWM（ポークウイートマイト−ジエ
ン）や上皮細胞培養液の添加も行なわれているが、充分
な効果が未だ得られていない。
じめ、抗原添加やPWM（ポークウイートマイト−ジエ
ン）や上皮細胞培養液の添加も行なわれているが、充分
な効果が未だ得られていない。
一方、EB（イービー）ウイルス（EBV）トランスフオー
メーシヨン法によるヒト抗体取得の方法は、Ｔ細胞の存
在が株樹立に際して障害になるため、ロゼツト法、ナイ
ロンカラム法等で全Ｔ細胞を除去する方法が用いられて
いる。
メーシヨン法によるヒト抗体取得の方法は、Ｔ細胞の存
在が株樹立に際して障害になるため、ロゼツト法、ナイ
ロンカラム法等で全Ｔ細胞を除去する方法が用いられて
いる。
（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは、目的とする腫瘍抗原に対する抗体
を効率的に得るin vitroでの免疫方法を得るべく種々検
討を行ない、本発明に到達した。
を効率的に得るin vitroでの免疫方法を得るべく種々検
討を行ない、本発明に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、ヘルパー／インデューサー
Ｔ細胞及び腫瘍抗原並びに抗サプレッサー／サイトキシ
ックＴ細胞抗体を含有する培地で、Ｂ細胞を培養し、腫
瘍抗原に対するヒト型抗体を産生する細胞株をEBウイル
ストランスフォーメーション又はハイブリドーマ法等に
より樹立することを特徴とするヒト型抗体産生細胞株の
樹立方法にある。
Ｔ細胞及び腫瘍抗原並びに抗サプレッサー／サイトキシ
ックＴ細胞抗体を含有する培地で、Ｂ細胞を培養し、腫
瘍抗原に対するヒト型抗体を産生する細胞株をEBウイル
ストランスフォーメーション又はハイブリドーマ法等に
より樹立することを特徴とするヒト型抗体産生細胞株の
樹立方法にある。
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明において、培養に用いられるＢ細胞として
は、癌患者又は正常人の脾細胞、腹水リンパ球、胸水リ
ンパ球、末梢リンパ球等が挙げられる。このＢ細胞は、
Ｔ細胞を分離して用いることもできるが、通常はＢ細
胞、Ｔ細胞の混合物として用いることができる。
は、癌患者又は正常人の脾細胞、腹水リンパ球、胸水リ
ンパ球、末梢リンパ球等が挙げられる。このＢ細胞は、
Ｔ細胞を分離して用いることもできるが、通常はＢ細
胞、Ｔ細胞の混合物として用いることができる。
培養に際しては、ヘルパー／インデユーサーＴ細胞及び
腫瘍抗原を存在させることが必要である。前者は、Ｂ細
胞としてＴ細胞との混合物を用いるときには、特に添加
するには及ばない。添加する場合にはこのヘルパー／イ
ンデユーサーＴ細胞としては、抗ヘルパー／インデユー
サーＴ細胞抗体が認識するＴ細胞を含む細胞が用いられ
る。
腫瘍抗原を存在させることが必要である。前者は、Ｂ細
胞としてＴ細胞との混合物を用いるときには、特に添加
するには及ばない。添加する場合にはこのヘルパー／イ
ンデユーサーＴ細胞としては、抗ヘルパー／インデユー
サーＴ細胞抗体が認識するＴ細胞を含む細胞が用いられ
る。
一方、後者としては、腫瘍細胞もしくはその培養液又は
腫瘍抗原を含有する腹水、胸水もしくは血清等、さらに
は精製抗原が挙げられる。上記ヘルパー／インデユーサ
ーＴ細胞、腫瘍細胞の存在量は特に制限されない。
腫瘍抗原を含有する腹水、胸水もしくは血清等、さらに
は精製抗原が挙げられる。上記ヘルパー／インデユーサ
ーＴ細胞、腫瘍細胞の存在量は特に制限されない。
また、培養に際しては、抗サプレツサー／サイトキシツ
クＴ細胞抗体（OKT−８、Leu2b等）を培地中に添加する
ことにより、サプレツサー／サイトキシツクＴ細胞を少
なくともその機能を発揮しえないように除去し、実質的
な不存在状態とすることが必要である。また、この場
合、補対源を追加することも可能である。
クＴ細胞抗体（OKT−８、Leu2b等）を培地中に添加する
ことにより、サプレツサー／サイトキシツクＴ細胞を少
なくともその機能を発揮しえないように除去し、実質的
な不存在状態とすることが必要である。また、この場
合、補対源を追加することも可能である。
本発明方法においては、さらに系内にＴ細胞増殖因子
（TCGF）を添加することにより、一層良好な結果を得る
ことができる。
（TCGF）を添加することにより、一層良好な結果を得る
ことができる。
たとえば、細胞培養法あるいは遺伝子組み換え法により
得られるインターロイキン２を培地中に１〜10％程度添
加することができる。
得られるインターロイキン２を培地中に１〜10％程度添
加することができる。
さらに、必要に応じレクチン等の各種マイトージエンを
添加することもできる。
添加することもできる。
培地としては、RPMI1640、DMEM等の基本培地に、ウシ胎
児血清又は腹水、胸水等を５〜20vol％程度添加したも
のが通常用いられる。培養は通常５％CO2−95％空気の
流通下で37℃付近で３日間〜２週間程度行なわれる。
児血清又は腹水、胸水等を５〜20vol％程度添加したも
のが通常用いられる。培養は通常５％CO2−95％空気の
流通下で37℃付近で３日間〜２週間程度行なわれる。
本発明においては、EBウイルストランスフオーメーシヨ
ン又はハイブリドーマ法により、細胞株を樹立する。
ン又はハイブリドーマ法により、細胞株を樹立する。
たとえば、EBウイルストランスフオーメーシヨン法によ
る場合には、上記培養中にEBウイルスを存在させ、常法
により培養することにより目的を達成しうる。
る場合には、上記培養中にEBウイルスを存在させ、常法
により培養することにより目的を達成しうる。
また、ハイブリドーマ法による場合には、親細胞として
ミエローマ細胞と上記培養細胞を常法により融合するこ
とにより目的を達成しうる。
ミエローマ細胞と上記培養細胞を常法により融合するこ
とにより目的を達成しうる。
得られた抗体産生細胞は、限界希釈法または軟寒天法、
セルソーター等によるクルーニングの手法を用いること
によつて生産に適した細胞を選別する。本細胞を、たと
えば血清を若干含有した基本培地中で増殖させることに
よつて抗体を取得することができる。
セルソーター等によるクルーニングの手法を用いること
によつて生産に適した細胞を選別する。本細胞を、たと
えば血清を若干含有した基本培地中で増殖させることに
よつて抗体を取得することができる。
抗体のアツセイは、腫瘍抗原に対する反応をRIA（ラジ
オイムノアセイ）、EIA（エンザイムノムノアセイ）等
の常法により行なうことができる。
オイムノアセイ）、EIA（エンザイムノムノアセイ）等
の常法により行なうことができる。
（実施例） 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明は、その要旨を越えない限り以下の実施例によつ
て限定されるものではない。
本発明は、その要旨を越えない限り以下の実施例によつ
て限定されるものではない。
実施例１ 96穴マイクロタイタープレート（培地:RPMI1640:DMEM
（ダルベコ修正イーグル培地）＝1:1、ウシ胎児血清20v
ol.％添加）上に、胃癌細胞MKN−45細胞（103/well）、
抗サプレツサー／サイトキシツクＴ細胞抗体leu2B（１
μg/ml）、TCGF（5vol.％）を存在させ、さらにEBウイ
ルス産生細胞B95−８の培養上清を添加した。一方、胃
癌細胞摘出時に得られた脾臓よりフイコールコンレー法
によつて脾細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞を含む）を分離し、
この脾細胞を106/wellの割合で上記プレート上に添加
し、約１ケ月間培養した。その結果、抗原とした胃癌細
胞MKN45に対する反応性を間接酵素抗体法によつて検討
し、反応するヒト抗体を産生する細胞が多数取得され
た。
（ダルベコ修正イーグル培地）＝1:1、ウシ胎児血清20v
ol.％添加）上に、胃癌細胞MKN−45細胞（103/well）、
抗サプレツサー／サイトキシツクＴ細胞抗体leu2B（１
μg/ml）、TCGF（5vol.％）を存在させ、さらにEBウイ
ルス産生細胞B95−８の培養上清を添加した。一方、胃
癌細胞摘出時に得られた脾臓よりフイコールコンレー法
によつて脾細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞を含む）を分離し、
この脾細胞を106/wellの割合で上記プレート上に添加
し、約１ケ月間培養した。その結果、抗原とした胃癌細
胞MKN45に対する反応性を間接酵素抗体法によつて検討
し、反応するヒト抗体を産生する細胞が多数取得され
た。
培養上清をMKN45に反応させ間接酵素抗体法によつて抗
体産生wellの出現率をその活性に従つて抗原を添加した
場合と添加しない場合にわけて測定した。結果を以下に
示す。
体産生wellの出現率をその活性に従つて抗原を添加した
場合と添加しない場合にわけて測定した。結果を以下に
示す。
これら抗MKN45抗体産生EBVトランスフオーム細胞は常法
に従つたクローニング（限界希釈法）によつて株化され
た。
に従つたクローニング（限界希釈法）によつて株化され
た。
なお、抗原としてヒト培養癌細胞MKN74細胞株を用いて
上記抗体についてその抗原特異性を比色法で見ると下表
のようにMKN74抗原に特異的であることがわかる。
上記抗体についてその抗原特異性を比色法で見ると下表
のようにMKN74抗原に特異的であることがわかる。
実施例２ 実施例１において、腫瘍抗原としてCEA（癌胎児抗原）
を用い（CEA産生細胞培養液20％）、脾細胞を7.5×103/
wellとする以外は、実施例１と同様に培養すると、下記
のような抗体産生細胞の出現が認められた。
を用い（CEA産生細胞培養液20％）、脾細胞を7.5×103/
wellとする以外は、実施例１と同様に培養すると、下記
のような抗体産生細胞の出現が認められた。
抗CEA抗体産生細胞の出現率は以下のとおりであつた。
また、これらの抗体産生細胞の出現をフローサイトメー
ターで検出すると第１図のようになる。併せて、抗原な
しで培養した場合（コントロール）を第２図に示す。
ターで検出すると第１図のようになる。併せて、抗原な
しで培養した場合（コントロール）を第２図に示す。
第１及び２図において、縦軸は細胞数、横軸は螢光強度
（細胞あたり）を示す。（螢光強度120附近の細胞数が
抗CEA抗体産生に対応する） 実施例３ 健常人の末梢血より、リンパ球５×104/wellを、精製CE
A抗原をコーテイングした96wellマイクロタイタープレ
ート培養器でEBV、TCGF、leu2B存在下で培養したとこ
ろ、10％のwellにその抗体産生細胞の出現が認められ
た。一方、TCGF、leu2Bのない場合には、その出現率は
５％であつた。
（細胞あたり）を示す。（螢光強度120附近の細胞数が
抗CEA抗体産生に対応する） 実施例３ 健常人の末梢血より、リンパ球５×104/wellを、精製CE
A抗原をコーテイングした96wellマイクロタイタープレ
ート培養器でEBV、TCGF、leu2B存在下で培養したとこ
ろ、10％のwellにその抗体産生細胞の出現が認められ
た。一方、TCGF、leu2Bのない場合には、その出現率は
５％であつた。
実施例４ 実施例３と同様に調製したリンパ球をMKN45、培養上
清、TCGF、leu2B存在下に培養し、そのリンバ球を８−
アザグアニン耐性親細胞（U266）ヒト1gE産生ミエロー
マとポリエチレングリコール（PEG）1540で常法によつ
て融合した。その結果、胃癌に対する抗体産生細胞が第
３図のように取得された。第３図において縦軸は、抗原
陽性ウエル出現率、横軸は抗原感作時間を示す。
清、TCGF、leu2B存在下に培養し、そのリンバ球を８−
アザグアニン耐性親細胞（U266）ヒト1gE産生ミエロー
マとポリエチレングリコール（PEG）1540で常法によつ
て融合した。その結果、胃癌に対する抗体産生細胞が第
３図のように取得された。第３図において縦軸は、抗原
陽性ウエル出現率、横軸は抗原感作時間を示す。
図中、 ▲：抗原、FBS20％、TCGF、leu2Bを含む培地で培養した
場合 △：抗原、TCGF、leu2Bを含む培地で培養した場合 ●：抗原、FBS20％を含む培地で培養した場合 を示す。
場合 △：抗原、TCGF、leu2Bを含む培地で培養した場合 ●：抗原、FBS20％を含む培地で培養した場合 を示す。
すなわち、FCS、TCGF、leu2B添加で抗原感作後８日目に
融合した時、最大の陽性ウエルの出現率を得た。
融合した時、最大の陽性ウエルの出現率を得た。
（発明の効果） 本発明方法によれば、in vitroで腫瘍細胞に対する抗体
を効率よく産生する細胞を樹立することができる。
を効率よく産生する細胞を樹立することができる。
第１及び２図は、本発明及び比較例における抗体産生細
胞の出現をフローメーターを検出したチヤートを示す。
第３図は抗原陽性ウエル出現率と抗原感作時間の関係を
示す。
胞の出現をフローメーターを検出したチヤートを示す。
第３図は抗原陽性ウエル出現率と抗原感作時間の関係を
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (1)
- 【請求項１】ヘルパー／インデューサーＴ細胞及び腫瘍
抗原並びに抗サプレッサー／サイトキシックＴ細胞抗体
を含有する培地で、Ｂ細胞を培養し、腫瘍抗原に対する
ヒト型抗体を産生する細胞株をEBウイルストランスフォ
ーメーション又はハイブリドーマ法等により樹立するこ
とを特徴とするヒト型抗体産生細胞株の樹立方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61004678A JPH0767388B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | 抗体産生細胞株の樹立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61004678A JPH0767388B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | 抗体産生細胞株の樹立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62163686A JPS62163686A (ja) | 1987-07-20 |
| JPH0767388B2 true JPH0767388B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=11590551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61004678A Expired - Lifetime JPH0767388B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | 抗体産生細胞株の樹立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767388B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5896029A (ja) * | 1981-12-03 | 1983-06-07 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | 抗原特異性ｂ細胞の製造法 |
| JPS58201994A (ja) * | 1982-05-21 | 1983-11-25 | Hideaki Hagiwara | 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法 |
-
1986
- 1986-01-13 JP JP61004678A patent/JPH0767388B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62163686A (ja) | 1987-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abrams et al. | Determination of the optimal human cell lines for development of human hybridomas. | |
| Glassy et al. | UC 729-6, a human lymphoblastoid B-cell line useful for generating antibody-secreting human-human hybridomas. | |
| Spurr et al. | Characterization and chromosomal assignment of a human cell surface antigen defined by the monoclonal antibody AUAI | |
| US4464465A (en) | Cell-driven viral transfer in eukaryotes | |
| Vijayalaxmi et al. | Bloom's syndrome: evidence for an increased mutation frequency in vivo | |
| EP0161941A2 (en) | Monoclonal antibody useful in the diagnosis of human stomach or breast cancer | |
| JPH0690753A (ja) | ハイブリドーマセルラインの製造法 | |
| IL86832A (en) | A recombinant DNA molecule containing a nucleotide sequence of part of the region encoding HBV pre-1s, an immunogenic particle containing multiple peptide monomers containing a pre-s1 epitope and pharmaceutical preparations containing it | |
| JPH05276983A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| CN1585822A (zh) | 抗体的多顺反子表达 | |
| Durie et al. | Establishment of two new myeloma cell lines from bilateral pleural effusions: evidence for sequential in vivo clonal change | |
| Bai et al. | A monoclonal antibody recognizing a cell surface antigen coded for by a gene on human chromosome 17 | |
| JPH0753110B2 (ja) | 細胞産生物を取得する方法 | |
| Dorman et al. | Genetic analysis of the human cell surface: antigenic marker for the human X chromosome in human-mouse hybrids. | |
| EP0162034A2 (en) | Method of isolating monoclonal antibodies from hybridoma cultures | |
| Sompayrac et al. | Stabilization of the 53,000-dalton nonviral tumor antigen is not required for transformation by simian virus 40 | |
| EP0003173A1 (en) | Process for producing human antibodies and composition containing them | |
| Ralph et al. | Functions of macrophage cell lines | |
| JPH0767388B2 (ja) | 抗体産生細胞株の樹立方法 | |
| Astaldi et al. | Increase of hybridoma formation by human lymphocytes after stimulation in vitro; effect of antigen, endothelial cells, and PWM. | |
| US4652522A (en) | Continuous lymphocyte cell lines, their production and use | |
| JP2761543B2 (ja) | ヒト癌原遺伝子産物に対するモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ | |
| Flyer et al. | Lyt phenotype of H-2b CTL effectors and precursors specific for the SV40 transplantation rejection antigen. | |
| Treves et al. | Establishment of cell lines from somatic cell hybrids between human monocytes and mouse myeloma cells. | |
| Abrams et al. | [10] Optimal strategies for developing human—human monoclonal antibodies |