DE69637328T2

DE69637328T2 - Zelladhäsionsinhibitoren

Info

Publication number: DE69637328T2
Application number: DE69637328T
Authority: DE
Inventors: Ko-Chung Lexington LIN; Steven P. Andover ADAMS; Alfredo C. Woburn CASTRO; Craig N. Somerville ZIMMERMAN; Julio Hernan Cambridge CUERVO; Wen-Cherng Lexington LEE; Charles E. Burlington HAMMOND; Mary Beth Belmont CARTER; Ronald G. Lexington ALMQUIST; Carol Lee Lowell ENSINGER
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1995-07-11
Filing date: 1996-07-11
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2016-07-12
Also published as: EA199800119A1; EA003737B1; FI980033A; CA2226868A1; IL122783A; CZ299054B6; EE03694B1; PL188446B1; NO980097L; US6596687B1; BG63876B1; HUP9802202A3; EE9700362A; EP0842196A1; SK3798A3; DE69637328D1; MX9800348A; TW570927B; IS4648A; EP0842196B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die zur Hemmung und Vorbeugung von Zelladhäsion und durch Zelladhäsion bewirkte pathologische Zustände geeignet sind. Diese Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die diese Verbindungen umfassen, und Verfahren unter deren Verwendung zur Hemmung und Vorbeugung von Zelladhäsion und durch Zelladhäsion bewirkte pathologische Zustände. Die Verbindungen und Arzneimitel der Erfindung können als therapeutische oder prophylaktische Mittel verwendet werden. Sie sind insbesondere zur Behandlung vieler entzündlicher und Autoimmunerkrankungen gut geeignet.
Zelladhäsion ist ein Prozess, bei dem sich Zellen miteinander verbinden, zu einem bestimmten Ziel wandern oder in der extrazellulären Matrix lokalisiert sind. Als solche bildet die Zelladhäsion einen der grundlegenden Mechanismen, die zahlreichen biologischen Phänomenen zugrunde liegen. Zum Beispiel ist die Zelladhäsion für die Adhäsion der hämatopoetischen Zellen an endotheliale Zellen und die anschließende Wanderung dieser hämatopoetischen Zellen aus den Blutgefäßen und an die Stelle der Verletzung verantwortlich. Als solche spielt die Zelladhäsion eine Rolle bei pathologischen Zuständen, wie Entzündung und Immunreaktionen bei Säugern.
Untersuchungen in Richtung der molekularen Basis für Zelladhäsion zeigten, dass verschiedene Zelloberflächenmakromoleküle – zusammenfassend als Zelladhäsionsmoleküle oder -rezeptoren bekannt – die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen bewirken. Zum Beispiel sind Proteine der Superfamilie, genannte „Integrine", Schlüsselmediatoren in adhäsiven Wechselwirkungen zwischen hämatopoetischen Zellen und ihrer Mikroumgebung (M. E. Hemler, „VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Functions and Their Role an Leukocytes", Ann. Rev. Immunol., 8, S. 365 (1990)). Integrine sind nicht kovalente heterodimere Komplexe, die aus zwei Untereinheiten, genannt α und β, bestehen. Es gibt mindestens 12 unterschiedliche α-Untereinheiten (α1–α6, α-L, α-M, α-X, α-IIB, α-V und α-E) und mindestens 9 unterschiedliche β(β1–β9)-Untereinheiten. Basierend auf der Art der Komponenten ihrer α- und β-Untereinheit, wird jedes Integrinmolekül in eine Unterfamilie eingeordnet.
α4β1-Integrin, auch als sehr spätes Antigen-4 („VLA-4") oder CD49d/CD29 bekannt, ist ein Oberflächenrezeptor der Leucozytenzellen, der an einer großen Vielzahl von sowohl Zell-Zell- als auch Zell-Matrix-adhäsiven Wecheselwirkungen teilnimmt (M. E. Hemler, Ann. Rev. Immunol., 8, S. 365 (1990)). Er dient als Rezeptor für das durch Cytokin induzierbare Oberflächenprotein von Endothelialzellen, des vaskulären Zelladhäsion-Moleküls-1 („VCAM-1"), sowie des extrazellulären Matrixproteins Fibronectin („FN") (Ruegg et al., J. Cell. Biol., 177, S. 179 (1991); Wagner et al., J. Cell. Biol., 105, S. 1873 (1987); Kramer et al., J. Biol. Chem., 264, S. 4684 (1989); Gehlsen et al., Science, 24, S. 1228 (1988)). Von Anti-VLA4-monoclonalen Antikörpern („mAB") wurde gezeigt, dass sie die VLA4-abhängigen adhäsiven Wechselwirkungen sowohl in vitro als auch in vivo hemmen (Ferguson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, S. 8072 (1991); Ferguson et al., J. Immunol., 150, S. 1172 (1993)). Ergebnisse der in vivo-Experimente legen nahe, dass diese Hemmung von VLA-4-abhängiger Zelladhäsion mehreren entzündlichen und Autoimmun-Pathologien vorbeugen oder sie hemmen kann (R. L. Lobb et al., „The Pathophysiologic Role of α4 Integrins in Vivo", J. Clin. Invest., 94, S. 1722–28 (1994)).
Um die minimale aktive Aminosäuresequenz zu identifizieren, die erforderlich ist, um an VLA-4 zu binden, synthetisierten Komoriya et al. („The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), S. 15075–79 (1991)) eine Reihe von überlappenden Peptiden, basierend auf der Aminosäuresequenz des CS-1 Bereichs (die VLA-4-Bindungsdomäne) einer bestimmten Art von Fibronectin. Sie identifizierten ein 6-Aminosäurepeptid, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr [SEQ ID NO: 1] sowie zwei kleinere überlappende Pentapeptide, Glu-Ile-Leu-Asp-Val [SEQ ID NO: 2] und Leu-Asp-Vgl-Pro-Ser [SEQ ID NO: 3], die Inhibitoraktivität gegen FN-abhängige Zelladhäsion aufwiesen. Diese Ergebnisse legten das Tripeptid Leu-Asp-Val als eine Minimumsequenz für Zelladhäsionsaktivität nahe. Es wurde später gezeigt, dass Leu-Asp-Val nur an Lymphocyten bindet, die eine aktivierte Form von VLA-4 exprimieren, wobei so der Nutzen eines solchen Peptids in vivo in Frage gestellt wird (E. A. Wagner et al., „Activation-Dependent Recognition by Hematopoietic Cells of the LDV Sequenze in the V Region of Fibronectin", J. Cell. Biol., 116(2), S. 489–497 (1992)). Jedoch wurde von bestimmten größeren Peptiden, die die LDV-Sequenz enthalten, anschließend gezeigt, dass sie in vivo wirksam sind [T. A. Ferguson et al., „Two Integrin Einding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, S. 8072–76 (1991); und S. M. Wahl et al., „Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, S. 655–62 (1994)].
Ein cyclisches Pentapeptid
(wobei TPro 4-Thioprolin bezeichnet), das sowohl die VLA-4- als auch VLA-5-Adhäsion an FN hemmen kann, wurde ebenfalls beschrieben (D. M. Nowlin et al. „A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits α4β1 and α5β1 Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem. 268(27), S. 20352–59 (1993); und PCT-Veröffentlichung PCT/US91/04862 ). Dieses Peptid basierte auf der Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp von FN, das als ein gemeinsames Motiv in der Erkennungsstelle für mehrere extrazelluläre Matrixproteine bekannt war.
Trotz dieser Fortschritte bleibt ein Badarf an kleinen spezifischen Inhibitoren von VLA-4-abhängiger Zelladhäsion. Idealerweise wären solche Inhibitoren halbpeptidisch oder nicht peptidisch, so dass sie oral verabreicht werden können. Solche Verbindungen stellen geeignete Mittel zur Behandlung, Vorbeugung oder Unterdrückung verschiedener pathologischer Zustande bereit, die durch Zelladhäsion und VLA-4-Bindung vermittelt werden. Die gleichzeitig anhängige U.S.-Patentanmeldung 08/376,372 beschreibt β-Aminosäure enthaltende lineare Peptidylverbindungen mit Inhibitoraktivität der Zelladhäsion. Die internationalen Patentanmeldungen WO 94/15958 und WO 92/00995 beschreiben cyclische Peptid- und peptidomimetische Verbindungen mit die Zelladhäsion modulierender Wirksamkeit. Die internationalen Patentanmeldungen WO 93/08823 und WO 92/08464 beschreiben Guanidinyl, Harnstoff und Thioharnstoff enthaltende die Zelladhäsion modulierende Verbindungen. Das U.S.-Patent 5,260,277 beschreibt die Zelladhäsion modulierende Guanidinylverbindungen.
WO-A-9515973 offenbart Fragmente der Fibronectindomäne CS1, basierend auf der Sequenz LDV(P), die eine Vielzahl von N- und C-terminalen Substituenten zeigen und Inhibitoraktivität der Zelladhäsion aufweisen. WO-A-9312809 offenbart Peptide, die im Wesentlichen aus LDV bestehen, die auch Inhibitoraktivität der Zelladhäsion zeigen. DE-A-4309867 offenbart Harnstoffderivate, die Aminosäurestrukturen enthalten und auch die Hemmung der Zelladhäsion zeigen.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch Bereitstellen neuer halbpeptidischer Verbindungen, die die Bindung von Liganden an VLA-4 hemmen. Diese Verbindungen sind zur Hemmung, Vorbeugung und Unterdrückung der durch VLA-4 bewirkten Zelladhäsion und von pathologischen Zuständen, die mit der Adhäsion verbunden sind, wie Entzündung und Immunreaktionen, geeignet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln verwendet werden, um die Zelladhäsion zu hemmen, ihr vorzubeugen oder sie zu unterdrücken. Diese Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die diese Inhibitoren der durch VLA-4 vermittelten Zelladhäsion enthalten. Sie können in Verfahren zur Hemmung der Zelladhäsion verwendet werden.
Diese neuen Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren werden vorteilhafterweise zur Behandlung von Entzündungen und Immunkrankheiten verwendet. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen und von Zwischenprodukten bereit, die bei diesen Verfahren geeignet sind.

Die folgenden Abkürzungen werden in der Beschreibung verwendet:

Bezeichnung	Reagens oder Fragment
Ac	Acetyl
Bn	Benzyl
Boc	tert-Butoxycarbonyl
Bu	Butyl
Cbz	Carbobenzyloxy
Cy	Cyclohexyl
CyM	Cyclohexylmethyl
DIPEA	Diisopropylethylamin
EDC	1-(3-Diethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid
HOBT	1-Hydroxybenzotriazolhydrat
i-amyl	Isoamyl
i-Pn	Isopentyl
i-Pr	Isopropyl
Me	Methyl
2-MPUBA	4-(N'-(2-Methylphenyl)harnstoff)phenylmethylamino
2-MPUPA	4-(N'-(2-Methylphenyl)harnstoff)phenylacetyl
NMP	N-Methylpyrrolidinon
NMM	N-Methylmorpholin
Ph	Phenyl
PUPA	4-(N'-Phenylharnstoff)phenylacetyl
Su	Succinimidyl
TBTU	2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat
TEA	Triethylamin
TFA	Trifluoressigsäure
THAM	Tris(hydroxymethyl)aminomethan

Definitionen
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Alkyl" allein oder in Kombination auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylrest, der 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6 und stärker bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele solcher Reste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, iso-Amyl, Hexyl, Decyl und dgl.
Der Begriff „Alkenyl", allein oder in Kombination, bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkenylrest, der 2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 6 und stärker bevorzugt 2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele solcher Reste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Ethenyl, E- und Z-Propenyl, Isopropenyl, E- und Z-Butenyl, E- und Z-Isobutenyl, E- und Z-Pentenyl, Decenyl und dgl.
Der Begriff „Alkinyl" allein oder in Kombination bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkinylrest, der 2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 6 und stärker bevorzugt 2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele solcher Reste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Ethinyl (Acetylenyl), Propinyl, Propargyl, Butinyl, Hexinyl, Decinyl und dgl.
Der Begriff „Cycloalkyl" allein oder in Kombination bezieht sich auf einen cyclischen Alkylrest, der 3–10, vorzugsweise 3–8 und stärker bevorzugt 3–6 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls Aryl-kondensiert sein kann. Beispiele solcher Reste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und dgl.
Der Begriff „Cycloalkenyl" allein oder in Kombination bezieht sich auf einen cyclischen Carbocyclus, der 4 bis 8, vorzugsweise 5 oder 6 Kohlenstoffatome und eine oder mehrere Doppelbindungen enthält. Beispiele solcher Cycloalkenylreste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cyclopentadienyl und dgl.
Der Begriff „Arylrest" bezieht sich auf einen carbocyclischen aromatischen Rest, ausgewählt aus Phenyl, Naphthyl, Indenyl, Indanyl, Azulenyl, Fluorenyl und Anthracenyl; oder einen heterocyclischen aromatischen Rest, ausgewählt aus Furyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, 2-Pyrazolinyl, Pyrazolidinyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1,3,5-Triazinyl, 1,3,5-Trithianyl, Indolizinyl, Indolyl, Isoindolyl, 3H-Indolyl, Indolinyl, Benzo[b]furanyl, 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Benzo[b]thiophenyl, 1H-Indazolyl, Benzimidazolyl, Benzthiazolyl, Purinyl, 4H-Chinolizinyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, 1,8-Napthylridinyl, Pteridinyl, Carbazolyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl, Phenoxazinyl, Pyrazolo[1,5-c]triazinyl und dgl.
Die „Aryl"-, „Cycloalkyl"- und „Cycloalkenyl"-Reste, wie in dieser Anmeldung definiert, können unabhängig bis zu drei Substituenten enthalten, die unabhängig aus Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cyano, Carboxy, Carboalkoxy, Ar'-substituiertem Alkyl, Ar'-substituiertem Alkenyl oder Alkinyl, 1,2-Dioxymethylen, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenyloxy oder Alkinyloxy, Ar'-substituiertem Alkoxy, Ar'-substituiertem Alkenoxy oder Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Ar'-substituiertem Alkylamino, Ar'-substituiertem Alkenylamino oder Alkinylamino, Ar'-substituiertem Carbonyloxy, Alkylcarbonyloxy, aliphatischem oder aromatischem Acyl, Ar'-substituiertem Acyl, Ar'-substituiertem Alkylcarbonyloxy, Ar'-substituiertem Carbonylamino, Ar'-substiuiertem Amino, Ar'-substituiertem Oxy, Ar'-substituiertem Carbonyl, Alkylcarbonylamino, Ar'-substituiertem Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Ar'-substituiertem Alkoxycarbonylamino, Ar'-Oxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, mono- oder Bis-(Ar'-sulfonyl)amino, Ar'-substituiertem Alkylsulfonylamino, Morpholinocarbonylamino, Thiomorpholinocarbonyl amino, N-Alkylguanidino, N-Ar'-Guanidino, N,N-(Ar',alkyl)-Guanidino, N,N-(Ar',Ar')-Guanidino, N,N-Dialkylguanidino, N,N,N-Trialkylguanidino, N-Alkylharnstoff, N,N-Dialkylharnstoff, N-Ar'-Harnstoff, N,N-(Ar',alkyl)-Harnstoff, N,N-(Ar')2-Harnstoff, Aralkyloxycarbonyl-substituiertem Alkyl, Aralkylaminocarbonyl, Thioaryloxy und dgl. auswählt sind; wobei „Ar'" ähnlich wie Aryl definiert ist, aber bis zu drei Substituenten enthält, ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, 1,2-Dioxymethylen, 1,2-Dioxyethylen, Alkoxy, Alkenoxy, Alkinoxy, Alkylamino, Alkenylamino oder Alkinylamino, Alkylcarbonyloxy, aliphatischem oder aromatischem Acyl, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Alkylsulfonylamino, N-Alkyl oder N,N-Dialkylharnstoff.
Der Begriff „Aralkyl" allein oder in Kombination bezieht sich auf einen arylsubstituierten Alkylrest, wobei die Begriffe „Alkyl" und „Aryl" wie vorstehend definiert sind. Beispiele geeigneter Aralkylreste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Phenylmethyl, Phenethyl, Phenylhexyl, Diphenylmethyl, Pyridylmethyl, Tetrazolylmethyl, Furylmethyl, Imidazolylmethyl, Indolylmethyl, Thienylpropyl und dgl.
Der Begriff „Alkoxy" allein oder in Kombination bezieht sich auf einen Alkyletherrest, wobei der Begriff „Alkyl" wie vorstehend definiert ist. Beispiele geeigneter Alkyletherreste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy, iso-Butoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy und dgl.
Der Begriff „saurer funktioneller Rest" bezieht sich auf einen Rest, der ein saures Wasserstoffatom darin aufweist. Beispiele solcher Reste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Carbonsäure, Tetrazol, Imidazol, Hydroxyl, Mercapto, Hydroxylaminocarbonyl, Sulfonsäure, Sulfinsäure, Phosporsäure und Phosphonsäure.
Die Begriffe „geschützt" oder „Schutzgruppe" beziehen sich auf eine geeignete chemische Gruppe, die an eine funktionelle Gruppe eines Moleküls gebunden, dann in einem späteren Stadium entfernt werden kann, wobei die intakte funktionelle Gruppe und das Molekül erhalten werden. Beispiele geeigneter Schutzgruppen für verschiedene funktionelle Gruppen sind in T. W. Greene und P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausg., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser und M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); L. Paquette, Hrsg. Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) beschrieben.
Die Verbindungen dieser Erfindung enthalten ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome und treten so als Razemate oder razemische Gemische, einzelne Enantiomere, diastereomere Gemische und einzelne Diastereomere auf. Alle solchen isomeren Formen dieser Verbindungen sind ausdrücklich in die vorliegende Erfindung eingeschlossen. Jedes stereogene Kohlenstoffatom kann die R- oder S-Konfiguration aufweisen. Obwohl bestimmte Verbindungen, die in dieser Anmeldung veranschaulicht sind, in einer bestimmten stereochemischen Konfiguration dargestellt werden können, sind Verbindungen mit entweder der entgegengesetzten Stereochemie an einem bestimmten chiralen Zentrum oder Gemische davon als Teil der Erfindung in Betracht gezogen. Obwohl Aminosäuren und Aminosäureseitenketten in einer bestimmen Konfiguration dargestellt werden können, sind sowohl natürliche als auch unnatürliche Formen als Teil der Erfindung in Betracht gezogen.
Im Hinblick auf die vorstehenden Definitionen sind andere chemische Begriffe, die in dieser Anmeldung verwendet werden, vom Fachmann leicht zu verstehen. Begriffe können allein oder in jeder Kombination davon verwendet werden. Die bevorzugten und stärker bevorzugten Kettenlängen der Reste beziehen sich auf alle solchen Kombinationen.
Diese Erfindung stellt Verbindungen bereit, die zum Hemmen der durch VLA-4 bewirkten Zelladhäsion durch Hemmen der Bindung von Liganden an den Rezeptor fähig sind. Diese Verbindungen werden durch die Formel (I): Z-(Y¹)-(Y²)-(Y³)_n-X (I)dargestellt und pharmazeutisch verträgliche Derivate davon; wobei:
Z ein mit (N-Ar'-Harnstoff) para-substituierter Aralkylcarbonyl-Rest ist;
Y¹ -N(R¹)-C(R²)(A¹)-C(O)- ist;
Y² -N(R¹)–C(R²)(A²)–C(O)- ist;
jedes Y³ durch die Formel N(R¹)-C(R²)(A³)-C(O)- dargestellt ist;
jedes R¹ unabhängig ausgewählt ist aus einem Waserstoffatom, Alkyl und Aralkyl; Alkenyl; Alkinyl; Cycloalkyl; Cycloalkenyl; Cycloalkylalkyl; Aryl; Aminoalkyl; Mono- oder Di-alkyl- substituiertem Aminoalkyl; Mono- oder Di-aralkyl-substituiertem Aminoalkyl; Hydroxyalkyl; Alkoxyalkyl; Mercaptoalkyl; Thioalkoxyalkyl;
A¹ ausgewählt ist aus Aminocarbonylethyl, n-Butyl, Isobutyl, Carboxyethyl, Cyclohexyl, 1-Hydroxyethyl, Hydroxymethyl, Mercaptomethyl, 1-Methylpropyl, Methylthioethyl, n-Propyl, Isopropyl, Methoxycarbonylaminobutyl, 6-Aminohexanoylaminobutyl und (wenn A¹ und R¹ zusammengenommen werden) Azetidin, Aziridin, Pyrrolidin und Piperidin;
A² ausgewählt ist aus Carboxymethyl, 2-Carboxyethyl, 1-Carboxyethyl, Hydroxylaminocarbonylmethyl und Imidazolylmethyl;
A³ unabhängig ausgewählt ist aus Aminosäureseitenketten und entsprechenden geschützten Derivaten; Cyclohexyl; und Alkyl gegebenenfalls substituiert mit Phenyl, Cyclohexyl, Carboxy, Hydroxylaminocarbonyl, Methoxy, Benzyloxy, Mercapto, N-Benzylimidazolyl, Biotinyl, Tetrazolyl, Valinyl-N-carbonyl oder 6-Aminohexanoylamino;
jedes R² unabhängig ausgewählt ist aus einem Wasserstoffatom und Alkyl;
n eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist; und
X ausgewählt ist aus C_1-6 Alkoxy; Hydroxyl; Amino; und Tris(hydroxymethyl)aminomethan;
wobei Alkyl ein C_1-10-Alkylradikal darstellt; Alkenyl ein C_2-10-Alkenylradikal darstellt; Alkinyl ein C_2-10-Alkinylradikal darstellt; Cycloalkyl ein cyclisches C_3-8-Alkylradikal darstellt; Cycloalkenyl einen cyclischen C_4-8-Carbocyclus mit einer oder mehreren Doppelbindungen darstellt; Aryl einen Rest darstellt ausgewählt aus Phenyl, Naphthyl, Fluorenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Pyrazolyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1,3,5-Triazinyl, Indolyl, Benzo[b]furanyl, 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Chinoxalinyl, 1,8-Naphthyridinyl, Acridinyl; Aralkyl ein arylsubstituiertes Alkyl darstellt; wobei Ar(alk)yl oder Ar' mit Methoxy, Hydroxy, Methyl oder Fluor substituiert sein kann; und ein saurer funktioneller Rest einen Rest mit einem sauren Wasserstoffatom darstellt.
Ein „pharmazeutisch verträgliches Derivat" bezeichnet jedes pharmazeutisch verträgliche Salz, Ester, Salz eines solchen Esters, Amid oder Salz eines solchen Amids einer erfindungsgemäßen Verbindung.
Vorzugsweise ist A¹ aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Benzyl, n-Butyl, Methylthioethyl, Cyclohexyl, 1-Methylpropyl und Isopropyl. Ein alternatives bevorzugtes A¹ ist (wenn A¹ und R¹ zusammengenommen werden) Pyrrolidin.
Beispiele einiger bestimmter bevorzugter Verbindungen dieser Erfindung sind in Tabelle 1 bereitgestellt.
Tabelle 1

Z-(Y¹)-(Y²)-(Y³)_n-X (I)wobei Y¹-N(R¹)-C(R²)(A¹)-C(O)- ist; Y² -N(R¹)–C(R²)(A²)–C(O)- ist; jedes Y³ durch die Formel N(R¹)-C(R²)(A³)–C(O)- dargestellt wird.

Für A¹, A² und A³ bezieht sich ein Einzelbuchstabencode auf die Seitenkette der entsprechenden Aminosäure, die durch den Buchstaben bezeichnet wird. Ein Großbuchstabe (z. B. A) gibt die L-Aminosäure an, während ein kleiner Buchstabe (z. B. a) die D-Aminosäure angibt. Sowohl Großbuchstaben als auch kleine Buchstaben (z. B. L(l)) gibt ein Gemisch an.

Wenn nicht ausdrücklich das Gegenteil angegeben, weisen die Verbindungen in dieser Tabelle R¹ und R² als Wasserstoffatom auf.

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
1	3-methoxy-4-(N'-phenylharnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	OH
2	3-methoxy-4-(N'-phenylharnstoff)phenylacetyl	M	D	V/P	OH
3	6-methoxy-5-(N'-(2-methylphenyl)harnstoff)-2-pyridylacetyl	L	D	V	NH₂
4	6-methoxy-5-(N'-(2-methylphenyl)harnstoff)-2-pyridylacetyl	L	D	V	OH

Verb. Nr	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
144	4-(N'-2-hydroxyphenylharnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	OH
145	PUPA	L	D	V/P	OH
146	4-(N'-2-hydroxyphenylharnstoff)phenylacetyl	M	D	V/P	OH
147	3-methoxy-4-(N'-phenylharnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	NH₂
148	2-MPUPA	L	D	V/P	NH₂

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
199	PUPA	l	D	V/P	NH₂
200	PUPA	L	d	V/P	NH₂
201	PUPA	L	D	v/P	NH₂
202	2-MPUPA	(N-6-aminohexanoyl)-K	D	V/P	OH
203	PUPA	L	D	V	OH
206	2-MPUPA	L	D	V/P	OH

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
207	2-MPUPA	L	D	phenyl	OH
208	PUPA	L	D	V/P	NH₂
209	PUPA	l	D	V/P	NH₂
210	PUPA	L	d	V/P	NH₂
211	PUPA	L	D	v/P	NH₂
212	PUPA	l	d	v/p	NH₂
219	2-MPUPA	M	D	D	NH₂
220	2-MPUPA	M	D	L	NH₂
221	2-MPUPA	M	D	V	NH₂
222	2-MPUPA	M	D	l	NH₂
223	2-MPUPA	M	D	E	NH₂
224	2-MPUPA	M	D	T	NH₂
225	2-MPUPA	M	D	M	NH₂
226	2-MPUPA	M	D	n	NH₂
227	2-MPUPA	M	D	e	NH₂
228	2-MPUPA	M	D	W	NH₂
229	2-MPUPA	M	D	s	NH₂
230	2-MPUPA	L	D	D	NH₂
231	2-MPUPA	L	D	L	NH₂
232	2-MPUPA	L	D	V	NH₂
233	2-MPUPA	L	D	l	NH₂
234	2-MPUPA	L	D	E	NH₂

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
235	2-MPUPA	L	D	T	NH₂
236	2-MPUPA	L	D	M	NH₂
237	2-MPUPA	L	D	n	NH₂
238	2-MPUPA	L	D	e	NH₂
239	2-MPUPA	L	D	W	NH₂
240	2-MPUPA	L	D	s	NH₂
241	2-MPUPA	P	D	D	NH₂
242	2-MPUPA	P	D	L	NH₂
243	2-MPUPA	P	D	V	NH₂
244	2-MPUPA	P	D	l	NH₂
245	2-MPUPA	P	D	E	NH₂
246	2-MPUPA	P	D	T	NH₂
247	2-MPUPA	P	D	M	NH₂
248	2-MPUPA	P	D	n	NH₂
249	2-MPUPA	P	D	e	NH₂
250	2-MPUPA	P	D	W	NH₂
251	2-MPUPA	P	D	s	NH₂
252	2-MPUPA	T	D	D	NH₂
253	2-MPUPA	T	D	L	NH₂
254	2-MPUPA	T	D	V	NH₂
255	2-MPUPA	T	D	l	NH₂
256	2-MPUPA	T	D	T	NH₂
257	2-MPUPA	T	D	T	NH₂
258	2-MPUPA	T	D	M	NH₂
259	2-MPUPA	T	D	n	NH₂
260	2-MPUPA	T	D	e	NH₂
261	2-MPUPA	T	D	W	NH₂
262	2-MPUPA	T	D	s	NH₂
263	2-MPUPA	E	D	D	NH₂

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
264	2-MPUPA	E	D	L	NH₂
265	2-MPUPA	E	D	V	NH₂
266	2-MPUPA	E	D	l	NH₂
267	2-MPUPA	E	D	E	NH₂
268	2-MPUPA	E	D	T	NH₂
269	2-MPUPA	E	D	M	NH₂
270	2-MPUPA	E	D	n	NH₂
271	2-MPUPA	E	D	e	NH₂
272	2-MPUPA	E	D	W	NH₂
273	2-MPUPA	E	D	s	NH₂
274	2-MPUPA	E	D	V	NH₂
275	2-MPUPA	S	D	D	NH₂
276	2-MPUPA	S	D	L	NH₂
277	2-MPUPA	S	D	V	NH₂
278	2-MPUPA	S	D	l	NH₂
279	2-MPUPA	S	D	E	NH₂
280	2-MPUPA	S	D	T	NH₂
281	2-MPUPA	S	D	M	NH₂
282	2-MPUPA	S	D	n	NH₂
283	2-MPUPA	S	D	e	NH₂
284	2-MPUPA	S	D	W	NH₂
285	2-MPUPA	S	D	s	NH₂
286	2-MPUPA	l	D	D	NH₂
287	2-MPUPA	l	D	L	NH₂
288	2-MPUPA	l	D	V	NH₂
289	2-MPUPA	l	D	l	NH₂
290	2-MPUPA	l	D	E	NH₂
291	2-MPUPA	l	D	T	NH₂
292	2-MPUPA	l	D	M	NH₂

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
293	2-MPUPA	l	D	n	NH₂
294	2-MPUPA	l	D	e	NH₂
295	2-MPUPA	l	D	W	NH₂
296	2-MPUPA	l	D	s	NH₂
297	2-MPUPA	Q	D	D	NH₂
298	2-MPUPA	Q	D	L	NH₂
299	2-MPUPA	Q	D	V	NH₂
300	2-MPUPA	Q	D	l	NH₂
301	2-MPUPA	Q	D	E	NH₂
302	2-MPUPA	Q	D	T	NH₂
303	2-MPUPA	Q	D	M	NH₂
304	2-MPUPA	Q	D	n	NH₂
305	2-MPUPA	Q	D	e	NH₂
306	2-MPUPA	Q	D	W	NH₂
307	2-MPUPA	Q	D	s	NH₂
308	2-MPUPA	M	E	D	NH₂
309	2-MPUPA	M	E	V	NH₂
310	2-MPUPA	L	E	D	NH₂
311	2-MPUPA	L	E	V	NH₂
312	2-MPUPA	P	E	D	NH₂
313	2-MPUPA	P	E	V	NH₂
314	2-MPUPA	T	E	D	NH₂
315	2-MPUPA	M	D	V/P	OH
316	4-(N'-2-pyridylharnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	OH
317	3-methoxy-4-(N'-(2-methylphenyl)harnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	NH₂

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
336	4-(2-fluorphenylharnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	OH
337	2-MPUPA	L	D	V/P/S	OH
338	2-MPUPA	L	D	V/P/S/T	OH
345	2-MPUPA	L	D	V	OH

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
346	4(N-(6-methyl-2-pyridyl)harnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	OH
347	4-(N-2-fluorphenylharnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	OH
357	4-(N'-2-pyridylharnstoff)phenylacetyl	L	D	V/P	NH₂
358	2-MPUPA	L	D*THAM	V/P	OTHAM
359	2-MPUPA	L	D*Na	V/P	ONa

Verb. Nr.	Z	A¹	A²	(A³)_n	X
411	2-MPUPA	P	D	l	OH
412	2-MPUPA	-CH₂CH₂- (N of R¹)	D	l	OH
415	2-MPUPA	P	E	l	OH
416	2-MPUPA	P	E	-	OH

Die stärker bevorzugten Verbindungen der Formel (I) sind aus der Gruppe, bestehend aus den Verbindungsnummern 1, 2, 4, 144, 145, 146, 147, 148, 206, 315, 316, 317, 337, 338, 345, 346, 347, 357, 358 und 359, wie in Tabelle 1 identifiziert, ausgewählt. Noch stärker bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind aus der Gruppe, bestehend aus den Verbindungsnummern 1, 206, 316, 358 und 359, wie in Tabelle 1 identifiziert, ausgewählt. Die am stärksten bevorzugten Verbindungen der Formel (I) sind aus der Gruppe, bestehend aus den Verbindungsnummern 358 und 359, wie in Tabelle 1 identifiziert, ausgewählt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können unter Verwendung jedes herkömmlichen Verfahrens synthetisiert werden. Vorzugsweise werden diese Verbindungen aus leicht erhältlichen Ausgangssubstanzen, wie α-Aminosäuren und ihren funktionellen Äquivalenten, chemisch synthetisiert. Modulare und konvergente Verfahren für die Synthese dieser Verbindungen sind ebenfalls bevorzugt. In einer konvergenten Annäherung werden zum Beispiel große Abschnitte des Endprodukts in den letzten Stadien der Synthese zusammengebracht und nicht durch die Zugabe kleiner Teile in Inkrementen zu einer wachsenden Molekülkette.
Gemäß einer Ausführungsform können erfindungsgemäße Verbindungen auf folgende Weise synthetisiert werden. Eine geschützte Aminosäure oder ein funktionelles Äquivalent wird an eine geeignete aktivierte Estereinheit gekoppelt. Das gekoppelte Produkt kann, wenn es geeignet funktionalisiert ist, weiter umgesetzt werden, wobei noch eine andere aktivierte Estereinheit erhalten wird. Diese Substanz kann weiter manipuliert werden, wobei die gewünschten Verbindungen der Erfindung erhalten werden. In jedem Schritt der vorstehenden Sequenz kann der Ester zu der entsprechenden Säure hydrolysiert werden, wobei eine andere Verbindung der Erfindung erhalten wird. Diese Säure kann auch mit Standardverfahren in ein entsprechendes Säurederivat umgewandelt werden.
In einer anderen Ausführungsform können die vorstehend genannten aktivierten Estereinheiten zuerst verbunden werden, dann kann die erhaltene Esterverbindung an zusätzliche Aminosäuren oder ihre Äquivalente der funktionellen Gruppen angeknüpft werden. Zu diesem Zeitpunkt können die endgültigen Manipulationen und/oder erforderlichen Schritte zur Schutzgruppenabspaltung durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform können unter geeigneten Bedingungen die gewünschten Funktionalitäten in eine der aktivierten Estereinheiten eingebaut werden (geschützt oder nicht geschützt). Der Ester wird dann mit einem Aminosäurederivat oder einer Einheit gekoppelt, die aus einem Aminosäurederivat besteht, das zuvor an einen aktivierten Ester gekoppelt wurde. Das erhaltene Produkt kann dann jedem Schritt zur Schutzgruppenabspaltung, falls erforderlich, unterzogen werden, wobei erfindungsgemäße Verbindungen erhalten werden.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen unter Verwendung von Festträgertechniken synthetisiert werden. Die Kernaminosäure oder ihre funktionellen äquivalenten Gruppen werden unter Verwendung einer reiterativen Standardkopplungsverfahrensweise auf einem Harz angeordnet. Wenn der gewünschte Kern vollständig ist, kann das erhaltene Fragment mit einer aktivierten Estereinheit gekoppelt werden und/oder das gebundene Ende des Fragments kann weiter derivatisiert werden, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird. Geeignete Verfahren zum Schützen/zur Schutzgruppenabspaltung können an jedem Punkt während der Synthesesequenz verwendet werden.
Wie in der Anmeldung verwendet, bezieht sich der Begriff „Patient" auf Säuger, einschließlich Menschen. Und der Begriff „Zelle" bezieht sich auf Zellen von Säugern, einschließlich Zellen von Menschen.
Nachdem sie synthetisiert wurden, können die Wirksamkeiten und VLA-4 Spezifitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen unter Verwendung von in vitro- und in vivo-Assays bestimmt werden.
Zum Beispiel kann die Inhibitoraktivität der Zelladhäsion dieser Verbindungen durch Bestimmen der Konzentration des Inhibitors gemessen werden, die erforderlich ist, die Bindung von VLA-4 exprimierenden Zellen an Fibronectin- oder CS1-beschichtete Platten zu blockieren. Bei diesem Assay werden Mikrotitervertiefungen mit entweder Fibronectin (enthält die CS-1 Sequenz) oder CS-1 beschichtet. Wenn CS-1 verwendet wird, muss es an ein Trägerprotein, wie Rinderserumalbumin, konjugiert werden, um an die Vertiefungen zu binden. Nachdem die Vertiefungen beschichtet sind, werden dann variierende Konzentrationen der Testverbindung zusammen mit geeignet markierten VLA-4 exprimierenden Zellen zugegeben. In einer anderen Ausführungsform kann die Testverbindung zuerst zugegeben werden, und man läßt sie vor der Zugabe der Zellen mit den beschichteten Vertiefungen inkubieren. Die Zellen läßt man in den Vertiefungen mindestens 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen geleert und gewaschen. Die Hemmung der Bindung wird durch quantitative Bestimmung der Fluoreszenz oder Radioaktivität, gebunden an die Platte für jede der verschiedenen Konzentrationen der Testverbindungen, sowie für Kontrollen, die keine Testverbindung enthalten, gemessen.
VLA-4 exprimierende Zellen, die in diesem Assay verwendet werden können, schließen Ramos-Zellen, Jurkat-Zellen, A375-Melanomzellen, sowie Lymphocyten von menschlichem peripheren Blut (PBL) ein. Die in diesem Assay verwendeten Zellen können fluoreszent oder radioaktiv markiert werden.
Ein direkter Bindungsassay kann ebenfalls zur quantitativen Bestimmung der Inhibitoraktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden. In diesem Assay wird ein VCAM-IgG-Fusionsprotein, das die ersten zwei Immunglobulindomänen von VCAM (D1D2) enthält, verknüpft oberhalb der Gelenkregion eines IgG1-Moleküls („VCAM 2D-IgG"), an ein Markerenzym, wie alkalische Phosphatase („AP") konjugiert. Die Synthese dieser VCAM-IgG-Fusion ist in der PCT-Veröffentlichung WO 90/13300 beschrieben, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Konjugation der Fusion an ein Markerenzym wird durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Vernetzungsverfahren erreicht.
Das VCAM-IgG-Enzymkonjugat wird dann in die Vertiefungen einer Filtrationsplatte mit vielen Vertiefungen gegeben, wie das im Millipore Multiscreen Assay System (Millipore Corp., Redford, MA) enthaltene. Variierende Konzentrationen der Testinhibitorverbindung werden dann zu den Vertiefungen gegeben, gefolgt von der Zugabe von VLA-4 exprimierenden Zellen. Die Zellen, Verbindung und VCAM-IgG-Enzymkonjugat werden zusammen gemischt, und man läßt sie bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach der Inkubation werden die Vertiefungen im Vakuum geelert, wobei die Zellen und gebundenes VCAM verbleiben. Die quantitative Bestimmung von gebundenem VCAM wird durch Zugabe eines geeigneten kolorimetrischen Substrats für das an VCAM-IgG konjugierte Enzym und Bestimmen der Menge des Reaktionsprodukts bestimmt. Verringertes Reaktionsprodukt zeigt erhöhte Inhibitoraktivität der Bindung an.
Um die VLA-4 Inhibitorspezifität der erfindungsgemäßen Verbindungen zu untersuchen, werden Assays für andere Hauptgruppen von Integrinen, d. h. 132 und 133, sowie andere β1-Integrine, wie VLA-5, VLA-6 und α4β7, durchgeführt. Diese Assays können ähnlich zu den Assays zur Adhäsionshemmung und der direkten Bindung sein, die vorstehend beschrieben sind, wobei die geeignete Integrin exprimierende Zelle und der entsprechende Ligand ersetzt werden. Zum Beispiel exprimieren polymorphonucleare Zellen (PMN) die β2-Integrine auf ihrer Oberfläche und binden an ICAM. β3-Integrine sind in Blutpiättchenaggregation einbezogen, und die Hemmung kann in einem Standardassay der Blutplättchenaggregation gemessen werden. VLA-5 bindet spezifisch an Arg-Gly-Asp-Sequenzen, während VLA-6 an Laminin bindet. α4β7 ist ein vor kurzem entdecktes Homolog von VLA-4, das auch Fibronectin und VCAM bindet. Spezifität in Bezug auf α4β7 wird in einem Bindungsassay bestimmt, der das vorstehend beschriebene VCAM-IgG-Enzymmarkerkonjugat und eine Zelllinie verwendet, die α4β7, aber nicht VLA-4, ausdrückt, wie RPMI-8866-Zellen.
Nachdem VLA-4 spezifische Inhibitoren identifiziert sind, können sie weiter in in vivo-Assays charakterisiert werden. Ein solcher Assay untersucht die Hemmung der Kontaktüberempfindlichkeit bei einem Tier, wie von P. L. Chisholm et al., „Monoclonal Antibodies to the Integrin α-4 Subunit Inhibit the Murine Contact Hypersensitivity Response", Eur. J. Immunol., 23, S. 682–688 (1993) und in „Current Protocols in Immunology", J. E. Coligan et al., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, 1, S. 4.2.1–4.2.5 (1991) beschrieben. Bei diesem Assay wird die Haut des Tieres durch Aussetzen an eine reizende Substanz, wie Dinitrofluorbenzol, sensibilisiert, gefolgt von leichter physikalischer Reizung, wie leichtes Kratzen der Haut mit einer scharfen Kante. Nach einem Erhohlungszeitraum werden die Tiere unter Durchführen des gleichen Verfahrens wieder sensibilisiert. Mehrere Tage nach der Sensibilisierung wird ein Ohr des Tieres der chemischen reizenden Substanz ausgesetzt, während das andere Ohr mit einer nicht reizenden Kontrolllösung behandelt wird. Kurz nach Behandeln der Ohren werden den Tieren verschiedene Dosen des VLA-4-Inhibitors durch subcutane Injektion verabreicht. Die in vivo-Hemmung der mit Zelladhäsion verbundenen Entzündung wird durch Messen der Reaktion des Anschwellens des Ohrs des Tieres bei dem behandelten gegen das nicht behandelte Ohr untersucht. Das Anschwellen wird unter Verwendung einer Mikrometerschraube oder eines anderen geeigneten Instruments zum Messen der Dicke des Ohrs gemessen. Auf diese Weise kann man die erfindungsgemäßen Inhibitoren identifizieren, die am besten zur Hemmung der Entzündung geeignet sind.
Ein anderer in vivo-Assay, der zum Untersuchen der erfindungsgemäßen Inhibitoren verwendet werden kann, ist der Schafasthma-Assay. Dieser Assay wird im Wesentlichen wie in W. M. Abraham et al., „α-Integrins Mediate Antigen-induced Late Bronchial Responses and Prolonged Airway Hyperresponsiveness in Sheep", J. Clin. Invest., 93, S. 776–87 (1994). Dieser Assay misst die Hemmung der durch Ascaris-Antigen bewirkten Atemwegsreaktion in der späten Phase und Atemwegsüberreaktivität beim asthmatischem Schaf.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in der Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren und Basen abgeleitet sind. Eingeschlossen unter solchen Säuresalzen sind die folgenden: Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat. Basensalze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit organischen Basen, wie Dicyclohexylaminsalze, N-Methyl-D-glucamin, Tris(hydroxymethyl)methylamin und Salze mit Aminosäuren, wie Arginin, Lysin usw., ein. Ebenfalls können die basischen Stickstoff enthaltenden Reste mit solchen Mitteln, wie Niederalkylhalogeniden, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchlorid, -bromiden und -iodiden; Dialkylsulfaten, wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten, langkettigen Halogeniden, wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, -bromiden und -iodiden, Aralkylhalogeniden, wie Benzyl- und Phenethylbromiden und anderen, quaternisiert werden. Wasser- oder öllösliche oder -dispergierbare Produkte werden dabei erhalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zu Arzneimitteln formuliert werden, die oral, parenteral, durch Inhalationsspray, topisch, rektal, nasal, buccal, vaginal oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden können. Der Begriff „parenteral", wie hier verwendet, schließt subcutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahepatische, intraläsionale und intracraniale Injektions- oder Infusionsverfahren ein.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel umfassen jede der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutisch verträgliche Derivate davon, zusammen mit jedem pharmazeutisch verträglichen Träger. Der Begriff „Träger", wie hier verwendet, schließt verträgliche Hilfsmittel und Träger ein. Pharmazeutisch verträgliche Träger, die in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie menschliches Seriumalbumin, Puffersubstanzen, wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Teilglyceridgemische von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid, Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulosebasis, Polyethylenglycol, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyacrylate, Wachse, Polyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglycol und Wollfett.
Gemäß dieser Erfindung können die Arzneimittel in der Form eines sterilen injizierbaren Präparats, zum Beispiel einer sterilen injizierbaren wässrigen oder ölhaltigen Suspension, sein. Diese Suspension kann gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspendiermittel formuliert werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, zum Beispiel als eine Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Unter den verträglichen Trägem und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile fette Öle herkömmlich als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Für diesen Zweck kann jedes milde fette Öl verwendet werden, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride. Fettsäuren, wie Ölsäure und ihre Glyceridderivate, sind zur Herstellung von injizierbaren Mitteln geeignet, sowie natürliche pharmazeutisch verträgliche Öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere ihre polyoxyethylierten Versionen. Diese Öllösungen oder Suspensionen können auch ein langkettiges Alkoholverdünnungsmittel oder -dispergiermittel enthalten, wie Ph. Hely oder einen ähnlichen Alkohol.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können oral in jeder verträglichen Dosierungsform verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kapseln, Tabletten, wässrige Suspensionen oder Lösungen. Im Fall von Tabletten für orale Verwendung schließen Träger, die herkömmlich verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden ebenfalls typischerweise zugegeben. Für orale Verabreichung in einer Kapselform schließen geeignete Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen für orale Verwendung erforderlich sind, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süß-, Geschmacks- oder färbende Mittel ebenfalls zugegeben werden.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Arzneimittel in der Form von Suppositorien für rektale Verabreichung verabreicht werden. Diese können durch Mischen des Mittels mit einem geeigneten nicht reizenden Exzipienten, der bei Raumtemperatur fest, aber bei Rektaltemperatur flüssig ist und daher im Rektum schmilzt, hergestellt werden, wobei der Arzneistoff freigesetzt wird. Solche Substanzen schließen Kakaobutter, Bienenwachs und Polyethylenglycole ein.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können ebenfalls topisch verabreicht werden, insbesondere wenn das Ziel der Behandlung Bereiche oder Organe einschließt, die durch topische Aufbringung leicht zugänglich sind, einschließlich Erkrankungen des Auges, der Haut oder des unteren Intestinaltrakts. Geeignete topische Formulierungen werden ohne weiteres für jeden dieser Bereiche oder Organe hergestellt.
Topische Aufbringung für den unteren Intestinaltrakt kann in einer rektalen Suppositorienformulierung (siehe vorstehend) oder in einer geeigneten Klistierformulierung durchgeführt werden. Topisch-transdermale Pflaster können ebenfalls verwendet werden.
Für topische Anwendungen können die Arzneimittel in einer geeigneten Salbe formuliert werden, die den Wirkstoff suspendiert oder gelöst in einem oder mehreren Trägern enthält. Träger für topische Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mineralöl, flüssiges Petrolat, weißes Petrolat, Propylenglycol, Polyoxyethylen, Polyoxypropylenverbindung, emulgierendes Wachs und Wasser. In einer anderen Ausführungsform können die Arzneimittel in einer geeigneten Lotion oder Creme formuliert werden, die die Wirkstoffe suspendiert oder gelöst in einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern enthält. Geeignete Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mineralöl, Sorbitanmonostearat, Polysorbat 60, Cetylesterwachs, Cetarylalkohol, 2-Octyldodecanol, Benzylalkohol und Wasser.
Für ophthalmische Verwendung können die Arzneimittel als mikronisierte Suspensionen in isotonischer steriler Salzlösung mit eingestelltem pH-Wert oder vorzugsweise als Lösungen in isotonischer steriler Salzlösung mit eingestelltem pH-Wert entweder mit oder ohne einem Konservierungsmittel, wie Benzylalkoniumchlorid, formuliert werden. In einer anderen Ausführungsform können für ophthalmologische Verwendungen die Arzneimittel in einer Salbe, wie Petrolat, formuliert werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch durch ein nasales Aerosol oder Inhalation durch die Verwendung eines Nebelbildners, eines Trockenpulverinhalators oder eines Inhalators mit abgemessener Dosis verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen werden gemäß auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren der Arzneimittelformulierung hergestellt und können als Lösungen in Salzlösung unter Verwendung von Benzylalkohol oder anderen geeigneten Konservierungsmitteln, Absorptionsverbesserern zum Erhöhen der Bioverfügbarkeit, Fluorkohlenstoffen und/oder anderen herkömmlichen Mitteln zum Löslichmachen oder Dispergieren hergestellt.
Die Menge des Wirkstoffs, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine einzelne Dosierungsform herzustellen, variiert abhängig vom behandelten Wirt und der betreffenden Art der Verabreichung. Es sollte jedoch zu verstehen sein, dass ein bestimmtes Dosierungs- und Behandlungsschema für einen betreffenden Patienten von einer Reihe von Faktoren abhängt, einschließlich der Wirksamkeit der bestimmten verwendeten Verbindung, dem Alter, Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, der Diät, dem Zeitpunkt der Verabreichung, der Geschwindigkeit der Ausscheidung, der Arzneistoffkombination und der Einstufung durch den behandelnden praktischen Arzt und der Schwere der betreffenden zu behandelnden Krankheit. Die Menge des Wirkstoffs kann auch von dem therapeutischen oder prophylaktischen Mittel, falls vorhanden abhängen, mit dem der Bestandteil gleichzeitig verabreicht wird.
Die Dosierung und die Dosisrate der erfindungsgemäßen Verbindungen, die zum Vorbeugen, Unterdrücken oder Hemmen der Zelladhäsion wirksam sind, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie der Art des Inhibitors, der Größe des Patienten, dem Ziel der Behandlung, der Art des zu behandelnden pathologischen Zustands, des bestimmten verwendeten Arzneimittels und der Einstufung durch den behandelnden praktischen Arzt. Dosierungsniveaus zwischen etwa 0,001 und etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag, der Verbindung des Wirkstoffs sind geeignet.
Gemäß einer anderen Ausführungsform können Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, auch ein zusätzliches Mittel umfassen, ausgewählt aus Corticosteroiden, Bronchodilatoren, Antiasthmatika (Mastzellenstabilisatoren), Antiphlogistika, Antirheumatika, immunsuppresiven Mitteln, Antimetaboliten, Immunmodulatoren, Antipsoriatika und Antidiabetika. Bestimmte Verbindungen in jeder dieser Gruppen können aus einem der unter den geeigneten Gruppenüberschriften in „Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, S. 970–986 (1990) ausgewählt werden. Ebenfalls eingeschlossen in diese Gruppe sind Verbindungen, wie Theophyllin, Sulfasalazin und Aminosalicylate (Antiphlogistika); Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin (immunsuppressive Mittel); Cyclophosphamid und Methotrexat (Antimetaboliten); und Interferone (Immunmodulatoren).
Gemäß anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln bereit, die in Verfahren zur Vorbeugung, Hemmung oder Unterdrückung der mit Zelladhäsion verbundenen Entzündung und der mit Zelladhäsion verbundenen Immun- oder Autoimmunreaktionen zu verwenden sind. Die mit VLA4 verbundene Zelladhäsion spielt eine zentrale Rolle in einer Reihe von Entzündungs-, Immun- und Autoimmunerkrankungen. So kann die Hemmung der Zelladhäsion durch die erfindungsgemäßen Verbindungen bei Verfahren der Behandlung oder Verhinderung von Entzündungs-, Immun- und Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Vorzugsweise sind die mit den Verfahren der Erfindung zu behandelnden Erkrankungen aus Asthma, Arthritis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, multipler Sklerose, Diabetes und Reizdarmsyndrom ausgewählt.
Diese Verfahren können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Monotherapie oder in Kombination mit einem Mittel gegen Entzündungen oder immunsuppressiven Mittel verwenden. Solche Kombinationstherapien schließen die Verabreichung der Mittel in einer einzelnen Dosierungsform oder in mehreren Dosierungsformen, gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeiten verabreicht, ein.
Um die Erfindung vollständiger zu verstehen, sind die folgenden Beispiele aufgeführt. Diese Beispiele sind nur zur Veranschaulichung und sind. nicht als Einschränkung des Schutzbereichs der Erfindung in irgendeiner Weise aufzufassen.
BEISPIELE
Allgemeine Verfahren für die Bildung einer Amidbindung in Lösung:
Verfahren A: Kopplung mit EDC/HOBt
Eine Lösung von Carbonsäure (1,2 Äquiv.) in DMF bei 0°C wurde mit HOBT (1,8 Äquiv.) und EDC (1,4 Äquiv.) behandelt. Das Gemisch wurde bei 0°C 1 bis 2 Std. gerührt und dann wurde das freie Amin (1,0 Äquiv., neutralisiert mit TEA oder DIPEA) zugegeben. Nach Rühren bei RT für mehr als 3 Std. wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser (1×), 5%iger wässriger Citronensäure (2×), gesätt. NaHCO₃ (2×) und Salzlösung (1×) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄ oder MgSO₄) und im Vakuum konzentriert.
Verfahren B: Kopplung unter Verwendung eines aktivierten Esters (N-Hydroxysuccinat oder Chlorid)
Eine Lösung des freien Amins (1–1,2 Äquiv., neutralisiert mit TEA oder DIPEA) in CH₂Cl₂ wurde mit aktiviertem Ester oder Acylhalogenid (1 Äquiv.) bei 0°C oder RT behandelt. Nach Rühren bei RT für über 1 Std. wurde das Reaktionsgemisch mit 5%iger wässriger Citronensäure (2×), gesätt. NaHCO₃ (2×) und Salzlösung (1×) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄ oder MgSO₄) und im Vakuum konzentriert.
Allgemeines Verfahren zur Harnstoffbildung in Lösung:
Verfahren C: Bildung von Harnstoff mit Isocyanat und Amin
Eine Lösung von Amin (1 Äquiv.) und TEA (1 Äquiv.) in CH₂Cl₂ wurde mit einem Isocyanat (1 Äquiv.) behandelt und wurde bei RT für über 0,5 Std. gerührt. Nach Konzentrieren im Vakuum wurde das Produkt entweder wie es ist verwendet oder durch Chromatographie gereinigt.
Allgemeine Verfahren zur Schutzgruppenabspaltung in Lösung:
Verfahen D: Abspaltung von BOC mit TFA
Eine Lösung von tBuOC(O)NH-R (wobei R Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einer beliebigen Zahl von geeigneten funktionellen Gruppen, ist) in CH₂Cl₂ bei 0°C wurde mit Trifluoressigsäure behandelt. Man ließ den Reaktionsansatz auf RT erwärmen, und er wurde 1 bis 2 Std. gerührt. Nach Konzentrieren im Vakuum wurde das erhaltene Amin/TFA-Salz gelagert und mit TEA oder DIPEA vor der Verwendung neutralisiert.
Verfahren E: Abspaltung von BOC mit HCl
Eine Lösung von tBuOC(O)NH-R (wobei R Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einer beliebigen Zahl von geeigneten funktionellen Gruppen, ist) in Dioxan bei 0°C wurde mit 4 N HCl in Dioxan behandelt. Man ließ den Reaktionsansatz auf RT erwärmen und rührte 1 bis 2 Std. Nach Konzentrieren im Vakuum wurde das erhaltene Amin/HCl-Salz gelagert und mit TEA oder DIPEA vor der Verwendung neutralisiert.
Verfahren F: Hydrierung
Ein Gemisch der Ausgangssubstanz und 10% Pd/C in Methanol, Wasser, Ethylacetat und/oder DMF wurde unter Wasserstoff (40 bis 50 psi) für mehr als 2 Std. bei RT kräftig gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde durch eine Schicht Celite filtriert und das Filtrat im Vakuum konzentriert.
Allgemeine Verfahren zur Bildung einer Amidbindung auf einem festen Träger:
Verfahren G: Kopplung mit DCC/HOBt
Ein Gemisch von Harz (siehe nachstehend für Herstellung von Harz MCB1), tBuOC(O)NH-AA_x-CO₂H (wobei AA eine Aminosäure oder ein funktionelles Äquivalent ist) oder R₁-CO₂H (10 Äquiv.), HOBt (10 Äquiv.), DCC (10 Äquiv.) und N-Methylmorpholin (3 Äquiv.) in NMP wurde 0,5 Std. bei RT geschüttelt. Das Harz wurde dann mit NMP (2×) und CH₂Cl₂ (3×) gewaschen.
Verfahren H: Verdrängung vom Harz mit Amin
Ein Gemisch von Harz und Amin (xs) in DMF wurde 6 Std. bei RT geschüttelt. Das Harz wurde dann mit Methanol (3×) gewaschen und die vereinigten Lösungen im Vakuum konzentriert.
Allgemeine Verfahren zur Schutzgruppenabspaltung auf dem festen Träger:
Verfahren I: Abspaltung von BOC mit TFA/CH₂Cl₂
Ein Gemisch von Harz und 50% TFA/CH₂Cl₂ wurde über 0,5 Std. bei RT geschüttelt. Das Harz wurde dann mit CH₂Cl₂ (2×), Isopropanol (1×) und CH₂Cl₂ (3×) gewaschen.
Verfahren J: HF mit Fänger
Das geschützte Produkt wurde mit HF bei –10 bis 0°C für über 1,5 Std. in Gegenwart von Anisol oder Thioanisol als Fänger behandelt. Das HF wurde mit einem Stickstoffstrom bei 0°C entfernt.
Beispiel 1
Synthese von gemeinsamen Zwischenprodukten
Succinimidyl-3-isochinolincarboxylat (iQn-Osu):
Eine Lösung von 3-Isochinolincarbonsäure (1,2 Äquiv.) in DMF bei 0°C wurde mit EDC (1,4 Äquiv.) behandelt. Das Gemisch wurde bei 0°C 1 bis 2 Std. gerührt und dann N-Hydroxy succinimid (1,0 Äquiv.) zugegeben. Nach Rühren bei RT für mehr als 3 Std. wurde das Reaktionsgemisch in 60%iges gesätt. NaHCO₃ gegossen und das Produkt filtriert: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 9,35 (s, 1H), 8,67 (s, 1H), 8,09 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 7,82 (m, 2H), 2,94 (s, 4H).
Succinimidyl-2-chinolincarboxylat (Qn-Osu):
Eine Lösung von 2-Chinolincarbonsäure (1,2 Äquiv.) in DMF bei 0°C wurde mit EDC (1,4 Äquiv.) behandelt. Das Gemisch wurde bei 0°C für 1 bis 2 Std. gerührt und dann N-Hydroxysuccinimid (1,0 Äquiv.) zugegeben. Nach Rühren bei RT für mehr als 3 Std. wurde das Reaktionsgemisch in 60%iges gesätt. NaHCO₃ gegossen und das Produkt filtriert: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 8,35 (d, 1H), 8,27 (d, 1H), 8,19 (d, 1H), 7,87 (d, 1H), 7,80 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 2,91 (s, 4H).
Methyl-4-isocyanatophenylacetat (KC1):
Eine gut gerührte kalte Lösung von Methyl-p-aminophenylacetat (9,8 g, 59,4 mmol) in CH₂Cl₂ (200 ml) und TEA (25 ml, 18 g, 178,2 mmol) wurde mit COCl₂ (96 ml 1,9 M Lösung in Toluol) während 1 Std. behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C zusätzlich 1 Std. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert und 3:1 Ether/Pet-Ether (125 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat konzentriert, wobei KC1 in Form einer braunen Flüssigkeit erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde durch Destillation (118–120°C/1,0 mm) gereinigt, wobei reines KC1 (8,5 g, 75%) in Form einer farblosen Flüssigkeit erhalten wurde:
¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 7,20 (d, J = 8,4 Hz), 7,02 (d, J = 8,4 Hz), 3,69 (s, 3H, 3,48 (s, 2H).
4-Phenylureidophenylessigsäure:
4-Phenylureidophenylessigsäure wurde unter Verwendung von Verfahren C mit 4-Aminophenylessigsäure und Phenylisocyanat hergestellt:
¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 8,72– 8,64 (m, 2H), 7,44 (d, 2H), 7,36 (d, 2H), 7,28 (d, 2H), 7,16 (d, 2H), 6,96 (t, 1H), 3,52 (s, 2H); m/z 272.
4-o-Tolylureidophenylessigsäure:
4-o-Tolylureidophenylessigsäure wurde unter Verwendung von Verfahren C mit 4-Aminophenylessigsäure und o-Tolylisocyanat hergestellt:
¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 8,97 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,83 (d, 1H), 7,38 (d, 2H), 7,17–7,09 (m, 4H), 6,92 (t, 1H), 3,48 (s, 2H), 2,23 (s, 3H); m/z 285.
4-(2-Fluorphenyl)ureidophenylessigsäure:
4-(2-Fluorphenyl)ureidophenylessigsäure wurde unter Verwendung des Verfahrens C mit 2-Fluoranilin und KC1 hergestellt:
¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz_' ppm) 9,00 (s, 1H), 8,51 (d, 2,4 Hz, 1H), 8,14 (dd, 8,3 Hz, 1,5 Hz, 1H), 7,37 (d, 8,5 Hz, 2H), 7,07–7,25 (m, 4H), 6,99 (m, 1H), 3,48 (s, 2H).
4-(2-Hydroxyphenylureido)phenylessigsäure:
4-(2-Hydroxyphenylureido)phenylessigsäure wurde unter Verwendung des Verfahrens C mit 2-Hydroxyanilin und KC1 hergestellt:
¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 9,90 (s, 1H), 9,25 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 8,02 (bd, 1H), 7,37 (d, 2H), 7,13 (d, 2H), 6,70–6,97 (m, 3H), 3,48 (s, 2H).
N-Succinimidyl-4-(2-(3-methylphenylureido)phenylacetat:
Hergestellt in drei Schritten wie folgt:
Verfahren C mit 2-Amino-3-methylpyridin und KC1, wobei Methyl-4-(2-(3-methylpyridylureido)phenylacetat erhalten wird.
Eine Lösung von Methyl-4-(2-(3-methylpyridylureido)phenylacetat (1 Äquiv.) in Methanol wurde mit 1 N NaOH (2 Äquiv.) behandelt. Der Reaktionsansatz wurde 16 Std. gerührt, dann vorsichtig mit 1 N HCl auf pH 7, dann mit Essigsäure auf pH 3 angesäuert. Das Produkt wurde filtriert und mit Methanol, dann Ether gewaschen, wobei 4-(2-(3-Methylpyridylureido)phenylessigsäure erhalten wird: ¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 11,97 (s, 1H), 8,64 (brs, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,69 (m, 1H), 7,62 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,33 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,09 (m, 1H), 3,62 (s, 2H), 2,38 (s, 3H); m/z 286.
Eine Lösung von 4-(2-(3-Methylpyridylureido)phenylessigsäure (1 Äquiv.), N-Hydroxysuccinimid (1,2 Äquiv.) und EDC (1,2 Äquiv.) in DMF wurde mit TEA basisch gemacht (pH 10). Nach Rühren bei RT für über 12 Std. wurde der Reaktionsansatz in 60%iges gesätt. NaHCO₃ gegossen und das Produkt filtriert:
¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 12,04 (s, 1H), 8,84 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,72 (m, 3H), 7,42 (m, 2H), 7,10 (m, 1H), 4,18 (s, 2H), 2,98 (3, 4H), 2,38 (s, 3H); m/z 383.
N-Succinimidyl-4-(2-pyridylureido)phenylacetat:
Hergestellt in drei Schritten wie folgt:
Verfahren C mit 2-Aminopyridin und KC1, wobei Methyl-4-(2-pyridylureido)phenylacetat erhalten wird: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 8,20 (s, 2H), 7,62–7,51 (m, 3H), 7,33 (d, 2H), 7,01 (d, 2H), 6,89–6,85 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,59 (s, 2H).
Eine Lösung von Methyl-4-(2-pyridylureido)phenylacetat (5,7 g, 20,0 mmol) in Methanol (20 ml) wurde mit 1 N NaOH (40 ml) behandelt. Der Reaktionsansatz wurde 16 Std. gerührt, dann vorsichtig mit 1 N HCl auf pH 7, dann mit Essigsäure auf pH 3 angesäuert. Das Produkt wurde filtriert und mit Methanol, dann Ether gewaschen, wobei 4-(2-Pydridyl)ureidophenylessigsäure (4,7 g, 87%) in Form eines weißen Pulvers erhalten wird:
¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 10,62 (bs, 1H), 9,53 (bs, 1H), 8,39 (d, 1H), 7,82 (t, 1H), 7,63–7,55 (m, 1H), 7,33–7,27 (d, 2H), 7,14–7,08 (m, 1H), 3,62 (s, 3H).
Eine Lösung von 4-(2-Pyridyl)ureidophenylessigsäure (1 Äquiv.), N-Hydroxysuccinimid (1,2 Äquiv.) und EDC (1,2 Äquiv.) in DMF wurde mit TEA basisch gemacht (pH 10). Nach Rühren bei RT für über 12 Std. wurde der Reaktionsansatz in 60%iges gesätt. NaHCO₃ gegossen und das Produkt filtriert: ¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 10,08 (s, 1H), 9,57 (s, 1H), 8,39 (m, 1H), 7,86 (m, 1H), 7,62 (m, 3H), 7,38 (d, 2H), 7,12 (m, 1H), 4,15 (s, 2H), 2,91 (s, 4H); m/z 369.
3-Methoxy-4-phenylureidophenylessigsäure:
Hergestellt in sechs Schritten aus 3-Methoxy-4-nitrobenzoesäure wie folgt:
Ein Gemisch von 3-Methoxy-4-nitrobenzoesäure (2,01 g, 10,2 mmol) und Thionylchlorid (2,3 ml, 31,5 mmol) wurde bei 80–90°C für 1,5 Std. gerührt. Der Reaktionsansatz wurde konzentriert und der Rückstand mit Ether verdünnt. Die organische Lösung wurde mit gesätt. wässr. NaHCO₃ (2×), H₂O, dann gesätt. wässr. NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, wobei 3-Methoxy-4-nitrobenzoylchlorid (1,92 g, 87%) in Form eines weißen Feststoffs erhalten wurde:
¹H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm) 7,95–7,70 (m, 3H), 4,06 (s, 3H).
Eine kalte (0°C) Lösung von TMSCHN₂ (2 M in Hexan, 1,5 ml, 3,0 mmol) und Triethylamin (420 μl, 3,0 mmol) wurde mit einer Lösung von 3-Methoxy-4-nitrobenzoylchlorid (0,52 g, 2,4 mmol) in Acetonitril (8,5 ml) behandelt. Der Reaktionsansatz wurde bei 0°C für 24 Std. gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde mit gesätt. wässr. NaHCO₃ aufgeschlämmt und das Gemisch mit Ether (3×) extrahiert. Die vereinigten Etherwaschflüssigkeiten wurden mit Wasser, dann gesätt. wässr. NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, wobei ω-Diazo-3-methoxy-4-nitroacetophenon (0,53 g, 100%) in Form eines gelben Schaums erhalten wurde:
¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 7,88 (d, 10 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,27 (d, 10 Hz, 1H), 5,97 (s, 1H), 4,02 (s, 3H).
Eine Rückfluss-Lösung von ω-Diazo-3-methoxy-4-nitroacetophenon (7,95 g, 35,9 mmol) in t-BuOH (100 ml) wurde mit einer filtrierten Lösung von Silberbenzoat (2,50 g, 10,9 mmol) in Triethylamin (15 ml) tropfenweise während 1 Std. behandelt. Nach 45 min. Rückfluss wurde Entfärbungskohle zugegeben und das heiße Gemisch durch eine Schicht Celite filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und der Rückstand mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Lösung wurde mit 5%igem wässr. NaHCO₃ (2×), H₂O, 5%iger wässr. Citronensäure, H₂O, dann gesätt. wässr. NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, wobei tert-Butyl-3-methoxy-4-nitrophenylacetat (8,92 g, 93%) in Form eines braunen Öls erhalten wurde: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 7,83 (d, 8,3 Hz, 1H), 7,03 (s, 1H), 6,93 (d, 8,3 Hz, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,58 (s, 2H), 1,45 (s, 9H).
Ein Gemisch von tert-Butyl-3-methoxy-4-nitrophenylacetat (0,144 g, 0,539 mmol) und 10% Pd auf Aktivkohle (0,155 g) in Ethylacetat (8 ml) und Methanol (2 ml) wurde unter H₂ (40–60 psi) für 2 Std. gerührt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert und das Filtrat konzentriert, wobei t-Butyl-4-amino-3-methoxyphenylacetat (0,123 g, 96%) in Form eines hellgelben Öls erhalten wurde:
¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 6,70 (m, 3H), 4,04 (bs, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,42 (s, 2H), 1,43 (s, 9H).
Verfahren C mit t-Butyl-4-amino-3-methoxyphenylacetat und Phenylisocyanat ergab t-Butyl-3-methoxy-4-phenylureidophenylacetat:
¹H NMR (CDCl₃, 300 MHZ, ppm) 8,00 (d, 11 Hz, 1H) 7,65–6,94 (m, 7H), 6,80 (d, 9,0 Hz, 1H), 6,74 (s, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,45 (s, 2H), 1,44 (s, 9H).
Eine Lösung von t-Butyl-3-methoxy-4-phenylureidophenylacetat (0,108 g, 0,303 mmol) in Trifluoressigsäure (5,0 ml) wurde 30 Min gerührt. Der Reaktionsansatz wurde konzentriert und der Rückstand zusammen mit Dichlormethan (2×), dann Ether eingedampft, wobei 3- Methoxy-4-phenylureidophenylessigsäure (0,090 g, 99%) in Form eines weißen Schaums erhalten wurde:
¹H NMR (CD₃SOCD₃, 300 MHz, ppm) 9,28 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,02 (d, 7,5 Hz, 1H), 7,58–7,15 (m, 5H), 6,91 (bm, 2H), 6,77 (d, 7,5 Hz, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,49 (s, 2H).
N-Succinimidyl-3-methoxy-4-phenylureidophenylacetat:
Eine Lösung von 3-Methoxy-4-phenylureidophenylessigsäure (1 Äquiv.) in DMF bei 0°C wurde mit EDC (1,1 Äquiv.) behandelt. Das Gemisch wurde bei 0°C 1 bis 2 Std. gerührt und dann N-Hydroxysuccinimid (1,1 Äquiv.) zugegeben. Nach Rühren bei RT für mehr als 3 Std. wurde das Reaktionsgemisch in 60%iges gesätt. NaHCO₃ gegossen und das N-Succinimidyl-3-methoxy-4-phenylureidophenylacetat filtriert.
N-Succinimidyl-6-(2-methoxy-3-o-tolylureido)pyridylacetat:
Hergestellt in sechs Schritten aus 2,6-Dichlor-3-nitropyridin wie folgt:
Eine Aufschlämmung von 2,6-Dichlor-3-nitropyridin (92%, 9,9 g, 47 mmol) und K₂CO₃ Pulver (6,5 g, 47 mmol) in Methanol (100 ml) wurde eine Woche bei RT gerührt. Der Reaktionsansatz wurde filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und 60%igem gesätt. wässr. NaHCO₃ verteilt. Die organische Lösung wurde mit 60%igem gesätt. wäss. NaHCO₃ (2×), H₂O, dann gesätt. wässr. NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, wobei 2-Chlor-6-methoxy-5-nitropyridin und 2-Chlor-6-methoxy-3-nitropyridin (8,9 g, 100%) in Form eines hellgelben Feststoffs erhalten wurden:
¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 8,31 (d, 8,3 Hz, 1H), 8,28 (d, 8,9 Hz, 1H), 7,10 (d, 8,3 Hz, 1H), 6,82 (d, 8,9 Hz, 1H), 4,15 (s, 3H), 4,06 (s, 3H).
Ein Gemisch von 2-Chlor-6-methoxy-5-nitropyridin und 2-Chlor-6-methoxy-3-nitropyridin (8,9 g, 47 mmol) und t-Butylmethylmalonat (10 ml, 60 mmol) und NaH (95%, 3,1 g, 120 mmol) in THF (250 ml) wurde bei RT für 24 Std. gerührt. Der Reaktionsansatz wurde konzentriert und der Rückstand mit Trifluoressigsäure (200 ml) für 2 Std. behandelt. Der Reaktionsansatz wurde konzentriert und das Produkt durch Flashchromatographie (Kieselgel, 95:5 Hexan – Ethylacetat) getrennt, wobei Methyl-6-(2-methoxy-3-nitro)pyridylacetat (3,3 g, 62%) in Form eines gelben Öls erhalten wurde:
¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz ppm) 8,27 (d, 8,0 Hz, 1H), 7,04 (d, 8,0 Hz, 1H), 4,09 (s, 3H), 3,85 (s, 2H), 3,75 (s, 3H).
Ein Gemisch von Methyl-6-(2-methoxy-3-nitro)pyridylacetat (0,047 g, 0,21 mmol) und 10% Pd auf Aktivkohle (0,063 g) in Ethylacetat (2 ml) und Ethanol (1 ml) wurde unter H₂ (40–50 psi) für 6 Std. gerührt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert und das Filtrat konzentriert, wobei Methyl-6-(2-methoxy-3-amino)pyridiylacetat (0,041 g, 100%) in Form eines hellgelben Öls erhalten wurde:
¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 6,82 (d, 7,6 Hz, 1H), 6,65 (d, 7,6 3,94 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 3,65 (s, 2H).
Verfahren C mit Methyl-6-(2-methoxy-3-amino)pyridylacetat und o-Tolylisocyanat, wobei Methyl-6-(2-methoxy-3-o-tolylureido)pyridylacetat erhalten wird: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, ppm) 8,33 (d, 7,9 Hz, 1H), 7,51 (d, 7,8 Hz, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,17 (m, 2H), 7,08 (m, 2H), 6,77 (d, 7,9 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,20 (s, 3H).
Eine Lösung von Methyl-6-(2-methoxy-3-o-tolylureido)pyridylacetat (0,023 g, 0,070 mmol) in Methanol (1,0 ml) wurde mit 2 M LiOH (90 μl, 0,18 mmol) behandelt. Der Reaktionsansatz wurde 18 Std. gerührt, mit H₂O (5,0 ml) verdünnt und mit Ether (2×) gewaschen. Die wässrige Lösung wurde dann mit 5%iger wässr. Citronensäure angesäuert. Das Produkt wurde filtriert und mit H₂O, dann Ether gewaschen, wobei 6-(2-Methoxy-3-o-tolylureido)pyridylessigsäure (0,014 g, 64%) in Form eines weißen Feststoffs erhalten wurde:
¹H NMR (CD₃OD, 300 MHz, ppm) 8,50–8,25 (m, 3H), 7,60 (bd, 1H), 7,28–7,00 (m, 3H), 4,01 (s, 3H), 3,69 (s, 2H), 2,30 (s, 3H) MS, m/z 316.
Eine Lösung von 6-(2-Methoxy-3-o-tolylureido)pyridylessigsäure (1,61 g, 5,10 mmol) in DMF bei 0°C wurde mit EDC (1,00 g, 5,2 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde bei 0°C für 1 bis 2 Std. gerührt und dann N-Hydroxysuccinimid (0,60 g, 5,2 mmol) zugegeben. Nach Rühren bei RT für mehr als 3 Std. wurde das Reaktionsgemisch in 60%iges gesätt. NaHCO₃ gegossen und das N-Succinimidyl-6-(2-methoxy-3-o-tolylureido)pyridylacetat abfiltriert.
H-LD(OBn)V-NHCH₃:
H-LD(OBn)V-NHCH₃ wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren B mit BOC-Val-Osu und Methylamin, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Leu-OSu, dann Verfahren D verwendet wurde.
H-LD(OBn)V-OCH₃:
H-LD(OBn)V-OCH₃ wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu und H-Val-OMe, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Leu-OSu, dann Verfahren D verwendet wurde.
H-LD(OBn)V-OBn:
H-LD(OBn)V-OBn wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu und H-Val-OBn, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Leu-OSu, dann Verfahren D verwendet wurde.
H-LD(OBn)VP-OBn:
H-LD(OBn)VP-OBn wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren B mit BOC-Val-OSu und H-Pro-OBn, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Leu-OSu, dann Verfahren D verwendet wurde.
H-LD(OBn)VP-OMe:
H-LD(OBn)VP-OMe wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren A mit BOC-Val-OH und H-Pro-OMe, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Leu-OSu, dann Verfahren D verwendet wurde.
H-LDVP-OH:
H-LDVP-OH wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren B mit BOC-Val-OSu und H-Pro-OBn, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Leu-OSu, Verfahren F, dann Verfahren D verwendet wurde.
H-MD(OBn)VP-OBn:
H-MD(OBn)VP-OBn wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren B mit BOC-Val-OSu und H-Pro-OBn, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Met-OSu, dann Verfahren D verwendet wurde.
H-LD(OBn)VP-NH₂:
H-LD(OBn)VP-NH₂ wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren B mit BOC-Val-OSu und H-Pro-NH₂, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Asp(OBn)-OSu, Verfahren D, Verfahren B mit BOC-Leu-OSu, dann Verfahren D verwendet wurde.
Harz (MBC1):
Modifiziertes Harz MBC1 (0,437 mmol/g) wurde gemäß dem Literaturverfahren (siehe: Richter, L. S. et al., Tetrahedron Lett. 35, S. 5547 (1994)) synthetisiert. MBC1 wurde mit 50% TFA/CH₂Cl₂ und Triethylsilan für 2 Std. bei RT behandelt, dann mit CH₂Cl₂ (2×), Isopropanol (1×) und CH₂Cl₂ (3×) vor der Verwendung gewaschen.
MBC2:
MBC2 wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren G mit BOC-Asp(OBn)-OH, Verfahren I, Verfahren G mit BOC-Leu-OH, Verfahren I, dann Verfahren G mit 4-Phenylureidophenylessigsäure verwendet wurde.
MBC3:
MBC3 wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren G mit BOC-Val-OH, Verfahren I, Verfahren G mit BOC-Asp(OBn)-OH, Verfahren I, Verfahren G mit BOC-Leu-OH, Verfahren I, dann Verfahren G mit 4-Phenylureidophenylessigsäure verwendet wurde.
MBC4:
MBC4 wurde hergestellt, indem der Reihe nach Verfahren G mit BOC-Pro-OH, Verfahren I, Verfahren G mit BOC-Val-OH, Verfahren I, Verfahren G mit BOC-Asp(OBn)-OH, Verfahren I, Verfahren G mit BOC-Leu-OH, Verfahren I, dann Verfahren G mit 4-Phenylureidophenylessigsäure verwendet wurde.
Beispiel 2
Verbindung 345:
Verbindung 345 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-o-Tolylureidophenylessigsäure und H-LD(OBn)V-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung mit HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 606.
Beispiel 3
Verbindung 206:
Verbindung 206 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-o-Tolylureidophenylessigsäure und H-LD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung mit HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 709.
Beispiel 4
Verbindung 144:
Verbindung 144 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-(2-Hydroxyphenylureido)phenylessigsäure und H-LD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung mit HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 711, 24,6 min (Gradient 8).
Beispiel 5
Verbindung 145:
Verbindung 145 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-Phenylureidophenylessigsäure und H-LD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung mit HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 695, 26,8 min (Gradient 8).
Beispiel 6
Verbindung 146:
Verbindung 146 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-(2-Hydroxyphenylureido)phenylessigsäure und H-MD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung mit HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 729, 22,4 min (Gradient 8).
Beispiel 7
Verbindung 1:
Verbindung 1 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 3-Methoxy-4-phenylureidophenylessigsäure und H-LD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung mit HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 725, 28,5 min (Gradient 8).
Beispiel 8
Verbindung 2:
Verbindung 2 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 3-Methoxy-4-phenylureidophenylessigsäure und H-MD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung mit HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 743, 27,0 min (Gradient 8).
Beispiel 9
Verbindung 315:
Verbindung 315 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-o-Tolylureidophenylessigsäure und H-MD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 727.
Beispiel 10
Verbindung 346:
Verbindung 346 wurde unter Verwendung des Verfahrens B mit N-Hydroxysuccinimidyl-4-(2-(3-methylpyridylureido)phenylacetat und H-LDVP-OH hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab Verbindung 346: m/z 710.
Beispiel 11
Verbindung 316:
Verbindung 316 wurde unter Verwendung des Verfahrens B mit N-Hydroxysuccinimidyl-4-(2-pyridylureido)phenylacetat und H-LDVP-OH hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 696.
Beispiel 12
Verbindung 4:
Verbindung 4 wurde unter Verwendung des Verfahrens B mit N-Hydroxysuccinimidyl-6-(2-methoxy-3-o-tolylureido)pyridylacetat und H-LDVP-OH hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 740, 30,7 min (Gradient 8).
Beispiel 13
Verbindung 147:
Verbindung 147 wurde unter Verwendung des Verfahrens B mit N-Hydroxysuccinimidyl-3-methoxy-4-phenylureidophenylacetat und H-LD(OBn)VP-NH₂, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 724, 26,7 min (Gradient 8).
Beispiel 14
Verbindung 148:
Verbindung 148 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-o-Tolylureidophenylessigsäure und H-LD(OBn)VP-NH₂, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 708, 26,0 min (Gradient 8).
Beispiel 15
Verbindung 317:
Verbindung 317 wurde unter Verwendung des Verfahrens B mit N-Hydroxysuccinimidyl-6-(2-methoxy-3-o-tolylureido)pyridylacetat und H-LD(OBn)VP-NH₂, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 739, 28,0 min (Gradient 8).
Beispiel 16
Verbindung 336:
Verbindung 336 wurde unter Verwendung des Verfahrens A mit 4-(2-Fluorphenyl)ureidophenylessigsäure und H-LD(OBn)VP-OBn, dann des Verfahrens F hergestellt. Reinigung durch HPLC ergab die Titelverbindung: m/z 713.
Beispiel 17
Hemmung der VLA4-abhängigen Adhäsion an BSA-CS1
Dieser Assay wurde zum Untersuchen der Stärke der VLA4-gerichteten Inhibitorverbindungen der Erfindung verwendet.
1. Konjugation von CS1 an BSA
Wir lösten Bsa-SMCC (Pierce Chemical, Rockford, IL; Katalog-Nr. 77115) in H₂O in einer Konzentration von 10 mg/ml. [SEQ ID Nr. 4]: Cys-Tyr-Asp-Glu-Leu-Pro-Gln-Leu-Val-Thr-Leu-Pro-His-Pro-Asn-Leu-His-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr („Cys-Tyr-CS1 Peptid"), das wir mit herkömmlicher Festphasenchemie synthetisierten und mit HPLC reinigten, wurde in 10 mM HEPES pH 5, 50 mM NaCl und 0,1 mM EDTA, ebenfalls in einer Konzentration von 10 mg/ml, gelöst. Dann mischten wir 500 μl BSA-SMCC, 250 μl Cys-Tyr-CS1 Peptid und 75 μl 1 mM HEPES pH-Wert 7,5 und ließen die Konjugationsreaktion 30 Minuten ablaufen. Wir beendeten die Reaktion unter Zugabe von 1 μl beta-Mercaptoethanol. Proben wurden auf die Vernetzung mit SDS-PAGE analysiert. Diese Reaktion bildete mehrfache Moleküle des Cys-Tyr-CS1 Peptidkonjugats an jedes BSA-Molekül.
2. Herstellung der Platten für den Adhäsionsassay
Wir beschichteten Vertiefungen einer Linbro Titertek-Polystyrolplatte mit 96 Mulden mit flachem Boden (Flow Laboratories, Maclean, VA; Katalog Nr. 76-231-05) mit 100 μl der vorstehend beschriebenen BSA-CS1 Lösung, verdünnt auf 1 μg/ml in 0,05 M NaHCO₃ (15 mM NaHCO₃, 35 mM Na₂CO₃) pH 9,2. Einige Vertiefungen wurden nicht mit CS1 beschichtet, um die nicht spezifische Zellbindung (NSB) zu untersuchen. Die Platte wurde dann über Nacht bei 4°C inkubiert.
Nach dieser Inkubation wurde der Inhalt der Vertiefungen durch Umdrehen und Abtupfen der Platte entfernt. Alle Vertiefungen wurden dann mit 100 μl 1%igem BSA in PBS, 0,02% NaN₃ für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert.
3. Herstellung der Fluoreszenz-markierten Ramos-Zellen
Ramos-Zellen werden in RPMI 1640-Kulturmedium, das 1% BSA enthält, gezüchtet, gehalten und markiert. Kurz vor Durchführen des Versuchs gaben wir 2',7'-Bis(2-carboxyethyl)-5- (und -6)-carboxyfluoresceinacetoxymethylester („BCECF-AM"; Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon; Katalog Nr. B-1150) bis zu einer Endkonzentration von 2 μM zu einer Kultur von Ramos-Zellen (4 × 10⁶ Zellen/ml). Wir inkubierten die Zellen für 20 Minuten bei 37°C.
Nach dem Markieren wurden die Zellen zweimal in Assaypuffer (24 mM TRIS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4, enthält 0,1% BSA und 2 mM Glucose) gewaschen, um irgendwelche Kationen zu entfernen, die aus dem Kulturmedium stammen. Die Zellen wurden dann wieder in Assaypuffer auf 4 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert und 2 mM MnCl₂ wurde zugegeben, um VLA4 auf der Oberfläche der Zellen hinaufzuregulieren.
4. Durchführung des Assays
Unmittelbar vor Durchführen des Assays entfernten wir die BSA-Blockierlösung aus den Platten mit 96 Vertiefungen und wuschen die Vertiefungen mit 100 μl Assaypuffer. Wir gaben dann zu jeder Vertiefung 25 μl der Testinhibitorverbindung der Zelladhäsion in 2× der Endkonzentration und 25 μl der markierten Ramos-Zellen. Endkonzentrationen wurden in einem Bereich der erwarteten IC50-Werte, üblicherweise zwischen 0,01 nM–10 μM, gewählt. Jede Konzentration der Verbindung wurde in dreifacher Wiederholung untersucht. Die Verbindung und Zellen ließ man 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Wir leerten dann den Inhalt der Platte und wuschen die Vertiefungen 4mal mit Assaypuffer. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops untersuchten wir die NSB-Vertiefungen. Wenn mehr als ein paar Zellen an diese Vertiefungen gebunden Waren, wuschen wir die Platte noch einmal, um den Überschuß der nicht spezifisch gebundenen Zellen zu entfernen.
Die Bindung der Ramos-Zellen an die mit CS1-Peptid beschichteten Vertiefungen wurde unter Zugabe von 100 μl Assaypuffer zu jeder Vertiefung und quantitative Bestimmung der Fluoreszenz in einem Millipore Cytofluor 2300 System-Plattenlesegerät, eingestellt auf 485 nm Anregung und 530 nm Emission, gemessen. Die Bindung wurde als ein IC50-Wert ausgedrückt – die Konzentration des Inhibitors, bei der 50% Kontrollbindung auftritt. Der Prozentsatz der Bindung wird mit der Formel: [(FTB – FWS) – (FI – FNS)]/[(FTB – FM) × 100 = % Bindung,berechnet, wobei F_TB die gesamte Fluoreszenz, gebunden an CS1-enthaltende Vertiefungen ohne zugegebenem Inhibitor ist; F_NS die Fluoreszenz, gebunden an Vertiefungen ist, denen CS1 fehlt; und F_I die Fluoreszenz, gebunden an Vertiefungen ist, die einen erfindungsgemäßen Inhibitor enthalten.
Andere erfindungsgemäße Verbindungen wurden ähnlich untersucht. Der IC50-Bereich für jede dieser Verbindungen ist in der nachstehenden Tabelle angegeben:

Tabellenabkürzungen: A – < 50 nm; B – 50 nm–10 μm, C – > 10 μm; nd – nicht bestimmt. Alle untersuchten Verbindungen in dieser Tabelle zeigten einen IC₅₀ < 1 mM.

Beispiel 18
Direkte Bindung von VLA4-darstellenden Zellen an VCAM-IgG
Wir untersuchten als Nächstes die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die VCAM/VLA4-Bindung zu hemmen, unter Verwendung eines VCAM-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugats. Um diesen Assay durchzuführen, verwendeten wir das Millipore Multiscreen Assaysystem (Millipore Corp., Redford, MA), um die Zellen wirksam zu waschen.
1. Herstellung der VCAM-IgG-AP-Konjugate
Die Konstruktion der VCAM 2D-IgG-Expressionsvektoren, Transfektion von CHO-Zellen mit diesen Konstrukten und die Reinigung des erhaltenen Expressionsprodukts ist in der PCT-Veröffentlichung WO 90/13300 beschrieben, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
1,2 ml gereinigtes VCAM 2D-IgG (5 mg/ml in 10 mM HEPES, pH 7,5) wurde mit 44 μl Traut-Reagens (2-Iminothiolan, 20 mg/ml in Wasser; Pierce Chemical, Rockford, IL.) bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgesetzt. Die Probe wurde auf einer 15 ml Sephadex G-25-Säule, äquilibriert mit 100 mM NaCl, 10 mM MES, pH 5,0 entsalzt, 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Extinktion bei 280 nm wurde bestimmt. Die zwei Peakfraktionen wurden gesammelt.
1 ml alkalische Phosphatase vom Kälberdarm (19 mg/ml; Pierce Chemical, Rockford, IL) wurde mit 100 μl Sulfo-SMCC (30 mg/ml in Wasser) und 100 μl 1 M HEPES, pH 7,5 für 35 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf einer 12 ml Sephadex G-25-Säule, äquilibriert mit 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 6,0 entsalzt. 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Extinktion bei 280 nm wurde bestimmt. Die zwei Peakfraktionen wurden gesammelt und auf Eis gelagert.
Die alkalische Phosphatase-SMCC und VCAM 2D-IgG-Iminothilan-Addukte wurden in einem Molverhältnis von 2:1 in Tris-HCl, pH 7,5, durch Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten vernetzt. Das Ausmaß der Vernetzung wurde durch SDS-PAGE bestimmt. Die vernetzten Produkte wurden durch die Zugabe von 2 mM MgCl und 0,25 mM ZnCl₂ stabilisiert und bei 4°C gelagert.
2. Bindungsassay
Zuerst blockierten wir eine Filtrationsplatte mit 96 Vertiefungen durch Zugabe von 275 μl PBS, das 0,1% Tween 20 und 2% BSA enthielt („Blockierpuffer"), zu jeder Vertiefung und Inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Platte wurde dann auf einen Vakuumverteiler gelegt und der Blockierpuffer durch den Boden der Filtrationsvertiefungen in ein Abfallsammeltablett abgelassen. Dann wuschen wir die Vertiefungen dreimal mit 200–250 μl Tris-gepufferter Salzlösung, die 0,1% BSA, 2 mM Glucose und 1 mM HEPES, pH 7,5 enthielt („Assaypuffer"), um verbleibenden Blockierpuffer auszuwaschen. Wir ließen dann die Platten ablaufen und tupften sie auf Papiertücher, um den Puffer von der Unterseite der Platte zu entfernen.
Wir stellten dann eine Stammlösung von VCAM-IgG-AP (4 μg/ml in Assaypuffer) her und filtrierten sie durch ein 0,2 μ Spritzenfilter mit geringer Proteinbindung (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI Nr. 4454). Diese Lösung wurde dann 1:10 in Assaypuffer verdünnt und 25 μl wurden zu jeder Vertiefung der gewaschenen Platte gegeben.
Wir verdünnten den zu untersuchenden Zelladhäsionsinhibitor auf 2× die Endkonzentration im Assaypuffer und gaben 25 μl jeder Verdünnung zu den Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung in der Platte. Die verwendeten Endkonzentrationen lagen im Bereich von 0,01 nM–10 μM. Die Kontrollvertiefungen für die gesamte Bindung und nicht spezifische Bindung erhielten 25 μl Assaypuffer statt Inhibitor. Die gesamten Bindungsvertiefungen enthielten Zellen und VCAM-IgG-AP in Assaypuffer. Die Vertiefungen mit nicht spezifischer Bindung enthielten nur VCAM-IgG-AP in Assaypuffer.
Jurkat-Zellen wurden einmal in Assaypuffer gewaschen, um das Wachstumsmedium zu entfernen, und wieder mit 8 × 10⁶/ml in Assaypuffer suspendiert, der 2 mM MnCl₂ enthielt. Wir gaben 50 μl Jurkat-Zellen zu jeder Vertiefung, außer den Vertiefungen mit nicht spezifischer Bindung, die 50 μl Assaypuffer erhielten, um ein endgültiges Assayvolumen von 100 μl pro Vertiefung aufrecht zu erhalten. Wir mischten die Inhalte der Vertiefungen durch Antippen der Seiten der Platte vorsichtig. Man ließ die Platte dann ungestört 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Am Ende der 60 Minuten Inkubation gaben wir die Platte auf einen Vakuumverteiler, um die Vertiefungen zu leeren. Wir gaben vorsichtig 100 μl des Assaypuffers, der 1 mM MnCl₂ enthielt (Waschpuffer) zu jeder Vertiefung, um so nicht die Zellen am Boden zu stören. Der Waschpuffer wurde durch Vakuum entfernt und die Platte wurde wieder mit 150 μl Waschpuffer gewaschen. Nach erneutem Ablassen des Waschpuffers wurde die Unterseite der Platte auf Papiertüchern abgetupft.
Als Nächstes stellten wir eine 10 mg/ml Lösung von 4-Nitrophenylphosphat in 0,1 M Glycin, 1 mM ZnCl₂, pH 10,5 (Substratpuffer) her und gaben 100 μl unmittelbar zu jeder Vertiefung. Die Platte wurde dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die kolorimetrische Reaktion ablaufen zu lassen. Wir stoppten die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 3 N NaOH zu jeder Vertiefung.
Der Inhalt der Filtrationsplatte mit 96 Vertiefungen wurde dann direkt in eine Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines Vakuumverteilers übergeführt. Die Platte wurde dann bei einer Wellenlänge von 405 nm abgelesen, um die Menge an VCAM-Konjugat, gebunden an die Zellen, zu bestimmen. Der Prozentsatz der Bindung wird durch die Formel: [(ATB – ANS) – (AI – ANS)]/[(ATB – ANS) × 100 = % Bindung,berechnet, wobei A_TB die Extinktion bei 405 nm der CS1-enthaltenden Vertiefungen ohne zugegebenen Inhibitor ist; ANS die Extinktion bei 405 nm bei Vertiefungen ist, denen CS1 fehlt; und A_I die Extinktion bei 405 nm bei Vertiefungen ist, die einen erfindungsgemäßen Inhibitor enthielten.
Wir untersuchten andere erfindungsgemäße Verbindungen im gleichen Assay. Die IC50-Werte sind vergleichbar mit den von dem CS1-Bindungsassay abgeleiteten, der im vorstehenden Beispiel beschrieben ist, obwohl bestimmte Verbindungen bis zu 10fach größere Bindung in diesem Assay als im vorhergehenden Assay zeigten.
Beispiel 19
Hemmung der Kontaktüberempfindlichkeit bei der Maus
Wir anästhesierten weibliche Balb/c Mäuse mit 20 g (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) mit Natriumpentobarbital (90 mg/kg, i. p.). Ein 3 cm² großes Stück der abdominalen Haut wurde dann durch gründliches Rasieren des Pelzes exponiert. Die Haut wurde dann mit 70% Ethanol abgerieben, gefolgt von Aufbringen von 25 μl 0,5% DNFB in 4:1 Vol/Vol Aceton: Olivenöl auf die nackte abdominale Haut. Wir kratzten dann leicht die Haut mit der Spitze der Auftragpipette, um eine leichte Entzündung hervorzurufen. Vierundzwanzig Stunden nach der anfänglichen Sensibilisierung sensibilisierten wir wieder die Maus mit 25 μl 0,5% DNFB an der gleichen abdominalen Hautstelle, wieder gefolgt von leichtem Kratzen mit der Pipettenspitze. Die zweite Sensibilisierung wurde unter Festhalten der nicht anästhesierten Maus durchgeführt.
Am Tag 5 (120 Stunden nach der anfänglichen Sensibilisierung) anästhesierten wir die Mäuse mit 90:10 mg/kg Ketamin:Xylazin i. p. und brachten eine sub-reizende Dosis von 10 μl 0,2% DNFB auf die dorsale Oberfläche des linken Ohrs auf. Das rechte Ohr erhielt eine ähnliche Aufbringung des 4:1 Vol/Vol Aceton:Olivenöl-Trägers.
Vier Stunden nach dem Hervorrufen der Immunreaktion verabreichten wir verschiedene Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren an die Mäuse in 100 μl 0,5% Natriumphosphatpuffer, pH 8,8, und 3% Vol./Vol. DMSO durch subcutane (s. c.) Injektion. Weniger lösliche Inhibitoren erforderten gelegentlich bis zu 30% DMSO Zugabe in den höchsten untersuchten Konzentrationen. Gruppen von 8 Mäusen wurden für jede untersuchte Behandlung verwendet. Positive(PS2-Antimaus-VLA-4-Antikörper, 8 mg/kg, i. v.) und negative Kontrolle (phosphatgepufferte physiologische Salzlösung, PBS, 100 μl i. v.; DMSO in PBS, 100 μl s. c.)-Gruppen wurden routinemäßig zum Vergleich als Teil des Assays der Testverbindungen untersucht.
24 Stunden nach dem Challenge wurden die Mäuse wieder mit Ketamin:Xylazin anästhesiert und die Dicke des Ohrs beider Ohren mit einer Mikrometerschraube bis zu einer Genauigkeit von 10^–4 inch gemessen. Die Schwellreaktion des Ohrs für jede Maus war der Unterschied zwischen der Dicke des Kontroll- und mit DNFB-gereizten Ohrs. Typische nicht gehemmte Ohrschwellungsreaktionen waren 65 – 75 × 10^–4 inch. Die Hemmung der Schwellreaktion des Ohrs wurde durch Vergleich der behandelten Gruppen mit ihrer negativen Kontrollgruppe beurteilt. Der Prozentsatz der Hemmung wurde als:
berechnet. Die statistische Signifikanz des Unterschieds zwischen den Behandlungsgruppen wurde unter Verwendung einer einfachen Analyse der Varianz, gefolgt von Berechnung des Tukey-Kramer echt signifikanten Unterschieds (JMP, SAS Institute) unter Verwendung von p < 0,05 beurteilt.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren bewirken eine statistisch signifikante Verringerung der Schwellreaktion des Ohrs der mit DNFB behandelten Mäuse, verglichen mit den Kontrolltieren ohne Hemmung.
Beispiel 20
Hemmung der durch Ascaris-Antigen bewirkten Atemwegsempfindlichkeit in der späten Phase bei allergischem Schafen
Schafe, von denen vorher gezeigt wurde, dass sie sowohl frühe als auch späte Bronchialreaktionen auf Acaris suum-Antigen entwickeln, wurden bei dieser Untersuchung verwendet. Das für das Experiment verwendete Protokoll war das in W. M. Abraham et al., J. Clin. Invest., 93, S. 776–87 (1994) beschriebene, außer dass die erfindungsgemäßen VLA-4 Inhibitoren den Tieren verabreicht wurden, die in 3–4 ml 50%igem wässrigem Ethanol gelöst und durch Aerosolspray abgegeben wurden.
Die Ergebnisse zeigten, dass alle VLA-4 Inhibitoren der Erfindung die Atemwegsreaktionen hemmten, die mit der Verabreichung von Ascaris suum-Antigen in Verbindung gebracht werden.
Während wir vorstehend eine Reihe von Ausführungsformen dieser Erfindung darstellten, ist deutlich zu erkennen, dass unsere grundlegende Konstruktion geändert werden kann, wobei andere Verbindungen und Verfahren, die die erfindungsgemäßen Verbindungen verwenden, bereitgestellt werden können. Daher ist zu erkennen, dass der Schutzbereich der Erfindung durch die anhängenden Patentansprüche und nicht durch die bestimmten Ausführungsformen zu definieren ist, die vorstehend als Beispiele dargestellt wurden.

Claims

Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung der Formel (I), Z-(Y¹)-(Y²)-(Y³)_n-X (I)und pharmazeutisch verträgliche Derivate davon, wobei: Z ein mit (N-Ar'-Harnstoff) para-substituierter Aralkylcarbonyl-Rest ist; Y¹ -N(R¹)-C(R²)(A¹)-C(O)- ist; Y² -N(R¹)-C(R²)(A²)-C(O)- ist; jedes Y³ durch die Formel -N(R¹)-C(R²)(A³)-C(O)- dargestellt ist; jedes R¹ unabhängig ausgewählt ist aus einem Wasserstoffatom, Alkyl und Aralkyl; Alkenyl; Alkinyl; Cycloalkyl; Cycloalkenyl; Cycloalkylalkyl; Aryl; Aminoalkyl; Mono- oder Di-alkyl-substituiertem Aminoalkyl; Mono- oder Di-aralkyl-substituiertem Aminoalkyl; Hydroxyalkyl; Alkoxyalkyl; Mercaptoalkyl; Thioalkoxyalkyl; A¹ ausgewählt ist aus Aminocarbonylethyl, n-Butyl, Isobutyl, Carboxyethyl, Cyclohexyl, 1-Hydroxyethyl, Hydroxymethyl, Mercaptomethyl, 1-Methylpropyl, Methylthioethyl, n-Propyl, Isopropyl, Methoxycarbonylaminobutyl, 6-Aminohexanoylaminobutyl und (wenn A¹ und R¹ zusammengenommen werden) Azetidin, Aziridin, Pyrrolidin und Piperidin; A² ausgewählt ist aus Carboxymethyl, 2-Carboxyethyl, 1-Carboxyethyl, Hydroxylaminocarbonylmethyl und Imidazolylmethyl; A³ unabhängig ausgewählt ist aus Aminosäureseitenketten und entsprechenden geschützten Derivaten; Cyclohexyl; und Alkyl gegebenenfalls substituiert mit Phenyl, Cyclohexyl, Carboxy, Hydroxylaminocarbonyl, Methoxy, Benzyloxy, Mercapto, N-Benzylimidazolyl, Biotinyl, Tetrazolyl, Valinyl-N-carbonyl oder 6-Aminohexanoylamino; jedes R² unabhängig ausgewählt ist aus einem Wasserstoffatom und Alkyl; n eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist; und X ausgewählt ist aus C_1-6 Alkoxy; Hydroxyl; Amino; und Tris(hydroxymethyl)aminomethan; wobei Alkyl ein C_1-10-Alkylradikal darstellt; Alkenyl ein C_2-10-Alkenylradikal darstellt; Alkinyl ein C_2-10-Alkinylradikal darstellt; Cycloalkyl ein cyclisches C_3-8-Alkylradikal darstellt; Cycloalkenyl einen cyclischen C_4-8-Carbocyclus mit einer oder mehreren Doppelbindungen darstellt; Aryl einen Rest darstellt ausgewählt aus Phenyl, Naphthyl, Fluorenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Pyrazolyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1,3,5-Triazinyl, Indolyl, Benzo[b]furanyl, 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Chinoxalinyl, 1,8-Naphthyridinyl, Acridinyl; Aralkyl ein arylsubstituiertes Alkyl darstellt; wobei Ar(alk)yl oder Ar' mit Methoxy, Hydroxy, Methyl oder Fluor substituiert sein kann; und ein saurer funktioneller Rest einen Rest mit einem sauren Wasserstoffatom darstellt.
Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei jedes Y³ unabhängig ausgewählt ist aus Aminosäuren und entsprechenden geschützten Derivaten.
Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Z eine mit (N-Ar'-Harnstoff) para-substituierte Phenylmethylcarbonyl-Gruppe ist.
Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Y¹ Leucinyl ist, Y² Aspartyl ist und Y³ Valinylprolinyl ist.
Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei n 0 bis 2 ist.
Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung gemäß Anspruch 1 ausgewählt aus den Verbindungsnummern 1 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[Phenylamino]carbonyl]amino](3-methoxyphenyl)]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 2 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[Phenylamino]carbonyl]amino](3-methoxyphenyl)]acetyl]-L-methionyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 144 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Hydroxy)phenylamino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 145 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[Phenylamino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 146 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Hydroxy)phenylamino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-methionyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 147 (L-Prolinamid, 1-[N-[N-[N-[[4-[[Phenylamino]carbonyl]amino](3-methoxyphenyl)]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 148 (L-Prolinamid, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl] acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 206 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 315 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-methionyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 316 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Pyridylamino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L- leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 317 (L-Prolinamid, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino](3-methoxyphenyl)]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 337 (L-Serin, 1-[N-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-L-prolyl]-), 338 (L-Threonin, 1-[N-[N-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-L-prolyl]-L-seryl]-), 345 (L-Valin, 1-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-), 346 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(6-Methyl-2-pyridyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl-), 347 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Fluorphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 357 (L-Prolinamid, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Pyridyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-), 358 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-, Verbindung mit 2 Äquivalenten von 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol] und 359 (L-Prolin, 1-[N-[N-[N-[[4-[[(2-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]phenyl]acetyl]-L-leucyl]-L-a-aspartyl]-L-valyl]-, Natriumsalz).
Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung gemäß Anspruch 6 ausgewählt aus den Verbindungsnummern 1, 206, 316, 358 und 359.
Zelladhäsionsinhibitor-Verbindung gemäß Anspruch 7 ausgewählt aus den Verbindungsnummern 358 und 359.
Arzneimittel umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel gemäß Anspruch 9, weiter umfassend einen Wirkstoff ausgewählt aus Corticosteroiden, Bronchodilatoren, Antiasthmatika, Antiphlogistika, Antirheumatika, immunsuppressiven Mitteln, Antimetaboliten, Immunmodulatoren, Antipsoriatika und Antidiabetika.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung, Hemmung und Unterdrückung von Zelladhäsion, Entzündung, oder einer Immun- oder Autoimmun-Antwort oder -Krankheit.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Arzneimittel gestaltet ist, um mit einem Wirkstoff ausgewählt aus Corticosteroiden, Bronchodilatoren, Antiasthmatika, Antiphlogistika, Antirheumatika, immunsuppressiven Mitteln, Antimetaboliten, Immunmodulatoren, Antipsoriatika und Antidiabetika verabreicht zu werden.
Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei die Entzündung mit Zelladhäsion assoziiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei die Immun- oder Autoimmun-Antwort oder -Krankheit mit Zelladhäsion assoziiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei die Immun- oder Autoimmunkrankheit Asthma, Arthritis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, multiple Sklerose, Diabetes oder entzündliche Darmerkrankung ist.